(57)【要約】  非対称ヘテロ二量体抗体は、第１の重鎖のＣＨ３ドメイン中に形成されたノブ構造；第２の重鎖のＣＨ３ドメイン中に形成されたホール構造であって、ホール構造は、ヘテロ二量体抗体が形成されるようにノブ構造を収容するように構成されている、ホール構造；および第１の重鎖または第２の重鎖のＣＨ３ドメインに融合したＴ細胞標的化ドメインであって、Ｔ細胞標的化ドメインは、Ｔ細胞上の抗原に特異的に結合する、Ｔ細胞標的化ドメインを含む。Ｔ細胞標的化ドメインは、抗ＣＤ３抗体に由来するＳｃＦｖまたはＦａｂである。非対称ヘテロ二量体抗体は、そのエフェクター結合が損なわれるように、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ突然変異またはＬ２３５ＡおよびＧ２３７Ａを有し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の重鎖のＣＨ３ドメイン中に形成されたノブ構造と、
第２の重鎖のＣＨ３ドメイン中に形成されたホール構造であって、ヘテロ二量体抗体が形成されるように前記ノブ構造を収容するように構成されているものと、
前記第１の重鎖または前記第２の重鎖の前記ＣＨ３ドメインに融合したＴ細胞標的化ドメインであって、前記Ｔ細胞上の抗原に特異的に結合するものと、を含む
非対称ヘテロ二量体抗体。
【請求項２】
前記Ｔ細胞標的化ドメインは、ＳｃＦｖまたはＦａｂである
請求項１に記載の非対称ヘテロ二量体抗体。
【請求項３】
前記ＳｃＦｖまたはＦａｂは、抗ＣＤ３抗体に由来する
請求項１に記載の非対称ヘテロ二量体抗体。
【請求項４】
前記非対称ヘテロ二量体抗体の第１の結合または標的化ドメインは、腫瘍関連抗原に特異的に結合する
請求項１に記載の非対称ヘテロ二量体抗体。
【請求項５】
前記非対称ヘテロ二量体抗体は、前記第１の結合または標的化ドメインとは異なる第２の結合または標的化ドメインを含む
請求項４に記載の非対称ヘテロ二量体抗体。
【請求項６】
前記非対称ヘテロ二量体抗体は、前記第１の結合または標的化ドメインと同一の第２の結合または標的化ドメインを含む
請求項４に記載の非対称ヘテロ二量体抗体。
【請求項７】
前記非対称ヘテロ二量体抗体が減少したエフェクター機能を有するように、エフェクター結合部位において突然変異をさらに含む
請求項１に記載の非対称ヘテロ二量体抗体。
【請求項８】
前記突然変異は、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ突然変異を含む
請求項７に記載の非対称ヘテロ二量体抗体。
【請求項９】
前記突然変異は、Ｌ２３５ＡおよびＧ２３７Ａ突然変異を含む
請求項７に記載の非対称ヘテロ二量体抗体。
【請求項１０】
がんを治療するための医薬組成物であって、
請求項１〜９のいずれか１項に記載の非対称ヘテロ二量体抗体を含む
医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体操作、特に、多重特異的な非対称ヘテロ二量体抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）は、疾患のための有望な治療剤である。非対称二重特異的抗体は、２つの異なる標的エピトープを認識するように設計される。これらの抗体は、従来の抗体では達成できない新規の機能を達成することができる。非対称二重特異的抗体への１つのアプローチは、重鎖のＣＨ３ドメイン中にノブ−アンド−ホールを設計することである。ノブ−アンド−ホール構造の相補性は、ヘテロ二量体抗体の形成に有利に働く。（Ａ．Ｍ．  Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｒｏｕｔｅ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩｇＧ，”  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １９９８，  １６：６７７−８１；  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ０７９８−６７７）。
【０００３】
非対称二重特異的抗体は、療法における潜在的な応用を示している。しかしながら、より良好な多重特異的非対称抗体の必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、多重特異性を有し得る非対称抗体の生成のためのプラットフォーム、および療法におけるそれらの使用に関する。
【０００５】
本発明の実施形態によれば、非対称抗体は、ノブアームおよびホールアームを含む重鎖を有し得る。これらの抗体は、ヘテロ二量体Ｆｃ−ＳｃＦｖ（ＡＨＦＳ）またはＦａｂ（ＡＨＦＦ）融合二重特異的または三重特異的抗体フォーマットを有し、ＳｃＦｖまたはＦａｂは、抗ＣＤ３抗体のようなＴ細胞標的化抗体に由来する。ＳｃＦｖまたはＦａｂは、ノブアームまたはホールアームのいずれかに融合させることができる。
【０００６】
本発明の実施形態によれば、ＡＤＣＣおよびＣＤＣエフェクター機能を減少させるために、ノブアームおよびホールアームの両方のＣＨ２ドメイン中のアミノ酸残基は、突然変異を含有し得る。例えば、位置２３４および２３５における残基は、ロイシンからアラニンへと改変されてよく、または位置２３５および２３７における残基は、ロイシンおよびグリシンからアラニンへと改変されてよい。同様に、当該技術分野において公知のエフェクター機能を低減させる／除去するための他のアプローチもまた使用することができる。
【０００７】
本発明の実施形態によれば、Ｆｃヘテロ二量体化を増進させるために、抗体の２つの半分を、それらが好ましくは互いに結合して非対称ディマー（ｄｉｍｍｅｒ）を形成するように相補的な構造を有するように操作することができる。当該技術分野において公知のそのようなアプローチとしては、「ノブ−イントゥー−ホール」のアプローチが挙げられ、これは、重鎖ＣＨ３ドメインの１つにおいて「ノブ」および他の重鎖ＣＨ３ドメインにおいて「ホール」を構築することを伴う。例えば、位置３５４および３６６におけるノブアームのＣＨ３ドメインのアミノ酸残基は、セリンおよびスレオニンからシステインおよびトリプトファンへと改変されてよく、かつ、位置３４９、３６６、３６８および４０７におけるホールアームのＣＨ３ドメインのアミノ酸残基は、チロシン、スレオニン、ロイシンおよびチロシンからシステイン、セリン、アラニンおよびバリンへとそれぞれ改変されてよい。本発明の抗体によるＴ細胞エンゲージメントおよび活性化は、標的細胞の表面上に発現される抗原の存在に依存する。
【０００８】
本発明の一態様は、非対称ヘテロ二量体抗体に関する。本発明の一実施形態による非対称ヘテロ二量体抗体は、第１の重鎖のＣＨ３ドメイン中に形成されたノブ構造；第２の重鎖のＣＨ３ドメイン中に形成されたホール構造であって、ホール構造は、ヘテロ二量体抗体が形成されるようにノブ構造を収容するように構成されている、ホール構造；および第１の重鎖または第２の重鎖のＣＨ３ドメインに融合したＴ細胞標的化ドメインであって、Ｔ細胞標的化ドメインは、Ｔ細胞上の抗原に特異的に結合する、Ｔ細胞標的化ドメインを含む。
【０００９】
本発明の一部の実施形態によれば、Ｔ細胞標的化ドメインは、ＳｃＦｖまたはＦａｂであり得る。本発明の一部の実施形態によれば、ＳｃＦｖまたはＦａｂは、抗ＣＤ３抗体に由来し得る。
【００１０】
本発明の一部の実施形態によれば、非対称ヘテロ二量体抗体は、エフェクター細胞への減少した結合性を有するように突然変異したエフェクター結合部位を有し得る。減少したエフェクター結合性を有する非対称ヘテロ二量体抗体は、ＣＨ２ドメイン中にＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ突然変異またはＬ２３５ＡおよびＧ２３７Ａ突然変異を有し得る。
【００１１】
本発明の別の態様は、がんを治療する方法に関する。本発明の一実施形態による方法は、それを必要とする対象に上記の非対称ヘテロ二量体抗体のいずれか１つを投与することを含む。
【００１２】
本発明の他の態様は、以下の説明から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の非対称ヘテロ二量体抗体の包括的フォーマットを説明する構成図を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、結合因子としてＦａｂを有する本発明の実施形態を説明する構成図を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、結合因子としてＳｃＦｖを有する本発明の実施形態を説明する構成図を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、結合因子として成長因子またはサイトカインを有する本発明の実施形態を説明する構成図を示す。
【図１Ｅ】図１Ｅは、結合因子としてがん標的化ペプチドを有する本発明の実施形態を説明する構成図を示す。
【００１４】
【図２Ａ】図２Ａは、本発明の実施形態による非対称二量体多重特異的抗体の異なるフォーマットの「ノブ」アームの製造のための様々な発現ベクターコンストラクトを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明の実施形態による、エフェクター結合部位に突然変異を含有する非対称二量体多重特異的抗体の異なるフォーマットの「ノブ」アームの製造のための様々な発現ベクターコンストラクトを示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、本発明の実施形態による非対称二量体多重特異的抗体の異なるフォーマットの「ホール」アームの製造のための様々な発現ベクターコンストラクトを示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、本発明の実施形態による、エフェクター結合部位に突然変異を含有する非対称二量体多重特異的抗体の異なるフォーマットの「ホール」アームの製造のための様々な発現ベクターコンストラクトを示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、本発明の実施形態による、エフェクター結合部位に突然変異を含有する、非対称二量体多重特異的抗体の異なるフォーマットのＴ細胞標的化ドメインを有しない重鎖の製造のための様々な発現ベクターコンストラクトを示す。
【００１５】
【図３】図３は、エフェクター結合部位における突然変異を有するまたは有しない本発明のＡＨＦＳが、Ｔ細胞標的化ドメインが存在する場合、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞に特異的に結合できることを示す。
【００１６】
【図４】図４は、エフェクター結合部位における突然変異を有するまたは有しない本発明のＡＨＦＳが、Ｔ細胞標的化ドメインが存在する場合、乳がん細胞ＨＣ１４２８に特異的に結合できることを示す。
【００１７】
【図５】図５は、ＡＨＦＳ  ＥＧＦ×抗ＣＤ３および乳がん標的化ペプチド（ＣＴＰ）×抗ＣＤ３二重特異的タンパク質は乳がんＢＴ４７４標的細胞に結合するが、ＡＨＦＳ  ＡＭＧ３８６×抗ＣＤ３二重特異的タンパク質はそうでないことを示す。
【００１８】
【図６】図６は、ＡＨＦＳ抗ＴＡＡ×抗ＣＤ３二重特異的抗体が、ヒトＰＢＭＣの存在下かつＡＤＣＣ機能の非存在下でＴＡＡ発現乳がん細胞株ＨＣＣ１４２８を効果的に殺傷することを示す。
【００１９】
【図７】図７は、ＡＨＦＳ抗ＴＡＡ×抗ＣＤ３二重特異的抗体が、Ｔ細胞の存在下でＴＡＡ発現乳がん細胞株ＨＣＣ１４２８を効果的に殺傷することを示す。
【００２０】
【図８】図８は、ＡＨＦＳ  Ｎ−ＬＦｖ×抗ＣＤ３二重特異的および三重特異的抗体が、Ｔ細胞の存在下でＴＡＡおよびＨＥＲ２発現乳がん細胞株ＨＣＣ１４２８を効果的に殺傷することを示す。
【００２１】
【図９】図９は、ＡＨＦＳ  Ｎ−ＬＦｖ×抗ＣＤ３二重特異的および三重特異的抗体が、Ｔ細胞の存在下でＨＥＲ２発現乳がん細胞株ＢＴ４７４を効果的に殺傷することを示す。
【００２２】
【図１０】図１０は、ＡＨＦＳ  Ｎ−ＳｃＦｖ×抗ＣＤ３二重特異的抗体が、Ｔ細胞の存在下でＨＥＲ２発現乳がん細胞株ＨＣＣ１４２８を効果的に殺傷することを示す。
【００２３】
【図１１】図１１は、ＡＨＦＳ  ＥＧＦ×抗ＣＤ３二重特異的タンパク質が、Ｔ細胞の存在下でＨＥＲ２発現乳がん細胞株ＢＴ４７４を効果的に殺傷することを示す。
【００２４】
【図１２】図１２は、ＡＨＦＳ乳がんＣＴＰ×抗ＣＤ３二重特異的タンパク質が、Ｔ細胞の存在下で乳がん細胞株ＢＴ４７４を効果的に殺傷することを示す。
【００２５】
【図１３】図１３は、Ｆｃ−抗ＣＤ３  ＳｃＦｖ融合ドメインにより誘導されるＮＫ細胞によるＩＬ−２産生および非特異的Ｔ細胞活性化が、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５ＡまたはＬ２３５ＡおよびＧ２３７ＡのＦｃ操作により完全に減少したことを示す。
【００２６】
【図１４】図１４は、Ｆｃ−抗ＣＤ３  ＳｃＦｖ融合ドメインにより誘導されるＮＫ細胞によるＴＮＦ−α産生および非特異的Ｔ細胞活性化が、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５ＡまたはＬ２３５ＡおよびＧ２３７ＡのＦｃ操作により完全に減少したことを示す。
【００２７】
【図１５】図１５は、ＮＫ細胞活性化およびＩＦＮ−γ産生が、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５ＡまたはＬ２３５ＡおよびＧ２３７ＡのＦｃ操作により完全に減少したことを示す。
【００２８】
【図１６】図１６は、Ｆｃ−抗ＣＤ３  ＳｃＦｖ融合ドメインにより誘導されるＮＫ細胞によるグランザイムＢ産生および非特異的Ｔ細胞活性化が、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５ＡまたはＬ２３５ＡおよびＧ２３７ＡのＦｃ操作により完全に減少したことを示す。
【００２９】
【図１７】図１７は、Ｆｃ−抗ＣＤ３  ＳｃＦｖ融合ドメインにより誘導されるＮＫ細胞によるパーフォリン産生および非特異的Ｔ細胞活性化が、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５ＡまたはＬ２３５ＡおよびＧ２３７ＡのＦｃ操作により完全に減少したことを示す。
【００３０】
【図１８】図１８は、ＡＨＦＳ抗ＴＡＡ×抗ＣＤ３  ＢｓＡｂが、腫瘍標的細胞依存的方式で効果的にＴ細胞を活性化させかつＩＬ−２産生を誘導することを示す。
【００３１】
【図１９】図１９は、ＡＨＦＳ抗ＴＡＡ×抗ＣＤ３  ＢｓＡｂが、腫瘍標的細胞依存的方式で効果的にＴ細胞を活性化させかつＴＮＦ−α産生を誘導することを示す。
【００３２】
【図２０】図２０は、Ｆｃ−抗ＣＤ３  ＳｃＦｖ融合物ならびにＬ２３４ＡおよびＬ２３５ＡまたはＬ２３５ＡおよびＧ２３７Ａの操作によるＩＦＮ−γ産生の増進を示す。
【００３３】
【図２１】図２１は、Ｆｃ−抗ＣＤ３  ＳｃＦｖ融合物ならびにＬ２３４ＡおよびＬ２３５ＡまたはＬ２３５ＡおよびＧ２３７Ａの操作によるグランザイムＢ産生の増進を示す。
【００３４】
【図２２】図２２は、ＡＨＦＳ抗ＴＡＡ×抗ＣＤ３  ＢｓＡｂが、腫瘍標的細胞依存的方式で効果的にＴ細胞を活性化させかつパーフォリン産生を誘導することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明の実施形態は、多重特異的非対称抗体の製造方法およびその使用に関する。本発明の実施形態によれば、非対称抗体は、同一でない２つの重鎖を含有する。重鎖の１つはノブアームとして機能し、他の重鎖は、ノブを収容できるホールアームとして機能する。ノブおよびホール構造は、重鎖の第３の定常ドメインＣＨ３において（例えば、部位特異的突然変異生成により）操作される。ノブおよびホールの相補性は、非対称抗体の形成を促進する。
【００３６】
本発明の実施形態によれば、Ｆｃヘテロ二量体化を増進させるために、位置３５４および３６６におけるノブアームＣＨ３ドメインのアミノ酸残基は、セリンおよびスレオニンからシステインおよびトリプトファンへとそれぞれ改変され、かつ、位置３４９、３６６、３６８および４０７におけるホールアームＣＨ３ドメインのアミノ酸残基は、チロシン、スレオニン、ロイシンおよびチロシンからシステイン、セリン、アラニンおよびバリンへとそれぞれ改変される。ノブ−イントゥー−ホール非対称抗体の特定の例を本明細書において説明するが、当該技術分野において公知の他の類似の突然変異もまた本発明の範囲から離れることなく使用することができる。（Ａ．Ｍ．Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｒｏｕｔｅ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩｇＧ，”  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １９９８，  １６：６７７−８１；  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ０７９８−６７７；およびＡ．Ｔｕｓｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｆｏｒ  ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｕｐｏｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｖｉｄｉｔｙ，”  ＭＡｂｓ，  ２０１６  Ｍａｙ−Ｊｕｎ；  ８（４）：８２８−８３８；  ｄｏｉ：１０．１０８０／１９４２０８６２．２０１６．１１６０１９２．）
【００３７】
本発明の一部の実施形態は、２つの異なる抗原結合ドメインを含有する非対称抗体（ヘテロ二量体抗体）を含む二重特異的抗体である。本発明の一部の実施形態は、２つより多くの異なる抗原結合ドメインを含有する多重特異的抗体である。
【００３８】
例えば、本発明の一部の実施形態は、ヘテロ二量体Ｆｃ−ＳｃＦｖ（ＡＨＦＳ）またはヘテロ二量体Ｆｃ−Ｆａｂ（ＡＨＦＦ）融合抗体フォーマットの形態の三重特異的抗体であってよく、ＳｃＦｖまたはＦａｂは、Ｔ細胞標的化のために選択される任意の抗体、例えば抗ＣＤ３抗体に由来し得る。本発明の実施形態によれば、ＳｃＦｖまたはＦａｂ断片は、抗体のノブアームまたはホールアームのいずれかと融合されて、三重特異的抗体を生成し得る。本発明の他の実施形態によれば、異なるＳｃＦｖまたはＦａｂ断片が抗体のノブアームおよびホールアームと融合されて、四重特異的抗体を生成し得る。
【００３９】
図１Ａは、本発明の非対称抗体の包括的形態の構成図を示す。示されるように、抗体は、典型的な抗体の可変ドメインがあるような場所に位置する結合因子ＡおよびＢを有する。ＡおよびＢの結合因子は、同一または異なるものであってよい。それらは、Ｆａｂ、ＳｃＦｖ、成長因子、サイトカイン、またはペプチドを含み得る。加えて、Ｔ細胞エンゲージャー（すなわち、Ｔ細胞標的化ドメイン）がＣＨ３ドメインの１つに融合される。Ｔ細胞エンゲージャーは、例えば、抗ＣＤ３抗体に由来するＳｃＦｖまたはＦａｂであり得る。
【００４０】
図１Ａに示される抗Ａおよび抗Ｂは、任意の所望の標的のために選択され得る。例えば、がん療法のために、そのような抗原は、Ｈｅｒ２、アルファ−エノラーゼなどのような腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）について選択され得る。
【００４１】
図１Ｂは、Ｔ細胞エンゲージャーが抗ＣＤ３抗体に由来し、かつ、結合因子ＡおよびＢがＦａｂ断片であり、Ｆａｂ断片が同一または異なるものであり得る（すなわち、抗Ａ＋抗Ａ；抗Ｂ＋抗Ｂ；または抗Ａ＋抗Ｂ）場合の３つの異なる可能性を説明する構成図を示す。
【００４２】
図１Ｃは、Ｔ細胞エンゲージャーが抗ＣＤ３抗体に由来し、かつ、結合因子ＡおよびＢがＳｃＦｖ断片であり、ＳｃＦｖ断片が同一または異なるものであり得る場合の３つの異なる可能性を説明する構成図を示す。
【００４３】
図１Ｄは、Ｔ細胞エンゲージャーが抗ＣＤ３抗体に由来し、かつ、結合因子ＡおよびＢが成長因子またはサイトカインであり、成長因子またはサイトカインが同一または異なるものであり得る場合の３つの異なる可能性を説明する構成図を示す。
【００４４】
図１Ｅは、Ｔ細胞エンゲージャーが抗ＣＤ３抗体に由来し、かつ、結合因子ＡおよびＢが、特異的結合部位を標的化できるペプチド（例えば、受容体）であり、該ペプチドが同一または異なるものであり得る場合の３つの異なる可能性を説明する構成図を示す。
【００４５】
これらの例では、抗ＣＤ３  ＳｃＦｖは、Ｔ細胞標的化ドメイン（Ｔ細胞エンゲージャー）として説明される。当業者は、これらの例は説明的なものに過ぎず、他のＴ細胞標的化結合因子もまた本発明の範囲から離れることなく使用できることを理解する。
【００４６】
抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）のような抗体エフェクター機能は免疫療法において望ましいが、これらのエフェクター機能は望ましくないことがある。したがって、一部の治療的抗体では、低減またはサイレンシングされたエフェクター機能を有することが好ましいことがある。
【００４７】
例えば、本発明の多重特異的抗体は、免疫細胞上の標的に方向付けられた結合部位を含有してよいとともに（例えば、図１の抗ＣＤ３を参照）、別の結合部位は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を標的化し得る。エフェクター機能がインタクトな場合、ＮＫ細胞は、（ＮＫ細胞上のＦｃＲを介して）多重特異的抗体のＦｃ部分のエフェクター機能部位（ヒンジおよびＣＨ２ドメインに位置する）に結合できるとともに、抗ＣＤ３は、Ｔ細胞上のＣＤ３に結合する。これが起こる場合、ＮＫ細胞は、Ｔ細胞に対する細胞傷害性を媒介し得る。これは逆向きの効果となる。
【００４８】
エフェクター機能を低減させるためのいくつものアプローチが先行技術において開示されており、これには、グリカン修飾、エフェクター細胞上の受容体とあまり相互作用しないＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４サブタイプの使用、二重特異的抗体のエフェクター相互作用部位（すなわち、下部ヒンジまたはＣＨ２ドメイン）における突然変異が含まれる。
【００４９】
本発明の実施形態によれば、一部の抗体は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣエフェクター機能を低減または減少させるように改変され得る。一例では、ノブアームおよび／またはホールアームのＣＨ２ドメイン中の位置２３４および２３５におけるアミノ酸残基は、ロイシンからアラニンへと改変される。別の例では、ノブアームおよび／またはホールアームのＣＨ２ドメイン中の位置２３５および２３７におけるアミノ酸残基は、ロイシンおよびグリシンからアラニンへと改変される。
【００５０】
減少したＡＤＣＣおよびＣＤＣエフェクター機能を有する場合、そのような抗体は、それ自体でＡＤＣＣまたはＣＤＣ応答を誘発しない。代わりに、Ｔ細胞エンゲージメントおよび活性化は、標的細胞の表面上に発現される抗原への本発明の抗体の結合に依存し、それにより、標的化療法の効率を増加させる。
【００５１】
本発明の抗体は、様々な発現コンストラクトを用いて得られ得る。発現ベクターの改変およびこれらのコンストラクトの発現は、当該技術分野において常用の公知の技術を伴う。当業者は、過度の実験なく、これらの発現ベクターを構築し、発現されたタンパク質を得ることができる。
【００５２】
図２Ａは、非対称ヘテロ二量体Ｆｃ−ＳｃＦｖ融合抗体のための様々な発現コンストラクトを示す（ＫＴベクター、すなわち、テザー連結された（Ｔｅｔｈｅｒｅｄ）結合断片を含有するノブアーム（Ｋｎｏｂ  ａｒｍ）、抗ＣＤ３  ＳｃＦｖ）。これらの例では、重鎖発現ベクターは、「ノブ」構造を形成するためのＣＨ３ドメイン中の改変を含有する。加えて、抗ＣＤ３  ＳｃＦｖは、重鎖のＣ末端に融合されている。
【００５３】
図２Ａに示されるように、ＫＴベクター１は、（通常の抗体におけるように）重鎖可変ドメインを含有し、重鎖可変ドメインは、軽鎖と会合して結合ドメイン（すなわち、図１Ａにおける結合因子Ａまたは結合因子Ｂ）を形成することができる。ＫＴベクター２は、結合ドメインを形成するように重鎖可変ドメインと融合した軽鎖可変ドメイン（ＬＦｖ）を含有する。このコンストラクトでは、重鎖は、第１の定常ドメインを保持する。したがって、軽鎖定常ドメイン（例えば、カッパ鎖）は、この重鎖融合タンパク質と会合し得る。ＫＴベクター３は、結合ドメイン（すなわち、図１Ａにおける結合因子Ａまたは結合因子Ｂ）を形成するようにＳｃＦｖのフォーマットの重鎖可変ドメインと融合した軽鎖可変ドメイン（ＬＦｖ）を含有する。このコンストラクトでは、重鎖は、第１の定常ドメインを欠いている。したがって、軽鎖定常ドメインは、この融合タンパク質と会合しない。ＫＴベクター４およびＫＴベクター５は、重鎖定常ドメインとそれぞれ融合したリガンド（例えば、成長因子またはサイトカイン）またはペプチドを含有する。リガンドまたはペプチドは、標的（例えば、腫瘍細胞上の受容体）との特異的結合について選択されるとともに、Ｔ細胞標的化ドメイン（例えば、抗ＣＤ３  ＳｃＦｖ）は、Ｔ細胞に結合することができる。
【００５４】
図２Ｂは、これもまたエフェクター結合部位における突然変異を含む非対称ヘテロ二量体Ｆｃ−ＳｃＦｖ融合抗体のための様々な発現コンストラクトを示す。これらの例（ｍｕｔ−ＫＴベクター、すなわち、テザー連結された（Ｔｅｔｈｅｒｅｄ）結合断片を含有するノブアーム（Ｋｎｏｂ  ａｒｍ）、抗ＣＤ３  ＳｃＦｖ、ＣＨ２ドメインはエフェクター機能を低減または除去するための突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）を含有する）では、重鎖発現ベクターは、「ノブ」構造を形成するためのＣＨ３ドメイン中の改変およびエフェクター機能を損なわせるためのＣＨ２ドメイン中の突然変異を含有する。加えて、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖは、重鎖のＣ末端に融合されている。図２Ａに示されるコンストラクトと比較して、これらの突然変異体コンストラクト（エフェクターバイディング（ｂｉｄｉｎｇ）部位における突然変異）は、エフェクター機能を有しないか、または減少したエフェクター機能を有する。結果として、非特異的なＴ細胞活性化が最小であるか、または存在しない。本発明の二重特異的または多重特異的抗体により結合されたＴ細胞は、結合ドメインが標的細胞（例えば、腫瘍細胞）に結合した後にのみ活性化される。
【００５５】
上記の例は、抗体重鎖のノブアームを示す。対応する「ホール」アームを同様に構築することができる。図２Ｃおよび図２Ｄは、図２Ａおよび図２Ｂにおけるものにそれぞれ対応する「ホール」アームのための発現コンストラクトを示す。図２Ｃに示される例（ＨＴベクター、すなわち、テザー連結された（Ｔｅｔｈｅｒｅｄ）結合断片を含有するホールアーム（Ｈｏｌｅ  ａｒｍ）、抗ＣＤ３  ＳｃＦｖ）では、重鎖発現ベクターは、「ホール」構造を形成するためのＣＨ３ドメイン中の改変を含有する。加えて、抗ＣＤ３  ＳｃＦｖは、重鎖のＣ末端に融合されている。
【００５６】
図２Ｄに示される例（ｍｕｔ−ＨＴベクター、すなわち、テザー連結された（Ｔｅｔｈｅｒｅｄ）結合断片を含有するホールアーム（Ｈｏｌｅ  ａｒｍ）、抗ＣＤ３  ＳｃＦｖ、ＣＨ２ドメインはエフェクター機能を低減または除去するための突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）を含有する）では、重鎖発現ベクターは、「ホール」構造を形成するためのＣＨ３ドメイン中の改変およびエフェクター機能を損なわせるためのＣＨ２ドメイン中の突然変異を含有する。加えて、抗ＣＤ３  ＳｃＦｖは、重鎖のＣ末端に融合されている。
【００５７】
上記の例では、重鎖ＣＨ３は、Ｔ細胞標的化ドメイン（例えば、抗ＣＤ３  ＳｃＦｖ）と融合されている。非対称抗体を形成するために、上記のコンストラクトからのタンパク質は、融合した抗ＣＤ３  ＳｃＦｖを有しないコンストラクトからのタンパク質とペアリングさせることができる。図２Ｅは、抗ＣＤ３  ＳｃＦｖと共に、ＣＨ２ドメイン中に突然変異を有するまたは有しない、タンパク質を製造するための例示的なコンストラクトを示す。
【００５８】
これらの発現ベクターは、ＣＨＯ細胞、２９３細胞などのような抗体発現のための任意の好適な細胞にトランスフェクトされ得る。抗体の発現および精製の方法は、当該技術分野において公知である。
【００５９】
本発明の非対称抗体の製造の一般的概要は以下の通りであり得る：（１）これらのベクターの重鎖Ｎ末端結合因子領域および軽鎖Ｎ末端結合因子領域を成長因子、サイトカインまたはがん標的化ペプチド（ＣＴＰ）のような任意の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）特異的抗体または受容体リガンドのＶＨおよびＶＬから操作する。（２）非対称ヘテロ二量体Ｆｃ−ＳｃＦｖ二重特異的または三重特異的抗体は、重鎖の天然または改変（ｍｕｔ）ＫＴおよびＨ（ＫＴ＋Ｈ）プラスミドＤＮＡまたはＫおよびＨＴ（Ｋ＋ＨＴ）プラスミドＤＮＡのいずれかの、２９３−ＦＳまたはＣＨＯ細胞のような産生用細胞宿主への共トランスフェクションにより生成され得る。（３）二重特異的抗体を生成するために、重鎖の天然または改変（ｍｕｔ）ＫＴおよびＨ（ＫＴ＋Ｈ）プラスミドＤＮＡまたはＫおよびＨＴ（Ｋ＋ＨＴ）プラスミドＤＮＡのＶＨおよびＶＬを同じ抗体から操作する。（４）三重特異的抗体を生成するために、重鎖の天然または改変（ｍｕｔ）ＫＴおよびＨ（ＫＴ＋Ｈ）プラスミドＤＮＡまたはＫおよびＨＴ（Ｋ＋ＨＴ）プラスミドＤＮＡのＶＨおよびＶＬを２つの異なる抗体から操作する。（５）重鎖ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基改変は、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５ＡまたはＬ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａである。（６）重鎖ノブアームＣＨ３ドメインのアミノ酸残基改変は、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗである。（７）重鎖ホールアームＣＨ３ドメインのアミノ酸残基改変は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖである。（８）ＫＴまたはＨＴベクターのＳｃＦｖを抗ＣＤ３抗体から操作する。（９）ＫＴまたはＨＴベクターのＳｃＦｖを抗ＣＤ３抗体のＦａｂにより置換することができる。
【００６０】
非対称ヘテロ二量体Ｆｃ−ＳｃＦｖ（ＡＨＦＳ）融合抗体を生成する方法は以下の通りであり得る：（１）ＰＣＲ増幅した合成ノブアーム遺伝子、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ、ならびにホールアーム遺伝子、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを、ＭｆｅＩおよびＢａｍＨＩ消化と共に、標的化された抗体を発現するｐＴＡＣＥ８ベクターにサブクローニングすることによりノブアームおよびホールアームを生成する。（２）リンカー−抗ＣＤ３  ＳｃＦｖ遺伝子断片を用いる合成ノブアーム−リンカーまたはホールアーム−リカー（ｌｉｋｅｒ）遺伝子断片のアセンブリーＰＣＲにより抗ＣＤ３  ＳｃＦｖと融合したノブアームまたはホールアームを生成し、アセンブルしたＤＮＡを、ＭｆｅＩおよびＢａｍＨＩ消化後に標的抗体発現ベクターにサブクローニングし、異なる標的抗体発現ベクターへの全重鎖断片のサブクローニングをＡｖｒＩＩおよびＢｓｔＺ１７Ｉを用いて消化した。（３）Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ突然変異またはＬ２３５ＡおよびＧ２３７Ａ突然変異を有する合成遺伝子断片のアセンブリーＰＣＲによりＣＨ２ドメインの突然変異を生成し、アセンブルしたＤＮＡを、ＮｈｅＩおよびＭｆｅＩ消化後に、標的抗体発現ベクターにサブクローニングし、異なる標的抗体発現ベクターへの全重鎖断片のサブクローニングをＡｖｒＩＩおよびＢｓｔＺ１７Ｉを用いて消化する。
【００６１】
本発明の実施形態を以下の特定の実施例により説明する。当業者は、これらの実施例は、説明のために過ぎず、本発明の範囲から離れることなく他の改変およびバリエーションが可能であることを理解する。様々な分子生物学技術、ベクター、発現系、タンパク質精製、抗体−抗原結合アッセイなどは、当該技術分野において周知であり、詳細に繰り返さない。
【実施例１】
【００６２】
抗ＴＡＡ抗体の調製
本発明の実施形態によれば、モノクローナル抗体を生成するための一般的方法は、選択されたＴＡＡに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ることを含む。あるいは、本発明の多重特異的非対称抗体は、公知のモノクローナル抗体、例えば抗Ｈｅｒ２抗体トラスツズマブから開始して得られ得る。
【００６３】
モノクローナル抗体の製造方法は当該技術分野において公知であり、ここでは詳細に述べない。簡潔に述べれば、マウスを適切なアジュバントと共に抗原（ＴＡＡ）に負荷する。次に、免疫化マウスの脾臓細胞を回収し、骨髄腫と融合させた。ＥＬＩＳＡのような任意の公知の方法を使用して、ＴＡＡに結合する能力について陽性クローンを同定することができる。
【００６４】
本発明の実施形態によれば、抗体の配列が決定され、該配列が、ノブおよびホール構造を生成するための突然変異の他に、エフェクター機能を低減させまたはサイレンシングするための突然変異の基礎として使用される。簡潔に述べれば、例えばＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬を使用して、ハイブリドーマのトータルＲＮＡを単離した。次に、例えば、第１鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ）およびオリゴ（ｄＴ２０）プライマーまたはＩｇ−３’定常領域プライマーを使用して、トータルＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。免疫グロブリン遺伝子の重鎖および軽鎖配列を次にｃＤＮＡからクローニングした。クローニングでは、適切なプライマー、例えばＩｇ−５’プライマーセット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用するＰＣＲを使用することができる。ＣｌｏｎｅＪｅｔ（商標）  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用してＰＣＲ生成物を直接的に好適なベクター（例えば、ｐＪＥＴ１．２ベクター）中にクローニングすることができる。ｐＪＥＴ１．２ベクターは致死性の挿入を含有し、所望の遺伝子がこの致死性領域にクローニングされた時にのみ選択条件を生き延びる。これは組換えコロニーの選択を促進する。最後に、組換えコロニーを所望のクローンについてスクリーニングし、それらのクローンのＤＮＡを単離し、シークエンシングした。ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  （ＩＧＭＴ）のウェブサイトにおいて免疫グロブリン（ＩＧ）ヌクレオチド配列を解析することができる。ＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔの方法を使用して同定することができる。
【実施例２】
【００６５】
ノブ−アンド−ホール構造を生成し、エフェクター機能をサイレンシングするための突然変異生成
抗ＴＡＡモノクローナル抗体配列は、ＰＣＲを使用するもののような当該技術分野において公知の技術を使用する部位特異的突然変異生成の基礎として使用される。所望の突然変異体クローンは、シークエンシング解析を用いて確認することができる。
【００６６】
抗ＴＡＡ抗体配列を使用する特定の例として、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ突然変異を有する非対称ヘテロ二量体ＳｃＦｖ（ＡＨＦＳ）ＩｇＧホールアームのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は以下の通りである：
ｇｃｔａｇｃａｃｃａａｇｇｇｃｃｃｔｔｃｃｇｔｇｔｔｃｃｃｔｃｔｇｇｃｃｃｃｔｔｃｃａｇｃａａｇｔｃｔａｃｃｔｃｔｇｇｃｇｇｃａｃｃｇｃｔｇｃｔｃｔｇｇｇｃｔｇｃｃｔｃｇｔｇａａｇｇａｃｔａｃｔｔｃｃｃｔｇａｇｃｃｔｇｔｇａｃａｇｔｇｔｃｃｔｇｇａａｃｔｃｔｇｇｃｇｃｃｃｔｇａｃｃｔｃｃｇｇｃｇｔｇｃａｃａｃｃｔｔｃｃｃｔｇｃｃｇｔｇｃｔｇｃａｇｔｃｃｔｃｃｇｇｃｃｔｇｔａｃｔｃｔｃｔｇｔｃｃｔｃｃｇｔｃｇｔｇａｃａｇｔｇｃｃｔｔｃｃｔｃｃａｇｃｃｔｇｇｇｃａｃｃｃａｇａｃｃｔａｃａｔｃｔｇｃａａｃｇｔｇａａｃｃａｃａａｇｃｃｔｔｃｃａａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇａｃａａｇａａｇｇｔｇｇａｇｃｃｔａａｇｔｃｃｔｇｃｇａｃａａｇａｃｃｃａｃａｃｃｔｇｔｃｃｔｃｃａｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃｃｔｇａｇｇｃｔｇｃｔｇｇｃｇｇａｃｃｃｔｃｃｇｔｇｔｔｃｃｔｇｔｔｃｃｃｔｃｃａａａｇｃｃｔａａｇｇａｃａｃｃｃｔｇａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａａｇｔｇａｃｃｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇｔｃｃｃａｃｇａｇｇａｃｃｃｔｇａａｇｔｇａａｇｔｔｃａａｔｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇａａｇｔｇｃａｃａａｃｇｃｃａａｇａｃｃａａｇｃｃｃａｇａｇａｇｇａａｃａｇｔａｃａａｃｔｃｃａｃｃｔａｃｃｇｇｇｔｇｇｔｇｔｃｃｇｔｇｃｔｇａｃｃｇｔｇｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｔｔｇｇｃｔｇａａｃｇｇｃａａａｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｇｔｃｃａａｃａａｇｇｃｃｃｔｇｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａａａａｇａｃｃａｔｃｔｃｃａａｇｇｃｃａａｇｇｇｃｃａｇｃｃｃｃｇｇｇａａｃｃｔｃａａｇｔｇｔｇｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃｔａｇｃｃｇｇｇａａｇａｇａｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｇｔｃｃｃｔｇｔｃｃｔｇｃｇｃｃｇｔｇａａｇｇｇｃｔｔｃｔａｃｃｃｃｔｃｃｇａｃａｔｔｇｃｃｇｔｇｇａａｔｇｇｇａｇｔｃｃａａｃｇｇｃｃａｇｃｃｔｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｃｃｃｃｃｃｔｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃａｔｔｃｔｔｃｃｔｇｇｔｇｔｃｃａａｇｃｔｇａｃａｇｔｇｇａｃａａｇｔｃｃｃｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｃａａｃｇｔｇｔｔｃｔｃｃｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｃｇａｇｇｃｃｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｃｃａｇａａｇｔｃｃｃｔｇａｇｃｃｔｇｔｃｃｃｃｔｇｇｃ  （配列番号：１）。
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ  （配列番号：１５）。
【００６７】
Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ突然変異を有するＡＨＦＳ  ＩｇＧノブアームのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は以下の通りである：
ｇｃｔａｇｃａｃｃａａｇｇｇｃｃｃｔｔｃｃｇｔｇｔｔｃｃｃｔｃｔｇｇｃｃｃｃｔｔｃｃａｇｃａａｇｔｃｔａｃｃｔｃｔｇｇｃｇｇｃａｃｃｇｃｔｇｃｔｃｔｇｇｇｃｔｇｃｃｔｃｇｔｇａａｇｇａｃｔａｃｔｔｃｃｃｔｇａｇｃｃｔｇｔｇａｃａｇｔｇｔｃｃｔｇｇａａｃｔｃｔｇｇｃｇｃｃｃｔｇａｃｃｔｃｃｇｇｃｇｔｇｃａｃａｃｃｔｔｃｃｃｔｇｃｃｇｔｇｃｔｇｃａｇｔｃｃｔｃｃｇｇｃｃｔｇｔａｃｔｃｔｃｔｇｔｃｃｔｃｃｇｔｃｇｔｇａｃａｇｔｇｃｃｔｔｃｃｔｃｃａｇｃｃｔｇｇｇｃａｃｃｃａｇａｃｃｔａｃａｔｃｔｇｃａａｃｇｔｇａａｃｃａｃａａｇｃｃｔｔｃｃａａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇａｃａａｇａａｇｇｔｇｇａｇｃｃｔａａｇｔｃｃｔｇｃｇａｃａａｇａｃｃｃａｃａｃｃｔｇｔｃｃｔｃｃａｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃｃｔｇａｇｇｃｔｇｃｔｇｇｃｇｇａｃｃｃｔｃｃｇｔｇｔｔｃｃｔｇｔｔｃｃｃｔｃｃａａａｇｃｃｔａａｇｇａｃａｃｃｃｔｇａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａａｇｔｇａｃｃｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇｔｃｃｃａｃｇａｇｇａｃｃｃｔｇａａｇｔｇａａｇｔｔｃａａｔｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇａａｇｔｇｃａｃａａｃｇｃｃａａｇａｃｃａａｇｃｃｃａｇａｇａｇｇａａｃａｇｔａｃａａｃｔｃｃａｃｃｔａｃｃｇｇｇｔｇｇｔｇｔｃｃｇｔｇｃｔｇａｃｃｇｔｇｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｔｔｇｇｃｔｇａａｃｇｇｃａａａｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｇｔｃｃａａｃａａｇｇｃｃｃｔｇｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａａａａｇａｃｃａｔｃｔｃｃａａｇｇｃｃａａｇｇｇｃｃａｇｃｃｃｃｇｇｇａａｃｃｃｃａｇｇｔｇｔａｃａｃａｃｔｇｃｃｃｃｃｔｔｇｃｃｇｇｇａａｇａｇａｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｇｔｃｃｃｔｇｔｇｇｔｇｃｃｔｃｇｔｇａａｇｇｇｃｔｔｃｔａｃｃｃｃｔｃｃｇａｃａｔｔｇｃｃｇｔｇｇａａｔｇｇｇａｇｔｃｃａａｃｇｇｃｃａｇｃｃｔｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｃｃｃｃｃｃｔｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃａｔｔｃｔｔｃｃｔｇｔａｃｔｃｃａａｇｃｔｇａｃａｇｔｇｇａｃａａｇｔｃｃｃｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｃａａｃｇｔｇｔｔｃｔｃｃｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｃｇａｇｇｃｃｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｃｃａｇａａｇｔｃｃｃｔｇｔｃｃｃｔｇａｇｃｃｃｔｇｇｃ  （配列番号：２）。
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ  （配列番号：１６）。
【００６８】
同様に、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ突然変異を有するＡＨＦＳ  ＩｇＧホールアームのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は以下の通りである：
ｇｃｔａｇｃａｃｃａａｇｇｇｃｃｃｔｔｃｃｇｔｇｔｔｃｃｃｔｃｔｇｇｃｃｃｃｔｔｃｃａｇｃａａｇｔｃｔａｃｃｔｃｔｇｇｃｇｇｃａｃｃｇｃｔｇｃｔｃｔｇｇｇｃｔｇｃｃｔｃｇｔｇａａｇｇａｃｔａｃｔｔｃｃｃｔｇａｇｃｃｔｇｔｇａｃａｇｔｇｔｃｃｔｇｇａａｃｔｃｔｇｇｃｇｃｃｃｔｇａｃｃｔｃｃｇｇｃｇｔｇｃａｃａｃｃｔｔｃｃｃｔｇｃｃｇｔｇｃｔｇｃａｇｔｃｃｔｃｃｇｇｃｃｔｇｔａｃｔｃｔｃｔｇｔｃｃｔｃｃｇｔｃｇｔｇａｃａｇｔｇｃｃｔｔｃｃｔｃｃａｇｃｃｔｇｇｇｃａｃｃｃａｇａｃｃｔａｃａｔｃｔｇｃａａｃｇｔｇａａｃｃａｃａａｇｃｃｔｔｃｃａａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇａｃａａｇａａｇｇｔｇｇａｇｃｃｔａａｇｔｃｃｔｇｃｇａｃａａｇａｃｃｃａｃａｃｃｔｇｔｃｃｔｃｃａｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃｃｔｇａｇｃｔｇｇｃｔｇｇｃｇｃｔｃｃｃｔｃｃｇｔｇｔｔｃｃｔｇｔｔｃｃｃｔｃｃａａａｇｃｃｔａａｇｇａｃａｃｃｃｔｇａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａａｇｔｇａｃｃｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇｔｃｃｃａｃｇａｇｇａｃｃｃｔｇａａｇｔｇａａｇｔｔｃａａｔｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇａａｇｔｇｃａｃａａｃｇｃｃａａｇａｃｃａａｇｃｃｃａｇａｇａｇｇａａｃａｇｔａｃａａｃｔｃｃａｃｃｔａｃｃｇｇｇｔｇｇｔｇｔｃｃｇｔｇｃｔｇａｃｃｇｔｇｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｔｔｇｇｃｔｇａａｃｇｇｃａａａｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｇｔｃｃａａｃａａｇｇｃｃｃｔｇｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａａａａｇａｃｃａｔｃｔｃｃａａｇｇｃｃａａｇｇｇｃｃａｇｃｃｃｃｇｇｇａａｃｃｔｃａａｇｔｇｔｇｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃｔａｇｃｃｇｇｇａａｇａｇａｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｇｔｃｃｃｔｇｔｃｃｔｇｃｇｃｃｇｔｇａａｇｇｇｃｔｔｃｔａｃｃｃｃｔｃｃｇａｃａｔｔｇｃｃｇｔｇｇａａｔｇｇｇａｇｔｃｃａａｃｇｇｃｃａｇｃｃｔｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｃｃｃｃｃｃｔｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃａｔｔｃｔｔｃｃｔｇｇｔｇｔｃｃａａｇｃｔｇａｃａｇｔｇｇａｃａａｇｔｃｃｃｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｃａａｃｇｔｇｔｔｃｔｃｃｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｃｇａｇｇｃｃｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｃｃａｇａａｇｔｃｃｃｔｇａｇｃｃｔｇｔｃｃｃｃｔｇｇｃ  （配列番号：３）。
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ  （配列番号：１７）。
【００６９】
Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ突然変異を有するＡＨＦＳ  ＩｇＧノブアームのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は以下の通りである：
ｇｃｔａｇｃａｃｃａａｇｇｇｃｃｃｔｔｃｃｇｔｇｔｔｃｃｃｔｃｔｇｇｃｃｃｃｔｔｃｃａｇｃａａｇｔｃｔａｃｃｔｃｔｇｇｃｇｇｃａｃｃｇｃｔｇｃｔｃｔｇｇｇｃｔｇｃｃｔｃｇｔｇａａｇｇａｃｔａｃｔｔｃｃｃｔｇａｇｃｃｔｇｔｇａｃａｇｔｇｔｃｃｔｇｇａａｃｔｃｔｇｇｃｇｃｃｃｔｇａｃｃｔｃｃｇｇｃｇｔｇｃａｃａｃｃｔｔｃｃｃｔｇｃｃｇｔｇｃｔｇｃａｇｔｃｃｔｃｃｇｇｃｃｔｇｔａｃｔｃｔｃｔｇｔｃｃｔｃｃｇｔｃｇｔｇａｃａｇｔｇｃｃｔｔｃｃｔｃｃａｇｃｃｔｇｇｇｃａｃｃｃａｇａｃｃｔａｃａｔｃｔｇｃａａｃｇｔｇａａｃｃａｃａａｇｃｃｔｔｃｃａａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇａｃａａｇａａｇｇｔｇｇａｇｃｃｔａａｇｔｃｃｔｇｃｇａｃａａｇａｃｃｃａｃａｃｃｔｇｔｃｃｔｃｃａｔｇｃｃｃｔｇｃｃｃｃｔｇａｇｃｔｇｇｃｔｇｇｃｇｃｔｃｃｃｔｃｃｇｔｇｔｔｃｃｔｇｔｔｃｃｃｔｃｃａａａｇｃｃｔａａｇｇａｃａｃｃｃｔｇａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａａｇｔｇａｃｃｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇｔｃｃｃａｃｇａｇｇａｃｃｃｔｇａａｇｔｇａａｇｔｔｃａａｔｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇａａｇｔｇｃａｃａａｃｇｃｃａａｇａｃｃａａｇｃｃｃａｇａｇａｇｇａａｃａｇｔａｃａａｃｔｃｃａｃｃｔａｃｃｇｇｇｔｇｇｔｇｔｃｃｇｔｇｃｔｇａｃｃｇｔｇｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｔｔｇｇｃｔｇａａｃｇｇｃａａａｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｇｔｃｃａａｃａａｇｇｃｃｃｔｇｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａａａａｇａｃｃａｔｃｔｃｃａａｇｇｃｃａａｇｇｇｃｃａｇｃｃｃｃｇｇｇａａｃｃｃｃａｇｇｔｇｔａｃａｃａｃｔｇｃｃｃｃｃｔｔｇｃｃｇｇｇａａｇａｇａｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｇｔｃｃｃｔｇｔｇｇｔｇｃｃｔｃｇｔｇａａｇｇｇｃｔｔｃｔａｃｃｃｃｔｃｃｇａｃａｔｔｇｃｃｇｔｇｇａａｔｇｇｇａｇｔｃｃａａｃｇｇｃｃａｇｃｃｔｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｃｃｃｃｃｃｔｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃａｔｔｃｔｔｃｃｔｇｔａｃｔｃｃａａｇｃｔｇａｃａｇｔｇｇａｃａａｇｔｃｃｃｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｃａａｃｇｔｇｔｔｃｔｃｃｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｃｇａｇｇｃｃｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｃｃａｇａａｇｔｃｃｃｔｇｔｃｃｃｔｇａｇｃｃｃｔｇｇｃ  （配列番号：４）。
ＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＡＧＡＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ  （配列番号：１８）。
【００７０】
類似の例では、第２の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する別の抗体は、本発明の非対称抗体を生成するための基礎であり得る。抗ＴＡＡ−１  Ｂ１３１１（抗Ｈｅｒ２抗体）重鎖ＶＨのヌクレオチド配列は以下の通りである：
Ｇａｇａｔｃｃａｇｃｔｇｇｔｇｃａｇｔｃｔｇｇｃｇｇａｇｇａｃｔｇｇｃｔｃａｇｃｃｔｇｇｃｇｇｃｔｃｔａｔｃａｇａｃｔｇａｇｃｔｇｔｇｃｃｃｃｃａｇｃｇｇｃｔａｃａｔｃａｇｃａｇｃｇａｃｃａｇａｔｃｃｔｇａａｃｔｇｇｇｔｃａａｇａａｇｇｃｃｃｃｔｇｇｃａａｇｇｇｃｃｔｇｇａａｔｇｇａｔｃｇｇｃａｇａａｔｃｔａｃｃｃｃｇｔｇａｃｃｇｇｃｇｔｇａｃｃｃａｇｔａｃａａｃｃａｃａａｇｔｔｃｇｔｇｇｇｃａａｇｇｃｃａｃｃｔｔｃａｇｃｇｔｇｇａｃａｇａｔｃｃａａｇｇａｃａｃｃｇｔｇｔａｃａｔｇｃａｇａｔｇａａｃａｇｃｃｔｇａｇａｇｃｃｇａｇｇａｃａｃｃｇｇｃｇｔｇｔａｃｔａｃｔｇｃｇｇｃａｇａｇｇｃｇａｇａｃａｔｔｃｇａｃａｇｃｔｇｇｇｇｃｃａｇｇｇｃａｃａｃｔｇｃｔｇａｃｃｇｔｇｔｃａｔｃｔ  （配列番号：５）。
【００７１】
抗ＴＡＡ−１  Ｂ１３１１軽鎖ＶＬのヌクレオチド配列は以下の通りである：
Ｇａｃａｔｃｃａｇｃｔｇａｃｃｃａｇａｇｃａｔｃａｇｃａｇｃｃｔｇａｇｃｇｔｇｔｃｃｇｔｇｇｇｃｇａｃａｇａｇｔｇａｃｃａｔｃａａｃｔｇｃａａｇａｇｃａａｃｃａｇａａｃｃｔｇｃｔｇｔｇｇａｇｃｇｇｃａａｃａｇａｃｇｇｔａｃａｃｃｃｔｃｇｔｇｔｇｇｃａｃｃａｇｔｇｇａａｇｃｃｔｇｇｃａａｇａｇｃｃｃｃａａｇｃｃｃｃｔｇａｔｃａｃａｔｇｇｇｃｃａｇｃｇａｃａｇａｔｃｃｔｔｃｇｇｃｇｔｇｃｃｃａｇｃａｇａｔｔｃａｇｃｇｇｃａｇｃｇｇｃｔｃｔｇｔｇａｃｃｇａｃｔｔｃａｃｃｃｔｇａｃｃａｔｃａｇｃｔｃｃｇｔｇｃａｇｃｃｃｇａｇｇａｃｔｔｃｇｃｃｇｔｇｔａｃｔｔｃｔｇｃｃａｇｃａｇｃａｃｃｔｇｇａｃａｔｃｃｃｔｔａｃａｃｃｔｔｃｇｇｃｇｇａｇｇｃａｃｃａａｇｃｔｇｇａａａｔｃａａｇａｇａ  （配列番号：６）。
【００７２】
抗ＴＡＡ−１  Ｂ１３１１  ＳｃＦｖのヌクレオチド配列は以下の通りである：
ｇａｃａｔｃｃａｇｃｔｇａｃｃｃａｇａｇｃａｔｃａｇｃａｇｃｃｔｇａｇｃｇｔｇｔｃｃｇｔｇｇｇｃｇａｃａｇａｇｔｇａｃｃａｔｃａａｃｔｇｃａａｇａｇｃａａｃｃａｇａａｃｃｔｇｃｔｇｔｇｇａｇｃｇｇｃａａｃａｇａｃｇｇｔａｃａｃｃｃｔｃｇｔｇｔｇｇｃａｃｃａｇｔｇｇａａｇｃｃｔｇｇｃａａｇａｇｃｃｃｃａａｇｃｃｃｃｔｇａｔｃａｃａｔｇｇｇｃｃａｇｃｇａｃａｇａｔｃｃｔｔｃｇｇｃｇｔｇｃｃｃａｇｃａｇａｔｔｃａｇｃｇｇｃａｇｃｇｇｃｔｃｔｇｔｇａｃｃｇａｃｔｔｃａｃｃｃｔｇａｃｃａｔｃａｇｃｔｃｃｇｔｇｃａｇｃｃｃｇａｇｇａｃｔｔｃｇｃｃｇｔｇｔａｃｔｔｃｔｇｃｃａｇｃａｇｃａｃｃｔｇｇａｃａｔｃｃｃｔｔａｃａｃｃｔｔｃｇｇｃｇｇａｇｇｃａｃｃａａｇｃｔｇｇａａａｔｃａａｇａｇａｔｇｔｇｇａｇｇｃｇｇｔｔｃａｇｇｃｇｇａｇｇｔｇｇｃｔｃｔｇｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇａｔｃｇｇａｇａｔｃｃａｇｃｔｇｇｔｇｃａｇｔｃｔｇｇｃｇｇａｇｇａｃｔｇｇｃｔｃａｇｃｃｔｇｇｃｇｇｃｔｃｔａｔｃａｇａｃｔｇａｇｃｔｇｔｇｃｃｃｃｃａｇｃｇｇｃｔａｃａｔｃａｇｃａｇｃｇａｃｃａｇａｔｃｃｔｇａａｃｔｇｇｇｔｃａａｇａａｇｇｃｃｃｃｔｇｇｃａａｇｇｇｃｃｔｇｇａａｔｇｇａｔｃｇｇｃａｇａａｔｃｔａｃｃｃｃｇｔｇａｃｃｇｇｃｇｔｇａｃｃｃａｇｔａｃａａｃｃａｃａａｇｔｔｃｇｔｇｇｇｃａａｇｇｃｃａｃｃｔｔｃａｇｃｇｔｇｇａｃａｇａｔｃｃａａｇｇａｃａｃｃｇｔｇｔａｃａｔｇｃａｇａｔｇａａｃａｇｃｃｔｇａｇａｇｃｃｇａｇｇａｃａｃｃｇｇｃｇｔｇｔａｃｔａｃｔｇｃｇｇｃａｇａｇｇｃｇａｇａｃａｔｔｃｇａｃａｇｃｔｇｇｇｇｃｃａｇｇｇｃａｃａｃｔｇｃｔｇａｃｃｇｔｇｔｃａｔｃｔ  （配列番号：７）。
【００７３】
さらに別の例では、ハーセプチン抗体は、本発明の非対称抗体を構築するための基礎であり得る。この例では、ハーセプチンに基づくＳｃＦｖは、以下の通りのヌクレオチド配列を有する：
Ｇａｔａｔｃｃａｇａｔｇａｃｃｃａｇｔｃｃｃｃｃｔｃｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｇｃｃｔｃｃｇｔｇｇｇｃｇａｃａｇａｇｔｇａｃｃａｔｃａｃｃｔｇｔｃｇｇｇｃｃｔｃｃｃａｇｇａｔｇｔｇａａｃａｃｃｇｃｃｇｔｇｇｃｃｔｇｇｔａｔｃａｇｃａｇａａｇｃｃｔｇｇｃａａｇｇｃｃｃｃｔａａｇｃｔｇｃｔｇａｔｃｔａｃｔｃｃｇｃｃｔｃｃｔｔｃｃｔｇｔａｃｔｃｃｇｇｃｇｔｇｃｃｃｔｃｃｃｇｇｔｔｃｔｃｃｇｇｃｔｃｔａｇａｔｃｃｇｇｃａｃａｇａｃｔｔｃａｃｃｃｔｇａｃｃａｔｃｔｃｃａｇｃｃｔｇｃａｇｃｃｔｇａｇｇａｃｔｔｃｇｃｃａｃｃｔａｃｔａｃｔｇｃｃａｇｃａｇｃａｃｔａｃａｃｃａｃｃｃｃｔｃｃａａｃｃｔｔｃｇｇｃｃａｇｇｇｃａｃｃａａｇｇｔｇｇａｇａｔｃａａｇｃｇｇｔｇｔｇｇａｇｇｃｇｇｔａｇｃｇｇｃｇｇａｇｇａｇｇａｔｃｃｇｇｇｇｇｃｇｇｃｇｇｇｔｃｃｇｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇａａｇｃｇａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｔｇｇａｇｔｃｔｇｇｇｇｇａｇｇａｃｔｇｇｔｇｃａｇｃｃｔｇｇｃｇｇｃｔｃｃｃｔｇａｇａｃｔｇｔｃｔｔｇｃｇｃｔｇｃｔａｇｃｇｇｃｔｔｃａａｃａｔｃａａｇｇａｃａｃｃｔａｃａｔｃｃａｃｔｇｇｇｔｔｃｇｃｃａｇｇｃｔｃｃａｇｇｃａａｇｇｇａｃｔｇｇａａｔｇｇｇｔｇｇｃｃｃｇｇａｔｃｔａｃｃｃｔａｃｃａａｃｇｇｃｔａｃａｃｃａｇａｔａｃｇｃｃｇａｃｔｃｃｇｔｇａａｇｇｇｃｃｇｇｔｔｃａｃｃａｔｃｔｃｃｇｃｃｇａｃａｃｃｔｃｃａａｇａａｃａｃｃｇｃｃｔａｃｃｔｇｃａｇａｔｇａａｃｔｃｃｃｔｇａｇｇｇｃｃｇａｇｇａｃａｃｃｇｃｃｇｔｇｔａｃｔａｃｔｇｃｔｃｃａｇａｔｇｇｇｇａｇｇｃｇａｃｇｇｃｔｔｃｔａｃｇｃｃａｔｇｇａｃｔａｃｔｇｇｇｇｃｃａｇｇｇｃａｃｃｃｔｇｇｔｔａｃｃｇｔｇｔｃｃｔｃｃ  （配列番号：８）。
【００７４】
本発明の一部の実施形態は、標的化ドメインとしてリガンド（例えば、成長因子またはサイトカイン）を有し得る。特定の例として、ＥＧＦは、がん細胞上のＥＧＦ受容体を標的化するために使用され得る。ＥＧＦのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は以下の通りである：
ａａｔａｇｃｇａｔａｇｃｇａｇｔｇｃｃｃｔｃｔｇａｇｃｃａｃｇａｃｇｇｃｔａｃｔｇｔｃｔｇｃａｔｇａｔｇｇｃｇｔｇｔｇｃａｔｇｔａｃａｔｃｇａｇｇｃｃｃｔｇｇａｔａａｇｔａｃｇｃｃｔｇｃａａｃｔｇｃｇｔｃｇｔｇｇｇｃｔａｃａｔｃｇｇａｇａｇａｇａｔｇｃｃａｇｔａｃｃｇｇｇａｃｃｔｇａａｇｔｇｇｔｇｇｇａｇｃｔｔａｇａ  （配列番号：９）。
ＮＳＤＳＥＣＰＬＳＨＤＧＹＣＬＨＤＧＶＣＭＹＩＥＡＬＤＫＹＡＣＮＣＶＶＧＹＩＧＥＲＣＱＹＲＤＬＫＷＷＥＬＲ  （配列番号：２２）。
【００７５】
本発明の一部の実施形態は、ペプチド標的化特異的結合因子（例えば、受容体）を有し得る。任意の公知（ｋｎｏｗ）のペプチドリガンドを使用することができる。ペプチドリガンドの例としては、アンジオポエチンのアンタゴニストであるＡＭＧ３８６（トレバナニブ）を挙げることができる。ＡＭＧ３８６のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は以下の通りである：
Ａｔｇｇｇｔｇｃｃｃａｇｃａａｇａｇｇａａｔｇｃｇａａｔｇｇｇａｃｃｃｔｔｇｇａｃｃｔｇｃｇａｇｃａｃａｔｇｃｔｔｇａａ  （配列番号：１０）。
ＭＧＡＱＱＥＥＣＥＷＤＰＷＴＣＥＨＭＬＥ  （配列番号：１９）。
【００７６】
他のがん標的化ペプチド（ＣＴＰ）としては、以下のＣＴＰ１（乳がんを標的化する）およびＣＴＰ２（卵巣がんを標的化する）を挙げることができ、これらのＣＴＰのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は以下の通りである：
ＣＴＰ１：ｔｃｔａｔｇｇａｃｃｃａｔｔｃｃｔｇｔｔｔｃａｇｃｔｇｃｔｇｃａｇｃｔｃ（配列番号：１１）；
ＣＴＰ１：ＳＭＤＰＦＬＦＱＬＬＱＬ（配列番号：２０）；
ＣＴＰ２：ａｔｇｃｃｔｃａｔｃｃｔａｃｃａａｇａａｃｔｔｃｇａｃｃｔｇｔａｃｇｔｇ（配列番号：１２）；
ＣＴＰ２：ＭＰＨＰＴＫＮＦＤＬＹＶ（配列番号：２１）。
【００７７】
本発明のＡＨＦＳは、抗体のＣ末端に融合した抗ＣＤ３  ＳｃＦｖを含有し得る。抗ＣＤ３  ＳｃＦｖと抗体のＣＨ３ドメインとの間にリンカーを使用することができる。リンカーの例示的なヌクレオチドおよびアミノ酸配列は以下の通りである：
ｇｇｃｇｇａｇｇｃｇｇａｇｇａｔｃｔｇｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｔｃｔｇｇｃｇｇｃｇｇａｇｇａａｇｔ  （配列番号：１３）。
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ  （配列番号：２３）。
【００７８】
Ｔ細胞標的化の例は、抗ＣＤ３  ＳｃＦｖのものである。ＯＫＴＦ１抗ＣＤ３  ＳｃＦｖのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は以下の通りである：
ｃａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｔｇｃａｇａｇｃｇｇｃｇｃｔｇａａｇｔｇａａｇａａａｃｃｔｇｇｃｇｃｃｔｃｃｇｔｇａａｇｇｔｇｔｃｃｔｇｃａａｇｇｃｔｔｃｔｇｇｃｔａｃａｃｃｔｔｔａｃｃｃｇｇｔａｃａｃｃａｔｇｃａｔｔｇｇｇｔｇｃｇａｃａｇｇｃｔｃｃａｇｇｃｃａｇｇｇｇｃｔｇｇａａｔｇｇａｔｔｇｇｃｔａｃａｔｃａａｃｃｃｃａｇｃｃｇｇｇｇｃｔａｃａｃｃａａｃｔａｃａａｔｃａｇａａｇｔｔｃａａｇｇａｔａａｇｇｃｃａｃｃｃｔｇａｃｃａｃｃｇａｃａａｇｔｃｃａｔｃｔｃｃａｃｃｇｃｃｔａｃａｔｇｇａａｃｔｇｔｃｃｃｇｇｃｔｇａｇａｔｃｃｇａｃｇａｔａｃｃｇｃｔｇｔｇｔａｃｔａｃｔｇｃｇｃｃｃｇｇｔａｃｔａｃｇａｃｇａｃｃａｃｔａｃａｃｃｃｔｇｇａｃｔａｃｔｇｇｇｇａｃａｇｇｇｔａｃｔｃｔｃｇｔｇａｃｔｇｔｇｔｃａａｇｔｇｇｃｇｇｔｇｇｔｇｇｔａｇｔｇｇｃｇｇｇｇｇａｇｇｔｔｃａｇｇｇｇｇｇｇｇａｇｇａａｇｃｇａａａｔｃｇｔｇｃｔｇａｃａｃａｇａｇｃｃｃｃｇｃｃａｃｃｃｔｇｔｃａｃｔｇｔｃｔｃｃａｇｇｃｇａｇａｇａｇｃｔａｃｃｃｔｇａｇｃｔｇｃｔｃｔｇｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｇｔｇｔｃｔｔａｃａｔｇａａｃｔｇｇｔａｔｃａｇｃａｇａａｇｃｃｃｇｇｃｃａｇｇｃｃｃｃｃａｇａｃｇｇｔｇｇａｔｃｔａｃｇａｔａｃｃｔｃｃａａｇｃｔｇｇｃｃｔｃｃｇｇｃａｔｃｃｃｔｇｃｃａｇａｔｔｃｔｃｃｇｇｃｔｃｔｇｇｃｔｃｃｇｇｃａｃｃｔｃｃｔａｔａｃｃｃｔｇａｃａａｔｃｔｃｃａｇｃｃｔｇｇａａｃｃｃｇａｇｇａｃｔｔｔｇｃｃｇｔｇｔａｔｔａｃｔｇｃｃａｇｃａｇｔｇｇｔｃｃｔｃｃａａｃｃｃｃｔｔｃａｃｃｔｔｃｇｇａｃａｇｇｇｃａｃａａａｇｇｔｇｇａａａｔｃａａｇｃｇｃ  （配列番号：１４）。
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＴＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＦＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ  （配列番号：２４）。
【実施例３】
【００７９】
抗体の発現および精製
抗体産生のために、ＣＨＯまたはＦ２９３細胞のような任意の好適な細胞中で様々なクローンを発現させることができる。一例として、Ｆ２９３細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に抗ＴＡＡ  ｍＡｂ発現プラスミドをトランスフェクトし、７日間培養した。プロテインＡ親和性カラム（ＧＥ）を使用して培養培地から抗ＴＡＡ抗体を精製することができる。Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイキットを用いてタンパク質濃度を決定し、当該技術分野において公知の手順を使用してまたは製造業者の説明書にしたがって１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析することができる。
【００８０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨＰＬＣのような当該技術分野において公知の技術を用いて本発明の様々な抗体を分析することができる。例えば、４〜１２％の非還元および還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルならびにその後のクマシーブリリアントブルー染色を使用することにより抗ＴＡＡ抗体試料の溶液を分析することができる。
【実施例４】
【００８１】
結合アッセイ
ＥＬＩＳＡまたはＢｉａｃｏｒｅのような当該技術分野において公知の任意の好適な方法を用いて本発明の抗体の結合親和性を評価することができる。加えて、ＦＡＣＳを使用して結合を質的に評価することができる。
【００８２】
簡潔に述べれば、細胞を回収し、ポリスチレン丸底１２×７５ｍｍ２チューブ中１〜５×１０Ｅ６／ｍｌの細胞密度で氷冷した染色緩衝液（１ｘ  ＰＢＳ、１％ＢＳＡ）を用いて洗浄する。特定の蛍光を有する適切な抗体を用いて細胞を染色する。染色後、細胞を遠心分離して、細胞をほとんど損失せずに上清液を分離することができるが、細胞の再懸濁が困難になるほど激しくは行わない。
【００８３】
図３は、ＦＡＣＳ分析の結果を示す。示されるように、抗ＣＤｓ  ＳｃＦｖを有しないノブおよびホール抗体（Ｈ＋Ｋ）はＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞に結合しなかった。他方、エフェクター結合部位中に突然変異を有するまたは有しないＴ細胞標的化ドメインを有する非対称抗体（Ｔ＋Ｋ、またはＨ＋Ｔ）はＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞に特異的に結合する。
【００８４】
図４は、ＦＡＣＳ分析の結果を示す。示されるように、抗ＣＤｓ  ＳｃＦｖを有しないノブおよびホール抗体（Ｈ＋Ｋ）は乳がんＨＣＣ１４２８細胞に結合しなかった。他方、エフェクター結合部位中に突然変異を有するまたは有しないＴ細胞標的化ドメインを有する非対称抗体（Ｔ＋Ｋ、またはＨ＋Ｔ）はＨＣＣ１４２８細胞に特異的に結合する。
【００８５】
図５は、乳がん細胞ＢＴ４７４への二重特異的タンパク質の結合のＦＡＣＳ分析の結果を示す。示されるように、ＡＨＦＳ  ＥＧＦ×抗ＣＤ３および乳がん細胞を標的化するＣＴＰ×抗ＣＤ３は乳がん細胞ＢＴ４７４に結合できる一方、ＡＨＦＳ  ＡＭＧ３８６×抗ＣＤ３は結合できない。
【００８６】
これらの結果は、非対称抗体（タンパク質）または本発明は、設計された通りの標的に特異的に結合できることを指し示す。
【実施例５】
【００８７】
ＡＨＦＳ抗ＴＡＡ×抗ＣＤ３二重特異的抗体が、ＰＢＭＣの存在下かつＡＤＣＣ機能の非存在下でＴＡＡ発現乳がん細胞株ＨＣＣ１４２８を効果的に殺傷することを示す。
がん細胞を殺傷する本発明の抗体の能力は、ＡＴＣＣから得ることができるＭＣＦ−７、ＨＣＣ−１４２８、ＢＴ−４７４細胞のような任意の好適な細胞を使用して評価することができる。一例として、ＨＣＣ１４２８細胞（緑色蛍光タンパク質のトランスフェクションを伴う）を好適な培養培地中、加湿インキュベーター中３７℃で５％のＣＯ２の雰囲気下で培養する。全ての細胞株を少なくとも３継代数にわたり継代培養し、細胞を９６ウェル黒色平底プレートにプレーティングし（全ての細胞株について１０，０００細胞／１００μｌ／ウェル）、５％のＣＯ２の湿潤雰囲気下３７℃で終夜接着させた。
【００８８】
抗ＣＤ３二重特異的抗体を含むＡＨＦＳ抗ＴＡＡの溶液を調製し、細胞播種の２４時間後に適切な作用濃度に希釈する。ＡＨＦＳ抗ＴＡＡ×抗ＣＤ３溶液のアリコートを細胞培養物に加えて、２０ｎＭおよび１００ｎＭを達成し、細胞を７２時間インキュベートした。ＰＢＭＣまたはＴ細胞を標的細胞に対して１０：１の比でエフェクター細胞として使用する。０時間および７２時間の時点で緑色蛍光について細胞を調べる。
【００８９】
図６は、エフェクター細胞としてＰＢＭＣを使用したこの実験の結果を示す。結果は、ＡＨＦＳ抗ＴＡＡ×抗ＣＤ３二重特異的抗体がＰＢＭＣの存在下でＴＡＡ発現乳がん細胞株ＨＣＣ１４２８を効果的に殺傷することを示す。野生型（すなわち、エフェクター機能をサイレンシングするための突然変異を有しない）ＡＨＦＳは、抗ＣＤ３融合物ありまたはなしで、がん細胞を殺傷することができる。対照的に、突然変異体（エフェクター機能を有しない）は、抗ＣＤ３融合物のみを用いてＡＤＣＣ機能の非存在下でがん細胞を殺傷することができる。すなわち、ｍｕｔ２３４−２３５またはｍｕｔ２３５−２３７を有する場合、テザー連結された抗ＣＤ３（Ｋ＋ＨＴおよびＫＴ＋Ｈ）を有する抗体はがん細胞の殺傷において効果的であるが、（Ｋ＋Ｈ）を有しないものはそうではない。
【００９０】
図６に示される結果は、本発明のＡＨＦＳは、最小のエフェクター機能を有するか、またはエフェクター機能を有しない（エフェクター細胞としてＰＢＭＣを有する細胞傷害性が全くないか、またはほとんどない）が、Ｔ細胞特異的細胞傷害性を介してがん細胞を殺傷する能力を保持するように操作できることを明確に示す。
【００９１】
図７は、エフェクター細胞としてＴ細胞を使用したこの実験の結果を示す。結果は、ＡＨＦＳ抗ＴＡＡ×抗ＣＤ３二重特異的抗体が、Ｔ細胞の存在下でＴＡＡ発現乳がん細胞株ＨＣＣ１４２８を効果的に殺傷することを示す。野生型（すなわち、エフェクター機能をサイレンシングするための突然変異を有しない）または抗ＣＤ３融合物を有しない突然変異体（ｍｕｔ２３４−２３５またはｍｕｔ２３５−２３７）ＡＨＦＳは、がん細胞の殺傷において効果的でない。抗ＣＤ３融合物なしの場合、これらの抗体は、Ｔ細胞にエンゲージメントして活性化させることができない。
【００９２】
図７に示される結果は、本発明のＡＨＦＳは、Ｔ細胞エンゲージメントおよび活性化に依存し、それにより非特異的ＡＤＣＣを回避するように操作（抗ＣＤ３融合物）できることを明確に示す。
【００９３】
図８は、エフェクター細胞としてＴ細胞および非対称抗体の新たなフォーマット（Ｎ−ＬＦｖ）を使用した類似の実験の結果を示す。結果は、ＡＨＦＳ  Ｎ−ＬＦｖ×抗ＣＤ３二重特異的抗体が、Ｔ細胞の存在下でＨｅｒ２発現乳がん細胞株ＨＣＣ１４２８を効果的に殺傷することを示す。対照的に、Ｂ１３１１およびハーセプチンの両方は、ＡＤＣＣの欠如（このアッセイではＮＫ細胞は存在しない）に起因して効果的でない。
【００９４】
図８に示される結果は、本発明のＡＨＦＳは、Ｔ細胞エンゲージメントおよび活性化に依存し、かつエフェクター機能に依存せず、それにより非特異的ＡＤＣＣを回避するように操作（抗ＣＤ３融合物）できることを明確に示す。
【００９５】
図９は、エフェクター細胞としてＴ細胞および非対称抗体の同じフォーマット（Ｎ−ＬＦｖ）を使用するが、異なるがん細胞株（ＢＴ４７４）に対する類似の実験の結果を示す。結果は、ＡＨＦＳ  Ｎ−ＬＦｖ×抗ＣＤ３二重特異的抗体が、Ｔ細胞の存在下でＨｅｒ２発現乳がん細胞株ＢＴ４７４を効果的に殺傷することを示す。対照的に、Ｂ１３１１およびハーセプチンは、エフェクター機能の非存在（ＮＫ細胞なし）に起因して効果的でない。
【００９６】
図９に示される結果は、本発明のＡＨＦＳは、Ｔ細胞エンゲージメントおよび活性化に依存し、かつエフェクター機能に依存せず、それにより非特異的ＡＤＣＣを回避するように操作（抗ＣＤ３融合物）できることを明確に示す。
【００９７】
図１０は、エフェクター細胞としてＴ細胞および非対称抗体の新たなフォーマット（Ｎ−ＳｃＦｖ）を使用した類似の実験の結果を示す。結果は、ＡＨＦＳ  Ｎ−ＳｃＦｖ×抗ＣＤ３二重特異的抗体が、ＮＫ細胞なしで、Ｔ細胞の存在下でＨｅｒ２発現乳がん細胞株ＨＣＣ１４２８を効果的に殺傷することを示す。対照的に、ハーセプチンは、ＮＫ細胞の非存在に起因して効果的でない。
【００９８】
図１０に示される結果は、本発明のＡＨＦＳは、Ｔ細胞エンゲージメントおよび活性化に依存し、それにより非特異的ＡＤＣＣを回避するように操作（抗ＣＤ３融合物）できることを明確に示す。
【００９９】
抗体に基づく結合ドメインに加えて、本発明の実施形態はまた、がん細胞を標的化するためのリガンド（例えば、成長因子またはサイトカイン）に基づくことができる。図１１は、エフェクター細胞としてＴ細胞および非対称抗体の新たなフォーマット（ＥＧＦ）を使用した実験の結果を示す。結果は、ＡＨＦＳ  ＥＧＦ×抗ＣＤ３二重特異的抗体が、ＮＫ細胞なしで、Ｔ細胞の存在下でＨｅｒ２発現乳がん細胞株ＢＴ４７４を効果的に殺傷することを示す。対照的に、ＡＭＧ３８６ベースの二重特異的抗体は、ＮＫ細胞の非存在に起因して効果的でない。ＡＭＧ３８６は、ＢＴ４７４上に存在しないアンジオポエチンに結合する。
【０１００】
本発明の一部の実施形態は、腫瘍細胞を標的化できるペプチドリガンドに基づく。図１２は、エフェクター細胞としてＴ細胞およびがん細胞を標的化するペプチド（ＣＴＰ）を有する非対称抗体を使用した実験の結果を示す。結果は、ＡＨＦＳ  ＣＴＰ×抗ＣＤ３二重特異的抗体が、ＮＫ細胞なしで、Ｔ細胞の存在下で乳がん細胞株ＢＴ４７４を効果的に殺傷することを示す。対照的に、ＡＭＧ３８６ベースの二重特異的抗体は、ＮＫ細胞の非存在に起因して効果的でない。ＡＭＧ３８６は、ＢＴ４７４上に存在しないアンジオポエチンに結合する。
【０１０１】
以上の実験からの結果は、二重特異的または三重特異的抗体の有用性を明確に実証する。本発明の抗体は、他の抗体に基づく標的化ドメイン（図１Ａにおける結合因子Ａおよび結合因子Ｂ）を有することができる。これらの結合因子ドメインは、通常の可変ドメイン、Ｆａｂ、ＬＦｖ、またはＳｃＦｖの形態であり得る。加えて、これらの結合因子ドメインは、リガンド（例えば、成長因子またはサイトカイン）またはがん標的化ペプチドに基づくことができる。本発明の抗体は、Ｔ細胞にエンゲージメントして活性化させることができる特定のＴ細胞標的化ドメイン（例えば、抗ＣＤ３  ＳｃＦｖ）を有する。加えて、本発明の非対称抗体（または非対称タンパク質）は、エフェクター機能が減少または破壊され、それにより非特異的Ｔ細胞作用が最小化されるようにエフェクター結合部位中に突然変異を有し得る。
【実施例６】
【０１０２】
非特異的Ｔ細胞活性化はエフェクター機能をサイレンシングすることにより防止される
本発明のＡＨＦＳ多重特異的抗体は、エフェクター機能をほとんどまたは全く有しないように操作され、それにより、非特異的なＴ細胞エンゲージメントおよび活性化を回避することができる。Ｔ細胞活性化は、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＮＦ−γ）および他の因子（例えば、パーフォリン、グランザイムＡ、グランザイムＢなど）を産生させる。エフェクター機能がない場合、本発明のＡＨＦＳ多重特異的抗体は、非特異的なＴ細胞活性化を誘導しない。すなわち、これらの抗体を用いるＴ細胞活性化は、がん細胞を標的化する抗体の特異的結合に依存する。
【０１０３】
図１３は、エフェクター機能を有しない本発明のＡＨＦＳ多重特異的抗体（すなわち、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５ＡまたはＬ２３５ＡおよびＧ２３７Ａの突然変異体）で処理した時にＴ細胞によるＩＬ−２産生が減少することを示す。対照的に、天然のエフェクター機能を有する本発明のＡＨＦＳ多重特異的抗体（Ｋ＋ＨＴまたはＫＴ＋Ｈ）は、ＰＢＭＣの存在下で依然としてＩＬ−２産生を誘導することができる。上記のように、減少したエフェクター機能を有する本発明のＡＨＦＳ多重特異的抗体は、非特異的Ｔ細胞作用を回避することができる。
【０１０４】
図１４は、エフェクター機能を有しない本発明のＡＨＦＳ多重特異的抗体（すなわち、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５ＡまたはＬ２３５ＡおよびＧ２３７Ａの突然変異体）で処理した時にＴ細胞によるＴＮＦ−α産生が減少することを示す。
【０１０５】
図１５は、エフェクター機能を有しない本発明のＡＨＦＳ多重特異的抗体（すなわち、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５ＡまたはＬ２３５ＡおよびＧ２３７Ａの突然変異体）で処理した時にＴ細胞によるＩＮＦ−γ産生が完全に破壊されることを示す。
【０１０６】
図１６は、エフェクター機能を有しない本発明のＡＨＦＳ多重特異的抗体（すなわち、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５ＡまたはＬ２３５ＡおよびＧ２３７Ａの突然変異体）で処理した時にＴ細胞によるグランザイムＢ産生および非特異的Ｔ細胞作用が減少することを示す。グランザイムＢは、パーフォリンと共にＮＫ細胞により分泌されて、標的細胞におけるアポトーシスを媒介する。
【０１０７】
図１７は、エフェクター機能を有しない本発明のＡＨＦＳ多重特異的抗体（すなわち、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５ＡまたはＬ２３５ＡおよびＧ２３７Ａの突然変異体）で処理した時にＴ細胞によるパーフォリン産生および非特異的Ｔ細胞作用が減少することを示す。
【０１０８】
図１３〜１７に示される結果は、非特異的なＴ細胞活性化およびＮＫ細胞作用が、本発明のＡＨＦＳ多重特異的抗体（エフェクター結合部位中に突然変異を有する）を用いて回避できることを明確に指し示す。したがって、Ｔ細胞媒介性の作用は、ＡＨＦＳ多重特異的抗体の標的細胞の特異的結合に依存し、それにより、望ましくない効果なしで治療効果が達成される。
【実施例７】
【０１０９】
特異的Ｔ細胞活性化は標的細胞の結合に依存する
本発明のＡＨＦＳ多重特異的抗体は、エフェクター機能をほとんどまたは全く有しないように操作され、それにより、非特異的なＴ細胞エンゲージメントおよび活性化を回避することができる。結果として、本発明のＡＨＦＳ多重特異的抗体によるＴ細胞活性化は、標的がん細胞への抗体の特異的結合に依存する。
【０１１０】
図１８は、標的腫瘍細胞（ＨＣＣ１４２８）の存在下で、エフェクター機能を有しない本発明のＡＨＦＳ多重特異的抗体（すなわち、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５ＡまたはＬ２３５ＡおよびＧ２３７Ａの突然変異体）は、Ｔ細胞によるＩＬ−２の産生を誘導できることを示す。対照的に、標的腫瘍細胞の非存在下で、本発明のＡＨＦＳ多重特異的抗体は、ＩＬ−２の産生を誘導しない。この結果は、標的腫瘍細胞のエンゲージメントが、本発明のＡＨＦＳ多重特異的抗体を使用するＴ細胞活性化のために必要であることを指し示す。
【０１１１】
図１９は、標的腫瘍細胞の存在下で、エフェクター機能を有しない本発明のＡＨＦＳ多重特異的抗体（すなわち、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５ＡまたはＬ２３５ＡおよびＧ２３７Ａの突然変異体）は、Ｔ細胞によるＴＮＦ−αの産生を誘導できることを示す。対照的に、標的腫瘍細胞の非存在下で、本発明のＡＨＦＳ多重特異的抗体は、ＴＮＦ−αの産生を誘導しない。この結果は、標的腫瘍細胞のエンゲージメントが、本発明のＡＨＦＳ多重特異的抗体を使用するＴ細胞活性化のために必要であることを指し示す。
【０１１２】
図２０は、標的腫瘍細胞の存在下で、エフェクター機能を有しない本発明のＡＨＦＳ多重特異的抗体（すなわち、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５ＡまたはＬ２３５ＡおよびＧ２３７Ａの突然変異体）は、Ｔ細胞によるＩＮＦ−γの産生を誘導できることを示す。対照的に、標的腫瘍細胞の非存在下で、本発明のＡＨＦＳ多重特異的抗体は、ＩＮＦ−γの産生を誘導しない。この結果は、標的腫瘍細胞のエンゲージメントが、本発明のＡＨＦＳ多重特異的抗体を使用するＴ細胞活性化のために必要であることを指し示す。
【０１１３】
図２１は、標的腫瘍細胞の存在下で、エフェクター機能を有しない本発明のＡＨＦＳ多重特異的抗体（すなわち、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５ＡまたはＬ２３５ＡおよびＧ２３７Ａの突然変異体）は、Ｔ細胞によるグランザイムＢの産生を誘導できることを示す。対照的に、標的腫瘍細胞の非存在下で、本発明のＡＨＦＳ多重特異的抗体は、グランザイムＢの産生を誘導しない。この結果は、標的腫瘍細胞のエンゲージメントが、本発明のＡＨＦＳ多重特異的抗体を使用するＴ細胞活性化のために必要であることを指し示す。
【０１１４】
図２２は、標的腫瘍細胞の存在下で、エフェクター機能を有しない本発明のＡＨＦＳ多重特異的抗体（すなわち、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５ＡまたはＬ２３５ＡおよびＧ２３７Ａの突然変異体）は、Ｔ細胞によるパーフォリンの産生を誘導できることを示す。対照的に、標的腫瘍細胞の非存在下で、本発明のＡＨＦＳ多重特異的抗体は、パーフォリンの産生を誘導しない。この結果は、標的腫瘍細胞のエンゲージメントが、本発明のＡＨＦＳ多重特異的抗体を使用するＴ細胞活性化のために必要であることを指し示す。
【０１１５】
図１８〜２２に示される結果は、本発明のＡＨＦＳ多重特異的抗体を用いて非特異的なＴ細胞活性化を回避できるとともに、これらの抗体は、標的細胞依存的な方式で特異的Ｔ細胞細胞傷害性を有するようにＴ細胞にエンゲージメントして活性化させることができることを明確に指し示す。これらの結果は、治療剤として、本発明のＡＨＦＳ多重特異的抗体は、より特異的であり得、かつより少ない望ましくない効果を有し得ることを指し示す。
【０１１６】
本発明の一部の実施形態は、本発明のＡＨＦＳ多重特異的抗体のいずれか１つを使用してがんを治療する方法に関する。本発明の実施形態を用いて治療できるがんは、上記に示される様々ながん細胞により立証されるように、腫瘍関連抗原を標的化するための特異的結合ドメインまたはリガンドを設計できる限り、特に限定されない。
【０１１７】
本発明の実施形態を限られた数の実施例を用いて説明したが、当業者は、他の改変およびバリエーションが本発明の範囲から離れることなく可能であることを理解する。したがって、本発明の保護の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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