(57)【要約】本開示は、疾患遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子調節に関する、アルツハイマー病の診断および治療の分野である。本明細書には、アルツハイマー病（ＡＤ）などの１つまたは複数のタウオパチーを診断、予防、および／または処置するための方法および組成物が開示されている。特に、本明細書には、遺伝子操作転写因子リプレッサー（タウ発現を抑制する）を含む、ＡＤなどの少なくとも１つのタウオパチーを処置するようにタウ対立遺伝子を修飾する（例えば、その発現を調節する）ための方法および組成物が提供されている。
2020500526.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微小管結合タンパク質タウ（ＭＡＰＴ）遺伝子の遺伝子モジュレーターであって、
該ＭＡＰＴ遺伝子の少なくとも１２個のヌクレオチドの標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメイン、および
転写制御ドメインまたはヌクレアーゼドメイン
を含む遺伝子モジュレーター。
【請求項２】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）、ＴＡＬ−エフェクタードメインタンパク質（ＴＡＬＥ）、または単鎖ガイドＲＮＡを含む、請求項１に記載の遺伝子モジュレーター。
【請求項３】
前記転写制御ドメインが、抑制ドメインまたは活性化ドメインを含む、請求項１または請求項２に記載の遺伝子モジュレーター。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の遺伝子モジュレーターをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを含む遺伝子送達ビヒクル。
【請求項６】
ＡＡＶベクターを含む、請求項５に記載の遺伝子送達ビヒクル。
【請求項７】
請求項１から３に記載の１つまたは複数の遺伝子モジュレーター、請求項４に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチド、および／または請求項５または６に記載の１つまたは複数の遺伝子送達ビヒクルを含む医薬組成物。
【請求項８】
前記遺伝子モジュレーターが、ヌクレアーゼドメインを含み、該遺伝子モジュレーターが、前記ＭＡＰＴ遺伝子を切断する、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
切断された前記ＭＡＰＴ遺伝子に組み込まれるドナー分子をさらに含む、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１から３に記載の１つまたは複数の遺伝子モジュレーター、請求項４に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチド、請求項５または６に記載の１つまたは複数の遺伝子送達ビヒクル、および／または請求項７から９のいずれかに記載の医薬組成物を含む単離細胞。
【請求項１１】
対象のＭＡＰＴ発現を調節するための、請求項１から３に記載の１つまたは複数の遺伝子モジュレーター、請求項４に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチド、請求項５または６に記載の１つまたは複数の遺伝子送達ビヒクル、および／または請求項７から９のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
【請求項１２】
ＭＡＰＴ発現が抑制される、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記対象への投与が、脳室内、髄腔内、頭蓋内、静脈内、後眼窩的、または槽内である、請求項１１または１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記対象中のＭＡＰＴ発現の抑制が、タウオパチーを処置および／または予防する、請求項１１から１３のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
前記対象中のタウの量が低減される、請求項１１から１４のいずれかに記載の使用。
【請求項１６】
請求項１から３に記載の１つまたは複数の遺伝子モジュレーター、請求項４に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチド、請求項５または６に記載の１つまたは複数の遺伝子送達ビヒクル、請求項７から９のいずれかに記載の医薬組成物、および／または使用のための指示を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年１２月１日に出願された米国仮出願第６２／４２８，８７１号、２０１７年１月２６日に出願された米国仮出願第６２／４５０，８９５号、２０１７年３月２日に出願された米国仮出願第６２／４６６，１９８号、２０１７年５月３日に出願された米国仮出願第６２／５００，８０７号、および２０１７年１１月１０日に出願された米国仮出願第６２／５８４，３４２号の利益を主張し、それらの開示は、その全体が本明細書において参考として援用される。
【０００２】
技術分野
本開示は、アルツハイマー病などのタウオパチーの診断および治療の分野に属する。
【背景技術】
【０００３】
多数の、恐らくはほとんどの生理学的および病態生理学的プロセスは、遺伝子発現の異常な上方または下方制御と関連付けることができる。例としては、ごく一部の例にすぎないが、関節リウマチにおける炎症性（proinflamatory）サイトカインの不適切な発現、高コレステロール血症における肝臓ＬＤＬ受容体の過少発現、固形腫瘍増殖における血管新生促進性因子の過剰発現および抗血管新生因子の過少発現が挙げられる。加えて、遺伝子発現を変更することにより、ウイルス、細菌、真菌、および原生動物などの病原性生物をコントロールすることができる可能性がある。
【０００４】
遺伝子のプロモーター領域は、典型的には、近位の、コアの、および下流のエレメントを含み、転写は、複数のエンハンサーにより制御することができる。こうした配列は、様々な転写因子のための複数の結合部位を含み、プロモーター配列に対する位置、距離、または配向性に関わらず、転写を活性化することができる。遺伝子発現制御を達成するために、エンハンサー結合転写因子は、介在配列をループアウトし、プロモーター領域と接触する。加えて、真核生物遺伝子の活性化は、クロマチン構造の脱緊密化を必要とする場合があり、これは、ヒストン修飾酵素またはＡＴＰ依存性クロマチン再構成複合体を動員することにより行われ、クロマチン構造を変更し、遺伝子発現に関与する他のタンパク質に対するＤＮＡの接近可能度を増加させることができる（OngおよびCorces（２０１１年）、Nat  Rev  Genetics、１２巻：２８３頁）。
【０００５】
クロマチン構造の乱れは、幾つかの機序により生じ得るが、あるものは特定のゲノムに局在化され、他のものは、ゲノムワイドであり、クロマチンの凝縮が必要な有糸分裂などの細胞プロセス中に生じる。ヒストンのリジン残基がアセチル化され、ヒストンタンパク質と染色体ＤＮＡとの間の電荷相互作用が効果的に中和される場合がある。これは、高アセチル化されており、高度に転写され、ＤＮＡｓｅ感受性であることも示されているβ−グロビン遺伝子座で観察されており、ＤＮＡｓｅ感受性であることは、全般的な接近可能度の証である。観察されている他のタイプのヒストン修飾としては、メチル化、リン酸化、脱アミノ化、ＡＤＰリボシル化、β−Ｎ−アセチルグルコサミン（acetlyglucosamine）糖の付加、ユビキチン化、およびＳＵＭＯ化が挙げられる（BannisterおよびKouzarides（２０１１年）、Cell  Res、２１巻：３８１頁を参照）。
【０００６】
疾患関連遺伝子の抑制または活性化は、遺伝子操作転写因子を使用することにより達成されている。遺伝子操作ジンクフィンガー転写因子（ＺＦＰ−ＴＦ）を設計および使用するための方法は、十分に文書化されており（例えば、米国特許第６，５３４，２６１号を参照）、また、より最近では、エフェクター転写因子（ＴＡＬＥ−ＴＦ）のような転写活性化因子およびクラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピートＣａｓに基づく転写因子（clustered  regularly  interspaced  short  palindromic  repeat  Cas  based  transcription  factor：ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ−ＴＦ）が両方とも記載されている（総説は、KabadiおよびGersbach（２０１４年）Methods、６９巻（２号）：１８８〜１９７頁を参照）。標的とされる遺伝子の非限定的な例としては、ホスホランバン（Zhangら、（２０１２年）Mol  Ther  ２０巻（８号）：１５０８〜１５１５頁）、ＧＤＮＦ（Langaniereら、（２０１０年）J.Neurosci  ３９巻（４９号）：１６４６９頁）、およびＶＥＧＦ（Liuら、（２００１年）J  Biol  Chem  ２７６巻：１１３２３〜１１３３４頁）が挙げられる。加えて、遺伝子の活性化は、ＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ−アセチルトランスフェラーゼ融合体の使用により達成されている（Hiltonら、（２０１５年）Nat  Biotechnol  ３３巻（５号）：５１０〜５１７頁）。また、遺伝子発現を抑制する遺伝子操作ＴＦ（リプレッサー）は、ハンチントン病（Huntingtin's  Disease）（ＨＤ）などのトリヌクレオチド疾患の処置に有効であることが示されている。例えば、米国特許第８，９５６，８２８２号および米国特許出願公開第２０１５／０３３５７０８号を参照されたい。
【０００７】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、完全には理解されておらず、現在のところ依然としてよく理解されていない様式で互いと相互作用し得る幾つかの異なる疾患機序により特徴付けられる複雑な多因子性の疾患である。全年齢の推定５３０万人のアメリカ人がＡＤを有しており、アメリカの上位１０位の死因の１つであり、２０５０年までに、世界中で１億６２０万人が、この疾患を有することになると推定されている（van  Dijkら、（２０１５年）Front  Neurosci  ９巻、論文１７３）。この疾患は、女性がより多く（症例の３分の２）、また、アフリカ系またはヒスパニック系の人々は、コーカサス系の人々よりもＡＤを発症する可能性がより高い。ＡＤの原因は、遺伝的要因（特に、初期発症の場合、症例の５％）ならびに環境およびライフスタイル要因に関連すると考えられる。典型的には、この疾患は、６０歳代の個人で診断されるが、診断がなされるまでに、数年間またはさらに数十年間にわたって進行している。この疾患は、経時的に継続して進行し、これまでのところ、この疾患の影響を縮小または逆行させる治療介入は特定されていない。
【０００８】
この疾患の証は、認知低下に結び付く、脳のシナプスの喪失である。健康な脳では、シナプス可塑性が、学習および記憶形成を可能にするものであると考えられている。ＡＤの経過中に、シナプス可塑性が変更され、その可塑性の維持に関与する機序の多くが制御不全になり、シナプス機能障害および崩壊を引き起こす（Spires-JonesおよびHyman（２０１４年）Neuron  ８２巻：７５６頁）。
【０００９】
ＡＤの発症および進行に影響を及ぼす分子的因子は、多数存在すると考えられるが、この疾患の２つの主要な関与物質に科学的焦点のほとんどが当てられている。第１は、アミロイドβ（Ａβ）と呼ばれる、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）の４０〜４２個アミノ酸断片であり、これは、ベータセクレターゼおよびガンマセクレターゼによるタンパク質分解性切断により生成される（Olssonら、（２０１４年）J  Biol  Chem  ２８９巻（３号）：１５４０〜１５５０頁）。不溶性Ａβ断片は、脳の「老人」斑に蓄積するが、こうした斑の存在と神経変性との間に厳密な相関性はないと考えられている。
【００１０】
別の関係物質であるタウも、多大な関心を集めている。タウは、元々は微小管を安定化させると考えられていた微小管結合タンパク質である。ＡＤ患者では、および程度はより低いが一般に高齢者では、タウは、神経原線維濃縮体（ＮＦＴ）に蓄積する場合がある。この疾患の経過中、タウは、高リン酸化され、微小管から脱離し、線維に蓄積する。Ａβ斑とは対照的に、ＮＦＴの存在と認知低下との間には直接的な相関性が存在する（Spires-JonesおよびHyman、同書）。
【００１１】
興味深いことには、タウおよびＡβは両方とも、正常なシナプス機能に重要な役割を果たすと考えられる。タウは、細胞のミトコンドリアをシナプスに輸送する際に重要な役割を果たすと考えられ、タウの過剰発現が、この輸送を阻害することが示されている。ミトコンドリアは、ＡＴＰ産生およびカルシウム緩衝化に必須の役割を果たすため、ミトコンドリア輸送の障害により、シナプス喪失が引き起こされると考えられる。Ａβは、健康な細胞のシナプス可塑性に役割を果たすと考えられる。しかしながら、斑および濃縮体におけるこれら２つのタンパク質の蓄積は、ＡＤ進行に関連する。実際、アミロイド斑の出現は、ＡＤの最も初期の段階で重要であり、これは、ＮＦＴの出現に結び付くと考えられ、実際、上記２つのタンパク質は、互いに相乗的に作用して、この疾患の進行を加速させると考えられる（Poolerら、（２０１５年）Acta  Neuropath  Comm  ３巻（１４号）：１頁）。しかしながら、これらタンパク質の可溶性形態が、毒性に寄与することがより明らかになりつつある（Spires-JonesおよびHyman、同書）。
【００１２】
実際、タウの異常レベルおよび／または凝集が、総称としてタウオパチーと呼ばれる多くの状態に関与することが示唆されている。それらには、アルツハイマー病ＡＤ、前頭側頭型認知症（Frontotermporal  dementia）（ＦＴＤ、Benussiら（２０１５年）Front  Ag  Neuro  ７巻、論文１７１を参照）、進行性核上麻痺（ＰＳＰ）、難治性遺伝性てんかん（例えば、ドラベ症候群（Dravat  syndrome）、Gheyaraら（２０１４年）Ann  Neurol  ７６巻：４４３〜４５６頁を参照）、および大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ、ScholzおよびBras、２０１５年、Int  J.  Mol  Sci、１６巻（１０号）：２４６２９〜２４６５５頁を参照）が挙げられる。脳脊髄液（ＣＳＦ）に対して直接的にアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用した、成体マウスにおけるタウ発現の低減は、タウレベルの完全なまたは部分的な低減を引き起こし、また処置マウスを発作重症度の点で化学誘導発作から保護した（DeVosら、（２０１３年）J  of  NeuroSci  ３３巻（３１号）：１２８８７頁）。
【００１３】
ＡＤは、嗅内皮質から開始し、その後海馬体、辺縁皮質、および連合皮質へと広がり、最終的にこの疾患の後期段階では、ほとんどの脳区域に影響を及ぼすという、階層的パターンで脳を進行することが示されている。興味深いことには、ＡＤの進行は、ＮＦＴの出現を特色とし、この疾患の後期段階にはタウが関与することを示唆している。ミスフォールディングし、高度にリン酸化されたタウタンパク質は、より容易にニューロンにより取り込まれ、この疾患を脳にわたって伝播させる場合があり、ＡＤ患者の脳から単離されたこのミスフォールディングしたタウは、より直ちにマウスニューロンにより取り込まれ得ることを示す研究があるため、タウは、プリオン様の特性を有する可能性があることさえ示唆されている（Takedaら、（２０１５年）Nat  Comm  doi:10.1038/ncomms9490；Hyman（２０１４年）Neuron  ８２巻：１１８９頁）。加えて、トランスジェニックマウスモデルで行われた研究によると、濃縮体形成に関連付けられるヒトタウ突然変異体をマウス脳の嗅内皮質のみで発現させると、マウスタウのミスフォールディングおよびそのタウのニューロンでの凝集に結び付き、検出可能なヒトタウは一切発現されなかったことが示された（de  Calignonら、（２０１２年）Neuron  ７３巻：６８５〜６９７頁）が、これは、ミスフォールディングしたヒトタンパク質が、ミスフォールディングの「種」であり、マウスタンパク質の凝集を引き起こすことができることを示唆している。さらに、内因性マウスタウの遺伝的低減または喪失は、突然変異体ヒトタウ導入遺伝子の過剰発現により引き起こされる神経病理学的毒性に対して保護性である（Wegmannら、（２０１５年）EMBO  J.  ３４巻（２４号）：３０２８〜４１頁）。
したがって、脳への広範な送達を示すモダリティを含む、ＡＤ、ＦＴＤ、ＰＳＰ  ＣＢＤ、および発作を含むタウオパチーを予防および／または処置するための方法に対する必要性が依然として存在している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】OngおよびCorces（２０１１年）、Nat  Rev  Genetics、１２巻：２８３頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本明細書には、アルツハイマー病（ＡＤ）などの１つまたは複数のタウオパチー（taupathies）を診断、予防、および／または処置するための方法および組成物が開示されている。特に、本明細書には、遺伝子操作転写因子リプレッサー（タウ発現を抑制する）を含む、ＡＤなどの少なくとも１つのタウオパチーを処置するようにタウ対立遺伝子を修飾する（例えば、その発現を調節する）ための方法および組成物が提供されている。さらに、こうした方法および組成物を使用して、ＡＤ、ＦＴＤ、ＰＳＰ  ＣＢＤ、および／または発作を含む他のタウオパチーを処置および／または予防するためにタウ対立遺伝子を修飾することができる。特に、本明細書には、タウオパチーを有する対象のタウ凝集体を検出、低減、および／または排除するための方法および組成物が提供されている。
【００１６】
したがって、本明細書には、微小管結合タンパク質タウ（ＭＡＰＴ）遺伝子の遺伝子モジュレーターであって、ＭＡＰＴ遺伝子中の少なくとも１２個のヌクレオチドの標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメイン、および機能性ドメイン（例えば、転写制御ドメイン（抑制ドメインまたは活性化ドメインなど）またはヌクレアーゼドメイン）を含む遺伝子モジュレーターが記載されている。ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）、ＴＡＬ−エフェクタードメインタンパク質（ＴＡＬＥ）、単鎖ガイドＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ系の）、およびアルゴノートタンパク質などを含むが、これらに限定されない、任意のＤＮＡ結合ドメインを使用することができる。本明細書に記載のような遺伝子モジュレーター（または同じまたは異なるポリヌクレオチドにあるその１つまたは複数の成分）をコードするウイルスおよび非ウイルス遺伝子送達ビヒクル（例えば、ｍＲＮＡ、プラスミド、ＡＡＶベクター、レンチウイルスベクター、Ａｄベクターとして）を含む、１つまたは複数のポリヌクレオチドも提供される。ある特定の実施形態では、遺伝子送達ビヒクルは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、ＡＡＶ  ｒｈ１０、当技術分野で公知のＡＡＶベクター変異体（例えば、米国特許第９，５８５，９７１号および米国特許仮出願第６２／５０３，１２１号）を含む、これらベクターの偽型（例えば、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／９などとして）を含むが、これらに限定されないＡＶＶベクターを含む。遺伝子モジュレーターの１つまたは複数、１つまたは複数のポリヌクレオチド、および／または１つまたは複数の遺伝子送達ビヒクルを含む医薬組成物ならびに単離細胞も提供される。また、本発明は、それを必要とする対象のＭＡＰＴ発現を調節するための方法および使用であって、本明細書に記載のような、１つまたは複数のポリヌクレオチド、１つまたは複数の遺伝子送達ビヒクル、および／または医薬組成物を対象に提供することによることを含む方法および使用を提供する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、タウオパチーを処置および／または予防するため（例えば、対象におけるタウの量を低減することにより）を含む、対象のＭＡＰＴ発現を抑制するために使用される。本明細書に記載の組成物は、脳（前頭皮質、前部皮質、後部皮質、海馬、脳幹、線条体、視床、中脳、小脳を含むが、これらに限定されない）および脊髄（腰部、胸部、および頚部領域を含むが、これらに限定されない）のタウレベルを持続的な期間（６か月から１年またはそれよりも長期間）にわたって低減する。本明細書に記載の組成物は、脳室内、髄腔内、頭蓋内、静脈内、眼窩的（後眼窩的（ＲＯ））、および／または槽内投与を含むが、これらに限定されない、任意の投与手段により対象に提供することができる。また、本明細書に記載の組成物（例えば、遺伝子モジュレーター、ポリヌクレオチド、医薬組成物、および／または細胞）の１つまたは複数ならびにこれら組成物を使用するための説明書を含むキットが提供される。
【００１７】
したがって、一態様では、１つまたは複数のタウ遺伝子の遺伝子操作（天然に存在しない）遺伝子モジュレーター（例えば、リプレッサー）が提供される。遺伝子タウモジュレーターは、タウ対立遺伝子の発現を調節する（例えば、抑制する）系（例えば、ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質、またはＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ−ＴＦ）を含んでいてもよい。遺伝子操作ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、そのＤＮＡ結合ドメイン（例えば、認識ヘリックスまたはＲＶＤ）が、あらかじめ選択された標的部位に結合するように変更されている（例えば、選択および／または合理的設計により）天然に存在しないジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質である。本明細書に記載のジンクフィンガータンパク質のいずれかは、各々が、選択された配列（例えば、遺伝子）の標的サブサイトに結合する認識ヘリックスを有する１、２、３、４、５、６つ、またはそれよりも多くのジンクフィンガーを含んでいてもよい。同様に、本明細書に記載のＴＡＬＥタンパク質のいずれかは、任意の数のＴＡＬＥ  ＲＶＤを含んでいてもよい。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲＶＤは、非特異的ＤＮＡ結合特徴を有する。一部の実施形態では、少なくとも１つの認識ヘリックス（またはＲＶＤ）は、天然に存在しない。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ＴＦは、標的配列と結合する単鎖ガイドＲＮＡを含む。ある特定の実施形態では、遺伝子操作転写因子は（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはｓｇＲＮＡ  ＤＮＡ結合ドメインを介して）、タウをコードする遺伝子の少なくとも１２塩基対の標的部位、例えば、これら標的部位内の連続または非連続配列を含む、表１〜３（配列番号１〜６、３３、および４４〜４６）の少なくとも１２塩基対（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８個、またはそれよりも多くの）を含む標的部位に結合する。ある特定の実施形態では、ジンクフィンガータンパク質ＤＮＡ結合ドメインは、表１、２、および３の５２２８８、５２３２２、５２３６６、５７８９０、５７８８０、６５８８８、５２３６４、５２３８９、６５８９４、５７９３０、６５９１８、６５９２０、６５８８７、５７９４７、６５９６８、６５９７６、または６５８６０と指定されているＺＦＰを含む、表１〜３のいずれかに示されているタンパク質の認識ヘリックスを有する。ある特定の実施形態では、遺伝子モジュレーターは、転写抑制ドメインに作動可能に連結した、本明細書に記載のようなＤＮＡ結合ドメイン（ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、単鎖ガイドＲＮＡ）を含む遺伝子リプレッサーである。他の実施形態では、遺伝子モジュレーターは、少なくとも１つのヌクレアーゼドメイン（例えば、１つ、２つ、またはそれよりも多くのヌクレアーゼドメイン）に作動可能に連結した、本明細書に記載のようなＤＮＡ結合ドメイン（ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、単鎖ガイドＲＮＡ）を含む遺伝子リプレッサーである。その結果生じるヌクレアーゼは、例えば、ＤＮＡ結合ドメイン標的配列内、切断部位内、標的配列および／もしくは切断部位の付近（１〜５０個またはそれよりも多くの塩基対）、ならびに／または１対のヌクレアーゼが切断に使用される場合は対合する標的部位間の標的��伝子を遺伝子的に修飾する（挿入および／または欠失により）ことが可能である。
【００１８】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のようなジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のＣａｓタンパク質、またはＴＡＬＥタンパク質は、融合タンパク質の一部として制御ドメイン（または機能性ドメイン）と作動可能な連結で配置することができる。機能性ドメインは、例えば、転写活性化ドメイン、転写抑制ドメイン、および／またはヌクレアーゼ（切断）ドメインであってもよい。ＤＮＡ結合ドメインと共に使用するために活性化ドメインまたは抑制ドメインのいずれかを選択することにより、そのような分子は、タウ発現を活性化または抑制するかのいずれかのために使用することができる。ある特定の実施形態では、機能性ドメインまたは制御ドメインは、ヒストン翻訳後修飾に役割を果たすことができる。一部の例では、ドメインは、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチラーゼ、またはヒストンをＳＵＭＯ化する（sumolyate）またはビオチン化する酵素、または翻訳後ヒストン修飾制御遺伝子抑制を可能にする他の酵素ドメインである（Kousarides（２００７年）Cell  １２８巻：６９３〜７０５頁）。一部の実施形態では、タウ発現を下方制御するために使用することができる転写抑制ドメインに融合されている、本明細書に記載のようなタウ遺伝子（例えば、ＭＡＰＴ）を標的とするＺＦＰ、ｄＣａｓ、またはＴＡＬＥを含む分子が提供される。一部の実施形態では、本発明の方法および組成物は、真核生物を処置するのに有用である。ある特定の実施形態では、制御ドメインの活性は、細胞の転写機構との相互作用が、外因性リガンドの非存在下では起こらないように、外因性低分子またはリガンドにより制御される。そのような外部リガンドは、ＺＦＰ−ＴＦ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ＴＦ、またはＴＡＬＥ−ＴＦと転写機構との相互作用の度合いをコントロールする。制御ドメインは、１つまたは複数のＺＦＰ、ｄＣａｓ、またはＴＡＬＥの間、１つまたは複数のＺＦＰ、ｄＣａｓ、またはＴＡＬＥの外部、およびそれらの任意の組合せを含む、ＺＦＰ、ｄＣａｓ、またはＴＡＬＥの１つまたは複数の任意の部分に作動可能に連結していてもよい。好ましい実施形態では、制御ドメインは、標的とされたタウ遺伝子の遺伝子発現の抑制をもたらす。本明細書に記載の融合タンパク質のいずれかは、医薬組成物に製剤化されていてもよい。
【００１９】
一部の実施形態では、本発明の方法および組成物は、本明細書に記載のような２つまたはそれよりも多くの融合タンパク質、例えば、２つまたはそれよりも多くのタウモジュレーター（例えば、タウリプレッサー）の使用を含む。２つまたはそれよりも多くの融合タンパク質は、異なる標的部位に結合し、同じまたは異なる機能性ドメインを含んでいてもよい。あるいは、本明細書に記載のような２つまたはそれよりも多くの融合タンパク質は、同じ標的部位に結合するが、異なる機能性ドメインを含んでいてもよい。一部の例では、３つまたはそれよりも多くの融合タンパク質が使用され、他の例では、４つまたはそれよりも多くの融合タンパク質が使用されるが、他の例では、５つまたはそれよりも多くの融合タンパク質が使用される。好ましい実施形態では、２つまたはそれよりも多くの、３つまたはそれよりも多くの、４つまたはそれよりも多くの、または５つまたはそれよりも多くの融合タンパク質は、核酸として細胞に送達される。好ましい実施形態では、融合タンパク質は、標的とされた遺伝子の発現の抑制を引き起こす。一部の実施形態では、２つの融合タンパク質は、各タンパク質がそれ自体で活性であるが、組み合わせると抑制活性が付加的である用量で与えられる。好ましい実施形態では、２つの融合タンパク質は、いずれもそれ自体では活性ではないが、組み合わせると抑制活性が相乗的である用量で与えられる。
【００２０】
一部の実施形態では、本明細書に記載のような遺伝子操作ＤＮＡ結合ドメインは、融合タンパク質の一部としてヌクレアーゼ（切断）ドメインと作動可能な連結で配置することができる。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｔｔａｇｏヌクレアーゼを含む。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系などのヌクレアーゼ系を、特定の単鎖ガイドＲＮＡと共に使用して、ヌクレアーゼをＤＮＡの標的位置に標的化することができる。ある特定の実施形態では、そのようなヌクレアーゼおよびヌクレアーゼ融合体は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、またはニューロン幹細胞などの幹細胞のタウ対立遺伝子を標的とするために使用することができ、ヌクレアーゼ融合体の活性が、タウ対立遺伝子の発現低減をもたらすことになる。ある特定の実施形態では、修飾幹細胞を含む医薬組成物が提供される。
【００２１】
さらに別の態様では、本明細書に記載のＤＮＡ結合タンパク質、ヌクレアーゼ、および／または転写因子のいずれかをコードするポリヌクレオチドが提供される。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のＡＡＶ２、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ９ベクターを含むが、それらに限定されず、米国特許第９，５８５，９７１号または米国特許第７，１９８，９５１号に記載のような１つまたは複数のＡＡＶベクター、および／または米国特許仮出願第６２／５０３，１２１号に記載のような１つまたは複数のＡＡＶベクターを含むが、それらに限定されない、少なくとも１つのＡＡＶベクター（または、それらの偽型または変異体）を含む。
【００２２】
他の態様では、本発明は、ドナー核酸を標的細胞に送達することを含む。ドナーは、ヌクレアーゼをコードする核酸の前に、後で、または一緒に送達してもよい。ドナー核酸は、細胞のゲノム、例えば内因性遺伝子座に組み込まれる外因性配列（導入遺伝子）を含んでいてもよい。一部の実施形態では、ドナーは、標的とされる切断部位と相同性の領域を端部に有する全長遺伝子またはその断片を含んでもよい。一部の実施形態では、ドナーは、相同性領域を欠如し、相同性非依存的機序（つまり、ＮＨＥＪ）により標的遺伝子座に組み込まれる。ドナーは、任意の核酸配列、例えば、ヌクレアーゼ誘導性二本鎖破断の相同組換え修復の基質として使用されると、内因性染色体遺伝子座で生成されるドナー特異的欠失、またはその代わりに（またはそれに加えて）、作り出される内因性遺伝子座の新規対立形態（例えば、転写因子結合部位を取り除く点突然変異）に結び付く核酸を含んでいてもよい。一部の態様では、ドナー核酸は、組込みが遺伝子修正事象または標的化欠失に結び付くオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、ドナーは、タウ発現を抑制することが可能な転写因子をコードする。他の実施形態では、ドナーは、タウタンパク質の発現を阻害するＲＮＡ分子をコードする。
【００２３】
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。一部の態様では、ｍＲＮＡは、化学的に修飾されていてもよい（例えば、Kormannら（２０１１年）Nature  Biotechnology  ２９巻（２号）：１５４〜１５７頁を参照）。他の態様では、ｍＲＮＡは、ＡＲＣＡキャップを含んでいてもよい（米国特許第７，０７４，５９６号および第８，１５３，７７３号を参照）。さらなる実施形態では、ｍＲＮＡは、未修飾および修飾ヌクレオチドの混合物を含んでいてもよい（米国特許出願公開第２０１２／０１９５９３６号を参照）。
【００２４】
さらに別の態様では、本明細書に記載のようなポリヌクレオチドのいずれかを含む遺伝子送達ベクター（例えば、遺伝子モジュレーター（リプレッサー）をコードする）が提供される。ある特定の実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクター（例えば、Ａｄ５／Ｆ３５ベクター）、組込み可能または組込み欠損レンチウイルスベクターを含むレンチウイルスベクター（ＬＶ）、またはアデノウイルス随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。ある特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ９ベクターである。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、血液脳関門を越えることが可能なＡＡＶ変異体である（例えば、米国特許第９，５８５，９７１号および米国特許仮出願第６２／５０３，１２１号）。また、本明細書では、少なくとも１つのヌクレアーゼ（ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮ）をコードする配列および／または標的遺伝子への標的化組込みのためのドナー配列を含むアデノウイルス（Ａｄ）ベクター、ＬＶ、またはアデノウイルス随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）が提供される。ある特定の実施形態では、Ａｄベクターは、キメラＡｄベクター、例えばＡｄ５／Ｆ３５ベクターである。ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）または組込み可能なレンチウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、ベクターは、ＶＳＶ−Ｇエンベロープまたは他のエンベロープを有する偽型である。
【００２５】
加えて、核酸（例えば、本明細書に記載の人工転写因子（タウリプレッサー）をコードする配列を含む送達（例えば、ＡＡＶ）ベクター）および／またはタンパク質（例えば、ＺＦＰ、Ｃａｓ、もしくはＴＡＬＥ、またはＺＦＰ、Ｃａｓ、もしくはＴＡＬＥを含む融合タンパク質）を含む医薬組成物も提供される。例えば、ある特定の組成物は、薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせて、制御配列に作動可能に連結した本明細書に記載のＺＦＰ、Ｃａｓ、またはＴＡＬＥの１つをコードする配列を含む核酸を含み、上記制御配列は、細胞での上記核酸の発現を可能にする。ある特定の実施形態では、コードされたＺＦＰ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、またはＴＡＬＥは、突然変異体タウ対立遺伝子に対して特異的である。一部の実施形態では、医薬組成物は、突然変異体タウ対立遺伝子を調節するＺＦＰ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、またはＴＡＬＥ、および神経栄養因子を調節するＺＦＰ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、またはＴＡＬＥを含む。タンパク質に基づく組成物は、本明細書で開示されているような１つまたは複数のＺＦＰ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、またはＴＡＬＥ、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。
【００２６】
さらに別の態様では、本明細書に記載のようなタンパク質、ポリヌクレオチド、および／または組成物のいずれかを含む単離細胞も提供される。
【００２７】
別の態様では、本明細書では、本明細書に記載の方法および組成物を使用して、アルツハイマー病または発作などのタウオパチーを処置および／または予防するための方法が提供される。一部の実施形態では、上記方法は、上記ポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質を、ウイルスベクター、非ウイルスベクター（例えば、プラスミド）、および／またはそれらの組合せを使用して送達することができる組成物を伴う。一部の実施形態では、上記方法は、ＺＦＰもしくはＴＡＬＥを含むか、または本発明のＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、Ｔｔａｇｏ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系で変更された幹細胞集団を含む組成物を伴う。本明細書に記載のような組成物（タンパク質、ポリヌクレオチド、細胞、ならびに／またはそうしたタンパク質、ポリヌクレオチド、および／もしくは細胞を含む医薬組成物）の投与は、ＡＤ、タウオパチー、または発作に関連する任意の臨床症状の寛解または排除、ならびにＣＮＳ細胞（例えば、ニューロン、星状細胞、ミエリンなど）の機能および／または個数の増加を含むが、それらに限定されない、治療（臨床）効果をもたらす。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、タウ発現を（本明細書に記載のような人工リプレッサーを受容しない対照と比較して）、少なくとも３０％、または４０％、好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％低減する。一部の実施形態では、少なくとも５０％低減が達成される。
【００２８】
またさらなる態様では、本明細書には、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを使用して、対象（例えば、マウス、ヒト、または非ヒト霊長類（ＮＨＰ）などの哺乳動物対象）の脳に、タウのリプレッサーを送達するための方法が記載されている。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶベクター、例えばＡＡＶ９ベクター、または米国特許第９，５８５，９７１号または米国特許仮出願第６２／５０３，１２１号に記載のようなＡＡＶベクター変異体である。送達は、カニューレまたは任意の他の送達技術の使用を含む任意の好適な手段により、任意の脳領域、例えば海馬または嗅内皮質になされてもよい。いずれのＡＡＶベクターも、ベクターが直接投与されない脳領域への順行性および逆行性軸索輸送などを含む、対象の脳に対するリプレッサーの広範な送達を提供する（例えば、被殻への送達は、皮質、黒質、視床などなど他の構造への送達をもたらす）。ある特定の実施形態では、対象はヒトであり、他の実施形態では、対象は非ヒト霊長類である。投与は、単一用量または複数の投与（投与間の任意のタイミングでの）であってもよい。
【００２９】
したがって、他の態様では、本明細書には、対象のタウオパチー（例えば、ＡＤ）を予防および／または処置するための方法であって、１つまたは複数のＡＡＶベクターを使用して、タウ対立遺伝子のリプレッサーを対象に投与することを含む方法が記載されている。ある特定の実施形態では、リプレッサーをコードするＡＡＶは、脳室内、髄腔内、または槽内送達を含むが、それらに限定されない、任意の送達方法により、ＣＮＳ（脳および／またはＣＳＦ）に投与される。他の実施形態では、リプレッサーをコードするＡＡＶは、対象の実質組織（例えば、海馬および／または嗅内皮質）に直接投与される。他の実施形態では、リプレッサーをコードするＡＡＶは、静脈内（ＩＶ）投与される。本明細書に記載の方法のいずれかでは、投与は、１回（単回投与）で行われてもよく、または複数回（投与間に任意の時間をおいて）行われてもよい。複数回投与される場合、同じまたは異なる投薬量および／または送達ビヒクルの投与モードを使用することができる（例えば、異なるＡＡＶベクターが、ＩＶおよび／またはＩＣＶで投与される）。上記方法としては、対象での、例えばＡＤを有する対象のＡＤニューロンでのタウの凝集を低減する（例えば、タウ凝集のＮＦＴ特徴を低減する）ための方法；ニューロンまたはニューロンの集団（例えば、ＡＤニューロンまたはＡＤニューロンの集団）のアポトーシスを低減するための方法；神経過興奮を低減するための方法；アミロイドベータ誘導性毒性（例えば、シナプス喪失および／または神経炎性ジストロフィー）を低減するための方法；および／またはＡＤ対象の１つまたは複数の認知機能の喪失を低減するための方法が挙げられ、すべては、上記方法を受けていない対象との比較、または上記方法を受ける前の対象自身との比較である。したがって、本明細書に記載の方法は、以下のもの：神経毒性、グリオーシス、変性神経突起、脊椎喪失、興奮毒性、皮質および海馬の収縮、樹状タウ蓄積、認知（例えば、げっ歯動物モデルにおける放射状アーム迷路およびモリス水迷路、恐怖条件付けなど）、および／または運動障害の１つまたは複数を含む、タウオパチーのバイオマーカーおよび／または症状の低減をもたらす。
【００３０】
一部の態様では、細胞の病原性タウ種の量を低減するための本発明の方法および組成物が提供される。一部の実施形態では、上記方法は、高リン酸化タウの低減をもたらす。一部の例では、高リン酸化タウの低減は、可溶性または粒状タウの低減をもたらす。他の実施形態では、病原性タウ種の低減は、本発明の方法に従っておよび／または本発明の組成物を用いて処置されていない細胞または対象と比較して、タウ凝集を減少させ、神経原線維濃縮体（ＮＦＴ）の低減を引き起こす。さらなる実施形態では、細胞で観察されるＮＦＴの量を逆行させるための方法が提供される。またさらなる実施形態では、本発明の方法および組成物は、対象の脳内の病原性タウ種（ＮＦＴ、高リン酸化タウ）の伝播の緩徐化を引き起こす。一部の実施形態では、脳にわたる病原性タウの伝播が停止し、他の実施形態では、脳にわたる病原性タウの伝播が逆行する。さらなる実施形態では、脳のアミロイドβ斑に関連する変性神経突起の個数が低減される。一部の実施形態では、変性神経突起の個数が、年齢一致野生型脳で見出されるレベルまで低減される。さらなる実施形態では、本明細書には、対象の脳のアミロイドβ斑に関連する高リン酸化タウを低減するための方法および組成物が提供される。
【００３１】
本明細書に記載の方法のいずれかでは、タウ対立遺伝子のリプレッサーは、ＺＦＰ−ＴＦ、例えば、タウ対立遺伝子に特異的に結合するＺＦＰおよび転写抑制ドメイン（例えば、ＫＯＸ、ＫＲＡＢなど）を含む融合タンパク質であってもよい。他の実施形態では、タウ対立遺伝子のリプレッサーは、ＴＡＬＥ−ＴＦ、例えば、タウ対立遺伝子に特異的に結合するＴＡＬＥポリペプチドおよび転写抑制ドメイン（例えば、ＫＯＸ、ＫＲＡＢなど）を含む融合タンパク質であってもよい。一部の実施形態では、タウ対立遺伝子リプレッサーは、タンパク質がもはやＤＮＡを切断しないように、Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼドメインが不活化されているＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ＴＦである。その結果としてのＣａｓ  ＲＮＡガイド化ＤＮＡ結合ドメインは、タウ対立遺伝子を抑制する転写リプレッサー（例えば、ＫＯＸ、ＫＲＡＢなど）に融合される。
【００３２】
一部の実施形態では、本明細書に記載のような遺伝子モジュレーター（遺伝子リプレッサー）（例えば、ＺＦＰ−ＴＦ、ＴＡＬＥ−ＴＦ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ＴＦ）をコードする配列は、ゲノムに挿入される（組み込まれる）が、他の実施形態では、リプレッサーをコードする配列は、エピソームとして維持される。一部の例では、ＴＦ融合体をコードする核酸は、内因性プロモーターが発現を駆動するように、プロモーターを含むセーフハーバー部位に挿入される（例えば、ヌクレアーゼ媒介性組込みにより）。他の実施形態では、リプレッサー（ＴＦ）ドナー配列は、セーフハーバー部位に挿入され（ヌクレアーゼ媒介性組込みにより）、ドナー配列は、リプレッサーの発現を駆動するプロモーターを含む。一部の実施形態では、遺伝子モジュレーターをコードする配列は、送達後、染色体外に（エピソームとして）維持され、異種性プロモーターを含んでいてもよい。プロモーターは、構成的プロモーターであってもよく、または誘導可能プロモーターであってもよい。一部の実施形態では、プロモーター配列は、幅広く発現されるが、他の実施形態では、プロモーターは、組織または細胞／タイプ特異的である。好ましい実施形態では、プロモーター配列は、ニューロン細胞に特異的である。特に好ましい実施形態では、選択されたプロモーターは、それが低発現を示すという点で特徴付けられる。好ましいプロモーターの非限定的な例としては、神経特異的プロモーターＮＳＥ、Ｓｙｎａｐｓｉｎ、ＣＡＭＫｉｉａ、およびＭＥＣＰが挙げられる。遍在性プロモーターの非限定的な例としては、ＣＡＳおよびＵｂｃが挙げられる。さらなる実施形態としては、米国特許出願公開第２０１５／０２６７２０５号に記載されているような自己制御性プロモーターの使用が挙げられる。
【００３３】
またさらなる実施形態では、リプレッサーは、タウ対立遺伝子を切断し、それによりタウ対立遺伝子を不活化することにより、タウ対立遺伝子を抑制するヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）を含んでいてもよい。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼによる切断後、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により挿入および／または欠失（「インデル」）を導入する。他の実施形態では、ヌクレアーゼは、ドナー配列を導入し（相同性または非相同性により誘導される方法により）、ドナー組込みが、タウ対立遺伝子を不活化する。
【００３４】
本明細書に記載の方法のいずれかでは、リプレッサーは、タンパク質、ポリヌクレオチド、またはタンパク質およびポリヌクレオチドの任意の組合せとして、対象（例えば、脳）に送達することができる。ある特定の実施形態では、リプレッサーは、ＡＡＶベクターを使用して送達される。他の実施形態では、リプレッサー（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のｓｇＲＮＡ）の少なくとも１つの成分は、ＲＮＡ形態で送達される。他の実施形態では、リプレッサーは、本明細書に記載の発現構築物のいずれかの組合せ、例えば、１つの発現構築物（ＡＡＶ９）に対する１つのリプレッサー（またはその部分）および別々の発現構築物（ＡＡＶ、または他のウイルス構築物もしくは非ウイルス構築物）に対する１つのリプレッサー（またはその部分）を使用して送達される。
【００３５】
さらに、本明細書に記載の方法のいずれかでは、リプレッサーは、所望の効果を提供する任意の濃度（用量）で送達することができる。好ましい実施形態では、リプレッサーは、１０，０００〜５００，０００ベクターゲノム／細胞（またはその間の任意の値）のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用して送達される。ある特定の実施形態では、リプレッサーは、２５０〜１，０００（またはその間の任意の値）のＭＯＩのレンチウイルスのベクターを使用して送達される。他の実施形態では、リプレッサーは、０．０１〜１，０００ｎｇ／１００，０００細胞（またはその間の任意の値）のプラスミドベクターを使用して送達される。他の実施形態では、リプレッサーは、１５０〜１，５００ｎｇ／１００，０００細胞（またはその間の任意の値）のｍＲＮＡとして送達される。
【００３６】
本明細書に記載の方法のいずれかでは、方法は、約５０％またはそれよりも高い、５５％またはそれよりも高い、６０％またはそれよりも高い、６５％またはそれよりも高い、約７０％またはそれよりも高い、約７５％またはそれよりも高い、約８５％またはそれよりも高い、約９０％またはそれよりも高い、約９２％またはそれよりも高い、または約９５％またはそれよりも高い、対象の１つまたは複数のＡＤニューロンでのタウ対立遺伝子の抑制を産出することができる。
【００３７】
さらなる態様では、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ  ＴＦ）、ＴＡＬＥ（ＴＡＬＥ−ＴＦ）、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ＴＦの１つまたは複数を含むタウ調節転写因子などの、本明細書に記載のようなタウ調節転写因子、例えば、ＺＦＰ−ＴＦ、ＴＡＬＥ−ＴＦ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ＴＦを使用して、対象の脳（例えば、ニューロン）での突然変異体タウ対立遺伝子または野生型タウ対立遺伝子の発現を抑制する。抑制は、対象の未処置（野生型）ニューロンと比較して、約５０％またはそれよりも高い、５５％またはそれよりも高い、６０％またはそれよりも高い、６５％またはそれよりも高い、７０％またはそれよりも高い、約７５％またはそれよりも高い、約８５％またはそれよりも高い、約９０％またはそれよりも高い、約９２％またはそれよりも高い、または約９５％またはそれよりも高い、対象の１つまたは複数のニューロンでのタウ対立遺伝子の抑制であってもよい。ある特定の実施形態では、タウ調節転写因子を使用して、本明細書に記載の方法の１つまたは複数を達成することができる。
【００３８】
また、本明細書に記載のようなタウモジュレーターの成分を含むおよび／またはタウモジュレーター（またはその成分）をコードするＡＡＶタウモジュレーター（例えば、リプレッサー）および／またはポリヌクレオチドの１つまたは複数を含むキットが提供される。キットは、細胞（例えば、ニューロン）、（例えば、例えばＣＳＦにおいてタウタンパク質を検出および／または定量化するための）試薬、および／または本明細書に記載のような方法を含むその使用のための説明書をさらに含んでいてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１ＡＢ】図１Ａ〜１Ｄは、本明細書に記載のような遺伝子操作ＭＡＰＴ遺伝子モジュレーターを導入した後のＭＡＰＴ発現を表す。図１Ａは、遺伝子モジュレーターのＤＮＡ結合分子のＭＡＰＴ遺伝子内の標的部位を示す模式図である。これら実験のモジュレーターは、リプレッサーであった。図１Ｂは、表示量のＭＡＰＴリプレッサー（５２３２２、５２３６４、５２３６６、５２３８９、５７８８０、５７８９０、および５２２８８）またはＧＦＰまたはｍＲＮＡ形態の偽薬対照を（それぞれ左から右に、１０００ｎｇ、３００ｎｇ、１００ｎｇ、３０ｎｇ、１０ｎｇ、または３ｎｇの表示用量で）Ｎｅｕｒｏ  ２Ａ細胞に投与した２４時間後のＭＡＰＴ発現を示すグラフを示す。図１Ｃは、ＭＡＰＴリプレッサー（５２３２２、５２３６４、５２３６６、５２３８９、５７８８０、５７８９０、および５２２８８）またはＧＦＰまたは偽薬対照を、ＡＡＶ９ベクター（ＣＭＶプロモーターを有する）を使用して、３×１０５ｖｇ／細胞、１×１０５ｖｇ／細胞、３×１０４ｖｇ／細胞、１×１０４ｖｇ／細胞の表示用量で、初代マウス皮質ニューロン（ＭＣＮ）に投与した７日後のＭＡＰＴ発現を示すグラフを表す。図１Ｄは、５７８８０、およびＺＦＰ骨格のホスフェート接触の突然変異を含む２つの例示的な誘導体（６５８８７および６５８８８）によるタウ（ＭＡＰＴ）抑制およびオフターゲット抑制を表すグラフを示す。
【図１Ｃ】同上。
【図１Ｄ】同上。
【００４０】
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、ＡＡＶ９ベクターにより運搬される表示リプレッサー（５２３８９）で処置したＭＣＮでのタンパク質レベル（タウ、ＧＡＰＤＨ、およびＺＦＰ）を表す。図２Ａは、表示ＡＡＶ９投薬量での表示タンパク質のタンパク質レベルを示すウエスタンブロットである。図２Ｂおよび図２Ｃは、表示投薬量のＡＡＶ９−５２３８９または偽薬（Ｍ）でのタウ／ＧＡＰＤＨタンパク質（上段パネル）およびＺＦＰ／ＧＡＰＤＨ（下段パネル）の比を示すグラフである。
【００４１】
【図３】図３は、ＭＡＰＴ遺伝子に対する、表示リプレッサー（５２３２２、５２３６４、５２３６６、５２３８９、５７８８０、５７８９０、または５２２８８）の特異性を示すマイクロアレイ分析結果の結果を示す。分析は、ｍＲＮＡ形態の３００ｎｇのリプレッサーをＮｅｕｒｏ２Ａ細胞に投与した２４時間後に実施した。結果は、実施例３で考察されている。各グラフの上にある数値は、その発現が増加（上向き矢印）または減少（抑制）（下向き矢印）した遺伝子の個数を表す。
【００４２】
【図４】図４は、ｍＲＮＡ形態の３００ｎｇのリプレッサーを初代ヒト線維芽細胞に投与した２４時間後の、表示リプレッサー（５２３２２、５２３６４、５２３６６、５２３８９、５７８８０、５７８９０、５２２８８）のマイクロアレイ分析結果の結果を示す。結果は、実施例３で考察されている。各グラフの上にある数値は、その発現が増加（上向き矢印）または減少（抑制）（下向き矢印）した遺伝子の個数を表す。
【００４３】
【図５Ａ】図５Ａおよび５Ｂは、表示リプレッサー（５２３２２、５２３６４、５２３６６、５２３８９、５７８８０、５７８９０）のマイクロアレイ分析結果の結果を示す。図５Ａは、１×１０５ｖｇ／細胞のＡＡＶベクター（ＡＡＶ）により運搬されるリプレッサーをマウス皮質ニューロンに投与した７日後の結果を示す。結果は、実施例３で考察されている。各グラフの上にある数値は、その発現が増加（上向き矢印）または減少（抑制）（下向き矢印）した遺伝子の個数を表す。図５Ｂは、同一のヘリックスを有する２つのリプレッサー５７８８０および６５８８８を比較したマイクロアレイ分析結果を示す。５７８８０タンパク質のデータは上段列に示されており、６５８８８タンパク質のデータは、下段列に示されている。６５８８８は、一部の潜在的ホスフェート接触がジンクフィンガー骨格から除去されており（表２を参照）、データは、マウス皮質ニューロンでの同様のタウ抑制活性を維持しつつ、６５８８８タンパク質での特異性が実質的に増加することを実証する（これらの実験条件では、５７８８０は、７５個の遺伝子を上方制御し、１１０個の遺伝子を抑制するが、６５８８８は、３つの遺伝子を上方制御し、タウを含む４つの遺伝子を抑制する）。
【図５Ｂ】同上。
【００４４】
【図６Ａ】図６Ａおよび６Ｂは、ＡＡＶベクター（ＡＡＶ９）により運搬される遺伝子リプレッサーを使用した、細胞でのｍＲＮＡ発現を表すグラフであり、この場合、リプレッサーの発現は、表示プロモーター（ＣＭＶ、ｓｙｎａｐｓｉｎ（ＳＹＮ１）、アルファ−カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼプロモーター（ＣａｍＫＩＩ）、およびメチルＣｐＧ結合タンパク質２プロモーター（ＭｅＣＰ２）の２２９ｂｐ断片により駆動される。図６Ａは、ＭＣＮでの発現を示す。図６Ｂは、初代海馬ニューロンでの発現を示す。
【図６Ｂ】同上。
【００４５】
【図７ＡＢ】図７Ａ〜７Ｄは、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンでのｍＲＮＡ（ヒトタウおよびＺＦＰ）レベルを示す。図７Ａは、ヒトおよびマウスＭＡＰＴ標的部位（配列番号３１および３２）の部分配列を示す模式図である。図７Ｂは、ＡＡＶベクターにより運搬される表示リプレッサーを表示投薬量で投与した１８日後のｉＰＳＣでのｍＲＮＡ発現を示すグラフを示す。図７Ｃは、表示プロモーターを有するＡＡＶベクターにより運搬される表示リプレッサー（５２３６６）を投与した１８日後のｉＰＳＣでのｍＲＮＡ発現を示すグラフを示す。図７Ｄは、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンにおいて例示的なＺＦＰ  ＴＦを使用した一連のマイクロアレイプロットであり、ＺＦＰ  ＴＦが高度に特異的であることを示す。細胞を、分析前に１９日間にわたって、ＺＦＰ−ＴＦドナーを含む１Ｅ５のＡＡＶ６に曝露した。
【図７Ｃ】同上。
【図７Ｄ】同上。
【００４６】
【図８ＡＢ】図８Ａ〜８Ｈは、タウリプレッサーを送達するための種々のＡＡＶベクターを使用した、マウス対象でのＺＦＰ−ＴＦの効率的なニューロン形質導入およびｍＲＮＡ（タウおよびＺＦＰ）発現に対するｉｎ  ｖｉｖｏ効果を示す。実施例６を参照されたい。図８Ａは、ＡＡＶをＩＶ（右パネル）またはＩＣＶ（左パネル）のいずれかで投与した後の、運動皮質（上段パネル）、海馬（中段パネル）、および小脳（下段パネル）の効率的な形質導入を示す。図８Ｂは、運動皮質（左パネル、上段列）、脳幹（右パネル、上段列）、および海馬（下段左パネル）を含む、重要なタウオパチー領域のＩＣＶおよびＩＶ投与の両方による強力なタウ低減（約５０〜７０％低減）を示す。図８Ｃは、ＡＡＶ−ＺＦＰ−ＴＦベクターをＩＶまたはＩＣＶで投与した後の、脳および脊髄の全体にわたるタウｍＲＮＡ低減（約４０〜７０％低減）を示す。図８Ｄは、タウ（ＭＡＰＴ）ｍＲＮＡのレベルを示す。図８Ｅは、各海馬切片のリプレッサー（ＺＦＰ）ｍＲＮＡのレベルを示す。図８Ｆは、ＡＡＶベクターを使用して本明細書に記載のタウリプレッサー（左パネルは、５２３８９リプレッサーを示し、右パネルは、５７８９０リプレッサーを示す）を投与した後の、ＣＮＳおよび脊髄の全体にわたるタウのロバストな抑制を示すグラフである。図８Ｇは、表示組成物（「ＧＦＰ」はＧＦＰ対照を指し、「１７２」は、ＭＡＰＴに結合しない無関連対照ＺＦＰ−ＴＦを指し、「５２３８９」は、ＡＡＶ構築物で運搬される５２３８９リプレッサーを指し、「５７８９０」は、ＡＡＶ構築物で運搬される本明細書に記載の５７８９０リプレッサーを指し、「ＰＢＳ」は、ＰＢＳのみを受容した動物の対照を指す）を投与した動物の皮質（左パネル）および海馬（右パネル）においてタウ抑制が迅速であり、数か月間にわたって保持されることを表すグラフである。図８Ｇの上段列は、タウｍＲＮＡ発現を表し、下段列は、正規化されたタウタンパク質レベルを表す。図８Ｈは、表示組成物（「ＶＥＨ」は、ビヒクルのみを投与された対照動物を指し、「１７２Ｖ」は、ＡＡＶベクターで運搬されるＭＡＰＴに結合しない無関連対照ＺＦＰ−ＴＦを受容した動物を指し、「３８９Ｖ」は、ＡＡＶ構築物で運搬される５２３８９リプレッサーを指し、「８９０Ｖ」は、ＡＡＶ構築物で運搬される本明細書に記載の５７８９０リプレッサーを指す）を受容した動物のＣＳＦ（上段列、左パネル）、皮質（上段列、右パネル）、および海馬（上段列、右端グラフ）における総マウスタウタンパク質レベルを示すグラフである。また、ＣＳＦと、皮質（右パネル）および海馬（左パネル）におけるレベルとの間の相関性を示す統計的分析が示されている（下段列）。
【図８Ｃ】同上。
【図８ＤＥ】同上。
【図８Ｆ】同上。
【図８Ｇ】同上。
【図８Ｈ】同上。
【００４７】
【図９】図９Ａ〜９Ｄは、実施例６に記載のような統計的分析を使用した、ＭＡＰＴのｉｎ  ｖｉｖｏ調節（抑制）のさらなる分析を表す。図９Ａは、すべての薄片のＡＮＯＶＡ、その後のシダック事後検定分析を示す（上段パネルは、タウを示し、下段パネルは、ＺＦＰを示す）。図９Ｂは、平均最大タウ低減を示す（上段パネルはタウを示し、下段パネルはＺＦＰを示す）。図９Ｃは、５２３２２ＭＡＰＴリプレッサーで処置した動物には、ＭＡＰＴレベルとＺＦＰ−ＴＦレベルとの間に高い相関性があることを示す。図９Ｄは、５２３８９ＭＡＰＴリプレッサーで処置した動物には、ＭＡＰＴレベルとＺＦＰ−ＴＦレベルとの間に高い相関性があることを示す。
【００４８】
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｄは、海馬内に注射した後にタウ特異的ＺＦＰ−ＴＦでｉｎ  ｖｉｖｏ処置した後のＭＡＰＴ（タウ）ｍＲＮＡ抑制を表すグラフである。この実験では、４つの異なるプロモーター（ＣＭＶ、ＳＮＹ１、ＣＡＭＫＩＩ、またはＭｅＣＰ２）を使用して、ＺＦＰ−ＴＦ−ｖｅｎｕｓ構築物の発現を駆動した。図１０Ａは、注射６週間後のタウ発現を示し、選択したプロモーターに関わらず、ＺＦＰ−ＴＦを受容した動物すべてで減少したことを実証する。星印は、ＰＢＳ対照と比較して、シグナルが有意であることを示す（すべてのプロモーターで、Ｐ＜０．０００１）。図１０Ｂは、種々のプロモーターからのＺＦＰ−ＴＦの発現を示し、最も高いＺＦＰ−ＴＦ発現は、ＣＡＭＫＩＩ駆動性ベクターで処置した動物で検出された。各処置群での活性化星状細胞の存在を、ＧＦＡＰを検出することにより測定した（図１０Ｃ）。この実験では、ＭｅＣＰ２プロモーターは、ＰＢＳ注射動物と比較してＧＦＡＰ上昇をもたらさず、ＳＹＮ１は、４．０倍のより高いＧＦＡＰレベル（Ｐ＜０．０００１）をもたらし、ＣＭＶは、３．２倍のより高いレベル（Ｐ＜０．０１）をもたらし、ＣＡＭＫＩＩは、２．４倍のより高いレベル（Ｐ＜０．０５）をもたらした。また、同様に、処置群における小グリア細胞の存在を決定した（図１０Ｄ）。ＭｅＣＰ２プロモーターは、ＰＢＳ注射動物と比較してＩＢＡ１レベルの有意な変化をもたらさず、ＳＹＮ１は、４．７倍のより高いＩＢＡ１レベル（Ｐ＜０．０００１）をもたらし、ＣＭＶは、３．０倍のより高いレベル（Ｐ＜０．０５）をもたらし、ＣＡＭＫＩＩは、３．２倍のより高いレベル（Ｐ＜０．００１）をもたらした。
【００４９】
【図１１】図１１は、図１０に記載されている群におけるタウタンパク質発現の低減を示すグラフである。ＰＢＳ注射対照レベル（２６９ｎｇ／ｍｌ）と比較して、ｒＡＡＶ９−ＳＹＮ１−５２３８９Ｖ構築物は、対照レベルの２３％をもたらし（６１ｎｇ／ｍｌ、Ｐ＜０．０００１）、ｒＡＡＶ９−ＣＡＭＫＩＩ−５２３８９Ｖ構築物は、対照レベルの１８％を産出し（４９ｎｇ／ｍｌ、Ｐ＜０．０００１）、ｒＡＡＶ９−ＳＹＮ１−５２３８９Ｖ構築物は、対照レベルの１２％を示した（３２ｎｇ／ｍｌ、Ｐ＜０．０００１）。したがって、ニューロンプロモーターは、マウス海馬の全体にわたって、＞８０％のタウｍＲＮＡおよびタンパク質低減を駆動することが可能である。
【００５０】
【図１２Ａ−Ｃ】図１２Ａ〜１２Ｆは、海馬および接続脳領域におけるタウ低減の組織学的実証を表す。ＣＭＶプロモーターにより駆動されるタウ特異的ＺＦＰ−ＴＦを含むＡＡＶを海馬に送達して、免疫蛍光染色による内因性タウタンパク質低減を評価した。ＺＦＰ−ＴＦを、検出用の蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓに連結させ、注射６週間後に動物を犠牲にした。図１２Ａは、海馬の断面であり、より詳しい研究のための４つのボックス領域が線で囲まれている。図１２Ｂは、図１２Ａのボックス１の拡大図であり、ＧＦＰ／ＤＡＰＩ染色（左パネル）、ＧＦＰ／タウ／ＤＡＰＩ（中央パネル）、およびタウ（右パネル）を示す。図１２Ｃは、ボックス１を横断する蛍光強度のグラフであり、断面の同側でのタウ低減が実証されている（右パネル）。図１２Ｄは、ボックス２の拡大図を示し、図１２Ｅは、ボックス３の拡大図であり、同側でのタウ染色の減少が実証されている（右パネル）。図１２Ｆは、ボックス４を示し、上段パネルは、注射の同側でのＧＦＰ（ＺＦＰ−ＴＦの指標）シグナルを示し、さらにタウ染色の同時減少（下段パネル）が示される。また、下段中央パネルは、タウ染色の減少のグラフ表示を示す。下段左および右パネルは、同側（左）および対側（右）断面における染色を示す。データは、実施例でより詳しく考察されている。
【図１２Ｄ−Ｆ】同上。
【００５１】
【図１３Ａ−Ｆ】図１３Ａ〜１３Ｊは、海馬での６か月間にわたるＺＦＰ−ＴＦのｉｎ  ｖｉｖｏ安全性および持続発現を実証する。図１３Ａは、６週時点における海馬全体の形質導入細胞のシグナルを表し、ＺＦＰ−ＴＦおよびＧＦＰ単独ベクターの発現が、ほぼ同じであることが示されている。図１３Ｂは、特に星状細胞で結果が同様であることを示し、図１３Ｃは、小グリア細胞の結果を示す。図１３Ｄは、６か月時点を除いて、図１３Ａと同様の形質導入データを示す。同様に、図１３Ｅは、６か月時点での星状細胞データを示し、図１３Ｆは、６か月時点での小グリア細胞データを示す。図１３Ｇは、海馬領域の平均厚さが、種々の処置群で維持されていることを実証し、ＺＦＰ−ＴＦの長期発現に由来する顕性ニューロン毒性がないことが実証されている。図１３Ｈは、前部（左パネル）および後部（右パネル）海馬での注射剤の網羅範囲を示す。データは、実施例でより詳しく考察されている。図１３Ｉは、表示のＺＦ（上段左はタウ、上段中央はＺＦ、上段右はＶＧ／細胞、下段左はＧＦＰＡ（グリア繊維性酸タンパク質、星状細胞のマーカー）、下段中央はＩＢＡ１（イオン化カルシウム結合アダプター分子１、小グリア細胞のマーカー）、および下段右はＮｅｕＮ（様々な種で高度に保存されている有系分裂後ニューロンのよく認識されているマーカー（Wangら、（２０１５年）Sci  Reports  ５巻：１７３８３頁、doi  10.1038/spre17383））で処置した対象での正規化発現レベルを示すグラフである。図１３Ｊは、表示の組成物（「ＰＢＳ」は、タウモジュレーター無しを指し、「８９Ｖ  ６週」は、６週で試料採取した５２３８９Ｖｅｎｕｓ構築物で処置したマウスを指し、「８９Ｖ  １１ｍ」は、１１か月で試料採取した５２３８９Ｖｅｎｕｓ構築物を指す、で処置した対象での表示のタンパク質の正規化発現レベルを示すグラフである（上段パネルの左から右に向かって、タウ、ＺＦＰ、ＧＦＡＰ、ＩＢＡ１；下段パネルの左から右に向かって、ＮｅｕＮ、ＭＡＰ１、ＭＡＰ１Ａ、ＭＡＰ２）。
【図１３Ｇ−Ｈ】同上。
【図１３Ｉ】同上。
【図１３Ｊ−１】同上。
【図１３Ｊ−２】同上。
【００５２】
【図１４Ａ−Ｄ】図１４Ａ〜１４Ｆは、ＺＦＰ−ＴＦで処置したＡＰＰ／ＰＳ１マウスの脳切片の顕微鏡写真である。これらの画像では、ＧＦＰは色が緑色であり、ＲＦＰは色が赤色であり、Ａβに特異的な抗体は、二次抗体（青色）で標識されている。図１４Ａおよび１４Ｃは、野生型皮質（ＣＴＸ）の画像であり、左ＣＴＸを無関連ＺＦＰ−ＴＦで処置し（図１４Ａ）、右ＣＴＸを、蛍光タンパク質ｔＲＦＰをコードするＡＡＶで処置した（図１４Ｃ）。図１４Ｂおよび１４Ｄは、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスに由来する脳皮質の画像であり、左ＣＴＸを、タウ特異的ＺＦＰ−ＴＦをコードするＡＡＶ（「３８９ｄＶ」、図１４Ｂ）またはｔＲＦＰをコードするＡＡＶ（図１４Ｄ）で処置した。画像には、タウ特異的ＺＦＰ−ＴＦで処置したＣＴＸでの変性神経突起（Ａβ斑周辺の点状染色として特定可能であり、矢印により示されている）の低減が図示されている。図１４Ｅおよび１４Ｆは、タウ特異的ＺＦＰ−ＴＦ（図１４Ｅ）またはｔＲＦＰ（図１４Ｆ）のいずれかで処置したＡＰＰ／ＰＳ１  ＣＴＸ切片の２つの例のより高倍率の画像であり、ｔＲＦＰ処置切片には、３８９ＺＦＰ−ＴＦ処置切片よりも多くの変性神経突起（矢印により示されている）が存在する。
【図１４Ｅ−Ｆ】同上。
【００５３】
【図１５】図１５は、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける、１Ａβ斑当たりの変性神経突起の個数の定量的表示を示すグラフである。各ドットは、１つの皮質切片のすべての斑について、１斑当たりの変性神経突起の平均個数を表している。１マウス当たり１脳半球当たり、３〜５つの切片を分析した。理解することができるように、ｔＲＦＰで処置したＣＴＸと比較して、３８９ｄＶ  ＺＦＰ−ＴＦで処置したＣＴＸには統計的に有意な変性神経突起の低減が存在した（左端の（灰色）バーは、３８９ｄＶ処置であり、左から２番目の（白色）バーは、ｔＲＦＰ処置である）。また、無関連ＺＦＰ−ＴＦ（「１７２ｄＶ」、灰色縞模様バー、右から２番目のバー）またはｔＲＦＰ（白色縞模様バー、右端バー）で処置したマウスでのＣＴＸの比較が示されている。理解することができるように、これら試料間の変性神経突起／斑の個数に差異はなかった。
【００５４】
【図１６】図１６は、図１５に表されているデータの定量的比較を示すグラフであり、１斑当たりの基線変性神経突起の動物間のばらつきが考慮されている。１Ａβ斑当たりのジストロフィーの個数を、各ＺＦＰ−ＴＦ処置脳半球または対側ｔＲＦＰ処置脳半球毎に平均し、対応のある両側Ｔ検定を使用して比較した。各コホートの値は、ｔＲＦＰ処置側の平均に合わせて調整した（１００％に設定）。この対応のある分析を使用したところ、変性神経突起は、５２３８９Ｖ処置コホート（左端（灰色）バーは、３８９ｄＶ処置であり、左から２番目の（白色）バーは、ｔＲＦＰ処置である）で有意に低減されたが（平均３４％低減）、無関連ＺＦＰ−ＴＦで処置したコホート（１７２ｄＶ、右から２番目の（灰色縞模様）バー；ｔＲＦＰ、右端の（白色縞模様）バー）では低減されなかったことが見出された。
【００５５】
【図１７】図１７は、ＺＦＰ−ＴＦで処置したマウスに由来する海馬組織に対するマイクロアレイ分析の例示的な結果を表す。ＺＦＰ−ＴＦを、本明細書に記載のＡＡＶ（２．５ｅ１２ｖｇ／動物）を使用して、後眼窩送達により動物に送達した。マウスを処置し、１０週で犠牲にした。表されている結果は、無関連ＺＦＰ−ＴＦ対照と比較したデータである。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
本明細書には、タウオパチーを予防および／または処置するための組成物および方法が開示される。特に、本明細書に記載の組成物および方法は、ＭＡＰＴ（タウ）タンパク質の発現を抑制して、アルツハイマー病（ＡＤ）、前頭側頭型認知症（Frontotermporal  Dementia）、進行性核上麻痺、発作性障害、および／または大脳皮質基底核変性症などのタウオパチーを予防または処置するために使用される。ＭＡＰＴリプレッサー（例えば、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ  ＴＦ）、ＴＡＬＥ（ＴＡＬＥ−ＴＦ）、および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ＴＦ）を含むＭＡＰＴ調節転写因子などのＭＡＰＴ調節転写因子）は、例えば、タウオパチー（例えば、ＡＤ）を有する対象の脳におけるタウの凝集を低減することにより、および神経濃縮体の発生を低減することにより、タウオパチーの影響および／または症状が低減または排除されるようにＣＮＳを修飾する。好ましい実施形態では、ＭＡＰＴ調節転写因子は、ＡＡＶなどのウイルスベクターにより脳に送達される。ＡＡＶは、脳送達に十分に好適であることが示されており、したがってＭＡＰＴ調節転写因子を送達するためのこれらウイルスベクターの使用は、タウタンパク質の不適切な発現およびそれによる凝集と関連するアルツハイマー病などの疾患の処置に特に有用である。
基本的事項
【００５７】
本明細書で開示されている方法の実施ならびに組成物の調製および使用には、別様の指定がない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算機化学、細胞培養、組換えＤＮＡ、および関連分野の従来技法が使用され、それらは、当業者の技能の範囲内である。こうした技法は、文献に十分に説明されている。例えば、以下の文献を参照されたい：Sambrookら、MOLECULAR  CLONING:  A  LABORATORY  MANUAL、第２版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、１９８９年および第３版、２００１年；Ausubelら、CURRENT  PROTOCOLS  IN  MOLECULAR  BIOLOGY、John  Wiley  &  Sons、New  York、１９８７年および定期改訂版；  METHODS  IN  ENZYMOLOGYシリーズ、Academic  Press、San  Diego；Wolffe、CHROMATIN  STRUCTURE  AND  FUNCTION、第３版、Academic  Press、San  Diego、１９９８年；METHODS  IN  ENZYMOLOGY、３０４巻、「Chromatin」（P.M.  WassarmanおよびA.  P.  Wolffe編）、Academic  Press、San  Diego、１９９９年；およびMETHODS  IN  MOLECULAR  BIOLOGY、１１９巻、「Chromatin  Protocols」（P.B.  Becker編）Humana  Press、Totowa、１９９９年。
定義
【００５８】
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」は、同義的に使用され、線形または環状コンフォメーションおよび一本鎖または二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的では、こうした用語は、ポリマーの長さに関して限定されると解釈されるべきではない。上記用語は、天然ヌクレオチドの公知類似体、ならびに塩基、糖、および／またはホスフェート部分（例えば、ホスホロチオエート骨格）が修飾されているヌクレオチドを包含することができる。一般的に、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対合特異性を有する。つまり、Ａの類似体は、Ｔと塩基対合するであろう。
【００５９】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、同義的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学類似体または修飾誘導体であるアミノ酸ポリマーにも当てはまる。
【００６０】
「結合」は、巨大分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的な非共有結合による相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用のすべての成分が、配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格のホスフェート残基との接触）。そのような相互作用は、一般的には、１０−６Ｍ−１またはそれよりも低い解離定数（Ｋｄ）により特徴付けられる。「親和性」は、結合の強さを指し、結合親和性の増加は、より低いＫｄに相関する。
【００６１】
「結合タンパク質」は、別の分子と非共有結合で結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）、および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合、それ自体と結合してもよく（ホモ二量体、ホモ三量体などを形成する）および／または異なるタンパク質（複数可）の１つまたは複数の分子に結合してもよい。結合タンパク質は、１つよりも多いタイプの結合活性を有する場合がある。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合活性、ＲＮＡ結合活性、およびタンパク質結合活性を有する。
【００６２】
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、その構造が亜鉛イオンの配位により安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１つまたは複数のジンクフィンガーを介して、配列特異的な様式でＤＮＡに結合するタンパク質またはより大きなタンパク質内のドメインである。用語ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略されることが多い。
【００６３】
「ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つまたは複数のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。反復ドメインは、その同種標的ＤＮＡ配列に対するＴＡＬＥの結合に関与する。単一の「反復単位」（「リピート」とも呼ばれる）は、典型的には、長さが３３〜３５個のアミノ酸であり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥ反復配列と少なくともある程度の配列相同性を示す。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。
【００６４】
「ＴｔＡｇｏ」は、遺伝子サイレンシングに関与すると考えられている原核生物アルゴノートタンパク質である。ＴｔＡｇｏは、細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来する。例えば、Swartsら（２０１４年）Nature  ５０７巻（７４９１号）：２５８〜２６１頁、G.  Shengら、（２０１３年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.、１１１巻、６５２号）を参照されたい。「ＴｔＡｇｏ系」は、例えば、ＴｔＡｇｏ酵素による切断のためのガイドＤＮＡを含む、必要とされるすべての成分である。「組換え」は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組換えによるドナー捕捉を含むが、それに限定されない、２つのポリヌクレオチド間で遺伝情報を交換するプロセスを指す。本開示の目的では、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば、相同組換え修復機序による細胞での二本鎖破断の修復中に生じるような交換の特殊な形態を指す。このプロセスでは、ヌクレオチド配列相同性が必要とされ、「標的」分子（つまり、二本鎖破断を経験したもの）の鋳型修復に対する「ドナー」分子が使用され、ドナーから標的への遺伝情報の移転に結び付くため、「非交差型遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として種々に公知である。いかなる特定の理論にも束縛されることは望まないが、そのような移転は、破断された標的とドナーとの間で形成されるヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ修正、および／またはドナーを使用して、標的の一部になることになる遺伝情報を再合成する「合成依存性鎖アニーリング」、および／または関連プロセスに関与する場合がある。このような特殊なＨＲは、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部またはすべてが、標的ポリヌクレオチドに組み込まれるように、標的分子の配列の変更をもたらすことが多い。
【００６５】
ｓｇＲＮＡ、ジンクフィンガー結合ドメイン、またはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインなどのＤＮＡ結合ドメインは、例えば、選択した標的部位に結合するｓｇＲＮＡを設計することにより、または天然に存在するジンクフィンガータンパク質の認識ヘリックス領域を遺伝子操作すること（１つまたは複数のアミノ酸を変更すること）により、またはＴＡＬＥタンパク質のＲＶＤを遺伝子操作することにより、所定のヌクレオチド配列に結合するように「遺伝子操作」することができる。したがって、遺伝子操作ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、天然に存在しないタンパク質である。ＤＮＡ結合ドメインを遺伝子操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。「設計」されたジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、その設計／組成物が原理的に合理的基準に起因する、天然に存在しないタンパク質である。設計の合理的基準は、置換ルール、ならびに既存のＺＦＰ設計および結合データの情報が保存されているデータベースの情報を処理するためのコンピューター化アルゴリズムを適用することを含む。「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、自然界に見出されないタンパク質であり、その産生は、主に、ファージディスプレイ、相互作用トラップ、またはハイブリッド選択などの実験的プロセスに起因する。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号、第６，１４０，０８１号、第６，４５３，２４２号、第６，７４６，８３８号、第７，２４１，５７３号、第６，８６６，９９７号、第７，２４１，５７４号、および第６，５３４，２６１号を参照されたい。また国際公開第０３／０１６４９６号を参照されたい。
【００６６】
用語「配列」は、任意の長さのヌクレオチド配列を指し、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、線形、環状、または分岐であってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。用語「ドナー配列」は、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さであってもよく、例えば、２〜１０，０００個ヌクレオチドの長さ（またはその間のまたはそれよりも大きな任意の整数値）、好ましくは約１００〜１，０００個ヌクレオチドの長さ（またはその間の任意の整数）、より好ましくは約２００〜５００個ヌクレオチドの長さであってもよい。
【００６７】
「標的部位」または「標的配列」は、結合が存在するために条件が十分である場合に、結合分子が結合することになる核酸の部分を画定する核酸配列である。
【００６８】
「外因性」分子は、通常は細胞中に存在しないが、１つまたは複数の遺伝子的、生化学的、または他の方法により細胞に導入することができる分子である。「通常は細胞中に存在する」は、細胞の特定の発生段階および環境条件に関して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生中にのみ存在する分子は、成人筋細胞に関しては外因性分子である。同様に、熱ショックにより誘導される分子は、熱ショックを受けていない細胞に関しては外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全の内因性分子の機能性型または正常に機能する内因性分子の機能不全型を含むことができる。
【００６９】
外因性分子は、特に、コンビナトリアルケミストリープロセスにより生成されるものなどの低分子であってもよく、あるいはタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、ポリサッカリド、上記分子の任意の修飾誘導体、または上記分子の１つまたは複数を含む任意の複合体などの巨大分子であってもよい。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、一本鎖または二本鎖であってもよく、線形、分岐、または環状であってもよく、任意の長さであってもよい。核酸としては、二重鎖を形成することが可能なもの、ならびに三重鎖形成核酸が挙げられる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチン再構成因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース、およびヘリカーゼ。
【００７０】
外因性分子は、内因性分子と同じタイプの分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であってもよい。例えば、外因性核酸は、感染ウイルスゲノム、細胞に導入されるプラスミドもしくはエピソーム、または通常は細胞に存在しない染色体を含むことができる。外因性分子を細胞に導入するための方法は、当業者に公知であり、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：脂質媒介性移入（つまり、中性および陽イオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注射、細胞融合、粒子衝撃、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性移入、およびウイルスベクター媒介性移入。また、外因性分子は、内因性分子と同じタイプであるが、細胞が由来するものとは異なる種に由来する分子であってもよい。例えば、ヒト核酸配列は、元々はマウスまたはハムスターに由来する細胞株に導入してもよい。
【００７１】
対照的に、「内因性」分子は、特定の環境条件下の特定の発生段階にある特定の細胞に通常存在するものである。例えば、内因性核酸は、染色体；ミトコンドリア、葉緑体、または他のオルガネラゲノム；または天然に存在するエピソーム核酸を含むことができる。追加の内因性分子としては、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を挙げることができる。
【００７２】
「融合」分子は、２つまたはそれよりも多くのサブユニット分子が、好ましくは共有結合で連結されている分子である。サブユニット分子は、同じ化学タイプの分子であってもよく、または異なる化学タイプの分子であってもよい。第１のタイプの融合分子の例としては、これらに限定されないが、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインと１つまたは複数の活性化ドメインとの融合）および融合核酸（例えば、上記に記載の融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられる。第２のタイプの融合分子の例としては、これらに限定されないが、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの融合体、および副溝結合剤と核酸との融合体が挙げられる。また、この用語は、ポリヌクレオチド成分が、ポリペプチド成分に付随して、機能性分子を形成する系（例えば、単鎖ガイドＲＮＡが、機能性ドメインに付随して、遺伝子発現を調節するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）を含む。
【００７３】
細胞での融合タンパク質の発現は、融合タンパク質を細胞に送達することに起因してもよく、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞に送達して、細胞内でポリヌクレオチドが転写され、転写物が翻訳されて、融合タンパク質が生成されることに起因してもよい。また、トランススプライシング、ポリペプチド切断、およびポリペプチドライゲーションが、細胞でのタンパク質の発現に関与する場合がある。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを細胞に送達するための方法は、本開示の他所に示されている。
【００７４】
「多量体化ドメイン」（「二量体化ドメイン」または「タンパク質相互作用ドメイン」とも呼ばれる）は、ＺＦＰ  ＴＦまたはＴＡＬＥ  ＴＦのアミノ、カルボキシ、またはアミノおよびカルボキシ末端領域に組み込まれるドメインである。こうしたドメインは、よりロングトラクトのトリヌクレオチド反復ドメインが、野生型数の長さを有するよりショートトラクトのものと比べて、多量体化ＺＦＰ  ＴＦまたはＴＡＬＥ  ＴＦに優先的に結合されるように、複数のＺＦＰ  ＴＦまたはＴＡＬＥ  ＴＦ単位の多量体化を可能にする。多量体化ドメインの例としては、ロイシンジッパーが挙げられる。また、多量体化ドメインは、低分子により制御することができ、その場合、多量体化ドメインは、低分子または外部リガンドの存在下でのみ、別の多量体化ドメインとの相互作用が可能である適切なコンフォメーションであることが想定される。このように、外因性リガンドを使用して、こうしたドメインの活性を制御することができる。
【００７５】
「遺伝子」は、本開示の目的では、そのような制御配列がコード配列および／または転写配列に隣接しているか否かに関わらず、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（下記を参照）ならびに遺伝子産物の産生を制御するすべてのＤＮＡ領域を含む。したがって、遺伝子は、必ずしもこれらに限定されないが、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および内部リボソーム侵入部位などの翻訳制御配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位、および遺伝子座コントロール領域を含む。
【００７６】
「遺伝子発現」は、遺伝子に含まれている情報を遺伝子産物へと変換することを指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、または任意の他のタイプのＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳により産生されるタンパク質であってもよい。また、遺伝子産物としては、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集などのプロセスにより修飾されたＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリストイル化（myristilation）、およびグリコシル化により修飾されたタンパク質が挙げられる。
【００７７】
遺伝子発現の「調節」は、遺伝子の活性を変化させることを指す。発現の調節としては、これらに限定されないが、遺伝子活性化および遺伝子抑制を挙げることができる。ゲノム編集（例えば、切断、変更、不活化、ランダム突然変異）を使用して、発現を調節することができる。遺伝子不活化は、本明細書に記載のようなＺＦＰまたはＴＡＬＥタンパク質を含まない細胞と比較した、遺伝子発現の任意の低減を指す。したがって、遺伝子不活化は、部分的であってもよく、または完全であってもよい。
【００７８】
「遺伝子モジュレーター」は、１つまたは複数の遺伝子の発現および／または配列を変更する任意の分子を指す。遺伝子モジュレーターの非限定的な例としては、標的遺伝子に結合し、その発現を変更する転写因子（本明細書に記載のような人工転写因子など）および標的遺伝子の配列を修飾し、ひいてはその発現を変更する（例えば、挿入および／または欠失により標的を不活化する）ヌクレアーゼが挙げられる。したがって、遺伝子モジュレーターは、遺伝子リプレッサー（遺伝子発現を抑制および／または不活化する）であってもよく、または遺伝子活性化因子であってもよい。
【００７９】
「目的の領域」は、外因性分子に結合することが望ましい、例えば、遺伝子または遺伝子内のもしくは隣接する非コード配列などの、細胞性クロマチンの任意の領域である。結合は、標的化ＤＮＡ切断および／または標的化組換えの目的であってもよい。例えば、目的の領域は、染色体、エピソーム、オルガネラゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）、または感染ウイルスゲノムに存在してもよい。目的の領域は、遺伝子のコード領域内にあってもよく、例えば、リーダー配列、トレーラー配列、またはイントロンなどの転写された非コード領域内にあってもよく、またはコード領域の上流または下流のいずれかの非転写領域内にあってもよい。目的の領域は、単一のヌクレオチド対と小さくともよく、または最大で２，０００個ヌクレオチド対の長さであってもよく、または任意の整数値のヌクレオチド対であってもよい。
【００８０】
「真核生物」細胞としては、これらに限定されないが、真菌細胞（酵母など）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が挙げられる。
【００８１】
用語「作動可能な連結」および「作動可能に連結した」（または「作動可能に連結した」）は、２つまたはそれよりも多くの成分（配列エレメントなど）の並置であって、両成分が正常に機能し、成分の少なくとも１つが、他の成分の少なくとも１つに及ぼされる機能を媒介することができる可能性をもたらすように配置されている並置に関して、同義的に使用される。説明のためであるが、プロモーターなどの転写制御配列は、転写制御配列が１つまたは複数の転写制御因子の存在または非存在に応答してコード配列の転写レベルをコントロールする場合、コード配列に作動可能に連結している。転写制御配列は、一般的には、コード配列とｃｉｓで作動可能に連結されるが、それに直接隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは、近接していないが、コード配列に作動可能に連結した転写制御配列である。
【００８２】
融合ポリペプチドに関して、用語「作動可能に連結した」は、成分の各々が、他の成分と連結している状態で、そのように連結されていない場合と同じ機能を果たすという事実を指すことができる。例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインが活性化ドメインに融合されている融合分子に関して、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン部分が、その標的部位および／またはその結合部位に結合することができ、活性化ドメインが、遺伝子発現を上方制御することができる場合、作動可能な連結にある。遺伝子発現を制御することが可能なドメインと融合されたＺＦＰは、「ＺＦＰ−ＴＦ」または「ジンクフィンガー転写因子」と総称され、遺伝子発現を制御することが可能なドメインと融合されたＴＡＬＥは、「ＴＡＬＥ−ＴＦ」または「ＴＡＬＥ転写因子」と総称される。ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメイン部分が切断ドメインと融合されている融合ポリペプチド（「ＺＦＮ」または「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」）の場合、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインは、この融合ポリペプチドのＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメイン部分が、その標的部位および／または結合部位に結合することができ、切断ドメインが、標的部位の近傍でＤＮＡを切断することができる場合、作動可能な連結にある。ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインと融合されている融合ポリペプチド（「ＴＡＬＥＮ」または「ＴＡＬＥヌクレアーゼ」）の場合、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインは、この融合ポリペプチドのＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン部分が、その標的部位および／または結合部位に結合することができ、切断ドメインが、標的部位の近傍でＤＮＡを切断することができる場合、作動可能な連結にある。Ｃａｓ  ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、単鎖ガイドＲＮＡ）が活性化ドメインと融合されている融合分子に関して、Ｃａｓ  ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、融合ポリペプチドのＣａｓ  ＤＮＡ結合ドメイン部分が、その標的部位および／またはその結合部位に結合することができ、活性化ドメインが遺伝子発現を上方制御することができる場合、作動可能な連結にある。Ｃａｓ  ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインと融合されている融合ポリペプチドの場合、Ｃａｓ  ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインは、この融合ポリペプチドのＣａｓ  ＤＮＡ結合ドメイン部分が、その標的部位および／または結合部位に結合することができ、切断ドメインが、標的部位の近傍でＤＮＡを切断することができる場合、作動可能な連結にある。
【００８３】
タンパク質、ポリペプチド、または核酸の「機能性断片」は、その配列が、全長タンパク質、ポリペプチド、または核酸と同一ではないが、全長タンパク質、ポリペプチド、または核酸と同じ機能を保持するタンパク質、ポリペプチド、または核酸である。機能性断片は、対応する天然分子よりも多くの、少数の、または同じ数の残基を有していてもよく、および／または１つまたは複数のアミノ酸またはヌクレオチド置換を含んでいてもよい。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、当技術分野で周知である。同様に、タンパク質機能を決定するための方法は、周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合、電気泳動移動度シフト、または免疫沈降アッセイにより決定することができる。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動によりアッセイすることができる。Ausubelら、上記を参照されたい。タンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば、遺伝学的および生化学的の両方である、免疫共沈降、ツーハイブリッドアッセイ、または相補性により決定することができる。例えば、Fieldsら、（１９８９年）Nature  ３４０巻：２４５〜２４６頁；米国特許第５，５８５，２４５号および国際公開第９８／４４３５０号を参照されたい。
【００８４】
「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に移入することが可能である。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、および「遺伝子移入ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に移入することができる、目的の遺伝子の発現を指図することが可能な任意の核酸構築物を意味する。したがって、この用語は、クローニングおよび発現ビヒクルならびに組込みベクターを含む。
【００８５】
「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」は、必ずではなくともよいが好ましくは、日常的なアッセイで容易に測定されるタンパク質産物を産生する任意の配列を指す。好適なレポーター遺伝子としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、有色または蛍光性または発光性タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）をコードする配列、ならびに細胞増殖増強および／または遺伝子増幅を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素）。エピトープタグとしては、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡ、または任意の検出可能なアミノ酸配列の１つまたは複数のコピーが挙げられる。「発現タグ」としては、目的の遺伝子の発現をモニターするために所望の遺伝子配列に作動可能に連結していてもよいレポーターをコードする配列が挙げられる。
タウおよびアルツハイマー病
【００８６】
タウタンパク質は、１６個のエクソンを含むＭＡＰＴ遺伝子によりコードされる。興味深いことには、エクソン１、４、５、７、９、１１、および１２ならびに構成的に発現されるエクソン２、３、および１０が、選択的スプライス変異体に由来するタウタンパク質種に存在し、成人脳での６つの異なるタウタンパク質アイソフォームの存在に結び付く。タウは、このタンパク質のＣ末端半分にある３つまたは４つの反復チューブリン結合モチーフを介して微小管に結合し、細管を安定化させると考えられており、ｔａｕ４Ｒ（４つのチューブリン結合モチーフ）が、ｔａｕ３Ｒよりも強く微小管と相互作用すると考えられている。３Ｒの４Ｒに対する比は、一般的に安定しているが、病理学的状態では影響を受ける場合がある。微小管と相互作用するタウ形態は、リン酸化されており、高リン酸化は、タウを微小管から脱離させると考えられる。高リン酸化（Hyperphosphoylated）タウは、細胞では隔離される場合があり、その後タンパク質のコンフォメーション変化および凝集に結び付く。こうした凝集体は、病原性神経原線維濃縮体（ＮＦＴ）の形成の初期ステップであり得るが、高リン酸化タウは、可溶性形態でもならびに濃縮体に存在する場合でも、病原性であり得る（Bodeaら、（２０１６年）J  of  Neurochem  １３８巻（付録１）：７１〜９４頁）。ＮＦＴは、ＡＤの初期段階での嗅内皮質および内側頭葉に限定され、疾患の重度臨床症状が現れる時点までには、脳の全体にわたって広く蔓延している。豊富なＮＦＴの存在と一致して、アミロイド斑の広範囲の分布も生じる。実際、皮質におけるアミロイド沈着は、タウ伝播の速度、および脳の遠位領域へのＮＦＴ蔓延の増加に結び付くと考えられる。タウ濃縮体の蔓延と共に、ニューロン喪失が同時に増加する（Poolerら、（２０１５年）Acta  Neuropathol  Commun  ３巻：１４頁、doi:10.1186/s40478-015-0199-x）。
【００８７】
タウは、リン酸化することが可能な９５個のアミノ酸残基を有しており、タウリン酸化の原因であり得る幾つかのキナーゼが特定されており、それらは、グリコーゲン合成酵素−３、サイクリン依存性キナーゼ５、ＭＡＰＫファミリーのメンバー、細胞外制御キナーゼ、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ、および微小管親和性制御キナーゼを含む、新しい治療剤の考え得る標的候補であり得る（Bodea（２０１６年）同書）。
【００８８】
アミロイドβタンパク質（Ａβ）は、老人斑の主要構成成分であり、ＮＦＴと共に、アルツハイマー病の神経病理学的確認の証である。Ａβは、３９〜４２個アミノ酸鎖を有するペプチドであり、４２個アミノ酸は、より活発に凝集体を形成し、この疾患の病態形成に関与が示唆されると考えられており、アミロイド仮説の基盤である（脳におけるＡβの蓄積が、ＡＤの主要原因であるという提唱。総説は、HardyおよびSelkoe（２００２年）Science  ２９７巻：３５３頁を参照）。Ａβは、遍在性のグリコシル化、硫酸化、およびリン酸化された膜内在性タンパク質であるアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）のタンパク質分解性切断の産物である（Sorrentinoら、（２０１４年）FEBS  Lett  ５８８巻：６４１〜６５２頁）。しかしながら、ＡＤに結び付く病態形成は非常に複雑であり、Ａβ蓄積の病態形成が、異常なタウ挙動に役割を果たし得ることが明らかになりつつある（Andoら、（２０１６年）PLoS  Genet  １２巻（３号）：ｅ１００５９１７頁。
【００８９】
脳におけるタウの低減は、ＡＤの病理を改善することが示されている。マウスＡＤモデルにおけるタウ導入遺伝子発現の制御された抑制により、導入遺伝子関連タウ凝集体が低減され、高リン酸化タウおよびＮＦＴの濃度が減少することが実証された。実際、この研究は、全体的なＮＦＴの喪失も示し、ＮＦＴの蓄積が可逆的であり得ることが示された（Polydoroら、（２０１３年）J  of  Neurosci  ３３巻（３３号）：１３３００〜１３３１１頁）。加えて、海馬内投与によりＡＡＶを介して直接送達された細胞内抗タウ抗体を用いて実施された研究により、不溶性タウ種であるＮＦＴの低減、および未処置マウスモデルで観察される海馬萎縮の救出が実証された（Liuら、（２０１６年）J  Neurosci  ３６巻（４９号）：１２４２５〜１２４３５頁）。
ＤＮＡ結合ドメイン
【００９０】
本明細書に記載の方法では、タウ（ＭＡＴＰ）遺伝子の標的配列に特異的に結合するＤＮＡ結合ドメインを含む組成物、例えばタウ調節転写因子が使用される。任意のポリヌクレオチドまたはポリペプチドＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ）またはＤＮＡ結合ポリヌクレオチド（例えば、単鎖ガイドＲＮＡ）を、本明細書に開示されている組成物および方法に使用することができる。したがって、タウ遺伝子の遺伝子モジュレーター（リプレッサー）が記載されている。
【００９１】
ある特定の実施形態では、タウリプレッサーまたはその中にあるＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。標的部位の選択；ＺＦＰおよび融合タンパク質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）を設計および構築するための方法は当業者に公知であり、以下の文献に詳述されている：米国特許第６，１４０，０８１号、第５，７８９，５３８号、第６，４５３，２４２号、第６，５３４，２６１号、第５，９２５，５２３号、第６，００７，９８８号、第６，０１３，４５３号、第６，２００，７５９号、ならびに国際公開第９５／１９４３１号、第９６／０６１６６号、第９８／５３０５７号、第９８／５４３１１号、第００／２７８７８号、第０１／６０９７０号、第０１／８８１９７号、第０２／０９９０８４号、第９８／５３０５８号、第９８／５３０５９号、第９８／５３０６０号、第０２／０１６５３６号、および第０３／０１６４９６号。
【００９２】
タウ標的部位は、典型的には、少なくとも１つのジンクフィンガーを含むが、複数のジンクフィンガー（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれよりも多くのフィンガー）を含んでいてもよい。通常、ＺＦＰは、少なくとも３つのフィンガーを含む。ＺＦＰのあるものは、４、５、または６つのフィンガーを含み、一部のＺＦＰは、８、９、１０、１１、または１２個のフィンガーを含む。３つのフィンガーを含むＺＦＰは、典型的には、９個または１０個のヌクレオチドを含む標的部位を認識し、４つのフィンガーを含むＺＦＰは、典型的には、１２〜１４個のヌクレオチドを含む標的部位を認識し、６つのフィンガーを有するＺＦＰは、１８〜２１個のヌクレオチドを含む標的部位を認識することができる。また、ＺＦＰは、転写活性化ドメインであってもよくまたは転写抑制ドメインであってもよい１つまたは複数の制御ドメインを含む融合タンパク質であってもよい。一部の実施形態では、融合タンパク質は、共に連結されている２つのＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。したがって、こうしたジンクフィンガータンパク質は、８、９、１０、１１、１２個、またはそれよりも多くのフィンガーを含んでいてもよい。一部の実施形態では、２つのＤＮＡ結合ドメインは、１つのＤＮＡ結合ドメインが、４、５、または６つのジンクフィンガーを含み、第２のＤＮＡ結合ドメインが、追加の４、５、または５つのジンクフィンガーを含むように、拡張可能な可撓性リンカーを介して連結されている。一部の実施形態では、リンカーは、標準的フィンガー間リンカーであり、フィンガーアレイが、８、９、１０、１１、または１２個、またはそれよりも多くのフィンガーを含む１つのＤＮＡ結合ドメインを含む。他の実施形態では、リンカーは、可撓性リンカーなどの非典型的なリンカーである。ＤＮＡ結合ドメインは、少なくとも１つの制御ドメインと融合されており、「ＺＦＰ−ＺＦＰ−ＴＦ」アーキテクチャと考えることができる。こうした実施形態の具体的な例は、可撓性リンカーで連結された２つのＤＮＡ結合ドメインを含み、ＫＯＸリプレッサーと融合されている「ＺＦＰ−ＺＦＰ−ＫＯＸ」、および２つのＺＦＰ−ＫＯＸ融合タンパク質がリンカーを介して共に融合されている「ＺＦＰ−ＫＯＸ−ＺＦＰ−ＫＯＸ」と称される場合がある。
【００９３】
遺伝子操作ジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して、新規の結合特異性を有することができる。遺伝子操作法としては、これらに限定されないが、合理的設計および種々のタイプの選択が挙げられる。合理的設計は、例えば、三重（または四重）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することを含み、各三重または四重ヌクレオチド配列は、特定の三重または四重配列に結合するジンクフィンガーの１つまたは複数のアミノ酸配列に付随する。例えば、共有の米国特許第６，４５３，２４２号および第６，５３４，２６１号を参照されたい。これらの文献は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００９４】
加えて、これらおよび他の文献に開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／または多フィンガーのジンクフィンガータンパク質は、例えば、長さが５つまたはそれよりも多くのアミノ酸のリンカーを含む、任意の好適なリンカー配列を使用して共に連結することができる。また、長さが６つまたはそれよりも多くのアミノ酸の例示的なリンカー配列は、米国特許第６，４７９，６２６号、第６，９０３，１８５号、および第７，１５３，９４９号を参照されたい。本明細書に記載のタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間の好適なリンカーの任意の組合せを含んでいてもよい。
【００９５】
ＺＦＰを、１つまたは複数の転写制御（例えば、抑制ドメイン）に作動可能に付随（連結）させて、ＺＦ−ＴＦ（例えば、リプレッサー）を形成することができる。また、方法および組成物を使用して、例えば、米国特許出願第１５／６８５，５８０号に記載のようなＺＦＰ骨格に対する突然変異により、オフターゲット部位として公知の他の意図されていない切断部位と比べて、その意図されている標的に対するＺＦＰの特異性を増加させることができる。したがって、本明細書に記載のタウリプレッサーは、それらのＤＮＡ結合ドメイン骨格領域の１つまたは複数に突然変異を含んでいてもよく、および／またはそれらの転写制御ドメインに１つまたは複数の突然変異を含んでいてもよい。こうしたＺＦＰは、ＤＮＡ骨格のホスフェートと非特異的に相互作用する場合がある、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメイン（「ＺＦＰ骨格」）内のアミノ酸に突然変異を含んでいてもよいが、ＤＮＡ認識ヘリックスには変化を含まない。したがって、本発明は、ヌクレオチド標的特異性に必要とされないＺＦＰ骨格に陽イオン性アミノ酸残基の突然変異を含む。一部の実施形態では、ＺＦＰ骨格におけるこうした突然変異は、陽イオン性アミノ酸残基を、中性または陰イオン性アミノ酸残基に突然変異させることを含む。一部の実施形態では、ＺＦＰ骨格におけるこうした突然変異は、極性アミノ酸残基を、中性または無極性アミノ酸残基に突然変異させることを含む。好ましい実施形態では、突然変異は、ＤＮＡ結合ヘリックスに対して（−５）位、（−９）位、および／または（−１４）位になされている。一部の実施形態では、ジンクフィンガーは、（−５）、（−９）、および／または（−１４）に１つまたは複数の突然変異を含んでいてもよい。さらなる実施形態では、多フィンガーのジンクフィンガータンパク質の１つまたは複数のジンクフィンガーは、（−５）、（−９）、および／または（−１４）に突然変異を含んでいてもよい。一部の実施形態では、（−５）、（−９）、および／または（−１４）のアミノ酸（例えば、アルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ））を、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ａｓｐ（Ｎ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、および／またはグルタミン（Ｑ）に突然変異させる。
【００９６】
あるいは、ＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼに由来してもよい。例えば、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、およびＩ−ＴｅｖＩＩＩなどのホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの認識配列が公知である。また、米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Belfortら、（１９９７年）Nucleic  Acids  Res.  ２５巻：３３７９〜３３８８頁；Dujonら、（１９８９年）Gene  ８２巻：１１５〜１１８頁；Perlerら、（１９９４年）Nucleic  Acids  Res.  ２２巻、１１２５〜１１２７頁；Jasin（１９９６年）Trends  Genet.  １２巻：２２４〜２２８頁；Gimbleら、（１９９６年）J.  Mol.  Biol.  ２６３巻：１６３〜１８０頁；Argastら、（１９９８年）J.  Mol.  Biol.  ２８０巻：３４５〜３５３頁；およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログを参照されたい。加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性を、非天然標的部位に結合するように遺伝子操作することができる。例えば、Chevalierら、（２００２年）Molec.  Cell  １０巻：８９５〜９０５頁；Epinatら、（２００３年）Nucleic  Acids  Res.  ３１巻：２９５２〜２９６２頁；Ashworthら、（２００６年）Nature  ４４１巻：６５６〜６５９頁；Paquesら、（２００７年）Current  Gene  Therapy  ７巻：４９〜６６頁；米国特許出願公開第２００７／０１１７１２８号を参照されたい。
【００９７】
「両手型」ジンクフィンガータンパク質は、２つのジンクフィンガードメインが２つの不連続標的部位に結合するように、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインの２つのクラスターが、介在性アミノ酸により分離されているタンパク質である。両手型タイプのジンクフィンガー結合タンパク質の例は、４つのジンクフィンガーのクラスターが、タンパク質のアミノ末端に位置し、３つのフィンガーのクラスターが、カルボキシル末端に位置するＳＩＰ１である（Remacleら（１９９９年）EMBO  Journal  １８巻（１８号）：５０７３〜５０８４頁を参照されたい）。こうしたタンパク質中のジンクフィンガーの各クラスターは、固有の標的配列に結合することができ、２つの標的配列間の間隔は、多数のヌクレオチドを含んでいてもよい。両手型ＺＦＰは、例えば、一方のまたは両方のＺＦＰに融合されている機能性ドメインを含んでいてもよい。したがって、機能性ドメインは、一方のまたは両方のＺＦＰの外側に付着されていてもよく、またはＺＦＰ間に配置（両方のＺＦＰに付着）されていてもよいことは明白であろう。
【００９８】
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するかまたは遺伝子操作された（天然に存在しない）ＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態では、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合タンパク質は、表１または２（配列番号１〜６または３３）に示されているような、タウ標的部位の１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれよりも多くの近接ヌクレオチドに結合する。タウ標的部位に結合するＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合タンパク質のＲＶＤは、天然に存在するかまたは天然に存在しないＲＶＤであってもよい。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号および第９，４５８，２０５号を参照されたい。
【００９９】
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属の植物病原性細菌は、重要な穀物植物に多数の疾患を引き起こすことが公知である。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓの病原性は、２５個よりも多くの異なるエフェクタータンパク質を植物細胞に注入する保存されたＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。こうした注入タンパク質の中には、植物転写活性化因子を模倣し、植物トランスクリプトームを操作する転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）がある（Kayら、（２００７年）Science  ３１８巻：６４８〜６５１頁を参照）。こうしたタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含む。最もよく特徴付けられているＴＡＬＥの１つは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｇｒｉｓ  ｐｖ．Ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａに由来するＡｖｒＢｓ３である（Bonasら、（１９８９年）Mol  Gen  Genet  ２１８巻：１２７〜１３６頁および国際公開第２０１００７９４３０号を参照）。ＴＡＬＥは、各々がおよそ３４個のアミノ酸を含み、こうしたタンパク質のＤＮＡ結合特異性に重要であるタンデムリピートの中央ドメインを含む。加えて、それらは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含む（総説は、Schornack  Sら、（２００６年）J  Plant  Physiol  １６３巻（３号）：２５６〜２７２頁を参照）。加えて、植物病原性細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍでは、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と名付けられている２つの遺伝子が、Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ次亜種１菌株ＧＭＩ１０００および次亜種４菌株ＲＳ１０００のＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリーと相同性であることが見出されている（Heuerら、（２００７年）Appl  and  Envir  Micro  ７３巻（１３号）：４３７９〜４３８４頁を参照）。これらの遺伝子は、ヌクレオチド配列が互いに９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７の反復ドメインでは１，５７５ｂｐが欠失していることにより異なる。しかしながら、両遺伝子産物は、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性を有する。
【０１００】
こうしたＴＡＬＥの特異性は、タンデムリピートに見出される配列に依存する。反復配列は、およそ１０２ｂｐを含み、上記リピートは、典型的には、互いに９１〜１００％相同性である（Bonasら、同書）。上記リピートの遺伝子多型は、通常は、１２位および１３位に位置し、１２位および１３位の超可変性二残基の同一性と、ＴＡＬＥの標的配列の近接ヌクレオチドの同一性との間には一対一の対応性があると考えられる（MoscouおよびBogdanove（２００９年）Science  ３２６巻：１５０１頁およびBochら、（２００９年）Science  ３２６巻：１５０９〜１５１２頁を参照）。実験的に、こうしたＴＡＬＥのＤＮＡ認識のためのコードは、１２位および１３位のＨＤ配列が、シトシン（Ｃ）への結合に結び付き、ＮＧがＴに結合し、ＮＩがＡ、Ｃ、Ｇ、またはＴに結合し、ＮＮがＡまたはＧに結合し、ＮＧがＴに結合すると決定されている。こうしたＤＮＡ結合リピートは、新しい配列と相互作用することができる人工転写因子を製作するために、新しい組合せおよび個数のリピートを有するタンパク質に構築されている。加えて、米国特許第８，５８６，５２６号および米国特許出願公開第２０１３／０１９６３７３号には、Ｎ−キャップポリペプチド、Ｃ−キャップポリペプチド（例えば、＋６３、＋２３１、または＋２７８）および／または新規（非典型的）ＲＶＤを有するＴＡＬＥが記載されている。これら文献は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１０１】
例示的なＴＡＬＥは、米国特許第８，５８６，５２６号および第９，４５８，２０５号に記載されている。これら文献は、参照によりこれらの全体が組み込まれる。
【０１０２】
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインとしては、二量体化および／または多量体化ドメイン、例えば、コイルドコイル（ＣＣ）および二量体化ジンクフィンガー（ＤＺ）が挙げられる。米国特許出願公開第２０１３／０２５３０４０号を参照されたい。
【０１０３】
またさらなる実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の単鎖ガイドＲＮＡ、例えば２０１５００５６７０５に開示されているようなｓｇＲＮＡを含む。
【０１０４】
最近になって、真核生物ＲＮＡｉ経路と同様であると仮定されているＲＮＡ媒介性ゲノム防御経路が古細菌および多数の細菌に存在することを示す有力な証拠が出現している（総説は、GoddeおよびBickerton、２００６年．J.  Mol.  Evol.６２巻：７１８〜７２９頁；Lillestolら、２００６年．Archaea  ２巻：５９〜７２頁；Makarovaら、２００６年．Biol.  Direct  １巻：７頁．；Sorekら、２００８年．Nat.  Rev.  Microbiol.  ６巻：１８１〜１８６頁を参照）。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系または原核生物ＲＮＡｉ（ｐＲＮＡｉ）として公知のように、上記経路は、２つの進化的におよび多くの場合は物理的に関連付けられる遺伝子座：この系のＲＮＡ成分をコードするＣＲＩＳＰＲ（クラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピート）遺伝子座およびタンパク質をコードするｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座から生じると提案されている（Jansenら、２００２年．Mol.  Microbiol.  ４３巻：１５６５〜１５７５頁；Makarovaら、２００２年．Nucleic  Acids  Res.  ３０巻：４８２〜４９６頁；Makarovaら、２００６年．Biol.  Direct  １巻：７頁；Haftら、２００５年．PLoS  Comput.  Biol.  １巻：ｅ６０頁）。微生物宿主のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子ならびにＣＲＩＳＰＲ媒介性核酸切断の特異性をプログラムすることが可能な非コードＲＮＡエレメントの組合せを含む。個々のＣａｓタンパク質は、真核生物ＲＮＡｉ機構のタンパク質成分とは著しい配列類似性を共有しないが、類似の機能（例えば、ＲＮＡ結合、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼなど）を有することが予測されている（Makarovaら、２００６年．Biol.  Direct  １巻：７頁）。ＣＲＩＳＰＲ関連（ｃａｓ）遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ反復スペーサーアレイと関連していることが多い。４０個よりも多くの異なるＣａｓタンパク質ファミリーが記載されている。これらタンパク質ファミリーのうち、Ｃａｓ１は、様々なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に遍在すると考えられる。ｃａｓ遺伝子および反復構造の特定の組合せを使用して、８つのＣＲＩＳＰＲサブタイプ（Ｅｃｏｌｉ、Ｙｐｅｓｔ、Ｎｍｅｎｉ、Ｄｖｕｌｇ、Ｔｎｅａｐ、Ｈｍａｒｉ、Ａｐｅｒｎ、およびＭｔｕｂｅ）が画定されており、それらの一部は、反復関連ミステリアスタンパク質（ＲＡＭＰ、repeat-associated  mysterious  protein）をコードする追加の遺伝子モジュールと関連している。１つよりも多くのＣＲＩＳＰＲサブタイプが、単一ゲノムに生じる場合がある。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓサブタイプの散発性分布は、この系が、微生物進化中の遺伝子水平移入の影響下にあることを示唆する。
【０１０５】
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓで最初に記載されたＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最もよく特徴付けられている系の１つであり、標的化されたＤＮＡ二本鎖破断を４つの逐次ステップで実施する。第１に、２つの非コードＲＮＡ：プレ−ｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡが、プレ−ｃｒＲＮＡの反復領域にハイブリダイズし、プレ−ｃｒＲＮＡの、個々のスペーサー配列を含む成熟ｃｒＲＮＡへのプロセシングを媒介し、プロセシングは、Ｃａｓ９タンパク質の存在下で二本鎖特異的ＲＮａｓｅ  ＩＩＩにより生じる。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が、ｃｒＲＮＡのスペーサーと、標的認識の追加要件であるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する標的ＤＮＡのプロトスペーサーとの間のワトソン−クリック型塩基対合により、Ｃａｓ９を標的ＤＮＡへと誘導する。加えて、ｔｒａｃｒＲＮＡも、存在しなければならない。それは、その３’末端がｃｒＲＮＡと塩基対合し、この付随がＣａｓ９活性を開始させるからである。最後に、Ｃａｓ９が、標的ＤＮＡの切断を媒介して、プロトスペーサー内に二本鎖破断が作り出される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性は、３つのステップで構成される：（ｉ）「適応」と呼ばれるプロセスにて、外来性ＤＮＡ配列をＣＲＩＳＰＲアレイに挿入して、将来の攻撃を防止するステップ、（ｉｉ）関連タンパク質を発現し、ならびに上記アレイを発現およびプロセシングするステップ、その後（ｉｉｉ）外来性核酸をＲＮＡ媒介性干渉するステップ。したがって、細菌細胞では、いわゆる「Ｃａｓ」タンパク質の幾つかは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の天然機能に関与する。
【０１０６】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は、多数の異なる細菌に見出されている。Fonfaraら（（２０１３年）Nuc  Acid  Res  ４２巻（４号）：２３７７〜２５９０頁）による公的に入手可能なゲノムに対するＢＬＡＳＴ検索は、３４７種の細菌にＣａｓ９オルソログがあることを見出した。加えて、この研究グループは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、およびＦ．ｎｏｖｉｃｉｄａに由来するＣａｓ９オルソログを使用して、ＤＮＡ標的がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ切断されることを実証した。したがって、用語「Ｃａｓ９」は、ＤＮＡ結合ドメインおよび２つのヌクレアーゼドメインを含み、Ｃａｓ９をコードする遺伝子が、任意の好適な細菌に由来していてもよい、ＲＮＡ誘導ＤＮＡヌクレアーゼを指す。
【０１０７】
Ｃａｓ９タンパク質は、少なくとも２つのヌクレアーゼドメインを有する。一方のヌクレアーゼドメインは、ＨＮＨエンドヌクレアーゼに類似し、他方は、Ｒｕｖエンドヌクレアーゼドメインに類似する。ＨＮＨ型ドメインは、ｃｒＲＮＡに相補的であるＤＮＡ鎖の切断に関与し、Ｒｕｖドメインは、非相補鎖を切断すると考えられる。Ｃａｓ９ヌクレアーゼを、ヌクレアーゼドメインの１つのみが機能的であるように遺伝子操作して、Ｃａｓニッカーゼを作り出すことができる（Jinekら、（２０１２年）Science  ３３７巻：８１６頁を参照）。ニッカーゼは、酵素の触媒ドメインのアミノ酸の特定の突然変異により、またはドメインの一部分またはすべてを、もはや機能的でなくなるように短縮することにより生成することができる。Ｃａｓ９は２つのヌクレアーゼドメインを含むため、この手法は、いずれかのドメインに対して採用してもよい。標的ＤＮＡの二本鎖破断は、２つのそのようなＣａｓ９ニッカーゼを使用することにより達成することができる。ニッカーゼは、各々がＤＮＡの一方の鎖を切断することになり、２つを使用すれば、二本鎖破断が作り出されることになる。
【０１０８】
ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の必要性は、通常はｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡのアニーリングにより形成されるヘアピンを含む遺伝子操作「単鎖ガイドＲＮＡ」（ｓｇＲＮＡ）を使用することにより回避することができる（Jinekら、同書およびCongら、（２０１３年）Sciencexpress/10.1126/science.1231143を参照）。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓでは、Ｃａｓ関連ＲＮＡと標的ＤＮＡとの間に二本鎖ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二量体が形成されると、遺伝子操作ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ融合体またはｓｇＲＮＡが、Ｃａｓ９をガイドして標的ＤＮＡを切断する。Ｃａｓ９タンパク質と、ＰＡＭ配列を含む遺伝子操作ｓｇＲＮＡとを含むこの系は、ＲＮＡガイド化ゲノム編集に使用されており（Ramalingamら、Stem  Cells  and  Development２２巻（４号）：５９５〜６１０頁（２０１３年）を参照）、ｉｎ  ｖｉｖｏでのゼブラフィッシュ胚ゲノム編集に有用であり、編集効率は、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮと同様であった（Hwangら、（２０１３年）Nature  Biotechnology  ３１巻（３号）：２２７頁を参照）。
【０１０９】
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の主要産物は、インベーダー標的化配列を含み、この経路におけるそれらの仮説的役割に基づき、ガイドＲＮＡまたは原核生物サイレンシングＲＮＡ（ｐｓｉＲＮＡ）と名付けられている短鎖ＲＮＡであると考えられる（Makarovaら、２００６年．Biol.  Direct  １巻：７頁；Haleら、２００８年．RNA、１４巻：２５７２〜２５７９頁）。ＲＮＡ分析は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座転写物が反復配列内で切断されて、個々のインベーダー標的指向性配列および隣接する反復断片を含む約６０〜７０ｎｔのＲＮＡ中間体が放出されることを示している（Tangら、２００２年．Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  ９９巻：７５３６〜７５４１頁；Tangら、２００５年．Mol.  Microbiol.  ５５巻：４６９〜４８１頁；Lillestolら、２００６年．Archaea  ２巻：５９〜７２頁；Brounsら、２００８年．Science  ３２１巻：９６０〜９６４頁；Haleら、２００８年．RNA、１４巻：２５７２〜２５７９頁）。古細菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓでは、こうした中間体ＲＮＡは、豊富に存在する安定的な約３５〜４５ｎｔの成熟ｐｓｉＲＮＡへとさらにプロセシングされる（Haleら、２００８年．ＲＮＡ、１４巻：２５７２〜２５７９頁）。
【０１１０】
ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の必要性は、通常はｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡのアニーリングにより形成されるヘアピンを含む遺伝子操作「単鎖ガイドＲＮＡ」（ｓｇＲＮＡ）を使用することにより回避することができる（Jinekら、（２０１２年）Science  ３３７巻：８１６頁およびCongら、（２０１３年）Sciencexpress/10.1126/science.1231143を参照）。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓでは、Ｃａｓ関連ＲＮＡと標的ＤＮＡとの間に二本鎖ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二量体が形成されると、遺伝子操作ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ融合体またはｓｇＲＮＡが、Ｃａｓ９をガイドして標的ＤＮＡを切断する。Ｃａｓ９タンパク質と、ＰＡＭ配列を含む遺伝子操作ｓｇＲＮＡとを含むこの系は、ＲＮＡガイド化ゲノム編集に使用されており（Ramalingamら、同書を参照）、ｉｎ  ｖｉｖｏでのゼブラフィッシュ胚ゲノム編集に有用であり、編集効率は、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮと同様であった（Hwangら、（２０１３年）Nature  Biotechnology  ３１巻（３号）：２２７頁を参照）。
【０１１１】
キメラまたはｓｇＲＮＡは、任意の所望の標的と相補的な配列を含むように遺伝子操作することができる。一部の実施形態では、ガイド配列は、長さが、約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５個、または約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５個より多く、またはそれよりも多くのヌクレオチドである。一部の実施形態では、ガイド配列は、長さが、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２個未満、またはそれよりも少ないヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、表１または２（配列番号１〜６または３３）に示されているような、タウ標的部位の１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれよりも多くの近接ヌクレオチドに結合する配列を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡは、標的に相補的で形態Ｇ［ｎ１９］の２２個塩基、その後にＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系で使用するための形態ＮＧＧまたはＮＡＧのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。したがって、１つの方法では、ｓｇＲＮＡは、（ｉ）ＺＦＮヘテロ二量体の認識配列を、関連ゲノムの（ヒト、マウス、または特定の植物種の）参照配列とアラインすること；（ｉｉ）ＺＦＮハーフサイト間のスペーサー領域を特定すること；（ｉｉｉ）スペーサー領域に最も近いモチーフＧ［Ｎ２０］ＧＧの位置を特定すること（１つよりも多くのそのようなモチーフがスペーサーと重複している場合、スペーサーに対して中心のモチーフが選択される）；（ｉｖ）そのモチーフをｓｇＲＮＡのコアとして使用することにより目的の遺伝子の既知ＺＦＮ標的を使用することにより設計することができる。この方法は、実績のあるヌクレアーゼ標的に依存することが有利である。あるいは、ｓｇＲＮＡは、Ｇ［ｎ２０］ＧＧ形式と一致する好適な標的配列を単に特定することにより、任意の目的の領域を標的とするように設計することができる。ｓｇＲＮＡは、相補性領域と共に、ｓｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ部分の尾部領域へと伸長するように追加のヌクレオチドを含んでいてもよい（Hsuら、（２０１３年）Nature  Biotech  doi:10.1038/nbt.2647を参照）。尾部は、＋６７〜＋８５個のヌクレオチドであってもよく、またはその間の任意の個数であってもよく、好ましい長さは、＋８５個のヌクレオチドである。また、短縮型ｓｇＲＮＡ「ｔｒｕ−ｇＲＮＡ」を使用することができる（Fuら、（２０１４年）Nature  Biotech  ３２巻（３号）：２７９頁を参照）。ｔｒｕ−ｇＲＮＡでは、相補性領域は、長さが１７個または１８個ヌクレオチドに縮小されている。
【０１１２】
さらに、代替的ＰＡＭ配列を使用することもでき、その場合、ＰＡＭ配列は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９を使用したＮＧＧの代替物としてのＮＡＧ（Hsu  ２０１３年、同書）であってもよい。また、追加のＰＡＭ配列としては、最初のＧを欠如するものを挙げることができる（SanderおよびJoung（２０１４年）Nature  Biotech  ３２巻（４号）：３４７頁）。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓにコードされているＣａｓ９  ＰＡＭ配列に加えて、他の細菌源に由来するＣａｓ９タンパク質に特異的である他のＰＡＭ配列を使用することができる。例えば、下記に示されているＰＡＭ配列（出典は、SanderおよびJoung、同書およびEsveltら、（２０１３年）Nat  Meth  １０巻（１１号）：１１１６頁）は、そうしたＣａｓ９タンパク質に特異的である。
種                                  ＰＡＭ
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ                ＮＧＧ
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ                ＮＡＧ
Ｓ．ｍｕｔａｎｓ                    ＮＧＧ
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｓ      ＮＧＧＮＧ
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｓ      ＮＮＡＡＡＷ
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｓ      ＮＮＡＧＡＡ
Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｓ      ＮＮＮＧＡＴＴ
Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ                    ＮＮＮＮＡＣＡ
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ        ＮＮＮＮＧＡＴＴ
Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ              ＧＮＮＮＣＮＮＡ
Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ                ＮＧ
【０１１３】
したがって、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系での使用に好適な標的配列は、以下のガイドライン：［ｎ１７、ｎ１８、ｎ１９、またはｎ２０］（Ｇ／Ａ）Ｇに従って選択することができる。あるいは、ＰＡＭ配列は、ガイドラインＧ［ｎ１７、ｎ１８、ｎ１９、ｎ２０］（Ｇ／Ａ）Ｇに従ってもよい。非Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ細菌に由来するＣａｓ９タンパク質の場合も、同じガイドラインを使用してもよく、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ＰＡＭ配列の代わりに、代替的ＰＡＭが用いられる。
【０１１４】
潜在的なオフターゲット配列を回避する特異性を有する可能性が最も高い標的配列を選択することが最も好ましい。こうした望ましくないオフターゲット配列は、以下の属性を考慮することにより特定することができる：ｉ）使用するＣａｓ９タンパク質で機能することが公知であるＰＡＭ配列が後続する標的配列の類似性；ｉｉ）所望の標的配列とのミスマッチが３つ未満である類似標的配列；ｉｉｉ）ミスマッチはすべて、ＰＡＭ近位領域ではなくＰＡＭ遠位領域に位置する、ｉｉ）と同様の類似標的配列（ＰＡＭに１〜５個すぐに隣接するかまたは近位にあるヌクレオチドは、「シード」領域と呼ばれる場合があり（Wuら、（２０１４年）Nature  Biotech  doi:10.1038/nbt2889）、認識にとって最も重要であり、したがって、シード領域に位置するミスマッチを有する推定オフターゲット部位は、ｓｇ  ＲＮＡにより認識される可能性が最も少ない場合があることを示す証拠が幾つか存在する）；およびｉｖ）ミスマッチが連続的に離間されていないか、または４個ヌクレオチドよりも離れて離間されている類似標的配列（Hsu  ２０１４年、同書）。したがって、どちらのＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ系を使用する場合でも、こうした上記の基準を使用して、ゲノムにおける潜在的なオフターゲット部位の個数の分析を実施することにより、ｓｇＲＮＡに好適な標的配列を特定することができる。
【０１１５】
ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＣａｓタンパク質の「機能的誘導体」であってもよい。天然配列ポリペプチドの「機能的誘導体」は、天然配列ポリペプチドと共通の定性的生物学的特性を有する化合物である。「機能的誘導体」としては、これらに限定されないが、対応する天然配列ポリペプチドと共通の生物学的活性を有する限り、天然配列の断片、ならびに天然配列ポリペプチドの誘導体およびその断片が挙げられる。本明細書で企図されている生物学的活性は、機能的誘導体が、ＤＮＡ基質を加水分解して断片にする能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列変異体、それらの共有結合修飾および融合体を両方とも包含する。一部の態様では、機能的誘導体は、天然に存在するＣａｓタンパク質の単一の生物学的特性を含んでいてもよい。他の態様では、機能的誘導体は、天然に存在するＣａｓタンパク質の生物学的特性のサブセットを含んでいてもよい。Ｃａｓポリペプチドの好適な誘導体またはその断片としては、これらに限定されないが、Ｃａｓタンパク質の突然変異体、融合体、共有結合修飾、またはそれらの断片が挙げられる。Ｃａｓタンパク質またはその断片ならびにＣａｓタンパク質の誘導体またはその断片を含むＣａｓタンパク質は、細胞から取得可能であってもよく、または化学的に合成してもよく、またはこれら２つの手順の組合せによるものであってもよい。細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然で産生する細胞であってもよく、またはＣａｓタンパク質を天然で産生し、より高い発現レベルで内因性Ｃａｓタンパク質を産生するように、または内因性Ｃａｓと同じまたは異なるＣａｓをコードする外因的に導入された核酸からＣａｓタンパク質を産生するように遺伝子的に操作されている細胞であってもよい。一部の場合では、細胞は、天然ではＣａｓタンパク質を産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝子的に操作されている。
【０１１６】
特定の遺伝子（セーフハーバー遺伝子を含む）を標的とする例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系は、例えば、米国特許出願公開第２０１５／００５６７０５号に開示されている。
【０１１７】
したがって、ヌクレアーゼは、ＤＮＡを切断するヌクレアーゼドメインと組み合わせて、ドナー（導入遺伝子）を挿入することが所望である任意の遺伝子の標的部位に特異的に結合するＤＮＡ結合ドメインを含む。
タウ遺伝子モジュレーター
【０１１８】
タウＤＮＡ結合ドメインは、本明細書に記載の方法で使用するための任意の追加の分子（例えば、ポリペプチド）と融合されていてもよく、またはそうでなければ付随されていてもよい。ある特定の実施形態では、上記方法は、少なくとも１つのＤＮＡ結合分子（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、または単鎖ガイドＲＮＡ）および異種性制御（機能性）ドメイン（またはその機能性断片）を含む融合分子を使用する。
【０１１９】
ある特定の実施形態では、タウモジュレーターの機能性ドメインは、転写抑制ドメインを含む。一般的なドメインとしては、以下のものが挙げられる：例えば、転写因子ドメイン（活性化因子、リプレッサー、活性化補助因子、コリプレッサー）、サイレンサー、オンコジーン（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリーメンバーなど）；ＤＮＡ修復酵素ならびにそれらの関連因子およびモディファイヤー；ＤＮＡ再編成酵素ならびにそれらの関連因子およびモディファイヤー；クロマチン関連タンパク質およびそれらのモディファイヤー（例えば、キナーゼ、アセチラーゼ、およびデアセチラーゼ）；ならびにＤＮＡ修飾酵素（例えば、メチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ）ならびにそれらの関連因子およびモディファイヤー。例えば、米国特許出願公開第２０１３／０２５３０４０号を参照されたい。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１２０】
活性化を達成するために好適なドメインとしては、以下のものが挙げられる：ＨＳＶ  ＶＰ１６活性化ドメイン（例えば、Hagmannら、J.  Virol.  ７１巻、５９５２〜５９６２頁（１９９７年）を参照）、核内ホルモン受容体（例えば、Torchiaら、Curr.  Opin.  Cell.  Biol.  １０巻：３７３〜３８３頁（１９９８年）を参照）、核内因子カッパＢのｐ６５サブユニット（BitkoおよびBarik、J.  Virol.  ７２巻：５６１０〜５６１８頁（１９９８年）ならびにDoyleおよびHunt、Neuroreport  ８巻：２９３７〜２９４２頁（１９９７年）；Liuら、Cancer  Gene  Ther.  ５巻：３〜２８頁（１９９８年））、またはＶＰ６４（Beerliら、（１９９８年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ９５巻：１４６２３〜３３頁）およびｄｅｇｒｏｎ（Molinariら、（１９９９年）EMBO  J.  １８巻、６４３９〜６４４７頁）などの人工キメラ機能性ドメイン。追加の例示的な活性化ドメインとしては、以下のものが挙げられる：Ｏｃｔ１、Ｏｃｔ−２Ａ、Ｓｐ１、ＡＰ−２、およびＣＴＦ１（Seipelら、EMBO  J.  １１巻、４９６１〜４９６８頁（１９９２年）、ならびにｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１、ＰｖＡＬＦ、ＡｔＨＤ２Ａ、およびＥＲＦ−２。例えば、Robyrら、（２０００年）Mol.  Endocrinol.  １４巻：３２９〜３４７頁；Collingwoodら、（１９９９年）J.  Mol.  Endocrinol.  ２３巻：２５５〜２７５頁；Leoら、（２０００年）Gene  ２４５巻：１〜１１頁；Manteuffel-Cymborowska（１９９９年）Acta  Biochim.  Pol.  ４６巻：７７〜８９頁；McKennaら、（１９９９年）J.  Steroid  Biochem.  Mol.  Biol.  ６９巻：３〜１２頁；Malikら、（２０００年）Trends  Biochem.  Sci.  ２５巻：２７７〜２８３頁；およびLemonら、（１９９９年）Curr.  Opin.  Genet.  Dev.  ９巻：４９９〜５０４頁を参照されたい。追加の例示的な活性化ドメインとしては、これらに限定されないが、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ−１、Ｃ１、ＡＰ１、ＡＲＦ−５、−６、−７、および−８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ−ＲＰ／ＧＰ、ならびにＴＲＡＢ１が挙げられる。例えば、Ogawaら、（２０００年）Gene  ２４５巻：２１〜２９頁；Okanamiら、（１９９６年）Genes  Cells  １巻：８７〜９９頁；Goffら、（１９９１年）Genes  Dev.  ５巻：２９８〜３０９頁；Choら、（１９９９年）Plant  Mol.  Biol.  ４０巻：４１９〜４２９頁；Ulmasonら、（１９９９年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ９６巻：５８４４〜５８４９頁；Sprenger-Hausselsら、（２０００年）Plant  J.  ２２巻：１〜８頁；Gongら、（１９９９年）Plant  Mol.  Biol.  ４１巻：３３〜４４頁；およびHoboら、（１９９９年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ９６巻：１５，３４８〜１５，３５３頁を参照されたい。
【０１２１】
タウリプレッサーを製作するために使用することができる例示的な抑制ドメインとしては、これらに限定されないが、ＫＲＡＢ  Ａ／Ｂ、ＫＯＸ、ＴＧＦベータ誘導性初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ−ｅｒｂＡ、ＳＩＤ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）、Ｒｂ、およびＭｅＣＰ２が挙げられる。例えば、Birdら、（１９９９年）Cell  ９９巻：４５１〜４５４頁；Tylerら、（１９９９年）Cell  ９９巻：４４３〜４４６頁；Knoepflerら、（１９９９年）Cell  ９９巻：４４７〜４５０頁；およびRobertsonら、（２０００年）Nature  Genet.  ２５巻：３３８〜３４２頁を参照されたい。追加の例示的な抑制ドメインとしては、これらに限定されないが、ＲＯＭ２およびＡｔＨＤ２Ａが挙げられる。例えば、Chemら、（１９９６年）Plant  Cell  ８巻：３０５〜３２１頁；およびWuら、（２０００年）Plant  J.  ２２巻：１９〜２７頁を参照されたい。
【０１２２】
一部の例では、ドメインは、染色体の後成的制御に関与する。一部の実施形態では、ドメインは、例えば、ＭＹＳＴファミリーメンバーＭＯＺ、Ｙｂｆ２／Ｓａｓ３、ＭＯＦ、およびＴｉｐ６０、ＧＮＡＴファミリーメンバーＧｃｎ５またはｐＣＡＦ、ｐ３００ファミリーメンバーＣＢＰ、ｐ３００、またはＲｔｔ１０９などの、Ａ型で核内局在性のヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）である（BerndsenおよびDenu（２００８年）Curr  Opin  Struct  Biol  １８巻（６号）：６８２〜６８９頁）。他の場合では、ドメインは、クラスＩ（ＨＤＡＣ−１、２、３、および８）、クラスＩＩ（ＨＤＡＣ  ＩＩＡ（ＨＤＡＣ−４、５、７、および９）、ＨＤＡＣ  ＩＩＢ（ＨＤＡＣ６および１０））、クラスＩＶ（ＨＤＡＣ−１１）、クラスＩＩＩ（サーチュイン（ＳＩＲＴ）としても公知；ＳＩＲＴ１−７）などのヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）である（Mottamalら、（２０１５年）Molecules  ２０巻（３号）：３８９８〜３９４１頁を参照）。一部の実施形態で使用される別のドメインは、ヒストンホスホリラーゼまたはキナーゼであり、例としては、ＭＳＫ１、ＭＳＫ２、ＡＴＲ、ＡＴＭ、ＤＮＡ−ＰＫ、Ｂｕｂ１、ＶｐｒＢＰ、ＩＫＫ−α、ＰＫＣβ１、Ｄｉｋ／Ｚｉｐ、ＪＡＫ２、ＰＫＣ５、ＷＳＴＦ、およびＣＫ２が挙げられる。一部の実施形態では、メチル化ドメインが使用され、Ｅｚｈ２、ＰＲＭＴ１／６、ＰＲＭＴ５／７、ＰＲＭＴ２／６、ＣＡＲＭ１、ｓｅｔ７／９、ＭＬＬ、ＡＬＬ−１、Ｓｕｖ３９ｈ、Ｇ９ａ、ＳＥＴＤＢ１、Ｅｚｈ２、Ｓｅｔ２、Ｄｏｔ１、ＰＲＭＴ１／６、ＰＲＭＴ５／７、ＰＲ−Ｓｅｔ７、およびＳｕｖ４−２０ｈなどの群から選択してもよい。一部の実施形態では、ＳＵＭＯ化およびビオチン化（Ｌｙｓ９、１３、４、１８、および１２）に関与するドメインも使用することができる（総説は、Kousarides（２００７年）cell  １２８巻：６９３〜７０５頁を参照）。
【０１２３】
融合分子は、当業者に周知であるクローニング法および生化学コンジュゲーション法により構築される。融合分子は、ＤＮＡ結合ドメインおよび機能性ドメイン（例えば、転写活性化または抑制ドメイン）を含む。また、融合分子は、任意選択で、核局在化シグナル（例えば、ＳＶ４０ミディアムＴ抗原（SV40  medium  T-antigen）に由来するものなど）およびエピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧおよび赤血球凝集素など）を含む。融合タンパク質（およびそれらをコードする核酸）は、翻訳リーディングフレームが、融合体の成分中に保存されるように設計されている。
【０１２４】
一方の機能性ドメイン（またはその機能性断片）のポリペプチド成分と、他方の非タンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、抗生物質、挿入剤、副溝結合剤、核酸）との融合体は、当業者に公知の生化学コンジュゲーション法により構築される。例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）カタログを参照されたい。副溝結合剤とポリペプチドとの融合体を製作するための方法および組成物が記載されている。Mappら、（２０００年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ９７巻：３９３０〜３９３５頁。同様に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ＴＦ、およびポリペプチド成分機能ドメインに付随するｓｇＲＮＡ核酸成分を含むヌクレアーゼも、当業者に公知であり、本明細書に詳述されている。
【０１２５】
融合分子は、当業者に公知であるような、薬学的に許容される担体を用いて製剤化することができる。例えば、Remington's  Pharmaceutical  Sciences、第１７版、１９８５年；および共有の国際公開第００／４２２１９号を参照されたい。
【０１２６】
融合分子の機能性成分／ドメインは、融合分子がそのＤＮＡ結合ドメインを介して標的配列に結合すると、遺伝子の転写に影響を及ぼすことが可能である様々な異なる成分のいずれかから選択することができる。したがって、機能性成分としては、これらに限定されないが、活性化因子、リプレッサー、活性化補助因子、コリプレッサー、およびサイレンサーなどの種々の転写因子ドメインを挙げることができる。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、融合分子は、ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含み、それらの遺伝子操作（ＺＦＰまたはＴＡＬＥまたはｓｇＲＮＡ）ＤＮＡ結合ドメインを介してそれらの意図されている核酸標的を認識することができる機能性実体を作り出し、ヌクレアーゼ活性によりＤＮＡ結合部位付近でＤＮＡの切断を引き起こすヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはＴＡＬＥヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ）を作り出す。この切断は、タウ遺伝子の不活化（抑制）をもたらす。したがって、タウリプレッサーとしては、タウヌクレアーゼも挙げられる。
【０１２８】
したがって、本明細書に記載の方法および組成物は、幅広く適用可能であり、任意の目的のヌクレアーゼを含むことができる。ヌクレアーゼの非限定的な例としては、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、およびジンクフィンガーヌクレアーゼが挙げられる。ヌクレアーゼは、異種性ＤＮＡ結合および切断ドメイン（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ；ＴＡＬＥＮ；異種性切断ドメインを有するメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン；ヌクレアーゼドメインに付随されているｓｇＲＮＡ）を含んでいてもよく、またはその代わりに天然に存在するヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインを、選択された標的部位に結合するように変更してもよい（例えば、同種結合部位とは異なる部位に結合するように遺伝子操作されているメガヌクレアーゼ）。
【０１２９】
ヌクレアーゼドメインは、任意のヌクレアーゼ、例えば、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼに由来してもよい。本明細書に記載のようなタウＤＮＡ結合ドメインと融合することができる好適なヌクレアーゼ（切断）ドメインの非限定的な例としては、任意の制限酵素、例えば、ＩＩＳ型制限酵素（例えば、ＦｏｋＩ）に由来するドメインが挙げられる。ある特定の実施形態では、切断ドメインは、切断活性のために二量体化が必要とされる切断ハーフドメインである。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号、第８，４０９，８６１号、および第７，８８８，１２１号を参照されたい。これらの文献は、これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。一般的に、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、２つの融合タンパク質が切断に必要とされる。あるいは、２つの切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質を使用することができる。２つの切断ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能性断片）に由来してもよく、または各切断ハーフドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能性断片）に由来してもよい。加えて、２つの融合タンパク質の標的部位は、好ましくは、２つの融合タンパク質がそれぞれの標的部位に結合すると、切断ハーフドメインが、例えば二量体化により機能性切断ドメインを形成することを可能にする空間的配向性に互いに置かれるように、互いに対して配置される。
【０１３０】
また、ヌクレアーゼドメインは、切断活性を有する任意のメガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）ドメインに由来してもよく、これらに限定されないが、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、およびＩ−ＴｅｖＩＩＩを含む、本明細書に記載のヌクレアーゼと共に使用することもできる。
【０１３１】
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、コンパクトＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮ）を含む。これらは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインをＴｅｖＩヌクレアーゼドメインと連結した単鎖融合タンパク質である。融合タンパク質は、メガヌクレアーゼ（例えば、ＴｅｖＩ）ヌクレアーゼドメインに対してＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインが位置する場所に応じて、ＴＡＬＥ領域により局在化されるニッカーゼとして作用することができるか、または二本鎖破断を作り出すことができるかのいずれかである（Beurdeleyら、（２０１３年）Nat  Comm：１〜８頁  DOI:  10.1038/ncomms2782を参照）。
【０１３２】
他の実施形態では、ＴＡＬＥヌクレアーゼは、メガＴＡＬである。こうしたメガＴＡＬヌクレアーゼは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよびメガヌクレアーゼ切断ドメインを含む融合タンパク質である。メガヌクレアーゼ切断ドメインは、単量体として活性であり、活性のために二量体化を必要としない。（Boisselら、（２０１３年）Nucl  Acid  Res:  １〜１３頁、doi:  10.1093/nar/gkt1224を参照）。
【０１３３】
加えて、メガヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡ結合機能性も示すことができる。任意のＴＡＬＥＮを、追加のＴＡＬＥＮ（例えば、１つまたは複数のメガ−ＴＡＬを有する１つまたは複数のＴＡＬＥＮ（ｃＴＡＬＥＮまたはＦｏｋＩ−ＴＡＬＥＮ））および／またはＺＦＮと組み合わせて使用してもよい。
【０１３４】
加えて、切断ドメインは、例えば、オフターゲット切断効果を低減または排除する必須ヘテロ二量体を形成するために、野生型と比較して１つまたは複数の変更を含んでいてもよい。例えば、米国特許第７，９１４，７９６号、第８，０３４，５９８号、および第８，６２３，６１８号を参照されたい。これらの文献は、これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３５】
本明細書に記載のようなヌクレアーゼは、二本鎖標的（例えば、遺伝子）に二本鎖または一本鎖破断を生成することができる。一本鎖破断（「ニック」）の生成は、例えば、米国特許第８，７０３，４８９号および第９，２００，２６６号に記載されており、これらの文献は参照により本明細書に組み込まれ、ヌクレアーゼドメインの１つの触媒ドメインの突然変異により、ニッカーゼをもたらす方法が記載されている。
【０１３６】
したがって、ヌクレアーゼ（切断）ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持するか、または多量体化して（例えば、二量体化して）機能性切断ドメインを形成する能力を保持するタンパク質の任意の部分であってもよい。
【０１３７】
あるいは、ヌクレアーゼは、いわゆる「分割酵素」技術（例えば、米国特許出願公開第２００９／００６８１６４号を参照）を使用して、核酸標的部位にてｉｎ  ｖｉｖｏで集合させてもよい。そのような分割酵素の成分は、別々の発現構築物で発現してもよく、または個々の成分が、例えば自己切断性２ＡペプチドまたはＩＲＥＳ配列により分離されている１つのオープンリーディングフレームにて連結されていてもいずれでもよい。成分は、個々のジンクフィンガー結合ドメインであってもよく、またはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであってもよい。
【０１３８】
ヌクレアーゼは、使用前に、例えば、米国特許出願公開第２００９／０１１１１１９号に記載のような酵母に基づく染色体系で活性をスクリーニングすることができる。ヌクレアーゼ発現構築物は、当技術分野で公知の方法を使用して容易に設計することができる。
【０１３９】
融合タンパク質（またはその成分）の発現は、構成的プロモーターまたは誘導可能なプロモーター、例えば、ラフィノースおよび／またはガラクトースの存在下で活性化され（脱抑制され）、グルコースの存在下で抑制されるガラクトキナーゼプロモーターのコントロール下であってもよい。好ましいプロモーターの非限定的な例としては、神経特異的プロモーターＮＳＥ、Ｓｙｎａｐｓｉｎ、ＣＡＭＫｉｉａ、およびＭＥＣＰが挙げられる。遍在性プロモーターの非限定的な例としては、ＣＡＳおよびＵｂｃが挙げられる。さらなる実施形態は、米国特許出願公開第２０１５／０２６７２０５号に記載のような自己制御性プロモーターの使用（タウＤＮＡ結合ドメインの高親和性結合部位を介在させることによる）を含む。
送達
【０１４０】
本明細書に記載のタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含むタンパク質および／またはポリヌクレオチド（例えば、タウモジュレーター）および組成物は、例えば、タンパク質の注入によること、ｍＲＮＡによること、および／または発現構築物（例えば、プラスミド、レンチウイルスベクター、ＡＡＶベクター、Ａｄベクターなど）を使用することを含む、任意の好適な手段により、標的細胞に送達することができる。好ましい実施形態では、リプレッサーは、これらに限定されないが、ＡＡＶ９（米国特許第７，１９８，９５１号を参照）、米国特許第９，５８５，９７１号に記載のようなＡＡＶベクター、および／または米国特許仮出願第６２／５０３，１２１号に記載のようなＡＡＶベクターを含む、ＡＡＶベクターを使用して送達される。
【０１４１】
本明細書に記載のようなジンクフィンガータンパク質を含むタンパク質を送達するための方法は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号、第６，５０３，７１７号、第６，５３４，２６１号、第６，５９９，６９２号、第６，６０７，８８２号、第６，６８９，５５８号、第６，８２４，９７８号、第６，９３３，１１３号、第６，９７９，５３９号、第７，０１３，２１９号、および第７，１６３，８２４号に記載されており、これらの文献のすべての開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４２】
これらに限定されないが、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターなどを含む、任意のベクター系を使用することができる。また、米国特許第８，５８６，５２６号、第６，５３４，２６１号、第６，６０７，８８２号、第６，８２４，９７８号、第６，９３３，１１３号、第６，９７９，５３９号、第７，０１３，２１９号、および第７，１６３，８２４号を参照されたい。これらの文献は、これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらに、こうしたベクターはいずれも、１つまたは複数のＤＮＡ結合タンパク質コード配列を含んでいてもよいことは明白であろう。したがって、１つまたは複数のタウモジュレーター（例えば、リプレッサー）を細胞に導入する場合、タンパク質成分および／またはポリヌクレオチド成分をコードする配列は、同じベクターでまたは異なるベクターで運搬されてもよい。複数のベクターを使用する場合、各ベクターは、１つまたは複数のタウモジュレーター（例えば、リプレッサー）またはその成分をコードする配列を含んでいてもよい。好ましい実施形態では、ベクター系は、ＡＡＶベクター、例えばＡＡＶ９、または米国特許第９，５８５，９７１号および／もしくは米国特許仮出願第６２／５０３，１２１号に記載のＡＡＶ変異体である。
【０１４３】
従来のウイルスおよび非ウイルスに基づく遺伝子移入法を使用して、遺伝子操作タウモジュレーターをコードする核酸を、細胞（例えば、哺乳動物細胞）および標的組織に導入することができる。また、そのような方法を使用して、そのようなリプレッサー（またはその成分）をコードする核酸を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞に投与することができる。ある特定の実施形態では、リプレッサーをコードする核酸は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子治療で使用するために投与される。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、ネイキッド核酸、およびリポソームまたはポロキサマーなどの送達ビヒクルと複合体化された核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、エピソームゲノムまたは細胞への送達後に組み込まれるゲノムのいずれかを有するＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが挙げられる。遺伝子治療手順の総説は、以下の文献を参照されたい：Anderson、Science  ２５６巻：８０８〜８１３頁（１９９２年）；NabelおよびFelgner、TIBTECH  １１巻：２１１〜２１７頁（１９９３年）；MitaniおよびCaskey、TIBTECH  １１巻：１６２〜１６６頁（１９９３年）；Dillon、TIBTECH  １１巻：１６７〜１７５頁（１９９３年）；Miller、Nature  ３５７巻：４５５〜４６０頁（１９９２年）；Van  Brunt、Biotechnology  ６巻（１０号）：１１４９〜１１５４頁（１９８８年）；Vigne、Restorative  Neurology  and  Neuroscience  ８巻：３５〜３６頁（１９９５年）；KremerおよびPerricaudet、British  Medical  Bulletin  ５１巻（１号）：３１〜４４頁（１９９５年）；Haddadaら、Current  Topics  in  Microbiology  and  Immunology、DoerflerおよびBohm（編）（１９９５年）中；ならびにYuら、Gene  Therapy  １巻：１３〜２６頁（１９９４年）。
【０１４４】
核酸を非ウイルス送達するための方法としては、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、ネイキッドＲＮＡ、人工ビリオン、およびＤＮＡの作用剤増強取込みが挙げられる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ  ２０００システム（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用したソノポレーションも、核酸の送達に使用することができる。好ましい実施形態では、１つまたは複数の核酸は、ｍＲＮＡとして送達される。また、翻訳効率および／またはｍＲＮＡ安定性を増加させるために、キャップされたｍＲＮＡの使用が好ましい。特に、ＡＲＣＡ（抗逆キャップ類似体）キャップまたはそれらの変異体が好ましい。米国特許第７，０７４，５９６号および第８，１５３，７７３号を参照されたい。これらの文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４５】
追加の例示的な核酸送達系としては、Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ，（例えば、米国特許第６，００８，３３６号を参照）により提供されるものが挙げられる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、第４，９４６，７８７号、および第４，８９７，３５５号）に記載されており、リポフェクション試薬は、商業的に販売されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ）。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適である陽イオン性および中性脂質としては、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際公開第９１／１７４２４号、および国際公開第９１／１６０２４号のものが挙げられる。送達は、細胞に対してであってもよく（ｅｘ  ｖｉｖｏ投与）、または標的組織に対してであってもよい（ｉｎ  ｖｉｖｏ投与）。
【０１４６】
免疫脂質複合体などの標的化リポソームを含む、脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Crystal、Science  ２７０巻：４０４〜４１０頁（１９９５年）；Blaeseら、Cancer  Gene  Ther.  ２巻：２９１〜２９７頁（１９９５年）；Behrら、Bioconjugate  Chem.  ５巻：３８２〜３８９頁（１９９４年）；Remyら、Bioconjugate  Chem.  ５巻：６４７〜６５４頁（１９９４年）；Gaoら、Gene  Therapy  ２巻：７１０〜７２２頁（１９９５年）；Ahmadら、Cancer  Res.  ５２巻：４８１７〜４８２０頁（１９９２年）；米国特許第４，１８６，１８３号；第４，２１７，３４４号；第４，２３５，８７１号；第４，２６１，９７５号；第４，４８５，０５４号；第４，５０１，７２８号；第４，７７４，０８５号；第４，８３７，０２８号；および第４，９４６，７８７号を参照）。
【０１４７】
追加の送達方法としては、送達しようとする核酸のＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）へのパッケージングの使用が挙げられる。こうしたＥＤＶは、抗体の一方のアームが、標的組織に対する特異性を有し、他方が、ＥＤＶに対する特異性を有する二重特異性抗体を使用して、標的組織へと特異的に送達される。ＥＤＶは、抗体により標的細胞表面へと運ばれ、その後、エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれる。細胞内に入ると、内容物が放出される（MacDiarmidら、（２００９年）Nature  Biotechnology  ２７巻（７号）：６４３頁を参照）。
【０１４８】
遺伝子操作ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする核酸を送達するための、ＲＮＡまたはＤＮＡウイルスに基づく系の使用は、ウイルスを体内の特定の細胞に標的化し、ウイルスペイロードを核へと輸送するための高度に進化したプロセスを活用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与してもよく（ｉｎ  ｖｉｖｏ）、または細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで処置するために使用してもよく、修飾細胞は、患者に投与される（ｅｘ  ｖｉｖｏ）。ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を送達するための従来のウイルスに基づく系としては、これらに限定されないが、遺伝子移入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴、ワクシニア、および単純ヘルペスウイルスベクターが挙げられる。宿主ゲノムへの組込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルス遺伝子移入法を用いて可能であり、挿入された導入遺伝子の長期発現がもたらされることが多い。加えて、高い形質導入効率が、多数の異なる細胞タイプおよび標的組織で観察されている。
【０１４９】
レトロウイルスのトロピズムは、外来性エンベロープタンパク質を組み込むことにより変更することができ、標的細胞の潜在的標的集団が拡張される。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入または感染し、典型的には、高いウイルス力価をもたらすことができるレトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子移入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、６〜１０ｋｂまでの外来性配列をパッケージングする能力を有するｃｉｓ作用性の長い末端反復で構成される。ベクターの複製およびパッケージングには、最小限のシス作用性ＬＴＲで十分であり、その後それらを使用して、治療用遺伝子を標的細胞に組み込んで、恒久的な導入遺伝子発現を提供する。広く使用されるレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル類人猿白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびそれらの組合せに基づくものが挙げられる（例えば、Buchscherら、J.  Virol.  ６６巻：２７３１〜２７３９頁（１９９２年）；Johannら、J.  Virol.  ６６巻：１６３５〜１６４０頁（１９９２年）；Sommerfeltら、Virol.  １７６巻：５８〜５９頁（１９９０年）；Wilsonら、J.  Virol.  ６３巻：２３７４〜２３７８頁（１９８９年）；Millerら、J.  Virol.  ６５巻：２２２０〜２２２４頁（１９９１年）；国際公開第１９９４／０２６８７７号を参照）。
【０１５０】
一過性発現が好ましい応用では、アデノウイルスに基づく系を使用することができる。アデノウイルスに基づくベクターは、多数の細胞タイプで非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターにより、高力価および高レベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純な系で多量に産生することができる。また、アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターを使用して、例えば、核酸およびペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生で、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子治療手順のために、標的核酸を細胞に形質導入する（例えば、Westら、Virology  １６０巻：３８〜４７頁（１９８７年）；米国特許第４，７９７，３６８号；国際公開第９３／２４６４１号；Kotin、Human  Gene  Therapy  ５巻：７９３〜８０１頁（１９９４年）；Muzyczka、J.  Clin.  Invest.  ９４巻：１３５１頁（１９９４年）を参照。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号；Tratschinら、Mol.  Cell.  Biol.  ５巻：３２５１〜３２６０頁（１９８５年）；Tratschinら、Mol.  Cell.  Biol.  ４巻：２０７２〜２０８１頁（１９８４年）；HermonatおよびMuzyczka、PNAS  ８１巻：６４６６〜６４７０頁（１９８４年）；ならびにSamulskiら、J.  Virol.  ６３巻：０３８２２〜３８２８頁（１９８９年）を含む多数の刊行物に記載されている。
【０１５１】
現在、少なくとも６つのウイルスベクター手法が、臨床治験における遺伝子移入に利用可能であり、形質導入剤を生成するためにヘルパー細胞株に挿入された遺伝子により、欠損ベクターを補完することを含む手法が使用されている。
【０１５２】
ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床治験で使用されているレトロウイルスベクターの例である（Dunbarら、Blood  ８５巻：３０４８〜３０５頁（１９９５年）；Kohnら、Nat.  Med.  １巻：１０１７〜１０２頁（１９９５年）Malechら、PNAS  ９４巻：２２号  １２１３３〜１２１３８頁（１９９７年））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療治験で使用された最初の治療用ベクターであった。（Blaeseら、Science  ２７０巻：４７５〜４８０頁（１９９５年））。５０％またはそれよりも高い形質導入効率が、ＭＦＧ−Ｓでパッケージされたベクターで観察された。（Ellemら、Immunol  Immunother.  ４４巻（１号）：１０〜２０頁（１９９７年）；Dranoffら、Hum.  Gene  Ther.  １巻：１１１〜２頁（１９９７年）。
【０１５３】
組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損および非病原性パルボウィルスアデノ随伴２型ウイルスに基づく有望な代替的遺伝子送達系である。ベクターはすべて、導入遺伝子発現カセットの端部にあるＡＡＶ１４５ｂｐ逆位末端反復のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入細胞のゲノムへの組込みによる、効率的な遺伝子移入および安定的導入遺伝子送達は、このベクター系の重要な特徴である。（Wagnerら、Lancet  ３５１巻：９１１７号  １７０２〜３頁（１９９８年）、Kearnsら、Gene  Ther.  ９巻：７４８〜５５頁（１９９６年））。また、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ  ｒｈ１０を含む他のＡＡＶ血清型、ならびにＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／９、およびＡＡＶ２／６などの偽型ＡＡＶを、本発明に従って使用することができる。また、血液脳関門を越えることが可能な新規ＡＡＶ血清型を、本発明に従って使用することができる（例えば、米国特許第９，５８５，９７１号を参照）。好ましい実施形態では、ＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９の変異体および偽型を含む）が使用される。
【０１５４】
複製欠損組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）を、高力価で産生し、多くの異なる細胞タイプに容易に感染させることができる。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄ  Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置換し、後に複製欠損ベクターが、欠失遺伝子機能をｔｒａｎｓで供給するヒト２９３細胞中で伝播されるように遺伝子操作されている。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓、および筋肉に見出されるものなど、非分裂性分化細胞を含む、複数のタイプの組織をｉｎ  ｖｉｖｏで形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、大きな運搬能力を有する。臨床治験におけるＡｄベクターの使用の一例は、筋肉内注射による抗腫瘍免疫化のためのポリヌクレオチド治療を含んでいた（Stermanら、Hum.  Gene  Ther.  ７巻：１０８３〜９頁（１９９８年））。臨床治験における遺伝子移入のためのアデノウイルスベクターの使用の追加の例としては、Roseneckerら、Infection  ２４巻：１号  ５〜１０頁（１９９６年）；Stermanら、Hum.  Gene  Ther.  ９巻：７号  １０８３〜１０８９頁（１９９８年）；Welshら、Hum.  Gene  Ther.  ２巻：２０５〜１８頁（１９９５年）；Alvarezら、Hum.  Gene  Ther.  ５巻：５９７〜６１３頁（１９９７年）；Topfら、Gene  Ther.  ５巻：５０７〜５１３頁（１９９８年）；Stermanら、Hum.  Gene  Ther.  ７巻：１０８３〜１０８９頁（１９９８年）が挙げられる。
【０１５５】
パッケージング細胞を使用して、宿主細胞に感染することが可能なウイルス粒子が形成される。そのような細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子治療に使用されるウイルスベクターは、通常は、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージングするプロデューサー細胞株により生成される。ベクターは、典型的には、パッケージングおよびその後の宿主への組込み（該当する場合）に必要な最小限のウイルス配列を含み、他のウイルス配列は、発現しようとするタンパク質をコードする発現カセットにより置換されている。失われたウイルス機能は、パッケージング細胞株によりｔｒａｎｓで供給される。例えば、遺伝子治療に使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージングおよび宿主ゲノムへの組込みに必要である、ＡＡＶゲノムに由来する逆位末端反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠如するヘルパープラスミドを含む細胞株にパッケージングされる。また、細胞株を、ヘルパーとしてのアデノウイルスに感染させる。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列が欠如しているため、大量にはパッケージングされない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性である熱処理により低減することができる。
【０１５６】
多数の遺伝子治療応用では、遺伝子治療ベクターは、高度な特異性で特定の組織タイプに送達されることが望ましい。したがって、ウイルスベクターは、リガンドを、ウイルスの外側表面にあるウイルスコートタンパク質との融合タンパク質として発現することにより、所与の細胞タイプに対する特異性を有するように修飾することができる。リガンドは、目的の細胞タイプに存在することが公知である受容体に対する親和性を有するように選択される。例えば、Hanら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ９２巻：９７４７〜９７５１頁（１９９５年）は、モロニーマウス白血病ウイルスを、ｇｐ７０に融合されたヒトヘレグリンを発現するように修飾することができ、組換えウイルスは、ヒト上皮増殖因子受容体を発現するある特定のヒト乳がん細胞に感染することを報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、ウイルスが、細胞表面受容体のリガンドを含む融合タンパク質を発現する他のウイルス−標的細胞対に拡張することができる。例えば、繊維状ファージは、事実上あらゆる選択された細胞受容体に対する特異的結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示するように遺伝子操作することができる。上記の記載は、主にウイルスベクターに当てはまるが、同じ原理を、非ウイルスベクターに適用することができる。そのようなベクターは、特定の標的細胞による取込みを促進する特定の取込み配列を含むように遺伝子操作することができる。
【０１５７】
遺伝子治療ベクターは、下記に記載のように、典型的には全身性投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、髄腔内、槽内、脳室内、または海馬、皮質、線条体などの脳の任意の領域内を含む脳内への直接注射を含む頭蓋内注入）または局所塗布により個々の患者に投与することによりｉｎ  ｖｉｖｏ送達することができる。あるいは、ベクターを、個々の患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）または万能供血者造血幹細胞などの細胞にｅｘ  ｖｉｖｏで送達し、その後、通常はベクターが組み込まれた細胞を選択した後で、細胞を患者に再移植してもよい。
【０１５８】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のような組成物（例えば、ポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質）は、直接的にｉｎ  ｖｉｖｏ送達される。組成物（細胞、ポリヌクレオチド、および／またはタンパク質）は、脳または脊髄への直接注射を含むが、それらに限定されず、中枢神経系（ＣＮＳ）に直接投与することができる。これらに限定されないが、海馬、黒質、マイネルト基底核（ＮＢＭ）、線条体、および／または皮質を含む、脳の１つまたは複数の区域を標的とすることができる。ＣＮＳ送達の代わりにまたはそれに加えて、組成物は、全身性投与してもよい（例えば、静脈内、腹腔内、心臓内、筋肉内、皮下、髄腔内、槽内、脳室内、および／または頭蓋内注入）。本明細書に記載のような組成物を対象に直接的に送達する（ＣＮＳに直接を含む）ための方法および組成物としては、これに限定されないが、針アセンブリによる直接注射（例えば、定位注射）が挙げられる。そのような方法は、例えば、脳への組成物（発現ベクターを含む）の送達に関する米国特許第７，８３７，６６８号および第８，０９２，４２９号、ならびに米国特許出願公開第２００６／０２３９９６６号に記載されており、これらの文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１５９】
投与される有効量は、患者によって、ならびに投与モードおよび投与部位によって様々であろう。したがって、有効量は、組成物を投与する医師により決定されるのが最良であり、適切な投薬量は、当業者により容易に決定することができる。組込みおよび発現に十分な時間を取った後（例えば、典型的には４〜１５日間）、治療用ポリペプチドの血清または他の組織レベルを分析すること、ならびに投与前の初期レベルと比較することにより、投与されている量が低すぎるか、正しい範囲内にあるのか、または高すぎるのか否かが決定されるであろう。また、初期およびその後の投与に好適なレジメンは、様々であるが、典型的には、初期投与の後、必要に応じてその後の投与が行われる。その後の投与は、１日１回から年１回、数年毎までの範囲の、様々な間隔で投与することができる。ある特定の実施形態では。
【０１６０】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用してＺＦＰをヒト脳に直接送達するために、１線条体当たり１×１０１０〜５×１０１５（またはその間の任意の値）ベクターゲノムの用量範囲を適用することができる。なお、投薬量は、他の脳構造の場合および異なる送達プロトコールの場合、変更してもよい。ＡＡＶベクターを脳に直接送達するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、米国特許第９，０８９，６６７号、第９，０５０，２９９号、第８，３３７，４５８号、第８，３０９，３５５号、第７，１８２，９４４号、第６，９５３，５７５号、および第６，３０９，６３４号を参照。
【０１６１】
診断、研究、または遺伝子治療のためのｅｘ  ｖｉｖｏ細胞トランスフェクション（例えば、トランスフェクトした細胞を宿主生物に再注入することによる）は、当業者に周知である。好ましい実施形態では、細胞を対象生物から単離し、少なくとも１つのタウモジュレーター（例えば、リプレッサー）またはその成分をトランスフェクトし、対象生物（例えば、患者）に再注入して戻す。好ましい実施形態では、タウモジュレーター（例えば、リプレッサー）の１つまたは複数の核酸は、ＡＡＶ９を使用して送達される。他の実施形態では、タウモジュレーター（例えば、リプレッサー）の１つまたは複数の核酸は、ｍＲＮＡとして送達される。また、翻訳効率および／またはｍＲＮＡ安定性を増加させるために、キャップされたｍＲＮＡの使用が好ましい。特に、ＡＲＣＡ（抗逆キャップ類似体）キャップまたはそれらの変異体が好ましい。米国特許第７，０７４，５９６号および第８，１５３，７７３号を参照されたい。これらの文献は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。ｅｘ  ｖｉｖｏトランスフェクションに好適な種々の細胞タイプは、当業者に周知である（例えば、Freshneyら、Culture  of  Animal  Cells,  A  Manual  of  Basic  Technique（第３版、１９９４年））、および細胞を患者から単離し、培養する方法を考察するために、その中で引用されている文献を参照）。
【０１６２】
一実施形態では、幹細胞が、細胞トランスフェクションおよび遺伝子治療のためのｅｘ  ｖｉｖｏ手順に使用される。幹細胞を使用する利点は、幹細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで他の細胞タイプに分化させることができること、または骨髄に移植することになる哺乳動物（細胞のドナーなど）に導入することができることである。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αなどのサイトカインを使用して、ＣＤ３４＋細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで臨床的に重要な免疫細胞タイプに分化させるための方法は、公知である（Inabaら、J.  Exp.  Med.  １７６巻：１６９３〜１７０２頁（１９９２年）を参照）。
【０１６３】
幹細胞は、公知の方法を使用して形質導入および分化のために単離される。例えば、幹細胞は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（ｐａｎＢ細胞）、ＧＲ−１（顆粒球）、およびＩａｄ（分化した抗原提示細胞）などの望ましくない細胞に結合する抗体を用いて骨髄細胞をパニングすることにより、骨髄細胞から単離される（Inabaら、J.  Exp.  Med.  １７６巻：１６９３〜１７０２頁（１９９２年）を参照）。
【０１６４】
また、一部の実施形態では、修飾されている幹細胞を使用してもよい。例えば、アポトーシスに耐性とされたニューロン幹細胞を治療用組成物として使用してもよく、その場合、幹細胞は、本発明のＺＦＰ  ＴＦも含む。アポトーシスに対する耐性は、例えば、ＢＡＸまたはＢＡＫに特異的なＴＡＬＥＮまたはＺＦＮを使用して、幹細胞のＢＡＸおよび／またはＢＡＫをノックアウトすることにより（米国特許第８，５９７，９１２号を参照）、またはこの場合も例えばカスパーゼ−６に特異的なＺＦＮを使用してカスパーゼを妨害したもので発生させることができる。こうした細胞に、タウ遺伝子を制御することが公知であるＺＦＰ  ＴＦまたはＴＡＬＥ  ＴＦをトランスフェクトすることができる。
【０１６５】
また、治療用ＺＦＰ核酸を含むベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）を、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞の形質導入のために、生物に直接投与することができる。あるいは、ネイキッドＤＮＡを投与することができる。投与は、これらに限定されないが、注射、注入、局所塗布、およびエレクトロポレーションを含む、分子を導入して血液または組織細胞と最終的に接触させるために通常使用される経路のいずれかによる。そのような核酸を投与するための好適な方法は、当業者に利用可能および周知であり、特定の組成物を投与するために１つよりも多くの経路を使用することができるが、特定の経路は、別の経路よりもより即時でより有効な反応を提供することができることが多い。
【０１６６】
ＤＮＡを造血幹細胞に導入するための方法は、例えば、米国特許第５，９２８，６３８号に開示されている。導入遺伝子を、造血幹細胞、例えばＣＤ３４＋細胞に導入するために有用なベクターには、アデノウイルス３５型が挙げられる。
【０１６７】
導入遺伝子を免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）に導入するために好適なベクターとしては、非組込みレンチウイルスベクターが挙げられる。例えば、Oryら、（１９９６年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ９３巻：１１３８２〜１１３８８頁；Dullら、（１９９８年）J.  Virol.  ７２巻：８４６３〜８４７１頁；Zufferyら、（１９９８年）J.  Virol.  ７２巻：９８７３〜９８８０頁；Follenziら、（２０００年）Nature  Genetics  ２５巻：２１７〜２２２頁を参照されたい。
【０１６８】
薬学的に許容される担体は、部分的には、投与される特定の組成物により、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法により決定される。したがって、下記に記載のような、医薬組成物の多種多様の好適な製剤が利用可能である（例えば、Remington's  Pharmaceutical  Sciences、第１７版、１９８９年を参照）。
【０１６９】
上述のように、本開示の方法および組成物は、これらに限定されないが、原核細胞、真菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞、およびヒト細胞を含む、任意のタイプの細胞で使用することができる。タンパク質発現に好適な細胞株は、当業者に公知であり、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、ｐｅｒＣ６、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）などの昆虫細胞、ならびにＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｓｃｈｉａ、およびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓなどの真菌細胞。こうした細胞株の後代、変異体、および誘導体も使用することができる。好ましい実施形態では、方法および組成物は、脳細胞に、例えば線条体に直接送達される。
ＣＮＳ障害のモデル
【０１７０】
ＣＮＳ障害の研究は、非ヒト霊長類（例えば、パーキンソン病（JohnstonおよびFox（２０１５年）Curr  Top  Behav  Neurosci  ２２巻：２２１〜３５頁）、筋萎縮性側索硬化症（Jacksonら、（２０１５年）J.  Med  Primatol：４４巻（２号）：６６〜７５頁）、ハンチントン病（Yangら、（２００８年）Nature  ４５３巻（７１９７号）：９２１〜４頁）、アルツハイマー病（Parkら、（２０１５年）Int  J  Mol  Sci  １６巻（２号）：２３８６〜４０２頁）、発作（Hsiaoら、（２０１６年）E  Bio  Med  ９巻：２５７〜７７頁）、イヌ（例えば、ＭＰＳ  ＶＩＩ（Gurdaら、（２０１６年）Mol  Ther  ２４巻（２号）：２０６〜２１６頁）、アルツハイマー病（Schuttら、（２０１６年）J  Alzheimers  Dis  ５２巻（２号）：４３３〜４９頁）、発作（Varatharajahら、（２０１７年）Int  J  Neural  Syst  ２７巻（１号）：１６５００４６頁）、およびマウス（例えば、発作（Kadiyalaら、（２０１５年）Epilepsy  Res  １０９巻：１８３〜９６頁）、アルツハイマー病（Liら、（２０１５年）J  Alzheimers  Dis  Parkin  ５巻（３号）doi  10:4172/2161-0460）などの動物モデル系で実施することができる（総説：Websterら、（２０１４年）Front  Genet  ５巻、論文８８、doi:10.3389f/gene.2014.00088）。こうしたモデルは、疾患の特定の症状セットを調査するために有用であり得るため、ＣＮＳ疾患を完全に再現する動物モデルが存在しない場合でさえ、使用することができる。上記モデルは、本明細書に記載の治療方法および組成物（遺伝子リプレッサー）の効力および安全性プロファイルの決定に有用であり得る。
応用
【０１７１】
本明細書に記載のようなＭＡＰＴ結合分子（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、Ｔｔａｇｏなど）を含む、本明細書に記載のようなタウモジュレーター（例えば、タウリプレッサー）、およびそれらをコードする核酸は、様々な応用に使用することができる。こうした応用としては、ＭＡＰＴ結合分子（ＤＮＡ結合タンパク質をコードする核酸を含む）が、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）または非ウイルスベクターを使用して対象に投与され、対象内での標的遺伝子の発現を調節するために使用される治療方法が挙げられる。調節は、抑制、例えばＡＤ疾患状態に寄与しているタウ発現の抑制の形態であってもよい。あるいは、調節は、内因性細胞遺伝子の発現の活性化または発現増加が、疾患状態を寛解することができる場合、活性化の形態であってもよい。またさらなる実施形態では、調節は、例えば、ＭＡＰＴ遺伝子の不活化のための切断による（例えば、１つまたは複数のヌクレアーゼによる）抑制であってもよい。上述のように、そのような応用の場合、ＭＡＰＴ結合分子、またはより典型的には、それらをコードする核酸は、薬学的に許容される担体を用いて医薬組成物として製剤化される。
【０１７２】
ＭＡＰＴ結合分子またはそれらをコードするベクターは、単独でまたは他の好適な成分（例えば、リポソーム、ナノ粒子、または当技術分野で公知の他の成分）と組み合わせて、吸入により投与されるエーロゾル製剤に製作することができる（つまり、それらは「噴霧」することができる）。エーロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など、加圧された許容可能な噴射剤に入れることができる。例えば、静脈内、筋肉内、皮内、および皮下経路などによる非経口投与に好適な製剤としては、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を意図されているレシピエントの血液と等張性にする溶質を含んでいてもよい水性および非水性の等張性無菌注射溶液、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および保存剤を含んでいてもよい水性および非水性無菌懸濁物が挙げられる。組成物は、例えば、静脈注入により、経口で、局所的に、腹腔内に、膀胱内に、後眼窩（ＲＯ）的に、頭蓋内に（例えば、海馬および／または皮質を含むが、それらに限定されない脳の任意の区域に）、または髄腔内に投与することができる。化合物の製剤は、アンプルおよびバイアルなどの単位用量または複数用量の密封容器で提供することができる。注射溶液および懸濁物は、以前に記載されている種類の無菌粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。
【０１７３】
患者に投与される用量は、有益な治療応答を患者において経時的に達成するのに十分であるべきである。用量は、使用される特定のＭＡＰＴ結合分子の効力およびＫｄ、標的細胞、および患者の状態、ならびに処置される患者の体重または表面積により決定される。また、用量のサイズは、特定の患者における、特定の化合物またはベクターの投与に伴う任意の有害副作用の存在、性質、および程度により決定される。
【０１７４】
以下の実施例は、ＭＡＰＴモジュレーターがジンクフィンガータンパク質を含む本開示の例示的な実施形態に関する。これは、例示が目的であるに過ぎず、これらに限定されないが、ＴＡＬＥ−ＴＦ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、追加のＺＦＰ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、追加のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、遺伝子操作ＤＮＡ結合ドメインを有するホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）を含む、他のＭＡＰＴモジュレーター（例えば、リプレッサー）を使用することができることが理解されるであろう。下記で例示されているような標的部位に結合するこうしたモジュレーターは、当業者に公知の方法を使用して容易に得ることができることは明らかであろう。同様に、以下の実施例は、送達ビヒクルが任意のＡＡＶベクターである例示的な実施形態に関するが、任意のウイルス（Ａｄ、ＬＶなど）または非ウイルス（プラスミド、ｍＲＮＡなど）を使用して、本明細書に記載のタウリプレッサーを送達することができることは明らかであろう。
【実施例】
【０１７５】
（実施例１）
ＭＡＰＴリプレッサー
本質的に米国特許第６，５３４，２６１号、米国特許出願公開第２０１５／００５６７０５号、第２０１１／００８２０９３号、第２０１３／０２５３０４０号、および第２０１５／０３３５７０８号に記載のように遺伝子操作されたおよそ１８５個のジンクフィンガータンパク質のスクリーニングを実施し、ＺＦＰをそれらのＭＡＰＴ標的部位に結合させた。マウスＭＡＰＴを標的とするジンクフィンガータンパク質５２２８８、５２３２２、５２３６４、５２３６６、５２３８９、５７８８０、５７８９０、および６５８８８（下記の表１〜３を参照）を、さらなる研究のために選択した。６５８８８に関して列挙されているホスフェート接触突然変異体は、以前に記載されている（例えば、米国特許出願第１５／６８５，５８０号を参照）。表１は、これらＺＦＰのＤＮＡ結合ドメインの認識ヘリックスおよびこれらＺＦＰの標的配列を示す。また、１セットのＺＦＰを、マウスおよびヒト遺伝子間で共有されるＭＡＰＴ配列を標的とするように製作した。それらは表２に示されている。表３は、親ＺＦＰ  ＴＦ、および潜在的な非特異的ホスフェート接触を除去するためにＺＦＰ骨格を表示位置で突然変異させた誘導体ＺＦＰ  ＴＦを示す。ＺＦＰは、標準的ＳＥＬＥＸ分析により評価したところ、それらの標的部位に結合することが示された。
表１：マウスＭＡＰＴ特異的リプレッサー設計
【表１】
2020500526.tif 000003
表２：ヒト／マウスＭＡＰＴ特異的リプレッサー設計
【表２】
2020500526.tif 000004
【０１７６】
また、米国特許出願第１５／６８５，５８０号に記載のような、骨格領域に１つまたは複数の突然変異（例えば、ＤＮＡ結合ヘリックスに対して（−５）位、（−９）位、および／または（−１４）位に製作された、例えば、ＲまたはＫからＡ、Ｌ、Ｓ、Ｎ、Ｅ、Ｙ、またはＱへの突然変異）を含むＺＦＰを調製した（例えば、表１〜３の、６５８８８、５７９３０、６５９１８、６５９２０、６５８９４、５７９４７、６５，９６８、６５８８７、６５８６０、および６５９７６を参照）。本明細書に記載のＺＦＰをすべて、ＫＲＡＢ抑制ドメインに作動可能に連結して、ＺＦＰ−ＴＦを形成した。すべてがＭＡＰＴ発現を抑制した。
【０１７７】
例示的なＺＦＰ  ＴＦを、マウスＮｅｕｒｏ２ａ細胞または初代マウス皮質ニューロンにトランスフェクトした。２４時間後、全ＲＮＡを抽出し、ＭＡＰＴおよび２つの参照遺伝子（ＡＴＰ５ｂ、ＲＰＬ３８）の発現を、リアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲを使用してモニターした。図１に示されているように、ＺＦＰ−ＴＦは、多様な用量応答およびＭＡＰＴ抑制活性で、ＭＡＰＴ発現の抑制に有効であることが見出された（図１Ｂを参照）。
【０１７８】
骨格領域に突然変異を含むＺＦＰ−ＴＦタウリプレッサーを遺伝子操作した。表３には、例示的ＺＦＰ−ＴＦリプレッサー（およびそれらの親化合物）が表されている。こうした最適化されたＺＦＰ  ＴＦでの結果（例えば、６５８８８〜５７８８０を比較して示した例示的な結果）によると、初代ニューロンでは、活性に影響を及ぼさずに特異性が劇的に（１０倍よりも大きく）向上したことが実証された（タウ抑制、図１Ｂを参照）。さらに、５７８８０親の２つの誘導体６５８８７および６５８８８を、ＢＯＤ１およびＭＯＳＰＤ１オフターゲットの抑制活性について、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞で試験したところ（図１Ｄを参照）、ＺＦＰ骨格にホスフェート接触突然変異を含むタンパク質では、オフターゲット抑制が低減された。米国特許出願第１５／６８５，５８０号も参照されたい。
【表３−１】
2020500526.tif 000005
【表３−２】
2020500526.tif 000006
（実施例２）
マウスニューロンでのタウ抑制
【０１７９】
ＺＦＰリプレッサーはすべて、発現を駆動するためにＣＭＶプロモーターを使用するｒＡＡＶ２／９ベクターにクローニングした。ウイルスを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で産生し、ＣｓＣｌ密度勾配を使用して精製し、当技術分野で公知の方法に従ってリアルタイムｑＰＣＲにより力価を測定した。精製したウイルスを使用して、３Ｅ５、１Ｅ５、３Ｅ４、および１Ｅ４ＶＧ／細胞で、培養初代マウス皮質ニューロンに感染させた。７日後、全ＲＮＡを抽出し、ＭＡＰＴおよび２つの参照遺伝子（ＡＴＰ５ｂ、ＥＩＦ４ａ２）の発現を、リアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲを使用してモニターした。
【０１８０】
図１Ｃに示されているように、ＺＦＰ−ＴＦをコードするＡＡＶベクターはすべて、広範囲の感染用量にわたってマウスＭＡＰＴを有効に抑制し、一部のＺＦＰは、複数用量では９５％よりも大幅に標的を低減したことが見出された。対照的に、等価の用量で試験したｒＡＡＶ２／９  ＣＭＶ−ＧＦＰウイルス、または偽薬処置ニューロンでは、ＭＡＰＴ抑制は観察されなかった（図１を参照）。
【０１８１】
ＣＭＶ−５２３８９−ＫＲＡＢをコードするｒＡＡＶ２／９を、３Ｅ５、１Ｅ５、および３Ｅ４ＶＧ／細胞で使用して、マウス皮質ニューロンに感染させた。１０日後に、１セットの複製物から全タンパク質を抽出し、対応する感染群を、全ＲＮＡ抽出に使用した。等量の全細胞溶解物を、総タウタンパク質（抗タウ−５）、５２３８９−ＫＲＡＢ（抗ＺＮＦ１０）、およびＧＡＰＤＨ（抗ＧＡＰＤＨ）についてウエスタンブロットにより調査した（図２Ａを参照）。ＬｉＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ装置を使用して定量的蛍光を測定したところ、３Ｅ５ＶＧ／細胞の用量では、偽薬処置ニューロンと比較して９８％タウタンパク質低減が明らかになった（図２を参照）。ＭＡＰＴ、５２３８９−ＫＲＡＢ、および２つの参照遺伝子（ＡＴＰ５ｂ、ＥＩＦ４ａ２）の発現を、リアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲを使用してモニターした。ＭＡＰＴ転写物レベルは、３Ｅ５ＶＧ／細胞群では、偽薬処置ニューロンと比べて９８％低減された（図２を参照）。
【０１８２】
したがって、表１および２に示されているような標的部位に結合するものを含む、本明細書に記載のような遺伝子モジュレーター（例えば、リプレッサー）は、プラスミドとして、ｍＲＮＡ形態に、Ａｄベクターに、および／またはＡＡＶベクターに、製剤化した場合、機能的リプレッサーであった。
（実施例３）
ＭＡＰＴ抑制の特異性
【０１８３】
表１および２に示されているＺＦＰ−ＴＦのグローバルな特異性を、マウスＮｅｕｒｏ２Ａ細胞でのマイクロアレイ分析により評価した。手短に述べると、３００ｎｇのＺＦＰ−ＴＦをコードするｍＲＮＡを、生物学的な４連の複製物で、１５０，０００個のＮｅｕｒｏ２Ａ細胞にトランスフェクトした。２４時間後、全ＲＮＡを、製造業者のプロトコール（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｇｅｎｅｃｈｉｐ  ＭＴＡ１．０）に従って抽出および処理した。ロバストマルチアレイ平均法（ＲＭＡ、Robust  Multi-array  Average）を使用して、各プローブセットからの生シグナルを正規化した。分析は、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｏｎｓｏｌｅ  ３．０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を、「Ｇｅｎｅ  Ｌｅｖｅｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」オプションで使用して実施した。ＺＦＰトランスフェクト試料を、無関連ＺＦＰ−ＴＦ（ＭＡＰＴ標的部位に結合しないもの）で処置した試料と比較した。対照と比べて平均シグナルが＞２倍差であり、Ｐ値が＜０．０５（一元配置ＡＮＯＶＡ分析、各プローブセットの独立ｔ−検定）の転写物（プローブセット）について、変化の注意喚起を報告する。
【０１８４】
図３に示されているように、ＳＢＳ＃５２３２２は、ＭＡＰＴに加えて５つの遺伝子を抑制し、他の３つでは増加を引き起こした。ＳＢＳ＃５２３６４および＃５２３６６は、ＭＡＰＴに加えて４つの遺伝子を抑制したが、ＳＢＳ＃５２３８９は、ＭＡＰＴ遺伝子のみの抑制および１つの遺伝子の増加を引き起こした。ＳＢＳ＃５７８８０は、ＭＡＰＴに加えて２つの遺伝子を低減し、１つの遺伝子を増加させた。ＳＢＳ＃５７８９０は、ＭＡＰＴに加えて４つの遺伝子を低減し、１つの遺伝子を増加させた。ＳＢＳ＃５２２８８は、ＭＡＰＴに加えて１２４個の遺伝子を抑制し、２５個の遺伝子発現を増加させた。
【０１８５】
また、ＺＦＰ−ＴＦ特異性を、トランスフェクションに対してより感受性であり、さらにより高い有効なＺＦＰ−ＴＦレベルで特異性を評価することが可能である初代ヒト線維芽細胞で評価した。１５０，０００個のヒト線維芽細胞にトランスフェクトした３００ｎｇのＺＦＰ−ＴＦをコードしたｍＲＮＡからなる、各処置の４つの生物学的複製物を使用した。２４時間後、全ＲＮＡを、製造業者のプロトコール（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｉｍｅｖｉｅｗ）に従って抽出および処理した。処理および分析は、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞について記載されている通りであった。重要なことには、ヒト線維芽細胞はＭＡＰＴを発現せず、したがって、ＭＡＰＴレベルの変化は検出されなかった。以前に概説されている倍数変化基準に基づくと、ＳＢＳ＃５２３２２は、５８個の遺伝子を抑制し、他の５３個では増加を引き起こした。ＳＢＳ＃５２３６４は、４３個の遺伝子を抑制し、２５個の遺伝子を増加させた。ＳＢＳ＃５２３６６は、６３個を抑制し、他の６３個の増加を引き起こした。ＳＢＳ＃５２３８９は、いかなる遺伝子も抑制せず、他の１３個を増加させた。ＳＢＳ＃５７８８０は、７つの遺伝子を低減し、２つを増加させた。ＳＢＳ＃５７８９０は１つの遺伝子を低減し、２つを増加させたが、ＳＢＳ＃５２２８８は、５９４個の遺伝子を抑制した一方で、３０２個の遺伝子の発現を増加させた（図４を参照）。
【０１８６】
ＺＦＰ−ＴＦ特異性を、ＺＦＰ−ＴＦのＡＡＶ送達後の初代マウス皮質ニューロンでさらに評価した。１６０ｋの初代マウス皮質ニューロンに１Ｅ５ＶＧ／細胞で感染させた、ＣＭＶ−ＺＦＰ−ＴＦをコードするｒＡＡＶ２／９からなる、各処置の６つの生物学的複製物を使用した。７日後、全ＲＮＡを、製造業者のプロトコール（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｇｅｎｅｃｈｉｐ  ＭＴＡ１．０）に従って抽出および処理した。処理および分析は、Ｎｅｕｒｏ２Ａおよび線維芽細胞について記載されている通りであった。
【０１８７】
以前に概説されている倍数変化基準に基づくと、ＳＢＳ＃５２３２２は、ＭＡＰＴに加えて８０個の遺伝子を抑制し、他の１９個では増加を引き起こした。ＳＢＳ＃５２３６４は、ＭＡＰＴに加えて２９個の遺伝子を抑制し、２つの遺伝子を増加させた。ＳＢＳ＃５２３８９は、ＭＡＰＴに加えて１つの遺伝子を抑制した。ＳＢＳ＃５７８８０は、ＭＡＰＴに加えて６０個の遺伝子を低減し、３つを増加させた。ＳＢＳ＃５７８９０は、ＭＡＰＴのみを抑制し、１つの遺伝子を増加させた（図５を参照）。
【０１８８】
また、実験を実施して、ジンクフィンガー骨格からの潜在的ホスフェート接触の修飾（ここで米国特許出願第１５／６８５，５８０号に記載のような）の特異性に対する影響を調査した。２つの例示的なＺＦＰタウ抑制タンパク質（５７８８０および６５８８８）を比較した。これらは、同一のヘリックスドメインを有するが（表３を参照）、６５８８８は、アミノ酸残基とホスフェートとの潜在的な接触を除去するための突然変異をジンクフィンガー骨格に有する。
【０１８９】
図５Ｂに示されているように、５７８００により上方および下方のいずれかで制御された遺伝子の個数（それぞれ、７５個および１１０個）は、６５８８８タンパク質により顕著に低減され（３つが上方制御され、タウを含む４つが下方制御された）、骨格領域を修飾することにより特異性が増加することが実証された。
（実施例４）
ＣＮＳ限定ＺＦＰ−ＴＦ発現のためのニューロンプロモーター
【０１９０】
３つのニューロンプロモーター：ヒトＳｙｎａｐｓｉｎ１プロモーターの４６９ｂｐ断片（ＳＹＮ１；Kuglerら、（２００１年）Methods  Mol  Med  ５３巻：１３９〜５０頁）、アルファ−カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼプロモーターの３７５ｂｐ断片（ＣａｍＫＩＩ；Dittgenら、（２００４年）Proc  Natl  Acad  Sci  USA  １０１巻（５２号）：１８２０６〜１１頁）、およびメチルＣｐＧ結合タンパク質２プロモーターの２２９ｂｐ断片（ＭｅＣＰ２；Adachiら、（２００５年）Hum  Mol  Genet  １４巻（２３号）：３７０９〜２２頁）を、初代マウスニューロンでＺＦＰ−ＴＦを発現するそれらの能力について評価した。各断片を、実施例２で使用したＣＭＶプロモーターの代わりにクローニングし、ｒＡＡＶ２／９を、２Ａペプチド配列により連結された５２３８９−ＫＲＡＢを駆動する各プロモーター構築物毎に製造して、両タンパク質の共発現を可能にした（Nagaiら、（２００２年）Nat  Biotechnol  ２０巻（１号）：８７〜９０頁およびM.  D.  Ryanら、（１９９１年）J.  Gen.  Virol.  ７２巻、２７２７頁）。
【０１９１】
精製したウイルスを使用して、３Ｅ５、１Ｅ５、３Ｅ４、および１Ｅ４ＶＧ／細胞で、培養初代マウス皮質ニューロンを感染させた。７日後、全ＲＮＡを抽出し、ＭＡＰＴおよび２つの参照遺伝子（ＡＴＰ５ｂ、ＥＩＦ４ａ２）の発現を、リアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲを使用してモニターした。
【０１９２】
すべてのプロモーターは、ＳＹＮ１およびＣａｍＫＩＩの両方でＺＦＰ発現をもたらし、ＣＭＶと同様の転写物レベルが達成された。対照的に、ＭｅＣＰ２は、おおよそ１０分の１のレベルで発現された。また、ＭＡＰＴは、広範囲の感染用量にわたって抑制され、ＳＹＮ１が最も強い応答を示し、ＣＡＭＫＩＩがそれに続き、次がＣＭＶであり、ＭｅＣＰ２が最後であり、最も弱いレベルのＭＡＰＴ抑制を示した。３Ｅ５ＶＧ／細胞の最上位用量では、プロモーターはすべて、偽薬処置ニューロンと比較して、ＭＡＰＴを＞９０％抑制することが可能であり、ＳＹＮ１が、９９．４％の最も強力なＭＡＰＴ低減（約１７５分の１）を示した（図６Ａを参照）。
【０１９３】
また、精製したウイルスを使用して、培養初代海馬ニューロンを感染させ、試料を、皮質ニューロンについて記載されているように分析および処理した。ニューロンプロモーターはすべて、初代皮質ニューロンで観察されたものと同じ活性の順位序列、類似の抑制度合い、および用量応答プロファイルのＺＦＰ発現およびＭＡＰＴ抑制をもたらした（図６Ｂを参照）。
【０１９４】
まとめると、こうした結果は、ニューロンプロモーターはいずれも、ＭＡＰＴ関連兆候の主要な目的の領域、すなわち海馬および皮質において、ＺＦＰ発現およびＭＡＰＴ抑制を達成するのに十分であろうということを示唆する。
【０１９５】
さらに、ＺＦＰ−ＴＦの適切な送達が制限される場合（例えば、静脈内または髄腔内送達による）、および／またはオフターゲット遺伝子制御を最小限に抑えるために低親和性ＺＦＰ−ＴＦを選択することができる場合、強力なニューロンプロモーター（ＳＹＮ１またはＣＡＭＫＩＩなど）の使用を採用して、高度に発現された転写物標的のレベルを低減することができる。逆に、目的の標的遺伝子が、中から低レベルで発現される場合、標的領域に対する十分な送達が制限されない場合（例えば、直接的頭蓋内送達）、および／または高親和性ＺＦＰ−ＴＦのオフターゲット活性を最小限に抑えるために、より弱いニューロンプロモーター（ＭｅＣＰ２など）を選択することができる。
（実施例５）
ｉＰＳ由来ニューロンでのヒトＭＡＰＴの抑制
【０１９６】
本明細書に記載のすべてのＺＦＰの標準的ＳＥＬＥＸ特異性分析に基づき、表２および３に列挙されているＺＦＰは、ヒトＭＡＰＴ配列の１つ（ＳＢＳ＃５７８９０およびＳＢＳ＃５２３６６の場合）または２つ（ＳＢＳ＃５７８８０の場合）の非保存的位置でのミスマッチを許容することが予測された（図７Ａ、配列番号３１および３２を参照）。
【０１９７】
表２および３の例示的なＺＦＰ−ＴＦを、実施例４に記載の４６９ｂｐ  ＳＹＮ１プロモーター断片と共に、ＡＡＶベクター（ＡＡＶ６、ＡＡＶ９  ＡＡＶ２／９、またはその変異体）にクローニングした。ｒＡＡＶウイルスを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で産生し、ＣｓＣｌ密度勾配を使用して精製し、ｑＰＣＲにより力価を測定した。精製したウイルスを使用して、３Ｅ５、１Ｅ５、３Ｅ４、および１Ｅ４ＶＧ／細胞で、ヒトｉＰＳ由来ニューロンを感染させた（ｉＣｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｎｓ、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ）。１８日または１９日後、全ＲＮＡを抽出し、ヒトＭＡＰＴ、ＺＦＰ−ＫＲＡＢ、および３つの参照遺伝子（ＡＴＰ５ｂ、ＥＩＦ４ａ２、ＧＡＰＤＨ）の発現を、リアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲを使用して評価した。各ウイルスで、試験した用量の範囲にわたって類似レベルのＺＦＰが発現された。
【０１９８】
例示的な結果は、図７に示されている。最上位用量の３Ｅ５ＶＧ／細胞では、偽薬感染細胞と比較して、５７８８０−ＫＲＡＢは、ヒトＭＡＰＴを９５％抑制し、５２３６６−ＫＲＡＢは、８７％ＭＡＰＴ低減をもたらし、５７８９０−ＫＲＡＢは、ＭＡＰＴを４５％低下させた（図７Ｂを参照）。本明細書に記載の他の転写因子（例えば、表１〜３に示されているようなＺＦＰ−ＴＦ）でも、同様の結果が得られた。マウスＭＡＰＴで観察された挙動と比較して、ＳＢＳ＃５７８９０がヒトＭＡＰＴ抑制活性を低減した１つの説明は、その例外的な度合いのゲノムワイドの特異性であり、これは、その標的部位でのミスマッチに対する許容性が乏しいことと一致する（実施例３を参照）。
【０１９９】
ＣＭＶ、ＳＹＮ１、およびＣＡＭＫＩＩプロモーターを、ＺＦＰ−ＴＦ  ５２３６６を使用して、ＺＦＰ−ＴＦ発現およびヒトＭＡＰＴのＭＡＰＴ抑制について評価した。ｒＡＡＶ２／９を、５２３６６−ＫＲＡＢを駆動する各プロモーター構築物毎に製造し、記載のようにヒトｉＰＳ由来ニューロンに感染させるために使用した。ＳＹＮ１プロモーターは、ＣＡＭＫＩＩ（偽薬の４０％）およびＣＭＶ（偽薬の７１％）と比較して、最高レベルのＺＦＰ発現およびＭＡＰＴ低減（偽薬処置ニューロンの５％）をもたらした（図７Ｃを参照）。
【０２００】
また、ヒトｉＰＳ由来ニューロンを、上記に記載のようなマイクロアレイ分析に供して、１９，９５９個のコード転写物の集団におけるオフターゲット抑制の量を分析した。各々の場合で、ＺＦＰ−ＴＦを、以前に概説されている倍数変化基準に基づいて、６５９７６のタンパク質と比較した。プロットは、試験ＺＦＰ−ＴＦのプロファイルにおける変化を示す（図７Ｄを参照）。結果は、ヒトタウＺＦＰ−ＴＦの幾つかは、ヒトニューロンに高度に特異的であることを示している。
（実施例６）
ＡＡＶ送達ＺＦＰ  ＴＦにより駆動されるｉｎ  ｖｉｖｏ  ＭＡＰＴ抑制
【０２０１】
本明細書に記載のような種々のＺＦＰ−ＴＦを、種々の異なるＡＡＶベクターを使用してマウス海馬に送達し、ＭＡＰＴの抑制をｉｎ  ｖｉｖｏで評価した。タウリプレッサーをコードするＡＡＶを、５７８９０．Ｔ２Ａ．Ｖｅｎｕｓによる静脈内（ＩＶ）もしくは脳室内（ＩＣＶ）または定位注射による頭蓋内（ＩＣ）のいずれかで投与した。
【０２０２】
手短に述べると、ＡＡＶ２／９の場合、総用量が１脳半球当たり８Ｅ９ＶＧのｒＡＡＶ２／９−ＣＭＶ−ＺＦＰ−ＴＦを、二重両側性２μＬ注射による定位注射により投与した。米国特許第９，５８５，９７１号に記載のＡＡＶベクターの場合、ＡＡＶベクターを、１Ｅ１２の総用量で脳室内（ＩＣＶ）または静脈内（ＩＶ）投与した。米国特許仮出願第６２／５０３，１２１号に記載のようなＡＡＶベクターを、ＩＣＶの場合は１Ｅ１２ｖｇで、またはＩＶの場合は２Ｅ１２ｖｇ／動物で投与した。
【０２０３】
注射の４週間後（ＩＶおよびＩＣＶ）または５週間後（ＩＣ）、動物を犠牲にした。ＩＶおよびＩＣＶ処置動物の場合、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析用に右脳半球を種々の脳領域に解体し、左脳半球を組織学的検査に使用した。ＩＣ処置動物の場合、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析用に各海馬を３片（Ａ、前部；Ｂ、中間部；Ｃ、後部海馬）に切片化した。また、ＭＡＰＴおよびＺＦＰ−ＴＦ発現を、リアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲにより分析し、３つのハウスキーピング遺伝子（ＡＴＰ５ｂ、ＥＩＦ４ａ２、およびＧＡＰＤＨ）の幾何平均に対して正規化した。
【０２０４】
データによると、ＡＡＶベクターは、脳室内または静脈内に投与すると、ニューロン標的を効率的に形質導入し、ＺＦＰ−ＴＦは、ＣＮＳ（前頭皮質、前部皮質、後部皮質、海馬、脳幹、線条体、視床、中脳、小脳、腰髄、胸髄、および頚髄を含む、脳および脊髄）の全体にわたって強力で持続的なタウ低減をもたらしたことが示された。図８Ａ〜８Ｃは、ＡＡＶ９（図８Ｂの「９」）と比較した、６２／５０３，１２１に記載のＡＡＶベクター（図８Ｂの「ＳＧＭＯ」）投与後にＺＦＰ−ＴＦ  ＳＢＳ＃５２３２２、ＳＢＳ＃５２３８９、およびＳＢＳ＃５７８９０を使用した例示的な結果を示す。図８Ａに表されている顕微鏡写真は、ＳＧＭＯベクター送達の４週間後に撮影されたものであり、ＩＣＶ送達での用量は１ｅ１１ｖｇ／マウスであり、ＩＶ送達での用量は２ｅ１２ｖｇ／マウスであった。図８Ｃには、同じ実験でＩＣＶまたはＩＶ投薬により単回投与した後のタウｍＲＮＡレベルの変化が示されている。試験した追加のＺＦＰ−ＴＦのすべてで同じ結果が得られた。
【０２０５】
図８Ｄおよび８Ｅは、ＡＡＶ２／９ベクターを使用した例示的な結果を示し、海馬への頭蓋内送達の場合、５２３８９−ＫＲＡＢおよび５２３２２−ＫＲＡＢは両方とも、ＭＡＰＴを効率的に抑制することができたことが実証された（図８Ｄを参照）。網羅範囲を、各脳半球毎に３つの薄片にわたる相対的ＺＦＰ発現レベルにより評価した。この分析は、多数の薄片が優れた網羅範囲を示したが、幾つかはＺＦＰ−ＴＦ発現をほとんどまたは全く示さないことを明らかにし、幾つかの動物では、頭蓋内に定位送達した後の網羅範囲が、海馬全体にわたって不均一であることが示唆された（図８Ｅを参照）。本明細書に記載のような他のＺＦＰ−ＴＦでも同様の結果が得られた。
【０２０６】
加えて、米国特許第９，５８５，９７１号に記載のＡＡＶベクターを使用して送達した、本明細書に記載のようなタウリプレッサーは、ＣＮＳ（脊髄を含む）においてもタウを有意に抑制した。例示的な結果は、図８Ｆ〜８Ｈに示されている。本明細書に記載のＺＦＰ−ＴＦはすべて、両ｍＲＮＡタンパク質レベルにて、ＣＮＳでの抑制が、迅速であり、経時的に保持された。さらに、タウのＣＳＦレベルは、脳レベルと相関するため、タウリプレッサー機能の指標として使用することができる（例示的な図８Ｈを参照）。
【０２０７】
要約すると、任意の経路により任意のＡＡＶベクターで送達された、本明細書に記載のような任意のタウリプレッサーは、長期間にわたってタウを有効に調節する（抑制する）。
【０２０８】
海馬でのＺＦＰ−ＴＦ誘導性ＭＡＰＴ抑制の度合いをさらに理解するために、３つの分析方法を使用した。第１に、処置群の各動物の６つの薄片すべてのＺＦＰ−ＴＦおよびＭＡＰＴ発現値を平均し、ＡＮＯＶＡ、その後のシダック事後検定によりＰＢＳ群と比較した。高度に有意な（Ｐ＜０．０００１）ＭＡＰＴ抑制が、５２３２２（平均ＭＡＰＴ低減６６％）および５２３８９（平均ＭＡＰＴ低減５５％）の両方で観察された（図９Ａを参照）。
【０２０９】
第２に、各動物で最も高いレベルのＺＦＰ−ＴＦ発現を示す切片を特定および使用して、理想的な網羅範囲シナリオに基づく平均最大タウ低減を算出した。この場合も、高度に有意な（Ｐ＜０．０００１）ＭＡＰＴ抑制が、試験したＺＦＰ−ＴＦすべてで観察された。図９Ｂに示されている例示的な結果は、５２３２２（平均ＭＡＰＴ低減７３％）および５２３８９（平均ＭＡＰＴ低減８９％）を使用すると、低減が７０％よりも高いことを示す。
【０２１０】
第３に、ＭＡＰＴレベルとＺＦＰ−ＴＦレベルとの間の相関性を評価した（ここでは、ＲＴ−ｑＰＣＲ反応におけるＺＦＰコピー／ＲＮＡ入力のｎｇの絶対値として表されている）。高度に有意な関係性が、５２３２２（Ｐ＜０．０００１、Ｒ２＝０．５３）および５２３８９（Ｐ＜０．０００１、Ｒ２＝０．８２）の両方で観察された（図９Ｃおよび９Ｄを参照）。
【０２１１】
また、タウオパチーのＰ３０１Ｌ突然変異体ヒトタウ（Ｐ３０１Ｌ）トランスジェニックマウスモデル（ｒＴｇ４５１０、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）におけるタウ低減を、本明細書に記載のような遺伝子リプレッサーの投与後に評価する。加えて、リプレッサーの臨床および治療有効性を、このおよび他のマウスＡＤモデル（例えば、ＡＰＰｓｗｅ／ＰＳ１ｄ９、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）で評価して、以下のものの１つまたは複数を含む、タウオパチーのバイオマーカーおよび症状に低減があるか否かを決定した：神経毒性、グリオーシス、変性神経突起、脊椎喪失、興奮毒性、皮質および海馬の収縮、樹状タウ蓄積、認知（例えば、放射状アーム迷路、およびモリス水迷路、恐怖条件付けなど）、および運動障害。例えば、Bryanら、（２００９年）Chapter  1:  Transgenic  Mouse  Models  of  Alzheimer's  Disease:  Behavioral  Testing  and  Considerations  in  Methods  of  Behavior  Analysis  in  Neuroscience．第２版、Buccafusco編、Boca  Raton  (FL):  CRC  Press/Taylor  &  Francisを参照されたい。また、加えて、化学的に誘導された発作モデル、例えば、ペンチレンテトラゾール（ＰＴＺは、例えば、Meyersら、（１９７５年）Epilepsia  １６巻（２号）：２５７〜６７頁を参照）またはカイネート（Ferraroら、（１９９７年）Mamm  Genome  ８巻：２００〜２０８頁などの興奮毒性化合物で処置した野生型マウスを、本明細書に記載のような遺伝子リプレッサーを投与した４〜８週間後に評価して、タウ低減が、発作に関連する致死率、発作に至るまでの長期潜伏期間、および／または発作重症度の低減を含む、発作に対する保護効果を付与するか否かを決定する。
【０２１２】
本明細書に記載のようなタウモジュレーター（例えば、リプレッサー）を、本明細書に記載のような非ウイルスまたはウイルス（例えば、ＡＡＶ）ベクターを使用して、例えば、海馬または皮質への頭蓋内注射により脳内に直接的に、脳室内送達で、または静脈内送達で送達した。リプレッサー投与後の期間（リプレッサー投与後の１〜１１か月間）後に、脳を回収し、切片化し、免疫組織化学法分析および／または画像分析（例えば、２光子画像化法）に供して、ニューロン生存能、グリオーシス、変性神経突起、脊椎密度、皮質および海馬の厚さ、タウｍＲＮＡ発現、およびタウタンパク質レベルを評価した。
【０２１３】
リプレッサーを受容したマウスは、ＺＦＰリプレッサー投与の８週間後に、ＺＦＰ発現ニューロンにおけるタウ（ｍＲＮＡおよびタンパク質）の８０〜９０％またはそれよりも高い抑制を示した。長期間（６か月間）のタウノックダウン後に、有意なニューロン喪失またはグリオーシス上昇は、見られなかった。また、マウスタウ抑制は、神経炎性ジストロフィーに対して保護性であった。したがって、本明細書に記載のようなタウモジュレーター（例えば、リプレッサー）は、タウオパチーを有する対象に、ｉｎ  ｖｉｖｏ臨床および治療利益を提供する。
（実施例７）
ニューロンプロモーターから発現されるＡＡＶ送達ＺＦＰ  ＴＦにより駆動されるｉｎ  ｖｉｖｏ  ＭＡＰＴ抑制およびタンパク質ノックダウン
【０２１４】
実施例５に記載のＣＭＶ、ＳＹＮ１、ＣＡＭＫＩＩ、またはＭｅＣＰ２プロモーターにより駆動される本明細書に記載のようなＺＦＰ−ＴＦ  ２Ａ−Ｖｅｎｕｓ構築物をコードする組換えＡＡＶベクターをマウス海馬に送達して、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＭＡＰＴ  ｍＲＮＡおよびタンパク質低減を評価した。手短に述べると、１脳半球当たり２．４Ｅ１０ＶＧの総用量を、二重両側性１．５μＬ注射による定位注射により成体野生型マウスに投与した。注射の６週間後に、動物を犠牲にし、各海馬を、カミソリ刀で細かくホモジナイズし、得られた組織を２つの等量に分配した。一方の半分をｍＲＮＡ分析のために使って、ＭＡＰＴ、ＺＦＰ−ＴＦ、ＧＦＡＰ、およびＩＢＡ１発現を、リアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲにより分析し、３つのハウスキーピング遺伝子（ＡＴＰ５ｂ、ＥＩＦ４ａ２、およびＧＡＰＤＨ）の幾何平均に対して正規化した。他方の半分を、ＥＬＩＳＡによる定量的タウタンパク質分析のために使った。例示的な結果は、図１０に示されている。対照処置動物と比べて、タウｍＲＮＡは、ＡＡＶ  ＺＦＰ−ＴＦの投与後に少なくとも８５％低減された。ｒＡＡＶ９−ＣＭＶ−５２３８９Ｖ投与後の例示的な結果は以下の通りであった：ｒＡＡＶ９−ＳＹＮ１−５２３８９Ｖによるタウ発現の６３％低減；ｒＡＡＶ９−ＣＡＭＫＩＩ−５２３８９Ｖによるタウ発現の７４％低減；およびｒＡＡＶ９−ＭｅＣＰ２−５２３８９Ｖ構築物による８３％低減（すべてのプロモーターで、Ｐ＜０．０００１）。平均ＺＦＰ発現は、ＣＡＭＫＩＩプロモーターをコードするベクターが最も高く（１の値に設定する）、ＭｅＣＰ２プロモーターが最も低く（ＣＡＭＫＩＩレベルの１５％）、およびＣＭＶ（ＣＡＭＫＩＩレベルの５９％）およびＳＹＮ１（ＣＡＭＫＩＩレベルの９０％）プロモーターが中間であることが見出された。
【０２１５】
また、小グリア細胞および活性化された星状細胞の存在を、それぞれＩＢＡ１およびＧＦＡＰについて、ＲＴ−ｑＰＣＲ試薬を使用して評価した。ＭｅＣＰ２プロモーターは、ＰＢＳ注射動物と比較してＩＢＡ１レベルの有意な変化をもたらさず、ＳＹＮ１は、４．７倍のより高いＩＢＡ１レベル（Ｐ＜０．０００１）をもたらし、ＣＭＶは、３．０倍のより高いレベル（Ｐ＜０．０５）をもたらし、ＣＡＭＫＩＩは、３．２倍のより高いレベル（Ｐ＜０．００１）をもたらした。同様に、ＭｅＣＰ２プロモーターは、ＰＢＳ注射動物と比較してＧＦＡＰ上昇をもたらさず、ＳＹＮ１は、４．０倍のより高いＧＦＡＰレベル（Ｐ＜０．０００１）をもたらし、ＣＭＶは、３．２倍のより高いレベル（Ｐ＜０．０１）をもたらし、ＣＡＭＫＩＩは、２．４倍のより高いレベル（Ｐ＜０．０５）をもたらした。
【０２１６】
また、総タウタンパク質のロバストな低減が、３つのニューロンプロモーター構築物すべてで観察された（ＳＢＳ５２３８９を使用した例示的な結果が図１１に示されている）。ＰＢＳ注射対照レベル（２６９ｎｇ／ｍｌ）と比較して、ｒＡＡＶ９−ＳＹＮ１−５２３８９Ｖ構築物は、対照レベルの２３％をもたらし（６１ｎｇ／ｍｌ、Ｐ＜０．０００１）、ｒＡＡＶ９−ＣＡＭＫＩＩ−５２３８９Ｖ構築物は、対照レベルの１８％を産出し（４９ｎｇ／ｍｌ、Ｐ＜０．０００１）、ｒＡＡＶ９−ＳＹＮ１−５２３８９Ｖ構築物は、対照レベルの１２％を示した（３２ｎｇ／ｍｌ、Ｐ＜０．０００１）。同様のまたは高いレベルの低減が、本明細書に記載のような他のＺＦＰ−ＴＦで得られる（例えば、５７８９０、６５８９４、５７９３０、６５９１８、６５９２０、５７８８０、６５８８７、６５８８８、５７９４７、６５９６８、５２３２２、５２３６４、５２３６６、５２２８８、５２３８９、および／または６５８６０）。
【０２１７】
したがって、ニューロンプロモーターは、マウス海馬の全体にわたって、＞８０％のタウｍＲＮＡおよびタンパク質低減を駆動することが可能である。
（実施例８）
海馬および接続脳領域の全体にわたるタウ低減の組織学的証拠
【０２１８】
本明細書に記載のような人工転写因子をマウス海馬に送達して、ｉｎ  ｖｉｖｏでのタウの抑制を免疫蛍光染色により評価した。総用量が２．４Ｅ１０ＶＧのｒＡＡＶ−ＣＭＶ−ＺＦＰ−ＴＦ（ｒＡＡＶ２／９、ｒＡＡＶ６など）を、二重片側性１．５μＬ注射による定位注射により成体野生型マウスに投与した。ＺＦＰ−ＴＦを蛍光性Ｖｅｎｕｓタンパク質に連結して、ＴＦ発現を局在化した。注射の６週後に動物を犠牲にし、脳全体を収集し、標準的方法を使用して核（ＤＡＰＩ）、タウ、およびＧＦＰを組織学的に染色するために切片化した。また、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析を実施した。手短に述べると、ＡＡＶ  ＺＦＰ−ｄＶｅｎｕｓ形質導入細胞でのタウノックダウン効率を評価するために、本発明者らは、製造業者マニュアルに従ってパパイン分散キット（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｏｒｐ．）を使用して、ＡＡＶ  ＣＭＶ  ＺＦＰ−ｄＶｅｎｕｓを注射した海馬を分散させ、その後、フローサイトメトリー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＭＡＣＳＱｕａｎｔ  ＶＹＢ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を使用して細胞懸濁物を分析した。その後、同じ試料中のｄＶｅｎｕｓまたはＧＦＰ発現細胞を、緑色４８８ｎｍレーザーを使用してＦＡＣＳにより分離した（ＢｉｏＲａｄＳ３セルソーター；１試料当たり３０ｋ〜５０ｋのＧＦＰ陽性細胞）。選別した後、細胞を１，０００×ｇで１０分間の遠心分離により遠沈させ、ＲＮＡ分析のために１００μｌのＲＮＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に再懸濁した。
【０２１９】
例示的な結果は、図１２に示されている（ｒＡＡＶ２／９−ＣＭＶ−ＺＦＰ−ＴＦ  ＳＢＳ＃５２３８９を注射した動物）。図１２Ａには、前部海馬にわたるマウス脳の断面を示し、１〜４と付番されている４つのボックス領域が特定されている。左脳半球に注射し（同側）、それにより断面の左側でより高い蛍光がもたらされた。以降のパネルは、これらボックスの各々の拡大画像である。ボックスは、下記のように説明される。
【０２２０】
ボックス１（図１２Ｂ）には、脳梁膨大後部皮質を横断した蛍光強度の定量化が示されており、ＺＦＰ−ＴＦ発現は、同側脳半球と対側脳半球との間で明白に境界が画定されている。図１２Ｂの左パネルでは、蛍光シグナルは、対側（「ｃｏｎｔｒａ」）よりも正中線の同側（「ｉｐｓｉ」）がより高かった。ここでのＺＦＰ発現は、海馬軸索投射から生じる可能性が高い。パネルの右側のシグナルの大部分は、核のＤＡＰＩ染色によるものであった。中央の画像には、抗タウタグ化抗体による全体的な蛍光が示されている。パネルの同側の（左）側のシグナルがほぼすべてＧＦＰシグナルによるものであったのに対して、パネルの対側の（右）側のシグナルは、ほとんどがタウの存在および根底にあるＤＡＰＩ染色によるものであった。１２Ｂの右パネルには、タウシグナルの定量化（図１２Ｃに表示）のために分析した断面ボックスが示されている。この図には、注射した（処置した）側からのタウ特異的蛍光が低減されたことが示されている（「ｉｐｓｉ」対「ｃｏｎｔｒａ」）。
【０２２１】
ボックス２、図１２Ｄ（同側）およびボックス３、図１２Ｅ（対側）は、対側と比べた同側の（処置した）側のタウ低減を示す海馬の画像であり、タウノックダウンは、同側（矢印で示されている）と比べて、対側の歯状回で特に明らかであった。
【０２２２】
ボックス４は、視床下部の領域であり、同側に局所的なＺＦＰ発現があり（上段パネルはＧＦＰ蛍光を示す。左側の楕円）、バルクタウ蛍光（下段パネル）は、総タウシグナルの約５０％低減を示す（同側と対側とのグラフを参照）。同様の結果が、表１、２、および３に記載のようなＺＦＰ−ＴＦを含むＡＡＶ構築物を使用して得られる。
【０２２３】
したがって、本明細書に記載のようなＺＦＰ−ＴＦは、タウ発現をｉｎ  ｖｉｖｏで抑制する。
（実施例９）
マウス海馬でのＺＦＰ−ＴＦのｉｎ  ｖｉｖｏ安全性、タウ低減、および持続発現
【０２２４】
本明細書に記載のタウを標的とする人工転写因子の短期および長期の両方の海馬発現の安全性を評価するために、本明細書に記載のようなＺＦＰ−ＴＦを、マウス海馬にｉｎ  ｖｉｖｏ送達して、ＺＦＰ発現、ならびに星状細胞および小グリア細胞応答、ならびに全体的な海馬の解剖学的特徴をモニターした。１つの実験では、総用量が２．４Ｅ１０ＶＧのｒＡＡＶ２／９−ＣＭＶ−５２３８９−２Ａ−Ｖｅｎｕｓ（「３８９ｄＶ」）、ｒＡＡＶ２／９−ＣＭＶ−ＺＦＰ−ＴＦ（「３８９」）、ｒＡＡＶ２／９−ＣＭＶ  ＧＦＰ（「ＧＦＰ」）、またはＰＢＳ（「ＰＢＳ」）を、二重片側性１．５μＬ注射による定位注射により成体野生型マウスに投与した。２つのコホートを、注射の６週間後または６か月後のいずれかで犠牲にし、脳全体を収集し、標準的方法を使用して、核（ＤＡＰＩ）、ＧＦＰ、ＧＦＡＰ（活性化された星状細胞を検出するため）、およびＩＢＡ１（小グリア細胞を検出するため）の組織学的染色のために切片化した。結果は、図１３に示されている。図１３Ｈは、注射後に海馬の前部および後部区域の両方でタウが抑制されたことを実証する、海馬の２つの領域の蛍光を示す画像を含む。
【０２２５】
６週時点では（図１３Ａ）、海馬における形質導入細胞のシグナルを図示すると、ＺＦＰ−ＴＦのシグナルは、ＧＦＰベクターとほぼ同じである。図１３Ｂは、星状細胞での結果を示し、また、海馬小グリア細胞でも見られるように、３つの処置にわたってほぼ同じ結果を示す（図１３Ｃ）。
【０２２６】
６か月時点では、図１３Ｄのデータは、６週時点で見られたように、ＧＦＰおよびＺＦＰ  ＴＦベクターの蛍光が非常に類似したレベルであることを実証し、海馬における形質導入細胞の量に、経時的な大きな変化はなかったことが示唆される。また、図１３Ｅは、異なる処置間のシグナルが非常に類似しており、６週時点と６か月時点との間で有意な変化がなかったことを示す（図１３Ｂ対１３Ｅ、２つの図ではｙ軸が異なることに留意されたい）。ＡＡＶベクターによる処置後の６か月時点における小グリア細胞は、ほぼ同じであり、ＰＢＳ処置試料でわずかに減少する。
【０２２７】
平均ＣＡ１（海馬領域の１つ）の厚さの測定は、６か月間のＺＦＰ発現後に有意な変化を示さず（図１３Ｇ）、ＺＦＰの長期発現に由来する顕在的なニューロン毒性がないことが実証される。
【０２２８】
追加の分析を実施し、ＰＢＳのみと、２ａ−Ｖｅｎｕｓに連結された５２２８８、５２３６４、および５２３８９構築物とが比較されたことを除き上記と同様に、ＺＦＰ−ＴＦを投与した。投薬は、実施例６に記載の通りであった。投薬後、動物を４週で犠牲にした。データは、図１３Ｉに示されている。示されているデータは、５２２８８構築物による処置が、他の構築物と比較して、実質的に減弱されたベクターゲノムおよびＺＦＰ発現をもたらし、いかなる有意な様式でもタウ発現を抑制しなかったことを示す。しかしながら、それにより、高レベルのＧＦＡＰおよびＩＢＡ１がもたらされた。ＺＦＰ５２３６４は、５２２８８構築物よりも高いベクターゲノムレベルおよびＺＦＰ発現を示したが、同様に高いレベルのＧＦＡＰおよびＩＢＡ１に結び付き、タウ発現を有意には抑制しなかった。対照的に、５２３８９構築物は、ＧＦＡＰまたはＩＢＡ１発現に影響を及ぼさずに、タウ発現の有意な低下を引き起こすことができた。
【０２２９】
ＺＦＰ５２２８８および５２３６４でのｉｎ  ｖｉｖｏタウ低減の欠如および神経炎症バイオマーカー上昇は、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞、ヒト線維芽細胞、および初代ニューロン（図３、４、５）で評価したＺＦＰ特異性プロファイルと相関し、高度に特異的なＺＦＰがタウ発現を有意に低減し、ｉｎ  ｖｉｖｏで許容性であったことを示す。
【０２３０】
ＰＢＳまたは５２３８９−２ａ−Ｖｅｎｕｓを受容した投薬群の一部を、１１か月間延期した。また、タウ抑制の量の分析に加えて、試料を、発現されたＺＦＰの量のｍＲＮＡ発現レベル、およびＧＦＡＰ、ＩＢＡ１、ＮｅｕＮ、ＭＡＰ１Ａ、ＭＡＰ１Ｂ、およびＭＡＰ２をコードする転写物の量の任意の変化について分析した。手短に述べると、各海馬を、カミソリ刀で細かくホモジナイズし、得られた組織を２つの等量に分配した。一方の半分をｍＲＮＡ分析のために使って、ＭＡＰＴ、ＺＦＰ、ＧＦＡＰ、ＩＢＡ１、ＮｅｕＮ、ＭＡＰ１Ａ、ＭＡＰ１Ｂ、およびＭＡＰ２発現を、リアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲにより分析し、３つのハウスキーピング遺伝子（ＡＴＰ５ｂ、ＥＩＦ４ａ２、およびＧＡＰＤＨ）の幾何平均に対して正規化した。例示的な結果は、図１３Ｊに示されており、比較のために、６週データも含まれている。データは、一般的には、６週時間枠と１１か月時間枠との間で分析したほとんどのデータセットに、大きな変化がなかったことを実証している。しかしながら、検出されたＺＦＰ発現の量に減少が検出された。３つの他の微小管結合タンパク質（ＭＡＰ１Ａ、ＭＡＰ１Ｂ、およびＭＡＰ２）には、有意な補償性変化は観察されず、ＮｅｕＮレベルのいかなる低減も観察されなかった。これは、ＺＦＰ送達の６か月後に評価した、ＺＦＰ処置脳半球の海馬容積の保存と一致する。本明細書に記載のようなＺＦＰ−ＴＦを使用して追加の実験を実施したところ、同様の結果がもたらされた。
【０２３１】
したがって、結果は、単回投与後、ＺＦＰ発現がｉｎ  ｖｉｖｏで経時的に存続し、対象のＣＮＳに毒性をもたらさず、成体海馬におけるＺＦＰ媒介性タウ低減が、少なくとも１１か月間にわたって持続し、許容性が良好であることを実証している。
【０２３２】
Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウス（８週齢の雌）を使用して別の研究を実施し、本明細書に記載のＡＡＶを使用して、ＺＦＰ−ＴＦを後眼窩送達により送達した。１動物当たり２．５ｅ１２ウイルスゲノム（ｖｇ）を使用し、動物を１０週間後に犠牲にした。処置マウスに由来する海馬組織に対してマイクロアレイ分析を実施した。示されているデータは、同じ様式で送達した無関連ＺＦＰ−ＴＦと比較されている。図１７は、タウが、ＧＦＰをコードするＡＡＶによる処置と比較して、５７８９０Ｖおよび５２３８９Ｖタンパク質により特異的に抑制されたことを示す。こうしたデータは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察されたこうしたタンパク質の特異性が、ｉｎ  ｖｉｖｏでも見出されることを実証している。
（実施例１０）
ＡＤのマウスモデルにおけるタウ低減
【０２３３】
上記にて野生型マウスで行われたものに加えて、ＡＤのマウスモデルにおける研究を実施した。ＡＰＰ／ＰＳ１マウス（Liら、同書に総説されている）を、本明細書に記載のようなＺＦＰ−ＴＦで処置して、このモデルにおける効力を分析した。
【０２３４】
手短に述べると、１つの実験では、４匹のＡＰＰ／ＰＳ１マウスおよび２匹の野生型対照を、４．５月齢で処置した。単回注射を実施して、脳の反対側の皮質（ＣＴＸ）に３μＬのＡＡＶ組成物を導入した。各マウスの左ＣＴＸは、Ｓｙｎａｐｓｉｎ１プロモーターにより駆動されるＧＦＰに連結したＺＦＰ−ＴＦ（無関連ＺＦＰ−ＴＦ対照（「１７２」；ＡＡＶ９  ｓｙｎ１−１７２ｖ））または５２３８９ＺＦＰ−ＴＦ（「３８９」；ＡＡＶ９  ｓｙｎ１−３８９ｖ）を含む３μＬのＡＡＶ９を受容した。各マウスの右ＣＴＸは、Ｓｙｎａｐｓｉｎ１プロモーターにより駆動されるＲＦＰ発現構築物を含む３μＬのＡＡＶ９（「ＡＡＶ９  ｓｙｎ１−ｔＲＦＰ」）を受容した。
【０２３５】
処置の１１（十一）週後、７月齢マウスを４％ＰＦＡ／ＰＢＳで灌流した。その後、脳全体を取り出し、４℃にて２日間４％ＰＦＡ／ＰＢＳで後固定した。その後、組織を３０％スクロース／ＰＢＳ溶液で凍結保護した。５０μｍ冠状切片を、ｔＲＦＰ、ＧＦＰ、およびアミロイドベータ（「Ａβ」）の免疫蛍光標識化について分析した。１マウス当たり３つの脳切片を分析し、各切片の３〜５つの画像を撮影した。Ａβを多く含む斑の変性神経突起を計数し、１動物当たり１２１〜２５６個の斑を分析した。ＡＡＶ９  ｓｙｎ１−３８９ｖ処置ＣＴＸでは、７０８個の斑を計数し、ＡＡＶ９  ｓｙｎ１−ｔＲＦＰ  ＣＴＸでは、２８７個を計数した。例示的なデータは、図１４Ａ〜Ｄに示されており、ｔＲＦＰ処置皮質と比較して、５２３８９ＺＦＰ−ＴＦで処置した皮質では、Ａβ斑の個数当たりの変性神経突起の個数に統計的有意差があることが示されている（図１５および１６）。対照的に、無関連ＺＦＰ−ＴＦで処置した動物では、１斑当たりのジストロフィーに差異はなかった。加えて、斑の個数および容積は、処置動物および未処置動物の両方で変化はなかった。他のＡＡＶベクター、投与モード、および／または本明細書に記載のようなＺＦＰ−ＴＦを使用して実施したさらなる実験は、同様の結果をもたらした。
【０２３６】
したがって、本明細書に記載のタウ遺伝子リプレッサーは、既知ＡＤマウスモデルでの研究により示されたように、ＡＤなどのタウオパチーに臨床的および治療的利益を提供する。
（実施例１１）
霊長類脳におけるｉｎ  ｖｉｖｏでのタウ低減
【０２３７】
霊長類タウ特異的ＺＦＰ−ＴＦを、カニクイザル（Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）で試験して、霊長類（非ヒト霊長類（ＮＨＰ）モデル）におけるタウ発現の抑制を観察する。カニクイザルを、ステンレス網床および自動給水バルブを装備したステンレス鋼ケージに収容する。この研究は、動物保護法（連邦規則集、第９巻）の最終規則のすべての該当し得る条項に準拠している。
【０２３８】
初期実験を実施して、サルの海馬を適切に標的とすることができるか否かを決定する。対照物質（製剤緩衝剤、ＰＢＳ、および０．００１％プルロニックＦ−６８、ｐＨ７．１）および試験物質を、研究の１日目に解凍および分注し、試験物質および対照物質を、ＡＡＶ９−ＧＦＰまたはＡＡＶ９−ＺＦＰ−ＴＦのＭＲＩガイド化送達により海馬に投与する。
【０２３９】
最初の実験では、ｈＳＹＮ１駆動性ＧＦＰ遺伝子を含むＡＡＶ９を、３．８４ｅ１１ｖｇ／脳半球で左脳半球に、および７．６８ｅ１１ｖｇ／脳半球で右脳半球に送達する。１匹の動物は、４０μＬの容積中の単一用量の試験物質を左側に受容し、８０μＬの単一用量を右側に受容する。第２の動物は、左側に２０μＬの２用量を、および右脳半球に４０μＬの２用量を受容する。試験物質は両方とも、用量濃度が、９．６ｅ１２ｖｇ／ｍＬである。１４日後、動物を犠牲にし、脳を２等分し、およそ１７個の薄片（各３ｍｍ）に分割する。海馬／嗅内皮質領域を含む薄片を使用して、内因性ＧＦＰ蛍光およびＧＦＰ免疫組織化学的特徴を分析する。他の薄片を使用して、ｑＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡ分析用に組織パンチを収集し、タウおよびハウスキーピング遺伝子のレベルを分析する。加えて、一部のパンチを、探索タウタンパク質分析のために収集および保持する。結果は、ｈＳＹＮ１プロモーターが、送達後に、海馬領域において検出可能なＧＦＰ発現を駆動することができることを示す。
【０２４０】
第２の実験を実施して、投与経路が、脳におけるＧＦＰ発現および位置に及ぼす影響を評価する。この研究では、ＧＦＰ導入遺伝子は、ＳＢ３  ＡＡＶ粒子（米国特許仮出願第６２／５０３，１２１号を参照）により運搬され、試験物質の用量濃度は、２．５ｅ１３ｖｇ／ｍＬである。用量を、脳室内、髄腔内、または静脈内経路により投与し、用量容積（ｍＬ／動物）は、それぞれおよそ１、１．５、および１０〜１６である。投薬１４日後に、動物を犠牲にし、脳を上述のように２等分する。ｑＲＴ−ＰＣＲによりタウおよびハウスキーピング遺伝子のレベルを分析することに加えて、炎症に関連する遺伝子（ＧＦＡＰおよびＩｂａ１）も分析する。また、探索研究を実施して、脳組織試料および脳脊髄液中のタウタンパク質レベルを分析する。こうした研究は、投薬経路はすべて十分に許容性であり、ＧＦＰ導入遺伝子を海馬領域に送達することができることを示す。
【０２４１】
続いて、本明細書に記載のような人工転写因子による、カニクイザル脳でのタウ発現の抑制を分析するための研究を実施する。本明細書に記載のような３つまたはそれよりも多くのＺＦＰ−ＴＦ（表１〜３）を試験し、３つのＺＦＰを、高特異性（０個のオフターゲット）および高い（≧９０％抑制）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力を有するタンパク質（ＺＦＰ−ＴＦ１）；中程度の特異性（５〜１０個のオフターゲット）および高いｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力を有するタンパク質（ＺＦＰ−ＴＦ２）；および高特異性および中程度（５０〜６０％）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力を有するタンパク質（ＺＦＰ−ＴＦ３）として特徴付ける。１、３、および６か月時点で動物を犠牲にし、上述のように分析する。脳およびＣＳＦ全体にわたる有意なタウ抑制が観察され、有意なニューロン喪失は観察されない。
【０２４２】
上記研究は、タウＺＦＰ−ＴＦ試薬が、霊長類脳のタウ発現を抑制する（治療レベルのものを含む）ことを実証する。
【０２４３】
本明細書で言及されている特許、特許出願、および刊行物はすべて、参照によりそれらの全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。
【０２４４】
明瞭な理解を目的とした図示および例によりある程度詳細な開示が提供されているが、当業者であれば、本開示の趣旨または範囲から逸脱せずに種々の変化および改変をなすことができることは明白であろう。したがって、先述の記載および例は、限定として解釈されるべきでない。
【図１ＡＢ】
2020500526.tif 000007
【図１Ｃ】
2020500526.tif 000008
【図１Ｄ】
2020500526.tif 000009
【図２】
2020500526.tif 000010
【図３】
2020500526.tif 000011
【図４】
2020500526.tif 000012
【図５Ａ】
2020500526.tif 000013
【図５Ｂ】
2020500526.tif 000014
【図６Ａ】
2020500526.tif 000015
【図６Ｂ】
2020500526.tif 000016
【図７ＡＢ】
2020500526.tif 000017
【図７Ｃ】
2020500526.tif 000018
【図７Ｄ】
2020500526.tif 000019
【図８ＡＢ】
2020500526.tif 000020
【図８Ｃ】
2020500526.tif 000021
【図８ＤＥ】
2020500526.tif 000022
【図８Ｆ】
2020500526.tif 000023
【図８Ｇ】
2020500526.tif 000024
【図８Ｈ】
2020500526.tif 000025
【図９】
2020500526.tif 000026
【図１０】
2020500526.tif 000027
【図１１】
2020500526.tif 000028
【図１２Ａ−Ｃ】
2020500526.tif 000029
【図１２Ｄ−Ｆ】
2020500526.tif 000030
【図１３Ａ−Ｆ】
2020500526.tif 000031
【図１３Ｇ−Ｈ】
2020500526.tif 000032
【図１３Ｉ】
2020500526.tif 000033
【図１３Ｊ−１】
2020500526.tif 000034
【図１３Ｊ−２】
2020500526.tif 000035
【図１４Ａ−Ｄ】
2020500526.tif 000036
【図１４Ｅ−Ｆ】
2020500526.tif 000037
【図１５】
2020500526.tif 000038
【図１６】
2020500526.tif 000039
【図１７】
2020500526.tif 000040
【配列表】
2020500526000001.app
【国際調査報告】
2020500526.tif 000041
2020500526.tif 000042