(57)【要約】本発明は、不均質性を含む流体の膜（３）の受入領域を画定する、撮像のおよびレーザー（５）のスペクトル域内の透明スライドと、局所パルス（local pulse）を印加するために、流体膜（３）の平面内に焦点を合わせるための、制御される転換（diversion）手段および光学ブロック（１０）に関連するレーザー源（５）と、を有する、標的上にバイオインクを転写するための装置に関し、前記装置は、また、膜内における不均質性の幾何学的位置、および適当な解析手段によって認識される不均質性（サイズ、形状因子、粒子のタイプ、粒子の齢、密度、生物材料のタイプ、分子、・・・）の各々の観察可能な特徴を認識するために、撮像手段および画像を解析するための手段を含み、装置は、このように位置しおよび特性化される不均質領域のうちの少なくとも１つを選択するための選択手段、および前記不均質領域の位置に向かってレーザービームを方向付けおよびレーザーの発射をトリガするために転換を制御するための手段、をさらに含むことを特徴とする。本発明は、また、本発明を実施するための方法に関する。
2020511162.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
−  異質性を含む流体膜（３）のための受け入れ領域を画定する撮像およびレーザー（５）のスペクトル領域内の透明スライド、
−  限局化パルスを印加するように流体膜（３）の平面内に焦点を合わせるための、制御される偏向手段および光学ユニット（１０）に関連するレーザー源（５）、
を含む、標的にバイオインクを転写させるための器具であって、
前記器具は、
−  不均質性の公称断面よりも少なくとも５倍大きい撮像区画を有する撮像領域を撮像するための手段と、
−  画像解析手段であって、
・  前記膜内の前記不均質性の幾何学的位置と、
・  適当な分析的手段による、認識される不均質性（サイズ、形状因子、粒子のタイプ、粒子の齢、密度、生物材料のタイプ、分子、・・・）の各々の観察可能な特性と、
を認識するための画像解析手段、および
−  このように位置しおよび特性化される不均質帯域のうちの少なくとも１つを選択するための、および前記不均質帯域の前記位置に向かってレーザービームを方向付けるためおよびレーザーパルスをトリガするために前記偏向手段を制御するための、手段、
をさらに含むことを特徴とする標的にバイオインクを転写させるための器具。
【請求項２】
前記バイオインクの前記不均質性は、粒子で構成されていることを特徴とする請求項１に記載の標的にバイオインクを転写させるための器具。
【請求項３】
前記バイオインクの前記不均質性は、生物材料によって構成されることを特徴とする請求項１に記載の標的にバイオインクを転写させるための器具。
【請求項４】
前記バイオインクの前記不均質性は、生化学的種（成長因子、生物学的分子、イオン、等）によって構成されることを特徴とする請求項１に記載の標的にバイオインクを転写させるための器具。
【請求項５】
前記バイオインクの前記不均質性は、粒子、および／または生物材料および／または生化学的種の組み合わせによって構成されることを特徴とする請求項１に記載の標的にバイオインクを転写させるための器具。
【請求項６】
前記撮像フィールドは、１×１ｍｍより大きいことを特徴とする請求項１に記載の標的にバイオインクを転写させるための器具。
【請求項７】
前記撮像領域は、前記レーザーと前記流体膜との間の相互作用の領域を含むことを特徴とする請求項１に記載の標的にバイオインクを転写させるための器具。
【請求項８】
前記撮像領域は、前記レーザーと前記流体膜との間の相互作用領域とは異なることを特徴とする請求項１に記載の標的にバイオインクを転写させるための器具。
【請求項９】
それは、前記撮像領域内に存在する不均質性の前記特性化のための画像処理を実行するローカルコンピュータを含むことを特徴とする請求項１に記載の標的にバイオインクを転写させるための器具。
【請求項１０】
それは、前記撮像領域内に存在する不均質性の前記特性化のための画像処理を実行するリモートコンピュータとの通信の手段を含むことを特徴とする請求項１に記載の標的にバイオインクを転写させるための器具。
【請求項１１】
前記特性化手段は分光計を含むことを特徴とする請求項１に記載の標的にバイオインクを転写させるための器具。
【請求項１２】
前記膜は生細胞を含むことを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項１３】
それは、レーザー材料相互作用（多色印刷）のいくつかの領域を含むことを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項１４】
それは、印刷領域から過剰の印刷されたアイテムを除去するための吸引システムを含むことを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項１５】
それは、印刷された基材を撮像するための手段を含むことを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項１６】
画像再構築手段は、リアルタイム処理と両立可能な情報処理能力を有することを特徴とする請求項１に記載の器具。
【請求項１７】
転写器具内に、複数の不均質性を含む透明流体膜の受け入れ領域を画定する透明スライドを配置する工程、およびレーザービームの前記膜との相互作用を引き起こすために、制御される偏向手段に関連するレーザーによって放出されるレーザーパルスの配向および作動を制御する工程、からなり、
ｅ）不均質性の公称断面よりも少なくとも５倍大きい撮像断面を持つ膜の領域の少なくとも１つの撮像ステップ、
ｆ）前記不均質性の幾何学的位置、および認識される不均質性（サイズ、形状因子、粒子タイプ、粒子の齢、生物材料密度、生物材料タイプ、分子、・・・）の各々のうちの少なくとも１つの観察可能な特性、を認識するための少なくとも１つの画像解析ステップ、
ｇ）このように位置しおよび特性化される前記不均質性のうちの１つを選択する少なくとも１つのステップ、および
ｈ）前記レーザービームを１つの不均質性の位置に方向付けるための前記偏向手段の制御、およびレーザーパルスをトリガするための制御、を含む、少なくとも１つの転写ステップ、
をさらに含むことを特徴とする、標的にバイオインクを転写させるための方法。
【請求項１８】
転写させられるべき前記不均質性は、粒子であることを特徴とする請求項１７に記載の標的にバイオインクを転写させるための方法。
【請求項１９】
転写させられるべき前記不均質性は、生物材料であることを特徴とする請求項１７に記載の標的にバイオインクを転写させるための方法。
【請求項２０】
転写させられるべき前記不均質性は、生化学的種（成長因子、生物学的分子、イオン、等）であることを特徴とする請求項１７に記載の標的にバイオインクを転写させるための方法。
【請求項２１】
転写させられるべき前記不均質性は、粒子、および／または生物材料および／または化学種の組み合わせであることを特徴とする請求項１７に記載の標的にバイオインクを転写させるための方法。
【請求項２２】
それは、撮像、解析および特性化のステップならびに少なくとも１つの限局化されおよび特性化された不均質性に各々対応する複数の転写ステップを含むことを特徴とする請求項１７に記載の標的にバイオインクを転写させるための方法。
【請求項２３】
それは、一方での撮像、解析および特性化のステップおよび他方での転写ステップの交替を含むことを特徴とする請求項１７に記載の標的にバイオインクを転写させるための方法。
【請求項２４】
それは、転写されるべき不均質性の規則正しいシーケンスを計算するステップを含むことを特徴とする請求項１７に記載の標的にバイオインクを転写させるための方法。
【請求項２５】
前記撮像ステップは、撮像された不均質性に対応する単純化されたパターンを抽出するように生画像を処理する工程を含むことを特徴とする請求項１７に記載の標的にバイオインクを転写させるための方法。
【請求項２６】
前記不均質性の前記位置の計算およびそれらの特性化のステップは同時に実施されることを特徴とする請求項１７に記載の標的にバイオインクを転写させるための方法。
【請求項２７】
前記不均質性の前記位置の計算およびそれらの特性化のステップは、並列アーキテクチャを備えるプロセッサ上で実行されるアルゴリズムによって処理することによって実施されることを特徴とする請求項１７に記載の標的にバイオインクを転写させるための方法。
【請求項２８】
それは、転写後の転写領域の画像を理論的移植のマップと比較する付加的なステップを含むことを特徴とする請求項１７に記載の標的にバイオインクを転写させるための方法。
【請求項２９】
それは、観察された転写と理論的移植との間の違いを修正するための新規転写をトリガする付加的なステップを含むことを特徴とする請求項２８に記載の標的にバイオインクを転写させるための方法。
【請求項３０】
それは、観察された転写と理論的移植との間の違いを修正するための付加的な吸引ステップを含むことを特徴とする請求項２８に記載の標的にバイオインクを転写させるための方法。
【請求項３１】
前記膜は生細胞を含むことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、再生医療、薬理学および細胞生物学の研究における使用のための生物工学によって作られた構造を生成するために、所定の２Ｄまたは３Ｄ構造（organization）を持つ生体材料（living material）および任意選択的に非生体材料（non-living material）をモデル化しおよび組み立てるためのコンピュータ支援転写プロセスによるレーザーバイオプリンティングの分野に関する。
【０００２】
レーザー支援バイオプリンティングは、組織の個々の要素をその製造の間に細胞および生物材料（biomaterials）の層ごと（layer-by-layer）の堆積によって高精度で組織化することを可能にする。それは、特定の幾何学的構造を持つ３Ｄ組織を再生（reproduce）することを可能にする。ブリックごと（brick by brick）におよび次いで層ごとに目的物を組み立てる工程に基づく「ボトムアップ（bottom-up）」アプローチは、組織製造プロセスの自動化と両立可能であり、および無菌環境において運用することができる。加えて、自動化は、コストを削減し、生物学的組織製造の質および再生性（reproducibility）を向上させ得る。
【０００３】
本発明は、より具体的には、マイクロメートルの解像度での印刷基材（printing substrate）上の粒子の堆積に向けられるレーザービームの直接（レーザー放射の吸収）および間接（プラズマおよびキャビテーション気泡の生成）作用に基づくレーザー支援堆積解決策（laser-assisted deposition solution）に関する。
【背景技術】
【０００４】
技術水準
論文（非特許文献１）は、そのようなプロセスを実施するための器具の例を記載する。
【０００５】
技術水準において、少なくとも１つのインクで印刷するための方法および器具を記載する特許出願（特許文献１）もまた知られており、前記方法は、インク膜内にキャビテーション気泡を生成させるようにレーザービームの焦点を合わせるステップと、インク膜の自由表面から少なくとも１つのインク滴を形成するステップと、受け入れ基材（receiving substrate）の堆積表面上に前記滴を堆積させるステップと、を含み、レーザービームは、重力と反対の方向に配向され、膜の自由表面は、インク膜の上に配置される堆積表面に向かって上方に配向されることを特徴とする。
【０００６】
この構成は、特に、インク膜に関して実質的に一定の厚さＥを得て、一方では、沈降現象（settling phenomena）の発生を制限することを可能にする。その上、それは、広範囲のインクの使用を可能にする。この構成は、また、ジェットの形成を研究しおよび制御するためのシャドウグラフによる時間分解撮像（time-resolved imaging）（ＴＲＩ）の使用を可能にする。
【０００７】
ニューロンのレーザーアブレーションの監視に適用されるリアルタイム撮像技術の別の例は、出版物（非特許文献２）に記載される。この構成において、視野は非常に小さく、および多数の複雑な光化学的（photochemical）および光生物学的（photo-biological）現象が研究されるレーザーアブレーション帯域に焦点が合わせられる。これは、微細加工（micro-machining）のためのレーザー物質相互作用プロセス（laser-matter interaction process）に関連する撮像の一般的な例（general example）である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１６／０９７６１９号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】F. Guillemot, A. Souquet, S. Catros, B. Guillotin, J. Lopez, M. Faucon, B. Pippenger, R. Bareille, M. Remy, S. Bellance, P. Chabassier, J. C. Fricain, and J. Amedee, "High-throughput laser printing of cells and biomateiral s for tissue engineering," Acta Biomater. 6, 2494- 2500 (2010)
【非特許文献２】"Real time imaging of femtosecond laser induced nano-neurosurgery dynamics in C. elegans", OPTICS EXPRESS 364, Vol. 18, No. 1, 4 January 2010.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
先行技術の技術的問題
バイオプリンティングの分野において、バイオインクは、いわゆる不均質媒体であり、すなわち、それらは、浮遊粒子（suspended particles）または溶液中の異なる生化学的種（biochemical species）（成長因子（growth factors）、生物学的分子（biological molecules）、イオン、等）、または生物材料（溶液中に均一に分散された、またはいくつかある場合には、勾配もしくは共線状流束（co-linear fluxes）を有する）のいずれか、またはこれらの３つの主成分の多かれ少なかれ複雑な混合物を含有し、後者が最も一般的である。これらのインクの複雑性、特にそれらの不均質性は、レーザーによる前方バイオプリンティングの先行技術において、全く対処されていない。
【００１１】
加えて、先行技術は、バイオインクの粒子密度は高度にランダム（コロイド流体）であり、したがって、統計学的やり方で、受け入れ基材への多数の粒子の転写をもたらすことを示している。
【００１２】
そのような状況において、先行技術の解決策は、正確な組成（生化学的または生物材料粒子または種）を持つバイオインク膜内において、それを膜内に存在するバイオインクを構成する他の要素と区別する特定の特性によって、あらかじめ定義されたバイオプリンティング計画に対応する適切な（right）バイオインク組成物を受容体に転写するように、選定することができない。
【００１３】
先行技術の解決策において、レーザーは、「盲目的に（blindly）」転写されることとなる不均質性を含むことが予期される膜の領域と相互作用し、膜は、まさに飽和に近い十分な密度の転写可能粒子を含み、十分な数の粒子の転写を保証する。
【００１４】
膜は、十分な数の粒子を維持するために、新しい粒子を含む流体で手動で周期的に再充填（rechargeed）され、盲目的な転写を可能にする。そのような問題は、結局、全てのバイオプリンティングプロセス、特にインクジェットおよび押し出しに共通することが指摘され得る。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明によって提供される解決策
前置きとして、バイオインク膜の「不均質性（inhomogeneity）」は、膜の任意の領域が、組成、すなわち、粒子、生化学的種（成長因子、生物学的分子、イオン、等）または生物材料のいずれか、の観点において、それ自身の特性を有することを意味する。概して、用語「不均質帯域」、「組成の局所変動」、「特定組成帯域」は、総称「不均質性（inhonomogeneity）」と同義語として使用される。
【００１６】
これらの不利点に対処するために、本発明は、その最も一般的な意味において、標的へのバイオインクの転写のための器具に関し：
−  複数の粒子および／または複数の生化学的種および／または複数の生物材料、または複数の粒子および／または１つまたは複数の生物材料タイプおよび／または１つまたは複数の生化学的種および／または１つまたは複数の生化学的種タイプ、のいずれかを含む異質性（heterogeneous）流体膜のための受け入れ領域（reception area）を画定する透明スライドと、
−  限局化パルス（localized pulse）を印加するように流体膜の平面内に焦点を合わせるための、制御される偏向手段（deflection means）および光学ユニットに関連するレーザー源と、
を含み、前記器具は、
−  バイオインク膜の不均質性の公称区画よりも少なくとも５倍大きい撮像区画（imaging section）を有する撮像領域（imaging area）を撮像するための手段と、
−  画像解析手段であって、
・  膜内の不均質性の幾何学的位置、
・  特性化手段（characterization means）（例えば光学撮像、ラマン分光法または自己蛍光（auto-fluorescence）分析）による、および時空間（spatio-temporal）解析手段（不均質性の挙動の個々のおよび／またはグループの動力学、等）による、認識される不均質性（サイズ、形状因子（shape factor）、粒子のタイプ、粒子の齢（particle age）、生物材料の密度およびタイプ、分子、・・・）の各々の観察可能な特性、
を認識するための、画像解析手段と、
−  このように位置しおよび特性化される不均質性のうちの少なくとも１つを選択するための、および不均質性の位置に向かってレーザービームを方向付けおよびレーザーパルスをトリガするように偏向手段を制御するための、手段と、
をさらに含むことを特徴とする。
【００１７】
その変形のいくつかによると：
−  上部撮像フィールドは、１×１ｍｍであり、
−  撮像フィールドは、ＲＯＩ（関心領域）を適用することによってスケーラブルであり、
−  撮像領域は、レーザーの流体膜との相互作用の領域を含み、
−  撮像領域は、例えば２つの別個の焦平面上または同一焦平面の２つの隣接領域上において、レーザーの流体膜との相互作用領域とは異なる。
−  器具は、撮像領域内に存在する不均質性を特性化するための画像処理を実行するローカルコンピュータを含む。
−  器具は、撮像領域内に存在する不均質性を特性化するための画像処理を実行するリモートコンピュータとの通信の手段を含む。
−  特性化の手段は、以下の要素：単色または多色光学撮像システム、ラマン分光計、赤外分光計、または粒子および生物材料の内在性（endogenous）自己蛍光の分析の手段、のうちの１つまたは複数を含む。
−  膜は、原核の（prokaryotic）または真核の（eukaryotic）、浮遊した（suspended）または凝集した（aggregated）、生細胞（living cells）を含む。
−  膜は、成長因子または決定された生体分子（biomolecules）のような生化学的種とはもちろん、１つまたは複数のタイプの細胞と、潜在的に混合され得る１つまたは複数の生物材料を含む。そのような構成は、プロセスを単純化しおよびそれをより速くおよびより安価にすることによる、特定の組織（certain tissues）を生成するための「特異的（unique）」インクとして使用され得る非常に複雑なおよび異質性のインクの作製への道を開く。複雑性は、次いで、複雑なおよびカスタマイズ可能な組織の制御された製造を可能にするために、流体膜内に存在する粒子、生物材料および／または化学種の多数の領域の場所および特性化に素早く対処する、この発明の能力にあることとなる。
−  システムは、また、有利には、あらかじめ定義されたバイオプリンティング計画に適合するように標的とされる広範囲の不均質性へのアクセスを提供すると同時に、高い生産性を保証するように、連続的なバイオインク再充填デバイスと組み合わされ得る。
【００１８】
本発明は、また、不均質性を含むバイオインクの標的への転写のための方法に関し、複数の不均質性（粒子または生化学的もしくは生物材料種）を含む透明流体膜の受け入れ領域を画定する透明スライドを転写器具内に配置する工程、および制御される偏向手段に関連するレーザーによって放出されるレーザーパルスの配向および活性化を制御して、レーザービームの前記膜との相互作用を引き起こす工程、にあり、方法は：
ａ）不均質性の公称断面よりも少なくとも５倍大きい撮像断面（imaging cross-section）を持つ膜の領域の少なくとも１つの撮像ステップ、
ｂ）不均質性の幾何学的位置、および認識される不均質性（サイズ、形状因子、粒子タイプ、粒子の齢、生物材料のタイプおよび密度、分子、．．．）の各々のうちの少なくとも１つの観察可能な特性、を認識するための少なくとも１つの画像解析ステップ、および
ｃ）このように位置しおよび特性化される不均質性のうちの１つを選択する少なくとも１つのステップ、および
ｄ）選択された不均質性の位置へレーザービームを方向付けるための偏向手段の制御およびレーザーパルスをトリガするための制御を含む少なくとも１つの転写ステップ、
をさらに含むことを特徴とする。
【００１９】
プロセスの変形によると：
−  それは、また、撮像、解析および特性化のステップならびに転写されるべき少なくとも１つの限局化され（localized）および特性化された領域に各々対応する複数の転写ステップを含む。
−  それは、交互の、一方での撮像、解析および特性化のステップならびに他方での転写ステップを含む。
−  それは、転写されるべきフィールドの規則正しいシーケンス（ordered sequence）を計算するステップを含む。
−  撮像ステップは、転写されるべき領域に対応する単純化されたパターンを抽出するために生画像を処理する工程を含む。
−  位置計算および転写されるべき領域の特性化のステップは、同時に行われる。
−  位置を計算しおよび転写されるべき領域を特性化するステップは、並列アーキテクチャプロセッサ上で実行されるアルゴリズムに基づく処理によって行われる。
−  それは、転写後の印刷された領域の画像と理論的移植（theoretical implantation）のマップとを比較する付加的なステップを含む。
−  それは、観察された転写と理論的移植との間の違いを修正するための新規転写をトリガする付加的なステップを含む。
−  前記膜は、生細胞を含み、
−  前記膜は、１つまたは複数のタイプの生化学的種を含み、
−  前記膜は、１つまたは複数のタイプの生物材料を含み、
−  前記膜は、同一の生物材料の様々な濃度を含み、
−  プロセスは、また、レーザーパルス領域を連続的にまたは不連続的に充填するようにバイオインク膜を再充填するための手段を含んでもよい。バイオインクの不均質性は、次いで、膜内部で必然的に（necessarily）動いており（in motion）、これは、バイオインクを素早くおよび信頼性を持って特性化するためのデータ取得および処理の適当な手段の使用を必然的にもたらす（implies）。これらの手段は、撮像、分光法、物理化学的分析、オンライン測定、等の使用を含んでいてもよい。
【００２０】
本発明の目的のために、「不均質性」は、有機、鉱物または生体（living）組成物のバイオインクの関心領域、特に：
−  エキソソーム（exosomes）または細胞によって生成される他の小胞（vesicles）、または生物材料（ヒドロキシアパタイト）のナノ粒子、または生体分子（成長因子）のナノカプセル、のようなナノスコピック粒子、
−  生細胞（真核細胞、幹細胞、小球体（globules）、．．．）、生物材料のマイクロ粒子、生体分子（成長因子）のマイクロカプセル、のようなマイクロスコピック粒子、
−  細胞または生物材料のクラスターで構成されるスフェロイドのようなメソスコピック粒子、
を意味する。
【００２１】
好ましくは、バイオプリンティングの状況下で、粒子は、生細胞、エキソソームまたは生体分子のような生物学的性質を持つ物体（objects）として定義される。
【００２２】
しかしながら、この器具および対応するプロセスは、本発明のこの定義にとどまらない。実際に、粒子は、また、非生物学的（すなわち、不活性）であり得、および例えば、それらの性質が目標とされる用途に応じる１つまたは複数の生物材料で構成され得る。
【００２３】
非制限的な例示的実施形態の詳細な説明
他の特徴および利点は、本発明の以下の記載から明らかになり、前記記載は、添付図面を参照して単に例として与えられる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明による器具の概略図である。
【図２】取得画像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明の背景
本発明は、ヒトの組織を３Ｄで再構築することを目的とする、レーザーバイオプリンティング（ＬＡＢ）の分野の一部である。ＬＡＢの原理は、生物材料、生化学的種の溶液および／または液体媒体中の細胞浮遊からなるバイオインク膜上に吸収によってプラズマを作り出すようにレーザーを焦点に合わせることにある。このプラズマから、キャビテーション気泡がバイオインク中に生成される。この気泡は、その流体力学的運動を通して、物質の流れを作り出す点までバイオインクの自由表面を変形させる。この流れの特性は、多数の物理的パラメータに依存する。受け入れ基材への材料の転写が制御されたやり方で起こるのは、この流れ（これは少数の細胞、生物材料または化学種を含む）を通してである。
【００２６】
この状況において、
−  天然の生体組織（living tissue）にできるだけ近い性質（形状および機能）を有する２Ｄ／３Ｄオブジェクトのいずれか、
−  または組織形態形成（morphogenesis）、または外用剤（external agents）（活性剤（active agents））に対する生物学的応答機構、の理解を向上させるために生物学的状況を複雑にし／試験し／シミュレートすることを可能にするキメラ、
を得るために、特定のパターン／場所によって生物学的組織の構成成分を印刷することが必要である。
【００２７】
このように、細胞の印刷と併せて行われる生物材料の印刷はまた、要求されるアイテムを実現するために、印刷された細胞に生存可能な環境を提供するために、非常に特定の印刷スキームに従わなければならない。要するに、受け入れ基材上に印刷される細胞／生物材料／生化学的種の量および位置を制御することは、バイオプリンティングされるアイテムの必要なおよび期待される質を実現するために必須である。
【００２８】
この発明の目的は、不均質なバイオインク中の特定組成の領域を印刷前に識別／マッピングし、およびしたがって、印刷されるべき領域（「レシーバー（receiver）」上）および標的アイテムのＣＡＤの間にデザインされるパターンによる所望の組成領域を特に目指すようにレーザーをトリガすることを可能にする測定デバイスをセットアップすることである。
【００２９】
この目的のために、本発明は：
ｉ）ドナーの２Ｄ特性化を実行する工程、
ｉｉ）アドホックなデジタル処理によって不均質性を検出する工程、
ｉｉｉ）特定の組成領域の位置を自動的にマッピングする工程、
ｉｖ）レーザー発射（laser shooting）パターン（印刷軌道（printing trajectory））を特定のドナー組成の領域のマッピングと一致（matching）させる工程、
にある。
【００３０】
バイオプリンティングの状況において、特に新モデルを開発（developing）するときに、マーカーは、印刷されたアイテムの特性化を支援するための外用剤（免疫マーキング、蛍光．．．）によって細胞をタグ付けするために、一時的に使用され得る。他方、インビトロまたはインビボ用途のためのモデルを生成するときに、細胞は、それらは標的組織の構成単位（building blocks）を構成するので、任意の外因性障害から十分に保護されたままでなければならない。したがって、それらは、これらの場合において、外用剤によってマークされ得ない。したがって、細胞の検出は、培地（culture media）内部において、それらの屈折率はこれらの培地の主成分である水の屈折率と極めて近いので、比較的複雑になる。細胞の撮像（Cellular imaging）は、したがって、対処されるべき重要な問題を既に呈している。
【００３１】
加えて、プリンティングヘッドの充填動力学（filling dynamics）または浮遊細胞の自然な動きは、経時的な細胞の位置に直接的に影響を及ぼす。これは、レーザー印刷パスがそれらの場所のマッピングに常に即するべきである場合に、それらの位置を繰り返しておよび高周波で検出することを意味する。これは、高速で作動しなければならない検出およびマッピング手段に直接的な影響をもたらす（データ取得を可能にするハードウエア部およびデータ処理を可能にするソフトウエア部の両方に関して）。
【００３２】
本発明が解決しようと目指す、提起された問題は、したがって：
−  視覚化するのが困難であるバイオインクの組成（不均質性）内の局所変動を検出する（撮像手段＋画像処理)、
−  不均質性をマッピングする（ドナー中のそれらの数および位置の両方が与えられることを可能にする画像処理）、
−  マッピングに対応するレーザー発射（laser shots）を行う（リアルタイムでの印刷軌道の適応）、
ために多様である（manifold）。
【００３３】
変形によると、この発明は、また、細胞分類（cell sorting）の非常に興味深い事例：  −  生細胞のみを印刷するために、生細胞および視細胞を区別することができること。
−  同一インク中に（自発的に共培養（co-culture）によってまたはよらないで）混合されているであろう２つの細胞タイプを解離（dissociate）させることができること、
−  同一タイプの細胞をしかし高度な差異（disparity）で区別することができること（幹細胞、異なるレベルの分化（differentiation）／成熟（maturity））、
−  観察領域内に存在し自発的にまたは自発的にではなく生成されたであろう同一生物材料の集結（concentrations）の領域を区別することができること、
−  同一バイオインク中に混合されているであろう異なる生物材料を区別することができること、
をカバーすることを目的とする。
【００３４】
性能レベルにおいて、本発明の目的である「標的発射（Target-Shoot）」機能は：
−  さもなければ「印刷歩留まり（Printing Yield）」として知られる、印刷プロセスの合理化（バイオインク中に存在する細胞の数に対する印刷された細胞の数の比）。これは、プロセスの間に使用されない細胞の数を最小限にする。
−  空間的に存在する細胞の数に基づいてレーザー発射帯域を選択することによるプロセスの最適化（同一領域を印刷するために多数の（multiple）レーザー発射の使用を必要としない）。これは、レーザー発射の数を最小限にしおよびしたがって細胞ストレス（cellular stress）を最小限にするために、印刷パスを最適化することを意味する、
−  さもなければ「印刷率（Printing Rate）」として知られる、レーザー発射（laser firing）の効率のために（必要な場合）プロセスをスピードアップすること。
−  「標的発射（Target-Shot）」法は、どんな時でも流れが比較的高流量（high）となるバイオインク中における細胞変位（displacements）を測定することを可能にしなければならないので、プロセスを、連続的な再充填カートリッジ（recharging cartridge）と両立可能にすること、
を可能にしなければならない。
【００３５】
利害（stakes）は、また：
−  「印刷歩留まり」の制御（mastery）のために、細胞を少量または希薄な量で印刷することを可能にすること。これは、利用可能な（available）細胞の数が非常に少ない特定の薬学、化粧用または臨床の用途に関して、極めて重要な点である。
−  空間的に存在する細胞の数によるレーザー発射領域の制御された選択による組織モデルの非常に高度な（advanced）オーダーメードを可能にすること。したがって、研究所または製造業者からのオーダーメードの組織の開発（development）の要求への対応は、標的発射法によって支援される高解像度および高精度のレーザープロセスによって可能にされる非常に広範囲の市場および用途によって、可能になる。
−  標的発射機能によって保証されるレーザー発射の体系的な効率によるプロセスの加速（「印刷率」）のために、プロセスの工業化（industrialisation）およびその生産性の増大を可能にすること、
−  バイオインクの取り扱いは連続的な再充填カートリッジにより最適化されおよび自動化されるので、テクノロジーの使用をはるかに容易にすること、
−  印刷されたパターンとＣＡＤデザインされたパターンとの間の良好な一致を保証するために、バイオプリンティングプロセスの間のどんな時でも（レーザー印刷前／レーザー印刷後の比較）転写される粒子の数を制御すること。
−  転写の時に分類されるであろう異なる組織成分がその中に配置されるであろう単一カートリッジ（または低減された数のカートリッジ）を一体化することによって、バイオプリンティングデバイスのコストを削減すること。潜在的に、コスト削減は、医療分野におけるバイオプリンティングの使用にとって大いに有効であろう単回使用カートリッジの具現（definition）への道を開きさえし得る。
である。
【００３６】
器具の説明
それは、例えば１８メガピクセルの高精細度センサからなる、カメラ（１）を含む。例えば、カメラ（１）は、ＩＤＳ社によって参照番号「ＵＳＢ  ３  ｕＥｙｅ  ＣＰ」で市販されるセンサである。
【００３７】
このカメラ（１）は、フィールドレンズとして作用しおよびしたがって膜（３）の焦平面とカメラセンサ（１）の平面との間において画像を結合させることを保証する第２の画像結合（image-combining）光学ユニット（２）に関連する。
【００３８】
膜（３）は、レーザーパルスがトリガされたときに細胞または粒子がそれに対して転写される標的（１１）の前に配置される。
【００３９】
例えば、第２の画像結合光学ユニット（２）は、レンズからなり、好ましくはテレセントリックであり、可視域において最適化される少なくとも２つのレンズを含む。
【００４０】
光路は、ハイパスダイクロイックミラー（４）によって反射され、赤外線（レーザー（５）の発振波長（emission wavelength）に対応する）を送信しおよび可視域内の波長を反射する。
【００４１】
器具はまた、必要な場合に例えば放出されるビームから源が発散（divergent）するときに光源（６）をコリメートすることがその機能である整形光学系（shaping optics）（７）に関連する、可視域で放射する（emitting）光源（６）を含む。この光源は、単一のＬＥＤ源、ＬＥＤのアレイからなる構成要素、または白熱灯のような白色光源、ハロゲンランプ、スーパーコンティニュームレーザー、・・・であり得る。それはまた、マーカーまたは粒子の蛍光励起を可能にする波長で放射する狭スペクトル源（使用されるテクノロジーのまさに本質、または光学フィルタの使用、のいずれかによる）からなり得る。
【００４２】
セパレータースライド（８）は、照明光路および観察光路を重ね合わせるために使用される。
【００４３】
ダイクロイックミラー（４）の出口において、スキャナに向かって進む２つのビーム（照明およびレーザー）は、互いに共線状（co-linear）であり、および事実上、膜から戻る撮像ビームと共線状でもある。したがって、３つのビームは、ダイクロイックミラー（４）とインク膜（３）との間において共線状である。
【００４４】
それらは、外部コンピュータによって制御される配向を保証するスキャナ（９）によって偏向（deflected）させられる。
【００４５】
スキャナ（９）は、上述される３つの共線状ビームの角度配向を提供し、２つの垂直軸に沿って、それらのうちの２つは、バイオインクを含むドナー上で走査させられ、および最後のもの（the last）は、撮像システム（imaging system）に向かうコリメートされる撮像ビームに「偏向」させられる。それは、例えば、電磁アクチュエータによって駆動される２つのミラー、例えば、ＳＣＡＮＬＡＢ（商標）社によって参照符「ＳＣＡＮｃｕｂｅ  １４」で市販されるもの、から成る。
【００４６】
３つの観察、照明およびレーザービームは、このように共線状であり、およびスキャナの出口（９）において同一方向に配向させられる。したがって、観察方向および照明方向は、レーザービームの配向に従う。
【００４７】
光学ユニット（１０）の機能は：
ａ）角度配向を膜（３）の平面内における２つの軸Ｘ、Ｙに沿った横方向の配置／変位に変更すること、
ｂ）膜（３）の同一の平面内においてレーザービームおよび照明ビームの焦点を合わせること、および
ｃ）カメラ（１）による観察画像を構成するために、膜（３）によって反射される可視領域（visible domain）内の光を集めること、
である。
【００４８】
光学ユニット（１０）は、テレセントリックなレンズを形成する１組のレンズからなり、以下の特性を備える：
赤外線スペクトル内において、レンズ表面は、高いレーザーエネルギーを支持するために、反射防止コーティングで処理される。これは、第１の光学ユニット（１０）の経時による劣化を防止し、そのデザインは、前記第１の光学ユニット（１０）内部におけるレーザー「ホットスポット」の創出を防止するように計算される。
【００４９】
ダイクロイックミラー（４）は、パルスがトリガされたときに、カメラ（１）へのレーザー赤外線放射の戻りを防止する。任意選択的に、赤外線阻止フィルタは、また、ダイクロイックフィルタ（４）とカメラ（１３）との間の光路内に配置され得る。
【００５０】
第２の光学ユニット（２）の焦点距離とレンズ（１０）の焦点距離との比は、その最も小さい観察された対象が１ピクセルよりも大きいサイズを有する画像をカメラ（１）の平面内に（in the plane）提供するように決定される。
【００５１】
器具は、また、カメラ（１）からデータを受信するコンピュータ（１２）、および
標的（１１）を観察する第２のカメラ（１３）を含む。このコンピュータ（１２）は、また、スキャナ（９）およびレーザー（５）を制御する。
【００５２】
操作（Operation）
コンピュータ（１２）は、異なる処理タスク：
−  カメラ（１）からの生画像の前処理、
−  前述の前処理の間に識別される粒子の限局化および特性化、
−  レーザーの発射を粒子の位置に一致させるためのスキャナ（９）およびレーザー（５）の制御処理、
−  任意選択的に、標的（１１）を観察するカメラ（１３）からの生画像の処理、
を実施するためのコンピュータプログラムを実行する。
【００５３】
カメラからの生画像の前処理
この前処理は、レーザートリガシーケンス（laser triggering sequence）が展開される（engaged）前にまたは連続するトリガシーケンスの間に膜（３）のマッピングを記録するために、周期的に行われ得る。
【００５４】
第１の解決策は、膜が安定粒子を担持する状況に、膜平面内におけるそれらの場所の観点およびそれらの発達（development）の観点の両方から、特に適当である。これは、例えば、基材に関してあまり反応性でない鉱物または有機粒子に関する。
【００５５】
第２の解決策は、粒子が可動（mobile）およびスケーラブルである状況に、よりよく適する。これは、例えば、膜内において移動可能であり使用される細胞および媒体のタイプに強く依存するであろう凝集する強い傾向を持つ、細胞のような生体粒子（living particles）の場合である。
【００５６】
両方の場合において、処理は、例えば、分割（segmentation）、形状認識、または外形（contour）および重心認識技術による、関心粒子に対応するグラフィックアイテムの検出に対応する生画像から情報を抽出する工程にある。
【００５７】
分水嶺、メイヤーの洪水アルゴリズム（Watershed, Meyer's flooding algorithm）または最適全域森アルゴリズム閾値技術（Optimal spanning forest algorithms thresholding techniques）は、このマッピングを実行するために使用されてもよい。
【００５８】
この処理は、いくつかの段階：
−  生画像の復元または調整（ノイズ抑制、ブレ防止（de-blurring）、不均一な照明の修正）の段階、
−  分割段階、
−  特性抽出段階、
−  およびデータ解析段階、
に分けられ得る。
【００５９】
この処理は、各識別されたグラフィックアイテムに、ＩＤ±識別子および膜平面内におけるデカルト座標（Cartesian coordinates）の形式での位置を割り当てる。
【００６０】
図２は、カメラ（１）によって取り込まれた生画像（２０）、および画像フィールド内における複数の粒子の存在を示す拡大された領域（２１）、に基づく画像のシーケンスを示す。
【００６１】
閾値処理（thresholding processing）は、画像（２２）に示されるように、ヒストグラムの形式でコントラスト変化を計算するための知られているやり方で、使用される。このヒストグラムは、閾値アルゴリズムを用いることによってコントラスト画像（contrasted image）（２３）を計算することを可能にする。
【００６２】
このコントラスト画像（２３）は、質量中心（centroids）（画像（２４））および外形（画像（２５））を計算するために使用される。
【００６３】
この情報は、各処理されたグラフィックアイテムの識別子およびこれらのアイテムの各々の中心の座標の表（２６）を構築することを可能にする。
【００６４】
特性化処理は：
−  アイテムのサイズ等級、
−  特定の照明、例えば光ルミネセンスに対する反応、
−  スペクトル特性、
−  外形のタイプ（形状、規則正しさ（regularity）、・・・）、
−  アイテムの凝集体（aggregate）に対する属性（affiliation）、
−  アイテムの光学濃度（optical density）、
−  凝集体の密度（凝集したアイテムの推定数）、
−  時空間動力学、
のようなこれらの物理的パラメータによってあらかじめ定義されたファミリーに対するそれらの属性に従って、識別されおよび限局化されたグラフィックアイテムの各々に特質（attributes）を割り当てることにある。
【００６５】
これらのパラメータは、もちろん、制限的でなはい。
【００６６】
この処理の結果は、各識別子に、等級の１つまたは複数のシリーズに対する属性についての情報を加えることによって、上記表を完成させる。
【００６７】
処理は、好ましくは、並列にされ、およびＧＰＵのような並列アーキテクチャプロセッサ上で行われる。
【００６８】
情報は、次いで、コンピュータ（１２）の制御下において、スキャナ配向の計算および次いでレーザーパルスのトリガという結果をもたらすレーザー発射のシーケンスの計算のために、このように実施されるマッピングを以前に記録された標的マップと一致させるために使用される。シーケンスの計算は、「巡回セールスマンの最適化問題またはＮＰ完全問題の解決策」のような知られているアルゴリズムによる、大域（global）プロセス時間の低減の計算を考慮に入れる。
【００６９】
各レーザー発射後または一連のレーザー発射後に、コンピュータは、標的（１１）を観察するカメラ（１３）によって送信された画像とあらかじめ登録された標的マップとを比較することによって転写の適合性（conformity）を検査する。計算機は、最大公算（maximum likelihood）計算を行い、および不一致（discrepancy）（印刷されたアイテムの欠如）の場合には、観察された異常（anomalies）を修正するために、レーザー発射の後続シーケンスを再計算する。それは、また、標的マップに関して多すぎる印刷されたアイテムを有する領域を修正するために使用され得る。この修正は、概して、少量の材料の非常に正確な除去を可能にする従来の吸引手段によってなされる。この吸引は、コンピュータ（１２）によって制御される。どのような場合においても、ここでの制御は、あらかじめ記録された標的マップと実際に印刷された標的（１１）との間の制御ループのインストールを意味し、これは、両方のマップ間において１００％に可能な限り近い最大公算を得ることを可能にしなければならない。
【００７０】
さらに、この発明は、単一レーザー印刷プロセスに限定されない。それは、同時に行われる「多色（multicolour）」印刷（いくつかの異なる細胞タイプが単一プロセスにおいて印刷される）の可能性を保証するために撮像手段およびそれらの関連処理がいくつかの領域（several areas）を同時に処理することができることがそのために必須である、マルチヘッド印刷（multi-head printing）（いくつかの膜（３）が１つまたは複数のレーザーを用いて同時に使用される）をカバーする。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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