(57)【要約】  光応答性量子ドット（ＱＤ）薬物送達システム（ＱＤ−ＤＤＳ）を介して所望の組織に薬物を送達するための組成物及びその使用が記載される。ＱＤ−ＤＤＳは、ＱＤにより吸収される波長の光を当てるとＱＤ−ＤＤＳから放出可能な薬物分子を担持した水溶性ＱＤナノ粒子を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光応答性量子ドット（ＱＤ）薬物送達システム（ＱＤ−ＤＤＳ）であって、ＱＤによって吸収される波長で光を当てるとＱＤ−ＤＤＳから放出可能な薬物分子を担持した水溶性ＱＤナノ粒子を含む、光応答性量子ドット（ＱＤ）薬物送達システム。
【請求項２】
水溶性ＱＤナノ粒子は、１つの半導体材料で形成されたコアを含む、請求項１に記載の光応答性量子ドット（ＱＤ）薬物送達システム。
【請求項３】
水溶性ＱＤナノ粒子は、バンドギャップ値が傾斜合金化により外向きに増加する合金化半導体材料を含む、請求項１に記載の光応答性量子ドット（ＱＤ）薬物送達システム。
【請求項４】
水溶性ＱＤナノ粒子は、リガンド相互作用剤及び表面修飾リガンドを含む、請求項１に記載の光応答性量子ドット（ＱＤ）薬物送達システム。
【請求項５】
水溶性ＱＤナノ粒子は、ヘキサメトキシメチルメラミンを含む溶液中での、リガンド相互作用剤及び表面修飾リガンドのＱＤへの化学的添加により形成される、請求項４に記載の光応答性量子ドット（ＱＤ）薬物送達システム。
【請求項６】
リガンド相互作用剤は、Ｃ８−２０脂肪酸及びそのエステルである、請求項５に記載の光応答性量子ドット薬物送達システム。
【請求項７】
表面修飾リガンドは、モノメトキシポリエチレンオキシドである、請求項５に記載の光応答性量子ドット薬物送達システム。
【請求項８】
ナノ粒子は、キャッピングリガンドを含み、薬物分子は、ナノ粒子のキャッピングリガンドに物理的に捕捉されている、請求項１に記載の光応答性量子ドット薬物送達システム。
【請求項９】
キャッピングリガンドは、チオール、カルボキシル、アミン、ホスフィン、ホスフィンオキシド、ホスホン酸、ホスフィン酸、イミダゾール、ＯＨ、チオエーテル、及びカリキサレン基からなる群から選択される、請求項８に記載の光応答性量子ドット薬物送達システム。
【請求項１０】
薬物分子は、オクタノール−水分配係数（ｌｏｇＰ）が０よりも大きい疎水性である、請求項１に記載の光応答性量子ドット薬物送達システム。
【請求項１１】
薬物分子は、オクタノール−水分配係数（ｌｏｇＰ）が１よりも大きい疎水性である、請求項１に記載の光応答性量子ドット薬物送達システム。
【請求項１２】
薬物分子は、通常の青色光、ＵＶ光、レーザー光、ＬＥＤ光、多光子励起、及び電流から選択される励起源でＱＤを励起すると放出される、請求項１に記載の光応答性量子ドット薬物送達システム。
【請求項１３】
ＱＤは、薬物を担持する前に標的リガンドで誘導体化されている、請求項１に記載の光応答性量子ドット薬物送達システム。
【請求項１４】
標的リガンドは、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ；ＥＲＢＢ１としても知られている）ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２としても知られている）、ＥＲＢＢ３、ＭＥＴ（ＨＧＦＲとしても知られている）、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）、エフリン受容体Ａ３（ＥＰＨＡ３）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド受容体１（ＴＲＡＩＬＲ１；ＴＮＦＲＳＦ１０Ａとしても知られている）、ＴＲＡＩＬＲ２（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂとしても知られている）、核因子κＢリガンドの受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ；ＴＮＦＳＦ１１としても知られている）、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）、インテグリンαＶβ３、インテグリンα５β１、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、テネイシン、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＥｐＣＡＭ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ−７２、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＰＳＭＡ、葉酸結合タンパク質、ガングリオシドＧＤ２、ＧＤ３及びＧＭ２、ＰＤ−Ｌ２、並びにテロメラーゼサブユニットからなる群から選択される標的に向けられるモノクローナル抗体である、請求項１３に記載の光応答性量子ドット薬物送達システム。
【請求項１５】
水溶性ＱＤナノ粒子は、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＳｂ、ＡｌＰ、ＡｌＳ、ＡｌＳｂ、ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＳｂ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＡｇＩｎＳ２、ＡｇＳ、ＣｕＩｎＳ２、Ｓｉ、Ｇｅ、並びにそれらの合金、及びそれらのドープされた誘導体からなる材料の群から選択される半導体材料を含む、請求項１に記載の光応答性量子ドット（ＱＤ）薬物送達システム。
【請求項１６】
水溶性ＱＤは、カドミウム（Ｃｄ）、鉛（Ｐｂ）、水銀（Ｈｇ）、バナジウム（Ｖ）、及びヒ素（Ａｓ）、それらの合金、及びそれらのドープされた誘導体からなる群から選択される重金属半導体材料を含む、請求項１に記載の光応答性量子ドット薬物送達システム。
【請求項１７】
標的組織を治療する方法であって、薬物担持光応答性量子ドット薬物送達システムを投与することと、薬物送達システムから薬物の放出を誘導するのに十分な光を標的組織に当てることとを含む、標的組織を治療する方法。
【請求項１８】
薬物送達システムは、ヒト、動物、植物、及び他の生物の病状を診断、治療、治癒、緩和、又は予防するために使用される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
薬物送達システムは、動脈内、静脈内、腹腔内、くも膜下腔内、皮下、筋肉内、腫瘍内、経口、舌下、鼻、直腸、硬膜外、及び肺の経路から選択される経路によって全身投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
薬物送達システムは、外科手術中に、標的組織への直接点滴又は噴霧により投与される、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は概して、量子ドットナノ粒子を使用した薬物の送達のための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の範囲を限定することなく、背景が、既存の薬物送達システムに関連して説明される。刺激応答性薬物送達システム（ＤＤＳ）は、空間、時間、及び用量が制御されて薬物を送達するように設計できるならば、非常に望ましいものである。具体的には、送達をトリガーする能力には、時間制御され、かつ標的された薬物送達を可能にすることで、そして必要な用量を減らし、かつ全身暴露を最小限に抑えることで、全体的な毒性を減らすことが期待される。刺激応答性ＤＤＳの幾つかの概念が提唱されており、プロトン化、加水分解、及び（超）分子構造変化が挙げられる。ナノスケール刺激応答性システムのデザインにおける最近の進歩は、内因性及び外因性の刺激が挙げられる特定の刺激に応じて薬物の生体内分布を制御することを目的とするものである。提唱される内因性刺激として、ｐＨ、酵素濃度、及び酸化還元勾配の変化が挙げられる。提唱される外因性刺激として、温度、磁場、超音波強度、電気、及び光パルスの変動が挙げられる。これまで、光応答性薬物療法は、光に曝されると活性酸素種（ＲＯＳ）を生成する光感受性化合物及び光活性化合物の使用に焦点を合わせてきた。例えば、Ｌｉｕ，  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．"Ｔｈｅ  Ｓｍａｒｔ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ"  Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ  ６  （９）  （２０１６）  １３０６  −  １３２３を参照。
【０００３】
既存の試みは、光に応答して立体構造が変化するような設計された光応答性分子を提供していない。上記から、光誘導薬物送達を可能にする組成物及び方法が必要であると思われる。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書に記載の幾つかの実施形態では、薬物分子が担持された水溶性ＱＤナノ粒子を含む光応答性量子ドット薬物送達システム（ＱＤ−ＤＤＳ）が提供され、薬物分子は、ＱＤによって吸収される波長の光を当てることで、ＱＤ−ＤＤＳから放出可能である。幾つかの実施形態では、薬物分子は疎水性であり、オクタノール−水分配係数（ｌｏｇＰ）は０よりも大きい。幾つかの実施形態では、通常の青色光、ＵＶ光、レーザー光、ＬＥＤ光、多光子励起、及び電流から選択される励起源でＱＤを励起すると、薬物分子が放出される。
【０００５】
幾つかの実施形態における水溶性ＱＤナノ粒子は、１つの半導体材料で構成されたコアと、一部の実施形態では異なる半導体分子で構成された少なくとも１つのシェルとを含み、他の実施形態では、水溶性ＱＤナノ粒子は、バンドギャップ値が傾斜合金化により外向きに増加する合金化半導体材料を含む。
【０００６】
幾つかの実施形態では、光応答性ＱＤ−ＤＤＳは、リガンド相互作用剤及び表面修飾リガンドを有する水溶性ＱＤナノ粒子を含む。水溶性ＱＤナノ粒子は、ヘキサメトキシメチルメラミン（ＨＭＭＭ）を含む溶液中での、ＱＤへのリガンド相互作用剤及び表面修飾リガンドの化学的添加により形成され得る。幾つかの実施形態では、リガンド相互作用剤はＣ８−２０脂肪酸及びそのエステルであり、一方で、表面修飾リガンドはモノメトキシポリエチレンオキシドである。
【０００７】
幾つかの実施形態では、水溶性ナノ粒子は、担持される薬物分子を物理的に捕捉することができるキャッピングリガンドを含む。幾つかの実施形態では、キャッピングリガンドは、チオール、カルボキシル、アミン、ホスフィン、ホスフィンオキシド、ホスホン酸、ホスフィン酸、イミダゾール、ＯＨ、チオエーテル、及びカリキサレン基からなる群から選択される。
【０００８】
幾つかの実施形態では、水溶性ＱＤナノ粒子は、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＩｎＳｂ、ＡｌＰ、ＡｌＳ、ＡｌＡｓ、ＡｌＳｂ、ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＧａＳｂ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＡｇＩｎＳ２、ＡｇＳ、ＣｕＩｎＳ２、Ｓｉ、Ｇｅ、それらの合金、及びそれらのドープされた誘導体からなる材料の群から選択される半導体材料を含み得る。他の実施形態では、水溶性ＱＤは、カドミウム（Ｃｄ）、鉛（Ｐｂ）、水銀（Ｈｇ）、バナジウム（Ｖ）、ヒ素（Ａｓ）、それらの合金、及びそれらのドープされた誘導体からなる群から選択される重金属半導体材料を含む。
【０００９】
光応答性量子ドット（ＱＤ）薬物送達システムは、薬物を担持する前に標的リガンドで誘導体化されるＱＤを含んでよい。幾つかの実施形態では、標的リガンドは、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ；ＥＲＢＢ１としても知られている）、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２としても知られている）、ＥＲＢＢ３、ＭＥＴ（ＨＧＦＲとしても知られている）、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）、エフリン受容体Ａ３（ＥＰＨＡ３）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド受容体１（ＴＲＡＩＬＲ１；ＴＮＦＲＳＦ１０Ａとしても知られている）、ＴＲＡＩＬＲ２（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂとしても知られている）、核因子κＢリガンドの受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ；ＴＮＦＳＦ１１としても知られている）、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）、インテグリンαＶβ３、インテグリンα５β１、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、テネイシン、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＥｐＣＡＭ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ−７２、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＰＳＭＡ、葉酸結合タンパク質、ガングリオシドＧＤ２、ＧＤ３及びＧＭ２、ＰＤ−Ｌ２、並びにテロメラーゼサブユニットからなる群から選択される標的に向けられるモノクローナル抗体である。
【００１０】
ヒト、動物、植物、及びその他の生物の病状の診断、治療、治癒、緩和、又は予防を目的として、薬物を担持した光応答性ＱＤ薬物送達システムを投与することと、所望の時間及び場所にて薬物送達システムからの薬物の放出を誘導するのに十分な光を標的組織に当てることとを含む、標的組織を治療する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
特徴及び利点を含む本発明のより完全な理解のために、添付の図面と共に本発明の詳細な説明を参照する。
【００１２】
【図１】量子ドットの薬物担持及び光励起による薬物の放出の概略図を示す。
【００１３】
【図２】水溶性量子ドットの生成の一実施形態を示す。
【００１４】
【図３】薬物が担持された量子ドットからの光誘導薬物放出を試験するための例示的な実験構成を示す。
【００１５】
【図４】４５０ｎｍの青色光を照射した後における量子ドット薬物送達システムからのアズレンの放出の実験結果を示す。
【００１６】
【図５】４５０ｎｍの青色光を照射した後における量子ドット薬物送達システムからの７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシンの放出の実験結果を示す。
【００１７】
【図６】機能化量子ドットの構造内の様々なドメイン（疎水性、極性、イオン性）からの薬物の取込み、及び励起でトリガーされた放出の様々な態様の概略図を示す。
【００１８】
【図７】イオン対形成機能化量子ドットからのイオン性薬物の取込みと、励起でトリガーされた放出との概略図を示す。
【００１９】
【図８】緑色光の照射前後におけるＱＤ−ＤＤＳ処理した癌細胞の顕微鏡写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
既存の技術の短所を十分に認識して、本発明者らは、薬物を担持できて、刺激があると、担持された薬物を放出する能力を有する薬物送達ＱＤを提供することを試みた。本明細書では、高い安全性及び生体適合性プロファイルを特徴とし、照射があるとＱＤから放出される薬物が担持可能であるＱＤを提供する幾つかの実施形態を提供する。幾つかの実施形態では、送達デバイスは、生体適合性であって非毒性である蛍光ＱＤと薬物とのコンジュゲートとして設計される。他の実施形態では、薬物送達ＱＤは、細胞毒性薬物を含んでおり、半導体材料で形成され、当該半導体材料は、それ自体が毒性であり、薬物送達システムの細胞毒性に寄与する。他の実施形態では、送達デバイスは、薬物分子の吸着を可能にする不動態化リガンド又はコーティングを備えた単純なＱＤとして設計される。
【００２１】
ＱＤは、優れた光学特性を備えた蛍光性半導体ナノ粒子である。ＱＤは、従来の蛍光色素（インドシアニングリーン（ＩＣＧ）など）の何れよりも約２０倍明るく輝き、何倍も光安定性がある。重要なことに、ＱＤの滞留時間は、その化学的性質とナノサイズに起因して、より長くなる。ＱＤは、かなり強い光強度を吸収かつ放出できる。幾つかの実施形態では、薬物が担持されたＱＤは、複数の結合タグを備えており、二重又は三重特異性ナノデバイスを形成し得る。ＱＤのユニークな特性により、標的化薬物送達及び光線力学療法で満たされていないニーズを満たす幾つかの医療用途が可能となる。従って、そのようなコンジュゲートは、送達される薬物の位置を特定し、疾患の時間制御された局所治療を実現する能力を含む多様な特性を備えた「セラノスティック（theranostic）」ナノデバイスである。
【００２２】
本明細書で使用される用語「薬物」は、疎水性薬物及び親水性薬物の両方を含む任意の医薬化合物を含む。ある薬物は経腸投与によって送達され得るが、他の薬物は通常、非経口的に送達される。経腸送達は、舌下、経口、又は直腸でなされ得る。非経口送達は、静脈内注射、動脈内注射、髄腔内注射、筋肉内注射、又は皮下注射によるもの、並びに吸入及び局所送達によるものであり得る。血流中に吸収されると、薬物は体中を急速に循環し、平均循環時間は１分である。血液が再循環するにつれ、薬物は血流から組織中に移動する。水溶性（親水性）薬物は、血液及び細胞外液内にとどまる傾向がある一方、脂溶性（疎水性）薬物は、脂肪組織中で濃縮する傾向がある。
【００２３】
疎水性薬物は、たとえあるとしても水溶性に乏しく、（特に経口経路による）薬物送達に困難をもたらす。経口送達は、投与及び患者の服薬遵守の容易さ、費用対効果、無菌性への懸念の最小化、及び剤形の柔軟性のために、最も便利で一般的に採用されている薬物送達経路である。ある推定によると、市場で認可されている薬物の約４０％と送達経路の薬物の９０％とは、水にほとんど又は実質的に不溶である。そのような薬物は、経口で送達されると、薬物吸収が遅く、生物学的利用能が不十分で変動しやすく、胃腸粘膜毒性がある。その結果、溶解度は、全身循環系において所望の濃度を達成するのに、経口投与される薬物にとって重要なレート制限パラメーターとなる。水不溶性薬物の生物学的利用能を向上させるために、典型的なアプローチとして、粒子サイズの縮小、結晶工学、及び塩形成が挙げられる薬物の物理的及び／又は化学的修飾が挙げられる。マイクロ化又はナノ化が施された難水溶性薬物の例として、ラパマイシン（別名シロリムス）などの免疫抑制薬、パクリタキセルなどの抗癌剤、フェノフィブラートが挙げられるコレステロール降下薬、及びダナゾールなどのホルモンが挙げられる。
【００２４】
水不溶性薬物は、患者に有害反応を引き起こす虞がある界面活性剤又は共溶媒による製剤化を必要とする場合がある。共溶媒及び界面活性剤を用いて製剤化される難溶性薬物の例として、パクリタキセル及びテニポシドなどの抗癌剤、タクロリムスなどの免疫抑制薬、ジヒドロエルゴタミンなどの血管収縮薬、ドキシサイクリンなどの抗感染薬、及びメトカルバミルなどの筋弛緩薬が挙げられる。他の場合、水不溶性薬物は、固体分散体としてキャリア分子と共に形成され得る。固体分散体として製剤化された市販の難溶性又は不溶性の薬物の例としては、イトラコナゾール（Ｓｐｏｒａｎｏｘ（登録商標））などの抗感染薬、タクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ（登録商標））などの免疫抑制薬、ロピナビル／リトナビル（Ｋａｌｅｔｒａ（登録商標））及びエトラビリン（Ｉｎｔｅｌｅｎｃｅ（登録商標））などの抗ウイルス薬、並びにフェノフィブラート（Ｆｅｎｏｇｌｉｄｅ（登録商標））などのコレステロール降下薬が挙げられる。幾つかの不溶性薬物には、シクロデキストランなどのホストコーティング分子との包接化合物形成が施される。他の場合では、水不溶性薬物は、ミセルとして、又はリポソームで製剤化される。市販の、そして開発中のミセル製剤の双方の例として、パクリタキセル、ドキソルビシン、ＳＮ−３８（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン）、シスプラチン、オキサリプラチン、エピルビシン、及びＤＡＣＨ−プラチン（オキサリプラチンの代謝産物）などの抗癌剤が挙げられる。エストラジオールなどのエストロゲンは、経皮送達用のミセルナノ粒子として製剤化される。インスリンは中性ｐＨでは難溶性であるため、経口送達用の製剤はミセル製剤を使用して開発されている。リポソームで送達される水不溶性薬物の例として、アムホテリシンＢ、アミカシン、及びナイスタチンなどの抗感染薬、並びにクエン酸ダウノルビシン、トレチノイン、ドキソルビシン、及びビンクリスチンなどの抗腫瘍薬が挙げられる。難水溶性薬物は、固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）に製剤化され得る。ＳＬＮテクノロジーで製剤化された薬物の例としては、アポモルフィンなどの疼痛制御薬、シクロスポリンＡなどの免疫抑制薬、ゴナドトロピン放出ホルモンなどのホルモン、プロゲステロン及びインスリン、イブプロフェン及びニムスリドなどの抗炎症薬、イダルビシン及び５−フルオロウラシルなどの抗腫瘍薬、ロピナビル及びテトラサイクリンなどの抗感染薬、並びにレパグリニドなどの血糖降下薬が挙げられる。
【００２５】
不溶性又は難溶性の薬物は、不溶性の基礎として疎水性であり、本明細書に開示されるように、ＱＤ上への担持により送達され得る。一実施形態では、薬物が担持されたＱＤは、直接、標的組織の局所環境に送達される。次に、光源を標的組織の近くに配置して、ＱＤからの薬物の放出を誘導するのに十分な光を照射して、局所濃度を高める。上記に挙げられた薬物の多くは、かなりの用量制限的な全身毒性があるが、これは、本明細書に開示される局所放出により回避され得る。一実施形態では、疎水性薬物がＱＤに担持されて患者に投与されるような全身薬物毒性に対する解決策が提供される。薬物は、開放手順又は閉鎖手順の何れかによって、標的組織の局所環境中に光を当てることにより放出される。従って、薬物は、局所放出により、全身的には安全に投与され得ないであろう濃度で送達される。
【００２６】
本明細書に提示される実施形態では、ＱＤは、身体の水性環境でのＱＤの使用を可能にする親水性の外層又はコロナを呈するように機能化される。このようなＱＤは、水溶性ＱＤと呼ばれる。幾つかの実施形態では、水溶性ＱＤには水溶性薬物が担持される。薬物の放出は光の適用で行われるため、水溶性薬物は、投与されて、放出が望まれるまでＱＤと結合したままであることができる。一例として、水溶性薬物が担持された水溶性ＱＤは口から投与されてよく、口などの即時吸収により循環系に入ることなく消化管内の所望の位置に到達するまでＱＤと結合したままであってよい。
【００２７】
腫瘍の治療における全身送達の一例では、薬物が疎水性であろうと親水性であろうと、薬物が担持されたＱＤは、非経口投与されて、薬物が担持されたＱＤが腫瘍内で濃縮するまで循環させられ得る。腫瘍の海綿状血管は、循環系中の粒子を、全身に存在する粒子よりも高いレベルにまで捕捉することが知られているため、循環系を繰り返し通過した後、ＱＤなどの粒子は、腫瘍の血管系内に蓄積すると予想される。この現象は、透過性及び保持効果の強化（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔ：ＥＰＲ）として知られている。一実施形態では、ＱＤは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含んでおり、これは、循環する際に細網内皮系によるＱＤの除去を低減して、ＱＤが腫瘍内に蓄積することが可能になる。ＱＤが腫瘍に送達されると、開放又は閉鎖手順の何れかにより、標的組織の局所環境中に光を当てることにより、担持された薬物が放出される。光が腫瘍の局所環境に当てられる一実施形態では、腫瘍は神経内分泌腹腔内腫瘍であり、光源は内視鏡的に腹部に導入される。他の実施形態では、薬物が担持されたＱＤは、腫瘍組織に直接注入されて、薬物は、開放又は閉鎖手順の何れかにより標的腫瘍の局所環境に光を当てることにより放出される。
【００２８】
一実施形態では、薬物担持用のＱＤは、コンジュゲート可能な官能基（ＣＯＯＨ、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、アジド、アルキン）を備えた表面であってよい。例示的な一実施形態では、水溶性非毒性ＱＤは、カルボキシル機能化されており、又はカルボキシル機能化される。標的薬物送達効果のために、水溶性１−エチル−３−（−３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を採用したカルボジイミド結合技術を使用して、ＣＯＯＨ−ＱＤが標的化抗体のアミン末端に結合されてよい。カルボキシル機能化ＱＤは、ＥＤＣと混合されて活性Ｏ−アシルイソウレア中間体を形成し、これはその後、反応混合物中のモノクローナル抗体上の第一級アミノ基からの求核攻撃により置換される。必要に応じて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのスルホ誘導体（スルホ−ＮＨＳ）を、第一級アミンを持つ抗体との反応中に添加する。スルホ−ＮＨＳの添加により、ＥＤＣはＮＨＳをカルボキシルに結合して、Ｏ−アシルイソウレア中間体よりも安定なＮＨＳエステルを形成する一方、生理学的ｐＨでの第一級アミンへの効率的なコンジュゲートを可能にする。どちらの場合でも、結果はＱＤと抗体間の共有結合である。Ｓｕｚｕｋｉ−Ｍｉｙａｕｒａクロスカップリング、（スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）（ＳＭＣＣ）、又はアルデヒド系反応など、他の化学も代わりに使用されてよい。
【００２９】
コア及びコアシェルナノ粒子を合成する方法が、例えば所有者を同じくする米国特許第７，８６７，５５６号明細書、米国特許第７，８６７，５５７号明細書、米国特許第７，８０３，４２３号明細書、米国特許第７，５８８，８２８号明細書、及び米国特許第６，３７９，６３５号明細書に開示されている。前述の特許のそれぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。米国特許第９，１１５，０９７号明細書、米国特許第８，０６２，７０３号明細書、米国特許第７，９８５，４４６号明細書、米国特許第７，８０３，４２３号明細書、及び米国特許第７，５８８，８２８号明細書、並びに米国特許出願公開第２０１０／０２８３００５号明細書、米国特許出願公開第２０１４／０２６４１９６号明細書、米国特許出願公開第２０１４／０２７７２９７号明細書、及び米国特許出願公開第２０１４／０３７０６９０号明細書のそれぞれの内容全体は参照により本明細書に組み込まれ、大量の高品質の単分散量子ドットを生成する方法を説明している。
【００３０】
幾つかの実施形態では、光応答性ＱＤ−ＤＤＳは、水溶性ＱＤナノ粒子を利用しており、これは、半導体材料で形成されているが、異なる半導体材料の無機シェルを欠く「コアのみ」のナノ粒子とされる。コアのみのＱＤは光吸収が可能であるが、場合によっては、強力な蛍光発光を発揮しないため、発光がＱＤの目的である場合には好ましくない。薬物送達に使用する場合、強い蛍光発光を欠くが、光励起後の構造的摂動と薬物放出にとってエネルギー吸収が十分であるコアのみのＱＤが利用され得る。
【００３１】
他の実施形態では、コア／シェル粒子が利用され、当該コア／シェル粒子は、少なくとも１つの半導体組成物の中央領域、即ち「コア」を有しており、当該コアは、全く異なる半導体組成物である１又は複数の外層、即ち「シェル」に埋め込まれ、又はそれでコーティングされている。ある実施例では、コアは、Ｉｎ、Ｐ、Ｚｎ及びＳの合金から構成されてよく、ＺｎＳ分子クラスター上へのＩｎＰの分子シーディングとそれに続くＺｎＳのシェルの形成を含む実施例１の説明によって形成される。
【００３２】
さらに他の実施形態では、使用される水溶性ＱＤナノ粒子は、コア／シェルＱＤの製造の代わりに傾斜合金化によって外側方向にバンドギャップ値又はエネルギー（Ｅｇ）が増加する合金化半導体材料を含む。バンドギャップエネルギー（Ｅｇ）は、電子を、基底状態の価電子エネルギーバンドから空の伝導エネルギーバンドに電子を励起するために必要な最小エネルギーである。
【００３３】
傾斜合金ＱＤ組成は、別個のシェル層で覆われた別個のコアとして形成されるのではなく、粒子の中心又はその近くからＱＤの最表面まで元素組成が「傾斜」になっていると考えられる。一例としては、Ｉｎ１−ｘＰ１−ｙＺｎｘＳｙの傾斜合金ＱＤがあろう（式中、ｘ及びｙはＱＤの中心から表面に向かって０から１に徐々に増加する）。このような例では、ＱＤのバンドギャップは、純ＩｎＰのバンドギャップから中心に向かって徐々に変化して、表面の純ＺｎＳのバンドギャップ値よりも大きくなるであろう。バンドギャップは粒径に依存するが、ＺｎＳのバンドギャップはＩｎＰのバンドギャップよりも広いため、傾斜合金のバンドギャップはＱＤの内側から表面に向かって徐々に増加するであろう。
【００３４】
ワンポット合成プロセスが、本明細書の実施例１に記載されている分子シーディングプロセスの修飾として使用されてよい。これは、実施例１の「コア」粒子の生成について記載されているようなプロセス中において、亜鉛及び硫黄前駆体の量を増やして添加しつつ、粒子の成長を維持するために反応溶液に添加されるミリスチン酸インジウム（Ｉｎ（ＭＡ）３）及び（ＴＭＳ）３Ｐの量を徐々に減らすことで実現され得る。従って、一例では、ジブチルエステル及び飽和脂肪酸を反応フラスコに入れて、加熱しながら脱気する。窒素が導入されて、温度が上げられる。例えば、ＺｎＳ分子クラスター［Ｅｔ３ＮＨ］４［Ｚｎ１０Ｓ４（ＳＰｈ）ｌ６］などの分子クラスターが、撹拌されながら添加される。傾斜合金前駆体溶液が、濃度が徐々に減少する第１の半導体材料及び濃度が徐々に増加する第２の半導体材料の添加を含むランピング（ramping）プロトコルに従って添加されるにつれて、温度が上げられる。例えば、ランピングプロトコルは、ジカルボン酸エステル（例えば、セバシン酸ジ−ｎ−ブチルエステルなど）中に溶解したＩｎ（ＭＡ）３及びトリメチルシリルホスフィン（ＴＭＳ）３Ｐの添加から開始し、Ｉｎ（ＭＡ）３及び（ＴＭＳ）３Ｐの添加量は時間と共に徐々に減少して、濃度が徐々に増加する（ＴＭＳ）２Ｓ及び酢酸亜鉛などの硫黄及び亜鉛の化合物と置き換えられる。Ｉｎ（ＭＡ）３及び（ＴＭＳ）３Ｐの添加量が減少すると、飽和脂肪酸（ミリスチン酸又はオレイン酸など）及びジカルボン酸エステル（セバシン酸ジ−ｎ−ブチルエステルなど）中に溶解する（ＴＭＳ）２Ｓの量を酢酸亜鉛と一緒に徐々に増加させて添加する。以下の反応により、ＺｎＳ化合物の生成が増加することとなる。添加が継続すると、発光極大の波長が徐々に増加する、所望のサイズのＱＤ粒子が形成され、ここでは、ＩｎＰ及びＺｎＳの濃度は、ＱＤ粒子の中心に向かってＩｎＰの濃度が最高となり、ＱＤ粒子の外側のＺｎＳの濃度が最高となるように段階付けられる。所望の発光極大が得られると、反応物へのさらなる添加が停止されて、得られた傾斜合金粒子がアニールされて、続いて沈殿及び洗浄により粒子が単離される。
【００３５】
媒体とのナノ粒子の相溶性、並びに凝集、光酸化、及び／又はクエンチングに対するナノ粒子の感受性は、主にナノ粒子の表面組成によってもたらされる。コア、コアシェル、又はコアマルチシェルナノ粒子の何れかにおける最終的な無機表面原子に関する配位は、不完全なことがあり、表面上に反応性の高い「ダングリングボンド」が粒子の凝集を引き起こし得る。この問題は、「裸の」表面原子を、本明細書でキャッピングリガンド又はキャッピング剤と呼ばれる保護有機基で不動態化（キャッピング）することにより克服される。粒子のキャッピング又は不動態化は、粒子の凝集の発生を防ぐだけでなく、粒子を周囲の化学環境から保護し、かつコア材料の場合は粒子に電子的安定化（不動態化）を提供する。キャッピングリガンドは、粒子の最も外側の無機層の表面金属原子に結合したルイス塩基であってもよいが、これに限定されない。キャッピングリガンドの性質により、ナノ粒子と特定の媒体との相溶性が主に決まる。本明細書に開示される幾つかの実施形態では、キャッピングリガンドは、ＱＤ上に担持されることとなる薬物分子を物理的に捕捉する目的で選択される。キャッピングリガンドは、所望の特性に応じて選択され得る。採用され得るキャッピングリガンドのタイプとしては、チオール基、カルボキシル、アミン、ホスフィン、ホスフィンオキシド、ホスホン酸、ホスフィン酸、イミダゾール、ＯＨ、チオエーテル、及びカリキサレン基が挙げられる。カリックスアレーンを除き、これらのキャッピングリガンドはすべて、粒子の表面上にキャッピングリガンド用のアンカー中心を形成し得る頭部基を有する。キャッピングリガンドの本体は、直鎖であっても、環状であっても、芳香族であってもよい。キャッピングリガンド自体は、大きくても、小さくても、オリゴマーであっても、多座であってもよい。リガンドの本体と、粒子上に結合していない突出側との性質が一緒になって、リガンドが親水性、疎水性、両親媒性、負、正又は両性イオンであるかどうかが判定される。
【００３６】
多くの量子ドット材料では、キャッピングリガンドは疎水性である（例えば、アルキルチオール、脂肪酸、アルキルホスフィン、アルキルホスフィンオキシドなど）。従って、ナノ粒子は典型的には、ナノ粒子の合成及び単離後に、トルエンなどの疎水性溶媒中に分散される。そのようなキャップされたナノ粒子は通常、より極性の高い媒体には分散しない。ＱＤの表面修飾が必要な場合、最も広く使用されている手順はリガンド交換として知られている。コア合成及び／又はシェル化手順中にナノ粒子の表面に配位する親油性リガンド分子が、その後、極性／帯電リガンド化合物と交換され得る。別の表面修飾戦略では、ナノ粒子の表面にすでに配位されているリガンド分子を用いて、極性／帯電分子又はポリマー分子を挿入する。しかしながら、特定のリガンド交換及びインターカレーション手順により、ナノ粒子は水性媒体により適合しやすくなるが、対応する未修飾ナノ粒子よりも低い量子収率（ＱＹ）及び／又は実質的に大きいサイズの材料が得られ得る。
【００３７】
必要でない場合、ｉｎ  ｖｉｖｏの目的のためには低毒性プロファイルのＱＤが望ましい。従って、一部のセラノスティックの目的のために、ＱＤは、カドミウム、鉛、及びヒ素などの有毒な重金属を実質的に含まないか（例えば、５ｗｔ％未満、４ｗｔ％未満、３ｗｔ％未満、２ｗｔ％未満、１ｗｔ％未満、０．５ｗｔ％未満、０．１ｗｔ％、０．０５ｗｔ％未満、又は０．０１ｗｔ％未満のカドミウム、鉛、及びヒ素などの重金属しか含有しない）、カドミウム、鉛、及びヒ素などの重金属を含まないことが好ましい。一実施形態では、カドミウムや鉛などの重金属を欠く毒性が低いＱＤが、薬物担持への使用に提供される。一方、毒性薬物が送達されているなどの一部の実施形態では、ＱＤ自体にさらなる毒性を付与させることが望ましい場合がある。そのような場合、カドミウム、鉛、及びヒ素などの有毒重金属などの重金属で形成されたＱＤが使用され得る。
【００３８】
ＱＤの独自の特性により、満たされていないｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ診断、臨床画像化、標的薬物送達、及び光線力学療法が挙げられる、幾つかの潜在的な医療用途が可能になる。ＱＤの医療用途に関する主な懸念の１つは、研究の大部分が、カドミウム、鉛、及びヒ素などの有毒重金属を含有するＱＤに焦点を合わせていることであった。本明細書に記載の生物学的に適合性の、水溶性の重金属を含まないＱＤは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方で医療用途に安全に使用され得る。幾つかの実施形態では、１０〜２０ｎｍの流体力学的サイズ（完全ＩｇＧ２抗体の寸法サイズの範囲内）を有するｉｎ  ｖｉｖｏ適合性の水分散性カドミウムフリーＱＤが提供される。一実施形態では、本明細書の実施例１及び２に記載の手順に従って、ｉｎ  ｖｉｖｏ適合性水分散性カドミウムフリーＱＤが製造される。幾つかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏ適合性水分散性カドミウムフリーＱＤは、カルボキシル機能化されて、リガンド結合部分でさらに誘導体化される。
【００３９】
本明細書に開示されるｉｎ  ｖｉｖｏ生体適合性水分散性カドミウムフリーＱＤを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ毒性試験では、市販のカドミウム系ＱＤよりも少なくとも２０倍、細胞毒性が低いことが示され、有用な用量よりも数倍高くても、動物モデルで毒性徴候は観察されなかった。さらに、本明細書で提供されるｉｎ  ｖｉｖｏ生体適合性水分散性カドミウムフリーＱＤナノ粒子は。溶血効果も補体Ｃ３活性化も示さず、好ましい臨床適合性プロファイルを示す。
【００４０】
カドミウム、鉛、及びヒ素を含まないナノ粒子の例として、半導体材料、例えば、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＳｂ、ＡｌＰ、ＡｌＳ、ＡｌＳｂ、ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＳｂ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＡｇＩｎＳ２、ＣｕＩｎＳ２、Ｓｉ、Ｇｅ、並びにそれらの合金、及びそれらのドープされた誘導体を含むナノ粒子、特に、これらの材料の１つのコア及びこれらの材料の別の１又は複数のシェルを含むナノ粒子が挙げられる。
【００４１】
単一の半導体材料、例えば、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＩｎＰ、ＧａＮなどを含むナノ粒子は、ナノ粒子の表面の欠陥やダングリングボンドにて発生する非放射性電子正孔再結合により、量子効率が比較的低くなり得ることに注意する。これらの問題に少なくとも部分的に対処するために、ナノ粒子コアは、コアの材料とは異なる材料、例えば「コア」の材料とは異なる半導体材料の１又は複数の層（本明細書では「シェル」とも呼ばれる）で少なくとも部分的にコーティングされてよい。１又は複数のシェルに含まれる材料は、周期表の族２〜１６の何れか１又は複数由来のイオンを組み込んでもよい。ナノ粒子に２つ以上のシェルがある場合、各シェルは異なる材料で形成されていてもよい。例示的なコア／シェル材料では、コアは上記で指定された材料の１つから形成され、シェルはコア材料よりも大きいバンドギャップエネルギー及びコア材料と格子寸法が似たような半導体材料を含む。例示的なシェル材料として、ＺｎＳ、ＺｎＯ、ＺｎＳｅ、ＭｇＳ、ＭｇＳｅ、ＭｇＴｅ及びＧａＮが挙げられるが、これらに限定されない。マルチシェルナノ粒子の一例は、ＩｎＰ／ＺｎＳ／ＺｎＯである。コア内及び表面状態から離れた電荷キャリアの閉じ込めにより、安定性と量子収率が向上したナノ粒子が得られる。
【００４２】
しかしながら、有毒な重金属を含まないＱＤが望ましい場合もあるが、カドミウムを含まないナノ粒子の表面を修飾することが特に困難であることがわかっている。カドミウムを含まないナノ粒子の表面を修飾するために前述のリガンド交換法などの方法を使用すると、カドミウムを含まないナノ粒子は容易に劣化する。例えば、カドミウムを含まないナノ粒子の表面を修飾する試みは、そのようなナノ粒子のルミネセンスＱＹの著しい減少を引き起こすことが観察されている。本明細書に開示される特定のｉｎ  ｖｉｖｏ目的のために、高ＱＹの、表面修飾された、カドミウムを含まないナノ粒子が必要である。本明細書に開示される高ＱＹの、カドミウムを含まない水分散性ナノ粒子は、約２０％超、約２５％超、約３０％超、約３５％超、又は約４０％超のＱＹを有する。特定のｉｎ  ｖｉｖｏの実施形態では、重金属を含まない半導体インジウム系ナノ粒子、或いはインジウム及び／又はリンを含むナノ粒子が好ましい。
【００４３】
幾つかの実施形態では、非毒性ＱＤナノ粒子は表面修飾されて水溶性にされており、リガンド相互作用剤に曝して誘導体化を可能にしてリガンド相互作用剤とＱＤの表面との結合をもたらす表面部分を有している。リガンド相互作用剤は、以下に記載されるように、鎖部分と、結合／架橋剤に対して特異的な親和性又は反応性を有する官能基とを含み得る。鎖部分は、例えば、アルカン鎖であり得る。官能基の例は、チオ基、ヒドロキシル基、カルボキサミド基、エステル基、及びカルボキシル基などの求核基が挙げられる。リガンド相互作用剤はまた、ＱＤの表面に対する親和性を有する部分を含んでも含まなくてもよい。そのような部分の例として、チオール、アミン、カルボキシル基、及びホスフィンが挙げられる。リガンド相互作用基がそのような部分を含まない場合、リガンド相互作用基は、キャッピングリガンドとインターカレートすることによりナノ粒子の表面と結合し得る。リガンド相互作用剤の例として、例えば、ミリスチン酸イソプロピルなどのＣ８−２０脂肪酸及びそのエステルが挙げられる。
【００４４】
リガンド相互作用剤は、単にナノ粒子の合成に使用されるプロセスの結果としてＱＤナノ粒子と結合されて、ナノ粒子を追加量のリガンド相互作用剤に曝す必要性を無くすことができることに留意すべきである。そのような場合、さらなるリガンド相互作用剤をナノ粒子と結合させる必要はないかもしれない。代替的又は追加的に、ナノ粒子が合成かつ単離された後、ＱＤナノ粒子はリガンド相互作用剤に曝されてよい。例えば、ナノ粒子は、リガンド相互作用剤を含む溶液中で一定期間インキュベートされてもよい。そのようなインキュベーション、又はインキュベーション期間の一部は、リガンド相互作用剤の、ナノ粒子の表面との結合を促進するために高温であってよい。リガンド相互作用剤とナノ粒子の表面との結合に続いて、ＱＤナノ粒子は、連結剤／架橋剤及び表面修飾リガンドに曝される。連結剤／架橋剤は、リガンド相互作用剤の基及び表面修飾リガンドとの特定の親和性を有する官能基を含む。リガンド相互作用剤−ナノ粒子結合複合体は、連結剤／架橋剤及び表面修飾リガンドに連続的に曝されてよい。例えば、ナノ粒子は、架橋を行うために一定期間、連結剤／架橋剤に曝されてから、表面修飾リガンドに曝されて、それがナノ粒子のリガンドシェルに組み込まれてよい。或いは、ナノ粒子は、連結剤／架橋剤及び表面修飾リガンドの混合物に曝されるので、架橋をもたらすことができ、表面修飾リガンドを単一のステップで組み込むことができる。
【００４５】
以下の実施例は、開示の完全性のため、本発明の組成物及び複合体の製造方法を説明するため、そして組成物の特定の特徴を提示するために含まれる。これらの実施例は、本開示の範囲又は教示を制限することを決して意図しない。
【実施例】
【００４６】
＜実施例１＞
＜非毒性量子ドットの合成＞
分子シーディングプロセスを使用して、非毒性のＱＤを生成した。簡単に説明すると、５００〜７００ｎｍの範囲で発光する非機能化インジウム系量子ドットの調製を、次のように行った。ジブチルエステル（約１００ｍｌ）及びミリスチン酸（ＭＡ）（１０．０６ｇ）を３つ口フラスコに入れて、真空下で約７０℃で１時間脱気した。この期間の後、窒素を導入して、温度を約９０℃に上げた。約４．７ｇのＺｎＳ分子クラスター［Ｅｔ３ＮＨ］４［Ｚｎ１０Ｓ４（ＳＰｈ）ｌ６］を添加して、混合物を約４５分間撹拌した。次いで、温度を約１００℃に上げ、その後、Ｉｎ（ＭＡ）３（１Ｍ、１５ｍｌ）を滴加し、続いてトリメチルシリルホスフィン（ＴＭＳ）３Ｐ（１Ｍ、１５ｍｌ）を滴加した。温度を約１４０℃に上げながら反応混合物を撹拌した。１４０℃で、セバシン酸ジ−ｎ−ブチルエステル中に溶解したＩｎ（ＭＡ）３（１Ｍ、３５ｍｌ）をさらに滴加（５分間撹拌して放置）して、セバシン酸ジ−ｎ−ブチルエステル中に溶解した（ＴＭＳ）３Ｐ（１Ｍ、３５ｍｌ）を作製した。その後、温度をゆっくりと１８０℃に上げて、さらにＩｎ（ＭＡ）３（１Ｍ、５５ｍｌ）、続いて（ＴＭＳ）３Ｐ（１Ｍ、４０ｍｌ）を滴加した。このように前駆体を添加することにより、発光極大が５００ｎｍから７２０ｎｍに徐々に増加するインジウム系粒子が形成された。所望の発光極大が得られたときに反応を停止して、反応温度で半時間撹拌した。この期間の後、混合物を最大約４日間（反応温度よりも約２０〜４０℃低い温度で）アニールした。この段階では、アニールを支援するためにＵＶランプも使用した。
【００４７】
カニューレ技術を介して乾燥脱気メタノール（約２００ｍｌ）を添加することにより、粒子を単離した。沈殿物を沈降させた後、フィルタースティックの助けを借りてカニューレを介してメタノールを除去した。乾燥した脱気クロロホルム（約１０ｍｌ）を加えて固体を洗浄した。固体を真空下で１日間乾燥させた。この手順により、ＺｎＳ分子クラスター上にインジウム系ナノ粒子が形成された。さらなる処理では、希フッ化水素酸（ＨＦ）中で洗浄することにより、得られるインジウム系ナノ粒子の量子収率がさらに増加した。インジウム系コア材料の量子効率は、約２５％〜５０％の範囲であった。この組成は、Ｉｎ、Ｐ、Ｚｎ、及びＳを含む合金構造とみなされる。
【００４８】
ＺｎＳシェルの成長：ＨＦエッチングされたインジウム系コア粒子の２０ｍｌ部を３つ口フラスコ内で乾燥させた。１．３ｇのミリスチン酸及び２０ｍｌのセバシン酸ジ−ｎ−ブチルエステルを添加して、３０分間脱気した。溶液を２００℃に加熱して、２ｍｌの１Ｍ（ＴＭＳ）２Ｓを（７．９３ｍｌ／ｈの速度で）滴加した。この添加が完了した後、溶液を２分間放置し、次いで１．２ｇの無水酢酸亜鉛を添加した。溶液を２００℃で１時間保持した。その後、室温まで冷却した。得られた粒子は、４０ｍｌの無水脱気メタノールを加えて遠心分離することにより単離した。上澄み液を廃棄して、３０ｍｌの無水脱気ヘキサンを残りの固体に加えた。溶液を５時間静置した後、再び遠心分離した。上澄み液を収集して、残った固体を廃棄した。最終的な非機能化インジウム系ナノ粒子材料のＱＹは、有機溶媒中の約６０％〜９０％の範囲であった。
【００４９】
＜実施例２＞
＜水溶性表面修飾ＱＤ＞
本明細書では、メラミンヘキサメトキシメチルメラミン（ＨＭＭＭ）修飾蛍光ナノ粒子を生成して、薬物送達ビヒクルとして使用する方法の一実施形態を提供する。独自のメラミン系コーティングは、優れた生体適合性、低毒性、非常に低い非特異的結合を示す。これらの独自機能により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方で、幅広い生物医学的用途が可能となる。
【００５０】
適切な水溶性ナノ粒子の調製の一例は、次のとおりである。インジウム及びリンを、実施例１に記載のＺｎ含有シェルと共に含む合金をコア材料として有する、６０８ｎｍで赤色発光する、２００ｍｇのカドミウムを含まないＱＤを、ミリスチン酸イソプロピル（１００マイクロリットル）を加えたトルエン（１ｍｌ）中に分散させた。ミリスチン酸イソプロピルは、リガンド相互作用剤として含まれている。混合物を５０℃で約１〜２分間加熱した後、室温で１５時間ゆっくり振とうした。ＨＭＭＭ（ＣＹＭＥＬ  ３０３、Ｃｙｔｅｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ、ＮＪから入手可能）（４００ｍｇ）、モノメトキシポリエチレンオキシド（ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ２０００−ＯＨ）（４００ｍｇ）、及びサリチル酸（５０ｍｇ）のトルエン溶液（４ｍｌ）をナノ粒子分散液に加えた。機能化反応に含まれるサリチル酸は、触媒、架橋剤、及びＣＯＯＨ源として３つの役割を果たす。ＯＨ基に対するＨＭＭＭの選好に部分的に起因して、サリチル酸によって提供される多くのＣＯＯＨ基は、架橋後もＱＤ上で利用可能なままである。
【００５１】
ＨＭＭＭは、次の構造を有するメラミン系連結剤／架橋剤である。
【化１】
2020519565.tif 000003
【００５２】
ＨＭＭＭは、酸触媒反応で反応して、アミド、カルボキシル基、ヒドロキシル基、及びチオールなどの様々な官能基を架橋し得る。
【００５３】
混合物を脱気し、最初の１時間は１３０℃で還流し、続いてマグネチックスターラーで３００ｒｐｍで撹拌しながら１４０℃で３時間還流した。最初の１時間は、ＨＭＭＭと求核基との反応によって生成された揮発性副生成物を確実に除去するために、窒素流をフラスコに通した。混合物を室温まで冷却させて、不活性ガス下で保存した。表面修飾されたナノ粒子は、修飾されていないナノ粒子と比較して、蛍光量子収率の損失をほとんど又はまったく示さず、発光ピーク又は半値全幅（ＦＷＨＭ）値の変化を示さなかった。表面修飾ナノ粒子のアリコートを真空下で乾燥させて、脱イオン水を残渣に加えた。表面修飾されたナノ粒子は水性媒体中によく分散して、永続的に分散したままであった。対照的に、未修飾ナノ粒子は水性媒体に懸濁できなかった。上記の手順による表面修飾ナノ粒子の蛍光ＱＹは４０〜５０％である。典型的なバッチでは、４７％±５％の量子収率が得られる。
【００５４】
別の実施形態では、６０８ｎｍで赤色発光するカドミウムを含まないＱＤ（２００ｍｇ）を、コレステロール（７１．５ｍｇ）入りトルエン（１ｍｌ）中に分散させた。混合物を５０℃で約１〜２分間加熱し、次いで室温で１５時間ゆっくり振とうした。ＨＭＭＭ（Ｃｙｍｅｌ  ３０３）（４００ｍｇ）、モノメトキシポリエチレンオキシド（ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ２０００−ＯＨ）（４００ｍｇ）、グアイフェネシン（１００ｍｇ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）（２ｍＬ）及びサリチル酸（５０ｍｇ）のトルエン溶液（４ｍｌ）をナノ粒子分散液に加えた。
【００５５】
本明細書で使用される化合物「グアイフェネシン」は、以下の化学構造を有する：
【化２】
2020519565.tif 000004
【００５６】
本明細書で使用される化合物「サリチル酸」は、以下の化学構造を有する：
【化３】
2020519565.tif 000005
【００５７】
混合物を脱気して、マグネチックスターラーで３００ｒｐｍで撹拌しながら１４０℃で４時間還流した。前の手順と同様に、最初の１時間に窒素流をフラスコに通して、ＨＭＭＭと求核基との反応によって生成された揮発性副生成物を確実に除去した。混合物を室温まで冷却させて、不活性ガス下で保存した。表面修飾ナノ粒子のアリコートを真空下で乾燥させて、脱イオン水を残渣に加えた。１００ｍＭのＫＯＨ溶液を使用して溶液のｐＨを６．５に調整して、Ａｍｉｃｏｎフィルター（３０ｋＤ）を使用した３サイクルの限外ろ過により、過剰な未反応物質を除去した。最終水溶液を、使用するまで冷蔵した。図２は、生成プロセス、及び生じた表面修飾ＱＤを示す。
【００５８】
ナノ粒子を修飾して水溶性を高める従来の方法（例：メルカプト機能化水溶性リガンドとのリガンド交換）は、ナノ粒子を水溶性にするための穏やかな条件下では効果がないことは注目に値する。熱や超音波処理などの過酷な条件下では、水溶性になる画分のＱＹは非常に低くなる（＜２０％）。対照的に、本方法は、高い量子収率の水溶性ナノ粒子を提供する。本明細書で定義されるように、高い量子収率は４０％以上である。幾つかの実施形態では、４５％以上の高い量子収率が得られる。この実施例のように調製された表面修飾ナノ粒子は、エタノール、プロパノール、アセトン、メチルエチルケトン、ブタノール、トリプロピルメチルメタクリレート、又はメチルメタクリレートなどの他の極性溶媒中にも十分に分散し、かつ永続的に分散したままである。
【００５９】
＜実施例３＞
＜光応答性薬物送達システム＞
一実施形態では、実施例１及び２によるものを含む非毒性の水溶性ＱＤが生成され、続いて薬物が担持される。他の実施形態では、ＱＤは、カドミウム、鉛、及びヒ素などの重金属半導体材料を含む。そのような材料の例として、硫化鉛（ＰｂＳ）、セレン化鉛（ＰｂＳｅ）、セレン化カドミウム（ＣｄＳｅ）、硫化カドミウム（ＣｄＳ）、テルル化カドミウム（ＣｄＴｅ）、硫セレン化カドミウム（ＣｄＳｅＳ）、ヒ化ガリウム（ＧｄＡｓ）、ヒ化インジウム（ＩｎＡｓ）並びにそれらのハイブリッド及び合金、例えば、限定されないが、ＣｄＳｅ１−ｘＴｅｘ（０≦ｘ≦１）及びＣｄ１−ｘＺｎｘＳｅ１−ｙＴｅｙ（０≦ｘ；ｙ≦１）などが挙げられる。一部の実施形態では、薬物送達システムを使用して細胞増殖を制御する、又は細胞死をもたらす薬物を送達する場合、毒性重金属を含むＱＤの使用により、ＱＤ薬物担体自体が、固有の毒性による複合システムの細胞毒性に寄与することが実現される。そのような例の１つが、殺腫瘍性用途での使用である。他の実施形態では、効能は、乾癬などの非悪性過剰増殖性障害の治療においてあり、薬物送達システムは局所投与される。例えば、乾癬の治療に使用するような幾つかの実施形態では、薬物送達システムのＱＤは、投与される細胞のアポトーシスに寄与するカドミウム又はヒ酸塩を含んでもよい。ＣｄＳｅ量子ドットからのＣｄ２＋原子などの細胞毒性原子の解放は、酸化及び紫外線照射が挙げられる幾つかのメカニズムによって達成され得る。Ｄｅｒｆｕｓ，  ＡＭ，  ｅｔ  ａｌ．"Ｐｒｏｂｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔｓ"  Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４  （１）  （２００４）  １１  −  １８を参照。
【００６０】
幾つかの実施形態では、薬物は、水及び油において二重の混和性を有する疎水性薬物分子であって（例：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アルコール、プロピレングリコール、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）など）、溶媒中に最初に薬物を溶解することによってＱＤ上に担持されている。次に、薬液をＱＤの水溶液に滴加する。薬物は、目視検査及び他のタイプの検査によって判定できるように、ＱＤの担持容量を過度に超えない量で加えられ得る。過剰な未結合薬物分子は、限外ろ過又は透析により除去され得る。疎水性薬物を担持する場合、薬物の疎水性は、水性媒体中に長時間滞留することなく、薬物分子を溶媒からＱＤの表面中に直接移動させるほど十分に高い。幾つかの実施形態では、ＱＤは、薬物の疎水性及びハンセン溶解度パラメーターと一致するように修飾される。幾つかの実施形態では、薬物分子は疎水性であり、オクタノール−水分配係数（ｌｏｇＰ）は０よりも大きい。（ＬｏｇＰ＝０は、親水性＝疎水性の場合である。０よりも大きいｌｏｇＰは疎水性であり、０よりも小さい値は親水性である。）他の実施形態では、薬物分子は疎水性であり、オクタノール−水分配係数（ｌｏｇＰ）は１よりも大きい。（ｌｏｇＰが１の場合、有機相での薬物の１０：１の分布を意味することとなる。）
【００６１】
分配係数（partition-coefficient)（Ｐ）又は分布係数（distribution-coefficient）（Ｄ）は、平衡状態にある２つの不混和相の混合物中の化合物の濃度の比であり、２つの相における化合物の溶解度の差の尺度を構成する。分配係数は、化合物の疎水性／親水性の最も広く使用されている尺度である。分配係数は、ｌｏｇＰ又はｌｏｇＰｅｘｐとして表される。実験的に判定されるのではなく計算される場合、分配係数はＣｌｏｇＰと呼ばれる。一般的に、分配係数（Ｐ）は非イオン化化合物に関連して使用される一方、分布係数（Ｄ）は、化合物のすべての種に関連して使用され、ｐＨに依存する。
【００６２】
薬物学において、Ｐを測定する際の２つの相は一般に水と１−オクタノールであり、結果として生じる分配値は、以下の式に従ってｌｏｇＰとして表される。
【数１】
2020519565.tif 000006
式中、［Ｃｕ］ｏ及び［Ｃｕ］ｗは、オクタノール相（ｏ）及び水相（ｗ）における非イオン化種ｕの濃度である。
【００６３】
ｌｏｇＰは、化合物の親水性（「水を好む」）又は疎水性（「水を恐れる」）の性質の尺度を提供する。疎水性薬物はオクタノール／水分配係数が高く、親水性薬物はオクタノール／水分配係数が低い。例えば、親水性分子であるアスコルビン酸のｌｏｇＰｏ／ｗは−１．８５である一方、親油性の高い薬物であるクロトリマゾールのｌｏｇＰｏ／ｗは５．２である。一般的な薬物で実験的に判定されたｌｏｇＰ値の範囲は、約−２．０〜約５．２である。Ａｖｄｅｅｆ，  Ａ．  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ，  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｃｈａｒｇｅ  ｓｔａｔｅ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  ２００３，  Ｔａｂｌｅ  ４．１，  ｐｇｓ．５９  −  ６６を参照。
【００６４】
薬物分子の疎水性が所定のＱＤに合うほど高くない幾つかの実施形態では、薬物溶液及びＱＤ溶液を最初に混合し、そして形成された二成分溶媒（Ｈ２Ｏ／テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）など）を蒸発によって除去することができる。次に、最終残留物を適切な緩衝液（例えば、脱イオン水（ＤＩ）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））中で再構成する。このプロセス（固体分散と呼ばれることが多い）は、薬物分子の注入を可能にする。過剰な未結合薬物分子は、限外ろ過又は透析により除去され得る。
【００６５】
単離されたＱＤ−ＤＤＳは、励起光を照射すると薬物分子を放出する刺激応答性薬物担体として使用され得る。励起されたＱＤ粒子が薬物分子を放出するメカニズムとして、リガンド振動の増加、表面分極の変化、及び界面部位での水分子の揺れの増加の１又は複数が挙げられ得る。
【００６６】
本明細書に開示される薬物担持ＱＤを含む医薬組成物は、幾つかの実施形態において経腸投与用に適合される。他の実施形態では、医薬組成物は、非経口的、即ち、動脈内、静脈内、腹腔内、くも膜下腔内、皮下、又は筋肉内に投与されるように適合される。幾つかの実施形態では、医薬組成物は、ボーラス注射により静脈内又は腹腔内に投与される。
【００６７】
他の送達の実施形態では、本明細書に開示される薬物担持ＱＤを含む医薬製剤は、組織への製剤の直接投与により標的組織と接触する。投与は、局所的に、又は「開放」若しくは「閉鎖」手順によってなされ得る。本明細書では、「局所」は、環境に曝された組織への製剤の直接投与を意味しており、環境は、皮膚又は粘膜及び外耳道などであるが、これらに限定されない。「開放手順」とは、患者の皮膚、粘膜、又は他の組織を切断して、製剤を投与するために、隠れている組織を露出させて直接視覚化することを含む手順を意味する。これは、外科的に達成でき、肺アクセスのための開胸、腹部開腹による腹部内臓アクセス、又は標的組織への他の直接的な外科的アプローチを介するものが挙げられる。「閉鎖手順」とは、内部標的組織を直接視覚化するのではなく、皮膚又は粘膜内の小さな開口部に挿入された器具を介してアクセスかつ視覚化する経皮内視鏡手順である。例えば、腹腔鏡検査は腹部で行われる閉鎖手順であり、関節鏡検査は関節にアクセスして治療するために行われる閉鎖手順である。閉鎖手順を使用して、後房眼内手術を行うことができる。製剤は、内視鏡装置を通して投与されてもよい。
【００６８】
薬物担持ＱＤ薬物を含む医薬組成物は、水、緩衝水、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなどが挙げられる張度調整剤と、ｐＨ調整剤が挙げられる標準的な賦形剤とをさらに含んでもよい。アルブミン、リポタンパク質、グロブリン、グリシン、デキストロースなどの安定性を高めるためのさらなる剤が含まれてもよい。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術により滅菌されてよい。得られた水溶液は、使用のために包装されてもよいし、無菌条件下でろ過されて凍結乾燥されてもよく、凍結乾燥製剤は投与前に滅菌水溶液と組み合わされる。
【００６９】
本明細書の実施例に記載される水溶性ＱＤに吸着された疎水性薬物分子は、安定した薬物送達システムを形成することとなり、例えば、遠心分離、蒸発、移出、及び再製剤化され得る。
【００７０】
投与後、そして所望されれば標的組織中への蓄積の後、薬物分子は光照射すると放出される。これについての１つの可能性のあるメカニズムは、励起が振動モードを誘発して、ＱＤに結合したリガンドを、薬物分子を放出するように揺する放出である。高強度の照射はまた、加温（４０〜４５℃）を引き起こし、これが振動を増加させ得る。ヒト内での光照射は、放出を誘発するために、沈着した薬物に十分に近接した発光体の並置によって起こり得る。発光体は、皮膚、粘膜、眼内組織、及び内部組織が挙げられる任意の標的組織の近くに直接的に配置されてよく、そこでは組織の貫通により十分な光の透過が可能になり、又は開放若しくは閉鎖手順により配置されてよい。
【００７１】
＜実施例４＞
＜標的リガンドを含む光応答性薬物送達システム＞
幾つかの実施形態では、水溶性ＱＤは、薬物担持の前に、ＱＤに添加される標的リガンドを含むように修飾される。従って、一実施形態では、非毒性であって水溶性（生体適合性）であり、コンジュゲート可能な官能基（ＣＯＯＨ、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、アジド、アルキン）を表面に備えた量子ドットナノ粒子が合成される。例えば、本明細書の実施例２で提供されるＣＯＯＨ官能基など、ＱＤに加えられ得る官能基のおかげで、ＱＤは、ＱＤが標的組織に選択的に付着して標的組織中に蓄積できるようにする標的リガンドを含むように修飾されてよい。薬物は、標的リガンド修飾ＱＤに担持されて送達される。薬物は光励起により局所的に放出される。
【００７２】
例示的な一実施形態では、水溶性非毒性ＱＤは、カルボキシル機能化され、又はカルボキシル機能化される。ＣＯＯＨ−ＱＤは、例えば水溶性１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を採用したカルボジイミド結合技術などの化学的方法を使用して、腫瘍標的化抗体のアミン末端に結合される。カルボキシル機能化ＱＤはＥＤＣと混合されて活性Ｏ−アシルイソウレア中間体を形成し、これはその後、反応混合物中のモノクローナル抗体上の第一級アミノ基からの求核攻撃により置換される。必要に応じて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのスルホ誘導体（スルホ−ＮＨＳ）を、第一級アミンを持つ抗体との反応中に添加する。スルホ−ＮＨＳの添加により、ＥＤＣはＮＨＳをカルボキシルに結合して、Ｏ−アシルイソウレア中間体よりも安定なＮＨＳエステルを形成し、生理学的ｐＨでの第一級アミンへの効率的な結合を可能にする。何れにしても、結果はＱＤと抗体間の共有結合である。Ｓｕｚｕｋｉ−Ｍｉｙａｕｒａクロスカップリング、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、又はアルデヒド系反応など、他の化学作用も代わりに使用され得る。
【００７３】
一実施形態では、非毒性の水溶性ＱＤは、腫瘍組織上に優先的に発現される又は腫瘍成長に必要な分子の細胞外ドメインに向けられる抗体に、化学的に結合される。そのような分子（これに対してモノクローナル抗体が開発されている）の幾つかの例があり、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ；ＥＲＢＢ１としても知られている）ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２としても知られている）、ＥＲＢＢ３、ＭＥＴ（ＨＧＦＲとしても知られている）、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）、エフリン受容体Ａ３（ＥＰＨＡ３）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド受容体１（ＴＲＡＩＬＲ１；ＴＮＦＲＳＦ１０Ａとしても知られている）、ＴＲＡＩＬＲ２（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂとしても知られている）、核因子κＢリガンドの受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ；ＴＮＦＳＦ１１としても知られている）、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）、インテグリンαＶβ３、インテグリンα５β１、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、テネイシン、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＥｐＣＡＭ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ−７２、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＰＳＭＡ、葉酸結合タンパク質、ガングリオシドＧＤ２、ＧＤ３、及びＧＭ２、プログラム細胞死１リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）、並びにテレメラーゼサブユニットが挙げられる。
【００７４】
ＥＲＢＢ２標的に対するモノクローナル抗体、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）の商品名で販売）への水溶性非毒性ＱＤのコンジュゲートが例示される。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）は、ＨＥＲ２、別名ＥＲＢＢ２、陽性乳癌、胃癌又は胃食道癌の治療に使用される。
【００７５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ適合性の水分散性カドミウムフリーＱＤのトラスツズマブとの共有結合：エッペンドルフチューブ内で、１ｍｇのカルボキシル機能化水溶性ＱＤを１００μｌ  ＭＥＳ活性化緩衝液と混合した（つまり、２５μｌの４０ｍｇ／ｍｌストックを１００μｌ  ＭＥＳ中に入れた）。ＭＥＳ緩衝液は、ｐＨ４．５の脱イオン（ＤＩ）水中の２５ｍＭ溶液（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸ヘミナトリウム塩（ＭＥＳ）、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）として調製した。これに、３３μｌの新鮮なＥＤＣ溶液（ＤＩ水中３０ｍｇ／ｍｌストック、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加えて、溶液を混合した。これに、４μｌの新鮮なスルホ−ＮＨＳ（ＤＩ水中１００ｍｇ／ｍｌストック、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加えて、溶液を混合した。ＮａｎｏＳｅｐ  ３００Ｋフィルター（ＰＡＬＬ  ＮａｎｏＳｅｐ  ３００Ｋ  Ｏｍｅｇａウルトラフィルター）は、１００μｌ  ＭＥＳ中で事前に湿らせた。ＭＥＳ／ＥＤＣ／Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ／ＱＤ溶液をＮａｎｏＳｅｐ  ３００Ｋフィルターに加えて、ＭＥＳで５００μｌになるまで補充した。フィルターを５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。保持されたドットを、５０μｌの活性化緩衝液中に再分散させて、１０μｌのトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、ＨＥＰＥＳ緩衝液の２５ｍＭ溶液中の１００ｍｇ／ｍｌストック、ｐＨ  ８．５）＋４０μｌ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．５を含有するエッペンドルフチューブに移した。溶液を十分に混合して、室温で一晩（約１６〜１８時間）インキュベートした。溶液を、１６μｌの６−アミノカプロン酸（６ＡＣ）（１９．７ｍｇ／１００ｍＭ）でクエンチした。クエンチは、第一級アミンを有する他の化合物で代替的に実施できることに留意されたいが、ＣＯＯＨを有し、生成物のコロイド安定性を維持できるため、この実施形態では６ＡＣを選択した。溶液を、あらかじめ湿らせたＮａｎｏｓｅｐ  ３００Ｋフィルター（１００μｌ  １×ＰＢＳ）に移して、１×ＰＢＳで５００μｌラインまで補充した。Ｎａｎｏｓｅｐ  ３００Ｋフィルター及び１×ＰＢＳ緩衝液を使用した３サイクルの限外ろ過により、過剰なＳＡＶを除去した。遠心分離の各サイクルは、２０分間５０００ｒｐｍであった。各サイクル後に約４００μｌの１×ＰＢＳで再分散させた。最終濃縮液を１００μｌのＰＢＳ中に再分散させた。調製されたトラズツズマブコンジュゲートＱＤは、明るい蛍光を発して、ＨＥＲ２陽性４Ｔ１細胞の表面に結合するが、対照ＨＥＲ２陰性４Ｔ１細胞には結合しないことが示された。
【００７６】
＜実施例５＞
＜アズレンＱＤ−ＤＤＳの調製＞
一試験的実施形態では、視覚的に観察可能な有機化合物アズレンを使用して薬物担持を試験した。アズレンは、ビシクロ［５．３．０］デカペンタエンとして系統的ＩＵＰＡＣ名によっても知られており、ナフタレンの異性体である。アズレンは、本質的に水に不溶の固体結晶物質である（溶解度＝０．０２ｇ／水１００ｇ）。アズレンのｌｏｇＰｏｃｔ／ｗａｔは２．７９である。アズレンは有機溶媒に可溶である。アズレンの構造を以下に示す：
【化４】
2020519565.tif 000007
【００７７】
約５０ｍｇの６３３ｎｍ発光性水溶性ＱＤ（Ｎａｎｏｃｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄにより提供されるＶｉｖｏｄｏｔｓ（商標）ナノ粒子）を、６１０μＬのＨ２Ｏ中に分散させた。この溶液に、５０μｌのプロピレングリコール中０．５ｍｇのアズレンを混合しながら滴加した。
【００７８】
アズレンが水に不溶性であるという事実にもかかわらず、青いアズレンの液滴をＱＤ溶液に直に入れても、最終溶液は青い沈殿物を何ら示さなかった。最終溶液の色は茶色に変わったが、励起すると強い蛍光を発した。形成されたアズレンＱＤ−ＤＤＳの光応答性を試験するために、２つの２５０ｍＬガラスビーカーにそれぞれ２００ｍＬのＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ  ８０溶液を充填した。次に、０．５ｍＬのＱＤ−ＤＤＳ溶液（各２０ｍｇ）をＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（商標）透析カセット（２５ｋＤａカットオフ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ）に注入した。２つのカセットを準備して、各ビーカー内に１つずつ浸した。ビーカーの１つに、ＢＬＵ（バックライトユニット、光出力：２．５ｍｗ／ｃｍ２）パネルからの弱い４５０ｎｍ光を照射して、他方は暗所に置いた（図３）。所定の間隔でビーカーから溶液のサンプルを取り出して、ＵＶ  Ｃａｒｙ分光計を使用してＵＶスペクトルを取得した。図４に示すように、照射されたビーカーはアズレンの顕著な放出を示したが、非照射ビーカーはわずかなベースライン放出しか示さなかった。
【００７９】
＜実施例６＞
＜７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシンＱＤ−ＤＤＳの調製＞
薬物の担持と放出を試験するために、薬物７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシンを試験した。７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシンのＣＡＳ番号は８６６３９−５２−３であり、ＳＮ−３８としても知られている。７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシンは、イリノテカンの活性代謝物として形成される抗腫瘍薬であるが、活性はイリノテカンの１０００倍を超える。イリノテカンは、天然化合物のカンプトテシンに由来し、トポイソメラーゼＩ阻害剤として機能する。イリノテカンは、とりわけＣａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標）のブランド名で販売されている。ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅが商品名Ｈｙｃａｍｔｉｎ（登録商標）で販売しているトポテカンは、癌治療に使用される別のカンプトテシン類似体である。
【００８０】
７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシンは結晶性固体として供給され、特定の有機溶媒に可溶であるが（ＤＭＳＯ中での溶解度は２ｍｇ／ｍｌである）、水中に本質的に不溶である。非常に親油性である分子の例として、ＳＮ−３８のｌｏｇＰｏｃｔ／ｗａｔは３．３６±０．５である。７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシンの構造を以下に示す：
【化５】
2020519565.tif 000008
【００８１】
水中でのカンプトテシンの不溶性は、その臨床製品としての開発を制限してきた。従って、カンプトテシンを可溶化する努力が、とりわけ、米国特許第５，４４７，９３６号明細書（１０−ヒドロキシ−７−エチルカンプトテシンをジメチルアセトアミド及び酸中に可溶化）、米国特許第５，６７４，８７４号明細書（７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシンをジメチルイソソルビド中に可溶化）、米国特許第５，８５９，０２３号明細書（Ｎ−メチル−２−ピロリドン中にＡ環置換カンプトテシンを可溶化）、米国特許第５，９００，４１９号明細書（酸、ＰＥＧ、及び低級アルコールと共にＮ−メチル−２−ピロリドン中にＢ環置換カンプトテシンを可溶化）が挙げられる幾つかの特許出願の主題となってきた。
【００８２】
カンプトテシン化合物の担持及び放出を試験するために、実施例１及び２に従って調製した約３８ｍｇの６３３ｎｍ発光性水溶性ＱＤ（Ｖｉｖｏｄｏｔｓ（商標）ナノ粒子）を４４０μＬのＨ２Ｏに分散させた。この溶液に、０．５ｍｇの７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシンの５００μＬのＤＭＳＯ溶液を、混合しながら滴加した。溶液はほんの限られた曇りを有して透明のままであったが、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシンが水に不溶性であるという事実にもかかわらず、沈殿は観察されなかった。薬物分子がＱＤの表面に完全に分散することを確実にするために、溶液を４０℃で数分間温めた。限外ろ過を使用して、過剰な（結合していない）薬物分子を除去した。これは、溶液をＡｍｉｃｏｎ  ３０ＫＤａ遠心ろ過ユニット（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ−４、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ−Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ）に移して、ＤＩ水で希釈してから、２５００ｒｐｍで３０分間回転させることで行われた。濃縮液（約２５０μｌ）を４ｍＬのＤＩ水で再度希釈して、遠心分離を第２のサイクルについて繰り返した。最終濃縮液（約２５０μｌ）を２ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水で希釈して、暗所で４℃で保存した。
【００８３】
形成された７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシンＱＤ−ＤＤＳの光応答性を試験するために、２つの２５０ｍＬガラスビーカーにそれぞれ２００ｍＬのＰＢＳを満たした。次に、１ｍＬのＱＤ−ＤＤＳ溶液（それぞれ約１５ｍｇ）をＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（商標）透析カセット（２５ｋＤａカットオフ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ）に注入した。２つのカセットを準備して、１つを各ビーカー内に浸した。ビーカーの一方に、ＬＥＤライトエンジンからの強い４５０ｎｍの光を照射して（出力：３１０ｍＷ／ｃｍ２）、他方を暗所に置いた（図３）。所定の間隔でビーカーから溶液のサンプルを取り出して、ＵＶ  Ｃａｒｙ分光計を使用してＵＶスペクトルを取得した。図５に示すように、照射されたビーカーは７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシンの顕著な放出を示したが、非照射ビーカーはわずかなベースライン放出しか示さなかった。
【００８４】
＜実施例７＞
癌細胞に対する７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシンＱＤ−ＤＤＳの効果。実施例６に記載したＱＤ−ＤＤＳ調製物を、細胞培地（ＭｃＣｏｙの５Ａ培地）中で培養したＳＫ−ＢＲ３ヒト乳房腺癌細胞に試験した。
【００８５】
約７０％の細胞密度で２つの等しく培養した皿を、最終濃度４００マイクログラム／ｍＬの７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシンＱＤ−ＤＤＳで１５時間処理し、次いで、ＦＩＴＣフィルターセットを使用して、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ２００Ｍ蛍光顕微鏡の２．５倍対物レンズの下で、２つのプレートのうち１つだけを５分間照射した。図８に示すように、細胞の標識が増加したことから明らかなように、照射されたプレートのみが顕著な細胞損傷を示した。これは、細胞膜の完全性が損なわれたことに起因する。
【００８６】
＜実施例８＞
＜水溶性表面修飾ＱＤ＞
一実施形態では、メルカプト系極性リガンドを使用してナノ粒子を水溶性にする水溶性ＱＤを生成及び使用する方法が提供される。メルカプトコハク酸、メルカプトウンデカン酸、メルカプトヘキサン酸、メルカプトプロピオニン酸、メルカプト酢酸、システイン、メチオニン、及びメルカプトＰＥＧなどのリガンドが例としてあるが、同様のメルカプトリガンドが当業者には自明であろう。
【００８７】
そのような方法の１つでは、過剰のメルカプトリガンド（例えば、メルカプトコハク酸）を、ナノ粒子及びメルカプトリガンドに十分な量の一般的な溶媒で溶解又は分散させる。典型的な一般的な溶媒として、クロロホルム、ＤＣＭ、ＴＨＦ、アニソール、又はトルエンがあり得る。次に、ＱＤの同溶媒溶液を加えて、１０〜１５分間激しく混合してから、１５時間超放置して、メルカプトリガンドでのキャッピングを誘導する。インキュベーション後、数ミリリットルの塩基性水溶液（水酸化アンモニウムなど）を加えて、数分間激しく撹拌してから、室温で一晩ゆっくりと撹拌する。このプロセスの後、ＱＤは水層に移動したことがわかり、浸透などによって分離することができる。次に、ＱＤ水溶液を限外ろ過で繰り返し洗浄して、過剰なリガンドを除去する。
【００８８】
実施例２で説明した最終精製ＱＤ水溶液中のＱＤナノ粒子に、強く負に帯電したリガンドが備わっている場合、アルカロイドやカチオン分子などの正に帯電した極性薬物分子を、イオン対形成により引き付けることができる。カチオン性薬物の例として、プロカルバジン、ダカルバジン、エトポシド、及びアマンタジンが挙げられる。図７で比喩的に示すように、ＱＤ（１０）に、強く正に帯電したリガンド（６０）が備わっている場合、誘導体化されたＱＤは、例えば、メトトレキサート、ナプロキセン、インドメタシン、及びｉＲＮＡなどの核酸などの負に帯電した（アニオン）薬物分子（７０）をイオン対形成により引き付けることができる。
【００８９】
芳香族リガンドが、実施例２に記載される水溶性ドットの有機コーティング（例えば、サリチル酸）に使用されている場合、芳香族薬物分子は、π−πスタッキング効果によってＱＤに結合し得る。芳香薬物の例として、フェニトイン（５，５−ジフェニル−イミダゾリジン−２，４−ジオン：２．４７のｌｏｇＰ）、ジアゼパム（７−クロロ−１，３−ジヒドロ−１−メチル−５−フェニル−２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−オン：２．８２のｌｏｇＰ）、キナゾリン含有薬、例えば、癌化学治療ゲンチチニブ（４−（３'−クロロ−４'−フルオロアニリノ）−７−メトキシ−６−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン：３．２のｌｏｇＰ）などその他多数が挙げられる。
【００９０】
図６は、天然のキャッピングリガンド（アルキルチオール又はステアリン酸など）由来のアルキル鎖（２０）を含むＱＤ（１０）を示す。示されるＱＤは、内側疎水性ドメイン（４０）、中間の両親媒性ドメイン（３０）、及び外側親水性ドメイン（５０）を含み、疎水性、両親媒性、親水性の薬物の何れの薬物担持にも対応でき、薬物は、その撥水撥油性（phobicity）と関連するドメインに入る。
【００９１】
内側疎水性ドメイン（４０）は、結合した疎水性（非極性）リガンド（４１）のおかげで生成される。これらの非極性リガンドは、アルキルチオール、脂肪酸、及びコレステロール由来の脂肪族鎖を含む。両親媒性ドメイン（３０）は、小分子（グアイフェネシン、サリチル酸、及びメルカプトアルキル酸など）、界面活性剤（サポニン及び脂肪酸など）、及びポリマー（ＰＥＧ、アクリレートコポリマー、及びポリ酢酸ビニルなど）によって提供され得る。極性ドメイン（５０）は、カルボキシル、ＯＨ、ＮＨ２、ＮＨ３＋、及びＳＨ基から選択されるコーティングリガンドなどの親水性極性リガンド（５１）によって付与される。
【００９２】
本明細書の実施例２に従って大部分が疎水性のコレステロール部分を使用して生成される場合、内側層（４０）の疎水性は、コレステロールの嵩高い（bulky）ステロイド及び炭化水素鎖によって付与される。ミリステートを使用して生成された場合、ミリステートの炭化水素尾部は疎水性環境を提供する。疎水性部分としてコレステロール又はミリステートを使用するかどうかにかかわらず、疎水性部分は、最初にネイティブリガンド由来のアルキル鎖と相互作用することにより（疎水性相互作用により）付加され、次いで、疎水性部分に含まれるＯＨ基は、ＨＭＭＭ（ＣＹＭＥＬ  ３０３）との反応を使用するなどして、他のＯＨ及びＣＯＯＨ基と架橋される。
【００９３】
疎水性（非イオン）薬物の例として、プレドニゾロン（（１１ベータ）−１１，１７，２１−トリヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン：１．６６のｌｏｇＰ）などのステロイドが挙げられ、これは、疎水性ドメインに担持され得る。癌化学療法薬ダクチノマイシン（フェナキサジンにより結合された２つの環状ペプチドで構成される２−アミノ−Ｎ，Ｎ'−ビス（ヘキサデカヒドロ−２，５，９−トリメチル−６，１３−ビス（１−メチルエチル）−１，４，７，１１，１４−ペンタオキソ−１Ｈ−ピロロ（２，１−Ｉ）（１，４，７，１０，１３）オキサテトラ−アザシクロヘキサデシン−１０−イル）−４，６−ジメチル−３−オキソ−３Ｈ−フェノキサジン−１，９−ジカルボキサミド、別名、アクチノマイシンＤ：１．６のｌｏｇＰ）が挙げられる他の非イオン性薬物もまた、疎水性ドメイン（４０）に担持され得る。
【００９４】
疎水性の負に帯電した薬物として、レチノイド酸（トレトニン、３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチル−１−シクロヘキセン−１−イル）−２，４，６，８−ノナテトラエン酸：６．３のｌｏｇＰ）が挙げられる。疎水性の正に帯電した薬物として、フェンタニル（１−フェネチル−４−（Ｎ−フェニルプロピオンアミド）ピペリジン：４．０５のｌｏｇＰ）が挙げられる。これらのような疎水性薬物は、機能化されたＱＤの内側疎水性ドメイン（４０）中に隔離され得る。
【００９５】
特定の薬物の親水性は、電荷に大きく依存する。例えば、負に帯電した薬物ワルファリン（Ｃｏｕｍａｄｉｎ（登録商標））のｌｏｇＤ７．４は１．１２である。しかしながら、ｌｏｇＰＩ（イオン化状態）は０．０４であり、ｌｏｇＰＮ（中性）は３．５４である。同様に、負に帯電した非ステロイド性抗炎症薬スリンダク（Ｃｌｉｎｏｒｉｌ（登録商標））のｌｏｇＤ７．４は０．１２であるが、ｌｏｇＰＮ（中性）は３．６０である。親水性の正に帯電した薬物として、ブレオマイシン（−０．５２のＣｌｏｇＰ）、デスモプレシン（１−（３−メルカプトプロピオン酸）−８−Ｄ−アルギニン−バソプレシン：−４．２のｌｏｇＰｅｘｐ）、ネオスチグミン（３−トリメチルアンモニウムフェニルＮ，Ｎ−ジメチルカルバメート：−１．６のＣｌｏｇＰ）、及びスキサメトニウム（スクシニルコリン：−２．５のＣｌｏｇＰ）が挙げられる。これらのような親水性薬物は、電荷（イオン）相互作用により薬物と相互作用する、ＱＤに付加された帯電基により、親水性ドメイン（５０）中に担持され得る。
【００９６】
薬物の最大グループの１つが、カチオン性両親媒性薬物（ＣＡＤ）であり、これは通常、疎水性環構造と、カチオン性アミン基を有する親水性側鎖とを含有する。内側疎水性ドメイン（４０）と外側親水性ドメイン（５０）の間に挟まれた両親媒性ドメイン（３０）が介在するため、図６に示すＱＤは、分子が、疎水性ドメイン（４０）中の疎水性部分及び親水性ドメイン（５０）中の親水性部分とアラインし得るので、親水性部分及び疎水性部分の両方を有する分子を収容し得る。ＣＡＤとして、ゲンタマイシン、クリンダマイシン、テリスロマイシン、及びアジスロマイシンなどの抗菌剤；フルオキセチン（Ｐｒｏｚａｃ（登録商標））及びイミプラミンなどの抗うつ薬；アミオダロンなどの抗不整脈薬；ケトチフェンなどの抗喘息薬；シロリムス及びサーティカンなどの免疫抑制薬；クロルフェンテルミンなどの食欲不振剤；ゾニサミドなどの抗てんかん薬；アラピプラゾール及びクロルプロマジンなどの抗精神病薬；メマンチンなどの抗アルツハイマー病薬；レボドパなどの抗パーキンソン病薬；並びにベポタスチンなどの抗ヒスチミンが挙げられる多くのよく知られた重要な薬物が挙げられる。また、両親媒性の非イオン性薬物として、コルヒチン（１．８５のｌｏｇＰ）、グアイフェネシン（３−（２−メトキシフェノキシ）プロパン−１，２−ジオール：１．３９のｌｏｇＰ）、及びアナストロゾール（アルファ、アルファ、アルファ'、アルファ'−テトラメチル−５−（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イルメチル）−ｍ−ベンゼンジアセトニトリル、アロマターゼ阻害剤：２．４のｌｏｇＰ）が挙げられる。
【００９７】
本明細書に引用されるすべての刊行物、特許及び特許出願は、本明細書にその全体が記載されているかのように参照により本明細書に組み込まれる。本発明を例示的な実施形態を参照して説明してきたが、この説明は限定的な意味に解釈されることを意図したものではない。例示的な実施形態の様々な改変及び組み合わせ、並びに本発明の他の実施形態は、説明を参照して直ぐに当業者に明らかになるであろう。従って、添付の特許請求の範囲はそのような改変及び強化を包含することを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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