(57)【要約】  対象を治療するために、有効な量のＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤を、それを必要とする対象に投与することによる、脊椎円板変性（ＳＤＤ）を治療するための方法が、本明細書で提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において１又は２以上の椎間円板での椎間円板変性を治療する方法であって、椎間円板変性の治療に有効な量のソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達経路活性化剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤が、スムーズンドアゴニスト又はＳＡＧである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤が、ブラキウリのアップレギュレーターである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤が、ＳＨＨの下流エフェクターである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤が、古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路から独立している、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
有効な量の古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化剤を投与することをさらに含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化剤が、ＧＳＫ３阻害剤である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
投与することが、１若しくは２以上の椎間円板に注入すること、硬膜外腔に注入すること、腹腔内に注入すること、又は１若しくは２以上の椎間円板の髄核に注入することを含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
投与することが、経口投与を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
変性が、病理学的又は加齢関連性である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
変性が、腰痛、頸椎円板疾患、又は胸椎円板疾患である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
椎間円板変性を治療することが、脊椎円板変性を回復させること、又は脊椎円板変性の進行を遅延させることを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
椎間円板変性を治療することが、前記円板変性に関連する痛みを減少させること、又は椎間円板変性と診断された脊椎関節の可動域を拡大することを含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
椎間円板変性を治療することが、変性を測定するために使用される、円板又は脊椎部分の磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、Ｘ線、又はＣＴスキャンから選択される放射線撮像技術に基づく測定値を、治療前の測定値と比較して改善することを含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
有効な量のソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達経路活性化剤を含む、椎間円板変性の治療に使用するための組成物。
【請求項１６】
ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤が、スムーズンドアゴニスト又はＳＡＧである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤が、ブラキウリのアップレギュレーターである、請求項１５又は１６に記載の組成物。
【請求項１８】
ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤が、ＳＨＨの下流エフェクターである、請求項１５〜１７のいずれかに記載の組成物。
【請求項１９】
ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤が、古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路から独立している、請求項１５〜１８のいずれかに記載の組成物。
【請求項２０】
古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化剤をさらに含む、請求項１５〜１８のいずれかに記載の組成物。
【請求項２１】
古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化剤が、ＧＳＫ３阻害剤である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
注入に適している、請求項１５〜２１のいずれかに記載の組成物。
【請求項２３】
経口投与に適している、請求項１５〜２１のいずれかに記載の組成物。
【請求項２４】
変性が、病理学的又は加齢関連性である、請求項１５〜２３のいずれかに記載の組成物。
【請求項２５】
変性が、腰痛、頸椎円板疾患、又は胸椎円板疾患である、請求項１５〜２４のいずれかに記載の組成物。
【請求項２６】
椎間円板変性を治療することが、脊椎円板変性を回復させること、又は脊椎円板変性の進行を遅延させることを含む、請求項１５〜２５のいずれかに記載の組成物。
【請求項２７】
椎間円板変性を治療することが、前記円板変性に関連する痛みを減少させること、又は椎間円板変性と診断された脊椎関節の可動域を拡大することを含む、請求項１５〜２６のいずれかに記載の組成物。
【請求項２８】
椎間円板変性を治療することが、変性を測定するために使用される、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）に基づく円板及び脊椎部分の測定値を、治療前の測定値と比較して改善することを含む、請求項１５〜２７のいずれかに記載の組成物。
【請求項２９】
椎間円板変性の治療のための医薬の製造のための、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達経路活性化剤の使用。
【請求項３０】
ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤が、スムーズンドアゴニスト又はＳＡＧである、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤が、ブラキウリのアップレギュレーターである、請求項２９又は３０に記載の使用。
【請求項３２】
ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤が、ＳＨＨの下流エフェクターである、請求項２９〜３１のいずれかに記載の使用。
【請求項３３】
ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤が、古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路から独立している、請求項２９〜３２のいずれかに記載の使用。
【請求項３４】
古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化剤をさらに含む、請求項２９〜３２のいずれかに記載の使用。
【請求項３５】
古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化剤が、ＧＳＫ３阻害剤である、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
医薬が、注入に適している、請求項２９〜３５のいずれかに記載の使用。
【請求項３７】
医薬が、経口投与に適している、請求項２９〜３６のいずれかに記載の使用。
【請求項３８】
変性が、病理学的又は加齢関連性である、請求項２９〜３７のいずれかに記載の使用。
【請求項３９】
変性が、腰痛、頸椎円板疾患、又は胸椎円板疾患である、請求項２９〜３８のいずれかに記載の使用。
【請求項４０】
椎間円板変性を治療することが、脊椎円板変性を回復させること、又は脊椎円板変性の進行を遅延させることを含む、請求項２９〜３９のいずれかに記載の使用。
【請求項４１】
椎間円板変性を治療することが、前記円板変性に関連する痛みを減少させること、又は椎間円板変性と診断された脊椎関節の可動域を拡大することを含む、請求項２９〜４０のいずれかに記載の使用。
【請求項４２】
椎間円板変性を治療することが、変性を測定するために使用される、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）に基づく円板及び脊椎部分の測定値を、治療前の測定値と比較して改善することを含む、請求項２９〜４１のいずれかに記載の使用。
【請求項４３】
対象において椎間円板の機能を修復又は改善するための方法であって、前記対象において椎間円板の機能を修復又は改善するために有効な量のソニック（ＳＨＨ）シグナル伝達経路活性化剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項４４】
対象において椎間円板の機能を修復又は改善することに使用するための組成物であって、前記対象において椎間円板の機能を修復又は改善するために有効な量のソニック（ＳＨＨ）シグナル伝達経路活性化剤を含む、前記組成物。
【請求項４５】
対象において椎間円板の機能を修復又は改善するための医薬の製造のための、ソニック（ＳＨＨ）シグナル伝達経路活性化剤の使用。
【請求項４６】
対象において椎間円板変性の１又は２以上の症状を緩和するための方法であって、前記対象において椎間円板変性の１又は２以上の症状を緩和するために有効な量のソニック（ＳＨＨ）シグナル伝達経路活性化剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項４７】
対象において椎間円板変性の１又は２以上の症状を緩和することに使用するための組成物であって、前記対象において椎間円板変性の１又は２以上の症状を緩和するために有効な量のソニック（ＳＨＨ）シグナル伝達経路活性化剤を含む、前記組成物。
【請求項４８】
対象において椎間円板変性の１又は２以上の症状を緩和するための医薬の製造のための、ソニック（ＳＨＨ）シグナル伝達経路活性化剤の使用。
【請求項４９】
ソニック（ＳＨＨ）シグナル伝達経路活性化剤が、ＳＨＨである、又はＰａｔｃｈｅｄへの等価な結合性を有する化合物である、請求項１〜４８のいずれかに記載の方法、組成物、又は使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路の活性化剤を、それを必要とする対象において用いる、脊椎円板変性の治療のための組成物、使用及び方法を対象としたものである。
【０００２】
助成金に関する記載
本発明は、国立保健研究所によって授与された１Ｒ０１ＡＲ０６５５３０−０１Ａ１の下に政府助成を受けて行われた。該政府は本発明の特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
変性円板疾患及び治療
変性円板疾患及び関連する下背部痛は、痛みの主要な原因の１つであり、先進国の人口の約７０％〜８５％に影響している。変性円板疾患のための現在の治療では、痛みの最小化、脊椎の安定化、及び運動性の改善又は維持に重点が置かれている。通常、治療には、ステロイド注入及び鎮痛剤、理学療法、体重減量、及び手術など、痛み及び炎症の管理技術のいくつかの組合せを含む。これらの治療のどれも、変性疾患を治癒又は予防することはない。
【０００４】
このため、円板変性は、より効果的な管理を必要とする重要な、かつ満たされていない臨床的ニーズを代表している。現在処方されている治療法は、中等度の有効性、緩和性、及び／又は侵襲性のもののみである。円板変性を治療できる比較的非侵襲的な医薬組成物の開発は有益であろう。
【０００５】
円板の解剖学的構造及び生理機能
脊椎円板は、３つの主要な細胞構造である、中心の髄核（ＮＰ，nucleus pulposus）、外側の線維輪（ＡＦ，annulus fibrosus）、及び隣接する終板（ＥＰ，endplate）、から構成される。ＮＰは、同種集団のＳＨＨ由来の胚の脊索細胞（Choi, K. S., Cohn, M. J. and Harfe, B. D. (2008). Identification of nucleus pulposus precursor cells and notochordal remnants in the mouse: implications for disk degeneration and chordoma formation. Dev Dyn 237, 3953-3958）から得られ、かつＡＦは靭帯節（syndectome）、及びＥＰは硬節（sclerotome）にそれぞれ由来する。円板の変性は、円板の低細胞化、円板の高さの損失、及びアグリカン及びグリコサミノグリカンなどの細胞外マトリックス（ＥＣＭ，extracellular matrix）タンパク質の喪失（Urban, J. P. and Roberts, S. (2003). Degeneration of the intervertebral disc. Arthritis Res Ther 5, 120-130、Vergroesen, P. P., Kingma, I., Emanuel, K. S., Hoogendoorn, R. J., Welting, T. J., van Royen, B. J., van Dieen, J. H. and Smit, T. H. (2015). Mechanics and biology in intervertebral disc degeneration: a vicious circle. Osteoarthritis and cartilage 23, 1057-1070）に関連する。
【０００６】
若齢の健康なマウス由来のＮＰ細胞は、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ，sonic hedgehog）及びブラキウリ（Ｂｒａ，Brachyury）（Dahia, C. L., Mahoney, E. J., Durrani, A. A. and Wylie, C. (2009a). Intercellular signaling pathways active during intervertebral disc growth, differentiation, and aging. Spine (Phila Pa 1976) 34, 456-462、---- (2009b). Postnatal growth, differentiation, and aging of the mouse intervertebral disc. Spine (Phila Pa 1976) 34, 447-455、Dahia, C. L., Mahoney, E. and Wylie, C. (2012). Shh signaling from the nucleus pulposus is required for the postnatal growth and differentiation of the mouse intervertebral disc. PLoS One 7, e35944、Winkler, T., Mahoney, E. J., Sinner, D., Wylie, C. C. and Dahia, C. L. (2014). Wnt signaling activates Shh signaling in early postnatal intervertebral discs, and re-activates Shh signaling in old discs in the mouse. PLoS One 9, e98444）及びＣＫ１９（Dahia, C. L., Mahoney, E. and Wylie, C. (2012). Shh signaling from the nucleus pulposus is required for the postnatal growth and differentiation of the mouse intervertebral disc. PLoS One 7, e35944、Winkler, T., Mahoney, E. J., Sinner, D., Wylie, C. C. and Dahia, C. L. (2014). Wnt signaling activates Shh signaling in early postnatal intervertebral discs, and re-activates Shh signaling in old discs in the mouse. PLoS One 9, e98444）などの脊索マーカーを発現し続けることが研究により示されている。ＳＨＨは、インディアンヘッジホッグ（ＩＨＨ，Indian hedgehog）及びデザートヘッジホッグ（ＤＨＨ，Desert Hedgehog）も含む、ヘッジホッグタンパク質ファミリーに属する。すべてのヘッジホッグタンパク質は、同じ受容体である、Ｐａｔｃｈｅｄ１（ＰＴＣＨ１，patched1）及びスムーズンド受容体（ＳＭＯ，smoothened receptor）によって働き、ＧＬＩ転写因子に関与する同じシグナル伝達経路を介して作用する。ＰＴＣＨ１及びＧｌｉ１は、公知のヘッジホッグシグナル伝達の下流標的であり、その発現レベルの変化によって、ヘッジホッグ経路の状態を知ることができる。ＰＴＣＨ１受容体へのヘッジホッグタンパク質の結合、又は、スムーズンドアゴニスト（ＳＡＧ，Smoothened Agonist）若しくはパルモルファミンなどのヘッジホッグ経路の小分子アゴニストの使用、又は、マウスにおいてＳｍｏＭ２として知られる、その条件付きアレル（conditional allele）の使用、のいずれかにより起こるＳＭＯの構造変化は、リガンドのヘッジホッグシグナル伝達の下流を活性化することができる。
【０００７】
ＳＨＨは、椎間円板に発現する唯一のヘッジホッグファミリーメンバーである（Dahia, C. L., Mahoney, E. and Wylie, C. (2012). Shh signaling from the nucleus pulposus is required for the postnatal growth and differentiation of the mouse intervertebral disc. PLoS One 7, e35944）。ＳＨＨは、若いマウスの椎間円板において、ＮＰ細胞、及びＴボックス転写因子ブラキウリ（Ｂｒａ）及びＣＫ１９などのそれらの分子マーカー、円板の周囲の線維輪（ＡＦ）及び終板（ＥＰ）の増殖及び維持、及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）マーカーの産生による円板全体の分化に不可欠である。しかし、これらのマーカーの発現は、マウスの加齢とともに減少する（Dahia, C. L., Mahoney, E. J., Durrani, A. A. and Wylie, C. (2009a). Intercellular signaling pathways active during intervertebral disc growth, differentiation, and aging. Spine (Phila Pa 1976) 34, 456-462、---- (2009b). Postnatal growth, differentiation, and aging of the mouse intervertebral disc. Spine (Phila Pa 1976) 34, 447-455、Winkler, T., Mahoney, E. J., Sinner, D., Wylie, C. C. and Dahia, C. L. (2014). Wnt signaling activates Shh signaling in early postnatal intervertebral discs, and re-activates Shh signaling in old discs in the mouse. PLoS One 9, e98444）。ＳＨＨは、ＴＧＦ−ベータ経路を陽性に調節するが、ＢＭＰ及び古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路に拮抗する（Dahia, C. L., Mahoney, E. and Wylie, C. (2012). Shh signaling from the nucleus pulposus is required for the postnatal growth and differentiation of the mouse intervertebral disc. PLoS One 7, e35944）。
【０００８】
マウスにおいて、ＳＨＨの発現及びそれに対する応答は、出生後４日（Ｐ４）から１年齢に劇的に減少し、Ｂｒａ及びＥＣＭタンパク質などのＮＰマーカーの発現の減少に関連している。インビトロにおける古典的Ｗｎｔシグナル伝達の小分子アゴニストであるＢＩＯを使用して、１年齢のマウスの円板が再活性化されると、ヘッジホッグシグナル伝達の刺激及びＥＣＭの産生が増加する（Winkler, T., Mahoney, E. J., Sinner, D., Wylie, C. C. and Dahia, C. L. (2014). Wnt signaling activates Shh signaling in early postnatal intervertebral discs, and re-activates Shh signaling in old discs in the mouse. PLoS One 9, e98444）。古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路を活性化した場合には、１年齢のマウスの円板における細胞増殖の増加は観察されなかった（Winkler, T., Mahoney, E. J., Sinner, D., Wylie, C. C. and Dahia, C. L. (2014). Wnt signaling activates Shh signaling in early postnatal intervertebral discs, and re-activates Shh signaling in old discs in the mouse. PLoS One 9, e98444）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Choi, K. S., Cohn, M. J. and Harfe, B. D. (2008). Identification of nucleus pulposus precursor cells and notochordal remnants in the mouse: implications for disk degeneration and chordoma formation. Dev Dyn 237, 3953-3958
【非特許文献２】Dahia, C. L., Mahoney, E. and Wylie, C. (2012). Shh signaling from the nucleus pulposus is required for the postnatal growth and differentiation of the mouse intervertebral disc. PLoS One 7, e35944
【非特許文献３】Dahia, C. L., Mahoney, E. J., Durrani, A. A. and Wylie, C. (2009a). Intercellular signaling pathways active during intervertebral disc growth, differentiation, and aging. Spine (Phila Pa 1976) 34, 456-462
【非特許文献４】---- (2009b). Postnatal growth, differentiation, and aging of the mouse intervertebral disc. Spine (Phila Pa 1976) 34, 447-455
【非特許文献５】Urban, J. P. and Roberts, S. (2003). Degeneration of the intervertebral disc. Arthritis Res Ther 5, 120-130
【非特許文献６】Vergroesen, P. P., Kingma, I., Emanuel, K. S., Hoogendoorn, R. J., Welting, T. J., van Royen, B. J., van Dieen, J. H. and Smit, T. H. (2015). Mechanics and biology in intervertebral disc degeneration: a vicious circle. Osteoarthritis and cartilage 23, 1057-1070
【非特許文献７】Winkler, T., Mahoney, E. J., Sinner, D., Wylie, C. C. and Dahia, C. L. (2014). Wnt signaling activates Shh signaling in early postnatal intervertebral discs, and re-activates Shh signaling in old discs in the mouse. PLoS One 9, e98444
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
円板の髄核細胞内のソニックヘッジホッグシグナル伝達経路を介して、それを必要とする対象において脊髄円板変性（ＳＤＤ，spinal disc degeneration）又はその症状を予防、回復、寛解及び／又は治療する方法が、本明細書で開示される。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一態様では、対象においてＳＤＤを治療する方法であって、ＳＤＤの症状、特にＳＤＤに関連する痛み及び／又は運動障害を治療、回復及び／又は寛解する、又はＳＤＤを予防するために、それを必要とする対象に、ある量のソニックヘッジホッグシグナル伝達経路活性化剤を含む組成物を投与することを含む方法が、本明細書で提供される。特定の実施形態では、ソニックヘッジホッグシグナル伝達経路活性化剤は、スムーズンドアゴニストである。
【００１２】
様々な実施形態では、投与は、約２〜３０ｍｇ／ｋｇ、具体的には約５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ、１日に１回、１日に２回、又はなお１日に３回、投与することを含む。ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤は、経口投与剤形又は注入可能な形態で製剤化されてよい。局所投与のための注入可能な形態では、局所送達のために、投与量が減らされてよい。特定の実施形態では、特に局所的な円板注入による使用のために、ＳＨＨ活性化剤は、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌの用量濃度で投与される。
【００１３】
本発明の一態様では、円板組織のインサイチュでの再生のために、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤を、前記円板組織の再生に有効な量において治療を必要とする個体に投与することによって、ＮＰ細胞の増殖を刺激することを含む、方法が提供される。
【００１４】
別の態様では、対象において１又は２以上の椎間円板での椎間円板変性を治療する方法であって、椎間円板変性の治療に有効な量のソニック（ＳＨＨ）シグナル伝達経路活性化剤を投与することを含む方法が、本明細書で提供される。
【００１５】
別の態様では、有効な量のソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達経路活性化剤を含む、椎間円板変性の治療に使用するための組成物が、本明細書で提供される。
【００１６】
別の態様では、椎間円板変性の治療のための医薬の製造のための、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達経路活性化剤の使用が、本明細書で提供される。
【００１７】
さらなる別の態様では、対象において椎間円板の機能を修復又は改善するための方法であって、対象において椎間円板の機能を修復又は改善するために有効な量のソニック（ＳＨＨ）シグナル伝達経路活性化剤を投与することを含む方法が、本明細書で提供される。
【００１８】
別の態様では、対象において椎間円板の機能を修復又は改善することに使用するための組成物であって、対象において椎間円板の機能を修復又は改善するために有効な量のソニック（ＳＨＨ）シグナル伝達経路活性化剤を含む組成物が、本明細書で提供される。
【００１９】
別の態様では、対象において椎間円板の機能を修復又は改善するための医薬の製造のための、ソニック（ＳＨＨ）シグナル伝達経路活性化剤の使用が、本明細書で提供される。
【００２０】
さらなる別の態様では、対象において椎間円板変性の１又は２以上の症状を緩和するための方法であって、対象において椎間円板変性の１又は２以上の症状を緩和するために有効な量のソニック（ＳＨＨ）シグナル伝達経路活性化剤を投与することを含む方法が、本明細書で提供される。
【００２１】
別の態様では、対象において椎間円板変性の１又は２以上の症状を緩和することに使用するための組成物であって、対象において椎間円板変性の１又は２以上の症状を緩和するために有効な量のソニック（ＳＨＨ）シグナル伝達経路活性化剤を含む組成物が、本明細書で提供される。
【００２２】
別の態様では、対象において椎間円板変性の１又は２以上の症状を緩和するための医薬の製造のための、ソニック（ＳＨＨ）シグナル伝達経路活性化剤の使用が、本明細書で提供される。他の実施形態は以下に開示される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】マウスの仙椎の形成の図である。（Ａ）は、異なる週齢（行）のマウス由来の３つのレベルの仙椎円板（列）のＨＥ染色された中央冠状切片を表形式で配置する。（Ｂ）は、（Ａ）に対応する週齢の仙椎の脊椎のＸ線画像を示す。（Ｃ）は、形態計測的解析のためのスキームである。（Ｄ〜Ｆ）は、形態計測パラメータの定量を表すグラフであり、（Ｄ）は円板の高さの測定、（Ｅ）は、ＮＰ領域、及び（Ｆ）は、この研究における定量されたＮＰ細胞数である。（Ｇ）は、１８カ月齢のＳＨＨＧＦＰＣＴｅ／＋、−Ｒ２６ｍＴｍＧ系統由来のＳ２／Ｓ３の円板である。（Ｈ）は、ＰＥＣＡＭ−１が染色されたＰ４及び１２週由来のＳ１／Ｓ２の円板である。（Ｉ）は、週齢ごとのＡＦ及びＥＰにおけるＰＥＣＡＭ−１＋血管構造の数である。Ｈ＝高さ。平均±標準偏差、それぞれの時点で、それぞれＮ＝３、有意性は、一元配置分散分析を使用して計算した。スケールバー＝２００μｍｉｎ  Ａ、１００μｍｉｎ  Ｇ及びＨ。裸画像ではスケールを提示しない。核は、Ｇ及びＨにおいてＤＡＰＩで対比染色され、画像は、ＤＩＣフィルターを使用して撮影した。
【図２】マウスの仙椎の細胞増殖及び細胞死の図である。（Ａ）は、Ｐ４のＳ１／Ｓ２の円板におけるＫｉ６７染色（白色の矢印）の代表的な画像である。（Ｂ）は、異なる年齢のすべての仙椎レベルのＮＰ及びＡＦにおけるＫｉ６７＋細胞のパーセントを定量化した図である。（Ｃ）は、１２週のＳ１／Ｓ２の円板におけるＴＵＮＥＬ染色（白色の矢印）の代表的な画像である。（Ｄ）は、異なる年齢のすべての仙椎レベルのＮＰ及びＡＦにおけるＴＵＮＥＬ＋細胞のパーセントを定量化した図である。平均±標準偏差。それぞれＮ＝３。一元配置分散分析。スケールバー＝１００μｍ。
【図３】加齢にともなうマウスの仙椎のＮＰ細胞におけるＳＨＨ標的及び脊索マーカーの発現を示す図である。週齢ごとのＳ１／Ｓ２及びＳ３／Ｓ４の円板における、ＳＨＨ（Ａ）、ＣＫ１９（Ｂ）、及びＢｒａ（Ｃ）の脊索／ＮＰマーカーの免疫蛍光。それぞれＮ＝３。スケールバー＝１００μｍ。核をすべての画像においてＤＡＰＩで対比染色した。
【図４】ＳＨＨ標的及びＮＰマーカーの免疫蛍光染色を定量化した図である。（Ａ）は、週齢ごとの、Ｓ１／Ｓ２、Ｓ２／Ｓ３、及びＳ３／Ｓ４の円板における、ＳＨＨ（Ａ）及びＣＫ１９（Ｂ）の平均免疫蛍光強度を定量化した図である。（Ｃ）は、週齢ごとの、Ｓ１／Ｓ２、Ｓ２／Ｓ３、及びＳ３／Ｓ４の円板のＮＰにおけるＢｒａ＋細胞のパーセントを定量化した図を示す。平均±標準偏差、それぞれＮ＝３。一元配置分散分析。
【図５】加齢にともなう仙椎ＩＶＤにおけるＳＨＨ標的及びＥＣＭマーカーの発現を示す図である。この図は、表形式で示す。（Ａ及びＢ）は、異なる週齢でのＳ１／Ｓ２及びＳ３／Ｓ４の円板における、ＣＨＳＯ４（Ａ）、及びＣＯＬ１（Ｂ）の免疫染色を示す。それぞれＮ＝３。スケールバー＝ｌ００μｍ。核をすべての画像においてＤＡＰＩで対比染色した。
【図６】ＳＨＨ標的及びＥＣＭマーカーの免疫蛍光強度を定量化した図である。（Ａ）は、週齢ごとの、Ｓ１／Ｓ２、Ｓ２／Ｓ３、及びＳ３／Ｓ４の円板における、ＣＨＳＯ４（Ａ）及びＣＯＬ１（Ｂ）の平均免疫蛍光強度を定量化した図である。平均±標準偏差、それぞれＮ＝３。一元配置分散分析。
【図７】ＮＰ細胞におけるＳｍｏＭ２の構成的活性化が、仙椎円板を再活性化することを示す図である。（Ａ）は、４カ月齢で強制経口投与（gavaged）し、４８時間後に分析したＣＫ１９ＣｒｅＥＲ／Ｊ＋；Ｒ２６ｍＴｍＧ由来のＳ２／Ｓ３の冠状切片を示す。（Ｂ）は、ＮＰ細胞におけるＳＨＨシグナル伝達の活性化のスキームである。データは、Ｓ１／Ｓ２の円板の分析から得られた。（Ｃ）は、対照（ＣＴＲＬ，control）及びＳｍｏＭ２の同腹仔由来の中央冠状切片のＨＥ染色である。（Ｄ〜Ｇ）は、同腹仔対照と比較したＳｍｏＭ２群の仙椎円板における、形態測定パラメータの、円板の高さ（Ｄ）、ＮＰ細胞が占める領域（Ｅ）、ＮＰ細胞数（Ｆ）、及びＡＦにおける層の数（Ｇ）の定量化を示す。（Ｈ及びＩ）は、ＳｍｏＭ２及び対照の円板におけるＹＦＰ＋ＮＰ細胞の免疫染色及び定量化である。（Ｊ〜Ｏ）は、ＳＨＨの免疫染色から得られたデータ、並びにその下流標的及びその定量化である、対照及びＳｍｏＭ２のマウス由来のＳ１／Ｓ２の円板における、（Ｊ及びＫ）ＳＨＨ、（Ｌ及びＭ）ＣＫ１９、（Ｎ）ＣＨＳＯ４、及び（Ｏ）ＣＯＬ１の発現を示す。（Ｐ及びＱ）は、ＳｍｏＭ２及び対照マウスの円板のＡＦ及びＥＰにおけるＰＥＣＡＭ−１陽性構造の免疫染色及び定量化を示す。平均±標準偏差。Ｎ＝４  対照、Ｎ＝３  ＳｍｏＭ２。対応のない両側ｔ検定。スケールバー＝１００μｍ。核を、免疫染色画像のＤＡＰＩで対比染色する。
【図８】ＮＰ細胞におけるＳｍｏＭ２によるＳＨＨシグナル伝達の活性化は、仙椎円板の細胞死を減少させることを示す図である。（Ａ）は、Ｒ２６ＬＳＬ−ＳｍｏＭ２−ＹＦＰ／ＬＳＬ−ＳｍｏＭ２−ＹＦＰ対照（ＣＴＲＬ）及びＣＫ１９ＣｒｅＥＲＴ２／＋；Ｒ２６ＬＳＬ−ＳｍｏＭ２−ＹＦＰ／ＬＳＬＳｍｏＭ２−ＹＦＰ（ＳｍｏＭ２）の同腹仔由来のＳ１／Ｓ２の円板のＴＵＮＥＬ染色（白色の矢印）を示す画像である。ＮＰ（Ｂ）及びＡＦ（Ｃ）におけるＴＵＮＥＬ＋細胞のパーセントの定量を、ＤＡＰＩを使用してカウントされた各領域の細胞の総数に対して決定する。平均±標準偏差。２つの独立した実験からのデータを組み合わせることによって各群においてＮ＝６。対応のないｔ検定。スケールバー＝１００μｍ。
【図９】１８カ月齢（ａ及びｂ）及び２４カ月齢（ｃ）のＳＨＨＣｒｅ；Ｒ２６ｍＴ／ｍＧマウスの腰椎円板を通る中央冠状切片の図である。椎間円板及び脊椎におけるＳＨＨ源であるＮＰ細胞（緑色）は、マウスの正常な加齢の間に失われる。核は対比染色された青色である。ＩＶＤ＝椎間円板、ＮＰ＝髄核、ＡＦ＝線維輪、ＥＰ＝終板。
【図１０】ＥＸＭタンパク質アグリカンの免疫染色（ＡＣＡＮ、紫）された１８カ月齢（ａ）及び２４カ月齢（ｂ）のＳＨＨＣｒｅ；Ｒ２６ｍＴ／ｍＧマウスの腰椎円板を通る中央冠状切片の図である。ＮＰ細胞の喪失は、加齢にともなうマウスの円板における細胞外マトリックスの喪失に関連している。核は対比染色された青色である。ＩＶＤ＝椎間円板、ＮＰ＝髄核、ＡＦ＝線維輪、ＥＰ＝終板、ＩＦ＝免疫蛍光。
【図１１】１８カ月齢（ａ）及び２４カ月齢（ｂ）のＳＨＨＣｒｅＥＲＴ２；Ｒ２６ｍＴ／ｍＧマウスの腰椎円板を通る中央冠状切片の図である。マウスにタモキシフェンを強制経口投与して、ＳＨＨ発現細胞におけるＣｒｅ発現を誘導し、それらの細胞をＧＦＰ＋（緑色）でマークした。椎間円板においてＳＨＨを発現するＮＰ細胞のサブセット（緑色）は加齢とともに減少し、２４カ月齢には失われた。核は対比染色された青色である。ＮＰ＝髄核、ＡＦ＝線維輪、ＥＰ＝終板。
【図１２】中年齢（middle aged）マウスのＮＰ細胞におけるＳＨＨ（ＳＨＨ−ｃＫＯ）の条件付き標的化（conditional targeting）は、円板の崩壊、細胞外マトリックス（アグリカン−赤色）の喪失を引き起こし、かつＳＨＨの標的化の後５カ月以内に円板の加齢を加速させる。切片は冠状面において収集される。核は対比染色された青色である。ＮＰ＝髄核、ＡＦ＝線維輪、ＥＰ＝終板、ＩＦ＝免疫蛍光、ＨｎＥ＝ヘマトキシリン及びエオシン。
【図１３】中年齢マウスのＮＰ細胞におけるｒＳＨＨの一過性の過剰発現（ｒＳＨＨパルス）は、対照マウスの円板が加齢し続けるのに対して、円板を再活性化し、かつ加齢を遅延させることを示す図である。ｒＳＨＨパルスされたマウスの円板は、より多くの内因性ＳＨＨ（赤色、ａ）及びその標的アグリカン（赤色、ｂ）を、５カ月後にさえも産生し続ける。核は対比染色された青色である。ＮＰ＝髄核、ＡＦ＝線維輪、ＥＰ＝終板。
【図１４】ＳＨＨシグナル伝達経路の小分子アゴニストであるＳＡＧ（スムーズンドアゴニスト１０ｍｇ／ｋｇ体重）により、７日間処理された後の、成体マウスの椎間円板において、媒体処理対照と比較して、ＳＨＨ及びその下流標的がアップレギュレートされたことを、リアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲ解析により示す図である。
【図１５】患者試料から収集されたＮＰ細胞におけるＳＨＨのｍＲＮＡ発現を、リアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲ解析により示す図である。ＳＨＨのｍＲＮＡ発現は加齢とともに減少した。
【図１６】ＳＨＨの条件付き標的化が、円板の加齢を加速し、かつＢｒａ発現の喪失を示す図である。Ａは、ＨｎＥ染色による組織学的変化を示す。Ｂは、Ｂｒａ（赤色）の免疫染色を示す。いずれの分析も、タモキシフェン処理されたＳＨＨ−ＷＴ（ＳＨＨｆｌｘ／ｆｌｘ）マウス及びＳＨＨ−ｃＫＯ（ＣＫ１９ＣｒｅＥＲＴ２／＋；ＳＨＨｆｌｘ／ｆｌｘ）マウス由来の腰椎円板の中央冠状凍結切開片において行われる。Ｂでは、核はＤＡＰＩで対比染色された青色である。スケールバー＝１００μｍ、ｎ＝３（男性及び女性の両方）。
【図１７】３週齢（Ａ）及び１２カ月齢（Ｂ）のＢｒａＦｌｏｘＤ／ＷＴ（Ｂｒａ−ＨＥＴ）系統及びＢｒａｆｌｘ／ｆｌｘ（Ｂｒａ−ＷＴ）系統由来のＨｎＥ染色された腰椎円板の中央冠状切片の図である。スケールバー＝１００μｍ、ｎ＝４（男性及び女性の両方）。
【図１８】生後４日（Ｐ４）マウスにおけるＢｒａの条件付き標的化を示す図である。Ａは、生後１５日（Ｐ１５）でのタモキシフェン処理されたＢｒａ−ＷＴ（Ｂｒａｆｌｘ／ｆｌｘ）及びＢｒａ−ｃＫＯ（ＣＫ１９ＣｒｅＥＲＴ２／＋；Ｂｒａｆｌｘ／ｆｌｘ）のＨｎＥ染色された中央冠状切片を示す。Ｂは、Ｋｉ６７（赤色）の免疫染色を示し、かつＣは、ＥＣＭマーカーであるＡＣＡＮ（緑色）の免疫染色を示す。Ｄは、Ｂｒａ−ＷＴマウス及びＢｒａ−ｃＫＯマウスから切り出されたＮＰ細胞における参照遺伝子（Ｂ２Ｍ）に対するＢｒａ  ｍＲＮＡのｑＰＣＲ解析を示す。Ｂ及びＣでは、核はＤＡＰＩで対比染色された青色である。スケールバー＝１００μｍ。Ｄにおいて、＊＊＊＊はｐ＜０．００１であり、ｎ＝３（男性及び女性の両方）である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本明細書における実施例は、ヒトＮＰ細胞が、加齢に応じてＳＨＨの発現を減少させたことを示している。ＳＨＨ発現のように、Ｂｒａの発現も、加齢とともに減少する。本明細書における実施例は、仙椎の椎間円板におけるＮＰ細胞のサブセットにおいて、ＳｍｏＭ２を使用したＳＭＯの条件的、構成的活性化が、ＳＨＨ発現を増加させ、円板全体の再生の兆候を示す結果をもたらした（円板構造の変化、細胞数の増加、ＥＣＭタンパク質の発現の増加、及び円板における血管構造の減少によって実証される）。円板の血管新生は、円板変性に関連している（Kauppila, L. I. (1995). Ingrowth of blood vessels in disc degeneration. Angiographic and histological studies of cadaveric spines. J Bone Joint Surg Am 77, 26-31）。
【００２５】
本明細書の実施例は、また、正常な加齢の間に、ＳＨＨ由来及びＳＨＨ発現ＮＰ細胞が失われ、結果として、椎間円板の崩壊又は融合、及びＥＣＭの喪失がもたらされることを、フェイトマッピング研究によっても示している。中年齢マウスにおいてＳＨＨを条件付き標的化することで、円板の崩壊及び加齢が、ＥＣＭタンパク質の喪失と同様に加速され、このことは、ＳＨＨの喪失のために、変性及び加齢が起こることを示唆している。中年齢を通じてＮＰ細胞において一過性にＳＨＨを過剰発現する遺伝的マウスモデルを使用することで、円板全体がさらにより長い間、若く、かつより健康のままであり、かつＥＣＭタンパク質などのＳＨＨ及びＳＨＨの下流標的をさらに多く産生し続けることが示された。最後に、小分子アゴニストであるＳＡＧを中年齢マウスの腹腔内注入することで、椎間円板における、ＳＨＨシグナル伝達標的のＰＴＣＨ１、ＧＬＩ１、及びＳＯＸ９、ＡＣＡＮ、ＣＯＬ２のようなＥＣＭタンパク質のアップレギュレーションが観察された。ゆえに、本明細書に記載される研究は、ＳＨＨリガンド、又は小分子活性化剤を使用すること、又は下流標的を操作することによるＳＨＨシグナル伝達経路の活性化が、椎間円板を再生することが可能であることを示している。
【００２６】
したがって、本明細書にて開示される方法は、ＳＤＤを有する対象へのＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤の量の投与に関する。
【００２７】
Ｉ．定義
単数で用語が与えられる場合、本発明者らは、その用語の複数形によって規定される本発明の態様も企図している。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとおり、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に指示しない限り、複数の表記を含む、例えば、「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」は複数の化合物を含む。したがって、例えば、「方法」という表記は、本明細書に記載される種類の、１又は２以上の方法、及び／又はステップを含み、及び／又は、これらは、本開示を読むことで当業者に明らかとなる。
【００２８】
「寛解させる（ameliorate）」、「緩和する（alleviate）」、「改善する（improve）」、又はそれらの変化形は、例えば、１の対象又は少なくとも少数の対象において、例えば、少なくとも約２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、１００％、又はこれらの値のうちのいずれかの約２つの間の範囲において、起こる検出可能な改善、又は改善と同義の検出可能な変化を指す。このような改善又は変化は、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤で治療されていない対象、又は治療を開始する前の対象（該治療されていない対象とは、同一又は類似の疾患、状態、症状などを有する、又は発症しやすい）と比較して、治療された対象において観察され得る。疾患、状態、症状、又はアッセイパラメータの寛解は、例えば、１又は複数の対象（又は介護者の評価）による自己評価、臨床医の評価又は適切なアッセイ又は測定の実施など、主観的又は客観的に決定されてよい。寛解は、一過性、長期的、若しくは永久的であってもよく、又はＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤が対象に投与される間若しくは後に関連する時間、又は本明細書若しくは引用参照に記載されるアッセイ若しくは他の方法において使用される間若しくは後に関連する時間で可変であってもよく、例えば、１又は複数の対象がそのような治療を受けた後の、下記の期間内、又はＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤の投与、若しくは使用の約３日後から約７日後、２週間後、２８日後、又は１、３、６、９カ月以上である。特定の実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤が、慢性的に投与される。
【００２９】
本明細書で使用されるとおり、ＳＤＤを「予防する」という用語はある行為を指し、例えば、対象がＳＤＤの１又は２以上の症状を示し始める前、又はそれとほぼ同時に行われる、ＳＨＨシグナル伝達回路活性化剤の投与であり、かかる行為は１又は２以上のＳＤＤの症状の発症又は重症度を阻害又は遅延させる。いくつかの実施形態では、対象がＳＤＤの遺伝性素因を有してよい。いくつかの実施形態では、対象が脊椎損傷、外傷及び／又は手術を受けていてもよい。
【００３０】
例えば、症状、円板関連の測定値又はパラメータ、分子のレベル又は生物学的活性などの「モジュレーション」とは、例えば、症状、パラメータ、又は活性などが検出可能に増加すること、又は減少することを指す。このような増加又は減少は、脊椎円板変性を有する、又は発症しやすい未治療の対象と比較して、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤で治療された対象において観察され得る。このような増加又は減少は、少なくとも約２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、１０００％以上、又はこれらの値のいずれか２つの間の任意の範囲であってよい。モジュレーションは、主観的又は客観的に決定されてよい。モジュレーションは、一過性、長期的、若しくは永久的であってもよく、又はＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤が対象に投与される間若しくは後の関連する時間、又は本明細書若しくは引用文献に記載されるアッセイ若しくは他の方法において使用される間若しくは後の関連する時間に可変であってよく、例えば、下記の期間内、すなわちＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤の投与若しくは使用後１週間以内から、１又は複数の対象にＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤を施して約２週間、２８日、又は３、６、９カ月以上後までである。
【００３１】
本明細書で使用されるとおり、「対象」は、人間を含む動物を含み、かつＳＤＤの危険性を有する若しくは危険性があるが、他の点では、本明細書で記載されるとおりのＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤の投与から恩恵を受けることができる動物、例えばヒトを含む。
【００３２】
化合物の「治療的に有効な量」という言葉は、ＳＤＤの症状の治療、管理、回復、又は寛解において、対象に単回又は複数回投与したときに、有効なＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤の量を指す。
【００３３】
化合物の「予防的に有効な量」という言葉は、ＳＤＤの症状の発症を予防又は遅延させることにおいて、対象への単回又は複数回投与したときに、有効なＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤の量を指す。
【００３４】
「投与」又は「投与する」という用語は、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤の意図した機能が発揮されるように、対象へＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤を導入する経路を含む。使用され得る投与経路の例としては、注入（例えば、皮下、硬膜外、腹腔内、又は直接的に円板若しくは髄核への注入）、経口、吸入、膣、直腸、及び経皮を含む。医薬調製物は、それぞれの投与経路に適する形態で行ってよい。例えば、これらの調製物は、注入、吸入、軟膏、又は坐剤によって、錠剤又はカプセルの形態で投与される。投与は、また、注入、点滴、吸入、ローション、軟膏、又はパッチによる局所投与、及び坐剤による直腸投与であってもよい。円板への注入が好ましい。
【００３５】
ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤は、単独で、又は別の１又は複数の薬剤のどちらかと併用して、又は薬学的に許容される担体とともに、又はその両方で投与することができる。１又は２以上のさらなる治療剤との「組合せ」における投与は、同時（並行）及び任意の順序における連続の投与を含む。
【００３６】
「薬学的に許容される」という語句は、本明細書に記載されたＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤を含有する組成物、及び／又は投与形態（dosage forms）を指し、該投与形態は、正当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症がなく、合理的な利益／リスクの割合に見合ったヒト及び動物の組織との接触における使用に適する。
【００３７】
「薬学的に許容される担体」という語句は、液体若しくは固体のフィラー、希釈剤、賦形剤、溶剤又は封入材料などの、薬学的に許容される材料、組成物、又は媒体を含み、対象の化学物質をある臓器、若しくは身体の一部から別の臓器、若しくは身体の一部に運ぶこと、若しくは輸送することに関与する。
【００３８】
本明細書で使用されるとおり、「治療する」又は「治療」という用語は、ＳＤＤの状態、又は１若しくは２以上の症状の進行、重症度、及び／又は持続期間の減少、回復、又は寛解を含むことを意図する。
【００３９】
例えば、ＳＤＤの治療には、ＳＤＤの次の症状の改善が含まれてよく、例えば、痛みの程度の減少、柔軟性パラメータの改善、鎮痛剤を必要とする１週間あたりの日数の減少、円板の厚さの測定値の増加、円板の高さ低下の減衰若しくは停止、円板の膨隆量の減少、姿勢の改善、又は円板形状の改善を含む。
【００４０】
II．活性化合物
Ａ．ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤
いくつかの実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤は、そのように機能する、任意の小分子であることが可能である。いくつかの実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤は、ＳＨＨである、ＳＨＨ活性を模倣する、Ｐａｔｃｈｅｄ活性に拮抗する、又はスムーズンド活性を刺激する。いくつかの実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤は、スムーズンド（ＳＭＯ）及び亜鉛フィンガー転写因子の神経膠腫関連腫瘍遺伝子ホモログ（ＧＬＩ）ファミリーなどのＳＨＨ経路の下流エフェクターである。ある実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤は、ブラキウリ（Ｂｒａ）のアップレギュレーターである。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤は、ＳＨＨ又はその活性を模倣するリガンド（「ＳＨＨ等価物」）であり得る。ＳＨＨアゴニストの例は、米国特許出願公開第２０１０／０３１７６９９（Ａ１）号明細書及び米国特許出願公開第２００６／００７８４９９（Ａ１）号明細書で記載されており、これらのすべては、それらの全体が参照によって、本明細書に組み込まれる。米国特許出願公開第２０１０／０３１７６９９（Ａ１）号明細書には、式（Ｉ）に示すとおりの化学骨格を有するＳＨＨ等価化合物が記載されている。
【００４２】
【化１】
2020525448.tif 000002
【００４３】
上記によって示される化合物のクラスの詳細は、米国特許出願公開第２０１０／０３１７６９９（Ａ１）号明細書の［００３０］〜［００４６］でみることができる。特定の実施形態は、以下の構造を含む。
【００４４】
【化２】
2020525448.tif 000003
【００４５】
米国特許出願公開第２００６／００７８４９９（Ａ１）号明細書には、以下の構造を有するＳＨＨアゴニスト化合物が記載されている。
【００４６】
【化３】
2020525448.tif 000004
【００４７】
上記の構造の誘導体は、本明細書でも記載される実施形態で使用することができるアゴニストも示す。このような誘導体の一般式は次のとおりである。
【００４８】
【化４】
2020525448.tif 000005
【００４９】
式中、Ｘ＝Ｃ、又はＮ＝Ｃ−（ＣＨ）、Ｃ、ここで０≦ａ≦５。Ｙ＝Ｒ又は−Ｏ−（ＣＨ）、ＣＨ、ここで０≦ｂ≦５。Ｚ＝Ｈ、ＣＨ又はＣＨ（ＣＨ）、ここで０≦ｃ≦５。
【００５０】
ある実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤は、スムーズンドアゴニストである。スムーズンドアゴニストの例には、ＳＡＧ、パルモルファミン、及びＧＳＡ−１０を含む。スムーズンドアゴニストの例は、国際公開第２０１１／１０９７１１（Ａ１）号パンフレットにも記載されており（グルココルチコイド化合物）、そのすべては、その全体が参照によって、本明細書に組み込まれる。国際公開第２０１１／１０９７１１（Ａ１）号パンフレットには、下記のとおりの化学骨格を有するグルココルチコイド化合物が記載されている。
【００５１】
【化５】
2020525448.tif 000006
【００５２】
上記によって示される化合物のクラスの詳細は、国際公開第２０１１／１０９７１１（Ａ１）号パンフレットの［００５９］〜［００６１］でみることができる。
【００５３】
ある実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤は、オキシステロールであってもよい。適切なオキシステロールの例は、米国特許第９５２６７３７（Ｂ２）号明細書に記載されており、そのすべては、その全体が参照によって、本明細書に組み込まれる。米国特許第９５２６７３７（Ｂ２）号明細書には、下記のとおりの化学骨格を有するオキシステロールが記載されている。
【００５４】
【化６】
2020525448.tif 000007
【００５５】
上記によって示される化合物のクラスの詳細は、米国特許第９５２６７３７（Ｂ２）号明細書の２列２１行〜３列３５行でみることができる。
【００５６】
III．治療方法
ＳＤＤによって引き起こされる１又は２以上の症状を治療、予防、回復、減少、又は緩和する方法であって、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤の治療的に有効な量を、それを必要とする対象へ投与することを含む方法が、本明細書で提供される。特定の実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤は、ＳＡＧである。対象は、好ましくはヒトである。他の実施形態では、対象は、馬、牛、ラクダ、犬、又は猫などの哺乳動物である。
【００５７】
本明細書で提供される治療方法は、ＳＤＤに関連する痛みを治療する、減少させる、予防する、又は緩和する。ＳＤＤは、痛みに関連するとして特定されており、かつＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤で治療することができる。
【００５８】
本明細書で提供される治療方法は、椎間円板の機能を修復又は改善する。特定の実施形態では、対象は、脊椎損傷を有し、脊椎付近又は脊椎に関与する領域で手術を受けている。特定の実施形態では、対象は、円板に損傷を有する、又は円板に有害な影響、又は損傷的な影響を有する炎症に罹患している。
【００５９】
一実施形態では、ＳＤＤを治療することは、ＳＤＤの下記の症状の改善を含み、例えば、痛み、炎症、及び１又は２以上の柔軟性パラメータ（例えば、ニュートラルゾーン、可動域及びニュートラルゾーンの比）を含む。この減少又は増加は、ベースラインから測定されてよい。該ベースラインは、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤を用いる治療の前の数日間に決定されてよい。
【００６０】
一実施形態では、ＳＤＤを治療することは、変性を測定するために使用される、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、Ｘ線、又はＣＴに基づく円板及び脊椎部分の測定値を、治療前の測定値と比較して改善することを含む。このような測定値は、円板の厚さ及び／又は密度の増加、円板の軸方向の変形の減少（例えば、（１）インタクト、（２）膨隆、（３）突出、（４）脱出、及び／又は（５）分離）、分裂又は破裂のサイズの減少、又は核の形状の改善（例えば、（１）円形／楕円形、（２）内輪への拡張、（３）外輪への拡張、及び／又は（４）外輪を超える拡張によって）を含む。
【００６１】
特定の実施形態では、ＳＤＤの症状が寛解され、その結果、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤が中止されるまで、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤が投与される。ＳＤＤは、治療が終了すると再発する可能性があるため、変性の再発を予防する、遅延する、又は減衰させるための、予防的に有効な量で、断続的で慢性的に、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤が投与されてよい。
【００６２】
当業者に容易に明らかであるように、投与される有用なインビボでの投与量及び特定の投与様式は、年齢、体重、変性の量、治療される哺乳動物種の種類、採用される特定の活性物質、及び／又は投与様式に応じて異なってよい。有効な投与量のレベル、すなわち所望の結果を達成するために必要な投与量のレベルの決定は、通常の薬理学的方法を使用して、かつ本明細書に示されるデータ及び使用される特定の活性物質の特定の効力及び半減期を参照して、当業者によって達成され得る。
【００６３】
ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤の用量が、例えば、１日に１回、１日おきに、週に１回、１週間おきに（「２週間に１回」）、月に１回、１カ月おきに（「２カ月に１回」）、３カ月ごと、４カ月ごと、６カ月ごと、又は１年に１回、投与されてよい。ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤は、ＳＡＧであり、例えば、１用量あたり約５ｍｇ〜約３０００ｍｇの間の用量で投与されてよく、好ましくは、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤は、１用量あたり約１００ｍｇ〜約１０００ｍｇの間で投与される、又は１用量あたり約１０００ｍｇ〜約２０００ｍｇの間で投与される。別の実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤は、症状に応じて、１用量あたり５０ｍｇ〜約５００ｍｇの間で投与される。実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤は、液体の注入可能な形態で製剤化される。他の実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤は、経口投与剤形である。
【００６４】
特定の実施形態では、特に経口又は他の非局所投与のために、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤は、ＳＡＧであり、かつ、２〜３０ｍｇ／ｋｇの用量、特に１用量あたり約２ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ又は３０ｍｇ／ｋｇで投与される。ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤は、固体又は液体の経口投与剤形で製剤化されてよい。
【００６５】
他の実施形態では、対象は、２週間、４週間、６週間、８週間、１０週間、１２週間、１４週間、１６週間、１８週間、２０週間、２２週間、２４週間、２６週間若しくはそれ以上又は２６週間若しくはそれ以上の間、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤で治療される。好ましい実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤は、慢性的に投与される。治療の長さは、変性の重症度に応じて変化してよい。
【００６６】
一態様では、対象に有効な量で、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤を含む組成物を投与することによって、脊椎円板の厚さを増加させる、又は円板の膨隆の程度を減少させる方法が、本明細書で提供される。
【００６７】
別の態様では、予防的に有効な量のＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤を、それを必要とする対象に投与することによって、ＳＤＤの発症を阻害する方法が、本明細書で提供される。
【００６８】
特定の実施形態では、対象は、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化剤と組み合わせて、ＳＤＤの治療のためのＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤を投与される。特定の実施形態では、対象は、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤が、Ｗｎｔシグナル伝達経路から独立している、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤が投与される。
【００６９】
IV．医薬調製物
また、本明細書で記載されるＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤の有効な量及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が、本明細書で提供される。さらなる実施形態では、有効な量が、ＳＤＤ、又は１若しくは２以上のその症状を治療、回復、予防又は寛解させることに有効である。さらなる実施形態では、有効な量が、椎間円板の機能を修復又は改善することに有効である。
【００７０】
一実施形態は、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、例えば、硬膜外腔への注入に適切な形態など、注入可能な形態である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、錠剤又はカプセルなどの経口投与剤形である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、局所的使用を目的とする。
【００７１】
特定の実施形態では、医薬組成物は、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤に加えて、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤とは異なる、Ｗｎｔシグナル伝達経路活性化剤を含むことができる。他の実施形態では、医薬組成物は、Ｗｎｔシグナル伝達経路から独立している、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤のみからなる、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤を含む。
【００７２】
本明細書に記載される医薬組成物は、例えば、１又は２以上の安定剤、保存剤、希釈剤、粘度調整剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、香味剤、又は甘味料などの賦形剤をさらに含んでよい。組成物は、選択されるコーティング及び非コーティング錠剤、硬及び軟ゼラチンカプセル、糖衣錠剤、薬用キャンディー剤、オブラート（wafer sheet）、ペレット剤及び密封の包みに入った粉剤に製剤化されてよい。組成物は、例えば、パッチ、軟膏、ポマード、クリーム、ゲル、及びローションなどの局所的使用のために製剤化されてよい。
【００７３】
特定の実施形態では、医薬組成物は、固体又は液体の形態での投与のために、特別に製剤化されてよく、下記の適合する形態を含む：（１）経口投与、例えば、ドレンチ剤（水性又は非水性の溶液又は懸濁液）、錠剤、ボーラス、散剤、顆粒剤、ペースト剤、（２）非経口投与、例えば、無菌溶液又は懸濁液としての、例えば、皮下、筋肉内、硬膜外、腹腔内、又は静脈内の注入による、（３）局所塗布、例えば、皮膚へ塗布されるクリーム、軟膏、パッチ、又はスプレーとして（４）膣内又は直腸内の、例えば、ペッサリー、クリーム又は泡状物質として、又は（５）エアロゾル、例えば、化合物を含有する水性エアロゾル、リポソーム調製物又は固体粒子として。
【００７４】
薬学的担体は、製剤の他の成分と適合し、かつ患者に害を与えることがないという意味で、「許容される」ものでなければならない。薬学的に許容される担体として働くことができる材料のいくつかの例として、以下を含む。（１）ラクトース、グルコース、及びスクロースなどの糖、（２）トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプンなどのデンプン、（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロースなどのセルロース及びその誘導体、（４）粉状のトラガカント、（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）タルク、（８）ココアバター及び坐剤ワックスなどの賦形剤、（９）ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、及び大豆油などの油、（１０）プロピレングリコールなどのグリコール、（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコールなどのポリオール、（１２）オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル、（１３）寒天、（１４）水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤、（１５）アルギン酸、（１６）発熱物質を含まない水、（１７）等張食塩水、（１８）リンガー溶液、（１９）エチルアルコール、（２０）リン酸緩衝液、及び（２１）薬学的製剤に採用される他の非毒性適合物質。
【００７５】
ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムなどの湿潤剤、乳化剤及び滑沢剤、並びに着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味料、調味料、香料、防腐剤及び抗酸化剤も該組成物中に存在させることも可能である。
【００７６】
薬学的に許容される抗酸化剤の例は、下記を含む。（１）アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤、（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ，butylated hydroxyanisole）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ，butylated hydroxytoluene）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤、（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ，ethylenediamine tetraacetic acid）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート剤。
【００７７】
ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤を含有する組成物は、経口、鼻腔、局所（頬側及び舌下を含む）、直腸、膣、エアロゾル、硬膜外、及び／又は非経口の投与に適切なものを含む。該組成物は、便宜上、単一の剤形で提供されてよく、かつ薬学の技術分野において公知のいかなる方法によって調製されてよい。単一の剤形を産生するための担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、治療される宿主、特定の投与様式に応じて変化するであろう。単一の剤形を産生するための担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、一般には、治療効果を産生する化合物のその量である。一般的に、１００パーセントから外れ、この量が活性成分のうちの約０．０１％〜約９９％ｗ／ｗ、例えば、約５％〜約７０％ｗ／ｗ、又は約１０％〜約３０％ｗ／ｗの範囲になる。
【００７８】
ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤の注入可能な投与のための液体投与剤形は、例えば、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、及び懸濁液などを含むことができる。活性成分に加えて、液体投与剤形は、例えば、水又は他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に綿実油、落花生油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、及びそれらの混合物など、当技術分野で通常、使用される不活性希釈剤を含有してよい。
【００７９】
懸濁液は、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤に加えて、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天及びトラガカント、及びそれらの混合物などの懸濁剤を含有してよい。ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤の局所的な、又は経皮的な投与のための剤形は、例えば、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ、及び吸入剤を含むことができる。軟膏、ペースト、クリーム、及びゲルは、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤に加えて、例えば、動物性及び植物性の脂肪、オイル、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、及び酸化亜鉛、又はそれらの混合物などの賦形剤を含有してよい。粉末及びスプレーは、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤に加えて、例えば、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム及びポリアミド粉末、又はこれらの物質の混合物などの賦形剤を含有することができる。スプレーは、例えば、クロロフルオロ炭化水素、並びに、例えば、ブタン及びプロパンなどの揮発性無置換炭化水素などの通常の噴射剤をさらに含有することができる。
【００８０】
医薬組成物に採用されてよい適切な水性及び非水性担体の例として、例えば、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、及び適切なその混合物、オリーブ油などの植物油、及びエチルオレイン酸などの注入可能な有機エステルを含むことができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散液の場合は必要な粒子径の維持によって、及び界面活性化剤の使用によって維持することができる。
【００８１】
一実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤は、胃の酸性条件による分解から、及び／又は胃に存在するペプシンなどのタンパク質との相互作用から保護されるように、腸溶コーティングされる。例えば、腸溶性保護製剤である。特定の実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤は、錠剤の形態である。さらなる別の実施形態では、錠剤は、例えば、オイドラギット（Eubdragit）（登録商標）などの腸溶コーティングされている。一実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤は、腸溶コーティングされたカプセル殻内の腸溶コーティングのビーズ又は顆粒として製剤化される。別の実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤が、遅延放出組成物に製剤化される。
【００８２】
選択される投与経路にかかわらず、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤は、当技術分野の当業者に公知の方法によって、薬学的に許容される剤形へ製剤化される。
【００８３】
ＳＤＤ又はその症状の治療において、治療的に有効な用量での薬学的に許容される担体をともなう組成物を含む、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤の薬学的製剤も、本明細書で提供される。
【００８４】
組合せ療法の治療では、当技術分野において公知の方法によって、化合物及び他の１つ又は複数の薬剤の両方が、哺乳動物（例えば、ヒト、男性又は女性）に投与される。薬剤は、単一の剤形又は複数の剤形で投与されてよい。ただし、投薬量は、特定の時点において投与される量である。
【００８５】
Ｖ．キット
キット、例えば、対象において、ＳＤＤを治療するため、又は１又は２以上のＳＤＤに関連する症状を治療するためのキットも、本明細書で提供される。キットは、例えば、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤又はＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤を含む医薬組成物、及び使用説明書を含有してよい。キットは、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤を含む医薬組成物を有するバイアルを含んでよい。キットは、あらかじめ充填されたシリンジを含んでよい。使用説明書は、処方情報、投薬情報、保管情報などが含有されてよい。
【００８６】
ラベルの説明は、例えば、注入によるＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤を摂取するための説明を含む。また、説明書は、例えば、症状が解消するまで、毎日、１日おきに、又は１日に２回、ＳＨＨシグナル伝達経路活性化剤の用量を摂取することを説明することもできる。
［実施例］
【００８７】
VI．実施例
マウス仙骨の形成
ほとんどのマウス系統は、７つの頸椎、１３の胸椎、５〜６つの腰椎、４つの仙椎を有する（A. and Michie、1958、Wellik、2007）。マウスにおける仙骨形成のタイムラインを決定するために、新生児（生後４日（Ｐ４，postnatal day four））、急速成長期（４週）、縦成長期間の末期（１２週及び１４週）及び、中年齢（１年齢）の範囲のＦＶＢマウス由来の仙椎円板（Ｓ１／Ｓ２、Ｓ２／Ｓ３、Ｓ３／Ｓ４）をＸ線によって比較し（図１Ｂ）、ヘマトキシリン及びエオシン（ＨＥ，hematoxylin and eosin）染色された中央冠状切片において、組織形態計測的解析を実施した（図１Ａ、Ｃ〜Ｆ）。すべての仙椎円板は、Ｐ４で、網状のＮＰ細胞及び組織されたＡＦ層を有して、組織学的に正常であった（図１Ａ）。４週間後、すべての仙椎円板は、網状のＮＰを保持し続けたが、一方、ＡＦは２つの最も頭部側の仙椎円板（Ｓ１／Ｓ２及びＳ２／Ｓ３）で組織破壊されていた。１２〜１４週齢までに、ＮＰ細胞は、２つの頭部の円板で崩壊し、かつ該円板の高さ及びＮＰ空間が、Ｓ３／Ｓ４と比較して劇的に減少した（図１Ａ、Ｄ及びＥにおいてＳ１／Ｓ２をＳ３／Ｓ４と比較）。これらの２つの円板のＡＦは、より組織破壊されたようにみえ、検出可能な層もなく、かつ血管体のようにみえる構造を含有し、これは加齢に関連する円板変性時にみられることが知られている（Kauppila, L. I. (1995). Ingrowth of blood vessels in disc degeneration. Angiographic and histological studies of cadaveric spines. J Bone Joint Surg Am 77, 26-31）、（Nerlich et al.、2007）。これを確認し、内皮細胞マーカーＣＤ３１の免疫染色によって、それぞれの円板を定量した（ＰＥＣＡＭ−１、図１Ｈ及びＩ）。免疫蛍光法により、４週齢という早い時期にＡＦに血管体が存在することが確認された。
【００８８】
上記２つの頭部の仙椎円板とは対照的に、Ｓ３／Ｓ４の円板は、正常な組織構造を維持し、かつ調査したいずれの段階においても融合していなかった。観察された唯一の変化は、１２週齢で始まるＥＰの血管新生であった（図１）。Ｘ線により、Ｓ１／Ｓ２及びＳ２／Ｓ３の円板の間の空間（緑色の矢印の頭）において４週からの進行的な減少が示されたが、一方、Ｓ３／Ｓ４の円板の空間は、分析されたすべての段階で維持された（図１Ｂ）。組織形態計測的解析では、Ｐ４〜４週齢由来のＳ３／Ｓ４の円板の高さについて、急速成長と同様のパターンが示され、１２〜１４週齢までに軽度に低下して、その後維持された（ｐ＝０．００１３）。一方、Ｓ１／Ｓ２及びＳ２／Ｓ３の円板の高さは、１４週齢まで一定のまま維持され、その後は減少した（それぞれｐ＝０．９０６４及び０．００２１）（図１Ｄ）。ＮＰの空間及びＮＰ細胞数において、同様のパターンが観察され、Ｐ４〜４週に大幅に増加し、続いて１４週にて大幅に減少し、１年齢まで低下が継続した（図１Ｆ及びＧ）。１年齢までに、Ｓ１／Ｓ２及びＳ２／Ｓ３の円板にはＮＰ細胞がほとんど存在しておらず、それらの細胞はすべて円型で、かつ共に凝集していた（図１Ａ）。中年齢マウスの上部２つの仙椎円板における、円形で凝集した細胞が、ＮＰ細胞であることを確認するために、１８カ月齢のＳＨＨＧＦＰｃｒｅｌ＋，−Ｒ２６ｍＴｍＧ系統由来のＳ２／Ｓ３の円板の中央冠状切片を分析した。この試験では、円板の中心部が緑色に示されたことから、その起源が初期のＮＰ細胞由来であることが確認された。Ｐ４〜４週齢のＮＰ細胞数の増加は、Ｐ４にてＫｉ６７＋免疫染色されたＮＰ細胞のパーセントによってみられるとおり、これらの細胞の高い増殖率に関連し、Ｓ３／Ｓ４よりも、Ｓ１／Ｓ２及びＳ２／Ｓ３の円板において４週齢までに劇的に減少した（図２Ａ及びＢ）。すべての仙椎円板において、１２週齢までに細胞増殖は認められなかった。ＴＵＮＥＬアッセイは、４週齢由来のＳ１／Ｓ２及びＳ２／Ｓ３の円板における陽性細胞のパーセントの増加を示し（図２Ｃ及びＤ）、ＮＰ細胞数の減少が、細胞死の結果であることを示した。
【００８９】
ＳＨＨ及びその標的の喪失は、仙椎円板の崩壊に関連する
ＮＰ細胞によるＳＨＨシグナル伝達は、円板の生後の成長及び分化に必要とされ、かつ年齢とともに減少する（Dahia, C. L., Mahoney, E. and Wylie, C. (2012). Shh signaling from the nucleus pulposus is required for the postnatal growth and differentiation of the mouse intervertebral disc. PLoS One 7, e35944、Dahia, C. L., Mahoney, E. J., Durrani, A. A. and Wylie, C. (2009a). Intercellular signaling pathways active during intervertebral disc growth, differentiation, and aging. Spine (Phila Pa 1976) 34, 456-462、Winkler, T., Mahoney, E. J., Sinner, D., Wylie, C. C. and Dahia, C. L. (2014). Wnt signaling activates Shh signaling in early postnatal intervertebral discs, and re-activates Shh signaling in old discs in the mouse. PLoS One 9, e98444）。Ｓ１〜Ｓ３の仙椎円板の崩壊が、ＳＨＨシグナル伝達の喪失（又はＳＨＨシグナル伝達への応答の喪失）に関連しているかどうかを決定するため、Ｓ１／Ｓ２、Ｓ２／Ｓ３及びＳ３／Ｓ４の円板でのＳＨＨの免疫染色を、成長及び分化時に実施した。図３Ａには、Ｓ１／Ｓ２において４週以降のＳＨＨの発現が劇的に減少するが、正常な構造が長く維持されるＳ３／Ｓ４では、その発現ははるかに遅く減少することが示される。この結果は、ＳＨＨの転写標的ＣＫ１９及びＢｒａについても示される。ＣＫ１９及びＢｒａの発現は、それらの発現が１年齢まで検出可能であるＳ３／Ｓ４の円板と比較して、４週以降のＳ１／Ｓ２の円板においてＳＨＨの発現に対応して減少した（図３Ｂ及びＣ）。Ｓ２／Ｓ３の円板の免疫染色データは、結果がＳ１／Ｓ２の円板と類似したために、示していない。３つの仙椎円板のすべてにおけるＳＨＨ、ＣＫ１９及びＢｒａの免疫蛍光強度を定量化した結果を図４Ａ〜Ｃに示す。
【００９０】
ＥＣＭは、脊索［（Stemple、2005）によって改正］及び円板［（Sivan et al.、2014、Urban, J. P. and Roberts, S. (2003). Degeneration of the intervertebral disc. Arthritis Res Ther 5, 120-130）によって改正］の構造及び機能の維持に重要な役割を果たす。ＮＰは、プロテオグリカン及びＧＡＧが豊富であるが（Antoniou et al.、1996）、ＡＦは、その原線維を形成するコラーゲンが比較的に豊富である［（Urban, J. P. and Roberts, S. (2003). Degeneration of the intervertebral disc. Arthritis Res Ther 5, 120-130）によって改正］。ＳＨＨは、出生後の成長時にＮＰ及びＡＦの両方でＥＣＭマーカーの発現及び合成を調節し、そして、これらのマーカーの発現は年齢とともに減少する（Dahia, C. L., Mahoney, E. and Wylie, C. (2012). Shh signaling from the nucleus pulposus is required for the postnatal growth and differentiation of the mouse intervertebral disc. PLoS One 7, e35944、Winkler, T., Mahoney, E. J., Sinner, D., Wylie, C. C. and Dahia, C. L. (2014). Wnt signaling activates Shh signaling in early postnatal intervertebral discs, and re-activates Shh signaling in old discs in the mouse. PLoS One 9, e98444）。ＥＣＭマーカーであるコンドロイチン硫酸（ＣＨＳＯ４，Chondroitin sulfate）及びコラーゲン１（ＣＯＬ１，Collagen 1）の発現を、出生後の成長及び分化時にすべての仙椎円板で免疫蛍光によって分析した。Ｓ１／Ｓ２の円板におけるＡＦにおいて、ＣＨＳＯ４及びＣＯＬ１の発現は１２〜１４週齢までに減少したが、Ｓ３／Ｓ４のレベルでは１年齢まで存在し続けた（図５Ａ及びＢ）。ＣＨＳＯ４及びＣＯＬ１の両方の発現パターンは、Ｓ２／Ｓ３において、Ｓ１／Ｓ２におけるそれと非常に類似していたので、ゆえに示さない。３つの仙椎円板すべてについて、ＣＨＳＯ４及びＣＯＬ１の免疫蛍光強度を定量化した結果を図６Ａ及びＢに提示する。ＥＣＭマーカーのダウンレギュレーションは、ＳＨＨを発現するＮＰ細胞だけでなく、週齢ごとの仙椎円板の周囲ＡＦにおいても観察された。それらのことから、ＥＣＭマーカーのダウンレギュレーションはＮＰ細胞によって産生されるＳＨＨに応答することが示された。
【００９１】
ＮＰ細胞におけるＳＨＨ経路の条件的活性化は、仙椎円板を再覚醒させることができる
この試験では、ＳＨＨシグナル伝達の再活性化によって、仙椎円板の崩壊を回復することができるかどうかを試験した。これは、Ｓ１／Ｓ２の円板においてＳＨＨの発現がすでに減少し、かつＮＰ細胞がそれらの網状の表現型を失い始め、円形となって共に凝集しはじめる、１２週齢で実施された。この研究のために、本発明者らは、ＣＫ１９ＣｒｅＥＲＴ２由来系統を使用した。最初に、４カ月齢のＣＫ１９ＣｒｅＥＲＪ＋，−Ｒ２６ｍＴｍＧに２つの用量のタモキシフェンをを投与して、最も頭部の仙椎円板を通る中央冠状切片を分析することによって、ＣＫ１９を発現し、かつ組換えを受けることができる細胞の量を調査した。図７Ａは、Ｓ２／Ｓ３の円板（白い矢印の頭で示す）において、この週齢までにＣＫ１９を発現する細胞がほとんどないことを示す。
【００９２】
次に、ＣＫ１９ＣｒｅＥＲＴ２／＋をＲ２６ＬＳＬ−ＳｍｏＭ２−ＹＦＰＩＬＳＬＳｍｏＭ２−ＹＦＰと交配させて、ＣＫｌ９ｃｒｅＥＲＴ２／＋；Ｒ２６ＬＳＬ−ＳｍｏＭ２−ＹＦＰＩ＋（ＳｍｏＭ２）アレル及びＲ２６ＬｓＬ−ＳｍｏＭ２−ＹＦＰＩ＋（ＷＴ）アレルを生成した。１２週齢の同腹仔を２つの用量のタモキシフェンで処理し、一般的にＳｍｏＭ２として知られる、ＳＨＨリガンドが存在しない場合でも構成的に活性化しているＳＭＯの形態（ｃａＳｍｏ，constitutively active form of SMO）の発現を誘導した（Jeong et al.、2004）。この組換えは、ＣＫ１９を発現するＮＰ細胞のサブセットでのみ起こる（図７Ａで示す）。マウスを安楽死させ、最後のタモキシフェン投与の２週間後に仙椎の脊椎を収集した（図７Ｂ）。結果を、同腹仔の対照と比較した。図７Ｃ及び図６は、同腹仔対照と比較したＳｍｏＭ２群における組織学の劇的な回復（rescue）を示す。すべてのＮＰ細胞が網状になっており、かつ均一に分布し、並びにＡＦがＳｍｏＭ２群において、より組織化されている。組織形態計測的解析は、同腹仔の対照と比較しＳｍｏＭ２群において、円板の高さの改善（図７Ｃ）、ＮＰ領域（ｐ＝０．０１６０、図７Ｄ）、及びＮＰ細胞数の増加（ｐ＝０．０００３）（図７Ｅ）を含む定量可能な差異を示す。ＳｍｏＭ２の円板のＡＦは、より明確な層も有する（図７Ｆ）。ＴＵＮＥＬアッセイは、対照と比較しＳｍｏＭ２マウスのＳ１／Ｓ２の円板において、ＳＨＨシグナル伝達の活性化の後に、ＮＰ細胞の細胞死が有意に（ｐ＝０．０４３２）減少したことを示す（図８Ａ〜Ｃ）。興味深いことに、ＹＦＰ（ＳｍｏＭ２に融合）の免疫染色は、７５％を超えるＮＰ細胞が陽性であることを示した（図７Ｇ及びＨ）。したがって、ＮＰ細胞のサブセットのみが、通常、１２週でＳ１／Ｓ２の仙椎円板においてＣＫ１９ＣｒｅＥＲＴ２を発現するため（図７Ａ）、これらの結果は、ＳｍｏＭ２発現ＮＰ細胞の拡大を示唆している。さらに、ＹＦＰ＋であることとは無関係に、ＳｍｏＭ２の実験用の円板においてすべてのＮＰ細胞が網状であった。そのため、本発明者らは、ＳＨＨの発現を分析して、それが、ＳｍｏＭ２の円板においてより高いことを確認し（図７Ｉ及びＪ）、ＳｍｏＭ２発現の誘導が、ＮＰ細胞によるＳＨＨ発現を刺激し、次いでＳｍｏＭ２アレルを発現させる組換え細胞であるかどうかにかかわらず、仙椎円板が、ＳＨＨの高レベルに応答するという仮説を支持した。この結果は、ＮＰ細胞において排他的にドライブされるＳｍｏＭ２の発現にもかかわらず、ＡＦの表現型の救助もまた説明する。ＳＨＨの下流標的である、ＰＴＣＨ１、ＣＫ１９、ＣＨＳＯ４、及びＣＯＬ１（図７Ｋ〜Ｐ）の増加が、ＳｍｏＭ２の実験用の円板において観察された。年齢１２週の後のＳ１／Ｓ２の円板におけるＡＦの血管新生（図１Ｈ及びＩ）が、ＳＨＨレベルの減少の結果として発生するかどうか決定するために、本発明者らは、対照と比較して、実験用ＳｍｏＭ２の円板のＡＦ及びＥＰにおけるＰＥＣＡＭ−１＋の血管構造の数を定量した。結果は、ＳｍｏＭ２の円板のＡＦにおけるＰＥＣＡＭ−１＋の構造（図７Ｑ及びＲ）において有意な減少（ｐ＝０．０２１８）を示すが、ＥＰには変化は観察されなかった。��Ｆの血管新生は、加齢及び円板変性（Binch et al.、2014）（Kauppila, L. I. (1995). Ingrowth of blood vessels in disc degeneration. Angiographic and histological studies of cadaveric spines. J Bone Joint Surg Am 77, 26-31）（Melrose et al.、2002; Nerlich et al.、2007）で記載されており、かつＥＣＭ、主にプロテオグリカンの喪失に関連している（Johnson et al.、2005; Melrose et al.、2002）。
【００９３】
椎間円板の加齢は、ＳＨＨ由来ＮＰ細胞及びＳＨＨ発現の喪失に関連する
以前に、出生後のＮＰ全体が、ＳＨＨ発現脊索細胞に由来していることが示されている（Choi, K. S., Cohn, M. J. and Harfe, B. D. (2008). Identification of nucleus pulposus precursor cells and notochordal remnants in the mouse: implications for disk degeneration and chordoma formation. Dev Dyn 237, 3953-3958）。加齢時のＳＨＨ由来ＮＰ細胞の運命を決定するために、ＳＨＨｔｍ１（ＥＧＦＰ／ｃｒｅ）Ｃｊｔ／Ｊ（Harfe, B. D., Scherz, P. J., Nissim, S., Tian, H., McMahon, A. P. and Tabin, C. J. (2004). Evidence for an expansion-based temporal Shh gradient in specifying vertebrate digit identities. Cell 118, 517-528）を、Ｒ２６ｔｍ４（ＡＣＴＢ−ｔｄＴｏｍａｔｏ，−ＥＧＦＰ）Ｌｕｏ（Ｒ２６ｍＴｍＧ）（Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L. and Luo, L. (2007). A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis 45, 593-605）と交配させた、ＳＨＨＧＦＰＣｒｅ／＋；Ｒ２６ｍＴｍＧでは、ＳＨＨ由来の脊索細胞のみがＣｒｅを発現し、膜局在ｔｄＴＯＭＡＴＯ（ｍＴ）をフロックスアウト（flox out）し、膜局在ＥＧＦＰ（ｍＧ）を「オン」にして緑色でマークされるが、一方、残りの細胞は、ｍＴを発現し続け、「赤色」のままである。骨格的に成熟した１８カ月齢（１８Ｍ）のＳＨＨＧＦＰＣｒｅ／＋；Ｒ２６ｍＴｍＧマウスにおける系統追跡（lineage tracing）は、ＮＰ全体が、排他的にＳＨＨ由来細胞（ＳＨＨ＋）で構成されていることを示す（図９ａ〜ｂ）。この研究で使用される系統を含め、マウスのほとんどの系統には６つの腰椎がある。１８カ月齢のＬ５／Ｌ６の円板は、網状のＮＰ細胞及び組織化されたＡＦ層を有して、輪郭が明らかな構造を維持した（図９ａ）。対照的に、腰仙（Ｌ６／Ｓ１）の円板は、より少なくより丸いＮＰ細胞及びＮＰ空間に移動する組織破壊されたＡＦ層をともなう加齢した表現型を示す（図９ｂ）。２４カ月齢までに、ＮＰ空間において、ＳＨＨ＋の緑色の細胞はみられず、椎間円板は低細胞化し、かつ円板の高さの減少とともに崩壊する（図９ｃ）。アグリカン（ＡＣＡＮ）の免疫染色は、１８カ月齢〜２４カ月齢の円板の崩壊に関連するＥＣＭの喪失を示す（図１０ａ及びｂ）。
【００９４】
週齢にともなうＳＨＨの喪失は、椎間円板の変性及び崩壊に関連する
新生児マウスＮＰ細胞と比較して、１年齢のマウスの円板において、ＳＨＨ及びその下流ＥＣＭマーカーの発現は、大幅に減少する（Winkler, T., Mahoney, E. J., Sinner, D., Wylie, C. C. and Dahia, C. L. (2014). Wnt signaling activates Shh signaling in early postnatal intervertebral discs, and re-activates Shh signaling in old discs in the mouse. PLoS One 9, e98444）。したがって、より低いレベルでも、ＳＨＨが、椎間円板を維持することができ、かつさらに１年ほど加齢を遅らせることができる。ＳＨＨの量の減少が、それを作る細胞の減少によるものであるか否か、これに向けて、本発明者らは、タモキシフェン誘導性ＳＨＨドライバー系統ＳＨＨＣｒｅＥＲＴ２／＋（Harfe, B. D., Scherz, P. J., Nissim, S., Tian, H., McMahon, A. P. and Tabin, C. J. (2004). Evidence for an expansion-based temporal Shh gradient in specifying vertebrate digit identities. Cell 118, 517-528）及びＲ２６ｍＴｍＧレポーター（Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L. and Luo, L. (2007). A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis 45, 593-605）を交配させ、誘導可能なＳＨＨレポーター（ＳＨＨＣｒｅＥＲＴ２／ＷＴ；Ｒ２６ｍＴ／ｍＧ）系統を生成し、かつ最後のタモキシフェン投与の２日後に腰椎脊椎を収集することによって、１２カ月齢及び２４カ月齢のＳＨＨ発現ＮＰ細胞の集団を分析した。１２カ月齢では、主にＮＰ周辺に存在している、ＡＦ及びＥＰにより近い位置にあるＮＰ細胞のサブセットのみがＳＨＨを発現していた（図１１ａ）。これらの少数のＳＨＨ＋ＮＰ細胞は、網状のＮＰ及びよく組織化されたＡＦを備えた円板構造を維持するのに十分であると考えられる。２４カ月齢までには、崩壊した腰椎円板は、ＳＨＨ＋細胞が維持されず、低細胞化した（図１１ｂ）。これらの結果から、加齢にともなうＳＨＨ発現の喪失が、円板細胞数、ＥＣＭタンパク質、及び円板の高さの喪失をもたらすことが示唆される。
【００９５】
成体マウスＮＰ細胞におけるＳＨＨの条件付き標的化
ＳＨＨの喪失が円板の加齢を引き起こすかどうかを試験するために、ＳＨＨのフロックスアレル［ＳＨＨｔｍ２Ａｍｃ／Ｊ（Lewis, P. M., Dunn, M. P., McMahon, J. A., Logan, M., Martin, J. F., St-Jacques, B. and McMahon, A. P. (2001). Cholesterol modification of sonic hedgehog is required for long-range signaling activity and effective modulation of signaling by Ptc1. Cell 105, 599-612）］を、ＣＫ１９ＣｒｅＥＲＴ２／＋（Means, A. L., Xu, Y., Zhao, A., Ray, K. C. and Gu, G. (2008). A CK19(CreERT) knockin mouse line allows for conditional DNA recombination in epithelial cells in multiple endodermal organs. Genesis 46, 318-323）と交配させ、中年齢マウスのＮＰ細胞におけるＳＨＨを標的化した。約１１カ月齢の時点で、マウスに、タモキシフェンを２回、強制経口投与し、５カ月間加齢させた。ＨｎＥ染色は、実験終了時での対照における同じレベルと比較して、ＳＨＨ  ｃＫＯの腰椎円板における劇的な組織学的変化を示した（図１２ａ）。ＳＨＨ  ｃＫＯの円板における組織学的変化が、ＳＨＨ及びその標的の喪失によるためであることを確認するために、対照及びＳＨＨ  ｃＫＯ群の腰椎円板におけるＳＨＨの免疫蛍光分析を実施した（図１２ｂ）。ＳＨＨ発現が、対照の円板では検出可能であったが、ＳＨＨ  ｃＫＯの円板では検出されなかった。また、免疫蛍光分析は、対照及びＳＨＨ  ｃＫＯの腰椎円板においてＥＣＭマーカーであるＡＣＡＮの喪失を示した（図１２ｃ）。これらの研究は、椎間円板の変性及び加齢が、ＳＨＨの喪失によるものであり、かつＳＨＨが円板の健康維持に不可欠であるという仮説が正当であることを立証する。
【００９６】
成体マウスにおけるＳＨＨ発現の条件付き及び一過性の過剰発現は、椎間の加齢を遅延させる
ＳＨＨの完全なノックアウトは加齢を加速させるのに対し、正常な加齢マウスは、最小限の継続したＳＨＨの発現が提供される場合、変性を遅延させることが可能である。それに向けて、ＣＫ１９ＣｒｅＥＲＴ２／＋（Means, A. L., Xu, Y., Zhao, A., Ray, K. C. and Gu, G. (2008). A CK19(CreERT) knockin mouse line allows for conditional DNA recombination in epithelial cells in multiple endodermal organs. Genesis 46, 318-323）アレル、Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ１（ｒｔＴＡ）Ｎａｇｙ（Belteki, G., Haigh, J., Kabacs, N., Haigh, K., Sison, K., Costantini, F., Whitsett, J., Quaggin, S. E. and Nagy, A. (2005). Conditional and inducible transgene expression in mice through the combinatorial use of Cre-mediated recombination and tetracycline induction. Nucleic acids research 33, e51）アレル及び（ｔｅｔＯ）７ＣＭＶ−ｒＳＨＨＴｇ（Miller, L. A., Wert, S. E., Clark, J. C., Xu, Y., Perl, A. K. and Whitsett, J. A. (2004). Role of Sonic hedgehog in patterning of tracheal-bronchial cartilage and the peripheral lung. Dev Dyn 231, 57-71）アレルを保持する三重変異体を生成することによって、ＳＨＨを一過性に過剰発現させた。１１カ月齢にて、タモキシフェン投与後のＣＫ１９発現ＮＰ細胞においてｒｔＴＡが活性化された。さらに１２〜１３カ月齢から、マウスは、飲用水においてドキシサイクリンを与えられて、これ以降ｒＳＨＨパルスと呼ばれる、（ｔｅｔＯ）７ＣＭＶ−ｒＳＨＨアレルからのｒＳＨＨ発現を刺激した。対照マウスは、同じ遺伝子の組合せを有しておらず、ｒＳＨＨ発現もなかった。次いで、マウスを１８カ月に加齢させた。図１３ａは、１８カ月齢の対照マウス及びｒＳＨＨパルスマウスの腰椎円板を示す。対照マウスの円板は、ＮＰ空間の減少、円板内のごくわずかな細胞、及びＡＦの層及び構造の喪失を含む、加齢に関連する変性の兆候を示す。対照的に、ｒＳＨＨパルスされた円板は、網状の及び拡散されたＮＰ細胞、並びにＡＦ細胞の組織化された層を有して、非常に健康にみえた。ＳＨＨの免疫染色（図１３ａにおいて赤色で示す）は、１２〜１３カ月齢からｒＳＨＨの発現を刺激することで、ＮＰがこれらの円板においてさらに多くのＳＨＨを産生し続けるように再プログラムされたことを示す。ＥＣＭマーカーであるＡＣＡＮの免疫染色（図１３ｂ）は、ＳＨＨの条件付き及び一過性の過剰発現が、円板のＥＣＭの維持をもたらしたことを示す。これらの結果は、中年齢マウスの円板をＳＨＨに一過性に曝露すると、円板構造、細胞数、及びＥＣＭ産生の維持を介して、円板が再活性化され、円板の加齢を遅らせることができることを示唆する。
【００９７】
ヘッジホッグシグナル伝達の小分子アゴニストが、中年齢マウスの円板を再活性化することが可能である
下背部痛の円板療法及び治療のためのＳＨＨ又はＳＨＨシグナル伝達の活性化の可能性を試験するために、リガンドのスムーズンド受容体の下流を活性化する、ＳＡＧと呼ばれるヘッジホッグシグナル伝達経路の小分子アゴニストをマウスに投与した。成体マウスに、水、又は１０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度で水に溶解したＳＡＧのどちらかを腹腔内投与した。マウスを７日間、毎日処置した。次の日に、ＲＮＡ単離、並びにＳＨＨ及びその下流標的のリアルタイムＲＴ−ｑＰＣＲ解析のために、腰椎円板を収集した。ＲＴ−ｑＰＣＲ解析（図１４）は、ＳＡＧをマウスに注入することにより、対照と比較してＳＨＨのｍＲＮＡ発現が増加したことを示す。ＳＨＨのｍＲＮＡ発現のアップレギュレーションは、その下流標的のＰｔｃｈ１及びＧｌｉ１の発現の増加にも関連した。そして、ＳＨＨシグナル伝達の増加が、結果として、Ｓｏｘ９及びＣｏｌ２のようなＥＣＭマーカーの発現を増加させた。これらの結果は、円板は、体内において最大の無血構造であるが、ヘッジホッグアゴニストの全身送達により、椎間円板におけるＳＨＨシグナル伝達経路を首尾よく活性化できる証拠を提供する。
【００９８】
ＳＨＨは、ヒトＮＰ細胞によって発現し、かつその発現は年齢とともに減少する
ヒト椎間円板の再生のために、ＳＨＨシグナル伝達及びその下流標的を標的する可能性を決定するために、第１に、外科的廃棄物として廃棄されるＮＰ細胞におけるＳＨＨのｍＲＮＡ発現を試験した。このような試料には、若年及び高齢患者の両方から収集されたＮＰ細胞が含まれた。図１５は、若年患者由来のヒトＮＰ細胞はＳＨＨを発現するが、ＳＨＨの発現は年齢とともに減少することを示す。この分析は、マウス及びヒトの円板が、両方において、加齢にともなってＳＨＨの発現を喪失することにより、分子的に類似することを示す。そのため、このような所見は、ＳＨＨシグナル伝達を標的することによる加齢マウス円板の再活性化が、患者に同様の効果をもたらす可能性があることを示唆する。
【００９９】
Ｂｒａの喪失は、ヒトＮＰ細胞におけるＳＨＨの喪失、及び新生児マウスのＮＰにおける病理学的変化に関連付けられる
タモキシフェン誘導性ＣＫ１９ＣｒｅＥＲＴ２／＋系統を使用した、１１カ月齢のマウスのＮＰ細胞におけるＳＨＨ（ＳＨＨｆｌｘ／ｆｌｘ）の条件付き標的化が、ＳＨＨの喪失の５カ月以内の加齢円板と同様の表現型を示した（図１６Ａ）。免疫染色は、ＳＨＨ標的化の後に、Ｂｒａ発現が喪失したことを示す（図１６Ｂ）。
【０１００】
ＢｒａＦｌｏｘＤ／ＷＴ（Ｂｒａ−ＨＥＴ）アレル及びＢｒａ（Ｂｒａｆｌｘ／ｆｌｘ）のＢｒａの条件付きアレルを有するマウス系統を生成した。組織学的解析を、３週齢（図１７Ａ）及び１２カ月齢（図１７Ｂ）での両系統由来の腰椎円板の中央冠状切片上で実施した。Ｂｒａ−ｈｅｔは、３週間までにＣＬＣｓの出現のような病理学的変化を示し、かつ１２カ月齢までに加齢を加速させた。Ｂｒａ（Ｂｒａｆｌｘ／ｆｌｘ）の条件付きアレルを有するマウスは、分析された両年齢にて、円板の通常の組織学的構造を維持した。
【０１０１】
ＥＣＭ産生により細胞の成長及び分化のマーカーが喪失するのに沿って、新生児マウスにおけるＢｒａの条件付き標的化は、病理学的変化を引き起こす。体重１グラムあたり２００ｕｇのタモキシフェンで処理した後のタモキシフェン誘導性ＮＰ特異的ＣＫ１９ＣｒｅＲＴ２／＋を使用して、Ｂｒａｆｌｘ／ｆｌｘを、Ｐ４及びＰ５のマウスのＮＰ細胞において条件付き標的化した。腰椎脊椎をＰ１５で収集した。ＨｎＥ染色は、インビボ及びインビトロの両方でのＳＨＨの遮断後に観察された表現型である、ＮＰ細胞の凝集及びＡＦ層の組織破壊（図１８Ａ）を示した。細胞増殖への影響を分析するために、Ｋｉ６７（赤色）の免疫染色を実施した。Ｂｒａ−ｃＫＯのＮＰ細胞では、Ｂｒａ−ＷＴ対照と比較して、Ｋｉ６７＋が検出されなかったが、Ｂｒａ−ｃＫＯにおいて成長板（ＧＰ，growth plate）はＫｉ６７＋を継続し、このことは予想されていた（図１８Ｂ）。ＥＣＭマーカーのＡＣＡＮ（緑色）の免疫染色も、Ｂｒａ−ＷＴ対照と比較して、Ｂｒａ−ｃＫＯ上の円板において減少した（図１８Ｃ）。次に、マウスＢｒａのエクソン２〜３にまたがるＭｍ０１３１８２４９＿ｍ１のＴａｑＭａｎプローブを用いたｑＰＣＲ解析によって、ＢｒａのｍＲＮＡレベルを決定した。結果は、Ｂｒａ−ＷＴ同腹仔の対照と比較して、Ｂｒａ−ｃＫＯのＢｒａ  ｍＲＮＡレベルが有意に減少することを示し、遺伝子が効率的に標的化されたことを示す（図１８Ｄ）。
【０１０２】
本明細書で引用されるすべての公開、特許、特許出願は、それらの全体が参照によって、本明細書に、本明細書により組み込まれる。
VII．参考文献
1. Belteki, G., Haigh, J., Kabacs, N., Haigh, K., Sison, K., Costantini, F., Whitsett, J., Quaggin, S. E. and Nagy, A. (2005). Conditional and inducible transgene expression in mice through the combinatorial use of Cre-mediated recombination and tetracycline induction. Nucleic acids research 33, e51
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【図１】
2020525448.tif 000008
【図２】
2020525448.tif 000009
【図３】
2020525448.tif 000010
【図４】
2020525448.tif 000011
【図５】
2020525448.tif 000012
【図６】
2020525448.tif 000013
【図７】
2020525448.tif 000014
【図８】
2020525448.tif 000015
【図９】
2020525448.tif 000016
【図１０】
2020525448.tif 000017
【図１１】
2020525448.tif 000018
【図１２】
2020525448.tif 000019
【図１３】
2020525448.tif 000020
【図１４】
2020525448.tif 000021
【図１５】
2020525448.tif 000022
【図１６】
2020525448.tif 000023
【図１７】
2020525448.tif 000024
【図１８】
2020525448.tif 000025
【国際調査報告】
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2020525448.tif 000027