(57)【要約】本発明は、TIM-3 抗体、その抗原結合断片、及びそれらの医学的使用を提供する。更に、本発明は、前記 TIM-3 抗体の CDR 領域を含むラット由来抗体、キメラ抗体、ヒト由来抗体、及び前記 TIM-3 抗体及びその抗原結合断片を含む医薬組成物、並びに薬物としてのそれらの使用を提供する。薬物としての使用と同様に。特に、本発明は、TIM-3 に関連した状態を治療するための薬物の調製における、ヒト由来 TIM-3 抗体の使用を提供する。【選択図】図２Ｃ
2020508658.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１．ヒト TIM-3 抗原の細胞外領域に結合し、以下の(i)から(ii)のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の何れか 1 つから選択される TIM-3 抗体又はその抗原結合断片：
(i) 以下の配列から選択されるか、又は以下の配列と少なくとも 95% の同一性を有するアミノ酸配列から選択される 1 つ以上の CDR 領域配列を含むモノクローナル抗体又はその抗原結合断片：
配列番号: 8、43 及び 10 に示される重鎖可変領域 HCDR 配列；並びに配列番号: 11、12 及び 13 に示される軽鎖可変領域 LCDR 配列、
ここで、前記配列番号: 43 は DIIPX1X2X3GSKYNQKFKD として示され、
配列中、X1 は N、L、V、M 又は E から選択され、X2 は N、E、M、H、K、L、A 又は V から選択され、X3 は G 又は A から選択される；
(ii) 以下の配列から選択されるか、又は以下の配列と少なくとも 95% の同一性を有するアミノ酸配列から選択される 1 つ以上の CDR 領域配列を含むモノクローナル抗体又はその抗原結合断片：
配列番号: 14、15 及び 16 に示される重鎖可変領域 HCDR 配列；並びに配列番号: 17、18 及び 19 に示される軽鎖可変領域 LCDR 配列。
【請求項２】
以下の(i)から(ii)のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の何れか 1 つから選択される、請求項１に記載の TIM-3 抗体又はその抗原結合断片：
(i) 配列番号: 8、43 及び 10 にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域 HCDR1-3、並びに配列番号: 11、12 及び 13 にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域 LCDR1-3 を含む、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片； 
(ii) 配列番号: 14、15 及び 16 にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域 HCDR1-3、並びに配列番号: 17、18 及び 19 にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域 LCDR1-3 を含む、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
以下の (a) から (m) のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の何れか 1 つから選択される、請求項１又は請求項２に記載の TIM-3 抗体又はその抗原結合断片：
(a) 配列番号: 8、9 及び 10 にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域 HCDR1-3、並びに配列番号: 11、12 及び 13 にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域 LCDR1-3 を含む、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片；
(b) 配列番号: 8、62 及び 10 にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域 HCDR1-3、並びに配列番号: 11、12 及び 13 にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域 LCDR1-3 を含む、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片；
(c) 配列番号: 8、63 及び 10 にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域 HCDR1-3、並びに配列番号: 11、12 及び 13 にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域 LCDR1-3 を含む、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片；
(d) 配列番号: 8、64 及び 10 にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域 HCDR1-3、並びに配列番号: 11、12 及び 13 にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域 LCDR1-3 を含む、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片；
(e) 配列番号: 8、65 及び 10 にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域 HCDR1-3、並びに配列番号: 11、12 及び 13 にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域 LCDR1-3 を含む、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片；
(f) 配列番号: 8、66 及び 10 にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域 HCDR1-3、並びに配列番号: 11、12 及び 13 にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域 LCDR1-3 を含む、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片；
(g) 配列番号: 8、67 及び 10 にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域 HCDR1-3、並びに配列番号: 11、12 及び 13 にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域 LCDR1-3 を含む、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片；
(h) 配列番号: 8、68 及び 10 にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域 HCDR1-3、並びに配列番号: 11、12 及び 13 にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域 LCDR1-3 を含む、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片；
(i) 配列番号: 8、69 及び 10 にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域 HCDR1-3、並びに配列番号: 11、12 及び 13 にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域 LCDR1-3 を含む、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片；
(j) 配列番号: 8、70 及び 10 にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域 HCDR1-3、並びに配列番号: 11、12 及び 13 にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域 LCDR1-3 を含む、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片；
(k) 配列番号: 8、71 及び 10 にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域 HCDR1-3、並びに配列番号: 11、12 及び 13 にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域 LCDR1-3 を含む、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片；
(l) 配列番号: 8、72 及び 10 にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域 HCDR1-3、並びに配列番号: 11、12 及び 13 にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域 LCDR1-3 を含む、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片；
(m) 配列番号: 14、15 及び 16 にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域 HCDR1-3、並びに配列番号: 17、18 及び 19 にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域 LCDR1-3 を含む、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
前記モノクローナル抗体が組換え抗体である、請求項１から３の何れか一項に記載の TIM-3 抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
前記モノクローナル抗体が、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はそれらの抗原結合断片の組換え抗体から選択される、請求項４に記載の TIM-3 抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６】
前記ヒト化抗体の軽鎖及び重鎖可変領域の FR 配列が、ヒト生殖細胞系列型軽鎖及び重鎖にそれぞれ由来する、又はその変異配列に由来する、請求項５に記載の TIM-3 抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７】
前記ヒト化抗体が配列番号: 44 若しくは 31 に示される重鎖可変領域又はそのバリアントを含み、前記バリアントが配列番号: 44 又は 31 の重鎖可変領域それぞれに 1-10 個のアミノ酸変異を有する、請求項６に記載の TIM-3 抗体又はその抗原結合断片。
【請求項８】
前記バリアントが配列番号: 44 又は 31 の重鎖可変領域の FR 領域に 1-10 個のアミノ酸復帰変異を有し；好ましくは、前記復帰変異が、配列番号: 44 の重鎖可変領域上のD89E、R98T、G49A、M48I、M70L、R38K 及び V68A 復帰変異からなる群から選択される、又は配列番号: 31 の重鎖可変領域内の Q3K 若しくは R87K 復帰変異から選択される、請求項７に記載の TIM-3 抗体又はその抗原結合断片。
【請求項９】
前記ヒト化抗体が、配列番号: 45-50 の何れか 1 つから選択される重鎖可変領域を含む、又は配列番号: 34-35 の何れか 1 つから選択される重鎖可変領域を含む、請求項８に記載の TIM-3 抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１０】
前記ヒト化抗体が、配列番号: 21 又は 32 に示される軽鎖可変領域又はそのバリアントを含み；前記バリアントが配列番号: 21 又は 32 の軽鎖可変領域上に 1-10 個のアミノ酸変異を有する、請求項６記載の TIM-3 抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１１】
前記バリアントが、配列番号: 21 又は 32 の軽鎖可変領域の FR 領域に 1-10 個のアミノ酸の復帰変異を有し；好ましくは、前記復帰変異が、配列番号: 21 の軽鎖可変領域の A43S 復帰変異から選択される、又は配列番号: 32 の重鎖可変領域の Q3K、I48V、K45Q、A43S 若しくは T85S 復帰変異から選択される、請求項１０に記載の TIM-3 抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１２】
前記ヒト化抗体が、配列番号: 30 の軽鎖可変領域を含む、又は配列番号: 37-40 の何れか 1 つから選択される軽鎖可変領域を含む、請求項１１に記載の TIM-3 抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１３】
前記ヒト化抗体が、配列番号: 44-50 の何れか 1 つから選択される重鎖可変領域、及び配列番号: 29-30 の何れか 1 つから選択される軽鎖可変領域を含む；若しくは配列番号: 22-28 の何れか 1 つから選択される重鎖可変領域、及び配列番号: 29-30 の何れか 1 つから選択される軽鎖可変領域を含む；又は配列番号: 33-35 の何れか 1 つから選択される重鎖可変領域、及び配列番号: 36-40 の何れか 1 つから選択される軽鎖可変領域を含む；好ましくは、配列番号: 24 の重鎖可変領域、及び配列番号: 29 の軽鎖可変領域を含む；若しくは配列番号: 33 の重鎖可変領域、及び配列番号: 36 の軽鎖可変領域を含む、請求項１から１２の何れか一項に記載の TIM-3 抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１４】
前記ヒト化抗体が、配列番号: 51-61 の何れか 1 つから選択される重鎖可変領域、及び配列番号: 29-30 の何れか 1 つから選択される軽鎖可変領域を含み；好ましくは、配列番号: 51 の重鎖可変領域、及び配列番号: 29 の軽鎖可変領域を含む、又は、配列番号: 52 の重鎖可変領域、及び配列番号: 29 の軽鎖可変領域を含む、請求項１３に記載の TIM-3 抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１５】
前記抗体が全長抗体であり、ヒト抗体の定常領域を更に含み、好ましくは配列番号: 41 に示されるヒト重鎖定常領域を含み、及び好ましくは配列番号: 42 に示されるヒト軽鎖定常領域を含む、請求項１から１４の何れか一項に記載の TIM-3 抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１６】
前記抗原結合断片が、Fab、Fab’、F(ab’)2、単鎖抗体（scFv）、二量体化 V 領域（ダイアボディ（diabody））、ジスルフィド安定化 V 領域（dsFv）及び CDR 含有ペプチドからなる群より選択される、請求項１から１４の何れか一項に記載の TIM-3 抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１７】
TIM-3 への結合について、請求項１から１６に記載のモノクローナル抗体又は抗原結合断片と競合することを特徴とする、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１８】
治療有効量の請求項１から１７の何れか一項に記載の TIM-3 抗体又はその抗原結合断片、及び １ つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤とを含む組成物。
【請求項１９】
請求項１から１７の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸分子。
【請求項２０】
請求項１９に記載の核酸分子を含む組換えベクター。
【請求項２１】
宿主細胞が、原核細胞及び真核細胞からなる群、好ましくは真核細胞、より好ましくは哺乳動物細胞から選択される、請求項２０に記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項２２】
請求項２１に記載の宿主細胞を培養物中で培養して、請求項１から１７の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を形成及び蓄積させ、及び前記培養物から前記抗体又はその抗原結合断片を回収することを含む、請求項１から１７の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を生産する方法。
【請求項２３】
請求項１から１７の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を使用することを含む、ヒト TIM-3 を免疫アッセイする、又は測定するための方法。
【請求項２４】
請求項１から１７の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む、ヒト TIM-3 を検出するため、又は測定するための試薬。
【請求項２５】
請求項１から１７の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む、ヒト TIM-3 陽性細胞に関連する疾患を検出するのに使用するための診断薬。
【請求項２６】
請求項１から１７の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を使用することにより、ヒト TIM-3 又は TIM-3 陽性細胞を検出すること、又は測定することを含む、ヒトTIM-3陽性細胞に関連する疾患を診断するための方法。
【請求項２７】
ヒト TIM-3 陽性細胞に関連する疾患の診断薬を調製することにおける、請求項1から１７の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片の使用。
【請求項２８】
請求項１から１７の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、若しくは請求項１８に記載の医薬組成物、又は請求項１９に記載の核酸分子を含む、ヒト TIM-3 陽性細胞に関連する疾患で使用するための治療薬。
【請求項２９】
請求項１から１７の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、若しくは請求項１８に記載の医薬組成物、又は請求項１９に記載の核酸分子によって、ヒト TIM-3 陽性細胞死を誘導することを含む、ヒト TIM-3 陽性細胞に関連する疾患を治療する方法。
【請求項３０】
ヒト TIM-3 陽性細胞に関連する疾患の治療のための治療薬の調製における、請求項１から１７の何れか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、若しくは請求項１８に記載の医薬組成物、又は請求項１９に記載の核酸分子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、TIM-3 抗体及びその抗原結合断片に関する。更に、本発明は、前記 TIM-3 抗体の CDR 領域を含むキメラ抗体及びヒト化抗体、並びに TIM-3 抗体及びその抗原結合断片を含む医薬組成物、並びに TIM-3 関連疾患における診断薬及び治療薬としてのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
T 細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有分子-3（T cell immunoglobulin and mucin domain-containing molecule-3（TIM-3））は、A 型肝炎ウイルス細胞受容体 2（HAVCR-2）としても知られ、I 型膜表面タンパク質分子であり、TIM ファミリーのメンバーに属する。ヒト TIM-3 分子は、シグナル・ペプチド、Ig 可変領域（IgV）、セリン/スレオニンに富むムチン領域、膜貫通ドメイン、及び細胞質領域等を含む 301 アミノ酸で構成され、マウスとヒトの間で 63% の相同性がある。
【０００３】
TIM-3 は、IFN-γ を分泌するヘルパー T 細胞（Th1 及び Th17）、制御性 T 細胞（Treg）、樹状細胞（DC）、単球、マスト細胞、NK 細胞及び腫瘍浸潤リンパ球（TILs）等で、選択的に発現する（例えば、Clayton et al., J. Immunol., 192(2): 782-791 (2014)；Jones et al., J. Exp. Med., 205: 2763-2779 (2008) を参照）。現在知られている TIM-3 受容体には、ホスファチジルセリン・ガラクトース・レクチン 9（ガレクチン-9、Gal-9）、高移動度グループ・タンパク質 1（high mobility group protein 1（HMGB1））、及びがん胎児性抗原細胞接着分子 1（carcinoembryonic antigen cell adhesion molecule 1（CEACAM1））が含まれる。
【０００４】
TIM-3 は、多くの態様において、免疫系の機能を調節することができる。TIM-3 は、Th1 細胞の表面の Gal-9 リガンドに結合した後、Th1 細胞の免疫応答をダウンレギュレートすることができ、Th1 細胞のアポトーシスを誘発し、自己免疫疾患（全身性エリテマトーデス、喘息等）及び免疫寛容において、重要な役割を果たす。単球マクロファージが発現する TIM-3 は、ホスファチジルセリンと相互作用して、アポトーシス細胞の細胞貪食を促進する；TIM-3 は、腫瘍に浸潤した樹状細胞の HMGB1 リガンドに結合し、核酸の正常な輸送を阻害するため、核酸の免疫応答を阻害し、免疫回避に関与する。TIM-3 は免疫細胞だけでなく、卵巣がん、髄膜腫、黒色腫、その他の腫瘍細胞にも発現し、腫瘍の成長を直接的に促進する。TIM-3 の発現がダウンレギュレーションすると、Hela 細胞の浸潤と転移が著しく抑制される。TIM-3 が過剰発現することは、肺がん、胃がん、前立腺がん、及び子宮頸がんが予後不良であることと密接に関連していた。血液悪性腫瘍では、TIM-3 は、急性骨髄性白血病患者の白血病幹細胞及び MDS（骨髄異形成症候群）患者の造血幹細胞で過剰発現し、TIM-3+ 造血幹細胞は、低分化、低アポトーシス及び高増殖等の悪性の生物学的特性を持っている。従って、TIM-3の活性を阻害して（TIM-3 抗体等）固有の免疫系の機能を改善することは、腫瘍を治療するための有望な新しい方法である（例えば、Ngiow et a1., Cancer Res., 71(21): 1-5 (2011)；Guo et a1., Journαl of Translationαl Medicine, 11: 215 (2013)；及び Ngiow et a1., Cancer Res., 71(21): 6567-6571 (2011) を参照） 。
【０００５】
抗体ベースの薬物の安定性は、それが薬剤になり得る可能性（ドラッガビリティ（druggability））に影響を与える重要な要因の 1 つである。ここで、アスパラギン（Asn）とグルタミン（Gln）が非酵素的に脱アミド化されると、抗体の不安定化と不均一化が引き起こされるが、これは、抗体分子の一般的な化学分解経路の 1 つである。複数の IgG1 サブタイプ抗体が、CDR 領域のアミノ酸の脱アミド化及び異性化によって、生物学的活性を失うことが報告されている。Huang らは、IgG1 モノクローナル抗体の重鎖可変領域 2（CDR2）に位置する Asn55 が脱アミド化されると、前記抗体の結合活性が著しく低下することを発見した。従って、抗体を開発するプロセスでは、その対応するアミノ酸を回避するか、アミノ酸を変更することによって、脱アミド化が発生することを減らし、抗体の安定性と生物学的利用能を高める必要がある。
【０００６】
TIM-3 抗体が報告されているいくつかの特許、例えば、WO2011159877、WO2013006490、WO2015117002、WO2016144803、WO2016161270、US20150218274 があるが、中国及び海外で、臨床研究段階にある TIM-3 抗体は僅か 2 つだけである。他の抗体ベースの薬物はまだ探索（discovery）及び研究段階にあり、臨床適用されている TIM-3 抗体は存在しない。従って、TIM-3 関連疾患における治療研究及び適用のためには、より高い活性、より高い親和性及びより高い安定性を備えた TIM-3 抗体を更に開発する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、TIM-3 の細胞外領域のアミノ酸配列又は三次元構造に結合するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を提供する。更に、本発明は、本モノクローナル抗体又はその抗体断片と競合する抗ヒト TIM-3 抗体をスクリーニングすることにより、高い活性及び高い安定性を有する抗ヒト TIM-3 抗体を提供する。
【０００８】
また、本発明は、本発明の抗体を生産するハイブリドーマ、本発明の抗体をコードする DNA、前記 DNA を含むベクター、前記ベクターで形質転換をすることによって得られる形質転換体、前記ハイブリドーマ又は前記形質転換体を使用することによる前記抗体又はその抗体断片の生産方法、及び前記抗体又はその抗体断片を使用することによる診断薬又は治療薬、を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ある態様では、本発明は、ヒト TIM-3 の細胞外領域に結合し、及び以下の (i) から (iv) から選択されるモノクローナル抗体又は抗原結合断片と競合する、又は以下の (i) から (iv) から選択されるモノクローナル抗体又は抗原結合断片である、TIM-3 抗体又は抗原結合断片を提供する：
(i) 以下の配列から選択されるか、又は以下の配列と少なくとも 95% の同一性を有するアミノ酸配列から選択される 1 つ以上の CDR 領域配列を含むモノクローナル抗体又はその抗原結合断片：
配列番号： 8、43 及び 10 に示される重鎖可変領域 HCDR 配列；並びに配列番号：11、12 及び 13 に示される軽鎖可変領域 LCDR 配列；
(ii) 以下の配列から選択されるか、又は以下の配列と少なくとも 95% の同一性を有するアミノ酸配列から選択される 1 つ以上の CDR 領域配列を含むモノクローナル抗体又はその抗原結合断片：
配列番号: 14、15 及び 16 に示される重鎖可変領域 HCDR 配列；並びに配列番号: 17、18 及び 19 に示される軽鎖可変領域 LCDR 配列；
(iii) 配列番号: 8、43 及び 10 にそれぞれ示される重鎖可変領域 HCDR1-3、並びに配列番号: 11、12 及び 13 にそれぞれ示される軽鎖可変領域 LCDR1-3 を含む、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片； 
(iV) 配列番号: 14、15 及び 16 にそれぞれ示される重鎖可変領域 HCDR1-3、並びに配列番号: 17、18 及び 19 にそれぞれ示される軽鎖可変領域 LCDR1-3 を含む、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【００１０】
ある態様では、本発明は、ヒト TIM-3 の細胞外領域に結合し、及び以下の (a) から (m) からなる群から選択されるモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片と競合する、又は以下の (a) から (m) からなる群から選択されるモノクローナル抗体若しくはその抗原結合断片である、TIM-3 抗体又はその抗原結合断片を提供する：
(a) 配列番号: 8、9 及び 10 にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域 HCDR1-3、並びに配列番号: 11、12 及び 13 にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域 LCDR1-3 を含む、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片；
(b) 配列番号: 8、62 及び 10 にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域 HCDR1-3、並びに配列番号: 11、12 及び 13 にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域 LCDR1-3 を含む、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片；
(c) 配列番号: 8、63 及び 10 にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域 HCDR1-3、並びに配列番号: 11、12 及び 13 にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域 LCDR1-3 を含む、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片；
(d) 配列番号: 8、64 及び 10 にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域 HCDR1-3、並びに配列番号: 11、12 及び 13 にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域 LCDR1-3 を含む、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片；
(e) 配列番号: 8、65 及び 10 にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域 HCDR1-3、並びに配列番号: 11、12 及び 13 にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域 LCDR1-3 を含む、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片；
(f) 配列番号: 8、66 及び 10 にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域 HCDR1-3、並びに配列番号: 11、12 及び 13 にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域 LCDR1-3 を含む、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片；
(g) 配列番号: 8、67 及び 10 にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域 HCDR1-3、並びに配列番号: 11、12 及び 13 にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域 LCDR1-3 を含む、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片；
(h) 配列番号: 8、68 及び 10 にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域 HCDR1-3、並びに配列番号: 11、12 及び 13 にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域 LCDR1-3 を含む、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片；
(i) 配列番号: 8、69 及び 10 にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域 HCDR1-3、並びに配列番号: 11、12 及び 13 にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域 LCDR1-3 を含む、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片；
(j) 配列番号: 8、70 及び 10 にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域 HCDR1-3、並びに配列番号: 11、12 及び 13 にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域 LCDR1-3 を含む、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片；
(k) 配列番号: 8、71 及び 10 にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域 HCDR1-3、並びに配列番号: 11、12 及び 13 にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域 LCDR1-3 を含む、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片；
(l) 配列番号: 8、72 及び 10 にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域 HCDR1-3、並びに配列番号: 11、12 及び 13 にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域 LCDR1-3 を含む、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片；
(m) 配列番号: 14、15 及び 16 にそれぞれ示される抗体重鎖可変領域 HCDR1-3、並びに配列番号: 17、18 及び 19 にそれぞれ示される抗体軽鎖可変領域 LCDR1-3 を含む、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【００１１】
本発明の好ましい実施形態では、本明細書に記載の TIM-3 抗体又はその抗原結合断片を提供し、ここで、前記 TIM-3 抗体又はその抗原結合断片は、上記 (i) から (iv) から選択されるモノクローナル抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する。
【００１２】
本発明の好ましい実施形態では、本明細書に記載の TIM-3 抗体又はその抗原結合断片を提供し、前記モノクローナル抗体は組換え抗体である。
【００１３】
本発明の好ましい実施形態では、本明細書に記載の TIM-3 抗体又はその抗原結合断片を提供し、前記モノクローナル抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はそれらの抗原結合断片の組換え抗体から選択される。
【００１４】
本発明の好ましい実施形態では、本明細書に記載の TIM-3 抗体又はその抗原結合断片を提供し、ここで、前記ヒト化抗体の軽鎖及び重鎖可変領域の FR 配列が、ヒト生殖細胞系列型の軽鎖及び重鎖にそれぞれ由来する、又はそれらの変異配列に由来する。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態では、本明細書に記載の TIM-3 抗体又はその抗原結合断片を提供し、前記ヒト化抗体は、配列番号: 44 若しくは 31 又はそれらのバリアントとして示される重鎖可変領域を含み、前記バリアントは、配列番号: 44 又は 31 の重鎖可変領域に 1-10 個のアミノ酸変異を有する。
【００１６】
本発明の好ましい実施形態では、本明細書に記載の TIM-3 抗体又はその抗原結合断片を提供し、前記バリアントが配列番号: 44 又は 31 の重鎖可変領域の FR 領域に 1-10 個のアミノ酸復帰変異を有し；好ましくは、前記復帰変異は、配列番号: 44 の重鎖可変領域上のD89E、R98T、G49A、M48I、M70L、R38K 及び V68A 復帰変異からなる群から選択される、又は配列番号: 31 の重鎖可変領域内の Q3K 若しくは R87K 復帰変異から選択される。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態では、本明細書に記載の TIM-3 抗体又はその抗原結合断片を提供し、前記抗体の CDR 領域におけるアセチル化及び脱アミド化等の化学的修飾を排除するために、前記 CDR 領域上の化学修飾を起こしやすいアミノ酸部位を置換し、好ましくは CDR2 中の NNG を置換する。好ましくは、本明細書に記載の TIM-3 抗体又はその抗原結合断片を提供し、前記ヒト化抗体は、配列番号: 45-50 の何れか 1 つから選択される重鎖可変領域を含む、又は配列番号: 34-35 の何れか 1 つから選択される重鎖可変領域を含む。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態では、本明細書に記載の TIM-3 抗体又はその抗原結合断片を提供し、前記ヒト化抗体は、配列番号: 21 又は 32 に示される軽鎖可変領域又はそのバリアントを含み、前記バリアントは、配列番号: 21 又は 32 に示される軽鎖可変領域上に 1-10 個のアミノ酸変異を有する。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態では、本明細書に記載の TIM-3 抗体又はその抗原結合断片を提供し、前記バリアントは、配列番号: 21 又は 32 の軽鎖可変領域の FR 領域に 1-10 個のアミノ酸復帰変異を有し；前記復帰変異は、配列番号: 21 の軽鎖可変領域の A43S 復帰変異から選択される、又は配列番号: 32 の重鎖可変領域の Q3K、I48V、K45Q、A43S 及び T85S 復帰変異から選択される。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態では、本明細書に記載の TIM-3 抗体又はその抗原結合断片を提供し、前記ヒト化抗体は、配列番号: 30 の軽鎖可変領域を含む、又は配列番号: 37-40 の何れか 1 つから選択される軽鎖可変領域を含む。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態では、本明細書に記載の TIM-3 抗体又はその抗原結合断片を提供し、ここで、前記抗体の CDR 領域におけるアセチル化及び脱アミド化等の化学的修飾を排除するために、前記 CDR 領域上の化学修飾を起こしやすいアミノ酸部位を置換し、好ましくは CDR2 中の NNG を置換し、及び配列番号: 43 に示されるような CDR2 配列を得る。好ましくは、本明細書に記載の TIM-3 抗体又はその抗原結合断片を提供し、ここで、前記ヒト化抗体が、配列番号: 44-50 の何れか 1 つから選択される重鎖可変領域、及び配列番号: 29-30 の何れか 1 つから選択される軽鎖可変領域を含む；若しくは配列番号: 22-28 の何れか 1 つから選択される重鎖可変領域、及び配列番号: 29-30 の何れか 1 つから選択される軽鎖可変領域を含む；又は配列番号: 33-35 の何れか 1 つから選択される重鎖可変領域、及び配列番号: 36-40 の何れか 1 つから選択される軽鎖可変領域を含む；好ましくは、配列番号: 24 の重鎖可変領域、及び配列番号: 29 の軽鎖可変領域を含む；若しくは配列番号: 33 の重鎖可変領域、及び配列番号: 36 の軽鎖可変領域を含む。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態では、本明細書に記載の TIM-3 抗体又はその抗原結合断片を提供し、ここで、前記抗体の CDR 領域におけるアセチル化及び脱アミド化等の化学的修飾を排除するために、前記 CDR 領域上の化学修飾を起こしやすいアミノ酸部位を置換し、好ましくは CDR2 中の NNG を置換する。好ましい実施形態では、本明細書に記載の TIM-3 抗体又はその抗原結合断片を提供し、ここで前記ヒト化抗体は、配列番号: 51-61 の何れか 1 つから選択される重鎖可変領域、及び配列番号: 29-30 の何れか 1 つから選択される軽鎖可変領域を含み；好ましくは、配列番号: 51 の重鎖可変領域及び配列番号: 29 の軽鎖可変領域を含む、又は、配列番号: 52 の重鎖可変領域及び配列番号: 29 の軽鎖可変領域を含む。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態では、本明細書で提供される TIM-3 抗体又はその抗原結合断片は、全長抗体であり、ヒト抗体の定常領域を更に含む。好ましくは、配列番号: 41 に示されるヒト重鎖定常領域配列、及び好ましくは配列番号: 42 に示されるヒト軽鎖定常領域配列を含む。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態では、本明細書に記載の TIM-3 抗体又はその抗原結合断片を提供し、前記抗原結合断片が、Fab、Fab'、F(ab')2、単鎖抗体（scFv）、二量体化 V 領域（ダイアボディ（diabody））、ジスルフィド安定化 V 領域（dsFv）及び CDR 含有ペプチドからなる群より選択される。
【００２５】
本発明は更に、治療有効量の本明細書に記載の TIM-3 抗体又は抗原結合断片、及び 1 つ以上の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００２６】
本発明は更に、上記の TIM-3 抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸分子を提供する。
【００２７】
本発明は更に、上記の核酸分子を含む組換えベクターを提供する。
【００２８】
本発明は更に、上記の組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、前記宿主細胞は、原核細胞及び真核細胞からなる群、好ましくは真核細胞、より好ましくは哺乳動物細胞から選択される。
【００２９】
本発明は更に、上記宿主細胞を培養物中で培養して、上記の抗体又はその抗原結合断片を形成及び蓄積させ、及び前記培養物から前記抗体又はその抗原結合断片を回収することを含む、上記の抗体又はその抗原結合断片を生産する方法を提供する。
【００３０】
本発明は更に、ヒト TIM-3 を免疫アッセイする、又は測定するための方法を提供し、前記方法は、上記の抗体又はその抗原結合断片を使用することを含む。
【００３１】
本発明は更に、上記の抗体又はその抗原結合断片を含む、ヒト TIM-3 を検出するため、又は測定するための試薬を提供する。
【００３２】
本発明は更に、ヒト TIM-3 陽性細胞に関連する疾患を検出するのに使用するための診断薬を提供し、前記診断薬は上記の抗体又はその抗原結合断片を含む。
【００３３】
本発明は更に、ヒト TIM-3 陽性細胞に関連する疾患を診断する方法を提供し、前記方法は、上記の何れか 1 つに記載の抗体又はその抗体断片を使用することにより、ヒト TIM-3 陽性細胞を検出すること、又は測定することを含む 。
【００３４】
本発明は更に、ヒト TIM-3 陽性細胞に関連する疾患の診断薬を製造するための、上記の抗体又はその抗原結合断片の使用を提供する。
【００３５】
本発明は更に、ヒト TIM-3 陽性細胞に関連する疾患で使用するための治療薬を提供し、前記治療薬は前記抗体若しくはその抗原結合断片を含む、又は上記の組成物を含む若しくは核酸分子を含む。
【００３６】
本発明は更に、ヒト TIM-3 陽性細胞に関連する疾患を治療する方法を提供し、前記方法は、上記の抗体若しくはその抗原結合断片若しくは前記組成物又は前記核酸分子によって、ヒト TIM-3 陽性細胞死を誘導することを含む。
【００３７】
本発明は更に、ヒト TIM-3 陽性細胞に関連する疾患を治療するための治療薬を製造するための、上記の抗体若しくはその抗原結合断片若しくは前記組成物又は前記核酸分子の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１：候補 TIM-3 抗体の細胞への結合に関する実験曲線。本データは、候補抗体 mAb-1701 及び mAb-1799 の両方が抗原発現細胞に対して強い結合活性を有することを示している。
【図２】図２Ａ−２Ｃ：混合リンパ球反応の実験における、IFNγ の分泌に対する本発明の候補抗体及びその抗原結合断片の効果。図２Ａ：IFNγ の分泌に対する h1701-009 及びその抗原結合断片の効果；図２Ｂ：IFNγ の分泌に対する h1701-005 及びその抗原結合断片の効果；図２Ｃ：IFNγ の分泌に対する h1701-009 及び h1799-005 の効果。この結果は、h1701-009 と h1799-005 の両方が IFN の分泌を効果的に刺激できることを示す。
【図３】図３Ａ−３Ｄ：PBMC は CD3/CD28 抗体によって活性化された。活性化された PBMC における IFNγ の発現に対する h1701-009、h1799-005 及び AbTIM-3 の効果。それらは全て、IFNγ 陽性細胞の割合と IFNγ の発現を様々な程度に増加させた。
【図４】図４Ａ−４Ｂ：PBMC を SEB で刺激してから 5 日後、h1701-009、h1799-005 及び AbTIM-3 は全て、SEB 誘導性の IL12 及び IFNγ の分泌を増加させた。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
発明の詳細な説明
用語
本発明をより容易に理解するために、ある特定の技術用語及び科学用語を以下で具体的に定義する。本文書の他の箇所で特に定義していない限り、本明細書で使用する他のすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。
【００４０】
本明細書で使用する場合、アミノ酸の 1 文字コード及び 3 文字コードは、J. Biol. Chem, 243, (1968) p3558 に記載されている通りである。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「抗体」は、免疫グロブリン、即ち、2 つの同一の重鎖と 2 つの同一の軽鎖の間のジスルフィド結合によって一緒に繋がった 4 つのペプチド鎖構造を指す。異なる免疫グロブリン重鎖定常領域は、異なるアミノ酸組成とランク順を示すため、異なる種類の抗原性を示す。それ故に、免疫グロブリンは、5つのタイプに分けられ、重鎖 μ、δ、γ、α 及び ε を有する免疫グロブリン・アイソタイプ、即ち IgM、IgD、IgG、IgA 及び IgE と、それぞれ呼ばれることがある。ヒンジ領域のアミノ酸組成と重鎖ジスルフィド結合の数と位置に応じて、同じタイプの Ig を異なるサブタイプに更に分けることができる（例えば、IgG を IgG1、IgG2、IgG3 及び IgG4 に分けることができる）。軽鎖は、異なる定常領域を考慮して、κ 又は λ 鎖に分けることができる。5種類の Ig はそれぞれ、κ 又は λ 鎖を有する。
【００４２】
本発明では、本明細書で言及する抗体軽鎖は、ヒト又はマウスの κ、λ 鎖又はそれらのバリアントを含む軽鎖定常領域を更に含む。
【００４３】
本発明では、本明細書で言及する抗体重鎖は、ヒト又はマウスの IgG1、IgG2、IgG3、IgG4 又はそのバリアントを含む重鎖定常領域を更に含む。
【００４４】
抗体の重鎖及び軽鎖の N 末端付近では、約 110 個のアミノ酸が大きく変化し、可変領域（Fv 領域）として知られている；C 末端付近の残りのアミノ酸残基は比較的安定しており、定常領域として知られている。可変領域は、3 つの超可変領域（hypervariable regions（HVR））及び 4 つの比較的保存された FR 領域（FR）を含む。3 つの超可変領域は、前記抗体の特異性を決定し、相補性決定領域（complementarity determining region（CDR））としても知られる。各軽鎖可変領域（LCVR）及び各重鎖可変領域（HCVR）は、3 つの CDR 領域と 4 つの FR 領域で構成され、これらが、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、及び FR4 の順に、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって配列する。3 つの軽鎖 CDR 領域を、LCDR1、LCDR2、及び LCDR3 と呼び；3 つの重鎖 CDR 領域を、HCDR1、HCDR2、及び HCDR3 と呼ぶ。本明細書の抗体又は抗原結合断片の LCVR 及び HCVR 領域にある CDR 領域アミノ酸残基の数及び位置は、既知のカバット（Kabat）の番号付け基準（LCDR1-3、HCDE2-3）に準拠するか、カバット（Kabat）及びコーシア（Chothia）の番号付け基準（HCDR1）に準拠する。
【００４５】
本発明の抗体は、マウス抗体、キメラ抗体及びヒト化抗体を含み、好ましくはヒト化抗体である。
【００４６】
本発明における用語「マウス抗体」は、当該分野の知識及び技能に従って調製された抗ヒト TIM-3 モノクローナル抗体を指す。前記調製では、対象に TIM-3 抗原を注射し、その後、所望の配列又は機能特性を有する抗体を発現するハイブリドーマを単離した。本発明の好ましい実施形態では、マウス TIM-3 抗体又はその抗原結合断片は、マウス κ、λ 鎖又はそれらのバリアントの軽鎖定常領域を更に含むか、又はマウス IgG1、IgG2、IgG3 若しくは IgG4、又はそのバリアントの重鎖定常領域を更に含む。
【００４７】
用語「キメラ抗体」は、マウス抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域と融合させることによる抗体であり、前記キメラ抗体は前記マウス抗体誘導性の免疫応答を軽減することができる。キメラ抗体を確立するために、特定のマウス・モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを確立し、可変領域遺伝子をマウス・ハイブリドーマからクローン化する。次いで、ヒト抗体の所望の定常領域遺伝子をクローン化し、これをマウスの可変領域遺伝子と連結してキメラ遺伝子とし、その後発現ベクターに挿入する。最後に、キメラ抗体分子を真核生物又は原核生物のシステムで発現させる。本発明の好ましい実施形態では、TIM-3 キメラ抗体の軽鎖は、ヒト κ、λ 鎖又はそのバリアントに由来する軽鎖定常領域を更に含む。TIM-3 キメラ抗体の重鎖は、ヒト IgG1、IgG2、IgG3、IgG4 又はそのバリアントに由来する重鎖定常領域を更に含み、好ましくは、アミノ酸変異（例えば、YTE 変異又は復帰変異等）をさせた後、ヒト IgG1、IgG2、IgG4 又はそのバリアントに由来する重鎖定常領域を含む。
【００４８】
用語「ヒト化抗体」は、CDR 移植抗体（CDR-grafted antibody）としても知られていて、ヒト抗体の可変領域フレームワークに移植したマウス CDR 配列によって生成される抗体、即ち、異なるタイプのヒト生殖細胞系列型抗体のフレームワーク配列で産生される抗体、を指す。ヒト化抗体は、多数のマウス成分を含むキメラ抗体が誘発する強い抗体応答という欠点を克服する。そのようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列型抗体の遺伝子配列を網羅する公共の DNA データベース又は公開された参考文献から取得できる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列型の DNA 配列は、「VBase」ヒト生殖細胞系列型配列データベース（ウェブ www.mrccpe.com.ac.uk/vbase で入手可能）、及び Kabat, EA, etc. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第 5 版 の中で見出すことができる。免疫原性が下降することによる活性の低下を回避するために、ヒト抗体可変領域フレームワークに最小限の復帰変異を入れ、前記活性を維持する。本発明のヒト化抗体は、ファージ・ディスプレイによる CDR 親和性の成熟化に更に供したヒト化抗体も含む。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態では、TIM-3 ヒト化抗体のマウス CDR 配列は、配列番号: 8-13 及び 14-19 からなる群から選択される。前記重鎖 FR 領域の配列が、ヒト生殖細胞系列型重鎖 IGHV1-18*01 と hjh4.1 の組み合わせ配列又は IGHV3-7*01 と hjh4.1 の組み合わせ配列に由来する；前記軽鎖 FR 領域の配列が、ヒト生殖細胞系列型軽鎖IGKV1-33*01 と hjk4.1 の組み合わせ配列、又は IGKV1-39*01 と hjk2.1 の組み合わせ配列に由来する、ヒト抗体可変領域フレームワークを設計及び選択した。免疫原性が下降することによる活性の低下を回避するために、ヒト抗体可変領域に最小限の復帰変異を入れ、前記活性を維持する。
【００５０】
CDR を移植すると、抗原と接触するフレームワーク残基により、前記抗原に対する TIM-3 抗体又はその抗原結合断片の親和性が減少することがある。そのような相互作用は、高度な体細胞変異の結果である可能性がある。従って、ドナー・フレームワークのアミノ酸をヒト化抗体フレームワークに移す必要が依然としてあることがある。非ヒト TIM-3 抗体又はその抗原結合断片の抗原結合に関与するアミノ酸残基は、マウス・モノクローナル抗体可変領域の配列及び構造をチェックすることにより同定することができる。ドナーの CDR フレームワークと生殖細胞系列型との間で異なるアミノ酸残基が関連している、と考えることがある。最も密接に関連する生殖細胞系列型を決定することが不可能な場合、前記配列を、サブタイプの共通配列、又は高い類似性割合を有するマウスの配列と比較することがある。まれなフレームワーク残基は、体細胞の高い変異の結果であると考えられており、結合に重要な役割を果たす。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「抗原結合断片（antigen-binding fragment）」又は「機能的断片（functional fragment）」は、前記抗原（例えば、TIM-3）への結合能力を保持する 1 つ以上の抗体の断片を指す。全長抗体の断片は、特定の抗原と結合する機能があることが示されてきている。用語「抗原結合断片」における結合断片の例には、(i) Fab断片、VL、VH、CL 及び CH1 ドメインから構成される一価の断片；(ii) F(ab’)2 断片、ヒンジ領域のジスルフィド結合で繋がった 2 つの Fab 断片を含む二価の断片；(iii) Fd 断片、VH 及び CH1 ドメインからなる；(iv) Fv 断片、片腕の抗体の VH 及び VL ドメインからなる；(v) VH ドメインで構成される単一ドメイン又はdAb断片（Ward et al。（1989）Nature341：544-546）；及び (vi) 別個の相補性決定領域（complementarity determining region（CDR））並びに (vii) 合成リンカーによって任意選択的に繋がった 2 つ以上の別個の CDRs の組み合わせ、が挙げられる。更に、Fv 断片の VL ドメインと VH ドメインは 2 つの別々の遺伝子によってコードされているが、それらを組換え法を使用する合成リンカーによって繋げて、VL と VH ドメインをペアリングすることにより、一価の分子である一本のタンパク質鎖を生成する（一本鎖 Fv（scFv）と呼ぶ；例えば、Bird et al. (1988): 423-426; Science 242 及び Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA85:5879-5883 を参照）。この一本鎖抗体が前記抗体の用語「抗原結合断片」に含まれることも意図する。そのような抗体は、当該分野で公知である従来の技術を使用して得られ、断片の機能的スクリーニングを、失われた部分が無い抗体の場合と同じ方法で使用する。抗原結合部分は、組換え DNA 技術又は失われた部分が無い免疫グロブリンを酵素的又は化学的に破壊することによって作製することができる。抗体は、異なる表現型（例えば、IgG（例えば、IgG1、IgG2、IgG3 又は IgG4 サブタイプ）、IgA1、IgA2、IgD、IgE 又は IgM）の形態をとることがある。
【００５２】
本発明における抗原結合断片には、Fab、F(ab’)2、Fab’、一本鎖抗体（scFv）、二量体化 V 領域（ダイアボディ）、ジスルフィド安定化 V 領域（dsFv）及び CDR-含有ペプチドが含まれる。
【００５３】
Fab は、IgG 抗体分子をパパインで処理することにより（H 鎖の位置 224 のアミノ酸残基で切断する）得られる抗体断片である。前記 Fab 断片は、約 50,000 の分子量を有し、抗原結合活性を有し、H 鎖の N 末端側の約半分及び L 鎖全体がジスルフィド結合を介して一緒に結合した Fab 断片を含む。
【００５４】
本発明の Fab は、ヒト TIM-3 を特異的に認識し、その細胞外領域又はその三次元構造に結合する本発明のモノクローナル抗体をパパインで処理することにより生産することができる。また、前記抗体の Fab をコードする DNA を原核生物発現ベクター又は真核生物発現ベクターに挿入し、このベクターを原核生物又は真核生物に導入して前記 Fab を発現させることにより、前記 Fab を生産することもできる。
【００５５】
F(ab’)2は、分子量が約 100,000 であり、抗原結合活性を有し、IgG のヒンジ領域にある 2 つのジスルフィド結合のうち、より下側の部分をペプシンで消化することにより得られる、ヒンジ位置で結合した 2 つの Fab 領域を含む抗体断片である。
【００５６】
本発明の F(ab’)2 は、ヒト TIM-3 を特異的に認識し、その細胞外領域又はその三次元構造に結合する本発明のモノクローナル抗体をペプシンで処理することにより生産することができる。また、前記 F(ab’)2 は、チオエーテル結合又はジスルフィド結合を介して、以下に説明する Fab’ に結合することにより、生産することもできる。
【００５７】
Fab’ は、約 50,000 の分子量を有し、抗原結合活性を有する抗体断片である。Fab’ は、上記 F(ab’)2 のヒンジ領域で、ジスルフィド結合を切断することにより得られる。本発明の Fab’ は、TIM-3 を特異的に認識し、その細胞外領域又はその三次元構造に結合する本発明の F(ab’)2 を、ジチオトレイトール等の還元剤で処理することにより生産することができる。
【００５８】
また、前記抗体の Fab’ 断片をコードする DNA を原核生物発現ベクター又は真核生物発現ベクターに挿入し、このベクターを原核生物又は真核生物に導入して前記 Fab’ を発現させることにより、前記 Fab’ を生産することもできる。
【００５９】
用語「単鎖抗体」、「単鎖 Fv（single chain Fv）」又は「scFv」は、リンカーによって繋がった、抗体重鎖可変ドメイン（又は領域；VH）及び抗体軽鎖可変ドメイン（又は領域；VL）を含む分子を指す。そのようなscFv 分子は、NH2-VL-リンカー-VH-COOH 又は NH2-VH-リンカー-VL-COOH の一般構造を有する。先行技術における適切なリンカーは、繰り返される GGGGS アミノ酸配列又はそのバリアントからなり、例えば、1-4 回の繰り返しを有するバリアントを使用する（Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448）。本発明に使用できる他のリンカーは、Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731、Choi et al.(2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106、Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061、Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56 及び Roovers et al. (2001), Cancer Immunol に記載されている。
【００６０】
本発明の scFv は、以下のステップによって生産することができる：ヒト TIM-3 を特異的に認識し、その細胞外領域又はその三次元構造に結合する本発明のモノクローナル抗体の VH 及び VL をコードする cDNAs を取得し、scFv をコードする DNA を構築し、この DNA を原核生物発現ベクター又は真核生物発現ベクターに挿入し、その後、この発現ベクターを原核生物又は真核生物に導入して前記 scFv を発現させる。
【００６１】
ダイアボディ（diabody）は、前記 scFv を二量体化させた抗体断片であり、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性に関しては、2 つの抗原は同じでも、又は異なっていてもよい。
【００６２】
本発明のダイアボディは、以下のステップによって生産することができる。ヒト TIM-3 を特異的に認識し、その細胞外領域又はその三次元構造に結合する本発明のモノクローナル抗体の VH 及び VL をコードする cDNAs を取得し、リンカー・ペプチドの長さが 8 アミノ酸残基以下になるように scFv をコードする DNA を構築し、この DNA を原核生物発現ベクター又は真核生物発現ベクターに挿入し、その後、この発現ベクターを原核生物又は真核生物に導入して前記ダイアボディを発現させる。
【００６３】
dsFv は、VH と VL にあるそれぞれの 1 つのアミノ酸残基をシステイン残基で置換し、この 2 つのシステイン残基間のジスルフィド結合を介して、この置換したポリペプチドを繋げることにより取得される。システイン残基で置換されるアミノ酸残基は、既知の方法による抗体の三次元構造予測に基づいて選択することができる（Protein Engineering, 7, 697 (1994)）。
【００６４】
本発明の dsFv は、以下のステップによって生産することができる：ヒト TIM-3 を特異的に認識し、その細胞外領域又はその三次元構造に結合する本発明のモノクローナル抗体の VH 及び VL をコードする cDNAs を取得し、dsFv をコードする DNA を構築し、この DNA を原核生物発現ベクター又は真核生物発現ベクターに挿入し、その後、この発現ベクターを原核生物又は真核生物に導入して前記 dsFv を発現させる。
【００６５】
CDR 含有ペプチドは、VH 又は VL の CDRs の 1 つ以上の領域を含むことにより構成される。複数の CDRs を含むペプチドは、直接的に、又は適切なリンカー・ペプチドを介して、繋げることができる。
【００６６】
本発明の CDR 含有ペプチドは、以下のステップによって生産することができる：ヒト TIM-3 を特異的に認識し、その細胞外領域又は三次元に結合する本発明のモノクローナル抗体の VH 及び VL の CDRs をコードする DNA を構築する、この DNA を原核生物発現ベクター又は真核生物発現ベクターに挿入し、次いで、この発現ベクターを原核生物又は真核生物に導入して前記ペプチドを発現させる。前記 CDR 含有ペプチドは、Fmoc 法又は tBoc 法等の化学合成法によって生産することもできる。
【００６７】
用語「CDR」は、抗原結合に主に寄与する、抗体の可変ドメイン内の 6 つの超可変領域のうちの 1 つを指す。前記 6 つの CDRs に対して最も一般的に使用される定義の 1 つは、（Kabat E.A. et al., (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242）によって提供される。本明細書で使用する場合、CDRs に関する Kabat の定義は、軽鎖可変ドメインのCDR1、CDR2 及び CDR3（CDR LI、CDR L2、CDR L3、又はL1、L2、L3）、並びに重鎖可変ドメインの CDR2 及び CDR3（CDR H2、CDR H3、又はH2、H3）にのみ適用される。
【００６８】
本明細書で使用される用語「抗体フレームワーク（antibody framework）」は、VL 又は VH のどちらかの可変ドメインの一部を指し、この可変ドメインの抗原結合ループ（CDRs）の足場として機能する。本質的には、CDRs のない可変ドメインである。
【００６９】
用語「エピトープ」又は「抗原決定基」は、免疫グロブリン又は抗体が特異的に結合する抗原上の部位（例えば、TNF 分子上の特定の部位）を指す。エピトープには、通常、ユニークな空間的コンフォメーションの中にある、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 又は 15 個の連続の又は非連続のアミノ酸が含まれる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, 編. (1996) を参照のこと。
【００７０】
用語「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合する」、及び「特異的に結合する」は、所定の抗原上のエピトープへの抗体の結合を指す。典型的には、前記抗体は、およそ 10 -7 M 未満（例えば、およそ 10 -8 M、10 -9 M 又は 10 -10M 未満又は更に低い等）の親和性（KD）で結合する。
【００７１】
用語「KD」又は「Kd」は、特定の抗体-抗原相互作用の解離平衡定数を指す。典型的には、本発明の抗体は、およそ 10 -7 M 未満（例えば、およそ 10 -8 M、10 -9 M 又は 10 -10M 未満又は更に低い等）の解離平衡定数（KD）で TIM3 に結合し、例えば、BIACORE 機器の表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance（SPR））テクノロジーを使用して測定される。
【００７２】
用語「競合的結合」は、本発明のモノクローナル抗体によって認識されるヒト TIM-3 の細胞外ドメインに関して、同じエピトープ（抗原決定基としても知られる）又は同じエピトープの一部を認識し、その抗原に結合する抗体を指す。本発明のモノクローナル抗体が結合するのと同じエピトープに結合する抗体は、本発明のモノクローナル抗体によって同定されるヒト TIM-3 のアミノ酸配列を認識して結合する抗体である。
【００７３】
本明細書で使用される用語「核酸分子」は、DNA 分子及び RNA 分子を指す。核酸分子は一本鎖でも二本鎖でもよいが、好ましくは二本鎖 DNA である。核酸は、別の核酸配列と機能的に関係するように配置されている場合、「効果的に繋がっている」。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、コーディング配列の転写に影響を与える場合、そのコーディング配列に効果的に繋がっている。
【００７４】
用語「ベクター」は、繋がっている別の核酸を運ぶことができる核酸分子を指す。ある実施形態では、前記ベクターは「プラスミド」であり、これは、追加の DNA セグメントを連結することができる、環状二本鎖 DNA ループを指す。別の実施形態では、前記ベクターはウイルス・ベクターであり、追加の DNA セグメントをウイルス・ゲノムに連結することができる。本明細書で開示されるベクターは、それらを導入した宿主細胞で自己複製することができる（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーマル哺乳動物ベクター）、又は宿主細胞への導入時に前記宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それにより前記宿主のゲノムに合わせて複製される（例えば、非エピソーマル哺乳類ベクター）。
【００７５】
抗体及び抗原結合断片を生産及び精製する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 第 5-8 章及び第 15 章中に見出すことができる。例えば、当技術分野で良く知られた従来の方法によって、マウスをヒト TIM-3 又はその断片で免疫し、その後、得られた抗体を復元（renatured）し、精製し、及びアミノ酸配列について配列決定することができる。抗原結合断片はまた、従来の方法によって調製することもできる。本発明の抗体又は抗原結合断片は、非ヒト抗体に由来する CDRs 上に 1 つ以上のヒトのフレームワーク領域（FRs）を含むように改変される。ヒトのフレームワークの生殖細胞系列型の配列は、ImMunoGeneTics（IMGT）のウェブサイト（http://imgt.cines.fr）のヒト抗体の可変的な生殖細胞系列型遺伝子のデータベース及び MOE ソフトウェアを連携させることによって、又は The Immunoglobulin Facts Book, 2001, ISBN 012441351 から取得することができる。
【００７６】
用語「宿主細胞」は、前記発現ベクターを導入した細胞を指す。宿主細胞には、細菌、微生物、植物又は動物の細胞が含まれる。形質転換しやすい細菌には、例えば大腸菌（Escherichia coli）やサルモネラ株（Salmonella strains）等の腸内細菌科（enterobacteriaceae）；例えば枯草菌（Bacillus subtilis）等のバチルス科（Bacillaceae）；肺炎球菌（Pneumococcus）；連鎖球菌（Streptococcus）及びインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）のメンバーが含まれる。適した微生物には、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）及びピキア酵母（Pichia pastoris）が含まれる。適した動物宿主細胞株には、CHO（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）及び NS0 細胞が含まれる。
【００７７】
本発明の改変抗体又は抗原結合断片は、公知の方法を使用して調製及び精製することができる。例えば、重鎖及び軽鎖をコードする cDNA 配列をクローン化し、GS 発現ベクターに組み込むことがある。次いで、改変した免疫グロブリン発現ベクターを、CHO 細胞に安定的にトランスフェクトすることがある。当該分野で周知のより推奨される方法として、哺乳動物発現系を使用すると、典型的には Fc 領域の高度に保存された N 末端部位で、グリコシル化される。ヒト TIM-3 に特異的に結合する抗体の発現について、安定したクローンを確認することがある。バイオリアクター中で抗体を生産するために、陽性クローンを無血清培地に入れて増やすこともある。抗体が分泌された培養培地は、従来の技術により精製することができる。例えば、前記培地に対して、適合性のあるバッファーで平衡化したプロテイン A 又は G セファロース FF カラムをうまく適用することができる。非特異的な結合成分を除去するために、前記カラムを洗浄する。結合した抗体は、例えば、pH 勾配によって溶出し、抗体画分を、例えば SDS-PAGE 等によって検出し、プールする。前記抗体を、一般的な手法を使用して、ろ過及び濃縮することができる。可溶性の凝集体と多量体は、サイズ排除やイオン交換等の一般的な手法で、効果的に除去できる。この生成物は、例えば -70℃ で即座に凍結しても良いし、凍結乾燥しても良い。
【００７８】
動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、臓器、又は体液に適用する場合、「投与（Administration）」及び「治療・処置（treatment）」とは、外因性の医薬品、治療薬、診断薬、又は組成物が、前記の動物、ヒト、対象、細胞、組織、臓器、又は体液に接触することを指す。「投与」及び「治療・処置」は、例えば、治療、薬物動態、診断、研究、及び実験の方法を指す場合がある。細胞を処置することは、細胞に試薬を接触させること、並びに流体が細胞と接触している場合、その流体に試薬を接触させることを包含する。「投与」及び「治療・処置」は、例えば細胞を、試薬、診断薬、結合化合物、又は別の細胞により、in vitro 及び ex vivo で処置することも意味する。「治療」とは、人間、獣医、又は研究の対象に適用する場合、治療的処置、予防的（prophylactic）又は予防的（preventative）手段、研究及び診断適用を指す。
【００７９】
「治療する・処置する（treat）」とは、本発明の結合化合物の何れかを含む組成物等の治療薬を、前記治療薬が既知の治療活性を有する 1 種以上の疾患症状を有する患者に対して、内部的に又は外部的に投与することを意味する。典型的には、前記薬剤は、臨床的に測定可能な何らかの程度まで、症状の退行を誘導すること、或いは症状の進行を阻害することの何れかによって、治療を受ける患者又は集団における 1 種以上の疾患症状を緩和するのに有効な量で投与される。任意の具体的な疾患症状を緩和するのに有効な治療薬の量（「治療有効量」とも呼ばれる）は、患者の病状、年齢、体重、及び患者に望ましい反応を引き出すことができる薬剤の力によって変わり得る。病気の症状が緩和されたかどうかは、その症状の重症度又は進行状態を評価するために医師又は他の熟練した医療提供者が通常使用する臨床測定によって、評価できる。本発明の実施形態（例えば、治療方法又は生産品）は、標的とする疾患症状を緩和するのに、すべての患者において、必ずしも効果的ではないかもしれないが、統計的に有意な数の患者において（例えば、スチューデント（Student’s）の t-検定、カイ 2 乗検定、マンホイットニー（Mann and Whitney）による U-検定、クラスカル−ウォリス（Kruskal-Wallis）検定（H-検定）、ヨンクヒール−タプストラ（Jonckheere-Terpstra）検定、及びウィルコクソン（Wilcoxon）検定等の当技術分野で知られている統計検定によって決定されるように）、その標的とする疾患症状を緩和するはずである。
【００８０】
「保存的修飾（Conservative modifications）」又は「保存的置換（conservative substitution）」とは、タンパク質中のアミノ酸を、類似の特性（例えば、電荷、側鎖のサイズ、疎水性/親水性、骨格の立体配座及び剛性など）を有する他のアミノ酸で置換することを指す。そして、前記タンパク質の生物活性を変えることなく、頻繁にこうした変更を加えることができる。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域において、単一のアミノ酸を置換することは、実質的に生物学的活性を変化させないものと認識する（例えば、Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (第 4 版)を参照）。更に、構造的又は機能的に類似したアミノ酸による置換は、生物学的活性を破壊する可能性がより低い。
【００８１】
「有効量」には、病状の症状又は兆候を改善又は予防するのに十分な量が含まれる。有効量とは、診断を可能にする又は促進するのに十分な量も意味する。特定の患者又は獣医学的な対象にとっての有効量は、例えば治療中の状態、前記患者の全体的な健康状態、投与の経路と用量、及び副作用の重症度等の要因によって変わり得る。有効量は、重大な副作用又は毒性作用を回避する最大用量又は投与プロトコルであることがある。
【００８２】
「外因性（Exogenous）」とは、状況に応じて、生物、細胞、又は人体の外部で生成される物質を指す。「内因性（Endogenous）」とは、状況に応じて、細胞、生物、又は人体の内部で生成される物質を指す。
【００８３】
「ホモロジー（Homology）」とは、2 つのポリヌクレオチド配列間又は 2 つのポリペプチド配列間の配列の類似性を指す。比較する 2 つの配列の両方の位置が、同じ塩基又はアミノ酸モノマー・サブユニットによって占められている場合（例えば、2 つの DNA 分子のそれぞれの位置がアデニンによって占められている場合）、その分子はその位置でホモロジーがある。2 つの配列間のホモロジーの割合は、2 つの配列が共有する、一致する位置又はホモロジーがある位置の数を、比較する位置の数で割って 100 倍した値の関数である。例えば、2 つの配列を最適に並べたときに、2 つの配列中の 10 個の位置のうち 6 個が一致する又はホモロジーがある場合、この 2 つの配列のホモロジーは 60％ である。一般的に、この比較は、2 つの配列を並べて最大パーセントのホモロジーの割合になるようにして実行される。
【００８４】
本明細書で使用される場合、表現「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養」は、交換可能に使用され、それら全てが示すことは派生物を含む。従って、「形質転換体」及び「形質転換した細胞」という言葉には、継代（transfer）の回数に関係なく、初代の対象細胞及びそこから派生した培養物が含まれる。又、意図的又は不測の変異のために、すべての派生物の DNA 含有量が正確に同一ではない可能性があることも理解する必要がある。最初に形質転換した細胞でスクリーニングしたものと同じ機能又は生物学的活性を有する変異体の派生物が含まれる。はっきりと異なるものを示すことを意図する場合、それは文脈から明確に理解されるであろう。
【００８５】
本明細書で使用する場合、「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「PCR」とは、例えば米国特許第 4,983,973 号に記載されているように、微量な核酸、RNA 及び／又は DNA の特定部分を増幅する手順又は技術を指す。一般に、オリゴヌクレオチド・プライマーを設計できるように、関心領域の末端の配列情報又はそれ以降の配列情報を入手する必要がある；これらのプライマーは、増幅するテンプレートの反対の鎖と配列が同一又は類似である。2 つのプライマーの 5 '末端ヌクレオチドは、増幅された材料の末端と一致することがある。PCR は、特定の RNA 配列を、全ゲノム DNA の中の特定の DNA 配列を、及び全細胞の RNA から転写した cDNA を、バクテリオファージ又はプラスミド配列等を増幅するために使用することがある。Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Ouant. Biol. 51:263；Erlich, ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.) を一般的に参照のこと。本発明で使用する PCR 試験は、核酸の試験サンプルを増幅するためのポリメラーゼ反応方法の 1 つの例であると考えられるが、唯一ではない。この方法は、既知の核酸配列をプライマーとして、及び核酸ポリメラーゼを使用して、核酸の特定の部分を増幅又は生成することを含む。
【００８６】
「任意選択的の（Optional）」又は「任意選択的に（optionally）」とは、これに後述するイベント又は状況が発生することがあるが、必ずしも発生するわけではないことを意味し、その記載にはそのイベント又は状況が発生する、又は発生しない事例が含まれる。例えば、「1-3 個の抗体重鎖可変領域を任意選択的に含む（optionally contains 1-3 antibody heavy chain variable regions）」とは、特定の配列を有する抗体重鎖可変領域が存在することがあるが、必ずしも存在する必要はないことを意味する。
【００８７】
「医薬組成物」とは、本発明に係る 1 種以上の化合物又はその生理学的/薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグ、及び生理学的/薬学的に許容される担体及び賦形剤等の他の化学成分を含む混合物を指す。前記医薬組成物は、生物への投与を促進し、活性成分の吸収を促進し、それにより生物学的効果を発揮することを目的としている。
【００８８】
更に、本発明は、TIM-3 陽性細胞に関連する疾患を治療するための薬剤を含み、この薬剤は、本発明のモノクローナル抗体又はその抗体断片を有効成分として含む。
【００８９】
がん、自己免疫疾患及びアレルギー性疾患等、TIM-3 を発現する細胞に関連する疾患である限り、TIM-3 陽性細胞に関連する疾患は限定されるものではない。
【００９０】
前記がんには、血液がん、乳がん、子宮がん、結腸直腸がん、食道がん、胃がん、卵巣がん、肺がん、腎臓がん、直腸がん、甲状腺がん、子宮頸がん、小腸がん、前立腺がん、膵臓がんが含まれる。前記がんの好ましい例には、血液がん、食道がん、胃がん、結腸直腸がん、肝臓がん及び前立腺がんが含まれる。
【００９１】
前記血液がんの例には、急性骨髄性白血病（AML）、慢性骨髄性白血病（CML）、骨髄異形成症候群（MDS）、多発性骨髄腫、皮膚 T 細胞リンパ腫（CTCL）、末梢 T 細胞リンパ腫（PTCL）、未分化大細胞リンパ腫（anaplastic large cell lymphoma （ALCL））、急性リンパ性白血病（ALL）、慢性リンパ性白血病（CLL）、その他のリンパ性白血病、NK 細胞リンパ腫、ホジキン・リンパ腫、バーキット・リンパ腫などの非ホジキン・リンパ腫等が含まれる。
【００９２】
自己免疫疾患の具体例としては、関節リウマチ、乾癬、クローン病、強直性脊椎炎、多発性硬化症、I 型糖尿病、肝炎、心筋炎、シェーグレン症候群、移植拒絶後の自己免疫性溶血性貧血、水疱性類天疱瘡、グレーブス病、橋本病（Hashimoto's thyroiditis）、全身性エリテマトーデス（SLE）、重症筋無力症、天疱瘡、悪性貧血等が含まれる。
【００９３】
前記アレルギー性疾患の例には、急性又は慢性反応性気道疾患、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、蕁麻疹（urticaria）、PIE 症候群、食物アレルギー、花粉症、アレルギー性の鼻（allergic nose）、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、アナフィラキシー・ショック等が含まれる。
【００９４】
更に、本発明は、TIM-3 の免疫アッセイ又は測定のための方法、TIM-3 の免疫アッセイ又は測定のための薬剤、TIM-3 を発現する細胞の免疫アッセイ又は測定のための方法、及びTIM-3 陽性細胞に関連する疾患を診断するための診断薬に関するものであり、これらは、ヒト TIM-3 を特異的に認識し、その細胞外領域又はその三次元構造に結合する本発明のモノクローナル抗体又は抗体断片を有効成分として含む。
【００９５】
本発明において、TIM-3 を検出する、又はTIM-3 の量を測定する方法は、任意の既知の方法であることがある。例えば、それには免疫アッセイや測定の方法が含まれる。
【００９６】
免疫アッセイ又は測定は、標識した抗原又は抗体を使用して、抗体又は抗原の量を検出する、又は測定する方法である。この免疫アッセイ又は測定の方法の例には、放射性物質標識免疫抗体法（radioactive substance-labeled immunoantibody method（RIA））、酵素免疫測定法（enzyme immunoassay（EIA 又は ELISA））、蛍光免疫測定法（fluorescent immunoassay（FIA））、発光免疫測定法、ウエスタン・ブロット法、物理化学法等が含まれる。
【００９７】
TIM-3 陽性細胞に関連する上記疾患は、本発明のモノクローナル抗体又は抗体断片を使用して、TIM-3 を発現する細胞を検出又は測定することにより診断することができる。
【００９８】
前記ポリペプチドを発現する細胞の検出には、公知の免疫学的検出法を用いることができ、免疫沈降法、蛍光細胞染色法、免疫組織染色法等が好ましく用いられる。また、FMAT 8100 HTS システム（Applied Biosystem）等を用いた蛍光抗体染色法を使用することもできる。
【００９９】
本発明において、TIM-3 を検出する、又は測定するのに用いる生体サンプルは、TIM-3 を発現する細胞を含む可能性がある限り、特に限定されず、例えば、組織細胞、血液、血漿、血清、膵液、尿、糞便、組織液又は培養液等がある。
【０１００】
本発明のモノクローナル抗体若しくはその抗体断片、又はその複合体を含む診断薬は、所望の診断方法に応じて、抗原抗体反応を行うための試薬又はその反応を検出するための試薬を更に含むことがある。前記抗原抗体反応を実施するための試薬には、バッファー、塩等が含まれる。この検出用試薬には、前記モノクローナル抗体、その抗体断片又はその複合体、を認識する標識二次抗体、前記標識に対応する基質等の、免疫学的な検出又は測定に、一般的に使用される試薬が含まれる。
【実施例】
【０１０１】
実施例と試験例
以下、実施例を参照して本発明を更に説明する。しかし、本発明の範囲はこれに限定されない。特定の条件が記載されていない本発明の実施例では、実験は、一般に、Cold Spring Harbor の Antibody Technology Laboratory Manual 及び  Mecular Cloning Manual に記載されている従来の条件下、又は材料又は製品の生産業者によって提示される条件下、で行う。試薬の供給元が具体的に示されていない場合、前記試薬は市販されている普通の試薬である。
【０１０２】
実施例１．TIM-3 抗原と検出用タンパク質の調製
１．TIM-3 抗原の設計と発現
UniProt の A 型肝炎ウイルス細胞受容体 2（ヒト HAVCR2、ヒト TIM-3 、Uniprot 番号：Q8TDQ0）を、本発明の TIM-3 のテンプレートとして使用して、抗原のアミノ酸配列及び検出用タンパク質を設計した。又は、様々なタグを TIM-3 タンパク質に基づいて融合させ、pHr ベクター（インハウス（in-house）で生産）又は pTargeT ベクター（プロメガ、A1410）中にそれぞれクローニングし、293 細胞で一過的に発現させるか、CHO-S 細胞で安定的に発現させ、精製して本発明の抗原及び検出用タンパク質を入手する。以下に記載する TIM-3 抗原は、特に指定しない限り、すべてヒト TIM-3 を指す。
【０１０３】
TIM-3 細胞外ドメイン及び hIgG1 Fc 融合タンパク質：マウスを免疫するための TIM-3-Fc（配列番号: 1）。
【化１】
2020508658.tif 000003
【０１０４】
フラグ（Flag）タグ及び His タグを有する TIM-3 の細胞外ドメイン：検出のための TIM-3-Flag-His（配列番号: 2）。
TIM-3-flag-His  
【化２】
2020508658.tif 000004
【０１０５】
TIM-3 過剰発現細胞株を構築するための TIM-3 の全長
TIM-3-full length（配列番号：3）
【化３】
2020508658.tif 000005
【０１０６】
２．組換え TIM-3 関連タンパク質、ハイブリドーマ抗体及び組換え抗体の精製
２．１．組換え TIM-3-Flag-His タンパク質の精製ステップ：
前記サンプルを高速で遠心分離して不純物を除去し、適切な容量に濃縮した。NI-NTA アフィニティーカラム（QIAGEN、カタログ番号 30721）をPBSで平衡化し、2-5 倍のカラム容量で洗浄した。不純物のない上清をカラムにロードした。A280 測定値がベースラインに戻るまで、前記カラムを PBS で洗浄した。次に、前記カラムを PBS で洗浄して非特異的にハイブリダイズしたタンパク質を除去し、流出液を回収した。洗浄バッファー（20 mM イミダゾール）及び溶出バッファー（300 mM イミダゾール）を順に使用し、標的タンパク質を溶出し、その溶出ピークを集めた。
【０１０７】
この集めた溶出液は、イオン交換（Hiload 16/600 superdex 200 カラム）により更に精製した。前記カラムを 2-5 倍のカラム容量の PBS で平衡化して、pH7.4 になるようにした。標的タンパク質を含む溶出バッファーを濃縮して前記カラムにロードし、サンプルを集めた。得られたタンパク質は SDS-PAGE 及び LC-MS により同定し、正しいサンプルを分注して使用した。
【０１０８】
２．２．ハイブリドーマ、組換え抗体、Fc 融合タンパク質の精製
細胞発現の上清のサンプルを高速で遠心分離して、不純物を除去した。ハイブリドーマ発現の上清をプロテイン G カラムで精製し、組換え抗体と Fc 融合タンパク質をプロテイン A カラムで精製した。A280 の読み取り値がベースラインに低下するまで、カラムを PBS で洗浄した。標的タンパク質は、100mM 酢酸ナトリウム（pH 3.0）で溶出し、1M Tris-HCl（pH 8.0）で中和させた。溶出したサンプルを適切に濃縮した後、PBS で平衡化したゲル・クロマトグラフィー Superdex200（GE）で更に精製した。凝集物のないピークを収集し、分注して使用した。
【０１０９】
実施例２．抗ヒト TIM-3 モノクローナル抗体の調製
１．動物への免疫
抗ヒト TIM-3 モノクローナル抗体は、マウスを免疫することにより作製した。実験用 SJL 白マウス、雌、6-8 週齢（Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd.、動物生産ライセンス番号：SCXK（北京）2012-0001）。給餌環境を SPF レベルにした。マウスを購入した後、その動物を実験室で 1 週間、12/12 時間の明暗サイクル、温度 20-25℃、湿度 40-60% で適応させた。その環境に適応したマウスを、以下のスキームに従って免疫した。免疫するための抗原は、Fc タグを有する TIM-3 の細胞外ドメインとした（配列番号：1）。
【０１１０】
免疫スキーム：マウスを QuickAntibody-Mouse5W（KX0210041）で免疫した。抗原とアジュバントの比は 1:1、10 μg/マウス、1 回注射（初回免疫/追加免疫）とした。抗原とアジュバントを迅速かつ完全に混合し、それからそれを接種した。1 回目と 2 回目の免疫の間隔は 21 日間で、2 回目の免疫後の間隔は 14 日間とした。各免疫の 7 日後にマウスから血液を採取した。マウス血清中の抗体の力価は ELISA 法により測定した。抗体の血清力価がより高く、プラトーに達している傾向があるマウスを、脾細胞融合用として選択し、脾細胞融合をする 3 日前に、生理食塩水中に調製した抗原を 20 μg/マウスで i.p. 注射をして、追加免疫をした。
【０１１１】
２．脾細胞融合
ハイブリドーマ細胞は、最適化されたPEGを介した融合手順を使用して、脾臓リンパ球と骨髄腫 Sp2/0 細胞（ATCC（登録商標）CRL-8287（登録商標））を融合することにより得た。前記ハイブリドーマ細胞を 4-5E5/ml の密度で完全培地（20% FBS、1 x HAT 及び 1 x OPI を含む DMEM 培地）に再懸濁し、96ウェル細胞培養プレート（100μl/ウェル）で、37°C、5％ CO2、3-4 日間、インキュベートした。100μl/ウェルの HAT 完全培地を添加し、針様クローンが形成されるまで 3-4 日間、インキュベーションを続けた。上清を除去し、200μl/ウェルの HAT 完全培地（20% FBS、1xHT 及び 1xOPI を含む RPMI-1640 培地）を添加し、37℃、5% CO2 で 3 日間培養した。その後、ELISA アッセイを実施した。
【０１１２】
３．ハイブリドーマ細胞のスクリーニング
ハイブリドーマの培養上清は、細胞成長密度に従って ELISA 法を使用して、検出を行った（実施例４及び試験例４を参照）。TIM-3 過剰発現細胞との結合アッセイは、ELISA によって実施した（実施例４及び試験例２を参照）。タンパク質結合アッセイと細胞結合アッセイの両方での陽性クローンを直接的に拡大し、凍結保存のために凍結し、及び 2 回から 3 回サブクローニングして単一細胞クローンを得た。
【０１１３】
TIM-3 結合 ELISA 及び細胞結合アッセイを、サブクローン化した細胞のそれぞれで実施した。上記の実験により、ハイブリドーマ・クローンを得て、そのハイブリドーマが分泌する mAb-1701 及び mAb-1799 抗体を得た。前記抗体は、試験例で使用するために、無血清培養を使用することにより更に調製し、精製の実施例に従って精製した。
【０１１４】
４．陽性ハイブリドーマ・クローンの DNA シークエンシング
陽性ハイブリドーマのクローニング及びシークエンシングの手順は、以下の通りとした：対数増殖期のハイブリドーマ細胞を収集し、RNA をトリゾール（Trizol）（Invitrogen、カタログ番号 15596-018）により、そのキットのマニュアルに従って、抽出した。PrimeScript（登録商標）Reverse Transcriptase Kit（Takara、カタログ番号 2680A）を使用して逆転写を行った。逆転写から得られた cDNA を、マウス Ig-プライマー・セット（Novagen、TB326 Rev.B 0503）で PCR 増幅し、シークエンシング受託会社でシークエンシングを行った。mAb-1799 及び mAb-1701 の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、次のようなものとして得た：
【０１１５】
mAb-1701 重鎖可変領域（配列番号: 4）
【化４】
2020508658.tif 000006
【０１１６】
mAb-1701 軽鎖可変領域 (配列番号: 5)
【化５】
2020508658.tif 000007
【０１１７】
mAb-1799 重鎖可変領域（配列番号: 6）
【化６】
2020508658.tif 000008
【０１１８】
mAb-1799 軽鎖可変領域 (配列番号: 7)
【化７】
2020508658.tif 000009
【０１１９】
各抗体の重鎖及び軽鎖の CDR 配列は表１に示す通りである。
【０１２０】
【表１】
2020508658.tif 000010
【０１２１】
実施例３．抗ヒト TIM-3 マウス・ハイブリドーマ・モノクローナル抗体のヒト化
１．抗 TIM-3 抗体 mAb-1701 のヒト化
MOE ソフトウェアにより、IMGT ヒト抗体重鎖及び軽鎖可変領域の遺伝子データベースと比較することによって、mAb-1701 と高い相同性を有する重鎖及び軽鎖可変領域の生殖細胞系列型遺伝子をテンプレートとして選択し、前記マウス抗体の CDRs を対応するヒトのソース・テンプレートに移植して、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 の順序の可変領域配列を形成した。前記アミノ酸残基は、Kabat 番号付けシステムによって同定し、及び注釈を付けた。
【０１２２】
１．１  ハイブリドーマ・クローン mAb-1701 のヒト化フレームワーク配列の選択
マウス抗体 mAb-1701 軽鎖のヒト化テンプレートは IGKV1-33*01 及び hjk4.1 であり、重鎖のヒト化テンプレートは IGHV1-18*01 及び hjh4.1 である。ヒト化可変領域の配列は次の通りである：
【０１２３】
h1701VH-CDR グラフト（graft）（配列番号: 20）
【化８】
2020508658.tif 000011
【０１２４】
h1701VL-CDR グラフト（graft）（配列番号: 21）
【化９】
2020508658.tif 000012
注：順序は FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4、斜体の配列は FR 配列、下線付きの配列は CDR 配列である。
【０１２５】
１．２．h1701 のテンプレート選択及び復帰変異の設計
具体的な変異を表２に示す。
【０１２６】
【表２】
2020508658.tif 000013
注：例えば、A43S は、Kabat 番号付けシステムによる位置 43 での A から S への復帰変異を示す。移植（Grafted）は、マウス抗体の CDRs をヒト生殖細胞系列型の FR 配列に移植したことを示す。
【０１２７】
【表３】
2020508658.tif 000014
注：この表は、様々な変異の様々な配列の組み合わせを示す。例えば、h1701-007 は、ヒト化マウス抗体 h1701-007 に 2 つの変異（軽鎖 h1701_VL.1A 及び重鎖 h1701_VH.1A）が存在することを示す。他も同様である。
【０１２８】
ヒト化抗体 1701 の具体的な配列は次の通りである。
> h1701_VH.1（h1701VH-CDR グラフト（graft）と同じ、配列番号: 22）
【化１０】
2020508658.tif 000015
【０１２９】
>h1701h1701_VH.1A（配列番号: 23）
【化１１】
2020508658.tif 000016
【０１３０】
>h1701_VH.1B（配列番号: 24）
【化１２】
2020508658.tif 000017
【０１３１】
>h1701_VH.1C（配列番号: 25）
【化１３】
2020508658.tif 000018
【０１３２】
>h1701_VH.1D（配列番号: 26）
【化１４】
2020508658.tif 000019
【０１３３】
>h1701_VH.1E（配列番号: 27）
【化１５】
2020508658.tif 000020
【０１３４】
>h1701_VH.1F（配列番号: 28）
【化１６】
2020508658.tif 000021
【０１３５】
>h1701_VL.1（h1701VL-CDR グラフト（graft）と同一、配列番号: 29）
【化１７】
2020508658.tif 000022
【０１３６】
>h1701_VL.1A（配列番号: 30 と同一）
【化１８】
2020508658.tif 000023
【０１３７】
２．抗 TIM-3 抗体 mAb-1799 のヒト化
IMGT のヒト抗体重鎖及び軽鎖可変領域の遺伝子データベース及び MOE ソフトウェアを使った比較をして、mAb-1799 と高い相同性を持つ重鎖及び軽鎖可変領域の生殖細胞系列型遺伝子をテンプレートとして選択した。マウス抗体の CDRs を、対応するヒト・ソース・テンプレートに移植して、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 の順に可変領域配列を形成した。アミノ酸残基は、Kabat番号付けシステムによって特定し、及び注釈を付けた。
【０１３８】
２．１．ハイブリドーマ・クローン 1799 についてのヒト化フレームワーク配列の選択
マウス抗体 mAb-1799 軽鎖についてのヒト化テンプレートは IGKV1-39*01 及び hjk2.1 であり、重鎖のヒト化テンプレートは IGHV3-7*01 及び hjh4.1 である。ヒト化可変領域の配列は次の通りである： 
【０１３９】
h1799VH-CDR グラフト（graft）  （配列番号: 31） 
【化１９】
2020508658.tif 000024
【０１４０】
h1799VL-CDR グラフト（graft）  （配列番号: 32） 
【化２０】
2020508658.tif 000025
注：順序は FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4、斜体の配列は FR 配列、下線付きの配列は CDR 配列である。
【０１４１】
２．２．ハイブリドーマ・クローン 1799 についてのテンプレートの選択と復帰変異の設計。
表４は以下の通り：
【０１４２】
【表４】
2020508658.tif 000026
注：例えば、I48V は、Kabat 番号付けシステムによる位置 48 での I から V への復帰変異を示す。移植（Grafted）は、マウス抗体の CDRs をヒト生殖細胞系列型 FR 配列に移植したことを示す。
【０１４３】
【表５】
2020508658.tif 000027
注：この表は、様々な変異の様々な配列の組み合わせを示す。例えば、h1799-005 は、ヒト化マウス抗体 h1799-005 に 2 つの変異（軽鎖 h1799_VL.1A 及び重鎖 h1799_VH.1A）が存在することを示す。他も同様である。
【０１４４】
ヒト化 1799 の特異的配列は以下の通りである：
【０１４５】
>h1799_VH.1 （h1799VH-CDR グラフト（graft）と同一である、配列番号: 33）
【化２１】
2020508658.tif 000028
【０１４６】
>h1799_VH.1A （配列番号: 34）
【化２２】
2020508658.tif 000029
【０１４７】
>h1799_VH.1B （配列番号: 35）
【化２３】
2020508658.tif 000030
【０１４８】
>h1799_VL.1 （h1799VL-CDR グラフト（graft）と同一、配列番号: 36） 
【化２４】
2020508658.tif 000031
【０１４９】
>h1799_VL.1A （配列番号: 37） 
【化２５】
2020508658.tif 000032
【０１５０】
>h1799_VL.1B （配列番号: 38）
【化２６】
2020508658.tif 000033
【０１５１】
>h1799_VL.1C （配列番号: 39）
【化２７】
2020508658.tif 000034
【０１５２】
>h1799_VL.1D （配列番号: 40）
【化２８】
2020508658.tif 000035
【０１５３】
実施例４．組換えキメラ抗体及びヒト化抗体の調製及び試験
ヒト重鎖 IgG4／軽鎖カッパ定常領域及び様々な可変領域の組み合わせを抗体用に選択した。S228P 変異を Fc セグメントに導入して、IgG4 抗体の安定性を高めた。また、この分野で知られている他の変異を使用してその性能を向上させることもできる。
【０１５４】
重鎖定常領域の配列を配列番号: 41 に示す
【化２９】
2020508658.tif 000036
【０１５５】
軽鎖定常領域の配列を配列番号: 42 に示す
【化３０】
2020508658.tif 000037
【０１５６】
１．キメラ抗体重鎖の分子クローニング
可変領域の遺伝子配列は、ハイブリドーマのスクリーニングから選択した陽性抗体分子をシークエンシングすることにより得た。取得した配列に従ってプライマーを設計した。シークエンシングした遺伝子は、PCR を介して様々な抗体の VH/VK 遺伝子断片を構築するためのテンプレートとして使用した。取得した断片を、相同組換えを介して発現ベクター pHr（シグナル・ペプチド及び hIgG4/hκ 定常領域（CH1-FC/CL）断片とともに）に挿入し、組換えキメラ抗体の全長発現プラスミドVH-CH1-FC-pHr/VL-CL-pHr を構築した。最終的に、2つのキメラ抗体 Ch1701 及び Ch1799 とした。
【０１５７】
２．ヒト化抗体の分子クローニング
ヒト化抗体について設計した配列は、コドン最適化をしており、ヒトのコドン嗜好性を有するコーディング配列を得た。プライマーを設計し、さまざまな抗体の VH/VK 遺伝子断片を構築した。取得した断片を、相同組換えを介して発現ベクター pHr（シグナル・ペプチド及び hIgG4/hκ 定常領域（CH1-FC/CL）断片とともに）に挿入し、ヒト化抗体の全長発現プラスミド VH-CH1-FC-pHr/VL-CL-pHr を構築した。
【０１５８】
３．組換えキメラ抗体及びヒト化抗体の発現と精製
抗体の重鎖及び軽鎖を発現するベクターを 1：1.2 の比率で HEK293E 細胞にトランスフェクトし、6 日後に上清を回収した。サンプルを高速で遠心分離して不純物を除去し、プロテイン A カラムで精製した。A280 の測定値がベースラインに低下するまで、前記カラムを PBS で洗浄した。標的のタンパク質を酸性溶出バッファー（pH 3.0 - pH 3.5）で溶出した。1M Tris-HCl（pH 8.0-9.0）を使用して、前記標的タンパク質を中和した。溶出したサンプルを適切に濃縮し、PBS で平衡化したゲル・クロマトグラフィー Superdex200（GE）で更に精製した。凝集物のないピークを収集し、分注して使用した。
【０１５９】
実施例５．抗体 h1701 の点変異
脱アミド化は、抗体の安定性に影響を与える、より後の段階での一般的な化学修飾である。特に、変異を介して、CDR アミノ酸の高度な脱アミド化、酸化、又は異性化の修飾を回避する、又はこのような修飾を減らすことは一般的である。加速安定性試験及び抗体構造及びホットスポット予測に関するコンピューター・シミュレーションによると、h1701 抗体の重鎖 CDR2 中の NNG 部位は脱アミド化されやすい傾向がある。上記の NNG は、抗体 h1701 重鎖可変領域のアミノ酸位置 54-56 に位置する。アミノ酸の特性及び抗体構造のコンピューター・シミュレーションによれば、上記の部位のアミノ酸を任意のアミノ酸に置換することができる。好ましくは、h1701 の CDR2 バリアントは：DIIPX1X2X3GSKYNQKFKD（配列番号: 43）であり、ここで、X1X2X3は、h1701 抗体の重鎖可変領域の中の位置 54-56 のアミノ酸残基であり、X1 は、Asn、Leu、Val、Met 又は Glu から選択され、X2 は Asn、Glu、Met、His、Lys、Leu、Ala 又は Val から選択され、X3 は Gly 又は Ala から選択される。
【０１６０】
更に、位置 54-56 に上記の変異を含む CDR2 及び異なる復帰変異を含む FR は、以下の重鎖可変領域を形成することがある：
【０１６１】
>h1701_VH.1-CDR2 変異体  （配列番号: 44） 
【化３１】
2020508658.tif 000038
【０１６２】
>h1701_VH.1A-CDR2 変異体 （配列番号: 45） 
【化３２】
2020508658.tif 000039
【０１６３】
>h1701_VH.1B-CDR2 変異体 （配列番号: 46） 
【化３３】
2020508658.tif 000040
【０１６４】
>h1701_VH.1C-CDR2 変異体 （配列番号: 47） 
【化３４】
2020508658.tif 000041
【０１６５】
>h1701_VH.1D-CDR2 変異体 （配列番号: 48） 
【化３５】
2020508658.tif 000042
【０１６６】
>h1701_VH.1E-CDR2 変異体 （配列番号: 49） 
【化３６】
2020508658.tif 000043
【０１６７】
>h1701_VH.1F-CDR2 変異体 （配列番号: 50） 
【化３７】
2020508658.tif 000044
【０１６８】
抗体 h1701 HCDR2 バリアント及び対応する CDR2 バリアントを含むヒト化 h1701_VH.1B-CDR2 バリアント（配列番号: 46）の例示的な配列を、以下のバリアント及び表６に示す。
【０１６９】
例えば、h1701-009 HCDR2 の NNG を、NLG、NVG、NNA、NMA、NEA、NHA、NMG、NEG、NKG、NAG、NHG として設計した（対応する重鎖可変領域 CDR2 の配列は、配列番号：51-61 に示す）。発現プラスミドの構築と 293E の発現は、分子クローニングにより行った。この変異抗体の親和性と安定性を、精製後にも更に検出した。
【０１７０】
例示的なバリアントの親和性試験の結果を、試験例１及び３に示す。
【０１７１】
h1701-009 に、一連の特定のアミノ酸変異を入れた。これらの変異には、表６に示すものが含まれるが、これらに限定されない。化学的安定性試験の結果は、試験例９に示す。
【０１７２】
【表６】
2020508658.tif 000045
【０１７３】
本抗体の性能と利点を、以下に示す試験方法により検証する。
【０１７４】
試験例１．ヒト TIM-3 を過剰発現する CHO-s 細胞に対する抗 TIM-3 抗体の結合アッセイ
ヒト TIM-3 を過剰発現する CHO-S 細胞に対する抗 TIM-3 抗体の結合活性を、結合アッセイにより検出する。前記 TIM-3 全長のプラスミド（インハウス（in-house）で作製、配列番号： 3）をエレクトロポレーションにより CHO-S 細胞にトランスフェクトし、選択圧力を加えて 2 週間後に TIM-3 の発現を検出した。TIM-3 過剰発現細胞を 96 ウェルプレートに固定した。抗体を添加した後、シグナル強度を使用して、抗体が Tim-3 過剰発現 CHO-S 細胞に結合する活性を測定した。具体的な手順は次の通りである。AbTim-3 を陽性対照として使用し、その配列は US20150218274A1 の表２からのものであり、当社が作製した。
【０１７５】
細胞を 96 ウェルプレートに 4E5/ml の密度で、100μg/ウェルで播種し、一晩培養した。上清を廃棄し、前記プレートを PBS で 3 回洗浄した。100μl/ウェルの 4％PFA を各ウェルに加え、プレートを室温で 30 分間固定した。このプレートを PBS で 3 回洗浄した。液体を捨て、200μl のブロッキング溶液（PBS で希釈した 5% スキムミルク（光明（Guangming）スキム・ミルク・パウダー））を各ウェルに加えた。プレートを 37℃ で 2.5 時間インキュベートした。次に、前記ブロッキング溶液を捨て、プレートを PBST バッファー（0.05% の tweeen-20 を含む pH7.4 PBS）で 5 回洗浄した。サンプル・バッファーで希釈した、試験する様々な濃度の抗体（ハイブリドーマ精製した抗体又はヒト化抗体）を、50μl/ウェルで各ウェルに加え、37℃ で 1 時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを PBST バッファーで 5 回洗浄し、サンプル希釈液で希釈した HRP 標識ヤギ抗マウス二次抗体（Jackson Immuno Research、カタログ番号 115-035-003）又はヤギ抗ヒト二次抗体（Jackson Immuno Research、カタログ番号109-035-003）を、100μl/ウェルで各ウェルに添加し、37℃で 1 時間インキュベートした。プレートを PBST で 6 回洗浄し、100μl/ウェルの TMB 発色基質（KPL、カタログ番号、52-00-03）を各ウェルに加えた。プレートを室温で 5-15 分間インキュベートした。50μlの 1M H2SO4を各ウェルに加えることにより、反応を停止させた。450nm の波長での OD 値を ELISA マイクロプレート・リーダー（BMG Labtech、NOVOStar）で読み取り、TIM-3 抗体が Tim-3 過剰発現細胞に結合することに関する EC50 値を計算した。
【０１７６】
【表７】
2020508658.tif 000046
【０１７７】
本結果は、TIM-3 抗体 1701 及び 1799 及びそのヒト化抗体が、ヒトの全長 TIM-3 タンパク質を発現する CHO-s 細胞に対して良好な結合活性を有することを示している。
【０１７８】
h1701-009 及び HCDR2 に点変異を有するそのバリアントの、ヒト TIM-3 過剰発現細胞に対する結合活性を表８に示した。
【０１７９】
【表８】
2020508658.tif 000047
【０１８０】
本結果によれば、HCDR2 に点変異を有する 1701-009 抗体のバリアントが、ヒト TIM-3 過剰発現 CHO-s 細胞に対して良好な結合活性を有する、ことが示された。
【０１８１】
試験例２．抗 TIM-3 抗体の競合試験
抗体 A を PBS、pH7.4（Sigma、カタログ番号 P4417-100TAB）で 2μg/ ml に希釈し、50μg/ウェルを 96 ウェル・マイクロタイター・プレート（Corning、カタログ番号CLS3590-100EA）に添加し、37℃で 2 時間、インキュベートした。この液体は捨てた。200μl のブロッキング溶液（PBS で希釈した 5% スキムミルク（光明（Guangming）スキム・ミルク・パウダー）を各ウェルに添加し、このプレートを 37°Cで 2.5 時間又は 4°C で一晩（16-18 時間）インキュベートした。次にこのブロッキング溶液を捨てて、プレートを PBST バッファー（0.05% の tweeen-20 を含む PH7.4 PBS）で 5 回洗浄した。サンプル希釈液（1% BSA を含む PH7.4 PBS）で希釈した 20μg/ml 及び 4μg/ml の抗体 B と 0.4μg/ml のビオチン標識 TIM-3-Fc タンパク質（インハウスで作製、配列番号: 1）の事前混合物を 50μl/ウェルで各ウェルに加えた。このプレートを 37℃ で 1 時間インキュベートした。インキュベーション後、マイクロタイタープレート内の液体を廃棄し、そのプレートを PBST バッファーで 5 回洗浄した。サンプル溶液で希釈したHRP 標識ストレプトアビジン（Sigma、カタログ番号 S2438）を 100μl/ウェルで各ウェルに加え、そのプレートを 37℃ で 1 時間インキュベートした。そのプレートを PBST で 5 回洗浄し、50μl/ウェルの TMB 発色基質（KPL、カタログ番号、52-00-03）を各ウェルに加え、プレートを室温で 5-10 分間インキュベートした。この反応は、1M H2SO4 を 50μl/ウェルで各ウェルに加えることにより、停止させた。450nm の波長での OD 値を ELISA マイクロプレート・リーダー（BMG Labtech、NOVOStar）で読み取り、Tim-3 への結合に対する種々の抗体の競合効果を計算した。
【０１８２】
【表９】
2020508658.tif 000048
【０１８３】
本結果によれば、TIM-3 との結合において、mAb-1701 と mAb-1799 の間に競合関係がないことが示された。
【０１８４】
試験例３．Biacore を使用した TIM-3 抗体の親和性アッセイ
１．Biacore システムを使用したマウス抗体の親和性アッセイ
マウス抗体捕捉抗体キット（the mouse antibody capture antibody Kit（カタログ番号 BR-1008-38、GE））のマニュアルに記載されている方法に従って、試験する前記抗体を捕捉するために、マウス抗体捕捉抗体をバイオセンサー・チップ CM5（カタログ番号 BR-1000-12、GE）に共有結合的に固定させた。そして、TIM-3-His 抗原（Sino. Biol, カタログ番号 10390-H03H）をチップの表面を通るように流した。この反応シグナルを、Biacore 機器を使用してリアルタイムで検出し、結合及び解離曲線を取得した。最後に、親和性の値をフィッティングすることによって取得した。本実験では、解離させる各サイクルが終了した後、前記バイオセンサー・チップをマウス捕捉抗体キットにある再生溶液で洗浄した。結果を表１０に示す。
【０１８５】
【表１０】
2020508658.tif 000049
【０１８６】
本結果によれば、TIM-3 抗体 mAb-1701 及び mAb-1799 がヒト TIM-3 タンパク質に対して、強い結合活性と親和性を持っていることが示される。
【０１８７】
２．Biacore システムを使用したキメラ抗体及びヒト化抗体の親和性アッセイ
ヒト抗体捕捉キット（the human antibody capture Kit（カタログ番号 BR-1008-39、GE））のマニュアルに記載されている方法に従って、試験する前記抗体を親和性で捕捉するために、ヒト抗体捕捉抗体をバイオセンサー・チップ CM5（カタログ番号 BR-1000-12、GE）に共有結合的に固定させた。そして、TIM-3-Flag-His 抗原（インハウスで作製、配列番号: 2）をチップの表面を通るように流した。これの反応シグナルを、Biacore 機器を使用してリアルタイムで検出し、結合及び解離曲線を取得した。最後に、親和性の値をフィッティングすることによって取得した。下記の表１１を参照のこと。本実験では、解離させる各サイクルが終了した後、前記バイオセンサー・チップをヒト捕捉抗体キットに入っている再生溶液で洗浄した。
【０１８８】
【表１１】
2020508658.tif 000050
【０１８９】
本結果によれば、取得した本発明のヒト化抗体がヒト TIM-3 タンパク質に対して、強い結合活性と親和性を有することが示される（すべての結果を示しているわけではない）。
【０１９０】
HCDR2 に点変異を有する h1701-009 バリアント抗体の結合親和性は、BIAcore を使用して検出した。その結果を表１２に示す。
【０１９１】
【表１２】
2020508658.tif 000051
【０１９２】
本結果によれば、上記の h1701-009 バリアントが、なお依然として TIM-3 に対して強い親和性を持っていることが示される。NNG 部位での変異は、抗原に対する抗体の結合親和性に影響しない。
【０１９３】
試験例４．In vitro での細胞性免疫機能アッセイ
T リンパ球の活性化に対する抗 TIM-3 抗体の効果を研究するために、in vitro での 3 種の機能試験：即ち、混合リンパ球反応（MLR アッセイ）、PBMC 活性化試験及びスーパー抗原ブドウ球菌エンテロトキシン B（SEB）刺激試験、を確立した。
【０１９４】
１．混合リンパ球反応（MLR アッセイ）
実験手順は次のとおりである：
１）ヒト末梢血単核細胞（PBMC）を採取して精製した；
２）PBMCs を NUNC プレートに 2E6 細胞/ml の密度で播種し、2 時間置いた。
３）非接着細胞を除去し、接着細胞を GM-CSF（100ng/ml）及び IL-4（100ng/ml）で 5 日間刺激した後、TNFα（100ng/ml）で 2 日間インキュベートして、DC 細胞の成熟を誘導した；
４）前記成熟した DC 細胞を、異なるドナーからの PBMCs と 1：5 の比率で混合し、10ng/ml のCD3抗体でプレコートしてある 96 ウェル・プレートで培養し、様々な濃度の h1701-009、h1799- 005、AbTIM-3 及び陰性対照の Fc-IgG を添加した； 
５）5 日後に、上清中の IFNγ の濃度を ELISA で検出した（結果を図２Ａから２Ｃに示す）。
【０１９５】
本結果によれば、h1701-009、h1799-005 及び AbTIM-3 が IFNγ の分泌を効果的に刺激し、h1701-009 及び h1799-005 がより強い刺激効果を示すことが示される。
【０１９６】
２．PBMC 活性化試験
本実験の手順を次のように簡単に説明する：
１）ヒト末梢血単核細胞（PBMC）を採取して精製し、96 ウェル・プレートを CD3 及び CD28 抗体（両方とも濃度 10ng/ml）でコーティングした；
２）PBMCs を、コーティングした 96 ウェル・プレートに、1E5 細胞/ウェルの密度で播種し、様々な濃度の TIM-3 抗体と陰性対照 Fc-IgG を同時に添加した；
３）6 日後、細胞内の IFNγ 及び TIM-3 を染色するために細胞を回収した。IFNγ 陽性細胞の割合（IFNγ+%）（すべての細胞の IFNγ 幾何（Geo）平均値）及び IFNγ 及び TIM-3 の二重陽性細胞の割合（TIM-3+IFNγ+%）（TIM-3+細胞中の IFNγ 幾何（Geo）平均値）を FACS で解析した（図３Ａから３Ｄ）；
【０１９７】
本結果によれば、h1701-009、h1799-005 及び AbTIM-3 が IFNγ 陽性細胞の割合及び IFNγ の発現を様々な程度に増加させ、h1701-009 及び h1799-005 の効果が、AbTIM-3 より強いことが示された。
【０１９８】
３．SEB 刺激試験
本実験の手順は次のとおりである：
１）ヒト末梢血単核細胞（PBMC）を採取して精製した； 
２）PBMCsを、1E5 細胞/ウェルの密度でコーティングした 96 ウェル・プレートに播種し、1ng/ml SEB 並びに様々な濃度の TIM-3 抗体及び陰性対照 Fc-IgG を同時に添加した；
３）5 日後、その上清を収集し、IL12 及び IFNγ を ELISA で検出した（それぞれ図４Ａ及び４Ｂを参照）。
【０１９９】
本結果によれば、h1701-009、h1799-005 及び AbTIM-3 の全てが SEB により誘導される IL12 及び IFNγ の分泌を効果的に増加させ、h1701-009 及び h1799-005 は低用量で、AbTIM-3 より良い効果を示すことが示された。
【０２００】
試験例５．ラットにおけるヒト化抗 TIM-3 抗体、h1701-009、h1799-005 の薬物動態（PK）アッセイ
体重 180-240gの 12 匹の SD ラットを Sippr-BK 実験動物社から購入した。給餌期間中、ラットは水と飼料を自由に摂取できるようにした。実験環境での適応期間は、12/12 時間の明暗サイクル制御で 3 日以上とした（温度は 16-26°C、相対湿度は 40-70% とした）。本実験の 1 日前に、SD ラットに番号を付け、各群に 3 匹のラット（雄 2 匹と雌 1 匹）となるようにランダムに群分けをした。実験当日に、2 群のラットに試験薬 h1701-009 を 3 mg/kg と 10 mg/kg の用量で静脈内注射した；2 群のラットに試験薬 h1701-005 を 3 mg/kg と 10 mg/kg の用量で静脈内注射した。静脈内注射の容量は 5 ml/kg とした。
【０２０１】
投与前及び投与後 5 分、8 時間、1 日、2 日、4 日、7 日、10 日、14 日、21 日、28 日、の各時点で血液を採取した。抗凝固剤を使わないで、各動物から 0.2 ml の全血を採取した。この血液サンプルを 4°C で 30 分間置いた後、1000 g で 15 分間遠心分離した。前記上清を EP チューブに取り、-80℃ で保存した。
【０２０２】
血清抗体の濃度は ELLSA によって測定し、薬物動態パラメータは Winnolin ソフトウェアによって計算した。主な薬物動態パラメータについては、表１３を参照のこと。
【０２０３】
【表１３】
2020508658.tif 000052
【０２０４】
SD ラットに 10mg/kg の用量で抗 TIM 3 抗体 h1701-009 及び h1701-005 を静脈内注射した後、ラット中でのその血清レベルは類似していた。抗体 h107-005 に関して、3 mg/kg及び 10 mg/kg の投与量での血清レベルの増加は、投与量の増加と線形的に相関した；一方、抗体 h107-009 に関しては、3 mg/kg及び 10 mg/kg の投与量での血清レベルの増加は、投与量の増加よりわずかに高かった。抗体 h1701-009 と g1799-005 の排出半減期は類似していた。
【０２０５】
試験例６．DSC による抗体 h1701-009 及び h1799-005 の熱安定性
熱安定性を、様々な pH 値の様々なバッファー系で比較した。様々な pH を有する例示的なバッファー系は、例えば、10mM PB（pH7）、15mM His（pH6.0）及び 10mM 酢酸（pH5.2）であった。前記サンプルを対応するバッファーに溶解し、その濃度を約 1 mg/ml に調節した。MicroCal*VP-Capillary DSC（Malvern）によって検出を行った。試験前に、真空脱気装置を使用して、各サンプルとブランク・バッファーを 1 分間から 2 分間脱気した。プレートの各ウェルに 400μl のサンプル又はブランク・バッファーを加えた（ローディング量は 300μl とした）。最後に、2 組のウェルに洗浄用にそれぞれ 14% の Decon 90 と ddH2O を添加した。そして、プレートをプラスチック・カバーで密閉した。スキャンは 25°C の温度から開始し、100°C で終了し、スキャン速度は 60°C/h とした。本結果を表１４に示す。本結果によれば、h1701-009 と h1799-005 の両方がいくつかの試験系で良好な熱安定性を示すことを示される。
【０２０６】
【表１４】
2020508658.tif 000053
【０２０７】
試験例７．SEC-HPLC による純度のモニタリング、及び特定の濃度での安定性を断続的に観察すること
例示的な条件は、例えば、前記サンプルの濃度を約 50mg/ml に調節するものとした。PBS（pH7.4）系中の様々な抗体の安定性を、-80°C で 5 回凍結融解を繰り返し、4°C 及び 40°C で 1 か月間保存する等の条件下で比較した。Xbridge タンパク質 BEH SEC 200A（Waters）HPLC カラムを使用して、抗体の純度を検出した。1 か月間検討した後、h1701-009 と h1799-005 の両方が良好な安定性を示し、SEC による純度は、40℃ で 1 か月間置いても、有意に変化しなかった。
【０２０８】
試験例８．抗体の化学的安定性
配列番号: 51-55 に示す h1701-009、h1799-005 及び h1701-009 バリアントの化学的安定性を検出した。
【０２０９】
試験する 500μg の抗体を 500μl の PBS、pH 7.4 に溶解し、40℃ の水浴に置いた。酵素加水分解アッセイのために、0、14、28 日目にサンプリングを実施した。様々な時点で採取した各サンプル 100μg を、100μl の 0.2 M His-HCl、8 M Gua-HCl 溶液（pH 6.0）に溶解した。3μl の 0.1g/mL DTT を加えた後、前記サンプルを 50℃ の水浴に 1 時間置いた。それから、前記サンプルを 0.02M His-HCl（pH 6.0）で 2 回限外ろ過し、3μL の 0.25 mg/mL トリプシンを加え、37℃ の水浴に置いて、一晩、酵素消化をした。
【０２１０】
LC-MS 解析を、Agilent 6530 Q-TOF によって行った。その結果によれば、h1799-005 は、40℃ の条件に 1 か月間置いて、明らかな異性化、酸化、脱アミド化の修飾を示さないことが示され、この分子が良好な化学的安定性を有することが示された。h1701-009 は、明らかな酸化及び異性化の修飾を示さなかった。しかしながら、N54N55G56 部位で、強く脱アミド化の修飾を受けていることが h1701-009 で観察された。例えば NLG、NVG、NMA、NEA、NNA 等の変異等を含む、一連のアミノ酸変異を導入することを試みた。これらの変異は、in vitro 活性アッセイを使用することにより、生物活性に影響を与えないことが実証された。加速試験の後、前記変異を LC-MS で解析し、その結果によれば、これら全ての変異が脱アミド化の修飾を効果的に減らすことが示された。加速試験後の様々なバリアントにおける脱アミド化の修飾の割合を表１５に示す。
【０２１１】
【表１５】
2020508658.tif 000054
【０２１２】
本発明を、明確な理解を目的として、図及び特定の実施形態を使って詳細に説明したが、本説明及び実施形態は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本出願で引用された文献及び特許のすべての公開内容は、参照によりその全体が明示的に組み込まれる。
【図１】
2020508658.tif 000055
【図２Ａ】
2020508658.tif 000056
【図２Ｂ】
2020508658.tif 000057
【図２Ｃ】
2020508658.tif 000058
【図３Ａ】
2020508658.tif 000059
【図３Ｂ】
2020508658.tif 000060
【図３Ｃ】
2020508658.tif 000061
【図３Ｄ】
2020508658.tif 000062
【図４Ａ】
2020508658.tif 000063
【図４Ｂ】
2020508658.tif 000064
【配列表】
2020508658000001.app
【国際調査報告】
2020508658.tif 000065
2020508658.tif 000066
2020508658.tif 000067
2020508658.tif 000068
2020508658.tif 000069
2020508658.tif 000070
2020508658.tif 000071