(57)【要約】  本明細書に開示されるのは、細胞の増殖を阻害する、または細胞死を誘導するための組成物および方法である。細胞の増殖を阻害する、または細胞死を誘導することができる組成物は、５’−三リン酸非直鎖状ＲＮＡを含む。該ＲＮＡは、少なくとも８個のヌクレオチド対合の完全または部分的なハイブリダイゼーションから形成される第１のステムループを含み、少なくとも８個のヌクレオチド対合の完全または部分的なハイブリダイゼーションから形成される第２のステムループ、および第１のステムループと第２のステムループの間のスペーサーを含んでもよい。細胞の増殖を阻害する、または細胞死を誘導するための方法は、組成物と細胞を接触させるステップ、または細胞の増殖を阻害する、または細胞の死を誘導するのに有効な量で組成物を対象に投与するステップを含む。
2020515625.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’−三リン酸、２’−フルオロ修飾ピリミジン非直鎖状ＲＮＡを含む、細胞死を誘導することができる組成物であって、
ＲＮＡが、
（ａ）少なくとも８個のヌクレオチド対合の完全または部分的なハイブリダイゼーションから形成される第１のステムループと、
（ｂ）少なくとも８個のヌクレオチド対合の完全または部分的なハイブリダイゼーションから形成される第２のステムループと、
（ｃ）第１のステムループと第２のステムループの間のスペーサーと
を含む、組成物。
【請求項２】
ＲＮＡが、ＩＣＲ２（配列番号８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＲＮＡが、ＩＣＲ４（配列番号１５）、ＩＣＲ４Ａ（配列番号１６）、ＩＣＲ５Ｘ（配列番号１７）、またはＩＣＲ５Ｙ（配列番号１８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
ＲＮＡが、ＩＣＲ４（配列番号１５）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
ＲＮＡが、ＩＣＲ４Ａ（配列番号１６）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
ＲＮＡが、ＩＣＲ５Ｘ（配列番号１７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
ＲＮＡが、ＩＣＲ５Ｙ（配列番号１８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項８】
ＲＮＡが、
ＩＣＲ５Ｘ（配列番号１７）またはＩＣＲ５Ｙ（配列番号１８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する第１のオリゴヌクレオチドと、
第１のオリゴヌクレオチドの一部に完全または部分的にハイブリダイズされた第２のオリゴヌクレオチドと
を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項９】
第１のオリゴヌクレオチドが、ＩＣＲ５Ｘ（配列番号１７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドを含み、
第２のオリゴヌクレオチドが、ＩＣＲ５Ｙ（配列番号１８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドを含む、
請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
第１のステムループが、ＩＣＲ２（配列番号８）から本質的になるオリゴヌクレオチドから形成される、請求項２から９までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
ＲＮＡが、
（ｉ）ＩＣＲ４（配列番号１５）またはＩＣＲ４Ａ（配列番号１６）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチド、または
（ｉｉ）ＩＣＲ５Ｙ（配列番号１８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する第２のオリゴヌクレオチドに完全または部分的にハイブリダイズされた、ＩＣＲ５Ｘ（配列番号１７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する第１のオリゴヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡ
から本質的になる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
ＲＮＡが、ＩＣＲ４（配列番号１５）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドから本質的になる、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
ＲＮＡが、ＩＣＲ４Ａ（配列番号１６）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドから本質的になる、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
ＲＮＡが、ＩＣＲ５Ｙ（配列番号１８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する第２のオリゴヌクレオチドに完全または部分的にハイブリダイズされた、ＩＣＲ５Ｘ（配列番号１７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する第１のオリゴヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡから本質的になる、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
第１のステムループが、その相補体とハイブリダイズして第１のステムループを形成することができる５’−三リン酸修飾末端ヌクレオチドを含み、
第２のステムループが、その相補体とハイブリダイズして第２のステムループを形成することができる５’−三リン酸修飾末端ヌクレオチドまたは３’末端ヌクレオチドを含む、
請求項１から１４までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
第１のステムループが、その相補的ヌクレオチドとハイブリダイズして第１のステムループを形成することができる５’−三リン酸修飾末端ヌクレオチドを含み、
第２のステムループが、その相補的ヌクレオチドとハイブリダイズして第２のステムループを形成することができる５’−三リン酸修飾末端ヌクレオチドまたは３’末端ヌクレオチドを含む、
請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
第１のステムループが、その相補的ヌクレオチドとハイブリダイズして第１のステムループを形成することができる５’−三リン酸修飾末端ヌクレオチドを含み、
第２のステムループが、その相補的ヌクレオチドとハイブリダイズして第２のステムループを形成することができる３’末端ヌクレオチドを含む、
請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
第１のステムループが、その相補的ヌクレオチドとハイブリダイズして第１のステムループを形成することができる５’−三リン酸修飾末端ヌクレオチドを含み、
第２のステムループが、その相補的ヌクレオチドとハイブリダイズして第２のステムループを形成することができる５’−三リン酸修飾末端ヌクレオチドを含む、
請求項１５に記載の組成物。
【請求項１９】
スペーサーがＲＮＡの一本鎖セグメントを含む、請求項１から１８までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
スペーサーが、少なくとも８個のヌクレオチド対合の完全または部分的なハイブリダイゼーションから形成される第３のステムループを含む、請求項１から１９までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
スペーサーが、ＲＮＡの二本鎖セグメントを含む、請求項１から２０までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
ＩＣＲ２（配列番号８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドから形成されるステムループを含む２’−フルオロ修飾ピリミジン非直鎖状ＲＮＡを含む、細胞死を誘導することができる組成物であって、オリゴヌクレオチドが、その相補的ヌクレオチドとハイブリダイズしてステムループを形成することができる５’−三リン酸修飾末端ヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項２３】
ＲＮＡが、少なくとも８個のヌクレオチド対合の完全または部分的なハイブリダイゼーションから形成される第２のステムループと、ＩＣＲ２（配列番号８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドから形成されるステムループと第２のステムループの間のスペーサーとをさらに含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
ＲＮＡが、ＩＣＲ４（配列番号１５）、ＩＣＲ４Ａ（配列番号１６）、ＩＣＲ５Ｘ（配列番号１７）、またはＩＣＲ５Ｙ（配列番号１８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
ＲＮＡが、ＩＣＲ４（配列番号１５）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
ＲＮＡが、ＩＣＲ４Ａ（配列番号１６）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
ＲＮＡが、ＩＣＲ５Ｘ（配列番号１７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２８】
ＲＮＡが、ＩＣＲ５Ｙ（配列番号１８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２９】
ＲＮＡが、
ＩＣＲ５Ｘ（配列番号１７）またはＩＣＲ５Ｙ（配列番号１８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する第１のオリゴヌクレオチドと、
第１のオリゴヌクレオチドの一部に完全または部分的にハイブリダイズされた第２のオリゴヌクレオチドと
を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項３０】
第１のオリゴヌクレオチドが、ＩＣＲ５Ｘ（配列番号１７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドを含み、
第２のオリゴヌクレオチドが、ＩＣＲ５Ｙ（配列番号１８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドを含む、
請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
ステムループが、ＩＣＲ２（配列番号８）から本質的になるオリゴヌクレオチドから形成される、請求項２３から３０までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３２】
ＲＮＡが、
（ｉ）ＩＣＲ４（配列番号１５）もしくはＩＣＲ４Ａ（配列番号１６）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチド、または
（ｉｉ）ＩＣＲ５Ｙ（配列番号１８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する第２のオリゴヌクレオチドに完全または部分的にハイブリダイズされた、ＩＣＲ５Ｘ（配列番号１７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する第１のオリゴヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡ
から本質的になる、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３３】
ＲＮＡが、ＩＣＲ４（配列番号１５）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドから本質的になる、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
ＲＮＡが、ＩＣＲ４Ａ（配列番号１６）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドから本質的になる、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３５】
ＲＮＡが、ＩＣＲ５Ｙ（配列番号１８）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する第２のオリゴヌクレオチドに完全または部分的にハイブリダイズされた、ＩＣＲ５Ｘ（配列番号１７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する第１のオリゴヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡから本質的になる、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３６】
治療剤をさらに含む、請求項１から３５までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３７】
治療剤が、化学療法剤、抗癌生物製剤、免疫療法剤、およびそれらの任意の組み合わせから選択される群のメンバーを含む、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
細胞質送達組成物をさらに含む、請求項１から３７までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３９】
細胞質送達組成物が、リポソーム、合成ポリマー、細胞透過性ペプチド、ナノ粒子、ウイルス粒子、エレクトロポレーション緩衝液、またはヌクレオフェクション試薬、およびそれらの任意の組み合わせからなる群のメンバーを含む、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
請求項１から３９までのいずれか１項に記載の組成物の治療有効量、および１つまたは複数の薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項４１】
細胞の増殖を阻害する、または細胞の死を誘導するのに有効な量で、請求項１から４０までのいずれか１項に記載の組成物と細胞を接触させるステップを含む、細胞の増殖を阻害する、または細胞死を誘導する方法。
【請求項４２】
請求項１から４１までのいずれか１項に記載の組成物を、細胞の増殖を阻害する、または細胞の死を誘導するのに有効な量で、そのような治療を必要とする対象に投与するステップを含む、対象における細胞の増殖を阻害する、または細胞死を誘導する方法。
【請求項４３】
細胞が癌細胞を含む、請求項４１または請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
癌細胞が、メラノーマ、脳癌、前立腺癌、乳癌、腎臓癌、肺癌、肝臓癌、結腸直腸癌、白血病、リンパ腫、または卵巣癌細胞を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
組成物が、少なくとも複数の細胞の細胞質に送達される、請求項４１から４４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、２０１７年４月３日に出願された米国仮特許出願第６２／４８０，７８０号の優先権の利益を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の参照
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子的に出願されており、．ｔｘｔフォーマットで電子的に提出された配列表を含む。．ｔｘｔファイルは、２０１８年４月３日に作成された「２０１８−０４−０３＿５６６７−００４２９＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題された配列表を含有し、サイズは４，０１４バイトである。この．ｔｘｔファイルに含有される配列表は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
技術分野
開示された技術は、一般には細胞死の誘導のための組成物および方法を対象とする。より詳細には、技術は、細胞死および差次的なインターフェロン発現の誘導のためのＲＮＡ組成物およびその使用を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
パターン認識受容体（ＰＲＲ）は、感染に対して宿主防御応答を開始する免疫センサーである。これらは、エンドソームコンパートメントおよび細胞質内の細胞表面に位置し、そこで侵入病原体と関連した種々の分子サインを認識する態勢にある1。ウイルスまたは細菌ＲＮＡは、複数のＰＲＲの強力なリガンドであることが公知である1。レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）、メラノーマ分化関連遺伝子５（ＭＤＡ−５）、ＲＮＡ活性化タンパク質キナーゼＲ（ＰＫＲ）、ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２（ＬＧＰ２）、Ｎａｃｈｔ  ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３（ＮＡＬＰ３）およびｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ｔｅｔｒａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｐｅａｔｓ  １（ＩＦＩＴ１）は細胞質内に位置し、そこでＲＮＡ内の特異的分子パターン、例えば、５’三リン酸（５’ｐｐｐ）、５’二リン酸（５’ｐｐ）および二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を感知する。2、3  Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）３、７および８は、エンドソームコンパートメントに局在化され、ｄｓＲＮＡ（ＴＬＲ３）および一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）（ＴＬＲ７およびＴＬＲ８）によって活性化される。3
【０００３】
抗感染免疫に加えて、ＲＮＡ感知ＰＲＲの活性化は、感染細胞のプログラム細胞死を媒介することができ、これにより宿主は、感染細胞を犠牲にしてウイルス複製を効率的にブロックできるようになる。4  ＰＲＲ活性化は、感染細胞だけでなく、感染していない悪性細胞においても細胞死を誘導する。合成ウイルスｄｓＲＮＡ類似体、ポリイノシンポリシチジン酸（ｐｏｌｙＩ：Ｃ）、および５’ｐｐｐを含有する短いＲＮＡ二本鎖によるトランスフェクションは、インターフェロン（ＩＦＮ）−β産生、ならびにＲＮＡ感知ＰＲＲの活性化を通じた、メラノーマ5、肝細胞癌、6  神経膠芽腫、7  前立腺癌、8  卵巣癌、9  乳癌10および膵臓癌11を含む様々なヒト癌細胞のプログラム細胞死を誘導する。興味深いことに、ＲＮＡ誘導ＰＲＲ活性化は、アポトーシス促進分子、例えば、Ｎｏｘａ、ＰｕｍａおよびＴＲＡＩＬを腫瘍細胞で上方制御したが、非悪性細胞では上方制御しなかった。これは、ＰＲＲ活性化ＲＮＡによる腫瘍選択的細胞死の誘導に関係している可能性がある。5、12
【０００４】
さらに、ＰＲＲ媒介性細胞死は、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）（例えば、ｈｉｇｈ−ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ  ｂｏｘ  １  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＭＧＢ１））の放出、カルレティキュリンの表面移行、樹状細胞（ＤＣ）の抗原取り込みおよび成熟を生じさせる。これは、ＲＮＡ誘導腫瘍細胞死が免疫原性促進性であり、抗腫瘍免疫をもたらし得ることを示唆するものである。11、13、14  Ｉ型ＩＦＮ、例えば、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βは、ヘルパー１型Ｔ細胞応答の増強、ＭＨＣクラスＩ分子の上方制御、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＴ細胞媒介性細胞傷害性の生成を含む幅広い免疫刺激活性、ならびに抗増殖性、抗血管新生およびアポトーシス促進効果を含む抗腫瘍活性を有する。15  故に、ＰＲＲ媒介性細胞死およびＩ型ＩＦＮの放出は、腫瘍に対する治療的および予防的細胞性免疫応答の両方を協同的および相乗的に誘導することができる。
【０００５】
現在、ＲＮＡ感知ＰＲＲアゴニストは、癌患者にとって全般的利益がほとんどないまたはないことを示している。16、17  この失敗は、１つには、免疫反応の非特異的誘導によって引き起こされる毒性に起因する。18  全てのＰＲＲシグナル伝達は、結果としてＭＡＰキナーゼ、ＮＦ−κＢおよびＩＦＮ調節因子（ＩＲＦ）の活性化に至り、最終的には炎症性サイトカインおよびＩＦＮの産生につながる。3  これらのサイトカインおよびＩＦＮは、抗腫瘍免疫応答および癌細胞死の誘導を促進する。その一方で、これらは、正常な組織の損傷および臓器不全の原因となり得る。15  さらに、腫瘍および腫瘍間質細胞によって産生される炎症促進性サイトカインは、腫瘍増殖および生存を促進させ、抗腫瘍免疫の調節解除に寄与し、19  抗癌ＰＲＲアゴニストの治療効果に負の影響を与える。したがって、これらが臨床的に有用な薬剤になるには、安全で有効なＲＮＡ感知ＰＲＲアゴニストの開発が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＲＩＧ−Ｉ、5  ＭＤＡ５、20  ＴＬＲ３10およびＴＬＲ７、21を含む複数のＲＮＡ感知ＰＲＲは、サイトカイン発現と共にプログラム細胞死を誘導することが示されている。そのようなＲＮＡ感知ＰＲＲの活性化が癌細胞の細胞死にどうつながるのか、およびＰＲＲ媒介性細胞死とサイトカイン発現が分離され得るかどうかは依然として明らかになっていない。近年、Ｙｕらは、Ｎ末端カスパーゼ動員ドメイン（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｃａｓｐａｓｅ−ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｄｏｍａｉｎ）（ＣＡＲＤ）を欠くＭＤＡ５変異体は、前立腺癌細胞のプログラム細胞死プログラムに関与しているが、ＩＦＮ−βの発現は誘導しないことを示した。22  しかし、癌細胞において細胞死とＩＦＮおよび炎症促進性サイトカイン発現を差次的に誘導するＲＮＡアゴニストは開発されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書に開示されるのは、細胞の増殖を阻害する、または細胞死を誘導するための組成物および方法である。本発明の１つの態様において、細胞の増殖を阻害する、または細胞死を誘導することができる組成物は、５’−三リン酸非直鎖状ＲＮＡを含む。ＲＮＡは、少なくとも８個のヌクレオチド対合の完全または部分的なハイブリダイゼーションから形成される第１のステムループを含んでもよい。ＲＮＡはまた、少なくとも８個のヌクレオチド対合の完全または部分的なハイブリダイゼーションから形成される第２のステムループと、第１のステムループと第２のステムループの間のスペーサーとを含むこともできる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡはまた、１つもしくは複数の２’−フルオロ修飾ピリミジン、または１つもしくは複数の２’−フルオロ修飾プリンもしくはホスホロチオール化ヌクレオチドなどの他の修飾も含んでもよい。いくつかの実施形態において、第１のステムループは、その相補体とハイブリダイズして第１のステムループを形成することができる５’−三リン酸修飾末端ヌクレオチドを含み、および／または第２のステムループは、その相補体とハイブリダイズして第２のステムループを形成することができる５’−三リン酸修飾末端ヌクレオチドもしくは３’末端ヌクレオチドを含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡは、ＩＣＲ２（配列番号８）に対して、限定するものではないが少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％を含む、少なくとも５０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、ＲＮＡは、ＩＣＲ４（配列番号１５）、ＩＣＲ４Ａ（配列番号１６）、ＩＣＲ５Ｘ（配列番号１７）、またはＩＣＲ５Ｙ（配列番号１８）に対して、限定するものではないが少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％を含む、少なくとも５０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、ＲＮＡは、ＩＣＲ４（配列番号１５）もしくはＩＣＲ４Ａ（配列番号１６）に対して、限定するものではないが少なくとも８０％、８５％、９０％、もしくは９５％を含む、少なくとも５０％の配列同一性を有するｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチド；またはＩＣＲ５Ｙ（配列番号１８）に対して、限定するものではないが少なくとも８０％、８５％、９０％、もしくは９５％を含む、少なくとも５０％の配列同一性を有する第２のオリゴヌクレオチドに完全にもしくは部分的にハイブリダイズされた、ＩＣＲ５Ｘ（配列番号１７）に対して、限定するものではないが少なくとも８０％、８５％、９０％、もしくは９５％を含む、少なくとも５０％の配列同一性を有する第１のオリゴヌクレオチドを含むｄｓＲＮＡから本質的になる。
【０００９】
いくつかの実施形態において、ステムループは、ＩＣＲ２（配列番号８）に対して、限定するものではないが少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％を含む、少なくとも５０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドから形成され、オリゴヌクレオチドは、その相補的ヌクレオチドとハイブリダイズしてステムループを形成することができる５’−三リン酸修飾末端ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、ステムループは、ＩＣＲ２（配列番号８）から本質的になるオリゴヌクレオチドから形成される。
いくつかの実施形態において、スペーサーは、ＲＮＡの一本鎖セグメントを含む。特定の実施形態においてスペーサーは、少なくとも８個のヌクレオチド対合の完全または部分的なハイブリダイゼーションから形成される第３のステムループを含む。他の実施形態において、スペーサーは、ＲＮＡの二本鎖セグメントを含む。
組成物は、１つまたは複数の治療剤をさらに含んでもよい。治療剤は、化学療法剤、抗癌生物製剤、免疫療法剤、またはそれらの任意の組み合わせから選択されてもよい。
組成物は、１つまたは複数の細胞質送達組成物をさらに含んでもよい。細胞質送達組成物は、リポソーム、合成ポリマー、細胞透過性ペプチド、ナノ粒子、ウイルス粒子、エレクトロポレーション緩衝液、ヌクレオフェクション試薬、またはそれらの任意の組み合わせから選択されてもよい。
【００１０】
本発明の別の態様は、上記に記載された組成物のいずれかを含む医薬組成物である。医薬組成物は、細胞の増殖を阻害する、または細胞死を誘導することができる組成物の治療有効量、および１つまたは複数の薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含んでもよい。
本発明の別の態様は、細胞の増殖を阻害する、または細胞死を誘導する方法である。方法は、細胞の増殖を阻害する、または細胞の死を誘導するのに有効な量で、細胞の増殖を阻害する、または細胞死を誘導することができる上記に記載された組成物のいずれかと細胞を接触させるステップを含んでもよい。
【００１１】
本発明の別の態様は、対象における細胞の増殖を阻害する、または細胞死を誘導する方法である。方法は、前記請求項のいずれか１項のような組成物を、細胞の増殖を阻害する、または細胞の死を誘導するのに有効な量で、そのような治療を必要とする対象に投与するステップを含んでもよい。
上記に記載された方法のどちらかにおいて、細胞は癌細胞を含んでもよい。癌細胞は、メラノーマ、脳癌、前立腺癌、乳癌、腎臓癌、肺癌、肝臓癌、結腸直腸癌、白血病、リンパ腫、または卵巣癌細胞を含んでもよい。
上記に記載された方法のどちらかにおいて、組成物、または少なくともＲＮＡは、少なくとも複数の細胞の細胞質に送達される。
【００１２】
本発明の非限定的な実施形態は、添付図面を参照しながら例として記載される。添付図面は概略的であり、縮尺通りに描かれることを意図するものではない。図面では、例示される各々の同一またはほぼ同一の構成要素は、典型的には単一の数字で表される。当業者が本発明を理解できるようにするために例示が必要でない場合、明確にする目的で、全ての構成要素が全ての図面において表示されるわけでも、本発明の各実施形態の全ての構成要素が示されるわけでもない。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】２’Ｆ修飾５’ｐｐｐ  ＲＮＡによる構造依存的な増殖阻害およびＩＦＮ−β発現の差次的誘導を例示する図である。２’Ｆピリミジンを組み込んだ５’ｐｐｐ  ＲＮＡは、５’ｐｐｐならびに、様々な長さの３’オーバーハングヘアピン（ＩＣＲ１（配列番号１）、ＩＣＲ１Ａ（配列番号２）、ＩＣＲ１Ｂ（配列番号３）、ＩＣＲ１Ｃ（配列番号４））、平滑末端ヘアピン（ＩＣＲ２−３（配列番号５）、ＩＣＲ２（配列番号８）、ＩＣＲ２Ａ（配列番号９）、ＩＣＲ２Ｂ（配列番号１０））、５’オーバーハングヘアピン（ＩＣＲ３（配列番号１１）、ＩＣＲ３Ａ（配列番号１２）、ＩＣＲ３Ｂ（配列番号１３）、ＩＣＲ３Ｃ（配列番号１４））および複数のステムループ（ＩＣＲ４（配列番号１５）、ＩＣＲ４Ａ（配列番号１６）、ＩＣＲ５（配列番号１７および１８））を含む様々な二次構造を含有するように設計し、生成した。直鎖状５’ｐｐｐ  ｓｓＲＮＡ（ＩＣＲ−Ｌ（配列番号１９））および長いｄｓＲＮＡ（ｐＩＣ）も生成した。ＲＮＡ二次構造は、ｍＦｏｌｄを用いて予測した。癌細胞をこれらのＲＮＡで治療するために、ＷＭ２６６．４ヒトメラノーマ細胞（１×１０4細胞／ウェル）に、示された濃度のＲＮＡを９６ウェルプレートで４時間トランスフェクトした。ＲＮＡ治療後７２時間時点で、細胞および培養上清を回収し、増殖阻害およびＩＦＮ−β発現についてそれぞれ分析した。データは、２つの個別の実験を表す。エラーバーはＳ．Ｄ．である。
【図１Ｂ】（図１Ｂ）ＩＣＲ４（配列番号１５）、ＩＣＲ２（配列番号８）、ＩＣＲ２−１（配列番号７）、ＩＣＲ２−２（配列番号６）、およびＩＣＲ２−３（配列番号５）の予測された構造、ならびに（図１Ｃ）６〜９ｂｐステムを有する５’ｐｐｐ  ２’ＦヘアピンＲＮＡの細胞傷害性を例示する図である。ＷＭ２６６−４細胞に、示されたＲＮＡを４時間トランスフェクトした。細胞増殖率は、トランスフェクション後３日時点でＭＴＳアッセイによって決定した。エラーバーはＳ．Ｄ．である。
【図１Ｃ】（図１Ｂ）ＩＣＲ４（配列番号１５）、ＩＣＲ２（配列番号８）、ＩＣＲ２−１（配列番号７）、ＩＣＲ２−２（配列番号６）、およびＩＣＲ２−３（配列番号５）の予測された構造、ならびに（図１Ｃ）６〜９ｂｐステムを有する５’ｐｐｐ  ２’ＦヘアピンＲＮＡの細胞傷害性を例示する図である。ＷＭ２６６−４細胞に、示されたＲＮＡを４時間トランスフェクトした。細胞増殖率は、トランスフェクション後３日時点でＭＴＳアッセイによって決定した。エラーバーはＳ．Ｄ．である。
【図２Ａ】ＩＣＲ４が、ＩＣＲ２と比べてヒト癌細胞および自然免疫細胞におけるＩＦＮ−βおよび炎症促進性サイトカイン発現の減少を誘導することを示す図である。ＷＭ２６６−４細胞（１×１０4細胞／ウェル）（図２Ａ）、ヒトＰＢＭＣ（１×１０5細胞／ウェル）（図２Ｂ、図２Ｅ）およびヒトＤＣ（５×１０4細胞／ウェル）（図２Ｃ〜２Ｄ）に、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４、ｐｏｌｙＩ：Ｃ（各１μｇ／ｍｌ）またはトランスフェクション剤単独（モック）を９６ウェルプレートで４時間トランスフェクトした。図２Ａ〜図２Ｄ、培養上清をトランスフェクション後２４時間時点で回収した。図２Ｅ、ヒトＰＢＭＣの増殖を、トランスフェクション後３日時点でＭＴＳアッセイを用いて測定した。データは３つの実験の平均である。エラーバーはＳ．Ｄ．である。＊：Ｐ＜０．０５。
【図２Ｂ】ＩＣＲ４が、ＩＣＲ２と比べてヒト癌細胞および自然免疫細胞におけるＩＦＮ−βおよび炎症促進性サイトカイン発現の減少を誘導することを示す図である。ＷＭ２６６−４細胞（１×１０4細胞／ウェル）（図２Ａ）、ヒトＰＢＭＣ（１×１０5細胞／ウェル）（図２Ｂ、図２Ｅ）およびヒトＤＣ（５×１０4細胞／ウェル）（図２Ｃ〜２Ｄ）に、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４、ｐｏｌｙＩ：Ｃ（各１μｇ／ｍｌ）またはトランスフェクション剤単独（モック）を９６ウェルプレートで４時間トランスフェクトした。図２Ａ〜図２Ｄ、培養上清をトランスフェクション後２４時間時点で回収した。図２Ｅ、ヒトＰＢＭＣの増殖を、トランスフェクション後３日時点でＭＴＳアッセイを用いて測定した。データは３つの実験の平均である。エラーバーはＳ．Ｄ．である。＊：Ｐ＜０．０５。
【図２Ｃ】ＩＣＲ４が、ＩＣＲ２と比べてヒト癌細胞および自然免疫細胞におけるＩＦＮ−βおよび炎症促進性サイトカイン発現の減少を誘導することを示す図である。ＷＭ２６６−４細胞（１×１０4細胞／ウェル）（図２Ａ）、ヒトＰＢＭＣ（１×１０5細胞／ウェル）（図２Ｂ、図２Ｅ）およびヒトＤＣ（５×１０4細胞／ウェル）（図２Ｃ〜２Ｄ）に、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４、ｐｏｌｙＩ：Ｃ（各１μｇ／ｍｌ）またはトランスフェクション剤単独（モック）を９６ウェルプレートで４時間トランスフェクトした。図２Ａ〜図２Ｄ、培養上清をトランスフェクション後２４時間時点で回収した。図２Ｅ、ヒトＰＢＭＣの増殖を、トランスフェクション後３日時点でＭＴＳアッセイを用いて測定した。データは３つの実験の平均である。エラーバーはＳ．Ｄ．である。＊：Ｐ＜０．０５。
【図２Ｄ】ＩＣＲ４が、ＩＣＲ２と比べてヒト癌細胞および自然免疫細胞におけるＩＦＮ−βおよび炎症促進性サイトカイン発現の減少を誘導することを示す図である。ＷＭ２６６−４細胞（１×１０4細胞／ウェル）（図２Ａ）、ヒトＰＢＭＣ（１×１０5細胞／ウェル）（図２Ｂ、図２Ｅ）およびヒトＤＣ（５×１０4細胞／ウェル）（図２Ｃ〜２Ｄ）に、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４、ｐｏｌｙＩ：Ｃ（各１μｇ／ｍｌ）またはトランスフェクション剤単独（モック）を９６ウェルプレートで４時間トランスフェクトした。図２Ａ〜図２Ｄ、培養上清をトランスフェクション後２４時間時点で回収した。図２Ｅ、ヒトＰＢＭＣの増殖を、トランスフェクション後３日時点でＭＴＳアッセイを用いて測定した。データは３つの実験の平均である。エラーバーはＳ．Ｄ．である。＊：Ｐ＜０．０５。
【図２Ｅ】ＩＣＲ４が、ＩＣＲ２と比べてヒト癌細胞および自然免疫細胞におけるＩＦＮ−βおよび炎症促進性サイトカイン発現の減少を誘導することを示す図である。ＷＭ２６６−４細胞（１×１０4細胞／ウェル）（図２Ａ）、ヒトＰＢＭＣ（１×１０5細胞／ウェル）（図２Ｂ、図２Ｅ）およびヒトＤＣ（５×１０4細胞／ウェル）（図２Ｃ〜２Ｄ）に、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４、ｐｏｌｙＩ：Ｃ（各１μｇ／ｍｌ）またはトランスフェクション剤単独（モック）を９６ウェルプレートで４時間トランスフェクトした。図２Ａ〜図２Ｄ、培養上清をトランスフェクション後２４時間時点で回収した。図２Ｅ、ヒトＰＢＭＣの増殖を、トランスフェクション後３日時点でＭＴＳアッセイを用いて測定した。データは３つの実験の平均である。エラーバーはＳ．Ｄ．である。＊：Ｐ＜０．０５。
【図２Ｆ】ＩＣＲ２およびＩＣＲ４によるヒト前立腺およびヒト膵臓癌細胞のＩＦＮ−β発現および増殖阻害の差次的誘導を示す図である。ＤＵ−１４５ヒト前立腺癌細胞株（図２Ｆ）、ＰＡＮＣ−１ヒト膵臓癌細胞株（図２Ｇ）およびＢｘＰＣ３ヒト膵臓癌細胞株（図２Ｈ）に、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４（各１μｇ／ｍｌ）またはトランスフェクション試薬単独（モック）をトランスフェクトした。細胞増殖およびＩＦＮ−β産生を、それぞれＭＴＳアッセイおよびＥＬＩＳＡによって決定した。エラーバーはＳ．Ｄ．である。
【図２Ｇ】ＩＣＲ２およびＩＣＲ４によるヒト前立腺およびヒト膵臓癌細胞のＩＦＮ−β発現および増殖阻害の差次的誘導を示す図である。ＤＵ−１４５ヒト前立腺癌細胞株（図２Ｆ）、ＰＡＮＣ−１ヒト膵臓癌細胞株（図２Ｇ）およびＢｘＰＣ３ヒト膵臓癌細胞株（図２Ｈ）に、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４（各１μｇ／ｍｌ）またはトランスフェクション試薬単独（モック）をトランスフェクトした。細胞増殖およびＩＦＮ−β産生を、それぞれＭＴＳアッセイおよびＥＬＩＳＡによって決定した。エラーバーはＳ．Ｄ．である。
【図２Ｈ】ＩＣＲ２およびＩＣＲ４によるヒト前立腺およびヒト膵臓癌細胞のＩＦＮ−β発現および増殖阻害の差次的誘導を示す図である。ＤＵ−１４５ヒト前立腺癌細胞株（図２Ｆ）、ＰＡＮＣ−１ヒト膵臓癌細胞株（図２Ｇ）およびＢｘＰＣ３ヒト膵臓癌細胞株（図２Ｈ）に、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４（各１μｇ／ｍｌ）またはトランスフェクション試薬単独（モック）をトランスフェクトした。細胞増殖およびＩＦＮ−β産生を、それぞれＭＴＳアッセイおよびＥＬＩＳＡによって決定した。エラーバーはＳ．Ｄ．である。
【図２Ｉ】ＩＣＲ２、ＩＣＲ４およびｐｏｌｙＩ：Ｃをトランスフェクトしたマウス癌細胞による細胞傷害性（図２Ｉ）およびサイトカイン産生（図２Ｊ〜Ｌ）を示す図である。Ｂ１６マウスメラノーマ細胞株およびＰＡＮＣ−０２マウス膵臓癌細胞株にトランスフェクション試薬単独（モック）、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４またはｐｏｌｙＩ：Ｃ（ｐＩＣ）（各１μｇ／ｍｌ）をトランスフェクトした。細胞および培養上清をトランスフェクション後３日時点で回収した。細胞増殖（図２Ｉ）および（図２Ｊ）ＩＦＮ−β、（図２Ｋ）ＩＬ−６および（図２Ｌ）ＴＮＦαの産生を、それぞれＭＴＳアッセイおよびＥＬＩＳＡによって決定した。エラーバーはＳ．Ｄ．である。
【図２Ｊ】ＩＣＲ２、ＩＣＲ４およびｐｏｌｙＩ：Ｃをトランスフェクトしたマウス癌細胞による細胞傷害性（図２Ｉ）およびサイトカイン産生（図２Ｊ〜Ｌ）を示す図である。Ｂ１６マウスメラノーマ細胞株およびＰＡＮＣ−０２マウス膵臓癌細胞株にトランスフェクション試薬単独（モック）、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４またはｐｏｌｙＩ：Ｃ（ｐＩＣ）（各１μｇ／ｍｌ）をトランスフェクトした。細胞および培養上清をトランスフェクション後３日時点で回収した。細胞増殖（図２Ｉ）および（図２Ｊ）ＩＦＮ−β、（図２Ｋ）ＩＬ−６および（図２Ｌ）ＴＮＦαの産生を、それぞれＭＴＳアッセイおよびＥＬＩＳＡによって決定した。エラーバーはＳ．Ｄ．である。
【図２Ｋ】ＩＣＲ２、ＩＣＲ４およびｐｏｌｙＩ：Ｃをトランスフェクトしたマウス癌細胞による細胞傷害性（図２Ｉ）およびサイトカイン産生（図２Ｊ〜Ｌ）を示す図である。Ｂ１６マウスメラノーマ細胞株およびＰＡＮＣ−０２マウス膵臓癌細胞株にトランスフェクション試薬単独（モック）、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４またはｐｏｌｙＩ：Ｃ（ｐＩＣ）（各１μｇ／ｍｌ）をトランスフェクトした。細胞および培養上清をトランスフェクション後３日時点で回収した。細胞増殖（図２Ｉ）および（図２Ｊ）ＩＦＮ−β、（図２Ｋ）ＩＬ−６および（図２Ｌ）ＴＮＦαの産生を、それぞれＭＴＳアッセイおよびＥＬＩＳＡによって決定した。エラーバーはＳ．Ｄ．である。
【図２Ｌ】ＩＣＲ２、ＩＣＲ４およびｐｏｌｙＩ：Ｃをトランスフェクトしたマウス癌細胞による細胞傷害性（図２Ｉ）およびサイトカイン産生（図２Ｊ〜Ｌ）を示す図である。Ｂ１６マウスメラノーマ細胞株およびＰＡＮＣ−０２マウス膵臓癌細胞株にトランスフェクション試薬単独（モック）、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４またはｐｏｌｙＩ：Ｃ（ｐＩＣ）（各１μｇ／ｍｌ）をトランスフェクトした。細胞および培養上清をトランスフェクション後３日時点で回収した。細胞増殖（図２Ｉ）および（図２Ｊ）ＩＦＮ−β、（図２Ｋ）ＩＬ−６および（図２Ｌ）ＴＮＦαの産生を、それぞれＭＴＳアッセイおよびＥＬＩＳＡによって決定した。エラーバーはＳ．Ｄ．である。
【図３Ａ】ＩＣＲ４およびｐｏｌｙＩ：Ｃは急性細胞死を誘導し、一方ＩＣＲ２は遅発性細胞死を誘導したことを示す図である。ＷＭ２６６−４細胞（２×１０5細胞／ウェル）に、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４、ｐｏｌｙＩ：Ｃ（各１μｇ／ｍｌ）またはトランスフェクション剤単独（モック）を２４ウェルプレートで４時間トランスフェクトした。細胞および培養上清を、トランスフェクション後４時間（図３Ａ）、２４時間（図３Ｂ）および４８時間（図３Ｃ）時点で回収した。細胞死を、アネキシンＶおよび７−ＡＡＤ染色（図３Ｄ）を用いて決定した。％細胞死＝（％アネキシンＶ＋／７−ＡＡＤ−）＋（％アネキシンＶ−／７−ＡＡＤ＋）＋（％アネキシンＶ＋／７−ＡＡＤ＋）。ＩＦＮ−β産生をＥＬＩＳＡ（図３Ｅ）によって決定した。図３Ａ〜３Ｃデータは、３つの個別の実験を表す。図３Ｄ〜３Ｅデータは、３つの実験の平均である。エラーバーはＳ．Ｄ．である。＊：Ｐ＜０．０５。
【図３Ｂ】ＩＣＲ４およびｐｏｌｙＩ：Ｃは急性細胞死を誘導し、一方ＩＣＲ２は遅発性細胞死を誘導したことを示す図である。ＷＭ２６６−４細胞（２×１０5細胞／ウェル）に、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４、ｐｏｌｙＩ：Ｃ（各１μｇ／ｍｌ）またはトランスフェクション剤単独（モック）を２４ウェルプレートで４時間トランスフェクトした。細胞および培養上清を、トランスフェクション後４時間（図３Ａ）、２４時間（図３Ｂ）および４８時間（図３Ｃ）時点で回収した。細胞死を、アネキシンＶおよび７−ＡＡＤ染色（図３Ｄ）を用いて決定した。％細胞死＝（％アネキシンＶ＋／７−ＡＡＤ−）＋（％アネキシンＶ−／７−ＡＡＤ＋）＋（％アネキシンＶ＋／７−ＡＡＤ＋）。ＩＦＮ−β産生をＥＬＩＳＡ（図３Ｅ）によって決定した。図３Ａ〜３Ｃデータは、３つの個別の実験を表す。図３Ｄ〜３Ｅデータは、３つの実験の平均である。エラーバーはＳ．Ｄ．である。＊：Ｐ＜０．０５。
【図３Ｃ】ＩＣＲ４およびｐｏｌｙＩ：Ｃは急性細胞死を誘導し、一方ＩＣＲ２は遅発性細胞死を誘導したことを示す図である。ＷＭ２６６−４細胞（２×１０5細胞／ウェル）に、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４、ｐｏｌｙＩ：Ｃ（各１μｇ／ｍｌ）またはトランスフェクション剤単独（モック）を２４ウェルプレートで４時間トランスフェクトした。細胞および培養上清を、トランスフェクション後４時間（図３Ａ）、２４時間（図３Ｂ）および４８時間（図３Ｃ）時点で回収した。細胞死を、アネキシンＶおよび７−ＡＡＤ染色（図３Ｄ）を用いて決定した。％細胞死＝（％アネキシンＶ＋／７−ＡＡＤ−）＋（％アネキシンＶ−／７−ＡＡＤ＋）＋（％アネキシンＶ＋／７−ＡＡＤ＋）。ＩＦＮ−β産生をＥＬＩＳＡ（図３Ｅ）によって決定した。図３Ａ〜３Ｃデータは、３つの個別の実験を表す。図３Ｄ〜３Ｅデータは、３つの実験の平均である。エラーバーはＳ．Ｄ．である。＊：Ｐ＜０．０５。
【図３Ｄ】ＩＣＲ４およびｐｏｌｙＩ：Ｃは急性細胞死を誘導し、一方ＩＣＲ２は遅発性細胞死を誘導したことを示す図である。ＷＭ２６６−４細胞（２×１０5細胞／ウェル）に、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４、ｐｏｌｙＩ：Ｃ（各１μｇ／ｍｌ）またはトランスフェクション剤単独（モック）を２４ウェルプレートで４時間トランスフェクトした。細胞および培養上清を、トランスフェクション後４時間（図３Ａ）、２４時間（図３Ｂ）および４８時間（図３Ｃ）時点で回収した。細胞死を、アネキシンＶおよび７−ＡＡＤ染色（図３Ｄ）を用いて決定した。％細胞死＝（％アネキシンＶ＋／７−ＡＡＤ−）＋（％アネキシンＶ−／７−ＡＡＤ＋）＋（％アネキシンＶ＋／７−ＡＡＤ＋）。ＩＦＮ−β産生をＥＬＩＳＡ（図３Ｅ）によって決定した。図３Ａ〜３Ｃデータは、３つの個別の実験を表す。図３Ｄ〜３Ｅデータは、３つの実験の平均である。エラーバーはＳ．Ｄ．である。＊：Ｐ＜０．０５。
【図３Ｅ】ＩＣＲ４およびｐｏｌｙＩ：Ｃは急性細胞死を誘導し、一方ＩＣＲ２は遅発性細胞死を誘導したことを示す図である。ＷＭ２６６−４細胞（２×１０5細胞／ウェル）に、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４、ｐｏｌｙＩ：Ｃ（各１μｇ／ｍｌ）またはトランスフェクション剤単独（モック）を２４ウェルプレートで４時間トランスフェクトした。細胞および培養上清を、トランスフェクション後４時間（図３Ａ）、２４時間（図３Ｂ）および４８時間（図３Ｃ）時点で回収した。細胞死を、アネキシンＶおよび７−ＡＡＤ染色（図３Ｄ）を用いて決定した。％細胞死＝（％アネキシンＶ＋／７−ＡＡＤ−）＋（％アネキシンＶ−／７−ＡＡＤ＋）＋（％アネキシンＶ＋／７−ＡＡＤ＋）。ＩＦＮ−β産生をＥＬＩＳＡ（図３Ｅ）によって決定した。図３Ａ〜３Ｃデータは、３つの個別の実験を表す。図３Ｄ〜３Ｅデータは、３つの実験の平均である。エラーバーはＳ．Ｄ．である。＊：Ｐ＜０．０５。
【図３Ｆ】ＩＣＲ２はＩＦＮ依存性細胞死を誘導するが、ＩＣＲ４は誘導しないことを示す図である。ＷＭ２６６−４細胞（１×１０4細胞／ウェル）に、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４（各０．２μｇ／ｍｌ）またはトランスフェクション剤単独（モック）を９６ウェルプレートで４時間トランスフェクトした。組換えヒトＩＦＮ−β（１００ｎｇ／ｍｌ）を陽性対照として使用した。トランスフェクション後直ちに、Ｂ１８Ｒ（１μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で細胞を３日間培養した。細胞傷害性を、Ｂ１８Ｒ（１μｇ／ｍｌ）の存在下（図３Ｆ）または非存在下（図３Ｇ）のアネキシンＶ／７−ＡＡＤアッセイおよびＭＴＳアッセイ（図３Ｈ）によって決定した。図３Ｆ〜３Ｇデータは、２つの個別の実験を表す。図３Ｈデータは、３つの実験の平均である。エラーバーはＳ．Ｄ．である。＊：Ｐ＜０．０５。
【図３Ｇ】ＩＣＲ２はＩＦＮ依存性細胞死を誘導するが、ＩＣＲ４は誘導しないことを示す図である。ＷＭ２６６−４細胞（１×１０4細胞／ウェル）に、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４（各０．２μｇ／ｍｌ）またはトランスフェクション剤単独（モック）を９６ウェルプレートで４時間トランスフェクトした。組換えヒトＩＦＮ−β（１００ｎｇ／ｍｌ）を陽性対照として使用した。トランスフェクション後直ちに、Ｂ１８Ｒ（１μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で細胞を３日間培養した。細胞傷害性を、Ｂ１８Ｒ（１μｇ／ｍｌ）の存在下（図３Ｆ）または非存在下（図３Ｇ）のアネキシンＶ／７−ＡＡＤアッセイおよびＭＴＳアッセイ（図３Ｈ）によって決定した。図３Ｆ〜３Ｇデータは、２つの個別の実験を表す。図３Ｈデータは、３つの実験の平均である。エラーバーはＳ．Ｄ．である。＊：Ｐ＜０．０５。
【図３Ｈ】ＩＣＲ２はＩＦＮ依存性細胞死を誘導するが、ＩＣＲ４は誘導しないことを示す図である。ＷＭ２６６−４細胞（１×１０4細胞／ウェル）に、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４（各０．２μｇ／ｍｌ）またはトランスフェクション剤単独（モック）を９６ウェルプレートで４時間トランスフェクトした。組換えヒトＩＦＮ−β（１００ｎｇ／ｍｌ）を陽性対照として使用した。トランスフェクション後直ちに、Ｂ１８Ｒ（１μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で細胞を３日間培養した。細胞傷害性を、Ｂ１８Ｒ（１μｇ／ｍｌ）の存在下（図３Ｆ）または非存在下（図３Ｇ）のアネキシンＶ／７−ＡＡＤアッセイおよびＭＴＳアッセイ（図３Ｈ）によって決定した。図３Ｆ〜３Ｇデータは、２つの個別の実験を表す。図３Ｈデータは、３つの実験の平均である。エラーバーはＳ．Ｄ．である。＊：Ｐ＜０．０５。
【図３Ｉ】Ｔ７ポリメラーゼ誘導ＩＶＴ副産物の生成を示す図である。（図３Ｉ）ＩＣＲ２およびＩＣＲ２に相補的なＩＣＲ２アンチセンスを、Ｔ７ポリメラーゼ誘導ＩＶＴによって生成した。ＩＣＲ２二本鎖を、ＩＣＲ２およびＩＣＲ２アンチセンスのハイブリダイゼーションによって生成した。ＲＮＡを２０％ポリアクリルアミドゲルで分析した。ＩＣＲ２  ＩＶＴの（図３Ｊ）下方および（図３Ｋ）上方のバンドを精製し、ヒトメラノーマ細胞株ＷＭ２６６−４にトランスフェクトした。細胞死レベルを、フローサイトメトリーベースアネキシンＶ−ＰＥ／７−ＡＡＤ染色分析によってトランスフェクション後翌日に決定した。
【図３Ｊ】Ｔ７ポリメラーゼ誘導ＩＶＴ副産物の生成を示す図である。（図３Ｉ）ＩＣＲ２およびＩＣＲ２に相補的なＩＣＲ２アンチセンスを、Ｔ７ポリメラーゼ誘導ＩＶＴによって生成した。ＩＣＲ２二本鎖を、ＩＣＲ２およびＩＣＲ２アンチセンスのハイブリダイゼーションによって生成した。ＲＮＡを２０％ポリアクリルアミドゲルで分析した。ＩＣＲ２  ＩＶＴの（図３Ｊ）下方および（図３Ｋ）上方のバンドを精製し、ヒトメラノーマ細胞株ＷＭ２６６−４にトランスフェクトした。細胞死レベルを、フローサイトメトリーベースアネキシンＶ−ＰＥ／７−ＡＡＤ染色分析によってトランスフェクション後翌日に決定した。
【図３Ｋ】Ｔ７ポリメラーゼ誘導ＩＶＴ副産物の生成を示す図である。（図３Ｉ）ＩＣＲ２およびＩＣＲ２に相補的なＩＣＲ２アンチセンスを、Ｔ７ポリメラーゼ誘導ＩＶＴによって生成した。ＩＣＲ２二本鎖を、ＩＣＲ２およびＩＣＲ２アンチセンスのハイブリダイゼーションによって生成した。ＲＮＡを２０％ポリアクリルアミドゲルで分析した。ＩＣＲ２  ＩＶＴの（図３Ｊ）下方および（図３Ｋ）上方のバンドを精製し、ヒトメラノーマ細胞株ＷＭ２６６−４にトランスフェクトした。細胞死レベルを、フローサイトメトリーベースアネキシンＶ−ＰＥ／７−ＡＡＤ染色分析によってトランスフェクション後翌日に決定した。
【図４Ａ】ＩＣＲ２およびＩＣＲ４が、細胞死およびＰＲＲシグナル伝達経路の差次的な活性化をトリガーすることを示す図である。（図４Ａ）ＷＭ２６６−４細胞（２×１０5細胞／ウェル）を、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ、Ｎｅｃ−１、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋおよびＮｅｃ−１またはＤＭＳＯの混合物と６時間プレインキュベートし、その後、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４（各０．２μｇ／ｍｌ）またはトランスフェクション剤単独（モック）を４時間トランスフェクトした。ＤＭＳＯ、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋおよび／またはＮｅｃ−１の存在下で細胞を３日間培養した。細胞死を、トランスフェクション後７２時間時点でアネキシンＶ／７−ＡＡＤアッセイによって決定した。（図４Ｂ〜４Ｃ）ＷＭ２６６．４細胞を、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４またはモックをトランスフェクション後２４時間時点で回収した。全細胞溶解物、ミトコンドリア溶解物および核抽出物を調製し、ウエスタンブロットによって分析した。（図４Ｂ）全細胞溶解物中の切断されたカスパーゼ３および７、ＸＩＡＰおよびＴＲＡＩＬを含む細胞死関連分子の発現を評価した。β−チューブリン発現をローディング対照として使用した。（図４Ｃ）ミトコンドリア溶解物中のミトコンドリアＲＩＰ１およびシトクロムＣオキシダーゼＩＶ（ＣＯＸ  ＩＶ）、核抽出物中のＮＦ−κＢ  ｐ６５およびヒストンＨ３ならびに全細胞溶解物中のホスホ−ＩＲＦ３の発現を決定した。エラーバーはＳ．Ｄ．を表す。図４Ａデータは、３つの実験の平均である。エラーバーはＳ．Ｄ．である。図４Ｂおよび図４Ｃデータは、２つの個別の実験を表す。＊Ｐ＜０．０５（ｖｓ  ＤＭＳＯ）。
【図４Ｂ】ＩＣＲ２およびＩＣＲ４が、細胞死およびＰＲＲシグナル伝達経路の差次的な活性化をトリガーすることを示す図である。（図４Ａ）ＷＭ２６６−４細胞（２×１０5細胞／ウェル）を、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ、Ｎｅｃ−１、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋおよびＮｅｃ−１またはＤＭＳＯの混合物と６時間プレインキュベートし、その後、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４（各０．２μｇ／ｍｌ）またはトランスフェクション剤単独（モック）を４時間トランスフェクトした。ＤＭＳＯ、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋおよび／またはＮｅｃ−１の存在下で細胞を３日間培養した。細胞死を、トランスフェクション後７２時間時点でアネキシンＶ／７−ＡＡＤアッセイによって決定した。（図４Ｂ〜４Ｃ）ＷＭ２６６．４細胞を、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４またはモックをトランスフェクション後２４時間時点で回収した。全細胞溶解物、ミトコンドリア溶解物および核抽出物を調製し、ウエスタンブロットによって分析した。（図４Ｂ）全細胞溶解物中の切断されたカスパーゼ３および７、ＸＩＡＰおよびＴＲＡＩＬを含む細胞死関連分子の発現を評価した。β−チューブリン発現をローディング対照として使用した。（図４Ｃ）ミトコンドリア溶解物中のミトコンドリアＲＩＰ１およびシトクロムＣオキシダーゼＩＶ（ＣＯＸ  ＩＶ）、核抽出物中のＮＦ−κＢ  ｐ６５およびヒストンＨ３ならびに全細胞溶解物中のホスホ−ＩＲＦ３の発現を決定した。エラーバーはＳ．Ｄ．を表す。図４Ａデータは、３つの実験の平均である。エラーバーはＳ．Ｄ．である。図４Ｂおよび図４Ｃデータは、２つの個別の実験を表す。＊Ｐ＜０．０５（ｖｓ  ＤＭＳＯ）。
【図４Ｃ】ＩＣＲ２およびＩＣＲ４が、細胞死およびＰＲＲシグナル伝達経路の差次的な活性化をトリガーすることを示す図である。（図４Ａ）ＷＭ２６６−４細胞（２×１０5細胞／ウェル）を、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ、Ｎｅｃ−１、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋおよびＮｅｃ−１またはＤＭＳＯの混合物と６時間プレインキュベートし、その後、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４（各０．２μｇ／ｍｌ）またはトランスフェクション剤単独（モック）を４時間トランスフェクトした。ＤＭＳＯ、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋおよび／またはＮｅｃ−１の存在下で細胞を３日間培養した。細胞死を、トランスフェクション後７２時間時点でアネキシンＶ／７−ＡＡＤアッセイによって決定した。（図４Ｂ〜４Ｃ）ＷＭ２６６．４細胞を、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４またはモックをトランスフェクション後２４時間時点で回収した。全細胞溶解物、ミトコンドリア溶解物および核抽出物を調製し、ウエスタンブロットによって分析した。（図４Ｂ）全細胞溶解物中の切断されたカスパーゼ３および７、ＸＩＡＰおよびＴＲＡＩＬを含む細胞死関連分子の発現を評価した。β−チューブリン発現をローディング対照として使用した。（図４Ｃ）ミトコンドリア溶解物中のミトコンドリアＲＩＰ１およびシトクロムＣオキシダーゼＩＶ（ＣＯＸ  ＩＶ）、核抽出物中のＮＦ−κＢ  ｐ６５およびヒストンＨ３ならびに全細胞溶解物中のホスホ−ＩＲＦ３の発現を決定した。エラーバーはＳ．Ｄ．を表す。図４Ａデータは、３つの実験の平均である。エラーバーはＳ．Ｄ．である。図４Ｂおよび図４Ｃデータは、２つの個別の実験を表す。＊Ｐ＜０．０５（ｖｓ  ＤＭＳＯ）。
【図５Ａ】ＩＣＲ２およびＩＣＲ４によるＲＮＡ感知ＰＲＲ媒介性細胞傷害性の誘導を示す図である。（図５Ａ）Ｈｕｈ７．０（ＲＩＧ−Ｉ野生型）およびＨｕｈ７．５（ＲＩＧ−Ｉ変異体）細胞（７×１０3細胞／ウェル）に、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４（各１ｍｇ／ｍｌ）またはモックを９６ウェルプレートでトランスフェクトした。細胞傷害性を、トランスフェクション後３日時点でＭＴＳアッセイによって決定した。（図５Ｂ）ＷＭ２６６−４細胞中のＲＩＧ−Ｉ、ＰＫＲおよびＭＤＡ５を、ｓｉＲＮＡで３回ノックダウンした。細胞（１×１０4細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに再播種し、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４（各０．２μｇ／ｍｌ）またはモックでトランスフェクトした。エラーバーはＳ．Ｄ．を表す。＊Ｐ＜０．０５。（図５Ｃ）ヒトメラノーマ細胞におけるＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５およびＰＫＲのノックダウン。ｓｉＲＮＡ媒介ノックダウン効率を、モックトランスフェクション（対照）またはｓｉＲＮＡ（５’ｐｐｐを欠く）トランスフェクション４日後、示されているようにｓｉＲＮＡ対応抗体を用いてウエスタンブロットによって評価した。β−アクチン抗体をローディング対照として使用した。（図５Ｄ）ＨＥＫ−ＴＬＲ３およびＨＥＫ−ＴＬＲ７レポーター細胞（各４×１０4細胞／ウェル）に、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４またはｐｏｌｙＩ：Ｃ（ｐＩＣ）（各０．５μｇ／ｍｌ）をトランスフェクトした。非トランスフェクトｐｏｌｙＩ：Ｃ（ｐｏｌｙＩ：Ｃ）およびＲ８４８を、それぞれＴＬＲ３およびＴＬＲ７の陽性対照として使用した。ＰＢＳ処理を陰性対照として使用した。ＩＣＲ２およびＩＣＲ４を、細菌性アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）による処理により脱リン酸化して、ＩＮＦ−β（図５Ｅ）および増殖阻害（図５Ｆ）を調べた。脱リン酸化は２回繰り返した。ＷＭ２６６−４細胞に、ＢＡＰ処理およびＢＡＰ未処理ＩＣＲ２もしくはＩＣＲ４（各３０ｎＭ）またはモックトランスフェクションをトランスフェクトした。細胞傷害性およびＩＦＮ−β産生を、トランスフェクション後２日時点で決定した。エラーバーはＳ．Ｄ．を表す。＊Ｐ＜０．０５。
【図５Ｂ】ＩＣＲ２およびＩＣＲ４によるＲＮＡ感知ＰＲＲ媒介性細胞傷害性の誘導を示す図である。（図５Ａ）Ｈｕｈ７．０（ＲＩＧ−Ｉ野生型）およびＨｕｈ７．５（ＲＩＧ−Ｉ変異体）細胞（７×１０3細胞／ウェル）に、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４（各１ｍｇ／ｍｌ）またはモックを９６ウェルプレートでトランスフェクトした。細胞傷害性を、トランスフェクション後３日時点でＭＴＳアッセイによって決定した。（図５Ｂ）ＷＭ２６６−４細胞中のＲＩＧ−Ｉ、ＰＫＲおよびＭＤＡ５を、ｓｉＲＮＡで３回ノックダウンした。細胞（１×１０4細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに再播種し、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４（各０．２μｇ／ｍｌ）またはモックでトランスフェクトした。エラーバーはＳ．Ｄ．を表す。＊Ｐ＜０．０５。（図５Ｃ）ヒトメラノーマ細胞におけるＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５およびＰＫＲのノックダウン。ｓｉＲＮＡ媒介ノックダウン効率を、モックトランスフェクション（対照）またはｓｉＲＮＡ（５’ｐｐｐを欠く）トランスフェクション４日後、示されているようにｓｉＲＮＡ対応抗体を用いてウエスタンブロットによって評価した。β−アクチン抗体をローディング対照として使用した。（図５Ｄ）ＨＥＫ−ＴＬＲ３およびＨＥＫ−ＴＬＲ７レポーター細胞（各４×１０4細胞／ウェル）に、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４またはｐｏｌｙＩ：Ｃ（ｐＩＣ）（各０．５μｇ／ｍｌ）をトランスフェクトした。非トランスフェクトｐｏｌｙＩ：Ｃ（ｐｏｌｙＩ：Ｃ）およびＲ８４８を、それぞれＴＬＲ３およびＴＬＲ７の陽性対照として使用した。ＰＢＳ処理を陰性対照として使用した。ＩＣＲ２およびＩＣＲ４を、細菌性アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）による処理により脱リン酸化して、ＩＮＦ−β（図５Ｅ）および増殖阻害（図５Ｆ）を調べた。脱リン酸化は２回繰り返した。ＷＭ２６６−４細胞に、ＢＡＰ処理およびＢＡＰ未処理ＩＣＲ２もしくはＩＣＲ４（各３０ｎＭ）またはモックトランスフェクションをトランスフェクトした。細胞傷害性およびＩＦＮ−β産生を、トランスフェクション後２日時点で決定した。エラーバーはＳ．Ｄ．を表す。＊Ｐ＜０．０５。
【図５Ｃ】ＩＣＲ２およびＩＣＲ４によるＲＮＡ感知ＰＲＲ媒介性細胞傷害性の誘導を示す図である。（図５Ａ）Ｈｕｈ７．０（ＲＩＧ−Ｉ野生型）およびＨｕｈ７．５（ＲＩＧ−Ｉ変異体）細胞（７×１０3細胞／ウェル）に、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４（各１ｍｇ／ｍｌ）またはモックを９６ウェルプレートでトランスフェクトした。細胞傷害性を、トランスフェクション後３日時点でＭＴＳアッセイによって決定した。（図５Ｂ）ＷＭ２６６−４細胞中のＲＩＧ−Ｉ、ＰＫＲおよびＭＤＡ５を、ｓｉＲＮＡで３回ノックダウンした。細胞（１×１０4細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに再播種し、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４（各０．２μｇ／ｍｌ）またはモックでトランスフェクトした。エラーバーはＳ．Ｄ．を表す。＊Ｐ＜０．０５。（図５Ｃ）ヒトメラノーマ細胞におけるＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５およびＰＫＲのノックダウン。ｓｉＲＮＡ媒介ノックダウン効率を、モックトランスフェクション（対照）またはｓｉＲＮＡ（５’ｐｐｐを欠く）トランスフェクション４日後、示されているようにｓｉＲＮＡ対応抗体を用いてウエスタンブロットによって評価した。β−アクチン抗体をローディング対照として使用した。（図５Ｄ）ＨＥＫ−ＴＬＲ３およびＨＥＫ−ＴＬＲ７レポーター細胞（各４×１０4細胞／ウェル）に、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４またはｐｏｌｙＩ：Ｃ（ｐＩＣ）（各０．５μｇ／ｍｌ）をトランスフェクトした。非トランスフェクトｐｏｌｙＩ：Ｃ（ｐｏｌｙＩ：Ｃ）およびＲ８４８を、それぞれＴＬＲ３およびＴＬＲ７の陽性対照として使用した。ＰＢＳ処理を陰性対照として使用した。ＩＣＲ２およびＩＣＲ４を、細菌性アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）による処理により脱リン酸化して、ＩＮＦ−β（図５Ｅ）および増殖阻害（図５Ｆ）を調べた。脱リン酸化は２回繰り返した。ＷＭ２６６−４細胞に、ＢＡＰ処理およびＢＡＰ未処理ＩＣＲ２もしくはＩＣＲ４（各３０ｎＭ）またはモックトランスフェクションをトランスフェクトした。細胞傷害性およびＩＦＮ−β産生を、トランスフェクション後２日時点で決定した。エラーバーはＳ．Ｄ．を表す。＊Ｐ＜０．０５。
【図５Ｄ】ＩＣＲ２およびＩＣＲ４によるＲＮＡ感知ＰＲＲ媒介性細胞傷害性の誘導を示す図である。（図５Ａ）Ｈｕｈ７．０（ＲＩＧ−Ｉ野生型）およびＨｕｈ７．５（ＲＩＧ−Ｉ変異体）細胞（７×１０3細胞／ウェル）に、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４（各１ｍｇ／ｍｌ）またはモックを９６ウェルプレートでトランスフェクトした。細胞傷害性を、トランスフェクション後３日時点でＭＴＳアッセイによって決定した。（図５Ｂ）ＷＭ２６６−４細胞中のＲＩＧ−Ｉ、ＰＫＲおよびＭＤＡ５を、ｓｉＲＮＡで３回ノックダウンした。細胞（１×１０4細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに再播種し、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４（各０．２μｇ／ｍｌ）またはモックでトランスフェクトした。エラーバーはＳ．Ｄ．を表す。＊Ｐ＜０．０５。（図５Ｃ）ヒトメラノーマ細胞におけるＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５およびＰＫＲのノックダウン。ｓｉＲＮＡ媒介ノックダウン効率を、モックトランスフェクション（対照）またはｓｉＲＮＡ（５’ｐｐｐを欠く）トランスフェクション４日後、示されているようにｓｉＲＮＡ対応抗体を用いてウエスタンブロットによって評価した。β−アクチン抗体をローディング対照として使用した。（図５Ｄ）ＨＥＫ−ＴＬＲ３およびＨＥＫ−ＴＬＲ７レポーター細胞（各４×１０4細胞／ウェル）に、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４またはｐｏｌｙＩ：Ｃ（ｐＩＣ）（各０．５μｇ／ｍｌ）をトランスフェクトした。非トランスフェクトｐｏｌｙＩ：Ｃ（ｐｏｌｙＩ：Ｃ）およびＲ８４８を、それぞれＴＬＲ３およびＴＬＲ７の陽性対照として使用した。ＰＢＳ処理を陰性対照として使用した。ＩＣＲ２およびＩＣＲ４を、細菌性アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）による処理により脱リン酸化して、ＩＮＦ−β（図５Ｅ）および増殖阻害（図５Ｆ）を調べた。脱リン酸化は２回繰り返した。ＷＭ２６６−４細胞に、ＢＡＰ処理およびＢＡＰ未処理ＩＣＲ２もしくはＩＣＲ４（各３０ｎＭ）またはモックトランスフェクションをトランスフェクトした。細胞傷害性およびＩＦＮ−β産生を、トランスフェクション後２日時点で決定した。エラーバーはＳ．Ｄ．を表す。＊Ｐ＜０．０５。
【図５Ｅ】ＩＣＲ２およびＩＣＲ４によるＲＮＡ感知ＰＲＲ媒介性細胞傷害性の誘導を示す図である。（図５Ａ）Ｈｕｈ７．０（ＲＩＧ−Ｉ野生型）およびＨｕｈ７．５（ＲＩＧ−Ｉ変異体）細胞（７×１０3細胞／ウェル）に、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４（各１ｍｇ／ｍｌ）またはモックを９６ウェルプレートでトランスフェクトした。細胞傷害性を、トランスフェクション後３日時点でＭＴＳアッセイによって決定した。エラーバーはＳ．Ｄ．を表す。＊Ｐ＜０．０５。（図５Ｂ）ＷＭ２６６−４細胞中のＲＩＧ−Ｉ、ＰＫＲおよびＭＤＡ５を、ｓｉＲＮＡで３回ノックダウンした。細胞（１×１０4細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに再播種し、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４（各０．２μｇ／ｍｌ）またはモックでトランスフェクトした。（図５Ｃ）ヒトメラノーマ細胞におけるＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５およびＰＫＲのノックダウン。ｓｉＲＮＡ媒介ノックダウン効率を、モックトランスフェクション（対照）またはｓｉＲＮＡ（５’ｐｐｐを欠く）トランスフェクション４日後、示されているようにｓｉＲＮＡ対応抗体を用いてウエスタンブロットによって評価した。β−アクチン抗体をローディング対照として使用した。（図５Ｄ）ＨＥＫ−ＴＬＲ３およびＨＥＫ−ＴＬＲ７レポーター細胞（各４×１０4細胞／ウェル）に、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４またはｐｏｌｙＩ：Ｃ（ｐＩＣ）（各０．５μｇ／ｍｌ）をトランスフェクトした。非トランスフェクトｐｏｌｙＩ：Ｃ（ｐｏｌｙＩ：Ｃ）およびＲ８４８を、それぞれＴＬＲ３およびＴＬＲ７の陽性対照として使用した。ＰＢＳ処理を陰性対照として使用した。ＩＣＲ２およびＩＣＲ４を、細菌性アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）による処理により脱リン酸化して、ＩＮＦ−β（図５Ｅ）および増殖阻害（図５Ｆ）を調べた。脱リン酸化は２回繰り返した。ＷＭ２６６−４細胞に、ＢＡＰ処理およびＢＡＰ未処理ＩＣＲ２もしくはＩＣＲ４（各３０ｎＭ）またはモックトランスフェクションをトランスフェクトした。細胞傷害性およびＩＦＮ−β産生を、トランスフェクション後２日時点で決定した。エラーバーはＳ．Ｄ．を表す。＊Ｐ＜０．０５。
【図５Ｆ】ＩＣＲ２およびＩＣＲ４によるＲＮＡ感知ＰＲＲ媒介性細胞傷害性の誘導を示す図である。（図５Ａ）Ｈｕｈ７．０（ＲＩＧ−Ｉ野生型）およびＨｕｈ７．５（ＲＩＧ−Ｉ変異体）細胞（７×１０3細胞／ウェル）に、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４（各１ｍｇ／ｍｌ）またはモックを９６ウェルプレートでトランスフェクトした。細胞傷害性を、トランスフェクション後３日時点でＭＴＳアッセイによって決定した。（図５Ｂ）ＷＭ２６６−４細胞中のＲＩＧ−Ｉ、ＰＫＲおよびＭＤＡ５を、ｓｉＲＮＡで３回ノックダウンした。細胞（１×１０4細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに再播種し、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４（各０．２μｇ／ｍｌ）またはモックでトランスフェクトした。エラーバーはＳ．Ｄ．を表す。＊Ｐ＜０．０５。（図５Ｃ）ヒトメラノーマ細胞におけるＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５およびＰＫＲのノックダウン。ｓｉＲＮＡ媒介ノックダウン効率を、モックトランスフェクション（対照）またはｓｉＲＮＡ（５’ｐｐｐを欠く）トランスフェクション４日後、示されているようにｓｉＲＮＡ対応抗体を用いてウエスタンブロットによって評価した。β−アクチン抗体をローディング対照として使用した。（図５Ｄ）ＨＥＫ−ＴＬＲ３およびＨＥＫ−ＴＬＲ７レポーター細胞（各４×１０4細胞／ウェル）に、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４またはｐｏｌｙＩ：Ｃ（ｐＩＣ）（各０．５μｇ／ｍｌ）をトランスフェクトした。非トランスフェクトｐｏｌｙＩ：Ｃ（ｐｏｌｙＩ：Ｃ）およびＲ８４８を、それぞれＴＬＲ３およびＴＬＲ７の陽性対照として使用した。ＰＢＳ処理を陰性対照として使用した。ＩＣＲ２およびＩＣＲ４を、細菌性アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）による処理により脱リン酸化して、ＩＮＦ−β（図５Ｅ）および増殖阻害（図５Ｆ）を調べた。脱リン酸化は２回繰り返した。ＷＭ２６６−４細胞に、ＢＡＰ処理およびＢＡＰ未処理ＩＣＲ２もしくはＩＣＲ４（各３０ｎＭ）またはモックトランスフェクションをトランスフェクトした。細胞傷害性およびＩＦＮ−β産生を、トランスフェクション後２日時点で決定した。エラーバーはＳ．Ｄ．を表す。＊Ｐ＜０．０５。
【図５Ｇ】２’Ｆピリミジンまたは２’ＯＨピリミジンを含有するＩＣＲ２およびＩＣＲ４の細胞死およびＩＦＮ−β誘導活性の比較を示す図である。ＷＭ２６６−４細胞に、２’Ｆ  ＩＣＲ２、２’ＯＨ  ＩＣＲ２、２’Ｆ  ＩＣＲ４または２’ＯＨ  ＩＣＲ４（各３５ｎＭ）をトランスフェクトした。（図５Ｇ）細胞傷害性および（図５Ｈ）ＩＦＮ−β産生を、トランスフェクション後７２時間時点で評価した。エラーバーはＳ．Ｄ．を表す。＊Ｐ＜０．０５。
【図５Ｈ】２’Ｆピリミジンまたは２’ＯＨピリミジンを含有するＩＣＲ２およびＩＣＲ４の細胞死およびＩＦＮ−β誘導活性の比較を示す図である。ＷＭ２６６−４細胞に、２’Ｆ  ＩＣＲ２、２’ＯＨ  ＩＣＲ２、２’Ｆ  ＩＣＲ４または２’ＯＨ  ＩＣＲ４（各３５ｎＭ）をトランスフェクトした。（図５Ｇ）細胞傷害性および（図５Ｈ）ＩＦＮ−β産生を、トランスフェクション後７２時間時点で評価した。エラーバーはＳ．Ｄ．を表す。＊Ｐ＜０．０５。
【図６Ａ−１】免疫原性細胞死誘導剤による処理後のヒト癌細胞からの自然免疫刺激性ＤＡＭＰおよびカルレティキュリンの放出を示す図である。（図６Ａ）ＷＭ２６６−４（２×１０5細胞／ウェル）細胞に、２４ウェルプレートでＩＣＲ２またはＩＣＲ４（各０．５μｇ／ｍｌ）をトランスフェクトし、トランスフェクション後２４時間時点で回収した。カルレティキュリンの表面発現をフローサイトメトリーによって決定した。（図６Ｂ）ＩＣＲ２、ＩＣＲ４またはドキソルビシン（Ｄｏｘ）で処理した、死んだ／死につつあるＷＭ２６６−４細胞のＤＣによる取り込みを、食作用アッセイによって決定した。（図６Ｃ）ＩＣＲ２、ＩＣＲ４またはＤｏｘで処理した細胞からの核タンパク質ＨＭＧＢ１の分泌を、ＥＬＩＳＡによって決定した。（図６Ｄ〜６Ｆ）ＤＡＭＰを、「方法」に記載されているようにトランスフェクション剤単独（モックＤＡＭＰ）、ＩＣＲ２（ＩＣＲ２  ＤＡＭＰ）、ＩＣＲ４（ＩＣＲ４  ＤＡＭＰ）、ｐｏｌｙＩ：Ｃ（ｐＩＣ  ＤＡＭＰ）またはドキソルビシン（Ｄｏｘ  ＤＡＭＰ）で処理したＷＭ２６６−４細胞から単離した。ＨＥＫ−ＴＬＲ２、ＨＥＫ−ＴＬＲ３、ＨＥＫ−ＴＬＲ４およびＨＥＫ−ＴＬＲ９レポーター細胞（５×１０4細胞／ウェル）をＤＡＭＰ（２５％ｖ／ｖ）とインキュベートした。ＴＬＲ４（図６Ｄ）、ＴＬＲ３（図６Ｅ）、ＴＬＲ２（図６Ｆ）、およびＴＬＲ９（図６Ｇ）の活性化を比色アッセイによって決定した。Ｐａｍ３ＣＳＫ４、非トランスフェクトＰｏｌｙＩ：Ｃ、ＬＰＳおよびＣｐＧ  ２００６を、ＴＬＲレポーターアッセイの陽性対照として使用した。図６Ａ〜６Ｂデータは、２つの個別の実験を表す。図６Ｃ〜６Ｇデータは、３つの実験の平均である。エラーバーはＳ．Ｄ．である。＊Ｐ＜０．０５。
【図６Ａ−２】免疫原性細胞死誘導剤による処理後のヒト癌細胞からの自然免疫刺激性ＤＡＭＰおよびカルレティキュリンの放出を示す図である。（図６Ａ）ＷＭ２６６−４（２×１０5細胞／ウェル）細胞に、２４ウェルプレートでＩＣＲ２またはＩＣＲ４（各０．５μｇ／ｍｌ）をトランスフェクトし、トランスフェクション後２４時間時点で回収した。カルレティキュリンの表面発現をフローサイトメトリーによって決定した。（図６Ｂ）ＩＣＲ２、ＩＣＲ４またはドキソルビシン（Ｄｏｘ）で処理した、死んだ／死につつあるＷＭ２６６−４細胞のＤＣによる取り込みを、食作用アッセイによって決定した。（図６Ｃ）ＩＣＲ２、ＩＣＲ４またはＤｏｘで処理した細胞からの核タンパク質ＨＭＧＢ１の分泌を、ＥＬＩＳＡによって決定した。（図６Ｄ〜６Ｆ）ＤＡＭＰを、「方法」に記載されているようにトランスフェクション剤単独（モックＤＡＭＰ）、ＩＣＲ２（ＩＣＲ２  ＤＡＭＰ）、ＩＣＲ４（ＩＣＲ４  ＤＡＭＰ）、ｐｏｌｙＩ：Ｃ（ｐＩＣ  ＤＡＭＰ）またはドキソルビシン（Ｄｏｘ  ＤＡＭＰ）で処理したＷＭ２６６−４細胞から単離した。ＨＥＫ−ＴＬＲ２、ＨＥＫ−ＴＬＲ３、ＨＥＫ−ＴＬＲ４およびＨＥＫ−ＴＬＲ９レポーター細胞（５×１０4細胞／ウェル）をＤＡＭＰ（２５％ｖ／ｖ）とインキュベートした。ＴＬＲ４（図６Ｄ）、ＴＬＲ３（図６Ｅ）、ＴＬＲ２（図６Ｆ）、およびＴＬＲ９（図６Ｇ）の活性化を比色アッセイによって決定した。Ｐａｍ３ＣＳＫ４、非トランスフェクトＰｏｌｙＩ：Ｃ、ＬＰＳおよびＣｐＧ  ２００６を、ＴＬＲレポーターアッセイの陽性対照として使用した。図６Ａ〜６Ｂデータは、２つの個別の実験を表す。図６Ｃ〜６Ｇデータは、３つの実験の平均である。エラーバーはＳ．Ｄ．である。＊Ｐ＜０．０５。
【図６Ｂ】免疫原性細胞死誘導剤による処理後のヒト癌細胞からの自然免疫刺激性ＤＡＭＰおよびカルレティキュリンの放出を示す図である。（図６Ａ）ＷＭ２６６−４（２×１０5細胞／ウェル）細胞に、２４ウェルプレートでＩＣＲ２またはＩＣＲ４（各０．５μｇ／ｍｌ）をトランスフェクトし、トランスフェクション後２４時間時点で回収した。カルレティキュリンの表面発現をフローサイトメトリーによって決定した。（図６Ｂ）ＩＣＲ２、ＩＣＲ４またはドキソルビシン（Ｄｏｘ）で処理した、死んだ／死につつあるＷＭ２６６−４細胞のＤＣによる取り込みを、食作用アッセイによって決定した。（図６Ｃ）ＩＣＲ２、ＩＣＲ４またはＤｏｘで処理した細胞からの核タンパク質ＨＭＧＢ１の分泌を、ＥＬＩＳＡによって決定した。（図６Ｄ〜６Ｆ）ＤＡＭＰを、「方法」に記載されているようにトランスフェクション剤単独（モックＤＡＭＰ）、ＩＣＲ２（ＩＣＲ２  ＤＡＭＰ）、ＩＣＲ４（ＩＣＲ４  ＤＡＭＰ）、ｐｏｌｙＩ：Ｃ（ｐＩＣ  ＤＡＭＰ）またはドキソルビシン（Ｄｏｘ  ＤＡＭＰ）で処理したＷＭ２６６−４細胞から単離した。ＨＥＫ−ＴＬＲ２、ＨＥＫ−ＴＬＲ３、ＨＥＫ−ＴＬＲ４およびＨＥＫ−ＴＬＲ９レポーター細胞（５×１０4細胞／ウェル）をＤＡＭＰ（２５％ｖ／ｖ）とインキュベートした。ＴＬＲ４（図６Ｄ）、ＴＬＲ３（図６Ｅ）、ＴＬＲ２（図６Ｆ）、およびＴＬＲ９（図６Ｇ）の活性化を比色アッセイによって決定した。Ｐａｍ３ＣＳＫ４、非トランスフェクトＰｏｌｙＩ：Ｃ、ＬＰＳおよびＣｐＧ  ２００６を、ＴＬＲレポーターアッセイの陽性対照として使用した。図６Ａ〜６Ｂデータは、２つの個別の実験を表す。図６Ｃ〜６Ｇデータは、３つの実験の平均である。エラーバーはＳ．Ｄ．である。＊Ｐ＜０．０５。
【図６Ｃ】免疫原性細胞死誘導剤による処理後のヒト癌細胞からの自然免疫刺激性ＤＡＭＰおよびカルレティキュリンの放出を示す図である。（図６Ａ）ＷＭ２６６−４（２×１０5細胞／ウェル）細胞に、２４ウェルプレートでＩＣＲ２またはＩＣＲ４（各０．５μｇ／ｍｌ）をトランスフェクトし、トランスフェクション後２４時間時点で回収した。カルレティキュリンの表面発現をフローサイトメトリーによって決定した。（図６Ｂ）ＩＣＲ２、ＩＣＲ４またはドキソルビシン（Ｄｏｘ）で処理した、死んだ／死につつあるＷＭ２６６−４細胞のＤＣによる取り込みを、食作用アッセイによって決定した。（図６Ｃ）ＩＣＲ２、ＩＣＲ４またはＤｏｘで処理した細胞からの核タンパク質ＨＭＧＢ１の分泌を、ＥＬＩＳＡによって決定した。（図６Ｄ〜６Ｆ）ＤＡＭＰを、「方法」に記載されているようにトランスフェクション剤単独（モックＤＡＭＰ）、ＩＣＲ２（ＩＣＲ２  ＤＡＭＰ）、ＩＣＲ４（ＩＣＲ４  ＤＡＭＰ）、ｐｏｌｙＩ：Ｃ（ｐＩＣ  ＤＡＭＰ）またはドキソルビシン（Ｄｏｘ  ＤＡＭＰ）で処理したＷＭ２６６−４細胞から単離した。ＨＥＫ−ＴＬＲ２、ＨＥＫ−ＴＬＲ３、ＨＥＫ−ＴＬＲ４およびＨＥＫ−ＴＬＲ９レポーター細胞（５×１０4細胞／ウェル）をＤＡＭＰ（２５％ｖ／ｖ）とインキュベートした。ＴＬＲ４（図６Ｄ）、ＴＬＲ３（図６Ｅ）、ＴＬＲ２（図６Ｆ）、およびＴＬＲ９（図６Ｇ）の活性化を比色アッセイによって決定した。Ｐａｍ３ＣＳＫ４、非トランスフェクトＰｏｌｙＩ：Ｃ、ＬＰＳおよびＣｐＧ  ２００６を、ＴＬＲレポーターアッセイの陽性対照として使用した。図６Ａ〜６Ｂデータは、２つの個別の実験を表す。図６Ｃ〜６Ｇデータは、３つの実験の平均である。エラーバーはＳ．Ｄ．である。＊Ｐ＜０．０５。
【図６Ｄ】免疫原性細胞死誘導剤による処理後のヒト癌細胞からの自然免疫刺激性ＤＡＭＰおよびカルレティキュリンの放出を示す図である。（図６Ａ）ＷＭ２６６−４（２×１０5細胞／ウェル）細胞に、２４ウェルプレートでＩＣＲ２またはＩＣＲ４（各０．５μｇ／ｍｌ）をトランスフェクトし、トランスフェクション後２４時間時点で回収した。カルレティキュリンの表面発現をフローサイトメトリーによって決定した。（図６Ｂ）ＩＣＲ２、ＩＣＲ４またはドキソルビシン（Ｄｏｘ）で処理した、死んだ／死につつあるＷＭ２６６−４細胞のＤＣによる取り込みを、食作用アッセイによって決定した。（図６Ｃ）ＩＣＲ２、ＩＣＲ４またはＤｏｘで処理した細胞からの核タンパク質ＨＭＧＢ１の分泌を、ＥＬＩＳＡによって決定した。（図６Ｄ〜６Ｆ）ＤＡＭＰを、「方法」に記載されているようにトランスフェクション剤単独（モックＤＡＭＰ）、ＩＣＲ２（ＩＣＲ２  ＤＡＭＰ）、ＩＣＲ４（ＩＣＲ４  ＤＡＭＰ）、ｐｏｌｙＩ：Ｃ（ｐＩＣ  ＤＡＭＰ）またはドキソルビシン（Ｄｏｘ  ＤＡＭＰ）で処理したＷＭ２６６−４細胞から単離した。ＨＥＫ−ＴＬＲ２、ＨＥＫ−ＴＬＲ３、ＨＥＫ−ＴＬＲ４およびＨＥＫ−ＴＬＲ９レポーター細胞（５×１０4細胞／ウェル）をＤＡＭＰ（２５％ｖ／ｖ）とインキュベートした。ＴＬＲ４（図６Ｄ）、ＴＬＲ３（図６Ｅ）、ＴＬＲ２（図６Ｆ）、およびＴＬＲ９（図６Ｇ）の活性化を比色アッセイによって決定した。Ｐａｍ３ＣＳＫ４、非トランスフェクトＰｏｌｙＩ：Ｃ、ＬＰＳおよびＣｐＧ  ２００６を、ＴＬＲレポーターアッセイの陽性対照として使用した。図６Ａ〜６Ｂデータは、２つの個別の実験を表す。図６Ｃ〜６Ｇデータは、３つの実験の平均である。エラーバーはＳ．Ｄ．である。＊Ｐ＜０．０５。
【図６Ｅ】免疫原性細胞死誘導剤による処理後のヒト癌細胞からの自然免疫刺激性ＤＡＭＰおよびカルレティキュリンの放出を示す図である。（図６Ａ）ＷＭ２６６−４（２×１０5細胞／ウェル）細胞に、２４ウェルプレートでＩＣＲ２またはＩＣＲ４（各０．５μｇ／ｍｌ）をトランスフェクトし、トランスフェクション後２４時間時点で回収した。カルレティキュリンの表面発現をフローサイトメトリーによって決定した。（図６Ｂ）ＩＣＲ２、ＩＣＲ４またはドキソルビシン（Ｄｏｘ）で処理した、死んだ／死につつあるＷＭ２６６−４細胞のＤＣによる取り込みを、食作用アッセイによって決定した。（図６Ｃ）ＩＣＲ２、ＩＣＲ４またはＤｏｘで処理した細胞からの核タンパク質ＨＭＧＢ１の分泌を、ＥＬＩＳＡによって決定した。（図６Ｄ〜６Ｆ）ＤＡＭＰを、「方法」に記載されているようにトランスフェクション剤単独（モックＤＡＭＰ）、ＩＣＲ２（ＩＣＲ２  ＤＡＭＰ）、ＩＣＲ４（ＩＣＲ４  ＤＡＭＰ）、ｐｏｌｙＩ：Ｃ（ｐＩＣ  ＤＡＭＰ）またはドキソルビシン（Ｄｏｘ  ＤＡＭＰ）で処理したＷＭ２６６−４細胞から単離した。ＨＥＫ−ＴＬＲ２、ＨＥＫ−ＴＬＲ３、ＨＥＫ−ＴＬＲ４およびＨＥＫ−ＴＬＲ９レポーター細胞（５×１０4細胞／ウェル）をＤＡＭＰ（２５％ｖ／ｖ）とインキュベートした。ＴＬＲ４（図６Ｄ）、ＴＬＲ３（図６Ｅ）、ＴＬＲ２（図６Ｆ）、およびＴＬＲ９（図６Ｇ）の活性化を比色アッセイによって決定した。Ｐａｍ３ＣＳＫ４、非トランスフェクトＰｏｌｙＩ：Ｃ、ＬＰＳおよびＣｐＧ  ２００６を、ＴＬＲレポーターアッセイの陽性対照として使用した。図６Ａ〜６Ｂデータは、２つの個別の実験を表す。図６Ｃ〜６Ｇデータは、３つの実験の平均である。エラーバーはＳ．Ｄ．である。＊Ｐ＜０．０５。
【図６Ｆ】免疫原性細胞死誘導剤による処理後のヒト癌細胞からの自然免疫刺激性ＤＡＭＰおよびカルレティキュリンの放出を示す図である。（図６Ａ）ＷＭ２６６−４（２×１０5細胞／ウェル）細胞に、２４ウェルプレートでＩＣＲ２またはＩＣＲ４（各０．５μｇ／ｍｌ）をトランスフェクトし、トランスフェクション後２４時間時点で回収した。カルレティキュリンの表面発現をフローサイトメトリーによって決定した。（図６Ｂ）ＩＣＲ２、ＩＣＲ４またはドキソルビシン（Ｄｏｘ）で処理した、死んだ／死につつあるＷＭ２６６−４細胞のＤＣによる取り込みを、食作用アッセイによって決定した。（図６Ｃ）ＩＣＲ２、ＩＣＲ４またはＤｏｘで処理した細胞からの核タンパク質ＨＭＧＢ１の分泌を、ＥＬＩＳＡによって決定した。（図６Ｄ〜６Ｆ）ＤＡＭＰを、「方法」に記載されているようにトランスフェクション剤単独（モックＤＡＭＰ）、ＩＣＲ２（ＩＣＲ２  ＤＡＭＰ）、ＩＣＲ４（ＩＣＲ４  ＤＡＭＰ）、ｐｏｌｙＩ：Ｃ（ｐＩＣ  ＤＡＭＰ）またはドキソルビシン（Ｄｏｘ  ＤＡＭＰ）で処理したＷＭ２６６−４細胞から単離した。ＨＥＫ−ＴＬＲ２、ＨＥＫ−ＴＬＲ３、ＨＥＫ−ＴＬＲ４およびＨＥＫ−ＴＬＲ９レポーター細胞（５×１０4細胞／ウェル）をＤＡＭＰ（２５％ｖ／ｖ）とインキュベートした。ＴＬＲ４（図６Ｄ）、ＴＬＲ３（図６Ｅ）、ＴＬＲ２（図６Ｆ）、およびＴＬＲ９（図６Ｇ）の活性化を比色アッセイによって決定した。Ｐａｍ３ＣＳＫ４、非トランスフェクトＰｏｌｙＩ：Ｃ、ＬＰＳおよびＣｐＧ  ２００６を、ＴＬＲレポーターアッセイの陽性対照として使用した。図６Ａ〜６Ｂデータは、２つの個別の実験を表す。図６Ｃ〜６Ｇデータは、３つの実験の平均である。エラーバーはＳ．Ｄ．である。＊Ｐ＜０．０５。
【図６Ｇ】免疫原性細胞死誘導剤による処理後のヒト癌細胞からの自然免疫刺激性ＤＡＭＰおよびカルレティキュリンの放出を示す図である。（図６Ａ）ＷＭ２６６−４（２×１０5細胞／ウェル）細胞に、２４ウェルプレートでＩＣＲ２またはＩＣＲ４（各０．５μｇ／ｍｌ）をトランスフェクトし、トランスフェクション後２４時間時点で回収した。カルレティキュリンの表面発現をフローサイトメトリーによって決定した。（図６Ｂ）ＩＣＲ２、ＩＣＲ４またはドキソルビシン（Ｄｏｘ）で処理した、死んだ／死につつあるＷＭ２６６−４細胞のＤＣによる取り込みを、食作用アッセイによって決定した。（図６Ｃ）ＩＣＲ２、ＩＣＲ４またはＤｏｘで処理した細胞からの核タンパク質ＨＭＧＢ１の分泌を、ＥＬＩＳＡによって決定した。（図６Ｄ〜６Ｆ）ＤＡＭＰを、「方法」に記載されているようにトランスフェクション剤単独（モックＤＡＭＰ）、ＩＣＲ２（ＩＣＲ２  ＤＡＭＰ）、ＩＣＲ４（ＩＣＲ４  ＤＡＭＰ）、ｐｏｌｙＩ：Ｃ（ｐＩＣ  ＤＡＭＰ）またはドキソルビシン（Ｄｏｘ  ＤＡＭＰ）で処理したＷＭ２６６−４細胞から単離した。ＨＥＫ−ＴＬＲ２、ＨＥＫ−ＴＬＲ３、ＨＥＫ−ＴＬＲ４およびＨＥＫ−ＴＬＲ９レポーター細胞（５×１０4細胞／ウェル）をＤＡＭＰ（２５％ｖ／ｖ）とインキュベートした。ＴＬＲ４（図６Ｄ）、ＴＬＲ３（図６Ｅ）、ＴＬＲ２（図６Ｆ）、およびＴＬＲ９（図６Ｇ）の活性化を比色アッセイによって決定した。Ｐａｍ３ＣＳＫ４、非トランスフェクトＰｏｌｙＩ：Ｃ、ＬＰＳおよびＣｐＧ  ２００６を、ＴＬＲレポーターアッセイの陽性対照として使用した。図６Ａ〜６Ｂデータは、２つの個別の実験を表す。図６Ｃ〜６Ｇデータは、３つの実験の平均である。エラーバーはＳ．Ｄ．である。＊Ｐ＜０．０５。
【図６Ｈ】ＩＣＲ２およびＩＣＲ４をトランスフェクトした細胞における核タンパク質ＨＭＧＢ１の細胞質移行を示す図である。ＷＭ２６６−４細胞に、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４またはトランスフェクション試薬単独（モック）を４時間トランスフェクトした。細胞をトランスフェクション後２４時間時点で回収し、抗ＨＭＧＢ１（緑色）およびＤＡＰＩ（青色）で共染色した。核および細胞質ＨＭＧＢ１および核ＤＡＰＩの発現を、蛍光顕微鏡（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）によって検出した。
【図６Ｉ】ＤＡＭＰで刺激したヒトＤＣがサイトカインを産生したことを示す図である。ヒトＰＢＭＣ由来未成熟ＤＣを、トランスフェクション試薬単独（モックＤＡＭＰ）、ＩＣＲ２（ＩＣＲ２  ＤＡＭＰ）、ＩＣＲ４（ＩＣＲ４  ＤＡＭＰ）またはドキソルビシン（Ｄｏｘ  ＤＡＭＰ）で処理したＷＭ２６６−４細胞から単離したＤＡＭＰで刺激した。刺激ＤＣ（デノボ）によるＴＮＦα、ＩＬ−６およびＩＬ−８のデノボ産生、ならびにＤＡＭＰ中の既存のサイトカイン（キャリーオーバー）をＥＬＩＳＡによって決定した。
【図６Ｊ】免疫原性細胞死誘導剤で処理したヒト癌細胞からの凝固促進性ＤＡＭＰの放出を示す図である。トランスフェクション試薬単独（モックＤＡＭＰ）、ＩＣＲ２（ＩＣＲ２  ＤＡＭＰ）、ＩＣＲ４（ＩＣＲ４  ＤＡＭＰ）、ｐｏｌｙＩ：Ｃ（ｐＩＣ  ＤＡＭＰ）およびドキソルビシン（Ｄｏｘ  ＤＡＭＰ）で処理した細胞からのＤＡＭＰ放出によるヒト血漿凝固の増強を、凝固アッセイによって決定した。ｎ＝３、エラーバーはＳ．Ｄ．である。＃  Ｐ＜０．０５（示された比較）。＊Ｐ＜０．０５（ｖｓ正常な血漿凝固時間（なし））。
【図７Ａ】ＩＣＲ２およびＩＣＲ４による腫瘍増殖の阻害を示す図である。（図７Ａ〜７Ｂ）ヒトメラノーマＷＭ２６６−４細胞（７×１０5）をヌードマウスに皮下注射した。担腫瘍マウスに、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４またはｐｏｌｙＩ：Ｃ（ｐＩＣ）（各２０μｇ／マウス）をｉｎ  ｖｉｖｏ  ｊｅｔＰＥＩを用いて５日間連続で毎日腫瘍内注射した（ｎ＝９）。腫瘍増殖（図７Ａ）を１日おきに測定し、生存率（図７Ｂ）を決定した。（図７Ｃ）Ｂ１６−Ｆ０マウスメラノーマ細胞（２×１０5）を、同系Ｃ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射した。ＩＣＲ４またはｐＩＣ（各２０μｇ／マウス）のどちらかを４日間連続で腫瘍内投与し（ｎ＝５）、生存率（図７Ｃ）を決定した。エラーバーはＳ．Ｄ．である。＊Ｐ＜０．０５（ビヒクルｖｓ  ＩＣＲ２、ＩＣＲ４、ｐＩＣ）。
【図７Ｂ】ＩＣＲ２およびＩＣＲ４による腫瘍増殖の阻害を示す図である。（図７Ａ〜７Ｂ）ヒトメラノーマＷＭ２６６−４細胞（７×１０5）をヌードマウスに皮下注射した。担腫瘍マウスに、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４またはｐｏｌｙＩ：Ｃ（ｐＩＣ）（各２０μｇ／マウス）をｉｎ  ｖｉｖｏ  ｊｅｔＰＥＩを用いて５日間連続で毎日腫瘍内注射した（ｎ＝９）。腫瘍増殖（図７Ａ）を１日おきに測定し、生存率（図７Ｂ）を決定した。（図７Ｃ）Ｂ１６−Ｆ０マウスメラノーマ細胞（２×１０5）を、同系Ｃ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射した。ＩＣＲ４またはｐＩＣ（各２０μｇ／マウス）のどちらかを４日間連続で腫瘍内投与し（ｎ＝５）、生存率（図７Ｃ）を決定した。エラーバーはＳ．Ｄ．である。＊Ｐ＜０．０５（ビヒクルｖｓ  ＩＣＲ２、ＩＣＲ４、ｐＩＣ）。
【図７Ｃ】ＩＣＲ２およびＩＣＲ４による腫瘍増殖の阻害を示す図である。（図７Ａ〜７Ｂ）ヒトメラノーマＷＭ２６６−４細胞（７×１０5）をヌードマウスに皮下注射した。担腫瘍マウスに、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４またはｐｏｌｙＩ：Ｃ（ｐＩＣ）（各２０μｇ／マウス）をｉｎ  ｖｉｖｏ  ｊｅｔＰＥＩを用いて５日間連続で毎日腫瘍内注射した（ｎ＝９）。腫瘍増殖（図７Ａ）を１日おきに測定し、生存率（図７Ｂ）を決定した。（図７Ｃ）Ｂ１６−Ｆ０マウスメラノーマ細胞（２×１０5）を、同系Ｃ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射した。ＩＣＲ４またはｐＩＣ（各２０μｇ／マウス）のどちらかを４日間連続で腫瘍内投与し（ｎ＝５）、生存率（図７Ｃ）を決定した。エラーバーはＳ．Ｄ．である。＊Ｐ＜０．０５（ビヒクルｖｓ  ＩＣＲ２、ＩＣＲ４、ｐＩＣ）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書に開示されるのは、ＩＮＦ−β、ＴＮＦ−α、またはＩＬ−６を含む炎症促進性サイトカインの同時発現を伴うまたは伴わない免疫原性癌細胞死を差次的に誘導することができる複数のヌクレアーゼ耐性ＲＮＡ分子である。組成物は、５’三リン酸、２’フルオロ修飾ピリミジン非直鎖状一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）または二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含む。この後の例に示されるように、組成物は強力な細胞傷害性を誘発する。いくつかの場合では、組成物はまた相当量のＩ型ＩＦＮ産生も誘導する。しかし、他の場合では、組成物は相当量のサイトカイン産生を誘導しない。故に、本明細書に開示された組成物は、強力な細胞傷害性ではあるがサイトカイン産生の差次的誘導をもたらす。
【００１５】
本明細書に記載されるＲＮＡ組成物は、ステムループの共通の構造モチーフを共有する。複数のステムループを含むＲＮＡ組成物は、サイトカイン産生を大きく誘導することなくテストされた最低濃度でいくつかの最高レベルの細胞傷害性または増殖阻害を示した。単一のステムループを有するＲＮＡ組成物のいくつかは、サイトカイン産生を大きく誘導することなく相当な細胞傷害性または増殖阻害を示すが、それらの単一ステム組成物は、複数ステム組成物と同等の濃度でより低い細胞傷害性もしくは増殖阻害、またはより大きなサイトカイン産生を示す傾向があった。いくつかの場合では、単一ステム組成物は、同等の濃度でより低い細胞傷害性もしくは増殖阻害またはより大きなＩＦＮ産生を示す。
サイトカインは、インターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、ケモカイン、およびリンホカインなどの一連のタンパク質を含む免疫調節剤である。この後の例に示されるように、ＲＮＡ組成物は、ＩＮＦ−β、ＴＮＦ−α、またはＩＬ−６などのサイトカインの産生を差次的に誘導することができる。
【００１６】
ステムループは、ヌクレオチドの完全または部分的なハイブリダイゼーションから形成され、ヘアピン構造モチーフをもたらす。ステムループは、約５個〜約３０個または約８個〜約２５個の任意の数のヌクレオチド対合を含む、任意の適切な数のヌクレオチド対合から形成され得る。特定の実施形態において、ステムループは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０個のヌクレオチド対合、またはその間の任意の数のヌクレオチド対合を含む。部分的なハイブリダイゼーションのみを有するステムループは、ステムに沿った相補的ヌクレオチド間のヌクレオチド対合を妨げる任意の数のヌクレオチド対ミスマッチを有し得る。好ましくは、ステムループは、生理的条件下で依然として安定である。いくつかの場合では、ステムループは、１、２、３、４、もしくは５個のヌクレオチド対ミスマッチ、またはその間の任意の範囲のヌクレオチド対ミスマッチを有する。ステム内のミスマッチは、ステムループにおけるバルジと呼ぶことができる。本明細書で使用される場合、安定は、熱力学的安定性または動力学的安定性であり得る。
ＲＮＡ組成物は、５’末端修飾を含んでもよい。５’末端修飾は、５’−三リン酸を含んでもよい。ＲＮＡ組成物がｄｓＲＮＡを含む場合、５’末端の一方または両方が５’−三リン酸を含むように修飾され得る。
【００１７】
ＲＮＡ組成物は、２’−フルオロ修飾ピリミジンまたは２’−フルオロ修飾プリンを含んでもよい。２’−フルオロ修飾は、少なくとも１つのピリミジンまたはプリンに存在してもよく、ピリミジンの全て、プリンの全て、またはピリミジンおよびプリンの全てを含む、任意の数のピリミジンまたはプリンに存在してもよい。適切には、２’−フルオロ修飾は、ピリミジンおよび／またはプリンの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％、またはその間の任意の範囲で存在している。２−フルオロ修飾は、ウリジン、シチジン、グアニン、アデニン、またはそれらの任意の組み合わせに存在してもよい。いくつかの実施形態において、ウリジンのみが２’−フルオロ修飾である。一実施形態において、ＲＮＡ中のウリジンの全てが２’−フルオロ−修飾され、ＲＮＡ中のシチジンの全てが２’−フルオロ−修飾され、ＲＮＡ中のグアニンの全てが２’−フルオロ−修飾され、ＲＮＡ中のアデニンの全てが２’−フルオロ−修飾され、またはそれらの任意の組み合わせである。
【００１８】
ＲＮＡ組成物は、硫黄原子がリン酸の非架橋酸素に置換されたホスホロチオエート修飾ヌクレオチドを含んでもよい。適切には、ホスホロチオエート修飾は、ヌクレオチドの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％、またはその間の任意の範囲で存在している。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドの５’および／または３’末端の最後の３〜５ヌクレオチドがホスホロチオエート修飾される。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの全てがホスホロチオエート修飾される。
【００１９】
ＲＮＡ組成物は、平滑末端ステムループ、５’オーバーハングを有するステムループ、３’オーバーハング、または５’オーバーハングおよび３’オーバーハングの両方を有するステムループを含んでもよい。平滑末端ステムループは、互いとハイブリダイズし、ステムループを形成することができる５’末端ヌクレオチドおよびその３’末端相補体を含む。５’オーバーハングのみを有するステムループは、その相補体とハイブリダイズしてステムループを形成することができる３’末端ヌクレオチドを含む。３’オーバーハングのみを有するステムループは、その相補体とハイブリダイズしてステムループを形成することができる５’末端ヌクレオチドを含む。５’オーバーハングおよび３’オーバーハングの両方を有するステムループに関して、５’末端ヌクレオチドも３’末端ヌクレオチドもステムループの一部を形成しない。
【００２０】
５’または３’オーバーハングは、ＲＮＡ組成物が細胞増殖を阻害する、または細胞死を誘導することを可能にする任意の長さとなり得る。適切には、５’および／または３’オーバーハングは、約１〜約５０ヌクレオチド長となり得る。いくつかの実施形態において、５’および／または３’オーバーハングは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ヌクレオチドの長さ、またはその間の任意の範囲の長さを含む、約１〜約１０ヌクレオチド長である。他の場合では、５’および／または３’オーバーハングは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０ヌクレオチドの長さ、またはその間の任意の範囲の長さを含む、約１０〜約５０ヌクレオチド長である。当業者は、所望の活性をもたらす適当なオーバーハングの長さを選択することができるであろう。例が示しているように、より短いオーバーハング、特に３’オーバーハングを含むＲＮＡ組成物は、細胞増殖を阻害または細胞死を誘導し、サイトカイン産生を誘導する能力を示す可能性がより高い。対照的に、より長いオーバーハングを含むＲＮＡ組成物は、サイトカイン産生を誘導することなく細胞増殖を阻害する、または細胞死を誘導する能力を示す可能性がより高い。
【００２１】
特定の実施形態において、ＲＮＡ組成物は、複数のステムループを含む。この後の例に示されるように、２つまたは３つのステムループを含むＲＮＡ組成物は、驚くべきことに、大幅なＩＦＮ産生も同様に誘導することなく細胞の増殖を阻害する、または細胞死を誘導するのに有効である。複数のステムループを有するＲＮＡ組成物は、第１のステムループ、第２のステムループ、およびステムループ間のスペーサーを最小限含む。ステムループは同じであってもよいが、例に示されている通りである必要はない。
【００２２】
ＲＮＡ組成物は、末端ヌクレオチドがその相補体とハイブリダイズして第１のステムループ、第２のステムループ、または両方のいずれかを形成することを可能にするヌクレオチド配列を含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ組成物は、その相補的ヌクレオチドとハイブリダイズして第１または第２のステムループのどちらかを形成することができる５’−三リン酸修飾末端ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ組成物は、その相補的ヌクレオチドとハイブリダイズしてどちらかのステムループを形成することができる３’末端ヌクレオチドを含む。例に示されるように、ＲＮＡ組成物は、その相補的ヌクレオチドとハイブリダイズして第１のステムループを形成することができる５’−三リン酸修飾末端ヌクレオチド、およびその相補的ヌクレオチドとハイブリダイズして第２のステムループを形成することができる３’末端ヌクレオチドを含んでもよい。また、例に示されるように、ＲＮＡ組成物は二本鎖であってもよく、その相補的ヌクレオチドとハイブリダイズして第１のステムループを形成することができる５’−三リン酸修飾末端ヌクレオチド、およびその相補的ヌクレオチドとハイブリダイズして第２のステムループを形成することができる５’−三リン酸修飾末端ヌクレオチドを含んでもよい。
【００２３】
ＲＮＡ組成物は、第１のステムループおよび第２のステムループのどちらかまたは両方と結合された５’または３’オーバーハングを含んでもよい。第１のステムループまたは第２のステムループのどちらかと結合された５’または３’オーバーハングは、ＲＮＡ組成物が細胞増殖を阻害する、または細胞死を誘導することを可能にする任意の長さとなり得る。適切には、５’および／または３’オーバーハングは、約１〜約５０ヌクレオチド長となり得る。いくつかの実施形態において、５’および／または３’オーバーハングは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ヌクレオチドの長さ、またはその間の任意の範囲の長さを含む、約１〜約１０ヌクレオチド長である。他の場合では、５’および／または３’オーバーハングは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０ヌクレオチドの長さ、またはその間の任意の範囲の長さを含む、約１０〜約５０ヌクレオチド長である。当業者は、所望の活性をもたらす適当なオーバーハングの長さを選択することができるであろう。
【００２４】
スペーサーは、複数ステムループ組成物におけるステムループを接続する。いくつかの実施形態において、スペーサーは、ｓｓＲＮＡのセグメント、ｄｓＲＮＡのセグメント、またはその組み合わせを含む。ｄｓＲＮＡセグメントは、第２のヌクレオチド配列を伴う第１のヌクレオチド配列のセグメントの完全または部分的にハイブリダイズされたセグメントを含んでもよい。部分的なハイブリダイゼーションのみを有するスペーサーは、スペーサーに沿った相補的ヌクレオチド間のヌクレオチド対合を妨げる任意の数のヌクレオチド対ミスマッチを有し得る。好ましくは、スペーサーは、生理的条件下で熱力学的または動力学的に依然として安定である。いくつかの場合、ステムループは、１、２、３、４、５個、またはそれ以上のヌクレオチド対ミスマッチを有する。
【００２５】
スペーサーは、ＩＦＮ産生を大きく誘導することなく細胞傷害性の利点を提供する任意の適切な長さとなり得る。適切には、スペーサーの長さは、ｓｓＲＮＡセグメントに沿った約５〜約１００ヌクレオチド、ｄｓＲＮＡセグメントに沿った約５〜約１００個のハイブリダイズもしくはミスマッチヌクレオチド対、またはその組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、スペーサーの長さは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０ヌクレオチドの長さ、またはその間の任意の範囲の長さを含む、約５〜約５０ヌクレオチドである。
【００２６】
いくつかの実施形態において、スペーサーは二次構造を伴わない。他の実施形態において、スペーサーは二次構造を伴う。構造化されたスペーサーは、ステムループを含み、少なくとも第３のステムループを含むＲＮＡ組成物をもたらすことができる。第３のステムループは、ヌクレオチドの完全または部分的なハイブリダイゼーションから形成され、ヘアピン構造モチーフをもたらすことができる。ステムループは、約５〜約３０個または約８〜約２５個の任意の数のヌクレオチド対合を含む、任意の適切な数のヌクレオチド対合から形成され得る。特定の実施形態において、ステムループは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０個のヌクレオチド対合、またはその間の任意の数のヌクレオチド対合を含む。部分的なハイブリダイゼーションのみを有するステムループは、ステムループが生理的条件下で依然として安定である限り、ステムに沿った相補的ヌクレオチド間のヌクレオチド対合を妨げる任意の数のヌクレオチド対ミスマッチを有し得る。いくつかの場合、ステムループは、１、２、３、４、または５個のヌクレオチド対ミスマッチ、またはその間の任意の範囲のヌクレオチド対ミスマッチを有する。
【００２７】
例示的なＲＮＡオリゴヌクレオチドが、表１に示されている。２’Ｆピリミジンを組み込んだ５’ｐｐｐ  ＲＮＡを含む免疫原性癌細胞殺滅ＲＮＡ（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ−ｋｉｌｌｉｎｇ  ＲＮＡ）（ＩＣＲ）と呼ばれるＲＮＡ組成物は、５’ｐｐｐならびに３’オーバーハングヘアピン（ＩＣＲ１、ＩＣＲ１Ａ、ＩＣＲ１Ｂ、ＩＣＲ１Ｃ）、平滑末端ヘアピン（ＩＣＲ２−３、ＩＣＲ２、ＩＣＲ２Ａ、ＩＣＲ２Ｂ）、５’オーバーハングヘアピン（ＩＣＲ３、ＩＣＲ３Ａ、ＩＣＲ３Ｂ、ＩＣＲ３Ｃ）、複数のステムループを含むｓｓＲＮＡ（ＩＣＲ４、ＩＣＲ４Ａ）および複数のステムループを含むｄｓＲＮＡ（ＩＣＲ５ＸおよびＩＣＲ５Ｙのハイブリダイゼーションから形成されるＩＣＲ５）を含む様々な予測された二次構造を様々な長さで含有するように設計および生成された。直鎖状５’ｐｐｐ  ｓｓＲＮＡ（ＩＣＲ−Ｌ）および長いｄｓＲＮＡ（ｐＩＣ）もまた比較のために生成された。当業者には明らかであるように、ＩＣＲ１、ＩＣＲ１Ａ、ＩＣＲ１Ｂ、ＩＣＲ１Ｃ、ＩＣＲ２Ａ、ＩＣＲ２Ｂ、ＩＣＲ３、ＩＣＲ３Ａ、ＩＣＲ３Ｂ、ＩＣＲ３Ｃ、ＩＣＲ４、ＩＣＲ４Ａ、ＩＣＲ５Ｘ、およびＩＣＲ５Ｙの各々は、ＩＣＲ２のオリゴヌクレオチド配列を含む。
【００２８】
【表１】
2020515625.tif 000003
【００２９】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ組成物は、ステムループを形成することができるオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ組成物は、ＩＣＲ２に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドの完全または部分的なハイブリダイゼーションから形成される１つまたは複数のステムループを含む。特定の実施形態において、ＲＮＡ組成物は、ＩＣＲ２に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドの完全または部分的なハイブリダイゼーションから形成される１つまたは複数のステムループを含む。ＲＮＡ組成物はまた、ＩＣＲ２に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するオリゴヌクレオチドの完全または部分的なハイブリダイゼーションから形成される１つまたは複数のステムループから本質的になる。
【００３０】
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ組成物は、ＩＣＲ１、ＩＣＲ１Ａ、ＩＣＲ１Ｂ、ＩＣＲ１Ｃ、ＩＣＲ２Ａ、ＩＣＲ２Ｂ、ＩＣＲ３、ＩＣＲ３Ａ、ＩＣＲ３Ｂ、ＩＣＲ３Ｃ、ＩＣＲ４、ＩＣＲ４Ａ、ＩＣＲ５Ｘ、またはＩＣＲ５Ｙに対して少なくとも５０％の配列同一性を有する１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、ＲＮＡ組成物は、任意のＩＣＲ１、ＩＣＲ１Ａ、ＩＣＲ１Ｂ、ＩＣＲ１Ｃ、ＩＣＲ２Ａ、ＩＣＲ２Ｂ、ＩＣＲ３、ＩＣＲ３Ａ、ＩＣＲ３Ｂ、ＩＣＲ３Ｃ、ＩＣＲ４、ＩＣＲ４Ａ、ＩＣＲ５Ｘ、またはＩＣＲ５Ｙに対して、少なくとも６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む。ＲＮＡ組成物はまた、ＩＣＲ１、ＩＣＲ１Ａ、ＩＣＲ１Ｂ、ＩＣＲ１Ｃ、ＩＣＲ２Ａ、ＩＣＲ２Ｂ、ＩＣＲ３、ＩＣＲ３Ａ、ＩＣＲ３Ｂ、ＩＣＲ３Ｃ、ＩＣＲ４、ＩＣＲ４Ａ、ＩＣＲ５Ｘ、またはＩＣＲ５Ｙのいずれかに対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する１つまたは複数のオリゴヌクレオチドから本質的に成ってもよい。
【００３１】
例１に示されるように、ＩＣＲは、直鎖状ＩＣＲおよび最も短いステムループを含有するＩＣＲを除き用量依存的細胞傷害性を示した。細胞傷害性を示すそれらのＩＣＲに関して、サイトカイン発現は差次的に誘導された。９〜１２ｂｐの長いステムループに平滑末端を有するＩＣＲは、ヒトメラノーマ細胞によるＩＦＮ−βのｐｏｌｙＩ：Ｃより２〜３倍高い産生を誘導し、５’および３’オーバーハングの長さ、ならびにステムループの数および長さは、ＩＦＮ−β発現と逆相関した。
本明細書で使用される場合、ＲＮＡ組成物が、同じ条件下でｐｏｌｙＩ：Ｃと少なくとも同程度のサイトカインの産生を誘導するならば、あるいは、サイトカイン産生が、未処理対照細胞におけるＩＦＮの産生と比較して５、６、７、８、９、１０倍またはそれ以上増加するならば、ＲＮＡ組成物は相当量または多量のサイトカインを誘導する。いくつかの場合、測定されるサイトカインは、ＩＮＦ−β、ＴＮＦ−α、またはＩＬ−６である。
【００３２】
ＰＲＲ誘導癌細胞死は、結集して癌に対する自然および適応免疫応答を刺激し、また、正常な組織に対する破壊的な炎症性応答および血栓性合併症も引き起こす可能性がある複数の免疫および止血調節因子、例えば、ＩＦＮ、炎症性サイトカイン、ＤＡＭＰの放出を伴う。ＰＲＲ誘導癌細胞死によって生成される２つに分かれた応答が、どうしたらＰＲＲ治療の抗癌治療効果および全般的利点を増強するように好都合に修飾されるかが長いこと問われてきた。以下に示されるように、ＩＣＲ２もＩＣＲ４も、ｐｏｌｙＩ：Ｃと比べて、ヒト癌細胞の強い免疫原性細胞死、ならびにヒト癌細胞および免疫細胞によるＴＮＦ−α産生の大幅な低下を誘発する新規のＰＲＲ刺激ｓｓＲＮＡである。ＩＣＲ２は、ヒト癌細胞のＩＦＮ依存性壊死およびＩＣＲ４よりはるかに高量のＩ型ＩＦＮを誘導する。対照的に、ＩＣＲ４は、ＲＩＧ−Ｉ依存性アポトーシス細胞死を誘導し、ＩＣＲ２より炎症性が大幅に低いＤＡＭＰおよび凝固性が低いＤＡＭＰを生成した。
【００３３】
アポトーシスなどの生理学的細胞死は免疫原性または免疫寛容原性が乏しく、一方で、壊死などの病理的死は免疫原性であると考えられてきた。37  しかし、特定のアポトーシス剤、例えば、ドキソルビシンは、壊死剤より免疫原性の癌細胞死を誘導したことも示されている。34、38  免疫系が、異なる癌細胞死にどのように差次的に応答するのかは依然として不明である。ＩＣＲ４生成ＤＡＭＰによって刺激されるＴＬＲのタイプは、ＩＣＲ２およびｐｏｌｙＩ：Ｃ生成ＤＡＭＰによって刺激されるものと類似していたが、ＩＣＲ４生成ＤＡＭＰによって刺激されるＴＬＲのシグナル強度は、ＩＣＲ２およびｐｏｌｙＩ：Ｃ生成ＤＡＭＰによって刺激されるＴＬＲのシグナル強度より大幅に低かった。ＴＬＲシグナル強度と一致して、ＩＣＲ４誘導細胞死は、ＩＣＲ２およびｐｏｌｙＩ：Ｃ誘導細胞死より大幅に少ない量の内因性ＴＬＲ４リガンドＨＭＧＢ１を放出した。
【００３４】
ＤＡＭＰのレベルは、細胞死の免疫原性およびＴＬＲ刺激活性と必ずしも直接相関しない。ＩＣＲ４もドキソルビシンもアポトーシス癌細胞死を誘導し、それらは同等量のＨＭＧＢ１放出を引き起こした。しかし、ＴＬＲ４レポーター細胞は、ＩＣＲ４生成ＤＡＭＰによって刺激されたが、ドキソルビシン生成ＤＡＭＰには刺激されなかった。酸化的状態に応じて、ＨＭＧＢ１は、自然応答および炎症性応答を差次的に誘導することが示された。39  還元型ＨＭＧＢ１はＴＬＲ４を刺激することができ、免疫刺激活性を有するが、酸化型ＨＭＧＢ１はＴＬＲ４を刺激せず、免疫寛容原性活性を有する。39、40  これらのデータは、異なるタイプの細胞死は、量的および質的に異なるＤＡＭＰを生成し、異なるＴＬＲ刺激および異なる免疫応答につながり得ることを示唆している。
【００３５】
Ｋｏｈｌｗａｙらは、１０ｂｐの二本鎖長を有する５’ｐｐｐ  ＲＮＡヘアピンが、ＲＩＧ−Ｉ  ＡＴＰアーゼ活性をインビトロで有効に刺激し、このＲＮＡヘアピンによるトランスフェクションが、ＲＩＧ−Ｉ発現２９３Ｔ細胞株によるＩＦＮ−β産生を誘導することを示した。24  ＩＣＲ２は、９ｂｐの二本鎖長を有する２’Ｆ修飾５’ｐｐｐ  ＲＮＡヘアピンである。ＩＣＲ２の二次構造は、ＫｏｈｌｗａｙのＲＮＡヘアピンと極めて類似している。しかし、ＩＣＲ２は、公知のＲＩＧ−Ｉ刺激モチーフ、例えば、Ｕ／ＵＣ、41を含有せず、一方、ＫｏｈｌｗａｙのＲＮＡはＵ／ＵＣモチーフを有する。本発明者らは、ＩＣＲ２による処理が、Ｈｕｈ７．０およびＲＩＧ−Ｉ欠損Ｈｕｈ７．５細胞株の両方と同等の細胞傷害性を示すことを示した。さらに、ＩＣＲ２誘導癌細胞死およびＩＦＮ−β発現は、個別のＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５およびＰＫＲの欠損によって著しい影響を受けなかった。理論に拘束されるものではないが、１つの可能性は、ＩＣＲ２が他のＲＮＡ感知ＰＲＲによって認識され得るということである。例えば、ＴＬＲ１３は、機能およびリガンドが依然としてほとんど理解されていないエンドソームＴＬＲである。最近の研究は、ステムループ構造を形成すると予測されるウイルス由来１６ｎｔ  ｓｓＲＮＡが、マウスＴＬＲ１３を刺激したことを示している。42  ヒトＴＬＲ１３遺伝子およびその抗癌活性は、まだ解明されていない。ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン２（ＮＯＤ２）は、細菌ペプチドグリカンおよびウイルスｓｓＲＮＡを認識する別の細胞質ＰＲＲである。43  ＮＯＤ２は、ヒトおよびマウス細胞においてＩＲＦ３の活性化およびＩＦＮ−βの発現をトリガーする。44  さらに、ＩＦＩＴ１は、配列非依存的に５’ｐｐｐ  ＲＮＡに選択的に結合し、抗ウイルス応答を誘導する。2  別の可能性は、複数のＲＮＡ感知ＰＲＲがＩＣＲ２を同時に認識し、ＩＣＲ２誘導ＩＦＮ−β発現および細胞死における代償的役割を果たし得るということである。
本明細書に記載されるＲＮＡ組成物は、１つまたは複数の治療剤と組み合わせることができる。治療剤は、対象における癌を治療するのに使用される抗癌治療剤であってもよい。適切な抗癌治療剤には、限定するものではないが、放射線、化学療法剤、抗癌生物製剤、または免疫療法剤が挙げられ得る。
【００３６】
化学療法剤は、癌を治療するのに使用され得る化学療法化合物である。適切な化学療法剤には、限定するものではないが、５−フルオロウラシル、アクラシノマイシン、活性化シトキサン、ビサントレン、ブレオマイシン、カルモフール、ＣＣＮＵ、シスプラチナム、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ＤＴＩＣ、メルファラン、メトトレキサート、ミトロマイシン（ｍｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、マイトマイシンＣ、ペプロマイシン、ピポブロマン、プリカマイシン、プロカルバジン、レチノイン酸、タモキシフェン、タキソール、テガフール、ＶＰ１６、またはＶＭ２５が挙げられ得る。
【００３７】
抗癌生物製剤は、癌を治療するのに使用され得る生体分子（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、脂質、または炭水化物）である。抗癌生物製剤には、限定するものではないが、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−２β、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＣＴＬＡ−２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１５、ＩＬ−７、もしくはそれらの任意の組み合わせなどのサイトカイン；またはリツキシマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブ、アレムツズマブ、イブリツモマブ  チウキセタン、トシツモマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、パニツムマブ、オファツムマブ、ブレンツキシマブベドチン、ペルツズマブ、アドトラスツズマブエムタンシン、およびオビヌツズマブなどの抗癌抗体が挙げられ得る。
【００３８】
用語「免疫療法剤」は、その対象における免疫応答を誘導および／または増強することにより、対象における癌を治療するのに使用される任意の治療薬を指す。免疫療法剤には、限定するものではないが、チェックポイント阻害剤、癌ワクチン、改変Ｔ細胞などの免疫細胞、抗癌ウイルス、または二重特異性抗体が挙げられ得る。チェックポイント阻害剤は、自己寛容の維持および免疫応答の程度の調節に関与する免疫細胞中の免疫チェックポイント経路をブロックする抗体などの治療薬である。腫瘍は、腫瘍抗原に特異的なＴ細胞に対する免疫耐性の主な機構として、特定の免疫チェックポイント経路をしばしば利用する。免疫チェックポイントの多くは、受容体−リガンド相互作用によって開始され、故にリガンドもしくは受容体のどちらかに対する抗体によってブロックされ得、またはリガンドもしくは受容体の可溶性組換え形態によって調節され得る。そのような免疫チェックポイント遮断は、さもなければ免疫抑制的な腫瘍微小環境で腫瘍特異的Ｔ細胞が機能し続けることを可能にする。
【００３９】
例示的なチェックポイント阻害剤には、限定するものではないが、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１、ＣＤ２７９としても知られる）、プログラム細胞死１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２７４としても知られる）、ＰＤ−Ｌ２、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４、ＣＤ１５２としても知られる）、Ａ２ＡＲ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１２２、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＩＤＯ、ＫＩＲ、またはＶＩＳＴＡを標的にする抗体または他の治療薬が挙げられる。適切な抗ＰＤ１抗体には、限定するものではないが、ランブロリズマブ（Ｍｅｒｃｋ  ＭＫ−３４７５）、ニボルマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  ＢＭＳ−９３６５５８）、ＡＭＰ−２２４（Ｍｅｒｃｋ）、およびピディリズマブ（ＣｕｒｅＴｅｃｈ  ＣＴ−０１１）が挙げられる。適切な抗ＰＤ−Ｌ１抗体には、限定するものではないが、ＭＤＸ−１１０５（Ｍｅｄａｒｅｘ）、ＭＥＤＩ４７３６（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）ＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）およびＢＭＳ−９３６５５９（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）が挙げられる。例示的な抗ＣＴＬＡ４抗体には、限定するものではないが、イピリムマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）およびトレメリムマブ（Ｐｆｉｚｅｒ）が挙げられる。
最近の研究は、免疫原性細胞死誘導癌治療薬およびチェックポイント阻害剤、例えば、抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ−Ｌ１の組み合わせが、抗腫瘍応答および抗腫瘍免疫を相乗的に増強することを示した。45  ＩＣＲ２およびＩＣＲ４は、ヒト癌に対する強力なＰＲＲ刺激細胞傷害性剤である。ＩＣＲ２およびＩＣＲ４は、特有の免疫刺激活性および止血活性を有する。チェックポイント阻害剤および本明細書に記載されるＲＮＡ組成物の組み合わせは、進行癌に対する強力および有効な抗癌療法となるであろう。
【００４０】
癌ワクチンは、生体の免疫系を刺激して癌細胞を攻撃する。癌ワクチンは、一般には、腫瘍抗原特異的ヘルパーＴ細胞ならびに／または細胞傷害性Ｔ細胞およびＢ細胞を活性化する腫瘍抗原を免疫原性製剤中に含む。ワクチンは、限定するものではないが、樹状細胞、単球、ウイルス、リポソームおよびＤＮＡワクチンを含む様々な製剤であり得る。例示的な癌ワクチンには、限定するものではないが、シプリューセル−Ｔ（Ｐｒｏｖｅｎｇｅ（登録商標）、またはＡＰＣ８０１５）が挙げられる。シプリューセル−Ｔは、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の改変融合タンパク質を充填された自己樹状細胞（ＤＣ）から開発された、ＦＤＡ承認癌ワクチンである。
【００４１】
免疫療法剤には、癌細胞または癌細胞増殖を攻撃または低減するように対象へ養子移入される免疫細胞（すなわち、Ｔ細胞またはＢ細胞）が挙げられ得る。免疫細胞は、自己であってもよく、または免疫細胞を受け取る対象とは異なる対象に由来し、拒絶反応を低減するように修飾されてもよい。免疫細胞はまた、対象の癌に対する天然または遺伝子改変反応性も有し得る。例えば、天然自己Ｔ細胞は、転移性癌の治療に有効であることが示されている。例えば、Rosenberg SA et al., Nat. Rev. Cancer 8 (4): 299-308（2008）参照。天然自己Ｔ細胞は、切除された対象の腫瘍内で見出され得る。そのようなＴ細胞は、高濃度のＩＬ−２、抗ＣＤ３およびアロ反応性フィーダー細胞を用いてインビトロで増えるように誘導することができる。これらのＴ細胞は、例えば、その抗癌活性をさらに高めるためのＩＬ−２の外因性投与と共に、次いで対象に戻される。
【００４２】
本明細書に記載される組成物はまた、細胞質送達機構も含むことができる。そのような送達機構は当業者が利用可能であり、以下に限定されるものではないが、合成ポリマー（ｓｉＲＮＡ送達に使用されるものなど）、細胞透過性ペプチド（ＶＰ１６など）、ナノ粒子、ウイルス送達もしくは細胞の細胞質へのリポソーム送達（リポフェクション）、遺伝子銃による送達を含む全ての遺伝子送達機構を含み、またはトランスフェクション、ヌクレオフェクションもしくは電気穿孔を含み得る。細胞質送達機構は、細胞増殖阻害またはプログラム細胞死の誘導が望まれる細胞に組成物を送達することのみを標的にすることができる。例えば、細胞送達機構は、癌細胞またはウイルス感染細胞に対するＲＮＡを特異的に標的にすることができる。組成物は、その上、受容体媒介エンドサイトーシスによる取り込みのために細胞を標的にすることもできる。さらに、細胞は、本明細書に記載されるＲＮＡ組成物を発現するように遺伝子改変することができる。ＲＮＡは、適切に刺激されたときのみＲＮＡの発現を可能にする、誘導性プロモーターなどのプロモーターに作動可能に接続することができる。
【００４３】
本明細書に記載される組成物はまた、対象における癌の治療をもたらし得る癌細胞増殖の阻害または癌細胞のプログラム細胞死の誘導に使用することもできる。組成物はまた、他の非癌性増殖性障害の治療、またはウイルスもしくは他の細胞内病原体に感染された細胞などの感染細胞の治療においても有用であり得る。本明細書に提供される組成物はまた、抗原、病原体または癌細胞に対する免疫応答を刺激するアジュバントとして投与することもできる。本明細書に記載される組成物を投与され得る対象には、以下に限定されるものではないが、哺乳動物、家畜およびヒトが挙げられ、具体的にはイヌ、ネコ、魚、ニワトリ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギが挙げられ得る。
【００４４】
これらの系統と一緒に、本明細書に記載されるｓｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを含む組成物を用いて細胞の増殖を阻害する、またはプログラム細胞死を誘導する方法もまた提供される。方法は、組成物と細胞を接触させるステップ、あるいは細胞の増殖を阻害する、細胞のプログラム細胞死を誘導する、または細胞による炎症性サイトカイン産生を増加させるのに有効な量で組成物を対象に投与するステップを含む。細胞は、メラノーマ細胞、または以下に限定されるものではないが、脳、前立腺、卵巣、腎臓、肺、肝臓、結腸直腸および乳癌細胞または白血病もしくはリンパ腫細胞を含む他の癌細胞であってもよい。
適切には、組成物は、細胞の細胞質に送達される。組成物は、上記に記載され、以下に限定されるものではないが、リポソーム、合成ポリマー、細胞透過性ペプチド、ナノ粒子、ウイルスカプセル化、受容体媒介エンドサイトーシス、電気穿孔、または細胞の細胞質に組成物を送達するための任意の他の手段を含む、細胞質送達機構を通じて送達することができる。
細胞は、インビボ、インビトロ、またはエクスビボで直接または間接的に組成物と接触され得る。接触は、細胞、組織、哺乳動物、患者、またはヒトへの投与を包含する。さらに、細胞の接触には、細胞質送達機構による細胞培養物への組成物の添加、または任意の利用可能な手段による細胞の細胞質への組成物の導入が挙げられる。他の適切な方法には、以下に記載される投与の適当な手順および経路を用いた、細胞、組織、哺乳動物、または患者への組成物の導入または投与が挙げられ得る。
【００４５】
本明細書に記載される組成物の投与は、癌細胞の増殖を阻害する、または癌を治療することができる。この効果は、組成物の投与の全体的な免疫刺激効果に起因する、または組成物との接触によって開始されるプログラム細胞死による可能性がある。本明細書に記載される組成物の投与は、対照処理細胞と比較して、細胞の増殖を２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％またはそれ以上阻害することができる。本明細書に記載される組成物の投与はまた、処理細胞の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％超において細胞死、適切にはプログラム細胞死を誘導することもできる。プログラム細胞死は、細胞内プログラムによって媒介される細胞死の任意の方法を含み、以下に限定されるものではないが、アポトーシス、オートファジー、ネクロトーシス、アノイキス、または他の非アポトーシス型のプログラム細胞死を含む。
【００４６】
本明細書に記載される組成物は、対象における癌を治療するために対象に投与することができる。癌の治療には、以下に限定されるものではないが、対象における癌細胞数または腫瘍サイズの低減、より攻撃的な形態への癌の進行の低減、癌細胞の増殖の低減（増殖の阻害）または腫瘍増殖の速度の低減、癌細胞の殺滅（任意の方法による）、癌細胞の転移の低減または対象における癌の再発の可能性の低減が挙げられる。対象の治療は、本明細書で使用される場合、疾患を患っているまたは疾患を発症するリスクのある対象に、対象の状態（例えば、１つまたは複数の症状）の改善、疾患の進行の遅延、症状の発症の遅延または症状の進行の緩徐化等を含む利点を与える任意のタイプの治療を指す。
【００４７】
組成物は、医薬組成物を製造するのに使用されてもよい。上記に記載されたＲＮＡおよび組成物ならびに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。薬学的に許容される担体は、インビボでの投与に適した任意の担体である。組成物における使用に適した薬学的に許容される担体の例には、以下に限定されるものではないが、水、緩衝溶液、グルコース溶液、オイルヌクレオチド（ｏｉｌ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｄ）または細菌培養液が挙げられる。組成物の追加の成分には、安定剤、保存料、希釈剤、乳化剤および潤滑剤などの、例えば賦形剤が適切には挙げられ得る。薬学的に許容される担体または希釈剤の例には、炭水化物などの安定剤（例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、グルコース、デキストラン）、アルブミンまたはカゼインなどのタンパク質、ウシ血清または脱脂乳などのタンパク質含有剤、および緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）が挙げられる。特に、そのような安定剤が組成物に添加される場合、組成物は凍結乾燥または噴霧乾燥に適している。組成物はまた、乳化することもできる。
有効量または治療有効量は、本明細書で使用される場合、癌などの状況、障害または状態を治療するために対象に投与されるときに、治療（上記に定義された）を達成するのに十分な組成物の量を意味する。治療有効量は、組成物、疾患およびその重症度、ならびに治療される対象の年齢、体重、健康状態および反応性に応じて異なるであろう。
【００４８】
本明細書に記載される組成物は、以下に限定されるものではないが、経口、局所、鼻腔内、腹腔内、非経口、静脈内、頭蓋内、腫瘍内、筋肉内、皮下、髄腔内、経皮、鼻咽頭、または経粘膜吸収を含む、当業者に公知の任意の手段によって投与することができる。故に組成物は、摂取可能、注射可能な局所または座薬製剤として製剤化され得る。組成物はまた、リポプレックス、ポリプレックス、標的特異的ナノ粒子または徐放性ビヒクルで送達することもできる。本発明による対象への組成物の投与は、用量依存的に有益な効果を示すようである。故に、広範な限度内で、より大量の組成物の投与は、より少量の投与より有益な生物学的効果の増加を達成することが予想される。さらに、有効性もまた、毒性が見られるレベルより下の投与量で企図される。
【００４９】
いずれの場合においても投与される特定の投与量は、当業者に公知のように、投与される組成物、治療または阻害される疾患、対象の状態、および組成物の活性または対象の応答を変更し得る他の関連のある医学的要因に従って調整されることが理解されるであろう。例えば、特定の対象に対する特定の用量は、年齢、体重、全般的な健康状態、食生活、投与のタイミングおよび方法、排出速度、併用される医薬品、ならびに療法が適用される特定の障害の重症度に依存する。所与の患者に対する投与量は、従来の考察を用いて、例えば適当な従来の薬理学的または予防的プロトコルによって決定することができる。
【００５０】
対象に対する最大投与量は、望ましくないまたは耐え難い副作用を引き起こさない最高投与量である。個別の予防的または治療レジメンに関して変数の数は大きく、広範囲の用量が予想される。投与経路もまた、投与量要件に影響を与えるであろう。組成物の投与量は、治療前症状または未治療で放置された症状と比べて、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％状態の症状を低減することが予期される。薬学的調製物および組成物は、治癒をもたらすことなく疾患の症状を緩和もしくは軽減し得る、または、いくつかの実施形態において、疾患もしくは障害を治癒するのに使用され得ることが具体的に企図される。
【００５１】
組成物を投与するための適切な有効投与量は、当業者により決定され得るが、典型的には体重１キログラムあたり、週に約１マイクログラム〜約１００，０００マイクログラムに及ぶものの、典型的には体重１キログラムあたり、週に約１，０００マイクログラム以下である。いくつかの実施形態において、有効投与量は、体重１キログラムあたり、週に約１０〜約１０，０００マイクログラムに及ぶ。別の実施形態において有効投与量は、体重１キログラムあたり、週に約５０〜約５，０００マイクログラムに及ぶ。別の実施形態において、有効投与量は、体重１キログラムあたり、週に約７５〜約１，０００マイクログラムに及ぶ。本明細書に記載される有効投与量は、投与される総量を指す。すなわち、１つを超える組成物が投与される場合、有効投与量は投与される総量に相当する。組成物は、単回投与または分割投与として投与することができる。例えば、組成物は、４時間、６時間、８時間、１２時間、１日、２日、３日、４日、１週間、２週間、もしくは３週間またはそれ以上隔てて２回以上投与されてもよい。
【００５２】
その他
本開示は、本明細書に記載された構成要素、または方法ステップの構成、配置の特定の細部に限定されない。本明細書に開示された組成物および方法は、この後の本開示に照らして当業者に明らかとなる様々な方法で作成され、実践され、使用され、実施され、および／または形成されることができる。本明細書で使用される表現および用語は、説明の目的のみであり、特許請求の範囲の限定として見なされるべきではない。第１の、第２の、および第３のなどの序数標識は、説明および特許請求の範囲で使用される場合、様々な構造または方法ステップを指し、任意の特定の構造もしくはステップ、またはそのような構造もしくはステップの任意の特定の順序もしくは構成を示すと解釈されることを意味するものではない。本明細書に記載された全ての方法は、本明細書に特に指示のない限り、または文脈によって特に明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で行うことができる。本明細書に提供されるありとあらゆる例、または例示的用語（例えば、「など（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）の使用は、本開示を容易にすることが単に意図され、特に主張されない限り、本開示の範囲に対するいかなる制限も意味するものではない。本明細書の用語、および図面に示された構造は、任意の特許請求されていない要素が、開示された発明の主題の実践に不可欠であることを示していると解釈されるべきではない。用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」およびそれらの変形形態の本明細書における使用は、その後に列挙された要素およびその同等物、ならびに追加の要素を包含することを意図している。特定の要素を「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」として記載された実施形態は、それらの特定の要素「から本質的になる」および「からなる」としても企図される。
【００５３】
本明細書における値の範囲の記載は、本明細書に特に指示のない限り、範囲内にあるそれぞれの値を個々に指す簡略表記法としての役目を果たすことが意図されているにすぎず、それぞれの値は、本明細書に個々に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。例えば、濃度範囲が１％〜５０％として述べられているならば、２％〜４０％、１０％〜３０％、または１％〜３％などの値が、本明細書に明示的に列挙されることが意図される。これらは、具体的に意図されるものの例にすぎず、列挙された最低値と最高値の間の数値、ならびに列挙された最低値および最高値を含む数値の全ての可能性のある組み合わせが、本開示に明示的に述べられていると見なされるべきである。特定の記載された量または量の範囲を説明するための単語「約」の使用は、例えば、成形測定等における製造公差、器械誤差および人的誤差に起因することが説明され得る、または当然説明される値などの、記載された量に極めて近い値がその量に含まれることを示すことを意図するものである。量に言及する全てのパーセンテージは、特に指示のない限り質量による。
【００５４】
本明細書に引用された任意の非特許または特許文献を含むいかなる参考文献も、先行技術となることを承認するものではない。特に、本明細書における任意の文献への言及は、特に記載のない限り、これらの文献のいずれかが米国または任意の他の国における当技術分野の共通の一般常識の一部を形成するという承認にはならないことが理解されるであろう。参考文献のいずれの論考もその著者が主張することを述べており、本出願者は、本明細書に引用された文献のいずれかの正確さおよび適切さに異議を申し立てる権利を有する。本明細書に引用された全ての参考文献は、特に明示的に指示されない限り、その全体が参照により完全に組み込まれる。引用された参考文献に見出されるいずれかの定義および／または説明に何らかの不一致がある場合には、本開示が支配するものとする。
【００５５】
文脈によって特に指定または指示されない限り、用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、「１つまたは複数」を意味する。例えば、「タンパク質（ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」または「ＲＮＡ（ａｎ  ＲＮＡ）」は、それぞれ「１つまたは複数のタンパク質」または「１つまたは複数のＲＮＡ」を意味すると解釈されるべきである。
以下の例は、例示することを意図するにすぎず、本発明の範囲または添付の特許請求の範囲に対する限定として意図するものではない。
参考文献
2020515625.tif 000004
2020515625.tif 000005
2020515625.tif 000006
2020515625.tif 000007
2020515625.tif 000008
【実施例】
【００５６】
材料および方法
細胞培養
ヒトメラノーマ細胞株ＷＭ２６６−４（ＡＴＣＣ、マナッサス、ＶＡ）は、１０％ＦＢＳ、１×非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）および１ｍＭピルビン酸ナトリウムを補充したイーグル最小必須培地で維持した（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、カールスバッド、ＣＡ）。ヒト前立腺癌細胞株ＤＵ１４５（ＡＴＣＣ）は、１×ＮＥＡＡおよび１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０％ＦＢＳを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。ヒト肝細胞癌細胞株、Ｈｕｈ７．０およびＨｕｈ７．５は、Ｄｒ．  Ｓｔａｃｙ  Ｍ．  Ｈｏｒｎｅｒ、デューク大学によって好意により提供された。Ｈｕｈ７．０、Ｈｕｈ７．５、ヒト膵臓癌細胞株ＰＡＮＣ−１（ＡＴＣＣ）、マウス膵臓癌細胞株ＰＡＮＣ−０２（ＮＩＨ）およびマウスメラノーマ細胞株Ｂ１６．Ｆ０（ＡＴＣＣ）は、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭで維持した。ヒト膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ３細胞は、１０％ＦＢＳおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含むＲＰＭＩ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で維持した。ＴＬＲレポーター細胞株、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  Ｎｕｌｌ、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ｈＴＬＲ２、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ｈＴＬＲ３、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ｈＴＬＲ４およびＨＥＫ−Ｂｌｕｅ  ｈＴＬＲ９細胞（全てＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、サンディエゴ、ＣＡから購入）は、ＮＦ−ｋＢ／ＡＰ−１誘導性分泌型胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）および対応するＴＬＲを安定に発現し、これらの細胞は製造者の指示書に従って維持された。ヒト正常末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バンクーバー、カナダ）は、１０％ＦＢＳおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含むＲＰＭＩ  １６４０で培養した。未成熟樹状細胞（ＤＣ）は、以前に記載されているようにＰＢＭＣから生成した。46  全ての細胞を３７℃、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気でインキュベートした。
ＩＣＲの生成
全てのＩＣＲは、以前に記載されているように、Ｙ６３９Ｆ変異体Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写と、その後のゲル精製によって産生した。28  ＩＣＲ中の全てのピリミジンは２’フルオロ修飾される。
【００５７】
インビトロＲＮＡ処理およびＰＲＲ刺激
ＩＣＲおよびｐｏｌｙＩ：Ｃに、どちらもＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（登録商標）Ｄｕｏリポソームトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、ＭＡ）をトランスフェクション試薬（μｌ）：ＲＮＡ（μｇ）比３：１で製造者の指示書に従ってトランスフェクトした。ＲＮＡは８０〜９０％のコンフルエント細胞にトランスフェクトした。細胞をＲＮＡトランスフェクション剤複合体と４時間インキュベートし、その後新鮮な培養培地を補充した。細胞および培養上清を様々な時点で回収した。Ｐａｍ３ＣＳＫ４、ＣｐＧ  ２００６、ＰｏｌｙＩ：Ｃ、Ｒ８４８（全てＩｎｖｉｖｏＧｅｎ製）およびＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ）を、対照ＴＬＲおよびＰＲＲアゴニストとして使用した。
【００５８】
細胞増殖阻害および細胞死の定量化
未処理細胞と比べた増殖阻害を、Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＭＴＳ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ＷＩ）を用いて処理後７２時間時点で製造者の指示書に従って定量化した。増殖阻害パーセントは、以下の式：増殖阻害％＝（［Ｏ．Ｄ．］未処理−［Ｏ．Ｄ．］処理）／［Ｏ．Ｄ．］未処理×１００を使用して計算した。細胞死はＰＥ  Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｉ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンノゼ、ＣＡ）を用いて測定した。
【００５９】
Ｉ型ＩＦＮ、ＲＩＰＫおよびカスパーゼの阻害
Ｉ型ＩＦＮデコイ受容体Ｂ１８Ｒ（１μｇ／ｍｌ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、サンディエゴ、ＣＡ）、ＲＩＰキナーゼ阻害剤ネクロスタチン−１（１００μＭ）（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＯ）およびパン−カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ（５０μＭ）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）で細胞をＲＮＡ処理前および処理直後に６時間処理した。ＩＦＮ−β依存性細胞死を誘導するために、細胞を組換えヒトＩＦＮ−β（１００ｎｇ／ｍｌ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ロッキーヒル、ＮＪ）で処理した。
ＲＩＧ−Ｉ、ＰＫＲおよびＭＤＡ５発現のｓｉＲＮＡノックダウン
ＲＩＧ−Ｉ、ＰＫＲおよびＭＤＡ５の一過性ノックダウンは、以前に記載されているように行った。28  ２回目のｓｉＲＮＡトランスフェクション後５時間時点で、細胞を回収し、９６ウェルプレートに再播種し、一晩インキュベートした。細胞を、次いでＰＲＲ活性化ＲＮＡで処理した。
【００６０】
ＤＡＭＰの生成
ＤＡＭＰを生成するために、５×１０5  ＷＭ２６６−４細胞にＲＮＡ（１μｇ／ｍｌ）をトランスフェクトし、またはドキソルビシン（７．５μＭ）（Ｓｉｇｍａ）とインキュベートした。４時間後、細胞を新鮮な培養培地で５回洗浄し、１ｍｌの培養培地で２〜３日間インキュベートした。死細胞はトリパンブルーを用いてカウントする。９５％を超える細胞が死滅したら、培養上清を１２００ＲＰＭで５分間、遠心分離によって回収し、使用まで−８０℃で保管した。
食作用アッセイ
細胞をＰＫＨ６７  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｋｅｒ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いて標識した。ＰＫＨ６７標識細胞をＲＮＡまたはドキソルビシン（７．５μＭ）（Ｓｉｇｍａ）を用いて殺滅した。死んだ／死につつある細胞を処理後４８時間時点で回収し、未成熟ＤＣと１時間インキュベートした。ＰＫＨ６７標識した、死んだ／死につつある細胞の食作用を、フローサイトメトリーによって決定した。
【００６１】
ＤＡＭＰ誘導ＴＬＲ活性化およびＤＣ刺激
ＤＡＭＰを完全培地で２５％（ｖ／ｖ）に希釈した。５×１０4ＴＬＲレポーター細胞または１×１０5未成熟ＤＣを、希釈したＤＡＭＰと９６ウェルプレートで一晩インキュベートした。ＴＬＲ活性化を決定するために、ＳＥＡＰ放出のレベルを比色アッセイを用いて決定した。簡単には、４０μｌ培養上清を回収し、１８０μｌ  ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）と平底９６ウェルプレートで３時間インキュベートした。ＳＥＡＰ活性は、光学密度（ＯＤ）をＢｉｏＴｅｋ  Ｐｏｗｅｒ  Ｗａｖｅ  ＸＳ２  ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、ウィヌースキ、ＶＴ）により６５０ｎｍで読み取って得た。Ｐａｍ３ＣＳＫ４（ＴＬＲ２アゴニスト）、ＣｐＧ  ２００６（ＴＬＲ９アゴニスト）、ＰｏｌｙＩ：Ｃ（ＴＬＲ３アゴニスト）およびＬＰＳ（全てＩｎｖｉｖｏＧｅｎ製）を、対照ＴＬＲ刺激因子として使用した。ＤＣ刺激を決定するために、ＤＣによるサイトカイン産生をＥＬＩＳＡによって決定した。
【００６２】
インビボ抗腫瘍療法
５〜６週齢ＮＵ／ＪマウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（バーハーバー、ＭＥ）から入手した。７×１０5ＷＭ２６６−４ヒトメラノーマ細胞をＮＵ／Ｊヌードマウスの右側腹部に皮下移植した。マウスが触知可能な腫瘍を有する場合、ｉｎ  ｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩ（登録商標）（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、ニューヨーク、ＮＹ）を用いて、Ｎ／Ｐ＝８で担腫瘍マウスに２０μｇのＲＮＡ分子を腫瘍内注射した。ＲＮＡを５日間連続で毎日注射した。腫瘍増殖は、キャリパーを用いて腫瘍の直径を１日おきに測定して評価した。腫瘍体積は、［（横）2×（縦）］／２として定義した。２０００ｍｍ3を超える腫瘍体積を有するマウスを安楽死させた。マウスの使用を含む全ての実験手順は、ガイドラインに従って、およびデューク大学の動物実験委員会に準拠して行った。
【００６３】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
ＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＩＬ−８は、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ（商標）ＥＬＩＳＡセット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、フランクリンレイクス、ＮＪ）を用いて決定した。ＩＦＮ−β産生は、ＩＦＮ−β  ＥＬＩＳＡキット（ＰＢＬ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ピスカタウェイ、ＮＪ）を用いて決定した。ＨＭＧＢ−１分泌は、ＨＭＧＢ１  ＥＬＩＳＡキット（Ｔｅｃａｎ、モリスビル、ＮＣ）を用いて製造者の指示書に従って決定した。
【００６４】
イムノブロット分析および抗体
ミトコンドリアおよび核画分を、それぞれＭｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ＫｉｔおよびＮＥ−ＰＥＲ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ試薬（両方ともＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を用いて単離した。ミトコンドリア溶解物、核溶解物および全細胞溶解物を、完全プロテアーゼ阻害剤カクテルおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）の存在下、１×ＲＩＰＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＯ）中で調製した。３０μｇのタンパク質溶解物を４〜２０％Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ（商標）ポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ハーキュリーズ、ＣＡ）で電気泳動分離し、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（ＰｏｌｙＳｃｒｅｅｎ（登録商標）、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に移した。ＴＢＳＴ２０ですすいだ後、膜をＴＢＴＳ２０中５％ドライミルクで１時間ブロッキングし、その後、一次抗体抗ＸＩＡＰ（１：１０００）（３Ｂ６；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ダンバーズ、ＭＡ）、抗ＴＲＡＩＬ（１：１０００）（Ｃ９２Ｂ９；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ホスホ（ｐ）−ＩＲＦ−３（１：５００）（４Ｄ４Ｇ；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗切断カスパーゼ−３（１：２００）（Ｄ３Ｅ９；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗カスパーゼ−７（１：２００）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ＮＦ−κＢ  ｐ６５（１：１，０００）（Ｌ８Ｆ６；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ＲＩＰ（１：１，０００）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ＲＩＧ−Ｉ（１：５００）（Ｄ１４Ｇ６；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）、抗ＭＤＡ５（１：５００）（Ｄ７４Ｅ４；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）および抗ＰＫＲ（１：３５０）（カタログ番号３０７２；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）と一晩インキュベーションした。異なるタンパク質を同じ膜で順次検出する場合、Ｒｅｓｔｏｒｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ  Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ロックフォード、ＩＬ）で膜を８分間処理し、上記に記載したように洗浄し、ブロッキングし、再びプロービングした。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗ウサギ（１：２，０００）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）または抗マウス（１：２，０００）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）二次抗体を用いて一次抗体を検出した。抗β−チューブリン（１：１，０００）（９Ｆ３；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ＣｏｘＩＶ（１：１，０００）（３Ｅ１１；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）および抗ヒストンＨ３（１：１，０００）（Ｄ１Ｈ２；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を、ローディング対照として使用した。ＨＲＰ活性は、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｐｌｕｓ  Ｋｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ウォルサム、ＭＡ）を用いて可視化した。
【００６５】
表面カルレティキュリンおよび細胞質ＨＭＧＢ−１の検出
表面カルレティキュリンの発現は、抗カルレティキュリン−ＰＥ（１／１００希釈）（Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、ＭＡ）および７−ＡＡＤ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共染色した後、フローサイトメトリーによって決定した。ＨＭＧＢ１の検出には、細胞を４％パラホルムアルデヒド溶液で固定し、その後５％ＢＳＡ、ＰＢＳ中０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００でブロッキングおよび透過処理し、抗ＨＭＧＢ１（１／１０００希釈）（Ａｂｃａｍ）で一晩染色し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１／１０００希釈）（Ａｂｃａｍ）を二次抗体として使用した。ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）（Ｓｉｇｍａ）を、核対比染色剤として使用した。ＨＭＧＢ１およびＤＡＰＩの発現をＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ顕微鏡下で観察し、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェア（サニーベール、ＣＡ）を用いて画像を分析した。
【００６６】
凝固アッセイ
５μｌ  ＤＡＭＰまたは培養培地を、５０μＬ正常プールヒト血漿（Ｇｅｏｒｇｅ  Ｋｉｎｇ  Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．、オーバーランドパーク、ＫＳ）と混合した。混合物を３７℃で３分間インキュベートし、その後５０μＬ  ＣａＣｌ2（２５ｍＭ）を添加した。ＳＴａｒｔ（登録商標）Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ、パーシッパニー、ＮＪ）を用いて凝固時間を記録した。
統計分析
実験群の細胞増殖、細胞死、サイトカイン産生および腫瘍体積の違いを、両側スチューデントｔ検定を用いて比較した。生存の有意性をログランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定によって決定した。０．０５未満の確率（Ｐ＜０．０５）を統計的有意性に使用した。
【００６７】
（例１）
癌細胞死ならびにＩＦＮ−βおよび炎症促進性サイトカインの発現の差次的誘導に関するＲＮＡ分子のスクリーニング
鎖間または鎖内塩基対（１０〜２０ｂｐ）からなる５’（ｐ）ｐｐおよび短いＲＮＡ二本鎖は、ＲＩＧ−Ｉによって認識される公知のモチーフである。23、24  ＭＤＡ５およびＴＬＲ３は、それぞれ長いｄｓＲＮＡ（０．５〜６ｋｂ）25および短いｄｓＲＮＡ（＞２１ｂｐ）26によって配列非依存的に活性化され、一方ＴＬＲ７は、ＡＵおよびＧＵリッチな短いｓｓＲＮＡによって配列依存的に活性化される。27  しかし、ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５、ＴＬＲ３およびＴＬＲ７によって認識される他のモチーフが存在している可能性がある。本発明者らは近年、５’ｐｐｐおよびステムループを含有するＲＮＡアプタマーによるトランスフェクションが、ヒトメラノーマ細胞における細胞死およびＩＦＮ−β発現をＲＩＧ−ＩおよびＩＰＳ−Ｉ依存的に誘導することを見出した。28  これらのＲＮＡリガンドの構造および配列情報を用いて、本発明者らは先ず、５’ｐｐｐ、ＡＵおよびＧＵモチーフならびに様々な長さおよび数のステムループを含有するｓｓＲＮＡを設計して、ヒト癌細胞におけるＰＲＲ媒介性免疫原性細胞死およびＩ型ＩＦＮ発現の増強に最適なＲＮＡ構造を決定した（図１Ａおよび表１）。ＲＮＡリガンドの安定性および細胞半減期を増加させるために、本発明者らは、２’フルオロ（２’Ｆ）ピリミジンをＲＮＡに組み込んだ。これらのＲＮＡは、免疫原性癌細胞殺滅ＲＮＡ（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ−ｋｉｌｌｉｎｇ  ＲＮＡ）（ＩＣＲ）と呼ばれる。
【００６８】
９ｂｐより長い少なくとも１つのステム構造を含有するＩＣＲによるトランスフェクションは、ヒトメラノーマ細胞において細胞傷害性を用量依存的に誘導し、一方、直鎖状ＩＣＲおよび９ｂｐより短いステム構造を含有するＩＣＲは、これらの細胞において細胞傷害性を誘導しなかった（図１Ａ〜１Ｃ）。興味深いことに、３’オーバーハングの長さではなく５’オーバーハングの長さが細胞傷害性と逆相関した。細胞傷害性とは異なり、９〜１２ｂｐ長のステムループに平滑末端を有するＩＣＲは、ｐｏｌｙＩ：Ｃより２〜３倍高い、ヒトメラノーマ細胞によるＩＦＮ−βの産生を誘導し、一方、５’および３’オーバーハングの長さならびにステムループの数および長さは、ヒトメラノーマ細胞におけるＩＦＮ−β発現と逆相関した（図１Ａおよび２Ａ）。種々のＩＣＲ間の細胞傷害性およびＩＦＮ−β発現パターンの違いを解明するために、本発明者らは２つの代表的なＩＣＲ、ＩＣＲ２およびＩＣＲ４をさらに調べた。ＩＣＲ２は２３ｎｔ長の平滑末端、ヘアピンＲＮＡであり、高い細胞傷害性および高いＩＦＮ−β発現を誘導し、一方ＩＣＲ４は、５５ｎｔ長の二重ステムループ構造を形成すると予測され、高い細胞傷害性および低いＩＦＮ−β発現を誘導した（図１Ａ〜１Ｃ）。
【００６９】
（例２）
ＩＣＲ２およびＩＣＲ４は、ヒトおよびマウス癌細胞および自然免疫細胞において炎症促進性サイトカインおよびＩＦＮ−βの発現を差次的に誘導した
本発明者らは次に、ＩＣＲ２およびＩＣＲ４が、メラノーマ細胞以外の種々のタイプの癌細胞において細胞傷害性およびＩＦＮ−β発現を差次的に誘導するかどうかを問うた。ＩＣＲ２およびＩＣＲ４は両方とも、ヒト前立腺癌細胞（ＤＵ−１４５）およびヒト膵臓癌細胞（ＰＡＮＣ−１およびＢｘＰＣ３）の増殖の７０％を超える減少を誘導した。ＩＣＲ２は、これらの細胞におけるＩＦＮ−β発現のＩＣＲ４より２倍以上高い増加を誘導した（図２Ｆ〜２Ｇ）。ＩＣＲ２およびＩＣＲ４によるＩＦＮ−β発現の差次的誘導はまた、ヒトＰＢＭＣおよびＤＣを含む自然免疫細胞でも観察された（図２Ｂ〜２Ｃ）。ＩＦＮ−βに加えて、ヒトＤＣにおける炎症促進性サイトカイン、例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αおよびインターロイキン（ＩＬ）−６の発現は、ＩＣＲ２よりＩＣＲ４によって有意に低く誘導された（図２Ｄ）。興味深いことに、ＩＣＲ２によるトランスフェクションは、ヒト癌細胞およびＤＣにおいてｐｏｌｙＩ：Ｃによるトランスフェクションより有意に高いＩＦＮ−β発現を誘導したが、ＩＣＲ２によるトランスフェクションは、ｐｏｌｙＩ：ＣによるトランスフェクションよりＴＮＦαおよびＩＬ−６の有意に低い発現を誘導した（図２Ａ、２Ｃ、および２Ｄ）。癌細胞とは対照的に、ＩＣＲ２およびＩＣＲ４は、ヒトＰＢＭＣにおいて細胞傷害性を誘導しなかった（図２Ｅ）。驚くべきことに、ＩＣＲ２は、マウス癌細胞において細胞傷害性もＩＦＮ−β、ＴＮＦαおよびＩＬ−６の発現も誘導しなかった。ＩＣＲ４は、マウスメラノーマ細胞およびマウス膵臓癌細胞において細胞傷害性およびＩＦＮ−β発現を誘導したが、細胞傷害性効果は、ヒト対応物と比べてマウス癌細胞ではるかに低かった（４８．１１±５．３６５％（Ｂ１６）ｖｓ  ９２．７０７５±１．２２３％（ＷＭ２６６−４）；４１．５９±７．８０９％（ＰＡＮＣ−０２）ｖｓ  ８８．３９±４．４７０％（ＰＡＮＣ−１）（図２Ｆ〜２Ｈおよび２Ｉ〜２Ｌ）。
【００７０】
（例３）
ＩＣＲ２は遅発性ＩＦＮ依存性細胞死を誘導し、一方ＩＣＲ４は急性ＩＦＮ非依存性細胞死を誘導した
本発明者らは次に、ヒト癌細胞においてＩＣＲ２およびＩＣＲ４によって誘導される細胞傷害性の機構を解明した。アネキシンＶ単一陽性細胞は早期アポトーシスを表し、一方、アネキシンＶおよび７−ＡＡＤ二重陽性細胞は一次および二次壊死細胞である。29  早期アポトーシスは、ＩＣＲ４またはｐｏｌｙＩ：Ｃによるトランスフェクション後４時間時点で現れ、早期アポトーシスならびに一次および二次壊死は両方とも、培養中これらの細胞において徐々に増加した（図３Ａ〜３Ｇ）。ＩＣＲ２をトランスフェクトした細胞では、有意な細胞死は４時間時点で現れず、ほんのわずかな早期アポトーシスおよび壊死が２４時間時点で現れた。興味深いことに、ＩＣＲ２をトランスフェクトした細胞は、４８時間時点で早期アポトーシス事象よりはるかに多くの壊死事象を示した（図３Ａ〜３Ｅ）。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を有し、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ誘導ＩＶＴは、非鋳型自己相補的産物を形成する可能性があることが示されている。23  本発明者らは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ誘導ＩＶＴによって産生したＩＣＲ２が、予想された長さのＩＣＲ２  ＲＮＡおよび予想より長い長さのＩＣＲ２  ＩＶＴ産物の両方を含有することを観察した（図３Ｉ）。より長い長さのＩＣＲ２  ＩＶＴ産物によるトランスフェクションは、トランスフェクション後２４時間時点で顕著な細胞死を誘導した（図３Ｊ〜３Ｋ）。ＩＶＴ副産物によって誘導される非特異的細胞死を回避するために、予想された長さのＩＣＲをポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。細胞死とは異なり、ヒトメラノーマ細胞によるＩＦＮ−β産生は、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４またはｐｏｌｙＩ：Ｃによるトランスフェクション後４時間時点で観察されなかった。ＩＦＮ−βは、トランスフェクション後２４時間および４８時間時点で継続的に検出した。ＩＣＲ２をトランスフェクトした細胞は、ＩＣＲ４をトランスフェクトした細胞より８〜１０倍高い量のＩＦＮ−βを産生した（図３Ｈ）。ＩＦＮ−βは、カスパーゼ依存性アポトーシス30およびネクロトーシスと呼ばれるプログラム壊死31を含む複数の機構を介した細胞死を誘導することが知られている。故に、本発明者らは、ＩＣＲ２はＩＦＮ依存性癌細胞死を誘導し、一方ＩＣＲ４はＩＦＮ非依存性癌細胞死を誘導すると推測した。ＩＣＲ２およびＩＣＲ４によるＩＦＮ依存性または非依存性細胞死の機構をさらに解明するために、ヒトメラノーマ細胞にＩＣＲ２またはＩＣＲ４のどちらかをトランスフェクトし、その後、ワクシニアウイルスコードインターフェロンαおよびβデコイ受容体Ｂ１８Ｒで処理した。Ｂ１８ＲはＩＣＲ２およびＩＦＮ−β誘導細胞死を有意に阻害したが、ＩＣＲ４誘導細胞死は有意に阻害しなかった（図３Ｆ〜３Ｈ）。このデータは、ＩＣＲ２がＩＦＮ依存的に細胞死を少なくとも一部誘導し、一方ＩＣＲ４はＩＦＮ非依存的にアポトーシスを誘導することを示唆している。
【００７１】
（例４）
ＩＣＲ２およびＩＣＲ４は、ヒト癌細胞における異なる細胞死機構をトリガーした
本発明者らは次に、ＩＣＲ２およびＩＣＲ４で処理したヒト癌細胞における細胞死機構およびシグナル伝達経路を調べた。Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋはパン−カスパーゼ阻害剤であり、故にアポトーシス阻害剤と見なされている。ネクロスタチン−１（Ｎｅｃ−１）は、受容体相互作用セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ１（ＲＩＰ１）の阻害剤であり、ネクロトーシス阻害剤として一般に使用されている。ＩＣＲ４によって誘導される細胞死は、Ｎｅｃ−１よりｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋによって阻害され、一方ＩＣＲ２については、細胞死はｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋよりＮｅｃ−１によって阻害されることから、逆が当てはまる（図４Ａ）。ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋおよびＮｅｃ−１の両方による同時処理は、ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋまたはＮｅｃ−１のどちらかによる単一治療より癌細胞死を大幅に阻害した（図４Ａ）。これらのデータは、ＩＣＲ２誘導細胞死はカスパーゼよりはるかにＲＩＰ１に依存性であり、一方、ＩＣＲ４誘導細胞死はＲＩＰ１よりカスパーゼに依存性であることを示している。この結果と一致して、ＩＣＲ４で処理したメラノーマ細胞における切断カスパーゼ３および７の発現レベルは、ＩＣＲ２で処理した細胞よりはるかに高いことが見出された（図４Ｂ）。対照的に、ＩＣＲ２で処理した細胞は、ＩＣＲ４で処理した細胞よりミトコンドリアに移行したＲＩＰ１が有意に多かった（図４Ｃ）。興味深いことに、ＩＣＲ２およびＩＣＲ４は両方とも、ヒトメラノーマ細胞において抗アポトーシスタンパク質Ｘ連鎖アポトーシス阻害剤（ａｎｔｉ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）（ＸＩＡＰ）を有意に下方制御し、アポトーシス促進性タンパク質ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ）（ＴＲＡＩＬ）を上方制御した（図４Ｂ）。これらの観察は、ＩＣＲ２およびＩＣＲ４は両方とも、ＸＩＡＰの下方制御およびＴＲＡＩＬの上方制御によってヒト癌細胞をプログラム細胞死に対して感作させることを示唆している。
【００７２】
（例５）
ＩＣＲ２およびＩＣＲ４で処理した癌細胞におけるＮＦ−κＢの差次的な活性化
ＩＣＲ２で処理した細胞は、ＩＣＲ４で処理した細胞よりはるかに多くのＩＦＮ−βおよび炎症促進性サイトカインを産生した（図２Ａ〜２Ｄ）。本発明者らは、ＩＣＲ２およびＩＣＲ４が、それぞれ炎症性サイトカインおよびＩＦＮの発現をもたらすＮＦ−ｋＢおよびＩＲＦシグナル伝達経路を差次的に活性化すると推測した。ＮＦ−κＢは、ＩＣＲ２をトランスフェクトした細胞の核画分で高度に検出されたが、ＩＣＲ４をトランスフェクトした細胞の核画分ではわずかに検出されたのみであり、一方リン酸化ＩＲＦ３は、ＩＣＲ２またはＩＣＲ４のどちらかをトランスフェクトした細胞で同じように検出された（図４Ｃ）。ＩＲＦ３の活性化は、抗ウイルス応答において、アポトーシスの誘導およびＩ型ＩＦＮ遺伝子の発現を含む二重の役割を有することが知られている。32  ＩＲＦ３は、ヒトメラノーマ細胞においてＩＣＲ２およびＩＣＲ４によって同様に活性化されたが、ＩＲＦ３は、ＩＣＲ２およびＩＣＲ４をトランスフェクトした細胞において異なる役割を果たしている可能性がある。ＩＣＲ２およびＩＣＲ４をトランスフェクトした細胞におけるＩＲＦ３の機能的活性化を解明するために、さらなる研究が必要とされる。
【００７３】
（例６）
ＩＣＲ２およびＩＣＲ４によるＲＮＡ感知ＰＲＲの活性化
本発明者らの最近の研究は、５’ｐｐｐおよびステムループを含有する２’Ｆ修飾ＲＮＡアプタマーが、ヒトメラノーマおよび肝細胞癌細胞によるプログラム細胞死およびＩＦＮ−β産生をＲＩＧ−Ｉ依存的に誘導することを示した。28  ＩＣＲ２およびＩＣＲ４がヒト癌細胞のＲＩＧ−Ｉ依存性細胞死を誘導したかどうかに答えるために、本発明者らは、Ｈｕｈ７．０、ＲＩＧ−Ｉ野生型ヒト肝細胞癌細胞株、およびＨｕｈ７．５、ＲＩＧ−Ｉ変異体Ｈｕｈ７．０細胞株を、ＩＣＲ２またはＩＣＲ４のどちらかで処理した。ＩＣＲ４は、Ｈｕｈ７．０細胞に対して細胞傷害性であったが、Ｈｕｈ７．５に対しては細胞傷害性でなかった（図５Ａ）。興味深いことに、ＩＣＲ２は、Ｈｕｈ７．０およびＨｕｈ７．５において類似した細胞傷害性を誘導した。さらに、ＩＣＲ４は、ｓｉＲＮＡ媒介ＲＩＧ−Ｉノックアウトを有するヒトメラノーマ細胞において細胞傷害性を有意に低減したが、ＩＣＲ２では低減せず、一方ＩＣＲ４およびＩＣＲ２は、ＰＫＲおよびＭＤＡ５を含む他の細胞質ＲＮＡ感知ＰＲＲのノックアウトを有するヒトメラノーマ細胞において類似したレベルの細胞傷害性をもたらした（図５Ｂ〜５Ｃ）。さらに、ヒトＴＬＲ３およびＴＬＲ７レポーター細胞は、ＩＣＲ２およびＩＣＲ４によって刺激されなかった（図５Ｄ）。細菌性アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）誘導脱リン酸化によってＩＣＲ２およびＩＣＲ４の５’ｐｐｐを除去すると、ヒトメラノーマ細胞による細胞死およびＩＦＮ−β産生を有意に妨げた（図５Ｅ〜５Ｆ）。興味深いことに、２’ＯＨピリミジンを組み込んだＩＣＲ４は、２’Ｆピリミジンを組み込んだＩＣＲ４と比べて細胞傷害性を有意に減少させたが、ＩＦＮ−β誘導活性は減少させず、一方２’ＯＨピリミジンを組み込んだＩＣＲ２は、細胞傷害性およびＩＦＮ−β誘導活性の両方を完全に抑制した（図５Ｇ〜５Ｈ）。故に、ＩＣＲ４は、抗癌応答をＲＩＧ−Ｉ依存的だがＰＫＲおよびＭＤＡ５非依存的に誘導した。対照的に、ＩＣＲ２誘導抗癌応答は、ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５またはＰＫＲの喪失によって影響を受けないようであった。
【００７４】
（例７）
ＩＣＲ２およびＩＣＲ４は、カルレティキュリンおよびＨＭＧＢ１の移行を誘導した
特定のタイプの抗癌薬剤、例えば、ドキソルビシンは、ＤＡＭＰの放出、「ｅａｔ−ｍｅ」シグナル（例えば、小胞体常在タンパク質カルレティキュリン）の表面発現、ならびにＤＣおよびＮＫ細胞などの自然免疫細胞の活性化を特徴とする免疫原性細胞死を誘導することができる。33  この免疫原性細胞死は、抗腫瘍免疫応答の誘導による癌療法の全体的な治療転帰に大きく寄与する。ＩＣＲ２およびＩＣＲ４は両方とも、カルレティキュリンの表面移行をわずかに誘導した（図６Ａ）。表面カルレティキュリンは、ＤＣによるドキソルビシン処理癌細胞の食作用を促進することが示されている。34  ＤＣによるＩＣＲ２およびＩＣＲ４処理癌細胞の食作用を研究するために、ヒト未成熟ＤＣを、図６Ｂに示されているようにＩＣＲ２およびＩＣＲ４によって殺滅されたヒトメラノーマ細胞とインキュベートした。これらの死んだ／死につつある癌細胞は、ドキソルビシンによって殺滅された細胞と同じくらい有効にＤＣに取り込まれた。核から細胞質へのＨＭＧＢ１の移行もまた、ＩＣＲ２およびＩＣＲ４で処理したヒトメラノーマ細胞において観察された（図６Ｈ）。興味深いことに、ＩＣＲ２による処理は、ＩＣＲ４またはドキソルビシンによる処理より有意に高いレベル、およびｐｏｌｙＩ：Ｃによる処理と類似した高レベルの、ヒトメラノーマ細胞からのＨＭＧＢ１放出を誘導した（図６Ｃ）。ＩＣＲ４誘導細胞死によって放出されたＤＡＭＰは、ドキソルビシン誘導細胞死によって放出されたＤＡＭＰよりＴＬＲ４の刺激において有意に強力であったにもかかわらず、ＨＭＧＢ１放出の増加と一致して、ＩＣＲ２誘導メラノーマ細胞死によって生成されたＤＡＭＰは、ＩＣＲ４誘導細胞死によって生成されたＤＡＭＰより、ＨＭＧＢ１認識ＴＬＲ４の有意に多い活性化を誘導した（図６Ｄ）。
【００７５】
（例８）
ＩＣＲ２およびＩＣＲ４は、自然免疫刺激性および凝固促進性ＤＡＭＰのヒト癌細胞からの放出を誘導した
ＩＣＲ２およびＩＣＲ４で処理した癌細胞から放出されたＤＡＭＰが、他のＴＬＲを刺激するかどうかを解明するために、本発明者らは、死んだ／死につつあるヒトメラノーマ細胞から放出されたＤＡＭＰを回収し、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３およびＴＬＲ９レポーター細胞とインキュベートした。これらのＴＬＲレポーター細胞の活性化のレベルは、ＩＣＲ２処理細胞から放出されたＤＡＭＰとｐｏｌｙＩ：Ｃ処理細胞から放出されたＤＡＭＰの間で有意に異ならなかった。しかし、ＩＣＲ２処理細胞から放出されたＤＡＭＰは、ＩＣＲ４処理細胞から放出されたＤＡＭＰよりＴＬＲレポーター細胞を強力に活性化した。ＩＣＲ４処理細胞は、ドキソルビシン処理細胞より有意に高いＴＬＲ３活性化を誘導し（図６Ｅ）、一方ＩＣＲ４処理細胞は、ドキソルビシン処理細胞より有意に少ないＴＬＲ２およびＴＬＲ９活性化を誘導した（図６Ｆ〜６Ｇ）。ＩＣＲ２およびＩＣＲ４処理癌細胞から放出されたこれらのＤＡＭＰは、未成熟ヒトＤＣを刺激してサイトカインを産生した（図６Ｉ）。免疫刺激活性に加えて、ＤＡＭＰは止血および血栓症を促進することが知られており35、抗癌療法後の腫瘍再発および転移において重要な役割を果たしている可能性がある。36  興味深いことに、ＩＣＲ２およびｐｏｌｙＩ：Ｃ処理ヒトメラノーマ細胞から放出されたＤＡＭＰは、モックトランスフェクト細胞から放出されたＤＡＭＰと比べて血漿の凝固を活性化し、一方、ＩＣＲ４およびドキソルビシン処理メラノーマ細胞から放出されたＤＡＭＰは、血漿凝固時間を有意に変化させなかった（図６Ｊ）。これらのデータは、ＩＣＲ４処理癌細胞が、ＩＣＲ２処理細胞より低い量の自然免疫刺激因子およびプロコアグラントを放出したことを示唆した。
【００７６】
（例９）
ＩＣＲ２およびＩＣＲ４によるインビボトランスフェクションは、メラノーマ−保有マウスにおける生存を延長した
最後に、本発明者らは、ヒトメラノーマ異種移植モデルにおいてＩＣＲ２およびＩＣＲ４のインビボ治療有効性を評価した。ＩＣＲ２またはＩＣＲ４による反復腫瘍内治療は、腫瘍増殖を阻害し（図７Ａ）、皮下ヒトメラノーマ異種移植片を有するヌードマウスにおける生存を有意に増強した（図７Ｂ）。ＩＣＲ２およびゴールドスタンダートのＰＲＲ刺激ＲＮＡアゴニストｐｏｌｙＩ：Ｃと比べて、ＩＣＲ４の治療効果の低減傾向が観察された。しかし、ＩＣＲ２、ＩＣＲ４およびｐｏｌｙＩ：Ｃの差は、統計的に有意ではなかった。Ｂ１６マウスメラノーマを有する免疫応答性マウスにおいて、ＩＣＲ４治療は、ｐｏｌｙＩ：Ｃ治療より治療効果が有意に少ないようであった（図７Ｃ）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2020515625.tif 000013
【図２Ｃ】
2020515625.tif 000014
【図２Ｄ】
2020515625.tif 000015
【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
2020515625.tif 000018
【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図２Ｋ】
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【図２Ｌ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
2020515625.tif 000044
【図５Ｈ】
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【図６Ａ−１】
2020515625.tif 000046
【図６Ａ−２】
2020515625.tif 000047
【図６Ｂ】
2020515625.tif 000048
【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
2020515625.tif 000051
【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
2020515625.tif 000055
【図６Ｊ】
2020515625.tif 000056
【図７Ａ】
2020515625.tif 000057
【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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