(57)【要約】  本発明は、宿主細胞における組換えタンパク質の産生の分野に関する。より詳細には、本発明は、タンパク質の経口送達の分野に関する。具体的には、本発明は、組換えタンパク質を分泌する組換え宿主の培地を含む、経口医薬配合物を提供する。得られた経口医薬配合物は、胃腸障害及び／又は口腔障害の治療のために有用である。さらに経口医薬配合物は、予防目的及びワクチン目的のために有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え真菌の培地中に存在する５ｋＤａより大きい複数の高分子を含む、乾燥配合物であって、前記真菌が、前記培地中に分泌されるＦｃドメインに融合した外因性ポリペプチドを産生する、乾燥配合物。
【請求項２】
前記Ｆｃドメインが、ＩｇＡＦｃドメインである、請求項１に記載の乾燥配合物。
【請求項３】
Ｆｃドメインに融合した前記外因性ペプチドが、予防用若しくは治療用ペプチドであり、又は前記外因性ペプチドが、ワクチンであり、若しくはワクチンの部分を形成する、請求項１又は２に記載の乾燥配合物。
【請求項４】
糸状真菌又は酵母細胞等の組換え真菌宿主の培地中に存在する５ｋＤａより大きい複数の高分子を、経口投与可能なマトリックスに添加し、続いて、得られた混合物を乾燥させることによって得られた、乾燥配合物であって、前記培地が、前記組換え宿主に対して外因性の分泌ポリペプチドを含む、乾燥配合物。
【請求項５】
前記外因性ポリペプチドが、Ｆｃドメイン、特にＩｇＡ  Ｆｃドメインに融合している、請求項４に記載の乾燥配合物。
【請求項６】
乾燥させることが、組換え真菌細胞の培地中に存在する５ｋＤａより大きい複数の高分子及び経口投与可能なマトリックスを噴霧乾燥させることによって実施される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の乾燥配合物。
【請求項７】
乾燥させることが、組換え宿主の培地中に存在する５ｋＤａより大きい複数の高分子及び経口投与可能なマトリックスを凍結乾燥させることによって実施される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の乾燥配合物。
【請求項８】
医薬品としての使用のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の乾燥配合物。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の乾燥配合物及び医薬用賦形剤を含む、経口医薬組成物。
【請求項１０】
胃腸疾患の治療を目的とした使用のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の乾燥配合物又は請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
口腔疾患の治療を目的とした使用のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の乾燥配合物又は請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
ワクチンとしての使用のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の乾燥配合物又は請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の乾燥配合物を含む、食品製品。
【請求項１４】
機能性又は薬用食品製品である、請求項１３に記載の食品製品。
【請求項１５】
ポリペプチドが、ＩＬ２２  ＩｇＡ  Ｆｃ融合物である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の乾燥配合物又は請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
真菌産生ＩｇＡＦｃ融合タンパク質を含む、経口医薬組成物であって、ＩｇＡＦｃと融合したタンパク質が、免疫グロブリン単一可変ドメインである、経口医薬組成物。
【請求項１７】
Ｎ−グリカン及び／又はＯ−グリカンによって修飾された、真菌産生タンパク質であって、糖タンパク質の分子量のうちの少なくとも３０％が、経口投与における使用のための前記Ｎ−グリカン又はＯ−グリカンによって占められる、真菌産生タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母細胞等の宿主細胞中における組換えタンパク質の産生の分野に関する。より詳細には、本発明は、タンパク質の経口送達の分野に関する。具体的には、本発明は、組換えポリペプチドを分泌する組換え宿主の培地を含む、経口医薬配合物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ホルモン、酵素、リガンド又は抗体を含む阻害剤を含むペプチド又はタンパク質は、様々な細胞機能を調節する。したがって、これらのペプチド又はタンパク質は、クリニックにおいて、生理学的又は病理学的な過程の調節によってヒト障害を治療又は予防するために有用である。小分子分子薬物とは著しく異なり、標的に対するペプチド又はタンパク質の高い選択性は、副作用及び宿主細胞に対する毒性を低減することができる。がん、代謝障害、胃腸疾患、口腔疾患、神経変性性疾患及び感染症の治療において、治療を目的としたタンパク質又はペプチドの使用が増え続けることが、予想されている。現在、タンパク質型薬物の大部分は、ほ乳類、植物、酵母又は細菌細胞培養系を使用して、製造されている。これらの発現タンパク質は、抽出及び精製されなければならないが、抽出及び精製は、高価で複雑な工程並びに低温における貯蔵及び輸送を必要とする。生物学的製剤は、一般に、静脈内注射又は皮下注射によって送達され、このことは、効果的ではあるが、患者、特に慢性状態の患者にとっては望ましくない。注射可能な形態のタンパク質型薬物は、投与のために医療従事者を要することが多く、頻繁な病院に頻繁に来院することになり、患者のコンプライアンスが低下する。経皮投与、鼻腔内投与、吸入投与及び経口投与等の他の送達経路も調査中であるが、一般に、経口送達が最も望ましい経路だと考えられる。数十年の努力にもかかわらず、ペプチド、タンパク質及び抗体薬の経口送達は、医薬における主要な難点のままであり、上市されているこのようなタンパク質は、ほんの一握りにすぎない。このことは、生物学的製剤が製薬市場において急速に成長しているセグメントであり、その価値は直近１０年間で３６０億ドルから１６３０億ドルに３倍化しているため、特に失望を誘う事柄である。したがって、患者にとっては好都合であるが、この投与経路を大分子型薬物にとって厄介なものにする、いくつかの技術的な障壁が存在する。確実なこととして、最も重要な難点は、胃及び腸管における、ｐＨに応じた酵素による薬物の分解である。さらに、これらの化合物は、胃腸（ＧＩ）管を裏打ちする上皮細胞の透過性が低く、固有の不安定もある。大分子の経口送達を容易にするためのいくつかの技術が、開発されてきた。ポリエチレングリコールのような分子を付着させることにより、抗体Ｆｃドメイン又はヒト血清アルブミンは、循環中の血清中におけるペプチド安定性を高める。さらに、ペプチド薬物は、血清プロテアーゼ及びペプチダーゼから保護するために修飾されてもよい。このような修飾は、Ｎ末端アセチル化、Ｃ末端アミド化、非天然アミノ酸の使用及びジスルフィド結合による環化を含む。さらに、いくつかの改善が、酵素阻害剤の開発、吸収又は浸透向上剤の使用、カプセル内へのポリペプチドの配合、消化器官の管壁に張り付く接着性ポリマーの施用及び配合物中へのキャリア分子の組み込みにおいてなされた。これらの技術にもかかわらず、タンパク質及びペプチドは一般的に、口から摂取した場合に２％未満である、極めて低い生物学的利用能を有する。最近、本発明者らにより、植物種子産生抗体は胃体管を生き残るものであり、腸管において生物活性だったことが示された（ＷＯ２０１４０３３３１３及びＶｉｒｄｉ  Ｖ．ｅｔ  ａｌ（２０１３）ＰＮＡＳ、１１０、２９、１１８０９−１１８１４を参照されたい。）。多量の組換えタンパク質を産生することができる植物産生系は、冗長で高価な調節手順のため、可食型ワクチンを産生するための最良の選択ではないであろう。真核生物が少ないほど、より多量の組換えタンパク質の産生が可能になり、より望ましい。経口送達することができる治療用タンパク質の産生のための、酵母等の下等真核生物宿主を使用することは、利点であろう。下等真核生物細胞は、治療用タンパク質の送達に関して記述されてきたが、治療用タンパク質を産生することができる完全組換え細胞としてのみ記述されてきた（例えば、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：９７及びＷＯ２００７０３９５８６を参照されたい。）。組換え酵母自体ではなく、分泌ポリペプチドを含む培地のみを使用できることは、望ましいであろう。さらにより望ましくは、培地から治療用ポリペプチドを精製する必要はなく、培地をそのままの状態で使用することが、重要であろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２０１４／０３３３１３号
【特許文献２】国際公開第２００７／０３９５８６号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｖｉｒｄｉ  Ｖ．ｅｔ  ａｌ（２０１３）ＰＮＡＳ、１１０、２９、１１８０９−１１８１４
【非特許文献２】Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：９７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明において、本発明者らは驚くべきことに、治療用ポリペプチドを含み、透過物状化合物の濃度を低減するために膜分離工程によって処理された、組換え酵母の培地を含む、乾燥配合物が、経口送達配合物として使用され得ることを示した。驚くべきことに、治療用ポリペプチドを含む粉末状乾燥済みの培地（凍結乾燥又は噴霧乾燥によって得られたもの）は、消化器官において分解から保護されることが示されている。さらに、粉末状乾燥配合物もまた、消化器官において、生物学的活性を維持していることがやはり示されている。
【０００６】
第１の態様において、本発明は、経口投与可能なマトリックスと、組換え宿主から得た培地との混合物を含む、乾燥配合物であって、培地中において、可溶性透過物状化合物の濃度が、膜分離工程において低減されており、前記宿主が、前記培地中に分泌される外因性ポリペプチドを産生する、乾燥配合物を提供する。
【０００７】
さらに別の特定の態様において、本発明は、組換え酵母に由来の培地を含む、配合物であって、前記酵母が、前記培地中に分泌される外因性ポリペプチドを産生する、配合物を提供する。
【０００８】
第２の態様において、本発明は、前記配合物の含水量及び５ｋＤａ未満の分子量を有する可溶性分子が、膜分離工程において前記培地を濃縮した後で前記配合物を調製することによって低減される、態様１による配合物を提供する。
【０００９】
第３の態様において、本発明は、含水量及び５ｋＤａ未満の分子量を有する可溶性分子が、前記培地を乾燥させた後で前記配合物を調製することによって低減される、態様１による配合物を提供する。
【００１０】
第４の態様において、本発明は、前記配合物の含水量及び５ｋＤａ未満の分子量を有する可溶性分子が、前記配合物を乾燥させることによって低減される、態様１による配合物を提供する。
【００１１】
第５の態様において、本発明は、組換え宿主の培地を含む、乾燥配合物であって、前記宿主が、前記培地中に分泌される外因性ポリペプチドを産生する、乾燥配合物を提供する。
【００１２】
第６の態様において、本発明は、前記組換え宿主が、酵母である、態様５による乾燥配合物を提供する。
【００１３】
第７の態様において、本発明は、外因性ポリペプチドが、Ｆｃドメインに融合している、態様５及び６による乾燥配合物を提供する。
【００１４】
第８の態様において、本発明は、態様７による乾燥配合物であって、前記Ｆｃドメインが、ＩｇＡ  Ｆｃドメインである、乾燥配合物を提供する。
【００１５】
第９の態様において、本発明は、前記外因性ペプチドが、予防用若しくは治療用ペプチドであり、又は前記外因性ペプチドが、ワクチンであり、若しくはワクチンの部分を形成する、態様５〜８のいずれか１つによる乾燥配合物を提供する。
【００１６】
第１０の態様において、本発明は、ポリペプチドを組換え宿主の培地中に分泌させ、続いて、前記培地を乾燥させることによって得られた組換え宿主に対して外因性の前記ポリペプチドを含む、乾燥配合物を提供する。
【００１７】
第１１の態様において、本発明は、融合ポリペプチドを組換え宿主の培地中に産生させ、続いて、前記培地を乾燥させることによって得られた、Ｆｃドメインとの前記融合ポリペプチドを含む、乾燥配合物を提供する。
【００１８】
第１２の態様において、本発明は、前記組換え宿主が、原核生物宿主、植物細胞又は真菌細胞、特に糸状真菌である、態様１０又は１１による乾燥配合物を提供する。
【００１９】
第１３の態様において、本発明は、態様１０又は１１による乾燥配合物であって、前記組換え宿主が、酵母細胞である、乾燥配合物を提供する。
【００２０】
第１４の態様において、本発明は、前記乾燥させることが、噴霧乾燥によって実施される、態様５〜１３のいずれか１つによる乾燥配合物を提供する。
【００２１】
第１５の態様において、本発明は、前記乾燥させることが、凍結乾燥によって実施される、態様５〜１３のいずれか１つによる乾燥配合物を提供する。
【００２２】
第１６の態様において、本発明は、酵母細胞をさらに含む、態様５〜１３のいずれか１つによる乾燥配合物を提供する。
【００２３】
第１７の態様において、本発明は、タンパク質に富んだ金属をさらに含む、態様５〜１３のいずれか１つによる乾燥配合物を提供する。
【００２４】
第１８の態様において、本発明は、医薬品としての使用のための、態様５〜１７のいずれか１つによる乾燥配合物を提供する。
【００２５】
第１９の態様において、本発明は、胃腸疾患を治療するための、態様５〜１７のいずれか１つによる乾燥配合物を提供する。
【００２６】
第２０の態様において、本発明は、口腔疾患の治療を目的とした使用のための、態様５〜１７のいずれか１つによる乾燥配合物を提供する。
【００２７】
第２１の態様において、本発明は、予防用製品としての使用のための、態様５〜１７のいずれか１つによる乾燥配合物を提供する。
【００２８】
第２２の態様において、本発明は、ワクチンとしての使用のための、態様５〜１７のいずれか１つによる乾燥配合物を提供する。
【００２９】
第２３の態様において、本発明は、機能性食品製品としての使用のための、態様５〜１７のいずれか１つによる乾燥配合物を提供する。
【００３０】
第２３の態様において、本発明は、薬用食品製品としての使用のための、態様５〜１７のいずれか１つによる乾燥配合物を提供する。
【００３１】
第２４の態様において、本発明は、態様５〜１７のいずれか１つによる乾燥配合物を含む、食品製品を提供する。
【００３２】
第２５の態様において、本発明は、ポリペプチドが、ＩＬ２２ＩｇＡＦｃ融合物である、態様５〜１７のいずれか１つによる乾燥配合物を提供する。
【００３３】
第２７の態様において、本発明は、態様５〜１７のいずれか１つによる乾燥配合物及び医薬用賦形剤を含む、経口医薬配合物を提供する。
【００３４】
第２８の態様において、本発明は、医薬品としての使用のための、態様５〜１７のいずれか１つによる乾燥配合物を提供する。
【００３５】
第２９の態様において、本発明は、医薬品としての使用のための、第２７の態様による経口医薬配合物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１−１】ＦａｅＧ固定化ＥＬＩＳＡ構成による、高発現するピキア（Ｐｉｃｈｉａ）クローン（Ａ）及びダイズ種子（Ｂ）のスクリーニング及び選択の図である。
【図１−２】ＦａｅＧ固定化ＥＬＩＳＡ構成による、高発現するピキア（Ｐｉｃｈｉａ）クローン（Ａ）及びダイズ種子（Ｂ）のスクリーニング及び選択の図である。
【図１−３】パネル「Ｃ」は、キアＶＨＨ−ＩｇＡＦｃを含有する上澄みの代表的な免疫ブロット法を示している。
【図１−４】パネル「Ｄ」は，ダイズＶＨＨ−ＩｇＡＦｃを発現した種子抽出物の代表的な免疫ブロット法を示している。
【図２】ピキア産生抗体と種子産生抗体との機能的同等性を比較する、ＥＬＩＳＡに基づいた滴定の典型例の図である。この代表図において、点線によるピキア産生Ｖ２Ａ抗体（ピキア−Ｖ２Ａ）の曲線は、実線によるアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）産生Ｖ２Ａ（Ａｔ―Ｖ２Ａ）の異なる濃度に対して比較されている。
【図３−１】ピキア及びダイズ産生ＶＨＨ−ＩｇＡが、子ブタにおけるＥＴＥＣ感染を予防する、図である。実験（Ａ）の概略図。
【図３−２】ピキア及びダイズ産生ＶＨＨ−ＩｇＡが、子ブタにおけるＥＴＥＣ感染を予防する、図である。チャレンジ（Ｂ）後のＦ４−ＥＴＥＣのシェディング。
【図３−３】ピキア及びダイズ産生ＶＨＨ−ＩｇＡが、子ブタにおけるＥＴＥＣ感染を予防する、図である。セロコンバージョンは、抗Ｆ４−ＥＴＥＣ血清ＩｇＭ（Ｃ）力価を示している。
【図３−４】ピキア及びダイズ産生ＶＨＨ−ＩｇＡが、子ブタにおけるＥＴＥＣ感染を予防する、図である。セロコンバージョンは、抗Ｆ４−ＥＴＥＣ血清ＩｇＧ（Ｄ）力価を示している。
【図３−５】ピキア及びダイズ産生ＶＨＨ−ＩｇＡが、子ブタにおけるＥＴＥＣ感染を予防する、図である。セロコンバージョンは、抗Ｆ４−ＥＴＥＣ血清ＩｇＡ（Ｅ）力価を示している。
【図４−１】パネルＡ。実施例３の実験機構。
【図４−２】パネルＢ。６日目までで４つの異なる群における糞便１グラム当たりのＦ４＋ＥＴＥＣ細菌のシェディング。
【図４−３】パネルＣ。４つの異なる群に属する個々の子ブタに関する抗ＥＴＥＣＩｇＧの血清力価。
【図４−４】パネルＤ。４つの異なる群に属する個々の子ブタに関する抗ＥＴＥＣＩｇＡの血清力価。
【図５】ＧＡＰプロモーターによって駆動される、コマガタエッラ・ファッフィ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉ）（以前は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）としても知られていた）において産生されたＶ２ＩｇＡＦｃ融合物の発現に関する、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の図である。パネルＡ）  Ｃ末端ｈｉｓタグＶ２ＩｇＡＦｃをＮｉ−ＩＭＡＣ精製し、１μｇの組換えタンパク質を、ＰＮＧａｓｅＦによって処置し（右側レーン）、又は処置しなかった（左側レーン）。パネルＢ）  コマガタエッラ・ファッフィが産生するＶ２ＩｇＡＦｃの粗製上澄みを、ＰＮＧａｓｅＦによって処置し（右側レーン）、又は処置しなかった（左側レーン）。ＰＮＧａｓｅ  Ｆによって処置すると、分子量は、約３８ｋＤａに大幅に低下するが、これは、グリコシル化されていない分子の理論分子量に対応する。単一のＮ−グリコシル化部位に存在するハイパーマンノシル構造は、タンパク質の分子量に、３０ｋＤａ超を追加する。
【図６】Ｖ２ＩｇＡＦｃ分子が、コマガタエッラ・ファッフィにおいて、メタノール誘導性ＡＯＸＩプロモーター（メタノール上の培養物）ではなく構成的ＧＡＰプロモーター（グリコース上の培養物）から産生されたときにグリコシル化レベルが上昇する、図である。ＧＡＰプロモーター産生タンパク質の平均ＭＷは、約７０ｋＤａであるが、グリコシル化されていないＶ２ＩｇＡＦｃタンパク質の予想ＭＷは、３８．４ｋＤａである。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明は、特定の実施形態を参照しつつ、特定の図面も参照しながら記述されるが、本発明は、これらの実施形態及び図面に限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。特許請求の範囲におけるあらゆる参照符号は、その範囲を限定するものとして解釈すべきでない。当然ながら、必ずしもすべての態様又は利点が、本発明の任意の特定の実施形態によって達成され得るとは限らないことを理解すべきである。したがって、例えば、当業者は、本発明が、本明細書において教示された一利点又は一群の利点を達成又は最適化する方式で実現又は実施されることが可能であり、必ずしも本明細書において教示又は示唆され得る他の態様又は利点を達成するとは限らないことを認識されよう。
【００３８】
本発明は、構成と動作方法との両方に関して、下記の詳細な記述を参照により、添付の図面も併せて読めば、本発明の特徴及び利点と一緒に最も深く理解することができる。本発明の態様及び利点は、本明細書において後述される実施形態（複数可）への参照によって明らかになり、明確化される。本明細書を通して、「一実施形態」又は「ある実施形態」への言及は、実施形態との関連で記述された特定の特徴、構造又は特質が、少なくとも１つの本発明の実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書を通して様々な場所における「一実施形態において」又は「ある実施形態において」という語句の出現は、必ずしも、すべてが同じ実施形態を指すとは限らないが、すべてが同じ実施形態を指すことも可能である。同様に、本発明の例示的な実施形態に関する記述において、本発明の様々な特徴は時に、単一の実施形態、図面、又は、本開示を的確化し、様々な本発明の態様のうちの１種以上の理解を促すことを目的とした当該実施形態若しくは図面に関する記述において、一緒にしてグループ化されることもあることを理解すべきである。しかしながら、本開示の方法は、特許請求された本発明が、各クレームにおいて明示的に記載されたより多くの特徴を必要とするという意図を反映したものとして、解釈すべきでない。逆に、下記の特許請求の範囲が提示するように、本発明の態様は、先に開示された単一の実施形態に関するすべての特徴より少ないものである。
【００３９】
単数名詞に言及するときに不定冠詞又は定冠詞が使用されている場合、例えば、「一（ａ）」又は「ある（ａｎ）」、「当該（ｔｈｅ）」は、そうではないことが明示的に記載されていない限り、この名詞の複数形を含む。「含む」という用語が本明細書及び特許請求の範囲において使用されている場合、他の要素又はステップを排除するものではない。さらに、本明細書及び特許請求の範囲における第１、第２及び第３等という用語は、類似した要素どうしを区別するために使用されており、必ずしも、連続的又は経時的な順番を記述するために使用されているとは限らない。このようにして使用される用語は、適切な状況下においては、相互変換可能であること、及び、本明細書において記述された本発明の実施形態は、本明細書において記述又は例示されてもの以外の配列中での動作が可能であることを理解すべきである。下記の用語又は規定は、本発明の理解を促すためにのみ提供されている。本明細書において明示的に規定されていない限り、本明細書において使用されているすべての用語は、本発明の技術分野における当業者にとっての意味と同じ意味を有する。当技術分野の規定及び用語に関しては、実践者は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０１２）及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １１４），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０１６）を特に対象とする。本明細書において提供された規定は、当業者によって理解されるものより狭い範囲を有するように解釈すべきでない。
【００４０】
量及び時間的な持続期間等の測定可能な値に言及するときに本明細書において使用されている「約」は、そのようなバラつきが本開示の方法を実施するために適切であるとき、指定の値から±２０％又は±１０％、より好ましくは±５％、さらにより好ましくは±１％、さらにより好ましくは±０．１％のバラつきを包含することを意味する。
【００４１】
本明細書において使用されている「ヌクレオチド配列」、「ＤＮＡ配列」、「ＤＮＡエレメント（複数可）」又は「核酸分子（複数可）」は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドである、任意の長さヌクレオチドのポリマー形態を指す。これらの用語は、分子の一次構造のみを指す。したがって、これらの用語は、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ並びにＲＮＡを含む。これらの用語は、既知の種類の修飾も含み、例えば、メチル化、アナログによる天然のヌクレオチドのうちの１種以上の「キャップ」置換も含む。「コーディング配列」は、適切な調節配列の制御下で配置されたときにｍＲＮＡに転写され、及び／又はポリペプチドに翻訳される、ヌクレオチド配列である。コーディング配列の境界は、５’−末端にある翻訳開始コドン及び３’−末端にある翻訳停止コドンによって決定される。「コーディング配列」は、限定するわけではないが、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えヌクレオチド配列又はゲノムＤＮＡを含み得るが、特定の状況下においてはイントロンも存在し得る。「オルソログ」は、種分化を経て生み出されており、やはり、一般的な祖先遺伝子に由来する、異なる生物の遺伝子である。
【００４２】
「調節エレメント」、「制御配列」及び「プロモーター」又は「遺伝子のプロモーター領域」という用語はすべて、相互変換可能に使用されており、幅広い文脈の中で、機能的ＤＮＡ配列単位が連結された配列の発現を実施することが可能な機能的ＤＮＡ配列単位である、調節核酸配列を指すように解すべきである。「プロモーター」という用語は一般的に、遺伝子の転写開始から上流側に配置された、又は、コーディング配列に動作可能に結合した、核酸制御配列であって、おそらくは適切な誘導条件下に置かれたときに、配列の認識及びＲＮＡポリメラーゼと他のタンパク質との結合によって前記コーディング配列の転写を促進するために十分である、核酸制御配列を指す。古典的な真核生物ゲノム遺伝子（ＣＣＡＡＴボックス配列の有無にかかわらず、高精度の転写開始のために必要とされるＴＡＴＡボックスを含む）及び発生的刺激及び／又は外的刺激に応じて又は組織特異的な方式で遺伝子発現を変化させるさらなる調節エレメント（すなわち、上流活性化配列、エンハンサー及びサイレンサー）に由来した転写調節配列は、上記「プロモーター」という用語によって包含される。古典的な原核生物遺伝子の転写調節配列もまた、上記「プロモーター」という用語に含まれるが、この場合、上記「プロモーター」という用語は、−３５ボックス配列及び／又は−１０ボックス転写調節配列を含み売る。「調節エレメント」という用語は、細胞、組織又は器官における核酸分子の発現をもたらし、活性化させ、又は向上する、合成融合分子又は誘導体も包含する。
【００４３】
さらに、「タンパク質」、「ポリペプチド」及び「ペプチド」という用語は、本明細書において、アミノ酸残基のポリマー並びに当該ポリマーのバリアント及び合成アナログを指すように、相互変換可能に使用されている。したがって、これらの用語は、１個以上のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の化学的アナログ等、天然ではない合成アミノ酸である、アミノ酸ポリマーに適用され、さらには、天然アミノ酸ポリマーにも適用される。この用語は、グリコシル化、リン酸化及びアセチル化等のポリペプチドの翻訳後修飾も含む。「組換えポリペプチド」は、組換え技法を使用して、すなわち、組換え又は合成ポリヌクレオチドの発現によって製造された、ポリペプチドを意味する。「発現」又は「遺伝子発現」という用語は、特異的な１個の遺伝子若しくは特異的な複数の遺伝子、又は特異的な遺伝的構造の転写を意味する。「発現」又は「遺伝子発現」という用語は特に、後で当該構造的ＲＮＡ又はｍＲＮＡをタンパク質に翻訳するか否かにかかわらず、１個の遺伝子若しくは複数の遺伝子又は遺伝子構築体を、構造的ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）又はｍＲＮＡに転写することを意味する。この過程は、ＤＮＡの転写及び得られたｍＲＮＡ生成物の処理を含む。本明細書において使用されている「組換え宿主細胞」、「改変細胞」、「発現宿主細胞」、「発現宿主系」、「発現系」又は単に「宿主細胞」という用語は、組換えベクター及び／又はキメラ遺伝子構築体が導入された細胞を指すように意図されている。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の後代も指すよう意図されていることを理解すべきである。特定の修飾は、突然変異又は環境の影響により、後続の世代においても生じ得るため、このような後代は、実際には、親細胞と同一でないこともあり得るが、依然として、本明細書において使用されている「宿主細胞」という用語の範囲に含まれる。組換え宿主細胞は、単離された細胞であってもよいし、又は培養物中で増殖した細胞株であってもよく、細胞は、原核細胞、動物細胞、植物細胞、糸状菌等の真菌細胞等の真核細胞であってよく、好ましくは、細胞は、組換え酵母細胞である。
【００４４】
本明細書において使用されている「内因性」という用語は、ある生物、組織又は細胞の内部に由来した物質（例えば、遺伝子）を指す。同様に、本明細書において使用されている「外因性」は、ある生物、組織又は細胞の外部に由来するが、当該生物、組織又は細胞に存在する（一般的には、活性な状態になることが可能である）、任意の物質である。
【００４５】
胃腸（ＧＩ）管は、栄養素を分解し、病原体を不活性化するように進化的に最適化されているため、ポリペプチドにとって厳しい環境である。胃における酸性度が高いｐＨにより、タンパク質のプロトン化及びアンフォールディングが起き、これにより、タンパク質分解酵素によって認識されるより多くのモチーフをむき出しにする。胃（ペプシン）における酵素、小腸（例えば、キモトリプシン、アミノペプチダーゼ及びカルボキシペプチダーゼ）における酵素、並びに、膵臓及び胆汁によって産生された酵素は、タンパク質を開裂して、より小さなフラグメント及び単一単位に変える。治療的に活性なポリペプチド（例えば、ワクチン成分に属する予防用の治療用物質）もこれらの工程によって影響されるため、これらの分解工程を生き残った画分は、特に食品の存在下において、一般に少なく、変わりやすいものである。さらに、ポリペプチド型薬物は、全身的コンパートメントに到達するためには、食物及び細菌抗原の進入を防止するように設計された複数の障壁を克服する必要がある。上皮細胞層に接触するためには、ポリペプチドは最初に、腸管上皮を覆っている粘液層中に拡散する必要がある。この上皮は、上皮細胞を封止するタイトジャンクションが、傍細胞輸送（すなわち、細胞間の通路）を６００Ｄａよち小さい小さな分子及びイオンに制限しているため、別の重要なバリアである。さらに、細胞を横断する経路は、管腔内で発現したエンドサイトーシスリセプター（例えば、ビタミンＢ１２リセプター、トランスフェリンリセプター）によって媒介され、したがって、薬物送達において活用するためには、各リガンドへの共役を必要とする。全身的コンパートメントに至るさらに別の接触箇所は、管腔抗原をサンプリングし、低マイクロメートル範囲で特定の基質を取り込むことができる、パイエル板の貪食性Ｍ細胞である。しかしながら、消化器官の上皮中におけるＭ細胞の比率は低く、種ごとに大きく変化し、これにより、動物データに基づいて人間における吸収の予測が複雑化する。略述した上記の障害を考えれば、局所送達される２種のペプチド及び全身的に送達される２種のペプチド、局所送達される１種の非ペプチド型大環状化合物、及び、局所送達される１種のタンパク質混合物という、わずか６種の生体高分子のみが、経口送達用としてｔｈｅ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ投与（ＦＤＡ）によって承認されていることは、驚くべきことではない（Ｍｏｒｏｚ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ（２０１６）Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １０１，１０８−１２１）。しかしながら、経口施用されるいくつかのタンパク質、ペプチド及び核酸の配合物は現在、臨床学的な評価中である。しばしば、これらの配合物は、高分子の傍細胞輸送を可能にするという目的で薬物分解向上剤及び薬物浸透向上剤を防止するためのエンテリックコーティング及び／又はプロテアーゼ阻害剤という、賦形剤のうちの少なくとも１つを含有する。機構的には、吸収の向上は、タイトジャンクション又はプラズマメンブレンを機械的に乱し、粘液の粘度を低下させ、タイトジャンクション調節シグナリング経路を調節することによって、達成することができる。臨床���おいて開発されている生体高分子の経口送達のためのさらなる戦略は、キャリア媒介トランスサイトーシス及びＧＩターゲットへの局所送達を利用した口腔送達を含む。現在承認されている経口薬物及び臨床学的候補物質のうちの圧倒的な大部分は、１０００Ｄａ未満の分子量を示す。この閾値より高い場合、生物学的利用能を向上する賦形剤に関する低い生物学的利用能、個体間及び個体内における可変性、食品に関する効果、並びに、長期的な安全性上の懸念は、ほぼ９０年間の試行錯誤を経で知識は明確に進歩したにもかかわらず、経口送達に関する重要な難点のままである。
【００４６】
本発明は、現在における治療用タンパク質の経口送達に関する欠点に対して、明確な解決法を提供する。本発明において、驚くべきことに、本発明者らは、培地中に治療用タンパク質を分泌させる組換え酵母の５ｋＤａより大きい複数の高分子を含む培地を乾燥させることによって得られた乾燥配合物が、乾燥配合物の経口送達のために使用され得ることを見出した。驚くべきことに、この配合物は、胃腸管の中でタンパク質分解及び分解によって保護されているだけでなく、乾燥配合物中に治療用タンパク質もまた、やはり驚くべきことに、生物活性である。本発明を特定の機構又は作用に限定しなければならないわけではないが、少なくとも１種の機構は、酵母細胞外培地が、消化器官における治療用タンパク質のタンパク質分解を防止する（又は減速させる）治療用タンパク質の周囲で、保護されたフィルムとして作用するというものであると、本発明者らは考えている。これは、治療用タンパク質が植物種子中で発現し、乾燥済みの種子マトリックスが分解から治療用タンパク質を保護する状況とは異なる（ＷＯ２０１４０３３３１３を参照されたい。）。さらに別の可能な機構は、グリコシル化治療用タンパク質が、（高）マンノース糖構造のみからなる（組換え酵母宿主中で当該グリコシル化治療用タンパク質を発現させる性質によるもの）という点である。これらのかさ高い高マンノース構造は、やはり、消化器官におけるタンパク質分解から治療用ペプチドを保護し得る。図５は、ピキア・パストリス中で産生されたＶ２Ａ−ＩｇＡＦｃ融合物に存在するかさ高い高マンノースグリコシル化を表しており、この組換えタンパク質が、本例において使用されている。本発明者らの発見の主要な利点は、治療用タンパク質の精製が必要ではないという点であり、これは、培地をそのままの状態で含む配合物、又は、培地中に存在する５ｋＤａより大きい複数の高分子（酵母が自力で産生したタンパク質を含む）及び培地中に存在する治療用タンパク質を含む乾燥配合物が、経口医薬製品として使用され得ることを意味する。これらの利点は、下記の実施形態において略述されている。
【００４７】
特定の実施形態において、本発明は、組換え宿主細胞の培地を含む、乾燥配合物であって、前記宿主細胞が、前記組換え宿主細胞の増殖培地（又は培地）中に分泌される外因性タンパク質を産生する、乾燥配合物を提供する。組換え宿主細胞は、原核宿主（例えば、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）及び他の細菌宿主）、植物細胞、動物細胞、真菌細胞、特に糸状菌細胞及び酵母細胞等の真核生物宿主であってよい。ポリペプチドは、治療用ペプチド、予防用ペプチド、又は、ワクチン組成物中に使用され得るペプチドであってよい。
【００４８】
別の特定の実施形態において、本発明は、組換え酵母の培地を含む乾燥配合物であって、前記酵母が、培地中に分泌される外因性タンパク質を産生する、乾燥配合物を提供する。「培地」は、酵母細胞を不含の発酵ブロス（一般的には、高密度の酵母発酵ブロスから得たもの）を意味する。「培地」は、当技術分野において、「増殖培地」としても知られている。発酵ブロスから酵母細胞を分離するための下流処理（発酵ブロス清澄化法としても知られている）においては、例えば遠心分離した後で深層ろ過を行うこと、遠心分離後にフィルターの支援によって強化された深層ろ過を行うこと、及び、精密ろ過法等、いくつかの選択肢が存在する。
【００４９】
発酵ブロスが非常に複雑なスープ又は溶液であることは、明らかである。基本的には、発酵ブロスは、酵母が増殖し、複製し、さらには、治療的に関連するポリペプチドを分泌する、栄養素の海である。発酵ブロスは一般的に、酵母ペプトン（酵母抽出物を含む）、酵母自己溶解物及び不活性酵母等の発酵栄養素成分を含有する。これらの生成物の含量は、ビタミンＢ、ヌクレオチド、ミネラル、α−アミノ窒素含量及び他の生物活性な化合物に関して、異なる。
【００５０】
可溶性透過物状成分の濃度を低下させ、保持された化合物（ここでは、対象とする組換えポリペプチド）の濃度をさらに上昇させるために使用することができる、（異なるメンブレン細孔経を用いる）いくつかの膜分離工程が、当業者に知られている。逆浸透又は過剰ろ過は、圧力勾配によって駆動される膜分離工程であり、メンブレンが、溶液の他の成分から溶媒を分離する。メンブレン構成は通常、クロスフローである。逆浸透を用いた場合、メンブレン細孔経は非常に小さく、これにより、非常に少量の非常に低い分子量の溶質（例えば、１００の分画分子量）のみがメンブレンを通過できるようになる。限外ろ過は、圧力勾配によって駆動される別の膜分離工程であり、メンブレンが、溶媒和済みのサイズ及び構造の画分として、溶解及び分散された液体の成分を分画する。メンブレン構成は通常、クロスフローである。限外ろ過において、メンブレン細孔経は、逆浸透工程の場合より大きく、この結果、一部の成分は、水と一緒に細孔を通過することができる。限外ろ過は、１０，０００の分画分子量を用いる、分離／分画工程である。透析ろ過は、微小分子の浸透が可能な型のフィルターの使用によって分子サイズに基づいて、溶液の成分（塩、小タンパク質、溶媒等のような浸透可能な分子）を除去又は分離するものである、別の種類の限外ろ過である。タンパク質の精製及び分画の過程で一般的に使用されるさらに別の工程は、高塩濃縮物を増殖培地に添加することである。タンパク質は、高いイオン強度において、可溶度が顕著に異なり、したがって、「塩析」は、増殖培地中に存在するタンパク質の精製及び濃縮を支援するための非常に有用な手順である。硫酸アンモニウムは、水溶液中でアンモニウム及びスルフェートに解離する、高い可溶度を有する無機塩である。硫酸アンモニウムは、非常に可溶性であり、タンパク質構造を安定化させ、比較的低い密度を有し、比較的安価なものであるため、沈殿剤として特に有用である。
【００５１】
したがって、さらに別の実施形態において、本発明は、組換え真菌の培地中に存在する５ｋＤａより大きい複数の高分子を含む、乾燥配合物であって、前記真菌が、前記培地中に分泌されるＦｃドメインに融合した外因性ポリペプチドを産生する、乾燥配合物を提供する。
【００５２】
さらに別の実施形態において、本発明は、組換え真菌の培地中に存在する１０ｋＤａより大きい複数の高分子を含む、乾燥配合物であって、前記真菌が、前記培地中に分泌されるＦｃドメインに融合した外因性ポリペプチドを産生する、乾燥配合物を提供する。
【００５３】
さらに別の実施形態において、本発明は、組換え真菌の培地中に存在する１５ｋＤａより大きい複数の高分子を含む、乾燥配合物であって、前記真菌が、前記培地中に分泌されるＦｃドメインに融合した外因性ポリペプチドを産生する、乾燥配合物を提供する。
【００５４】
特定の実施形態において、乾燥配合物中のＦｃドメインは、ＩｇＡＦｃドメインである。
【００５５】
特定の実施形態において、乾燥配合物中の外因性ペプチドが、予防用又は治療用ペプチドであり、又は前記外因性ペプチドが、ワクチンであり、又はワクチンの部分を形成する。
【００５６】
技術的及び構造的特徴の観点から本発明の乾燥配合物を規定することが難しいため、本発明者らは、これらの配合物が、特許請求の範囲において、「によって得ることができる」配合物として、より適切に規定されていると考えている。したがって、別の実施形態において、本発明は、タンパク質を組換え酵母の培地中に分泌させ、続いて、前記培地を乾燥させることによって得られた酵母に対して外因性のタンパク質を含む、乾燥配合物を提供する。さらに別の実施形態において、本発明は、治療用タンパク質を組換え酵母の培地中に分泌させ、続いて、前記培地を乾燥させることによって得られた酵母に対して外因性の治療用タンパク質を含む、乾燥配合物を提供する。さらに別の実施形態において、本発明は、予防用タンパク質を組換え酵母の培地中に分泌させ、続いて、前記培地を乾燥させることによって得られた酵母に対して外因性の予防用タンパク質を含む、乾燥配合物を提供する。さらに別の実施形態において、本発明は、タンパク質を組換え酵母の培地中に分泌させ、続いて、前記培地を乾燥させることによって得られた酵母に対して外因性のワクチンの部分を形成するタンパク質を含む、乾燥配合物を提供する。さらに別の実施形態において、本発明は、糸状真菌又は酵母細胞等の組換え真菌宿主の培地中に存在する５ｋＤａより大きい複数の高分子を、経口投与可能なマトリックスに添加し、続いて、得られた混合物を乾燥させることによって得られた、乾燥配合物であって、前記培地が、前記組換え宿主に対して外因性の分泌ポリペプチドを含む、乾燥配合物を提供する。
【００５７】
さらに別の実施形態において、本発明は、組換え宿主の培地と経口投与可能なマトリックスとの混合物を含む、乾燥配合物であって、前記宿主が、前記培地中に分泌される外因性ポリペプチドを産生する、乾燥配合物を提供する。
【００５８】
さらに別の実施形態において、本発明は、組換え宿主の培地と経口投与可能なマトリックスとの混合物を含む、乾燥配合物であって、前記宿主が、前記培地中に分泌される外因性ポリペプチドを産生し、前記配合物の含水量が、前記培地を濃縮した後で前記配合物を調製することによって低減される、乾燥配合物を提供する。
【００５９】
さらに別の実施形態において、本発明は、組換え宿主の培地と経口投与可能なマトリックスとの混合物を含む、乾燥配合物であって、前記宿主が、前記培地中に分泌される外因性ポリペプチドを産生し、前記配合物の含水量が、前記配合物を調製する前に前記培地を乾燥させることによって低減される、乾燥配合物を提供する。
【００６０】
さらに別の実施形態において、本発明は、組換え宿主の培地と経口投与可能なマトリックスとの混合物を含む、乾燥配合物であって、前記宿主が、前記培地中に分泌される外因性ポリペプチドを産生し、前記配合物の含水量が、前記配合物を乾燥させることによって低減される、乾燥配合物を提供する。
【００６１】
さらに別の実施形態において、本発明は、組換え宿主に対して外因性である分泌ポリペプチドを含む組換え宿主の培地中に存在する５ｋＤａより大きい複数の高分子を、経口投与可能なマトリックスに添加し、続いて、得られた混合物を混合させることによって得られた、乾燥配合物を提供する。
【００６２】
さらに別の実施形態において、本発明は、組換え真菌細胞に対して外因性の分泌ポリペプチドを含む組換え糸状宿主又は組換え酵母細胞等の組換え真菌細胞の培地中に存在する５ｋＤａより大きい複数の高分子を、経口投与可能なマトリックスに添加し、続いて、得られた混合物を乾燥させることによって得られた、乾燥配合物を提供する。
【００６３】
さらに別の実施形態において、本発明は、組換え真菌細胞に対して外因性の分泌ポリペプチドを含む組換え糸状宿主又は組換え酵母細胞等の組換え真菌細胞の培地中に存在する５ｋＤａより大きい複数の高分子を、経口投与可能なマトリックスに添加し、得られた混合物を乾燥させることによって得られた、乾燥配合物であって、前記乾燥させることが、噴霧乾燥によって実施される、乾燥配合物を提供する。
【００６４】
さらに別の実施形態において、本発明は、組換え真菌細胞に対して外因性の分泌ポリペプチドを含む組換え糸状宿主又は組換え酵母細胞等の前記組換え真菌細胞の培地中に存在する５ｋＤａより大きい複数の高分子、及び経口投与可能なマトリックスを添加し、続いて、得られた混合物を乾燥させることによって得られた、乾燥配合物であって、前記乾燥させることが、凍結乾燥によって実施される、乾燥配合物を提供する。
【００６５】
本明細書において規定された「経口投与可能なマトリックス」は、食品産業において、例えばデンプン、マルトデキストリン、豆乳タンパク質、セルロース、ペクチン及びグアーガム等のキャリアとして使用されている、製品である。特定の実施形態において、経口投与可能なマトリックスは、可食型マトリックスである。別の特定の実施形態において、経口投与可能なマトリックスは、可溶性食品グレード栄養素又は可溶性食品グレードマトリックス又は可溶性食品グレード物質である。
【００６６】
＜乾燥配合物＞
大抵の場合、乾燥タンパク質は、カプセル、錠剤及び薄膜への変換を容易にする粉末形態にすることが、有利である。タンパク質溶液を乾燥粉末形態に変換するためのいくつかの乾燥法が、当技術分野において利用可能である。大部分の乾燥法は、フリーズドライ等の昇華、若しくは噴霧乾燥及び流動層乾燥等の蒸発、又は超臨界流体技術等の沈殿によって、溶媒を蒸発させるものである。これらの方法の中でも、噴霧乾燥及びフリーズドライは、真に最も一般的に使用されている、タンパク質溶液を乾燥させる工業的な方法である。凍結乾燥（等価な用語は、フリーズドライである。）は、バイオ医薬品から水分を除去するための処理法の１つであり、これらの製品の安定性、温度許容度及びシェルフライフを高めることができる。凍結乾燥は、工業的には十分に確立されているが、製造施設内でかなり大きなスペースを占める高価な設備を必要とする。凍結乾燥は、やはり、完了までに日数がかかる可能性があり、粉末状製品を必要とする製造業者は、この凍結乾燥という工程に造粒ステップを組み込まなければならない。したがって、凍結乾燥は、組換え酵母を除去した後に酵母発酵ブロスを凍結乾燥させることによって乾燥配合物を得るために、使用することができる。
【００６７】
したがって、さらに別の実施形態において、本発明は、タンパク質が存在する組換え酵母の培地を含む乾燥配合物を製造するための方法であって、凍結乾燥によって前記培地を乾燥させることを含む、方法を提供する。
【００６８】
噴霧乾燥は、バイオ医薬品を保存するための代替法であり、単一のステップで液体製剤を乾燥粉末に変換する工程である。この噴霧乾燥という工程は一般的に、最初に溶液を噴霧して微細な液滴に変え、次いで、これらの微細な液滴を、大きなチャンバの中で温かい気体の使用によって素早く乾燥させることによって、実施される。得られた乾燥粒子は、サイクロンを用いて収集される。噴霧乾燥は、噴霧ステップ中にバイオ医薬品をせん断応力に晒すが、これにより、タンパク質等の変化しやすいバイオ医薬品型化合物を不安定化する可能性がある。複雑な生物学的分子は、高いせん断応力に影響されやすいため、噴霧乾燥がより難しい。受けるせん断応力の量は、使用される噴霧装置の種類及び噴霧圧力に依存する。２０ｐｓｉｇ未満の比較的低い圧力で動作することが可能であり、せん断応力を最小化し、複雑なバイオ医薬品を処理することができる、超音波ノズルが、好都合に使用される。噴霧乾燥は、タンパク質、酵素、抗体、ウイルス及び細菌等の多種多様なバイオ医薬品を対象にして実施されてきた。この噴霧乾燥という工程は水を除去し、バイオ医薬品の移動度を制限し、この結果、分解速度が著しく低下する。したがって、噴霧乾燥は、組換え酵母の除去後に酵母発酵ブロスを噴霧乾燥によって乾燥配合物を得るために使用され得る。
【００６９】
したがって、さらに別の実施形態において、本発明は、タンパク質が存在する組換え酵母の培地を含む乾燥配合物を、前記培地中に産生するための方法であって、噴霧乾燥によって前記培地を乾燥させることを含む、方法を提供する。
【００７０】
特定の実施形態において、噴霧乾燥の実施前に、二糖又は界面活性剤が培地に添加される。二糖及び界面活性剤は、凝集（Ｂｒｏａｄｈｅａｄ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４６（６）４５８−４６７）を防止し、さらには、タンパク質担持粉末の貯蔵容量を改善する（Ａｄｌｅｒ  Ｍ  ａｎｄ  Ｌｅｅ  Ｇ（１９９９）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８８，１９９−２０８）ことが、記述されている。
【００７１】
さらに別の実施形態において、噴霧乾燥の実施前に、トレハロース及び／又はソルビトールが培地に添加されてもよい。３０重量％ソルビトールの存在が、噴霧乾燥中の医薬用タンパク質の凝集を大幅に低減し、さらには、乾燥貯蔵安定性も改善されることが記述されおり（Ｍａｕｒｙ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｅｕｒ．Ｊ．ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ５９，２５１−２６１）、類似した効果が、トレハロースに関しても記述されている。
【００７２】
したがって、特定の実施形態において、噴霧乾燥工程の実施前に、超音波による粘度低下が実施される。超音波による粘度の低下により、溶液により多くの粒子を詰め込むことができ、これにより、蒸発させなければならない液体の体積が低減される。超音波による粘度低下により、エネルギー消費が低減され、処理量が高められる。
【００７３】
噴霧乾燥は、設備、施設及び実用品に関しては、より低いコストでよりスケーラブルなものである。さらに、噴霧乾燥に関するサイクル時間は、日数ではなく時間であり、したがって、作業コストは、凍結乾燥の作業コストより低いことが可能である。
【００７４】
＜食品製品＞
さらに別の実施形態において、本発明は、本明細書において先述された乾燥配合物を含む、食品製品を提供する。
【００７５】
さらに別の実施形態において、本発明は、本明細書において先述された乾燥配合物を含む、食品製品であって、機能性食品製品である、食品製品を提供する。
【００７６】
さらに別の実施形態において、本発明は、本明細書において先述された乾燥配合物を含む、食品製品であって、薬用食品製品である、食品製品を提供する。
【００７７】
いくつかの食品製品は、本発明によって調製することができる。食品製品の非限定的なリストは、食事代替品、スープ、麺類、アイスクリーム、ソース、ドレッシング、スプレッド、スナック、シリアル、飲料、パン、ビスケット、他のベーカリー製品、スイーツ、バー型食品、チョコレート、チューインガム、乳製品及びダイエット製品を含む。後に挙げた製品及びどのようにしてそれらの製品を調製できるかについての論述は、ＵＳ８１０５５９２（２０頁、６２行目〜２３頁、３５行目）において提供されている。
【００７８】
さらに別の実施形態において、本発明は、真菌産生ＩｇＡＦｃ融合タンパク質を含む、経口医薬組成物であって、ＩｇＡＦｃタンパク質と融合したタンパク質が、予防用又は治療用タンパク質又はワクチン成分である、経口医薬組成物を提供する。
【００７９】
さらに別の実施形態において、本発明は、真菌産生ＩｇＡＦｃ融合タンパク質を含む、経口医薬組成物であって、ＩｇＡＦｃと融合したタンパク質が、免疫グロブリン単一可変ドメインである、経口医薬組成物を提供する。
【００８０】
さらに別の実施形態において、本発明は、真菌産生ＩｇＡＦｃ融合タンパク質を含む、経口医薬組成物であって、ＩｇＡＦｃと融合したタンパク質が、ＶＨＨドメインである、経口医薬組成物を提供する。
【００８１】
さらに別の実施形態において、本発明は、真菌産生ＩｇＡＦｃ融合タンパク質を含む、経口医薬組成物であって、ＩｇＡＦｃと融合したタンパク質が、ＶＨＨドメインであり、ＶＨＨドメインが、人為的に導入されたＮ−グリコシル化部位を含有する、経口医薬組成物を提供する。
【００８２】
さらに別の実施形態において、本発明は、Ｎ−グリカン及び／又はＯ−グリカンによって修飾された真菌産生タンパク質を含む、経口医薬組成物であって、糖タンパク質の分子量の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又はそれより多くが、前記Ｎ−又はＯ−グリカンによって占められる、経口医薬組成物を提供する。
【００８３】
さらに別の実施形態において、本発明は、Ｎ−グリカン及び／又はＯ−グリカンによって修飾された真菌産生ＩｇＡＦｃ融合タンパク質を含む、経口医薬組成物であって、糖タンパク質の分子量の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又はそれより多くが、前記Ｎ−又はＯ−グリカンによって占められる、経口医薬組成物を提供する。
【００８４】
さらに別の実施形態において、本発明は、Ｎ−グリカン及び／又はＯ−グリカンによって修飾された真菌産生ＩｇＡＦｃ−融合タンパク質を含む、経口医薬組成物であって、糖タンパク質の分子量の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又はそれより多くが、前記Ｎ−又はＯ−グリカンによって占められ、ＩｇＡＦｃと融合したタンパク質が、免疫グロブリン単一可変ドメインである、経口医薬組成物を提供する。
【００８５】
注目すべきことに、ハイパーマンノシル構造から主になるＮ−グリコシル化構造は、酵母中で組換え産生されたＩｇＡＦｃ融合タンパク質に、分子量の５０％超を加える。これは、図５において見受けられる（グリコシル化されたＶ２Ａ−ＩｇＡＦｃ融合物と、脱グリコシル化されたＶ２Ａ−ＩｇＡＦｃ融合タンパク質との差異を参照されたい。）。ＩｇＡＦｃ融合タンパク質が酵母中の構成的ＧＡＰプロモーターの制御下で産生される場合、そのハイパーグリコシル化は、ＩｇＡＦｃ融合タンパク質がメタノールオキシダーゼ誘導性プロモーター（ＡＯＸプロモーター）の制御下で産生される場合に比べてさらにより豊富であることにも、注目すべきである（図６を参照されたい。）。
【００８６】
さらに別の実施形態において、本発明は、経口投与による使用のための、真菌産生ＩｇＡＦｃ融合タンパク質を提供する。
【００８７】
さらに別の実施形態において、本発明は、経口投与による使用のための、真菌産生ＩｇＡＦｃ融合タンパク質であって、ＩｇＡＦｃと融合したタンパク質が、免疫グロブリン単一可変ドメインである、真菌産生ＩｇＡＦｃ融合タンパク質を提供する。
【００８８】
さらに別の実施形態において、本発明は、経口投与による使用のための、真菌産生ＩｇＡＦｃ融合タンパク質であって、ＩｇＡＦｃと融合したタンパク質が、ＶＨＨドメインである、真菌産生ＩｇＡＦｃ融合タンパク質を提供する。
【００８９】
さらに別の実施形態において、本発明は、経口投与による使用のための、真菌産生ＩｇＡＦｃ融合タンパク質であって、ＩｇＡＦｃと融合したタンパク質が、ＶＨＨドメインであり、ＶＨＨドメインが、人為的に導入されたＮ−グリコシル化部位を含有する、真菌産生ＩｇＡＦｃ融合タンパク質を提供する。
【００９０】
さらに別の実施形態において、本発明は、Ｎ−グリカン及び／又はＯ−グリカンによって修飾された、経口投与による使用のための、真菌産生タンパク質であって、糖タンパク質の分子量の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又はそれより多くが、前記Ｎ−又はＯ−グリカンによって占められる、真菌産生タンパク質を提供する。
【００９１】
本発明を特定の機構に限定するわけではないが、本発明者らは、組換え（融合）タンパク質において真菌細胞によって生成されたハイパーマンノシル化グリカン構造が、このハイパーマンノシル化組換えタンパク質が経口送達に適するように、消化器官において組換えタンパク質を保護すると考えている。
【００９２】
「単一可変ドメイン」という用語に等価である「免疫グロブリン単一可変ドメイン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ）」（「ＩＳＶＤ」と略す）という用語は、抗原結合部位が存在し、単一の免疫グロブリンドメインによって形成される、分子を規定している。これにより、免疫グロブリン単一可変ドメインが、「従来の」免疫グロブリン又はそのフラグメントから引き離され、２個の免疫グロブリンドメイン、特に２個の可変ドメインが相互作用して、抗原結合部位を形成する。一般的に、従来の免疫グロブリンにおいて、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とが相互作用して、抗原結合部位を形成する。この場合、ＶＨとＶＬとの両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）が、抗原結合部位に寄与し、すなわち、合計で６個のＣＤＲが、抗原結合部位形成に関与する。
【００９３】
上記規定を考慮すると、従来の４本鎖抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥ分子等。当技術分野において既知のもの）、又は、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ジスルフィド結合型Ｆｖ若しくはｓｃＦｖフラグメント等のＦｖフラグメント、又は、このような従来の４本鎖抗体に由来したダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）（すべて当技術分野において既知のもの）の抗原結合ドメインは通常、免疫グロブリン単一可変ドメインであると考えられず、理由としては、この場合においては、抗原の各エピトープへの結合は通常、１個の（単一の）免疫グロブリンドメインによって起きるのではなく、軽鎖及び重鎖可変ドメイン等の１組の（関連する）免疫グロブリンドメインによって起き、すなわち、各抗原のエピトープに一体的に結合する免疫グロブリンドメインのＶＨ−ＶＬ組によって起きるという点がある。
【００９４】
対照的に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、さらなる免疫グロブリン可変ドメインと組を形成することなく抗原のエピトープに特異的に結合することができる。免疫グロブリン単一可変ドメインの結合部位は、単一のＶＨ／ＶＨＨ又はＶＬドメインによって形成される。したがって免疫グロブリン単一可変ドメインの抗原結合部位は、３個以下のＣＤＲによって形成される。
【００９５】
したがって、単一可変ドメインは、単一可変ドメインが、単一抗原結合単位（すなわち、単一抗原結合ドメインが別の可変ドメインと相互作用して、機能的抗原結合単位を形成する必要がないような、単一可変ドメインから本質的になる機能的抗原結合単位）を形成できる限り、軽鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＬ配列）若しくは適切なそのフラグメントであってもよいし、又は重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ配列又はＶＨＨ配列）若しくは適切なそのフラグメントであってもよい。
【００９６】
本発明の一実施形態において、免疫グロブリン単一可変ドメインは、重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ配列）であり；より詳細には、免疫グロブリン単一可変ドメインは、従来の４本鎖抗体に由来した重鎖可変ドメイン配列であってもよいし、又は重鎖抗体に由来した重鎖可変ドメイン配列であってもよい。
【００９７】
例えば、免疫グロブリン単一可変ドメインは、１つの（単一の）ドメイン抗体（又は、１つの（単一の）ドメイン抗体としての使用に適したアミノ酸配列）、「ｄＡｂ」若しくはｄＡｂ（又は、ｄＡｂとしての使用に適したアミノ酸配列）、若しくはＮａｎｏｂｏｄｙ（本明細書において規定されたもので、限定されるわけではないが、ＶＨＨを含む）；他の単一可変ドメイン、又は、それらのいずれか１つの任意の適切なフラグメントであってよい。
【００９８】
特に、免疫グロブリン単一可変ドメインは、（本明細書において規定された）Ｎａｎｏｂｏｄｙ（Ｒ）であってもよいし、又は適切なそのフラグメントであってもよい。［注記：Ｎａｎｏｂｏｄｙ（Ｒ）、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（Ｒ）及びＮａｎｏｃｌｏｎｅ（Ｒ）は、Ａｂｌｙｎｘ  Ｎ．Ｖ．の登録商標である。］。Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓの概説に関しては、下記のさらなる記述、及び、例えばＷＯ０８／０２００７９（１６頁）において記述されたもの等、下記のさらなる記述の中で引用された従来技術を参照する。
【００９９】
ＶＨＨ、ＶＨＨドメイン、ＶＨＨ抗体フラグメント及びＶＨＨ抗体としても知られた「ＶＨＨドメイン」は元々、「重鎖抗体」（すなわち、「軽鎖を欠いた抗体」。Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８）の抗原も結合する免疫グロブリン（可変）ドメインとして記述されてきた。「ＶＨＨドメイン」という用語は、これらの可変ドメインを、従来の４本鎖抗体中に存在する重鎖可変ドメイン（本明細書において「ＶＨドメイン」又は「ＶＨドメイン」と呼ばれる）及び従来の４本鎖抗体中に存在する軽鎖可変ドメイン（本明細書において「ＶＬドメイン」又は「ＶＬドメイン」と呼ばれる）から区別するために選択されている。ＶＨＨ及びＮａｎｏｂｏｄｉｅｓのさらなる記述に関しては、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ（Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７４：２７７−３０２，２００１）による総説論文を参照し、さらには、ｔｈｅ  Ｖｒｉｊｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ  ＢｒｕｓｓｅｌのＷＯ９４／０４６７８、ＷＯ９５／０４０７９及びＷＯ９６／３４１０３；ＵｎｉｌｅｖｅｒのＷＯ９４／２５５９１、ＷＯ９９／３７６８１、ＷＯ００／４０９６８、ＷＯ００／４３５０７、ＷＯ００／６５０５７、ＷＯ０１／４０３１０、ＷＯ０１／４４３０１、ＥＰ１１３４２３１及びＷＯ０２／４８１９３；ｔｈｅ  Ｖｌａａｍｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｕｔ  ｖｏｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ（ＶＩＢ）のＷＯ９７／４９８０５、ＷＯ０１／２１８１７、ＷＯ０３／０３５６９４、ＷＯ０３／０５４０１６及びＷＯ０３／０５５５２７；Ａｌｇｏｎｏｍｉｃｓ  Ｎ．Ｖ．及びＡｂｌｙｎｘＮ．Ｖ．のＷＯ０３／０５０５３１；ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｆ  ＣａｎａｄａのＷＯ０１／９０１９０；ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓのＷＯ０３／０２５０２０（＝ＥＰ１４３３７９３）；並びに、ＡｂｌｙｎｘＮ．Ｖ．のＷＯ０４／０４１８６７、ＷＯ０４／０４１８６２、ＷＯ０４／０４１８６５、ＷＯ０４／０４１８６３、ＷＯ０４／０６２５５１、ＷＯ０５／０４４８５８、ＷＯ０６／４０１５３、ＷＯ０６／０７９３７２、ＷＯ０６／１２２７８６、ＷＯ０６／１２２７８７及びＷＯ０６／１２２８２５並びにＡｂｌｙｎｘＮ．Ｖ．のさらなる公開特許出願という、概括的な背景技術として言及される特許出願も参照する。これらの出願において言及されたさらなる従来技術も同様に参照し、特に、国際特許出願ＷＯ０６／０４０１５３の４１〜４３頁で言及された参考文献のリストも同様に参照し、これらのリスト及び参考文献は、参照により本明細書に組み込む。これらの参考文献において記述されているように、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（特に、ＶＨＨ配列及び部分的にヒト化されたＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ）は特に、フレームワーク配列のうちの１個以上に含まれる１個以上の「ホールマーク残基（Ｈａｌｌｍａｒｋ  ｒｅｓｉｄｕｅ）」の存在によって特徴付けることができる。Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓのヒト化及び／又はラクダ化、並びに、他の修飾、部分若しくはフラグメント、誘導体又は「Ｎａｎｏｂｏｄｙ融合物」、多価構築体（リンカー配列に関するいくつかの非限定的な例を含む）及びＮａｎｏｂｏｄｉｅｓの半減期を延長するための異なる修飾並びにこれらの調製を含む、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓのさらなる記述は、例えばＷＯ０８／１０１９８５及びＷＯ０８／１４２１６４において見出すことができる。Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓのさらなる概説に関しては、例えばＷＯ０８／０２００７９（１６頁）において記述されたもの等、本明細書において引用された従来技術を参照する。
【０１００】
「Ｄａｂ」、「ドメイン抗体」及び「ｄＡｂ」（「ドメイン抗体」及び「ｄＡｂ」という用語は、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  ｃｏｍｐａｎｉｅｓの商標として使用されている。）としても知られている「ドメイン抗体」は、例えばＥＰ０３６８６８４、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４−５４６、１９８９）、Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｔｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１：４８４−４９０，２００３）及びＷＯ０３／００２６０９において記述されており、さらには、例えばＷＯ０４／０６８８２０、ＷＯ０６／０３０２２０、ＷＯ０６／００３３８８及びＤｏｍａｎｔｉｓ  Ｌｔｄ．の他の公開特許出願においても記述されてきた。ドメイン抗体は、ラクダではないほ乳類のＶＨ又はＶＬドメイン、特にヒト４本鎖抗体に本質的に対応する。単一の抗原結合ドメインとしてエピトープを結合させるため、すなわち、それぞれＶＬ又はＶＨドメインと組を形成することなくエピトープを結合させるため、このような抗原結合特性に対する特異的な選択が、例えばヒト単一ＶＨ又はＶＬドメイン配列のライブラリーの使用によって、必要とされる。ドメイン抗体は、ＶＨＨと同様に、約１３〜約１６ｋＤａの分子量を有しており、完全ヒト配列に由来する場合、例えば人間における治療目的に使用ためにヒト化を必要としない。
【０１０１】
単一可変ドメインは、特定のサメの種に由来し得ることにも留意すべきである（例えば、いわゆる「ＩｇＮＡＲドメイン」。例えば、ＷＯ０５／１８６２９を参照されたい。）。
【０１０２】
したがって、本発明の意味において、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」又は「単一可変ドメイン」という用語は、非ヒト型の供給源、好ましくはラクダ、好ましくはラクダ重鎖抗体に由来したポリペプチドを含む。これらのポリペプチドは、先述のとおり、ヒト化されていてもよい。さらに、これらの「免疫グロブリン単一可変ドメイン」又は「単一可変ドメイン」という用語は、例えばＤａｖｉｅｓ及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ（ＦＥＢＳ  ３３９：２８５−２９０，１９９４；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：４７５−４７９，  １９９５；Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．９：５３１−５３７，１９９６）並びにＲｉｅｃｈｍａｎｎ及びＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：２５−３８，１９９９）において記述されたような、非ラクダ型の供給源、例えば、マウス又はヒトに由来しており、「ラクダ化」された、ポリペプチドを含む。
【０１０３】
さらに別の実施形態において、本発明は、タンパク質が存在する組換え酵母の培地を乾燥配合物を前記培地の中に産生するための方法であって、
ｉ）  タンパク質を含む組換え酵母を培養し、前記タンパク質を培地中に分泌させること、
ｉｉ）  培地から組換え酵母細胞を分離すること、
ｉｉｉ）  膜分離工程において前記培地を濃縮すること、及び、
ｉｖ）  前記濃縮された培地を乾燥させること
を含む、方法を提供する。
【０１０４】
組換え酵母を作製するための方法は、当技術分野において周知である。簡単に言うと、組換えタンパク質をコードするキメラ遺伝子を含む発現ベクターが、組換え酵母中に存在する。発現ベクターは、ゲノムに一体化されてもよいし、又は、組換え酵母中で自己複製することも可能である。宿主クロモサムに一体化するベクターは、選択がない場合における有糸分裂安定性のため、最も幅広く使用されている。しかしながら、エピソーム発現ベクターが、一部の酵母系には存在する。発現ベクターは一般的に、強力な酵母プロモーター／ターミネーター及び酵母選択マーカーカセットを含有する。大部分の酵母ベクターは、クローニングを容易にするために、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で繁殖及び増幅することが可能であり、したがって、やはり、Ｅ．コリの複製に由来したアンピシリン選択マーカーが含有する。最後に、数多くの酵母発現ベクターは、細胞から分泌される状態になるように不均一タンパク質を効率的に仕向ける効率的な分泌リーダー（例えば、接合因子又はＯｓｔ１配列のリーダー（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉ＆Ｇｌｉｃｋ  ＢＳ（２０１４）Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒｉｅｓ  １３，１））の下流側において、任意選択により遺伝子をクローニングする能力を備える。キメラ遺伝子は、有用なポリペプチドをコードする組換え遺伝子に動作可能に連結されたシグナル配列をコードする、核酸配列に動作可能に連結された、プロモーターを含む。プロモーターは、構成的プロモーター又は誘導性プロモーターであってよい。
【０１０５】
さらに別の実施形態において、本発明は、タンパク質が存在する組換え酵母の発酵ブロスを含む乾燥配合物を前記培地の中に産生するための方法であって、
ｉ）  タンパク質を含む組換え酵母を培養し、前記治療用タンパク質を培地中に分泌させることと、
ｉｉ）  （組換え酵母及び培地）を含む前記発酵ブロスを乾燥させることと
を含む、方法を提供する
【０１０６】
さらに別の実施形態において、本発明は、酵母細胞をさらに含む、本発明の乾燥配合物を提供する。
【０１０７】
さらに別の実施形態において、本発明は、非組換え酵母細胞をさらに含む、本発明の乾燥配合物を提供する。
【０１０８】
さらに別の実施形態において、本発明は、外因性タンパク質が存在する組換え酵母の培地を含む乾燥配合物を、前記培地及び非組換え酵母細胞の中に産生するための方法であって、
ｉ）  外因性タンパク質を含む組換え酵母を培養し、前記タンパク質を培地中に分泌させることと、
ｉｉ）  培地から組換え酵母細胞を分離すること、
ｉｉｉ）  膜分離工程において前記培地を濃縮することと、
ｉｖ）  非組換え酵母細胞を培地に添加することと、
ｖ）  前記培地を乾燥させることと
を含む、方法を提供する。
【０１０９】
さらに別の実施形態において、本発明は、外因性タンパク質が存在する組換え酵母の培地を含む乾燥配合物を、前記培地及び非組換え酵母細胞の中に産生するための方法であって、
ｉ）  外因性タンパク質を含む組換え酵母を培養し、前記外因性タンパク質を培地中に分泌させることと、
ｉｉ）  培地から組換え酵母細胞を分離することと、
ｉｉｉ）  前記培地を乾燥させることと、
ｉｖ）  非組換え酵母細胞の乾燥配合物を、ステップｉｉｉ）において得られた乾燥済みの培地に添加することと、
を含む、方法を提供する。
【０１１０】
さらに別の実施形態において、本発明は、酵母発酵ブロス中に存在するタンパク質とは異なるタンパク質に富んだ配合物をさらに含む、本発明の乾燥配合物を提供する。
【０１１１】
さらに別の実施形態において、本発明は、外因性タンパク質が存在する組換え酵母の培地を含む乾燥配合物を、前記培地、及び、酵母発酵ブロス中に存在するタンパク質とは異なるタンパク質に富んだ配合物の中に産生するための方法であって、
ｉ）  外因性タンパク質を含む組換え酵母を培養し、前記タンパク質を培地中に分泌させることと、
ｉｉ）  培地から組換え酵母細胞を分離することと、
ｉｉｉ）  タンパク質に富んだ配合物を培地に添加することと、
ｉｖ）  前記培地を乾燥させることと
を含む、方法を提供する。
【０１１２】
さらに別の実施形態において、本発明は、治療用タンパク質が存在する組換え酵母の培地を含む乾燥配合物を、前記培地及び非組換え酵母細胞の中に産生するための方法であって、
ｉ）  治療用タンパク質を含む組換え酵母を培養し、前記治療用タンパク質を培地中に分泌させることと、
ｉｉ）  培地から組換え酵母細胞を分離することと、
ｉｉｉ）  前記培地を乾燥させることと、
ｉｖ）  タンパク質に富んだ配合物の乾燥配合物を、ステップｉｉｉ）において得られた乾燥済みの培地に添加することと
を含む、方法を提供する。
【０１１３】
さらに別の実施形態において、本発明は、組換え酵母の培地を含む乾燥配合物であって、前記酵母が、培地中に分泌される外因性Ｆｃ融合タンパク質を産生する、乾燥配合物を提供する。
【０１１４】
さらに別の実施形態において、本発明は、組換え酵母の培地を含む乾燥配合物であって、前記酵母が、培地中に分泌される外因性Ｆｃ融合タンパク質を産生し、前記Ｆｃドメインが、ＩｇＡＦｃドメインである、乾燥配合物を提供する。
【０１１５】
技術的特徴の観点から本発明の乾燥配合物を構造的に記述することが難しいため、「によって得ることができる」というクレームの表現形式によって乾燥配合物を規定することの方が、より適切である。したがって、別の実施形態において、本発明は、前記外因性タンパク質を組換え酵母の培地中に分泌し、続いて、前記培地を乾燥させることによって得られたＦｃドメインとポリペプチドとの外因性融合タンパク質を含む、乾燥配合物を提供する。
【０１１６】
＜Ｆｃ融合タンパク質＞
Ｆｃ領域（結晶形成可能フラグメント領域）は、Ｆｃリセプターと呼ばれる細胞表面リセプター及び補体系の一部のタンパク質と相互作用する、免疫グロブリンのテール領域である。特に想定される実施形態によれば、Ｆｃ融合タンパク質中のＦｃ領域は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）アイソタイプに由来のＦｃ領域である。これは、ＩｇＧサブクラス（人間では、ＩｇＧ１、２、３、４）のいずれであってもよい。ＩｇＧの場合、ＩｇＡ及びＩｇＤアイソタイプと同様に、Ｆｃ領域は、抗体の２本の重鎖にある第２及び第３の定常ドメインに由来した、２個の同一のタンパク質フラグメントから構成される。別の実施形態において、融合タンパク質中のＦｃ部分は、ＩｇＡ抗体に由来する。本明細書において使用されている「Ｆｃ融合タンパク質」は、Ｆｃ領域がタンパク質又はペプチドに融合した、融合タンパク質である。特定のクラスのＦｃ含有タンパク質は、抗原を拘束することができる、Ｆｃ含有タンパク質である。例は、抗体であり、又は、Ｆｃ領域が結合形成作用のある部分（例えば、ｎａｎｏｂｏｄｙ、Ｆａｂ領域、Ｆ（ａｂ’）２領域）に結合している、融合タンパク質である。さらに、本発明は、ヒト配列に限定されない。例えば、Ｆｃ領域が、マウスのＦｃ領域であり、又は、ラクダ、アカゲザル、イヌ、ウシ、モルモット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ、ラット、ウサギ、ネコ又は任意の他のほ乳類のＦｃ領域であることも、可能である。Ｆｃ領域が、ほ乳類ではない動物（例えば、ニワトリ）のものであることさえも、可能である。具体例において、結合形成作用のある部分は、非抗体型足場であってよい。非抗体型足場は、広義には、２種の構造的クラスに属し、すなわち、ドメインサイズ化合物（６〜２０ｋＤａの分子量）及び拘束性ペプチド（２〜４ｋＤａ）に属する。ドメインサイズの足場には、Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ、Ａｆｆｉｌｉｎｓ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ、Ａｔｒｉｍｅｒｓ、ＤＡＲＰｉｎｓ、ＦＮ３足場（例えば、Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ及びＣｅｎｔｙｒｉｎｓ）、Ｆｙｎｏｍｅｒｓ、Ｋｕｎｉｔｚドメイン、Ｐｒｏｎｅｃｔｉｎｓ及びＯＢｏｄｉｅｓが挙げられるが、Ａｖｉｍｅｒｓ、二環式ペプチド及びＣｙｓ―ｋｎｏｔｓは、ペプチド同族である（包括的な総説に関しては、Ｖａｚｑｕｅｚ−Ｌｏｍｂａｒｄｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ２０，１０，１２７１を参照されたい。）。
【０１１７】
＜医薬配合物＞
特定の実施形態において、本発明の乾燥配合物は、エンテリックコーティング又は遅延放出性コーティングをさらに含んでもよい固体状経口医薬剤形をもたらすために、利用可能な任意の軟質又は硬質カプセル技術を用いてカプセル封入されていてもよい。
【０１１８】
さらに別の態様において、乾燥配合物を液体中に溶解させて、エマルションを得ることができる（Ｍｏｒｅｉｒａ  ＴＣ  ｅｔ  ａｌ（２０１６）Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  Ｓｕｒｆ  Ｂ．Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅ  １４３：３９９−４０５を参照されたい。）。したがって、特定の態様において、医薬配合物は、液体である。一態様において、本発明による医薬配合物は液体であり、１０％（ｗ／ｗ）未満の水を含む。一態様において、本発明による医薬配合物は液体であり、９％（ｗ／ｗ）未満の水を含む。一態様において、本発明による医薬配合物は液体であり、８％（ｗ／ｗ）未満の水を含む。一態様において、本発明による医薬配合物は液体であり、７％（ｗ／ｗ）未満の水を含む。一態様において、本発明による医薬配合物は液体であり、６％（ｗ／ｗ）未満の水を含む。一態様において、本発明による医薬配合物は液体であり、５％（ｗ／ｗ）未満の水を含む。一態様において、本発明による医薬配合物は液体であり、４％（ｗ／ｗ）未満の水を含む。一態様において、本発明による医薬配合物は液体であり、３％（ｗ／ｗ）未満の水を含む。一態様において、本発明による医薬配合物は、液体であり、２％（ｗ／ｗ）未満の水を含む。一態様において、本発明による医薬配合物は液体であり、１％（ｗ／ｗ）未満の水を含む。一態様において、本発明による医薬配合物は液体であり、０％（ｗ／ｗ）未満の水を含む。
【０１１９】
本発明の特定の態様において、医薬配合物は、医薬配合物において一般的に見受けられるさらなる賦形剤を含んでもよく、このような賦形剤の例には、限定されるわけではないが、抗酸化剤、抗菌剤、酵素阻害剤、安定剤、保存料、風味剤、甘味料、及び、参照により本明細書に組み込むＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ｒｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（２０１２）において記述されたような他の成分が挙げられる。
【０１２０】
これらのさらなる賦形剤は、合計での医薬配合物に対して約０．０５〜５重量％の量であってよい。抗酸化剤、抗菌剤、酵素阻害剤、安定剤又は保存料は一般的に、合計での医薬配合物のうち、最大で約０．０５〜１重量％を占める。甘味料又は香味剤は一般的に、合計での医薬配合物のうち最大で約２．５重量％又は５重量％を占める。
【０１２１】
本発明による経口医薬配合物は、固体剤形として配合されてもよい。
【０１２２】
本発明による経口医薬配合物は、固体剤形として配合されてもよく、カプセル剤、錠剤、糖衣錠、丸剤、ロゼンジ、散剤及び顆粒剤からなる群より選択することができる。
【０１２３】
本発明による経口医薬配合物は、多粒子型剤形として配合されてもよい。
【０１２４】
本発明による経口医薬配合物は、多粒子型剤形として配合されてもよく、ペレット、微粒子、ナノ粒子、軟質又は硬質カプセルに入った液体又は半固体充填型配合物、エンテリックコーティングされた軟質−硬質カプセルからなる群より選択することができる。
【０１２５】
一態様において、経口医薬配合物は、エンテリックコーティング等の１種以上のコーティングを有するように調製することもできるし、又は、当技術分野において周知の方法による遅延放出性配合物として配合することもできる。
【０１２６】
一態様において、本発明による医薬配合物は、医薬品の調製のために使用される。
【０１２７】
本明細書において使用されている「界面活性剤」という用語は、表面、及び、限定されるわけではないが液体と空気との界面、液体と液体との界面、液体と容器との界面又は液体と任意の固体との界面等、界面に吸着することができる、任意の物質、特に清浄剤を指す。
【０１２８】
本明細書において使用されているときの「薬物」、「治療用」、「医薬品」又は「薬」という用語は、予防用途、治療用途又はワクチン用途のために使用され得る医薬配合物中に使用された活性成分を指し、したがって、本特許出願において「高分子型治療用」又は「治療用高分子」又は「予防用高分子」又は「ワクチン高分子」として規定されたものも指す。
【０１２９】
＜予防用／治療／ワクチン＞
ポリペプチドを含む本発明の乾燥配合物は、明白ながらペプチドの性質に応じて、種々の疾患のために使用され得る。例えば、ペプチドが治療用ペプチドである場合、いくつかの疾患には、限定されるわけではないが、神経変性性障害、がん、血液障害、免疫障害、心臓障害、肝臓障害、呼吸器障害、吸収不良障害、糖尿病、ウイルス感染、真菌感染、細菌感染、眼病、希少代謝障害及び高血圧が挙げられる。
【０１３０】
特定の実施形態において、本発明は、胃腸障害の処置における使用のための、本発明の乾燥配合物を提供する。胃腸障害の非限定的な例は、過敏性腸症候群、便秘、痔核（例えば、内痔核）、肛門裂創、憩室症、結腸ポリープ、結腸がん、感染性大腸炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、虚血性大腸炎、放射線大腸炎及び腸管粘膜炎を含む。
【０１３１】
さらに別の特定の実施形態において、本発明は、口唇ヘルペス、口内炎、鵞口瘡、白板症、口内乾燥症、歯肉、口臭、虫歯、歯周疾患（例えば、歯肉炎）、口腔カンジダ症、口腔タンジュンヘルペスウイルス感染、口腔ヒトパピローマウイルス感染、再発性アフタ性潰瘍、口腔咽頭がん及び口腔粘膜炎等の口腔（又は口唇）障害の治療における使用のための、本発明の乾燥配合物を提供する。
【０１３２】
本発明の乾燥配合物中に存在する治療用タンパク質は、モノクローナル抗体、成長因子及びインターロイキン等を含む。別の態様において、外因性ポリペプチドは、ワクチンを目的として使用され得る。特に、外因性ポリペプチドは、ワクチンとして単独で使用することもできるし、又は、ワクチン組成物の部分を形成することもできる。
【０１３３】
＜組換え酵母＞
特定の実施形態において、本発明の乾燥配合物を調製するために使用される組換え酵母は、ＧＲＡＳステータスを獲得した酵母種である。ＧＲＡＳは、一般に安全と認められる（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  Ｒｅｇａｒｄｅｄ  ａｓ  Ｓａｆｅ）ことを意味する。ＧＲＡＳステータスを有する酵母には、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）及びクルイウェロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）等の酵母が挙げられる。組換え酵母中における治療用タンパク質の産生は、当業者に周知である。酵母ピキア・パストリスに関しては、例えば、Ｊｕｌｉｅｎ  Ｃ（２００６）ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｊａｎｕａｒｙ，ｐ．２２−３１の総説が存在しており、サッカロマイセス・セレビシエに関しては、例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｊ（２０１３）Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ４：４，２０７−２１１の総説が存在しており、ハンセヌラ・ポリモルファに関しては、Ｃｏｘ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｙｅａｓｔ，Ｖｏｌｕｍｅ  １６，１３，ｐｐ．１１９１−１２０３の総説が存在しており、クルイウェロマイセス・ラクチスに関しては、ｖａｎ  Ｏｏｙｅｎ  ＡＪＪ  ｅｔ  ａｌ（２００６）ＦＥＭ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ  ６，３８１−３９２の総説が存在しており、ヤロウィア・リポリティカに関しては、Ｍａｄｚａｋ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０９（１−２）：６３−８１の総説が存在する。
【０１３４】
本明細書においては特定の実施形態、特定の構成並びに材料及び／又は分子が、改変組換え酵母細胞及び本発明による方法に関して論述されてきたが、形態及び詳細に関する様々な変更又は修正が、本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなされ得ることを理解すべきである。下記の例は、特定の実施形態をより良く説明するために提供されており、本出願を限定するものとして考えるべきでない。本出願は、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１３５】
＜１．経口送達されるピキア産生モノマー型ＶＨＨ−ＩｇＡＦｃ融合物は、子ブタにおけるＦ４−ＥＴＥＣ感染の予防において有効である＞
事前に作製され、アラビドプシス種子において評価されたものである（Ｖｉｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１３）１１０、２９、１１８０９−１１８１４を参照されたい。）、Ｖ２Ａ及びＶ３Ａと呼ばれるモノマー型ＶＨＨ−ＩｇＡＦｃ融合物を、ここで、やはり酵母ピキア・パストリス及びダイズ種子において産生した。簡単に言うと、重鎖のみのラマ抗体（ＶＨＨ）を、Ｆ４＋ＥＴＥＣ線毛に対するように作製した。選択されたＦ４＋  ＥＴＥＣ  ＶＨＨを、ブタＩｇＡｂのコドン最適化部分にグラフト化した。得られたＶＨＨ−ＩｇＡＦｃ融合物は、Ｖ２Ａ及びＶ３Ａと呼ぶ。Ｆ４−ＥＴＥＣ先端接着抗原−ＦａｅＧコーティングされたウェルを用いるＥＬＩＳＡを使用して、機能的ＶＨＨ−ＩｇＡＦｃ融合物の発現レベルを評価し、ホースラディッシュペルオキシダーゼに共役したａｎｔｉ−ｐｉｇ  ＩｇＡによって検出した。図１は、ピキアクローン（図１Ａを参照されたい。）又はダイズ種子ストック（図１Ｂを参照されたい。）のスクリーニングの典型例を示している。２０個の個々のコロニーを、ピキア産生抗体Ｖ２Ａ及びＶ３Ａのそれぞれについてスクリーニングした。同様に、１０〜１２個の種子を、形質転換ダイズ事象のそれぞれからスクリーニングした。このような５つの事象を、Ｖ２Ａ及びＶ３Ａのそれぞれについてスクリーニングした。高発現種子ストックを保持しておき、これらのストックの一部を、やはり、Ｔ３ホモ接合型種子ストックを産生するために使用した。ダイズ産生Ｖ２Ａ及びＶ３Ａの発生レベルは、種子重量に対して約０．２％であると計算されたが、これは、アラビドプシス種子における発現レベルに類似していた。分泌されたピキアＶ２Ａ及びＶ３Ａの発現レベルは、１００ｍｇ／Ｌの高さだった（クマシーブルーによって染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを対象にして分析した）。しかしながら、ＥＬＩＳＡに基づいた機能的分析により、１ｍｌのピキア上澄みが、１ｍｌのダイズ又はアラビドプシス種子抽出物（５ｍｇの種子）に等価だったことが示された（図２を参照されたい。）。おそらくは、このＥＬＩＳＡ構成においては、ピキアグリカンによる遮へいのため、ピキア産生ＶＨＨ−ＩｇＡＦｃの定量化が妨害されたのだと思われる。実際、ピキア上澄み（図２Ｃを参照されたい。）及びダイズ種子抽出物（図１Ｄを参照されたい。）の免疫ブロット法分析は、差次的なグリコシル化の明確なホールマークを示している。ピキアＶＨＨ−ＩｇＡＦｃは、５０ｋ  Ｄａより高く（約５２ｋＤａ）移動しているが、ダイズ産生ＶＨＨ−ＩｇＡＦｃは、５０ｋＤａ未満（約４８ｋＤａ）である（図１Ｃ及び図１Ｄを参照されたい。）
【０１３６】
＜ピキア及びダイズ産生ＶＨＨ−ＩｇＡＦｃ融合物は、子ブタにおけるＥＴＥＣ感染を予防する＞
Ｖ２Ａ及びＶ３Ａ（用量  １日当たりブタ１匹ごとに５ｍｇ）のピキア及びダイズ種子産生ＶＨＨ−ＩｇＡＦｃ抗体混合品のインビボ有効性を、子ブタ飼料−チャレンジ実験において評価した。事前に作製したアラビドプシス産生モノマー型ＶＨＨ−ＩｇＡＦｃ（Ｖｉｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３を参照されたい。）ＰＮＡＳ１１０、２９、１１８０９−１１８１４）は、基準物質（アラビドプシス群）として作用したが、抗体を含有しない飼料（亜麻飼料、図３Ａ）は、陰性対照として作用した。これら群のそれぞれに存在する、Ｆ４−ＥＴＥＣに対して血清反応陰性であり、Ｆ４リセプター（Ｆ４Ｒ）遺伝子型陽性である、６匹の子ブタは、１０日の期間にわたって実験用飼料を受容した。３日目に、すべての子ブタには、連続する２日間（０日目及び１日目）にわたって、１０１０個のＦ４−ＥＴＥＣ細菌をチャレンジし、得られた感染の効果は、チャレンジ用の株の毎日のシェディングを１４日目まで分析することによってモニタリングした（図３Ｂ）。子ブタは、１４日目に安楽死させ、この時点で、空腸、回腸及び盲腸の内容物中のＦ４−ＥＴＥＣ細菌も測定した（表１）。
【０１３７】
【表１】
2020509026.tif 000002
【０１３８】
特記事項：検視観察により、アラビドプシス群に属する子ブタ−１８は、小腸の極度の絞扼の結果、詰まりやすい経路が生じることにより、臍ヘルニアを有していたことが明らかにされた。したがって、子ブタ−１８のデータは、シェディングのグラフ（図３Ｂ）又は統計学的分析（データは、表１に報告されている。）の中に含まれていない。
【０１３９】
安楽死の後にはやはり、腸管絨毛エンテロサイトを使用して実施されたＦ４−ＥＴＥＣ接着アッセイが、細胞表面２５０μｍ当たり４１〜８５個の細菌が結合していることが示されており、多数のＦ４リセプター（Ｆ４Ｒ）の形質発現が二重に確認されている。したがって、子ブタ−１８を除いて、すべての子ブタから得たデータを使用して、モノマー型ＶＨＨ−ＩｇＡＦｃの有効性を評価した。
【０１４０】
シェディングのデータにより、ピキア、アラビドプシス種子又はダイズ種子において産生された１日当たりブタ１匹ごとに５ｍｇの用量のモノマー型ＶＨＨ−ＩｇＡＦｃ  Ｖ２Ａ及びＶ３Ａ混合物は、ＥＴＥＣ感染をうまく予防したことが明らかにされた。ＶＨＨ−ＩｇＡＦｃ受容群は、有意に減じたシェディングを有していた（図３Ｂ、表１を参照されたい。）。これらの３つの群における最も高い平均シェディングを２日目に記録したが、ダイズ群、ピキア群及びアラビドプシス群のそれぞれに関しては、糞便１グラム当たり４．５（ｌｏｇ１０）、３．７（ｌｏｇ１０）及び４（ｌｏｇ１０）個の細菌だった。これらの３つの群において、後続する日では、シェディングがｌｏｇ基準で低下した。５日目における平均シェディングを、ダイズ群、ピキア群及びアラビドプシス群のそれぞれにおいて、糞便１グラム当たり２．６（ｌｏｇ１０）、２（ｌｏｇ１０）及び２，７（ｌｏｇ１０）個の細菌に到達させる。その後も、これらの群におけるシェディングは低いままであり、これらの３つの群の子ブタの一部に関しては、しばしば、検出可能なレベル（糞便１グラム当たり２（ｌｏｇ１０）個の細菌）を下回っていた（表１を参照されたい。）。対照的に、飼料に取り込まれた状態の抗体を受容していない群（対照群）の子ブタは、チャレンジ済みの細菌の力価が高く、３日目から６日目までで、平均で、糞便１グラム当たり６．３（Ｌｏｇ１０）個の細菌より高い、長期のシェディングを有しており、その後は、７日目（糞便１グラム当たり５．３（ｌｏｇ１０）個の細菌）及び８日目（糞便１グラム当たり３．３（ｌｏｇ１０）個の細菌）に低下し、９日目までに検出レベルを下回った。長期的な高いシェディングにより、チャレンジ済みの菌株は、確実な感染を効果的に行うことができ、対照群における小腸にうまくコロニー形成することが可能であったことが、指し示されている。一方、アラビドプシス群、ピキア群及びダイズ群における飼料に取り込まれた状態のＶＨＨ−ＩｇＡＦｃ抗体を受容した子ブタはすべて、チャレンジ直後にＦ４−ＥＴＥＣの素早い低下を示した。これにより、これらの飼料中のモノマー型ＶＨＨ−ＩｇＡＦｃは、Ｆ４−ＥＴＥＣがエンテロサイトに付着し、コロニー形成し、感染を確実にすることがないようにしたことを示している。これは、抗Ｆ４−ＥＴＥＣセロコンバージョンによってさらに裏付けられている（図３Ｃを参照されたい。）。ピキア群、ダイズ群及びアラビドプシス群に属する子ブタの大部分は、免疫系へのＦ４−ＥＴＥＣ病原体の曝露が限定的であるため、より小さい免疫反応を開始したが、対照群の抗Ｆ４−ＥＴＥＣ血清ＩｇＧ、ＩｇＭ及びＩｇＡレベルの平均力価は、７日目まで着実に増加し、１４日目まで上昇が続いた。
【０１４１】
シェディング及びセロコンバージョンの結果は、アラビドプシス、ダイズ又はピキア中で産生されたものである等しい比率のＶＨＨ−ＩｇＡＦｃ抗体Ｖ２Ａ及びＶ３Ａから構成された、Ｆ４−ＥＴＥＣに対する５ｍｇの用量のモノマー型ＶＨＨ−ＩｇＡＦｃ配合物を、飼料に取り込ませた状態で送達することが有効であることを、明確に実証している。さらに、ピキア産生抗体の場合、インビボ有効性の結果により、分泌ＶＨＨ−ＩｇＡＦｃを保有する培地の処理及び配合は、胃部適応症のための飼料に基づいたピキア産生分子の安定的な組み込み及び経口送達に適することが、十分に確認されている。
【０１４２】
＜実施例１の材料及び方法＞
ＶＨＨ−ＩｇＡＦｃの発現
アラビドプシス：以前から公になっていたモノマー型Ｖ２Ａ−ＩｇＡＦｃ及びＶ３Ａ−ＩｇＡＦｃ融合物を発現するアラビドプシス系統（Ｖｉｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＰＮＡＳ１１０、２９、１１８０９−１１８１４）を、温室内で増やし、Ｖ２Ａ−ＩｇＡＦｃ及びＶ３Ａ−ＩｇＡＦｃを産生する約１００グラムの種子を産生させて、チャレンジ実験におけるアラビドプシス群のための抗体含有飼料を配合した。
【０１４３】
ダイズ：それぞれ抗体Ｖ２Ａ及びＶ３ＡのためのＶＨＨ−ＩｇＡＦｃ融合遺伝子を保有するプラスミドｐＥＶ２Ａ及びｐＥＶ３Ａ（Ｖｉｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＰＮＡＳ  １１０，２９，１１８０９−１１８１４）を、Ｇａｔｅｗａｙ（Ｒ）クローニングの取扱い説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って除草剤Ｂａｓｔａ（Ｒ）を使用して、形質転換体の選択のためのホスフィノトリシン耐性を付与する遺伝子を保有するｐＧＷ４３  ｍｕｌｔｉｓｉｔｅ  ｇａｔｅｗａｙカセット（Ｋａｒｉｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ  ７，１９３−１９５）中に組み換えた。得られた発現ベクターはｐＭＸＶ２Ａ及びｐＭＸＶ３Ａと名付けた後、ダイズ植物（栽培品種Ｗｉｌｌｉａｍｓ８２）の形質転換のために、ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａ  Ｓｔａｔｅ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＰａｚ  ＭＭ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２５，２０６−２１３）によって記述された方法に従って外植片として子葉を使用して、アグロバクテリウム菌株ＥＨＡ１０１に導入した。抗原−ＦａｅＧａｃ（Ｆ４−ＥＴＥＣの先端接着）コーティングされたウェル（Ｖｉｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１３）ＰＮＡＳ  １１０，２９，１１８０９−１１８１４）を用いるＥＬＩＳＡによって、形質転換事象のＴ２種子において、ＶＨＨ−ＩｇＡＦｃ抗体の発現を評価し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃｈ；ＡＡ１４０Ｐ）に共役したポリクローナルａｎｔｉ−ｐｉｇ  ＩｇＡによって検出した。多量の抗体を発現する事象からの１０〜２０個の種子は、Ｔ２植物を成長させるために保持されたが、残りの種子は、子ブタに対する飼料によるチャレンジの評価を目的としたダイズ産生ＶＨＨ−ＩｇＡＦｃを保有する食事を配合するために使用した。
【０１４４】
ピキア：  ＶＨＨ−ＩｇＡＦｃ  Ｖ２Ａ及びＶ３ＡのためのＶＨＨ−ＩｇＡＦｃ融合遺伝子は、プライマーセットα−Ｖ２（ＣＴＣＴＣＴＣＧＡＧＡＡＧＡＧＡＧＡＧＧＣＣＧＡＡＧＣＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣ）及びＩｇＡ−ＮｏｔＩ（ＣＣＴＣＴＴＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＴＴＴＡＧＴＡＧＣＡＴＡＴＧＣＣＴＴＣＴＧ）を使用してＰＣＲ増幅したが、Ｄｅ  Ｍｅｙｅｒ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ  １３，９３８−９４７）によってＶＨＨ−ＩｇＧに関して先述されたように、これらのプライマーは、制限部位ＡｖａＩ及びＮｏｔＩを保有し、これにより、抗体遺伝子は、ｐＰｐＴ４＿Ａｌｐｈａ＿Ｓ発現ベクター中において、α−接合因子によってインフレームでクローニングされた（Ｎａａｔｓａａｒｉ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７，ｅ３９７２０）。酵素ＰｍｅＩを使用して各発現ベクターを直線化し、エレクトロポレーション（Ｊａｃｏｂｓ  ＰＰ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．４，５８−７０）によってピキア・パストリス中に導入した。陽性ピキアコロニーを、１００μｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎ（Ｒ）及び３００μｇ／ｍｌのブラストサイジンを蒔いたＹＰＤ寒天上で選抜した。２０個の個々のコロニーの発現を、２４ウェル系において、２ｍｌのＢＭＧＹ（１％酵母抽出物、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム、１．３４％ＹＮＢ、１％グリセロール、ｐＨ６．０）液体培養物中で分析した。増殖から４８時間後には、液体培地をＢＭＭＹ（１％酵母抽出物、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム、１．３４％ＹＮＢ、ｐＨ５．７）によって置き換え、約１２時間ごとに１％メタノールによってスパイクした。分泌ＶＨＨ−ＩｇＡＦｃ抗体を含有する培地は一般的に、ＢＭＭＹ培地における誘導の４８時間後に回収された。ＦａｅＧコーティングされたウェルを用いるＥＬＩＳＡによって、発現レベルを評価した。高発現のクローンを識別し、グリセロールストックを作製した。
【０１４５】
＜子ブタチャレンジ実験＞
子ブタチャレンジ実験は、Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆａｃｕｌｔｙ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｔ  Ｇｈｅｎｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｂｅｌｇｉｕｍ（倫理関係書類番号ＥＣ２０１５／４７）の承認を受けて、動物福祉に関するベルギーの法律に従って実施した。ピキア及びダイズ産生モノマー型ＩｇＡを用いた実験の場合は、ワクチン接種していない雌ブタの子ブタ（ベルギーランドレース種×イングランドランドレース種）を、ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （ＩＬＶＯ），Ｍｅｌｌｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）の農場から連れて行った。２〜３週齢の子ブタから血液試料を収集して、血清中の抗ＥＴＥＣ抗体のレベルをモニタリングした（ＩＬＶＯの施設倫理委員会によって承認済み。関係書類番号２０１６／２６７）。Ｆ４−ＥＴＥＣに対して血液反応陰性であり、ＭＵＣ―１３ＰＣＲ（Ｇｏｅｔｓｔｏｕｗｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ（２０１４）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ９，ｅ１０５０１３）によって判定したときに、Ｆ４−ＥＴＥＣリセプター（Ｆ４Ｒ）の存在を相関するＭＵＣ―１３遺伝子（顕性ホモ接合型及び顕性ヘテロ接合型）に対して陽性である、子ブタを選択した。各実験群は、６匹の子ブタからなっていた。ウィーニング後、子ブタは、学部にある家畜小屋に連れて行き、子ブタのリター、遺伝子型及び重量に基づいて給餌群に対して適切にランダム化した。各群の開始時点における平均重量は、７．２ｋｇだった。チャレンジは、先述のようにして（Ｖｉｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１１０，２９，１１８０９−１１８１４）実施した。簡単に言うと、子ブタには、重炭酸バッファーによって胃内ｐＨを３０分中和した後で、鎮静下における胃内挿管により、１０１０個のＦ４−ＥＴＥＣ細菌（菌株ＧＩＳ２６Ｒｓｔｒｅｐ）を連続日にチャレンジした。チャレンジの最初の日は、予定表の中では、０日目として勘定に入れられている。抗体含有飼料は、チャレンジ前の３日間から開始して、１０日の期間にわたって投与した（図３Ａ）。チャレンジの日から１２日目まで及び安楽死の日に、糞便試料を収集して、ストレプトマイシン選択（１ｍｇ／ｍｌ）によって血液寒天プレート上において、Ｆ４−ＥＴＥＣチャレンジ済みの菌株ＧＩＳ２６Ｒｓｔｒｅｐのシェディングをモニタリングした。１日目、７日目及び１４日目に血液試料を採取して、Ｆ４−ＥＴＥＣ特異的なＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭ力価をモニタリングした。動物を用いる特異的な修飾、試料の収集及び操作が、図３Ａに概略的に示されている。
【０１４６】
＜飼料調製＞
種子産生抗体の場合、厳密に秤量した各種子（ダイズ又はアラビドプシス）を砕いた後、徹底的な均一性を確保するという目的で、最初に小さな体積のブタ用基礎飼料と混合して、濃縮プレミックスを生じさせ、続いて、より多くのブタ用飼料によって希釈して、実験用飼料を調製するという２段階でブタ用基礎飼料と混合した（表２）。ナイフミル（Ｒｅｔｓｃｈ  Ｇｒｉｎｄｏｍｉｘ  ＧＭ２００）を使用して種子を粉砕した後、ドライアイスを使用して種子及び粉砕処理用チャンバを冷やした。各実験を通してすべての群において比例的な栄養を維持するために、亜麻種子を使用して、アラビドプシス種子を置き変えた（表２）。同様に、さらなるダイズタンパク質を構成するために、野生型ダイズ種を、ＩｇＡ産生するダイズ種子に対して等しい比率で、ダイズ−ＩｇＡ群以外の群に添加した（表２）。
【０１４７】
【表２】
2020509026.tif 000003
【０１４８】
＜ピキア＞
ＥＬＩＳＡに基づいた同等性検定（図２）によれば、１ｍｌのピキア抽出物は、１ｍｌの抽出バッファー中に可溶化されたＶＨＨ−ＩｇＡＦｃを産生する５ｍｇのアラビドプシス種子粉末に等価だった。この比率に基づいて、１０日間にわたって５ｍｇのピキア産生ＶＨＨ−ＩｇＡＦｃを６匹の子ブタに投与するために、３０Ｌの必要量のピキア培地を製造した。３０Ｌのピキア培養物は、上記のような標準的な発現プロトコル（ＢＭＧＹ培地中で４８時間増殖させ、続いて、ＢＭＭＹ培地中で４８時間誘導させる）に従って、７．５Ｌの毎週１回実施の４つのバッチとして製造された。各実施の終了時に、培地を遠心分離によって回収し、細胞不含の上澄みを透析ろ過によって２〜１．５Ｌに濃縮し、続いて、５ｋＤａ  Ｏｍｅｇａ（商標）ｃｅｎｔｒａｍａｔｅフィルターカセットを装着したＣｅｎｔｒａｍａｔｅ（商標）５００Ｓタンジェントフローろ過システム（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、１８．７５ｍＭ  ＮａＣｌを含有のリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６）によってバッファー交換した。４つのバッチの終了時に得られたものである、ピキア産生ＶＨＨ−ＩｇＡＦｃを含有する得られた約２〜１．５Ｌのタンパク質溶液には、等しい重量の市販用ブタ用飼料を添加し、いかなる発泡もないように手持ち式パドルを用いて混合し、スラリーを、フリーズドライ（Ｅｐｓｉｌｏｎ２−１０  Ｄ  ＬＳＣ−Ｍａｒｔｉｎ−Ｃｈｒｉｓｔ）を用いて４７時間凍結乾燥させた。ピキアプレミックスと呼ぶ、得られた合計で４つのバッチの乾燥粉末は、５．３６８Ｋｇだったが、これを次いで、ブタ用飼料と混合して、ピキア産生ＶＨＨ−ＩｇＡＦｃを保有する１８Ｋｇの最終的な飼料を生じさせた（表２）。
【０１４９】
＜統計学的分析＞
線形混合モデルを使用して、１日目から１０日目まで毎日測定したｌｏｇ１０変換済みの細菌数を、ＳＡＳ（Ｗｉｎｄｏｗｓ７  ６４ビット用のＳＡＳ  Ｓｙｓｔｅｍのバージョン９．４。コピーライト（Ｃ）２００２−２０１２  ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．Ｃａｒｙ，ＮＣ，ＵＳＡ，ｗｗｗ．ｓａｓ．ｃｏｍ）の複合式の手順を用いてモデル化した。細菌シェディングを判定するための検出限界が糞便１グラム当たり２（Ｌｏｇ１０）だったため、欠測データは、細菌が検出されなかった場合における１．９（ｌｏｇ１０）の値によって補完した。残渣の分散共分散行列に関するいくつかの構造は、飽和平均モデルに基づいて（すなわち、すべての独立変数をカテゴリー変数であると考え、すべての相互作用効果を含めて）試験した。非構造化、複合対称性、自己回帰及び帯テプリッツ行列といった、いくつかの構造を試験した。最も良い構造を、ＡＩＣ値に基づいて選択した。モデルの固定効果は、飼料群及び日数並びにこれらの交互作用項に関する主要な効果を含んでいた。固定効果の検定に関する分母自由度を算定するためのＫｅｎｗａｒｄ−Ｒｏｇｅｒ近似法は、ＳＡＳにおいて実装されているようにして、適用した。ｐｌｍ手順を使用して、部分的Ｆ検定を１日ごとに計算した。５％有意水準において部分的Ｆ検定が有意だった日に、一対比較を実施した。統計学的有意性は、Ｗａｌｄ検定によって計算し、複数回の比較のために、Ｔｕｋｅｙ法を使用して１日ごとに調節された。残渣の診断は、慎重に検査した。
【０１５０】
＜２．ピキア・パストリスにおいて産生されたヒトＩＬ−２２とのＩｇＡＦｃ融合物の評価＞
＜材料＞
組換えＭｕｒｉｎｅ  ＴＮＦ（ｍＴＮＦ）が、屋内でＥ．コリ中に生成されたが、９．４６×１０７ＩＵ／ｍｇの特異的活性を有していた）。
【０１５１】
＜動物＞
Ａ２０コンディショナルノックアウトマウス（Ａ２０ＩＥＣ−ＫＯ）を、Ｐｒｏｆ  Ｇｅｅｒｔ  ｖａｎ  Ｌｏｏから得た。Ａ２０ＩＥＣ−ＫＯマウスは、腸管上皮細胞（ＩＥＣ）においてＡ２０を欠損している（Ｖｅｒｅｅｃｋｅ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ．ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０７，１５１３−１５２３）。実験には、８〜１２週齢の雌マウスのみを使用した。マウスは、特定の病原体が存在しない施設にあるｔｈｅ  ＶＩＢ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＩＲＣ）において、個別に換気されているケージに収容した。すべてのマウス実験は、学会、国家及び欧州の動物に関する規制に従って実施された。動物プロトコルは、Ｇｈｅｎｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの倫理委員会によって承認された。
【０１５２】
＜飼料＞
標準的な粉末状マウス用飼料（ｓｓｎｉｆｆ（Ｒ）Ｒ／Ｍ―Ｈ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｆｅｅｄ−Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ）を、Ｂｉｏ−Ｓｅｒｖｉｃｅ（Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から購入した。ＩＬ−２２含有飼料を調製するために、それぞれが各ＩＬ−２２フォーマットを含有する培養物上澄みを、透析ろ過によって濃縮し、続いて、５ｋＤａ  Ｏｍｅｇａ（商標）ｃｅｎｔｒａｍａｔｅフィルターカセットを装着したＣｅｎｔｒａｍａｔｅ（商標）５００Ｓタンジェントフローろ過システム（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、１８．７５ｍＭ  ＮａＣｌを含有のリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６）によってバッファー交換した。各フォーマットに関しては、生物活性を濃縮物において測定し、各フォーマットの体積は、濃縮物１ｍｌ当たりある等しい量の生物活性が得られるように設定した。飼料と混合するために、等しい重量の標準的な粉末状げっ歯類用飼料を、ＩＬ−２２含有濃縮物に添加し、混合した。続いて、スラリーを、フリーズドライ（Ｅｐｓｉｌｏｎ２−１０Ｄ  ＬＳＣ−Ｍａｒｔｉｎ−Ｃｈｒｉｓｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって４７時間凍結乾燥させた。得られた乾燥粉末は以降、ピキアげっ歯類用プレミックスと呼ぶ。
【０１５３】
＜インビトロ試験＞
産生培地中における異なるＩＬ−２２フォーマットの生物活性を試験するために、培地をサンプリングし、培地を無菌ＰＢＳ中に希釈した後、バイオアッセイを実施した。乾燥済みの飼料における異なるＩＬ−２２フォーマットの生物活性の保持を試験するために、飼料を１：１（ｖ／ｖ）ＰＢＳに溶解させた。次いで、スラリーを１３．０００ｇで遠心分離した。上側水性相を新たなチューブに移し、低タンパク質結合型０．２２μｍシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してろ過滅菌した。次いで、ろ液を無菌ＰＢＳ中に希釈した後、バイオアッセイを実施した。
【０１５４】
ヒトＣｏｌｏ−２０５結腸癌細胞をｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に注文し、データシートに提供されたガイドラインに従って培養した。簡単に言うと、細胞株は、３７℃、５％ＣＯ２において、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）中で、半接着細胞として培養した。継代のために、懸濁状態で増殖している細胞を収集し、接着細胞を、標準的な組織培養物手順に従ってトリプシン処理した。
【０１５５】
Ｃｏｌｏ−２０５アッセイを使用してＩＬ−２２の生物活性を判定するために、３．０×１０５個の細胞／ｍＬ（１００μｌ／ウェル）として細胞を９６ウェル丸底プレートに播種した。細胞を２４時間順応させた後、ある希釈系列のＩＬ−２２含有画分によって細胞を刺激した。すべてのシミュレーションを、終夜進行させた。対照として、ある希釈系列の市販の組換えｈＩＬ−２２（キャリア不含）によって産生されたＥ．コリ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用した。翌日、プレートを４００ｇにおいて１０分間４℃で遠心分離し、上澄みを収集した。ｈＩＬ−１０  ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、上澄みをＩＬ−１０についてアッセイした。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６によって、データを分析した。特異的活性は、用量応答曲線に基づいて判定されており、用量応答曲線は、ＥＣ５０を判定するために使用した。
【０１５６】
＜実験モデル＞
ＩＬ−２２の保護効果を試験するという目的で、Ｃ５７ＢＬ／６  Ａ２０ＩＥＣ−ＫＯマウス（１群当たりｎ＝８）には、２０μｇ、１０μｇ、５μｇ、１μｇに等価な各ＩＬ−２２フォーマットを含有する１０ｍｌ／ｋｇの液体状食事（２００μｌに等価）、又は、対照としてのＩＬ−２２を不含の等価な飼料を強制飼養した。
【０１５７】
実験的な大腸炎を誘導するために、強制飼養の１時間後、マウスに、２５０μｇ／ｋｇの亜致死用量のｍＴＮＦを腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。対照マウス（Ｍｏｃｋ）には、ある等価な体積の０．９％ＮａＣｌをｉ．ｐ．注射した。体温及び生存を、１時間ごとにモニタリングした。並列実験において、マウスは、組織学的分析及びカスパーゼ活性アッセイのために４時間後に安楽死させた。
【０１５８】
＜組織学＞
検死。盲腸から肛門までの結腸全体を取り除き、炎症のマーカーとして、結腸の長さを測定した。測定後、腸管から出た部分を取り除き、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中に固定した。パラフィン包埋及び薄片化の後、組織学的検査のためにヘマトキシリン／エオシンによって組織を染色した。ＴＵＮＥＬ染色のためのインサイチュー細胞死検出キット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、蛍光顕微鏡法によってアポトーシスを分析した。
【０１５９】
＜血清分析＞
血清炎症誘発性サイトカインＩＬ−６及びＭＣＰ−１を、それぞれマウスＩＬ−６  ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びマウスＣＣＬ２／ＪＥ／ＭＣＰ−１  ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して血清中で測定した。アラニンアミノトランスフェラーゼ活性（ＡＬＴ）及びアスパルテートアミノトランスフェラーゼ活性（ＡＳＴ）を、Ｈｉｔａｃｈｉ７４７分析装置（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）により、通例の光度測定試験によって分析した。
【０１６０】
＜結果＞
ｍｏｃｋ処置済みのＡ２０ＩＥＣ−ＫＯマウスは、苦痛に関する表現型の徴候を全く示していない。対照的に、ＴＮＦ注射を受けたマウスは、注射から２時間経つとすぐに、低体温症及び重度の下痢を含むＴＮＦ毒性の明確な症状を示している。さらに、ＴＮＦの注射から５時間後〜９時間後の間に、マウスが死亡し始めた。ＩＬ−２２含有飼料（ＩＬ−２２  ＩｇＡＦｃ又はＩＬ−２２）による胃内処置を受けたマウスのみが、体温の軽度の低下を示し、下痢を発症しなかった。さらに、ＩＬ−２２フォーマットのいずれかによって処置されたマウスのいずれもが、ＴＮＦチャレンジ後に死亡しなかった。
【０１６１】
組織学的には、ＴＮＦによってのみ処置されたがＩＬ−２２を受容していないマウスは、はなはだしい上皮損傷及び陰窩−絨毛構造のほぼ完全な喪失を特徴とする、回腸及び空腸の重度の損傷を受けている。対照的に、ＩＬ−２２フォーマットのいずれかを受容したマウスは、いかなる損傷の徴候も示しておらず、バリアの完全性を明確に維持している。細胞レベルにおいては、ＴＵＮＥＬ染色は、ＩＬ−２２処置後にはないが、ＴＮＦのみによって処置されたマウスにおいては、アポトーシス細胞は、すでに脱離していて腸管腔に見受けられる細胞に加えて、絨毛の上皮内層においても、非常に豊富である。
【０１６２】
さらに、本発明者らは、炎症誘発性サイトカインＩＬ−６及びＭＣＰ−１の測定によって、全身的効果を査定している。ＩＬ−６のレベルとＭＣＰ−１レベルのレベルは両方とも、対照マウスの場合と、ＩＬ−２２フォーマットを受容したマウスの場合とでは同等であるが、ＴＮＦのみによって処置されたがＩＬ−２２を受容していないマウスは、Ｉｌ−６及びＭＣＰ−１レベルを上昇させた。さらに、ＴＮＦも肝臓の生理機能に影響すると報告されているため、本発明者らは、肝臓アミノ基転移酵素レベル（ＡＳＴ及びＡＬＴ）も査定している。実際、ＴＮＦによって処置されたマウスは、血清中におけるＡＳＴ及びＡＬＴのレベルが上昇しているが、ＩＬ−２２治療済みのマウスは、この上昇を示していない。
【０１６３】
＜実施例２の材料及び方法＞
＜菌株、培地及び試薬＞
エスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（Ｅ．コリ）ＭＣ１０６１又はＤＨ５αを、標準的な分子生物学的操作のために使用した。プラスミド繁殖のために、適切な抗生物質、すなわち、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン（Ｄｕｃｈｅｆａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ）、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、５０μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ（Ｄｕｃｈｅｆａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ）又は５０μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎ（Ｒ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加したＬＢブロス（０．５％酵母抽出物、１％トリプトン及び０．５％ＮａＣｌ）中でＥ．コリを培養した。すべてのＰＣＲ反応は、Ｐｈｕｓｉｏｎ高フィデリティーポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用して実施された。ｄＮＴＰ等のＰＣＲ試薬及びプライマーは、それぞれＰｒｏｍｅｇａ及びＩＤＴに注文した。
【０１６４】
ピキア・パストリスＮＲＲＬ―Ｙ１１４３０菌株（同義語コマガテラ・ファッフィ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉ））は、Ａ．Ｇｌｉｅｄｅｒ（Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ  Ｇｒａｚ、Ａｕｓｔｒｉａ）によって提供された。この菌株は、野生型と呼ばれる。酵母培養物は、液体状ＹＰＤ（１％酵母抽出物、２％ペプトン、１％Ｄ−グリコース）中又は固体状ＹＰＤ−寒天（１％酵母抽出物、２％ペプトン、１％Ｄ−グリコース、２％寒天）上において増殖させ、１００μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎ（Ｒ）、５００μｇ／ｍＬのジェネティシン／Ｇ４１８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又は３００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢという適切な抗生物質の使用によって選択した。Ｂａｃｔｏ酵母抽出物、Ｂａｃｔｏトリプトン、Ｂａｃｔｏペプトン、Ｂａｃｔｏ寒天及び酵母窒素塩基（ＹＮＢ）は、Ｄｉｆｃｏ（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）から購入した。
【０１６５】
タンパク質発現のために、振とうインキュベーター（２８℃、２２５ｒｐｍ）内で、ＢＭＧＹ（１％酵母抽出物、２％ペプトン、１００ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４、１．３４％ＹＮＢ、１％グリセロール、ｐＨ５．５）中で培養物を増殖させた。タンパク質発現の誘導のために、細胞は、１％ＭｅＯＨを含有するＢＭＭＹ（１％酵母抽出物、２％ペプトン、１００ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４、１．３４％ＹＮＢ、ｐＨ５．５）に切り替えた。誘導を維持するため、及び蒸発を補償するために、８〜１２時間ごとに１％ＭｅＯＨによって培養物をスパイクした。誘導の終了時に、遠心分離（１．５００ｇ、４℃で１０分）によって培養物を回収した。試料を、すぐに分析し、又は、液体窒素中で急速凍結した後、−２０℃で貯蔵した。
【０１６６】
＜ｈＩＬ−２２発現ベクターの構築＞
Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔの独自開発アルゴリズムを使用して、成熟ヒトインターロイキン−２２（ｈＩＬ−２２、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ登録番号Ｑ９ＧＺＸ６、残基３４〜１７９）のオープンリーディングフレームを、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現を対象にしてコドン最適化し、合成により秩序化した。ｈＩＬ−２２をコードする配列を、ｐＫａｉ６１ＥＡ−ｙＥＧＦＰ発現ベクター中にあるがＥＡ反復体を含まないＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α−接合因子によって、インフレームでクローニングした（Ｓｃｈｏｏｎｏｏｇｈｅ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ（２００９）ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９，７０）。最終的な発現ベクターｐＫａｉ−ｈＩＬ２２は、強力なメタノール誘導性ＡＯＸ１プロモーターの制御下にあるｈＩＬ−２２導入遺伝子を含有し、細菌と酵母との両方の選択のためのＺｅｏｃｉｎ（Ｒ）耐性マーカーを有している。
【０１６７】
代替的な分泌シグナルとして、Ｓ．セレビシエＯｓｔ１配列（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉ  ａｎｄ  Ｇｌｉｃｋ  ＢＳ（２０１４）Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒｉｅｓ  １３，１）を、プライマーＯｓｔ１ＳａｃｃｈａｒｏｐＡＯＸ１Ｆｗ及びＯｓｔ１ＳａｃｃｈａｒｏＲｖを使用してＳ．セレビシエゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。
【０１６８】
＜ｈＩＬ−２２−ｈＩｇＡ＿Ｆｃ―６ｘＨｉｓ発現ベクターの構築＞
すべての構築体は、モジュール式クローニング戦略（ＭｏＣｌｏ）を使用してクローニングされた。この系は、Ｓ．セレビシエ（Ｌｅｅ  ＭＥ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ  ４，９７５−９８６）のために開発されていたが、ピキアにおける使用のために屋内で順応させた。要するに、ＭｏＣｌｏ系は、標準化されたエントリーベクターを用いて、望ましい構築に属する各「部分」をサブクローニングする。これらのベクター内の各部分には、別個のＩＩ型制限酵素部位が隣接する。単一反応でエントリーベクターをプール化し、連続する制限酵素消化及びＴ４ライゲーション反応を実施することによって、適合する末端を有する部分どうしが、環状プラスミドの中に入るように集合及び連結して、最終的な発現ベクターを生じさせる。すべてのエントリーベクターは、等モル量（約２０フェムトモル）である増幅されたフラグメントとＭｏＣｌｏエントリーベクターｐＹＴＫ００１との両方、又は、合成物であるが同一のベクターｐＰＴＫ０８１をプール化することによって、作製した。標準的なモジュール式クローニング（「ＭｏＣｌｏ」）プロトコルが使用されており、ＩＩ型制限酵素ＢｓｍＢＩ（１Ｕ；ＮＥＢ）、Ｔ４リガーゼ（１Ｕ；ＮＥＢ）及び１０ｘＴ４リガーゼバッファー（ＮＥＢ）をプール化配列に添加することを特徴とする。４２℃で２分と１６℃で５分の２４回のサイクルを、ＰＣＲサイクラーにおいて実施し、続いて、最後の消化ステップを５０℃で１０分を行い、熱変性ステップを８０℃でさらに１０分行った後、１２℃で無期限に保持した。得られたベクターをＥ．コリＭＣ１０６１コンピテント細胞中に導入し、次いでをＬＢクロラムフェニコール培地に蒔いた。ｐＹＴＫ００１／ｐＰＴＫ０８１レシピエントエントリーベクターがＧＦＰドロップアウトカセットを特徴とするため、緑色−白色方式のスクリーニングにより、（適正な）プラスミドを含有するコロニーを、緑色の偽陽性クローンから区別することができた。プラスミド単離し、対象とする配列を、プライマーＰＰ００１及びＰＰ００２を使用してサンガーシーケンシングによって確かめる。
【０１６９】
ＩｇＡ（ＰＡＯＸ１−ｈＩＬ−２２−ｈＩｇＡ＿Ｆｃ−６ｘＨｉｓ）の不変ドメインを有するｈＩＬ−２２融合構築体を改変するために、α−ＭＦ／Ｏｓｔ１／ｐｒｅ−ｈＩＬ−２２配列を、ＭｏＣｌｏ系と適合するプライマーを用いるＰＣＲによって増幅した。ｈＩｇＡ配列へのｈＩＬ−２２配列のＮ末端融合物を作製するために、完全なα−ＭＦ−ｈＩＬ−２２ＣＤＳ、Ｏｓｔ１−ｈＩＬ−２２ＣＤＳ及びｐｒｅ−ｈＩＬ−２２ＣＤＳは、ＭｏＣｌｏ系におけるＮ末端タグ又は３ａ部分であると考えた。同様に、ＩｇＡ（ヒト、マウス及びブタ）の不変ドメインは、目的遺伝子又は３ｂ部分として考えた。
【０１７０】
α−ＭＦ−ｈＩＬ−２２、Ｏｓｔ１−ｈＩＬ−２２又はｐｒｅ−ｈＩＬ−２２を保有するＭｏＣｌｏエントリーベクターはすべて、テンプレートとして上記ｐＰｐＴ４＿Ａｌｐｈａ＿Ｓ発現ベクターを使用する初期のＰＣＲ増幅によって作製した。α−ＭＦ−ｈＩＬ−２２とｐｒｅ−ｈＩＬ−２２配列とは両方とも、プライマーＩＬ−２２ｆｏｒｅｎｔｒｙｆｗ及びＩＬ−２２ｆｏｒｅｎｔｒｙｒｖによって増幅したが、Ｏｓｔ１−ｈＩＬ−２２配列は、プライマーＩＬ−２２ｏｓｔ１ｆｏｒｅｎｔｒｙｆｗ及びＩＬ−２２ｆｏｒｅｎｔｒｙｒｖによって増幅した。次いで、ＰＣＲフラグメントを、ＢｓｍＢＩ制限消化及びＴ４ライゲーションによってｐＹＴＫ００１／ｐＰＴＫ０８１に導入した。
【０１７１】
ヒトＩｇＡ（ホモサピエンス、ＵｎｉｐｒｏＫＢ：Ｐ０１８７７）及びマウスＩｇＡ（ムス・ムスクルス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ：Ｐ０１８７８）のＦｃ領域の配列を、Ｐ．パストリスにおける発現を対象にしてコドン最適化し、ＩＤＴのｇＢｌｏｃｋｓとして合成により秩序化した。次いで、ヒト及びマウスＩｇＡ  ｇＢｌｏｃｋｓを、モジュール式クローニングを可能にするために、プライマーＩｇＡｆｏｒｅｎｔｒｙｆｗ及びＩｇＡｆｏｒｅｎｔｒｙｒｖ又はＩｇＡｍｏｕｓｅｆｏｒｅｎｔｒｙｆｗ及びＩｇＡｍｏｕｓｅｆｏｒｅｎｔｒｙｒｖによって増幅した。ブタＩｇＡ（スス・スクロファ、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ：Ｋ７ＺＲＫ０）のＦｃ領域を、プライマーＩｇＡｐｉｇｆｏｒｅｎｔｒｙｆｗｃｏｒｒｅｃｔ及びＩｇＡｐｉｇｆｏｒｅｎｔｒｙｒｖｎｅｗによって事前に作製した（（Ｖｉｒｄｉ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ（２０１３）ＰＮＡＳ  １１０，１１８０９）ＥＶ２Ａベクターから増幅した。すべてのＩｇＡ配列は、ＭｏＣｌｏ系中の「部分３ｂ」として、ｐＹＴＫ００１／ｐＰＴＫ０８１ベクター中にクローニングした。
【０１７２】
次いで、エントリーベクターを使用して、ＭｏＣｌｏ系を用いて発現ベクターを作製した。各発現ベクターは、等モル量（約２０フェムトモル）の下記部分（Ａｄｄｇｅｎｅから入手可能である又は将来入手可能になる）をプール化することによって、作製した。
【０１７３】
部分１  集合体連結部  ＣＯＮＬＳ
部分２  プロモーター  ＰＡＯＸ１／ＰＣＡＴ１
部分３ａ  Ｎ末端タグ  α−ＭＦ−ｐｒｅｐｒｏ／α−ＭＦ−ｐｒｅ／Ｏｓｔ１−ｈＩＬ−２２
部分３ｂ  目的遺伝子  ｈＩｇＡ／ｍＩｇＡ／ｐＩｇＡ
部分４ａ  Ｃ末端タグ  ６ｘＨｉｓ／６ｘＨｉｓ−ＨＤＥＬ
部分４ｂ  ターミネーター  ＡＯＸ１ＴＴ
部分５  集合体連結部  ＣＯＮＲＥ
部分６  酵母マーカー  スタッファー（ゼオシン耐性が、細菌と真菌との両方において機能するため。）
部分７  種々雑多  スタッファー
部分８  Ｅ．コリマーカー＋ＯＲＩ  ＺｅｏＲ＋ＣｏｌＥ１
【０１７４】
【表３】
2020509026.tif 000004
【０１７５】
＜３．ピキア産生ＶＨＨ−ＩｇＡ−Ｆｃ融合物の異なる乾燥工程から得た可食型配合物のインビボ有効性の比較＞
経口及び胃内安定性は、胃腸管において有用であるべきＶＨＨ−ＩｇＡＦｃのような生物学的治療薬にとって、最も重要なことである。（分子レベルで）抗体を取り囲むマトリックス及び乾燥工程は、ＶＨＨ−ＩｇＡＦｃ抗体を保護して、消化器官において消化されて無効なものになることがないようにするときに、重要な役割を担う可能性が非常に高い。ここで、本発明者らは、Ｆ４−ＥＴＥＣ感染を明確化するときに、飼料マトリックスと一緒にフリーズドライし（実施例１を参照されたい。）、又は飼料マトリックスなしでフリーズドライした、差次的に乾燥させたピキア産生ＶＨＨ−ＩｇＡＦｃのインビボ有効性に対する効果を評価することについて説明する。さらに、本発明者らは、熱を伴う代替的な原理に基づいた噴霧乾燥工程も評価しており、このとき、マルトデキストリン（ｍａｔｏｄｅｘｔｒｉｎ）をマトリックス／キャリアとして使用した。差次的に処理された３種のピキア産生抗Ｆ４−ＥＴＥＣＶＨＨ−ＩｇＡＦｃ（Ｖ２Ａ及びＶ３Ａ）の飼料配合物を、１日当たり子ブタ１匹ごとに０．５Ｌの発酵物又は５ｍｇ  ＶＨＨ−ＩｇＡＦｃ／日／子ブタに等価である同じ用量から構成した。飼料中のＶＨＨ−ＩｇＡＦｃ抗体を受容しなかった第４の群は、陰性対照として働いた。Ｆ４−ＥＴＥＣへの感染しやすさに相関するものである、Ｆ４−ＥＴＥＣに対して血清反応陰性でｍｕｃ−１３遺伝子試験において陽性の２４匹の子ブタを選択し、ウィーニングし、それぞれ６匹の子ブタから構成される４つの群に収容した。これらの子ブタは、固体食品に対して順応させ、その後、群特異的な実験用飼料に導入した（図４Ａを参照されたい。）。実験用飼料は、１０日分として用意したが、この１０日間の３日目において、すべての子ブタには、連続する２日間（０日目及び１日目）で、１０１０個のＦ４−ＥＴＥＣ細菌をチャレンジした。飼料配合物に応じて得られた感染の効果は、糞便中における１２日目（図４Ｂ及び表３を参照されたい。）まで毎日シェディングされたチャレンジ用の株のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を分析することによって、モニタリングした。
【０１７６】
【表４】
2020509026.tif 000005
【０１７７】
注記：ｌｏｇ（１０）ＣＦＵ検出限界は、２であり、ダッシュ（―）は、細菌が検出されなかったことを表す
注記：子ブタ２及び子ブタ９は、それぞれ５日目及び２日目に死亡しており、理由は、検死調査中に発見された大きな胃潰瘍だった。
【０１７８】
陰性対照群に属するすべての子ブタは、１日目及び２日目において、Ｆ４−ＥＴＥＣの高いＣＦＵをシェディングしており、シェディングは、少なくとも、３日目までは子ブタの半分において維持された。抗体受容群における総合的なシェディングは、低かった。図４Ｂは、各群における平均シェディング及び６日目までの平均（ＳＥＭ）の標準誤差を示しており、これらは、Ｆ４−ＥＴＥＣ感染の予防における、これらの３種のピキアによって産生された差次的な処理済みのＶＨＨ−ＩｇＡ−Ｆｃ融合物を含有する食事の有効な傾向を反映している。これらのデータにより、フリーズドライ工程におけるブタ用飼料の状態又は噴霧乾燥におけるマルトデキストリンの状態であるマットリックスは、インビボにおけるより高い有効性に帰結することが示されている。血清抗ＥＴＥＣ  ＩｇＧ（図４Ｃを参照されたい。）及びＩｇＡ（図４Ｄ）レベルは、飼料マトリックス配合物にフリーズドライを受けた群において最も低く、このことは、シェディング結果を裏付けている。総合的には、相違点は、セロコンバージョンを示す群に含まれる個別の子ブタを観察したことである（図４Ｃ及び図４Ｄ中のエラーバーは、平均の標準誤差を表す。）。
【０１７９】
＜実施例３の材料及び方法＞
＜ピキア産生ＶＨＨ−ＩｇＡ−Ｆｃを主体とした飼料配合物＞
チャレンジ実験である実施例１において施用されたような有効用量の抗ＥＴＥＣ  ＶＨＨ−ＩｇＡＦｃは、約５ｍｇのＶＨＨ−ＩｇＡＦｃであり、又はより適切には、１日当たり子ブタごとに０．５Ｌの振とうフラスコ内で増殖した培養物から得た乾燥産生物を保有する飼料配合物だった。この用量は、等しい部の２種の抗Ｆ４−ＥＴＥＣ  ＶＨＨ−ＩｇＡＦｃ、すなわち、Ｖ２Ａ及びＶ３Ａから構成された（Ｖｉｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１３）１１０、２９、１１８０９−１１８１４を参照されたい。）。ピキア産生ＶＨＨ−ＩｇＡＦｃを受容した１８匹の子ブタ（３つの群のそれぞれにおいて、６匹の動物）のために類似した用量を調製するという目的で、それぞれ４５ＬのＶ２Ａ及びＶ３Ａ（合計で９０Ｌ）を発現したピキア培養物を、振とうフラスコ内で増殖した。これは、下記の表５にまとめられているように、６つのバッチとして製造した（５日間かかる工程において、実施例１の場合と同様に、ＢＭＧＹ培地中で４８時間増殖させ、続いて、ＢＭＭＹ培地中で４８時間誘導させた）。したがって、毎週１回、１５Ｌの培養物バッチを製造した。各実施の終了時に、培地を遠心分離によって回収し、細胞不含の上澄みを透析ろ過によって１Ｌに濃縮し、続いて、５ｋＤａ  Ｏｍｅｇａ（商標）ｃｅｎｔｒａｍａｔｅフィルターカセットを装着したＣｅｎｔｒａｍａｔｅ（商標）５００Ｓタンジェントフローろ過システム（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、リン酸ナトリウムバッファー（２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１８．７５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６）によってバッファー交換した。６つのバッチのそれぞれの終了時に得られたものである、ピキア産生ＶＨＨ−ＩｇＡＦｃと呼ばれる保持液を含有する得られた１Ｌの保持液タンパク質溶液（表４）を、下記のような３種の特定の方法によって乾燥させた。
【０１８０】
【表５】
2020509026.tif 000006
【０１８１】
方式１：マトリックスによって凍結乾燥させる（実施例１に類似）：ＶＨＨ−ＩｇＡＦｃ  Ｖ２Ａ（バッチ１、表５）又はＶ３Ａ（バッチ２、表４）を保有する１リットルの保持液を、手持ち式パドルを用いて、いかなる発泡もないように１キログラムの市販用子ブタ飼料（供給業者：Ｖａｎ  Ｈｕｆｆｅｌ、９８５０Ｐｏｅｓｅｌｅ（Ｎｅｖｅｌｅ）Ｂｅｌｇｉｕｍ）と混合し、スラリーを、フリーズドライ装置（Ｅｐｓｉｌｏｎ２−１０Ｄ  ＬＳＣ−Ｍａｒｔｉｎ−Ｃｈｒｉｓｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して４７時間凍結乾燥させた。次いで、それぞれＶＨＨ−ＩｇＡ−Ｆｃ  Ｖ２Ａ及びＶ３Ａを含有する２つのフリーズドライ用バッチ（それぞれが約１Ｋｇ）から構成される得られた乾燥粉末を、ブタ用飼料と混合して、ピキアによって産生されたマトリックスにフリーズドライ済みのＶＨＨ−ＩｇＡＦｃを保有する１８Ｋｇの最終的な飼料を生じさせた（表４）。
【０１８２】
方式２：マトリックスなしでフリーズドライさせる：ＶＨＨ−ＩｇＡＦｃ  Ｖ２Ａ（バッチ３）又はＶ３Ａ（バッチ４）を保有する１リットルの保持液を、フリーズドライ装置（Ｅｐｓｉｌｏｎ２−１０Ｄ  ＬＳＣ−Ｍａｒｔｉｎ−Ｃｈｒｉｓｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して４７時間凍結乾燥させた。次いで、それぞれＶＨＨ−ＩｇＡＦｃ  Ｖ２Ａ及びＶ３Ａを含有する２つのフリーズドライ用バッチ（それぞれが約３０グラム）から構成される得られた乾燥粉末を、ブタ用飼料と混合して、ピキアによって産生されたマトリックスなしでフリーズドライ済みのＶＨＨ−ＩｇＡＦｃを保有する１８Ｋｇの最終的な飼料を生じさせた（表４）。
【０１８３】
方式３：噴霧乾燥させる：ＶＨＨ−ＩｇＡＦｃ  Ｖ３Ａを保有する１リットルの保持液（バッチ５、表４）、及び、ＶＨＨ−ＩｇＡＦｃ  Ｖ２Ａを保有する別の１リットルの保持液（バッチ６、表５）を、２．５Ｋｇのマルトデキストリンを含有する２３Ｌのリン酸ナトリウムバッファー（２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１８．７５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６）と混合した。合計２５Ｌの液体を、工業用ブレンダーを使用して５〜７分徹底的に混合した後、給餌用液体の４５℃における予備加熱及び１７０℃の入口空気温度にパラメータが設定された噴霧乾燥機に供給した。乾燥工程中、平均出口空気温度は、約８０℃であり、一定の液体圧送速度を維持した。乾燥済みのＶ２Ａ及びＶ３Ａを保有する約２．３ｋｇの粉末を回収し、ブタ用飼料と混合して、ピキアによって産生された噴霧乾燥済みのＶＨＨ−ＩｇＡＦｃを保有する１８Ｋｇの最終的な飼料を生じさせた（表４）。
【０１８４】
リン酸緩衝生理食塩水中に可溶化してＥＬＩＳＡにおいて評価した場合において、飼料にフリーズドライされたもの（Ｖ２Ａバッチ１、Ｖ３Ａバッチ２）、マトリックスなしでフリーズドライされたもの（Ｖ２Ａバッチ３、Ｖ３Ａバッチ４）及びマルトデキストリンによって乾燥させたもの（Ｖ３Ａ＋Ｖ２Ａ、バッチ５及びバッチ６を含みあわせたもの）である、差次的な乾燥工程の実施のそれぞれ（表５を参照されたい。）から得た乾燥済みのＶＨＨ−ＩｇＡＦｃは、固定化Ｆ４−ＦａｅＧ抗原への結合として機能的に活性であることが観察された。
【０１８５】
対照飼料は、いかなる抗体も不含の１８ｋｇの基礎飼料を含んでいた。１８Ｋｇの飼料配合物のそれぞれを、一群当たりの１日分飼料許容量としてそれぞれが１．８Ｋｇである、１０個のバッグに分割したが、これは、３日目から７日目まで、子ブタのための給餌用の大桶の中に用意した（図４Ａ）。
【０１８６】
＜子ブタチャレンジ実験＞
子ブタチャレンジ実験は、Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆａｃｕｌｔｙ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｔ  Ｇｈｅｎｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｌｇｉｕｍの承認（倫理関係書類番号ＥＣ２０１７／１２２）を受けて、動物福祉に関するベルギーの法律に従って実施した。子ブタ（品種：交配種）を、ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＩＬＶＯ），Ｍｅｌｌｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ（倫理関係書類番号２０１７／３０６）の農場から連れて行った。５匹の初産雌ブタには、Ｆ４−ＥＴＥＣに対するブースターワクチンをやめさせて、低い乳汁免疫を確保した。これらの雌ブタが生んだ子ブタには、誕生してから１日おきに抗生物質（子ブタ１匹当たりＤｕｐｈａｍｏｘ０．１ｍｌ）を３回投与して、Ｆ４−ＥＴＥＣ感染から保護した。さらに、抗Ｆ４−ＥＴＥＣ血清の力価、及び、Ｆ４−ＥＴＥＣリセプターの存在と相関するＭＵＣ１３遺伝子タイピングアッセイ（Ｇｏｅｔｓｔｏｕｗｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ（２０１４）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ９，ｅ１０５０１３）を評価するために、これらの子ブタから誕生１５日目に血液をサンプリングした。ＭＵＣ１３Ｆ４−ＥＴＥＣ感受性遺伝子型に対して血清反応陰性でホモ接合型の２４匹を選択し、ウィーニングし、チャレンジ実験のためにＧｅｎｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの獣医学部の家畜小屋に輸送した。子ブタは、子ブタのリター、遺伝子型及び重量に基づいて、給餌群に対して適切にランダム化した。各群の開始時点における平均重量は、８．５ｋｇだった。子ブタには、１２日目及び１１日目に、抗生物質Ｄｕｐｈａｍｏｘ（子ブタ１匹当たり０．６ｍｌ）を筋肉内投与したが、Ｂａｙｔｒｉｌ（子ブタ１匹当たり０．２５ｍｌ）を、輸送後に偶発的に細菌感染が起きる事態を予防するために、８日目、７日目及び６日目に投与した。チャレンジは、先述のようにして（Ｖｉｒｄｉｅｔａｌ（２０１３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１１０、２９、１１８０９−１１８１４）、実施した。簡単に言うと、子ブタには、６０ｍｌの重炭酸バッファー（蒸留水中の１．４％ＮａＨＣＯ３ｗ／ｖ）によって胃内ｐＨを中和した後で、鎮静（１ｍｌのアザペロン、Ｓｔｒｅｓｓｎｉｌｌ（Ｒ）Ｊａｎｓｓｅｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）下における胃内挿管により、１０１０個のＦ４−ＥＴＥＣ細菌（菌株ＧＩＳ２６Ｒｓｔｒｅｐ）を連続日にチャレンジした。チャレンジの最初の日は、予定表の中では、０日目として勘定に入れられている（図４Ａ）。抗体含有飼料は、チャレンジ前の３日間開始して、１０日間の期間にわたって投与した（図４Ａ）。チャレンジの日から１２日目までで糞便試料を収集して、ストレプトマイシンへの選択（１ｍｇ／ｍｌ）によって血液寒天プレート上において、Ｆ４−ＥＴＥＣチャレンジ済みの菌株ＧＩＳ２６Ｒｓｔｒｅｐのシェディングをモニタリングした。血液試料を採取して、１５日目（ウィーニング日）、４日目、７日目に、Ｆ４−ＥＴＥＣ特異的なＩｇＧ及びＩｇＡ力価をモニタリングした。動物を用いる特異的な試料の収集及び操作が、図４Ａに概略的に示されている。
【図１−１】
2020509026.tif 000007
【図１−２】
2020509026.tif 000008
【図１−３】
2020509026.tif 000009
【図１−４】
2020509026.tif 000010
【図２】
2020509026.tif 000011
【図３−１】
2020509026.tif 000012
【図３−２】
2020509026.tif 000013
【図３−３】
2020509026.tif 000014
【図３−４】
2020509026.tif 000015
【図３−５】
2020509026.tif 000016
【図４−１】
2020509026.tif 000017
【図４−２】
2020509026.tif 000018
【図４−３】
2020509026.tif 000019
【図４−４】
2020509026.tif 000020
【図５】
2020509026.tif 000021
【図６】
2020509026.tif 000022
【配列表】
2020509026000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年10月29日(2019.10.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）膜分離工程又はａ１４  深層ろ過工程によって、組換え真菌宿主細胞培養物の培地を処理するステップと、ここで、前記培地は、前記新規宿主細胞から分泌され、前記真菌宿主細胞に外因性である組換えポリペプチドを含み、ｉｉ）ステップｉ）において得られた培地を乾燥させるステップとによって得られる、乾燥配合物。
【請求項２】
ステップｉ）のあと、経口投与可能なマトリックスが添加される、請求項１に記載の乾燥配合物。
【請求項３】
ポリペプチドが、Ｆｃドメイン、特にＩｇＡ  Ｆｃドメインに融合している、請求項１又は２に記載の乾燥配合物。
【請求項４】
前記ペプチドが、予防用若しくは治療用ペプチドであり、又は前記ペプチドが、ワクチンであり、若しくはワクチンの部分を形成する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の乾燥配合物。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、免疫グロブリン単一可変ドメインである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の乾燥配合物。
【請求項６】
乾燥させることが、噴霧乾燥又は凍結乾燥させることによって実施される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の乾燥配合物。
【請求項７】
医薬品としての使用のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の乾燥配合物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の乾燥配合物及び医薬用賦形剤を含む、経口医薬組成物。
【請求項９】
胃腸疾患の治療を目的とした使用のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の乾燥配合物又は請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
口腔疾患の治療を目的とした使用のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の乾燥配合物又は請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ワクチンとしての使用のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の乾燥配合物又は請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の乾燥配合物を含む、食品又は食品製品。
【請求項１３】
機能性又は薬用食品製品である、請求項１２に記載の食品又は食品製品。
【請求項１４】
ポリペプチドが、ＩＬ２２である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の乾燥配合物又は請求項８に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
2020509026.tif 000023
2020509026.tif 000024
2020509026.tif 000025
2020509026.tif 000026
2020509026.tif 000027
2020509026.tif 000028
2020509026.tif 000029
2020509026.tif 000030
2020509026.tif 000031
2020509026.tif 000032
2020509026.tif 000033
2020509026.tif 000034