(57)【要約】  本発明は、ＣＸＣＲ４に対する単一特異的抗体又はその結合断片、その発生機序がＣＸＣＲ４の活性化に関する疾患の治療におけるこのような抗ＣＸＣＲ４抗体又は結合断片の使用の他に、このような抗ＣＸＣＲ４抗体又は結合断片を含む医薬組成物に関する。
2020508697.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）配列番号１３若しくは１４のアミノ酸配列又は１つ以上の保存的改変により前記アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び
（ｉｉ）配列番号１５、１６、１７、１８若しくは１９のアミノ酸配列又は１つ以上の保存的改変により前記アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、単一特異的抗体又は結合断片。
【請求項２】
（ｉ）配列番号１の配列又は１つ以上の保存的改変により前記アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１Ｌ；配列番号２の配列又は１つ以上の保存的改変により前記アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２Ｌ；及び配列番号３若しくは４の配列又は１つ以上の保存的改変により前記アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３Ｌを含む可変軽鎖；及び
（ｉｉ）配列番号５若しくは６の配列又は１つ以上の保存的改変により前記アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１Ｈ；配列番号７、８、９若しくは１０の配列又は１つ以上の保存的改変により前記アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２Ｈ；及び配列番号１１若しくは１２の配列又は１つ以上の保存的改変により前記アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３Ｈを含む可変重鎖を有する、単一特異的抗体又は結合断片。
【請求項３】
操作されたヒト抗体又は結合断片である、請求項１又は２に記載の単一特異的抗体又は結合断片。
【請求項４】
ｌｇＧ１アイソタイプである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単一特異的抗体又は結合断片。
【請求項５】
ＣＸＣＲ４を発現するがんの治療において使用するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単一特異的抗体又は結合断片。
【請求項６】
バーキットリンパ腫の治療において使用するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単一特異的抗体又は結合断片。
【請求項７】
乳がんの治療において使用するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単一特異的抗体又は結合断片。
【請求項８】
治療される対象がヒト対象である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
哺乳動物対象においてＣＸＣＲ４発現がん細胞を検出する方法であって、
（ｉ）がん細胞を含有する生検若しくは液体試料を、前記対象から採取すること、及び前記がん細胞におけるＣＸＣＲ４の発現を検出する免疫化学若しくは免疫組織化学アッセイにおいて、請求項１〜４のいずれかに記載の単一特異的抗体若しくは結合断片を使用すること、又は
（ｉｉ）放射性標識された請求項１〜４のいずれかに記載の単一特異的抗体若しくは結合断片を、前記対象に非経口的に投与すること、及び免疫シンチグラフィーにより前記対象中の抗体若しくは結合断片を検出すること
を含む、方法。
【請求項１０】
哺乳動物対象がヒト対象である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
治療有効量の請求項１〜４のいずれかに記載の単一特異的抗体又は結合断片、及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
治療有効量の請求項１〜４のいずれかに記載の単一特異的抗体又は結合断片、非経口的に許容される希釈剤、及び任意選択的に、薬学的に許容される賦形剤を含む、対象への非経口投与のための医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれかに記載の単一特異的抗体又は結合断片を含む、診断キット。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれかに記載の単一特異的抗体又は結合断片をコードする、ポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単一特異的抗ＣＸＣＲ４抗体及び結合断片、発生機序がＣＸＣＲ４の活性化に関する疾患の治療におけるこのような抗ＣＸＣＲ４抗体及び結合断片の使用、並びに、このような抗ＣＸＣＲ４抗体及び結合断片を含む医薬組成物及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
７回膜貫通ドメイン受容体としても公知であるＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、一般に、様々な生物学的及び病理学的プロセスにおいて重要な役割を果たす、タンパク質のスーパーファミリーを形成する。ケモカイン受容体はＧＰＣＲのサブファミリーであり、近くの応答性細胞において定方向走化性を誘導するそのリガンド（すなわち、ケモカイン）の能力にちなんで命名されている。これらのケモカイン受容体のうち、ＣＸＣＲ４（当技術分野において、例えば、ＬＥＳＴＲ、Ｆｕｓｉｎ又はＣＤ１８４としても公知）は、白血球の定方向遊走及び活性化を媒介することにより免疫及び炎症応答において重要な役割を果たす。ＣＸＣＲ４はまた、様々ながん細胞株及び組織において発現されるか又は過剰発現されることが、示されている。ＣＸＣＲ４の重要なリガンドは、間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１、ＣＸＣＬ１２としても公知）である。ＣＸＣＲ４とＳＤＦ−１との相互作用は、腫瘍成長、浸潤、血管新生及び転移などの腫瘍発生の複数の段階において重要な役割を果たしていると思われる。ユビキチンはＣＸＣＲ４の別の公知のリガンドである。
【０００３】
ＣＸＣＲ４活性化に関する疾患を治療するとの観点で、いくつものＣＸＣＲ４アンタゴニストが同定及び／又は開発されている。例えば、ビシクラムＣＸＣＲ４アンタゴニストであるプレリキサホル又はＡＭＤ３１００は、多発性骨髄腫及び非ホジキンリンパ腫を有する患者における回収及びその後の自家移植のために血流に造血幹細胞を動員させるために顆粒球コロニー刺激因子と組み合わせて使用することをＦＤＡにより承認されている。ＣＸＣＲ４アンタゴニストペプチドであるＬＹ２５１０９２４は現在、がんの第ＩＩ相臨床試験にある。
【０００４】
公知の抗ＣＸＣＲ４抗体の例は１２Ｇ５であり、これは一般的に、研究室の実験において試薬／陽性対照として使用されるマウス抗体である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＣＸＣＲ４を標的とする利用可能な又は開発中のいくつもの剤があるが、ＣＸＣＲ４を標的とする効果的な治療剤の必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、ＣＤＲ１Ｌ、ＣＤＲ２Ｌ及びＣＤＲ３Ｌを有する軽鎖可変領域並びにＣＤＲ１Ｈ、ＣＤＲ２Ｈ及びＣＤＲ３Ｈを有する重鎖可変領域を含む単一特異的抗体又はその結合断片であって、前記ＣＤＲ１Ｌが配列番号１のアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ２Ｌが配列番号２のアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ３Ｌが配列番号３又は４のアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ１Ｈが配列番号５又は６のアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ２Ｈが配列番号７、８、９又は１０のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＣＤＲ３Ｈが配列番号１１又は１２のアミノ酸配列を含む、単一特異的抗体又はその結合断片に関する。また、１つ以上の保存的改変を含有する配列番号１〜１２の配列のバリアントも包含される。抗体又は結合断片は、ヒトＣＸＣＲ４に特異的に結合する。
【０００７】
本発明は、配列番号１３又は１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、単一特異的抗体又はその結合断片にさらに関する。また、保存的改変を含有する後者の配列のバリアントも包含される。単一特異的抗体又は結合断片は、配列番号１５、１６、１７、１８又は１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をさらに含む。１つ以上の保存的改変を含有する後者の配列のバリアントも包含される。抗体又は結合断片は、ヒトＣＸＣＲ４に特異的に結合する。
【０００８】
特定の実施形態では、本発明の上記の単一特異的抗体又は結合断片は、それぞれ、ヒトの操作された抗体又は結合断片である。
【０００９】
より特定の実施形態では、本発明の上記の単一特異的抗体は、ＩｇＧアイソタイプである。
【００１０】
本発明は、本発明の単一特異的抗体及び結合断片の治療応用の他に、診断応用をさらに包含する。
【００１１】
ヒト又は別の哺乳動物対象においてＣＸＣＲ４発現がん細胞を発見するためのインビトロ診断アッセイにおいて、対象から採取されたがん細胞を含有する生検又は液体試料は、ＣＸＣＲ４を検出するために本発明の単一特異的抗体又は結合断片を用いる免疫化学又は免疫組織化学アッセイにおいて分析され得る。ヒト又は他の哺乳動物対象においてＣＸＣＲ４発現がん細胞及び組織を発見するためのインビボ診断アッセイは、放射性に標識された本発明の単一特異的抗体又は結合断片を使用し得る。アッセイにおいて、放射性標識された抗体又は結合断片は、対象に典型的には非経口的に投与され、その後に免疫シンチグラフィーにより抗体又は結合断片の分布が評価される。
【００１２】
本発明は、バーキットリンパ腫及び乳がんなどのＣＸＣＲ４を発現するがんを治療する方法であって、治療有効量の本発明の単一特異的抗体又は結合断片をこのような治療を必要とするヒト又は他の哺乳動物対象に投与することを含む方法に、さらに関する。本発明は、バーキットリンパ腫及び乳がんなどのＣＸＣＲ４を発現するがんの治療のための、本発明の単一特異的抗体又は結合断片の使用にさらに関する。
【００１３】
本発明は、ＣＸＣＲ４を発現する乳がん又は別のがんの転移を予防する方法であって、治療有効量の本発明の単一特異的抗体又は結合断片をこのような治療を必要とするヒト又は非ヒト哺乳動物対象に投与することを含む方法に、さらに関する。本発明は、ＣＸＣＲ４を発現する乳がん又は他のがんの転移の予防のための、本発明の単一特異的抗体又は結合断片の使用にさらに関する。
【００１４】
本発明はまた、治療有効量の本発明の単一特異的抗体又は結合断片及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に関する。典型的に、このような医薬組成物は対象への非経口投与のためのものであり、したがって、治療有効量の本発明の単一特異的抗体又は結合断片、非経口的に許容される希釈剤、及び任意選択的に、薬学的に許容される賦形剤を含む。本発明の単一特異的抗体又は結合断片を含む診断キットも包含される。
【００１５】
本発明はまた、本発明の単一特異的抗体又は結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。したがって、本発明はまた、ＣＤＲ１Ｌ、ＣＤＲ２Ｌ及びＣＤＲ３Ｌを有する軽鎖可変領域並びにＣＤＲ１Ｈ、ＣＤＲ２Ｈ及びＣＤＲ３Ｈを有する重鎖可変領域を含む単一特異的抗体又はその結合断片をコードするポリヌクレオチド（又は単離されたポリヌクレオチド）であって、前記ＣＤＲ１Ｌが配列番号１のアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ２Ｌが配列番号２のアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ３Ｌが配列番号３又は４のアミノ酸配列を含み、前記ＣＤＲ１Ｈが配列番号５又は６のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２Ｈが配列番号７、８、９又は１０のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＣＤＲ３Ｈが配列番号１１又は１２のアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチドに、関する。１つ以上の保存的改変を含有する配列番号１〜１２の配列のバリアントも、包含される。後者のポリヌクレオチドから発現される抗体又は結合断片は、ヒトＣＸＣＲ４に特異的に結合する。例えば、ポリヌクレオチドは、配列番号２０のＣＤＲ１Ｌをコードするポリヌクレオチド、配列番号２１のＣＤＲ２Ｌをコードするポリヌクレオチド、配列番号２２又は２３のＣＤＲ３Ｌをコードするポリヌクレオチド、配列番号２４又は２５のＣＤＲ１Ｈをコードするポリヌクレオチド、配列番号２６、２７、２８又は２９のＣＤＲ２Ｈをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号３０又は３１のＣＤＲ３Ｈをコードするポリヌクレオチドを含み得る。
【００１６】
より具体的には、単一特異的抗体又はその結合断片をコードするポリヌクレオチド（又は単離されたポリヌクレオチド）は、配列番号１３又は１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み得る。保存的改変を含有する後者の配列のバリアントも包含される。単一特異的抗体又は結合断片は、配列番号１５、１６、１７、１８又は１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をさらに含む。１つ以上の保存的改変を含有する後者の配列のバリアントも包含される。後者のポリヌクレオチドから発現される抗体又は結合断片は、ヒトＣＸＣＲ４に特異的に結合する。例えば、ポリヌクレオチドは、配列番号３２又は３３の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド及び配列番号３４、３５、３６、３７又は３８の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１ａ】図１は、実施例４に記載される通りに得られたＩｇＧ１フォーマットの本発明の抗体についてのＣＸＣＲ４結合の用量応答曲線を表す。図１ａ〜図１ｅは、それぞれ、Ｖ６２．１、Ｖ６２．１−Ｒ１０８Ｈ、Ｖ６２．１−Ｈ−ｍ８０、Ｖ６２．１−Ｈ−ｍ４３−ｍ３８及びＶ６２．１−Ｈ−ｍ４７−ｍ３８についての用量応答曲線を表す。
【図１ｂ】図１は、実施例４に記載される通りに得られたＩｇＧ１フォーマットの本発明の抗体についてのＣＸＣＲ４結合の用量応答曲線を表す。図１ａ〜図１ｅは、それぞれ、Ｖ６２．１、Ｖ６２．１−Ｒ１０８Ｈ、Ｖ６２．１−Ｈ−ｍ８０、Ｖ６２．１−Ｈ−ｍ４３−ｍ３８及びＶ６２．１−Ｈ−ｍ４７−ｍ３８についての用量応答曲線を表す。
【図１ｃ】図１は、実施例４に記載される通りに得られたＩｇＧ１フォーマットの本発明の抗体についてのＣＸＣＲ４結合の用量応答曲線を表す。図１ａ〜図１ｅは、それぞれ、Ｖ６２．１、Ｖ６２．１−Ｒ１０８Ｈ、Ｖ６２．１−Ｈ−ｍ８０、Ｖ６２．１−Ｈ−ｍ４３−ｍ３８及びＶ６２．１−Ｈ−ｍ４７−ｍ３８についての用量応答曲線を表す。
【図１ｄ】図１は、実施例４に記載される通りに得られたＩｇＧ１フォーマットの本発明の抗体についてのＣＸＣＲ４結合の用量応答曲線を表す。図１ａ〜図１ｅは、それぞれ、Ｖ６２．１、Ｖ６２．１−Ｒ１０８Ｈ、Ｖ６２．１−Ｈ−ｍ８０、Ｖ６２．１−Ｈ−ｍ４３−ｍ３８及びＶ６２．１−Ｈ−ｍ４７−ｍ３８についての用量応答曲線を表す。
【図１ｅ】図１は、実施例４に記載される通りに得られたＩｇＧ１フォーマットの本発明の抗体についてのＣＸＣＲ４結合の用量応答曲線を表す。図１ａ〜図１ｅは、それぞれ、Ｖ６２．１、Ｖ６２．１−Ｒ１０８Ｈ、Ｖ６２．１−Ｈ−ｍ８０、Ｖ６２．１−Ｈ−ｍ４３−ｍ３８及びＶ６２．１−Ｈ−ｍ４７−ｍ３８についての用量応答曲線を表す。
【図２】図２は、実施例１２の抗転移モデルにおいて測定されたマウスの乳房領域におけるインビボルシフェラーゼ活性を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、抗ＣＸＣＲ４抗体及びその使用の他に、抗ＣＸＣＲ４抗体を含む医薬組成物に関する。
【００１９】
本発明がより容易に理解され得るように、ある特定の用語が以下に具体的に定義される。この文献の他の箇所で明示的に定義されない限り、本明細書において使用される全ての他の科学技術用語は、関連技術の当業者により一般的に理解される意味を有する。
【００２０】
添付の特許請求の範囲を含めて本明細書において使用される場合、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」のような語の単数形は、明らかにそうでないことを文脈が指し示さない限り、対応する複数への言及を包含する。
【００２１】
「ヒトＣＸＣＲ４」という用語は、そのアミノ酸配列が、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ６１０７３を有するヒトＣＸＣＲ４の完全なアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％若しくは少なくとも９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるタンパク質を指し、又はＣＸＣＲ４と実質的に同じ生物学的機能を有するが、その配列が、１つ以上のアミノ酸の置換、挿入若しくは欠失によりヒトＣＸＣＲ４の完全なアミノ酸配列とは異なるタンパク質を指す。
【００２２】
「抗体」の一般構造は、当技術分野において周知である。ＩｇＧ型の抗体について、鎖間ジスルフィド結合を介して架橋された４つのアミノ酸鎖（２つの「重」鎖及び２つの「軽」鎖）がある。重鎖及び軽鎖のそれぞれは、可変のＮ末端領域及び定常領域を有する。免疫グロブリン抗体の定常領域はＦｃ部分と呼ばれ、ヒトにおいて高度に保存されている。各軽鎖／重鎖ペアの可変領域は、抗体の抗原結合部位を含む可変ドメインを形成する。
【００２３】
重鎖及び軽鎖可変領域のそれぞれは、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域が散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される、超可変性の領域にさらに細分され得る。各可変領域は、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で並んだ３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される。本明細書において、重鎖の３つのＣＤＲはＣＤＲ１Ｈ、ＣＤＲ２Ｈ及びＣＤＲ３Ｈと称され、軽鎖の３つのＣＤＲはＣＤＲ１Ｌ、ＣＤＲ２Ｌ及びＣＤＲ３Ｌと称される。ＣＤＲは、抗原との特異的相互作用を形成する残基のほとんどを含有する。以下において、重鎖及び軽鎖可変領域はそれぞれＨＣＶＲ及びＬＣＶＲと称されることがある。
【００２４】
本明細書において使用される場合、抗体若しくは結合断片又はその部分の所与のアミノ酸配列の「保存的改変」という用語は、アミノ酸配列を含有する抗体、結合断片又はその部分の結合性の特徴に有意に影響することもそれを有意に変化させることもない、アミノ酸改変を指す。このような保存的改変としては、アミノ酸の置換、付加及び欠失が挙げられる。改変は、部位特異的変異生成及びＰＣＲ媒介変異生成のような当技術分野において公知の標準技術により本開示の抗体中に導入され得る。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、関連する化学的特徴の側鎖を有するアミノ酸残基と置換されるものである。関連する化学的特徴の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）を有するアミノ酸が挙げられる。したがって、本開示の抗体のＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基と置換されてよく、改変された抗体は、本明細書において記載される機能アッセイを使用して抗原結合特性の保持について試験され得る。
【００２５】
本明細書において使用される配列のナンバリングは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａに従う。本明細書において使用されるＣＤＲの定義は、ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ６２６：７３２−７４５に記載されている方法に従う。
【００２６】
本発明による抗体は、Ｆｃ領域を含む、完全な若しくは全長の定常領域を含むインタクトなものであってよく、又は抗原結合部分を含みかつ抗原結合能力を保持するこのような抗体の部分若しくは断片（「結合断片」）であってよい。このような部分又は断片は、例えば、それぞれが定常及び可変領域を含有する一対の重鎖及び軽鎖断片から構成されるＦａｂ断片（「ｆｒａｇｍｅｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ」；すなわち、抗原に結合する抗体の領域）、又は本明細書において開示される抗ＣＸＣＲ４抗体のＣＤＲ若しくは可変領域を含むＦａｂ’若しくはＦ（ａｂ’）２断片を含み得る。さらには、このような部分又は断片は、軽鎖及び重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドから製造され得る単鎖Ｆｖ断片であって、後者のヌクレオチド配列がリンカー配列により分離されている単鎖Ｆｖ断片であり得る（例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ｖｏｌ．  １１３，  Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ  ２６９−３１５，  １９９４）。断片又は部分が特定されているかどうかにかかわらず、本明細書において使用される「結合断片」という用語は、別に指し示さない限り、このような断片又は部分の他に、単鎖形態を含む。タンパク質が、ＣＸＣＲ４に特異的又は優先的に結合する能力を保持しかつ本明細書において開示されるＣＤＲ配列を含む限り、タンパク質は、それぞれ、「抗体」及び「結合断片」という用語に含まれる。全長抗体のみが抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）のようなある特定のエフェクター機能を行い得ることが理解される。
【００２７】
本発明の抗体は、免疫グロブリンクラス（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ及びＩｇＥ）のいずれかから選択される重鎖定常領域を有してよい。好ましくは、本発明の抗体は、ＩｇＧ型であり、より好ましくはＩｇＧ１アイソタイプである。特に逆の記載がない限り、本明細書における「ＩｇＧ１」という用語はヒトＩｇＧ１を指すことが理解されるべきである。
【００２８】
「ヒトの操作された抗体」という用語は、ヒトゲノム配列に由来するフレームワーク、ヒンジ領域及び定常領域と同一又は実質的に同一（実質的にヒト）であるヒト起源のフレームワーク、ヒンジ領域及び定常領域を有する抗体を指す。完全ヒトフレームワーク、ヒンジ領域及び定常領域は、ヒト生殖細胞系列において発現される配列の他に、自発的な体細胞変異を含有する配列を包含する。ヒトの操作された抗体は、その中に１つ以上のアミノ酸置換、欠失若しくは付加及び／又はグリコシル化修飾を含有する完全ヒトフレームワーク、ヒンジ又は定常領域に由来するフレームワーク、ヒンジ又は定常領域を含み得る。「ヒトの操作された結合断片」は、ヒトの操作された抗体の部分又は断片を指す。多くの場合、ヒトの操作された抗体は、ヒトにおいて実質的に非免疫原性である。
【００２９】
様々な異なるヒトフレームワーク配列が、本発明のヒトの操作された抗体の基礎として単独又は組合せで使用されてよい。好ましくは、本発明の抗体のフレームワーク領域は、ヒト起源である又は実質的にヒトのもの（少なくとも９５％、９７％又は９９％のヒト起源）である。ヒト起源のフレームワーク領域の配列は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，  Ｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ＩＳＢＮ  ９７８−０−３８７−７６６４３−０から得ることができる。好ましくは、本発明による抗体において、重鎖のフレームワーク領域は、生殖細胞系列コンセンサス配列サブグループＩＩＩに対応する。好ましくはまた、本発明による抗体において、軽鎖のフレームワーク領域は、生殖細胞系列カッパーＩＩＩコンセンサス配列に対応する。
【００３０】
本明細書において使用される場合、「単一特異的抗体」又は「単一特異的抗体組成物」という用語は、同一のタンパク質配列を有する抗体分子の調製物を指す（イオン性又は酸化マイクロバリアントが挙げられる）。単一特異的抗体組成物は、特定のエピトープについて単一の結合特異性及び親和性を示す。
【００３１】
本明細書において使用される場合、「ヒトＣＸＣＲ４に特異的に結合する」抗体は、以下の本明細書の実施例４において記載される蛍光フローサイトメトリーベースのアッセイにおける測定で５０ｎＭ以下のＥＣ５０でヒトＣＸＣＲ４（及び場合により１つ以上の非ヒト種からのＣＸＣＲ４）に結合するが、例えばＣＸＣＲ７のような他のＧＰＣＲに実質的に結合しない抗体を指す。
【００３２】
抗体に言及する時に本明細書において使用される場合、非ＣＸＣＲ４タンパク質に「実質的に結合しない」という語句は、抗体が非ＣＸＣＲ４タンパク質に全く結合しない又は弱い結合のみを呈することを意味する。このような弱い結合のＥＣ５０値は、実施例４に記載される蛍光フローサイトメトリーベースのアッセイにおける測定で１００ｎＭ以上であり得る。
【００３３】
本明細書において使用される場合、ＡＤＣＣは抗体依存性細胞傷害性、すなわち、主にＦｃ領域により促される抗体のエフェクター機能である、抗体媒介性の細胞死を指す。ＩｇＧアイソタイプ、特にＩｇＧ１の抗体は、良好なＡＤＣＣ特性を有することが公知である。
【００３４】
本明細書においてＳＤＦ−１又はＣＸＣＬ１２に言及する場合、別の記載又は例示がなければ、それは、例えば、ＳＤＦ−１アルファ又はＣＸＣＬ１２ａ及びＳＤＦ−１ベータ又はＣＸＣＬ１２ｂなどの、任意の及び全てのヒトＳＤＦ−１バリアントを指すことが意図される。
【００３５】
結合特性に言及する場合、最大半量有効濃度５０（ＥＣ５０）は、所与の抗体のベースラインの結合と最大の結合との中間の応答を誘導する濃度である。それは、本明細書の実施例４に説明されるように、用量応答曲線を介して算出される。
【００３６】
「対象」は哺乳動物、好ましくはヒトである。
【００３７】
「治療すること」（又は「治療する」若しくは「治療」）という用語は、症状、障害、状態又は疾患の進行又は重症度を緩慢化させ、停止させ、低減させ又は後退させることを意味する。
【００３８】
「予防すること」（又は「予防する」若しくは「予防」）という用語は、症状、障害、状態又は疾患の出現、発生又は再発を妨げ、抑制し又は阻害することを意味する。
【００３９】
「治療有効量」という用語は、患者への単回又は複数回用量の投与により所望の治療を提供する、本発明の抗体の量又は用量を指す。
【００４０】
本発明の特定の抗体は、ファージディスプレイライブラリー、及び本明細書において記載される親和性成熟プロセスを起源とする。
【００４１】
ファージディスプレイライブラリーは、ヒトの操作された抗体の生成及び最適化のための出発点を提供する抗体断片の選択のための一般的に使用される技術である。例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  （２００５）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３：  １１０５−１１１６；Ｂｒａｄｂｕｒｙ  ＆  Ｍａｒｋｓ  （２００４）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２９０：  ２９−４９；及びＦｒｅｄｅｒｉｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００４）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  Ｄｅｓ．  ＳｅＩ．  １７：  ９５−１０６を参照。酵母、ｍＲＮＡ及びリボソームのディスプレイライブラリーなどの、生成及び親和性成熟（最適化）のために有用な他の種類のディスプレイ技術が抗体の選択及び最適化のために普及してきている（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、Ｂｒａｄｂｕｒｙ  ＆  Ｍａｒｋｓ、及びＦｒｅｄｅｒｉｃｋｓらを参照）。
【００４２】
ディスプレイライブラリーは、単鎖可変ドメイン抗体断片（ｓｃＦｖ）又はＦａｂ断片を提示するものであってよく、またコーディングＤＮＡ又はＲＮＡを含有してよい。それらは、高い遺伝的多様性又はレパートリーの大きさ（一般的に１０＾９〜１０＾１３）を有する。これらのライブラリーにおける遺伝的多様性は、一般的に、ナイーブ又は免疫化個体からの免疫グロブリン重鎖及び軽鎖可変遺伝子セグメントのレパートリーをクローニングすることにより作出される。あるいは、この多様性は、化学合成されたＣＤＲ断片の使用などの、ＣＤＲ配列の無作為化により、又はこれらの２つのアプローチの組合せにより達成され得る。次に、（このようなライブラリーからの選択のために）結合ステップが、表面上、（米国特許第６，７６１，９０２号に記載されるプロテオリポソームのような）リポソーム上、細胞上などに固定された、溶液中の標的（受容体）を用いて行われ得る。大規模な洗浄後、結合したクローンが回収され、さらなる選択ラウンドのために増幅される。
【００４３】
次に、より良好な安定性及び／又は向上した結合性などのような向上した特性を有する誘導体候補を得るための試みにおいて、最初の最良の結合抗体候補に対して親和性成熟プロセスが行われてよい。以下に限定されないが、定方向包括的変異生成（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、ＣＤＲ又は軽鎖／重鎖シャッフリング、ＣＤＲ中の点挿入若しくは欠失又はこれらのアプローチの任意の組合せのようないくつもの親和性成熟戦略が当業者に利用可能である。
【００４４】
本発明の特定の抗体は、本明細書の実施例１及び２において開示される抗体を含む。本発明はまた、本明細書において提供される可変領域の間のＣＤＲのそれぞれの及びあらゆる可能な交換を包含することが理解されるべきである。好ましくは、重鎖ＣＤＲは別の重鎖可変領域のＣＤＲと交換されてよく、同様に、軽鎖ＣＤＲは別の軽鎖可変領域のＣＤＲと交換されてよい。
【００４５】
抗体の合成
本発明の抗体は、当技術分野において周知の技術、例えば、組換え技術、インビトロタンパク質発現技術、又はこのような技術又は当技術分野において容易に知られる他の技術との組合せを使用して製造され得る。
【００４６】
例えば、Ｆａｂディスプレイライブラリーのスクリーニングから直接的に又は親和性成熟の後に得られるＦａｂ断片は、所望の定常領域をコードする適切な発現ベクターへのクローニングのような一般的に使用される技術によりＩｇＧに変換され得る。
【００４７】
ＩｇＧ抗体の直接的な製造のために、ＨＥＫ２９３又はＣＨＯ細胞のような適切な宿主細胞は、ＩｇＧ抗体を製造及び分泌するために好適な発現系を一過的に又は安定的に形質導入されてよい。発現系は、最適化された比で形質導入される重鎖及び軽鎖発現構築物を含み、又は発現可能な軽鎖遺伝子の他に重鎖遺伝子を含む単一のベクター系を含む。分泌された抗体は、多くの慣用技術のいずれかを使用して精製され得る。例えば、抗体を含有する培養培地は、適合性緩衝液、例えばリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）で平衡化されたプロテインＡ又はＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムに簡便に適用され得る。次に、非特異的に結合した成分を除去するためにカラムは洗浄される。結合した抗体は、例えばｐＨ勾配の適用により溶出される。抗体含有画分は、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出され、プールされる。意図する使用に応じて、抗体はさらに精製され得る。抗体は、一般的な技術を使用して濃縮及び／又は滅菌濾過され得る。可溶性凝集物及び多量体は、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換又はヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの一般的な技術により効果的に除去され得る。精製された抗体は、典型的に、冷蔵、冷凍又は凍結乾燥されて貯蔵され得る。
【００４８】
Ｆａｂ抗体が、細菌、真菌（酵母）又は昆虫細胞のような細胞を使用して同様に製造され得ることは当業者に知られている。
【００４９】
本発明の抗体の特性
Ｆａｂフォーマット及び／又はＩｇＧフォーマットの本発明の抗体は、いくつもの望ましい生物学的特性に関して特徴付けられた。
【００５０】
ＣＸＣＲ４への結合は、本発明による抗体の有効性の第１の基準である。本発明による抗体は、トランスフェクトされた発現可能な遺伝子からＣＸＣＲ４を発現する細胞及び／又はＣＸＣＲ４を発現する腫瘍細胞株を使用する実験により明らかにされたように、５０ｎＭ未満、好ましくは１０ｎＭ未満のＥＣ５０でＣＸＣＲ４に特異的に結合する。
【００５１】
ＩｇＧ抗体へのＦａｂ断片の変換は、一般に、受容体結合（ＥＣ５０）を向上させる。これもまた本発明の抗体で検証された。好ましくは、ＩｇＧ１フォーマットの場合、本発明による抗体は、５ｎＭ未満のＥＣ５０でＣＸＣＲ４に特異的に結合する。
【００５２】
本発明の抗体は、ＣＸＣＲ４受容体へのＳＤＦ−１の結合を阻害し、受容体活性化を防止する。ＳＤＦ−１のその受容体への結合の帰結としては、例えば、がん細胞の浸潤の重要なパラメーターである、カルシウムフラックスの誘導及び細胞遊走が挙げられる。本発明の抗体は、ＣＸＣＲ４発現細胞のカルシウムフラックスの誘導及び／又は遊走を阻害する。
【００５３】
トラスツズマブ及びリツキシマブのような抗体について実証されたように、ＡＤＣＣは、腫瘍に対する治療的抗体の重要な作用機序であり得る。本発明の抗体は、ＡＤＣＣの能力があることが示された。異種移植腫瘍モデルでの研究により、本発明の抗体の抗腫瘍活性が実証された。
【００５４】
医薬組成物及びこれらの投与
本発明はまた、本発明の抗体を含む医薬組成物に関する。後者の組成物は、優先的には非経口的に投与されるが、経鼻、経肺又は経皮送達もまた想定される。医薬組成物は、任意の従来の非毒性の薬学的に許容される賦形剤を含有してよく、液体配合物の場合、希釈剤を含有してよい。一部の場合には、配合物のｐＨは、配合された剤又はその送達形態の安定性を増進させるために薬学的に許容される酸、塩基又は緩衝剤で調整されてよい。本明細書において使用される非経口という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病巣内及び頭蓋内注射又は注入を含む。
【００５５】
本発明の抗体は、凍結乾燥配合物として又は溶液として貯蔵され得る。注射用調製物、例えば、無菌注射用水性又は油性懸濁液は、好適な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を使用して公知の技術に従って配合されてよい。無菌注射用調製物はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の無菌の注射溶液、懸濁液又はエマルションであってよい。用いられ得る許容される希釈剤には、水、リンゲル溶液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．及び等張性塩化ナトリウム溶液が含まれる。加えて、無菌の固定油が溶媒又は懸濁媒として従来通りに用いられる。組成物は、当技術分野において典型的に用いられる「薬学的に許容される」賦形剤又は安定化剤（これらの全ては「賦形剤」と称される。）をさらに含み得る。賦形剤は、例えば、緩衝剤、安定化剤、防腐剤、張度剤、非イオン性洗剤、酸化防止剤及び他の種々雑多な添加剤を含む。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ａ．  Ｏｓｏｌ，  Ｅｄ．  （１９８０）を参照）。このような添加剤は、用いられる投与量及び濃度においてレシピエントに対して非毒性でなければならない。
【００５６】
緩衝剤は、好ましくは、約２ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲内の濃度で存在する。好適な緩衝剤としては、クエン酸緩衝剤（例えば、クエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合物など）、コハク酸緩衝剤（例えば、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物など）、酒石酸緩衝剤（例えば、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物など）、フマル酸緩衝剤（例えば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物など）、フマル酸緩衝剤（例えば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸緩衝剤（例えば、グルコン酸−グリコン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｇｌｙｃｏｎａｔｅ）混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グリウコン酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｇｌｙｕｃｏｎａｔｅ）混合物など）、シュウ酸緩衝剤（例えば、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸緩衝剤（例えば、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物など）及び酢酸緩衝剤（例えば、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物など）のような有機及び無機の両方の酸及びこれらの塩が挙げられる。さらに、リン酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤及びトリスのようなトリメチルアミン塩を挙げることができる。防腐剤は、微生物増殖を遅らせるために加えられてよく、０．２％〜１％（ｗ／ｖ）の範囲内の量で加えられてよい。本発明で使用するための好適な防腐剤としては、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ベンザルコニウム（ｂｅｎｚａｌｃｏｎｉｕｍ）ハロゲン化物（例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物）、塩化ヘキサメトニウム、メチル又はプロピルパラベンのようなアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール及び３−ペンタノールが挙げられる。
【００５７】
医薬組成物の容量オスモル濃度は、組成物の意図する使用と適合する値に張度剤で調整されてよい。例えば、注射溶液の容量オスモル濃度は、水中の約０．９ｗ／ｖ％の塩化ナトリウムに相当するおおよそ血液の浸透圧に調整されてよい。好適な張度剤の例としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム及びマグネシウムの塩化物塩、デキストロース、グリセロール、プロピレングリコール、マンニトール、ソルビトール、エリスリトール、アラビトール、キシリトールなど及びこれらの混合物が挙げられる。張度剤は、典型的に、約０．００１〜約１％ｗ／ｖの範囲内の量で使用される。これらの量は、生理学的に許容される張度の提供において有用であることが判明している。好ましくは、張度剤は、１５０〜４５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、より好ましくは約２２０〜約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、最も好ましくは約２７０〜約３００ｍＯｓｍ／ｋｇの最終浸透値を組成物に提供する量で用いられる。
【００５８】
組成物は、安定化剤（ｓｔａｂｌｉｌｉｚｅｒ）をさらに含み得る。典型的な安定化剤は、多価糖アルコール（上に列記）；アルギニン、リシン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなどのようなアミノ酸、イノシトールのようなシクリトールを含めて、ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトール、ガラクチトール、グリセロールなどのような有機の糖又は糖アルコール；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、アルファ−モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウムのような硫黄含有還元剤；低分子量ポリペプチド（すなわち、１０残基未満）；ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；キシロース、マンノース、フルクトース、グルコースのような単糖；ラクトース、マルトース、スクロースのような二糖及びラフィノースのような三糖（ｔｒｉｓａｃｃａｃｈａｒｉｄｅｓ）；デキストランのような多糖であり得る。安定化剤は、本発明の抗体の質量の０．１〜１０，０００倍の質量範囲内で存在してよい。
【００５９】
本発明の抗体の可溶化を助けるための他に、撹拌誘導性の凝集からそれを保護するために湿潤剤を加えてよい。好適な湿潤剤としては、ポリソルベート（２０、８０など）、ポロキサマー（１８４、１８８など）、プルロニック．ＲＴＭ、ポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（Ｔｗｅｅｎ．ＲＴＭ．−２０、Ｔｗｅｅｎ．ＲＴＭ．−８０など）のような非イオン性界面活性剤が挙げられる。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．０７ｍｇ／ｍｌ〜約０．２ｍｇ／ｍｌの範囲内で存在してよい。
【００６０】
医薬組成物はまた、治療されている特定の適応症のために必要に応じて追加の活性化合物を含有してよく、好ましくは、本発明の抗体の活性に有害に影響しない活性を有する化合物を含有してよい。例えば、がんが治療されている場合、１つ以上の化学療法剤をさらに提供することが望ましいことがある。このような化合物は、好適には、意図する目的のために効果的な量の組合せで存在する。
【００６１】
医薬組成物は、例えば、滅菌濾過膜を通した濾過により、滅菌され得る。
【００６２】
本発明の抗体はまた、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合により調製されるマイクロカプセル中に捕捉されていてよく、例えば、それぞれ、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中又はマクロエマルション中のヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタシレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセル中に捕捉されていてよい。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ａ．  Ｏｓａｌ，  Ｅｄ．  （１９８０）に開示されている。
【００６３】
持続放出調製物が調製されてよい。本発明の抗体の送達のために適合され得る持続放出調製物の好適な例としては、成形品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの形態であるマトリックスである、抗体を含有する固形疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられる。持続放出マトリックスの例としては、ポリエステル、ハイドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−ビニルアセテート及び乳酸−グリコール酸のようなポリマーは１００日を超えて分子の放出を可能とするが、ある特定のハイドロゲルはより短い期間にわたりタンパク質を放出する。カプセル化された抗体が身体中に長期間残存する場合、これらは３７℃の水分への曝露の結果として変性又は凝集して、生物学的活性の喪失及び免疫原性の変化の可能性を結果としてもたらすことがある。関与する機序に応じて安定化のための合理的な戦略を工夫することができる。例えば、凝集の機序がチオール−ジスルフィド相互変換による分子間Ｓ−−Ｓ結合の形成であると発見された場合、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含有量を制御し、適切な添加剤を使用し、及び特定のポリマーマトリックス組成物を開発することにより、安定化が達成され得る。
【００６４】
投与方法は、対象の年齢及び症状を考慮して適切に選択することができる。本発明の抗体又は結合断片の医薬組成物中の用量は、例えば、各投与について約０．０００５〜約１００ｍｇ／ｋｇであってよい。より好ましくは、用量は、各投与について約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇであってよい。投与は、１日に数回、連日、２日毎、半週毎又は１週毎であってよい。しかしながら、本発明は、上記した数値により限定されない。用量及び投与方法は、対象の体重、年齢、症状などに応じて異なる。当業者は、上記した要因を考慮して適切な用量及び投与方法を設定することができる。
【００６５】
本発明の抗体の診断的使用
本発明の抗体及び結合断片は、診断アッセイ、例えば、特定の細胞、組織又は血清におけるＣＸＣＲ４の発現を検出するためのアッセイにおいて有用であり得る。診断応用のために、抗体は、典型的に、検出可能な部分により標識される。多数の標識が利用可能である。酵素標識の例としては、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４，７３７，４５６号）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）のようなペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、（ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼのような）複素環オキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが挙げられる。抗体に酵素をコンジュゲートさせる技術は、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍ．  （Ｅｄ．  Ｌａｎｇｏｎｅ  ＆  Ｖａｎ  Ｖｕｎａｋｉｓ），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ７３：  １４７−１６６  （１９８１）に記載されている。
【００６６】
時に、標識は抗体と間接的にコンジュゲートされる。当業者は、これを達成するための様々な技術を認識している。例えば、抗体がビオチンとコンジュゲートされてよく、かつ上記した標識のいずれかがアビジンとコンジュゲートされてよい、又はその逆であってよい。ビオチンはアビジンに選択的に結合し、したがって、標識は、この間接的な様式で抗体バリアントとコンジュゲートされ得る。あるいは、抗体との標識の間接的なコンジュゲートを達成するために、抗体は小さいハプテン（例えば、ジゴキシン）とコンジュゲートされ、かつ上記した異なる種類の標識のうちの１つは抗ハプテン抗体（例えば、抗ジゴキシン抗体）とコンジュゲートされる。このようにして、抗体との標識の間接的なコンジュゲートが達成され得る。
【００６７】
本発明の別の実施形態では、本発明の抗体は標識される必要がなく、その存在は、抗体に結合する標識された抗体を使用して検出され得る。
【００６８】
本発明の抗体又は結合断片は、競合結合アッセイ、直接及び間接サンドイッチアッセイ及び免疫沈降アッセイのような任意の公知の免疫化学アッセイ方法において用いられてよい。Ｚｏｌａ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ｐｐ．  １４７−１５８  （ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．  １９８７）。これらはまた、細胞及び組織上のＣＸＣＲ４の免疫組織化学検出のために使用され得る。免疫組織化学のために、組織試料、例えば腫瘍組織試料は、新鮮若しくは凍結されていてよく、又はパラフィン中に包埋され、例えばホルマリンのような防腐剤で固定されていてよい。
【００６９】
抗体はまた、インビボ診断アッセイのために使用されてよい。一般に、免疫シンチオグラフィー（ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｏｇｒａｐｈｙ）を使用してＣＸＣＲ４過剰発現細胞が局在化され得るように、抗体又は結合断片は、（１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、３Ｈ、３２Ｐ又は３５Ｓのような）放射性ヌクレオチドで標識される。
【００７０】
本発明の抗体又は結合断片は、キット、すなわち、診断アッセイを行うための使用説明書との予め決定された量の試薬のパッケージ化された組合せで提供され得る。抗体が酵素で標識されている場合、キットは、基質及び酵素により必要とされる補因子（例えば、検出可能な発色団又はフルオロフォアを提供する基質前駆体）を含んでよい。加えて、安定化剤、緩衝剤（例えば、遮断緩衝剤又は溶解緩衝剤）などのような他の添加剤が含まれてよい。様々な試薬の相対的な量は、アッセイの感度を実質的に最適化する試薬の溶液中の濃度を提供するために広範に異なってよい。特に、試薬は、溶解時に適切な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含む、通常は凍結乾燥された、乾燥粉末として提供されてよい。
【００７１】
本発明の抗体及び結合断片のヒト治療での使用
本発明の抗体は、幹細胞及び再生医療において使用され得る。ＳＤＦ−１アルファとのＣＸＣＲ４の相互作用は、骨髄中の造血幹細胞の保持において重要である。抗ＣＸＣＲ４抗体は、末梢血幹細胞として血流中に造血幹細胞を動員することができるアンタゴニストとして働き得る。末梢血幹細胞の動員は、（外科的に回収した骨髄の移植の代替として）造血幹細胞移植において重要であり得、Ｇ−ＣＳＦのような薬物を使用して現在行われている。本発明の抗体及び結合断片はまた、後期ステージのＨＩＶ（Ｘ４ウイルス）がＣＸＣＲ４受容体と相互作用してＴ細胞に入るのを防止するために使用され得る。
【００７２】
本発明の抗体及び結合断片はさらに、ＣＸＣＲ４を発現する様々な異なるがんの治療において使用され得る。ＣＸＣＲ４は、ヒトのがん及び実験用マウスのがんの両方において、最も一般的に腫瘍細胞上に見出されるケモカイン受容体であり得る。受容体は、少なくとも以下の腫瘍の種類において見出されている：Ｂ−ＣＬＬ、ＡＭＬ、Ｂ系列ＡＬＬ（バーキットリンパ腫を含む）、濾胞中心骨髄腫、ＣＭＬ、多発性骨髄腫、膵臓がん、前立腺がん、乳がん、卵巣がん、甲状腺がん、結腸直腸がん、口腔扁平癌、子宮頸がん、神経芽腫、腎臓がん、神経膠腫、横紋筋肉腫、小肺がん及び黒色腫。Ｂａｌｋｗｉｌｌ  （２００４）  Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １４：  １７１−９。治療は、本発明の抗体又は結合断片を含む医薬組成物のがん患者への投与を伴う。組成物は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、鼻腔内及び病巣内投与などの任意の好適な手段により投与されてよい。非経口注入としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与が挙げられる。加えて、抗体又は結合断片は、好適には、パルス注入により、特に抗体又は結合断片の用量を漸減させるパルス注入により投与される。好ましくは、投薬は、部分的には投与が短期であるのかそれとも慢性的であるのかに応じて、注射により、最も好ましくは静脈内又は皮下注射により、与えられる。
【００７３】
疾患の種類及び重症度に応じて、例えば、１つ以上の別々の投与による、又は連続的な注入によるかにかかわらず、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの抗体又は結合断片が、対象への投与のための最初の投与量候補である。典型的な１日の投与量は、約１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲内でよい。
【００７４】
本発明の抗体又は結合断片を含む医薬組成物は、良質な医学のための原則に合致する様式で配合され、適量に分けられ、投与される。この文脈において考慮される因子としては、がんの種類及びステージ、個々の対象の臨床状態、剤の送達部位、投与の方法、投与のスケジュール、及び医師に既知の他の因子が挙げられる。投与される抗体の「治療有効量」はこのような考慮により支配され、疾患を治療するために必要な最小量である。抗体は、その必要はないが、任意選択的に、疾患を治療するために現在使用されている１つ以上の剤、例えば１つ以上の化学療法剤と共に配合される。このような他の剤の有効量は、配合物中に存在する抗体又は結合断片の量、がんの種類及びステージ、並びに上記で論じた他の因子に依存する。これらは、一般に、（本発明の抗体なしで）現在使用されているのと同じ投与量及び投与経路で使用され、又は現在用いられている投与量の約１〜９９％で使用される。
【実施例】
【００７５】
実施例１：Ｆａｂファージライブラリーの調製及びファージ抗体のスクリーニング
本発明の抗体は、元々、無作為化ＣＤＲによるヒトＦａｂ重鎖及びヒトＦａｂ軽鎖をコードするＦａｂ  Ｅ．コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）コドン最適化合成遺伝子を持つｐＳＦ１ファージミドを含む１０＾１１のサイズのＦａｂライブラリーに由来する。重鎖のためにフレームワークＤＰ４７を用い、軽鎖のためにフレームワークＤＰＫ２２を用いた。
【００７６】
Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２９６：５７−８６；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３４０：１０７３−９３；Ｈｏｅｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  ２３：３４４−８に記載されるプロトコール及びＣＤＲ無作為化スキームを用いてファージライブラリーを生成した。
【００７７】
より具体的には、Ｆａｂライブラリーにおいて重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３並びに軽鎖ＣＤＲ３を無作為化に供した。重鎖ＣＤＲ３の無作為化のために、トリヌクレオチドベースのオリゴヌクレオチドをＫｎａｐｐｉｋらに記載される通りに用いた一方、他のＣＤＲについて標準的なヌクレオチド混合物を用いてＣＤＲオリゴヌクレオチドを生成した。
【００７８】
Ｆａｂライブラリーの一般的な軽鎖ＣＤＲは以下の通りであった（ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ６２６：７３２−７４５）：
ＣＤＲ１Ｌ−−ＳＳＹＬＡＷＹ−−（配列番号１）
ＣＤＲ２Ｌ−−ＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡ−−（配列番号２）
【００７９】
Ｆａｂライブラリーのスクリーニングのために、Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ＰｒｏｔｅｏＬｉｐｏｓｏｍｅ技術を使用して、その天然コンフォメーションに密接に似たコンフォメーションでリポソーム膜中にＣＸＣＲ４を提示させた。Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １８：６４９−５４及び米国特許第６，７６１，９０２号を参照。
【００８０】
Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖらに記載される方法を使用してＦａｂライブラリーのスクリーニングを実行し、以下のＦａｂ候補を得た：
【００８１】
【表１】
2020508697.tif 000003
【００８２】
実施例２：親和性成熟
次に、上記した通りの初期候補を親和性成熟に付した。それぞれＣＤＲ２Ｈ又はＣＤＲ３Ｌ無作為化により２つの親和性成熟ライブラリーを生成した。これらのライブラリーのそれぞれを２ラウンドの高ストリンジェンシー選択に付した。選択したＦａｂを個々に発現させ、向上した結合特性を有するクローンを保持した。最良のＣＸＣＲ４結合親和性及び選択性の他に、Ｃａフラックスのリガンド誘導を防止する最良の能力で特徴付けた最良のクローンをＩｇＧとしてリフォーマットした。最終ステップとして、最も有望なＩｇＧの重鎖及び軽鎖を組み換え、結果として得られたＩｇＧを以前の通りに再び特徴付けた。
【００８３】
加えて、ＣＤＲ３Ｈを点変異の導入により成熟させた。結果として得られた変異型Ｆａｂ断片を特徴付けて、最良のＣＸＣＲ４結合物を同定した。
【００８４】
以下の成熟化抗体候補をさらに追及した：
【００８５】
【表２】
2020508697.tif 000004
【００８６】
以前に記載した通り、本発明の全ての抗体は同じＣＤＲ１Ｌ（配列番号１）及びＣＤＲ２Ｌ（配列番号２）を共有する。
【００８７】
実施例３：ＩｇＧ抗体の合成
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ（ＮＲＣ−ＢＲＩ）のＣＨＯ／ｐＴＴ  Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍをＮＲＣ−ＢＲＩにより提供されたプロトコールに従って使用した。国際特許出願公開ＷＯ２００９／１３７９１１Ａ１を参照。より具体的には、トランスフェクション試薬としてポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用してＩｇＧのそれぞれ軽鎖及び重鎖を発現するｐＴＴベクターを共トランスフェクトしたＣＨＯ−３Ｅ７細胞中で目的の各ＩｇＧを製造した。
【００８８】
ＩｇＧを含有する細胞培地を回収し、標準的な方法論を使用してＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｐｌｕｓ  Ａｇａｒｏｓｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）でＩｇＧを精製した。全ての精製手順は、無菌のエンドトキシンフリーの溶液を使用して行った。
【００８９】
以下の実施例では、目的のＦａｂ断片又は目的のＩｇＧ抗体を、適宜、「試験Ｆａｂ」、「試験抗体」又は「試験ＩｇＧ」と称する。
【００９０】
実施例４：ＣＸＣＲ４発現細胞への結合
ＣＸＣＲ４発現細胞へのＦａｂ又はＩｇＧの結合を蛍光フローサイトメトリーベースのアッセイにより測定した。細胞を以下のもので染色した：
（Ａ）Ｆａｂについて、試験Ｆａｂ中に存在するタグに結合する抗ｃ−Ｍｙｃマウス抗体９Ｅ１０  Ｍａｂの後に、二次抗マウスＩｇＧフィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート抗体、又は
（Ｂ）ＩｇＧについて、抗ヒトＦｃ  ＰＥコンジュゲート抗体。
【００９１】
対照として、ＣＸＣＲ４を発現しない細胞又は他のＧＰＣＲを発現する細胞を使用した。
【００９２】
蛍光フローサイトメトリーベースのアッセイの典型的なプロトコールは以下の通りであった。１０マイクロリットルの精製した試験ＩｇＧ溶液又は対照として緩衝液を、ヒトＣＸＣＲ４を発現するようにトランスフェクトした約３０，０００個のＣｆ２−Ｔｈ細胞を含有する１０マイクロリットルの懸濁液に加えた。氷上での４０分間のインキュベーション後、ＦＡＣＳ緩衝液（リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４；２％のウシ胎仔血清、０．１％のアジ化ナトリウム）で細胞を洗浄して未結合の抗体を除去した。次に、１０マイクロリットルのフィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲートマウス抗ヒトＦｃモノクローナル抗体溶液（１／２０希釈；商品番号１２−４９９８−８２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を細胞に加え、氷上での３０分間のインキュベーション後、細胞を２回洗浄し、ホルマリン固定した（ＦＩＸ緩衝液：ＰＢＳ、ｐＨ７．４；０．５％のホルムアルデヒド）。Ｇｕａｖａ−ＰＣＡ９６機器（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して蛍光フローサイトメトリーにより、固定した試料を分析した。
【００９３】
ＥＣ５０値を決定するために、試験抗体の異なる濃度においてＣＸＣＲ４発現細胞への結合を測定した。各濃度について２連又は３連の試料を分析した。ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ５プログラム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して機器により提供される平均蛍光強度（ＭＦＩ）値に基づいて滴定曲線を構築した。
【００９４】
一部の実験では、トランスフェクトされていないＣｆ２−Ｔｈ親細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１４３０（商標））を陰性対照として使用し、それによりＣＸＣＲ４に対する抗体の特異性を確立した。一部の他の実験では、同じ抗体候補のいくつものバッチを並行して試験した。ＩｇＧ１フォーマットの試験抗体で得られた用量応答曲線及びＥＣ５０の結果を図１ａ〜図１ｅに示す。全ての試験ＩｇＧ１抗体は１０ｎＭより充分に低いＥＣ５０を呈した。
【００９５】
実施例５：ＣＸＣＲ−４発現ヒトリンパ腫細胞への結合
ＣＸＣＲ４発現ヒトリンパ腫細胞（Ｒａｍｏｓ；ＲＡ１、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１５９６（商標））への試験ＩｇＧの結合を蛍光フローサイトメトリーベースのアッセイにより測定した。腫瘍細胞の染色を以下の通りに実行した：２％のヒト血清及び０．５ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中４℃での３０分間のインキュベーションによりＲＡ１細胞のヒトＦｃγ受容体を飽和させた。次に、細胞を試験ＩｇＧ又はヒトアイソタイプＩｇＧ１カッパー対照（Ｃｏｇｅｒ  Ｓａｒｌ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）（両方の抗体の種類は１０μｇ／ｍＬ）で４℃で１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、ヤギＦ（ａｂ’）２断片抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＰＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で４℃で１時間さらにインキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、フローサイトメトリーによる分析のためにＰＢＳ中の０．５％のホルムアルデヒドで固定した。１１色のフローサイトメーター（ＬＳＲＩＩ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏフローサイトメトリー分析ソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を用いて分析を行った。側方散乱（ＳＳＣ）及び前方散乱（ＦＳＣ）を使用して生細胞を選択し、１０，０００の事象を各分析のために取得した。ＰＥチャネルを使用してＭＦＩ値を記録した。
【００９６】
【表３】
2020508697.tif 000005
【００９７】
アイソタイプ対照のものより充分に高いＭＦＩ値はＲＡ１細胞の陽性染色を指し示し、これは全ての試験ＩｇＧについて観察された。
【００９８】
実施例６：ＣＸＣＲ４への特異性
ＣＸＣＲ４以外の異なるＧＰＣＲを過剰発現する細胞及びＣＸＣＲ４を過剰発現するようにトランスフェクトしたいくつもの株（Ｒ１６１０−ｈＣＸＣＲ４、Ｃｆ２Ｔｈ−ｈＣＸＣＲ４及びＣＨＯ−ｈＣＸＣＲ４）を比較した。培養物をＦＡＣＳ緩衝液中１００ｎＭの試験ＩｇＧで４℃で４０分間インキュベートした。その後、細胞を２回洗浄し、抗ヒトＦｃ抗体−ＰＥコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）で染色し、ＦＡＣＳ緩衝液中で２回洗浄した後、ＦＩＸ緩衝液に移した。４２５ＶでＧＵＡＶＡ  ＰＣＡ−９６により蛍光強度を測定（３連）した。
【００９９】
市販の抗体（陽性対照）を使用してＣＸＣＲ４以外のＧＰＣＲの発現を確認した。例えば、ＣＸＣＲ１トランスフェクトＣＨＯ細胞上のＣＸＣＲ１の発現を確認するために市販の抗ＣＸＣＲ１抗体を陽性対照として使用した。
【０１００】
得られたＭＦＩデータの要約を以下の表に示す。
【０１０１】
【表４】
2020508697.tif 000006
【０１０２】
実施例７：ＣＸＣＲ４へのリガンド結合の阻害
Ｎ末端ＦＬＡＧタグを含有する細菌発現ＳＤＦ−１アルファを使用して蛍光フローサイトメトリーによりＳＤＦ−１アルファのリガンド結合の阻害をアッセイした。
【０１０３】
ＣＸＣＲ４を発現するようにトランスフェクトしたＣｆ２−Ｔｈ細胞を試験ＩｇＧ抗体（１００ｎＭ）で氷上で３０分間インキュベートした。その後、ＦＬＡＧタグ化リガンドを１００ｎＭの最終濃度まで加え、細胞をさらに２０分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、適切な抗ＦＬＡＧタグＰＥコンジュゲート抗体で染色し、ＦＩＸ緩衝液で固定した。対照には抗体を加えなかった。次に、蛍光を記録した。ＩｇＧ試験抗体に曝露しなかった細胞のＭＦＩ（ＭＦＩＮｏＡｂ）と比較した試験抗体に曝露した細胞のＭＦＩ値（ＭＦＩＷｉｔｈＡｂ）の減少は、抗体とリガンドとの競合を指し示した。阻害パーセントを（ＭＦＩＷｉｔｈＡｂ／ＭＦＩＮｏＡｂ）×１００％として定義した。類似のＭＦＩＷｉｔｈＡｂ及びＭＦＩＮｏＡｂの値は、事前に結合した試験抗体が細胞表面上のＣＸＣＲ４へのタグ化リガンドの結合を防止しなかったことを指し示した。試験した抗体Ｖ６２．１及びＶ６２．１Ｒ１０８Ｈは、リガンド結合を最大９６％阻害することができた。
【０１０４】
実施例８：ＳＤＦ−１誘導性のカルシウムフラックスの阻害
ＣＸＣＲ４トランスフェクトＣｈｅｍ−１細胞（商品番号ＨＴＳ００４Ｃ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）でのＦＬＩＰＲカルシウムアッセイ（Ｃａｌｃｉｕｍ−５キット、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＬＬＣ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）から得られたデータに基づいてＩＣ５０値を推定した。細胞を３７℃及び５％のＣＯ２で終夜生育させた。Ｃａフラックス測定の前に、細胞を３７℃及び５％のＣＯ２で３時間、無血清培地中で飢餓状態とさせた。色素を細胞に加えた後、細胞を異なる濃度の試験ＩｇＧ１抗体の存在下、３７℃及び５％のＣＯ２で３０分間インキュベートした。対照試料を同様に調製したが、抗体を加えなかった。その後、ＴＢＳ中のＳＤＦ−１アルファ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を３０ｎＭの最終濃度まで色素負荷細胞に加えた。細胞内カルシウム濃度（Ｃａフラックス）のケモカイン誘導性の増加の阻害を以下の通りに算出した：
【０１０５】
【数１】
2020508697.tif 000007
式中、［Ｉ］は阻害される試料におけるピークの色素の蛍光（ｎ＝４）を意味し、［Ｃ］は対照試料におけるピークの色素の蛍光（ｎ＝１８）を意味する。
【０１０６】
用量応答曲線を作成し、ＩＣ５０値を算出した。ＩＣ５０は、ＳＤＦ−１アルファ誘導性のカルシウムフラックスの５０％の阻害が観察される試験ＩｇＧの濃度を表す。異なる試験ＩｇＧについて決定されたＩＣ５０値の要約を以下の表に示す：
【０１０７】
【表５】
2020508697.tif 000008
【０１０８】
全ての試験抗体は、ＣＸＣＲ４発現細胞においてＳＤＦ−１アルファ誘導性のカルシウムフラックスを有意に阻害した。
【０１０９】
実施例９：走化性／細胞遊走の阻害
ヒトＵ９３７細胞を１０％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で生育させた後、２回洗浄し、無血清ＲＰＭＩ−１６４０中３７℃で３時間（５％のＣＯ２）でインキュベートした。飢餓状態とさせたＵ９３７細胞を１ｍｌ当たり３＊１０＾５個の細胞で走化性用の培地（０．３％のＢＳＡを含むＲＰＭＩ−１６４０）に再懸濁し、
ａ）室温で３０分間インキュベートし（アッセイ用の前処理しない陽性対照）、
ｂ）１μＭの濃度のＡＭＤ３１００で３０分間室温で前処理し（走化性阻害用の陽性対照）、又は
ｃ）１００ｎＭの濃度の試験ＩｇＧで３０分間室温で前処理した。
【０１１０】
次に、各々の前処理しなかった又は前処理したＵ９３７細胞をミクロ走化性チャンバーの上ウェルに入れた（１ウェル当たり１５，０００個の細胞）。以下の表に概略的に示すように、下ウェルへの添加を行った。
【０１１１】
【表６】
2020508697.tif 000009
【０１１２】
８μＭの孔径を有するポリカーボネートフィルターにより上チャンバー及び下チャンバーを分離した。
【０１１３】
３７℃（５％のＣＯ２）での１時間のインキュベーション後、細胞懸濁液を上ウェルから除去し、ＰＢＳでウェルを１回洗浄した。次に、チャンバーを５００ｒｐｍで４分間遠心分離し、下ウェルから遊走細胞を５０μｌのＰＢＳを含有するＶ字型９６ウェルプレートのウェル内に移した。Ｇｕａｖａ  ＰＣＡ−９６サイトメーターを使用して各ウェル中の遊走細胞の数を決定した。全ての測定を３連で行った。
【０１１４】
すぐ上の表における条件（ａ１）と条件（ａ）との遊走細胞の数の差異としてＳＤＦ−１誘導性の最大遊走を算出した。次に、この最大遊走を参照することにより試験抗体についての遊走阻害のパーセンテージを算出した。
【０１１５】
異なる試験ＩｇＧによるＳＤＦ−１アルファ誘導性の走化性の阻害の結果を以下の表に示す。
【０１１６】
【表７】
2020508697.tif 000010
【０１１７】
全ての試験抗体は、ＳＤＦ−１アルファ誘導性の走化性を少なくとも約７０％阻害した。
【０１１８】
実施例１０：抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）
乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出を測定するアッセイである、ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、Ｆｉｔｃｈｂｕｒｇ、ＷＩ））を使用し、ＲＡ１細胞を標的細胞（Ｔ）として用いてＡＤＣＣを測定した。丸底９６ウェル培養プレートを以下の対照ウェル及び実験ウェルで準備した（１００マイクロリットルの最終体積）：
ａ．ＲＡ１細胞（標的細胞自発性ＬＤＨ放出対照用）
ｂ．ＲＡ１細胞（標的細胞最大ＬＤＨ放出対照用）
ｃ．体積訂正対照のために使用した培養培地（フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ  １６４０培地（１Ｘ））
ｄ．培養培地（培養培地バックグラウンド対照用）
ｅ．ＲＡ１＋エフェクター細胞（Ｅ）（標的＋エフェクター細胞自発性ＬＤＨ放出対照用）
ｆ．各試験ＩｇＧの段階希釈液を有する又は試験ＩｇＧを有しないエフェクター細胞及び標的細胞（１０５）の実験ウェル。
【０１１９】
プレートを１６００ｒｐｍで２分間遠心分離し、３７℃で４時間インキュベートした。上清回収の１時間前に、２０マイクロリットルの溶解溶液（１０Ｘ）を条件ｂ）及び条件ｃ）に加えた。プレートを１６００ｒｐｍで２分間遠心分離し、アッセイプレートの各ウェルから５０マイクロリットルの上清を平底９６ウェル酵素アッセイプレートの対応するウェルに移した。基質混合物（５０マイクロリットル）を後者のプレートの各ウェルに加え、プレート（光から保護）を室温で３０分間インキュベートした。最後に、５０マイクロリットルの停止溶液を各ウェルに加え、４９０ｎｍで吸光度（ＯＤ値）を測定した。各条件を３連で試験した。
【０１２０】
最適なＥ：Ｔ比を決定するために事前実験を実行した。以下に示すデータが、１０５個のＲＡ１標的細胞を用いて２０：１のＥ：Ｔ比で得られた。この研究において使用したエフェクター細胞は以下の通りに調製した：リンパ球分離培地（ｒｅｆ．  Ｊ１５−００４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用する密度勾配遠心分離により、健常ドナーから得られたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。３７℃の加湿インキュベーター（５％のＣＯ２）中、１０％のＦＣＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン及び１ｍＬ当たり１００単位のヒト組換えＩＬ−２（Ｒｏｕｓｓｅｌ−Ｕｃｌａｆより入手）を含むＲＰＭＩ  １６４０中で１ｍＬ当たり２×１０６個のＰＢＭＣを２日間培養した。
【０１２１】
異なる濃度の試験ＩｇＧにおいて得られたＡＤＣＣのパーセンテージを式％  ＡＤＣＣ＝（ｆ−ｅ）／（ｂ−ａ）×１００、すなわち、％  ＡＤＣＣ＝（標的＋エフェクター細胞＋／−試験ＭａｂのＯＤ  −  標的＋エフェクター細胞の自発性放出のＯＤ）／（最大放出標的細胞のＯＤ  −  標的細胞の自発性放出のＯＤ）×１００で算出した。
【０１２２】
以下の表に示すデータは、全ての試験抗体が有意な細胞媒介性の細胞傷害性を誘導したことを実証する。
【０１２３】
【表８】
2020508697.tif 000011
【０１２４】
実施例１１：ＳＣＩＤ／ＲＡ１異種移植モデルにおける抗腫瘍活性
試験抗体の治療効果をバーキットリンパ腫の動物モデルにおいて評価した。使用したモデルにおいて、ＳＣＩＤマウスにおける全身性のがんは、後肢麻痺を引き起こし、全ての主な臓器に浸潤する。
【０１２５】
腫瘍細胞注射の４８時間前に、雌ＳＣＩＤマウス（７〜９週齢、体重１７〜２２ｇ）にγ線源（１．８Ｇｙ、６０Ｃｏ）で照射した。Ｄ０に、２００μｌのＲＰＭＩ  １６４０中に懸濁した１００万個のＲＡ１細胞（アメリカ型バーキットリンパ腫の患者から確立されたＢリンパ球型細胞株）をマウスの尾静脈に静脈注射した。Ｄ４に、Ｖｉｖｏ  ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｅｓ、Ｄｉｊｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、腫瘍を有するマウスを体重に基づいて各１０匹のマウスの１０群に割り当てた。平均体重は群間で統計的に異ならなかった（平均体重：１９．３±１．４ｇ）。処置をＤ４に開始した：４、８、１２、１６、２０及び２４日目にマウスに５ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの用量の試験抗体を静脈内投与した。注射用のビヒクルは、１０ｍＭのクエン酸Ｎａ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのアルギニン（ｐＨ５．５）であった。体重を週に２回測定し、記録した。各群について死亡日の平均として平均生存期間を算出し、各群について死亡日の中央値（メジアン）としてメジアン生存期間を算出した。寿命値の増加（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｌｉｆｅ  ｓｐａｎ  ｖａｌｕｅ；ＩＬＳ）により各試験抗体の有効性を判定した。ＩＬＳ％を以下の通りに表した：ＩＬＳ％＝［（Ｔ−Ｃ）／Ｃ］×１００。Ｔは各試験抗体で処置した動物の生存期間の中央値（メジアン）であり、Ｃはビヒクルで処置した対照動物のメジアン生存期間であった。実験は腫瘍注射の８１日後に終了した。
【０１２６】
ビヒクル又はゾレア（登録商標）（アイソタイプ対照）で処置した全ての対照マウスは重篤な体重減少と共に散剤性疾患により死亡し、又はマウスは腫瘍細胞接種後４週間以内に瀕死であったので終了させた。
【０１２７】
抗体Ｖ６２．１又はＶ６２．１−Ｒ１０８Ｈでの繰返しの処置は、対照マウスと比較して生存率の２倍の増加に繋がった（ｐ＜０．００１）。加えて、陽性対照として使用したＣＤ２０抗体マブセラ（登録商標）で処置したマウスは、対照マウスより有意に長く生存した（ｐ＜０．００１）。これらのデータは、試験抗体Ｖ６２．１及びＶ６２．１−Ｒ１０８Ｈがこの高度に侵襲性の異種移植モデルにおいてＲＡ１細胞増殖を効果的に標的化及び抑制できたことを指し示した。詳細な結果を以下の表に示す。
【０１２８】
【表９】
2020508697.tif 000012
【０１２９】
実施例１２：ヒト乳がん異種移植モデルにおける抗転移活性
この実験の目的は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／Ｌｕｃ細胞（商品番号ＡＫＲ−２３１、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）をＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの静脈内に移植した乳癌転移モデルにおいて４つの試験抗体の有効性を評価することであった。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／Ｌｕｃ細胞株は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳がん細胞株に由来するルシフェラーゼ発現亜株である。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／Ｌｕｃ細胞は、肺において実験的転移を生じさせる。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１がん細胞の経内皮遊走の他に血管透過性はＳＤＦ１／ＣＸＣＲ４シグナル伝達に依存することが公知であった（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｍｏｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２：  ３２７）。
【０１３０】
試験は、１２匹の雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスをそれぞれ含有する７つの実験群からなるものであった。−１日目に、体重に基づいて動物を無作為化した。各群の平均体重は、分散分析により群間で統計的に異ならなかった。０日目に、１００μｌの０．９％のＮａＣｌ中の２×１０６個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１／Ｌｕｃ細胞を全ての参加する動物の静脈内に移植した。インビボ生物発光イメージングを使用して２、９、１５、２４、２８、３１、３５及び３８日目に転移性増殖を評価した。１日毎に動物の体重を測定した（月、水、金曜日）。群２〜５の動物の静脈内に−１、３、７、１１、１５及び１９日目に１０ｍｇ／ｋｇの試験抗体を投与し（Ｑ４Ｄｘ６）、群１にビヒクル（１０ｍＭのクエン酸Ｎａ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのアルギニン、ｐＨ５．５）を与えた。最新の体重測定に基づいて抗体の用量を算出した。
【０１３１】
試験終了時（３８日目）の胸部領域の総ルシフェラーゼ活性を図２に示す。全ての試験抗体は、胸部領域において腫瘍細胞増殖を有意に阻害した。
【０１３２】
本明細書における値の範囲の記載は単に、本明細書において別に指し示さない限り、範囲内に入る各別々の値に個々に言及する簡略化された方法として働くことを意図し、各別々の値は、これが本明細書において個々に記載されているかのように、本明細書に組み込まれる。別に指し示さない限り、本明細書において提供される全ての厳密な値は、対応するおおよその値の代表である（例えば、特定の因子又は測定値に関して提供される全ての厳密な例示的な値は、適切な場合、「約」により修飾された、対応するおおよその測定値も提供すると考えることができる。）。
【０１３３】
本明細書において提供される任意の及び全ての例又は例示的な表現（例えば、「のような」）の使用は単に、本発明をよりよく説明することを意図するものであり、別に指し示さない限り、発明の範囲を限定しない。
【０１３４】
本明細書における特許文献の引用及び組込みは簡便性のために行うものに過ぎず、このような特許文献の妥当性、特許性及び／又は権利行使可能性に関するいかなる見解も反映しない。構成要素への言及のような用語を使用する本発明の任意の態様又は実施形態の本明細書における記載は、別の記載がない限り又は明らかに文脈に矛盾しない限り、その特定の構成要素「からなる」、「から本質的になる」又は「実質的に含む」本発明の類似の態様又は実施形態のサポートを提供することを意図する（例えば、特定の構成要素を含むと本明細書において記載される組成物は、別の記載がない限り又は明らかに文脈に矛盾しない限り、その構成要素からなる組成物も記載するものと理解されるべきである。）。
【０１３５】
本発明は、適用法により許容される最大の程度まで、本明細書において提示される態様又は特許請求の範囲に記載される主題の全ての改変及び均等物を含む。
【０１３６】
本明細書において引用される全ての刊行物及び特許出願は、各個々の刊行物又は特許出願が参照することにより組み込まれることを具体的かつ個々に指し示されたかのように、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３７】
理解を明確にする目的から説明及び例により、以上の発明の一部の詳細を記載してきたが、添付の特許請求の範囲の本質又は範囲から離れることなくある特定の変更及び改変が為され得ることが本発明の教示に照らして当業者に容易に明らかとなる。
【図１ａ】
2020508697.tif 000013
【図１ｂ】
2020508697.tif 000014
【図１ｃ】
2020508697.tif 000015
【図１ｄ】
2020508697.tif 000016
【図１ｅ】
2020508697.tif 000017
【図２】
2020508697.tif 000018
【配列表】
2020508697000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月10日(2020.1.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）配列番号１３若しくは１４のアミノ酸配列又は１つ以上の保存的改変により前記アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び
（ｉｉ）配列番号１５、１６、１７、１８若しくは１９のアミノ酸配列又は１つ以上の保存的改変により前記アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、単一特異的抗体又は結合断片。
【請求項２】
（ｉ）配列番号１の配列又は１つ以上の保存的改変により前記アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１Ｌ；配列番号２の配列又は１つ以上の保存的改変により前記アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２Ｌ；及び配列番号３若しくは４の配列又は１つ以上の保存的改変により前記アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３Ｌを含む可変軽鎖；及び
（ｉｉ）配列番号５若しくは６の配列又は１つ以上の保存的改変により前記アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１Ｈ；配列番号７、８、９若しくは１０の配列又は１つ以上の保存的改変により前記アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２Ｈ；及び配列番号１１若しくは１２の配列又は１つ以上の保存的改変により前記アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３Ｈを含む可変重鎖を有する、単一特異的抗体又は結合断片。
【請求項３】
操作されたヒト抗体又は結合断片である、請求項１又は２に記載の単一特異的抗体又は結合断片。
【請求項４】
ｌｇＧ１アイソタイプである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単一特異的抗体又は結合断片。
【請求項５】
ＣＸＣＲ４を発現するがんの治療において使用するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単一特異的抗体又は結合断片。
【請求項６】
哺乳動物対象においてＣＸＣＲ４発現がん細胞を検出する方法であって、
（ｉ）がん細胞を含有する生検若しくは液体試料を、前記対象から採取すること、及び前記がん細胞におけるＣＸＣＲ４の発現を検出する免疫化学若しくは免疫組織化学アッセイにおいて、請求項１〜４のいずれかに記載の単一特異的抗体若しくは結合断片を使用すること、又は
（ｉｉ）放射性標識された請求項１〜４のいずれかに記載の単一特異的抗体若しくは結合断片を、前記対象に非経口的に投与すること、及び免疫シンチグラフィーにより前記対象中の抗体若しくは結合断片を検出すること
を含む、方法。
【請求項７】
治療有効量の請求項１〜４のいずれかに記載の単一特異的抗体又は結合断片、及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれかに記載の単一特異的抗体又は結合断片を含む、診断キット。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれかに記載の単一特異的抗体又は結合断片をコードする、ポリヌクレオチド。
【国際調査報告】
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