(57)【要約】ＢＳＨ活性を示す酵素を標的化し、同定し、単離するためのプローブ実施形態、ならびにそのプローブを使用するデバイスおよびキットが、本明細書において記載されている。プローブ、デバイス、およびキットの製造方法ならびに使用方法も記載されている。いくつかの実施形態では、生体試料中の酵素を標的化し、同定し、単離するためのプローブ、デバイス、およびキットが開示されている。いくつかの実施形態では、本明細書に開示のプローブ、デバイス、およびキットを使用した治療用組成物および治療方法が記載されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉを満たす構造を有するプローブ
【化１】
2020536566.tif 000044
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の各々は独立して水素または−ＯＲから選択され、各Ｒは独立して水素；酸素原子の負電荷のバランスをとる対イオン；脂肪族；ヘテロ脂肪族；芳香族；または脂肪族、ヘテロ脂肪族、もしくは芳香族の任意の組み合わせから選択される；Ｒ５は水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、芳香族、または脂肪族、ヘテロ脂肪族、もしくは芳香族の任意の組み合わせである；リンカーは脂肪族、ヘテロ脂肪族、芳香族、または脂肪族、ヘテロ脂肪族、もしくは芳香族の任意の組み合わせである；ＤＭは検出可能部位である；ｐＤＭは検出可能部位前駆体である；ＰＭは光活性化可能部位である；ＡＭはアンカー部位である；ｎは０〜１０の整数である；ｍは０または１から選択される整数である）。
【請求項２】
ｍが１であり、前記リンカーが−（ＣＨ２）ｐ−；
【化２】
2020536566.tif 000045
；
2020536566.tif 000046
（式中、各ｐは独立して１〜１０の整数とし、各ｑは独立して０〜１０の整数である）である、請求項１に記載のプローブ。
【請求項３】
前記ＤＭ基が存在し、前記ＤＭ基がフルオロフォア、色原体、または特定の結合ペアのメンバーである、請求項１または請求項２に記載のプローブ。
【請求項４】
前記ｐＤＭ基が存在し、前記ｐＤＭ基がアルキンまたはアジドである、請求項１または請求項２に記載のプローブ。
【請求項５】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の各々が独立して水素、−ＯＨ、または−Ｏ−Ｍ＋（式中、Ｍ＋はＬｉ＋、Ｋ＋、Ｎａ＋、またはＮＨ４＋から選択される対イオンである）である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項６】
前記ＰＭ基が存在し、前記ＰＭ基がアジリジンまたはベンゾフェノンである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項７】
前記ＡＭ基が存在し、前記ＡＭ基がアルキン、アジド、カルボン酸、ＮＨＳ−エステル、アミン、またはハロゲン化アルキルである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項８】
ｍが０であり、前記ＤＭ基が存在し、前記ＤＭ基が
【化３】
2020536566.tif 000047
である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項９】
ｍが１であり、前記ＰＭ基と前記ｐＤＭ基との両方が存在する、請求項１、３、または６に記載のプローブ。
【請求項１０】
ｍが１であり、前記ＡＭ基と前記ｐＤＭ基との両方が存在する、請求項１、３、または７に記載のプローブ。
【請求項１１】
前記プローブが式ＩＩＡまたはＩＩＢを満たす構造を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のプローブ
【化４】
2020536566.tif 000048
【請求項１２】
前記プローブが式ＩＩＩＡ〜ＩＩＩＦの１つ以上を満たす構造を有する、請求項１に記載のプローブ
【化５−１】
2020536566.tif 000049
【化５−２】
2020536566.tif 000050
（式中、各ｐは独立して１〜１０の整数であり、各ｑは独立して０〜２０の整数である）。
【請求項１３】
以下から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のプローブ
【化６−１】
2020536566.tif 000051
【化６−２】
2020536566.tif 000052
【化６−３】
2020536566.tif 000053
【化６−４】
2020536566.tif 000054
【化６−５】
2020536566.tif 000055
【化６−６】
2020536566.tif 000056
【化６−７】
2020536566.tif 000057
【化６−８】
2020536566.tif 000058
【化６−９】
2020536566.tif 000059
【化６−１０】
2020536566.tif 000060
【請求項１４】
以下の工程を含む、方法：
被験体または試料を、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のプローブに、前記プローブと胆汁酸塩を加水分解することができる酵素との結合によりプローブ−酵素コンジュゲートが形成されるのに十分な時間さらす工程と；
前記プローブと前記酵素との間の反応によって生成される検出可能シグナルを識別するのに十分な検出技法を使用して、前記被験体または前記試料を分析する工程。
【請求項１５】
前記酵素が前記プローブに結合したときに、検出可能部位が前記プローブから放出される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記プローブがｐＤＭ基を含み、前記方法が、前記ｐＤＭ基と反応することができるクリック可能な官能基を含む検出可能部位基に前記プローブ−酵素コンジュゲートをさらす工程をさらに含む、請求項１４または請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記プローブがＰＭ基を含み、前記方法が、前記試料または前記被験体を光源にさらして前記ＰＭ基と前記酵素との結合を促進し、それによって前記プローブ−酵素コンジュゲートを形成する工程をさらに含む、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記プローブ−酵素コンジュゲートまたは前記プローブ−酵素コンジュゲートを含む微生物を使用して、ゲノムアッセイまたはプロテオミクスアッセイを行う工程をさらに含む、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
以下の工程を含む、方法：
胆汁酸塩を加水分解することができる少なくとも１種の酵素を請求項１〜１３のいずれか一項に記載のプローブで標識し、少なくとも１種の標識酵素を提供する工程と；
検出可能シグナルを検出することにより、試料中の前記少なくとも１種の標識酵素の存在を判定する工程と；
前記少なくとも１種の標識酵素または前記少なくとも１種の標識酵素を含む微生物をソーティングするか単離する工程と；
前記少なくとも１種の標識酵素を含む前記微生物を同定する工程と；
前記少なくとも１種の酵素の胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を変化させる身体環境を選択する工程と；
前記選択した身体環境を同定した微生物で富化することによって、または前記選択した身体環境において同定した微生物の量を減少させることによって、または前記選択した身体環境において胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を低下させることによって、またはそれらの組み合わせによって前記選択した身体環境における胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を変化させ、それによって疾患もしくは状態を治療する工程。
【請求項２０】
以下を含む、キット：
基板と；
式Ｉを満たす構造を有するプローブ
【化７】
2020536566.tif 000061
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の各々は独立して水素または−ＯＲから選択され、各Ｒは独立して水素；酸素原子の負電荷のバランスをとる対イオン；脂肪族；ヘテロ脂肪族；芳香族；または脂肪族、ヘテロ脂肪族、もしくは芳香族の任意の組み合わせから選択される；Ｒ５は水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、芳香族、または脂肪族、ヘテロ脂肪族、もしくは芳香族の任意の組み合わせである；リンカーは脂肪族、ヘテロ脂肪族、芳香族、または脂肪族、ヘテロ脂肪族、もしくは芳香族の任意の組み合わせである；ＤＭは検出可能部位である；ｐＤＭは検出可能部位前駆体である；ＡＭはアンカー部位である；ｎは０〜１０の整数である；ｍは０または１から選択される整数である；前記プローブは、前記ＡＭ基を介して前記基板の表面に共有結合している）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１７年１０月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／５７１，９４１号の先の優先日の利益を主張する；この先行出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（政府支援の承認）
本発明は、米国エネルギー省から授与されたＤＥ−ＡＣ０５７６ＲＬ０１８３０の下で、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本開示は、胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を同定するためのプローブならびにその製造方法および使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
腸内マイクロバイオームは、栄養吸収および宿主への化学シグナル伝達に対する影響を含む、宿主の健康状態を決定する役割を担っている。現在のところ、関与する微生物分類群と、これらのプロセスを実行するために微生物分類群が採用する特定の細胞機構（酵素）とに関する情報を与えるアプローチはほとんどない。腸内微生物の複合混合体は、宿主の健康状態に大きな影響を与える可能性がある。マイクロバイオーム−宿主相互作用の顕著な例は、宿主の胆汁酸プールの微生物による化学修飾である。特定の微生物は、胆汁酸塩ヒドロラーゼの活性を介して胆汁酸プールの疎水性を調節することができる。胆汁酸塩ヒドロラーゼ（ＢＳＨ）は、遊離胆汁酸およびアミノ酸への胆汁酸塩の加水分解を触媒する。ＢＳＨ活性の結果は、胆汁酸プールの物理化学的特性の正味の変化であり、最終的には胆汁酸プールはより疎水性になり、したがって脂肪性腸内容物が排泄されやすくなる。ＢＳＨ活性を高めることは、肥満および高コレステロール血症の治療に効果的な戦略であると考えられている。また、ＢＳＨ活性は肝がんおよび大腸がんとの関連性も知られている。現在、胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を特性評価するためのバイオアッセイは、時間がかかるか、感度が低い。当該技術分野では、胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を示す酵素を同定し、特性評価し、富化するための新規技法およびプローブが必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書に開示されているのは、胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を示す被分析物を同定することが可能なプローブ実施形態である。いくつかの実施形態では、プローブは、本明細書に開示の式のいずれかまたはすべてに記載の構造を有する。代表的なプローブ種も開示されている。
【０００６】
また、本明細書に開示のプローブの使用方法の実施形態は、被験体または試料を、プローブ実施形態に、プローブと胆汁酸塩を加水分解することができる酵素との結合によりプローブ−酵素コンジュゲートが形成されるのに十分な時間さらす工程と；プローブと酵素との間の反応によって生成される検出可能シグナルを識別するのに十分な検出技法を使用して、被験体または試料を分析する工程を含む。胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性に関連する疾患の治療方法または予防方法の実施形態も開示されている。いくつかの実施形態では、本方法は、以下の工程の任意の１つ以上を含み得る：（ｉ）胆汁酸塩を加水分解することができる少なくとも１種の酵素を本開示のプローブ実施形態で標識し、少なくとも１種の標識酵素を提供する工程；（ｉｉ）検出可能シグナルを検出することにより、試料中の少なくとも１種の標識酵素の存在を判定する工程；（ｉｉｉ）少なくとも１種の標識酵素もしくは少なくとも１種の標識酵素を含む微生物をソーティングするか単離する工程；（ｉｖ）少なくとも１種の標識酵素を含む微生物を同定する工程；（ｖ）少なくとも１種の酵素の胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を変化させる身体環境を選択する工程；および／または（ｖｉ）選択した身体環境を同定した微生物で富化することによって；もしくは選択した身体環境において同定した微生物の量を減少させることによって；もしくは選択した身体環境において胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を低下させることによって選択した身体環境における胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を変化させ、それによって疾患もしくは状態を治療する工程。
【０００７】
プローブ実施形態と基板とを含むキットの実施形態も本明細書に開示されており、プローブは基板に共有結合している。
【０００８】
本開示の上述かつ他の目的および特徴は、添付の図を参照して進む以下の発明を実施するための形態から、より明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１Ａは、胆汁酸塩に対する胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性の概略図である。図１Ｂは、本明細書に開示の代表的なプローブ実施形態に対する胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性の概略図である。
【図２】多重プロービング実施形態にマイクロスフェアを使用する例示的な方法を示す図であって、機能ベースのプローブ（「Ｐ」）は蛍光ガラスマイクロスフェア上に官能基化されてフローサイトメトリーを可能にし、各フルオロフォアは、特定のプローブに適合する；マイクロスフェアを混合し、試料に追加し、胆汁酸塩ヒドロラーゼを含み得る試料などの複合生体試料の多機能特性評価を行うことができ、標識後、タンパク質−プローブ−マイクロスフェアをさらに分析することができる（例えば、ソーティングされた各試料の蛍光発光および／またはプロテオミクス分析に基づいて定量化された全体的な機能活性を決定し、機能的に活性な酵素の識別と、全体的な機能活性へのそれらの相対的寄与度とを提供する）。
【図３】ＰＢＳ中の７−アミノ−４−メチル−３−クマリニル酢酸（ＡＭＣＡ）部位を含む代表的なプローブ実施形態１５０μＭの溶液を特性評価することから得られた複合発光スペクトルを示す図であって、この分析では、遊離７−アミノ−４−メチル−３−クマリニル酢酸と比較して、プローブの蛍光がはるかに少ないことが明らかになった。
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、代表的なプローブ実施形態である「ＣＡ−ＡＭＣＡ」が、緩衝液中の精製組換えＢＳＨの活性を連続的にレポートすることを示す；図４Ａは、ＣＡ−ＡＭＣＡ（１５０μＭ）を様々な濃度のＢＳＨの緩衝液に添加し、蛍光光度計を使用して生成物の形成をモニターすることにより評価すると、ＢＳＨの濃度の上昇により、ＣＡ−ＡＭＣＡ加水分解速度の上昇がもたらされたことを示す図である。図４Ｂは、ＣＡ−ＡＭＣＡ（１５０μＭ）をＢＳＨに添加することで観察される蛍光の増加が、真の基質、グリココール酸（ＧＣＡ）（１０ｍＭ）、またはシステイン反応性ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）（１２ｍＭ）の添加により減衰するが、ＤＭＳＯでは減衰しないことを示す図である。
【図５】精製タンパク質をＣＡ−ＡＭＣＡプローブで処理し、３５０ｎｍで励起したときの４５０ｎｍの蛍光をモニターすることによって反応速度を評価した結果を示すグラフである；ＣＡ−ＡＭＣＡプローブはＢＳＨと反応するが、ＢＳＡまたは無関係のヒドロラーゼ（トリプシン）とは反応しないことが証明された。
【図６】図６Ａは、ＣＡ−ＡＭＣＡ添加前に精製ＢＳＨをヨードアセトアミド（ＩＡＡ）またはグリココール酸（ＧＣＡ）で処理した個々の複製物を分析して得られたグラフであり、各複製物は、ＣＡ−ＡＭＣＡプローブが標準的なＢＳＨ基質結合部位に結合し、システイン依存的に代謝回転されることを示している。図６Ｂは、ＣＡ−ＡＭＣＡ添加前に精製ＢＳＨをヨードアセトアミド（ＩＡＡ）またはグリココール酸（ＧＣＡ）で処理した個々の複製物を分析して得られたグラフであり、各複製物は、ＣＡ−ＡＭＣＡプローブが標準的なＢＳＨ基質結合部位に結合し、システイン依存的に代謝回転されることを示している。図６Ｃは、ＣＡ−ＡＭＣＡ添加前に精製ＢＳＨをヨードアセトアミド（ＩＡＡ）またはグリココール酸（ＧＣＡ）で処理した個々の複製物を分析して得られたグラフであり、各複製物は、ＣＡ−ＡＭＣＡプローブが標準的なＢＳＨ基質結合部位に結合し、システイン依存的に代謝回転されることを示している。
【図７】精製ＢＳＨの緩衝液を様々な濃度のＣＡ−ＡＭＣＡで処理し、基質濃度に対する代謝回転速度をプロットすることによって作成したＣＡ−ＡＭＣＡプローブのミカエリス−メンテン曲線である。
【図８】図８Ａは、ＢＳＨをＣＡ−ＡＭＣＡ  １５０μＭで処理し、３５０ｎｍで励起したときの４５０ｎｍの蛍光をモニターすることによって基質代謝回転を評価した個々の複製物を分析した結果を示すグラフである；初速度をいくつかのプローブ濃度で記録し、Ｋｍ曲線としてプロットした；３連の結果は、プローブの個々のＫｍ曲線が天然基質のレポート値と同様の親和性を示すことを示している。図８Ｂは、ＢＳＨをＣＡ−ＡＭＣＡ  １５０μＭで処理し、３５０ｎｍで励起したときの４５０ｎｍの蛍光をモニターすることによって基質代謝回転を評価した個々の複製物を分析した結果を示すグラフである；初速度をいくつかのプローブ濃度で記録し、Ｋｍ曲線としてプロットした；３連の結果は、プローブの個々のＫｍ曲線が天然基質のレポート値と同様の親和性を示すことを示している。図８Ｃは、ＢＳＨをＣＡ−ＡＭＣＡ  １５０μＭで処理し、３５０ｎｍで励起したときの４５０ｎｍの蛍光をモニターすることによって基質代謝回転を評価した個々の複製物を分析した結果を示すグラフである；初速度をいくつかのプローブ濃度で記録し、Ｋｍ曲線としてプロットした；３連の結果は、プローブの個々のＫｍ曲線が天然基質のレポート値と同様の親和性を示すことを示している。
【図９】図９Ａは、精製ＢＳＨを大腸菌溶解液に添加した異なる複製物から得た複製グラフであり、ＣＡ−ＡＭＣＡプローブが細胞溶解液中のＢＳＨ活性をレポートすることができることをさらに示している。図９Ｂは、精製ＢＳＨを大腸菌溶解液に添加した異なる複製物から得た複製グラフであり、ＣＡ−ＡＭＣＡプローブが細胞溶解液中のＢＳＨ活性をレポートすることができることをさらに示している。図９Ｃは、精製ＢＳＨを大腸菌溶解液に添加した異なる複製物から得た複製グラフであり、ＣＡ−ＡＭＣＡプローブが細胞溶解液中のＢＳＨ活性をレポートすることができることをさらに示している。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、ＣＡ−ＡＭＣＡプローブが、ＢＳＨを発現するヒト腸の居住微生物であるＬ．プランタラムの細胞溶解液中およびｉｎ  ｖｉｖｏ両方で内因性発現したＢＳＨを検出することができることを示すグラフである；図１０Ａは、様々な量のＬ．プランタラム溶解液を含む緩衝液にＣＡ−ＡＭＣＡ（１５０μＭ）を添加することによって得たグラフである。図１０Ｂは、様々な量の無傷Ｌ．プランタラム細胞を含む緩衝液にＣＡ−ＡＭＣＡ（１５０μＭ）を添加することによって得たグラフである；ＣＡ−ＡＭＣＡ代謝回転の速度は、細胞密度に依存する。
【図１１】図１１Ａは、ＣＡ−ＡＭＣＡ  １５０μＭで様々な濃度のＬ．プランタラム溶解液を処理することから得られた結果の複製物のグラフであり、ＣＡ−ＡＭＣＡプローブがＬ．プランタラム溶解液中で内因性発現したＢＳＨの活性をレポートすることを証明している；反応速度は蛍光定量化によってモニターした。図１１Ｂは、ＣＡ−ＡＭＣＡ  １５０μＭで様々な濃度のＬ．プランタラム溶解液を処理することから得られた結果の複製物のグラフであり、ＣＡ−ＡＭＣＡプローブがＬ．プランタラム溶解液中で内因性発現したＢＳＨの活性をレポートすることを証明している；反応速度は蛍光定量化によってモニターした。図１１Ｃは、ＣＡ−ＡＭＣＡ  １５０μＭで様々な濃度のＬ．プランタラム溶解液を処理することから得られた結果の複製物のグラフであり、ＣＡ−ＡＭＣＡプローブがＬ．プランタラム溶解液中で内因性発現したＢＳＨの活性をレポートすることを証明している；反応速度は蛍光定量化によってモニターした。
【図１２】図１２Ａは、薬理学的阻害により、観察されたＣＡ−ＡＭＣＡプローブの活性がＢＳＨによるものであることが確認されたことを証明するために得られた結果の複製物のグラフである；グラフから分かるように、ＢＳＨ阻害剤であるＣＡＰＥ（２ｍＭ）を反応に添加すると、基質代謝回転はＬ．プランタラム溶解液中で観察されない。図１２Ｂは、薬理学的阻害により、観察されたＣＡ−ＡＭＣＡプローブの活性がＢＳＨによるものであることが確認されたことを証明するために得られた結果の複製物のグラフである；グラフから分かるように、ＢＳＨ阻害剤であるＣＡＰＥ（２ｍＭ）を反応に添加すると、基質代謝回転はＬ．プランタラム溶解液中で観察されない。図１２Ｃは、薬理学的阻害により、観察されたＣＡ−ＡＭＣＡプローブの活性がＢＳＨによるものであることが確認されたことを証明するために得られた結果の複製物のグラフである；グラフから分かるように、ＢＳＨ阻害剤であるＣＡＰＥ（２ｍＭ）を反応に添加すると、基質代謝回転はＬ．プランタラム溶解液中で観察されない。
【図１３】図１３Ａは、様々な密度のＬ．プランタラムの全細胞懸濁液にＣＡ−ＡＭＣＡ（１５０μＭ）を添加することから得られた結果の複製物のグラフであり、ＣＡ−ＡＭＣＡプローブがｉｎ  ｖｉｖｏでＢＳＨ活性を評価することができることを確認する；蛍光（励起：３５０、発光：４５０）の定量化により、反応速度を追跡した。図１３Ｂは、様々な密度のＬ．プランタラムの全細胞懸濁液にＣＡ−ＡＭＣＡ（１５０μＭ）を添加することから得られた結果の複製物のグラフであり、ＣＡ−ＡＭＣＡプローブがｉｎ  ｖｉｖｏでＢＳＨ活性を評価することができることを確認する；蛍光（励起：３５０、発光：４５０）の定量化により、反応速度を追跡した。図１３Ｃは、様々な密度のＬ．プランタラムの全細胞懸濁液にＣＡ−ＡＭＣＡ（１５０μＭ）を添加することから得られた結果の複製物のグラフであり、ＣＡ−ＡＭＣＡプローブがｉｎ  ｖｉｖｏでＢＳＨ活性を評価することができることを確認する；蛍光（励起：３５０、発光：４５０）の定量化により、反応速度を追跡した。
【図１４】図１４Ａは、ＢＳＨを発現しない大腸菌の全細胞懸濁液にＣＡ−ＡＭＣＡ（１５０μＭ）を添加することから得られた結果の複製物のグラフである；このグラフは、ＣＡ−ＡＭＣＡを添加しても蛍光の増加が起こらないことを確認し、ＢＳＨを持たない細胞株では代謝回転されないことを確認する；比較を容易にするために、Ｙ軸の範囲をＬ．プランタラムプロットと同じに設定した。図１４Ｂは、ＢＳＨを発現しない大腸菌の全細胞懸濁液にＣＡ−ＡＭＣＡ（１５０μＭ）を添加することから得られた結果の複製物のグラフである；このグラフは、ＣＡ−ＡＭＣＡを添加しても蛍光の増加が起こらないことを確認し、ＢＳＨを持たない細胞株では代謝回転されないことを確認する；比較を容易にするために、Ｙ軸の範囲をＬ．プランタラムプロットと同じに設定した。図１４Ｃは、ＢＳＨを発現しない大腸菌の全細胞懸濁液にＣＡ−ＡＭＣＡ（１５０μＭ）を添加することから得られた結果の複製物のグラフである；このグラフは、ＣＡ−ＡＭＣＡを添加しても蛍光の増加が起こらないことを確認し、ＢＳＨを持たない細胞株では代謝回転されないことを確認する；比較を容易にするために、Ｙ軸の範囲をＬ．プランタラムプロットと同じに設定した。
【図１５】ＢＳＨを内因性発現することが知られている微生物において、クマリン検出可能部位を含む別のプローブ実施形態の基質代謝回転の特性評価を示す図である。
【図１６】腸内マイクロバイオーム溶解液という状況の中で、ＣＡ−ＡＭＣＡがＢＳＨ活性について確実にレポートすることを示すグラフである；このグラフは、精製ＢＳＨ（２０μｇ／ｍｌ）を添加した緩衝化ヒト腸内マイクロバイオーム溶解液（５００μｇ／ｍｌタンパク質）の調製試料にＣＡ−ＡＭＣＡ（１５０μＭ）を添加した後に作成した；基質代謝回転は、蛍光光度計を使用してモニターした。
【図１７】図１７Ａは、精製ＢＳＨを腸内マイクロバイオーム溶解液に添加した結果の複製物のグラフであり、ＣＡ−ＡＭＣＡプローブが腸内マイクロバイオーム溶解液中のＢＳＨ活性をレポートすることをさらに示している。図１７Ｂは、精製ＢＳＨを腸内マイクロバイオーム溶解液に添加した結果の複製物のグラフであり、ＣＡ−ＡＭＣＡプローブが腸内マイクロバイオーム溶解液中のＢＳＨ活性をレポートすることをさらに示している。図１７Ｃは、精製ＢＳＨを腸内マイクロバイオーム溶解液に添加した結果の複製物のグラフであり、ＣＡ−ＡＭＣＡプローブが腸内マイクロバイオーム溶解液中のＢＳＨ活性をレポートすることをさらに示している。
【図１８】図１８Ａは、本明細書に開示の代表的なプローブ実施形態での精製ＢＳＨの標識の用量応答、および天然基質との競合を示す図である。図１８Ｂは、本明細書に開示の代表的なプローブ実施形態での精製ＢＳＨの標識の用量応答、および天然基質との競合を示す図である。
【図１９】大腸菌溶解液中のＢＳＨのプローブ標識を示す図である。
【図２０】図２０Ａは、ラクトバチルス・プランタラムのＢＳＨのプローブ標識を示す図である（溶解液からのもの）。図２０Ｂは、ラクトバチルス・プランタラムのＢＳＨのプローブ標識を示す図である（ｉｎ  ｖｉｖｏ標識からのもの）。
【図２１】本明細書に開示の代表的なプローブ実施形態が、細菌溶解液中のＢＳＨ活性を質量分析を介して定量的に追跡することを示す図である。
【図２２】ヒト腸内マイクロバイオーム溶解液の存在下でのＢＳＨの標識を示す図である。
【図２３】プローブのステロール成分上の保護されたヒドロキシル基を含む代表的なプローブ実施形態の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図２４】プローブのステロール成分上の遊離ヒドロキシル基を含む代表的なプローブ実施形態の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図２５】別の代表的なプローブ実施形態の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（Ｉ．用語の概要）
以下の用語の説明は、本開示をより良く説明し、本開示の実施において当業者を導くために提供される。本明細書で使用されるとき、「含む」は「含有する」を意味し、単数形「ａ」または「ａｎ」または「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数形の参照を含む。用語「または」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、記載の代替要素の単一要素、あるいは２つ以上の要素の組み合わせを指す。
【００１１】
別段の説明がない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本開示が属する当該技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本開示の実施または試験において、本明細書に記載のものと類似または均等の方法および材料を使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。材料、方法、および例は、例示的なものに過ぎず、別段の指示がない限り、限定的なものであることを意図していない。本開示の他の特徴は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【００１２】
別段の指示がない限り、本明細書または特許請求の範囲で使用される、構成要素の量、分子量、パーセンテージ、温度、時間などを表すすべての数値は、「約」という用語によって修飾されるものとして理解されるべきである。したがって、別段の指示がない限り、暗黙的にまたは明示的に、記載の数値パラメータは、求められる所望の特性および／または標準的な試験条件／方法の下での検出限界によって決まり得る近似値である。説明された先行技術からの実施形態を直接的かつ明示的に区別するとき、「約」という言葉が記載されない限り、実施形態の数値は近似値ではない。さらに、本明細書で記載されるすべての代替形態が均等であるとは限らない。
【００１３】
本明細書に開の化合物は、立体中心、不斉軸などの１つ以上の不斉要素、例えば、不斉炭素原子を含んでいてもよく、その結果、化学的コンジュゲートは様々な立体異性形態で存在し得る。これらの化合物は、例えば、ラセミ体または光学活性形態であり得る。２つ以上の不斉中心を有する化合物では、これらの化合物はさらに、ジアステレオマーの混合物であり得る。不斉中心を有する化合物については、純粋な形態のすべての光学異性体およびそれらの混合物が包含される。これらの状況では、単一エナンチオマー、すなわち光学活性形態は、非対称合成、光学的に純粋な前駆体からの合成、またはラセミ体の分割によって得ることができる。ラセミ体の分割は、例えば、分割剤の存在下での結晶化、または、例えばキラルＨＰＬＣカラムを使用したクロマトグラフィーなどの従来方法によっても達成することができる。すべての形態が、それらを得るために使用される方法に関係なく、本明細書において企図される。特定の立体化学が図示されていない構造では、すべての立体異性体および／またはジアステレオマーが企図されることが理解される。代表的な構造は、立体異性体および／またはジアステレオマーを設定し、本明細書に提供され、一般式の代表的な例を構成する；しかしながら、そのような例は排他的ではなく、特定の立体化学が例示されていない一般構造を含めることなどにより、１つ以上の他の形態も考えられる。
【００１４】
本明細書で使用される立体化学的な定義および慣例は、一般に、Ｓ．  Ｐ．  Ｐａｒｋｅｒ，  Ｅｄ．，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ  （１９８４）  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｂｏｏｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；およびＥｌｉｅｌ，  Ｅ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｎ，  Ｓ．，  Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  （１９９４）  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに従う。多くの有機化合物は、光学活性形態で存在し、すなわち、平面偏光の平面を回転させる能力を有する。光学活性化合物を記述する際、接頭辞ＤおよびＬまたはＲおよびＳは、そのキラル中心（複数可）の周りの分子の絶対配置を表すために使用される。接頭辞ｄおよびｌ、または（＋）および（−）は、化合物による平面偏光の回転の符号を表すために使用され、（−）または１は、その化合物が左旋性であることを意味する。接頭辞が（＋）またはｄの化合物は、右旋性である。さらに、本明細書に例示される特定の構造は、実線の結合を通る波線（"
2020536566.tif 000002
”)（例えば、
【化１】
2020536566.tif 000003
)を含み得る；この文脈での波線は、結合の切断を示すために使用される。
【００１５】
プローブのすべての形態（例えば、溶媒和物、光学異性体、エナンチオマー形態、多形体、遊離化合物および塩）は、単独でまたは組み合わせて採用され得る。
【００１６】
本開示の様々な実施形態のレビューを容易にするために、以下の特定の用語の説明を提供する。特定の官能基の用語は、官能基の式の先頭に「−」記号を含む；この記号は、官能基の一部ではなく、官能基が本明細書に記載の式にどのように接続するかを示す。例えば、式「−ＯＣ（Ｏ）Ｒｂ」の官能基は、「−」記号の隣にある官能基の酸素原子によって官能基化化合物の原子に結合している。
【００１７】
アシルオキシ：−ＯＣ（Ｏ）Ｒｂであり、Ｒｂは水素、脂肪族、アリール、ヘテロ脂肪族、脂肪族−アリール、ヘテロアリール、脂肪族−ヘテロアリール、ヘテロ脂肪族−アリール、ヘテロ脂肪族−ヘテロアリール、およびそれらの任意の組み合わせから選択される。
【００１８】
投与する：本明細書で使用されるとき、組成物を被験体に投与することは、組成物を被験体に与え、適用し、または接触させることを意味する。投与は、例えば、局所投与、経口投与、直腸投与、膣投与、経皮投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与、髄腔内投与、および皮内投与などの任意のいくつかの経路によって達成され得る。
【００１９】
アルデヒド：−Ｃ（Ｏ）Ｈ。
【００２０】
脂肪族：少なくとも１個の炭素原子〜５０個の炭素原子（Ｃ１−５０）、例えば１〜２５個の炭素原子（Ｃ１−２５）、または１〜１０個の炭素原子（Ｃ１−１０）を有する炭化水素基であって、アルカン（またはアルキル）、アルケン（またはアルケニル）、アルキン（またはアルキニル）が含まれ、それらの環状バージョンを含み、直鎖および分岐鎖の配列、ならびにすべての立体異性体および位置異性体もさらに含む。
【００２１】
脂肪族−芳香族：本明細書に開示のプローブに結合しているか、結合し得る芳香族基であって、芳香族基は脂肪族基を介して結合しているか、結合することになる。
【００２２】
脂肪族−アリール：本明細書に開示のプローブに結合しているか、結合し得るアリール基であって、アリール基は脂肪族基を介して結合しているか、結合することになる。
【００２３】
脂肪族−ヘテロ芳香族：本明細書に開示のプローブに結合しているか、結合し得るヘテロ芳香族基であって、ヘテロ芳香族基は脂肪族基を介して結合しているか、結合することになる。
【００２４】
脂肪族−ヘテロアリール：本明細書に開示のプローブに結合しているか、結合し得るヘテロアリール基であって、ヘテロアリール基は脂肪族基を介して結合しているか、結合することになる。
【００２５】
アルケニル：少なくとも２個の炭素原子〜５０個の炭素原子（Ｃ２−５０）、例えば２〜２５個の炭素原子（Ｃ２−２５）、または２〜１０個の炭素原子（Ｃ２−１０）、および少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する不飽和一価炭化水素であって、不飽和一価炭化水素は、親アルケンの１個の炭素原子から１個の水素原子を除去することによって得ることができる。アルケニル基は、分岐鎖、直鎖、環状（例えば、シクロアルケニル）、シス、またはトランス（例えば、ＥもしくはＺ）であり得る。
【００２６】
アルコキシ：−Ｏ−脂肪族、例えば−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アルケニル、または−Ｏ−アルキニルなどであって、例示的な実施形態には、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｎ−ペントキシが含まれるが、これらに限定されない。
【００２７】
アルキル：少なくとも１個の炭素原子〜５０個の炭素原子（Ｃ１−５０）、例えば１〜２５個の炭素原子（Ｃ１−２５）、または１〜１０個の炭素原子（Ｃ１−１０）を有する飽和一価炭化水素であって、飽和一価炭化水素は、親化合物（例えば、アルカン）の１個の炭素原子から１個の水素原子を除去することによって得ることができる。アルキル基は、分岐鎖、直鎖、または環状（例えば、シクロアルキル）であり得る。
【００２８】
アルキニル：少なくとも２個の炭素原子〜５０個の炭素原子（Ｃ２−５０）、例えば２〜２５個の炭素原子（Ｃ２−２５）、または２〜１０個の炭素原子（Ｃ２−１０）、および少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する不飽和一価炭化水素であって、不飽和一価炭化水素は、親アルキンの１個の炭素原子から１個の水素原子を除去することによって得ることができる。アルキニル基は、分岐鎖、直鎖、または環状（例えば、シクロアルキニル）であり得る。
【００２９】
アルキルアリール／アルケニルアリール／アルキニルアリール：本明細書に開示のプローブに結合しているか、結合し得るアリール基であって、アリール基は、それぞれアルキル基、アルケニル基、またはアルキニル基を介して結合しているか、結合することになる。
【００３０】
アルキルヘテロアリール／アルケニルヘテロアリール／アルキニルヘテロアリール：本明細書に開示のプローブに結合しているか、結合し得るヘテロアリール基であって、ヘテロアリール基は、それぞれアルキル基、アルケニル基、またはアルキニル基を介して結合しているか、結合することになる。
【００３１】
アミド：−Ｃ（Ｏ）ＮＲｂＲｃであり、ＲｂおよびＲｃの各々は独立して水素、脂肪族、アリール、ヘテロ脂肪族、脂肪族−アリール、ヘテロアリール、脂肪族−ヘテロアリール、ヘテロ脂肪族−アリール、ヘテロ脂肪族−ヘテロアリール、およびそれらの任意の組み合わせから選択される。
【００３２】
アミン：−ＮＲｂＲｃであり、ＲｂおよびＲｃの各々は独立して水素、脂肪族、アリール、ヘテロ脂肪族、脂肪族−アリール、ヘテロアリール、脂肪族−ヘテロアリール、ヘテロ脂肪族−アリール、ヘテロ脂肪族−ヘテロアリール、およびそれらの任意の組み合わせから選択される。
【００３３】
アンカー部位：プローブ実施形態を基板構成要素の表面に結合させるために使用され得る官能基。いくつかの実施形態では、アンカー部位は、クリック可能な官能基、活性化エステル（例えば、ＮＨＳ−エステル）、カルボン酸、ハロゲン化物、またはハロゲン化アルキルであり得る。
【００３４】
芳香族：別段に指定されない限り、少なくとも１つの環が芳香族（例えば、ナフチル、インドリル、もしくはピラゾロピリジニル）である単環（例えば、フェニル、ピリジニル、もしくはピラゾリル）または複数の縮合環を有する、５〜１５個の環原子を有する環状共役基またはその部位；すなわち、少なくとも１つの環および任意選択の複数の縮合環は、連続的で、非局在化されたπ電子系を有する。典型的には、面外π電子の数はヒュッケル則（４ｎ＋２）に対応する。親構造への結合点は、典型的には縮合環系の芳香族部位を介している。例えば、
【化２】
2020536566.tif 000004
。しかしながら、特定の例では、文脈または明示的な開示は、結合点が縮合環系の非芳香族部位を介していることを示し得る。例えば、
【化３】
2020536566.tif 000005
。芳香族基または芳香族部位は、環内に、アリール基もしくはアリール部位のように、炭素原子のみを含んでいてもよく、または、ヘテロアリール基もしくはヘテロアリール部位のように、１個以上の環炭素原子と、孤立電子対を含む１個以上の環ヘテロ原子（例えば、Ｓ、Ｏ、Ｎ、Ｐ、もしくはＳｉ）とを含んでいてもよい。
【００３５】
アリール：少なくとも５個の炭素原子〜１５個の炭素原子（Ｃ５−Ｃ１５）、例えば５〜１０個の炭素原子（Ｃ５−Ｃ１０）を含む芳香族炭化水素環基であって、単環または複数の縮合環を有し、縮合環は、本明細書に開示の化合物の残りの位置への結合点が芳香族炭化水素環基の原子を介していることを条件に、芳香族であってもなくてもよい。アリール基は、水素以外の１つ以上の基、例えば脂肪族基、ヘテロ脂肪族基、アリール基、ヘテロアリール基、他の官能基、またはそれらの任意の組み合わせで置換されていてもよい。いくつかの実施形態では、アリール環は、フェニル、ナフチル、アントラセニル、インデニル、アズレニル、フルオレニル、テトラシアノアンタキノジメチルなどから選択されるが、これらに限定されない。
【００３６】
ベンジルカルボニル：−Ｃ（Ｏ）Ｐｈ。
【００３７】
胆汁酸：胆汁に含まれる低分子有機化合物であり、その正味の物理化学的特性に影響を与え得る（例えば、脂肪および栄養素の消化および吸収、ならびに薬物および代謝物の廃棄を補助することによって；Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，  ２４（６）：  １１５１-１１６４，  ２０１０、その関連部分は参照により本明細書に組み込まれる）。コレステロールを出発物質として使用して、胆汁酸は、コレステロール７α−ヒドロキシラーゼによって調節される多段階生合成経路を通じて肝臓で生成されるステロイド酸である。ヒトは、２つの一次胆汁酸、コール酸およびケノデオキシコール酸（例えば、その関連部分が参照により本明細書に組み込まれるＣｈｉａｎｇ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ５０：１９５５−１９６６，  ２００９を参照）を産生し、これらは１個のヒドロキシル基によって異なるものであるが、様々な生物学的効果を発揮することができる。肝臓での合成後、胆汁酸はグリシンまたはタウリンに抱合し、親水性を大幅に調節する胆汁酸塩生成物を与える。合成後、胆汁酸塩は胆嚢に貯蔵され、最終的には十二指腸に放出されて消化を助ける。胆汁酸は、脂肪酸などの疎水性分子の溶解性を増加させる界面活性剤として作用することができ、消化を助ける。胆汁酸はまた、ＦＸＲなどのヒト核内受容体に結合する選択的化学シグナル（例えば、シグナル伝達分子）（例えば、その関連部分が参照により本明細書に組み込まれるＪｏｙｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １１１：７４２１−７４２６，  ２０１４を参照）、ビタミンＤ受容体（例えば、その関連部分が参照により本明細書に組み込まれるＭａｋｉｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９６：１３１３−１３１６，  ２００２を参照）、低分子ヘテロ二量体パートナー（ＮＲ０Ｂ２）、およびＴＧＲ５などの表面受容体（例えば、両方とも参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＭａｒｕｙａｍａ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，  ２９８：７１４−７１９，  ２００２；  Ｋａｗａｍａｔａ，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２７８：９４３５−９４４０，  ２００３を参照）としても機能し、シグナル伝達経路を調節し、脂質、グルコース、薬物、およびエネルギー代謝において役割を果たす。宿主受容体による胆汁酸塩の結合は、胆汁酸プールの状態に関する情報を提供し、胆汁酸、コレステロール、脂質および炭水化物の代謝、ならびに炎症、線維化、および発癌を含む他のプロセスとともに、コレステロールからの胆汁酸塩合成の第１段階を調節することができる。腸内での微生物代謝は、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、およびリトコール酸を含む修飾された二次胆汁酸をもたらし得る（例えば、その関連部分が参照により本明細書に組み込まれるＲｉｄｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ４７：２４１−２５９，  ２００６を参照）。
【００３８】
胆汁酸塩ヒドロラーゼ（ＢＳＨ）：胆汁酸塩の胆汁酸およびアミノ酸（例えば、グリシンおよびタウリン）への加水分解を触媒する酵素であり、これは脱抱合としても知られるプロセスである。例えば、胆汁酸塩ヒドロラーゼは、Ｎ末端システインを含み得る触媒三残基などを介して、反応を促進するシステインヒドロラーゼとして作用することができる。ＢＳＨの脱抱合は、胆汁酸プールの物理化学的特性の正味の変化を生じさせ、最終的には疎水性を増加させることができ、非極性／脂肪性腸内容物が排泄されやすくなる。いくつかの例では、ＢＳＨ活性を変化させること（例えば、ＢＳＨ活性を上昇または低下させること）は、疾患の治療に有用であり得る（例えば、肥満および高コレステロール血症では、ＢＳＨ活性を上昇させることなどにより、コレステロールプールが使い尽くされ、胆汁酸が内因的に過剰に排泄される新鮮な胆汁の産生を補うことができる（Ｊｏｙｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １１１：７４２１−７４２６，  ２０１４、その関連部分は参照により本明細書に組み込まれる）。ＢＳＨ活性は、一般的なプロバイオティクスでよく観察される（Ｂｅｇｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ７２，  １７２９−１７３８，  ２００６、、その関連部分は参照により本明細書に組み込まれる）。ＢＳＨによる胆汁酸塩の酵素加水分解は、標準的なミカエリス−メンテン速度を発揮することができ、アミド結合を攻撃する求核性システインを含んで共有結合性酵素−胆汁酸複合体を形成することができ、これは加水分解され、ヒドロラーゼが別の触媒サイクルに参加できるようにする。ＢＳＨ阻害剤には、例えば、抗菌性成長促進剤、カルノシン酸、ＦｅＳＯ４、ＣｏＣｌ２、ＮａＳｅＯ３、ＮａＩＯ４、レチノール、およびリノレン酸、ＫＩＯ３、ＮａＨＩＯ３、ＮａＩＯ４、ＣｕＳＯ４、ＣｕＣｌ２、ＺｎＳＯ４、ＺｎＣｌ２、メナジオン、リボフラビン、ゴシペチン、カフェ酸フェネチルエステル［ＣＡＰＥ］、エピカテキンモノガレート、プルプロガリン、オキシテトラサイクリン、塩酸デメクロサイクリン、塩酸メタサイクリン、塩酸ドキシサイクリン、ロキサルソン、またはリンコマイシンが含まれ得る（例えば、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，  ９（１）：  ｅ８５３４４，  ２０１４；  Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，  ３（４）：  ９４７-９５６，  ２０１４；  Ｋａｔｉｅ  Ｓｍｉｔｈ，  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｌｅ  ｓａｌｔ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，  ｔｈｅ  ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ａｎｉｍａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，  Ｍａｓｔｅｒ’ｓ  Ｔｈｅｓｉｓ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ，  ２０１３，  ｔｒａｃｅ．ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ．ｅｄｕ、これらはすべて、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００３９】
胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性：胆汁酸塩（または本開示のプローブ実施形態）中に存在するアミド結合を加水分解する能力。特定の実施形態では、胆汁酸塩のアミド結合は、アミノ酸をステロール部位に抱合させている。
【００４０】
胆汁酸塩：タウロコール酸塩、グリココール酸塩、タウロデオキシコール酸塩、およびグリコデオキシコール酸塩などの、ミセルを形成することができる両親媒性物質（例えば、その関連部分が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２００９／００７４８９５号を参照）。胆汁酸塩は、抱合胆汁酸（例えば、グリシンまたはタウリンなどのアミノ酸に抱合した胆汁酸）とも呼ばれ得る。
【００４１】
カルボキシル：−Ｃ（Ｏ）ＯＲｂであり、Ｒｂは脂肪族、アリール、ヘテロ脂肪族、脂肪族−アリール、ヘテロアリール、脂肪族−ヘテロアリール、ヘテロ脂肪族−アリール、ヘテロ脂肪族−ヘテロアリール、水素、およびそれらの任意の組み合わせである。
【００４２】
クリックケミストリー：効率的な試薬条件で結合することができ、温和な溶媒中、または蒸発、抽出、もしくは蒸留などの簡便な方法で除去もしくは抽出することができる溶媒中で行うことができる試薬を使用して化合物を作るための化学合成法である。クリックケミストリーの代表的な例は、アジドとアルキンとを結合させてトリアゾールを形成する反応である。
【００４３】
クリック可能な官能基：クリックケミストリー反応で使用して生成物を形成することができる官能基。いくつかの実施形態では、クリック可能な官能基はアジドまたはアルキンである。
【００４４】
結腸がん（大腸がん）：腺がん、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、リンパ腫、カルチノイド、ターコット症候群、ポイツ・ジェガース症候群（ＰＪＳ）、家族性大腸がん（ＦＣＣ）、若年性大腸ポリポーシス、またはＩ期、ＩＩ期、ＩＩＩ期、もしくはＩＶ期結腸がんを含む、結腸（例えば、大腸）のがん。結腸がんは、遺伝性のものと非遺伝性のものがあり、小さな非がん性の細胞塊（腺腫性ポリープなどのポリープ）として始まることがあり、それが結腸がんになることがある。結腸がんの症状の例としては、腸の変化、直腸出血（すなわち血便）、持続的な腹部不快感、腸が空にならないという感覚、脱力感、疲労感、原因不明の体重減少などが挙げられる。診断技法には、大腸内視鏡検査および／または血液検査（例えば、癌胎児性抗原［ＣＥＡ］の検査）が含まれる。治療には、手術、化学療法もしくは薬物療法、免疫療法、または緩和ケアが含まれ得る。いくつかの例では、結腸がんはＢＳＨに関連しており、例えば、過活性ＢＳＨまたは過剰量の脱抱合胆汁酸塩に関連している（例えば、Ｒｉｄｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，  ４７（２）：２４１−５９，  ２００６、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００４５】
検出可能部位（すなわちＤＭ）：視覚的におよび／または機械で検出され得るシグナルを発生させることができる官能基または分子。特定の開示の実施形態では、レポーティング部位が酵素に共有結合することになるため、検出可能部位は、適切な検出方法を使用して、酵素を可視化する能力または検出する能力を提供する。
【００４６】
検出可能部位前駆体（すなわちｐＤＭ）：視覚的におよび／または機械で検出され得るシグナルを発生させることができる官能基または分子と結合することによって検出可能部位に変換され得る官能基。
【００４７】
糖尿病：膵臓が十分なインスリンを産生しないか、または細胞が産生されたインスリンに反応しないために、被験体が高血糖を示す代謝性疾患のグループ。１型糖尿病は、体内でインスリンが産生されないために起こる。この型は、「インスリン依存性糖尿病」（ＩＤＤＭ）または「若年性糖尿病」とも呼ばれている。１型糖尿病は、インスリン産生β細胞が失われ、インスリン欠乏に陥ることを特徴とする。このタイプは、免疫介在性または特発性にさらに分類される。２型糖尿病は、細胞がインスリンを適切に使用できない状態であるインスリン耐性に起因しており、時には絶対的インスリン欠乏症を併発することもある。２型糖尿病は、「インスリン非依存性糖尿病」（ＮＩＤＤＭ）または「成人発症型糖尿病」とも呼ばれる。いくつかの例では、２型糖尿病などの糖尿病は、ＢＳＨ活性に関連している（例えば、Ｌａｂｂe  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，  ９（１２）：ｅ１１５１７５，  ２０１４、その関連部分は参照により本明細書に組み込まれる）。インスリンに対する身体組織の反応性の欠陥は、インスリン受容体が関与していると考えられている。糖尿病は、再発性または持続性の高血糖症を特徴とし、以下のいずれかを示すことで診断され得る。
ａ．    空腹時血漿グルコースレベル≧７．０ｍｍｏｌ／ｌ（１２６ｍｇ／ｄｌ）；
ｂ．    グルコース負荷試験などにおける、７５ｇ経口グルコース負荷２時間後の血漿グルコース≧１１．１ｍｍｏｌ／ｌ（２００ｍｇ／ｄＬ）。
ｃ．    高血糖の症状および偶発的血漿グルコース≧１１．１ｍｍｏｌ／ｌ（２００ｍｇ／ｄｌ）。
ｄ．    糖化ヘモグロビン（Ｈｂ  Ａ１Ｃ）≧６．５％。
いくつかの例では、糖尿病はＢＳＨ活性に関連しており、一次および二次胆汁酸の不均衡など、例えば、低活性もしくは不活性ＢＳＨ、または胆汁酸の不十分な脱抱合に関連している。
【００４８】
腸内毒素症：マイクロバイオータ障害などの、身体上または体内の微生物の不均衡または不適応（例えば、ヒトまたは動物の腸、皮膚、肺、口腔、眼球、口、膣、および子宮環境）。腸内毒素症は、最も一般的には、腸内の状態として、特に小腸細菌過剰増殖（ＳＩＢＯ）または小腸真菌過剰増殖（ＳＩＦＯ）として報告される。体内および身体上の微生物および微生物コロニーは、多くの場合有益である（例えば、ＢＳＨ活性または薬剤代謝活性もしくは異物代謝活性を有する微生物または微生物コロニー）。したがって、バランスの崩壊または乱れ（例えば、慢性的な不均衡）は病理学的結果をもたらす可能性があり、例えば、歯周病、炎症性腸疾患、慢性疲労症候群、肥満、がん、細菌性膣炎、および大腸炎は、腸内毒素症に関連している。いくつかの例では、腸内毒素症はＢＳＨ活性に関連しており、一次および二次胆汁酸の不均衡など、例えば、低活性もしくは不活性ＢＳＨ、または胆汁酸の不十分な脱抱合に関連している（例えば、  Ｋａｋｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｈｅｐａｔｏｌ．，  ５８（５）：９４９-９５５，  ２０１３、その関連部分は参照により本明細書に組み込まれる）。
【００４９】
エステル：−Ｃ（Ｏ）ＯＲｂであり、Ｒｂは水素、脂肪族、アリール、ヘテロ脂肪族、脂肪族−アリール、ヘテロアリール、脂肪族−ヘテロアリール、ヘテロ脂肪族−アリール、ヘテロ脂肪族−ヘテロアリール、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。
【００５０】
ファルネソイドＸ活性化受容体（ＦＸＲ）：レチノイドＸ受容体−相互作用タンパク質１４（ＲＩＰ１４）；ＲＸＲ−相互作用タンパク質１４；胆汁酸受容体（ＢＡＲ）；および核受容体サブファミリー１、グループＨ、メンバー４（ＮＲ１Ｈ４；例えば、ＯＭＩＭ６０３８２６）としても知られているＦＸＲは、ケノデオキシコール酸などの胆汁酸を結合する転写因子および核受容体である。ＦＸＲは、腸内マイクロバイオータ、胆汁酸、脂質、およびグルコース代謝、ならびに器官間コミュニケーションの調節において役割を果たし、したがって、肝臓および代謝性疾患の治療標的である。
【００５１】
ＦＸＲ核酸分子およびタンパク質を含む。ＦＸＲ配列は公開されている。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＨＱ７０９１７５．１、ＮＭ＿０２１７４５．１、およびＢＣ０１５２６１．１は、それぞれ例示的なヒト、ラット、およびマウスのＦＸＲヌクレオチド配列を開示しており、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＢＡＨ０２２９０．１、ＡＡＣ５２２０５．１、およびＮＰ＿００１１５７１７２．１は、それぞれ例示的なヒト、ラット、およびマウスのＦＸＲタンパク質配列を開示しており、これらはすべて、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。当業者は、ＦＸＲの生物学的活性（腸内マイクロバイオータ、胆汁酸、脂質、およびグルコース代謝の調節など）を保持するＦＸＲ変異体を含む、さらなるＦＸＲ核酸およびタンパク質配列を同定することができる。
【００５２】
胆石：胆嚢内の胆汁成分から形成される硬化した消化液または結石。症状としては、腹部中央または右上、肩甲骨、または右肩周辺の痛み；吐き気；嘔吐；発熱；悪寒；ならびに目および皮膚の黄変などがある。胆石には、コレステロール胆石または色素胆石が含まれる。いくつかの例では、胆石はＢＳＨに関連しており、例えば、過活性ＢＳＨまたは過剰量の脱抱合胆汁酸塩に関連している（例えば、Ｒｉｄｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，  ４７（２）：２４１−５９，  ２００６、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの例では、胆石はコレステロール胆石である。
【００５３】
ゲノミクス：ゲノムの構造、機能、進化、マッピング、および編集の研究であって（例えば、Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．，  １５（２）：１２１−３２，  ２０１４、その関連部分は参照により本明細書に組み込まれる）、例えば、全ゲノムおよび／または全エクソームシーケンシング（それぞれＷＧＳおよびＷＥＳ）；単一ヌクレオチド変異、挿入、および／または欠失（インデル）、コピー数多型のシーケンシング；ＲＮＡシーケンシング（例えば、ＲＮＡ−シーケンシングもしくは全トランスクリプトームショットガンシーケンシング）、例えば１６Ｓシーケンシングなど；核酸とリガンドおよび／または高分子間の相互作用のアッセイ（例えば、典型的には少なくとも２ｋＤａの質量を有する分子、例えば少なくとも１０個のヌクレオチドを有する核酸、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、酵素、および複数の高分子の複合体など）；ならびにメタゲノミクス（例えば、Ｓｈａｒｍａ  ａｎｄ  Ｌａｌ，  Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ５７（１）：２３-３８，  ２０１７、参照により本明細書に組み込まれる）を介して行われる。典型的なゲノミクスアッセイは、シーケンシングおよびシーケンスアセンブリおよびアノテーションを含み、例えばショットガンシーケンシングもしくはＰＣＲなどのｄｅ  ｎｏｖｏ技法、または次世代技法（例えば、「ネクストジェン」もしくはハイスループット）、例えば、リアルタイム単一分子、イオントレント、パイロ、合成、コンビナトリアルプローブアンカー、ライゲーション（例えば、オリゴヌクレオチドライゲーションおよび検出もしくはＳＯＬｉＤ）、ナノポアまたはサンガーシーケンシング；クロマチンまたは架橋免疫沈降（例えば、それぞれＣｈＩおよびＣＬＩＰ）；ならびにバイオインフォマティクスおよび計算生物学を使用する。
【００５４】
ハロゲン：フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨードから選択される原子。
【００５５】
ヘテロ脂肪族：少なくとも１個のヘテロ原子〜２０個のヘテロ原子、例えば１〜１５個のヘテロ原子、または１〜５個のヘテロ原子を含む脂肪族基であって、ヘテロ原子は酸素、窒素、硫黄、セレン、リン、および基内のそれらの酸化型から選択され得るが、これらに限定されない。例示的なヘテロ脂肪族基としては、エーテル、チオエーテル、エステル、アミン、カルボキシ、カルボニル、またはアミドを含む脂肪族基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
ヘテロ脂肪族−芳香族：本明細書に開示のプローブに結合しているか、結合し得る芳香族基であって、芳香族基はヘテロ脂肪族基を介して結合しているか、結合することになる。
【００５７】
ヘテロ脂肪族−アリール：本明細書に開示のプローブに結合しているか、結合し得るアリール基であって、アリール基はヘテロ脂肪族基を介して結合しているか、結合することになる。
【００５８】
ヘテロアルキル／ヘテロアルケニル／ヘテロアルキニル：少なくとも１個のヘテロ原子〜２０個のヘテロ原子、例えば１〜１５個のヘテロ原子、または１〜５個のヘテロ原子を含むアルキル、アルケニル、またはアルキニル基（これらは分岐鎖、直鎖、または環状であり得る）であって、ヘテロ原子は酸素、窒素、硫黄、セレン、リン、および基内のそれらの酸化型から選択され得るが、これらに限定されない。
【００５９】
ヘテロ芳香族：少なくとも１個のヘテロ原子〜２０個のヘテロ原子、例えば１〜１５個のヘテロ原子、または１〜５個のヘテロ原子を含む芳香族基であって、ヘテロ原子は酸素、窒素、硫黄、セレン、リン、および基内のそれらの酸化型から選択され得るが、これらに限定されない。
【００６０】
ヘテロアリール：少なくとも１個のヘテロ原子〜６個のヘテロ原子、例えば１〜４個のヘテロ原子を含むアリール基であって、ヘテロ原子は酸素、窒素、硫黄、セレン、リン、および環内のそれらの酸化型から選択され得るが、これらに限定されない。そのようなヘテロアリール基は、単環または２つ以上の融合環を有していてもよく、その融合環は、結合点が芳香族ヘテロアリール基の原子を介していることを条件に、芳香族であってもなくてもよく、および／またはヘテロ原子を含んでいてもいなくてもよい。いくつかの実施形態では、ヘテロアリール環は、ピリジニル、キノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ベンゾキノリニル、ベンゾキノキサリニル、ベンゾキナゾリニル、インドリル、インドリニル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、ベンズイミジゾリル、プリニル、カルバゾリル、アクリジニル、フェナジニルなどから選択されるが、これらに限定されない。
【００６１】
ヘテロ脂肪族−ヘテロ芳香族：本明細書に開示のプローブに結合しているか、結合し得るヘテロ芳香族基であって、ヘテロ芳香族基は、ヘテロ脂肪族基を介して結合しているか、結合することになる。
【００６２】
高コレステロール血症：高コレステロールとしても知られており、高コレステロール血症は、血中コレステロールの高レベルであり、遺伝性および後天性高コレステロール血症を含む（例えば、Ｉｂｒａｈｉｍ  ａｎｄ  Ｊｉａｌａｌ，  Ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ，  ＳｔａｔＰｅａｒｌｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  ２０１８，  ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ、その関連部分は参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの例では、高コレステロール血症の特徴は、ＬＤＬコレステロールが１９０ｍｇ／ｄＬを超えること、１つの心血管系危険因子で１６０ｍｇ／ｄＬを超えること、または２つの心血管系危険因子で１３０ｍｇ／ｄＬを超えることを含み、ここで、例示的な危険因子には、男性で４５歳以上および女性で５５歳以上の年齢、男性で５５歳未満および女性で６５歳未満の早期アテローム性動脈硬化症の陽性家族歴、高血圧、糖尿病、喫煙、ならびに男性で４０ｍｇ／ｄｌ未満および女性で５５ｍｇ／ｄｌ未満などの低ＨＤＬコレステロール値が挙げられる。いくつかの例では、高コレステロール血症はＢＳＨ活性に関連しており、一次および二次胆汁酸の不均衡など、例えば、低活性もしくは不活性ＢＳＨ、または胆汁酸の不十分な脱抱合に関連している。
【００６３】
疾患の抑制または治療：例えば、肥満および／または高コレステロール血症などの疾患のリスクがある被験体における、疾患または状態の完全な発症の抑制。「治療」とは、疾患または病理学的状態が発症し始めた後に、その徴候または症状を改善する治療的介入を指す。疾患または病理学的状態に関して「改善する」という用語は、治療の任意の観察可能な有益な効果を指す。有益な効果は、例えば、感染しやすい被験体における疾患の臨床症状の発症の遅延、疾患の一部またはすべての臨床症状の重症度の低下、疾患の進行の遅延、被験体の全体的な健康状態または幸福状態の改善、または特定の疾患に特異的である当該技術分野でよく知られている他のパラメータによって証明され得る。「予防的」治療とは、疾患の徴候を示さない、または初期の徴候のみを示す被験体に、病理学的発症のリスクを減少させる目的で施される治療法である。
【００６４】
過敏性腸疾患（ＩＢＤ）：ＩＢＤは小腸および大腸の炎症を伴い、クローン病および潰瘍性大腸炎が含まれる。クローン病は小腸と大腸のほか、口、食道、胃、および肛門にも影響を与えるが、潰瘍性大腸炎は主に大腸と直腸に影響を与える。症状としては、腹痛、嘔吐、下痢、直腸出血、骨盤周辺の重度の内部けいれん／筋肉けいれん、および体重減少などがある。貧血は、炎症性腸疾患の最も一般的な腸管外合併症である。ＩＢＤに関連するさらなる病状または疾患には、関節炎、壊疽性膿皮症、原発性硬化性胆管炎、非甲状腺疾患症候群（ＮＴＩＳ）、深部静脈血栓症（ＤＶＴ）、および閉塞性細気管支炎器質化肺炎（ＢＯＯＰ）などがある。診断は、一般に、便中の炎症性マーカーの評価に続いて、病理学的病変の生検を伴う大腸内視鏡検査によって行われる。いくつかの例では、ＩＢＤはＢＳＨ活性に関連しており、一次および二次胆汁酸の不均衡など、例えば、低活性もしくは不活性ＢＳＨ、または胆汁酸の不十分な脱抱合に関連している。
【００６５】
ケトン：−Ｃ（Ｏ）Ｒｂであり、Ｒｂは脂肪族、アリール、ヘテロ脂肪族、脂肪族−アリール、ヘテロアリール、脂肪族−ヘテロアリール、ヘテロ脂肪族−アリール、ヘテロ脂肪族−ヘテロアリールおよびそれらの任意の組み合わせから選択される。
【００６６】
肝がん：原発性肝がんおよび続発性肝がんを含む肝臓のがん。原発性肝がんでは、がんは肝臓に発生するが、続発性肝がん（すなわち、転移性肝がん）では、がんは体内の別の発生部位から肝臓に転移している。原発性肝がんの例としては、肝細胞癌（すなわち、肝細胞がん）、肝内胆管癌（すなわち、胆管がん）、血管肉腫、血管肉腫、および肝芽腫が挙げられる。いくつかの例では、肝がんは肥満に関連している（例えば、Ｒｉｄｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，  ３０（３）：３３２-３３８，  ２０１４、その関連部分は参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの例では、結腸がんはＢＳＨに関連しており、例えば、過活性ＢＳＨまたは過剰量の脱抱合胆汁酸塩に関連している。
【００６７】
代謝：栄養およびエネルギーを調節する代謝などの、生化学的構築および破壊。いくつかの例では、代謝は、環境（例えば、植物、動物、ヒト、または微生物の周囲環境であって、植物、動物、ヒト、または微生物の内部環境を含み得る）で起こる微生物代謝、例えば、生体異物、医薬品または生物学的物質、炭素、窒素、硫黄、リン酸塩、還元均等物、およびエネルギーの代謝を含む（例えば、Ｎａｋａｍｕｒａ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅｄ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １４（５）：４５４−９，  ２００３、その関連部分は参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの例では、代謝は、特定の代謝機能（例えば、酵素活性および／または代謝物の取り込みもしくは感知）を含む。いくつかの例では、代謝に関与する環境における微生物（例えば、細菌、古細菌、または真菌）を富化もしくは減少させることによって、または代謝に関与する１種以上のタンパク質の量もしくは発現を変化させることなどによって、代謝を変化させることができる（例えば、少なくとも１つの特定の代謝機能に関与する微生物を富化もしくは減少させることによって、または少なくとも１つの特定の代謝機能に関与する１種以上のタンパク質の量または発現を変化させることによって）。いくつかの例では、代謝は、エネルギー（例えば、エネルギー生産もしくは変換）、栄養素（例えば、栄養素生産もしくは変換）、生体異物（例えば、生体異物変換もしくは異化）、または細胞内もしくは細胞外プロセス（例えば、植物、動物、ヒト、または微生物の内部または外部）の調節を伴う。したがって、代謝を変化させることは、エネルギー、栄養素、生体異物、または細胞内もしくは細胞外プロセスの調節を変化させることができる。
【００６８】
いくつかの例では、代謝は、薬物または生体異物代謝（例えば、生体による薬物または生体異物の分解）である。ヒトなどにおけるいくつかの例では、薬物代謝は、３つの段階を含むことができる。第Ｉ相では、酵素（例えば、シトクロムＰ４５０オキシダーゼ）が、反応性基または極性基を薬物または生体異物に付加する。第ＩＩ相では、修飾された薬物または生体異物は、次いで、極性化合物（例えば、メチル基、硫酸基、アセチル基、グルクロン酸基、グルタチオン基、およびグリシン基）に、例えば、トランスフェラーゼ酵素（例えば、メチルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、胆汁酸−ｃｏＡ：アミノ酸Ｎ−アシルトランスフェラーゼ、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ＸＭ−リガーゼ、およびグリシンＮ−アシルトランスフェラーゼ）によって抱合され得る。第ＩＩＩ相では、抱合された薬物または生体異物はさらに処理されてもよく、次いで、排出トランスポーターによって細胞からポンプで排出される。薬物または生体異物代謝のいくつかの例では、親油性化合物は、より容易に排泄される親水性生成物に変換され得る。いくつかの例では、薬物または生体異物代謝は、薬力学または薬物クリアランスに影響を与え得る。いくつかの例では、薬物または生体異物代謝が不十分または過剰であると、治療の失敗または副作用が生じる可能性がある。
【００６９】
微生物：単細胞としてまたは細胞のコロニーで生存するすべての単細胞生物および微生物を含む微細生物または微視的生物。微生物の例としては、細菌、古細菌、藻類、真菌、原生動物、およびウイルスが挙げられる。いくつかの例では、微生物は、植物、動物、またはヒトなどの別の生物に存在する（例えば、動物またはヒト体内のマイクロバイオームの一部として、例えば動物またはヒトの腸内マイクロバイオームなど）。具体的な例では、微生物には、Ｌ．プランタラム、バクテロイデス、またはファーミキューテスが含まれ得る。
【００７０】
肥満：体格指数（ＢＭＩ）が３０以上であることを特徴とする疾患状態。肥満は、２型糖尿病、高血圧、心臓病および脳卒中、特定の種類のがん、睡眠時無呼吸、変形性関節症、脂肪肝疾患、腎臓病、妊娠中の問題（例えば、妊娠中の高血糖、高血圧、および帝王切開分娩のリスク増加）などの他の疾患と関連している。いくつかの例では、肥満は、微生物または酵素（例えば、微生物酵素）、例えば少なくとも１つの特定の代謝機能（例えば、ＢＳＨ活性）を有する微生物または酵素の存在、不在、もしくは存在量に関連しているか、または少なくとも部分的に関連している。いくつかの例では、肥満は、一次および二次胆汁酸の不均衡、例えば、低活性もしくは不活性ＢＳＨ、または胆汁酸の不十分な脱抱合に関連している。
【００７１】
医薬品または薬物：被験体に適切に投与されたときに、所望の治療効果または予防効果を誘発することができる化学化合物または組成物。
【００７２】
薬学的に許容される担体：本開示において有用な薬学的に許容される担体は、従来のものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （Ｅ．  Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ，  １８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９９０、その関連部分は参照により本明細書に組み込まれる）には、医薬品または薬物の薬学的送達に適した組成物および製剤が記載されている。一般に、担体の性質は、採用される特定の投与様式に依存することになる。例えば、非経口製剤は、通常、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの薬学的および生理学的に許容される流体を溶媒として含む、注射可能な流体を含む。固体組成物（例えば、粉末、丸薬、錠剤、またはカプセル形態）のでは、従来の非毒性固体担体は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含むことができる。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、ｐＨ緩衝剤などの非毒性補助物質、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートなどを少量含むことができる。
【００７３】
プロテオミクス：タンパク質の研究であって、例えば、タンパク質を分離し、同定し、分析するための技法を使用するような大規模研究または小規模研究（例えば、タンパク質構造、タンパク質−タンパク質相互作用、もしくはタンパク質−リガンド相互作用などの分子間または分子内相互作用の分析；Ｌｅｅ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １９（６）：２１７−２２，  ２００１、その関連部分は参照により本明細書に組み込まれる）。プロテオミクス分析用の多くのツールが利用可能であり、例えば、以下が挙げられる：質量分析（例えば、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化もしくはエレクトロスプレーイオン化を含むハードイオン化もしくはソフトイオン化技法を、例えば、飛行時間、四重極フィルター、もしくはイオントラップなどの質量分析計とともに使用して、ならびに液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、タンデム質量分析、もしくはフラグメント化技法、例えば、衝突誘起解離などの他の技法を使用して）；電気泳動（例えば、１Ｄもしくは２Ｄゲル電気泳動もしくはウエスタンブロッティング）、免疫学的アッセイ（例えば、免疫学的マイクロアレイアッセイもしくは酵素結合免疫吸着アッセイ、ＥＬＩＳＡ）、タンパク質マイクロアレイアッセイ（例えば、機能性タンパク質もしくは標的タンパク質アレイアッセイ）、クロマトグラフィー（例えば、アフィニティ、サイズ排除、イオン交換、もしくは逆相）、タンパク質の構造もしくは電気化学の分析用ツール（例えば、Ｘ線結晶学もしくは核磁気共鳴）、計算もしくはバイオインフォマティクスツール（例えば、タンパク質同定、構造、もしくは相互作用モデリングツール）、またはそれらの任意の組み合わせ。いくつかの実施形態では、液体クロマトグラフィーＭＳ（ＬＣ−ＭＳ）などの質量分析（ＭＳ）が使用される。
【００７４】
試料：分析に使用する検体。任意のタイプの試料を使用することができ、身体環境（例えば、腸（小腸、大腸、直腸など）、胃、肝臓、胆嚢、糞便、血液またはその一部（例えば、血清もしくは血漿）、尿、精液、唾液、組織生検、手術用試料、および剖検材料）からの試料などの被験体から取得した試料、またはバイオリアクター、土壌、もしくは水性環境から取得した試料を含む。いくつかの例では、試料は、本明細書で提供される方法で直接使用される。いくつかの例では、試料は、濃縮、濾過、遠心分離、希釈、脱塩、変性、還元、アルキル化、タンパク質分解、またはそれらの組み合わせを介してなど、開示の方法を使用して分析する前に操作を受ける。いくつかの例では、試料から細胞、タンパク質、および／または核酸分子を単離するなど、開示の方法を使用して分析する前に、試料の成分は単離されるか精製される。いくつかの例では、試料は微生物タンパク質を含む。
【００７５】
被験体：本明細書で使用されるとき、用語「被験体」は動物を指し、限定されないが、ヒト、家庭用動物（例えば、イヌまたはネコ）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、またはブタ）、非ヒト霊長類、および実験動物（マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ブタ、ウサギ、イヌ、またはサル）などの哺乳類が挙げられる。他の例示的な被験体としては、魚類、両生類、爬虫類、および鳥類（ニワトリおよびシチメンチョウなど）が挙げられる。被験体は、開示の方法およびデバイスを使用して分析される試料の供給源としての役割を果たし得る。
【００７６】
タケダＧタンパク質共役型胆汁酸受容体（ＴＧＲ５）：ＢＧ３７、Ｇタンパク質共役型胆汁酸受容体１（ＧＰＢＡＲ１）、Ｇタンパク質共役型受容体１９（ＧＰＣＲ１９）、および胆汁酸の膜型受容体（Ｍ−ＢＡＲ；例えば、ＯＭＩＭ番号６１０１４７）としても知られており、ＴＧＲ５はマクロファージの機能を抑制し、胆汁酸によりエネルギー恒常性および代謝を調節し、代謝障害（例えば、肥満）、肝疾患（例えば、非アルコール性脂肪肝疾患）、高コレステロール血症、およびアテローム性動脈硬化症などの疾患に関与する。
【００７７】
ＴＧＲ５核酸分子およびタンパク質を含む。ＴＧＲ５配列は公開されている。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＡＢ０８９３０７．１、ＡＢ０８９３１０．１、およびＡＢ０８９３０８．１は、それぞれ例示的なヒト、ラット、およびマウスのＴＧＲ５ヌクレオチド配列を開示しており、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＮＰ＿００１３０８８７９．１、ＮＰ＿８０８７９７．１、およびＮＰ＿７７８１５０．１は、それぞれ例示的なヒト、ラット、およびマウスのＴＧＲ５タンパク質配列を開示しており、これらはすべて、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。当業者は、ＴＧＲ５の生物学的活性（エネルギー恒常性および代謝の調節など）を保持するＴＧＲ５変異体を含む、さらなるＴＧＲ５核酸およびタンパク質配列を同定することができる。
【００７８】
治療薬剤：一般的な意味で使用され、治療剤、予防剤、および置換剤を含む。
【００７９】
治療有効量：治療を受ける被験体において所望の効果を達成するのに十分な量の薬剤。例えば、これは、被験体における疾患もしくは状態を治療するのに必要な量、疾患もしくは状態の進行を防止するか疾患もしくは状態の退行を引き起こすのに十分な用量、または疾患もしくは状態によって引き起こされる症状を緩和することができる量であり得る。一例では、その量は、疾患または状態の進行を防止するか疾患もしくは状態の退行を引き起こすのに十分である。別の例では、その量は、疾患もしくは状態の徴候または症状を抑制するのに十分である。
【００８０】
有効量の薬剤は、全身的または局所的に投与することができる。さらに別の例では、有効量は、治療の過程で、例えば毎日、単回投与または複数回投与することができる。しかしながら、有効量は、投与される製剤、治療を受ける被験体、苦痛の重症度および種類、ならびに化合物の投与方法によって決まる。
【００８１】
ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）：１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３受容体；ビタミンＤホルモン受容体；カルシトリオール受容体；および核内受容体サブファミリー１、グループＩ、メンバー１（ＮＲ１Ｉ１；例えば、ＯＭＩＭ番号６０１７６９）としても知られており、ＶＤＲは、ビタミンＤおよび他のリガンドに加えて胆汁酸にも結合する。さらに、ＶＤＲは、胆汁酸産生、カルシウムおよびリン酸塩の恒常性、細胞の増殖および分化、ならびに免疫系および神経系を調節し、心血管疾患、糖尿病、およびがんからの保護を補助する。
【００８２】
ＶＤＲ核酸分子およびタンパク質を含む。ＶＤＲ配列は公開されている。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号Ｊ０３２５８．１、ＮＭ＿０１７０５８．１、およびＤ３１９６９．１は、それぞれ例示的なヒト、ラット、およびマウスのＶＤＲヌクレオチド配列を開示しており、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＢＡＡ８３３８９．１、ＥＤＬ８７０９５．１、およびＢＡＡ０６７３７．１は、それぞれ例示的なヒト、ラット、およびマウスのＶＤＲタンパク質配列を開示しており、これらはすべて、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。当業者は、ＶＤＲの生物学的活性（胆汁酸産生の調節など）を保持するＶＤＲ変異体を含む、さらなるＶＤＲ核酸およびタンパク質配列を同定することができる。
【００８３】
上記に示す用語の記載は、許容可能でない置換パターン（例えば、５個の異なる基で置換されたメチルなど）を含むことを意図するものではない。そのような許容可能でない置換パターンは、当業者によって認識される。本明細書に開示の式および特定の化合物において、官能基または他の原子が図示されていない場合はいつでも、水素原子が存在し、形式的な価数要件を満たす（ただし、必ずしも図示されていなくてもよい）。例えば、
【化４】
2020536566.tif 000006
のように描かれているフェニル環は、「ａ」の炭素以外のフェニル環の各炭素原子に結合した水素原子を、そのような水素原子が図示されていなくても含んでいる。
【００８４】
本明細書に開示の任意の官能基および／または上記で定義された官能基は、本明細書に別段の記載がない限り、置換されていても、置換されていなくてもよい。
【００８５】
（ＩＩ．緒言）
動物の腸は、宿主の健康状態に大きな影響を与える微生物の複合混合体を収容しており、影響としては栄養吸収の変化、宿主の生理機能を調節する化学シグナルの生成、および病原体からの保護が挙げられる。腸内マイクロバイオームが宿主に影響を与える主な経路は、生体異物と内因性物質の化学変換を介したものである。特定の種類の化学変換の能力は、腸内マイクロバイオーム内の個々の微生物の身元および存在量に依存しており、個人間で劇的に変化し、食生活、年齢、地理的な場所、さらには季節などの要因にも影響される。腸内マイクロバイオームの代謝活動は、複合多糖類の消化の場合のように、食物から抽出され得る栄養価を増加させることにより、宿主の健康状態にプラスの影響を与えることができる。腸内マイクロバイオームはまた、短鎖脂肪酸などの化学代謝物を生成することができ、これは、疾患に対する感受性を低下させる宿主のシグナル伝達経路を誘導する。あるいは、腸内微生物による宿主産生代謝物の化学修飾は、一部の代謝物ががんの発生率の増加と関連しているため、有害である可能性がある。宿主の回復力を高め、疾患への感受性を低下させるためには、腸内マイクロバイオーム代謝をより明確に理解することが必要である。
【００８６】
マイクロバイオータ−宿主相互作用の例として、宿主の胆汁液の微生物による修飾がある。動物は胆汁を産生し、溶解性を高めることで疎水性栄養素の消化を助ける。胆汁酸は、胆汁の主成分である低分子有機化合物であり、この液体の正味の物理化学的特性に大きな影響を与える。胆汁酸は、コレステロールを出発物質として使用する多段階生合成経路を経て肝臓で生成される。ヒトは、２つの主要な胆汁酸であるコール酸およびケノデオキシコール酸を生成し、これらは１個のヒドロキシル基の存在によって異なるものであるが、異なる生物学的効果を有し得る。肝臓で合成された後、胆汁酸はその後グリシンまたはタウリンと抱合して胆汁酸塩を生成し、これにより分子の親水性が大幅に向上する。肝臓で合成された後、胆汁酸塩は胆嚢に貯蔵され、十二指腸に放出されて消化を促進し、最終的には後の使用のために再吸収される。
【００８７】
胆汁酸は明らかに消化に影響を与えるが、これらの分子はもはや疎水性栄養素の溶解性を高める単純な界面活性剤とは考えられておらず、ＦＸＲおよびビタミンＤ受容体などの腸内のヒト核受容体、ならびにＴＧＲ５などの表面受容体に結合する選択的化学シグナルであると認識されるようになった。宿主受容体による胆汁酸塩の結合は、胆汁酸プールの状態に関する情報を提供し、コレステロールからの胆汁酸塩の合成の第一段階を負に調節する。胆汁酸受容体はまた、グルコースおよびエネルギーの恒常性を含む他のプロセスを調節するシグナル伝達経路に供給する。
【００８８】
腸内の微生物代謝は、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、およびリトコール酸を含む修飾された二次胆汁酸を生成し、これらは、互いにおよび一次胆汁酸とは異なる生物学的効果を有し得る。胆汁酸塩は、微生物が一次胆汁酸を修飾するように、グリシン／タウリンから脱抱合されなければならない。胆汁酸塩の脱抱合は、微生物胆汁酸塩ヒドロラーゼ（ＢＳＨ）の活性に起因し、これは求核性システインを使用して胆汁酸とグリシン／タウリンとの間のアミド結合を加水分解する（図１Ａ）。さらなる微生物修飾のために胆汁酸を調製するというその役割のために、ＢＳＨは、二次胆汁酸形成の門番と考えることができる。ＢＳＨの脱抱合活性の結果は、胆汁酸プールの物理化学的特性の正味の変化であり、最終的に胆汁酸プールをより疎水性にする。ＢＳＨ脱抱合はまた、胆汁酸の排泄と強く相関している。胆汁酸が過剰に排泄されると、内因的に産生されるコレステロールプールが使い尽くされて新鮮な胆汁の産生を補うため、ＢＳＨ活性の上昇は、肥満および高コレステロール血症の治療に効果的な戦略であることが示唆されている。ＢＳＨ活性は、いくつかの一般的なプロバイオティクスの有益な健康効果の要因であると提唱されている。
【００８９】
ＢＳＨによる胆汁酸塩の酵素加水分解は、一般に、胆汁酸塩のアミド結合を攻撃してアミノ酸を遊離させ、中間的な共有結合した酵素−胆汁酸複合体を形成するＮ末端求核性システインに依存しており、これはその後加水分解され、システインを遊離させて別の触媒サイクルに参加する。ＢＳＨ活性を定量化する現在の方法は、遊離アミン（アミノ酸生成物）の多段階検出、ＨＰＬＣ精製、または沈殿生成物の分光光度検出に依存している。これらの方法はいずれも、それぞれの欠点を抱えている。遊離アミンの検出は、ニンヒドリンベースのアッセイなどにおいて、アッセイ妨害の原因となり得る多くの求核性アミンを含有する複合試料（例えば、細胞溶解液または便）を分析する場合には実用的ではない。ＨＰＬＣ法は、長時間の実験および低スループットのデータ生成に悩まされている。現在の方法では、臨床設定に最も関連性の高い糞便試料中のＢＳＨ活性の分析に有用なものはほとんどない。さらに、現在のところ、ｉｎ  ｖｉｖｏ細菌培養物に適用することができる方法が存在しないため、ＢＳＨの生物学について研究者が問うことができる問題の種類が著しく制限されている。
【００９０】
本明細書に開示するのは、プローブ実施形態と、プローブを使用してＢＳＨと類似の活性を示す酵素種を同定し、特性評価する方法の実施形態である。開示のプローブ実施形態は、ＢＳＨ活性を示す酵素に共有結合して、および／またはそのような酵素と反応して、検出可能シグナルを出すように設計されているため、これらの酵素を同定し、単離し、特性評価することができる。図１Ｂは、プローブがＢＳＨと反応して、プローブから検出可能部位を外す実施形態を示す。そうして、そのような酵素に関与する腸内の分類群を決定することができる。また、開示のプローブ実施形態と共に使用することができるアッセイ方法の実施形態も開示する。一実施形態では、連続蛍光ベースのＢＳＨアッセイが記載されている。開示のプローブ実施形態および方法実施形態を使用して、腸内のどの微生物がＢＳＨ活性を有するかを決定することができるため、それらを使用して、健康な個体と病気の個体とで活性がどのように異なるかについての洞察を提供することができる。胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を有する腸内マイクロバイオーム中の酵素を包括的に決定することを可能にするアプローチは、現在のところ存在しない。開示のプローブ実施形態および方法実施形態は、ＢＳＨの検出および／または単離に適用されていない独自の化学および反応性を使用する。
【００９１】
（ＩＩＩ．  プローブ実施形態）
本明細書に開示するのは、ＢＳＨ活性を示す酵素を標的化し、同定し、単離するために使用することができるプローブ実施形態である。特定の開示の実施形態では、プローブは、検出可能部位（「ＤＭ」）または検出可能部位前駆体（「ｐＤＭ」）を含む。ｐＤＭ基を使用して、プローブに検出可能部位を付加することができる。プローブのいくつかの実施形態では、検出可能部位（または検出可能部位前駆体）をプローブに結合させるリンカー基を含むことができる。リンカーを含む実施形態では、プローブは、リンカーに共有結合している光活性化可能部位またはアンカー部位をさらに含むことができる。光活性化可能部位は、エネルギー源（例えば、光源であって、１０ｎｍ〜４００ｎｍ、または１０ｎｍ〜３７０ｎｍ、または１０ｎｍ〜３６５ｎｍの波長の光を提供する光源など）によって活性化された後、酵素と共有結合を形成することができる。アンカー部位は、プローブ実施形態を基板の表面に結合させるために使用することができる官能基である。プローブの他の実施形態は、リンカーを含まず、代わりに、プローブに直接結合した検出可能部位（または検出可能部位前駆体）を有する。
【００９２】
本明細書に記載のプローブ実施形態は、式Ｉを満たす構造を有し得る。特定の開示の実施形態では、プローブは、式ＩＡ〜ＩＤに示す立体化学を有する構造を有することができ、Ｒ１〜Ｒ３の立体異性体の任意の組み合わせが企図される。
【化５−１】
2020536566.tif 000007
【化５−２】
2020536566.tif 000008
【００９３】
式ＩおよびＩＡ〜ＩＤに関して、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の各々は独立して水素または−ＯＲから選択され得、各Ｒは独立して水素、酸素原子の負電荷のバランスをとる対イオン（Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｌｉ＋などのアルカリ金属イオン；アンモニウムイオン、もしくは他の正に帯電したイオン化有機化合物など）、脂肪族、ヘテロ脂肪族、芳香族、または脂肪族、ヘテロ脂肪族、もしくは芳香族の任意の組み合わせ（例えば、脂肪族−芳香族もしくはヘテロ脂肪族−芳香族）から選択される；Ｒ５は水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、芳香族、または脂肪族、ヘテロ脂肪族、もしくは芳香族の任意の組み合わせ（例えば、脂肪族−芳香族もしくはヘテロ脂肪族−芳香族）であり得る；リンカーは、存在する場合（ｍが１であるときなど）、脂肪族、ヘテロ脂肪族、芳香族、または脂肪族、ヘテロ脂肪族、もしくは芳香族の任意の組み合わせであり得る；ＤＭは、存在する場合（ｐＤＭ基が存在しないときなど）、検出可能部位である；ｐＤＭは、存在する場合（ＤＭ基が存在しないときなど）、検出可能部位前駆体である；ＰＭは、存在する場合（ＡＭ基が存在しないときなど）、光活性化可能部位である；ＡＭは、存在する場合（ＰＭ基が存在しないときなど）、アンカー部位である；ｎは０〜１０、例えば０〜５、または０、１、２、もしくは３などの０〜３の整数である；ｍは０または１から選択される整数である。式ＩおよびＩＡ〜ＩＤに関して、破線結合（
2020536566.tif 000009
）は、その結合が存在する場合と存在しない場合があるため、ＰＭもしくはＡＭ基がリンカーに結合し得ること、および／または図示のカルボニル基に対するα炭素とβ炭素との間に二重結合が存在し得ることを示す（二重結合が存在しない場合は、単結合が存在する）。また、式ＩおよびＩＡ〜ＩＤ（および以下に開示の他の式）の波状結合（
2020536566.tif 000010
）は、二重結合が存在する場合、二重結合はＥまたはＺ配置をとることができることを示す。
【００９４】
いくつかの実施形態では、各Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は独立して水素、ヒドロキシル、またはアルコキシである；Ｒ５は水素または脂肪族である；リンカーは、脂肪族（例えば、アルキル）またはヘテロ脂肪族（例えば、アミド含有基、ベータ−ラクタム含有基など）である；ＤＭは、存在する場合、フルオロフォア、染料、または特定の結合ペアのメンバーである；ｐＤＭは、存在する場合、クリック可能な官能基である；ＰＭは、存在する場合、ジアジリンまたはベンゾフェノンである；ＡＭは、存在する場合、クリック可能な官能基（例えば、アルキンまたはアジド）、カルボン酸、ＮＨＳ−エステル、アミン、ハロゲン化アルキル、または本明細書に記載のように表面修飾した基板に結合することができる任意の他の官能基を含む；ｎは０、１、または２から選択される；ｍは０または１である。
【００９５】
いくつかの実施形態では、プローブは、式ＩＩＡまたはＩＩＢのいずれか１つを満たす構造を有し得る。
【化６】
2020536566.tif 000011
【００９６】
式ＩＩＩＡおよびＩＩＢに関して、Ｒ１、Ｒ２、リンカー、ＤＭ、ｐＤＭ、ＰＭ、ＡＭ、ｎ、およびｍの各々は、式ＩおよびＩＡについて上述した通りであり得る。
【００９７】
いくつかの実施形態では、プローブは、式ＩＩＩＡ〜ＩＩＩＦの任意の１つ以上を満たす構造を有し得る。
【化７−１】
2020536566.tif 000012
【化７−２】
2020536566.tif 000013
【００９８】
式ＩＩＩＡ〜ＩＩＩＦに関して、Ｒ１、Ｒ２、リンカー、ＤＭ、ｐＤＭ、ＰＭ、ＡＭ、およびｎの各々は、式ＩおよびＩＡについて上述した通りであり得る。さらに、ｐは１〜１０、例えば１〜８、または１〜６、または１〜４から選択される整数であり得る；ｑは０〜２０、例えば１〜２０、または１〜１５、または１〜１０、または１〜５の整数であり得る。特定の実施形態では、ｐは１、２、３、または４であり、ｑは０、１、２、３、４、または５である。式ＩＩＩＡは、アミド窒素とＤＭ基との間にリンカー部位を含まないプローブの代表的な式を提供する。式ＩＩＩＢは、代表的な脂肪族リンカー基（−（ＣＨ２）ｓ−、ｓは１〜１０、例えば１〜８、または１〜６、または１〜４の整数である）を含む。式ＩＩＩＣは、代表的なヘテロ脂肪族リンカー基
【化８】
2020536566.tif 000014
を含む。式ＩＩＩＤは、（二官能性リンカーとしても機能する）別の代表的なヘテロ脂肪族リンカー基
【化９】
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を含む。式ＩＩＩＥおよびＩＩＩＦはまた、二官能性リンカーとしても機能する代表的なヘテロ脂肪族リンカー基
【化１０】
2020536566.tif 000016
および
2020536566.tif 000017
を含む。
【００９９】
例示的なプローブ実施形態を以下に示す。
【化１１−１】
2020536566.tif 000018
【化１１−２】
2020536566.tif 000019
【化１１−３】
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【化１１−４】
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【化１１−５】
2020536566.tif 000022
【化１１−６】
2020536566.tif 000023
【化１１−７】
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【化１１−８】
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【化１１−９】
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【化１１−１０】
2020536566.tif 000027
【０１００】
上記の種に関して、ステロール部位の任意のヒドロキシル基の立体化学は、構造中に定義されている通りであり得る。ステロール部位の特定のヒドロキシル基の立体化学が示されていない場合は、各エナンチオマーが企図されており、したがって任意の結果として得られるジアステレオマー生成物も企図される。例えば、マウスベースのステロール基（例えば、ムリコールステロール基）を含む実施形態では、α−ムリコール、β−ムリコール、γ−ムリコール、およびω−ムリコールステロール部位がすべて企図される。さらに、カルボニル基に二重結合を連結させる波状結合（すなわち、
2020536566.tif 000028
）を有する上記の種は、Ｚ生成物、Ｅ生成物、またはいくつかの実施形態では、Ｅ生成物とＺ生成物との混合物を包含することが意図される。
【０１０１】
本明細書に記載のプローブを、本明細書に記載の組成物の実施形態、キットの実施形態、およびデバイスの実施形態において使用することができる。特定の実施形態では、プローブを組成物として提供することができ、この組成物は１つ以上のプローブ実施形態と、ｐＨ緩衝剤などの薬学的に許容される担体とを含むことができる。いくつかの実施形態では、組成物は、プローブ上に存在するｐＤＭ基と反応することができるクリック可能な官能基を含むＤＭ基をさらに含むことができる。いくつかの追加の実施形態では、組成物は、ＣｕＩ、塩基（例えば、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン）および溶媒（例えば、ＤＭＳＯ）などのクリックケミストリー試薬；またはホスフィン化合物（例えば、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）、リガンド（例えば、当該技術分野で知られている銅結合リガンド）、および銅含有化合物（例えば、ＣｕＳＯ４）をさらに含むことができる。追加の組成物の実施形態を以下に開示する。
【０１０２】
（ＩＶ．プローブ実施形態の作製方法）
上記のプローブ実施形態を作製する方法を本明細書に開示する。特定の開示の実施形態では、式Ｉを満たす構造を有するプローブを、スキーム１に示す方法の実施形態に従って作製することができる。スキーム１に関して、化合物１００などのステロール含有出発物質を、アミド結合形成工程を使用して、式Ｉを満たす構造を有するプローブ（化合物１０４）に変換することができる。この工程では、化合物１００のカルボン酸部位を、プローブの様々な構成要素（例えば、ＤＭ基、ｐＤＭ基、ＰＭ基、および／またはＡＭ基）を含むアミン含有化合物、例えばアミン１０２と結合させることができる。本開示の恩恵を受けて当業者であれば認識可能であるアミド結合形成条件を使用することができる（例えば、塩基およびＨＯＢｔ、ＤＣＣ、ＨＡＴＵ、ＴＢＴＵ、ＰｙＢＯＰなどのようなアミド形成カップリング試薬を使用する）。そのような方法を使用して、式ＩＩＢも満たす構造を有するプローブを作製することができる。
【０１０３】
追加の実施形態では、ステロール含有化合物１００を、スキーム１にも示すように、式ＩＩＡを満たす他のプローブ実施形態に変換することができる。そのような実施形態では、ステロール含有化合物１００を、メチル化工程、保護工程、還元工程、および酸化工程、ならびにそれらの任意の組み合わせを含む（ただし、これらに限定されない）様々な官能基化工程にさらし、それによってアルデヒド１０６を提供することができる。そのような工程を実行するのに十分な試薬は、本開示の恩恵を受けて当業者であれば容易に認識可能である；しかしながら、代表的な試薬をスキーム２に例として提供する。いくつかの実施形態では、アルデヒド１０６を、塩基（例えば、ピペリジン、ピリジン、またはそれらの組み合わせ）を使用して、マロン酸などの二酸化合物と縮合させ、α，β−不飽和酸化合物１０８を提供することができる。次いでα，β−不飽和酸化合物１０８に、化合物１０４を作るために上述したものと同様のアミド結合形成工程を施し、それによってプローブ１１０を提供することができる。
【化１２】
2020536566.tif 000029
【０１０４】
式Ｉ、ＩＡ〜ＩＤ、ＩＩＡ、またはＩＩＩＢの任意の１つ以上を満たす構造を有するプローブ実施形態を作製するための代表的な方法を、以下のスキーム２に提供する。
【化１３】
2020536566.tif 000030
【０１０５】
式Ｉ、ＩＡ〜ＩＤ、ＩＩＡ、およびＩＩＩＤ〜ＩＩＩＦの任意の１つ以上を満たす構造を有するプローブ実施形態を作製するための代表的な方法を、以下のスキーム３に提供する。
【化１４】
2020536566.tif 000031
【０１０６】
式Ｉ、ＩＡ〜ＩＤ、ＩＩＢ、およびＩＩＩＣの任意の１つ以上を満たす構造を有するプローブなどの追加のプローブ実施形態を、以下のスキーム４に示す代表的な方法を使用して作製することができる。
【化１５】
2020536566.tif 000032
【０１０７】
式Ｉ、ＩＡ〜ＩＤ、ＩＩＢ、およびＩＩＩＡの任意の１つ以上を満たす構造を有するプローブなどの追加のプローブ実施形態を、以下のスキーム５および６に示す代表的な方法を使用して作製することができる。
【化１６】
2020536566.tif 000033
【０１０８】
（Ｖ．デバイスおよびキットの実施形態）
本明細書に記載のプローブ実施形態はまた、生体試料などの試料を分析するために使用され得るデバイスおよび／またはキットで使用するように構成され得る。デバイスおよびキットを使用して、生体試料中に存在する様々な種を評価し同定することができ、試料内のそのような種が関与する機能／プロセスを評価することもできる。特定の開示の実施形態では、デバイスは、１つ以上のプローブ実施形態と基板とを含むことができ、プローブ（または複数のプローブ）は、生体試料にさらされる前に基板に結合しているか、基板とプローブは生体試料にさらされた後に結合することができる。デバイスおよびキットの実施形態を使用して複数の生体試料を評価することができ、多重化の状況において使用することもできる。
【０１０９】
特定の実施形態では、デバイスの基板構成要素は、生体試料にさらされるのに適切な基板である。代表的な基板には、プローブがガラスベースの基板の表面上に存在する官能基に結合するような、本明細書に記載のプローブ実施形態で官能基化され得るガラスベースの基板が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ガラスプレート、ガラス棒、および／またはガラスマイクロスフェアが基板構成要素として使用される。
【０１１０】
デバイスおよび／またはキットに使用されるプローブは、本明細書に開示の任意のプローブ実施形態から選択され得る。いくつかの実施形態では、プローブは、プローブをデバイスの基板構成要素に固定することができるアンカー部位を含む二官能性リンカー基を含むか、または含むように修飾されている。特定の開示の実施形態では、アンカー部位は、クリックケミストリー反応を使用して基板表面に存在するクリック可能な官能基と反応させることができるクリック可能な官能基であり、それによってプローブを基板に共有結合させることができる。いくつかの実施形態では、プローブは、そのような技法を使用して、試料ばく露の前に基板に事前結合され得る。いくつかの追加の実施形態では、プローブは、プローブが試料にさらされた後に、そのような技法を使用して基板に事後結合され得る。事前結合されたプローブまたは事後結合されたプローブは、デバイスの使用中に検出可能部位に変換されるｐＤＭ基をさらに含むか、またはいくつかの実施形態では、検出可能部位は、プローブ上に事前に取り付けられ得る。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、デバイスは、プローブ実施形態が基板に事前結合され、試料の分析に使用される任意の追加の試薬がデバイス内に事前収容されているように、事前組み立てされている。いくつかの他の実施形態では、デバイスは、事前組み立てされたデバイスを含むキットの一部として提供されてもよく、試料の分析に使用される任意の追加の試薬は、キットの別個の構成要素として（例えば、試薬ボトル内などに）提供される。キットのこれらの構成要素を、使用者が使用前に合わせることができる。さらにいくつかの追加の実施形態では、キットは、適切な結合条件を使用してキット内の別個の試薬ボトルによって提供されるプローブ実施形態で処理され得る基板を含むことができ、それにより任意の所望のプローブ実施形態を基板に結合させ、装置を使える状態にする。
【０１１２】
本開示のデバイス実施形態を作製する方法も開示している。いくつかの実施形態では、デバイスは、クリック可能な官能基または基板の官能基に化学結合することができる他の官能基などのアンカー部位を含むプローブ実施形態に基板をさらすことによって作製され得る。プローブがクリック可能な官能基を含む実施形態では、基板は典型的にはその表面上に、プローブのクリック可能な官能基と反応することができるクリック可能な官能基も含む。いくつかの実施形態では、基板はヒドロキシル基を有する表面を含むガラス基板であり、ヒドロキシル基がアルコキシシラン分子で修飾され、シラン化された基板表面を提供することができる。いくつかの実施形態では、シラン化された基板表面は、クリック可能な官能基を含む試薬とさらに反応することができる。特定の開示の実施形態では、プローブのアンカー部位は、基板表面の官能基（例えば、ヒドロキシル基、アルコキシシラン基、クリック可能な官能基など）と共有結合を形成する。例示的なアルコキシシラン分子には、アミノシラン（例えば、（３−アミノプロピル）−トリエトキシシラン、（３−アミノプロピル）−ジエトキシ−メチルシラン、（３−アミノプロピル）−ジメチル−エトキシシラン、（３−アミノプロピル）−トリメトキシシランなど）、グリシドキシシラン（例えば、３−グリシドキシプロピル）−ジメチル−エトキシシランなど）、およびメルカプトシラン（例えば、（３−メルカプトプロピル）−トリメトキシシラン、（３−メルカプトプロピル）−メチル−ジメトキシシランなど）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、これらの代表的な基をさらに化学修飾し、アルコキシシランの１個以上の官能基を、プローブのアンカー部位と結合可能な官能基に変換することができる。単に例示として、アミノシランのアミン基をアジドに変換するか、またはアジド含有試薬に結合させて、プローブ上に存在するアンカー部位（例えば、クリック可能なアルキン）とのクリックケミストリー反応が可能なクリック可能な基を提供することができる。特定の開示の実施形態では、プローブのアンカー部位は、シラン化された基板表面上に存在する１個以上の官能基と結合することができる官能基から選択され得る。例えば、プローブは、シラン化された基板表面上に存在する任意のアジド（またはアルキン）と反応し得る１個以上のアルキン（またはアジド）部位；またはシラン化された基板表面上に存在する任意のアミンと反応し得る１個以上のカルボン酸基；またはシラン化された基板表面上に存在する任意のエポキシドと反応し得る１個以上の求核性官能基；またはシラン化された基板表面上に存在する任意のチオールと反応し得る１個以上のアルケン部位を含み得る。基板表面および／またはシラン化された基板表面上に存在するヒドロキシル基に結合し得る追加のプローブアンカー部位は、本開示の恩恵を受ける当業者によって認識されるであろう。
【０１１３】
代表的な実施形態では、ガラスプレートデバイスは、スライドガラスをアルコキシシラン試薬、例えばトリエトキシシランアミンで官能基化することにより作製される。次に、ＮＨＳ−エステル−ＰＥＧ−アジドなどのクリック可能な官能基を含む試薬の溶液をスライドガラスに添加し、基板表面をアジド部位で官能基化する。次いで、官能基化したガラススライドを、試料にさらす前にプローブ実施形態にさらすか、または最初に試料にさらしたプローブ実施形態にさらす。プローブは、基板のアジドと反応することができるクリック可能なアルキンなどのアンカー部位を含む（または、いくつかの実施形態では、基板のアルキンと反応することができるクリック可能なアジドを含む）。プローブのアルキン基と基板のアジド基との間に形成されたトリアゾールによってプローブのスライドガラスへの共有結合を容易にする反応条件に、スライドガラスおよびプローブをさらす。本実施形態では、反応条件は、溶媒としてＤＭＳＯを用い、塩基としてトリエチルアミン（またはジイソプロピルエチルアミン）を用い、触媒としてＣｕＩを用いることを含む。
【０１１４】
別の例では、プローブ実施形態を蛍光ガラスマイクロスフェアに結合させ、本明細書に記載の方法で使用するデバイスを提供することができる。そのような実施形態では、単一のプローブ実施形態は、単一のマイクロスフェアに結合することができる。複数のマイクロスフィアは、複数のマイクロスフィアの各々を同じタイプのプローブ実施形態に結合させるか、または複数のマイクロスフィアの各々を異なるタイプのプローブ実施形態に結合させて作製され得る。上述のような類似の化学を使用して、プローブをマイクロスフェアに結合させることができる。蛍光ガラスマイクロスフェアに結合したプローブを含むデバイス実施形態は、単一の限定されたサイズの試料中の複数の異なる酵素標的に対して様々なプローブを使用することを可能にする。さらに、これらのデバイス実施形態は、図２に模式的に描いているように、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）およびプロテオミクスを使用した標的酵素のタンデム直接定量を容易にする。特定の実施形態では、タンパク質−プローブ−蛍光マイクロスフィアは、ＦＡＣＳによってソーティングされ、定量される。次いで、フローサイトメトリー装置を使用して定量的蛍光プロファイルを提供することができるか、またはフルＦＡＣＳシステムを使用してプローブのタイプによってソーティングし、それに続いてプロテオミクス測定を行い、測定分解能を向上させることができる。
【０１１５】
別の代表的な例では、クリック可能な官能基（例えば、アジドまたはアルキン）で表面修飾されたウェルを有するウェルプレートを含むデバイスは、表面修飾されたウェルのクリック可能な官能基と反応してプローブを個々のウェルに共有結合させることができる少なくとも１つのアンカー部位（例えば、アルキンまたはアジド）をそれぞれ含むプローブ実施形態にさらされる。いくつかの実施形態では、単一のウェルは、そこに共有結合している複数のプローブを含み得る。いくつかの実施形態では、ウェルプレートの別個のウェルは、別個のプローブ実施形態で官能基化され得る。
【０１１６】
（ＶＩ．使用の方法）
本明細書に開示の方法は、開示のプローブと、プローブを含むデバイスおよび／またはキットとを使用する方法の実施形態である。本明細書に開示のプローブおよびデバイス／キットの実施形態を使用して、ＢＳＨ活性を示す腸内マイクロバイオーム中の酵素を同定し、そのような酵素が属する分類群を特性評価することができる。本明細書に開示のプローブは、プローブが相互作用しない他の被分析物の存在下で、ＢＳＨと、またはＢＳＨに類似の結合特性および／もしくは反応性を示す酵素と特異的に相互作用するように設計されているため、デバイスは、本明細書に開示のプローブ実施形態（またはそのようなプローブの組み合わせ）を含むように設計され得る。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、本方法は、被験体（哺乳動物または他の動物など）から得た生体試料などの試料を、本明細書に開示のプローブ実施形態にさらす工程を含む。特定の例では、試料は、胃、小腸、大腸、直腸、または糞便試料から得られるものである。試料を、直接、濃縮して、または希釈して使用することができる。本方法のこの工程は、本明細書に開示のデバイス実施形態を使用し、デバイスの基板構成要素に結合しているプローブが試料と接触するように、デバイスを試料にさらすことによって実施され得る。
【０１１８】
典型的には、試料をプローブ実施形態（複数可）に、試料中に存在し得る目的の被分析物（例えば、ＢＳＨ酵素または本明細書に開示のプローブ実施形態と相互作用することが可能な他の酵素）がプローブ実施形態を識別してプローブ実施形態と相互作用し、プローブ−酵素コンジュゲートなどのコンジュゲートを形成するのに十分な時間さらす。いくつかの実施形態では、目的の被分析物は、プローブと共有結合を形成するようにプローブと相互作用することができる。いくつかの実施形態では、被分析物とプローブとの結合を容易にするために追加の工程を実行してもよく、例えば、試料およびプローブを、プローブ上の官能基を活性化するエネルギー源（例えば、光源であって、１０ｎｍ〜４００ｎｍ、または１０ｎｍ〜３７０ｎｍ、または１０ｎｍ〜３６５ｎｍの波長の光を提供する光源など）にさらすことで、そのプローブが被分析物と共有結合を形成するエネルギーばく露工程などを実行してもよい。例えば、本明細書に開示の特定のプローブ実施形態は、光によって活性化されて被分析物と共有結合を形成することができる光活性化可能な基（例えば、ジアジリンまたはベンゾフェノン官能基）を含むことができる。追加の実施形態では、プローブ上の官能基の被分析物ベースの活性化を促進するのに十分な条件にプローブと被分析物とをさらすことにより、官能基が被分析物と共有結合を形成する反応性種に変換され得る。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、本方法はまた、プローブ上に存在する任意のｐＤＭ部位を、検出可能シグナルを生成することができるＤＭ部位に変換するのに十分な条件にプローブをさらす工程をさらに含むことができる。いくつかのそのような実施形態では、ｐＤＭ部位を変換する前に、プローブを目的の被分析物に結合させることができる。ｐＤＭ部位を変換するのに適した条件は、ｐＤＭ部位と試薬の検出可能部位上に存在するクリック可能な官能基との間のトリアゾール部位の形成を促進するクリックケミストリー反応条件下で、プローブを検出可能部位を含む試薬と結合させる工程を含むことができる。このクリックケミストリーに基づくカップリングは、検出可能部位を共有結合させ、プローブ上にＤＭ基を提供する。いくつかの実施形態では、ＤＭ基は、フルオロフォアまたは色原体などの他の視覚的に検出可能な部位であり得る。さらなる追加の実施形態では、ＤＭ基は、プローブに結合した被分析物の濃縮を促進する部位であり得る。そのようなＤＭ基の代表的な例はビオチンである。
【０１２０】
ＤＭ基が生成されると、被分析物に結合したプローブを、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ法、アフィニティクロマトグラフィー、トリプシン消化、質量分析、フローサイトメトリー、およびそれらの任意の組み合わせでの蛍光検出など、適切な検出方法を使用して検出し、同定し、定量することができる。いくつかの実施形態では、複数の異なるプローブ実施形態を使用することができ、使用者は、使用中に生成されたシグナルに基づいて、試料中に存在する特定の被分析物を識別する能力がある。単なる例示として、試料を、本明細書に開示のプローブ実施形態の任意の組み合わせを含むデバイスにさらすことができ、そのようなプローブに結合するか、そうでなければ相互作用することが可能な種が試料中に存在する場合、それらは対応するプローブ実施形態と相互作用してコンジュゲートを形成し、コンジュゲートはＤＭ基を含むように修飾された後に可視化および／または濃縮され得る。例えば、蛍光ＤＭ部位は、試料がプローブに結合した被分析種を含むことの確認として使用者が使用することができる検出可能シグナルを提供する。いくつかの追加の実施形態では、デバイスは、使用者が試料内の特定の被分析物の有無を決定することを可能にするだけでなく、使用者が、特定の被分析物がどの程度存在するかを決定することを可能にする定性的結果を提供することができる。
【０１２１】
さらなる追加の実施形態では、プローブは、プローブとＢＳＨ（またはＢＳＨ活性を示すことができる他の酵素）との反応に伴って切断され、蛍光シグナルなどの検出可能シグナルを提供することができる検出可能部位を含むことができる。そのような実施形態では、検出可能部位はプローブに結合されているが、消光状態で存在する（したがって、見えない）。酵素による置換などにより、検出可能部位がプローブから放出されると、それは蛍光を発し、検出可能シグナルを提供する。そのようなプローブおよび方法の実施形態を使用して、リアルタイムで蛍光読み出しを提供することができ、高感度のアッセイ方法を提供する。
【０１２２】
本明細書に記載の方法の例示的な実施形態を、本開示の実施例のセクションで提供する。
【０１２３】
（ＶＩＩ．治療用組成物および治療方法の実施形態）
胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性に関連する疾患または状態を治療する方法を、本明細書に記載する。いくつかの例では、本方法は、疾患もしくは状態の徴候または症状を改善することができる。特定の例では、疾患または状態は、ＢＳＨ活性に関連する（例えば、肥満、高コレステロール血症、肝がん、糖尿病（Ｉ型またはＩＩ型）、腸内毒素症、胆石、結腸がん、または潰瘍性大腸炎もしくはクローン病を含む過敏性腸疾患）。
【０１２４】
いくつかの例において、本方法は、少なくとも１種の微生物タンパク質（例えば、胆汁酸塩ヒドロラーゼまたは胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を示す他の酵素）を標識する工程を含む。いくつかの例において、本方法は、試料（例えば、腸試料）中の少なくとも１種の微生物タンパク質（例えば、胆汁酸塩ヒドロラーゼまたは胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を示す他の酵素）の存在を判定する工程を含む。いくつかの例において、本方法は、少なくとも１種の微生物タンパク質または少なくとも１種の標識微生物タンパク質を含む微生物をソーティングするか単離する工程を含む。いくつかの例において、本方法は、プローブに結合した少なくとも１種の標識微生物タンパク質を含む微生物を同定する工程を含む。いくつかの例において、本方法は、胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を変化させる身体環境（例えば、ヒトまたは動物であって、ヒトまたは動物の腸内環境、皮膚環境、肺環境、口腔環境、眼内環境、口内環境、膣環境、および子宮環境、例えば、腸環境など）を選択する工程を含む。いくつかの例において、本方法は、例えば、選択した身体環境を同定した微生物で富化することによって、または選択した身体環境において同定した微生物の量を減少させることによって、または選択した身体環境において同定した微生物または微生物タンパク質の活性を変化させることによって、選択した身体環境における胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を変化させる工程を含む。
【０１２５】
本明細書に記載の任意の方法は、少なくとも１種の標識微生物タンパク質または少なくとも１種の標識微生物タンパク質を含む微生物を使用して、ゲノムアッセイまたはプロテオミクスアッセイを行う工程を含むことができる。以下のものが挙げられる任意のゲノムアッセイを使用することができる：全ゲノムおよび／または全エクソームシーケンシング（それぞれＷＧＳおよびＷＥＳ）；単一ヌクレオチド変異、挿入、および／または欠失（インデル）、コピー数多型のシーケンシング；ＲＮＡシーケンシング（例えば、ＲＮＡ−シーケンシングもしくは全トランスクリプトームショットガンシーケンシング）、例えば１６Ｓシーケンシングなど；核酸とリガンドおよび／または高分子間の相互作用のアッセイ（例えば、典型的には少なくとも２ｋＤａの質量を有する分子、例えば少なくとも１０個のヌクレオチドを有する核酸、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、酵素、および複数の高分子の複合体など）；ならびにメタゲノミクス（例えば、Ｓｈａｒｍａ  ａｎｄ  Ｌａｌ，  Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ５７（１）：２３-３８，  ２０１７、参照により本明細書に組み込まれる）。ゲノミクスアッセイは、シーケンシングおよびシーケンスアセンブリおよびアノテーションを含むことができ、例えばショットガンシーケンシングもしくはＰＣＲなどのｄｅ  ｎｏｖｏ技法、または次世代技法（例えば、「ネクストジェン」もしくはハイスループット）、例えば、リアルタイム単一分子、イオントレント、パイロ、合成、コンビナトリアルプローブアンカー、ライゲーション（例えば、オリゴヌクレオチドライゲーションおよび検出もしくはＳＯＬｉＤ）、ナノポアもしくはサンガーシーケンシング；クロマチンまたは架橋免疫沈降（例えば、それぞれＣｈＩおよびＣＬＩＰ）；ならびにバイオインフォマティクスおよび計算生物学を使用する。特定の例では、ゲノムアッセイを行う工程は、１６Ｓシーケンシングおよび／または単細胞ゲノムシーケンシングを行う工程を含む。
【０１２６】
タンパク質を分離し、同定し、分析するための技法を含む、任意のプロテオミクスアッセイを使用することができる（例えば、タンパク質構造、タンパク質−タンパク質相互作用、もしくはタンパク質−リガンド相互作用などの分子間または分子内相互作用の分析；Ｌｅｅ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １９（６）：２１７−２２，  ２００１、その関連部分は参照により本明細書に組み込まれる）。プロテオミクスアッセイは、プロテオミクス分析に利用可能な任意のツールの使用を含むことができ、例えば、以下が挙げられる：質量分析（例えば、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化もしくはエレクトロスプレーイオン化を含むハードイオン化もしくはソフトイオン化技法を、例えば、飛行時間、四重極フィルター、もしくはイオントラップなどの質量分析計とともに使用して、ならびに液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、タンデム質量分析、もしくはフラグメント化技法、例えば、衝突誘起解離などの他の技法を使用して）；電気泳動（例えば、１Ｄもしくは２Ｄゲル電気泳動もしくはウエスタンブロッティング）、免疫学的アッセイ（例えば、免疫学的マイクロアレイアッセイもしくは酵素結合免疫吸着アッセイ、ＥＬＩＳＡ）、タンパク質マイクロアレイアッセイ（例えば、機能性タンパク質もしくは標的タンパク質アレイアッセイ）、クロマトグラフィー（例えば、アフィニティ、サイズ排除、イオン交換、もしくは逆相）、タンパク質の構造もしくは電気化学の分析用ツール（例えば、Ｘ線結晶学もしくは核磁気共鳴）、計算もしくはバイオインフォマティクスツール（例えば、タンパク質同定、構造、もしくは相互作用モデリングツール）、またはそれらの任意の組み合わせ。特定の例では、液体クロマトグラフィーＭＳ（ＬＣ−ＭＳ）などの質量分析（ＭＳ）、および／またはＥＬＩＳＡが使用される。
【０１２７】
本明細書に記載の任意の方法は、任意の環境（例えば、自然環境または人工環境）での標識を含むことができる。環境は、生物および群集に応じて変化し得るものであり、例えば、ヒトまたは動物の腸内環境、皮膚環境、肺環境、口腔環境、眼内環境、口内環境、膣環境、子宮環境、または腸環境が含まれる。いくつかの例では、本方法は、少なくとも１種の微生物タンパク質を含む微生物の固有生息地（例えば、腸環境）での標識を含む。いくつかの例では、本方法は、微生物タンパク質または微生物を、微生物が培養されていない状態で標識する工程を含む。
【０１２８】
本明細書に記載の任意のプローブ、デバイス、またはキットを、標識に使用することができる。いくつかの例では、本方法は、本明細書に記載のプローブ、例えば、式Ｉの構造を含むプローブ、例えば、式ＩＡ〜ＩＤ、ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ、ＩＩＩＣ、ＩＩＩＤ、ＩＩＩＥ、またはＩＩＩＦのいずれか１つの構造を含むプローブを使用して、微生物タンパク質または微生物を標識する工程を含む。いくつかの例では、本方法は、本明細書に記載のデバイスまたはキットを使用して、微生物タンパク質または微生物を標識する工程を含む。
【０１２９】
いくつかの例では、少なくとも１つの特定の代謝機能は、少なくとも１種の胆汁酸（例えば、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、またはリトコール酸）を産生するなどのＢＳＨ活性を含む。特定の例では、少なくとも１種の胆汁酸は、少なくとも１種の核内受容体または表面受容体、例えばＦＸＲ、ビタミンＤ受容体、またはＴＧＲ５に特異的に結合する。特定の例では、疾患または状態は、ＢＳＨ活性に関連する（例えば、肥満、腸内毒素症、高コレステロール血症、肝がんもしくは結腸がん、糖尿病、胆石、または潰瘍性大腸炎もしくはクローン病を含む過敏性腸疾患）。
【０１３０】
本方法は、ＢＳＨ活性に関連する疾患または状態を有する被験体を選択する工程を含むことができる。いくつかの例では、疾患または状態は、肥満、高コレステロール血症、肝がん、糖尿病、過敏性腸疾患（潰瘍性大腸炎またはクローン病など）、胆石、結腸がん、または腸内毒素症である。いくつかの例では、本方法は、胆汁酸塩ヒドロラーゼを標識することによって同定した微生物を投与することによって、または胆汁酸塩ヒドロラーゼを投与することなどによって、被験体の腸内マイクロバイオームを、胆汁酸塩ヒドロラーゼを標識することによって同定した微生物で富化する工程を含む（例えば、疾患または状態が、不活性もしくは低活性ＢＳＨ、または胆汁酸の不十分な脱抱合、例えば、腸内毒素症、ＩＢＤ、肥満、糖尿病、高コレステロール血症などに関連している場合）。いくつかの例において、本方法は、ＢＳＨの阻害剤（例えば、抗菌性成長促進剤、カルノシン酸、ＦｅＳＯ４、ＣｏＣｌ２、ＮａＳｅＯ３、ＮａＩＯ４、レチノール、およびリノレン酸、ＫＩＯ３、ＮａＨＩＯ３、ＮａＩＯ４、ＣｕＳＯ４、ＣｕＣｌ２、ＺｎＳＯ４、ＺｎＣｌ２、メナジオン、リボフラビン、ゴシペチン、カフェ酸フェネチルエステル［ＣＡＰＥ］、エピカテキンモノガレート、プルプロガリン、オキシテトラサイクリン、塩酸デメクロサイクリン、塩酸メタサイクリン、塩酸ドキシサイクリン、ロキサルソン、もしくはリンコマイシン）、または胆汁酸塩ヒドロラーゼを標識することによって同定した微生物の阻害剤を投与する工程を含む（例えば、疾患または状態が、過活性ＢＳＨまたは過剰量の脱抱合胆汁酸塩に関連している場合、例えば、結腸がん、胆石、または肝がん）。
【０１３１】
いくつかの例では、本方法は、肥満の被験体（例えば、ＢＭＩが３０以上の被験体）を選択する工程を含む。したがって、いくつかの例では、治療を受ける被験体は、ＢＭＩが３０以上、例えば少なくとも３０、少なくとも３５、または少なくとも４０である。いくつかの例では、肥満は、微生物または酵素（例えば、微生物酵素）、例えば少なくとも１つの特定の代謝機能（例えば、ＢＳＨ活性）を有する微生物または酵素の存在、不在、もしくは存在量に関連しているか、または少なくとも部分的に関連している。いくつかの例では、本方法は、胆汁酸塩ヒドロラーゼを標識することによって、または胆汁酸塩ヒドロラーゼを投与することによって同定した微生物を、肥満の被験体に投与する工程を含む。
【０１３２】
いくつかの例では、本方法は、高コレステロール血症の被験体、例えば、血中コレステロール値が高い被験体、例えば、ＬＤＬコレステロールが１９０ｍｇ／ｄＬを超え、１つの心血管系危険因子で１６０ｍｇ／ｄＬを超え、または２つの心血管系危険因子で１３０ｍｇ／ｄＬを超える被験体を選択する工程を含む（例示的な危険因子には、男性で４５歳以上および女性で５５歳以上の年齢、男性で５５歳未満および女性で６５歳未満の早期アテローム性動脈硬化症の陽性家族歴、高血圧、糖尿病、喫煙、ならびに男性で４０ｍｇ／ｄｌ未満および女性で５５ｍｇ／ｄｌ未満などの低ＨＤＬコレステロール値が挙げられ得る；例えば、Ｉｂｒａｈｉｍ  ａｎｄ  Ｊｉａｌａｌ，  Ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ，  ＳｔａｔＰｅａｒｌｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  ２０１８，  ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ、その関連部分は参照により本明細書に組み込まれる）。したがって、いくつかの例では、治療を受ける被験体は、ＬＤＬコレステロールが少なくとも１９０ｍｇ／ｄＬ、少なくとも２００ｍｇ／ｄＬ、または少なくとも２５０ｍｇ／ｄＬである。したがって、いくつかの例では、治療を受ける被験体は、ＬＤＬコレステロールが１つの主要な危険因子で少なくとも１６０ｍｇ／ｄＬ、１つの主要な危険因子で少なくとも１７０ｍｇ／ｄＬ、または１つの主要な危険因子で少なくとも１８０ｍｇ／ｄＬである。したがって、いくつかの例では、治療を受ける被験体は、ＬＤＬコレステロールが２つの主要な危険因子で少なくとも１３０ｍｇ／ｄＬ、２つの主要な危険因子で少なくとも１４０ｍｇ／ｄＬ、または２つの主要な危険因子で少なくとも１５０ｍｇ／ｄＬである。高コレステロール血症は、遺伝性または後天性であり得る。いくつかの例では、本方法は、胆汁酸塩ヒドロラーゼを標識することによって、または胆汁酸塩ヒドロラーゼを投与することによって同定した微生物を、高コレステロール血症の被験体に投与する工程を含む。
【０１３３】
いくつかの例では、本方法は、肝がんの被験体を選択する工程を含む。本方法は、任意のタイプの肝がん、例えば肥満に関連する肝がんの被験体を選択する工程を含む（例えば、Ｒｉｄｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．，  ３０（３）：３３２-３３８，  ２０１４、その関連部分は参照により本明細書に組み込まれる）。したがって、いくつかの例では、治療を受ける被験体は、肥満に関連する肝がんなどの肝がんを有する。いくつかの例では、本方法は、ＢＳＨの阻害剤、または胆汁酸塩ヒドロラーゼを標識することによって同定した微生物の阻害剤を投与する工程を含む。
【０１３４】
いくつかの例では、本方法は、糖尿病の被験体を選択する工程を含む。本方法は、任意のタイプの糖尿病、例えば２型糖尿病（例えば、ＢＳＨ活性に関連する２型糖尿病；Ｌａｂｂe  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，  ９（１２）：ｅ１１５１７５，  ２０１４、その関連部分は参照により本明細書に組み込まれる）の被験体を選択する工程を含む。したがって、いくつかの例では、治療を受ける被験体は、肝臓ＩＩ型糖尿病、例えばＢＳＨ活性に関連する肝臓ＩＩ型糖尿病などを有する。いくつかの例では、本方法は、胆汁酸塩ヒドロラーゼを標識することによって、または胆汁酸塩ヒドロラーゼを投与することによって同定した微生物を、２型糖尿病の被験体に投与する工程を含む。
【０１３５】
いくつかの例では、本方法は、潰瘍性大腸炎またはクローン病などの過敏性腸疾患（ＩＢＤ）の被験体を選択する工程を含む（例えば、ＢＳＨ活性に関連する潰瘍性大腸炎またはクローン病；Ｌａｂｂe  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，  ９（１２）：ｅ１１５１７５，  ２０１４、その関連部分は参照により本明細書に組み込まれる）。したがって、いくつかの例では、治療を受ける被験体は、ＩＢＤ、例えばＢＳＨ活性に関連するＩＢＤなどを有する。いくつかの例では、本方法は、胆汁酸塩ヒドロラーゼを標識することによって、または胆汁酸塩ヒドロラーゼを投与することによって同定した微生物を、ＩＢＤの被験体に投与する工程を含む。
【０１３６】
いくつかの例では、本方法は、ＢＳＨまたは胆汁酸不均衡に関連する腸内毒素症などの腸内毒素症の被験体を選択する工程を含む（例えば、Ｋａｋｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｈｅｐａｔｏｌ．，  ５８（５）：９４９-９５５，  ２０１３、その関連部分は参照により本明細書に組み込まれる）。したがって、いくつかの例では、治療を受ける被験体は、腸内毒素症、例えばＢＳＨ活性に関連する腸内毒素症などを有する。いくつかの例では、本方法は、胆汁酸塩ヒドロラーゼを標識することによって、または胆汁酸塩ヒドロラーゼを投与することによって同定した微生物を、腸内毒素症の被験体に投与する工程を含む。
【０１３７】
いくつかの例では、本方法は、結腸（または大腸）がんの被験体を選択する工程を含む。本方法は、任意のタイプの結腸がん、例えばＢＳＨに関連する結腸がんの被験体を選択する工程を含むことができる（例えば、Ｒｉｄｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，  ４７（２）：２４１−５９，  ２００６、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。したがって、いくつかの例では、治療を受ける被験体は、結腸がん、例えばＢＳＨに関連する結腸がんを有する。いくつかの例では、本方法は、ＢＳＨの阻害剤、または胆汁酸塩ヒドロラーゼを標識することによって同定した微生物の阻害剤を、結腸がんの被験体に投与する工程を含む。
【０１３８】
いくつかの例では、本方法は、胆石（例えば、コレステロール胆石）を有する被験体を選択する工程を含む。本方法は、任意のタイプの胆石、例えばＢＳＨに関連する胆石またはコレステロール胆石を有する被験体を選択する工程を含むことができる（例えば、Ｒｉｄｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，  ４７（２）：２４１−５９，  ２００６、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。したがって、いくつかの例では、治療を受ける被験体は、胆石、例えばＢＳＨに関連する胆石またはコレステロール胆石を有する。いくつかの例では、本方法は、ＢＳＨの阻害剤、または胆汁酸塩ヒドロラーゼを標識することによって同定した微生物の阻害剤を、胆石を有する被験体に投与する工程を含む。
【０１３９】
いくつかの例では、被験体に、追加のプロトコルおよび／または医薬品を施す。施され得る追加のプロトコルまたは医薬品の例としては以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：食事もしくは運動の変更、肥満手術、フェンテルミン、Ａｄｉｐｅｘ−Ｐ（登録商標）、Ｆａｓｔｉｎ（登録商標）、Ｉｏｎａｍｉｎ（登録商標）、Ｓｕｐｒｅｎｚａ（登録商標）、Ａｔｔｉ−Ｐｌｅｘ  Ｐ（登録商標）、Ｌｏｍａｉｒａ（登録商標）、Ｐｈｅｎｔｅｒｃｏｔ（登録商標）、Ｐｈｅｎｔｒｉｄｅ（登録商標）、トピラメート、Ｔｏｐａｍａｘ（登録商標）、Ｔｏｐｉｒａｇｅｎ（登録商標）、Ｔｏｐａｍａｘ  Ｓｐｒｉｎｋｌｅ（登録商標）、フェンジメトラジン、Ｂｏｎｔｒｉｌ  Ｓｌｏｗ  Ｒｅｌｅａｓｅ（登録商標）、Ｂｏｎｔｒｉｌ  ＰＤＭ（登録商標）、Ｐｈｅｎｄｉｅｔ（登録商標）、Ｐｒｅｌｕ−２（登録商標）、Ｍｅｌｆｉａｔ（登録商標）、Ｏｂｅｚｉｎｅ（登録商標）、Ｐｈｅｎｄｉｅｔ−１０５（登録商標）、オルリスタット、Ａｌｌｉ（登録商標）、Ｘｅｎｉｃａｌ（登録商標）、ブプロピオン、ジエチルプロピオン、Ｔｅｎｕａｔｅ（登録商標）、Ｔｅｎｕａｔｅ  Ｄｏｓｐａｎ（登録商標）、Ｔｅｐａｎｉｌ（登録商標）、メタンフェタミン、Ｄｅｓｏｘｙｎ（登録商標）、ロルカセリン、Ｂｅｌｖｉｑ（登録商標）、Ｂｅｌｖｉｑ  ＸＲ（登録商標）、ブプロピオン／ナルトレキソン、Ｃｏｎｔｒａｖｅ（登録商標）、絨毛性ゴナドトロピン（ｈｃｇ）、ＨＣＧ（登録商標）、Ｐｒｅｇｎｙｌ（登録商標）、リラグルチド、Ｓａｘｅｎｄａ（登録商標）、フェンテルミン／トピラメート、Ｑｓｙｍｉａ（登録商標）、アンフェタミン、Ｅｖｅｋｅｏ（登録商標）、ベンズフェタミン、Ｄｉｄｒｅｘ（登録商標）、Ｒｅｃｅｄｅ（登録商標）、Ｒｅｇｉｍｅｘ（登録商標）、シメチジン、Ｔａｇａｍｅｔ（登録商標）、Ｅｑｕａｌｉｎｅ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｄｕｃｅｒ（登録商標）、Ｔａｇａｍｅｔ  ＨＢ（登録商標）、メチルフェニデート、またはデスベンラファキシン（例えば、肥満の被験体に対して）；食事の変更、禁煙、アルコール摂取量の減少、運動量の増加、アトルバスタチン、Ｌｉｐｉｔｏｒ（登録商標）、シンバスタチン、Ｚｏｃｏｒ（登録商標）、ＦｌｏＬｉｐｉｄ（登録商標）、プラバスタチン、Ｐｒａｖａｃｈｏｌ（登録商標）、ロバスタチン、Ａｌｔｏｃｏｒ（登録商標）、Ａｌｔｏｐｒｅｖ（登録商標）、ロスバスタチン、Ｃｒｅｓｔｏｒ（登録商標）、ゲムフィブロジル、Ｌｏｐｉｄ（登録商標）、エゼチミブ、Ｚｅｔｉａ（登録商標）、ナイアシン、Ｎｉａｓｐａｎ（登録商標）、Ｎｉａｃｉｎ  ＳＲ（登録商標）、Ｓｌｏ−Ｎｉａｃｉｎ（登録商標）、Ｂ３−５００−Ｇｒ（登録商標）、Ｎｉａｃｏｒ（登録商標）、Ｂ−３−５０（登録商標）、Ｎｉｃｏｔｉｎｅｘ（登録商標）、エゼチミブ／シンバスタチン、Ｖｙｔｏｒｉｎ（登録商標）、ピタバスタチン、Ｌｉｖａｌｏ（登録商標）、Ｚｙｐｉｔａｍａｇ（登録商標）、フェノフィブリン酸、Ｔｒｉｌｉｐｉｘ（登録商標）、Ｆｉｂｒｉｃｏｒ（登録商標）、コレセベラム、Ｗｅｌｃｈｏｌ（登録商標）、フルバスタチン、Ｌｅｓｃｏｌ（登録商標）、Ｌｅｓｃｏｌ  ＸＬ（登録商標）、アリロクマブ、Ｐｒａｌｕｅｎｔ（登録商標）、アムロジピン／アトルバスタチン、Ｃａｄｕｅｔ（登録商標）、エボロクマブ、Ｒｅｐａｔｈａ（登録商標）、Ｒｅｐａｔｈａ  Ｐｕｓｈｔｒｏｎｅｘ（登録商標）、ミコフェノール酸モフェチル、ロミタピド、Ｊｕｘｔａｐｉｄ（登録商標）、ミポメルセン、またはＫｙｎａｍｒｏ（登録商標）（例えば、高コレステロール血症の被験体に対して）；手術（切除もしくは肝移植を含む）、経皮的アブレーション、化学療法（細胞障害性薬物の局所投与など）、放射線治療、ドキソルビシン、シスプラチン、またはリピオドール（例えば、肝がんの被験体に対して）；食事および運動の変更、肥満手術、メトホルミン、スルホニル尿素剤（例えば、グリベンクラミド、トルブタミド、グリメピリド）、ナテグリニド、レパグリニド、チアゾリジンジオン（例えば、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）−ガンマ−アゴニスト（Ｃ１２６２５７０など）およびアンタゴニスト、ＰＰＡＲ−ガンマ／アルファモジュレーター（例えば、ＫＲＰ  ２９７）、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤（例えば、アカルボース、ボグリボース）、ジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰ）−ＩＶ阻害剤（ＬＡＦ２３７、ＭＫ−４３１など）、アルファ２アンタゴニスト、血糖値を下げるための薬剤、コレステロール吸収阻害剤、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−コエンザイムＡ（ＨＭＧＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤（スタチンなど）、インスリンおよびインスリン類似体、ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−１類似体（例えば、エキセンジン−４）、またはアミリン（例えば、糖尿病の被験体に対して）；手術、抗生物質（例えば、Ｃｉｐｒｏ（登録商標）もしくはＦｌａｇｙｌ（登録商標））、止痢薬（例えば、サイリウム粉末［例えば、Ｍｅｔａｍｕｃｉｌ（登録商標）］もしくはメチルセルロース［例えば、Ｃｉｔｒｕｃｅｌ（登録商標）］などの食物繊維サプリメント、もしくはロペラミド、例えば、Ｉｍｏｄｉｕｍ  Ａ−Ｄ（登録商標）などの薬剤）、栄養サプリメント（例えば、鉄、カルシウム、もしくはビタミンＤ）、または栄養介入（例えば、ＩＢＤの被験体に対して）；抗生物質（例えば、シプロフロキサシン、Ｃｉｐｒｏ（登録商標）、リファキシミン、Ｘｉｆａｘａｎ（登録商標）、コトリモキサゾール、もしくはＳｅｐｔｒｉｎ（登録商標））、または栄養介入（例えば、腸内毒素症の被験体に対して）。
【０１４０】
追加の実施形態では、被験体に、追加の医薬品を投与することができる。「併用的療法」または「併用療法」という語句は、１種以上の微生物（例えば、ＢＳＨ活性を有する微生物）または微生物タンパク質または酵素（例えば、ＢＳＨ）の投与だけでなく、１種以上の治療剤の追加も特定の治療レジメンの一部として包含し、これらの治療剤の共作用から有益な効果を得ることを意図するものである。
【０１４１】
本明細書に開示の任意の方法について、１種以上の微生物（例えば、ＢＳＨ活性を有する微生物）または微生物タンパク質または酵素（例えば、ＢＳＨ）は、全身投与または局所投与され得る。
【０１４２】
（ＶＩＩＩ．いくつかの実施形態の概要）
本明細書に開示するのは、プローブ実施形態であって、プローブは、本明細書に記載のように、式Ｉを満たす構造を有する。いずれかまたはすべての実施形態において、式Ｉに関して、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の各々は独立して水素または−ＯＲから選択され、各Ｒは独立して水素；酸素原子の負電荷のバランスをとる対イオン；脂肪族；ヘテロ脂肪族；芳香族；または脂肪族、ヘテロ脂肪族、もしくは芳香族の任意の組み合わせから選択される；Ｒ５は水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、芳香族、または脂肪族、ヘテロ脂肪族、もしくは芳香族の任意の組み合わせである；リンカーは脂肪族、ヘテロ脂肪族、芳香族、または脂肪族、ヘテロ脂肪族、もしくは芳香族の任意の組み合わせである；ＤＭは検出可能部位である；ｐＤＭは検出可能部位前駆体である；ＰＭは光活性化可能部位である；ＡＭはアンカー部位である；ｎは０〜１０の整数である；ｍは０または１から選択される整数である。
【０１４３】
上記の実施形態のいずれかまたはすべてにおいて、ｍは１であり、リンカーは−（ＣＨ２）ｐ−；
【化１７】
2020536566.tif 000034
；
2020536566.tif 000035
（式中、各ｐは独立して１〜１０の整数とし、各ｑは独立して０〜１０の整数である）である。
【０１４４】
上記の実施形態のいずれかまたはすべてにおいて、ＤＭ基は存在し、ＤＭ基はフルオロフォア、色原体、または特定の結合ペアのメンバーである。
【０１４５】
上記の実施形態のいずれかまたはすべてにおいて、ｐＤＭ基は存在し、ｐＤＭ基はアルキンまたはアジドである。
【０１４６】
上記の実施形態のいずれかまたはすべてにおいて、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の各々は独立して水素、−ＯＨ、または−Ｏ−Ｍ＋（式中、Ｍ＋はＬｉ＋、Ｋ＋、Ｎａ＋、またはＮＨ４＋から選択される対イオンである）である。
【０１４７】
上記の実施形態のいずれかまたはすべてにおいて、ＰＭ基は存在し、ＰＭ基はアジリジンまたはベンゾフェノンである。
【０１４８】
上記の実施形態のいずれかまたはすべてにおいて、ＡＭ基は存在し、ＡＭ基はアルキン、アジド、カルボン酸、ＮＨＳ−エステル、アミン、またはハロゲン化アルキルである。
【０１４９】
上記の実施形態のいずれかまたはすべてにおいて、ｍは０であり、ＤＭ基は存在し、ＤＭ基は
【化１８】
2020536566.tif 000036
である。
【０１５０】
上記の実施形態のいずれかまたはすべてにおいて、ｍは１であり、ＰＭ基とｐＤＭ基との両方が存在する。
【０１５１】
上記の実施形態のいずれかまたはすべてにおいて、ｍは１であり、ＡＭ基とｐＤＭ基との両方が存在する。
【０１５２】
上記の実施形態のいずれかまたはすべてにおいて、プローブは本明細書に記載の式ＩＩＡまたはＩＩＢを満たす構造を有する。
【０１５３】
上記の実施形態のいずれかまたはすべてにおいて、プローブは、本明細書に記載の式ＩＩＩＡ〜ＩＩＩＦの１つ以上を満たす構造を有し、式ＩＩＩＡ〜ＩＩＩＦの任意の１つ以上の各ｐは独立して１〜１０の整数であり、各ｑは独立して０〜２０の整数である。
【０１５４】
さらに開示するのは、以下の工程を含む方法である：被験体または試料を、請求項１に記載のプローブに、プローブと胆汁酸塩を加水分解することができる酵素との結合によりプローブ−酵素コンジュゲートが形成されるのに十分な時間さらす工程と；プローブと酵素との間の反応によって生成される検出可能シグナルを識別するのに十分な検出技法を使用して、被験体または試料を分析する工程。
【０１５５】
上記の実施形態のいずれかまたはすべてにおいて、酵素がプローブに結合したときに、検出可能部位はプローブから放出される。
【０１５６】
上記の実施形態のいずれかまたはすべてにおいて、プローブはｐＤＭ基を含み、本方法は、ｐＤＭ基と反応することができるクリック可能な官能基を含む検出可能部位基にプローブ−酵素コンジュゲートをさらす工程をさらに含む。
【０１５７】
上記の実施形態のいずれかまたはすべてにおいて、プローブはＰＭ基を含み、本方法は、試料または被験体を光源にさらしてＰＭ基と酵素との結合を促進し、それによってプローブ−酵素コンジュゲートを形成する工程をさらに含む。
【０１５８】
上記の実施形態のいずれかまたはすべてにおいて、本方法は、プローブ−酵素コンジュゲートまたはプローブ−酵素コンジュゲートを含む微生物を使用して、ゲノムアッセイまたはプロテオミクスアッセイを行う工程をさらに含む。
【０１５９】
胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性に関連する疾患または状態を治療する方法の実施形態も開示する。
【０１６０】
上記の実施形態のいずれかまたはすべてにおいて、本方法は以下の工程を含む：胆汁酸塩を加水分解することができる少なくとも１種の酵素を上記のプローブ実施形態のいずれかまたはすべてに記載のプローブで標識し、少なくとも１種の標識酵素を提供する工程と；検出可能シグナルを検出することにより、試料中の少なくとも１種の標識酵素の存在を判定する工程と；少なくとも１種の標識酵素または少なくとも１種の標識酵素を含む微生物をソーティングするか単離する工程と；少なくとも１種の標識酵素を含む微生物を同定する工程と；少なくとも１種の酵素の胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を変化させる身体環境を選択する工程と；および／または選択した身体環境を同定した微生物で富化することによって、もしくは選択した身体環境において同定した微生物の量を減少させることによって、もしくは選択した身体環境において胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を低下させることによって、もしくはそれらの組み合わせによって選択した身体環境における胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を変化させ、それによって疾患もしくは状態を治療する工程。
【０１６１】
以下を含むキットも開示する：基板と；式Ｉを満たす構造を有するプローブ（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の各々は独立して水素または−ＯＲから選択され、各Ｒは独立して水素；酸素原子の負電荷のバランスをとる対イオン；脂肪族；ヘテロ脂肪族；芳香族；または脂肪族、ヘテロ脂肪族、もしくは芳香族の任意の組み合わせから選択される；Ｒ５は水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、芳香族、または脂肪族、ヘテロ脂肪族、もしくは芳香族の任意の組み合わせである；リンカーは脂肪族、ヘテロ脂肪族、芳香族、または脂肪族、ヘテロ脂肪族、もしくは芳香族の任意の組み合わせである；ＤＭは検出可能部位である；ｐＤＭは検出可能部位前駆体である；ＡＭはアンカー部位である；ｎは０〜１０の整数である；ｍは０または１から選択される整数である；プローブは、ＡＭ基を介して基板の表面に共有結合している）。
【実施例】
【０１６２】
（ＩＸ．実施例）
（細胞株および培地）
ラクトバチルス・プランタラム（Ｏｒｌａ−Ｊｅｎｓｅｎ）をＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−７９３）から購入し、ＭＲＳ培地（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＤｉｆｃｏラクトバチルスＭＲＳブロス、ＢＤ２８８１３０）を使用して供給業者の推奨に従って培養した。ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ  ＤＨ５α−ＥコンピテントセルをＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（１１３１９０１９）から購入し、ＬＢ培地（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＡＣ６１２７２５０００）を使用して供給業者の推奨に従って培養した。
【０１６３】
（精製タンパク質の代表的アッセイ条件）
反応量１００μＬを、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｏｒ１ブラックフラットボトムマイクロタイター９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で使用した。０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝６）中のＢＳＨ  ５０μＬ（８０、４０、２０、１０、５、２．５、１．３、０μｇ／ｍｌ）を、適切なウェルに添加した。次に、５％ＤＭＳＯを含む緩衝液中のプローブ（３００μＭ）溶液５０μＬを添加し、反応を開始した。反応液を直ちに３７℃に予熱したプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  ＸＳ）に入れ、反応の進行を４５０ｎｍ（励起３５０ｎｍ）で２０分間モニターした。反応液の最終濃度は、１５０μＭプローブおよび２．５％ＤＭＳＯであった。
【０１６４】
（細胞溶解液用の代表的なアッセイ条件）
反応量１００μＬを、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｏｒ１ブラックフラットボトムマイクロタイター９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で使用した。緩衝液（０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ＝６）中のＬ．プランタラム溶解液５０μＬ（３０００、１５００、７５０、３７５、１８８、９４、４７μｇ／ｍｌ）を各ウェルに添加した。次に、５％ＤＭＳＯを含む緩衝液中のプローブ（３００μＭ）溶液５０μＬを添加し、反応を開始した。反応液を直ちに３７℃に予熱したプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  ＸＳ）に入れ、反応の進行を４５０ｎｍ（励起３５０ｎｍ）で２０分間モニターした。反応液の最終濃度は、１５０μＭプローブ、０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６）、および２．５％ＤＭＳＯであった。
【０１６５】
（全細胞用の代表的なアッセイ条件）
ＭＲＳ寒天上で増殖したＬ．プランタラムのコロニーからＭＲＳブロス５ｍｌを接種してスターター培養物を作製した。スターター培養物を３７℃で一晩インキュベートした。次に、スターター培養物５ｍｌを新鮮なＭＲＳブロス９５ｍｌに添加し、６００ｎｍでの光学密度が０．７に達するまで増殖させた。その時点で、細胞を遠心分離によりペレット化した。細胞ペレットをＰＢＳ  １５ｍｌに再懸濁し、遠心分離した。細胞をＰＢＳでさらに洗浄し、もう一度ペレット化した。得られたペレットをＰＢＳ  ３８０μＬに懸濁した。次に、細胞懸濁液を２倍段階希釈した。
【０１６６】
細胞懸濁液５０μＬをＭｉｃｒｏｆｌｕｏｒ１ブラックフラットボトムマイクロタイター９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に添加した。次に、５％ＤＭＳＯを含む緩衝液中のプローブ（３００μＭ）溶液５０μＬを添加し、反応を開始した。反応液を直ちに３７℃に予熱したプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  ＸＳ）に入れ、反応の進行を４５０ｎｍ（励起３５０ｎｍ）で６０分間モニターした。反応液の最終濃度は、１５０μＭプローブおよび２．５％ＤＭＳＯであった。
【０１６７】
（精製ＢＳＨアッセイ）
反応量１００μＬを、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｏｒ１ブラックフラットボトムマイクロタイター９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で使用した。０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝６）中のＢＳＨ  ５０μＬ（８０、４０、２０、１０、５、２．５、１．３、０μｇ／ｍｌ）を、適切なウェルに添加した。次に、５％ＤＭＳＯを含む緩衝液中のプローブ（３００μＭ）溶液５０μＬを添加し、反応を開始した。反応液を直ちに３７℃に予熱したプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  ＸＳ）に入れ、反応の進行を４５０ｎｍ（励起３５０ｎｍ）で２０分間モニターした。反応液の最終濃度は、１５０μＭプローブおよび２．５％ＤＭＳＯであった。
【０１６８】
（ＧＣＡおよびヨードアセトアミド競合アッセイ）
ＣＡ−ＡＭＣＡプローブの前に競合物質を添加したことを除いて、精製ＢＳＨアッセイと同様に実験を実行した。最終濃度は、それぞれ以下の通りであった：ＢＳＨ（１０μｇ／ｍｌ）、ＤＭＳＯ（２．５％ｖ／ｖ）、ＣＡ−ＡＭＣＡ（１５０μＭ）、およびＧＣＡ（１０ｍＭ）またはＩＡＡ（１２ｍＭ）。
【０１６９】
（Ｋｍ決定）
反応量１００μＬを、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｏｒ１ブラックフラットボトムマイクロタイター９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で使用した。緩衝液（０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ＝６）中の酵素５０μＬ（４０μｇ／ｍｌ）を各ウェルに添加した。５％ＤＭＳＯを含む緩衝液に溶解した適切なＣＡ−ＡＭＣＡ基質希釈液５０μＬ（２５００、１２５０、６２５、３１２．５、１５６．２、７８．１、３９．１、０μＭ）を添加し、反応を開始した。反応液を直ちに３７℃に予熱したプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  ＸＳ）に入れ、反応の進行を４５０ｎｍ（励起３５０ｎｍ）で２０分間モニターした。反応液の最終濃度は、酵素２０μｇ／ｍｌ、０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６）、および２．５％ＤＭＳＯであった。
【０１７０】
初速度データを、Ｋｍ値の決定に使用した。Ｋｍ決定では、ＢＡ−ＡＭＣＡの濃度を変化させた基質速度曲線の非線形回帰から動力学的値を直接得た。式Ｙ＝（Ｖ最大＊Ｘ）／（Ｋｍ＋Ｘ＊（１＋Ｘ／Ｋｉ））、Ｘ＝基質濃度（μＭ）およびＹ＝酵素速度（ＲＦＵ／秒）；を非線形回帰で使用した。少なくとも３つの独立した実験を使用して、各ＢＡ−ＡＭＣＡのＫｍ値を決定した。
【０１７１】
（Ｋｉ決定）
反応量１００μＬを、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｏｒ１ブラックフラットボトムマイクロタイター９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で使用した。緩衝液（０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ＝６）中の酵素５０μＬ（１０μｇ／ｍｌ）を各ウェルに添加した。次に、５％ＤＭＳＯを含む緩衝液中のプローブ（５０μＭ）とＣＡＰＥ（１００００、３３３３、１１１１、３７０、１２３、４１、１４μＭ）との溶液５０μＬを添加し、反応を開始した。反応液を直ちに３７℃に予熱したプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  ＸＳ）に入れ、反応の進行を４５０ｎｍ（励起３５０ｎｍ）で２０分間モニターした。反応液の最終濃度は、酵素５μｇ／ｍｌ、０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６）、および２．５％ＤＭＳＯであった。
【０１７２】
（ＨＰＬＣアッセイ）
ＤＭＳＯ中の６ｍＭ  ＣＡ−ＡＭＣＡ  １０μＬと．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）１９０μＬとを混合した。緩衝液中の酵素２００μＬを添加して反応を開始した。様々な時点（０、１、２、３、４、５、７．５、１０、１５、２０分）でアリコート３０μＬを除去し、直ちに５００ｍＭヨードアセトアミド２μＬと混合してヒドロラーゼを不活性化した。すべての試料を回収した後、各１０μＬをＡｇｉｌｅｎｔ  １００シリーズ分析用ＨＰＬＣのＣ１８逆相ＨＰＬＣカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）に投入し、特性評価を行った。Ｈ２Ｏ中５→１００％ＭｅＯＨの直線グラジエントを１５分かけて使用し、溶出ストリームを４５０ｎｍ（励起３５０ｎｍ）でモニターした。
【０１７３】
（大腸菌溶解液への精製ＢＳＨの添加）
反応量１００μＬを、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｏｒ１ブラックフラットボトムマイクロタイター９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で使用した。０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝６）中の様々な濃度のＢＳＨ（８０、４０、２０、１０、５、２．５、１．３、０μｇ／ｍｌ）を含む大腸菌溶解液（２ｍｇ／ｍｌ）５０μＬを、適切なウェルに添加した。次に、５％ＤＭＳＯを含む緩衝液中のプローブ（３００μＭ）溶液５０μＬを添加し、反応を開始した。反応液を直ちに３７℃に予熱したプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  ＸＳ）に入れ、反応の進行を４５０ｎｍ（励起３５０ｎｍ）で２０分間モニターした。反応液の最終濃度は、１５０μＭプローブおよび２．５％ＤＭＳＯであった。
【０１７４】
（ラクトバチルス・プランタラム溶解液アッセイ）
反応量１００μＬを、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｏｒ１ブラックフラットボトムマイクロタイター９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で使用した。緩衝液（０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ＝６）中のＬ．プランタラム溶解液５０μＬ（３０００、１５００、７５０、３７５、１８８、９４、４７μｇ／ｍｌ）を各ウェルに添加した。次に、５％ＤＭＳＯを含む緩衝液中のプローブ（３００μＭ）溶液５０μＬを添加し、反応を開始した。反応液を直ちに３７℃に予熱したプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  ＸＳ）に入れ、反応の進行を４５０ｎｍ（励起３５０ｎｍ）で２０分間モニターした。反応液の最終濃度は、１５０μＭプローブ、０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６）、および２．５％ＤＭＳＯであった。
【０１７５】
（全細胞ラクトバチルス・プランタラムアッセイ）
ＭＲＳ寒天上で増殖したＬ．プランタラムのコロニーからＭＲＳブロス５ｍｌを接種してスターター培養物を作製した。スターター培養物を３７℃で一晩インキュベートした。次に、スターター培養物５ｍｌを新鮮なＭＲＳブロス９５ｍｌに添加し、６００ｎｍでの光学密度が０．７に達するまで増殖させた。その時点で、細胞を遠心分離によりペレット化した。細胞ペレットをＰＢＳ  １５ｍｌに再懸濁し、遠心分離した。細胞をＰＢＳでさらに洗浄し、もう一度ペレット化した。得られたペレットをＰＢＳ  ３８０μＬに懸濁した。次に、細胞懸濁液を２倍段階希釈した。
【０１７６】
細胞懸濁液５０μＬをＭｉｃｒｏｆｌｕｏｒ１ブラックフラットボトムマイクロタイター９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に添加した。次に、５％ＤＭＳＯを含む緩衝液中のプローブ（３００μＭ）溶液５０μＬを添加し、反応を開始した。反応液を直ちに３７℃に予熱したプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  ＸＳ）に入れ、反応の進行を４５０ｎｍ（励起３５０ｎｍ）で６０分間モニターした。反応液の最終濃度は、１５０μＭプローブおよび２．５％ＤＭＳＯであった。
【０１７７】
（腸内マイクロバイオーム細胞溶解液の調製）
ヒト糞便試料を、Ｌｅｅ  ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ（カタログ番号９９１−１８）から入手した。試料（１ｇ）を３０秒間ボルテックスし、氷上に１０分間置き、ビーズと大きな残片を沈殿させた。上清を清潔な５０ｍＬのコニカチューブに移した。上清を７００ｇで１５分間４℃で遠心分離した。上清を清潔な１５ｍＬのコニカルに移した。上清を７０００ｇで１５分間４℃で遠心し、細菌細胞をペレット化した。その後、上清を廃棄した。細胞ペレットを冷ＰＢＳ  １ｍＬに再懸濁し、１．７ｍＬのエッペンドルフチューブに移した。試料を短時間ボルテックスし、溶液をホモジナイズした。次に細胞を８０００ｇでペレット化した。ペレットを冷ＰＢＳ  １ｍＬで洗浄した。ペレットをＰＢＳ  ２ｍＬに再懸濁した。試料を１．５ｍＬのセーフロックチューブに移した。小さな（０．３ｍｍ）ガラスビーズ５０〜１００μＬを添加した。試料を、ブレットブレンダーで最高速度で５分間ビードビーティングした。ビードビーティングをさらに２回、合計３ラウンド繰り返した。次いで、タンパク質含有量をＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により決定した。
【０１７８】
（腸内マイクロバイオーム試料におけるＢＳＨ活性の分析）
反応量１００μＬを、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｏｒ１ブラックフラットボトムマイクロタイター９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で使用した。ＢＳＨ（４０μｇ／ｍｌ）または緩衝液を含む腸内マイクロバイオーム溶解液（１ｍｇ／ｍｌ）５０μＬを、適切なウェルに添加した。次に、５％ＤＭＳＯを含む緩衝液中のプローブ（３００μＭ）溶液５０μＬを添加し、反応を開始した。反応液を直ちに３７℃に予熱したプレートリーダー（ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  Ｇｅｍｉｎｉ  ＸＳ）に入れ、反応の進行を４５０ｎｍ（励起３５０ｎｍ）で２０分間モニターした。反応液の最終濃度は、ＢＳＨ  ２０μｇ／ｍｌ、溶解液タンパク質５００μｇ／ｍｌ、１５０μＭプローブ、および２．５％ＤＭＳＯであった。
【０１７９】
（実施例１）
アミンと胆汁酸のカルボン酸とのアミドカップリングにより消光可能なアミノクマリン蛍光体を用いて化学プローブを設計し、化学プローブは、その合成基質をＢＳＨにさらすとアミド結合が切断され、遊離胆汁酸と消光されていない遊離アミノクマリン蛍光体とを与えるものである。したがって、生成物の形成は、蛍光光度計を使用して連続的かつ定量的にモニターすることができる。
【０１８０】
本実施例では、適切な胆汁酸と７−アミノ−４−メチル−３−クマリン酢酸とのアミドカップリングを介して、コール酸（ＣＡ−ＡＭＣＡ）およびケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸−ＡＭＣＡ）ベースの２つのプローブを合成した。プローブ生成物の分光学的特性評価により、類似のプロテアーゼ基質と同様に、抱合されたプローブは、非抱合アミノクマリンよりもはるかに蛍光が少ないことが明らかになった（図３）。
【０１８１】
ＣＡ−ＡＭＣＡプローブを、精製ＢＳＨを含有する緩衝液に添加すると、合成基質の酵素代謝回転と一致する蛍光曲線が観察された（図４Ａ）。プローブを緩衝液のみに、または無関係のヒドロラーゼを含有する緩衝液に添加しても、蛍光の増加は観察されず（図５）、これは、プローブが水溶液中で安定であり、ＢＳＨに対して選択性があることを示唆している。基質代謝回転の蛍光シグナルは、中ナノモル酵素濃度まで検出することができ、これは、精製ＢＳＨでの従来のニンヒドリンアッセイに必要なマイクロモル濃度と比較すると、かなり少ない酵素量である。プローブは予期せず基質阻害を示したが、これは、天然ＢＳＨ基質では観察されず、他の多くの酵素−基質反応では一般的に観察されるものである。さらに、低マイクロモルの基質濃度範囲では、基質阻害の兆候が現れる前に、ロバストなシグナルを確実に観測することができた。ＢＳＨ反応を二次ＨＰＬＣベースのアッセイと組み合わせることで、生成物の生成をさらに確認した。天然基質であるグリココール酸を多量に反応に添加すると、活性の減衰が観察され（図４Ｂおよび図６Ａ〜６Ｃ）、これは、プローブが標準的なＢＳＨ基質結合部位に結合することを示している。求核性システインを共有結合的にキャップするヨードアセトアミドの添加により、基質代謝回転が完全に除去され、これは、天然基質の加水分解と一致するシステイン依存性メカニズムでプローブが加水分解されていることを示唆している（図４Ｂおよび図６Ａ〜６Ｃ）。ＣＡ−ＡＭＣＡが天然基質と同様の挙動をしていることを確認した後、ＢＳＨによるＣＡ−ＡＭＣＡ代謝回転効率を定量的に分析し、さらなる生化学的特性評価により、２桁マイクロモルの低いミカエリス−メンテン定数（Ｋｍ＝２６μＭ；図７および図８Ａ〜８Ｃ）が明らかになり、これは、天然ＢＳＨ基質についてレポートされている値よりも予想外に低い値である。
【０１８２】
次に、このアッセイを使用して、ＢＳＨの低分子モジュレーターの親和性を決定した。ＢＳＨの選択的薬理学的モジュレーターは、医学および畜産の両方に応用されている。さらに、ＢＳＨの以前の活性ベースのアッセイは、生細胞の単培養物または複数の分類群を含む腸内マイクロバイオーム試料とは相容れないものであった。したがって、開示のプローブ実施形態は、タンパク質、全細胞、および微生物群集試料における低分子ＢＳＨモジュレーターの特性評価に特に適している。ＢＡ−ＡＭＣＡプローブは、ＢＳＨ阻害剤ＣＡＰＥのＩＣ５０値を提供した（図７）。
【０１８３】
ＣＡ−ＡＭＣＡレポーターが精製タンパク質で確実に機能することを確認した後、ＢＳＨを発現しない大腸菌細胞の溶解液に既知量のＢＳＨを添加することにより、複合生物学的混合物を分析する可能性を探った（図９Ａ〜９Ｃ）。基質代謝回転速度はＢＳＨ濃度と相関し、精製タンパク質で得られた結果と同程度であったため、このアッセイは複合生体試料におけるＢＳＨ活性を正確にレポートすることを示唆している。
【０１８４】
現在、ｉｎ  ｖｉｖｏで胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を連続的かつ非破壊的にモニターする定量的な方法はないため、ＣＡ−ＡＭＣＡレポーターをこの目的で評価した。ラクトバチルス・プランタラムは、４つの形態のＢＳＨを発現する、よく特性評価された腸内共生生物である。この種は、一般的に摂取されるプロバイオティクスであり、高コレステロール血症に良い影響を与えることが示されているため、特に関心が高い。したがって、ＣＡ−ＡＭＣＡプローブのｉｎ  ｖｉｖｏ特性評価のモデル生物として、Ｌ．プランタラムを採用した。
【０１８５】
最初に、Ｌ．プランタラム細胞溶解液をＣＡ−ＡＭＣＡで処理し、予想通りの基質代謝回転を観察した（図１０Ａ、図１１Ａ〜１１Ｃ）。溶解液をＣＡＰＥで処理しても活性は観察されず、観察された活性がＢＳＨによるものであることを示唆している（図１２Ａ〜１２Ｃ）。ＢＳＨを発現しない微生物（大腸菌）の細胞溶解液にプローブを添加しても、基質代謝回転は観察されなかった（図９Ａ〜９Ｃ）。第二に、ＣＡ−ＡＭＣＡを、Ｌ．プランタラムの全細胞単培養において評価した。細胞を対数期まで増殖させ、分析用に緩衝液に懸濁させた。ＢＡ−ＡＭＣＡを生きたＬ．プランタラム細胞の懸濁液へ添加すると、基質代謝回転と一致する蛍光プロットが得られた（図１０Ｂ、図１３Ａ〜１３Ｃ）。ＢＳＨを発現しない生きた微生物の懸濁液にプローブを添加しても、活性は観察されなかった（図１４Ａ〜１４Ｃ）。これは現在、ＢＳＨ活性の最初の非破壊的全細胞分析であると考えられている。最後に、低分子ＢＳＨモジュレーターがＢＡ−ＡＭＣレポーターを使用して特性評価され得ることを示すと同時に、プローブ速度は、全細胞懸濁液に添加されたＣＡＰＥの量と一致した（図１５）。
【０１８６】
このアッセイは、ヒト糞便試料からの腸内マイクロバイオーム抽出物中のＢＳＨ活性の特性評価に特に有益であるが、それは、このための単純な方法が現在のところ存在しないためである。そのような方法は、臨床医が患者試料中の正味のＢＳＨ活性を定量化するのに役立ち得る。そこで、次に、ＣＡ−ＡＭＣＡレポーターが複合腸内マイクロバイオーム試料で機能し得るかどうかを決定した。代表的な腸内マイクロバイオームモデルについては、業者から購入したヒト試料を使用した。細胞画分を遠心分離により単離し、その後溶解させた。処理したヒト腸内マイクロバイオーム試料に精製ＢＳＨを添加し、基質代謝回転の比例的増加を観察した（図１６、図１７Ａ〜１７Ｃ）。対照マイクロバイオーム試料では基礎活性は観察されなかったが、より最近に得られた天然試料では活性が定量化され得ると現在考えられている。それでも、これは腸内マイクロバイオーム試料中のＢＳＨ活性の連続的定量分析の最初の実証である。
【０１８７】
このアッセイは、ＢＳＨ活性のリアルタイム連続モニタリングの最初の例である。また、全細胞中および腸内マイクロバイオームホモジネートの存在下で、このアプローチを使用してＢＳＨ活性をモニターすることができることも初めて実証されている。本明細書に記載の組成物および方法は、全細胞および腸内マイクロバイオーム試料の両方に適用可能であるため、臨床的に使用することで、患者試料中のＢＳＨ活性を定量化することができ、かつＢＳＨの低分子モジュレーターを発見するための優れた戦略を形成することができる。
【０１８８】
（実施例２）
胆汁酸に結合する活性酵素のアッセイ用に、いくつかの胆汁酸ベースの化学プローブを作製した。活性ベースのタンパク質プロファイリングプローブを使用したが、これは、化学プローブを応用して特定の活性を有する活性酵素を選択的かつ共有結合的に標識することを含む。タンパク質の標識に続いて、試料を濃縮し、イメージングおよび質量分析を含む様々な分析を行うことができる。
【０１８９】
プローブを、胆汁酸塩を加水分解して遊離胆汁酸にする酵素と特異的に反応するように設計した。動物およびヒトの腸では、この活性は主に胆汁酸塩ヒドロラーゼに起因しており、これは多くのプロバイオティクス製剤に共通の酵素であり、その活性のアップレギュレーションは健康的なコレステロールプロファイルと相関している。胆汁酸塩ヒドロラーゼには、Ｎ末端システインを含む触媒三残基を介して反応するシステインヒドロラーゼが含まれる。ＢＳＨは、触媒システインと反応する胆汁酸コアへの官能基の組み込みによって捕捉されるが、その後の加水分解の影響を受けない。求核性システインの標識に使用することができるアクリルアミド部位を利用し、求電子中心を求核性システインと反応する炭素に配置した。このアクリルアミドは内部にあるため、立体効果による非特異的なチオール付加物の形成を減少させることができる。さらに、Ｘ線共結晶構造によって示されるように、リガンド結合を妨げないはずであるアルキンタグを分子の一部に組み込んだ。
【０１９０】
精製された組換えラクトバチルス・プランタラムＢＳＨへのＢＡ−ＡＢＰの結合を、緩衝液中のプローブとのインキュベーションにより評価した（図１８Ａ）。ＢＳＨの標識は用量依存的であり、遊離胆汁酸塩の添加により減弱され得、ＢＡ−ＡＢＰプローブが真正基質と同じ部位を競合していることを示した（図１８Ｂ）。結合はヨードアセトイミドで前処理することで除去され、ＢＡ−ＡＢＰの標識は反応性システインを介して行われる可能性が高いことを示しており、これは提案されたメカニズムと一致している。さらに、標識は時間依存的であった。
【０１９１】
次いでＢＳＨプローブを、複合細胞溶解液の存在下での機能の保持についてアッセイした。精製ＢＳＨを、ＢＳＨを内因性発現することが知られていない生物に添加し、この変数を正確に制御した。ＢＡ−ＡＢＰは、いくつかの他の未知標的とともに、ＢＳＨ標識と一致する蛍光バンドを生成した（図１９Ａ）。
【０１９２】
ＢＳＨ−ＡＢＰが複合生物学的混合物中でＢＳＨを標識することができることを確認した後、プローブの適用を内因性ＢＳＨの検出についてアッセイした。ＢＳＨの発現が十分に裏付けされているためＬ．プランタラムを使用し、この生物は、健康的なコレステロール値をサポートするための多くの一般的な市販のプロバイオティクス製剤に含まれている。溶解液とのプローブのインキュベーションの後、蛍光イメージングは、いくつかの他のものとともに、ＢＳＨと一致するバンドを明らかにした（図２０Ａ）。Ｉｎ  ｖｉｖｏでの標識も確認し、あまり複雑ではないプロファイルを観察した（図２０Ｂ）。
【０１９３】
次に、細菌溶解液中のＢＳＨの存在をプロテオミクスを使用して定量化した。試料中のＢＳＨの量は、活性ベースのタンパク質プロファイリングで観察されたペプチドと強く相関していた（図２１）。
【０１９４】
プローブを、ヒト腸内マイクロバイオーム抽出物中の活性についてアッセイした。腸マイクロバイオーム溶解液をＢＳＨ  ＡＢＰで処理し、標識を観察した（図２２）。
【０１９５】
（実施例３）
特に断りのない限り、すべての試薬は市販の供給元から入手し、さらなる精製を行わずに使用した。すべての試薬および溶媒は市販の供給業者から入手し、さらなる精製を行わずにそのまま使用した。化学シフトは、ＮＭＲ溶媒の残留ピークを基準としたｐｐｍ（δ）で報告され、結合定数（Ｊ）はヘルツである。すべての反応は、ＴＬＣおよびＬＴＱ−ＭＳを使用してモニターした。新規化合物の特性評価には、１Ｈ、１３Ｃ  ＮＭＲおよびＬＴＱ−ＭＳデータが含まれている。質量分析（ＨＲＭＳ）はＰＮＮＬで行った。
【０１９６】
【化１９】
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文献のプロトコルに従ってコール酸メチルエステルを合成した。撹拌子を装入したオーブン乾燥丸底フラスコにコール酸メチルエステル（１．５ｇ、４．７５ｍｍｏｌ）を添加し、ゴム隔膜で密封した。フラスコを真空にして窒素で満たし、このサイクルをさらに２回繰り返した。ジクロロメタン（１５ｍＬ）を添加し、反応液を氷浴で冷却した。撹拌液にＴＥＳ−ＯＴｆをゆっくりと添加した。次いでＤＩＥＡをゆっくりと添加した。氷浴を取り外し、反応液を室温に１時間温めた。次いで反応液を酢酸エチルで希釈し、ＮＨ４Ｃｌで洗浄した後、ブラインで洗浄した。回転蒸発により溶媒を除去した後、クルード反応混合物をＢｉｏｔａｇｅ  Ｉｓｏｌｅｒａを使用してシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。生成物を透明な無色油として単離した（２．７ｇ、収率７５％）。
【０１９７】
【化２０】
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撹拌子を装入したオーブン乾燥丸底フラスコに、上記のエステル生成物（１．５ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を添加した。フラスコをゴム隔膜で密封し、その後真空ポンプを使用して排気し、続いて窒素充填し、このサイクルをさらに２回繰り返した。次にＴＨＦ（１０ｍｌ）を添加した。次に反応液を氷浴で冷却した。次に、水素化リチウムアルミニウム（２２８ｍｇ、６ｍｍｏｌ）の懸濁液をゆっくりと添加した。３０分間撹拌した後、反応液を０℃に保ち、水２４０ｕｌを添加して溶液を撹拌した。次に１Ｍ  ＮａＯＨ  ２４０ｕｌを添加し、反応液を撹拌した。次に水７２０ｕＬを添加し、溶液を３０分間かけて室温まで温めながら撹拌した。２すくい分のＭｇＳＯ４を添加し、混合液を１５分間撹拌した。次いで、反応混合液をセライトのベッドに通して濾過した。セライトベッドを酢酸エチルで洗浄した。次に濾液を硫酸ナトリウムで乾燥させた。回転蒸発により溶媒を除去した後、クルード反応混合物をＢｉｏｔａｇｅ  Ｉｓｏｌｌａを使用してシリカゲルクロマトグラフィーにかけた。生成物を透明な無色油として単離した（１．３ｇ）。
【０１９８】
【化２１】
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オーブン乾燥丸底フラスコに撹拌子を装入し、ゴム隔膜で密封した。排気−窒素充填を３サイクル行うことにより、フラスコを不活性雰囲気にした。次にジクロロメタン（５ｍＬ）を添加し、続いて塩化オキサリル（２１４ｕｌ、２．５ｍｍｏｌ）を添加した。次いで、ドライアイス／アセトン浴を使用して、反応液を−７８℃に冷却した。次にＤＭＳＯ（３５４ｕｌ、５ｍｍｏｌ）を滴下した。反応液を１５分間撹拌した。次に、上記のアルコール（３７７ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン溶液２ｍＬに滴下した。反応液を３０分間撹拌した。次にトリエチルアミン（１．１ｍｌ、７．５ｍｍｏｌ）を滴下した。その後、反応液をさらに３０分間−７８℃で撹拌した後、室温に温め、さらに１時間撹拌した。反応液を酢酸エチルに懸濁し、水で洗浄し、続いて塩化アンモニウム、次にブラインで洗浄した。次いで、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた。回転蒸発により溶媒を除去した後、クルード混合物をシリカゲルクロマトグラフィーにかけた。生成物は、近接のＴＬＣスポットから分離されず、さらに精製することなく次の反応に持ち込んだ。
【０１９９】
【化２２】
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上記のクルードアルデヒド中間体（１８０ｍｇ）を、撹拌子を装入したオーブン乾燥丸底フラスコに添加した。次にマロン酸（２６ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を添加し、続いてピリジン（１ｍｌ）を添加し、次いでピペリジン（１滴）を添加した。次いで、反応液を９５℃に１時間加熱した。ピリジンを回転蒸発により除去した。クルード残渣を酢酸エチルで希釈し、次に１Ｎ  ＨＣｌで洗浄した。その後、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させた。回転蒸発により溶媒を除去した後、クルード反応物をＢｉｏｔａｇｅ  Ｉｓｏｌｅｒａを使用してシリカゲルクロマトグラフィーにかけた。生成物を透明な無色ゲル状油として単離した（１９３ｍｇ）。
【０２００】
【化２３】
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上記のα，β−不飽和酸を、撹拌子を装入したオーブン乾燥丸底フラスコに入れた。ＨＡＴＵを添加し、続いてＤＭＦ、ＤＩＥＡ、およびプロパルギルアミンを添加した。反応液を室温で一晩撹拌した。反応混合液を酢酸エチルに希釈し、ブラインで洗浄した後、塩化アンモニウムで洗浄した。その後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。回転蒸発により溶媒を除去した後、クルード混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。生成物を透明な無色樹脂として単離した。図２３は、生成物の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【０２０１】
【化２４】
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上記のＴＥＳ保護化合物（２５ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を、撹拌子を装入したオーブン乾燥丸底フラスコに添加した。ＴＨＦ（１ｍｌ）を添加し、続いて１Ｍ  ＴＢＡＦ−ＴＨＦ溶液（０．３ｍｌ）を添加した。次いで、反応液を室温で一晩撹拌した。次いで、反応液をシリカゲルで蒸発させ、クロマトグラフィー用にＢｉｏｔａｇｅシリカゲルカラムに装填した。生成物を単離した（１０ｍｇ）。図２４は、生成物の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【０２０２】
同様の方法を使用して、図２５に示すプローブを作製することができる；図２５は、この生成物の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルも提供する。
【０２０３】
（実施例４）
【化２５】
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ＣＡ−ＡＭＣＡの合成。撹拌子を装入したオーブン乾燥丸底フラスコにコール酸（１２０ｍｇ、０．２９５ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（１１２．２ｍｇ、０．２９５ｍｍｏｌ）を添加し、次いでＤＭＦ（２ｍｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（３１０μＬ）を添加した。反応液を室温で１５分間撹拌した後、ＡＭＣＡ（１３７．７ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ）を添加した。反応液を５０℃に４時間加熱した。反応混合液を室温まで冷却し、次いで精製用に逆相ＨＰＬＣカラムに直接投入した（Ｈ２Ｏ中１０→９５％ＣＨ３ＣＮの直線グラジエント）。生成物を、淡いオレンジ色固体として単離した（４４．５ｍｇ、収率２４．３％）。
【０２０４】
スペクトルデータ。１Ｈ  ＮＭＲ（５００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ  １０．３０  （１Ｈ，  ｓ），  ７．７９−７．６７  （２Ｈ，  ｍ），  ７．５１−７．４３  （１Ｈ，  ｍ），  ４．３２−４．２１  （１Ｈ，  ｍ），  ４．１１−４．０４  （１Ｈ，  ｍ），  ４．００−３．９４  （１Ｈ，  ｍ），  ３．８１−３．７３  （１Ｈ，  ｍ），  ３．６４−３．４８  （３Ｈ，  ｍ），  ３．２１−３．１０  （１Ｈ，  ｍ），  ２．５３−２．５１  （１Ｈ，  ｍ），  ２．４２−２．０８  （７Ｈ，  ｍ），  ２．０３−１．９３  （１Ｈ，  ｍ），  １．８７−１．７０  （３Ｈ，  ｍ），  １．６８−１．５８  （２Ｈ，  ｍ），  １．４７−１．１０  （１０Ｈ，  ｍ），  １．００−０．９０  （４Ｈ，  ｍ），  ０．８０  （３Ｈ，  ｓ），  ０．５８  （３Ｈ，  ｓ）；  １３Ｃ  ＮＭＲ  （１２５  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  １７６．１８，  １７５．０５，  １７３．３２，  １７３．００，  １７１．９２，  １６８．９４，  １６１．３５，  １５２．７９，  １４９．０２，  １４２．５８，  １２６．４７，  １１５．６３，  １１５．５３，  １０５．６５，  ７１．４７，  ７０．９０，  ６６．７０，  ４６．５５，  ４１．９９，  ４１．８５，  ４０．９２，  ４０．６０，  ３５．７８，  ３５．６０，  ３５．３７，  ３４．０５，  ３３．４４，  ３１．６９，  ３０．８７，  ２９．０５，  ２７．７３，  ２６．６９，  ２３．２７，  １７．６３，  １５．３６，  １２．８３．    ＨＲＭＳ−ＥＳＩ  （ｍ／ｚ）：  ［Ｍ  ＋  Ｎａ］＋  Ｃ３６Ｈ４９ＮＯ８の計算値，  ６４６．３３５；  実測値  ６４６．３３３．
【０２０５】
本開示の原理が適用され得る多くの可能な実施形態を考慮して、例示の実施形態は例に過ぎず、本開示の範囲を制限するものとして解釈されるべきではないことが認識されるべきである。むしろ、その範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義される。したがって、本発明者らは、これらのクレームの範囲および趣旨に含まれるすべてのものを本発明者らの発明として主張する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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