(57)【要約】  本発明は、捕捉分子に対する少なくとも１つの結合部位およびプローブに対する少なくとも１つの結合部位を含むウイルス粒子を定量的および／または定性的に測定するための方法、前記方法を実施するためのキット、ならびに様々な使用に関する。
2020500307.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
捕捉分子に対する少なくとも１つの結合部位およびプローブに対する少なくとも１つの結合部位を含むウイルス粒子を定量的および／または定性的に測定するための方法であって、
ａ）捕捉分子を基材上に固定化する工程と、
ｂ）ウイルス粒子を捕捉分子と接触させる工程と、
ｃ）捕捉分子に結合させることによってウイルス粒子を基材上に固定化する工程と、
ｄ）ウイルス粒子をプローブと接触させる工程と
ｅ）プローブをウイルス粒子に結合させる工程と、
を含み、
前記プローブは、特定の信号を発することができ、前記工程ｂ）および前記工程ｄ）は同時に、または前記工程ｄ）は前記工程ｂ）の前に行うことができる、
方法。
【請求項２】
プローブ信号の空間分解測定を行うことを特徴とする、
請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ウイルス粒子を、ウイルス、ビリオン、バクテリオファージ、およびそれらの部分もしくは断片を含む群またはそれらからなる群から選択することを特徴とする、
請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記基材が、プラスチック、ケイ素または二酸化ケイ素、好ましくはガラスからなることを特徴とする、
請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記工程ａ）の前に、前記基材が親水性表面を有することを特徴とする、
請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記工程ａ）の前に、前記基材上に親水性層を適用することを特徴とする、
請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記親水性層を、ＰＥＧ、ポリリジンおよびデキストランもしくはそれらの誘導体を含む群またはそれらからなる群から選択することを特徴とする、
請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記親水性層の適用前に、前記基材をヒドロキシル化し、反応性基（アミノ基）で官能化することを特徴とする、
請求項６記載の方法。
【請求項９】
アミノ基による官能化を、前記基材とＡＰＴＥＳ（３−アミノプロピルトリエトキシシラン）またはエタノールアミンとの接触によって行うことを特徴とする、
請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記基材とＡＰＴＥＳとの接触を気相中で行うことを特徴とする、
請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記捕捉分子が前記基材またはコーティングに共有結合していることを特徴とする、
請求項１から１０までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記ウイルス粒子の結合部位がエピトープであり、前記捕捉分子およびプロープが抗体またはアプタマーまたはそれらの組合せであることを特徴とする、
請求項１から１１までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
前記プローブが蛍光染料で標識されていることを特徴とする、
請求項１から１２までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
検出を空間分解能蛍光顕微鏡法によって行うことを特徴とする、
請求項１から１３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
以下の成分：
場合により親水性表面を有する基材、捕捉分子、プローブ、捕捉分子を有する基材、溶液、緩衝液
のうちの１つ以上を含む、
請求項１から１４までのいずれか１項記載の方法を実施するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、捕捉分子に対する少なくとも１つの結合部位およびプローブに対する少なくとも１つの結合部位を含むウイルス粒子を定量的および／または定性的に測定するための方法、前記方法を実施するためのキット、ならびに様々な使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスは、適切な宿主細胞内でのみ増殖することができる感染性粒子として定義されている。ウイルスは、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、タンパク質および場合により脂質からも構築されている。それらにはバクテリアに感染するバクテリオファージも含まれる。それらは全て独立した複製も独自の代謝も有しないので、それらは一般的な意見によれば生物として分類され得ない。個々のウイルス粒子は、上述の核酸のゲノムとタンパク質コートとからなる。追加のコートを有しているウイルス粒子も多い。そのような完全な感染性ウイルス粒子はウイルスの細胞外形態を表し、ビリオンとも呼ばれる。種にもよるが、感染性ウイルス粒子のサイズは１５ｎｍから３００ｎｍの間と小さいために、これまでに知られている直接検出法はほんの少ししかない。大部分の検出は、感染した細胞または生物の症状に基づいている。感染とは、一般的に、例えばウイルス粒子のような病原体が生物内に能動的または受動的に侵入し、残存し、続けて増殖することを言う。宿主細胞が原核生物として分類され得る場合、感染性ウイルス粒子はバクテリオファージと呼ばれる。
【０００３】
粒子のサイズが小さいために、これまでウイルス粒子の直接的な検出に唯一使用されてきたのが電子顕微鏡法である。この方法には、粒子としてのそれらの特性に基づきウイルスを検出することが含まれる。対応する関連機器のための高い費用に加えて、電子顕微鏡法は、異なるウイルス科を単に区別することを可能にするだけであり、対応する亜種の測定は可能ではない。さらに、サンプルは化学的または物理的に固定されていなければならず、その結果、機能性タンパク質がもはや存在しなくなるか、またはエピトープが変性またはマスキングされることになる。そのうえ、多数のウイルス粒子が存在している必要がある。
【０００４】
最新技術によれば、ウイルスまたはウイルス成分は、機能的な、抗体ベースまたはゲノムベースの技術、例えばウイルスＲＮＡまたはＤＮＡのＰＣＲベースの増幅およびハイブリダイゼーション依存性プローブによる同定によって検出される。
【０００５】
機能性ウイルスは、細胞変性効果を利用したプラークアッセイによって検出される。不活化ウイルスまたは非感染性粒子は取り込まれない。ゲノムベースの技術は、ウイルス粒子の量よりもウイルスＲＮＡ／ＤＮＡの量をより定量化する。
【０００６】
ウイルスタンパク質の連続エピトープは、ウエスタンブロッティングにおいて抗体を用いて検出することができる。
【０００７】
ウイルス感染が強く疑われる場合や、他の検出方法が肯定的な結果を提供できない場合には、ＰＣＲ技術が使用される。この技術には、ウイルス特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によってゲノムを増幅することが含まれる。ＲＮＡウイルスの場合、これには逆転写酵素によるＲＮＡのＤＮＡへの転写が必要である。アンプリコンは、特異的プローブによるハイブリダイゼーションによるか、または増幅されたＤＮＡの非特異的染色およびゲル電気泳動後のサイズ依存的同定によって検出される。
【０００８】
ＰＣＲベースの方法は、煩雑に校正されなければならず、厳密には定量的ではなく、そして汚染を非常に受けやすく、それは偽陽性結果をもたらし得る。実際には、それらはウイルスＤＮＡ／ＲＮＡの存在を決定するが、または時にはその一部の存在しか決定できないこともある。そのうえ、ＰＣＲ反応を阻害するサンプル成分は偽陰性結果を引き起こす可能性がある。したがって、サンプルは分析され得る前に必ず精製しなければならない。
【０００９】
内因性の抗ウイルス抗体を検出するイムノアッセイは、一般的に感染後わずか数週間で陽性結果をもたらすことがある（診断上のギャップ）。ＥＬＩＳＡ法は、一般的にウイルスのサブフラグメントの存在のみを検出し、無傷の粒子は検出しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、ウイルス粒子の超高感度検出を提供することである。更なる課題は、任意のサンプル中のウイルス粒子およびウイルス様粒子の検出を可能な限り少ない数で、したがって任意のサンプル中の個々の検出でさえも、特に培養不可能なウイルスについても可能にする方法を提供することである。それによって、任意のサンプル中のウイルス感染および汚染の検出を実施することが可能である。
【００１１】
さらに、ウイルス粒子の定性的検出だけでなく、任意のサンプル中のウイルス粒子の定量化および特性評価も可能であることが意図されている。それによって、第一に、粒子数の直接的かつ絶対的な定量化、第二に、ウイルス粒子の正確な特性評価が保証され、そのため型別が可能になることが意図されている。結果は、治療に伴う診断、鑑別診断および／またはウイルスアセンブリの分析において使用可能であることが意図されている。
【００１２】
この方法はさらに、タンパク質−タンパク質相互作用、つまり宿主−ウイルス相互作用の検出も保証することが意図されている。
【００１３】
検出は、例えば体液または剖検もしくは生検材料、器官からのエクスビボのような任意のサンプルから直接いくつかの簡単な工程で可能であるが、例えば水サンプル、植物および土壌サンプル、ならびに食物のような環境からのサンプルからも可能であることが意図されている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
これらの課題は、捕捉分子に対する少なくとも１つの結合部位およびプローブに対する少なくとも１つの結合部位を含むウイルス粒子を定量的および／または定性的に測定するための方法によって解決される。この方法は、以下の工程：
ａ）捕捉分子を基材上に固定化する工程、
ｂ）ウイルス粒子を捕捉分子と接触させる工程、
ｃ）捕捉分子に結合させることによってウイルス粒子を基材上に固定化する工程、
ｄ）ウイルス粒子をプローブと接触させる工程および
ｅ）プローブをウイルス粒子に結合させる工程
を含み、ここで、プローブは、特定の信号を発することができ、工程ｂ）およびｄ）は同時に、またはｄ）はｂ）の前に行うことができる。
【００１５】
工程ｂ）およびｄ）が同時に行われる場合、したがって、工程ｃ）およびｅ）も同時に実施される。
【００１６】
工程ｄ）が工程ｂ）の前に実施される更なる変形形態では、したがって、プローブで標識されたウイルス粒子が工程ｃ）において基材上に固定化される。したがって、工程ｅ）も工程ｂ）およびｃ）の前に実施される。
【００１７】
本発明の文脈において、「定量的測定」は、まず第一にウイルス粒子の濃度の測定、したがってそれらの存在または非存在の測定も意味する。
【００１８】
好ましくは、定量的測定はまた、特定のウイルス型の選択的定量化も意味する。そのような定量化は、適切なプローブを介して制御することができる。
【００１９】
本発明の文脈において、「定性的測定」は、例えば形態の測定などのウイルス粒子の特性評価を意味する。
【００２０】
ウイルス粒子は、検出に役立つ１つまたは複数のプローブで標識される。一変形形態では、少なくとも２、３、４、５、６、７またはそれ以上のプローブが使用される。更なる変形形態では、２、３、４、５、６、７またはそれ以上の異なるプローブが使用される。
【００２１】
プローブには、ウイルス粒子に対して親和性を有し、そしてウイルス粒子の結合部位を認識し、それに結合する分子または分子部分が含まれる。そのうえ、プローブには、ウイルス粒子に対して親和性を有する分子または分子部分に共有結合しており、かつ化学的または物理的方法によって検出および測定可能である少なくとも１つの検出分子または分子部分が含まれる。
【００２２】
一代替形態では、プローブは、異なる検出分子（または部分）を有する同一の親和性分子または分子部分を含むことができる。更なる代替形態では、異なる親和性分子または分子部分が異なる検出分子または部分と組み合わされていてよいか、あるいは代替的に異なる親和性分子または部分が同一の検出分子または部分と組み合わされていてよい。様々なプローブの混合物を使用することも可能である。
【００２３】
異なる検出分子または分子部分に結合した複数の異なるプローブの使用は、第一に、信号（相関信号）の特異性を高め、第二に、これは、１つ以上の特徴において異なるウイルス粒子の同定を可能にする。これにより、ウイルス粒子の選択的定量化および特性評価が可能になる。
【００２４】
一実施形態では、プローブ信号の空間分解測定、すなわちプローブによって放出された信号の空間分解検出が行われる。したがって、本発明のこの実施形態は、ＥＬＩＳＡまたはサンドイッチＥＬＩＳＡなどの非空間的に分解された信号に基づく方法を除外する。これらの方法にはまた、ＥＬＩＳＡ様の方法、すなわち、非空間的に分解された信号に基づいているが、「バルク」測定、換言すれば：集団測定：したがって、個々の粒子の信号ではなく、全容量セグメントの信号が検出されるならば、検出が酵素呈色反応に基づくか、または蛍光的、磁気的もしくは放射能的に標識されたプローブもしくは抗体の検出に基づくかどうかにかかわらず、全てのイムノアッセイに基づいている全ての方法が含まれる。
【００２５】
本発明による方法は、以下の特徴によってさらに特徴付けられる：
無傷の破壊されていないウイルス粒子（すなわち破壊されていないウイルス）の測定；これらの粒子の数および／または形態の測定；個々の粒子の調査または分析、したがってアンサンブル測定ではない；１００粒子／μｌ以下の低濃度の測定および分析；空のウイルスコートと、コート以外に、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、コートのものとは異なるタンパク質などの更なる成分を含むウイルス粒子との間の区別；
しかしながら、検出において、高い空間分解能は有利ではあるが必須ではない。本発明による方法の一実施形態では、例えば機器固有のノイズ、他の非特異的信号または非特異的結合プローブによって引き起こされるバックグラウンド信号に対してウイルスまたはウイルス様粒子を検出するのに十分なデータポイントが収集される。このようにして、例えばピクセルのような空間的に分解された事象が存在するのと同数の値が読み出される（読み出し値）。空間分解能によって、各事象がそれぞれのバックグラウンドに対して測定され、そのため空間的に分解された信号がないＥＬＩＳＡ法よりも有利である。
【００２６】
一実施形態では、プローブ信号の空間分解測定は、数フェムトリットルから１フェムトリットル未満の範囲内の、サンプルの体積と比較した小体積要素の調査、または５００ｎｍ、好ましくは３００ｎｍ、特に好ましくは２５０ｎｍ、特に２００ｎｍの高さでの捕捉分子の接触表面より上の体積領域の調査に基づく。
【００２７】
本発明の文脈において、ウイルス粒子は、ウイルス、ビリオン、バクテリオファージ、およびそれらの部分もしくは断片を含む群またはそれらからなる群から選択される。ウイルス様粒子は、例えば、複製できないウイルスコート、それらの一部もしくは断片である。本発明の文脈において、ウイルスという用語はまた、ウイルス様粒子、ならびにいずれの場合もウイルスおよび／またはウイルス様粒子の一部もしくは断片を包含する。
【００２８】
分類学的に、ウイルスは、キャプシド、すなわちタンパク質からなるコートを有するウイルスと、脂質からなるコート、ウイルスタンパク質が埋め込まれた脂質二層膜を有するウイルスとに分類することができる。本発明の文脈において、本発明による全てのウイルス粒子は、それに応じて、したがって、脂質を含有するコートまたはコートの一部と、場合によってはタンパク質からなるコートまたはコートの一部をさらに有する粒子と、タンパク質からなるコートまたはコートの一部を単に有する粒子とに区分され得る。
【００２９】
個々の粒子を検出および分析する可能性に基づき、異なるキャッチャーおよびプローブを適切に選択することによって、１つのサンプル中で異なるウイルスを同時に分析することも可能である。したがって、この方法は鑑別診断にも使用することができる。
【００３０】
この方法は、人体内および／または人体上ではなく、エクスビボ、したがってインビトロで実施される。
【００３１】
本発明によれば、ウイルス粒子の部分または断片は少なくとも２つの結合部位を含む部分である。
【００３２】
一実施形態では、基板の材料は、プラスチック、ケイ素および二酸化ケイ素を含む群またはそれらからなる群から選択される。好ましい代替形態では、使用される基材はガラスである。
【００３３】
本発明の更なる実施形態では、捕捉分子は基材に共有結合している。
【００３４】
このために、一代替形態で使用される基材は、親水性表面を有する。一代替形態では、これは、工程ａ）の前に親水性層を基材に適用することによって達成される。したがって、捕捉分子は、基材、または基材が担持されている親水性層に共有結合する。
【００３５】
親水性層は生体分子忌避層であり、そのため基材への生体分子の非特異的結合が最小限に抑えられることを意味する。捕捉分子はこの層上に、好ましくは共有結合的に固定化される。これらはウイルス粒子の特徴に対して親和性を有する。捕捉分子は全て同一でも異なる捕捉分子の混合物でもよい。一代替形態では、使用される捕捉分子およびプローブは同じ分子であり、好ましくは、捕捉分子は検出分子または分子部分を含まない。
【００３６】
一実施形態では、親水性層は、ＰＥＧ、ポリリジン、好ましくはポリＤ−リジン、およびデキストランもしくはそれらの誘導体、好ましくはカルボキシメチル−デキストラン（ＣＭＤ）を含む群またはそれらからなる群から選択される。本発明の文脈における誘導体は、いくつかの置換基において親化合物とは異なる化合物であり、それらの置換基は本発明による方法に対して不活性である。
【００３７】
一実施形態では、基材の表面を、親水性層の適用前に最初にヒドロキシル化し、続けて適切な化学基、好ましくはアミノ基で官能化する。一代替形態では、アミノ基によるこの官能化は、基材をアミノシラン、好ましくはＡＰＴＥＳ（３−アミノプロピルトリエトキシシラン）と、またはエタノールアミンと接触させることによって行われる。
【００３８】
コーティング用の基材を調製するために、以下の工程のうちの１つ以上が実施される：
−  ガラス製の基材またはスライドガラスを超音波浴槽またはプラズマクリーナーで洗浄するか、あるいは５ＭのＮａＯＨ中で少なくとも３時間インキュベートする工程、
−  水ですすぎ、続けて窒素下または真空下で乾燥する工程、
−  水酸基を活性化するために、３：１の比の濃硫酸と過酸化水素とからなる溶液に浸漬する工程、
−  中性ｐＨまで水ですすぎ、続けてエタノールですすぎ、そして窒素雰囲気下で乾燥する工程、
−  ３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）（１〜７％）を含む溶液、好ましくは乾燥トルエン、またはエタノールアミンの溶液に浸漬する工程、
−  アセトンまたはＤＭＳＯと水ですすぎ、窒素雰囲気下で乾燥する工程。
【００３９】
一代替形態では、基材を、アミノシラン、好ましくはＡＰＴＥＳと気相中で接触させる；したがって、場合により前処理された基材をアミノシランと共に蒸着に付す。
【００４０】
デキストラン、好ましくはカルボキシメチル−デキストラン（ＣＭＤ）でのコーティングのために、基材をＣＭＤの水溶液（１０ｍｇ／ｍｌまたは２０ｍｇ／ｍｌの濃度で）および場合によりＮ−エチル−Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（２００ｍＭ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（５０ｍＭ）と共にインキュベートし、続けて洗浄する。
【００４１】
一変形形態では、カルボキシメチルデキストランは、上記のように、最初にヒドロキシル化され、続けてアミン基で官能化されたガラス表面に共有結合される。
【００４２】
使用される基材は、好ましくはガラスベースのマイクロタイタープレートであることもできる。ポリスチレンフレームを使用する場合、濃硫酸の使用は不可能であるので、ガラス表面は、本発明の一実施変形形態では、Janissen et al. (Colloids Surf B Biointerfaces, 2009, 71(2), 200-207)と同様に活性化される。
【００４３】
この親水性層上に（好ましくは共有結合的に）固定化されているのは、検出すべきウイルス様またはウイルス粒子の特徴（例えばタンパク質）に対して親和性を有する捕捉分子である。捕捉分子は全て同一でも異なる捕捉分子の混合物でもよい。
【００４４】
本発明の一実施形態では、捕捉分子（好ましくは抗体）は、場合によりＥＤＣ／ＮＨＳ（それぞれ２００ｍＭと５０ｍＭ）の混合物によるＣＭＤコーティング支持体の活性化後に基材上に固定化される。
【００４５】
捕捉分子が結合していない残りのカルボキシレート末端基は不活性化することができる。ＣＭＤスペーサー上のこれらのカルボキシレート末端基を不活性化するために、ＤＭＳＯ中のエタノールアミンが使用される。サンプルの適用前に、基材または支持体を場合によりＰＢＳですすぐ。
【００４６】
測定すべきサンプルを、このようにして調製した基材と接触させ、場合によりインキュベートする。調査すべきサンプルとして、内因性の液体または組織を使用することができる。本発明の一実施形態では、サンプルは、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液、血漿および尿から選択される。しかし、対象の食物や採取物もサンプルとして用いられる。サンプルは、当業者に知られている様々な処理工程を通過することができる。
【００４７】
本発明の一実施形態では、サンプルは、場合により基材の活性化されていてもよい表面上への共有結合によって、基材（非コーティング基材）上に直接適用される。
【００４８】
本発明の一変形形態では、サンプルの前処理は、以下の方法のうちの１つ以上によって行われる：
−  サンプルの加熱、
−  １回以上の凍結融解サイクル、
−  機械的融解、
−  サンプルの均質化、
−  水または緩衝液による希釈、
−  酵素、例えばプロテアーゼ、ヌクレアーゼ、リパーゼによる処理、
−  遠心分離、
−  沈殿、
−  場合によっては存在する抗体を置換するためのプローブによる競合。
【００４９】
好ましくは、サンプルは直接および／または前処理なしで基材と接触させられる。
【００５０】
非特異的に結合した物質は、洗浄工程により除去することができる。
【００５１】
更なる工程では、固定化されたウイルス様粒子またはウイルス粒子は、更なる検出に役立つ１つ以上のプローブで標識される。上記のように、個々の工程は、本発明に従って他の順序で実施することもできる。
【００５２】
適切な洗浄工程によって、ウイルス粒子に結合していない過剰のプローブが除去される。
【００５３】
一代替形態では、これらの過剰のプローブは除去されない。それによって、最後の洗浄工程が省略され、ウイルス粒子−プローブ複合体または結合の解離の方向に平衡シフトも生じない。空間的に分解された検出によって、過剰のプローブは評価に取り込まれず、測定を損なわない。
【００５４】
一変形形態では、ウイルス粒子−捕捉分子複合体は、基材上への固定化に加えて化学的に固定されており、すなわち、ウイルス粒子と捕捉分子とは、結合部位を介した結合に加えて、化学結合、好ましくは共有結合によって互いに結合されており、そのため解離が防止される。
【００５５】
一代替形態では、プローブ−ウイルス粒子−捕捉分子複合体は、基材上への固定化に加えて化学的に固定されており、すなわち、プローブ、ウイルス粒子および捕捉分子は、結合部位を介した結合に加えて、化学結合、好ましくは共有結合によって互いに結合されており、そのため解離が防止される。
【００５６】
別の代替形態では、プローブ−ウイルス粒子複合体は化学的に固定されており、すなわちウイルス粒子とプローブとは、結合部位を介した結合に加えて、化学結合、好ましくは共有結合によって互いに結合されており、そのため解離が防止される。続けて基材上に固定化される。
【００５７】
一実施形態では、ウイルス粒子の結合部位はエピトープであり、捕捉分子および／またはプローブは抗体またはアプタマーまたはそれらの組合せである。一変形形態では、捕捉分子および／またはプローブは抗体である。本発明の一変形態様では、捕捉分子およびプローブは同一であり得る。
【００５８】
本発明の一実施形態では、捕捉分子とプローブとは異なる。例えば、異なる抗体を捕捉分子およびプローブとして使用することができる。本発明の更なる実施形態では、任意の（染料）標識を除いて互いに同一である捕捉分子およびプローブが使用される。本発明の一代替形態では、任意の（染料）標識を除いて互いに同一である様々なプローブが使用される。本発明の更なる代替形態では、異なる抗体を含み、かつ場合により異なる染料標識も有する少なくとも２つ以上の異なる捕捉分子および／またはプローブが使用される。
【００５９】
検出のために、プローブは、それらが蛍光発光、生物ルミネセンス発光および化学ルミネセンス発光ならびに吸光からなる群から選択される光学的に検出可能な信号を発することを特徴とする。
【００６０】
したがって、一代替形態では、プローブは蛍光染料で標識されている。蛍光染料として、当業者に知られている染料を使用することができる。あるいは蛍光生体分子、好ましくはＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、それらのコンジュゲートおよび／または融合タンパク質、ならびに量子ドットを使用することも可能である。
【００６１】
表面のその後の品質管理、例えば捕捉分子を有するコーティングの均一性のために、蛍光染料で標識された捕捉分子を使用することが可能である。このために、検出を妨害しない染料を使用することが好ましい。それによって可能なのは、事後の構造管理および測定結果の正規化である。
【００６２】
固定化され標識されたウイルス様またはウイルス粒子の検出は、表面の画像化（例えば、レーザー顕微鏡法）によって行われる。可能な限り高い空間解像度により多数のピクセルが確認され、その結果、構造的特徴が同時に撮像および分析され得るので、アッセイの感度および選択性を高めることができるようになる。したがって、特異的信号はバックグラウンド信号（例えば、非特異的に結合したプローブ）に対して高まる。
【００６３】
検出は、好ましくは共焦点蛍光顕微鏡法、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）により、特に相互相関法およびレーザー走査型顕微鏡（ＬＳＭ）と組み合わせて実施される。
【００６４】
検出は、本発明の一代替形態では、共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて実施される。
【００６５】
本発明の一実施形態では、例えばレーザー走査型顕微鏡法（ＬＳＭ）で使用されるようなレーザー焦点、またはＦＣＳ（蛍光相関分光システム）が、このために、例えばＳＴＥＤ、ＰＡＬＭまたはＳＩＭなどの対応する超解像変法と同様に使用される。
【００６６】
更なる実施形態では、検出は、空間分解能蛍光顕微鏡法、好ましくはＴＩＲＦ顕微鏡、および例えばＳＴＯＲＭ、ｄＳＴＯＲＭのような対応する超解像変法によって達成することができる。
【００６７】
したがって、好ましくはＬＳＭおよび／またはＴＩＲＦ、特に好ましくはＴＩＲＦが検出のために使用される。
【００６８】
ＥＬＩＳＡとは対照的に、これらの方法は、空間的に分解された事象（例えばピクセル）が存在するのと同数の読み出し値を生じさせる。異なるプローブの数に応じて、この情報はさらに倍増する。この倍増は、ウイルス様またはウイルス粒子に関する更なる特性（例えば第２の特徴）を開示するので、あらゆる検出事象に適用され、情報の獲得につながる。そのような設定によって、信号の特異性を任意の事象について高めることができる。
【００６９】
プローブは、個々のウイルス構成要素（例えば個々のコート／キャプシド−タンパク質分子）の存在が測定結果に影響を及ぼさないように選択することができる。プローブは、ウイルス種および亜種（血清型）が任意の個々のウイルス粒子について測定され得るように選択することができる。追加のプローブを、例えばＤＮＡ／ＲＮＡ結合フルオロフォア（ＥｔＢｒ、ＥｔＩ）によって、ＤＮＡ／ＲＮＡ含有ウイルスコートと「空の」ウイルスコートとを区別することが可能となるように選択することができる。
【００７０】
評価のために、使用され検出された全てのプローブの空間的に分解された情報（例えば蛍光強度）は、例えばウイルス様またはウイルス粒子の数、それらのサイズおよびそれらの特徴を測定するために考慮される。同時に、例えば、バックグラウンド最小化のアルゴリズムおよび／または強度閾値も更なる評価およびパターン認識に使用することが可能である。更なる画像分析オプションには、例えば、画像情報から検出されたウイルス粒子の数を得るための局所強度極大の調査が含まれる。
【００７１】
アッセイ結果を（除去、時間および実験者にわたって）互いに比較可能にするために、標準（内部および／または外部）を使用することができる。
【００７２】
したがって、本発明の一実施形態では、標準、特に国際公開第２０１６／１４６０９３号(WO 2016/146093 A)に記載されているような標準が使用される。これらは校正標準および／または内部標準として使用されるのが好ましい。本発明によれば、このために使用されるものは、ウイルスのサイズ、したがって直径１０〜５００ｎｍ、好ましくは直径２０〜２００ｎｍに対応する標準である。上述の国際公開第２０１６／１４６０９３号(WO 2016/146093 A)による方法においてエピトープを含有するかまたはそれからなるウイルス粒子のコートタンパク質の一部が結合している無機ナノ粒子を基体として使用するのが好ましい。
【００７３】
一実施形態では、そのような標準は、以下の工程で調製される：
Ａ）分析すべきウイルス粒子のサイズ（１０〜５００ｎｍ、好ましくは２０〜２００ｎｍ）を有する無機ナノ粒子を用意する工程、
Ｂ）ナノ粒子表面を官能化してアミンまたはカルボキシ官能化ナノ粒子を形成するために、ナノ粒子の表面に遊離アミノ基または遊離カルボキシ基を形成する工程、
Ｃ）
ｉ）工程Ｂ）における遊離アミノ基にマレインイミド−スペーサー−カルボン酸を結合する工程、または
ｉｉ）工程Ｂ）における遊離カルボキシ基をＮＨＳエステルに変換する工程、
Ｄ）少なくとも１つのエピトープを含有するかもしくはそれからなるコートもしくはコートの一部を、
ｉ）少なくとも１つのエピトープを含有するかもしくはそれからなるコートもしくはコートの一部の遊離末端におけるスルフヒドリル基を介してマレインイミド−スペーサー−カルボン酸に結合させるか、または
ｉｉ）少なくとも１つのエピトープを含有するかもしくはそれからなるコートもしくはコートの一部の遊離末端におけるアミノ基を介してＮＨＳ−エステルに結合させる工程。
【００７４】
シリカナノ粒子を調製するための工程Ａ）におけるストーバー合成(Stoebersynthese)を特徴とする、上記の方法。
【００７５】
工程Ｂ）でエタノール中のアミノプロピルトリエトキシシランで表面をシラン化して遊離アミノ基を形成することを特徴とする、上記の方法。
【００７６】
工程Ｂ）でアミノ基と無水コハク酸との反応による遊離カルボキシ基の形成を特徴とする、上記の方法のいずれかに記載の方法。
【００７７】
マレインイミド−スペーサー−カルボン酸が、工程Ｃ）ｉ）で工程Ｂ）の遊離アミノ基に結合される前にＮＨＳエステルに変換される、上記の方法のいずれかに記載の方法。
【００７８】
工程Ｃ）ｉ）からのマレインイミド−スペーサー−カルボン酸または工程Ｂ）からの遊離カルボキシ基と１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドおよび／またはＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの反応により工程Ｃ）ｉ）の前または工程Ｃ）ｉｉ）においてＮＨＳエステルに変換することを特徴とする、上記の方法のいずれかに記載の方法。
【００７９】
工程Ｄ）ｉｉ）で少なくとも１つのエピトープを含有するかまたはそれからなるコートまたはコートの一部のアミノ基とＮＨＳエステルとの共有結合を特徴とする、上記の方法のいずれかに記載の方法。
【００８０】
工程Ｃ）ｉｉ）の実施後にストレプトアビジン分子が、ナノ粒子のＮＨＳエステル上に配置され、工程Ｄ）の前にビオチン基が、タンパク質凝集体の少なくとも１つのエピトープを含有するかまたはそれからなるコートまたはコートの一部に配置されることを特徴とする、上記の方法のいずれかに記載の方法。
【００８１】
本発明の一実施形態では、本発明による方法を使用して達成することができるのは、校正標準または外部もしくは内部標準を使用せずに懸濁液中のウイルス粒子の数である。このために、場合により最初に調製されるものは濃度系列の連続希釈ウイルス粒子である。この系列は、本発明による方法を用いて分析される。これに関連して、異なる位置（例えば５×５の位置）で反応チャンバー毎に連続的に記録されるものは、それぞれ２つの蛍光チャネル（励起／発光＝６３５／７０５ｎｍおよび４８８／５２５ｎｍ）における２つの画像である。両方のチャネルについて、最大レーザー出力（１００％）、露光時間５００ｍｓおよびゲイン値８００を選択することができる。次いで画像データが評価される。このために、各チャネルの強度閾値は陰性対照に基づいて確認される。この閾値について、陰性対照の全画像が各チャネルについて平均され、確認されたのは、その値を超えるとピクセル全体（エルゴ１０００ピクセル）のわずか０．１％のみが存在する強度値である。評価工程では、各チャネルの各画像に対して最初に強度閾値が適用され、続けて同じ位置の画像が両方の値において互いに比較される。画像毎にカウントされるのは、両方のチャネルにおいて、まったく同じ位置にあるピクセルがチャネルの強度閾値を超えているピクセルだけである。最後に、各反応チャンバー内の全ての画像にわたってピクセル数が平均され、その後、複製値の平均ピクセル数の平均値が確認され、標準偏差が特定される。
【００８２】
更なる評価において、各記録について乗算されるのは、蛍光カラーチャネルが得られた両方の画像からの各対応するピクセルのグレースケール値である。結果として得られる画像、またはグレースケール値マトリックスは、数ピクセル、例えば４ピクセルの標準偏差で２Ｄガウス関数（「imgaussfilt」）に基づいて平滑化される。続けて、関数「imregionalmax」に基づく局所極大の測定が行われる。閾値を超える局所極大の数は、ここでは粒子の数に対応し、ここで、閾値は上で確認されたものに対応する。このようにして、各記録について粒子の数が測定され、平均値が同じ濃度の反応チャンバーにわたって形成される。これによりウイルス粒子の絶対数を特定することが可能である。正確な説明は、実施例５および６から得られる。
【００８３】
本発明の対象はまた、標準を使用せずに、特に校正標準または外部もしくは内部標準を使用せずに、懸濁液中のウイルス粒子の絶対数を測定するための方法である。
【００８４】
本発明の対象はまた、以下の成分のうちの１つ以上を含むキットである:
場合により親水性表面を有する基材、捕捉分子、プローブ、捕捉分子を有する基材、溶液、緩衝液。
【００８５】
本発明のキットの化合物および／または成分は、場合により緩衝液および／または溶液と共に／中で容器に包装されていてよい。あるいはいくつかの成分が同じ容器に包装されていてもよい。これに加えて、またはこれに代わるものとして、例えばガラス板、チップ、もしくはナイロン膜のような固体支持体に、またはマイクロタイタープレートのウェルに、成分の１つ以上が吸着されていてもよい。キットはさらに、任意の実施形態についてのキットの使用説明書を含み得る。
【００８６】
キットの更なる変形形態では、上記の捕捉分子は基材上に固定化されている。さらに、キットは溶液および／または緩衝液を含み得る。生体分子忌避表面（例えばデキストラン表面）および／またはその上に固定化された捕捉分子を保護するために、これらを溶液または緩衝液でコーティングすることができる。一代替形態では、溶液は、表面の貯蔵寿命を延ばす１種以上の殺生物剤を含有する。
【００８７】
本発明の更なる対象は、任意のサンプル中のウイルス粒子およびウイルス様粒子の検出、ウイルス粒子およびウイルス様粒子の定量化（力価測定）、ウイルス感染の検出、ウイルス汚染の検出、有効な抗ウイルス成分の開発における使用、粒子数の直接的かつ絶対的な定量化、治療に伴う診断（ターゲットエンゲージメント）、ウイルスアセンブリの分析、鑑別診断、タンパク質間相互作用の検出（宿主／ウイルス）および／またはウイルスのタイピングのための本発明による方法の使用である。
【００８８】
本発明の更なる対象は、例えばウイルス粒子またはウイルス様粒子の力価測定による、感染症の治療のモニタリングならびに有効成分および／または治療方法の有効性のモニタリングおよび／またはチェックのための本発明による方法の使用である。これは臨床試験や臨床実験の他に治療モニタリングにも使用することができる。このために、サンプルは本発明による方法に従って測定され、結果が比較される。
【００８９】
本発明の更なる対象は、ウイルスに対する有効成分の有効性を測定するための本発明による方法の使用であって、この場合、サンプルの結果が互いに比較される。サンプルは、有効成分の投与もしくは治療方法の実施の前後、またはその後の異なる時点で採取された体液である。本発明によれば、結果は、有効成分および／または治療方法に供されていない対照と比較される。有効成分および／またはその投与量および／または治療方法は結果に基づいて選択される。
【００９０】
本発明は更なる対象は、ヒトが臨床実験に含まれるかどうかを測定するための本発明による方法の使用である。このために、本発明による方法に従ってサンプルが測定され、限界値を参照して決定が下される。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】陰性ヒトＥＤＴＡ血漿中の濃度系列の連続希釈Ｍ１３ファージを示す図である。
【図２】ＴＲＩＳ緩衝食塩水中の濃度系列の連続希釈Ｍ１３ファージを示す図である。
【図３】ヘキスト染色を含有するＴＢＳ中の濃度系列の連続希釈Ｍ１３ファージを示す図である。
【図４】ヘキスト染色を用いた測定後の図３からのファージを示す図である。
【図５】細胞培養培地からのＴＢＳ中に希釈されたＨＩＶ安全株の濃度系列の連続希釈ウイルス粒子を示す図である。
【図６】図５からのデータの個々の希釈段階における１μｍ２当たりのウイルス粒子の数を示す図である。
【実施例】
【００９２】
実施例１
実験は、３８４個の反応チャンバー（ＲＣ）を含む市販の３Ｄ  ＮＨＳマイクロタイタープレート（ＰｏｌｙＡｎ  ＧｍｂＨ）中で実施した。マイクロタイタープレートのＲＣを、捕捉分子として抗体：クローン抗ｇｐ８−Ｅ１（製品番号ＡＢＩＮ７９３８４０、ロット番号７７４１０、ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−ｏｎｌｉｎｅ．ｃｏｍ）でコーティングした（１５μｌ；１００ｍＭ  ＭＥＳ中１０μｇ／ｍｌ、ｐＨ＝４．７；一晩インキュベート）。その後、ＲＣを、それぞれ０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）およびＰＢＳで３回洗浄および吸引することからなる洗浄プログラムにかけた。次の工程で、ＲＣを５０μｌのＳｍａｒｔｂｌｏｃｋ（Ｃａｎｄｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＧｍｂＨ）で室温（ＲＴ）にて１時間コーティングし、この時間が経過した後、再び上記の洗浄プログラムにかけた。その後、ヒトＥＤＴＡ血漿中で４倍に逐次希釈した１５μｌのサンプルをそれぞれＲＣ中にロードし、室温でインキュベートした。一晩インキュベートした後、ＲＣを洗浄プログラムにより洗浄し、ＲＣを吸引乾燥し、そして検出抗体をロードした。
【００９３】
検出抗体はいずれの場合も１種類の蛍光染料で標識した。抗体ＲＬ−ｐｈ１（製品番号ＬＳ−Ｃ１４６７５０、ＬｉｆｅＳｐａｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）を蛍光染料ＣＦ４８８で標識し、抗体ＬＲＬ−ｐｈ２（製品番号ＬＳ−Ｃ１４６７５１、ロット番号７６９５５、ＬｉｆｅＳｐａｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）を蛍光染料ＣＦ６３３で標識した。検出抗体をＰＢＳ中で一緒に希釈して、各抗体について１．２５ｎｇ／ｍｌの最終濃度を得た。１ＲＣあたり１５μｌの抗体溶液をロードし、室温で１時間インキュベートした。この時間が経過した後、プレートを０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで５回およびＰＢＳで５回洗浄した。完全に吸引した後、ＲＣを２０μｌの水で満たし、プレートをフィルムで密封した。
【００９４】
測定は、１００倍の油浸対物レンズを備えたＴＩＲＦ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）で行った。このために、マイクロタイタープレートのガラスベースを液浸油で十分に塗り付け、プレートを顕微鏡の自動ステージに導入した。その後、５×５の位置でＲＣ毎に連続して記録されたものは、それぞれ２つの蛍光チャネル（励起／発光＝６３５／７０５ｎｍおよび４８８／５２５ｎｍ）における２つの画像であった。両方のチャネルについて、最大レーザー出力（１００％）、露光時間５００ｍｓおよびゲイン値１３００を選択した。その後に画像データを評価した。
【００９５】
分析のために、最初に８００の二次ＲＯＩを使用した。これは、各画像のそれぞれの側の最も外側の１００ピクセルがそれぞれ評価に含まれなかったことを意味し、したがって１０００×１０００ピクセルの画像から８００×８００ピクセルの画像が生成される。次の工程で、各チャネルの強度閾値を陰性対照に基づいて確認した。この閾値について、陰性対照の全画像を各チャネルについて平均し、確認されたのは、その値を超えるとピクセル全体（エルゴ６４０ピクセル）のわずか０．１％のみが存在する強度値であった。評価工程では、各チャネルの各画像について最初に強度閾値を適用し、続けて同じ位置の画像を両方の値において互いに比較した。画像毎にカウントされるのは、両方のチャネルにおいて、まったく同じ位置にあるピクセルがチャネルの強度閾値を超えているピクセルだけであった。最後に、各反応チャンバー内の全ての画像についてピクセル数を平均し、その後、複製値の平均ピクセル数の平均値を確認し、標準偏差を特定した。
【００９６】
結果を図１にまとめている。
図１は、陰性ヒトＥＤＴＡ血漿中の濃度系列の連続希釈Ｍ１３ファージ（Ｐｈ．Ｄ．−７  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ；製品番号Ｅ８１０２Ｌ、ロット番号００６１００５、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を示す。この図は、５ｌｏｇ希釈工程にわたる測定信号とＭ１３ファージの濃度との間の線形関係およびバックグラウンドに対する最低濃度の識別可能性を示す。
【００９７】
実施例２
その結果を図２にまとめている実験は、実施例１と同様に実施したが、ただし、ファージはヒト血漿中ではなくＴＲＩＳ緩衝食塩水中で希釈した。これもまた異なる強度閾値を生じさせたが、それらは同じ規則を用いて確認された（陰性対照の０．１％）。実施例１と同様に評価を行った。
【００９８】
実施例３
ヘキスト染色を用いた測定後のファージを示す。
実験のために、３８４個の反応チャンバー（ＲＣ）を含む市販のマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ；Ｓｅｎｓｏｐｌａｔｅ  Ｐｌｕｓ）を使用した。最初にマイクロタイタープレートの表面を構築した。このために、プレートをデシケーターに入れ、その中にトルエン中５％のＡＰＴＥＳを含むボウルを配置した。デシケーターをアルゴンで満たし、１時間インキュベートした。その後、ボウルを取り除き、プレートを真空下で２時間乾燥した。脱イオン化Ｈ２Ｏ中のＳＣ−ＰＥＧ−ＣＭ（ＭＷ３４００；Ｌａｙｓａｎ  Ｂｉｏ）の２ｍＭ溶液２０μｌを乾燥プレートの反応チャンバーに充填し、４時間インキュベートした。インキュベーション後、ＲＣを水で３回洗浄し、続けてそのつど２０μｌの２００ｍＭのＥＤＣ水溶液（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド；Ｓｉｇｍａ）および５０ｍＭのＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓｉｇｍａ）と共に３０分間インキュベートした。プレートを再び脱イオン水で３回洗浄した。その後、ＲＣを、捕捉分子としてクローン抗ｇｐ８−Ｅ１（製品番号ＡＢＩＮ７９３８４０、ロット番号７７４１０、ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−ｏｎｌｉｎｅ．ｃｏｍ）抗体でコーティングした（２０μｌ；ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ；１時間）。続けて、ＲＣを、それぞれ０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＴＢＳおよびＴＢＳで３回洗浄および完全吸引することからなる洗浄プログラムで処理した。次の工程で、ＲＣを、５０μｌのＳｍａｒｔｂｌｏｃｋ（Ｃａｎｄｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＧｍｂＨ）で室温（ＲＴ）にて一晩コーティングし、この時間が経過した後、再びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝食塩水（ＴＢＳ；ｐＨ＝７．４）を用いて３回洗浄および完全吸引した。サンプルを、染料ヘキスト染色（１μｇ／ｍｌ）を含有するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）緩衝液中で順次希釈し、１時間インキュベートした。その後、１５μｌのサンプルをそれぞれ３通りにＲＣにロードし、室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ＲＣをＴＢＳで３回洗浄し、この時間が経過した後、プレートをＴＢＳで３回洗浄した。完全吸引後、ＲＣを２０μｌのＴＢＳで満たし、プレートをフィルムで密封した。
【００９９】
測定は、１００倍の油浸対物レンズを備えたＴＩＲＦ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）で行った。このために、マイクロタイタープレートのガラスベースを液浸油で十分に塗り付け、プレートを顕微鏡の自動ステージに導入した。その後、５×５の位置でＲＣ毎に連続して記録されたものは、蛍光チャネル（励起／発光＝４０５／４５０ｎｍ）における１つの画像であった。最大レーザー出力（１００％）、露光時間５００ｍｓおよびゲイン値８００を選択した。その後に画像データを評価した。チャネルについては、強度閾値を４０００グレースケールに設定した。評価工程では、各チャネルの各画像について最初に強度閾値を適用し、続けて同じ位置の画像を両方の値において互いに比較した。画像毎にカウントされるのは、両方のチャネルにおいて、まったく同じ位置にあるピクセルがチャネルの強度閾値を超えているピクセルだけであった。最後に、各反応チャンバー内の全ての画像についてピクセル数を平均し、その後、複製値の平均ピクセル数の平均値を確認し、標準偏差を特定した。
【０１００】
結果を図３にまとめている。
図３は、ヘキスト染色を含有するＴＢＳ中の濃度系列の連続希釈Ｍ１３ファージ（Ｐｈ．Ｄ．−７  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ；製品番号Ｅ８１０２Ｌ、ロット番号００６１００５、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を示す。この図は、５ｌｏｇ希釈段階（１０＾９〜１０＾５）にわたるＭ１３ファージの濃度依存関係を示しており、最後の２つの濃縮段階はもはやバックグラウンドと区別することができなかった。
【０１０１】
明らかに示されているのは、ウイルス粒子の染色のためにウイルスアッセイにおいてＤＮＡおよびＲＮＡに付着する染料としてのヘキスト染色の適合性である。したがって、無傷のウイルスを検出すること、あるいは空のコートとＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含有するコートとを区別することが可能であろう。
【０１０２】
実施例４
図４は、ヘキスト染色を用いた測定後の図３からのファージを示す。実施例３からのマイクロプレートのＲＣをＴＢＳで３回洗浄し、そしてＣＦ４８８蛍光染料で標識された検出抗体１．２５μｇ／ｍｌのＲＬ−ｐｈ１（製品番号ＬＳ−Ｃ１４６７５０、ＬｉｆｅＳｐａｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）およびＣＦ６３３蛍光染料で標識された検出抗体１．２５μｇ／ｍｌのＬＲＬ−ｐｈ２（製品番号ＬＳ−Ｃ１４６７５１、ロット番号７６９５５、ＬｉｆｅＳｐａｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）と共に１時間インキュベートした。ＴＢＳで３回洗浄した後、１００倍の油浸対物レンズを備えたＴＩＲＦ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）でサンプルを測定した。このために、マイクロタイタープレートのガラスベースを液浸油で十分に塗り付け、プレートを顕微鏡の自動ステージに導入した。その後、５×５の位置でＲＣ毎に連続して記録されたものは、それぞれ２つの蛍光チャネル（励起／発光＝６３５／７０５ｎｍおよび４８８／５２５ｎｍ）における２つの画像であった。両方のチャネルについて、最大レーザー出力（１００％）、露光時間５００ｍｓおよびゲイン値８００を選択した。その後に画像データを評価した。このために、各チャネルの強度閾値を陰性対照に基づいて確認した。この閾値について、陰性対照の全画像を各チャネルについて平均し、確認されたのは、その値を超えるとピクセル全体（エルゴ１０００ピクセル）のわずか０．１％のみが存在する強度値であった。評価工程では、各チャネルの各画像について最初に強度閾値を適用し、続けて同じ位置の画像を両方の値において互いに比較した。画像毎にカウントされるのは、両方のチャネルにおいて、まったく同じ位置にあるピクセルがチャネルの強度閾値を超えているピクセルだけであった。最後に、各反応チャンバー内の全ての画像についてピクセル数を平均し、その後、複製値の平均ピクセル数の平均値を確認し、標準偏差を特定した。
【０１０３】
実験は、４ｌｏｇ希釈段階（１０＾６〜１０＾３）にわたるＭ１３ファージの濃度依存関係を示す。それは、蛍光標識抗体による事後の染色が可能であることを示す。さらに、実験は、ＰＥＧコーティングを有するマイクロタイタープレートが、より短いインキュベーション時間で３Ｄ  ＮＨＳプレートの場合とほぼ同じ感度を達成することを示す（図２参照）。
【０１０４】
実施例５
実験は、３８４個の反応チャンバー（ＲＣ）を含む市販の３Ｄ  ＮＨＳマイクロタイタープレート（ＰｏｌｙＡｎ  ＧｍｂＨ）中で実施した。マイクロタイタープレートのＲＣを、捕捉分子として抗ＶＳＶ−Ｇ抗体Ｐ５Ｄ４（Ｓｉｇｍａ）でコーティングした（１５μｌ；１００ｍＭ  ＭＥＳ中１０μｇ／ｍｌ、ｐＨ＝４．７；一晩インキュベート）。その後、ＲＣを、それぞれ０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）およびＰＢＳで３回洗浄および完全吸引することからなる洗浄プログラムにかけた。次の工程で、ＲＣを５０μｌのＳｍａｒｔｂｌｏｃｋ（Ｃａｎｄｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＧｍｂＨ）で室温（ＲＴ）にて１時間コーティングし、この時間が経過した後、再びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝食塩水（ＴＢＳ；ｐＨ＝７．４）を用いて３回洗浄および完全吸引した。サンプルを順次、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＢＳ）緩衝液中で１時間インキュベートした。その後、１５μｌのサンプルをそれぞれ３通りにＲＣにロードし、室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ＲＣをＴＢＳで３回洗浄および完全吸引し、それを１５μｌの検出抗体と混合した。検出抗体はそれぞれ１種類の蛍光染料で標識した。抗ＶＳＶ−Ｇ抗体Ｐ５Ｄ４（Ｓｉｇｍａ）をそれぞれＣＦ４８８およびＣＦ６３３で標識した。検出抗体をＴＢＳ中で一緒に希釈して、各抗体について１．２５ｎｇ／ｍｌの最終濃度を得た。１ＲＣあたり１５μｌの抗体溶液をロードし、室温で１時間インキュベートした。この時間が経過した後、プレートをＴＢＳで３回洗浄した。完全に吸引した後、ＲＣを２０μｌのＴＢＳで満たし、プレートをフィルムで密封した。
【０１０５】
測定は、１００倍の油浸対物レンズを備えたＴＩＲＦ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）で行った。このために、マイクロタイタープレートのガラスベースを液浸油で十分に塗り付け、プレートを顕微鏡の自動ステージに導入した。その後、５×５の位置でＲＣ毎に連続して記録されたものは、それぞれ２つの蛍光チャネル（励起／発光＝６３５／７０５ｎｍおよび４８８／５２５ｎｍ）における２つの画像であった。両方のチャネルについて、最大レーザー出力（１００％）、露光時間５００ｍｓおよびゲイン値８００を選択した。その後に画像データを評価した。このために、各チャネルの強度閾値を陰性対照に基づいて確認した。この閾値について、陰性対照の全画像を各チャネルについて平均し、確認されたのは、その値を超えるとピクセル全体（エルゴ１０００ピクセル）のわずか０．１％のみが存在する強度値であった。評価工程では、各チャネルの各画像について最初に強度閾値を適用し、続けて同じ位置の画像を両方の値において互いに比較した。画像毎にカウントされるのは、両方のチャネルにおいて、まったく同じ位置にあるピクセルがチャネルの強度閾値を超えているピクセルだけであった。最後に、各反応チャンバー内の全ての画像についてピクセル数を平均し、その後、複製値の平均ピクセル数の平均値を確認し、標準偏差を特定した。
【０１０６】
結果を図５にまとめている。
図５は、細胞培養培地からのＴＢＳ中に希釈されたＨＩＶ安全株（生合成については、J Mol Biol. 2017 Apr 21; 429(8): 1171-1191. doi: 10.1016/j.jmb.2017.03.015を参照のこと、これは脂質膜中にＶＳＶ糖タンパク質を含有する）の濃度系列の連続希釈ウイルス粒子を示す。この図は、３ｌｏｇ希釈工程にわたる測定信号とウイルス粒子の濃度との間の線形関係およびバックグラウンドに対する最低濃度の識別可能性を示す。ここでは脂質コートを有するウイルス粒子が関係しているので、本発明による方法はこの分類群の分析に使用することができる。
【０１０７】
実施例６
図６は、図５からのデータの個々の希釈段階における１μｍ２当たりのウイルス粒子の数を示す。データのこの代替評価はウイルス粒子の絶対計数を可能にし、ひいては標準とは無関係である。評価のために、各記録について乗算されたものは、蛍光カラーチャネルが得られた両方の画像からの各対応するピクセルのグレースケール値であった。結果として得られた画像、またはグレースケール値マトリックスは、４ピクセルの標準偏差で２Ｄガウス関数（「imgaussfilt」）に基づいて平滑化した。これに続いて、関数「imregionalmax」に基づく局所極大の測定を行った。閾値を超える局所極大の数は、ここでは粒子の数に対応し、ここで、閾値は図５で確認された閾値に対応する。このようにして、各記録について粒子の数を測定し、そして最後に、同じ濃度のＲＣについての平均値を出した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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