(57)【要約】  タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物は、重量百分率で８０〜８５％のルチンを含む。前記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法は、溶媒による浸出、複合物による酵素分解、マクロ孔質樹脂による単離および精製工程を含む。前記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物は、アルコール性脂肪肝に関連する薬品または健康製品の調製に用いられる。【選択図】図１
2020534357.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重量百分率で８０〜８５％のルチンを含有する、ことを特徴とするタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物。
【請求項２】
以下の工程
（１）浸出：タカサゴサンシチソウに浸出溶媒を添加して浸出させ、浸出液のｐＨ値を４〜８に調節して反応液を得る；
（２）酵素分解：その後、反応液中に複合酵素を添加して酵素分解を行い、３０〜５０℃で１〜４時間強制循環反応させ、吸引ろ過し、ろ液を収集する；
（３）抽出、濃縮：ろ液をマクロ孔質樹脂Ａで抽出し、抽出液を合わせて濃縮し、濃縮液を得る；
（４）単離、精製：濃縮液を遠心分離し、上清液をマクロ孔質樹脂Ｂで単離精製し、波長５１０ｎｍで吸光度を測定し、溶出液を収集して濃縮、乾燥させ、フラボノイド抽出物を得る；
を含むことを特徴とする、請求項１に記載のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法。
【請求項３】
前記酵素分解工程で、パパイン、セルラーゼおよびペクチナーゼからなる複合酵素を用いて酵素分解を行い；
前記複合酵素および前記タカサゴサンシチソウの重量比が１：５〜１：３である
ことを特徴とする、請求項２に記載のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法。
【請求項４】
前記複合酵素のパパイン、セルラーゼおよびペクチナーゼの３つの重量比が、（０．５〜１．５）：（２〜５）：（１〜３）であることを特徴とする、請求項２または請求項３に記載のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法。
【請求項５】
前記複合酵素のパパイン、セルラーゼおよびペクチナーゼの３つの重量比が、１：３：２であることを特徴とする、請求項４に記載のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法。
【請求項６】
前記マクロ孔質樹脂Ａが、ＡＢ−８、ＤＭ−１３０、ＨＺ８４１、ＺＨ−００、ＺＨ−０１、ＺＨ−０２、ＺＨ−０３、ＣＡＤ−４０、ＣＡＤ−４５、ＢＳ−３０から選択される少なくとも１つであり；
前記マクロ孔質樹脂Ｂが、Ｄ−１０１、Ｄ−１４０、Ｄ−１４１、ＸＡＤ−３、ＸＡＤ−４、ＨＰ−２０、ＨＰ−２１、ＬＤ−６０５、ＬＳＡ−１０から選択される少なくとも１つである
ことを特徴とする、請求項２〜５のいずれか１項に記載のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法。
【請求項７】
前記浸出工程の浸出溶媒が水であり、前記タカサゴサンシチソウおよび前記水の重量比が１：（２０〜６０）である
ことを特徴とする、請求項２〜６のいずれか１項に記載のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法。
【請求項８】
前記単離、精製工程の溶出溶媒は、体積濃度７０〜８０％のエタノール水溶液であり、溶出速度は３〜１５ｍ／ｈであり；
前記濃縮液におけるタカサゴサンシチソウのフラボノイド濃度が０．５ｍｇ／ｍＬである
ことを特徴とする、請求項２〜７のいずれか１項に記載のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法。
【請求項９】
請求項１に記載のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物、または請求項２〜８のいずれか１項に記載の調製方法で得られたタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を活性成分とし、通常の工程に基づき、通常の添加剤を添加して、臨床的に許容可能な錠剤、カプセル剤、散剤、配合剤、丸剤、顆粒剤、シロップ、貼付剤、坐剤、スプレー、軟膏または注射剤に製造されることを特徴とする、医薬品。
【請求項１０】
請求項１に記載のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物、請求項２〜８のいずれか１項に記載の調製方法で得られたタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物、またはアルコール性脂肪肝を治療する薬品または健康製品の調製における請求項９に記載の医薬品の応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は薬品または健康製品の分野に属し、具体的にタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物、ならびにその調製方法およびアルコール性脂肪肝を治療する用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルコール性脂肪肝（ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ、ＡＦＬＤ）は、長期間、大量にアルコールを摂取することにより生じる肝障害性の疾患を指し、臨床的に最も一般的なアルコール性肝疾患（ＡＬＤ）の１つである。アルコール性肝疾患の約９０％を占め、その病理的特徴は肝細胞内への脂質の蓄積が肝湿重量の５％を超えることである。中国では、アルコール性肝疾患は、肝障害を引き起こす肝疾患のうち、すでにウイルス性肝疾患に続く第２の肝疾患となっている。発症後、さらに進行して肝線維化さらには肝硬変など不可逆的な肝損傷に変化し、生命の健康を深刻に脅かす。現代医学はＡＦＬＤの病因に対して病理研究を行い、大きく進展しているが、治療においてはいまだ特効薬はなく、禁酒、限酒、対症療法および栄養サポートを主とし、効果はあまり満足のいくものではない。
【０００３】
タカサゴサンシチソウ（Ｇｙｎｕｒａ  ｆｏｒｍｏｓａｎａ  Ｋｉｔａｍ．）は、キク科サンシチソウ属の多年生草木植物で、別名は白背天葵、片仔ファン草である。豊富なビタミン、アルカロイド類およびフラボノイド物質を含有し、薬食両用の植物である。タカサゴサンシチソウは主に肺炎、肺癌、肝炎、肝硬変、高血圧などの疾病の治療に用いられ、解熱解毒の効果も有することが研究により明らかにされている。
【０００４】
ある文献は、タカサゴサンシチソウ抽出物がアルコール性肝損傷に対して効果的に保護効果を発揮することができ、肝保護作用を有することを報告している。タカサゴサンシチソウ抽出物は多種の化学成分を含有するため、具体的にどの化学成分がアルコール性肝損傷に対して保護作用を示す活性成分であるかは、現在まだ明確にはなっていない。
【０００５】
したがって、タカサゴサンシチソウ抽出物のうち、アルコール性肝損傷に対して保護作用を示す活性成分をさらに研究し、アルコール性脂肪肝を治療する新規の薬物を開発することは、重要な意義を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このため、本発明はタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を提供し、さらにその調製方法および用途を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記技術的問題を解決するため、本発明は以下の技術案を採用し、これにより実現する。
【０００８】
本発明は、重量百分率で８０〜８５％のルチンを含有する、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を提供する。
【０００９】
本発明は、さらに上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法を提供し、以下の工程を含む。
（１）浸出：タカサゴサンシチソウに浸出溶媒を添加して浸出させ、浸出液のｐＨ値を４〜８に調節して反応液を得る。
（２）酵素分解：その後、反応液中に複合酵素を添加して酵素分解を行い、３０〜５０℃で１〜４時間強制循環反応させ、吸引ろ過し、ろ液を収集する。
（３）抽出、濃縮：ろ液をマクロ孔質樹脂Ａで抽出し、抽出液を合わせて濃縮し、濃縮液を得る。
（４）単離、精製：濃縮液を遠心分離し、上清液をマクロ孔質樹脂Ｂで単離精製し、波長５１０ｎｍで吸光度を測定し、溶出液を収集して濃縮、乾燥させ、フラボノイド抽出物を得る。
【００１０】
好ましくは、上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法において、前記酵素分解工程で、パパイン、セルラーゼおよびペクチナーゼからなる複合酵素を用いて酵素分解を行う。
【００１１】
さらに好ましくは、上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法において、前記複合酵素および前記タカサゴサンシチソウの重量比は１：５〜１：３である。
【００１２】
さらに好ましくは、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法において、前記複合酵素のパパイン、セルラーゼおよびペクチナーゼの３つの重量比は、（０．５〜１．５）：（２〜５）：（１〜３）である。
【００１３】
さらに好ましくは、上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法において、前記複合酵素のパパイン、セルラーゼおよびペクチナーゼの３つの重量比は、１：３：２である。
【００１４】
さらに好ましくは、上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法において、
前記マクロ孔質樹脂Ａは、ＡＢ−８、ＤＭ−１３０、ＨＺ８４１、ＺＨ−００、ＺＨ−０１、ＺＨ−０２、ＺＨ−０３、ＣＡＤ−４０、ＣＡＤ−４５、ＢＳ−３０から選択される少なくとも１つである。
前記マクロ孔質樹脂Ｂは、Ｄ−１０１、Ｄ−１４０、Ｄ−１４１、ＸＡＤ−３、ＸＡＤ−４、ＨＰ−２０、ＨＰ−２１、ＬＤ−６０５、ＬＳＡ−１０から選択される少なくとも１つである。
【００１５】
さらに好ましくは、上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法において、前記浸出工程の浸出溶媒は水であり、前記タカサゴサンシチソウおよび前記水の重量比は１：（２０〜６０）である。
【００１６】
さらに好ましくは、上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法において、前記単離、精製工程の溶出溶媒は、体積濃度７０〜８０％のエタノール水溶液であり、溶出速度は３〜１５ｍ／ｈである。
【００１７】
さらに好ましくは、上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法において、前記単離、精製工程の溶出溶媒は、体積濃度７５％のエタノール水溶液であり、溶出速度は５ｍ／ｈである。
【００１８】
さらに好ましくは、上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法において、前記濃縮液におけるタカサゴサンシチソウのフラボノイド濃度は０．５ｍｇ／ｍＬである。
【００１９】
さらに好ましくは、上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法において、前記抽出、濃縮工程で、マクロ孔質樹脂Ａを収容した抽出槽中にろ液を添加し、３０℃、８０〜１５０ｒｐｍで６〜２４時間撹拌してろ過する。マクロ孔質樹脂Ａの重量に基づいて、吸着後のマクロ孔質樹脂Ａに重量で１０〜３０倍量の体積濃度７０〜９５％のエタノール溶液を添加する。その後３０℃、８０〜１５０ｒｐｍで６〜２４時間撹拌してろ過し、抽出液を得る。
【００２０】
さらに好ましくは、上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法において、前記浸出工程で、塩酸または水酸化ナトリウムを用いて浸出液のｐＨ値を４〜８に調節する。
【００２１】
さらに好ましくは、上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法において、前記乾燥は凍結乾燥である。
【００２２】
本発明は、さらに上記調製方法で得られたタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を提供する。
【００２３】
本発明は、さらに上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物、または上記調製方法で得られたタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を活性成分とし、通常の工程に基づき、通常の添加剤を添加して、臨床的に許容可能な錠剤、カプセル剤、散剤、配合剤、丸剤、顆粒剤、シロップ、貼付剤、坐剤、スプレー、軟膏または注射剤に製造される医薬品を提供する。
【００２４】
前記通常の添加剤は、充填剤、崩壊剤、滑沢剤、懸濁化剤、結合剤、甘味剤、矯味剤、防腐剤、基剤などである。充填剤は、デンプン、アルファ化デンプン、ラクトース、マンニトール、キトサン、微結晶セルロース、スクロースなどを含み；崩壊剤は、デンプン、アルファ化デンプン、微結晶セルロース、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、クロスカルメロースナトリウムなどを含み；滑沢剤は、ステアリン酸マグネシウム、ドデシル硫酸ナトリウム、タルク粉末、二酸化ケイ素などを含み；懸濁化剤は、ポリビニルピロリドン、微結晶セルロース、スクロース、寒天、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどを含み；結合剤は、デンプンスラリー、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどを含み；甘味剤は、サッカリンナトリウム、アスパルテーム、スクロース、チクロ、グリチルレチン酸などを含み；矯味剤は、甘味剤および各種フレーバーを含み；防腐剤は、パラベン類、安息香酸、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸およびその塩類、ベンザルコニウムブロミド、酢酸クロロヘキシジン、ユーカリ油などを含み；基剤は、ＰＥＧ６０００、ＰＥＧ４０００、白ろうなどを含む。
【００２５】
本発明は、さらに上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物、上記調製方法で得られたタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物、またはアルコール性脂肪肝を治療する薬品または健康製品の調製における上記医薬品の応用を提供する。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の技術案は以下の利点を有する。
（１）本発明は、タカサゴサンシチソウ抽出物についてさらに掘り下げて研究する。これにより８０〜８５％のルチンを含有するタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を浸出、単離し；さらにゼブラフィッシュのアルコール性脂肪肝モデルを実験モデルとして有効性試験の研究を行う。実験結果は、本発明のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物が、アルコール性肝損傷に対して効果的に保護効果を発揮することができ、肝保護の薬効作用を有し、アルコール性肝損傷を潜在的に治療する薬物とすることができることを明らかにしている。
（２）本発明のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法は、浸出工程の後、特定の組成、特定の混合比の酵素組成である複合酵素を選択することにより、３０〜５０℃で酵素分解を行う。タカサゴサンシチソウのフラボノイド化合物の構造が高温下で破壊されるのを防止するだけでなく、タカサゴサンシチソウのフラボノイド化合物を最大限に浸出させることができる。さらにマクロ孔質樹脂を用いた抽出、濃縮およびマクロ孔質樹脂を用いた単離、精製工程により、タカサゴサンシチソウのフラボノイド化合物の抽出率は１．８％〜２．０％に達することができる。既存方法におけるタカサゴサンシチソウのフラボノイド化合物の抽出率より３０％以上高くなり、得られたタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物におけるルチンのＨＰＬＣ純度は８０〜８５％に達することができる。
【００２７】
本発明の内容をより容易に明確に理解できるようにするため、以下、本発明を実施するための形態に基づき、図を組み合わせて、本発明についてさらに詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の実験例１における溶出液のクロマトグラムである。
【図２】本発明の実施例１で調製したタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の赤外吸収スペクトルである。
【図３】本発明の実施例１におけるルチン標準物質溶液のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４】本発明の実施例１で調製したタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図５】本発明の実験例１において、ゼブラフィッシュを屠殺してサンプリングする順序である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は以下の実施例および実験例において、タカサゴサンシチソウを福建省ザン州市竜文区登科村から入手し、タカサゴサンシチソウと同定している。
【実施例１】
【００３０】
本実施例のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物は、以下の方法で調製する。
（１）浸出：タカサゴサンシチソウ１００ｇに重量で３０倍量の水を添加して浸出させ、希塩酸で浸出液のｐＨ値を５に調節して反応液を得る。
（２）酵素分解：その後、反応液中に２５ｇの複合酵素（該複合酵素は重量比で１：３：２のパパイン、セルラーゼおよびペクチナーゼからなる）を添加して酵素分解を行い、４０℃で３時間強制循環反応させ、吸引ろ過し、ろ液を収集する。
（３）抽出、濃縮：ＡＢ−８マクロ孔質樹脂を収容した抽出槽中にろ液を添加し、３０℃、１００ｒｐｍで１２時間撹拌して、ろ過する。ＡＢ−８マクロ孔質樹脂の重量に基づき、吸着後のＡＢ−８マクロ孔質樹脂に重量で２０倍量の体積濃度７５％のエタノール溶液を添加する。その後３０℃、１２０ｒｐｍで１２時間撹拌し、ろ過して抽出液を得る。抽出液を合わせて、タカサゴサンシチソウのフラボノイド濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるまで抽出液を減圧濃縮し、濃縮液を得る。
（４）単離、精製：濃縮液を１００００ｒｐｍで１０分間高速遠心分離し、マクロ孔質樹脂Ｄ−１０１を収容したクロマトグラフィカラム内に上清液を添加し、６０ｍｉｎ静止吸着させる。体積濃度７５％のエタノール水溶液を用いて、５ｍ／ｈの速度で溶出し、波長５１０ｎｍで吸光度を測定する。吸光度値を縦座標、溶出時間を横座標として、溶出曲線図（クロマトグラムは図１に示す）を作成し、溶出曲線中の吸収ピーク範囲内の溶出液を収集し、濃縮、凍結乾燥して、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を得る。
【００３１】
計算の結果、本実施例のタカサゴサンシチソウのフラボノイド化合物における抽出率は２．０％である。
【００３２】
図１から、溶出液は３４０ｍｉｎ部分に１つの明らかな吸収ピークを有し、ピーク形状は比較的単一であることがわかり、溶出液中のフラボノイドが相対して比較的純粋であることを説明している。
【００３３】
Ａ、本実施例のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物は、以下の方法で赤外吸収スペクトルによる同定を行う。
一定質量の乾燥させたルチン標準物質に１：１００で乾燥させた臭化カリウムを添加し、すり混ぜた後、固体の錠剤を作製する。フーリエ赤外線分光光度計を用いて、スキャン範囲４０００〜４００ｃｍ−１、分解能４、スキャン回数４の条件で赤外吸収スペクトルを作成する。同じ方法で精製後のタカサゴサンシチソウ抽出物の赤外吸収スペクトルを作成し、比較同定する。結果は図２に示す通りである。
【００３４】
図２から以下のことがわかる。ルチン標準物質およびタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の赤外吸収スペクトルは、それぞれ３６８５．４５５〜３０１８．１７７ｃｍ−１前後に、広く強い吸収ピークが出現する。これは−ＯＨの伸縮振動ピークであり、フェノール性ヒドロキシ基または糖のヒドロキシ基が存在し、数が比較的多いことを表す。２９１４．０３６ｃｍ−１部分に弱い吸収ピークが出現し、これは炭素水素結合の伸縮振動ピークであり、飽和炭素の水素が比較的少ないことを説明している。１６５４．６９４ｃｍ−１部分にＣ＝Ｏの中強度の伸縮振動ピークが出現し、両者の位置およびピーク形状は基本的に一致し、抽出物がフラボノイド物質であることを説明している。１３７１．８８、１３６２．８９ｃｍ−１部分にヒドロキシ基の変角振動ピークが出現する。８０４．８０、８１０．５６ｃｍ−１部分にベンゼン環のオルト位の水素による吸収ピークが出現する。１０１０．０７〜６９６．６２ｃｍ−１部分にベンゼン環の置換基の位置による吸収ピークが出現するが、ピーク位置は異なり、抽出物およびルチンのヒドロキシ基の置換位置が異なることを説明している。これらは抽出物中にヒドロキシ基、カルボニル基および異なる位置が置換されたベンゼン環などの官能基を含有し、特徴的な吸収ピークは基本的に一致することを表している。したがって、抽出物がフラボノイド化合物であると確定することができる。
【００３５】
Ｂ、以下の方法に基づいて、液体クロマトグラフィにより、本実施例のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物におけるルチン含量を分析する。
【００３６】
Ｂ１、液体クロマトグラフ条件の確定
液体クロマトグラフ条件：ガードカラムＥｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１８  ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＧｕａｒｄ  Ｃｏｌｕｍｎ（４．６×１２．５ｍｍ、５μｍ）：ＺＯＲ  ＢＺＸ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１８（４．６×１５０ｍｍ、５μｍ）、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度３５℃、検出波長３６８ｎｍ、２５４ｎｍ、２１０ｎｍ、サンプル体積１０μＬ、移動相０．０３％ギ酸水溶液（Ａ）、アセトニトリル（Ｂ）、グラジエント溶離プログラム：０〜１０ｍｉｎ、２０％Ｂ；１０〜１２ｍｉｎ、２０％〜２４％Ｂ；１２〜２０ｍｉｎ、２４％Ｂ；２０〜２５ｍｉｎ、２４％〜３０％Ｂ；２５〜４８ｍｉｎ、３０％Ｂ。
【００３７】
Ｂ２、標準物質溶液の調製
ルチン０．００１ｇを正確に秤取し、１ｍＬメタノール中に溶解し、１ｍｇ／ｍＬの単一の標準物質溶液を調製する。使い捨てフィルタでろ過し、小さな試験管に入れて使用に備える。
【００３８】
Ｂ３、測定
標準物質溶液、被験物質溶液（実施例１で調製したタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物であり、濃度１μｇ／μＬのメタノール溶液に調製した）を精密に量り、液体クロマトグラフの検出条件に基づいて、それぞれ検出分析する。
【００３９】
標準物質溶液のＨＰＬＣクロマトグラムは図３に示す通りであり、被験物質溶液のＨＰＬＣクロマトグラムは図４に示す通りである。
【００４０】
図３から、ルチン標準物質溶液は、１０分間で完全に分離することができることがわかる。ルチンは本実験のクロマトグラフ条件で、クロマトグラムのベースラインが基本的に平らでまっすぐである。クロマトグラフピークにテーリング現象がなく、不純物の干渉もなく、ピークの出現は比較的速く、その保持時間は２．７４５ｍｉｎであることを示している。
【００４１】
図４から、面積百分率法で計算し、タカサゴサンシチソウ抽出物中のルチン含量が８１．２９％であることがわかる。
【実施例２】
【００４２】
本実施例のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物は、以下の方法で調製する。
（１）浸出：タカサゴサンシチソウ１００ｇに重量で２０倍量の水を添加して浸出させ、希水酸化ナトリウム溶液で浸出液のｐＨ値を８に調節して反応液を得る。
（２）酵素分解：その後、反応液中に２０ｇの複合酵素（該複合酵素は重量比で０．５：５：１のパパイン、セルラーゼおよびペクチナーゼからなる）を添加して酵素分解を行い、３０℃で４時間強制循環反応させ、吸引ろ過し、ろ液を収集する。
（３）抽出、濃縮：ＤＭ−１３０マクロ孔質樹脂を収容した抽出槽中にろ液を添加し、３０℃、８０ｒｐｍで２４時間撹拌して、ろ過する。ＤＭ−１３０マクロ孔質樹脂の重量に基づいて、吸着後のＤＭ−１３０マクロ孔質樹脂に重量で１０倍量の体積濃度９５％のエタノール溶液を添加する。その後３０℃、８０ｒｐｍで２４時間撹拌し、ろ過して抽出液を得る。抽出液を合わせて、タカサゴサンシチソウのフラボノイド濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるまで抽出液を減圧濃縮し、濃縮液を得る。
（４）単離、精製：濃縮液を６０００ｒｐｍで８分間高速遠心分離し、マクロ孔質樹脂ＨＰ−２１を収容したクロマトグラフィカラム内に上清液を添加し、６０ｍｉｎ静止吸着させる。体積濃度８０％のエタノール水溶液を用いて、３ｍ／ｈの速度で溶出し、波長５１０ｎｍで吸光度を測定する。吸光度値を縦座標、溶出時間を横座標として、溶出曲線図を作成し、溶出曲線中の吸収ピーク範囲内の溶出液を収集し、濃縮、凍結乾燥して、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を得る。
【００４３】
計算の結果、本実施例のタカサゴサンシチソウのフラボノイド化合物における抽出率は１．８２％である。
【００４４】
実施例１における「項目Ｂ」に基づいて、本実施例のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物におけるルチンを測定する。測定分析により、ＨＰＬＣクロマトグラムで、本実施例のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物におけるルチン含量が８０％であることがわかる。
【実施例３】
【００４５】
本実施例のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物は、以下の方法で調製する。
（１）浸出：タカサゴサンシチソウ１００ｇに重量で６０倍量の水を添加して浸出させ、希塩酸で浸出液のｐＨ値を４に調節して反応液を得る。
（２）酵素分解：その後、反応液中に３２ｇの複合酵素（該複合酵素は重量比で１．５：２：３のパパイン、セルラーゼおよびペクチナーゼからなる）を添加して酵素分解を行い、５０℃で１時間強制循環反応させ、吸引ろ過し、ろ液を収集する。
（３）抽出、濃縮：ＺＨ−０１マクロ孔質樹脂を収容した抽出槽中にろ液を添加し、３０℃、１５０ｒｐｍで６時間撹拌して、ろ過する。ＺＨ−０１マクロ孔質樹脂の重量に基づいて、吸着後のＺＨ−０１マクロ孔質樹脂に重量で３０倍量の体積濃度７０％のエタノール溶液を添加する。その後３０℃、１５０ｒｐｍで６時間撹拌し、ろ過して抽出液を得る。抽出液を合わせて、タカサゴサンシチソウのフラボノイド濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるまで抽出液を減圧濃縮し、濃縮液を得る。
（４）単離、精製：濃縮液を８０００ｒｐｍで５分間高速遠心分離し、マクロ孔質樹脂ＸＡＤ−３を収容したクロマトグラフィカラム内に上清液を添加し、６０ｍｉｎ静止吸着させる。体積濃度７０％のエタノール水溶液を用いて、１５ｍ／ｈの速度で溶出し、波長５１０ｎｍで吸光度を測定する。吸光度値を縦座標、溶出時間を横座標として、溶出曲線図を作成し、溶出曲線中の吸収ピーク範囲内の溶出液を収集し、濃縮、凍結乾燥して、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を得る。
【００４６】
計算の結果、本実施例のタカサゴサンシチソウのフラボノイド化合物における抽出率は１．９１％である。
【００４７】
実施例１における「項目Ｂ」に基づいて、本実施例のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物におけるルチンを測定する。測定分析により、ＨＰＬＣクロマトグラムで、本実施例のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物におけるルチン含量が８５％であることがわかる。
【００４８】
実験例１  ゼブラフィッシュのアルコール性脂肪肝損傷に対するタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の実験研究
一、実験材料
デジタル位相差倒立顕微鏡（ＩＸ５１  日本Ｏｌｙｍｐｕｓ）；Ｎｉｋｏｎ  ＳＭＺ１８デジタル顕微鏡；全自動生化学分析装置（ＢＳ−２２０深ゼン邁端生物医療電子股フン有限公司）；組織包埋装置（ＢＭＪ−ＩＩＩ常州中威電子儀器廠）；ミクロトーム（ＲＭ２２３５  ドイツＬｅｉｃａ）；スライドウォーマー（ＰＨＹ−ＩＩＩ常州事郊区中威電子機器廠）；マイクロプレートリーダ（ＳＵＮＲＩＳＥ  スイスＴｅｃａｎ）；組織ホモジナイザー（ＰＲＯ２００  米国ＰＲＯ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；高速冷却遠心分離機（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５８１０Ｒ  ドイツＥｐｐｅｎｄｏｒｆ）；逆浸透純水システム（ＲＯ−２００上海和泰儀器有限公司）；ＭＤＡアッセイキット（碧雲天生物技術研究所）；ＳＯＤアッセイキット（碧雲天生物技術研究所）；無水エタノール（西隴化工股フン有限公司）；Ｏｉｌ  ｒｅｄ  Ｏ  オイルレッド染色液（阿拉丁）；ＰＢＳ緩衝溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；プロピレングリコール（西隴化工股フン有限公司）；グリセリン（西隴化工股フン有限公司）；Ｎ−ベンジルチオ尿素（Ｓｉｇｍａ）；トリカインメタンスルホフォナート（Ｓｉｇｍａ）；ポリオキシメチレン（北京拓英坊科技有限公司）；キシレン（西隴化工股フン有限公司）；ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）。以上の試薬はいずれも分析用試薬である。実験試薬キットは碧雲天生物技術研究所から提供された。
【００４９】
二、実験方法
１、試験薬物の調製
実施１の方法に基づいて、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を調製し、被験薬物とする。
【００５０】
２、実験動物の飼育および群分け
野生型のゼブラフィッシュ成魚はザン州市花鳥市場から購入した。２８℃の恒温環境において、自動タイマーで実験室を明期１４ｈ、暗期１０ｈに制御し、１週間連続して毎日定時に一定量で給餌し、実験に備えた。実験で用いるゼブラフィッシュ稚魚は、すべて実験室で飼育した野生型のＴＵゼブラフィッシュである。ゼブラフィッシュはＷｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ方法に基づき、養殖する。つまり明期１４ｈ、暗期１０ｈを交互に行い、雌雄は別々に飼育し、毎日定時に新鮮なブラインシュリンプを与える。実験前日の晩に、ＴＵゼブラフィッシュを雌雄１：１で別々に交配タンク中に入れ、仕切り板を挿入する。次の日の朝、仕切り板を抜くと、ゼブラフィッシュは交配、産卵する。卵を２８℃の恒温培養器中に集めて９６ｈｐｆ培養し、期間中は定時に水を換え、死卵を除去し、実験に備える。
【００５１】
実験の群分けを行うため、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物がゼブラフィッシュのアルコール性脂肪肝損傷を修復する際の最大非致死濃度を選択する。そのため、ゼブラフィッシュの慢性毒性実験における通常の方法に基づいて、ゼブラフィッシュ成魚６０匹を無作為に各群１０匹で５群に分け、別々に飼育する。タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物は１．０％アルコールに溶解し、毎日１回液を交換し、１週間飼育を続ける。通常水で飼育したゼブラフィッシュを対照とする。実験開始後、毎日、実験魚の中毒症状および死亡匹数を記録し、死んだ魚を速やかに除去する。各群の用量は表１に示す通りである。
【００５２】
【表１】
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【００５３】
ゼブラフィッシュ稚魚の急性毒性実験における通常の方法に基づいて、ゼブラフィッシュ稚魚を無作為に各群１８０匹で７群に分け、別々に飼育する。タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を２．０％アルコールに溶解し、３２ｈ飼育を続け、通常水で飼育したゼブラフィッシュを対照とする。実験開始後は、毎日、実験魚の中毒症状および死亡匹数を記録し、死んだ魚を速やかに除去する。各群の用量は表２に示す通りである。
【００５４】
ゼブラフィッシュ成魚、稚魚をいずれも対照群、モデル群、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の高、中、低用量群である計５群に分ける。ゼブラフィッシュ成魚の高、中、低用量群は、実験開始からそれぞれ相応する薬物濃度で、１．０％アルコール水中に投入して飼育する。期間中は定時に液を交換し、２８ｄ飼育を続け、対照群は通常水で飼育する。ゼブラフィッシュ稚魚の高、中、低用量群は、実験開始からそれぞれ相応する薬物濃度で、２．０％アルコール水中に投入して３２ｈ飼育し、対照群は通常水で飼育する。
【００５５】
【表２】
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【００５６】
３、ゼブラフィッシュ成魚の肝臓指数の測定
各実験群のゼブラフィッシュについて、最後の水交換の後、実験動物を１２ｈ絶食させる。ゼブラフィッシュを屠殺する前に体重を量り、眼球から採血する。各５０匹を１群とし、ブランク対照群、モデル群および実験群の各３つである。採血後すぐに屠殺し、重さを量り、実験に必要な肝臓組織をただちに分離し、肝臓組織の重さを量る。その後ホルマリン固定するか、または液体窒素で保存する。ゼブラフィッシュを屠殺し、サンプリングする順序は図５に示す通りである。
【００５７】
肝臓指数＝肝湿重量（ｇ）／体重（ｇ）×１００％を用いて、肝臓指数の計算を行う。
【００５８】
４、ゼブラフィッシュにおける血清肝機能の生化学指標の測定
血液を４０００ｒ／ｍｉｎ、４℃で１０ｍｉｎ遠心分離して上清を採取し、全自動生化学分析装置を用いて血清のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、総コレステロール（ＴＣ）、トリグリセリド（ＴＧ）を測定する。上記指標はキットの指示に基づいて全自動生化学分析装置で測定し、さらにキットの使用説明に基づいて肝臓中の抗酸化レベルＳＯＤ、抗ストレスレベルＭＤＡを測定する。
【００５９】
５、ゼブラフィッシュ成魚の肝臓のＨＥ染色
固定した組織サンプルを脱水（脱水順序：７５％エタノール３０ｍｉｎ→９０％エタノール１０ｍｉｎ→９５％エタノール１０ｍｉｎ→９５％エタノール１０ｍｉｎ→１００％エタノール１０ｍｉｎ→１００％エタノール１０ｍｉｎ→１００％エタノール１０ｍｉｎ→キシレンＩ５ｍｉｎ→キシレンＩＩ５ｍｉｎ→キシレンＩＩＩ５ｍｉｎ）後、パラフィン包埋し、４μｍで薄切し、７０℃で３０ｍｉｎスライドを加温する。通常の染色液ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）で染色し、中性樹脂で封入し、顕微鏡で観察する。
【００６０】
６、ゼブラフィッシュ稚魚の肝臓生化学指標に対してタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物が及ぼす影響の測定
必要とする実験を３２ｈ行った後、対照群、モデル群、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の高、中、低濃度群である計５群に、ゼブラフィッシュ稚魚を各５０匹で無作為に選び、全自動生化学分析装置でゼブラフィッシュ稚魚全体のホモジネートのＡＳＴ、ＡＬＴ含量を測定する。キットの説明に基づいて、ゼブラフィッシュ稚魚全体のホモジネートのＳＯＤ活性およびＭＤＡ含量を測定し、各群で３回繰り返す。データを記録して分析する。
【００６１】
７、データの統計学処理
実験データは平均±標準偏差（ｘ±ｓ）の形式で表し、統計学ソフトＳＰＳＳ１０．０および一元配置分散分析法を採用してデータを分析処理する。Ｐ＜０．０５は有意水準の差を表し、Ｐ＜０．０１は高有意水準の差を表す。
【００６２】
三、実験結果
１、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物がゼブラフィッシュのアルコール性脂肪肝損傷を修復する際の最大の非致死濃度の確定
タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物のゼブラフィッシュ成魚に対する慢性毒性実験の結果および急性毒性実験の結果は、表３および表４に示す通りである。表３および表４から、ゼブラフィッシュ成魚に対する１週間の投与期間内に、各群の外観の形態、遊動能力、精神状態を観察すると、いずれも正常で、死亡の記録はないことがわかる。ゼブラフィッシュ稚魚は３２ｈの投与時間内に、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の濃度が０．０８ｍｇ／ｍＬに達する実験群で死亡が起こり、０．１２ｍｇ／ｍＬ群は４ｈで死亡し始め、３２ｈの死亡率は７％で、大規模な死亡は起こらなかった。タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の濃度０．０８ｍｇ／ｍＬ、０．０４ｍｇ／ｍＬ、０．０２ｍｇ／ｍＬを、ゼブラフィッシュ稚魚の実験群における高、中、低用量群の濃度とする。
【００６３】
【表３】
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【００６４】
【表４】
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【００６５】
２、ゼブラフィッシュ成魚の体重、肝臓重量および肝臓指数に対してタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物が及ぼす影響
ゼブラフィッシュ成魚の体重、肝臓重量および肝臓指数に対してタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物が及ぼす影響は、表５に示す通りである。表５から、正常対照群と比較して、モデル群のゼブラフィッシュ成魚はアルコール処理後に体重が低下し、肝臓重量は上昇し、肝臓指数は顕著に上昇し、有意差を有する（Ｐ＜０．０５）ことがわかり、アルコールが一定程度でゼブラフィッシュに毒性作用を有し、ゼブラフィッシュの肝臓を損傷させることを立証している。モデル群と比較して、様々な濃度のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物群は、処理後、ゼブラフィッシュの肝臓重量が低下し、体重および肝臓指数はいずれも上昇し、中、高用量群の肝臓指数はモデル群と比較して有意差を有する（Ｐ＜０．０５）。これは、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物がゼブラフィッシュの肝臓指数を改善させる効果が比較的良好であることを表している。
【００６６】
【表５】
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【００６７】
３、アルコール性脂肪肝のゼブラフィッシュ成魚の血清指標に対してタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物が及ぼす影響
ゼブラフィッシュ血清のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、総コレステロール（ＴＣ）、トリグリセリド（ＴＧ）含量は、表６に示す通りである。
【００６８】
表６から、正常対照群と比較して、モデル群ゼブラフィッシュの血清ＡＳＴ、ＡＬＴ活性は有意に上昇し（Ｐ＜０．０５）、ＴＧ指標も明らかに増加し、高有意差に達した（Ｐ＜０．０１）ことがわかり、アルコール飼育はゼブラフィッシュのアルコール性脂肪肝の発症を明らかに促進することを立証している。様々な用量のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物が添加されたゼブラフィッシュの血清ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＴＣ、ＴＧレベルはいずれも低下する傾向を有し、このうちＡＬＴ、ＡＳＴ、ＴＧはモデル群と比較して有意差を有する（Ｐ＜０．０５）。これは、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物がゼブラフィッシュ体内の血清ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＴＧの増加を抑制する効果が比較的良好であることを表している。
【００６９】
ゼブラフィッシュ血清および肝臓のＳＯＤ活性およびＭＤＡレベルは、表７に示す通りである。表７から、モデル群ゼブラフィッシュのＳＯＤ活性は対照群より顕著に低下し（Ｐ＜０．０５）、ＭＤＡ含量は顕著に上昇する（Ｐ＜０．０５）ことがわかり、アルコールがゼブラフィッシュの肝臓に対して毒性作用を有し、ゼブラフィッシュの抗酸化能力を低下させ、ゼブラフィッシュ体内の酸化ストレスレベルを低下させることを立証している。モデル群と比較して、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の各用量群は、ＳＯＤ活性がいずれもやや上昇し、このうち中、高用量群のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の差は有意水準（Ｐ＜０．０５）に達し；タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の各用量群は、いずれもゼブラフィッシュの肝臓ＭＤＡ含量が低下した。これは、アルコールによるゼブラフィッシュのアルコール性脂肪肝に対してタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物が一定の予防治療作用を有することを表している。
【００７０】
【表６】
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【００７１】
【表７】
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【００７２】
４、ゼブラフィッシュ稚魚の肝臓関連の生化学指標に対してタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物が及ぼす影響の測定結果
アルコール性脂肪肝を有するゼブラフィッシュ稚魚のホモジネートのＡＬＴ、ＡＳＴ、ＳＯＤ、ＭＤＡに対してタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物が及ぼす影響は、表８に示す通りである。表８から、対照群と比較して、モデル群はゼブラフィッシュ稚魚のＡＬＴ、ＡＳＴ、ＳＯＤ活性がいずれも明らかに低下し、高有意差に達し（Ｐ＜０．０１）、ＭＤＡは明らかに上昇し、高有意差に達した（Ｐ＜０．０１）ことがわかる。ＡＬＴおよびＡＳＴの変化傾向に関する様々な原因は以下の通りである。前の研究で測定したのは血清中のＡＬＴおよびＡＳＴ活性であり、本実験で測定したのは組織ホモジネート液中のＡＬＴおよびＡＳＴ活性である。モデル群は肝臓を損傷すると、細胞透過性が高くなり、血清中のＡＬＴおよびＡＳＴ活性は高くなる。しかし、動物全体について述べると、肝臓を損傷すると、肝細胞のＡＬＴおよびＡＳＴ合成能力は低下するため、ＡＬＴおよびＡＳＴの総活性は低下する。異なる視点から、アルコールがＡＬＴおよびＡＳＴに対して影響を及ぼすことを説明している。
【００７３】
タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の各用量群は、いずれもアルコール性脂肪肝のゼブラフィッシュのＡＬＴ、ＡＳＴ、ＳＯＤ活性をやや上昇させることができる。タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物が、効果的にゼブラフィッシュ稚魚の肝臓の正常な成長発育を保護するか、または肝損傷を修復することができ、稚魚の肝臓肥大、脂肪滴の蓄積症状を軽減し、肝細胞のＡＳＴおよびＡＬＴ合成能力を高めるため、ＡＳＴおよびＡＬＴの総活性がやや上昇することを立証している。このうち高用量群のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物は、ＡＬＴ活性が上昇して高有意水準に達し（Ｐ＜０．０１）、中用量群のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物は、ＡＬＴ活性が上昇して有意水準に達した（Ｐ＜０．０５）。高用量群、中用量群のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物は、ＡＳＴ活性が上昇して有意水準に達し（Ｐ＜０．０５）；各用量群のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物は、ＳＯＤレベルが一定程度に上昇し、ＭＤＡレベルは一定程度に低下する。以上の結果は、アルコールによるゼブラフィッシュ稚魚のアルコール性脂肪肝に対してタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物が一定の予防治療作用を有し、ゼブラフィッシュ体内の自己ストレスの程度を軽減させることを表している。
【００７４】
【表８】
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【００７５】
四、実験の結論
タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物が肝保護効果を有しているかどうかをより深いレベルで探求するため、本実験は新規のゼブラフィッシュのアルコール性脂肪肝モデルを採用する。該モデルはサンプル量が多く、実験技術の操作は簡単で、実験周期が短く、浪費が少ないなどの利点を有する。
【００７６】
実験結果は以下を表している。ゼブラフィッシュ成魚の実験において、モデル群と比較して、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の各用量群は、肝臓重量および肝臓指数がいずれも一定程度に低下し、モデル群のゼブラフィッシュ血清中のＡＳＴ、ＡＬＴ、ＴＣ、ＴＧ含量を低下させることができ、ゼブラフィッシュ体内の細胞損傷の状況を軽減させる。ＳＯＤ活性レベルを上昇させ、ゼブラフィッシュの抗酸化能力を高め、ＭＤＡレベルを引き下げることにより、ゼブラフィッシュ体内の酸化ストレスレベルを低下させる。ゼブラフィッシュ稚魚の生化学指標は、タカサゴサンシチソウの各抽出物群がゼブラフィッシュ稚魚全体のホモジネートにおけるＡＬＴ、ＡＳＴ、ＳＯＤ活性を高めることができ、肝細胞のＡＳＴおよびＡＬＴ合成能力を高め、ＭＤＡレベルを低下させることを示している。各投与群のうちタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物における高用量群（０．０８ｍｇ／ｍＬ）の効果が最も良好であり、本実験において、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物は、アルコール性肝損傷に対して効果的に保護効果を発揮することができ、肝保護の薬効作用を有することがわかる。タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物は、アルコール性肝損傷を治療する薬物の調製に、薬力学研究の基礎を提供する。
【００７７】
上記実施例は実施した例を明確に説明したに過ぎず、実施方式を限定するものでないことは明らかである。当業者は、上記説明を基に、その他の様々な形式の変更または修正を行うこともできる。ここでは、すべての実施方式を網羅する必要はなく、することもできない。これから派生した明らかな変更または修正は、依然として本発明の保護の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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