(57)【要約】  核、複数の核、細胞、複数の細胞、および／または組織内の分子を固有に標識化またはバーコード化する方法が提供される。核、複数の核、細胞、複数の細胞、および／または組織内の分子を固有に標識化またはバーコード化するためのキットが提供される。標識化される分子としては、これらに限定されないが、ＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡを挙げることができる。
2020534015.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の細胞内のＲＮＡ分子を固有に標識化する方法であって、
（ａ）ステップ（ｂ）の前に第１の複数の細胞を固定および透過処理するステップであって、前記第１の複数の細胞は、約８℃未満で固定および透過処理されるステップ；
（ｂ）前記第１の複数の細胞内で前記ＲＮＡ分子を逆転写して、前記第１の複数の細胞内で相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子を形成するステップであって、前記ＲＮＡ分子を逆転写するステップは、プライマーを前記ＲＮＡ分子にカップリングするステップを含み、前記プライマーは、ポリ（Ｔ）配列またはランダム配列の少なくとも１つを含むステップ；
（ｃ）ｃＤＮＡ分子を含む前記第１の複数の細胞を少なくとも２つの一次アリコートに分割するステップであって、前記少なくとも２つの一次アリコートは、第１の一次アリコートおよび第２の一次アリコートを含むステップ；
（ｄ）一次核酸タグを前記少なくとも２つの一次アリコートに提供するステップであって、前記第１の一次アリコートに提供された前記一次核酸タグは、前記第２の一次アリコートに提供された前記一次核酸タグとは異なるステップ；
（ｅ）前記少なくとも２つの一次アリコートの各々の内の前記ｃＤＮＡ分子を、提供された前記一次核酸タグとカップリングするステップ；
（ｆ）前記少なくとも２つの一次アリコートを組み合わせるステップ；
（ｇ）組み合わせた前記一次アリコートを少なくとも２つの二次アリコートに分割するステップであって、前記少なくとも２つの二次アリコートは、第１の二次アリコートおよび第２の二次アリコートを含むステップ；
（ｈ）二次核酸タグを前記少なくとも２つの二次アリコートに提供するステップであって、前記第１の二次アリコートに提供された前記二次核酸タグは、前記第２の二次アリコートに提供された前記二次核酸タグとは異なるステップ；
（ｉ）前記少なくとも２つの二次アリコートの各々の内の前記ｃＤＮＡ分子を、提供された前記二次核酸タグとカップリングするステップ；
（ｊ）その後のアリコートを用いて、ステップ（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、および（ｉ）を繰り返すステップであって、最終核酸タグは捕捉剤を含むステップ；
（ｋ）最終アリコートを組み合わせるステップ；
（ｌ）前記第１の複数の細胞を溶解して、前記第１の複数の細胞内から前記ｃＤＮＡ分子を放出させて、ライセートを形成するステップ；ならびに
（ｍ）プロテアーゼ阻害剤および結合剤を前記ライセートに添加し、前記ｃＤＮＡ分子が前記結合剤に結合するようにするステップ
を含む方法。
【請求項２】
組み合わせた前記最終アリコートを少なくとも２つの最終アリコートに分割するステップであって、前記少なくとも２つの最終アリコートは、第１の最終アリコートおよび第２の最終アリコートを含むステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の複数の細胞は、約７℃未満、約６℃未満、約５℃未満、約４℃未満、約３℃未満、約２℃未満、または約１℃未満で固定および透過処理される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記プロテアーゼ阻害剤は、フッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ）または４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記捕捉剤はビオチンを含み、前記結合剤はアビジンを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記結合剤はストレプトアビジンを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（ｎ）前記結合剤に結合した前記ｃＤＮＡ分子のテンプレートスイッチを実行するステップ；
（ｏ）前記ｃＤＮＡ分子を増幅して、増幅ｃＤＮＡ分子溶液を形成するステップ；および
（ｐ）固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）ビーズ溶液を前記増幅ｃＤＮＡ分子溶液に導入して、２００塩基対未満のポリヌクレオチドを除去するステップであって、ＳＰＲＩビーズ溶液対増幅ｃＤＮＡ分子溶液の比は、約０．９：１〜約０．７：１であるステップ
をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ＳＰＲＩビーズ溶液対ライセートの比は、約０．８７５：１〜約０．７７５：１、約０．８５：１〜約０．７５：１、または約０．８２５：１〜約０．７２５：１である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＳＰＲＩビーズ溶液は、約２Ｍ〜３ＭのＮａＣｌ、および約１５ｗ／ｖ％〜２５ｗ／ｖ％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み、前記ＰＥＧの分子量は、約７，０００ｇ／ｍｏｌ〜９，０００ｇ／ｍｏｌである、請求項７または請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
共通アダプター配列を、放出された前記ｃＤＮＡ分子の３’末端に付加するステップであって、付加する前記ステップは、約１０ｗ／ｖ％までのポリエチレングリコールを含む溶液中で実行され、前記ポリエチレングリコールの分子量は、約７，０００ｇ／ｍｏｌ〜９，０００ｇ／ｍｏｌであるステップ
をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記共通アダプター配列は、テンプレートスイッチを行うことにより、放出された前記ｃＤＮＡ分子の前記３’末端に付加される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｊ）は、単一細胞の核酸に対して固有の一連の核酸タグを生成するのに十分な回数だけ繰り返される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記回数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、および１００から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｂ）の前記プライマーは、第１の特異的バーコードをさらに含み、前記方法は、
（ｑ）第２の複数の細胞内でＲＮＡ分子を逆転写して、前記第２の複数の細胞内でｃＤＮＡ分子を形成するステップであって、前記ＲＮＡ分子を逆転写するステップは、特異的プライマーを前記ＲＮＡ分子にカップリングするステップを含み、前記プライマーは、第２の特異的バーコードと、ポリ（Ｔ）配列またはランダム配列の少なくとも１つとを含み、前記第１の特異的バーコードは、前記第１の複数の細胞に由来する前記ｃＤＮＡ分子を、前記第２の複数の細胞に由来する前記ｃＤＮＡ分子と比較して識別することができるように、前記第２の特異的バーコードとは異なるステップ；
（ｒ）ｃＤＮＡ分子を含む前記第２の複数の細胞を少なくとも２つの一次アリコートに分割するステップであって、前記少なくとも２つの一次アリコートは、第１の一次アリコートおよび第２の一次アリコートを含むステップ；
（ｓ）一次核酸タグを前記少なくとも２つの一次アリコートに提供するステップであって、前記第１の一次アリコートに提供された前記一次核酸タグは、前記第２の一次アリコートに提供された前記一次核酸タグとは異なるステップ；
（ｔ）前記少なくとも２つの一次アリコートの各々の内の前記ｃＤＮＡ分子を、提供された前記一次核酸タグとカップリングするステップ；
（ｕ）前記少なくとも２つの一次アリコートを組み合わせるステップ；
（ｖ）組み合わせた前記一次アリコートを少なくとも２つの二次アリコートに分割するステップであって、前記少なくとも２つの二次アリコートは、第１の二次アリコートおよび第２の二次アリコートを含むステップ；
（ｗ）二次核酸タグを前記少なくとも２つの二次アリコートに提供するステップであって、前記第１の二次アリコートに提供された前記二次核酸タグは、前記第２の二次アリコートに提供された前記二次核酸タグとは異なるステップ；
（ｘ）前記少なくとも２つの二次アリコートの各々の内の前記ｃＤＮＡ分子を、提供された前記二次核酸タグとカップリングするステップ；ならびに
（ｙ）その後のアリコートを用いて、ステップ（ｕ）、（ｖ）、（ｗ）、および（ｘ）を繰り返すステップであって、最終核酸タグは捕捉剤を含むステップ
をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記核酸タグの各々は、
３’末端および５’末端を含むバーコード配列、ならびに
前記バーコード配列の前記３’末端および前記５’末端にそれぞれ隣接する３’ハイブリダイゼーション配列および５’ハイブリダイゼーション配列
を含む第１の鎖；ならびに
前記５’ハイブリダイゼーション配列および前記アダプター配列の少なくとも１つに相補的な第１の部分、ならびに
前記３’ハイブリダイゼーション配列に相補的な第２の部分
を含む第２の鎖
を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｃＤＮＡ分子に結合している前記核酸タグの少なくとも２つをライゲーションするステップ
をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ライゲーションは、前記第１の複数の細胞内で実施される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
未結合核酸タグを除去するステップ
をさらに含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
放出された前記ｃＤＮＡ分子に結合している前記核酸タグの少なくとも２つをライゲーションするステップ
をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
単一細胞に由来する、前記核酸タグに結合したｃＤＮＡ分子の大部分は、同じ一連の結合した核酸タグを含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１の複数の細胞は、哺乳動物細胞、酵母細胞、および細菌細胞の少なくとも１つから選択される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
第１の細胞内の核酸を標識化する方法であって、
（ａ）
（ｉ）５’突出配列を含む第１の逆転写プライマーであって、前記第１の逆転写プライマーがポリ（Ａ）尾部を有するＲＮＡを逆転写するように構成されている第１の逆転写プライマー、および
（ｉｉ）５’突出配列と、ランダム六量体、ランダム七量体、ランダム八量体、ランダム九量体、およびランダム十量体の少なくとも１つとを含む第２の逆転写プライマー
の少なくとも１つを使用してＲＮＡを逆転写することにより、前記第１の細胞を含む複数の細胞内で相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子を生成するステップ：
（ｂ）前記複数の細胞を（ｎ）個のアリコートに分割するステップ；
（ｃ）複数の核酸タグを前記ｎ個のアリコートの各々に提供するステップであって、各核酸タグは、
標識化配列の３’末端から伸長する３’ハイブリダイゼーション配列、および前記標識化配列の５’末端から伸長する５’ハイブリダイゼーション配列を含む第１の鎖、ならびに
突出配列を含む第２の鎖であって、前記突出配列は、（ｉ）前記５’ハイブリダイゼーション配列および前記５’突出配列の少なくとも１つに相補的な第１の部分、ならびに（ｉｉ）前記３’ハイブリダイゼーション配列に相補的な第２の部分を含む第２の鎖を含み、
所与のアリコートに提供された前記複数の核酸タグの各標識化配列は同じであり、前記ｎ個のアリコートの各々には異なる標識化配列が提供されるステップ；
（ｄ）前記ｎ個のアリコートの各々の前記ｃＤＮＡ分子の少なくとも１つを前記核酸タグに結合させるステップ；
（ｅ）前記ｎ個のアリコートを組み合わせるステップ；ならびに
（ｆ）組み合わせた前記アリコートを用いて、ステップ（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）を繰り返すステップ；
（ｇ）最終アリコートを組み合わせるステップ；
（ｈ）前記第１の細胞を含む前記複数の細胞を溶解して、前記第１の細胞を含む前記複数の細胞内から前記ｃＤＮＡ分子を放出させて、ライセートを形成するステップ；ならびに
（ｉ）プロテアーゼ阻害剤および結合剤を前記ライセートに添加し、前記ｃＤＮＡ分子が前記結合剤に結合するようにするステップ
を含む方法。
【請求項２３】
ステップ（ｆ）は、前記第１の細胞の前記ｃＤＮＡ分子に対して固有の一連の標識化配列を生成するのに十分な回数だけ繰り返される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記回数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、および１００から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ｃＤＮＡ分子は、アリコート中で生成され、前記アリコート中の前記第１の逆転写プライマーの濃度は、約０．５μＭ〜約１０μＭであり、前記アリコート中の前記第２の逆転写プライマーの濃度は、約０．５μＭ〜約１０μＭである、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
ステップ（ａ）の前に前記複数の細胞を固定するステップであって、前記複数の細胞は、約８℃未満で固定されるステップ
をさらに含む、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記複数の細胞は、約７℃未満、約６℃未満、約５℃未満、約４℃未満、約３℃未満、約２℃未満、または約１℃未満で固定される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ステップ（ａ）の前に前記複数の細胞を透過処理するステップであって、前記複数の細胞は、約８℃未満で透過処理されるステップ
をさらに含む、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記複数の細胞は、約７℃未満、約６℃未満、約５℃未満、約４℃未満、約３℃未満、約２℃未満、または約１℃未満で透過処理される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ｃＤＮＡ分子に結合している前記核酸タグの少なくとも２つをライゲーションするステップ
をさらに含む、請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ライゲーションは、前記複数の細胞内で実施される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
未結合核酸タグを除去するステップ
をさらに含む、請求項２２〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１および第２の逆転写プライマーの少なくとも１つは、所定のＲＮＡを逆転写するように構成されている、請求項２２〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記最終核酸タグは捕捉剤を含み、前記方法は、
ステップ（ｆ）の後で、前記複数の細胞を溶解して、前記複数の細胞内から前記ｃＤＮＡ分子を放出させて、ライセートを形成するステップ；ならびに
プロテアーゼ阻害剤および結合剤を前記ライセートに添加して、前記ｃＤＮＡ分子を単離するステップ
をさらに含む、請求項２２〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記プロテアーゼ阻害剤は、フッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ）または４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記捕捉剤はビオチンを含み、前記結合剤はアビジンを含む、請求項３４または請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記結合剤はストレプトアビジンを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
（ｊ）前記結合剤に結合した前記ｃＤＮＡ分子のテンプレートスイッチを実行するステップ；
（ｋ）前記ｃＤＮＡ分子を増幅して、増幅ｃＤＮＡ分子溶液を形成するステップ；および
（ｌ）固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）ビーズ溶液を前記増幅ｃＤＮＡ分子溶液に導入して、２００塩基対未満のポリヌクレオチドを除去するステップであって、ＳＰＲＩビーズ溶液対増幅ｃＤＮＡ分子溶液の比は、約０．９：１〜約０．７：１であるステップ
をさらに含む、請求項２２〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
ＳＰＲＩビーズ溶液対ライセートの比は、約０．８７５：１〜約０．７７５：１、約０．８５：１〜約０．７５：１、または約０．８２５：１〜約０．７２５：１である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＳＰＲＩビーズ溶液は、約２Ｍ〜３ＭのＮａＣｌ、および約１５ｗ／ｖ％〜２５ｗ／ｖ％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み、前記ＰＥＧの分子量は、約７，０００ｇ／ｍｏｌ〜９，０００ｇ／ｍｏｌである、請求項３８または請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
共通アダプター配列を、放出された前記ｃＤＮＡ分子の３’末端に付加するステップであって、付加する前記ステップは、約１０ｗ／ｖ％までのポリエチレングリコールを含む溶液中で実行され、前記ポリエチレングリコールの分子量は、約７，０００ｇ／ｍｏｌ〜９，０００ｇ／ｍｏｌであるステップ
をさらに含む、請求項２２〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記共通アダプター配列は、テンプレートスイッチを行うことにより、放出された前記ｃＤＮＡ分子の前記３’末端に付加される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
放出された前記ｃＤＮＡ分子に結合している前記核酸タグの少なくとも２つをライゲーションするステップ
をさらに含む、請求項２２〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記複数の細胞は、哺乳動物細胞、酵母細胞、および細菌細胞の少なくとも１つから選択される、請求項２２〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
第１の細胞内の核酸を標識化するためのキットであって、
５’突出配列を含む第１の逆転写プライマーであって、前記第１の逆転写プライマーがポリ（Ａ）尾部を有するＲＮＡを逆転写するように構成されている第１の逆転写プライマー；
５’突出配列と、ランダム六量体、ランダム七量体、ランダム八量体、ランダム九量体、およびランダム十量体の少なくとも１つとを含む第２の逆転写プライマー；
複数の第１の核酸タグであって、各第１の核酸タグは、
第１の標識化配列の３’末端から伸長する３’ハイブリダイゼーション配列、および前記第１の標識化配列の５’末端から伸長する５’ハイブリダイゼーション配列を含む第１の鎖、ならびに
突出配列を含む第２の鎖であって、前記突出配列は、（ｉ）前記第１および第２の逆転写プライマーの前記５’ハイブリダイゼーション配列および前記５’突出配列の少なくとも１つに相補的な第１の部分、ならびに（ｉｉ）前記３’ハイブリダイゼーション配列に相補的な第２の部分を含む第２の鎖を含む複数の第１の核酸タグ；
複数の第２の核酸タグであって、各第２の核酸タグは、
第２の標識化配列の３’末端から伸長する３’ハイブリダイゼーション配列、および前記第２の標識化配列の５’末端から伸長する５’ハイブリダイゼーション配列を含む第１の鎖、ならびに
突出配列を含む第２の鎖であって、前記突出配列は、（ｉ）前記第１および第２の逆転写プライマーの前記５’ハイブリダイゼーション配列および前記５’突出配列の少なくとも１つに相補的な第１の部分、ならびに（ｉｉ）前記３’ハイブリダイゼーション配列に相補的な第２の部分を含む第２の鎖を含み、前記第１の標識化配列は前記第２の標識化配列とは異なる、複数の第２の核酸タグ；ならびに
複数の最終核酸タグであって、各最終核酸タグは、
最終標識化配列の３’末端から伸長する３’ハイブリダイゼーション配列、および前記最終標識化配列の５’末端から伸長する５’ハイブリダイゼーション配列を含む第１の鎖、
突出配列を含む第２の鎖であって、前記突出配列は、（ｉ）前記第１および第２の逆転写プライマーの前記５’ハイブリダイゼーション配列および前記５’突出配列の少なくとも１つに相補的な第１の部分、ならびに（ｉｉ）前記３’ハイブリダイゼーション配列に相補的な第２の部分を含む第２の鎖、ならびに
捕捉剤を含み、前記最終標識化配列は、前記第１および第２の標識化配列とは異なる、複数の最終核酸タグ
を含むキット。
【請求項４６】
逆転写酵素、固定剤、透過処理剤、ライゲーション剤、溶解剤、およびプロテアーゼ阻害剤の少なくとも１つをさらに含む、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
１つまたは複数の追加の複数の核酸タグであって、各核酸タグは、
標識化配列の３’末端から伸長する３’ハイブリダイゼーション配列、および前記標識化配列の５’末端から伸長する５’ハイブリダイゼーション配列を含む第１の鎖、ならびに
突出配列を含む第２の鎖であって、前記突出配列は、（ｉ）前記第１および第２の逆転写プライマーの前記５’ハイブリダイゼーション配列および前記５’突出配列の少なくとも１つに相補的な第１の部分、ならびに（ｉｉ）前記３’ハイブリダイゼーション配列に相補的な第２の部分を含む第２の鎖を含み、
前記標識化配列は、各所与の追加の複数の核酸タグが異なる、１つまたは複数の追加の複数の核酸タグをさらに含む、請求項４５または請求項４６に記載のキット。
【請求項４８】
複数の核内のＲＮＡ分子を固有に標識化する方法であって、
（ａ）ステップ（ｂ）の前に第１の複数の核を固定および透過処理するステップであって、前記第１の複数の核は、約８℃未満で固定および透過処理されるステップ；
（ｂ）前記第１の複数の核内で前記ＲＮＡ分子を逆転写して、前記第１の複数の核内で相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子を形成するステップであって、前記ＲＮＡ分子を逆転写するステップは、プライマーを前記ＲＮＡ分子にカップリングするステップを含み、前記プライマーは、ポリ（Ｔ）配列またはランダム配列の少なくとも１つを含むステップ；
（ｃ）ｃＤＮＡ分子を含む前記第１の複数の核を少なくとも２つの一次アリコートに分割するステップであって、前記少なくとも２つの一次アリコートは、第１の一次アリコートおよび第２の一次アリコートを含むステップ；
（ｄ）一次核酸タグを前記少なくとも２つの一次アリコートに提供するステップであって、前記第１の一次アリコートに提供された前記一次核酸タグは、前記第２の一次アリコートに提供された前記一次核酸タグとは異なるステップ；
（ｅ）前記少なくとも２つの一次アリコートの各々の内の前記ｃＤＮＡ分子を、提供された前記一次核酸タグとカップリングするステップ；
（ｆ）前記少なくとも２つの一次アリコートを組み合わせるステップ；
（ｇ）組み合わせた前記一次アリコートを少なくとも２つの二次アリコートに分割するステップであって、前記少なくとも２つの二次アリコートは、第１の二次アリコートおよび第２の二次アリコートを含むステップ；
（ｈ）二次核酸タグを前記少なくとも２つの二次アリコートに提供するステップであって、前記第１の二次アリコートに提供された前記二次核酸タグは、前記第２の二次アリコートに提供された前記二次核酸タグとは異なるステップ；
（ｉ）前記少なくとも２つの二次アリコートの各々の内の前記ｃＤＮＡ分子を、提供された前記二次核酸タグとカップリングするステップ；
（ｊ）その後のアリコートを用いて、ステップ（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、および（ｉ）を繰り返すステップであって、最終核酸タグは捕捉剤を含むステップ；
（ｋ）最終アリコートを組み合わせるステップ；
（ｌ）前記第１の複数の核を溶解して、前記第１の複数の核内から前記ｃＤＮＡ分子を放出させて、ライセートを形成するステップ；ならびに
（ｍ）プロテアーゼ阻害剤および結合剤を前記ライセートに添加し、前記ｃＤＮＡ分子が前記結合剤に結合するようにするステップ
を含む方法。
【請求項４９】
組み合わせた前記最終アリコートを少なくとも２つの最終アリコートに分割するステップであって、前記少なくとも２つの最終アリコートは、第１の最終アリコートおよび第２の最終アリコートを含むステップをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記第１の複数の核は、約７℃未満、約６℃未満、約５℃未満、約４℃未満、約３℃未満、約２℃未満、または約１℃未満で固定および透過処理される、請求項４８または請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記プロテアーゼ阻害剤は、フッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ）または４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）を含む、請求項４８〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記捕捉剤はビオチンを含み、前記結合剤はアビジンを含む、請求項４８〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記結合剤はストレプトアビジンを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
（ｎ）前記結合剤に結合した前記ｃＤＮＡ分子のテンプレートスイッチを実行するステップ；
（ｏ）前記ｃＤＮＡ分子を増幅して、増幅ｃＤＮＡ分子溶液を形成するステップ；および
（ｐ）固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）ビーズ溶液を前記増幅ｃＤＮＡ分子溶液に導入して、２００塩基対未満のポリヌクレオチドを除去するステップであって、ＳＰＲＩビーズ溶液対増幅ｃＤＮＡ分子溶液の比は、約０．９：１〜約０．７：１であるステップ
をさらに含む、請求項４８〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
ＳＰＲＩビーズ溶液対ライセートの比は、約０．８７５：１〜約０．７７５：１、約０．８５：１〜約０．７５：１、または約０．８２５：１〜約０．７２５：１である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＳＰＲＩビーズ溶液は、約２Ｍ〜３ＭのＮａＣｌ、および約１５ｗ／ｖ％〜２５ｗ／ｖ％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み、前記ＰＥＧの分子量は、約７，０００ｇ／ｍｏｌ〜９，０００ｇ／ｍｏｌである、請求項５４または請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
共通アダプター配列を、放出された前記ｃＤＮＡ分子の３’末端に付加するステップであって、付加する前記ステップは、約１０ｗ／ｖ％までのポリエチレングリコールを含む溶液中で実行され、前記ポリエチレングリコールの分子量は、約７，０００ｇ／ｍｏｌ〜９，０００ｇ／ｍｏｌであるステップをさらに含む、請求項４８〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記共通アダプター配列は、テンプレートスイッチを行うことにより、放出された前記ｃＤＮＡ分子の前記３’末端に付加される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
ステップ（ｊ）は、単一細胞の核酸に対して固有の一連の核酸タグを生成するのに十分な回数だけ繰り返される、請求項４８〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記回数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、および１００から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
ステップ（ｂ）の前記プライマーは、第１の特異的バーコードをさらに含み、前記方法は、
（ｑ）第２の複数の核内でＲＮＡ分子を逆転写して、前記第２の複数の核内でｃＤＮＡ分子を形成するステップであって、前記ＲＮＡ分子を逆転写するステップは、特異的プライマーを前記ＲＮＡ分子にカップリングするステップを含み、前記プライマーは、第２の特異的バーコードと、ポリ（Ｔ）配列またはランダム配列の少なくとも１つとを含み、前記第１の特異的バーコードは、前記第１の複数の核に由来する前記ｃＤＮＡ分子を、前記第２の複数の核に由来する前記ｃＤＮＡ分子と比較して識別することができるように、前記第２の特異的バーコードとは異なるステップ；
（ｒ）ｃＤＮＡ分子を含む前記第２の複数の核を少なくとも２つの一次アリコートに分割するステップであって、前記少なくとも２つの一次アリコートは、第１の一次アリコートおよび第２の一次アリコートを含むステップ；
（ｓ）一次核酸タグを前記少なくとも２つの一次アリコートに提供するステップであって、前記第１の一次アリコートに提供された前記一次核酸タグは、前記第２の一次アリコートに提供された前記一次核酸タグとは異なるステップ；
（ｔ）前記少なくとも２つの一次アリコートの各々の内の前記ｃＤＮＡ分子を、提供された前記一次核酸タグとカップリングするステップ；
（ｕ）前記少なくとも２つの一次アリコートを組み合わせるステップ；
（ｖ）組み合わせた前記一次アリコートを少なくとも２つの二次アリコートに分割するステップであって、前記少なくとも２つの二次アリコートは、第１の二次アリコートおよび第２の二次アリコートを含むステップ；
（ｗ）二次核酸タグを前記少なくとも２つの二次アリコートに提供するステップであって、前記第１の二次アリコートに提供された前記二次核酸タグは、前記第２の二次アリコートに提供された前記二次核酸タグとは異なるステップ；
（ｘ）前記少なくとも２つの二次アリコートの各々の内の前記ｃＤＮＡ分子を、提供された前記二次核酸タグとカップリングするステップ；および
（ｙ）その後のアリコートを用いて、ステップ（ｕ）、（ｖ）、（ｗ）、および（ｘ）を繰り返すステップであって、最終核酸タグは捕捉剤を含むステップ
をさらに含む、請求項４８〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記核酸タグの各々は、
３’末端および５’末端を含むバーコード配列、ならびに
前記バーコード配列の前記３’末端および前記５’末端にそれぞれ隣接する３’ハイブリダイゼーション配列および５’ハイブリダイゼーション配列
を含む第１の鎖；ならびに
前記５’ハイブリダイゼーション配列および前記アダプター配列の少なくとも１つに相補的な第１の部分、ならびに
前記３’ハイブリダイゼーション配列に相補的な第２の部分
を含む第２の鎖
を含む、請求項４８〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記ｃＤＮＡ分子に結合している前記核酸タグの少なくとも２つをライゲーションするステップ
をさらに含む、請求項４８〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記ライゲーションは、前記第１の複数の核内で実施される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
未結合核酸タグを除去するステップ
をさらに含む、請求項４８〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
放出された前記ｃＤＮＡ分子に結合している前記核酸タグの少なくとも２つをライゲーションするステップ
をさらに含む、請求項４８〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
単一細胞に由来する、前記核酸タグに結合したｃＤＮＡ分子の大部分は、同じ一連の結合した核酸タグを含む、請求項４８〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
第１の核内の核酸を標識化する方法であって、
（ａ）
（ｉ）５’突出配列を含む第１の逆転写プライマーであって、前記第１の逆転写プライマーがポリ（Ａ）尾部を有するＲＮＡを逆転写するように構成されている第１の逆転写プライマー、および
（ｉｉ）５’突出配列と、ランダム六量体、ランダム七量体、ランダム八量体、ランダム九量体、およびランダム十量体の少なくとも１つとを含む第２の逆転写プライマー
の少なくとも１つを使用してＲＮＡを逆転写することにより、前記第１の核を含む複数の核内で相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子を生成するステップ：
（ｂ）前記複数の核を（ｎ）個のアリコートに分割するステップ；
（ｃ）複数の核酸タグを前記ｎ個のアリコートの各々に提供するステップであって、各核酸タグは、
標識化配列の３’末端から伸長する３’ハイブリダイゼーション配列、および前記標識化配列の５’末端から伸長する５’ハイブリダイゼーション配列を含む第１の鎖、ならびに
突出配列を含む第２の鎖であって、前記突出配列は、（ｉ）前記５’ハイブリダイゼーション配列および前記５’突出配列の少なくとも１つに相補的な第１の部分、ならびに（ｉｉ）前記３’ハイブリダイゼーション配列に相補的な第２の部分を含む第２の鎖を含み、
所与のアリコートに提供された前記複数の核酸タグの各標識化配列は同じであり、前記ｎ個のアリコートの各々には異なる標識化配列が提供されるステップ；
（ｄ）前記ｎ個のアリコートの各々の前記ｃＤＮＡ分子の少なくとも１つを前記核酸タグに結合させるステップ；
（ｅ）前記ｎ個のアリコートを組み合わせるステップ；ならびに
（ｆ）組み合わせた前記アリコートを用いて、ステップ（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）を繰り返すステップ；
（ｇ）最終アリコートを組み合わせるステップ；
（ｈ）前記第１の核を含む前記複数の核を溶解して、前記第１の核を含む前記複数の核内から前記ｃＤＮＡ分子を放出させて、ライセートを形成するステップ；ならびに
（ｉ）プロテアーゼ阻害剤および結合剤を前記ライセートに添加し、前記ｃＤＮＡ分子が前記結合剤に結合するようにするステップ
を含む方法。
【請求項６９】
ステップ（ｆ）は、前記第１の核の前記ｃＤＮＡ分子に対して固有の一連の標識化配列を生成するのに十分な回数だけ繰り返される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記回数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、および１００から選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記ｃＤＮＡ分子は、アリコート中で生成され、前記アリコート中の前記第１の逆転写プライマーの濃度は、約０．５μＭ〜約１０μＭであり、前記アリコート中の前記第２の逆転写プライマーの濃度は、約０．５μＭ〜約１０μＭである、請求項６８〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
ステップ（ａ）の前に前記複数の核を固定するステップであって、前記複数の核は、約８℃未満で固定されるステップ
をさらに含む、請求項６８〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記複数の核は、約７℃未満、約６℃未満、約５℃未満、約４℃未満、約３℃未満、約２℃未満、または約１℃未満で固定される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
ステップ（ａ）の前に前記複数の核を透過処理するステップであって、前記複数の核は、約８℃未満で透過処理されるステップ
をさらに含む、請求項６８〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記複数の核は、約７℃未満、約６℃未満、約５℃未満、約４℃未満、約３℃未満、約２℃未満、または約１℃未満で透過処理される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記ｃＤＮＡ分子に結合している前記核酸タグの少なくとも２つをライゲーションするステップ
をさらに含む、請求項６８〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記ライゲーションは、前記複数の核内で実施される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
未結合核酸タグを除去するステップ
をさらに含む、請求項６８〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記第１および第２の逆転写プライマーの少なくとも１つは、所定のＲＮＡを逆転写するように構成されている、請求項６８〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
前記最終核酸タグは捕捉剤を含み、前記方法は、
ステップ（ｆ）の後に、前記複数の核を溶解して、前記複数の核内から前記ｃＤＮＡ分子を放出させて、ライセートを形成するステップ；ならびに
プロテアーゼ阻害剤および結合剤を前記ライセートに添加して、前記ｃＤＮＡ分子を単離するステップ
をさらに含む、請求項６８〜７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
前記プロテアーゼ阻害剤は、フッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ）または４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）を含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記捕捉剤はビオチンを含み、前記結合剤はアビジンを含む、請求項８０または請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記結合剤はストレプトアビジンを含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
（ｊ）前記結合剤に結合した前記ｃＤＮＡ分子のテンプレートスイッチを実行するステップ；
（ｋ）前記ｃＤＮＡ分子を増幅して、増幅ｃＤＮＡ分子溶液を形成するステップ；および
（ｌ）固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）ビーズ溶液を前記増幅ｃＤＮＡ分子溶液に導入して、２００塩基対未満のポリヌクレオチドを除去するステップであって、ＳＰＲＩビーズ溶液対増幅ｃＤＮＡ分子溶液の比は、約０．９：１〜約０．７：１であるステップ
をさらに含む、請求項６８〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８５】
ＳＰＲＩビーズ溶液対ライセートの比は、約０．８７５：１〜約０．７７５：１、約０．８５：１〜約０．７５：１、または約０．８２５：１〜約０．７２５：１である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記ＳＰＲＩビーズ溶液は、約２Ｍ〜３ＭのＮａＣｌ、および約１５ｗ／ｖ％〜２５ｗ／ｖ％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み、前記ＰＥＧの分子量は、約７，０００ｇ／ｍｏｌ〜９，０００ｇ／ｍｏｌである、請求項８４または請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
共通アダプター配列を、放出された前記ｃＤＮＡ分子の３’末端に付加するステップであって、付加する前記ステップは、約１０ｗ／ｖ％までのポリエチレングリコールを含む溶液中で実行され、前記ポリエチレングリコールの分子量は、約７，０００ｇ／ｍｏｌ〜９，０００ｇ／ｍｏｌであるステップをさらに含む、請求項６８〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
前記共通アダプター配列は、テンプレートスイッチを行うことにより、放出された前記ｃＤＮＡ分子の前記３’末端に付加される、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
放出された前記ｃＤＮＡ分子に結合している前記核酸タグの少なくとも２つをライゲーションするステップ
をさらに含む、請求項６８〜８８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年９月２２日に出願された米国特許仮出願第６２／５６１，８０６号の利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本開示は、概して、核、複数の核、細胞、複数の細胞、および／または組織内の分子を固有に標識化またはバーコード化する方法に関する。また、本開示は、核、複数の核、細胞、複数の細胞、および／または組織内の分子を固有に標識化するためのキットに関する。特に、本方法およびキットは、ＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡの標識化に関し得る。
【背景技術】
【０００３】
背景
次世代塩基配列決定法（ＮＧＳ）は、細胞の試料に由来する個々の転写物を識別および／または定量化するために使用することができる。しかしながら、そのような技法は、大規模試料中の個々の細胞に対して実施するには複雑過ぎる場合がある。そのような方法では、一般に、溶解細胞（つまり、ばらばらに破壊された細胞）からＲＮＡ転写物を精製し、続いて逆転写を使用してＲＮＡ転写物を相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）へと変換する。その後、ＮＧＳを使用してｃＤＮＡ配列を配列決定することができる。そのような手順では、ｃＤＮＡ配列がすべて配列決定前に一緒に混合されるため、試料全体のＲＮＡ発現が測定され、個々の配列を元の個々の細胞に関連付けることができない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
個々の細胞に由来する転写物を固有に標識化またはバーコード化する方法は、個々の細胞を別々の反応槽へと手動で分離すること含んでいてもよく、専門装置を必要とする場合がある。細胞の個々の転写物を配列決定するための代替的手法は、顕微鏡検査を使用して、個々の蛍光性塩基を識別することである。しかしながら、この技法は、実施が困難であり、少数の細胞の配列決定に限定される場合がある。
【０００５】
本明細書で開示された実施形態は、添付の図面と併せて考慮すると、以下の説明および添付の特許請求の範囲からより完全に明らかになるだろう。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
詳細な説明
本開示は、概して、核、複数の核、細胞、複数の細胞、および／または組織内の分子を固有に標識化またはバーコード化する方法に関する。また、本開示は、核、複数の核、細胞、複数の細胞、および／または組織内の分子を固有に標識化またはバーコード化するためのキットに関する。標識化される分子としては、これらに限定されないが、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、ペプチド、および／または抗原を挙げることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】標識またはバーコードを形成するための核酸タグのライゲーションを示す図である。
【図２】ｉｎ  ｓｉｔｕ逆転写によるｃＤＮＡ形成の概略図である。パネルＡは、固定および透過処理されている細胞を示す。パネルＢは、ポリアデニル化転写物の逆転写を鋳型化する（template）ことができるポリ（Ｔ）プライマーの付加を示す。パネルＣは、実質的にあらゆる転写物の逆転写を鋳型化することができるランダム六量体の付加を示す。パネルＤは、転写物のサブセットのみを増幅することができるように特定の転写物を標的とするように設計されているプライマーの付加を示す。パネルＥは、逆転写後のパネルＡの細胞を示し、ｃＤＮＡがＲＮＡにハイブリダイズしていることが表されている。
【図３Ａ】ＲＮＡ断片に対する一本鎖アダプターの非鋳型ライゲーションを示す図である。
【図３Ｂ】ランダム六量体プライマーとの部分的な二重鎖を使用した、一本鎖アダプターのライゲーションを示す図である。
【図４】プライマー結合を示す図である。
【図５】プライマー結合後の逆転写を示す図である。
【図６】細胞タンパク質の標識化に使用されるＤＮＡタグ化抗体を示す図である。
【図７】細胞タンパク質の標識化に使用されるアプタマーを示す図である。
【図８】本開示の実施形態による、細胞の分割、タグ化、およびプール化の概略図である。図示されているように、細胞を複数の反応槽に分割することができる。図示されているプロセスを通るその経路を示すために１つの細胞が強調されている。
【図９Ａ】本開示の実施形態による例示的なワークフローを示す図である。
【図９Ｂ】本開示の別の実施形態による例示的なワークフローを示す図である。
【図１０】本開示の実施形態による逆転写プライマー（ＢＣ＿００５５）を示す図である。
【図１１】本開示の実施形態による、アニーリングされた第１ラウンドバーコードオリゴを示す図である。
【図１２】本開示の実施形態による、アニーリングされた第２ラウンドバーコードオリゴを示す図である。
【図１３】本開示の実施形態による、アニーリングされた第３ラウンドバーコードオリゴを示す図である。
【図１４】本開示の実施形態によるライゲーション停止オリゴを示す図である。
【図１５】本開示の実施形態による、ｃＤＮＡの３’末端にライゲーションした一本鎖ＤＮＡアダプターオリゴ（ＢＣ＿００４７）を示す図である。
【図１６】プライマーＢＣ＿００５１およびＢＣ＿００６２を使用して形成されたＰＣＲ産物、ならびにバーコード化ｃＤＮＡにライゲーションした後の３’アダプターオリゴ（ＢＣ＿００４７）を示す図である。
【図１７】フローセル結合配列とＴＲＵＳＥＱ（商標）ｒｅａｄ１プライマーの結合部位とを含むＢＣ＿００２７、およびフローセル結合配列とＴｒｕＳｅｑマルチプレックスリード２とインデックス結合配列とを含むＢＣ＿００６３を示す図である。図１７には、この実施形態ではＧＡＴＣＴＧである試料インデックスの領域も示されている。
【図１８】各固有バーコード組合せについて、ヒトゲノムにアラインしたリードの数（Ｘ軸）およびマウスゲノムにアラインしたリードの数（Ｙ軸）がプロットされている散布図である。
【図１９】タグメンテーション（tagmentation）の前および後のｃＤＮＡのサイズを示す図である。
【図２０】Ｐ２およびＰ１１マウスの脳および脊髄に由来する１５０，０００個よりも多くの核を、６００万通りよりも多くのバーコード組合せが使用された単一実験でプロファイルした実験を示す図である。４つの開始試料（Ｐ２脊髄、Ｐ２脳、Ｐ１１脊髄、またはＰ１１脊髄）のどれを各ウェルに添加したかを記録することにより、第１ラウンドバーコード配列を使用して、どの細胞／核がどの試料に由来したかを識別することができる。
【図２１】３ラウンドのバーコード化中の、各ウェルの核の数を示す図である。手作業で細胞をピペットしたにも関わらず、ほとんどのウェルは、ほぼ等しい数の核を含んでいる。Ｐ２脊髄の分離は、他の試料よりも少数の細胞をもたらした。これにより、対応する第１ラウンドのウェル内の核の数がより少ないことが説明される。
【図２２】乏枝神経膠細胞系統内のＰ２／Ｐ１１脳および脊髄単一核トランスクリプトームの分布を示す図である。各核試料（Ｐ２脊髄、Ｐ２脳、Ｐ１１脊髄、またはＰ１１脊髄）は、各細胞／核バーコード組合せに由来する第１ラウンドのバーコードを調査することにより決定することができる。
【図２３】本明細書で提供されるプロトコールの全体像を示す図である。
【図２４】本明細書で提供されるプロトコールの分子ダイヤグラムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
概して本明細書に記載されている実施形態は例示であることが容易に理解されるだろう。種々の実施形態の以下のより詳細な説明は、本開示の範囲を限定することは意図されておらず、種々の実施形態を代表するものであるに過ぎない。さらに、当業者であれば、本開示の範囲から逸脱せずに、本明細書で開示された方法のステップまたは動作の順序を変えることができる。言い換えれば、ステップまたは動作の特定の順序が実施形態の適切な作業に必要でない限り、特定のステップまたは動作の順序または使用は改変することができる。
【０００９】
用語「結合」は、２つまたはそれよりも多くの成分、実体、または物体を付着またはカップリングするための任意の形態を指すために、本開示の全体にわたって広く使用される。例えば、２つまたはそれよりも多くの成分は、化学結合、共有結合、イオン結合、水素結合、静電力、ワトソン−クリック型ハイブリダイゼーションなどにより互いに結合されてもよい。
【００１０】
本開示の１つの態様は、核酸を標識化する方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、第１の細胞にて核酸を標識化するステップを含んでいてもよい。本方法は、（ａ）５’突出配列を含む逆転写プライマーを使用してＲＮＡを逆転写することにより、第１の細胞を含む複数の細胞内で相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成するステップ；（ｂ）複数の細胞を（ｎ）個のアリコートに分割するステップ；（ｃ）複数の核酸タグをｎ個のアリコートの各々に提供するステップであって、所与のアリコートに提供される複数の核酸タグの各標識化配列は同じであり、ｎ個のアリコートの各々には異なる標識化配列が提供されるステップ；（ｄ）ｎ個のアリコートの各々のｃＤＮＡの少なくとも１つを核酸タグに結合させるステップ；（ｅ）ｎ個のアリコートを組み合わせるステップ；ならびに（ｆ）組み合わせたアリコートを用いて、ステップ（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）を繰り返すステップを含んでいてもよい。種々の実施形態では、複数の細胞は、真核細胞および原核細胞から選択することができる。種々の他の実施形態では、複数の細胞は、これらに限定されないが、哺乳動物細胞、酵母細胞、および／または細菌細胞の少なくとも１つから選択することができる。
【００１１】
ある特定の実施形態では、各核酸タグは、標識化配列の３’末端から伸長する３’ハイブリダイゼーション配列、および標識化配列の５’末端から伸長する５’ハイブリダイゼーション配列を含む第１の鎖を含んでいてもよい。また、各核酸タグは、突出配列を含む第２の鎖を含んでいてもよい。突出配列は、（ｉ）５’ハイブリダイゼーション配列および５’突出配列の少なくとも１つに相補的な第１の部分、ならびに（ｉｉ）３’ハイブリダイゼーション配列に相補的な第２の部分を含んでいてもよい。一部の実施形態では、核酸タグ（例えば、最終核酸タグ）は、これに限定されないが５’ビオチンなどの捕捉剤を含んでいてもよい。５’−ビオチンを含む核酸タグで標識化されたｃＤＮＡは、ｃＤＮＡに対するストレプトアビジンコーティング磁気ビーズの付着またはカップリングを可能または許容することができる。一部の他の実施形態では、複数のビーズを、バーコードの最終配列突出にハイブリダイズするように構成されている捕捉鎖（つまり、核酸配列）でコーティングしてもよい。さらなる一部の他の実施形態では、ｃＤＮＡを、市販のキット（例えば、ＲＮＥＡＳＹ（商標）キット）を使用することにより精製または単離してもよい。
【００１２】
種々の実施形態では、ステップ（ｆ）（つまり、ステップ（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ））は、第１の細胞のｃＤＮＡに対して固有の一連の標識化配列を生成するのに十分な回数だけ繰り返すことができる。別の様式で述べると、ステップ（ｆ）は、第１の細胞のｃＤＮＡが第１の固有の一連の標識化配列を有し、第２の細胞のｃＤＮＡが第２の固有の一連の標識化配列を有し、第３の細胞のｃＤＮＡが第３の固有の一連の標識化配列を有するなど、ある回数だけ繰り返してもよい。本開示の方法は、単一細胞に由来するｃＤＮＡ配列の固有バーコードによる標識を提供し、固有バーコードは、ｃＤＮＡが由来した細胞の識別または識別を支援することができる。言い換えれば、単一細胞に由来するｃＤＮＡの部分、大部分、または実質的にすべてが、同じバーコードを有していてもよく、そのバーコードは、試料中の１つまたは複数の他の細胞に由来する（例えば、第２の細胞、第３の細胞、第４の細胞などに由来する）ｃＤＮＡでは繰り返されていなくともよい。
【００１３】
一部の実施形態では、バーコード化ｃＤＮＡを一緒に混合し、配列決定して（例えば、ＮＧＳを使用して）、ＲＮＡ発現に関するデータを単一細胞レベルで収集することができる。例えば、本開示の方法のある特定の実施形態は、１つまたは複数の個々の細胞のトランスクリプトーム（所与の細胞のゲノムから転写される様々なＲＮＡ種）の評価、分析、または研究に有用であり得る。
【００１４】
上記で議論されているように、細胞のアリコートまたは群を異なる反応槽または容器へと分離してもよく、第１のセットの核酸タグを複数のｃＤＮＡ転写物に付加してもよい。槽または容器は、本明細書では、入れ物、試料、およびウェルとも呼ぶことができる。したがって、槽、容器、入れ物、試料、およびウェルという用語は、本明細書では同義的に使用することができる。その後、細胞のアリコートを再グループ化し、混合し、再び分離してもよく、第２のセットの核酸タグを第１のセットの核酸タグに付加してもよい。種々の実施形態では、同じ核酸タグを、単一のまたは所与のラウンドの標識化において１つよりも多くのアリコートの細胞に添加してもよい。しかしながら、分離、タグ化、および再プールのラウンドを繰り返した後、各細胞のｃＤＮＡは、バーコードを形成する核酸タグの固有の組合せまたは配列に結合することができる。一部の実施形態では、単一試料中の細胞を、ある個数の異なる反応槽へと分離してもよい。例えば、反応槽の個数としては、４つの１．５ｍｌ微量遠心チューブ、９６ウェルプレートの複数のウェル、または別の好適な個数およびタイプの反応槽が挙げられる。
【００１５】
ある特定の実施形態では、ステップ（ｆ）（つまり、ステップ（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ））は、ある回数だけ繰り返してもよく、ある回数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００などから選択される。ある特定の他の実施形態では、ステップ（ｆ）は、各細胞のｃＤＮＡが固有バーコードに結合している可能性が高くなると考えられる十分な回数だけ繰り返してもよい。この回数は、５０％よりも高い可能性、９０％よりも高い可能性で、９５％よりも高い可能性で、９９％よりも高い可能性で、または幾つかの他の確率で、各細胞のｃＤＮＡが固有バーコードに結合することを提供するように選択することができる。さらなる他の実施形態では、ステップ（ｆ）は、幾つかの他の適切な回数だけ繰り返してもよい。
【００１６】
一部の実施形態では、第１の細胞の核酸を標識化する方法は、ステップ（ａ）の前に複数の細胞を固定するステップを含んでいてもよい。例えば、細胞の成分を、成分が適所に固定化または保持されるように固定または架橋してもよい。複数の細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のホルムアルデヒドを使用して固定してもよい。例えば、複数の細胞を、ＰＢＳ中約１〜４％ホルムアルデヒドで固定してもよい。種々の実施形態では、複数の細胞を、約−２０℃または約２５℃にてメタノール（例えば、１００％メタノール）を使用して固定してもよい。種々の他の実施形態では、複数の細胞を、約−２０℃〜約２５℃にてメタノール（例えば、１００％メタノール）を使用して固定してもよい。さらなる種々の他の実施形態では、複数の細胞を、約−２０℃または室温にてエタノール（例えば、約７０〜１００％エタノール）を使用して固定してもよい。さらなる種々の他の実施形態では、複数の細胞を、約−２０℃〜室温にてエタノール（例えば、約７０〜１００％エタノール）を使用して固定してもよい。また種々の他の実施形態では、複数の細胞を、例えば約−２０℃にて酢酸を使用して固定してもよい。また種々の他の実施形態では、複数の細胞を、例えば約−２０℃にてアセトンを使用して固定してもよい。複数の細胞を固定するための他の好適な方法も、本開示の範囲内にある。
【００１７】
ある特定の実施形態では、第１の細胞の核酸を標識化する方法は、ステップ（ａ）の前に複数の細胞を透過処理するステップを含んでいてもよい。例えば、複数の細胞の外膜に穴または開口部を形成してもよい。ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００を、複数の細胞に添加し、続いて任意選択でＨＣｌを添加して、１つまたは複数の穴を形成してもよい。約０．２％のＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００を複数の細胞に添加し、例えば続いて約０．１ＮのＨＣｌを添加してもよい。ある特定の他の実施形態では、エタノール（例えば、約７０％エタノール）、メタノール（例えば、約１００％メタノール）、Ｔｗｅｅｎ２０（例えば、約０．２％のＴｗｅｅｎ２０）、および／またはＮＰ−４０（例えば、約０．１％のＮＰ−４０）を使用して、複数の細胞を透過処理してもよい。種々の実施形態では、第１の細胞の核酸を標識化する方法は、ステップ（ａ）の前に複数の細胞を固定および透過処理するステップを含んでいてもよい。
【００１８】
一部の実施形態では、細胞は、接着細胞（例えば、接着哺乳動物細胞）であってもよい。固定、透過処理、および／または逆転写は、接着細胞に対して（例えば、プレートに接着した細胞に対して）実行または実施してもよい。例えば、接着細胞を固定し、透過処理し、および／または逆転写を行い、続いてトリプシン処理して細胞を表面から剥離してもよい。あるいは、接着細胞は、分離および／またはタグ化ステップ前に剥離してもよい。一部の他の実施形態では、接着細胞は、固定および／または透過処理ステップ前にトリプシン処理してもよい。
【００１９】
一部の実施形態では、第１の細胞の核酸を標識化する方法は、ｃＤＮＡに結合している核酸タグの少なくとも２つをライゲーションするステップを含んでいてもよい。ライゲーションは、溶解および／またはｃＤＮＡ精製ステップ前にまたは後で実施してもよい。ライゲーションは、個々のタグが、ｃＤＮＡ配列の３’末端に結合している連続したまたは実質的に連続したバーコード配列へと形成されるように、核酸タグの５’リン酸配列を、隣接する鎖または核酸タグの３’末端に共有結合で連結することを含んでいてもよい。種々の実施形態では、「ニック入り」二本鎖コンフォメーションにて核酸タグを隣接する核酸と共に保持するように構成されている追加のリンカー鎖と共に、二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼを使用してもよい。その後、二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼを使用して、「ニック」を埋めてもよい。種々の他の実施形態では、追加のリンカーを用いずに、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼを使用してもよい。ある特定の実施形態では、ライゲーションは、複数の細胞内で実施してもよい。
【００２０】
図１には、複数の核酸タグをライゲーションして、実質的に連続した標識またはバーコードを形成することが示されている。例えば、複数の核酸タグを添加すると、各ｃＤＮＡ転写物は、一連の核酸タグに結合または連結され得る。リガーゼを使用することにより、核酸タグの部分をライゲーションするかまたは共有結合で連結して、ｃＤＮＡ転写物に結合または付着している実質的に連続した標識またはバーコードを形成することができる。
【００２１】
ある特定の他の実施形態では、本方法は、例えばステップ（ｆ）の後で、複数の細胞を溶解（つまり、細胞構造を分解する）して、複数の細胞内からｃＤＮＡを放出させるステップを含んでいてもよい。一部の実施形態では、複数の細胞は、溶解溶液（例えば、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．９）、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、２．２％  ＳＤＳ、０．５ｍｇ／ｍｌ  ＡＮＴＩ−ＲＮａｓｅ（タンパク質リボヌクレアーゼ阻害剤；ＡＭＢＩＯＮ（登録商標））、および１０００ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（ＡＭＢＩＯＮ（登録商標）））中で、例えば約５５℃にて約１〜３時間にわたって振盪しながら（例えば激しく振盪しながら）溶解してもよい。一部の他の実施形態では、複数の細胞は、超音波処理により、および／または１８〜２５ゲージ注射針を少なくとも１回通過させることにより溶解してもよい。さらに一部の他の実施形態では、複数の細胞は、約７０〜９０℃に加熱することにより溶解してもよい。例えば、複数の細胞は、約１時間またはそれよりも長時間にわたって、約７０〜９０℃に加熱することにより溶解してもよい。その後、ｃＤＮＡを溶解細胞から単離してもよい。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ  ＨをｃＤＮＡに添加して、ＲＮＡを除去してもよい。本方法は、放出されたｃＤＮＡに結合している核酸タグの少なくとも２つをライゲーションするステップをさらに含んでいてもよい。一部の他の実施形態では、第１の細胞の核酸を標識化する方法は、ｃＤＮＡに結合している核酸タグの少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０個などをライゲーションするステップを含んでいてもよい。
【００２２】
種々の実施形態では、第１の細胞の核酸を標識化する方法は、１つまたは複数の未結合核酸タグを除去するステップ（例えば、複数の細胞を洗浄するステップ）を含んでいてもよい。例えば、本方法は、未結合核酸タグの部分、大部分、または実質的にすべてを除去するステップを含んでいてもよい。未結合核酸タグは、本開示の方法のさらなるラウンドが、所与の方法の以前のラウンドに由来する１つまたは複数の未結合核酸タグで夾雑されないように除去してもよい。一部の実施形態では、未結合核酸タグは、遠心分離により除去してもよい。例えば、細胞のペレットが遠心分離チューブの底に形成されるように、複数の細胞を遠心分離することができる。遠心分離した細胞から上清（つまり、未結合核酸タグを含む液体）を除去することができる。その後、細胞を、緩衝液（例えば、未結合核酸タグを含まないかまたは実質的に含まない新たな緩衝液）に再懸濁してもよい。別の例では、複数の細胞を、細胞膜または核膜に結合するように構成されている抗体でコーティングされている磁気ビーズにカップリングまたは連結してもよい。その後、磁石を使用して複数の細胞を反応槽の１つの側面に引き付けて、複数の細胞をペレットにすることができる。一部の他の実施形態では、複数の細胞を細胞ストレーナー（例えば、ＰＬＵＲＩＳＴＲＡＩＮＥＲ（登録商標）細胞ストレーナー）に入れ、洗浄緩衝液で洗浄してもよい。例えば、複数の細胞を細胞ストレーナーに残してもよく、洗浄緩衝液は細胞ストレーナーを通り抜ける。洗浄緩衝液は、界面活性剤、デタージェント、および／または約５〜６０％ホルムアミドを含んでいてもよい。
【００２３】
上記で議論されているように、複数の細胞を再プールしてもよく、本方法を任意の回数だけ繰り返し、より多くのタグをｃＤＮＡに付加して、バーコードとして作用することができる１セットの核酸タグを生成することができる。さらに多くのラウンドを付加すると共に、細胞が取り得る経路の数が増加し、結果的に、生成することができる考え得るバーコードの数も増加する。十分なラウンドおよび分割を行えば、考え得るバーコードの数は、細胞の数よりはるかに多くなり、各細胞が固有バーコードを有する可能性が高くなる。例えば、９６ウェルプレートで分割を行う場合、４回の分割後には、９６４＝８４，９３４，６５６個の考え得るバーコードが存在することになる。
【００２４】
一部の実施形態では、逆転写プライマーは、細胞中のＲＮＡをすべてまたは実質的にすべて逆転写するように構成されていてもよい（例えば、５’突出を有するランダム六量体）。一部の他の実施形態では、逆転写プライマーは、ポリ（Ａ）尾部を有するＲＮＡを逆転写するように構成されていてもよい（例えば、５’突出を有するｄＴ（１５）プライマーなどのポリ（ｄＴ）プライマー）。さらに一部の他の実施形態では、逆転写プライマーは、所定のＲＮＡを逆転写するように構成されていてもよい（例えば、転写物特異的プライマー）。例えば、逆転写プライマーは、プロファイルすることができる１細胞当たりの転写物はより少数であり得るが、転写物の各々をより多数の細胞にわたってプロファイルすることができるように、特定の転写物をバーコード化するように構成されていてもよい。
【００２５】
図２は、ｉｎ  ｓｉｔｕ逆転写によるｃＤＮＡの形成を示す。パネルＡは、固定および透過処理されている細胞を示す。パネルＢは、上記で議論されているように、ポリアデニル化転写物の逆転写を鋳型化することができるポリ（Ｔ）プライマーの付加を示す。パネルＣは、上記で議論されているように、実質的にあらゆる転写物の逆転写を鋳型化することができるランダム六量体の付加を示す。パネルＤは、上記で議論されているように、転写物のサブセットのみが増幅され得るように特定の転写物を標的とするように設計されているプライマーの付加を示す。パネルＥは、逆転写後のパネルＡの細胞を示し、ｃＤＮＡがＲＮＡにハイブリダイズされていることが表されている。
【００２６】
逆転写は、複数の細胞に対して実行または実施してもよい。ある特定の実施形態では、逆転写は、固定および／または透過処理した複数の細胞に対して実行してもよい。一部の実施形態では、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素の変異体を逆転写に使用してもよい。逆転写のあらゆる好適な方法が本開示の範囲内にある。例えば、逆転写ミックスは、５’突出を含む逆転写プライマーを含んでいてもよく、逆転写プライマーは、逆転写を開始するようにおよび／または核酸タグに対する結合配列として作用するように構成されていてもよい。一部の他の実施形態では、ＲＮＡに結合するようにおよび／または逆転写を開始するように構成されている逆転写プライマーの部分は、以下のもの：ヌクレオチドのランダム六量体、七量体（septamer）、八量体（octomer）、九量体、十量体、ポリ（Ｔ）伸張、および／または１つもしくは複数の遺伝子特異的プライマーの１つまたは複数を含んでいてもよい。
【００２７】
本開示の別の態様は、細胞内または複数の細胞内の分子を固有に標識化する方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、（ａ）アダプター配列またはユニバーサルアダプターを、複数の細胞内の分子に結合させるステップ；（ｂ）複数の細胞を少なくとも２つの一次アリコートに分割するステップであって、少なくとも２つの一次アリコートは、少なくとも第１の一次アリコートおよび第２の一次アリコートを含むステップ；（ｃ）一次核酸タグを少なくとも２つの一次アリコートに提供するステップであって、第１の一次アリコートに提供された一次核酸タグは、第２の一次アリコートに提供された一次核酸タグとは異なるステップ；（ｄ）少なくとも２つの一次アリコートの各々の内のアダプター配列を、提供された一次核酸タグに結合させるステップ；（ｅ）少なくとも２つの一次アリコートを組み合わせるステップ；（ｆ）組み合わせた一次アリコートを少なくとも２つの二次アリコートに分割するステップであって、少なくとも２つの二次アリコートは、少なくとも第１の二次アリコートおよび第２の二次アリコートを含むステップ；（ｇ）二次核酸タグを少なくとも２つの二次アリコートに提供するステップであって、第１の二次アリコートに提供された二次核酸タグは、第２の二次アリコートに提供された二次核酸タグとは異なるステップ；ならびに（ｈ）少なくとも２つの二次アリコートの各々の内の分子を、提供された二次核酸タグに結合させるステップを含んでいてもよい。
【００２８】
ある特定の実施形態では、本方法は、ステップ（ｉ）、つまりその後のアリコートを用いてステップ（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、および（ｈ）を繰り返すステップをさらに含んでいてもよい。ステップ（ｉ）は、単一細胞の分子に対して固有の一連の核酸タグを生成するのに十分な回数だけ繰り返すことができる。種々の実施形態では、回数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００などから選択することができる。ある特定の他の実施形態では、ステップ（ｉ）は、別の好適な回数だけ繰り返すことができる。
【００２９】
一部の実施形態では、分子は、細胞内または複数の細胞内に配置されていてもよい。一部の他の実施形態では、分子は、細胞または複数の細胞にカップリングされていてもよい。例えば、分子は細胞表面分子であってもよい。さらに一部の他の実施形態では、分子は、細胞内または複数の細胞内に配置されていてもよくおよび／または細胞または複数の細胞にカップリングされていてもよい。
【００３０】
上記で議論されているように、本方法は、ステップ（ａ）の前に、複数の細胞を固定および／または透過処理するステップを含んでいてもよい。種々の実施形態では、核酸タグの各々は、第１の鎖を含んでいてもよい。第１の鎖は、３’末端および５’末端を含むバーコード配列を含んでいてもよい。第１の鎖は、バーコード配列の３’末端および５’末端にそれぞれ隣接する３’ハイブリダイゼーション配列および５’ハイブリダイゼーション配列をさらに含んでいてもよい。一部の実施形態では、核酸タグの各々は、第２の鎖を含んでいてもよい。第２の鎖は、５’ハイブリダイゼーション配列およびアダプター配列の少なくとも１つに相補的な第１の部分、ならびに３’ハイブリダイゼーション配列に相補的な第２の部分を含んでいてもよい。
【００３１】
ある特定の実施形態では、分子は巨大分子である。種々の実施形態では、分子は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、ペプチド、および／または抗原の少なくとも１つから選択される。
【００３２】
一部の実施形態では、分子はＲＮＡであり、アダプター配列は一本鎖であってもよい。さらに、ステップ（ａ）は、一本鎖アダプター配列の５’末端をＲＮＡの３’末端にライゲーションすることおよび／または一本鎖アダプター配列の３’末端をＲＮＡの５’末端にライゲーションすることの１つを含んでいてもよい。一部の他の実施形態では、分子はＲＮＡであり、ステップ（ａ）は、アダプター配列をＲＮＡにハイブリダイズさせるステップを含んでいてもよい。
【００３３】
アダプター配列をＲＮＡに結合またはカップリングすることに関する方法は、例えば、ＲＮＡトランスクリプトーム配列決定、リボソームプロファイリング、小分子ＲＮＡ配列決定、非コードＲＮＡ配列決定、および／またはＲＮＡ構造プロファイリングに使用することができる。一部の実施形態では、複数の細胞を、固定および／または透過処理してもよい。一本鎖アダプター配列の５’末端を、ＲＮＡの３’末端にライゲーションさせてもよい（図３Ａおよび３Ｂを参照）。ある特定の実施形態では、ライゲーションは、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１により実行または実施してもよい。ある特定の他の実施形態では、ライゲーションは、５’リン酸を含む一本鎖アダプター配列を用いてＴ４  ＲＮＡリガーゼ１により実行してもよい。種々の実施形態では、ライゲーションは、ＴＨＥＲＭＯＳＴＡＢＬＥ  ５’ＡＰＰＤＮＡ／ＲＮＡ  ＬＩＧＡＳＥ（商標）（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢＳ（登録商標））により実行してもよい。種々の他の実施形態では、ライゲーションは、５’プレアデニル化一本鎖アダプター配列を用いて、ＴＨＥＲＭＯＳＴＡＢＬＥ  ５’ＡＰＰＤＮＡ／ＲＮＡ  ＬＩＧＡＳＥ（商標）により実行してもよい。他の好適なリガーゼおよびアダプター配列も本開示の範囲内である。
【００３４】
一部の実施形態では、例えばワトソン−クリック型塩基対合によるハイブリダイゼーションを使用して、ＲＮＡをアダプター配列で標識化することができる（図４を参照）。アダプター配列は、上記で議論されているように、標識化ステップおよび／または細胞溶解の後に、逆転写を開始してｃＤＮＡを形成または生成するように構成されていてもよい（図５を参照）。
【００３５】
一本鎖アダプター配列の３’末端を、ＲＮＡの５’末端にライゲーションしてもよい。ある特定の実施形態では、ライゲーションは、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１により実行または実施してもよい。ある特定の他の実施形態では、ライゲーションは、５’リン酸を含むＲＮＡを用いてＴ４  ＲＮＡリガーゼ１により実行してもよい。種々の実施形態では、ライゲーションは、ＴＨＥＲＭＯＳＴＡＢＬＥ  ５’ＡＰＰＤＮＡ／ＲＮＡ  ＬＩＧＡＳＥ（商標）（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢＳ（登録商標））により実行してもよい。種々の他の実施形態では、ライゲーションは、５’プレアデニル化ＲＮＡを用いて、ＴＨＥＲＭＯＳＴＡＢＬＥ  ５’ＡＰＰＤＮＡ／ＲＮＡ  ＬＩＧＡＳＥ（商標）により実行してもよい。上記で述べられているように、他の好適なリガーゼおよびアダプター配列も本開示の範囲内である。
【００３６】
一部の実施形態では、分子はｃＤＮＡであってもよい。アダプター配列をｃＤＮＡに結合またはカップリングすることに関する方法は、例えばＲＮＡトランスクリプトーム配列決定に使用することができる。ある特定の実施形態では、複数の細胞を、固定および／または透過処理してもよい。逆転写は、５’末端にアダプター配列を含むプライマーを用いて、複数の固定および／または透過処理細胞に対して実施してもよい。上記で議論されているように、プライマーの３’末端は、遺伝子特異的なランダム六量体であってもよく、またはポリ（Ｔ）配列であってもよい。得られたｃＤＮＡは、その５’末端にアダプター配列を含んでいてもよい（図５を参照）。
【００３７】
一部の実施形態では、分子がＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）である場合、本方法は、ステップ（ａ）の前に、制限酵素でＤＮＡを消化するステップをさらに含んでいてもよい。さらに、ステップ（ａ）は、消化したＤＮＡにアダプター配列をライゲーションするステップを含んでいてもよい。
【００３８】
アダプター配列をＤＮＡに結合またはカップリングすることに関する方法は、例えば、全ゲノム配列決定、標的ゲノム配列決定、ＤＮａｓｅ−Ｓｅｑ、ＣｈＩＰ配列決定、および／またはＡＴＡＣ−ｓｅｑに使用することができる。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の制限酵素を使用してＤＮＡを消化し、平滑末端断片および／または突出配列を有する断片の少なくとも１つにしてもよい。一方の末端が突き出ている、一本鎖ユニバーサルアダプターまたはアダプター配列との部分的二本鎖配列を、消化したゲノムＤＮＡにライゲーションしてもよい。例えば、突出を有する、一本鎖アダプター配列との部分的二本鎖配列であって、突出は１つまたは複数の制限酵素により生成される突出と適合性である部分的二本鎖配列を、消化したゲノムＤＮＡにライゲーションしてもよい。
【００３９】
種々の実施形態では、Ｔｎ５トランスポサーゼを使用してアダプター配列をゲノムＤＮＡに組み込む（例えば、直接的に組み込む）ことができ、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を添加することによりトランスポサーゼを放出させて、アダプター配列を露出させることができる。アダプター配列をゲノムＤＮＡに組み込むための他のトランスポサーゼおよび方法も本開示の範囲内にある。
【００４０】
ある特定の実施形態では、分子は、タンパク質、ペプチド、および／または抗原であり、アダプター配列は、抗体にカップリングされている固有識別子配列（例えば、核酸を含む）に結合することができる。固有識別子配列は、固有識別子配列が結合している抗体を固有に識別するように構成されていてもよい。さらに、ステップ（ａ）は、アダプター配列および固有識別子配列の各々を含む抗体を、タンパク質、ペプチド、および／または抗原に結合させるステップを含んでいてもよい。ある特定の他の実施形態では、分子は、タンパク質、ペプチド、および／または抗原であり、アダプター配列は、アプタマーに組み込まれていてもよい。さらに、ステップ（ａ）は、アプタマーを、タンパク質、ペプチド、および／または抗原に結合させるステップを含んでいてもよい。
【００４１】
アダプター配列をタンパク質、ペプチド、および／または抗原に結合またはカップリングすることに関する方法は、例えば、タンパク質定量化、ペプチド定量化、および／または抗原定量化に使用することができる。種々の実施形態では、アダプター配列を抗体に付着させる（例えば、化学的に付着させる）ことができる。例えば、アダプター配列は、ＤＮＡ−タンパク質結合を媒介するための当業者に公知の化学を使用して抗体に付着させることができる。異なるタンパク質に対する抗体を、アダプター配列に加えて固有識別子配列を含む核酸配列または核酸鎖で標識化することができる。その後、抗体または１セットの抗体を、固定および／または透過処理細胞または組織のタンパク質または１セットのタンパク質を標識化する免疫染色実験に使用してもよい（図６を参照）。続いて、細胞を、本明細書で開示された標識化またはバーコード化手順にかけてもよい。
【００４２】
一部の実施形態では、抗体に付着または結合している核酸配列（例えば、ＤＮＡ分子）を、抗体および／またはアダプター配列から放出させることができる。配列決定反応により、所与のタンパク質に関連付けられる固有識別子配列ならびに１つまたは複数の固有細胞に関連付けられる標識またはバーコードを明らかにすることができる。ある特定の実施形態では、そのような方法は、１つまたは複数の細胞に存在するタンパク質の数および／またはタイプを明らかにするかまたは識別することができる。
【００４３】
種々の実施形態では、上記に記載のような核酸修飾（またはＤＮＡ修飾）抗体の代わりにまたは加えて、ＤＮＡアプタマーおよび／またはＲＮＡアプタマーを使用することができる（図７を参照）。アダプター配列（および標的タンパク質特異的抗体）を、所与のアプタマーの配列に組み込む（例えば、直接的に組み込む）ことができる。
【００４４】
本開示の別の態様は、細胞内の核酸をバーコード化する方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、細胞内の核酸をバーコード化する方法であって、（ａ）５’突出配列を含む逆転写プライマーを使用してＲＮＡを逆転写することにより、複数の細胞内でｃＤＮＡを生成するステップ；（ｂ）複数の細胞を少なくとも２つのアリコートに分割するステップ；（ｃ）複数の核酸タグを少なくとも２つのアリコートの各々に提供するステップであって、所与のアリコートに導入された複数の核酸タグの各バーコード配列は同じであり、各アリコートには異なるバーコード配列が導入されるステップ；（ｄ）少なくとも２つのアリコートの各々のｃＤＮＡの少なくとも１つを核酸タグに結合させるステップ；（ｅ）少なくとも２つのアリコートを組み合わせるステップ；ならびに（ｆ）組み合わせたアリコートを用いて、ステップ（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）を少なくとも１回繰り返すステップを含んでいてもよい。
【００４５】
ある特定の実施形態では、各核酸タグは、バーコード配列の３’末端から伸長する３’ハイブリダイゼーション配列、およびバーコード配列の５’末端から伸長する５’ハイブリダイゼーション配列を含む第１の鎖を含んでいてもよい。また、各核酸タグは、突出配列を含む第２の鎖を含んでいてもよく、突出配列は、（ｉ）５’ハイブリダイゼーション配列および５’突出配列の少なくとも１つに相補的な第１の部分、ならびに（ｉｉ）３’ハイブリダイゼーション配列に相補的な第２の部分を含む。
【００４６】
図８は、本開示の実施形態による、細胞の分割、タグ化、およびプール化を示す。逆転写した細胞を、反応槽またはウェルに分割してもよい。図８には、４つのウェルが示されている。しかしながら、上記で議論されているように、任意の好適な数の反応槽またはウェルを使用することができる。このプロセスを通るその経路を示すために１つの細胞が強調されている。図示されているように、強調されている細胞は、まずウェル「ａ」に入り、そこにはすべてのｃＤＮＡ転写物の突出にハイブリダイズする第１のタグが付加される（四角枠内に示されている）。このタグは、細胞が入っていたウェルを識別する固有バーコード領域「ａ」を保持する。ハイブリダイゼーション後、細胞をすべて洗浄して過剰なタグを除去し、再グループ化し、その後同数のウェルに再分配する。その後、強調されている細胞は、ウェル「ｃ」に入り、細胞が入っていたウェルを識別するための第２のタグが付加される。第２ラウンドの後、細胞は、４２＝１６通りの考え得る経路のチューブを経ることが考えられる。このプロセスを繰り返して、より多くのタグをｃＤＮＡ転写物に付加し、細胞が経ることができる考え得る経路の数を増加させることができる。図９Ａおよび９Ｂは、本開示の実施形態による２つの例示的なワークフローを示す。
【００４７】
本開示の別の態様は、少なくとも第１の細胞内の核酸を標識化するためのキットに関する。一部の実施形態では、キットは、５’突出配列を含む少なくとも１つの逆転写プライマーを含んでいてもよい。また、キットは、複数の第１の核酸タグを含んでいてもよい。各第１の核酸タグは、第１の鎖を含んでいてもよい。第１の鎖は、第１の標識化配列の３’末端から伸長する３’ハイブリダイゼーション配列、および第１の標識化配列の５’末端から伸長する５’ハイブリダイゼーション配列を含んでいてもよい。各第１の核酸タグは、第２の鎖をさらに含んでいてもよい。第２の鎖は、突出配列を含んでいてもよく、突出配列は、（ｉ）逆転写プライマーの５’ハイブリダイゼーション配列および５’突出配列の少なくとも１つに相補的な第１の部分、ならびに（ｉｉ）３’ハイブリダイゼーション配列に相補的な第２の部分を含んでいてもよい。
【００４８】
キットは、複数の第２の核酸タグをさらに含んでいてもよい。各第２の核酸タグは、第１の鎖を含んでいてもよい。第１の鎖は、第２の標識化配列の３’末端から伸長する３’ハイブリダイゼーション配列、および第２の標識化配列の５’末端から伸長する５’ハイブリダイゼーション配列を含んでいてもよい。各第２の核酸タグは、第２の鎖をさらに含んでいてもよい。第２の鎖は、突出配列を含んでいてもよく、突出配列は、（ｉ）逆転写プライマーの５’ハイブリダイゼーション配列および５’突出配列の少なくとも１つに相補的な第１の部分、ならびに（ｉｉ）３’ハイブリダイゼーション配列に相補的な第２の部分を含んでいてもよい。一部の実施形態では、第１の標識化配列は、第２の標識化配列と異なっていてもよい。
【００４９】
また、一部の実施形態では、キットは、１つまたは複数の追加の複数の核酸タグを含んでいてもよい。１つまたは複数の追加の複数の核酸タグの各核酸タグは、第１の鎖を含んでいてもよい。第１の鎖は、標識化配列の３’末端から伸長する３’ハイブリダイゼーション配列、および標識化配列の５’末端から伸長する５’ハイブリダイゼーション配列を含んでいてもよい。また、１つまたは複数の追加の複数の核酸タグの各核酸タグは、第２の鎖を含んでいてもよい。第２の鎖は、突出配列を含んでいてもよく、突出配列は、（ｉ）逆転写プライマーの５’ハイブリダイゼーション配列および５’突出配列の少なくとも１つに相補的な第１の部分、ならびに（ｉｉ）３’ハイブリダイゼーション配列に相補的な第２の部分を含む。一部の実施形態では、標識化配列は、各所与の追加の複数の核酸タグが異なっていてもよい。
【００５０】
種々の実施形態では、キットは、逆転写酵素、固定剤、透過処理剤、ライゲーション剤、および／または溶解剤の少なくとも１つをさらに含んでいてよい。
【００５１】
本開示の別の態様は、少なくとも第１の細胞内の分子を標識化するためのキットに関する。例えば、上記で開示されたキットは、少なくとも第１の細胞内のＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、ペプチド、または抗原の１つまたは複数を標識化するように適合されていてもよい。
【００５２】
本開示の別の態様は、複数の細胞内のＲＮＡ分子を固有に標識化する方法に関する。本方法は、（ａ）ステップ（ｂ）の前に第１の複数の細胞を固定および透過処理するステップであって、第１の複数の細胞は、約８℃未満で固定および透過処理されるステップ；（ｂ）第１の複数の細胞内でＲＮＡ分子を逆転写して、第１の複数の細胞内で相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子を形成するステップであって、ＲＮＡ分子を逆転写するステップは、プライマーをＲＮＡ分子にカップリングするステップを含み、プライマーは、ポリ（Ｔ）配列またはランダム配列の少なくとも１つを含むステップ；（ｃ）ｃＤＮＡ分子を含む第１の複数の細胞を少なくとも２つの一次アリコートに分割するステップであって、少なくとも２つの一次アリコートは、第１の一次アリコートおよび第２の一次アリコートを含むステップ；（ｄ）一次核酸タグを少なくとも２つの一次アリコートに提供するステップであって、第１の一次アリコートに提供された一次核酸タグは、第２の一次アリコートに提供された一次核酸タグとは異なるステップ；（ｅ）少なくとも２つの一次アリコートの各々の内のｃＤＮＡ分子を、提供された一次核酸タグとカップリングするステップ；（ｆ）少なくとも２つの一次アリコートを組み合わせるステップ；（ｇ）組み合わせた一次アリコートを少なくとも２つの二次アリコートに分割するステップであって、少なくとも２つの二次アリコートは、第１の二次アリコートおよび第２の二次アリコートを含むステップ；（ｈ）二次核酸タグを少なくとも２つの二次アリコートに提供するステップであって、第１の二次アリコートに提供された二次核酸タグは、第２の二次アリコートに提供された二次核酸タグとは異なるステップ；（ｉ）少なくとも２つの二次アリコートの各々の内のｃＤＮＡ分子を、提供された二次核酸タグとカップリングするステップ；（ｊ）その後のアリコートを用いて、ステップ（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、および（ｉ）を繰り返すステップであって、最終核酸タグは捕捉剤を含むステップ；（ｋ）最終アリコートを組み合わせるステップ；（ｌ）第１の複数の細胞を溶解して、第１の複数の細胞内からｃＤＮＡ分子を放出させて、ライセートを形成するステップ；ならびに／または（ｍ）プロテアーゼ阻害剤および／または結合剤をライセートに添加し、ｃＤＮＡ分子が結合剤に結合するようにするステップを含んでいてもよい。
【００５３】
本方法は、組み合わせた最終アリコートを少なくとも２つの最終アリコートにさらに分割するステップを含み、少なくとも２つの最終アリコートは、第１の最終アリコートおよび第２の最終アリコートを含む。一部の実施形態では、第１の複数の細胞は、約８℃未満で、約７℃未満で、約６℃未満で、約５℃未満で、約４℃で、約４℃未満で、約３℃未満で、約２℃未満で、約１℃未満で、または別の好適な温度で、固定および透過処理してもよい。ある特定の実施形態では、本方法は、細胞を分配するステップを含んでいてもよい。例えば、最後のまたは最終ラウンドのバーコード化（ライゲーションによる）後、細胞をプールしてから溶解してもよく、その後細胞を異なるライセートアリコートに分配してもよい。各ライセートアリコートは、所定数の細胞を含んでいてもよい。
【００５４】
例えば、ステップ（ｍ）を参照すると、プロテアーゼ阻害剤は、フッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ）、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）、それらの組合せ、および／または別の好適なプロテアーゼ阻害剤を含んでいてもよい。例えば、ステップ（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）、および／または（ｍ）を参照すると、捕捉剤は、ビオチンまたは別の好適な捕捉剤を含んでいてもよい。さらに、結合剤は、アビジン（例えば、ストレプトアビジン）または別の好適な結合剤を含んでいてもよい。
【００５５】
ある特定の実施形態では、複数の細胞内のＲＮＡ分子を固有に標識化する方法は（例えば、ステップ（ｍ）の後に）、（ｎ）テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドを使用して、結合剤に結合しているｃＤＮＡ分子のテンプレートスイッチを実行するステップ；（ｏ）ｃＤＮＡ分子を増幅して、増幅ｃＤＮＡ分子溶液を形成するステップ；および／または（ｐ）固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）ビーズ溶液を、増幅ｃＤＮＡ分子溶液に導入して、約２００塩基対未満の、約１７５塩基対未満の、または約１５０塩基対未満のポリヌクレオチドを除去するステップ（ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ，ＭＭら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９５年）２３巻（２２号）：４７４２頁を参照）をさらに含んでいてもよい。言い換えれば、ｃＤＮＡ分子を、ライセート内でストレプトアビジンビーズに結合させてもよい。ビーズに付着したｃＤＮＡ分子のテンプレートスイッチングを実施してもよい（例えば、ｃＤＮＡ分子の３’末端にアダプターを付加するために）。その後、ｃＤＮＡ分子のＰＣＲ増幅を実施し、続いてＳＰＲＩビーズを添加して、約２００塩基対未満のポリヌクレオチドを除去することができる。ＳＰＲＩビーズ溶液対増幅ｃＤＮＡ分子溶液の比は、約０．９：１〜約０．７：１、約０．８７５：１〜約０．７７５：１、約０．８５：１〜約０．７５：１、約０．８２５：１〜約０．７２５：１、約０．８：１、または別の好適な比であってもよい。さらに、ＳＰＲＩビーズ溶液は、約１Ｍ〜４ＭのＮａＣｌ、約２Ｍ〜３ＭのＮａＣｌ、約２．２５Ｍ〜２．７５ＭのＮａＣｌ、約２．５ＭのＮａＣｌ、または別の好適な量のＮａＣｌを含んでいてもよい。また、ＳＰＲＩビーズ溶液は、約１５ｗ／ｖ％〜２５ｗ／ｖ％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含んでいてもよく、ＰＥＧの分子量は、約７，０００ｇ／ｍｏｌ〜９，０００ｇ／ｍｏｌ（ＰＥＧ８０００）である。種々の実施形態では、ＳＰＲＩビーズ溶液は、約１７ｗ／ｖ％〜２３ｗ／ｖ％のＰＥＧ８０００、約１８ｗ／ｖ％〜２２ｗ／ｖ％のＰＥＧ８０００、約１９ｗ／ｖ％〜２１ｗ／ｖ％のＰＥＧ８０００、約２０ｗ／ｖ％のＰＥＧ８０００、または別の好適なｗ／ｖ％のＰＥＧ８０００を含んでいてもよい。
【００５６】
複数の細胞内のＲＮＡ分子を固有に標識化する方法は、放出されたｃＤＮＡ分子の３’末端に共通アダプター配列を付加するステップをさらに含んでいてもよい。共通アダプター配列は、ｃＤＮＡ分子の各々について（つまり、所与の実験内で）同じであるかまたは実質的に同じであるアダプター配列であってもよい。共通アダプターの付加は、約１０ｗ／ｖ％までのＰＥＧを含む溶液中で実行または実施してもよく、ＰＥＧの分子量は、約７，０００ｇ／ｍｏｌ〜９，０００ｇ／ｍｏｌである。ある特定の実施形態では、共通アダプター配列は、テンプレートスイッチングを行うことにより、放出されたｃＤＮＡ分子の３’末端に付加することができる（Ｐｉｃｅｌｌｉ，Ｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０巻、１０９６〜１０９８頁（２０１３年）を参照）。
【００５７】
ステップ（ｊ）は、単一細胞の核酸に対して固有の一連の核酸タグを生成するのに十分な回数だけ繰り返すことができる。例えば、回数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、および１００から選択することができる。
【００５８】
種々の実施形態では、ステップ（ｂ）のプライマーは、第１の特異的バーコードをさらに含んでいてもよい。別様に述べると、特定の容器、混合物、反応、入れ物、試料、ウェル、または槽中のｃＤＮＡ分子に添加される第１のバーコードは、事前に決められていてもよい（例えば、所与の容器、混合物、反応、入れ物、試料、ウェル、または槽に特異的であってもよい）。例えば、４８セットの異なるウェル特異的ＲＴプライマーを使用してもよい（例えば、４８ウェルプレートで）。したがって、４８個の試料（例えば、細胞、組織など）が存在する場合、各試料は、固有のウェル特異的バーコードを得ることができる。しかしながら、試料が４つしかない場合、各試料は、１２個の異なるセットのウェル特異的ＲＴプライマーを有していてもよい。ユーザは、どの１２個が各試料に対応するかを知ることができ、したがってユーザは、試料同一性を取り戻すことができる。他の数の第１の特異的バーコード（またはウェル特異的ＲＴプライマー）も、本開示の範囲内にある。そのような構成は、実施例１６でさらに説明されるような本方法の多重化を可能にするかまたは提供することができる。
【００５９】
本方法は、（ｑ）第２の複数の細胞内でＲＮＡ分子を逆転写して、第２の複数の細胞内でｃＤＮＡ分子を形成するステップであって、ＲＮＡ分子を逆転写するステップは、特異的プライマーをＲＮＡ分子にカップリングするステップを含み、プライマーは、第２の特異的バーコードと、ポリ（Ｔ）配列またはランダム配列の少なくとも１つとを含み、第１の特異的バーコードは、第１の複数の細胞に由来するｃＤＮＡ分子を、第２の複数の細胞に由来するｃＤＮＡ分子と比較して識別することができるように、第２の特異的バーコードとは異なるステップ；（ｒ）ｃＤＮＡ分子を含む第２の複数の細胞を少なくとも２つの一次アリコートに分割するステップであって、少なくとも２つの一次アリコートは、第１の一次アリコートおよび第２の一次アリコートを含むステップ；（ｓ）一次核酸タグを少なくとも２つの一次アリコートに提供するステップであって、第１の一次アリコートに提供された一次核酸タグは、第２の一次アリコートに提供された一次核酸タグとは異なるステップ；（ｔ）少なくとも２つの一次アリコートの各々の内のｃＤＮＡ分子を、提供された一次核酸タグとカップリングするステップ；（ｕ）少なくとも２つの一次アリコートを組み合わせるステップ；（ｖ）組み合わせた一次アリコートを少なくとも２つの二次アリコートに分割するステップであって、少なくとも２つの二次アリコートは、第１の二次アリコートおよび第２の二次アリコートを含むステップ；（ｗ）二次核酸タグを少なくとも２つの二次アリコートに提供するステップであって、第１の二次アリコートに提供された二次核酸タグは、第２の二次アリコートに提供された二次核酸タグとは異なるステップ；（ｘ）少なくとも２つの二次アリコートの各々の内のｃＤＮＡ分子を、提供された二次核酸タグとカップリングするステップ；ならびに／または（ｙ）その後のアリコートを用いて、ステップ（ｕ）、（ｖ）、（ｗ）、および（ｘ）を繰り返すステップであって、最終核酸タグは捕捉剤を含むステップをさらに含んでいてもよい。第１の複数の細胞で使用される上記のステップ（例えば、ステップ（ｋ）、（ｌ）、および（ｍ））は、第２の複数の細胞でも使用されるように適合されていてもよい。
【００６０】
種々の実施形態では、核酸タグの各々は、第１の鎖を含んでいてもよく、第１の鎖は、（ｉ）３’末端および５’末端を含むバーコード配列、ならびに（ｉｉ）バーコード配列の５’末端および３’末端にそれぞれ隣接する３’ハイブリダイゼーション配列および５’ハイブリダイゼーション配列を含む。また、核酸タグの各々は、第２の鎖を含んでいてもよく、第２の鎖は、（ｉ）５’ハイブリダイゼーション配列およびアダプター配列の少なくとも１つに相補的な第１の部分、ならびに（ｉｉ）３’ハイブリダイゼーション配列に相補的な第２の部分を含む。
【００６１】
複数の細胞内のＲＮＡ分子を固有に標識化する方法は、ｃＤＮＡ分子に結合している核酸タグの少なくとも２つ（またはそれよりの多く）をライゲーションするステップをさらに含んでいてもよい。ライゲーションは、第１の複数の細胞内で実施してもよい。
【００６２】
本方法は、未結合核酸タグを除去するステップをさらに含んでいてもよい。一部の実施形態では、本方法は、放出されたｃＤＮＡ分子に結合している核酸タグの少なくとも２つをライゲーションするステップを含んでいてもよい。単一細胞に由来する、核酸タグに結合したｃＤＮＡ分子の大部分は、同じ一連の結合した核酸タグを含んでいてもよい。種々の実施形態では、複数の細胞（例えば、第１および第２の複数の細胞）は、哺乳動物細胞、酵母細胞、および細菌細胞の少なくとも１つから選択してもよい。
【００６３】
本開示の別の態様は、第１の細胞内の核酸を標識化する方法を対象とする。ある特定の実施形態では、本方法は、（ａ）（ｉ）５’突出配列を含む第１の逆転写プライマーであって、第１の逆転写プライマーがポリ（Ａ）尾部を有するＲＮＡを逆転写するように構成されている第１の逆転写プライマー、および／または、（ｉｉ）５’突出配列と、ランダム六量体、ランダム七量体、ランダム八量体、ランダム九量体、およびランダム十量体の少なくとも１つとを含む第２の逆転写プライマーの少なくとも１つを使用してＲＮＡを逆転写することにより、第１の細胞を含む複数の細胞内でｃＤＮＡ分子を生成するステップ；（ｂ）複数の細胞を（ｎ）個のアリコートに分割するステップ；（ｃ）複数の核酸タグをｎ個のアリコートの各々に提供するステップ；（ｄ）ｎ個のアリコートの各々のｃＤＮＡ分子の少なくとも１つを核酸タグに結合させるステップ；（ｅ）ｎ個のアリコートを組み合わせるステップ；（ｆ）組み合わせたアリコートを用いて、ステップ（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）を繰り返すステップ；（ｇ）最終アリコートを組み合わせるステップ；（ｈ）第１の細胞を含む複数の細胞を溶解して、第１の細胞を含む複数の細胞内からｃＤＮＡ分子を放出させて、ライセートを形成するステップ；および／または、（ｉ）プロテアーゼ阻害剤および／または結合剤をライセートに添加し、ｃＤＮＡ分子は結合剤に結合するようにするステップを含んでいてもよい。
【００６４】
例えば、ステップ（ｃ）を参照すると、各核酸タグは、（ｉ）標識化配列の３’末端から伸長する３’ハイブリダイゼーション配列、および（ｉｉ）標識化配列の５’末端から伸長する５’ハイブリダイゼーション配列を含む第１の鎖を含んでいてもよい。また、各核酸タグは、突出配列を含む第２の鎖を含んでいてもよく、突出配列は、（ｉ）５’ハイブリダイゼーション配列および５’突出配列の少なくとも１つに相補的な第１の部分、ならびに（ｉｉ）３’ハイブリダイゼーション配列に相補的な第２の部分を含む。一部の実施形態では、所与のアリコートに提供される複数の核酸タグの標識化配列は同じであってもよく、ｎ個のアリコートの各々には異なる標識化配列が提供されてもよい。
【００６５】
ある特定の実施形態では、ステップ（ｆ）は、第１の細胞のｃＤＮＡ分子に対して固有の一連の標識化配列を生成するのに十分な回数だけ繰り返すことができる。例えば、回数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、および１００から選択することができる。
【００６６】
ｃＤＮＡ分子は、アリコート（例えば、反応混合物）中で形成または生成してもよい。アリコート中の第１の逆転写プライマーの濃度は、約０．５μＭ〜約１０μＭ、約１μＭ〜約７μＭ、約１．５μＭ〜約４μＭ、約２μＭ〜約３μＭ、約２．５μＭ、または別の好適な濃度であってもよい。アリコート中の第２の逆転写プライマーの濃度は、約０．５μＭ〜約１０μＭ、約１μＭ〜約７μＭ、約１．５μＭ〜約４μＭ、約２μＭ〜約３μＭ、約２．５μＭ、または別の好適な濃度であってもよい。
【００６７】
一部の実施形態では、本方法は、ステップ（ａ）の前に複数の細胞を固定するステップを含んでいてもよい。複数の細胞は、約８℃未満で、約７℃未満で、約６℃未満で、約５℃未満で、約４℃で、約４℃未満で、約３℃未満で、約２℃未満で、約１℃未満で、または別の好適な温度で固定してもよい。ある特定の実施形態では、本方法は、ステップ（ａ）の前に複数の細胞を透過処理するステップを含んでいてもよい。複数の細胞は、約８℃未満で、約７℃未満で、約６℃未満で、約５℃未満で、約４℃で、約４℃未満で、約３℃未満で、約２℃未満で、約１℃未満で、または別の好適な温度で透過処理してもよい。
【００６８】
また、第１の細胞内の核酸を標識化する方法は、ｃＤＮＡ分子に結合している核酸タグの少なくとも２つをライゲーションするステップを含んでいてもよい。種々の実施形態では、ライゲーションは、複数の細胞内で実施してもよい。本方法は、未結合核酸タグを除去するステップを含んでいてもよい。さらに、第１および第２の逆転写プライマーの少なくとも１つは、所定のＲＮＡを逆転写してもよく、または所定のＲＮＡを逆転写するように構成されていてもよい。
【００６９】
種々の実施形態では、最終核酸タグは、捕捉剤を含んでいてもよい。さらに、本方法は、ステップ（ｆ）後に、複数の細胞を溶解して、複数の細胞内からｃＤＮＡ分子を放出させて、ライセートを形成するステップを含んでいてもよい。また、本方法は、プロテアーゼ阻害剤および／または結合剤をライセートに添加して、ｃＤＮＡ分子を単離するステップを含んでいてもよい。上記で議論されているように、プロテアーゼ阻害剤は、ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、それらの組合せ、および／または別の好適なプロテアーゼ阻害剤を含んでいてもよい。捕捉剤は、ビオチンまたは別の好適な捕捉剤を含んでいてもよく、結合剤は、アビジン（例えば、ストレプトアビジン）または別の好適な結合剤を含んでいてもよい。
【００７０】
また、第１の細胞内の核酸を標識化する方法は、（ｊ）結合剤に結合したｃＤＮＡ分子のテンプレートスイッチを実行するステップ；（ｋ）ｃＤＮＡ分子を増幅して、増幅ｃＤＮＡ分子溶液を形成するステップ；および（ｌ）ＳＰＲＩビーズ溶液を、増幅ｃＤＮＡ分子溶液に導入して、約２００塩基対未満の、約１７５塩基対未満の、または約１５０塩基対未満のポリヌクレオチドを除去するステップを含んでいてもよい。ＳＰＲＩビーズ溶液対増幅ｃＤＮＡ分子溶液の比は、約０．９：１〜約０．７：１、約０．８７５：１〜約０．７７５：１、約０．８５：１〜約０．７５：１、約０．８２５：１〜約０．７２５：１、約０．８：１、または別の好適な比であってもよい。
【００７１】
さらに、ＳＰＲＩビーズ溶液は、約１Ｍ〜４ＭのＮａＣｌ、約２Ｍ〜３ＭのＮａＣｌ、約２．２５Ｍ〜２．７５ＭのＮａＣｌ、約２．５ＭのＮａＣｌ、または別の好適な量のＮａＣｌを含んでいてもよい。また、ＳＰＲＩビーズ溶液は、約１５ｗ／ｖ％〜２５ｗ／ｖ％のＰＥＧを含んでいてもよく、ＰＥＧの分子量は、約７，０００ｇ／ｍｏｌ〜９，０００ｇ／ｍｏｌである。種々の実施形態では、ＳＰＲＩビーズ溶液は、約１７ｗ／ｖ％〜２３ｗ／ｖ％のＰＥＧ８０００、約１８ｗ／ｖ％〜２２ｗ／ｖ％のＰＥＧ８０００、約１９ｗ／ｖ％〜２１ｗ／ｖ％のＰＥＧ８０００、約２０ｗ／ｖ％のＰＥＧ８０００、または別の好適なｗ／ｖ％のＰＥＧ８０００を含んでいてもよい。
【００７２】
複数の細胞内のＲＮＡ分子を固有に標識化する方法は、共通アダプター配列を、放出されたｃＤＮＡ分子の３’末端に付加するステップをさらに含んでいてもよい。上記で議論されているように、共通アダプターの付加は、約１０ｗ／ｖ％までのＰＥＧを含む溶液中で実行または実施してもよく、ＰＥＧの分子量は、約７，０００ｇ／ｍｏｌ〜９，０００ｇ／ｍｏｌである。ある特定の実施形態では、共通アダプター配列は、テンプレートスイッチングを行うことにより、放出されたｃＤＮＡ分子の３’末端に付加することができる。
【００７３】
ある特定の実施形態では、上記に記載されている方法はいずれも、核または複数の核内の核酸分子を標識化するように適合されていてもよい。例えば、本方法は、複数の核内のＲＮＡ分子を固有に標識化するステップ、または第１の核内の核酸を標識化するステップを含んでいてもよい。
【００７４】
本開示の別の態様は、第１の細胞内の核酸を標識化するためのキットを対象とする。キットは、５’突出配列を含む第１の逆転写プライマーを含んでいてもよく、ポリ（Ａ）尾部を有するＲＮＡを逆転写するように構成されていてもよい。また、キットは、５’突出配列と、ランダム六量体、ランダム七量体、ランダム八量体、ランダム九量体、および／またはランダム十量体の少なくとも１つとを含む第２の逆転写プライマーを含んでいてもよい。
【００７５】
一部の実施形態では、キットは、複数の第１の核酸タグを含んでいてもよい。上記で議論されているように、各第１の核酸タグは、（ｉ）第１の標識化配列の３’末端から伸長する３’ハイブリダイゼーション配列、および（ｉｉ）第１の標識化配列の５’末端から伸長する５’ハイブリダイゼーション配列を含む第１の鎖を含んでいてもよい。また、各第１の核酸タグは、突出配列を含む第２の鎖を含んでいてもよい。突出配列は、（ｉ）第１および第２の逆転写プライマーの５’ハイブリダイゼーション配列および５’突出配列の少なくとも１つに相補的な第１の部分、ならびに（ｉｉ）３’ハイブリダイゼーション配列に相補的な第２の部分を含んでいてもよい。
【００７６】
また、ある特定の実施形態では、キットは、複数の第２の核酸タグを含んでいてもよい。各第２の核酸タグは、（ｉ）第２の標識化配列の３’末端から伸長する３’ハイブリダイゼーション配列、および（ｉｉ）第２の標識化配列の５’末端から伸長する５’ハイブリダイゼーション配列を含む第１の鎖を含んでいてもよい。また、各第２の核酸タグは、突出配列を含む第２の鎖を含んでいてもよい。突出配列は、（ｉ）第１および第２の逆転写プライマーの５’ハイブリダイゼーション配列および５’突出配列の少なくとも１つに相補的な第１の部分、ならびに（ｉｉ）３’ハイブリダイゼーション配列に相補的な第２の部分を含んでいてもよい。さらに、第１の標識化配列は、第２の標識化配列と異なっていてもよい。
【００７７】
また、種々の実施形態では、キットは、複数の最終核酸タグを含んでいてもよい。各最終核酸タグは、（ｉ）最終標識化配列の３’末端から伸長する３’ハイブリダイゼーション配列、および（ｉｉ）最終標識化配列の５’末端から伸長する５’ハイブリダイゼーション配列を含む第１の鎖を含んでいてもよい。また、各最終核酸タグは、突出配列を含む第２の鎖を含んでいてもよい。突出配列は、（ｉ）第１および第２の逆転写プライマーの５’ハイブリダイゼーション配列および５’突出配列の少なくとも１つに相補的な第１の部分、ならびに（ｉｉ）３’ハイブリダイゼーション配列に相補的な第２の部分を含んでいてもよい。また、各最終核酸タグは、捕捉剤を含んでいてもよい。さらに、最終標識化配列は、第１および第２の標識化配列（および／または、任意の他の標識化配列）と異なっていてもよい。また、一部の実施形態では、キットは、逆転写酵素、固定剤、透過処理剤、ライゲーション剤、溶解剤、プロテアーゼ阻害剤、および／または、他の好適な成分の少なくとも１つを含んでいてもよい。
【００７８】
当業者であれば理解することになるが、本明細書で開示された各実施形態は、その具体的に記されている要素、ステップ、成分、または構成要素を含んでいてもよく、から本質的になっていてもよく、またはからなっていてもよい。本明細書で使用される場合、移行部の用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、これらに限定されないが、明記されていない要素、ステップ、成分、または構成要素を、たとえ大量であっても含むこと、および介在を可能にすること意味する。移行部の語句「からなる」は、指定されていない任意の要素、ステップ、成分、または構成要素を除外する。移行部の語句「から本質的になる」は、実施形態の範囲を、指定されている要素、ステップ、成分、または構成要素、および実施形態に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。
【００７９】
別様の指定がない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される、成分の量、分子量などの特性、および反応条件などを表す数値はすべて、あらゆる場合において用語「約」により修飾されていると理解されるべきである。したがって、そうではないと示されていない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲に示されている数値パラメータは、本開示により得ようと試みる所望の特性に応じて様々であってもよい近似である。少なくとも、均等論の適用を特許請求の範囲に限定する試みとしてでなく、各数値パラメータは、少なくとも、報告されている有効数字の数に照らして、および通常の端数丸め技法を適用することにより解釈されるべきである。さらなる明瞭性が求められる場合、用語「約」は、記載の数値または範囲と共に使用される場合、当業者により合理的に認められる意味を有し、つまり記載の値または範囲よりも若干多いまたは若干少ないことを指し、記載値の±２０％の、記載値の±１９％の、記載値の±１８％の、記載値の±１７％の、記載値の±１６％の、記載値の±１５％の、記載値の±１４％の、記載値の±１３％の、記載値の±１２％の、記載値の±１１％の、記載値の±１０％の、記載値の±９％の、記載値の±８％の、記載値の±７％の、記載値の±６％の、記載値の±５％の、記載値の±４％の、記載値の±３％の、記載値の±２％の、または記載値の±１％の範囲内である。
【００８０】
それにもかかわらず、本開示の幅広い範囲を示す数値範囲およびパラメータ設定は近似であり、特定の例に示される数値は、可能な限り正確に報告されている。しかしながら、あらゆる数値は、本来的に、それぞれの試験測定に見出される標準偏差から必然的に生じるある程度の誤差を含む。
【００８１】
本開示を記載する状況で（特に、以下の特許請求の範囲の状況で）使用される用語「ａ」「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および類似の参照対象は、本明細書にて別様の指定がない限り、または状況により明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の記述は、範囲内に入る各個別の値を個々に参照するための簡便な方法としての役目を果たすことが意図されているに過ぎない。本明細書に別様の指定がない限り、各個々の値は、あたかもそれが個々に本明細書に記述されているかの如く、本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の方法はすべて、本明細書に別様の指定がない限り、またはそうでなければ状況により明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例または例示的言語（例えば、「など」）の使用は、本開示をより良好に明らかにするためのものに過ぎず、別様に特許請求されている本開示の範囲を限定するものでない。本明細書における言語は、本開示の実施にとって不可欠な任意の特許請求されていない要素を示すと解釈されるべきでない。
【００８２】
本明細書で開示された開示の代替的な要素または実施形態のグループ化は、限定として解釈されるべきではない。各群メンバーは、個々に、またはその群の他のメンバーもしくは本明細書に見出される他の要素との任意の組合せで参照および特許請求される。群の１つまたは複数のメンバーは、利便性および／または特許性の理由で、群に含まれてよく、または群から削除されてもよいことが理解される。任意のそのような包含または削除が生じる場合、本明細書は、改変された群を含むとみなされ、したがって添付の特許請求の範囲で使用されるすべてのマーカッシュ群の記載要件を満たす。
【００８３】
本開示で使用される定義および説明は、以下の例において、またはその意味を適用すると任意の構成が意味をなさないかまたは本質的に意味をなさなくなる場合に、明示的におよび明確に改変されない限り、あらゆる将来の構成を支配することが意図および目的とされており、その用語の構成により、意味をなさないかまたは本質的に意味をなさなくなってしまう場合、定義は、Ｗｅｂｓｔｅｒ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ、第３版、またはＯｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｓｍｉｔｈ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード  ２００４年）などの、当業者に知られている辞書によるべきである。
【実施例】
【００８４】
以下の例は、本開示の方法および組成物の例示である。本開示に照らして、当業者であれば、本開示の方法および組成物のこうした例および他の例の変異は、過度な実験作業を行わずに可能になることを認識するだろう。
【００８５】
実施例１−固定および逆転写
ＮＩＨ／３Ｔ３（マウス）およびＨｅｌａ−Ｓ３（ヒト）細胞を、２つの個別の１０ｃｍ細胞培養プレートでコンフルエンスになるまで増殖させることができる。細胞を、１０ｍｌの１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回すすぐことができ、１ｍｌの０．０５％  トリプシンを各プレートに添加することができ、プレートを３７℃で５分間インキュベートすることができる。プレート全体にトリプシンをピペットしながら各プレートを４５°の角度に傾けることにより細胞を剥離することができ、すべてのまたは実質的にすべての細胞が剥離するまで、これを続けることができる。各細胞株を、各自の１５ｍｌ円錐遠心分離チューブ（ＦＡＬＣＯＮ（商標））に移すことができる。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を有する２ｍｌダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を、各チューブに添加することができる。各チューブの細胞数を算出することができる（例えば、血球計算器またはフローサイトメーターで）。例えば、２００μｌの試料を、各チューブから個別の１．７ｍｌ微量遠心チューブ（ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標））へと移すことができ、１００μｌの試料を、ＡＣＣＵＲＩ（商標）フローサイトメーターに流して、細胞濃度を算出することができる。
【００８６】
各チューブに由来する同数の細胞を、できるだけ多くの細胞を使用して組み合わせて、新しい単一の１５ｍｌ円錐遠心分離チューブ（ＦＡＬＣＯＮ（商標））に入れることができる。１５ｍｌ円錐遠心分離チューブ（ＦＡＬＣＯＮ（商標））で５００×ｇにて５分間の遠心を実行することができる。細胞がチューブの側面ではなくチューブの底部にペレット化するように、バケット遠心分離機を使用することが有用であり得る。細胞ペレットを崩さずに液体を吸引することができ、細胞を、５００μｌの４％ホルムアルデヒドに再懸濁することができる。その後、細胞を１０分間室温（つまり、２０〜２５℃）に置いておくことができる。１．５ｍｌの０．５％ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００をチューブに添加し、ピペットで穏やかに混合することができる。その後、チューブを５００×ｇで５分間遠心することができる。再び、ペレットを崩さずに液体を吸引することができ、ペレットを再懸濁せずにペレットを１ｍｌのＰＢＳで２回洗浄することができる。洗浄でペレットが崩れる場合、第２の洗浄を飛ばして次に進んでもよい。その後、ペレットを１ｍｌの０．１Ｎ  ＨＣｌに再懸濁し、室温で５分間インキュベートすることができる。
【００８７】
２ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を、新しい１５ｍｌ円錐遠心分離チューブ（ＦＡＬＣＯＮ（商標））に添加することができる。上記のＨＣｌ中の固定細胞を、ＨＣｌを中和するためにＴｒｉｓ−ＨＣｌを有するチューブに移すことができる。その後、チューブの細胞数を、上記で議論されているように算出することができる（例えば、血球計算器またはフローサイトメーターで）。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中の固定細胞を、５００×ｇで５分間遠沈することができ、ペレットを崩さずに液体を吸引することができる。ペレットを崩さずに、ペレットを１ｍｌの無ＲＮａｓｅ分子グレード水で２回洗浄することができる。その後、細胞を、２５０万細胞／ｍｌの濃度に再懸濁することができる（これを行うために、最後の遠心ステップ前に算出された濃度を使用することができる）。
【００８８】
逆転写ミックスを作製することができる（５５μｌ  Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素緩衝液（ＥＮＺＹＭＡＴＩＣＳ（登録商標））、５５μｌ  Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素（ＥＮＺＹＭＡＴＩＣＳ（登録商標））、５．５μｌ  ｄＮＴＰ（１塩基当たり２５ｍＭ）、３．４４μｌ  ＲＮａｓｅ阻害剤（ＥＮＺＹＭＡＴＩＣＳ（登録商標）、４０単位／μｌ）、２１０．４μｌ無ヌクレアーゼ水、および２．７５μｌ  ＲＴプライマー（ＢＣ＿００５５、１００μＭ））。２４ウェル細胞培養プレートのウェル中で、３００μｌの逆転写ミックスを、２００μｌの固定細胞（約５００，０００細胞）を組み合わせ、ピペットすることにより穏やかに混合することができる。その後、混合物を室温で１０分間インキュベートして、逆転写プライマーをアニーリングさせることができ、その後混合物を、３７℃にて一晩（つまり、約１６時間）加湿インキュベータでインキュベートすることができる。
【００８９】
逆転写に使用することができるプライマー（ＢＣ＿００５５）が、図１０に示されている。これは、メッセンジャーＲＮＡのポリ（Ａ）尾部の開始部に結合するように設計されている係留プライマーである。３’末端が４塩基のいずれかであり（Ｎ）、３’から２番目の位置がＴ以外の任意の塩基（Ｖ）であるプライマーを合成することができる。また、プライマーは、１５個の連続ｄＴを含むことができる。一部の実施形態では、プライマーは、１５個よりも多くのｄＴを含んでいてもよい。一部の他の実施形態では、プライマーは、１５個未満のｄＴを含んでいてもよい。プライマーが１５個未満のｄＴを含む実施形態では、プライマーの融解温度が低下する場合がある。ドメインｓ０は、メッセンジャーＲＮＡにハイブリダイズしなくともよいが、代わりにリンカーオリゴに対するアクセス可能な結合ドメインを提供することができる。また、プライマーは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによりプライマーを別のオリゴにライゲーションさせることができる５’リン酸を含む。
【００９０】
実施例２−バーコードの調製
バーコードを、１００μＭ濃度にて９６ウェルプレートに順序立てて配置した。各バーコードを、その対応するリンカーオリゴにアニーリングさせた（図１０〜１２を参照）。
【００９１】
図１１は、アニーリングされた第１ラウンドバーコードオリゴを示す。ドメインｉ８ａに固有配列を有する９６個の第１ラウンドバーコードオリゴを使用した。第１ラウンドでは、ドメインｉ８ａの固有配列は、バーコードとして使用される配列の領域である。８個のヌクレオチドを変えることにより、６５，５３６個の考え得る固有配列が存在する。一部の実施形態では、８個よりも多くのヌクレオチドが、ドメインｉ８ａに存在してもよい。一部の他の実施形態では、８個未満のヌクレオチドが、ドメインｉ８ａに存在してもよい。第１ラウンドバーコードを、ドメインｓ１の相補的配列を介してリンカー鎖（ＢＣ＿００５６）にプレアニーリングさせた。リンカー鎖は、第１ラウンドバーコードの３’末端を、逆転写プライマーの５’末端の最近傍に接近およびハイブリダイズさせることができる、逆転写プライマーの一部（ドメインｓ０）に対する相補的配列を含むことができる。その後、逆転写プライマーのリン酸を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼにより第１ラウンドバーコードの３’末端にライゲーションすることができる。ドメインｓ２は、別のラウンドのバーコード化で使用するためのリンカーオリゴに対するアクセス可能な結合ドメインを提供することができる。また、第１ラウンドバーコードオリゴは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼにより別のオリゴの３’末端にライゲーションさせることができる５’リン酸を含むことができる。
【００９２】
図１２は、アニーリングされた第２ラウンドバーコードオリゴを示す。ドメインｉ８ｂに固有配列を有する９６個の第２ラウンドバーコードオリゴを使用した。第２ラウンドでは、ドメインｉ８ｂの固有配列は、バーコードとして使用される配列の領域である。８個のヌクレオチドを変えることにより、６５，５３６個の考え得る固有配列が存在する。一部の実施形態では、８個よりも多くのヌクレオチドが、ドメインｉ８ｂに存在してもよい。一部の実施形態では、８個未満のヌクレオチドが、ドメインｉ８ｂに存在してもよい。第２ラウンドバーコードを、ドメインｓ３の相補的配列を介してリンカー鎖（ＢＣ＿００５８）にプレアニーリングさせることができる。リンカー鎖は、第１ラウンドバーコードの３’末端を、第２ラウンドバーコードオリゴの５’末端の最近傍に接近およびハイブリダイズさせることができる、第１ラウンドバーコードオリゴの一部（ドメインｓ２）に対する相補的配列を含むことができる。その後、第１ラウンドバーコードオリゴのリン酸を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼにより第２ラウンドバーコードの３’末端にライゲーションすることができる。ドメインｓ４は、別のラウンドのバーコード化で使用するためのリンカーオリゴに対するアクセス可能な結合ドメインを提供することができる。また、第２ラウンドバーコードオリゴは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼにより別のオリゴの３’末端にライゲーションさせることができる５’リン酸を含むことができる。
【００９３】
図１３は、アニーリングされた第３ラウンドバーコードオリゴを示す。ドメインｉ８ｃに固有配列を有する９６個の第３ラウンドバーコードオリゴを使用した。第３ラウンドでは、ドメインｉ８ｃの固有配列は、バーコードとして使用される配列の領域である。８個のヌクレオチドを変えることにより、６５，５３６個の考え得る固有配列が存在する。一部の実施形態では、８個よりも多くのヌクレオチドが、ドメインｉ８ｃに存在してもよい。一部の他の実施形態では、８個未満のヌクレオチドが、ドメインｉ８ｃに存在してもよい。第３ラウンドのバーコードを、ドメインｓ５の相補的配列を介してリンカー鎖（ＢＣ＿００６０）にプレアニーリングさせることができる。リンカー鎖は、第２ラウンドバーコードの３’末端を、第３ラウンドバーコードオリゴの５’末端の最近傍に接近およびハイブリダイズさせることができる、第２ラウンドバーコードオリゴの一部（ドメインｓ４）に対する相補的配列を含むことができる。その後、第２ラウンドバーコードオリゴのリン酸を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼにより第３ラウンドバーコードの３’末端にライゲーションすることができる。１０個のランダムヌクレオチド（ドメインＵＭＩ：ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ）からなる固有分子識別子（ＵＭＩ；Ｉｓｌａｍら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１４年を参照）を有する第３ラウンドバーコードオリゴを合成することができる。ＰＣＲ増幅バイアスのため、ｃＤＮＡから複数の配列決定リードが生じる場合がある。ＵＭＩを使用すれば、各ｃＤＮＡを１回のみ計数することができる。また、第３ラウンドバーコードは、ＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）ＴｒｕＳｅｑアダプターの一部に相当するドメインを含むことができる。ストレプトアビジンをコーティングした磁気ビーズでバーコード化ｃＤＮＡを十分に単離することができるように５’末端にビオチン分子を有する第３ラウンドバーコードを合成することができる。
【００９４】
各バーコードオリゴの１００μＭストックから開始して（つまり、各ラウンド毎に１つの９６ウェルプレートで）、１１μｌのバーコードオリゴを、９６ウェルＰＣＲプレートに移した。９μｌのＢＣ＿００５６（１００μＭストック）を、ラウンド１バーコードを有するプレートの各ウェルに添加した。９μｌのＢＣ＿００５８（１００μＭストック）を、ラウンド２バーコードを有するプレートの各ウェルに添加した。９μｌのＢＣ＿００６０（１００μＭストック）を、ラウンド３バーコードを有するプレートの各ウェルに添加した。その後、９０℃に加熱し、０．１℃／秒で熱を低減させ、温度が２５℃に達したら停止させるというプログラムのサーモサイクラーに各プレートを入れ、バーコードを、対応するリンカーオリゴにアニーリングさせた。２．２μｌを、ラウンド１バーコードを有する各ウェルから、新しい９６ウェルプレート（プレートＬ１と呼ぶ）へと移した。３．８μｌを、ラウンド２バーコードを有する各ウェルから、新しい９６ウェルプレート（プレートＬ２と呼ぶ）へと移した。６．１μｌを、ラウンド３バーコードを有する各ウェルから、新しい９６ウェルプレート（プレートＬ３と呼ぶ）へと移した。
【００９５】
実施例３−ライゲーション停止オリゴの調製
各ラウンドのライゲーション後、リンカー鎖に相補的な過剰量のオリゴを添加することにより、ライゲーションを停止させることができる（図１４を参照）。各バーコードライゲーションを停止させるために、リンカーオリゴに完全に相補的なオリゴ鎖を添加することができる。こうしたオリゴは、未ライゲーションバーコードに付着しているリンカー鎖に結合し、鎖置換反応により未ライゲーションバーコードを置換することができる。その後、未ライゲーションバーコードを、完全に一本鎖化することができる。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼは、一本鎖ＤＮＡを他の一本鎖ＤＮＡにライゲーションすることができないため、ライゲーション反応は進行が停止することになる。すべてのリンカーオリゴが相補的オリゴに結合することを保証するために、モル過剰量の相補的オリゴ（リンカーオリゴに対して）を添加する。第１ラウンドライゲーションを停止させるために、ＢＣ＿００６４（ＢＣ＿００５６に相補的）を添加する。第２ラウンドライゲーションを停止させるために、ＢＣ＿００６５（ＢＣ＿００５８に相補的）を添加する。第３ラウンドライゲーションを停止させるために、ＢＣ＿００６６（ＢＣ＿００６０に相補的）を添加する。
【００９６】
各停止ライゲーション鎖（ＢＣ＿００６４、ＢＣ＿００６５、ＢＣ＿００６６）の希釈物を、以下の通りに調製することができる：２６４μｌの停止ライゲーション鎖（ＢＣ＿００６４、ＢＣ＿００６５、ＢＣ＿００６６）、３００μｌの１０×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液、および６３６μｌの無ヌクレアーゼ水。
【００９７】
実施例４−ｃＤＮＡに対するバーコードのライゲーション
５μｌの１０％ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００を、上記に記載の２４ウェルプレートの逆転写反応物（０．１％の終濃度に）に添加することができる。細胞との逆転写（ＲＴ）反応物を、１５ｍｌ円錐遠心分離チューブ（ＦＡＬＣＯＮ（商標））に移すことができる。ＲＴ反応物を５００×ｇで１０分間遠心し、２ｍｌの無ヌクレアーゼ水に再懸濁することができる。細胞を、リガーゼミックスと組み合わせることができる（使い捨てピペットリザーバー（１０ｍｌ）中、６００μｌの１０×Ｔ４リガーゼ緩衝液、２０４０μｌの無ヌクレアーゼ水、再懸濁細胞のすべて（２０００μｌ）、１００μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢＳ（登録商標）、４００，０００単位／ｍｌ）、および６０μｌの１０％ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００）。リザーバーを前後に数回穏やかに傾けることにより、細胞およびリガーゼミックスを混合することができる。マルチチャネルピペットを使用して、リガーゼミックス中４０μｌの細胞を、アニーリングされたラウンド１バーコードの各ウェル（プレートＬ１）に添加することができる。上下に穏やかに２〜３回ピペットすることにより、各ウェルを混合することができる。リガーゼミックス中の細胞を、３７℃で６０分間インキュベートすることができる。
【００９８】
１０μｌの希釈ＢＣ＿００６４を各ウェルに添加して、ライゲーションを停止させることができる。その後、試料を３７℃で３０分間インキュベートすることができる。細胞のすべてを、新しい使い捨てピペットリザーバー（１０ｍｌ）に収集することができる。１ｍｌピペットを使用して、細胞を４０μＭストレーナーに通し、新しい使い捨てピペットリザーバー（１０ｍｌ）へと通過させることができる。１００μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢＳ（登録商標）、４００，０００単位／ｍｌ）を、リザーバーの細胞に添加することができる。リザーバーを前後に数回穏やかに傾けることにより細胞およびリガーゼミックスを混合することができ、マルチチャネルピペットを使用して、リガーゼミックス中４０μｌの細胞を、アニーリングされたラウンド２バーコード（プレートＬ２）の各ウェルに添加することができる。上下に穏やかに２〜３回ピペットすることにより、各ウェルを混合することができ、その後試料を３７℃で６０分間インキュベートすることができる。
【００９９】
１０μｌの希釈ＢＣ＿００６５を各ウェルに添加して、ライゲーションを停止させることができる。試料を３７℃で３０分間インキュベートすることができ、その後細胞を、新しい使い捨てピペットリザーバー（１０ｍｌ）に収集することができる。１ｍｌピペットを使用して、細胞を４０μＭストレーナーに通し、新しい使い捨てピペットリザーバー（１０ｍｌ）へと通過させることができる。１００μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢＳ（登録商標）、４００，０００単位／ｍｌ）を、リザーバーの細胞に添加することができる。リザーバーを前後に数回穏やかに傾けることにより、細胞およびリガーゼミックスを混合することができる。マルチチャネルピペットを使用して、リガーゼミックス中４０μｌの細胞を、アニーリングされたラウンド３バーコードの各ウェル（プレートＬ３）に添加することができる。その後、上下に穏やかに２〜３回ピペットすることにより、各ウェルを混合することができ、試料を３７℃で６０分間インキュベートすることができる。
【０１００】
１０μｌの希釈ＢＣ＿００６６を各ウェルに添加して、ライゲーションを停止させることができる。試料を３７℃で３０分間インキュベートすることができる。細胞をすべて、新しい使い捨てピペットリザーバー（１０ｍｌ）に収集することができる。細胞を１５ｍｌ円錐遠心分離チューブ（ＦＡＬＣＯＮ（商標））に移すことができ、チューブを洗浄緩衝液（無ヌクレアーゼ水、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、および２５％ホルムアミド）で満たして１５ｍｌにすることができる。試料を室温で１５分間インキュベートすることができる。その後細胞を、５００×ｇで１０分間ペレット化することができ、ペレットを崩さずに液体を除去することができる。各チューブの細胞を１００μｌのＰＢＳに再懸濁することができ、細胞を計数することができる（例えば、血球計算器またはフローサイトメーターで）。一例では、５７，０００個の細胞が保持された。配列決定する細胞数を選択することができる。一例では、細胞を、２５個細胞のアリコート、２５０個細胞のアリコート、２，５００個細胞のアリコート、および２５，０００個細胞のアリコートに分配した。３００μｌの溶解緩衝液（１０ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、０．５％ＤＯＣ緩衝液、および０．５％ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００）を、細胞アリコートの各々に添加することができ、細胞アリコートの各々は、２５ゲージ注射針を８回通過させることができる。
【０１０１】
実施例５−ストレプトアビジンでコーティングしたビーズへのバーコード化ｃＤＮＡの結合
まず、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＭＹＯＮＥ（商標）ストレプトアビジンＣ１ビーズを再懸濁することができる。２０μｌの再懸濁ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＭＹＯＮＥ（商標）ストレプトアビジンＣ１ビーズを（細胞の各アリコート毎に）、１．７ｍｌ微量遠心チューブ（ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標））に添加することができる。ビーズを、１×リン酸緩衝生理食塩水Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、２０μｌのＰＢＳＴに再懸濁することができる。９００μｌのＰＢＳＴを細胞アリコートに添加することができ、２０μｌの洗浄したＣ１ビーズを、溶解細胞のアリコートに添加することができる。試料を、室温で１５分間穏やかなローラーに置き、その後磁気チューブラック（ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標））を使用して、８００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄することができる。その後ビーズを、１００μｌのＰＢＳに再懸濁することができる。
【０１０２】
実施例６−ビーズのＲＮａｓｅ処理
試料を含む微量遠心チューブ（ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標））を、磁気チューブラック（ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標））に２分間設置することができ、その後液体を吸引することができる。ビーズをＲＮａｓｅ反応物（３μｌ  ＲＮａｓｅミックス（ＲＯＣＨＥ（商標））、１μｌ  ＲＮａｓｅＨ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢＳ（登録商標））、５μｌ  ＲＮａｓｅＨ  １０×緩衝液（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢＳ（登録商標））、および４１μｌ無ヌクレアーゼ水）に再懸濁することができる。試料を３７℃で１時間インキュベートし、３７℃から除去し、磁気チューブラック（ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標））に２分間設置することができる。ビーズを再懸濁せずに、チューブを磁気チューブラックに配置したまま、試料を７５０μｌの無ヌクレアーゼ水＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｈ２Ｏ−Ｔ）で洗浄することができる。その後液体を吸引することができる。ビーズを再懸濁せずに、チューブを磁気チューブラックに配置したまま、試料を７５０μｌのＨ２Ｏ−Ｔで洗浄することができる。次に、チューブを磁気チューブラックに配置したまま、液体を吸引することができる。その後、チューブを磁気チューブラックから取り外すことができ、試料を、４０μｌの無ヌクレアーゼ水に再懸濁することができる。
【０１０３】
実施例７−３’アダプターライゲーション
図１５を参照すると、ＰＣＲ増幅を促進するために、一本鎖ＤＮＡアダプターオリゴ（ＢＣ＿００４７）を、ｃＤＮＡの３’末端にライゲーションすることができる。アダプターオリゴのコンカテマーを防止するために、ジデオキシシチジン（ｄｄＣ）を、アダプターオリゴの３’末端に含めることができる。５’末端にリン酸および３’末端にｄｄＣを有するＢＣ＿００４７を生成した。幾つかの酵素は、一本鎖オリゴを一本鎖ＤＮＡの３’末端にライゲーションすることが可能である。本明細書では、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢＳ（登録商標））を使用した。熱安定性５’ＡｐｐＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢＳ（登録商標））も、プレアデニル化アダプターオリゴと共に使用することができる。
【０１０４】
具体的には、２０μｌのＲＮａｓｅ処理ビーズを、単一のＰＣＲチューブに添加することができる。８０μｌのリガーゼミックス（５μｌのＴ４  ＲＮＡリガーゼ１（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢＳ（登録商標））、１０μｌの１０×Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ緩衝液、５μｌの５０μＭ  ＢＣ＿００４７オリゴ、５０μｌの５０％ＰＥＧ８０００、および１０μｌの１０ｍＭ  ＡＴＰ）を、ＰＣＲチューブ中の２０μｌビーズに添加することができる。ビーズと混合した５０μｌのリガーゼを新しいＰＣＲチューブに移して、多過ぎるビーズが単一チューブの底部に沈殿することを防止することができ、試料を２５℃で１６時間インキュベートすることができる。
【０１０５】
実施例８−ＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）適合性配列決定産物の生成
両ＰＣＲチューブに由来するライゲーション反応物を組み合わせて、単一の１．７ｍｌ微量遠心チューブ（ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標））に入れることができる。７５０μｌのＨ２Ｏ−Ｔを各試料に添加することができる。チューブの各々を、磁気チューブラック（ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標））に２分間設置することができ、液体を吸引することができ、試料を４０μｌの水に再懸濁することができる。試料をＰＣＲチューブに移すことができる。６０μｌのＰＣＲミックスを各チューブに添加することができる（５０μｌの２×ＰＨＵＳＩＯＮ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼマスターミックス（ＴＨＥＲＭＯ  ＦＩＳＨＥＲ（商標）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５μｌのＢＣ＿００５１（１０μＭ）、および５μｌのＢＣ＿００６２（１０μＭ））。１０サイクルのＰＣＲを実施することができる（９８℃で３分間、１０回の反復（９８℃で１０秒間、６５℃で１５秒間、および７２℃で６０秒間）、および７２℃で５分間）。図１６はＰＣＲ産物を示す。３’アダプターオリゴ（ＢＣ＿００４７）をバーコード化ｃＤＮＡにライゲーションさせた後、ＰＣＲを使用してｃＤＮＡを増幅することができる。図１６に示されているように、プライマーＢＣ＿００５１およびＢＣ＿００６２を使用した。
【０１０６】
以前のステップからＰＣＲ試料を調達することができ、磁気ビーズを、磁石を用いて各チューブの底部へと動かすことができる。磁気ビーズを一切移さずに、９０μｌのＰＣＲ反応物を新しい１．７ｍｌに移すことができる。１０μｌの無ヌクレアーゼ水を１．７ｍｌチューブの各々に添加して、総容積を１００μｌにすることができる。６０μｌのＡＭＰＵＲＥ（商標）ビーズを、１００μｌのＰＣＲ反応物（０．６×ＳＰＲＩ）に添加し、５分間結合させることができる。チューブを２分間磁石に設置することができ、ビーズを再懸濁させずに、試料を２００μｌの７０％エタノールで洗浄することができる（３０秒間待機）。ビーズを再懸濁させずに、試料を２００μｌの７０％エタノールで再度洗浄することができ（３０秒間待機）、その後エタノールが蒸発するまで、試料を５〜１０分間空気乾燥することができる。
【０１０７】
試料の各々を、４０μｌの無ヌクレアーゼ水に再懸濁することができる。チューブを磁気ラックに２分間設置することができる。微量遠心チューブ（ＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（登録商標））を依然として磁気ラックに配置させたまま、ビーズを移さずに３８μｌの溶液を新しい１．７ｍｌチューブに移すことができる。６２μｌの無ヌクレアーゼ水を試料に添加して、総容積を１００μｌにすることができる。その後、６０μｌのＡＭＰＵＲＥ（商標）ビーズを、１００μｌのＰＣＲ反応物（０．６×ＳＰＲＩ）に添加し、５分間結合させることができる。チューブを２分間磁石に設置することができ、その後、ビーズを再懸濁させずに、試料を２００μｌの７０％エタノールで洗浄することができる（３０秒間待機）。ビーズを再懸濁させずに、試料を２００μｌの７０％エタノールで再度洗浄することができ（３０秒間待機）、その後エタノールが蒸発するまで、試料を５〜１０分間空気乾燥することができる。
【０１０８】
試料を４０μｌの無ヌクレアーゼ水に再懸濁することができ、各チューブを磁気ラックに２分間設置することができる。チューブを依然として磁気ラックに配置させたまま、ビーズを一切移さずに３８μｌの溶液を新しい１．７ｍｌチューブに移すことができる。３８μｌ溶出液のうち２０μｌを、光学ＰＣＲチューブに添加することができる。さらに、ＰＣＲミックスを、このチューブに添加することができる（２５μｌのＰＨＵＳＩＯＮ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼマスターミックス（ＴＨＥＲＭＯ  ＦＩＳＨＥＲ（商標）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２．５μｌのＢＣ＿００２７（１０μＭ）、２．５μｌのＢＣ＿００６３（１０μＭ）、および２．５μｌの２０×ＥＶＡＧＲＥＥＮ（登録商標）（ＢＩＯＴＩＵＭ（商標）））。図１６に示されているＰＣＲ後、全長ＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）アダプター配列を、別のラウンドのＰＣＲにより導入することができる。図１７に示されているように、ＢＣ＿００２７は、フローセル結合配列、およびＴＲＵＳＥＱ（商標）リード１プライマーの結合部位を含む。ＢＣ＿００６３は、フローセル結合配列、およびＴｒｕＳｅｑマルチプレックスリード２、およびインデックス結合配列を含む。試料インデックスの領域も存在し、この例ではＧＡＴＣＴＧである。
【０１０９】
上記の試料を、以下のサイクル条件でｑＰＣＲ機にかけることができる：１）９８℃で３分間、２）９８℃で１０秒間、３）６５℃で１５秒間、４）７２℃で６０秒間、および５）ステップ２〜４を繰り返す（例えば、蛍光の指数関数的増加が止まる時点に応じて、１０〜４０回）。チューブを、５分間７２℃に設定したサーモサイクラーに移すことができる。ｑＰＣＲ反応物を、１．５％アガロースゲルに４０分間流すことができ、４５０〜５５０ｂｐのバンドを切り出し、ゲル抽出することができる（ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ゲル抽出キット）。産物を、ＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）ＭＩＳＥＱ（商標）でペアエンド配列決定を使用して配列決定することができる。配列決定用プライマーは、標準ＴＲＵＳＥＱ（商標）マルチプレックスプライマーであってもよい。リード１はｃＤＮＡ配列を配列決定することができ、リード２は、固有分子識別子ならびに３個のバーコード配列（各々８個ヌクレオチド）を網羅することができる。インデックスリード１を使用して試料バーコードを配列決定することができ、したがって複数の試料を一緒に配列決定してもよい。
【０１１０】
実施例９−データ分析
配列決定リードを、細胞バーコードによりグループ化した（各々が８個ヌクレオチドの３個のバーコード、全組合せは９６×９６×９６＝８８４，７３６通り）。各バーコード組合せは、単一細胞に由来するｃＤＮＡに対応するはずである。有効なバーコードを有するリードのみを保持した。各バーコード組合せを有する配列決定リードを、ヒトゲノムおよびマウスゲノムの両方に対してアラインした。両ゲノムにアラインしたリードを廃棄した。同じ固有分子識別子を有する複数のリードを、単一リードとして計数した。２つまたはそれよりも少ないミスマッチを有する固有分子識別子を有するリードは、配列決定エラーにより生成されたとみなし、単一リードとして計数した。各固有バーコード組合せについて、ヒトゲノムにアラインしたリードの数（ｘ軸）およびマウスゲノムにアラインしたリードの数（ｙ軸）をプロットした（図１８を参照）。各細胞は、マウスまたはヒトのいずれかであるため、理想的には唯一のタイプのＲＮＡを含むはずである。したがって、理想的なプロットは、すべての点がｘ軸またはｙ軸に沿っていることになる。図１８のプロットのほとんどの点が軸線付近にあるという事実は、本方法が実施可能であることを示す。
【０１１１】
プロットの各点は、同じ組合せのバーコードを有するｃＤＮＡに対応し、単一細胞に由来するｃＤＮＡを表すはずである。各点について、マウスゲノムに固有にマッピングされるリードの数はｙ軸にプロットされ、ヒトゲノムに固有にマッピングされるリードの数は、ｘ軸にプロットされる。特定の組合せのバーコードを有するｃＤＮＡが単一細胞に由来した場合、特定の組合せのバーコードを有するｃＤＮＡはすべて、完全にヒトゲノムにまたは完全にマウスゲノムにマッピングされるはずである。上述のように、ほとんどのバーコード組合せがｘ軸（ヒト細胞）またはｙ軸（マウス細胞）のいずれか付近にマッピングされるという事実は、本方法が実際に単一細胞ＲＮＡ配列決定データをもたらすことができることを示す。
【０１１２】
実施例１０−複数の細胞の分子を固有に標識化する方法
以下に開示されているプロトコールの場合、予測される実験時間は、２（二）日間である。下記に示されているように、ＲＮａｓｅ阻害剤を緩衝液に添加してもよい。したがって、任意の緩衝液が用語「＋ＲＩ」を含む場合、これは、ＥＮＺＹＭＡＴＩＣＳ（登録商標）ＲＮａｓｅ阻害剤が、０．１Ｕ／μＬの終濃度で添加されているはずであることを示す。遠心分離ステップは、スインギングバケットローターで実施してもよい。一部の実施形態では、固定角遠心分離機の使用は、より多くの細胞喪失に結び付く場合がある。組織タイプに応じて、遠心分離速度を変化させて、細胞保持を最適化する必要があり得る（例えば、より小さな細胞＝より高速）。
【０１１３】
ＤＮＡバーコード化プレート生成には、以下のものが必要とされ得る：ｉ）３個のＩＤＴ（登録商標）９６ウェルプレート、逆転写バーコードプライマー、ライゲーションラウンド１、およびライゲーションラウンド２ストックＤＮＡオリゴプレート（１００μＭ）；ｉｉ）２つのリンカーオリゴ、ＢＣ＿０２１５およびＢＣ＿００６０（注：これらは、ストック濃度が１ｍＭであることが仮定されており、したがって別のストック濃度が使用される場合は（例えば、１００μＭストック）、容積を修正すること）；およびｉｉｉ）６つの９６ウェルＰＣＲプレート（例えば、少なくとも１０回の実験を継続することになる３（三）つのストックプレート、および最初の実験のための３（三）つのプレート）。なお、これにより、１００μＬのＤＮＡバーコードを各ウェルに生成することができる。一般に、各実験は、わずか４μＬ／ウェルの逆転写プライマー溶液しか必要とせず、これで２５回の実験を継続することができる。一般に、各実験は、わずか１０μＬ／ウェルのバーコード／リンカー溶液しか必要とせず、こうしたプレートで合計１０回の実験を継続することができる。
【０１１４】
ラウンド１逆転写バーコードプライマー（４８ウェルの各々の終濃度は、１２．５μＭのランダム六量体および１２．５μＭの１５ｄＴプライマー）：１）マルチチャネルピペットを使用して、ＩＤＴ（登録商標）逆転写バーコードプライマーの列Ａ〜Ｄの１２．５μＬを、ＢＣストック９６ウェルＰＣＲプレートの列Ａ〜Ｄに添加する；２）マルチチャネルピペットを使用して、ＩＤＴ（登録商標）逆転写バーコードプライマーの列Ｅ〜Ｈの１２．５μＬを、ＢＣストック９６ウェルＰＣＲプレートの列Ａ〜Ｄに添加する（ここで、ポリｄＴをランダム六量体プライマーと混合する）；３）７５μｌの水を、ＢＣストック９６ウェルＰＣＲプレートの列Ａ〜Ｄに添加する。
【０１１５】
ラウンド２ライゲーションラウンド（終濃度は、１２μＭのバーコード、１１μＭのリンカー−ＢＣ＿０２１５）：１）マルチチャネルピペットを使用して、１２μＬのＩＤＴ（登録商標）ラウンド２バーコードをＲ１ストック９６ウェルＰＣＲプレートに添加する；２）１３８．６μｌのＢＣ＿０２１５（１ｍＭ）を、凹部分の１０．９４９４ｍＬの水に添加する（ＢＣ＿０２１５＿ｄｉｌ）；および３）マルチチャネルピペットを使用して、８８μＬのＢＣ＿０２１５＿ｄｉｌを、Ｒ２ストック９６ウェルＰＣＲプレートの各ウェルに添加する。
【０１１６】
ライゲーションラウンド３（終濃度は、１４μＭのバーコード、１３μＭのリンカー−ＢＣ＿００６０）：１）マルチチャネルピペットを使用して、１４μＬのラウンド３バーコードを、Ｒ３ストック９６ウェルＰＣＲプレートに添加する；２）１６３．８μｌのＢＣ＿００６０（１ｍＭ）を、凹部分の１０．６７２２ｍＬの水に添加する（ＢＣ＿００６０＿ｄｉｌ）；および３）マルチチャネルピペットを使用して、８６μＬのＢＣ＿００６０を、Ｒ３ストック９６ウェルＰＣＲプレートの各ウェルに添加する。
【０１１７】
各ライゲーションプレートは（Ｒ２およびＲ３、逆転写バーコードを含まない）、以下のサーモサイクルプロトコールでバーコードおよびリンカーオリゴをアニーリングする：１）９５℃に２（二）分間加熱、および２）０．１℃／秒の速度で２０℃まで冷却；および３）４℃。
【０１１８】
各バーコード／リンカーストックの１０μＬを、３（三）つの新しい９６ウェルＰＣＲプレートにアリコートする。これらは、このプロトコールの分配−プールライゲーションステップでのＤＮＡバーコード化に使用されるべきプレートである。
【０１１９】
Ｉ．核抽出（任意選択）：１）以下のものを準備する：ａ）使用するまでダンス型ホモジナイザーを４℃に維持すること、ｂ）１５ｍｌの１×ＰＢＳ＋３７．５ＳＵＰＥＲＡＳＥ−ＩＮ（商標）＋１９μｌのＥＮＺＹＭＡＴＩＣＳ（登録商標）ＲＮａｓｅ阻害剤（氷上で維持）、およびｃ）遠心分離機を４℃に予冷すること。
【０１２０】
２）ＮＩＭ１緩衝液（表１）を作製する：
【０１２１】
【表１】
2020534015.tif 000003
【０１２２】
３）ホモジナイゼーション緩衝液（表２）を作製する：
【０１２３】
【表２】
2020534015.tif 000004
【０１２４】
４）ダンス型ホモジナイザー：ａ）組織／細胞試料をダンス型ホモジナイザーに添加する；細胞の場合は、７００μｌのホモジナイゼーション緩衝液に再懸濁する；ｂ）ホモジナイゼーション緩衝液を約７００μｌに添加する；ｃ）緩い乳棒の５回往復を実施する；ｄ）密着乳棒の１０〜１５回往復を実施する；ｅ）ホモジナイゼーション緩衝液を添加して１ｍｌにする；およびｆ）５μｌのトリパンブルーおよび５μｌの細胞を有する細胞ライセートを血球計算器で検査して、核が放出されたか否かを確かめる。
【０１２５】
５）ホモジネートを４０μｍストレーナーで濾過して、５ｍｌのＥＰＰＥＮＤＯＲＦ（商標）チューブ（または１５ｍＬのＦＡＬＣＯＮ（商標）チューブ）に入れる。チューブ上方で漉過しながらフィルターを４５°に傾けることにより、ライセートが意図した通りに通過することを保証することができる。注：この漉過プロセスは、下記の漉過プロセスとは異なる。
【０１２６】
６）６００×ｇで４分間遠心し（４℃）、上清を除去する（ペレット吸引を回避するために約２０μＬを残してもよい）。７）１ｍｌの１×ＰＢＳ＋ＲＩに再懸濁する。８）１０μｌのＢＳＡを添加する。９）６００×ｇで４分間遠心分離する。１０）２００μｌの１×ＰＢＳ＋ＲＩに再懸濁する。
【０１２７】
１１）ステップ４の再懸濁細胞の５０μｌを取り、１５０μｌの１×ＰＢＳ＋ＲＩを添加する。血球計算器および／またはフローサイトメーターで試料を計数する。ステップ４の再懸濁細胞の容積は、ユーザの裁量に基づいて変化させることができる。１２）細胞を４０μｍストレーナーに通して新たな１５ｍＬファルコン（商標）チューブへと通過させ、氷上に置く（ＩＩ．固定および透過処理のステップ４に関する下記の注釈を参照）。１３）所望の数の核（典型的には２Ｍ）を１ｍＬの１×ＰＢＳ＋ＲＩに再懸濁し、以下の固定および透過処理プロトコールのステップ５へと進む。
【０１２８】
ＩＩ．固定および透過処理：１）以下の緩衝液を調製する（２回の実験用に算出）：ａ）１．３３％ホルマリン（３６０μＬの３７％ホルムアルデヒド水溶液（ＳＩＧＭＡ（登録商標））＋９．６６ｍｌのＰＢＳ）溶液、４℃で保管；ｂ）６ｍＬの１×ＰＢＳ＋ＲＩ（１５μＬのＳＵＰＥＲＡＳＥ−ＩＮ（商標）および７．５μＬのＥＮＺＹＭＡＴＩＣＳ（登録商標）ＲＮａｓｅ阻害剤）；ｃ）２ｍＬの０．５×ＰＢＳ＋ＲＩ（５μＬのＳＵＰＥＲＡＳＥ−ＩＮ（商標）および２．５μＬのＥＮＺＹＭＡＴＩＣＳ（登録商標）ＲＮａｓｅ阻害剤）；ｄ）５００μＬの５％ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００＋ＲＩ（２μＬのＳＵＰＥＲＡＳＥ−ＩＮ（商標））；ｅ）５００μＬの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０＋２μＬのＳＵＰＥＲＡＳＥ−ＩＮ（商標）；およびｆ）遠心分離機を４℃に設定する。
【０１２９】
２）５００×ｇで３分間４℃にて遠心分離することにより細胞をペレットにする（一部の細胞では、より速い遠心分離が必要となる場合がある）。３）細胞を１ｍＬの冷却ＰＢＳ＋ＲＩに再懸濁する。これらのステップ間は、細胞を氷上で維持する。４）細胞を４０μｍストレーナーに通して新たな１５ｍＬファルコン（商標）チューブへと通過させ、氷上に置く。注：細胞再懸濁物は、ストレーナーを受動的に通過しない可能性が高く、それにより細胞喪失が引き起こされる場合がある。代わりに、１ｍｌのピペットを再懸濁物で満たし、先端の端部をストレーナーに直接押し付け、液体を能動的に押し出す。この動作には、約１（一）秒間かけるべきである。５）３ｍＬの冷却１．３３％ホルムアルデヒドを添加する（終濃度は、１％ホルムアルデヒド）。細胞を氷上で１０分間固定する。６）１６０μＬの５％ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００＋ＲＩを固定細胞に添加し、１ｍＬピペットを用いて穏やかに５回上下にピペットすることにより混合する。細胞を氷上で３分間透過処理する。７）細胞を５００×ｇで３分間４℃にて遠心分離する。８）細胞を注意深く吸引し、５００μＬの冷却ＰＢＳ＋ＲＩに再懸濁する。９）５００μＬの冷却１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を添加する。１０）２０μＬの５％ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００を添加する。１１）細胞を５００×ｇで３分間４℃にて遠心分離する。１２）細胞を吸引し、３００μＬの冷却０．５×ＰＢＳ＋ＲＩに再懸濁する。
【０１３０】
１３）細胞を４０μＭストレーナーに通して、新しい１．７ｍＬチューブに入れる（ＩＩ．固定および透過処理のステップ４に関する上記に注釈を参照）。１４）血球計算器またはフローサイトメーターを使用して細胞を計数し、細胞懸濁物を１，０００，０００細胞／ｍＬに希釈する。細胞の計数中は、細胞懸濁物を氷上で維持する。注：このステップにより、分配−プールラウンドへと進む細胞の個数が決定されることになる。分配−プールラウンドへと進む細胞のサブセットのみを配列決定することが可能になるだろう（溶解ステップでのサブライブラリー生成中に行うことができる）。使用されることになるバーコード組合せの総数を算出して、最小限のバーコード衝突（barcode collisions）で配列決定することができる細胞の最大数を決定すべきである。いかなる１つの特定の理論にも拘泥するものではないが、処理されることになる細胞の数は、総バーコード組合せの５％を超過すべきでない。一般に、ここでは５００ｋ〜１Ｍ細胞／ｍＬの希釈物を使用することができる（４〜８ｋ細胞が、逆転写バーコード化ラウンドの各ウェルに入ることと等しい）。
【０１３１】
ＩＩＩ．逆転写：１）ＲＴバーコードストックプレートの４μＬを、新しい９６ウェルプレートの上部４（四）列（４８ウェル）にアリコートする。このプレートを、使用準備ができるまで粘着プレートシールで覆う。
【０１３２】
２）以下の逆転写（ＲＴ）ミックスを氷上で生成する（表３）：
【０１３３】
【表３】
2020534015.tif 000005
【０１３４】
３）８μＬのＲＴミックスを、上部４８ウェルの各々に添加する。各ウェルは、ここで１２μＬの容積を含んでいるはずである。４）０．５×ＰＢＳ＋ＲＩ中８μＬの細胞を、上部４８ウェルの各々に添加する。各ウェルは、ここで２０μＬの容積を含んでいるはずである。５）プレートを、以下のプロトコールのサーモサイクラーに追加する：ａ）５０℃で１０分間；ｂ）ｉ）８℃で１２秒間、ｉｉ）１５℃で４５秒間、ｉｉｉ）２０℃で４５秒間、およびｉｖ）３０℃で３０秒間、ｖ）４２℃で２分間、ｖｉ）５０℃で３分間のサイクルを３（三）回；ｃ）５０℃で５分間；およびｄ）その後は常に４℃。
【０１３５】
６）ＲＴプレートを氷上に置く。７）２０μＬのＥＮＺＹＭＡＴＩＣＳ（登録商標）ＲＮａｓｅ阻害剤を有する２ｍＬの１×ＮＥＢ緩衝液３．１を調製する。８）各ＲＴ反応物を１５ｍＬのＦＡＬＣＯＮ（商標）チューブに移す（この場合も氷上）。９）９．６μＬの１０％ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００を添加して、０．１％の終濃度を得る。１０）プールしたＲＴ反応物を５００×ｇで３分間遠心分離する。１１）上清を吸引し、２ｍＬの１×ＮＥＢ緩衝液３．１＋２０μＬのＥＮＺＹＭＡＴＩＣＳ（登録商標）ＲＮａｓｅ阻害剤に再懸濁する。
【０１３６】
ＩＶ．ライゲーションバーコード化：１）以下のライゲーションマスターミックスを氷上で作製する（表４）：
【０１３７】
【表４】
2020534015.tif 000006
【０１３８】
２）ＮＥＢ緩衝液３．１中２ｍＬの細胞を、ライゲーションミックスに添加する。このミックスは、ここでは４．０４ｍＬの容積を有しているはずである。３）ミックスを凹部分に添加する。４）マルチチャネルピペットを使用して、４０μＬのライゲーションミックス（細胞を有する）を、ラウンド１  ＤＮＡバーコードプレートの各ウェルに添加する。５）ラウンド１  ＤＮＡバーコードプレートを粘着プレートシールで覆い、穏やかに回転させながら（５０ｒｐｍ）３７℃で３０分間インキュベートする。６）ラウンド１ブロッキング溶液を作製し、それを新しい凹部分に添加する（表５）。
【０１３９】
【表５】
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【０１４０】
７）ラウンド１  ＤＮＡバーコード化プレートをインキュベータから取り出し、カバーを取り外す。８）マルチチャネルピペットを使用して、１０μＬのラウンド１ブロッキング溶液を、ラウンド１  ＤＮＡバーコード化プレートの９６ウェルの各々に添加する。９）ラウンド１  ＤＮＡバーコードプレートを粘着プレートシールで覆い、穏やかに回転させながら（５０ｒｐｍ）３７℃で３０分間インキュベートする。１０）ラウンド１  ＤＮＡバーコード化プレートをインキュベータから取り出し、カバーを取り外し、すべての細胞を新しい凹部分にプールする。１１）この凹部分の細胞をすべて、４０μｍストレーナーを通して別の凹部分へと通過させる（固定および透過処理のステップ４に関する上記の注記を参照）。１２）１００μＬのＴ４  ＤＮＡリガーゼをこの凹部分に添加し、約２０回ピペットすることにより混合する。１３）マルチチャネルピペットを使用して、５０μＬの細胞／ライゲーション溶液を、ラウンド２  ＤＮＡバーコードプレートの各ウェルに添加する。１４）ラウンド２  ＤＮＡバーコードプレートを粘着プレートシールで覆い、穏やかに回転させながら（５０ｒｐｍ）３７℃で３０分間インキュベートする。
【０１４１】
１５）ラウンド２  ブロッキング溶液を作製し、それを新しい凹部分に添加する（表６）。
【０１４２】
【表６】
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【０１４３】
１６）ラウンド２  ＤＮＡバーコード化プレートをインキュベータから取り出し、カバーを取り外す。１７）マルチチャネルピペットを使用して、２０μＬのラウンド２  ブロッキングおよび終止溶液を、ラウンド２  ＤＮＡバーコード化プレートの９６ウェルの各々に添加する。１８）すべての細胞を新しい凹部分にプールする（最終ブロッキングステップではインキュベーションしない）。１９）この凹部分の細胞をすべて、４０μｍストレーナーを通して１５ｍＬ  ＦＡＬＣＯＮ（商標）チューブへと通過させる（固定および透過処理のステップ４に関する上記の注記を参照）。１９）フローサイトメーターで細胞を計数する。計数するために試料をアリコートする前に、細胞が十分に混合されていることを確かめる。
【０１４４】
Ｖ．溶解：１）２×溶解緩衝液を作製する（表７）。
【０１４５】
【表７】
2020534015.tif 000009
【０１４６】
２）白色沈殿物が現れた場合、沈殿物が溶液に戻るまで３７℃で加温する（約１０〜１５分間）。
【０１４７】
３）以下の洗浄緩衝液を作製する（表８）。
【０１４８】
【表８】
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【０１４９】
４）７０μＬの１０％ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００を細胞に添加する（約０．１％の終濃度）。５）１５ｍｌチューブ中で１０００×ｇにて５分間遠心分離する。注：下記のステップでのペレットは非常に小さい場合があり、目に見えない場合がある。６）上清を吸引し、ペレットの取出しを回避するために約３０μｌを残し、ａ）可能な場合は、２０μＬのピペットを用いて上清をできるだけ取り出す。７）４ｍＬの洗浄緩衝液に再懸濁する。８）１０００×ｇで５分間遠心分離する。９）上清を吸引し、５０μｌの１×ＰＢＳ＋ＲＩに再懸濁する。
【０１５０】
１０）５μｌを、１９５μＬの１×ＰＢＳで希釈し、フローサイトメトリーで計数する。または、５μｌを取って５μｌの１×ＰＢＳに入れ、血球計算器で計数する（残渣と細胞とを区別するのは困難であり得る）。１１）幾つのサブライブラリーを生成するのか（サブライブラリーの数＝必要とされるチューブの数）、およびそうしたサブライブラリーの各々が幾つの細胞を有するのかを決定する。１２）各サブライブラリーの所望数の細胞を、新しい１．７ｍＬチューブにアリコートする。１×ＰＢＳを各チューブ添加して、最終容積を５０μＬにする。
【０１５１】
１３）５０μＬの２×溶解緩衝液を各チューブに添加する。１４）１０μＬのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬ）を各ライセートに添加する。１５）２００ｒｐｍで振盪しながら５５℃で２時間インキュベートする。１６）停止ポイント（任意選択）：ライセートを−８０℃で凍結する。
【０１５２】
ＶＩ．緩衝液を調製する。まず、以下のストック溶液を作製する（表９〜１１）。
【０１５３】
【表９】
2020534015.tif 000011
【０１５４】
【表１０】
2020534015.tif 000012
【０１５５】
【表１１】
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【０１５６】
その後、以下のより小さなアリコートを作製する（ＲＮａｓｅ阻害剤が添加されている；表１２〜１４）：
【０１５７】
【表１２】
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【０１５８】
【表１３】
2020534015.tif 000015
【０１５９】
【表１４】
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【０１６０】
ＶＩＩ．  ｃＤＮＡの精製  注：撹拌ステップは、発泡体１．７ｍＬチューブホルダーを用いて、低設定（２／１０）のボルテクサーで実施する。
【０１６１】
ＭＹＯＮＥ（商標）Ｃ１  ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）を洗浄する：１）処理する各ライセート毎に、４４μＬのＭＹＯＮＥ（商標）Ｃ１  ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）を１．５ｍＬチューブに添加する（例えば、１ライセート＝４４μＬ、２ライセート＝８８μＬ、３ライセート＝１３２μＬなど）。２）８００μＬの１×Ｂ＆ＷＴ緩衝液を添加する。３）試料を磁気ラックに設置し、液体が透明になるまで待機する（１〜２分間）。４）上清を除去し、ビーズを８００μＬの１×Ｂ＆Ｗ−Ｔ緩衝液に再懸濁する。５）ステップ３〜４をさらに２回繰り返して、合計３回洗浄する。６）試料を磁気ラックに設置し、液体が透明になるまで待機する。７）ビーズを１００μＬ（１試料当たり）の２×Ｂ＆Ｗ緩衝液＋ＲＩに再懸濁する。
【０１６２】
ストレプトアビジンに対する試料の結合：１）５μＬの１００μＭ  ＰＭＳＦを各試料に添加し、室温で１０分間置いておく。２）１００μｌの再懸濁（resupended）Ｃ１ビーズを各チューブに添加する。３）ｃＤＮＡをＣ１ビーズに結合させるために、室温で６０分間撹拌する。４）試料を磁気ラックに設置し、液体が透明になるまで待機する（１〜２分間）。５）上清を除去し、ビーズを２５０μＬの１×Ｂ＆Ｗに再懸濁する。６）ビーズを室温で５分間撹拌する。７）ステップ５および６を繰り返す。８）上清を除去し、ビーズを２５０μＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋Ｔに再懸濁する。９）ビーズを室温で５分間撹拌する。１０）ビーズを氷上の最終洗浄溶液に入れたままにしておく。
【０１６３】
テンプレートスイッチ。試料数に応じて、以下のミックスを調製する（表１５）。
【０１６４】
【表１５】
2020534015.tif 000017
【０１６５】
１）試料を磁気ラックに設置し、液体が透明になるまで待機する。２）試料を依然として磁気ラックに付けたまま、上清を除去し、２５０μＬの水で洗浄する（今回はビーズを再懸濁しない）。３）試料を２００μｌのテンプレートスイッチミックスに再懸濁する。４）  撹拌または回転させながら室温で３０分間インキュベートする。５）撹拌または回転させながら（インキュベータを１００ｒｐｍで振盪する）４２℃で９０分間インキュベートする。
【０１６６】
６）潜在的な停止ポイント。停止させる場合、以下を実施する（そうでなければ飛ばして次のセクションに進む）：ａ）試料を磁気ラックに設置し、液体が透明になるまで待機し、ｂ）２５０μＬのＴｒｉｓ−Ｔに再懸濁する。
【０１６７】
ＶＩＩＩ．  ｃＤＮＡ増幅。試料数に応じて、以下のＰＣＲミックスを調製する（表１６）。
【０１６８】
【表１６】
2020534015.tif 000018
【０１６９】
１）試料を磁気ラックに設置し、液体が透明になるまで待機する。２）試料を磁気ラックに当てたまま、２５０μＬの無ヌクレアーゼ水で洗浄する（再懸濁しない）。３）試料を２２０μＬのＰＣＲミックスに再懸濁し、４（四）つの異なるＰＣＲチューブに等しく分配する。
【０１７０】
４）以下のサーモサイクルプログラムを実行する：ａ）９５℃、３分間；ｂ）９８℃、２０秒間；ｃ）６５℃、４５秒間；ｄ）７２℃、３分間；ｅ）（ｂ〜ｄ）を４回繰り返す（合計５サイクル）；およびｆ）４℃、維持。
【０１７１】
５）４（四）つの反応物をすべて、単一１．７ｍＬチューブで組み合わせる。反応物を組み合わせる前に、ＰＣＲチューブの底部または側面に付着している場合のあるすべてのビーズを確実に再懸濁する。６）試料を磁気ラックに設置し、液体が透明になるまで待機する。７）２００μＬの上清を、４（四）つの光学グレードｑＰＣＲチューブに移す（各チューブ中５０μＬ）。８）２．５μＬの２０×ＥＶＡＧＲＥＥＮ（登録商標）を各ｑＰＣＲチューブに添加する。９）以下のｑＰＣＲプログラムを実行する（過剰増幅を防止するために、シグナルが対数期を過ぎ始めたら、試料を確実に取り出すこと）：ａ）９５℃、３分間；ｂ）９８℃、２０秒間；ｃ）６７℃、２０秒間；ｄ）７２℃、３分間；ｅ）シグナルが指数関数的増幅から横ばい状態になるまで（ｂ〜ｄ）を繰り返す；ｆ）７２℃、５分間；およびｇ）４℃、維持。
【０１７２】
１０）任意選択：アガロースゲルを流すか、または得られたｑＰＣＲをバイオ分析する。ｃＤＮＡおよび二量体の組合せが存在することになる可能性が高いだろう。
【０１７３】
ＳＰＲＩサイズ選択（０．８×）。１）ｑＰＣＲ反応物を単一チューブで組み合わせる。２）プールしたｑＰＣＲ反応物の１８０μＬを取り出し、新しい１．７ｍＬチューブに入れる。３）１４４μＬのＫＡＰＡ（商標）ピュアビーズをチューブに添加し、手短にボルテックスして混合する。５（五）分間待機してＤＮＡに結合させる。４）チューブを磁気ラックに設置し、液体が透明になるまで待機する。５）上清を除去する。６）チューブを依然として磁気ラックに付けたまま、７５０μＬの８５％エタノールで洗浄する。ビーズを再懸濁しないこと。７）ステップ６を繰り返す。
【０１７４】
８）エタノールを除去し、ビーズを空気乾燥する（約５分間）。ビーズを過剰に乾燥させて亀裂させないこと。９）各チューブのビーズを２０μＬの水に再懸濁する。ビーズを水に完全に再懸濁したら、チューブを３７℃で１０分間インキュベートする。１０）チューブを磁気ラックに取り付け、液体が透明になるまで待機する。１１）１８．５μＬの溶出液を新しい光学グレードＰＣＲチューブに移す。１２）１０μＬの溶出液に対してバイオアナライザートレースを実行する。
【０１７５】
１３）サイズ選択後に二量体が存在しない場合、下記の「タグメンテーションおよびＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）アンプリコン生成」セクションへと直接移行する。二量体が依然として存在する場合、ステップ１４に進んで、第２の増幅およびサイズ選択ステップを実施する。これは、ＲＮＡ含量が低い細胞の場合に必要な場合があるが、ＲＮＡ含量が高い細胞（例えば、ＨｅＬａ−Ｓ３、ＮＩＨ／３Ｔ３など）では不要なはずである。
【０１７６】
第２のｑＰＣＲ（任意選択）。１４）試料数に応じて、以下のＰＣＲミックスを作製する（表１７）。
【０１７７】
【表１７】
2020534015.tif 000019
【０１７８】
１５）３１．５μＬのｑＰＣＲマスターミックスを、以前のＰＣＲ試料を有する各光学ＰＣＲチューブに添加する。チューブを軽く手ではじいて混合し、卓上型遠心分離機で手短に遠心して気泡を除去する。１６）以下のｑＰＣＲプログラムを実行する（過剰増幅を防止するために、シグナルが対数期を過ぎ始めたら、試料を確実に取り出すこと）：ａ）９５℃、３分間；ｂ）９８℃、２０秒間；ｃ）６７℃、２０秒間；ｄ）７２℃、３分間；ｅ）シグナルが指数関数的増幅から横ばい状態になるまで（ｂ〜ｄ）を繰り返す；ｆ）７２℃、５分間；およびｇ）４℃、維持。
【０１７９】
１７）アガロースゲルを流すか、または得られたｑＰＣＲをバイオ分析する。二量体が依然として存在し得る間は、増幅ｃＤＮＡが、５００ｂｐ〜２５００ｂｐに明白に視認されるはずである（予想サイズ分布は、図１９左側を参照）。
【０１８０】
第２のＳＰＲＩサイズ選択（０．８×）。１８）ｑＰＣＲ反応物を単一チューブで組み合わせる。１９）ｑＰＣＲ反応物の４０μＬを取り出し、新しい１．７ｍＬチューブに入れる。２０）３２μＬのＫＡＰＡ（商標）ピュアビーズを各チューブに添加し、手短にボルテックスして混合する。５分間待機してＤＮＡに結合させる。
【０１８１】
２１）チューブを磁気ラックに設置し、液体が透明になるまで待機する。２２）上清を除去する。２３）チューブを依然として磁気ラックに付けたまま、７５０μＬの８５％エタノールで洗浄する。２４）ステップ５を繰り返す。２５）エタノールを除去し、ビーズを空気乾燥する（約５分間）。ビーズを過剰に乾燥させて亀裂させないこと。２６）各チューブのビーズを２０μＬの水に再懸濁し、５分間待機する。２７）チューブを磁気ラックに取り付け、液体が透明になるまで待機する。２８）１８．５μＬの溶出液を１．７ｍＬチューブに移す。２９）アガロースゲルを流すか、または得られたｑＰＣＲをバイオ分析する。この時点で二量体はほとんど存在しないはずである。二量体が残留している場合、別のラウンドのｑＰＣＲを実施し、続いて０．８×ＳＰＲＩサイズ選択をもう一度行う。
【０１８２】
ＩＸ．タグメンテーションおよびＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）アンプリコン生成。１）増幅したｃＤＮＡをＱｕｉｂｉｔで定量化し、０．１２ｎｇ／μＬに希釈する。２）サーモサイクラーを５５℃に予熱する。３）各試料について、６００ｐｇの精製ｃＤＮＡをＨ２Ｏと組み合わせて、総容積を５μｌにする。４）各チューブに、１０μｌのＮｅｘｔｅｒａ  ＴＤ緩衝液および５μｌのアンプリコンタグメント酵素（Amplicon Tagment enzyme）を添加する（反応の総容積は、ここでは２０μｌである）。約５回ピペットすることにより混合し、遠沈する。５）５５℃で５分間インキュベートする。６）５μｌの中和緩衝液を添加する。約５回ピペットすることにより混合し、遠沈する（気泡は異常ではない）。７）室温で５分間インキュベートする。
【０１８３】
８）各ＰＣＲを以下の順序でチューブに添加する：
ｉ）１５μｌのＮｅｘｔｅｒａ  ＰＣＲミックス；ｉｉ）．８μｌのＨ２Ｏ；ｉｉｉ）１μｌの１０μＭ（Ｎ７インデックス付きプライマー、ＢＣ＿００７６〜ＢＣ＿００８３の１つ）；およびｉｖ）１μｌの１０μＭ  Ｎｅｘｔｅｒａ（ＢＣ＿０１１８）Ｎ５０１オリゴ。９）以下のサーモサイクルプログラムを実行する：ｉ）９５℃、３０秒間；ｉｉ）ａ）９５℃、１０秒間；ｂ）５５℃、３０秒間；およびｃ）７２℃、３０秒間を１２サイクル；ならびにｉｉｉ）その後７２℃で５分間およびその後常に４℃。
【０１８４】
１０）５０μＬ反応物の４０μｌを１．７ｍＬチューブに移す。１１）２８μＬのＫＡＰＡ（商標）ピュアビーズを添加して、０．７×クリーンアップを行う。２０μｌを溶出する。１２）得られた試料をバイオ分析し、配列決定の前にＱｕｉｂｉｔで定量化する（予想サイズ分布は、図１９右側を参照）。
【０１８５】
Ｘ．  ＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）配列決定。１）１５０ｂｐキットで実行されるペアエンド配列決定を使用する。２）リード１を６６ｎｔに設定する（転写物配列）。３）リード２を９４ｎｔに設定する（細胞特異的バーコードおよびＵＭＩ）。４）６ｎｔのリード１インデックスを含めて、サブライブラリーインデックスを準備する。
【０１８６】
実施例１１−氷上での細胞固定および透過処理のための氷上での細胞維持
固有分子インデックス（ＵＭＩ）は、増幅前に各転写物／ｃＤＮＡに添加されるランダム分子バーコードである。固有分子インデックスは、コンピューターによるＰＣＲ複製物の除外を可能にする。これは、そうした複製物が同じＵＭＩ配列を有するため可能になる。したがって、複数のＰＣＲ複製物を配列決定したとしても、元の転写物は各々１回だけ計数されることになる。
【０１８７】
１細胞当たりのＵＭＩの尺度は、１細胞当たり幾つの固有ＲＮＡ分子を検出することができるかを示す。これは、分子をバーコード化および処理して、次世代配列決定による検出を可能にする効率の程度に直接関連する。この尺度は、一般に、当分野における究極の基準であり、単一細胞ＲＮＡ配列決定空間に関するほとんどの研究者は、所与量の生配列決定リードで検出される１細胞当たりのＵＭＩ数に基づいて、実験がどの程度うまくいくかを決定する（例えば、１細胞当たり５０，０００個の配列リードの場合、１細胞当たり１０，０００個のＵＭＩ）。
【０１８８】
実施例１１〜１６の各々について、同じ表（つまり、表１８、表１９、表２０、表２１、および表２２）内ではすべての条件を同じ飽和レベルに配列決定し、条件にわたって正確な比較を可能にした。各条件は、別の条件と比較して同数の生配列決定リードを有していた。これは、１細胞当たりの検出されたＵＭＩの検出された違いが、配列決定の深さではなく、条件の変化によるものであったことを示していた。
【０１８９】
他のプロトコールでは（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，ＡＢら、ＢｉｏＲｘｉｖ（２０１７年）：１０５１６３頁を参照）、ホルムアルデヒド固定を室温で実施する。本明細書では、実験を実施して、固定および透過処理中に細胞を氷上で（例えば、４℃で）維持すると相当な向上があることを示した（表１８を参照）。
【０１９０】
【表１８】
2020534015.tif 000020
【０１９１】
実施例１２−プロテアーゼ阻害剤（ＰＭＳＦ）の添加、およびストレプトアビジンビーズへの直接結合
他のプロトコールでは（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，ＡＢら、ＢｉｏＲｘｉｖ（２０１７年）：１０５１６３頁を参照）、まず、ＳＰＲＩビーズクリーンアップを用いて核酸を溶解溶液から単離してから、所望の核酸（５’ビオチンを含む）をストレプトアビジンビーズに結合させる。本明細書では、ＰＭＳＦをライセートに添加し、その後ストレプトアビジンビーズを直接添加することにより（それにより核酸の最初のＳＰＲＩ単離を飛ばして次に進む）、１細胞当たりの検出された固有分子の数の向上が見出された（表１９を参照）。
【０１９２】
【表１９】
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【０１９３】
実施例１３−０．６×対０．８×ＳＰＲＩクリーンアップ
他のプロトコールでは（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，ＡＢら、ＢｉｏＲｘｉｖ（２０１７年）：１０５１６３頁を参照）、ｃＤＮＡ増幅後、０．６×ＳＰＲＩクリーンアップを実施した。ｃＤＮＡ増幅後、ＳＰＲＩクリーンアップを使用して、短鎖産物（つまり、約２００塩基対未満の産物）を除去することができる。本明細書では、０．８：１比のＳＰＲＩビーズをＰＣＲ産物に添加することにより、１細胞当たりの検出された固有ＲＮＡ分子が、以前の０．６：１比のＳＰＲＩ対ＰＣＲ産物の場合よりも多くなったことが見出された（表２０を参照）。
【０１９４】
【表２０】
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【０１９５】
実施例１４−ランダム六量体およびポリｄＴ  ＲＴプライマーの濃度
他のプロトコールでは（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，ＡＢら、ＢｉｏＲｘｉｖ（２０１７年）：１０５１６３頁を参照）、ポリｄＴプライマーのみを逆転写に使用して逆転写を実施する。本明細書では、バーコード化ランダム六量体プライマーを組み合わせること、および濃度を変更することにより、ＵＭＩ／細胞の著しい増加がもたらされたことが見出された。表２１を参照すると、プロトコール、バージョン２．１では、条件番号４（７２９ＵＭＩ／細胞）を使用する。引き続き表２１を参照すると、本明細書では、条件番号１０を使用した（１２６３ＵＭＩ／細胞）。このように、特定の濃度のランダム六量体およびポリｄＴ逆転写プライマーを一緒に組み合わせることにより、ｉｎ  ｓｉｔｕ逆転写の効率が増加する。
【０１９６】
【表２１】
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【０１９７】
実施例１５−試料識別子としての第１ラウンドバーコードの使用
バーコード化逆転写プライマーを使用して、ｃＤＮＡ分子で第１ラウンドバーコードを生成した。その後、上記に記載のようにバーコードをライゲーションにより５’末端に付加することにより、こうしたｃＤＮＡ分子をさらにバーコード化する。
【０１９８】
概念実証は、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，ＡＢら、（２０１８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、３６０巻（６３８５号）；１７６〜１８２頁に記載されている。この文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載のように、実験は４（四）つの固有の試料を含んでいた。どの細胞がどの試料に属するかは、本質的には、第１のバーコード（ＲＴにより組み込まれた）を観察することにより追跡した。この試料識別は、各ウェルに対応するバーコード配列およびどの試料をどのウェルに入れたかが既知であることを必要とする場合がある。この情報を用いると、第１ラウンドバーコード配列からサンプルＩＤまでの参照表を作成することができる。
【０１９９】
図２０および２１は、試料を多重化するために実験設定を示す。この特定の場合では、４つの試料を９６ウェルプレートの４８ウェルにわたって多重化した。この同じ理論を拡張すると、最大９６試料を単一実験で多重化できることを理解することができる。
【０２００】
図２２を参照すると、４つの異なる生物学的試料を用いた実験におけるＴ分布型確率的近傍埋め込み法（ｔ−ＳＮＥ）を使用したトランスクリプトームの分析が示されている。各点は、１つの個々の細胞に由来するトランスクリプトームを表す。ＲＴ（バーコード化ＲＴプライマーを用いた）中に組み込まれたバーコードの同一性を使用して、各トランスクリプトームの試料同一性を決定することができる。
【０２０１】
実施例１６−磁気ビーズに結合したＤＮＡ／ＲＮＡのテンプレートスイッチのためのＰＥＧ組込み
逆転写ＲＮＡに付着したビオチン化オリゴ（ｃＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖）を、ストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズに結合させる。その後、単一の共通アダプター配列をｃＤＮＡの３’末端に組み込むことができるように、このｃＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖に対してテンプレートスイッチを実施する。１０ｗ／ｖ％までのＰＥＧ（分子量７０００〜９０００）を、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズに結合したｃＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖を含むテンプレートスイッチ反応に組み込むことにより、１細胞当たりの転写物検出により測定されるこのステップの効率を向上させることができる（表２２）。
【０２０２】
【表２２】
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【０２０３】
実施例１８−ＲＮＡ分子を固有に標識化する例示的な方法
図２３のパネルＡは、分配−プールバーコード化によるトランスクリプトームの標識化を示す。各分配−プールラウンドでは、固定細胞または核を無作為にウェルに分配することができ、転写物をウェル特異的バーコードで標識化することができる。バーコード化ＲＴプライマーを、第１ラウンドに使用することができる。第２および第３ラウンドバーコードを、ライゲーションによりｃＤＮＡに付加することができる。第４のバーコードを、配列決定ライブラリー調製中にＰＣＲによりｃＤＮＡ分子に付加することができる。最下段のスキームは、最終バーコード化ｃＤＮＡ分子を示す。
【０２０４】
図２３のパネルＢは、１，７５８個の全細胞から調製されたライブラリーによる種混合実験を示す。ヒトＵＢＣは、ｘ軸に沿って水平に伸長し、マウスＵＢＣはｙ軸に沿って垂直に伸長し、混合種ＵＢＣは、ヒトＵＢＣとマウスＵＢＣの間に分布する。推定バーコード衝突頻度は、０．２％であるが、種純度は＞９９％である。
【０２０５】
図２３のパネルＣは、新鮮凍結（−８０℃で２週間保管した）細胞および核で実施した混合実験に由来するＵＭＩ計数を示す。新鮮細胞のヒトＵＭＩ計数中央値：１５，３６５；凍結細胞：１５，０７８；核：１２，１１３；凍結核：１３，６３６。
【０２０６】
図２３のパネルＤは、ここで提供された方法により測定した遺伝子発現が、凍結細胞と直ちに処理した細胞との間で高度に相関することを示す（ピアソン−ｒ：０．９８７）。凍結新鮮細胞を、２つの異なるＳＰＬｉＴ−ｓｅｑ実験で処理した。
【０２０７】
図２４に図示されているように、固定および透過処理した細胞を、ウェル特異的バーコードを有する逆転写プライマーを各々が含むウェルに無作為に分配することができる。ｉｎ  ｓｉｔｕ逆転写は、ウェル特異的バーコードを付加すると共に、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する。その後、細胞をプールし、各々が固有のウェル特異的バーコードを含む第２のセットのウェルに再度無作為に分配することができる。こうしたバーコードを、バーコード化逆転写プライマーの５’末端にハイブリダイズおよびライゲーションして、第２ラウンドのバーコード化に付加することができる。細胞をプールして再び一緒にし、その後の分配−ライゲーション−プールラウンドを実施することができる。最後のラウンドのライゲーション後、ｃＤＮＡ分子は、バーコード、固有分子識別子、およびユニバーサルＰＣＲハンドルの細胞特異的組合せを５’末端に含む。ライブラリー調製のＰＣＲステップ中に、第４のバーコード化ラウンドを実施することができる。
【０２０８】
表２３に列挙されているオリゴヌクレオチドを、上記の実施例で使用した。「ｒＧ」はＲＮＡ塩基であり、「＋Ｇ」はロックド核酸塩基である。
【０２０９】
【表２３−１】
2020534015.tif 000025
【０２１０】
【表２３−２】
2020534015.tif 000026
【０２１１】
本開示を実施するための本発明者らに知られている最良のモードを含む、本開示のある特定の実施形態が本明細書に記載されている。無論、こうした記載されている実施形態に対する変異は、当業者であれば、上述の説明を読むと明白になるだろう。本出願人らは、当業者が必要に応じてそのような変異を使用することを予想し、本出願人らは、本開示の種々の実施形態が、本明細書の具体的な記載とは別様に実施されることを意図する。したがって、本開示は、本明細書に添付されている特許請求の範囲に記載されている主題の、準拠法により許容される改変および均等物をすべて含む。さらに、それらのありとあらゆるこれらの変異の上記に記載の要素の任意の組合せは、別様の指定がない限り、またはそうでなければ状況と明らかに矛盾しない限り、本開示により包含される。
【０２１２】
さらに、本明細書の全体にわたって、多数の参照が特許および印刷刊行物になされている。上記で引用された参考文献および印刷刊行物の各々は、それらの全体が参照により個々に本明細書に組み込まれる。
【０２１３】
本開示の実施形態は、本開示の原理の例示であることが理解されるべきである。使用することができる他の改変は、本開示の範囲内にある。したがって、例であり、限定ではないが、本開示の代替的構成を、本明細書の教示に従って使用することができる。したがって、本開示は、図示および記載されているものとまったく同じものに限定されない。
【０２１４】
本明細書で示されている詳細は、例であり、本開示の好ましい実施形態を例示的に考察するためのものに過ぎず、本開示の種々の実施形態の原理および概念的態様の最も有用で容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示されている。
【０２１５】
上記に記載の実施形態の詳細に対して本開示の根本原理から逸脱せずに多数の変更をなすことができることは、当業者であれば明白だろう。したがって、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によってのみ決定されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2020534015.tif 000030
【図４】
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【図５】
2020534015.tif 000032
【図６】
2020534015.tif 000033
【図７】
2020534015.tif 000034
【図８】
2020534015.tif 000035
【図９Ａ】
2020534015.tif 000036
【図９Ｂ】
2020534015.tif 000037
【図１０】
2020534015.tif 000038
【図１１】
2020534015.tif 000039
【図１２】
2020534015.tif 000040
【図１３】
2020534015.tif 000041
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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