(57)【要約】  本発明は、リンカーペプチドを介して抗体のＮ末端に連結された増殖因子を含む融合タンパク質に関し、特に、ここで前記増殖因子はＩＧＦ−１であり、かつ前記抗体はコラーゲンに対してである。
2020508319.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体または標的結合特性を保持するその断片もしくは誘導体、および
増殖因子または増殖因子活性を保持するその断片もしくはサブユニットを含む
融合タンパク質であって、
前記抗体またはその断片もしくは誘導体、および前記増殖因子またはその断片もしくはサブユニットが、ペプチドリンカーによって連結され、
前記ペプチドリンカーが、前記抗体またはその前記断片もしくは誘導体の少なくとも１つのペプチド鎖のＮ末端に融合される、
融合タンパク質。
【請求項２】
前記抗体またはその断片もしくは誘導体が、コラーゲンに特異的に結合される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記抗体またはその断片もしくは誘導体が、コラーゲンＩとコラーゲンＩＩの双方に結合する能力がある、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記コラーゲンが、ヒトコラーゲン、イヌコラーゲンまたはウマコラーゲンである、請求項２または３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記抗体が、ハイブリドーマ由来抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体からなる群のいずれかから選択されるモノクローナル抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記抗体が、イヌもしくはイヌ化抗体、および／またはウマもしくはウマ化抗体からなる群のいずれかから選択されるモノクローナル抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記抗体が、
・ＩｇＧ
・ダイアボディ
からなる群から選択される少なくとも１つの形式である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記リンカーが、
ａ）ＧＧＧＡＫＧＧＧＧＫＡＧＧＧＳ（配列番号１０）
ｂ）ＧＧＧＧＤＧＧＧＧＤＧＧＧＧＳ（配列番号１１）
ｃ）ＧＳＡＤＧＧＳＳＡＧＧＳＤＡＧ（配列番号１２）
ｄ）ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＥＧＧＧＧＳ（配列番号１３）、および
ｅ）ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１４）
からなる群のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記抗体が、以下のＣＤＲを有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
ＶＬ−ＣＤＲ１  配列番号１
ＶＬ−ＣＤＲ２  配列番号２
ＶＬ−ＣＤＲ３  配列番号３
ＶＨ−ＣＤＲ１  配列番号４
ＶＨ−ＣＤＲ２  配列番号５
ＶＨ−ＣＤＲ３  配列番号６
【請求項１０】
前記抗体が、配列番号７に記載の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）ドメインおよび配列番号８に記載の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）ドメインを有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記抗体がＣ１１である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記増殖因子またはその断片もしくはサブユニットが、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記インスリン様増殖因子が、ＩＧＦ−１である、請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記融合タンパク質が、組換え融合タンパク質である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
融合タンパク質が、配列番号１５、１６、１７、１８、１９または２０に記載のいずれかのアミノ酸配列を含む少なくとも１つの鎖を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質を製造するための方法であって、
ａ）（ｉ）前記抗体またはその断片もしくは誘導体、
（ｉｉ）前記増殖因子またはその断片もしくはサブユニット、および
（ｉｉｉ）前記ペプチドリンカー
をコードする核酸配列を包含するゲノム、合成または相補的（ｃ）ＤＮＡを、各融合タンパク質の発現に適した少なくとも１つの発現ベクターにクローンニングするステップと、
ｂ）前記融合タンパク質を好適な発現系において発現させるステップと、
ｃ）前記融合タンパク質を精製するステップと
を含む、方法。
【請求項１７】
前記発現系が、哺乳動物細胞株を含む、請求項１６に記載の製造するための方法。
【請求項１８】
前記細胞株が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である、請求項１７に記載の製造するための方法。
【請求項１９】
１リットル以上の細胞培養物あたり１０ｍｇの融合タンパク質を産生する、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の製造するための方法。
【請求項２０】
医学的処置のための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項２１】
医薬としての使用するための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
（ａ）関節炎、優先的には変形性関節症、または（ｂ）靱帯または腱損傷に罹患しているか、発症するリスクがあるか、またはその診断を受けているヒトまたは動物対象を治療する方法であって、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質を前記対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項２３】
（ａ）関節炎、優先的には変形性関節症、または（ｂ）靱帯または腱損傷に罹患しているか、発症するリスクがあるか、またはその診断を受けているヒトまたは動物対象の治療における使用のための、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
前記融合タンパク質が、関節内注射によって投与される、請求項２２に記載の方法、または請求項２３に記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
修復手術に用いるための靱帯または腱の前処理のex vivo方法であって、靱帯または腱を請求項１〜１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質とともにインキュベートするステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、最適化されたリンカーおよび方向性を有する免疫複合体に関する。これらのコンジュゲートは、所与のリンカーによってコンジュゲートされた抗体および増殖因子を含む融合タンパク質である。
【０００２】
本発明は、様々な軟骨成分中に存在し、かつインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、またはその断片もしくはサブユニットのような増殖因子にコンジュゲートされているエピトープを標的にする免疫複合体に関し、ここで前記抗体またはその断片もしくは誘導体、および前記増殖因子またはその断片もしくはサブユニットは、ペプチドリンカーにより共有結合的に連結され、軟骨および他の線維構造の再生用に用いられる。
【背景技術】
【０００３】
組換えＩＧＦ１は、様々な臨床用途に用いられる生物医薬品である。それは、例えば低身長症における増殖異常を有する個体に投与される。さらに、ＩＧＦ１は、筋肉成長を促進するため、筋肉内注射としてボディービルダーによって頻用される。多数の他の増殖因子のように、ＩＧＦ１として、通常、自ら疾患の部位に優先的に局所化せず、患部組織への送達のためにそれらを抗体に連結させることが、効力を改善し、副作用を低減することにより、有意な治療的利点をもたらし得ることは理解されている。
【０００４】
治療指数、すなわち毒性を引き起こす量まで治療効果をもたらす増殖因子の量の間の比を改善するため、ＩＧＦ１は、好適なモノクローナル抗体、抗体断片、または抗体誘導体に融合またはコンジュゲートされ得、そこでは医薬送達（ｐｈａｒｍａｃｏｄｅｌｉｖｅｒｙ）媒体として役立つ。
【０００５】
関節炎および変形性関節症
関節炎は、新しい治療法の開発における適切な標的の１つを表す。関節炎は、米国における５５歳を超える人々の約８０％で発症する。損傷、衰弱した免疫系、および／または遺伝性因子が、関節炎の発症を誘発し得る。炎症、関節痛、および経時的な関節表面の進行性増悪を含む類似症状を共有する関節炎には数百のタイプがある。関節は、正常な輪郭を失うことがあり、過剰な量の体液が、浮遊するデブリ片とともに関節内部に集積することがある。関節炎は、脊椎における関節を冒すことがあり、それは身体の屈曲および湾曲をもたらし得る。課題の一部は、関節炎に対する身体の応答である場合があり、それは関節動作を停止させるような余分な骨を作ることになる。余分な骨は、骨棘または骨の過成長と称される。
【０００６】
関節炎の最も一般的形態は、関節リウマチ、変形性関節症、線維筋痛症、乾癬性関節炎、痛風、ループス、若年性関節炎および強直性脊椎炎である。
【０００７】
時として変性関節疾患または変性関節炎と称される、変形性関節症（ＯＡ）は、世界中でおよそ数百万の患者が発症する、関節の最も一般的な慢性症状である。ＯＡは、任意の関節を冒し得るが、膝、臀部、下背および首、指の小関節、ならびに母指および母趾の底において最も頻繁に生じる。
【０００８】
正常な関節では、軟骨は、各骨の末端をカバーする。軟骨は、関節動作に対する滑らかな滑走面を提供し、骨間のクッションとして作用する。ＯＡでは、軟骨が破壊し、疼痛、腫脹および関節動作上の問題を引き起こす。ＯＡが経時的に増悪すると、骨は破壊し、棘と称される成長を生じることがある。骨片または軟骨片がはげ落ち、関節周囲に浮遊することがある。身体において、炎症過程が生じ、軟骨をさらに損傷させるサイトカイン（タンパク質）および酵素が発生する。ＯＡの最終ステージでは、軟骨がすり減り、骨同士が擦れ、関節障害やさらなる疼痛を引き起こされる。
【０００９】
靱帯または腱損傷
靱帯または腱損傷は、加齢の症状として、さらに慢性筋挫傷および急性損傷に起因し、生じ得る。現在、破裂が生じるとき、唯一の治療選択肢は、断裂した靱帯または腱が一般に置換移植片で置換されるような手術である。それらは重要な医学的需要を構成する。例えば、米国に限っての前十字靱帯（ＡＣＬ）の再建術は、２００９年に約７５，０００人と見積もられた［Ｌｙｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）］。ＡＣＬの置換に用いられる移植片は、膝蓋腱自己移植片（患者に由来する自己移植片）、ハムストリング自己移植片または四頭筋自己移植片を含む。しかし、再建された靱帯の破裂または伸展または不十分な外科的技術に起因した手術の不満足な転帰が考えられる［Ｆｒｅｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３），Ｂｒｏｗｎ  ＆  Ｃａｒｓｏｎ（１９９９）］。このため、手術の転帰を改善し得る任意の技術または薬理学的介入であれば、極めて重要となる。
【００１０】
活性成分としてのインスリン様増殖因子１
インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）は、インスリンに対する高い配列類似性を有するタンパク質である。それらは、リラクシンを含むインスリン関連ペプチドおよび低級無脊椎動物から単離される幾つかのペプチドのファミリーのメンバーである。１９７６年、ＲｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔおよびＨｕｍｂｅｒは、ヒト血清から、プロインスリンに対するそれらの構造的類似点のおかげで、「インスリン様増殖因子１および２」（ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２）と新たに命名される２つの活性物質を単離した。
【００１１】
ＩＧＦ−１は、７６４９ダルトンの分子量を有する７０アミノ酸からなる小ペプチドである。インスリンと同様、ＩＧＦ−１は、ジスルフィド結合によって連結されたＡおよびＢ鎖を有する。Ｃペプチド領域は、１２アミノ酸を有する。インスリンに対する構造的類似性は、ＩＧＦ−１がインスリン受容体に（低親和性で）結合する能力を説明する。
【００１２】
ＩＧＦ−１の主な作用は、多数の組織内の多数の細胞型上に存在する、その特異的な受容体、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）への結合によって媒介される。ＩＧＦ１Ｒ、受容体チロシンキナーゼへの結合は、細胞内シグナル伝達を開始させ；ＩＧＦ−１は、細胞成長および増殖の刺激因子である、ＡＫＴシグナル伝達経路の最も強力な天然アクチベーターの１つである。
【００１３】
極めて多数の臨床試験が、ＩＧＦ−１が軟骨組織を保護および修復するように機能することを示唆している。ＩＧＦ−１のこの修復性効果が、軟骨に対する、反応性免疫メディエーター、例えばサイトカインによって被る損傷を相殺すると考えられることから、ＩＧＦ−１は、理論上、変形性関節症の治療における優れた候補とみなされ得る。
【００１４】
しかし、ＩＧＦ−１は、部分的には血清中に存在する異常に高レベルの細胞外のＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）によるその隔離のため、また部分的にはその短い半減期のため、変形性関節症（ＯＡ）において軟骨における不十分な同化有効性を有する。
【００１５】
ＩＧＦ−１の治療活性を最大化するための一方法は、それをＯＡに冒された関節に関節内注射を通じて投与することである。ＩＧＦ−１の治療活性を最大化するためのさらにより優れた方法は、ＯＡに存在する標的に結合する能力があるタンパク質にそれをコンジュゲートすることである。次に、ＩＧＦ１融合タンパク質は、患部組織内で維持されることから、より長期間、その生物学的機能を発揮することになる。さらにより優れた方法は、ＩＧＦ−１融合タンパク質を関節内注射で投与することである。
【００１６】
抗体標的としてのコラーゲン
コラーゲンは、細胞外マトリックスの主要な構成成分である。異なるコラーゲンの発現の協調および調節は、脊椎動物における正確な発現にとって重要であり、コラーゲン突然変異は、幾つかの遺伝性結合組織障害に関与する。それらの中で、コラーゲンＩＩ型（コラーゲンＩＩ、またはＣＯＬ２Ａ１とも称される）は、軟骨に最も豊富に存在する［Ｓｔｒｏｍ  ａｎｄ  Ｕｐｈｏｌｔ（１９８４），Ｃｈｅａｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）］。ＣＯＬ２Ａ１は、胚形成中の軟骨細胞により、また成体における病態において新規に合成される。ＣＯＬ２Ａ１は、３つのａ１（ｌｌ）鎖からなるホモ三量体である。これらは、長い未熟プロコラーゲン分子として分泌され、それは細胞外環境下でコラゲナーゼによるタンパク質分解切断を経て、それにより成熟ＩＩ型コラーゲンを形成する。ＣＯＬ２Ａ１は、コラーゲンＩＸおよびコラーゲンＸＩとヘテロポリマーを形成し、軟骨に典型的な線維網を創出する［Ｅｙｒｅ  Ｄ．（２００２）］。１９８０年代後期以降、ＣＯＬ２Ａ１遺伝子における突然変異が、脊椎骨端異形成の先天型［Ｌｅｅ  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）］、脊椎骨端骨幹端異形成のｓｔｒｕｄｗｉｃｋ型およびその他多数を含む、骨および軟骨の異常な発生に関連する幾つかの遺伝性障害の原因であることは知られている。さらに、正常およびリウマチ様ヒト関節軟骨におけるＣＯＬ２Ａ１の発現を調べるため、異なる技術が用いられている。
【００１７】
正常なＣＯＬ２Ａ１が健常組織内で一様に発現される一方、患部関節はＩＩ型コラーゲンの強力な増強を示す［Ａｉｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）］。細胞外マトリックス組成物におけるこの明確な変化は、軟骨の線維網の恒常性を維持できないことに起因する［Ｇｏｕｔｔｅｎｏｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）］。ＣＯＬ２Ａ１は、当然ながら、マウス、ラットおよびヒトの間で十分に保存される。
【００１８】
しかし、ＣＯＬ２Ａ１に加えて、様々な他の成分が、ヒト軟骨中に存在する。さらなる軟骨成分（すなわち、ＣＯＬ２Ａ１だけでなく、例えば、コラーゲンＩまたはＣＯＬ１Ａ１とも称されるコラーゲンタイプ）に結合する能力がある抗体は、軟骨および他の線維小体構造のさらなる生理学的再生を促進するためのより優れた特性を有してもよい。
【００１９】
コラーゲンに対する抗体および融合タンパク質
軟骨は、関節で長管骨の末端を保護する組織であり、多数の身体部位の構成要素である。軟骨は、大量の細胞外マトリックスを生成する軟骨細胞と称される特殊化細胞からなる。細胞外マトリックスは、自己組織化高分子の複合体である。それは、主に、コラーゲン、非コラーゲン性糖タンパク質、ヒアルロナンおよびプロテオグリカンからなる。
【００２０】
原則として、コラーゲンであれば、医薬送達用途に対する標的とみなされ得る。
【００２１】
国際公開第２０１６／０１６２６９号パンフレットでは、現出願人は、コラーゲンＩＩとコラーゲンＩの双方に結合するときに独自の生物学的特性を有する、「Ｃ１１」という名称の抗コラーゲン抗体を開示している。Ｃ１１抗体は、様々な患部組織（例えば、ＳＫＲＣ−５２腎細胞がん、Ｆ９マウステラトカルシノーマ、ＲＡモデルからのマウス足）の血管構造で良好な染色を示した。Ｃ１１抗体は、ＯＡのラットＭＭＴモデルにおける体内分布および免疫組織化学（ＩＨＣ）試験において、またヒトＯＡ患者からの膝関節および滑膜において試験されている。さらに、Ｃ１１抗体はまた、軟骨細胞、損傷した軟骨および肋軟骨下に結合する。したがって、Ｃ１１抗体は、骨関節炎関節に対する治療薬を標的にする可能性を有する。
【００２２】
Ｃ１１の複雑な軟骨結合特性と対照的に、出願人はまた、国際公開第２０１６／０１６２６９号パンフレット中に、コラーゲンＩＩ構造を特異的に認識するがコラーゲンＩに結合しない、「Ｆ９」という名称の別の抗コラーゲン抗体について記載している。
【００２３】
国際公開第２００８／１３５７３４号パンフレットは、酸化されたコラーゲンＩＩに対する抗体、特にコラーゲンＩＩの酸化型の中に特異的に含有されるエピトープを認識するクローン１−１１Ｅについて記載した。この抗体１−１１Ｅは、専ら損傷されたＯＡ軟骨に結合する（軟骨組織の細胞外マトリックスの細胞周囲染色）が、免疫化学において正常軟骨に結合しない。１−１１Ｅダイアボディは、マウスＯＡモデルにおける損傷部位と同様、関節炎マウスモデルの炎症した足に局所化することができた。
【００２４】
国際公開第２００８／１３５７３４号パンフレットはまた、サイトカインまたはサイトカイン受容体にコンジュゲートされる抗体を開示した。ＩＦＮ−βと融合される１−１１ＥまたはＴＮＦＲ２−Ｆｃと融合される１−１１Ｅなどの融合タンパク質の作製。
【００２５】
増殖因子の抗体分子への結合は、ペプチドリンカーを用いて生じ得る［Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）］。リンカーは、機能ドメインを一緒に連結する（フレキシブルおよびリジッドリンカーなどの場合）、または機能ドメインをインビボで遊離放出する（インビボで切断可能なリンカーなどの場合）といった基本的役割以外では、融合タンパク質の作製における多くの他の利点、例えば、生物学的活性を改善すること、発現収量を増加させること、および望ましい薬物動態特性を達成することを提供してもよい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明が詳述される前、本発明が記述されるデバイスの特定の成分部分に限定されることがない、またはかかるデバイスおよび方法として記述される方法のプロセスステップが変化してもよいことは理解されるべきである。本明細書で用いられる用語法が、あくまで特定の実施形態を説明することを目的とし、限定することが意図されないことも理解されるべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲にて用いられるとき、文脈上特に明示されない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」が単数および／または複数の参照対象を含むことは認められる必要がある。数値によって定められるパラメータ範囲が与えられる場合、該範囲がこれらの制限値を含むように見なされることはさらに理解されるべきである。
【００２７】
本明細書に開示される実施形態が、互いに関連することがない個別の実施形態として理解されることが意図されないことはさらに理解されるべきである。一実施形態で考察される特徴は、本明細書中に示される他の実施形態とも関連させて開示されることが意図される。ある状況で、具体的特徴が一実施形態で開示されず、他の実施形態で開示される場合、当業者は、それが、前記特徴が前記他の実施形態で開示されることが意図されないことを必ずしも意味しないことを理解するであろう。当業者は、前記特徴を他の実施形態においても開示することが本願の要点であるが、あくまで明確化を目的とし、本明細書を管理しやすい（これまで達成されていない）ボリュームで維持するためであることを理解するであろう。
【００２８】
さらに、本明細書で参照される先行技術文書の内容は、参照により援用される。ここでは特に、標準または通常の方法を開示する先行技術文書が参照される。その場合、参照による援用は主に、十分な権限を付与する開示を提供し、かつ冗長な繰り返しを回避するという目的を有する。
【００２９】
一態様によると、本発明は、抗体または標的結合特性を保持するその断片もしくは誘導体、および増殖因子または増殖因子活性を保持するその断片もしくはサブユニットを含む融合タンパク質に関し、ここで前記抗体またはその断片もしくは誘導体、および前記増殖因子またはその断片もしくはサブユニットは、ペプチドリンカーによって連結され、ここでペプチドリンカーは、抗体またはその断片もしくは誘導体の少なくとも１つのペプチド鎖のＮ末端と融合される。
【００３０】
これは、この実施形態では、増殖因子が、抗原結合ドメイン、すなわち可変ドメインも含んだ抗体の一部に融合されることを意味する（図９を参照）。
【００３１】
これは、融合タンパク質が、以下のＮ−＞Ｃの方向性：
Ｎ−増殖因子−リンカー−抗体−Ｃ
を有することを意味する。
【００３２】
この立体配置は、毒素、増殖因子またはサイトカインが、定常ドメイン（多くはそのＣ末端）に融合またはコンジュゲートされ、例えばＳＳ１Ｐのような、抗メソセリン抗体Ｆｖを含み、そのＣＨ１部分がＰＥ３８菌体外毒素に連結される、抗体の標的結合性に干渉しない場合、他の免疫複合体と全く異なる。
【００３３】
発明者は、意外にも、これらの考察に反して、抗体の可変ドメインに対する増殖因子−リンカーの融合が後者の標的結合に干渉しないことを示している。
【００３４】
これに関連して、米国特許第８，３９４，３７８号明細書が、ヒトコラーゲンＩＩに結合する抗体を開示し、増殖因子、サイトカインおよび抗炎症剤がそれにカップリングされる可能性があることを示唆するように理解することは重要である。かかるコンジュゲートでは、米国特許第８，３９４，３７８号明細書は、治療用タンパク質が、本発明の抗体のＣ末端にアミド結合またはペプチドリンカーを介して直接的に連結される可能性があることを示唆する。それ故、米国特許第８，３９４，３７８号明細書は、上記のような配置と比べて逆の配置が異質であることを明示していることを示唆する。
【００３５】
本発明の一実施形態では、抗体またはその断片もしくは誘導体は、コラーゲンに特異的に結合される。本発明の他の一実施形態では、抗体またはその断片もしくは誘導体は、コラーゲンＩとコラーゲンＩＩの双方に結合する能力がある。本発明の他の一実施形態では、前記コラーゲンは、ヒトコラーゲン、イヌコラーゲンまたはウマコラーゲンである。
【００３６】
本明細書で用いられるとき、「抗体」は、同義的に「免疫グロブリン」（Ｉｇ）とも称され、一般に４つのポリペプチド鎖、つまり２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含んでおり、それ故、多量体タンパク質、またはその等価なＩｇ相同体（例えば、重鎖のみを含むラクダ科ナノボディ、重鎖または軽鎖のいずれかに由来し得る単一ドメイン抗体（ｄＡｂ））；例えば、完全長機能的突然変異体、変異体、またはその誘導体であり（Ｉｇ分子に必須のエピトープ結合特性を保持する、限定はされないが、マウス、キメラ、ヒト化および完全ヒト抗体を含み、かつ二重特異性、二特異性、多特異性、および二重可変ドメイン免疫グロブリンを含む；免疫グロブリン分子は、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）およびアロタイプであり得る。
【００３７】
「抗体誘導体または断片」は、本明細書で用いられるとき、限定はされないが、（ｉ）可変軽（ＶL）、可変重（ＶH）、定常軽（ＣL）および定常重１（ＣH１）ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶHおよびＣH１ドメインからなる、Ｆab（Ｆd）断片の重鎖部分；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶLおよびＶHドメインからなる、可変断片（Ｆv）断片、（ｖ）単一可変ドメインを含む、ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；（ｖｉｉ）一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）；（ｖｉｉｉ）ＶHおよびＶLドメインが単一のポリペプチド鎖上に、しかし同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを用いて発現され、それにより、該ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対合させ、２つの抗原結合部位を作出する、二価の二特異性抗体であるダイアボディ（ｄｂ）；（ｉｘ）相補性軽鎖ポリペプチドと一緒に、抗原結合領域の対を形成する、一対のタンデムＦｖセグメント（ＶH−ＣH１−ＶH−ＣH１）を含む、線状抗体；（ｘ）国際公開第２００３／０７６４６９号パンフレットに記載のように、１つ以上のＣＨドメインを用いて互いに架橋された２つの一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含む、ＳＩＰ（小免疫タンパク質）（例えば、ＶH−ＶL−ＣH４−ＣH４−ＶL−ＶH）、（ｘｉ）ｓｃＦｖ−Ｆｃ、すなわちｓｃＦｖがＣH２−ＣH３にヒンジ領域を通じて（またはＣH１−ＣH２−ＣH３領域に直接的に）融合される、すなわちＣＬドメインが欠如する場合の構築物、および（ｘｉｉ）免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖の他の非完全長部分、またはそれらの突然変異体、変異体、もしくは誘導体、を単独でまたは任意の組み合わせで含む、完全長でない抗体に由来する少なくとも１つのポリペプチド鎖を含む分子に関する。いずれの場合でも、前記誘導体または断片は、標的結合特性を保持する。
【００３８】
ＶＨおよびＶＬは、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）と称される超可変領域に細分化され、フレームワーク領域（「ＦＲ」）と称されるより保存された領域が点在し得る。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端にかけて、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配列される、３つのＣＤＲと４つのＦＲ配列とからなる。本明細書では、重鎖の３つのＣＤＲは、「ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３」と称され、また軽鎖の３つのＣＤＲは、「ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２およびＶＬ−ＣＤＲ３」と称される。
【００３９】
本発明の一実施形態では、抗体は、抗体の
ａ）ハイブリドーマ由来の抗体
ｂ）キメラ化抗体
ｃ）ヒト化抗体、および／または
ｄ）ヒト抗体
からなる群のいずれかから選択されるモノクローナル抗体である。
【００４０】
ハイブリドーマ技術は、当該技術分野で周知であり、ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによって記載がなされている［Ｋｏｅｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）］。キメラ、ヒト化および／またはヒトｍＡｂの作製および／または選択のための方法は、当該技術分野で公知である。例えば、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによる米国特許第６３３１４１５号明細書は、キメラ抗体の作製について記載している一方で、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌによる米国特許第６５４８６４０号明細書は、ＣＤＲ移植技術について記載し、またＣｅｌｌｔｅｃｈによる米国特許第５８５９２０５号明細書は、ヒト化抗体の作製について記載している。
【００４１】
一般的に引用すると、該抗体は、哺乳類化され得る。この用語は、哺乳動物種（例えばマウス）からの重鎖および軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨおよび／またはＶＬ配列の少なくとも一部が、「目的の哺乳動物」により類似するように改変されている抗体を指し、例えば、本明細書中に定義されるヒト化、イヌ化（ｃａｎｉｎｉｚｅｄ）、ウマ化（ｅｑｕｉｎｉｚｅｄ）またはネコ化（ｆｅｌｉｎｉｚｅｄ）抗体を参照されたい。かかる哺乳類化抗体は、限定はされないが、ウシ化（ｂｏｖａｎｉｚｅｄ）、ラクダ化、イヌ化、ウマ化、ネコ化抗体を含み、またそれらの概念は、ヒト化抗体の場合に類似する。イヌ化（ｃａｎｉｎｉｚａｔｉｏｎ）およびウマ化（ｅｑｕｉｎｉｚａｔｉｏｎ）を含む抗体の哺乳類化は、特に米国特許出願公開第２０１６０００２３２４号明細書に開示されている。
【００４２】
さらに別の実施形態によると、抗体は、
・イヌまたはイヌ化抗体、および／または
・ウマまたはウマ化抗体
からなる群のいずれかから選択されるモノクローナル抗体である。
【００４３】
非イヌ（例えばヒトまたはマウス）抗体の「イヌ化」形態は、非イヌ免疫グロブリンに由来する最小配列を有する遺伝子操作された抗体である。イヌ化抗体は、レシピエントの超可変領域残基が、所望される特異性、親和性、および能力を有するヒトまたはマウスなどの非イヌ種（ドナー抗体）からの超可変領域残基で置換される場合のイヌ免疫グロブリン配列（レシピエント抗体）である。場合によっては、イヌ免疫グロブリン配列のフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非イヌ残基で置換される。さらに、イヌ化抗体は、レシピエント抗体中またはドナー抗体中に見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体性能をさらに改良するため、設けられる。一般に、イヌ化抗体は、少なくとも１つ、また典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含むことになり、ここで超可変領域のすべてまたは実質的にすべては、非イヌ免疫グロブリン配列の場合に対応し、ＦＲのすべてまたは実質的にすべては、イヌ免疫グロブリン配列の場合に対応する。イヌ化抗体はまた、任意選択的には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の全部、または少なくとも一部、典型的にはイヌ免疫グロブリン配列の場合を含むことになる。この実施形態では、非イヌＣＤＲは、イヌフレームワークに移植される。
【００４４】
非ウマ（例えばヒトまたはマウス）抗体の「ウマ化」形態は、非ウマ免疫グロブリンに由来する最小配列を有する遺伝子操作された抗体である。ウマ化抗体は、レシピエントの超可変領域残基が、所望される特異性、親和性、および能力を有するヒトまたはマウスなどの非ウマ種（ドナー抗体）からの超可変領域残基で置換される場合のウマ免疫グロブリン配列（レシピエント抗体）である。場合によっては、ウマ免疫グロブリン配列のフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ウマ残基で置換される。さらに、ウマ化抗体は、レシピエント抗体中またはドナー抗体中に見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体性能をさらに改良するため、設けられる。一般に、ウマ化抗体は、少なくとも１つ、また典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含むことになり、ここで超可変領域のすべてまたは実質的にすべては、非ウマ免疫グロブリン配列の場合に対応し、ＦＲのすべてまたは実質的にすべては、ウマ免疫グロブリン配列の場合に対応する。ウマ化抗体はまた、任意選択的には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の全部、または少なくとも一部、典型的にはウマ免疫グロブリン配列の場合を含むことになる。この実施形態では、非ウマＣＤＲは、ウマフレームワークに移植される。
【００４５】
抗体ライブラリーまたはペプチドライブラリーを作出し、次いでほぼすべての考えられる細胞または分子標的に対して好適な結合剤をかかるライブラリーから選択するための通常の方法が存在する。インビトロ抗体ライブラリーは、特に、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓによる米国特許第６３０００６４号明細書およびＭＲＣ／Ｓｃｒｉｐｐｓ／Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅによる米国特許第６２４８５１６号明細書に開示されている。ファージディスプレイ技術は、例えば、Ｄｙａｘによる米国特許第５２２３４０９号明細書に開示されている。
【００４６】
用語「親和性」は、本明細書で用いられるとき、結合剤がその標的に対して有する結合力を指す。通常、かかる親和性は、抗体−標的複合体のその成分への解離における平衡定数である解離定数ＫD［Ｍ］を用いて表される。それは、ｋoff／ｋon比として計算される。ＫDおよび親和性には逆相関があり、それは低いＫDが高い親和性を示す一方、高いＫDが低い親和性を示すことを意味する。
【００４７】
本発明の他の実施形態によると、該抗体は、
・ＩｇＧ
・ダイアボディ
からなる群から選択される形式である。
【００４８】
ＩｇＧ形式は、本発明に記載の融合タンパク質の、関節内という好ましい投与様式との関連では特に適する。この好ましい投与様式では、融合タンパク質は、系統的でなく局所的に投与される。それ故、ＩｇＧ形式の潜在的な不利益、例えば全身投与において役立つ肝臓による取り込みは、関節内投与において考慮されない。
【００４９】
本発明の他の実施形態によると、抗体または標的結合特性を保持するその断片もしくは誘導体、ならびに増殖因子または増殖因子活性を保持するその断片もしくはサブユニットは、
ａ）ＧＧＧＡＫＧＧＧＧＫＡＧＧＧＳ（配列番号１０）、本明細書中で「ＡＫＫＡＳ」とも称される
ｂ）ＧＧＧＧＤＧＧＧＧＤＧＧＧＧＳ（配列番号１１）、本明細書中で「ＤＤＳ」とも称される
ｃ）ＧＳＡＤＧＧＳＳＡＧＧＳＤＡＧ（配列番号１２）、本明細書中で「ＳＡＤ」とも称される
ｄ）ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＥＧＧＧＧＳ（配列番号１３）、本明細書中で「ＳＥＳ」とも称される
ｅ）ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１４）、本明細書中で「（Ｇ４Ｓ）３」とも称される
からなる群のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むペプチドリンカーにより共有結合的に連結される。
【００５０】
本発明者は、上記のような融合ペプチドにおいてこれらのリンカーを初めて用いている。
【００５１】
「ＡＫＫＡＳ」リンカーは、正に荷電される。「ＤＤＳ」リンカーは、負に荷電される。「ＳＡＤ」リンカーは、正および負電荷の双方を有し、「ＳＥＳ」リンカーは、部分的に負に荷電され、「（Ｇ４Ｓ）３」は、中性電荷を有する。
【００５２】
実施例１および表４に詳細に示される通り、本発明者は、前記５つのリンカーペプチドａ）〜ｅ）が、増殖因子を抗体のＮ末端に遺伝的にコンジュゲートするように用いられるとき、融合タンパク質の作製を可能にすることを見出した。
【００５３】
リンカーａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）からなる群のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する前記ペプチドリンカーが抗体のＮ末端に配置されたとき、得られる融合タンパク質が、活性、有効性または安定性の観点で損なわれないことも見出された。
【００５４】
一実施形態では、該抗体は、以下のＣＤＲ：
ＶＬ−ＣＤＲ１  配列番号１
ＶＬ−ＣＤＲ２  配列番号２
ＶＬ−ＣＤＲ３  配列番号３
ＶＨ−ＣＤＲ１  配列番号４
ＶＨ−ＣＤＲ２  配列番号５
ＶＨ−ＣＤＲ３  配列番号６
を有する。
【００５５】
その好ましい実施形態では、該抗体は、配列番号７に従う軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および配列番号８に従う重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を有する。
【００５６】
ＣＤＲおよびＶＨ／ＶＬ配列が、３以下のアミノ酸の置換、欠失、または挿入を包含する、わずかな相違の対象であり得る一方で、さらに標的結合能を維持することは注目される。それ故、さらに提供されるのは、９０％同一、好ましくは９３、９５、９８または９９％同一である配列もまた、本発明の範囲によって包含されることである。
【００５７】
１つ以上のフレームワーク領域および／または１つ以上のＣＤＲにおいて、わずかな相違が設けられてもよい。ＶＨおよび／またはＶＬドメインのフレームワーク領域内に、３、２または１つのアミノ酸置換が設けられてもよい。例えば、１つのアミノ酸置換は、配列番号８の４７位、ＶＨのフレームワーク領域内に設けられてもよい。一部の実施形態では、前記位置のグルタミン（ＧｌｎまたはＱ）は、異なるアミノ酸、好ましくはトリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）で置換されてもよい。
【００５８】
上記のＣＤＲおよびＶＬ／ＶＨドメインは、国際公開第２０１６／０１６２６９号パンフレットに開示されるモノクローナル抗体Ｃ１１から生じる。Ｃ１１は、その最も広い様式ではそのＣＤＲによって定義される。個別のＣＤＲは、Ｋａｂａｔ［Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ（１９９１）］またはＣｈｏｔｈｉａ［ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（１９８７）］付番系に基づいて、または双方に基づいて、定義され得る。国際公開第２０１６／０１６２６９号パンフレット中でのＶＨ−ＣＤＲ１の定義は、Ｃｈｏｔｈｉａに基づく。Ｃ１１の好ましい一実施形態は、前記ＣＤＲを含むそのＶＬ／ＶＨ配列により定義される。特に好ましい一実施形態では、Ｃ１１は、前記ＶＬ／ＶＨ配列を含むＩｇＧである。国際公開第２０１６／０１６２６９号パンフレットの内容は、特にＣ１１、およびコラーゲンにさらに結合するＣ１１に対する代替物に関して、参照により本明細書中に援用される。
【００５９】
それ故、本発明の好ましい一実施形態では、抗体は、Ｃ１１である。
【００６０】
本発明のさらに別の態様では、組換え融合タンパク質は、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）である、増殖因子またはその断片もしくはサブユニットを含む。好ましくは、このインスリン様増殖因子は、ヒトＩＧＦである。同様に、好ましくは、このインスリン様増殖因子は、ＩＧＦ−１である。
【００６１】
さらに別の態様によると、本発明は、抗体または標的結合特性を保持するその断片もしくは誘導体、および増殖因子または増殖因子活性を保持するその断片もしくはサブユニットを提供し、ここで前記抗体またはその断片もしくは誘導体、および前記増殖因子またはその断片もしくはサブユニットは、ペプチドリンカーによって連結され、ここでリンカーは、
ａ）ＧＧＧＡＫＧＧＧＧＫＡＧＧＧＳ（配列番号１０）
ｂ）ＧＧＧＧＤＧＧＧＧＤＧＧＧＧＳ（配列番号１１）
ｃ）ＧＳＡＤＧＧＳＳＡＧＧＳＤＡＧ（配列番号１２）
ｄ）ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＥＧＧＧＧＳ（配列番号１３）、および
ｅ）ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１４）
からなる群のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む。
【００６２】
この実施形態では、抗体は、リンカーを介して増殖因子のＣ末端に融合され得る、またはその逆であり得る。同様に、本発明の範囲は、抗体がコラーゲンに結合する実施形態にも、増殖因子がインスリン様増殖因子である実施形態にも限定されない。同様に、上記の論拠および好ましい実施形態がここで適用される。これは特に、生成収率における利点に適用される。
【００６３】
さらに別の態様によると、本発明は、抗体または標的結合特性を保持するその断片もしくは誘導体、および増殖因子または増殖因子活性を保持するその断片もしくはサブユニットを提供し、ここで前記抗体またはその断片もしくは誘導体、および前記増殖因子またはその断片もしくはサブユニットは、ペプチドリンカーによって連結され、ここで前記抗体は、以下のＣＤＲ
ＶＬ−ＣＤＲ１  配列番号１
ＶＬ−ＣＤＲ２  配列番号２
ＶＬ−ＣＤＲ３  配列番号３
ＶＨ−ＣＤＲ１  配列番号４
ＶＨ−ＣＤＲ２  配列番号５
ＶＨ−ＣＤＲ３  配列番号６
を有し、またここで前記増殖因子またはその断片もしくはサブユニットは、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）である。
【００６４】
この実施形態では、抗体は、リンカーを介して増殖因子のＣ末端に融合され得る、またはその逆であり得る。同様に、本発明の範囲は、リンカーが配列番号１０〜１４のいずれかであるような実施形態に限定されない。同様に、上記の論拠および好ましい実施形態がここで適用される。これは特に、抗体の有効性、および抗体と増殖因子との間の相乗的相互作用に適用される。
【００６５】
上記の論拠および好ましい実施形態も同様にここで適用される。
【００６６】
抗体／増殖因子比は、好ましくは表１に示される通りであり得る。
【００６７】
【表１】
2020508319.tif 000003
【００６８】
本発明のいくつかの実施形態では、融合ペプチドは、以下の要素を有する（表２）。
【００６９】
【表２】
2020508319.tif 000004
【００７０】
本発明の一実施形態によると、組換え融合タンパク質は、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−１分子のＣ末端とＣ１１抗体のＮ末端との間に配置される配列ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）のいずれかを有するペプチドリンカー、およびＣ１１抗体を含む。
【００７１】
本発明の別の実施形態によると、組換え融合タンパク質は、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−１分子のＣ末端とＣ１１抗体のＮ末端との間に配置される配列ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）（配列番号１０〜１４）のいずれかを有するペプチドリンカー、およびＣ１１抗体を含み、ここでＣ１１抗体は、ＩｇＧ形式またはダイアボディ形式を有する。
【００７２】
本発明の別の実施形態によると、組換え融合タンパク質は、ＩＧＦ−１を含み、（Ｇ４Ｓ）３またはＡＫＫＡＳであり、かつＩＧＦ−１分子のＣ末端とＣ１１抗体のＮ末端との間に配置されるペプチドリンカー、およびＣ１１抗体を含み、ここでＣ１１抗体は、ＩｇＧ形式またはダイアボディ形式を有する。
【００７３】
好ましくは、本発明に従う融合タンパク質は、組換え融合タンパク質である。
【００７４】
一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０のいずれかのアミノ酸配列を含む少なくとも１つの鎖を含む。
【００７５】
これらの配列の各々は、Ｎ−＞Ｃ方向に、ＩＧＦ−１（配列番号９）、上記に従うリンカー（配列番号１０、１１、１２、１３または１４）、およびＣ１１の可変重鎖（配列番号８）のアミノ酸配列を含む。
【００７６】
ＣＤＲおよびＶＬ／ＶＨ配列と同様、配列番号９で与えられるＩＧＦ−１の配列は、ＩＧＦ−１の異なるアイソタイプおよび突然変異体が存在する（すべてがそれらの生理学的活性を維持する）ことから、変動し得ることに着目されたい。
【００７７】
それ故、配列番号９に対して９０％同一である、好ましくは９３、９５、９８または９９％同一である配列を有する機能的ＩＧＦ−１変異体もまた、本発明の範囲により包含されることがさらに提供される。
【００７８】
他の一実施形態では、融合タンパク質は、前記鎖の２つに加えて、２つの抗体軽鎖を含む。この実施形態の例示を意図した図９を参照されたい。
【００７９】
本発明のさらなる一態様によると、前記融合タンパク質は、融合タンパク質を製造する方法であって、次のステップ；
ａ）（ｉ）前記抗体またはその断片もしくは誘導体、（ｉｉ）前記増殖因子またはその断片もしくはサブユニット、および（ｉｉｉ）前記ペプチドリンカーをコードする核酸配列を包含するゲノム、合成または相補的（ｃ）ＤＮＡの、各融合タンパク質の発現に適した少なくとも１つの発現ベクターへのクローニング
ｂ）好適な発現系における前記融合タンパク質の発現、および
ｃ）前記融合タンパク質の精製
を含む、方法により製造され得る。
【００８０】
本発明の一実施形態では、前記発現系は、哺乳動物細胞株を含む。前記細胞株は、好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である。
【００８１】
本発明の一実施形態では、前記製造方法により、１リットル以上の細胞培養物あたり１０ｍｇの融合タンパク質が得られる。
【００８２】
本発明のさらなる一態様によると、医学的処置のための上記の融合タンパク質の使用が提供される。
【００８３】
本発明のさらなる一態様によると、医薬としての使用するための上記の融合タンパク質が提供される。
【００８４】
本発明のさらなる一態様によると、（ａ）関節炎、優先的には変形性関節炎、または（ｂ）靱帯または腱損傷を罹患しているか、発症するリスクがあるか、またはその診断を受けている、ヒト対象または動物対象、好ましくはウマまたはイヌを治療する方法であって、上記に従う融合タンパク質を前記対象に投与するステップを含む、方法が提供される。
【００８５】
本発明のさらなる一態様によると、上記に従う融合タンパク質は、（ａ）関節炎、優先的には変形性関節症、または（ｂ）靱帯または腱損傷を罹患しているか、発症するリスクがあるか、またはその診断を受けているヒトまたは動物対象の治療における使用のため、提供される。
【００８６】
特に好ましい一実施形態では、前記動物は、哺乳動物、好ましくはウマまたはイヌである。両種は、定期的にかかる疾患を患うことになる。大部分の増殖因子の配列は、ヒト、イヌおよびウマを含む大部分の哺乳類において類似する。具体的には、ＩＧＦ１（配列番号９）は、ヒト、イヌおよびウマにおいて同一である。
【００８７】
上で考察したように、かかる場合、抗体は、哺乳類化、例えばイヌ化またはウマ化され得る。
【００８８】
一実施形態では、融合タンパク質は、関節内注射により投与される。この投与様式においては、融合タンパク質は、好適な配合を要求し、高濃度で投与される必要がある。本発明に従う融合タンパク質が高濃度で安定に配合され得ることを示す実施例５〜８を参照されたい。
【００８９】
本発明の別の態様によると、修復手術に用いるための靱帯または腱の前処理のex vivo方法が提供され、該方法は、靱帯または腱を上記に従う融合タンパク質とともにインキュベートするステップを含む。
【００９０】
好ましくは、靱帯が十字靱帯である一方、腱は膝蓋腱である。これに関連し、実施例１３への参照がなされる。
【００９１】
用語「融合タンパク質」は、本発明に従って用いられるとき、元は別々のタンパク質をコードした異なる遺伝子、または元はタンパク質の異なる領域もしくはドメインをコードした遺伝子の異なる部分に由来する２つ以上の核酸配列の連結を通じて作出されるキメラタンパク質に関する。
【００９２】
本発明に従う用語「発現ベクター」は、少なくとも１つの発現カセットを含む遺伝子ベクターを指す。
【００９３】
用語「発現カセット」は、コード領域の前に位置する調節エレメントまたはプロモーター、コード領域およびオープンリーディングフレームを各々有すると共に、コード領域の後に置かれた転写終結要素を有する、核酸分子および核酸分子の領域を各々指す。コード領域の前に存在する調節エレメントおよびプロモーターは各々、構成的プロモーター、すなわち転写を永久的に活性化するプロモーター（例えばＣＭＶプロモーター）、または調節可能なプロモーター、すなわちスイッチのオンおよび／またはオフが可能なプロモーター（例えばテトラサイクリン調節可能プロモーター）であり得る。発現カセットのコード領域は、５’末端に開始コドンを有しかつ３’末端に停止コドンを有するｃＤＮＡの場合のように、連続したオープンリーディングフレームであり得る。コード領域は、コーディングエクソンと点在する非コーディングイントロンとのゲノム編成または新たな組み合わせの編成から構成され得る。しかし、発現カセットのコード領域は、いわゆるＩＲＥ（内部リボソーム進入部位）によって分離された幾つかのオープンリーディングフレームから構成され得る。
【００９４】
本明細書で用いられるとき、トランスフェクションという用語は、外来ＤＮＡの真核細胞の核、またはＲＮＡの真核細胞への導入を意味する。トランスフェクションは、限定はされないが、リン酸カルシウム沈降、ＤＥＡＥ−デキストラン法、脂質、リポソーム、カチオン性ポリマー、活性化デンドリマー、もしくは磁気ビーズの使用、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）技術、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、「遺伝子銃」技術またはウイルスベクターに基づく導入を含む様々な方法によって媒介され得る。
【００９５】
安定的トランスフェクションでは、外来ＤＮＡが、細胞および核膜の通過により核に送達され、宿主ゲノムに組み込まれ、持続的に発現される。
【００９６】
一過性トランスフェクションでは、外来ＤＮＡが、真核細胞の核に送達されるが、ゲノムに組み込まれない、または外来ＲＮＡが、それが翻訳されるサイトゾルに送達される。遺伝子発現は通常、一過性トランスフェクションでは特定期間に制限され；増殖性細胞において、トランスフェクト核酸は、経時的に希釈除去されるようになっている。
【００９７】
本明細書で用いられるとき、用語「細胞株」は、それらが細胞培養下、好適な培養条件下で永久的に増殖し続ける可能性があるような方法で遺伝子改変される細胞を指す。かかる細胞は、不死化細胞または形質転換細胞であり得る。
【実施例】
【００９８】
本発明の対象のさらなる詳細、特徴、特性および利点は、従属クレーム、ならびに各々の実施例および図面の以下の説明にて開示され、それは本発明の好ましい実施形態を例示的様式で示す。しかし、これらの図面は、決して本発明の範囲を限定するものとして理解されるべきではない。
【００９９】
実施例１：ＣＨＯ−Ｓ細胞における一過性遺伝子発現によるＩＧＦ１−Ｃ１１融合タンパク質の作製
（Ａ）ＩＧＦ１および抗コラーゲンＩＩ抗体Ｃ１１を含む融合タンパク質のクローニング
（ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）由来の）ＩＧＦ−１および抗コラーゲンＩＩ抗体Ｃ１１を含む抗体融合タンパク質をコードする遺伝子を、ＰＣＲアセンブリを用いて作製した。（シグナルペプチド配列が欠如する）ＩＧＦ−１をコードする配列を、１５のアミノ酸（ＧＧＧＡＫ−ＧＧＧＧＫ−ＡＧＧＧＳ、配列番号１０）；（ＧＳＡＤＧ−ＧＳＳＡＧ−ＧＳＤＡＧ、配列番号１２）；（ＧＧＧＧＳ−ＧＧＧＧＥ−ＧＧＧＧＳ、配列番号１３）；（ＧＧＧＧＤ−ＧＧＧＧＤ−ＧＧＧＧＳ、配列番号１１）；ＧＧＧＧＳ−ＧＧＧＧＳ−ＧＧＧＧＳ（配列番号１４）（表３）をコードする５つの異なる配列を介して、Ｃ１１抗体の重鎖の可変領域（Ｃ１１（ＶＨ））をコードする遺伝子断片のＮ末端に連結した。ＩｇＧ由来シグナルペプチドをコードする配列をＮ末端に付加し、コードされた融合タンパク質の高収率作製を可能にした。改変されたＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ制限部位を用いて、「シグナルペプチド−ＩＧＦ−１−１５アミノ酸リンカー−Ｃ１１（ＶＨ）」を含む異なるＰＣＲで構築された断片を、Ｃ１１抗体の完全長重鎖および軽鎖遺伝子を有するｐＭＭ１３７−Ｃ１１（ＩｇＧ）ベクターにクローニングした。構築された遺伝子の模式図を図１に示す。
【０１００】
下で報じる実験で用いた成熟Ｃ１１可変軽鎖およびＩＧＦ−１−Ｃ１１可変重鎖融合タンパク質のアミノ酸配列を各々、配列番号７および８に示す。シグナルペプチドは、融合タンパク質の発現後に切断されることから、成熟融合タンパク質の一部ではない。
【０１０１】
【表３】
2020508319.tif 000005
【０１０２】
（Ｂ）融合タンパク質の発現
異なるリンカーを用いてＣ１１  ＩｇＧに融合されたＩＧＦ−１を含む融合タンパク質を、懸濁液適合ＣＨＯ−Ｓ細胞培養物における一過性遺伝子発現により作製した。細胞を、ＰＥＩ媒介トランスフェクションにより、０．５Ｌの規模で一過性に発現させた。トランスフェクション細胞を、振盪条件下、３１℃、（４ｍＭのＵｌｔｒａｇｌｕｔａｍｉｎｅを添加した）ＰｏｗｅｒＣＨＯ−２培地で６日間維持し、その後、培養上清を遠心分離により収集し、さらに処理し、融合タンパク質を精製した。
【０１０３】
（Ｃ）プロテインＡ樹脂を用いての融合タンパク質の精製
トランスフェクトされたＣＨＯ−Ｓ細胞懸濁培養物を、４℃、５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。０．４５μｍのフィルター（ｒａｐｉｄ  Ｆｌｏｗボトルトップフィルター、Ｎａｌｇｅｎｅ）を用いた濾過により、上清をさらに清澄化した。プロテインＡ樹脂（Ｕｌｔｒａ  ｌｉｎｋｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｒｅｓｉｎ，Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）を濾過上清に添加し、混合物を振盪条件下で約１時間インキュベートした。次に、樹脂を液体クロマトグラフィーカラム（ＳＩＧＭＡ）に収集し、「緩衝液Ａ」（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ツイーン２０（ＰＢＳ中）、ｐＨ７．４）で洗浄し、次いで「緩衝液Ｂ」（５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＰＢＳ中）、ｐＨ７．４）で２回目の洗浄を行った。０．１Ｍグリシン、ｐＨ３を用いて、融合タンパク質を重力流により溶出した。一定分量を収集し、融合タンパク質を含有する画分を、ＵＶ分光法により確認されると、プールし、ＰＢＳに対して一晩透析した。
【０１０４】
（Ｄ）結果
ＩＧＦ−１−Ｃ１１融合タンパク質の５つの異なる変異体を、一過性遺伝子発現により、ＣＨＯ−Ｓ細胞において５００ｍＬの規模で発現させた。発現実験は、タンパク質バッチの精製につながるように実施した。対応する哺乳動物発現ベクターを用いてのトランスフェクション後、細胞を、振盪条件下、３１℃で６日間維持した。上清を遠心分離および０．４μｍの濾過によって収集し、融合タンパク質をプロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって精製した。変異体は、一過性遺伝子発現実験における改善された発現の容量収量（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ  ｙｉｅｌｄｓ）を示した（表４）。
【０１０５】
【表４】
2020508319.tif 000006
【０１０６】
実施例２：ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析によるＩＧＦ−１−Ｃ１１融合タンパク質の特徴づけ
（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析
５μｇの一定分量の異なる精製された融合タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとその後のクーマシーブルー染色を用いて、還元および非還元条件下で分析した。ウエスタンブロット解析においては、試料を４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて走らせ、イモビロン−Ｐメンブレンに移し、ウサギ抗ヒトＩＧＦ１（１：５００）、次いで抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（１：２’０００）を用いて検出した。化学発光ＥＣＬ検出試薬を用いて、Ｘ線フィルム上でバンドシグナルを可視化した。
【０１０７】
（Ｂ）結果
融合タンパク質の完全性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとその後のクーマシーブルー染色により分析した（図２）。すべての変異体が、還元または非還元条件下で予想される分子量でのバンドを示し、すべてのリンカー変異体がＩＧＦ−１−Ｃ１１融合タンパク質の発現に適することが示唆される。
【０１０８】
融合タンパク質の同一性および完全性を、ウサギ抗ヒトＩＧＦ−１抗体を用いてウエスタンブロットにより分析した（図３）。還元条件下で、Ｃ１１抗体の重鎖に融合されたＩＧＦ−１（ＩＧＦ−１−ＨＣ（Ｃ１１））に対応する単一バンドのみを検出することができた。非還元条件下で、完全に構築されたＩＧＦ−１−Ｃ１１融合タンパク質に対応する約１６０ＫＤａの主要バンド以外では、おそらくは軽鎖の一方のコピーが欠損しているＩＧＦ−１−Ｃ１１（予想サイズが１３７．４ＫＤａ）、および軽鎖の両コピーが欠損しているＩＧＦ−１−Ｃ１１（予想サイズが１１４ＫＤａ）に対応する２つのより小さいバンドを検出することができた。これらの実験条件下で、ＩＧＦ−１−Ｃ１１変異体のいずれにおいても、Ｃ１１重鎖からのＩＧＦ−１分子の切断、または他の分解生成物を検出することができなかった。
【０１０９】
実施例３：サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によるＩＧＦ−１−Ｃ１１融合タンパク質の特徴づけ
（Ａ）融合タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィー
融合タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィーを、ＡＫＴＡ−ＦＰＬＣシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でランニングバッファーとしてＰＢＳを用いるＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｉｎｃｒｅａｓｅ  １０／３００  ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて実施した。０．２５ｍｇ／ｍＬの濃度のタンパク質溶液１００μｌをループ内に注射し、カラムに自動的に注射した。２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を経時的に評価した。
【０１１０】
（Ｂ）結果
コンジュゲート製剤の均一性および凝集状態を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  １０／３００  ＧＬカラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した（図４）。すべてのＩＧＦ−１−Ｃ１１変異体が、タンパク質の予想分子量と一致する、約１１．４ｍＬの保持容量での主ピーク、およびより早期の保持容量でタンパク質凝集体が溶出することを表す追加的な小ピークを示した。
【０１１１】
実施例４：表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）によるＩＧＦ１−Ｃ１１融合タンパク質の特徴づけ
（Ａ）融合タンパク質の表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）
ＩＧＦ１およびＣ１１抗体を含む融合タンパク質のコラーゲンＩＩへの結合親和性を、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｘ−１００システム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて分析した。マイクロセンサチップ（ＣＭ５，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、約２０００共鳴単位のコーティング密度で、コラーゲンＩＩでコーティングした。表面プラズモン共鳴に関する分析においては、タンパク質を、シリンジ駆動のフィルターユニット（Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）−ＧＶ、低いタンパク質結合性のデュラポアメンブレン、０．２２μｍ）で濾過し、それらの濃度を分光光度計で測定した。異なる融合タンパク質を、８００、４００、２００、および１００ｎＭの濃度で注射した。
【０１１２】
（Ｂ）結果
異なるペプチドリンカーを用いてのＩＧＦ１との融合後、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）を用いた確認として、Ｃ１１部分のコラーゲンＩＩに対する結合能を維持した。図５に示すように、異なる融合タンパク質は、コラーゲンＩＩに対する結合能を同等の結合動力学で保持した。
【０１１３】
実施例５：ＩＧＦ１−Ｃ１１融合タンパク質の濃度
（Ａ）ＩＧＦ１−Ｃ１１融合タンパク質の濃度
異なるペプチドリンカーを用いてＣ１１抗体に融合されたＩＧＦ１を含む融合タンパク質を、懸濁液適合ＣＨＯ−Ｓ細胞培養物における一過性遺伝子発現により作製した。プロテインＡによる精製とＰＢＳに対する透析の後、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）Ｔｕｒｂｏ  １５限外濾過スピンカラム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ，ＭＷＣＯ  １０ＫＤａ）を用いて、異なる試料をＰＢＳ中、１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。次に、試料の光学密度を、分光光度計（ＯＤ２８０ｎｍ）を用いて測定し、試料の最終濃度を評価するために用いた。
【０１１４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析においては、約５ｕｇの一定分量の異なる融合タンパク質を、限外濾過の前と後に、４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルとその後のクーマシーブルー染色を用いて、還元条件下で分析した。
【０１１５】
融合タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィーを、ＡＫＴＡ−ＦＰＬＣシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でランニングバッファーとしてＰＢＳを用いるＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｉｎｃｒｅａｓｅ  １０／３００  ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて実施した。分析においては、試料を０．２５ｍｇ／ｍＬ（限外濾過前の試料）または０．４ｍｇ／ｍＬ（限外濾過後の試料）まで希釈し、タンパク質溶液１００μｌをループ内に注射し、カラムに自動的に注射した。２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を経時的に評価した。
【０１１６】
（Ｂ）結果
異なる融合変異体を、ＳＥＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による確認として、ＰＢＳ中、約１０ｍｇ／ｍＬで配合することができ（表５、図６）、これは異なるＩＧＦ１に基づく融合タンパク質の良好な溶解度を示す。
【０１１７】
【表５】
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【０１１８】
実施例６：ＩＧＦ１−Ｃ１１融合タンパク質の凍結貯蔵中の安定性試験
（Ａ）凍結−解凍の安定性
異なるペプチドリンカーを用いてＣ１１抗体に融合されたＩＧＦ１を含む５つの融合タンパク質を１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、凍結貯蔵時のタンパク質安定性を測定するため、４サイクルの凍結および解凍を施した。バイアルを液体窒素に約２分間突っ込むことにより、タンパク質試料を急速凍結し、次に凍結試料を、試料が完全に解凍されるまで、室温で約５分間インキュベートした。凍結および解凍手順を全部で４回繰り返し、その後、試料を、凝集体または分解断片の存在について、２８０ｎｍでのＯＤ測定、サイズ排除クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングにより分析した。
【０１１９】
試料の光学密度を、分光光度計（ＯＤ２８０ｎｍ）を用いて測定した。融合タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィーを、ＡＫＴＡ−ＦＰＬＣシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でランニングバッファーとしてＰＢＳを用いるＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ５／１５０  ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて実施した。約１０ｍｇ／ｍＬの濃度のタンパク質溶液２０μｌをループ内に注射し、カラムに自動的に注射した。２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を経時的に評価した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥとその後のクーマシーブルー染色において走らせる、約５ｕｇの一定分量の異なる融合タンパク質を用いて還元条件下で実施した。ウエスタンブロット解析においては、試料を、４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて走らせ、イモビロン−Ｐメンブレンに移し、ウサギ抗ヒトＩＧＦ１（１：５００）、次いで抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（１：２’０００）を用いて検出した。化学発光ＥＣＬ検出試薬を用いて、Ｘ線フィルム上でバンドシグナルを可視化した。
【０１２０】
（Ｂ）結果
融合タンパク質の４回の凍結／および解凍後の完全性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとその後のクーマシーブルー染色（図７Ａ）、ウエスタンブロッティング（図７Ｂ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（図７Ｃ）により分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングにおける異なるＩＧＦ１−Ｃ１１変異体のバンド特性は、Ｔ０と凍結および解凍の４サイクル後とで同等であった。一方では、ＩＧＦ１−ＨＣおよびＣ１１−ＬＣ断片（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）またはＩＧＦ１−ＨＣ断片単独（ウエスタンブロッティング）に対応するバンドを各々、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングにより検出することができたが、これらの条件下で、Ｃ１１重鎖からのＩＧＦ１分子の切断、または他の分解生成物を認めることができなかった。同様に、異なるＩＧＦ１−Ｃ１１変異体のサイズ排除特性は、凍結および解凍サイクルの反復後に保持され、タンパク質の予想分子量と一致する、約１．７ｍＬの保持容量での主ピーク、およびより早期の保持容量でタンパク質凝集体が溶出することを表す追加的な小ピークを伴った。
【０１２１】
実施例７：ＩＧＦ１−Ｃ１１融合タンパク質の貯蔵中の安定性試験
（Ａ）貯蔵中の安定性試験
１０ｍｇ／ｍＬへの濃縮後、異なるペプチドリンカーを用いてＣ１１抗体に融合されたＩＧＦ１を含む５つの融合タンパク質を、０．５ｍＬの管にアリコートし（５０ｕＬの一定分量）、４℃、２５℃または３７℃のいずれかでインキュベートした。５つの異なる融合タンパク質からの単一の一定分量を、規定温度でのインキュベーションの１日後、１週後および１月後、ＯＤ２８０の測定、ＳＥＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングにより分析した。
【０１２２】
試料の光学密度を、分光光度計（ＯＤ２８０ｎｍ）を用いて判定した。融合タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィーを、ＡＫＴＡ−ＦＰＬＣシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でランニングバッファーとしてＰＢＳを用いるＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ５／１５０  ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて実施した。約１０ｍｇ／ｍＬの濃度のタンパク質溶液２０μｌをループ内に注射し、カラムに自動的に注射した。２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を経時的に評価した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥとその後のクーマシーブルー染色において走らせる、約５ｕｇの一定分量の異なる融合タンパク質を用いて還元条件下で実施した。ウエスタンブロット解析においては、試料を、４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて走らせ、イモビロン−Ｐメンブレンに移し、ウサギ抗ヒトＩＧＦ１（１：５００）、次いで抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（１：２’０００）を用いて検出した。化学発光ＥＣＬ検出試薬を用いて、Ｘ線フィルム上でバンドシグナルを可視化した。
【０１２３】
（Ｂ）結果
表６は、５つの融合タンパク質の異なる温度および異なる時点での安定性試験の結果を概説する。２８０ｎｍのＯＤ測定値は、異なるタンパク質変異体とインキュベーション条件との間の主要な差異を示さなかった。すべてのタンパク質変異体が、４℃で１か月に至るインキュベーションで良好な安定性を示し、ＳＥＣ分析およびＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはウエスタンブロッティングによって示されるように、タンパク質の品質における見かけの変化も、分解の主要な徴候も認められなかった。２５°または３７℃で少なくとも１週間のインキュベーションの結果、２．５ｍＬより大きい保持容量で、（約０．５〜８％の全ピーク面積を表す）小さい分解生成物のすべての試料でＳＥＣ特性における外観が得られた。これは、理論上の分子量よりも小さい見かけ上の分子量を有するＩＧＦ１−ＨＣ断片における新しいバンドの、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロッティングの双方における外観と相関した。
【０１２４】
【表６】
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【０１２５】
実施例８：ヒト血清中のＩＧＦ１−Ｃ１１融合タンパク質の安定性試験
（Ａ）血清安定性
一定分量の異なるＩＧＦ１−Ｃ１１融合タンパク質を、ヒト血清（１：１０の比）とともに３７℃で２４または１２０時間インキュベートした。次に、試料を、４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて走らせ、イモビロン−Ｐメンブレンに移し、ウサギ抗ヒトＩＧＦ１（１：５００）、次いで抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（１：２’０００）を用いて検出した。化学発光ＥＣＬ検出試薬を用いて、Ｘ線フィルム上でバンドシグナルを可視化した。
【０１２６】
（Ｂ）結果
ヒト血清を伴うインキュベーション時の異なる融合タンパク質の完全性を、ウサギ抗ヒトＩＧＦ１抗体を用いたウエスタンブロットにより分析した（図８）。還元条件下で、Ｃ１１抗体の重鎖に融合されたＩＧＦ−１（ＩＧＦ１−ＨＣ（Ｃ１１））に対応する約５７Ｋｄａの単一バンドのみを検出することができた。これらの実験条件下で、ＩＧＦ１−Ｃ１１変異体の不在下で、Ｃ１１重鎖からのＩＧＦ１分子の切断、または他の分解生成物を検出することができなかった。
【０１２７】
実施例９：ｓｃＦｖ−Ｆｃ形式およびＳＩＰ形式における抗コラーゲン抗体Ｃ１１にコンジュゲートされたＩＧＦ１の調製および特徴づけ
（Ａ）ＩＧＦ１および異なる抗体形式における抗コラーゲン抗体Ｃ１１を含む融合タンパク質のクローニング
ＩＧＦ１（ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）由来）ならびに異なる抗体形式における抗コラーゲンＩおよびＩＩ抗体Ｃ１１を含む抗体融合タンパク質をコードする遺伝子を、ＰＣＲアセンブリを用いて作製した。（シグナルペプチド配列が欠如する）ＩＧＦ１をコードする配列を、１５アミノ酸のグリシン−セリン−リンカー（ＧＧＧＧＳ−ＧＧＧＧＳ−ＧＧＧＧＳ）により、ｓｃＦｖ−ＦｃまたはＳＩＰ形式におけるＣ１１抗体をコードする遺伝子断片のＮ末端に連結した。ＩｇＧ由来のシグナルペプチドをコードする配列をＮ末端に付加し、コードされた融合タンパク質の高収率作製を可能にした。
【０１２８】
改変されたＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩ制限部位を用いて、ＩＧＦ１−Ｃ１１（ｓｃＦｖ−Ｆｃ）およびＩＧＦ１−Ｃ１１（ＳＩＰ）ｃＤＮＡに対応する構築したＰＣＲ断片を、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｎｅｏ（＋）にクローニングした。融合タンパク質の発現後、シグナルペプチドは、切断したことから、成熟融合タンパク質の一部ではない。構築した遺伝子の模式図を図１０に示す。
【０１２９】
ＩＧＦ１−Ｃ１１（ｓｃＦｖ−Ｆｃ）およびＩＧＦ１−Ｃ１１（ＳＩＰ）融合タンパク質のアミノ酸配列を各々、配列番号２０および２１で示す。
【０１３０】
（Ｂ）融合タンパク質の発現
（Ｇ４Ｓ）３リンカーを用いて、ｓｃＦｖ−ＦｃまたはＳＩＰ形式におけるＣ１１抗体に融合されたＩＧＦ１を含む融合タンパク質を、懸濁液適合ＣＨＯ−Ｓ細胞培養物における一過性遺伝子発現により作製した。細胞を、ＰＥＩ媒介トランスフェクションにより、０．７〜１Ｌの規模で一過性に発現させた。トランスフェクション細胞を、振盪条件下、３１℃、（４ｍＭのＵｌｔｒａｇｌｕｔａｍｉｎｅを添加した）ＰｏｗｅｒＣＨＯ−２培地で６日間維持し、その後、培養上清を遠心分離により収集し、さらに処理し、融合タンパク質を精製した。
【０１３１】
（Ｃ）プロテインＡ樹脂を用いる融合タンパク質の精製
トランスフェクトされたＣＨＯ−Ｓ細胞懸濁培養物を、４℃、５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。０．４５μｍのフィルターを用いた濾過により、上清をさらに清澄化した。プロテインＡ樹脂を濾過上清に添加し、混合物を振盪条件下で約１時間インキュベートした。次に、樹脂を液体クロマトグラフィーカラムに収集し、「緩衝液Ａ」（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ツイーン２０（ＰＢＳ中）、ｐＨ７．４）で洗浄し、次いで「緩衝液Ｂ」（５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＰＢＳ中）、ｐＨ７．４）で２回目の洗浄を行った。０．１Ｍグリシン、ｐＨ３を用いて、融合タンパク質を重力流により溶出した。一定分量を収集し、融合タンパク質を含有する画分を、ＵＶ分光法により確認されると、プールし、ＰＢＳに対して一晩透析した。
【０１３２】
（Ｄ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析
一定分量の異なる精製した融合タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとその後のクーマシーブルー染色を用いて、還元および非還元条件下で分析した。
【０１３３】
（Ｅ）融合タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィー
融合タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィーを、ＡＫＴＡ−ＦＰＬＣシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でランニングバッファーとしてＰＢＳを用いるＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｉｎｃｒｅａｓｅ  １０／３００  ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて実施した。タンパク質溶液１００μｌをループ内に注射し、カラムに自動的に注射した。２８０ｎｍでのＵＶ吸光度を経時的に評価した。
【０１３４】
（Ｆ）結果：ＣＨＯ−Ｓ細胞における一過性遺伝子発現による異なる抗体形式におけるＩＧＦ１−Ｃ１１融合タンパク質の作製
ＩｇＧ、ｓｃＦｖ−ＦｃおよびＳＩＰ形式に対応するＩＧＦ１−Ｃ１１融合タンパク質の３つの変異体を、一過性遺伝子発現により、７００ｍＬ〜１Ｌの規模でＣＨＯ−Ｓ細胞において発現させた。対応する哺乳動物の発現ベクターを用いたトランスフェクション後、細胞を振盪条件下、３１℃で６日間維持した。上清を遠心分離および０．４ｕｍの濾過により収集し、融合タンパク質をプロテインＡ親和性クロマトグラフィーにより精製した。一過性遺伝子発現実験において、ＩｇＧ形式におけるＩＧＦ１−Ｃ１１変異体は、ｓｃＦｖ−ＦｃおよびＳＩＰ形式を上回る（後者は発現できなかった）改善された発現の容量収量を示した（表７）。
【０１３５】
【表７】
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【０１３６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＩＧＦ１−Ｃ１１融合タンパク質の特徴づけ
融合タンパク質の完全性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとその後のクーマシーブルー染色により分析した（図１１）。ＩｇＧおよびｓｃＦｖ−Ｆｃ変異体の双方が、還元（Ｒ）または非還元（ＮＲ）条件下で、予想分子量でのバンドを示し、これらの形式がＩＧＦ１−Ｃ１１融合タンパク質の発現に適することが示唆された。
【０１３７】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によるＩＧＦ１−Ｃ１１融合タンパク質の特徴づけ
コンジュゲート製剤の均一性および凝集状態を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  １０／３００  ＧＬカラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した（図１１）。ＩｇＧ形式では、融合タンパク質は、タンパク質の予想分子量と一致する、約１１．４ｍＬの保持容量での主ピークを示した。ＩＧＦ１−Ｃ１１（ｓｃＦｖ−Ｆｃ）形式は、インタクトなタンパク質のより小さい分子量と一致する、約１２．３ｍＬでの主ピークを示した。両方の融合タンパク質変異体が、より早期の保持容量でタンパク質凝集体が溶出することを表す追加的な小ピークを示した。
【０１３８】
実施例１０：Ｃ１１のダイアボディ形式にコンジュゲートされたＩＧＦ１の調製および特徴づけ
（Ａ）ダイアボディ形式におけるクローニングおよび小規模作製
総ＩｇＧ形式およびダイアボディ形式における抗体分子を、ＩＧＦ１とのコンジュゲーションのために用いた。総ＩｇＧの融合の場合、ＩＧＦ−１を、ペプチドリンカー（Ｇ４Ｓ）３を通じて、図１２Ａに表すクローニングスキームに従うＶＨのＮ末端、または図１２Ｂに表すクローニングスキームに従うＣＨ３のＣ末端のいずれかにコンジュゲートした。
【０１３９】
ダイアボディの融合の場合、ＩＧＦ−１を、ペプチドリンカー（Ｇ４Ｓ）３を通じて、図１２Ｃに表すクローニングスキームに従うダイアボディのＮ末端、または図１２Ｄに表すクローニングスキームに従うダイアボディのＣ末端のいずれかにコンジュゲートした。
【０１４０】
つまり、それら調製物を次のように調製した。すなわち、トランスフェクトされたＣＨＯ−Ｓ細胞懸濁培養物を、４℃、５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。０．４５μｍのフィルターを用いた濾過により、上清をさらに清澄化した。プロテインＡ樹脂を濾過上清に添加し、混合物を振盪条件下で約１時間インキュベートした。次に、樹脂を液体クロマトグラフィーカラムに収集し、「緩衝液Ａ」（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ツイーン２０（ＰＢＳ中）、ｐＨ７．４）で洗浄し、次いで「緩衝液Ｂ」（５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＰＢＳ中）、ｐＨ７．４）で２回目の洗浄を行った。０．１Ｍグリシン、ｐＨ３を用いて、融合タンパク質を重力流により溶出した。一定分量を収集し、融合タンパク質を含有する画分を、ＵＶ分光法により確認されると、プールし、ＰＢＳに対して一晩透析した。
【０１４１】
（Ｂ）結果
総ＩｇＧ形式（Ｃ１１）のＮ末端にコンジュゲートしたＩＧＦ１に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィーおよびＢｉａｃｏｒｅ分析を、図２、４および５に示す。ダイアボディのＮ末端にコンジュゲートしたＩＧＦ１に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィーを図１３Ａに示す。ダイアボディのＣ末端にコンジュゲートしたＩＧＦ１に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィーを図１３Ｂに示す。これらの実験は、増殖因子が該抗体のＮ末端にコンジュゲートされる場合の第１の実施形態が優位な活性を有することを示す。
【０１４２】
実施例１１：総ＩｇＧに異なる方向性でコンジュゲートされたＩＧＦ１のインビトロ活性
我々は、ＩＧＦ−１が、（Ｇ４Ｓ）３リンカーを用いて、総ＩｇＧ形式における無関係抗体のＮ末端またはＣ末端に融合されるとき、ヒトＩＧＦＲ−１を安定に発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を刺激するその能力を保持するか否かを試験した。その結果を、Ｎ末端での融合については図１４Ａに、またＣ末端での融合については図１４Ｂに示す。
【０１４３】
ＩＧＦ−１を総免疫グロブリンＧまたはダイアボディとしてのＣ１１のＮ末端にコンジュゲートすることについて、実験を繰り返した。結果を、ＩｇＧのＮ末端での融合については図１４Ｃに、またダイアボディのＮ末端での融合については図１４Ｄに示す。
【０１４４】
Ｎ−＞Ｃの方向性を有する融合タンパク質：
Ｎ−増殖因子−リンカー−抗体−Ｃ
は、ペイロードが、毒素、増殖因子またはサイトカインであり、定常ドメイン（多くはそのＣ末端）に融合またはコンジュゲートされ、例えばＳＳ１Ｐのような、抗メソセリン抗体Ｆｖを含み、そのＣＨ１部分がＰＥ３８菌体外毒素に連結される、抗体の標的結合性に干渉しない場合、他の免疫複合体と全く異なる。
【０１４５】
発明者は、意外にも、これらの考察に反して、抗体の可変ドメインに対する増殖因子−リンカーの融合が後者の標的結合に干渉しないことを示している。
【０１４６】
実施例１２：ＩＧＦ１−Ｃ１１のインビボ活性
（Ａ）治療実験
ＩＧＦ１−Ｃ１１（ＩｇＧおよび（Ｇ４Ｓ）３リンカーとの融合体）を、変形性関節症（ＯＡ）のラット内側半月板断裂（ＭＭＴ）モデルにおいて、非標的ＩＧＦ−１、フィブロネクチンの抗ＥＤＡドメインに対するＦ８抗体にコンジュゲートされたＩＧＦ−１、およびＦＧＦ−１８、このモデルにおけるベンチマークである増殖因子と比べて試験した。
【０１４７】
ＯＡのＭＭＴモデルにおいては、体重が一致したルイスラット（３００〜３２５ｇ）に膝のＭＭＴ手術を施した。関節を露出させ、内側側副靱帯を横切することにより、偽手術を実施した。次に、ＭＭＴ動物において、露出した半月板をその最も狭いポイントで横切した。次に、関節および皮膚を縫合により閉じた。手術（０日目）までにＯＡを誘発した後、ラットを７つの異なる群（各々がラット９匹）に分け、次のように週１回で３週間（３週目、４週目および５週目）、関節内注射した。
１）ＰＢＳ
２）ＩＧＦ−１−ＩｇＧ（ＫＳＦ）  １回／週  ６００ｕｇ（非標的ＩＧＦ−１融合タンパク質）
３）ＩＧＦ−１−ＩｇＧ（Ｆ８）  １回／週  ６００ｕｇ（抗ＥＤＡ抗体を有するＩＧＦ−１融合タンパク質）
４）ＩＧＦ−１−ＩｇＧ（Ｃ１１）  １回／週  １００ｕｇ
５）ＩＧＦ−１−ＩｇＧ（Ｃ１１）  １回／週  ３００ｕｇ
６）ＩＧＦ−１−ＩｇＧ（Ｃ１１）  １回／週  ６００ｕｇ
７）ＦＧＦ−１８  ２回／週        ２回／週  ５ｕｇ
【０１４８】
１０週目、組織学的検査のため、動物を屠殺し、膝を収集した。実験の結果を図１５に示す。
【０１４９】
（Ｂ）免疫組織化学
実施例１２に記載の治療試験から取得した組織のＩＨＣ分析においては、エピトープ回復後、すべてのスライドを、ストレプトアビジンブロックで１５分間、ビオチンブロックで１５分間、二重内因性酵素ブロックで１０分間およびタンパク質ブロックで２０分間処理した。内因性酵素活性および非特異的結合に対する遮断後、２ｕｇ／ｍＬのウサギ抗ヒト抗体を、スライド上で３０分間インキュベートし、一次抗体（Ｃ１１またはＦ８）を検出した。抗ウサギＨＲＰポリマーを用いて、二次抗体を標識し（１０分）、次いでジアミノベンジジンを２分間適用し、反応物を染色した。スライドをヘマトキシリンで対比染色した。各ステップ間で、洗浄緩衝液を用いる３回の洗浄ステップを実施した。結果を図１６に示す。
【０１５０】
実施例１３：ヒツジ十字靱帯および膝蓋腱の染色
（Ａ）ＩｇＧ形式におけるＣ１１抗体による十字靱帯および膝蓋腱の染色
膝蓋腱および前十字靱帯の試料を、無関係の外科実験手順後に安楽死させた若年（約２００日）交雑家畜ヒツジ３匹から得た。安楽死から３０分以内に試料を収集し、ＯＣＴ包埋し、凍結し、次いで−８０℃で保存した。つまり、ＩｇＧ形式における精製したＫＳＦおよびＣ１１抗体を、０．５μｇ／ｍｌの最終濃度で切片に添加した。一次抗体の検出を、ウサギ抗ヒトＩｇＧ（１：１０００）、次いで抗ウサギアレクサ４８８（１：５００）を用いて実施した。
【０１５１】
（Ｂ）ＩＲＤｙｅ８００ＣＷで蛍光標識されたＣ１１またはＫＳＦを用いたヒツジ十字靱帯および膝蓋腱の染色
膝蓋腱および前十字靱帯の試料を、無関係の外科実験手順後に安楽死させた若年（約２００日）交雑家畜ヒツジから得た。安楽死から３０分以内に試料を収集し、ＰＢＳに入れ、４℃にした。両方のセグメントを、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷで蛍光標識したＣ１１またはＫＳＦのいずれかの５０μｇ／ｍＬの溶液１ｍＬに浸した。穏やかな混合後、セグメントを標識溶液から取り除き、新しいＰＢＳで繰り返し洗浄した。ＩＶＩＳスペクトルイメージングシステム（０．２秒の曝露、ビニングファクタ４、７４５ｎｍで励起、８００ｎｍでの発光フィルター、ｆ値が２、有効視野１３．１）で画像を取得した。初回洗浄ステップ直後（ｔ＝０）または２時間後（ｔ＝２時間）のいずれかに画像を取得した。セグメントは、取得間で新しいＰＢＳ溶液中で維持した。
【０１５２】
（Ｃ）結果
ＩｇＧ形式におけるＣ１１抗体を用いて実施した染色によると、ＫＳＦと比べて有意により明るいシグナルが示された（図１７Ａ）。ＩＲＤｙｅ８００ＣＷで蛍光標識したＣ１１抗体について、無関係のＫＳＦ抗体と比べるとき、靱帯および十字型に対する特異的かつ長期持続的な結合を認めることができた（図１７Ｂ）。
【０１５３】
これらの実験は、増殖因子および好適な抗体を含む融合タンパク質を、
・靱帯または腱損傷を患う、それを発現するリスクがある、もしくはそれの診断を受けている患者の治療、および／または
・修復術に用いるための靱帯または腱のex vivo前処理
に用いることができることを示唆する。
【０１５４】
実施例１４：ＩＧＦ１−Ｃ１１およびＩＧＦ１−Ｆ９の血液濃度の測定
（Ａ）血液濃度の測定
変形性関節症（ＯＡ）のラット内側半月板断裂（ＭＭＴ）モデルにおいて、ＩＧＦ１−Ｃ１１（ＩｇＧおよび（Ｇ４Ｓ）３リンカーとの融合体）およびＩＧＦ１−Ｆ９（ＩｇＧおよび（Ｇ４Ｓ）３リンカーとの融合体）を、陰性対照としてＩＧＦ１−ＫＳＦと比べて試験した。ラットに、様々な量：１００、３００または６００ｕｇ／用量を週１回で３週間、関節内注射し、４２日目に中止した。最初から２回の注射後、ＩＧＦ１−Ｃ１１およびＩＧＦ１−Ｆ９の血液レベルを、ＩＧＦ１−ＫＳＦの血液レベルと比較した。
【０１５５】
（Ｂ）結果
ＩＧＦ１−Ｃ１１は、ＩＧＦ１−Ｆ９およびＩＧＦ１−ＫＳＦと比べて最低の血液曝露を有した。ＩＧＦ１−ＫＳＦとの有意な曝露差は、疾患の部位でのＣ１１を介した融合の標的化が有効であり、かつ血液中での漏出が制限されることを示した（図１８Ａ）。ＩＧＦ１−Ｆ９は、ＩＧＦ１−ＫＳＦと比べて同等な血液曝露を示した（図１８Ｂ）。結果によると、その血清濃度低下によって確認される通り、Ｆ９抗体を上回るＣ１１抗体の優位性が示され、これは病変部位での取り込みおよび保持がより高度であることを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】ＣＨＯ−Ｓ細胞における異なるＩＧＦ１−Ｃ１１変異体の作製に用いられるＩＧＦ１−Ｃ１１哺乳動物発現ベクターの略図。ＳＰ＝シグナルペプチド、Ｃ１１−ＬＣ＝Ｃ１１抗体の軽鎖配列、ｐＡ＝ポリＡシグナル；Ｃ１１−ＶＨ＝Ｃ１１抗体の重鎖の可変ドメイン、Ｃ１１−Ｆｃ＝抗体のＣＨ１およびＦｃ部分を含むＣ１１重鎖断片。
【図２】一過性遺伝子発現によって作製されるＩＧＦ１−Ｃ１１変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【図３】一過性遺伝子発現によって作製されるＩＧＦ１−Ｃ１１変異体のウエスタンブロット解析。
【図４】一過性遺伝子発現によって作製されるＩＧＦ１−Ｃ１１変異体のサイズ排除クロマトグラフィー分析。
【図５】コラーゲンＩＩ抗原でコーティングされたセンサチップ上での異なるＩＧＦ１−Ｃ１１融合タンパク質の表面プラズモン分析（ＢＩＡｃｏｒｅ）。
【図６−１】（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥのクーマシーブルー染色、ならびに（Ｂ）限外濾過による濃縮前および後のサイズ排除クロマトグラフィーによる、異なるＩＧＦ１−Ｃ１１変異体の品質管理分析。
【図６−２】（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥのクーマシーブルー染色、ならびに（Ｂ）限外濾過による濃縮前および後のサイズ排除クロマトグラフィーによる、異なるＩＧＦ１−Ｃ１１変異体の品質管理分析。
【図７−１】異なるＩＧＦ１−Ｃ１１タンパク質変異体の凍結／解凍（Ｆ／Ｔ）の前（Ｔ０）および４サイクル後の分析。（Ａ）還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥであり、予想バンド：ＩＧＦ１−Ｃ１１−ＨＣ＝約５７Ｋｄａ、Ｃ１１−ＬＣ＝約２３．４ＫＤａ。（Ｂ）検出を意図した抗ＩＧＦ１抗体を用いての還元条件下でのウエスタンブロッティングであり、予想バンド：ＩＧＦ１−Ｃ１１−ＨＣ＝約５７Ｋｄａ、および（Ｃ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ５／１５０  ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いるサイズ排除クロマトグラフィー。
【図７−２】異なるＩＧＦ１−Ｃ１１タンパク質変異体の凍結／解凍（Ｆ／Ｔ）の前（Ｔ０）および４サイクル後の分析。（Ａ）還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥであり、予想バンド：ＩＧＦ１−Ｃ１１−ＨＣ＝約５７Ｋｄａ、Ｃ１１−ＬＣ＝約２３．４ＫＤａ。（Ｂ）検出を意図した抗ＩＧＦ１抗体を用いての還元条件下でのウエスタンブロッティングであり、予想バンド：ＩＧＦ１−Ｃ１１−ＨＣ＝約５７Ｋｄａ、および（Ｃ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ５／１５０  ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いるサイズ排除クロマトグラフィー。
【図８】ＩＧＦ１−Ｃ１１タンパク質変異体の、３７℃、ヒト血清中での２４または１２０時間のインキュベーション後のウエスタンブロット解析。試料を還元条件下で走らせ、抗ＩＧＦ１抗体を用いて可視化した。予想バンド：ＩＧＦ１−Ｃ１１−ＨＣ＝約５７ＫＤａ。
【図９】重鎖および軽鎖を有するＩｇＧ１型抗体、および重鎖のＮ末端に融合されたペプチドリンカーとともに、ペプチドリンカーのＮ末端に融合された増殖因子を含む、本発明の例示的実施形態の模式図。ペプチドリンカーは、典型的にはＡＫＫＡＳリンカーとして示され、また増殖因子は、典型的にはＩＧＦ−１として示される。
【図１０】ＣＨＯ−Ｓ細胞における異なるＩＧＦ１−Ｃ１１形式の作製に用いられるＩＧＦ１−Ｃ１１哺乳動物発現ベクターの略図。（Ａ）ＩｇＧ形式におけるＩＧＦ１−Ｃ１１、（Ｂ）ｓｃＦｖ−Ｆｃ形式におけるＩＧＦ１−Ｃ１１、および（Ｃ）ＳＩＰ形式におけるＩＧＦ１−Ｃ１１。ＳＰ＝シグナルペプチド、Ｃ１１−ＬＣ＝Ｃ１１抗体の軽鎖配列、ｐＡ＝ポリＡシグナル；Ｃ１１−ＶＬ＝Ｃ１１抗体の軽鎖の可変ドメイン、Ｃ１１−ＶＨ＝Ｃ１１抗体の重鎖の可変ドメイン、Ｃ１１−Ｆｃ＝抗体のＣＨ１およびＦｃ部分を含むＣ１１重鎖断片、ＣＨ４＝ヒトＩｇＥ分泌型アイソフォームの重鎖定常領域４。
【図１１】（Ａ）ＩｇＧ形式、および（Ｂ）ｓｃＦｖ−Ｆｃ形式におけるＩＧＦ１−Ｃ１１融合タンパク質のＳＥＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる品質管理分析。
【図１２−１】ＩｇＧまたはダイアボディのＣ末端またはＮ末端でのＩＧＦ１におけるクローニング方法を示す。
【図１２−２】ＩｇＧまたはダイアボディのＣ末端またはＮ末端でのＩＧＦ１におけるクローニング方法を示す。
【図１３−１】ＩＧＦ１がＩｇＧとダイアボディの双方のＮ末端で融合されるときに十分に機能する一方、ダイアボディのＣ末端での融合の結果、そのインビボでの使用を妨害することになる共有結合二量体が生じることを示す。
【図１３−２】ＩＧＦ１がＩｇＧとダイアボディの双方のＮ末端で融合されるときに十分に機能する一方、ダイアボディのＣ末端での融合の結果、そのインビボでの使用を妨害することになる共有結合二量体が生じることを示す。
【図１４−１】ＩＧＦ１が、ＩｇＧのＮ末端で融合されるときにその生物学的活性を保持する一方、ＩｇＧのＣ末端で融合されるときにＩＧＦ１受容体を発現する細胞の増殖を誘導しないことを示す。非コンジュゲートＩＧＦ１は陽性対照として用いられ、非刺激細胞は陰性対照として用いられる。
【図１４−２】ＩＧＦ１が、ＩｇＧおよびダイアボディ形式の双方におけるＣ１１抗体のＮ末端で融合されるときにその生物学的活性を保持することを示す。非コンジュゲートＩＧＦ１は陽性対照として用いられ、非刺激細胞は陰性対照として用いられる。
【図１５】変形性関節症のラットモデルにおける異なる用量のＩＧＦ１−Ｃ１１が、滑液嚢内注射後に軟骨再生を促進することを示す。かかる改善は、ＰＢＳ、無関係のＫＳＦ抗体に融合されたＩＧＦ１、抗ＥＤＡ「Ｆ８」抗体に融合されたＩＧＦ１、およびＦＧＦ１８、ＯＡの治療における生物学的なベンチマークである増殖因子と比べて優位であることが統計学的に有意である。
【図１６】融合タンパク質ＩＧＦ１−Ｃ１１が、変形性関節症のラットモデルにおいて、滑液嚢内注射後、軟骨への持続的局所化（治療後の＞５週）を示すことを示す。ＰＢＳ、ＩＧＦ１−ＫＳＦおよびＩＧＦ１−Ｆ８で治療された軟骨では、染色が視認できない。
【図１７】ＩｇＧ形式におけるＣ１１抗体（Ａ）を用いて、またはＩＲＤｙｅ８００ＣＷで蛍光標識されたＣ１１抗体（Ｂ）を用いてのヒツジ十字靱帯および膝蓋腱の染色を示す。
【図１８】ＩＧＦ１−Ｃ１１、ＩＧＦ１−Ｆ９およびＩＧＦ１−ＫＳＦの、変形性関節症（ＯＡ）のラット内側半月板断裂（ＭＭＴ）モデルにおける６００μｇ／用量のＩＧＦ１−Ｃ１１、ＩＧＦ１−Ｆ９およびＩＧＦ１−ＫＳＦの週１回の１回目および２回目の関節内注射後の血液レベルを示す。（Ａ）ＩＧＦ１−Ｃ１１およびＩＧＦ１−ＫＳＦの血液レベルの比較：ＩＧＦ１−Ｃ１１は最低の血液曝露を示す、（Ｂ）ＩＧＦ１−Ｆ９およびＩＧＦ１−ＫＳＦの血液レベルの比較：ＩＧＦ１−Ｆ９は、ＩＧＦ１−ＫＳＦと類似し、かつＩＧＦ１−Ｃ１１よりも高い血液曝露を示す。
【０１５７】
参考文献
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【０１５８】
【表８】
2020508319.tif 000011
2020508319.tif 000012
【図１】
2020508319.tif 000013
【図２】
2020508319.tif 000014
【図３】
2020508319.tif 000015
【図４】
2020508319.tif 000016
【図５】
2020508319.tif 000017
【図６−１】
2020508319.tif 000018
【図６−２】
2020508319.tif 000019
【図７−１】
2020508319.tif 000020
【図７−２】
2020508319.tif 000021
【図８】
2020508319.tif 000022
【図９】
2020508319.tif 000023
【図１０】
2020508319.tif 000024
【図１１】
2020508319.tif 000025
【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
2020508319.tif 000028
【図１３−２】
2020508319.tif 000029
【図１４−１】
2020508319.tif 000030
【図１４−２】
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【図１５】
2020508319.tif 000032
【図１６】
2020508319.tif 000033
【図１７】
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【図１８】
2020508319.tif 000035
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年9月26日(2019.9.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体または標的結合特性を保持するその断片もしくは誘導体、および
インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ-１）を含む
融合タンパク質であって、
前記抗体またはその断片もしくは誘導体、および前記増殖因子が、ペプチドリンカーによって連結され、
前記ペプチドリンカーが、前記抗体またはその前記断片もしくは誘導体の少なくとも１つのペプチド鎖のＮ末端に融合される、
融合タンパク質。
【請求項２】
前記抗体またはその断片もしくは誘導体が、コラーゲンに特異的に結合される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記抗体またはその断片もしくは誘導体が、コラーゲンＩとコラーゲンＩＩの双方に結合する能力がある、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記コラーゲンが、ヒトコラーゲン、イヌコラーゲンまたはウマコラーゲンである、請求項２または３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記抗体が、ハイブリドーマ由来抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体からなる群のいずれかから選択されるモノクローナル抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記抗体が、イヌもしくはイヌ化抗体、および／またはウマもしくはウマ化抗体からなる群のいずれかから選択されるモノクローナル抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記抗体が、
・ＩｇＧ
・ダイアボディ
からなる群から選択される少なくとも１つの形式である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記リンカーが、
ａ）ＧＧＧＡＫＧＧＧＧＫＡＧＧＧＳ（配列番号１０）
ｂ）ＧＧＧＧＤＧＧＧＧＤＧＧＧＧＳ（配列番号１１）
ｃ）ＧＳＡＤＧＧＳＳＡＧＧＳＤＡＧ（配列番号１２）
ｄ）ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＥＧＧＧＧＳ（配列番号１３）、および
ｅ）ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１４）
からなる群のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記抗体が、以下のＣＤＲを有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
ＶＬ−ＣＤＲ１  配列番号１
ＶＬ−ＣＤＲ２  配列番号２
ＶＬ−ＣＤＲ３  配列番号３
ＶＨ−ＣＤＲ１  配列番号４
ＶＨ−ＣＤＲ２  配列番号５
ＶＨ−ＣＤＲ３  配列番号６
【請求項１０】
前記抗体が、配列番号７に記載の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）ドメインおよび配列番号８に記載の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）ドメインを有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記抗体がＣ１１である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記融合タンパク質が、組換え融合タンパク質である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
融合タンパク質が、配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む少なくとも１つの鎖を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
融合タンパク質が、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む少なくとも１つの鎖を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
融合タンパク質が、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含む少なくとも１つの鎖を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
融合タンパク質が、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含む少なくとも１つの鎖を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
融合タンパク質が、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含む少なくとも１つの鎖を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
融合タンパク質が、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含む少なくとも１つの鎖を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質を製造するための方法であって、
ａ）（ｉ）前記抗体またはその断片もしくは誘導体、
（ｉｉ）インスリン様増殖因子１、および
（ｉｉｉ）前記ペプチドリンカー
をコードする核酸配列を包含するゲノム、合成または相補的（ｃ）ＤＮＡを、各融合タンパク質の発現に適した少なくとも１つの発現ベクターにクローンニングするステップと、
ｂ）前記融合タンパク質を好適な発現系において発現させるステップと、
ｃ）前記融合タンパク質を精製するステップと
を含む、方法。
【請求項２０】
前記発現系が、哺乳動物細胞株を含む、請求項１９に記載の製造するための方法。
【請求項２１】
１リットル以上の細胞培養物あたり１０ｍｇの融合タンパク質を産生する、請求項１９又は２０に記載の製造するための方法。
【請求項２２】
医学的処置のための、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項２３】
医薬としての使用するための、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
（ａ）関節炎、優先的には変形性関節症、または（ｂ）靱帯または腱損傷に罹患しているか、発症するリスクがあるか、またはその診断を受けているヒトまたは動物対象を治療する方法であって、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質を前記対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項２５】
（ａ）関節炎、優先的には変形性関節症、または（ｂ）靱帯または腱損傷に罹患しているか、発症するリスクがあるか、またはその診断を受けているヒトまたは動物対象の治療における使用のための、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
前記融合タンパク質が、関節内注射によって投与される、請求項２４に記載の方法、または請求項２５に記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
修復手術に用いるための靱帯または腱の前処理のex vivo方法であって、靱帯または腱を請求項１〜１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質とともにインキュベートするステップを含む、方法。
【国際調査報告】
2020508319.tif 000036
2020508319.tif 000037
2020508319.tif 000038
2020508319.tif 000039