(57)【要約】  本発明は、ウイルス性およびがん疾患の処置のための化学療法剤に関する。本発明の化合物は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のＤＮＡポリメラーゼの阻害剤のプロドラッグであり、ヒト免疫不全ウイルス、Ｂ型肝炎、ならびにＨＩＶ／ＨＣＶ、ＨＩＶ／ＨＢＶ、ＨＩＶ／ＨＣＶ／ＨＢＶおよびＨＣＶ／ＨＢＶの重感染の処置を目的とするものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式１のシクロブチル（Ｓ）−２−［［［（Ｒ）−２−（６−アミノプリン−９−イル）−１−メチル−エトキシ］メチル−フェノキシ−ホスホリル］アミノ］プロパノエート、式１．１のシクロブチル（Ｓ）−２−［（Ｓ）−［［（Ｒ）−２−（６−アミノプリン−９−イル）−１−メチル−エトキシ］メチル−フェノキシ−ホスホリル］アミノ］プロパノエート、および式１．２のシクロブチル（Ｓ）−２−［（Ｒ）−［［（Ｒ）−２−（６−アミノプリン−９−イル）−１−メチル−エトキシ］メチル−フェノキシ−ホスホリル］アミノ］プロパノエート、ならびにその同位体で濃縮された類似体、医薬的に許容される塩、水和物、溶媒和物、結晶形態または多結晶形態。
【化１】
2020509046.tif 000012
【請求項２】
式１．１のフマル酸塩、ヘミフマル酸塩、ジクロロ酢酸塩、または塩酸塩として表される、請求項１に記載の化合物。
【化２】
2020509046.tif 000013
【請求項３】
医薬的に許容されるパッケージ中に入れられた、錠剤、カプセル、または注射の形態のウイルス感染の併用療法および予防のための医薬組成物であって、一般式１の化合物もしくはその立体異性体、またはそれらの同位体で濃縮された類似体、医薬的に許容される塩、水和物、溶媒和物、または結晶形態もしくは多結晶形態を治療有効量で含む、上記医薬組成物。
【請求項４】
式１．１の化合物のフマル酸塩、もしくはヘミフマル酸塩、もしくはジクロロ酢酸塩、もしくは塩酸塩、またはそれらの同位体で濃縮された類似体、水和物、溶媒和物、もしくは結晶形態もしくは多結晶形態を含有する、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
１種またはそれより多くの医薬的に許容される増量剤をさらに含む、請求項３または４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロテアーゼ阻害剤、非ヌクレオシド系ＨＩＶ逆転写酵素阻害剤、ヌクレオシド系ＨＩＶ逆転写酵素阻害剤、ヌクレオチド系ＨＩＶ逆転写酵素阻害剤、ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤、およびＣＣＲ５阻害剤からなる群から選択される１種またはそれより多くの治療剤をさらに含む、請求項３、４、または５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
治療有効量の一般式１の化合物もしくはその立体異性体、またはそれらの同位体で濃縮された類似体、医薬的に許容される塩、水和物、溶媒和物、または結晶形態もしくは多結晶形態を、それを必要とする対象に投与することを含む、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の併用療法のための方法。
【請求項８】
前記立体異性体が、式１．１の化合物、もしくはその立体異性体、またはそれらの同位体で濃縮された類似体、医薬的に許容される塩、水和物、溶媒和物、もしくは結晶形態もしくは多結晶形態である、請求項７に記載の併用療法のための方法。
【請求項９】
前記塩が、式１．１の化合物のフマル酸塩、もしくはヘミフマル酸塩、もしくはジクロロ酢酸塩、もしくは塩酸塩、またはそれらの同位体で濃縮された類似体、水和物、溶媒和物、もしくは結晶形態もしくは多結晶形態である、請求項７または８に記載の併用療法のための方法。
【請求項１０】
治療有効量の請求項３〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の併用療法のための方法。
【請求項１１】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロテアーゼ阻害剤である阻害化合物、非ヌクレオシド系ＨＩＶ逆転写酵素阻害剤、ヌクレオシド系ＨＩＶ逆転写酵素阻害剤、ヌクレオチド系逆転写酵素阻害剤、ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤、およびＣＣＲ５阻害剤からなる群から選択される１種またはそれより多くの追加の治療剤を対象に投与することを含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載の併用療法のための方法。
【請求項１２】
治療有効量の一般式１の化合物もしくはその立体異性体、またはそれらの同位体で濃縮された類似体、医薬的に許容される塩、水和物、溶媒和物、または結晶形態もしくは多結晶形態を、それを必要とする対象に投与することを含む、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の併用療法のための方法。
【請求項１３】
前記立体異性体が、式１．１の化合物、またはその同位体で濃縮された類似体、医薬的に許容される塩、水和物、溶媒和物、もしくは結晶形態もしくは多結晶形態である、請求項１２に記載の併用療法のための方法。
【請求項１４】
前記塩が、式１．１の化合物のフマル酸塩、もしくはヘミフマル酸塩、もしくはジクロロ酢酸塩、もしくは塩酸塩、またはそれらの同位体で濃縮された類似体、水和物、溶媒和物、もしくは結晶形態もしくは多結晶形態である、請求項１２または１３に記載の併用療法のための方法。
【請求項１５】
治療有効量の請求項３〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の併用療法のための方法。
【請求項１６】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロテアーゼ阻害剤である阻害化合物、非ヌクレオシド系ＨＩＶ逆転写酵素阻害剤、ヌクレオシド系ＨＩＶ逆転写酵素阻害剤、ヌクレオチド系逆転写酵素阻害剤、ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤およびＣＣＲ５阻害剤からなる群から選択される１種またはそれより多くの追加の治療剤を、それを必要とする対象に投与することを含む、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の併用療法のための方法。
【請求項１７】
請求項１および２に記載の化合物または請求項３〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物の１つまたはそれより多くの用量を、それを必要とする対象に投与することを含む、請求項７〜１１のいずれか一項に記載のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の併用療法のための方法。
【請求項１８】
請求項１および２に記載の化合物または請求項３〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物の１つまたはそれより多くの用量を、それを必要とする対象に投与することを含む、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の併用療法のための方法。
【請求項１９】
一般式１のシクロブチル（Ｓ）−２−［［［（Ｒ）−２−（６−アミノプリン−９−イル）−１−メチル−エトキシ］メチル−フェノキシ−ホスホリル］アミノ］プロパノエート、式１．１のシクロブチル（Ｓ）−２−［（Ｓ）−［［（Ｒ）−２−（６−アミノプリン−９−イル）−１−メチル−エトキシ］メチル−フェノキシ−ホスホリル］アミノ］プロパノエート、式１．２のシクロブチル（Ｓ）−２−［（Ｒ）−［［（Ｒ）−２−（６−アミノプリン−９−イル）−１−メチル−エトキシ］メチル−フェノキシ−ホスホリル］アミノ］−プロパノエート、ならびにその同位体で濃縮された類似体、医薬的に許容される塩、水和物、溶媒和物、または結晶形態もしくは多結晶形態を調製するための、式２のＬ−アラニンシクロブチルエステルおよび一般式３の化合物：
【化３】
2020509046.tif 000014
の使用を含む、製法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス性およびがん疾患の処置のための化学療法剤に関する。これらの化合物は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のＤＮＡポリメラーゼ、およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＤＮＡポリメラーゼの阻害剤のプロドラッグであり、ヒト免疫不全ウイルス、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、およびＨＩＶ／ＨＣＶ、ＨＩＶ／ＨＢＶ、ＨＩＶ／ＨＣＶ／ＨＢＶ、およびＨＣＶ／ＨＢＶの重感染の処置を目的とするものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病原体である霊長類レンチウイルス属の一種である。この疾患は、１９８１年に初めて記載され、ＨＩＶ−１は、１９８３年末に単離された。それ以来、ＡＩＤＳは、ＨＩＶ感染は様々な人口集団および地域に影響を及ぼすことから、範囲および規模ともに拡大し続ける世界的な流行疾患になっている。現在、世界中で数百万の人がＨＩＶに感染しており、一度感染したら、個体は生涯にわたり感染したままである。１０年以内に、未処置のままのＨＩＶ感染個体の圧倒的多数は、ＨＩＶによって誘発される免疫不全の結果として致死的感染に進行する。ＡＩＤＳは、２１世紀初頭における世界的に最も重要な公衆衛生問題の１つである。ＨＩＶ薬における大きな成果は、ＨＩＶ複製の長期抑制とＡＩＤＳ予防のための高活性抗レトロウイルス剤療法（ＨＡＡＲＴ）が開発されたことであった［http://basicmedicalkey.com/aids-and-lentiviruses/］。
【０００３】
ＨＩＶは、主要な全世界の公衆衛生問題であり続けている。２０１５年において、世界中で３６７０万の人がＨＩＶを有しながら生存しており（そのうち１８０万人は子供）、全世界のＨＩＶ罹患率は０．８％であった。この人数の大多数が低所得から中所得の国で生活している。同年において、１１０万の人がＡＩＤＳ関連疾患によって死亡した。専門家の推定によれば、流行が始まってから、７８００万の人がＨＩＶに感染し始め、３５００万人がＡＩＤＳ関連疾患によって死亡した。推定２５５０万のＨＩＶ感染者がサハラ以南アフリカで生活している。２０１５年において、彼らの圧倒的多数（１９００万人と推定）がアフリカ東部および南部で生活しており、これは、全世界の新規のＨＩＶ感染の４６％にあたる。ＨＩＶと共に生きている全ての人の約４０％は、自身がウイルス保持者であることを認識していない［http://www.avert.org/global-hiv-and-aids-statistics］。
【０００４】
抗ウイルス薬の開発は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳの認識を、死に至るものから、慢性的な、もしかすると制御可能な疾患へと大幅に変え、抗レトロウイルス剤療法（ＡＲＴ）の利用可能性および投与は、ＨＩＶおよびＡＩＤＳに関連する死亡率および罹患率を大幅に低下させた。ＡＲＴとＨＩＶおよびＡＩＤＳと共に生きる人の生活の質との間には関連があり、数々の研究によれば、先進国と発展途上国のいずれにおいても、ＨＩＶおよびＡＩＤＳと共に生きる人において、様々な地域でＡＲＴと生活の質の改善との間に強いプラスの関連があることが報告されている［https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3418767/］。
【０００５】
高活性抗レトロウイルス剤療法（ＨＡＡＲＴ）の時代において、ＨＩＶ感染患者は、より長い人生を送る。ＡＲＴ療法の性能により、彼らの寿命は７０〜８０歳まで延長することが可能である。しかしながら、付随するＨＢＶおよび／またはＨＣＶ感染により、肝疾患に関連する罹患率および死亡率がより高くなる。制御不能なＨＩＶ感染は、ＨＣＶによって誘発される肝硬変の進行を促進する。
【０００６】
ＨＩＶ／ＨＢＶ重感染は、一般的な現象である。慢性ＨＢＶ感染は、一般的な集団より１０倍高い率でＨＢＶに曝露されたＨＩＶ感染個体の５〜１０％で起こる［http://hivinsite.ucsf.edu/InSite? page=kb-05-03-04#S1X］。
【０００７】
ＨＩＶ／ＨＣＶに重感染した患者は、肝硬変または非代償性肝疾患が進行するリスクが、ＨＣＶ単独に感染した患者より３倍大きくなる［https://aidsinfo.nih.gov/guidelines/html/1/adult-and-adolescent-arv-guidelines/26/hcv-hiv］。米国および欧州における２００６年における２５０００人より多くのＨＩＶに感染した人の多国籍コホートでは、死亡の１４％が肝臓関連であり、そのうち６６％が付随するＨＣＶ感染を有する人で起こっていた［http://hivinsite.ucsf.edu/InSite? page=kb-00&doc=kb-05-03-05］。
【０００８】
ＨＢＶまたはＨＣＶのいずれかでの単一感染は、全世界における慢性肝疾患の主原因の１つの代表例である。しかしながら、流行地域では、相当数の患者が、主として一般的な感染経路の結果として両方のウイルスに感染している。多数の研究から、二重に感染した患者は、単一感染した患者と比較して肝硬変および肝細胞癌のリスクがより大きいことが実証されている。印象的なことに、ＨＣＶ処置の前に不活性なＨＢＶに感染した患者のおよそ６０％は、ＨＢＶ再活性化を示すことがあるが、他のＨＢＶ感染患者は、Ｂ型肝炎表面抗原のセロコンバージョンを経る［https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4367211/］。
【０００９】
ヌクレオシド（およびヌクレオチド）はすでに、約５０年にわたり臨床実践で使用されており、ウイルス感染またはがんを有する患者の処置の土台になりつつある。この１０年にわたる一部の新しい医薬製剤の開発によれば、このクラスの化合物はそれでもかなりの将来性を示すことが実証されている。
【００１０】
ヌクレオシド（ヌクレオチド）は、ウイルス性疾患の処置において重要な役割を果たしてきた。これらは、ＨＩＶ感染患者のための一部の多剤レジメンの基礎になると考えられる。今日、ヌクレオシド（ヌクレオチド）は、ＨＢＶ感染患者を処置することにおいて好ましい選択肢および基準である。
【００１１】
多数のヌクレオシド（ヌクレオチド）ＲＴ阻害剤が、ＨＩＶ感染の処置のために承認されている［R. F. Shinaziら、Pharmacology of current and promising nucleosides for the treatment of human immunodeficiency viruses. J. Antiviral Res. 2006、71、322〜334. E. De Clercq. The nucleoside reverse transcriptase inhibitors, nonnucleoside reverse transcriptase inhibitors, and protease inhibitors in the treatment of HIV infections (AIDS). Adva Pharmacol. 2013、67、317〜358］。それらの一部は、他のＨＩＶ複製阻害剤と組み合わせたアジュバント療法で適用されており、高活性抗レトロウイルス剤療法（ＨＡＡＲＴ）において標準的治療になりつつある便利な治療レジメンが提供される。このような複合薬としては、コンビビル（Combivir）（登録商標）、トリジビル（Trizivir）（登録商標）、エプジコム（Epzicom）（登録商標）、ツルバダ、アトリプル（Atriple）、スタリビルド（Stribile）、およびコムプレラが挙げられる。ツルバダ、アトリプル、スタリビルド、およびコムプレラは、ヌクレオシドとしてエムトリシタビンおよび非環式ヌクレオチドとしてフマル酸テノホビルジイソプロピル（ＴＤＦ）を含み、一方でコンビビル（商標）、トリジビル、およびエプジコムは、ヌクレオシドとしてのジドブジン（ＡＺＴ）、ラミブジン（３ＴＣ、Ｎｕｃ２１、および／またはアバカビル（ＡＢＣ）を含有する２または３種の薬物の組合せを含む［R. F. Shinaziら、Pharmacology of current and promising nucleosides for the treatment of human immunodeficiency viruses. J. Antiviral Res. 2006、71、322〜334］。抗レトロウイルス剤ＨＩＶ療法の成功は、これまで治療不能であったＨＩＶ疾患に感染している個体の寿命を劇的に延ばした。しかしながら、これらの進歩にもかかわらず、慢性感染者を処置するための、さらに長期の薬物投与に関する耐性および副作用を低下させるための新しい薬剤を発見するための探求が進められている。
【００１２】
【化１】
2020509046.tif 000002
【００１３】
新規の抗ウイルス性非環式ヌクレオシドプロドラッグの１つは、テノホビルホスホン酸塩（ＴＦＶ）である。フマル酸テノホビルジソプロキシル（ＴＤＦ）、加えてテノホビルアラフェナミドおよびその塩（ＴＡＦ、ＧＳ−７３４０、ベムリディ）は、より一層優れた特性を有することが示されている。このプロドラッグは、それを必要とする患者の併用療法処置のために的確に設計された抗ウイルス薬療法である［ＷＯ２００２００８２４１、ＵＳ７３９０７９１、A.S. Ray, M.W. Fordyce、M.J.M. Hitchcock. Tenofovir alafenamide：A novel prodrug of tenofovir for the treatment of Human Immunodeficiency Virus. Antiviral Research、125巻、2016年1月、63〜70頁、ＷＯ２００２００８２４１、ＵＳ７３９０７９１、ＷＯ２０１３０２５７８８、ＷＯ２０１３１１６７２０、ＵＳ９２９６７６９、http://www.gilead.ca/pdf/ca/genvoya_pm_english.pdf. http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfdadocs/nda/2015/207561 Orig1s000PharmR.pdf.］。
【００１４】
【化２】
2020509046.tif 000003
【００１５】
２０１５年に、ＦＤＡは、ＨＩＶの併用処置のための最初のＴＡＦベースの組成物を承認し［http://www.dailykos.com/story/2013/4/10/1200735/-Gilead-s-New-FDA-Approved-HIV-Drug-Improves-Nothing-So-Naturally-It-Costs-A-Lot］、２０１６年に、ＴＡＦがＨＢＶ処置のための医薬品としてＦＤＡによって承認された［https://www.hepmag.com/article/fda-approves-vemlidy-tenofovir-alafenamide-taf-hepatitis-b］。ＴＡＦは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対する強力なプロドラッグである。ＴＡＦは、ＴＤＦと比較して、腎臓および骨に対する有害作用がより少ない［http://www.aidsmap.com/Tenofovir-alafenamide-works-well-against-hepatitis-B-with-less-effect-on-bones-and-kidneys/page/3051008/］。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】ＷＯ２００２００８２４１
【特許文献２】ＵＳ７３９０７９１
【特許文献３】ＷＯ２００２００８２４１
【特許文献４】ＵＳ７３９０７９１
【特許文献５】ＷＯ２０１３０２５７８８
【特許文献６】ＷＯ２０１３１１６７２０
【特許文献７】ＵＳ９２９６７６９
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】http://basicmedicalkey.com/aids-and-lentiviruses/
【非特許文献２】http://www.avert.org/global-hiv-and-aids-statistics
【非特許文献３】https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3418767/
【非特許文献４】http://hivinsite.ucsf.edu/InSite? page=kb-05-03-04#S1X
【非特許文献５】https://aidsinfo.nih.gov/guidelines/html/1/adult-and-adolescent-arv-guidelines/26/hcv-hiv
【非特許文献６】http://hivinsite.ucsf.edu/InSite? page=kb-00&doc=kb-05-03-05
【非特許文献７】https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4367211/
【非特許文献８】R. F. Shinaziら、Pharmacology of current and promising nucleosides for the treatment of human immunodeficiency viruses. J. Antiviral Res. 2006、71、322〜334
【非特許文献９】E. De Clercq. The nucleoside reverse transcriptase inhibitors, nonnucleoside reverse transcriptase inhibitors, and protease inhibitors in the treatment of HIV infections (AIDS). Adva Pharmacol. 2013、67、317〜358
【非特許文献１０】A.S. Ray, M.W. Fordyce、M.J.M. Hitchcock. Tenofovir alafenamide：A novel prodrug of tenofovir for the treatment of Human Immunodeficiency Virus. Antiviral Research、125巻、2016年1月、63〜70頁
【非特許文献１１】http://www.gilead.ca/pdf/ca/genvoya_pm_english.pdf.
【非特許文献１２】http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfdadocs/nda/2015/207561 Orig1s000PharmR.pdf.
【非特許文献１３】http://www.dailykos.com/story/2013/4/10/1200735/-Gilead-s-New-FDA-Approved-HIV-Drug-Improves-Nothing-So-Naturally-It-Costs-A-Lot
【非特許文献１４】https://www.hepmag.com/article/fda-approves-vemlidy-tenofovir-alafenamide-taf-hepatitis-b
【非特許文献１５】http://www.aidsmap.com/Tenofovir-alafenamide-works-well-against-hepatitis-B-with-less-effect-on-bones-and-kidneys/page/3051008/
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
長期間にわたるＨＩＶおよびＨＢＶ感染を抑制するための抗レトロウイルス剤の併用レジメンの開発における劇的な進歩にもかかわらず、患者の生涯にわたり高い効力を維持することが可能な新規の安全な医薬品が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
発明者らは、驚くべきことに、これまで未知の一般式１のシクロブチル（Ｓ）−２−［［［（Ｒ）−２−（６−アミノプリン−９−イル）−１−メチル−エトキシ］メチル−フェノキシ−ホスホリル］アミノ］プロパノエート、立体異性体である式１．１の（シクロブチル（Ｓ）−２−［（Ｓ）−［［（Ｒ）−２−（６−アミノプリン−９−イル）−１−メチル−エトキシ］メチル−フェノキシ−ホスホリル］アミノ］プロパノエート、および式１．２のシクロブチル（Ｓ）−２−［（Ｒ）−［［（Ｒ）−２−（６−アミノプリン−９−イル）−１−メチル−エトキシ］メチル−フェノキシ−ホスホリル］アミノ］プロパノエート、それらの同位体で濃縮された類似体、医薬的に許容される塩、水和物、溶媒和物、ならびに結晶形態または多結晶形態が、ウイルス性疾患、特にＨＩＶおよびウイルス性肝炎の併用処置に関して有望な、より有効なＴＦＶのプロドラッグであることを見出した。
【００２０】
【化３】
2020509046.tif 000004
【００２１】
以下に、本発明を説明するのに使用される様々な用語の定義を列挙する。これらの定義は、特定の例において別段の限定がない限り、その用語が本明細書と特許請求の範囲にわたり使用されるときに、個々に、またはより大きい群の一部としてのいずれかでそれに適用される。
【００２２】
用語「プロドラッグ」は、化学的または代謝的に切断可能な基を有する本発明の化合物を指し、加溶媒分解によって、または生理学的条件下でインビボで医薬活性を有する本発明の化合物になる。プロドラッグは、哺乳動物において溶解性、組織適合性、送達、または遅延放出の利点を提供することが多い（Bungard, H.、Design of Prodrugs、7〜9、21〜24頁、Elsevier、アムステルダム、1985を参照）。プロドラッグとしては、当業者周知の酸誘導体、例えば初発の酸化合物を好適なアルコールと反応させることにより得られたエステル、または初発の酸化合物を好適なアミンと反応させることにより得られたアミドが挙げられる。プロドラッグの例としては、これらに限定されないが、本発明の化合物中の官能基のアルコールまたはアミンの、酢酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、および他のアシル化誘導体が挙げられる。
【００２３】
用語「活性成分」（医薬物質）は、薬理活性を示す合成または他の（生物工学的な、植物性、動物性、細菌などの）起源の生理学的に活性な化合物を指し、医薬組成物の活性成分である。
【００２４】
用語「結晶形態」は、結晶格子が形成されるように分子が配列されている物質構造を指す。
用語「多結晶形態」は、特定の結晶形態の複数の単結晶または晶子からなる多結晶性の構造を指す。
【００２５】
用語「医療用薬物」は、ヒトおよび動物における生理学的機能の回復、改善または改変、ならびに疾患の処置および予防、診断、麻酔、避妊、美容術などを意図した、錠剤、カプセル剤、注射剤、軟膏剤、または他の完成した剤形の形態の化合物（または医薬組成物を形成する化合物の混合物）を指す。
【００２６】
用語「治療用カクテル」は、薬理学的作用の異なるメカニズムを示し、疾患の病因に関与する様々なバイオターゲットを標的化する、同時に投与される２種またはそれより多くの医療用薬物の組合せを指す。
【００２７】
用語「医薬組成物」は、一般式２の化合物と、医薬的に許容され、薬理学的に適合性を有する、増量剤（フィラー）、溶媒、希釈剤、担体、助剤、分散剤、および知覚剤、賦形剤、送達のための物質、例えば保存剤、安定剤、増量剤、崩壊薬、湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、増粘剤、甘味料、矯味矯臭剤、芳香剤、抗菌剤、殺真菌剤、潤滑剤、および持続性の送達制御物質からなる群から選択される成分の少なくとも１つとを含む組成物を指し、これらの選択および比率は、投与の性質および方法ならびに投薬量によって決まる。好適な懸濁化剤の例は、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレン、ソルビトールおよびソルビトールエーテル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガカント、ならびにそれらの混合物である。
【００２８】
微生物からの保護は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、ソルビン酸などを使用して提供することができる。前記組成物はまた、糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を含んでいてもよい。組成物の持続的な作用は、活性成分の吸収を遅らせる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを使用して達成することができる。好適な担体、増量剤、溶媒、希釈剤および送達のための物質の例としては、注射の場合、水、エタノール、多価アルコールおよびそれらの混合物、天然油（例えばオリーブ油）、ならびに有機エステル（例えばオレイン酸エチル）が挙げられる。増量剤の例は、ラクトース、乳糖、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムなどである。崩壊薬および分散剤の例は、デンプン、アルギン酸およびその塩、ならびにケイ酸塩である。潤滑剤の例は、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク、および高分子量のポリエチレングリコールである。活性成分の経口、舌下、経皮、筋肉内、静脈内、皮下、および局所または直腸内投与のための医薬組成物は、単独で、または別の活性化合物と組み合わせて、標準的な投与形態で、従来の医薬用担体との混合物として動物やヒトに投与することができる。好適な標準的な投与形態としては、経口の形態、例えば、錠剤、ゼラチンカプセル剤、丸剤、粉末剤、顆粒剤、チューインガム、および経口溶液または懸濁液；舌下およびバッカル経由の投与形態；エアロゾル；インプラント；局所、経皮、皮下、筋肉内、静脈内、鼻腔内、または眼球内の形態；ならびに直腸内投与形態が挙げられる。
【００２９】
用語「不活性増量剤」は、本明細書で使用される場合、医薬組成物を形成するために使用され、概して安全で非毒性であり、生物学的にもそれ以外の観点からも有害ではない化合物を指し、獣医学的な使用やヒトの医薬における使用にとって許容できる賦形剤を含む。本発明の化合物は、個別に投与することもできるが、一般的に、予期される薬物の投与方法および標準的な製薬上の実施に応じて選択された１つまたはそれより多くの医薬的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体との混合物として投与される。
【００３０】
用語「医薬的に許容される塩」は、ここで特許請求される酸および塩基の、比較的非毒性の有機塩および無機塩の両方を指す。前記塩は、インサイチュでの化合物の合成、単離、または精製により得てもよいし、またはそれらは、特別に調製してもよい。特定には、塩基性塩は、ここで特許請求される化合物の精製した遊離塩基および好適な有機または無機酸から特別に調製することができる。このようにして調製された塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、ジクロロ酢酸塩、シュウ酸塩、吉草酸塩（valeriate）、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、ホウ酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、メシル酸塩、マロン酸塩、サリチル酸塩、プロピオン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、スルファミン酸塩などが挙げられる（前記塩の特性の詳細な説明は、Berge S.M.ら、「Pharmaceutical Salts」J. Pharm. Sci. 1977, 66：1〜19に示されている）。ここで特許請求される酸の塩はまた、精製した酸を好適な塩基と反応させて、金属塩およびアミンを生産することによって特別に調製されてもよい。前記金属塩としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、バリウム、亜鉛、マグネシウム、リチウム、およびアルミニウムの塩が挙げられ、なかでもナトリウム塩およびカリウム塩が好ましい。金属塩を生産するのに使用される好適な無機塩基としては、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、および水素化ナトリウム、水酸化カリウムおよび炭酸水素カリウム、炭酸カリウム；水酸化リチウム；水酸化カルシウム；水酸化マグネシウム；ならびに水酸化亜鉛が挙げられる。ここで特許請求されるような酸性塩を生産するのに使用される好適な有機塩基としては、安定な塩を形成するのに十分に塩基性であり、医学的用途に好適なアミンおよびアミノ酸（特定には、これらは低い毒性を有すると予想される）が挙げられる。前記アミンとしては、アンモニア、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、ベンジルアミン、ジベンジルアミン、ジシクロヘキシルアミン、ピペラジン、エチルピペリジン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなどが挙げられる。さらに塩は、水酸化テトラアルキルアンモニウム、例えばコリン、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウムなどを使用して調製することができる。アミノ酸は、塩基性アミノ酸：リシン、オルニチン、およびアルギニンから選択することができる。
【００３１】
用語「治療有効量」は、本明細書で使用される場合、対象におけるの疾患の症状を軽減するのに必要な物質、プロドラッグ、または薬物の量を指す。物質、プロドラッグ、または薬物の用量は、それぞれの特定のケースにおいて個々の要求を満たすものと予想される。前記用量は、処置しようとする疾患の重症度、患者の年齢および全体の状態、患者の処置に使用される他の医薬、投与の様式および経路、ならびに担当医師の経験のような多数の要因に応じて広範に変更することができる。経口投与の場合、１日用量は、単独療法および／または併用療法の両方において、その間の全ての値を含め約０．０１〜１０ｇである。好ましい１日用量は、約０．１〜７ｇである。一般的に、ウイルスを低減するかまたはなくすために、処置の開始時にはより多くの負荷用量を与え、続いて用量を、感染バーストを防ぐのに十分な程度のレベルに低減する。
【００３２】
用語「対象」は、これらに限定されないが、ウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、シチメンチョウ、スイギュウ、ラマ、ダチョウ、イヌ、ネコ、およびヒトなどの哺乳動物を指し、最も好ましくは、ヒト対象である。対象の処置は、一般式１のいずれかのプロドラッグ、その立体異性体、同位体で濃縮された類似体、医薬的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および結晶形態もしくは多結晶形態、またはそれらとＨＣＶ  ＮＳ５Ａ阻害剤などの別の化合物との組合せの使用を含み得ることが想定される。
【００３３】
用語「溶媒和物」は、溶質の、すなわち本発明の化合物またはその医薬的に許容される塩の１つまたはそれより多くの分子と、溶媒の１つまたはそれより多くの分子とによって形成された複合体または集合体を指す。前記溶媒和物は、典型的には、溶質と溶媒とのモル比が固定された結晶質固体である。代表的な溶媒としては、これらに限定されないが、水、エタノール、イソプロパノール、酢酸などが挙げられる。溶媒が水である場合、形成される溶媒和物は、水和物である。
【００３４】
本発明は、ＴＦＶである一般式１のシクロブチル（Ｓ）−２−［［［（Ｒ）−２−（６−アミノプリン−９−イル）−１−メチル−エトキシ］メチル−フェノキシ−ホスホリル］アミノ］プロパノエート、その立体異性体である式１．１のシクロブチル（Ｓ）−２−［（Ｓ）−［［（Ｒ）−２−（６−アミノプリン−９−イル）−１−メチル−エトキシ］メチル−フェノキシ−ホスホリル］アミノ］プロパノエート、および式１．２のシクロブチル（Ｓ）−２−［（Ｒ）−［［（Ｒ）−２−（６−アミノプリン−９−イル）−１−メチル−エトキシ］メチル−フェノキシ−ホスホリル］アミノ］プロパノエート、ならびにそれらの同位体で濃縮された類似体、医薬的に許容される塩、水和物、溶媒和物、および結晶形態または多結晶形態の新規のプロドラッグに関する。
【００３５】
【化４】
2020509046.tif 000005
【００３６】
好ましい塩は、式１の化合物の、フマル酸塩、ヘミフマル酸塩、ジクロロ酢酸塩または塩酸塩である。
より好ましい塩は、式１．１の化合物のフマル酸塩、ヘミフマル酸塩、ジクロロ酢酸塩または塩酸塩である。
【００３７】
【化５】
2020509046.tif 000006
【００３８】
驚くべきことに、新規の式１．１および式１．２のプロドラッグは、ＨＩＶおよびＨＢＶに感染した対象の併用療法で現在使用されている公知のＴＡＦのプロドラッグより有効なようであった。実際に、ＴＦＶおよびＴＦＶ二リン酸の式１．１および１．２の化合物のフマル酸塩は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）で代謝されて、匹敵する条件でのＴＡＦ代謝による結果と比べて代謝産物の濃度およびＡＵＣｌａｓｔの増加をもたらす。表１に記載の式１．１のプロドラッグのＴＦＶ代謝産物生産速度からわかるように、ＴＦＶ二リン酸（薬物）のＣｍａｘおよびＡＵＣｌａｓｔは、それに対応するＴＡＦ代謝で観察された値のおよそ２倍である。式１．２のプロドラッグの代謝についても、それに対応するＴＡＦ代謝で観察された値と比較して、それより高いＣｍａｘおよびＡＵＣｌａｓｔ値（表１）が観察されている。
【００３９】
【化６】
2020509046.tif 000007
【００４０】
【表１】
2020509046.tif 000008
【００４１】
ＧＦＰ−レポーター（ＮＬ４．３ＧＦＰ）ウイルスを含有するＮＬ４．３ＨＩＶ株に感染したＳｕｐＴ１細胞を使用したＨＩＶ試験で、化合物１．１および１．２のフマル酸塩ならびにＴＡＦの抗ウイルス活性を評価したところ、活性と選択性の両方がＴＡＦのそれらより１．４倍高いことを示したことから、式１．１の化合物のフマル酸塩が最も有力のようであることが示された（表２）。
【００４２】
【表２】
2020509046.tif 000009
【００４３】
本発明の主題は、一般式１の化合物もしくはその立体異性体、またはそれらの同位体で濃縮された類似体、医薬的に許容される塩、水和物、溶媒和物、または結晶形態もしくは多結晶形態を含む、ウイルス感染の併用療法および予防が意図された、医薬的に許容されるパッケージ中に入れられた錠剤、カプセル剤、または注射の形態で使用される医薬組成物である。
【００４４】
好ましくは、式１．１のプロドラッグ、またはその同位体で濃縮された類似体、医薬的に許容される塩、水和物、溶媒和物、または結晶形態もしくは多結晶形態のフマル酸塩、ヘミフマル酸塩、ジクロロ酢酸塩または塩酸塩を含有する医薬組成物である。
【００４５】
本発明によれば、前記医薬組成物は、医薬的に許容される増量剤、ならびにヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロテアーゼ阻害化合物、非ヌクレオシド系ＨＩＶ逆転写酵素阻害剤、ヌクレオシド系ＨＩＶ逆転写酵素阻害剤、ヌクレオチド系ＨＩＶ逆転写酵素阻害剤、ＨＩＶ−インテグラーゼ阻害剤、およびＣＣＲ５阻害剤からなる群から選択される追加の治療剤を含んでいてもよい。
【００４６】
本発明のさらなる主題は、治療有効量の一般式１の化合物もしくはその立体異性体、またはそれらの同位体で濃縮された類似体、医薬的に許容される塩、水和物、溶媒和物、または結晶形態もしくは多結晶形態を、それを必要とする対象に投与することを含む、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の処置のための方法である。
【００４７】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の処置のためのさらなる好ましい方法は、治療有効量の一般式１．１の化合物、またはその同位体で濃縮された類似体、医薬的に許容される塩、水和物、溶媒和物、もしくは結晶形態もしくは多結晶形態を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【００４８】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の処置のためのよりさらなる好ましい方法は、治療有効量の式１．１のプロドラッグ、またはその同位体で濃縮された類似体、水和物、溶媒和物、もしくは結晶形態もしくは多結晶形態のフマル酸塩、またはヘミフマル酸塩、またはジクロロ酢酸塩、または塩酸塩を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【００４９】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の処置のためのよりさらなる好ましい方法は、治療有効量の前記医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。
本発明のさらなる主題は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロテアーゼ阻害剤である阻害化合物、非ヌクレオシド系ＨＩＶ逆転写酵素阻害剤、ヌクレオシド系ＨＩＶ逆転写酵素阻害剤、ヌクレオチド系逆転写酵素阻害剤、ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤、およびＣＣＲ５阻害剤からなる群から選択される１種またはそれより多くの追加の治療剤を、それを必要とする対象に投与することを含む、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の処置のための方法である。
【００５０】
本発明のよりさらなる主題は、治療有効量の一般式１の化合物、その立体異性体、またはその同位体で濃縮された類似体、医薬的に許容される塩、水和物、溶媒和物、もしくは結晶形態もしくは多結晶形態によるＨＢＶ感染の処置のための方法である。
【００５１】
ＨＢＶ感染の処置のための好ましい方法は、治療有効量の式１．１のプロドラッグ、またはその同位体で濃縮された類似体、水和物、溶媒和物、もしくは結晶形態もしくは多結晶形態のフマル酸塩、またはヘミフマル酸塩、またはジクロロ酢酸塩、または塩酸塩を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【００５２】
本発明のさらなる主題は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロテアーゼ阻害剤である阻害化合物、非ヌクレオシド系ＨＩＶ逆転写酵素阻害剤、ヌクレオシド系ＨＩＶ逆転写酵素阻害剤、ヌクレオチド系逆転写酵素阻害剤、ＨＩＶインテグラーゼ阻害剤、およびＣＣＲ５阻害剤からなる群から選択される治療有効量の１種またはそれより多くの追加の治療剤を、それを必要とする対象に投与することを含む、ＨＢＶ感染の処置のための方法である。
【００５３】
本発明のさらなる主題は、治療有効量の上述の医薬組成物の１つまたはそれより多くの用量を、それを必要とする対象に投与することを含む、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の処置のための方法である。
【００５４】
本発明のさらなる主題は、式２のＬ−アラニンシクロブチルエステルおよび一般式３の化合物の使用を含む、一般式１のシクロブチル（Ｓ）−２−［［［（Ｒ）−２−（６−アミノプリン−９−イル）−１−メチル−エトキシ］メチル−フェノキシ−ホスホリル］アミノ］プロパノエート、その立体異性体である式１．１の（シクロブチル（Ｓ）−２−［（Ｓ）−［［（Ｒ）−２−（６−アミノプリン−９−イル）−１−メチル−エトキシ］メチル−フェノキシ−ホスホリル］アミノ］プロパノエート、および式１．２のシクロブチル（Ｓ）−２−［（Ｒ）−［［（Ｒ）−２−（６−アミノプリン−９−イル）−１−メチル−エトキシ］メチル−フェノキシ−ホスホリル］アミノ］−プロパノエート、ならびにその同位体で濃縮された類似体、医薬的に許容される塩、水和物、溶媒和物、または結晶形態もしくは多結晶形態を生産するための方法である。
【００５５】
【化７】
2020509046.tif 000010
【発明を実施するための形態】
【００５６】
最良の実施態様
ここで本発明を特定の実施態様に関して説明するが、これらは、その範囲を限定することは意図されない。それとは逆に、本発明は、特許請求の範囲内に含めることができる全ての代替物、改変、および均等物を網羅する。したがって、以下の実施例は、具体的な実施態様も含め、本発明を例示するものであり、本発明を限定しない。
【００５７】
実施例１．一般式１のプロドラッグの合成のための一般的な合成プロトコール（スキーム１）。
【００５８】
【化８】
2020509046.tif 000011
【００５９】
スルホラン（１４ｍｌ）およびジクロロメタン（１２ｍｌ）中の［（Ｒ）−２−（６−アミノ−プリン−９−イル）−１−メチル−エトキシメチル］ホスホン酸モノフェニルエーテル（３．６３ｇ、１０ｍｍｏｌ）（４）［ＷＯ２０１３１１６７２０］の懸濁液に、塩化チオニル（３ｍｌ、４０ｍｍｏｌ）を撹拌しながら一滴ずつ添加した。混合物を、低いＡｒ流下で、５０〜５５℃で１５時間還流した。次いでフラスコ中を真空にして（膜ポンプを介して）、５０〜５５℃で２時間かけて揮発性成分を除去した。反応混合物を３０℃に冷却し、ジクロロメタン（１０ｍｌ）および乾燥アセトニトリル（４０ｍｌ）の混合物を撹拌しながら添加した。塩化物（３）を含有する反応混合物を−６０〜−５０℃に冷却し、６ｍｌのアセトニトリル中のＬ−アラニンシクロブチルエステル（２）（１．５４６ｇ、１２ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（４．１７２ｍｌ、３０ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。混合物をゆっくり室温に加熱し、ジクロロメタン（１００ｍｌ）で希釈し、溶液をガラスフィルター上の約１００ｍｌのシリカゲル上に広げた。最初にジクロロメタン、次いでジクロロメタン中の３０％アセトン溶液、最後に純粋なテトラヒドロフランで溶出させる乾式フラッシュクロマトグラフィーによって生成物を抽出して、２ｇの一般式１の化合物を得た。立体異性体１．１および１．２の比率は２：３であった。式１．１および１．２の立体異性体を、２５４ｎｍのＵＶ検出器を備えた、ＡｃＣＮ：ＥｔＯＨ：ＨＣＯＯＨが２００：２０：０．５（流速２０ｍｌ／分）の無勾配系中でのフェノメネックス（Phenomenex）のアミロース−２ＡＸＩＡ−Ｐａｃ２５０×２１．２０ＭＭ光学カラムでのＨＰＬＣによって分離した。
【００６０】
等モル量のフマル酸を用いた１００ｍｌのアセトニトリルからの結晶化によって、立体異性体１．１および１．２のフマル酸塩を得た。得られた生成物は、（Ｓ）−シクロブチル２−（（Ｓ）−（（（Ｒ）−１−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−２−イルオキシ）メチル）（フェノキシ）−ホスホリルアミノ）−プロパノエート（１．１）のフマル酸塩、LC-MS（ESI）489（M+H）+, 1H NMR（DMSO-d6, 300 MHz）δ 8.14（s, 1H）, 8.10（s, 1H）, 7.30（m, 2H）, 7.19（s, 2H）, 7.14（m, 1H）, 7.06（m, 2H）, 6.63（s, 2H）, 5.64（t, J=11.1 Hz, 1H）, 4.86（p, J=7.2 Hz, 1H）, 4.27（dd, J1=14.4 Hz, J2=3.0 Hz, 1H）, 4.14（dd, J1=14.4 Hz, J2=6.6 Hz, 1H）, 3.85（m, 4H）, 2.23（m, 2H）, 1.94（m, 2H）, 1.72（m, 1H）, 1.59（m, 1H）, 1.13（d, J=6.9 Hz, 3H）, 1.07（d, J=6.6 Hz, 3H）。31P NMR（DMSO-d6, 121.5 MHz）δ 22.05、および（Ｓ）−シクロブチル２−（（Ｒ）−（（（Ｒ）−１−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−２−イルオキシ）メチル）（フェノキシ）ホスホリルアミノ）プロパノエート（１．２）のフマル酸塩、LC-MS（ESI）489（M+H）+, 1H NMR（DMSO-d6, 300 MHz）δ 8.14（s, 1H）, 8.12（s, 1H）, 7.34（m, 2H）, 7.21（s, 2H）, 7.15（m, 1H）, 7.11（m, 2H）, 6.63（s, 2H）, 5.53（dd, J1=12.0 Hz, J2=10.5 Hz, 1H）, 4.82（p, J=7.5 Hz, 1H）, 4.29（dd, J1=14.4 Hz, J2=3.6 Hz, 1H）, 4.20（dd, J1=14.4 Hz, J2=5.7 Hz, 1H）, 3.98（m, 1H）, 3.86（m, 3H）, 2.21（m, 2H）, 1.91（m, 2H）, 1.69（m, 1H）, 1.57（m, 1H）, 1.13（d, J=6.9 Hz, 3H）, 1.05（d, J=6.3 Hz, 3H）31P NMR（DMSO-d6, 121.5 MHz）δ 22.86であった。
【００６１】
実施例２．錠剤の形態の医薬組成物の調製。デンプン（１６００ｍｇ）、すりつぶしたラクトース（１６００ｍｇ）、タルク（４００ｍｇ）、および式１．１のプロドラッグの塩（１０００ｍｇ）を一緒に混合し、棒状にプレスした。得られた棒状物を顆粒状に粉砕し、篩にかけ、１４〜１６メッシュの顆粒を収集した。このようにして得られた顆粒を、それぞれ２００または４００ｍｇの重さの好適な形態を有する錠剤に成形した。
【００６２】
実施例３．カプセルの形態の医薬組成物の調製。式１．１のプロドラッグの塩およびラクトース粉末を、２：１の比率で慎重に混合した。得られた粉末状の混合物を、それぞれ１５０または３００ｍｇのいずれかの重さで好適なサイズを有するゼラチンカプセルにパックした。
【００６３】
実施例４．筋肉内、腹膜内または皮下注射のための組成物の形態の医薬組成物の調製。式１．１のプロドラッグの塩（５００ｍｇ）、クロロブタノール（３００ｍｇ）、プロピレングリコール（２ｍｌ）、および注射可能な水（１００ｍｌ）を一緒に混合した。得られた溶液をろ過し、５ｍｌのアンプルに入れ、シールした。
【００６４】
実施例５．ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるプロドラッグ１．１および１．２ならびにＴＡＦプロトタイプの代謝パラメーターの評価
試験される式１．１および１．２の化合物およびＴＡＦの総合溶液をＤＭＳＯ（シグマ（Sigma））中で調製し、−２０℃で維持した。フィコールパックプレミアム（Ficoll-Paque Premium）（ＧＥヘルスケア（GE Healthcare））勾配遠心分離を用いて、ＰＢＭＣ（使用前に液体窒素中で維持された）をヒト血液から抽出した。ＰＢＭＣを、２４−ウェルプレート（グライナーバイオワン（Greiner Bio-one））に、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（０．１１ｍｇ／ｍｌ）、必須および非必須アミノ酸、ペニシリン５０Ｕｎ／ｍｌ、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）（全ての試薬はＰａｎＥｃｏより得た）、および５％ＨＩ（熱不活性化）ウシ胎児血清（ハイクローン（HyClone））を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中、ウェル当たり１５０万個の細胞（４２０万個／ｍｌ）で入れた。細胞を、３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。次の日、試験される化合物と参照化合物を最終濃度３０μＭで細胞に添加した。細胞と化合物を３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。２、４、８、２４、４８、および７２時間のインキュベーション後、非接着細胞を培地と共に１．５ｍｌの試験管（エッペンドルフ（Eppendorf））に移し、１０００ｇで５分間遠心分離して、培地を除去した。細胞を１ｍｌのリン酸緩衝液（ギブコ（Gibco））で洗浄し、−２０℃に冷却した２００μｌの７０％メタノールで溶解させた。ウェルに接着する細胞を１ｍｌのＰＢＳ（ギブコ）で洗浄し、−２０℃に冷却した２００μｌの７０％メタノールで溶解させた。それぞれのウェルからの接着細胞および非接着細胞の溶解産物を合わせ、撹拌した。
【００６５】
細胞溶解産物中のテノホビル（ＴＦＶ）およびテノホビル二リン酸（ＤＰ−ＴＦＶ）の含量を、１２９０ＵＰＬＣシステム（アジレント（Agilent））クロマトグラフおよびＱＴｒａｐ５５００システム（AB Sciex）三連四重極質量分析計を使用したＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって決定した。分析物を、Ａ−２５ｍＭの酢酸アンモニウム中の０．５％アンモニアおよびＢ−２５ｍＭの酢酸アンモニウム中の０．５％アンモニア：２−プロパノール：メタノール（１：１：３）を含む移動相中で、サーモハイパーカーボ（Thermo Hypercarb）（５０×３．０ｍｍ、５μｍ、サーモサイエンティフィック（Thermo Scientific））カラムで、０．８ｍｌ／分の流速で分離した。陰イオン検出モードのエレクトロスプレー（TurboIonSpray）を、イオン源として使用した。ＴＦＶ：２８６＞１０７、２８６＞７９、２８６＞６３ｍ／ｚおよびＤＰ−ＴＦＶ：４４６＞３４８、４４６＞１７６、４４６＞１５８、４４６＞７９ｍ／ｚの遷移を用いたＭＲＭモードで、分析物を検出した。クロマトグラムをアナリスト（Analyst）１．５．２ソフトウェア（AB Sciex）を使用して分析した。細胞溶解産物中のＴＦＶおよびＴＦＶリン酸の濃度を、７０％メタノール中のＴＦＶおよびＤＰ−ＴＦＶの参照サンプルを使用して得られた検量線から推定した。表１に、結果を示す。
【００６６】
実施例６．一般式１のプロドラッグおよびプロトタイプ（ＴＡＦ）の抗ＨＩＶ活性の評価。試験された化合物の抗ウイルス活性をＴリンパ球株ＳｕｐＴ１で評価した。細胞を、緑色蛍光タンパク質（ＮＬ４．３−ＧＦＰ）をコードする遺伝子を有するＨＩＶ株ＮＬ４．３に感染させた。抗ウイルス性ＤＮＡで２９３Т細胞をトランスフェクトすることによって、ウイルス調製物を得た。トランスフェクションの４８時間後、調製物を凍結し、使用されるまで貯蔵した。感染効率を増加させるために、感染混合物からＳｕｐＴ１細胞の懸濁液を遠心分離によって沈殿させた。ウイルスを添加する直前に、試験された化合物を細胞に添加した。インキュベーションの２時間後、感染混合物を、試験された化合物を含む新鮮な培養培地で交換した。４５時間後、非感染細胞培養物に対する蛍光で明るい細胞のパーセンテージをコンピューターで計算することによって、感染効率を評価した。同時に、試験された化合物の細胞傷害性を、同じ、ただし未感染の細胞株ＳｕｐＴ１で、ＸＴＴ試薬を使用して評価した。抗ウイルス活性および細胞傷害性を決定するために、調製物の連続１０倍希釈液を使用した（抗ウイルス活性のためには１０μＭから、細胞傷害性のためには１００μＭから開始した）。陰性対照としてＤＭＳＯ（０．１％）を使用した。ＥＣ５０、ＣＣ５０およびＳＩ（選択指数）の値を見出した。試験の品質を、以下の対照：シグナル対バックグラウンドの比率、インテグラーゼ阻害剤のラルテグラビル（１μＭ）、および試験結果の再現性に基づき評価した。エメチン（０．０３、０．０９、および０．２μＭ）を、細胞傷害性評価のための参照として使用した。表２に結果を要約する。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明は、医薬および獣医学において使用することができる。
【国際調査報告】
2020509046.tif 000015
2020509046.tif 000016
2020509046.tif 000017
2020509046.tif 000018