(57)【要約】本発明はウイルス学及び腫瘍治療法の分野に関する。特に、本発明は、本発明の組み換え単純ヘルペスウイルスが腫瘍細胞に対して高い致死性を有するのみならず、副作用（特に神経毒性）が著しく減少されるように、腫瘍細胞において高レベルで特異的に複製し、腫瘍細胞を効果的に殺傷することができるが、正常細胞では低レベルで複製し得る、組み換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を提供する。さらに、本発明は、組み換え単純ヘルペスウイルスに基づいて構築されたウイルスベクター、上記組み換え単純ヘルペスウイルス又は該ウイルスベクターを含む医薬組成物、及び上記組み換え単純ヘルペスウイルス又は上記ウイルスベクターの使用に関する。本発明の組み換え単純ヘルペスウイルスを、腫瘍細胞に感染させて腫瘍細胞を殺傷するために使用することができ、また遺伝子治療のための腫瘍細胞への遺伝子薬物の送達に対して使用され得る。
2020511160.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み換えＨＳＶウイルスであって、機能性のＩＣＰ０タンパク質及びＩＣＰ３４．５タンパク質を発現しないが、機能性ＵＬ４３タンパク質、機能性ＵＬ４１タンパク質（すなわち、ｖｈｓタンパク質）、機能性ＵＬ４８タンパク質（すなわち、ＶＭＷ６５タンパク質）又はそれらの任意の組み合わせを発現することができ、
好ましくは、前記組み換えＨＳＶウイルスが、組み換えＨＳＶ−１ウイルス、組み換えＨＳＶ−２ウイルス又はＨＳＶ−１／ＨＳＶ−２キメラウイルスであり、
好ましくは、前記組み換えＨＳＶウイルスがＨＳＶ−１株ＫＯＳに由来する、
組み換えＨＳＶウイルス。
【請求項２】
前記組み換えＨＳＶウイルスのゲノムが、以下の修飾を含む：
ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーの各々が独立して、機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、又は欠失している、又は外因性ヌクレオチド配列（例えば外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている、かつ、
ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーの各々が独立して、機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、又は欠失している、又は外因性ヌクレオチド配列（例えば外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている、
例えば、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムにおいて、
（ａ１）ＩＣＰ０遺伝子の一方のコピーが、機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含み、ＩＣＰ０遺伝子の他方のコピーが機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、若しくは欠失している、若しくは外因性ヌクレオチド配列（例えば外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている、又は、
（ｂ１）ＩＣＰ０遺伝子の一方のコピーが欠失され、ＩＣＰ０遺伝子の他方のコピーが、機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、若しくは欠失している、若しくは外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている、又は、
（ｃ１）ＩＣＰ０遺伝子の一方のコピーが外因性ヌクレオチド配列（例えば外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換され、ＩＣＰ０遺伝子の他方のコピーが、機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、若しくは欠失している、若しくは外因性ヌクレオチド配列（例えば外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている、かつ、
（ａ２）ＩＣＰ３４．５遺伝子の一方のコピーが機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含み、ＩＣＰ３４．５遺伝子の他方のコピーが、機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、若しくは欠失している、若しくは外因性ヌクレオチド配列（例えば外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている、又は、
（ｂ２）ＩＣＰ３４．５遺伝子の一方のコピーが欠失され、ＩＣＰ３４．５遺伝子の他方のコピーが、機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、若しくは欠失している、若しくは外因性ヌクレオチド配列（例えば外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている、又は、
（ｃ２）ＩＣＰ３４．５遺伝子の一方のコピーが外因性ヌクレオチド配列（例えば外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換され、ＩＣＰ３４．５遺伝子の他方のコピーが、機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、若しくは欠失している、若しくは外因性ヌクレオチド配列（例えば外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている、
好ましくは、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーが、同一の機能喪失型変異若しくは異なる機能喪失型変異を含む、又は全て欠失している、又は同じ外因性ヌクレオチド配列若しくは異なる外因性ヌクレオチド配列で置換されている、
好ましくは、ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーが、同じ機能喪失型変異若しくは異なる機能喪失型変異を含む、又は全て欠失している、又は同じ外因性ヌクレオチド配列若しくは異なる外因性ヌクレオチド配列で置換されている、
好ましくは前記組み換えＨＳＶウイルスのゲノムにおいて、
（１）前記ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーの各々が独立して機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含み、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーの各々が独立して機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、又は、
（２）前記ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーの各々が独立して機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含み、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーが欠失している、又は、
（３）前記ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーの各々が独立して機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含み、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーの各々が独立して外因性ヌクレオチド配列（例えば外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている、又は、
（４）前記ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーが欠失され、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーの各々が独立して機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、又は、
（５）前記ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーが欠失され、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーが欠失している、又は、
（６）前記ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーが欠失され、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーの各々が独立して外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている、又は、
（７）前記ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーの各々が独立して外因性ヌクレオチド配列（例えば外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換され、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーの各々が独立して機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、又は、
（８）前記ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーの各々が独立して外因性ヌクレオチド配列（例えば外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換され、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーが欠失している、又は、
（９）前記ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーの各々が独立して外因性ヌクレオチド配列（例えば外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換され、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーの各々が独立して外因性ヌクレオチド配列（例えば外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている、
好ましくは前記組み換えＨＳＶウイルスのゲノムにおいて、
（１）前記ＩＣＰ０遺伝子の第１のコピーが第１の機能喪失型変異を含み、前記ＩＣＰ０遺伝子の第２のコピーが第２の機能喪失型変異を含み、かつ、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーが第３の機能喪失型変異を含み、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の第２のコピーが第４の機能喪失型変異を含む、又は、
（２）前記ＩＣＰ０遺伝子の第１のコピーが第１の機能喪失型変異を含み、前記ＩＣＰ０遺伝子の第２のコピーが第２の機能喪失型変異を含み、かつ、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーが欠失している、又は、
（３）前記ＩＣＰ０遺伝子の第１のコピーが第１の機能喪失型変異を含み、前記ＩＣＰ０遺伝子の第２のコピーが第２の機能喪失型変異を含み、かつ、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーが第３の外因性ヌクレオチド配列で置換され、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の第２のコピーが第４の外因性ヌクレオチド配列で置換されている、又は、
（４）前記ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーが欠失され、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーが第３の機能喪失型変異を含み、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の第２のコピーが第４の機能喪失型変異を含む、又は、
（５）前記ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーが欠失され、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーが欠失され、例えば、前記組み換えＨＳＶウイルスのゲノムが、野生型ＨＳＶ−１ウイルスゲノムのｎｔ５１０〜ｎｔ５４３９の塩基配列及びｎｔ１２０８０２〜ｎｔ１２５７３１の塩基配列の欠失を有する、又は、
（６）前記ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーが欠失され、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーが第３の外因性ヌクレオチド配列で置換され、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の第２のコピーが第４の外因性ヌクレオチド配列で置換されている、又は、
（７）前記ＩＣＰ０遺伝子の第１のコピーが第１の外因性ヌクレオチド配列で置換され、前記ＩＣＰ０遺伝子の第２のコピーが第２の外因性ヌクレオチド配列で置換され、かつ
前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーが第３の機能喪失型変異を含み、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の第２のコピーが第４の機能喪失型変異を含む、又は、
（８）前記ＩＣＰ０遺伝子の第１のコピーが第１の外因性ヌクレオチド配列で置換され、前記ＩＣＰ０遺伝子の第２のコピーが第２の外因性ヌクレオチド配列で置換され、かつ
前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーが欠失している、又は、
（９）前記ＩＣＰ０遺伝子の第１のコピーが第１の外因性ヌクレオチド配列で置換され、前記ＩＣＰ０遺伝子の第２のコピーが第２の外因性ヌクレオチド配列で置換され、かつ前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーが第３の外因性ヌクレオチド配列で置換され、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の第２のコピーが第４の外因性ヌクレオチド配列で置換されている、
請求項１に記載の組み換えＨＳＶウイルス。
【請求項３】
前記第１の機能喪失型変異、前記第２の機能喪失型変異、前記第３の機能喪失型変異、及び前記第４の機能喪失型変異が、各々独立して、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、フレームシフト突然変異、塩基欠失、塩基置換、塩基付加、及びそれらの任意の組み合わせ（例えば、遺伝子フラグメントの欠失又は置換又は付加）からなる群から選択され、及び／又は、
前記第１の外因性ヌクレオチド配列、前記第２の外因性ヌクレオチド配列、前記第３の外因性ヌクレオチド配列、及び前記第４の外因性ヌクレオチド配列が、各々独立して、蛍光タンパク質、免疫調節ポリペプチド、サイトカイン、ケモカイン、抗体、及び細胞毒性ペプチドからなる群から選択される外来タンパク質をコードし、
好ましくは、前記蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質（例えば、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する緑色蛍光タンパク質）、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、
好ましくは、前記免疫調節ポリペプチドが、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激分子（ＩＣＯＳ）、ＦＴＬ３Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ７０、４−１ＢＢ、ＧＩＴＲ、ＣＤ２８、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、
好ましくは、前記サイトカインが、インターロイキン（例えばＩＬ−２、ＩＬ−１２及びＩＬ−１５）、インターフェロン（例えばＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子（例えばＴＮＦα）、コロニー刺激因子（例えばＧＭ−ＣＳＦ）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、
好ましくは、前記ケモカインが、ＣＣＬ２、ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ７、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２０、ＸＣＬ−１、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、
好ましくは、前記細胞毒性ペプチドが、チミジンキナーゼＴＫ（ＴＫ／ＧＣＶ）、ＴＲＡＩＬ、ＦａｓＬ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、
好ましくは、前記抗体が、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗Ｔｉｍ−３抗体、抗Ｌａｇ−３抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＣＤ７３抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＣＳＦ１Ｒ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＶＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＰＤＧＦＲ抗体、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、
請求項２に記載の組み換えＨＳＶウイルス。
【請求項４】
前記組み換えＨＳＶウイルスのゲノムが、機能性ＵＬ４３タンパク質を発現することができるＵＬ４３遺伝子、機能性ＵＬ４１タンパク質を発現することができるＵＬ４１遺伝子（すなわち、ｖｈｓ遺伝子）、及び／又は機能性ＵＬ４８タンパク質を発現することができるＵＬ４８遺伝子（すなわち、ＶＭＷ６５遺伝子）を含み、
好ましくは、前記組み換えＨＳＶウイルスが、以下：
（１）１つ以上の非必須遺伝子が欠失又は変異導入される（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換される）、好ましくは、前記非必須遺伝子が、ＵＬ３遺伝子、ＵＬ４遺伝子、ＵＬ１４遺伝子、ＵＬ１６遺伝子、ＵＬ２１遺伝子、ＵＬ２４遺伝子、ＵＬ３１遺伝子、ＵＬ３２遺伝子、ＵＳ３遺伝子、ＵＬ５１遺伝子、ＵＬ５５遺伝子、ＵＬ５６遺伝子、ＵＳ２遺伝子、ＵＳ１２遺伝子（すなわち、ＩＣＰ４７遺伝子）、ＬＡＴ遺伝子、ＪＱ６７３４８０．１のｎｔ５８５３〜ｎｔ７４８５に対応するヌクレオチドフラグメント、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、好ましくは、前記ＵＬ５５遺伝子、前記ＵＳ２遺伝子、前記ＬＡＴ遺伝子、及び前記ＪＱ６７３４８０．１のｎｔ５８５３〜ｎｔ７４８５に対応するヌクレオチドフラグメントの１つ以上が欠失又は変異導入される（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換される）、
（２）前記組み換えＨＳＶウイルスの必須遺伝子が欠失されず、機能喪失型変異を含まない、好ましくは、１つ以上の必須遺伝子（例えばＩＣＰ２７遺伝子、ＩＣＰ４遺伝子、ＶＰ５遺伝子、ｇＬ遺伝子、ｇＨ遺伝子、ｇＤ遺伝子、ｇＫ遺伝子、ｇＢ遺伝子、ｇＮ遺伝子、ＵＬ５遺伝子、ＵＬ６遺伝子、ＵＬ８遺伝子、ＵＬ９遺伝子、ＵＬ１２遺伝子、ＵＬ２５遺伝子、ＵＬ２６遺伝子、ＵＬ２８遺伝子、ＵＬ２９遺伝子、ＵＬ３０遺伝子、ＵＬ３３遺伝子、ＵＬ３６遺伝子、ＵＬ３８遺伝子、ＵＬ４２遺伝子、ＵＬ４８遺伝子、及び／又はＵＬ５２遺伝子）の本来のプロモーターが、ｈＴＥＲＴプロモーター等の腫瘍特異的プロモーターで置換されている、並びに、
（３）前記ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピー及び前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーを除いて、前記組み換えＨＳＶウイルスのゲノムが、野生型ＨＳＶウイルスの全ての他の遺伝子を含み、該他の遺伝子のいずれも機能喪失型変異を含まない、好ましくは、前記組み換えＨＳＶウイルスのゲノムが、１つ以上のＨＳＶ遺伝子の本来のプロモーターがｈＴＥＲＴプロモーター等の腫瘍特異的プロモーターで置換される修飾を更に含み、好ましくは、前記ＨＳＶ遺伝子が、ＶＰ５遺伝子、ＩＣＰ２７遺伝子及びＩＣＰ４遺伝子から選択される、
からなる群から選択される１つ以上の特徴を更に有し、
好ましくは、前記組み換えＨＳＶウイルスのゲノムが、
（１）ｈＴＥＲＴプロモーター等の腫瘍特異的プロモーターによる前記ＶＰ５遺伝子の本来のプロモーターの置換、
（２）ｈＴＥＲＴプロモーター等の腫瘍特異的プロモーターによる前記ＩＣＰ２７遺伝子の本来のプロモーターの置換、
（３）ｈＴＥＲＴプロモーター等の腫瘍特異的プロモーターによる前記ＩＣＰ４遺伝子の本来のプロモーターの置換、及び、
（４）前記ＵＬ５５遺伝子、前記ＵＳ２遺伝子、前記ＬＡＴ遺伝子及び前記ＪＱ６７３４８０．１のｎｔ５８５３〜ｎｔ７４８５に対応するヌクレオチドフラグメントの１つ以上の欠失又は変異導入（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換される）、
からなる群から選択される１つ以上の修飾を更に含み、
好ましくは、前記ｈＴＥＲＴプロモーターが配列番号５に示される配列を有する、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の組み換えＨＳＶウイルス。
【請求項５】
前記組み換えＨＳＶウイルスが第５の外因性ヌクレオチド配列を更に含み、
好ましくは、前記第５の外因性ヌクレオチド配列が、蛍光タンパク質、免疫調節ポリペプチド、サイトカイン、ケモカイン、抗体、及び細胞毒性ペプチドからなる群から選択される外来タンパク質をコードする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組み換えＨＳＶウイルス。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の組み換えＨＳＶウイルスのゲノムを含む、又は請求項１〜５のいずれか一項に記載の組み換えＨＳＶウイルスのゲノムからなるウイルスベクター。
【請求項７】
変異型ＨＳＶゲノムを含む又は変異型ＨＳＶゲノムからなるウイルスベクターであって、前記変異型ＨＳＶゲノムは、機能性ＩＣＰ０タンパク質及び機能性ＩＣＰ３４．５タンパク質を発現しないが、機能性ＵＬ４３タンパク質、機能性ＵＬ４１タンパク質（すなわち、ｖｈｓタンパク質）、機能性ＵＬ４８タンパク質（すなわち、ＶＭＷ６５タンパク質）、又はそれらの任意の組み合わせを発現することができ、
好ましくは、前記変異型ＨＳＶゲノムは、ＨＳＶ−１ウイルス、ＨＳＶ−２ウイルス又はＨＳＶ−１／ＨＳＶ−２キメラウイルスのゲノムに由来し、
好ましくは、前記変異型ＨＳＶゲノムはＨＳＶ−１株ＫＯＳのゲノムに由来し、
好ましくは、前記変異型ＨＳＶゲノムはＧｅｎＢａｎｋ：ＪＱ６７３４８０．１に示されるゲノムに由来する、
ウイルスベクター。
【請求項８】
前記変異型ＨＳＶゲノムが、以下の修飾を含む：
前記ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーの各々が独立して、機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、又は欠失している、又は外因性ヌクレオチド配列（例えば外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている、かつ、
前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーの各々が独立して、機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、又は欠失している、又は外因性ヌクレオチド配列（例えば外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている、
例えば、前記変異型ＨＳＶゲノムにおいて、
（ａ１）前記ＩＣＰ０遺伝子の一方のコピーが機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含み、前記ＩＣＰ０遺伝子の他方のコピーが、機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、若しくは欠失している、若しくは外因性ヌクレオチド配列（例えば外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている、又は、
（ｂ１）前記ＩＣＰ０遺伝子の一方のコピーが欠失され、前記ＩＣＰ０遺伝子の他方のコピーが、機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、若しくは欠失している、若しくは外因性ヌクレオチド配列（例えば外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている、又は、
（ｃ１）前記ＩＣＰ０遺伝子の一方のコピーが外因性ヌクレオチド配列（例えば外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換され、前記ＩＣＰ０遺伝子の他方のコピーが、機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、若しくは欠失している、若しくは外因性ヌクレオチド配列（例えば外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている、かつ、
（ａ２）前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の一方のコピーが機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含み、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の他方のコピーが、機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、若しくは欠失している、若しくは外因性ヌクレオチド配列（例えば外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている、又は、
（ｂ２）前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の一方のコピーが欠失され、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の他方のコピーが、機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、若しくは欠失している、若しくは外因性ヌクレオチド配列（例えば外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている、又は、
（ｃ２）前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の一方のコピーが外因性ヌクレオチド配列（例えば外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換され、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の他方のコピーが、機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、若しくは欠失している、若しくは外因性ヌクレオチド配列（例えば外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている、
好ましくは、前記ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーが、同一の機能喪失型変異若しくは異なる機能喪失型変異を含む、又は全て欠失している、又は同じ外因性ヌクレオチド配列若しくは異なる外因性ヌクレオチド配列で置換されている、
好ましくは、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーが、同じ機能喪失型変異若しくは異なる機能喪失型変異を含む、又は全て欠失している、又は同じ外因性ヌクレオチド配列若しくは異なる外因性ヌクレオチド配列で置換されている、
好ましくは、前記変異型ＨＳＶゲノムにおいて、
（１）前記ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーの各々が独立して機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含み、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーの各々が独立して機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、又は、
（２）前記ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーの各々が独立して機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含み、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーが欠失している、又は、
（３）前記ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーの各々が独立して機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含み、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーの各々が独立して外因性ヌクレオチド配列（例えば外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている、又は、
（４）前記ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーが欠失され、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーの各々が独立して機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、又は、
（５）前記ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーが欠失され、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーが欠失している、又は、
（６）前記ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーが欠失され、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーの各々が独立して外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている、又は、
（７）前記ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーの各々が独立して外因性ヌクレオチド配列（例えば外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換され、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーの各々が独立して機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、又は、
（８）前記ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーの各々が独立して外因性ヌクレオチド配列（例えば外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換され、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーが欠失している、又は、
（９）前記ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーの各々が独立して外因性ヌクレオチド配列（例えば外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換され、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーの各々が独立して外因性ヌクレオチド配列（例えば外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている、
好ましくは、前記変異型ＨＳＶゲノムにおいて、
（１）前記ＩＣＰ０遺伝子の第１のコピーが第１の機能喪失型変異を含み、前記ＩＣＰ０遺伝子の第２のコピーが第２の機能喪失型変異を含み、かつ、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーが第３の機能喪失型変異を含み、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の第２のコピーが第４の機能喪失型変異を含む、又は、
（２）前記ＩＣＰ０遺伝子の第１のコピーが第１の機能喪失型変異を含み、前記ＩＣＰ０遺伝子の第２のコピーが第２の機能喪失型変異を含み、かつ、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーが欠失している、又は、
（３）前記ＩＣＰ０遺伝子の第１のコピーが第１の機能喪失型変異を含み、前記ＩＣＰ０遺伝子の第２のコピーが第２の機能喪失型変異を含み、かつ、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーが第３の外因性ヌクレオチド配列で置換され、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の第２のコピーが第４の外因性ヌクレオチド配列で置換されている、又は、
（４）前記ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーが欠失され、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーが第３の機能喪失型変異を含み、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の第２のコピーが第４の機能喪失型変異を含む、又は、
（５）前記ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーが欠失され、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーが欠失され、例えば、前記組み換えＨＳＶウイルスのゲノムが、野生型ＨＳＶ−１ウイルスゲノムのｎｔ５１０〜ｎｔ５４３９の塩基配列及びｎｔ１２０８０２〜ｎｔ１２５７３１の塩基配列の欠失を有する、又は、
（６）前記ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーが欠失され、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーが第３の外因性ヌクレオチド配列で置換され、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の第２のコピーが第４の外因性ヌクレオチド配列で置換されている、又は、
（７）前記ＩＣＰ０遺伝子の第１のコピーが第１の外因性ヌクレオチド配列で置換され、前記ＩＣＰ０遺伝子の第２のコピーが第２の外因性ヌクレオチド配列で置換され、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーが第３の機能喪失型変異を含み、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の第２のコピーが第４の機能喪失型変異を含む、又は、
（８）前記ＩＣＰ０遺伝子の第１のコピーが第１の外因性ヌクレオチド配列で置換され、前記ＩＣＰ０遺伝子の第２のコピーが第２の外因性ヌクレオチド配列で置換され、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーが欠失している、又は、
（９）前記ＩＣＰ０遺伝子の第１のコピーが第１の外因性ヌクレオチド配列で置換され、前記ＩＣＰ０遺伝子の第２のコピーが第２の外因性ヌクレオチド配列で置換され、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーが第３の外因性ヌクレオチド配列で置換され、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の第２のコピーが第４の外因性ヌクレオチド配列で置換されている、
請求項７に記載のウイルスベクター。
【請求項９】
前記第１の機能喪失型変異、前記第２の機能喪失型変異、前記第３の機能喪失型変異、及び前記第４の機能喪失型変異が、それぞれ独立して、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、フレームシフト突然変異、塩基欠失、塩基置換、塩基付加、及びそれらの任意の組み合わせ（例えば、遺伝子フラグメントの欠失又は置換又は付加）から選択され、及び／又は、
前記第１の外因性ヌクレオチド配列、前記第２の外因性ヌクレオチド配列、前記第３の外因性ヌクレオチド配列、及び前記第４の外因性ヌクレオチド配列が各々独立して、蛍光タンパク質、免疫調節ポリペプチド、サイトカイン、ケモカイン、抗体、及び細胞毒性ペプチドからなる群から選択される外来タンパク質をコードし、
好ましくは、前記蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質（例えば、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する緑色蛍光タンパク質）、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、
好ましくは、前記免疫調節ポリペプチドが、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激分子（ＩＣＯＳ）、ＦＴＬ３Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ７０、４−１ＢＢ、ＧＩＴＲ、ＣＤ２８、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、
好ましくは、前記サイトカインが、インターロイキン（例えばＩＬ−２、ＩＬ−１２及びＩＬ−１５）、インターフェロン（例えばＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子（例えばＴＮＦα）、コロニー刺激因子（例えばＧＭ−ＣＳＦ）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、
好ましくは、前記ケモカインが、ＣＣＬ２、ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ７、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２０、ＸＣＬ−１、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、
好ましくは、前記細胞毒性ペプチドが、チミジンキナーゼＴＫ（ＴＫ／ＧＣＶ）、ＴＲＡＩＬ、ＦａｓＬ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、
好ましくは、前記抗体が、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗Ｔｉｍ−３抗体、抗Ｌａｇ−３抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＣＤ７３抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＣＳＦ１Ｒ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＶＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＰＤＧＦＲ抗体、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、
請求項８に記載のウイルスベクター。
【請求項１０】
前記変異型ＨＳＶゲノムが、機能性ＵＬ４３タンパク質を発現することができるＵＬ４３遺伝子、機能性ＵＬ４１タンパク質を発現することができるＵＬ４１遺伝子（すなわち、ｖｈｓ遺伝子）、及び／又は機能性ＵＬ４８タンパク質を発現することができるＵＬ４８遺伝子（すなわち、ＶＭＷ６５遺伝子）を含み、
好ましくは、前記変異型ＨＳＶゲノムが、
（１）１つ以上の非必須遺伝子が欠失又は変異導入され（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換される）、好ましくは、前記非必須遺伝子が、ＵＬ３遺伝子、ＵＬ４遺伝子、ＵＬ１４遺伝子、ＵＬ１６遺伝子、ＵＬ２１遺伝子、ＵＬ２４遺伝子、ＵＬ３１遺伝子、ＵＬ３２遺伝子、ＵＳ３遺伝子、ＵＬ５１遺伝子、ＵＬ５５遺伝子、ＵＬ５６遺伝子、ＵＳ２遺伝子、ＵＳ１２遺伝子（すなわち、ＩＣＰ４７遺伝子）、ＬＡＴ遺伝子、ＪＱ６７３４８０．１のｎｔ５８５３〜ｎｔ７４８５に対応するヌクレオチドフラグメント、及びそれらの任意の組み合わせから選択され、好ましくは、前記ＵＬ５５遺伝子、前記ＵＳ２遺伝子、前記ＬＡＴ遺伝子、及び前記ＪＱ６７３４８０．１のｎｔ５８５３〜ｎｔ７４８５に対応するヌクレオチドフラグメントの１つ以上が欠失又は変異導入される（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換される）、
（２）前記変異型ＨＳＶゲノム中の必須遺伝子が欠失されず、機能喪失型変異を含まず、好ましくは、１つ以上の必須遺伝子（例えばＩＣＰ２７遺伝子、ＩＣＰ４遺伝子、ＶＰ５遺伝子、ｇＬ遺伝子、ｇＨ遺伝子、ｇＤ遺伝子、ｇＫ遺伝子、ｇＢ遺伝子、ｇＮ遺伝子、ＵＬ５遺伝子、ＵＬ６遺伝子、ＵＬ８遺伝子、ＵＬ９遺伝子、ＵＬ１２遺伝子、ＵＬ２５遺伝子、ＵＬ２６遺伝子、ＵＬ２８遺伝子、ＵＬ２９遺伝子、ＵＬ３０遺伝子、ＵＬ３３遺伝子、ＵＬ３６遺伝子、ＵＬ３８遺伝子、ＵＬ４２遺伝子、ＵＬ４８遺伝子、及び／又はＵＬ５２遺伝子）の本来のプロモーターが、ｈＴＥＲＴプロモーター等の腫瘍特異的プロモーターで置換されている、並びに、
（３）前記ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピー及び前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーを除いて、前記変異型ＨＳＶゲノムが、野生型ＨＳＶウイルスの全ての他の遺伝子を含み、該他の遺伝子のいずれも機能喪失型変異を含まず、好ましくは、前記変異型ＨＳＶゲノムが、１つ以上のＨＳＶ遺伝子の本来のプロモーターがｈＴＥＲＴプロモーター等の腫瘍特異的プロモーターで置換される修飾を更に含み、好ましくは、前記ＨＳＶ遺伝子が、ＶＰ５遺伝子、ＩＣＰ２７遺伝子及びＩＣＰ４遺伝子から選択される、
からなる群から選択される１つ以上の特徴を更に有し、
好ましくは、前記変異型ＨＳＶゲノムが、
（１）ｈＴＥＲＴプロモーター等の腫瘍特異的プロモーターによる前記ＶＰ５遺伝子の本来のプロモーターの置換、
（２）ｈＴＥＲＴプロモーター等の腫瘍特異的プロモーターによる前記ＩＣＰ２７遺伝子の本来のプロモーターの置換、
（３）ｈＴＥＲＴプロモーター等の腫瘍特異的プロモーターによる前記ＩＣＰ４遺伝子の本来のプロモーターの置換、及び、
（４）前記ＵＬ５５遺伝子、前記ＵＳ２遺伝子、前記ＬＡＴ遺伝子及び前記ＪＱ６７３４８０．１のｎｔ５８５３〜ｎｔ７４８５に対応するヌクレオチドフラグメントの１つ以上の欠失又は変異導入（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換される）、
からなる群から選択される１つ以上の修飾を更に含み、
好ましくは、前記ｈＴＥＲＴプロモーターが配列番号５に示される配列を有する、
請求項７〜９のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
【請求項１１】
前記変異型ＨＳＶゲノムが第５の外因性ヌクレオチド配列を更に含み、
好ましくは、前記第５の外因性ヌクレオチド配列が、蛍光タンパク質、免疫調節ポリペプチド、サイトカイン、ケモカイン、抗体、及び細胞毒性ペプチドからなる群から選択される外来タンパク質をコードする、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の組み換えＨＳＶウイルスに感染している、又は請求項１〜５のいずれか一項に記載の組み換えＨＳＶウイルスのゲノムを含む、又は請求項６〜１１のいずれか一項に記載のウイルスベクターでトランスフェクトされている、宿主細胞であって、
好ましくは、前記細胞が、肺癌細胞、肝臓癌細胞、乳癌細胞、骨肉腫細胞、卵巣癌細胞、子宮頸癌細胞、前立腺癌細胞、神経膠腫細胞、黒色腫細胞、結腸直腸癌細胞、及び膵癌細胞からなる群から選択される腫瘍細胞である、宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の組み換えＨＳＶウイルスを得る方法であって、
（１）請求項１２に記載の宿主細胞を培養することと、
（２）前記宿主細胞に病変が生じた後、該宿主細胞を収集し、溶解させて前記宿主細胞の溶解物を得ることと、
（３）前記溶解物から前記組み換えＨＳＶウイルスを回収することと、
を含む、方法。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の組み換えＨＳＶウイルス、又は請求項１〜５のいずれか一項に記載の組み換えＨＳＶウイルスのゲノム、又は請求項６〜１１のいずれか一項に記載のウイルスベクターと、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤とを含む医薬組成物であって、
好ましくは、前記医薬組成物が、腫瘍、例えば肺癌、肝臓癌、乳癌、骨肉腫、卵巣癌、前立腺癌、神経膠腫、黒色腫、結腸直腸癌、及び膵臓癌の治療に対して使用され、
好ましくは、前記医薬組成物が注射液又は凍結乾燥粉体であり、
好ましくは、前記医薬組成物が、治療的有効量（例えば、腫瘍の治療に対して治療的に有効な量）の前記組み換えＨＳＶウイルス、又は前記組み換えＨＳＶウイルスのゲノム、又は前記ウイルスベクターを含み、
好ましくは、前記医薬組成物が単位剤形で存在し、例えば、１０２ｐｆｕ〜１０９ｐｆｕの前記組み換えＨＳＶウイルスが、前記医薬組成物１単位用量当たりに含まれる、
医薬組成物。
【請求項１５】
治療的有効量の請求項１〜５のいずれか一項に記載の組み換えＨＳＶウイルス、又は請求項６〜１１のいずれか一項に記載のウイルスベクター、又は請求項１４に記載の医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む腫瘍を治療する方法であって、
好ましくは、前記腫瘍が、肺癌、肝臓癌、乳癌、骨肉腫、卵巣癌、前立腺癌、神経膠腫、黒色腫、結腸直腸癌、及び膵臓癌からなる群から選択され、
好ましくは、前記被験体がヒト等の哺乳動物である、方法。
【請求項１６】
被験体において腫瘍を治療するための医薬組成物の製造における請求項１〜５のいずれか一項に記載の組み換えＨＳＶウイルス、又は請求項６〜１１のいずれか一項に記載のウイルスベクターの使用であって、
好ましくは、前記腫瘍が、肺癌、肝臓癌、乳癌、骨肉腫、卵巣癌、前立腺癌、神経膠腫、黒色腫、結腸直腸癌、及び膵臓癌からなる群から選択され、
好ましくは、前記被験体がヒト等の哺乳動物である、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はウイルス学及び腫瘍治療法の分野に関する。特に、本発明は、本発明の組み換え単純ヘルペスウイルスが腫瘍細胞に対して高い致死性を有するのみならず、副作用（特に神経毒性）が著しく減少されるように、腫瘍細胞において高レベルで特異的に複製し、腫瘍細胞を効果的に殺傷することができるが、正常細胞では低レベルで複製し得る、組み換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を提供する。さらに、本発明は、組み換え単純ヘルペスウイルスに基づいて構築されたウイルスベクター、上記組み換え単純ヘルペスウイルス又は該ウイルスベクターを含む医薬組成物、及び上記組み換え単純ヘルペスウイルス又は上記ウイルスベクターの使用に関する。本発明の組み換え単純ヘルペスウイルスを、腫瘍細胞に感染させて腫瘍細胞を殺傷するために使用することができ、また遺伝子治療のための腫瘍細胞への遺伝子薬物の送達に対して使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
放射線療法、化学療法、及び標的化薬物は、現在広く用いられている腫瘍治療レジメンであるが、それらはいずれも、不完全な治療、大きな副作用、薬剤耐性の傾向、腫瘍の再発及び転移の制御不能、並びに不十分な腫瘍治療効果等の多くの問題がある。したがって、新たな有効な腫瘍治療法を開発することが急務である。近年、人々の腫瘍と免疫の関係の理解に著しい改善がなされ、腫瘍の免疫療法が急速に発展した。それらのうち、腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ：oncolytic virus）療法は、新たなタイプの腫瘍免疫療法として注意を引いた（非特許文献１）。腫瘍溶解性ウイルスは、正常細胞においてそれらの増殖を制限しながら、腫瘍細胞では選択的に複製することができる腫瘍親和性の（tumorphilic）特性を有するウイルス群である。腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞において複製し、腫瘍細胞の溶解及び死をもたらし、増幅されたウイルスは、周囲の腫瘍細胞に感染し続けることで、カスケード効果を生み出すことができる。さらに、腫瘍細胞を溶解する過程の間、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍抗原も放出して身体を刺激することで、特異的な抗腫瘍免疫を持つ抗腫瘍抗体を産生し、さらに腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍溶解効果を増強することができる。腫瘍溶解性ウイルスは、悪性腫瘍治療の分野において最も使用されている新規な遺伝子療法の薬物である。特に固形腫瘍の局所制御治療では、腫瘍溶解性ウイルスの感染及び増殖は注入部位で腫瘍アブレーションをもたらし、腫瘍細胞の溶解が腫瘍細胞からの腫瘍抗原の放出をもたらすことで、腫瘍の広がり及び転移の全身制御にとって重要な免疫応答となり得る全身性の抗腫瘍免疫応答を誘導して、体内のその他の領域の腫瘍と戦う（非特許文献２）。
【０００３】
現在の腫瘍溶解性ウイルスは、ウイルスの種類によって１０を超える種類に分けることができる。それらのうち、使用されるウイルスベクターは、大きな遺伝子を保有する能力、短い複製サイクル、高い感染効率、複数の治療用遺伝子を挿入する能力、及びその他の利点を有することから、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ−１）は国内及び海外で遺伝子工学的腫瘍治療薬物に対する第１選択となっている。
【０００４】
ＨＳＶ−１ウイルスは、ヘルペスウイルス科に属し、ヒトにおいて唇、眼及び顔の皮膚に対してヘルペスを引き起こす、エンベロープＤＮＡウイルスの一種である。疫学的調査によれば、人口の６０％超がＨＳＶ−１ウイルスに感染している。ＨＳＶ−１ウイルスのゲノムは１５２ｋｂの二本鎖の直鎖ＤＮＡからなり、互いにライゲートされた長いフラグメントと短いフラグメントの２つのフラグメントを含む（非特許文献３）。長いフラグメント（Ｌ領域）はゲノムの約８２％を占めるのに対し、短いフラグメント（Ｓ領域）はゲノムの約１８％を占め、長いフラグメントと短いフラグメントは接合領域によって共にライゲートされる。Ｌ領域は１対の逆方向反復セグメントを含み、その間のセグメントはユニークセグメント（unique segment）ＵＬと称され、Ｓ領域もまた１対の逆方向反復セグメントを有し、その間のセグメントはユニークセグメントＵＳと称される。現在、ＨＳＶ−１  ＫＯＳ株の全ゲノムの配列決定は完了している。ＫＯＳ株のゲノムは合計１５２０１１個のヌクレオチド塩基を含み、またタンパク質をコードする遺伝子を合計７２個含み、ここでユニークセグメントＵＬは５６個の遺伝子を含み、ユニークセグメントＵＳは１２個の遺伝子を含み、ＵＬ末端逆方向反復セグメント（ＴＲＬ）及びＵＬ中間逆方向反復配列（ＩＲＬ）は各々３つの同じ遺伝子（それぞれ、ＩＣＰ３４．５、ＩＣＰ０及びＬＡＴ）を含み、ＵＳ末端逆方向反復セグメント（ＴＲＳ）及びＵＳ中間逆方向反復配列（ＩＲＳ）は各々１つの同じ遺伝子（ＩＣＰ４）を含む。
【０００５】
ＨＳＶ−１が豊富に複製される場合、ＨＳＶ−１は転写レベルにおいてカスケードを調節するようにタンパク質を合成する。これらのタンパク質を、それらの合成の時間順にα、β及びγの３種類に分類することができる。ＨＳＶ−１ウイルスは、最初に、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７及びＩＣＰ４７を含む５つの前初期タンパク質（ＩＥタンパク質）をコードするα型遺伝子を転写し、次に転写レベルでβ型及びγ型の遺伝子を活性化して、ウイルスの初期（Ｅ）及び後期（Ｌ）のタンパク質の発現を促進する。前初期タンパク質ＩＣＰ０は、独立して、全てのタイプのウイルス遺伝子（すなわち、ＩＥ、Ｅ及びＬ）と並んで様々な細胞遺伝子を活性化することができる（幾つかの場合には、ＩＣＰ４の相乗的な活性化を必要とすることがある）。ＩＣＰ０は複数の細胞内転写因子又は調節タンパク質と相互作用して宿主細胞において或る特定の遺伝子の転写を活性化するだけでなく、そのユビキチンリガーゼＥ３の機能性ドメインによってウイルスゲノム発現及びウイルス遺伝子転写の調節も行う（非特許文献４）。ＩＣＰ４及びＩＣＰ２７はウイルス複製に必要な前初期タンパク質である（非特許文献５、非特許文献６）。ＩＣＰ２７は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩと相互作用することによりウイルス遺伝子の転写を促進する多機能性調節タンパク質である。ＩＣＰ２７は、ＩＣＰ４と相互作用して初期及び後期の遺伝子発現を活性化することができる。また、ＩＣＰ２７は、ウイルス複製関連遺伝子をアップレギュレートすることにより、間接的にウイルスＤＮＡ複製を促進する。さらに、ＩＣＰ２７は、細胞原始ＲＮＡスプライシングを阻害し、ウイルスｍＲＮＡの移行及び翻訳を促進する機能も有する。ＩＣＰ３４．５は、抗ウイルスタンパク質ＰＫＲの作用を逆転して、宿主及びウイルスのタンパク質合成を継続させることで、ウイルス複製を促進することができる。さらに、ＩＣＰ３４．５は、ＰＰ１ホスファターゼ活性を調節することにより宿主の抗ウイルス応答を回避することもできる（非特許文献７）。
【０００６】
これまで、Ｒ３６１６突然変異株（ＨＳＶ−１Ｆ株に由来する）におけるＩＣＰ３４．５遺伝子のノックアウトによって得られたＨＳＶ１７１６（非特許文献８及び非特許文献９）、Ｒ３６１６突然変異株におけるＩＣＰ３４．５／ＩＣＰ６遺伝子のダブルノックアウトによって得られたＧ２０７（非特許文献１０及び非特許文献１１）、Ｒ７０２０突然変異株（ＨＳＶ−１Ｆ株に由来）におけるＩＣＰ３４．５／ＩＣＰ０／ＩＣＰ４／ＵＬ５６遺伝子の単一のコピーの欠失により得られたＮＶ１０２０（非特許文献１２及び非特許文献１３）、及び臨床ＨＳＶ−１単離株ＪＳ１におけるＩＣＰ３４．５／ＩＣＰ４７遺伝子のダブルノックアウトによって得られたＴ−ＶＥＣ（非特許文献１４）を含む様々な腫瘍溶解性ＨＳＶ−１ウイルスベクターが前臨床又は臨床研究のフェーズにあった。米国のAmgen社では、組み換えＨＳＶ−１ウイルスＴ−ＶＥＣは、進行した黒色腫を有する患者の第ＩＩＩ相臨床試験において突破口を開き、ＦＤＡによって承認された最初の腫瘍溶解性ウイルス型治療薬となった。しかしながら、データは、Ｔ−ＶＥＣ治療群が強く有望な傾向を示したものの、この臨床試験は、主要評価項目である持続時間反応率（ＤＲＲ：duration response rate）に達するにとどまり、副次的評価項目である改善された全生存（ＯＳ：overall survival）には達しなかったことを示唆する（非特許文献１５）。これは主に、Ｔ−ＶＥＣが強い毒性の副作用を有するためであり、その初期の腫瘍内治療用量は、わずか１０６ＰＦＵのウイルスであり、これは腫瘍治療効果の著しい減少をもたらし、患者は腫瘍溶解治療に絶好の時期を逃すこととなる。
【０００７】
単純ヘルペスウイルスＩ型の腫瘍溶解治療は近年一定の結果を達成したものの、癌治療の臨床研究に入った組み換えＨＳＶ−１ウイルスの分析は、異なる腫瘍溶解性ウイルスが異なる遺伝子修飾、異なる腫瘍溶解効果、及び安全特性を有することから、それらのウイルスの腫瘍適応及び腫瘍治療効果が異なることを示す（非特許文献１６）。概して、既存の腫瘍溶解性ウイルスは著しい毒性及び副作用を有し、安全性が不十分であって、腫瘍溶解性ウイルスの治療用量は制限されており、このことが腫瘍治療研究にとって厳しい課題となっている（非特許文献１７）。腫瘍溶解性ウイルスの治療効果は、投与されたウイルスの用量と正の相関がある。腫瘍溶解性ウイルスの特異性及び安全性が十分に高くない場合、腫瘍溶解性ウイルスの必要な用量は、身体に対して重篤な副作用を回避するように制限されていなければならないことがある。これは、腫瘍溶解性ウイルスの臨床治療効果に大きな影響を与え、所定の安全性の問題をもたらす。アメリカ合衆国のAmgenのＴ−ＶＥＣを例に挙げると、その毒性／副作用はＴ−ＶＥＣの臨床効果を制限する重要な要因である。科学者は、Ｔ−ＶＥＣを用いて実験を行っているが、正常細胞に対して重篤な副作用を引き起こすことなく、腫瘍細胞において高レベルで複製し、腫瘍細胞を殺傷することができる腫瘍溶解性ウイルスは、これまでのところ見つかっていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Lichty B D, Breitbach CJ, Stojdl DF, et al. Going viral with cancer immunotherapy [J]. Nat Rev Cancer, 2014, 14 (8): 559-567
【非特許文献２】Russell S J, Peng KW, Bell J C. Oncolytic virotherapy [J]. Nat Biotechnol, 2012, 30 (7): 658-670
【非特許文献３】Macdonald S J, Mostafa HH, Morrison L A, et al. Genome sequence of herpes simplex virus 1 strain KOS [J]. J Virol, 2012, 86 (11): 6371-6372
【非特許文献４】Kawaguchi Y, Bruni R, Roizman B. Interaction of herpes simplex virus 1 alpha regulatory protein ICP0 with elongation factor 1delta: ICP0 affects translational machinery [J]. J Virol, 1997, 71 (2): 1019-1024
【非特許文献５】DeLuca N A, McCarthy A M, Schaffer P A. Isolation and characterization of deletion mutants of herpes simplex virus type 1 in the gene encoding immediate-early regulatory protein ICP4 [J]. J Virol, 1985, 56 (2): 558-570
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【非特許文献７】Randall G, Roizman B. Transcription of the derepressed open reading frame P of herpes simplex virus 1 precludes the expression of the antisense gamma (1) 34.5 gene and may account for the attenuation of the mutant virus [J]. J Virol, 1997, 71 (10): 7750-7757
【非特許文献８】MacKie R M, Stewart B, Brown S M. Intralesional injection of herpes simplex virus 1716 in metastatic melanoma [J]. Lancet, 2001, 357(9255): 525-526
【非特許文献９】Papanastassiou V, Rampling R, Fraser M, et al. The potential for efficacy of the modified (ICP 34.5(-)) herpes simplex virus HSV1716 following intratumoural injection into human malignant glioma: a proof of principle study [J]. Gene Ther, 2002, 9(6): 398-406
【非特許文献１０】Markert J M, Medlock M D, Rabkin S D, et al. Conditionally replicating herpes simplex virus mutant, G207 for the treatment of malignant glioma: results of phase I trial [J]. Gene Ther, 2000, 7(10): 867-874
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【非特許文献１２】Gutermann A, Mayer E, von Dehn-Rothfelser K, et al. Efficacy of oncolytic herpesvirus NV1020 can be enhanced by combination with chemotherapeutics in colon carcinoma cells [J]. Hum Gene Ther, 2006, 17(12): 1241-1253
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【非特許文献１４】Liu B L, Robinson M, Han Z Q, et al. ICP34.5 deleted herpes simplex virus with enhanced oncolytic, immune stimulating, and anti-tumour properties [J]. Gene Ther, 2003, 10(4): 292-303
【非特許文献１５】Andtbacka R H, Kaufman H L, Collichio F, et al. Talimogene Laherparepvec Improves Durable Response Rate in Patients With Advanced Melanoma [J]. J Clin Oncol, 2015, 33(25): 2780-2788
【非特許文献１６】Eager R M, Nemunaitis J. Clinical development directions in oncolytic virus therapy [J]. Cancer Gene Ther, 2011, 18(5): 305-317
【非特許文献１７】Liu T C, Galanis E, Kirn D. Clinical trial results with oncolytic virotherapy: a century of promise, a decade of progress [J]. Nat Clin Pract Oncol, 2007, 4(2): 101-117
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、毒性が低く、有効性の高い腫瘍溶解性ウイルス療法を達成する新たな腫瘍溶解性ウイルスを開発するニーズが今なお存在している。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従来技術の腫瘍の遺伝子療法における組み換え単純ヘルペスウイルスの上述の欠点を克服するため、本出願の発明者らは、腫瘍細胞において高レベルで複製することができ、腫瘍細胞に対して高い致死性を示すことができるだけでなく、副作用（特に神経毒性）が顕著に軽減されている、新規な組み換え単純ヘルペスウイルスを構築した。したがって、本発明の組み換え単純ヘルペスウイルスは、腫瘍溶解性ウイルスの高い治療効果を維持するだけでなく、腫瘍溶解性ウイルスの安全性を大いに改善する。
【００１１】
本発明では、本明細書で使用される科学用語及び技術用語は、別段の指示がない限り、当業者によって一般に理解される意味を有する。さらに、本明細書で使用される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、及び免疫学的実験手順は、いずれも対応する技術分野において広く使用されている通例の工程である。また、本発明のより良い理解のため、関連する用語の定義及び説明を以下に提供する。
【００１２】
本明細書で使用される、「組み換えＨＳＶウイルス」の用語は、野生型ＨＳＶウイルスと比較して、人為的に導入された突然変異を含む操作されたＨＳＶウイルスを指す。本発明の組み換えＨＳＶウイルスは、その産生方法に限定されないと理解されるべきである。例えば、本発明の組み換えＨＳＶウイルスは相同組換えによって、又は組み換えＨＳＶウイルスに感染した宿主細胞を培養することによって産生され得る。
【００１３】
本明細書で使用される「ウイルスベクター」の用語は、ウイルスゲノムに基づいて構築され、外因性ヌクレオチド配列を保有することができる核酸送達ビヒクルを指す。概して、ウイルスベクターは、好適な宿主細胞において、自己複製することができる、及び／又は該ウイルスベクターに含まれる遺伝子（内因性及び外因性）を発現することができる。ウイルスベクターは、無傷の野生型ウイルスのゲノム、又は変異導入された若しくは修飾されたウイルスゲノムを含んでもよい。しかしながら、安全性の理由で、ウイルスベクターは、概して、変異された又は修飾されたウイルスゲノムを含むことが好ましい。本発明のウイルスベクターがＨＳＶのウイルスゲノムに由来することから、本発明のウイルスベクターはＨＳＶウイルスベクターと称される場合もある。
【００１４】
本明細書で使用される「対象の機能性タンパク質を発現しない」という表現は、細胞がウイルス又はウイルスベクター又はウイルスゲノムに感染している場合に、ウイルス又はウイルスベクター又はウイルスゲノムが、生物学的に機能性の活性を伴って対象のタンパク質を産生する又は発現することができないことを意味する。例えば、ウイルス又はウイルスベクター又はウイルスゲノムは、遺伝子欠失により対象のタンパク質を全く産生しない若しくは発現しない場合があり、又は機能喪失型変異により生物学的に機能性の活性を伴わずに対象のタンパク質を産生若しくは発現する場合がある。
【００１５】
本明細書で使用される「機能喪失型変異」の用語は、変異遺伝子によってコードされ、発現されるタンパク質の生物学的に機能性の活性の喪失をもたらす変異を指す。機能喪失型変異としては、限定されないが、機能喪失型変異を含む遺伝子が生物学的に機能性の活性を有するタンパク質を産生又は発現することができない限りにおいて、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、フレームシフト突然変異、塩基欠失、塩基置換、塩基付加、及びそれらの任意の組み合わせ（例えば、遺伝子フラグメントの欠失又は置換又は付加）が挙げられる。
【００１６】
本明細書で使用される「必須遺伝子」の用語は、ＨＳＶウイルスの生存及び複製の維持に不可欠な遺伝子を指す。かかる必須遺伝子の具体例として、限定されるものではないが、ＩＣＰ２７遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦＥ６２８８３．１を参照）、ＩＣＰ４遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦＥ６２８８８．１を参照）、ＶＰ５遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦＥ６２８４６．１を参照）、ｇＬ遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦＥ６２８２８．１を参照）、ｇＨ遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦＥ６２８４９．１を参照）、ｇＤ遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦＥ６２８９４．１を参照）、ｇＫ遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦＥ６２８８２．１を参照）、ｇＢ遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦＥ６２８５５．１を参照）、ｇＮ遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦＥ６２８７８．１を参照）、ＵＬ５遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦＥ６２８３２．１を参照）、ＵＬ６遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦＥ６２８３３．１を参照）、ＵＬ８遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦＥ６２８３５．１を参照）、ＵＬ９遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦＥ６２８３６．１を参照）、ＵＬ１２遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦＥ６２８３９．１を参照）、ＵＬ２５遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦＥ６２８５２．１を参照）、ＵＬ２６遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦＥ６２８５３．１を参照）、ＵＬ２８遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦＥ６２８５６．１を参照）、ＵＬ２９遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦＥ６２８５７．１を参照）、ＵＬ３０遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦＥ６２８５８．１を参照）、ＵＬ３３遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦＥ６２８６１．１を参照）、ＵＬ３６遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦＥ６２８６４．１を参照）、ＵＬ３８遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦＥ６２８６６．１を参照）、ＵＬ４２遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦＥ６２８７０．１を参照）、ＵＬ４８遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦＥ６２８７６．１を参照）、ＵＬ５２遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦＥ６２８８１．１を参照）が挙げられる。ＨＳＶウイルスに対する必須遺伝子の詳細な記載については、例えば、Roizman B, Knipe DM. Herpes simplex viruses and their replication.  In: Knipe D M, Howley P M, editors. Fields Virology. 2nd ed. Vol 2. Philadelphia, PA Lippincot, Williams and Wilkins, 2001: 2399-2460、Subak-Sharpe J H, Dargan D J. HSV molecular biology: general aspects of herpes simplex virus molecular biology. Virus Genes, 1998, 16(3): 239-251を参照されたい。
【００１７】
本明細書で使用される「非必須遺伝子」の用語は、ＨＳＶウイルスの生存及び複製を維持するのに必要ではない遺伝子を指す。概して、ＨＳＶウイルスゲノム中のかかる遺伝子は、ＨＳＶウイルスの生存及び複製の能力に影響を与えることなく、ノックアウト（欠失）又は変異導入され得る。かかる必須遺伝子の具体例として、限定されるものではないが、ＵＬ３遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦＥ６２８３０．１を参照）、ＵＬ４遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦＥ６２８３１．１を参照）、ＵＬ１４遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦＥ６２８４１．１を参照）、ＵＬ１６遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦＥ６２８４３．１を参照）、ＵＬ２１遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦＥ６２８４８．１を参照）、ＵＬ２４遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦＥ６２８５１．１を参照）、ＵＬ３１遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦＥ６２８５９．１を参照）、ＵＬ３２遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦＥ６２８６０．１を参照）、ＵＳ３遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦＥ６２８９１．１を参照）、ＵＬ５１遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦＥ６２８８０．１を参照）、ＵＬ５５遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦＥ６２８８４．１を参照）、ＵＬ５６遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦＥ６２８８５．１を参照）、ＵＳ２遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦＥ６２８９０．１を参照）、ＵＳ１２遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＦＥ６２９０１．１、すなわちＩＣＰ４７遺伝子を参照）、及びＬＡＴ遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＪＱ６７３４８０．１を参照）が挙げられる。ＨＳＶウイルスの非必須遺伝子の詳細な記載については、例えば、Roizman B, Knipe D M. Herpes simplex viruses and their replication.  In: Knipe D M, Howley P M, editors. Fields Virology. 2nd ed. Vol 2. Philadelphia, PA: Lippincot, Williams and Wilkins, 2001: 2399-2460、Subak-Sharpe J H, Dargan D J. HSV molecular biology: general aspects of herpes simplex virus molecular biology. Virus Genes, 1998, 16(3): 239-251を参照されたい。
【００１８】
本明細書で使用される「ＩＣＰ０タンパク質」の用語は、ＲＬ２遺伝子によってコードされ、ＨＳＶウイルスの前初期遺伝子産物の１つである、ＨＳＶウイルスの感染細胞タンパク質０を指す。ＩＣＰ０タンパク質のアミノ酸配列は知られており、例えば、公的なデータベースＮＣＢＩ（ＡＦＥ６２８２７．１）において見ることができる。
【００１９】
本明細書で使用される「ＩＣＰ３４．５タンパク質」の用語は、ＲＬ１遺伝子によってコードされ、ＨＳＶウイルスの前初期遺伝子産物の１つである、ＨＳＶウイルスの感染細胞タンパク質３４．５を指す。ＩＣＰ３４．５タンパク質のアミノ酸配列は知られており、例えば、公的なデータベースＮＣＢＩ（ＡＦＥ６２８２６．１）に見ることができる。
【００２０】
本明細書で使用される「ＩＣＰ２７タンパク質」の用語は、ＵＬ５４遺伝子によってコードされる、ＨＳＶウイルスの感染細胞タンパク質２７を指す。ＩＣＰ２７タンパク質のアミノ酸配列は知られており、例えば、公的なデータベースＮＣＢＩ（ＡＦＥ６２８８３．１）に見ることができる。
【００２１】
本明細書で使用される「ＩＣＰ４タンパク質」の用語は、ＲＳ１遺伝子によってコードされる、ＨＳＶウイルスの感染細胞タンパク質４を指す。ＩＣＰ４タンパク質のアミノ酸配列は知られており、例えば、公的なデータベースＮＣＢＩ（ＡＦＥ６２８８８．１）に見ることができる。
【００２２】
本明細書で使用される「ＶＰ５タンパク質」の用語は、ＵＬ１９遺伝子によってコードされる、ＨＳＶウイルスの主なカプシドタンパク質を指す。ＶＰ５タンパク質のアミノ酸配列は知られており、例えば、公的なデータベースＮＣＢＩ（ＡＦＥ６２８４６．１）に見ることができる。
【００２３】
本明細書で使用される「ＩＣＰ０遺伝子」の用語は、ＨＳＶウイルスゲノム中のＩＣＰ０タンパク質をコードするヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用される「ＩＣＰ３４．５遺伝子」の用語は、ＨＳＶウイルスゲノム中のＩＣＰ３４．５タンパク質をコードするヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用される「ＩＣＰ２７遺伝子」の用語は、ＨＳＶウイルスゲノム中のＩＣＰ２７タンパク質をコードするヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用される「ＩＣＰ４遺伝子」の用語は、ＨＳＶウイルスゲノム中のＩＣＰ４タンパク質をコードするヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用される「ＶＰ５遺伝子」の用語は、ＨＳＶウイルスゲノム中のＶＰ５タンパク質をコードするヌクレオチド配列を指す。
【００２４】
本明細書で使用される「外因性ヌクレオチド配列」の用語は、元の配列にとって外来の人為的に導入されたヌクレオチド配列を指す。外因性ヌクレオチド配列としては、限定されないが、ウイルスゲノムに見られない任意の遺伝子が挙げられる。しかしながら、或る特定の例では、外因性ヌクレオチド配列は、免疫調節性ポリペプチド、サイトカイン、ケモカイン、抗体、及び細胞毒性ペプチド等の治療用途を有するポリペプチドをコードすることが好ましい。
【００２５】
本明細書で使用される「免疫調節性ポリペプチド」の用語は、免疫細胞の機能を調節するポリペプチドを指し、その例としては、限定されないが、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激分子（ＩＣＯＳ）、ＦＴＬ３Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ７０、４−１ＢＢ、ＧＩＴＲ、及びＣＤ２８が挙げられる（例えば、Khalil D N, Smith E L, Brentjens R J, et al. The future of cancer treatment: immunomodulation, CARs and combination immunotherapy [J]. Nat Rev Clin Oncol, 2016, 13 (5): 273-290を参照されたい）。
【００２６】
本明細書で使用される「サイトカイン」の用語は、当業者に良く知られている意味を有する。しかしながら、本発明の方法では、本発明の組み換えウイルスを使用して腫瘍を治療する場合、サイトカインは腫瘍治療に使用することができるサイトカインであることが特に好ましい。「サイトカイン」の例としては、限定されないが、インターロイキン（例えばＩＬ−２、ＩＬ−１２及びＩＬ−１５）、インターフェロン（例えばＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子（例えばＴＮＦα）、コロニー刺激因子（例えばＧＭ−ＣＳＦ）、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる（例えば、Ardolino M, Hsu J, Raulet D H. Cytokine treatment in cancer immunotherapy [J]. Oncotarget, 2015, 6 (23): 19346-19347を参照されたい）。
【００２７】
本明細書で使用される「ケモカイン」の用語は、当業者によく知られている意味を有する。しかしながら、本発明の方法では、本発明の組み換えウイルスを使用して腫瘍を治療する場合、サイトカインは腫瘍治療に使用することができるケモカインであることが特に好ましい。「ケモカイン」の例としては、限定されないが、ＣＣＬ２、ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ７、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２０、ＸＣＬ−１、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる（Homey B, Muller A, Zlotnik A. CHEMOKINES: AGENTS FOR THE IMMUNOTHERAPY OF CANCER? [J]. Nat Rev Immunol, 2002, 2: 175-184）。
【００２８】
本明細書で使用される「細胞毒性ペプチド」の用語は、細胞に対して毒性であるか、又はアポトーシスを誘導するポリペプチドを指し、その例としては、限定されないが、チミジンキナーゼＴＫ（ＴＫ／ＧＣＶ）、ＴＲＡＩＬ、及びＦａｓＬが挙げられる（例えば、Candolfi M, King G D, Muhammad A G, et al. Evaluation of proapototic transgenes to use in combination with Flt3L in an immune-stimulatory gene therapy approach for Glioblastoma multiforme (GBM) [J]. FASEB J, 2008, 22: 1077.13を参照されたい）。
【００２９】
本明細書で使用される「抗体」の用語は、当業者に良く知られている意味を有する。しかしながら、本発明の方法では、本発明の組み換えウイルスを使用して腫瘍を治療する場合、抗体は腫瘍治療に使用することができる抗体であることが特に好ましい。「抗体」の例としては、限定されないが、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗Ｔｉｍ−３抗体、抗Ｌａｇ−３抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＣＤ７３抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＣＳＦ１Ｒ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＶＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、及び抗ＰＤＧＦＲ抗体が挙げられる（例えば、Khalil D N, Smith E L, Brentjens R J, et al. The future of cancer treatment: immunomodulation, CARs and combination immunotherapy [J]. Nat Rev Clin Oncol, 2016, 13 (5): 273-290、及びHughes P E, Caenepeel S, Wu L C. Targeted Therapy and Checkpoint Immunotherapy Combinations for the Treatment of Cancer [J]. Trends Immunol, 2016, 37 (7): 462-476を参照されたい）。
【００３０】
本明細書で使用される「薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤」の用語は、当該技術分野でよく知られている、被験体及び有効成分と薬理学的に及び／又は生理学的に適合性の担体及び／又は賦形剤を指し（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995を参照されたい）、限定されないが、ｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバント、イオン強度増強剤が挙げられる。例えば、ｐＨ調整剤としては、限定されないが、リン酸緩衝液が挙げられ、界面活性剤としては、限定されないが、Ｔｗｅｅｎ−８０等の、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、又は非イオン界面活性剤が挙げられ、アジュバントとしては、限定されないが、アルミニウムアジュバント（例えば水酸化アルミニウム）、フロイントアジュバント（例えば完全フロイントアジュバント）が挙げられ、イオン強度増強剤としては、限定されないが、塩化ナトリウムが挙げられる。
【００３１】
本明細書で使用される「有効量」の用語は、所望の効果を達成する又は少なくとも部分的に達成するのに十分な量を指す。例えば、予防的有効量は、疾患の発症を予防、制御、又は遅延するのに十分な量を指し、疾患に対する治療的有効量は、既に疾患を患っている患者において、疾患及びその合併症を治癒又は少なくとも部分的に制御するのに十分な量を指す。かかる有効量の決定は、当業者の能力の範囲に十分含まれる。例えば、治療的使用に有効な量は、治療される疾患の重症度、患者自身の免疫系の全体的な状態、年齢、体重及び性別等の患者の全身状態、薬物の投与様式、同時に適用されるその他の治療等に依存する。
【００３２】
腫瘍治療法に対する既存の組み換えＨＳＶウイルスの安全性の問題及び副作用を克服するため、本出願の発明者らは、機能性のＩＣＰ０タンパク質及びＩＣＰ３４．５タンパク質を発現しない（例えば、ＩＣＰ０及びＩＣＰ３４．５の遺伝子のダブルコピーが欠失している）新規の組み換えＨＳＶウイルスを構築した。本発明の組み換えＨＳＶウイルスは、腫瘍細胞において高レベルの複製能を有し、様々な腫瘍細胞を効果的に殺傷することができるが、正常細胞では顕著に減少された複製能及び殺傷能を示す。さらに、本発明の組み換えＨＳＶウイルスは、動物では顕著に減少された神経毒性を示し、顕著に増加した用量で動物に投与され得ることもわかった。したがって、既存の組み換えＨＳＶウイルスと比較して、本発明の組み換えＨＳＶウイルスは高い腫瘍溶解能を維持するだけでなく、顕著に改善された安全性を示すことから、より高用量で投与することができ、幅広い適用の見込みがある。
【００３３】
組み換えＨＳＶウイルス
したがって、一態様では、本発明は、機能性のＩＣＰ０タンパク質及びＩＣＰ３４．５タンパク質を発現しない組み換えＨＳＶウイルスを提供する。
【００３４】
当業者に良く知られているように、対象のタンパク質をコードする遺伝子を修飾することによって、対象のタンパク質（例えば、ＩＣＰ０タンパク質及び／又はＩＣＰ３４．５タンパク質）の機能的発現を妨げることができる。例えば、機能喪失型変異は対象のタンパク質（例えば、ＩＣＰ０タンパク質及び／又はＩＣＰ３４．５タンパク質）をコードする遺伝子に導入されてもよく、又は対象のタンパク質（例えば、ＩＣＰ０タンパク質及び／又はＩＣＰ３４．５タンパク質）をコードする遺伝子が欠失されてもよく、又は外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されてもよく、それによって、対象のタンパク質の機能的発現を妨げる。
【００３５】
ＨＳＶウイルスのゲノムはＩＣＰ０遺伝子の２つのコピー及びＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーを含むことが当業者に知られている。したがって、組み換えＨＳＶウイルスにおいてＩＣＰ０タンパク質及びＩＣＰ３４．５タンパク質の機能的発現を妨げるためには、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピー及びＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーを同時に修飾することが必要である。しかしながら、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピー及びＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピー（４つのヌクレオチドセグメント）の修飾は、互いに独立してもよく、同一又は異なってもよいことが容易に理解され得る。
【００３６】
したがって、或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスは、
ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーの各々が独立して、機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、又は欠失している、又は外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている、かつ、
ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーの各々が独立して、機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、又は欠失している、又は外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている、
ゲノムを有する。
【００３７】
或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムは以下の修飾を含む：
ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーの各々が独立して、機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、又は欠失している、又は外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている、かつ、
ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーの各々が独立して、機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、又は欠失している、又は外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている。
【００３８】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の一方のコピーは機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含み、ＩＣＰ０遺伝子の他方のコピーは、機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、又は欠失している、又は外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている。或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の一方のコピーは欠失され、ＩＣＰ０遺伝子の他方のコピーは、機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、又は欠失している、又は外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている。或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の一方のコピーは外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換され、ＩＣＰ０遺伝子の他方のコピーは、機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、又は欠失している、又は外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている。
【００３９】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーの各々が独立して機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーは同じ機能喪失型変異を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーは異なる機能喪失型変異を含む。例えば、或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の第１のコピーは第１の機能喪失型変異を含み、ＩＣＰ０遺伝子の第２のコピーは第２の機能喪失型変異を含む。第１の機能喪失型変異及び第２の機能喪失型変異は、同一であってもよく、異なってもよい。
【００４０】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーが欠失している。
【００４１】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーの各々が独立して外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている。或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーは同じ外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている。或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーは異なる外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている。例えば、或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の第１のコピーは第１の外因性ヌクレオチド配列で置換され、ＩＣＰ０遺伝子の第２のコピーは第２の外因性ヌクレオチド配列で置換されている。第１の外因性ヌクレオチド配列及び第２の外因性ヌクレオチド配列は、同一であってもよく、異なってもよい。
【００４２】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ３４．５遺伝子の一方のコピーは機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含み、ＩＣＰ３４．５遺伝子の他方のコピーは、機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、又は欠失している、又は外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている。或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ３４．５遺伝子の一方のコピーは欠失され、ＩＣＰ３４．５遺伝子の他方のコピーは、機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、又は欠失している、又は外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている。或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ３４．５遺伝子の一方のコピーは外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換され、ＩＣＰ３４．５遺伝子の他方のコピーは機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、又は欠失している、又は外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている。
【００４３】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーの各々が独立して機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーは同じ機能喪失型変異を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーは異なる機能喪失型変異を含む。例えば、或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーは第３の機能喪失型変異を含み、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第２のコピーは第４の機能喪失型変異を含む。第３の機能喪失型変異及び第４の機能喪失型変異は、同一であってもよく、異なってもよい。
【００４４】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーが欠失している。
【００４５】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーの各々が独立して外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている。或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーは同じ外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている。或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーは異なる外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている。例えば、或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーは第３の外因性ヌクレオチド配列で置換され、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第２のコピーは第４の外因性ヌクレオチド配列で置換されている。第３の外因性ヌクレオチド配列及び第４の外因性ヌクレオチド配列は、同一であってもよく、異なってもよい。
【００４６】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーの各々が独立して機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含み、ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーの各々が独立して機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む。例えば、或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の第１のコピーは第１の機能喪失型変異を含み、ＩＣＰ０遺伝子の第２のコピーは第２の機能喪失型変異を含み、かつ、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーは第３の機能喪失型変異を含み、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第２のコピーは第４の機能喪失型変異を含む。第１の機能喪失型変異、第２の機能喪失型変異、第３の機能喪失型変異、及び第４の機能喪失型変異は、同一であってもよく、異なってもよい。
【００４７】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーの各々が独立して機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含み、ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーは欠失している。例えば、或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の第１のコピーは第１の機能喪失型変異を含み、ＩＣＰ０遺伝子の第２のコピーは第２の機能喪失型変異を含み、かつ、ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーは欠失している。第１の機能喪失型変異及び第２の機能喪失型変異は、同一であってもよく、異なってもよい。
【００４８】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーの各々が独立して機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含み、ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーの各々が独立して外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている。例えば、或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の第１のコピーは第１の機能喪失型変異を含み、ＩＣＰ０遺伝子の第２のコピーは第２の機能喪失型変異を含み、かつ、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーは第３の外因性ヌクレオチド配列で置換され、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第２のコピーは第４の外因性ヌクレオチド配列で置換されている。第１の機能喪失型変異及び第２の機能喪失型変異は、同一であってもよく、異なってもよい。第３の外因性ヌクレオチド配列及び第４の外因性ヌクレオチド配列は、同一であってもよく、異なってもよい。
【００４９】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーは欠失され、ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーの各々が独立して機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む。例えば、或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーは欠失され、かつ、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーは第３の機能喪失型変異を含み、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第２のコピーは第４の機能喪失型変異を含む。第３の機能喪失型変異及び第４の機能喪失型変異は、同一であってもよく、異なってもよい。
【００５０】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーは欠失され、かつ、ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーが欠失している。かかる実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスは、ＩＣＰ０タンパク質及びＩＣＰ３４．５タンパク質を発現しない。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムは、野生型ＨＳＶ−１ウイルスゲノムのｎｔ５１０〜ｎｔ５４３９の塩基配列、及びｎｔ１２０８０２〜ｎｔ１２５７３１の塩基配列の欠失を有する。
【００５１】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーは欠失され、かつ、ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーの各々が独立して外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている。例えば、或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーは欠失され、かつ、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーは第３の外因性ヌクレオチド配列で置換され、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第２のコピーは第４の外因性ヌクレオチド配列で置換されている。第３の外因性ヌクレオチド配列及び第４の外因性ヌクレオチド配列は、同一であってもよく、異なってもよい。
【００５２】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーの各々が独立して外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換され、ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーの各々が独立して機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む。例えば、或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の第１のコピーは第１の外因性ヌクレオチド配列で置換され、ＩＣＰ０遺伝子の第２のコピーは第２の外因性ヌクレオチド配列で置換され、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーは第３の機能喪失型変異を含み、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第２のコピーは第４の機能喪失型変異を含む。第１の外因性ヌクレオチド配列及び第２の外因性ヌクレオチド配列は、同一であってもよく、異なってもよい。第３の機能喪失型変異及び第４の機能喪失型変異は、同一であってもよく、異なってもよい。
【００５３】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーの各々が独立して外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換され、ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーが欠失している。例えば、或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の第１のコピーは第１の外因性ヌクレオチド配列で置換され、ＩＣＰ０遺伝子の第２のコピーは第２の外因性ヌクレオチド配列で置換され、ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーは欠失している。第１の外因性ヌクレオチド配列及び第２の外因性ヌクレオチド配列は、同一であってもよく、異なってもよい。
【００５４】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーの各々が独立して外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換され、ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーの各々が独立して外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている。例えば、或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の第１のコピーは第１の外因性ヌクレオチド配列で置換され、ＩＣＰ０遺伝子の第２のコピーは第２の外因性ヌクレオチド配列で置換され、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーは第３の外因性ヌクレオチド配列で置換され、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第２のコピーは第４の外因性ヌクレオチド配列で置換されている。第１の外因性ヌクレオチド配列、第２の外因性ヌクレオチド配列、第３の外因性ヌクレオチド配列、及び第４の外因性ヌクレオチド配列は、同一であってもよく、異なってもよい。
【００５５】
或る特定の好ましい実施の形態では、第１の機能喪失型変異、第２の機能喪失型変異、第３の機能喪失型変異、及び第４の機能喪失型変異は、各々独立して、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、フレームシフト突然変異、塩基欠失、塩基置換、塩基付加、及びそれらの任意の組み合わせ（例えば、遺伝子フラグメントの欠失又は置換又は付加）から選択される。
【００５６】
或る特定の好ましい実施の形態では、第１の外因性ヌクレオチド配列、第２の外因性ヌクレオチド配列、第３の外因性ヌクレオチド配列、及び第４の外因性ヌクレオチド配列は、各々独立して、蛍光タンパク質、免疫調節ポリペプチド、サイトカイン、ケモカイン、抗体、及び細胞毒性ペプチドからなる群から選択される外来タンパク質をコードする。
【００５７】
或る特定の好ましい実施の形態では、蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（例えば、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する緑色蛍光タンパク質）、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【００５８】
或る特定の好ましい実施の形態では、免疫調節ポリペプチドは、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激分子（ＩＣＯＳ）、ＦＴＬ３Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ７０、４−１ＢＢ、ＧＩＴＲ、ＣＤ２８、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【００５９】
或る特定の好ましい実施の形態では、サイトカインは、インターロイキン（例えばＩＬ−２、ＩＬ−１２及びＩＬ−１５）、インターフェロン（例えばＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子（例えばＴＮＦα）、コロニー刺激因子（例えばＧＭ−ＣＳＦ）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【００６０】
或る特定の好ましい実施の形態では、ケモカインは、ＣＣＬ２、ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ７、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２０、ＸＣＬ−１、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【００６１】
或る特定の好ましい実施の形態では、細胞毒性ペプチドは、チミジンキナーゼＴＫ（ＴＫ／ＧＣＶ）、ＴＲＡＩＬ、ＦａｓＬ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【００６２】
或る特定の好ましい実施の形態では、抗体は、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗Ｔｉｍ−３抗体、抗Ｌａｇ−３抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＣＤ７３抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＣＳＦ１Ｒ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＶＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＰＤＧＦＲ抗体、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【００６３】
過去５年でＰＤ−１に対する抗体医薬は大きな臨床上の成功を達成し、ＦＤＡにより、黒色腫及び肺癌等の固形腫瘍患者の治療に対して承認された。しかしながら、臨床研究は、抗ＰＤ−１抗体が固形腫瘍患者の約３０％に有効であることを示したにすぎない。これは、Ｔ細胞が固形腫瘍に侵入するのが難しく、抗ＰＤ−１抗体と共に固形腫瘍内部の腫瘍細胞に作用することができないからかもしれない。いかなる理論にも拘束されるものではないが、腫瘍溶解性ＨＳＶウイルスは、腫瘍細胞を直接標的として殺傷するだけでなく、免疫細胞（Ｔ細胞等）を誘導して腫瘍に浸潤する。したがって、本発明の組み換えＨＳＶウイルスと抗ＰＤ−１抗体との併用は、腫瘍治療の効果の改善に特に有利な可能性があり、腫瘍免疫療法における適用の見込みが大きい。したがって、或る特定の好ましい実施の形態では、外来タンパク質は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−１抗体、又はそれらの任意の組み合わせである。例えば、外来タンパク質は抗ＰＤ−１単鎖抗体である。
【００６４】
或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスは、組み換えＨＳＶ−１ウイルス、組み換えＨＳＶ−２ウイルス、又はＨＳＶ−１／ＨＳＶ−２キメラウイルス（すなわち、ゲノムがＨＳＶ−１に由来するＤＮＡとＨＳＶ−２に由来するＤＮＡの両方を含む組み換えＨＳＶウイルス）である。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスはＨＳＶ−１株ＫＯＳに由来する。
【００６５】
或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスは、機能性ＵＬ４３タンパク質、機能性ＵＬ４１タンパク質（すなわち、ｖｈｓタンパク質）、機能性ＵＬ４８タンパク質（すなわち、ＶＭＷ６５タンパク質）、又はそれらの任意の組み合わせを発現することができる。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスは機能性ＵＬ４３タンパク質を発現することができる。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスは機能性ＵＬ４１タンパク質を発現することができる。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスは機能性ＵＬ４８タンパク質を発現することができる。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスは機能性ＵＬ４３タンパク質及び機能性ＵＬ４１タンパク質を発現することができる。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスは機能性ＵＬ４３タンパク質及び機能性ＵＬ４８タンパク質を発現することができる。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスは機能性ＵＬ４１タンパク質及び機能性ＵＬ４８タンパク質を発現することができる。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスは機能性ＵＬ４３タンパク質、機能性ＵＬ４１タンパク質、及び機能性ＵＬ４８タンパク質を発現することができる。
【００６６】
或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムは、機能性ＵＬ４３タンパク質を発現することができるＵＬ４３遺伝子、機能性ＵＬ４１タンパク質を発現することができるＵＬ４１遺伝子（すなわち、ｖｈｓ遺伝子）、及び／又は機能性ＵＬ４８タンパク質を発現することができるＵＬ４８遺伝子（すなわち、ＶＭＷ６５遺伝子）を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムは、機能性ＵＬ４３タンパク質を発現することができるＵＬ４３遺伝子を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムは、機能性ＵＬ４１タンパク質を発現することができるＵＬ４１遺伝子を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムは、機能性ＵＬ４８タンパク質を発現することができるＵＬ４８遺伝子を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムは、機能性ＵＬ４３タンパク質を発現することができるＵＬ４３遺伝子、及び機能性ＵＬ４１タンパク質を発現することができるＵＬ４１遺伝子を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムは、機能性ＵＬ４３タンパク質を発現することができるＵＬ４３遺伝子、及び機能性ＵＬ４８タンパク質を発現することができるＵＬ４８遺伝子を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムは、機能性ＵＬ４１タンパク質を発現することができるＵＬ４１遺伝子、及び機能性ＵＬ４８タンパク質を発現することができるＵＬ４８遺伝子を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムは、機能性ＵＬ４３タンパク質を発現することができるＵＬ４３遺伝子、機能性ＵＬ４１タンパク質を発現することができるＵＬ４１遺伝子、及び機能性ＵＬ４８タンパク質を発現することができるＵＬ４８遺伝子を含む。
【００６７】
或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムは、ＵＬ４３遺伝子、ＵＬ４１遺伝子（すなわち、ｖｈｓ遺伝子）及び／又はＵＬ４８遺伝子（すなわち、ＶＭＷ６５遺伝子）を含み、ＵＬ４３遺伝子、ＵＬ４１遺伝子及び／又はＵＬ４８遺伝子は機能喪失型変異を含まない。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムは、機能喪失型変異を含まないＵＬ４３遺伝子を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムは、機能喪失型変異を含まないＵＬ４１遺伝子を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムは、機能喪失型変異を含まないＵＬ４８遺伝子を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムは、機能喪失型変異を含まないＵＬ４３遺伝子及びＵＬ４１遺伝子を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムは、機能喪失型変異を含まないＵＬ４３遺伝子及びＵＬ４８遺伝子を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムは、機能喪失型変異を含まないＵＬ４１遺伝子及びＵＬ４８遺伝子を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムは、機能喪失型変異を含まないＵＬ４３遺伝子、ＵＬ４１遺伝子及びＵＬ４８遺伝子を含む。
【００６８】
或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムは、１つ以上の非必須遺伝子が欠失している又は変異導入されている（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている）修飾を更に含む。或る特定の好ましい実施の形態では、非必須遺伝子は、ＵＬ３遺伝子、ＵＬ４遺伝子、ＵＬ１４遺伝子、ＵＬ１６遺伝子、ＵＬ２１遺伝子、ＵＬ２４遺伝子、ＵＬ３１遺伝子、ＵＬ３２遺伝子、ＵＳ３遺伝子、ＵＬ５１遺伝子、ＵＬ５５遺伝子、ＵＬ５６遺伝子、ＵＳ２遺伝子、ＵＳ１２遺伝子（すなわち、ＩＣＰ４７遺伝子）、ＬＡＴ遺伝子、ＪＱ６７３４８０．１のｎｔ５８５３〜ｎｔ７４８５に対応するヌクレオチドフラグメント、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムにおいて、ＵＬ３遺伝子は欠失している又は変異導入されている（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている）。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムにおいて、ＵＬ４遺伝子は欠失している又は変異導入されている（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている）。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムにおいて、ＵＬ１４遺伝子は欠失している又は変異導入されている（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている）。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムにおいて、ＵＬ１６遺伝子は欠失している又は変異導入されている（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている）。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムにおいて、ＵＬ２１遺伝子は欠失している又は変異導入されている（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている）。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムにおいて、ＵＬ２４遺伝子は欠失している又は変異導入されている（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている）。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムにおいて、ＵＬ３１遺伝子は欠失している又は変異導入されている（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている）。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムにおいて、ＵＬ３２遺伝子は欠失している又は変異導入されている（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている）。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムにおいて、ＵＳ３遺伝子は欠失している又は変異導入されている（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている）。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムにおいて、ＵＬ５１遺伝子は欠失している又は変異導入されている（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている）。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムにおいて、ＵＬ５５遺伝子は欠失している又は変異導入されている（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている）。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムにおいて、ＵＬ５６遺伝子は欠失している又は変異導入されている（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている）。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムにおいて、ＵＳ２遺伝子は欠失している又は変異導入されている（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている）。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムにおいて、ＵＳ１２遺伝子は欠失している又は変異導入されている（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている）。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムにおいて、ＬＡＴ遺伝子は欠失している又は変異導入されている（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている）。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムにおいて、ＪＱ６７３４８０．１のｎｔ５８５３〜ｎｔ７４８５に対応するヌクレオチドフラグメントは欠失している又は変異導入されている（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている）。
【００６９】
或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムは、以下の修飾：ＵＬ５５遺伝子、ＵＳ２遺伝子、ＬＡＴ遺伝子、及びＪＱ６７３４８０．１のｎｔ５８５３〜ｎｔ７４８５に対応するヌクレオチドフラグメントの１つ以上における欠失又は突然変異（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている）の１つ以上を更に含む。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムは、以下の修飾：ＵＬ５５遺伝子、ＵＳ２遺伝子、ＬＡＴ遺伝子、又はＪＱ６７３４８０．１のｎｔ５８５３〜ｎｔ７４８５に対応するヌクレオチドフラグメントの欠失又はそれらの突然変異（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている）を更に含む。
【００７０】
或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスの必須遺伝子は欠失されず、機能喪失型変異を含まない。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスの必須遺伝子に対するコーディング配列は欠失されず、変異導入もされない。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスは全ての必須遺伝子を発現することができる。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムは全ての必須遺伝子を含み、どの必須遺伝子も機能喪失型変異を含まない。或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムは全ての必須遺伝子を含み、どの必須遺伝子のコーディング配列も突然変異を含まない。概して、必須遺伝子はＨＳＶウイルスの生存及び複製にとって不可欠であるため、組み換えＨＳＶウイルスでは、どの必須遺伝子も機能喪失型変異を含まない。しかしながら、かかる必須遺伝子のプロモーターを操作することで（例えば、必須遺伝子の本来の(native)プロモーターをｈＴＥＲＴプロモーター等の腫瘍特異的プロモーターで置換してもよい）、本発明の組み換えＨＳＶウイルスの機能／特性に影響を及ぼすことなく、組み換えＨＳＶウイルスの安全性を更に増強させ得ることが容易に理解される。したがって、或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムにおいて、１つ以上の必須遺伝子の本来のプロモーターは、ｈＴＥＲＴプロモーター等の腫瘍特異的プロモーターで置換される。或る特定の好ましい実施の形態では、必須遺伝子は、ＩＣＰ２７遺伝子、ＩＣＰ４遺伝子、ＶＰ５遺伝子、ｇＬ遺伝子、ｇＨ遺伝子、ｇＤ遺伝子、ｇＫ遺伝子、ｇＢ遺伝子、ｇＮ遺伝子、ＵＬ５遺伝子、ＵＬ６遺伝子、ＵＬ８遺伝子、ＵＬ９遺伝子、ＵＬ１２遺伝子、ＵＬ２５遺伝子、ＵＬ２６遺伝子、ＵＬ２８遺伝子、ＵＬ２９遺伝子、ＵＬ３０遺伝子、ＵＬ３３遺伝子、ＵＬ３６遺伝子、ＵＬ３８遺伝子、ＵＬ４２遺伝子、ＵＬ４８遺伝子、ＵＬ５２遺伝子、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【００７１】
或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムは、上に記載されるようにＩＣＰ０遺伝子の２つのコピー及びＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーを除いて、野生型ＨＳＶウイルスの全てのその他の遺伝子を含み、その他のいずれの遺伝子も機能喪失型変異を含まない。しかしながら、その他の遺伝子のプロモーターを操作することで（例えば、本来のプロモーターをｈＴＥＲＴプロモーター等の腫瘍特異的プロモーターで置換してもよい）、本発明の組み換えＨＳＶウイルスの機能／特性に影響を及ぼすことなく組み換えＨＳＶウイルスの安全性を更に増強させ得ることが容易に理解される。したがって、或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムは、１つ以上のＨＳＶ遺伝子の本来のプロモーターがｈＴＥＲＴプロモーター等の腫瘍特異的プロモーターで置換される修飾を更に含む。或る特定の好ましい実施の形態では、ＨＳＶ遺伝子は、ＶＰ５遺伝子、ＩＣＰ２７遺伝子、及びＩＣＰ４遺伝子からなる群から選択される。
【００７２】
或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムは、
（１）ｈＴＥＲＴプロモーター等の腫瘍特異的プロモーターによるＶＰ５遺伝子の本来のプロモーターの置換、
（２）ｈＴＥＲＴプロモーター等の腫瘍特異的プロモーターによるＩＣＰ２７遺伝子の本来のプロモーターの置換、
（３）ｈＴＥＲＴプロモーター等の腫瘍特異的プロモーターによるＩＣＰ４遺伝子の本来のプロモーターの置換、及び、
（４）ＵＬ５５遺伝子、ＵＳ２遺伝子、ＬＡＴ遺伝子及びＪＱ６７３４８０．１のｎｔ５８５３〜ｎｔ７４８５に対応するヌクレオチドフラグメントの１つ以上の欠失又は変異導入（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換される）、
からなる群から選択される１つ以上の修飾を更に含む。
【００７３】
或る特定の好ましい実施の形態では、ｈＴＥＲＴプロモーターは配列番号５に示される配列を有する。
【００７４】
またさらに、本発明の組み換えＨＳＶウイルスは、１つ以上の外因性ヌクレオチド配列を保有するように修飾され得る。例えば、或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムは第５の外因性ヌクレオチド配列を更に含む。或る特定の好ましい実施の形態では、第５の外因性ヌクレオチド配列は、蛍光タンパク質、免疫調節性ポリペプチド、サイトカイン、ケモカイン、抗体、及び細胞毒性ペプチドからなる群から選択される外来タンパク質をコードする。
【００７５】
本出願では、機能喪失型変異は、当該技術分野でよく知られている技術によって、上で言及される様々なウイルス遺伝子へと導入され得る。例えば、機能喪失型変異は、ウイルス遺伝子を機能的に不活性化するように塩基の欠失、置換又は挿入によってウイルス遺伝子へと導入され得る。或る特定の例示的な実施の形態では、ウイルス遺伝子は、欠失（例えば遺伝子全体又はその部分の欠失）によって機能的に不活性化される。かかる実施の形態では、対象のウイルス遺伝子の配列の少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、若しくは１００％が欠失されてもよく、又は対象のウイルス遺伝子の配列の少なくとも１０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、若しくは少なくとも１０００ｂｐが欠失されてもよい。或る特定の例示的な実施の形態では、フレームシフト突然変異は、ウイルス遺伝子を機能的に不活性化するように、塩基の挿入又は欠失によって引き起こされる。或る特定の例示的な実施の形態では、ウイルス遺伝子は、対象の遺伝子全体又はその部分を外因性ヌクレオチド配列で置換することによって機能的に不活性化される。
【００７６】
ウイルスベクター
別の態様では、本発明は、本発明による組み換えＨＳＶウイルスのゲノムを含む、又は本発明による組み換えＨＳＶウイルスのゲノムからなるウイルスベクターを提供する。
【００７７】
別の態様では、本発明は、機能性のＩＣＰ０タンパク質及びＩＣＰ３４．５タンパク質を発現しない変異型ＨＳＶゲノムを含む、又はそれからなるウイルスベクターを提供する。
【００７８】
或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムにおいて、
ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーの各々が独立して、機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、又は欠失している、又は外因性ヌクレオチド配列（例えば外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている、かつ、
ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーの各々が独立して、機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、又は欠失している、又は外因性ヌクレオチド配列（例えば外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている。
【００７９】
或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムは以下の修飾を含む：
ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーの各々が独立して、機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、又は欠失している、又は外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている、かつ、
ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーの各々が独立して、機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、又は欠失している、又は外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている。
【００８０】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の一方のコピーは機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含み、ＩＣＰ０遺伝子の他方のコピーは、機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、又は欠失している、又は外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている。或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の一方のコピーは欠失され、ＩＣＰ０遺伝子の他方のコピーは、機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、又は欠失している、又は外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている。或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の一方のコピーは外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換され、ＩＣＰ０遺伝子の他方のコピーは、機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、又は欠失している、又は外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている。
【００８１】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーの各々が独立して機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーは同じ機能喪失型変異を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーは異なる機能喪失型変異を含む。例えば、或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の第１のコピーは第１の機能喪失型変異を含み、ＩＣＰ０遺伝子の第２のコピーは第２の機能喪失型変異を含む。第１の機能喪失型変異及び第２の機能喪失型変異は、同一であってもよく、異なってもよい。
【００８２】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーが欠失している。
【００８３】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーの各々が独立して外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている。或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーは同じ外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている。或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーは異なる外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている。例えば、或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の第１のコピーは第１の外因性ヌクレオチド配列で置換され、ＩＣＰ０遺伝子の第２のコピーは第２の外因性ヌクレオチド配列で置換されている。第１の外因性ヌクレオチド配列及び第２の外因性ヌクレオチド配列は、同一であってもよく、異なってもよい。
【００８４】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ３４．５遺伝子の一方のコピーは機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含み、ＩＣＰ３４．５遺伝子の他方のコピーは、機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、又は欠失している、又は外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている。或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ３４．５遺伝子の一方のコピーは欠失され、ＩＣＰ３４．５遺伝子の他方のコピーは、機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、又は欠失している、又は外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている。或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ３４．５遺伝子の一方のコピーは外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換され、ＩＣＰ３４．５遺伝子の他方のコピーは、機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む、又は欠失している、又は外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている。
【００８５】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーの各々が独立して機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーは同じ機能喪失型変異を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーは異なる機能喪失型変異を含む。例えば、或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーは第３の機能喪失型変異を含み、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第２のコピーは第４の機能喪失型変異を含む。第３の機能喪失型変異及び第４の機能喪失型変異は、同一であってもよく、異なってもよい。
【００８６】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーが欠失している。
【００８７】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーの各々が独立して外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている。或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーは同じ外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている。或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーは異なる外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている。例えば、或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーは第３の外因性ヌクレオチド配列で置換され、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第２のコピーは第４の外因性ヌクレオチド配列で置換されている。第３の外因性ヌクレオチド配列及び第４の外因性ヌクレオチド配列は、同一であってもよく、異なってもよい。
【００８８】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーの各々が独立して機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含み、ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーの各々が独立して機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む。例えば、或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の第１のコピーは第１の機能喪失型変異を含み、ＩＣＰ０遺伝子の第２のコピーは第２の機能喪失型変異を含み、かつ、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーは第３の機能喪失型変異を含み、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第２のコピーは第４の機能喪失型変異を含む。第１の機能喪失型変異、第２の機能喪失型変異、第３の機能喪失型変異、及び第４の機能喪失型変異は、同一であってもよく、異なってもよい。
【００８９】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーの各々が独立して機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含み、ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーは欠失している。例えば、或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の第１のコピーは第１の機能喪失型変異を含み、ＩＣＰ０遺伝子の第２のコピーは第２の機能喪失型変異を含み、かつ、ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーは欠失している。第１の機能喪失型変異及び第２の機能喪失型変異は、同一であってもよく、異なってもよい。
【００９０】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーの各々が独立して機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含み、ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーの各々が独立して外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている。例えば、或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の第１のコピーは第１の機能喪失型変異を含み、ＩＣＰ０遺伝子の第２のコピーは第２の機能喪失型変異を含み、かつ、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーは第３の外因性ヌクレオチド配列で置換され、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第２のコピーは第４の外因性ヌクレオチド配列で置換されている。第１の機能喪失型変異及び第２の機能喪失型変異は、同一であってもよく、異なってもよい。第３の外因性ヌクレオチド配列及び第４の外因性ヌクレオチド配列は、同一であってもよく、異なってもよい。
【００９１】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーは欠失され、かつ、ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーの各々が独立して機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む。例えば、或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーは欠失され、かつ、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーは第３の機能喪失型変異を含み、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第２のコピーは第４の機能喪失型変異を含む。第３の機能喪失型変異及び第４の機能喪失型変異は、同一であってもよく、異なってもよい。
【００９２】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーは欠失され、かつ、ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーが欠失している。かかる実施の形態では、ウイルスベクターは、ＩＣＰ０タンパク質をコードする遺伝子、及びＩＣＰ３４．５タンパク質をコードする遺伝子を含まない。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムは、野生型ＨＳＶ−１ウイルスゲノムのｎｔ５１０〜ｎｔ５４３９の塩基配列、及びｎｔ１２０８０２〜ｎｔ１２５７３１の塩基配列を欠く。
【００９３】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーは欠失され、かつ、ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーの各々が、独立して外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている。例えば、或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーは欠失され、かつ、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーは第３の外因性ヌクレオチド配列で置換され、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第２のコピーは第４の外因性ヌクレオチド配列で置換されている。第３の外因性ヌクレオチド配列及び第４の外因性ヌクレオチド配列は、同一であってもよく、異なってもよい。
【００９４】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーの各々が独立して外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換され、ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーの各々が、独立して機能喪失型変異（例えば、１つ以上の塩基の付加、欠失及び／又は置換）を含む。例えば、或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の第１のコピーは第１の外因性ヌクレオチド配列で置換され、ＩＣＰ０遺伝子の第２のコピーは第２の外因性ヌクレオチド配列で置換され、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーは第３の機能喪失型変異を含み、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第２のコピーは第４の機能喪失型変異を含む。第１の外因性ヌクレオチド配列及び第２の外因性ヌクレオチド配列は、同一であってもよく、異なってもよい。第３の機能喪失型変異及び第４の機能喪失型変異は、同一であってもよく、異なってもよい。
【００９５】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーの各々が、独立して外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換され、ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーが欠失している。例えば、或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の第１のコピーは第１の外因性ヌクレオチド配列で置換され、ＩＣＰ０遺伝子の第２のコピーは第２の外因性ヌクレオチド配列で置換され、ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーが欠失している。第１の外因性ヌクレオチド配列及び第２の外因性ヌクレオチド配列は、同一であってもよく、異なってもよい。
【００９６】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーの各々が独立して外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換され、ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーの各々が、独立して外因性ヌクレオチド配列（例えば、外来タンパク質をコードするヌクレオチド配列）で置換されている。例えば、或る特定の好ましい実施の形態では、ＩＣＰ０遺伝子の第１のコピーは第１の外因性ヌクレオチド配列で置換され、ＩＣＰ０遺伝子の第２のコピーは第２の外因性ヌクレオチド配列で置換され、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーは第３の外因性ヌクレオチド配列で置換され、ＩＣＰ３４．５遺伝子の第２のコピーは第４の外因性ヌクレオチド配列で置換されている。第１の外因性ヌクレオチド配列、第２の外因性ヌクレオチド配列、第３の外因性ヌクレオチド配列、及び第４の外因性ヌクレオチド配列は、同一であってもよく、異なってもよい。
【００９７】
或る特定の好ましい実施の形態では、第１の機能喪失型変異、第２の機能喪失型変異、第３の機能喪失型変異、及び第４の機能喪失型変異がそれぞれ独立して、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、フレームシフト突然変異、塩基欠失、塩基置換、塩基付加、及びそれらの任意の組み合わせ（例えば、遺伝子フラグメントの欠失又は置換又は付加）から選択される。
【００９８】
或る特定の好ましい実施の形態では、第１の外因性ヌクレオチド配列、第２の外因性ヌクレオチド配列、第３の外因性ヌクレオチド配列、及び第４の外因性ヌクレオチド配列が各々独立して、蛍光タンパク質、免疫調節ポリペプチド、サイトカイン、ケモカイン、抗体、及び細胞毒性ペプチドからなる群から選択される外来タンパク質をコードする。
【００９９】
或る特定の好ましい実施の形態では、蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（例えば、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する緑色蛍光タンパク質）、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【０１００】
或る特定の好ましい実施の形態では、免疫調節ポリペプチドは、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激分子（ＩＣＯＳ）、ＦＴＬ３Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ７０、４−１ＢＢ、ＧＩＴＲ、ＣＤ２８、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【０１０１】
或る特定の好ましい実施の形態では、サイトカインは、インターロイキン（例えばＩＬ−２、ＩＬ−１２及びＩＬ−１５）、インターフェロン（例えばＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子（例えばＴＮＦα）、コロニー刺激因子（例えばＧＭ−ＣＳＦ）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【０１０２】
或る特定の好ましい実施の形態では、ケモカインは、ＣＣＬ２、ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ７、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２０、ＸＣＬ−１、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【０１０３】
或る特定の好ましい実施の形態では、細胞毒性ペプチドは、チミジンキナーゼＴＫ（ＴＫ／ＧＣＶ）、ＴＲＡＩＬ、ＦａｓＬ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【０１０４】
或る特定の好ましい実施の形態では、抗体は、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗Ｔｉｍ−３抗体、抗Ｌａｇ−３抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＣＤ７３抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＣＳＦ１Ｒ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＶＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＰＤＧＦＲ抗体、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【０１０５】
或る特定の好ましい実施の形態では、外来タンパク質は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−１抗体、又はそれらの任意の組み合わせである。例えば、外来タンパク質は抗ＰＤ−１単鎖抗体である。
【０１０６】
或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムは、ＨＳＶ−１ウイルス、ＨＳＶ−２ウイルス、又はＨＳＶ−１／ＨＳＶ−２キメラウイルス（すなわち、ゲノムがＨＳＶ−１に由来するＤＮＡと、ＨＳＶ−２に由来するＤＮＡの両方を含む組み換えＨＳＶウイルス）に由来する。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムはＨＳＶ−１株ＫＯＳのゲノムに由来する。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムはＧｅｎＢａｎｋ：ＪＱ６７３４８０．１に示されるゲノムに由来する。
【０１０７】
或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムは、機能性ＵＬ４３タンパク質、機能性ＵＬ４１タンパク質（すなわち、ｖｈｓタンパク質）、機能性ＵＬ４８タンパク質（すなわち、ＶＭＷ６５タンパク質）、又はそれらの任意の組み合わせを発現することができる。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムは機能性ＵＬ４３タンパク質を発現することができる。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムは機能性ＵＬ４１タンパク質を発現することができる。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムは機能性ＵＬ４８タンパク質を発現することができる。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムは機能性ＵＬ４３タンパク質及び機能性ＵＬ４１タンパク質を発現することができる。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムは機能性ＵＬ４３タンパク質及び機能性ＵＬ４８タンパク質を発現することができる。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムは機能性ＵＬ４１タンパク質及び機能性ＵＬ４８タンパク質を発現することができる。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムは機能性ＵＬ４３タンパク質、機能性ＵＬ４１タンパク質、及び機能性ＵＬ４８タンパク質を発現することができる。
【０１０８】
或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムは、機能性ＵＬ４３タンパク質を発現することができるＵＬ４３遺伝子、機能性ＵＬ４１タンパク質を発現することができるＵＬ４１遺伝子（すなわち、ｖｈｓ遺伝子）、及び／又は機能性ＵＬ４８タンパク質を発現することができるＵＬ４８遺伝子（すなわち、ＶＭＷ６５遺伝子）を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムは、機能性ＵＬ４３タンパク質を発現することができるＵＬ４３遺伝子を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムは、機能性ＵＬ４１タンパク質を発現することができるＵＬ４１遺伝子を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムは、機能性ＵＬ４８タンパク質を発現することができるＵＬ４８遺伝子を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムは、機能性ＵＬ４３タンパク質を発現することができるＵＬ４３遺伝子、及び機能性ＵＬ４１タンパク質を発現することができるＵＬ４１遺伝子を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムは、機能性ＵＬ４３タンパク質を発現することができるＵＬ４３遺伝子、及び機能性ＵＬ４８タンパク質を発現することができるＵＬ４８遺伝子を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムは、機能性ＵＬ４１タンパク質を発現することができるＵＬ４１遺伝子、及び機能性ＵＬ４８タンパク質を発現することができるＵＬ４８遺伝子を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムは、機能性ＵＬ４３タンパク質を発現することができるＵＬ４３遺伝子、機能性ＵＬ４１タンパク質を発現することができるＵＬ４１遺伝子、及び機能性ＵＬ４８タンパク質を発現することができるＵＬ４８遺伝子を含む。
【０１０９】
或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムは、ＵＬ４３遺伝子、ＵＬ４１遺伝子（すなわち、ｖｈｓ遺伝子）、及び／又はＵＬ４８遺伝子（すなわち、ＶＭＷ６５遺伝子）を含み、ＵＬ４３遺伝子、ＵＬ４１遺伝子及び／又はＵＬ４８遺伝子は機能喪失型変異を含まない。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムは、機能喪失型変異を含まないＵＬ４３遺伝子を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムは、機能喪失型変異を含まないＵＬ４１遺伝子を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムは、機能喪失型変異を含まないＵＬ４８遺伝子を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムは、機能喪失型変異を含まないＵＬ４３遺伝子及びＵＬ４１遺伝子を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムは、機能喪失型変異を含まないＵＬ４３遺伝子及びＵＬ４８遺伝子を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムは、機能喪失型変異を含まないＵＬ４１遺伝子及びＵＬ４８遺伝子を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムは、機能喪失型変異を含まないＵＬ４３遺伝子、ＵＬ４１遺伝子及びＵＬ４８遺伝子を含む。
【０１１０】
或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムは、１つ以上の非必須遺伝子が欠失される又は変異導入される（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている）修飾を更に含む。或る特定の好ましい実施の形態では、非必須遺伝子は、ＵＬ３遺伝子、ＵＬ４遺伝子、ＵＬ１４遺伝子、ＵＬ１６遺伝子、ＵＬ２１遺伝子、ＵＬ２４遺伝子、ＵＬ３１遺伝子、ＵＬ３２遺伝子、ＵＳ３遺伝子、ＵＬ５１遺伝子、ＵＬ５５遺伝子、ＵＬ５６遺伝子、ＵＳ２遺伝子、ＵＳ１２遺伝子（すなわち、ＩＣＰ４７遺伝子）、ＬＡＴ遺伝子、ＪＱ６７３４８０．１のｎｔ５８５３〜ｎｔ７４８５に対応するヌクレオチドフラグメント、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムにおいて、ＵＬ３遺伝子は欠失している、又は変異導入されている（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている）。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムにおいて、ＵＬ４遺伝子は欠失している、又は変異導入されている（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている）。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムにおいて、ＵＬ１４遺伝子は欠失している、又は変異導入されている（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている）。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムにおいて、ＵＬ１６遺伝子は欠失している、又は変異導入されている（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている）。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムにおいて、ＵＬ２１遺伝子は欠失している、又は変異導入されている（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている）。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムにおいて、ＵＬ２４遺伝子は欠失している、又は変異導入されている（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている）。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムにおいて、ＵＬ３１遺伝子は欠失している、又は変異導入されている（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている）。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムにおいて、ＵＬ３２遺伝子は欠失している、又は変異導入されている（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている）。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムにおいて、ＵＳ３遺伝子は欠失している、又は変異導入されている（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている）。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムにおいて、ＵＬ５１遺伝子は欠失している、又は変異導入されている（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている）。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムにおいて、ＵＬ５５遺伝子は欠失している、又は変異導入されている（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている）。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムにおいて、ＵＬ５６遺伝子は欠失している、又は変異導入されている（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている）。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムにおいて、ＵＳ２遺伝子は欠失している、又は変異導入されている（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている）。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムにおいて、ＵＳ１２遺伝子は欠失している、又は変異導入されている（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている）。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムにおいて、ＬＡＴ遺伝子は欠失している、又は変異導入されている（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている）。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムにおいて、ＪＱ６７３４８０．１に対応するｎｔ５８５３〜ｎｔ７４８５のヌクレオチドフラグメントは欠失している、又は変異導入されている（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている）。
【０１１１】
或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムは、以下の修飾：ＵＬ５５遺伝子、ＵＳ２遺伝子、ＬＡＴ遺伝子、及びＪＱ６７３４８０．１のｎｔ５８５３〜ｎｔ７４８５に対応するヌクレオチドフラグメントの１つ以上の欠失又は突然変異（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている）の１つ以上を更に含む。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムは、ＵＬ５５遺伝子、ＵＳ２遺伝子、ＬＡＴ遺伝子、又はＪＱ６７３４８０．１のｎｔ５８５３〜ｎｔ７４８５に対応するヌクレオチドフラグメントの欠失又は突然変異（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている）という修飾を更に含む。
【０１１２】
或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノム中の必須遺伝子は欠失されず、機能喪失型変異を含まない。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノム中の必須遺伝子のコーディング配列は欠失されず、変異導入もされない。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムは全ての必須遺伝子を発現することができる。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムは全ての必須遺伝子を含み、どの必須遺伝子も機能喪失型変異を含まない。或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムは全ての必須遺伝子を含み、どの必須遺伝子のコーディング配列も突然変異を含まない。概して、必須遺伝子はＨＳＶウイルスの生存及び複製にとって不可欠であるため、組み換えＨＳＶウイルスのゲノムでは、どの必須遺伝子も機能喪失型変異を含まない。しかしながら、かかる必須遺伝子のプロモーターを操作することで（例えば、必須遺伝子の本来のプロモーターをｈＴＥＲＴプロモーター等の腫瘍特異的プロモーターで置換する）、本発明の組み換えＨＳＶウイルスの機能／特性に影響を及ぼすことなく、組み換えＨＳＶウイルスの安全性を更に増強させ得ることが容易に理解される。したがって或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムにおいて、１つ以上の必須遺伝子の本来のプロモーターは、ｈＴＥＲＴプロモーター等の腫瘍特異的なプロモーターで置換されている。或る特定の好ましい実施の形態では、必須遺伝子は、ＩＣＰ２７遺伝子、ＩＣＰ４遺伝子、ＶＰ５遺伝子、ｇＬ遺伝子、ｇＨ遺伝子、ｇＤ遺伝子、ｇＫ遺伝子、ｇＢ遺伝子、ｇＮ遺伝子、ＵＬ５遺伝子、ＵＬ６遺伝子、ＵＬ８遺伝子、ＵＬ９遺伝子、ＵＬ１２遺伝子、ＵＬ２５遺伝子、ＵＬ２６遺伝子、ＵＬ２８遺伝子、ＵＬ２９遺伝子、ＵＬ３０遺伝子、ＵＬ３３遺伝子、ＵＬ３６遺伝子、ＵＬ３８遺伝子、ＵＬ４２遺伝子、ＵＬ４８遺伝子、ＵＬ５２遺伝子、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【０１１３】
或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムは、上に記載されるＩＣＰ０遺伝子の２つのコピー及びＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーを除いて、野生型ＨＳＶウイルスの全てのその他の遺伝子を含み、いずれのその他の遺伝子も機能喪失型変異を含まない。しかしながら、その他の遺伝子のプロモーターを操作することで（例えば、本来のプロモーターをｈＴＥＲＴプロモーター等の腫瘍特異的プロモーターで置換してもよい）、本発明の組み換えＨＳＶウイルスの機能／特性に影響を及ぼすことなく組み換えＨＳＶウイルスの安全性を更に増強させ得ることが容易に理解される。したがって、或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムは以下の修飾を更に含む：１つ以上のＨＳＶ遺伝子の本来のプロモーターがｈＴＥＲＴプロモーター等の腫瘍特異的プロモーターで置換されている。或る特定の好ましい実施の形態では、ＨＳＶ遺伝子は、ＶＰ５遺伝子、ＩＣＰ２７遺伝子、及びＩＣＰ４遺伝子からなる群から選択される。
【０１１４】
或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムは、
（１）ｈＴＥＲＴプロモーター等の腫瘍特異的プロモーターによるＶＰ５遺伝子の本来のプロモーターの置換、
（２）ｈＴＥＲＴプロモーター等の腫瘍特異的プロモーターによるＩＣＰ２７遺伝子の本来のプロモーターの置換、
（３）ｈＴＥＲＴプロモーター等の腫瘍特異的プロモーターによるＩＣＰ４遺伝子の本来のプロモーターの置換、及び、
（４）ＵＬ５５遺伝子、ＵＳ２遺伝子、ＬＡＴ遺伝子及びＪＱ６７３４８０．１のｎｔ５８５３〜ｎｔ７４８５に対応するヌクレオチドフラグメントの１つ以上の欠失又は変異導入（例えば、機能喪失型変異を含む、又は外因性ヌクレオチド配列で置換される）、
からなる群から選択される１つ以上の修飾を更に含む。
【０１１５】
或る特定の好ましい実施の形態では、ｈＴＥＲＴプロモーターは配列番号５に示される配列を有する。
【０１１６】
またさらに、変異型ＨＳＶゲノムは、１つ以上の外因性ヌクレオチド配列を保有するように修飾され得る。例えば、或る特定の好ましい実施の形態では、変異型ＨＳＶゲノムは第５の外因性ヌクレオチド配列を更に含む。或る特定の好ましい実施の形態では、第５の外因性ヌクレオチド配列は、蛍光タンパク質、免疫調節性ポリペプチド、サイトカイン、ケモカイン、抗体、及び細胞毒性ペプチドからなる群から選択される外来タンパク質をコードする。
【０１１７】
宿主細胞
別の態様では、本発明は、本発明による組み換えＨＳＶウイルスに感染している、又は本発明による組み換えＨＳＶウイルスのゲノムを含む、又は本発明によるウイルスベクターでトランスフェクトされている宿主細胞を提供する。かかる宿主細胞としては、限定されないが、Ｅ．コリ（E.coli）細胞等の原核細胞、並びに酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、及び動物細胞（例えば、マウス細胞、ヒト細胞等の哺乳動物細胞）等の真核細胞が挙げられる。本発明の組み換えＨＳＶウイルスは、腫瘍細胞では高い複製能を有するが、正常細胞では低レベルで複製するにとどまる。したがって、或る特定の特に好ましい実施の形態では、細胞は腫瘍細胞である。かかる腫瘍細胞としては、限定されないが、肺癌細胞（例えばＨ１２９９、Ｈ５２０、Ｈ１９７５、ＮＣＩ−Ｈ３５８及びＡ５４９）、肝臓癌細胞（例えばＨｕｈ７、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２、ＧＳＧ７７０１、ＳＭＭＣ７７２１、Ｈｅｐａ１−６、ＢＥＬ７４０４、ＰＬＣ／ＰＲＦ及びＱＧＹ７７０３）、乳癌細胞（例えばＭＡＤＭＢ２３１、ＭＣＦ７及びＭＡＤＭＢ４６８）、骨肉腫細胞（例えばＵ２ＯＳ及びＳＡＯＳ２）、卵巣癌細胞（例えばＳＫＯＶ３及びＣＡＯＶ３）、子宮頸癌細胞（例えばＳｉＨＡ及びＨｅｌａ）、前立腺癌細胞（例えばＰＣ−３）、神経膠腫細胞（例えばＵ８７ＭＧ）、黒色腫細胞（例えばＡ３７５）、結腸直腸癌細胞（例えばＨＣＴ１１６）、及び膵癌細胞（例えばＰａｎｃ−１）が挙げられる。
【０１１８】
作製
別の態様において、本発明は、本発明の組み換えＨＳＶウイルスを調製する方法であって、
（１）本発明による宿主細胞を培養することと、
（２）宿主細胞に病変が生じた後、該宿主細胞を収集し、溶解させて宿主細胞の溶解物を得ることと、
（３）溶解物から本発明の組み換えＨＳＶウイルスを回収することと、
を含む、方法に関する。
【０１１９】
医薬組成物
別の態様では、本発明は、本発明による組み換えＨＳＶウイルス、又は本発明による組み換えＨＳＶウイルスのゲノム、又は本発明によるウイルスベクターと、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤とを含む医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、肺癌、肝臓癌、乳癌、骨肉腫、卵巣癌、前立腺癌、神経膠腫、黒色腫、結腸直腸癌、及び膵臓癌等の腫瘍の治療に使用され得る。
【０１２０】
本発明の医薬組成物は、限定されないが、注射による投与等の当該技術分野でよく知られている方法によって投与され得る。或る特定の好ましい実施の形態では、本発明の医薬組成物は注射（例えば腫瘍内注射）によって投与される。或る特定の好ましい実施の形態では、本発明の医薬組成物は注射液又は凍結乾燥粉体である。
【０１２１】
或る特定の好ましい実施の形態では、組み換えＨＳＶウイルス、又は組み換えＨＳＶウイルスのゲノム、又はウイルスベクターは、治療的有効量（例えば、腫瘍治療において治療的に有効な量）で存在する。或る特定の好ましい実施の形態では、本発明の医薬組成物は単位剤形で提示される。例えば、本発明を限定することを意図するものではないが、１単位用量当たりの医薬組成物に含まれる組み換えＨＳＶウイルスの量は、１０２ｐｆｕ〜１０９ｐｆｕ、例えば１０２ｐｆｕ〜１０３ｐｆｕ、１０３ｐｆｕ〜１０４ｐｆｕ、１０４ｐｆｕ〜１０５ｐｆｕ、１０５ｐｆｕ〜１０６ｐｆｕ、１０６ｐｆｕ〜１０７ｐｆｕ、１０７ｐｆｕ〜１０８ｐｆｕ、又は１０８ｐｆｕ〜１０９ｐｆｕであってもよい。
【０１２２】
使用／使用の方法
本発明の組み換えＨＳＶウイルスは、様々な腫瘍の治療に使用され得る。したがって、別の態様では、本発明は、治療有効量の本発明の組み換えＨＳＶウイルス、又は本発明のウイルスベクター、又は本発明の医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、腫瘍を治療する方法に関する。或る特定の好ましい実施の形態では、腫瘍としては、限定されないが、肺癌、肝臓癌、乳癌、骨肉腫、卵巣癌、前立腺癌、神経膠腫、黒色腫、結腸直腸癌、及び膵臓癌が挙げられる。或る特定の好ましい実施の形態では、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。或る特定の好ましい実施の形態では、本発明の組み換えＨＳＶウイルス、又は本発明のウイルスベクター、又は本発明の医薬組成物は、注射（例えば腫瘍内注射）によって被験体に投与される。
【０１２３】
別の態様では、本発明は、被験体の腫瘍を治療する医薬組成物の製造における、本発明の組み換えＨＳＶウイルス又は本発明のウイルスベクターの使用に関する。或る特定の好ましい実施の形態では、腫瘍としては、限定されないが、肺癌、肝臓癌、乳癌、骨肉腫、卵巣癌、前立腺癌、神経膠腫、黒色腫、結腸直腸癌、及び膵臓癌が挙げられる。或る特定の好ましい実施の形態では、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。或る特定の好ましい実施の形態では、医薬組成物は注射（例えば腫瘍内注射）によって投与される。或る特定の好ましい実施の形態では、医薬組成物は注射液又は凍結乾燥粉体である。
【０１２４】
本発明の有利な効果
従来技術の組み換え単純ヘルペスウイルスと比較して、本発明の組み換えＨＳＶウイルスは以下の有益な技術的効果を有する：本発明の組み換えＨＳＶウイルスは腫瘍細胞において高レベルの複製能を有し、様々な腫瘍細胞を効果的に殺傷することができるが、正常細胞においては顕著にレベルが減少した複製能及び殺傷能を有している。さらに、本発明の組み換えＨＳＶウイルスは、動物における神経毒性のレベルが顕著に減少され、顕著に増加した用量で動物に投与することができることも示された。したがって、既存の組み換えＨＳＶウイルスと比較して、本発明の組み換えＨＳＶウイルスは、高レベルの腫瘍退縮能を維持するだけでなく、安全性レベルが顕著に改善され、したがってより高用量で投与することができ、幅広い適用の見込みがある。
【０１２５】
配列情報の記載
本発明に関与する配列に関する情報を表１に提供する。
【０１２６】
【表１】
2020511160.tif 000003
【０１２７】
配列番号１
GCAAAAAAGGCGGGCGGCGGTCCGGGCGGCGTGCGCGCGCGCGGCGGGCGTGGGGGGCGGGGCCGCGGGAGCGGGGGAGGAGCGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGGAGGAGCGGGGGAGGAGCGGCCAGACCCCGGAAACGGGCCCCCCCCAAAACACACCCCCCGGGGGTCGCGCGCGGCCCTTTAAAGGCGGGCGGCGGGCAGCCCGGGCCCCCCGCGGCCGAGACTAGCGAGTTAGACAGGCAAGCACTACTCGCCTCTGCACGCACATGCTTGCCTGTCAAACTCTACCACCCCGGCACGCTCTCTGTCTCCATGGCCCGCCGCCGCCATCGCGGCCCCCGCCGCCCCCGGCCGCCCGGGCCCACGGGCGCGGTCCCAACCGCACAGTCCCAGGTAACCTCCACGCCCAACTCGGAACCCGTGGTCAGGAGCGCGCCCGCGGCCGCCCCGCCGCCGCCCCCCGCCAGTGGGCCCCCGCCTTCTTGTTCGCTGCTGCTGCGCCAGTGGCTCCACGTTCCCGAGTCCGCGTCCGACGACGACGACGACGACTGGCCGGACAGCCCCCCGCCCGAGCCGGCGCCAGAGGCCCGGCCCACCGCCGCCGCCCCCCGCCCCCGGTCCCCACCGCCCGGCGCGGGCCCGGGGGGCGGGGCTAACCCCTCCCACCCCCCCTCACGCCCCTTCCGCCTTCCGCCGCGCCTCGCCCTCCGCCTGCGCGTCACCGCAGAGCACCTGGCGCGCCTGCGCCTGCGACGCGCGGGCGGGGAGGGGGCGCCGAAGCCCCCCGCGACCCCCGCGACCCCCGCGACCCCCACGCGGGTGCGCTTCTCGCCCCACGTCCGGGTGCGCCACCTGGTGGTCTGGGCCTCGGCCGCCCGCCTGGCGCGCCGCGGCTCGTGGGCCCGCGAGCGGGCCGACCGGGCTCGGTTCCGGCGCCGGGTGGCGGAGGCCGAGGCGGTCATCGGGCCGTGCCTGGGGCCCGAGGCCCGTGCCCGGGCCCTGGCCCGCGGAGCCGGCCCGGCGAACTCGGTCTAACGTTACACCCGAGGCGGCCTGGGTCTTCCGCGGAGCTCCCGGGAGCTCCGCACCAAGCCGCTCTCCGGAGAGACGATGGCAGGAGCCGCGCATATATACGCTTGGAGCCGGCCCGCCCCCGAGGCGGGCCCGCCCTCGGAGGGCGGGACTGGCCAATCGGCGGCCGCCAGCGCGGCGGGGCCCGGCCAACCAGCGTCCGCCGAGTCGTCGGGGCCCGGCCCACTGGGCGGTAACTCCCGCCCAGTGGGCCGGGCCGCCCACTTCCCGGTATGGTAATTAAAAACTTGCAGAGGCCTTGTTCCGCTTCCCGGTATGGTAATTAGAAACTCATTAATGGGCGGCCCCGGCCGCCCTTCCCGCTTCCGGCAATTCCCGCGGCCCTTAATGGGCAACCCCGGTATTCCCCGCCTCCCGCGCCGCGCGTAACCACTCCCCTGGGGTTCCGGGTTATGTTAATTGCTTTTTTGGCGGAACACACGGCCCCTCGCGCATTGGCCCGCGGGTCGCTCAATGAACCCGCATTGGTCCCCTGGGGTTCCGGGTATGGTAATGAGTTTCTTCGGGAAGGCGGGAAGCCCCGGGGCACCGACGCAGGCCAAGCCCCTGTTGCGTCGGCGGGAGGGGCATGCTAATGGGGTTCTTTGGGGGACACCGGGTTGGTCCCCCAAATCGGGGGCCGGGCCGTGCATGCTAATGATATTCTTTGGGGGCGCCGGGTTGGTCCCCGGGGACGGGGCCGCCCCGCGGTGGGCCTGCCTCCCCTGGGACGCGCGGCCATTGGGGGAATCGTCACTGCCGCCCCTTTGGGGAGGGGAAAGGCGTGGGGTATAAGTTAGCCCTGGCCCGACGGTCTGGTCGCATTTGCACCTCGGCACTCGGAGCGAGACGCAGCAGCCAGGCAGACTCGGGCCGCCCCCTCTCCGCATCACCACAGAAGCCCCGCCTACGTTGCGACCCCCAGGGACCCTCCGTCAGCGACCCTCCAGCCGCATACGACCCCCATGGAGCCCCGCCCCGGAGCGAGTACCCGCCGGCCTGAGGGCCGCCCCCAGCGCGAGGTGAGGGGCCGGGCGCCATGTCTGGGGCGCCATGTTGGGGGGCGCCATGTTGGGGGGCGCCATGTTGGGGGACCCCCGACCCTTACACTGGAACCGGCCGCCATGTTGGGGGACCCCCACTCATACACGGGAGCCGGGCGCCATGTTGGGGCGCCATGTTAGGGGGCGTGGAACCCCGTGACACTATATATACAGGGACCGGGGGCGCCATGTTAGGGGGCGCGGAACCCCCTGACCCTATATATACAGGGACCGGGGTCGCCCTGTTAGGGGTCGCCATGTGACCCCCTGACTTTATATATACAGACCCCCAACACCTACACATGGCCCCTTTGACTCAGACGCAGGGCCCGGGGTCGCCGTGGGACCCCCCTGACTCATACACAGAGACACGCCCCCACAACAAACACACAGGGACCGGGGTCGCCGTGTTAGGGGGCGTGGTCCCCACTGACTCATACGCAGGGCCCCCTTACTCACACGCATCTAGGGGGGTGGGGAGGAGCCGCCCGCCATATTTGGGGGACGCCGTGGGACCCCCGACTCCGGTGCGTCTGGAGGGCGGGAGAAGAGGGAAGAAGAGGGGTCGGGATCCAAAGGACGGACCCAGACCACCTTTGGTTGCAGACCCCTTTCTCCCCCCTCTTCCGAGGCCAGCAGGGGGGCAGGACTTTGTGAGGCGGGGGGGGAGGGGGAACTCGTGGGCGCTGATTGACGCGGGAAATCCCCCCATTCTTACCCGCCCCCCCTTTTTTCCCCTCAGCCCGCCCCGGATGTCTGGGTGTTTCCCTGCGACCGAGACCTGCCGGACAGCAGCGACTCGGAGGCGGAGACCGAAGTGGGGGGGCGGGGGGACGCCGACCACCATGACGACGACTCCGCCTCCGAGGCGGACAGCACGGACACGGAACTGTTCGAGACGGGGCTGCTGGGGCCGCAGGGCGTGGATGGGGGGGCGGTCTCGGGGGGGAGCCCCCCCCGCGAGGAAGACCCCGGCAGTTGCGGGGGCGCCCCCCCTCGAGAGGACGGGGGGAGCGACGAGGGCGACGTGTGCGCCGTGTGCACGGATGAGATCGCGCCCCACCTGCGCTGCGACACCTTCCCGTGCATGCACCGCTTCTGCATCCCGTGCATGAAAACCTGGATGCAATTGCGCAACACCTGCCCGCTGTGCAACGCCAAGCTGGTGTACCTGATAGTGGGCGTGACGCCCAGCGGGTCGTTCAGCACCATCCCGATCGTGAACGACCCCCAGACCCGCATGGAGGCCGAGGAGGCCGTCAGGGCGGGCACGGCCGTGGACTTTATCTGGACGGGCAATCAGCGGTTCGCCCCGCGGTACCTGACCCTGGGGGGGCACACGGTGAGGGCCCTGTCGCCCACCCACCCTGAGCCCACCACGGACGAGGATGACGACGACCTGGACGACGGTGAGGCGGGGGGGCGGCGAGGACCCTGGGGGAGGAGGAGGAGGGGGGGGGGAGGGAGGAATAGGCGGGCGGGCGGGCGAGGAAAGGGCGGGCCGGGGAGGGGGCGTAACCTGATCGCGCCCCCCGTTGTCTCTTGCAGCAGACTACGTACCGCCCGCCCCCCGCCGGACGCCCCGCGCCCCCCCACGCAGAGGCGCCGCCGCGCCCCCCGTGACGGGCGGGGCGTCTCACGCAGCCCCCCAGCCGGCCGCGGCTCGGACAGCGCCCCCCTCGGCGCCCATCGGGCCACACGGCAGCAGTAACACTAACACCACCACCAACAGCAGCGGCGGCGGCGGCTCCCGCCAGTCGCGAGCCGCGGTGCCGCGGGGGGCGTCTGGCCCCTCCGGGGGGGTTGGGGTTGTTGAAGCGGAGGCGGGGCGGCCGAGGGGCCGGACGGGCCCCCTTGTCAACAGACCCGCCCCCCTTGCAAACAACAGAGACCCCATAGTGATCAGCGACTCCCCCCCGGCCTCTCCCCACAGGCCCCCCGCGGCGCCCATGCCAGGCTCCGCCCCCCGCCCCGGTCCCCCCGCGTCCGCGGCCGCGTCGGGCCCCGCGCGCCCCCGCGCGGCCGTGGCCCCGTGTGTGCGGGCGCCGCCTCCGGGGCCCGGCCCCCGCGCCCCGGCCCCCGGGGCGGAGCCGGCCGCCCGCCCCGCGGACGCGCGCCGTGTGCCCCAGTCGCACTCGTCCCTGGCTCAGGCCGCGAACCAAGAACAGAGTCTGTGCCGGGCGCGTGCGACGGTGGCGCGCGGCTCGGGGGGGCCGGGCGTGGAGGGTGGACACGGGCCCTCCCGCGGCGCCGCCCCCTCCGGCGCCGCCCCCTCCGGCGCCCCCCCGCTCCCCTCCGCCGCCTCTGTCGAGCAGGAGGCGGCGGTGCGTCCGAGGAAGAGGCGCGGGTCGGGCCAGGAAAACCCCTCCCCCCAGTCCACGCGTCCCCCCCTCGCGCCGGCAGGGGCCAAGAGGGCGGCGACGCACCCCCCCTCCGACTCAGGGCCGGGGGGGCGCGGCCAGGGAGGGCCCGGGACCCCCCTGACGTCCTCGGCGGCCTCCGCCTCTTCCTCCTCCGCCTCTTCCTCCTCGGCCCCGACTCCCGCGGGGGCCACCTCTTCCGCCACCGGGGCCGCGTCCTCCTCCGCTTCCGCCTCCTCGGGCGGGGCCGTCGGTGCCCTGGGAGGGAGACAAGAGGAAACCTCCCTCGGCCCCCGCGCTGCTTCTGGGCCGCGGGGGCCGAGGAAGTGTGCCCGGAAGACGCGCCACGCGGAGACTTCCGGGGCCGTCCCCGCGGGCGGCCTCACGCGCTACCTGCCCATCTCGGGGGTCTCTAGCGTGGTCGCCCTGTCGCCTTACGTGAACAAGACGATCACGGGGGACTGCCTGCCCATCCTGGACATGGAGACGGGGAACATCGGGGCGTACGTGGTCCTGGTGGACCAGACGGGAAACATGGCGACCCGGCTGCGGGCCGCGGTCCCCGGCTGGAGCCGCCGCACCCTGCTCCCCGAGACCGCGGGTAACCACGTGACGCCCCCCGAGTACCCGACGGCCCCCGCGTCGGAGTGGAACAGCCTCTGGATGACCCCCGTGGGGAACATGCTGTTCGACCAGGGCACCCTAGTGGGCGCCCTGGACTTCCGCAGCCTGCGGTCTCGGCACCCGTGGTCCGGGGAGCAGGGGGCGTCGACCCGGGACGAGGGAAAACAATAAGGGACGCCCCCGTGTTTGTGGGGAGGGGGGGGTCGGGCGCTGGGTGGTCTCTGGCCGCGCCCACTACACCAGCCAATCCGTGTCGGGGAGGTGGAAAGTGAAAGACACGGGCACCACACACCAGCGGGTCTTTTGTGTTGGCCCTAATAAAAAAAACTCAGGGGATTTTTGCTGTCTGTTGGGAAATAAAGGTTTACTTTTGTATCTTTTCCCTGTCTGTGTTGGATGTATCGCGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCCATGTTGGGCAGGCTCTGGTGTT
【０１２８】
配列番号２
GTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCTTTGCCTGGTTTCCGGCACCAGAAGCGGTGCCGGAAAGCTGGCTGGAGTGCGATCTTCCTGAGGCCGATACTGTCGTCGTCCCCTCAAACTGGCAGATGCACGGTTACGATGCGCCCATCTACACCAACGTGACCTATCCCATTACGGTCAATCCGCCGTTTGTTCCCACGGAGAATCCGACGGGTTGTTACTCGCTCACATTTAATGTTGATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCCAGACGCGAATTATTTTTGATGGCGTTAACTCGGCGTTTCATCTGTGGTGCAACGGGCGCTGGGTCGGTTACGGCCAGGACAGTCGTTTGCCGTCTGAATTTGACCTGAGCGCATTTTTACGCGCCGGAGAAAACCGCCTCGCGGTGATGGTGCTGCGCTGGAGTGACGGCAGTTATCTGGAAGATCAGGATATGTGGCGGATGAGCGGCATTTTCCGTGACGTCTCGTTGCTGCATAAACCGACTACACAAATCAGCGATTTCCATGTTGCCACTCGCTTTAATGATGATTTCAGCCGCGCTGTACTGGAGGCTGAAGTTCAGATGTGCGGCGAGTTGCGTGACTACCTACGGGTAACAGTTTCTTTATGGCAGGGTGAAACGCAGGTCGCCAGCGGCACCGCGCCTTTCGGCGGTGAAATTATCGATGAGCGTGGTGGTTATGCCGATCGCGTCACACTACGTCTGAACGTCGAAAACCCGAAACTGTGGAGCGCCGAAATCCCGAATCTCTATCGTGCGGTGGTTGAACTGCACACCGCCGACGGCACGCTGATTGAAGCAGAAGCCTGCGATGTCGGTTTCCGCGAGGTGCGGATTGAAAATGGTCTGCTGCTGCTGAACGGCAAGCCGTTGCTGATTCGAGGCGTTAACCGTCACGAGCATCATCCTCTGCATGGTCAGGTCATGGATGAGCAGACGATGGTGCAGGATATCCTGCTGATGAAGCAGAACAACTTTAACGCCGTGCGCTGTTCGCATTATCCGAACCATCCGCTGTGGTACACGCTGTGCGACCGCTACGGCCTGTATGTGGTGGATGAAGCCAATATTGAAACCCACGGCATGGTGCCAATGAATCGTCTGACCGATGATCCGCGCTGGCTACCGGCGATGAGCGAACGCGTAACGCGAATGGTGCAGCGCGATCGTAATCACCCGAGTGTGATCATCTGGTCGCTGGGGAATGAATCAGGCCACGGCGCTAATCACGACGCGCTGTATCGCTGGATCAAATCTGTCGATCCTTCCCGCCCGGTGCAGTATGAAGGCGGCGGAGCCGACACCACGGCCACCGATATTATTTGCCCGATGTACGCGCGCGTGGATGAAGACCAGCCCTTCCCGGCTGTGCCGAAATGGTCCATCAAAAAATGGCTTTCGCTACCTGGAGAGACGCGCCCGCTGATCCTTTGCGAATACGCCCACGCGATGGGTAACAGTCTTGGCGGTTTCGCTAAATACTGGCAGGCGTTTCGTCAGTATCCCCGTTTACAGGGCGGCTTCGTCTGGGACTGGGTGGATCAGTCGCTGATTAAATATGATGAAAACGGCAACCCGTGGTCGGCTTACGGCGGTGATTTTGGCGATACGCCGAACGATCGCCAGTTCTGTATGAACGGTCTGGTCTTTGCCGACCGCACGCCGCATCCAGCGCTGACGGAAGCAAAACACCAGCAGCAGTTTTTCCAGTTCCGTTTATCCGGGCAAACCATCGAAGTGACCAGCGAATACCTGTTCCGTCATAGCGATAACGAGCTCCTGCACTGGATGGTGGCGCTGGATGGTAAGCCGCTGGCAAGCGGTGAAGTGCCTCTGGATGTCGCTCCACAAGGTAAACAGTTGATTGAACTGCCTGAACTACCGCAGCCGGAGAGCGCCGGGCAACTCTGGCTCACAGTACGCGTAGTGCAACCGAACGCGACCGCATGGTCAGAAGCCGGGCACATCAGCGCCTGGCAGCAGTGGCGTCTGGCGGAAAACCTCAGTGTGACGCTCCCCGCCGCGTCCCACGCCATCCCGCATCTGACCACCAGCGAAATGGATTTTTGCATCGAGCTGGGTAATAAGCGTTGGCAATTTAACCGCCAGTCAGGCTTTCTTTCACAGATGTGGATTGGCGATAAAAAACAACTGCTGACGCCGCTGCGCGATCAGTTCACCCGTGCACCGCTGGATAACGACATTGGCGTAAGTGAAGCGACCCGCATTGACCCTAACGCCTGGGTCGAACGCTGGAAGGCGGCGGGCCATTACCAGGCCGAAAGCAGCGTTGTTGCAGTGCACGGCAGATACACTTGCTGATGCGGTGCTGATTACGACCGCTCACGCGTGGCAGCATCAGGGGAAAACCTTATTTATCAGCCGGAAAACCTACCGGATTGATGGTAGTGGTCAAATGGCGATTACCGTTGATGTTGAAGTGGCGAGCGATACACCGCATCCGGCGCGGATTGGCCTGAACTGCCAGCTGGCGCAGGTAGCAGAGCGGGTAAACTGGCTCGGATTAGGGCCGCAAGAAAACTATCCCGACCGCCTTACTGCCGCCTGTTTTGACCGCTGGGATCTGCCATTGTCAGACATGTATACCCCGTACGTCTTCCCGAGCGAAAACGGTCTGCGCTGCGGGACGCGCGAATTGAATTATGGCCCACACCAGTGGCGCGGCGACTTCCAGTTCAACATCAGCCGCTACAGTCAACAGCAACTGATGGAAACCAGCCATCGCCATCTGCTGCACGCGGAAGAAGGCACATGGCTGAATATCGACGGTTTCCATATGGGGATTGGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCGTCAGTATCGGCGGAATTCCAGCTGAGCGCCGGTCGCTACCATTACCAGTTGGTCTGGTGTCAAAAATAA
【０１２９】
配列番号３
CCACCTGGTGTTTTGTCTCCACCATCGGCCTGACAGAGCTGTATTGTATTCTGCGGCGGGGCCCGGCCCCCAAGAACGCAGACAAGGCCGCCGCCCCGGGGCGATCCAAGGGGCTGTCGGGCGTCTGCGGGCGCTGTTGTTCCATCATCCTGTCGGGCATCGCAATGCGATTGTGTTATATCGCCGTGGTGGCCGGGGTGGTGCTCGTGGCGCTTCACTACGAGCAGGAGATCCAGAGGCGCCTGTTTGATGTATGACGTCACATCCAGGCCGGCGGAAACCGGAACGGCATATGCAAACTGGAAACTGTCCTGTCTTGGGGCCCACCCACCCGACGCGTCATATGTAAATGAAAATCGTTCCCCCGAGGCCATGTGTAGCCTGGATCCCAACGACCCCGCCCATGGGTCCCAATTGGCCGTCCCGTTACCAAGACCAACCCAGCCAGCGTATCCACCCCCGCCCGGGTCCCCGCGGAAGCGGAACGGTGTATGTGATATGCTAATTAAATACATGCCACGTACTTATGGTGTCTGATTGGTCCTTGTCTGTGCCGGAGGTG
【０１３０】
配列番号４
ACCGGTGCGCCACCACCAGAGGCCATATCCGACACCCCAGCCCCGACGGCAGCCGACAGCCCGGTCATGGCGACTGACATTGATATGCTAATTGACCTCGGCCTGGACCTCTCCGACAGCGATCTGGACGAGGACCCCCCCGAGCCGGCGGAGAGCCGCCGCGACGACCTGGAATCGGACAGCAACGGGGAGTGTTCCTCGTCGGACGAGGACATGGAAGACCCCCACGGAGAGGACGGACCGGAGCCGATACTCGACGCCGCTCGCCCGGCGGTCCGCCCGTCTCGTCCAGAAGACCCCGGCGTACCCAGCACCCAGACGCCTCGTCCGACGGAGCGGCAGGGCCCCAACGATCCTCAACCAGCGCCCCACAGTGTGTGGTCGCGCCTCGGGGCCCGGCGACCGTCTTGCTCCCCCGAGCGGCACGGGGGCAAGGTGGCCCGCCTCCAACCCCCACCGACCAAAGCCCAGCCTGCCCGCGGCGGACGCCGTGGGCGTCGCAGGGGTCGGGGTCGCGGTGGTCCCGGGGCCGCCGATGGTTTGTCGGACCCCCGCCGGCGTGCCCCCAGAACCAATCGCAACCCGGGGGGACCCCGCCCCGGGGCGGGGTGGACGGACGGCCCCGGCGCCCCCCATGGCGAGGCGTGGCGCGGAAGTGAGCAGCCCGACCCACCCGGAGGCCCGCGGACACGGAGCGTGCGCCAAGCACCCCCCCCGCTAATGACGCTGGCGATTGCCCCCCCGCCCGCGGACCCCCGCGCCCCGGCCCCGGAGCGAAAGGCGCCCGCCGCCGACACCATCGACGCCACCACGCGGTTGGTCCTGCGCTCCATCTCCGAGCGCGCGGCGGTCGACCGCATCAGCGAGAGCTTCGGCCGCAGCGCACAGGTCATGCACGACCCCTTTGGGGGGCAGCCGTTTCCCGCCGCGAATAGCCCCTGGGCCCCGGTGCTGGCGGGCCAAGGAGGGCCCTTTGACGCCGAGACCAGACGGGTCTCCTGGGAAACCTTGGTCGCCCACGGCCCGAGCCTCTATCGCACTTTTGCCGGCAATCCTCGGGCCGCATCGACCGCCAAGGCCATGCGCGACTGCGTGCTGCGCCAAGAAAATTTCATCGAGGCGCTGGCCTCCGCCGACGAGACGCTGGCGTGGTGCAAGATGTGCATCCACCACAACCTGCCGCTGCGCCCCCAGGACCCCATTATCGGGACGGCCGCGGCGGTGCTGGATAACCTCGCCACGCGCCTGCGGCCCTTTCTCCAGTGCTACCTGAAGGCGCGAGGCCTGTGCGGCCTGGACGAACTGTGTTCGCGGCGGCGTCTGGCGGACATTAAGGACATTGCATCCTTCGTGTTTGTCATTCTGGCCAGGCTCGCCAACCGCGTCGAGCGTGGCGTCGCGGAGATCGACTACGCGACCCTTGGTGTCGGGGTCGGAGAGAAGATGCATTTCTACCTCCCCGGGGCCTGCATGGCGGGCCTGATCGAAATCCTAGACACGCACCGCCAGGAGTGTTCGAGTCGTGTCTGCGAGTTGACGGCCAGTCACATCGTCGCCCCCCCGTACGTGCACGGCAAATATTTTTATTGCAACTCCCTGTTTTAG
【０１３１】
配列番号５
CTGCGCTGTCGGGGCCAGGCCGGGCTCCCAGTGGATTCGCGGGCACAGACGCCCAGGACCGCGCTTCCCACGTGGCGGAGGGACTGGGGACCCGGGCACCCGTCCTGCCCCTTCACCTTCCAGCTCCGCCTCCTCCGCGCGGACCCCGCCCCGTCCCGACCCCTCCCGGGTCCCCGGCCCAGCCCCCTCCGGGCCCTCCCAGCCCCTCCCCTTCCTTTCCGCGGCCCCGCCCTCTCCTCGCGGCGCGAGTTTCAGGCAGC
【０１３２】
配列番号６
CATGGCCCGCCGCCGCCATCGCGGCCCCCGCCGCCCCCGGCCGCCCGGGCCCACGGGCGCGGTCCCAACCGCACAGTCCCAGGTAACCTCCACGCCCAACTCGGAACCCGTGGTCAGGAGCGCGCCCGCGGCCGCCCCGCCGCCGCCCCCCGCCAGTGGGCCCCCGCCTTCTTGTTCGCTGCTGCTGCGCCAGTGGCTCCACGTTCCCGAGTCCGCGTCCGACGACGACGACGACGACTGGCCGGACAGCCCCCCGCCCGAGCCGGCGCCAGAGGCCCGGCCCACCGCCGCCGCCCCCCGCCCCCGGTCCCCACCGCCCGGCGCGGGCCCGGGGGGCGGGGCTAACCCCTCCCACCCCCCCTCACGCCCCTTCCGCCTTCCGCCGCGCCTCGCCCTCCGCCTGCGCGTCACCGCAGAGCACCTGGCGCGCCTGCGCCTGCGACGCGCGGGCGGGGAGGGGGCGCCGAAGCCCCCCGCGACCCCCGCGACCCCCGCGACCCCCACGCGGGTGCGCTTCTCGCCCCACGTCCGGGTGCGCCACCTGGTGGTCTGGGCCTCGGCCGCCCGCCTGGCGCGCCGCGGCTCGTGGGCCCGCGAGCGGGCCGACCGGGCTCGGTTCCGGCGCCGGGTGGCGGAGGCCGAGGCGGTCATCGGGCCGTGCCTGGGGCCCGAGGCCCGTGCCCGGGCCCTGGCCCGCGGAGCCGGCCCGGCGAACTCGGTCTAACGTTACACCCGAGGCGGCCTGGGTCTTCCGCGGAGCTCCCGGGAGCTCCGCACCAAGCCGCTCTCCGGAGAGACGATGGCAGGAGCCGCGCATATATACGCTTGGAGCCGGCCCGCCCCCGAGGCGGGCCCGCCCTCGGAGGGCGGGACTGGCCAATCGGCGGCCGCCAGCGCGGCGGGGCCCGGCCAACCAGCGTCCGCCGAGTCGTCGGGGCCCGGCCCACTGGGCGGTAACTCCCGCCCAGTGGGCCGGGCCGCCCACTTCCCGGTATGGTAATTAAAAACTTGCAGAGGCCTTGTTCCGCTTCCCGGTATGGTAATTAGAAACTCATTAATGGGCGGCCCCGGCCGCCCTTCCCGCTTCCGGCAATTCCCGCGGCCCTTAATGGGCAACCCCGGTATTCCCCGCCTCCCGCGCCGCGCGTAACCACTCCCCTGGGGTTCCGGGTTATGTTAATTGCTTTTTTGGCGGAACACACGGCCCCTCGCGCATTGGCCCGCGGGTCGCTCAATGAACCCGCATTGGTCCCCTGGGGTTCCGGGTATGGTAATGAGTTTCTTCGGGAAGGCGGGAAGCCCCGGGGCACCGACGCAGGCCAAGCCCCTGTTGCGTCGGCGGGAGGGGCATGCTAATGGGGTTCTTTGGGGGACACCGGGTTGGTCCCCCAAATCGGGGGCCGGGCCGTGCATGCTAATGATATTCTTTGGGGGCGCCGGGTTGGTCCCCGGGGACGGGGCCGCCCCGCGGTGGGCCTGCCTCCCCTGGGACGCGCGGCCATTGGGGGAATCGTCACTGCCGCCCCTTTGGGGAGGGGAAAGGCGTGGGGTATAAGTTAGCCCTGGCCCGACGGTCTGGTCGCATTTGCACCTCGGCACTCGGAGCGAGACGCAGCAGCCAGGCAGACTCGGGCCGCCCCCTCTCCGCATCACCACAGAAGCCCCGCCTACGTTGCGACCCCCAGGGACCCTCCGTCAGCGACCCTCCAGCCGCATACGACCCCCATGGAGCCCCGCCCCGGAGCGAGTACCCGCCGGCCTGAGGGCCGCCCCCAGCGCGAGGTGAGGGGCCGGGCGCCATGTCTGGGGCGCCATGTTGGGGGGCGCCATGTTGGGGGGCGCCATGTTGGGGGACCCCCGACCCTTACACTGGAACCGGCCGCCATGTTGGGGGACCCCCACTCATACACGGGAGCCGGGCGCCATGTTGGGGCGCCATGTTAGGGGGCGTGGAACCCCGTGACACTATATATACAGGGACCGGGGGCGCCATGTTAGGGGGCGCGGAACCCCCTGACCCTATATATACAGGGACCGGGGTCGCCCTGTTAGGGGTCGCCATGTGACCCCCTGACTTTATATATACAGACCCCCAACACCTACACATGGCCCCTTTGACTCAGACGCAGGGCCCGGGGTCGCCGTGGGACCCCCCTGACTCATACACAGAGACACGCCCCCACAACAAACACACAGGGACCGGGGTCGCCGTGTTAGGGGGCGTGGTCCCCACTGACTCATACGCAGGGCCCCCTTACTCACACGCATCTAGGGGGGTGGGGAGGAGCCGCCCGCCATATTTGGGGGACGCCGTGGGACCCCCGACTCCGGTGCGTCTGGAGGGCGGGAGAAGAGGGAAGAAGAGGGGTCGGGATCCAAAGGACGGACCCAGACCACCTTTGGTTGCAGACCCCTTTCTCCCCCCTCTTCCGAGGCCAGCAGGGGGGCAGGACTTTGTGAGGCGGGGGGGGAGGGGGAACTCGTGGGCGCTGATTGACGCGGGAAATCCCCCCATTCTTACCCGCCCCCCCTTTTTTCCCCTCAGCCCGCCCCGGATGTCTGGGTGTTTCCCTGCGACCGAGACCTGCCGGACAGCAGCGACTCGGAGGCGGAGACCGAAGTGGGGGGGCGGGGGGACGCCGACCACCATGACGACGACTCCGCCTCCGAGGCGGACAGCACGGACACGGAACTGTTCGAGACGGGGCTGCTGGGGCCGCAGGGCGTGGATGGGGGGGCGGTCTCGGGGGGGAGCCCCCCCCGCGAGGAAGACCCCGGCAGTTGCGGGGGCGCCCCCCCTCGAGAGGACGGGGGGAGCGACGAGGGCGACGTGTGCGCCGTGTGCACGGATGAGATCGCGCCCCACCTGCGCTGCGACACCTTCCCGTGCATGCACCGCTTCTGCATCCCGTGCATGAAAACCTGGATGCAATTGCGCAACACCTGCCCGCTGTGCAACGCCAAGCTGGTGTACCTGATAGTGGGCGTGACGCCCAGCGGGTCGTTCAGCACCATCCCGATCGTGAACGACCCCCAGACCCGCATGGAGGCCGAGGAGGCCGTCAGGGCGGGCACGGCCGTGGACTTTATCTGGACGGGCAATCAGCGGTTCGCCCCGCGGTACCTGACCCTGGGGGGGCACACGGTGAGGGCCCTGTCGCCCACCCACCCTGAGCCCACCACGGACGAGGATGACGACGACCTGGACGACGGTGAGGCGGGGGGGCGGCGAGGACCCTGGGGGAGGAGGAGGAGGGGGGGGGGAGGGAGGAATAGGCGGGCGGGCGGGCGAGGAAAGGGCGGGCCGGGGAGGGGGCGTAACCTGATCGCGCCCCCCGTTGTCTCTTGCAGCAGACTACGTACCGCCCGCCCCCCGCCGGACGCCCCGCGCCCCCCCACGCAGAGGCGCCGCCGCGCCCCCCGTGACGGGCGGGGCGTCTCACGCAGCCCCCCAGCCGGCCGCGGCTCGGACAGCGCCCCCCTCGGCGCCCATCGGGCCACACGGCAGCAGTAACACTAACACCACCACCAACAGCAGCGGCGGCGGCGGCTCCCGCCAGTCGCGAGCCGCGGTGCCGCGGGGGGCGTCTGGCCCCTCCGGGGGGGTTGGGGTTGTTGAAGCGGAGGCGGGGCGGCCGAGGGGCCGGACGGGCCCCCTTGTCAACAGACCCGCCCCCCTTGCAAACAACAGAGACCCCATAGTGATCAGCGACTCCCCCCCGGCCTCTCCCCACAGGCCCCCCGCGGCGCCCATGCCAGGCTCCGCCCCCCGCCCCGGTCCCCCCGCGTCCGCGGCCGCGTCGGGCCCCGCGCGCCCCCGCGCGGCCGTGGCCCCGTGTGTGCGGGCGCCGCCTCCGGGGCCCGGCCCCCGCGCCCCGGCCCCCGGGGCGGAGCCGGCCGCCCGCCCCGCGGACGCGCGCCGTGTGCCCCAGTCGCACTCGTCCCTGGCTCAGGCCGCGAACCAAGAACAGAGTCTGTGCCGGGCGCGTGCGACGGTGGCGCGCGGCTCGGGGGGGCCGGGCGTGGAGGGTGGACACGGGCCCTCCCGCGGCGCCGCCCCCTCCGGCGCCGCCCCCTCCGGCGCCCCCCCGCTCCCCTCCGCCGCCTCTGTCGAGCAGGAGGCGGCGGTGCGTCCGAGGAAGAGGCGCGGGTCGGGCCAGGAAAACCCCTCCCCCCAGTCCACGCGTCCCCCCCTCGCGCCGGCAGGGGCCAAGAGGGCGGCGACGCACCCCCCCTCCGACTCAGGGCCGGGGGGGCGCGGCCAGGGAGGGCCCGGGACCCCCCTGACGTCCTCGGCGGCCTCCGCCTCTTCCTCCTCCGCCTCTTCCTCCTCGGCCCCGACTCCCGCGGGGGCCACCTCTTCCGCCACCGGGGCCGCGTCCTCCTCCGCTTCCGCCTCCTCGGGCGGGGCCGTCGGTGCCCTGGGAGGGAGACAAGAGGAAACCTCCCTCGGCCCCCGCGCTGCTTCTGGGCCGCGGGGGCCGAGGAAGTGTGCCCGGAAGACGCGCCACGCGGAGACTTCCGGGGCCGTCCCCGCGGGCGGCCTCACGCGCTACCTGCCCATCTCGGGGGTCTCTAGCGTGGTCGCCCTGTCGCCTTACGTGAACAAGACGATCACGGGGGACTGCCTGCCCATCCTGGACATGGAGACGGGGAACATCGGGGCGTACGTGGTCCTGGTGGACCAGACGGGAAACATGGCGACCCGGCTGCGGGCCGCGGTCCCCGGCTGGAGCCGCCGCACCCTGCTCCCCGAGACCGCGGGTAACCACGTGACGCCCCCCGAGTACCCGACGGCCCCCGCGTCGGAGTGGAACAGCCTCTGGATGACCCCCGTGGGGAACATGCTGTTCGACCAGGGCACCCTAGTGGGCGCCCTGGACTTCCGCAGCCTGCGGTCTCGGCACCCGTGGTCCGGGGAGCAGGGGGC
【０１３３】
配列番号７
MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK
【０１３４】
配列番号８
DVLMTQTPLFLPVSLGDQASIFCRSSQNIVHINGNTYLEWYLQKPGQFPKLLMYKVSNRFFGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSDVQVQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGSSITSDFAWEWIRQFPGNKLECMGYIGYSGGTIYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARWHGSSHWYFDVWGAGTTVTVSS
【０１３５】
配列番号１７
CTACTCGTCCCAGAATTTGGCCAGGACGTCCTTGTAGAACGCGGGTGGGGGGGCCTGGGTCCGCAGCTGCTCCAGAAACCTGTCGGCGATATCAGGGGCCGTGATATGCCGGGTCACAATAGATCGCGCCAGGTTTTCGTCGCGGATGTCCTGGTAGATAGGCAGGCGTTTCAGAAGAGTCCACGGCCCCCGCTCCTTGGGGCCGATAAGCGATATGACGTACTTAATGTAGCGGTGTTCCACCAGCTCGGTGATGGTCATGGGATCGGGGAGCCAGTCCAGGGACTCTGGGGCGTCGTGGATGACGTGGCGTCGCCGGCTGGCCACATAACTGCGGTGCTCTTCCAGCAGCTGCGCGTTCGGGACCTGGACGAGCTCGGGCGGGGTGAGTATCTCCGAGGAGGACGACCTGGGGCCGGGGTGGCCCCCGGTAACGTCCCGGGGATCCAGGGGGAGGTCCTCGTCGTCTTCGTATCCGCCGGCGATCTGTTGGGTTAGAATTTCGGTCCACGAGACGCGCATCTCGGTGCCGCCGGCGGCCGGCGGCAAAGGGGGCCTGGTTTCCGTGGAGCGCGAGCTGGTGTGTTCCCGGCGGATGGCCCGCCGGGTCTGAGAGCGACTCGGGGGGGTCCAGTGACATTCGCGCAGCACATCCTCCACGGAGGCGTAGGTGTTATTGGGATGGAGGTCGGTGTGGCAGCGGACAAAGAGGGCCAGGAACTGGGGGTAGCTCATCTTAAAGTACTTTAGTATATCGCGACAGTTGATCGTGGGAATGTAGCAGGCGCTAATATCCAACACAATATCACAGCCCATCAACAGGAGGTCAGTGTCTGTGGTGTACACGTACGCGACCGTGTTGGTGTGATAGAGGTTGGCGCAGGCATCGTCCGCCTCCAGCTGACCCGAGTTAATGTAGGCGTACCCCAGGGCCCGGAGAACGCGAATACAGAACAGATGCGCCAGACGCAGGGCCGGCTTCGAGGGCGCGGCGGACGGCAGCGCGGCTCCGGACCCGGCCGTCCCCCGGGTCCCCGAGGCCAGAGAGGTGCCGCGCCGGCGCATGTTGGAAAAGGCAGAGCTGGGTCTGGAGTCGGTGATGGGGGAAGGCGGTGGAGAGGCGTCCACGTCACTGGCCTCCTCGTCCGTCCGGCATTGGGCCGTCGTGCGGGCCAGGATGGCCTTGGCTCCAAACACAACCGGCTCCATACAATTGACCCCGCGATCGGTAACGAAGATGGGGAAAAGGGACTTTTGGGTAAACACCTTTAATAAGCGACAGAGGCAGTGTAGCGTAATGGCCTCGCGGTCGTAACTGGGGTATCGGCGCTGATATTTGACCACCAACGTGTACATGACGTTCCACAGGTCCACGGCGATGGGGGTGAAGTACCCGGCCGGGGCCCCAAGGCCCTGGCGCTTGACCAGATGGTGTGTGTGGGCAAACTTCATCATCCCGAACAAACCCAT
【０１３６】
配列番号１８
ATGCTCCGCAACGACAGCCACCGGGCCGCGTCCCCGGAGGACGGCCAGGGACGGGTCGACGACGGACGGCCACACCTCGCGTGCGTGGGGGCCCTGGCGCGGGGGTTCATGCATATCTGGCTTCAGGCCGCCACGCTGGGTTTTGCGGGATCGGTCGTTATGTCGCGCGGGCCGTACGCGAATGCCGCGTCTGGGGCGTTCGCCGTCGGGTGCGCCGTGCTGGGCTTTATGCGCGCACCCCCTCCCCTCGCGCGGCCCACCGCGCGGATATACGCCTGGCTCAAACTGGCGGCCGGTGGAGCGGCCCTTGTTCTGTGGAGTCTCGGGGAGCCCGGAACGCAGCCGGGGGCCCCGGGCCCGGCCACCCAGTGCCTGGCGCTGGGCGCCGCCTATGCGGCGCTCCTGGTGCTCGCCGATGACGTCTATCCGCTCTTTCTCCTCGCCCCGGGGCCCCTGTTCGTCGGCACCCTGGGGATGGTCGTCGGCGGGCTGACGATCGGAGGCAGCGCGCGCTACTGGTGGATCGGTGGGCCCGCCGCGGCCGCCTTGGCCGCGGCGGTGTTGGCGGGCCCGGGGGCGACCACCGCCAGGGACTGCTTCTCCAGGGCGTGCCCCGACCACCGCCGCGTCTGCGTCATCGTCGCAGGCGAGTCTGTTTCCCGCCGCCCCCCGGAGGACCCAGAGCGACCCGGGGACCCCGGGCCACCGTCCCCCCCGACACCCCAACGATCCCAGGGGCCGCCGGCCGATGAGGTCGCACCGGCCGGGGTAGCGCGGCCCGAAAACGTCTGGGTGCCCGTGGTCACCTTTCTGGGGGCGGGCGCGCTCGCCGTCAAGACGGTGCGAGAACATGCCCGGGAAACGCCGGGCCCGGGCCTGCCGCTGTGGCCCCAGGTGTTTCTCGGAGGCCATGTGGCGGTGGCCCTGACGGAGCTGTGTCAGGCGCTTATGCCCTGGGACCTTACGGACCCGCTGCTGTTTGTTCACGCCGGACTGCAGGTCATCAACCTCGGGTTGGTGTTTCGGTTTTCCGAGGTTGTCGTGTATGCGGCGCTAGGGGGTGCCGTGTGGATTTCGTTGGCGCAGGTGCTGGGGCTCCGGCGTCGCCTGCACAGGAAGGACCCCGGGGACGGGGCCCGGTTGGCGGCGACGCTTCGGGGCCTCTTCTTCTCCGTGTACGCGCTGGGGTTTGGGGTGGGGGCGCTGCTGTGCCCTCCGGGGTCAACGGGCGGGTGGTCGGGCGATTGA
【０１３７】
配列番号１９
CTACCCACCGTACTCGTCAATTCCAAGGGCATCGGTAAACATCTGCTCAAACTCGAAGTCGGCCATATCCAGAGCGCCGTAGGGGGCGGAGTCGTGGGGGGTAAATCCCGGACCCGGGGAATCCCCGTCCCCCAACATGTCCAGATCGAAATCGTCTAGCGCGTCGGCATGCGCCATCGCCACGTCCTCGCCGTCTAAGTGGAGCTCGTCCCCCAGGCTGACATCGGTCGGGGGGGCCGTCGACAGTCTGCGCGTGTGTCCCGCGGGGAGAAAGGACAGGCGCGGAGCCGCCAGCCCCGCCTCTTCGGGGGCGTCGTCGTCCGGGAGATCGAGCAGGCCCTCGATGGTAGACCCGTAATTGTTTTTCGTACGCGCGCGGCTGTACGCGTGTTCCCGCATGACCGCCTCGGAGGGCGAGGTCGTGAAGCTGGAATACGAGTCCAACTTCGCCCGAATCAACACCATAAAGTACCCAGAGGCGCGGGCCTGGTTGCCATGCAGGGTGGGAGGGGTCGTCAACGGCGCCCCTGGCTCCTCCGTAGCCGCGCTGCGCACCAGCGGGAGGTTAAGGTGCTCGCGAATGTGGTTTAGCTCCCGCAGCCGGCGGGCCTCGATTGGCACTCCCCGGACGGTGAGCGCTCCGTTGACGAACATGAAGGGCTGGAACAGACCCGCCAACTGACGCCAGCTCTCCAGGTCGCAACAGAGGCAGTCAAACAGGTCGGGCCGCATCATCTGCTCGGCGTACGCGGCCCATAGGATCTCGCGGGTCAAAAATAGATACAAATGCAAAAACAGAACACGCGCCAGACGAGCGGTCTCTCGGTAGTACCTGTCCGCGATCGTGGCGCGCAGCATTTCTCCCAGGTCGCGATCGCGTCCGCGCATGTGCGCCTGGCGGTGCAGCTGCCGGACGCTGGCGCGCAGGTACCGGTACAGGGCCGAGCAGAAGTTGGCCAACACGGTTCGATAGCTCTCCTCCCGCGCCCGTAGCTCGGCGTGGAAGAAACGAGAGAGCGCTTCGTAGTAGAGCCCGAGGCCGTCGCGGGTGGCCGGAAGCGTCGGGAAGGCCACGTCGCCGTGGGCGCGAATGTCGATTTGGGCGCGTTCGGGGACGTACGCGTCCCCCCATTCCACCACATCGCTGGGCAGCGTTGATAGGAATTTACACTCCCGGTACAGGTCGGCGTTGGTCGGTAACGCCGAAAACAAATCCTCGTTCCAGGTATCGAGCATGGTACATAGCGCGGGGCCCGCGCTAAAGCCCAAGTCGTCGAGGAGACGGTTAAAGAGGGCGGCGGGGGGGACGGGCATGGGCGGGGAGGGCATGAGCTGGGCCTGGCTCAGGCGCCCCGTTGCGTACAGCGGAGGGGCCGCCGGGGTGTTTTTGGGACCCCCGGCCGGGCGGGGGGGTGGTGGCGAAGCGCCGTCCGCGTCCATGTCGGCAAACAGCTCGTCGACCAAGAGGTCCAT
【０１３８】
配列番号２０
ATGACAGCGACCCCCCTCACCAACCTGTTCTTACGGGCCCCGGACATAACCCACGTGGCCCCCCCTTACTGCCTCAACGCCACCTGGCAGGCCGAAACGGCCATGCACACCAGCAAAACGGACTCCGCTTGCGTGGCCGTGCGGAGTTACCTGGTCCGCGCCTCCTGTGAGACCAGCGGCACAATCCACTGCTTTTTCTTTGCGGTATACAAGGACACCCACCATACCCCTCCGCTGATTACCGAGCTCCGCAACTTTGCGGACCTGGTTAACCACCCGCCGGTCCTACGCGAACTGGAGGATAAGCGCGGGGTGCGGCTGCGGTGTGCGCGGCCGTTTAGCGTCGGGACGATTAAGGACGTCTCTGGGTCCGGCGCGTCCTCGGCGGGAGAGTACACGATAAACGGGATCGTGTACCACTGCCACTGTCGGTATCCGTTCTCAAAAACATGCTGGATGGGGGCCTCCGCGGCCCTACAGCACCTGCGCTCCATCAGCTCCAGCGGCATGGCCGCCCGCGCGGCAGAGCATCGACGCGTCAAGATTAAAATTAAGGCGTGA
【０１３９】
配列番号２１
CTACAGGGTGGTAACCGGATAGCAGATGTGAGGAAGTCTGGGCCGTTCGCCGCGAACGGCGATCAGAGGGTCCGTTTCTTGCGGACCACGGCCCGGTGATGTGGGTTGCTCGTCTAAAATCTCGGGCATACCCATACACGCACAACACGGACGCCGCACCGAATGGGACGTCGTAAGGGGGTGGGAGGTAGCTGGGTGGGGTTTGTGCAGAGCAATCAGGGACCGCAGCCAGCGCATACAATCGCGCTCCCGTCCGTTGGTCCCGGGCAGGACCACGCCGTACTGGTATTCGTACCGGCTGAGCAGGGTCTCCAGGGGGTGGTTGGGTGCCGCGGGGAACGGGGTCCACGCCACGGTCCACTCGGGCAAAAACCGAGTCGGCACGGCCCACGGTTCTCCCACCCACGCGTCTGGGGTCTTGATGGCGATAAATCTTACCCCGAGCCGGATTTTTTGGGCGTATTCGAGAAACGGCACACACAGATCCGCCGCGCCTACCACCCACAAGTGGTAGAGGCGAGGGGGGCTGGGTTGGTCTCGGTGCAACAGTCGGAAGCACGCCACGGCGTCCACGACCTCGGTGCTCTCCAAGGGGCTGTCCTCCGCAAACAGGCCCGTGGTGGTGTTTGGGGGGCAGCGACAGGACCTAGTGCGCACGATCGGGCGGGTGGGTTTGGGTAAGTCCATCAGCGGCTCGGCCAACCGTCGAAGGTTGGCCGGGCGAACGACGACCGGGGTACCCAGGGGTTCTGATGCCAAAATGCGGCACTGCCTAAGCAGGAAGCTCCACAGGGCCGGGCTTGCGTCGACGGAAGTCCGGGGCAGGGCGTTGTTCTGGTCAAGGAGGGTCATTACGTTGACGACAACAACGCCCAT
【０１４０】
配列番号２２
CCCGGGACCCCCCTGACGTCCTCGGCGGCCTCCGCCTCTTCCTCCTCCGCCTCTTCCTCCTCGGCCCCGACTCCCGCGGGGGCCACCTCTTCCGCCACCGGGGCCGCGTCCTCCTCCGCTTCCGCCTCCTCGGGCGGGGCCGTCGGTGCCCTGGGAGGGAGACAAGAGGAAACCTCCCTCGGCCCCCGCGCTGCTTCTGGGCCGCGGGGGCCGAGGAAGTGTGCCCGGAAGACGCGCCACGCGGAGACTTCCGGGGCCGTCCCCGCGGGCGGCCTCACGCGCTACCTGCCCATCTCGGGGGTCTCTAGCGTGGTCGCCCTGTCGCCTTACGTGAACAAGACGATCACGGGGGACTGCCTGCCCATCCTGGACATGGAGACGGGGAACATCGGGGCGTACGTGGTCCTGGTGGACCAGACGGGAAACATGGCGACCCGGCTGCGGGCCGCGGTCCCCGGCTGGAGCCGCCGCACCCTGCTCCCCGAGACCGCGGGTAACCACGTGACGCCCCCCGAGTACCCGACGGCCCCCGCGTCGGAGTGGAACAGCCTCTGGATGACCCCCGTGGGGAACATGCTGTTCGACCAGGGCACCCTAGTGGGCGCCCTGGACTTCCGCAGCCTGCGGTCTCGGCACCCGTGGTCCGGGGAGCAGGGGGCGTCGACCCGGGACGAGGGAAAACAATAAGGGACGCCCCCGTGTTTGTGGGGAGGGGGGGGTCGGGCGCTGGGTGGTCTCTGGCCGCGCCCACTACACCAGCCAATCCGTGTCGGGGAGGTGGAAAGTGAAAGACACGGGCACCACACACCAGCGGGTCTTTTGTGTTGGCCCTAATAAAAAAAACTCAGGGGATTTTTGCTGTCTGTTGGGAAATAAAGGTTTACTTTTGTATCTTTTCCCTGTCTGTGTTGGATGTATCGCGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCGTGGGAGTGGGGGTGCCATGTTGGGCAGGCTCTGGTGTTAACCACAGAGCCGCGGCCCGGGCTGCCTGACCACCGATCCCCGAAAGCATCCTGCCACTGGCATGGAGCCAGAACCACAGTGGGTTGGGTGTGGGTGTTAAGTTTCCGCGAGCGCCTGCCCGCCCGGACTGACCTGGCCTCTGGCCGCCACAAAGGGCGGGGGGGGGGGTTAACTACACTATAGGGCAACAAAGGATGGGAGGGGTAGCGGGGCGGGACGGGGCGCCCAAAAGGGGGTCGGCCACACCACAGACGTGGGTGTTGGGGGGTGGGGCGGAGGGGTGGGGGGGGAGACAGAAACAGGAACATAGTTAGAAAACAAGAATGCGGTGCAGCCAGAGAATCACAGGAGACGAGGGGATGGGCGTGTTGGTTACCAACCCACACCCAGGCATGCTCGGTGGTATGAAGGAGGGGGGGCGGTGTTTCTTAGAGACCGCCGGGGGACGTGGGGTTGGTGTGCAAAGGCACGCGCACCCGCGCCGGCCAGGTGGGCCGGTACCCCATCCCCCCCTCCCCCGACCCTTCCCACCCCCGCGTGCCAGAGATCACCCCGGTCCCCCGGCACCCGCCACTCCTCCATATCCTCGCTTTAGGAACAACTTTAGGGGGGGGTACACACGCGCCGTGCATTTCCTTCCACACCCCCCCCCTCCCCCGCACTCCCCCCCCCCAGGCAGTAAGACCCAAGCATAGAGAGCCAGGCACAAAAACACAGGCGGGGTGGGACACATGCCTTCTTGGAGTACGTGGGTCATTGGCGTGGGGGGTTACAGCGACACCGGCCGACCCCCTGGCGGTCTTCCAGCCGGCCCTTAGATAAGGGGGCAGTTGGTGGTCGGACGGGTAAGTAACAGAGTCTAACTAAGGGTGGGAGGGGGGGAAAATAACGGGCTGGTGTGCTGTAACACGAGCCCACCCGCGAGTGGCGTGGCCGACCTTAGCCTCTGGGGCGCCCCCTGTCGTTTGGGTCCCCCCCCCTCTATTGGGGAGAAGCAGGTGTCTAACCTACCTGGAAACGCGGCGTCTTTGTTGAACGACACCGGGGCGCCCTCGACGAGTGGGATAACGGGGGAGGAAGGGAGGGAGGAGGGTACTGGGGGTGAAGGGGGGGGGGGAGAAGCGAGAACAGGAAAGGCGACGGAGCCCGGCAGAACACCGAGGAAAAAAAAACCACAGCGCATGC
【０１４１】
配列番号２３
CCATGTTGGGCAGGCTCTGGTGTTAACCACAGAGCCGCGGCCCGGGCTGCCTGACCACCGATCCCCGAAAGCATCCTGCCACTGGCATGGAGCCAGAACCACAGTGGGTTGGGTGTGGGTGTTAAGTTTCCGCGAGCGCCTGCCCGCCCGGACTGACCTGGCCTCTGGCCGCCACAAAGGGCGGGGGGGGGGGTTAACTACACTATAGGGCAACAAAGGATGGGAGGGGTAGCGGGGCGGGACGGGGCGCCCAAAAGGGGGTCGGCCACACCACAGACGTGGGTGTTGGGGGGTGGGGCGGAGGGGTGGGGGGGGAGACAGAAACAGGAACATAGTTAGAAAACAAGAATGCGGTGCAGCCAGAGAATCACAGGAGACGAGGGGATGGGCGTGTTGGTTACCAACCCACACCCAGGCATGCTCGGTGGTATGAAGGAGGGGGGGCGGTGTTTCTTAGAGACCGCCGGGGGACGTGGGGTTGGTGTGCAAAGGCACGCGCACCCGCGCCGGCCAGGTGGGCCGGTACCCCATCCCCCCCTCCCCCGACCCTTCCCACCCCCGCGTGCCAGAGATCACCCCGGTCCCCCGGCACCCGCCACTCCTCCATATCCTCGCTTTAGGAACAACTTTAGGGGGGGGTACACACGCGCCGTGCATTTCCTTCCACACCCCCCCCCTCCCCCGCACTCCCCCCCCCCAGGCAGTAAGACCCAAGCATAGAGAGCCAGGCACAAAAACACAGGCGGGGTGGGACACATGCCTTCTTGGAGTACGTGGGTCATTGGCGTGGGGGGTTACAGCGACACCGGCCGACCCCCTGGCGGTCTTCCAGCCGGCCCTTAGATAAGGGGGCAGTTGGTGGTCGGACGGGTAAGTAACAGAGTCTAACTAAGGGTGGGAGGGGGGGAAAATAACGGGCTGGTGTGCTGTAACACGAGCCCACCCGCGAGTGGCGTGGCCGACCTTAGCCTCTGGGGCGCCCCCTGTCGTTTGGGTCCCCCCCCCTCTATTGGGGAGAAGCAGGTGTCTAACCTACCTGGAAACGCGGCGTCTTTGTTGAACGACACCGGGGCGCCCTCGACGAGTGGGATAACGGGGGAGGAAGGGAGGGAGGAGGGTACTGGGGGTGAAGGGGGGGGGGGAGAAGCGAGAACAGGAAAGGCGACGGAGCCCGGCAGAACACCGAGGAAAAAAAAACCACAGCGCATGCGCCGGGCCGTTGTGGGGCCCCGGGCCGGGGCCCCTTGGGTCCGCCGGGGCCCCGGGCCGGGCCGCCACGGGGGCCGGCCGTTGGCGGTAACCCCGAGTGTTCATCTCAGGCCCCGGGCCGGGAACCCGGAAAAGCCTCCGGGGGGCCTTTTTCGCGTCGCGTGCCGGCGAGCGGGTCCGGACGGGGCCCGGACCGCCGCGGTCGGGGGCCCCTCGTCCCGGGCCGTACGCGGCCTTCGCCCCGTGAGGGGACAGACGAACGAAACATTCCGGCGACGGAACGAAAAACACCCCAGACGGGTTAAAGAAACAGAAACCGCAACCCCCACCACCCCCGAAACGGGGAAAACGAAAAAACAGACCAGCGGCCGGCCGGCGCTTAGGGGGAGGATGTCGCCGACGCCCCTTGGCCGCCCCGGCTGCA
【０１４２】
本発明の実施形態を、添付の図面及び実施例を参照して以下に詳細に記載する。当業者は、以下の図面及び実施例が本発明の実例であるにすぎず、本発明の範囲を限定することを意図するものではないと十分に理解するであろう。本発明の様々な目的及び有利な態様は、以下の図面及び好ましい実施形態の詳細な記載により、当業者に明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１Ａ】組み換えウイルスＯＶＮの構築戦略を示す図である。
【図１Ｂ】組み換えウイルスＯＶＨの構築戦略を示す図である。
【図２】組み換えウイルスＨＳＶ１７１６、ＮＶ１０２０、Ｇ２０７、ＯｎｃｏＶｅｘＧＭ−ＣＳＦ（Ｔ−ＶＥＣ）及びＯＶＮに含まれるゲノム修飾の概略図であり、図中、記号「×」は欠失を示す。
【図３】ウイルス株ＫＯＳと比較した、組み換えウイルスＯＶＮ、ＯＶＨ及びｄＩＣＰ０に含まれるゲノム修飾の概略図であり、図中、記号「×」は欠失を示す。
【図４】テンプレートとしてウイルス株ＫＯＳ、ＯＶＮ、ＯＶＨ又はｄＩＣＰ０のゲノム、及びＩＣＰ０遺伝子、ＩＣＰ３４．５遺伝子、ＩＣＰ２７遺伝子又はｈＴＥＲＴコアプロモーターを特異的に増幅することができるプライマーを使用するＰＣＲによって得られた生成物のゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図５】ＫＯＳ、ＯＶＮ、ＯＶＨ又はｄＩＣＰ０のＩＥ遺伝子発現（ｍＲＮＡ）のリアルタイム定量的ＰＣＲ分析の結果を示す図である。
【図６】感染多重度１（すなわちＭＯＩ＝１）のウイルスＫＯＳ、ＯＶＮ、ＯＶＨ又はｄＩＣＰ０による４８時間のＬ−Ｏ２細胞（図６Ａ）又はＵ−２  ＯＳ細胞（図６Ｂ）の感染後のウイルス力価を示す図である。
【図７】ＭＯＩが０．０１のウイルスＫＯＳ、ＯＶＮ、ＯＶＨ又はｄＩＣＰ０による単層Ｕ−２  ＯＳ細胞の感染後の種々の時間点（感染から１２時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、及び６０時間後）のウイルス力価を示す図である。図７の結果は、ウイルスＫＯＳ、ＯＶＮ、ＯＶＨ又はｄＩＣＰ０が腫瘍細胞（例えばＵ−２  ＯＳ細胞）において、実質的に同等の複製能を有していることを示す。
【図８】ＭＯＩが１のウイルスＫＯＳ、ＯＶＮ、ＯＶＨ又はｄＩＣＰ０による７２時間のＬ−Ｏ２細胞（図８Ａ）又はＵ−２  ＯＳ細胞（図８Ｂ）の感染後の細胞生存率を示す図であり、図中、モック（MOCK）はウイルスに感染していない細胞を表す。図８の結果は、ウイルスＫＯＳ、ＯＶＮ、ＯＶＨ及びｄＩＣＰ０が腫瘍細胞（例えばＵ−２  ＯＳ細胞）において実質的に同等の細胞殺傷能を有するが、ウイルスＯＶＮ及びＯＶＨは正常細胞（例えばＬ−Ｏ２細胞）においてウイルスＫＯＳ及びｄＩＣＰ０より顕著に低い細胞殺傷能を有することを示す。
【図９】４８時間のウイルスＯＶＮ又はＯＶＨによる様々な腫瘍細胞の感染後の細胞生存率を示す図であり、図中、モックはウイルスに感染していない腫瘍細胞を表す。図９の実験結果は、組み換えウイルスＯＶＮ及びＯＶＨが様々な腫瘍細胞を顕著に殺傷し得ることを示す。
【図１０】所与の用量のウイルスＫＯＳ、ｄＩＣＰ０、ＯＶＮ又はＯＶＨの頭蓋内注射後のマウスの生存率を示す図であり、図中、ビヒクルはウイルスが注射されていないマウスを表す。
【図１１】ＯＶＮ又はＯＶＨによる治療後にＨｕｈ７細胞が接種されたヌードマウスの腫瘍体積−時間曲線（図１１Ａ）及び生存率−時間曲線（図１１Ｂ）を示す図であり、図中、ＤＭＥＭは治療していないマウスを表す。
【図１２】ＯＶＮ又はＯＶＨによる治療後にＨｅｐａ１−６細胞が接種されたマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の左脇腹の腫瘍（図１２Ａ）及び右脇腹の腫瘍（図１２Ｂ）の腫瘍体積−時間曲線を示す図であり、図中、ＤＭＥＭは治療していないマウスを表す。
【図１３】組み換えウイルスＯＶＨ、ＯＶＨ１及びＯＶＨ２と、組み換えウイルスＯＶＮとの間のゲノム構造の違いを示す概略図であり、組み換えウイルスＯＶＮと比較して、組み換えウイルスＯＶＨのＩＣＰ２７遺伝子の本来のプロモーター配列、組み換えウイルスＯＶＨ１のＶＰ５遺伝子の本来のプロモーター配列、組み換えウイルスＯＶＨ２のＩＣＰ４遺伝子の本来のプロモーター配列は、それぞれ、ｈＴＥＲＴコアプロモーター配列で置換されていた。
【図１４】組み換えウイルスｄ３４．５／０ｌａｃＺ、ＯＶＮ、ＯＶＮ−ＧＦＰ、ＯＶＮ−ＰＤ−１−ｓｃｆｖ、ＯＶＨ−ＧＦＰ及びＯＶＨ−ＰＤ−１−ｓｃｆｖの間のゲノム構造の違いの概略図であり、図中、「ヌル（NULL）」は欠失を表す。
【図１５】組み換えウイルスＯＶＮ−ＧＦＰ又はＯＶＨ−ＧＦＰに感染したＵ−２  ＯＳ細胞の蛍光顕微鏡観察の結果を示す図である。
【図１６】２４時間又は４８時間の組み換えウイルスＯＶＨ又はＯＶＨ−ＰＤ−１−ｓｃｆｖによるＵ−２  ＯＳ細胞の感染後に、細胞上清が、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の特異的結合を阻害する能力（図１６Ａ）、並びに細胞上清とＰＤ−１タンパク質との間の相互作用の分析結果（図１６Ｂ）を示す図であり、図中、モックはウイルスに感染していない腫瘍細胞を表す。
【図１７】ＯＶＨ又はＯＶＨ−ＰＤ−１−ｓｃｆｖによる治療後のＨｅｐａ１−６細胞が接種されたマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の左脇腹の腫瘍（図１７Ａ）及び右脇腹の腫瘍（図１７Ｂ）の腫瘍体積−時間曲線を示す図であり、図中、ビヒクルは治療していないマウスを表す。
【図１８】それぞれ、ＭＯＩが０．０１のウイルスＯＶＮ、ＯＶＮ−ｄＵＬ４１、ＯＶＮ−ｄＵＬ４３、ＯＶＮ−ｄＵＬ４８、ＯＶＮ−ｄＵＬ５５、ＯＶＮ−ｄＵＳ２、ＯＶＮ−ｄＬＡＴ又はＯＶＮ−ｄＮＦによる６０時間に亘るＵ−２  ＯＳ細胞の感染後のウイルス力価を示す図である。
【図１９】それぞれ、ＭＯＩが０．５のウイルスＯＶＮ、ＯＶＮ−ｄＵＬ４１、ＯＶＮ−ｄＵＬ４３、ＯＶＮ−ｄＵＬ４８、ＯＶＮ−ｄＵＬ５５、ＯＶＮ−ｄＵＳ２、ＯＶＮ−ｄＬＡＴ又はＯＶＮ−ｄＮＦによる７２時間の正常細胞（Ｌ−Ｏ２細胞、図１９Ａ）、又は腫瘍細胞（Ｕ−２  ＯＳ細胞、図１９Ｂ）の感染後の細胞生存率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１４４】
本発明を説明することを意図するが、限定することを意図しない以下の実施例を参照して、本発明を記載する。
【０１４５】
別段の指定がない限り、本出願で使用される分子生物学の実験方法、ウイルス学の実験方法、イムノアッセイ、及び動物学の実験方法はいずれも、当業者によって従来使用される実験方法である。例えば、分子生物学の実験方法は、J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989、及びF. M. Ausubel et al., Guide to Molecular Biology Experiments, 3rd edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995に記載される方法であってもよい。各実施例で使用される試薬（例えば、酵素、プラスミド、及びプライマー）を商事会社から購入し、製造業者によって推奨される条件に従って様々な試薬（例えば、酵素）を使用した。当業者らは、実施例が本発明を説明するものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを理解するであろう。
【実施例】
【０１４６】
実施例１．組み換えウイルスＯＶＮ及びＯＶＨの構築
（１．１）単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）の培養及び力価決定
野生型ＨＳＶ−１株ＫＯＳはＡＴＣＣ（カタログ番号ＶＲ−１４９３（商標））から購入され、その全ゲノム情報はＮＣＢＩ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＱ６７３４８０．１）に公開されている。培養ベロ細胞（米国のＡＴＣＣから購入、カタログ番号ＣＣＬ−８１（商標））をＭＯＩが０．１の株ＫＯＳで感染させた。４８時間後、全ての細胞を細胞スクレーパーによって収集し、遠心分離を行って細胞培養培地を除去した。得られた細胞沈殿物を新鮮な完全培地に再懸濁し、−８０℃で保管した。その後、細胞懸濁液の凍結融解を繰り返し（３回）、次いで遠心分離を行い、上清を収集してウイルス溶液を得た。ウイルス溶液を等分して−８０℃で保管した。
【０１４７】
Ｕ−２  ＯＳ細胞（米国のＡＴＣＣから購入、カタログ番号ＨＴＢ−９６（商標））を１×１０６細胞の密度で６ｃｍの培養プレートに蒔いた。細胞が単層へと増殖した後、上で得られたウイルス溶液の１０倍段階希釈を行い、次いで細胞を種々の希釈勾配のウイルス溶液（５００μｌ）でそれぞれ感染させた。感染の７５分後、細胞培養培地を廃棄し、新鮮な完全培地５ｍＬを添加して、細胞を更に培養した。２時間後、メチルセルロース培地１０ｍＬを添加し、プレートを２日間インキュベーターに入れた。その後、０．０１％ニュートラルレッドを含む基本培地をプレートに添加し、１２時間に亘りインキュベーションを継続した。培養の完了後、全ての細胞培養培地を廃棄し、それぞれの培養プレートのプラークを数えた。各培養プレートのプラークの数及びウイルス溶液の希釈係数に従い、ウイルス力価を次の式により計算した：ウイルス力価（ＰＦＵ／ｍＬ）＝１プレート当たりのプラークの数×２×ウイルス希釈係数。
【０１４８】
（１．２）組み換えプラスミドの構築
野生型ＨＳＶ−１ウイルスゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＱ６７３４８０．１）の３３番目の塩基（ｎｔ３３）〜５８７６番目の塩基（ｎｔ５８７６）の配列（配列番号１）を、制限酵素ＳａｃＩ及びＰｓｔＩを使用して、商業的に入手可能なＰＵＣ５７ベクター（Shanghai Shenggong）にクローニングすることにより、プラスミドＰＵＣ５７−Ｆ０を得た。その後、プラスミドＰＵＣ５７−Ｆ０中のＮｃｏＩ切断部位とＳａｌＩ切断部位との間の配列を、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩ及びＳａｌＩを使用して、ＬａｃＺの遺伝子配列（配列番号２）で置換することにより、プラスミドＰＵＣ５７−ｄ３４．５／０ｌａｃＺを得た。またさらに、プラスミドＰＵＣ５７−Ｆ０中のＮｃｏＩ切断部位とＳａｌＩ切断部位との間の配列を切り取ることにより、プラスミドＰＵＣ５７−ｄ３４．５／０を得た。
【０１４９】
（１．３）組み換えウイルスＯＶＮ及びＯＶＨの構築及び同定
組み換えウイルスＯＶＮ及びＯＶＨの構築戦略を図１Ａ及び図１Ｂにそれぞれ示す。
【０１５０】
（１．３．１）組み換えウイルスｄ３４．５／０ｌａｃＺの構築
Ｕ−２  ＯＳ細胞を１ウェル当たり１×１０５細胞の密度で２４ウェルプレートに蒔き、細胞培養インキュベーターにおいて３７℃にて一晩培養した。組み換えプラスミドＰＵＣ５７−ｄ３４．５／０ｌａｃＺをトランスフェクション試薬であるリポフェクタミン２０００を使用してＵ−２  ＯＳ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞をＭＯＩが３のウイルス株ＫＯＳで感染させた。細胞変性効果を観察した後、細胞を採取した。凍結融解法を繰り返すことにより採取した細胞を溶解させ、次いで遠心分離を行い、上清を収集してウイルス溶液を得た。得られたウイルス溶液のウイルス力価を測定した。
【０１５１】
採取されたウイルスを、単層のＵ−２  ＯＳ細胞を増殖させる培養プレートに接種した。２日間培養した後、０．０１％ニュートラルレッド及び１００μｇ／ｍＬのＸ−ｇａｌを含む基本培地を培養プレートに均一に添加し、細胞を更に１２時間培養した。その後、培養プレートに出現する青色プラークを選択し、その青色プラークから得られたウイルスをモノクローナル化（monoclonalized）（３回）して、組み換えウイルスｄ３４．５／０ｌａｃＺを得た。シーケンシングによって検証すると、株ＫＯＳと比較して、組み換えウイルスｄ３４．５／０ｌａｃＺゲノム中のＩＣＰ３４．５及びＩＣＰ０の遺伝子の２つのコピーは、ｌａｃＺ遺伝子で置換されていたことがわかった。
【０１５２】
（１．３．２）組み換えウイルスＯＶＮ（ｄ３４．５／０）の構築
１ウェル当たり１×１０５細胞の密度で２４ウェルプレートにＵ−２  ＯＳ細胞を蒔き、細胞培養インキュベーターにおいて３７℃にて一晩培養した。組み換えプラスミドＰＵＣ５７−ｄ３４．５／０を、トランスフェクション試薬であるリポフェクタミン２０００を使用してＵ−２  ＯＳ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞をＭＯＩが３の組み換えウイルスｄ３４．５／０ｌａｃＺで感染させた。細胞変性効果を観察した後、細胞を採取した。凍結融解法を繰り返すことにより採取した細胞を溶解させ、次いで遠心分離を行い、上清を収集してウイルス溶液を得た。得られたウイルス溶液のウイルス力価を測定した。
【０１５３】
単層のＵ−２  ＯＳ細胞を増殖させる培養プレートに採取したウイルスを蒔いた。２日間培養した後、０．０１％ニュートラルレッド及び１００μｇ／ｍＬのＸ−ｇａｌを含む基本培地を培養プレートに均一に添加し、細胞を更に１２時間培養した。その後、培養プレートに出現する白色プラークを選択し、その白色プラークから得られたウイルスをモノクローナル化（３回）して組み換えウイルスＯＶＮ（ｄ３４．５／０）を得た。シーケンシングによって検証すると、組み換えウイルスｄ３４．５／０ｌａｃＺと比較して、ｌａｃＺ遺伝子の２つのコピーが組み換えウイルスＯＶＮ（ｄ３４．５／０）ゲノムにおいて欠失され、株ＫＯＳと比較して、野生型ＨＳＶ−１ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＱ６７３４８０．１）のｎｔ５１０〜ｎｔ５４３９の配列（配列番号６）、及びｎｔ１２０８０２〜ｎｔ１２５７３１の配列（配列番号６）が組み換えウイルスＯＶＮ（ｄ３４．５／０）において欠失されていた。
【０１５４】
（１．３．３）組み換えウイルスＯＶＨの構築
野生型ＨＳＶ−１ウイルスゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＱ６７３４８０．１）の塩基１１２８６１（ｎｔ１１２８６１）〜１１３４２２（ｎｔ１１３４２２）の配列（配列番号３）を制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩ及びＰｍｅＩを使用して商業的に入手可能なＰＵＣ５７ベクターにクローニングすることにより、プラスミドＰＵＣ５７−２７ｐ０を得た。その後、野生型ＨＳＶ−１ウイルスゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＱ６７３４８０．１）の塩基１１３５９０（ｎｔ１１３５９０）〜塩基１１５１９４（ｎｔ１１５１９４）の配列（配列番号４）を制限酵素ＳｐｅＩ及びＰｓｔＩを使用してプラスミドＰＵＣ５７−２７ｐ０にクローニングすることにより、プラスミドＰＵＣ５７−２７ｐ１を得た。プラスミドＰＵＣ５７−２７ｐ１において、ＩＣＰ２７遺伝子の本来のプロモーター配列（野生型ＨＳＶ−１ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＱ６７３４８０．１）のｎｔ１１３４２２〜ｎｔ１１３５９０）は欠失されていた。
【０１５５】
その後、プラスミドＰＵＣ５７−２７ｐ１中のＰｍｅＩ切断部位とＳｐｅＩ切断部位との間の配列を、ＬａｃＺ発現配列（配列番号２）で置換することにより、プラスミドＰＵＣ５７−２７ｐ／ｌａｃＺを得た。さらに、プラスミドＰＵＣ５７−２７ｐ１中のＰｍｅＩ切断部位とＳｐｅＩ切断部位との間の配列を、成人テロメラーゼ逆転写酵素ｈＴＥＲＴのコアプロモーター配列（配列番号５、Takakura M, Kyo S, Kanaya T, et al. Cloning of human telomerase catalytic subunit (hTERT) gene promoter and identification of proximal core promoter sequences essential for transcriptional activation in immortalized and cancer cells [J]. Cancer Res, 1999, 59 (3): 551-557を参照されたい）に代えることにより、プラスミドＰＵＣ５７−２７ｐ／ｈｔｅｒｔを得た。プラスミドＰＵＣ５７−２７ｐ／ｈｔｅｒｔにおいて、ＩＣＰ２７遺伝子は、腫瘍特異的プロモーター（すなわち、ｈＴＥＲＴコアプロモーター）によって調節された。
【０１５６】
その後、（１．３．１）及び（１．３．２）に記載される構築方法を参照して、組み換えウイルスＯＶＮを出発ウイルスとして使用し、ＩＣＰ２７遺伝子を調節するため、プラスミドＰＵＣ５７−２７ｐ／ｌａｃＺ及びＰＵＣ５７−２７ｐ／ｈｔｅｒｔを使用してｈＴＥＲＴコアプロモーター配列を組み換えウイルスＯＶＮゲノムへと導入することにより、組み換えウイルスＯＶＨを構築した。シーケンシングによって検証すると、組み換えウイルスＯＶＮと比較して、ＩＣＰ２７遺伝子の本来のプロモーター配列（野生型ＨＳＶ−１ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＱ６７３４８０．１）のｎｔ１１３４２３〜ｎｔ１１３５８９）が組み換えウイルスＯＶＨゲノム中のｈＴＥＲＴコアプロモーター（配列番号５）によって置換されていた。
【０１５７】
（１．４）組み換えウイルスＯＶＮ及びＯＶＨの既知の組み換えＨＳＶウイルスとの比較
現在、例えばＨＳＶ１７１６、ＮＶ１０２０、Ｇ２０７、ＯｎｃｏＶｅｘＧＭ−ＣＳＦ（Ｔ−ＶＥＣ）等を含む様々な組み換えＨＳＶウイルスが、腫瘍治療における使用に対して開発されている。これらの組み換えＨＳＶウイルス及び本発明の組み換えウイルスＯＶＮ及びＯＶＨに含まれるゲノム修飾を下記表２に要約する。
【０１５８】
【表２】
2020511160.tif 000004
【０１５９】
図２は、組み換えウイルスＨＳＶ１７１６、ＮＶ１０２０、Ｇ２０７、ＯｎｃｏＶｅｘＧＭ−ＣＳＦ（Ｔ−ＶＥＣ）及びＯＶＮに含まれるゲノム修飾の概略図である。
【０１６０】
実施例２．組み換えウイルスＯＶＮ及びＯＶＨの特性評価
株ＫＯＳと比較して、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーが欠失している組み換えウイルスｄＩＣＰ０を、実施例１に記載される方法を参照して構築した。組み換えウイルスＯＶＮ及びＯＶＨを特性評価するため、ウイルス株ＫＯＳ及び組み換えウイルスｄＩＣＰ０を対照ウイルスとして使用した。図３は、ウイルス株ＫＯＳと比較した、組み換えウイルスＯＶＮ、ＯＶＨ及びｄＩＣＰ０に含まれるゲノム修飾の概略図であり、ここで、組み換えウイルスｄＩＣＰ０では、ウイルス株ＫＯＳと比較して、ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーが欠失し、組み換えウイルスＯＶＮではＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピー及びＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーが欠失し、組み換えウイルスＯＶＨではＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピー及びＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーが欠失して、ＩＣＰ２７遺伝子の本来のプロモーターがｈＴＥＲＴコアプロモーターで置換されていた。
【０１６１】
組み換えウイルスＯＶＮ、ＯＶＨ及びｄＩＣＰ０における遺伝子欠失をＰＣＲによって検証した。簡潔には、ＩＣＰ０遺伝子、ＩＣＰ３４．５遺伝子、ＩＣＰ２７遺伝子又はｈＴＥＲＴコアプロモーターの特異的増幅のためのプライマーを使用し、テンプレートとしてウイルス株ＫＯＳ、ＯＶＮ、ＯＶＨ又はｄＩＣＰ０のゲノムを使用してＰＣＲを行った。ＰＣＲで使用したプライマーを表３に要約する。
【０１６２】
【表３】
2020511160.tif 000005
【０１６３】
反応が完了した後、ＰＣＲ産物をゲル電気泳動によって分析した。結果を図４に示す。図４は、テンプレートとしてウイルス株ＫＯＳ、ＯＶＮ、ＯＶＨ又はｄＩＣＰ０のゲノム、及びＩＣＰ０遺伝子、ＩＣＰ３４．５遺伝子、ＩＣＰ２７遺伝子又はｈＴＥＲＴコアプロモーターを特異的に増幅することができるプライマーを使用するＰＣＲによって得られた生成物のゲル電気泳動の結果を示し、図中、レーン１はＤＮＡ分子量マーカーを表し、レーン２はテンプレートとしてウイルス株ＫＯＳゲノムを使用するＰＣＲ産物を表し、レーン３はテンプレートとして組み換えウイルスｄＩＣＰ０ゲノムを使用するＰＣＲ産物を表し、レーン４はテンプレートとして組み換えウイルスＯＶＮゲノムを使用するＰＣＲ産物を表し、レーン５はテンプレートとして組み換えウイルスＯＶＨゲノムを使用するＰＣＲ産物を表し、レーン６はテンプレートとして水を使用するＰＣＲ産物を表す。
【０１６４】
図４の結果は、ウイルス株ＫＯＳのゲノムはＩＣＰ０遺伝子、ＩＣＰ３４．５遺伝子及びＩＣＰ２７遺伝子を含んだが、ｈＴＥＲＴコアプロモーターを含まず、組み換えウイルスｄＩＣＰ０のゲノムはＩＣＰ３４．５遺伝子及びＩＣＰ２７遺伝子を含んだが、ＩＣＰ０遺伝子及びｈＴＥＲＴコアプロモーターを含まず、組み換えウイルスＯＶＮのゲノムはＩＣＰ２７遺伝子を含んだが、ＩＣＰ３４．５遺伝子、ＩＣＰ０遺伝子及びｈＴＥＲＴコアプロモーターを含まず、組み換えウイルスＯＶＨのゲノムはＩＣＰ２７遺伝子及びｈＴＥＲＴコアプロモーターを含んだが、ＩＣＰ３４．５遺伝子及びＩＣＰ０遺伝子を含まなかったことを示す。
【０１６５】
さらに、ＫＯＳ、ＯＶＮ、ＯＶＨ又はｄＩＣＰ０による感染後の細胞の遺伝子発現（ｍＲＮＡ）も、リアルタイム定量的ＰＣＲを使用して分析した。簡潔には、Ｕ−２  ＯＳ宿主細胞を、ＫＯＳ、ＯＶＮ、ＯＶＨ及びｄＩＣＰ０でそれぞれ感染させた。細胞変性効果を観察した後、細胞を採取し、トータルｍＲＮＡを抽出した。トータルｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、ＩＣＰ０遺伝子、ＩＣＰ３４．５遺伝子又はＩＣＰ２７遺伝子を特異的に増幅するプライマーをそれぞれ使用してリアルタイム定量的ＰＣＲを行った。結果を図５に示す。
【０１６６】
図５は、ＫＯＳ、ＯＶＮ、ＯＶＨ又はｄＩＣＰ０のＩＥ遺伝子発現（ｍＲＮＡ）のリアルタイム定量的ＰＣＲ分析の結果を示す。図５の結果は、株ＫＯＳはＩＣＰ０遺伝子、ＩＣＰ３４．５遺伝子及びＩＣＰ２７遺伝子を発現することができ、組み換えウイルスｄＩＣＰ０はＩＣＰ３４．５遺伝子及びＩＣＰ２７遺伝子を発現することができたが、ＩＣＰ０遺伝子を発現せず、組み換えウイルスＯＶＮ及びＯＶＨはＩＣＰ２７遺伝子を発現することができたが、ＩＣＰ３４．５遺伝子もＩＣＰ０遺伝子も発現しなかったことを示す。これは、組み換えウイルスｄＩＣＰ０ではＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーが欠失しており、宿主細胞の感染後にＩＣＰ０タンパク質を発現することができなかったこと、並びに組み換えウイルスＯＶＮ及びＯＶＨではいずれもＩＣＰ３４．５遺伝子及びＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーが欠失しているため、宿主細胞の感染後にＩＣＰ０タンパク質及びＩＣＰ３４．５タンパク質を発現することができなかったことを示す。
【０１６７】
実施例３．組み換えウイルスＯＶＮ／ＯＶＨの複製能及び殺傷能の評価
対数増殖期の正常細胞（Ｌ−Ｏ２細胞）及び腫瘍細胞（Ｕ−２  ＯＳ細胞）を５×１０６細胞／プレート〜７．５×１０６細胞／プレートの密度で６ｃｍの培養プレートに蒔いた。その後、培養細胞をＭＯＩが１のウイルスＫＯＳ、ＯＶＮ、ＯＶＨ又はｄＩＣＰ０で感染させた。感染から４８時間後、細胞の状態を顕微鏡下で観察し、撮影した。その後、ウイルス感染細胞を消化し、細胞の生存率をトリパンブルー染色によって計算した。細胞生存率（％）＝（ウイルスによる感染後の生細胞の数）／（ウイルスに感染していない対照細胞の数）×１００。３ウェルの複製を実験の各群に対して設定し、実験結果は３つの独立した実験の平均であった。さらに、ウイルスＫＯＳ、ＯＶＮ、ＯＶＨ又はｄＩＣＰ０による正常細胞（Ｌ−Ｏ２細胞）及び腫瘍細胞（Ｕ−２  ＯＳ細胞）の感染後の種々の時間点でのウイルス力価を実施例１に記載されるプロトコルを参照して決定した。３ウェルの複製を実験の各群に対して設定し、実験結果は３つの独立した実験の平均であった。実験結果を図６〜図８に示す。
【０１６８】
図６は、ＭＯＩが１のウイルスＫＯＳ、ＯＶＮ、ＯＶＨ又はｄＩＣＰ０によるＬ−Ｏ２細胞（図６Ａ）又はＵ−２  ＯＳ細胞（図６Ｂ）の感染から４８時間後のウイルス力価を示す。図６Ａの結果は、ＫＯＳ及びｄＩＣＰ０のウイルスはいずれもＬ−Ｏ２細胞の感染後に高レベルの複製を有し、またそれらのウイルス力価は感染から４８時間後におよそ１．９４×１０７ｐｆｕ／ｍｌ及び３．０１×１０６ｐｆｕ／ｍｌに達したが、ウイルスＯＶＮ及びＯＶＨの複製能は顕著に減少し、感染から４８時間後、それらのウイルス力価はわずか約２．１４×１０５ｐｆｕ／ｍｌ及び１．８５×１０３ｐｆｕ／ｍｌであったことを示す。図６Ｂの結果は、Ｕ−２  ＯＳ細胞の感染後にウイルスＫＯＳ、ＯＶＮ、ＯＶＨ及びｄＩＣＰ０が高レベルの複製を有し、それらのウイルス力価が感染から４８時間後に１．０１×１０８ｐｆｕ／ｍｌ〜１．８３×１０８ｐｆｕ／ｍｌであったことを示す。これらの結果は、ウイルスＫＯＳ及びｄＩＣＰ０は、正常細胞（例えばＬ−Ｏ２細胞）及び腫瘍細胞（例えばＵ−２  ＯＳ細胞）において高レベルで複製することができたのに対し、ウイルスＯＶＮ及びＯＶＨは腫瘍細胞（例えばＵ−２  ＯＳ細胞）でのみ高レベルで複製することができ（ウイルスＫＯＳ及びｄＩＣＰ０と比較して、それらの複製能はわずかに減少したにすぎなかった）、またそれらの複製能は正常細胞（例えばＬ−Ｏ２細胞）では顕著に減少したことを示す。例えば、Ｌ−Ｏ２細胞では、ウイルスＯＶＮ及びＯＶＨの複製能は、ウイルスＫＯＳの複製能と比較して、それぞれ約９０倍及び１０４倍減少され、ウイルスＯＶＮ及びＯＶＨの複製能は、ウイルスｄＩＣＰ０の複製能と比較して、それぞれ約１４倍及び１．６×１０３倍減少された。
【０１６９】
図７は、ＭＯＩが０．０１のウイルスＫＯＳ、ＯＶＮ、ＯＶＨ又はｄＩＣＰ０による単層Ｕ−２  ＯＳ細胞の感染後の種々の時間点（感染から１２時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、６０時間後）でのウイルス力価を示す。図７の結果は、ウイルスＫＯＳ、ＯＶＮ、ＯＶＨ又はｄＩＣＰ０が腫瘍細胞（例えばＵ−２  ＯＳ細胞）において実質的に同等の複製能を有したことを示す。
【０１７０】
図８は、ＭＯＩが１のウイルスＫＯＳ、ＯＶＮ、ＯＶＨ又はｄＩＣＰ０によるＬ−Ｏ２細胞（図８Ａ）又はＵ−２  ＯＳ細胞（図８Ｂ）の感染から７２時間後の細胞生存率を示し、図中、モックはウイルスに感染していない細胞を表す。図８Ａの結果は、感染から７２時間後のＬ−Ｏ２細胞に対するウイルスＫＯＳ及びｄＩＣＰ０の殺傷能は、それぞれ約９１．５％及び８９％であり（それらはいずれもＬ−Ｏ２細胞に対する著しい殺傷能を有していた）、Ｌ−Ｏ２細胞に対するウイルスＯＶＮ及びＯＶＨの殺傷能は、それぞれ約４２％及び５％（Ｌ−Ｏ２細胞に対するそれらの殺傷能は著しく減少された）であったことを示す。図８Ｂの結果は、ウイルスＫＯＳ、ＯＶＮ、ＯＶＨ及びｄＩＣＰ０は、感染の７２時間後、１００％のＵ−２  ＯＳ細胞を殺傷することができた（それらはいずれもＵ−２  ＯＳ細胞に対して非常に強い殺傷能を有していた）ことを示す。これらの結果は、正常細胞（例えばＬ−Ｏ２細胞）及び腫瘍細胞（例えばＵ−２  ＯＳ細胞）に対してウイルスＫＯＳ及びｄＩＣＰ０が非常に高い殺傷能を有していたのに対し、ウイルスＯＶＮ及びＯＶＨは腫瘍細胞（例えばＵ−２  ＯＳ細胞）に対してのみ高い殺傷能を有していた（それらの殺傷能はウイルスＫＯＳ及びｄＩＣＰ０のものと実質的に同じであった）が、正常細胞（例えばＬ−Ｏ２細胞）に対するそれらの殺傷能は顕著に減少されたことを示す。例えば、Ｌ−Ｏ２細胞では、ウイルスＯＶＮ及びＯＶＨの殺傷能は、ウイルスＫＯＳと比較して、それぞれ約５４．１％及び９４．５％減少され、ウイルスＯＶＮ及びＯＶＨの殺傷能は、ウイルスｄＩＣＰ０と比較して、約５２．８％及び９４．４％それぞれ減少された。
【０１７１】
図６〜図８の実験結果は、野生型ウイルスＫＯＳ及び組み換えウイルスｄＩＣＰ０と比較して、正常細胞において組み換えウイルスＯＶＮ及びＯＶＨの複製能及び殺傷能は顕著に減少されるのに対し、腫瘍細胞におけるそれらの複製能及び殺傷能は実質的には同じであった（又はわずかに減少されたにすぎなかった）。これは、本発明の組み換えウイルスＯＶＮ及びＯＶＨは、腫瘍細胞において（良好な抗腫瘍活性と共に）高い複製能及び高い殺傷能を維持することができるのみならず、正常細胞に対する病原性を顕著に減少させ得ることも示す。したがって、本発明の組み換えウイルスＯＶＮ及びＯＶＨは抗腫瘍治療に有用であり、それらは正常細胞に対してより高い安全性を有し、より高用量で使用され得る。
【０１７２】
またさらに、様々な腫瘍細胞に対する組み換えウイルスＯＶＮ及びＯＶＨの殺傷能を、上に記載される方法を参照して決定した。簡潔には、良好な状態及び対数増殖期の腫瘍細胞を、５×１０６細胞／プレート〜７．５×１０６細胞／プレートの密度で６ｃｍの培養プレートに蒔いた。その後、培養腫瘍細胞を、ＭＯＩが１のウイルスＯＶＮ又はＯＶＨで感染させた。感染の４８時間後、感染した腫瘍細胞を消化し、腫瘍細胞の生存率をトリパンブルー染色によって計算した。この実験では、ウイルスに感染していない細胞を対照として使用した。細胞生存率（％）＝（ウイルスによる感染後の生細胞の数）／（ウイルスに感染していない対照細胞の数）×１００。３ウェルの複製を実験の各群に対して設定し、実験結果は３つの独立した実験の平均であった。実験結果を図９に示す。
【０１７３】
図９は、４８時間のウイルスＯＶＮ又はＯＶＨによる様々な腫瘍細胞の感染の後の細胞生存率の結果を示し、図中、モックはウイルスに感染させなかった腫瘍細胞を表す。図９の実験結果は、組み換えウイルスＯＶＮ及びＯＶＨが、例えば、肺癌細胞Ｈ１２９９、Ｈ５２０、Ｈ１９７５、ＮＣＩ−Ｈ３５８及びＡ５４９（５株）、肝臓癌細胞Ｈｕｈ７、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２、ＧＳＧ７７０１、ＳＭＭＣ７７２１、Ｈｅｐａ１−６、ＢＥＬ７４０４、ＰＬＣ／ＰＲＦ、ＱＧＹ７７０３（９株）、乳癌細胞ＭＡＤＭＢ２３１、ＭＣＦ７、ＭＡＤＭＢ４６８（３株）、骨肉腫細胞Ｕ２ＯＳ及びＳＡＯＳ２（２株）、卵巣癌細胞ＳＫＯＶ３及びＣＡＯＶ３（２株）、子宮頸癌細胞ＳｉＨＡ及びＨｅｌａ（２株）、前立腺癌細胞ＰＣ−３（１株）、神経膠腫細胞Ｕ８７ＭＧ（１株）、黒色腫Ａ３７５（１株）、結腸直腸癌ＨＣＴ１１６（１株）及び膵臓癌Ｐａｎｃ１（１株）を含む様々な腫瘍細胞を顕著に殺傷することができ、ＯＶＮ及びＯＶＨは同等の腫瘍殺傷能を有したことを示す。これらの実験結果は、本発明の組み換えウイルスＯＶＮ及びＯＶＨが様々な腫瘍細胞に対して良好な殺傷活性を有し、腫瘍治療に使用され得ることを示す。
【０１７４】
実施例４．組み換えウイルスＯＶＮ／ＯＶＨの神経毒性及びｉｎ  ｖｉｖｏ安全性の評価
ヘルペスウイルスは神経毒性であって、神経学的に潜伏しており、最大の脅威は、脳炎等の重篤な副作用に結びつくヒト又は動物の中枢神経系に感染する能力である。したがって、ヘルペスウイルスの安全性を評価する最も直接的で最も感度の良い方法は、若いマウスにウイルスを頭蓋内注射し、ウイルスによるマウス中枢神経系の直接的な殺傷を評価することである。この実施例において、本発明者らは、ウイルスの頭蓋内注射によって誘導されたマウス脳炎モデルを使用して、マウスにおける様々な組み換えＨＳＶ−１ウイルスの神経毒性及び安全性を評価した。
【０１７５】
簡潔には、４週齢〜６週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌性マウス（ｎ＝１０）を実験対象として使用し、冠状縫合及び矢状縫合の接合部近くの脳の左前頭葉にウイルス２０μｌをゆっくりと頭蓋内注射した。注射後、マウスの発病率及び生存を毎日観察した。図１０は、所与の用量のウイルスＫＯＳ、ｄＩＣＰ０、ＯＶＮ又はＯＶＨの頭蓋内注射後のマウスの生存率を示し、図中、ビヒクルはウイルスが注射されていないマウスを表す。
【０１７６】
結果は、１×１０４ＰＦＵの野生型ウイルスＫＯＳの頭蓋内注射の場合、１００％のマウスが中程度から重篤な副作用を発症し、疾患を発症した後、マウスは、しばしば、立毛（hair rising）、食欲減退、悪寒（cold）、動作緩慢、更には麻痺等の症状を伴い、１００％のマウスがウイルス注射後４日〜６日以内に死亡した（図１０）ことを示す。１×１０５ＰＦＵのウイルスｄＩＣＰ０の頭蓋内注射の場合、約８０％のマウスが、ウイルス注射後４日〜８日以内に死亡し、わずか２０％のマウスが１週間後に徐々に回復した。
【０１７７】
高用量（１×１０７ＰＦＵ）のウイルスＯＶＮを頭蓋内注射した場合、全実験期間中に死亡したマウスはなく（０／１０）、マウスの生存率は１００％であった。これは、野生型ウイルスＫＯＳ及び組み換えウイルスｄＩＣＰ０と比較して、ウイルスＯＶＮの神経毒性が顕著に減少され、ｉｎ  ｖｉｖｏでの安全性が著しく改善され、使用される用量は、それぞれ、少なくとも１０００倍及び１００倍に増加され得ることを示す。
【０１７８】
より高用量（４×１０７ＰＦＵ）のウイルスＯＶＮを頭蓋内注射した場合、１匹のマウスのみ（１／１０）が全実験期間中に死亡し、マウス生存率は９０％であった。これは、ウイルスのＯＶＮがマウスにおいて４×１０７ＰＦＵより高い半致死量を有し、したがって優れたｉｎ  ｖｉｖｏ安全性を有していたことを示す。
【０１７９】
４×１０７ＰＦＵのウイルスＯＶＨを頭蓋内注射した場合、全実験期間中に死亡したマウスはなく（０／１０）、マウス生存率は１００％であった。さらに、より重要なことには、マウスは実験期間を通して何らの有害反応も示さなかった。これは、ウイルスＯＶＮと比較して、ウイルスＯＶＨは、更に顕著に減少された神経毒性、及び更に顕著に改善されたｉｎ  ｖｉｖｏ安全性を有していたことを示す。
【０１８０】
上の実験結果は、本発明のウイルスＯＶＮ及びＯＶＨは神経毒性が低く、ｉｎ  ｖｉｖｏでの安全性が高く、幅広い適用の見込みがあることを示す。
【０１８１】
実施例５．組み換えウイルスＯＶＮ／ＯＶＨの治療可能性の評価
腫瘍細胞（Ｈｕｈ７及びＨｅｐａ１−６）を、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターにおいて、１０％仔ウシ血清を含む完全培地中で培養した。細胞が対数増殖期まで増殖したら、細胞を０．０５％トリプシンで消化し、ＰＢＳで洗浄して、ＰＢＳに再懸濁された細胞懸濁液（５×１０７／ｍＬの細胞密度）を得た。
【０１８２】
Ｈｕｈ７細胞懸濁液０．１ｍＬを、５週齢〜６週齢の各ヌードマウスの右脇腹の皮下に接種した。マウス背部の腫瘍が６ｍｍ×６ｍｍ（腫瘍体積はおよそ１００ｍｍ３であった）まで増殖したら、マウスをグループ分けして（ｎ＝８／群）、治療を開始した（０日目）。治療レジメンは次の通りであった：１×１０７ＰＦＵのウイルス（ＯＶＮ又はＯＶＨ）又は同じ容量のＤＭＥＭ（対照として使用）を、３日毎に１回合計３回の注射にて、腫瘍内に注射した。
【０１８３】
Ｈｅｐａ１−６細胞懸濁液０．１ｍＬを、５週齢の各マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の左側及び右側の脇腹に皮下接種した。マウス背部の腫瘍が６ｍｍ×６ｍｍ（腫瘍体積はおよそ約１００ｍｍ３であった）まで増殖したら、マウスをグループ分けして、治療を開始した。治療レジメンは次の通りであった：１×１０７ＰＦＵのウイルス（ＯＶＮ又はＯＶＨ）又は同じ容量のＤＭＥＭを、３日毎に１回合計３回の注射にて、腫瘍内に注射した。
【０１８４】
マウスの状態を３日毎にモニターし、電子ノギスを使用して腫瘍サイズを測定した。腫瘍体積及び腫瘍阻害率を下記式に従って計算した：
Ｖ（体積）＝［Ｌ×（Ｗ）２］／２、Ｌは長径を表し、Ｗは短径を表す。
腫瘍阻害率＝（対照群の腫瘍体積−実験群の腫瘍体積）／対照群の腫瘍体積×１００％。
【０１８５】
実験結果を図１１及び図１２に要約する。
【０１８６】
図１１は、ＯＶＮ又はＯＶＨによる治療後にＨｕｈ７細胞が接種されたヌードマウスの腫瘍体積−時間曲線（図１１Ａ）及び生存率−時間曲線（図１１Ｂ）を示し、図中、ＤＭＥＭは治療していないマウスを表す。図１１Ａの結果は、３回の投与によるウイルス注射後、組み換えウイルスＯＶＮとＯＶＨの両方が腫瘍増殖を顕著に阻害し、２１日目にはＯＶＮの阻害率が８６．１％に達し、ＯＶＨの阻害率が７８％に達したことを示す。図１１Ｂの結果は、３回のウイルス注射の後、組み換えウイルスＯＶＮ及びＯＶＨが腫瘍担持ヌードマウスの生存期間を顕著に延長し、６０日目には対照群のヌードマウスが完全に死亡したのに対し、組み換えウイルスＯＶＮ又はＯＶＨが投与されたヌードマウスは、実験が終わっても７５％の生存率を有したことを示す。
【０１８７】
図１２は、ＯＶＮ又はＯＶＨによる治療後にＨｅｐａ１−６細胞が接種されたマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の左脇腹の腫瘍（図１２Ａ）及び右脇腹の腫瘍（図１２Ｂ）の腫瘍体積−時間曲線を示し、図中、ＤＭＥＭは治療していないマウスを表す。図１２の結果は、右脇腹の腫瘍に対する３回の投与によるウイルス注射後、組み換えウイルスＯＶＮ及びＯＶＨが安全にマウスの右脇腹の腫瘍を除去しただけなく、左脇腹の腫瘍も除去したことを示す。
【０１８８】
これらの実験結果は、本発明のウイルスＯＶＮ及びＯＶＨがｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍を治療する大きな可能性を有し、幅広い適用の見込みがあることを確認した。
【０１８９】
実施例６．その他の組み換えウイルスの構築及び特性評価（１）
この実施例では、一連の得られる組み換えウイルスを組み換えウイルスＯＶＮ及びＯＶＨに基づいて構築した。
【０１９０】
実施例１（特に１．３．１〜１．３．３）に記載される方法を参照して、組み換えウイルスＯＶＮを出発ウイルスとして使用し、ＶＰ５遺伝子又はＩＣＰ４遺伝子を調節するため、ｈＴＥＲＴコアプロモーター配列を組み換えプラスミドによって組み換えウイルスＯＶＮゲノムに導入することにより、組み換えウイルスＯＶＨ１及びＯＶＨ２を構築した。
【０１９１】
シーケンシングによって検証すると、組み換えウイルスＯＶＮと比較して、組み換えウイルスＯＶＨ１ゲノムでは、ＶＰ５遺伝子の本来のプロモーター配列（野生型ＨＳＶ−１ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＱ６７３４８０．１）のｎｔ４０７２９〜ｎｔ４０４７５）がｈＴＥＲＴコアプロモーター配列（配列番号５）で置換され、組み換えウイルスＯＶＨ２ゲノムでは、ＩＣＰ４遺伝子の本来のプロモーター配列（野生型ＨＳＶ−１ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＱ６７３４８０．１）のｎｔ１４６１５１〜ｎｔ１４６８６７及びｎｔ１３１７０６〜ｎｔ１３０９９０）がｈＴＥＲＴコアプロモーター配列（配列番号５）で置換されていた。
【０１９２】
図１３は、組み換えウイルスＯＶＨ、ＯＶＨ１及びＯＶＨ２と、組み換えウイルスＯＶＮとの間のゲノム構造の違いを示す概略図であり、ここで、組み換えウイルスＯＶＨのＩＣＰ２７遺伝子の本来のプロモーター配列、組み換えウイルスＯＶＨ１のＶＰ５遺伝子の本来のプロモーター配列、及び組み換えウイルスＯＶＨ２のＩＣＰ４遺伝子の本来のプロモーター配列は、組み換えウイルスＯＶＮと比較して、それぞれｈＴＥＲＴコアプロモーター配列で置換されていた。
【０１９３】
さらに、実施例１（特に１．３．１〜１．３．３）に記載される方法を参照して、組み換えウイルスｄ３４．５／０ｌａｃＺを出発ウイルスとして使用し、ＧＦＰタンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号７）及び抗ヒトＰＤ−１単鎖抗体をコードするヌクレオチド配列（配列番号８）を、組み換えプラスミドを使用して組み換えウイルスｄ３４．５／０ｌａｃＺゲノムに導入し、ｌａｃＺ遺伝子を置換することにより、組み換えウイルスＯＶＮ−ＧＦＰ及びＯＶＮ−ＰＤ−１−ｓｃｆｖを構築し、それらを得た。シーケンシングによって検証すると、組み換えウイルスｄ３４．５／０ｌａｃＺと比較して、組み換えウイルスＯＶＮ−ＧＦＰゲノムでは、ｌａｃＺ遺伝子の２つのコピーがＧＦＰタンパク質をコードするヌクレオチド配列で置換され（すなわち、組み換えウイルスＯＶＮ−ＧＦＰのゲノムでは、野生型ＨＳＶ−１ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＱ６７３４８０．１）のｎｔ５１０〜ｎｔ５４３９の配列及びｎｔ１２０８０２〜ｎｔ１２５７３１の配列が、ＧＦＰタンパク質をコードするヌクレオチド配列で置換されていた）、組み換えウイルスＯＶＮ−ＰＤ−１−ｓｃｆｖのゲノムでは、ｌａｃＺ遺伝子の２つのコピーがＰＤ−１単鎖抗体をコードするヌクレオチド配列で置換されていた（すなわち、組み換えウイルスＯＶＮ−ＰＤ−１−ｓｃｆｖのゲノムにおいて、野生型ＨＳＶ−１ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＱ６７３４８０．１）のｎｔ５１０〜ｎｔ５４３９の配列及びｎｔ１２０８０２〜ｎｔ１２５７３１の配列が、ＰＤ−１単鎖抗体をコードするヌクレオチド配列で置換されていた）。
【０１９４】
さらに、組み換えウイルスＯＶＮ−ＧＦＰ及びＯＶＮ−ＰＤ−１−ｓｃｆｖを出発ウイルスとして使用し、ｈＴＥＲＴコアプロモーター配列を、プラスミドＰＵＣ５７−２７ｐ／ｌａｃＺ及びＰＵＣ５７−２７ｐ／ｈｔｅｒｔを使用して出発ウイルスゲノムに導入し、ＩＣＰ２７遺伝子を調節することにより、組み換えウイルスＯＶＨ−ＧＦＰ及びＯＶＨ−ＰＤ−１−ｓｃｆｖを構築して、それらを得た。
【０１９５】
シーケンシングによって検証すると、組み換えウイルスＯＶＮ−ＧＦＰと比較して、組み換えウイルスＯＶＨ−ＧＦＰゲノム中のＩＣＰ２７遺伝子の本来のプロモーター配列（野生型ＨＳＶ−１ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＱ６７３４８０．１）のｎｔ１１３４２３〜ｎｔ１１３５８９）は、ｈＴＥＲＴコアプロモーター配列（配列番号５）で置換されていた。組み換えウイルスＯＶＮ−ＰＤ−１−ｓｃｆｖと比較して、組み換えウイルスＯＶＨ−ＰＤ−１−ｓｃｆｖゲノム中のＩＣＰ２７遺伝子の本来のプロモーター配列（野生型ＨＳＶ−１ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＱ６７３４８０．１）のｎｔ１１３４２３〜ｎｔ１１３５８９）は、ｈＴＥＲＴコアプロモーター配列（配列番号５）で置換されていた。
【０１９６】
図１４は、組み換えウイルスｄ３４．５／０ｌａｃＺ、ＯＶＮ、ＯＶＮ−ＧＦＰ、ＯＶＮ−ＰＤ−１−ｓｃｆｖ、ＯＶＨ−ＧＦＰ及びＯＶＨ−ＰＤ−１−ｓｃｆｖのゲノム構造の違いを示す概略図である。
【０１９７】
Ｕ−２  ＯＳ細胞（米国のＡＴＣＣから購入、商品番号ＨＴＢ−９６（商標））を１×１０６細胞の密度で６ｃｍの培養プレートに蒔いた。細胞を単層へと増殖させた後、その細胞を組み換えウイルスＯＶＮ−ＧＦＰ及びＯＶＨ−ＧＦＰでそれぞれ感染させた。細胞変性効果を観察した後、組み換えウイルスＯＶＮ−ＧＦＰ及びＯＶＨ−ＧＦＰで感染させた細胞を蛍光顕微鏡下で観察した。結果を図１５に示す。図１５は、組み換えウイルスＯＶＮ−ＧＦＰ又はＯＶＨ−ＧＦＰで感染させたＵ−２  ＯＳ細胞の蛍光顕微鏡観察の結果を示す。図１５の結果は、ＯＶＮ−ＧＦＰに感染したＵ−２  ＯＳ細胞及びＯＶＨ−ＧＦＰに感染したＵ−２  ＯＳ細胞が緑色蛍光を発光することができたことを示す。これは組み換えウイルスＯＶＮ−ＧＦＰ及びＯＶＨ−ＧＦＰが宿主細胞の感染後にＧＦＰタンパク質を発現することができたことを示す。
【０１９８】
Ｕ−２  ＯＳ細胞（米国のＡＴＣＣから購入、カタログ番号ＨＴＢ−９６（商標））を１×１０６細胞の密度で６ｃｍの培養プレートに蒔いた。細胞を単層まで増殖させた後、細胞を組み換えウイルスＯＶＨ及びＯＶＨ−ＰＤ−１−ｓｃｆｖでそれぞれ感染させた。後の分析のため、感染から２４時間後及び４８時間後、細胞の培養上清をそれぞれ採取した。感染から４８時間後に収集した上清を２倍段階希釈に供し、ＰＤ−１タンパク質への結合に対するＰＤ−１単鎖抗体とＰＤ−Ｌ１タンパク質との間の競合に基づくＥＬＩＳＡ法によって、各希釈の上清のＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用を阻害する能力を判定した。さらに、感染から２４時間後及び４８時間後に収集された上清のＰＤ−１を結合する能力も、ＰＤ−１単鎖抗体とＰＤ−１タンパク質との間の反応性に基づいてＥＬＩＳＡ法によって決定した。実験結果を図１６に示す。
【０１９９】
図１６は、組み換えウイルスＯＶＨ又はＯＶＨ−ＰＤ−１−ｓｃｆｖによるＵ−２  ＯＳ細胞の感染から２４時間後又は４８時間後における、細胞上清がＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の特異的結合を阻害する能力（図１６Ａ）、及び細胞上清とＰＤ−１タンパク質との間の相互作用の分析の結果（図１６Ｂ）を示し、図中、モックはウイルスに感染していない腫瘍細胞を表す。図１６の結果は、ＯＶＨ−ＰＤ−１−ｓｃｆｖに感染したＵ−２  ＯＳ細胞の上清が、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の特異的結合を阻害することができ、ＰＤ−１に特異的に結合することができたことを示す。これは、宿主細胞の感染後に、組み換えウイルスＯＶＨ−ＰＤ−１−ｓｃｆｖがＰＤ−１単鎖抗体を発現し、該抗体はＰＤ−１に結合され、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用を遮断したことを示す。
【０２００】
図１５及び図１６の実験結果は、本発明の組み換えウイルスＯＶＮ及びＯＶＨのゲノムが、外来遺伝子を持ち、それを発現するウイルスベクターとして有用であることを示す。
【０２０１】
さらに、組み換えウイルスＯＶＨ及びＯＶＨ−ＰＤ−１−ｓｃｆｖの腫瘍を治療する能力も、実施例５に記載される方法に従ってＨｅｐａ１−６細胞を接種したマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）において検証した。結果を図１７に示す。
【０２０２】
図１７は、ＯＶＨ又はＯＶＨ−ＰＤ−１−ｓｃｆｖによる治療後にＨｅｐａ１−６細胞を接種したマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の左脇腹の腫瘍（図１７Ａ）及び右脇腹の腫瘍（図１７Ｂ）の腫瘍体積−時間曲線を示し、図中、ビヒクルは治療していないマウスを表す。図１７の結果は、右脇腹の腫瘍に対する３回の投与によるウイルス注射後、組み換えウイルスＯＶＨ及びＯＶＨ−ＰＤ−１−ｓｃｆｖはマウスの右脇腹の腫瘍を安全に除去しただけでなく、左脇腹の腫瘍も除去したことを示す。
【０２０３】
これらの実験結果は、本発明の組み換えウイルスＯＶＨ−ＰＤ−１−ｓｃｆｖ及びＯＶＨがｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍を治療する大きな可能性を有し、広い適用の見込みを有することを確認する。
【０２０４】
実施例７．その他の組み換えウイルスの構築及び特性評価（２）
この実施例では、一連の得られる組み換えウイルスを組み換えウイルスＯＶＮに基づいて構築した。簡潔には、実施例１（特に１．３．１〜１．３．３）に記載される方法を参照して、組み換えウイルスＯＶＮを出発ウイルスとして使用し、組み換えウイルスＯＶＮゲノム中の非必須遺伝子ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４８、ＵＬ５５、ＵＳ２、ＬＡＴ又はＮＦを、それぞれ組み換えプラスミドを使用して欠失させることにより、組み換えウイルスＯＶＮ−ｄＵＬ４１、ＯＶＮ−ｄＵＬ４３、ＯＶＮ−ｄＵＬ４８、ＯＶＮ−ｄＵＬ５５、ＯＶＮ−ｄＵＳ２、ＯＶＮ−ｄＬＡＴ及びＯＶＮ−ｄＮＦを構築して、それらを得た。
【０２０５】
シーケンシングによる検証によれば、組み換えウイルスＯＶＮと比較して、組み換えウイルスＯＶＮ−ｄＵＬ４１ゲノムにはＵＬ４１（ｖｈｓ）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦＥ６２８６９．１、野生型ＨＳＶ−１ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＱ６７３４８０．１）のｎｔ９１０８８〜ｎｔ９２５５７に対応する）の欠失があり、組み換えウイルスＯＶＮ−ｄＵＬ４３ゲノムにはＵＬ４３遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦＥ６２８７１．１、野生型ＨＳＶ−１ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＱ６７３４８０．１）のｎｔ９４７２１〜ｎｔ９５９６８に対応する）の欠失があり、組み換えウイルスＯＶＮ−ｄＵＬ４８ゲノムにはＵＬ４８（ＶＭＷ６５）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦＥ６２８７６．１、野生型ＨＳＶ−１ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＱ６７３４８０．１）のｎｔ１０３５２７〜ｎｔ１０４９９９に対応する）の欠失があり、組み換えウイルスＯＶＮ−ｄＵＬ５５ゲノムにはＵＬ５５遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦＥ６２８８４．１、野生型ＨＳＶ−１ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＱ６７３４８０．１）のｎｔ１１５４１８〜ｎｔ１１５９７８に対応する）の欠失があり、組み換えウイルスＯＶＮ−ｄＵＳ２ゲノムにはＵＳ２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦＥ６２８９０．１、野生型ＨＳＶ−１ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＱ６７３４８０．１）のｎｔ１３３９１１〜ｎｔ１３４７８６に対応する）の欠失があり、組み換えウイルスＯＶＮ−ｄＬＡＴゲノムにはＬＡＴ遺伝子（野生型ＨＳＶ−１ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＱ６７３４８０．１）のｎｔ４７８１〜ｎｔ７０６２に対応する）の欠失があり、組み換えウイルスＯＶＮ−ｄＮＦゲノムにはヌクレオチドフラグメント（ＮＦ）（野生型ＨＳＶ−１ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＪＱ６７３４８０．１）のｎｔ５８５３〜ｎｔ７４８５に対応する）の欠失があった。
【０２０６】
代替的には、例えば、特定のｓｇＲＮＡプライマーを設計すること、及び商業的に入手可能なＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ  ｖ２ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ）を使用することにより、ＣＲＩＳＰＲ技術も使用することができ、組み換えウイルスＯＶＮゲノム中の非必須遺伝子ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４８、ＵＬ５５、ＵＳ２、ＬＡＴ又はＮＦをそれぞれ欠失することができた。
【０２０７】
非必須遺伝子ＵＬ４１、ＵＬ４３、ＵＬ４８、ＵＬ５５、ＵＳ２、ＬＡＴ及びＮＦに関する情報も表４に提供される。
【０２０８】
【表４】
2020511160.tif 000006
【０２０９】
良好な状態及び対数増殖期の腫瘍細胞（Ｕ−２  ＯＳ細胞）を、５×１０６細胞／プレート〜７．５×１０６細胞／プレートの密度で６ｃｍの培養プレートに蒔いた。その後、培養細胞を、ＭＯＩが０．０１の組み換えウイルスＯＶＮ、ＯＶＮ−ｄＵＬ４１、ＯＶＮ−ｄＵＬ４３、ＯＶＮ−ｄＵＬ４８、ＯＶＮ−ｄＵＬ５５、ＯＶＮ−ｄＵＳ２、ＯＶＮ−ｄＬＡＴ又はＯＶＮ−ｄＮＦでそれぞれ感染させた。感染の６０時間後、上の組み換えウイルスのウイルス力価を、実施例１に記載されるプロトコルを参照して決定した。３ウェルの複製を実験の各群に対して設定し、実験結果は３つの独立した実験の平均であった。実験結果を図１８に示す。
【０２１０】
図１８は、ＭＯＩが０．０１のウイルスＯＶＮ、ＯＶＮ−ｄＵＬ４１、ＯＶＮ−ｄＵＬ４３、ＯＶＮ−ｄＵＬ４８、ＯＶＮ−ｄＵＬ５５、ＯＶＮ−ｄＵＳ２、ＯＶＮ−ｄＬＡＴ又はＯＶＮ−ｄＮＦによるＵ−２  ＯＳ細胞の感染から６０時間後のウイルス力価をそれぞれ示す。図１８の結果は、Ｕ−２  ＯＳ細胞の感染後、ウイルスＯＶＮ、ＯＶＮ−ｄＵＬ５５、ＯＶＮ−ｄＵＳ２、ＯＶＮ−ｄＬＡＴ及びＯＶＮ−ｄＮＦが高レベルの複製を示し、感染から６０時間後のそれらのウイルス力価は１．０１×１０８ｐｆｕ／ｍｌ〜１．１８×１０８ｐｆｕ／ｍｌ、約１０８ｐｆｕ／ｍｌほどであったのに対し、ウイルスＯＶＮ−ｄＵＬ４３、ＯＶＮ−ｄＵＬ４１及びＯＶＮ−ｄＵＬ４８は低レベルの複製を示し、感染から６０時間後のそれらのウイルス力価は、１０７ｐｆｕ／ｍｌ未満、１０４ｐｆｕ／ｍｌ〜１０６ｐｆｕ／ｍｌほどであったことを示す。これらの組み換えウイルスのウイルス力価も表５に提供される。
【０２１１】
【表５】
2020511160.tif 000007
【０２１２】
これらの結果は、腫瘍細胞（例えばＵ−２  ＯＳ細胞）では、ウイルスＯＶＮ、ＯＶＮ−ｄＵＬ５５、ＯＶＮ−ｄＵＳ２、ＯＶＮ−ｄＬＡＴ及びＯＶＮ−ｄＮＦが高レベルで複製可能であったが、腫瘍細胞（例えばＵ−２  ＯＳ細胞）では、ウイルスＯＶＮ−ｄＵＬ４３、ＯＶＮ−ｄＵＬ４１及びＯＶＮ−ｄＵＬ４８の複製能は顕著に減少したことを示す。例えば、Ｕ−２  ＯＳ細胞では、ウイルスＯＶＮ−ｄＵＬ４１、ＯＶＮ−ｄＵＬ４３及びＯＶＮ−ｄＵＬ４８の複製能は、ウイルスＯＶＮと比較して、約５６１倍、５５倍及び３×１０３倍にそれぞれ減少された。
【０２１３】
さらに、培養正常細胞（Ｌ−Ｏ２細胞）又は腫瘍細胞（Ｕ−２  ＯＳ細胞）を、ＭＯＩが０．５の組み換えウイルスＯＶＮ、ＯＶＮ−ｄＵＬ４１、ＯＶＮ−ｄＵＬ４３、ＯＶＮ−ｄＵＬ４８、ＯＶＮ−ｄＵＬ５５、ＯＶＮ−ｄＵＳ２、ＯＶＮ−ｄＬＡＴ又はＯＶＮ−ｄＮＦでそれぞれ感染させた。感染から７２時間後に細胞の生存率を判断した。３ウェルの複製を実験の各セットに対して設定し、実験結果は３つの独立した実験の平均であった。実験結果を図１９に示す。
【０２１４】
図１９は、ＭＯＩが０．５のウイルスＯＶＮ、ＯＶＮ−ｄＵＬ４１、ＯＶＮ−ｄＵＬ４３、ＯＶＮ−ｄＵＬ４８、ＯＶＮ−ｄＵＬ５５、ＯＶＮ−ｄＵＳ２、ＯＶＮ−ｄＬＡＴ又はＯＶＮ−ｄＮＦによる感染から７２時間後の正常細胞（Ｌ−Ｏ２細胞、図１９Ａ）又は腫瘍細胞（Ｕ−２  ＯＳ細胞、図１９Ｂ）の細胞生存率をそれぞれ示す。
【０２１５】
図１９Ａの結果は、感染から７２時間後のＬ−Ｏ２細胞に対するウイルスＯＶＮ−ｄＵＬ４１及びＯＶＨ−ｄＵＬ４８の殺傷率が、それぞれ約１７．６７％及び１４．３３％であり、Ｌ−Ｏ２細胞に対する両方の殺傷能はウイルスＯＶＮの殺傷能よりも強かったことを示す。Ｌ−Ｏ２細胞に対するウイルスＯＶＮ−ｄＵＬ４３、ＯＶＮ−ｄＵＬ５５、ＯＶＮ−ｄＵＳ２、ＯＶＮ−ｄＬＡＴ及びＯＶＮ−ｄＮＦの殺傷率は、８．３３％〜１１．００％であり、ウイルスのＯＶＮの殺傷率とそれほど違いはなかった。
【０２１６】
図１９Ｂの結果は、感染から７２時間後のＵ−２  ＯＳ細胞に対するウイルスＯＶＮ、ＯＶＮ−ｄＵＬ５５、ＯＶＮ−ｄＵＳ２、ＯＶＮ−ｄＬＡＴ及びＯＶＮ−ｄＮＦの殺傷率が１００％であった（すなわち、腫瘍細胞に対して非常に高い殺傷能を有する）ことを示す。Ｕ−２  ＯＳ細胞に対するウイルスＯＶＮ−ｄＵＬ４１、ＯＶＮ−ｄＵＬ４３及びＯＶＮ−ｄＵＬ４８の殺傷能は顕著に減少された。
【０２１７】
Ｌ−Ｏ２細胞及びＵ−２  ＯＳ細胞に対するこれらの組み換えウイルスの殺傷率も、表６に提供される。
【０２１８】
【表６】
2020511160.tif 000008
【０２１９】
これらの結果は、ウイルスＯＶＮと同様に、ウイルスＯＶＮ−ｄＵＬ５５、ＯＶＮ−ｄＵＳ２、ＯＶＮ−ｄＬＡＴ及びＯＶＮ−ｄＮＦは、正常細胞（例えばＬ−Ｏ２細胞）に対して非常に限定的な殺傷能を有するにすぎないが、腫瘍細胞（例えばＵ−２  ＯＳ細胞）に対するそれらの殺傷能は非常に高かったことを示し、これは、４つの組み換えウイルスがウイルスＯＶＮと等価であったことを示す。ウイルスＯＶＮと比較して、ウイルスＯＶＮ−ｄＵＬ４１及びＯＶＨ−ｄＵＬ４８は、正常細胞（例えばＬ−Ｏ２細胞）に対する増強した殺傷能を有するのみならず、腫瘍細胞（例えばＵ−２  ＯＳ細胞）に対して顕著に減少した殺傷能を有し、これは、２つの組み換えウイルスが、正常細胞に対する増大した毒性及び減少した抗腫瘍活性を有していたことを示す。ウイルスＯＶＮと比較して、正常細胞（例えばＬ−Ｏ２細胞）に対するウイルスＯＶＮ−ｄＵＬ４３の殺傷活性は顕著に増強されなかったが、腫瘍細胞（例えばＵ−２  ＯＳ細胞）に対するその殺傷活性は顕著に減少された。
【０２２０】
具体的には、正常細胞において、ウイルスＯＶＮ−ｄＵＬ４１、ＯＶＮ−ｄＵＬ４３及びＯＶＨ−ｄＵＬ４８の殺傷能は、ウイルスのＯＶＮと比較して、それぞれ約７．６７％、１．００％及び４．３３％増加された。腫瘍細胞では、ウイルスＯＶＮと比較して、ウイルスＯＶＮ−ｄＵＬ４１、ＯＶＮ−ｄＵＬ４３及びＯＶＨ−ｄＵＬ４８の殺傷能は、それぞれ約７５．１３％、５１．８０％及び６７．４６％減少された。
【０２２１】
上記の実験結果は、本発明の組み換えＨＳＶウイルスにおいて、ＵＬ４１、ＵＬ４３及びＵＬ４８以外の非必須遺伝子（例えばＵＬ５５、ＵＳ２、ＬＡＴ及びＮＦ）が、更に修飾され得る（例えば、機能喪失型変異が挿入される、又は欠失される）ことを示す。
【０２２２】
本発明の特定の実施形態を詳細に記載したが、本発明の細部において様々な修飾及び変更がなされる得ることが当業者によって理解されよう。本発明の全範囲は、添付の特許請求の範囲及びその任意の等価物によって与えられる。
【図１Ａ】
2020511160.tif 000009
【図１Ｂ】
2020511160.tif 000010
【図２】
2020511160.tif 000011
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2020511160.tif 000016
【図８】
2020511160.tif 000017
【図９】
2020511160.tif 000018
【図１０】
2020511160.tif 000019
【図１１】
2020511160.tif 000020
【図１２】
2020511160.tif 000021
【図１３】
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【図１４】
2020511160.tif 000023
【図１５】
2020511160.tif 000024
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年11月12日(2019.11.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み換えＨＳＶウイルスであって、機能性のＩＣＰ０タンパク質及びＩＣＰ３４．５タンパク質を発現しないが、機能性ＵＬ４３タンパク質、機能性ＵＬ４１タンパク質（すなわち、ｖｈｓタンパク質）、機能性ＵＬ４８タンパク質（すなわち、ＶＭＷ６５タンパク質）又はそれらの任意の組み合わせを発現することができる、
組み換えＨＳＶウイルス。
【請求項２】
前記組み換えＨＳＶウイルスのゲノムが、以下の修飾を含む：
ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーの各々が独立して、機能喪失型変異を含む、又は欠失している、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている、かつ、
ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーの各々が独立して、機能喪失型変異を含む、又は欠失している、又は外因性ヌクレオチド配列で置換されている、
請求項１に記載の組み換えＨＳＶウイルス。
【請求項３】
前記組み換えＨＳＶウイルスのゲノムにおいて、
（１）前記ＩＣＰ０遺伝子の第１のコピーが第１の機能喪失型変異を含み、前記ＩＣＰ０遺伝子の第２のコピーが第２の機能喪失型変異を含み、かつ、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーが第３の機能喪失型変異を含み、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の第２のコピーが第４の機能喪失型変異を含む、又は、
（２）前記ＩＣＰ０遺伝子の第１のコピーが第１の機能喪失型変異を含み、前記ＩＣＰ０遺伝子の第２のコピーが第２の機能喪失型変異を含み、かつ、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーが欠失している、又は、
（３）前記ＩＣＰ０遺伝子の第１のコピーが第１の機能喪失型変異を含み、前記ＩＣＰ０遺伝子の第２のコピーが第２の機能喪失型変異を含み、かつ、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーが第３の外因性ヌクレオチド配列で置換され、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の第２のコピーが第４の外因性ヌクレオチド配列で置換されている、又は、
（４）前記ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーが欠失され、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーが第３の機能喪失型変異を含み、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の第２のコピーが第４の機能喪失型変異を含む、又は、
（５）前記ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーが欠失され、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーが欠失している、又は、
（６）前記ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピーが欠失され、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーが第３の外因性ヌクレオチド配列で置換され、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の第２のコピーが第４の外因性ヌクレオチド配列で置換されている、又は、
（７）前記ＩＣＰ０遺伝子の第１のコピーが第１の外因性ヌクレオチド配列で置換され、前記ＩＣＰ０遺伝子の第２のコピーが第２の外因性ヌクレオチド配列で置換され、かつ
前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーが第３の機能喪失型変異を含み、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の第２のコピーが第４の機能喪失型変異を含む、又は、
（８）前記ＩＣＰ０遺伝子の第１のコピーが第１の外因性ヌクレオチド配列で置換され、前記ＩＣＰ０遺伝子の第２のコピーが第２の外因性ヌクレオチド配列で置換され、かつ
前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーが欠失している、又は、
（９）前記ＩＣＰ０遺伝子の第１のコピーが第１の外因性ヌクレオチド配列で置換され、前記ＩＣＰ０遺伝子の第２のコピーが第２の外因性ヌクレオチド配列で置換され、かつ前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の第１のコピーが第３の外因性ヌクレオチド配列で置換され、前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の第２のコピーが第４の外因性ヌクレオチド配列で置換されている、
請求項２に記載の組み換えＨＳＶウイルス。
【請求項４】
前記第１の機能喪失型変異、前記第２の機能喪失型変異、前記第３の機能喪失型変異、及び前記第４の機能喪失型変異が、各々独立して、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、フレームシフト突然変異、塩基欠失、塩基置換、塩基付加、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、及び／又は、
前記第１の外因性ヌクレオチド配列、前記第２の外因性ヌクレオチド配列、前記第３の外因性ヌクレオチド配列、及び前記第４の外因性ヌクレオチド配列が、各々独立して、蛍光タンパク質、免疫調節ポリペプチド、サイトカイン、ケモカイン、抗体、及び細胞毒性ペプチドからなる群から選択される外来タンパク質をコードする、
請求項３に記載の組み換えＨＳＶウイルス。
【請求項５】
以下の任意の１つ以上：
（１）前記蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、
（２）前記免疫調節ポリペプチドが、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激分子（ＩＣＯＳ）、ＦＴＬ３Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ７０、４−１ＢＢ、ＧＩＴＲ、ＣＤ２８、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、
（３）前記サイトカインが、インターロイキン、インターフェロン、腫瘍壊死因子、コロニー刺激因子、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、
（４）前記ケモカインが、ＣＣＬ２、ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ７、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２０、ＸＣＬ−１、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、
（５）前記細胞毒性ペプチドが、チミジンキナーゼＴＫ（ＴＫ／ＧＣＶ）、ＴＲＡＩＬ、ＦａｓＬ、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、及び
（６）前記抗体が、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗Ｔｉｍ−３抗体、抗Ｌａｇ−３抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＣＤ７３抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＣＳＦ１Ｒ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＶＥＧＦＲ抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＰＤＧＦＲ抗体、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、
ことによって特徴づけられる、請求項４に記載の組み換えＨＳＶウイルス。
【請求項６】
前記組み換えＨＳＶウイルスのゲノムが、機能性ＵＬ４３タンパク質を発現することができるＵＬ４３遺伝子、機能性ＵＬ４１タンパク質を発現することができるＵＬ４１遺伝子（すなわち、ｖｈｓ遺伝子）、及び／又は機能性ＵＬ４８タンパク質を発現することができるＵＬ４８遺伝子（すなわち、ＶＭＷ６５遺伝子）を含む、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の組み換えＨＳＶウイルス。
【請求項７】
前記組み換えＨＳＶウイルスが、以下：
（１）１つ以上の非必須遺伝子が欠失又は変異導入されること、
（２）前記組み換えＨＳＶウイルスの必須遺伝子が欠失されず、機能喪失型変異を含まないこと、
（３）前記ＩＣＰ０遺伝子の２つのコピー及び前記ＩＣＰ３４．５遺伝子の２つのコピーを除いて、前記組み換えＨＳＶウイルスのゲノムが、野生型ＨＳＶウイルスの全ての他の遺伝子を含み、該他の遺伝子のいずれも機能喪失型変異を含まないこと、並びに、
（４）前記組み換えＨＳＶウイルスのゲノムが、１つ以上のＨＳＶ遺伝子の本来のプロモーターが腫瘍特異的プロモーターで置換される修飾を更に含むこと、
からなる群から選択される１つ以上の特徴を更に有する、
請求項６に記載の組み換えＨＳＶウイルス。
【請求項８】
以下の任意の１つ以上：
（１）前記非必須遺伝子が、ＵＬ３遺伝子、ＵＬ４遺伝子、ＵＬ１４遺伝子、ＵＬ１６遺伝子、ＵＬ２１遺伝子、ＵＬ２４遺伝子、ＵＬ３１遺伝子、ＵＬ３２遺伝子、ＵＳ３遺伝子、ＵＬ５１遺伝子、ＵＬ５５遺伝子、ＵＬ５６遺伝子、ＵＳ２遺伝子、ＵＳ１２遺伝子（すなわち、ＩＣＰ４７遺伝子）、ＬＡＴ遺伝子、ＪＱ６７３４８０．１のｎｔ５８５３〜ｎｔ７４８５に対応するヌクレオチドフラグメント、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されること、
（２）前記非必須遺伝子が、機能喪失型変異を含むか、又は、外因性ヌクレオチド配列で置換されること、
（３）前記必須遺伝子が、ＩＣＰ２７遺伝子、ＩＣＰ４遺伝子、ＶＰ５遺伝子、ｇＬ遺伝子、ｇＨ遺伝子、ｇＤ遺伝子、ｇＫ遺伝子、ｇＢ遺伝子、ｇＮ遺伝子、ＵＬ５遺伝子、ＵＬ６遺伝子、ＵＬ８遺伝子、ＵＬ９遺伝子、ＵＬ１２遺伝子、ＵＬ２５遺伝子、ＵＬ２６遺伝子、ＵＬ２８遺伝子、ＵＬ２９遺伝子、ＵＬ３０遺伝子、ＵＬ３３遺伝子、ＵＬ３６遺伝子、ＵＬ３８遺伝子、ＵＬ４２遺伝子、ＵＬ４８遺伝子、及びＵＬ５２遺伝子を含むこと、並びに、
（４）前記腫瘍特異的プロモーターがｈＴＥＲＴプロモーターであること、
によって特徴づけられる、請求項７に記載の組み換えＨＳＶウイルス。
【請求項９】
前記組み換えＨＳＶウイルスのゲノムが、
（１）ｈＴＥＲＴプロモーター等の腫瘍特異的プロモーターによる前記ＶＰ５遺伝子の本来のプロモーターの置換、
（２）ｈＴＥＲＴプロモーター等の腫瘍特異的プロモーターによる前記ＩＣＰ２７遺伝子の本来のプロモーターの置換、
（３）腫瘍特異的プロモーターによる前記ＩＣＰ４遺伝子の本来のプロモーターの置換、及び、
（４）前記ＵＬ５５遺伝子、前記ＵＳ２遺伝子、前記ＬＡＴ遺伝子及び前記ＪＱ６７３４８０．１のｎｔ５８５３〜ｎｔ７４８５に対応するヌクレオチドフラグメントの１つ以上の欠失又は変異導入、
からなる群から選択される１つ以上の修飾を更に含む、
請求項６に記載の組み換えＨＳＶウイルス。
【請求項１０】
前記組み換えＨＳＶウイルスは、以下の：
（１）前記組み換えＨＳＶウイルスは、ＨＳＶ−１ウイルス、ＨＳＶ−２ウイルス又はＨＳＶ−１／ＨＳＶ−２キメラウイルスであること、
（２）前記組み換えＨＳＶウイルスはＨＳＶ−１株ＫＯＳのゲノムに由来すること、及び、
（３）前記組み換えＨＳＶウイルスが第５の外因性ヌクレオチド配列を更に含むこと、
からなる群から選択される１つ以上の特徴を有する、
請求項１〜９のいずれか１項に記載の組み換えＨＳＶウイルス。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組み換えＨＳＶウイルスのゲノムを含む、又は請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組み換えＨＳＶウイルスのゲノムからなるウイルスベクター。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組み換えＨＳＶウイルスに感染している、又は請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組み換えＨＳＶウイルスのゲノムを含む、又は請求項１１に記載のウイルスベクターでトランスフェクトされている、宿主細胞。
【請求項１３】
前記細胞が、肺癌細胞、肝臓癌細胞、乳癌細胞、骨肉腫細胞、卵巣癌細胞、子宮頸癌細胞、前立腺癌細胞、神経膠腫細胞、黒色腫細胞、結腸直腸癌細胞、及び膵癌細胞からなる群から選択される腫瘍細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組み換えＨＳＶウイルスを得る方法であって、
（１）請求項１２又は１３に記載の宿主細胞を培養することと、
（２）前記宿主細胞に病変が生じた後、該宿主細胞を収集し、溶解させて前記宿主細胞の溶解物を得ることと、
（３）前記溶解物から前記組み換えＨＳＶウイルスを回収することと、
を含む、方法。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組み換えＨＳＶウイルス、又は請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組み換えＨＳＶウイルスのゲノム、又は請求項１１に記載のウイルスベクターと、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項１６】
以下の任意の１つ以上の：
（１）前記医薬組成物が、腫瘍、例えば肺癌、肝臓癌、乳癌、骨肉腫、卵巣癌、前立腺癌、神経膠腫、黒色腫、結腸直腸癌、及び膵臓癌の治療に対して使用されること、
（２）前記医薬組成物が注射液又は凍結乾燥粉体であること、
（３）前記医薬組成物が、治療的有効量の前記組み換えＨＳＶウイルス、又は前記組み換えＨＳＶウイルスのゲノム、又は前記ウイルスベクターを含むこと、
（４）前記医薬組成物が単位剤形で存在すること、並びに
（５）１０２ｐｆｕ〜１０９ｐｆｕの前記組み換えＨＳＶウイルスが、前記医薬組成物１単位用量当たりに含まれること、
によって特徴づけられる、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
被験体の腫瘍の治療における使用のための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組み換えＨＳＶウイルス、又は請求項１１に記載のウイルスベクター。
【請求項１８】
以下の任意の１つ以上の：
（１）前記腫瘍が、肺癌、肝臓癌、乳癌、骨肉腫、卵巣癌、前立腺癌、神経膠腫、黒色腫、結腸直腸癌、及び膵臓癌からなる群から選択されること、
（２）前記被験体が哺乳動物であること、及び
（３）前記被験体がヒトであること、
によって、特徴づけられる、請求項１７に記載の使用のための組み換えＨＳＶウイルス又はウイルスベクター。
【国際調査報告】
2020511160.tif 000029
2020511160.tif 000030
2020511160.tif 000031
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2020511160.tif 000033
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