(57)【要約】二元ペプチドまたは三元ペプチドのいずれかからなるペプチドであって、該ペプチドは、少なくとも４個のアミノ酸から最大１６個までのアミノ酸を含有し、２つまたは３つの異なる領域からなり、二元ペプチドは、２つの異なる領域を有し、三元ペプチドは、３つの異なる領域を有し、該ペプチドが、動物の腸内プロテアーゼ及び昆虫または線虫の腸内プロテアーゼの両方によって切断可能である、ペプチド。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つまたは３つの異なる領域からなる、少なくとも４個のアミノ酸から最大１６個までのアミノ酸を含有する二元ペプチドまたは三元ペプチドのいずれかからなるペプチドであって、前記二元ペプチドは、２つの異なる領域を有し、前記三元ペプチドは、３つの異なる領域を有し、前記二元ペプチド及び三元ペプチドが、動物の腸内プロテアーゼ及び昆虫または線虫の腸内プロテアーゼの両方によって切断可能である、前記ペプチド。
【請求項２】
前記二元ペプチドが、少なくとも４個のアミノ酸から最大８個までのアミノ酸を含有し、前記ペプチドが、２つの異なる領域を含み、前記領域のうちの一方が、動物の腸内プロテアーゼによって切断可能であり、他方の領域が、昆虫または線虫の腸内プロテアーゼによって切断可能である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記三元ペプチドが、少なくとも５個のアミノ酸から最大１６個までのアミノ酸を含有し、前記三元ペプチドが、二元ペプチド及びアミノ酸数１〜４のスペーサーを含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
前記スペーサーが、アミノ酸配列ＧＳ、ＷＮ、ＷＱ、ＭＡ、ＭＶ、ＡＭ、ＬＨ、ＭＮ、ＥＳ、ＷＱ、またはＤＴを含む、請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
前記二元ペプチドが、Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２、Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３、Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４、Ｙ１−Ｙ２−Ｘ１−Ｘ２、Ｙ１−Ｙ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３、Ｙ１−Ｙ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４、Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｘ１−Ｘ２、Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３、Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４、Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｘ１−Ｘ２、Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３、Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４からなる群から選択されるアミノ酸配列［式中、各Ｘｎ及び各Ｙｎはアミノ酸であり、各Ｘｎ及び各Ｙｎはアミノ酸であり、Ｘ１は、（全て一文字アミノ酸形式で）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、及びＶからなる群から選択され、Ｘ２は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ４は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｙ１は、（全て一文字アミノ酸形式で）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ２は、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ４は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される］を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の二元ペプチド。
【請求項６】
前記二元ペプチドが、アミノ酸配列：ＡＦＶＲＬＦ、ＡＫＬＦＶ、ＡＬＦＡＬＫ、ＡＬＦＬＫ、ＡＬＦＬＲ、ＡＬＦＲ、ＡＬＦＲＬＲ、ＡＬＫＡＬＦ、ＡＬＫＦＦ、ＡＬＫＦＬＶ、ＡＬＫＩＦＶ、ＡＬＫＬＦＶ、ＦＦＡＤＩＫ、ＦＦＡＬＫ、ＦＦＬＫ、ＦＦＬＲ、ＦＦＲＬＲ、ＦＧＹＲＩＫ、ＦＬＲＬＦ、ＦＹＡＲＲ、ＧＧＬＲＫＫ、ＩＦＶＡＬＫ、ＩＦＶＬＫ、ＩＦＶＬＲ、ＩＦＶＲ、ＩＦＶＲＬＲ、ＩＬＦＮＩＫ、ＬＦＡＡＰＦ、ＦＶＡＬＫ、ＬＦＶＬＫ、ＬＦＶＬＲ、ＬＦＶＲ、ＬＦＶＲＬＲ、ＬＦＶＲＶＦＬ、ＬＧＥＲ、ＬＫＡＬＦ、ＬＫＦＦ、ＬＫＩＦＶ、ＬＫＬＦＶ、ＬＲＡＬＦ、ＬＲＦＦ、ＬＲＩＦＶ、ＬＲＬＦＶ、ＲＡＬＦ、ＲＩＦＶ、ＲＬＦＶ、ＲＬＲＡＬＦ、ＲＬＲＦＦ、ＲＬＲＩＦＶ、ＲＬＲＬＦＶ、ＲＲＫＡＦＶ、ＲＲＫＬＩＦ、ＲＲＲＦＦＡ、ＶＦＧＲＫＧ、及びＹＦＶＲＫを有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項７】
前記二元ペプチドが、アミノ酸配列：ＩＦＶＡＬＫ、ＩＦＶＲＬＲ、ＡＬＫＬＦＶ、ＡＬＫＦＬＶ、ＲＲＫＡＦＶ、ＬＦＡＡＰＦ、ＬＦＶＡＬＫ、ＬＲＬＦＶ、ＬＦＶＲＬＲ、またはＬＫＬＦＶを有する、請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
前記三元ペプチドが、ＩＦＶＡＬＫＧＳ、ＩＦＶＲＬＲＧＳ、ＡＬＫＬＦＶＧＳ、ＡＬＫＦＬＶＧＳ、ＲＲＫＡＦＶＧＳ、ＬＦＡＡＰＦＧＳ、ＬＦＶＡＬＫＧＳ、ＬＲＬＦＶＧＳ、ＬＦＶＲＬＲＧＳ、またはＬＫＬＦＶＧＳのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項９】
前記二元ペプチドが、アミノ酸配列ＩＦＶＲＬＲ、ＡＬＫＬＦＶ、ＡＬＫＦＬＶ、ＲＲＫＡＦＶ、またはＬＦＡＡＰＦを有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１０】
前記三元ペプチドが、ＩＦＶＲＬＲＧＳ、ＡＬＫＬＦＶＧＳ、ＡＬＫＦＬＶＧＳ、ＲＲＫＡＦＶＧＳ、ＬＦＡＡＰＦＧＳ、ＧＳＩＦＶＲＬＲ、ＧＳＡＬＫＬＦＶ、ＧＳＡＬＫＦＬＶ、ＧＳＧＳＲＲＫＡＦＶ、またはＧＳＬＦＡＡＰＦのアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１１】
前記二元ペプチドまたは三元ペプチドが、毒性タンパク質（ＴＰ）に連結している、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１２】
前記ＴＰのＣ末端にインフレームで連結した第２の二元ペプチドまたは三元ペプチドを更に含む、請求項１１に記載のペプチド。
【請求項１３】
前記二元ペプチドまたは三元ペプチドが、小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）のＣ末端に連結している、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１４】
１つ以上の切断可能な連結ペプチドを有する殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質であって、前記殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質が、二元ペプチドまたは三元ペプチドのＮ末端にインフレームで融合したＥＲＳＰを含み、前記二元ペプチドまたは三元ペプチドが、（Ｌ−ＴＰ）ｎ、（Ｌ−ＴＰ）ｎ−Ｌ、（ＴＰ−Ｌ）ｎ、またはＬ−（ＴＰ−Ｌ）ｎ（式中、ＴＰは毒性タンパク質であり、Ｌは二元ペプチドまたは三元ペプチドであり、ｎは１〜２００の範囲の整数である）を含む構築物にインフレームで融合している、前記殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質。
【請求項１５】
前記昆虫のプロテアーゼが、ＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａまたはＣｏｌｅｏｐｔｅｒａ昆虫種に由来するプロテアーゼである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のペプチドあるいは殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質。
【請求項１６】
前記動物の腸内プロテアーゼが、ヒトの消化管プロテアーゼである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のペプチドあるいは殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質。
【請求項１７】
前記ＴＰが、ポア形成殺虫性タンパク質（ＰＦＩＰ）及びシステインリッチ殺虫性タンパク質（ＣＲＩＰ）からなる群から選択されるタンパク質である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のペプチドあるいは殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質。
【請求項１８】
前記ＴＰが、配列番号５〜１５９３及び１７６１〜１７７５に示されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはタンパク質と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％の配列同一性または配列相同性を有するペプチドまたはタンパク質である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のペプチドあるいは殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質。
【請求項１９】
前記ＴＰが、配列番号５、６及び１７６１、１７６２、１７６７、１７７１〜１７７３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはタンパク質、及びそれらの変異形と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％の配列同一性または配列相同性を有するペプチドまたはタンパク質である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のペプチドあるいは殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質。
【請求項２０】
前記ＴＰが、配列番号５、６、１７６１、１７６２、１７６７、１７７１〜１７７３、またはそれらの変異形のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するペプチドである、請求項１９に記載のペプチドあるいは殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のペプチドあるいは殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２２】
請求項２１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２３】
請求項２２に記載のベクターを含む細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、植物宿主細胞、または動物宿主細胞。
【請求項２４】
作動可能なプロモーターに連結したポリヌクレオチドを含むＤＮＡ構築物であって、前記ポリヌクレオチドが、二元ペプチドまたは三元ペプチドのいずれかを含む切断可能ペプチドをコードし、前記切断可能ペプチドが、少なくとも４個のアミノ酸から最大１６個までのアミノ酸を含有し、かつ２つまたは３つの異なる領域からなり、前記二元ペプチドは、２つの異なる領域を有し、前記三元ペプチドは、３つの異なる領域を有し、前記切断可能ペプチドが、動物の腸内プロテアーゼ及び昆虫または線虫の腸内プロテアーゼの両方によって切断可能であり、前記ポリヌクレオチドが、前記切断可能ペプチドにインフレームで融合した毒性ペプチドを更にコードする、前記ＤＮＡ構築物。
【請求項２５】
前記三元ペプチドが、少なくとも５個のアミノ酸から最大１６個までのアミノ酸を含有し、前記三元ペプチドが、二元ペプチド及びアミノ酸数１〜４のスペーサーを含む、請求項２４に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２６】
前記スペーサーが、アミノ酸配列ＧＳ、ＷＮ、ＷＱ、ＭＡ、ＭＶ、ＡＭ、ＬＨ、ＭＮ、ＥＳ、ＷＱ、またはＤＴを含む、請求項２５に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２７】
前記二元ペプチドが、Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２、Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３、Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４、Ｙ１−Ｙ２−Ｘ１−Ｘ２、Ｙ１−Ｙ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３、Ｙ１−Ｙ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４、Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｘ１−Ｘ２、Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３、Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４、Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｘ１−Ｘ２、Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３、Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４のアミノ酸配列［式中、各Ｘｎ及び各Ｙｎはアミノ酸であり、各Ｘｎ及び各Ｙｎはアミノ酸であり、Ｘ１は、（全て一文字アミノ酸形式で）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、及びＶからなる群から選択され、Ｘ２は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ４は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｙ１は、（全て一文字アミノ酸形式で）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ２は、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ４は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される］を含む、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２８】
前記二元ペプチドが、アミノ酸配列：ＡＦＶＲＬＦ、ＡＫＬＦＶ、ＡＬＦＡＬＫ、ＡＬＦＬＫ、ＡＬＦＬＲ、ＡＬＦＲ、ＡＬＦＲＬＲ、ＡＬＫＡＬＦ、ＡＬＫＦＦ、ＡＬＫＦＬＶ、ＡＬＫＩＦＶ、ＡＬＫＬＦＶ、ＦＦＡＤＩＫ、ＦＦＡＬＫ、ＦＦＬＫ、ＦＦＬＲ、ＦＦＲＬＲ、ＦＧＹＲＩＫ、ＦＬＲＬＦ、ＦＹＡＲＲ、ＧＧＬＲＫＫ、ＩＦＶＡＬＫ、ＩＦＶＬＫ、ＩＦＶＬＲ、ＩＦＶＲ、ＩＦＶＲＬＲ、ＩＬＦＮＩＫ、ＬＦＡＡＰＦ、ＦＶＡＬＫ、ＬＦＶＬＫ、ＬＦＶＬＲ、ＬＦＶＲ、ＬＦＶＲＬＲ、ＬＦＶＲＶＦＬ、ＬＧＥＲ、ＬＫＡＬＦ、ＬＫＦＦ、ＬＫＩＦＶ、ＬＫＬＦＶ、ＬＲＡＬＦ、ＬＲＦＦ、ＬＲＩＦＶ、ＬＲＬＦＶ、ＲＡＬＦ、ＲＩＦＶ、ＲＬＦＶ、ＲＬＲＡＬＦ、ＲＬＲＦＦ、ＲＬＲＩＦＶ、ＲＬＲＬＦＶ、ＲＲＫＡＦＶ、ＲＲＫＬＩＦ、ＲＲＲＦＦＡ、ＶＦＧＲＫＧ、及びＹＦＶＲＫを含む、請求項２７に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２９】
前記二元ペプチドが、アミノ酸配列：ＩＦＶＲＬＲ、ＡＬＫＬＦＶ、ＡＬＫＦＬＶ、ＲＲＫＡＦＶ、またはＬＦＡＡＰＦを含む、請求項２８に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３０】
前記ポリヌクレオチドが、アミノ酸配列：ＡＦＶＲＬＦＧＳ、ＡＫＬＦＶＧＳ、ＡＬＦＡＬＫＧＳ、ＡＬＦＬＫＧＳ、ＡＬＦＬＲＧＳ、ＡＬＦＲＧＳ、ＡＬＦＲＬＲＧＳ、ＡＬＫＡＬＦＧＳ、ＡＬＫＦＦＧＳ、ＡＬＫＦＬＶＧＳ、ＡＬＫＩＦＶＧＳ、ＡＬＫＬＦＶＧＳ、ＦＦＡＤＩＫＧＳ、ＦＦＡＬＫＧＳ、ＦＦＬＫＧＳ、ＦＦＬＲＧＳ、ＦＦＲＬＲＧＳ、ＦＧＹＲＩＫＧＳ、ＦＬＲＬＦＧＳ、ＦＹＡＲＲＧＳ、ＧＧＬＲＫＫＧＳ、ＩＦＶＡＬＫＧＳ、ＩＦＶＬＫＧＳ、ＩＦＶＬＲＧＳ、ＩＦＶＲＧＳ、ＩＦＶＲＬＲＧＳ、ＩＬＦＮＩＫＧＳ、ＬＦＡＡＰＦＧＳ、ＬＦＶＡＬＫＧＳ、ＬＦＶＬＫＧＳ、ＬＦＶＬＲＧＳ、ＬＦＶＲＧＳ、ＬＦＶＲＬＲＧＳ、ＬＦＶＲＶＦＬＧＳ、ＬＧＥＲＧＳ、ＬＫＡＬＦＧＳ、ＬＫＦＦＧＳ、ＬＫＩＦＶＧＳ、ＬＫＬＦＶＧＳ、ＬＲＡＬＦＧＳ、ＬＲＦＦＧＳ、ＬＲＩＦＶＧＳ、ＬＲＬＦＶＧＳ、ＲＡＬＦＧＳ、ＲＩＦＶＧＳ、ＲＬＦＶＧＳ、ＲＬＲＡＬＦＧＳ、ＲＬＲＦＦＧＳ、ＲＬＲＩＦＶＧＳ、ＲＬＲＬＦＶＧＳ、ＲＲＫＡＦＶＧＳ、ＲＲＫＬＩＦＧＳ、ＲＲＲＦＦＡＧＳ、ＶＦＧＲＫＧＧＳ、ＹＦＶＲＫＧＳ、ＧＳＡＦＶＲＬＦ、ＧＳＡＫＬＦＶ、ＧＳＡＬＦＡＬＫ、ＧＳＡＬＦＬＫ、ＧＳＡＬＦＬＲ、ＧＳＡＬＦＲ、ＧＳＡＬＦＲＬＲ、ＧＳＡＬＫＡＬＦ、ＧＳＡＬＫＦＦ、ＧＳＡＬＫＦＬＶ、ＧＳＡＬＫＩＦＶ、ＧＳＡＬＫＬＦＶ、ＧＳＦＦＡＤＩＫ、ＧＳＦＦＡＬＫ、ＧＳＦＦＬＫ、ＧＳＦＦＬＲ、ＧＳＦＦＲＬＲ、ＧＳＦＧＹＲＩＫ、ＧＳＦＬＲＬＦ、ＧＳＦＹＡＲＲ、ＧＳＧＧＬＲＫＫ、ＧＳＩＦＶＡＬＫ、ＧＳＩＦＶＬＫ、ＧＳＩＦＶＬＲ、ＧＳＩＦＶＲ、ＧＳＩＦＶＲＬＲ、ＧＳＩＬＦＮＩＫ、ＧＳＬＦＡＡＰＦ、ＧＳＬＦＶＡＬＫ、ＧＳＬＦＶＬＫ、ＧＳＬＦＶＬＲ、ＧＳＬＦＶＲ、ＧＳＬＦＶＲＬＲ、ＧＳＬＦＶＲＶＦＬ、ＧＳＬＧＥＲ、ＧＳＬＫＡＬＦ、ＧＳＬＫＦＦ、ＧＳＬＫＩＦＶ、ＧＳＬＫＬＦＶ、ＧＳＬＲＡＬＦ、ＧＳＬＲＦＦ、ＧＳＬＲＩＦＶ、ＧＳＬＲＬＦＶ、ＧＳＲＡＬＦ、ＧＳＲＩＦＶ、ＧＳＲＬＦＶ、ＧＳＲＬＲＡＬＦ、ＧＳＲＬＲＦＦ、ＧＳＲＬＲＩＦＶ、ＧＳＲＬＲＬＦＶ、ＧＳＲＲＫＡＦＶ、ＧＳＲＲＫＬＩＦ、ＧＳＲＲＲＦＦＡ、ＧＳＶＦＧＲＫＧ、及びＧＳＹＦＶＲＫを含む三元ペプチドをコードする、請求項２４に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３１】
前記昆虫のプロテアーゼが、ＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａまたはＣｏｌｅｏｐｔｅｒａ昆虫種に由来するプロテアーゼである、請求項２４に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３２】
前記動物の腸内プロテアーゼが、ヒトの消化管プロテアーゼである、請求項２４に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３３】
前記ＴＰが、ポア形成殺虫性タンパク質（ＰＦＩＰ）及びシステインリッチ殺虫性タンパク質（ＣＲＩＰ）からなる群から選択されるペプチドまたはタンパク質である、請求項２４〜３２のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３４】
前記ＴＰが、配列番号５〜１５９３及び１７６１〜１７７５に示されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはタンパク質と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％の配列同一性または配列相同性を有するペプチドまたはタンパク質である、請求項３３に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３５】
前記ＴＰが、配列番号５、６及び１７６１、１７６２、１７６７、１７７１〜１７７３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはタンパク質、及びそれらの変異形と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％の配列同一性または配列相同性を有するペプチドまたはタンパク質である、請求項３４に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３６】
前記ＴＰが、配列番号５、６、１７６１、１７６２、１７６７、１７７１〜１７７３、またはそれらの変異形のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するペプチドまたはタンパク質である、請求項３５に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３７】
請求項２４〜３６のいずれか１項に記載のＤＮＡ構築物を含む宿主細胞。
【請求項３８】
請求項３５に記載のＤＮＡ構築物を含む、請求項３７に記載の宿主細胞。
【請求項３９】
前記宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、または動物細胞である、請求項３７に記載の宿主細胞。
【請求項４０】
前記細菌細胞が、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞、Ｂａｃｉｌｌｕｓ細胞、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ細胞、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ細胞、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ細胞、及びＲｈｉｚｏｂｉｕｍ細胞からなる群から選択される、請求項３９に記載の宿主細胞。
【請求項４１】
前記植物細胞が、アルファルファ、バナナ、オオムギ、マメ、ブロッコリー、キャベツ、キャノーラ、ニンジン、キャッサバ、トウゴマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、柑橘類、ココナツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバ、ワタ、ウリ科植物、キュウリ、ベイマツ、ナス、ユーカリ、アマ、ニンニク、ブドウ、ホップ、ニラ、レタス、タエダマツ、アワ、メロン、ナッツ、カラスムギ、オリーブ、タマネギ、装飾用植物、パーム、牧草、エンドウマメ、ピーナッツ、コショウ、キマメ、マツ、ジャガイモ、ポプラ、カボチャ、ラジアータマツ、ダイコン、ナタネ、イネ、台木、ライムギ、ベニバナ、低木、ソルガム、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、スカッシュ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、スイートコーン、モミジバフウ、サツマイモ、スイッチグラス、茶、タバコ、トマト、ライコムギ、芝草、スイカ、及びコムギ植物の細胞からなる群から選択される、請求項３９に記載の宿主細胞。
【請求項４２】
作動可能なプロモーターに連結したポリヌクレオチドを含む植物またはその一部であって、前記ポリヌクレオチドが、二元ペプチドまたは三元ペプチドのいずれかを含む切断可能ペプチドをコードし、前記切断可能ペプチドが、少なくとも４個のアミノ酸から最大１６個までのアミノ酸を含有し、かつ２つまたは３つの異なる領域からなり、前記二元ペプチドは、２つの異なる領域を有し、前記三元ペプチドは、３つの異なる領域を有し、前記切断可能ペプチドが、動物の腸内プロテアーゼ及び昆虫または線虫の腸内プロテアーゼの両方によって切断可能であり、前記ポリヌクレオチドが、前記切断可能ペプチドにインフレームで融合した毒性ペプチドを更にコードする、前記植物またはその一部。
【請求項４３】
前記植物が、アルファルファ、バナナ、オオムギ、マメ、ブロッコリー、キャベツ、キャノーラ、ニンジン、キャッサバ、トウゴマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、柑橘類、ココナツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバ、ワタ、ウリ科植物、キュウリ、ベイマツ、ナス、ユーカリ、アマ、ニンニク、ブドウ、ホップ、ニラ、レタス、タエダマツ、アワ、メロン、ナッツ、カラスムギ、オリーブ、タマネギ、装飾用植物、パーム、牧草、エンドウマメ、ピーナッツ、コショウ、キマメ、マツ、ジャガイモ、ポプラ、カボチャ、ラジアータマツ、ダイコン、ナタネ、イネ、台木、ライムギ、ベニバナ、低木、ソルガム、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、スカッシュ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、スイートコーン、モミジバフウ、サツマイモ、スイッチグラス、茶、タバコ、トマト、ライコムギ、芝草、スイカ、及びコムギ植物からなる群から選択され、前記一部が、葉、茎、花、萼片、果実、根、または種子からなる群から選択される、請求項４２に記載の植物またはその一部。
【請求項４４】
植物の有害生物感染を制御する方法であって、前記方法が、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を発現する前記植物もしくはその一部を、前記有害生物の食餌に供給すること、あるいは、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を含む組成物を、前記植物またはその一部の少なくとも一部分にコーティングして供給することを含み、前記殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質が、１つ以上の切断可能な二元ペプチドまたは三元ペプチドと、１つ以上のＴＰとを含み、前記二元ペプチド及び三元ペプチドが、動物の腸内プロテアーゼ及び昆虫または線虫の腸内プロテアーゼの両方によって切断可能である、前記方法。
【請求項４５】
前記切断可能な二元ペプチドが、アミノ酸配列：Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２、Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３、Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４、Ｙ１−Ｙ２−Ｘ１−Ｘ２、Ｙ１−Ｙ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３、Ｙ１−Ｙ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４、Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｘ１−Ｘ２、Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３、Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４、Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｘ１−Ｘ２、Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３、Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４［式中、各Ｘｎ及び各Ｙｎはアミノ酸であり、各Ｘｎ及び各Ｙｎはアミノ酸であり、Ｘ１は、（全て一文字アミノ酸形式で）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、及びＶからなる群から選択され、Ｘ２は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ４は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｙ１は、（全て一文字アミノ酸形式で）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ２は、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ４は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される］を含む、請求項４４に記載の植物の有害生物感染を制御する方法。
【請求項４６】
前記二元ペプチドが、ＡＦＶＲＬＦ、ＡＫＬＦＶ、ＡＬＦＡＬＫ、ＡＬＦＬＫ、ＡＬＦＬＲ、ＡＬＦＲ、ＡＬＦＲＬＲ、ＡＬＫＡＬＦ、ＡＬＫＦＦ、ＡＬＫＦＬＶ、ＡＬＫＩＦＶ、ＡＬＫＬＦＶ、ＦＦＡＤＩＫ、ＦＦＡＬＫ、ＦＦＬＫ、ＦＦＬＲ、ＦＦＲＬＲ、ＦＧＹＲＩＫ、ＦＬＲＬＦ、ＦＹＡＲＲ、ＧＧＬＲＫＫ、ＩＦＶＡＬＫ、ＩＦＶＬＫ、ＩＦＶＬＲ、ＩＦＶＲ、ＩＦＶＲＬＲ、ＩＬＦＮＩＫ、ＬＦＡＡＰＦ、ＦＶＡＬＫ、ＬＦＶＬＫ、ＬＦＶＬＲ、ＬＦＶＲ、ＬＦＶＲＬＲ、ＬＦＶＲＶＦＬ、ＬＧＥＲ、ＬＫＡＬＦ、ＬＫＦＦ、ＬＫＩＦＶ、ＬＫＬＦＶ、ＬＲＡＬＦ、ＬＲＦＦ、ＬＲＩＦＶ、ＬＲＬＦＶ、ＲＡＬＦ、ＲＩＦＶ、ＲＬＦＶ、ＲＬＲＡＬＦ、ＲＬＲＦＦ、ＲＬＲＩＦＶ、ＲＬＲＬＦＶ、ＲＲＫＡＦＶ、ＲＲＫＬＩＦ、ＲＲＲＦＦＡ、ＶＦＧＲＫＧ、及びＹＦＶＲＫのアミノ酸配列を含む、請求項４４に記載の植物の有害生物感染を制御する方法。
【請求項４７】
前記二元ペプチドが、アミノ配列ＩＦＶＲＬＲ、ＡＬＫＬＦＶ、ＡＬＫＦＬＶ、ＲＲＫＡＦＶ、またはＬＦＡＡＰＦを含む、請求項４６に記載の植物の有害生物感染を制御する方法。
【請求項４８】
前記切断可能な三元ペプチドが、少なくとも５個のアミノ酸から最大１６個までのアミノ酸を含有し、前記三元ペプチドが、二元ペプチド及びアミノ酸数１〜４のスペーサーを含む、請求項４４に記載の植物の有害生物感染を制御する方法。
【請求項４９】
前記三元ペプチドが、そのＣ末端において、アミノ酸配列ＧＳ、ＷＮ、ＷＱ、ＭＡ、ＭＶ、ＡＭ、ＬＨ、ＭＮ、ＥＳ、ＷＱ、またはＤＴを含むジペプチドに融合している二元ペプチドを含む、請求項４８に記載の植物の有害生物感染を制御する方法。
【請求項５０】
前記昆虫のプロテアーゼが、ＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａまたはＣｏｌｅｏｐｔｅｒａ昆虫種に由来するプロテアーゼである、請求項４４に記載の植物の有害生物感染を制御する方法。
【請求項５１】
前記動物の腸内プロテアーゼが、ヒトの消化管プロテアーゼである、請求項４４に記載の植物の有害生物感染を制御する方法。
【請求項５２】
前記ＴＰが、ポア形成殺虫性タンパク質（ＰＦＩＰ）及びシステインリッチ殺虫性タンパク質（ＣＲＩＰ）からなる群から選択されるタンパク質である、請求項４４〜５１のいずれか１項に記載の植物の有害生物感染を制御する方法。
【請求項５３】
前記有害生物が、昆虫または線虫である、請求項４４に記載の植物の有害生物感染を制御する方法。
【請求項５４】
前記有害生物が、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ及びＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａからなる群から選択される昆虫目の昆虫である、請求項５３に記載の植物の有害生物感染を制御する方法。
【請求項５５】
前記ＴＰが、ポア形成殺虫性タンパク質（ＰＦＩＰ）及びシステインリッチ殺虫性ペプチド（ＣＲＩＰ）からなる群から選択されるペプチドまたはタンパク質である、請求項４４に記載の植物の有害生物感染を制御する方法。
【請求項５６】
前記ＴＰが、インヒビターシステインノット（ＩＣＫ）モチーフタンパク質または非ＩＣＫタンパク質である、請求項５５に記載の植物の有害生物感染を制御する方法。
【請求項５７】
前記ＴＰが、配列番号５、６及び１７６１、１７６２、１７６７、１７７１〜１７７３に示されるアミノ酸配列を有するペプチドまたはタンパク質、またはそれらの変異形と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも１００％の配列同一性または配列相同性を有するペプチドまたはタンパク質である、請求項５６に記載の植物の有害生物感染を制御する方法。
【請求項５８】
前記ＴＰが、配列番号５、６、１７６１、１７６２、１７６７、１７７１〜１７７３、またはそれらの変異形のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するペプチドまたはタンパク質である、請求項５７に記載の植物の有害生物感染を制御する方法。
【請求項５９】
前記植物によって殺虫有効量の前記ＴＰが供給され、前記植物が、組換え植物、前記植物の一部、または前記植物もしくは前記植物の一部の産物である、請求項４４に記載の植物の有害生物感染を制御する方法。
【請求項６０】
殺虫有効量の前記殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質が、前記植物または前記植物の一部に局所適用される１つ以上の製剤で供給され、前記１つ以上の製剤が、前記殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を含む細菌細胞、細菌胞子、真菌細胞、真菌胞子、またはパラ胞子結晶を含む、請求項４４に記載の植物の有害生物感染を制御する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１０月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／４１１，１１７号に基づく利益及び優先権を主張するＰＣＴ出願であり、この米国仮特許出願の開示内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
【０００２】
配列表
本出願は、２０１７年９月２９日に作成され本明細書と共に電子提出された「ＦＡＭ＿Ｏ＿ＰＣＴ＿２２５３１２＿４１７６４１＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴ＿２０１７＿０９＿２９＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題する配列表（５．３７ＭＢ）の全体を参照により組み込む。
【０００３】
新たな殺虫性及び殺線虫性タンパク質、切断可能ペプチド、それらをコードするＤＮＡ構築物、トランスジェニックタンパク質、植物におけるそれらの発現、トランスジェニックタンパク質を産生する方法、新たなプロセス、産生技術、新たなペプチド、新たな製剤、ならびに昆虫及び線虫を制御するための関連する殺虫性及び殺線虫性タンパク質に期待されるものよりも高い有害生物抵抗性をもたらすトランスジェニックタンパク質に含有された新規及び公知の殺虫性及び殺線虫性タンパク質の組み合わせが記述され、特許請求される。
【背景技術】
【０００４】
近代農業及び園芸によって生産される食物の世界的安全性には、昆虫有害生物という問題がある。農業従事者は虫害を抑制するために殺虫剤に依存しているが、危険な化学物質の市場からの排除、ならびにあらゆる主要なクラスの化学的殺虫剤及び生物学的殺虫剤に対して抵抗性がある昆虫系統の進化により、農業従事者にとって利用可能な安全かつ機能的な殺虫剤の商業的選択肢は減少している。農業従事者が作物保護を維持するためには新たな殺虫剤が必要である。
【０００５】
殺虫性及び殺線虫性のペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質は、それらの標的、通常は昆虫または線虫に対して毒性があるペプチド及びタンパク質ポリマーである。殺虫性ペプチドまたは毒素は、一般的にサソリまたはクモなどの節足動物起源に由来する。これらの毒素は、昆虫の腸または内臓に直接注入することによって送達してもよいし、または昆虫がその食物から毒素を摂取すること、例えば昆虫がトランスジェニック植物を採餌することを誘導することによって送達してもよい。これらの毒素は、昆虫の棲む生息地（ｌｏｃｕｓ）または昆虫の環境に散布または他の手段によって毒素を拡散することにより毒素が昆虫に送達されると、昆虫の成長を阻害したり、動きを損なったり、または更にはそれを殺傷したりする能力を有することが知られている。昆虫は、直接曝露または摂取により、毒性ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質と何らかのかたちで接触する。
【０００６】
しかしながら、殺虫性ペプチドが商業市場に達するには数多くの問題があり、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓすなわちＢｔに由来するペプチドという１つの注目すべき例外を除いては、これまでに認可され商業市場に出回っている殺虫性ペプチドは、あるとしてもごく少数である。現在、Ｂｔタンパク質に対する昆虫の抵抗性の上昇が大きく懸念されている。
【０００７】
Ｂｔタンパク質、またはＢｔペプチドは、植物組み込み保護剤及び葉面散布剤の両形態において作物保護のために使用される効果的な殺虫剤である。市販のＢｔタンパク質製剤は、幼虫段階で昆虫を制御するために広く使用されている。阻害性システインノットモチーフ（ＩＣＫ）タンパク質もまた、サソリまたはクモの毒液などの節足動物起源に由来する殺虫性ペプチドのクラスである。
【０００８】
トリプシン調節性卵形成阻害因子（ＴＭＯＦ）ペプチドなど、他のクラス及びタイプの潜在的なペプチドが特定されている。ＴＭＯＦペプチドは、殺虫活性を引き起こすためには、その生理学的作用部位に送達される必要がある。ＴＭＯＦペプチドは、大きな可能性をもつ潜在的な殺幼虫剤として特定されている（Ｄ．Ｂｏｒｏｖｓｋｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０６，３８６９−３８７５を参照のこと）。しかし、ほぼ全ての他の殺虫性ペプチドと同様に、ＴＭＯＦは商業化されておらず、また、農業従事者によって広く使用されていない。これには理由がある。
【０００９】
殺虫性ペプチドをペプチド構造及びフォールディングの再現性よく合理的かつ経済的な価格において商業規模で首尾よく産生できるようにすることは、商業化への大きな障害であり得る。殺虫性ペプチドの幅広い種類、独特の特性、及び特殊な性質を可能性のある多種多様な産生技術と組み合わせると、ペプチドの応用及び産生のための膨大な数の手法がもたらされ得るが、商業的に成功しているものは、あるとしてもごく少数である。
【００１０】
特定されている多数の殺虫性ペプチドのうち市場に出回っているものがほとんどない理由はいくつかある。第１に、ほとんどの殺虫性ペプチドは、商業的に使用するには脆弱すぎるか、または毒性が不十分であるかのいずれかである。第２に、殺虫性ペプチドは商業的に産生するのが困難であり、コストが高い。第３に、多くの殺虫性ペプチドは急速に分解され、短い半減期を有する。第４に、植物で発現させたときに適切にフォールディングする殺虫性ペプチドはごく少数であり、遺伝子修飾植物などの遺伝子修飾生物（ＧＭＯ）においてその毒性は失われる。第５に、特定されている殺虫性ペプチドのほとんどは、昆虫の全身に分布することができず、かつ／または昆虫に摂取されるとその毒性を失う。この最後の問題に関してＢｔタンパク質は例外であり、Ｂｔタンパク質は昆虫の採餌を妨害するため広く使用されている。
本発明は、殺虫性ペプチドの商業化及び広範な使用を妨げてきたこれらの主要な問題に対し、いくつかの解決策を提示する。本発明は、活性部位、すなわち昆虫または線虫の腸もしくは他の臓器における、比較的多数の殺虫性及び殺線虫性の毒性ペプチドの合成及び放出を可能にする、トランスジェニックタンパク質を提示する。宿主における合成は、トランスジェニックタンパク質の適切なフォールディングを可能にし、宿主細胞における合成を増強させる、宿主細胞の領域における指向性発現によって促進される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｄ．Ｂｏｒｏｖｓｋｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０６，３８６９−３８７５
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、宿主細胞、例えば昆虫または線虫有害生物によって摂取される植物細胞において発現及び合成され得る、毒性のある殺虫性及び／または殺線虫性の毒性ペプチド及びタンパク質に融合した切断可能ペプチドを提示する。切断可能ペプチドは、昆虫及び／または線虫の腸内環境及び／または血リンパ環境ならびにヒトの胃腸管系において切断されることにより、１つ以上の殺虫性及び／または殺線虫性の毒性ペプチド及びタンパク質を含むそのペイロードを放出し得る。
【００１３】
第１の態様において、本発明は、２つまたは３つの異なる領域からなる、少なくとも４個のアミノ酸から最大１６個までのアミノ酸を含有する、二元ペプチドまたは三元ペプチドを含む切断可能ペプチドを提示する。一例において、二元ペプチドは、２つの異なる領域（昆虫もしくは線虫の切断可能領域及び動物（例えばヒト）の腸内切断可能領域）を有し、三元ペプチドは、二元ペプチドと同じ２つの領域を有するが、二元ペプチドには見出されないもう１つの領域も含む。またこの二元ペプチド及び三元ペプチドは、動物の腸内プロテアーゼ及び昆虫または線虫の腸内プロテアーゼの両方によって切断可能である。一部の実施形態では、本発明の切断可能ペプチド（二元及び三元の切断可能ペプチド（Ｌ））は、植物細胞において、内因性植物プロテアーゼによっても、天然に存在する植物プロテアーゼによっても切断され得ない。
【００１４】
関連する実施形態において、例示的な二元ペプチドは、Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２、Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３、Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４、Ｙ１−Ｙ２−Ｘ１−Ｘ２、Ｙ１−Ｙ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３、Ｙ１−Ｙ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４、Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｘ１−Ｘ２、Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３、Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４、Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｘ１−Ｘ２、Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３、Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４のアミノ酸配列［式中、各Ｘｎ及び各Ｙｎはアミノ酸であり、Ｘ１は、（全て一文字アミノ酸形式で）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、及びＶからなる群から選択され、Ｘ２は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ４は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｙ１は、（全て一文字アミノ酸形式で）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ２は、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ４は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される］を含む。
【００１５】
別の関連する態様において、本発明の三元ペプチドは、少なくとも５個のアミノ酸から最大１６個までのアミノ酸を含有し、三元ペプチドは、二元ペプチド及びアミノ酸数１〜４のスペーサーを含む。一部の実施形態では、スペーサーは、本明細書に開示されるように、アミノ酸配列ＧＳを含み、二元ペプチドのＮ末端に、または二元ペプチドのＣ末端に、または二元ペプチドのＮ末端及びＣ末端の両方にインフレームで融合している。
【００１６】
第２の態様において、本発明は、殺虫性または殺線虫性の毒性タンパク質に切断可能ペプチド（二元ペプチドまたは三元ペプチド）がインフレームで融合している殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を提示する。別の実施形態では、本発明は、２つ以上の切断可能ペプチドを有する殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質であって、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質が、二元ペプチドまたは三元ペプチドを含み、二元ペプチドまたは三元ペプチドが、（ＴＰ−Ｌ）ｎ（式中、ｎは、１〜２００、または１〜１００、または１〜１０の範囲の整数である）を含む構築物にインフレームで融合している、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を提示する。別の実施形態では、本明細書に記述される殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、二元ペプチドまたは三元ペプチドにインフレームで融合した小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）を含み、二元ペプチドまたは三元ペプチドは、殺虫性もしくは殺線虫性の毒性タンパク質及び／またはリピート構築物（Ｌ−ＴＰ）ｎもしくは（ＴＰ−Ｌ）ｎ（式中、ｎは、１〜２００、または１〜１００、または１〜１０の範囲の整数である）にインフレームで融合している。種々の実施形態において、例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、（ＥＲＳＰ）−（ＴＰ−Ｌ）ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）ｎ−（Ｌ）（式中、ｎは１〜２００の範囲の整数である）を含むタンパク質構築物を含み得る。上述した種々の関連する実施形態において、ＴＰは毒性タンパク質であり、Ｌは二元ペプチドまたは三元ペプチドであり、ｎは、１〜２００の範囲の整数、好ましくは１〜１００の範囲の整数、より好ましくは１〜１０の範囲の整数である。一部の実施形態では、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、同じであるかまたは異なっているＴＰと、同じであるかまたは異なっている二元ペプチド及び／または三元ペプチドとを含有し得る。一部の実施形態では、Ｃ末端側ＴＰは、そのＣ末端において、二元ペプチドまたは三元ペプチドに融合しているか、または融合していない。一部の実施形態では、Ｎ末端側ＴＰは、そのＮ末端において、二元ペプチドまたは三元ペプチドに融合しているか、または融合していない。
【００１７】
別の実施形態では、本発明は、２つ以上の切断可能ペプチドを有する殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質であって、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質が、二元ペプチドまたは三元ペプチドのＮ末端、あるいは（Ｌ−ＴＰ）ｎ、（Ｌ−ＴＰ）ｎ−Ｌ、（ＴＰ−Ｌ）ｎ、またはＬ−（ＴＰ−Ｌ）ｎを含む構築物のＮ末端のいずれかにインフレームで融合した安定化ドメイン（ＳＴＡ）を含む、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を提示する。一部の関連する実施形態において、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、毒性タンパク質のＮ末端に融合している二元ペプチドまたは三元ペプチドのＮ末端、あるいは（Ｌ−ＴＰ）ｎ、（Ｌ−ＴＰ）ｎ−Ｌ、（ＴＰ−Ｌ）ｎ、またはＬ−（ＴＰ−Ｌ）ｎを含む構築物のＮ末端のいずれかにインフレームで融合した、安定化ドメイン（ＳＴＡ）のＮ末端にインフレームで融合した、ＥＲＳＰを含む。種々の実施形態において、例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）ｎ−（Ｌ）、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）ｎ−（Ｌ）、または（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）ｎを含む構築物を含み得る。一部の関連する実施形態において、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、毒性タンパク質のＮ末端に融合している二元ペプチドまたは三元ペプチドのＮ末端、あるいは（Ｌ−ＴＰ）ｎ、（Ｌ−ＴＰ）ｎ−Ｌ、（ＴＰ−Ｌ）ｎ、またはＬ−（ＴＰ−Ｌ）ｎを含む構築物のＮ末端のいずれかにインフレームで融合した、ＥＲＳＰを含む。種々の実施形態において、例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）ｎ−（Ｌ）、または（ＥＲＳＰ）−（ＴＰ−Ｌ）ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）ｎを含む構築物を含み得る。本明細書及び上文に記述される種々の実施形態において、ＴＰは、昆虫及び／または線虫に対して毒性のある毒性タンパク質と定義され、Ｌは二元ペプチドまたは三元ペプチドであり、ｎは、１〜２００の範囲の整数、好ましくは１〜１００の範囲の整数、より好ましくは１〜１０の範囲の整数である。一部の実施形態では、本明細書及び上文に記述される構築物のＣ末端側ＴＰは、そのＣ末端において、二元ペプチドまたは三元ペプチドに融合しているか、または融合していない。一部の実施形態では、Ｎ末端側ＴＰは、そのＮ末端において、二元ペプチドまたは三元ペプチドに融合しているか、または融合していない。
【００１８】
別の関連する態様において、本発明は、本明細書に例示される殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を含む植物またはその一部を提示する。関連する実施形態において、本発明は、ＤＮＡ構築物、例えば発現ベクターにおいて、作動可能なプロモーター（例えば同種または異種プロモーター）に作動可能に連結したポリヌクレオチドを含む、植物またはその一部であって、ポリヌクレオチドが、二元ペプチドまたは三元ペプチドのいずれかを含むペプチドを含む殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードし、二元ペプチド及び／または三元ペプチドが、少なくとも４個のアミノ酸から最大１６個までのアミノ酸を含有し、かつ２つまたは３つの異なる領域からなり、二元ペプチドは、２つの異なる領域を有し、三元ペプチドは、３つの異なる領域を有し、二元ペプチド及び／または三元ペプチドが、動物の腸内プロテアーゼ（例えばヒトの腸内プロテアーゼ）及び昆虫または線虫の腸内プロテアーゼの両方によって切断可能であり、二元ペプチドまたは三元ペプチド（Ｌ）が、毒性タンパク質（ＴＰ）にインフレームで融合している、植物またはその一部を提示する。一部の実施形態では、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、リピート構築物（Ｌ−ＴＰ）ｎまたは（ＴＰ−Ｌ）ｎ（式中、ｎは、１〜２００、または１〜１００、または１〜１０の範囲の整数である）を含む。関連する実施形態において、二元ペプチド及び／または三元ペプチドは、そのＮ末端において、小胞体シグナルペプチド（ＥＲＳＰ）のＣ末端に作動可能に融合しており、そのＣ末端において、ＴＰのＮ末端に作動可能に融合している。図４、５、及び６Ｃを参照のこと。関連する実施形態において、植物またはその一部は、本明細書に例示される、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質、及び／または、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、この殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、二元ペプチドまたは三元ペプチドを含む（この二元ペプチドまたは三元ペプチドは、（ＴＰ−Ｌ）ｎを含む構築物にインフレームで融合している）か、あるいは殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、リピート構築物（Ｌ−ＴＰ）ｎまたは（ＴＰ−Ｌ）ｎ（式中、ｎは、１〜２００、または１〜１００、または１〜１０の範囲の整数である）を含む。関連する実施形態において、植物またはその一部は、本明細書に例示される、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質、及び／または、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、この殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、二元ペプチドまたは三元ペプチドのＮ末端にインフレームで融合したＥＲＳＰを含む（この二元ペプチドまたは三元ペプチドは、（ＴＰ−Ｌ）ｎを含む構築物にインフレームで融合している）か、あるいは殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、二元ペプチド及び／またはリピート構築物（Ｌ−ＴＰ）ｎもしくは（ＴＰ−Ｌ）ｎにインフレームで融合したＥＲＳＰを含む。図４、５、及び６Ｃを参照のこと。種々の実施形態において、例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、（ＥＲＳＰ）−（ＴＰ−Ｌ）ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）ｎ−（Ｌ）の構築物を含み得る。別の実施形態では、植物またはその一部は、作動可能なプロモーター（例えば同種または異種プロモーター）に作動可能に連結したポリヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドは、安定化ドメイン（ＳＴＡ）のＮ末端にインフレームで融合したＥＲＳＰを含む殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードする。図３、図５、及び図６Ｃを参照のこと。ＳＴＡは、二元ペプチドまたは三元ペプチドのＮ末端、あるいは（Ｌ−ＴＰ）ｎ、（Ｌ−ＴＰ）ｎ−Ｌ、（ＴＰ−Ｌ）ｎ、またはＬ−（ＴＰ−Ｌ）ｎを含む構築物のＮ末端のいずれかにインフレームで融合している。種々の実施形態において、例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）ｎ−（Ｌ）、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）ｎ−（Ｌ）、または（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）ｎを含み得る。種々の実施形態において、ＴＰは、本開示において記述及び例示される殺虫性タンパク質及び／または殺線虫性タンパク質であり得る毒性タンパク質であり、Ｌは二元ペプチドまたは三元ペプチドであり、ｎは、１〜２００、または１０〜１７５、または２０〜１５０、または３０〜１００、または４０〜１００、または２０〜７０、または２０〜６０、または２０〜５０、または２０〜４０、または３０〜４０の範囲の整数である。一部の実施形態では、ｎは、１〜２０、または５〜２０、または１０〜２０、または２０〜８０、または３０〜６０、または３０〜５０の範囲、好ましくは、およそもしくは約、または明確に２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０の整数である。一部の実施形態では、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、同じであるかまたは異なっているＴＰと、同じであるかまたは異なっている二元ペプチド及び／または三元ペプチドとを含有し得る。一部の実施形態では、Ｃ末端側ＴＰは、そのＣ末端において、二元ペプチドまたは三元ペプチドに融合しているか、または融合していない。
【００１９】
第３の態様において、本発明は、植物の有害生物感染または寄生を制御する方法を提示する。本方法は、植物もしくはその一部または植物細胞を該有害生物の食餌に供給することを含み、該植物、その一部、または植物細胞は、本明細書に例示される殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質、及び／または、作動可能なプロモーター（例えば同種もしくは異種プロモーター）に作動可能に連結した少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むＤＮＡ構築物を含み、このポリヌクレオチドは、１つ以上の切断可能な二元ペプチド及び／または三元ペプチドを有する殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードする。関連する実施形態において、植物またはその一部は、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするＤＮＡ構築物を含み、この殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、（ＴＰ−Ｌ）ｎを含む構築物、またはリピート構築物（Ｌ−ＴＰ）ｎ、（Ｌ−ＴＰ）ｎ−Ｌ、（ＴＰ−Ｌ）ｎ、もしくはＬ−（ＴＰ−Ｌ）ｎ（式中、ｎは、１〜２００、または１０〜１７５、または２０〜１５０、または３０〜１００、または４０〜１００、または２０〜７０、または２０〜６０、または２０〜５０、または２０〜４０、または３０〜４０の範囲の整数である）にインフレームで融合している二元ペプチドまたは三元ペプチドを含む。一部の実施形態では、ｎは、１〜２０、または５〜２０、または１０〜２０、または２０〜８０、または３０〜６０、または３０〜５０の範囲、好ましくは、およそもしくは約、または明確に２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０の整数である。関連する実施形態において、植物またはその一部は、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするＤＮＡ構築物を含み、この殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、二元ペプチドまたは三元ペプチドのＮ末端にインフレームで融合したＥＲＳＰを含む（この二元ペプチドまたは三元ペプチドは、（ＴＰ−Ｌ）ｎを含む構築物にインフレームで融合している）か、あるいは殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、二元ペプチド及び／またはリピート構築物（Ｌ−ＴＰ）ｎもしくは（ＴＰ−Ｌ）ｎにインフレームで融合したＥＲＳＰを含む。種々の実施形態において、例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、（ＥＲＳＰ）−（ＴＰ−Ｌ）ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（Ｌ−ＴＰ）ｎ−（Ｌ）（式中、ｎは、１〜２００、または１０〜１７５、または２０〜１５０、または３０〜１００、または４０〜１００、または２０〜７０、または２０〜６０、または２０〜５０、または２０〜４０、または３０〜４０の範囲の整数である）を含み得る。一部の実施形態では、ｎは、１〜２０、または５〜２０、または１０〜２０、または２０〜８０、または３０〜６０、または３０〜５０の範囲、好ましくは、およそもしくは約、または明確に２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０の整数である。
【００２０】
別の実施形態では、植物またはその一部は、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするＤＮＡ構築物を含み、この殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、安定化ドメイン（ＳＴＡ）のＮ末端にインフレームで融合したＥＲＳＰを含む。ＳＴＡは、二元ペプチドまたは三元ペプチドのＮ末端、あるいは（Ｌ−ＴＰ）ｎ、（Ｌ−ＴＰ）ｎ−Ｌ、（ＴＰ−Ｌ）ｎ、またはＬ−（ＴＰ−Ｌ）ｎを含む構築物のＮ末端のいずれかにインフレームで融合している。種々の実施形態において、例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）ｎ−（Ｌ）（式中、ｎは、１〜２００、または１０〜１７５、または２０〜１５０、または３０〜１００、または４０〜１００、または２０〜７０、または２０〜６０、または２０〜５０、または２０〜４０、または３０〜４０の範囲の整数である）の構築物を含み得る。一部の実施形態では、ｎは、１〜２０、または５〜２０、または１０〜２０、または２０〜８０、または３０〜６０、または３０〜５０の範囲、好ましくは、およそもしくは約、または明確に２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０の整数である。種々の実施形態において、例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）ｎ−（Ｌ）、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）ｎ、または（ＥＲＳＰ）−（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ−ＴＰ）ｎ−（Ｌ）、または（ＳＴＡ）−（ＴＰ−Ｌ）ｎ、または（ＳＴＡ）−（Ｌ）−（ＴＰ−Ｌ）ｎの構築物を含み得る。種々の実施形態において、ＴＰは毒性タンパク質であり、Ｌは二元ペプチドまたは三元ペプチドであり、ｎは、１〜２００の範囲の整数、好ましくは１〜１００の範囲の整数、より好ましくは１〜１０の範囲の整数である。一部の実施形態では、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、同じであるかまたは異なっているＴＰと、同じであるかまたは異なっている二元ペプチド及び／または三元ペプチドとを含有し得る。一部の実施形態では、Ｃ末端側ＴＰは、そのＣ末端において、二元ペプチドまたは三元ペプチドに融合しているか、または融合していない。上記に例示した実施形態の各々において、有害生物は、本開示に記述される昆虫または線虫であり得る。種々の実施形態において、ＤＮＡ構築物は、ベクター、例えば、本発明の殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むコーディング配列と、宿主細胞、例えば細菌細胞、酵母細胞、もしくは植物細胞におけるコーディング配列の複製及び／または発現を可能にする１つ以上の制御配列とを含有する、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る。上記の実施形態の一部では、本発明の二元ペプチド及び／または三元ペプチドは、植物細胞において、内因性植物プロテアーゼによっても、天然に存在する植物プロテアーゼによっても切断され得ない。
【００２１】
第４の態様において、本発明は、毒性ペプチドの活性部分と不活性部分との間に挿入された（例えばインフレームで融合した）二元ペプチドまたは三元ペプチドを含む、修飾された毒性ペプチドまたはタンパク質（ＴＰ）を提示する。一例では、ペプチドの切断可能なプロ型の不活性部分と、ペプチドの成熟型の活性部分との間に、二元ペプチドまたは三元ペプチドが挿入される。別の例では、修飾された毒性タンパク質（ＴＰ）は、毒性タンパク質（ＴＰ）の活性部分にインフレームで融合した本発明の二元ペプチドまたは三元ペプチドにインフレームで融合している安定化ドメインを含む。別の例では、修飾された毒性タンパク質（ＴＰ）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓすなわちＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（「Ｂｔ」）由来タンパク質であり、本明細書では別称「Ｂｔタンパク質」及び「Ｂｔペプチド」といい、これらは交換可能に使用され、Ｂｔにより産生されるペプチドを含み、本明細書ではこれらを集合的にＢｔ毒性タンパク質または「Ｂｔ  ＴＰ」と呼ぶ。このようなペプチド及びタンパク質は、ｃｒｙ、ｃｙｔ、及びｖｉｐ遺伝子によってコードされる「ｃｒｙ」、「ｃｙｔ」、または「ＶＩＰ」タンパク質と書かれることが多い。Ｂｔ  ＴＰは、より一般的には、ｃｒｙ遺伝子によってコードされる殺虫性結晶タンパク質に起因する。Ｂｔ  ＴＰは、ＰＦＩＰＳ（ポア形成殺虫性タンパク質）の例である。種々の実施形態において、修飾されたＴＰは、安定化ドメイン（ＳＴＡ）が、二元ペプチドまたは三元ペプチド、あるいは本発明の二元ペプチドまたは三元ペプチドを１つまたは２つ以上含有する構築物にインフレームで融合している、上文及び本明細書に記述されるＢｔタンパク質を含み得る。二元ペプチドまたは三元ペプチドは、昆虫及び／または線虫の腸内環境及び／または血リンパ環境に曝露されると、またヒトの胃腸管系において、二元ペプチドまたは三元ペプチドが切断され、それによりＴＰの活性型または成熟型からＴＰの安定化部分または不活性部分が分離し、切断された活性部分または成熟部分が殺虫性及び／または殺線虫性になるように、Ｂｔタンパク質の活性断片にインフレームで融合している。一部の実施形態では、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、Ｂｔ  ＴＰ及び／または修飾されたＢｔタンパク質、１つ以上の二元ペプチド及び／または三元ペプチド、ならびに上述のＥＲＳＰ及びＳＴＡのうちの１つ以上を含む。図３Ｂに示される一部の例示的な実施形態では、修飾されたＴＰは、Ｂｔ  ＴＰ、例えばｃｒｙ、ｃｙｔ、またはＶＩＰタンパク質を含んでよく、ここでＴＰｉｎａｃｔｉｖｅは、Ｂｔ（ｉｎａｃｔｉｖｅ）（Ｂｔ  ＴＰの不活性部分）であり、ＴＰａｃｔｉｖｅは、Ｂｔ（ａｃｔｉｖｅ）（Ｂｔ  ＴＰの活性部分）であり、これらは分離し、かつ、図３Ｂに示されるようにＬと表記される１つ以上の二元ペプチド及び／または三元ペプチドにインフレームで融合している。昆虫及び／または線虫の腸内環境及び／または血リンパ環境に曝露されると、また動物対象（例えばヒト対象）の胃腸管系において、二元ペプチドまたは三元ペプチドは切断され、それによりＴＰの活性部分または成熟部分からＴＰの不活性部分が分離し、切��された活性部分または成熟部分が昆虫及び／または線虫において殺虫性及び／または殺線虫性になる。一部の関連する実施形態において、上記の修飾されたＴＰ、例えば例示的なＢｔ  ＴＰは、場合により、修飾されたＴＰのＮ末端側部分にインフレームで融合したＥＲＳＰを含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ヒトの擬似胃腸液（ＳＧＦ）及び昆虫の腸内消化酵素によるアミノ酸配列ベースの切断の特異性を検出する、ＦＲＥＴキット（カタログ番号ＰＳＲＥＰＬＩ００５、Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ）におけるＦＲＥＴ分子の例証。この図は、いかに切断によって検出可能な蛍光が発生するかを説明するためにＭｉｍｏｔｏｐｅｓ  ＦＲＥＴキットから拝借したものである。
【図２】本発明の例示的な実施形態である第１及び第２の態様の例証。第１の態様は、（Ｌ）と表記される二元及び／または三元の切断可能リンカーペプチドの図形表現である。第２の態様は、毒性ペプチドまたはタンパク質（ＴＰ）に融合したＬの種々の組み合わせ（１〜２００のリピート）を例示している。
【図３】図３Ａ。ＴＰに融合したＬに融合した任意選択の安定性ドメインまたは安定性タンパク質（ＳＴＡ）の付加の例証。この図は、Ｎ末端位置に位置付けられ、Ｌ及びＴＰにインフレームで融合して例示的なＳＴＡ−Ｌ−ＴＰ構築物を形成している、ＳＴＡの例示的な使用を例証する。図３Ｂは、ＴＰのＴＰｉｎａｃｔｉｖｅ部分を含む修飾されたＴＰが、ＴＰのＴＰａｃｔｉｖｅ部分にインフレームで融合した切断可能（Ｌ）ペプチドにインフレームで融合している実施形態を示す。図３Ｂに例示されているように、動物ならびに昆虫及び／または線虫の腸内環境に曝露されると、切断可能なＬペプチドが切断され、それによりＴＰｉｎａｃｔｉｖｅ部分及びＴＰａｃｔｉｖｅ部分が分離し、よって昆虫及び／または線虫においてＴＰの活性部分が遊離する。種々の実施形態において、修飾されたＴＰは、本明細書に記述されるＢｔ  ＴＰである。
【図４】２つ以上のＴＰ及びＥＲＳＰを有する殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質における二元または三元の切断可能な連結ペプチドの例証。この図は、図２の種々の実施形態に、Ｎ末端側に融合したＥＲＳＰが付加されたものを例示する。
【図５】２つ以上のＴＰと、ＳＴＡのＮ末端側に融合したＥＲＳＰとを含む、例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質の二元または三元の切断可能な連結ペプチドの例証。この図は、図２の種々の実施形態に、ＳＴＡ及びこのＳＴＡのＮ末端側に融合したＥＲＳＰが付加されたものを例示する。
【図６】図６Ａは、ＢＡＡＳ  ＥＲＳＰを含む例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を示し、ＢＡＡＳ  ＥＲＳＰは、ユビキチンにインフレームで融合しており、ユビキチンは、Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ  ＴＰに融合しており、Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ  ＴＰは、３つのＬ−ＴＰ融合構築物（各反復構築物は、切断可能な連結ペプチドＬを含み、ここでＬは、３つの領域（ＸＹＺ）を有する三元の切断可能な連結ペプチドであり、Ｚ領域は、ジペプチドグリシン−セリンＧＳであり、ＴＰは、Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａである）に融合しており、最後のＴＰ  Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａは、融合した１０Ｈｉｓタグを有する。図６Ｂは、３反復構築物にインフレームで融合したＢＡＡＳ  ＥＲＳＰを含む例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を示し、この構築物は、二元または三元の切断可能な連結ペプチドであり得るリンカー（Ｌ）に融合したＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ  ＴＰを含む。最後のＵ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ  ＴＰは、１０Ｈｉｓタグを有する。図６Ｃは、構築物の形態で示されている例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質の図形表現を示し、示されているＥＲＳＰ、ＳＴＡ、（ＴＰ−Ｌ）Ｎ、及びＴＰの各々はインフレームで融合している。この構築物において、ＥＲＳＰはＳＴＡドメインのＮ末端に融合しており、ＳＴＡドメインは反復構築物に融合しており、反復構築物はリンカーペプチド（Ｌ）に融合したＴＰのユニットを含み、反復構築物中の各ＴＰは同じであっても異なっていてもよく、反復構築物中の各Ｌは同じであっても異なっていてもよい。最後に、ＴＰ−Ｌ構築物の最後の反復ユニットは、ＴＰのＮ末端に融合している。この例示的な実施形態において、Ｎは、昆虫及び／または線虫の腸内環境における切断時に各Ｌが切断されることにより、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を摂取した昆虫または線虫に対する殺虫性及び／または殺線虫性があるＴＰの複数のコピーが放出されるような、１〜１０個の反復ユニット、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のユニットであり得る。
【図７】全ての消化酵素条件における、ＣＥＷ腸抽出物中でのみ切断する対照ペプチドＩＧＥＲと比較した、三元の連結ペプチドＡＬＫＬＦＶＧＳ及びＩＦＶＲＬＲＧＳの切断の検出の例証。この図は、３つの消化酵素条件（横列）と、介在する三元の連結ペプチドまたは対照ペプチドＩＧＥＲを含む４つのＴＰユニット（Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ）を各々が含有する３つの異なるタンパク質（縦列）とを含む。切断反応は、各ゲル画像の下に列記されている時点で変性条件（化学物質及び熱）を付加することにより停止される。Ｈｉｓタグのウエスタンブロット検出は、全ての消化条件における三元ペプチドＡＬＫＬＦＶＧＳ及びＩＦＶＲＬＲＧＳの消化及びタンパク質バンドの消失、またはＳＣＲ腸抽出物及びＳＧＦの両方における複数時点での対照ペプチドＩＧＥＲのインタクトなタンパク質バンドの保持を例示している。
【図８】安定なトウモロコシ形質転換ベクターの一例。この図は、安定なトウモロコシ形質転換ベクターの一例を示す。白矢印は、ベクターの基本的な骨格成分を示す。黒矢印は、トウモロコシゲノムに形質転換され、切断可能な連結ペプチドを含有する殺虫性タンパク質を発現するトランスジェニックトウモロコシ植物の選択及び再生をもたらす、ベクターのＴ−ＤＮＡ部分を示す。
【図９】図８において説明されるベクターによる形質転換後に、図６Ａにおいて説明される例示的な殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を含むオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を発現する、トウモロコシ植物の圃場試験の効力データの一例。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
定義
【００２４】
「ＡＣＴＸ」または「ＡＣＴＸペプチド」とは、Ａｔｒａｃｉｎａｅ亜科に属するオーストラリアジョウゴグモから単離された殺虫性ＩＣＫ  ＴＰのファミリーを意味する。そのようなクモの１つは、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ  ｖｅｒｓｕｔａという学名を有するオーストラリアブルーマウンテンジョウゴグモとして知られている。この種に由来するＡＣＴＸペプチドの３つの例は、オメガペプチド、カッパペプチド、及びＵペプチドである。
【００２５】
「アグロインフェクション」とは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属のＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓまたはＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓを使用することによってＤＮＡを植物細胞に導入する植物形質転換法を意味する。
【００２６】
「ＢＡＡＳ」とは、オオムギアルファアミラーゼシグナルペプチドを意味する。これはＥＲＳＰの一例である。
【００２７】
「二元ベクター」または「二元発現ベクター」とは、Ｅ．ｃｏｌｉ株及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株の両方で自己複製することができる発現ベクターを意味する。またこのベクターは、病原性遺伝子によって認識されてコピーされ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによって植物細胞内に送達される、左及び右の境界配列に挟まれたＤＮＡの領域（ｔ−ＤＮＡと呼ばれることが多い）を含有する。
【００２８】
「Ｂｔ」、別称Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓまたはＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓは、農業、林業、及び公衆衛生における昆虫有害生物を制御するために６０年超にわたって世界中で使用されてきたグラム陽性土壌細菌を意味する。
【００２９】
「Ｂｔタンパク質」及び「Ｂｔペプチド」は交換可能に使用され、Ｂｔにより産生されるペプチドを含み、本明細書ではこれらを集合的に「Ｂｔ毒性タンパク質」または「Ｂｔ  ＴＰ」と呼ぶ。このようなペプチドは、ｃｒｙ、ｃｙｔ、及びｖｉｐ遺伝子によってコードされる「ｃｒｙ」、「ｃｙｔ」、または「ＶＩＰ」タンパク質と書かれることが多い。Ｂｔ  ＴＰは、より一般的には、ｃｒｙ遺伝子によってコードされる殺虫性結晶タンパク質に起因する。Ｂｔ  ＴＰは、ＰＦＩＰＳ（ポア形成殺虫性タンパク質）の例である。下記の定義を参照のこと。ＰＦＩＰＳ及び他のＢｔタンパク質の例は配列表に提示する。
【００３０】
「キメラ遺伝子」とは、新たな遺伝子を生成するように１つ以上のコーディング配列の部分に由来する遺伝子をコードするＤＮＡ配列を意味する。
【００３１】
「切断可能リンカー」についてはリンカーを参照のこと。
【００３２】
「馴化培地」とは、細胞により使用された細胞培養培地で、細胞由来物質が濃縮されているが細胞は含有しないものを意味する。
【００３３】
「変換」または「変換される」とは、ＨＰペプチドを作製するプロセスを指す。
【００３４】
「ＣＲＩＰ」及び「ＣＲＩＰＳ」はそれぞれ、システインリッチ殺虫性タンパク質の単数形及び複数形の略語である。システインリッチ殺虫性ペプチド（ＣＲＩＰＳ）は、ジスルフィド結合を形成するシステインに富んだペプチドである。ＣＲＩＰＳは、少なくとも１０個のアミノ酸を有するタンパク質またはペプチドの中で、少なくとも４個、場合によっては６個、場合によっては８個のシステインアミノ酸を含有し、これらのシステインは、２つ、３つ、または４つのジスルフィド結合を形成する。ジスルフィド結合は、殺虫性ペプチドのフォールディング、三次元構造、及び活性に寄与する。システイン間ジスルフィド結合及びそれらが形成する三次元構造は、これらの殺虫性ペプチドの毒性において重要な役割を果たす。ＣＲＩＰの例には、阻害性システインノット毒性タンパク質すなわちＩＣＫ  ＴＰ（通常は６〜８つのシステインを有するもの）があり、また例として、ジスルフィド結合を有するがＩＣＫ  ＴＰとはみなされない毒性ペプチド（非ＩＣＫ  ＣＲＩＰＳ）がある。ＩＣＫの例には、クモ由来で上記に定義したＡＣＴＸペプチドがある。ＩＣＫタンパク質の代表例としては、Ｕ−ＡＣＴＸ殺虫性ペプチド、オメガＡＣＴＸ殺虫性ペプチド、及びカッパＡＣＴＸ殺虫性ペプチドが挙げられる。非ＩＣＫ  ＣＲＩＰの例には、イソギンチャクから最初に特定された毒性ペプチドであるＡｖ２及びＡｖ３のようなペプチドがある。これらのペプチドは、昆虫の末梢神経系（ＰＮＳ）におけるナトリウムチャネルを調整する化合物のクラスの例である。非ＩＣＫ  ＣＲＩＰＳは、２〜４つのジスルフィド結合を形成する４〜８つのシステインを有し得る。これらのシステイン間ジスルフィド結合によって安定化された毒性ペプチド（ＣＲＩＰＳ）は、環境に曝露されたときに著しい安定性を有し得る。多くのＣＲＩＰＳは、クモ、サソリ、ヘビ、海産巻貝、及びイソギンチャクなどの有毒動物から単離され、これらは昆虫に対して毒性がある。更なる説明を以下に提示する。
【００３５】
「限定培地」とは、既知の化学成分からなるが、粗タンパク質抽出物または酵母抽出物もしくはペプトンなどの副産物を含有しない培地を意味する。
【００３６】
「ジスルフィド結合」とは、側鎖にある２つのチオール基のカップリングによって得られる２つのシステインアミノ酸間の共有結合を意味する。
【００３７】
「二重導入遺伝子ペプチド発現ベクター」または「二重導入遺伝子発現ベクター」とは、殺虫性ペプチド発現カセットの２つのコピーを含有する酵母発現ベクターを意味する。
【００３８】
「ＥＬＩＳＡ」または「ｉＥＬＩＳＡ」とは、次のように試料をプレートの表面に固定してから検出する分子生物学プロトコールを意味する：一次抗体の後に、酵素にコンジュゲートした二次抗体を適用する。この酵素は、無色の基質を、検出及び試料間の数量化が可能な発色基質に変換する。このプロトコールにおいて、エピトープに結合するものだけが残って検出されるように抗体を洗い流す。手元に残った試料が植物から単離されたタンパク質であり、ＥＬＩＳＡにより、発現したトランスジェニックタンパク質の回収量の数量化が可能になる。
【００３９】
「発現ＯＲＦ」とは、タンパク質複合体をコードするヌクレオチドを意味し、ＯＲＦ内のヌクレオチドと定義される。
【００４０】
「ＥＲ」または「小胞体」とは、全ての真核生物に共通する細胞内小器官であり、ここで一部の翻訳後修飾プロセスが起こる。
【００４１】
「ＥＲＳＰ」または「小胞体シグナルペプチド」とは、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子のタンパク質翻訳中に、宿主細胞シグナル認識粒子によって認識され結合されるアミノ酸のＮ末端配列であり、タンパク質翻訳リボソーム／ｍＲＮＡ複合体を細胞質内のＥＲに移動させる。その結果、ＥＲとドッキングするまでタンパク質翻訳が中断され、ＥＲにおいてタンパク質翻訳が継続し、結果として得られるタンパク質がＥＲに注入される。
【００４２】
「ｅｒｓｐ」とは、ペプチドのＥＲＳＰをコードするヌクレオチドを意味する。
【００４３】
「ＥＲ輸送」とは、翻訳後修飾、ソーティング、及び輸送のための、細胞で発現したタンパク質のＥＲへの輸送を意味する。
【００４４】
「ＦＥＣＴ」とは、コートタンパク質遺伝子及びトリプル遺伝子ブロックの除去を伴うＦｏｘｔａｉｌモザイクウイルスを使用した一過性の植物発現系を意味する。
【００４５】
「ＧＦＰ」は、クラゲのＡｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａに由来する緑色蛍光タンパク質を意味する。これは翻訳安定化タンパク質の一例である。
【００４６】
「高産生量ペプチド」または「ＨＰペプチド」とは、本明細書に記述される手順に従って作製可能な、または「変換される」ペプチドで、変換され次第、増加した収量で、または高い産生率で、または通常よりも多い量で、生物系において産生され得るものを意味する。高い産生率は、変換前のペプチドを産生するために使用されたものと同じまたは同様の産生方法を使用して、変換前のペプチドで達成され得るものよりも、２０〜４００％高い場合がある。
【００４７】
核酸との関連で使用される場合の「相同性」は、相補性の程度を指す。部分的な相同性がある場合もあれば、完全な相同性（すなわち同一性）がある場合もある。「配列同一性」とは、２つ以上の核酸またはタンパク質同士の間の関連性の尺度を指し、比較する長さ全体を基準にした百分率として示される。同一性の計算は、それぞれのより大きな配列において同一であり、同じ相対位置におけるヌクレオチドまたはアミノ酸残基を考慮する。同一性の計算は、「ＧＡＰ」（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）及び「ＡＬＩＧＮ」（ＤＮＡＳｔａｒ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）などのコンピュータプログラムに含まれるアルゴリズムによって行うことができる。部分的に相補的な配列とは、完全に相補的な配列が標的核酸とハイブリダイズすることを少なくとも部分的に阻害する（またはそれと競合する）ものであり、「実質的に相同な」という機能的用語を使用して参照される。完全に相補的な配列の標的配列とのハイブリダイゼーションの阻害は、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションアッセイ（サザンブロットまたはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど）を使用して検査することができる。実質的に相同な配列またはプローブは、低ストリンジェンシー条件下で標的と完全に相同な配列の結合（すなわち、ハイブリダイゼーション）について競合し、これを阻害する。低ストリンジェンシー条件は、非特異的な結合が許容されるようなものであるというわけではない。低ストリンジェンシー条件は、２つの配列の互いに対する結合が特異的（すなわち、選択的）相互作用であることを必要とする。非特異的結合の非存在は、部分的な程度の相補性（例えば、約３０％未満の同一性）さえも欠いている第２の標的の使用によって試験され得る。非特異的結合の非存在下では、プローブは、第２の非相補的標的とハイブリダイズしない。
【００４８】
好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーション条件は、核酸結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づき、規定の「ストリンジェンシー」をもたらす。「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的な核酸の対合を指す。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸間の会合の強度）は、核酸間の相補性度、用いられる条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドのＴｍ、及び核酸内のＧ：Ｃ比などの要因による影響を受ける。相補的な核酸の対をその構造に含む単一分子は、「自己ハイブリダイズしている」と言われる。
【００４９】
「Ｔｍ」という用語は、核酸の「融解温度」を指す。融解温度は、二本鎖核酸分子の集団が半分に解離して一本鎖になる温度である。核酸のＴｍを計算するための方程式は、当技術分野において周知である。標準的な参考文献に示されているように、核酸が１Ｍ  ＮａＣｌ水溶液中にある場合、Ｔｍ値の簡易推定値は、次式：Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）によって計算され得る。「ストリンジェンシー」という用語は、核酸ハイブリダイゼーションが行われる温度、イオン強度、及び有機溶媒などの他の化合物の存在といった条件を指す。「高ストリンジェンシー」条件では、核酸塩基の対合は、高頻度の相補的塩基配列を有する核酸断片間でしか起こらない。よって、遺伝的に多様な生物に由来する核酸では、相補的配列の頻度が通常低いため、「低」ストリンジェンシー条件が必要とされることが多い。
【００５０】
核酸ハイブリダイゼーションに関して使用される「低ストリンジェンシー条件」は、長さ約５００ヌクレオチドのプローブを用いた場合、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌのＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌのＮａＨ２ＰＯ４．Ｈ２Ｏ、及び１．８５ｇ／ｌのＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整したもの）、０．１％のＳＤＳ、５×デンハルト試薬［５０×デンハルト液は、５００ｍｌ当たり５ｇのＦｉｃｏｌｌ（Ｔｙｐｅ  ４００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、５ｇのＢＳＡ（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ；Ｓｉｇｍａ）を含有する］、及び１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡからなる４２℃の溶液中での結合またはハイブリダイゼーションに続いて、５×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを含む４２℃の溶液中での洗浄に相当する条件を含む。
【００５１】
核酸ハイブリダイゼーションに関して使用される「中ストリンジェンシー条件」は、長さ約５００ヌクレオチドのプローブを用いた場合、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌのＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌのＮａＨ２ＰＯ４．Ｈ２Ｏ、及び１．８５ｇ／ｌのＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整したもの）、０．５％のＳＤＳ、５×デンハルト試薬、及び１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡからなる４２℃の溶液中での結合またはハイブリダイゼーションに続いて、１０×ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む４２℃の溶液中での洗浄に相当する条件を含む。
【００５２】
核酸ハイブリダイゼーションに関して使用される「高ストリンジェンシー条件」は、長さ約５００ヌクレオチドのプローブを用いた場合、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌのＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌのＮａＨ２ＰＯ４．Ｈ２Ｏ、及び１．８５ｇ／ｌのＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整したもの）、０．５％のＳＤＳ、５×デンハルト試薬、及び１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡからなる４２℃の溶液中での結合またはハイブリダイゼーションに続いて、０．１×ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む４２℃の溶液中での洗浄に相当する条件を含む。
【００５３】
低ストリンジェンシー条件を構成するために多数の等価条件が用いられ得ることは周知である。プローブの長さ及び性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）、ならびに標的の性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成、溶存しているか固定化されているかなど）、ならびに塩及び他の成分の濃度（例えば、ホルムアミド、デキストラン硫酸、ポリエチレングリコールの存在または非存在）などの要因が考慮され、ハイブリダイゼーション溶液を変更することで、上文に列記した条件とは異なるが等価である低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件を作り出すことができる。加えて、当技術分野では、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションを促進する条件（例えば、ハイブリダイゼーション及び／または洗浄ステップの温度上昇、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの使用など）が知られている。
【００５４】
「ハイブリッドペプチド」、別称「ハイブリッド」、別称「ハイブリッド毒素」、別称「ハイブリッドＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」、別称「天然ハイブリッドＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」、ならびに「Ｕペプチド」、別称「Ｕ毒素」、別称「天然Ｕ」、別称「Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」、別称「天然Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」は全て、オーストラリアブルーマウンテンジョウゴグモＨａｄｒｏｎｙｃｈｅ  ｖｅｒｓｕｔａとして知られるクモから発見されたＡＣＴＸペプチドを指し、昆虫の電位開口型Ｃａ２＋チャネル及び電位開口型Ｋ＋チャネルに対する二重アンタゴニストである。
【００５５】
「ＩＧＥＲ」とは、一文字コードの実際の配列に基づく短いペプチドの名称を意味する。これは、昆虫においてしか切断されないペプチドの一例である。
【００５６】
「ＩＣＫモチーフ」、「ＩＣＫモチーフタンパク質」、「ＩＣＫポリペプチド」、「ＩＣＫタンパク質」、「インヒビターシスチンノットモチーフ」、「毒性昆虫ＩＣＫ  ＴＰ」、「ＩＣＫモチーフＴＰ」、「ＣＫペプチド」、「シスチンノットモチーフ」、または「シスチンノットペプチド」（全て本明細書では交換可能に使用される）は、３つのジスルフィド架橋を有する少なくとも６個のハーフシスチンコアアミノ酸を含む１６〜６０アミノ酸ペプチドを意味し、この３つのジスルフィド架橋は共有結合であり、６個のハーフシスチン残基のうち共有結合性のジスルフィド結合は、Ｎ末端側アミノ酸から始めて６個のコアのハーフシスチンアミノ酸のうち、第１と第４、第２と第５、及び第３と第６のハーフシスチン同士の間にある。一般的に、このタイプのペプチドは、モチーフの第４と第６のコアハーフシスチン間に位置する残基から通常はなるベータヘアピン二次構造を含み、このヘアピンは、モチーフの３つのジスルフィド結合によってもたらされる構造の架橋によって安定化されている。更なるシステイン／シスチンまたはハーフシスチンアミノ酸がインヒビターシスチンノットモチーフ内に存在してもよいことに留意されたい。配列表に例を提示する。ＩＣＫタンパク質の代表例としては、Ｕ−ＡＣＴＸ殺虫性ペプチド、オメガＡＣＴＸ殺虫性ペプチド、及びカッパＡＣＴＸ殺虫性ペプチドが挙げられる。
【００５７】
「ｉｃｋ」とは、ＩＣＫモチーフタンパク質をコードするヌクレオチドを意味する。
【００５８】
「ＩＣＫモチーフタンパク質発現ＯＲＦ」または「発現ＯＲＦ」とは、ＩＣＫモチーフタンパク質複合体をコードするヌクレオチドを意味し、ＯＲＦ内のヌクレオチドと定義される。
【００５９】
「ＩＣＫモチーフタンパク質発現ベクター」または「ＩＣＫ発現ベクター」、または「ＩＣＫモチーフ発現ベクター」とは、発現ＯＲＦを含有する二元ベクターを意味する。二元ベクターはまた、ＯＲＦ及びそれがコードするタンパク質の発現を促進するため、必要な転写プロモーター及びターミネーター配列を発現ＯＲＦの周囲に含有する。
【００６０】
「昆虫」には、「昆虫綱」のクラスにおける全ての生物が含まれる。「前成体期」の昆虫という用語は、例えば卵、幼虫、及び若虫を含む、成体期前の任意の形態の生物を指す。
【００６１】
「昆虫の腸内環境」または「腸内環境」とは、昆虫または昆虫の幼虫の前腸、中腸、もしくは後腸において見出される特定のｐＨ及びプロテアーゼ条件を意味する。
【００６２】
「昆虫の血リンパ環境」とは、昆虫または昆虫の幼虫において見出される特定のｐＨ及びプロテアーゼ条件を意味する。
【００６３】
本明細書で使用される「殺虫性」という用語は、概して、本明細書で使用されるポリペプチドまたはタンパク質がもつ、昆虫の死亡率を増加させる、または成長速度を抑制する能力を指すために使用される。本明細書で使用される「殺線虫性」という用語は、本明細書で使用されるポリペプチドまたはタンパク質がもつ、線虫の死亡率を増加させる、または成長速度を抑制する能力を指す。一般的に、「線虫」という用語は、該生物の卵、幼虫、幼若型及び成熟型を含む。
【００６４】
「殺虫活性」とは、昆虫が化合物またはペプチドに曝露された時点またはその後に、昆虫が死亡すること、その動きもしくはその採餌が停止もしくは減速すること、その成長が停止もしくは減速すること、蛹化できないこと、繁殖できないこと、または繁殖力のある子孫を産めないことのいずれかを意味する。
【００６５】
「殺虫性ペプチド」もしくは「殺虫性タンパク質」または「毒性ポリペプチド」もしくは「毒性タンパク質」（本明細書では交換可能に使用される）とは、昆虫に摂取されたとき、昆虫と接触したとき、または昆虫に注入されたときに殺虫活性を有するタンパク質またはポリペプチドを意味する。
【００６６】
「殺虫性ペプチド産生株スクリーニング」とは、収量の高い殺虫性ペプチド産生酵母株を収量の低い株から特定するスクリーニングプロセスを意味する。本明細書に記述される方法では、逆相ＨＰＬＣまたはイエバエ注入バイオアッセイを使用するスクリーニングを指す。
【００６７】
「組込み発現ベクター」または「組込みベクター」とは、酵母細胞ゲノムの特定の遺伝子座に自らを挿入することができ、安定に酵母ゲノムの一部になる酵母発現ベクターを意味する。
【００６８】
「公知のペプチド」とは、生物活性を有することが知られているペプチドを意味し、成熟ペプチド、またはプレペプチド及びプロペプチドを含むその任意のバージョンもしくは断片、ならびに活性ペプチドのコンジュゲートであり得る。好ましい公知のペプチドは、殺虫活性をもつものである。
【００６９】
適切な文脈における「Ｌ」とは、切断可能な介在する二元ペプチドまたは三元ペプチドを意味する。アミノ酸を参照しているとき、「Ｌ」はロイシンを意味する場合もある。
【００７０】
「リンカー、切断可能リンカー、またはペプチドリンカー」とは、少なくとも２タイプのプロテアーゼの標的部位である短いペプチド配列（二元ペプチドまたは三元ペプチド）（２タイプのプロテアーゼのうちの一方は昆虫及び／または線虫プロテアーゼであり、もう一方はヒトプロテアーゼであるため、タンパク質を切断して２つの部分に分離させることができる両タイプのプロテアーゼによってリンカーが分離され得る）か、または、ＯＲＦのリーディングフレーム内に配置され、タンパク質を切断して２つの部分に分離させることができる昆虫及び／または線虫プロテアーゼならびに動物（例えばヒト）プロテアーゼの標的部位であるタンパク質内の短いペプチド配列をコードする短いＤＮＡ配列を意味する。
【００７１】
「Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａの腸内環境」とは、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａの昆虫または幼虫の前腸、中腸、もしくは後腸において見出される特定のｐＨ及びプロテアーゼ条件を意味する。
【００７２】
「Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａの血リンパ環境」とは、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａの昆虫または幼虫において見出される特定のｐＨ及びプロテアーゼ条件を意味する。
【００７３】
「複合ＩＣＫモチーフタンパク質ドメイン」とは、複数の介在するリンカーペプチドによって連結されている複数のＩＣＫモチーフＴＰからなるタンパク質を意味する。複合ＩＣＫモチーフＴＰドメイン内のＩＣＫモチーフＴＰは同じであっても異なっていてもよく、このドメイン内の介在するリンカーペプチドもまた同じであっても異なっていてもよい。
【００７４】
「殺線虫性ペプチド」または「殺線虫性タンパク質」とは、線虫に摂取されたとき、線虫と接触したとき、または線虫に注入されたときに殺線虫活性を有するペプチドまたはタンパク質を意味し、毒性ペプチド及び毒性タンパク質の例として使用される。
【００７５】
「殺線虫剤」及び「殺線虫性」とは、殺線虫性ペプチドまたは殺線虫性タンパク質がもつ、線虫の死亡率を増加させる、または成長速度を抑制する能力を指す。一般的に、「線虫」という用語は、該生物の卵、幼虫、幼若型及び成熟型を含む。
【００７６】
「非ＩＣＫ  ＣＲＩＰＳ」は、２〜４つのジスルフィド結合を形成する４〜８つのシステインを有し得る。非ＩＣＫ  ＴＰは、ＩＣＫ  ＴＰではないシスチンノットペプチドを含む。非ＩＣＫ  ＴＰは、ＩＣＫとは異なるシスチン結合の結合順序を有し得る。非ＩＣＫ  ＣＲＩＰの例は、イソギンチャクから最初に特定されたペプチドであるＡｖ２及びＡｖ３のようなペプチドである。これらのアネモネペプチドは、昆虫の末梢神経系（ＰＮＳ）におけるナトリウムチャネルを調整する化合物のクラスの例である。
【００７７】
「非極性アミノ酸」は、弱疎水性のアミノ酸であり、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、及びメチオニンを含む。グリシンまたはｇｌｙは、本発明のジペプチドに対して最も好ましい非極性アミノ酸である。
【００７８】
「正規化されたペプチド収量」とは、馴化培地中のペプチド収量をペプチド収量測定時の対応する細胞密度で除したものを意味する。このペプチド収量は、例えばｍｇ毎リットルすなわちｍｇ／Ｌの体積単位における産生されたペプチドの質量によって、または、ＨＰＬＣクロマトグラフにおける産生されたペプチドのＵＶ吸光度ピーク面積、例えばｍＡｕ．ｓｅｃによって表すことができる。細胞密度は、６００ｎｍの波長における培養物の可視光吸光度（ＯＤ６００）によって表すことができる。
【００７９】
「一文字コード」とは、タンパク質の一次構造における種々のアミノ酸を区別するために一文字コードで列記されるペプチド配列を意味する。アラニン＝Ａ、アルギニン＝Ｒ、アスパラギン＝Ｎ、アスパラギン酸＝Ｄ、アスパラギンまたはアスパラギン酸＝Ｂ、システイン＝Ｃ、グルタミン酸＝Ｅ、グルタミン＝Ｑ、グルタミンまたはグルタミン酸＝Ｚ、グリシン＝Ｇ、ヒスチジン＝Ｈ、イソロイシン＝Ｉ、ロイシン＝Ｌ、リジン＝Ｋ、メチオニン＝Ｍ、フェニルアラニン＝Ｆ、プロリン＝Ｐ、セリン＝Ｓ、スレオニン＝Ｔ、トリプトファン＝Ｗ、チロシン＝Ｙ、バリン＝Ｖ。
【００８０】
「オメガペプチド」は、本明細書では別称「オメガ毒素」ともいい、これには「オメガＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」、別称「天然オメガＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」の例が含まれ、これらは全て、オーストラリアブルーマウンテンジョウゴグモＨａｄｒｏｎｙｃｈｅ  ｖｅｒｓｕｔａとして知られるクモから最初に単離され、昆虫の電位開口型Ｃａ２＋チャネルに対するアンタゴニストであるＡＣＴＸペプチドのクラスを指す。
【００８１】
「ＯＲＦ」または「オープンリーディングフレーム」または「ペプチド発現ＯＲＦ」とは、ＡＴＧ開始コドンで始まり、ＴＧＡ、ＴＡＡ、またはＴＡＧ終止コドンで終わるタンパク質をコードするＤＮＡ配列を意味する。ＯＲＦは、ＤＮＡがコードする翻訳タンパク質を意味する場合もある。
【００８２】
「作動可能に連結した」とは、２つの隣接するＤＮＡ配列が、一方の転写活性化が他方に作用し得るように一緒に配置されていることを意味する。
【００８３】
「ＰＥＰ」とは、植物発現ペプチドを意味する。
【００８４】
「ペプチド発現カセット」、または「発現カセット」とは、生物発現系における殺虫性ペプチドの転写を完了するために必要な全てのＤＮＡエレメントからなるＤＮＡ配列を意味する。本明細書に記述される方法では、これには、転写プロモーター、α接合因子シグナル配列及びＫｅｘ２切断部位をコードするＤＮＡ配列、殺虫性ペプチド導入遺伝子、終止コドン、ならびに転写ターミネーターが含まれる。
【００８５】
「ペプチド発現ベクター」とは、異種の殺虫性ペプチド導入遺伝子を含有する宿主生物発現ベクターを意味する。
【００８６】
「ペプチド発現酵母株」、「ペプチド発現株」、または「ペプチド産生株」とは、異種殺虫性ペプチドを産生することができる酵母株を意味する。
【００８７】
「ペプチドを特別にする」とは、以前は生物発現系からのペプチド収量が低かったペプチドが、その収量を増加させるために本明細書に記述される方法を使用することによってＨＰペプチドになることを意味する。
【００８８】
「ペプチドリンカー」についてはリンカーを参照のこと。
【００８９】
「ペプチド導入遺伝子」または「殺虫性ペプチド導入遺伝子」とは、殺虫性ペプチドをコードし、生物発現系において翻訳され得るＤＮＡ配列を意味する。
【００９０】
「ペプチド収量」とは、ペプチド発現酵母株の細胞によって産生される馴化培地中の殺虫性ペプチドの濃度を意味する。これは、例えばｍｇ毎リットルすなわちｍｇ／Ｌの体積単位における産生されたペプチドの質量によって、または、ＨＰＬＣクロマトグラフにおける産生されたペプチドのＵＶ吸光度ピーク面積、例えばｍＡｕ．ｓｅｃによって表すことができる。
【００９１】
「囲食膜」とは、大きな食物粒子を捕捉し、腸を通過する食物粒子の動きを助け、消化しつつ腸壁を保護することもできる、昆虫の腸内の内膜を意味する。
【００９２】
「有害生物」としては、昆虫、真菌、細菌、線虫、ダニ、マダニなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９３】
「ＰＦＩＰ」とは、昆虫の腸を覆う細胞、例えば腸上皮細胞において、ポアまたはチャネルを形成することができるタンパク質を意味する。ＰＦＩＰＳの例は、ｃｒｙ、ｃｒｔ、及びＶＩＰなどのＢｔ毒性ペプチド（Ｂｔ  ＴＰ）であり、他のＰＦＩＰの例は、配列表で確認することができる。
【００９４】
「植物再生培地」とは、植物の生育に必要な要素及びビタミンや、発芽して組織培養から得られる小植物を発生させることができる胚への細胞の再生を促進するために必要な植物ホルモンを含有する、任意の培地を意味する。多くの場合、この培地は選択可能因子を含有し、これに対してトランスジェニック細胞は、この因子に対する抵抗性をもたらす選択遺伝子を発現する。
【００９５】
「植物トランスジェニックタンパク質」とは、それをコードするＤＮＡまたはＲＮＡが植物細胞のうちの１つ以上に送達された後に植物で発現する異種の種に由来するタンパク質を意味する。
【００９６】
「極性アミノ酸」とは極性のアミノ酸であり、セリン、スレオニン、シスチン、システイン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、トリプトファン、及びチロシンを含む。好ましい極性アミノ酸は、セリン、スレオニン、シスチン、システイン、アスパラギン、及びグルタミンであり、セリンが最も好ましい。
【００９７】
「転写後遺伝子サイレンシング」、または「ＰＴＧＳ」とは、遺伝子の発現を抑制する生細胞内の細胞プロセスを意味する。
【００９８】
「タンパク質」は、本文書では「ペプチド」と同じ意味を有する。
【００９９】
「組換えベクター」とは、外来ＤＮＡが挿入されているＤＮＡプラスミドベクターを意味する。
【０１００】
「選択遺伝子」とは、ゲノムが修飾された生物に選択圧下で成長する利点を与える遺伝子を意味する。
【０１０１】
「スペーサー」（単数または複数）は、本明細書に開示されるように、二元ペプチドのＮ末端に、または二元ペプチドのＣ末端に、または二元ペプチドのＮ末端及びＣ末端の両方のいずれかにインフレームで融合している１〜４個のアミノ酸を含むペプチドで、したがって三元ペプチドを形成するものを意味する。三元ペプチドは、二元ペプチドと似ているが、任意の１〜４個のアミノ酸、より多くの場合では２〜４個のアミノ酸、時に１個、時に２個、時に３個、時に４個のアミノ酸を含む、スペーサーと呼ばれ、また時には「Ｚ」領域とも呼ばれる更なる領域を有するという点のみが二元ペプチドとは異なる。一部の特定の実施形態では、スペーサーは、「＋２」または「プラス２」と呼ばれる場合があり、これは、ペプチドのうち、本明細書に記述されるいずれかの２アミノ酸ペプチド、例えば「ＧＳ」などを含むジペプチドである部分を基準としている。一部の実施形態では、本発明のいわゆる三元ペプチドは３つの領域を有し、それらは、Ｘ領域及びＹ領域、ならびに「スペーサー」または「Ｚ」領域と呼ばれる第３の領域である。一部の実施形態では、Ｘ及びＹの各々は、２〜４アミノ酸長であってよく、Ｚは、各Ｚで更に１〜４アミノ酸長であってよく、１つのＺが二元ペプチドの前にあり、かつ１つのＺが二元ペプチドの後にある場合、１つまたは２つのＺ領域が可能であるため、１６アミノ酸長のリンカーが可能である。
【０１０２】
「ＳＴＡ」または「翻訳安定化タンパク質」、または「安定化ドメイン」、または「安定化タンパク質」（本明細書では交換可能に使用される）とは、タンパク質分解の細胞プロセスによる標的となることなく細胞内で蓄積し得る十分な三次構造を有するタンパク質を意味する。このタンパク質は、５〜５０アミノ酸（ａａ）であり得る。本明細書の例示的な実施形態を通して使用される一部の実施形態では、ＳＴＡは、ＩＣＫモチーフタンパク質、５０〜２５０ａａ（ＧＮＡ）、２５０〜７５０ａａ（例えばキチナーゼ）、及び７５０〜１５００ａａ（例えばエンハンシン）を含み得る。翻訳安定化タンパク質は、ＯＲＦ内の殺虫性タンパク質をコードする配列にインフレームで融合しているタンパク質のＤＮＡ配列によってコードされる。この融合タンパク質は、毒性タンパク質の上流にあっても下流にあってもよく、介在配列がいずれかのＤＮＡ配列のフレームシフトをもたらさない限り、２つの配列間に任意の介在配列を有し得る。翻訳安定化タンパク質は、昆虫の腸壁を超えて血リンパ中に送達されるＩＣＫモチーフＴＰを増加させる活性を有する場合もある。そのような送達は、腸壁を超えるようにＯＲＦ全体を能動的に輸送すること、あるいは、腸内環境内の切断によりＩＣＫモチーフＴＰを分離させつつ、翻訳安定化タンパク質に囲食膜及び／または腸壁を損傷させ、ＩＣＫモチーフＴＰの血リンパ中への拡散を増加させることによって達成することができる。
【０１０３】
「ｓｔａ」とは、翻訳安定化タンパク質をコードするヌクレオチドを意味する。
【０１０４】
「ＴＭＯＦ」、「ＴＭＯＦモチーフ」、または「ＴＭＯＦ  ＴＰ」とは、「トリプシン調節性卵形成阻害因子」タンパク質配列を意味する。配列表に例を提示する。本明細書では多数の例及び変異形を提示する。配列番号７０８は、野生型ＴＭＯＦ配列である。配列番号７０９〜７２１には他の非限定的な変異形が提示されている。他の例は当業者には公知であるか、または当業者によって作出され得る。
【０１０５】
「毒性ペプチド」または「毒性タンパク質」または「ＴＰ」（全て交換可能に使用される）は、それぞれ昆虫もしくは線虫に摂取されたとき、それらと接触したとき、またはそれらに注入されたときに殺虫活性及び／または殺線虫活性を有するペプチドまたはタンパク質を意味する。本発明のＴＰには、修飾されたＴＰ、変異体ＴＰ、または誘導体ＴＰも含まれる。一部の実施形態では、変異体または変異形ＴＰには、保存的アミノ酸置換が組み合わさったとき、変異型ＴＰの殺虫活性及び／または殺線虫活性が、その非変異型ＴＰと比べて実質的に減少しない、すなわち、非変異型ＴＰの殺虫活性及び／または殺線虫活性の少なくとも９０％、または少なくとも８０％、または少なくとも７０％、または少なくとも６０％、または少なくとも５０％、または少なくとも４０％、または少なくとも３０％の殺虫活性及び／または殺線虫活性が保持される、１つ以上の保存的アミノ酸置換を有し得るＴＰが包含される。ＴＰには、変異型ＴＰをコードするポリヌクレオチドが転写及び／または翻訳されたとき、発現した変異型ＴＰペプチドまたはタンパク質が、対応する非変異型ＴＰポリヌクレオチドによってコードされるペプチドまたはタンパク質の殺虫活性及び／または殺線虫活性の少なくとも９０％、または少なくとも８０％、または少なくとも７０％、または少なくとも６０％、または少なくとも５０％、または少なくとも４０％、または少なくとも３０％である殺虫活性及び／または殺線虫活性を保持するような、１つ以上の点変異、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上の点変異を有するポリヌクレオチドによってコードされるペプチド及びタンパク質も含まれ得る。本発明のＴＰには、配列番号５〜１５９３及び１７６１〜１７７５及び１７６１〜１７７５に開示される任意のＴＰと少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、更に、配列番号５〜１５９３及び１７６１〜１７７５に示される対応するＴＰの殺虫活性及び／または殺線虫活性の少なくとも９０％、または少なくとも８０％、または少なくとも７０％、または少なくとも６０％、または少なくとも５０％、または少なくとも４０％、または少なくとも３０％を保持する、ＴＰペプチド及びタンパク質も含まれ得る。本発明のＴＰには、配列番号５〜１５９３及び１７６１〜１７７５に示されるアミノ酸配列を有する任意のＴＰのＮ末端またはＣ末端または両末端に１〜６個のアミノ酸伸長がインフレームで融合したＴＰペプチド及びタンパク質も含まれ得る。
【０１０６】
「ＴＳＰ」または「全可溶性タンパク質」とは、植物組織試料から抽出され、抽出バッファー中に可溶化され得るタンパク質の総量を意味する。
【０１０７】
「導入遺伝子」とは、植物に形質転換されるタンパク質をコードする異種ＤＮＡ配列を意味する。
【０１０８】
「トランスジェニック宿主細胞」とは、遺伝子によって形質転換される細胞で、そのトランスジェニック状態について更なる選択遺伝子によって選択された細胞を意味する。
【０１０９】
「トランスジェニック植物」とは、外来ＤＮＡにより、植物中の全ての細胞がその導入遺伝子を含有するように形質転換された、単一の細胞に由来する植物を意味する。
【０１１０】
「一過性発現系」とは、武装解除した（ｄｉｓａｒｍｅｄ）植物ウイルスをコードするＤＮＡを植物細胞中に送達して発現させるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓベースの系を意味する。この植物ウイルスは、最高でＴＳＰの４０％という高濃度で目的のタンパク質を発現させるように工学操作されたものである。技術的試験において使用されている一過性発現系にはＴＲＢＯ系及びＦＥＣＴ系の２つがあり、植物細胞はタバコ植物「Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ」の葉組織である。
【０１１１】
「ＴＲＢＯ」とは、ウイルスコートタンパク質遺伝子の除去を伴うタバコモザイクウイルスを使用した一過性の植物発現系を意味する。
【０１１２】
「トリプシン切断」とは、プロテアーゼ酵素トリプシン（曝露されたリジン及びアルギニンのアミノ酸残基を認識する）を使用して切断可能リンカーをその切断部位で分離させるインビトロアッセイを意味する。また、トリプシン酵素がその部位を切断する作用も意味する。
【０１１３】
「Ｕ−ＡＣＴＸペプチド」、または「Ｕタンパク質」、または「Ｕ毒素」は、「天然Ｕ」、または「Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」、または「天然Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」の例を含む場合があり、これには代表例の「ハイブリッドペプチド」、別称「ハイブリッド毒素」、別称「ハイブリッドＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」、別称「天然ハイブリッドＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」が含まれ、これらは全て、天然に見出され得るか、さもなければＵ−ＡＣＴＸペプチドの例として知られる天然タンパク質または天然毒素を指し、これは、「Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」、別称「天然Ｕ−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」の場合は、オーストラリアのブルーマウンテンに起源をもつクモから最初に発見された天然のクモ毒であり、昆虫の電位開口型Ｃａ２＋チャネル及びＫ＋チャネルに対する二重アンタゴニストである。この毒素が発見されたクモは、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ  ｖｅｒｓｕｔａという学名を有するオーストラリアブルーマウンテンジョウゴグモとして知られている。
【０１１４】
「Ｕ＋２ペプチド」、「Ｕ＋２タンパク質」、「Ｕ＋２毒素」、または「Ｕ＋２」、または「Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」は全て、天然ペプチドに更なるジペプチドが動作可能に連結しているいずれかの毒素を指し、Ｕペプチド及び上述の他の名称で呼ばれることがあるクモ毒を指す場合がある。Ｕペプチドに動作可能に連結し、よって「＋２」または「プラス２」と示される更なるジペプチドは、いくつかのペプチドの中から選択することができ、これらのうちのいずれも、本明細書において詳解される独特の特性をもつ「Ｕ＋２ペプチド」をもたらし得る。これらは時に「高産生量ペプチド」と呼ばれることもある。「Ｕ＋２−ＡＣＴＸ−Ｈｖ１ａ」という用語が使用されるときは、Ｈａｄｒｏｎｙｃｈｅ  ｖｅｒｓｕｔａという学名を有するオーストラリアブルーマウンテンジョウゴグモに由来する天然に存在するペプチドを含む特定の高産生量毒性ペプチドを指す。
【０１１５】
「ＶＩＰ」タンパク質は、植物性に増殖したＢｔ株の上清を殺虫活性の可能性についてスクリーニングすることから発見された。これらにはｃｒｙタンパク質との類似性がほとんどまたは全くなく、これらは植物性殺虫性タンパク質（Ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ  Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）すなわちＶＩＰと名付けられた。特に有用であり、本文書での使用に好ましいのは、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａの活性を有するＶＩＰ３、Ｖｉｐ３タンパク質、またはＶｉｐ毒素と呼ばれているものである。これらは、Ｂｔ  ｃｒｙペプチドと同様の作用形態を有すると考えられている。本文書においてＶＩＰタンパク質はＰＦＩＰタイプのタンパク質と分類される。
【０１１６】
「酵母発現ベクター」、または「発現ベクター」、または「ベクター」とは、異種遺伝子及び／または発現カセットを酵母細胞に導入して転写及び翻訳させることができるプラスミドを意味する。
【０１１７】
「収量」とはペプチドの産生量を指し、収量の増加は、産生量の増加、産生速度の増加、ならびに収量の平均または中央値の増加及び収量上昇の頻度増加を意味し得る。
【０１１８】
（１）．殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質の切断可能な連結基
【０１１９】
本発明は、昆虫もしくは線虫の腸または血リンパ環境、及び動物の胃腸管系、例えばヒトの胃腸管系において切断されるように作動可能である二元ペプチド及び三元ペプチドを提示する。したがって本発明は、より大きな殺虫性または殺線虫性タンパク質の他の成分に連結したとき、ヒト、昆虫、及び線虫の腸内環境に見出されるある特定のプロテアーゼ及びペプチダーゼによって切断され得る、切断可能な二元ペプチド及び三元ペプチドを提示する。有利なことに、殺虫性及び殺線虫性ペプチドの複数のコピーが結合または連結していてよい。各コピーは１つ以上の二元ペプチドまたは三元ペプチドによって分離されており、摂取されると、あるいは腸内環境内で昆虫及び／または線虫のペプチダーゼまたはプロテアーゼに接触すると、二元ペプチドまたは三元ペプチドが切断され、連結した殺虫性及び殺線虫性ペプチドの活性型が放出される（例えば、図２、第２の態様を参照のこと）。これらの例示的な実施形態において、図２の第２の態様に示されているＮは、１〜２００、または例えば１〜１００、または好ましくは１〜１０の範囲の任意の整数、及びこれらの間の任意の整数であり得る。本発明の種々の実施形態では、二元ペプチド及び／または三元ペプチドを、１つまたは２００個ほど、及びその間の任意の数、例えば１〜１００、またはより好ましくは１〜１０個の毒性ペプチド（すなわち殺虫性及び／または殺線虫性ペプチド）に連結させることで、殺虫性及び／または殺線虫性トランスジェニックタンパク質を形成することができ、これが昆虫、線虫、またはヒトの胃腸内環境に曝露されると、二元ペプチド及び／または三元ペプチド内の特定の基質配列において切断し、それによって殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質ポリマー構造から複数の毒性ペプチドが遊離する。種々の実施形態では、殺虫性及び／または殺線虫性トランスジェニックタンパク質をコードするポリヌクレオチドを使用して、植物細胞を形質転換させることができる。一部の実施形態では、殺虫性及び／または殺線虫性トランスジェニックタンパク質は、植物またはその一部の表面に散布または当業者に公知の任意の様式で別様に適用することができる組成物中に配合され得る。したがって本明細書では、宿主細胞、例えば植物細胞において、適切な条件下で１つ以上の殺虫性及び／または殺線虫性トランスジェニックタンパク質をコードするように作動可能なＤＮＡ構築物が提示される。寄生性昆虫または寄生性線虫による植物細胞の有害生物感染を制御するための方法は、本明細書に記述される殺虫性及び／または殺線虫性トランスジェニックタンパク質をコードするポリヌクレオチドを組換え技術によって植物、植物組織、または植物細胞に投与または導入することと、有害生物に曝露された圃場において組換え的に改変された該植物、植物組織、または植物細胞を成長させることとを含む。代替的に、殺虫性及び／または殺線虫性トランスジェニックタンパク質は、感染性の昆虫及び／または線虫によって殺虫性及び／または殺線虫性トランスジェニックタンパク質が摂取されると、感染性の昆虫及び／または線虫によって摂取された殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質から殺虫性及び殺線虫性ペプチドの１つ以上のコピーまたはモノマーが切断され、昆虫及び／または線虫を殺すその効果がもたらされるように、散布可能な組成物に配合し、直接適用によって感受性植物に直接適用してもよい。
【０１２０】
（１Ａ）．切断可能な二元及び三元の連結ペプチド
【０１２１】
種々の実施形態において、本発明は、動物、例えばヒト、昆虫、及び／または線虫の胃腸管系において見出される動物、昆虫、及び線虫のプロテアーゼまたはペプチダーゼの存在下で切断される、切断可能な二元及び三元の連結ペプチドを提示する。本明細書で使用される場合、胃腸管環境及び腸内環境という用語は交換可能に使用され、その一般的な意味、すなわち摂取された食品がタンパク分解性に分解される場所を含むよう意図される。ヒトモデルにおいてペプチド及びタンパク質を分解することができる胃腸管環境としては、口、胃、及び小腸を挙げることができる。
【０１２２】
昆虫及び線虫の腸内環境に見出される利用可能なプロテアーゼ及びペプチダーゼは、空間的かつ時間的に発現することが多いため、これらの酵素の一部は、昆虫のライフステージに依存する。昆虫の消化器系は、消化管及び付随する腺からなる。食物は口に入り、消化性プロテアーゼ及びペプチダーゼを含有する場合もしない場合もある分泌物と混合される。前腸及び後腸は外胚葉性由来である。前腸は、概して生の食物の貯蔵所として機能する。前腸から、小さく分かれた食物が中腸（中腸部（ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｎ）または胃（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌｕｓ））に入る。中腸は、食物の栄養素が消化及び吸収される部位である。概して、ある特定のプロテアーゼ及びペプチダーゼが中腸に存在するかは、腸のｐＨによる。ヒト胃腸管系内のある特定のプロテアーゼ及びペプチダーゼには、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、及びジペプチダーゼが含まれ得る。昆虫及び線虫の腸内環境は、草食種の消化器系のうち、ペプチド及びタンパク質が消化中に分解される領域を含む。昆虫及び線虫の腸内環境に見出される利用可能なプロテアーゼ及びペプチダーゼの一部には、（１）セリンプロテアーゼ、（２）システインプロテアーゼ、（３）アスパラギン酸プロテアーゼ、及び（４）メタロプロテアーゼが含まれ得る。
【０１２３】
植食性昆虫の消化器系における２つの主なプロテアーゼクラスは、セリンプロテアーゼ及びシステインプロテアーゼである。Ｍｕｒｄｏｃｋら（１９８７）は、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａに属する種々の有害生物の中腸酵素に関する入念な研究を行い、Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎら（２００８）は、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａに属する種々の有害生物の中腸酵素について報告した。Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａではセリンプロテアーゼが幼虫の腸内環境において支配的であり、全消化活性の約９５％に寄与することが知られているが、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ種は、システインプロテアーゼを含め、より幅広い支配的な腸内プロテアーゼを有する。パパインファミリーには、広い特異性を有するエンドペプチダーゼ（例えばパパイン）、非常に狭い特異性を有するエンドペプチダーゼ（例えばグリシルエンドペプチダーゼ）、アミノペプチダーゼ、ジペプチジル−ペプチダーゼ、ならびにエンドペプチダーゼ活性及びエキソペプチダーゼ活性の両方を有するペプチダーゼ（例えばカテプシンＢ及びＨ）を含め、幅広い活性を有するペプチダーゼが含まれる。種々の昆虫の中腸に見出される他の例示的なプロテイナーゼとしては、トリプシン様酵素、例えばトリプシン及びキモトリプシン、ペプシン、カルボキシペプチダーゼ−Ｂ、及びアミノトリペプチダーゼが挙げられる。
【０１２４】
セリンプロテアーゼは、ほぼ全ての動物及び微生物に広く分布している（Ｊｏａｎｉｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。高等生物では、遺伝子の約２％がこれらの酵素をコードする（Ｂａｒｒｅｔｔｅ−Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。宿主生物の維持及び生存のために本質的に不可欠であるセリンプロテアーゼは、多くの生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たす。セリンプロテアーゼのクラスは、それらの基質特異性によって、特に、Ｐ１の残基がトリプシン様であるか（Ｌｙｓ／ＡｒｇがＰ１に好ましい）、キモトリプシン様であるか（Ｐ１にＰｈｅ／Ｔｙｒ／Ｌｅｕなどの大きな疎水性残基）、またはエラスターゼ様であるか（Ｐ１にＡｌａ／Ｖａｌなどの小さな疎水性残基）によって分類される（Ｔｙｎｄａｌｌらにより改訂、２００５）。セリンプロテアーゼは、中心的触媒機構がアスパラギン酸、ヒスチジン、及び独特の反応性を示すセリンという３つの不変残基からなるタンパク質分解酵素のクラスである。このため、これらの残基は「触媒トライアド」と命名されている。Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒのトライアドは、少なくとも４つの異なる構造的環境において見出され得る（Ｈｅｄｓｔｒｏｍ，２００２）。セリンプロテアーゼのこれら４つのクランは、キモトリプシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼＹ、及びＣｌｐプロテアーゼに代表される。キモトリプシン様クランの中で極めて詳細に研究されてきた３つのセリンプロテアーゼは、キモトリプシン、トリプシン、及びエラスターゼである。より最近では、Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ、Ｓｅｒ−Ｌｙｓ／Ｈｉｓ、Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ、及びＮ末端側Ｓｅｒを含む、新規の触媒トライアド及びダイアドを有するセリンプロテアーゼが、消化におけるそれらの役割に関して発見されている。
【０１２５】
主要なタイプのペプチダーゼは全て、線虫において説明されている。アスパラギン酸ペプチダーゼは主に、栄養素の消化に関する機能について説明されている。無脊椎動物において、これらはシステインペプチダーゼと併せて、脊椎動物におけるアスパラギン酸ペプチダーゼ及びセリンペプチダーゼと同じ役割を有すると考えられている。寄生性線虫では、システインペプチダーゼが、寄生性線虫においてペプチダーゼが関与する実質的に全ての機能をカバーする。したがって、カテプシンＢ及びＬは、パパインファミリーに属するシステインペプチダーゼのタイプであり、線虫において包括的に研究されてきた。異なる線虫種に由来するカテプシンＢ間では、最適な温度及びｐＨ、ならびに基質親和性に関する高い可変性が見出されている。それらの主な役割は栄養素を消化することであり、観察された種間の高い可変性は、線虫が占める環境適所に線虫が適合したことに起因すると考えられている。カテプシンＬもまた栄養素の消化に関与していると思われる。
【０１２６】
昆虫及び線虫の腸内環境に見出される消化酵素でよく研究されている１つのクラスは、システインプロテアーゼのクラスである。「システインプロテアーゼ」という用語は、システイン残基がもつ反応性の高いチオール基を酵素の触媒部位に保有するプロテアーゼを表すことを意図する。多くの植食性昆虫及び植物寄生性線虫が、中腸システインプロテアーゼに少なくとも部分的に依存してタンパク質消化を行うという証拠がある。これらは、Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ、特にヘリカメムシ（Ａｎａｓａ  ｔｒｉｓｔｉｓ）；アオカメムシ（Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ  ｈｉｌａｒｅ）；Ｒｉｐｔｏｒｔｕｓ  ｃｌａｖａｔｕｓ；及び今日までに検査されているほぼ全てのＣｏｌｅｏｐｔｅｒａ、特に、コロラドハムシ（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ  ｄｅａｅｍｌｉｎｅａｔａ）；スリーラインドポテトビートル（Ｌｅｍａ  ｔｒｉｌｉｎｅａｔａ）；アスパラガスクビナガハムシ（Ｃｒｉｏｃｅｒｉｓ  ａｓｐａｒａｇｉ）；インゲンテントウ（Ｅｐｉｌａｃｈｎａ  ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓ）；コクヌストモドキ（Ｔｒｉｏｌｉｕｍ  ｃａｓｔａｎｅｕｍ）；ヒラタコクヌストモドキ（Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ  ｃｏｎｆｕｓｕｍ）；ノミハムシ（Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ属、Ｈａｌｔｉｃａ属、及びＥｐｉｔｒｉｘ属）；コーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ属）；ヨツモンマメゾウムシ（Ｃａｌｌｏｓｏｂｒｕｃｈｕｓ  ａｃｕｌａｔｕｅ）；ワタミハナゾウムシ（Ａｎｔｏｎｏｍｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）；イネゾウムシ（Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ  ｏｒｙｚａ）；コクゾウムシ（Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ  ｚｅａｍａｉｓ）；グラナリアコクゾウムシ（Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ  ｇｒａｎａｒｉｕｓ）；エジプトアルファルファタコゾウムシ（Ｈｙｐｅｒａ  ｐｏｓｔｉｃａ）；マメゾウムシ（Ａｃａｎｔｈｏｓｅｅｌｉｄｅｓ  ｏｂｔｅｃｔｕｓ）；コナナガシンクイムシ（Ｒｈｙｚｏｐｅｒｔｈａ  ｄｏｍｉｎｉｃａ）；チャイロコメゴミムシダマシ（Ｔｅｎｅｂｒｉｏ  ｍｏｌｉｔｏｒ）；Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａ、特に、ミカンキイロアザミウマ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｉ  ｅｌｌａ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）；Ｄｉｐｔｅｒａ、特に、ハモグリバエ属（Ｌｉｒｉｏｍｙｚａ  ｔｒｉｆｏｌｉｉ）；植物寄生性線虫、特にジャガイモシスト線虫（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ属）、テンサイシスト線虫（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｓｃｈａｃｈｔｉｉ）、及びネコブ線虫（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ属）を含むが、これらに限定されない。
【０１２７】
別のクラスの消化酵素は、アスパラギン酸プロテアーゼである。「アスパラギン酸プロテアーゼ」という用語は、反応性の高い２つのアスパラギン酸残基を酵素の触媒部位に保有するプロテアーゼを表すことを意図し、これはほとんどの場合、ほぼ全ての既知のアスパラギン酸プロテアーゼの低分子量インヒビターであるペプスタチンによる、その特異的な阻害を特徴とする。多くの植食性昆虫は、ほとんどの場合でシステインプロテアーゼと併せて中腸アスパラギン酸プロテアーゼに部分的に依存してタンパク質消化を行うという証拠がある。これらは、Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ、特に（Ｒｈｏｄｎｉｕｓ  ｐｒｏｌｉｘｕｓ）及びトコジラミ（Ｃｉｍｅｘ属）ならびにＰｈｙｍａｔｉｄａｅ科、Ｐｅｎｔａｔｏｍｉｄａｅ科、Ｌｙｇａｅｉｄａｅ科、及びＢｅｌｏｓｔｏｍａｔｉｄａｅ科のメンバー；全てＣｕｃｕｊｉｆｏｒｍｉａ系に属するＭｅｌｏｉｄａｅ科、Ｃｈｒｙｓｏｍｅｌｉｄａｅ科、Ｃｏｃｃｉｎｅｌｉｄａｅ科、及びＢｒｕｃｈｉｄａｅ科のＣｏｌｅｏｐｔｅｒａ、特に、コロラドハムシ（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ  ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ）スリーラインドポテトビートル（Ｌｅｍａｔｒｉ  ｌｉｎｅａｔａ）；サザンコーンルートワーム及びウエスタンコーンルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ及びＤ．ｖｉｒｇｉｆｅｒａ）、ワタミハナゾウムシ（Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）、ヘリカメムシ（Ａｎａｓａｔｒｉｓｔｉｓ）；ノミハムシ（Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ  ｃｒｕｃｉｆｅｒａ）、Ｂｒｕｃｈｉｄａｅ科昆虫（Ｃａｌｌｏｓｏｂｒｕｃｈｕｓ  ｍａｃｕｌａｔｕｓ）、インゲンテントウ（Ｅｐｉｌａｃｈｎａ  ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓ）、ダイズハモグリバエ（Ｏｄｏｎｔｏｔａ  ｈｏｒｎｉ）、有縁ツチハンミョウ（ｍａｒｇｉｎｅｄ  ｂｌｉｓｔｅｒ  ｂｅｅｔｌｅ）（Ｅｐｉｃａｕｔａ  ｐｅｓｔｉｆｅｒａ）及びコクヌストモドキ（Ｔｒｉｏｌｉｕｍ  ｃａｓｔａｎｅｕｍ）；Ｄｉｐｔｅｒａ、特にイエバエ（Ｍｕｓｃａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）を含むが、これらに限定されない（Ｔｅｒｒａ  ａｎｄ  Ｆｅｒｒｅｉｒａ（１９９４）Ｃｏｍｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０９Ｂ：１−６２、Ｗｏｌｆｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍｕｒｄｏｃｋ（１９９０）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｃｏｌ．１６：１０８９−１１０２）。
【０１２８】
種々の実施形態において、本発明は、上述のように、ヒト、昆虫、及び線虫のプロテイナーゼ、プロテアーゼ、及びペプチダーゼ（本明細書では集合的に「プロテアーゼ」と呼ぶ）の基質として作用する二元ペプチド及び三元ペプチドを提示する。種々の実施形態において、二元ペプチド及び三元ペプチドは、２つまたは３つの異なる領域からなる、少なくとも４個のアミノ酸から最大１６個までのアミノ酸を含有する。したがって、二元ペプチドは２つの異なる領域を有し、三元ペプチドは３つの異なる領域を有する。種々の実施形態において、本発明の二元ペプチド及び三元ペプチドは全て、１つの領域内ではヒトプロテアーゼによって、そして第２の領域内では昆虫及び／または線虫プロテアーゼによって切断可能である。三元ペプチドは、１〜４個のアミノ酸を含むスペーサーと呼ばれる更なる領域を有する点において二元ペプチドとは異なる。一部の実施形態では、スペーサーは、本明細書に記述される任意のアミノ酸を２つ含む「＋２」または「プラス２」ジペプチドであり得る。
【０１２９】
本明細書で使用される場合、二元ペプチド及び三元ペプチドを形成し得るアミノ酸の様々な順列及び組み合わせについて記述する単なる例示目的に過ぎないが、二元ペプチド及び三元ペプチドの第１の領域は「Ｘ」と呼ばれ、「Ｘ」は昆虫及び／または線虫プロテアーゼの基質であり、二元ペプチド及び三元ペプチドの第２の領域は「Ｙ」と呼ばれ、これは、動物（例えばヒト）のプロテアーゼ、例えばヒトの胃腸管系に見出されるヒトプロテアーゼの基質である。一部の実施形態では、本発明の三元ペプチドはＸ領域及びＹ領域を有し、第３の領域はスペーサーまたは「Ｚ」領域と呼ばれる。一部の実施形態では、Ｘ及びＹの各々は２〜４アミノ酸長であってよく、Ｚは１〜４アミノ酸長であってよい。一部の実施形態では、特に殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を植物またはその一部において発現させる場合、二元及び／または三元の切断可能ペプチドは、植物プロテアーゼによって切断され得ない。これらの実施形態において、植物で発現させた殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質は、植物プロテアーゼによってインサイツで切断することはできないが、殺虫性及び／または殺線虫性タンパク質を発現する植物またはその一部がヒトまたは昆虫もしくは線虫によって摂取されると、ヒトまたは昆虫もしくは線虫の腸内プロテアーゼによって切断することができる。
【０１３０】
（１Ｂ）．二元ペプチドの説明及び例
【０１３１】
したがって、二元ペプチドは、Ｘ（２〜４）Ｙ（２〜４）、もしくはＹ（２〜４）Ｘ（２〜４）を含むか、またはこれらからなる場合があり、例示的な三元ペプチドは、Ｘ（２〜４）Ｙ（２〜４）Ｚ（１〜４）、またはＺ（１〜４）Ｘ（２〜４）Ｙ（２〜４）、またはＹ（２〜４）Ｘ（２〜４）Ｚ（１〜４）、またはＺ（１〜４）Ｙ（２〜４）Ｘ（２〜４）、またはＺ（１〜４）Ｘ（２〜４）Ｙ（２〜４）Ｚ（１〜４）、またはＺ（１〜４）Ｙ（２〜４）Ｘ（２〜４）Ｚ（１〜４）を含む場合があり、ここで括弧内の各数字は、その領域のアミノ酸の数を表す。例えば、Ｘ（２〜４）は、２〜４つのアミノ酸を含むＸ領域、例えばＸ１Ｘ２（２つのアミノ酸）、またはＸ１Ｘ２Ｘ３（３つのアミノ酸）、またはＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４（４つのアミノ酸）を表す。例えば、二元ペプチドは、アミノ酸配列：Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２、Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３、Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４、Ｙ１−Ｙ２−Ｘ１−Ｘ２、Ｙ１−Ｙ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３、Ｙ１−Ｙ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４、Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｘ１−Ｘ２、Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３、Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４、Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｘ１−Ｘ２、Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３、Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４［式中、各Ｘｎ及び各Ｙｎはアミノ酸であり、Ｘ１は、（全て一文字アミノ酸形式で）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、及びＶからなる群から選択され、Ｘ２は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ４は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｙ１は、（全て一文字アミノ酸形式で）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ２は、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ４は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される］を含み得る。
【０１３２】
種々の実施形態において、例示的なＸ領域のペプチド配列、すなわち、昆虫及び／または線虫の腸内／血リンパ環境に見出される１つ以上の昆虫及び／または線虫プロテアーゼによって切断され得るペプチド配列は、ＡＡＧ、ＡＡＫ、ＡＡＲ、ＡＦＧ、ＡＦＫ、ＡＦＲ、ＡＧＦ、ＡＧＩ、ＡＧＫ、ＡＧＬ、ＡＧＮ、ＡＧＱ、ＡＧＲ、ＡＧＳ、ＡＧＴ、ＡＧＹ、ＡＩＧ、ＡＩＫ、ＡＩＮ、ＡＩＱ、ＡＩＲ、ＡＫＦ、ＡＫＧ、ＡＫＩ、ＡＫＫ、ＡＫＬ、ＡＫＮ、ＡＫＱ、ＡＫＲ、ＡＫＳ、ＡＫＴ、ＡＫＹ、ＡＬＧ、ＡＬＫ、ＡＬＮ、ＡＬＱ、ＡＬＲ、ＡＰＦ、ＡＰＧ、ＡＰＫ、ＡＰＲ、ＡＲＦ、ＡＲＧ、ＡＲＩ、ＡＲＫ、ＡＲＬ、ＡＲＮ、ＡＲＱ、ＡＲＲ、ＡＲＳ、ＡＲＴ、ＡＲＹ、ＡＳＧ、ＡＳＫ、ＡＳＲ、ＡＴＧ、ＡＴＫ、ＡＴＲ、ＡＶＧ、ＡＶＫ、ＡＶＲ、ＡＹＧ、ＡＹＫ、ＡＹＲ、ＤＧＫ、ＤＧＲ、ＤＩＧ、ＤＩＫ、ＤＩＲ、ＤＬＧ、ＤＬＫ、ＤＬＲ、ＥＧＫ、ＥＧＲ、ＥＩＧ、ＥＩＫ、ＥＩＲ、ＥＬＧ、ＥＬＫ、ＥＬＲ、ＥＲ、ＦＶＲ、ＧＡＦ、ＧＡＩ、ＧＡＫ、ＧＡＬ、ＧＡＲ、ＧＡＹ、ＧＦＫ、ＧＦＲ、ＧＩＫ、ＧＩＮ、ＧＩＱ、ＧＩＲ、ＧＫＡ、ＧＫＤ、ＧＫＥ、ＧＫＦ、ＧＫＩ、ＧＫＫ、ＧＫＬ、ＧＫＮ、ＧＫＱ、ＧＫＲ、ＧＫＳ、ＧＫＴ、ＧＫＶ、ＧＫＹ、ＧＬＫ、ＧＬＮ、ＧＬＱ、ＧＬＲ、ＧＮＡ、ＧＮＫ、ＧＮＲ、ＧＮＶ、ＧＰＫ、ＧＰＲ、ＧＱＡ、ＧＱＫ、ＧＱＲ、ＧＱＶ、ＧＲＡ、ＧＲＤ、ＧＲＥ、ＧＲＦ、ＧＲＩ、ＧＲＫ、ＧＲＬ、ＧＲＮ、ＧＲＱ、ＧＲＲ、ＧＲＳ、ＧＲＴ、ＧＲＶ、ＧＲＹ、ＧＳＩ、ＧＳＫ、ＧＳＬ、ＧＳＲ、ＧＴＩ、ＧＴＫ、ＧＴＬ、ＧＴＲ、ＧＶＦ、ＧＶＩ、ＧＶＫ、ＧＶＬ、ＧＶＲ、ＧＶＹ、ＧＹＫ、ＧＹＲ、ＩＧＡ、ＩＧＦ、ＩＧＩ、ＩＧＫ、ＩＧＬ、ＩＧＮ、ＩＧＱ、ＩＧＲ、ＩＧＳ、ＩＧＴ、ＩＧＶ、ＩＧＹ、ＩＩＧ、ＩＩＫ、ＩＩＲ、ＩＫＡ、ＩＫＦ、ＩＫＧ、ＩＫＩ、ＩＫＫ、ＩＫＬ、ＩＫＮ、ＩＫＱ、ＩＫＲ、ＩＫＳ、ＩＫＴ、ＩＫＶ、ＩＫＹ、ＩＬＧ、ＩＬＫ、ＩＬＲ、ＩＮＡ、ＩＮＧ、ＩＮＫ、ＩＮＲ、ＩＮＶ、ＩＰＧ、ＩＰＫ、ＩＰＲ、ＩＱＡ、ＩＱＧ、ＩＱＫ、ＩＱＲ、ＩＱＶ、ＩＲＡ、ＩＲＦ、ＩＲＧ、ＩＲＩ、ＩＲＫ、ＩＲＬ、ＩＲＮ、ＩＲＱ、ＩＲＲ、ＩＲＳ、ＩＲＴ、ＩＲＶ、ＩＲＹ、ＩＳＧ、ＩＳＫ、ＩＳＲ、ＩＴＧ、ＩＴＫ、ＩＴＲ、ＫＡＦ、ＫＡＧ、ＫＡＩ、ＫＡＫ、ＫＡＬ、ＫＡＲ、ＫＡＹ、ＫＦＦ、ＫＦＧ、ＫＦＫ、ＫＦＲ、ＫＧＡ、ＫＧＤ、ＫＧＥ、ＫＧＦ、ＫＧＩ、ＫＧＫ、ＫＧＬ、ＫＧＮ、ＫＧＱ、ＫＧＲ、ＫＧＳ、ＫＧＴ、ＫＧＶ、ＫＧＹ、ＫＩＧ、ＫＩＫ、ＫＩＮ、ＫＩＱ、ＫＩＲ、ＫＫＡ、ＫＫＤ、ＫＫＥ、ＫＫＦ、ＫＫＧ、ＫＫＮ、ＫＫＱ、ＫＫＳ、ＫＫＴ、ＫＫＶ、ＫＫＹ、ＫＬＧ、ＫＬＫ、ＫＬＮ、ＫＬＱ、ＫＬＲ、ＫＮＧ、ＫＮＫ、ＫＮＲ、ＫＰＧ、ＫＰＫ、ＫＰＲ、ＫＱＧ、ＫＱＫ、ＫＱＲ、ＫＲＡ、ＫＲＤ、ＫＲＥ、ＫＲＦ、ＫＲＧ、ＫＲＮ、ＫＲＱ、ＫＲＳ、ＫＲＴ、ＫＲＶ、ＫＲＹ、ＫＳＧ、ＫＳＩ、ＫＳＫ、ＫＳＬ、ＫＳＲ、ＫＴＧ、ＫＴＩ、ＫＴＫ、ＫＴＬ、ＫＴＲ、ＫＶＦ、ＫＶＧ、ＫＶＩ、ＫＶＫ、ＫＶＬ、ＫＶＲ、ＫＶＹ、ＫＹＧ、ＫＹＫ、ＫＹＲ、ＬＦＲ、ＬＧＡ、ＬＧＦ、ＬＧＩ、ＬＧＫ、ＬＧＬ、ＬＧＮ、ＬＧＱ、ＬＧＲ、ＬＧＳ、ＬＧＴ、ＬＧＶ、ＬＧＹ、ＬＩＧ、ＬＩＫ、ＬＩＲ、ＬＫ、ＬＫＡ、ＬＫＦ、ＬＫＧ、ＬＫＩ、ＬＫＫ、ＬＫＬ、ＬＫＮ、ＬＫＱ、ＬＫＲ、ＬＫＳ、ＬＫＴ、ＬＫＶ、ＬＫＹ、ＬＬＧ、ＬＬＫ、ＬＬＲ、ＬＮＡ、ＬＮＧ、ＬＮＫ、ＬＮＲ、ＬＮＶ、ＬＰＧ、ＬＰＫ、ＬＰＲ、ＬＱＡ、ＬＱＧ、ＬＱＫ、ＬＱＲ、ＬＱＶ、ＬＲＡ、ＬＲＦ、ＬＲＧ、ＬＲＩ、ＬＲＫ、ＬＲＬ、ＬＲＮ、ＬＲＱ、ＬＲＲ、ＬＲＳ、ＬＲＴ、ＬＲＶ、ＬＲＹ、ＬＳＧ、ＬＳＫ、ＬＳＲ、ＬＴＧ、ＬＴＫ、ＬＴＲ、ＮＧＫ、ＮＧＲ、ＮＩＧ、ＮＩＫ、ＮＩＲ、ＮＬＧ、ＮＬＫ、ＮＬＲ、ＰＧＫ、ＰＧＲ、ＰＩＧ、ＰＩＫ、ＰＩＲ、ＰＫＧ、ＰＫＫ、ＰＫＲ、ＰＬＧ、ＰＬＫ、ＰＬＲ、ＰＲＧ、ＰＲＫ、ＰＲＲ、ＱＧＫ、ＱＧＲ、ＱＩＧ、ＱＩＫ、ＱＩＲ、ＱＬＧ、ＱＬＫ、ＱＬＲ、ＲＡＦ、ＲＡＧ、ＲＡＩ、ＲＡＫ、ＲＡＬ、ＲＡＲ、ＲＡＹ、ＲＦＦ、ＲＦＧ、ＲＦＫ、ＲＦＲ、ＲＧＡ、ＲＧＤ、ＲＧＥ、ＲＧＦ、ＲＧＩ、ＲＧＫ、ＲＧＬ、ＲＧＮ、ＲＧＱ、ＲＧＲ、ＲＧＳ、ＲＧＴ、ＲＧＶ、ＲＧＹ、ＲＩＧ、ＲＩＫ、ＲＩＮ、ＲＩＱ、ＲＩＲ、ＲＫＡ、ＲＫＤ、ＲＫＥ、ＲＫＦ、ＲＫＧ、ＲＫＫ、ＲＫＮ、ＲＫＱ、ＲＫＳ、ＲＫＴ、ＲＫＶ、ＲＫＹ、ＲＬＦ、ＲＬＦＬ、ＲＬＧ、ＲＬＫ、ＲＬＮ、ＲＬＱ、ＲＬＲ、ＲＮＧ、ＲＮＫ、ＲＮＲ、ＲＰＧ、ＲＰＫ、ＲＰＲ、ＲＱＧ、ＲＱＫ、ＲＱＲ、ＲＲＡ、ＲＲＤ、ＲＲＥ、ＲＲＦ、ＲＲＧ、ＲＲＫ、ＲＲＮ、ＲＲＱ、ＲＲＲ、ＲＲＳ、ＲＲＴ、ＲＲＶ、ＲＲＹ、ＲＳＧ、ＲＳＩ、ＲＳＫ、ＲＳＬ、ＲＳＲ、ＲＴＧ、ＲＴＩ、ＲＴＫ、ＲＴＬ、ＲＴＲ、ＲＶＦ、ＲＶＧ、ＲＶＩ、ＲＶＫ、ＲＶＬ、ＲＶＲ、ＲＶＹ、ＲＹＧ、ＲＹＫ、ＲＹＲ、ＶＡＧ、ＶＡＫ、ＶＡＲ、ＶＦＧ、ＶＦＫ、ＶＦＲ、ＶＧＦ、ＶＧＩ、ＶＧＫ、ＶＧＬ、ＶＧＮ、ＶＧＱ、ＶＧＲ、ＶＧＳ、ＶＧＴ、ＶＧＹ、ＶＩＧ、ＶＩＫ、ＶＩＮ、ＶＩＱ、ＶＩＲ、ＶＫＦ、ＶＫＧ、ＶＫＩ、ＶＫＫ、ＶＫＬ、ＶＫＮ、ＶＫＱ、ＶＫＲ、ＶＫＳ、ＶＫＴ、ＶＫＹ、ＶＬＧ、ＶＬＫ、ＶＬＮ、ＶＬＱ、ＶＬＲ、ＶＰＧ、ＶＰＫ、ＶＰＲ、ＶＲ、ＶＲＦ、ＶＲＧ、ＶＲＩ、ＶＲＫ、ＶＲＬ、ＶＲＮ、ＶＲＱ、ＶＲＲ、ＶＲＳ、ＶＲＴ、ＶＲＹ、ＶＳＧ、ＶＳＫ、ＶＳＲ、ＶＴＧ、ＶＴＫ、ＶＴＲ、ＶＶＧ、ＶＶＫ、ＶＶＲ、ＶＹＧ、ＶＹＫ、またはＶＹＲを含み得る。
【０１３３】
種々の実施形態において、例示的なＸ領域のペプチド配列、すなわち、昆虫及び／または線虫の腸内／血リンパ環境に見出される１つ以上の昆虫及び／または線虫プロテアーゼによって切断され得るペプチド配列は、ＡＡＫ、ＡＡＲ、ＡＦＫ、ＡＦＲ、ＡＩＫ、ＡＩＮ、ＡＩＱ、ＡＩＲ、ＡＫＦ、ＡＫＩ、ＡＫＫ、ＡＫＬ、ＡＫＮ、ＡＫＱ、ＡＫＲ、ＡＫＳ、ＡＫＴ、ＡＫＹ、ＡＬＫ、ＡＬＮ、ＡＬＱ、ＡＬＲ、ＡＰＫ、ＡＰＲ、ＡＲＦ、ＡＲＩ、ＡＲＫ、ＡＲＬ、ＡＲＮ、ＡＲＱ、ＡＲＲ、ＡＲＳ、ＡＲＴ、ＡＲＹ、ＡＳＫ、ＡＳＲ、ＡＴＫ、ＡＴＲ、ＡＶＫ、ＡＶＲ、ＡＹＫ、ＡＹＲ、ＤＩＫ、ＤＩＲ、ＤＬＫ、ＤＬＲ、ＥＩＫ、ＥＩＲ、ＥＬＫ、ＥＬＲ、ＩＩＫ、ＩＩＲ、ＩＫＡ、ＩＫＦ、ＩＫＩ、ＩＫＫ、ＩＫＬ、ＩＫＮ、ＩＫＱ、ＩＫＲ、ＩＫＳ、ＩＫＴ、ＩＫＶ、ＩＫＹ、ＩＬＫ、ＩＬＲ、ＩＮＡ、ＩＮＫ、ＩＮＲ、ＩＮＶ、ＩＰＫ、ＩＰＲ、ＩＱＡ、ＩＱＫ、ＩＱＲ、ＩＱＶ、ＩＲＡ、ＩＲＦ、ＩＲＩ、ＩＲＫ、ＩＲＬ、ＩＲＮ、ＩＲＱ、ＩＲＲ、ＩＲＳ、ＩＲＴ、ＩＲＶ、ＩＲＹ、ＩＳＫ、ＩＳＲ、ＩＴＫ、ＩＴＲ、ＫＡＦ、ＫＡＩ、ＫＡＫ、ＫＡＬ、ＫＡＲ、ＫＡＹ、ＫＦＫ、ＫＦＲ、ＫＩＫ、ＫＩＮ、ＫＩＱ、ＫＩＲ、ＫＫＡ、ＫＫＤ、ＫＫＥ、ＫＫＦ、ＫＫＮ、ＫＫＱ、ＫＫＳ、ＫＫＴ、ＫＫＶ、ＫＫＹ、ＫＬＫ、ＫＬＮ、ＫＬＱ、ＫＬＲ、ＫＮＫ、ＫＮＲ、ＫＰＫ、ＫＰＲ、ＫＱＫ、ＫＱＲ、ＫＲＡ、ＫＲＤ、ＫＲＥ、ＫＲＦ、ＫＲＮ、ＫＲＱ、ＫＲＳ、ＫＲＴ、ＫＲＶ、ＫＲＹ、ＫＳＩ、ＫＳＫ、ＫＳＬ、ＫＳＲ、ＫＴＩ、ＫＴＫ、ＫＴＬ、ＫＴＲ、ＫＶＦ、ＫＶＩ、ＫＶＫ、ＫＶＬ、ＫＶＲ、ＫＶＹ、ＫＹＫ、ＫＹＲ、ＬＩＫ、ＬＩＲ、ＬＫＡ、ＬＫＦ、ＬＫＩ、ＬＫＫ、ＬＫＬ、ＬＫＮ、ＬＫＱ、ＬＫＲ、ＬＫＳ、ＬＫＴ、ＬＫＶ、ＬＫＹ、ＬＬＫ、ＬＬＲ、ＬＮＡ、ＬＮＫ、ＬＮＲ、ＬＮＶ、ＬＰＫ、ＬＰＲ、ＬＱＡ、ＬＱＫ、ＬＱＲ、ＬＱＶ、ＬＲＡ、ＬＲＦ、ＬＲＩ、ＬＲＫ、ＬＲＬ、ＬＲＮ、ＬＲＱ、ＬＲＲ、ＬＲＳ、ＬＲＴ、ＬＲＶ、ＬＲＹ、ＬＳＫ、ＬＳＲ、ＬＴＫ、ＬＴＲ、ＮＩＫ、ＮＩＲ、ＮＬＫ、ＮＬＲ、ＰＩＫ、ＰＩＲ、ＰＫＫ、ＰＫＲ、ＰＬＫ、ＰＬＲ、ＰＲＫ、ＰＲＲ、ＱＩＫ、ＱＩＲ、ＱＬＫ、ＱＬＲ、ＲＡＦ、ＲＡＩ、ＲＡＫ、ＲＡＬ、ＲＡＲ、ＲＡＹ、ＲＦＫ、ＲＦＲ、ＲＩＫ、ＲＩＮ、ＲＩＱ、ＲＩＲ、ＲＫＡ、ＲＫＤ、ＲＫＥ、ＲＫＦ、ＲＫＮ、ＲＫＱ、ＲＫＳ、ＲＫＴ、ＲＫＶ、ＲＫＹ、ＲＬＫ、ＲＬＮ、ＲＬＱ、ＲＬＲ、ＲＮＫ、ＲＮＲ、ＲＰＫ、ＲＰＲ、ＲＱＫ、ＲＱＲ、ＲＲＡ、ＲＲＤ、ＲＲＥ、ＲＲＦ、ＲＲＮ、ＲＲＱ、ＲＲＳ、ＲＲＴ、ＲＲＶ、ＲＲＹ、ＲＳＩ、ＲＳＫ、ＲＳＬ、ＲＳＲ、ＲＴＩ、ＲＴＫ、ＲＴＬ、ＲＴＲ、ＲＶＦ、ＲＶＩ、ＲＶＫ、ＲＶＬ、ＲＶＲ、ＲＶＹ、ＲＹＫ、ＲＹＲ、ＶＡＫ、ＶＡＲ、ＶＦＫ、ＶＦＲ、ＶＩＫ、ＶＩＮ、ＶＩＱ、ＶＩＲ、ＶＫＦ、ＶＫＩ、ＶＫＫ、ＶＫＬ、ＶＫＮ、ＶＫＱ、ＶＫＲ、ＶＫＳ、ＶＫＴ、ＶＫＹ、ＶＬＫ、ＶＬＮ、ＶＬＱ、ＶＬＲ、ＶＰＫ、ＶＰＲ、ＶＲＦ、ＶＲＩ、ＶＲＫ、ＶＲＬ、ＶＲＮ、ＶＲＱ、ＶＲＲ、ＶＲＳ、ＶＲＴ、ＶＲＹ、ＶＳＫ、ＶＳＲ、ＶＴＫ、ＶＴＲ、ＶＶＫ、ＶＶＲ、ＶＹＫ、またはＶＹＲを含み得る。
【０１３４】
種々の実施形態において、例示的なＹ領域のペプチド配列、すなわち、動物（例えばヒト）の胃腸管環境に見出される１つ以上の動物（例えばヒト）のプロテアーゼによって切断され得るペプチド配列は、ＡＦＦ、ＡＦＧ、ＡＦＩ、ＡＦＬ、ＡＦＶ、ＡＦＹ、ＡＧＦ、ＡＧＬ、ＡＩＦ、ＡＩＬ、ＡＬＦ、ＡＬＧ、ＡＬＩ、ＡＬＬ、ＡＬＹ、ＡＹＦ、ＡＹＬ、ＤＦＦ、ＤＦＧ、ＤＦＩ、ＤＦＬ、ＤＦＹ、ＤＧＦ、ＤＧＬ、ＤＩＦ、ＤＬＦ、ＤＬＧ、ＤＬＹ、ＤＹＦ、ＤＹＬ、ＥＦＦ、ＥＦＧ、ＥＦＩ、ＥＦＬ、ＥＦＹ、ＥＧＦ、ＥＧＬ、ＥＩＦ、ＥＬＦ、ＥＬＧ、ＥＬＹ、ＥＹＦ、ＥＹＬ、ＦＦ、ＦＦＡ、ＦＦＤ、ＦＦＥ、ＦＦＦ、ＦＦＧ、ＦＦＩ、ＦＦＫ、ＦＦＬ、ＦＦＲ、ＦＦＳ、ＦＦＴ、ＦＦＶ、ＦＦＹ、ＦＧＡ、ＦＧＤ、ＦＧＥ、ＦＧＦ、ＦＧＩ、ＦＧＫ、ＦＧＬ、ＦＧＲ、ＦＧＳ、ＦＧＴ、ＦＧＶ、ＦＧＹ、ＦＬＶ、ＦＬＲ、ＦＹＡ、ＦＹＤ、ＦＹＥ、ＦＹＦ、ＦＹＧ、ＦＹＩ、ＦＹＫ、ＦＹＬ、ＦＹＲ、ＦＹＳ、ＦＹＴ、ＦＹＶ、ＦＹＹ、ＧＦＡ、ＧＦＤ、ＧＦＥ、ＧＦＦ、ＧＦＩ、ＧＦＫ、ＧＦＬ、ＧＦＲ、ＧＦＳ、ＧＦＴ、ＧＦＶ、ＧＦＹ、ＧＧＬ、ＧＩＦ、ＧＩＬ、ＧＬＦ、ＧＬＩ、ＧＬＬ、ＧＬＹ、ＧＹＦ、ＧＹＬ、ＩＦ、ＩＦＡ、ＩＦＦ、ＩＦＧ、ＩＦＩ、ＩＦＬ、ＩＦＶ、ＩＦＹ、ＩＧＦ、ＩＧＬ、ＩＩＦ、ＩＩＬ、ＩＬＦ、ＩＬＧ、ＩＬＩ、ＩＬＬ、ＩＬＹ、ＩＹＦ、ＩＹＬ、ＬＦＡ、ＬＦＦ、ＬＦＧ、ＬＦＩ、ＬＦＬ、ＬＦＶ、ＬＦＹ、ＬＧ、ＬＧＡ、ＬＧＥ、ＬＧＦ、ＬＧＩ、ＬＧＬ、ＬＧＶ、ＬＧＹ、ＬＩＦ、ＬＩＧ、ＬＩＩ、ＬＩＬ、ＬＩＹ、ＬＬＦ、ＬＬＧ、ＬＬＩ、ＬＬＬ、ＬＬＹ、ＬＹＡ、ＬＹＦ、ＬＹＧ、ＬＹＩ、ＬＹＬ、ＬＹＶ、ＬＹＹ、ＮＦＦ、ＮＦＧ、ＮＦＩ、ＮＦＬ、ＮＦＹ、ＮＧＦ、ＮＧＬ、ＮＩＬ、ＮＬＧ、ＮＬＩ、ＮＬＬ、ＮＹＦ、ＮＹＬ、ＱＦＦ、ＱＦＧ、ＱＦＩ、ＱＦＬ、ＱＦＹ、ＱＧＦ、ＱＧＬ、ＱＩＬ、ＱＬＧ、ＱＬＩ、ＱＬＬ、ＱＹＦ、ＱＹＬ、ＳＦＦ、ＳＦＧ、ＳＦＩ、ＳＦＬ、ＳＦＹ、ＳＧＦ、ＳＧＬ、ＳＩＦ、ＳＩＬ、ＳＬＦ、ＳＬＧ、ＳＬＩ、ＳＬＬ、ＳＬＹ、ＳＹＦ、ＳＹＬ、ＴＦＦ、ＴＦＧ、ＴＦＩ、ＴＦＬ、ＴＦＹ、ＴＧＦ、ＴＧＬ、ＴＩＦ、ＴＩＬ、ＴＬＦ、ＴＬＧ、ＴＬＩ、ＴＬＬ、ＴＬＹ、ＴＹＦ、ＴＹＬ、ＶＦＦ、ＶＦＧ、ＶＦＩ、ＶＦＬ、ＶＦＹ、ＶＧＦ、ＶＧＬ、ＶＩＦ、ＶＩＬ、ＶＬＦ、ＶＬＧ、ＶＬＩ、ＶＬＬ、ＶＬＹ、ＶＹＦ、ＶＹＬ、ＹＦＡ、ＹＦＤ、ＹＦＥ、ＹＦＦ、ＹＦＧ、ＹＦＩ、ＹＦＫ、ＹＦＬ、ＹＦＲ、ＹＦＳ、ＹＦＴ、ＹＦＶ、ＹＦＹ、ＹＧＦ、ＹＧＬ、ＹＹＦ、またはＹＹＬを含み得る。
【０１３５】
種々の実施形態において、例示的なＹ領域のペプチド配列、すなわち、動物（例えばヒト）の胃腸管環境に見出される１つ以上の動物（例えばヒト）のプロテアーゼによって切断され得るペプチド配列は、ＡＦＦ、ＡＦＩ、ＡＦＬ、ＡＦＹ、ＡＩＦ、ＡＩＬ、ＡＬＦ、ＡＬＩ、ＡＬＬ、ＡＬＹ、ＡＹＦ、ＡＹＬ、ＤＦＦ、ＤＦＩ、ＤＦＬ、ＤＦＹ、ＤＩＦ、ＤＬＦ、ＤＬＹ、ＤＹＦ、ＤＹＬ、ＹＦＬ、ＥＦＦ、ＥＦＩ、ＥＦＬ、０、ＥＦＹ、ＥＩＦ、ＥＬＦ、ＥＬＹ、ＥＹＦ、ＥＹＬ、ＦＦＡ、ＦＦＤ、ＦＦＥ、ＦＦＦ、ＦＦＩ、ＦＦＫ、ＦＦＬ、ＦＦＲ、ＦＦＳ、ＦＦＴ、ＦＦＶ、ＦＦＹ、ＦＹＡ、ＦＹＤ、ＦＹＥ、ＦＹＦ、ＦＹＩ、ＦＹＫ、ＦＹＬ、ＦＹＲ、ＦＹＳ、ＦＹＴ、ＦＹＶ、ＦＹＹ、ＩＦＡ、ＩＦＦ、ＩＦＩ、ＩＦＬ、ＩＦＶ、ＩＦＹ、ＩＩＦ、ＩＩＬ、ＩＬＦ、ＩＬＩ、ＩＬＬ、ＩＬＹ、ＩＹＦ、ＩＹＬ、ＬＦＡ、ＬＦＦ、ＬＦＩ、ＬＦＬ、ＬＦＶ、ＬＦＹ、ＬＩＦ、ＬＩＩ、ＬＩＬ、ＬＩＹ、ＬＬＦ、ＬＬＩ、ＬＬＬ、ＬＬＹ、ＬＹＡ、ＬＹＦ、ＬＹＩ、ＬＹＬ、ＬＹＶ、ＬＹＹ、ＮＦＦ、ＮＦＩ、ＮＦＬ、ＮＦＹ、ＮＩＬ、ＮＬＩ、ＮＬＬ、ＮＹＦ、ＮＹＬ、ＱＦＦ、ＱＦＩ、ＱＦＬ、ＱＦＹ、ＱＩＬ、ＱＬＩ、ＱＬＬ、ＱＹＦ、ＱＹＬ、ＳＦＦ、ＳＦＩ、ＳＦＬ、ＳＦＹ、ＳＩＦ、ＳＩＬ、ＳＬＦ、ＳＬＩ、ＳＬＬ、ＳＬＹ、ＳＹＦ、ＳＹＬ、ＴＦＦ、ＴＦＩ、ＴＦＬ、ＴＦＹ、ＴＩＦ、ＴＩＬ、ＴＬＦ、ＴＬＩ、ＴＬＬ、ＴＬＹ、ＴＹＦ、ＴＹＬ、ＶＦＦ、ＶＦＩ、ＶＦＬ、ＶＦＹ、ＶＩＦ、ＶＩＬ、ＶＬＦ、ＶＬＩ、ＶＬＬ、ＶＬＹ、ＶＹＦ、ＶＹＬ、ＹＦＡ、ＹＦＤ、ＹＦＥ、ＹＦＦ、ＹＦＩ、ＹＦＫ、ＹＦＬ、ＹＦＲ、ＹＦＳ、ＹＦＴ、ＹＦＶ、ＹＦＹ、ＹＹＦ、またはＹＹＬを含み得る。
【０１３６】
種々の実施形態において、例示的なＸまたはＹ領域のペプチド配列、すなわち、動物（例えばヒト）の胃腸管環境に見出される１つ以上の動物（例えばヒト）のプロテアーゼ、ならびに昆虫及び／または線虫の腸内／血リンパ環境に見出される１つ以上の昆虫及び／または線虫プロテアーゼによって切断され得るペプチド配列は、ＡＦＧ、ＡＧＦ、ＡＧＬ、ＡＬＧ、ＤＬＧ、ＥＬＧ、ＧＦＫ、ＧＦＲ、ＩＧＦ、ＩＧＬ、ＩＬＧ、ＬＧＡ、ＬＧＦ、ＬＧＩ、ＬＧＬ、ＬＧＶ、ＬＧＹ、ＬＩＧ、ＬＬＧ、ＮＬＧ、ＱＬＧ、ＶＦＧ、ＶＧＦ、ＶＧＬ、またはＶＬＧを含み得る。
【０１３７】
一部の例示的な例において、本発明の二元ペプチドは、次式：Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２、Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３、Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４、Ｙ１−Ｙ２−Ｘ１−Ｘ２、Ｙ１−Ｙ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３、Ｙ１−Ｙ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４、Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｘ１−Ｘ２、Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３、Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４、Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｘ１−Ｘ２、Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３、Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４［式中、Ｘ１は、（全て一文字アミノ酸形式で）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、及びＶからなる群から選択され、Ｘ２は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｘ４は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｙ１は、（全て一文字アミノ酸形式で）Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ２は、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ３は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群から選択され、Ｙ４は、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される］を含み得る。
【０１３８】
一部の実施形態では、例示的な二元ペプチド（ＸＹまたはＹＸ）は、次のアミノ酸配列：ＡＦＶＲＬＦ（配列番号１５９４）、ＡＫＬＦＶ（配列番号１５９５）、ＡＬＦＡＬＫ（配列番号１５９６）、ＡＬＦＬＫ（配列番号１５９７）、ＡＬＦＬＲ（配列番号１５９８）、ＡＬＦＲ（配列番号１５９９）、ＡＬＦＲＬＲ（配列番号１６００）、ＡＬＫＡＬＦ（配列番号１６０１）、ＡＬＫＦＦ（配列番号１６０２）、ＡＬＫＦＬＶ（配列番号１６０３）、ＡＬＫＩＦＶ（配列番号１６０４）、ＡＬＫＬＦＶ（配列番号１６０５）、ＦＦＡＤＩＫ（配列番号１６０６）、ＦＦＡＬＫ（配列番号１６０７）、ＦＦＬＫ（配列番号１６０８）、ＦＦＬＲ（配列番号１６０９）、ＦＦＲＬＲ（配列番号１６１０）、ＦＧＹＲＩＫ（配列番号１６１１）、ＦＬＲＬＦ（配列番号１６１２）、ＦＹＡＲＲ（配列番号１６１３）、ＧＧＬＲＫＫ（配列番号１６１４）、ＩＦＶＡＬＫ（配列番号１６１５）、ＩＦＶＬＫ（配列番号１６１６）、ＩＦＶＬＲ（配列番号１６１７）、ＩＦＶＲ（配列番号１６１８）、ＩＦＶＲＬＲ（配列番号１６１９）、ＩＬＦＮＩＫ（配列番号１６２０）、ＬＦＡＡＰＦ（配列番号１６２１）、ＦＶＡＬＫ（配列番号１６２２）、ＬＦＶＬＫ（配列番号１６２３）、ＬＦＶＬＲ（配列番号１６２４）、ＬＦＶＲ（配列番号１６２５）、ＬＦＶＲＬＲ（配列番号１６２６）、ＬＦＶＲＶＦＬ（配列番号１６２７）、ＬＧＥＲ（配列番号１６２８）、ＬＫＡＬＦ（配列番号１６２９）、ＬＫＦＦ（配列番号１６３０）、ＬＫＩＦＶ（配列番号１６３１）、ＬＫＬＦＶ（配列番号１６３２）、ＬＲＡＬＦ（配列番号１６３３）、ＬＲＦＦ（配列番号１６３４）、ＬＲＩＦＶ（配列番号１６３５）、ＬＲＬＦＶ（配列番号１６３６）、ＲＡＬＦ（配列番号１６３７）、ＲＩＦＶ（配列番号１６３８）、ＲＬＦＶ（配列番号１６３９）、ＲＬＲＡＬＦ（配列番号１６４０）、ＲＬＲＦＦ（配列番号１６４１）、ＲＬＲＩＦＶ（配列番号１６４２）、ＲＬＲＬＦＶ（配列番号１６４３）、ＲＲＫＡＦＶ（配列番号１６４４）、ＲＲＫＬＩＦ（配列番号１６４５）、ＲＲＲＦＦＡ（配列番号１６４６）、ＶＦＧＲＫＧ（配列番号１６４７）、及びＹＦＶＲＫ（配列番号１６４８）を含む。
【０１３９】
種々の実施形態において、殺虫性及び／または殺線虫性ポリペプチド及びタンパク質、ＤＮＡ構築物に使用され、また、トランスジェニック植物またはその一部に組み込まれる、本発明の例示的な二元ペプチドは、ＩＦＶＲＬＲ、ＡＬＫＬＦＶ、ＡＬＫＦＬＶ、ＲＲＫＡＦＶ、またはＬＦＡＡＰＦからなる群から選択される１つ以上の切断可能な二元ペプチドを含み得る。
【０１４０】
（１Ｃ）．三元ペプチドの説明及び例
【０１４１】
種々の実施形態において、三元ペプチドには、二元ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、または両末端にインフレームで融合した１〜４個のアミノ酸が付加された、上記で説明した例示的な二元ペプチドが全て含まれ得る。一部の実施形態では、本発明の三元ペプチドには、例示的な二元ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、または両末端に１個、２個、３個、または４個のアミノ酸がインフレームで融合した、上記に開示された例示的な二元ペプチドが全て含まれ得る。別の例において、例示的な三元ペプチドには、上記に定義した二元ペプチドのＮ末端、またはＣ末端、または両末端にインフレームで位置付けられたＺ（１〜４）が付加された、Ｘ（２〜４）Ｙ（２〜４）、またはＹ（２〜４）Ｘ（２〜４）が含まれ得る。一部の例示的な例において、種々の三元ペプチドの例は、アミノ酸配列：Ｚ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２、Ｚ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２、Ｚ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２、Ｚ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３、Ｚ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３、Ｚ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３、Ｚ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４、Ｚ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４、Ｚ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４、Ｚ１−Ｚ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２、Ｚ１−Ｚ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２、Ｚ１−Ｚ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２、Ｚ１−Ｚ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３、Ｚ１−Ｚ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３、Ｚ１−Ｚ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３、Ｚ１−Ｚ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４、Ｚ１−Ｚ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４、Ｚ１−Ｚ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４、Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｚ１、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｚ１、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｚ１、Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｚ１、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｚ１、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｚ１、Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｚ１、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｚ１、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｚ１、Ｚ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｚ１、Ｚ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｚ１、Ｚ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｚ１、Ｚ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｚ１、Ｚ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｚ１、Ｚ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｚ１、Ｚ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｚ１、Ｚ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｚ１、Ｚ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｚ１、Ｚ１−Ｚ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｚ１、Ｚ１−Ｚ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｚ１、Ｚ１−Ｚ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｚ１、Ｚ１−Ｚ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｚ１、Ｚ１−Ｚ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｚ１、Ｚ１−Ｚ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｚ１、Ｚ１−Ｚ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｚ１、Ｚ１−Ｚ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｚ１、Ｚ１−Ｚ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｚ１、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｚ１、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｚ１、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｚ１、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｚ１、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｚ１、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｚ１、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｚ１、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｚ１、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｚ１、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｚ１、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｚ１、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｚ１、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｚ１、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｚ１、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｚ１、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｚ１、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｚ１、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｚ１、
Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｚ１−Ｚ２、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｚ１−Ｚ２、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｚ１−Ｚ２、Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｚ１−Ｚ２、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｚ１−Ｚ２、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｚ１−Ｚ２、Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｚ１−Ｚ２、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｚ１−Ｚ２、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｚ１−Ｚ２、Ｚ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｚ１−Ｚ２、Ｚ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｚ１−Ｚ２、Ｚ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｚ１−Ｚ２、Ｚ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｚ１−Ｚ２、Ｚ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｚ１−Ｚ２、Ｚ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｚ１−Ｚ２、Ｚ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｚ１−Ｚ２、Ｚ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｚ１−Ｚ２、Ｚ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｚ１−Ｚ２、Ｚ１−Ｚ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｚ１−Ｚ２、Ｚ１−Ｚ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｚ１−Ｚ２、Ｚ１−Ｚ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｚ１−Ｚ２、Ｚ１−Ｚ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｚ１−Ｚ２、Ｚ１−Ｚ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｚ１−Ｚ２、Ｚ１−Ｚ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｚ１−Ｚ２、Ｚ１−Ｚ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｚ１−Ｚ２、Ｚ１−Ｚ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｚ１−Ｚ２、Ｚ１−Ｚ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｚ１−Ｚ２、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｚ１−Ｚ２、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｚ１−Ｚ２、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｚ１−Ｚ２、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｚ１−Ｚ２、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｚ１−Ｚ２、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｚ１−Ｚ２、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｚ１−Ｚ２、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｚ１−Ｚ２、Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｙ４−Ｚ１−Ｚ２、
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