(57)【要約】本発明は、医薬において使用するためのシロシビンの大規模生産に関する。より具体的には、本発明は、特に多形Ａの形態の高純度結晶性シロシビンを取得する方法に関する。本発明は、さらに、シロシビンの製造のための方法及びその生産における中間体並びにシロシビンを含有する調合物に関する。大規模とは、１０ｇより大きい、より好ましくは１００ｇより大きい、より好ましくは２５０ｇより大きい並びにＫｇレベルまで及びＫｇレベルを上回る重量を有するシロシビンのバッチを生産することを意味する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多形Ａ又は多形Ａ’の形態の結晶性シロシビンであって、
ａ．１１．５、１２．０及び１４．５°２θ±０．１°２θにおけるＸＲＰＤディフラクトグラム中のピーク；
ｂ．１１．５、１２．０及び１４．５°２θ±０．１°２θにおけるＸＲＰＤディフラクトグラム中のピーク［１９．７、２０．４、２２．２、２４．３若しくは２５．７°２θ±０．１°２θにおける少なくとも１つのさらなるピークによってさらに特徴付けられる］；
ｃ．図７ａ若しくは７ｂに実質的に図示されているＸＲＰＤディフラクトグラム；又は
ｄ．図８ａ若しくは図８ｂに実質的に図示されている、２０５〜２２０℃の開始温度を有するＤＳＣサーモグラムにおける吸熱事象
の１つ又はそれより多くによって特徴付けられる、多形Ａ又は多形Ａ’の形態の結晶性シロシビン。
【請求項２】
２１０〜２１５℃の開始温度を有するＤＳＣサーモグラムにおける吸熱事象によってさらに特徴付けられる、請求項１に記載の、多形Ａ又は多形Ａ’の形態の結晶性シロシビン。
【請求項３】
ａ．１１．５、１２．０、１４．５、及び１７．５°２θ±０．１°２θにおけるＸＲＰＤディフラクトグラム中のピーク；
ｂ．１１．５、１２．０、１４．５及び１７．５°２θ±０．１°２θにおけるＸＲＰＤディフラクトグラム中のピーク［１９．７、２０．４、２２．２、２４．３若しくは２５．７°２θ±０．１°２θにおける少なくとも１つのさらなるピークによってさらに特徴付けられる］；
ｃ．図７ａに実質的に図示されているＸＲＰＤディフラクトグラム；又は
ｄ．図８ａに実質的に図示されている、２０５〜２２０℃の開始温度を有するＤＳＣサーモグラムにおける吸熱事象
の１つ又はそれより多くによって特徴付けられる、請求項１又は２に記載の、多形Ａの形態の結晶性シロシビン。
【請求項４】
１７．５°２θ±０．１°２θにおけるピークが、１４．５°２θ±０．１°２θにおけるピークと比べて、少なくとも５％の相対強度を有する、請求項３に記載の、多形Ａの形態の結晶性シロシビン。
【請求項５】
ａ．１１．５、１２．０及び１４．５°２θ±０．１°２θにおけるＸＲＰＤディフラクトグラム中のピーク［ただし、１７．５°２θ±０．１°２θにおけるピークが非存在又は実質的に非存在である］；
ｂ．１１．５、１２．０及び１４．５°２θ±０．１°２θにおけるＸＲＰＤディフラクトグラム中のピーク［ただし、１７．５°２θ±０．１°２θにおけるピークが非存在又は実質的に非存在であり、１９．７、２０．４、２２．２、２４．３若しくは２５．７°２θ±０．１°２θにおける少なくとも１つのさらなるピークによってさらに特徴付けられる］；
ｃ．図７ｂに実質的に図示されているＸＲＰＤディフラクトグラム；又は
ｄ．図８ｂに実質的に図示されている、２０５〜２２０℃の開始温度を有するＤＳＣサーモグラムにおける吸熱事象
の１つ又はそれより多くによって特徴付けられる、請求項１又は２に記載の、多形Ａ’の形態の結晶性シロシビン。
【請求項６】
１７．５°２θ±０．１°２θにおけるいずれのピークも、１４．５°２θ±０．１°２θにおけるピークと比べて、５％未満の相対強度を有する、請求項５に記載の多形Ａ’の形態の結晶性シロシビン。
【請求項７】
ｉｉ）０．５％ｗ／ｗ未満の水含量又は
ｉｉｉ）２５℃などの周囲温度〜２００℃でのＴＧＡサーモグラムにおける０．５％ｗ／ｗ未満の損失
のいずれかを有することによってさらに特徴付けられる、請求項１から６のいずれかに記載の、多形Ａ又は多形Ａ’の形態の結晶性シロシビン。
【請求項８】
ＨＰＬＣによれば９７％より大きい化学的純度を有し、並びに３１Ｐ  ＮＭＲによって測定されるリン酸及びＨＰＬＣによって測定されるサイロシンを含めた、１％より大きい単一の不純物を有さない、先行する請求項のいずれかに記載の、多形Ａ又は多形Ａ’の形態の結晶性シロシビン。
【請求項９】
前記結晶性シロシビンが白色ないし灰白色の固体である、先行する請求項のいずれかに記載の多形Ａ又は多形Ａ’の形態の結晶性シロシビン。
【請求項１０】
図１０〜図１３のいずれか１つ又はそれより多くと合致するスペクトルを含む、先行する請求項のいずれかに記載の多形Ａ又は多形Ａ’の形態の結晶性シロシビン。
【請求項１１】
表９の点６〜１３の、１又はそれを超える品質特性の受容基準を含む、先行する請求項のいずれかに記載の多形Ａ又は多形Ａ’の形態の結晶性シロシビン。
【請求項１２】
少なくとも１００ｇを含む、請求項１〜４又は７〜１１に記載の結晶性シロシビン多形Ａのバッチ。
【請求項１３】
先行する請求項のいずれかに記載の多形Ａ又は多形Ａ’の形態の結晶性シロシビンを含む薬学的調合物。
【請求項１４】
経口剤形である請求項１３に記載の薬学的調合物。
【請求項１５】
前記多形Ａ又は多形Ａ’の形態の結晶性シロシビンが０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇの用量を与える量で存在する、請求項１３又は１４に記載の薬学的調合物。
【請求項１６】
１又はそれを超える賦形剤を含む、請求項１３〜１５のいずれかに記載の薬学的調合物。
【請求項１７】
前記１又はそれを超える賦形剤が微結晶セルロース又はデンプンを含む、請求項１６に記載の薬学的調合物。
【請求項１８】
前記１又はそれを超える賦形剤が珪化された微結晶セルロースを含む、請求項１６に記載の薬学的調合物。
【請求項１９】
医薬において使用するための、請求項１〜１１に記載の多形Ａ又は多形Ａ’の形態の結晶性シロシビン。
【請求項２０】
中枢神経障害を処置することにおいて使用するための、請求項１〜１１に記載の多形Ａ又は多形Ａ’の形態の結晶性シロシビン。
【請求項２１】
薬物抵抗性うつ病を処置することにおいて使用するための、請求項１〜１１に記載の多形Ａ又は多形Ａ’の形態の結晶性シロシビン。
【請求項２２】
多型Ａの形態のシロシビン（１２）の大規模製造のための方法であって、前記方法が、請求項１〜４又は７〜１１のいずれかに記載の結晶性シロシビン多形Ａを生産するために、制御された乾燥とともに、シロシビン（１２）を水結晶化工程に供することを含むことを特徴とする、方法。
【請求項２３】
医薬において使用するための、多形Ａ（１２Ａ）の形態の結晶性シロシビン。
【請求項２４】
薬物抵抗性うつ病を処置することにおいて使用するための、多形Ａ（１２Ａ）の形態の結晶性シロシビン。
【請求項２５】
薬物抵抗性うつ病を処置することを必要とする対象に、有効用量の多形Ａ（１２Ａ）の形態の結晶性シロシビンを投与することを含む、薬物抵抗性うつ病を処置する方法。
【請求項２６】
ａ．１１．５、１２．０、１４．５及び１７．５°２θ±０．１°２θにおけるＸＲＰＤディフラクトグラム中のピーク；
ｂ．１１．５、１２．０、１４．５及び１７．５°２θ±０．１°２θにおけるＸＲＰＤディフラクトグラム中のピーク［１９．７、２０．４、２２．２、２４．３若しくは２５．７°２θ±０．１°２θにおける少なくとも１つのさらなるピークによってさらに特徴付けられる］；
ｃ．図７ａに実質的に図示されているＸＲＰＤディフラクトグラム；又は
ｄ．図８ａに実質的に図示されている、２０５〜２２０℃の開始温度を有するＤＳＣサーモグラムにおける吸熱事象
の１つ又はそれより多くによって特徴付けられる、結晶を生産するために、制御された乾燥とともに、シロシビン（１２）を水結晶化工程に供することを含むことを特徴とする、多形Ａ（１２Ａ）の形態のシロシビン（１２）の大規模製造のための方法。
【請求項２７】
前記シロシビンが、約１０〜２０容量の水中で再結晶され、少なくとも７０℃の温度に撹拌しながら加熱され、仕上げろ過され、約７０℃の温度でシードされ、２時間を超える期間にわたって約５℃に冷却される、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬において使用するためのシロシビンの大規模生産に関する。
【０００２】
大規模とは、１０ｇより大きい、より好ましくは１００ｇより大きい、より好ましくは２５０ｇより大きい並びにＫｇレベルまで及びＫｇレベルを上回る重量を有するシロシビンのバッチを生産することを意味する。
【０００３】
本発明は、サイロシンを含むがこれに限定されない中間体、同形の変異形を含むシロシビンの異なる多形形態、及び単独で又はデジタル式に提供され得る心理学的支援と組み合わせて、具体的には、ただしこれに限定されないＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ，５ｔｈＥｄｉｔｉｏｎで定義されている治療抵抗性うつ病の処置のために、医薬において使用するためのそれらの調合物の生産にも関する。
【背景技術】
【０００４】
シロシビンは、Ｓａｎｄｏｚによって、１９５８年に最初に合成され（英国特許第９１２７１４号及び米国特許第３０７５９９２号参照）、１９６０年代半ばまで研究化学物質として広く利用可能であった。
【０００５】
植物を基礎とする幻覚剤、シロシビンは、気分障害及びアルコール性障害の処置のための心理療法の補助として使用されており、最近、３つの臨床試験が、抑うつ症候のためのシロシビンの使用を報告した。
【０００６】
Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら２０１６；Ｊ  Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３０（１２）：１１８１−１１９７；
【０００７】
Ｒｏｓｓら２０１６；Ｊ  Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３０（１２）：１１６５−１１８０；及び
【０００８】
Ｃａｒｈａｒｔ−Ｈａｒｒｉｓら２０１６，Ｌａｎｃｅｔ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ３（７）：６１９−６２７。
【０００９】
シロシビンの製造方法は限られており、以下のものが含まれる。
【００１０】
Ｊ  Ｎａｔ  Ｐｒｏｄ  ２００３，６６，８８５−８８７頁；
【００１１】
Ｈｅｌｖ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  １９５９，４２，２０７３−２１０３；
【００１２】
Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ  １９５８，１５，３９７−３９９；及び
【００１３】
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  １９９９，９３５−９３８。
【００１４】
この文献に基づいて、出願人は、Ｊ  Ｎａｔ  Ｐｒｏｄ  ２００３，６６，８８５−８８７頁（以下、ＪＮＰ）に開示されている方法が、商業的規模の方法に発展させるのに最も適した方法であると考えた。
【００１５】
その中に開示されている方法は、１０ｇの桁の量を生産し、（ｉ）〜（ｖｉ）の番号が付された６つの工程から構成された。
【００１６】
出願人の方法と同様に、以下では、工程ｉｉ及びｉｉｉは単一の工程（工程２）として論述され、ＪＮＰ法は本明細書の図１として再現されている。
【００１７】
工程１（ｉ）は、０℃で、４−ヒドロキシインドール（「３」）を、ピリジン及び無水ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）中で無水酢酸（Ａｃ２Ｏ）と反応させることを含んだ。水を添加し、混合物を蒸発させ、生じた濃縮物を酢酸エチル中に溶解し、水及び飽和塩化ナトリウムで洗浄し、硫酸ナトリウムで有機相を乾燥させ、蒸発させて、４−アセチルインドール（「４」）を得、ろ過によってこれを集め、水及び酢酸エチルで洗浄した。
【００１８】
工程２（ｉｉ及びｉｉｉ）、２工程の、アシル化（ｉｉ）−アミド化工程（ｉｉｉ）は、（ｉｉ）４−アセチルインドール（「４」）を無水ジエチルエーテル中の塩化オキサリル（（ＣＯＣｌ）２）と反応させ、撹拌し、ｎ−ヘキサンを添加し、−２０℃に維持して、ろ過によって分離された中間体３−（２−クロロ−２−オキソアセチル）−１Ｈ−インドール−４−イルアセテート（「５」）を生産することによって、３−ジメチルアミノオキサリル−４−アセチルインドール（「６」）を形成することを含んだ。この中間体を無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中に溶解し、テトラヒドロフラン及びピリジン中のジメチルアミン（（ＣＨ３）２ＮＨ）と反応させた。固化に起因して無水エーテルを添加し、反応生成物をろ過によって分離し、ｎヘキサン、酢酸エチル及び水で洗浄して３−ジメチルアミノオキサリル−４−アセチルインドール（「６」）を得た。
【００１９】
工程３（ｉｖ）は、アルゴン雰囲気下で、３−ジメチルアミノオキサリル−４−アセチルインドール（「６」）を無水ＴＨＦ中で水素化アルミニウムリチウム（ＬｉＡｌＨ４）と反応させることによるサイロシン（「１」）の形成を含んだ。還流及び冷却後、無水硫酸ナトリウムを添加した後、硫酸ナトリウムの溶液、さらに無水硫酸ナトリウムを添加した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、真空中で素早く濃縮し、得られたサイロシン結晶をメタノールで短時間洗浄した。
【００２０】
工程４（ｖ）は、無水ＴＨＦ中に溶解されたサイロシンを、−７８℃のｎ−ヘキサン中のｎ−ブチルリチウム（ｎ−ＢｕＬｉ）、及びテトラベンジルピロホスフェート［（ＢｎＯ）２ＰＯ］２Ｏと反応させ、反応を０℃まで加温し、中間体ジベンジル３−［（２−ジメチルアミノ）エチル］−１Ｈ−インドール−４−イルホスフェート（「７」）の生産をモニターすることによる、ベンジル［２−（４−オキシインドール−３−イル）エチル］ジメチルアンモニオ−４−Ｏ−ベンジルホスフェート（「８」）の形成を含んだ。「７」の存在をチェックしたら直ちに、アミノプロピルシリカゲルを添加し、混合物を酢酸エチルで希釈し、吸引によってＣｅｌｉｔｅパッドを通してろ過し、真空中でろ液を濃縮し、ＣＨ２Ｃｌ２中に再溶解し、ろ過によって沈殿物を集めた。
【００２１】
工程５（ｖｉ）は、パラジウム−活性炭触媒（Ｐｄ／Ｃ）を用いた、メタノール（ＭｅＯＨ）中の（「８」）の水素（Ｈ２）との反応によるシロシビン（「２」）の形成を含んだ。生成物沈殿に起因して、水を添加し、シロシビンの出現とともに、（「８」）、そのモノ脱ベンジル化された誘導体をモニターし、Ｃｅｌｉｔｅパッドを通して反応溶液をろ過した。ろ過によって生成物を集め、エタノールで洗浄して、融点１９０℃〜１９８℃を有する白色針状結晶形態を得た。
【００２２】
メタノール又はエタノールなどの非水性溶媒を使用する、ＪＮＰなどの多くの方法とは異なり、Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ１９５８，１５，３９７−３９９は、キノコ抽出物からシロシビンを得るために、単回の水からの再結晶を使用した。この教示は、クロマトグラフィーによって小規模で得られた出発材料を溶解するために沸騰水を使用することであり、得られた高真空乾燥された材料は１８５〜１９５℃の間で不明確に融解すると記述され、２５．４％の重量喪失を示したので、出願人によって得られたものと、純度及び形態において明瞭に異なることを示唆している。
【００２３】
シロシビンを生産するための合成の開発の間に、出願人は、５ｇ規模の多数の水素付加反応を実施し、異なる結晶性形態のシロシビンが取得された。最初の水素付加反応は、図７ｄに示されているＸＲＰＤディフラクトグラム並びに図８ｄに示されているＤＳＣ及びＴＧＡサーモグラムを示した水和物Ａ（ＪＣＣＡ２１５７Ｅ）を与えた。ＤＳＣは、脱水を示唆するＴＧＡの重量低下と同時に起こる約９７℃での吸熱、及び融解であると推定された約２１６℃の開始温度を有する吸熱事象を示す。別の水素付加反応はエタノール溶媒和物（ＪＣＣＡ２１５８Ｄ）を与え、これは、ＸＲＰＤ（図７ｅ）、ＤＳＣ（図８ｅ）、ＴＧＡ（図８ｅ）及び１Ｈ  ＮＭＲによって分析されたときに、１１％の捕捉されたエタノールを示した。ＤＳＣサーモグラムは、ＴＧＡにおける約１３％の重量喪失と同時に起こる融解であると思われた約１５４℃の開始を有する吸熱を示す。開発中に行われた別の実験では、出願人は、シロシビンの結晶化を行った。熱水中で溶液に留めて仕上げろ過（ｐｏｌｉｓｈ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）工程を可能にするよりむしろ、高温（＞９０℃）で沈殿が起こった。形成された固体は、さらなる加熱又はさらなる水の添加時に再溶解しなかった。固体（ＣＢ６４６Ｅ）の冷却及び単離に際して、ＸＲＰＤを実施した。ＸＲＰＤディフラクトグラム（図７ｆ）は、多形Ａ’（ＪＣＣＡ２１６０−Ｆ−Ｄ４）及び多形Ｂ（ＪＣＣＡ２１６０−Ｆ−ＴＭ２−Ｃ５）の混合された相を示唆した。これらの知見は、所望の結晶性形態を一貫して生産することができる方法を開発することの重要性を強調するので、出願人は、これらの形態のいずれが医薬において使用するのに適した制御された形態で化学的に純粋なシロシビンを生産することができる状態にあるかを決定するための実験に着手した。
【００２４】
臨床試験のために、いずれの新規活性物質（ＮＡＳ）も、ヒト対象に投薬されるべき活性物質の量に応じて、大規模な生産（典型的には１００ｇ以上、より典型的には２５０ｇより多い、より好ましくは５００ｇより多い、ｋｇ以上までのバッチ）が可能であるべきである。また、新規活性物質は、化学的に純粋であり、十分に確定され、保存時に安定であるべきである。
【００２５】
さらに、いずれの製造方法も、容易に再現可能でなければならず、バッチごとの一貫性を与えなければならない。
【００２６】
ヒト対象に投与するための、一貫した多形形態のシロシビンを提供することが本発明の第一の目的である。
【００２７】
ヒト対象に投与するための、一貫した多形形態の化学的に純粋なシロシビンを提供することが本発明の別の目的である。
【００２８】
商業的用途のために、純粋なシロシビンが規模を拡大して生産されなければならないので、大規模なバッチ量で、化学的に純粋なシロシビンを提供することがさらなる目的である。
【００２９】
シロシビンを所望の多形形態で結晶化する方法を提供することが本発明のさらなる目的である。
サイロシン又は４ヒドロキシインドールからシロシビンを製造するための拡張可能な方法を提供することが本発明のさらなる目的である。
【００３０】
適切な方法論を開発する際に、出願人は克服しなければならない数多くの問題及び困難を経験した。各工程で特定された問題を克服し、本発明を単独で又は組み合わせて使用することが別の独立した目的である。
単独で又はデジタル健康製品若しくはデジタルソリューションと組み合わせて、特に中枢神経系障害（ＣＮＳ）の処置において、より具体的には、ただしこれに限定されないが、うつ病、特に薬物抵抗性うつ病の処置において、ヒト対象に投与するのに適した形態で本発明のシロシビンを調合し、これを医薬において使用することが本発明のさらなる目的である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３１】
【特許文献１】英国特許第９１２７１４号明細書
【特許文献２】米国特許第３０７５９９２号明細書
【非特許文献】
【００３２】
【非特許文献１】Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら２０１６；Ｊ  Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３０（１２）：１１８１−１１９７
【非特許文献２】Ｒｏｓｓら２０１６；Ｊ  Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３０（１２）：１１６５−１１８０
【非特許文献３】Ｃａｒｈａｒｔ−Ｈａｒｒｉｓら２０１６，Ｌａｎｃｅｔ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ３（７）：６１９−６２７
【非特許文献４】Ｊ  Ｎａｔ  Ｐｒｏｄ  ２００３，６６，８８５−８８７
【非特許文献５】Ｈｅｌｖ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  １９５９，４２，２０７３−２１０３
【非特許文献６】Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ  １９５８，１５，３９７−３９９
【非特許文献７】Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  １９９９，９３５−９３８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００３３】
本発明の第一の態様にしたがい、以下の１つ又はそれより多くによって特徴付けられる多形Ａ又は多形Ａ’の形態での結晶性シロシビンが提供される。
ａ．１１．５、１２．０及び１４．５°２θ±０．１°２θにおけるＸＲＰＤディフラクトグラム中のピーク；
ｂ．１１．５、１２．０及び１４．５°２θ±０．１°２θにおけるＸＲＰＤディフラクトグラム中のピーク（１９．７、２０．４、２２．２、２４．３若しくは２５．７°２θ±０．１°２θにおける少なくとも１つのさらなるピークによってさらに特徴付けられる）；
ｃ．図７ａ若しくは図７ｂに実質的に図示されているＸＲＰＤディフラクトグラム；又は
ｄ．図８ａ若しくは図８ｂに実質的に図示されている、２０５〜２２０℃の開始温度を有するＤＳＣサーモグラムにおける吸熱事象。
多形Ａ
【００３４】
本発明の好ましい実施形態にしたがい、以下の１つ又はそれより多くによって特徴付けられる多形Ａの形態での結晶性シロシビンが提供される。
ａ．１１．５、１２．０、１４．５及び１７．５°２θ±０．１°２θにおけるＸＲＰＤディフラクトグラム中のピーク；
ｂ．１１．５、１２．０、１４．５及び１７．５°２θ±０．１°２θにおけるＸＲＰＤディフラクトグラム中のピーク（１９．７、２０．４、２２．２、２４．３若しくは２５．７°２θ±０．１°２θにおける少なくとも１つのさらなるピークによってさらに特徴付けられる）；
ｃ．図７ａに実質的に図示されているＸＲＰＤディフラクトグラム；又は
ｄ．図８ａに実質的に図示されている、２０５〜２２０℃の開始温度を有するＤＳＣサーモグラムにおける吸熱事象。
【００３５】
１７．５°２θ±０．１°２θのピークが、１４．５°２θ±０．１°２θのピークと比べて、少なくとも５％、好ましくは少なくとも６％、より好ましくは少なくとも７％、８％から、９％、少なくとも１０％までの相対強度を有する。
【００３６】
一実施形態において、シロシビン多形Ａは、表１に要約されているディフラクトグラムによって特徴付けられるＸＲＰＤディフラクトグラムを呈する。一実施形態において、本明細書に記載されている結晶性シロシビン多形Ａは、表１の少なくとも３つのピークの（±０．１°２θ）を含む。ある実施形態において、本明細書に記載されている結晶性シロシビン多形Ａは、表１の少なくとも４つのピークの（±０．１°２θ）を含む。ある実施形態において、本明細書に記載されている結晶性シロシビン多形Ａは、表１の少なくとも５つのピークの（±０．１°２θ）を含む。ある実施形態において、本明細書に記載されている結晶性シロシビン多形Ａは、表１の少なくとも６つのピークの（±０．１°２θ）を含む。ある実施形態において、本明細書に記載されている結晶性シロシビン多形Ａは、表１の少なくとも８つのピークの（±０．１°２θ）を含む。ある実施形態において、本明細書に記載されている結晶性シロシビン多形Ａは、表１の少なくとも１０のピークの（±０．１°２θ）を含む。ある実施形態において、本明細書に記載されている結晶性シロシビン多形Ａは、表１の少なくとも１５のピークの（±０．１°２θ）を含む。約１７．５°２θ±０．１°２θのピークは、このピークが非存在又は実質的に非存在である（すなわち、１４．５°２θ±０．１°２θのピークと比べて、２％未満、より好ましくは１％未満の相対強度を有する）多形Ａ’からシロシビン多形Ａを区別する。
【００３７】
【表１】
2020536960.tif 000003
【００３８】
一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａは、１１．５、１２．０、１４．５及び１７．５°２θ±０．１°２θにおけるＸＲＰＤディフラクトグラムピークによって特徴付けられる。別の実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａは、１９．７、２０．４、２２．２、２４．３又は２５．７°２θ±０．１°２θに出現する少なくとも１つの追加のピークによってさらに特徴付けられる。別の実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａは、１９．７、２０．４、２２．２、２４．３又は２５．７°２θ±０．１°２θに出現する少なくとも２つの追加のピークによってさらに特徴付けられる。別の実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａは、１９．７、２０．４、２２．２、２４．３又は２５．７°２θ±０．１°２θに出現する少なくとも３つの追加のピークによってさらに特徴付けられる。さらなる実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａは、図７ａに示されているＸＲＰＤディフラクトグラムと実質的に同一のＸＲＰＤディフラクトグラムを呈する。
【００３９】
一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａは、１４．５及び１７．５°２θ±０．１°２θにおけるＸＲＰＤディフラクトグラムピークによって特徴付けられ、１７．５°２θにおけるピークは、１４．５°２θにおけるピークの強度の少なくとも５％、より好ましくは少なくとも６％、少なくとも７％から、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％までである強度を有する。
【００４０】
一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａは、１０．１におけるＸＲＰＤディフラクトグラムピークが非存在であり、又は実質的に非存在である。実質的に非存在によって、１０．１におけるいずれのＸＲＰＤディフラクトグラムピークも、１４．５°２θにおけるピークの強度の２％未満、例えば１％未満であり、又はＸＲＰＤディフラクトグラム中に検出可能でないことを意味する。
【００４１】
一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａは、２０５〜２２０℃、例えば２１０〜２２０℃、例えば２１０〜２１８℃、又は例えば２１０〜２１６℃の開始温度を有するＤＳＣサーモグラムにおける吸熱事象によって特徴付けられる。別の実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａは、１４５〜１６５℃、例えば１４５〜１６０℃、又は例えば１４５〜１５５℃の開始温度を有するＤＳＣサーモグラムにおける吸熱事象によってさらに特徴付けられる。別の実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａは、ＤＳＣサーモグラムにおける、２０５〜２２０℃、例えば２１０〜２２０℃、例えば２１０〜２１８℃、又は例えば２１０〜２１６℃の開始温度を有する吸熱事象、及び１４５〜１６５℃、例えば１４５〜１６０℃、又は例えば１４５〜１５５℃の開始温度を有する吸熱事象によって特徴付けられる。さらに別の実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａは、図８ａのＤＳＣサーモグラムと実質的に同一のＤＳＣサーモグラムを呈する。
【００４２】
別の実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａは、０．５％ｗ／ｗ未満、例えば０．４％ｗ／ｗ未満、例えば０．３％ｗ／ｗ未満、例えば０．２％ｗ／ｗ未満、又は例えば０．１％ｗ／ｗ未満の水含量を有することによって特徴付けられる。当業者は、化合物の水含量を測定するための方法、例えば、カールフィッシャー滴定を知っているであろう。一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａは、約２５℃などの周囲温度〜２００℃でのＴＧＡサーモグラムにおける、０．５％ｗ／ｗ未満、例えば０．４％ｗ／ｗ未満、例えば０．３％ｗ／ｗ未満、例えば０．２％ｗ／ｗ未満、例えば０．１％ｗ／ｗ未満の喪失を有することによって特徴付けられる。一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａは、乾燥減量試験において、２重量％未満、例えば１重量％未満、例えば０．５重量％未満を喪失する。乾燥減量試験は、７０℃で行われる。
【００４３】
一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａは、多形Ａの極めて純粋な結晶性形態であり、例えば、シロシビンは、少なくとも９０重量％、例えば９５重量％、例えば９９重量％、例えば９９．５重量％の多形Ａを含む。
【００４４】
一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａは、白色ないし灰白色の固体である。
【００４５】
別の実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａは化学的に純粋であり、例えば、シロシビンは、ＨＰＬＣによって、９７％超、例えば９８％超、又は例えば９９％超の化学的純度を有する。一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａは、３１Ｐ  ＮＭＲによって測定されるリン酸及びＨＰＬＣによって測定されるサイロシンを含めた、１％より大きい、より好ましくは０．５％より小さい単一の不純物を有さない。一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａは、ＨＰＬＣによって、９７面積％より大きい、より好ましくは９８面積％より大きい、最も好ましくは９９面積％より大きい化学的純度を有する。一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａは、ＨＰＬＣによって測定された場合に、１面積％より大きい、より好ましくは０．５面積％より小さい単一の不純物を有さない。一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａは、ＨＰＬＣによって測定された場合に、１面積％より大きい、より好ましくは０．５面積％より小さいレベルでサイロシンを含有しない。一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａは、３１Ｐ  ＮＭＲによって測定された場合に、１重量％より大きい、より好ましくは０．５重量％より小さいレベルでリン酸を含有しない。一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａは、少なくとも９５重量％、例えば少なくとも９６重量％、又は例えば少なくとも９８重量％の化学的アッセイを有する。
多形Ａ’
【００４６】
本発明の別の実施形態にしたがい、以下の１つ又はそれより多くによって特徴付けられる結晶性シロシビン多形Ａ’が提供される。
ａ．１１．５、１２．０及び１４．５°２θ±０．１°２θにおけるＸＲＰＤディフラクトグラム中のピーク（ただし、１７．５°２θ±０．１°２θにピークが非存在若しくは実質的に非存在である）；
ｂ．１１．５、１２．０及び１４．５°２θ±０．１°２θにおけるＸＲＰＤディフラクトグラム中のピーク（ただし、１７．５°２θ±０．１°２θにピークが非存在若しくは実質的に非存在であり、１９．７、２０．４、２２．２、２４．３若しくは２５．７°２θ±０．１°２θにおける少なくとも１つのさらなるピークによってさらに特徴付けられる）；
ｃ．図７ｂに実質的に図示されているＸＲＰＤディフラクトグラム；又は
ｄ．図８ｂに実質的に図示されている、２０５〜２２０℃の開始温度を有するＤＳＣサーモグラムにおける吸熱事象。
【００４７】
１７．５°２θ±０．１°２θにピークが実質的に非存在とは、このピークが、存在する場合に、１４．５°２θ±０．１°２θのピークと比べて、５％未満、より好ましくは４％未満、３％未満から、２％、１％又はそれ未満の相対強度を有することを意味する。
【００４８】
一実施形態において、シロシビン多形Ａ’は、表２に要約されているディフラクトグラムによって特徴付けられるＸＲＰＤディフラクトグラムを呈する。一実施形態において、本明細書に記載されている結晶性シロシビン多形Ａ’は、表２の少なくとも３つのピークの（±０．１°２θ）を含むが、１７．５°２θ±０．１°２θにピークが非存在又は実質的に非存在である。ある実施形態において、本明細書に記載されている結晶性シロシビン多形Ａ’は、表２の少なくとも４つのピークの（±０．１°２θ）を含むが、１７．５°２θ±０．１°２θにピークが非存在又は実質的に非存在である。ある実施形態において、本明細書に記載されている結晶性シロシビン多形Ａ’は、表２の少なくとも５つのピークの（±０．１°２θ）を含むが、１７．５°２θ±０．１°２θにピークが非存在又は実質的に非存在である。ある実施形態において、本明細書に記載されている結晶性シロシビン多形Ａ’は、表２の少なくとも６つのピークの（±０．１°２θ）を含むが、１７．５°２θ±０．１°２θにピークが非存在又は実質的に非存在である。ある実施形態において、本明細書に記載されている結晶性シロシビン多形Ａ’は、表２の少なくとも８つのピークの（±０．１°２θ）を含むが、１７．５°２θ±０．１°２θにピークが非存在又は実質的に非存在である。ある実施形態において、本明細書に記載されている結晶性シロシビン多形Ａ’は、表２の少なくとも１０のピークの（±０．１°２θ）を含むが、１７．５°２θ±０．１°２θにピークが非存在又は実質的に非存在である。ある実施形態において、本明細書に記載されている結晶性シロシビン多形Ａ’は、表２の少なくとも１５のピークの（±０．１°２θ）を含むが、１７．５°２θ±０．１°２θにピークが非存在又は実質的に非存在である。ある実施形態において、本明細書に記載されている結晶性シロシビン多形Ａ’は、表２の少なくとも２０のピークの（±０．１°２θ）を含むが、１７．５°２θ±０．１°２θにピークが非存在又は実質的に非存在である。ある実施形態において、本明細書に記載されている結晶性シロシビン多形Ａ’は、表２の少なくとも２５のピークの（±０．１°２θ）を含むが、１７．５°２θ±０．１°２θにピークが非存在又は実質的に非存在である。
【００４９】
【表２】
2020536960.tif 000004
【００５０】
一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａ’は、１１．５、１２．０及び１４．５°２θ±０．１°２θにおけるＸＲＰＤディフラクトグラムピーク、ただし、１７．５°２θ±０．１°２θにピークが実質的に非存在であることによって特徴付けられる。別の実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａ’は、１９．７、２０．４、２２．２、２４．３又は２５．７°２θ±０．１°２θに出現する少なくとも１つの追加のピークによってさらに特徴付けられる。別の実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａ’は、１９．７、２０．４、２２．２、２４．３又は２５．７°２θ±０．１°２θに出現する少なくとも２つの追加のピークによってさらに特徴付けられる。別の実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａ’は、１０．１°２θ±０．１°２θに出現するピークの存在によってさらに特徴付けられ、多形Ａから区別される。さらなる実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａ’は、図７ｂに示されているＸＲＰＤディフラクトグラムと実質的に同一のＸＲＰＤディフラクトグラムを呈する。
【００５１】
一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａ’は、１４．５及び１７．５°２θ±０．１°２θにおけるＸＲＰＤディフラクトグラムピークによって特徴付けられ、１７．５°２θにおけるピークの強度は、１４．５°２θにおけるピークの強度の５％未満、例えば４％未満、例えば３％未満、例えば２％未満、例えば１％未満、又は例えば約１％である。
【００５２】
一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａ’は、１０．１及び１４．５°２θ±０．１°２θにおけるＸＲＰＤディフラクトグラムピークによって特徴付けられ、１０．１°２θにおけるピークの強度は、１４．５°２θにおけるピークの強度の少なくとも１％、例えば少なくとも２％、例えば少なくとも３％、又は例えば約４％である。
【００５３】
一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａ’は、２０５〜２２０℃、例えば２１０〜２２０℃、例えば２１０〜２１８℃、又は例えば２１０〜２１６℃の開始温度を有するＤＳＣサーモグラムにおける吸熱事象によって特徴付けられる。別の実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａ’は、１４５〜１６５℃、例えば１４５〜１６０℃、又は例えば１４５〜１５５℃の開始温度を有するＤＳＣサーモグラムにおける吸熱事象によってさらに特徴付けられる。別の実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａ’は、ＤＳＣサーモグラムにおける、２０５〜２２０℃、例えば２１０〜２２０℃、例えば２１０〜２１８℃、又は例えば２１０〜２１６℃の開始温度を有する吸熱事象、及び１４５〜１６５℃、例えば１４５〜１６０℃、又は例えば１４５〜１５５℃の開始温度を有する吸熱事象によって特徴付けられる。さらに別の実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａ’は、図８ｂのＤＳＣサーモグラムと実質的に同一のＤＳＣサーモグラムを呈する。
【００５４】
別の実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａ’は、０．５％ｗ／ｗ未満、例えば０．４％ｗ／ｗ未満、例えば０．３％ｗ／ｗ未満、例えば０．２％ｗ／ｗ未満、又は例えば０．１％ｗ／ｗ未満の水含量を有することによって特徴付けられる。当業者は、化合物の水含量を測定するための方法、例えば、カールフィッシャー滴定を知っているであろう。一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａ’は、２５℃などの周囲温度〜２００℃でのＴＧＡサーモグラムにおいて、０．５％ｗ／ｗ未満、例えば０．４％ｗ／ｗ未満、例えば０．３％ｗ／ｗ未満、例えば０．２％ｗ／ｗ未満、例えば０．１％ｗ／ｗ未満の喪失を有することによって特徴付けられる。一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａ’は、乾燥減量試験において、２重量％未満、例えば１重量％未満、例えば０．５重量％未満を喪失する。乾燥減量試験は、７０℃で行われる。
【００５５】
一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａ’は、多形Ａ’の極めて純粋な結晶性形態であり、例えば、シロシビンは、少なくとも９０重量％、例えば９５重量％、例えば９９重量％、例えば９９．５重量％の多形Ａ’を含む。
【００５６】
一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａ’は、白色ないし灰白色の固体である。
【００５７】
別の実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａ’は化学的に純粋であり、例えば、シロシビンは、ＨＰＬＣによって、９７％より大きい、より好ましくは９８％より大きい、最も好ましくは９９％より大きい化学的純度を有する。一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａ’は、３１Ｐ  ＮＭＲによって測定されるリン酸及びＨＰＬＣによって測定されるサイロシンを含めた、１％より大きい、より好ましくは０．５％より小さい単一の不純物を有さない。一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａ’は、ＨＰＬＣによって、９７面積％より大きい、より好ましくは９８面積％より大きい、最も好ましくは９９面積％より大きい化学的純度を有する。一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａ’は、ＨＰＬＣによって測定された場合に、１面積％より大きい、より好ましくは０．５面積％より小さい単一の不純物を有さない。一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａ’は、ＨＰＬＣによって測定された場合に、１面積％より大きい、より好ましくは０．５面積％より小さいレベルでサイロシンを含有しない。一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａ’は、３１Ｐ  ＮＭＲによって測定された場合に、１重量％より大きい、より好ましくは０．５重量％より小さいレベルでリン酸を含有しない。一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａ’は、少なくとも９５重量％、例えば少なくとも９６重量％、又は例えば少なくとも９８重量％の化学的アッセイを有する。
【００５８】
ＸＲＰＤディフラクトグラム及びＸＲＰＤピーク位置は、Ｃｕ  Ｋα放射線を用いて獲得される。
【００５９】
ＤＳＣ及びＴＧＡサーモグラムは、２０℃／分の加熱速度を用いて獲得される。
【００６０】
一実施形態において、図７ａ又は図７ｂに実質的に図示されているＸＲＰＤディフラクトグラム及び図８ａ又は図８ｂに実質的に図示されているＤＳＣサーモグラフを示す、高純度結晶性シロシビン、多形Ａ又は多形Ａ’（１２Ａ又は１２Ａ’）或いはこれらの混合物が提供される。
【００６１】
好ましくは、結晶性シロシビン多形Ａ（１２Ａ）は、図７ａに図示されているＸＲＰＤディフラクトグラム及び図８ａに図示されているＤＳＣサーモグラフを示す。
【００６２】
好ましくは、結晶性シロシビン多形Ａ’（１２Ａ’）は、図７ｂに実質的に図示されているＸＲＰＤディフラクトグラム及び図８ｂに実質的に図示されているＤＳＣサーモグラフを示す。
【００６３】
好ましくは、高純度結晶性シロシビン多形Ａ（１２Ａ）は、図７ａに実質的に図示されているＸＲＰＤディフラクトグラム及び図８ａに実質的に図示されているＤＳＣサーモグラフによって特徴付けられる。
【００６４】
好ましくは、高純度結晶性シロシビン多形Ａ（１２Ａ’）は、図７ｂに図示されているＸＲＰＤディフラクトグラム及び図８ｂに図示されているＤＳＣサーモグラフによって特徴付けられる。
【００６５】
多形Ａ（その同形変異形多形Ａ’を含む）（図７ａ及び図７ｂ）は、多形Ｂ（図７ｃ）、水和物Ａ（図７ｄ）及びエタノール溶媒和物（図７ｅ：溶媒和物Ａ）とは異なり、これらの異なる形態のいくつかの間の関係性は図９に図示されている。
【００６６】
結晶性シロシビン多形Ａ又は多形Ａ’は、白色ないし灰白色の固体であり、並びに／又はＨＰＬＣによって、９７％より大きい、より好ましくは９８％より大きい、最も好ましくは９９％より大きい化学的純度を有し、並びに３１Ｐ  ＮＭＲによって測定されるリン酸及びＨＰＬＣによって測定されるサイロシンを含めた、１％より多い、より好ましくは０．５％より少ない単一の不純物を有さない。一実施形態において、高純度結晶性シロシビン、多形Ａ又は多形Ａ’が提供される。一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａ又は多形Ａ’は、ＨＰＬＣによって、９７面積％より大きい、より好ましくは９８面積％より大きい、最も好ましくは９９面積％より大きい化学的純度を有する。一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａ又は多形Ａ’は、ＨＰＬＣによって測定された場合に、１面積％より大きい、より好ましくは０．５面積％より小さい単一の不純物を有さない。一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａ又は多形Ａ’は、ＨＰＬＣによって測定された場合に、１面積％より大きい、より好ましくは０．５面積％より小さいレベルでサイロシンを含有しない。一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａ又は多形Ａ’は、３１Ｐ  ＮＭＲによって測定された場合に、１重量％より大きい、より好ましくは０．５重量％より小さいレベルでリン酸を含有しない。一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａ又は多形Ａ’は、少なくとも９５重量％、例えば少なくとも９６重量％、又は例えば少なくとも９８重量％の化学的アッセイを有する。
【００６７】
多形Ａ又はＡ’の加熱は、多形Ａ又は多形Ａ’の多形Ｂへの固体−固体遷移に相当するおよそ１５０℃の開始温度を有する吸熱事象をもたらす。得られた固体、すなわち、多形Ｂの継続した加熱は、２０５〜２２０℃の開始温度を有する融点に対応する第二の吸熱事象をもたらす（図８ａ及び図８ｂ参照）。
【００６８】
本発明の別の独立した態様にしたがい、以下の１つ又はそれより多くによって特徴付けられるシロシビン、水和物Ａの結晶性形態が提供される。
ａ．８．９、１２．６及び１３．８°２θ±０．１°２θにおけるＸＲＰＤディフラクトグラム中のピーク；
ｂ．８．９、１２．６及び１３．８°２θ±０．１°２θにおけるＸＲＰＤディフラクトグラム中のピーク（６．５、１２．２、１９．４、２０．４若しくは２０．８°２θ±０．１°２θにおける少なくとも１つのさらなるピークによってさらに特徴付けられる）；
ｃ．図７ｄに実質的に図示されているＸＲＰＤディフラクトグラム；又は
ｄ．図８ｄに実質的に図示されている、２０５〜２２０℃の開始温度を有するＤＳＣサーモグラムにおける吸熱事象。
【００６９】
一実施形態において、シロシビン水和物Ａは、表３に要約されているディフラクトグラムによって特徴付けられるＸＲＰＤディフラクトグラムを呈する。一実施形態において、本明細書に記載されている結晶性シロシビン水和物Ａは、表３の少なくとも３つのピークの（±０．１°２θ）を含む。ある実施形態において、本明細書に記載されている結晶性シロシビン水和物Ａは、表３の少なくとも４つのピークの（±０．１°２θ）を含む。ある実施形態において、本明細書に記載されている結晶性シロシビン水和物Ａは、表３の少なくとも５つのピークの（±０．１°２θ）を含む。ある実施形態において、本明細書に記載されている結晶性シロシビン水和物Ａは、表３の少なくとも８つのピークの（±０．１°２θ）を含む。ある実施形態において、本明細書に記載されている結晶性シロシビン水和物Ａは、表３の少なくとも１０のピークの（±０．１°２θ）を含む。
【表３】
2020536960.tif 000005
【００７０】
一実施形態において、結晶性シロシビン水和物Ａは、８．９、１２．６及び１３．８°２θ±０．１°２θにおけるＸＲＰＤディフラクトグラムピークによって特徴付けられる。別の実施形態において、結晶性シロシビン水和物Ａは、６．５、１２．２、１９．４、２０．４又は２０．８°２θ±０．１°２θに出現する少なくとも１つのピークによってさらに特徴付けられる。別の実施形態において、結晶性シロシビン水和物Ａは、６．５、１２．２、１９．４、２０．４又は２０．８°２θ±０．１°２θに出現する少なくとも２つのピークによってさらに特徴付けられる。さらなる実施形態において、結晶性シロシビン水和物Ａは、図７ｄに示されているＸＲＰＤディフラクトグラムと実質的に同一のＸＲＰＤディフラクトグラムを呈する。
【００７１】
一実施形態において、結晶性シロシビン水和物Ａは、２０５〜２２０℃、例えば２１０〜２２０℃、例えば２１０〜２１８℃、又は例えば２１０〜２１６℃の開始温度を有するＤＳＣサーモグラムにおける吸熱事象によって特徴付けられる。別の実施形態において、結晶性シロシビン水和物Ａは、８５〜１０５℃の、又は９０〜１００℃などの開始温度を有するＤＳＣサーモグラムにおける吸熱事象によってさらに特徴付けられる。別の実施形態において、結晶性シロシビン水和物Ａは、ＤＳＣサーモグラムにおける、２０５〜２２０℃、例えば２１０〜２２０℃、例えば２１０〜２１８℃、又は例えば２１０〜２１６℃の開始温度を有する吸熱事象、及び８５℃〜１０５℃の、又は９０〜１００℃などの開始温度を有する吸熱事象によって特徴付けられる。さらに別の実施形態において、結晶性シロシビン水和物Ａは、図８ｄのＤＳＣサーモグラムと実質的に同一のＤＳＣサーモグラムを呈する。
【００７２】
別の実施形態において、結晶性シロシビン水和物Ａは、１０〜１８％、例えば１２〜１６％、又は例えば約１３％の水含量を有することによって特徴付けられる。当業者は、化合物の水含量を測定するための方法、例えば、カールフィッシャー滴定を知っているであろう。一実施形態において、結晶性シロシビン水和物Ａは、約２５℃などの周囲温度〜１２０℃で、１０〜１８％、例えば１２〜１６％、又は例えば約１３％の、ＴＧＡサーモグラムにおける重量喪失を有することによって特徴付けられる。
【００７３】
一実施形態において、結晶性シロシビン水和物Ａは、水和物Ａの極めて純粋な結晶性形態であり、例えば、シロシビンは、少なくとも９０重量％、例えば９５重量％、例えば９９重量％、例えば９９．５重量％の水和物Ａを含む。
【００７４】
本発明の別の独立した態様にしたがい、以下の１つ又はそれより多くによって特徴付けられるシロシビン、多形Ｂの結晶性形態が提供される。
ａ．１１．１、１１．８及び１４．３°２θ±０．１°２θにおけるＸＲＰＤディフラクトグラム中のピーク；
ｂ．１１．１、１１．８及び１４．３°２θ±０．１°２θにおけるＸＲＰＤディフラクトグラム中のピーク（１４．９、１５．４、１９．３、２０．０若しくは２０．６°２θ±０．１°２θにおける少なくとも１つのさらなるピークによってさらに特徴付けられる）；
ｃ．図７ｃに実質的に図示されているＸＲＰＤディフラクトグラム；又は
ｄ．図８ｃに実質的に図示されている、２０５〜２２０℃の開始温度を有するＤＳＣサーモグラムにおける吸熱事象。
【００７５】
一実施形態において、シロシビン多形Ｂは、表４に要約されているディフラクトグラムによって特徴付けられるＸＲＰＤディフラクトグラムを呈する。一実施形態において、本明細書に記載されている結晶性シロシビン多形Ｂは、表４の少なくとも３つのピークの（±０．１°２θ）を含む。ある実施形態において、本明細書に記載されている結晶性シロシビン多形Ｂは、表４の少なくとも４つのピークの（±０．１°２θ）を含む。ある実施形態において、本明細書に記載されている結晶性シロシビン多形Ｂは、表４の少なくとも５つのピークの（±０．１°２θ）を含む。ある実施形態において、本明細書に記載されている結晶性シロシビン多形Ｂは、表４の少なくとも８つのピークの（±０．１°２θ）を含む。ある実施形態において、本明細書に記載されている結晶性シロシビン多形Ｂは、表４の少なくとも１０のピークの（±０．１°２θ）を含む。
【表４】
2020536960.tif 000006
【００７６】
一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ｂは、１１．１、１１．８及び１４．３°２θ±０．１°２θにおけるＸＲＰＤディフラクトグラムピークによって特徴付けられる。別の実施形態において、結晶性シロシビン多形Ｂは、１４．９、１５．４、１９．３、２０．０又は２０．６°２θ±０．１°２θに出現する少なくとも１つのピークによってさらに特徴付けられる。別の実施形態において、結晶性シロシビン多形Ｂは、１４．９、１５．４、１９．３、２０．０又は２０．６°２θ±０．１°２θに出現する少なくとも２つのピークによってさらに特徴付けられる。さらなる実施形態において、結晶性シロシビン多形Ｂは、図７ｃに示されているＸＲＰＤディフラクトグラムと実質的に同一のＸＲＰＤディフラクトグラムを呈する。
【００７７】
一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ｂは、２０５〜２２０℃、例えば２１０〜２２０℃、例えば２１０〜２１８℃、又は例えば２１０〜２１６℃の開始温度を有するＤＳＣサーモグラムにおける吸熱事象によって特徴付けられる。さらに別の実施形態において、結晶性シロシビン多形Ｂは、図８ｃのＤＳＣサーモグラムと実質的に同一のＤＳＣサーモグラムを呈する。
【００７８】
別の実施形態において、結晶性シロシビン多形Ｂは、０．５％ｗ／ｗ未満、例えば０．４％ｗ／ｗ未満、例えば０．３％ｗ／ｗ未満、例えば０．２％ｗ／ｗ未満、又は例えば０．１％ｗ／ｗ未満の水含量を有することによって特徴付けられる。当業者は、化合物の水含量を測定するための方法、例えば、カールフィッシャー滴定を知っているであろう。一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ｂは、約２５℃などの周囲温度〜２００℃でのＴＧＡサーモグラムにおいて、０．５％ｗ／ｗ未満、例えば０．４％ｗ／ｗ未満、例えば０．３％ｗ／ｗ未満、例えば０．２％ｗ／ｗ未満、例えば０．１％ｗ／ｗ未満の喪失を有することによって特徴付けられる。一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ｂは、乾燥減量試験において、２重量％未満、例えば１重量％未満、例えば０．５重量％未満を喪失する。乾燥減量試験は、７０℃で行われる。
【００７９】
一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ｂは、多形Ｂの極めて純粋な結晶性形態であり、例えば、シロシビンは、少なくとも９０重量％、例えば９５重量％、例えば９９重量％、例えば９９．５重量％の多形Ｂを含む。
【００８０】
別の実施形態において、結晶性シロシビン多形Ｂは化学的に純粋であり、例えば、シロシビンは、ＨＰＬＣによって、９７％超、例えば９８％超、又は例えば９９％超の化学的純度を有する。一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ｂは、３１Ｐ  ＮＭＲによって測定されるリン酸及びＨＰＬＣによって測定されるサイロシンを含めた、１％より大きい、より好ましくは０．５％より小さい単一の不純物を有さない。一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ｂは、ＨＰＬＣによって、９７面積％より大きい、より好ましくは９８面積％より大きい、最も好ましくは９９面積％より大きい化学的純度を有する。一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ｂは、ＨＰＬＣによって測定された場合に、１面積％より大きい、より好ましくは０．５面積％より小さい単一の不純物を有さない。一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ｂは、ＨＰＬＣによって測定された場合に、１面積％より大きい、より好ましくは０．５面積％より小さいレベルでサイロシンを含有しない。一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ｂは、３１Ｐ  ＮＭＲによって測定された場合に、１重量％より大きい、より好ましくは０．５重量％より小さいレベルでリン酸を含有しない。一実施形態において、結晶性シロシビン多形Ｂは、少なくとも９５重量％、例えば少なくとも９６重量％、又は例えば少なくとも９８重量％の化学的アッセイを有する。
【００８１】
多形Ａ又はＡ’の形態の本発明のシロシビンは、下表５に示されている一般的な特性を有する。
【表５】
2020536960.tif 000007
【００８２】
シロシビンは、下表６に記された及び図１０〜１３のスペクトルに図示されているスペクトルと合致する。
【表６】
2020536960.tif 000008
【００８３】
高純度は、潜在的な有機不純物が著しく低下されることを確実にするために、反応条件の注意深い制御によって達成される。
【００８４】
シロシビン中の既知の及び潜在的な不純物が、下表７に示されている。
【表７−１】
2020536960.tif 000009
【表７−２】
2020536960.tif 000010
【００８５】
同様に、注意深い処理は、溶媒レベルが表８に記されているレベルを常に下回ることを確実にする。
【表８】
2020536960.tif 000011
【００８６】
操作方法論の注意深い選択を通じて、本発明のシロシビン薬物物質は、下表９に示されている受容基準を充足する。
【表９】
2020536960.tif 000012
表中で使用された略号：ＮＭＴ＝以下、ＮＬＴ＝以上。
【００８７】
純度を確認するために使用された方法論は、詳細な説明に記載されている。
【００８８】
実際に、下表１０に記されているように、基準６〜１３は実際には十分に充足されている。
【表１０】
2020536960.tif 000013
表中で使用された略号：ＮＭＴ＝以下、ＬＴ＝未満。
【００８９】
このように、多形Ａ又は多形Ａ’の形態の結晶性シロシビンは、プロトン（１Ｈ）及び炭素（１３Ｃ）ＮＭＲ、ＦＴ−赤外線分光法（ＦＴ−ＩＲ）及び質量分析（ＭＳ）−図１０〜１３と合致するスペクトルを有する。
【００９０】
多形Ａ又は多形Ａ’の形態の結晶性シロシビンは、表９又は表１０に明記されている基準のいずれかに合致する。
【００９１】
本発明の第二の態様にしたがい、本発明の第一の態様による多形Ａ又は多形Ａ’の形態で、結晶性シロシビンのバッチが提供される。一実施形態において、少なくとも１０ｇ、より好ましくは少なくとも１００ｇ、最も好ましくは少なくとも２５０ｇを含む結晶性シロシビン、多形Ａ又は多形Ａ’のバッチが提供される。一実施形態において、少なくとも１０ｇ、より好ましくは少なくとも１００ｇ、最も好ましくは少なくとも２５０ｇを含む結晶性シロシビン、多形Ａ又は多形Ａ’のバッチが提供される。一実施形態において、少なくとも１０ｇ、より好ましくは少なくとも１００ｇ、最も好ましくは少なくとも２５０ｇを含む高純度シロシビンのバッチが提供される。一実施形態において、少なくとも１０ｇ、より好ましくは少なくとも１００ｇ、最も好ましくは少なくとも２５０ｇを含む高純度シロシビン多形Ａのバッチが提供される。一実施形態において、少なくとも１０ｇ、より好ましくは少なくとも１００ｇ、最も好ましくは少なくとも２５０ｇを含む高純度シロシビン多形Ａ’のバッチが提供される。
【００９２】
又は、独立して、結晶性シロシビンは、水和物Ａ又は多形Ｂの形態を取り得る。
【００９３】
本発明の第三の態様にしたがい、結晶性シロシビンと１又はそれを超える賦形剤とを含む薬学的調合物が提供される。
【００９４】
一実施形態において、高純度シロシビン及び１又はそれを超える賦形剤を含む薬学的調合物が提供される。別の実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａと１又はそれを超える賦形剤とを含む薬学的調合物が提供される。別の実施形態において、結晶性シロシビン多形Ａ’と１又はそれを超える賦形剤とを含む薬学的調合物が提供される。別の実施形態において、高純度結晶性シロシビン、多形Ａ又は多形Ａ’と１又はそれを超える賦形剤とを含む薬学的調合物が提供される。別の実施形態において、高純度結晶性シロシビン多形Ａと１又はそれを超える賦形剤とを含む薬学的調合物が提供される。別の実施形態において、高純度結晶性シロシビン多形Ａ’と１又はそれを超える賦形剤とを含む薬学的調合物が提供される。
【００９５】
又は、独立して、調合物中の結晶性シロシビンは、水和物Ａ又は多形Ｂの形態を取り得る。
【００９６】
経口調合物用の好ましい薬学的賦形剤には、微結晶セルロース、デンプン、マンニトール、リン酸水素カルシウム無水物、又は二酸化ケイ素、炭酸カルシウム、微結晶セルロース及びタルクの共混合物（ｃｏ−ｍｉｘｔｕｒｅｓ）などの希釈剤；デンプングリコール酸ナトリウム又はクロスカルメロースナトリウムなどの崩壊剤；ポビドン、コポビドン又はヒドロキシルプロピルセルロースなどの結合剤；ステアリン酸マグネシウム又はステアリルフマル酸ナトリウムなどの滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；及びＯｐａｄｒｙＩＩホワイト又はＰＶＡをベースとするブラウンＯｐａｄｒｙＩＩなどのフィルムコートが含まれる。
【００９７】
シロシビンは、多数の理由のため、調合することが困難な活性物質である。第一に、シロシビンは乏しい流動特性を有し、第二に、相対的に低用量で使用され、この組み合わせのために、錠剤化する上での含量均一性を確実にすることが困難である。
【００９８】
優れた混和は、１５未満、より好ましくは１０未満のＡＶ値、受容値（Ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ  Ｖａｌｕｅ）を有するであろう。
【００９９】
優れた混和は、９０％より大きい、より好ましくは、９４％より大きい％ラベルクレーム（Ｌａｂｅｌ  ｃｌａｉｍ）も有するであろう。
【０１００】
それらの間において、これらのパラメータは、錠剤間でのシロシビンの一貫した投薬を示す。
【０１０１】
多くの薬学的錠剤に対して、標準的な賦形剤、特に増量剤を使用することができる。しかしながら、シロシビン錠剤を調合する際に、出願人は、満足できる製品を達成するためには、標準的でない増量剤が好ましいことを見出した。
【０１０２】
これに関して、機能的な増量剤が選択された。機能的な増量剤は、珪化された増量剤、好ましくは、珪化された微結晶セルロースであった。好ましい形態は、約４５〜１５０ミクロンの粒径範囲を有する高い圧縮可能性等級を含む。
【０１０３】
実際に、異なる粒径範囲を有する２つの機能的増量剤の混合物は、２つのうちより大きなサイズの粒子を好む重量百分率で使用され得る。
【０１０４】
一実施形態において、珪化された微結晶増量剤は、重量で、最大３０％、より好ましくは最大２０％、より好ましくは最大１５％又はそれ未満の量で約４５〜８０ミクロンの粒径範囲を有する第一の増量剤と、最大７０％、より好ましくは最大８０、より好ましくは最大８５％又はそれを超える量で約９０〜１５０ミクロンの粒径範囲を有する第二の増量剤とを含み得る。
【０１０５】
調合物は、崩壊剤、好ましくはデンプングリコール酸ナトリウム、流動促進剤、好ましくはコロイド状二酸化ケイ素、及び滑沢剤、好ましくはステアリルフマル酸ナトリウムをさらに含み得、又はこれらからなり得る。
【０１０６】
調合物開発のさらなる詳細は、実施例１２に記載されている。
【０１０７】
調合物は、開示されている好ましい多形形態だけではなく、任意の形態のシロシビンを含み得ることに注意すべきである。
【０１０８】
Ｓｔｕｄｅｒｕｓら、（２０１１）Ｊ  Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２５（１１）１４３４−１４５２は、シロシビンの経口用量を次のように分類した：０．０４５ｍｇ．ｋｇでの極めて低用量、０．１１５〜０．１２５ｍｇ／ｋｇの低用量、０．１１５〜０．２６０ｍｇ／ｋｇの中用量及び０．３１５ｍｇ／ｋｇの高用量。
【０１０９】
シロシビンは、典型的には、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇの量での調合された用量で存在するであろう。典型的な（６０〜８０ｋｇの体重の成人に対する）ヒト用量は、０．６０ｍｇ〜８０ｍｇのどこかの用量に等しいであろう。一実施形態において、２〜５０ｍｇの結晶性シロシビン、最も好ましくは、多形Ａ又は多形Ａ’は、２〜４０ｍｇなど、２〜１０ｍｇなど、５ｍｇなど、５〜３０ｍｇなど、５〜１５ｍｇなど、１０ｍｇなど、２０〜３０ｍｇなど、又は２５ｍｇなど、調合された用量で存在する。一実施形態において、２〜５０ｍｇの結晶性シロシビン、特に多形Ａは、２〜４０ｍｇなど、２〜１０ｍｇなど、５ｍｇなど、５〜３０ｍｇなど、５〜１５ｍｇなど、１０ｍｇなど、２０〜３０ｍｇなど、又は２５ｍｇなどの、調合された用量で存在する。一実施形態において、２〜５０ｍｇの結晶性シロシビン、特に多形Ａ’は、２〜４０ｍｇなど、２〜１０ｍｇなど、５ｍｇなど、５〜３０ｍｇなど、５〜１５ｍｇなど、１０ｍｇなど、２０〜３０ｍｇなど、又は２５ｍｇなど、調合された用量で存在する。
【０１１０】
好ましい成人経口用量は、１ｍｇ〜４０ｍｇ、好ましくは２〜３０ｍｇ、より好ましくは１５〜３０ｍｇの範囲、例えば、５ｍｇ、１０ｍｇ又は２５ｍｇである可能性が高い。微量投薬、典型的にはこれらの用量の約１／１０も可能であり、微量用量調合物は、典型的には、０．０５ｍｇ〜２．５ｍｇの範囲内に存在する。
【０１１１】
好ましい薬学的調合物は、経口剤形である。
【０１１２】
経口剤形は、錠剤又はカプセルであり得る。
【０１１３】
錠剤については、活性物質を正確に分散できることが必要である。これは、低用量並びにその流動性を制約する活性物質の吸湿性及び粘着性のために困難である。
【０１１４】
シロシビンは、１又はそれを超える賦形剤と一緒に存在するであろう。好ましい賦形剤には、微結晶セルロース及びデンプン、より好ましくは、珪化された微結晶セルロースが含まれる。
【０１１５】
本発明の第四の態様にしたがい、医薬において使用するための、本発明の第一の態様による多形Ａ又は多形Ａ’の形態の結晶性シロシビンが提供される。一実施形態において、医薬において使用するための結晶性シロシビン多形Ａが提供される。一実施形態において、医薬において使用するための結晶性シロシビン多形Ａ’が提供される。一実施形態において、医薬において使用するための高純度結晶性シロシビン多形Ａが提供される。一実施形態において、医薬において使用するための高純度結晶性シロシビン多形Ａ’が提供される。
【０１１６】
又は、独立して、結晶性シロシビンは、水和物Ａ又は多形Ｂの形態を取り得る。
【０１１７】
本発明の第五の態様にしたがい、中枢神経障害を処置することにおいて使用するための、本発明の第一の態様の多形Ａ又は多形Ａ’の形態の結晶性シロシビンが提供される。
【０１１８】
又は、独立して、結晶性シロシビンは、水和物Ａ又は多形Ｂの形態を取り得る。
【０１１９】
一実施形態において、うつ病を処置することにおいて使用するための結晶性シロシビン、多形Ａ又は多形Ａ’が提供される。一実施形態において、薬物抵抗性うつ病を処置することにおいて使用するための結晶性シロシビン、多形Ａ又は多形Ａ’が提供される。一実施形態において、薬物抵抗性うつ病を処置することにおいて使用するための結晶性シロシビン多形Ａが提供される。一実施形態において、薬物抵抗性うつ病を処置することにおいて使用するための結晶性シロシビン多形Ａ’が提供される。一実施形態において、薬物抵抗性うつ病を処置することにおいて使用するための高純度結晶性シロシビン多形Ａが提供される。一実施形態において、薬物抵抗性うつ病を処置することにおいて使用するための高純度結晶性シロシビン多形Ａ’が提供される。
【０１２０】
処置され得るその他の症状には、進行したステージの病気、例えば、がんにおける不安及び全般不安症を含む不安障害、大うつ病性障害を含むうつ病、群発頭痛、強迫性障害、行為障害を含むパーソナリティ障害、アルコール依存、ニコチン依存、オピオイド依存、コカイン依存を含む薬物障害並びにギャンブル依存症、摂食障害及び身体醜形障害を含むその他の嗜癖が含まれる。さらなる症状は、疼痛の処置である。
【０１２１】
本発明の第六の態様にしたがい、中枢神経障害を処置することを必要とする対象に、有効用量の、発明の第一の態様による多形Ａ又は多形Ａ’の形態の結晶性シロシビンを投与することを含む、中枢神経障害を処置する方法が提供される。
【０１２２】
一実施形態において、うつ病を処置することを必要とする対象に、有効用量の、多形Ａ又は多形Ａ’の形態の結晶性シロシビンを投与することを含む、うつ病を処置する方法が提供される。一実施形態において、薬物抵抗性うつ病を処置することを必要とする対象に、有効用量の、多形Ａ又は多形Ａ’の形態の結晶性シロシビンを投与することを含む、薬物抵抗性うつ病を処置する方法が提供される。一実施形態において、薬物抵抗性うつ病を処置することを必要とする対象に、有効用量のシロシビン多形Ａを投与することを含む、薬物抵抗性うつ病を処置する方法が提供される。一実施形態において、薬物抵抗性うつ病を処置することを必要とする対象に、有効用量のシロシビン多形Ａ’を投与することを含む、薬物抵抗性うつ病を処置する方法が提供される。一実施形態において、薬物抵抗性うつ病を処置することを必要とする対象に、有効用量の高純度結晶性シロシビン多形Ａを投与することを含む、薬物抵抗性うつ病を処置する方法が提供される。一実施形態において、薬物抵抗性うつ病を処置することを必要とする対象に、有効用量の高純度結晶性シロシビン多形Ａ’を投与することを含む、薬物抵抗性うつ病を処置する方法が提供される。
【０１２３】
又は、独立して、結晶性シロシビンは、水和物Ａ又は多形Ｂの形態を取り得る。
【０１２４】
本発明のシロシビンを生産するために、シロシビンは、制御された様式で水から結晶化された。
【０１２５】
本発明の第七の態様にしたがい、シロシビンの大規模製造のための方法であって、前記方法が、本発明の第一の態様による結晶性シロシビン多形Ａを生産するために、制御された乾燥とともに、シロシビンを水結晶化工程に供することを含むことを特徴とする、方法が提供される。
【０１２６】
一実施形態において、シロシビンの大規模製造のための方法であって、前記方法が、図７ａに図示されているＸＲＰＤディフラクトグラム並びに図８ａに例示されているＤＳＣ及びＴＧＡサーモグラフを有する結晶性シロシビン多形Ａを生産するために、制御された乾燥とともに、シロシビンを水結晶化工程に供することを含むことを特徴とする、方法が提供される。一実施形態において、シロシビンの大規模製造のための方法であって、前記方法が、図７ａに図示されているＸＲＰＤディフラクトグラム並びに図８ａに図示されているＤＳＣサーモグラフを有する高純度結晶性シロシビン−多形Ａを生産するために、制御された乾燥とともに、シロシビンを水結晶化工程に供することを含むことを特徴とする、方法が提供される。
【０１２７】
好ましくは、多形Ａは、図７ａに図示されているＸＲＰＤディフラクトグラム及び図８ａに図示されているＤＳＣサーモグラフを有する同形変異形である。
【０１２８】
より好ましくは、シロシビンは、典型的には約１０〜２０容量の水中で再結晶され、少なくとも７０℃の温度に撹拌しながら加熱され、適切なカットオフ（典型的には、５μｍ未満）で仕上げろ過され、約７０℃の温度でシードされ、２時間を超える期間にわたって制御された様式で約５℃に冷却される。
【０１２９】
より好ましくは、この方法は、１時間に約５℃〜１５℃、より好ましくは１時間に約１０℃温度を低下させる、制御された冷却を含む。
【０１３０】
好ましくは、仕上げろ過工程は、１．２μｍのインラインフィルターなどの適切な大きさのフィルターを通して行われる。
【０１３１】
好ましくは、撹拌は、約４００〜５００ｒｐｍ、典型的には、約４５０ｒｐｍで撹拌されることによる。
【０１３２】
好ましくは、結晶種はシロシビン水和物Ａである。一実施形態において、０．１重量％又はそれ未満の結晶種が前記過程に添加される。
【０１３３】
好ましくは、結晶性シロシビンは、真空ろ過によって単離される。
【０１３４】
一実施形態において、単離された結晶は、少なくとも３０℃、例えば３０〜５０℃、又は例えば４０〜５０℃の温度で、真空中で乾燥される。一実施形態において、単離された結晶は、少なくとも１０時間、例えば１２〜１８時間、又は例えば約３０時間、真空中で乾燥される。一実施形態において、単離された結晶は、真空中において、少なくとも３０℃、例えば３０〜５０℃、又は例えば４０〜５０℃の温度で、少なくとも１０時間、例えば１２〜１８時間又は例えば約３０時間乾燥される。一実施形態において、単離された結晶が、乾燥減量試験において２％未満、例えば０．５％未満の重量の重量を失うまで、単離された結晶が乾燥される。
【０１３５】
好ましくは、単離された結晶は、水中で数回洗浄され、真空中において、約５０℃で、少なくとも１２時間乾燥される。
【０１３６】
得られた結晶は、典型的には、相対的に大きく（５０〜２００ミクロンの範囲）、図１６ａに図示されているように、１０倍の顕微鏡下で見たときに均一である。
【０１３７】
これは、図１６ｂに図示されているように、１０倍の顕微鏡下で見たときに、はるかに小さいサイズ（典型的には、５〜５０ミクロン）である制御された冷却なしに得られた結晶と異なる。
【０１３８】
本発明の第八の態様にしたがい、本発明の結晶化の方法によって得られた本発明の第一の態様によるシロシビンが提供される。
【０１３９】
本発明の第九の態様にしたがい、本発明の結晶化の方法によって得られた本発明の第一の態様によるシロシビンを含む薬学的調合物が提供される。
【０１４０】
結晶化前に製造されたシロシビンは、合成的又は生物学的なあらゆる方法を用いて、例えば発酵によって生産され得、又はきのこからの抽出によって取得され得る。
【０１４１】
好ましい製造方法は、出発材料として、サイロシン又は４ヒドロキシ−インドールを使用する。
【０１４２】
本発明の第十の態様にしたがい、以下の工程を含む、サイロシンからのシロシビンの大規模製造のための方法が提供される。
ｉ）ステージ４  −  サイロシンをテトラベンジルピロホスフェートと反応させて、ベンジル３−［２−（ベンジルジメチルアザニウムイル）エチル］−１Ｈ−インドール−４−イルホスフェートを形成すること；及び
ｉｉ）ステージ５  −  ベンジル３−［２−（ベンジルジメチルアザニウムイル）エチル］−１Ｈ−インドール−４−イルホスフェートを水素と反応させて、シロシビンを形成すること。
【０１４３】
本発明の第十一の態様にしたがい、以下の工程を含む、４−ヒドロキシインドールからのシロシビンの大規模製造のための方法が提供される。
ｉ）ステージ１  −  ４−ヒドロキシインドールを無水酢酸と反応させて、１Ｈ−インドール−４−イルアセテートを形成すること；
ｉｉ）ステージ２  −  １Ｈ−インドール−４−イルアセテートを塩化オキサリル及びジメチルアミンと反応させて、３［（ジメチルカルバモイル）カルボニル］−１Ｈ−インドール−４イル−アセテートを形成すること；
ｉｉｉ）ステージ３  −  ３［（ジメチルカルバモイル）カルボニル］−１Ｈ−インドール−４イル−アセテートを水素化アルミニウムリチウムと反応させて、サイロシンを形成すること；
ｉｖ）ステージ４  −  サイロシンをテトラベンジルピロホスフェートと反応させて、ベンジル３−［２−（ベンジルジメチルアザニウムイル）エチル］−１Ｈ−インドール−４−イルホスフェートを形成すること；及び
ｖ）ステージ５  −  ベンジル３−［２−（ベンジルジメチルアザニウムイル）エチル］−１Ｈ−インドール−４−イルホスフェートを水素と反応させて、シロシビンを形成すること。
【０１４４】
本発明の第十二の態様にしたがい、以下をさらに含む、本発明の第十又は第十一の態様にしたがうシロシビンの大規模製造のための方法が提供される。
ｖｉ）ステージ６  −  本発明の第一の態様にしたがう結晶性シロシビン多形Ａを生産するための、制御された乾燥を伴う、水結晶化工程。
【０１４５】
一実施形態において、以下をさらに含む、本発明の第十又は第十一の態様にしたがうシロシビンの大規模製造のための方法が提供される。
ｖｉ）ステージ６  −  図７ａに実質的に図示されているＸＲＰＤディフラクトグラム及び図８ａに実質的に図示されているＤＳＣサーモグラフを有する結晶性シロシビン−多形Ａを生産するための、制御された乾燥を伴う、水結晶化工程。
【０１４６】
一実施形態において、以下をさらに含む、本発明の第十又は第十一の態様にしたがうシロシビンの大規模製造のための方法が提供される。
ｖｉ）ステージ６  −  図７ａに図示されているＸＲＰＤディフラクトグラム及び図８ａに図示されているＤＳＣサーモグラフを有する高純度結晶性シロシビン−多形Ａを生産するための、制御された乾燥を伴う、水結晶化工程。
【０１４７】
好ましくは、結晶性シロシビンは、多形Ａである。
【０１４８】
サイロシン又はシロシビンの大規模生産のための方法論を開発する際に、出願人は、ステージ１〜５の各々における１又はそれを超える重大な問題を克服し、サイロシン若しくはシロシビンの大規模生産各工程との関連でこれらの問題が検討され、より正確には各問題が克服された方法は、サイロシン、シロシビンへの中間体又はプロドラッグを与える、その他の誘導体、塩、エステルなどであれば、他の活性物質の製造において用途を有するので、別個の独立した発明と考えられる。
【０１４９】
好ましくは、ステージ４（ｉ）反応は、ヘキサメチルジシラザンナトリウム（ＮａＨＭＤＳ）の使用を含む。
【０１５０】
これは、ｉ）取り扱いがより容易であり、ｉｉ）下流の処理で問題を引き起こすリチウムを反応中に導入しない点で、ブチルリチウムの使用より利点を有する。
【０１５１】
好ましくは、反応は、溶媒ＴＨＦを使用する。
【０１５２】
これは、得られる生成物が著しくより高い純度で得られるという利点を有する。
【０１５３】
好ましくは、（ｉ）において、反応は−５０℃より下で開始される。
【０１５４】
これは、その後に下流で純度に影響を及ぼし得る不純物（ＬＣＭＳによって観察されたｍ／ｚ２９５．２）のレベルを低下させるという利点を有する。
【０１５５】
より好ましくは、ステージ４（ｉｉ）工程は、溶媒としてＴＨＦを使用する。
【０１５６】
これは、濃厚化が回避されることを確実にするという利点を有し、生成物を得るための単純な撹拌過程（ｓｔｉｒ  ｏｕｔ  ｐｒｏｃｅｓｓ）を容易にする。
【０１５７】
好ましくは、ステージ４（ｉｉ）工程は、ベンジル３−［２−（ベンジルジメチルアザニウムイル）エチル］−１Ｈ−インドール−４−イルホスフェートを得るための撹拌過程を含む。
【０１５８】
撹拌過程は、過程が単純化され、収率が改善されるという利点を有する。
【０１５９】
ステージ４（ｉｉ）反応が完了するまで実行されることを確実にするために、中間体４Ａのレベルがモニターされ、完了したら直ちに、ベンジル３−［２−（ベンジルジメチルアザニウムイル）エチル］−１Ｈ−インドール−４−イルホスフェートがろ過され、オーブンで乾燥される。
【０１６０】
これは、不純物が最小化され、より純粋な生成物が得られるという利点を有する。
【０１６１】
好ましくは、ステージ５反応は、相対保持時間（ＲＲＴ）を用いて、ＨＰＬＣによって、中間体のレベルに関してモニターされ、中間体が０．２％未満で存在することによって、完了が決定される。
【０１６２】
シロシビン粗製物（ステージ５生成物、（１２））は、ＨＰＬＣ法におけるその相対保持時間（ＲＲＴ）が、それぞれ、約１．８９及び２．４５である主なステージ５不純物並びにサイロシン（ＲＲＴ１．６６）を有する。これらの不純物は、表７に記されている。典型的には、シロシビン粗製物（ステージ５生成物（１２））は、０．２４面積％のＲＲＴ１．８９不純物、０．０３面積％のＲＲＴ２．４５不純物及び１．８６面積％のサイロシンを有する。さらに、ピロリン酸不純物（ＲＲＴ０．３１）が、例えば、ＨＰＬＣによれば約２〜６面積％のレベルでシロシビン粗製物中に存在する。
【０１６３】
このレベルで、実質的に純粋なシロシビン、例えば、ＨＰＬＣによって少なくとも９５面積％、例えば少なくとも９８面積％、又は例えば少なくとも９９面積％の純度を有するシロシビンを与えるために、後続の結晶化過程を実施することができる。一実施形態において、ピロリン酸不純物（ＲＲＴ０．３１）は、ＨＰＬＣによって０．３面積％未満、例えば０．２面積％未満、又は例えば０．１面積％未満のレベルで実質的に純粋なシロシビン中に存在する。
【０１６４】
さらに、このステージの間に、シロシビンを溶液中に維持するために、反応物に水が添加される。
【０１６５】
好ましくは、触媒はろ過によって回収される。
【０１６６】
好ましくは、ステージ１において、反応は、ＤＣＭ及びピリジン中で実施される。
【０１６７】
これは、可燃性溶媒が回避されるという利点を有する。
【０１６８】
好ましくは、反応混合物は、約２〜３のｐＨを与えて過剰なピリジンを除去するために、クエン酸で洗浄され、酸相はＤＣＭ相から分離される。
【０１６９】
これは、中間体２Ａを単離することができるという利点を有しており、過剰の塩化オキサリルを含まないようにする精製が可能となる。
【０１７０】
より好ましくは、ＤＣＭ相は、約ｐＨ８の重炭酸ナトリウムでさらに洗浄される。
【０１７１】
これは、より純粋な処理という利点を有する。
【０１７２】
好ましくは、１Ｈ−インドール−４−イルアセテートは、ヘプタン中に沈殿される。
【０１７３】
これは、沈殿を補助し、部分的な溶解度の問題を克服する。
【０１７４】
好ましくは、硫酸マグネシウムが乾燥剤として使用される。
【０１７５】
好ましくは、溶媒のｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）及びテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）が使用される。
【０１７６】
好ましくは、塩化オキサリルとの反応は、約３０℃〜４０℃で実施される。
【０１７７】
これは、高い反応速度が確実にされて、改善されたレベルの完了を与えるという利点を有する。
【０１７８】
好ましくは、中間体２Ａは、ろ過によって単離される。
【０１７９】
これは、中間体が過剰な塩化オキサリルを含まずに精製されるという利点を有する。
【０１８０】
好ましくは、ステージ２、工程ｉでは、過剰な塩化オキサリルを除去するために、中間体２Ａは洗浄もされる。
【０１８１】
好ましくは、中間体２Ａは、ＴＢＭＥで洗浄される。
【０１８２】
好ましくは、さらなる中間体２Ａを沈殿させるために、ヘプタン添加が行われる。
【０１８３】
好ましくは、ステージ２、工程ｉｉでは、ジメチルアミンは過剰に使用される。
【０１８４】
これは、さらに改善された不純物プロファイル及び収率が得られるという利点を有する。
【０１８５】
好ましくは、ｐＨは約ｐＨ７又はｐＨ７より上に維持される。
【０１８６】
好ましくは、反応はＴＢＭＥ中で実施される。
【０１８７】
好ましくは、このステージは、ジメチルアミン塩を除去する精製工程をさらに含む。
【０１８８】
これは、純度が改善されるという利点を有する。
【０１８９】
好ましくは、このステージは、スラリー化及びろ過工程を含む。
【０１９０】
これは、取り扱い及び純度が改善されるという利点を有する。
【０１９１】
より好ましくは、このステージは、水及び／又はＩＰＡでスラリー化すること、ろ過すること、及び単離された３［（ジメチルカルバモイル）カルボニル］−１Ｈ−インドール−４イル−アセテートを乾燥させることを含む。
【０１９２】
これは、純度及び収率が改善され、加水分解が低減されるという利点を有する。
【０１９３】
好ましくは、ステージ３において、反応は、溶媒ＴＨＦ中で実施される。
【０１９４】
これは、懸濁液／エマルジョンが濃厚化することなしに形成されるという利点を有する。
【０１９５】
好ましくは、３［（ジメチルカルバモイル）カルボニル］−１Ｈ−インドール−４イル−アセテートは、ＴＨＦ中のＬｉＡｌＨ４の溶液に添加される。
【０１９６】
好ましくは、反応は、アセトン、続いてクエン酸で停止され、混合物が強塩基性（ｐＨ１１又はそれより上）に留まることを確実にする。
【０１９７】
これは、高い収率が得られるという利点を有する。
【０１９８】
好ましくは、サイロシンはろ過され、ＴＨＦ中で洗浄され、ＰｒＯＡｃ：ＴＢＭＥ中でスラリー化され、ろ過され、ＴＢＭＥ中で洗浄され、乾燥される。
【０１９９】
これは、高い純度の生成物、例えば、ＨＰＬＣによって少なくとも９５％純粋、ＨＰＬＣによって例えば少なくとも９８％純粋、又はＨＰＬＣによって例えば少なくとも９９％純粋な生成物が得られるという利点を有する。
【０２００】
好ましい生産方法は、ステージ１〜６のそれぞれを含むが、各ステージの特徴のそれぞれは独立して存在することができ、又は反応の同一の若しくは異なる工程からの任意の他の特徴と組み合わせて使用できることが理解されるであろう。
【０２０１】
所定の形態、多形Ａ又は多形Ａ’のシロシビン及びこのような高純度のシロシビンは以前には得られておらず、出願人の知る限り、特に出願人の多形Ａ及び多形Ａ’（図７ａ及び図７ｂ並びに図８ａ及び図８ｂ中に図示されているような）の生産は新規である。実際に、多形Ａの巨大なバッチ量の生産は新規である。本発明の結晶化方法論及び一部には、製造方法の結果、このような高い化学的純度の結晶性シロシビンを得ることが可能になる。
【０２０２】
さらに、本化合物の不安定な性質を考慮すれば、加速された条件下で、（以下に記載されている）少なくとも１２ヶ月間、安定であることが示された結晶性形態を得た。
【０２０３】
多形Ａ及びＡ’（図７ａ及び７ｂ）は、以下に記載されているように、それらのＸＲＰＤディフラクトグラム及びＤＳＣサーモグラフから明らかなように、多形Ｂ（図７ｃ）、水和物Ａ（図７ｄ）及びエタノール溶媒和物（図７ｅ）及び混合物（図７ｆ（上））とは異なる。
【０２０４】
異なる多形間の関係は、図９に示されている。
【０２０５】
実際に、結晶のサイズ及び形状は、結晶化法論によって決定され、これらは、次いで、安定性及び生成物を調合する能力に影響を与え得る。
【０２０６】
特に好ましい実施形態において、シロシビンは、以下に概説されているように、６ステージの過程を通じて製造される。
【０２０７】
本発明の別の態様にしたがい、本発明の第一の態様による結晶性シロシビンの製造のための方法であって、前記方法が、本発明の第一の態様による結晶性シロシビン多形Ａ又は多形Ａ’を生産するために、制御された乾燥とともに、シロシビンを水結晶化工程に供することを含むことを特徴とする、方法が提供される。一実施形態において、本発明の第一の態様による結晶性シロシビンの製造のための方法であって、前記方法が、図７ａ又は図７ｂに実質的に図示されているＸＲＰＤディフラクトグラム並びに図８ａ又は図８ｂに実質的に図示されているＤＳＣサーモグラフを有する結晶性シロシビン−多形Ａ又は多形Ａ’を生産するために、制御された乾燥とともに、水結晶化工程を含むことを特徴とする、方法が提供される。一実施形態において、本発明の第一の態様によるシロシビンの製造のための方法であって、前記方法が、図７ａ又は７ｂに図示されているＸＲＰＤディフラクトグラム並びに図８ａ又は図８ｂに図示されているＤＳＣサーモグラフを有する高純度結晶性シロシビン−多形Ａ又は多形Ａ’を生産するために、制御された乾燥とともに、水結晶化工程を含むことを特徴とする、方法が提供される。
【０２０８】
好ましくは、多形Ａ及び多形Ａ’は、図７ａ及び図７ｂに実質的に図示されているＸＲＰＤディフラクトグラム並びに図８ａ及び図８ｂに実質的に図示されているＤＳＣサーモグラフを有する同形変異形である。
【０２０９】
より好ましくは、シロシビンは、約１０〜２０容量の水中で再結晶され、少なくとも７０℃の温度に撹拌しながら加熱され、適切なカットオフ（典型的には、５μｍ未満）で仕上げろ過され、約７０℃の温度でシードされ、２時間を超える期間にわたって制御された様式で約５℃に冷却される。
【０２１０】
より好ましくは、この方法は、１時間に約５℃〜１５℃、より好ましくは１時間に約１０℃温度を低下させる、制御された冷却を含む。
【０２１１】
好ましくは、仕上げろ過工程は、１．２μｍ又は０．４５μｍのインラインフィルターなどの適切な大きさのフィルターを通して行われる。
【０２１２】
好ましくは、撹拌は、約４００〜５００ｒｐｍ、典型的には、約４５０ｒｐｍで撹拌されることによる。
【０２１３】
好ましくは、結晶種はシロシビン水和物Ａである。一実施形態において、０．１重量％又はそれ未満の結晶種が前記過程に添加される。
【０２１４】
好ましくは、結晶性シロシビンは、真空ろ過によって単離される。
【０２１５】
一実施形態において、単離された結晶は、少なくとも３０℃、例えば３０〜５０℃、又は例えば４０〜５０℃の温度で、真空中で乾燥される。一実施形態において、単離された結晶は、少なくとも１０時間、例えば１２〜１８時間又は例えば約３０時間、真空中で乾燥される。一実施形態において、単離された結晶は、真空中において、少なくとも３０℃、例えば３０〜５０℃又は例えば４０〜５０℃の温度で、少なくとも１０時間、例えば１２〜１８時間又は例えば約３０時間乾燥される。一実施形態において、単離された結晶が、乾燥減量試験において２％未満、例えば０．５％未満の重量の重量を失うまで、単離された結晶が乾燥される。
【０２１６】
好ましくは、単離された結晶は、水中で数回洗浄され、真空中において、約５０℃で、少なくとも１２時間乾燥される。
【０２１７】
得られた結晶は、典型的には、相対的に大きく（５０〜２００ミクロンの範囲）、図１６ａに図示されているように、１０倍の顕微鏡下で見たときに均一である。
【０２１８】
これは、図１６ｂに図示されているように、１０倍の顕微鏡下で見たときに、はるかに小さいサイズ（典型的には、５〜５０ミクロン）である制御された冷却なしに得られた結晶と異なる。
ステージ１：１Ｈ−インドール−４−イルアセテート（３）の合成
【０２１９】
中核の反応は、１Ｈ−インドール−４−イルアセテート（３）を形成するための、４−ヒドロキシインドール（１）の無水酢酸（２）との反応である（図２）。
【０２２０】
最も好ましくは、ステージ１は、以下のとおりである。
【０２２１】
４−ヒドロキシインドール（１）、ＤＣＭ（１２）及びピリジン（１３）を容器に添加し、約０〜５℃まで冷却する。無水酢酸（２）を滴下により添加し、約２０〜２５℃まで混合物を加温し、ＨＰＬＣによる完了まで撹拌する。反応物質をクエン酸水溶液（１４）及び水性ＮａＨＣＯ３（１５）で洗浄し、ＭｇＳＯ４（１６）で乾燥させ、ろ過し、約半分の容量まで蒸発させる。ヘプタン（１７）を添加し、ＤＣＭの大半を除去するために蒸留を継続する。混合物を約５〜２５℃に冷却し、ろ過し、ヘプタンで洗浄し、真空オーブン中で一晩乾燥させて、以下のステージで使用するのに適した固体として、１Ｈ−インドール−４−イルアセテート（３）を単離する。
ステージ２：３［（ジメチルカルバモイル）カルボニル］−１Ｈ−インドール−４イル−アセテート（６）の合成
【０２２２】
中核の反応は、３［（ジメチルカルバモイル）カルボニル］−１Ｈ−インドール−４イル−アセテート（６）を形成するための、１Ｈ−インドール−４−イルアセテート（３）の塩化オキサリル（４）及びジメチルアミン（５）との反応である（図３）。
【０２２３】
最も好ましくは、ステージ２は、以下のとおりである。
【０２２４】
１Ｈ−インドール−４−イルアセテート（３）を、室温で、ＴＨＦ（１９）及びＴＢＭＥ（１８）の混合物中に溶解する。塩化オキサリル（４）を滴下により添加し、約３５〜４０℃で反応を発熱させる。残りの添加を通じて、温度範囲を維持する。次いで、ＨＰＬＣによる完了まで、約４０℃で反応物を撹拌する。反応物を室温まで冷却し、ヘプタン（１７）を添加し、さらなる固体を沈殿させる。スラリーを撹拌し、次いで、沈降させ、続いて、デカンテーションによって、溶媒（１８／１９）の大半を除去する。ヘプタン（１７）で２回、容器中で固体を洗浄した。ＴＢＭＥ（１８）を添加して黄色のスラリーを得、混合物を約−２０℃まで冷却する。−２０℃〜−１０℃に温度を維持しながら、ジメチルアミン溶液（５）を添加する。次いで、反応物を室温まで加温し、完了まで撹拌し、必要であれば、さらなるジメチルアミンを添加する。反応をろ過し、ヘプタン（１７）で洗浄し、真空オーブン中で乾燥した。水（２０）、次いで、ＩＰＡ（２１）中でのスラリー化によって、粗製の３［（ジメチルカルバモイル）カルボニル］−１Ｈ−インドール−４イル−アセテート（６）をさらに精製し、次いで、真空オーブン中で乾燥させて、以下のステージで使用するのに適した固体として（６）を得た。
ステージ３：３−（２−（ジメチルアミノ）エチル）−１Ｈ−インドール−４−オール（サイロシン）（８）の合成
【０２２５】
中核の反応は、サイロシン（８）を形成するための、３［（ジメチルカルバモイル）カルボニル］−１Ｈ−インドール−４イル−アセテート（６）の水素化アルミニウムリチウム（７）との反応である（図４）。
【０２２６】
最も好ましくは、ステージ３は、以下のとおりである。
【０２２７】
３［（ジメチルカルバモイル）カルボニル］−１Ｈ−インドール−４イル−アセテート（６）をＴＨＦ（１９）中にスラリー化し、約０℃まで冷却した。約０〜２０℃に温度を維持しながら、ＬｉＡｌＨ４（７）のＴＨＦ溶液を滴下により添加した。次いで、ＨＰＬＣによる完了まで、反応物を還流した。反応物を０℃まで冷却し、アセトン（２２）、続いてクエン酸水溶液（１４）の添加によって、過剰なＬｉＡｌＨ４をクエンチした。リチウム及びアルミニウム塩を除去するために、バッチをろ過した。ＭｇＳＯ４（１６）でろ液を乾燥させ、ろ過し、濃縮し、シリカパッド（２３）上に搭載した。ＴＨＦ（１９）でパッドを溶出し、生成物を含有する画分を蒸発させた。得られた固体をｉＰｒＯＡｃ：ＴＢＭＥ（２４／１８）混合物中でスラリー化し、ろ過し、ＴＢＭＥで洗浄した。固体をオーブン中で乾燥させて、灰白色の固体として高純度サイロシン（８）を得た。
ステージ４：ベンジル３−［２−（ベンジルジメチルアザニウムイル）エチル］−１Ｈ−インドール−４−イルホスフェート（１０）の合成
【０２２８】
中核の反応は、ベンジル３−［２−（ベンジルジメチルアザニウムイル）エチル］−１Ｈ−インドール−４−イルホスフェート（１０）を形成するための、サイロシン（８）のテトラベンジルピロホスフェート（９）との反応である（図５）。
【０２２９】
最も好ましくは、ステージ４は、以下のとおりである。
【０２３０】
容器にサイロシン（８）を加え、続いてＴＨＦ（１９）を加える。反応物を−５０℃〜−７０℃まで冷却し、ＮａＨＭＤＳ（２５）を約−４５℃〜−７０℃で滴下により添加した。温度を約−４５℃〜−６０℃に調整し、ＴＨＦ中のテトラベンジルピロホスフェートを添加した。バッチを０℃まで加温し、その後、固体副生成物をろ過によって除去し、真空中でろ液を濃縮した。次いで、濃縮された混合物を約４０℃に加熱し、モニタリング及びＨＰＬＣの使用によって制御して、中間体がステージ４生成物（１０）に転化するまで撹拌した。約０〜５℃にバッチを冷却し、得られた固体をろ過によって単離し、真空中で乾燥させて、固体として、ベンジル３−［２−（ベンジルジメチルアザニウムイル）エチル］−１Ｈ−インドール−４−イルホスフェート（１０）を与えた。
ステージ５：中間等級リン酸水素３−［２−（ジメチルアザニウムイル）エチル］−１Ｈ−インドール−４−イル（シロシビン粗製物）（１２）の合成
【０２３１】
中核の反応は、シロシビン（１２）を形成するために、ベンジル３−［２−（ベンジルジメチルアザニウムイル）エチル］−１Ｈ−インドール−４−イルホスフェート（１０）を水素（１１）と反応させることを含む（図６）。
【０２３２】
最も好ましくは、ステージ５は、以下のとおりである。
【０２３３】
Ｐｄ／Ｃ（２６）、メタノール（２４）及び３−［２−（ベンジルジメチルアザニウムイル）エチル］−１Ｈ−インドール−４−イルホスフェート（１０）を容器に加え、ＨＰＬＣによる完了まで、得られた混合物に水素（１１）を注入した。生成物を溶液中に保持するために、この過程の間、精製水（２０）を添加する。混合物を約３５℃〜４５℃に加熱し、次いで、Ｃｅｌｉｔｅ（２７）の床を通してろ過し、メタノール（２４）及び精製水（２０）で洗浄した。ろ液を真空中で蒸発させ、エタノール（２８）と共沸して、中間等級のシロシビン（１２）を得た。
ステージ６：リン酸水素３−［２−（ジメチルアザニウムイル）エチル］−１Ｈ−インドール−４−イル（シロシビン）の合成
【０２３４】
中核の精製／多形決定工程は、高純度結晶性シロシビン、多形Ａ又は多形Ａ’を生産するための、水結晶化工程、その後の制御された冷却及び乾燥工程である。
【０２３５】
最も好ましくは、ステージ６は、以下のとおりである。
【０２３６】
精製水（２０）を有する容器に中間等級のシロシビン（１２）（ステージ５）を加え、シロシビン（１２）が溶解するまで、混合物を加熱した。次いで、得られたバルク溶液を、予め加温された容器中に仕上げろ過した。好ましくは、約６８℃〜７０℃に温度を調整し、シロシビン水和物結晶種（すなわち、水和物Ａ）を反応物に添加した。次いで、制御された様式で、バッチを約０〜１０℃に冷却し、撹拌し、固体をろ過によって収集し、精製水で洗浄した。次いで、単離された固体を真空中で乾燥させて、灰白色の固体として、高純度結晶性シロシビン、多形Ａ又はＡ’を得た。
【図面の簡単な説明】
【０２３７】
以下では、添付の図面を参照しながら、本発明の実施形態をさらに記載する。
【図１】図１は、ＪＮＰにおいて教示された反応の模式図である。
【図２】図２は、本発明の一態様のステージ１反応の模式図である。
【図３】図３は、本発明の一態様のステージ２反応の模式図である。
【図４】図４は、本発明の一態様のステージ３反応の模式図である。
【図５】図５は、本発明の一態様のステージ４反応の模式図である。
【図６】図６は、本発明の一態様のステージ５反応の模式図である。
【図７Ａ】図７Ａは、多形Ａ（ＧＭ７６４Ｂ）のＸＲＰＤディフラクトグラムである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、多形Ａ’（ＪＣＣＡ２１６０Ｆ）のＸＲＰＤディフラクトグラムである。
【図７Ｃ】図７Ｃは、多形Ｂ（ＪＣＣＡ２１６０−Ｆ−ＴＭ２）のＸＲＰＤディフラクトグラムである。
【図７Ｄ】図７Ｄは、水和物Ａ（ＪＣＣＡ２１５７Ｅ）のＸＲＰＤディフラクトグラムである。
【図７Ｅ】図７Ｅは、エタノール溶媒和物（ＪＣＣＡ２１５８Ｄ）のＸＲＰＤディフラクトグラムである。
【図７Ｆ】図７Ｆは、ディフラクトグラム多形Ａ’（ＪＣＣＡ２１６０Ｆ）（中央）及び多形Ｂ（ＪＣＣＡ２１６０−ＴＭ２）（下）と比較した、本過程の開発の間に得られた生成物（ＣＢ６４６−Ｅ）のＸＲＰＤディフラクトグラム（上）である。
【図８Ａ】図８Ａは、多形Ａ（ＧＭ７６４Ｂ）のＤＳＣ及びＴＧＡサーモグラフである。
【図８Ｂ】図８Ｂは、多形Ａ’（ＪＣＣＡ２１６０Ｆ）のＤＳＣ及びＴＧＡサーモグラフである。
【図８Ｃ】図８Ｃは、多形Ｂ（ＧＭ７４８Ａ）のＤＳＣサーモグラフである。
【図８Ｄ】図８Ｄは、水和物Ａ（ＪＣＣＡ２１５７Ｅ）のＤＳＣ及びＴＧＡサーモグラフである。
【図８Ｅ】図８Ｅは、エタノール溶媒和物（ＪＣＣＡ２１５８Ｄ）のＤＳＣ及びＴＧＡサーモグラフである。
【図９】図９は、水をベースとする系中の形態の相互関係を示す形態相図である。
【図１０】図１０は、シロシビンの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである（帰属実施例７と併せて読まれたい）。
【図１１】図１１は、シロシビンの１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルである（帰属実施例７と併せて読まれたい）。
【図１２】図１２は、シロシビンのＦＴ−ＩＲスペクトルである。
【図１３】図１３は、シロシビンの質量スペクトルである。
【図１４】図１４は、シロシビンの数字が付された構造式である。
【図１５】図１５は、水中でのシロシビンに対する温度溶解度曲線である。
【図１６Ａ】図１６Ａは、制御された冷却によって得られた結晶を示す顕微鏡写真である。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、制御されていない冷却乾燥によって得られた結晶を示す顕微鏡写真である。
【図１７】図１７は、異なる溶媒系中の形態の相互関係性を示す形態相図である。
【図１８】図１８は、２５及び５０℃で単離された固体に対するＸＲＰＤディフラクトグラム−パターンＣである。
【図１９】図１９は、２５及び５０℃で単離された固体に対するＸＲＰＤディフラクトグラム−パターンＤ、Ｅ及びＦである。
【図２０】図２０は、溶媒Ａ〜Ｈ中での非晶質シロシビンの平衡状態から単離された固体に対して取得されたＸＲＰＤディフラクトグラムの比較である。
【図２１】図２１は、溶媒Ｉ〜Ｐ中での非晶質シロシビンの平衡状態から単離された固体に対して取得されたＸＲＰＤディフラクトグラムの比較である。
【図２２】図２２は、溶媒Ｒ〜Ｙ中での非晶質シロシビンの平衡状態から単離された固体に対して取得されたＸＲＰＤディフラクトグラムの比較である。
【発明を実施するための形態】
【０２３８】
従来技術とは対照的に、本発明は、少なくとも１００ｇ、より好ましくは少なくとも２５０ｇ、ＪＮＰ中に記載されているレベル（１０ｇ規模でグラム量を生産するための「大」規模法を記載する）より１対数又は２対数高いレベルの量又はバッチで、商業的大規模でシロシビンを生産することを目指す。
ＪＮＰからの多くの重要な開発工程を実証するために、以下の記載は、過程ステージの各々で行われた実験及び研究の詳細を記述し、４−ヒドロキシインドール（１）から出発して、ＧＭＰに適合するシロシビン（７）（様々な中間体（２〜６）を含む）を大規模に生産する上で、直面した多数の技術的課題を克服するために為された選択を例示している。
【０２３９】
特定の数値の参照は、文脈が明確に反対の意味を表していなければ、少なくともその特定の値を含む。値の範囲が表現されている場合には、別の実施形態は、一方の特定の値から及び／又は他方の特定の値までを含む。さらに、範囲で表記された値の参照は、その範囲内のそれぞれの全ての値を含む。全ての範囲は両端を含み、組み合わせることができる。
【０２４０】
先行詞「約」の使用によって値が近似として表されている場合、その特定の値が別の実施形態を形成することが理解されるであろう。
【０２４１】
本明細書において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数形を含む。
【０２４２】
数的範囲、カットオフ又は具体的な値の参照において使用される場合、「約」という用語は、示された値がその列記された値から最大１０％まで変動し得ることを示すために使用される。本明細書において使用される数値の多くは実験的に決定されるので、このような決定は、異なる実験ごとにしばしば変動し得ることが、当業者によって理解されるはずである。この固有の変動のために、本明細書において使用される値は過度に限定的に考えられるべきではない。このため、「約」という用語は、明記された値からの、±１０％若しくはそれ未満の変動、±５％若しくはそれ未満の変動、±１％若しくはそれ未満の変動、±０．５％若しくはそれ未満の変動又は±０．１％若しくはそれ未満の変動を包含するために使用される。
【０２４３】
本明細書において使用される場合、「処置する」及び類似の用語は、症候の重度及び／又は頻度を低下させること、症候及び／又は前記症候の基礎となる原因を除去すること、症候及び／又はその基礎となる原因の頻度又は可能性を低下させること、疾患及び／又は障害の進行を遅延させ、予防し及び／又は遅らせること、並びに疾患及び／又は障害によって直接的に又は間接的に引き起こされる損傷を改善すること又は是正することを表す。
【０２４４】
以下の略号が本明細書において使用されている。
ＤＳＣ−示差走査熱量測定
ＲＴ−室温
ＴＢＭＥ−メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル
ＴＧＡ−熱重量分析
ＴＨＦ−テトラヒドロフラン
ｗｒｔ−に関して
ＸＲＰＤ−Ｘ線粉末回折
【実施例】
【０２４５】
［実施例１］
ステージ６  結晶化過程及び得られる多形
形態Ａ’を生産するための実験：
１．０ｇの粗シロシビンを２５ｍＬフラスコに加えた。水（投入材料の活性に基づいて１２．８ｍＬ／１６容量）を添加した。混合物を撹拌し、８０℃に加熱した。可視的な溶解されていない固体を有する濃い茶色の溶液が得られた。加温された０．４５μｍフィルターを通して、熱い２５ｍＬフラスコ中に混合物を仕上げろ過した。溶解されていない固体を除去して、濃い茶色の溶液を得た。溶液を７５℃で再度平衡化し、次いで、周囲温度までゆっくり（１０℃／時間）冷却した。生じた薄い茶色の溶液を、周囲温度で１６時間平衡化させた。真空ろ過による固体の単離前に、懸濁液を５℃に冷却した。水（０．８ｍＬ／１容量）でろ過ケーキを洗浄し、５０℃で１６時間、真空中で乾燥させた。７５％の収率、化学的純度９９％、ＮＭＲアッセイ＞９８％。
【０２４６】
１４容量（１１．２ｍＬ）の水を用いて上記手順を繰り返した。６９％の収率、化学的純度９９％、ＮＭＲアッセイ＞９８％。
【０２４７】
両事例において、粗シロシビンの溶解はおよそ７５℃で達成された。徐々に冷却すると、およそ６０℃で沈殿が観察された。
【０２４８】
両事例において、シロシビン多形Ａ’が生産され、ＸＲＰＤ（図７ｂと一致するディフラクトグラム）及びＤＳＣ（図８ｂと一致するサーモグラム）によって確認された。
形態Ａを生産するための実験
【０２４９】
ステージ５過程から得られた９４ｇの粗シロシビン（約４％ピロホスフェート不純物を有し、ＨＰＬＣによれば約９３％純粋）を、以下に記載されているような水性再結晶に供した。
【０２５０】
プロトコールは、十分な水（１２容量）、急速な撹拌速度（４５０ｒｐｍ）及び制御された冷却プロファイル（１０℃／時間）を使用した。
【０２５１】
シロシビン（９４．０ｇ）（ＣＢ６５０Ｅ）を２Ｌフラスコに加えた。水（投入材料の活性に基づいて９０２ｍｌ、１２容量）を添加した。混合物を撹拌し、約７８℃に加熱した。可視的な溶解されていない固体を有する濃い茶色の溶液が得られた。オーバーヘッド撹拌機（４５０ｒｐｍ）が取り付けられた熱い５Ｌフラスコ中に、１．２μｍインラインフィルターを通して混合物を仕上げろ過した。溶解されていない固体を除去して、清澄化された濃い茶色の溶液を得た。溶液を１５分間約７５℃で再度平衡化し、次いで、周囲温度までゆっくり（１０℃／時間）冷却した。６８〜７０℃における水）中での熟成後に、シロシビン水和物Ａ（ＧＭ７５８Ａ−図７ｄと合致するＸＲＰＤディフラクトグラム）を溶液にシードした。生じた薄い茶色の懸濁液を、周囲温度で約１６時間平衡化させた。真空ろ過による固体の単離前に、懸濁液を５℃まで１時間冷却した。水（２８２ｍＬ、３容量）でろ過ケーキを洗浄し、約５０℃で３０時間、真空中で乾燥させた。
【０２５２】
この過程は、７５％の収率が達成されて、首尾よく完了された。固体の化学的純度は、９９．３％と確認された。３０時間の乾燥後のＸＲＰＤによる固体の分析が多形Ａを示した（図７ａ）。１７．５°２θなどのおよそ１７°２θで特徴的な摂動が観察され、バルク材料において顕著であった。
多形Ａ及び多形Ａ’の固体状態の性質決定
【０２５３】
多形Ａに対して得られたＤＳＣ及びＴＧＡサーモグラム（図８ａ）は、多形Ａ’に対して得られたＤＳＣ及びＴＧＡサーモグラム（図８ｂ）と同等であった。多形Ａ及び多形Ａ’に対して得られたＴＧＡサーモグラム（図８ａ）は、分解前に重量喪失を示さない。このことは、多形Ａに対して得られたＸＲＰＤ（図７ａ、およそ１７°２θに摂動が存在する）と小規模で得られた多形Ａ’に対して得られたＸＲＰＤ（図７ｂ、摂動は存在しない）との間の差が過剰な水和に起因するものでないことを示唆した。
【０２５４】
固体の顕微鏡法（図１６ａ）は、良好な均一性を有し、５０〜２００ミクロンの間のサイズ範囲の竿形状の結晶を示す。
【０２５５】
多形Ａ’に対して得られたＸＲＰＤディフラクトグラムは、多形Ａと同じ程度のおよそ１７°２θにおける摂動を示さない。およそ１７°２θにおけるＸＲＰＤディフラクトグラム中の摂動は、（小規模で得られたものと比べて）大規模に生産されたシロシビンに対してより顕著であり、予想外であった。出願人は、水和物Ａが、１７°２シータ領域中に回折ピークを持たずに、幅広い温度にわたって存在する唯一の多形形態であることを実証した（図７ｄ参照）。これは、脱水して水和物Ａが崩壊して、規模に応じて変動して多形Ａ又はＡ’を与えること、及び多形Ａが真正な形態であり、小規模で形成される多形Ａ’は非定型的であることを強く示唆する。
【０２５６】
この理論の確かさを調べるために、及び多形Ａへの回復を実証するために、（水和物Ａを再生するために）水の中に再度浸した後に、少量のバルクを再乾燥させた。少量の試料（２５０ｍｇ−シロシビン多形Ａ）を、１時間、水（１０容量）中で平衡化した。懸濁液をろ過し、湿った固体の分析は、水和物Ａが生成され（図７ｄ）、１７°２シータに摂動がないことを確認した。この材料を１６時間真空中で乾燥させ、ＸＲＰＤによって固体を再評価した。多形Ａ’材料が、ＸＲＰＤ（図７ｂ）によって確認され、ＸＲＰＤ摂動の低下が認められた。周囲温度での元のバルク固体のさらなる乾燥及び熟成は、固体のＸＲＰＤディフラクトグラムを変化させなかった。２つの固体様式が得られ、多形Ａ及び多形Ａ’に対するＸＲＰＤディフラクトグラムは、およそ１７．５°２シータピーク以外に実質的に同一である。熱的特性も同一である。多形Ａと多形Ａ’のＸＲＰＤディフラクトグラム間の差はわずかであり、両多形は、水和された状態に、極めて急速に、速度論的に転化する。
【０２５７】
多形Ａ及び多形Ａ’のＸＲＰＤディフラクトグラムの差が、その後にそれほど効果的に乾燥せず、変化を引き起こしたより大きな粒径の固体を与えるより大規模な結晶化過程によるものであるかどうか、又は結晶性固体の晶癖及びサイズ差が原因であったかどうかを確かめるために、さらなる実験を行った。乳鉢と乳棒を用いてシロシビン多形Ａ（実験前に確認された多形形態）をすりつぶし、ＸＲＰＤによって評価した。多形の変化は観察されなかった。別の一部（５１ｍｇ）に水（＜１ｍＬ）を加え、水和物が形成されたことを確認するために湿気を評価した。真空中において５０℃でおよそ１８時間両ロットを乾燥させ、ＸＲＰＤによって再評価した。すりつぶされた試料は、多形Ａとして残った。脱水後の水和された試料は、多形Ａ’であることが示された（すなわち、およそ１７．５°２θに反射がない）。これは、サイズ／晶癖だけが、元の反射ピークの唯一の理由でないことを示唆した。
【０２５８】
ＴＧＡ評価は、投入ロットはおよそ７０℃までに低い質量喪失（０．１３９％重量）を示すことを明らかにした。粒径が低下し、続いて乾燥された固体は、およそ７５℃までに０．３４３重量％のより大きな質量喪失を示したのに対して、水和され及び乾燥された固体は、およそ８０℃までに０．０６９重量％の最も小さい質量喪失を示した。粒径が低下し、続いて乾燥された固体を８０℃に（ＴＧＡによる質量喪失の点を過ぎた）１０分間維持したが、ＸＲＰＤによる評価は投入から変化がないことを明らかにし、低レベルの水和及び結晶格子の部分的膨潤は変動の原因でなかったことを意味する。
【０２５９】
多形Ａの水和及び単離された固体の小規模でのその後の乾燥を介して多形Ａ’を生成することが可能である。
【０２６０】
両ロットから水和物Ａを与えるために、シロシビン多形Ａ及び多形Ａ’、それぞれおよそ６０ｍｇに水０．２ｍｌを加えた。真空中２５℃で、およそ１７と１／４時間、各水和物Ａの半分を乾燥させ、周囲温度で、Ｎ２流下で、およそ１７と１／４時間、各水和物Ａの残りを乾燥させた。乾燥後に固体を単離し、ＸＲＰＤによって評価した。多形Ａ投入から単離された固体のＸＲＰＤ評価は、水和物Ａが首尾よく生成されること、及び固体が乾燥して両乾燥方法から多形Ａ’を与えることを確認した。多形Ａ’投入から単離された固体のＸＲＰＤ評価は、水和物Ａが首尾よく生成されること、及び固体が乾燥して両乾燥方法から多形Ａ’として残ることを確認した。
【０２６１】
調べられた小さな規模では、多形Ａ及び多形Ａ’は、乾燥して、水和物Ａへの転化を介して多形Ａ’を与えるであろう。
【０２６２】
乳鉢と乳棒によるすりつぶしを用いて、シロシビン多形Ａ（１００ｍｇ）の粒径を低下させた。粒径を低下させることが試料の脱水に影響を及ぼしたかどうかを評価するために、すりつぶしたロットを２つの異なる乾燥計画に供した。第一の試料は１０分間、８０℃に維持し、第二の試料は１０分間、１１０℃に維持した。両固体がＸＲＰＤによって評価され、多形Ａが保持されたことを明らかにした。事前の等温ストレス中に置かれたすりぶされたロットは、形態に影響を及ぼすのに十分な長さで、１１０℃に維持されなかったかどうかが検討され、このため、１１０℃でおよそ２４時間、すりつぶされたロットの一部を真空中で乾燥させた。ＸＲＰＤによる評価は、わずかに低下した強度であるが、多形Ａ反射がおよそ１７になお存在する形態のわずかな変化を明らかにした。
【０２６３】
粒径低下及び／又は高温での乾燥を介して、多形Ａは多形Ａ’に容易に転化しないであろうと結論付けられた。
方法論
【０２６４】
ピロホスフェート不純物を含有しないシロシビンの安定性評価は、８０℃を超える温度で、シロシビンの加水分解によって生成されたステージ３中間体不純物（サイロシン）のレベルが関心事項であることを示した。例えば、８３ｍｇ／ｍＬのシロシビン水溶液を９０℃に加熱し、１、２及び４時間でＨＰＬＣによって分析されるときに、ステージ３不純物のレベルは、それぞれ、０．２８、１．８２及び７．７９面積％と測定された。比較すると、５０ｍｇのシロシビンを水中（１．２〜１．８ｍｌ；溶液を維持するのに十分な容量）に溶解し、７０、７５及び８０℃まで４時間加熱すると、ステージ３不純物のレベルは、ＨＰＬＣによって、それぞれ、０．５３、０．７４及び２．３０面積％と測定された。溶解及び仕上げろ過を達成するために、再結晶は、７５℃〜８０℃まで粗シロシビンを加熱する。溶液の即時冷却は、過度な温度への材料の滞留時間を短縮することによって、シロシビン加水分解のレベルを制約する。
【０２６５】
以下の変化を導入して、シロシビンのさらなる試験的再結晶を行った。
【０２６６】
使用される水の容量を変動させる；
【０２６７】
撹拌を変動させる；
【０２６８】
制御された冷却プロファイルを有する；
【０２６９】
急速な（制御されない）冷却プロファイルを有する。
【０２７０】
より少容量の水（わずか１２容量）を用いることは、再結晶過程を妨害せず、仕上げろ過工程を可能にする温度でシロシビンの溶解が達成された。異なる冷却速度は、異なる結晶サイズ分布をもたらすことが示され、およそ１０℃／時間での遅い制御された冷却は、相対的により大きく、より均一な平均的結晶サイズを生じた（図１６ａ）のに対して、急速な冷却プロファイルはより小さな結晶を与えた（図１６ｂ）。制御された冷却プロファイルが好ましく、これは、制御された冷却に対する改善された純度に反映された。
【０２７１】
この過程を使用することは、７５％の収率で、９９．３％の化学純度のシロシビンをもたらした。固体の熱特性は、所望される熱特性と一致した。乾燥固体のＸＲＰＤディフラクトグラムの差は、水和物Ａがどのように崩壊して好ましい固体形態を与えるかを決定する上で、乾燥プロファイルが重要であり得ることを示唆した。多形Ａは、加速された安定性試験条件下で、１２ヶ月間安定であることが実証された。
【０２７２】
実験
【０２７３】
Ｎ２下で、ステージ５、続いて水（活性なステージ５に基づいておよそ１２〜１５容量）を容器に加えた。溶解を達成するために、混合物を約８０℃に加熱し、１．２μｍインラインフィルターを通して、８０℃に加熱されたきれいな新しいフラスコ中に仕上げろ過した。撹拌速度を高いレベル（４５０ｒｐｍ）に設定し、溶液を７０〜７５℃で平衡化した。およそ１０℃／時間で、溶液を周囲温度に冷却し、６８〜７０℃でシロシビン水和物Ａ（０．００１×ステージ５添加量）をシードした。懸濁液を周囲温度で一晩維持し、次いで、およそ５℃まで冷却し、１時間維持した。懸濁液をろ過し、水（ステージ５の活性添加量に基づいて２〜３容量）で洗浄した。純粋なシロシビンを、真空中、５０℃で乾燥させた。結晶性材料シロシビン（規模に応じて多形Ａ又は多形Ａ’）が得られ、例えば、９４ｇ投入のシロシビンを使用することは多形Ａを与え、１ｇ投入のシロシビンを使用することは多形Ａ’を与えた。典型的には、５ｇより大きなバッチサイズは多形Ａをもたらすのに対して、５ｇより小さなバッチサイズは多形Ａ’をもたらす。
【０２７４】
ＪＮＰからの差及び利点は、以下のように要約することができる：
ｉ）この追加の結晶化工程は、規定された結晶性形態−多形Ａ（又はＡ’）を生じる。
ｉｉ）短期間の、約８０℃への加熱は、溶解度が最大化される（及び加水分解が避けられる）という利点を有し、これは良好な収率を確実にする。
ｉｉｉ）約７０〜８０℃で、不溶性不純物を除去するために仕上げろ過を使用することができる。これは、インラインフィルター、典型的には約１．２μｍのものを用いると最も良好に達成される。これは、良好な化学的純度を確実にする。
ｉｖ）高い撹拌速度（典型的には約４５０ｒｐｍ）を用いることによって、素早い溶解が確実にされ、溶液が８０℃に維持される時間を最小限に抑えることができ、このため、シロシビンの加水分解によって形成されるステージ３中間体不純物の増加したレベルが回避される。
ｖ）制御された冷却、典型的には、約１０℃／時間での冷却の提供は、より均一な結晶サイズをもたらし、結晶性水和物Ａとして形態を維持する。
ｖｉ）約７０℃でシロシビン水和物Ａを溶液にシードすることは、水和物Ａとしての結晶化を促進する。
ｖｉｉ）純度を最大化し、規模に応じて多形Ａ又はＡ’をもたらすために、結晶は水中で洗浄され、約５０℃で乾燥される。
実施例２〜６
ステージ１〜５  シロシビンの生産
【０２７５】
本明細書中に前述されているように、以下の実施例は、ＪＮＰに記載されており、図１に図示されている過程からの重要な発展を示している。
［実施例２］
ステージ１（図２）
【０２７６】
ＪＮＰ中のステージ１条件は、溶媒ＤＣＭ中の、１．１当量Ａｃ２Ｏ及び１．２当量ピリジンを使用した。一晩撹拌した後、反応は完了したことが見出された（９９％生成物、０％出発材料（ＳＭ））。反応混合物を水で洗浄し、真空中で濃縮して、茶色の油状物を得た。文献では、油状物をＥｔＯＡｃ中に取り込み、蒸発によって濃縮し、低容量で固体の沈殿を与えた。
研究
【０２７７】
しかしながら、出願人の手許では、ＥｔＯＡｃからの固体の沈殿は観察されなかった。固体の沈殿はヘプタンでの摩砕によって促進されたが、これは、拡張可能な過程を形成しないであろう。固体を集めて、高純度のステージ１生成物を得た（７５％収率、ＮＭＲによれば９５％超純粋）。
【０２７８】
反応は良好に機能したが、取り扱いが容易な固体が得られ得るようにするために、単離手法はさらなる進展を必要とした。ろ過による固体の単離は、次いで、精製の手段も与えることが期待された。
【０２７９】
固体の沈殿を促進することができ、反応混合物から直接的に単離することを可能にするかどうかを明らかにするために、まず、ＥｔＯＡｃ中で反応を試した。しかしながら、ＥｔＯＡｃ中の反応プロファイルは、ＤＣＭ中よりも好ましくなことが明らかとなり、したがって、この反応は断念した。
【０２８０】
生成物の再結晶を抑制していることがあり得ると考えられたので、出願人は、ＤＣＭ反応混合物からピリジンを洗い流した。反応を反復し（ＨＰＬＣにより、０．４％出発材料、９８．７％生成物の完了）、ｐＨ２／３を達成するために、２０％クエン酸で反応混合物を洗浄し、蒸発工程中での低いｐＨを避けるために、ピリジン、次いで、飽和ＮａＨＣＯ３（水溶液）を除去した。有機物を乾燥させ、ヘプタンへの溶媒の切り替えを行い、ステージ１の沈殿を得た。ろ過によって、固体を収集し、真空中で乾燥した後に純粋なステージ１を得た（ＮＭＲによれば８７％収率、９５％超の純度）。
【０２８１】
安定性試験を実施し、２０％クエン酸及び飽和ＮａＨＣＯ３とも一緒に撹拌したときに、反応混合物が一晩安定であることを確認した。４０℃及び６０℃でオーブン乾燥されたときに、生成物は安定であることが見出された。
規模拡大
【０２８２】
ステージ１反応は首尾よく規模拡大され、１００ｇ超の４−ヒドロキシインドールを処理した。反応は、予想されたとおりに進行し、後処理されて、ステージ１生成物を与えた（９３％収率、約９８％ＮＭＲ純度）。
ＧＭＰ原料合成
【０２８３】
ＧＭＰ出発材料を供給するために、大規模なステージ１反応を実施した（５００ｇ超の４−ヒドロキシインドールを処理）。反応は、予想されたとおりに進行し、ＨＰＬＣにより、出発物質の消費を与えた（９９．２％生成物、０．１％未満出発物質）。確立された手法を用いて、反応を後処理して、乾燥後にステージ１生成物を得た（９４％収率、ＨＰＬＣにより９９．１％、９９％ＮＭＲアッセイ）。
【０２８４】
ステージ１の手法は、４−ヒドロキシインドールのいくつかのバッチ中に存在する微量の不純物を除去する上で効果的であることも開発中に注目された。４−ヒドロキシインドール中に存在する低レベルの不純物は、ステージ１反応後に完全に除去され、高い収率（８９％）と純度（ＨＰＬＣにより９９％、ＮＭＲアッセイにより９９％）できれいな材料を与えた。
【０２８５】
実験
【０２８６】
Ｎ２下で、４−ヒドロキシインドール（１当量制限試薬）を容器に加え、その後、ＤＣＭ（ジクロロメタン；４−ヒドロキシインドール添加量に基づいて６容量）を加えた。反応物を０〜５℃まで冷却し、０〜５℃でピリジンを滴下により添加した（１．２当量）。無水酢酸（１．１当量）を０〜５℃で滴下により添加し、２０〜２５℃まで１〜１．５時間反応物を加温し、２０〜２５℃でさらに３時間撹拌した。反応物の試料を採取し、完了に関して分析した。次いで、２０％クエン酸水溶液（４−ヒドロキシインドール添加量に基づいて３×３容量）で反応物を３回、飽和ＮａＨＣＯ３（４−ヒドロキシインドール添加量に基づいて３容量）で１回洗浄した。ＭｇＳＯ４でＤＣＭ溶液を乾燥させ、ろ過し、蒸留によって、ＤＣＭ層を半分の容量まで濃縮した。ヘプタン（４−ヒドロキシインドール添加量に基づいて６容量）を添加し、ステージ１の完全な沈殿が起こるまで、さらなるＤＣＭを蒸留によって除去した。１５〜２５℃まで反応物を冷却し、ろ過によって固体を集め、ヘプタン（４−ヒドロキシインドール添加量に基づいて１容量）で洗浄し、真空下で一晩、６０℃で乾燥させた。
【０２８７】
ＪＮＰからの差及び利点は、以下のように要約することができる：
ｉ）出願人は、約２〜３のｐＨのクエン酸を用いて、ピリジンを洗浄除去した。これにより、改善された単離及び結晶化が促進された。実際に、ＤＣＭ相が分離され、水性クエン酸相は廃棄される。
ｉｉ）重炭酸ナトリウム中でのさらなる洗浄は、さらなる改善をもたらした。
ｉｉｉ）溶媒をヘプタンに交換することによって、固体の沈殿が改善されて、収率が最大化し、再現可能な高純度のステージ１がもたらされた。
［実施例３］
ステージ２（図３）
工程ｉ−酸塩化物の形成
【０２８８】
文献中で使用されている、揮発性で高度に可燃性のＥｔ２Ｏの実行可能な代替物であるかどうかを決定するために、まず、ＴＢＭＥ及びＴＨＦ（６容量／１容量）の混合物中での、ステージ１生成物の塩化オキサリル（１．５当量）との反応による反応性中間体２Ａの形成を試した。反応は、Ｅｔ２Ｏと類似の溶解度プロファイルで、およそ１８時間後に完了した（溶液中のステージ１、ステージ２Ａの沈殿）。
【０２８９】
酸塩化物中間体は加水分解しやすく、変動する分析結果をもたらすので、反応が（ステージ２を与えるために）ＴＨＦ／ＮＭｅ２中にクエンチされ、次いで、ＨＰＬＣによって分析されるより強固な試料の作製及び分析を開発した。
【０２９０】
最高の純度及び収率の中間体を与えるために、ＴＢＭＥ及びＴＨＦの比が最適化され、大規模化のために、６：１のＴＢＭＥ：ＴＨＦの好ましい比率を選択した。他の比率のＴＢＭＥ：ＴＨＦが使用され得る。
【０２９１】
大規模な反応は、好ましい溶媒混合物（１容量ＴＨＦ、６容量ＴＢＭＥ）を用いて実施されたが、塩化オキサリルの添加は、３０〜３５℃で実施された。次いで、得られた溶液を４０℃で２．５時間加熱し、およそ１％のステージ１生成物が残存して完了した。溶液を維持するために添加を熱時で実施することは高い反応速度を確実にし、はるかに短い反応時間（２．５時間対一晩）で改善されたレベルの完了を与えた。生成物は、約１５分後の温度で、なお沈殿することが見られ、反応プロファイルに対する悪影響はＨＰＬＣによって観察されなかった。
【０２９２】
中間体２Ａの安定性は既知でなかったので、中間体を単離し、分解（加水分解）の危険を冒すよりむしろ、ステージ２まで材料をテレスコーピングすることを試みた。反応プロファイルは複雑であり、複数の成分が低いレベルで存在する。ＴＢＭＥを添加し、沈殿物を収集した。しかしながら、ＨＰＬＣ／ＮＭＲによって、これも複雑な混合物であることが見出された。
【０２９３】
不良な反応プロファイルの故に、過剰な塩化オキサリルを含まないようにする精製を可能にするために、中間体２Ａを単離することが必要であると思われた。反応が反復され、ろ過によって黄色の沈殿が収集され、ＴＢＭＥで洗浄して、過剰な塩化オキサリルを除去した（８０％収率）。ＮＭＲ分析は、生成物が十分な純度（ＮＭＲによれば約９５％）であることが確認された。しかしながら、窒素下で保存したにも関わらず、続く数日間にいくらかの分解が認められ、アセテート基の脱保護を含む部分的な加水分解を与えた。
【０２９４】
単離に際しての中間体酸塩化物の加水分解の可能性を検査し、低減するために、テレスコーピング手法のさらなる研究を実施した。反応混合物を沈降させることによって、ＴＢＭＥ液体は、容易にデカンテーションを行うことができ、次いで、同様の様式で、ＴＢＭＥのさらなる一部を用いて、残存する固体が洗浄されることを見出した。これにより、水分への曝露を最小に抑えながら、過剰な塩化オキサリルを含まないように、中間体２Ａを精製することが可能となった。
【０２９５】
ＴＨＦ／ＴＢＭＥ混合物中に中間体が一部溶解するために、いくらか反応収率が失われ得るように感じられた。これは、デカンテーション液体にヘプタンを添加すると、さらなる固体の沈殿が与えられたことによって確認された。この溶解性を制約するために、デカンテーションの前に、ヘプタン（８容量）の添加を行った。ＴＢＭＥで固体を洗浄するよりむしろ、ヘプタンも洗浄のために使用され（３×６容量）、これは、中間体の高純度を維持しながら、収率を最大にした。この方法論は、首尾よく大規模化され、好ましい過程である。
工程ｉｉ−ジメチルアミンとの反応
【０２９６】
文献（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９９９，６，９３５−９３８；Ｄ．Ｅ．Ｎｉｃｈｏｌｓ）は、ＨＮＭｅ２気体がこの転換に有効であることを示唆した。しかしながら、大規模処理を単純化するために、これは、さらなる過剰な塩基を加えた固体ＨＮＭｅ２．ＨＣｌ又はＴＨＦ中のＨＮＭｅ２の溶液のいずれかに置換された。ＪＮＰは、過剰な塩基（ピリジン）の存在下でＨＮＭｅ２を使用する。
【０２９７】
一連の試験反応を介してジメチルアミンとの反応を最適化するために、最初に単離された中間体２Ａを使用した（表１１参照）。
【０２９８】
【表１１】
2020536960.tif 000014
【０２９９】
Ｅｔ２Ｏ中での類似の反応（＃３）、Ｍｅ２ＮＨ．ＨＣｌ及び水性Ｋ２ＣＯ３を用いた二相性反応（＃２）、及びＴＨＦ中の過剰な２Ｍ  Ｍｅ２ＮＨを用いた反応（＃４）とともに、文献によって提供されたピリジンを用いる条件（＃１）を試した。全ての事例において、ＨＰＬＣによる主要成分は所望の生成物であり、水性塩基及び過剰なＭｅ２ＮＨを使用する条件は、ピリジンを用いる条件より、一般にはるかにきれいであった。全ての事例において、著しい加水分解生成物が見られたが、これは、ＨＰＬＣ分析のための試料の作製の間にクエンチされた未反応の中間体２Ａの結果であると考えられた。反応は、水の添加によって後処理され、次いで、真空中で有機溶媒を除去して、固体を沈殿させた。
【０３００】
過剰なアミンとの反応は、はるかに改善された不純物プロファイルを示し、より高い収率（７２％対６３％）と純度（９８％対９０％）になった。このアプローチは、反応の水含量を制限し、したがって、加水分解が発生する機会を最小限に抑えた。単離された固体中にピリジンが存在しないために、精製がより容易であることも予想された。これらの理由のために、塩基として過剰なＨＮＭｅ２を用いる条件を規模拡大のために選択した。
【０３０１】
Ｅｔ２Ｏ中の反応は、きれいな（＃４）プロファイルを与えた。しかしながら、大規模な処理を容易にするために、ＴＢＭＥなどのより揮発性が低い溶媒に切り替えることが有利であることが明らかとなった。これは、この酸塩化物をこの反応へテレスコーピングすることを容易にするであろう。これらの理由のために、ＴＨＦ中の過剰な２Ｍ  Ｍｅ２ＮＨを用いて、ＴＢＭＥ中で反応を実施することが選択された。
【０３０２】
水の添加は、存在して極めて濃厚な混合物と遅いろ過をもたらしたＨＮＭｅ２．ＨＣｌ塩を可溶化することによって後処理を補助するであろうと考えられた。これが試された。しかしながら、ＴＢＭＥ及びＴＨＦ中の反応に水を添加すると、不良な回収率が得られ、液体の分析は、さらなる不純物と大規模なアセテート脱保護（フェノール生成物）を示した。したがって、精製のさらなる開発が必要であった。
精製の開発
【０３０３】
加水分解生成物及び観察されたその他の不純物を除去する精製戦略を開発することが望ましかった。単離された材料の塩含量（ＨＮＭｅ２．ＨＣｌと仮定）を低下させるために、結晶化に水を含めることも望ましかった。この目的のために、一連の１５の溶媒及び溶媒混合物をスクリーニングした（１００ｍｇ規模、１０容量溶媒、６０℃までの加熱サイクリング）。
【０３０４】
【表１２】
2020536960.tif 000015
【０３０５】
＊濃厚な懸濁液であり、固体がガラスバイアルに付着したので、回収率は代表的なものでない。
【０３０６】
スクリーニングされた溶媒から、アセトン／水は、室温で溶解度がほとんど観察されない再結晶を与えた。これは水性の系であったので、固体からＭｅ２ＮＨ．ＨＣｌをパージすることに役立つという利点を有していた。
【０３０７】
アセトン／水再結晶を大規模化した。さらなる水（４容量）の添加前の温度で溶液が得られ（５容量アセトン、１容量水）、混合物を室温に冷却して、結晶化を与えた（６２％回収率、９９％超のＨＰＬＣ純度）。続いて、この過程は、回収を助けるためにより多くの水を添加してさらに大規模化された（合計５容量のアセトン、１０容量の水、７８％回収率）。
【０３０８】
この過程をさらに大規模化し（３０ｇ）、再結晶手法を通じて粗製固体が採取された。生成物の純度は高かったが、収率の低下が存在した（５６％収率、ＮＭＲアッセイによれば９９％、ＨＰＬＣによれば９９．４％）。
【０３０９】
回収率を改善するために、添加される水の量を１０容量から１５容量までさらに増加した。これは、９９％より高く生成物純度を維持し、小規模では、より高い回収率を与えた（９０％回収率、以前に観察された５６〜７０％）。しかしながら、この修正された手法の大規模化は、再び、低い回収率（５８％の収率）を与えた。したがって、再結晶を大規模化するときに遭遇する問題に起因して、実施された当初のスラリースクリーニングに基づいて（上表１２）、別の精製手段を探索した。
【０３１０】
大規模なステージ２反応から単離された材料を用いて、精製戦略の再開発が行われた。反応は、予想されたとおりに進行し、オーブン乾燥後に粗生成物を与えた（ＮＭＲアッセイによれば７０％、７９％活性物質収率）。著しい塩成分（ＨＮＭｅ２．ＨＣｌと推定された）を除去するために、室温にて、一部を水でスラリー化した。乾燥後、これは７５％の回収率（ＮＭＲアッセイによれば９５％）を与え、これが塩含量を低下させる有効な手段であることを示した。ＨＰＬＣ純度は、およそ９３％で変化しないままであった。次いで、固体の化学的純度を増加させるための方法を探索した。
【０３１１】
最初のスクリーニングから、ＥｔＯＨ：Ｈ２Ｏ、ＩＰＡ及びアセトン：Ｈ２Ｏはいずれも、優れた回収率で高純度の生成物を与えるように見受けられたので、さらなる研究のために、これらの溶媒系を選択した。投入純度は９２．７％であり、主な不純物は１．４％、１．０％及び０．８％のレベルであった。
【０３１２】
【表１３】
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【０３１３】
＊反応は、当初、５容量の１：１のＩＰＡ：Ｈ２Ｏ中で実行された。しかしながら、濃厚すぎて撹拌できなくなったので、さらに２容量のＩＰＡを添加した。
【０３１４】
＊＊  混合物は濃厚であり、存在する固体が極めて微細であったため、いくつかの固体がフィルターを通り抜けて、ろ過を困難にした。
【０３１５】
これらの試験の結果は、これらの系、特にＩＰＡをベースとする系から良好な回収が可能であることを示唆した。ＥｔＯＨ：Ｈ２Ｏは、ＩＰＡ単独より、若干優れた不純物プロファイルを与えたが、回収率はそれほどよくなかった（７９対９０％）。ＩＰＡによる不純物プロファイルは、水の存在によって大幅に強化されたが（９８．７％対およそ９７．５％）、これは、より低い回収率をもたらした（７９対９０％）。このことは、この化合物に対して一定レベルの水溶解度を示唆した。高い純度とおよそ９０％の回収率を与えるバランスを見出すことができるかどうかを明らかにするために、減少した水容量を用いて、ＩＰＡ及びＥｔＯＨ：水中での最終試験を行った。この系は収率を改善したが、ろ過は遅く、したがって、さらなる溶媒混合物も評価された。
【０３１６】
【表１４】
2020536960.tif 000017
【０３１７】
５容量ＥｔＯＨ／水スラリーは極めて濃厚であり、容易に取り扱えなかった。全ての試験から、固体の純度は同等であったので（わずかな変動は、ろ過及び洗浄の質によるものと思われる）、１００％ＩＰＡ条件が高い回収率を与え、得られる懸濁液が容易に取り扱われたため、１００％ＩＰＡ条件を大規模化した。
【０３１８】
好ましいスラリーの最初の規模拡大は、９６．４％のＨＰＬＣ純度（１．２％、０．７％、０．４％の不純物レベル）を与えた（９２％回収率）。液体分析は、それらが主な不純物の全てに富んでいることを示した−ＨＰＬＣによって７２％（８．６％、３．８％、３．４％）。これは、高い回収率を与える適切な精製法と考えられたので、不純物の追跡と除去が下流で達成されることを確実にするために（ステージ３で９９％超、０．５％を超える単一の不純物なし）、以下のステージでは、この材料の使用を試験した。
【０３１９】
無機物を除去するために残存する粗製のステージ２材料（７０％アッセイ）を水でスラリー化し、次いで、改善された純度の材料を与えるために（ＮＭＲアッセイによって９７％、ステージ２に対して７６％収率、ＨＰＬＣによって９６．８％、１．１％、０．８％、０．４％で不純物）ＩＰＡ中でスラリー化すると、スラリーは拡大可能であることが明らかとなった。
ＧＭＰ原料合成
【０３２０】
ＧＭＰキャンペーンを提供するために、大規模な、ステージ２反応を実施した。反応は予想通りに進行して粗生成物を与え、これを水でスラリー化し、ろ過して、ＨＰＬＣによれば９３％純粋であったステージ２を与えた。これは、８容量のＩＰＡ中にさらにスラリー化され、ろ過されて、ステージ２生成物を与えた（ＨＰＬＣによれば９３．７％、９２％アッセイ、６６％活性物質収率）。得られた純度は、開発キャンペーンの間に観察されたものより低かったので、使用試験を実施し、得られた高純度ステージ３がその後の処理に適していることを確認した（ＧＭＰ原料）。
【０３２１】
同一の条件下で、第二のバッチが実行されて、粗生成物を得、これは、水スラリー化後に、ＨＰＬＣによれば９０％純粋であった。この材料は、続いて、水スラリー化され、ＩＰＡスラリー化によって精製されて、３８４ｇのステージ２生成物を与えた（ＨＰＬＣによれば９３．０％、ＮＭＲアッセイによれば９１％、６０％活性物質収率）。
【０３２２】
ＧＭＰ合成を再度供給するために、第三のバッチを実行した。水、次いで、ＩＰＡスラリー化によって、粗生成物が首尾よく精製されて、以前のバッチと比較したときに、増加した純度を有する（ＨＰＬＣによれば９７．３％、９６％ＮＭＲアッセイ）ステージ２（７９％収率）を与えた。
【０３２３】
実験
【０３２４】
容器にＮ２下でステージ１（１当量制限試薬）を加えた後、ＴＨＦ（ステージ１添加量に関して１容量）及びＴＢＭＥ（ステージ１添加量に関して６容量）を加えた。次いで、塩化オキサリルを容器に滴下により添加し（１．５当量）、発熱させて、当初、温度を３５〜４０℃に上昇させ、次いで、３５〜４０℃に維持するために、必要に応じて冷却を施した。添加直後に、反応物は４０℃まで加熱され、２〜６時間撹拌された。反応物の試料を採取し、完了に関して分析し、次いで、室温まで冷却し、ヘプタン（ステージ１添加量に関して８容量）を添加すると、さらなる固体の沈殿が生じた。反応物を１０分間撹拌し、次いで、固体を沈降させた。デカンテーションによって、溶媒の大半を固体から除去し、次いで、固体をヘプタン（ステージ１添加量に関して６容量×２）で２回洗浄し、各洗浄後に同様にしてデカンテーションを行った。次いで、固体の試料を採取し、分析した。容器にＴＢＭＥを加えて（ステージ１添加量に関して４容量）、黄色のスラリーを得、ドライスアイス／アセトン浴を用いて、これを−２０℃に冷却した。温度を−２０℃〜−１０℃に維持しながら、およそ１５分にわたって、ＴＨＦ中のＭｅ２ＮＨの２Ｍ溶液（２当量）を容器に滴下により添加した。反応混合物を室温までゆっくり加温し、一晩撹拌した。必要であれば、この時点で、さらなるＭｅ２ＮＨを添加することができる。反応物の試料を採取し、完了に関して分析した。反応物をろ過し、ヘプタン（ステージ１添加量に関して２容量×２）で洗浄し、単離された固体を真空下で、６０℃で乾燥させた。２〜１８時間、粗製のステージ２を水（ステージ１添加量に関して８容量）の中でスラリー化し、次いで、ろ過し、水（ステージ１添加量に関して２容量）で洗浄した。真空下で、６０℃で固体を乾燥させて、２％ｗ／ｗ未満の水（カールフィッシャー滴定（ＫＦ）によって測定された）を含む粗製のステージ２を得た。２〜１８時間、粗製のステージ２をＩＰＡ（１０容量）中でスラリー化し、次いで、ろ過し、ＩＰＡ（粗製のステージ２の質量に関して１容量）で洗浄し、真空下で、６０℃でオーブン乾燥させた。
【０３２５】
ＪＮＰからの差及び利点は、以下のように要約することができる：
工程１
ｉ）第一に、ジエチルエーテルに代わるＴＨＦ／ＴＢＭＥ溶媒系の使用は、揮発性及び可燃性がより低かった。
ｉｉ）第二に、塩化オキサリルの添加が上昇した温度で行われ、４０℃まで加熱され、改善された溶解度がもたらされて、沈殿中にステージ１生成物が捕捉されるのを抑制した。これは、高い反応速度、改善されたレベルの完了及びより短い反応時間も与えた。
ｉｉｉ）第三に、過剰な塩化オキサリルを含まないようにする精製を可能にするために、中間体２Ａが単離された。
ｉｖ）第四に、中間体２Ａの沈殿を助けるために、ヘプタンが添加された。
工程２
ｖ）アミンが過剰に使用されることを確実にすることによって、最小限の水が存在し、それ故、加水分解が低減するために、大幅に改善された純度と収率が得られた。
ｖｉ）最後に、水及びＩＰＡスラリーの使用は、良好な純度のステージ２生成物を与えた。
［実施例４］
ステージ３
【０３２６】
精製されたステージ２材料（ＨＰＬＣによれば９９％超）及び提供された反応条件を用いて、最初のステージ３試験的反応を実施した。ステージ２投入材料は、ＴＨＦ中にほとんど不溶性であることが見出されたので、ステージ２の溶液をＬｉＡｌＨ４に添加するよりむしろ、逆添加を実施した。ＴＨＦ中の１Ｍ溶液として、４当量のＬｉＡｌＨ４を使用し、２０〜２５℃で、およそ２時間にわたって添加を行った。この時点で、１０％生成物が観察され、数個の中間体種が存在していた。還流しながらおよそ７時間、反応物を加熱して、９３％の生成物転化を与えた（ＨＰＬＣによる）。反応を後処理して、粗製のステージ３生成物を与えた（ＨＰＬＣによればおよそ９０％、ＮＭＲによればおよそ９０％、およそ８７％の補正された収率）。
【０３２７】
試験的反応が実施され、使用されるＬｉＡｌＨ４添加量が首尾よく低減された（３当量対４当量）。これは、生成されるＬｉ及びＡｌ塩の量を低減することによって後処理に役立つことが期待された。還流しながら長時間加熱した後（１０〜１８時間）、反応中間体は大部分が消費され（２〜３％残存）、ＨＰＬＣによると、およそ９５％が生成物であった。
後処理の開発
【０３２８】
第一の試験的反応は、ロッシェル塩を用いて首尾よく後処理されたが、使用された容量は極めて多く（およそ１００容量）、この手法は、規模拡大のための実行可能な過程にならないであろう。必要とされる容量を試み、低減するために、及びＬｉ／Ａｌ塩の除去を補助するために、様々な代替的後処理手法を調べた。
【０３２９】
ＥｔＯＡｃ、次いでロッシェル塩を用いて、低減された容量のクエンチを試みた。フラスコの底に沈降した、濃厚なペーストとして灰色の固体が存在した。ろ過は失敗したが、液体はデカンテーションをすることができ、生成物を抽出するために、ＴＨＦ／ＥｔＯＡｃ中に固体を再度スラリー化した。次いで、水性の後処理を実施し、濃縮によって生成物を単離した。これは、良好な収率（純度に対して補正せずに９４％）で、良好な純度（ＮＭＲによれば９０〜９５％）の生成物を与えた。しかしながら、この過程は、直ちには大規模化に適していなかった。
【０３３０】
結合剤として作用するための無水Ｎａ２ＳＯ４の存在下で、ＥｔＯＡｃ、次いで飽和Ｎａ２ＳＯ４の添加によって、反応をクエンチした。反応は、容易にろ過することができる顆粒状の固体を与えた。次いで、水性の後処理を実施し、濃縮によって生成物を単離した。良好な収率が得られたが（純度に対して補正せずにおよそ９４％）、生成物は、ＮＭＲによれば、より高いレベルの主たる不純物を含有していた（１０％対通常観察される２〜４％）。
【０３３１】
０℃の２０％ＡｃＯＨで、反応をクエンチし、ろ過できないゲルの形成を生じた。この反応は断念された。
【０３３２】
ＥｔＯＡｃ、次いで、２０％クエン酸で反応をクエンチして、ろ過によって分離することができた固体を得た。液体を濃縮して、生成物を得た。この手法は、わずかに低い収率であったが（純度に対して補正せずにおよそ７７％）、生成物は極めて高い純度（＞９５％）であった。
【０３３３】
ＥｔＯＡｃ、次いで水（ＴＨＦ中の１ｇのＬｉＡｌＨ４当たり３ｍＬ）の添加によって、さらなる反応をクエンチした。容易にろ過できないゲルが形成され、この反応は断念された。
【０３３４】
最後に、反応は、フィーザー法によってクエンチされた。水（１ｇのＬｉＡｌＨ４当たり１ｍＬ）、次いで１５％ＮａＯＨ（１ｇのＬｉＡｌＨ４当たり１ｍＬ）、最後に水（１ｇのＬｉＡｌＨ４当たり３ｍＬ）の添加を行った。これは、反応混合物からろ過できる固体を与えた。次いで、液体を分配し、真空中で濃縮した（８７％収率、ＮＭＲによれば９０〜９５％）。
【０３３５】
これらの実験は、下表１５に要約されている。
【０３３６】
【表１５】
2020536960.tif 000018
【０３３７】
クエン酸及びＮａＯＨによるクエンチはいずれも、反応混合物から容易にろ過することができ、最小の溶媒容量を必要とする固体を与えた。ＮａＯＨを用いる条件はより高い収率（およそ１０％）であったが、この手法から得られた生成物はより低い純度であり、次のステージで使用する前にさらなる精製を要する可能性があろう。クエン酸でのより低い収率は、生成物であるクエン酸塩のいくらかの沈殿によるものである可能性があった。これは、精製効果を有しており、濃縮の直後にきれいな生成物が得られた。これらの条件を大規模化のために選択し、クエン酸添加量のさらなる最適化は、この過程から高い収率できれいな生成物を単離することを可能にすることが期待された。
【０３３８】
回収を試み、回収を最大化するために、わずかに低下したクエン酸添加量を用いて反応を繰り返した。この反応は、５７％の収率で生成物を与え、ＴＨＦ中でのろ過ケーキの再スラリー化によって、さらに２０％の収率が得られた（ＨＰＬＣによれば両試料９７．７％）。
【０３３９】
この反応は大規模化された。しかしながら、以前に反応物が濃厚になることが見られたＥｔＯＡｃクエンチの間に、反応物はフラスコ中でガム状になり、混合を制約する濃厚な塊を形成した。クエン酸の添加は、その後、通常のスラリー／ゲルをもたらしたが、これは、実行可能な過程に該当しなかった。この反応を後処理して、ろ過ケーキをＴＨＦ中に再度スラリー化して回収率を最大化し、７６％活性物質収率、ＨＰＬＣによる９５．０％を与えた。
【０３４０】
よりよいクエンチを開発し、ＥｔＯＡｃで見られたガム状物質の形成を避けるために、反応を反復した。アセトンの添加によって、一部をクエンチし、これは、容易に撹拌される懸濁液／エマルジョンをもたらし、濃厚化の兆候はなかった。次いで、クエン酸処理を実施して、ろ過可能な混合物を得た。このクエンチは、反応の残部に対して首尾よく実施され、後処理されて、良好な収率で粗生成物を得た（７１％アッセイ、８２％補正された収率、ＨＰＬＣによれば９８．０％）。
【０３４１】
クエンチ後に、反応混合物は、一般にｐＨ８／９であることが見出された。後処理最適化過程の一部として、異なるｐＨを調べた。後処理のために反応物を分割し、半分は（クエンチ後にｐＨ１１／１２を得るために）わずかに低下したクエン酸添加量を受け、残りの半分は、さらなるクエン酸の添加によってｐＨ７にした。ｐＨ１１反応を後処理して、８５％ＮＭＲアッセイ（７３％収率）の材料を得、ｐＨ７反応は６０％ＮＭＲアッセイ（６２％収率）を与えた。クエンチ後に正しいｐＨを得ることが、７０％超の収率を与えるために決定的であることがこの結果から明瞭であった。クエン酸添加量をほんのわずか低下させることによって（なお、およそ２容量の２０％クエン酸）、収率のおよそ８％の増加が得られた。この情報を入手して、混合物が強塩基性を保つことを確実にするために、クエンチの間、将来の反応のｐＨをモニターした。
精製の開発
【０３４２】
加熱サイクルを６０℃にして、１０容量の溶媒中にスラリー化された粗サイロシン生成物の１００ｍｇ部分を用いて、精製スクリーニングを実施した。週末にわたって、スラリーを室温に冷却し、次いで、ろ過によって一切の固体を収集した。酸／塩基後処理を実施することを目的として、酸及び塩基に対する安定性も試験した。スクリーニングの結果が、下表１６に記されている。
【０３４３】
【表１６】
2020536960.tif 000019
【０３４４】
３つの強調される不純物の第一は、ＬｉＡｌＨ４添加が完了したときに、およそ７０％において観察される最も安定な反応中間体（生成物への転化のために還流を必要とする）に一致した。第三の不純物は投入物中には存在せず、スラリー化手順の間に生成されるようであった。スラリーとして残存した溶媒のうち、ｉＰｒＯＡｃが最高の純度を与えた。いくつかの再結晶が見出されたが、ＭｅＣＮが結晶化の間に不純物を除去する可能性を有し、開発の間に改善できる可能性を有する回収率を有していた。いくらかの分解が酸及び塩基の両方で観察され、ＫＯＨ試料は急速に黒変した。
【０３４５】
２つの最も有望な溶媒（ＭｅＣＮ及びｉＰｒＯＡｃ）を用いて、粗ステージ３材料の精製の規模を拡大した。回収率を改善するために、溶媒容量を最小限まで低下させた。これらの試行の結果は、下表１７に記されている。
【０３４６】
【表１７】
2020536960.tif 000020
【０３４７】
５容量のＭｅＣＮから再結晶が得られ、３容量のｉＰｒＯＡｃ中で熱スラリー化が達成された（いずれも７５℃で）。低下した容量にかかわらず、ＭｅＣＮからの回収率は同じく不良であったが、生成物は極めて高純度であった（ＮＭＲによれば＞＞９５％）。ｉＰｒＯＡｃからの回収率はより良好であり、ＮＭＲによって分析すると、生成物純度が大きく増加していた（およそ９５％）。
【０３４８】
ｉＰｒＯＡｃスラリーからの材料のＨＰＬＣ及びＮＭＲ純度は高かったが、低いアッセイ値（ＮＭＲアッセイによって８５％）が観察された。材料のアッセイ値を改善するために、及び色（これまでに得られた全ての材料は、強く紫、緑又は茶色であった）を除去するために、シリカパッドによる精製を調べた。
【０３４９】
粗サイロシン（７１％アッセイ、ＨＰＬＣによれば９８．０％）を４当量のシリカに通して、ＴＨＦで溶出した。わずかに改善されたＨＰＬＣ純度（９８．４％）及びアッセイ値（およそ８２％アッセイ）を有する、８０％回収率の灰白色の固体が得られた。これは、生成物のアッセイ値を増加させる有効な手段であることが判明し、したがって、反応後処理の一部として含められた。
【０３５０】
次いで、化学的純度（投入純度９８．４％）を維持しながら、回収率を試み、改善するために、シリカ処理された投入物（１００ｍｇ／スラリー）を用いて、一連のｉＰｒＯＡｃ／逆溶媒スラリー（表１８）を実施した。
【０３５１】
【表１８】
2020536960.tif 000021
【０３５２】
全ての純度値は同等であったので、得られた最高の回収率に基づいて、規模拡大のために２つの溶媒系を選択した。回収率をよりよく評価するために、２つの好ましいスラリー（逆溶媒として、ＴＢＭＥ及びトルエン）の規模を拡大した（スラリー当たり１．０ｇ）。
【０３５３】
【表１９】
2020536960.tif 000022
【０３５４】
およそ８０％の回収率で９９％超のＨＰＬＣ純度の材料を与え、シリカパッドと組み合わされたこれらの選択肢はいずれも、サイロシン生成物に対する有効な精製の手段を提供するように見受けられる。スラリー化の間に、さらなる色が液体中に移動し、白色固体としてサイロシンが得られた。全ての不純物は、０．５％未満に効果的に除去された。無毒なＩＣＨクラス３溶媒を使用したので、規模拡大のために、ｉＰｒＯＡｃ：ＴＢＭＥスラリーを選択した。
規模拡大
【０３５５】
開発されたステージ３条件の規模が拡大され、反応が進行して、還流しながら一晩後に、ＨＰＬＣによれば２．９％の反応中間体が存在する９４．４％生成物の完了が得られた（この過程で典型的）。シリカパッド後に、ＮＭＲアッセイによれば８３％純度、６６％活性物質収率、ＨＰＬＣによれば９７．０％でサイロシンが得られた。この材料は、ｉＰｒＯＡｃ／ＴＢＭＥ中でのスラリー化によってさらに精製されて、６２％の収率で、ＮＭＲアッセイによれば１００％、ＨＰＬＣによれば９９．７％の材料が得られた。
【０３５６】
この反応から得られる粗収率が予想より低かったので（６６％対およそ７５％）、さらなる材料を試み、回収するために、ろ過ケーキとシリカパッドを再び試験した。しかしながら、これは成功しなかった。
【０３５７】
予想より低い収率は、後処理中の生成物の分解によるものであったかもしれないが、事前のストレス試験は、使用された条件下でこの材料が安定であることを示した。さらにこれを調べるために、反応が反復された。後処理の間に生成物の分解が起こらなかったことを確認するために、シリカパッドの前に粗生成物を単離し、さらなるストレス試験試料を採取した。
【０３５８】
反応は予想通りに進行して、完了し（９３．７％生成物、２．９％中間体）、濃縮されて、粗材料を与えた（７７％ＮＭＲアッセイ、６６％活性物質収率）。ＴＨＦ／ＭｅＯＨ中にろ過ケーキを再度スラリー化したが、著しいサイロシンは単離されなかった。アルミニウム塩に配位された一切の生成物を試み、置き換えるために、さらなるクエン酸を添加して、（ｐＨ８から）ｐＨを４にし、ケーキをＴＨＦ中に再度スラリー化したが、再度、著しいサイロシンは単離されなかった。反応から物質収支は得られず、６６％の活性物質収率は以前に得られたものとよく合致していた。シリカパッド及びｉＰｒＯＡｃ／ＴＢＭＥ中でのスラリー化によって、このバッチを精製して、６２％収率の高純度材料を得た（ＨＰＬＣによれば９９．８％）。
【０３５９】
使用された溶媒容量は相対的に大きく、アルミニウム及びリチウム種の除去のためにシリカパッドが必要とされるにも関わらず、この過程は、必要とされる規模になお極めて適していた。
【０３６０】
ステージ３反応は、処理のためにさらに大規模化された。反応は予想通りに進行して、１８時間後に完了した（およそ９１％生成物、およそ３％反応中間体が残存）。シリカパッド及びスラリー化による後処理は、５７％収率の高純度サイロシンを与えた（ＨＰＬＣによれば９９％超、９９％ＮＭＲアッセイ、０．３５％ｗ／ｗ水  カールフィッシャー）。
【０３６１】
実験
【０３６２】
ステージ２（１当量制限試薬）、続いてＴＨＦ（ステージ２添加量に関して５容量）を容器に加えた。混合物を０℃に冷却し、温度を０〜２０℃に維持しながら、３０〜４５分にわたって、ＬｉＡｌＨ４（３当量）の１Ｍ  ＴＨＦ溶液を滴下により添加した。添加後に、３０分間、１０〜２０℃で反応物を撹拌し、次いで、加熱還流させ、およそ１６時間撹拌した。反応物の試料を採取し、完了について分析し、０℃まで冷却し、０〜３０℃のアセトン（９．３当量）、続いて０〜３０℃の２０％クエン酸水溶液（ステージ２添加量に関して１．９容量）を滴下により添加することによってクエンチした。ｐＨ＞１１に保たれることを確実にするために添加のｐＨをモニターし、必要であれば、添加を早期に停止した。得られた懸濁液を１時間撹拌し、ろ過し、Ｌｉ及びＡｌ塩を除去するためにＴＨＦ（ステージ２添加量に関して２容量）で洗浄した。およそ１時間、ＴＨＦ（ステージ２添加量に関して１２．５容量）中にろ過ケーキをスラリー化し、ろ過し、ＴＨＦ（ステージ２添加量に関して５容量）で洗浄して、Ｌｉ及びＡｌ塩から生成物を回収した。併せた有機物をＭｇＳＯ４で乾燥させ、ろ過した。およそ１０容量が残存するまで（ステージ２添加量に関して）、真空中でろ液を蒸発させ、シリカパッド（ステージ２添加量に関して３当量）にこの溶液を適用した。ＴＨＦでシリカパッドを溶出し、生成物画分を合わせ、乾燥状態になるまで真空中で蒸発させた。２〜１８時間、粗製のステージ３（サイロシン）を１：１のｉＰｒＯＡｃ：ＴＢＭＥ（工程１８の塊に関して５容量）中にスラリー化し、ろ過し、ＴＢＭＥ（工程１８の塊に関して２．５容量）で洗浄し、４０℃、真空中で乾燥させて純粋なサイロシンを単離した。
【０３６３】
ＪＮＰからの差及び利点は、以下のように要約することができる：
ｉ）第一に、出願人は、溶媒としてＴＨＦを使用するが、アセトンを用いて到達（ｒｅａｃｈｉｎｇ）をクエンチした。これは、濃厚化なしに懸濁液／エマルジョンをもたらす。
ｉｉ）第二に、出願人は、塩基性ｐＨ、典型的には約１１を維持しながら、クエン酸でクエンチした。ｐＨ調整によって、高収率が得られることが確実にされた。
ｉｉｉ）第三に、残存するＬｉ／Ａｌ塩を除去するためのシリカパッドによる精製後における、ＴＨＦでの溶出、ｉＰｒＯＡｃ：ＴＢＭＥでのスラリー化は、次いで乾燥された高度に精製された生成物を与える。
［実施例５］
ステージ４
【０３６４】
２．５８ｇの試料を処理するために、最初に、文献条件を使用して、ＨＰＬＣによって分析したときに、中間体４Ａへのおよそ８８％転化を得た。アミノプロピルシリカの添加及びＣｅｌｉｔｅを通したろ過によって、生成物を精製した。得られた緑の油状物（５．５ｇ）をＤＣＭ中にスラリー化すると、ベンジル転移及び双性イオン性のステージ４（４．１ｇ、７０％収率、ＮＭＲによればおよそ９５％）の沈殿が得られた。
工程ｉ
【０３６５】
このステージでの最初の開発は、より取り扱いやすく、理想的には、合成中にさらなるリチウムを導入しないｎＢｕＬｉの代替物を見出すことに焦点を当てた。以下の塩基：ＬｉｔＢｕＯ、ＫｔＢｕＯ、ＮａＨ、ＮａＨＭＤＳ及びＮａＮＨ２を含む別の条件の初期スクリーニングを行った。反応の全てが生成物を与え、ＮａＨＭＤＳはｎＢｕＬｉと同じように良好に機能した。反応物の全てが、極めて濃厚となり、ゲル化が観察され、効率的な撹拌のために、オーバーヘッド撹拌が推奨された。
【０３６６】
最初のスクリーニングは、ＮａＨＭＤＳがｎＢｕＬｉの適切な代替物であることを示唆した（生成物／中間体４Ａへ８１％転化）。これらの条件は、ｎＢｕＬｉを用いた参照反応と並行して、１．５ｇまで規模拡大された。両事例で、オーバーヘッド撹拌を使用した。
【０３６７】
【表２０】
2020536960.tif 000023
表中で使用された略号：Ｓｔ  ３＝ステージ３、Ｉｎｔ  ４Ａ＝中間体４Ａ、Ｓｔ  ４＝ステージ４
【０３６８】
両事例で得られた反応プロファイルは、ステージ３を消費するＮａＨＭＤＳ反応と極めて類似していた。両反応物は、白色の沈殿を除去するためにＣｅｌｉｔｅでろ過され、濃縮された。ＮＭＲによれば、（ｎＢｕＬｉを用いた例で特に）過剰なベンジルプロトンが両事例に存在し、単離された収率は１００％より大きかった。ＮａＨＭＤＳ条件は、好ましい反応プロファイルを与え、成功したことが判明し、さらなる規模拡大のために選択された。しかしながら、後処理及び精製の開発が必要であった。
工程ｉｉ
【０３６９】
ＨＰＬＣデータは、ＮａＨＭＤＳを用いた上記試行から単離された材料及びｎＢｕＬｉが転位して、濃縮すると、双性イオン性ステージ４を与えることを示した。ベンジルリン酸副生成物及びその他の不純物をこの材料から除去する精製が、多数の溶媒中でのスラリー化によって試みられた。
【０３７０】
【表２１】
2020536960.tif 000024
表中で使用された略号：Ｓｔ  ４＝ステージ４
【０３７１】
＊ろ過不良
【０３７２】
いくつかの溶媒から白色の固体が得られたが、ＤＣＭ及びＴＢＭＥから得られた固体は、週末に保存したときに、薄い紫色のガム状物質に変化した。ＩＰＡ及びアセトンから得られた白色の固体は、保存時に自由流動する白色の固体のままであり、これらの固体の安定性はより高い可能性があること、及びより容易な取り扱いを可能にすることを示唆している。
【０３７３】
ＩＰＡ及びアセトン中のスラリーを１ｇに規模拡大した。しかしながら、溶媒を添加すると直ちに、ガム状化が認められた。激しい撹拌によって、ガム状物質がゆっくり分散され、最終的に結晶化の兆候を示し、一晩の撹拌後に白色スラリーを形成した。しかしながら、この過程は規模拡大に適していなかった。固体は、ＩＰＡを用いて良好な収率で単離され、最高の純度を与えた。
【０３７４】
ＴＨＦは反応溶媒でもあるという利点があったので、ＴＨＦも調べた。しかしながら、これを試すと、再び、当初のガム形成が観察された（およそ８０％収率、ＨＰＬＣによればおよそ９２％で単離された）。ガム状物質形成を試み、回避し、より制御された結晶化を与えるために、まず、低容量のＤＭＳＯ（２容量）中に粗ステージ４を可溶化した。次いで、ＴＨＦをこれ（１０容量）に添加し、溶液を週末にわたって撹拌した。これは、生成物の沈殿をゆっくり与え、この沈殿はろ過によって収集され、ＴＨＦで洗浄されて、９６％ＨＰＬＣ純度（ＮＭＲによれば９５％超）でステージ４（８６％収率）を与えた。
【０３７５】
ＴＨＦ結晶化は成功し、４０℃での反応液（ＴＨＦ／ＥｔＯＡｃ）の濃縮に際して、双性イオン性ステージ４への完全な転化が起こることが以前に認められたので、溶媒の変更を回避することができ、生成物は、４０℃で反応混合物を撹拌することによって直接結晶化され得ることが期待された。
【０３７６】
両反応を用いて、２つの４ｇのＮａＨＭＤＳ反応が実施され、中間体４Ａへのおよそ８０％の転化で完了に達した。一方の反応物はＥｔＯＡｃ、他方はＴＨＦで希釈され、ホスフェート副生成物を除去するために、いずれもろ過された。ホスフェート不純物レベルをさらに低下させるために、ブライン洗浄を実施し、有機物を乾燥し、１０容量まで濃縮した。４０℃で一晩、これらの溶液を撹拌して、ステージ４への転化及び沈殿をもたらした（およそ１％ステージ３、およそ０．２％中間体４Ａ、およそ８２％ステージ４）。ろ過によって固体を集めると、ＥｔＯＡｃ／ＴＨＦから８．０３ｇ（８８％収率）、ＴＨＦから５．６５ｇ（６２％収率）が得られた。ＥｔＯＡｃ／ＴＨＦから得られた茶色／灰色の固体は、ＴＨＦから得られた白色固体（ＨＰＬＣによれば９７％、８８％アッセイ）と比較すると、より純度が低かった（ＨＰＬＣによればおよそ９０％、７８％アッセイ）。ＴＨＦ反応からの水層の分析は、生成物が存在することを示し、最終のＴＨＦろ液にさらなる喪失が生じた。
【０３７７】
ＴＨＦから得られたより高い純度に起因して、回収率を最適化するためにこの溶媒をさらに調べた。水層への生成物の喪失に起因して、塩水洗浄は省略し、最終的なろ過工程の間での喪失を最小限に抑えるために、反応後に反応混合物をさらに濃縮した。反応混合物の一部を８容量及び６容量に濃縮して、この新しい手法を７５ｇ規模で試した。ろ過すると、２つの部分間で収率に差は認められず、１４０．４ｇの総収率であった（ＮＭＲアッセイによれば９０％、７４％活性物質収率、ＨＰＬＣによれば９０％）。
不純物の追跡
【０３７８】
単離された生成物中に３つの主な不純物が観察され、これらの種の２つの正体がＭＳデータに基づいて提唱された。
【０３７９】
脱ベンジル化された不純物（ＨＰＬＣによれば、典型的にはおよそ２〜５％）は、以下の水素付加の間にシロシビンを与えることが示され、したがって、より高いレベルで許容され得る。単離されたステージ４中の主な観察された不純物（ＨＰＬＣによれば、典型的にはおよそ５〜８％）は、無水物不純物であった。これは、その後の水素付加を通じて追跡され、脱ベンジル化から生じる極めて可溶性のピロホスホレート不純物として、水からの再結晶によって容易に除去されることが示された。他の主要な観察された不純物（ＬＣＭＳによって観察されたｍ／ｚ２９５．２）は、反応温度を制約することによって（−５０℃未満）、２％未満に制御されることが見出され、水素付加後にはシロシビン中に観察されなかった。
【０３８０】
上で産生された１４０ｇバッチの不純物プロファイルは、９０．０％のステージ４、６．４％の無水物不純物、０．２％のＮ−脱ベンジル化された不純物及び１．２％のｍ／ｚ２９５．２不純物を示した。
ＧＭＰ合成
【０３８１】
確立された手法を用いて、第一の大規模ステージ３バッチ（５４４ｇ投入）を完了して、２１３．５ｇを得た（５３％収率、ＨＰＬＣにより９９％）。第二のバッチ（６２８．２ｇ投入）も首尾よく処理されて、２９５．２ｇを与えた（６６％収率、ＨＰＬＣによれば９９％）。
【０３８２】
このステージでの収率のいくらかの変動が、３つの大規模バッチにわたって認められた（５７％、５３％及び６６％）。これは、おそらく、後処理及びクエンチ手法の軽微な差の結果である。
【０３８３】
実験
【０３８４】
容器にステージ３、続いてＴＨＦ（ステージ３添加量に関して１５容量）を加え、ドライアイス／アセトン浴を用いて、−５０℃以下に冷却した。−４５℃以下、目標−５０℃未満の温度を維持しながら、ＴＨＦ中の１Ｍ  ＮａＨＭＤＳ溶液（１．１３当量）を加えた。−６０〜−５０℃で、反応物を３０分間撹拌した。反応温度を−３０℃未満に維持しながら、テトラベンジルピロホスフェート（２．２６当量）を一度に、続いてさらなるＴＨＦ（２０容量）を反応物に加えた。０℃まで、１．５〜２時間にわたって反応物を加温し、完了の確認のために試料を採取した。ＴＨＦ（８容量）で洗浄しながら、ホスフェート塩を除去するために反応物をろ過した。６〜８容量が残存するまで、ろ液を濃縮し、４０℃で一晩撹拌して、中間体４Ａをステージ４生成物へ転化した。完了の確認のために反応物の試料を採取し、次いでろ過し、ＴＨＦ（２容量）で固体を洗浄した。真空オーブン中において、４０℃で、ステージ４生成物を乾燥させた。
【０３８５】
ＪＮＰからの差及び利点は、以下のように要約することができる：
工程ｉ
ｉ）第一に、脱プロトン化を補助するために、ヘキサメチルジシラザンナトリウムを導入した。これは、より取り扱いやすく、反応中にさらなるリチウムを導入せず、ブチルリチウムに対する有効な代替物であることが判明した。
ｉｉ）第二に、反応物をＴＨＦで希釈することによって、はるかに高純度の中間体４Ａが得られた。
ｉｉｉ）第三に、反応温度を−５０℃未満に制御することによって、ＬＣＭＳによって観察された望ましくないｍｚ２９５．２は、２％未満のレベルに制御された。
工程ｉｉ
ｉｖ）第四に、ステージ４Ａ不純物、特にＮ−脱ベンジル化されたステージ４（表７）及び無水物ステージ４（表７）のレベルをモニタリングすることによって、純粋な生成物を再現可能に生産することができる。
ｖ）中間体ステージ４Ａのステージ４への転化は、反応溶媒中で実行することができ、時間がかかる溶媒交換の必要性が回避される。
ｖｉ）最後に、得られた固体はＴＨＦで洗浄され、オーブン乾燥されてステージ４を得る。
［実施例６］
ステージ５
【０３８６】
このステージの開発中に触媒中毒が認められ、不完全な水素付加を抑制するために必要とされる場合には、過程中に活性炭処理（ｃｈａｒｃｏｌａｔｉｏｎ）工程を含めることができる。しかしながら、活性炭処理が型どおりに必要とされるわけではない。
【０３８７】
水素を３時間散布した後、典型的な反応は高レベルの完了を示した（９０％超の生成物、３〜５％の出発材料が残存）。溶解性を補助するために少量の水が添加され、さらに１時間水素を散布した後、ステージ４の消費が達成された。
【０３８８】
成功した反応が、ろ過、続いてメタノールを除去するための蒸発によって後処理され、水中の濃厚な懸濁液として生成物が残存した。エタノールを添加し、固体をろ過して、６９％収率でシロシビンを得た。１Ｈ  ＮＭＲは、生成物の同一性を確認したが、微量の関連不純物が存在することを示した。ＬＣＭＳ分析は、９５．２％の純度を示し、主要な不純物（４．１％）がピロリン酸不純物として同定された。（表７）ステージ４での無水物不純物に由来。この不純物は、最終生成物の再結晶（ステージ６）の間に効果的にパージされることが後に示された。
【０３８９】
ＨＰＬＣによれば８８．０％純粋であり、７．３％のＮ−脱ベンジル化ステージ４（生成物に転化された）を含有し、無水物不純物を含まない最終ＴＨＦ後処理から得られるステージ４材料を用いて、次いで、さらなる反応を実施した。再度、完了が認められ、前述のように反応を後処理して、４６％収率でシロシビンを得た。低収率は、触媒ろ過工程中の生成物の沈殿に起因するものと考えられた。１Ｈ  ＮＭＲは、生成物の同一性を確認し、ＨＰＬＣは９８．９％の純度を示した。
【０３９０】
使用される水容量を最適化し、ろ過工程中の生成物喪失を最小限に抑えるために、反応条件のさらなる開発を実施した。反応後、４０℃に加熱しながら、１０容量の水の添加によって溶液が得られた。これにより、フィルター上での生成物喪失を生じることなく、ろ過によって触媒を除去することが可能になった。
【０３９１】
反応及び後処理中に、加水分解によっていくらかのステージ３が生成され、およそ１〜２．５％のレベルが本過程の典型であるように見受けられた。生成物の最終再結晶の間に、ステージ３レベルの低下が実証された。
規模拡大
【０３９２】
大規模ステージ４バッチ（非ＧＭＰ）を単一バッチ（１４８ｇの活性物質の投入物）として処理した。８８％生成物及び加水分解に起因する０．９％ステージ３とともに、ステージ４の消費が達成された。無水物不純物（６．４％）は、対応するピロリン酸不純物（５．２％）に完全に転化された。
【０３９３】
大規模水素付加体がろ過及び濃縮されて、水含量を低下させるためにエタノールから揮散後に１０９ｇの粗生成物を得た（ＮＭＲアッセイによればおよそ７１％、８６％収率）。
実験
【０３９４】
１０％Ｐｄ／Ｃ（およそ５０％水湿潤、タイプ８７Ｌ、０．１×ステージ４添加量）をＮ２下で、続いて、メタノール（ステージ４に関して２０容量）及びステージ４を容器に加えた。Ｎ２をＨ２で置き換え、Ｈ２（大気圧）下で、１〜２時間、反応物を撹拌した。完了の確認のために反応物の試料を採取し、次いで、２５℃未満の温度を維持しながら、水を添加した（ステージ４に関して１０容量）。さらに１〜２時間、Ｈ２下（大気圧）で、混合物を撹拌した。反応物の試料を採取し、完了に関して確認した。
【０３９５】
反応が不完全であった場合には、Ｈ２を再度加え、完了が観察されるまで、さらに１〜１２時間、反応を継続した。次いで、反応物をＮ２下に置き、４０℃まで加温し、１５〜４５分間維持した。触媒を除去するためにセライトを通して反応物をろ過し、メタノール（ステージ４添加量に関して１３．３容量）及び水（ステージ４添加量に関して６．７容量）で洗浄した。ろ液を真空中で濃縮し、固体が得られるまで水を除去するためにエタノールと共沸させた。ＪＮＰからの差及び利点は、以下のように要約することができる：
【０３９６】
主に、反応は、相対保持時間（ＲＲＴ）を用いて、ＨＰＬＣによって、中間物のレベルに関してモニターされ、中間体が０．２％未満で存在することで完了が制御される。最終的な再結晶で制御できることを確認するために、ステージ５ピロリン酸不純物も注意深くモニターする。
【０３９７】
最後のステージ６過程は、実施例１に記載されているとおりである。
［実施例７］
試験方法論及びプロトコール
【０３９８】
純度などを試験するために、以下の方法論／プロトコールを利用した。
７．１  ＮＭＲ
【０３９９】
４００ＭＨｚ分光計を用いて、Ｄ２Ｏ中のシロシビンの１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルが得られた。化学シフトは、１Ｈ  ＮＭＲでは、Ｄ２Ｏ（□＝４．７５ｐｐｍ）に対するｐｐｍで、１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルでは、参照として添加されたＭｅＯＨ（□＝４９．５ｐｐｍ）に対するｐｐｍで報告されている。シロシビンに対する文献値がＪＮＰに報告されている。ＮＭＲによるシロシビンの分析は、構造と合致し、文献中に報告されているものと合致し、イオン化可能な基の近くにあるプロトンに対する化学シフトのわずかな変動のみを有するデータを与えたが、化合物の双性イオン的性質がこの材料をｐＨの小さな変化に対して極めて敏感にするので、この変動は予測される。
【０４００】
１Ｈ  ＮＭＲ及び１３Ｃ  ＮＭＲデータは以下に要約されており、スペクトルは図１０及び図１１に示されている。
【０４０１】
1H  NMRデータ(400MHz,  D2O):    2.79  (s,  3H),  3.18  (t,  J=7.4Hz,  2H),  3.31  (t,  J=7.4Hz,  2H),  6.97  (d,  J=8.0Hz,  1H),  7.08  (s,  1H),  7.10  (t,  J=8.0Hz,  1H),  7.19  (d,  8.2Hz,  1H).
【０４０２】
13C  NMRデータ(400MHz,D2O(＋微量のMeOH):22.3(1  x  CH2)、43.4(2  x  CH3)、59.6(1  x  xCH2)、108.4(1  x  CH)、108.6(1  x  C)、109.5(1  x  CH)、119.1(d,3JP-H=6.7Hz,1  x  C)、123.3(1  x  CH2)、124.8(1  x  CH)、139.3(1  x  C)、146.3(d,2JP-H=6.7Hz,1  x  C)
７．２  ＦＴ−ＩＲ
【０４０３】
ＵＡＴＲ  Ｔｗｏアクセサリを備えたＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｔｗｏ（商標）Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒでデータを収集した。ＦＴ−ＩＲ分光法によるシロシビン（バッチ：ＡＲ７５５）の分析は、提唱された構造と合致するスペクトル（図１２）を与えた。３２４４ｃｍ−１の幅広いピークは、アミン塩に典型的である。ピークの残りはフィンガープリント領域中にあり、したがって、個別に帰属させることはできない。
７．３．質量分析
【０４０４】
シロシビン（ＡＲ７５５）の質量スペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｅｓｑｕｉｒｅ  ３０００  ｐｌｕｓ  Ｉｏｎ  Ｔｒａｐ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒで得られ、構造と合致していた。質量スペクトル（図１３）は、シロシビンの（Ｍ＋Ｈ）＋及び（２Ｍ＋Ｈ）＋に対応する主ピークをｍ／ｚ＝２８４．８及び５６８．１に示した。これは、この分子イオンが、シロシビンの分子式（Ｃ１２Ｈ１７Ｎ２Ｏ４Ｐ）に対応するｍ／ｚ２８４を有することを示唆した（図１４）。
７．４  強熱残分
【０４０５】
強熱残分法は、１つの調整を行って薬局方の方法にしたがう。るつぼが５００℃に加熱されたときに、一貫しない結果が得られた。これは、生成されるホスフェート残基の低い揮発性によるものであると考えられる。したがって、シロシビンに対しては、温度は８００℃に増加され、一貫した正確な結果が得られた。
７．５  ＨＰＬＣ−アッセイ及び純度測定
【０４０６】
シロシビンのアッセイ、化学的純度及び不純物を定量するために使用されたＨＰＬＣ法はグラジエントＨＰＬＣ−ＵＶ法であり、条件は表２２に要約されている。定量のために、外部標準が使用される。およそ１ｍｇ／ｍＬのシロシビンを精製水：ＭｅＯＨ（９５：５）中に溶解した。完全に溶解するために超音波処理する。
【０４０７】
ＨＰＬＣによる純度は、面積％に基づいて計算され、既知の保持時間標準に対して相関付けられる。
【０４０８】
ＨＰＬＣによるアッセイは、既知の純度及び組成の標準に対する重量％に基づいて、無水物ベースで計算される。
【０４０９】
【表２２】
2020536960.tif 000025
７．６  ＨＲＧＣによる残存溶媒含量
【０４１０】
残存溶媒を定量するためのＨＲＧＣ法はヘッドスペース法であり、下表２３に記載されている。
【０４１１】
【表２３】
2020536960.tif 000026
【０４１２】
以下の溶媒及び試薬のレベルが測定される：メタノール、エタノール、ＴＨＦ及びトルエン。
７．７  ＤＳＣによる融点
【０４１３】
ＤＳＣデータは、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｐｙｒｉｓ  ６０００  ＤＳＣ（又は類似のもの）で収集された。認証されたインジウムを用いて、エネルギー及び温度較正のために装置を検証した。ピンホールを開けたアルミニウムサンプルパン中に、試料を秤量した（典型的には、０．５〜３．０ｍｇ）。アルミニウムパンカバーを用いて、パンを圧着した。２０ｍＬ／分で乾燥窒素をパージしながら、２０℃／分で、３０〜３００℃までパンを加熱した。融点手法の間に、シロシビン多形Ａ又はＡ’の各バッチは、２つの吸熱事象後者を示した。吸熱事象の第一は、多形Ａ又はＡ’の多形Ｂへの固体−固体遷移に起因し、吸熱事象の第二は多形Ｂの融解に起因した。
７．８  ＸＲＰＤによる多形
【０４１４】
シロシビンの固体状態形態は、ＸＲＰＤによって決定される。ＸＲＰＤディフラクトグラムは、Ｃｕ  Ｋα放射線（４５ｋＶ、４０ｍＡ）、θ−θ角度計、集束ミラー、発散スリット（１／２インチ）、入射及び発散ビームの両方にソーラースリット（４ｍｍ）を用いて、周囲条件下で、回折計（ＰＡＮａｌｙｔｉｃａｌ  Ｘ’Ｐｅｒｔ  ＰＲＯ又は同等物など）で収集した。データ収集範囲は、０．２°ｓ−１の連続スキャン速度で、３〜３５°２θであった。得られたディフラクトグラムは、一致していることを確実にするために、多形Ａ又はＡ’の参照ディフラクトグラムのものと比較される（それぞれ、図７ａ又は７ｂ）。
７．９  熱重量分析（ＴＧＡ）
【０４１５】
ＴＧＡデータは、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｐｙｒｉｓ  １  ＴＧＡ（又は類似のもの）で収集された。機器は、認証された分銅並びに認証されたＡｌｕｍｅｌ及びＰｅｒｋａｌｌｏｙを用いて、温度に関して較正された。アルミニウムるつぼ中に、所定量の試料（典型的には、およそ５ｍｇ）を載せて、２０℃／分で、周囲温度から４００℃まで加熱した。２０ｍＬ／分での窒素パージを試料に対して維持した。
７．１０  乾燥時減量
【０４１６】
正確に秤量された１ｇ分量を用いて、一定重量まで７０℃で真空下で乾燥して、試料の乾燥時減量を２つ組で測定する。
【０４１７】
計算：
【数１】
2020536960.tif 000027
式中：
ＷＩＮＩＴＩＡＬ  ＝  乾燥前の皿及び試料の当初重量（ｇ）
ＷＦＩＮＡＬ  ＝  皿及び乾燥された試料の最終重量（ｇ）
ＷＳＡＭＰＬＥ  ＝  試料の重量（ｇ）
［実施例８］
強制分解試験
【０４１８】
分析法選択性を評価するための試料を提供するために、溶液中及び固体状態で、シロシビン薬物物質に様々な条件下でストレスを与えた。
【０４１９】
ＩＣＨ  Ｑ１Ａ（Ｒ２）の要件に基づいて、シロシビンに対して強制分解試験を実施した。ストレス条件下での試験は、シロシビンの起こり得る分解経路及び固有の安定性に関する情報を与えた。使用された最適化された分析法は、シロシビンへの特異性を実証した。この分析法は、適切であることが示され、この方法を用いて、生成物の同一性、純度及び効力に対する変化を検出することができる。使用されたこの方法は、特異性に関してＩＣＨ  Ｑ２（Ｒ１）（分析手法の検証）に合致し、生じ得る不純物及び分解生成物からの妨害がないことも示された。したがって、ＨＰＬＣ法は、シロシビンの純度及び関連する不純物を測定するのに適切であると考えられる。
【０４２０】
シロシビンの対照試料は、研究期間（非光安定性試料に対しては、研究期間は７日であった）にわたって、溶液中で安定であった。溶液中で加熱されると、シロシビンはゆっくり分解し、主な不純物としてサイロシンを生成した。シロシビンは、室温で、酸条件下においても安定であった。しかしながら、６０℃では、遅い着実な分解が観察され、主な不純物としてサイロシンを生成した。シロシビンは、塩基の存在下では、室温でわずかに不安定であり、研究期間にわたって、多様な不純物へゆっくり分解した。過酸化物条件下では、極めて低レベルの不純物のみが形成され、全体の純度はおよそ０．５％低下した。固体状態では、遅い化学的分解が認められ（１５０℃で３日）、不純物として主にサイロシン（ステージ３）を生成した。シロシビンは、固体として及び溶液中にあるときの両方で、光安定性条件下において安定であった。
安定性試験
【０４２１】
表２４に示されているように、２つのバッチのシロシビンを用いて、安定性研究に着手した。
【０４２２】
【表２４】
2020536960.tif 000028
【０４２３】
試料は、食品等級のポリエチレン（ｐｏｌｙｔｈｅｎｅ）袋中に二重に袋詰めされ、外側ポリエチレン容器中に密封され、２〜８℃、２５℃／６０％ＲＨ及び４５℃／７５％ＲＨで保存され、水分の取り込みを防ぐために、内側ポリエチレン袋の間には乾燥剤の袋が含められる。外観、水含量、純度及びアッセイの試験を実施した。
【０４２４】
２つの試験のプロトコールは、表２５及び表２６に示されている。
バッチＧＭ７６４Ｂに対する１ヶ月及び３ヶ月安定性データは、下表２７及び表２８に詳述されている。ＧＭＰバッチ１７０２３１に対する１、３、６、９及び１２ヶ月安定性データは、それぞれ、以下の表２９、表３０、表３１、表３２及び表３３に与えられている。
【０４２５】
【表２５】
2020536960.tif 000029
【０４２６】
【表２６】
2020536960.tif 000030
【０４２７】
【表２７】
2020536960.tif 000031
【０４２８】
【表２８】
2020536960.tif 000032
【０４２９】
【表２９】
2020536960.tif 000033
【０４３０】
【表３０】
2020536960.tif 000034
【０４３１】
【表３１】
2020536960.tif 000035
【０４３２】
【表３２】
2020536960.tif 000036
【０４３３】
【表３３】
2020536960.tif 000037
【０４３４】
ＩＣＨ安定性試験の最初の１２ヶ月にわたって、低温（２〜８℃）、周囲（２５℃／６０％ＲＨ）及び加速された（４０℃／７５％ＲＨ）条件下で、シロシビンは化学的に安定であることが判明した。外観には変化が存在せず、ＨＰＬＣ分析も一貫性を保った。当初の影響のため、次いで、試験で用いた乾燥剤の袋の劣化のために、水含量は全ての試料で変動した。
［実施例９］−水和物Ａを形成するための実験
【０４３５】
シロシビン（２００ｍｇ）、続いて、脱イオン水（４ｍｌ）を結晶化チューブに加えた。２５℃で２時間、混合物を平衡化した後に、固体を真空ろ過によって単離した。材料を２つの等しい部分に分けた。ＸＲＰＤ及びＤＳＣ（それぞれ、図７ｄ及び図８ｄと合致するディフラクトグラム及びサーモグラム）による水和物Ａ、ロットＧＫ２を与えるために、一方の部分はさらなる乾燥に供されなかった。
［実施例１０］−多形Ｂを形成するための実験
【０４３６】
丸底フラスコにシロシビン多形Ａ（２５０ｍｇ）を加え、油浴を用いて１７３℃まで加熱し、５分間、この温度に維持した。固体を周囲温度まで冷却し、単離して、９３％の回収率でロットＧＫ３を得た。ＸＲＰＤ及びＤＳＣによる分析（それぞれ、図７ｃ及び図８ｃと合致するディフラクトグラム及びサーモグラム）は、ロットＧＫ３が多形Ｂであることを明らかにした。
［実施例１１］−固体状態検査
【０４３７】
多数の多形検査を完了した。見出された固体形態の要約が、図１７に示されている。見出された形態の大半は、溶媒摂動に由来するものであった。いくつかの事例では、化学量論的溶媒和物が単離され、その他の事例では、非化学量論的溶媒和物が単離された。
多形Ａのスラリー
【０４３８】
固体形態の修飾への主要な経路として、及び２５〜５０℃で、多様な２４の溶媒中での材料の溶解度を視覚的に評価するために、溶媒によって媒介されたシロシビンパターンＡの平衡化を実施した。
【０４３９】
室温で、シロシビンパターンＡ（４０ｍｇ）を管の中に加え、１．２ｍｌの総容量（３０容量）まで、表３４に列記されている溶媒を０．４ｍｌ（１０容量）の分割量で添加して、観察を書き留めた。混合物は、絶えず撹拌した。熱サイクルは、以下のように実施した。５０℃１８時間、２時間にわたって２０℃まで冷却、４時間熟成、５０℃まで４時間加熱、２時間にわたって２０℃まで冷却、１８時間熟成。２４時間にわたる反復５０℃−２０℃サイクルを実施し、以下を適用した。
５０℃への加熱後に単離、固体が十分であった場合＝Ａ系列
２０℃への冷却後に単離、固体が十分であった場合＝Ｂ系列
真空中において、５０℃で２４時間、全ての単離された固体を乾燥し、ＸＲＰＤによって分析した。観察が、表３４に与えられている。
【０４４０】
３０容量、５０℃で試験された溶媒及び溶媒混合物中で、ＡＰＩは、大部分不溶性であり、懸濁度が高い懸濁液（ｈｅａｖｙ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ）が得られた。水は、５０℃で、シロシビンを可溶化した。
【０４４１】
【表３４】
2020536960.tif 000038
【０４４２】
結果：
【０４４３】
図（図１８及び図１９）では、「２５Ｃ」は、２５℃での固体の単離を表し、「５０Ｃ」は、５０℃での固体の単離を表す。例えば、ＧＭ８３２−２０＿５０＿Ａ９は、５０℃で単離されたＧＭ８３２エントリー２０（ＭｅＣＮ）を表す。
【０４４４】
５０℃スラリー
【０４４５】
エントリー１、２、３、４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１５、１６、２２、２３、２４：ＸＲＰＤディフラクトグラムは広く多形Ａと合致したが、１８°２θに変動する強度の追加のピークを有する。
【０４４６】
エントリー６、９、１２、２０：単離された固体に対して得られたＸＲＰＤディフラクトグラムは、広く合致しており（図１８参照）、いくつかの試料に対しては、１０°２θ及び１３．２°２θに追加のピークが観察された。このＸＲＰＤディフラクトグラムは、パターンＣと表記された。溶媒（ＣＨ３ＮＯ２、ＴＢＭＥ、ｉＰｒＯＡｃ及びＣＨ３ＣＮ）間に、化学種相関は存在しない。
【０４４７】
エントリー１７：得られたＸＲＰＤディフラクトグラムは、複数の回折ピークを有していた（図１９）。ＸＲＰＤディフラクトグラムは、パターンＤと表記された。
【０４４８】
エントリー１８：得られたＸＲＰＤディフラクトグラムは、複数の回折ピークを有していた（図１９）。ＸＲＰＤディフラクトグラムは、パターンＥと表記された。
【０４４９】
エントリー１９：得られたＸＲＰＤディフラクトグラムは、複数の回折ピークを有していた（図１９）。ＸＲＰＤディフラクトグラムは、パターンＦと表記された。
【０４５０】
２５℃スラリー：
【０４５１】
エントリー１、２、３、４、５、７、８、９、１０、１１、１３、１４、１５、１６、２０、２１、２２：ＸＲＰＤディフラクトグラムは全て、多形Ａに対して得られたものと似ている。
【０４５２】
エントリー６、１２、２４：単離された固体に対して得られたＸＲＰＤディフラクトグラムは、広くパターンＣと合致していた（図１８参照）。
【０４５３】
エントリー２３：ＸＲＰＤ分析は、水和物Ａが形成されたことを示した。
【０４５４】
エントリー１７：得られたＸＲＰＤディフラクトグラムは、複数の回折ピークを有していた（図１９）。ＸＲＰＤディフラクトグラムは、パターンＤと表記された。
【０４５５】
エントリー１８：得られたＸＲＰＤディフラクトグラムは、複数の回折ピークを有していた（図１９）。ＸＲＰＤディフラクトグラムは、パターンＥと表記された。
【０４５６】
エントリー１９：得られたＸＲＰＤディフラクトグラムは、複数の回折ピークを有していた（図１９）。ＸＲＰＤディフラクトグラムは、パターンＦと表記された。
【０４５７】
結果の分析：
【０４５８】
２５℃で単離された固体に対するＸＲＰＤディフラクトグラムは、５０℃で単離された固体に対して得られたＸＲＰＤディフラクトグラムと広く同一である。
【０４５９】
パターンＤ、Ｅ及びＦは、アルコール（ＭｅＯＨ、ＥｔＯＨ及びＩＰＡ）に由来した。開発の間に、エタノール溶媒和物が以前に単離されたことを考慮して、溶媒和された状態が想定された。エタノール溶媒和物に対するＸＲＰＤディフラクトグラムは同一でないが、正確な溶媒レベルの変動が格子内における変動する秩序状態をもたらし得ることに鑑みれば、これらのＸＲＰＤディフラクトグラム間での比較は、これらのより顕著な相変動が溶媒同伴によって引き起こされるという強力な仮説を与える。
【０４６０】
ＸＲＰＤパターンＤ、Ｅ及びＦ（図１９）は全て、水和物に対するＸＲＰＤディフラクトグラム（図７ｄ）と類似していない。
【０４６１】
ＭｅＯＨ、ＥｔＯＨ及びＩＰＡに由来した２つの温度で単離された固体（パターンＤ、Ｅ及びＦ−図１９）に対して得られたＸＲＰＤディフラクトグラムの直接的な比較は、一致するディフラクトグラムを示す。２つのＭｅＯＨディフラクトグラムは類似しているのに対して、ＥｔＯＨ及びＩＰＡは直接比較可能である。
【０４６２】
単離された固体に対して、ＤＳＣ分析を行い、十分な試料が入手可能な場合にはＴＧＡも行った。パターンＤ、Ｅ及びＦをもたらした固体は全て、およそ１７０〜１８０℃での吸熱を特徴として備えているが、その他は明瞭な熱的プロファイルを呈した。ＭｅＯＨスラリーから単離された固体に対するＴＧＡ分析は、およそ２５〜１９０℃までに１つの長い質量喪失を示した（３．１％）。化学量論的メタノール溶媒和物は、１０．３％重量の溶媒を必要とするであろう。ＥｔＯＨスラリーから単離された固体のＴＧＡ分析は、２つの明瞭な質量喪失段階を示した。１００℃より前に起こった第一の質量喪失（０．３％重量）は、水によるものであり、第二のより大きな喪失（１１．５％重量）は溶媒によるものであると考えられる。化学量論的エタノール溶媒和物は、１３．９％重量の溶媒を必要とする。ＩＰＡスラリーから単離された固体のＴＧＡ分析は、２つの明瞭な質量喪失段階を特徴として備えていた。１００℃より前の第一の質量喪失（０．４％重量）は水によるものと考えられ、第二のより大きな質量喪失（１３．９％重量）は残存溶媒によるものであると考えられる。化学量論的ＩＰＡ溶媒和は、１７．５％重量の溶媒を必要とする。
【０４６３】
非晶質シロシビンのスラリー
【０４６４】
非晶質材料を生成するために、シロシビンの少量試料（０．５ｇ）を水（０．５Ｌ、１０００容量）の中に溶解し、仕上げろ過し、凍結乾燥した。シロシビンは、灰白色の繊維状材料（ロットＭＣ１３６８Ａ；４１２ｍｇ、８２％、ＸＲＰＤ非晶質）として回収された。
【０４６５】
非晶質ＡＰＩの溶解性を視覚的に評価するために、及び形態の修飾を誘導するために、一連のスラリー熟成を以下のように行った。
シロシビン（１５ｍｇ）を管に加えた。次いで、周囲温度で溶媒を添加し（２０℃、０．３ｍｌ、２０容量）、懸濁液を撹拌した。観察を行った。１時間の撹拌後、試料を４５℃に１８時間加熱し、観察を行った。試料を５０℃に８時間加熱し、観察を行った。試料を２５℃で７２時間撹拌し、単離前に、最終の熱サイクルに供した。観察が、表３５に示されている。
【表３５】
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【０４６６】
結果
【０４６７】
大半の溶媒は、半結晶性であると考えられる固体を戻した（主に非晶質であり、およそ１８°２θに顕著な反射を有する）。
【０４６８】
ＭｅＣＮ中での平衡化からは、真正の非晶質が戻された。
【０４６９】
多形Ｂは、クロロブタン、ニトロメタン及びＩＰＡから戻された（図２０及び２２）。
【０４７０】
上に論述された多形Ａスラリー実験においてＭｅＯＨから単離されたパターンＤは、ＥｔＯＨ平衡化から戻されたのに対して、本研究におけるＭｅＯＨは半結晶性固体を戻した。
【０４７１】
パターンＡに類似する固体は、水、ＴＨＦ：水及びＩＰＡ：水（４：１）から回収された。
【０４７２】
パターンＤに類似する固体は、ＥｔＯＨ：水（４：１）から回収され、ＥｔＯＨ単独からのパターンＤの単離という知見を裏付けた。
【０４７３】
パターンＥに類似する固体は、クロロホルムから回収された。
【０４７４】
調査した溶媒からは、非晶質シロシビンの長期平衡化及び熱的熟成後に、真の多形Ａ又はＡ’は単離されなかった。
［実施例１２］−調合物の開発。
【０４７５】
下表３６に記載されているような調合を用いて、最初の一連の実験を実施した。目的は、大規模調合のための適切な単一増量剤又は組み合わせ増量剤を同定することであった。
【表３６】
2020536960.tif 000040
【０４７６】
主要な生理化学的特性−物質の流動性、混和均一性及び含量均一性の観点での結果が、下表３７に記載されている。
【表３７】
2020536960.tif 000041
【０４７７】
バッチ（ＡＰＬ−１１７−６０８５−０３）は、分析された異なる試料にわたって優れた混和均一性（最高、中間及び最低）並びに極めて優れた含量均一性を示したが、その流動性特性（カーの指数に基づく）は上限に近づき、調合物はより高い薬物搭載量（ｄｒｕｇ  ｌｏａｄｓ）を収容しないと予測された。
【０４７８】
この理由のために、多数の代替的調合物が試された。目的は、粉末流動性を改善すること並びに優れた混和均一性及び含量均一性を達成することを目的として、他の増量剤の組み合わせを検討することであった。
【０４７９】
バッチ３（ＡＰＬ−１１７−６０８５−０３）と比較して少ないＣｏｍｐａｃｔｃｅｌ  ＭＡＢを含有し、より大量の流動促進剤を含有する調合物も試した。
【０４８０】
これらのさらなる調合物は、下表３８に記載されている。
【表３８】
2020536960.tif 000042
【０４８１】
これらのバッチに対する結果は、下表３９に示されている。
【表３９】
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【０４８２】
ＡＰＬ−１１７−６０８５−０５は優れた混和均一性を達成することができず、含量均一性基準も充足できなかった。
【０４８３】
ＡＰＬ−１１７−６０８５−０６及びＡＰＬ−１１７−６０８５−０７はいずれも、改善された粉末流動性を示したが、両調合物に対する混和均一性はＡＰＬ−１１７−６０８５−０３より劣っていた。
【０４８４】
その結果、出願人は改変された賦形剤、より具体的には、異なる粒径を有する珪化された増量剤に注目した。これらの調合物は、下表４０に記載されている。
【表４０】
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【０４８５】
Ｐｒｏｓｏｌｖは珪化された微結晶セルロースであり、粒径が結果に影響を及ぼすかどうかを決定するために２つの変異形を選択した。標準的な微結晶セルロース（典型的なサイズ範囲は、ふるい分けに応じて、８０〜３５０ミクロンである）と比較して、Ｐｒｏｓｏｌｖはより微細な粒径分布を有し、増加した表面積を与える。増大した表面積は、調合物中の改善された含量均一性及び安定性とともに、優れた流動性及び増加した圧密（ｃｏｍｐａｃｔｉｏｎ）を与え得ると仮定された。Ｐｒｏｓｏｌｖ５０及びＰｒｏｓｏｌｖ９０の比率は、より微細な粒子とより粗い粒子の両方にわたる粒径分布を生成するためのものであった。
【０４８６】
これらの結果は、下表４１に記載されている。
【表４１】
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【０４８７】
混和均一性の一貫性（誤差を考慮して９５％超）と同様に、含量均一性の主要なパラメータ（９０％超、実際には９４％超）及びＡＶ（１０未満、実際には７未満）が優れていることを認めることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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