(57)【要約】  本発明は、樹状化合物、これらの化合物の医薬品としての使用、化合物を含有する医薬品及び薬用化粧品組成物、並びに癌、炎症、糖尿病性腎症、神経変性障害、ニーマン−ピック病Ｃ型又は皮膚病変を処置する方法に関する。
2020515633.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（ｉ）の化合物
【化１】
2020515633.tif 000115
（式中、
Ｒ３は、式（ｉｉ）、（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）のラジカル
【化２】
2020515633.tif 000116
であり、
Ｒ５は、式（ｖ）、（ｖｉ）又は（ｖｉｉ）のラジカル
【化３】
2020515633.tif 000117
であり、
Ｒ６は、Ｈ、ＳＯ３Ｈ、任意選択で放射性標識されているアシル基であり、又はＲ６は、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ８であり、Ｒ８は、アリール又はアラルキルであり、
Ｒ７は、Ｈ又はＳＯ３Ｈであり、並びに
ＹはＯであり、ＢはＯであり、Ｒ１及びＲ２は存在せず、Ａ、Ｅ、Ｄ及びＸは、いずれもＣＨ２であり、若しくはＡ、Ｄ及びＸは、いずれもＣＨ２であり、Ｅは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｔ＃ＣＨ２であり、＃は、Ｅの、隣接したカルボニル基への結合点を指し示し、ｔは１から１０の整数であり、
又は、
ＹはＣであり、Ｒ１及びＲ２は、いずれもＨであり、Ａ、Ｅ、Ｂ及びＤは、ＣＨ２であり、ＸはＯであり、
又は、
ＹはＣであり、Ａは（ＣＨ２）ｕであり、Ｒ１及びＲ２は、いずれもＨであり、Ｂ、Ｘ、Ｄ及びＥは、いずれも存在せず、ｕは１から１０の整数であり、
又は、
ＹはＣであり、ＸはＯであり、Ｂは（ＣＨ２）ｐであり、Ａ、Ｅ及びＤは、いずれもＣＨ２であり、Ｒ１は、Ｈ、ＮＨＺ若しくはＣ１〜６アルキルであり、Ｒ２は、式（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）若しくは（ｘ）のラジカル
【化４】
2020515633.tif 000118
であり、
Ｚは、Ｈ、アシル、Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｗＮ（Ｈ）Ｇ若しくはイメージング剤であり、
ｗは１から１１の整数であり、
Ｇは、Ｈ、アシル、Ｂｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル）、Ｔｒｏｃ（２，２，２−トリクロロエチルオキシカルボニル）、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）、Ｃｂｚ（ベンジルオキシカルボニル）若しくはイメージング剤であり、
又は、
ＹはＣであり、ＸはＯであり、Ｂは（ＣＨ２）ｐであり、Ａ、Ｅ及びＤは、いずれもＣＨ２であり、Ｒ１及びＲ２は、いずれも同一で、式（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）若しくは（ｘ）のラジカル
【化５】
2020515633.tif 000119
であり、
各Ｔは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＣＨ２ＣＨ２及びＣＨ２からなる群から独立して選択され、
各ｘは、独立して、１から１２の整数であり、
ｎは、１から１１の整数であり、但し、Ｔは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＣＨ２ＣＨ２である場合、ｎは１であることを条件とし、
ｑは１から１１の整数であり、
ｍは、１から１１の整数であり、但し、Ｔは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＣＨ２ＣＨ２である場合、ｍは１であることを条件とし、
ｐは１から５の整数である）
又は医薬として許容できるその塩、又はそのプロドラッグ。
【請求項２】
各ＴはＣＨ２である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
少なくとも１つのＴが、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＣＨ２ＣＨ２である、請求項１又は請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１及びＲ２が、いずれも式（ｖｉｉｉ）のラジカル
【化６】
2020515633.tif 000120
である、請求項１から３までのいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ１及びＲ２が、いずれも式（ｉｘ）のラジカル
【化７】
2020515633.tif 000121
である、請求項１から４までのいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ１及びＲ２が、いずれも式（ｘ）のラジカル
【化８】
2020515633.tif 000122
である、請求項１から４までのいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ３が、式（ｉｉ）のラジカル
【化９】
2020515633.tif 000123
である、請求項１から６までのいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ３が、式（ｉｉｉ）のラジカル
【化１０】
2020515633.tif 000124
である、請求項１から６までのいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ３が、式（ｉｖ）のラジカル
【化１１】
2020515633.tif 000125
である、請求項１から６までのいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ６、Ｚ及びＧの１つ若しくは２つ、又はすべてが、アセチル基である、請求項１から９までのいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
ＹがＣであり、ＸがＯであり、Ａ、Ｅ及びＤが、いずれもＣＨ２であり、Ｂが、（ＣＨ２）ｐであり、
Ｒ１が、Ｈ、ＮＨＺ若しくはＣ１〜６アルキルであり、
Ｒ２が、式（ｖｉｉｉ）のラジカル、式（ｉｘ）のラジカル又は式（ｘ）のラジカル
【化１２】
2020515633.tif 000126
であり、
Ｚが、Ｈ、アシル、Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｗＮ（Ｈ）Ｇ若しくはイメージング剤であり、
ｗが１から１１の整数であり、
Ｇが、Ｈ、アシル、Ｂｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル）、Ｔｒｏｃ（２，２，２−トリクロロエチルオキシカルボニル）、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）、Ｃｂｚ（カルボキシベンジル）又はイメージング剤である、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
ＹがＣであり、ＸがＯであり、Ａ、Ｅ及びＤが、いずれもＣＨ２であり、Ｂが、（ＣＨ２）ｐであり、Ｒ１及びＲ２が、いずれも同一で、式（ｖｉｉｉ）のラジカル、式（ｉｘ）のラジカル又は式（ｘ）のラジカル
【化１３】
2020515633.tif 000127
である、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
ＹがＣであり、ＸがＯであり、Ａ、Ｅ及びＤが、いずれもＣＨ２であり、Ｂが、（ＣＨ２）ｐであり、Ｒ１及びＲ２が、いずれも同一で、式（ｖｉｉｉ）のラジカル
【化１４】
2020515633.tif 000128
であり、
Ｒ３が、式（ｉｉ）のラジカル
【化１５】
2020515633.tif 000129
である、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１４】
ＹがＣであり、ＸがＯであり、Ａ、Ｂ、Ｅ及びＤが、いずれもＣＨ２であり、Ｒ１及びＲ２が、いずれも同一で、式（ｉｘ）のラジカル
【化１６】
2020515633.tif 000130
であり、
Ｒ３が、式（ｉｉｉ）のラジカル
【化１７】
2020515633.tif 000131
である、請求項１から１３までのいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
ＹがＣであり、ＸがＯであり、Ａ、Ｂ、Ｅ及びＤが、いずれもＣＨ２であり、Ｒ１及びＲ２が、いずれも同一で、式（ｘ）のラジカル
【化１８】
2020515633.tif 000132
であり、
Ｒ３が、式（ｉｖ）のラジカル
【化１９】
2020515633.tif 000133
である、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１６】
ｐが１であり、ｑが６であり、ｎが７であり、又はｘが３である、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１７】
式（ｉ）の化合物が、
【化２０−１】
2020515633.tif 000134
【化２０−２】
2020515633.tif 000135
【化２０−３】
2020515633.tif 000136
【化２０−４】
2020515633.tif 000137
【化２０−５】
2020515633.tif 000138
【化２０−６】
2020515633.tif 000139
又は医薬として許容できるその塩からなる群から選択される、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１８】
有効量の請求項１から１７までのいずれか一項に記載の化合物、及び適切な担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬品組成物又は薬用化粧品組成物。
【請求項１９】
癌、炎症、糖尿病性腎症、神経変性障害、ニーマン−ピック病Ｃ型及び皮膚病変のいずれか１つ又は複数を処置又は防止する方法であって、医薬としての有効量の請求項１から１７までのいずれか一項に記載の化合物を、処置を必要とする患者に投与するステップを含む、上記方法。
【請求項２０】
神経変性障害が、老人性認知症、初老期認知症、多発梗塞性認知症又はアルツハイマー病である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
皮膚を若返らせる、又は皮膚の加齢を防止する方法であって、有効量の請求項１から１７までのいずれか一項に記載の化合物を、ヒトの皮膚に投与するステップを含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般的に、ヘパラン硫酸の模倣物である硫酸化樹状化合物、これらの化合物の医薬品及び薬用化粧品としての使用、化合物を含有する医薬品又は薬用化粧品組成物、化合物を調製するためのプロセス、並びに様々な疾患又は状態を処置する方法に関する。本発明は、癌、炎症、糖尿病性腎症、神経変性障害、ニーマン−ピック病Ｃ型の処置又は防止、並びに、薬用化粧品としての及び皮膚科学的な使用に特に関係がある。
【背景技術】
【０００２】
ヘパラナーゼは、細胞外マトリックス及び基底膜におけるプロテオグリカンのヘパラン硫酸グリコサミノグリカン側鎖を分解するエンド−β−Ｄ−グルクロニダーゼである。ヘパラナーゼは、シンデカンのクラスター化、シェディング及びマイトジェン結合を調節するとみられている。ヘパラナーゼ酵素活性は、腫瘍血管形成、原発腫瘍増殖、浸潤及び転移の促進において重要なことが公知である。ヘパラナーゼは、低硫酸化部位においてヘパラン硫酸側鎖を切断するので、上皮及び内皮細胞に内在する細胞外マトリックス及び基底膜の構造的な変化を促す。重要なことには、ヘパラナーゼ活性は、癌細胞の転移能と相関する。ヘパラナーゼとその基質であるヘパラン硫酸の間の相互作用は、十分に特徴付けられている。ヘパラナーゼは、ヒト癌における唯一の有力なヘパラン硫酸分解酵素と同定されており、癌、炎症及び糖尿病性腎症を含む潜在的治療用途のためのヘパラナーゼ阻害剤の開発に関して、かなりの関心を集めている。ヘパラナーゼの機能及びその治療的潜在性は、Ｆｕｘ、Ｌ．、ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、２００９年１０月、３４（１０）：５１１〜５１９頁で概説されている。
【０００３】
人々は、加齢するにつれて、神経変性障害、例えばアルツハイマー病が、より頻発するようになる。アルツハイマー病は、認知症の普通の形態であり、進行性且つ不可逆性である。疾患の病因は、脳における凝集アミロイドβ−ペプチドの沈着に関与すると考えられている。アミロイドβ−ペプチドの生成における第１の律速段階は、β−セクレターゼ（β−部位アミロイド前駆体タンパク質切断酵素−１、β−セクレターゼ−１、以下「ＢＡＣＥ−１」）によるアミロイド前駆体タンパク質の切断である。これにより、ＢＡＣＥ−１は、アルツハイマー病の新たな治療法の目を引く標的となっている。
【０００４】
ヘパラン硫酸、及びその高度に硫酸化した類似体のヘパリンは、ＢＡＣＥ−１活性を阻害することが示されている。ヘパラン硫酸及びヘパリンは、いずれも、β−Ｄ−グルクロン酸又はα−Ｌ−イズロン酸とＮ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミン（ヘパラン硫酸のケースで優勢）又はＮ−スルホ−α−Ｄ−グルコサミン（ヘパリンのケースで優勢）の１，４−結合型二糖単位、並びに、さらにＯ−硫酸エステル置換基を含むグリコサミノグリカンである。ヘパリンは、抗凝固活性を有する周知の医薬品である。しかし他の医薬的用途に使用されることになる場合、ヘパリンの抗凝固性は弱める必要がある。他の点では、考えられる副作用、例えば内出血及び血液凝固不全の問題がある。
【０００５】
ニーマン−ピック病Ｃ型（ＮＰＣ）患者は、コレステロール及び他の脂質を、細胞内で適切に代謝することができない。結果として、過剰量のコレステロールが肝臓及び脾臓内に蓄積し、過剰量の他の脂質が脳に蓄積する。
【０００６】
Ｃ型症状が最初に現れた際、及び疾患が進行する際にはかなりの変化がある。症状は、早ければ生後数ヶ月で、又は遅ければ成人期で現れることがある。
【０００７】
幼児における垂直注視麻痺（眼の上下動不能）、肝腫、脾腫又は黄疸は、ＮＰＣと考えるべき確実な指標である。疾患の早期には、１つのみ、又は２つの症状が見出されるのが普通である。大半のケースでは、神経学的症状は、４歳から１０歳の間で現れ始める。一般的に、神経学的症状が始まるのが遅いほど、疾患の進行は遅くなる。
【０００８】
ＮＰＣは、全世界で推定５００の診断例がある。しかし、ＮＰＣに罹患した人数は多いものの、診断の困難さから、発生率を正確に評価できないとされている。ＮＰＣは、最初に、学習障害、軽度の精神遅滞、「不器用さ」及び微細運動技能発達の遅延と診断されている。ＮＰＣが特定される前に、家族が、診断を求めて数年を費やすことも珍しくない。
【０００９】
ＮＰＣは、常に致命的である。ＮＰＣを有する小児の大多数は、２０歳になる前に死亡する（多くは１０歳前に死亡する）。症状が後に発症すると、寿命が長くなることがあるが、ＮＰＣを有する者では、４０歳に達するのはきわめて希である。
【００１０】
取り込まれた脂質、例えばコレステロール及びスフィンゴ脂質が、真核細胞のリソソーム区画から放出される機構は、神経変性疾患の病変において、運搬が損なわれる転帰が重篤であるにもかかわらず不明である。２つの注目すべき保存遺伝子が、欠陥があると、コレステロール及びスフィンゴ脂質のリソソーム蓄積によって引き起こされる致命的な小児科神経変性疾患であるＮＰＣ疾患が生じるタンパク質をコードする。新生児の段階を超えて生存した個人での、ＮＰＣ疾患の臨床的な特質は、実行機能の著しい低下、及び包括的な認知障害を伴い、典型的には、最後に青年期前に命を失う進行性認知症である。ＮＰＣ疾患は、ＮＰＣ１遺伝子（症例の９５％）又はＮＰＣ２遺伝子（症例の５％）における変異により生じる。ＮＰＣ１は、リソソームの約１３回膜貫通ドメインタンパク質をコードし、ＮＰＣ２は、リソソームにおける可溶性の低分子量管腔タンパク質をコードする。いずれのタンパク質も、脂質結合ドメインを有し、脂質輸送体又はシャペロンと推測される謎めいた機能を有する。ＮＰＣ２は、コレステロールをＮＰＣ１に「渡す」らしいが、この事象の前後におけるこの経路の相互作用は不明である。結果として、処置は、現在実験的であり、疑われている標的、すなわちコレステロール又はスフィンゴ脂質の代謝の調節に限定される。ＮＰＣ疾患に対して、特に米国で承認された治療法は、このように症状の緩和的処置に限定され、例外なく致命的なこの疾患に対する新規な治療介入の、明らかな臨床的必要性が存在する。ＮＰＣにおけるコレステロールレベルを低下できる、さらなるオリゴ糖に対する必要性が存在する。
【００１１】
ヘパラン硫酸は、いくつかの薬用化粧品及び皮膚科学的製剤に使用される。ヘパラン硫酸オリゴ糖は、高度に硫酸化されたグリコサミノグリカンであり、これは、幅広い不可欠な生理学的プロセスできわめて重大な役割を果たす。ヘパラン硫酸は、コラーゲン（結合組織の主なタンパク質）に結合し、その合成を調節し、水分子を組織し、水分子の間の空間を満たす能力を有する。コラーゲンは、組織の強度、きめ及び弾性に関与するが、皮膚におけるその量は、毎年約１％徐々に減少する。様々なグリコサミノグリカン化合物、例えばヒアルロン酸及び低分子量ヘパリンでは、皮膚に薬物と同じような利益及び若返り効果をもたらす複数の薬用化粧品製剤における使用が既に見出されている。しかし、ヘパラン硫酸オリゴ糖の活用は、合成の複雑さにより妨げられてきた。本出願者は、樹状核として公知の化学構造上における小さい特定のヘパラン硫酸断片の、新規なポリバレントディスプレイを調製するためのロバストでスケーラブルな方法を最近開発した。この方法論は、合成の要件を大幅に単純化したが、ヘパラン硫酸構造の望ましい生物活性は保つ。生物学的に活性なヘパラン硫酸糖模倣物化合物は、皮膚の加齢の兆候及び症状を劇的に遅くし、場合により無効化する可能性がある。
【００１２】
上述の疾患及び障害に対する、改善した治療法及び処置の探索において、本出願者らは、ヘパラン硫酸の糖模倣物を調べた。ヘパラン硫酸をベースとしたある化合物は、本出願者らにより調製されており、ＢＡＣＥ−１が関わる障害の処置に潜在的に有効であるとＷＯ２０１４／０８４７４４で開示されている。これらの化合物は、樹状核に結合したヘパラン硫酸の二糖及び四糖の断片を有する、ヘパラン硫酸の模倣物である。これらの断片は、グリコシル化を伴う多段階合成、及び直交保護基戦略を用いる選択的保護−脱保護反応により、グルコース及びグルコサミン単糖から調製した。適切に保護されたヘパラン硫酸断片を、核に結合させ、選択的脱保護により、標的化合物を生じる選択的硫酸化を可能にした。このアプローチは、ヘパラン硫酸オリゴ糖を合成する他のアプローチと比較して、反応ステップの数を減少させたが、合成プロセスは冗長なままであった。本出願者らは、容易に利用でき、得ることができる出発原料、及び、もはや直交保護基戦略を必要としない著しく短縮した合成プロセスを使用して、ヘパラン硫酸糖模倣物化合物を合成するための新たな方法を今般開発した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、本発明の目的は、ＮＰＣ患者において、有効なヘパラナーゼ阻害剤、有効なＢＡＣＥ−１阻害剤、有効なコレステロール低下剤、又は薬用化粧品及び皮膚科学的製剤に有効な原料を提供すること、又は少なくとも、これらの使用のために、既存の化合物に対する有用な代用物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
第１の態様では、本発明は、式（ｉ）の化合物
【化１】
2020515633.tif 000003
（式中、
Ｒ３は、式（ｉｉ）、（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）のラジカル
【化２】
2020515633.tif 000004
であり、
Ｒ５は、式（ｖ）、（ｖｉ）又は（ｖｉｉ）のラジカル
【化３】
2020515633.tif 000005
であり、
Ｒ６は、Ｈ、ＳＯ３Ｈ、任意選択で放射性標識されているアシル基であり、又はＲ６は、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ８であり、Ｒ８は、アリール又はアラルキルであり、
Ｒ７は、Ｈ又はＳＯ３Ｈであり、
ＹはＯであり、ＢはＯであり、Ｒ１及びＲ２は存在せず、Ａ、Ｅ、Ｄ及びＸは、いずれもＣＨ２であり、若しくはＡ、Ｄ及びＸは、いずれもＣＨ２であり、Ｅは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｔ＃ＣＨ２であり、＃は、Ｅの、隣接したカルボニル基への結合点を指し示し、ｔは１から１０の整数であり、
又は、
ＹはＣであり、Ｒ１及びＲ２は、いずれもＨであり、Ａ、Ｅ、Ｂ及びＤは、ＣＨ２であり、ＸはＯであり、
又は、
ＹはＣであり、Ａは（ＣＨ２）ｕであり、Ｒ１及びＲ２は、いずれもＨであり、Ｂ、Ｘ、Ｄ及びＥは、いずれも存在せず、ｕは１から１０の整数であり、
又は、
ＹはＣであり、ＸはＯであり、Ｂは（ＣＨ２）ｐであり、Ａ、Ｅ及びＤは、いずれもＣＨ２であり、Ｒ１は、Ｈ、ＮＨＺ若しくはＣ１〜６アルキルであり、Ｒ２は、式（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）若しくは（ｘ）のラジカル
【化４】
2020515633.tif 000006
であり、
Ｚは、Ｈ、アシル、Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｗＮ（Ｈ）Ｇ若しくはイメージング剤であり、
ｗは１から１１の整数であり、
Ｇは、Ｈ、アシル、Ｂｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル）、Ｔｒｏｃ（２，２，２−トリクロロエチルオキシカルボニル）、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）、Ｃｂｚ（ベンジルオキシカルボニル）若しくはイメージング剤であり、
又は、
ＹはＣであり、ＸはＯであり、Ｂは（ＣＨ２）ｐであり、Ａ、Ｅ及びＤは、いずれもＣＨ２であり、Ｒ１及びＲ２は、いずれも同一で、式（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）若しくは（ｘ）のラジカル
【化５】
2020515633.tif 000007
であり、
各Ｔは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＣＨ２ＣＨ２及びＣＨ２からなる群から独立して選択され、
各ｘは、独立して、１から１２の整数であり、
ｎは、１から１１の整数であり、但し、Ｔが、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＣＨ２ＣＨ２である場合、ｎが１であることを条件とし、
ｑは１から１１の整数であり、
ｍは、１から１１の整数であり、但し、Ｔが、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＣＨ２ＣＨ２である場合、ｍが１であることを条件とし、
ｐは１から５の整数である）
又は医薬として許容できるその塩、又はそのプロドラッグを提供する。
【００１５】
別の態様では、本発明は、有効量の式（ｉ）の化合物、及び適切な担体、希釈剤又は賦形剤を含む組成物を提供する。組成物は、医薬品又は薬用化粧品組成物であり得る。
【００１６】
別の態様では、本発明は、癌、炎症、糖尿病性腎症、神経変性障害、ニーマン−ピック病Ｃ型及び皮膚病変のいずれか１つ又は複数を処置又は防止する方法であって、医薬としての有効量の式（ｉ）の化合物を、処置を必要とする患者に投与するステップを含む方法を提供する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、皮膚を若返らせる、又は皮膚の加齢を防止する方法であって、有効量の式（ｉ）の化合物を、ヒトの皮膚に投与するステップを含む方法を提供する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、癌、炎症、糖尿病性腎症、神経変性障害、ニーマン−ピック病Ｃ型及び皮膚病変のいずれか１つ又は複数を処置又は防止するための、式（ｉ）の化合物の使用を提供する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、皮膚を若返らせる、又は皮膚の加齢を防止するための、式（ｉ）の化合物の使用を提供する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、癌、炎症、糖尿病性腎症、神経変性障害、ニーマン−ピック病Ｃ型及び皮膚病変のいずれか１つ又は複数を処置又は防止するための薬の製造における、式（ｉ）の化合物の使用を提供する。
【００２１】
別の態様では、本発明は、皮膚の加齢を処置又は防止するための薬の製造における、式（ｉ）の化合物の使用を提供する。
【００２２】
別の態様では、本発明は、癌、炎症、糖尿病性腎症、神経変性障害、ニーマン−ピック病Ｃ型及び皮膚病変のいずれか１つ又は複数を処置又は防止するための、式（ｉ）の化合物を含む医薬品組成物を提供する。
【００２３】
神経変性障害は、老人性認知症、初老期認知症、多発梗塞性認知症及びアルツハイマー病を含むが、それらに限定されない。
【００２４】
別の態様では、本発明は、少なくとも１つの他の化合物、例えば、第２の薬物化合物と組み合わせた、式（ｉ）の化合物を提供する。他の化合物は、例えば、オリゴ糖化合物、シクリトール、例えばシロ−イノシトール若しくはＤ−カイロ−イノシトール、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、ニコチンアゴニスト、β−アミロイドを標的とする抗体、β−アミロイドの阻害剤、タウ凝集の阻害剤又はメマンチンであり得る。
【００２５】
別の態様では、本発明は、癌、炎症、糖尿病性腎症、神経変性障害、ニーマン−ピック病Ｃ型及び皮膚病変のいずれか１つ又は複数を処置又は防止するための、少なくとも１つの他の化合物、例えば第２の薬物化合物、例としてオリゴ糖化合物、シクリトール、例えばシロ−イノシトール若しくはＤ−カイロ−イノシトール、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、ニコチンアゴニスト、β−アミロイドを標的とする抗体、タウ凝集の阻害剤又はメマンチンと組み合わせた式（ｉ）の化合物の使用を提供する。
【００２６】
別の態様では、本発明は、癌、炎症、糖尿病性腎症、神経変性障害、ニーマン−ピック病Ｃ型及び皮膚病変のいずれか１つ又は複数を処置又は防止する方法であって、少なくとも１つの他の化合物、例えば第２の薬物化合物、例としてオリゴ糖化合物、シクリトール、例えばシロ−イノシトール若しくはＤ−カイロ−イノシトール、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、ニコチンアゴニスト、β−アミロイドを標的とする抗体、β−アミロイドの阻害剤、タウ凝集の阻害剤又はメマンチンと組み合わせた、医薬としての有効量の式（ｉ）の化合物を投与するステップを含む方法を提供する。式（ｉ）の化合物及び他の化合物は、別々に、同時に、又は連続して投与され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】１μＭの阻害剤濃度の、本発明の化合物によるヘパラナーゼの阻害を示す図である。
【図２】１０μＭの阻害剤濃度の、本発明の化合物によるヘパラナーゼの阻害を示す図である。
【図３】本発明の化合物の、ヘパラナーゼに対する阻害用量反応を示す図である。
【図４】対照マウス、及び化合物１７ｃで処置したマウスについて、３及び４週間にて判定された平均放射輝度を示す図である（左上：マウスの後面、接種後３週間。右上：マウスの前面、接種後３週間。左下：マウスの後面、接種後４週間。右下：マウスの前面、接種後４週間）。
【００２８】
定義
「Ｃ１〜Ｃ６アルキル」という用語は、６個までの炭素原子を有する任意の飽和炭化水素ラジカルを意味し、直鎖及び分岐鎖アルキル基の両方を含むように意図されている。アルキル基の例は、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、１，１−ジメチルプロピル基、１，２−ジメチルプロピル基、２，２−ジメチルプロピル基、１−エチルプロピル基、２−エチルプロピル基、ｎ−ヘキシル基及び１−メチル−２−エチルプロピル基を含む。
【００２９】
「アルキレン」という用語は、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基に対応するジラジカルを意味し、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルは、１２個までの炭素原子を有する任意の飽和炭化水素ラジカルを意味し、直鎖アルキル基を含むように意図されている。アルキレン基の例は、メチレン基及びエチレン基を含む。
【００３０】
「アシル」という用語は、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ’基を意味し、Ｒ’は、Ｃ１〜Ｃ３０アルキル基であり、Ｃ１〜Ｃ３０アルキルは、３０個までの炭素原子を有する任意の飽和炭化水素ラジカルを意味し、直鎖アルキル基を含むように意図されている。例は、アセチル基を含む。
【００３１】
「アリール」という用語は、４から１８個の炭素原子を有し、ヘテロ芳香族ラジカルを含む芳香族ラジカルを意味する。例は、単環式基、並びに縮合基、例えば二環式基及び三環式基を含む。例は、フェニル基、インデニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、アズレニル基、ヘプタレニル基、ビフェニル基、インダセニル基、アセナフチル基、フルオレニル基、フェナレニル基、フェナントレニル基、アントラセニル基、シクロペンタシクロオクテニル基及びベンゾシクロオクテニル基、ピリジル基、ピロリル基、ピリダジニル基、ピリミジニル基、ピラジニル基、トリアゾリル基（１−Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル及び１−Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル基を含む）、テトラゾリル基、ベンゾトリアゾリル基、ピラゾリル基、イミダゾリル基、ベンズイミダゾリル基、インドリル基、イソインドリル基、インドリジニル基、プリニル基、インダゾリル基、フリル基、ピラニル基、ベンゾフリル基、イソベンゾフリル基、チエニル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、ベンゾチアゾリル基、オキサゾリル基並びにイソオキサゾリル基を含む。
【００３２】
「アラルキル」という用語は、アルキレン部分に結合しているアリール基を意味し、アリール及びアルキレンは、上で定義されている通りである。例は、ベンジル基を含む。
【００３３】
「イメージング剤」という用語は、内臓器官、細胞プロセス、健常組織及び健常ではない組織、例えば腫瘍についての情報を得る目的で、患者に投与される任意の物質を意味し、そのような情報は、放射性標識されている化学物質及び蛍光化学物質を含めて、典型的には、疾患を診断するため、又は、処置効果をモニターするために使用される。例は、＊ＣＨ３＊Ｃ（Ｏ）−をアンクルードし、＊Ｃは、１３Ｃ又は１４Ｃを表し、５−ＴＡＭＲＡ（４−カルボキシテトラメチルローダミン）、フルオレセイン（レソルシノールフタレイン）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０（７−アミノ−４−メチル−６−スルホクマリン−３−酢酸）、ＢＯＤＩＰＹ（４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン）及びＡｌｋｙｎｅ  ＭｅｇａＳｔｏｋｅｓ  ｄｙｅ  ６０８（１−｛３−｛［４−（２−シクロオクチン−１−イルメチル）ベンゾイル］アミノ｝プロピル｝−４−｛２−［４−（ジメチルアミノ）フェニル］エテニル｝ピリジニウムヘキサフルオロホスファート）を含む。
【００３４】
本明細書で使用されている「プロドラッグ」という用語は、式（Ｉ）の化合物の薬理学的に許容できる誘導体を意味し、誘導体のｉｎ  ｖｉｖｏ生体内変化により、式（Ｉ）で定義されている化合物が得られる。式（Ｉ）の化合物のプロドラッグは、化合物に存在する官能基を改変し、その結果、改変体が、ｉｎ  ｖｉｖｏで切断されて未変化体が得られることにより調製され得る。典型的には、式（Ｉ）の化合物のプロドラッグは、エステルプロドラッグ形態である。
【００３５】
本明細書で使用されている「薬用化粧品」という用語は、医薬品及び化粧品の組合せを意味し、一般的に、医薬効果を有する、又はそれを有するといわれている、１つ又は複数の生物学的活性成分を含有する化粧料を指す。
【００３６】
「医薬として許容できる塩」という用語は、非毒性塩、例えばアンモニウム塩、金属塩、例えばナトリウム塩、又は有機カチオンの塩、又はそれらの混合物に当てはまるように意図されている。
【００３７】
「保護基」という用語は、有機官能基を選択的に保護する基を意味し、その官能基の化学的性質を一時的にマスキングし、分子における他の部位を、官能基に影響を与えずに操作できるようにする。適切な保護基は、当業者に公知であり、例えば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第３版）、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ及びＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ（１９９９年）に記載されている。保護基の例は、Ｏ−ベンジル、Ｏ−ベンズヒドリル、Ｏ−トリチル、Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル、Ｏ−４−メチルベンジル、Ｏ−アセチル、Ｏ−クロロアセチル、Ｏ−メトキシアセチル、Ｏ−ベンゾイル、Ｏ−４−ブロモベンゾイル、Ｏ−４−メチルベンゾイル、Ｏ−フルオレニルメトキシカルボニル及びＯ−レブリノイルを含むが、それらに限定されない。
【００３８】
「患者」という用語は、ヒト及びヒト以外の動物を含む。
【００３９】
「処置」、「処置すること」などという用語は、１つ又は複数の症状の緩和、又は疾患若しくは障害に関連する状態の改善、例えば、認知における改善、記憶機能における改善を含む。
【００４０】
「防止すること」、「防止」などという用語は、疾患又は障害に関連する１つ又は複数の症状の防止を含む。
【００４１】
本発明の化合物は、遊離塩基形態、並びに塩及び／又は溶媒和物の形態の両方に有用である。
【００４２】
当業者は、本発明の化合物が、立体異性体として存在し得ることを認識する。例えば、カルボキシル基を有する糖の環につながる結合（例えば、以下で示されている）「
【化６】
2020515633.tif 000008
」を含む、本明細書で示されている構造は、糖のグルコ−及びガラクト−型を含むように意図されている。当業者は、本発明の化合物に、グルコ−型のみ、ガラクト−型のみ、又はグルコ−及びガラクト−型の混合物を組み込むことが可能であることも認識する。
【化７】
2020515633.tif 000009
【００４３】
本発明の化合物
本明細書の式（Ｉ）の化合物は、「本発明の化合物」と記載されている。本発明の化合物は、任意の形態、例えば、遊離形態又は塩若しくは溶媒和物の形態の化合物を含む。
【００４４】
本発明の化合物は、式（ｉ）
【化８】
2020515633.tif 000010
（式中、
Ｒ３は、式（ｉｉ）、（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）のラジカル
【化９】
2020515633.tif 000011
であり、
Ｒ５は、式（ｖ）、（ｖｉ）又は（ｖｉｉ）のラジカル
【化１０】
2020515633.tif 000012
であり、
Ｒ６は、Ｈ、ＳＯ３Ｈ、任意選択で放射性標識されているアシル基であり、又はＲ６は、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ８であり、Ｒ８は、アリール又はアラルキルであり、
Ｒ７は、Ｈ又はＳＯ３Ｈであり、
ＹはＯであり、ＢはＯであり、Ｒ１及びＲ２は存在せず、Ａ、Ｅ、Ｄ及びＸは、いずれもＣＨ２であり、若しくはＡ、Ｄ及びＸは、いずれもＣＨ２であり、Ｅは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｔ＃ＣＨ２であり、＃は、Ｅの、隣接したカルボニル基への結合点を指し示し、ｔは１から１０の整数であり、
又は、
ＹはＣであり、Ｒ１及びＲ２は、いずれもＨであり、Ａ、Ｅ、Ｂ及びＤは、ＣＨ２であり、ＸはＯであり、
又は、
ＹはＣであり、Ａは（ＣＨ２）ｕであり、Ｒ１及びＲ２は、いずれもＨであり、Ｂ、Ｘ、Ｄ及びＥは、いずれも存在せず、ｕは１から１０の整数であり、
又は、
ＹはＣであり、ＸはＯであり、Ｂは（ＣＨ２）ｐであり、Ａ、Ｅ及びＤは、いずれもＣＨ２であり、Ｒ１は、Ｈ、ＮＨＺ若しくはＣ１〜６アルキルであり、Ｒ２は、式（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）若しくは（ｘ）のラジカル、
【化１１】
2020515633.tif 000013
であり、
Ｚは、Ｈ、アシル、Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｗＮ（Ｈ）Ｇ若しくはイメージング剤であり、
ｗは１から１１の整数であり、
Ｇは、Ｈ、アシル、Ｂｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル）、Ｔｒｏｃ（２，２，２−トリクロロエチルオキシカルボニル）、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）、Ｃｂｚ（ベンジルオキシカルボニル）若しくはイメージング剤であり、
又は、
ＹはＣであり、ＸはＯであり、Ｂは（ＣＨ２）ｐであり、Ａ、Ｅ及びＤは、いずれもＣＨ２であり、Ｒ１及びＲ２は、いずれも同一で、式（ｖｉｉｉ）、（ｉｘ）若しくは（ｘ）のラジカル
【化１２】
2020515633.tif 000014
であり、
各Ｔは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＣＨ２ＣＨ２及びＣＨ２からなる群から独立して選択され、
各ｘは、独立して、１から１２の整数であり、
ｎは、１から１１の整数であり、但し、Ｔが、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＣＨ２ＣＨ２である場合、ｎが１であることを条件とし、
ｑは１から１１の整数であり、
ｍは、１から１１の整数であり、但し、Ｔが、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＣＨ２ＣＨ２である場合、ｍが１であることを条件とし
ｐは１から５の整数である）に従って定義され、
又は医薬として許容できるその塩、又はそのプロドラッグである。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態では、各Ｔは、ＣＨ２である。好ましい実施形態では、少なくとも１つのＴは、ＣＨ２であり、又は少なくとも１つのＴは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＣＨ２ＣＨ２である。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態では、医薬として許容できる塩は、アンモニウム塩、金属塩若しくは有機カチオン塩、又はそれらの混合物である。ある特定の実施形態では、塩は、ナトリウム塩である。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態では、ラジカル（ｖｉ）又は（ｖｉｉ）は、すべてグルコ−型である。他の実施形態では、ラジカル（ｖｉ）又は（ｖｉｉ）は、すべてガラクト−型であり得る。
【００４８】
いくつかの実施形態では、ラジカル（ｖ）は、
【化１３】
2020515633.tif 000015
である。
【００４９】
いくつかの実施形態では、ラジカル（ｖｉ）は、
【化１４】
2020515633.tif 000016
である。
【００５０】
いくつかの実施形態では、ラジカル（ｖｉ）は、
【化１５】
2020515633.tif 000017
である。
【００５１】
いくつかの実施形態では、ラジカル（ｖｉｉ）は、
【化１６】
2020515633.tif 000018
である。
【００５２】
いくつかの実施形態では、ラジカル（ｖｉｉ）は、
【化１７】
2020515633.tif 000019
である。
【００５３】
Ｒ６は、任意選択で放射性標識されているアセチル基であり得る。
【００５４】
Ｚはアセチルであり得る。
【００５５】
Ｇはアセチルであり得る。
【００５６】
いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、いずれも式（ｖｉｉｉ）のラジカル
【化１８】
2020515633.tif 000020
である。
【００５７】
いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、いずれも式（ｉｘ）のラジカル
【化１９】
2020515633.tif 000021
である。
【００５８】
いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、いずれも式（ｘ）のラジカル
【化２０】
2020515633.tif 000022
である。
【００５９】
いくつかの実施形態では、Ｒ１では、１つのＴは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＣＨ２ＣＨ２であり、１つのＴは、ＣＨ２であり、Ｒ２では、１つのＴは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＣＨ２ＣＨ２であり、１つのＴは、ＣＨ２である。いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２の両方で、（Ｔ）ｍは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＣＨ２ＣＨ２であり、（Ｔ）ｎは、（ＣＨ２）ｎである。代替実施形態では、Ｒ１及びＲ２の両方で、（Ｔ）ｍは、（ＣＨ２）ｍであり、（Ｔ）ｎは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＣＨ２ＣＨ２である。
【００６０】
Ｒ１及びＲ２は、いずれも式（ｉｉ）（ａ）のラジカルであり得、各Ｔは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＣＨ２ＣＨ２であり、式（ｉｉ）（ａ）の各ラジカルにおける各ｘは、独立して、選択される。
【００６１】
いくつかの実施形態では、Ｒ３は、式（ｉｉ）のラジカル
【化２１】
2020515633.tif 000023
である。
【００６２】
いくつかの実施形態では、Ｒ３は、式（ｉｉｉ）のラジカル
【化２２】
2020515633.tif 000024
である。
【００６３】
いくつかの実施形態では、Ｒ３は、式（ｉｖ）のラジカル
【化２３】
2020515633.tif 000025
である。
【００６４】
いくつかの実施形態では、Ｒ３では、１つのＴは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＣＨ２ＣＨ２であり、１つのＴは、ＣＨ２である。いくつかの実施形態では、Ｒ３では、（Ｔ）ｍは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＣＨ２ＣＨ２であり、（Ｔ）ｎは、（ＣＨ２）ｎである。代替実施形態では、Ｒ３では、（Ｔ）ｎは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＣＨ２ＣＨ２であり、（Ｔ）ｍは、（ＣＨ２）ｍである。
【００６５】
いくつかの実施形態では、Ｒ３は、式（ｉｖ）（ａ）のラジカルであり、各Ｔは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＣＨ２ＣＨ２であり、式（ｉｖ）（ａ）の各ラジカルにおける各ｘは、独立して、選択される。
【００６６】
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、好ましくは、Ｈ又はＣ１〜６アルキル、例えばＣＨ３又はＣＨ２ＣＨ３であり得る。Ｒ１は、或いはＮＨ２であり得る。他の実施形態では、Ｒ１はＮＨＺであり得、Ｚは、好ましくはＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｗＮ（Ｈ）Ｇであり、例えばＧは、Ｔｒｏｃ（２，２，２−トリクロロエチルオキシカルボニル）、Ｆｍｏｃ（フルオレニルメチルオキシカルボニル）又はＣｂｚ（ベンジルオキシカルボニル）である。好ましくは、ｗは７である。
【００６７】
いくつかの実施形態では、ＹはＯであり、ＢはＯであり、Ｒ１及びＲ２は存在せず、Ａ、Ｅ、Ｄ及びＸは、いずれもＣＨ２であり、又はＡ、Ｄ及びＸは、いずれもＣＨ２であり、Ｅは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｔＣＨ２であり、ｔは１から１０の整数、好ましくは１から２の整数である。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ＹはＣであり、Ｒ１及びＲ２は、いずれもＨであり、Ａ、Ｅ、Ｂ及びＤは、ＣＨ２であり、ＸはＯである。
【００６９】
いくつかの実施形態では、ＹはＣであり、Ａは（ＣＨ２）ｕであり、Ｒ１及びＲ２は、いずれもＨであり、Ｂ、Ｘ、Ｄ及びＥは、いずれも存在せず、ｕは１から１０の整数である。
【００７０】
いくつかの実施形態では、
ＹはＣであり、ＸはＯであり、Ａ、Ｅ及びＤは、いずれもＣＨ２であり、Ｂは、（ＣＨ２）ｐであり、
Ｒ１は、Ｈ、ＮＨＺ又はＣ１〜６アルキルであり、
Ｒ２は、式（ｖｉｉｉ）のラジカル、式（ｉｘ）のラジカル又は式（ｘ）のラジカル
【化２４】
2020515633.tif 000026
であり、
Ｚは、Ｈ、アシル、Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｗＮ（Ｈ）Ｇ又はイメージング剤であり、
ｗは１から１１の整数であり、
Ｇは、Ｈ、アシル、Ｂｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル）、Ｔｒｏｃ（２，２，２−トリクロロエチルオキシカルボニル）、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）、Ｃｂｚ（カルボキシベンジル）又はイメージング剤である。
【００７１】
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｈ、ＮＨＺ又はＣ１〜６アルキルであり、Ｒ２は、式（ｖｉｉｉ）のラジカル
【化２５】
2020515633.tif 000027
である。
【００７２】
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｈ、ＮＨＺ又はＣ１〜６アルキルであり、Ｒ２は、式（ｉｘ）のラジカル
【化２６】
2020515633.tif 000028
である。
【００７３】
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｈ、ＮＨＺ又はＣ１〜６アルキルであり、Ｒ２は、式（ｘ）のラジカル
【化２７】
2020515633.tif 000029
である。
【００７４】
いくつかの実施形態では、Ｒ２では、（Ｔ）ｍは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＣＨ２ＣＨ２であり、（Ｔ）ｎは、（ＣＨ２）ｎである。いくつかの実施形態では、Ｒ２では、（Ｔ）ｍは、（ＣＨ２）ｍであり、（Ｔ）ｎは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＣＨ２ＣＨ２である。いくつかの実施形態では、Ｒ２は、式（ｉｉ）（ａ）のラジカルであり、各Ｔは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＣＨ２ＣＨ２であり、式（ｉｉ）（ａ）の各ラジカルにおける各ｘは、独立して、選択される。
【００７５】
いくつかの実施形態では、ＹはＣであり、ＸはＯであり、Ａ、Ｅ及びＤは、いずれもＣＨ２であり、Ｂは、（ＣＨ２）ｐであり、
Ｒ１及びＲ２は、いずれも同一で、式（ｖｉｉｉ）のラジカル、式（ｉｘ）のラジカル又は式（ｘ）のラジカル
【化２８】
2020515633.tif 000030
である。
【００７６】
いくつかの実施形態では、ＹはＣであり、ＸはＯであり、Ａ、Ｅ及びＤは、いずれもＣＨ２であり、Ｂは、（ＣＨ２）ｐであり、Ｒ１及びＲ２は、いずれも同一で、式（ｖｉｉｉ）のラジカル
【化２９】
2020515633.tif 000031
であり、
Ｒ３は、式（ｉｉ）のラジカル
【化３０】
2020515633.tif 000032
である。
【００７７】
いくつかの実施形態では、ＹはＣであり、ＸはＯであり、Ａ、Ｅ及びＤは、いずれもＣＨ２であり、Ｂは、（ＣＨ２）ｐであり、Ｒ１及びＲ２は、いずれも同一で、式（ｖｉｉｉ）のラジカル
【化３１】
2020515633.tif 000033
であり、
Ｒ３は、式（ｉｉ）のラジカル
【化３２】
2020515633.tif 000034
であり、
Ｒ５は、式（ｖｉｉ）のラジカル
【化３３】
2020515633.tif 000035
である。
【００７８】
いくつかの実施形態では、ＹはＣであり、ＸはＯであり、Ａ、Ｂ、Ｅ及びＤは、いずれもＣＨ２であり、Ｒ１及びＲ２は、いずれも同一で、式（ｉｘ）のラジカル
【化３４】
2020515633.tif 000036
であり、
Ｒ３は、式（ｉｉｉ）のラジカル
【化３５】
2020515633.tif 000037
である。
【００７９】
いくつかの実施形態では、ＹはＣであり、ＸはＯであり、Ａ、Ｂ、Ｅ及びＤは、いずれもＣＨ２であり、Ｒ１及びＲ２は、いずれも同一で、式（ｘ）のラジカル
【化３６】
2020515633.tif 000038
であり、
Ｒ３は、式（ｉｖ）のラジカル
【化３７】
2020515633.tif 000039
である。
【００８０】
いくつかの実施形態では、ＹはＣであり、ＸはＯであり、Ａ、Ｂ、Ｅ及びＤは、いずれもＣＨ２であり、Ｒ１及びＲ２は、いずれも同一で、式（ｉｘ）のラジカル
【化３８】
2020515633.tif 000040
であり、
Ｒ３は、式（ｉｉｉ）のラジカル
【化３９】
2020515633.tif 000041
であり、
Ｒ５は、式（ｖｉｉ）のラジカル
【化４０】
2020515633.tif 000042
である。
【００８１】
いくつかの実施形態では、ＹはＣであり、Ｒ１及びＲ２は、いずれもＨであり、Ａ、Ｅ、Ｂ及びＤは、ＣＨ２であり、ＸはＯであり、Ｒ３は、式（ｉｉ）のラジカル
【化４１】
2020515633.tif 000043
である。
【００８２】
いくつかの実施形態では、ＹはＣであり、Ｒ１及びＲ２は、いずれもＨであり、Ａ、Ｅ、Ｂ及びＤは、ＣＨ２であり、ＸはＯであり、Ｒ３は、式（ｉｉｉ）のラジカル
【化４２】
2020515633.tif 000044
である。
【００８３】
好ましくは、ＹはＣであり、ＸはＯであり、Ａ、Ｂ、Ｅ及びＤは、いずれもＣＨ２であり、Ｒ１はＨであり、Ｒ２は、式（ｖｉｉｉ）のラジカル
【化４３】
2020515633.tif 000045
であり、
Ｒ３は、式（ｉｉ）のラジカル
【化４４】
2020515633.tif 000046
である。
【００８４】
いくつかの実施形態では、ＹはＣであり、ＸはＯであり、Ａ、Ｂ、Ｅ及びＤは、いずれもＣＨ２であり、Ｒ１はＨであり、Ｒ２は、式（ｉｘ）のラジカル
【化４５】
2020515633.tif 000047
であり、
Ｒ３は、式（ｉｉｉ）のラジカル
【化４６】
2020515633.tif 000048
である。
【００８５】
いくつかの実施形態では、ＹはＣであり、ＸはＯであり、Ａ、Ｂ、Ｅ及びＤは、いずれもＣＨ２であり、Ｒ１はＨであり、Ｒ２は、式（ｉｘ）のラジカル
【化４７】
2020515633.tif 000049
であり、
Ｒ３は、式（ｉｉ）のラジカル
【化４８】
2020515633.tif 000050
である。
【００８６】
いくつかの実施形態では、ＹはＣであり、ＸはＯであり、Ａ、Ｂ、Ｅ及びＤは、いずれもＣＨ２であり、Ｒ１はＨであり、Ｒ２は、式（ｖｉｉｉ）のラジカル
【化４９】
2020515633.tif 000051
であり、
Ｒ３は、式（ｉｉｉ）のラジカル
【化５０】
2020515633.tif 000052
である。
【００８７】
いくつかの実施形態では、ＹはＣであり、Ａは（ＣＨ２）ｕであり、Ｒ１及びＲ２は、いずれもＨであり、Ｂ、Ｘ、Ｄ及びＥは、いずれも存在せず、ｕは１から１０の整数であり、及びＲ３は、式（ｉｉ）のラジカル
【化５１】
2020515633.tif 000053
である。
【００８８】
いくつかの実施形態では、ＹはＣであり、Ａは（ＣＨ２）ｕであり、Ｒ１及びＲ２は、いずれもＨであり、Ｂ、Ｘ、Ｄ及びＥは、いずれも存在せず、ｕは１から１０の整数であり、Ｒ３は、式（ｉｉｉ）のラジカル
【化５２】
2020515633.tif 000054
である。
【００８９】
いくつかの実施形態では、ＹはＯであり、ＢはＯであり、Ｒ１及びＲ２は存在せず、Ａ、Ｅ、Ｄ及びＸは、いずれもＣＨ２であり、又は、Ａ、Ｄ及びＸは、いずれもＣＨ２であり、Ｅは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｔＣＨ２であり、ｔは１から１０の整数、好ましくは１から２の整数であり、Ｒ３は、式（ｉｉ）のラジカル
【化５３】
2020515633.tif 000055
である。
【００９０】
いくつかの実施形態では、ＹはＯであり、ＢはＯであり、Ｒ１及びＲ２は存在せず、Ａ、Ｅ、Ｄ及びＸは、いずれもＣＨ２であり、又は、Ａ、Ｄ及びＸは、いずれもＣＨ２であり、Ｅは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｔＣＨ２であり、ｔは１から２の整数であり、Ｒ３は、式（ｉｉｉ）のラジカル
【化５４】
2020515633.tif 000056
である。
【００９１】
いくつかの実施形態では、ｐは１である。
【００９２】
いくつかの実施形態では、ｑは３から１０の整数であり、例えば４から９の整数であり、例えば５から８の整数であり、例えば６から７の整数である。いくつかの好ましい実施形態では、ｑは６である。
【００９３】
いくつかの実施形態では、ｎは３から１０の整数であり、例えば４から９の整数であり、例えば５から８の整数であり、例えば６から７の整数である。いくつかの好ましい実施形態では、ｎは７である。
【００９４】
いくつかの実施形態では、ｍは３から１０の整数であり、例えば４から９の整数であり、例えば５から８の整数であり、例えば６から７の整数である。いくつかの好ましい実施形態では、ｎは７である。
【００９５】
いくつかの実施形態では、各Ｔは、ＣＨ２であり、ｑは３から１０の整数であり、例えば４から９の整数であり、例えば５から８の整数であり、例えば６から７の整数である。いくつかの好ましい実施形態では、ｑは６である。
【００９６】
いくつかの実施形態では、各Ｔは、ＣＨ２であり、ｎは３から１０の整数であり、例えば４から９の整数であり、例えば５から８の整数であり、例えば６から７の整数である。いくつかの好ましい実施形態では、ｎは７である。
【００９７】
いくつかの実施形態では、各Ｔは、ＣＨ２であり、ｑ及びｎは、それぞれ独立して、３から１０の整数であり、例えば４から９の整数であり、例えば５から８の整数であり、例えば６から７の整数である。
【００９８】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＴは、ＣＨ２であり、ｑは３から１０の整数であり、例えば４から９の整数であり、例えば５から８の整数であり、例えば６から７の整数である。いくつかの好ましい実施形態では、ｑは６である。
【００９９】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＴは、ＣＨ２であり、ｎは３から１０の整数であり、例えば４から９の整数であり、例えば５から８の整数であり、例えば６から７の整数である。いくつかの好ましい実施形態では、ｎは７である。
【０１００】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＴは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘＣＨ２ＣＨ２であり、ｘは２から１０の整数であり、例えば２から９の整数であり、例えば２から８の整数であり、例えば２から７の整数であり、例えば２から６の整数であり、例えば２から５の整数であり、例えば２から４の整数である。いくつかの好ましい実施形態では、ｘは３である。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＴは、ＣＨ２であり、ｑは６であり、ｎは７である。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＴは、ＣＨ２であり、ｐは１であり、ｑは６である。いくつかの好ましい実施形態では、少なくとも１つのＴは、ＣＨ２であり、ｐは１であり、ｍは７であり、ｑは６である。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、式（ｉ）の化合物は、
【化５５−１】
2020515633.tif 000057
【化５５−２】
2020515633.tif 000058
【化５５−３】
2020515633.tif 000059
【化５５−４】
2020515633.tif 000060
【化５５−５】
2020515633.tif 000061
【化５５−６】
2020515633.tif 000062
又は医薬として許容できるその塩からなる群から選択される。
【０１０４】
治療的使用
本発明の化合物、特に範例となるものは、ヘパラナーゼの阻害剤であり、したがって、癌、炎症及び糖尿病性腎症を処置又は防止する可能性を有する。例４は、ヘパラナーゼに対して阻害活性を有する本発明の化合物の範囲を示す。
【０１０５】
化合物は、ＢＡＣＥ−１の阻害剤とも予想され、したがって、コレステロールレベルを低下させることが望ましい疾患又は状態、例えばニーマン−ピック病Ｃ型（ＮＰＣ）、神経変性障害、老人性認知症、初老期認知症、多発梗塞性認知症又はアルツハイマー病の処置又は防止に有用になり得る。
【０１０６】
特に、例５は、化合物１７ｃ及び２５ａが、ＮＰＣ及びアルツハイマー病患者由来の線維芽細胞において、フィリピン（コレステロール）の蛍光性に対してプラス効果を有することを示す。これらを、臨床的に承認されたヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤ＳＡＨＡと比較して優位であった。ＨＤＡＣ阻害は、ＮＰＣ疾患に対して潜在的な、新規且つ有望な治療と特定される。
【０１０７】
例６は、本発明の少なくとも１つの化合物、化合物１７ｃが、マウスにおける骨髄腫の処置に有効であることを示し、これにより、この化合物、及び構造的に関連した化合物が、骨髄腫及び潜在的に他の癌に対して、ヒトの治療可能性を有し得ることが指し示される。
【０１０８】
理論に束縛されることを望むものではないが、本出願者らは、本発明の化合物が、各樹状構造における硫酸化糖断片のコピーを複数使用することにより「クラスター化効果」を達成できるという仮説を立てている。そのようなクラスター化効果は、個々のサブユニット構造の反復により、硫酸化単糖における個々のサブユニット構造の、通常は弱い相互作用を増強できるため、有利である。
【０１０９】
薬用化粧品としての使用
上で言及されている治療的使用に加えて、本発明の化合物は、薬用化粧品として使用する可能性を有するとも特定されている。
【０１１０】
原線維のＩ型コラーゲンの減少は、経年した、又は「健常ではない」皮膚の特長であるが、既存のコラーゲンの破壊は、加齢した皮膚で観察される有害な変化の中心であることに疑いの余地はない。損傷を受けたコラーゲンを、新たに合成された物質で置きかえることに失敗するのも、病態生理全般にとって重大である。これらの観察は、皮膚を刺激してより多くのコラーゲンを生成し、続いて、これにより皮膚加齢の病態生理を遅くできる又は無効にできる局所製剤を開発するための強い根拠をスキンケア産業に与えている。例７は、いくつかの本発明の化合物の、コラーゲン生成に対するプラス効果を示す。
【０１１１】
細胞外マトリックスの減少は、結合組織の加齢における普通の事象である。高齢のドナーからのヒト皮膚の線維芽細胞は、若いドナーと比べてコラゲナーゼｍＲＮＡ及びタンパク質のレベルが上昇していたが、コラーゲンＩ型及びＩＩＩ型遺伝子の発現は、年齢に依存して減少する。ヒト皮膚の線維芽細胞の複製老化は、コラゲナーゼ活性の制御不能及び過剰発現と相互に関連付けられるとみられる。加齢に伴って皮膚のコラゲナーゼが増加するので、スキンケア会社は、皮膚のコラーゲン含有量を引き上げる目的で、コラゲナーゼを阻害し、続いて、これにより「若々しい皮膚」の美的外観を生じることができる化合物の開発を絶えず試みている。例８は、クロストリジウム・ヒストリチクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）からの細菌のコラゲナーゼＩＩ型の活性に対する、化合物１７ｂのヘパラナーゼ阻害効果を示す。
【０１１２】
皮膚の加齢は、皮膚の水分喪失にも関連する。皮膚の水分に関与する重要な分子は、水分子に結合し、それを保つ特有の能力を有するヒアルロナン又はヒアルロン酸（ＨＡ）であるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）である。表皮のＨＡの合成は、内在する真皮による影響を受け、真皮のＨＡの合成とは別のコントロール下にある。皮膚におけるＨＡポリマーの大きさが漸減するのは、加齢の結果である。したがって、表皮は、水分子に結合し、それを保つ役割を負う原則分子を失い、皮膚の水分を喪失する。真皮において、加齢に伴う主な変化は、組織構造に対するＨＡの親和性の増加と、付随するＨＡ抽出率の低下である。これは、進行性のコラーゲン架橋、及び、年齢に応じての一定したコラーゲン抽出率の低下に対応する。これらの加齢に伴う現象のいずれも、加齢した皮膚を特徴付ける明らかな脱水、萎縮及び弾性の喪失に寄与する。例９は、ヒト真皮線維芽細胞によるヒアルロナン生成に対する、いくつかの本発明の化合物のプラス効果を示す。
【０１１３】
異常な色素過剰、例えば肝斑、そばかす及び老人性黒子、並びに他の形態のメラニン色素過剰は、脱色剤、例えばヒドロキノン、アスコルビン酸誘導体、コウジ酸、アゼライン酸、電子が豊富なフェノール、副腎皮質ステロイド、レチノイドなどで処置した場合、満足すべき主観的改善を示す。これらの作用剤のうち、ヒドロキノン薬物は、使用者の８０％までに有効である。これらは、刺激及び皮膚炎を引き起こし得るため、ステロイドと共に製剤されることが多い。したがって、皮膚色素形成を抑制できる安全な化合物が定期的に探索されている。哺乳類のメラニン合成の律速段階は、チロシナーゼにより調節され、Ｌ−チロシンのＬ−ドーパへの変換、及びＬ−ドーパのＬ−ドーパ−キノンへの変換を触媒する。したがって、チロシナーゼ活性に対する化合物の効果の判定は、「皮膚ホワイトニング」成分として作用する能力の確実な指標となり得る。例１０は、少なくとも化合物１７ｃ及び１７ｄで、チロシナーゼ活性に対する有意な阻害効果を示す。
【０１１４】
例１１は、いくつかの化合物１７ｃ及び１７ｄも、精巣ヒアルロニダーゼの有効な阻害剤であることを示す。
【０１１５】
製剤及び投与
本発明の化合物は、経口、非経口、吸入噴霧、局所、直腸、経鼻、バッカル又はインプラントされたリザーバー経由を含む多彩な経路で患者に投与され得る。化合物は、脳内、脳室内又は髄腔内送達によっても投与され得る。非経口投与では、注入は、静脈内、動脈内、筋肉内又は皮下で付与され得る。
【０１１６】
患者に投与される本発明の化合物の量は、患者の性質、並びに、処置される障害の性質及び規模に従って幅広く変化する。典型的には、成人への投与量は、約０．０１μｇ／ｋｇから約１ｇ／ｋｇ、好ましくは約０．０１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの範囲になる。ある特定の患者に必要とされる特定の投与量は、多彩な要因、例えば患者の年齢、体重、全般的健康、性及び食生活に依存する。理想的な用量は、他の要因、例えば投与様式及び疾患又は障害の進行レベルに左右される。投与は、１日１回付与され得、又は１日に２回以上の投与が必要とされることもある。例えば、アルツハイマー病患者に対する投与レジームは、朝に１回投与及び夜に１回投与を必要とすることがある。或いは、そのような患者に対する投与レジームは、４時間ごとの投与を必要とすることがある。
【０１１７】
経口投与では、化合物は、固体又は液体調製物、例えば錠剤、カプセル剤、粒剤、散剤、液剤、懸濁液剤、シロップ剤、エリキシル剤及び分散剤に製剤できる。そのような調製物は、ここで列挙されていない他の経口投与レジームと同様、当業界で周知である。
【０１１８】
非経口投与では、本発明の化合物は、無菌液剤、エマルション剤及び懸濁液剤に製剤できる。
【０１１９】
本発明の化合物は、適切なビヒクルと混合され、次いで、望ましい形状及び大きさに圧縮され得る。化合物は、従来の錠剤ベース、例えばラクトース、スクロース及びトウモロコシデンプンを用いて、結合剤、崩壊剤及び潤滑剤と共に打錠され得る。結合剤は、例えば、トウモロコシデンプン又はゼラチンであり得、崩壊剤は、ジャガイモデンプン又はアルギン酸であり得、潤滑剤は、ステアリン酸マグネシウムであり得る。カプセル剤の形態の経口投与では、希釈剤、例えばラクトース及び乾燥トウモロコシデンプンが用いられ得る。他の成分、例えば着色料、甘味料又は香味料も添加され得る。経口投与用の錠剤、カプセル剤又は散剤は、本発明の化合物を約９９％まで含有し得る。
【０１２０】
液体調製物が、経口使用に必要とされる場合、本発明の化合物は、医薬として許容できる担体、例えば水、有機溶媒、例えばエタノール、又は両方の混合物と組み合わせられ得、任意選択で、他の添加剤、例えば乳化剤、懸濁剤、緩衝液、防腐剤及び／又は界面活性剤も使用され得る。着色料、甘味料又は香味料も添加され得る。
【０１２１】
化合物は、医薬として許容できる希釈剤、例えば水又は生理食塩水中で、注入によっても投与され得る。希釈剤は、１つ又は複数の他の原料、例えばエタノール、プロピレングリコール、油又は医薬として許容できる界面活性剤を含み得る。
【０１２２】
本発明の化合物は、局所的にも投与され得る。化合物を局所投与するための担体は、ミネラル油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス及び水を含む。化合物は、皮膚又は粘膜に局所投与するためのローション剤又はクリーム剤に、原料として存在し得る。そのようなクリーム剤は、１つ又は複数の医薬として許容できる担体に懸濁又は溶解した活性化合物を含有し得る。適切な担体は、ミネラル油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール及び水を含む。
【０１２３】
本発明の化合物は、持続放出系によってさらに投与され得る。例えば、これらは、ゆっくり溶解する錠剤又はカプセル剤中に組み込まれ得る。
【０１２４】
本発明の化合物の合成
本発明の化合物は、多彩な異なる方法により調製され得る。以下は、本発明の化合物を合成するための代表的、非限定的な、一般的方法である。
【０１２５】
１．樹状「核」出発原料の合成
本発明の樹状化合物の出発原料として使用される「核」は、ＷＯ２０１４／０８４７４４に記載されている方法に従って合成できる。例えば、スキーム１を参照されたい。
【化５６】
2020515633.tif 000063
【０１２６】
２．グリコシド単位の合成
核出発原料にカップリングできるグリコシドとして使用される、又は、それを調製するために使用される単糖、二糖及び三糖単位は、ＷＯ２０１２／１２１６１７に記載されているように合成できる。
【０１２７】
スキーム２は、本発明の四量体、三量体及び二量体化合物を調製するために使用できるグリコシドを合成するための一般的方法を示す。
【化５７】
2020515633.tif 000064
【０１２８】
３．本発明の樹状化合物の合成
「核」出発原料は、遊離アミノ基を有するグリコシドにカップリングでき、それにより本発明の樹状化合物の調製が可能となる。カップリング手順は、適切な溶媒（例えばＤＭＦ、ＤＭＳＯ、水）、少量の塩基（例えばトリエチルアミン）及び適切なグリコシドを必要とする。少なくとも約２当量のグリコシド（例えば約２．２当量）は、二量体核とのカップリングに使用される。少なくとも約３当量のグリコシド（例えば約３．３当量）は、三量体核とのカップリングに使用される。少なくとも約４当量のグリコシド（例えば約４．４当量）は、四量体核とのカップリングに使用される。
【０１２９】
スキーム３から６は、グリコシドを四量体、三量体及び二量体核にカップリングするための一般的方法を示す。
【化５８−１】
2020515633.tif 000065
【化５８−２】
2020515633.tif 000066
【化５８−３】
2020515633.tif 000067
【化５８−４】
2020515633.tif 000068
【実施例】
【０１３０】
以下の実施例は、本発明をさらに例証する。本発明が、実施例に限定されないことは、認識されるべきである。
【０１３１】
略語
ＮＭＲ  核磁気共鳴
ＨＲＭＳ  高分解能質量分析
ＥＳＩ  エレクトロスプレーイオン化
ＴＬＣ  薄層クロマトグラフィー
ＲＴ  室温
ＤＣＭ  ジクロロメタン
ＴＥＭＰＯ  ２，２，６，６−テトラメチルピペリジニルオキシ
ＴＨＦ  テトラヒドロフラン
ＤＭＦ  ジメチルホルムアミド
ＴＭＳ  トリメチルシリル
ＴＭＳ−ジアゾメタン  トリメチルシリル−ジアゾメタン
ＮＨＳ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＥＤＣ  １−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩
ＴＣＡ  トリクロロ酢酸
ＤＡＢＣＯ  １，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン
ＢＡＩＢ  ［ビス（アセトキシ）ヨード］ベンゼン
【０１３２】
（例１）
テトラ−スクシンイミジルエステルの合成
以下のスキーム７によるテトラ−スクシンイミジルエステルの合成は、ＷＯ２０１４／０８４７４４に記載されている。
【化５９】
2020515633.tif 000069
【０１３３】
（例２）
ジ−スクシンイミジルエステルの合成
以下のスキーム８によるジ−スクシンイミジルエステル３０の合成は、ＷＯ２０１４／０８４７４４に記載されている。
【化６０】
2020515633.tif 000070
【０１３４】
（例３）
硫酸化樹状クラスター化合物の合成
（例３．１）
ベンジルエステル２の調製
【化６１】
2020515633.tif 000071
３−（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エトキシ）プロパン酸１（Ｈ２Ｎ（ＰＥＧ）３ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ又はＰＥＧアミノ酸）（１．０ｇ、４．５２ｍｍｏｌ）を、ベンジルアルコール（３０ｍＬ、２８７ｍｍｏｌ）に溶解し、０℃に冷却する。塩化チオニル（６ｍＬ、８２．２ｍｍｏｌ）を、ゆっくり滴下添加する。反応混合物を、０℃にて１５分間撹拌し、続いて１００℃にて５時間加熱する。次いで、これを、ジエチルエーテルで希釈し、油状残渣を収集し、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、９：１→１：１で溶出するシリカゲル上で、フラッシュクロマトグラフィーにより精製して、ベンジルエステル（２、１．２ｇ、３．９ｍｍｏｌ、８５％）を得る。Ｒｆ＝０．１５（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、９：１）。
【数１】
2020515633.tif 000072
【０１３５】
（例３．２）
テトラベンジルエステル４の調製
【化６２】
2020515633.tif 000073
ベンジルエステル２（７６８ｍｇ、２．４６ｍｍｏｌ）及びテトラ−スクシンイミジルエステル（３、６８０ｍｇ、０．４９３ｍｍｏｌ）を、乾燥ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０．５ｍＬ、３．９４ｍｍｏｌ）で処理する。２４時間撹拌した後で、混合物を、酢酸エチルで希釈し、水で２回洗浄し、硫酸マグネシウムで脱水し、濃縮した。残渣は、温ＥｔＯＡｃに溶解し、結晶を濾別し、放出する。母液を濃縮し、残渣を、クロロホルム：酢酸エチル：ＭｅＯＨ、５：２：０．５で溶出するシリカゲル上で、フラッシュクロマトグラフィーにより精製して、テトラ−ベンジルエステル（４、７１０ｍｇ、０．３２８ｍｍｏｌ、７８％）を得る。Ｒｆ＝０．３（クロロホルム：酢酸エチル：ＭｅＯＨ、５：２：１）。
【数２】
2020515633.tif 000074
【０１３６】
（例３．３）
テトラ酸５の調製
【化６３】
2020515633.tif 000075
テトラベンジルエステル（４、３５０ｍｇ、０．１６２ｍｍｏｌ）を、乾燥ＴＨＦ（８ｍＬ）に溶解する。水（２ｍＬ）及び氷酢酸（２滴）を添加する。反応混合物を、水酸化パラジウム炭素（２０％Ｐｄ、２０ｍｇ）で処理し、水素下で、周囲温度及び周囲圧力にて３時間撹拌する。触媒を濾別し、５０％ＥｔＯＨ水溶液で洗浄する。溶液を濃縮乾固して、「ロングアーム」ＰＥＧ−ＰＥＴテトラ酸（５、２９１ｍｇ、０．１６１ｍｍｏｌ、９９％）を得る。生成物は、さらなる精製をせずに次のステップで使用する。Ｒｆ＝０．０（ベースライン、クロロホルム：酢酸エチル：ＭｅＯＨ、５：２：１）。
【数３】
2020515633.tif 000076
【０１３７】
（例３．４）
「ロングアーム」ＰＥＴ−ＰＥＧテトラ−Ｎ−スクシンイミジルエステル６の調製
【化６４】
2020515633.tif 000077
「ロングアーム」ＰＥＴ−ＰＥＧテトラ酸（５、３０３ｍｇ、０．１６８ｍｍｏｌ）を、乾燥ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解する。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１１８ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ、６ｅｑ．）、ＤＩＰＥＡ（０．１７７ｍＬ、１．０ｍｍｏｌ、６ｅｑ．）及び１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、１９３ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ、６ｅｑ．）を、室温にて反応混合物に添加し、撹拌を２４時間続ける。混合物を、ＤＣＭで希釈し、水で洗浄し、次いでＨＣｌ及び水で希釈し、硫酸マグネシウムで脱水し、濃縮する。残渣を、クロロホルム：酢酸エチル：ＭｅＯＨ、５：２：０．５→５：４：１で溶出するシリカゲル上で、フラッシュクロマトグラフィーにより精製して、「ロングアーム」ＰＥＴ−ＰＥＧテトラ−スクシンイミジルエステル（６、３０６ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ、８２％）を得る。Ｒｆ＝０．２５（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、９：１）。
【数４】
2020515633.tif 000078
【０１３８】
（例３．５）
一般的手順Ａ（ＧＰＡ）：トリクロロアセトイミダートの形成
非保護アノマー中心を有する出発原料（１ｅｑ）を、乾燥ＤＣＭ（２０ｅｑ）に溶解し、氷浴中で冷却する。トリクロロアセトニトリル（２０ｅｑ）及びＤＢＵ（０．１ｅｑ）を添加する。１５分後、氷浴を除去し、反応を室温に温め、ｔｌｃにより反応が完了したと指し示されるまで放置する。混合物を、ＤＣＭで希釈し、水で２回洗浄し、硫酸マグネシウムで脱水し、濃縮する。残渣を、シリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル：石油エーテル、１：１→２：１）により精製して、トリクロロアセトイミダート供与体を泡状物として得る。
【０１３９】
（例３．６）
２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−α，β−Ｄ−グルコピラノシルトリクロロアセトイミダート（１０ａ）の調製
【化６５】
2020515633.tif 000079
マルトース７ａ（３ｇ、８．７６ｍｍｏｌ）を、乾燥ピリジン（２０ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却し、無水酢酸（１０ｍＬ）を添加する。反応混合物を室温まで１時間かけて温め、放置し、ＲＴにて２４時間撹拌する。次いで、溶媒を真空中で除去する。混合物を、ＤＣＭで希釈し、飽和重炭酸ナトリウム水溶液及び水で洗浄し、硫酸マグネシウムで脱水し、濃縮する。残渣を、シリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル：石油エーテル、１：１）により精製して、過アセチル化マルトース８をシロップ状物（５．３ｇ、７．８ｍｍｏｌ、８９％）として得る、ＴＬＣ（酢酸エチル：石油エーテル、１：１、ｖ／ｖ）：Ｒｆ＝０．４５。これを、化合物９ａの合成に直接使用する。化合物８ａ（３ｇ、４．４２ｍｍｏｌ）及びヒドラジン酢酸（１００ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ、０．２ｅｑ．）を乾燥ＤＭＦに溶解し、５０℃にて４０分間撹拌する。次いで、混合物を、ＥｔＯＡｃで希釈し、飽和重炭酸ナトリウム水溶液及び水で洗浄し、硫酸マグネシウムで脱水し、濃縮する。残渣を、シリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル：石油エーテル、１：１→２：１）により精製して、９をシロップ状物（２．６ｇ、４．１ｍｍｏｌ、９２％）として得る、ＴＬＣ（酢酸エチル：石油エーテル、２：１、ｖ／ｖ）：Ｒｆ＝０．３５。化合物１０ａは、一般的手順Ａに従って、９ａ（１．８ｇ、２．８ｍｍｏｌ）から調製する：残渣を、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、公知の化合物１０ａ（２．０５ｇ、２．６３ｍｍｏｌ、９３％収率）を得る、ＴＬＣ（酢酸エチル：トルエン、１：１、ｖ／ｖ）：Ｒｆ＝０．３５。
【数５】
2020515633.tif 000080
【０１４０】
（例３．７）
一般的手順Ｂ（ＧＰＢ）：グリコシル化  −  ＴＣＡ化学
トリクロロアセトイミダート供与体（１．３ｅｑ）及びグリコシル受容体アルコール（１ｅｑ）の無水ＤＣＭ（受容体１ｍｍｏｌ当たり４０ｍＬ）中溶液を、反応温度（０℃から−２０℃の間）に冷却し、粉末化分子ふるい（４Å）を添加し、懸濁液をこの温度にて撹拌する。１５分後、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（０．３ｅｑ）を添加し、反応混合物を、ＴＬＣ（トルエン／酢酸エチル４：１）により完了が指し示されるまで、反応温度にて撹拌する。混合物を、酢酸エチルで希釈し、重炭酸ナトリウム水溶液中にセライトで濾過し、有機層を、水及び飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで脱水し、濃縮する。残渣を、フラッシュクロマトグラフィーにより精製して、リンカーを有する完全に保護された単糖を得る。
【０１４１】
（例３．８）
６−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−ヘキシル（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−［１→４］−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（１２ａ）の調製
【化６６】
2020515633.tif 000081
化合物１２ａは、ＴＭＳＯＴｆ（０．１３ｍＬ、０．７０ｍｍｏｌ）の存在下で、一般的手順Ｂに従って、化合物１０ａ（１．９ｇ、２．４ｍｍｏｌ）及びＮ−ベンジルオキシカルボニル−６−ヒドロキシヘキシルアミン１１（Ｚ＝Ｃｂｚ、０．９２ｇ、３．７ｍｍｏｌ）から調製される。残渣を、シリカゲルクロマトグラフィー（１５〜４０％石油エーテル中酢酸エチル）により精製して、表題化合物（１．９５ｇ、２．２４ｍｍｏｌ、９２％）を得る。ＴＬＣ（酢酸エチル：石油エーテル、１：２、ｖ／ｖ）：Ｒｆ＝０．４５。
【数６】
2020515633.tif 000082
【０１４２】
（例３．９）
６−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−ヘキシル−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（１２ｂ）の調製
【化６７】
2020515633.tif 000083
化合物１２ｂを、ＴＭＳＯＴｆ（０．７２ｍＬ、０．３ｅｑ．、３．９ｍｍｏｌ）の存在下で、一般的手順Ｂに従って、ＴＣＡ供与体１０ｂ（６．４ｇ、１３ｍｍｏｌ）及びＮ−ベンジルオキシカルボニル−６−ヒドロキシヘキシルアミン１１（４．２ｇ、１．３ｅｑ．、１７ｍｍｏｌ）から調製する。残渣を、シリカゲルクロマトグラフィー（１５〜４０％石油エーテル中酢酸エチル）により精製して、表題化合物１２ｂ（５．１ｇ、８．８ｍｍｏｌ、６８％）を得る。ＴＬＣ（トルエン：酢酸エチル、２：１、ｖ／ｖ）：Ｒｆ＝０．４。
【数７】
2020515633.tif 000084
【０１４３】
（例３．１０）
一般的手順Ｃ（ＧＰＣ）：ｚｅｍｐｌｅｎ脱−Ｏ−アセチル化
出発原料を、ＲＴにて、乾燥メタノールに溶解し（５０μｍｏｌに対して１０ｍＬ）し、新しく調製したナトリウムメトキシドの１％溶液（１５０ｍｇに対して２０μＬ）で処理する。反応混合物の撹拌を、ＲＴにて２４時間続ける。ＴＬＣ（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、９：１）により、反応の完了が指し示された後で、溶液を濃縮し、乾燥させた。残渣を、シリカゲルクロマトグラフィー（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、９：１→５：１）により精製して、脱−Ｏ−アセチル化生成物を得る。
【０１４４】
（例３．１１）
６−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−ヘキシル（α−Ｄ−グルコピラノシル）−［１→４］−β−Ｄ−グルコピラノシド（１３ａ）の調製
【化６８】
2020515633.tif 000085
化合物１３ａを、一般的手順Ｃに従って、化合物１２ａ（６００ｍｇ、０．６８９ｍｍｏｌ）から調製する。残渣を、シリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル）により精製して、表題化合物（３３７ｍｇ、０．５８５ｍｍｏｌ、８５％）を得る。ＴＬＣ（酢酸エチル：ＭｅＯＨ、９：１、ｖ／ｖ）：Ｒｆ＝０．３。
【数８】
2020515633.tif 000086
【０１４５】
（例３．１２）
６−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−ヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド（１３ｂ）の調製
【化６９】
2020515633.tif 000087
化合物１３ｂを、一般的手順Ｃに従って、化合物１２ｂ（６００ｍｇ、１．０３ｍｍｏｌ）から調製する。残渣を、シリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル：ＭｅＯＨ、９：１）により精製して、表題化合物（３４２ｍｇ、０．５８５ｍｍｏｌ、８０％）を得る。ＴＬＣ（酢酸エチル：ＭｅＯＨ、９：１、ｖ／ｖ）：Ｒｆ＝０．３。
【数９】
2020515633.tif 000088
【０１４６】
（例３．１３）
一般的手順Ｄ（ＧＰＤ）：Ｎ−Ｃｂｚ基の除去
水酸化パラジウム炭素（２０％Ｐｄ、基質１ｇにつき５００ｍｇ）を、出発原料のＭｅＯＨ（１ｇに対して１０ｍＬ）中溶液に添加する。反応混合物を、水素下で、周囲温度及び周囲圧力にてちょうど２０分撹拌する。触媒を濾別し、酢酸エチル：ＭｅＯＨ、１：１で洗浄する。溶液を濃縮乾固し、残渣のクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール：アンモニア水溶液、４：１：０．０５）により、遊離アミノ−リンカーを有する化合物を得る。
【０１４７】
（例３．１４）
６−アミノヘキシル（α−Ｄ−グルコピラノシル）−［１→４］−β−Ｄ−グルコピラノシド（１４ａ）の調製
【化７０】
2020515633.tif 000089
化合物１４ａを、一般的手順Ｄに従って、化合物１３ａ（３３３ｍｇ、０．５７８ｍｍｏｌ）から調製する。残渣を、シリカゲルクロマトグラフィー（３３％酢酸エチル中ＭｅＯＨ）により精製して、表題化合物（２４６ｍｇ、０．５５７ｍｍｏｌ、９６％）を得る。ＴＬＣ（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、５：１、ｖ／ｖ）：Ｒｆ＝０．２。
【数１０】
2020515633.tif 000090
【０１４８】
（例３．１５）
６−アミノヘキシル−β−Ｄ−グルコピラノシド（１４ｂ）の調製
【化７１】
2020515633.tif 000091
化合物１４ｂは、一般的手順Ｄに従って、化合物１３ｂ（６２７ｍｇ、１．５２ｍｍｏｌ）から調製する。残渣を、シリカゲルクロマトグラフィー（３３％酢酸エチル中ＭｅＯＨ→ＭｅＯＨ）により精製して、表題化合物（４１９ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ、９８．９％）を得る。ＴＬＣ（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ、５：１、ｖ／ｖ）：Ｒｆ＝０．２。
【数１１】
2020515633.tif 000092
【０１４９】
（例３．１６）
一般的手順Ｅ（ＧＰＥ）：テトラ−スクシンイミジルエステルとのカップリング
乾燥ＤＭＦ中のテトラ−スクシンイミジルエステル（１ｅｑ）の溶液（ＤＭＦの１ｍＬにつき４０ｍｇ）を、室温にて、乾燥ＤＭＦ中の６炭素リンカー、遊離ヒドロキシル及びマスキングされていないアミノ−官能基（４〜６ｅｑ．）を有するグリコシドの溶液（ＤＭＦ  １ｍＬにつき１００ｍｇ）に添加する。反応混合物をトリエチルアミン（８ｅｑ）で処理し、ＲＴにて２４時間撹拌する。ＤＭＦを真空で除去し、残渣を、アセトニトリル：水：アンモニア水溶液、６：２：１→３：２：１で溶出するシリカゲル上で、フラッシュクロマトグラフィーにより精製して、四量体を得る。
【０１５０】
（例３．１７）
１６ｂ（グルコースを有するショートアームクラスター）の調製
【化７２】
2020515633.tif 000093
化合物１６ｂを、一般的手順Ｅに従って、化合物１５（１０３ｍｇ、０．１２６ｍｍｏｌ）及び１４ｂ（２１２ｍｇ、０．７６ｍｍｏｌ）から調製し、残渣を、シリカゲルクロマトグラフィー（アセトニトリル：水：アンモニア水溶液、６：２：１→３：２：１）により精製して、四量体１６ｂを泡状物（１７９ｍｇ、０．１２２ｍｍｏｌ、９６％収率）として得る、ＴＬＣ（アセトニトリル：水：アンモニア水溶液、６：２：１、ｖ／ｖ）：Ｒｆ＝０．２。
【数１２】
2020515633.tif 000094
【０１５１】
（例３．１８）
１６ｃ（マルトースを有するＰＥＴクラスター）の調製
【化７３】
2020515633.tif 000095
化合物１６ｃを、一般的手順Ｅに従って、化合物３（５３ｍｇ、３８．５μｍｏｌ）及び１４ａ（８７．５ｍｇ、０．１９８ｍｍｏｌ）から調製し、残渣を、シリカゲルクロマトグラフィー（アセトニトリル：水：アンモニア水溶液、６：２：１→３：２：１）により精製して、四量体１６ｃを泡状物（８９ｍｇ、３３．２μｍｏｌ、８６％収率）として得る、ＴＬＣ（アセトニトリル：水：アンモニア水溶液、６：２：１、ｖ／ｖ）：Ｒｆ＝０．２。
【数１３】
2020515633.tif 000096
【０１５２】
（例３．１９）
１６ｄ（グルコースを有するＰＥＴクラスター）の調製
化合物１６ｄを、一般的手順Ｅに従って、化合物３（８２ｍｇ、５９．５μｍｏｌ）及び１４ｂ（９９．７ｍｇ、０．３５７ｍｍｏｌ）から調製し、残渣を、シリカゲルクロマトグラフィー（アセトニトリル：水：アンモニア水溶液、６：２：１→３：２：１）により精製して、四量体１６ｄを泡状物（１１８ｍｇ、５８．０μｍｏｌ、９７％収率）として得る、ＴＬＣ（アセトニトリル：水：アンモニア水溶液、６：２：１、ｖ／ｖ）：Ｒｆ＝０．２。
【数１４】
2020515633.tif 000097
【０１５３】
（例３．２０）
２４ａ（マルトースを有するＰＥＴ−ＰＥＧ）の調製
【化７４】
2020515633.tif 000098
化合物２４ａを、一般的手順Ｅに従って、化合物６（７６ｍｇ、３４．６μｍｏｌ）及び１４ａ（８１ｍｇ、０．１８３ｍｍｏｌ）から調製し、残渣を、シリカゲルクロマトグラフィー（アセトニトリル：水：アンモニア水溶液、６：２：１→３：２：１）により精製して、四量体２４ａを泡状物（１１０ｍｇ、３１．５μｍｏｌ、９０％収率）として得る、ＴＬＣ（アセトニトリル：水：アンモニア水溶液、６：２：１、ｖ／ｖ）：Ｒｆ＝０．２。
【数１５】
2020515633.tif 000099
【０１５４】
（例３．２１）
２４ｂ（グルコースを有するＰＥＴ−ＰＥＧ）の調製
化合物２４ｂは、一般的手順Ｅに従って、化合物６（７７ｍｇ、３５．１μｍｏｌ）及び１４ｂ（５８．９ｍｇ、０．２１１ｍｍｏｌ）から調製し、残渣を、シリカゲルクロマトグラフィー（アセトニトリル：水：アンモニア水溶液、６：２：１→３：２：１）により精製して、四量体２４ｂを泡状物（９５ｍｇ、３３．４μｍｏｌ、９４％収率）として得る、ＴＬＣ（アセトニトリル：水：アンモニア水溶液、６：２：１、ｖ／ｖ）：Ｒｆ＝０．２。
【数１６】
2020515633.tif 000100
【０１５５】
（例３．２２）
一般的手順Ｆ（ＧＰＦ）：Ｏ−硫酸化
三酸化硫黄トリメチルアミン複合体（ヒドロキシル基ごとに５ｅｑｕｉｖ．）を、乾燥ＤＭＦ中の出発原料（５０ｍｇに対して３ｍＬ）に添加する。混合物を、アルゴン下で、５０〜６０℃にて７２時間加熱する。ＭｅＯＨ（１ｍＬ）を添加し、混合物を１５分間撹拌し、真空で濃縮した。クロマトグラフィー（アセトニトリル：水：アンモニア水溶液、６：２：１→３：２：１→水：アンモニア水溶液、６：１）により、Ｏ−硫酸化生成物をアンモニウム塩として得る。生じた材料を水に溶解し、Ｄｏｗｅｘ  ５０ＷＸ８−２００（Ｎａ＋）樹脂カラム（８×１ｃｍ）を通過させ、水で溶出する。生成物を含有する分画を蒸発させ、真空で乾燥させて、最終生成物のナトリウム塩を得る。
【０１５６】
（例３．２３）
１７ｂ（グルコースを有するショートアームクラスター）の調製
【化７５】
2020515633.tif 000101
化合物１７ｂを、一般的手順Ｆに従って、化合物１６ｂ（１１７ｍｇ、７９．６μｍｏｌ）及び三酸化硫黄トリメチルアミン複合体（８０ｅｑ．、０．９３３ｇ、６．３６ｍｍｏｌ）から調製して、１７ｂを泡状物（２０８ｍｇ、７５．６μｍｏｌ、９５％収率）として得る、ＴＬＣ（アセトニトリル：水：アンモニア水溶液、３：２：１）：Ｒｆ＝０．２。
【数１７】
2020515633.tif 000102
【０１５７】
（例３．２４）
１７ｃ（マルトースを有するＰＥＴクラスター）の調製
【化７６】
2020515633.tif 000103
化合物１７ｃを、一般的手順Ｆに従って、化合物１６ｃ（６２ｍｇ、２３．１μｍｏｌ）及び三酸化硫黄トリメチルアミン複合体（１４０ｅｑ．、５４２  ｍｇ）から調製して、１７ｃを泡状物（９１ｍｇ、１８．５μｍｏｌ、６９％収率）として得る、ＴＬＣ（アセトニトリル：水：アンモニア水溶液、３：２：１）：Ｒｆ＝０．２。
【数１８】
2020515633.tif 000104
【０１５８】
（例３．２５）
１７ｄ（グルコースを有するＰＥＴクラスター）の調製
化合物１７ｄを、一般的手順Ｆに従って、化合物１６ｄ（４８ｍｇ、２３．５μｍｏｌ）及び三酸化硫黄トリメチルアミン複合体（８０ｅｑ．、５４２ｍｇ、１．８８ｍｍｏｌ）から調製して、１７ｄを泡状物（７１ｍｇ、２１．４μｍｏｌ、９０％収率）として得る、ＴＬＣ（アセトニトリル：水：アンモニア水溶液、３：２：１）：Ｒｆ＝０．２。
【数１９】
2020515633.tif 000105
【０１５９】
（例３．２６）
２５ａ（マルトースを有するＰＥＴ−ＰＥＧクラスター）の調製
【化７７】
2020515633.tif 000106
化合物２５ａを、一般的手順Ｆに従って、化合物２４ａ（４９ｍｇ、１４μｍｏｌ）及び三酸化硫黄トリメチルアミン複合体（１４０ｅｑ．、２８７ｍｇ）から調製して、２５ａを泡状物（７５ｍｇ、１３．１μｍｏｌ、９３％収率）として得る、ＴＬＣ（アセトニトリル：水：アンモニア水溶液、３：２：１）：Ｒｆ＝０．２。
【数２０】
2020515633.tif 000107
【０１６０】
（例３．２７）
２５ｂ（グルコースを有するＰＥＴ−ＰＥＧクラスター）の調製
化合物２５ｂを、一般的手順Ｆに従って、化合物２４ｂ（４４ｍｇ、１５．５μｍｏｌ）及び三酸化硫黄トリメチルアミン複合体（８０ｅｑ．、０．１８１ｇ、１．２３６ｍｍｏｌ）から調製して、２５ｂを泡状物（６０ｍｇ、１４．５μｍｏｌ、９４％収率）として得る、ＴＬＣ（アセトニトリル：水：アンモニア水溶液、３：２：１）：Ｒｆ＝０．２。
【数２１】
2020515633.tif 000108
【０１６１】
（例４）
ヘパラナーゼの阻害
（例４．１）
アッセイの方法論
使用されるアッセイの方法論は、Ｈａｍｍｏｎｄ、Ｅ．、ら、動態分析及び阻害剤スクリーニングのための比色分析アッセイの開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｈｅｐａｒａｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｓｕｉｔａｂｌｅ  ｆｏｒ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１０年、３９６（１）、１１２〜１１６頁に記載されている。
【０１６２】
試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得た。アッセイは、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳＴ）を含有するリン酸塩緩衝生理食塩水中の４％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液で、３７℃にて２時間前処理した９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ９０１８  ＥＩＡ／ＲＩＡ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）で実行した。プレートを、次いで、ＰＢＳＴで３回洗浄し、振り切り乾燥させた。前処理したプレートを、使用する前に、４℃にて２週間まで保存した。
【０１６３】
組換えヒトヘパラナーゼを昆虫細胞において発現させ、次いで、細胞培地から、それが分泌されたものに精製した。培地は、１７，７００ｇで、４℃にて３０分間遠心分離することにより清澄化してから、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）に予め平衡化した１００ｍｌヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。カラムを、同一のリン酸塩緩衝液中の１５０ｍｌ  ＮａＣｌの一連の濃縮段階３つ：０．３、０．６及び０．８Ｍで溶出する。０．８Ｍ段階で溶出するヘパラナーゼを含有する分画をプールし（典型的には７０ｍｌ）、２Ｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）に対して、４℃にて２０時間透析した。この物質を、次いで、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）に予め平衡化した５５ｍｌ  Ｓｏｕｒｃｅ  ３０Ｓカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードし、同一緩衝液中の０〜０．６Ｍ  ＮａＣｌ  ９００−ｍｌの直線グラジエントで溶出した。純粋ヘパラナーゼを含有する分画は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の銀染色により判定し、プールし、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中に透析し、Ｃｅｎｔｒｉｐｌｕｓ濃縮デバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮し、使用するまで−８０℃にて保存した。
【０１６４】
アッセイ溶液（１００μｌ）は、阻害剤の有無を問わず、４０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ  ５．０）及び１００ｍＭフォンダパリヌクス（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）で構成した。ヘパラナーゼを、特に明記しない限り、１４０ｐＭの最終濃度まで添加して、アッセイをスタートした。プレートを、接着テープでシールし、３７℃にて２〜２４時間インキュベーションしてから、０．１Ｍ  ＮａＯＨ中の１．６９ｍＭ  ４−［３−（４−ヨードフェニル）−２−（４−ニトロフェニル）−２Ｈ−５−テトラゾリオ］−１，３−ベンゼンジスルホナート（ＷＳＴ−１）を含有する１００μｌの溶液を添加することによりアッセイを止めた。プレートを接着テープで再びシールし、６０℃にて６０分間発現させ、吸光度を５８４ｎｍで測定した（ＦＬＵＯｓｔａｒ、ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ）。
【０１６５】
（例４．２）
アッセイの結果
ヘパラナーゼの阻害アッセイの結果は、図１から３で示されている。化合物は、以下のキーに従って同定できる：
Ｄｅｎ１２＝化合物２５ａ（スキーム６）
Ｄｅｎ１３＝化合物１７ｃ（スキーム３）
Ｄｅｎ１４＝化合物１７ｂ（スキーム３）
Ｄｅｎ１５＝化合物１７ｄ（スキーム３）
Ｄｅｎ１６＝化合物２５ｂ（スキーム６）
Ｄｅｎ１７＝化合物１７ａ（スキーム３）
【０１６６】
図１は、対照（陰性対照、ヘパラナーゼなし）及びＨＰＥの陽性対照（ヘパラナーゼ単体、阻害剤なし）に対する、１μＭの阻害剤の濃度での化合物１７ｃ、２５ｂ及び１７ａによるヘパラナーゼの阻害を示す。
【０１６７】
図２は、バックグラウンド対照（ヘパラナーゼを添加していない）及び阻害剤なしの陽性対照（ヘパラナーゼ単体）に対する、１０μＭの阻害剤濃度での、化合物２５ａ、１７ｃ、１７ｂ、１７ｄ及び２５ｂによるヘパラナーゼの阻害を示す。
【０１６８】
図３は、化合物１７ｃ、２５ｂ及び１７ａの用量反応を示す。
【０１６９】
化合物１７ａ〜ｄ、２５ａ及び２５ｂを、ヘパラナーゼの阻害剤として評価した。いずれの化合物も、ヘパラナーゼを阻害する能力を示し、化合物１７ａ、１７ｂ及び１７ｃは、特に良好な阻害剤であることが見出された。さらに、化合物１７ｂは、溶液中において、様々な濃度でヘパラナーゼのきわめて良好な阻害を示した。
【０１７０】
（例５）
ＮＰＣ中のコレステロール活性
（例５．１）
アッセイの方法論
細胞培養及び細胞系
アルツハイマー病及びニーマン−ピック病Ｃ型（ＮＰＣ）患者に由来する線維芽細胞の細胞系、及び健常な対照は、Ｃｏｒｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｃａｍｄｅｎ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）から得た。細胞系ＧＭ０３１２３は、ＮＰＣ１遺伝子に２つのヘテロ接合変異を有する９歳のＮＰＣ患者に由来していた。細胞系ＧＭ０９５０３を、ＮＰＣ細胞系に対する健常な対照として使用した。細胞系ＮＤ４１００１は、プレセニリン１変異を保有する４７歳の家族性（早期発症）アルツハイマー病（ＡＤ）患者に由来していた。細胞系ＮＤ３８５３０は、ＡＤ細胞系に対する健常な対照として使用した。細胞系のさらなる詳細は、Ｃｏｒｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｃａｔａｌｏｇ．ｃｏｒｉｅｌｌ．ｏｒｇ／）で入手できる。
【０１７１】
細胞培養作業は、Ｅｍａｉｌ  Ａｉｒ  Ｈａｎｄｌｉｎｇ  Ｃｌａｓｓ  ＩＩ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｃａｂｉｎｅｔ（ＡＥＳ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｐｔｙ  ＬＴＤ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）において無菌状態で実行した。１０％ウシ胎仔血清（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ）、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（安定化Ｌ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ）、１００単位／ｍＬペニシリン及び１００単位／ｍＬストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ）を補充したＤＭＥＭ（１０３１３−０２１、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ）中ですべての細胞系を培養した。３７℃及び５％ＣＯ２にて加湿したインキュベーター（Ｓａｎｙｏ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏ．Ｌｔｄ、Ｊａｐａｎ）中の２５又は７５ｃｍ２フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｉｎｖｉｔｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ）中で細胞系を維持した。実験培養は、テストされる化合物との何らかの潜在的な相互作用を避けるために抗生物質を入れない同培地中で実行した。
【０１７２】
実験に関して、細胞は、９６ウェル黒色プレート（Ｃｅｌｌ−ｃａｒｒｉｅｒ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｓｃｉｍｅｄ  Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ）中において、体積１００μＬの培地中に１．２５×１０３細胞／ｍＬの密度でシードし、２４時間増殖させてから処理した。培地を、次いで、必要とされる処理を補った新しい培地で置き換えた。細胞系ＧＭ０３１２３及びＮＤ４１００１は、未処理のままにした、或いは、無菌脱イオン水（ｄＨ２０）に溶解した１０μＭ若しくは１００μＭのヘパラン硫酸化合物、ＤＭＳＯに溶解した１０μＭスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、又は０．１％ＤＭＳＯで処理した。健常な対照細胞系ＧＭ０９５０３及びＮＤ３８５３０は、未処理のままにした、又は、１μｇ／ｍＬの最終濃度で無菌ｄＨ２０に溶解したＵ１８６６６Ａで処理した。Ｕ１８６６６Ａは、細胞にコレステロールの蓄積を引き起こすので、フィリピン染色に対する陽性対照である。細胞を、次いで、４８時間増殖させた。
【０１７３】
フィリピン染色及び共焦点顕微鏡法
固定する前に、細胞を、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。この時点から、１分当たり４５ｒｅｖの回転テーブルで、すべての処理及び洗浄に着手した。細胞を、１×ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ）中の１．５％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で２０分固定した。細胞を、次いで、１×ＰＢＳで４分間洗浄した。これを２回繰り返した。細胞を、次いで、光から保護された５０μｇ／ｍＬフィリピン色素（ストレプトマイセス・フィリピネンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｉｌｉｐｉｎｅｎｓｉｓ）、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａｕｓｔｒａｌｉａからのフィリピン複合体）で２時間染色した。光の曝露を最小限にして、細胞を、１×ＰＢＳで４分間洗浄し、これを２回繰り返した。細胞は、共焦点顕微鏡法のために１×ＰＢＳ中で放置した。フィリピンで染色した細胞は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｏｐｅｒａ（商標）ハイスループットスピニングディスク共焦点顕微鏡を使用し、４０５ｎｍレーザー及び２０×水浸対物レンズを使用して撮像した。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｃａｐｅｌｌａ（商標）ソフトウェアを、画像解析に使用した。ＮＰＣ細胞では、コレステロールは、後期エンドソーム又は早期リソソームの特性を有する小器官に蓄積する。これらは、リソソーム様貯蔵小器官（ＬＳＯ）として記載されている。細胞における遊離コレステロールレベルの分析は、Ｐｉｐａｌｉａら、ニーマン−ピック病Ｃ型細胞におけるコレステロール蓄積を部分的に回復する化合物に対する自動顕微鏡スクリーニング（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｔｈａｔ  ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｒｅｖｅｒｔ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｉｅｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ  Ｃ  ｃｅｌｌｓ）、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．、２００６年、４７（２）：２８４〜３０１頁により記載されているハイスループット共焦点像に向けて設計した方法を使用して実行した。低い蛍光閾値を選択し、これにより、細胞が占める合計面積が特定され、別の高い閾値を選択して、細胞内におけるコレステロールの明るいフィリピン染色面積を判定した。これらの領域は、一般的に核の周囲であった。
【０１７４】
リソソーム様貯蔵小器官（ＬＳＯ）の比を、
ＬＳＯ比＝高い閾値を超える全強度／低い閾値を超えるピクセル数と定義した。
【０１７５】
パーセントＬＳＯ（％ＬＳＯ）値を、
ＬＳＯ比（処理）／ＬＳＯ比（未処理）×１００と定義した。
【０１７６】
統計学的有意性は、両側スチューデントｔ検定により判定した。
【０１７７】
ＳＡＨＡは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤であり、標準として使用した。
【０１７８】
（例５．２）
アッセイの結果
ＮＰＣコレステロール活性アッセイの結果を、表１に示す。化合物１７ｃ及び２５ａは、ニーマン−ピック病Ｃ型及びアルツハイマー病患者に由来する線維芽細胞におけるフィリピン（コレステロール）蛍光性に対して、プラス効果を示した。これらを、ＨＤＡＣ遺伝子の大多数の調節異常を無効にする能力を有する、臨床的に承認されたヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤ＳＡＨＡと比較して優位であった。バイオアッセイの結果は、生物におけるコレステロール及びスフィンゴ脂質両方のリソソーム蓄積における変化、コレステロールのエステル化不良、及び複数の態様の脂質運搬と相互に関連付けられる。ＨＤＡＣ阻害は、ＮＰＣ疾患に対して潜在的な、新規且つ有望な治療と特定される。
【表１】
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【０１７９】
（例６）
マウスにおける骨髄腫の処置
Ｗｅｉｓｓｍａｎｎら（ＰＮＡＳ、１１３（２０１６年）、７０４頁）で報告されている方法論を使用して、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（ｎ＝１２）に、静脈内注入により、ルシフェラーゼで標識したヒトＣＡＧミエローマ細胞を接種した（５＊１０６細胞／マウス）。接種の２４時間後にスタートして、処置群（ｎ＝６）に、腹腔内注入により、１００μＬのリン酸緩衝生理食塩水に溶解した６００μｇの化合物１７ｃ（上の例３．２５を参照されたい）を４週間毎日投与した。対照群（ｎ＝６）に、１００μＬのリン酸緩衝生理食塩水を同様に注入した。２週目から、マウスにルシフェリンを注入した５〜２０分後に、ｉｎ  ｖｉｖｏ発光シグナルの画像を検出した。動物からの全身生物発光画像の定量は、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ（登録商標）ソフトウェアを使用して行った。マウスに、１５０ｍｇ／ｋｇのＤ−ルシフェリン基質を腹腔内に注入し、麻酔をかけ、遮光カメラボックス内の載物台に置き、イソフルラン（ＥＺＡｎｅｓｔｈｅｓｉａ）に連続して曝露した。生物発光細胞から放射される光は、ＩＶＩＳカメラシステムにより検出し、５×１０４から１×１０７に設定したログスケールカラーレンジを使用して腫瘍負荷について画像を定量し、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を使用して、１秒当たりの合計光子計数を測定した。画像を、個々の動物の腹側（前面）及び背側（後面）位置の両方から収集した。
【０１８０】
３及び４週での結果を図４に示す。これらは、化合物１７ｃを用いた処置により、未処置マウスと比較して、処置したマウスにおける腫瘍負荷の有意な減少が引き起こされたことを実証する。
【０１８１】
（例７）
コラーゲンＩ型の生成
５２歳の白人女性の正常な乳房皮膚から得られた、ヒト真皮線維芽細胞の細胞系からの細胞ＣＲＬ２０７１（１２〜１４代継代）は、テスト化合物を添加する前に６〜８時間付着させた。テスト物品に７２時間曝露させた後で、培地を除去し、細胞を計数し、細胞を伴う分画を抽出した。コラーゲンＩ型の濃度について、ＣｈｏｎｄｒｅｘヒトＩ型コラーゲン検出キットＥＬＩＳＡ（Ｃａｔ＃６０２１）を使用して、培地及び細胞を伴う分画を分析した。
【０１８２】
完全に溶解した後で、０．２２μＭシリンジフィルターを通して溶液を無菌濾過し、使用するまで４℃にて保持した。各実験の前に、細胞特異的培地中で１００ｎＭ、１μＭ又は１０μＭに希釈することにより希釈物を新しく調製した。
【０１８３】
テスト化合物、陽性対照及び処理なしの培地を、フラスコに添加（２．５ｍｌ／フラスコ）し、細胞を７２時間インキュベーションしてから、上澄みを除去した。上澄みを除去した後で、細胞単層を、各フラスコ中で、ＰＢＳ中の２．５ｍｌの０．０２５％トリプシン／０．１ｍｍ  ＥＤＴＡでトリプシン処理した。細胞を脱離した後で（７〜１０分）、１ｍｌの細胞／トリプシン混合物を、９ｍｌの通常の生理食塩水を含有する２０ｍｌ計数バイアルに添加した。細胞を、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ  Ｚ２で定量した。
【０１８４】
いくつかの処理では、細胞が浮いていることを見出した。これらを収集し、計数し、１％トリパンブルー染色を使用して生存能力テストを施した。残った１．５ｍｌのトリプシン／細胞混合物は、Ｂｒａｎｓｏｎ探針付き超音波処理器で、１分間超音波処理し、６にセットしてから、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄みを除去し、細胞を伴うコラーゲン定量のためにコラーゲンＥＬＩＳＡで使用した。
【表２】
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【０１８５】
（例８）
細菌コラゲナーゼＩＩ型の阻害
比色分析ゼラチン分解アッセイを使用して、クロストリジウム・ヒストリチクムからの細菌コラゲナーゼＩＩ型の活性に対するヘパラナーゼ阻害剤の効果を評価した。反応混合物を、マイクロプレートの各ウェルに対して２０μｌ／阻害アッセイの合計体積で調製した。まず、１μｌの１００ｎｇ細菌コラゲナーゼ及び２μｌのヘパラナーゼ阻害剤又は陽性対照（５０μｇ／ｍｌドキシサイクリン）を、９６ウェルプレートの各ウェル中に添加し、３７℃にて６０分間インキュベーションした。インキュベーションが完了したら、１０μｇのゼラチン及び２μｌの１０×コラゲナーゼ緩衝液（５００ｍＭトリス−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＣａＣｌ２、及び１．５Ｍ  ＮａＣｌ）を蒸留水に添加して、２０μｌの最終体積を得た。プレートを、次いで、３７℃にて４ｈインキュベーションした。続いて、４０％メタノール／１０％酢酸に溶解した２０μｌの２．５％ｗ／ｖクマシーブリリアントブルーＲ−２５０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し、続いて、軌道振とう機で５分間振とうすることにより、残ったゼラチンの量を定量した。上澄みをピペットで慎重に除去して、ゼラチン沈殿物が確実に分散しないようにし、５０μｌのジメチルスルホキシドを添加して、沈殿物を溶解した。プレートを室温にて１５分間インキュベーションし、続いて、軌道振とう機で５分間振とうした。プレートを、次いでＶｅｒｓａｍａｘマイクロプレートリーダーで、６００ｎｍにて読み取った。
【表３】
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【０１８６】
（例９）
ヒアルロナンの生成
５２歳の白人女性の正常な乳房皮膚から得られた、ヒト真皮線維芽細胞の細胞系からの細胞ＣＲＬ２０７１（１２〜１４代継代）は、テスト化合物を添加する前に６〜８時間付着させた。テスト物品に７２時間曝露させた後で、培地を除去し、細胞を計数し、細胞を伴う分画を抽出した。ヒアルロナンの濃度について、ヒアルロナン検出キットＥＬＩＳＡを使用して、培地及び細胞を伴う分画を分析した。
【０１８７】
テスト化合物、陽性対照及び処理なしの培地を、フラスコに添加（２．５ｍｌ／フラスコ）し、細胞を７２時間インキュベーションしてから、上澄みを除去した。上澄みを除去した後で、細胞単層を、各フラスコ中で、ＰＢＳ中の２．５ｍｌの０．０２５％トリプシン／０．１ｍｍ  ＥＤＴＡでトリプシン処理した。細胞を脱離した後で（７〜１０分）、１ｍｌの細胞／トリプシン混合物を、９ｍｌの通常の生理食塩水を含有する２０ｍｌ計数バイアルに添加した。細胞を、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ  Ｚ２で定量した。
【０１８８】
いくつかの処理では、細胞が浮いていることを見出した。これらを収集し、計数し、１％トリパンブルー染色を使用して生存能力テストを施した。残った１．５ｍｌのトリプシン／細胞混合物は、Ｂｒａｎｓｏｎ探針付き超音波処理器で、１分間超音波処理し、６にセットしてから、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄みを除去し、細胞を伴うヒアルロナン定量のためにヒアルロナンＥＬＩＳＡで使用した。
【表４】
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【０１８９】
（例１０）
チロシナーゼの阻害
初代ヒト表皮メラニン細胞の細胞系（ＰＣＳ−２００−０１３）を、テスト試薬に７２時間付着させてから２４時間インキュベーションした。インキュベーションした後に、細胞を可溶化し、基質としてＬ−ドーパを使用して、チロシナーゼ活性を判定し、キノコチロシナーゼの検量線を確立して、各化合物の阻害活性を定量化した。テスト及び対照化合物への曝露の７２時間後、細胞単層を１ｍｌのＰＢＳ中で洗浄し、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．９）中の１ｍｌの０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で可溶化し、−８０℃にて３０分間、続いて、室温にて２５分間、及び３７℃にて５分間インキュベーションすることにより凍結融解した。この細胞抽出物を、チロシナーゼ活性について分析した。
【０１９０】
改変したキノコチロシナーゼアッセイを使用して、チロシナーゼ活性を評価した。まず、３ｍｌの８ｍＭ  Ｌ−ドーパ（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を、５０ｍＭリン酸塩緩衝液、ｐＨ６．８に溶解し、これを、１ｍｌの管に添加し、上の細胞抽出物及び管を３７℃にて６０分間インキュベーションした。Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｎｏｖａｔｅｃ  Ｍｏｄｅｌ  ＩＩで、Ａ４９２ｎｍにて管を読み取り、各管は、ブランクに対して読み取った。
【表５】
2020515633.tif 000113
【０１９１】
（例１１）
ヒアルロニダーゼの阻害
ヘパラナーゼ阻害剤を、ヒアルロナンの存在下で、精巣ヒアルロニダーゼとインキュベーションし、インキュベーションした後で、残ったヒアルロン酸の量を定量した。ヒアルロニダーゼ活性を、Ｔｏｌｋｓｄｏｒｆの方法［Ｔｏｌｋｓｄｏｒｆ，Ｓ．＆ＭｃＣｒｅａｄｙ，Ｍ．Ｈ．、ヒアルロニダーゼの比濁判定（Ｔｈｅ  ｔｕｒｂｏｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ）、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９４９年、３４（１）：７４〜８９］に従って測定した。ヒアルロン酸は、酸性アルブミン溶液と濁りを形成する能力により測定した。濁りは、ヒアルロン酸濃度の作用であり、したがって、酵素活性と関連付けることができる。１単位は、ＵＳＰ内部標準の５４０ｎｍでの吸光度（濁り）の変化に基づく。すべての管を、５分間沸騰水浴に入れ、次いで、室温に冷却した。冷却する際、９．０ｍｌのアルブミン試薬を添加し、管を１０分間置いた。Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｎｏｖａｔｅｃ  モデルＩＩで、５４０ｎｍにて吸光度の読み取りを行った。ヒアルロン酸の濃度（ｍｇ）に対するＡ５４０ｎｍをプロットして、検量線を形成した。
【表６】
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【産業上の利用可能性】
【０１９２】
本発明は、癌、炎症、糖尿病性腎症、神経変性障害、ニーマン−ピック病Ｃ型を含む疾患の処置又は防止、並びに、ある薬用化粧品としての及び皮膚科学的な使用に有用な化合物に関する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
2020515633.tif 000142
【図４】
2020515633.tif 000143
【国際調査報告】
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2020515633.tif 000145
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