(57)【要約】  本発明は、炭素フラックスを、非不可欠または望ましくない生成物から、関心対象の生成物に戦略的に転用するための１つ以上の妨害された遺伝子を含む、遺伝子操作されたウッド−ユングダール微生物を提供する。本発明の発現戦略は、一酸化炭素、二酸化炭素、および／または水素などのガス状基質からの、有用な燃料および化学物質の生成を可能にする。【選択図】図１
2020535813.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非自然発生ウッド−ユングダール細菌であって、異種チオラーゼと、ＮＡＤ依存性電子分岐［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼ、グルタミン酸シンターゼ、シトラマル酸シンターゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、リン酸トランスアセチラーゼ、およびアルデヒドデヒドロゲナーゼのうちの１つ以上をコードする１つ以上の遺伝子における妨害的突然変異と、を含み、前記非自然発生細菌が、親細菌と比較して、アセトアセチル−ＣｏＡを通じた改善された炭素フラックスを有する、非自然発生ウッド−ユングダール細菌。
【請求項２】
前記１つ以上の遺伝子の発現が、前記親細菌と比較して減少または排除されている、請求項１に記載の非自然発生細菌。
【請求項３】
前記非自然発生細菌が、アセトン、イソプロパノール、３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシイソバレレート、イソブチレン、イソペンテニルピロホスフェート、ジメチルアリルピロホスフェート、イソプレン、ファルネセン、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、クロトニル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシブチリルアルデヒド、１，３−ブタンジオール、２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ、２−ヒドロキシイソブチレート、ブチリル−ＣｏＡ、ブチレート、ブタノール、カプロエート、ヘキサノール、オクタノエート、オクタノール、１，３−ヘキサンジオール、２−ブテン−１−オール、イソバレリル−ＣｏＡ、イソバレレート、またはイソアミルアルコールからなる群から選択される生成物を生成する、請求項１に記載の非自然発生細菌。
【請求項４】
前記親細菌が、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ  ｂａｃｃｈｉｉ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｓｋａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｍａｇｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ  ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｉｕｖｉからなる群から選択される、請求項１に記載の非自然発生細菌。
【請求項５】
前記親細菌が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉからなる群から選択される、請求項１に記載の非自然発生細菌。
【請求項６】
前記親細菌が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍであり、
（ａ）前記ＮＡＤ依存性電子分岐［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼが、ＣＡＥＴＨＧ＿１５７６、ＣＡＥＴＨＧ＿１５７８、ＣＡＥＴＨＧ＿３５６９、ＣＡＥＴＨＧ＿３５７０、およびＣＡＥＴＨＧ＿３５７１からなる群から選択されるか、
（ｂ）前記グルタミン酸シンターゼが、ＣＡＥＴＨＧ＿０４７７、ＣＡＥＴＨＧ＿１５８０、ＣＡＥＴＨＧ＿３８５０、およびＣＡＥＴＨＧ＿３８５１からなる群から選択されるか、
（ｃ）前記シトラマル酸シンターゼが、ＣＡＥＴＨＧ＿２７５１であるか、
（ｄ）前記アセト乳酸デカルボキシラーゼが、ＣＡＥＴＨＧ＿２９３２であるか、
（ｅ）前記乳酸デヒドロゲナーゼが、ＣＡＥＴＨＧ＿１１４７であるか、
（ｆ）前記酢酸キナーゼが、ＣＡＥＴＨＧ＿３３５９であるか、
（ｇ）前記リン酸トランスアセチラーゼが、ＣＡＥＴＨＧ＿３３５８であるか、または
（ｈ）前記アルデヒドデヒドロゲナーゼが、ＣＡＥＴＨＧ＿１８１９、ＣＡＥＴＨＧ＿３２８７、およびＣＡＥＴＨＧ＿１８３０からなる群から選択される、請求項１に記載の非自然発生細菌。
【請求項７】
ＣＯ、ＣＯ２、およびＨ２のうちの１つ以上を含むガス状基質の存在下で請求項１に記載の非自然発生細菌を培養することによって、生成物を生成する方法。
【請求項８】
前記生成物が、アセトン、イソプロパノール、３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシイソバレレート、イソブチレン、イソペンテニルピロホスフェート、ジメチルアリルピロホスフェート、イソプレン、ファルネセン、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、クロトニル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシブチリルアルデヒド、１，３−ブタンジオール、２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ、２−ヒドロキシイソブチレート、ブチリル−ＣｏＡ、ブチレート、ブタノール、カプロエート、ヘキサノール、オクタノエート、オクタノール、１，３−ヘキサンジオール、２−ブテン−１−オール、イソバレリル−ＣｏＡ、イソバレレート、またはイソアミルアルコールからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
１つ以上の遺伝子において妨害的突然変異を含む非自然発生ウッド−ユングダール細菌であって、前記非自然発生細菌が、親細菌と比較してコリスメートを通じて改善された炭素フラックスを有する、非自然発生ウッド−ユングダール細菌。
【請求項１０】
前記１つ以上の遺伝子が、プリン−ヌクレオシドホスホリラーゼ、乳酸パーミアーゼ、シスタチオニンガンマ−リアーゼ、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、５’−ヌクレオチダーゼ／３’−ヌクレオチダーゼ／エキソポリホスファターゼ、小コンダクタンス機械受容チャネル、アルギニンデイミナーゼ、ＬＬ−ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼアポ酵素、およびホスホペントムターゼのうちの１つ以上をコードする、請求項９に記載の非自然発生細菌。
【請求項１１】
前記１つ以上の遺伝子の発現が、前記親細菌と比較して減少または排除されている、請求項９に記載の非自然発生細菌。
【請求項１２】
前記非自然発生細菌が、コリスメート、パラ−ヒドロキシ安息香酸、サリチレート、２−アミノベンゾエート、ジヒドロキシベンゾエート、４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、ならびにそれらの塩およびイオンからなる群から選択される生成物を生成する、請求項９に記載の非自然発生細菌。
【請求項１３】
前記親細菌が、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ  ｂａｃｃｈｉｉ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｓｋａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｍａｇｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ  ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｉｕｖｉからなる群から選択される、請求項９に記載の非自然発生細菌。
【請求項１４】
前記親細菌が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉからなる群から選択される、請求項９に記載の非自然発生細菌。
【請求項１５】
（ａ）前記親細菌が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍであり、前記１つ以上の遺伝子が、ＣＡＥＴＨＧ＿０１６０、ＣＡＥＴＨＧ＿０２４８、ＣＡＥＴＨＧ＿０４９８、ＣＡＥＴＨＧ＿１２７０、ＣＡＥＴＨＧ＿１３７１、ＣＡＥＴＨＧ＿２１０７、ＣＡＥＴＨＧ＿３０２１、ＣＡＥＴＨＧ＿３５１０、およびＣＡＥＴＨＧ＿３９２４のうちの１つ以上をコードするか、
（ｂ）前記親細菌が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉであり、前記１つ以上の遺伝子が、ＣＬＪＵ＿ｃ２０７５０、ＣＬＪＵ＿ｃ２１６１０、ＣＬＪＵ＿ｃ２４３８０、ＣＬＪＵ＿ｃ３３７２０、ＣＬＪＵ＿ｃ３４７４０、ＣＬＪＵ＿ｃ４２８１０、ＣＬＪＵ＿ｃ０９２７０、ＣＬＪＵ＿ｃ１４２８０、およびＣＬＪＵ＿ｃ１８１５０のうちの１つ以上をコードするか、または
（ｃ）前記親細菌が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉであり、前記１つ以上の遺伝子が、ＣＬＲＡＧ＿１９２５０、ＣＬＲＡＧ＿３１２００、ＣＬＲＡＧ＿２５１２０、ＣＬＲＡＧ＿２４５６０、ＣＬＲＡＧ＿１４８００、ＣＬＲＡＧ＿２５６２０、ＣＬＲＡＧ＿０９６００、もしくはＣＬＲＡＧ＿００５２０のうちの１つ以上をコードする、請求項９に記載の非自然発生細菌。
【請求項１６】
ＣＯ、ＣＯ２、およびＨ２のうちの１つ以上を含むガス状基質の存在下で、請求項９に記載の非自然発生細菌を培養することによって、生成物を生成する方法。
【請求項１７】
前記非自然発生細菌が、コリスメート、パラ−ヒドロキシ安息香酸、サリチレート、２−アミノベンゾエート、ジヒドロキシベンゾエート、４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、ならびにそれらの塩およびイオンからなる群から選択される生成物を生成する、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年９月２８日出願の米国仮特許出願第６２／５６５，０００号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
フィッシャー−トロプシュ法などの触媒法を使用して、産業廃ガスまたは合成ガスなどの二酸化炭素（ＣＯ２）、一酸化炭素（ＣＯ）、および／または水素（Ｈ２）を含有するガスを様々な燃料および化学物質に変換することができることが長い間認識されている。しかしながら、最近、ガス発酵がそのようなガスの生物学的固定のための代替プラットフォームとして浮上している。具体的には、Ｃ１固定微生物は、ＣＯ２、ＣＯ、および／またはＨ２を含有するガスをエタノールおよび２，３−ブタンジオールなどの生成物に変換することが示されている。しかしながら、そのような生成物の効率的な生成は、緩徐な微生物増殖、制限されたガス吸収、毒素に対する感受性、または炭素基質の望ましくない副生成物への転用によって制限され得る。したがって、改善された特性を有する遺伝子操作された微生物の必要性が依然として存在する。
【図面の簡単な説明】
【０００３】
【図１】ウッド−ユングダール微生物の主要な生成経路および主要な代謝ノード（四角で表示）を示す図である。例えば、ある特定の遺伝子の発現を妨害することによって、これらのノードを通じて炭素フラックスを改善すると、下流での生成物の生成を改善する。
【発明を実施するための形態】
【０００４】
本発明は、少なくとも１つの妨害された遺伝子を含む非自然発生微生物を提供する。本発明の微生物では、炭素フラックスは、非不可欠または望ましくない生成物から、関心対象の生成物に戦略的に転用される。ある特定の実施形態において、これらの妨害された遺伝子は、非不可欠または望ましくない代謝ノードから、標的代謝ノードを通じて炭素フラックスを転用して、それらの標的代謝ノードの下流の生成物の生成を改善する。
【０００５】
本発明の微生物は、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ  ｂａｃｃｈｉｉ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｓｋａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｍａｇｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ  ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、またはＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｉｕｖｉなどの親細菌に由来する。好ましい実施形態において、親細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉである。特に好ましい実施形態において、親細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍである。
【０００６】
一実施形態において、本発明は、異種チオラーゼと、例えば、ＮＡＤ依存性電子分岐［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼ、グルタミン酸シンターゼ、シトラマル酸シンターゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、リン酸トランスアセチラーゼ、およびアルデヒドデヒドロゲナーゼのうちの１つ以上をコードする１つ以上の遺伝子において妨害的突然変異と、を含み、非自然発生細菌が、親細菌と比較して、アセトアセチル−ＣｏＡを通じた改善された炭素フラックスを有する、非自然発生ウッド−ユングダール細菌を提供する。具体的には、１つ以上の遺伝子の発現は、親細菌と比較して減少または排除されている。
【０００７】
そのような実施形態において、非自然発生細菌は、アセトン、イソプロパノール、３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシイソバレレート、イソブチレン、イソペンテニルピロホスフェート、ジメチルアリルピロホスフェート、イソプレン、ファルネセン、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、クロトニル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシブチリルアルデヒド、１，３−ブタンジオール、２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ、２−ヒドロキシイソブチレート、ブチリル−ＣｏＡ、ブチレート、ブタノール、カプロエート、ヘキサノール、オクタノエート、オクタノール、１，３−ヘキサンジオール、２−ブテン−１−オール、イソバレリル−ＣｏＡ、イソバレレート、またはイソアミルアルコールなどの生成物を生成することができる。
【０００８】
例えば、親細菌がＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍであるとき、（ａ）ＮＡＤ依存性電子分岐［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼは、ＣＡＥＴＨＧ＿１５７６、ＣＡＥＴＨＧ＿１５７８、ＣＡＥＴＨＧ＿３５６９、ＣＡＥＴＨＧ＿３５７０、およびＣＡＥＴＨＧ＿３５７１からなる群から選択され得るか、（ｂ）グルタミン酸シンターゼは、ＣＡＥＴＨＧ＿０４７７、ＣＡＥＴＨＧ＿１５８０、ＣＡＥＴＨＧ＿３８５０、およびＣＡＥＴＨＧ＿３８５１からなる群から選択され得るか、（ｃ）シトラマル酸シンターゼは、ＣＡＥＴＨＧ＿２７５１であり得るか、（ｄ）アセト乳酸デカルボキシラーゼは、ＣＡＥＴＨＧ＿２９３２であり得るか、（ｅ）乳酸デヒドロゲナーゼは、ＣＡＥＴＨＧ＿１１４７であり得るか、（ｆ）酢酸キナーゼは、ＣＡＥＴＨＧ＿３３５９であり得るか、（ｇ）リン酸トランスアセチラーゼは、ＣＡＥＴＨＧ＿３３５８であり得るか、または（ｈ）アルデヒドデヒドロゲナーゼは、ＣＡＥＴＨＧ＿１８１９、ＣＡＥＴＨＧ＿３２８７、およびＣＡＥＴＨＧ＿１８３０からなる群から選択され得る。
【０００９】
別の実施形態において、本発明は、非自然発生細菌が、親細菌と比較してコリスメートを通じて改善された炭素フラックスを有する、１つ以上の遺伝子において妨害的突然変異を含む非自然発生ウッド−ユングダール細菌を提供する。
【００１０】
１つ以上の遺伝子は、例えば、プリン−ヌクレオシドホスホリラーゼ、乳酸パーミアーゼ、シスタチオニンガンマ−リアーゼ、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、５’−ヌクレオチダーゼ／３’−ヌクレオチダーゼ／エキソポリホスファターゼ、小コンダクタンス機械受容チャネル、アルギニンデイミナーゼ、ＬＬ−ジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼアポ酵素、およびホスホペントムターゼのうちの１つ以上をコードする。具体的には、１つ以上の遺伝子の発現は、親細菌と比較して減少または排除されている。
【００１１】
そのような実施形態において、非自然発生細菌は、コリスメート、パラ−ヒドロキシ安息香酸、サリチレート、２−アミノベンゾエート、ジヒドロキシベンゾエート、４−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、ならびにそれらの塩およびイオンなどの生成物を生成することができる。
【００１２】
例えば、親細菌がＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍであるとき、１つ以上の遺伝子は、ＣＡＥＴＨＧ＿０１６０、ＣＡＥＴＨＧ＿０２４８、ＣＡＥＴＨＧ＿０４９８、ＣＡＥＴＨＧ＿１２７０、ＣＡＥＴＨＧ＿１３７１、ＣＡＥＴＨＧ＿２１０７、ＣＡＥＴＨＧ＿３０２１、ＣＡＥＴＨＧ＿３５１０、およびＣＡＥＴＨＧ＿３９２４のうちの１つ以上をコードすることができ、親細菌がＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉであると、１つ以上の遺伝子は、ＣＬＪＵ＿ｃ２０７５０、ＣＬＪＵ＿ｃ２１６１０、ＣＬＪＵ＿ｃ２４３８０、ＣＬＪＵ＿ｃ３３７２０、ＣＬＪＵ＿ｃ３４７４０、ＣＬＪＵ＿ｃ４２８１０、ＣＬＪＵ＿ｃ０９２７０、ＣＬＪＵ＿ｃ１４２８０、およびＣＬＪＵ＿ｃ１８１５０のうちの１つ以上をコードすることができ、親細菌がＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉであると、１つ以上の遺伝子は、ＣＬＲＡＧ＿１９２５０、ＣＬＲＡＧ＿３１２００、ＣＬＲＡＧ＿２５１２０、ＣＬＲＡＧ＿２４５６０、ＣＬＲＡＧ＿１４８００、ＣＬＲＡＧ＿２５６２０、ＣＬＲＡＧ＿０９６００、またはＣＬＲＡＧ＿００５２０のうちの１つ以上をコードすることができる。
【００１３】
本発明はまた、ＣＯ、ＣＯ２、および／またはＨ２のうちの１つ以上を含むガス状基質などの基質の存在下で、本発明の微生物を培養することによって生成物を生成する方法を提供する。
【００１４】
微生物に関して使用されるとき、「非自然発生」という用語は、微生物が、言及される種の野生型株を含む言及される種の自然発生株において見られない少なくとも１つの遺伝子修飾を有することを意味することが意図される。非自然発生微生物は、典型的には、実験室または研究施設で開発される。
【００１５】
「遺伝子修飾」、「遺伝子改変」、または「遺伝子操作」という用語は、微生物のゲノムまたは核酸の人の手による操作を広く指す。同様に、「遺伝子修飾された」、「遺伝子改変された」、または「遺伝子操作された」という用語は、そのような遺伝子修飾、遺伝子改変、または遺伝子操作を含む微生物を指す。これらの用語は、実験室で生成された微生物と自然発生の微生物を区別するために使用され得る。遺伝子修飾の方法は、例えば、異種遺伝子発現、遺伝子またはプロモータの挿入または欠失、核酸変異、修飾遺伝子発現または不活性化、酵素工学、指向性進化、知識ベース設計、ランダム変異導入法、遺伝子シャフリング、およびコドン最適化を含む。
【００１６】
「組換え」は、核酸、タンパク質、または微生物が、遺伝子修飾、操作、または組換えの生成物であることを示す。一般に、「組換え」という用語は、微生物の２つ以上の異なる株または種など、複数の源に由来する遺伝物質を含有するか、またはそれによってコードされる核酸、タンパク質、または微生物を指す。
【００１７】
「野生型」は、突然変異体または変異形とは区別されるように天然に存在する、生物、株、遺伝子、または特性の典型的な形態を指す。
【００１８】
「内在性」は、本発明の微生物が誘導される野生型または親微生物に存在または発現する核酸またはタンパク質を指す。例えば、内在性遺伝子は、本発明の微生物が誘導される野生型または親微生物に天然に存在する遺伝子である。一実施形態において、内在性遺伝子の発現は、外在性プロモータなどの外在性調節エレメントによって制御され得る。
【００１９】
「外在性」とは、本発明の微生物の外側に由来する核酸またはタンパク質を指す。例えば、外在性遺伝子または酵素は、本発明の微生物に、人工的にまたは組換えられて作製および導入されるか、あるいは発現させることができる。外在性遺伝子または酵素はまた、異種微生物から単離され、本発明の微生物に導入または発現させることができる。外在性核酸は、本発明の微生物のゲノムに組み込まれるように、または本発明の微生物、例えばプラスミド中で染色体外の状態にとどまるように適合され得る。「異種」とは、異なる株または種に由来し、本発明の微生物に導入または発現される核酸またはタンパク質を指す。
【００２０】
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用される。それらは、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらの類似体を指す。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有し得て、既知または未知の任意の機能を果たし得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である。遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、連鎖解析から定義される遺伝子座（複数可）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体などの１つ以上の修飾されたヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造の修飾は、ポリマーの組織化の前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成要素によって割り込まれ得る。ポリヌクレオチドは、重合の後、例えば標識構成要素との接合により、さらに修飾され得る。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（例えば、ｍＲＮＡもしくは他のＲＮＡ転写物へ）転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡが、続いて、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質へ翻訳されるプロセスを指す。転写物およびコードされたポリペプチドは、集合的に「遺伝子産物」と称され得る。
【００２２】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書で互換的に使用される。ポリマーは、直鎖であっても分岐鎖であってもよく、修飾アミノ酸を含んでいてもよく、非アミノ酸によって割り込まれていてもよい。これらの用語は、修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識構成要素との接合などの任意の他の操作を含む。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシン、ＤまたはＬ光学異性体の両方、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣体を含む天然および／または非天然もしくは合成アミノ酸を含む。
【００２３】
「酵素活性」または単に「活性」は、広範には、酵素の活性、酵素の量、または反応を触媒するための酵素の可用性を含むがこれらに限定されない、酵素的な活性を指す。したがって、酵素活性を「増大させること」は、酵素の活性を増大させること、酵素の量を増大させること、または反応を触媒するための酵素の可用性を増大させることを含む。同様に、酵素活性を「低下させること」は、酵素の活性を低下させること、酵素の量を低下させること、または反応を触媒するための酵素の可用性を低下させることを含む。
【００２４】
「変異した」は、本発明の微生物が誘導される野生型または親微生物と比較して、本発明の微生物において修飾されている核酸またはタンパク質を指す。一実施形態において、変異は、酵素をコードする遺伝子中の欠失、挿入、または置換であってもよい。別の実施形態において、変異は、酵素中の１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、または置換であってもよい。
【００２５】
「妨害された遺伝子」とは、遺伝子の発現、遺伝子の調節活性、またはコードされたタンパク質もしくは酵素の活性を低減または排除するために何らかの方法で修飾されている遺伝子を指す。妨害によって、遺伝子または酵素を、部分的に不活化するか、完全に不活化するか、または欠失させることができる。妨害は、遺伝子、タンパク質、または酵素の発現または活性を完全に排除するノックアウト（ＫＯ）突然変異であり得る。妨害はまた、遺伝子、タンパク質、または酵素の発現または活性を低減するが、完全に排除しないノックダウンでもあり得る。妨害は、酵素によって生成される生成物の生合成を低減、防止、または遮断するものであり得る。妨害としては、例えば、タンパク質もしくは酵素をコードする遺伝子における突然変異、酵素をコードする遺伝子の発現に関与する遺伝子調節エレメントにおける突然変異、酵素の活性を低減もしくは阻害する、タンパク質を生成する核酸の導入、またはタンパク質もしくは酵素の発現を阻害する核酸（例えば、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ＴＡＬＥＮ、ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ、ＣＲＩＳＰＲｉ）もしくはタンパク質の導入を挙げることができる。妨害は、当該技術分野において既知の任意の方法を使用して導入することができる。本発明の目的のために、妨害は、実験室で生成されたものであり、自然に発生するものではない。
【００２６】
「コドン最適化」とは、特定の株または種における核酸の最適化または改善された翻訳のための、遺伝子などの核酸の突然変異を指す。コドンの最適化により、より速い翻訳速度、またはより高い翻訳の精度を生じることができる。好ましい実施形態において、本発明の遺伝子は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、特にＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉでの発現に最適化されたコドンである。さらに好ましい態様において、本発明の遺伝子は、ＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ２３６９３で寄託されているＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＬＺ１５６１での発現のために最適化されたコドンである。
【００２７】
「過剰発現した」とは、本発明の微生物が由来する野生型または親微生物と比較して、本発明の微生物における核酸またはタンパク質の発現の増加を指す。過剰発現は、遺伝子コピー数、遺伝子転写速度、遺伝子翻訳速度、または酵素分解速度の変更を含む、当該技術分野において既知の任意の手段によって達成することができる。
【００２８】
「変異形」という用語は、核酸およびタンパク質の配列が、従来技術分野において開示されるかまたは本明細書に例示される参照核酸およびタンパク質の配列などの、参照核酸およびタンパク質の配列から変化する、核酸およびタンパク質を含む。本発明は、参照核酸またはタンパク質と実質的に同じ機能を果たす変異形核酸またはタンパク質を使用して実施されてもよい。例えば、変異形タンパク質は、参照タンパク質と実質的に同じ機能を果たすか、または実質的に同じ反応を触媒してもよい。変異形遺伝子は、参照遺伝子と同じ、または実質的に同じタンパク質をコードしてもよい。変異形プロモータは、参照プロモータと実質的に同じ、１つ以上の遺伝子の発現を促進するための能力を有してもよい。
【００２９】
そのような核酸またはタンパク質は、本明細書では「機能的に同等な変異形」と称され得る。例として、核酸の機能的に同等な変異形としては、対立遺伝子変異形、遺伝子の断片、変異遺伝子、多型などを挙げることができる。他の微生物からの相同遺伝子も、機能的に同等な変異形の例である。これらとしては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉなどの種の相同遺伝子が挙げられ、それらの詳細は、ＧｅｎｂａｎｋまたはＮＣＢＩなどのウェブサイトで公開されており入手可能である。機能的に同等な変異形としてはまた、特定の微生物のコドン最適化の結果として配列が変化している核酸が挙げられる。核酸の機能的に同等な変異形は、参照される核酸と、好ましくは少なくともおよそ７０％、およそ８０％、およそ８５％、およそ９０％、およそ９５％、およそ９８％、またはそれ以上の核酸配列同一性（相同性パーセント）を有するであろう。タンパク質の機能的に同等な変異形は、参照されるタンパク質と、好ましくは少なくともおよそ７０％、およそ８０％、およそ８５％、およそ９０％、およそ９５％、およそ９８％、またはそれ以上のアミノ酸同一性（相同性パーセント）を有するであろう。変異形の核酸またはタンパク質の機能的同等性は、当該技術分野において既知の任意の方法を使用して評価することができる。
【００３０】
「相補性」とは、従来のワトソン−クリック型または他の非従来型のいずれかによって、核酸が別の核酸配列と水素結合（複数可）を形成する能力を指す。相補性パーセントは、第２の核酸配列と水素結合（例えばワトソン−クリック塩基対合）を形成することができる核酸分子内の残基の割合（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％の相補性として、１０のうちの５、６、７、８、９、１０）を示す。「完全な相補性」とは、核酸配列の全ての隣接する残基が、第２の核酸配列の同数の隣接する残基と水素結合するであろうことを意味する。本明細書で使用される場合、「実質的な相補性」とは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれ以上のヌクレオチドの領域にわたる、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％の相補性の程度を指すか、あるいは厳格な条件下では、ハイブリダイズする２つの核酸を指す。
【００３１】
「ハイブリダイゼーション」とは、１つ以上のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化されている複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソンクリック塩基対合、フーグスティーン結合、または任意の他の配列に特異的な様式で起こり得る。複合体は、二重構造を形成する２本の鎖、多重鎖複合体を形成する３本以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、またはこれらの任意の組み合わせを含んでもよい。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲの開始、または酵素によるポリヌクレオチドの切断など、より広範なプロセスにおけるステップを構成し得る。所与の配列とハイブリダイズ可能な配列は、所与の配列の「補体」と称される。
【００３２】
核酸は、当該技術分野において既知の任意の方法を使用して、本発明の微生物に送達することができる。例えば、核酸は、裸の核酸として送達されてもよく、あるいはリポソームなどの１つ以上の薬剤とともに製剤化されてもよい。核酸は、必要に応じて、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはそれらの組み合わせであってもよい。ある特定の実施形態において、制限阻害因子を使用してもよい。追加のベクターとしては、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、コスミド、および人工染色体を挙げることができる。好ましい実施形態において、核酸は、プラスミドを使用して本発明の微生物に送達される。例として、形質転換（形質導入またはトランスフェクションを含む）は、エレクトロポレーション、超音波処理、ポリエチレングリコール媒介形質転換、化学的もしくは天然のコンピテンス、プロトプラスト形質転換、プロファージ誘導、またはコンジュゲーションによって達成することができる。活性制限酵素系を有するある特定の実施形態において、核酸を微生物に導入する前に核酸をメチル化する必要があり得る。
【００３３】
さらに、核酸は、特定の核酸の発現を増加または制御するために、プロモータなどの調節エレメントを含むように設計されてもよい。プロモータは、構成的プロモータまたは誘導性プロモータであり得る。理想的には、プロモータは、ウッド−ユングダール経路プロモータ、フェレドキシンプロモータ、ピルビン酸：フェレドキシン酸化還元酵素プロモータ、Ｒｎｆ複合オペロンプロモータ、ＡＴＰシンターゼオペロンプロモータ、またはホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼオペロンプロモータである。
【００３４】
「微生物」は、顕微鏡生物、特に細菌、古細菌、ウイルス、または真菌である。本発明の微生物は、典型的には細菌である。本明細書における「微生物」の記載は、「細菌」を包含するものと解釈されるべきである。
【００３５】
「親微生物」は、本発明の微生物を生成するために使用される微生物である。親微生物は、自然発生する微生物（即ち、野生型微生物）または以前に修飾されたことのある微生物（即ち、変異体または組換え微生物）であり得る。本発明の微生物は、親微生物において発現または過剰発現されなかった１つ以上の酵素を発現または過剰発現させるように修飾され得る。同様に、本発明の微生物は、親微生物によって含有されなかった１つ以上の遺伝子を含有するように修飾され得る。本発明の微生物は、また、親微生物において発現された１つ以上の酵素を発現しないまたはより少ない量を発現させるように修飾され得る。一実施形態において、親微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉである。好ましい実施形態において、親微生物は、２０１０年６月７日にドイツのＤ−３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｉｅｇ、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａβ  ７Ｂに位置するＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）にブダペスト条約の条項下で２０１０年６月７日に寄託され、受託番号ＤＳＭ２３６９３を付与されたＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＬＺ１５６１である。この株は、ＷＯ２０１２／０１５３１７として公開されている国際特許出願第ＰＣＴ／ＮＺ２０１１／０００１４４号に記載されている。
【００３６】
「〜から誘導される」という用語は、新しい核酸、タンパク質、または微生物を生成するように、核酸、タンパク質、または微生物が異なる（例えば、親または野生型）核酸、タンパク質、または微生物から修飾または適合されることを示す。そのような修飾または適合は、典型的には、核酸または遺伝子の挿入、欠失、変異、または置換を含む。一般に、本発明の微生物は、親微生物に由来する。一実施形態において、本発明の微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉに由来する。好ましい実施形態において、本発明の微生物は、ＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ２３６９３の下で寄託される、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＬＺ１５６１から誘導される。
【００３７】
本発明の微生物は、機能特性に基づいてさらに分類され得る。例えば、本発明の微生物は、Ｃ１固定微生物、嫌気性細菌、アセトゲン、エタノロゲン、カルボキシド栄養生物、および／もしくはメタン資化性菌であり得るか、またはそれらから誘導され得る。表１は、微生物の代表的なリストを提供し、微生物の機能特性を特定する。
【表１−１】
2020535813.tif 000003
【表１−２】
2020535813.tif 000004
【００３８】
「ウッド−ユングダール」とは、例えばＲａｇｓｄａｌｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１７８４：１８７３−１８９８，２００８に記載の炭素固定のウッド−ユングダール経路を指す。「ウッド−ユングダール微生物」とは、予測されるように、ウッド−ユングダール経路を含有する微生物を指す。本発明の微生物は、ウッド−ユングダール微生物、通常ウッド−ユングダール細菌である。一般に、本発明の微生物は天然のウッド−ユングダール経路を含有する。本明細書において、ウッド−ユングダール経路は、天然の未修飾のウッド−ユングダール経路であり得るか、あるいはＣＯ、ＣＯ２、および／またはＨ２をアセチル−ＣｏＡに変換するように依然として機能する限り、ある程度の遺伝子修飾（例えば、過剰発現、異種発現、ノックアウトなど）を有するウッド−ユングダール経路であり得る。
【００３９】
「Ｃ１」は、１炭素分子、例えば、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＨ４、またはＣＨ３ＯＨを指す。「Ｃ１酸素化物」は、少なくとも１つの酸素原子も含む１炭素分子、例えば、ＣＯ、ＣＯ２、またはＣＨ３ＯＨを指す。「Ｃ１炭素源」は、本発明の微生物のための部分的または唯一の炭素源として機能する１炭素分子を指す。例えば、Ｃ１炭素源は、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＨ４、ＣＨ３ＯＨ、またはＣＨ２Ｏ２のうちの１つ以上を含み得る。好ましくは、Ｃ１炭素源は、ＣＯおよびＣＯ２のうちの１つまたは両方を含む。「Ｃ１固定微生物」は、Ｃ１炭素源から１つ以上の生成物を生成する能力を有する微生物である。典型的には、本発明の微生物はＣ１固定細菌である。好ましい実施形態において、本発明の微生物は、表１で特定されるＣ１固定微生物から誘導される。
【００４０】
「嫌気性細菌」は、増殖のために酸素を必要としない微生物である。嫌気性細菌は、酸素が特定の閾値を超えて存在する場合、負の反応を起こし得るか、もしくは死滅し得る。しかしながら、いくつかの嫌気性細菌は、低レベルの酸素（例えば、０．０００００１〜５％の酸素）を許容可能である。典型的には、本発明の微生物は嫌気性細菌である。好ましい実施形態において、本発明の微生物は、表１で特定される嫌気性細菌から誘導される。
【００４１】
「アセトゲン」は、嫌気呼吸の生成物としてアセテート（もしくは酢酸）を生成する、または生成することが可能である微生物である。典型的には、アセトゲンは、エネルギー節約のため、ならびにアセチル−ＣｏＡおよびアセテートなどのアセチル−ＣｏＡ誘導生成物の合成のためのそれらの主要機構として、ウッド・ユングダール経路を使用する、偏性嫌気性細菌である（Ｒａｇｓｄａｌｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１７８４：１８７３−１８９８，２００８）。アセトゲンは、アセチル−ＣｏＡ経路を、（１）ＣＯ２からのアセチル−ＣｏＡの還元合成のための機構、（２）最終電子を受容する、エネルギー節約プロセス、（３）細胞炭素の合成におけるＣＯ２の固定（同化）のための機構として使用する（Ｄｒａｋｅ，Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ，Ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐ．３５４，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００６）。全ての自然発生するアセトゲンは、Ｃ１固定、嫌気性、独立栄養性、および非メタン資化性である。典型的には、本発明の微生物は、アセトゲンである。好ましい実施形態において、本発明の微生物は、表１で特定されるアセトゲンから誘導される。
【００４２】
「エタノロゲン」は、エタノールを生成する、または生成することが可能である微生物である。典型的には、本発明の微生物は、エタノロゲン（ｅｔｈａｎｏｌｏｇｅｎ）である。好ましい実施形態において、本発明の微生物は、表１で特定されるエタノロゲンから誘導される。
【００４３】
「独立栄養生物」は、有機炭素の不在下でも増殖することが可能な微生物である。代わりに、独立栄養生物は、ＣＯおよび／またはＣＯ２などの無機炭素源を使用する。典型的には、本発明の微生物は、独立栄養生物である。好ましい実施形態において、本発明の微生物は、表１で特定される独立栄養生物から誘導される。
【００４４】
「カルボキシドトローフ（ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｒｏｐｈ）」は、炭素およびエネルギーの唯一の供給源としてＣＯを利用することが可能な微生物である。典型的には、本発明の微生物は、カルボキシド栄養生物である。好ましい実施形態において、本発明の微生物は、表１で特定されるカルボキシド栄養生物から誘導される。
【００４５】
「メタン資化性菌」は、炭素とエネルギーの唯一の供給源としてメタンを利用することが可能な微生物である。特定の実施形態において、本発明の微生物は、メタン資化性菌であるか、またはメタン資化性菌から誘導される。他の実施形態において、本発明の微生物は、メタン資化性菌ではないか、メタン資化性菌から誘導されない。
【００４６】
より広くは、本発明の微生物は、表１で特定される何らかの属または種に由来し得る。例えば、微生物は、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒからなる群から選択される属のメンバーであり得る。具体的には、微生物は、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ、Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ  ｂａｃｃｈｉｉ、Ｂｌａｕｔｉａ  ｐｒｏｄｕｃｔａ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｓｋａｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｒａｋｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｍａｇｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｃａｔｏｌｏｇｅｎｅｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ、Ｏｘｏｂａｃｔｅｒ  ｐｆｅｎｎｉｇｉｉ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｏｖａｔａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｉｌｖａｃｅｔｉｃａ、Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｋｉｕｖｉからなる群から選択される親細菌に由来し得る。
【００４７】
好ましい実施形態において、本発明の微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ種、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ種を含むＣｌｏｓｔｒｉｄｉａのクラスターから得られる。これらの種は、Ａｂｒｉｎｉ，Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１６１：３４５−３５１，１９９４（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）、Ｔａｎｎｅｒ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，４３：２３２−２３６，１９９３（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、およびＨｕｈｎｋｅ，ＷＯ２００８／０２８０５５（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ）によって最初に報告され、かつ特徴付けられた。
【００４８】
これらの３つの種は、多くの類似点を有する。特に、これらの種は全て、Ｃ１固定、嫌気性、アセトゲン系、エタノロゲン系、およびカルボキシド栄養性のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属メンバーである。これらの種は、同様の遺伝子型および表現型ならびにエネルギー節約および発酵代謝のモードを有する。さらに、これらの種は、９９％を超えて同一である１６Ｓ  ｒＲＮＡ  ＤＮＡを有するクロストリジウムｒＲＮＡホモロジー群Ｉ内に群生し、約２２〜３０モル％の含有量でＤＮＡ  Ｇ＋Ｃを有し、グラム陽性であり、同様の形態およびサイズを有し（０．５〜０．７×３〜５μｍの対数増殖細胞）、中温性であり（３０〜３７℃で最適に増殖する）、約４〜７．５の同様のｐＨ範囲を有し（約５．５〜６の最適ｐＨ）、シトクロムを欠いており、Ｒｎｆ複合体を介してエネルギーを節約する。また、カルボン酸のそれらの対応するアルコールへの還元が、これらの種において示されている（Ｐｅｒｅｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，１１０：１０６６−１０７７，２０１２）。重要なことに、これらの種はまた、全て、ＣＯ含有ガスで強い独立栄養性増殖を示し、主要な発酵生成物としてエタノールおよびアセテート（または酢酸）を生成し、特定の条件下で少量の２，３−ブタンジオールおよび乳酸を生成する。
【００４９】
しかしながら、これら３つの種は、いくつかの違いも有する。これらの種は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍはウサギの腸から、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉは養鶏場の廃棄物から、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉは淡水堆積物からというように、異なる供給源から単離された。これらの種は、種々の糖（例えば、ラムノース、アラビノース）、酸（例えば、グルコン酸塩、クエン酸塩）、アミノ酸（例えば、アルギニン、ヒスチジン）、および他の基質（例えば、べタイン、ブタノール）の利用において異なる。さらに、これらの種は、特定のビタミン（例えば、チアミン、ビオチン）に対する栄養要求性において異なる。これらの種は、ウッド・ユングダール経路遺伝子およびタンパク質の核酸およびアミノ酸配列において違いを有するが、これらの遺伝子およびタンパク質の一般的構成および数は、全ての種において同じであることが分かっている（Ｋｏｐｋｅ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２：３２０−３２５，２０１１）。
【００５０】
したがって、要約すると、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉの特性の多くは、その種に特有ではなく、むしろＣ１固定、嫌気性、アセトゲン系、エタノロゲン系、およびカルボキシド栄養性のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属メンバーのこのクラスターの一般的な特性である。しかしながら、これらの種は、実際は、全く異なるため、これらの種のうちの１つの遺伝子修飾または操作は、これらの種のうちの別のものにおいては同一の効果を有しない場合がある。例えば、増殖、性能、または生成物生成における違いが観察され得る。
【００５１】
本発明の微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉの分離株または変異体から得ることもできる。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの分離株および突然変異体としては、ＪＡ１−１（ＤＳＭ１００６１）（Ａｂｒｉｎｉ，Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１６１：３４５−３５１，１９９４）、ＬＢＳ１５６０（ＤＳＭ１９６３０）（ＷＯ２００９／０６４２００）、およびＬＺ１５６１（ＤＳＭ２３６９３）（ＷＯ２０１２／０１５３１７）が挙げられる。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉの分離株および変異体としては、ＡＴＣＣ４９５８７（Ｔａｎｎｅｒ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，４３：２３２−２３６，１９９３）、ＰＥＴＣＴ（ＤＳＭ１３５２８、ＡＴＣＣ５５３８３）、ＥＲＩ−２（ＡＴＣＣ５５３８０）（ＵＳ５，５９３，８８６）、Ｃ−０１（ＡＴＣＣ５５９８８）（ＵＳ６，３６８，８１９）、Ｏ−５２（ＡＴＣＣ５５９８９）（ＵＳ６，３６８，８１９）、およびＯＴＡ−１（Ｔｉｒａｄｏ−Ａｃｅｖｅｄｏ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ  ｆｒｏｍ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｇａｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ，ＰｈＤ  ｔｈｅｓｉｓ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１０）が挙げられる。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉの分離株および変異体としては、ＰＩ  １（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６２２、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−７８２６）（ＷＯ２００８／０２８０５５）が挙げられる。
【００５２】
「基質」は、本発明の微生物のための炭素および／またはエネルギー源を指す。典型的には、基質は、ガス状であり、Ｃ１炭素源、例えば、ＣＯ、ＣＯ２、および／またはＣＨ４を含む。好ましくは、基質は、ＣＯまたはＣＯ＋ＣＯ２のＣ１炭素源を含む。基質は、Ｈ２、Ｎ２、または電子などの他の非炭素構成要素をさらに含み得る。
【００５３】
基質は、概して、約１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００モル％のＣＯなどの少なくともいくらかの量のＣＯを含む。基質は、約２０〜８０、３０〜７０、または４０〜６０モル％のＣＯなど、ある範囲のＣＯを含み得る。好ましくは、基質は、約４０〜７０モル％のＣＯ（例えば、製鋼または高炉ガス）、約２０〜３０モル％のＣＯ（例えば、塩基性酸素高炉ガス）、または約１５〜４５モル％のＣＯ（例えば、合成ガス）を含む。いくつかの実施形態において、基質は、約１〜１０または１〜２０モル％のＣＯなどの比較的低い量のＣＯを含み得る。本発明の微生物は、典型的には、基質中のＣＯの少なくとも一部分を生成物に変換する。いくつかの実施形態において、基質は、ＣＯを含まないか、または実質的に含まない（１モル％未満）。
【００５４】
基質は、いくらかの量のＨ２を含み得る。例えば、基質は、約１、２、５、１０、１５、２０、または３０モル％のＨ２を含み得る。いくつかの実施形態において、基質は、約６０、７０、８０、または９０モル％のＨ２など、比較的多量のＨ２を含み得る。さらなる実施形態において、基質は、Ｈ２を含まないか、または実質的に含まない（１モル％未満）。
【００５５】
基質は、いくらかの量のＣＯ２を含み得る。例えば、基質は、約１〜８０または１〜３０モル％のＣＯ２を含み得る。いくつかの実施形態において、基質は、約２０、１５、１０、または５モル％未満のＣＯ２を含み得る。別の実施形態において、基質は、ＣＯ２を含まないか、または実質的に含まない（１モル％未満）。
【００５６】
基質は典型的にはガス状であるが、基質はまた、代替的な形態で提供されてもよい。例えば、基質は、マイクロバブル分散物発生装置を使用して、ＣＯ含有ガスで飽和した液体中に溶解されてもよい。さらなる例として、基質は、固体支持体上に吸着されてもよい。
【００５７】
基質および／またはＣ１炭素源は、自動車の排出ガスまたはバイオマスガス化からなど、産業プロセスの副産物として得られる、または何らかの他の源からの廃ガスであってもよい。特定の実施形態において、産業プロセスは、鉄鋼製造などの鉄金属生成物製造、非鉄金属生成物製造、石油精製、石炭ガス化、電力生成、カーボンブラック生成、アンモニア生成、メタノール生成、およびコークス製造からなる群から選択される。これらの実施形態において、基質および／またはＣ１炭素源は、任意の簡便な方法を使用して、それが大気中に放出される前に産業プロセスから捕捉されてもよい。
【００５８】
基質および／またはＣ１炭素源は、石炭もしくは精錬残渣のガス化、バイオマスもしくはリグノセルロース物質のガス化、または天然ガスの改質によって得られる合成ガスなど、合成ガスであってもよい。別の実施形態において、合成ガスは、一般廃棄物または産業廃棄物のガス化から得てもよい。
【００５９】
基質の組成は、反応の効率および／または費用に著しい影響を及ぼし得る。例えば、酸素（Ｏ２）の存在は、嫌気性発酵プロセスの効率を低減し得る。基質の組成に応じて、基質を処理、スクラブ、または濾過して、毒素、望ましくない成分、またはちり粒子などのいかなる望ましくない不純物も除去すること、および／または所望の成分の濃度を増加させることが望ましくあり得る。
【００６０】
特定の実施形態において、発酵は、糖、デンプン、リグニン、セルロース、またはヘミセルロースなどの炭水化物基質の不在下で実施される。
【００６１】
本発明の微生物は、１つ以上の生成物を生成するように培養され得る。例えば、本発明の微生物は、エタノール（ＷＯ２００７／１１７１５７）、アセテート（ＷＯ２００７／１１７１５７）、ブタノール（ＷＯ２００８／１１５０８０およびＷＯ２０１２／０５３９０５）、ブチレート（ＷＯ２００８／１１５０８０）、２，３−ブタンジオール（ＷＯ２００９／１５１３４２およびＷＯ２０１６／０９４３３４）、ラクテート（ＷＯ２０１１／１１２１０３）、ブテン（ＷＯ２０１２／０２４５２２）、ブタジエン（ＷＯ２０１２／０２４５２２）、メチルエチルケトン（２−ブタノン）（ＷＯ２０１２／０２４５２２およびＷＯ２０１３／１８５１２３）、エチレン（ＷＯ２０１２／０２６８３３）、アセトン（ＷＯ２０１２／１１５５２７）、イソプロパノール（ＷＯ２０１２／１１５５２７）、脂質（ＷＯ２０１３／０３６１４７）、３−ヒドロキシプロピオネート（３−ＨＰ）（ＷＯ２０１３／１８０５８１）、イソプレン（ＷＯ２０１３／１８０５８４）、脂肪酸（ＷＯ２０１３／１９１５６７）、２−ブタノール（ＷＯ２０１３／１８５１２３）、１，２−プロパンジオール（ＷＯ２０１４／０３６１５２）、１−プロパノール（ＷＯ２０１４／０３６９１５２）、コリスメート由来生成物（ＷＯ２０１６／１９１６２５）、３−ヒドロキシブチレート（ＷＯ２０１７／０６６４９８）、および１，３−ブタンジオール（ＷＯ２０１７／００６６４９８）を生成することができるか、または生成するように操作することができる。１つ以上の標的生成物に加えて、本発明の微生物はまた、エタノール、アセテート、および／または２，３−ブタンジオールを生成することもできる。特定の実施形態において、微生物バイオマス自体が生成物と見なされ得る。
【００６２】
「天然生成物」は、遺伝子修飾されていない微生物によって生成される生成物である。例えば、エタノール、アセテート、および２，３−ブタンジオールは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉの天然生成物である。「非天然生成物」は、遺伝子修飾された微生物によって生成されるが、遺伝子修飾された微生物が由来する遺伝子修飾されていない微生物によって生成されない生成物である。
【００６３】
本明細書において、酸（例えば、酢酸または２−ヒドロキシイソ酪酸）についての言及は、対応する塩（例えば、アセテートまたは２−ヒドロキシイソブチレート）も含むと解釈されるべきである。
【００６４】
「選択性」は、微生物によって生成される全発酵生成物の生成に対する標的生成物の生成の比率を指す。本発明の微生物は、特定の選択性で、または最小の選択性で生成物を生成するように操作され得る。一実施形態において、標的生成物は、本発明の微生物によって生成される全発酵生成物のうちの少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、５０％、または７５％を占める。一実施形態において、標的生成物は、本発明の微生物が少なくとも１０％の標的生成物に対して選択性を有するように、本発明の微生物によって生成される全発酵生成物の少なくとも１０％を占める。別の実施形態において、標的生成物は、本発明の微生物が少なくとも３０％の標的生成物に対して選択性を有するように、本発明の微生物によって生成される全発酵生成物の少なくとも３０％を占める。
【００６５】
「効率を増大させること」、「増大した効率」などは、増殖速度、生成物生成速度もしくは体積、消費される基質の体積あたりの生成物体積、または生成物選択性を増大させることを含むが、これらに限定されない。効率は、本発明の微生物が誘導される親微生物の性能に対して測定され得る。
【００６６】
典型的には、培養は、バイオリアクタ中で実施される。「バイオリアクタ」という用語は、連続撹拌槽反応器（ＣＳＴＲ）、固定化細胞反応器（ＩＣＲ）、トリクルベッド反応器（ＴＢＲ）、気泡塔、ガスリフト発酵槽、静的ミキサ、またはガス−液体接触に好適な他の容器もしくは他の装置などの１つ以上の容器、塔、または配管からなる培養／発酵装置を含む。いくつかの実施形態において、バイオリアクタは、第１の増殖反応器および第２の培養／発酵反応器を含んでもよい。基質は、これらの反応器のうちの一方または両方に提供されてもよい。本明細書で使用される場合、「培養」および「発酵」という用語は、交換可能に使用される。これらの用語は、培養／発酵プロセスの増殖期および生成物生合成期の両方を包含する。
【００６７】
培養物は概して、微生物の増殖を可能にするのに十分な栄養素、ビタミン、および／または無機物を含有する水性培地中で維持される。好ましくは、水性培地は、最小嫌気性微生物増殖培地などの嫌気性微生物培地である。好適な培地は、当該技術分野において既知である。
【００６８】
培養／発酵は、望ましくは、標的生成物の生成に適切な条件下で実施されるべきである。典型的には、培養／発酵は、嫌気性条件下で実施される。考慮すべき反応条件は、圧力（または分圧）、温度、ガス流速、液体流速、培地ｐＨ、培地酸化還元電位、撹拌速度（連続撹拌槽反応器を使用する場合）、接種レベル、液相中のガスが制限的にならないことを確実にするための最大ガス基質濃度、および生成物阻害を回避するための最大生成物濃度を含む。具体的には、基質の導入速度は、生成物がガス制限条件下での培養によって消費され得るため、液相中のガスの濃度が制限的にならないことを確実にするように制御されてもよい。
【００６９】
上昇した圧力でバイオリアクタを操作することは、気相から液相へのガス物質移動の増加した速度を可能にする。したがって、概して、大気圧よりも高い圧力で培養／発酵を実施することが好ましい。また、所与のガス変換速度が部分的に基質保持時間の関数であり、かつ保持時間がバイオリアクタの必要な体積を示すため、加圧システムの使用は、必要なバイオリアクタの体積、およびその結果として培養／発酵装置の資本コストを大幅に低減することができる。これはさらに、バイオリアクタ中の液体体積を入力ガス流速で除算したものと定義される保持時間が、バイオリアクタが大気圧よりも上昇した圧力に維持されるときに減少され得ることを意味する。最適反応条件は、使用される特定の微生物に部分的に依存する。しかしながら、一般的には、大気圧より高い圧力で発酵を行うことが好ましい。また、所与のガス変換速度が部分的に基質保持時間の関数であり、かつ所望の保持時間を達成することがバイオリアクタの必要な体積をさらに示すため、加圧システムの使用は、必要なバイオリアクタの体積、およびその結果として発酵装置の資本コストを大幅に低減することができる。
【００７０】
特定の実施形態において、発酵は、光の不在下で、または光合成微生物のエネルギー要求を満たすには不十分な量の光の存在下で行われる。特定の実施形態において、本発明の微生物は、非光合成微生物である。
【００７１】
標的生成物は、例えば、分留蒸留、蒸発、浸透蒸発、ガスストリッピング、相分離、および例えば、液−液抽出を含む抽出発酵を含む、任意の方法または当該技術分野において既知の方法の組み合わせを使用して、発酵ブロスから分離または精製することができる。特定の実施形態において、標的生成物は、ブロスの一部分をバイオリアクタから連続的に取り出し、微生物細胞をブロスから（濾過により簡便に）分離し、１つ以上の標的生成物をブロスから回収することによって、発酵ブロスから回収される。アルコールおよび／またはアセトンは、例えば、蒸留によって回収され得る。酸は、例えば、活性炭上での吸着によって回収され得る。分離された微生物細胞は、好ましくは、バイオリアクタに戻される。標的生成物が取り出された後に残存している無細胞透過液も、好ましくは、バイオリアクタに戻される。追加の栄養素（ビタミンＢなど）が、無細胞透過液に添加されて、培地を補充した後に、バイオリアクタに戻され得る。
【００７２】
本発明の微生物は、少なくとも１つの妨害された遺伝子を含有する。いくつかの実施形態において、本発明の微生物は、２つ以上の妨害された遺伝子、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、または２００の妨害された遺伝子を含有する。例えば、妨害された遺伝子は、表２から選択され得る。Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、およびＣ．ｒａｇｓｄａｌｅｉには、代表的な受託番号が提供されているが、当業者であれば、他のウッド−ユングダール微生物の相同体を容易に識別することが可能であろう。
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【表２−８】
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【表２−９】
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【表２−１７】
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【表２−２０】
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【表２−２１】
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【表２−１１６】
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【表２−１１７】
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【表２−１７４】
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【表２−１７６】
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【表２−１８０】
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【表２−１８６】
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【表２−１８７】
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【表２−１８８】
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【表２−１８９】
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【表２−１９０】
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【表２−１９２】
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【表２−１９３】
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【表２−１９４】
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【表２−１９５】
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【表２−１９６】
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【表２−１９７】
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【表２−１９８】
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【表２−１９９】
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【表２−２００】
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【表２−２０１】
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【表２−２０３】
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【表２−２１０】
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【表２−２１１】
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【表２−２１２】
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【表２−２１３】
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【表２−２１４】
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【表２−２１５】
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【表２−２１６】
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【表２−２１７】
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【表２−２１８】
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【表２−２１９】
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【表２−２２０】
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【表２−２２２】
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【表２−２２３】
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【表２−２２５】
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【表２−２２６】
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【表２−２２７】
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【表２−２３０】
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【表２−２３１】
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【表２−２３３】
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【表２−２３４】
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【表２−２３５】
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【表２−２３６】
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【表２−２３７】
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【表２−２３８】
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【表２−２３９】
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【表２−２４０】
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【表２−２４１】
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【表２−２４２】
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【表２−２４３】
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【表２−２４４】
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【表２−２４５】
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【表２−２４６】
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【表２−２４７】
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【表２−２４８】
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【表２−２４９】
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【表２−２５０】
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【表２−２５１】
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【表２−２５２】
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【００７３】
本発明者らはさらに、ウッド−ユングダール微生物における主要な代謝経路および主要な代謝ノードを特定した（図１）。本発明は、標的代謝ノードを通じて、炭素フラックスを非不可欠または望ましくない代謝ノードから戦略的に転用するように妨害された遺伝子を含む微生物をさらに提供する。そのような株は、それらの標的代謝ノードの下流の生成物の改善された生成を有する。
【００７４】
本発明は、最終的には、ＣＯ、ＣＯ２、および／またはＨ２のうちの１つ以上を含むガス状基質などの基質の存在下で、本発明の微生物を培養することによって生成物を生成する方法を提供する。特定の生成物の生成を最適化するための妨害された遺伝子の可能な組み合わせは、実施例２〜１９に記載されている。
【００７５】
本明細書の他の箇所に記載されているように、そのような生成物としては、ウッド−ユングダール微生物の天然または非天然生成物を挙げることができる。例えば、そのような生成物としては、限定されないが、アセチル−ＣｏＡ、エタノール、アセテート、ブタノール、ブチレート、ブチリル−ＣｏＡ、２，３−ブタンジオール、ラクテート、ブテン、ブタジエン、メチルエチルケトン、エチレン、アセトン、イソプロパノール、脂質、３−ヒドロキシプロピオネート（３−ＨＰ）、イソプレン、ファルネセン、脂肪酸（脂肪酸エチルエステル、脂肪酸ブチルエステル）、２−ブタノール、１，２−プロパンジオール、１−プロパノール、コリスメート由来生成物、３−ヒドロキシブチレート、１，３−ブタンジオール、Ｃ６−Ｃ８アルコール（ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール）、カプロエート、オクタノエート、イソペンテニルピロホスフェート（ＩＰＰ）、ジメチルアリルピロホスフェート（ＤＭＡＰＰ）、アセトアセチル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシブチレート−ＣｏＡ（３−ＨＢ−ＣｏＡ）、マロニル−ＣｏＡ、ピルベート、デヒドロシキメート、コリスメート、パラ−ヒドロキシ安息香酸、サリチレート、２−アミノベンゾエート、２，３−ジヒドロキシベンゾエート、２−ヒドロキシシクロヘキサンカルボン酸、シトラマレート、ケトブチレート、アセトラクテート、アセトイン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンが挙げられる。
【実施例】
【００７６】
以下の実施例は、本発明をさらに例示するが、当然のことながら、いかなる方法によってもその範囲を制限すると解釈されるべきではない。
【００７７】
実施例１
本実施例は、ウッド−ユングダール微生物の代謝モデリングについて記載する。
【００７８】
Ｍａｒｃｅｌｌｉｎ、Ｇｒｅｅｎ  Ｃｈｅｍ、１８：３０２０−３０２８、２０１６に記載されているようなＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍのゲノム規模の代謝モデルを利用した。このモデルを使用して、妨害的な遺伝子突然変異を含む株の設計、構築、インシリコ増殖、およびスクリーニングをシミュレートして、より高い収率の天然化合物を生成するであろうものを予測した。加えて、多数の非天然化合物生成株用に、新しいゲノム規模のモデルを構築した。これらのために、異種遺伝子および代謝反応を野生型Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍモデル構造に添加して、非天然化合物生成経路の組み込みを示した。本明細書に記載の実験作業に使用されるモデルは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍに基づくが、代謝の類似性を考慮すると、結果は、他のウッド−ユングダール微生物にも当てはまると期待することは当然であり得る。
【００７９】
各化学生成株には、妨害的な遺伝子突然変異の異なる組み合わせを組み込む数百万の突然変異体株をインシリコで構築した。遺伝子の妨害の際にどの代謝反応が不活性化されたかを決定するために、ブーリアン遺伝子−タンパク質−反応の関連付け（Ｔｈｉｅｌｅ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，５：９３−１２１，２０１０）を使用した。突然変異体株の設計、構築、スクリーニングは、カメオバージョン０．１１．２（Ｓｏｎｎｅｎｓｃｈｅｉｎ，Ｂｉｏｓｕｓｔａｉｎ／Ｃａｍｅｏ：０．１１．０，ｄｏｉ：１０．５２８１／ｚｅｎｏｄｏ．８３５７３０，２０１７）およびｉｎｓｐｙｒｅｄ１．０．１版によって実行した進化的アルゴリズムを使用して実行された。
【００８０】
これらの突然変異体株の増殖は、２つの制約ベースのコンピューターモデリング技法：フラックスバランス分析（ＦＢＡ）および代謝調整の線形最小化（ＬＭＯＭＡ）を使用してシミュレートされた。これらの増殖シミュレーション技法は、２つの可能性のある代謝表現型、続いて遺伝的摂動を捕捉するために使用される（Ｍａｉａ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｏｎ−ＧＥＣＣＯ’１７，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＡＣＭ  Ｐｒｅｓｓ，１６６１−１６６８，２０１７）。実験的な代謝フラックスプロファイルを構築し、ＬＭＯＭＡシミュレーションの基準状態として使用した。ソルバーインターフェースとしてｏｐｔｌａｎｇバージョン１．２．３（Ｊｅｎｓｅｎ，Ｏｐｔｌａｎｇ：Ａｎ  Ａｌｇｅｂｒａｉｃ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｌａｎｇｕａｇｅ  ｆｏｒ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ，”Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，２，ｄｏｉ：１０．２１１０５／ｊｏｓｓ．００１３９，２０１７）、および最適化ソルバーとしてＧｕｒｏｂｉ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒバージョン７．０．２とともに、ｃｏｂｒａｐｙバージョン０．８．２（Ｅｂｒａｈｉｍ．，ＣＯＢＲＡｐｙ：ＣＯｎｓｔｒａｉｎｔｓ−Ｂａｓｅｄ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｐｙｔｈｏｎ，ＢＭＣ  Ｓｙｓｔ  Ｂｉｏｌ，７：７４，２０１３）からのスクリプトを使用して増殖シミュレーションを行った。
【００８１】
発酵生成物のものを含む増殖速度および主要な代謝フラックスを記録し、株のスクリーニングに使用した。各株のシミュレーションでは、バイオマスと生成物の結合収率（ｂｉｏｍａｓｓ−ｐｒｏｄｕｃｔ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｙｉｅｌｄ）（ＢＰＣＹ）および炭素モル収率を計算した。これらの収率を使用して、適合能スコアを決定した。
【００８２】
加えて、突然変異体株が増殖を行うために関心対象の化合物の生成を必要とするかどうか（増殖結合株設計）を決定するために、フラックス変動分析（ＦＶＡ）を実行した。増殖中に関心対象の化合物の最小境界フラックスがゼロ超の場合、その株は増殖結合として分類した。これらの増殖結合株の設計により、連続発酵中の発酵安定性が向上するはずである。この最小フラックスを炭素収率（ＦＶＡ最小収率）に変換し、株間の増殖結合のレベルを比較するために使用した。
【００８３】
実施例２
本実施例は、ウッド−ユングダール微生物でのアセテートの改善された生成への妨害について記載する。代謝モデリング実験は、実施例１に記載されるように実施した。アセテートは、ウッド−ユングダール微生物の天然生成物である。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【００８４】
実施例３
本実施例は、ウッド−ユングダール微生物でのエタノールの改善された生成への妨害について記載する。代謝モデリング実験は、実施例１に記載されるように実施した。エタノールは、ウッド−ユングダール微生物の天然生成物である。
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【表４−６】
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【表４−７】
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【表４−８】
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【表４−９】
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【００８５】
実施例４
本実施例は、ウッド−ユングダール微生物でのアセトンの改善された生成への妨害について記載する。代謝モデリング実験は、実施例１に記載されるように実施した。ウッド−ユングダール微生物におけるアセトンの生成は、例えばＷＯ２０１２／１１５５２７に記載されている。次の経路を使用して、本明細書のアセトン生成をモデル化した：２．０アセチル−ＣｏＡ−−＞ＣｏＡ＋アセトアセチル−ＣｏＡ、アセテート＋アセトアセチル−ＣｏＡ−−＞アセチル−ＣｏＡ＋アセトアセテート、アセトアセテート−−＞ＣＯ２＋アセトン、アセトン−−＞アセトン＿ｅｘｔ。
【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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【表５−５】
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【表５−６】
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【表５−７】
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【００８６】
実施例５
本実施例は、ウッド−ユングダール微生物でのイソプロパノールの改善された生成への妨害について記載する。代謝モデリング実験は、実施例１に記載されるように実施した。ウッド−ユングダール微生物におけるイソプロパノールの生成は、例えばＷＯ２０１２／１１５５２７に記載されている。次の経路を使用して、本明細書のイソプロパノール生成をモデル化した：２．０アセチル−ＣｏＡ−−＞ＣｏＡ＋アセトアセチル−ＣｏＡ、アセテート＋アセトアセチル−ＣｏＡ−−＞アセチル−ＣｏＡ＋アセトアセテート、アセトアセテート−−＞ＣＯ２＋アセトン、イソプロパノール−−＞イソプロパノール＿ｅｘｔ。
【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【表６−４】
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【表６−５】
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【表６−６】
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【表６−７】
2020535813.tif 000286
【００８７】
実施例６
本実施例は、ウッド−ユングダール微生物でのラクテートの改善された生成への妨害について記載する。代謝モデリング実験は、実施例１に記載されるように実施した。ラクテートは、ウッド−ユングダール微生物の天然生成物である。
【表７−１】
2020535813.tif 000287
【表７−２】
2020535813.tif 000288
【表７−３】
2020535813.tif 000289
【表７−４】
2020535813.tif 000290
【表７−５】
2020535813.tif 000291
【表７−６】
2020535813.tif 000292
【表７−７】
2020535813.tif 000293
【表７−８】
2020535813.tif 000294
【表７−９】
2020535813.tif 000295
【００８８】
実施例７
本実施例は、ウッド−ユングダール微生物での１，３−ブタンジオールの改善された生成への妨害について記載する。代謝モデリング実験は、実施例１に記載されるように実施した。ウッド−ユングダール微生物における１，３−ブタンジオールの生成は、例えばＷＯ２０１７／００６６４９８に記載されている。次の経路を使用して、本明細書の１，３−ブタンジオール生成をモデル化した：２．０アセチル−ＣｏＡ−−＞ＣｏＡ＋アセトアセチル−ＣｏＡ、ＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋＋アセトアセチル−ＣｏＡ−−＞ＮＡＤＰ＋（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、ホスフェート＋（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ−−＞ＣｏＡ＋（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ホスフェート、ＡＤＰ＋（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ホスフェート−−＞ＡＴＰ＋（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチレート＋還元フェレドキシン−−＞酸化フェレドキシン＋（Ｒ）−３−ヒドロキシブチルアルデヒド、ＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋＋（Ｒ）−３−ヒドロキシブチルアルデヒド−−＞ＮＡＤＰ＋１３ＢＤＯ、ＮＡＤＨ＋Ｈ＋＋（Ｒ）−３−ヒドロキシブチルアルデヒド−−＞ＮＡＤ＋１３ＢＤＯ、１３ＢＤＯ−−＞１３ＢＤＯ＿ｅｘｔ。
【表８−１】
2020535813.tif 000296
【表８−２】
2020535813.tif 000297
【表８−３】
2020535813.tif 000298
【００８９】
実施例８
本実施例は、ウッド−ユングダール微生物での２，３−ブタンジオールの改善された生成への妨害について記載する。代謝モデリング実験は、実施例１に記載されるように実施した。２，３−ブタンジオールは、少なくとも一部のウッド−ユングダール微生物の天然生成物である。
【表９−１】
2020535813.tif 000299
【表９−２】
2020535813.tif 000300
【表９−３】
2020535813.tif 000301
【表９−４】
2020535813.tif 000302
【表９−５】
2020535813.tif 000303
【表９−６】
2020535813.tif 000304
【表９−７】
2020535813.tif 000305
【表９−８】
2020535813.tif 000306
【表９−９】
2020535813.tif 000307
【表９−１０】
2020535813.tif 000308
【表９−１１】
2020535813.tif 000309
【表９−１２】
2020535813.tif 000310
【００９０】
実施例９
本実施例は、ウッド−ユングダール微生物での２−ブタノールの改善された生成への妨害について記載する。代謝モデリング実験は、実施例１に記載されるように実施した。ウッド−ユングダール微生物における２−ブタノールの生成は、例えばＷＯ２０１３／１８５１２３に記載されている。次の経路を使用して、本明細書の２−ブタノール生成をモデル化した：ＮＡＤＨ＋Ｈ＋＋（Ｒ）−アセトイン−−＞ＮＡＤ＋メソ−２，３−ブタンジオール、メソ−２，３−ブタンジオール−−＞Ｈ２Ｏ＋ＭＥＫ、ＭＥＫ＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋−−＞２−ブタノール＋ＮＡＤＰ、２−ブタノール−−＞２−ブタノール＿ｅｘｔ。
【表１０−１】
2020535813.tif 000311
【表１０−２】
2020535813.tif 000312
【表１０−３】
2020535813.tif 000313
【表１０−４】
2020535813.tif 000314
【００９１】
実施例１０
本実施例は、ウッド−ユングダール微生物での２−ヒドロキシイソ酪酸の改善された生成への妨害について記載する。代謝モデリング実験は、実施例１に記載されるように実施した。ウッド−ユングダール微生物における２−ヒドロキシイソ酪酸の生成は、例えばＷＯ２０１７／００６６４９８に記載されている。
【００９２】
次の経路を使用して、以下の行１〜４０での２−ヒドロキシイソ酪酸生成をモデル化した：２．０アセチル−ＣｏＡ−−＞ＣｏＡ＋アセトアセチル−ＣｏＡ、ＮＡＤＨ＋Ｈ＋＋アセトアセチル−ＣｏＡ−−＞ＮＡＤ＋（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ−−＞２ＨＩＢ−ＣｏＡ、２ＨＩＢ−ＣｏＡ＋Ｈ２Ｏ−−＞２ｈｉｂ＋ＣｏＡ、２ｈｉｂ−−＞２ｈｉｂ＿ｅｘｔ。
【００９３】
次の経路を使用して、以下の行４１〜９３での２−ヒドロキシイソ酪酸生成をモデル化した：２．０アセチル−ＣｏＡ−−＞ＣｏＡ＋アセトアセチル−ＣｏＡ、ＮＡＤＨ＋Ｈ＋＋アセトアセチル−ＣｏＡ−−＞ＮＡＤ＋（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ−−＞２ＨＩＢ−ＣｏＡ、２ＨＩＢ−ＣｏＡ＋ＡＤＰ＋ホスフェート−−＞２ｈｉｂ＋ＡＴＰ＋ＣｏＡ、２ｈｉｂ−−＞２ｈｉｂ＿ｅｘｔ。
【００９４】
次の経路を使用して、以下の行９４〜１０３での２−ヒドロキシイソ酪酸生成をモデル化した：２．０アセチル−ＣｏＡ−−＞ＣｏＡ＋アセトアセチル−ＣｏＡ、ＮＡＤＨ＋Ｈ＋＋アセトアセチル−ＣｏＡ−−＞ＮＡＤ＋（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ−−＞２ＨＩＢ−ＣｏＡ、２ＨＩＢ−ＣｏＡ＋アセテート−−＞２ｈｉｂ＋アセチル−ＣｏＡ、２ｈｉｂ−−＞２ｈｉｂ＿ｅｘｔ。
【表１１−１】
2020535813.tif 000315
【表１１−２】
2020535813.tif 000316
【表１１−３】
2020535813.tif 000317
【表１１−４】
2020535813.tif 000318
【表１１−５】
2020535813.tif 000319
【表１１−６】
2020535813.tif 000320
【表１１−７】
2020535813.tif 000321
【表１１−８】
2020535813.tif 000322
【表１１−９】
2020535813.tif 000323
【表１１−１０】
2020535813.tif 000324
【表１１−１１】
2020535813.tif 000325
【表１１−１２】
2020535813.tif 000326
【表１１−１３】
2020535813.tif 000327
【表１１−１４】
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【表１１−１５】
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【表１１−１６】
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【表１１−１７】
2020535813.tif 000331
【表１１−１８】
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【表１１−１９】
2020535813.tif 000333
【表１１−２０】
2020535813.tif 000334
【００９５】
実施例１１
本実施例は、ウッド−ユングダール微生物での３−ヒドロキシブチレートの改善された生成への妨害について記載する。代謝モデリング実験は、実施例１に記載されるように実施した。ウッド−ユングダール微生物における３−ヒドロキシブチレートの生成は、例えばＷＯ２０１７／０６６４９８に記載されている。次の経路を使用して、本明細書の３−ヒドロキシブチレート生成をモデル化した：３−ヒドロキシブチレート−−＞３−ヒドロキシブチレート＿ｅｘｔ、アセテート＋アセトアセチル−ＣｏＡ−−＞アセチル−ＣｏＡ＋アセトアセテート、ＮＡＤＨ＋Ｈ＋＋アセトアセテート−−＞ＮＡＤ＋３−ヒドロキシブチレート、２．０アセチル−ＣｏＡ−−＞ＣｏＡ＋アセトアセチル−ＣｏＡ。
【表１２−１】
2020535813.tif 000335
【表１２−２】
2020535813.tif 000336
【表１２−３】
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【表１２−４】
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【表１２−５】
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【表１２−６】
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【表１２−７】
2020535813.tif 000341
【表１２−８】
2020535813.tif 000342
【表１２−９】
2020535813.tif 000343
【表１２−１０】
2020535813.tif 000344
【表１２−１１】
2020535813.tif 000345
【００９６】
実施例１２
本実施例は、ウッド−ユングダール微生物でのメチルエチルケトン（ＭＥＫ）、即ち、２−ブタノンの改善された生成への妨害について記載する。代謝モデリング実験は、実施例１に記載されるように実施した。ウッド−ユングダール微生物におけるＭＥＫの生成は、例えばＷＯ２０１２／０２４５２２およびＷＯ２０１３／１８５１２３に記載されている。次の経路を使用して、本明細書のメチルエチルケトン生成をモデル化した：ＮＡＤＨ＋Ｈ＋＋（Ｒ）−アセトイン−−＞ＮＡＤ＋メソ−２，３−ブタンジオール、メソ−２，３−ブタンジオール−−＞Ｈ２Ｏ＋ＭＥＫ、Ｈ＋＋ＭＥＫ−−＞Ｈ＋＿ｅｘｔ＋ＭＥＫ＿ｅｘｔ。
【表１３−１】
2020535813.tif 000346
【表１３−２】
2020535813.tif 000347
【表１３−３】
2020535813.tif 000348
【表１３−４】
2020535813.tif 000349
【表１３−５】
2020535813.tif 000350
【表１３−６】
2020535813.tif 000351
【表１３−７】
2020535813.tif 000352
【表１３−８】
2020535813.tif 000353
【表１３−９】
2020535813.tif 000354
【表１３−１０】
2020535813.tif 000355
【００９７】
実施例１３
本実施例は、ウッド−ユングダール微生物でのアセトラクテートの改善された生成への妨害について記載する。代謝モデリング実験は、実施例１に記載されるように実施した。アセトラクテートは、少なくとも一部のウッド−ユングダール微生物の天然生成物である。
【表１４−１】
2020535813.tif 000356
【表１４−２】
2020535813.tif 000357
【表１４−３】
2020535813.tif 000358
【表１４−４】
2020535813.tif 000359
【表１４−５】
2020535813.tif 000360
【表１４−６】
2020535813.tif 000361
【表１４−７】
2020535813.tif 000362
【表１４−８】
2020535813.tif 000363
【表１４−９】
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【表１４−１０】
2020535813.tif 000365
【表１４−１１】
2020535813.tif 000366
【表１４−１２】
2020535813.tif 000367
【表１４−１３】
2020535813.tif 000368
【表１４−１４】
2020535813.tif 000369
【表１４−１５】
2020535813.tif 000370
【００９８】
実施例１４
本実施例は、ウッド−ユングダール微生物でのイソプレンの改善された生成への妨害について記載する。代謝モデリング実験は、実施例１に記載されるように実施した。ウッド−ユングダール微生物におけるイソプレンの生成は、例えばＷＯ２０１３／１８０５８４に記載されている。次の経路が使用して、本明細書のイソプレン生成をモデル化した：２．０アセチル−ＣｏＡ−−＞ＣｏＡ＋アセトアセチル−ＣｏＡ、２．０  ＮＡＤＨ＋２．０Ｈ＋＋（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ−−＞２．０ＮＡＤ＋ＣｏＡ＋（Ｒ）−メバロネート、ＡＴＰ＋（Ｒ）−メバロネート−−＞ＡＤＰ＋（Ｒ）−５−ホスホメバロネート、ＡＴＰ＋（Ｒ）−５−ホスホメバロネート−−＞ＡＤＰ＋（Ｒ）−５−ジホスホメバロネート、ＡＴＰ＋（Ｒ）−５−ジホスホメバロネート−−＞ＡＤＰ＋ホスフェート＋ＣＯ２＋イソペンテニルジホスフェート、イソペンテニルジホスフェート−−＞ＤＭＡＰＰ、ＤＭＡＰＰ−−＞ＰＰｉ＋イソプレン、Ｈ２Ｏ＋アセチル−ＣｏＡ＋アセトアセチル−ＣｏＡ−−＞ＣｏＡ＋（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ、ソプレン−−＞イソプレン＿ｅｘｔ。これらの妨害は、ＩＰＰ／ＤＭＡＰＰ、および／またはファルネセンおよび他のテルペノイドなどのＩＰＰ／ＤＭＡＰＰの下流生成物の生成を改善するのにも役立つ。
【表１５−１】
2020535813.tif 000371
【表１５−２】
2020535813.tif 000372
【表１５−３】
2020535813.tif 000373
【表１５−４】
2020535813.tif 000374
【表１５−５】
2020535813.tif 000375
【表１５−６】
2020535813.tif 000376
【表１５−７】
2020535813.tif 000377
【表１５−８】
2020535813.tif 000378
【表１５−９】
2020535813.tif 000379
【００９９】
実施例１５
本実施例は、ウッド−ユングダール微生物でのアジピン酸の改善された生成への妨害について記載する。代謝モデリング実験は、実施例１に記載されるように実施した。ウッド−ユングダール微生物におけるアジピン酸の生成は、例えばＷＯ２０１７／００６６４９８に記載されている。次の経路を使用して、本明細書のアジピン酸生成をモデル化した：ＡＴＰ＋ＣｏＡ＋スクシネート−−＞ＡＤＰ＋ホスフェート＋スクシニル−ＣｏＡ、ＮＡＤ＋ＣｏＡ＋２−オキソグルタレート−−＞ＮＡＤＨ＋ＣＯ２＋スクシニル−ＣｏＡ、アセチル−ＣｏＡ＋スクシニル−ＣｏＡ−−＞ＣｏＡ＋３−オキソ−アジピル−ＣｏＡ、ＮＡＤＨ＋Ｈ＋＋３−オキソ−アジピル−ＣｏＡ−−＞ＮＡＤ＋３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシアジピル−ＣｏＡ−−＞２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡ、ＮＡＤＨ＋Ｈ＋＋２，３−デヒドロアジピル−ＣｏＡ−−＞ＮＡＤ＋アジピル−ＣｏＡ、ホスフェート＋アジピル−ＣｏＡ−−＞ＣｏＡ＋アジピル−Ｐ、ＡＤＰ＋アジピル−Ｐ−−＞ＡＴＰ＋アジペート、アジペート−−＞アジペート＿ｅｘｔ。
【表１６−１】
2020535813.tif 000380
【表１６−２】
2020535813.tif 000381
【表１６−３】
2020535813.tif 000382
【表１６−４】
2020535813.tif 000383
【表１６−５】
2020535813.tif 000384
【表１６−６】
2020535813.tif 000385
【０１００】
実施例１６
本実施例は、ウッド−ユングダール微生物での２−アミノベンゾエートの改善された生成への妨害について記載する。代謝モデリング実験は、実施例１に記載されるように実施した。ウッド−ユングダール微生物における２−アミノベンゾエートの生成は、例えばＷＯ２０１６／１９１６２５に記載されている。次の経路を使用して、本明細書の２−アミノベンゾエートの生成をモデル化した：ＮＨ３＋コリスメート＝＞Ｈ２Ｏ＋ピルベート＋Ｈ＋＋２−アミノベンゾエート。
【表１７−１】
2020535813.tif 000386
【表１７−２】
2020535813.tif 000387
【表１７−３】
2020535813.tif 000388
【表１７−４】
2020535813.tif 000389
【表１７−５】
2020535813.tif 000390
【表１７−６】
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【表１７−７】
2020535813.tif 000392
【表１７−８】
2020535813.tif 000393
【０１０１】
実施例１７
本実施例は、ウッド−ユングダール微生物でのサリチレートの改善された生成への妨害について記載する。代謝モデリング実験は、実施例１に記載されるように実施した。ウッド−ユングダール微生物におけるサリチレートの生成は、例えばＷＯ２０１６／１９１６２５に記載されている。次の経路を使用して、本明細書のサリチレート生成をモデル化した：コリスメート−−＞イソコリスメート、イソコリスメート−−＞サリチレート＋ピルベート。
【表１８】
2020535813.tif 000394
【０１０２】
実施例１８
本実施例は、ウッド−ユングダール微生物でのコリスメートの改善された生成への妨害について記載する。代謝モデリング実験は、実施例１に記載されるように実施した。ウッド−ユングダール微生物におけるコリスメートの生成は、例えばＷＯ２０１６／１９１６２５に記載されている。コリスメートは、少なくとも一部のウッド−ユングダール微生物の天然生成物である。これらの同じ妨害は、コリスメートのすぐ上流の代謝ノードであるデヒドロシキメートを通じたフラックスを同様に増加させると期待されるであろう。
【表１９−１】
2020535813.tif 000395
【表１９−２】
2020535813.tif 000396
【表１９−３】
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【表１９−４】
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【表１９−５】
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【０１０３】
実施例１９
本実施例は、ウッド−ユングダール微生物でのファルネセンの改善された生成への妨害について記載する。代謝モデリング実験は、実施例１に記載されるように実施した。ウッド−ユングダール微生物におけるファルネセンの生成は、例えばＷＯ２０１３／１８０５８４に記載されている。次の経路を使用して、本明細書でファルネセン生成をモデル化した：２．０アセチル−ＣｏＡ−−＞ＣｏＡ＋アセトアセチル−ＣｏＡ、Ｈ２Ｏ＋アセチル−ＣｏＡ＋アセトアセチル−ＣｏＡ−−＞ＣｏＡ＋（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ、２．０ＮＡＤＨ＋２．０Ｈ＋＋（Ｓ）−３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ−−＞２．０ＮＡＤ＋ＣｏＡ＋（Ｒ）−メバロネート、ＡＴＰ＋（Ｒ）−メバロネート−−＞ＡＤＰ＋（Ｒ）−５−ホスホメバロネート、ＡＴＰ＋（Ｒ）−５−ジホスホメバロネート−−＞ＡＤＰ＋ホスフェート＋ＣＯ２＋イソペンテニルジホスフェート、ＡＴＰ＋（Ｒ）−５−ジホスホメバロネート−−＞ＡＤＰ＋ホスフェート＋ＣＯ２＋イソペンテニルジホスフェート、イソペンテニルジホスフェート−−＞ＤＭＡＰＰ、２．０イソペンテニルジホスフェート＋ＤＭＡＰＰ−−＞ＰＰｉ＋トランス，トランス−ファルネシル−ジホスフェート、トランス，トランス−ファルネシルジホスフェート−−＞ファルネセン＋ＰＰｉ、ファルネセン−−＞ファルネセン＿ｅｘｔ。
【表２０−１】
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【表２０−２】
2020535813.tif 000401
【表２０−３】
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【表２０−４】
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【表２０−５】
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【表２０−６】
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【表２０−７】
2020535813.tif 000406
【０１０４】
実施例２０
本実施例は、異なる生成物経路にわたり共通の遺伝子妨害標的について記載する。４４４の経路で進化的アルゴリズムを使用して最適化を実行した。各株設計は、達成された収率（非増殖結合設計）およびバイオマス生成物結合収率（増殖結合設計）に基づいて採点した。各遺伝子は、株設計での出現頻度に基づいてランク付けした。最適化された株の妨害に、１９個の遺伝子が共通して同定された。
【表２１】
2020535813.tif 000407
【０１０５】
実施例２１
本実施例は、独立栄養増殖中の標的化合物の生成を増加させる遺伝子妨害標的について説明する。この戦略は、他の発酵副生成物の生成を排除または減少させ、標的化合物を必要な増殖副生成物にすることに関与する。代謝モデリング実験は、実施例１に記載されるように実施した。
【０１０６】
モデリングは、この戦略が、最小限のＡＴＰの負荷での標的化合物の生成に適切であることを実証する。この戦略は、独立栄養増殖中に著しいＡＴＰ負荷を伴う生成物にはあまり好適ではない。これは、この戦略が、酢酸キナーゼによって触媒された基質レベルのリン酸化を排除することを通じて、細胞のＡＴＰ収率を減少させるためである。
【０１０７】
具体的には、アセトン、イソプロパノール、１，３−ブタンジオール、３−ヒドロキシブチレート、２−ヒドロキシイソブチレート、３−ヒドロキシイソバレレート、およびアジピン酸などの生成物の生成は、酢酸キナーゼおよび／またはリン酸トランスアセチラーゼをコードする遺伝子に妨害的突然変異を導入すること、ならびに任意選択的に、アセト乳酸デカルボキシラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、またはシトラマル酸シンターゼをコードする１つ以上の遺伝子に妨害的突然変異をさらに導入すること、によって改善することができる。
【０１０８】
フラックス変動分析を使用して各モデルを評価して、通常の増殖中に標的化合物に向かう最小必要フラックスを決定した。次いで、提案された一組の妨害的な遺伝子突然変異を各モデルに適用した。化合物生成と増殖との間の結合の存在を特定するために、フラックス変動分析を再度実行した。シミュレーションは、ｃｏｂｒａｐｙバージョン０．１３．４を使用して実行した。
【表２２】
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【０１０９】
実施例２２
本実施例は、必要なアセテートの同時生成を減少させることによって、ＣＯの割合が低いガス混合物での独立栄養増殖中の標的化合物生成を増加させることについて記載する。代謝モデリング実験は、実施例１に記載されるように実施した。
【０１１０】
この戦略は、ＮＡＤＰＨが過剰になるように酸化還元補因子のバランスの調節に関与する。酸化還元の恒常性を維持するために、細胞は、生成経路にＮＡＤＰＨを必要とする生成物を作製する必要がある。アセテート生成はこれを満たさないため、細胞は最大の増殖速度を達成するために他の生成物を作製する必要があるであろう。
【０１１１】
モデリングは、この戦略が、アセテートの同時生成を必要とするＡＴＰの負荷での標的化合物の生成に適切であることを実証する。この戦略は、エタノールを一次生成物として生成する株にも適切である。この戦略は、細胞がヒドロゲナーゼ酵素を利用してフェレドキシンおよびＮＡＤ（Ｐ）＋を還元することができる場合、低ＣＯガスで機能すると予測される。場合によっては、この戦略によって細胞のエネルギー代謝の効率が低減されるため、標的化合物の最大可能収率が減少する。
【０１１２】
具体的には、ＮＡＤ依存性電子分岐［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼ（例えばＨｙｄ）をコードする遺伝子に妨害的突然変異を導入すること、および任意選択的に、グルタミン酸シンターゼ、シトラマル酸シンターゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ、または乳酸デヒドロゲナーゼをコードする１つ以上の遺伝子に妨害的突然変異をさらに導入することによって、エタノール、アセトン、イソプロパノール、１，３−ブタンジオール、２−ブタノール、２−ヒドロキシイソブチレート、３−ヒドロキシイソバレレート、アジピン酸、メチルエチルケトン、イソプレン、サリチレート、コリスメート、およびファルネセンなどの生成物の生成を改善することができる。
【０１１３】
フラックス変動分析を使用して各モデルを評価して、高増殖速度でのアセテートへの最小必要フラックスを決定した。次いで、提案された一組の妨害的な遺伝子突然変異を各モデルに適用した。この酵素のノックアウトを表すのに、ＮＡＤ依存性ヒドロゲナーゼ（Ｈｙｄ）を化学量論的マトリックスから除外した。この酵素の妨害を表すのに、グルタミン酸シンターゼ反応を通じたフラックスを３０％減少させた。フラックス変動分析を再度実行して、最大増殖を達成するために最小アセテート生成要件を決定した。シミュレーションは、ｃｏｂｒａｐｙバージョン０．１３．４を使用して実行した。
【表２３】
2020535813.tif 000409
【０１１４】
実施例２３
本実施例は、中央代謝ノードであるアセトアセチル−ＣｏＡを通じたフラックスの増加について記載する。このノードを通じてフラックスを増加させると、アセトン、イソプロパノール、３−ヒドロキシイソバレリル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシイソバレレート、イソブチレン、イソペンテニルピロホスフェート（ＩＰＰ）、ジメチルアリルピロホスフェート（ＤＭＡＰＰ）、イソプレン、ファルネセンなどのテルペノイド、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ、クロトニル−ＣｏＡ、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシブチリルアルデヒド、１，３−ブタンジオール、２−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡ、２−ヒドロキシイソブチレート、ブチリル−ＣｏＡ、ブチレート、ブタノール、カプロエート、ヘキサノール、オクタノエート、オクタノール、１，３−ヘキサンジオール、２−ブテン−１−オール、イソバレリル−ＣｏＡ、イソバレレート、またはイソアミルアルコールなどの下流生成物の生成が増加するであろう。代謝モデリング実験は、実施例１に記載されるように実施した。
【０１１５】
ほとんどのウッド−ユングダール微生物は、アセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに天然で変換することができないので、このステップでは、チオラーゼなどの異種酵素（即ち、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ）（ＥＣ２．３．１．９）の導入を必要とし得る。チオラーゼは、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ（ＷＰ＿０１０９６６１５７．１）、ＰｈａＡ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ（ＷＰ＿０１３９５６４５２．１）、ＢｋｔＢ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ（ＷＰ＿０１１６１５０８９．１）、ＡｔｏＢ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＮＰ＿４１６７２８．１）からのＴｈｌＡであり得る。
【０１１６】
具体的には、アセトアセチル−ＣｏＡを通じたフラックスは、ＮＡＤ依存性電子−分岐［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼ（例えばＨｙｄ）、グルタミン酸シンターゼ、シトラマル酸シンターゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、リン酸トランスアセチラーゼ、またはアルデヒドデヒドロゲナーゼのうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上をコードする１つ以上の遺伝子に妨害的突然変異を導入することによって改善することができる。
【表２４】
2020535813.tif 000410
【０１１７】
本明細書に列挙される公表文献、特許出願、および特許を含む全ての参考文献は、各参考文献があたかも参照により組み込まれることが個々にかつ具体的に示され、かつその全体が本明細書中に記載された場合と同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書におけるいかなる先行技術への言及も、その先行技術がいかなる国における努力傾注分野の共通の一般的知識の一部をなすという承認ではなく、かつそのように解釈されるべきではない。
【０１１８】
本発明の記載との関連で（特に、以下の特許請求の範囲との関連で）、「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語ならびに同様の指示語の使用は、本明細書中に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに相反することがない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるものとする。「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有すること」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「含有すること」という用語は、特に断りのない限り、非限定的な用語（即ち、「〜を含むがこれらに限定されないこと」を意味する）として解釈されるものとする。「から本質的になる」という用語は、組成物、プロセス、または方法の範囲を、特定の材料もしくはステップ、または組成物、プロセス、もしくは方法の基本的および新規の特性に実質的に影響しないものに限定する。代替の使用（例えば、「または」）は、代替のうちの一方、両方、またはそれらの任意の組み合わせを意味すると理解されるべきである。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、別段の指示がない限り、示された範囲、値、または構造の±２０％を意味する。
【０１１９】
本明細書の値の範囲の記載は、本明細書に別段の指示がない限り、範囲内に入る各それぞれの値を個々に言及する省略法としての機能を果たすことを単に意図し、各それぞれの値は、あたかも本明細書に個々に記載されたかのように、本明細書中に組み込まれる。例えば、任意の濃度範囲、パーセント範囲、比率範囲、整数範囲、サイズ範囲、または厚さ範囲は、列挙された範囲内の任意の整数の値、および必要に応じてその端数（別段の指示がない限り、整数の１／１０および１００分の１など）を含むと理解されるものである。
【０１２０】
本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに相反することがない限り、任意の好適な順序で実施され得る。本明細書に提供されるありとあらゆる実施例または例示的な用語（例えば、「など」）の使用は、本発明をよりよく理解することを単に意図し、別段特許請求の範囲に記載されない限り、本発明の範囲を制限しない。本明細書におけるいかなる文言も、本発明の実施に不可欠な任意の特許請求されていない要素を示すものと解釈するべきではない。
【０１２１】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載される。それらの好ましい実施形態の変化形は、上記の説明を読むことによって当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者が必要に応じてそのような変化形を採用することを予想し、本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載されるものとは別の方法で実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用法によって許可された通り、本明細書に添付される特許請求の範囲に記載される主題の全ての修正物および均等物を含む。さらに、上記の要素のそれらの全ての考えられる変化形におけるあらゆる組み合わせは、本明細書中に他に指示がない限り、または文脈によって明らかに相反することがない限り、本発明によって包含される。
【図１】
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【国際調査報告】
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