(57)【要約】本開示は、組み換えタンパク質を産生するための方法、及びそのような方法に使用され且つそのような方法により産生される組成物に関する。具体的には、本開示は、高分泌収量の組み換えタンパク質を産生するための方法に関し、本明細書で提供される組成物は、少なくとも２つの別個の分泌シグナルに作動可能に連結されているタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む組み換え宿主細胞を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの別個の分泌シグナルに作動可能に連結されている組み換えタンパク質をコードする少なくとも２つのポリヌクレオチド配列を含む、組み換え宿主細胞。
【請求項２】
前記別個の分泌シグナルのうちの少なくとも１つが、シグナルペプチドを含むがリーダーペプチドを含まない、請求項１に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項３】
前記別個の分泌シグナルのうちの少なくとも１つが、シグナルペプチド及びリーダーペプチドを含む、請求項１に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項４】
前記別個の分泌シグナルのうちの少なくとも１つが、天然分泌シグナル、または天然分泌シグナルと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する機能的変異体である、請求項１に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項５】
前記別個の分泌シグナルのうちの少なくとも１つが、組み換え分泌シグナルである、請求項１に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項６】
前記別個の分泌シグナルのうちの少なくとも１つが、表１から選択されるシグナルペプチド、または表１から選択されるシグナルペプチドと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する機能的変異体を含む、請求項１に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項７】
前記別個の分泌シグナルのうちの少なくとも１つが、天然ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）であるリーダーペプチド、または配列番号１と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する機能的変異体を含む、請求項１に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項８】
前記組み換え分泌シグナルが、配列番号１と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するリーダーペプチド、及び、ｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）を含まないシグナルペプチドを含む、請求項５に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項９】
前記別個の分泌シグナルのうちの少なくとも１つが、天然ｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）／ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）または配列番号７と少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有する機能的変異体であり、かつ前記別個の分泌シグナルのうちの少なくとももう１つが、天然ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）または配列番号１と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する機能的変異体及びｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）ではないシグナルペプチドを含む、組み換え分泌シグナルである、請求項１に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１０】
天然ｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）／ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）の前記機能的変異体が、配列番号７と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項９に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１１】
天然ｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）／ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）の前記機能的変異体が、１つまたは２つの置換アミノ酸変化を含む天然ｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）／ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）である、請求項９に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１２】
天然ｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）／ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）の前記機能的変異体が、配列番号８である、請求項９に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１３】
天然ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）の前記機能的変異体が、配列番号１と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項９に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１４】
天然ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）の前記機能的変異体が、１つまたは２つの置換アミノ酸変化を含む天然ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）である、請求項９に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１５】
天然ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）の前記機能的変異体が、配列番号２である、請求項９に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１６】
前記シグナルペプチドが表１から選択されるか、または、表１から選択されるシグナルペプチドと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する機能的変異体である、請求項９に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１７】
前記シグナルペプチドの前記機能的変異体が、表１から選択されるシグナルペプチドと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％のアミノ酸同一性を有する、請求項１６に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１８】
前記組み換え分泌シグナルが、配列番号９〜１２から選択されるか、または、配列番号９〜１２から選択される組み換え分泌シグナルと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する機能的変異体である、請求項９に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１９】
前記機能的変異体が、配列番号９〜１２から選択される組み換え分泌シグナルと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１８に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項２０】
前記ポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つが、前記組み換え宿主細胞のゲノム内に安定的に組み込まれている、請求項１に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項２１】
前記ポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つが、前記組み換え宿主細胞において染色体外に維持されている、請求項１に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項２２】
前記タンパク質が、シルクまたはシルク様タンパク質である、請求項１に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項２３】
前記タンパク質が、配列番号１３を含む、請求項２２に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項２４】
前記タンパク質が、配列番号１３の複数のコピーを含む、請求項２２に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項２５】
前記ポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つが、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項２６】
前記プロモーターが、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）のｐＧＣＷ１４プロモーターである、請求項２５に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項２７】
前記プロモーターが、ピキア・パストリスのｐＧＡＰプロモーターである、請求項２５に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項２８】
前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項２５に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項２９】
酵母細胞である、請求項１に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項３０】
出芽酵母細胞である、請求項２９に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項３１】
メチロトローフ酵母細胞である、請求項２９に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項３２】
ピキア種である、請求項３０に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項３３】
ピキア・パストリスである、請求項３２に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項３４】
前記組み換え宿主細胞により産生される前記組み換えタンパク質の総収量の少なくとも３０重量％の分泌収量である前記組み換えタンパク質を産生する、請求項１に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項３５】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載の組み換え宿主細胞及び培養培地を含む、発酵。
【請求項３６】
前記組み換え宿主細胞により産生される前記組み換えタンパク質の総収量の少なくとも３０重量％を分泌組み換えタンパク質として含む、請求項３５に記載の発酵。
【請求項３７】
前記培養培地が、少なくとも０．５ｇ／Ｌの前記組み換えタンパク質を含む、請求項３５に記載の発酵。
【請求項３８】
組み換えタンパク質を産生するための方法であって、
（ａ）培養培地中で請求項１〜３４のいずれか１項に記載の組み換え宿主細胞を培養して、請求項３５〜３７のいずれかの発酵を得る段階、及び
（ｂ）前記培養培地から前記組み換えタンパク質を抽出する段階
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は、２０１７年３月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／４７０，１５３号の利益を主張し、この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本開示は、組み換えタンパク質を産生するための方法、及びそのような方法に使用され、且つ方法により産生される組成物、に関する。具体的には、本開示は、高分泌収量の組み換えタンパク質を産生するための方法、ならびに、そのような方法に使用される組み換えベクター、組み換え宿主細胞、及び発酵に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
研究、産業、または治療目的のために必要な多くのタンパク質（例えば、酵素、ワクチン、ホルモン、及びバイオ医薬品タンパク質）は、組み換え宿主細胞内で工業的に産生されている。酵母、特に、出芽酵母は、そのような用途に好まれる真核生物の宿主生物である。酵母細胞は、安価な培地中で高細胞密度まで急速に成長し、タンパク質のフォールディング及び翻訳後修飾（例えば、タンパク質分解性成熟、ジスルフィド結合の形成、リン酸化、Ｏ結合型及びＮ結合型グリコシル化）のための細胞機序を含む。組み換えタンパク質の産生に最も一般に使用される酵母種は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、及びクライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）を含む。これらのうち、ピキア・パストリスは、高密度の細胞成長を達成することができるので、特に、組み換えタンパク質がより大きな（例えば、工業用）規模で産生されることになる用途に適する。
【０００４】
分泌タンパク質が、インタクトな細胞から容易に分離されるため、組み換えタンパク質が細胞から分泌される時、組み換え宿主細胞における組み換えタンパク質の工業規模の産生が促進されて、細胞溶解の必要性及びそれに続く細胞破片からのタンパク質の分離が不要になる。ピキア・パストリスが濾過及び低伝導度のクロマトグラフィーによる分泌タンパク質の単離を許容する最小塩培地中で成長し得るので、且つ、ピキア・パストリスが比較的少ない発酵産物（すなわち、小タンパク質）を自然に分泌し、それが分泌組み換えタンパク質の単離及び精製をさらに促進するので、ピキア・パストリスは、特に、分泌組み換えタンパク質の産生に適する。
【０００５】
分泌組み換えタンパク質の産生に使用される組み換え宿主細胞は、理想的には、大量の組み換えタンパク質を産生し、産生された組み換えタンパク質の大きな画分を分泌する。前者は通常、当該技術分野で周知の方策、例えば、組み換え宿主細胞内に操作されて組み換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をコドン最適化すること、強力なプロモーター及び効果的なターミネーターの制御下に、そのようなポリヌクレオチド配列の転写を置くこと、好適なリボース結合部位を導入することにより翻訳を最適化すること、ならびに、（例えば、２コピー以上の特定のポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞を操作することにより）組み換え宿主細胞におけるポリヌクレオチド配列のコピー数を増加させること、を用いることにより達成される。しかし、これらの方策は、高コピー数が組み換え宿主細胞を遺伝的に不安定化させ、強力なプロモーターは、組み換え宿主細胞が、適切にフォールド及び／または分泌し得るよりも高いレベルの組み換えタンパク質を生じるので、有効性における自然の限界に到達する傾向がある（Ｄａｍａｓｃｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．［２０１２］Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９３：３１−３９（非特許文献1）；Ｐａｒｅｋｈ  ｅｔ  ａｌ．［１９９５］Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．６（４）：５３７−４５（非特許文献2）；Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．［２００９］Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １０７：９５４−９６３（非特許文献3）；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．［２００３］Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．３０：２６２−２７４（非特許文献4））。その結果、組み換えタンパク質の収量は、アンフォールドまたはミスフォールドした組み換えタンパク質が組み換え宿主細胞内部で蓄積し、且つ組み換え宿主細胞が分子ストレス応答（例えば、アンフォールドしたタンパク質応答［ＵＰＲ］またはＥＲ関連タンパク質分解経路［ＥＲＡＤ］）を活性化させるので、横ばいか、またはさらに減少する傾向がある（Ｈｏｈｅｎｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．［２００４］Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．１２：３６７−３７５（非特許文献5）；Ｖａｓｓｉｌｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．［２００１］Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：２１−３５（非特許文献6）；Ｉｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．［２００６］Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．１２：７７１−７７８（非特許文献7）；Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．［２００９］Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２（３）：９５４−９６３（非特許文献3））。実に、シャペロンタンパク質または主要なＵＰＲ転写制御因子（Ｈａｃ１ｐ）の上方制御は、ＵＰＲの影響を低減させ、組み換えタンパク質収量を高めることが示されている（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．［２００６］Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．１２：１０９０−１０９５（非特許文献8）；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．［２０１２］Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２：２３００−２３０５（非特許文献9）；Ｖａｌｋｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．［２００３］Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２：６９７９−６９８６（非特許文献10））。しかし、そのような手段は、功罪相半ばする結果を生じており（Ｇｕｅｒｆａｌ  ｅｔ  ａｌ．［２０１０］Ｍｉｃｒｏｂ  ���ｅｌｌ  Ｆａｃｔ．１２：４９（非特許文献11））、依然として、組み換え宿主細胞の分泌経路の飽和を完全に解決しない（Ｉｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．［２００６］Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．１２：７７１−７７８（非特許文献7））。従って、組み換え宿主細胞の分泌機序の能力は、依然として、組み換えタンパク質の産生に対する主要なボトルネックである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｄａｍａｓｃｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．［２０１２］Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９３：３１−３９
【非特許文献２】Ｐａｒｅｋｈ  ｅｔ  ａｌ．［１９９５］Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．６（４）：５３７−４５
【非特許文献３】Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．［２００９］Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １０７：９５４−９６３
【非特許文献４】Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．［２００３］Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．３０：２６２−２７４
【非特許文献５】Ｈｏｈｅｎｂｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．［２００４］Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．１２：３６７−３７５
【非特許文献６】Ｖａｓｓｉｌｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．［２００１］Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：２１−３５
【非特許文献７】Ｉｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．［２００６］Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．１２：７７１−７７８
【非特許文献８】Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．［２００６］Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．１２：１０９０−１０９５
【非特許文献９】Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．［２０１２］Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２：２３００−２３０５
【非特許文献１０】Ｖａｌｋｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．［２００３］Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２：６９７９−６９８６
【非特許文献１１】Ｇｕｅｒｆａｌ  ｅｔ  ａｌ．［２０１０］Ｍｉｃｒｏｂ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ．１２：４９
【発明の概要】
【０００７】
従って、必要なものは、組み換え宿主細胞における過剰発現の負の影響を緩和しながら、望ましい組み換えタンパク質の発現の増加を可能にする方法及び組成物である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】高分泌収量の組み換えタンパク質を産生するための方法のフローチャートである。
【図２Ａ】サッカロミセス・セレビシエのα接合因子（ｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）／＊ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ））の分泌シグナルの機能的変異体を含むＮ末端分泌シグナル、または、サッカロミセス・セレビシエのα接合因子（＊ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ））のリーダーペプチドの機能的変異体及びシグナルペプチドからなる組み換え分泌シグナルに作動可能に連結されているシルク様タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を１つ含む組み換えベクターの例示的なマップである。ポリヌクレオチド配列の単一コピーの導入に使用される組み換えベクターの例示的なマップである。
【図２Ｂ】サッカロミセス・セレビシエのα接合因子（ｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）／＊ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ））の分泌シグナルの機能的変異体を含むＮ末端分泌シグナル、または、サッカロミセス・セレビシエのα接合因子（＊ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ））のリーダーペプチドの機能的変異体及びシグナルペプチドからなる組み換え分泌シグナルに作動可能に連結されているシルク様タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を３つ含む組み換えベクターの例示的なマップである。ポリヌクレオチド配列の３コピーの導入に使用される組み換えベクターの例示的なマップである。
【図３】ＥＬＩＳＡでアッセイされた、種々のピキア・パストリス組み換え宿主細胞により産生される組み換えシルク様タンパク質の細胞内（非分泌）及び細胞外（分泌）収量を示す。凡例：４／５／６ｘαＭＦ＝シグナル配列ｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）／＊ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）（配列番号８）に作動可能に連結されているシルク様タンパク質をコードする４／５／６ポリヌクレオチド配列を含む組み換え宿主株；４ｘαＭＦ＋３ｘＰｅｐ４＝シグナル配列ｐｒｅ−ＰＥＰ４（ｓｃ）／＊ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）（配列番号９）に作動可能に連結されているシルク様タンパク質をコードする３つのポリヌクレオチド配列をさらに含む組み換え宿主株４ｘαＭＦ；４ｘαＭＦ＋３ｘＤｓｅ４＝シグナル配列ｐｒｅ−ＤＳＥ４（ｐｐ）／＊ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）（配列番号１０）に作動可能に連結されているシルク様タンパク質をコードする３つのポリヌクレオチド配列をさらに含む組み換え宿主株４ｘαＭＦ。
【図４】ＥＬＩＳＡでアッセイされた、種々のピキア・パストリス組み換え宿主細胞により産生される組み換えシルク様タンパク質の細胞内（非分泌）及び細胞外（分泌）収量を示す。凡例：６ｘαＭＦ＝シグナル配列ｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）／＊ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）（配列番号８）に作動可能に連結されているシルク様タンパク質をコードする６ポリヌクレオチド配列を含む組み換え宿主株；４ｘαＭＦ＋２ｘＥｐｘ１＝シグナル配列ｐｒｅ−ＥＰＸ１（ｐｐ）／＊ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）（配列番号１１）に作動可能に連結されているシルク様タンパク質をコードする２つのポリヌクレオチド配列をさらに含む組み換え宿主株４ｘαＭＦ。
【図５】ＥＬＩＳＡでアッセイされた、種々のピキア・パストリス組み換え宿主細胞により産生される組み換えシルク様タンパク質の細胞内（非分泌）及び細胞外（分泌）収量を示す。凡例：４／５／６ｘαＭＦ＝シグナル配列ｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）／＊ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）（配列番号８）に作動可能に連結されているシルク様タンパク質をコードする４／５／６ポリヌクレオチド配列を含む組み換え宿主株；４ｘαＭＦ＋２ｘＥｐｘ１＝シグナル配列ｐｒｅ−ＥＰＸ１（ｐｐ）／＊ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）（配列番号１１）に作動可能に連結されているシルク様タンパク質をコードする２つのポリヌクレオチド配列をさらに含む組み換え宿主株４ｘαＭＦ；４ｘαＭＦ＋２ｘＥｐｘ１＋１ｘＣＬＳＰ＝シグナル配列ｐｒｅ−ＣＬＳＰ（ｇｇ）／＊ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）（配列番号１２）に作動可能に連結されているシルク様タンパク質をコードする１つのポリヌクレオチド配列をさらに含む組み換え宿主株４ｘαＭＦ＋２ｘＥｐｘ１。
【図６】本発明の一実施形態による、組み換え分泌シグナルでポリペプチドを発現するための発現構築物を含む組み換えベクターの図である。
【図７】種々の組み換え分泌シグナルで組み換えα−アミラーゼを発現するように形質転換されたピキア・パストリス由来のα−アミラーゼの分泌レベルを示す。
【図８】種々の組み換え分泌シグナルで組み換え蛍光タンパク質を発現するように形質転換されたピキア・パストリス由来の蛍光タンパク質の分泌レベルを示す。
【０００９】
図は、説明のみを目的として、本開示の種々の実施形態を示す。本明細書に記載の原理から逸脱することなく、本明細書に示される構造及び方法の代替実施形態が用いられ得ることを、当業者は以下の考察から容易に認識するであろう。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
発明の詳細な説明
定義
別途記載のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が関係する当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００１１】
本明細書で使用される「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という用語ならびに類似の指示対象は、本明細書で別途指示のない限り、または文脈により明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の双方を指す。
【００１２】
アミノ酸は、１文字のコードまたは３文字のコードで指すことができる。１文字コード、アミノ酸名、及び３文字コードは、次の通りである：Ｇ−グリシン（Ｇｌｙ）、Ｐ−プロリン（Ｐｒｏ）、Ａ−アラニン（Ａｌａ）、Ｖ−バリン（Ｖａｌ）、Ｌ−ロイシン（Ｌｅｕ）、Ｉ−イソロイシン（Ｉｌｅ）、Ｍ−メチオニン（Ｍｅｔ）、Ｃ−システイン（Ｃｙｓ）、Ｆ−フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、Ｙ−チロシン（Ｔｙｒ）、Ｗ−トリプトファン（Ｔｒｐ）、Ｈ−ヒスチジン（Ｈｉｓ）、Ｋ−リジン（Ｌｙｓ）、Ｒ−アルギニン（Ａｒｇ）、Ｑ−グルタミン（Ｇｌｎ）、Ｎ−アスパラギン（Ａｓｎ）、Ｅ−グルタミン酸（Ｇｌｕ）、Ｄ−アスパラギン酸（Ａｓｐ）、Ｓ−セリン（Ｓｅｒ）、Ｔ−トレオニン（Ｔｈｒ）。
【００１３】
本明細書で使用される「機能的変異体」という用語は、機能的特性が天然タンパク質特性の１０％以内に保存されている、天然タンパク質と組成が異なるタンパク質を指す。一部の実施形態では、機能的変異体及び天然タンパク質の間の差は、１次アミノ酸配列（例えば、１つ以上のアミノ酸が、除去、挿入、または置換されている）、または翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化）中に存在し得る。アミノ酸挿入は、Ｎ末端及び／またはＣ末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸の配列内挿入を含み得る。アミノ酸置換としては、非保存的及び保存的置換が挙げられ、保存的アミノ酸置換表は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｅｄｓ）を参照のこと）。一部の実施形態では、機能的変異体及び天然タンパク質は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％のアミノ酸またはヌクレオチド配列同一性を有する。
【００１４】
本明細書で使用される核酸またはアミノ酸配列の文脈における「同一性」または「同一の」という用語は、配列が最大限一致するようにアラインされる時に同じである２つの配列内のヌクレオチドまたはアミノ酸残基を指す。用途に応じて、パーセント「同一性」は、比較される配列の領域（すなわち、［例えば、機能ドメインにわたる］部分配列）全体に存在するか、または、代わりに、配列の全長にわたって存在し得る。「領域」は、少なくとも９、２０、２４、２８、３２、もしくは３６ヌクレオチド、または少なくとも６アミノ酸の連続ストレッチと考えられる。配列比較では、通常、１つの配列が、試験配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する時、試験及び参照配列がコンピューターに入力され、必要に応じて、部分配列の座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。次に、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列（複数可）のパーセント配列同一性を計算する。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピューターでの実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、ウィスコンシン州マディソンのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）により、または目視検査（一般に、以下のＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．を参照のこと）により、行うことができる。パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するのに適するアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．［１９９０］Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ｇｉｓｈ  ＆  Ｓｔａｔｅｓ．［１９９３］Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２；Ｍａｄｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．［１９９６］Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．［１９９７］Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ  ７  Ｍａｄｄｅｎ．［１９９７］Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９−６５６を参照のこと）。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）から公的に入手可能である。そのようなソフトウェアは、ポリペプチド配列内またはそのような配列のドメイン内にある特定した任意のアミノ酸のモル百分率を決定するために使用することもできる。そのような百分率が検査及び手動計算により決定することもできることを、当業者は認識するであろう。
【００１５】
「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｗｉｔｈ）」という用語、またはそれらの変形は、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と同様に包括的であることが意図される。
【００１６】
本明細書で使用される「微生物」という用語は、微生物を指し、単細胞生物を指す。本明細書で使用される場合、この用語は、全ての細菌、全ての古細菌、単細胞原生生物、単細胞動物、単細胞植物、単細胞真菌、単細胞藻類、全ての原生動物、及び全てのクロミスタを含む。
【００１７】
本明細書で使用される「天然」という用語は、天然の変更されていない状態で自然界にみられるものを指す。
【００１８】
本明細書で使用される「作動可能に連結されている」という用語は、タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列またはタンパク質と連続的に連結している、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列、及び、タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に対してトランスでまたは距離を置いて作用し且つタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはタンパク質の転写、翻訳、フォールディング、分泌、もしくは他の機能的態様を制御する、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列を指す。
【００１９】
「任意」または「任意に」という用語は、特徴もしくは構造が存在しても存在しなくてもよいこと、または事象もしくは状況が生じても生じなくてもよいこと、ならびに、本明細書が、特定の特徴もしくは構造が存在する場合及び特徴もしくは構造が存在しない場合、または事象もしくは状況が生じる場合及び事象もしくは状況が生じない場合を含むことを意味する。
【００２０】
本明細書で使用される「タンパク質」という用語は、機能的構造を有さないポリペプチド及び活性構造にフォールドするポリペプチドの双方を指す。
【００２１】
本明細書で使用される「組み換えタンパク質」という用語は、組み換え宿主細胞で産生されるタンパク質、または組み換え核酸から合成されるタンパク質を指す。
【００２２】
本明細書で使用される「組み換え宿主細胞」という用語は、組み換え核酸を含む宿主細胞を指す。
【００２３】
本明細書で使用される「組み換え核酸」という用語は、天然の環境から取り出される核酸、または自然で見つかった時、核酸に接するもしくは最も近い核酸の全てもしくは一部と会合しない核酸、または自然に連結されていない核酸に有効に連結されている核酸、または自然に生じない核酸、または自然の核酸にみられない修飾（例えば、人工的に、例えば、人間の介入により導入された挿入、欠失、もしくは点変異）を含有する核酸、または異種部位で染色体に組み込まれている核酸を指す。この用語は、化学合成されたヌクレオチドアナログを含むクローン化されたＤＮＡ分離株及び核酸を含む。
【００２４】
本明細書で使用される「組み換え分泌シグナル」という用語は、シグナルペプチド及びリーダーペプチドの非天然の組み合わせを含む分泌シグナルを指す。
【００２５】
本明細書で使用される「組み換えベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸分子を輸送することが可能な核酸分子を指す。この用語は、追加のＤＮＡセグメントをライゲートすることができる環状二本鎖ＤＮＡループ、及び、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅または制限酵素を用いるプラスミドの処理から生じるような線形二本鎖分子を一般に指す「プラスミド」を含む。ベクターの他の非限定例としては、バクテリオファージ、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、及びウイルスベクター（すなわち、追加のＤＮＡセグメントがライゲートされる完全または部分的なウイルスゲノム）が挙げられる。ある特定のベクターは、それらが導入される組み換え宿主細胞において自律複製ができる（例えば、細胞内で機能する複製起点を有するベクター）。導入の際に他のベクターは、組み換え宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、それにより細胞ゲノムと一緒に複製される。
【００２６】
本明細書で使用される「分泌組み換えタンパク質」という用語は、組み換えタンパク質を産生する組み換え宿主細胞の細胞膜及び／または細胞壁を越えて輸出される組み換えタンパク質を指す。
【００２７】
本明細書で使用される「分泌収量」という用語は、宿主細胞を含む発酵に供給される固定量の炭素に基づく、宿主細胞により産生される分泌タンパク質の量を指す。
【００２８】
本明細書で使用される「総収量」という用語は、宿主細胞を含む発酵に供給される固定量の炭素に基づく、宿主細胞により産生される総タンパク質の量を指す。
【００２９】
本明細書で使用される「切断型」という用語は、天然タンパク質よりも長さが短いタンパク質配列を指す。一部の実施形態では、切断型タンパク質は、天然タンパク質の長さの１０％を超える、または２０％を超える、または３０％を超える、または４０％を超える、または５０％を超える、または６０％を超える、または７０％を超える、または８０％を超える、または９０％を超えるものとし得る。
【００３０】
例示的な方法及び材料を以下に記載する。但し、本明細書に記載のものと類似または同等の方法及び材料が、本発明の実施に使用することもでき、当業者らには明らかであろう。本明細書で言及される全ての出版物及び他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先される。材料、方法、及び例は、単に例示であり、限定するものではない。
【００３１】
値の範囲が列挙されている場合はいつでも、その範囲は、明示的に書かれたかのように、範囲内の全ての値を含み、さらに範囲の境界値を含む。従って、「Ｘ〜Ｙ」の範囲は、Ｘ及びＹの間に入る全ての値を含み、Ｘ及びＹを含む。
【００３２】
高分泌収量の組み換えタンパク質を産生するための組成物及び方法
組み換え宿主細胞及び発酵、ならびに、高分泌収量の組み換えタンパク質を産生するために、そのような組み換え宿主細胞及び発酵を使用する方法が、本明細書で提供される。
【００３３】
本明細書で提供される組成物及び方法の利点は、それらが、大量の組み換えタンパク質を産生するための費用効果の高い手段を提供することを含む。大量の産物が、分泌経路を介して組み換えタンパク質を分泌する組み換え宿主細胞を使用して得られる。組み換えタンパク質のそのような分泌は、（ａ）組み換えタンパク質の細胞内蓄積の毒性を回避し、（ｂ）細胞破壊、細胞構成要素からの分離、及びタンパク質リフォールディングプロセスをなくすことにより精製を簡略化し、（ｃ）組み換えタンパク質の活性／機能にとって重要であり得る翻訳後修飾を用いて適切にフォールドされた組み換えタンパク質を提供する。
【００３４】
組み換え宿主細胞
本明細書で提供される組み換え宿主細胞は、組み換えタンパク質の分泌をもたらすために複数の別個の分泌シグナルを用いる宿主細胞である。
【００３５】
分泌シグナル
分泌されるために、タンパク質は、それを産生する細胞の細胞内分泌経路を通って運ばれる必要がある。タンパク質は、Ｎ末端分泌シグナルにより、選ぶべき細胞の行き先ではなく、この経路に向けられる。少なくとも、分泌シグナルは、シグナルペプチドを含む。シグナルペプチドは通常、Ｎ末端の塩基性アミノ酸及びＣ末端の極性アミノ酸に隣接する１３〜３６の、主に疎水性アミノ酸で構成されている。シグナルペプチドは、サイトゾルからＥＲの内腔への新生タンパク質の共翻訳もしくは翻訳後移行を媒介するシグナル認識粒子（ＳＲＰ）または他の輸送タンパク質（例えば、ＳＮＤ、ＧＥＴ）と相互作用する。ＥＲでは、シグナルペプチドは通常、切断され、タンパク質は、フォールディングし、翻訳後修飾を受ける。次に、タンパク質は、ＥＲからゴルジ体に、次に、分泌小胞及び細胞外部に送達される。シグナルペプチドに加えて、本来分泌が予定される新生タンパク質のサブセットは、リーダーペプチドも含む分泌シグナルを保有する。リーダーペプチドは通常、荷電または極性アミノ酸が割り込む疎水性アミノ酸で構成されている。理論に拘束されることを望むものではないが、リーダーペプチドは、タンパク質の輸送を停滞させ、適切なフォールディングを確実にし、且つ／またはＥＲから、リーダーペプチドが通常切断されるゴルジ体へのタンパク質の輸送を促進すると考えられている。
【００３６】
細胞から分泌されるタンパク質の量は、タンパク質間で大きく異なり、発生期のタンパク質に作動可能に連結されている分泌シグナルに部分的に依存する。多くの分泌シグナルが、当該技術分野で知られており、いくつかは、分泌組み換えタンパク質の産生に一般に使用される。これらの中で顕著なものは、Ｎ末端１９アミノ酸シグナルペプチド（本明細書において、ｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）とも呼ばれる）、続いて、７０アミノ酸リーダーペプチド（本明細書において、ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）とも呼ばれ；配列番号１）からなる、サッカロミセス・セレビシエのα接合因子（αＭＦ）の分泌シグナルである。サッカロミセス・セレビシエのαＭＦの分泌シグナル（本明細書ではｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）／ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）（配列番号７）とも呼ばれる）に、ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）が含まれることが、タンパク質の高分泌収量を達成するために重要であることが判明している（例えば、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  ＆  Ｇｌｉｃｋ［２０１４］Ｍｉｃｒｏｂ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ  ２８；１３（１）：１２５；Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．［２０００］Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ７４（２）：１０５を参照のこと）。ｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）以外のシグナルペプチドに、ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）またはその機能的変異体を追加することは、組み換えタンパク質の分泌を達成する手段としても検討されているが、ある特定の組み換え宿主細胞内で特定の組み換えタンパク質の分泌を増加させるが、他の組み換えタンパク質の分泌には効果がないか、それを減少させるという、程度の異なる有効性を示している（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  ＆  Ｇｌｉｃｋ．［２０１４］Ｍｉｃｒｏｂ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ  ２８；１３（１）：１２５；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．［２００５］Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．３２６（４）：８１７−２４；Ｏｂｓｔ  ｅｔ  ａｌ．［２０１７］ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ．２０１７  Ｍａｒ  ２）。
【００３７】
本明細書で提供される本発明は、複数の別個の分泌シグナルの使用により、組み換えタンパク質の分泌収量を改善することができるという本発明者らによりなされた驚くべき発見に基づいている。具体的には、１つのみの分泌シグナル（例えば、ｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）／ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ））に作動可能に連結されている組み換えタンパク質をコードする複数のポリヌクレオチド配列を含む組み換え宿主細胞と比較して、少なくとも２つの別個の分泌シグナルに作動可能に連結されている組み換えタンパク質をコードする同数のポリヌクレオチド配列を含む組み換え宿主細胞は、より高い分泌収量の組み換えタンパク質を産生することを、本発明者らは見出した。理論に拘束されることを望むものではないが、少なくとも２つの別個の分泌シグナルの使用により、組み換え宿主細胞が、組み換えタンパク質の効率的な分泌を達成する別個の細胞の分泌経路に関与し、従って、いずれか１つの分泌経路の過剰飽和を防ぐことを可能にし得る。
【００３８】
従って、本明細書で提供される組み換え宿主細胞は、少なくとも２つの別個の分泌シグナルに作動可能に連結されている組み換えタンパク質をコードする少なくとも２つのポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞である。分泌シグナルは通常、タンパク質のＮ末端に連結されている。
【００３９】
一部の実施形態では、別個の分泌シグナルのうちの少なくとも１つは、シグナルペプチドを含むが、リーダーペプチドは含まない。一部の実施形態では、別個の分泌シグナルのうちの少なくとも１つは、シグナルペプチド及びリーダーペプチドを含む。一部の実施形態では、別個の分泌シグナルのうちの少なくとも１つは、天然分泌シグナルまたは天然分泌シグナルと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する機能的変異体である。一部の実施形態では、別個の分泌シグナルのうちの少なくとも１つは、組み換え分泌シグナルである。
【００４０】
一部の実施形態では、別個の分泌シグナルのうちの少なくとも１つは、表１から選択されるシグナルペプチドを含むか、または、表１から選択されるシグナルペプチドと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する機能的変異体である。一部の実施形態では、機能的変異体は、１つまたは２つの置換アミノ酸を含む表１から選択されるシグナルペプチドである。一部のそのような実施形態では、機能的変異体は、表１から選択されたシグナルペプチドと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、ＥＲへの新生組み換えタンパク質の翻訳後移行を媒介する（すなわち、タンパク質合成は、新生組み換えタンパク質がＥＲに移行する前の細胞サイトゾル内に存在するように、移行に先行する）。他の実施形態では、シグナルペプチドは、ＥＲへの新生組み換えタンパク質の共翻訳的移行を媒介する（すなわち、タンパク質合成及びＥＲへの移行が同時に生じる）。ＥＲへの共翻訳移行を媒介するシグナルペプチドを使用する利点は、急速なフォールディングの傾向のある組み換えタンパク質が、ＥＲへの移行、従って、分泌を妨げる立体構造をとることを防ぐことである。
【００４１】
（表１）シグナルペプチド
2020509755.tif 000002
【００４２】
一部の実施形態では、別個の分泌シグナルのうちの少なくとも１つは、天然ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）（配列番号１）であるリーダーペプチド、または、配列番号１と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する機能的変異体を含む。一部の実施形態では、機能的変異体は、１つまたは２つの置換アミノ酸を含む天然ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）である。一部の実施形態では、機能的変異体は、＊ｐｒｏ−αＭＦ（配列番号２）である。一部の実施形態では、機能的変異体は、配列番号１と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％のアミノ酸同一性を有する。一部の実施形態では、機能的変異体は、αＭＦ＿ｎｏ＿ＥＡＥＡまたはαＭＦΔまたはαＭＦΔ＿ｎｏ＿Ｋｅｘである（Ｏｂｓｔ  ｅｔ  ａｌ．［２０１７］ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ．２０１７  Ｍａｒ  ２）。
【００４３】
一部の実施形態では、別個の分泌シグナルのうちの少なくとも１つは、天然ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）（配列番号１）であるリーダーペプチド、または、配列番号１と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する機能的変異体、及びｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）を含まないシグナルペプチドを含む。一部の実施形態では、機能的変異体は、配列番号１と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％のアミノ酸同一性を有するか、１つもしくは２つの置換アミノ酸を含む天然ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）であるか、＊ｐｒｏ−αＭＦ（配列番号２）であるか、またはαＭＦ＿ｎｏ＿ＥＡＥＡもしくはαＭＦΔもしくはαＭＦΔ＿ｎｏ＿Ｋｅｘである（Ｏｂｓｔ  ｅｔ  ａｌ．［２０１７］ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ．２０１７  Ｍａｒ  ２）。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、表１から選択されるか、１つもしくは２つの置換アミノ酸を含む表１から選択されるシグナルペプチドであるか、または表１から選択されるシグナルペプチドと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する。一部の実施形態では、別個の分泌シグナルのうちの少なくとも１つは、天然ｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）／ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）（配列番号７）または配列番号７と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する機能的変異体であり、かつ別個の分泌シグナルのうちの少なくとももう１つは、天然ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）（配列番号１）または配列番号１と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する機能的変異体及びｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）ではないシグナルペプチドを含む、組み換え分泌シグナルである。一部の実施形態では、天然ｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）／ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）の機能的変異体は、２〜４つの置換アミノ酸変化を含む天然ｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）／ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）であるか、ｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）／＊ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）（配列番号８）であるか、または配列番号７と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する。一部のそのような実施形態では、天然ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）の機能的変異体は、１つもしくは２つの置換アミノ酸変化を含む天然ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）であるか、＊ｐｒｏ−αＭＦ（配列番号２）であるか、配列番号１と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するか、またはαＭＦ＿ｎｏ＿ＥＡＥＡもしくはαＭＦΔもしくはαＭＦΔ＿ｎｏ＿Ｋｅｘである（Ｏｂｓｔ  ｅｔ  ａｌ．［２０１７］ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ．２０１７  Ｍａｒ  ２）。一部の実施形態では、ｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）ではないシグナルペプチドは、表１、または表１から選択されるシグナルペプチドと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する機能的変異体から選択される。一部のそのような実施形態では、シグナルペプチドは、１つもしくは２つの置換アミノ酸を含む表１から選択されるシグナルペプチドであるか、または、表１から選択されるシグナルペプチドと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９���のアミノ酸配列同一性を有する。一部の実施形態では、組み換え分泌シグナルは、表２の配列番号９〜１２から選択されるか、または、配列番号９〜１２から選択される組み換え分泌シグナルと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する機能的変異体である。
【００４４】
（表２）組み換え分泌シグナル
2020509755.tif 000003
【００４５】
好適な別個の分泌シグナル及び分泌シグナルの組み合わせは、本明細書に開示の方法を使用することにより特定することができる。そのような方法は、
（ａ）第１の分泌シグナルに作動可能に連結されている組み換えタンパク質をコードする、ｚ個のコピーの第１のポリヌクレオチド配列を含む組み換え宿主細胞Ａにより産生される組み換えタンパク質の分泌収量を測定するステップ、
（ｂ）第２の分泌シグナルに作動可能に連結されている組み換えタンパク質をコードする、ｍ個のコピーの第１のポリヌクレオチド配列及びｎ個のコピーの第２のポリヌクレオチド配列を含む組み換え宿主細胞Ｂにより産生される組み換えタンパク質の分泌収量を測定するステップ（組み換え宿主細胞Ａ及び組み換え宿主細胞Ｂは、第１及び第２のポリヌクレオチド配列のコピー数を除いて同一であり、ｍ＋ｎ＝ｚであり、第１及び第２の分泌シグナルは同一ではない）、ならびに
（ｃ）組み換え宿主細胞Ｂにおいて、組み換え宿主細胞Ａで達成されるよりも、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％大きい分泌収量の組み換えタンパク質を提供する第１及び第２の分泌シグナルの組み合わせを選択するステップ
を含む。
【００４６】
一部の実施形態では、組み換え宿主細胞Ｂは、第３の分泌シグナルに作動可能に連結されている組み換えタンパク質をコードする、ｙ個のコピーの第３のポリヌクレオチド配列を含み、組み換え宿主細胞Ａ及び組み換え宿主細胞Ｂは、第１、第２、及び第３のポリヌクレオチド配列のコピー数を除いて同一であり、ｍ＋ｎ＋ｙ＝ｚであり、第１、第２、及び第３の分泌シグナルは同一ではない。さらなる実施形態では、組み換え宿主細胞Ｂは、追加の別個の分泌シグナルに作動可能に連結されている組み換えタンパク質をコードする追加のポリヌクレオチド配列を含む。組み換え宿主細胞Ｂと同数のポリヌクレオチド配列を含む組み換え宿主細胞Ａを単離できない実施形態では、ステップ（ｃ）は、より少ないコピーのポリヌクレオチド配列を含む組み換え宿主細胞Ａを使用することができる。理論に拘束されることを望むものではないが、ある特定数のポリヌクレオチド配列を有する組み換え宿主細胞Ａを単離できないことは、同一のポリヌクレオチド配列のコピー数の増加によりもたらされる遺伝的不安定性または宿主細胞の不十分な健康状態によるものであり得る。
【００４７】
一部の実施形態では、発現構築物は、例えば、相同組み換えまたは標的化組み込みを介して、組み換え宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）内に安定して組み込まれる。ゲノムインテグレーションに好適な部位の非限定例は、サッカロミセス・セレビシエゲノムのＴｙ１遺伝子座、ピキア・パストリスゲノムのｒＤＮＡ及びＨＳＰ８２遺伝子座、ならびに組み換え宿主細胞のゲノム全体にコピーが点在する転位因子を含む。他の実施形態では、発現構築物は、組み換え宿主細胞のゲノム内に安定して組み込まれているのではなく、むしろ染色体外で（例えば、プラスミド上で）維持されている。ポリヌクレオチド配列は、組み換え宿主細胞のゲノム内の単一の場所に配置されるか、または組み換え宿主細胞のゲノム全体に分布させてもよい。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ型発現カセット多量体として組み換え宿主細胞のゲノムに配置される。
【００４８】
本明細書で提供されるような少なくとも２つの別個の分泌シグナルの使用により、高分泌収量の組み換えタンパク質が提供される。従って、種々の実施形態では、組み換え宿主細胞は、組み換え宿主細胞により産生される組み換えタンパク質の総収量の少なくとも１重量％、少なくとも５重量％、少なくとも１０重量％、少なくとも２０重量％、もしくは少なくとも３０重量％；１重量％〜１００重量％、〜９０重量％、〜８０重量％、〜７０重量％、〜６０重量％、〜５０重量％、〜４０重量％、〜３０重量％、〜２０重量％、もしくは１０重量％；１０重量％〜１００重量％、〜９０重量％、〜８０重量％、〜７０重量％、〜６０重量％、〜５０重量％、〜４０重量％、〜３０重量％、もしくは〜２０重量％；２０重量％〜１００重量％、〜９０重量％、〜８０重量％、〜７０重量％、〜６０重量％、〜５０重量％、〜４０重量％、もしくは〜３０重量％；３０重量％〜１００重量％、〜９０重量％、〜８０重量％、〜７０重量％、〜６０重量％、〜５０重量％、もしくは〜４０重量％；４０重量％〜１００重量％、〜９０重量％、〜８０重量％、〜７０重量％、〜６０重量％、もしくは〜５０重量％；５０重量％〜１００重量％、〜９０重量％、〜８０重量％、〜７０重量％、もしくは〜６０重量％；６０重量％〜１００重量％、〜９０重量％、〜８０重量％、もしくは〜７０重量％；７０重量％〜１００重量％、〜９０重量％、もしくは〜８０重量％；８０重量％〜１００重量％、もしくは〜９０重量％；または９０重量％〜１００重量％の分泌収量である組み換えタンパク質を産生する。産生されたタンパク質の識別は、ＨＰＬＣ定量、ウェスタンブロット分析、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、及び２次元質量分析法（２Ｄ−ＭＳ／ＭＳ）配列同定により確認することができる。
【００４９】
組み換えタンパク質
本明細書で提供される組み換え宿主細胞に含まれる少なくとも２つのポリヌクレオチド配列によりコードされる組み換えタンパク質は、任意のタンパク質であってよい。
【００５０】
一部の実施形態では、組み換えタンパク質は、シルクまたはシルク様タンパク質である。そのようなシルクまたはシルク様タンパク質は、広範囲の全長もしくは切断型天然シルクタンパク質、または広範囲の全長もしくは切断型天然シルクタンパク質の機能的変異体から選択するか、あるいは、天然シルクタンパク質またはシルクタンパク質の機能的変異体のドメインを含むことができる。推定上の天然シルクタンパク質は、適切な語（例えば、カイコシルク、クモシルク、スピドロイン、フィブロイン、ＭａＳｐ）に関し配列データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）を検索して、任意のヌクレオチド配列をアミノ酸配列に翻訳することにより同定することができる。
【００５１】
一部の実施形態では、シルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質は、カイコの全長もしくは切断型天然シルクタンパク質、またはカイコの全長もしくは切断型天然シルクタンパク質の機能的変異体であるか、あるいは、カイコの天然シルクタンパク質または天然シルクタンパク質の機能的変異体のドメインを含む。一部のそのような実施形態では、カイコは、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉである。
【００５２】
一部の実施形態では、シルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質は、クモの全長もしくは切断型天然シルクタンパク質、またはクモの全長もしくは切断型天然シルクタンパク質の機能的変異体であるか、あるいは、クモの天然シルクタンパク質または天然シルクタンパク質の機能的変異体のドメインを含む。一部の実施形態では、天然シルクタンパク質は、ナガコガネグモの大瓶状クモフィブロイン（ＭａＳｐ、ドラグラインとも呼ばれる；例えば、ＭａＳｐ１、ＭａＳｐ２）シルクタンパク質、小瓶状クモフィブロイン（ＭｉＳｐ）シルクタンパク質、鞭毛状クモフィブロイン（Ｆｌａｇ）シルクタンパク質、ブドウ状クモフィブロイン（ＡｃＳｐ）シルクタンパク質、小管状クモフィブロイン（ＴｕＳｐ）シルクタンパク質、及び梨状クモフィブロイン（ＰｙＳｐ）シルクタンパク質からなる群より選択される。一部の実施形態では、クモは、アゲレノプシス・アペルタ（Ａｇｅｌｅｎｏｐｓｉｓ  ａｐｅｒｔａ）、アリアチプス・グロサス（Ａｌｉａｔｙｐｕｓ  ｇｕｌｏｓｕｓ）、アフォノペルマ・シーマニー（Ａｐｈｏｎｏｐｅｌｍａ  ｓｅｅｍａｎｎｉ）、アプトスチチュス種（Ａｐｔｏｓｔｉｃｈｕｓ  ｓｐ．）ＡＳ２１７、アプトスチチュス種ＡＳ２２０、アラネウス・ディアデマツス（Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）、アラネウス・ゲムモイデス（Ａｒａｎｅｕｓ  ｇｅｍｍｏｉｄｅｓ）、アラネウス・ヴェントリコサス（Ａｒａｎｅｕｓ  ｖｅｎｔｒｉｃｏｓｕｓ）、アルギオペ・アモエナ（Ａｒｇｉｏｐｅ  ａｍｏｅｎａ）、アルギオペ・アルゲンタタ（Ａｒｇｉｏｐｅ  ａｒｇｅｎｔａｔａ）、ナガコガネグモ（Ａｒｇｉｏｐｅ  ｂｒｕｅｎｎｉｃｈｉ）、アルギオペ・トリファスシアタ（Ａｒｇｉｏｐｅ  ｔｒｉｆａｓｃｉａｔａ）、アチポイデス・リヴェルシ（Ａｔｙｐｏｉｄｅｓ  ｒｉｖｅｒｓｉ）、アヴィキュラリア・ジュルエンシス（Ａｖｉｃｕｌａｒｉａ  ｊｕｒｕｅｎｓｉｓ）、ボスリオシルツム・カリフォルニカム（Ｂｏｔｈｒｉｏｃｙｒｔｕｍ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｍ）、デイノピス・スピノサ（Ｄｅｉｎｏｐｉｓ  Ｓｐｉｎｏｓａ）、ディグエチア・カニチエス（Ｄｉｇｕｅｔｉａ  ｃａｎｉｔｉｅｓ）、ドロメデス・テネブロサス（Ｄｏｌｏｍｅｄｅｓ  ｔｅｎｅｂｒｏｓｕｓ）、エウアグルス・キソセウス（Ｅｕａｇｒｕｓ  ｃｈｉｓｏｓｅｕｓ）、エウプロスセノプス・オーストラリス（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ガステラキャンタ・マンモサ（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ  ｍａｍｍｏｓａ）、ヒポキルス・トレルリ（Ｈｙｐｏｃｈｉｌｕｓ  ｔｈｏｒｅｌｌｉ）、ククルカニア・ヒベルナリス（Ｋｕｋｕｌｃａｎｉａ  ｈｉｂｅｒｎａｌｉｓ）、ラトロデクツス・ヘスペルス（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ  ｈｅｓｐｅｒｕｓ）、メガヘクスラ・フルヴァ（Ｍｅｇａｈｅｘｕｒａ  ｆｕｌｖａ）、メテペイラ・グランディオサ（Ｍｅｔｅｐｅｉｒａ  ｇｒａｎｄｉｏｓａ）、ネフィラ・アンチポディアナ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ａｎｔｉｐｏｄｉａｎａ）、ネフィラ・クラヴァタ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖａｔａ）、ネフィラ・クラヴィペス（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）、ネフィラ・マダガスカリエンシス（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｍａｄａｇａ��ｃａｒｉｅｎｓｉｓ）、ネフィラ・ピリペス（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｐｉｌｉｐｅｓ）、ネフィレンギス・クルエンタタ（Ｎｅｐｈｉｌｅｎｇｙｓ  ｃｒｕｅｎｔａｔａ）、パラウィキシア・ビストリアタ（Ｐａｒａｗｉｘｉａ  ｂｉｓｔｒｉａｔａ）、ペウセチア・ヴィリダンス（Ｐｅｕｃｅｔｉａ  ｖｉｒｉｄａｎｓ）、プレクトレウリス・トリスチス（Ｐｌｅｃｔｒｅｕｒｙｓ  ｔｒｉｓｔｉｓ）、ポエシロセリア・レガリス（Ｐｏｅｃｉｌｏｔｈｅｒｉａ  ｒｅｇａｌｉｓ）、テトラグナタ・カウアイエンシス（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ  ｋａｕａｉｅｎｓｉｓ）、またはウロボルス・ディヴェルサス（Ｕｌｏｂｏｒｕｓ  ｄｉｖｅｒｓｕｓ）からなる群より選択される。
【００５３】
通常、シルクタンパク質は、３つのドメイン、すなわちＮ末端非反復ドメイン（ＮＴＤ）、反復ドメイン（ＲＥＰ）、及びＣ末端非反復ドメイン（ＣＴＤ）に分割することができる大きなタンパク質（１５０ｋＤａを超える、１０００アミノ酸を超える）である。ＲＥＰは、少なくとも１２アミノ酸長であり、完全に（「完全反復単位」）または不完全（「準反復単位」）のいずれかで繰り返され、且つ２〜１０アミノ酸長の配列モチーフを含むことができるアミノ酸配列のブロック（「反復単位」）を含む（図１を参照のこと）。ＲＥＰは通常、天然のクモシルクタンパク質の約９０％を占め、理論に拘束されることを望むものではないが、それぞれクモシルク繊維に強度及び柔軟性を与えると考えられているアラニンリッチのナノ結晶（１０ｎｍ未満）ドメイン（交互のβシートで構成される可能性が高い）及びグリシンリッチの非晶質ドメイン（αヘリックス及び／またはβターンを含有する可能性がある）に組み立てられる。ＲＥＰの長さ及び組成は、異なるクモシルクタンパク質間で、及び異なるクモ種にわたって変動することが知られており、特定の特性を有する広範囲のシルク繊維を生じさせる。
【００５４】
一部の実施形態では、シルクまたはシルク様タンパク質は、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８）の天然ＲＥＰまたは天然ＲＥＰの機能的変異体、ＮＴＤの０以上（例えば、０、１）の天然または機能的変異体、及び０以上（例えば、０、１）の天然ＣＴＤまたは天然ＣＴＤの機能的変異体を含む。一部の実施形態では、シルクまたはシルク様タンパク質は、それぞれが７５〜３５０のアミノ酸を含む１つ以上のＮＴＤを含む。一部の実施形態では、シルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質は、それぞれ７５〜３５０のアミノ酸を含む１つ以上のＣＴＤを含む。一部の実施形態では、シルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質は、それぞれが６０を超える、１００を超える、１５０を超える、２００を超える、２５０を超える、３００を超える、３５０を超える、４００を超える、４５０を超える、５００を超える、６００を超える、７００を超える、８００を超える、９００を超える、１０００を超える、１２５０を超える、１５００を超える、１７５０を超える、もしくは２０００を超える；６０〜２０００、〜１７５０、〜１５００、〜１２５０、〜１０００、〜９００、〜８００、〜７００、〜６００、〜５００、〜４５０、〜４００、〜３５０、〜３００、〜２５０、〜２００、〜１５０、もしくは〜１００；１００〜２０００、〜１７５０、〜１５００、〜１２５０、〜１０００、〜９００、〜８００、〜７００、〜６００、〜５００、〜４５０、〜４００、〜３５０、〜３００、〜２５０、〜２００、もしくは〜１５０；１５０〜２０００、〜１７５０、〜１５００、〜１２５０、〜１０００、〜９００、〜８００、〜７００、〜６００、〜５００、〜４５０、〜４００、〜３５０、〜３００、〜２５０、もしくは〜２００；２００〜２０００、〜１７５０、〜１５００、〜１２５０、〜１０００、〜９００、〜８００、〜７００、〜６００、〜５００、〜４５０、〜４００、〜３５０、〜３００、もしくは〜２５０；２５０〜２０００、〜１７５０、〜１５００、〜１２５０、〜１０００、〜９００、〜８００、〜７００、〜６００、〜５００、〜４５０、〜４００、〜３５０、もしくは〜３００；３００〜２０００、〜１７５０、〜１５００、〜１２５０、〜１０００、〜９００、〜８００、〜７００、〜６００、〜５００、〜４５０、〜４００、もしくは〜３５０；３５０〜２０００、〜１７５０、〜１５００、〜１２５０、〜１０００、〜９００、〜８００、〜７００、〜６００、〜５００、〜４５０、もしくは〜４００；４００〜２０００、〜１７５０、〜１５００、〜１２５０、〜１０００、〜９００、〜８００、〜７００、〜６００、〜５００、もしくは〜４５０；４５０〜２０００、〜１７５０、〜１５００、〜１２５０、〜１０００、〜９００、〜８００、〜７００、〜６００、もしくは〜５００；５００〜２０００、〜１７５０、〜１５００、〜１２５０、〜１０００、〜９００、〜８００、〜７００、もしくは〜６００；６００〜２０００、〜１７５０、〜１５００、〜１２５０、〜１０００、〜９００、〜８００、もしくは〜７００；７００〜２０００、〜１７５０、〜１５００、〜１２５０、〜１０００、〜９００、もしくは〜８００；８００〜２０００、〜１７５０、〜１５００、〜１２５０、〜１０００、もしくは〜９００；９００〜２０００、〜１７５０、〜１５００、〜１２５０、もしくは〜１０００；１０００〜２０００、〜１７５０、〜１５００、もしくは〜１２５０；１２５０〜２０００、〜１７５０、もしくは〜１５００；１５００〜２０００、もしくは〜１７５０；または１７５０〜２０００アミノ酸残基を含む反復単位を含む１つ以上のＲＥＰを含む。
【００５５】
一部の実施形態では、シルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質は、それぞれが、５ｋＤａを超える、１０ｋＤａを超える、２０ｋＤａを超える、３０ｋＤａを超える、４０ｋＤａを超える、５０ｋＤａを超える、６０ｋＤａを超える、７０ｋＤａを超える、８０ｋＤａを超える、もしくは９０ｋＤａを超える；５ｋＤａ〜１００ｋＤａ、〜９０ｋＤａ、〜８０ｋＤａ、〜７０ｋＤａ、〜６０ｋＤａ、〜５０ｋＤａ、〜４０ｋＤａ、〜３０ｋＤａ、〜２０ｋＤａ、もしくは〜１０ｋＤａ；１０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、〜９０ｋＤａ、〜８０ｋＤａ、〜７０ｋＤａ、〜６０ｋＤａ、〜５０ｋＤａ、〜４０ｋＤａ、〜３０ｋＤａ、もしくは〜２０ｋＤａ；２０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、〜９０ｋＤａ、〜８０ｋＤａ、〜７０ｋＤａ、〜６０ｋＤａ、〜５０ｋＤａ、〜４０ｋＤａ、もしくは〜３０ｋＤａ；３０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、〜９０ｋＤａ、〜８０ｋＤａ、〜７０ｋＤａ、〜６０ｋＤａ、〜５０ｋＤａ、もしくは〜４０ｋＤａ；４０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、〜９０ｋＤａ、〜８０ｋＤａ、〜７０ｋＤａ、〜６０ｋＤａ、もしくは〜５０ｋＤａ；５０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、〜９０ｋＤａ、〜８０ｋＤａ、〜７０ｋＤａ、もしくは〜６０ｋＤａ；６０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、〜９０ｋＤａ、〜８０ｋＤａ、もしくは〜７０ｋＤａ；７０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、〜９０ｋＤａ、もしくは〜８０ｋＤａ；８０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、もしくは〜９０ｋＤａ；または９０ｋＤａ〜１００ｋＤａの分子量を有する、２を超える、４を超える、６を超える、８を超える、１０を超える、１２を超える、１４を超える、１６を超える、１８を超える、２０を超える、２２を超える、２４を超える、２６を超える、２８を超える、または３０を超える；２〜３０、〜２８、〜２６、〜２４、〜２２、〜２０、〜１８、〜１６、〜１４、〜１２、〜１０、〜８、〜６、または〜４；４〜３０、〜２８、〜２６、〜２４、〜２２、〜２０、〜１８、〜１６、〜１４、〜１２、〜１０、〜８、または〜６；６〜３０、〜２８、〜２６、〜２４、〜２２、〜２０、〜１８、〜１６、〜１４、〜１２、〜１０、または〜８；８〜３０、〜２８、〜２６、〜２４、〜２２、〜２０、〜１８、〜１６、〜１４、〜１２、または〜１０；１０〜３０、〜２８、〜２６、〜２４、〜２２、〜２０、〜１８、〜１６、〜１４、または〜１２；１２〜３０、〜２８、〜２６、〜２４、〜２２、〜２０、〜１８、〜１６、または〜１４；１４〜３０、〜２８、〜２６、〜２４、〜２２、〜２０、〜１８、または〜１６；１６〜３０、〜２８、〜２６、〜２４、〜２２、〜２０、または〜１８；１８〜３０、〜２８、〜２６、〜２４、〜２２、または〜２０；２０〜３０、〜２８、〜２６、〜２４、または〜２２；２２〜３０、〜２８、〜２６、または〜２４；２４〜３０、〜２８、または〜２６；２６〜３０、または〜２８；２８〜３０の完全反復及び／または準反復単位を含む。一部のそのような実施形態では、シルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質内の２つ以上の完全反復または準反復単位の順序は天然のものではない。
【００５６】
一部の実施形態では、シルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質は、１を超える、２を超える、４を超える、６を超える、８を超える、１０を超える、１５を超える、２０を超える、もしくは２５を超える；１〜３０、〜２５、〜２０、〜１５、〜１０、〜８、〜６、〜４、もしくは〜２；２〜３０、〜２５、〜２０、〜１５、〜１０、〜８、〜６、もしくは〜４；４〜３０、〜２５、〜２０、〜１５、〜１０、〜８、もしくは〜６；６〜３０、〜２５、〜２０、〜１５、〜１０、もしくは〜８；８〜３０、〜２５、〜２０、〜１５、もしくは〜１０；１０〜３０、〜２５、〜２０、もしくは〜１５；１５〜３０、〜２５、もしくは〜２０；２０〜３０、もしくは〜２５；または２５〜３０の、グリシンリッチの完全反復及び／または準反復単位を含む。一部のそのような実施形態では、グリシンリッチの完全反復及び／または準反復単位のうちの１つ以上は、３０％を超える、４０％を超える、４５％を超える、５０％を超える、５５％を超える、６０％を超える、７０％を超える、もしくは８０％を超える；３０％〜１００％、〜９０％、〜８０％、〜７０％、〜６０％、〜５５％、〜５０％、〜４５％、もしくは〜４０％；４０％〜１００％、〜９０％、〜８０％、〜７０％、〜６０％、〜５５％、〜５０％、もしくは〜４５％；４５％〜１００％、〜９０％、〜８０％、〜７０％、〜６０％、〜５５％、もしくは〜５０％；５０％〜１００％、〜９０％、〜８０％、〜７０％、〜６０％、もしくは〜５５％；５５％〜１００％、〜９０％、〜８０％、〜７０％、もしくは〜６０％；６０％〜１００％、〜９０％、〜８０％、もしくは〜７０％；７０％〜１００％、〜９０％、もしくは〜８０％；８０％〜１００％、もしくは〜９０％；または９０％〜１００％のグリシンである、４を超える、６を超える、８を超える、１０を超える、１２を超える、１５を超える、１８を超える、２０を超える、２５を超える、３０を超える、４０を超える、５０を超える、６０を超える、７０を超える、８０を超える、９０を超える、１００を超える、もしくは１５０を超える；４〜２００、〜１５０、〜１００、〜９０、〜８０、〜７０、〜６０、〜５０、〜４０、〜３０、〜２５、〜２０、〜１８、〜１５、〜１２、〜１０、〜８、もしくは〜６；６〜２００、〜１５０、〜１００、〜９０、〜８０、〜７０、〜６０、〜５０、〜４０、〜３０、〜２５、〜２０、〜１８、〜１５、〜１２、〜１０、もしくは〜８；８〜２００、〜１５０、〜１００、〜９０、〜８０、〜７０、〜６０、〜５０、〜４０、〜３０、〜２５、〜２０、〜１８、〜１５、〜１２、もしくは〜１０；１０〜２００、〜１５０、〜１００、〜９０、〜８０、〜７０、〜６０、〜５０、〜４０、〜３０、〜２５、〜２０、〜１８、〜１５、もしくは〜１２；１２〜２００、〜１５０、〜１００、〜９０、〜８０、〜７０、〜６０、〜５０、〜４０、〜３０、〜２５、〜２０、〜１８、もしくは〜１５；１５〜２００、〜１５０、〜１００、〜９０、〜８０、〜７０、〜６０、〜５０、〜４０、〜３０、〜２５、〜２０、もしくは〜１８；１８〜２００、〜１５０、〜１００、〜９０、〜８０、〜７０、〜６０、〜５０、〜４０、〜３０、〜２５、もしくは〜２０；２０〜２００、〜１５０、〜１００、〜９０、〜８０、〜７０、〜６０、〜５０、〜４０、〜３０、もしくは〜２５；２５〜２００、〜１５０、〜１００、〜９０、〜８０、〜７０、〜６０、〜５０、〜４０、もしくは〜３０；３０〜２００、〜１５０、〜１００、〜９０、〜８０、〜７０、〜６０、〜５０、もしくは〜４０；４０〜２００、〜１５０、〜１００、〜９０、〜８０、〜７０、〜６０、もしくは〜５０；５０〜２００、〜１５０、〜１００、〜９０、〜８０、〜７０、もしくは〜６０；６０〜２００、〜１５０、〜１００、〜９０、〜８０、もしくは〜７０；７０〜２００、〜１５０、〜１００、〜９０、もしくは〜８０；８０〜２００、〜１５０、〜１００、もしくは〜９０；９０〜２００、〜１５０、もしくは〜１００；１００〜２００、もしくは〜１５０；または１５０〜２００の連続したアミノ酸を含む。
【００５７】
一部の実施形態では、シルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質は、１を超える、２を超える、４を超える、６を超える、８を超える、１０を超える、１５を超える、２０を超える、もしくは２５を超える；１〜３０、〜２５、〜２０、〜１５、〜１０、〜８、〜６、〜４、もしくは〜２；２〜３０、〜２５、〜２０、〜１５、〜１０、〜８、〜６、もしくは〜４；４〜３０、〜２５、〜２０、〜１５、〜１０、〜８、もしくは〜６；６〜３０、〜２５、〜２０、〜１５、〜１０、もしくは〜８；８〜３０、〜２５、〜２０、〜１５、もしくは〜１０；１０〜３０、〜２５、〜２０、もしくは〜１５；１５〜３０、〜２５、もしくは〜２０；２０〜３０、もしくは〜２５；または２５〜３０の、アラニンリッチの完全反復及び／または準反復単位を含む。一部のそのような実施形態では、アラニンリッチの完全反復及び／または準反復単位のうちの１つ以上は、７０％を超える、７５％を超える、８０％を超える、８５％を超える、もしくは９０％を超える；７０％〜１００％、〜９０％、〜８５％、〜８０％、もしくは〜７５％；７５％〜１００％、〜９０％、〜８５％、もしくは〜８０％；８０％〜１００％、〜９０％、もしくは〜８５％；８５％〜１００％、もしくは〜９０％；または９０％〜１００％のアラニンである、４を超える、６を超える、８を超える、１０を超える、１２を超える、１５を超える、もしくは１８を超える；４〜２０、〜１８、〜１５、〜１２、〜１０、〜８、もしくは〜６；６〜２０、〜１８、〜１５、〜１２、〜１０、もしくは〜８；８〜２０、〜１８、〜１５、〜１２、もしくは〜１０；１０〜１８、〜１５、もしくは〜１２；１２〜２０、〜１８、もしくは〜１５；１５〜２０、もしくは〜１８；または１８〜２０の連続アミノ酸を含む。
【００５８】
一部の実施形態では、シルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質は、２０〜１００アミノ酸長であり、且つ４〜２０アミノ酸長であるポリアラニンリッチ領域と連結されている１つ以上のグリシンリッチ完全反復及び／または準反復単位を含む。一部の実施形態では、シルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質は、５〜２５％のポリアラニン領域（４〜２０ポリアラニン残基）を含む。一部の実施形態では、シルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質は、２５〜５０％のグリシンを含む。一部の実施形態では、シルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質は、１５〜３５％のＧＧＸを含み、Ｘは、任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、シルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質は、１５〜６０％のＧＰＧを含む。一部の実施形態では、シルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質は、１０〜４０％のアラニンを含む。一部の実施形態では、シルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質は、０〜２０％のプロリンを含む。一部の実施形態では、シルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質は、１０〜５０％のβターンを含む。一部の実施形態では、シルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質は、１０〜５０％のαヘリックス組成を含む。一部の実施形態では、これらの組成範囲の全ては、同じシルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質に適用される。一部の実施形態では、これらの組成範囲の２つ以上が、同じシルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質に適用される。
【００５９】
一部の実施形態では、シルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質の構造は、βシート構造、βターン構造、またはαヘリックス構造を形成する。一部の実施形態では、シルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質の２次、３次、及び４次構造は、ナノ結晶βシート領域、非晶質βターン領域、非晶質αヘリックス領域、非結晶マトリックスに埋め込まれているランダムに空間的に分布したナノ結晶領域、または非結晶マトリックスに埋め込まれているランダムに配向したナノ結晶領域を有する。一部の実施形態では、シルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質は、高度に結晶性である。他の実施形態では、シルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質は、高度に非晶質である。一部の実施形態では、シルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質は、結晶領域及び非晶質領域の双方を含む。一部の実施形態では、シルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質は、体積比で１０％〜４０％の結晶質を含む。
【００６０】
一部の実施形態では、シルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質は、天然クモシルクタンパク質の反復単位と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する１つ以上の完全反復または準反復単位を含む。一部の実施形態では、シルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質は、天然クモドラグラインシルクタンパク質の反復単位と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する１つ以上の完全反復または準反復単位を含む。一部の実施形態では、シルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質は、天然ＭＡドラグラインシルクタンパク質の反復単位と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する１つ以上の完全反復または準反復単位を含む。一部の実施形態では、シルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質は、天然ＭａＳｐ２ドラグラインシルクタンパク質の反復単位と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する１つ以上の完全反復または準反復単位を含む。
【００６１】
一部の実施形態では、シルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質は、１つ以上の準反復単位を含み、各準反復単位のアミノ酸配列は、式１により記載され、Ｘ１のアミノ酸配列（「モチーフ」と称される）は、式２により記載され、各準反復単位内でランダムに変動し得る。配列［ＧＰＧ−Ｘ１］ｎ１は、「第１の領域」と呼ばれ、グリシンリッチである。配列（Ａ）ｎ２は、「第２の領域」と呼ばれ、アラニンリッチである。一部の実施形態では、ｎ１の値は、４、５、６、７、または８のいずれか１つである。一部の実施形態では、ｎ２の値は、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のいずれか１つである。一部の実施形態では、ｎ３の値は、２〜２０のいずれか１つである。一部の実施形態では、シルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質は、式１及び２で記載される準反復単位と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する準反復単位のうちの１つ以上を含む。
｛ＧＧＹ−［ＧＰＧ−Ｘ１］ｎ１−ＧＰＳ−（Ａ）ｎ２｝ｎ３（式１）
Ｘ１＝ＳＧＧＱＱまたはＧＡＧＱＱまたはＧＱＧＰＹまたはＡＧＱＱまたはＳＱ（式２）
【００６２】
一部の実施形態では、シルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質は、式１及び式２で記載される準反復単位を含み、ｎ１は、準反復単位の少なくとも半分について、４または５である。一部の実施形態では、シルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質は、式１及び式２で記載される準反復単位を含み、ｎ２は、準反復単位の少なくとも半分について、５〜８である。
【００６３】
本明細書で使用される「短い準反復単位」という用語は、ｎ１が４または５である反復単位を指す（式１に示される通り）。本明細書で使用される「長い準反復単位」という用語は、ｎ１が６、７、または８である反復を指す（式１に示される通り）。一部の実施形態では、ｎ１は、準反復単位の少なくとも半分について、４〜５である。一部の実施形態では、ｎ２は、準反復単位の少なくとも半分について、５〜８である。一部の実施形態では、シルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質は、３つの「長い準反復単位」、続いて、３つの「短い準反復単位」を含む。一部の実施形態では、シルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質は、単一の準反復内で、連続して２回を超えて、または２回を超えて、同じＸ１モチーフを有さない準反復単位を含む。一部の実施形態では、シルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質は、同じ場所に同じＸ１モチーフを含む準反復単位を含む。一部の実施形態では、シルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質は、同じ場所に同じ式２の配列を含む準反復単位を含む。一部の実施形態では、シルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質は、準反復単位を含み、６つのうち３つ以下の準反復単位が同じＸ１を共有することはない。
【００６４】
一部の実施形態では、シルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質は、Ｘｑｒ準反復単位を含み、
Ｘｑｒ＝Ｘｓｑｒ＋Ｘｌｑｒ（式３）、
（式中、Ｘｑｒは、２〜２０の数であり、Ｘｓｑｒは、短い準反復の数及び１〜（Ｘｑｒ−１）の数であり、Ｘｌｑｒは、長い準反復の数及び１〜（Ｘｑｒ−１）の数である）である。一部の実施形態では、Ｘｑｒは、２〜２０の数である。反復単位のアミノ酸配列の非限定例が表３に示される。
【００６５】
（表３）シルクまたはシルク様タンパク質の例示的な反復単位
2020509755.tif 000004
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【００６６】
一部の実施形態では、シルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質は、配列番号１３を含む１つ以上の反復単位を含む。この反復単位は、６つの準反復単位を含有する。準反復単位は、約５０ｋＤａｌ〜約１，０００ｋＤａｌのポリペプチド分子を形成するように、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０回連結させることができる。この反復単位は、ナノ結晶領域に関連するポリアラニン領域、及び、結晶性が低い領域を含有するβターンに関連するグリシンリッチ領域も含有する。
【００６７】
追加の好適なシルクまたはシルクもしくはシルク様タンパク質の非限定例は、例えば、２０１６年１２月１５日に公表された国際特許公報第ＷＯ／２０１６／２０１３６９号、２０１６年９月１４日に出願された米国特許出願第６２／３９４，６８３号、２０１７年９月１４日に出願された米国特許出願第１５／７０５，１８５号、２０１６年８月４日に公表された米国特許公報第ＵＳ２０１６０２２２１７４号、２０１６年３月１６日に公表された国際特許公報第ＷＯ２０１６／１４９４１４号、２０１４年１月５日に公表された国際特許公報第ＷＯ２０１４／０６６３７４号、及び２０１５年３月２６日に公表された国際特許公報第ＷＯ２０１５／０４２１６４号で提供され、これらのそれぞれは、全体が本明細書で参照により組み込まれる。
【００６８】
通常は、組み換えタンパク質の分泌シグナルとの作動可能な連結は、組み換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の開始コドンの除去が必要である。
【００６９】
他の構成成分
一部の実施形態では、組み換え宿主細胞に含まれるポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つはさらに、タンパク質のＣ末端に作動可能に連結されているタグペプチドまたはポリペプチドをコードする。そのようなタグペプチドまたはポリペプチドは、組み換えタンパク質の精製に役立ち得る。タグペプチドまたはポリペプチドの非限定例としては、アフィニティータグ（すなわち、ある特定の薬剤またはマトリックスに結合するペプチドまたはポリペプチド）、可溶化タグ（すなわち、タンパク質の適切なフォールディングを助け、沈殿を防ぐペプチドまたはポリペプチド）、クロマトグラフィータグ（すなわち、特定の分離技術に対して異なる解像度を得るために、タンパク質のクロマトグラフィー特性を変更するペプチドまたはポリペプチド）、エピトープタグ（すなわち、抗体により結合されるペプチドまたはポリペプチド）、蛍光タグ、発色タグ、酵素基質タグ（すなわち、特定の酵素反応の基質であるペプチドまたはポリペプチド）、化学基質タグ（すなわち、具体的な化学修飾の基質であるペプチドまたはポリペプチド）、またはそれらの組み合わせが挙げられる。好適なアフィニティータグの非限定例としては、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリ（Ｈｉｓ）タグ、ＳＢＰタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、及びカルモジュリンタグが挙げられる。好適な溶解度タグの非限定例としては、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、ＭＢＰ、及びＧＳＴが挙げられる。クロマトグラフィータグの非限定例としては、ポリアニオン性アミノ酸（例えば、ＦＬＡＧタグ）及びポリグルタミン酸タグが挙げられる。エピトープタグの非限定例としては、Ｖ５タグ、ＶＳＶタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、Ｅタグ、ＮＥタグ、Ｈａタグ、Ｍｙｃタグ、及びＦＬＡＧタグが挙げられる。蛍光タグの非限定例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、橙赤色蛍光タンパク質（ＯＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、及びそれらの誘導体が挙げられる。酵素基質タグの非限定例としては、ビオチン化に適する配列内にリジンを含むペプチドまたはポリペプチドが挙げられる（例えば、ＡｖｉＴａｇ、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質［ＢＣＣＰ］）。化学基質タグの非限定例としては、ＦＩＡｓＨ−ＥＤＴ２との反応に適する基質が挙げられる。Ｃ末端タグの組み換えタンパク質とのペプチドまたはポリペプチドの融合は、（例えば、ＴＥＶプロテアーゼ、トロンビン、第Ｘａ因子、またはエンテロペプチダーゼにより）切断可能であるか、または切断不可能であり得る。
【００７０】
一部の実施形態では、組み換え宿主細胞に含まれるポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つはさらに、組み換えタンパク質及び分泌シグナルの間に作動可能に連結されているリンカーペプチドをコードする。リンカーペプチドは、種々のサイズを有し得る。一部のそのような実施形態では、リンカーペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、他のポリヌクレオチド配列の置換または付加を可能にする制限酵素部位を含む。
【００７１】
一部の実施形態では、組み換え宿主細胞に含まれる組み換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、プロモーターに、それらがポリヌクレオチド配列の転写を駆動するように作動可能に連結されている。プロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターであってよい。誘導は、例えば、グルコース抑制、ガラクトース誘導、スクロース誘導、リン酸抑制、チアミン抑制、またはメタノール誘導を介して生じ得る。好適なプロモーターは、本明細書で提供される組み換え宿主細胞におけるタンパク質の発現を媒介するプロモーターである。好適なプロモーターの非限定例としては、ピキア・パストリスのアルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーター（ｐＡＯＸ１）、ピキア・パストリスのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）プロモーター（ｐＧＡＰ）、ＹＰＴ１プロモーター、サッカロミセス・セレビシエの３−ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ１）プロモーター（ｐＰＫＧ１）、ＳＳＡ４プロモーター、ＨＳＰ８２プロモーター、ＧＰＭ１プロモーター、ＫＡＲ２プロモーター、ピキア・パストリスのトリオースリン酸イソメラーゼ１（ＴＰＩ１）プロモーター（ｐＴＰＩ１）、ピキア・パストリスのエノラーゼ１（ＥＮＯ１）プロモーター（ｐＥＮＯ１）、ＰＥＴ９プロモーター、ＰＥＸ８（ＰＥＲ３）プロモーター、ＡＯＸ２プロモーター、ＡＯＤプロモーター、ＴＨＩ１１プロモーター、ＤＡＳプロモーター、ＦＬＤ１プロモーター、ＰＨＯ８９プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター、ＧＴＨ１プロモーター、ＩＣＬ１プロモーター、ＴＥＦ１プロモーター、ＬＡＣ４−ＰＢＩプロモーター、Ｔ７プロモーター、ＴＡＣプロモーター、ＧＣＷ１４プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、λＰＬプロモーター、λＰＲプロモーター、β−ラクタマーゼプロモーター、ｓｐａプロモーター、ＣＹＣ１プロモーター、ＴＤＨ３プロモーター、ＧＰＤプロモーター、サッカロミセス・セレビシエの翻訳開始因子１（ＴＥＦ１）プロモーター、ＥＮＯ２プロモーター、ＰＧＬ１プロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＳＵＣ２プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＡＤＨ２プロモーター、ＨＸＴ７プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、及びＣＬＢ１プロモーターが挙げられる。使用することができる追加のプロモーターは、当該技術分野で既知である。
【００７２】
一部の実施形態では、組み換え宿主細胞に含まれる組み換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、ターミネーターに、それらが組み換えポリヌクレオチド配列の転写の終結をもたらすように作動可能に連結されている。好適なターミネーターは、本明細書で提供される組み換え宿主細胞の転写を終結させるターミネーターである。好適なターミネーターの非限定例としては、ピキア・パストリスのＡＯＸ１ターミネーター（ｔＡＯＸ１）、ＰＧＫ１ターミネーター、及びＴＰＳ１ターミネーターが挙げられる。追加のターミネーターは、当該技術分野で既知である。
【００７３】
組み換え宿主細胞に含まれる組み換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、同じプロモーター及び／もしくはターミネーター、または少なくとも２つの異なるプロモーター及び／もしくはターミネーターに作動可能に連結させることができる。
【００７４】
一部の実施形態では、組み換え宿主細胞に含まれる組み換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列はさらに、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子、栄養要求性マーカー）を含む。選択マーカーは、当該技術分野で既知である。一部の実施形態では、選択マーカーは、薬剤耐性マーカーである。薬剤耐性マーカーは、細胞が、それがなければ細胞を死滅させる外因的に添加された薬剤を解毒することを可能にする。薬剤耐性マーカーの例示的例としては、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、ブレオマイシン、ストレプトマイシン、ハイグロマイシン、ネオマイシン、Ｚｅｏｃｉｎ（商標）などの抗生物質への耐性に対するものが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、選択マーカーは、栄養要求性マーカーである。栄養要求性マーカーは、細胞が、必須構成成分（通常はアミノ酸）を欠く培地中で成長しながら必須構成成分を合成することを可能にする。選択可能な栄養要求性マーカーは、例えば、ヒスチジノールの存在下でヒスチジン不含培地中での成長を可能にするｈｉｓＤを含む。他の選択マーカーとしては、ブレオマイシン耐性遺伝子、メタロチオネイン遺伝子、ハイグロマイシンＢ−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ＡＵＲＩ遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、及びキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が挙げられる。
【００７５】
宿主細胞
組み換え宿主細胞は、哺乳動物、植物、藻類、真菌、または微生物のものとし得る。好適な真菌の非限定例としては、メチロトローフ酵母、糸状酵母、アークスラ・アデニニボランス（Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニガー  変種アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ｖａｒ．ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、カンジダ・エチェルシー（Ｃａｎｄｉｄａ  ｅｔｃｈｅｌｌｓｉｉ）、カンジダ・ギリエルモンディ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、カンジダ・フミリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｈｕｍｉｌｉｓ）、カンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、カンジダ・プソイドトロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・ユチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、カンジダ・バーサチルス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）、デバリオミセス・ハンゼニイ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）、エンドティア・パラシティカ（Ｅｎｄｏｔｈｉａ  ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）、エレモテシウム・アシュビイ（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ  ａｓｈｂｙｉｉ）、フサリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ、クライベロミセス・ラクチス、クライベロミセス・マルシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、クライベロミセス・サーモトレランス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、モルティエレラ・ヴィナセア  変種ラフィノースウチライザ（Ｍｏｒｔｅｉｒｅｌｌａ  ｖｉｎａｃｅａｅ  ｖａｒ．ｒａｆｆｉｎｏｓｅｕｔｉｌｉｚｅｒ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ムコール・ミエヘイ  変種コーニーエトエマルソン（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ  ｖａｒ．Ｃｏｏｎｅｙ  ｅｔ  Ｅｍｅｒｓｏｎ）、ムコール・プシルス・リント（Ｍｕｃｏｒ  ｐｕｓｉｌｌｕｓ  Ｌｉｎｄｔ）、ペニシリウム・ロックフォルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア（コマガタエラ）・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア（シェフェルソミセス）・スティピティス（Ｐｉｃｈｉａ（Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓｏｍｙｃｅｓ）ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、リゾプス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｖｅｕｓ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｓｐ．）、サッカロミセス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）、サッカロミセス・ベティカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｅｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・チェバリエリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ）、サッカロミセス・ディアスタティカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・エリプソイデウス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅｕｓ）、サッカロミセス・イグジグース（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｘｉｇｕｕｓ���、サッカロミセス・フロレンチヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ）、サッカロミセス・フラギリス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、サッカロミセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）、サッカロミセス・ポンべ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、サッカロミセス・サケ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓａｋｅ）、サッカロミセス・ウバルム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｒｕｍ）、スポリディオボラス・ジョンソニイ（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、スポリディオボラス・サルモニカラー（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ）、スポロボロミセス・ロゼウス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｕｓ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉ）、キサントフィロミセス・デンドロロウス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、チゴサッカロミセス・ルーキシィ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）、ならびにその誘導体及び交雑種が挙げられる。
【００７６】
好適な微生物の非限定例としては、アセトバクター・サブオキシダンス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ）、アセトバクター・キシリナム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｍ）、アクチノプラネス・ミズリエンシス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅ  ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ）、アルスロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、アルスロスピラ・マキシマ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｍａｘｉｍａ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）ランスフィールドＮ群、サイトロボラム乳酸菌（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｃｉｔｒｏｖｏｒｕｍ）、ロイコノストック・デキストラニカム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｄｅｘｔｒａｎｉｃｕｍ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＮＲＲＬ  Ｂ−５１２（Ｆ）株、ミクロコッカス・リゾディクティクス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）、スピルリナ、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・ラクチス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ストレプトコッカス・ラクチス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）亜種ジアセチラクチス（ｄｉａｃｅｔｙｌａｃｔｉｓ）、レンサ球菌、ストレプトミセス・チャタノオゲンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｈａｔｔａｎｏｏｇｅｎｓｉｓ）、ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトミセス・ナタレンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎａｔａｌｅｎｓｉｓ）、ストレプトミセス・オリバセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｏｌｉｖａｃｅｕｓ）、ストレプトミセス・オリボクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｏｌｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトミセス・ルビギノサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓ）、ザントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、ならびにそれらの誘導体及び交雑種が挙げられる。
【００７７】
組み換え宿主細胞として使用することができる追加の株は、当該技術分野で既知である。「組み換え宿主細胞」という用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も指すものであると理解すべきである。あう特定の変更が、変異または環境の影響のいずれかにより、後続の世代で生じ得るので、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一ではないことがあるが、依然として、本明細書で使用されるような「組み換え宿主細胞」という用語の範囲内に含まれている。
【００７８】
発酵
本明細書で提供される発酵は、本明細書で提供される組み換え宿主細胞、及び組み換え宿主細胞を成長させるのに適する培養培地を含む。発酵は、細胞の生存及び／または成長のために組み換え宿主細胞に必要な栄養素を提供する培養培地中で組み換え宿主細胞を培養することにより得られる。そのような培養培地は通常、過剰な炭素源を含有する。好適な炭素源の非限定例としては、単糖類、二糖類、多糖類、アルコール、及びそれらの組み合わせが挙げられる。好適な単糖類の非限定例としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、リボース、キシロース、アラビノース、リボース、及びそれらの組み合わせが挙げられる。好適な二糖類の非限定例としては、スクロース、ラクトース、マルトース、テハロース、セロビオース、及びそれらの組み合わせが挙げられる。好適な多糖類の非限定例としては、ラフィノース、デンプン、グリコーゲン、グリカン、セルロース、キチン、及びそれらの組み合わせが挙げられる。好適なアルコールの非限定例としては、メタノール及びグリコールが挙げられる。
【００７９】
本明細書で提供されるような少なくとも２つの別個の分泌シグナルの使用により、組み換えタンパク質の高分泌収量が促進される。従って、種々の実施形態では、本明細書で提供される発酵は、分泌組み換えタンパク質として組み換え宿主細胞により産生される組み換えタンパク質の総収量の少なくとも１重量％、５重量％、１０重量％、２０重量％、もしくは３０重量％；１重量％〜１００重量％、９０重量％、８０重量％、７０重量％、６０重量％、５０重量％、４０重量％、３０重量％、２０重量％、もしくは１０重量％；１０重量％〜１００重量％、９０重量％、８０重量％、７０重量％、６０重量％、５０重量％、４０重量％、３０重量％、もしくは２０重量％；２０重量％〜１００重量％、９０重量％、８０重量％、７０重量％、６０重量％、５０重量％、４０重量％、もしくは３０重量％；３０重量％〜１００重量％、９０重量％、８０重量％、７０重量％、６０重量％、５０重量％、もしくは４０重量％；４０重量％〜１００重量％、９０重量％、８０重量％、７０重量％、６０重量％、もしくは５０重量％；５０重量％〜１００重量％、９０重量％、８０重量％、７０重量％、もしくは６０重量％；６０重量％〜１００重量％、９０重量％、８０重量％、もしくは７０重量％；７０重量％〜１００重量％、９０重量％、もしくは８０重量％；８０重量％〜１００重量％、もしくは９０重量％；または９０重量％〜１００重量％を含む。一部の実施形態では、発酵の培養培地は、組み換え宿主細胞により産生される組み換えタンパク質を、少なくとも０．１ｇ／Ｌ、少なくとも０．５ｇ／Ｌ、少なくとも１ｇ／Ｌ、少なくとも２ｇ／Ｌ、少なくとも５ｇ／Ｌ、少なくとも７ｇ／Ｌ、少なくとも１０ｇ／Ｌ、少なくとも１５ｇ／Ｌ、もしくは少なくとも２０ｇ／Ｌ；０．１ｇ／Ｌ〜３０ｇ／Ｌ、〜２５ｇ／Ｌ、〜２０ｇ／Ｌ、〜１５ｇ／Ｌ、〜１０ｇ／Ｌ、〜７ｇ／Ｌ、〜５ｇ／Ｌ、〜２ｇ／Ｌ、〜１ｇ／Ｌ、もしくは〜０．５ｇ／Ｌ；０．５ｇ／Ｌ〜３０ｇ／Ｌ、〜２５ｇ／Ｌ、〜２０ｇ／Ｌ、〜１５ｇ／Ｌ、〜１０ｇ／Ｌ、〜７ｇ／Ｌ、〜５ｇ／Ｌ、〜２ｇ／Ｌ、もしくは〜１ｇ／Ｌ；１ｇ／Ｌ〜３０ｇ／Ｌ、〜２５ｇ／Ｌ、〜２０ｇ／Ｌ、〜１５ｇ／Ｌ、〜１０ｇ／Ｌ、〜７ｇ／Ｌ、〜５ｇ／Ｌ、もしくは〜２ｇ／Ｌ；２ｇ／Ｌ〜３０ｇ／Ｌ、〜２５ｇ／Ｌ、〜２０ｇ／Ｌ、〜１５ｇ／Ｌ、〜１０ｇ／Ｌ、〜７ｇ／Ｌ、もしくは〜５ｇ／Ｌ；５ｇ／Ｌ〜３０ｇ／Ｌ、〜２５ｇ／Ｌ、〜２０ｇ／Ｌ、〜１５ｇ／Ｌ、〜１０ｇ／Ｌ、もしくは〜７ｇ／Ｌ；７ｇ／Ｌ〜３０ｇ／Ｌ、〜２５ｇ／Ｌ、〜２０ｇ／Ｌ、〜１５ｇ／Ｌ、もしくは〜１０ｇ／Ｌ；１０ｇ／Ｌ〜３０ｇ／Ｌ、〜２５ｇ／Ｌ、〜２０ｇ／Ｌ、もしくは〜１５ｇ／Ｌ；１５ｇ／Ｌ〜３０ｇ／Ｌ、〜２５ｇ／Ｌ、もしくは〜２０ｇ／Ｌ；２０ｇ／Ｌ〜３０ｇ／Ｌ、もしくは〜２５ｇ／Ｌ；または２５ｇ／Ｌ〜３０ｇ／Ｌ含む。
【００８０】
高分泌収量の組み換えタンパク質を産生する方法
高分泌収量の組み換えタンパク質を産生するための方法が、本明細書で提供される。方法は一般に、別途指示のない限り、本明細書を通して引用及び考察される当該技術分野で周知の且つ種々の一般的でより具体的な参考文献に記載されるような従来の方法に従って実施される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，１９９２，ａｎｄ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ｔｏ  ２００２）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９０；Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，２００３；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，Ｎ．Ｊ．；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ  Ｉ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９７６；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ  ＩＩ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９７６；Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９を参照のこと。
【００８１】
本明細書で提供される方法は、本明細書で提供される発酵を得るのに適する条件下、培養培地中で、本明細書で提供される組み換え宿主細胞を培養するステップを含む（図１のステップ１００３）。これらの方法での使用に好適な培養培地は、当該技術分野で既知であり、好適な培養条件も同様である。酵母宿主細胞の培養の詳細は、例えば、Ｉｄｉｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８６：４０３−４１７；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ．Ｅｎｇ．５：２７５−２８７；Ｚｈｕ（２０１２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．３０：１１５８−１１７０；及びＬｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）ＭＡｂｓ  ２：４６６−４７７に記載されている。
【００８２】
一部の実施形態では、方法はさらに、分泌シグナルに作動可能に連結されている組み換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む組み換えベクターを構築するステップを含む（図１のステップ１００１）。組み換えベクターを構築するための方法は、当該技術分野で既知である。一部の実施形態では、組み換えベクターは、合成により生成される。他の実施形態では、組み換えベクターは、生物、細胞、組織、またはプラスミド構築物から標準手順により単離またはＰＣＲ増幅される。一部の実施形態では、組み換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、特定の宿主細胞での発現のためにコドン最適化されている。
【００８３】
一部の実施形態では、方法は、組み換えタンパク質の発現（例えば、ポリヌクレオチド配列の数及び／またはポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されているプロモーターの強度を増加または低減させることによる）と組み換えタンパク質の分泌の効率（例えば、別個の分泌シグナル、または別個の分泌シグナルの組み合わせを選択することによる）のバランスをとるステップを含む。
【００８４】
一部の実施形態では、方法はさらに、本明細書で提供される組み換え宿主細胞を得るために組み換えベクターで細胞を形質転換するステップを含む（図１のステップ１００２）。そのような形質転換の場合、組み換えベクターは、環状化または線形化することができる。細胞を形質転換するための方法は、当該技術分野で周知である。そのような方法の非限定例としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、リポソームトランスフェクション（例えば、カチオン性リポソームトランスフェクション）、カチオン性ポリマートランスフェクション、電気穿孔法、細胞スクイージング（ｃｅｌｌ  ｓｑｕｅｅｚｉｎｇ）、ソノポレーション、光学トランスフェクション、原形質融合、インペールフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、流体力学的送達、遺伝子銃、磁気感染、スフェロブラスト生成（ｓｐｈｅｒｏｂｌａｓｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＰ）処理、及びウイルス形質導入が挙げられる。当業者は、ベクターを導入するためのある特定の技術がある特定タイプの細胞によりよく機能するという当該技術分野の知識に基づいて、本明細書で提供される発現構築物または組み換えベクターで細胞を形質転換するための１つ以上の好適な方法を選択することができる。本明細書で提供される発現構築物または組み換えベクターを含む組み換え宿主細胞の形質転換は、例えば、細胞の成長のための選択、もしくは成長しないことに対する選択を可能にする組み換えベクターによりコードされる薬剤耐性または栄養要求性マーカーを発現することにより、あるいは他の手段（例えば、発現構築物または組み換えベクターに含まれる発光ペプチドの検出、個々の組み換え宿主細胞コロニーの分子解析［例えば、制限酵素マッピング、ＰＣＲ増幅、または単離染色体外ベクターもしくは染色体組み込み部位の配列解析により］）により、容易に同定することができる。一部の実施形態では、方法は、２つ以上の組み換えベクターを用いる宿主細胞の連続形質転換を含む。
【００８５】
一部の実施形態では、方法はさらに、本明細書で提供される発酵からの分泌組み換えタンパク質を抽出するステップを含む（図１のステップ１００４）。抽出は、分泌タンパク質を精製するための当該技術分野で既知の様々な方法により生じ得る。そのような方法における一般のステップは、細胞のペレット化を引き起こす速度の遠心分離ならびに組み換え宿主細胞及び細胞破片を含む細胞ペレットの除去、続いて、沈殿剤を使用する組み換えタンパク質の沈殿（例えば、５〜６０％飽和の硫酸アンモニウム、続いて、遠心分離）あるいはアフィニティー分離（例えば、組み換えタンパク質もしくはそのＣ末端タグ［例えば、ＦＬＡＧ、血球凝集素］に特異的に結合する抗体との免疫学的相互作用による、または６〜８ヒスチジン残基でタグ化されたポリペプチドの単離のためのニッケルカラムへの結合による）を含む。懸濁した組み換えタンパク質は、溶解した塩を除去するために透析することができる。加えて、透析した組み換えタンパク質は、他のタンパク質を変性するために加熱することができ、変性したタンパク質は、遠心分離により除去することができる。
【実施例】
【００８６】
実施例１：高収量の分泌組み換えタンパク質を産生するピキア・パストリス組み換え宿主細胞の生成
ＧＳ１１５（ＮＲＲＬ  Ｙ１５８５１）のＨＩＳ＋誘導体を第１の組み換えベクター及び第２の組み換えベクターで形質転換することにより、シルク様タンパク質を分泌するピキア・パストリス（コマガタエラ・ファフィ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉ））組み換え宿主細胞を生成した。
【００８７】
組み換えベクター（図２を参照のこと）は、ｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）／＊ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）（配列番号８）または＊ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）（配列番号２）及びシグナルペプチドからなる種々の組み換え分泌シグナルのいずれかに作動可能に連結されているシルク様タンパク質（配列番号１１０）をコードするポリヌクレオチド配列を含んでいた。シルク様タンパク質はさらに、Ｃ末端ＦＬＡＧタグに作動可能に連結されていた。
【００８８】
組み換えベクター内のシルク様タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、プロモーター（ｐＧＣＷ１４）及びターミネーター（ｔＡＯＸ１  ｐＡシグナル）に隣接していた。組み換えベクターはさらに、細菌及び酵母の形質転換体の選択のための優性耐性マーカー、ならびに細菌の複製起点を含んでいた。組み換えベクターはさらに、ピキア・パストリスのゲノム内のＨＩＳ４、ＨＳＰ８２、ＡＯＸ２、ＴＥＦ１、ＭＡＥ１、またはＩＣＬ１遺伝子座の３’に隣接したポリヌクレオチド配列の組み込みを目的とする標的指向領域を含んでいた。
【００８９】
電気穿孔法を介して、組み換えベクターをピキア・パストリス宿主細胞に連続的に形質転換して、組み換え宿主株を生成した。形質転換体を、ヒスチジンを欠く最小寒天プレートまたは抗生物質が補充されたＹＰＤ寒天プレートのいずれかにプレーティングし、３０℃で４８時間インキュベートした。
【００９０】
得られたクローンを、９６ウェルブロック中の緩衝化グリセロール複合培地（ＢＭＧＹ）４００μＬに接種し、１，０００ｒｐｍで撹拌しながら３０℃で４８時間インキュベートした。４８時間のインキュベーションの後、各培養物４μＬを使用して、９６ウェルブロック中の最小培地４００μＬに接種し、次に、これを３０℃で４８時間インキュベートした。
【００９１】
ＥＬＩＳＡによる測定のために組み換えタンパク質を抽出するために、グアニジンチオシアナートを、細胞培養物に最終濃度２．５Ｍまで添加した。５分間のインキュベーションの後、溶液を遠心分離し、上清をサンプリングした（図３〜５で細胞外とラベル付けされたデータを示した）。逆さにして上清を除去し、残った細胞ペレットを、元の体積までグアニジンチオシアナートに再懸濁した。ビーズミル中で機械的破壊することにより、細胞を溶解し、得られた溶解物を遠心分離により清澄化し、サンプリングした（図３〜５で細胞内とラベル付けされたデータを示した）。
【００９２】
図３に示されるように、ｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）／＊ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）に作動可能に連結されているシルク様タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の数を４から６に増加させると、シルク様タンパク質のより高い全体的な産生がもたらされたが、その分泌収量はそれほど有意には増加しなかった。図３にさらに示されるように、２つの別個の分泌シグナル（すなわち、４つのポリヌクレオチド配列内のｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）／＊ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）及び３つのポリヌクレオチド配列内のｐｒｅ−ＤＳＥ４（ｐｐ）／＊ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）またはｐｒｅ−ＰＥＰ４（ｓｃ）／＊ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ））に作動可能に連結されているシルク様タンパク質をコードする７コピーのポリヌクレオチド配列を含む組み換え宿主細胞は、単一タイプの分泌シグナル（すなわち、ｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）／＊ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ））に作動可能に連結されているシルク様タンパク質をコードする６コピーのポリヌクレオチド配列を含む組み換え宿主細胞よりも高い分泌収量を産生した。ｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）／＊ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）分泌シグナルに作動可能に連結されているシルク様タンパク質をコードする７コピーのポリヌクレオチド配列を含む組み換え宿主細胞を直接比較のために得ることはできなかったが、推測するに、これは、そのような宿主細胞が不安定及び／または生存不能であることを示し得ることに留意すべきである。
【００９３】
図４に示されるように、２つの別個の分泌シグナル（すなわち、４つのポリヌクレオチド配列内のｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）／＊ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）及び２つのポリヌクレオチド配列内のｐｒｅ−ＥＰＸ１（ｐｐ）／＊ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ））に作動可能に連結されているシルク様タンパク質をコードする６コピーのポリヌクレオチド配列を含む組み換え宿主細胞は、単一タイプの分泌シグナル（すなわち、ｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）／＊ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ））に作動可能に連結されているシルク様タンパク質をコードする同数のポリヌクレオチド配列を含む組み換え宿主細胞よりも高い分泌収量及びパーセント分泌のシルク様タンパク質を産生した。
【００９４】
図５に示されるように、図４の４＋２ｘＥＰＸ１（ｐｐ）株に第３の組み換え分泌シグナル（すなわち、ｐｒｅ−ＣＬＳＰ（ｇｇ）／＊ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ））を追加すると、シルク様タンパク質の分泌収量がさらに改善した。ｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）／＊ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）分泌シグナルに作動可能に連結されているシルク様タンパク質をコードする７コピーのポリヌクレオチド配列を含む細胞、または、ｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）／＊ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）分泌シグナルに作動可能に連結されているシルク様タンパク質をコードする４コピーのポリヌクレオチド配列及びｐｒｅ−ＥＰＸ１（ｐｐ）／＊ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）分泌シグナルに作動可能に連結されているシルク様タンパク質をコードする３コピーのポリヌクレオチド配列を含む細胞は、直接比較のために得ることができなかったが、推測するに、これは、そのような宿主細胞が不安定及び／または生存不能であることを示し得ることに留意すべきである。
【００９５】
実施例２：高分泌収量のα−アミラーゼまたは緑色蛍光タンパク質を産生するピキア・パストリス組み換え宿主細胞の生成
種々の組み換えベクターでＧＳ１１５（ＮＲＲＬ  Ｙ１５８５１）のＨＩＳ＋誘導体を形質転換することにより、α−アミラーゼまたは緑色蛍光タンパク質のいずれかを分泌するピキア・パストリス（コマガタエラ・ファフィ）組み換え宿主細胞を生成した。
【００９６】
組み換えベクター（図６を参照のこと）は、種々のＮ末端組み換え分泌シグナルに作動可能に連結されているα−アミラーゼ（配列番号１１１）または緑色蛍光タンパク質（配列番号１１２）のいずれかをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現構築物を含んでいた。組み換え分泌シグナルは、＊ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）（配列番号２）に作動可能に連結されているＮ末端シグナルペプチドからなっていた。α−アミラーゼまたは緑色蛍光タンパク質はさらに、Ｃ末端ＦＬＡＧタグに作動可能に連結されていた。ポリヌクレオチド配列のそれぞれは、プロモーター（ｐＧＣＷ１４）及びターミネーター（ｔＡＯＸ１  ｐＡシグナル）に隣接していた。組み換えベクターはさらに、ピキア・パストリスのゲノムにおけるＴＨＩ４遺伝子座の３’に隣接した領域への発現構築物の組み込みを目的とする標的指向領域、細菌及び酵母の形質転換体の選択のための優性耐性マーカー、ならびに細菌の複製起点を含んでいた。
【００９７】
（表４）発現した組み換えタンパク質
2020509755.tif 000016
【００９８】
組み換えベクターを、電気穿孔法を介してピキア・パストリス宿主細胞に形質転換して、組み換え宿主株を生成した。形質転換体を、抗生物質が補充されたＹＰＤ寒天プレートにプレーティングし、３０℃で４８〜９６時間インキュベートした。
【００９９】
最後の形質転換それぞれからのからのクローンを、９６ウェルブロック中の緩衝化グリセロール複合培地（ＢＭＧＹ）４００μＬに接種し、１，０００ｒｐｍで撹拌しながら３０℃で４８時間インキュベートした。４８時間のインキュベーションの後、各培養物４μＬを使用して、９６ウェルブロック中の最小培地４００μＬに接種し、次に、これを３０℃で４８時間インキュベートした。
【０１００】
ＥＬＩＳＡによる測定のために組み換えタンパク質を抽出するために、グアニジンチオシアナートを、細胞培養物に最終濃度２．５Ｍまで添加した。５分間のインキュベーションの後、溶液を遠心分離し、上清をサンプリングした。
【０１０１】
図７に示されるように、ｐｒｅ−ＥＰＸ１（ｐｐ）／＊ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）及びｐｒｅ−ＰＥＰ４（ｓｃ）／＊ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）組み換え分泌シグナルは、ｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）／＊ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）組み換え分泌シグナルよりも高い分泌収量のアミラーゼを産生した一方、ｐｒｅ−ＤＳＥ４（ｐｐ）／＊ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）分泌シグナルは、ほぼ同量の分泌アミラーゼを産生した。
【０１０２】
図８に示されるように、ｐｒｅ−ＥＰＸ１（ｐｐ）／＊ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）組み換え分泌シグナルは、ｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）／＊ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）組み換え分泌シグナルよりも高い分泌収量の緑色蛍光タンパク質を産生した一方、ｐｒｅ−ＰＥＰ４（ｓｃ）／＊ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）及びｐｒｅ−ＤＳＥ４（ｐｐ）／＊ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）分泌シグナルは、より分泌の少ない蛍光タンパク質を産生した。
【０１０３】
本開示の実施形態の上述の説明は、例示の目的で提示されており、網羅的であるものでも、本発明の範囲を限定するものでもない。
【０１０４】
実施例では、使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための取り組みがなされているが、一部の実験誤差及び偏差は、当然のことながら、許容されるべきである。実施例に用いられた試薬は、一般に市販されているか、または当該技術分野で公知の市販の機器、方法、もしくは試薬を使用して調製することができる。実施例は、本発明の多くの異なる実施形態の網羅的な説明を提供するものではない。添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、実施例に提示された実施形態に、多くの変更及び修正を行うことができることを、当業者らは容易に理解するであろう。
【０１０５】
（表５）ｐｒｏ−αＭＦ配列
2020509755.tif 000017
【図１】
2020509755.tif 000018
【図２Ａ】
2020509755.tif 000019
【図２Ｂ】
2020509755.tif 000020
【図３】
2020509755.tif 000021
【図４】
2020509755.tif 000022
【図５】
2020509755.tif 000023
【図６】
2020509755.tif 000024
【図７】
2020509755.tif 000025
【図８】
2020509755.tif 000026
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月19日(2019.11.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020509755000001.app
【国際調査報告】
2020509755.tif 000027
2020509755.tif 000028
2020509755.tif 000029
2020509755.tif 000030