(57)【要約】本開示は、ｓｔｒｅｐタグペプチドを含有する分子またはｓｔｒｅｐタグペプチドを含有する細胞を選択的に検出するためのタグ特異的融合タンパク質を提供する。開示される実施形態は、ｓｔｒｅｐタグペプチドを発現する免疫治療用細胞をモニタリングおよび／またはモジュレートするための試薬および方法に使用することができるタグ特異的融合タンパク質を含む。タグ付き標的に特異的に結合する融合タンパク質、およびタグ特異的融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞を含む実施形態も、提供される。タグ付きマーカーを発現する免疫治療用細胞も提供される。
2020535796.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ｓｔｒｅｐタグペプチドと特異的に結合する結合ドメインを含む細胞外成分；
（ｂ）エフェクタードメインまたはその機能的部分を含む細胞内成分；および
（ｃ）前記細胞外成分と前記細胞内成分を接続する膜貫通ドメイン
を含む、融合タンパク質。
【請求項２】
前記結合ドメインが、ｓｃＦｖ、ｓｃＴＣＲ、またはリガンドである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記結合ドメインが、キメラ、ヒトであるか、またはヒト化されている、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記ｓｔｒｅｐタグペプチドが、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記結合ドメインが、５Ｇ２抗体、３Ｅ８抗体または４Ｅ２抗体からのＣＤＲを含むｓｃＦｖである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記ｓｃＦｖが、５Ｇ２抗体、３Ｅ８抗体または４Ｅ２抗体に基づく重鎖および軽鎖可変領域を含む、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記ｓｃＦｖが、配列番号１０、３または１６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である軽鎖可変領域（ＶＬ）、および配列番号８、２または１４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記ｓｃＦｖが、配列番号１０、３もしくは１６に示されるアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１０、３もしくは１６に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ、および配列番号８、２もしくは１４に示されるアミノ酸配列を含むかまたは配列番号８、２もしくは１４に示されるアミノ酸配列からなるＶＨを含む、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記ｓｃＦｖが、
（ａ）配列番号１０のＶＬおよび配列番号８のＶＨ、
（ｂ）配列番号３のＶＬおよび配列番号２のＶＨ、または
（ｃ）配列番号１６のＶＬおよび配列番号１４のＶＨ
を含む、請求項７または８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記ｓｃＦｖが、配列番号１１もしくは１２に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１１もしくは１２に示されるアミノ酸配列からなる、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記ｓｃＦｖが、配列番号５もしくは６に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号５もしくは６に示されるアミノ酸配列からなる、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記ｓｃＦｖが、配列番号１７もしくは１８に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１７もしくは１８に示されるアミノ酸配列からなる、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記細胞内成分またはその機能的部分が、細胞内チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記エフェクタードメインが、ＣＤ３ζまたはその機能的部分を含む、請求項１〜１３に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
前記細胞内成分またはその前記機能的部分が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）またはそれらの組合せから選択される、共刺激ドメインまたはその機能的部分をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
前記細胞内成分が、ＣＤ２８共刺激ドメインもしくはその機能的部分、４−１ＢＢ共刺激ドメインもしくはその機能的部分、またはＣＤ２８共刺激ドメインもしくはその機能的部分と４−１ＢＢ共刺激ドメインもしくはその機能的部分の両方をさらに含む、請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ４膜貫通ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２７膜貫通ドメイン、またはＣＤ２８膜貫通ドメインを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
前記細胞外成分が、前記結合ドメインと前記膜貫通ドメインの間に配置されたリンカーをさらに含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
前記リンカーが、免疫グロブリン定常領域またはその一部分を含む、請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
前記免疫グロブリン定常領域またはその一部分が、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、または両方を含む、請求項１９に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
前記リンカーが、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
前記ＣＨ２ドメインおよび前記ＣＨ３ドメインが、各々、同じアイソタイプである、請求項２１に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
前記ＣＨ２ドメインおよび前記ＣＨ３ドメインが、各々、異なるアイソタイプである、請求項２１に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
前記ＣＨ２ドメインおよび前記ＣＨ３ドメインが、ＩｇＧ４またはＩｇＧ１アイソタイプである、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
前記ＣＨ２ドメインが、Ｎ２９７Ｑ変異を含む、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
前記免疫グロブリン定常領域またはその一部分が、ヒト免疫グロブリン定常領域またはその一部分を含む、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
前記リンカーが、ヒンジ領域およびその一部分を含む、請求項１８〜２６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２８】
前記リンカーが、免疫グロブリン定常領域またはその一部分、およびヒンジ領域またはその一部分を含む、請求項１８〜２７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２９】
前記リンカーが、配列番号２０、２１もしくは４９に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号２０、２１もしくは４９に示されるアミノ酸配列からなるグリシン−セリンリンカーを含む、請求項２８に記載の融合タンパク質。
【請求項３０】
前記細胞外成分が、タンパク質タグをさらに含み、ただし、前記タンパク質タグが、ｓｔｒｅｐタグペプチドを含まない、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３１】
前記タンパク質タグが、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、Ａｖｉタグ、カルモジュリンタグ、ポリグルタミン酸タグ、ＨＡタグ、Ｎｕｓタグ、Ｓタグ、Ｘタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｏｆｔａｇ、Ｖ５タグ、ＣＢＰ、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ＧＦＰ、チオレドキシンタグ、またはそれらの任意の組合せである、請求項３０に記載の融合タンパク質。
【請求項３２】
前記細胞外成分、前記結合ドメイン、前記リンカー、前記膜貫通ドメイン、前記細胞内成分、および前記共刺激ドメインのうちの１つまたは複数が、接合部アミノ酸を含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３３】
請求項１〜３２のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３４】
マーカーをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項３３に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３５】
前記マーカーをコードするポリヌクレオチドが、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの３’側に位置するか、または前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの５’側に位置する、請求項３４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３６】
前記コードされたマーカーが、ＥＧＦＲｔ、ＣＤ１９ｔ、ＣＤ３４ｔ、またはＮＧＦＲｔを含む、請求項３４または３５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３７】
自己切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、前記自己切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、前記細胞内成分をコードするポリヌクレオチドと前記マーカーをコードするポリヌクレオチドの間に位置する、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３８】
前記コードされた自己切断ポリペプチドが、ブタテッショウイルス−１  ２Ａペプチド（Ｐ２Ａ）、ゾセア・アシグナウイルス２Ａペプチド（Ｔ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス２Ａペプチド（Ｅ２Ａ）、または口蹄疫ウイルス２Ａペプチド（Ｆ２Ａ）である、請求項３７に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３９】
前記ポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドを含有する宿主細胞のためにコドン最適化される、請求項３３〜３８のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４０】
細胞表面受容体をコードする第１のポリヌクレオチド、タグ付きマーカーをコードする第２のポリヌクレオチド、および前記細胞表面受容体をコードする第１のポリヌクレオチドと前記タグ付きマーカーをコードする第２のポリヌクレオチドの間に配置された自己切断ポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドを含む、キメラポリヌクレオチドであって、
（１）前記細胞表面受容体をコードする第１のポリヌクレオチドが、
（ａ）標的抗原に特異的に結合する結合ドメインを含む細胞外成分、
（ｂ）エフェクタードメインまたはその機能的部分を含む細胞内成分、および
（ｃ）前記細胞外成分と前記細胞内成分を接続する膜貫通成分
を含み、
（２）前記タグ付きマーカーをコードする第２のポリヌクレオチドが、タグペプチドを含有するマーカーをコードするポリヌクレオチドを含み、前記コードされたタグペプチドが、ｓｔｒｅｐタグペプチドを含む、
キメラポリヌクレオチド。
【請求項４１】
コードされたｓｔｒｅｐタグペプチドが、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなる、請求項４０に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項４２】
前記コードされたマーカーが、ＥＧＦＲｔ、ＣＤ１９ｔ、ＣＤ３４ｔ、またはＮＧＦＲｔを含む、請求項４０または４１に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項４３】
前記細胞外成分のコードされた結合ドメインが、過剰増殖性疾患に関連する標的抗原と特異的に結合する、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項４４】
前記過剰増殖性疾患が、がんである、請求項４３に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項４５】
前記標的抗原が、ＣＤ１９抗原、ＣＤ２０抗原、ＣＤ２２抗原、ＲＯＲ１抗原、ＥＧＦＲ抗原、ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原、ＥＧＰ−２抗原、ＥＧＰ−４０抗原、ＧＤ２抗原、ＧＤ３抗原、ＨＰＶ  Ｅ６抗原、ＨＰＶ  Ｅ７抗原、Ｈｅｒ２抗原、Ｌ１−ＣＡＭ抗原、Ｌｅｗｉｓ  Ａ抗原、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ抗原、ＭＵＣ１抗原、ＭＵＣ１６抗原、ＰＳＣＡ抗原、ＰＳＭＡ抗原、ＣＤ５６抗原、ＣＤ２３抗原、ＣＤ２４抗原、ＣＤ３０抗原、ＣＤ３３抗原、ＣＤ３７抗原、ＣＤ４４ｖ７／８抗原、ＣＤ３８抗原、ＣＤ５６抗原、ＣＤ１２３抗原、ＣＡ１２５抗原、ｃ−ＭＥＴ抗原、ＦｃＲＨ５抗原、ＷＴ１抗原、葉酸受容体α抗原、ＶＥＧＦ−α抗原、ＶＥＧＦＲ１抗原、ＶＥＧＦＲ２抗原、ＩＬ−１３Ｒα２抗原、ＩＬ−１１Ｒα抗原、ＭＡＧＥ−Ａ１抗原、ＭＡＧＥ−Ａ３抗原、ＭＡＧＥ−Ａ４抗原、ＳＳＸ−２抗原、ＰＲＡＭＥ抗原、ＨＡ−１抗原、ＰＳＡ抗原、エフリンＡ２抗原、エフリンＢ２抗原、ＮＫＧ２Ｄ抗原、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原、ＴＡＧ−７２抗原、メソテリン抗原、５Ｔ４抗原、ＢＣＭＡ抗原、ＦＡＰ抗原、炭酸脱水酵素９抗原、ＥＲＢＢ２抗原、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ抗原、またはＣＥＡ抗原から選択される、請求項４３または４４に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項４６】
前記コードされた細胞表面受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、請求項４０〜４５のいずれか一項に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項４７】
前記コードされた自己切断ポリペプチドが、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２ＡまたはＦ２Ａである、請求項４０〜４６のいずれか一項に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項４８】
５’末端から３’末端へ、
（ａ）（前記細胞表面受容体をコードする第１のポリヌクレオチド）−（自己切断ポリペプチドをコードする前記第３のポリヌクレオチド）−（前記タグ付きマーカーをコードする第２のポリヌクレオチド）、または
（ｂ）（前記タグ付きマーカーをコードする第２のポリヌクレオチド）−（自己切断ポリペプチドをコードする前記第３のポリヌクレオチド）−（前記細胞表面受容体をコードする第１のポリヌクレオチド）
の構造を含む、請求項４０〜４７のいずれか一項に記載のキメラポリヌクレオチド。
【請求項４９】
発現制御配列に作動可能に連結された、請求項３３〜３９のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または請求項４０〜４８のいずれか一項に記載のキメラポリヌクレオチドを含む、発現構築物。
【請求項５０】
請求項４９に記載の発現構築物を含むベクター。
【請求項５１】
プラスミドベクターまたはウイルスベクターを含む、請求項５０に記載のベクター。
【請求項５２】
ウイルスベクターであり、前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターまたはγ−レトロウイルスベクターから選択される、請求項５１に記載のベクター。
【請求項５３】
（ａ）請求項３３〜３９のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または請求項４９に記載の融合タンパク質をコードする発現構築物を含み、前記コードされた融合タンパク質を発現する宿主細胞、または
（ｂ）請求項４０〜４８のいずれか一項に記載のキメラポリヌクレオチド、または請求項４９に記載のキメラポリヌクレオチド発現構築物を含み、前記コードされた細胞表面受容体およびコードされたタグ付きマーカーを発現する宿主細胞。
【請求項５４】
免疫細胞である、請求項５３に記載の宿主細胞。
【請求項５５】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫ−Ｔ細胞である、請求項５４に記載の宿主細胞。
【請求項５６】
免疫系細胞が、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、幹細胞メモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはそれらの任意の組合せである、請求項５４または５５に記載の宿主。
【請求項５７】
ＰＤ−１遺伝子、ＬＡＧ３遺伝子、ＴＩＭ３遺伝子、ＣＴＬＡ４遺伝子、ＨＬＡ成分遺伝子、ＴＣＲ成分遺伝子またはそれらの任意の組合せの染色体遺伝子ノックアウトを含む、請求項５３〜５５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５８】
請求項１〜３２のいずれか一項に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤とを含む、組成物。
【請求項５９】
請求項５３〜５７のいずれか一項に記載の宿主細胞と、薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤とを含む、組成物。
【請求項６０】
請求項５３〜５７のいずれか一項に記載の宿主細胞の治療有効量または請求項５８に記載の宿主細胞組成物の治療有効量を含む、単位用量。
【請求項６１】
請求項１〜３２のいずれか一項に記載の融合タンパク質をその表面に発現するように改変された免疫細胞を活性化または刺激する方法であって、前記改変された免疫細胞を、前記改変された免疫細胞を活性化するのに十分な条件下で、前記改変された免疫細胞を活性化するのに十分な時間、ｓｔｒｅｐタグペプチドと接触させることを含む方法。
【請求項６２】
前記ｓｔｒｅｐタグペプチドが、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなる、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ｓｔｒｅｐタグペプチドが、細胞表面タンパク質に含有される、請求項６１または６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記細胞表面タンパク質が、１〜約５つのｓｔｒｅｐタグペプチドを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記細胞表面タンパク質が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、またはマーカーを含む、請求項６１〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記改変された免疫細胞が、複数回、活性化または刺激される、請求項６１〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
改変された免疫細胞を活性化または刺激する方法であって、前記改変された免疫細胞を、前記改変された免疫細胞の細胞表面のｓｔｒｅｐタグペプチドと特異的に結合する結合タンパク質と接触させることによって、前記改変された免疫細胞を活性化または刺激することを含み、前記改変された免疫細胞が、
（ａ）前記ｓｔｒｅｐタグペプチドを含有する細胞表面受容体を必要に応じてコードする、細胞表面受容体をコードする第１のポリヌクレオチドであって、前記細胞表面受容体が、標的抗原と特異的に結合する、第１のポリヌクレオチドと、
（ｂ）前記ｓｔｒｅｐタグペプチドを含有する細胞表面マーカーを必要に応じてコードする、細胞表面マーカーをコードする第２のポリヌクレオチドと
を含み、ただし、前記細胞表面受容体および前記細胞表面マーカーの少なくとも一方が、前記タグペプチドを含有する、方法。
【請求項６８】
前記ｓｔｒｅｐタグペプチドが、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなる、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記細胞表面受容体が、前記ｓｔｒｅｐタグペプチドを含む、請求項６７または６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記細胞表面受容体が、ＣＡＲまたはＴＣＲを含む、請求項６７〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記細胞表面マーカーが、前記ｓｔｒｅｐタグペプチドを含む、請求項６７〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記細胞表面マーカーが、ＥＧＦＲｔ、ＣＤ１９ｔ、ＣＤ３４ｔ、またはＮＧＦＲｔを含む、請求項６７〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫ−Ｔ細胞である、請求項６７〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記細胞表面受容体および／または前記細胞表面マーカーが、１〜約５つのタグペプチドを含む、請求項６７〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記改変された免疫細胞が、複数回、活性化または刺激される、請求項６７〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
タグ付き細胞の標的アブレーションのための方法であって、ｓｔｒｅｐタグペプチドを含む細胞表面タンパク質を発現するタグ付き細胞を事前に投与しておいた対象に、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の融合タンパク質をその細胞表面に発現するように改変された免疫細胞を投与することによって、前記タグ付き細胞をアブレーションする標的化免疫応答を誘導することを含む方法。
【請求項７７】
前記ｓｔｒｅｐタグペプチドが、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなる、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記細胞表面タンパク質が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、および／またはマーカーを含む、請求項７６または７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記マーカーが、ＥＧＦＲｔ、ＣＤ１９ｔ、ＣＤ３４ｔ、またはＮＧＦＲｔを含む、請求項７６〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫ−Ｔ細胞から選択される、請求項７６〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記免疫系細胞が、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、幹細胞メモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはそれらの任意の組合せである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記タグ付き細胞が、前記対象に細胞免疫治療、グラフトまたは移植として事前に投与された、請求項７６〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記改変された免疫細胞を前記対象に投与した後、
（ｉ）前記対象体内に、または前記対象から採取された試料中に残存する前記タグ付き細胞、
（ｉｉ）前記対象体内に、または前記対象から採取された試料中に存在する前記改変された免疫細胞、
（ｉｉｉ）前記対象体内の１つもしくは複数のサイトカイン、または
（ｉｖ）それらの任意の組合せ
の存在を検出することおよび／またはその量を測定することをさらに含む、請求項７６〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記融合タンパク質を発現する前記改変された免疫細胞が、前記タグ付き細胞の存在に関連する少なくとも１つの有害事象を有する前記対象に投与される、請求項７６〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記タグ付き細胞、および／または前記融合タンパク質を発現する前記改変された免疫細胞が、前記対象にとって同種異系、自己または同系である、請求項７６〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記対象が、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）もしくは宿主対移植片病（ＨｖＧＤ）を有するかまたは有する疑いがある、請求項７６〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記対象がヒトである、請求項７６〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
（ａ）請求項５０〜５２のいずれか一項に記載のベクター、または請求項４９に記載の発現構築物と、
（ｂ）宿主細胞に（ａ）の前記ベクターまたは前記発現構築物で形質導入するための試薬と
を含む、キット。
【請求項９０】
（ａ）請求項５３〜５７のいずれか一項に記載の宿主細胞、および／または
（ｂ）請求項５８もしくは５９に記載の組成物、および／または
（ｃ）請求項５９に記載の単位用量
を含む、キット。
【請求項９１】
前記結合ドメインが、
（ａ）配列番号２２、２８もしくは３４、または１〜３つのアミノ酸置換および／または欠失を有する配列番号２２、２８もしくは３４のバリアントのいずれか１つで示される重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列と、
（ｂ）配列番号２３、２９もしくは３５、または１〜３つのアミノ酸置換および／または欠失を有する配列番号２３、２９もしくは３５のバリアントのいずれか１つで示される重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列と、
（ｃ）配列番号２４、３０もしくは３６、または１〜３つのアミノ酸置換および／または欠失を有する配列番号２４、３０もしくは３６のバリアントのいずれか１つで示される重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列と
を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項９２】
前記結合ドメインが、
（ａ）配列番号２５、３１もしくは３７、または１〜３つのアミノ酸置換および／または欠失を有する配列番号２５、３１もしくは３７のバリアントのいずれか１つで示される軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列と、
（ｂ）配列番号２６、３２もしくは３８、または１〜２つのアミノ酸置換および／または欠失を有する配列番号２６、３２もしくは３８のバリアントのいずれか１つで示される軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列と、
（ｃ）配列番号２７、３３もしくは３９、または１〜３つのアミノ酸置換および／または欠失を有する配列番号２７、３３もしくは３９のバリアントのいずれか１つで示される軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列と
を含む、請求項１〜５または９１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、本明細書に完全に明記されたものとしてあらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる２０１７年９月６日に出願した米国特許出願第６２／５５５，０１２号の優先権の利益を主張する。
【０００２】
配列表に関する記述
本願に関連する配列表は、紙コピーの代わりにテキスト形式で提供され、これによって参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、３６００５６＿４５０ＷＯ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。このテキストファイルは２８．９ＫＢであり、２０１８年９月３日に作成されたものであり、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子的に提出されている。
【背景技術】
【０００３】
背景
遺伝子改変されたＴ細胞の養子移入は、様々な悪性疾患に対する強力な治療法として出現した。最も広く利用されている戦略は、腫瘍関連抗原を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する患者由来Ｔ細胞の注入である。このアプローチには、Ｔ細胞を任意の細胞表面抗原に標的化できること、腫瘍エスケープ機構としての主要組織適合性遺伝子複合体の喪失を回避できること、および、いずれの患者の処置にもヒト白血球抗原ハプロタイプに関係なく単一のベクター構築物を利用できることを含む、非常に多くの理論的利点がある。例えば、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）についてのＣＡＲ臨床試験では、悪性リンパ系細胞上はもちろん正常Ｂ細胞上にも発現するＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ２２抗原が、これまでに標的とされたことがある（Brentjens  et  al.,  Sci  Transl  Med  2013;5(177):177ra38;  Haso  et  al.,Blood  2013;121(7):1165-74;  James  et  al.,  J  Immunol  2008;180(10):7028-38;  Kalos  et  al.,  Sci  Transl  Med  2011;3(95):95ra73;  Kochenderfer  et  al.,  J  Clin  Oncol  2015;33(6):540-9;  Lee  et  al.,  Lancet  2015;385(9967):517-28;  Porter  et  al.,  Sci  Transl  25  Med  2015;7(303):303ra139;  Savoldo  et  al.,  J  Clin  Invest  2011;121(5):1822-6;  Till  et  al.,  Blood  2008;112(6):2261-71;  Till  et  al.,  Blood  2012;119(17):3940-50;  Coiffier  et  al.,  N  Engl  J  Med  2002;346(4):235-42）。
しかし、養子細胞治療は、まだ開発途上である。例えば、Ｂ細胞悪性疾患におけるＣＤ１９を標的とするＣＡＲ  Ｔ細胞治療は、がん性Ｂ細胞のみならず正常Ｂ細胞も破壊する。Ｂ細胞無形成症として公知の状態である、健常Ｂ細胞数の低減または非存在は、感染症と闘う抗体を産生する患者の能力を損なわせ得る。ＣＡＲ  Ｔ免疫応答の特異度および強度のモジュレーションは、別の課題を提起する。「オンターゲット・オフ腫瘍」毒性の例示的な悲劇的症例では、転移性結腸がんを有した患者が、ＥＲＢＢ２（結腸がんにおいて高度に発現される）に特異的なキメラ抗原受容体を発現するＴ細胞を施された後、投与された細胞が肺に局在し、健常肺組織中の低レベルのＥＲＢＢ２に対してＣＲＳ（サイトカイン放出症候群）事象を誘発して、死亡した。例えば、Morgan  et  al.,  Mol.Ther.18(4):843-851  (2010)を参照されたい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Brentjens  et  al.,  Sci  Transl  Med  2013;5(177):177ra38
【非特許文献２】Haso  et  al.,Blood  2013;121(7):1165-74
【非特許文献３】James  et  al.,  J  Immunol  2008;180(10):7028-38
【非特許文献４】Kalos  et  al.,  Sci  Transl  Med  2011;3(95):95ra73
【非特許文献５】Kochenderfer  et  al.,  J  Clin  Oncol  2015;33(6):540-9
【非特許文献６】Lee  et  al.,  Lancet  2015;385(9967):517-28
【非特許文献７】Porter  et  al.,  Sci  Transl  25  Med  2015;7(303):303ra139
【非特許文献８】Savoldo  et  al.,  J  Clin  Invest  2011;121(5):1822-6
【非特許文献９】Till  et  al.,  Blood  2008;112(6):2261-71
【非特許文献１０】Till  et  al.,  Blood  2012;119(17):3940-50
【非特許文献１１】Coiffier  et  al.,  N  Engl  J  Med  2002;346(4):235-42
【非特許文献１２】Morgan  et  al.,  Mol.Ther.18(4):843-851  (2010)
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】図１は、（左上）Ｓｔｒｅｐ（登録商標）タグＩＩ（配列番号１９）（「ＳＴＩＩ」）ペプチドヒンジ領域を有する抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、短縮型ＥＧＦＲ形質導入マーカーをさらにコードする、例示的な発現構築物；（右上）コードされた抗ＣＤ１９−ＳＴＩＩ  ＣＡＲを発現する宿主細胞のモデル；（左下）抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲと短縮型ＥＧＦＲ形質導入マーカーとをコードする例示的な発現構築物；および（右下）コードされた抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲを発現する宿主細胞のモデルの概略図を示す。
【０００６】
【図２】図２は、例示的な抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ設計の概略図を示す。左：中等度の長さのスペーサー（ＩｇＧ４  ＣＨ３）を有する抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ。中央：長いスペーサー（ＩｇＧ４／２ＮＱ  ＣＨ２−ＣＨ３）を有する抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ。右：中等度または長いスペーサーおよびｓｃＦｖ結合ドメイン（「５Ｇ２」または「３Ｅ８」）を有する、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ配向で生成された例示的な抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲの記述。
【０００７】
【図３】図３は、図２に描示した構築物の初代ＰＢＭＣにおける発現を示す。（Ａ、上方左側の角）非形質導入ＰＢＭＣ。（Ｂ、下方左側の角）抗ＣＤ１９−ＳＴＩＩ  ＣＡＲ発現構築物で形質導入されたＰＢＭＣ。（Ｃ、下方右側の角）抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ発現構築物で形質導入されたＰＢＭＣ。形質導入細胞は、細胞へのγ−レトロウイルス形質導入後４日目にビオチン化抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体およびストレプトアビジン−ＰＥを使用するフローサイトメトリー実験で検出された。細胞は、生存リンパ球にプレゲートされた。数字は、検出された細胞の百分率を示す。
【０００８】
【図４Ａ−４Ｂ】図４Ａおよび４Ｂは、本開示の高親和性抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲを発現するように（Ａ）形質導入されていない初代ＰＢＭＣおよび（Ｂ）形質導入された初代ＰＢＭＣからの発現データを示すフローサイトメトリー実験からのデータを提供する。形質導入細胞は、γ−レトロウイルス形質導入後４日目にビオチン化抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体およびストレプトアビジン−ＰＥを使用するフローサイトメトリー実験で検出された。細胞は、生存リンパ球にプレゲートされた。数字は、検出された細胞の百分率を示す。
【０００９】
【図５Ａ】図５Ａおよび５Ｂは、本開示による例示的な抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の特異性および反応性を示す。（Ａ）図の説明文に示されるとおりの抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲで形質導入されたヒトＴ細胞によるＩＦＮ−γ産生（ｎｇ／ｍＬ）。Ｘ軸、左から右へ：陰性対照（抗ＣＤ１９−Ｈｉ  ＣＡＲ  Ｔ細胞）；１、２または３  ＳＴＩＩを発現する抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞；ＰＭＡ／ＩＯＮＯで活性化されたＴ細胞（陽性対照）。（Ｂ）抗ＣＤ１９−Ｈｉ  ＣＡＲ  Ｔ細胞もしくは培地のどちらか（上の横列）または抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞もしくは培地のどちらか（下の横列）での刺激後のカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）標識抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖を示すＦＡＣＳデータ。
【図５Ｂ】図５Ａおよび５Ｂは、本開示による例示的な抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の特異性および反応性を示す。（Ａ）図の説明文に示されるとおりの抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲで形質導入されたヒトＴ細胞によるＩＦＮ−γ産生（ｎｇ／ｍＬ）。Ｘ軸、左から右へ：陰性対照（抗ＣＤ１９−Ｈｉ  ＣＡＲ  Ｔ細胞）；１、２または３  ＳＴＩＩを発現する抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞；ＰＭＡ／ＩＯＮＯで活性化されたＴ細胞（陽性対照）。（Ｂ）抗ＣＤ１９−Ｈｉ  ＣＡＲ  Ｔ細胞もしくは培地のどちらか（上の横列）または抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞もしくは培地のどちらか（下の横列）での刺激後のカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）標識抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖を示すＦＡＣＳデータ。
【００１０】
【図６Ａ−６Ｃ】図６Ａ〜６Ｃは、示されている抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ構築物を発現するエフェクターＴ細胞が、（Ａ）抗ＣＤ１９−Ｈｉ  ＣＡＲ  Ｔ細胞、（Ｂ）抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞、または（Ｃ）抗ＣＤ１９−３ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を発現する１×１０３のＣｒ５１標識標的Ｔ細胞とともに、４時間、示されているエフェクター：標的比（ｘ軸）で、三重反復実験でインキュベートされた、細胞傷害性アッセイからのデータを提供する。特異的溶解は、クロム放出検出に基づいて標準式を使用して計算された。データは、三重反復実験の平均±ＳＤを意味する。
【００１１】
【図７】図７は、抗ＣＤ１９−ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞および抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の殺滅活性が判定された細胞傷害性アッセイからのデータを示す。丸：標的ＣＤ１９＋Ｋ５６２細胞とのエフェクター抗ＣＤ１９−ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の共培養；正方形：標的ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と共培養での抗Ｓｔｒｅｐ  Ｔａｇ  ＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞；三角形：非形質導入Ｔ細胞とのエフェクター抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の共培養；菱形：標的非改変Ｋ５６２細胞とのエフェクター抗ＣＤ１９−ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の共培養。Ｙ軸：標的細胞の％特異的溶解。Ｘ軸：エフェクター：標的比。
【００１２】
【図８】図８は、エフェクター抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が、抗ＣＤ１９−ＳＴＩＩ  ＣＡＲを発現する標的ＨＥＫ２９３細胞とともにインキュベートされた、細胞傷害性アッセイからのデータを示す。上の３つの曲線（丸、正方形、および上向き三角形は、データ点を表す）は、示されているエフェクター：標的比での抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲの殺滅能力を示す。一番下の曲線（下向き三角形）は、非形質導入細胞を使用する陰性対照からのものである。
【００１３】
【図９】図９は、マウス膜貫通およびシグナル伝達ドメインを有し、かつマウスＩｇＧ１  ＣＨ３スペーサー（左）またはＭｙｃタグスペーサー（右）のどちらかを有する、抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ構築物の概略図を示す。
【００１４】
【図１０Ａ】図１０Ａおよび１０Ｂは、標的細胞への曝露後の、図９に図示されている抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ構築物を発現するマウスＴ細胞によるサイトカイン産生を示す。（Ａ）Ｙ軸：図の説明文に示されるとおりの抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲで形質導入されたマウスＴ細胞によるＩＦＮ−γ産生（ｎｇ／ｍＬ）。Ｘ軸、左から右へ：陰性対照（マウス抗ＣＤ１９−Ｈｉ  ＣＡＲ  Ｔ細胞）；短縮型ＥＧＦＲ形質導入マーカーを有するまたは有さないマウス抗ＣＤ１９−ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞；ＰＭＡ／ＩＯＮＯで活性化されたマウスＴ細胞（陽性対照）；培地。（Ｂ）Ｙ軸：抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞によるＩＬ−２産生（ｎｇ／ｍＬ）。Ｘ軸、左から右へ：陰性対照（マウス抗ＣＤ１９−Ｈｉ  ＣＡＲ  Ｔ細胞）；短縮型ＥＧＦＲ形質導入マーカーを有するまたは有さないマウス抗ＣＤ１９−ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞；ＰＭＡ／ＩＯＮＯで活性化されたマウスＴ細胞（陽性対照）；培地。
【図１０Ｂ】図１０Ａおよび１０Ｂは、標的細胞への曝露後の、図９に図示されている抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ構築物を発現するマウスＴ細胞によるサイトカイン産生を示す。（Ａ）Ｙ軸：図の説明文に示されるとおりの抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲで形質導入されたマウスＴ細胞によるＩＦＮ−γ産生（ｎｇ／ｍＬ）。Ｘ軸、左から右へ：陰性対照（マウス抗ＣＤ１９−Ｈｉ  ＣＡＲ  Ｔ細胞）；短縮型ＥＧＦＲ形質導入マーカーを有するまたは有さないマウス抗ＣＤ１９−ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞；ＰＭＡ／ＩＯＮＯで活性化されたマウスＴ細胞（陽性対照）；培地。（Ｂ）Ｙ軸：抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞によるＩＬ−２産生（ｎｇ／ｍＬ）。Ｘ軸、左から右へ：陰性対照（マウス抗ＣＤ１９−Ｈｉ  ＣＡＲ  Ｔ細胞）；短縮型ＥＧＦＲ形質導入マーカーを有するまたは有さないマウス抗ＣＤ１９−ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞；ＰＭＡ／ＩＯＮＯで活性化されたマウスＴ細胞（陽性対照）；培地。
【００１５】
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｇは、マウス抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＡＲ発現およびｉｎ  ｖｉｖｏ細胞溶解活性を示す。（Ａ）マウスＴ細胞における抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ（左に示される）の表面発現を示すフローサイトメトリーデータ。（Ｂ）Ｂ細胞無形成症を有するマウスにおける抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（１  ＳＴＩＩタグ）の投与および照射後の抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞治療の効果を検査する実験的処置スキームの略図。（Ｃ）（Ｂ）に示される処置スキームに従っての第１群の抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の輸注後の標的（抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ；黒丸）およびエフェクター（抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ；白丸）細胞の細胞計数値（ＰＢＭＣ中の％）を示すフローサイトメトリーデータ。（Ｄ）抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の注入後＋３日目および＋４２日目における対照または第１群のマウスのＰＢＭＣ中のＢ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ４５．１−）、抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ４５．１＋ＥＧＦＲ＋ＳＴＩＩ＋）および抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ４５．１＋ＥＧＦＲ＋Ｍｙｃ＋）の頻度を示すフローサイトメトリーデータ。（Ｅ）第２群の抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（（Ｂ）を参照されたい）の輸注後の標的（抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ）およびエフェクター（抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ）細胞の細胞計数値（ＰＢＭＣ中の％）を示すフローサイトメトリーデータ。（Ｆ）抗ＣＤ１９−ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の注入後＋３日目（上の６パネル）および＋４２日目（下の６パネル）における対照および第２群のマウスのＰＢＭＣ中のＢ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ４５．１−）、抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ４５．１＋ＥＧＦＲ＋ＳＴＩＩ＋）および抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ４５．１＋ＥＧＦＲ＋）Ｍｙｃ＋）の頻度を示す、フローサイトメトリー実験からのデータ。（Ｇ）健常マウスに対する処置マウスにおけるＰＢＭＣ中のＢ細胞頻度を示すフローサイトメトリーデータの要約。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｇは、マウス抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＡＲ発現およびｉｎ  ｖｉｖｏ細胞溶解活性を示す。（Ａ）マウスＴ細胞における抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ（左に示される）の表面発現を示すフローサイトメトリーデータ。（Ｂ）Ｂ細胞無形成症を有するマウスにおける抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（１  ＳＴＩＩタグ）の投与および照射後の抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞治療の効果を検査する実験的処置スキームの略図。（Ｃ）（Ｂ）に示される処置スキームに従っての第１群の抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の輸注後の標的（抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ；黒丸）およびエフェクター（抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ；白丸）細胞の細胞計数値（ＰＢＭＣ中の％）を示すフローサイトメトリーデータ。（Ｄ）抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の注入後＋３日目および＋４２日目における対照または第１群のマウスのＰＢＭＣ中のＢ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ４５．１−）、抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ４５．１＋ＥＧＦＲ＋ＳＴＩＩ＋）および抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ４５．１＋ＥＧＦＲ＋Ｍｙｃ＋）の頻度を示すフローサイトメトリーデータ。（Ｅ）第２群の抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（（Ｂ）を参照されたい）の輸注後の標的（抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ）およびエフェクター（抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ）細胞の細胞計数値（ＰＢＭＣ中の％）を示すフローサイトメトリーデータ。（Ｆ）抗ＣＤ１９−ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の注入後＋３日目（上の６パネル）および＋４２日目（下の６パネル）における対照および第２群のマウスのＰＢＭＣ中のＢ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ４５．１−）、抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ４５．１＋ＥＧＦＲ＋ＳＴＩＩ＋）および抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ４５．１＋ＥＧＦＲ＋）Ｍｙｃ＋）の頻度を示す、フローサイトメトリー実験からのデータ。（Ｇ）健常マウスに対する処置マウスにおけるＰＢＭＣ中のＢ細胞頻度を示すフローサイトメトリーデータの要約。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜１１Ｇは、マウス抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＡＲ発現およびｉｎ  ｖｉｖｏ細胞溶解活性を示す。（Ａ）マウスＴ細胞における抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ（左に示される）の表面発現を示すフローサイトメトリーデータ。（Ｂ）Ｂ細胞無形成症を有するマウスにおける抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（１  ＳＴＩＩタグ）の投与および照射後の抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞治療の効果を検査する実験的処置スキームの略図。（Ｃ）（Ｂ）に示される処置スキームに従っての第１群の抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の輸注後の標的（抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ；黒丸）およびエフェクター（抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ；白丸）細胞の細胞計数値（ＰＢＭＣ中の％）を示すフローサイトメトリーデータ。（Ｄ）抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の注入後＋３日目および＋４２日目における対照または第１群のマウスのＰＢＭＣ中のＢ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ４５．１−）、抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ４５．１＋ＥＧＦＲ＋ＳＴＩＩ＋）および抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ４５．１＋ＥＧＦＲ＋Ｍｙｃ＋）の頻度を示すフローサイトメトリーデータ。（Ｅ）第２群の抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（（Ｂ）を参照されたい）の輸注後の標的（抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ）およびエフェクター（抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ）細胞の細胞計数値（ＰＢＭＣ中の％）を示すフローサイトメトリーデータ。（Ｆ）抗ＣＤ１９−ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の注入後＋３日目（上の６パネル）および＋４２日目（下の６パネル）における対照および第２群のマウスのＰＢＭＣ中のＢ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ４５．１−）、抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ４５．１＋ＥＧＦＲ＋ＳＴＩＩ＋）および抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ４５．１＋ＥＧＦＲ＋）Ｍｙｃ＋）の頻度を示す、フローサイトメトリー実験からのデータ。（Ｇ）健常マウスに対する処置マウスにおけるＰＢＭＣ中のＢ細胞頻度を示すフローサイトメトリーデータの要約。
【図１１Ｄ】図１１Ａ〜１１Ｇは、マウス抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＡＲ発現およびｉｎ  ｖｉｖｏ細胞溶解活性を示す。（Ａ）マウスＴ細胞における抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ（左に示される）の表面発現を示すフローサイトメトリーデータ。（Ｂ）Ｂ細胞無形成症を有するマウスにおける抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（１  ＳＴＩＩタグ）の投与および照射後の抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞治療の効果を検査する実験的処置スキームの略図。（Ｃ）（Ｂ）に示される処置スキームに従っての第１群の抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の輸注後の標的（抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ；黒丸）およびエフェクター（抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ；白丸）細胞の細胞計数値（ＰＢＭＣ中の％）を示すフローサイトメトリーデータ。（Ｄ）抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の注入後＋３日目および＋４２日目における対照または第１群のマウスのＰＢＭＣ中のＢ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ４５．１−）、抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ４５．１＋ＥＧＦＲ＋ＳＴＩＩ＋）および抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ４５．１＋ＥＧＦＲ＋Ｍｙｃ＋）の頻度を示すフローサイトメトリーデータ。（Ｅ）第２群の抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（（Ｂ）を参照されたい）の輸注後の標的（抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ）およびエフェクター（抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ）細胞の細胞計数値（ＰＢＭＣ中の％）を示すフローサイトメトリーデータ。（Ｆ）抗ＣＤ１９−ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の注入後＋３日目（上の６パネル）および＋４２日目（下の６パネル）における対照および第２群のマウスのＰＢＭＣ中のＢ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ４５．１−）、抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ４５．１＋ＥＧＦＲ＋ＳＴＩＩ＋）および抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ４５．１＋ＥＧＦＲ＋）Ｍｙｃ＋）の頻度を示す、フローサイトメトリー実験からのデータ。（Ｇ）健常マウスに対する処置マウスにおけるＰＢＭＣ中のＢ細胞頻度を示すフローサイトメトリーデータの要約。
【図１１Ｅ】図１１Ａ〜１１Ｇは、マウス抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＡＲ発現およびｉｎ  ｖｉｖｏ細胞溶解活性を示す。（Ａ）マウスＴ細胞における抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ（左に示される）の表面発現を示すフローサイトメトリーデータ。（Ｂ）Ｂ細胞無形成症を有するマウスにおける抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（１  ＳＴＩＩタグ）の投与および照射後の抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞治療の効果を検査する実験的処置スキームの略図。（Ｃ）（Ｂ）に示される処置スキームに従っての第１群の抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の輸注後の標的（抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ；黒丸）およびエフェクター（抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ；白丸）細胞の細胞計数値（ＰＢＭＣ中の％）を示すフローサイトメトリーデータ。（Ｄ）抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の注入後＋３日目および＋４２日目における対照または第１群のマウスのＰＢＭＣ中のＢ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ４５．１−）、抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ４５．１＋ＥＧＦＲ＋ＳＴＩＩ＋）および抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ４５．１＋ＥＧＦＲ＋Ｍｙｃ＋）の頻度を示すフローサイトメトリーデータ。（Ｅ）第２群の抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（（Ｂ）を参照されたい）の輸注後の標的（抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ）およびエフェクター（抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ）細胞の細胞計数値（ＰＢＭＣ中の％）を示すフローサイトメトリーデータ。（Ｆ）抗ＣＤ１９−ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の注入後＋３日目（上の６パネル）および＋４２日目（下の６パネル）における対照および第２群のマウスのＰＢＭＣ中のＢ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ４５．１−）、抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ４５．１＋ＥＧＦＲ＋ＳＴＩＩ＋）および抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ４５．１＋ＥＧＦＲ＋）Ｍｙｃ＋）の頻度を示す、フローサイトメトリー実験からのデータ。（Ｇ）健常マウスに対する処置マウスにおけるＰＢＭＣ中のＢ細胞頻度を示すフローサイトメトリーデータの要約。
【図１１Ｆ】図１１Ａ〜１１Ｇは、マウス抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＡＲ発現およびｉｎ  ｖｉｖｏ細胞溶解活性を示す。（Ａ）マウスＴ細胞における抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ（左に示される）の表面発現を示すフローサイトメトリーデータ。（Ｂ）Ｂ細胞無形成症を有するマウスにおける抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（１  ＳＴＩＩタグ）の投与および照射後の抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞治療の効果を検査する実験的処置スキームの略図。（Ｃ）（Ｂ）に示される処置スキームに従っての第１群の抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の輸注後の標的（抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ；黒丸）およびエフェクター（抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ；白丸）細胞の細胞計数値（ＰＢＭＣ中の％）を示すフローサイトメトリーデータ。（Ｄ）抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の注入後＋３日目および＋４２日目における対照または第１群のマウスのＰＢＭＣ中のＢ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ４５．１−）、抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ４５．１＋ＥＧＦＲ＋ＳＴＩＩ＋）および抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ４５．１＋ＥＧＦＲ＋Ｍｙｃ＋）の頻度を示すフローサイトメトリーデータ。（Ｅ）第２群の抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（（Ｂ）を参照されたい）の輸注後の標的（抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ）およびエフェクター（抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ）細胞の細胞計数値（ＰＢＭＣ中の％）を示すフローサイトメトリーデータ。（Ｆ）抗ＣＤ１９−ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の注入後＋３日目（上の６パネル）および＋４２日目（下の６パネル）における対照および第２群のマウスのＰＢＭＣ中のＢ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ４５．１−）、抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ４５．１＋ＥＧＦＲ＋ＳＴＩＩ＋）および抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ４５．１＋ＥＧＦＲ＋）Ｍｙｃ＋）の頻度を示す、フローサイトメトリー実験からのデータ。（Ｇ）健常マウスに対する処置マウスにおけるＰＢＭＣ中のＢ細胞頻度を示すフローサイトメトリーデータの要約。
【図１１Ｇ】図１１Ａ〜１１Ｇは、マウス抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＡＲ発現およびｉｎ  ｖｉｖｏ細胞溶解活性を示す。（Ａ）マウスＴ細胞における抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ（左に示される）の表面発現を示すフローサイトメトリーデータ。（Ｂ）Ｂ細胞無形成症を有するマウスにおける抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（１  ＳＴＩＩタグ）の投与および照射後の抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞治療の効果を検査する実験的処置スキームの略図。（Ｃ）（Ｂ）に示される処置スキームに従っての第１群の抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の輸注後の標的（抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ；黒丸）およびエフェクター（抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ；白丸）細胞の細胞計数値（ＰＢＭＣ中の％）を示すフローサイトメトリーデータ。（Ｄ）抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の注入後＋３日目および＋４２日目における対照または第１群のマウスのＰＢＭＣ中のＢ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ４５．１−）、抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ４５．１＋ＥＧＦＲ＋ＳＴＩＩ＋）および抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ４５．１＋ＥＧＦＲ＋Ｍｙｃ＋）の頻度を示すフローサイトメトリーデータ。（Ｅ）第２群の抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（（Ｂ）を参照されたい）の輸注後の標的（抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ）およびエフェクター（抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ）細胞の細胞計数値（ＰＢＭＣ中の％）を示すフローサイトメトリーデータ。（Ｆ）抗ＣＤ１９−ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の注入後＋３日目（上の６パネル）および＋４２日目（下の６パネル）における対照および第２群のマウスのＰＢＭＣ中のＢ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ４５．１−）、抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ４５．１＋ＥＧＦＲ＋ＳＴＩＩ＋）および抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ４５．１＋ＥＧＦＲ＋）Ｍｙｃ＋）の頻度を示す、フローサイトメトリー実験からのデータ。（Ｇ）健常マウスに対する処置マウスにおけるＰＢＭＣ中のＢ細胞頻度を示すフローサイトメトリーデータの要約。
【００１６】
【図１２Ａ】図１２Ａは、Ｂ細胞無形成症を有するマウスにおける抗ＣＤ１９−３ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（３  ＳＴＩＩタグ）の投与および照射後の抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞治療の効果を検査する実験的処置スキームの略図を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、処置に使用された抗ＣＤ１９−３ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（左）およびソートされた抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（右）の計数値を示す、フローサイトメトリー実験からのデータを示す。
【００１７】
【図１３Ａ−１３Ｄ】図１３Ａ〜１３Ｉは、抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の輸注前に測定された、図１２（Ａ）に示されるスケジュールに従って処置が施されたマウスにおけるＢ細胞枯渇を示す。（Ａ〜Ｈ）フローサイトメトリー実験からのデータ：（Ａ）生存リンパ球にゲートする、系列標識ＰＢＭＣについての前方散乱（ＦＳ）ｌｏｇ対側方散乱（ＳＳ）ｌｏｇプロット；（Ｂ）生存細胞にゲートする、ＴＸ  Ｒｅｄ（Ｙ軸）についてのフィコエリトリンコンジュゲート抗ＣＤ１９抗体（ＣＤ１９−ＰＥ）（Ｘ軸）に対する散布図；（Ｃ）ＳＳ  ｌｏｇ対ＣＤ１９ＰＥ；（Ｄ）図１３（Ｃ）に示される実験からの細胞計数値を要約するヒストグラム；散布図（Ｅ）およびヒストグラム（Ｆ）で示されたＣＤ１９＋画分と、ＣＤ１９枯渇画分（Ｇ、Ｈ）。（Ｉ）ＣＤ１９ＰＥで染色後に抗ＰＥ磁気ビーズを使用して判定された、ＰＢＭＣ中のＢ細胞枯渇。
【図１３Ｅ−１３Ｈ】図１３Ａ〜１３Ｉは、抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の輸注前に測定された、図１２（Ａ）に示されるスケジュールに従って処置が施されたマウスにおけるＢ細胞枯渇を示す。（Ａ〜Ｈ）フローサイトメトリー実験からのデータ：（Ａ）生存リンパ球にゲートする、系列標識ＰＢＭＣについての前方散乱（ＦＳ）ｌｏｇ対側方散乱（ＳＳ）ｌｏｇプロット；（Ｂ）生存細胞にゲートする、ＴＸ  Ｒｅｄ（Ｙ軸）についてのフィコエリトリンコンジュゲート抗ＣＤ１９抗体（ＣＤ１９−ＰＥ）（Ｘ軸）に対する散布図；（Ｃ）ＳＳ  ｌｏｇ対ＣＤ１９ＰＥ；（Ｄ）図１３（Ｃ）に示される実験からの細胞計数値を要約するヒストグラム；散布図（Ｅ）およびヒストグラム（Ｆ）で示されたＣＤ１９＋画分と、ＣＤ１９枯渇画分（Ｇ、Ｈ）。（Ｉ）ＣＤ１９ＰＥで染色後に抗ＰＥ磁気ビーズを使用して判定された、ＰＢＭＣ中のＢ細胞枯渇。
【図１３Ｉ】図１３Ａ〜１３Ｉは、抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の輸注前に測定された、図１２（Ａ）に示されるスケジュールに従って処置が施されたマウスにおけるＢ細胞枯渇を示す。（Ａ〜Ｈ）フローサイトメトリー実験からのデータ：（Ａ）生存リンパ球にゲートする、系列標識ＰＢＭＣについての前方散乱（ＦＳ）ｌｏｇ対側方散乱（ＳＳ）ｌｏｇプロット；（Ｂ）生存細胞にゲートする、ＴＸ  Ｒｅｄ（Ｙ軸）についてのフィコエリトリンコンジュゲート抗ＣＤ１９抗体（ＣＤ１９−ＰＥ）（Ｘ軸）に対する散布図；（Ｃ）ＳＳ  ｌｏｇ対ＣＤ１９ＰＥ；（Ｄ）図１３（Ｃ）に示される実験からの細胞計数値を要約するヒストグラム；散布図（Ｅ）およびヒストグラム（Ｆ）で示されたＣＤ１９＋画分と、ＣＤ１９枯渇画分（Ｇ、Ｈ）。（Ｉ）ＣＤ１９ＰＥで染色後に抗ＰＥ磁気ビーズを使用して判定された、ＰＢＭＣ中のＢ細胞枯渇。
【００１８】
【図１４】図１４は、図１２（Ａ）に示される処置を施されているマウスからのＰＢＭＣ中のＢ細胞計数値を測定するフローサイトメトリー実験からのデータを提供する。上の横列（「ｐｏｓ」）：照射も抗ＣＤ１９−３ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞も施されなかったマウスからの細胞。中央の横列（「試料」）：照射および抗ＣＤ１９−３ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が施され、その後、抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が施されたマウスからの細胞。下の横列（「ｎｅｇ」）：照射および抗ＣＤ１９−３ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は施されたが、抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は施されなかったマウスからの細胞。Ｙ軸：ナチュラルキラー細胞表面抗原１．１（ＮＫ１．１）に対する抗体。Ｘ軸：ＣＤ１９＋細胞（抗ＣＤ１９抗体で染色）。
【００１９】
【図１５Ａ】図１５Ａは、図１２Ａに示される処置スケジュールにわたっての抗ＣＤ１９−３ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ（三角形）、ＯＴ−１  ＣＤ４５．１／２＋抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ（正方形）およびＣＤ９０．１＋ＣＡＲ  Ｔ細胞（三角形）の細胞計数値（血液中の％）を示す、フローサイトメトリー実験からのデータを提供する。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、図１２Ａに示される処置スキームにわたっての内在性Ｂ細胞計数値（血液中の％）を示すフローサイトメトリー実験からのデータを示す。「ｐｏｓ」：照射も抗ＣＤ１９−３ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞も施されなかったマウスからの細胞。「試料」：照射および抗ＣＤ１９−３ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が施され、その後、抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が施されたマウスからの細胞。「ｎｅｇ」：照射および抗ＣＤ１９−３ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は施されたが、抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は施されなかったマウスからの細胞。灰色陰影：Ｂ細胞無形成の範囲。
【００２０】
【図１６Ａ】図１６Ａ〜１６Ｄは、図１５Ａに示される処置スケジュールの完了時のＢ細胞（抗ＣＤ１９抗体で染色された）、抗ＣＤ１９−３ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞、および抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（抗ＥＧＦＲｔ抗体で染色された）の細胞計数値を測定する、フローサイトメトリー実験からのデータを示す。試料は、（Ａ）血液、（Ｂ）骨髄、（Ｃ）リンパ節、および（Ｄ）脾臓から採取された。
【図１６Ｂ】図１６Ａ〜１６Ｄは、図１５Ａに示される処置スケジュールの完了時のＢ細胞（抗ＣＤ１９抗体で染色された）、抗ＣＤ１９−３ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞、および抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（抗ＥＧＦＲｔ抗体で染色された）の細胞計数値を測定する、フローサイトメトリー実験からのデータを示す。試料は、（Ａ）血液、（Ｂ）骨髄、（Ｃ）リンパ節、および（Ｄ）脾臓から採取された。
【図１６Ｃ】図１６Ａ〜１６Ｄは、図１５Ａに示される処置スケジュールの完了時のＢ細胞（抗ＣＤ１９抗体で染色された）、抗ＣＤ１９−３ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞、および抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（抗ＥＧＦＲｔ抗体で染色された）の細胞計数値を測定する、フローサイトメトリー実験からのデータを示す。試料は、（Ａ）血液、（Ｂ）骨髄、（Ｃ）リンパ節、および（Ｄ）脾臓から採取された。
【図１６Ｄ】図１６Ａ〜１６Ｄは、図１５Ａに示される処置スケジュールの完了時のＢ細胞（抗ＣＤ１９抗体で染色された）、抗ＣＤ１９−３ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞、および抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（抗ＥＧＦＲｔ抗体で染色された）の細胞計数値を測定する、フローサイトメトリー実験からのデータを示す。試料は、（Ａ）血液、（Ｂ）骨髄、（Ｃ）リンパ節、および（Ｄ）脾臓から採取された。
【００２１】
【図１７Ａ−１７Ｃ】図１７Ａ〜１７Ｃは、本開示の例示的な発現構築物の概略図を示す。（Ａ）３ＳＴＩＩヒンジ領域を有する抗ＣＤ１９  ＣＡＲをコードし、短縮型ＥＧＦＲ形質導入マーカーをさらにコードする、発現構築物であって、ＥＧＦＲｔをコードする部分がＣＡＲをコードする部分から自己切断Ｐ２Ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによって分離されている、発現構築物（「ｍ１９−３ＳＴＩＩ−２８ｚ＿Ｅ」）。（Ｂ）ＣＤ８ヒンジとＣＤ８膜貫通部分とＣＤ２８−４−１ＢＢ−ｚシグナル伝達ドメインとを有する抗ＣＤ１９  ＣＡＲをコードし、３ＳＴＩＩペプチドに融合されたＥＧＦＲｔ形質導入マーカーをさらにコードする、発現構築物であって、ＥＧＦＲｔ−３ＳＴＩＩをコードする部分がＣＡＲをコードする部分から自己切断Ｐ２Ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによって分離されている、発現構築物。（「ｍ１９−２８ｚ−Ｅ−３ＳＴＩＩ」）。（Ｃ）抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲと短縮型ＥＧＦＲ形質導入マーカーとをコードし、ＣＡＲをコードする部分とマーカーをコードする部分が自己切断Ｐ２Ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによって分離されている、発現構築物。
【図１７Ｄ−１７Ｆ】図１７Ｄ〜１７Ｆは、形質導入細胞による示されている構築物の発現を示すフローサイトメトリー実験からの代表データを（左に）提供するとともに、右に前記細胞の概略図を提供する。
【００２２】
【図１８Ａ】図１８Ａは、亜致死線量（６Ｇｙ）照射Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、（１）ｍ１９−３ＳＴＩＩ−２８ｚ＿Ｅまたは（２）ｍ１９−２８ｚ＿Ｅ−３ＳＴＩＩのどちらかを発現する２×１０６のマウスＣＤ９０．１＋／−Ｔ細胞が４０日目に投与された、実験的処置スキームの略図を示す。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、（１）ｍ１９−３ＳＴＩＩ−２８ｚ＿Ｅまたは（２）ｍ１９−２８ｚ＿Ｅ−３ＳＴＩＩの細胞表面発現を示す、フローサイトメトリー実験からのデータを提供する。細胞は、抗ＳＴ−アロフィコシアニン（Ｙ軸）および抗ＥＧＦＲｔ（Ｘ軸）を使用して染色された。
【００２３】
【図１９】図１９は、ｍ１９−３ＳＴＩＩ−２８ｚ＿Ｅ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（左パネル）（ｎ＝２）、ＳＴＩＩペプチドを有さない抗ＣＤ１９  ＣＡＲを発現するＴ細胞（中央パネル）またはｍ１９−２８ｚ＿Ｅ−３ＳＴＩＩ（右パネル）（ｎ＝２）が施されたＣＤ９０．１＋／−Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおけるＢ細胞枯渇を示す、フローサイトメトリー実験からのデータを提供する。Ｂ細胞は、抗ＣＤ１９抗体を使用して染色された。
【００２４】
【図２０Ａ】図２０Ａは、亜致死線量（６Ｇｙ）照射Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、（１）ｍ１９−３ＳＴＩＩ−２８ｚ＿Ｅまたは（２）ｍ１９−２８ｚ＿Ｅ−３ＳＴＩＩのどちらかを発現する２×１０６のマウスＣＤ９０．１＋／−Ｔ細胞が０日目に投与され、その後、＋４０日目に２．５×１０６のＣＤ４５．１＋／−抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞が輸注された、実験的処置スキームの略図を示す。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、（１）ｍ１９−３ＳＴＩＩ−２８ｚ−Ｅおよび（２）ｍ１９−２８ｚ−Ｅ−３ＳＴＩＩの細胞表面発現を示す、フローサイトメトリー実験からのデータを提供する。（３）形質導入Ｔ細胞における抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ構築物の発現を示すヒストグラム。
【００２５】
【図２１Ａ−ｉ】図２１Ａ（ｉ）〜（ｉｉ）および２１Ｂ（ｉ）〜（ｉｉ）は、図２０（Ａ）に示される処置スキームに従っての抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の注射の６日後に行われたフローサイトメトリー実験からのデータを示す。（Ａ）ｍ１９−３ＳＴＩＩ−２８ｚ＿Ｅを発現するＴ細胞が注射されたマウスからの散布図。Ｎ＝２（ｉ、ｉｉ）。Ｂ細胞にゲーティング。右側の（ａ）および（ｂ）は、形質導入されたＴ細胞における示されている構築物の発現を示す。（Ｂ）ｍ１９−２８ｚ＿Ｅ３ＳＴＩＩを発現するＴ細胞が注射されたマウスからの散布図。Ｎ＝２（ｉ、ｉｉ）。Ｂ細胞にゲーティング。左側の（ａ）および（ｂ）は、形質導入されたＴ細胞における構築物の発現を示す。
【図２１Ａ−ｉｉ】図２１Ａ（ｉ）〜（ｉｉ）および２１Ｂ（ｉ）〜（ｉｉ）は、図２０（Ａ）に示される処置スキームに従っての抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の注射の６日後に行われたフローサイトメトリー実験からのデータを示す。（Ａ）ｍ１９−３ＳＴＩＩ−２８ｚ＿Ｅを発現するＴ細胞が注射されたマウスからの散布図。Ｎ＝２（ｉ、ｉｉ）。Ｂ細胞にゲーティング。右側の（ａ）および（ｂ）は、形質導入されたＴ細胞における示されている構築物の発現を示す。（Ｂ）ｍ１９−２８ｚ＿Ｅ３ＳＴＩＩを発現するＴ細胞が注射されたマウスからの散布図。Ｎ＝２（ｉ、ｉｉ）。Ｂ細胞にゲーティング。左側の（ａ）および（ｂ）は、形質導入されたＴ細胞における構築物の発現を示す。
【図２１Ｂ−ｉ】図２１Ａ（ｉ）〜（ｉｉ）および２１Ｂ（ｉ）〜（ｉｉ）は、図２０（Ａ）に示される処置スキームに従っての抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の注射の６日後に行われたフローサイトメトリー実験からのデータを示す。（Ａ）ｍ１９−３ＳＴＩＩ−２８ｚ＿Ｅを発現するＴ細胞が注射されたマウスからの散布図。Ｎ＝２（ｉ、ｉｉ）。Ｂ細胞にゲーティング。右側の（ａ）および（ｂ）は、形質導入されたＴ細胞における示されている構築物の発現を示す。（Ｂ）ｍ１９−２８ｚ＿Ｅ３ＳＴＩＩを発現するＴ細胞が注射されたマウスからの散布図。Ｎ＝２（ｉ、ｉｉ）。Ｂ細胞にゲーティング。左側の（ａ）および（ｂ）は、形質導入されたＴ細胞における構築物の発現を示す。
【図２１Ｂ−ｉｉ】図２１Ａ（ｉ）〜（ｉｉ）および２１Ｂ（ｉ）〜（ｉｉ）は、図２０（Ａ）に示される処置スキームに従っての抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の注射の６日後に行われたフローサイトメトリー実験からのデータを示す。（Ａ）ｍ１９−３ＳＴＩＩ−２８ｚ＿Ｅを発現するＴ細胞が注射されたマウスからの散布図。Ｎ＝２（ｉ、ｉｉ）。Ｂ細胞にゲーティング。右側の（ａ）および（ｂ）は、形質導入されたＴ細胞における示されている構築物の発現を示す。（Ｂ）ｍ１９−２８ｚ＿Ｅ３ＳＴＩＩを発現するＴ細胞が注射されたマウスからの散布図。Ｎ＝２（ｉ、ｉｉ）。Ｂ細胞にゲーティング。左側の（ａ）および（ｂ）は、形質導入されたＴ細胞における構築物の発現を示す。
【００２６】
【図２２Ａ−ｉ】図２２Ａ（ｉ）〜（ｉｉ）および２２Ｂ（ｉ）〜（ｉｉ）は、図２０Ａに示される処置スキームに従っての抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の注射の３０日後に行われたフローサイトメトリー実験からのデータを示す。（Ａ）ｍ１９−３ＳＴＩＩ−２８ｚ＿Ｅを発現するＴ細胞が注射されたマウスからの散布図。Ｎ＝２（ｉ、ｉｉ）。Ｂ細胞にゲーティング。右側の（ａ）および（ｂ）は、形質導入されたＴ細胞における構築物の発現を示す。（Ｂ）ｍ１９−２８ｚ＿Ｅ３ＳＴＩＩを発現するＴ細胞が注射されたマウスからの散布図。Ｎ＝２（ｉ、ｉｉ）。Ｂ細胞にゲーティング。左側の（ａ）および（ｂ）は、形質導入されたＴ細胞における構築物の発現を示す。
【図２２Ａ−ｉｉ】図２２Ａ（ｉ）〜（ｉｉ）および２２Ｂ（ｉ）〜（ｉｉ）は、図２０Ａに示される処置スキームに従っての抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の注射の３０日後に行われたフローサイトメトリー実験からのデータを示す。（Ａ）ｍ１９−３ＳＴＩＩ−２８ｚ＿Ｅを発現するＴ細胞が注射されたマウスからの散布図。Ｎ＝２（ｉ、ｉｉ）。Ｂ細胞にゲーティング。右側の（ａ）および（ｂ）は、形質導入されたＴ細胞における構築物の発現を示す。（Ｂ）ｍ１９−２８ｚ＿Ｅ３ＳＴＩＩを発現するＴ細胞が注射されたマウスからの散布図。Ｎ＝２（ｉ、ｉｉ）。Ｂ細胞にゲーティング。左側の（ａ）および（ｂ）は、形質導入されたＴ細胞における構築物の発現を示す。
【図２２Ｂ−ｉ】図２２Ａ（ｉ）〜（ｉｉ）および２２Ｂ（ｉ）〜（ｉｉ）は、図２０Ａに示される処置スキームに従っての抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の注射の３０日後に行われたフローサイトメトリー実験からのデータを示す。（Ａ）ｍ１９−３ＳＴＩＩ−２８ｚ＿Ｅを発現するＴ細胞が注射されたマウスからの散布図。Ｎ＝２（ｉ、ｉｉ）。Ｂ細胞にゲーティング。右側の（ａ）および（ｂ）は、形質導入されたＴ細胞における構築物の発現を示す。（Ｂ）ｍ１９−２８ｚ＿Ｅ３ＳＴＩＩを発現するＴ細胞が注射されたマウスからの散布図。Ｎ＝２（ｉ、ｉｉ）。Ｂ細胞にゲーティング。左側の（ａ）および（ｂ）は、形質導入されたＴ細胞における構築物の発現を示す。
【図２２Ｂ−ｉｉ】図２２Ａ（ｉ）〜（ｉｉ）および２２Ｂ（ｉ）〜（ｉｉ）は、図２０Ａに示される処置スキームに従っての抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の注射の３０日後に行われたフローサイトメトリー実験からのデータを示す。（Ａ）ｍ１９−３ＳＴＩＩ−２８ｚ＿Ｅを発現するＴ細胞が注射されたマウスからの散布図。Ｎ＝２（ｉ、ｉｉ）。Ｂ細胞にゲーティング。右側の（ａ）および（ｂ）は、形質導入されたＴ細胞における構築物の発現を示す。（Ｂ）ｍ１９−２８ｚ＿Ｅ３ＳＴＩＩを発現するＴ細胞が注射されたマウスからの散布図。Ｎ＝２（ｉ、ｉｉ）。Ｂ細胞にゲーティング。左側の（ａ）および（ｂ）は、形質導入されたＴ細胞における構築物の発現を示す。
【００２７】
【図２３Ａ】図２３Ａおよび２３Ｂは、図２０（Ａ）に示される処置スキームの完了時のＢ細胞（大パネル；抗ＣＤ１９抗体で染色）、抗ＣＤ１９−３ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞、および抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（小パネル；抗ＥＧＦＲｔ抗体で染色）の計数値を測定する、フローサイトメトリー実験からのデータを示す。試料は、（Ａ）（上）血液、（下）骨髄、（Ｂ）（上）リンパ節および（下）脾臓から採取された。形質導入および移入されたＴ細胞によるＣＡＲ構築物の発現は、図２２Ａ（ｉ）（ａ〜ｂ）、（ｉｉ）（ａ〜ｂ）、および２２Ｂ（ｉ）（ａ〜ｂ）、（ｉｉ）（ａ〜ｂ）に示されるように分析された。
【図２３Ｂ】図２３Ａおよび２３Ｂは、図２０（Ａ）に示される処置スキームの完了時のＢ細胞（大パネル；抗ＣＤ１９抗体で染色）、抗ＣＤ１９−３ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞、および抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（小パネル；抗ＥＧＦＲｔ抗体で染色）の計数値を測定する、フローサイトメトリー実験からのデータを示す。試料は、（Ａ）（上）血液、（下）骨髄、（Ｂ）（上）リンパ節および（下）脾臓から採取された。形質導入および移入されたＴ細胞によるＣＡＲ構築物の発現は、図２２Ａ（ｉ）（ａ〜ｂ）、（ｉｉ）（ａ〜ｂ）、および２２Ｂ（ｉ）（ａ〜ｂ）、（ｉｉ）（ａ〜ｂ）に示されるように分析された。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
詳細な説明
本開示は、Ｓｔｒｅｐタグを含有する分子またはＳｔｒｅｐタグを含有する細胞を選択的に検出するためのタグ特異的融合タンパク質を提供する。タグ特異的融合タンパク質は、Ｓｔｒｅｐタグを含有するＣＡＲまたはマーカーなどの、タグ付き細胞表面分子を発現する免疫治療用細胞の活性のモニタリングおよび／またはモジュレーションに使用することができる。タグ付き分子またはタグ付き細胞を検出するための本開示の例示的な融合タンパク質（またはそのような融合タンパク質をその細胞表面に発現する細胞）は、（ａ）ｓｔｒｅｐタグペプチド（本明細書で定義されるとおり；例えば、アミノ酸配列ＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１９）を含むかまたはアミノ酸配列ＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１９）からなるペプチド）と特異的に結合する結合ドメインを含む細胞外成分と、（ｂ）エフェクタードメインまたはその機能的部分を含む細胞内成分と、（ｃ）前記細胞外成分と前記細胞内成分を接続する膜貫通ドメインとを含むことができる。
【００２９】
ある特定の実施形態では、本開示は、（ａ）標的抗原に特異的に結合する結合ドメインを含む細胞外成分、（ｂ）エフェクタードメインまたはその機能的部分を含む細胞内成分、および（ｃ）前記細胞外成分と前記細胞内成分を接続する膜貫通成分を含む、細胞表面受容体をコードする第１のポリヌクレオチドと；タグ付きマーカーをコードし、タグペプチドを含有するマーカーをコードするポリヌクレオチドを含む、第２のポリヌクレオチドであって、コードされたタグペプチドが、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を必要に応じて含むかまたは配列番号１９に示されるアミノ酸配列から必要に応じてなるｓｔｒｅｐタグペプチドを含む、第２のポリヌクレオチドと；前記細胞表面受容体をコードする第１のポリヌクレオチドと前記タグ付きマーカーをコードする第２のポリヌクレオチドの間に配置された、自己切断ポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドとを含有する、標的細胞を検出またはアブレーションすることができる、融合タンパク質（またはそのような融合タンパク質をその細胞表面に発現する細胞）を提供する。一部の実施形態では、今般開示される融合タンパク質（またはこの融合タンパク質をその細胞表面に発現する細胞）は、ｓｔｒｅｐタグペプチド（例えば、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなる）を含む融合タンパク質を発現する標的細胞を検出またはアブレーションすることができる。ある特定の実施形態では、ｓｔｒｅｐタグペプチドを含む融合タンパク質は、本明細書中でさらに論じられるように、マーカー、細胞表面受容体、または両方を含む。
【００３０】
本開示の組成物は、例えば、細胞免疫治療、グラフトおよび移植に使用されるタグ付き細胞などのタグ付き細胞を含む細胞治療をモジュレートする方法において、有用である。例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）などの異種分子を発現する免疫治療用細胞は、投与されたとき、ほとんど効果がないこともあり、または１つもしくは複数の有害事象をもたらすこともある。本開示は、免疫治療用細胞をモジュレートする（例えば、中和する、殺滅する、活性化する、刺激する、または別様にモジュレートする）ための試薬を提供する。本明細書に記載される組成物および方法は、ある特定の実施形態では、タグ付きＣＡＲ  Ｔ細胞、またはタグ付きマーカーを含むＣＡＲ  Ｔ細胞などの、タグ付き免疫治療用細胞を選択的にモジュレートする（例えば、所望に応じて、殺滅するまたは活性化する）のに有用である。
【００３１】
本開示をより詳細に示す前に、本明細書で使用されるある特定の用語の定義を提供することは、本開示の理解の助けになり得る。さらなる定義は、本開示を通して示される。
【００３２】
本説明では、任意の濃度範囲、百分率範囲、比の範囲、または整数範囲は、別段の指示がない限り、列挙されている範囲内の任意の整数の値、および適宜、それらの分数（例えば、整数の十分の一および百分の一）を含むと理解するべきである。また、任意の物理的特徴、例えば、ポリマーサブユニット、サイズまたは厚さに関して本明細書で列挙される任意の数値範囲は、別段の指示がない限り、列挙されている範囲内の任意の整数を含むと理解すべきである。本明細書で使用される用語「約」は、別段の指示がない限り、示されている範囲、値または構造の±２０％を意味する。用語「１つの（a）」および「１つの（an）」は、本明細書で使用される場合、列挙されている構成要素のうちの「１または複数」を指すと理解すべきである。選択肢（例えば、「または」）の使用は、それらの選択肢のうち１つ、両方、または任意の組合せを意味すると理解すべきである。本明細書で使用される場合、用語「含む（include）」、「有する」および「含む（comprise）」は、同義で使用され、これらの用語およびそれらの異表記は、非限定的と解釈されることを意図したものである。
【００３３】
「必要に応じた」または「必要に応じて」は、その後に記載される要素、成分、事象または状況が、起こることもあり、または起こらないこともあること、およびその記載が、要素、成分、事象または状況が起こる事例とそれらが起こらない事例とを含むことを意味する。
【００３４】
さらに、本明細書に記載される構造および置換基の様々な組合せから得られる個々の構築物または構築物の群は、あたかも各構築物または構築物の群が個々に示されたのと同程度に、本願により開示されると理解すべきである。したがって、特定の構造または特定のサブユニットの選択は、本開示の範囲内である。
【００３５】
用語「から本質的になる」は、「含む」と同等ではなく、請求項の明記された材料もしくはステップ、または特許請求された主題の基本的特徴に実質的に影響を与えない材料もしくはステップを指す。例えば、タンパク質のドメイン、領域もしくはモジュール（例えば、結合ドメイン、ヒンジ領域、またはリンカー）またはタンパク質（これは、１もしくは複数のドメイン、領域もしくはモジュールを有し得る）は、ドメイン、領域、モジュールまたはタンパク質のアミノ酸配列が、組み合わせて、ドメイン、領域、モジュールまたはタンパク質の長さの多くても２０％（例えば、多くても１５％、１０％、８％、６％、５％、４％、３％、２％または１％）に寄与し、ドメイン（複数可）、領域（複数可）、モジュール（複数可）またはタンパク質の活性（例えば、結合性タンパク質の標的結合親和性）に実質的に影響を与えない（すなわち、活性の低減が、５０％を超えない、例えば、４０％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下または１％以下である）、伸長、欠失、変異またはそれらの組合せ（例えば、アミノ末端もしくはカルボキシ末端にある、またはドメイン間にあるアミノ酸）を含む場合、特定のアミノ酸配列「から本質的になる」。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸はもちろん、天然に存在するアミノ酸と同じように機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物も指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによってコードされたもの、ならびに後で修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメートおよびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を有する化合物、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基と結合しているα−炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持するが、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有する。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じように機能する、化合物を指す。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「変異」は、参照または野生型核酸分子またはポリペプチド分子とそれぞれ比較したときの核酸分子またはポリペプチド分子の配列の変化を指す。変異は、ヌクレオチド（複数可）またはアミノ酸（複数可）の置換、挿入または欠失を含む、配列のいくつかの異なるタイプの変化をもたらすことができる。
【００３８】
「保存的置換」は、特定のタンパク質の結合特性に有意な影響を与えない、または特定のタンパク質の結合特性を有意に変化させない、アミノ酸置換を指す。一般に、保存的置換は、置換されるアミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられることである。保存的置換は、次の群のうちの１つの中で見いだされる置換を含む：第１群：アラニン（ＡｌａまたはＡ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）；第２群：アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＺ）；第３群：アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）；第４群：アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）；第５群：イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）；および第６群：フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）。加えてまたは代替的に、アミノ酸は、類似した機能、化学構造または組成（例えば、酸性、塩基性、脂肪族、芳香族、もしくは硫黄含有）により、保存的置換群に分類することができる。例えば、脂肪族分類は、置換を目的として、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅを含み得る。他の保存的置換群は、硫黄含有：Ｍｅｔおよびシステイン（ＣｙｓまたはＣ）；酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、およびＧｌｎ；小さい脂肪族、非極性または微極性残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＧｌｙ；極性、負荷電残基およびそれらのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、およびＧｌｎ；極性、正荷電残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、およびＬｙｓ；大きい脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、およびＣｙｓ；ならびに大きい芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐを含む。追加情報は、Creighton  (1984)  Proteins,  W.H.Freeman  and  Companyにおいて見つけることができる。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「タンパク質」または「ポリペプチド」は、アミノ酸残基のポリマーを指す。タンパク質は、天然に存在するアミノ酸ポリマーにはもちろん、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学的模倣物である、アミノ酸ポリマー、および天然に存在しないアミノ酸ポリマーにも当てはまる。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」は、単一鎖内に少なくとも２つの明確に異なるドメインを有するタンパク質であって、自然には前記ドメインが一緒にタンパク質内に見られないタンパク質を指す。融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＰＣＲを使用して構築されること、組換え操作されることなどがあり、またはそのような融合タンパク質を合成することができる。融合タンパク質は、タグ、リンカーまたは形質導入マーカーなどの、他の成分をさらに含有することができる。ある特定の実施形態では、宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）により発現または産生される融合タンパク質は、細胞表面に位置し、前記融合タンパク質は、細胞膜に（例えば、膜貫通ドメインによって）繋留されており、細胞外部分（例えば、結合ドメインを含有する）および細胞内部分（例えば、シグナル伝達ドメイン、エフェクタードメイン、共刺激ドメインまたはそれらの組合せを含有する）を含む。
【００４１】
「核酸分子」または「ポリヌクレオチド」は、天然サブユニット（例えば、プリンもしくはピリミジン塩基）または非天然サブユニット（例えば、モルホリン環）で構成され得る、共有結合的に連結されているヌクレオチドを含むポリマー化合物を指す。プリン塩基は、アデニン、グアニン、ヒポキサンチンおよびキサンチンを含み、ピリミジン塩基は、ウラシル、チミンおよびシトシンを含む。核酸分子は、ポリリボ核酸（ＲＮＡ）、ポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）（これは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを含む）を含み、これらはいずれも、一本鎖であってもよく、または二本鎖であってもよい。一本鎖の場合、核酸分子は、コード鎖または非コード鎖（アンチセンス鎖）であり得る。アミノ酸配列をコードする核酸分子は、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。ヌクレオチド配列の一部のバージョンは、イントロンが同時転写機構または転写後機構によって除去されることになる場合には、イントロンも含むことができる。言い換えると、異なるヌクレオチド配列が、遺伝コードの重複性もしくは縮重の結果として、またはスプライシングにより、同じアミノ酸配列をコードすることもある。
【００４２】
本開示の核酸分子のバリアントも企図される。バリアント核酸分子は、本明細書に記載の被定義もしくは参照ポリヌクレオチドの核酸分子と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％同一、好ましくは、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．９％同一であるか、または約６５〜６８℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、もしくは約４２℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムおよび５０％ホルムアミドというストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でポリヌクレオチドとハイブリダイズするものである。核酸分子バリアントは、標的分子に特異的に結合することなどの本明細書に記載される機能性を有する融合タンパク質またはその結合ドメインをコードする能力を保持する。
【００４３】
「配列同一性パーセント」は、配列を比較することにより決定されるような、２つまたはそれより多くの配列の間の関係を指す。配列同一性を決定する好ましい方法は、比較されることになる配列間のベストマッチをもたらすように設計される。例えば、配列は、最適な比較のためにアラインメントされる（例えば、最適なアラインメントのためにギャップを第１および第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方に導入することができる）。さらに、非相同配列は、比較のために無視されることもある。本明細書で言及される配列同一性パーセントは、別段の指示がない限り、参照配列の長さにわたって計算される。配列同一性および類似性を決定する方法は、公開されているコンピュータプログラムの中で見つけることができる。配列アラインメントおよび同一性パーセント計算は、ＢＬＡＳＴプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ  ２．０、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、またはＢＬＡＳＴＸ）を使用して行うことができる。ＢＬＡＳＴプログラムで使用される数学的アルゴリズムは、Altschul  et  al.,  Nucleic  Acids  Res.25:3389-3402,  1997において見つけることができる。本開示に関して、配列分析ソフトウェアが分析に使用される場合、分析結果が、言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づくことは、理解されるであろう。「デフォルト値」は、初回開始時にソフトウェアに元々ロードされている値またはパラメーターの任意のセットを意味する。
【００４４】
用語「単離された」は、材料がその元の環境（例えば、その材料が天然に存在する場合には天然環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生存動物に天然に存在する核酸またはポリペプチドは、単離されていないが、天然の系内に共存する材料の一部または全てから分離された同じ核酸またはポリペプチドは、単離されている。そのような核酸は、ベクターの一部であることもあり、および／またはそのような核酸もしくはポリペプチドは、組成物（例えば、細胞溶解物）の一部であることもあるが、それでもやはり、そのようなベクターもしくは組成物が核酸もしくはポリペプチドの天然環境の一部でないという点で単離されていることであり得る。用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントを意味し、このセグメントには、コード領域の前および後の領域（「リーダーおよびトレーラー」）ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）が含まれる。
【００４５】
「機能的バリアント」は、本開示の親または参照化合物と構造的に同様であるまたは実質的に構造的に同様であるが、わずかに組成が異なる（例えば、１つの塩基、原子または官能基が異なる、付加されている、または除去されている）、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドであって、したがって、ポリペプチドまたはコードされたポリペプチドが、コードされた親ポリペプチドの少なくとも１つの機能を、その親ポリペプチドの活性の少なくとも５０％の効率、好ましくは、少なくとも５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％の活性レベルで行うことができる、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指す。言い換えると、本開示のポリペプチドまたはコードされたポリペプチドの機能的バリアントは、結合親和性を測定するためのアッセイ（例えば、会合（Ｋａ）または解離（ＫＤ）定数を測定する、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）またはテトラマー染色）などの、選択されたアッセイにおいて、親または参照ポリペプチドと比較して性能の５０％を超える低下を示さない場合、「同様の結合」、「同様の親和性」または「同様の活性」を有する。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「機能的部分」または「機能的断片」は、親または参照化合物のドメイン、部分または断片のみを含む、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指し、このポリペプチドまたはコードされたポリペプチドは、親もしくは参照化合物のドメイン、部分もしくは断片に関連する少なくとも５０％の活性、好ましくは、親ポリペプチドの少なくとも５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、もしくは１００％の活性レベルを保持するか、または生物学的利益（例えば、エフェクター機能）を提供する。本開示のポリペプチドまたはコードされたポリペプチドの「機能的部分」または「機能的断片」は、その機能的部分または断片が、結合親和性を測定するためのアッセイまたはエフェクター機能（例えば、サイトカイン放出）を測定するためのアッセイなどの、選択されたアッセイにおいて、親または参照ペプチドと比較して５０％を超える性能の低下を示さない場合（好ましくは、親和性に関して親または参照物と比較して２０％もしくは１０％以下または対数差分以下）、「同様の結合」または「同様の活性」を有する。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「異種」または「非内在性」または「外因性」は、宿主細胞もしくは対象にとってネイティブでない任意の遺伝子、タンパク質、化合物、核酸分子もしくは活性、または変更された宿主細胞もしくは対象にとってネイティブの任意の遺伝子、タンパク質、化合物、核酸分子もしくは活性を指す。異種、非内在性、または外因性は、構造、活性、または両方が、ネイティブ遺伝子、タンパク質、化合物または核酸分子と変更された遺伝子、タンパク質、化合物または核酸分子との間で異なるように変異または別様に変更された、遺伝子、タンパク質、化合物または核酸分子を含む。ある特定の実施形態では、異種、非内在性または外因性遺伝子、タンパク質、または核酸分子（例えば、受容体、リガンドなど）は、宿主細胞にとっても対象にとっても内在性でないことがあり、その代わり、そのような遺伝子、タンパク質または核酸分子をコードする核酸をコンジュゲーション、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーションなどにより宿主細胞に付加することができ、付加された核酸分子は、宿主細胞ゲノムに組み込まれることがあり、または染色体外遺伝物質として（例えば、プラスミドもしくは他の自己複製ベクターとして）存在することができる。用語「相同（の）」または「相同体」は、宿主細胞、種もしくは株に見られる、または宿主細胞、種もしくは株から得られる、遺伝子、タンパク質、化合物、核酸分子または活性を指す。例えば、ポリペプチドをコードする異種または外因性ポリヌクレオチドまたは遺伝子は、ネイティブポリヌクレオチドまたは遺伝子と相同であることがあり、相同ポリペプチドまたは相同の活性をコードすることがあるが、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、変更された構造、配列、発現レベル、またはそれらの任意の組合せを有することもある。非内在性ポリヌクレオチドまたは遺伝子はもちろん、コードされたポリペプチドまたは活性も、同じ種からのものであることがあり、異なる種からのものであることがあり、またはそれらの組合せからのものであることがある。
【００４８】
本明細書で使用される場合、用語「内在性」または「ネイティブ」は、宿主細胞中または対象体内に通常存在するポリヌクレオチド、遺伝子、タンパク質、化合物、分子、または活性を指す。
【００４９】
用語「発現」は、本明細書で使用される場合、ポリペプチドが、遺伝子などの核酸分子のコード配列に基づいて産生されるプロセスを指す。このプロセスは、転写、転写後制御、転写後修飾、翻訳、翻訳後制御、翻訳後修飾、またはそれらの任意の組合せを含み得る。発現された核酸分子は、通常は、発現制御配列（例えば、プロモーター）に作動可能に連結されている。
【００５０】
用語「作動可能に連結された」は、１つの核酸分子の機能が他の核酸分子による影響を受けるような、単一核酸断片上の２つまたはそれより多くの核酸分子の会合を指す。例えば、プロモーターとコード配列は、プロモーターが、そのコード配列の発現に影響を与えることができる（すなわち、コード配列が、プロモーターの転写制御下にある）場合、作動可能に連結されている。「連結されていない」は、会合している遺伝子エレメントが、互いに密接に会合しておらず、１つの遺伝子エレメントの機能が他の遺伝子エレメントに影響を与えないことを意味する。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「発現ベクター」は、好適な宿主において核酸分子の発現を生じさせることができる好適な制御配列に作動可能に連結されている核酸分子を含有するＤＮＡ構築物を指す。そのような制御配列には、転写を生じさせるプロモーター、そのような転写を制御するための必要に応じたオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列が含まれる。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、ウイルス、または単に潜在的ゲノム挿入物であり得る。好適な宿主に形質転換されると、ベクターは、宿主ゲノムから独立して複製および機能することができ、または一部の場合には、自体を宿主細胞のゲノムに組み込むことができる。本明細書では、「プラスミド」、「発現プラスミド」、「ウイルス」および「ベクター」は、同義で使用されることが多い。
【００５２】
核酸分子を細胞に挿入する文脈での用語「導入される／された」は、「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」を意味し、核酸分子を細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチドまたはミトコンドリアＤＮＡ）に組み込むことができる、自律レプリコンに変換することができる、または（例えば、トランスフェクトされたｍＲＮＡを）一過性に発現することができる、真核または原核細胞への核酸分子の組込みへの言及を含む。本明細書で使用される場合、用語「操作された」、「組換え（の）」または「非天然（の）」は、少なくとも１つの遺伝子変更を含むかもしくは外因性核酸分子の導入により改変された生物、少なくとも１つの遺伝子変更を含むかもしくは外因性核酸分子の導入により改変された微生物、少なくとも１つの遺伝子変更を含むかもしくは外因性核酸分子の導入により改変された細胞、少なくとも１つの遺伝子変更を含むかもしくは外因性核酸分子の導入により修飾された核酸分子、または少なくとも１つの遺伝子変更を含むかもしくは外因性核酸分子の導入により修飾されたベクターであって、そのような変更または改変／修飾が、遺伝子操作（すなわち、人間の介入）により導入される、生物、微生物、細胞、核酸分子またはベクターを指す。遺伝子変更は、例えば、タンパク質、融合タンパク質もしくは酵素をコードする発現可能な核酸分子を導入する修飾、または他の核酸分子付加、欠失、置換、または細胞の遺伝物質の他の機能破壊を含む。追加の修飾は、例えば、修飾がポリヌクレオチド、遺伝子またはオペロンの発現を変更する、非コード調節領域を含む。
【００５３】
本明細書に記載されるように、１つより多くの異種核酸分子を、別々の核酸分子として、複数の個々に制御された遺伝子として、ポリシストロニック核酸分子として、融合タンパク質をコードする単一の核酸分子として、またはそれらの任意の組合せとして、宿主細胞に導入することができる。２つまたはそれより多くの異種核酸分子が宿主細胞に導入される場合、これら２つまたはそれより多くの異種核酸分子が、単一の核酸分子として（例えば、単一のベクターで）導入されることもあり、別々のベクターで宿主染色体の単一の部位もしくは複数の部位に組み込まれることもあり、またはそれらの任意の組合せであることもあることは理解される。言及された異種核酸分子またはタンパク質活性の数は、コードする核酸分子の数またはタンパク質活性の数を指し、宿主細胞に導入される別々の核酸分子の数を指さない。
【００５４】
用語「構築物」は、組換え核酸分子を含有する任意のポリヌクレオチドを指す。構築物は、ベクター（例えば、細菌ベクター、ウイルスベクター）中に存在することもあり、またはゲノムに組み込まれていることもある。「ベクター」は、別の核酸分子を輸送することができる核酸分子である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、ＲＮＡベクターであることもあり、または染色体の、非染色体の、半合成のもしくは合成の核酸分子を含み得る線状もしくは環状ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子であることもある。本開示のベクターは、トランスポゾン系（例えば、スリーピング・ビューティー、例えば、Geurts  et  al.,  Mol.Ther.8:108,  2003:  Mates  et  al.,  Nat.  Genet.  41:753,  2009を参照されたい）も含み得る。例示的なベクターは、自律複製することができるもの（エピソームベクター）、ポリヌクレオチドを細胞ゲノムに送達することができるもの（例えば、ウイルスベクター）、または自体が連結されている核酸分子を発現させることができるもの（発現ベクター）である。
【００５５】
本明細書で使用される場合、用語「宿主」は、目的のポリペプチド（例えば、本開示の融合タンパク質）を産生するために異種核酸分子での遺伝子修飾の標的とされる細胞（例えば、Ｔ細胞）または微生物を指す。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、例えば異種タンパク質の生合成に関係するまたは関係しない所望の特性を付与する他の遺伝子修飾（例えば、検出可能なマーカーの組み入れ；内在性ＴＣＲの欠失、変更もしくは短縮化；または共刺激因子発現の増加）を、必要に応じて、既に有することもあり、または含むように修飾されることもある。
【００５６】
本明細書で使用される場合、混合物中の細胞型の量に関して「濃縮された／される」または「枯渇された／される」は、１つまたは複数の濃縮または枯渇プロセスまたはステップの結果として生じる、細胞の混合物中の「濃縮」型の数の増加、「枯渇」細胞の数の減少、または両方を指す。したがって、濃縮プロセスに供された細胞の元となる集団の供給源に依存して、混合物または組成物は、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のもしくはそれを超える（数または計数値の点で）、「濃縮された」細胞を含有し得る。枯渇プロセスに供された細胞は、結果として、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％パーセントもしくはそれ未満（数または計数値の点で）の「枯渇された」細胞を含有する混合物または組成物になる。ある特定の実施形態では、混合物中のある特定の細胞型の量が濃縮されることになり、異なる細胞型の量が枯渇されることになる；例えば、ＣＤ４＋細胞の濃縮と同時にＣＤ８＋細胞を枯渇させること、またはＣＤ６２Ｌ＋細胞の濃縮と同時にＣＤ６２Ｌ−細胞を枯渇させること、またはそれらの組合せ。
【００５７】
「Ｔ細胞受容体」（ＴＣＲ）とは、ＭＨＣ受容体に結合した抗原ペプチドと特異的に結合することができる免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー（可変結合ドメイン、定常ドメイン、膜貫通領域および短い細胞質側テールを有する；例えば、Janeway  et  al.,  Immunobiology:  The  Immune  System  in  Health  and  Disease,  3rd  Ed.,  Current  Biology  Publications,  p.  4:33,  1997を参照されたい）を指す。ＴＣＲは、細胞の表面にまたは可溶性形態で見られることがあり、一般に、α鎖およびβ鎖（それぞれ、ＴＣＲαおよびＴＣＲβとしても公知）、またはγ鎖およびδ鎖（それぞれ、ＴＣＲγおよびＴＣＲδとしても公知）を有するヘテロダイマーから構成される。免疫グロブリンと同様に、ＴＣＲ鎖（例えば、α鎖、β鎖）の細胞外部分は、次の２つの免疫グロブリンドメインを含む：Ｎ末端における可変ドメイン（例えば、α鎖可変ドメインまたはＶα、β鎖可変ドメインまたはＶβ；通常は、Ｋａｂａｔ番号付け（Kabat  et  al.,  "Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest,  US  Dept.  Health  and  Human  Services,  Public  Health  Service  National  Institutes  of  Health,  1991,  5th  ed.）に基づいてアミノ酸１〜１１６）、および細胞膜に隣接した１つの定常ドメイン（例えば、α鎖定常ドメインまたはＣα、通常はＫａｂａｔに基づいてアミノ酸１１７〜２５９、β鎖定常ドメインまたはＣβ、通常はＫａｂａｔに基づいてアミノ酸１１７〜２９５）。また、免疫グロブリンと同様に、可変ドメインは、フレームワーク領域（ＦＲ）によって隔てられた相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む（例えば、Jores  et  al.,  Proc.  Nat'l  Acad.  Sci.U.S.A.87:9138,  1990;  Chothia  et  al.,  EMBO  J.  7:3745,  1988を参照されたく、Lefranc  et  al.,  Dev.Comp.Immunol.27:55,  2003も参照されたい）。ある特定の実施形態では、ＴＣＲは、Ｔ細胞（またはＴリンパ球）の表面に見られ、ＣＤ３複合体と会合している。本開示で使用される場合のＴＣＲの供給源は、様々な動物種、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギまたは他の哺乳動物からのものであり得る。
【００５８】
「ＣＤ３」は、６つの鎖の多タンパク質複合体として当技術分野において公知である（Abbas  and  Lichtman,  2003;  Janeway  et  al.,  p.  172  and  178,  1999を参照されたい）。哺乳動物では、この複合体は、１つのＣＤ３γ鎖と、１つのＣＤ３δ鎖と、２つのＣＤ３ε鎖と、ＣＤ３ζ鎖の１つのホモダイマーとを含む。ＣＤ３γ、ＣＤ３δおよびＣＤ３ε鎖は、単一の免疫グロブリンドメインを含有する、免疫グロブリンスーパーファミリーの高度に関連する細胞表面タンパク質である。ＣＤ３γ、ＣＤ３δおよびＣＤ３ε鎖の膜貫通領域は負に荷電しており、これは、これらの鎖の正荷電Ｔ細胞受容体鎖との会合を可能にする特性である。ＣＤ３γ、ＣＤ３δおよびＣＤ３ε鎖の細胞内テールは、各々、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして公知の単一の保存モチーフを含むが、各ＣＤ３ζ鎖は、３つのＩＴＡＭを有する。理論により拘束されることを望まないが、ＩＴＡＭは、ＴＣＲ複合体のシグナル伝達能にとって重要であると考えられる。本開示で使用される場合のＣＤ３は、ヒト、マウス、ラットまたは他の哺乳動物を含む様々な動物種からのものであり得る。
【００５９】
「主要組織適合遺伝子複合体分子」（ＭＨＣ分子）は、ペプチド抗原を細胞表面に送達する糖タンパク質を指す。ＭＨＣクラスＩ分子は、膜通過α鎖（３つのαドメインを有する）と非共有結合的に会合しているβ２ミクログロブリンとからなるヘテロダイマーである。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、２つの膜貫通糖タンパク質、αおよびβ、で構成されており、これらの両方が膜にまたがっている。各鎖は、２つのドメインを有する。ＭＨＣクラスＩ分子は、サイトゾルに由来するペプチドを細胞表面に送達し、そこでペプチド：ＭＨＣ複合体は、ＣＤ８＋Ｔ細胞により認識される。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、小胞系に由来するペプチドを細胞表面に送達し、そこで、それらは、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって認識される。ＭＨＣ分子は、ヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ヤギ、ウマまたは他の哺乳動物を含む、様々な動物種からのものであり得る。
【００６０】
「ＣＤ４」は、ＴＣＲの抗原提示細胞との通信を補助する免疫グロブリン共受容体糖タンパク質を指す（Campbell  &  Reece,  Biology  909  (Benjamin  Cummings,  Sixth  Ed.,  2002)；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｐ０１７３０を参照されたい）。ＣＤ４は、免疫細胞、例えば、Ｔヘルパー細胞、単球、マクロファージおよび樹状細胞の表面に見られ、前記細胞表面で発現される４つの免疫グロブリンドメイン（Ｄ１〜Ｄ４）を含む。抗原提示中に、ＣＤ４は、ＴＣＲ複合体とともに動員されて、ＭＨＣＩＩ分子の異なる領域と結合する（ＣＤ４はＭＨＣＩＩ  β２に結合し、その一方でＴＣＲ複合体はＭＨＣＩＩ  α１／β１に結合する）。理論により拘束されることを望まないが、ＴＣＲ複合体への近接は、ＣＤ４会合キナーゼ分子によるＣＤ３の細胞質ドメインに存在する免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）のリン酸化を可能にすると考えられる。この活性は、活性化されたＴＣＲにより生成されるシグナルを増幅して様々なタイプのＴヘルパー細胞を産生すると考えられる。
【００６１】
本明細書で使用される場合、用語「ＣＤ８共受容体」または「ＣＤ８」は、アルファ・アルファホモダイマーまたはアルファ・ベータヘテロダイマーのどちらかとしての、細胞表面糖タンパク質ＣＤ８を意味する。ＣＤ８共受容体は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋）の機能を補助し、その細胞質チロシンリン酸化経路経由でのシグナル伝達によって機能する（Gao  and  Jakobsen,  Immunol.Today  21:630-636,  2000;  Cole  and  Gao,  Cell.  Mol.Immunol.1:81-88,  2004）。ヒトの場合、五（５）つの異なるＣＤ８ベータ鎖（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ識別子Ｐ１０９６６を参照されたい）および単一のＣＤ８アルファ鎖（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ識別子Ｐ０１７３２を参照されたい）がある。
【００６２】
「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）は、天然に存在しないまたは宿主細胞に天然に存在しない方法で互いに連結された２つまたはそれより多くの天然に存在するアミノ酸配列を含有するように操作された、本開示の融合タンパク質であって、細胞の表面に存在するときに受容体として機能することができる融合タンパク質を指す。本開示のＣＡＲは、膜貫通ドメインおよび１つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインに連結されている、抗原結合ドメイン（すなわち、免疫グロブリンもしくは免疫グロブリン様分子から得られるもしくは誘導される抗原結合ドメイン、例えば、がん抗原に特異的な抗体もしくはＴＣＲから誘導されるｓｃＦｖもしくはｓｃＴＣＲ、またはＮＫ細胞からのキラー免疫受容体から誘導されるもしくは得られる抗原結合ドメイン）を含む（必要に応じて共刺激ドメインを含有する）細胞外部分を含む（例えば、Sadelain  et  al.,  Cancer  Discov.,  3(4):388  (2013)を参照されたく、Harris  and  Kranz,  Trends  Pharmacol.Sci.,  37(3):220  (2016);  Stone  et  al.,  Cancer  Immunol.Immunother.,  63(11):1163(2014)も参照されたい）。ある特定の実施形態では、結合タンパク質は、抗原特異的ＴＣＲ結合ドメインを含むＣＡＲを含む（例えば、Walseng  et  al.,  Scientific  Reports  7:10713,  2017を参照されたい；この参考文献のＴＣＲ  ＣＡＲ構築物および方法は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００６３】
用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗原への結合に関与する、ＴＣＲα鎖もしくはβ鎖（もしくはγδＴＣＲについてはγ鎖およびδ鎖）の、または抗体重鎖もしくは軽鎖の、ドメインを指す。ネイティブＴＣＲのα鎖およびβ鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶαおよびＶβ）は、類似の構造を一般に有し、一般に、各ドメインが４つの保存フレームワーク領域（ＦＲ）および３つのＣＤＲを含む。抗体重（ＶＨ）および軽（ＶＬ）鎖の可変ドメイン各々は、４つの一般に保存されるフレームワーク領域（ＦＲ）および３つのＣＤＲも、一般に含む。
【００６４】
用語「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」は、「超可変領域」または「ＨＶＲ」と同義であり、抗原特異性および／または結合親和性を付与するＴＣＲまたは抗体可変領域内のアミノ酸の非連続配列を指すことは当技術分野において公知である。一般に、各可変領域に３つのＣＤＲ（すなわち、ＴＣＲα鎖およびβ鎖可変領域の各々に３つのＣＤＲ；抗体重鎖および軽鎖可変領域の各々に３つのＣＤＲ）がある。ＴＣＲの場合、ＣＤＲ３は、プロセシングされた抗原の認識を担う主要ＣＤＲであると考えられる。ＣＤＲ１およびＣＤＲ２は、主としてＭＨＣと相互作用する。可変ドメイン配列を番号付けスキーム（例えば、Kabat,  EU,  International  Immunogenetics  Information  System  (IMGT)  and  Aho）に合わせてアラインメントすることができ、これにより、Ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  Ａｎｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＡＮＡＲＣＩ）ソフトウェアツール（2016,  Bioinformatics  15:298-300）を使用する、等価残基位置へのアノテーションの付与および異なる分子の比較が可能になり得る。
【００６５】
本明細書で使用される場合の「抗原」または「Ａｇ」は、免疫応答を誘発する免疫原性分子を指す。この免疫応答は、抗体産生、特定の免疫適格細胞（例えば、Ｔ細胞）の活性化、または両方に関与し得る。抗原（免疫原性分子）は、例えば、ペプチド、糖ペプチド、ポリペプチド、糖ポリペプチド、ポリヌクレオチド、多糖、脂質などであり得る。抗原を合成、組換えにより産生、または生体試料から得ることができることは、容易に分かる。１つまたは複数の抗原を含有することができる例示的な生体試料としては、組織試料、腫瘍試料、細胞、生体液、またはそれらの組合せが挙げられる。抗原は、抗原を発現するように改変されたまたは遺伝子操作された細胞によって産生され得る。
【００６６】
用語「エピトープ」または「抗原エピトープ」は、免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体または他の結合分子、ドメインもしくはタンパク質などの、同族結合分子により認識され、特異的に結合される、任意の分子、構造、アミノ酸配列またはタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、一般に、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的活性表面集団を含有し、特異的三次元構造特性および特異的電荷特性を有することができる。
【００６７】
「処置する」または「処置」または「改善する」は、対象（例えば、ヒト、または非ヒト動物、例えば、霊長類、ウマ、ネコ、イヌ、ヤギ、マウスもしくはラット）の疾患、障害または状態の医学的管理を指す。一般に、本開示の融合タンパク質を発現する宿主細胞と、必要に応じてアジュバントとを含む、適切な用量および処置レジメンは、治療的または予防的恩恵を生じさせるのに十分な量で投与される。治療的または予防的／防止的恩恵は、臨床成績の向上；疾患（例えば、Ｂ細胞無形成症）に関連する症状の緩和もしくは軽減；症状の発生率低下；生活の質向上；より長い無病状態；疾患の程度の低下；病状の安定化；疾患進行の遅延；寛解；生存；生存期間延長；またはそれらの任意の組合せを含む。
【００６８】
本開示の融合タンパク質または融合タンパク質を発現する宿主細胞の「治療有効量」または「有効量」は、統計的に有意な形での、臨床成績の向上；疾患に関連する症状の緩和もしくは軽減；症状の発生率低下；生活の質向上；より長い無病状態；疾患の程度の低下；病状の安定化；疾患進行の遅延；寛解；生存；または生存期間延長を含む、治療効果をもたらすのに十分な、融合タンパク質または宿主細胞の量を指す。単独で投与される個々の活性成分または単一活性成分を発現する細胞に言及する場合、治療有効量は、単独でのその成分のまたはその成分を発現する細胞の効果を指す。組合せに言及する場合、治療有効量は、活性成分の合計量、または活性成分を発現する細胞と合わせた補助活性成分の合計量であって、順次投与されるのか並行して投与されるのかを問わず、治療効果を生じさせる結果となる合計量を指す。組合せはまた、ｓｔｒｅｐタグペプチド（例えば、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むか、もしくは配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなる）に特異的に結合する２つの異なる融合タンパク質（例えば、ＣＡＲ）などの、１つより多くの活性成分を発現する細胞であることもあり、または本開示の１つの融合タンパク質であることもある。
【００６９】
用語「薬学的に許容される賦形剤または担体」または「生理的に許容される賦形剤または担体」は、ヒトまたは他の非ヒト哺乳動物対象への投与に好適であり、一般に、安全であるまたは重篤な有害事象を引き起こさないと認識されている、本明細書中でより詳細に説明される生体適合性ビヒクル、例えば、生理食塩水を指す。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「統計的に有意な」は、スチューデントｔ検定を使用して計算されたときの０．０５０またはそれ未満のｐ値を指し、測定される特定の事象または結果が偶然に生じた可能性が低いことを示す。
【００７１】
本明細書で使用される場合、用語「養子免疫療法」または「養子免疫治療」は、天然に存在する、または遺伝子操作された、疾患抗原特異的免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の投与を指す。養子細胞免疫治療は、自己（免疫細胞がレシピエントからのものである）、同種異系（免疫細胞が、同じ種のドナーからのものである）、または同系（免疫細胞が、レシピエントと遺伝的に同一のドナーからのものである）であり得る。
【００７２】
「標的アブレーション」は、本明細書で使用される場合、標的細胞（例えば、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有するタグペプチドを発現する細胞）を（例えば、アポトーシスの誘導、溶解、貪食、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）もしくは抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）により、または別の機構により）選択的に殺滅することを指す。本明細書に記載されるとおり、本開示の融合タンパク質を発現する宿主細胞は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有するタグペプチドを発現する標的細胞を他の細胞より選択的に（すなわち、特異的にまたは優先的に）標的とし、標的細胞への結合が、標的（すなわち、タグ付き）細胞をアブレーションする標的化免疫応答を誘導する。
【００７３】
今般開示される実施形態のいずれにおいても、融合タンパク質またはその結合ドメインは、ｓｔｒｅｐタグペプチドと特異的に結合することができる。本明細書で使用される場合、用語「ｓｔｒｅｐタグペプチド」は、ストレプトアビジン（これは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉから精製されたテトラマータンパク質であり、ビオチンに対するその高度な親和性のため分子生物学プロトコールにおいて広く使用されている）と、またはストレプトアビジンの操作された変異タンパク質であるストレプタクチンと、特異的に結合することができるペプチドを指す。本開示の例示的なｓｔｒｅｐタグペプチドは、ストレプトアビジンまたはストレプタクチンへの結合についてビオチンと競合し、例えば、オリジナルＳｔｒｅｐ（登録商標）タグ（ＷＲＨＰＱＦＧＧ、配列番号４８）、Ｓｔｒｅｐ（登録商標）タグＩＩ（本明細書では「ＳＴＩＩ」とも呼ばれ、これは、オリジナルＳｔｒｅｐ−Ｔａｇ（登録商標）の最適化バージョンであり、アミノ酸配列ＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１９）からなる）およびそれらのバリアントを含み、前記バリアントには、例えば、Schmidt  and  Skerra,  Nature  Protocols,  2:1528-1535  (2007)、米国特許第７，９８１，６３２号およびＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１５／０６７７６８において開示されているものが含まれ、これらのｓｔｒｅｐタグペプチド、ｓｔｒｅｐタグペプチド含有ポリペプチド、およびそれらの配列は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７４】
融合タンパク質
ある特定の態様では、本開示は、（ａ）ｓｔｒｅｐタグペプチドと特異的に結合する結合ドメインを含む細胞外成分；（ｂ）エフェクタードメインまたはその機能的部分を含む細胞内成分；および（ｃ）前記細胞外成分と前記細胞内成分を接続する膜貫通ドメインを含む、融合タンパク質を提供する。
【００７５】
ある特定の実施形態では、ｓｔｒｅｐタグペプチドは、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなる。
【００７６】
「結合ドメイン」（「結合領域」または「結合部分構造」とも呼ばれる）は、本明細書で使用される場合、標的（例えば、配列番号１９で示されるアミノ酸配列を含むペプチド）と特異的かつ非共有結合的に会合、一体化または化合する能力を有する分子またはその一部分（例えば、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質（例えば、融合タンパク質））を指す。結合ドメインは、生体分子、分子複合体（すなわち、２つもしくはそれより多くの生体分子を含む複合体）または目的の他の標的に対する、任意の天然に存在する、合成の、半合成の、または組換えにより産生された結合パートナーを含む。例示的な結合ドメインとしては、単鎖免疫グロブリン可変領域（例えば、ｓｃＴＣＲ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ＴＣＲ可変領域）、受容体細胞外ドメイン、リガンド（例えば、サイトカイン、ケモカイン）、または合成ポリペプチドであって、生体分子、分子複合体もしくは目的の他の標的と結合するそれらの特異的能力のために選択される合成ポリペプチドが挙げられる。ある特定の実施形態では、結合ドメインは、ｓｃＦｖ、ｓｃＴＣＲ、またはリガンドである。ある特定の実施形態では、結合ドメインは、キメラ、ヒトであるか、またはヒト化されている。
【００７７】
一部の実施形態では、結合ドメインは、（ａ）配列番号２２、２８もしくは３４、または１〜３つのアミノ酸置換および／または欠失を有する配列番号２２、２８もしくは３４のバリアントのいずれか１つで示される重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列と、（ｂ）配列番号２３、２９もしくは３５、または１〜３つのアミノ酸置換および／または欠失を有する配列番号２３、２９もしくは３５のバリアントのいずれか１つで示される重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列と、（ｃ）配列番号２４、３０もしくは３６、または１〜３つのアミノ酸置換および／または欠失を有する配列番号２４、３０もしくは３６のバリアントのいずれか１つで示される重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列とを含む。
【００７８】
ある特定の実施形態では、結合ドメインは、（ａ）配列番号２５、３１もしくは３７、または１〜３つのアミノ酸置換および／または欠失を有する配列番号２５、３１もしくは３７のバリアントのいずれか１つで示される軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列と、（ｂ）配列番号２６、３２もしくは３８、または１〜２つのアミノ酸置換および／または欠失を有する配列番号２６、３２もしくは３８のバリアントのいずれか１つで示される軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列と、（ｃ）配列番号２７、３３もしくは３９、または１〜３つのアミノ酸置換および／または欠失を有する配列番号２７、３３もしくは３９のバリアントのいずれか１つで示される軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列とを含む。
【００７９】
今般開示される実施形態のいずれにおいても、結合ドメインは、５Ｇ２抗体、３Ｅ８抗体、４Ｅ２抗体、３Ｃ９抗体、または４Ｃ４抗体からのＣＤＲ配列を含み得る。
【００８０】
一部の実施形態では、結合ドメインは、（ａ）配列番号２８に示される重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、（ｂ）配列番号２９に示される重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、（ｃ）配列番号３０に示される重鎖ＣＤＲ３酸配列、（ｄ）配列番号３１に示される軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、（ｅ）配列番号３２に示される軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、および（ｅ）配列番号３３に示される軽鎖ＣＤＲ３酸配列を含む。
【００８１】
他の実施形態では、結合ドメインは、（ａ）配列番号２２に示される重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、（ｂ）配列番号２３に示される重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、（ｃ）配列番号２４に示される重鎖ＣＤＲ３酸配列、（ｄ）配列番号２５に示される軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、（ｅ）配列番号２６に示される軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、および（ｅ）配列番号２７に示される軽鎖ＣＤＲ３酸配列を含む。さらに他の実施形態では、結合ドメインは、（ａ）配列番号３４に示される重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、（ｂ）配列番号３５に示される重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、（ｃ）配列番号３６に示される重鎖ＣＤＲ３酸配列、（ｄ）配列番号３７に示される軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、（ｅ）配列番号３８に示される軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、および（ｅ）配列番号３９に示される軽鎖ＣＤＲ３酸配列を含む。
【００８２】
さらに他の実施形態では、本開示の結合ドメインは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１５／０６７７６８において開示されているような「Ｃ２３．２１」抗体のＣＤＲおよび、必要に応じて、ＶＨおよびＶＬ配列を含み、このＣＤＲ、ＶＨおよびＶＬ配列は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８３】
本開示の結合ドメインを得ることまたは誘導することができる追加の抗体は、Ａｂｃａｍ（登録商標）から市販されている「Ａｎｔｉ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩ抗体」（ａｂ７６９４９）；「ＳｔｒｅｐＭＡＢ−Ｉｍｍｏ」および「ＳｔｒｅｐＭＡＢ−Ｃｌａｓｓｉｃ」、両方とも、例えば、Schmidt  and  Skerra,  Nature  Protocols,  2:1528-1535  (2007)において開示されており、Ｉｂａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから市販されているもの；ならびにＳｔｒｅｐ−ｔａｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号３４８５０）を含む。これらの抗体のＣＤＲ、ＶＨおよびＶＬ配列もまた、参照により組み込まれる。
【００８４】
ある特定の実施形態では、結合ドメインは、ＶＨドメインとＶＬドメインとペプチドリンカーとを含むｓｃＦｖである。特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、ペプチドリンカーによりＶＬドメインに連結されたＶＨドメインを含み、これは、ＶＨ−リンカー−ＶＬ配向であることもあり、またはＶＬ−リンカー−ＶＨ配向であることもある。一部の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＶＨおよびＶＬドメインが３Ｅ８抗体、５Ｇ２抗体、４Ｅ２抗体、３Ｃ９抗体または４Ｃ４抗体のＶＨおよびＶＬドメインに基づく、ＶＨドメイン、ＶＬドメインおよびペプチドリンカーを含む。
【００８５】
他の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＶＨおよびＶＬドメインがＣ２３．２１抗体のＶＨおよびＶＬドメインに基づく、ＶＨドメイン、ＶＬドメインおよびペプチドリンカーを含む。
【００８６】
さらに他の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＶＨおよびＶＬドメインがＡｎｔｉ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩ抗体、ＳｔｒｅｐＭＡＢ−Ｉｍｍｏ、ＳｔｒｅｐＭＡＢ−ＣｌａｓｓｉｃもしくはＳｔｒｅｐ−ｔａｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙまたはそれらの任意の組合せのＶＨおよびＶＬドメインに基づく、ＶＨドメイン、ＶＬドメインおよびペプチドリンカーを含む。
【００８７】
さらなる実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号３、１０または１６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である軽鎖可変領域（ＶＬ）、および配列番号２、８または１４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。さらなる実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号３、１０もしくは１６に示されるアミノ酸配列を含むかまたは配列番号３、１０もしくは１６に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ、および配列番号２、８もしくは１４に示されるアミノ酸配列を含むかまたは配列番号２、８もしくは１４に示されるアミノ酸配列からなるＶＨを含む。追加の実施形態では、ｓｃＦｖは、（ａ）配列番号３のＶＬおよび配列番号２のＶＨ、（ｂ）配列番号１０のＶＬおよび配列番号８のＶＨ、または（ｃ）配列番号１６のＶＬおよび配列番号１４のＶＨを含む。本開示の任意のｓｃＦｖを、ＶＬドメインのＣ末端が短いペプチド配列によってＶＨドメインのＮ末端に連結される、または逆に、ＶＨドメインのＣ末端が、短いペプチド配列によってＶＬドメインのＮ末端に連結される（すなわち、（Ｎ）ＶＬ（Ｃ）−リンカー−（Ｎ）ＶＨ（Ｃ）、または（Ｎ）ＶＨ（Ｃ）−リンカー−（Ｎ）ＶＬ（Ｃ））ように、操作することができる。特定の実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号５、６、１１、１２、１７もしくは１８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むか、または配列番号５、６、１１、１２、１７もしくは１８のいずれか１つのアミノ酸配列からなる。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」または「に特異的な」は、試料中のいずれの他の分子または成分とも有意に会合も一体化もしない、１０５Ｍ−１に等しいかまたはそれより高い（これは、この会合反応についてのオンレート［Ｋｏｎ］のオフレート［Ｋｏｆｆ］に対する比に相当する）親和性またはＫａ（すなわち、単位が１／Ｍである、特定の結合相互作用の平衡会合定数）での、結合タンパク質（例えば、Ｔ細胞受容体もしくはキメラ抗原受容体）または結合ドメイン（もしくはその融合タンパク質）と標的分子（例えば、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むｓｔｒｅｐタグペプチド）の会合または一体化を指す。結合タンパク質または結合ドメイン（またはそれらの融合タンパク質）は、「高親和性」結合タンパク質もしくは結合ドメイン（もしくはそれらの融合タンパク質）として分類されることもあり、または「低親和性」結合タンパク質もしくは結合ドメイン（もしくはそれらの融合タンパク質）として分類されることもある。「高親和性」結合タンパク質または結合ドメインは、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、または少なくとも１０１３Ｍ−１のＫａを有する、結合タンパク質または結合ドメインを指す。「低親和性」結合タンパク質または結合ドメインは、最大で１０７Ｍ−１、最大で１０６Ｍ−１、または最大で１０５Ｍ−１のＫａを有する、結合タンパク質または結合ドメインを指す。あるいは、単位がＭである（例えば、１０−５Ｍ〜１０−１３Ｍ）、特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）として、親和性を定義することができる。
【００８９】
ある特定の実施形態では、受容体または結合ドメインは、「増強された親和性」を有することができ、この「増強された親和性」は、野生型（または親）結合ドメインよりも標的抗原と強く結合する、選択もしくは操作された受容体または結合ドメインを指す。例えば、増強された親和性は、野生型結合ドメインよりも高い標的抗原に対するＫａ（平衡会合定数）に起因することもあり、野生型結合ドメインのものより低い標的抗原に対するＫｄ（解離定数）に起因することもあり、野生型結合ドメインのものよりも低い標的抗原に対するオフレート（ｋｏｆｆ）に起因することもあり、またはそれらの組合せであることもある。ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、Ｔ細胞などの特定の宿主細胞における発現を増強するためにコドン最適化され得る（Scholten  et  al.,  Clin.Immunol.119:135,  2006）。
【００９０】
特定の標的に特異的に結合する本開示の結合ドメインを同定するための、および結合ドメインまたは融合タンパク質親和性を決定するための、様々なアッセイ、例えば、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、分析用超遠心分離、分光法および表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標））分析が、公知である（例えば、Scatchard  et  al.,  Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660,  1949;  Wilson,  Science  295:2103,  2002;  Wolff  et  al.,  Cancer  Res.53:2560,  1993；および米国特許第５，２８３，１７３号、同第５，４６８，６１４号または対応特許を参照されたい）。親和性または見かけの親和性または相対親和性を評価するアッセイも公知である。ある特定の例では、融合タンパク質の見かけの親和性は、様々な濃度のテトラマーとの結合を評定することにより、例えば、標識されたテトラマーを使用してフローサイトメトリーにより測定される。一部の例では、融合タンパク質の見かけのＫＤは、ある濃度範囲の標識されたテトラマーの２倍希釈物を使用して測定され、続いて非線形回帰により結合曲線が決定され、半最大結合を生じさせたリガンドの濃度として見かけのＫＤが決定される。
【００９１】
本明細書で使用される場合、「エフェクタードメイン」は、適切なシグナルを受け取ったときの細胞における生物学的または生理的応答を直接または間接的に促進することができる、融合タンパク質または受容体の細胞内部分またはドメインである。ある特定の実施形態では、エフェクタードメインは、結合されたときに、あるいはタンパク質もしくはその一部分またはタンパク質複合体が、標的分子と直接結合し、エフェクタードメインからのシグナルを誘発したときにシグナルを受け取る、タンパク質もしくはその一部分またはタンパク質複合体からのものである。
【００９２】
エフェクタードメインは、それが、１つまたは複数のシグナル伝達ドメインまたはモチーフ、例えば、共刺激分子に見られるような細胞内チロシンベース活性化モチーフ（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｍｏｔｉｆ：ＩＴＡＭ）を含有する場合、細胞応答を直接促進することができる。理論により拘束されることを望まないが、ＩＴＡＭは、Ｔ細胞受容体によるまたはＴ細胞エフェクタードメインを含む融合タンパク質によるリガンド結合後のＴ細胞活性化に重要であると考えられる。ある特定の実施形態では、細胞内成分またはその機能的部分は、ＩＴＡＭを含む。例示的なエフェクタードメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＡＲＤ１１、ＤＡＰ１０、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、Ｆｙｎ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、Ｌｃｋ、ＬＡＧ３、ＬＡＴ、ＬＲＰ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、Ｗｎｔ、ＲＯＲ２、Ｒｙｋ、ＳＬＡＭＦ１、Ｓｌｐ７６、ｐＴα、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＲＩＭ、Ｚａｐ７０、ＰＴＣＨ２、またはそれらの任意の組合せからのものを含む。ある特定の実施形態では、エフェクタードメインは、リンパ球受容体シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζまたはその機能的部分）を含む。
【００９３】
さらなる実施形態では、融合タンパク質の細胞内成分は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）またはそれらの組合せから選択される、共刺激ドメインまたはその機能的部分を含む。ある特定の実施形態では、細胞内成分は、ＣＤ２８共刺激ドメインもしくはその機能的部分（これは、ネイティブＣＤ２８タンパク質の１８６〜１８７位にＬＬ→ＧＧ変異を必要に応じて含み得る（Nguyen  et  al.,  Blood  102:4320,  2003を参照されたい））、４−１ＢＢ共刺激ドメインもしくはその機能的部分、または両方を含む。
【００９４】
ある特定の実施形態では、エフェクタードメインは、ＣＤ３ζまたはその機能的部分を含む。さらなる実施形態では、エフェクタードメインは、ＣＤ２７からの部分またはドメインを含む。さらなる実施形態では、エフェクタードメインは、ＣＤ２８からの部分またはドメインを含む。なおさらなる実施形態では、エフェクタードメインは、４−１ＢＢからの部分またはドメインを含む。さらなる実施形態では、エフェクタードメインは、ＯＸ４０からの部分またはドメインを含む。
【００９５】
本開示の細胞外成分および細胞内成分は、膜貫通ドメインによって接続されている。「膜貫通ドメイン」は、本明細書で使用される場合、細胞膜に挿入することまたは細胞膜を通過することができる、膜貫通タンパク質の一部分である。膜貫通ドメインは、細胞膜内で熱力学的に安定している三次元構造を有し、一般に、長さが約１５アミノ酸〜約３０アミノ酸の範囲である。膜貫通ドメインの構造は、アルファヘリックス、ベータバレル、ベータシート、ベータヘリックス、またはそれらの任意の組合せを含み得る。ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、公知の膜貫通タンパク質を含むまたは公知の膜貫通タンパク質に由来するもの（例えば、ＣＤ４膜貫通ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２７膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、またはそれらの任意の組合せ）である。
【００９６】
ある特定の実施形態では、融合タンパク質の細胞外成分は、結合ドメインと膜貫通ドメインの間に配置されたリンカーをさらに含む。結合ドメインと膜貫通ドメインを接続する融合タンパク質の成分に言及するときに本明細書で使用される場合、「リンカー」は、リンカーによって接続された２つの領域、ドメイン、モチーフ、断片またはモジュール間に柔軟性および立体構造移動の余地を与えることができる、約２アミノ酸〜約５００アミノ酸を有するアミノ酸配列であり得る。例えば、本開示のリンカーは、融合タンパク質を発現する宿主細胞の表面から離れた位置に結合ドメインを置いて、宿主細胞と標的細胞間の適切な接触、抗原結合、および活性化を可能にすることができる（Patel  et  al.,  Gene  Therapy  6:  412-419,  1999）。選択される標的分子、選択される結合エピトープ、または抗原結合ドメインのサイズおよび親和性に基づいて、抗原認識を最大にするようにリンカー長を変えることができる（例えば、Guest  et  al.,  J.  Immunother.28:203-11,  2005；ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１４／０３１６８７を参照されたい）。例示的なリンカーとしては、ＧｌｙｘＳｅｒｙ（ここで、ｘおよびｙは、各々独立して０〜１０の整数であり、ただし、ｘおよびｙが両方ともに０ではない）の１〜約１０の反復を有するグリシン−セリンアミノ酸鎖を有するもの（例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号２０）；（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２（配列番号２１）；Ｇｌｙ２Ｓｅｒ；またはそれらの組合せ、例えば、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）２Ｇｌｙ２Ｓｅｒ（配列番号４９））が挙げられる。
【００９７】
本開示のリンカーは、免疫グロブリン定常領域（すなわち、任意のアイソタイプのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３またはＣＬ）およびそれらの部分も含む。ある特定の実施形態では、リンカーは、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、または両方を含む。ある特定の実施形態では、リンカーは、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。さらなる実施形態では、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインは、各々、同じアイソタイプである。特定の実施形態では、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４またはＩｇＧ１アイソタイプである。他の実施形態では、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインは、各々、異なるアイソタイプである。特定の実施形態では、ＣＨ２は、Ｎ２９７Ｑ変異を含む。理論により拘束されることを望まないが、Ｎ２９７Ｑ変異を有するＣＨ２ドメインは、ＦｃγＲに結合しないと考えられる（例えば、Sazinsky  et  al.,  PNAS  105(51):20167  (2008)を参照されたい）。ある特定の実施形態では、リンカーは、ヒト免疫グロブリン定常領域またはその一部分を含む。
【００９８】
本明細書に記載される実施形態のいずれにおいても、リンカーは、ヒンジ領域またはその一部分を含み得る。ヒンジ領域は、可変長および配列（通常はプロリンおよびシステインアミノ酸を多く含む）の柔軟なアミノ酸ポリマーであり、免疫グロブリンタンパク質の柔軟性がより高い領域とより低い領域を接続する。例えば、ヒンジ領域は、抗体のＦｃ領域とＦａｂ領域を接続し、ＴＣＲの定常領域と膜貫通領域を接続する。ある特定の実施形態では、リンカーは、免疫グロブリン定常領域またはその一部分、およびヒンジ領域またはその一部分を含む。ある特定の実施形態では、リンカーは、配列番号２０もしくは２１もしくは４９に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号２０もしくは２１もしくは４９に示されるアミノ酸配列からなる、グリシン−セリンリンカーを含む。
【００９９】
ある特定の実施形態では、細胞外成分、結合ドメイン、リンカー、膜貫通ドメイン、細胞内成分または共刺激ドメインのうちの１つまたは複数は、接合部アミノ酸を含む。「接合部アミノ酸」または「接合部アミノ酸残基」は、タンパク質の２つの隣接するドメイン、モチーフ、領域、モジュールまたは断片間の、例えば、結合ドメインと隣接リンカーの間、膜貫通ドメインと隣接細胞外もしくは細胞内ドメインの間、または２つのドメイン、モチーフ、領域、モジュールもしくは断片を連結するリンカーの一方もしくは両方の末端上（例えば、リンカーと隣接結合ドメインの間、またはリンカーと隣接ヒンジの間）の、１つまたは複数（例えば、約２〜２０）のアミノ酸残基を指す。接合部アミノ酸は、融合タンパク質の構築物設計の結果として生じ得る（例えば、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの構築中の制限酵素部位または自己切断ペプチド配列の使用の結果として生じるアミノ酸残基）。例えば、融合タンパク質の膜貫通ドメインは、アミノ末端、カルボキシ末端、または両方に、１つまたは複数の接合部アミノ酸を有し得る。
【０１００】
タンパク質タグは、目的のタンパク質に付けられている、または遺伝子融合されている、または目的のタンパク質の一部である、特有のペプチド配列であって、例えば、異種もしくは非内在性同族結合分子もしくは基質（例えば、受容体、リガンド、抗体、炭水化物、もしくは金属マトリックス）または本開示の融合タンパク質によって、認識または結合され得るペプチド配列である。タンパク質タグは、目的のタグ付きタンパク質の検出、同定、単離、追跡、精製、濃縮、標的化または生物学的もしくは化学的修飾に、特に、タグ付きタンパク質が、細胞タンパク質または細胞の異種集団（例えば、末梢血のような生体試料）の一部である場合、有用であり得る。タグ付き細胞表面タンパク質において、同族結合分子または本開示の融合タンパク質がタグと特異的に結合（すなわち、配列番号１９のアミノ酸配列を有するタグペプチドと結合）できることは、細胞表面タンパク質（例えば、ＣＡＲ、ＴＣＲ）に含有される結合ドメインが標的分子に特異的に結合できることとは明確に異なり、または細胞表面タンパク質（例えば、ＣＡＲ、ＴＣＲ）に含有される結合ドメインが標的分子に特異的に結合できることに加えてである。ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質のタンパク質タグは、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、Ａｖｉタグ、カルモジュリンタグ、ポリグルタミン酸タグ、ＨＡタグ、Ｎｕｓタグ、Ｓタグ、Ｘタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｏｆｔａｇ、Ｖ５タグ、ＣＢＰ、ＧＳＴ、ＭＢＰ、ＧＦＰ、チオレドキシンタグ、またはそれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、タンパク質タグ（本明細書では「ペプチドタグ」または「タグペプチド」とも呼ばれる）をさらに含み得、ただし、前記タンパク質タグは、ｓｔｒｅｐタグではない（例えば、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含まない）。
【０１０１】
本明細書に記載される実施形態のいずれにおいても、融合タンパク質は、ＣＡＲもしくはＴＣＲであることができ、またはＣＡＲもしくはＴＣＲを含むことができる。ＣＡＲを含む、融合タンパク質を作製する方法は、例えば、米国特許第６，４１０，３１９号、米国特許第７，４４６，１９１号、米国特許出願公開第２０１０／０６５８１８号、米国特許第８，８２２，６４７号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１４／０３１６８７、米国特許第７，５１４，５３７号、およびBrentjens  et  al.,  2007、Clin.Cancer  Res.  13:5426、およびWalseng  et  al.,  Scientific  Reports  7:10713,  2017に記載されており、これらの参考文献の手法は、参照により本明細書に組み込まれる。操作されたＴＣＲを産生する方法は、例えば、Bowerman  et  al.,  Mol.Immunol.,  46(15):3000  (2009)に記載されており、この参考文献の手法は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０２】
ある特定の実施形態では、ＴＣＲの抗原結合断片は、ＴＣＲ  ＶαおよびＶβドメインのＴＣＲ両方を含むが単一のＴＣＲ定常ドメイン（ＣαまたはＣβ）しか含まない、単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）を含む。ある特定の実施形態では、ＴＣＲの抗原結合断片、またはキメラ抗原受容体は、キメラ（例えば、１つより多くのドナーもしくは複数の種からのアミノ酸残基もしくはモチーフを含む）、ヒト化（例えば、ヒトにおける免疫原性のリスクを低下させるように変更もしくは置換されている非ヒト生物からの残基を含む）、またはヒトである。
【０１０３】
組換えにより産生された可溶性融合タンパク質を単離および精製するのに有用な方法は、例として、組換え可溶性融合タンパク質を培養培地に分泌する好適な宿主細胞／ベクター系から上清を得るステップ、および次いで市販のフィルターを使用して培地を濃縮するステップを含み得る。濃縮後、濃縮物を単一の好適な精製マトリックスに、または一連の好適なマトリックス、例えば、アフィニティーマトリックスもしくはイオン交換樹脂に、適用することができる。１つまたは複数の逆相ＨＰＬＣステップを利用して、組換えポリペプチドをさらに精製することができる。これらの精製方法は、免疫原をその天然環境から単離するときに利用することもできる。本明細書に記載される単離された／組換え可溶性融合タンパク質の１つまたは複数についての大規模産生方法は、好適な培養条件を維持するためにモニタリングおよび制御される、バッチ細胞培養を含む。本明細書に記載される、当技術分野で公知である、ならびに自国および外国の規制機関の法律およびガイドラインと適合する方法に従って、可溶性融合タンパク質の精製を行うことができる。
【０１０４】
本明細書に記載の融合タンパク質は、Ｔ細胞結合、活性化または誘導の決定を含み、抗原特異的であるＴ細胞応答の決定も含む、宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）活性をアッセイするための当技術分野において一般に認められている多数の方法論のいずれかに従って機能的に特徴付けることができる。例は、Ｔ細胞増殖、Ｔ細胞サイトカイン放出、抗原特異的Ｔ細胞刺激、ＭＨＣ拘束Ｔ細胞刺激、ＣＴＬ活性（例えば、前もって負荷された標的細胞からの５１Ｃｒまたはユーロピウムの放出を検出することによる）、Ｔ細胞表現型マーカー発現の変化、およびＴ細胞機能の他の尺度の決定を含む。これらおよび類似のアッセイを行うための手順は、例えば、Lefkovits（Immunology  Methods  Manual:  The  Comprehensive  Sourcebook  of  Techniques,  1998）において見つけることができる。Current  Protocols  in  Immunology;  Weir,  Handbook  of  Experimental  Immunology,  Blackwell  Scientific,  Boston,  MA  (1986);  Mishell  and  Shigii  (eds.)Selected  Methods  in  Cellular  Immunology,  Freeman  Publishing,  San  Francisco,  CA  (1979);  Green  and  Reed,  Science  281:1309  (1998)およびこれらに引用されている参考文献も参照されたい。
【０１０５】
サイトカインレベルは、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、細胞内サイトカイン染色およびフローサイトメトリー、ならびにそれらの組合せ（例えば、細胞内サイトカイン染色とフローサイトメトリー）を含む、本明細書に記載されるおよび当技術分野において実施されている方法に従って、決定することができる。免疫応答の抗原特異的惹起または刺激の結果として生じる免疫細胞増殖およびクローン拡大は、末梢血液細胞またはリンパ節からの細胞の試料中の循環リンパ球などのリンパ球を単離し、前記細胞を抗原で刺激し、サイトカイン産生、細胞増殖および／または細胞生存率を、例えば、トリチウム化チミジンの取り込みまたは非放射性アッセイ、例えばＭＴＴアッセイなどにより、測定することによって、決定することができる。Ｔｈ１免疫応答とＴｈ２免疫応答の間のバランスに対する本明細書に記載される免疫原の効果は、例えば、Ｔｈ１サイトカイン、例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２およびＴＮＦ−β、ならびに２型サイトカイン、例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３、のレベルを決定することによって、検査することができる。
【０１０６】
ポリヌクレオチド、ベクター、および宿主細胞
ある特定の態様では、本明細書に記載の融合タンパク質のいずれか１つまたは複数をコードする核酸分子が提供され、これらのポリヌクレオチドは、本明細書では「抗タグをコードするポリヌクレオチド」と呼ばれることもあり、コードされた融合タンパク質は、本明細書では、「抗タグ融合タンパク質」と呼ばれることもある。本開示の所望の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、目的の宿主細胞（例えば、Ｔ細胞などの免疫細胞）への導入のために適切なベクター（例えば、ウイルスベクターまたは非ウイルスプラスミドベクター）に挿入することができる。
【０１０７】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるような融合タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドで形質導入された宿主細胞を同定、モニタリングまたは単離するために、マーカーを使用することができる。ある特定の実施形態では、抗タグをコードするポリヌクレオチドは、マーカーをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。さらなる実施形態では、マーカーをコードするポリヌクレオチドは、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの３’側に位置するか、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの５’側に位置する。
【０１０８】
例示的なマーカーとしては、緑色蛍光タンパク質、ヒトＣＤ２の細胞外ドメイン、短縮型ヒトＥＧＦＲ（ｈｕＥＧＦＲｔ（Wang  et  al.,  Blood  118:1255,  2011を参照されたい）、短縮型ヒトＣＤ１９（ｈｕＣＤ１９ｔ）、短縮型ヒトＣＤ３４（ｈｕＣＤ３４ｔ）、または短縮型ヒトＮＧＦＲ（ｈｕＮＧＦＲｔ）が挙げられる。ある特定の実施形態では、コードされたマーカーは、ＥＧＦＲｔ、ＣＤ１９ｔ、ＣＤ３４ｔ、またはＮＧＦＲｔを含む。上述の実施形態のいずれにおいても、マーカーは、ペプチドタグを含有し得るが、抗タグ融合タンパク質が、その融合タンパク質が結合するタグと同じアミノ酸配列を有するペプチドタグを一般に含まないことは理解されるであろう。例えば、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むタグと結合する抗タグ融合タンパク質（または抗タグ融合タンパク質を発現する宿主細胞）自体は、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有するペプチドを含まない（または、宿主細胞の場合には、発現しない）ことが、好ましい。
【０１０９】
本明細書に記載される実施形態のいずれにおいても、抗タグ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、マーカーをコードするポリヌクレオチド、および自己切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含むことができ、前記自己切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドと前記マーカーをコードするポリヌクレオチドの間に位置する。抗タグをコードするポリヌクレオチド、マーカーをコードするポリヌクレオチド、および自己切断ポリペプチドが、宿主細胞により発現されたとき、融合タンパク質およびマーカーは、別々の分子として宿主細胞表面上に存在することになる。ある特定の実施形態では、自己切断ポリペプチドは、ブタテッショウイルス−１（Ｐ２Ａ；配列番号４０もしくは４１）、ゾセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａａｓｉｇｎａ）ウイルス（Ｔ２Ａ；配列番号４２もしくは４３）、ウマ鼻炎Ａウイルス（Ｅ２Ａ；配列番号４４もしくは４５）、または口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ）からの２Ａペプチドを含む。２Ａペプチドのさらなる例示的な核酸およびアミノ酸配列は、例えば、Kim  et  al.（PLOS  One  6:e18556,  2011、この２Ａ核酸およびアミノ酸配列は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１１０】
ある特定の実施形態では、本開示の抗タグをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１、７もしくは１３のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むかまたは配列番号１、７もしくは１３のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列からなる、ＶＨをコードするポリヌクレオチドを含み、配列番号４、９もしくは１５のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を含むかまたは配列番号４、９もしくは１５のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列からなる、ＶＬをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。
【０１１１】
１つまたは複数のタグペプチドを含有するＣＡＲなどの、代表的なタグ付きキメラエフェクター分子は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１５／０９５８９５に記載されており、この参考文献のタグおよびタグ付きエフェクター分子は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１２】
別の態様では、本開示は、タグ付き細胞表面タンパク質、例えば、タグ付きキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、タグ付きＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、またはタグ付きマーカー、を発現する宿主細胞の検出またはモニタリングに使用するための、抗タグ融合タンパク質、またはその細胞表面で抗タグ融合タンパク質を発現する細胞を提供する。例えば、検出またはモニタリングされる宿主細胞は、異種のタグなしＣＡＲまたはタグなしＴＣＲを発現することができ、タグ付きマーカーをさらに発現する。ある特定の実施形態では、タグ付きマーカーをコードするポリヌクレオチドは、ｓｔｒｅｐタグペプチドを含有するマーカーをコードするポリヌクレオチドを含み、前記ｓｔｒｅｐタグペプチドは、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むこともあり、または配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなることもある。ある特定の実施形態では、検出またはモニタリングされる免疫細胞は、キメラポリヌクレオチドを含有することもあり、このキメラポリヌクレオチドは、異種細胞表面受容体（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）をコードする第１のポリヌクレオチドと；タグペプチドを含有するマーカーをコードするポリヌクレオチドを含む、タグ付きマーカーをコードする第２のポリヌクレオチドであって、コードされたタグペプチドが、ｓｔｒｅｐタグペプチド（例えば、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるペプチド）を含む、第２のポリヌクレオチドと；前記細胞表面受容体をコードする第１のポリヌクレオチドと前記タグ付きマーカーをコードする第２のポリヌクレオチドの間に配置された、自己切断ポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドとを含む。
【０１１３】
例示的な抗タグ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの概略図が、図１７Ｃに提供される。
【０１１４】
標的抗原（ＣＤ１９）に特異的なタグ付き（ｓｔｒｅｐタグ）細胞表面受容体（ＣＡＲ）をコードする例示的なポリヌクレオチドの概略図が、図１７Ａに提供される。
【０１１５】
標的抗原（ＣＤ１９）に特異的な細胞表面受容体（ＣＡＲ）をコードする例示的なポリヌクレオチドおよびタグ付き（ｓｔｒｅｐタグ）マーカー（ｔＥＧＦＲ）をコードするポリヌクレオチドの概略図が、図１７Ｂに提供される。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、（ａ）標的抗原に特異的に結合する結合ドメインを含む第１の細胞外成分、（ｂ）エフェクタードメインまたはその機能的部分を含む細胞内成分、および（ｃ）前記細胞外成分と前記細胞内成分を接続する膜貫通成分を含む、細胞表面受容体をコードする第１のポリヌクレオチドと；タグ付きマーカーをコードし、タグペプチドを含有するマーカーをコードするポリヌクレオチドを含む、第２のポリヌクレオチドであって、コードされたタグペプチドが、ある特定の実施形態では配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなり得る、ｓｔｒｅｐタグペプチドを含む、第２のポリヌクレオチドとを含む。さらなる実施形態では、キメラポリヌクレオチドによりコードされた細胞表面受容体は、標的抗原（例えば、がん抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＰＶ  Ｅ６、ＨＰＶ  Ｅ７、Ｈｅｒ２、Ｌ１−ＣＡＭ、Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＣＤ５６、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、ＣＡ１２５、ｃ−ＭＥＴ、ＦｃＲＨ５、ＷＴ１、葉酸受容体α、ＶＥＧＦ−α、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＩＬ−１３Ｒα２、ＩＬ−１１Ｒα、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＳＳＸ−２、ＰＲＡＭＥ、ＨＡ−１、ＰＳＡ、エフリンＡ２、エフリンＢ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＡＧ−７２、メソテリン、ＮＹ−ＥＳＯ、５Ｔ４、ＢＣＭＡ、ＦＡＰ、炭酸脱水酵素９、ＥＲＢＢ２、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ、もしくはＣＥＡ抗原など）と特異的に結合するＣＡＲもしくはＴＣＲであるか、または標的抗原と特異的に結合するＣＡＲもしくはＴＣＲを含む。
【０１１７】
本明細書に記載される実施形態のいずれにおいても、本開示のキメラポリヌクレオチドによりコードされる自己切断ポリペプチドは、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２ＡまたはＦ２Ａをコードする。
【０１１８】
ある特定の実施形態では、コードされたタグ付きマーカーは、ＥＧＦＲｔ、ＣＤ１９ｔ、ＣＤ３４ｔ、またはＮＧＦＲｔを含む。コードされたタグ付きマーカーは、タグ付きマーカーが宿主細胞の表面に発現されたときに構築物のタグペプチド部分に本開示の融合タンパク質が特異的に結合できることを条件に、マーカー内のいずれの位置にタグを含有してもよい。特定の実施形態では、タグをコードするポリヌクレオチドは、マーカーをコードするポリヌクレオチドの３’側に位置するか、またはタグをコードするポリヌクレオチドは、マーカーをコードするポリヌクレオチドの５’側に位置する。他の実施形態では、タグをコードするポリヌクレオチドは、マーカーをコードするポリヌクレオチド内に位置する。
【０１１９】
特定の実施形態では、キメラポリヌクレオチドは、５’末端から３’末端へ、（ａ）（細胞表面受容体をコードする第１のポリヌクレオチド）−（自己切断ポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチド）−（タグ付きマーカーをコードする第２のポリヌクレオチド）、または（ｂ）（タグ付きマーカーをコードする第２のポリヌクレオチド）−（自己切断ポリペプチドをコードする前記第３のポリヌクレオチド）−（前記細胞表面受容体をコードする第１のポリヌクレオチド）の構造を含む。
【０１２０】
本明細書に記載される実施形態のいずれにおいても、本開示のポリヌクレオチド（すなわち、抗タグ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または細胞表面タンパク質およびタグ付きマーカーをコードするポリヌクレオチド）を、そのポリヌクレオチドを含有する宿主細胞のためにコドン最適化することができる（例えば、Scholten  et  al.,  Clin.Immunol.119:135-145  (2006)を参照されたい）。
【０１２１】
さらなる態様では、発現制御配列（例えば、プロモーター）に作動可能に連結された本開示のポリヌクレオチド（例えば、抗タグ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または細胞表面タンパク質およびタグ付きマーカーをコードするポリヌクレオチド）を含む発現構築物が、提供される。ある特定の実施形態では、発現構築物は、ベクター内に含まれる。例示的なベクターは、そのポリヌクレオチドが連結されている別のポリヌクレオチドを輸送することができるポリヌクレオチド、または宿主生物において複製することができるポリヌクレオチドを含むことができる。ベクターの一部の例としては、プラスミド、ウイルスベクター、コスミドなどが挙げられる。導入される宿主細胞において自律複製が可能であり得るベクター（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム哺乳動物ベクター）もあるが、宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る、または宿主細胞への導入の際にポリヌクレオチド挿入物の組込みを促進し、それによって宿主ゲノムとともに複製し得るベクター（例えば、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター）もある。加えて、一部のベクターは、それらが作用的に連結されている遺伝子の発現を指示することができる（これらのベクターは、「発現ベクター」と呼ばれることもある）。関連実施形態に従って、１つまたは複数の薬剤（例えば、本明細書に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）が対象に共投与される場合には、各薬剤が、別々のベクターまたは同じベクターの中に存在することができ、複数のベクター（各々が異なる薬剤または同じ薬剤を含有する）を細胞もしくは細胞集団に導入することができ、または対象に投与することができることは、さらに理解される。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドを、ベクターのある特定のエレメントに作用的に連結させることができる。例えば、ポリヌクレオチド配列であって、ポリヌクレオチド配列がライゲーションされるコード配列の発現およびプロセシングを生じさせる必要があるポリヌクレオチド配列を、作用的に連結させることができる。発現制御配列としては、適切な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列；効率的ＲＮＡプロセシングシグナル、例えば、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を向上させる配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質安定性を向上させる配列；ならびにことによると、タンパク質分泌を増進する配列を挙げることができる。発現制御配列は、発現制御配列が、目的の遺伝子と、および目的の遺伝子を制御するようにトランスでまたは少し離れて作用する発現制御配列と近接している場合、作用的に連結されていてよい。
【０１２３】
ある特定の実施形態では、ベクターは、プラスミドベクターまたはウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクターまたはγ−レトロウイルスベクターから選択されるベクター）を含む。ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、例えばオルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病および水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹およびセンダイ）、プラス鎖ＲＮＡウイルス、例えばピコルナウイルスおよびアルファウイルス、ならびに二本鎖ＤＮＡウイルスが挙げられ、二本鎖ＤＮＡウイルスには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型および２型、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス）、およびポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘およびカナリアポックス）が含まれる。他のウイルスとしては、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポーバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例としては、トリ白血症−肉腫、哺乳動物Ｃ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ群、レンチウイルス、スプーマウイルスが挙げられる（Coffin,  J.  M.,  Retroviridae:  The  viruses  and  their  replication,  In  Fundamental  Virology,  Third  Edition,  B.  N.  Fields  et  al.,  Eds.,  Lippincott-Raven  Publishers,  Philadelphia,  1996）。
【０１２４】
「レトロウイルス」は、ＲＮＡゲノムを有するウイルスであって、このＲＮＡゲノムが、逆転写酵素を使用してＤＮＡに逆転写され、次いで、逆転写されたＤＮＡが宿主細胞ゲノムに組み込まれる、ウイルスである。「ガンマレトロウイルス」は、レトロウイルス科の属を指す。例示的なガンマレトロウイルスとしては、マウス幹細胞ウイルス、マウス白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、およびトリ細網内皮症ウイルスが挙げられる。
【０１２５】
「レンチウイルスベクター」は、本明細書で使用される場合、遺伝子送達のためのＨＩＶベースのレンチウイルスベクターであって、組込み型であることもあり、または非組込み型であることもあり、比較的大きいパッケージング容量を有し、様々な異なる細胞型に形質導入することができる、レンチウイルスベクターを意味する。レンチウイルスベクターは、産生細胞内への３つ（パッケージング、エンベロープおよび移入）またはそれより多くのプラスミドの一過性トランスフェクション後に通常は生成される。ＨＩＶと同様に、レンチウイルスベクターは、ウイルス表面糖タンパク質と細胞表面の受容体との相互作用によって標的細胞に侵入する。侵入すると、ウイルスＲＮＡは、ウイルス逆転写酵素複合体により媒介される逆転写を受ける。逆転写の産物は、二本鎖線状ウイルスＤＮＡであり、これは、感染細胞のＤＮＡ中へのウイルス組込みの基質である。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ガンマレトロウイルス、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）由来ベクターであり得る。他の実施形態では、ウイルスベクターは、より複雑なレトロウイルス由来ベクター、例えば、レンチウイルス由来ベクターであり得る。ＨＩＶ−１由来ベクターは、このカテゴリーに属する。他の例としては、ＨＩＶ−２、ＦＩＶ、ウマ伝染性貧血ウイルス、ＳＩＶ、およびマエディ・ビスナウイルス（ヒツジレンチウイルス）に由来する、レンチウイルスベクターが挙げられる。レトロウイルスおよびレンチウイルスウイルスベクターの使用方法、およびＣＡＲ導入遺伝子を含有するウイルス粒子で哺乳動物宿主細胞に形質導入するための細胞のパッケージング細胞は、当技術分野において公知であり、以前に、例えば、米国特許第８，１１９，７７２号；Walchli  et  al.,  PLoS  One  6:327930,  2011;  Zhao  et  al.,  J.  Immunol.174:4415,  2005;  Engels  et  al.,  Hum.Gene  Ther.14:1155,  2003;  Frecha  et  al.,  Mol.Ther.18:1748,  2010；およびVerhoeyen  et  al.,  Methods  Mol.Biol.506:97,  2009に記載されている。レトロウイルスおよびレンチウイルスベクター構築物および発現系は、市販もされている。他のウイルスベクターも、ポリヌクレオチド送達に使用することができ、それらには、例えばアデノウイルスベースのベクターおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースのベクターを含む、ＤＮＡウイルスベクター；アンプリコンベクター、複製欠損ＨＳＶおよび弱毒化ＨＳＶを含む、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）に由来するベクターが含まれる（Krisky  et  al.,  Gene  Ther.5:1517,  1998）。
【０１２７】
遺伝子治療用に最近開発された他のベクターも、本開示の組成物および方法とともに使用することができる。そのようなベクターとしては、バキュロウイルスおよびαウイルスに由来するもの（Jolly,  D  J.  1999.  Emerging  Viral  Vectors.  pp  209-40  in  Friedmann  T.  ed.  The  Development  of  Human  Gene  Therapy.  New  York:  Cold  Spring  Harbor  Lab）、またはプラスミドベクター（例えば、スリーピング・ビューティーもしくは他のトランスポゾンベクター）が挙げられる。
【０１２８】
ウイルスベクターゲノムが、別々の転写物として宿主細胞において発現される多数のポリヌクレオチドを含む場合、そのウイルスベクターは、２つ（またはそれより多くの）転写物間に追加の配列を含むこともでき、それによってバイシストロン性またはマルチシストロン性発現が可能になる。ウイルスベクターに使用されるそのような配列の例としては、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、フューリン切断部位、ウイルス２Ａペプチド、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。
【０１２９】
目的の融合タンパク質の遺伝子操作および産生に使用される発現ベクターの構築は、当技術分野において公知の任意の好適な分子生物学操作手法を使用することにより遂行することができる。効率的な転写および翻訳を達成するために、各組換え発現構築物中のポリヌクレオチドは、免疫原をコードするヌクレオチド配列に作動可能に（すなわち、作用的に（operatively））連結された少なくとも１つの適切な発現制御配列（調節配列とも呼ばれる）、例えば、リーダー配列および特にプロモーターを含む。
【０１３０】
ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、養子移入治療（例えば、がん抗原を標的とする、またはタグペプチドを発現する養子移入された細胞を標的とする）において使用するための宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）へのトランスフェクション／形質導入に使用される。Ｔ細胞に所望の核酸をトランスフェクトする／Ｔ細胞に所望の核酸で形質導入する方法は、記載されており（例えば、米国特許出願公開第２００４／００８７０２５号）、所望の標的特異性のＴ細胞を使用する養子移入手順も記載されており（例えば、Schmitt  et  al.,  Hum.  Gen.  20:1240,  2009;  Dossett  et  al.,  Mol.  Ther.  17:742,  2009;  Till  et  al.,  Blood  112:2261,  2008;  Wang  et  al.,  Hum.  Gene  Ther.18:712,  2007;  Kuball  et  al.,  Blood  109:2331,  2007；米国特許出願公開第２０１１／０２４３９７２号；米国特許出願公開第２０１１／０１８９１４１号；Leen  et  al.,  Ann.  Rev.  Immunol.  25:243,  2007）、したがって、今般開示される実施形態へのこれらの方法論の適用が、本開示の融合タンパク質に関するものを含む本明細書における教示に基づいて企図される。したがって、別の態様では、本開示のポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、コードされた融合タンパク質を発現する、またはコードされた細胞表面受容体およびタグ付きマーカーを発現する、宿主細胞が提供される。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、（ａ）融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または本開示の融合タンパク質をコードする発現構築物を含み、コードされた融合タンパク質を発現するか；または（ｂ）本開示のキメラポリヌクレオチドまたはキメラポリヌクレオチド発現構築物を含み、コードされた細胞表面受容体およびコードされたタグ付きマーカーを発現する。
【０１３１】
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、造血前駆細胞またはヒト免疫系細胞である。本明細書で言及される場合、「造血前駆細胞」は、造血幹細胞または胎児組織に由来し得る細胞であって、成熟細胞型（例えば、免疫系細胞）へとさらに分化することができる細胞である。例示的な造血前駆細胞としては、ＣＤ２４ＬｏＬｉｎ−ＣＤ１１７＋表現型を有するもの、または胸腺に見られるもの（前駆胸腺細胞と呼ばれる）が挙げられる。
【０１３２】
本明細書で使用される場合、「免疫系細胞」は、２つの主要な系列、骨髄系前駆細胞（これは、骨髄系細胞、例えば、単球、マクロファージ、樹状細胞、巨核球および顆粒球を生じさせる）およびリンパ系前駆細胞（これは、リンパ系細胞、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびＮＫ−Ｔ細胞を生じさせる）、を生じさせる、骨髄中の造血幹細胞に由来する免疫系の任意の細胞を意味する。例示的な免疫系細胞としては、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−二重陰性Ｔ細胞、γδＴ細胞、調節性Ｔ細胞、幹細胞メモリーＴ細胞、ナチュラルキラー細胞（例えば、ＮＫ細胞またはＮＫ−Ｔ細胞）、Ｂ細胞、および樹状細胞が挙げられる。マクロファージおよび樹状細胞は、「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」と呼ばれることもあり、「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」は、ペプチドと複合体化したＡＰＣの表面の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）受容体がＴ細胞の表面のＴＣＲと相互作用したときＴ細胞を活性化することができる特殊化した細胞である。
【０１３３】
「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」は、胸腺において成熟し、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を産生する、免疫系細胞である。Ｔ細胞は、ナイーブ（抗原に曝露されていない；ＴＣＭと比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ１２７およびＣＤ４５ＲＡの発現増加、ならびにＣＤ４５ＲＯの発現減少）、メモリーＴ細胞（ＴＭ）（抗原を経験した、長寿命）およびエフェクター細胞（抗原を経験した、細胞傷害性）であり得る。ＴＭは、さらに、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ；ナイーブＴ細胞と比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ９５の発現増加、ならびにＣＤ５４ＲＡの発現減少）およびエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ；ナイーブＴ細胞またはＴＣＭと比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡの発現減少、およびＣＤ１２７の発現増加）のサブセットに分けることができる。
【０１３４】
エフェクターＴ細胞（ＴＥ）は、抗原を経験したＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球であって、ＴＣＭと比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８の発現減少を有し、グランザイムおよびパーフォリンに対して陽性である、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を指す。ヘルパーＴ細胞（ＴＨ）は、サイトカインを放出することにより他の免疫細胞の活性に影響を与えるＣＤ４＋細胞である。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、適応免疫応答を活性化することおよび抑制することができ、これら２つの機能のどちらが誘導されるのかは、他の細胞およびシグナルの存在に依存する。公知の技法を使用してＴ細胞を収集することができ、公知の技法により、例えば、抗体への親和性結合、フローサイトメトリーまたは免疫磁気選択により、様々な部分集団またはそれらの組合せを富化することまたは枯渇させることができる。他の例示的なＴ細胞としては、調節性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋（Ｆｏｘｐ３＋）調節性Ｔ細胞およびＴｒｅｇ１７細胞、ならびにＴｒ１、Ｔｈ３、ＣＤ８＋ＣＤ２８−、およびＱａ−１拘束Ｔ細胞が挙げられる。
【０１３５】
「Ｔ細胞系列の細胞」は、それらの細胞を他のリンパ系細胞、および赤血球または骨髄細胞系列と区別する、Ｔ細胞またはその先駆体もしくは前駆体の少なくとも１つの表現型特性を示す細胞を指す。そのような表現型特性としては、Ｔ細胞に特異的な１つもしくは複数のタンパク質（例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋）の発現、またはＴ細胞に特異的な生理的、形態的、機能的もしくは免疫学的特徴を挙げることができる。例えば、Ｔ細胞系列の細胞は、Ｔ細胞系列に運命決定された前駆細胞または先駆細胞；ＣＤ２５＋未熟および不活性化Ｔ細胞；ＣＤ４もしくはＣＤ８系列に運命決定された細胞；ＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性である胸腺細胞前駆細胞；単一陽性ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋；ＴＣＲαβもしくはＴＣＲγδ；または成熟および機能的または活性化Ｔ細胞であり得る。
【０１３６】
ある特定の実施形態では、免疫系細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−二重陰性Ｔ細胞、γδＴ細胞、ナチュラルキラー細胞（例えば、ＮＫ細胞またはＮＫ−Ｔ細胞）、樹状細胞、Ｂ細胞、またはそれらの任意の組合せである。ある特定の実施形態では、免疫系細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、幹細胞メモリーＴ細胞、またはそれらの任意の組合せである。
【０１３７】
宿主細胞は、ベクターをもしくは核酸の組み入れを受け入れることができる、またはタンパク質を発現することができる、任意の個々の細胞または細胞培養物を含むことができる。この用語は、遺伝的にまたは表現型的に同じであるのか異なるのかを問わず、宿主細胞の子孫も包含する。好適な宿主細胞は、ベクターに依存し得、哺乳動物細胞、動物細胞、ヒト細胞、サル細胞、昆虫細胞、酵母細胞および細菌細胞を含み得る。ウイルスベクターの使用、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションによる形質転換、または他の方法によって、ベクターまたは他の材料を組み入れるように、これらの細胞を誘導することができる。例えば、Sambrook  et  al.,  Molecular  Cloning:    A  Laboratory  Manual  2d  ed.  (Cold  Spring  Harbor  Laboratory,  1989)を参照されたい。
【０１３８】
上述の実施形態のいずれにおいても、抗タグ結合タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＨＬＡ分子、ＴＣＲ分子またはそれらの任意の成分もしくは組合せから選択されるポリペプチド産物をコードする１つまたは複数の内在性遺伝子の発現を低減または排除するように改変される免疫細胞である。
【０１３９】
理論により拘束されることを望まないが、ある特定の内在性発現された免疫細胞タンパク質は、改変された免疫宿主細胞の免疫活性を下方調節することができる（例えば、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ）；または本開示の異種抗タグ融合タンパク質と宿主細胞による発現について競合することができる；または本開示の異種発現された結合タンパク質の結合活性に干渉すること、およびタグ（例えば、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むタグペプチド）を発現する標的細胞もしくは融合タンパク質への免疫宿主細胞の結合に干渉することができる；またはそれらの任意の組合せ。さらに、細胞移入治療に使用されることになるドナー免疫細胞上に発現される内在性タンパク質（例えば、免疫宿主細胞タンパク質、例えばＨＬＡ）は、同種異系レシピエントにより外来性と見なされることがあり、その結果、同種異系レシピエントによりドナー免疫細胞が排除または抑制されることになり得る。
【０１４０】
したがって、そのような内在性遺伝子またはタンパク質の発現または活性を減少または排除することで、自己または同種異系宿主環境での宿主細胞の活性、寛容および持続性を向上させることができ、細胞の（例えば、ＨＬＡ型に関係なく任意のレシピエントへの）普遍的投与が可能になる。ある特定の実施形態では、改変宿主免疫細胞は、ドナー細胞（例えば、同種異系）または自己細胞である。ある特定の実施形態では、本開示の改変免疫宿主細胞は、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＨＬＡ成分（例えば、α１マクログロブリン、α２マクログロブリン、α３マクログロブリン、β１ミクログロブリンもしくはβ２ミクログロブリンをコードする遺伝子）、またはＴＣＲ成分（例えば、ＴＣＲ可変領域もしくはＴＣＲ定常領域をコードする遺伝子）をコードする遺伝子のうちの１つまたは複数についての染色体遺伝子ノックアウトを含む（例えば、Torikai  et  al.,  Nature  Sci.Rep.6:21757  (2016);  Torikai  et  al.,  Blood  119(24):5697  (2012)；およびTorikai  et  al.,  Blood  122(8):1341  (2013)を参照されたく、これらの参考文献の遺伝子編集技法、組成物および養子細胞治療は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる）。本明細書で使用される場合、用語「染色体遺伝子ノックアウト」は、機能的に活性な内在性ポリペプチド産物の宿主細胞による産生を妨げる、宿主細胞の遺伝子変化を指す。染色体遺伝子ノックアウトの結果として生じる変化は、例えば、導入ナンセンス変異（未成熟終止コドンの形成を含む）、ミスセンス変異、遺伝子欠失および鎖切断、ならびに宿主細胞における内在性遺伝子発現を阻害する阻害性核酸分子の異種発現を含み得る。
【０１４１】
ある特定の実施形態では、染色体遺伝子ノックアウトまたは遺伝子ノックインは、宿主細胞の染色体編集によってなされる。染色体編集は、例えばエンドヌクレアーゼを使用して、行うことができる。本明細書で使用される場合、「エンドヌクレアーゼ」は、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合の切断を触媒することができる酵素を指す。ある特定の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、標的遺伝子を切断することによって標的遺伝子を不活性化または「ノックアウト」することができる。エンドヌクレアーゼは、天然に存在するエンドヌクレアーゼ、組換えエンドヌクレアーゼ、遺伝子修飾エンドヌクレアーゼまたは融合エンドヌクレアーゼであり得る。エンドヌクレアーゼにより引き起こされる核酸鎖切断は、一般に、相同組換えまたは非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の明確に異なる機序によって修復される。相同組換え中に、ドナー核酸分子は、ドナー遺伝子「ノックイン」に、標的遺伝子「ノックアウト」に、および必要に応じて、ドナー遺伝子ノックインまたは標的遺伝子ノックアウト事象によって標的遺伝子を不活性化するために、使用され得る。ＮＨＥＪは、ＤＮＡ配列の切断部位での変化、例えば、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、欠失または付加をもたらすことが多い、エラープローン修復プロセスである。ＮＨＥＪは、標的遺伝子を「ノックアウトする」ために使用されることもある。エンドヌクレアーゼの例としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびメガＴＡＬが挙げられる。
【０１４２】
本明細書で使用される場合、「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」（ＺＦＮ）は、Ｆｏｋｌエンドヌクレアーゼなどの、非特異的ＤＮＡ切断ドメインに融合されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質を指す。約３０アミノ酸の各ジンクフィンガーモチーフがＤＮＡの約３塩基対と結合し、ある特定の残基におけるアミノ酸を変化させてトリプレット配列特異性を変更することができる（例えば、Desjarlais  et  al.,  Proc.Natl.Acad.Sci.90:2256-2260,  1993;  Wolfe  et  al.,  J.  Mol.Biol.285:1917-1934,  1999を参照されたい）。複数のジンクフィンガーモチーフをタンデムに連結させて、所望のＤＮＡ配列、例えば約９〜約１８塩基対の範囲の長さを有する領域、に対する結合特異性を生じさせることができる。背景として、ＺＦＮは、ゲノム内での部位特異的ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）の形成を触媒することによりゲノム編集を媒介し、ＤＳＢの部位にゲノムに相同な隣接配列を含む導入遺伝子の標的組込みが相同組換え修復により容易になる。あるいは、ＺＦＮにより生じたＤＳＢは、切断部位のヌクレオチドの挿入または欠失を生じさせる結果となるエラープローン細胞修復経路である非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による修復を介して、標的遺伝子のノックアウトをもたらし得る。ある特定の実施形態では、遺伝子ノックアウトは、ＺＦＮ分子を使用してなされる挿入、欠失、変異またはそれらの組合せを含む。
【０１４３】
本明細書で使用される場合、「転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ」（ＴＡＬＥＮ）は、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼなどの、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡ切断ドメインとを含む融合タンパク質を指す。「ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１２番目および１３番目のアミノ酸が異なる高度に保存された３３〜３５アミノ酸配列を各々が一般に有する、１つまたは複数のＴＡＬＥ反復ドメイン／ユニットで構成されている。ＴＡＬＥ反復ドメインは、ＴＡＬＥの標的ＤＮＡ配列への結合に関与する。反復可変二残基（ＲＶＤ）と呼ばれる、異なるアミノ酸残基は、特異的ヌクレオチド認識と相関する。これらのＴＡＬＥのＤＮＡ認識についての天然（標準）コードは、ＴＡＬＥの１２および１３位のＨＤ（ヒスチジン−アスパラギン酸）配列が、シトシン（Ｃ）へのＴＡＬＥ結合をもたらし、ＮＧ（アスパラギン−グリシン）がＴヌクレオチドと、ＮＩ（アスパラギン−イソロイシン）がＡと結合し、ＮＮ（アスパラギン−アスパラギン）がＧまたはＡヌクレオチドと結合し、ＮＧ（アスパラギン−グリシン）がＴヌクレオチドと結合するように、決定された。非標準（非定型）ＲＶＤもまた公知である（例えば、米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号を参照されたく、この非定型ＲＶＤは、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＴＡＬＥＮを使用して、Ｔ細胞のゲノム内での部位特異的二本鎖切断（ＤＳＢ）を指示することができる。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）は、アニーリングのための配列重複がほとんどまたは全くない、二本鎖切断の両側からのＤＮＡをライゲーションし、それによって、遺伝子発現をノックアウトする誤りを導入する。あるいは、相同組換え修復は、相同隣接配列が導入遺伝子に存在することを条件に、その導入遺伝子をＤＳＢの部位に導入することができる。ある特定の実施形態では、遺伝子ノックアウトは、ＴＡＬＥＮ分子を使用してなされる挿入、欠失、変異、またはそれらの組合せを含む。
【０１４４】
本明細書で使用される場合、「クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート／Ｃａｓ」（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）ヌクレアーゼシステムは、塩基対合相補性によってゲノム内の標的部位（プロトスペーサーとして公知）を認識するために、そしてその後、短い保存プロトスペーサー関連モチーフ（ＰＡＭ）が相補標的配列の３’の直後に続く場合にはＤＮＡを切断するために、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）誘導型Ｃａｓヌクレアーゼを利用するシステムを指す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓヌクレアーゼの配列および構造に基づいて３つの型（すなわち、Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型）に分類される。Ｉ型およびＩＩＩ型のｃｒＲＮＡ誘導型監視複合体は、複数のＣａｓサブユニットを必要とする。最もよく研究されているＩＩ型システムは、少なくとも次の３つの成分を含む：ＲＮＡ誘導型Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ｃｒＲＮＡ、およびトランス作用性ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）。ｔｒａｃｒＲＮＡは、二重鎖形成領域を含む。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと相互作用することおよびｃｒＲＮＡ上のスペーサーとＰＡＭから上流の標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとの間のワトソン・クリック塩基対合によって標的ＤＮＡ上の特定の部位にＣａｓ９／ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を誘導することができる、二重鎖を形成する。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ｃｒＲＮＡスペーサーにより規定される領域内で二本鎖切断を行う。ＮＨＥＪによる修復は、標的遺伝子座の発現を破壊する挿入および／または欠失をもたらす。あるいは、相同隣接配列を伴う導入遺伝子を相同組換え修復によってＤＳＢの部位に導入することができる。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを操作して一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ）にすることができる（例えば、Jinek  et  al.,  Science  337:816-21,  2012を参照されたい）。さらに、標的部位に相補的なガイドＲＮＡの領域を、所望の配列を標的とするように変更またはプログラムすることができる（Xie  et  al.,  PLOS  One  9:e100448,  2014；米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号、米国特許出願公開第２０１４／０１８６８４３号：米国特許第８，６９７，３５９号、およびＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１５／０７１４７４；これらの各々は、参照により組み込まれる）。ある特定の実施形態では、遺伝子ノックアウトは挿入、欠失、変異、またはそれらの組合せを含み、それは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムを使用してなされる。
【０１４５】
例示的なｇＲＮＡ配列、およびそれらを使用して、免疫細胞タンパク質をコードする内在性遺伝子をノックアウトする方法は、Ren  et  al.,  Clin.Cancer  Res.23(9):2255-2266  (2017)に記載されるものを含み、この文献のｇＲＮＡ、ＣＡＳ９  ＤＮＡ、ベクターおよび遺伝子ノックアウト技法は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４６】
本明細書で使用される場合、「ホーミングエンドヌクレアーゼ」とも呼ばれる「メガヌクレアーゼ」は、大きい認識部位（約１２〜約４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列）を特徴とするエンドデオキシリボヌクレアーゼを指す。メガヌクレアーゼは、配列および構造モチーフに基づいて次の５つのファミリーに分類することができる：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ、ＧＩＹ−ＹＩＧ、ＨＮＨ、Ｈｉｓ−ＣｙｓボックスおよびＰＤ−（Ｄ／Ｅ）ＸＫ。例示的なメガヌクレアーゼとしては、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩが挙げられ、これらの認識配列は公知である（例えば、米国特許第５，４２０，０３２号および同第６，８３３，２５２号；Belfort  et  al.,  Nucleic  Acids  Res.25:3379-3388,  1997;  Dujon  et  al.,  Gene  82:115-118,  1989;  Perler  et  al.,  Nucleic  Acids  Res.22:1125-1127,  1994;  Jasin,  Trends  Genet.12:224-228,  1996;  Gimble  et  al.,  J.  Mol.Biol.263:163-180,  1996;  Argast  et  al.,  J.  Mol.Biol.280:345-353,  1998を参照されたい）。
【０１４７】
ある特定の実施形態では、天然に存在するメガヌクレアーゼを使用して、ＰＤ−１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、ＨＬＡをコードする遺伝子、またはＴＣＲ成分をコードする遺伝子から選択される標的の部位特異的ゲノム修飾を促進することができる。他の実施形態では、標的遺伝子に対する新規結合特異性を有する操作されたメガヌクレアーゼが、部位特異的ゲノム修飾に使用される（例えば、Porteus  et  al.,  Nat.  Biotechnol.23:967-73,  2005;  Sussman  et  al.,  J.  Mol.Biol.342:31-41,  2004;  Epinat  et  al.,  Nucleic  Acids  Res.31:2952-62,  2003;  Chevalier  et  al.,  Molec.Cell  10:895-905,  2002;  Ashworth  et  al.,  Nature  441:656-659,  2006;  Paques  et  al.,  Curr.Gene  Ther.7:49-66,  2007；米国特許出願公開第２００７／０１１７１２８号、同第２００６／０２０６９４９号、同第２００６／０１５３８２６号、同第２００６／００７８５５２号、および同第２００４／０００２０９２号を参照されたい）。さらなる実施形態では、染色体遺伝子ノックアウトは、メガＴＡＬとして公知の融合タンパク質を作製するためにＴＡＬＥＮのモジュラーＤＮＡ結合ドメインで修飾されたホーミングエンドヌクレアーゼを使用して生成される。メガＴＡＬを利用して、１つまたは複数の標的遺伝子をノックアウトすることができるばかりでなく、目的のポリペプチドをコードする外因性ドナーテンプレートと組み合わせて使用すると異種または外因性ポリヌクレオチドを導入（ノックイン）することもできる。
【０１４８】
ある特定の実施形態では、染色体遺伝子ノックアウトは、腫瘍関連抗原と特異的に結合する抗原特異的受容体をコードする異種ポリヌクレオチドを含む、宿主細胞（例えば、免疫細胞）に導入される阻害性核酸分子を含み、前記阻害性核酸分子は、標的特異的インヒビターをコードし、コードされた標的特異的インヒビターは、宿主免疫細胞における内在性遺伝子発現（すなわち、ＰＤ−１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、ＨＬＡ成分もしくはＴＣＲ成分、またはそれらの任意の組合せの発現）を阻害する。
【０１４９】
染色体遺伝子ノックアウトを、ノックアウト手順またはノックアウト剤の使用後の宿主免疫細胞のＤＮＡシークエンシングによって直接確認することができる。染色体遺伝子ノックアウトを、ノックアウト後の遺伝子発現の非存在（例えば、遺伝子によりコードされたｍＲＮＡまたはポリペプチド産物の非存在）から推測することもできる。
【０１５０】
他の態様では、（ａ）本明細書に記載のベクターまたは発現構築物と、（ｂ）宿主細胞に前記ベクターまたは発現構築物で形質導入するための試薬とを含むキットが提供される。
【０１５１】
使用
本開示は、本明細書に記載の改変された細胞（例えば、タグペプチドを標的とするＣＡＲ  Ｔ細胞、またはタグペプチドでタグが付けられているＣＡＲ  Ｔ細胞）をモジュレート（例えば、アブレーション、刺激または活性化）する方法も提供する。ある特定の実施形態では、タグ付き細胞の標的アブレーションのための方法であって、ｓｔｒｅｐタグペプチド（例えば、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むかまたは配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるペプチド）であるタグペプチドを含む細胞表面タンパク質を発現する細胞（この細胞は、本明細書では「タグ付き細胞」と呼ばれることもある）を事前に投与しておいた対象に、本開示の抗タグ融合タンパク質をその細胞表面に発現するように改変された免疫細胞を投与することによって、前記タグ付き細胞をアブレーションする標的化免疫応答を誘導することを含む方法が、提供される。
【０１５２】
そのようなアブレーション方法は、事前に投与された（例えば、がん（例えば、Ｂ細胞がんを含む）などの疾患の免疫治療処置のために投与された）タグ付き細胞が、望ましくない活性（例えば、対象におけるオフターゲット細胞または組織に対する免疫応答を惹起する）または活性レベル（例えば、不適切に高い強度、継続期間、または両方の免疫応答、例えば、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）事象を惹起する）を有する場合、有用であり得る。ある特定の実施形態では、抗タグ融合タンパク質を発現する改変された免疫細胞は、タグ付き細胞の存在に関連する少なくとも１つの有害事象を有する対象に投与される。
【０１５３】
ある特定の実施形態では、タグ付き細胞表面タンパク質は、ＣＡＲ、ＴＣＲ、またはマーカーを含む。ある特定の実施形態では、マーカーは、ＥＧＦＲｔ、ＣＤ１９ｔ、ＣＤ３４ｔ、またはＮＧＦＲｔを含む。ある特定の実施形態では、タグペプチドは、マーカーに含有される。
【０１５４】
上述の実施形態のいずれにおいても、抗タグ融合タンパク質を発現する改変された免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫ−Ｔ細胞から選択される。特定の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞である。
【０１５５】
ある特定の実施形態では、タグ付き細胞は、免疫治療、グラフトまたは移植として対象に事前に投与された。特定の実施形態では、タグ付き細胞、または抗タグ融合タンパク質を発現する改変された免疫細胞は、対象にとって同種異系、自己または同系である。さらなる実施形態では、対象は、タグ付き細胞を含む免疫治療、グラフトまたは移植後に、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）または宿主対移植片病（ＨｖＧＤ）を有するか、有する疑いがある。ある特定の実施形態では、タグ付き細胞は、過剰増殖性障害を処置するために投与された。本明細書で使用される場合、「過剰増殖性障害」は、正常または非罹患細胞と比較して過剰な成長または増殖を指す。例示的な過剰増殖性障害としては、腫瘍、がん、新生物組織、癌、肉腫、悪性細胞、前悪性細胞、および非新生物性または非悪性過剰増殖性障害（例えば、腺腫、線維腫、脂肪腫、平滑筋腫、血管腫、線維症、再狭窄、ならびに自己免疫疾患、例えば、関節リウマチ、変形性関節症、乾癬、炎症性腸疾患など）が挙げられる。
【０１５６】
さらに、「がん」は、固形腫瘍、腹水腫瘍、血液もしくはリンパもしくは他の悪性疾患；結合組織悪性疾患；転移性疾患；器官または幹細胞の移植後の微小残存疾患；多剤耐性がん、原発性または二次性悪性疾患、悪性疾患に関係する血管新生、または他の形態のがんを含む、任意の加速された細胞増殖を指すことができる。
【０１５７】
対象が、タグ付き細胞に関連する１つまたは複数の有害事象を明示したときに必要なタグ付き細胞の（すなわち、タグ付き免疫治療用細胞またはタグ付き非免疫治療用細胞の）アブレーションを決定することができる。例えば、炎症、発熱、肺水腫または脳浮腫、血圧または心拍数の変化、健常細胞（例えば、白血球）の望ましくなく低い計数値、タグ付き細胞の望ましくなく高い計数値、サイトカインレベル上昇、発疹、疱疹、黄疸、下痢、嘔吐、腹部疝痛、疲労、疼痛、硬直、息切れ、体重減少、ドライアイまたは視力変化、口内乾燥、膣乾燥、および筋力低下は、タグ付き細胞のアブレーションが必要とされる指標であり得る。
【０１５８】
抗タグ融合タンパク質を発現する改変された免疫細胞がタグ付き細胞のアブレーションを引き起こす能力を、改変された免疫細胞での処置後に、直接または間接的に、どちらかで、判定することができる。ある特定の実施形態では、方法は、改変された免疫細胞を対象に投与した後、（ｉ）対象体内に、または対象から採取された試料中に残存する前記タグ付き細胞、（ｉｉ）対象体内に、または対象から採取された試料中に存在する前記改変された免疫細胞、（ｉｉｉ）対象体内の１つもしくは複数のサイトカイン、または（ｉｖ）それらの任意の組合せの存在を検出することおよび／またはその量を測定することをさらに含む。特定の実施形態では、方法は、タグ付き細胞の投与後に低減された細胞（例えば、タグ付き抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞の投与後に低減された健常なＣＤ１９発現Ｂ細胞）の存在を検出することおよび／またはその量をモニタリングすることをさらに含む。
【０１５９】
本発明により処置され得る対象は、一般に、ヒトおよび他の霊長類対象、例えば、獣医学目的でサルおよび類人猿である。上述の実施形態のいずれにおいても、対象は、ヒト対象であり得る。対象は、男性であってもよく、または女性であってもよく、乳幼児、若年、青年、成人および老年対象を含む、いずれの好適な年齢であってもよい。本開示による細胞は、医学技術分野の当業者により決定されるような、処置される疾患、状態または障害に適切な方法で、投与することができる。上記実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載の融合タンパク質を含む細胞は、アブレーションすべきタグ付き細胞に遭遇するために、静脈内投与、腹腔内投与、腫瘍内投与、骨髄に投与、リンパ節に投与、または脳脊髄液に投与される。組成物の適切な用量、好適な投与期間および頻度は、患者の状態；疾患、状態または障害のサイズ、タイプおよび重症度；タグ付き細胞の望ましくないタイプまたはレベルまたは活性；活性成分の特定の形態；ならびに投与方法などの因子によって決定されることになる。
【０１６０】
上記実施形態のいずれにおいても、本開示の方法は、本開示の融合タンパク質を発現する宿主細胞を投与することを含む。組成物中の細胞の量は、少なくとも１細胞（例えば、１つの融合タンパク質修飾ＣＤ８＋Ｔ細胞部分集団、１つの融合タンパク質修飾ＣＤ４＋Ｔ細胞部分集団）であるか、またはより典型的には、１０２より多くの細胞、例えば、最大で１０６、最大で１０７、最大で１０８細胞、最大で１０９細胞、または１０１０より多くの細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、約１０６〜約１０１０細胞／ｍ２の範囲で、好ましくは約１０５〜約１０９細胞／ｍ２の範囲で投与される。細胞の数は、組成物の意図される最終使用に加えて、それに含まれる細胞のタイプにも依存することになる。例えば、特定の抗原に特異的な融合タンパク質を含有するように改変された細胞は、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれより多くのそのような細胞を含有する細胞集団を含むことになる。本明細書で提供される使用について、細胞は、一般に、１リットルもしくはそれ未満、５００ｍｌもしくはそれ未満、２５０ｍｌもしくはそれ未満、または１００ｍｌもしくはそれ未満の体積である。実施形態では、所望の細胞の密度は、通常は、１０４細胞／ｍｌより高く、一般に、１０７細胞／ｍｌより高く、一般に、１０８細胞／ｍｌであるかまたはそれより高い。細胞を、単回注入として投与してもよく、またはある時間範囲にわたって複数回の注入で投与してもよい。臨床的に意義のある数の免疫細胞を、累積的に１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０もしくは１０１１細胞であるかまたはそれを超える複数の注入物に分配することができる。
【０１６１】
本開示の宿主細胞（例えば、本開示のポリヌクレオチドを含む改変された免疫細胞）または宿主細胞組成物を含む、単位用量も、本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、単位用量は、（ｉ）少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の改変されたＣＤ４＋Ｔ細胞を含む組成物と、（ｉｉ）少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の改変されたＣＤ８＋Ｔ細胞を含む組成物とを約１：１の比で組み合わせて含み、前記単位用量は、低減された量のナイーブＴ細胞を含有するかまたはナイーブＴ細胞を実質的に含有しない（すなわち、単位用量に存在するナイーブＴ細胞の集団を、匹敵する数のＰＢＭＣを有する患者試料と比較して約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満または約１％未満有する）。
【０１６２】
一部の実施形態では、単位用量は、（ｉ）少なくとも約５０％の改変されたＣＤ４＋Ｔ細胞を含む組成物と、（ｉｉ）少なくとも約５０％の改変されたＣＤ８＋Ｔ細胞を含む組成物とを約１：１の比で組み合わせて含み、前記単位用量は、低減された量のナイーブＴ細胞を含有するかまたはナイーブＴ細胞を実質的に含有しない。さらなる実施形態では、単位用量は、（ｉ）少なくとも約６０％の改変されたＣＤ４＋Ｔ細胞を含む組成物と、（ｉｉ）少なくとも約６０％の改変されたＣＤ８＋Ｔ細胞を含む組成物とを約１：１の比で組み合わせて含み、前記単位用量は、低減された量のナイーブＴ細胞を含有するかまたはナイーブＴ細胞を実質的に含有しない。なおさらなる実施形態では、単位用量は、（ｉ）少なくとも約７０％の改変されたＣＤ４＋Ｔ細胞を含む組成物と、（ｉｉ）少なくとも約７０％の改変されたＣＤ８＋Ｔ細胞を含む組成物とを約１：１の比で組み合わせて含み、前記単位用量は、低減された量のナイーブＴ細胞を含有するかまたはナイーブＴ細胞を実質的に含有しない。一部の実施形態では、単位用量は、（ｉ）少なくとも約８０％の改変されたＣＤ４＋Ｔ細胞を含む組成物と、（ｉｉ）少なくとも約８０％の改変されたＣＤ８＋Ｔ細胞を含む組成物とを約１：１の比で組み合わせて含み、前記単位用量は、低減された量のナイーブＴ細胞を含有するかまたはナイーブＴ細胞を実質的に含有しない。一部の実施形態では、単位用量は、（ｉ）少なくとも約８５％の改変されたＣＤ４＋Ｔ細胞を含む組成物と、（ｉｉ）少なくとも約８５％の改変されたＣＤ８＋Ｔ細胞を含む組成物とを約１：１の比で組み合わせて含み、前記単位用量は、低減された量のナイーブＴ細胞を含有するかまたはナイーブＴ細胞を実質的に含有しない。一部の実施形態では、単位用量は、（ｉ）少なくとも約９０％の改変されたＣＤ４＋Ｔ細胞を含む組成物と、（ｉｉ）少なくとも約９０％の改変されたＣＤ８＋Ｔ細胞を含む組成物とを約１：１の比で組み合わせて含み、前記単位用量は、低減された量のナイーブＴ細胞を含有するかまたはナイーブＴ細胞を実質的に含有しない。
【０１６３】
本明細書に記載される実施形態のいずれにおいても、単位用量は、操作されたＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ３＋ＣＤ８＋および操作されたＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＴＭ細胞の等しいまたはほぼ等しい数を含む。
【０１６４】
本明細書において開示されるとおりの融合タンパク質または融合タンパク質を発現する細胞と、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む、医薬組成物も企図される。好適な賦形剤は、水、食塩水、デキストロース、グリセロールなど、およびそれらの組合せを含む。実施形態では、本明細書において開示されるとおりの融合タンパク質または宿主細胞を含む組成物は、好適な注入媒体をさらに含む。好適な注入媒体は、任意の等張媒体処方物、通常は生理食塩水であり得、Ｎｏｒｍｏｓｏｌ  Ｒ（Ａｂｂｏｔｔ）またはＰｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ  Ａ（Ｂａｘｔｅｒ）、水中の５％デキストロース、乳酸リンゲル液を利用することができる。注入媒体にヒト血清アルブミンまたは他のヒト血清成分が補充されることもある。
【０１６５】
医薬組成物は、医学技術分野の当業者により決定されるような、処置（または予防）される疾患または状態に適切な方法で、投与することができる。組成物の適切な用量ならびに好適な投与期間および頻度は、患者の健康状態、患者のサイズ（すなわち、体重、量（mass）または体面積）、患者の状態のタイプおよび重症度、タグ化された細胞の望ましくないタイプもしくはレベルもしくは活性、活性成分の特定の形態、ならびに投与方法などの因子によって決定される。一般に、適切な用量および処置レジメンは、治療的および／または予防的恩恵（例えば、臨床成績向上、例えば、より高頻度の完全もしくは部分的寛解、またはより長い無病および／もしくは全生存期間、または症状重症度の低下を含む、本明細書に記載されるもの）をもたらすのに十分な量で、組成物（複数可）を提供する。予防的使用のための用量は、疾患もしくは障害を予防する、疾患もしくは障害の発症を遅延させる、または疾患もしくは障害に関連する疾患重症度を低下させるのに、十分なものであるべきである。本明細書に記載される方法に従って投与される免疫原性組成物の予防的恩恵は、前臨床研究（ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの動物研究を含む）および臨床研究の実施、ならびにそこから得られるデータの適切な統計的、生物学的および臨床的方法および技法による分析によって決定することができ、前記方法および技法の全てが当業者によって容易に実施され得る。
【０１６６】
本明細書において企図される処置または予防のある特定の方法は、本明細書に記載の所望のポリヌクレオチドを含む宿主細胞（これは、自己、同種異系または同系であり得る）であって、前記ポリヌクレオチドが細胞の染色体に安定的に組み込まれている宿主細胞を投与するステップを含む。例えば、そのような細胞組成物を、自己、同種異系または同系免疫系細胞（例えば、Ｔ細胞、抗原提示細胞、ナチュラルキラー細胞）を使用してｅｘ  ｖｉｖｏで生成して、融合タンパク質を発現する所望のＴ細胞組成物を養子免疫治療として対象に投与することができる。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、造血前駆細胞またはヒト免疫細胞である。ある特定の実施形態では、免疫系細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−二重陰性Ｔ細胞、γδＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、またはそれらの任意の組合せである。ある特定の実施形態では、免疫系細胞は、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、幹細胞メモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはそれらの任意の組合せである。特定の実施形態では、細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。特定の実施形態では、細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【０１６７】
本明細書で使用される場合、組成物の投与は、送達経路または方法に関係なく、対象への組成物または治療の送達を指す。投与を持続的にまたは間欠的に、および非経口的に果たすことができる。投与は、認識された状態、疾患または病状を有すると既に確認された対象を処置するためであることもあり、あるいはそのような状態、疾患もしくは病状に罹りやすいまたはそのような状態、疾患もしくは病状を発症するリスクがある対象を処置するためであることもある。補助的治療との共投与は、任意の順序および任意の投薬スケジュールでの、複数の薬剤（例えば、融合タンパク質を発現する組換え（すなわち、操作された）宿主細胞と、１または複数のサイトカイン；免疫抑制治療、例えば、カルシニューリン阻害剤、コルチコステロイド、微小管阻害剤、低用量のミコフェノール酸プロドラッグ、またはそれらの任意の組合せ）の同時のおよび／または逐次的な送達を含み得る。
【０１６８】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組換え宿主細胞の多数の用量が対象に投与され、前記用量は、約２週間〜約４週間の投与間隔で投与され得る。
【０１６９】
なおさらなる実施形態では、処置されている対象は、免疫抑制治療、例えば、カルシニューリン阻害剤、コルチコステロイド、微小管阻害剤、低用量のミコフェノール酸プロドラッグ、またはそれらの任意の組合せをさらに受けている。なおさらなる実施形態では、処置されている対象は、非骨髄破壊的または骨髄破壊的造血細胞移植を受けたことがあり、この処置は、非骨髄破壊的造血細胞移植の少なくとも２カ月〜少なくとも３カ月後に投与することができ、移植された細胞に、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有するペプチドで、必要に応じてタグを付けることができる。
【０１７０】
医薬組成物の有効量は、本明細書に記載されるような所望の臨床結果または有益な処置を達成するために、必要な投薬量でかつ必要な期間にわたって、十分な量を指す。有効量を１または複数回の投与で送達することができる。投与が、疾患または病状を有することが既に分かっているまたは確認された対象への投与である場合、用語「治療量」を、処置に関して使用することができ、これに対して「予防有効量」を、疾患もしくは病状（例えば、再発）に罹りやすいまたは疾患もしくは病状を発症するリスクがある対象に有効量を予防的コースとして投与することを記述するために、使用することができる。
【０１７１】
ＣＴＬ免疫応答のレベルは、本明細書に記載されるおよび当技術分野において日常的に実施されている非常に多くの免疫学的方法のいずれか１つによって決定することができる。ＣＴＬ免疫応答のレベルは、例えばＴ細胞により発現される本明細書に記載される融合タンパク質のいずれか１つの投与の前および後に、決定することができる。ＣＴＬ活性を決定するための細胞傷害性アッセイは、当技術分野において日常的に実施されているいくつかの技法および方法のいずれか１つを使用して行うことができる（例えば、Henkart  et  al.,  "Cytotoxic  T-Lymphocytes"  in  Fundamental  Immunology,  Paul  (ed.)  (2003  Lippincott  Williams  &  Wilkins,  Philadelphia,
PA),  pages  1127-50およびそこに引用されている参考文献を参照されたい）。
【０１７２】
抗原特異的Ｔ細胞応答は、観察されるＴ細胞応答を本明細書に記載されるＴ細胞の機能的パラメーター（例えば、増殖、サイトカイン放出、ＣＴＬ活性、変更された細胞表面マーカー表現型など）のいずれかに従って比較することによって、通常は決定され、この比較は、適切な状況で同族抗原（例えば、免疫適合性抗原提示細胞により提示されたときにＴ細胞をプライミングまたは活性化するために使用される抗原）に曝露されるＴ細胞と、構造的に異なるまたは無関係の対照抗原の代わりに曝露される同じ供給源の集団からのＴ細胞との間で行われ得る。統計的有意性をもって、対照抗原に対する応答より大きい、同族抗原に対する応答は、抗原特異性を示す。
【０１７３】
本明細書に記載のタグ化タンパク質または細胞に対する免疫応答の存在およびレベルを決定するために、生体試料を対象から得ることができる。「生体試料」は、本明細書で使用される場合、血液試料（ここから、血清または血漿を調製することができる）、生検材料、体液（例えば、肺洗浄液、腹水、粘膜洗液、滑液）、骨髄、リンパ節、組織外植片、器官培養物、または対象もしくは生物学的供給源からの任意の他の組織もしくは細胞調製物であり得る。生体試料をいずれの免疫原性組成物を受ける前の対象から得ることもでき、この生体試料は、ベースライン（すなわち、免疫処置前）データを確立するための対照として有用である。
【０１７４】
本明細書に記載される医薬組成物は、単位用量または複数用量用容器、例えば、密封アンプルまたはバイアルに入っている状態で提供することができる。そのような容器を凍結して、製剤の安定性を保つことができる。ある特定の実施形態では、単位用量は、本明細書に記載される組換え宿主細胞を約１０７細胞／ｍ２〜約１０１１細胞／ｍ２の用量で含む。例えば、非経口もしくは静脈内の投与または製剤を含む、様々の処置レジメンにおける、本明細書に記載される特定の組成物の使用に好適な投薬レジメンおよび処置レジメンの開発。
【０１７５】
対象組成物が非経口投与される場合、その組成物は、滅菌水性または油性溶液または懸濁液も含み得る。好適な非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒としては、水、リンゲル液、等張塩類溶液、水との混合物での１，３−ブタンジオール、エタノール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール（polythethylene  glycol）が挙げられる。水溶液または水性懸濁液は、１つまたは複数の緩衝剤、例えば、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウムまたは酒石酸ナトリウムをさらに含むことができる。もちろん、いずれの投薬単位製剤の調製に使用されるいずれの材料も、薬学的に純粋でなければならず、利用される量で実質的に非毒性でなければならない。加えて、活性化合物を、徐放性調製物および製剤中に組み込むことができる。投薬単位形態は、本明細書で使用される場合、処置される対象にとって単位投薬量として適している物理的に別個の単位を指し、各単位は、適切な医薬担体と共同で所望の効果を生じさせるように計算された所定量の組換え細胞または活性化合物を含有し得る。
【０１７６】
一般に、適切な投薬量および処置レジメンは、治療的または予防的恩恵をもたらすのに十分な量で、活性分子または細胞を提供する。そのような応答は、処置されていない対象と比較して処置された対象において臨床成績向上（例えば、より高頻度の寛解、完全もしくは部分的、またはより長い無病生存期間）を確立することによって、モニタリングすることができる。腫瘍タンパク質に対する既存の免疫応答の増加は、一般に、臨床成績向上と相関する。そのような免疫応答は、標準的な増殖、細胞傷害性またはサイトカインアッセイを使用して、一般に評価することができ、前記アッセイは、当技術分野において日常的であり、処置前および後に対象から得た試料を使用して行うことができる。
【０１７７】
さらなる態様では、本明細書に記載の（ａ）宿主細胞、（ｂ）組成物または（ｃ）単位用量を含む、キットが提供される。ある特定の実施形態では、キットは、（１）タグ付き細胞の単位用量と、（２）ｓｔｒｅｐタグペプチドに特異的な融合タンパク質を発現する改変された免疫細胞とを含み、前記ｓｔｒｅｐタグペプチドは、ある特定の実施形態では、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなり得る。言い換えると、キットは、免疫治療、グラフトまたは移植における使用のためのタグ付き細胞、およびモジュレーション（例えば、アブレーション）のためのタグ付き細胞を標的とし得る改変された免疫細胞、両方を、必要に応じて提供することができる。
【０１７８】
本開示による方法は、併用療法で疾患または障害を処置するために１つまたは複数の追加の薬剤を投与することをさらに含むことができる。例えば、ある特定の実施形態では、併用療法は、融合タンパク質（または前記融合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）を免疫チェックポイント阻害剤とともに（併せて、同時に、または逐次的に）投与することを含む。一部の実施形態では、併用療法は、本開示の融合タンパク質（または前記融合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）を刺激性免疫チェックポイント剤のアゴニストとともに投与することを含む。さらなる実施形態では、併用療法は、本開示の融合タンパク質（または前記融合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）を第２の治療、例えば、化学療法剤、放射線治療、外科手術、抗体またはそれらの任意の組合せとともに投与することを含む。
【０１７９】
本明細書で使用される場合、用語「免疫抑制（immune  suppression）剤」または「免疫抑制（immunosuppression）剤」は、免疫応答の制御または抑制を補助するための阻害性シグナルをもたらす１つまたは複数の細胞、タンパク質、分子、化合物または複合体を指す。例えば、免疫抑制剤は、免疫刺激を部分的にもしくは完全に遮断する、免疫活性化を減少、予防もしくは遅延させる、または免疫抑制を増加、活性化もしくは上方調節する分子を含む。標的化する（例えば、免疫チェックポイント阻害剤で）ための例示的な免疫抑制剤としては、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ２４４／２Ｂ４、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＫＩＲ、ＰＶＲ１Ｇ（ＣＤ１１２Ｒ）、ＰＶＲＬ２、アデノシン、Ａ２ａＲ、免疫抑制性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−３５）、ＩＤＯ、アルギナーゼ、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ−５、Ｔｒｅｇ細胞、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。
【０１８０】
免疫抑制剤阻害剤（免疫チェックポイント阻害剤とも呼ばれる）は、化合物、抗体、抗体断片もしくは融合ポリペプチド（例えば、Ｆｃ融合体、例えば、ＣＴＬＡ４−ＦｃもしくはＬＡＧ３−Ｆｃ）、アンチセンス分子、リボザイムもしくはＲＮＡｉ分子、または低分子量有機分子であり得る。本明細書において開示される実施形態のいずれにおいても、方法は、本開示の融合タンパク質（または前記融合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）を、単独でのまたは任意の組合せでの下記の免疫抑制成分のいずれか１つに対する１つまたは複数の阻害剤とともに、投与することを含み得る。
【０１８１】
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、ＰＤ−１阻害剤、例えば、ＰＤ−１特異的抗体またはその結合断片、例えば、ピディリズマブ、ニボルマブ（キートルダ、旧名ＭＤＸ−１１０６）、ペムブロリズマブ（オプジーボ、旧名ＭＫ−３４７５）、ＭＥＤＩ０６８０（旧名ＡＭＰ−５１４）、ＡＭＰ−２２４、ＢＭＳ−９３６５５８、またはそれらの任意の組合せと組み合わせて使用される。さらなる実施形態では、本開示の融合タンパク質（または前記融合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）は、ＰＤ−Ｌ１特異的抗体またはその結合断片、例えば、ＢＭＳ−９３６５５９、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、アテゾリズマブ（ＲＧ７４４６）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、またはそれらの任意の組合せと組み合わせて使用される。
【０１８２】
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質（または前記融合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）は、ＬＡＧ３阻害剤、例えば、ＬＡＧ５２５、ＩＭＰ３２１、ＩＭＰ７０１、９Ｈ１２、ＢＭＳ−９８６０１６、またはそれらの任意の組合せと組み合わせて使用される。
【０１８３】
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、ＣＴＬＡ４の阻害剤と組み合わせて使用される。特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質（または前記融合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）は、ＣＴＬＡ４特異的抗体またはその結合断片、例えば、イピリムマブ、トレメリムマブ、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質（例えば、アバタセプト、ベラタセプト）、またはそれらの任意の組合せと組み合わせて使用される。
【０１８４】
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質（または前記融合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）は、Ｂ７−Ｈ３特異的抗体またはその結合断片、例えば、エノブリツズマブ（ＭＧＡ２７１）、３７６．９６、または両方と組み合わせて使用される。Ｂ７−Ｈ４抗体結合断片は、例えば、Dangaj  et  al.,  Cancer  Res.73:4820,  2013に記載されているｓｃＦｖまたはその融合タンパク質、ならびに米国特許第９，５７４，０００号、ＰＣＴ特許公開番号ＷＯ／２０１６４０７２４Ａ１およびＷＯ２０１３／０２５７７９Ａ１に記載されているものであり得る。
【０１８５】
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質（または前記融合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）は、ＣＤ２４４の阻害剤と組み合わせて使用される。
【０１８６】
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質（または前記融合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）は、ＢＬＴＡ、ＨＶＥＭ、ＣＤ１６０の阻害剤、またはそれらの任意の組合せと組み合わせて使用される。抗ＣＤ１６０抗体は、例えばＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１０／０８４１５８に記載されている。
【０１８７】
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質（または前記融合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）は、ＴＩＭ３の阻害剤と組み合わせて使用される。
【０１８８】
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質（または前記融合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）は、Ｇａｌ９の阻害剤と組み合わせて使用される。
【０１８９】
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質（または前記融合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）は、アデノシンシグナル伝達の阻害剤、例えば、デコイアデノシン受容体と組み合わせて使用される。
【０１９０】
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質（または前記融合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）は、Ａ２ａＲの阻害剤と組み合わせて使用される。
【０１９１】
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質（または前記融合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）は、ＫＩＲの阻害剤、例えばリリルマブ（ＢＭＳ−９８６０１５）と組み合わせて使用される。
【０１９２】
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質（または前記融合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）は、阻害性サイトカイン（通常は、ＴＧＦβ以外のサイトカイン）またはＴｒｅｇ発生もしくは活性の阻害剤と組み合わせて使用される。
【０１９３】
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質（または前記融合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）は、ＩＤＯ阻害剤、例えば、レボ-１-メチルトリプトファン、エパカドスタット（ＩＮＣＢ０２４３６０；Liu  et  al.,  Blood  115:3520-30,  2010）、エブセレン（Terentis  et  al.,  Biochem.49:591-600,  2010）、インドキシモド、ＮＬＧ９１９（Mautino  et  al.,  American  Association  for  Cancer  Research  104th  Annual  Meeting  2013;  Apr  6-10,  2013）、１−メチル−トリプトファン（１−ＭＴ）−チラ−パザミン、またはそれらの任意の組合せと組み合わせて使用される。
【０１９４】
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質（または前記融合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）は、アルギナーゼ阻害剤、例えば、Ｎ（オメガ）−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ）、Ｎ−オメガ−ヒドロキシ−ノル−ｌ−アルギニン（ノル−ＮＯＨＡ）、Ｌ−ＮＯＨＡ、２（Ｓ）−アミノ−６−ボロノヘキサン酸（ＡＢＨ）、Ｓ−（２−ボロノエチル）−Ｌ−システイン（ＢＥＣ）、またはそれらの任意の組合せと組み合わせて使用される。
【０１９５】
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質（または前記融合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）は、ＶＩＳＴＡの阻害剤、例えばＣＡ−１７０（Ｃｕｒｉｓ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）と組み合わせて使用される。
【０１９６】
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質（または前記融合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）は、ＴＩＧＩＴの阻害剤、例えばＣＯＭ９０２（Ｃｏｍｐｕｇｅｎ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）など、ＣＤ１５５の阻害剤、例えばＣＯＭ７０１（Ｃｏｍｐｕｇｅｎ）など、または両方と組み合わせて使用される。
【０１９７】
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質（または前記融合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）は、ＰＶＲＩＧの阻害剤、ＰＶＲＬ２の阻害剤、または両方と組み合わせて使用される。抗ＰＶＲＩＧ抗体は、例えばＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１６／１３４３３３に記載されている。抗ＰＶＲＬ２抗体は、例えばＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１７／０２１５２６に記載されている。
【０１９８】
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質（または前記融合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）はＬＡＩＲ１阻害剤と組み合わせて使用される。
【０１９９】
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質（または前記融合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）は、ＣＥＡＣＡＭ−１の阻害剤、ＣＥＡＣＡＭ−３の阻害剤、ＣＥＡＣＡＭ−５の阻害剤、またはそれらの任意の組合せと組み合わせて使用される。
【０２００】
ある特定の実施形態では、本開示の融合タンパク質（または前記融合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）は、刺激性免疫チェックポイント分子の活性を増加させる（すなわち、アゴニストである）薬剤と組み合わせて使用される。例えば、本開示の融合タンパク質（または前記融合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）を、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）アゴニスト（例えば、ウレルマブなど）、ＣＤ１３４（ＯＸ−４０）アゴニスト（例えば、ＭＥＤＩ６４６９、ＭＥＤＩ６３８３、またはＭＥＤＩ０５６２など）、レナリドミド、ポマリドミド、ＣＤ２７アゴニスト（例えば、ＣＤＸ−１１２７など）、ＣＤ２８アゴニスト（例えば、ＴＧＮ１４１２、ＣＤ８０、またはＣＤ８６など）、ＣＤ４０アゴニスト（例えば、ＣＰ−８７０，８９３、ｒｈｕＣＤ４０Ｌ、またはＳＧＮ−４０など）、ＣＤ１２２アゴニスト（例えば、ＩＬ−２など）、ＧＩＴＲのアゴニスト（例えば、ＰＣＴ特許公開番号ＷＯ２０１６／０５４６３８に記載されているヒト化モノクローナル抗体など）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）のアゴニスト（例えば、ＧＳＫ３３５９６０９、ｍＡｂ  ８８．２、ＪＴＸ−２０１１、Ｉｃｏｓ  １４５−１、Ｉｃｏｓ  ３１４−８など、またはそれらの任意の組合せ）と組み合わせて使用することができる。本明細書において開示される実施形態のいずれにおいても、方法は、本開示の融合タンパク質（または前記融合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）を、単独でのまたは任意の組合せでの上述のいずれかを含む、刺激性免疫チェックポイント分子についての１つまたは複数のアゴニストとともに投与することを含み得る。
【０２０１】
ある特定の実施形態では、併用療法は、本開示の融合タンパク質（または前記融合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）と、非炎症型固形腫瘍により発現されるがん抗原に特異的である抗体もしくはその抗原結合断片、放射線処置、外科手術、化学療法剤、サイトカイン、ＲＮＡｉのうちの１つもしくは複数、またはそれらの任意の組合せを含む、第２の治療とを含む。
【０２０２】
ある特定の実施形態では、併用療法の方法は、融合タンパク質を投与すること、および放射線処置または外科手術をさらに施すことを含む。放射線治療は、当技術分野において周知であり、Ｘ線治療、例えばガンマ線照射、および放射性医薬品治療を含む。対象における所与のがんまたは非炎症型固形腫瘍の処置に適切な外科手術および外科的技法は、当業者には周知である。
【０２０３】
ある特定の実施形態では、併用療法の方法は、本開示の融合タンパク質（または前記融合タンパク質を発現する操作された宿主細胞）を投与すること、および化学療法剤をさらに投与することを含む。化学療法剤は、クロマチン機能の阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、微小管阻害薬、ＤＮＡ傷害剤、代謝拮抗薬（例えば、葉酸アンタゴニスト、ピリミジン類似体、プリン類似体、および糖修飾類似体）、ＤＮＡ合成阻害剤、ＤＮＡ相互作用剤（例えば、挿入剤）、およびＤＮＡ修復阻害剤を含むが、これらに限定されない。実例となる化学療法剤は、これらに限定されないが、以下の群を含む：代謝拮抗薬／抗がん剤、例えば、ピリミジン類似体（５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビンおよびシタラビン）およびプリン類似体、葉酸アンタゴニストおよび関連阻害剤（メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチンおよび２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン））；抗増殖性／抗有糸分裂剤、これには、天然産物、例えば、ビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビン）、微小管破壊剤、例えば、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロンおよびナベルビン、エピジポドフィロトキシン（エトポシド、テニポシド）、ＤＮＡ傷害剤（アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、サイトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミン、オキサリプラチン、イホスファミド、メルファラン、メクロレタミン（merchlorehtamine）、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソウレア、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテール、テモゾロミド（temozolamide）、テニポシド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびエトポシド（ＶＰ１６））が含まれる；抗生物質、例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、アントラサイクリン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）およびマイトマイシン；酵素（Ｌ−アスパラギンを全身代謝させ、独自のアスパラギンを合成する能力がない細胞を欠乏させる、Ｌ−アスパラギナーゼ）；抗血小板剤；抗増殖／抗有糸分裂アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミドおよび類似体、メルファラン、クロラムブシル）、エチレンイミンおよびメチルメラミン（ヘキサメチルメラミンおよびチオテパ）、アルキルスルホネート−ブスルファン、ニトロソウレア（カルムスチン（ＢＣＮＵ）および類似体、ストレプトゾシン）、トリアゼン（trazene）−ダカルバジン（dacarbazinine）（ＤＴＩＣ）；抗増殖／抗有糸分裂代謝拮抗薬、例えば、葉酸類似体（メトトレキサート）；白金配位錯体（シスプラチン、カルボプラチン）、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、ミトタン、アミノグルテチミド；ホルモン、ホルモン類似体（エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド）およびアロマターゼ阻害剤（レトロゾール、アナストロゾール）；抗凝固薬（ヘパリン、合成ヘパリン塩および他のトロンビン阻害剤）；線維素溶解剤（例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼおよびウロキナーゼ）、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ；抗遊走剤；分泌抑制剤（ブレフェルジン（breveldin））；免疫抑制薬（シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ−５０６）、シロリムス（ラパマイシン）、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）；抗血管新生化合物（ＴＮＰ４７０、ゲニステイン）および成長因子阻害剤（血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）阻害剤）；アンジオテンシン受容体遮断薬；一酸化窒素ドナー；アンチセンスオリゴヌクレオチド；抗体（トラスツズマブ、リツキシマブ）；キメラ抗原受容体；細胞周期阻害剤および分化誘導剤（トレチノイン）；ｍＴＯＲ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤（ドキソルビシン（アドリアマイシン）、アムサクリン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、テニポシド（eniposide）、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）およびミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン）、コルチコステロイド（コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン（methylpednisolone）、プレドニゾン、およびプレニゾロン（prenisolone））；成長因子シグナル伝達キナーゼ阻害剤；ミトコンドリア機能不全誘導剤、毒素、例えば、コレラ毒素、リシン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓアデニル酸シクラーゼ毒素、またはジフテリア毒素、およびカスパーゼ活性化因子；ならびにクロマチン破壊剤。
【０２０４】
サイトカインは、抗がん活性に対する宿主免疫応答を操作するために使用されることが増えている。例えば、Floros  &  Tarhini,  Semin.Oncol.42(4):539-548,  2015を参照されたい。免疫抗がんまたは抗腫瘍応答の促進に有用なサイトカインとしては、例えば、単独での、または本開示の結合タンパク質もしくは結合タンパク質を発現する細胞との任意の組合せでの、ＩＦＮ−α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２４、およびＧＭ−ＣＳＦが挙げられる。
【０２０５】
なおさらなる態様では、本開示の融合タンパク質をその細胞表面に発現するように改変された免疫細胞（すなわち、宿主細胞）を活性化または刺激するための方法であって、前記改変された免疫細胞を、前記改変された免疫細胞を活性化するのに十分な条件下で、前記改変された免疫細胞を活性化するのに十分な時間、ｓｔｒｅｐタグペプチド（これは、一部の実施形態では、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むか、または配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなる）と接触させることを含む方法が、提供される。ある特定の実施形態では、ｓｔｒｅｐタグペプチドは、細胞の表面に位置する。ある特定の実施形態では、ｓｔｒｅｐタグペプチドは、細胞表面タンパク質、例えば、細胞表面受容体またはマーカーに含有される。さらなる実施形態では、細胞表面受容体は、ＣＡＲまたはＴＣＲを含む。特定の実施形態では、細胞表面タンパク質は、１〜約５つのｓｔｒｅｐタグペプチド（例えば、１、２、３、４、５または６つのｓｔｒｅｐタグペプチド）を含む。
【０２０６】
追加の態様では、改変された免疫細胞を活性化または刺激するための方法であって、前記改変された免疫細胞を、前記改変された免疫細胞の細胞表面のｓｔｒｅｐタグペプチドと特異的に結合する結合タンパク質と接触させることによって、前記改変された免疫細胞を活性化または刺激することを含む方法が提供され、前記改変された免疫細胞は、（ａ）ｓｔｒｅｐタグペプチドを含有する細胞表面受容体を必要に応じてコードする、細胞表面受容体をコードする第１のポリヌクレオチドであって、前記細胞表面受容体が標的抗原と特異的に結合する、第１のポリヌクレオチドと、（ｂ）タグペプチドを含有する細胞表面マーカーを必要に応じてコードする、細胞表面マーカーをコードする第２のポリヌクレオチドであって、コードされたｓｔｒｅｐタグペプチドが、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を必要に応じて含むかまたは配列番号１９に示されるアミノ酸配列から必要に応じてなる、第２のポリヌクレオチドとを含み、ただし、前記細胞表面受容体および前記細胞表面マーカーの少なくとも一方は、前記ｓｔｒｅｐタグペプチドを含有する。実例として、改変された免疫細胞を活性化または刺激する例は、（ａ）配列番号１９のｓｔｒｅｐタグペプチド（例えば、ＣＡＲとの融合体として、またはＥＧＦＲｔなどの形質導入マーカーとの融合体として発現される）をその細胞表面に発現する抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、（ｂ）前記ｓｔｒｅｐタグペプチドと特異的に結合する結合タンパク質（例えば、必要に応じて融合タンパク質に含まれている、抗体またはその抗原結合断片）と接触させることを含む。
【０２０７】
ある特定の実施形態では、細胞表面受容体は、タグペプチドを含む。さらなる実施形態では、細胞表面受容体は、ＣＡＲまたはＴＣＲを含む。他の実施形態では、細胞表面マーカーは、タグペプチドを含む。ある特定の実施形態では、細胞表面受容体と細胞表面マーカーの両方が、ｓｔｒｅｐタグペプチドを含む。
【０２０８】
ある特定の実施形態では、活性化または刺激される改変された宿主細胞は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫ−Ｔ細胞）を含む。ある特定の実施形態では、細胞表面受容体は、ＣＡＲもしくはＴＣＲである、またはＣＡＲもしくはＴＣＲを含む。さらなる実施形態では、マーカーは、ＥＧＦＲｔ、ＣＤ１９ｔ、ＣＤ３４ｔ、またはＮＧＦＲｔを含む。特定の実施形態では、改変された免疫細胞は、複数回、活性化または刺激され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、活性化または刺激され得る。
【実施例】
【０２０９】
（実施例１）
抗ＳＴＩＩＣＡＲおよびＳＴＩＩタグ付きＣＡＲの設計および発現
養子免疫治療において使用するためのタグ付きＣＡＲは、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２０１５／０９５８９５に記載されている。そのようなＣＡＲを発現する細胞が選択的にアブレーションの標的にされ得るかどうかを調査するために、抗ＣＤ１９−ＳＴＩＩ  ＣＡＲ（配列番号１９）（タグ付きＣＡＲ）をコードする発現構築物および抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲをコードする発現構築物を生成した。例示的構築物を図１（左上および左下）に示し、コードされたＣＡＲを発現する細胞の概略図を右に示す。
【０２１０】
マウス抗ＳＴＩＩモノクローナル抗体５Ｇ２および３Ｅ８に由来するｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬおよびＶＬ−ＶＨ配向；配列番号５、６、１１および１２）を使用して、追加の抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲを産生した。ｓｃＦｖ配列を、中等度の長さの（ＩｇＧ４  ＣＨ３のみ）または長い（ＩｇＧ４ＣＨ２Ｎ２９７ＱＣＨ３）免疫グロブリンスペーサードメインを有する４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ  ＣＡＲベクターにサブクローニングして、図２に示すＣＡＲ設計を生じさせた。
【０２１１】
次に、初代ＰＢＭＣに、図１に示すＣＡＲ構築物で形質導入し、発現アッセイを行った。手短に述べると、細胞をフローサイトメトリーにより分析し、ビオチン化抗ＥＧＦＲ抗体およびストレプトアビジンＰＥを使用してＥＧＦＲｔ形質導入マーカーを検出した。抗ＣＤ１９−ＳＴＩＩ  ＣＡＲと抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲの両方が、確固たる発現を示した（図３；「Ｂ」および「Ｃ」）。追加の高親和性抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲも、初代ＰＢＭＣにおいて発現された（図４Ｂ）。
【０２１２】
（実施例２）
抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の機能的特徴付け
次に、図２に示す抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ構築物を、ＳＴＩＩタグ付きＣＡＲ  Ｔ細胞の認識について試験した。手短に述べると、ヒトＴ細胞に抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ構築物で形質導入し、抗ＣＤ１９−ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（抗ＣＤ１９  ＣＡＲに含有されている１、２もしくは３つのＳＴＩＩペプチドタグ）とともに、または対照抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＳＴＩＩなし）とともに、インキュベートした。ＰＭＡ／イオノマイシンで刺激したＴ細胞を陽性対照として使用した。２４時間の時点で、培養上清をＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γについて検査した。図５Ａに示すように、抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の全てが、標的ＣＡＲ  Ｔ細胞に応答してサイトカインを産生した。５Ｇ２  ｓｃＦｖ結合ドメインを有する抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、サイトカインの最大量を産生したが、３Ｅ８に基づくＣＡＲ  Ｔ細胞は、より少ない量を産生した。反応性は、標的中に存在するＳＴＩＩペプチドの数に伴って増加するように見えた。
【０２１３】
増殖アッセイを行って、タグ付き標的細胞に応答しての抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の拡大を調査した。抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞にカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルで標識し、対照抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＳＴＩＩなし）または抗ＣＤ１９−ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞で刺激した。刺激の３日後に細胞をフローサイトメトリーにより分析した。結果を図５Ｂに示す。試験した全ての抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、刺激に応答して増殖し、５Ｇ２に基づく抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のほうが３Ｅ８に基づく抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞よりも拡大した。
【０２１４】
（実施例３）
抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞溶解活性
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイを行って、抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の特異的殺滅活性を測定した。１つの実験では、Ｃｒ５１標識標的細胞（対照抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ；抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ；抗ＣＤ１９−３ＳＴＩＩ）を、抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と、様々なエフェクター：標的比（３０：１、１０：１、３：１、１：１）で共培養（４時間）した。その後、標準式を使用してクロム放出により特異的溶解を決定した。データを図６Ａ〜６Ｃに示す。試験した抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の全てに、標的細胞に対する細胞溶解活性があり、５Ｇ２に基づく細胞に最も強い活性があった。注目すべきことに、５Ｇ２に基づく抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、１：１のＥ：Ｔで、抗ＣＤ１９−３ＳＴＩＩ細胞のおおよそ４０％を溶解した。
【０２１５】
別の実験では、抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（抗ＣＤ１９−ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞に対する）および抗ＣＤ１９−ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＤ１９＋Ｋ５６２細胞に対する）の殺滅活性を試験した。手短に述べると、ＰＢＭＣを抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激試薬で２日間刺激し、その後、ＣＡＲ構築物でのγ−レトロウイルス形質導入を行った。ＥＬＩＳＡによるユーロピウムＴＤＡ放出アッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を製造業者の説明書に従って使用して、特異的溶解（Ｙ軸）を測定した。図７に示すように、ＣＡＲ  Ｔ細胞の両方の群が、用量依存的な形でそれらのそれぞれの標的に対する殺滅活性を示した。第３の実験では、抗ＳＴＩＩ（エフェクター）および抗ＣＤ１９−ＳＴＩＩ  ＣＡＲ発現細胞（標的）のより長い共インキュベーション後に殺滅活性を測定した。ＰＢＭＣを抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８で２日間刺激し、初代細胞に抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ構築物で形質導入した。抗ＣＤ１９−ＳＴＩＩ  ＣＡＲを発現するＨＥＫ２９３細胞を標的として使用した。細胞を２０時間、共インキュベートし、ｘＣＥＬＬＩＧＥＮＣＥ  ＲＴＣＡアッセイ（ＡＣＥＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用してインピーダンスによって標的細胞の溶解を測定した。抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の殺滅能力は、時間依存的なおよび用量依存的な形で増加した（図８）。
【０２１６】
（実施例４）
ｉｎ  ｖｉｖｏ動物研究のための抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲの構築および試験
実施例３に記載したｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結果が、ヒトへの応用のための治療の情報をもたらすものであるかどうかを判定するには、ｉｎ  ｖｉｖｏ動物研究が必要である。このために、マウスモデルに投与したときの免疫原性のリスクを低下させるためにマウス成分を使用して抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲを生成した。手短に述べると、マウス膜貫通および細胞内成分と（１）マウスＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン（中等度のスペーサー）または（２）単一Ｍｙｃタグ＋Ｇ４Ｓリンカー（短いスペーサー）のどちらかからなるスペーサーとを有するＣＡＲ構築物に、５Ｇ２  ｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ立体配置）をサブクローニングした。例示的ＣＡＲ設計を図９に示す。
【０２１７】
次に、マウスＴ細胞に、図９に示す抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲを発現するように形質導入した。構築物によりコードされたものでもある２Ｍｙｃ−ＥＧＦＲｔ形質導入マーカーについての染色により、ＣＡＲ発現を判定した。抗ＳＴＩＩマウスＣＡＲ  Ｔ細胞を、ｍＣＤ１９−ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＡＲスペーサー領域に含有されている、もしくは共発現される短縮型ＥＧＦＲに融合されている、どちらかの、ＳＴＩＩの１つのコピーを有する）とともに、または陰性対照細胞（抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ、ＳＴＩＩなし）とともに、インキュベートした。非処置およびＰＭＡ／イオノマイシン処置Ｔ細胞を陽性対照として使用した。サイトカイン産生（ＩＦＮ−γ、図１０Ａ；ＩＬ−２、図１０Ｂ）を２４時間の時点で測定した。これらのデータは、抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲが、細胞表面ＳＴＩＩを（ＣＡＲの一部として、またはＥＧＦＲｔ／ＳＴＩＩ融合体で、どちらかで）発現する細胞に、マウスＴ細胞の特異性を向け直したことを示す。
【０２１８】
（実施例５）
抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を使用するタグ付きＣＡＲ  Ｔ副作用の低減
次に、ＳＴＩＩタグ付きＣＡＲ  Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで排除し、それによってタグ付きＣＡＲ  Ｔ細胞からの副作用を低減させる、抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の能力（この場合は、照射およびタグ付き抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞での処置後にＢ細胞無形成症からの回復を可能にすること）を、マウスモデルを使用して調査した。先ず、ＣＡＲの細胞表面発現を検査した。手短に述べると、ＣＡＲ発現構築物で形質導入したＣＤ４５．１＋マウスＴ細胞を、マウス抗ＣＤ１９、抗ＣＤ４５．１、抗ＥＧＦＲ、抗ＳＴＩＩおよび抗Ｍｙｃモノクローナル抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。細胞表面発現が全てのＣＡＲについて確認された（図１１Ａ）。次いで、図１１Ｂに示す処置スケジュールに従って、細胞をＣＤ４５．２＋Ｃ５７／Ｂｌ６マウスに注射した。手短に述べると、全てのマウスに、６Ｇｙ全身照射（ＴＢＩ）を０日目に、２Ｇｙ（ＴＢＩ）を＋２７日目に施して、Ｂ細胞計数値を低下させた。非処置マウスには、照射のみを施し、ＣＡＲ  Ｔ細胞を施さなかった。対照マウスには、抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を施したが（＋０日目）、抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を施さなかった。試験マウスに、０日目に、５×１０６のＣＤ４５．１＋マウス抗ＣＤ１９−ＳＴＩＩ−ＣＤ２８ζ＋ＥＧＦＲｔ＋脾細胞を投与した。＋２８日目に、試験マウスに、短い（１つのＭｙｃタグ）スペーサーを有する抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ（処置「第１群」）または中等度の長さの（ＣＨ３）スペーサーを有する抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ（処置「第２群」）を発現する１×１０７のＣＤ４５．１＋マウスＴ細胞を輸注した。処置スケジュール全体を通してフローサイトメトリーによりＰＢＭＣ中のＴおよびＢ細胞計数値をモニタリングした。
【０２１９】
第１群からのデータを、図１１Ｃおよび１１Ｄに示す。手短に述べると、抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の頻度、および抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の頻度を、抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の注入後２８、３１、４２、５６および７０日目にモニタリングした。図１１Ｃに示すように、Ｍｙｃタグスペーサーを有する抗ＳＴＩＩ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで有効に移入され、抗ＣＤ１９−ＳＴＩＩ細胞をある程度排除した。Ｂ細胞計数値もフローサイトメトリーにより（抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の注入後＋３１および＋４２日目に）測定した。図１１Ｄは、短い（Ｍｙｃタグ）スペーサーを有する抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲを発現するＴ細胞での処置がマウスにおけるＢ細胞無形成症を好転させなかったことを示す。
【０２２０】
第２群からのデータを、図１１Ｅおよび１１Ｆに示す。ＰＢＭＣ中の抗ＣＤ１９−１ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞および抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の頻度を、抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の注入後２８、３１、４２、５６および７０日目にモニタリングした。図１１Ｅに示すように、Ｍｙｃタグスペーサーを有する抗ＳＴＩＩ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで有効に移入され、抗ＣＤ１９−ＳＴＩＩ細胞を排除した。Ｂ細胞計数値もフローサイトメトリーにより（抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の注入後＋３１および＋４２日目に）測定した。図１１Ｆは、中等度のスペーサーを有する抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲを発現するＴ細胞での処置が、マウスにおけるＢ細胞無形成症を有効に好転させたことを示す（下方左側パネル）。実験的処置スケジュールからのＢ細胞回復データを図１１Ｇに要約する。
【０２２１】
図１２Ａに示される第２の実験的処置では、Ｃ５７／Ｂｌ６マウスに上で説明したように亜致死線量の照射を施し、その後、＋０日目に、１×１０６のマウスＣＤ４５．１＋抗ＣＤ１９−３ＳＴＩＩ−２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を輸注して、Ｂ細胞無形成症を誘導した。３５日目に、マウスに、１．５×１０６のＯＴ−１  ＣＤ４５．１／２＋抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を施し、その後、１１３日目に２．５×１０６のＯＴ−１  ＣＤ９０．１＋抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を施した。全体を通して、フローサイトメトリーによりＢ細胞計数値をモニタリングした。図１２Ｂは、注入前の、抗ＣＤ１９−３ＳＴＩＩ−２８ｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の発現（左）および精製抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のソーティング（右）を示す。初回抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞移入後にＣＡＲ  Ｔ細胞計数値をモニタリングし、これは、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞計数値の持続的減少を示した（図１５Ａ）。内在性Ｂ細胞計数値もモニタリングし、未処置（「ｎｅｇ」）マウスに対して処置（「試料」）マウスにおける顕著な回復を示した（図１５Ｂ）。
【０２２２】
内在性Ｂ細胞の枯渇を、マウスへの照射および抗ＣＤ１９−３ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞注入後、しかし抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の移入前に確認した。手短に述べると、ＰＢＭＣを生存リンパ球にゲートしてフローサイトメトリーにより分析した（図１３Ａ）。次いで、ゲートした細胞を、ＣＤ１９ＰＥを使用してフローサイトメトリーにより（１３Ｂ〜１３Ｈ）、または抗ＰＥ磁気マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して（図１３Ｉ）、ＣＤ１９発現について分析した。図１４〜１６Ｄに示されるように、抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の注入は、内在性Ｂ細胞の回復を可能にした（「試料」データを参照されたい）。注目すべきことに、一次組織からのエンドポイント分析は、ＣＡＲ  Ｔ細胞および回復したＢ細胞の大部分が、脾臓に存在し、それより低い程度ではあるがリンパ節に存在することを示した（図１６Ａ〜１６Ｄ）。
【０２２３】
（実施例６）
抗原特異的Ｔ細胞におけるＳＴＩＩおよびＣＡＲの発現の脱共役
前の実施例で使用したタグ付きＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＡＲ分子の一部としてＳＴＩＩを発現した。しかし、抗タグＣＡＲ  Ｔ細胞による認識のために有効に提示されるタグペプチドの能力は、タグの発現部位による影響を受ける可能性がある。このことを試験するために、抗ＣＤ１９  ＣＡＲの発現をＳＴＩＩタグの発現から脱共役するように発現構築物を設計した。具体的には、ＳＴＩＩをコードする配列を、ＥＧＦＲｔをコードする配列の３’末端に融合させた。ＣＡＲおよびＥＧＦＲｔ：ＳＴＩＩコード領域は、自己切断ペプチド配列により分離されており、したがって、コードされたＣＡＲおよびＥＧＦＲｔ：ＳＴＩＩタンパク質は、別々の分子として細胞膜に局在する。図１７Ｂおよび１７Ｅ。
【０２２４】
２つの発現構築物（抗ＣＤ１９−３ＳＴＩＩ−２８ｚ＿ＥＧＦＲｔおよび抗ＣＤ１９−２８ｚ＿Ｅ−３ＳＴＩＩ）を、図１８Ａに図示する実験でマウスにおける発現および活性について試験した。手短に述べると、マウスに亜致死線量の照射を施し、その後、どちらかの構築物で形質導入した２×１０６のＣ５７／Ｂｌ６  ＣＤ９０．１＋／−Ｔ細胞を施した。フローサイトメトリー分析は、ＣＡＲおよびＳＴＩＩ発現が脱共役された細胞（抗ＣＤ１９−２８ｚ＿Ｅ−３ＳＴＩＩ）のほうが、ＣＡＲの一部としてＳＴＩＩを発現する細胞よりも効率的に拡大することを示した。図１８Ｂ。どちらかの構築物を発現するＣＡＲ  Ｔ細胞での処置は、内在性Ｂ細胞計数値を低減させた。図１９。
【０２２５】
ＳＴＩＩおよびＣＡＲ発現の、脱共役の抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞による認識に対する効果を検査した。マウスに亜致死線量の照射を施し、その後、０日目に、どちらかのＣＡＲ−ＳＴＩＩ構築物で形質導入した２×１０６のＣ５７／Ｂｌ６  ＣＤ９０．１＋／−Ｔ細胞を注射した。＋４０日目に、マウスに２．５×１０６のＣＤ４５．１＋／−抗ＳＴＩＩ細胞を注入した。図２０Ａ。３つのＣＡＲ  Ｔ細胞型の発現が確認された（図２０Ｂ）。Ｂ細胞計数値を、抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の注射後＋６および＋３５日目にフローサイトメトリーにより分析した（それぞれ、図２１Ａ〜２１Ｂおよび２２Ａ〜２２Ｂ）。驚くべきことに、内在性Ｂ細胞の回復は、抗ＣＤ１９−２８ｚ＿Ｅ−３ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を施したマウスにおいて、より高度であった。これは、ＳＴＩＩの抗ＣＤ１９  ＣＡＲからの脱共役が、抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞による認識および殺滅を改善することを示唆する。
【０２２６】
エンドポイント分析は、回復したＢ細胞が、分析した全ての一次組織に存在したことを示し、抗ＳＴＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞計数値が、タグ付き抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞のものより高いことも示した。図２３Ａおよび２３Ｂ。理論により拘束されることを望まないが、これらのデータは、タグおよび抗原特異的受容体が細胞表面に別々の分子として発現されたとき、タグ付き抗原特異的Ｔ細胞が、より有効に抗タグＣＡＲ  Ｔ細胞による標的にされ得ることを示唆する。
【０２２７】
上記の様々な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を得ることができる。本明細書において言及する、および／または米国特許仮出願第６２／５５５，０１２号に収載されている、および／または出願データシートに収載する、米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許公表文献の全ては、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。様々な特許、出願および公表文献の概念を利用するために必要に応じて実施形態の態様を修飾して、なおさらなる実施形態を得ることができる。
【０２２８】
上記の詳細な説明に照らして、これらおよび他の変更を実施形態に加えることができる。一般に、下記の特許請求の範囲において使用する用語は、本明細書および本特許請求の範囲において開示する特定の実施形態に、本特許請求の範囲を限定すると解釈すべきでなく、そのような特許請求の範囲に権利がある均等物の全範囲とともに全ての可能な実施形態を含むと解釈すべきである。したがって、本特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
【図１】
2020535796.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ−４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ−６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ−１３Ｈ】
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【図１３Ｉ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７Ａ−１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ−ｉ】
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【図２１Ａ−ｉｉ】
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【図２１Ｂ−ｉ】
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【図２１Ｂ−ｉｉ】
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【図２２Ａ−ｉ】
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【図２２Ａ−ｉｉ】
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【図２２Ｂ−ｉ】
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【図２２Ｂ−ｉｉ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【配列表】
2020535796000001.app
【国際調査報告】
2020535796.tif 000056
2020535796.tif 000057
2020535796.tif 000058