(57)【要約】  本発明は、主にＫＲＡＳ突然変異を阻害し、さらにＫＲＡＳ依存性腫瘍細胞オートファジーを阻害し、腫瘍細胞のアポトーシスを促進するアカネ科環状ペプチドを有効成分とするオートファジー阻害剤を開示する。前記阻害剤は好ましくはナノミセル注射剤であり、結腸癌、直腸癌、肺癌、膵臓癌を含むＫＲＡＳ関連の癌の治療と予防のための薬剤の調製に使用できる。本発明に係るオートファジー阻害剤は腫瘍細胞オートファジーを効果的に阻害でき、その有効成分としてのアカネ科環状ペプチドは幅広い供給源が存在し、抽出技術が成熟し、その剤形や投薬方法は多様化しており、ＫＲＡＳ関連の癌の治療や予防に応用でき、将来的に臨床応用に有望である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アカネ科環状ペプチドを有効成分とすることを特徴とするオートファジー阻害剤。
【請求項２】
下記の構造式に示されるアカネ科環状ペプチドＲＡ−Ｖ（１）又はＲＡ−ＸＩＩ（２）を有効成分とすることを特徴とする請求項１に記載のオートファジー阻害剤。
【化１】
2020536914.tif 000006
【請求項３】
ナノミセル注射剤であることを特徴とする請求項１又は２に記載のオートファジー阻害剤。
【請求項４】
前記ナノミセル注射剤は、前記アカネ科環状ペプチドを有効成分とし、ブロックコポリマーを担体として製造形成されることを特徴とする請求項３に記載のオートファジー阻害剤。
【請求項５】
前記担体はｍＰＥＧ２０００−ＰＤＬＬＡ２０００両親媒性ブロックコポリマーであることを特徴とする請求項４に記載のオートファジー阻害剤。
【請求項６】
前記ナノミセル注射剤の粒径は１０〜１００ｎｍであることを特徴とする請求項４に記載のオートファジー阻害剤。
【請求項７】
前記ナノミセル注射剤の薬物担持量は１〜１０％であることを特徴とする請求項４に記載のオートファジー阻害剤。
【請求項８】
ＫＲＡＳ関連の癌を治療と予防する薬物の調製のための請求項１〜７のいずれか１項に記載のオートファジー阻害剤の使用。
【請求項９】
前記ＫＲＡＳ関連の癌は結腸癌、直腸癌、肺癌と膵臓癌を含むことを特徴とする請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記阻害剤は、ＫＲＡＳ突然変異を阻害し、特にＫＲＡＳ依存性腫瘍細胞オートファジーを阻害することを通して、腫瘍細胞のアポトーシスを誘発することを特徴とする請求項８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬技術に属し、具体的には、アカネ科環状ペプチドを有効成分とするオートファジー阻害剤、及びその調製方法と応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＫＲＡＳ遺伝子は細胞内シグナル伝達経路の「下流領域」にあるシグナル伝達タンパク質であり、細胞の成長や生存と分化に重要な影響を与える。通常の生理学的条件下では、細胞が外界によって刺激された後、ＥＧＦＲなどのシグナル伝達経路が活性化される。活性化されたＥＧＦＲなどのチロシンキナーゼによって野生型ＫＲＡＳがリン酸化された後、一時的に活性化される。活性化された後のＫＲＡＳはシグナル伝達経路の下流にあるシグナルタンパク質を活性化し、その後、ＫＲＡＳは急速に不活性化される。ＫＲＡＳの活性化／不活性化効果は制御されるべきである。突然変異型ＫＲＡＳタンパク質は、異常なタンパク質機能を引き起こし、ＥＧＦＲ活性化シグナルによる刺激がなくても依然として活性化される状態にあり、その機能状態は制御不能である。このため、ＫＲＡＳ突然変異型ＨＣＴ１１６細胞などの腫瘍細胞の継続的な増殖が起こる。また、ＫＲＡＳ突然変異型は、Ｈ４４１、Ｈ３５８細胞などのＫＲＡＳ依存型と、Ａ５４９、Ｈ４６０細胞などの非依存型に分類される。そのうち、ＫＲＡＳ依存型腫瘍細胞の成長や生存はＫＲＡＳ遺伝子に完全に依存する。さまざまなヒトの癌において、ＫＲＡＳ遺伝子は、結腸癌、直腸癌、肺癌及び膵臓癌などのヒトの悪性腫瘍で頻繁に変異しており、関連する癌の治療が困難になる。ＫＲＡＳ遺伝子活性化変異に対する標的薬物治療は、医療従事者にとって優れた選択肢となるが、残念ながら、今日まで、ＫＲＡＳ遺伝子の突然変異による腫瘍の治療のための効果的な薬物対処手段は臨床上ない。近年、全ゲノムＲＮＡｉスクリーニングを通じて、国際的なリーディングリサーチグループが癌遺伝子ＫＲＡＳと相乗的に致命的な関係を持つ複数の遺伝子を発見した。ＴＡＫ１はその中の１つであり、ＴＡＫ１の活性の阻害は、ＫＲＡＳ依存性細胞アポトーシスを誘発する可能性があり、ＴＡＫ１の活性はＫＲＡＳ依存性細胞の生存の維持に対して非常に重要である。そのため、ＴＡＫ１阻害剤を用いると、ＫＲＡＳ依存性腫瘍細胞の生存が選択的に阻害され、ＫＲＡＳ依存性腫瘍細胞に対する新たな標的治療手段を提供することができる。
【０００３】
オートファジーは細胞の分解代謝過程である。細胞の生存は、細胞の成長、分化、恒常性及び栄養不足の条件下で重要な役割を果たし、生物の重要な自己保護と防御メカニズムである。具体的に、オートファジーは、細胞自身の代謝と再生に対応するように、細胞内の二重層膜構造によって、細胞質の一部、損傷したタンパク質、ミトコンドリア、ゴルジ体及び小胞体などの老化又は損傷したオルガネラが包まれ、それがリソソームに送達され、かつそれと融合してオートリソソームが形成され、タンパク質分解酵素によって内容物が加水分解されて消化、分解されることを指す。ＫＲＡＳ依存性腫瘍細胞は高い基礎的オートファジーを備える。飢餓状態及び腫瘍形成条件下では、腫瘍細胞の生存には高い基礎的オートファジーが必要である。ＫＲＡＳ依存性腫瘍細胞において、ＴＡＫ１が活性化されることで、ＴＡＫ−ＡＭＰＫシグナル伝達経路が活性化され、腫瘍細胞の基礎的オートファジーが強化され、ＴＲＡＩＬによって誘発される細胞死から細胞が保護される。
【０００４】
ポリマーミセルはナノシステム研究の重要な内容の１つであり、ここ数年間の研究ホットスポットである。ポリマーミセルは、薬物担持疎水性コアと親水性シェルという２つの部分を含む。両親媒性ブロックポリマーは疎水性セグメントと親水性セグメントとを含む。水溶液中の濃度が臨界ミセル濃度を超えると、疎水性セグメント同士が互いに接近して、疎水性コアを形成し、親水性セグメントは外側向きに親水性シェルを形成し、自発的にミセルを形成する。疎水性薬物は疎水作用又は共有結合の方式によって疎水性コアに包まれる。そのため、ポリマーミセルは水溶性の低い薬物担体として、薬物送達過程において大きな利点と可能性とを示す。ポリマーミセルは、低分子量の抗癌剤、造影剤、タンパク質、プラスミドＤＮＡ及び逆転写ＤＮＡなどのさまざまな種類の薬物を送達できる。現在、アドリアマイシン及びパクリタキセルなどの多くの抗腫瘍薬候補についてこの剤形で臨床試験が行われている。これらの研究は、ミセルがナノドラッグデリバリーシステムとして非常に優れた使用価値があることを証明し、ミセルナノドラッグデリバリーシステムに適用される薬物の開発のために確かな実用的基盤を提供する。
【０００５】
アカネ科環状ペプチド（Ｒｕｂｉａｃｅａｅ−ｔｙｐｅ  ｃｙｃｌｏｐｅｐｔｉｄｅｓ、ＲＡｓ）はアカネ科植物に含有され、アカネ科植物の中に一般に存在する二環式ホモ環式ヘキサペプチド化合物である。アカネ科環状ペプチドは主に１つのＤ−α−アラニン、１つのＬ−α−アラニン、３つのＬ−Ｎ置換α−チロシン、及び他のＬ−コード化α−アミノ酸がペプチド鎖で繋がることにより形成された１つのシクロヘキサペプチドであり、６つのアミノ酸が１８員環に凝縮されている。そのうち、２つの隣接しているチロシン間にあるベンゼン環が酸素ブリッジを介して接続され、大きな張力を持つ１４員環を形成する。ＲＡｓはその新規な二環式構造と、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでの顕著な抗腫瘍活性により、注目を集めている。本願の発明者の以前の研究は、ＲＡｓがＴＡＫ１のキナーゼ活性を阻害できることを示した（中国発明特許番号：ＣＮ２０１４１０４４５３２５．０）。従来の技術において、ＫＲＡＳ突然変異を阻害し、特にＫＲＡＳ依存性腫瘍細胞オートファジーを阻害してそのアポトーシスを促進し、及び抗腫瘍薬とするアカネ科環状ペプチドのナノミセル注射剤の調製方法及びその応用に関連する技術はない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来技術の空白に対し、本発明は、アカネ科環状ペプチド化合物を有効成分とするオートファジー阻害剤、特にＫＲＡＳ突然変異を阻害し、さらにＫＲＡＳ依存性腫瘍細胞のオートファジーを阻害し、腫瘍細胞のアポトーシスを促進するオートファジー阻害剤を提供することを目的とする。本発明は、上記アカネ科環状ペプチド化合物のナノミセル注射剤及びその調製方法と応用をさらに提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に記載のオートファジー阻害剤は、アカネ科環状ペプチドを有効成分とする。
【０００８】
さらに、前記阻害剤は、ＫＲＡＳ突然変異の阻害に最適であり、特に腫瘍細胞のアポトーシスを誘発するＫＲＡＳ依存性腫瘍細胞オートファジーの阻害に最適である。
【０００９】
具体的に、本出願では、ＫＲＡＳ依存性腫瘍細胞を対象とし、培養した腫瘍細胞をＲＡｓで処理し、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法でオートファジー関連タンパク質を検出し、ＧＦＰ−ＬＣ３トランスフェクションでオートファジー液胞の形成を検出した。かつ細胞死の程度を検出し、前記化合物が細胞オートファジーを阻害することが証明された。ＫＲＡＳ依存性腫瘍細胞を対象とし、培養した腫瘍細胞をＲＡｓで処理し、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法を用いてアポトーシス関連タンパク質を検出し、ＰＩ／Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ二重染色法でアポトーシス細胞の比率を検出した。前記化合物が細胞のアポトーシスを誘発することが証明された。ＫＲＡＳ突然変異のＨＣＴ１１６移植腫瘍モデル及びＫＲＡＳ依存性Ｈ４４１移植腫瘍モデルを選択してｉｎ  ｖｉｖｏでのＲＡｓの抗腫瘍活性を評価した。
【００１０】
さらに、前記アカネ科環状ペプチドは下記の構造式に示されるＲＡ−Ｖ（１）又はＲＡ−ＸＩＩ（２）である。
【００１１】
【化１】
2020536914.tif 000002
【００１２】
前記阻害剤は、薬理学的に許容される任意の剤形であってよく、その用量は、薬理学的に許容される任意の用量である。
【００１３】
前記阻害剤は好ましくナノミセル注射剤である。前記ナノミセル注射剤の調製方法は、アカネ科環状ペプチドを有効成分とし、ブロックコポリマーを担体としてコポリマーミセルを形成する。それにより、有効成分の溶解度と生物学的利用能を明らかに高め、その薬物動態学の性質を改善し、治療効果を高めることができる。ここで、前記ブロックコポリマー担体材料が好ましくはｍＰＥＧ２０００−ＰＤＬＬＡ２０００両親媒性ブロックコポリマーである。
【００１４】
具体的に、前記ナノミセル注射剤の調製方法は、有効成分とｍＰＥＧ２０００−ＰＤＬＬＡ２０００ブロックコポリマーとをともに有機溶媒に溶解し、振とうして充分溶解させ、均一に混合させ、真空で回転蒸発させて有機溶媒を除去し、混合薬膜を取得し、その後、注射用水を加え、振とうして薬膜を充分溶解させ、ミセル溶液を取得し、微多孔膜で濾過して除菌し、凍結乾燥し、無菌条件下で分包して、ナノミセル注射剤を製造して得る。
【００１５】
本発明において、前記ミセルはコロイド分散系の１種であり、会合コロイドに属し、溶液における両親媒性ブロックポリマーの濃度が閾値を超えた後、その分子又はイオンが自動的に会合して形成したコロイドサイズの凝集ナノ粒子である。ミセルは薬物の可溶化に使用され、ドラッグデリバリーシステムの担体としても使用でき、安定性を高め、治療効果を向上させ、毒性を減らす。本発明に係るポリマーミセル製剤は、有効成分の水溶性を明らかに高めることができ、腫瘍血管に対するポリマーミセルの血管透過性亢進と残存メカニズム（ＥＰＲ効果）を利用して、ナノミセルを受動的に標的化し、腫瘍組織に集中させる。それにより、抗腫瘍治療の効果を改善し、薬物の毒性と副作用を減らす。
【００１６】
調製したナノミセル注射剤の粒径は１０〜１００ｎｍである。
【００１７】
ここで、調製したナノミセル注射剤の薬物担持量、すなわち有効成分は、ｍＰＥＧ２０００−ＰＤＬＬＡ２０００ジブロックコポリマーにおいて１〜１０重量％を占める。
【００１８】
疾患の治療と予防に有利なオートファジー阻害薬物の調製に用いられる上記阻害剤の応用も、本発明の保護範囲内に含まれる。前記応用は腫瘍細胞のオートファジーの阻害を利用した疾患への応用を含むが、それらに限定されない。
【００１９】
本発明の阻害剤は、さらに、混合治療法を提供するように、他の薬物とともに使用することができる。ここで、他の薬物は上記阻害剤とともに組成物製剤を構成し、或いは、単独的な組成物として提供され、同時又は非同時投薬に用いることができる。
【００２０】
ここで、上記アカネ科環状ペプチドＲＡｓの調製方法については中国発明特許ＣＮ２０１４１０４４５３２５．０が参照される。
【発明の効果】
【００２１】
本発明に記載のオートファジー阻害剤は、細胞のオートファジーを効果的に阻害することができる。その有効成分としてのアカネ科環状ペプチドは幅広い供給源が存在し、抽出技術は成熟しており、その剤形や投薬方法は多様化しており、ＫＲＡＳ関連の癌の治療や予防に応用でき、将来的に臨床応用に有望である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１はアカネ科環状ペプチドＲＡ−Ｖ（１）のＫＲＡＳ依存性腫瘍細胞オートファジーに対する阻害を示す。ここで、（１）：ＲＡ−Ｖ（１）はＫＲＡＳ依存性肺癌細胞Ｈ４４１及びＨ３５８の増殖を阻害する。（２）：ＲＡ−Ｖ（１）はＫＲＡＳ依存性肺癌細胞Ｈ４４１及びＨ３５８のＧＦＰ−ＬＣ３オートファゴソームの形成を阻害する。（３）：ＲＡ−Ｖ（１）はＫＲＡＳ依存性肺癌細胞オートファジー関連タンパク質の発現を阻害する。
【図２】図２は、アカネ科環状ペプチドＲＡ−Ｖ（１）がＫＲＡＳ依存性腫瘍細胞のアポトーシスを誘発することを示す。ここで、（１）：Ａｎｎｘｉｎ−Ｖ／ＰＩ染色により、ＲＡ−Ｖ（１）がＫＲＡＳ依存性肺癌細胞のアポトーシスを促進することがわかる。（２）：Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ検出により、ＲＡ−Ｖ（１）がＫＲＡＳ依存性肺癌細胞のアポトーシスを誘発することがわかる。
【図３】図３はアカネ科環状ペプチドＲＡ−Ｖ（１）ナノミセルの特性を示す。ここで、（１）：ミセル粒径、（２）：リリースカーブである。
【図４】図４はアカネ科環状ペプチドＲＡ−Ｖ（１）とＲＡ−ＸＩＩ（２）ナノミセル注射剤のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍試験を示す。ここで、（１）：ＲＡ−Ｖ（１）はＫＲＡＳ依存性肺癌細胞に対してより良い固形腫瘍阻害効果がある。（２）：ＫＲＡＳ突然変異のＨＣＴ１１６モデルにおけるＲＡ−Ｖ（１）の抗腫瘍効果である。（３）：ＫＲＡＳ突然変異のＨＣＴ１１６モデルにおけるＲＡ−ＸＩＩ（２）の抗腫瘍効果である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
次に図面を合わせて、具体的な実施例を挙げて本発明の実質的な内容をさらに説明する。ただし、これによって本発明は限定されない。本発明の実質に基づいて本発明に対して行い得るすべての改善がいずれも本発明の範囲内に属する。
【００２４】
前記アカネ科環状ペプチドＲＡ−Ｖ（１）とＲＡ−ＸＩＩ（２）の調製については特許ＣＮ２０１４１０４４５３２５．０が参照される。
【００２５】
実施例１
（ＲＡ−Ｖ（１）のＫＲＡＳ依存性腫瘍細胞オートファジーに対する阻害）
ＭＴＴ法で細胞生存率を測定した。１０％のＦＢＳ培地で一晩培養した非ＫＲＡＳ依存性Ａ５４９とＨ４６０及びＫＲＡＳ依存性Ｈ４４１とＨ３５８細胞を、パンクレアチンを加えて消化して、細胞懸濁液を調製し、適切な濃度で９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルで接種した。細胞が完全に接着するまでＣＯ２インキュベーターの中で２４時間培養し、最終濃度０、５０、１００、２００ｎＭのＲＡ−Ｖ（１）を加えて、２４時間作用させた後、ウェル毎に２０μｌのＭＴＴ溶液（ＰＢＳで５ｍｇ／ｍｌに調製、ｐＨ＝７．４）を加え、引き続き４時間インキュベートし、培養を終了した。ウェル内の培養液の上澄み液を注意深く吸い上げて捨てた。ウェル毎に１５０μｌのＤＭＳＯを加え、１０分間振とうし、結晶物を充分溶かした。ＥＬＩＳＡ測定機器でウェル毎の４９０ｎｍ波長の光吸収値を測定し、結果を記録し、時間を横軸にし、光吸収値を縦軸として細胞成長曲線を作成した。
【００２６】
１０％のＦＢＳ培地で一晩培養したＫＲＡＳ依存性Ｈ４４１とＨ３５８細胞を適切な密度で２４ウェルプレートに撒き、２４時間後に０、５０、１００、２００ｎＭのＲＡ−Ｖ（１）を加えて、２４時間作用させた後、細胞を収集し、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ実験でオートファジー関連タンパク質ＬＣ３、Ａｔｇ７及びＢｅｃｌｉｎ１の発現レベルを検出した。
【００２７】
１０％のＦＢＳ培地で一晩培養したＫＲＡＳ依存性Ｈ４４１とＨ３５８細胞を適切な密度で２４ウェルプレートに撒き、ＧＦＰ−ＬＣ３プラスミドのトランスフェクションを行わせた。２４時間後にＲＡ−Ｖ（１）を加えて、２４時間作用させた後、蛍光顕微鏡でＧＦＰ−ＬＣ３の位置状況を観察し、オートファジー細胞の数を定量的に計算した。
【００２８】
試験の結果が図１に示される。この結果により、ＲＡ−Ｖ（１）がＫＲＡＳ依存性肺癌細胞の生存を阻害した。ＬＣ３−ＩＩ、Ａｔｇ７とＢｅｃｌｉｎ１は、ＲＡ−Ｖ（１）濃度の増加とともに減少した。ＲＡ−Ｖ（１）で処理された細胞は、ブランクグループのＧＦＰ−ＬＣ３と比較して有意に減少した。ＲＡ−Ｖ（１）がＨ４４１及びＨ３５８のオートファジーを有意に阻害することが証明された。
【００２９】
実施例２
（ＲＡ−Ｖ（１）は明らかにＫＲＡＳ依存性腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する）
１０％のＦＢＳ培地で一晩培養した非ＫＲＡＳ依存性Ａ５４９とＨ４６０及びＫＲＡＳ依存性Ｈ４４１とＨ３５８細胞を、パンクレアチンを加えて消化して、細胞懸濁液を形成し、適切な濃度で６ウェルプレートに接種した。２４時間後にＲＡ−Ｖ（１）を加え、２４時間処理し、パンクレアチンを加えて消化させた。室温において２０００ｒｐｍで５〜１０分間遠心し、細胞を収集した。予め冷やしておいた１×ＰＢＳ（４℃）に細胞を１回懸濁し、２０００ｒｐｍで５〜１０分間遠心し、細胞を洗浄した。３００μＬの１×Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ加え細胞を懸濁した。５μＬのＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣを加えて均一に混合した後、遮光保存し、室温で１５分間インキュベートした後、機器に置く５分前に５μＬのＰｌを加えて染色し、フローサイトメーターで細胞を検出した。
【００３０】
１０％のＦＢＳ培地で一晩培養した非ＫＲＡＳ依存性Ａ５４９とＨ４６０、ＫＲＡＳ依存性Ｈ４４１とＨ３５８細胞を適切な密度で２４ウェルプレートに撒き、２４時間作用させた後に細胞を収集した。Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ実験でアポトーシス関連タンパク質ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ＸＬ及びＣａｐｓａｓｅ３の発現レベルを検出した。
【００３１】
実験の結果は図２に示される。この結果により、アポトーシスのＰＩ／Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ二重染色検出によって、ＲＡ−Ｖ（１）がＨ３５８及びＨ４４１細胞のアポトーシスを有意に誘発し、Ｈ４６０及びＡ５４９に有意な影響を及ぼさなかったことが示された。関連するアポトーシスタンパク質Ｃａｐｓａｓｅ３、及びアポトーシス阻害タンパク質ＢＣＬ−２及びＢＣＬ−ＸＬの発現の検出によって、同様にＲＡ−ＶがＨ３５８とＨ４４１細胞のアポトーシスを有意に誘発し、Ｈ４６０及びＡ５４９に有意な影響を及ぼさなかったことが示された。
【００３２】
実施例３
（ｍＰＥＧ２００−ＰＤＬＬＡ２０００ミセルの調製方法）
（１）溶解：ｍＰＥＧ２０００−ＰＤＬＬＡ２０００とＲＡ−Ｖ（１）とを重量比３０〜１０：１として薬物担持ナノミセルを調製した。表１に従ってｍＰＥＧ２０００−ＰＤＬＬＡ２０００とＲＡ−Ｖ（１）を正確に秤取し、それらを１００ｍＬのジクロロメタン入り梨型フラスコの中に混合して溶かし、持続的に振とうし、薬物と材料を溶解させた。その後、２５ｍＬのメタノールを加え、持続的に振とうし、薬物と材料を完全に溶解させ、約５分間後に透明な溶液が得られた。
【００３３】
（２）溶媒を蒸留して除去した：梨型フラスコを回転蒸発機器に置き、真空回転蒸発させた。回転速度は１００回転／分であり、温度を６０℃に制御した。有機溶媒をすべて除去した後、温度を４０℃に下げ、残留の有機溶媒を除去するように、真空で引き続き３時間回転蒸発させた。透明なゲル状のＲＡ−Ｖ（１）とｍＰＥＧ２０００−ＰＤＬＬＡ２０００混合薬膜が得られた。
【００３４】
（３）再溶解：６０℃に予熱された０．９％の塩化ナトリウム含有の注射用水２５ｍＬを加え、高速振とうし、ゲル状薬膜を充分溶解させ、１ｍｇ／ｍＬのＲＡ−Ｖ（１）ナノミセル溶液を得た。
【００３５】
（４）濾過と除菌：ＲＡ−Ｖ（１）ナノミセル溶液を０．２２μｍの微多孔膜で濾過して除菌した。
【００３６】
（５）分包、凍結乾燥し、ＲＡ−Ｖ（１）ナノミセル凍結乾燥粉末を製造し取得した。
【００３７】
（６）キャップを付けて、完成品としてのＲＡ−Ｖ（１）ナノミセル注射剤を取得した。
【００３８】
実施例４
（ＲＡ−Ｖ（１）ナノミセルの特性）
（１）ＲＡ−Ｖミセルの粒径試験：実施例３で製造したミセル溶液に水を加えて５０倍希釈し、マルバーン粒度分析計でミセルの粒径を測定した。その結果が表１に示される。
【００３９】
【表１】
2020536914.tif 000003
【００４０】
図３に示される特性により、ミセルの粒径は一般に１０〜１００ｎｍであった。本発明により製造されたミセルの粒径はいずれも範囲内にあり、本発明のプロセスが利用可能であることが示された。
【００４１】
（２）カプセル化率の検出：実施例３により調製された注射用ナノミセルを１ｍＬの水に溶解し、５０μＬの溶液を９５０μＬのアセトニトリルに加え、振とうして均一に混合し、３分間遠心させ、上澄み液を取った。０．４５μｍの微多孔膜で濾過し、ＨＰＬＣでＲＡ−Ｖ（１）の含量を検出した。コポリマーとＲＡ−Ｖ（１）調製におけるカプセル化率を計算して、その可溶化効果を評価した。その結果は以下のとおりである。
【００４２】
【表２】
2020536914.tif 000004
【００４３】
ナノミセルの含量検出の結果により、本発明におけるコポリマーのＲＡ−Ｖ（１）に対する薬物担持能力が高いことが示された。９０％以上のＲＡ−Ｖ（１）がナノミセルに製造され、本発明に係る方法の可溶化の効果が充分に示された。
【００４４】
（３）ナノミセルのＲＡ−Ｖ（１）に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出能力の検出：実施例３で製造されたＲＡ−Ｖ（１）ナノミセル又は等量のＲＡ−Ｖ（１）粉末を透析バッグに入れ、透析を行った。透析媒体は０．５％ＳＤＳのＰＢＳ溶液とした。各時点で１ｍＬの透析液を取り出し、かつ１ｍＬの透析液を補給し、ＨＰＬＣでＲＡ−Ｖ（１）の含量を検出した。図３に示すように、液体を交換する度に測定されたＲＡ−Ｖ（１）の含量を累加して、時間に基づいて図を作成することで、ＲＡ−Ｖ（１）に対するミセルの放出曲線を取得した。この結果、ＲＡ−Ｖ（１）ナノミセルの放出が８９％に達することが示され、実施例３で製造されたＲＡ−Ｖ（１）ナノミセル放出性能は良好であった。
【００４５】
実施例５
（１）ＲＡ−Ｖ（１）ナノミセル注射剤のヒト肺癌移植腫瘍に対するｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍阻害作用
ヒト肺癌細胞ＫＲＡＳ依存性Ｈ４４１とＫＲＡＳ非依存性Ｈ４６０を生理食塩水で１×１０７個／ｍＬに希釈した。該細胞懸濁液１００μＬをＢＡＢＬ／ｃヌードマウスの左脇の下の皮下に接種し、７日間成長させて、担癌マウスモデルを作製した。接種後によく成長した担癌マウスをランダムに組分けし、実施例３で製造されたＲＡ−Ｖナノミセル注射剤を尾静脈に投薬し、隔日で１回投薬した。１４日間投薬した後に動物を殺し、腫瘍を剥がして重量を測り、腫瘍阻害率を計算し、統計処理を行った。腫瘍阻害率（％）＝（対照群の平均腫瘍重量−実験群の平均腫瘍重量）×１００／対照群の平均腫瘍重量。試験結果が図４に示される。この結果により、ＲＡ−Ｖ（１）の２．５ｍｇ／ｋｇはＫＲＡＳ非依存性Ｈ４６０モデルにおいて効果がないが、ＫＲＡＳ依存性Ｈ４４１モデルにおいて効果的であることが示された。腫瘍阻害率は５０．４％であった。
【００４６】
（２）ヒト結腸癌のＫＲＡＳ突然変異によるＨＣＴ１１６ヌードマウス移植腫瘍に対するＲＡ−Ｖ（１）ナノミセル注射剤のｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍阻害作用
ＨＣＴ１１６を無血清ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５ａ培地で１×１０７個／ｍＬに希釈した該細胞懸濁液１００μＬをＢＡＢＬ／ｃヌードマウスの左脇の下の皮下に接種し、７日間成長させ、担癌マウスモデルを作製した。接種後によく成長した担癌マウスをランダムに組分けし、実施例３で製造されたＲＡ−Ｖナノミセル注射剤を、尾静脈投薬し、隔日で１回投薬した。１４日間投薬した後に使用した動物を殺し、腫瘍を剥がして重量を測り、腫瘍阻害率を計算し、統計処理を行った。腫瘍阻害率（％）＝（対照組の平均腫瘍重量−実験組の平均腫瘍重量）×１００／対照組の平均腫瘍重量。試験結果が図４に示される。この結果により、ＲＡ−Ｖ（１）の高用量及び中用量のＲＡ−Ｖ（１）の腫瘍阻害率がそれぞれ６６．６７％及び４１．６７％であった。
【００４７】
（３）ヒト結腸癌のＫＲＡＳ突然変異によるＨＣＴ１１６ヌードマウス移植腫瘍に対するＲＡ−ＸＩＩ（２）ナノミセル注射剤のｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍阻害作用
ＨＣＴ１１６を無血清ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５ａ培地で１×１０７個／ｍＬに希釈した。該細胞懸濁液１００μＬをＢＡＢＬ／ｃヌードマウスの左脇の下の皮下に接種し、７日間成長させ、担癌マウスモデルを作製した。接種後によく成長した担癌マウスをランダム組分けし、ＲＡ−ＸＩＩ（２）注射剤を尾静脈投与し、隔日で１回投薬した。１４日間投薬した後に使用した動物を殺し、腫瘍を剥がして重量を測り、腫瘍阻害率を計算し、統計処理を行った。腫瘍阻害率（％）＝（対照組の平均腫瘍重量−実験組の平均腫瘍重量）×１００／対照組の平均腫瘍重量。試験結果が図４に示される。この結果により、ＲＡ−ＸＩＩ（２）の高用量及び中用量の腫瘍阻害率がそれぞれ７９．９２％及び６８．４７％であったことが示された。
【００４８】
（付記）
（付記１）
アカネ科環状ペプチドを有効成分とすることを特徴とするオートファジー阻害剤。
【００４９】
（付記２）
下記の構造式に示されるアカネ科環状ペプチドＲＡ−Ｖ（１）又はＲＡ−ＸＩＩ（２）を有効成分とすることを特徴とする付記１に記載のオートファジー阻害剤。
【化２】
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【００５０】
（付記３）
ナノミセル注射剤であることを特徴とする付記１又は２に記載のオートファジー阻害剤。
【００５１】
（付記４）
前記ナノミセル注射剤は、前記アカネ科環状ペプチドを有効成分とし、ブロックコポリマーを担体として製造形成されることを特徴とする付記３に記載のオートファジー阻害剤。
【００５２】
（付記５）
前記担体はｍＰＥＧ２０００−ＰＤＬＬＡ２０００両親媒性ブロックコポリマーであることを特徴とする付記４に記載のオートファジー阻害剤。
【００５３】
（付記６）
前記ナノミセル注射剤の粒径は１０〜１００ｎｍであることを特徴とする付記４に記載のオートファジー阻害剤。
【００５４】
（付記７）
前記ナノミセル注射剤の薬物担持量は１〜１０％であることを特徴とする付記４に記載のオートファジー阻害剤。
【００５５】
（付記８）
ＫＲＡＳ関連の癌を治療と予防する薬物の調製のための付記１〜７のいずれか１つに記載のオートファジー阻害剤の使用。
【００５６】
（付記９）
前記ＫＲＡＳ関連の癌は結腸癌、直腸癌、肺癌と膵臓癌を含むことを特徴とする付記８に記載の使用。
【００５７】
（付記１０）
前記阻害剤は、ＫＲＡＳ突然変異を阻害し、特にＫＲＡＳ依存性腫瘍細胞オートファジーを阻害することを通して、腫瘍細胞のアポトーシスを誘発することを特徴とする付記８に記載の使用。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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