(57)【要約】活性剤の制御放出のために、活性剤が負荷された1以上のナノ粒子またはマイクロ粒子によって表面が化学的に修飾されている免疫エフェクター細胞を含む組成物が本明細書に記載される。例となる薬剤が負荷されたナノ粒子には、Ａ２ａ受容体の阻害剤を封入している架橋された多重膜リポソーム（ｃＭＬＶ）が含まれる。修飾された免疫エフェクター細胞は表面上に１以上のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提示してもよい。がんを治療するためのその使用方法もまた提供される。2020511147.tif 000005
2020511147.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
操作された免疫エフェクター細胞であって、
（ａ）免疫エフェクター細胞と、
（ｂ）前記免疫エフェクター細胞の表面に化学的に結合された粒子とを含み、
前記免疫エフェクター細胞は１以上のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを含有するかまたはＣＡＲを発現し、
前記粒子に、アデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）の阻害剤が封入されている、
前記操作された免疫エフェクター細胞。
【請求項２】
前記免疫エフェクター細胞が、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、腫瘍特異的Ｔリンパ球及び造血幹細胞の１種以上を含む、請求項１に記載の操作された免疫エフェクター細胞。
【請求項３】
前記免疫エフェクター細胞が自己由来である、請求項２に記載の操作された免疫エフェクター細胞。
【請求項４】
前記Ａ２ＡＲ阻害剤が、ＳＣＨ５８２６１、カフェイン、ＳＹＮ１１５、ＦＳＰＴＰ、ＺＭ２４１３８５、ＰＢＳ−５０９、ＳＴ１５３５、ＳＴ４２０６、トザデナント、Ｖ８１４４４、またはイストラデフィリンを含む、請求項１に記載の操作された免疫エフェクター細胞。
【請求項５】
前記Ａ２Ａ受容体阻害剤がＳＣＨ５８２６１である、請求項４に記載の操作された免疫エフェクター細胞。
【請求項６】
前記粒子が、リポソームを含むナノ粒子もしくはマイクロ粒子である、または高分子粒子である、請求項１に記載の操作された免疫エフェクター細胞。
【請求項７】
前記粒子が、架橋された多重膜リポソーム（ｃＭＬＶ）である、請求項５に記載の操作された免疫エフェクター細胞。
【請求項８】
前記免疫エフェクター細胞がＴ細胞であり、前記粒子がｃＭＬＶであり、Ａ２ＡＲの前記阻害剤がＳＣＨ５８２６１である、請求項１に記載の操作された免疫エフェクター細胞。
【請求項９】
前記ＣＡＲが標的とする抗原が、４−１ＢＢ、５Ｔ４、腺癌抗原、アルファ−フェトプロテイン、ＢＡＦＦ、Ｂ−リンパ腫細胞、Ｃ２４２抗原、ＣＡ−１２５、炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ）、Ｃ−ＭＥＴ、ＣＣＲ４、ＣＤ１５２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ２２、ＣＤ２２１、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２８、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＥＡ、ＣＮＴＯ８８８、ＣＴＬＡ−４、ＤＲ５、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３、ＦＡＰ、フィブロネクチンエキストラドメイン−Ｂ、葉酸受容体１、ＧＤ２、ＧＤ３ガングリオシド、糖タンパク質７５、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＧＦ、ヒト散乱因子受容体キナーゼ、ＩＧＦ−１受容体、ＩＧＦ−Ｉ、ＩｇＧ１、Ｌ１−ＣＡＭ、ＩＬ−１３、ＩＬ−６、インスリン様増殖因子Ｉ受容体、インテグリンα５β１、インテグリンαｖβ３、ＭＯＲＡｂ−００９、ＭＳ４Ａ１、ＭＵＣ１、ムチンＣａｎＡｇ、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、ＮＰＣ−１Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｒα、ＰＤＬ１９２、ホスファチジルセリン、前立腺癌細胞、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＮ、ＲＯＲ１、ＳＣＨ９００１０５、ＳＤＣ１、ＳＬＡＭＦ７、ＴＡＧ−７２、テネイシンＣ、ＴＧＦベータ２、ＴＧＦ−β、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ２、ビメンチン、及びそれらの組み合わせのいずれか１以上である、請求項１に記載の操作された免疫エフェクター細胞。
【請求項１０】
がんを治療する、がんを抑制する、またはがんの重症度もしくは可能性を軽減することを必要とする対象においてがんを治療する、がんを抑制する、またはがんの重症度もしくは可能性を軽減するための方法であって、
治療上有効な量の操作された免疫エフェクター細胞を前記対象に投与することを含み、
各操作された免疫エフェクター細胞は
（ａ）免疫エフェクター細胞と
（ｂ）前記免疫エフェクター細胞の表面に化学的に結合された粒子とを含み、
前記免疫エフェクター細胞は１以上のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを含有するかまたはＣＡＲを発現し、
前記粒子に、アデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）の阻害剤が封入される、前記方法。
【請求項１１】
疾患を治療する、疾患を抑制する、または疾患の重症度もしくは可能性を軽減することを必要とする対象において疾患を治療する、疾患を抑制する、または疾患の重症度もしくは可能性を軽減するための方法であって、
治療上有効な量の操作された免疫エフェクター細胞を前記対象に投与することを含み、
各操作された免疫エフェクター細胞は
（ａ）免疫エフェクター細胞と
（ｂ）前記免疫エフェクター細胞の表面に結合された、架橋された多重膜リポソーム（ｃＭＬＶ）とを含み、
前記免疫エフェクター細胞は１以上のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含有するかまたはＣＡＲを発現し、
前記ｃＭＬＶに、アデノシンＡ２Ａ受容体の阻害剤が封入される、前記方法。
【請求項１２】
前記免疫エフェクター細胞が、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、腫瘍特異的Ｔリンパ球及び造血幹細胞の１種以上を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記免疫エフェクター細胞がＴ細胞であり、前記粒子がｃＭＬＶであり、Ａ２ＡＲの前記阻害剤がＳＣＨ５８２６１である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ａ２Ａ受容体阻害剤が、ＳＣＨ５８２６１、カフェイン、ＳＹＮ１１５、ＦＳＰＴＰ、ＺＭ２４１３８５、ＰＢＳ−５０９、ＳＴ１５３５、ＳＴ４２０６、トザデナント、Ｖ８１４４４、またはイストラデフィリンを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ａ２Ａ受容体阻害剤がＳＣＨ５８２６１である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記疾患が、がんである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法が、化学療法、放射線療法及びそれらの組み合わせから成る群から選択される既存の治療法を前記対象に施すことをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記既存の治療法が、前記操作された免疫エフェクター細胞と逐次的にまたは同時に施される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＣＡＲが標的とする抗原が、４−１ＢＢ、５Ｔ４、腺癌抗原、アルファ−フェトプロテイン、ＢＡＦＦ、Ｂ−リンパ腫細胞、Ｃ２４２抗原、ＣＡ−１２５、炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ）、Ｃ−ＭＥＴ、ＣＣＲ４、ＣＤ１５２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ２２、ＣＤ２２１、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２８、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＥＡ、ＣＮＴＯ８８８、ＣＴＬＡ−４、ＤＲ５、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３、ＦＡＰ、フィブロネクチンエキストラドメイン−Ｂ、葉酸受容体１、ＧＤ２、ＧＤ３ガングリオシド、糖タンパク質７５、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＧＦ、ヒト散乱因子受容体キナーゼ、ＩＧＦ−１受容体、ＩＧＦ−Ｉ、ＩｇＧ１、Ｌ１−ＣＡＭ、ＩＬ−１３、ＩＬ−６、インスリン様増殖因子Ｉ受容体、インテグリンα５β１、インテグリンαｖβ３、ＭＯＲＡｂ−００９、ＭＳ４Ａ１、ＭＵＣ１、ムチンＣａｎＡｇ、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、ＮＰＣ−１Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｒα、ＰＤＬ１９２、ホスファチジルセリン、前立腺癌細胞、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＮ、ＲＯＲ１、ＳＣＨ９００１０５、ＳＤＣ１、ＳＬＡＭＦ７、ＴＡＧ−７２、テネイシンＣ、ＴＧＦベータ２、ＴＧＦ−β、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ２、ビメンチン、及びそれらの組み合わせのいずれか１以上である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象が、前から存在する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を有するか、または以前にＣＡＲ−Ｔ細胞療法を受けたことがある、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、その開示が全体として参照によって本明細書に組み入れられる２０１７年３月２０日に出願された米国仮特許出願番号６２／４７３，５９４に対する優先権及びその利益を主張する。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＡＩ０６８９７８及びＥＢ０１７２０６のもとでの政府の支援によって行われた。政府は本発明にて特定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明の種々の実施形態はがんを治療するための組成物及び方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
本明細書における出版物はすべて、各個々の出版物または特許出願が具体的に且つ個々に参照によって組み入れられるように指示されたのと同程度に参照によって組み入れられる。以下の記載は本発明を理解するのに有用であってもよい情報を含む。それは、本明細書で提供されている情報のいずれかが従来技術である、もしくは現在請求されている本発明に関連する、または具体的にもしくは暗に参照されている出版物が従来技術であると見なすべきではない。
【０００５】
ＣＡＲ操作したＴ細胞の養子移入療法は、血液起源の腫瘍において、特に前臨床試験及び臨床試験にて白血病及びＢ細胞リンパ腫におけるＣＤ１９ＣＡＲが、成功を実証している。これらの有望な成績にもかかわらず、固形腫瘍に向けたＣＡＲ−Ｔ細胞療法の臨床応用は限定されている。これらの欠点は、血液悪性腫瘍には存在しない独特のバリアを有する腫瘍の微小環境のせいである。
【０００６】
血流にて体全体を通して循環する血液がんとは異なって、固形腫瘍はそれ自体の複雑な腫瘍微小環境（ＴＭＥ）を有し、それは免疫療法に対して独特のバリアを提供している。効果的であるには、免疫細胞は固形腫瘍塊に効率的に浸潤し、生体内での細胞の増殖が持続し続けなければならない。ＴＭＥは、がんを殺傷する免疫細胞が腫瘍領域に侵入するのを妨げるように、且つ腫瘍に浸潤しているリンパ球（ＴＩＬ）の活性を損なうように機能する種々の腫瘍形成促進性の因子を含有する。これらの免疫抑制性メカニズムの多くも養子移入されるＣＡＲ操作したＴ細胞に悪影響を及ぼすことができる。
【０００７】
実際、幾つかの研究は、定着したヒト固形腫瘍を有する免疫欠損マウスに注射された後、強力な免疫抑制環境によってＣＡＲ  Ｔ細胞の治療有効性を限定するエフェクター機能の急速な喪失を示す証拠を提示した。腫瘍が誘導するこの腫瘍に浸潤したＴ細胞（ＴＩＬ）の機能低下は複数のメカニズムによって引き起こされる。
【０００８】
腫瘍微小環境におけるＣＡＲ  Ｔ細胞エフェクター機能の進行性の喪失に関与する根底にある要因の１つは異常に高まった濃度の細胞外免疫抑制分子によってもたらされる細胞外の阻害経路である。
【０００９】
Ａ２ａアデノシン受容体（Ａ２ＡＲ）は活性化Ｔ細胞の表面で発現される。Ａ２ａＲ経路は、異常に高い濃度の細胞外免疫抑制分子であるアデノシンが引き金となり、それはＴ細胞の増殖及びＩＦＮ−γの分泌を抑制すると報告されている。ＴＭＥでは、組織の損傷及び細胞ストレスに応答して細胞外アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）が放出される。細胞外環境におけるＡＴＰは、低酸素のＴＭＥにおいて上方調節されているエクトヌクレアーゼＣＤ３９及びＣＤ７３によってアデノシンに変換される。ＣＤ７３の過剰発現は複数の悪性がんで観察されており、抗腫瘍剤に対する耐性を付与する。Ａ２ａＲへのアデノシンの結合はＴＩＬにおける細胞内環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）産生の上昇を招く。細胞内ｃＡＭＰの上昇はタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）の活性化及びｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質（ＣＲＥＢ）のリン酸化を誘導し、それは、結果としてＡｋｔ経路の活性を低下させ、ＮＦ−κＢが介在する免疫活性化を阻害することによってＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のシグナル伝達及びＩＦＮγの産生を無効にする。
【００１０】
研究は、薬理学的な阻害または遺伝子欠損のいずれかによるＡ２ａＲの経路の遮断は、細胞傷害性Ｔ細胞の有効性及び生体内での持続を高めることによって抗腫瘍免疫を有意に改善したことを実証している。ＳＣＨ−５８２６１は、他のアデノシン受容体と比べて５０倍を超える高いＡ２Ａへの選択性を持つ、アデノシン受容体Ａ２Ａに対する強力で且つ選択的なアンタゴニストである。その治療上の潜在力にもかかわらず、薬剤の不十分な溶解性及び生体内ＰＫプロファイルによってその臨床開発は遅れている。さらに、移入されたＣＡＲ  Ｔ細胞に直接作用するこれらの小分子薬剤は有効性のためには高く且つ持続する全身性レベルで維持される必要がある。標的抗原を有する正常組織への副作用を出来るだけ抑えながら、生体内での循環時間を調節し、特異的に且つ効率的に腫瘍に薬剤を送達することができる効果的なキャリアを開発することは難題のままである。
【００１１】
最近、薬剤送達にナノテクノロジーを採用する重要な前進があり、幾つかの抗癌剤の治療効果を向上させている。遊離の薬剤に比べて、薬剤を負荷したナノ粒子は、血液循環時間を延長し、持続する薬剤放出を制御し、全身性の毒性を減らし、血管透過性・滞留性亢進（ＥＰＲ）効果を介してがん組織における薬剤濃度を高めることによってさらに良好な有効性があり、副作用がさらに少ない標的化送達を上手く提供することができる。
【００１２】
しかしながら、ＥＰＲ効果は腫瘍の適切な血管新生に高く依存する。血管新生は、不十分な血液供給と低酸素を呈する一部の腫瘍では完全に欠けている可能性がある。さらに、腫瘍内の間質液圧は治療剤を血流に運び戻すように作用しうる。ほとんどの投与されたナノ粒子（９５％まで）は腫瘍以外の、たとえば、肝臓、脾臓及び肺を含む臓器に蓄積すると報告されている。このような訳で、腫瘍塊内でのナノ粒子の効率的な送達及び分布は難題のままである。
【００１３】
多数の研究は、ナノ粒子上への標的化部分の付加が、ナノ粒子の腫瘍特異性及び腫瘍蓄積を有意に改善することができるが、これらの標的化戦略は依然として血流を介したナノ粒子の受動的な分布に頼ることを示している。
【００１４】
したがって、本発明の目的は、腫瘍塊に浸潤し、存続して腫瘍の増殖を抑えまたは制御し、且つ腫瘍のサイズまたは関連する症状を減らす組成物及び／または送達システムを提供することである。
【００１５】
本発明のもう１つの目的は、腫瘍微小環境においてＣＡＲ  Ｔ細胞のエフェクター機能を促進するまたは救済することによって、腫瘍を有する対象または腫瘍を発症する対象を治療する方法を提供することである。
【発明の概要】
【００１６】
以下の実施形態及びそれらの態様は、例示であり、且つ説明に役立ち、範囲での限定ではないことを意図しているシステム、組成物及び方法と併せて記載され、説明される。
【００１７】
がんの治療のためのＣＡＲ  Ｔ細胞養子療法等の有効性を高めるために操作された細胞が提供され、その際、活性剤を負荷したナノ粒子またはマイクロ粒子が細胞の表面に化学的に結合される。種々の実施形態では、表面操作される（または修飾される）細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを有するまたは表面上で発現されたＣＡＲを有する免疫エフェクター細胞である。一般に、粒子との表面結合は、ナノ粒子を結合していないネイティブのＣＡＲ  Ｔ細胞の生存性、サイトカインの分泌機能、腫瘍細胞に向けられた細胞傷害性、または走化性に由来する移動を変化させることはない。
【００１８】
概して、薬剤を負荷したナノ粒子と表面結合しているＣＡＲ  Ｔ細胞は、腫瘍中の深部を、たとえば、抑制性の腫瘍微小環境を移動し、そこに留まって；その中で制御された時間または持続された時間、薬剤を放出する。好ましくは、薬剤は、抑制性の腫瘍微小環境からのＴ細胞に対する阻害の可能性を低下させることができるまたは阻害を元に戻すことができる治療剤または予防剤である。
【００１９】
結合のための例となるナノ粒子には、リポソーム、たとえば、架橋された多重膜リポソーム、及び制御放出高分子ナノ粒子が挙げられる。組み込まれる活性剤の溶解性に応じて、疎水性ポリマーまたはブロックコポリマー、たとえば、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、またはそれらのコポリマーが選択されてそれからの活性剤の制御放出のためのナノ粒子を形成してもよい。概して、ナノ粒子は、細胞の機能を変えないが、細胞当たり高い負荷の活性剤を送達するのに十分高い比で各細胞に結合される。たとえば、１細胞当たりの結合されるナノ粒子の数は、４００〜３５０の間、３５０〜３００の間、３００〜２５０の間、２５０〜２００の間、２００〜１５０の間、または１５０〜１００の間である。例となる結合は、マレイミドで官能化した粒子と表面チオール基を持つ細胞との間である。
【００２０】
概して、活性剤は、小分子化合物、サイトカイン、抗体またはその抗原結合断片のいずれかであることができる。ナノ粒子における封入、分散またはさもなければ組み込み、及びＣＡＲ  Ｔ細胞表面からのナノ粒子からの制御放出のための例となる活性剤には、腫瘍微小環境を変化させる阻害剤及びアンタゴニストが挙げられる。一部の実施形態では、活性剤はアデノシン受容体Ａ２ａのアンタゴニスト、たとえば、ＳＣＨ−５８２６１、カフェイン及びＺＭ２４１３８５である。他の実施形態では、活性剤は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のアンタゴニストもしくは阻害剤、またはＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）のアンタゴニストもしくは阻害剤である。
【００２１】
ナノ粒子またはマイクロ粒子が結合される例となる細胞型には、たとえば、ナチュラルキラー細胞のような「シャペロン」細胞、及びたとえば、腫瘍特異的Ｔリンパ球及び造血幹細胞のような「治療用細胞」が挙げられる。
【００２２】
種々の実施形態では、キャリア細胞が、アデノシンを産生している悪性がんの微小環境において内在性Ｔ細胞機能の阻害を防ぐ、元に戻すまたは阻止する活性剤を送達するナノ粒子と表面結合される。
【００２３】
一部の実施形態では、Ａ２ａＲ特異的なアンタゴニストＳＣＨ−５８２６１を組み込んでいる架橋された多重膜リポソーム（ｃＭＬＶ）がＣＡＲ  Ｔ細胞の表面に化学的に結合される。先ず発明者らは、アデノシン受容体Ａ２Ａに対する強力で且つ選択的なアンタゴニストＳＣＨを発明者らの架橋された多重膜リポソーム小胞（ｃＭＬＶ）薬剤送達システムに封入した。次いで発明者らは、ＣＡＲ  Ｔ細胞が、その生存率または機能に影響を及ぼすことなく、ＳＣＨを運ぶ発明者らのナノ粒子送達システムに共有結合することができることを実証した。生体内でのＴ細胞機能に対する能動的に標的化している送達システムの治療有効性を調べるために、発明者らは、２つの状態（１）腫瘍が誘導した、ＣＡＲ  Ｔ細胞の機能低下の予防及び（２）その回復を実証することを可能にするヒト固形腫瘍異種移植モデルを用いて２つの前臨床モデルを開発した。
【００２４】
双方の前臨床モデルにおける広範な生体内及び生体外の実験検討を介して、ＳＣＨ−５８２６１を送達するｃＭＬＶと結合した表面操作されたＣＡＲ  Ｔ細胞は腫瘍部位に移動し、腫瘍部位に薬剤負荷ｃＭＬＶを能動的に向かわせる能力を保持する。さらに、ＣＡＲ  Ｔ−ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）処置が、ＣＤ３＋ＴＩＬの有意に高い保持及び生体内でのＩＦＮγのような炎症性サイトカインのさらなる分泌とともに最高の抗腫瘍有効性を有したということは、ＣＡＲ  Ｔ細胞へのＳＣＨ負荷したｃＭＬＶの直接の結合がその治療効果を顕著に高めたことを示唆している。
【００２５】
一部の実施形態では、組成物は、免疫チェックポイント阻害剤、免疫調節剤、または化学療法剤の１以上と同時にまたは逐次的に共投与される。
【００２６】
例となる実施例は参照される図面において説明される。本明細書で開示されている実施形態及び図面は限定するものではなく、例示であると見なされるべきであることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１Ａは本発明の種々の実施形態に従って、ＣＡＲ  Ｔ細胞へのナノ粒子（ｃＭＬＶ）のマレイミドに基づく安定な結合を示す模式図である。図１Ｂは様々な結合比（ナノ粒子のＴ細胞に対する比：５０００対１、１０００対１、５００対１、２５０対１、および１００対１）でのＴ細胞１個当たりの結合されたナノ粒子の数を示す棒グラフである。データは３つ組で実施した２つの独立した実験の平均値±ＳＤを表す。図１Ｃ及び１Ｄは（ｃＭＬＶ：Ｔ細胞＝１０００：１の結合比で）ｃＭＬＶを結合するＣＤ３＋Ｔ細胞の比率を示すフローサイトメトリー解析（１Ｃ）及び対応する棒グラフ（１Ｄ）である。図１Ｅは赤色チャンネル、緑色チャンネル及び合体加工の画像におけるＤｉＤを負荷したｃＭＬＶと結合したＣＡＲ  Ｔ細胞の単一細胞共焦点顕微鏡像を示す。これらのＣＡＲ  Ｔ細胞は１μＭのＣＦＳＥで標識し、ｃＭＬＶ（ＤｉＤ）への結合に先立ってＰＢＳで洗浄した。共焦点顕微鏡を用いてＣＡＲ  Ｔ細胞表面上でのｃＭＬＶを可視化した。縮尺棒は１０μｍを表す。（赤色：ＤｉＤで標識したｃＭＬＶ、緑色：ＣＦＳＥで標識したＣＡＲ  Ｔ細胞）（ｎ＝３、平均値±ＳＤ；ｎｓ：有意ではない；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）
【図２−１】図２Ａ〜２Ｊは本発明の種々の実施形態に従って、ｃＭＬＶの結合がＣＡＲ  Ｔ細胞の機能を変化させなかったことを示す。図２Ａ及び２ＢはＩＦＮγ染色アッセイに由来するフローサイトメトリー解析（２Ａ）及び対応する棒グラフの説明（２Ｂ）である。ＳＫＯＶ３．ＣＤ１９細胞で６時間刺激してＩＦＮ−γの放出を検出した、未結合のＣＡＲＴ細胞（ＣＡＲＴ）または空のｃＭＬＶを結合したＣＡＲＴ細胞（ＣＡＲＴ.ｃＭＬＶ）の代表的なＦＡＣＳ解析。形質導入していないＣＡＲ−Ｔ細胞は陰性対照として役立った。ＩＦＮγは細胞内染色で測定した。図２Ａは下の列でＴ細胞と結合したまたは未結合のＣＤ３＋Ｔ細胞のＩＦＮγの分泌を示す。図２Ｃはナノ粒子の結合がＫ５６２−ＣＤ１９＋標的腫瘍に対するＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性を変化させないことを示す。図２Ｄはナノ粒子の結合がＳＫＯＶ３−ＣＤ１９＋標的腫瘍に対するＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性を変化させないことを示す。３つ組で行われた実験の平均の％細胞傷害性±ＳＤ。
【図２−２】図２Ａ〜２Ｊは本発明の種々の実施形態に従って、ｃＭＬＶの結合がＣＡＲ  Ｔ細胞の機能を変化させなかったことを示す。図２Ｅ及び２Ｆは遊走アッセイにおいて遊走したＴ細胞の比率（２Ｅ）及び数（２Ｆ）を示す。トランスウェルの下のチャンバーへの化学誘因物質ＣＸＣＬ９の添加の有無にかかわらず未結合のＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＡＲＴ）またはｃＭＬＶを結合したＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＡＲＴ.ｃＭＬＶ）を上のチャンバーに播種した。インキュベートの６時間後、下のチャンバーから培地を回収し、ＣＡＲ−Ｔ細胞の数を数えた。要約した統計をグラフ中で示した（ｎ＝３、平均値±ＳＤ、ｎｓ：有意ではない；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。データはすべて少なくとも３回の独立した実験の代表である。
【図２−３】図２Ａ〜２Ｊは本発明の種々の実施形態に従って、ｃＭＬＶの結合がＣＡＲ  Ｔ細胞の機能を変化させなかったことを示す。図２Ｇ及び２Ｈは、抗ヒトＣＤ３／ＣＤ２８抗体による再刺激の際、ｃＭＬＶの結合はＴ細胞によるサイトカインの分泌を変化させなかったことを示す（２Ｇは棒グラフを示し、２Ｈは対応するフローサイトメトリーのスペクトルを示す）。図２Ｉ及び２Ｊは、Ｋ５６２−ＣＤ１９＋腫瘍細胞による再刺激の際、ｃＭＬＶの結合はＴ細胞によるサイトカインの分泌を変化させなかったことを示す（２Ｉは棒グラフを示し、２Ｊは対応するフローサイトメトリーのスペクトルを示す）。３つ組で行われた実験の平均値％±ＳＤ。
【図３Ａ】図３Ａ及び３Ｂは、ＣＡＲ  Ｔ細胞に結合されたｃＭＬＶが遊離のｃＭＬＶよりも抗原発現腫瘍に対するさらに効率的な浸潤を示すことを図示する。皮下ＳＫＯＶ３．ＣＤ１９腫瘍の担癌ＮＯＤ／ｓｃｉｄ／ＩＬ２ｒγ−／−（ＮＳＧ）マウス３匹の群にＤｉＤ標識したｃＭＬＶと結合したＣＡＲ−Ｔ細胞（ＣＡＲＴ．ｃＭＬＶ）を１×１０７個、ＤｉＤ標識したｃＭＬＶと共に注射されるＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＡＲＴ＋ｃＭＬＶ）を１×１０７個、または同数のＤｉＤ標識したｃＭＬＶのみ（ｃＭＬＶ）を静脈内注射した。２４時間後（３Ａ）及び４８時間後（３Ｂ）、示した組織を取り出し、秤量し、ハサミでくずした。ＩＶＩＳスペクトル画像化システムを用いて各臓器について特異的なＤｉＤ組織蛍光を定量し、最終的な読み取りとして組織の１グラム当たりの注射した用量の平均比率（％ＩＤ／ｇ）を算出した。示されたデータは２つの独立した実験からプールされる。（ｎ＝３、平均値±ＳＤ、ｎｓ：有意ではない；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図３Ｂ】図３Ａ及び３Ｂは、ＣＡＲ  Ｔ細胞に結合されたｃＭＬＶが遊離のｃＭＬＶよりも抗原発現腫瘍に対するさらに効率的な浸潤を示すことを図示する。皮下ＳＫＯＶ３．ＣＤ１９腫瘍の担癌ＮＯＤ／ｓｃｉｄ／ＩＬ２ｒγ−／−（ＮＳＧ）マウス３匹の群にＤｉＤ標識したｃＭＬＶと結合したＣＡＲ−Ｔ細胞（ＣＡＲＴ．ｃＭＬＶ）を１×１０７個、ＤｉＤ標識したｃＭＬＶと共に注射されるＣＡＲ  Ｔ細胞（ＣＡＲＴ＋ｃＭＬＶ）を１×１０７個、または同数のＤｉＤ標識したｃＭＬＶのみ（ｃＭＬＶ）を静脈内注射した。２４時間後（３Ａ）及び４８時間後（３Ｂ）、示した組織を取り出し、秤量し、ハサミでくずした。ＩＶＩＳスペクトル画像化システムを用いて各臓器について特異的なＤｉＤ組織蛍光を定量し、最終的な読み取りとして組織の１グラム当たりの注射した用量の平均比率（％ＩＤ／ｇ）を算出した。示されたデータは２つの独立した実験からプールされる。（ｎ＝３、平均値±ＳＤ、ｎｓ：有意ではない；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図３Ｃ】Ｔ細胞に結合されたナノ粒子が遊離のｃＭＬＶと比べて腫瘍において高い蓄積を実証したことを示す。ＤｉＤ色素で標識したｃＭＬＶを光学蛍光顕微鏡で検出した。蛍光強度はＰＢＳ処置したマウスから回収した臓器で基準化した。ｎ＝３、＊＊ｐ＜０．０１、一元配置分散分析によって解析した。
【図４】図４Ａ〜４Ｄは、ＣＡＲ  Ｔ細胞の注入の４８時間後での腫瘍塊内部におけるＣＡＲ  Ｔ細胞とのｃＭＬＶ（ＣＡＲ  Ｔ細胞に表面結合した）の共局在化の共焦点顕微鏡像からの定量を示す。図４Ａ及び４Ｂは、ＣＡＲＴ．ｃＭＬＶ群またはＣＡＲＴ＋ｃＭＬＶ群に由来するＳＫＯＶ３．ＣＤ１９腫瘍に浸潤しているＣＡＲ  Ｔ細胞の密度のドットプロット（４Ａ）及び棒グラフ（４Ｂ）示す。図４Ｃ及び４Ｄは、腫瘍組織内部においてｃＭＬＶと共局在化している腫瘍に浸潤したＣＡＲ  Ｔ細胞の比率のドットプロット（４Ｃ）及び棒グラフ（４Ｄ）を示す（ｎ＝６、平均値±ＳＤ、ＮＳ：有意ではない；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図５−１】図５Ａ〜５Ｆは、ＳＣＨ５８２６１を放出するｃＭＬＶと結合した抗ＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞がＳＫＯＶ３．ＣＤ１９腫瘍を持つ動物において機能低下を発生するのを阻止したことを示す。ＳＫＯＶ３．ＣＤ１９細胞をＮＳＧマウスの右脇腹に皮下注射した。マウスを６つの群に無作為化し、ｉ．ｖ．注射を介して示した処置で処置した。図５Ａは様々な処置の標的化された生体内送達の模式図である。図５Ｂはデジタル測径器で測定したときの腫瘍サイズの推移を示す（ｎ＝８、平均値±ＳＤ、ｎ／ｓ：有意ではない；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。図５ＣはＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法を用いて算出したときのマウスの生存曲線を示す。示した処置の後、脇腹の腫瘍を摘出し、生体外での分析のために消化した。腫瘍に浸潤したＣＡＲ−Ｔ細胞の量及び機能を評価した。図５Ｄは処置の４８時間後での腫瘍におけるＣＤ３＋ＣＤ４５＋Ｔ細胞の比率を示す。図５Ｅは処置の２日後での抗ｈＣＤ３及び抗ｈＣＤ２８による刺激の際の腫瘍に浸潤したＴ細胞の生体外ＩＦＮγの分泌を示す。図５Ｆは処置の２日後での腫瘍に浸潤したＴ細胞におけるリン酸化されたＣＲＥＢの発現レベルの検出を示す（ｎ＝３、平均値±ＳＤ、ｎ／ｓ：有意ではない；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図５−２】図５Ｇは、ＳＣＨ５８２６１を封入しているｃＭＬＶと結合したＣＡＲＴ細胞は、Ｔ細胞の養子移入（ＡＣＴ）の後、腫瘍増殖のロバスト制御を実証したことを示す。生着した皮下ＳＫＯＶ３．ＣＤ１９＋腫瘍（１００〜１５０ｍｍ３）の担癌マウスが０日目にＰＢＳ、ＣＡＲＴ、ＣＡＲＴ−Ｅｍｐ（「Ｅｍｐ」として示す）またはＣＡＲＴ−ＳＣＨ（図面では「ＳＣＨ」として示す）の注入の１つを受けた。腫瘍の体積はノギスで測定し、式（ｗ２×ｌ）／２に従って計算した。データは、一元配置分散分析によって分析したｎ＝１５、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１で行った生体内実験の平均体積±ＳＤを表す。図５Ｈ〜５Ｋは、ＳＣＨ５８２６１を封入しているｃＭＬＶと結合したＣＡＲＴ細胞が腫瘍及び脾臓の双方でＣＤ３ＣＤ４５＋Ｔ細胞の浸潤及び増殖の増加を実証したことを示す。図５ＨはＡＣＴの２日後でのＴＩＬの分析を示す。図５ＩはＡＣＴの２日後での脾細胞の分析を示す。図５ＪはＡＣＴの１４日後でのＴＩＬの分析を示す。図５ＫはＡＣＴの１４日後での脾細胞の分析を示す。データは、一元配置分散分析によって分析した平均値±ＳＤ、ｎ＝５；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５を表す。図５Ｌ及び５Ｍは、ＳＣＨ５８２６１を封入しているｃＭＬＶと結合したＣＡＲＴ細胞がサイトカイン分泌の上昇及びＣＲＥＢリン酸化の低下を実証したことを示す。図５ＬはＡＣＴの２日後での細胞内ＩＦＮγの分泌を示す。図５ＭはＡＣＴの２日後でのリン酸化されたＣＲＥＢを示す。データは、一元配置分散分析によって分析したＭＦＩ±ＳＤ、ｎ＝３；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１を表す。
【図６−１】図６Ａ〜６Ｈは、ＳＣＨ５８２６１を放出するｃＭＬＶと結合した抗ＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞がＳＫＯＶ３．ＣＤ１９腫瘍において機能低下した腫瘍浸潤Ｔ細胞を救済することができたことを示す。図６Ａは、腫瘍に浸潤したＣＡＲＴ．ｔＥＧＦＲ細胞を救済することによってＳＫＯＶ３．ＣＤ１９腫瘍を抑制するためのＳＣＨを放出するｃＭＬＶと結合したＣＡＲ  Ｔ細胞の標的化生体内送達の模式的説明である。図６Ｂは、ｉ．ｖ．注射後３５日目でのベースラインからの腫瘍サイズのパーセント変化を示すウォーターフォールプロットである（ｎ＝６、平均値±ＳＤ、ｎｓ：有意ではない；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。図６Ｃは、示された処置の２日後での腫瘍におけるＣＡＲＴ．ｔＥＧＦＲ細胞の比率の代表的なＦＡＣＳプロットである。図６Ｄは、示された処置の２日後での腫瘍におけるＣＤ４５＋Ｔ細胞の比率を示す。図６Ｅは、示された処置の２日後での腫瘍におけるＣＡＲＴ．ｔＥＧＦＲ細胞の比率を示す定量的グラフである。図６Ｆは、示された処置の２日後でのＣＡＲＴ．ｔＥＧＦＲ細胞におけるＫｉ−６７の発現の検出を示す。
【図６−２】図６Ａ〜６Ｈは、ＳＣＨ５８２６１を放出するｃＭＬＶと結合した抗ＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞がＳＫＯＶ３．ＣＤ１９腫瘍において機能低下した腫瘍浸潤Ｔ細胞を救済することができたことを示す。図６Ｇは、示された処置の２日後での抗ｈＣＤ３及び抗ｈＣＤ２８による刺激の際の腫瘍に浸潤したＣＡＲＴ．ｔＥＧＦＲ細胞の生体外ＩＦＮγの分泌を示す。ＩＦＮγの放出は細胞内染色によって測定した。図６Ｈは、示された処置の２日後でのＣＡＲＴ．ｔＥＧＦＲ細胞におけるリン酸化されたＣＲＥＢの発現レベルの検出を示す（ｎ＝３、平均値±ＳＤ、ｎｓ：有意ではない；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。データはすべて少なくとも２つの独立した実験の代表である。図６Ｉ及び６Ｊは、ＳＣＨ５８２６１を封入しているｃＭＬＶと結合したＣＡＲＴ細胞が１０日目での２回目のＴ細胞養子移入（ＡＣＴ）による「救済」処置の後、腫瘍サイズを小さくしたことを示す。図６Ｉは実験の時系列の模式図である。図６Ｊは、最初のＣＡＲＴ注入（０日目）の後１０日目において、生着した皮下ＳＫＯＶ３−ＣＤ１９＋腫瘍（約２００ｍｍ３）の担癌マウスがＰＢＳ、ＣＡＲＴ、ＣＡＲＴ−ＥｍｐまたはＣＡＲＴ−ＳＣＨの注入を受けたことを示す。腫瘍体積はノギスで測定し、式（ｗ２×１）／２に従って計算した。データは、一元配置分散分析によって分析したｎ＝１５；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１で行った生体内実験の平均体積±ＳＤを表す。
【図６−３】図６Ｋ〜６Ｍは、ＳＣＨ５８２６１を封入しているｃＭＬＶと結合したＣＡＲＴ細胞が腫瘍においてＴ細胞の浸潤及び増殖を増やしたことを示す。図６Ｋは２回目のＴ細胞養子移入の４８時間後のＣＤ３ＣＤ４５＋ＴＩＬ集団のパーセントを示す。図６Ｍは２回目のＴ細胞養子移入の４８時間後のＣＤ３ＣＤ４５＋ＴＩＬ集団の疑似カラープロットを示す。図６ＬはＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞の比を示す。データは、一元配置分散分析によって分析したｎ＝５；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；および＊＊＊ｐ＜０．００５で行った生体内実験の平均体積±ＳＤを表す。図６Ｎ及び６Ｏは、ＳＣＨ５８２６１を封入しているｃＭＬＶと結合したＣＡＲＴ細胞が腫瘍に存在するＴ細胞のサイトカイン分泌を救済し、ＣＲＥＢリン酸化を減らしたことを示す。図６Ｎは処置の４８時間後での細胞内ＩＦＮγの分泌を示す。図６Ｏは、処置の４８時間後でのリン酸化されたＣＲＥＢを示す。データは、一元配置分散分析によって分析したｎ＝３；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１でのＭＦＩ±ＳＤを表す。
【図７】生体内にレシピエント細胞の存在下で養子移入されたｃＭＬＶを結合したＣＡＲ  Ｔ細胞の模式図である。Ａ２ＡＲの小分子阻害剤で負荷したマレイミド官能化ｃＭＬＶを、細胞表面チオールを介してＣＡＲ−Ｔ細胞に結合する。
【図８】本発明の種々の実施形態に従って、「救済」処置：薬剤を封入しているｃＭＬＶと結合したシャペロンＣＡＲＴ細胞の模式図を示す。
【図９】抗ＣＤ１９ＣＡＲはＴ細胞表面において安定して発現されたことを示す。フローサイトメトリー解析は、ＣＤ３＋Ｔ細胞全体に対して平均５０％の抗ＣＤ１９ＣＡＲの発現を示す。ＣＡＲ−Ｔ細胞を、ＣＡＲの検出のためのウサギ抗ＨＡ及びその後、Ａｌｅｘ６４７抗ウサギで染色した。
【図１０】ｃＭＬＶの結合はＣＡＲ−Ｔ細胞の機能を変化させなかったことを示す。ＤｉＤ標識したｃＭＬＶと結合させてｃＭＬＶ結合集団を区別したＩＦＮγ＋ＣＤ３＋Ｔ細胞の代表的なフローサイトメトリー解析。ＣＡＲＴ及びＣＡＲＴ.ｃＭＬＶ（ＤｉＤ）をＳＫＯＶ３．ＣＤ１９と６時間共培養し、細胞内ＩＦＮγの発現を定量した。
【図１１−１】図１１Ａは、ＡＰＣ−抗ｈＥＧＦＲで染色したＣＡＲＴ.ｔＥＧＦＲ細胞の代表的なフローサイトメトリー解析が、ｔＥＧＦＲは形質導入の１４日後、ＣＡＲＴ.ｔＥＧＦＲ細胞の試験管内培養で安定して発現されていることを示すことを示している。図１１Ｂは腫瘍に浸潤したＴ細胞がＩＦＮγ分泌の低下を示すことを図示する。ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の１０日後、腫瘍に浸潤したＴ細胞を生体外において抗ｈＣＤ３及び抗ｈＣＤ２８で刺激した。ＩＦＮγの放出は細胞内染色で測定した。陽性対照は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の注入を受けた非担癌マウスの脾細胞だった（ｎ＝３、平均値±ＳＤ、ｎｓ：有意ではない；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。図１１Ｃは腫瘍の進行をデジタル測径器で測定したことを示す。
【図１１−２】図１１ＤはＣＡＲＴ.ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）が処置の４８時間後、腫瘍サイズの有意な低下を示したことを図示する。治療後４８時間での各処置群の要約した統計を棒グラフで示す（ｎ＝１０、平均値±ＳＤ、ｎｓ：有意ではない；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。図１１Ｅは、ＣＡＲＴ＋ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）群及びＣＡＲＴ．ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）群を含むＳＣＨで処置したマウスにおける腫瘍内ＳＣＨ５８２６１濃度（ｕｇ／ｇ）のＨＰＬＣ解析を示す。
【図１２】ＣＡＲ−Ｔ細胞に未結合のｃＭＬＶ（ｃＭＬＶ）またはＣＡＲ−Ｔ細胞に結合したｃＭＬＶ（ＣＡＲＴ．ｃＭＬＶ）におけるＳＣＨ５８２６１の試験管内放出率（％）を示す。誤差棒は３つ組実験の平均値の標準偏差を表す。
【図１３】試験管内でのＳＫＯＶ−３ヒト卵巣癌細胞に対するＳＣＨ５８２６１を負荷したｃＭＬＶの細胞傷害性を示す。誤差棒は３つ組実験の平均値の標準偏差を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
発明の詳細な説明
本明細書で引用されている参考文献はすべて、まるで完全に示されているかのように全体として参照によって組み入れられる。特に定義されない限り、本明細書で使用されている専門用語及び科学用語は本発明が属する当該技術の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。Ａｌｌｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２２ｎｄ  ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，１５，２０１２）；Ｈｏｒｎｙａｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，（２００８）；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ及びＳａｉｎｓｂｕｒｙ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３ｒｄ  ｅｄ．，ｒｅｖｉｓｅｄ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００６）；Ｓｍｉｔｈ，Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ７ｔｈ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２０１３）；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３ｒｄ  ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ，２８，２０１２）；ならびにＧｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ４ｔｈ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ,
（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ,２０１２）は当業者に本出願で使用されている用語の多くに対する一般的な指針を提供する。抗体を調製する方法に関する参考文献については、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２０１３）；Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｌｉｎｅｓ  ｂｙ  ｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９７６，Ｊｕｌ，６（７）：５１１−９；Ｑｕｅｅｎ及びＳｅｌｉｃｋ，Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，５８５，０８９  （１９９６  Ｄｅｃ）；ならびにＲｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，Ｍａｒ．２４，３３２（６１６２）：３２３−７を参照のこと。
【００２９】
当業者は、本明細書に記載されているものに類似しまたはそれらと同等であり、本発明の実践で使用されてもよい多数の方法及び物質を認識するであろう。本発明の他の特徴及び利点は、例として本発明の実施形態の種々の特徴を説明している添付の図面と併せて以下の詳細な説明から明らかになるであろう。実際、本発明は記載されている方法及び物質に決して限定されない。便宜上、本明細書、実施例及び添付のクレームで採用されている特定の用語がここに集められている。
【００３０】
特に言及されない限り、または文脈から黙示的でない限り、以下の用語及び語句には以下で提供される意味が含まれる。明白に言及されない限り、または文脈から明らかでない限り、以下の用語及び語句は、それが関係する当該技術で用語または語句が獲得している意味を排除しない。本発明の範囲はクレームによってのみ限定されるので、定義は、特定の実施形態を記載するのに役立つように提供され、且つ請求項に係る発明を限定するようには意図されない。とくに定義されない限り、本明細書で使用されている専門用語及び科学用語はすべて、本発明が属する当該技術の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００３１】
本明細書で使用されるとき、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」は、実施形態に有用である組成物、方法及びそれらの各成分（複数可）を参照して使用されるが、有用であろうとあるまいと、特定されない要素の包含を受け入れる。一般に、本明細書で使用されている用語は「オープン」ターム（たとえば、用語「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」は「含むが、限定されない」と解釈されるべきであり、用語「ｈａｖｉｎｇ」は「少なくとも有する」と解釈されるべきであり、用語「ｉｎｃｌｕｄｅ」は「含むが、限定されない」と解釈されるべきである、等）として一般に意図されることが当業者によって理解されるであろう。
【００３２】
特に言及されない限り、本出願の特定の実施形態を記載する文脈で（特にクレームの文脈で）使用される用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び類似の言及は単数及び複数双方を対象とするように解釈することができる。本明細書での値の範囲の引用は、その範囲内に入る各別々の値を個々に指す省略法として役立つように単に意図される。本明細書で特に指示されない限り、各個々の値は、あたかもそれが本明細書で個々に引用されたかのように本明細書に組み入れられる。本明細書に記載されている方法はすべて、本明細書で特に指示されない限り、または文脈によって明瞭に否定されない限り、好適な順序で実施することができる。本明細書の特定の実施形態に関して提供される任意の及びすべての例または例となる言語（たとえば、「ｓｕｃｈ  ａｓ」）の使用は、本出願をさらに良好に説明するように単に意図され、さもなければ請求項に係る本出願の範囲の限定を提起するものではない。略語、「ｅ．ｇ．」はラテン語ｅｘｅｍｐｌｉ  ｇｒａｔｉａに由来し、非限定例を示すのに本明細書で使用される。したがって、略語、「ｅ．ｇ．」は用語「たとえば」と同義語である。本明細書における言語は、本出願の実践に必須である請求項に係らない要素を示すと解釈されるべきではない。
【００３３】
本明細書で使用されるとき、用語「約」は、たとえば、量、時間分等のような測定できる値を指し、特定された値から±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％または±０．１％の変動を包含する。
【００３４】
「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」または「ＣＡＲｓ」は本明細書で使用されるとき操作された受容体を指し、それは細胞（たとえば、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞のようなＴ細胞、またはそれらの組み合わせ）上に抗原特異性を移植する。ＣＡＲはまた、人工的Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、またはキメラ免疫受容体としても知られる。種々の実施形態では、ＣＡＲは、抗原特異的ドメイン（ＡＳＤ）とヒンジ領域（ＨＲ）と膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）と共刺激ドメイン（ＣＳＤ）と細胞内シグナル伝達ドメイン（ＩＳＤ）とを含む組換えポリペプチドである。
【００３５】
「エフェクター機能」は分化した細胞の特殊化された機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、たとえば、細胞溶解性／細胞傷害性活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であってもよい。
【００３６】
「遺伝子操作された細胞」、「リダイレクトされた細胞」、「遺伝的に操作された細胞」または「修飾された細胞」は本明細書で使用されるとき、ＣＡＲを発現する細胞を指す。
【００３７】
「遺伝子操作された細胞によって標的とされる疾患」は本明細書で使用されるとき、遺伝子操作された細胞が病んだ細胞または健常な細胞を標的として治療上有益な成績を達成するかどうかにかかわらず、本発明の遺伝子操作された細胞による任意の疾患における任意の方法で関与する細胞の標的指向性を包含する。遺伝子操作された細胞には、遺伝子操作されたＴ細胞、ＮＫ細胞、造血幹細胞、多能性胚性幹細胞または胚性幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子操作された細胞は、Ａ２Ａ受容体阻害剤を封入している架橋された多重膜性リポソーム（ＣＭＬＶ）と、１以上のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドとを含む。標的とされてもよい抗原の例には、Ｂ細胞上で発現される抗原；癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞腫瘍及び芽細胞腫で発現される抗原；種々の免疫細胞で発現される抗原；及び種々の血液疾患、自己免疫疾患及び／または炎症性疾患に関連する細胞で発現される抗原が挙げられるが、これらに限定されない。標的とされてもよい他の抗原は当業者に明らかであろうし、その代わりの実施形態と併せて本発明のＣＡＲによって標的とされてもよい。
【００３８】
「免疫細胞」は本明細書で使用されるとき、抗原提示細胞、Ｂ細胞、好塩基球、細胞傷害性Ｔ細胞、樹状細胞、好酸球、顆粒球、ヘルパーＴ細胞、白血球、リンパ球、マクロファージ、肥満細胞、メモリー細胞、単球、ナチュラルキラー細胞、好中球、食細胞、形質細胞及びＴ細胞を含むが、これらに限定されない哺乳類免疫系の細胞を指す。
【００３９】
「免疫応答」は本明細書で使用されるとき、先天性免疫、液性免疫、細胞性免疫、免疫、炎症性反応、後天性（適応）免疫、自己免疫及び／または免疫亢進を含むが、これらに限定されない免疫を指す。
【００４０】
本明細書で使用されるとき、「ＣＤ４リンパ球」は、ＣＤ４を発現しているリンパ球、すなわち、ＣＤ４＋であるリンパ球を指す。ＣＤ４リンパ球はＣＤ４を発現しているＴ細胞であってもよい。
【００４１】
用語「Ｔ細胞」及び「Ｔリンパ球」は相互交換可能であり、本明細書では同義語として使用される。例には、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
本明細書で使用されるとき、用語「抗体」はインタクトな免疫グロブリン、またはＦｃ（結晶性断片）領域もしくは「Ｆｃ断片」もしくは「Ｆｃドメイン」と本明細書で呼ばれるＦｃ領域のＦｃＲｎ結合断片を伴ったモノクローナルもしくはポリクローナルの抗原結合断片を指す。抗原結合断片は組換えＤＮＡ技法によって、またはインタクトな抗体の酵素的なもしくは化学的な切断によって作製されてもよい。抗原結合断片には、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ及び相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、キメラ抗体、ダイアボディ及びポリペプチドに特異的な抗原結合を付与するのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含有するポリペプチドが挙げられる。Ｆｃドメインには、抗体の２または３のクラスに寄与する２つの重鎖の一部が含まれる。Ｆｃドメインは組換えＤＮＡ技法によって、またはインタクトな抗体の酵素的切断（たとえば、パパイン切断）によって、またはその化学的切断を介して作製されてもよい。
【００４３】
「治療剤」は本明細書で使用されるとき、たとえば、疾患の影響を治療する、抑制する、防ぐ、緩和する、疾患の重症度を軽減する、疾患を発症する可能性を減らす、疾患の進行を遅らせる、及び／または疾患を治癒させるために使用される作用物質を指す。治療剤が標的とする疾患には、感染性疾患、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞腫瘍、芽細胞腫、種々の免疫細胞で発現される抗原、及び種々の血液疾患及び／または炎症性疾患に関連する細胞で発現される抗原が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
「がん」及び「がん性」は通常、無秩序な細胞増殖を特徴とする哺乳類における生理的状態を指す、または記載する。用語「がん」は、組織病理型または侵襲性のステージにかかわらず、がん性の増殖または腫瘍形成過程、転移性組織または悪性に形質転換した細胞、組織もしくは臓器の種類すべてを含むこととする。固形腫瘍の例には、悪性腫瘍、たとえば、種々の臓器系の肉腫、腺腫及び癌腫、たとえば、肝臓、肺、乳腺、リンパ系、消化器（たとえば、結腸）、尿生殖器（たとえば、腎臓細胞、尿路上皮細胞）、前立腺及び咽頭を冒すものが挙げられる。腺腫には、悪性腫瘍、たとえば、ほとんどの結腸癌、腎臓癌、腎細胞癌、肝臓癌、肺の非小細胞癌腫、小腸のがん及び食道のがんが挙げられる。一実施形態では、がんは悪性黒色腫、たとえば、進んだステージの悪性黒色腫である。前述のがんの転移性病変は本発明の方法及び組成物を用いて治療するまたは予防することもできる。治療することができる他のがんの例には、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頚部のがん、皮膚または眼内の悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域のがん、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頚部の癌腫、膣の癌腫、外陰部の癌腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ芽球性白血病を含む慢性及び急性の白血病、小児の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱のがん、腎臓または尿管のがん、腎盂の癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、原発ＣＮＳリンパ腫、腫瘍の血管新生、脊髄の軸の腫瘍、脳幹のグリオーマ、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストによって誘導されるものを含む環境的に誘導されたがん、及び前記がんの組み合わせが挙げられる。
【００４５】
「ポリヌクレオチド」には本明細書で使用されるとき、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ（相補性ＤＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（小ヘアピンＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（小型核ＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ（短鎖核ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、及び／またはｔＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
用語「Ｔ細胞」及び「Ｔリンパ球」は相互交換可能であり、本明細書では同義語として使用される。例には、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
本明細書で使用されるとき、用語「投与すること」は、所望の部位での本明細書で開示されている作用物質の少なくとも部分的な局在化を生じる方法または経路による作用物質の対象内での配置を指す。
【００４８】
「有益な結果」には、病状の重症度を軽減するまたは緩和すること、病状が悪化するのを防ぐこと、病状を治癒させること、病状が進展するのを防ぐこと、病状を発症している患者の変化を減らすこと、及び患者の生命または余命を延ばすことが挙げられてもよいが、決してそれらに限定されない。非限定例として、「有益な結果」または「所望の結果」は、１以上の症状（複数可）の緩和、欠損の程度の低下、がんの進行の安定した（すなわち、悪化しない）状態、転移または浸潤の遅延または減速、及びがんに関連する症状の改善または緩和であってもよい。
【００４９】
本明細書で使用されるとき、用語「治療する」、「治療」、「治療すること」または「改善」は、治療上の処置を指し、その際、目的は疾患または障害に関連する状態の進行または重症度を元に戻す、緩和する、改善する、抑制する、遅らせるまたは止めることである。用語「治療すること」には、たとえば、がんのような状態、疾患または障害の少なくとも１つの有害作用または症状を軽減することまたは緩和することが挙げられる。治療は概して、１以上の症状または臨床マーカーが減れば「有効である」。あるいは、治療は疾患の進行が減るまたは停止すれば、「有効である」。すなわち、「治療」には、単に症状またはマーカーの改善だけでなく、治療の非存在下で予想される症状の進行または悪化の停止または少なくとも減速も含まれる。有益なまたは所望の臨床結果には、検出可能であれ、検出不能であれ、１以上の症状（複数可）の緩和、疾患の程度の低下、疾患の安定した（すなわち、悪化しない）状態、疾患の進行の遅延または減速、病態の改善または緩和、及び寛解（部分的であれ、完全であれ）が挙げられるが、これらに限定されない。疾患の用語「治療」にはまた、疾患の症状または副作用の軽減を提供すること（緩和治療を含む）も含まれる。一部の実施形態では、がんの治療には、腫瘍体積を減らすこと、がん細胞の数を減らすこと、がんの転移を抑制すること、余命を増やすこと、がん細胞の増殖を減らすこと、がん細胞の生存を減らすこと、またはがん性の状態に関連する種々の生理的症状の改善が挙げられる。
【００５０】
「状態」及び「病状」には本明細書で使用されるとき、がん、腫瘍または感染性疾患が含まれてもよい。例となる実施形態では、状態には、悪性腫瘍細胞の増殖性の障害または疾患が挙げられるが、決してこれらに限定されない。例となる実施形態では、状態には、腎臓癌、黒色腫、前立腺癌、乳癌、膠芽細胞腫、肺癌、結腸癌または膀胱癌の１以上が含まれる。
【００５１】
用語「有効量」または「治療上有効な量」は本明細書で使用されるとき、疾患または障害の少なくとも１以上の症状を減らすための、本明細書で開示されているような１以上のペプチドまたはその突然変異体、変異体、類似体または誘導体を含む医薬組成物の量を指し、所望の効果を提供するのに十分な医薬組成物の量に関する。語句「治療上有効な量」は本明細書で使用されるとき、医学治療に適用できる理に適った利益／リスクの比で障害を治療するのに十分な組成物の量を意味する。
【００５２】
症状における治療上または予防上の十分な軽減は、対照または治療されていない対象と比べてまたは本明細書に記載されているオリゴペプチドを投与する前の対象の状態と比べて測定されたパラメーターにおいて、たとえば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１５０％以上である。測定されるまたは測定できるパラメーターには、疾患の臨床的に検出可能なマーカー、たとえば、上昇したまたは低下したレベルの生体マーカー、と同様に糖尿病の症状またはマーカーの臨床的に受け入れられるスケールに関するパラメーターが挙げられる。しかしながら、本明細書で開示されているような組成物及び製剤の１日の合計使用量は健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解されるであろう。必要とされる正確な量は、たとえば、治療される疾患の種類、対象の性別、年齢及び体重のような因子に応じて変化するであろう。
【００５３】
「哺乳類」は本明細書で使用されるとき、ヒト及び非ヒト霊長類、たとえば、チンパンジー及び他の類人猿及びサル種；家畜、たとえば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ及びウマ；ペット動物、たとえば、イヌ及びネコ；マウス、ラット及びモルモットのような齧歯類を含む実験動物、等を限定しないで含む哺乳動物綱の任意のメンバーを指す。用語は特定の年齢または性別を意味しない。したがって、成体及び新生子の対象、と同様に胎児がオスであれ、メスであれ、この用語の範囲内に含まれるように意図される。
【００５４】
「粒子」は本明細書で使用されるとき、種々のサイズで任意の形状の粒子状物質を指す。適当な粒度は、本明細書で開示されている教示の観点から当業者によって十分に理解されるように、粒子を作るのに使用される物質、その中で運ばれる活性剤または治療剤、及び免疫エフェクター細胞との結合に関与する官能基及び化学反応に基づいて変化することができる。たとえば、粒子は１ｎｍ〜１，０００ｎｍの間での平均直径を有するナノ粒子、または１μｍを超える平均直径を有するが、粒子が結合される免疫エフェクター細胞よりも少なくともおよそ１桁小さいマイクロ粒子であることができる。たとえば、一部の実施形態では、粒子は、約１ｎｍ〜約１０００ｎｍ；または約２５ｎｍ〜約７５０ｎｍ；または約５０ｎｍ〜約５００ｎｍ；または約１００ｎｍ〜約３００ｎｍの直径を有する。一部の実施形態では、平均粒度は、約１ｎｍ、約１０ｎｍ、約５０ｎｍ、約１００ｎｍ、約１５０ｎｍ、約２００ｎｍ、約２５０ｎｍ、約３００ｎｍ、約３５０ｎｍ、約４００ｎｍ、約４５０ｎｍ、約５００ｎｍ、約５５０ｎｍ、約６００ｎｍ、約６５０ｎｍ、約７００ｎｍ、約７５０ｎｍ、約８００ｎｍ、約８５０ｎｍ、約９００ｎｍ、約９５０ｎｍ、または約１０００ｎｍ、または約２，０００ｎｍ、または約５，０００ｎｍ、または約６，０００ｎｍ、または約１０，０００ｎｍであることができる。一部の実施形態では、粒子は、これらの用語が本明細書で定義されているようにナノ粒子またはマイクロ粒子であることができる。粒子はすべてナノ粒子、すべてマイクロ粒子、またはナノ粒子とマイクロ粒子の組み合わせであることができる。一部の実施形態では、粒子はリポソームである。他の実施形態では、粒子は生体適合性及び／または生分解性のポリマーから形成される高分子粒子である。一部の実施形態では、粒子はコアを含有する。一部の実施形態では、粒子はコーティングを含有する。
【００５５】
「生分解性ポリマー」は本明細書で使用されるとき、天然のポリマーも使用することができるが、合成ポリマーを含有することができる。ポリマーは、たとえば、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリスチレンまたはそれらの組み合わせであることができる。ポリスチレンは、たとえば、カルボキシ基で修飾することができる。生分解性ポリマーの他の例には、ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリ（乳酸）；ポリ（グリコール酸）；ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）；ポリ（ラクチド）；ポリ（グリコリド）；ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）；ポリ無水物；ポリオルソエステル；ポリアミド；ポリカーボネート；ポリアルキレン；ポリエチレン；ポリプロピレン；ポリアルキレングリコール；ポリ（エチレングリコール）；酸化ポリアルキレン；ポリ（酸化エチレン）；ポリアルキレンテレフタレート；ポリ（エチレンテレフタレート）；ポリビニルアルコール；ポリビニルエーテル；ポリビニルエステル；ポリビニルハロゲン化合物；ポリ（塩化ビニル）；ポリビニルピロリドン；ポリシロキサン；ポリ（ビニルアルコール）；ポリ（酢酸ビニル）；ポリウレタン；ポリウレタンのコポリマー；誘導体化セルロース；アルキルセルロース；ヒドロキシアルキルセルロース；セルロースエーテル；セルロースエステル；ニトロセルロース；メチルセルロース；エチルセルロース；ヒドロキシプロピルセルロース；ヒドロキシ−プロピルメチルセルロース；ヒドロキシブチルメチルセルロース；セルローアセテート；セルロースプロピオネート；セルロースアセテートブチレート；セルロースアセテートフタレート；カルボキシエチルセルロース；セルローストリアセテート；セルロース硫酸ナトリウム塩；アクリル酸のポリマー；メタクリル酸；メタクリル酸のコポリマー；メタクリル酸の誘導体；ポリ（メタクリル酸メチル）；ポリ（メタクリル酸エチル）；ポリ（メタクリル酸ブチル）；ポリ（メタクリル酸イソブチル）；ポリ（メタクリル酸ヘキシル）；ポリ（メタクリル酸イソデシル）；ポリ（メタクリル酸ラウリル）；ポリ（メタクリル酸フェニル）；ポリ（アクリル酸メチル）；ポリ（アクリル酸イソプロピル）；ポリ（アクリル酸イソブチル）；ポリ（アクリル酸オクタデシル）；ポリ（酪酸）；ポリ（吉草酸）；ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）；ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）のコポリマー；ポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）のブレンド；ポリ−（シアノアクリル酸イソブチル）；ポリ（２−ヒドロキシエチル−Ｌ−グルタミン）；及び前述のいずれかの１以上の組み合わせ、コポリマー及び／または混合物が挙げられる。さらに当業者が十分に理解するように、それらが代表的な生分解性ポリマーの上記のリストに含まれようと含まれまいと、「生体適合性」として上記でリストにしたポリマーの一部は生分解性とみなすこともできる。本明細書で使用されるとき、「誘導体」には、当業者が日常的に行う化学基の置換、付加、及び他の修飾を有するポリマーが含まれる。
【００５６】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子操作された細胞傷害性Ｔ細胞の養子Ｔ細胞移入は有望な免疫療法の方法になっている。複数の研究者の研究は、ＣＡＲ  Ｔ細胞の養子移入はＢ細胞の血液悪性腫瘍の患者では上手く行くが、固形腫瘍の治療については開発の依然として早期段階であることを示している。養子Ｔ細胞療法の限定要因の１つは、腫瘍に浸潤したＴ細胞（ＴＩＬ）の機能を不活化する抑制性の腫瘍微小環境である。腫瘍微小環境は、ＣＤ４及びＣＤ８のＴ細胞の細胞表面で発現されているＡ２Ａ受容体によって取り込まれるアデノシンのようなＴＩＬサプレッサー分子を高濃度で含有する。アデノシンは腫瘍細胞及び調節性Ｔ細胞の表面で発現されているＣＤ３９及びＣＤ７３を介して細胞外ＡＴＰから生成される。本発明者らは、Ａ２Ａ受容体阻害剤を封入している架橋した多重膜リポソーム小胞（ｃＭＬＶ）と結合したＣＡＲ  Ｔ細胞の同時送達が腫瘍微小環境においてＣＡＲＴ細胞のエフェクター機能の低下を防ぎ、腫瘍増殖を効果的に制限したことを実証している。本発明者らはさらに、腫瘍に存在する機能低下したＴ細胞を救済するための、薬剤を封入しているｃＭＬＶのためのシャペロンとしてのＣＡＲ  Ｔ細胞の適用を検討した。この生体内試験において、本発明者らは、「救済」システムがＴＩＬの機能を回復させ、腫瘍に浸潤しているＣＤ３＋Ｔ細胞を増やし、処置後４８時間以内に腫瘍サイズを小さくすることができることを示した。
【００５７】
操作された細胞が提供され、その際、活性剤を負荷した粒子が細胞の表面に化学的に結合される。種々の実施形態では、操作された細胞は操作された免疫エフェクター細胞（たとえば、ＣＡＲ  Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、造血幹細胞または腫瘍特異的なＴリンパ球）である。種々の実施形態では、活性剤を封入しているナノ粒子またはマイクロ粒子が細胞の表面に化学的に結合される。粒子は架橋された多重膜リポソーム（ｃＭＬＶ）または高分子粒子である。
【００５８】
一部の実施形態では、操作された免疫エフェクター細胞は、表面にｃＭＬＶが結合されたＣＡＲを発現しているＴ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）であり、その際、ｃＭＬＶはＡ２ａＲの阻害剤を封入している。他の実施形態では、操作された免疫エフェクター細胞は、１以上のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含有するＴ細胞であり、Ｔ細胞は表面でｃＭＬＶと結合し、その際、ｃＭＬＶはＡ２ａ受容体の阻害剤を封入している。一部の実施形態では、Ａ２Ａ受容体阻害剤はＳＣＨ５８２６１である。
【００５９】
概して、ナノ粒子は、細胞の機能を変化させないが、細胞当たり高い負荷の活性剤を送達するのに十分高い比で各細胞に結合される。たとえば、細胞当たり結合されるナノ粒子の数は４００〜３５０の間、３５０〜３００の間、３００〜２５０の間、２５０〜２００の間、２００〜１５０の間、または１５０〜１００の間である。
【００６０】
本明細書で提供されるのはまた、それを必要とする患者において疾患を治療する、疾患を抑制する及び／または疾患の重症度もしくは可能性を軽減する方法である。方法は、対象において疾患を治療する、疾患を抑制する及び／または疾患の重症度もしくは可能性を軽減するために、Ａ２Ａ受容体阻害剤を封入している架橋された多重膜リポソーム（ｃＭＬＶ）を含む免疫エフェクター細胞を含む組成物を治療上有効な量で対象に投与することを含む。一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞にはＮＫ細胞、Ｔ細胞（ＣＡＲを発現しているＴ細胞を含む）、腫瘍特異的Ｔリンパ球及び／または造血幹細胞が挙げられる。種々の実施形態では、免疫エフェクター細胞はＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含有する。一部の実施形態では、Ａ２Ａ受容体阻害剤はＳＣＨ５８２６１、カフェインまたはＺＭ２４１３８５である。一部の実施形態では、疾患は組成物におけるＣＡＲによって標的とされる抗原に関連する。
【００６１】
本明細書で提供されるのは、がんを治療する、がんを抑制する、がんの重症度及び／または転移の可能性を軽減することを必要とする対象においてがんを治療する、がんを抑制する、がんの重症度及び／または転移の可能性を軽減する方法である。方法は、対象においてがんを治療する、がんを抑制する、がんの重症度及び／または転移の可能性を軽減するために、Ａ２ａ受容体阻害剤を封入している架橋された多重膜リポソーム（ｃＭＬＶ）を含む免疫エフェクター細胞を含む組成物の治療上有効な量を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、Ａ２Ａ受容体阻害剤はＳＣＨ５８２６１、カフェイン、ＳＹＮ１１５、ＦＳＰＴＰ、ＺＭ２４１３８５、ＰＢＳ−５０９、ＳＴ１５３５、ＳＴ４２０６、トザデナント、Ｖ８１４４４、またはイストラデフィリンである。
【００６２】
種々の実施形態では、上記の治療法のいずれかを必要とする対象は、前から存在するＴＩＬを有する、またはＣＡＲ−Ｔ細胞療法を以前受けたことがある者である。
【００６３】
種々の実施形態では、上記方法のいずれかは対象への組成物の投与に続いて、たとえば、投与されなかった対象、表面結合したナノ粒子もしくは活性剤を欠いている免疫エフェクター細胞を投与された対象、ナノ粒子と表面結合しているが、Ａ２ａＲ阻害剤を含まない免疫エフェクター細胞を投与された対象、免疫エフェクター細胞とＡ２ａＲ阻害剤をさらに封入しているナノ粒子との双方を投与された対象、またはＡ２ａＲ阻害剤を組み込んでいるナノ粒子と表面結合した免疫エフェクター細胞の投与の前の対象のような対照群と比べて、以下：０．２０〜０．２５個の細胞／ｍｍ２の間、０．２５〜０．３０個の細胞／ｍｍ２の間、０．３０〜０．３５個の細胞／ｍｍ２の間、０.３５〜０．４０個の細胞／ｍｍ２の間、またはそれ以上の腫瘍における浸潤したＴ細胞の平均密度、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％またはそれ以上の腫瘍サイズの低下；少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％またはそれ以上の腫瘍におけるＴ細胞の合計集団の１以上を特徴とする。
【００６４】
種々の実施形態では、上記方法のいずれかにおいて治療される、抑制されるまたはその重症度または可能性が軽減される疾患にはがんが挙げられ、一部の実施形態では、それはＣＤ７３を発現している腫瘍である。
【００６５】
種々の実施形態では、ＣＡＲによって標的とされる抗原には、４−１ＢＢ、５Ｔ４、腺癌抗原、アルファ−フェトプロテイン、ＢＡＦＦ、Ｂ−リンパ腫細胞、Ｃ２４２抗原、ＣＡ−１２５、炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ）、Ｃ−ＭＥＴ、ＣＣＲ４、ＣＤ１５２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ２２、ＣＤ２２１、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２８、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＥＡ、ＣＮＴＯ８８８、ＣＴＬＡ−４、ＤＲ５、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３、ＦＡＰ、フィブロネクチンエキストラドメイン−Ｂ、葉酸受容体１、ＧＤ２、ＧＤ３ガングリオシド、糖タンパク質７５、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＧＦ、ヒト散乱因子受容体キナーゼ、ＩＧＦ−１受容体、ＩＧＦ−Ｉ、ＩｇＧ１、Ｌ１−ＣＡＭ、ＩＬ−１３、ＩＬ−６、インスリン様増殖因子Ｉ受容体、インテグリンα５β１、インテグリンαｖβ３、ＭＯＲＡｂ−００９、ＭＳ４Ａ１、ＭＵＣ１、ムチンＣａｎＡｇ、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、ＮＰＣ−１Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｒα、ＰＤＬ１９２、ホスファチジルセリン、前立腺癌細胞、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＮ、ＲＯＲ１、ＳＣＨ９００１０５、ＳＤＣ１、ＳＬＡＭＦ７、ＴＡＧ−７２、テネイシンＣ、ＴＧＦベータ２、ＴＧＦ−β、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ２またはビメンチンの１以上が挙げられるが、これらに限定されない。がんに特異的な他の抗原は当業者に明らかであろうし、本発明の代わりの実施形態と併せて使用されてもよい。
【００６６】
一部の実施形態では、本明細書に記載されている治療方法はさらに対象に既存の治療剤を逐次的にまたは同時に投与することを含む。既存のがん治療の例には、積極的監視、観察、外科的介入、化学療法、免疫療法、放射線療法（たとえば、外照射、定位放射線治療（ガンマナイフ）及び分割定位放射線治療（ＦＳＲ））、局所療法、全身療法、ワクチン療法、ウイルス療法、分子標的療法、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
化学療法剤の例には、アルブミン結合パクリタキセル（ｎａｂ−パクリタキセル）、アクチノマイシン、アリトレチノイン、オールトランスレチノイン酸、アザシチジン、アザチオプリン、ベバシズマブ、ベキサトテン、ブレオマイシン、ボルテゾニブ、カルボプラチン、カペシタビン、セツキシマブ、シスプラチン、クロラムブシル、サイクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エルロチニブ、エトポシド、フルオロウラシル、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イマチニブ、イピリムマブ、イリノテカン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メソトレキセート、ミトキサントロン、オクレリズマブ、オファツムマブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パニツマブ、ペメトレキセド、リツキシマブ、タフルポシド、テニポシド、チオグアニン、トポテカン、トレチノイン、バルルビシン、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ボリノスタット、ロミデプシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、クラドリビン、クロファラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、ペントスタチン、マイトマイシン、イキサベピロン、エストラムスチン、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
種々の実施形態では、Ａ２ａ受容体阻害剤の治療上有効な量は、約０．０１〜０．０５μｇ／ｋｇ／日、０．０５〜０．１μｇ／ｋｇ／日、０．１〜０．５μｇ／ｋｇ／日、０．５〜５μｇ／ｋｇ／日、５〜１０μｇ／ｋｇ／日、１０〜２０μｇ／ｋｇ／日、２０〜５０μｇ／ｋｇ／日、５０〜１００μｇ／ｋｇ／日、１００〜１５０μｇ／ｋｇ／日、１５０〜２００μｇ／ｋｇ／日、２００〜２５０μｇ／ｋｇ／日、２５０〜３００μｇ／ｋｇ／日、３００〜３５０μｇ／ｋｇ／日、３５０〜４００μｇ／ｋｇ／日、４００〜５００μｇ／ｋｇ／日、５００〜６００μｇ／ｋｇ／日、６００〜７００μｇ／ｋｇ／日、７００〜８００μｇ／ｋｇ／日、８００〜９００μｇ／ｋｇ／日、９００〜１０００μｇ／ｋｇ／日、０．０１〜０．０５ｍｇ／ｋｇ／日、０．０５〜０．１ｍｇ／ｋｇ／日、０．１〜０．５ｍｇ／ｋｇ／日、０．５〜１ｍｇ／ｋｇ／日、１〜５ｍｇ／ｋｇ／日、５〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、１０〜１５ｍｇ／ｋｇ／日、１５〜２０ｍｇ／ｋｇ／日、２０〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、５０〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、１００〜２００ｍｇ／ｋｇ／日、２００〜３００ｍｇ／ｋｇ／日、３００〜４００ｍｇ／ｋｇ／日、４００〜５００ｍｇ／ｋｇ／日、５００〜６００ｍｇ／ｋｇ／日、６００〜７００ｍｇ／ｋｇ／日、７００〜８００ｍｇ／ｋｇ／日、８００〜９００ｍｇ／ｋｇ／日、９００〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日またはそれらの組み合わせのいずれか１以上である。本明細書に記載されているＡ２Ａ受容体の有効量の典型的な投与量は、既知の治療用化合物が使用される製造元によって推奨される範囲にあることができ、且つ試験管内での応答または動物モデルにおける応答によって技量のある熟練者に示されるとおりでもあり得る。そのような投与量は通常、関連する生物活性を失わずに濃度または量において最大ほぼ一桁分減らすことができる。実際の投与量は、内科医の判断、患者の状態、及び、たとえば、関連する培養細胞もしくは組織培養した組織試料、たとえば、生検した悪性腫瘍の試験管内での応答性、または適当な動物モデルにおいて観察される応答に基づいた治療方法の有効性に依存することができる。
【００６９】
「免疫上有効な量」、「抗腫瘍で有効な量」、「腫瘍抑制で有効な量」または「治療上有効な量」が指示される場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、及び状態における個々の差異を考慮して内科医が決定することができる。本明細書に記載されている免疫エフェクター細胞（たとえば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を含む医薬組成物は、それらの範囲の整数値をすべて含む、１０４〜１０９個の細胞／ｋｇ体重、場合によっては１０５〜１０６個の細胞／ｋｇ体重の投与量で投与されてもよいことが概して述べられ得る。Ｔ細胞組成物はまた、これらの投与量で複数回投与されてもよい。細胞は点滴法を用いて投与することができる。
【００７０】
特定の態様では、本明細書に記載されている免疫エフェクター細胞（たとえば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を含む組成物を対象に投与し、次いでその後、再び採血し（またはアフェレーシスを行い）、本発明に従ってそれらからの免疫エフェクター細胞（たとえば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を活性化し、これらの活性化し、増やした免疫エフェクター細胞（たとえば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を再点滴することが望まれてもよい。この過程を数週間ごとに複数回行うことができる。特定の態様では、免疫エフェクター細胞（たとえば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は１０ｃｃ〜４００ｃｃの採血から活性化することができる。特定の態様では、免疫エフェクター細胞（たとえば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、または１００ｃｃの採血から活性化される。
【００７１】
種々の実施形態では、Ａ２Ａ受容体阻害剤を封入している架橋された多重膜リポソーム（ＣＭＬＶ）と本明細書に記載されている１以上のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドとを含む本発明の組成物は対象に有効量の組成物を投与するために、１日１回（ＳＩＤ／ＱＤ）、１日２回（ＢＩＤ）、１日３回（ＴＩＤ）、１日４回（ＱＩＤ）またはそれ以上投与されてもよく、その際、有効量は本明細書に記載されている用量のいずれか１以上である。
【００７２】
医薬組成物
種々の実施形態では、本発明は医薬組成物を提供する。医薬組成物はＡ２Ａ受容体阻害剤を封入している架橋された多重膜リポソーム（ＣＭＬＶ）を含む免疫エフェクター細胞を含む。一部の実施形態では、免疫エフェクター細胞には、ＮＫ細胞、Ｔ細胞（ＣＡＲを発現しているＴ細胞を含む）、腫瘍特異的Ｔリンパ球、及び／または造血幹細胞が挙げられる。一部の実施形態では、Ａ２Ａ受容体阻害剤はＳＣＨ５８２６１、カフェインまたはＺＭ２４１３８５である。
【００７３】
本発明に係る医薬組成物は薬学上許容できる賦形剤を含有することができる。「薬学上許容できる賦形剤」は、一般に安全であり、非毒性であり、且つ望ましい医薬組成物を調製するのに有用である賦形剤を意味し、ヒト医薬での使用と同様に獣医での使用に適用できる賦形剤を含む。そのような賦形剤は固体、液体、半固体であってもよく、または噴霧組成物の場合、気体であってもよい。賦形剤の例には、デンプン、糖類、微細結晶セルロース、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤、湿潤剤、乳化剤、着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、保存剤、抗酸化剤、可塑剤、ゲル化剤、増粘剤、硬化剤、硬化剤、懸濁剤、界面活性剤、保湿剤、キャリア、安定剤、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
種々の実施形態では、本発明に係る医薬組成物は投与の任意の経路を介した送達のために製剤化されてもよい。「投与の経路」は、噴霧、鼻内、経口、経粘膜、経皮、非経口または腸内を含むがこれらに限定されない当該技術で既知の投与経路を指してもよい。「非経口」は、眼窩内、点滴、動脈内、嚢内、心臓内、皮内、筋肉内、腹腔内、肺内、脊髄内、胸骨内、髄腔内、子宮内、静脈内、クモ膜下、被膜下、皮下、経粘膜、または経気管を含む、一般に注射に関連する投与の経路を指す。非経口経路を介して、組成物は点滴または注射用の溶液もしくは懸濁液の形態であってもよいし、または凍結乾燥した粉末としてでもよい。非経口経路を介して、組成物は点滴または注射用の溶液もしくは懸濁液の形態であってもよい。腸内経路を介して、医薬組成物は、錠剤、ジェルカプセル剤、糖衣錠、シロップ剤、懸濁剤、溶液、粉末、顆粒、エマルション、ミクロスフェア、またはナノスフェアまたは制御放出を可能にする脂質小胞またはポリマー小胞の形態であることができる。通常、組成物は注射によって投与される。これらの投与のための方法は当業者に既知である。
【００７５】
本発明に係る医薬組成物は薬学上許容できるキャリアを含有することができる。「薬学上許容できるキャリア」は本明細書で使用されるとき、生体の１つの組織、臓器または部分から生体の別の組織、臓器または部分に対象とする化合物を運ぶまたは輸送することに関与する薬学上許容できる物質、組成物または媒体を指す。たとえば、キャリアは液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または封入物質、またはそれらの組み合わせであってもよい。キャリアの各成分は、それが製剤の他の成分と相溶性でなければならないという点で「薬学上許容でき」なければならない。それはまたそれが接触してもよい組織または臓器との接触に使用するのに好適でなければならないということは、それが毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性のリスク、または治療利益に過度に勝る複雑化のリスクを伴ってはならないことを意味する。
【００７６】
本発明に係る医薬組成物は、経口投与用にカプセル化することができ、打錠することができ、またはエマルションもしくはシロップ中に調製することができる。薬学上許容できる固体または液体のキャリアを加えて組成物を強化してもよく、もしくは安定化させてもよく、または組成物の調製を円滑にしてもよい。液体キャリアにはシロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、グリセリン、生理食塩水、アルコール及び水が挙げられる。固体キャリアには、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム、二水和物、白土、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸、タルク、ペクチン、アラビアゴム、寒天またはゼラチンが挙げられる。キャリアにはまた、持続放出物質、たとえば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルが単独で、またはワックスと共に含まれてもよい。
【００７７】
医薬組成物は、錠剤形態については必要に応じて製粉、混合、造粒及び圧縮；または硬質ゼラチンカプセル形態については製粉、混合及び充填を含む薬学の従来の技法に従って作製される。液体キャリアが使用される場合、調製物はシロップ、エリキシル、エマルションまたは水性もしくは非水性の懸濁液の形態であるだろう。そのような液体製剤は、ｐ．ｏ．で直接投与されてもよく、または軟質ゼラチンカプセルに充填されてもよい。
【００７８】
本発明に係る医薬組成物は治療上有効な量で送達されてもよい。正確な治療上有効な量は、所与の対象における治療の有効性という点で最も効果的な結果が得られるであろう組成物のその量である。この量は、治療用化合物の特徴（活性、薬物力学、薬物動態及び生体利用効率を含む）、対象の生理的な状態（年齢、性別、疾患の種類及びステージ、全身の身体状態、所与の投与量に対する応答、及び薬物の種類）、製剤における薬学上許容できるキャリア（単数）またはキャリア（複数）の性質、及び投与の経路を含むが、これらに限定されない種々の因子に応じて変化するであろう。臨床及び医薬の技術の当業者は、たとえば、化合物の投与に対する対象の応答をモニターし、それに従って投与量を調整することによって日常の実験を介して治療上有効な量を決定することができるであろう。追加の指針については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄ．２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  ＰＡ，ＵＳＡ）（２０００）を参照のこと。
【００７９】
患者に投与する前に、製剤成分をｒＡＡＶベクターに加え、細胞にｒＡＡＶベクターで形質移入する、または形質移入した細胞で上清を馴化する。液体製剤が好まれてもよい。たとえば、これらの製剤成分には、油、ポリマー、ビタミン、炭水化物、アミノ酸、塩、緩衝液、アルブミン、界面活性剤、増量剤またはそれらの組み合わせが含まれてもよい。
【００８０】
炭水化物製剤成分には糖または糖アルコール、たとえば、単糖類、二糖類または多糖類または水溶性グルカンが含まれる。糖類またはグルカンには、フルクトース、デキストロース、ラクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、スクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、アルファ及びベータシクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、及びカルボキシメチルセルロース、またはそれらの組み合わせを挙げることができる。「糖アルコール」は−ＯＨ基を有するＣ４〜Ｃ８の炭化水素として定義され、それには、ガラクチトール、イノシトール、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、グリセロール、及びアラビトールが挙げられる。上記で言及されたこれらの糖及び糖アルコールは個々にまたは組み合わせで使用されてもよい。糖または糖アルコールが水溶性の調製物に可溶性である限り、使用される量には固定された限定はない。一実施形態では、糖または糖アルコールの濃度は１．０ｗ／ｖ％〜７．０ｗ／ｖ％の間、さらに好ましくは２．０〜６．０ｗ／ｖ％の間である。
【００８１】
アミノ酸製剤成分にはカルニチン、アルギニン及びベタインの左旋性（Ｌ）形態が含まれるが、他のアミノ酸を加えてもよい。
【００８２】
一部の実施形態では、製剤成分としてのポリマーには２，０００〜３，０００の間の平均分子量を持つポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）または３，０００〜５，０００の間の平均分子量を持つポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。
【００８３】
凍結乾燥の前にまたは再構成の後で溶液におけるｐＨの変化を出来るだけ抑えるために組成物で緩衝液を使用することも好まれる。クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、及びグルタミン酸緩衝液、またはそれらの混合物を含むが、これらに限定されない任意の生理的緩衝液のほとんどが使用されてもよい。一部の実施形態では、濃度は０．０１〜０．３モル濃度である。製剤に加えることができる界面活性剤はＥＰ番号２７０，７９９及び２６８，１１０に示されている。
【００８４】
循環半減期を増やすための他の薬剤送達システムはリポソームである。リポソーム送達システムを調製する方法は、Ｇａｂｉｚｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，（１９８２），４２：４７３４；Ｃａｆｉｓｏ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９８１），６４９：１２９；及びＳｚｏｋａ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｅｎｇ．（１９８０），９：４６７において議論されている。他の薬剤送達システムは当該技術で既知であり、たとえば、Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ，ｅｔ  ａｌ．，ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ．（Ｒ．Ｌ．Ｊｕｌｉａｎｏ，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｎ．Ｙ．１９８０），ｐｐ．２５３−３１５；Ｍ．Ｌ．Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｖｓ．（１９８４），３６：２７７に記載されている。
【００８５】
液体の医薬組成物が調製された後、それを凍結乾燥して分解を防ぎ、無菌性を保ってもよい。液体組成物を凍結乾燥する方法は当業者に既知である。使用の直前に、追加の成分を含んでもよい無菌希釈液（たとえば、リンガー溶液、蒸留水、無菌生理食塩水）で組成物を再構成してもよい。再構成の際、当業者に既知であるこれらの方法を用いて組成物が対象に投与される。
【実施例】
【００８６】
以下の実施例は、クレームの範囲を本発明に限定するようには意図されず、むしろ特定の実施形態の例示であるように意図される。技量のある熟練者の心に浮かぶ例示された方法における変化は本発明の範囲内に入るように意図される。
【００８７】
実施例１
実験方法
材料
ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３及びヒト骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２はＡＴＣＣから入手し、１０％の熱非働化ＦＢＳを伴ったＲＰＭＩ−１６４０で維持した。ＣＤ１９＋Ｋ５６２細胞及びＣＤ１９＋ＳＫＯＶ３細胞は親のＫ５６２細胞及びＳＫＯＶ３細胞にＦＵＷ−ＣＤ１９レンチウイルスで形質導入し、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によってＣＤ１９＋細胞を選別することによって生成した。ＳＣＨ５８２６１はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。脂質：１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１０−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）及び１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブタ−イラミド（マレイミド−頭基脂質、ＭＰＢ−ＰＥ）はすべてＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（日本）から購入した。
【００８８】
メス６〜１０週齢のＮＯＤ／ｓｃｉｄ／ＩＬ２ｒγ−／−（ＮＳＧ）マウスはＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入した。マウスはすべてＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）の動物施設において特定の病原体を減らした条件下で維持した。実験はすべて動物の管理と使用に関する国立衛生研究所とＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａが設定した指針に従って実施した。
【００８９】
抗ｈＣＤ１９プラスミド構築物の生成
ＦＵＷレンチウイルスベクターを構築してＨＡタグ付き抗ＣＤ１９第２世代ＣＡＲタンパク質を発現させた。抗ＣＤ１９単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の配列はＣａｒｌ  Ｊｕｎｅ（特許番号ＵＳ２０１３／０２８７７４８Ａ１，２０１３）によって開発された。ヒトＣＤ８ヒンジ領域（ａａ１３８〜１８４）がその後に続くこの配列をコドンで最適化し、ＩＤＴ  ＤＮＡによって構築した。ＰＣＲを用いて、抗ＣＤ１９／ＣＤ８ヒンジの遺伝子ブロックをヒトＣＤ２８の膜貫通ドメイン及び細胞内ドメイン（ａａ１５３〜２２０）及びヒトＣＤ３ζの細胞内ドメイン（ａａ５２〜１６４）と組み合わせた。ＨＡタグを抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ（配列：ｔａｃｃｃａｔａｃｇａｔｇｔｔｃｃａｇａｔｔａｃｇｃｔ）の上流に挿入し、ＣＡＲを発現する細胞の標識を可能にした。コザック配列及びヒトＣＤ８リーダー配列もＣＡＲ構築物の上流に挿入した。レンチウイルスベクターを作るために、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを用いて、この配列をレンチウイルスプラスミドＦＵＷにおけるヒトユビキチン−Ｃプロモーターの下流に挿入した。
【００９０】
ウイルス産生
標準のリン酸カルシウム沈殿法を用いて２９３Ｔ細胞に一時的に形質移入することによってレンチウイルスベクターを作製した。２９３Ｔ細胞を１５ｃｍのプレートに播き、１４〜１８時間後、８０〜９０％の集密度に達したらすぐに形質移入した。形質移入については、４０μｇのＦＵＷ−ＣＡＲプラスミドをパッケージングプラスミドｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ及びｐＲＳＶ−ＲｅｖならびにｐＶＳＶｇエンベローププラスミドのそれぞれ２０μｇと組み合わせた。細胞の形質移入の４時間後、培地を取り除き、細胞をＰＢＳで洗浄し、新しい培地を加えた。形質移入の４８時間後、ウイルス上清を回収した。
【００９１】
養子移入のためのＴ細胞の調製及びレンチウイルスの形質導入
健常ドナーに由来する解凍した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｘ−ｖｉｖｏ１５無血清培地（Ｌｏｎｚａ）と５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＧｅｍＣｅｌｌヒト血清抗体ＡＢ（Ｇｅｍｉｎｉ  ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｗｅｓｔ  Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ  ＣＡ）と１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＧｌｕｔａｍａｘ−１００ｘ（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｃｏｒｎｉｎｇ）と１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ）と１２．２５ｍＭのＮ−アセチル−Ｌ−システイン（Ｓｉｇｍａ）とを含有するＴ細胞培地（ＴＣＭ）で培養した。培養物に１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ−２を補完した。１０e＋６個の細胞／ｍＬの密度にてＤｙｎａｂｅａｄｓ  ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズＴ細胞エキスパンダー（細胞当たり３個のビーズ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰＢＭＣを活性化し、活性化の２日後、レンチウイルスで形質導入した。生体外増殖の間、培養培地を補給し、Ｔ細胞の密度は０．５〜１×１０６個／ｍＬの間で維持した。形質導入した細胞を増やし、活性化後１３日目に回収した。
【００９２】
Ｔ細胞表面での受容体発現の検出
ＨＡタグ付きＣＤ１９ｓｃＦｖ−２８−ζ  ＣＡＲ−Ｔ細胞をＰＢＳで洗浄し、ウサギ抗ＨＡとその後、ＣＡＲ検出のためのＡｌｅｘ６４７を結合した抗ウサギ抗体で染色した。レトロウイルスで形質導入した細胞をｔＥＧＦＲ検出のためのＡＰＣを結合した抗ヒトＥＧＦＲで染色した。ＭＡＣＳ  Ｑｕａｎｔフローサイトメトリーアナライザー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて受容体の発現を解析した。
【００９３】
ナノ粒子の合成
リポソームは、Ｊｏｏ，ｅｔ  ａｌ（２０１３）で報告された従来の脱水・再水和法に基づいて調製した。ＳＣＨ−５８２６１をｃＭＬＶに封入するために、有機溶媒中の１ｍｇのＳＣＨを脂質混合物と混合して乾燥させた脂質薄膜を形成した。ＤｉＤ脂溶性色素でリポソーム粒子を標識するために、０．０１：１（ＤｉＤ：脂質）の比でＤｉＤ色素をクロロホルムにおける脂質混合物に加えた。架橋した多重膜リポソームはクロロホルム中に混合した１．５マイクロモルの脂質ＤＯＰＣ：ＤＯＰＧ：ＭＰＥ−ＰＥ＝４０：１０：５０から調製し、アルゴン気体のもとで蒸発させた後、真空下で一晩乾燥させて乾燥脂質膜を形成した。脂質膜はｐＨ７．０での１０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓプロパンに再水和した。ＳＣＨ５８２６１の有無にかかわらず、１０分毎での１時間の激しいボルテックス撹拌を介して脂質を混合した後、それらは４サイクルの１５秒間の超音波処理（Ｍｉｓｏｎｉｘ  Ｍｉｃｒｏｓｏｎ  ＸＬ２０００，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）を受け、各サイクルの後１分間間隔で氷上にて静置した。最終濃度１０ｍＭのＭｇＣｌ２を加えて二価誘発性の小胞融合を誘導した。多重膜小胞の架橋（ｃＭＬＶ）は３７℃にて１時間１．５ｍＭの最終濃度でジチオスレイトール（ＤＴＴ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えることによって行った。架橋された多重膜小胞は１４，０００ｇでの４分間の遠心分離によって回収し、ＰＢＳで２回洗浄した。小胞の多重膜構造の形態的分析を行い、以前の研究での低温電子顕微鏡によって確認した。ｃＭＬＶの流体力学的サイズは動的光散乱（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）によって測定した。粒子は濾過水に浮遊させ、ボルテックス撹拌し、分析に先立って超音波処理した。放出動態と同様に小分子負荷の効率に関する詳細な情報は補足方法に含まれる。
【００９４】
ナノ粒子の細胞との結合及びインサイチュでのペグ化
ナノ粒子の細胞への化学結合はＳｔｅｐｈａｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１０）で提供された方法に基づいて行った。発明者らは、無血清Ｘ−ｖｉｖｏ１５培地（Ｌｏｎｚａ）に１０×１０６個の細胞／ｍＬを再浮遊させた。次いで、ナノ粒子のＴ細胞に対する様々な結合比でヌクレアーゼを含まない水に等体積のナノ粒子を再浮遊させ、３７℃でインキュベートした。１０分毎に合計３０分間、細胞及びナノ粒子を混合した。未結合のナノ粒子を細胞から離すためのＰＢＳ洗浄の後、我々は１ｍＬ当たり１０×１０６個の細胞をＴＣＭ中で１ｍｇ／ｍＬのチオール末端の２ｋＤａのＰＥＧと共に３７℃で３０分間インキュベートして細胞に結合した粒子上で残りのマレイミド基の反応を止めた。発明者らは２回のＰＢＳ洗浄を行って未結合のＰＥＧを除いた。
【００９５】
細胞に結合した粒子の定量のために、結合の前に粒子を脂質様蛍光色素１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドジカルボシアニン（ＤｉＤ）で蛍光標識し、フローサイトメトリー及び蛍光マイクロプレートリーダーによって粒子の蛍光を検出した。ＤｉＤ標識したｃＭＬＶ及びＣＦＳＥ標識したＣＡＲ−Ｔ細胞の表面結合をさらに共焦点顕微鏡を用いて視覚化した。
【００９６】
細胞傷害性アッセイ
改変型の細胞傷害性アッセイを以前記載されたＫｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ，ｅｔ  ａｌ（２００９）のように行った。ＳＫＯＶ３細胞及びＫ５６２細胞（非標的）を１．５×１０６個／ｍＬの濃度でＴＣＭに浮遊させ、５μＭの濃度での蛍光色素５−（及び−６）−（（（４−クロロメチル）ベンゾイル）アミノ）テトラメチルローダミン（ＣＭＴＭＲ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。細胞を混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、ＴＣＭに再浮遊させ、３７℃で６０分間インキュベートした。次いで、細胞を２回洗浄し、ＴＣＭに再浮遊させた。標的細胞（ＳＫＯＶ３−ＣＤ１９＋細胞及びＫ５６２−ＣＤ１９＋細胞）を１×１０６個／ｍＬでＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡに浮遊させ、１μＭの濃度でのカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミドエステル（ＣＦＳＥ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。細胞を３７℃で１０分間インキュベートし、ＲＴにて細胞浮遊液の容量と同じ容量のＦＢＳを２分間加えることによって標識反応を止めた。細胞を洗浄し、ＴＣＭに再浮遊させた。
【００９７】
形質導入していないＰＢＭＣ及びＣＡＲ  Ｔ細胞（エフェクター細胞）を洗浄し、５×１０６個／ｍＬでＴＣＭに浮遊させた。ｃＭＬＶを結合した及び未結合のＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性を陰性対照として使用した形質導入していないＰＢＭＣの細胞傷害性と比較した。
【００９８】
２０：１、１０：１、５：１及び１：１のＴ細胞：標的細胞（すなわち、エフェクター：標的、Ｅ：Ｔ）の比で無菌９６穴丸底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において３つ組で培養を設定した。各培養物は、５０，０００個のＳＫＯＶ３（非標的）細胞及び５０，０００個のＳＫＯＶ３−ＣＤ１９＋細胞（標的）を含有する。混合した後、３７℃で４時間インキュベートする前に培養物を３０秒間１０００ｒｐｍで遠沈し、細胞を沈殿させた。インキュベートの直後、製造元によって推奨されたように、７ＡＡＤ（７−アミノ−アクチノマイシンＤ）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｏｇｅｎ）を加えた。蛍光をフローサイトメトリーによって解析した。細胞の細胞傷害性は［ＣＦＳＥ＋７ＡＡＤ＋細胞／（ＣＦＳＥ＋７ＡＡＤ−＋ＣＦＳＥ＋７ＡＡＤ＋）］細胞のように算出した。
【００９９】
遊走アッセイ
直径２４ｍｍで３μｍの孔サイズのトランスウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）でＴ細胞遊走アッセイを行った。ｃＭＬＶを結合した及び未結合のＣＡＲ  Ｔ細胞（０．５×１０６個／ウェル）を上側ウェルに入れ、ＴＣＭを下側ウェルに加えた。Ｔ細胞の化学誘引物質ＣＸＣＬ−９（０．１ｍｇ／ｍＬ、Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ）を下側ウェルに加えた。３７℃で６時間インキュベートした後、下側チャンバーに移動したＴ細胞を数えた。
【０１００】
予防試験の生体内異種移植実験
上記に記載されているように、ＳＫＯＶ３．ＣＤ１９腫瘍をＮＳＧマウスに移植した。腫瘍が生着した後、マウスを各処置群に無作為に割り当てた。腫瘍増殖を、測径器を用いて測定し、式（幅２×長さ）／２を用いて算出した。各群から３匹のマウスを処置後２日目及び１４日目に屠殺した。さらなる生体外分析のために各マウスから腫瘍及び脾臓を摘出した。
【０１０１】
図５Ｇに対応して、ＰＢＳ溶液中の合計３×１０６個のＳＫＯＶ３−ＣＤ１９＋細胞をＮＯＤ／ｓｃｉｄ／ＩＬ２ｒγ−／−（ＮＳＧ）マウスの脇腹に注射した。腫瘍が生着した後（１００〜１５０ｍｍ３）、マウスは無作為に割り当てられ、以下の処置：（ｉ）生理食塩水またはＰＢＳ、（ｉｉ）ＣＡＲ  Ｔ細胞、（ｉｉｉ）空のｃＭＬＶｓに結合されたＣＡＲ  Ｔ細胞及び（ｉｖ）ＳＣＨ５８２６１を負荷したｃＭＬＶに結合されたＣＡＲ  Ｔ細胞を受けた。ＣＡＲ  Ｔ細胞処置群のすべてのマウスは５×１０６個のＣＡＲ  Ｔ細胞（５０％形質導入）を注入した。腫瘍をモニターし、測径器を用いて測定し、式（幅２×長さ）／２を用いて腫瘍体積を算出した。養子ＣＡＲ  Ｔ細胞移入の後２日目及び１４日目に各群から５匹のマウスを屠殺した。各マウスから腫瘍、脾臓及び血液を採取し、処理した。腫瘍及び脾臓は細かく切り刻み、７０μｍのナイロンメッシュを通した。脾臓及び血液の試料における赤血球を溶解した。単個細胞浮遊液から合計０．５×１０６個の細胞を９６穴丸底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に入れ、抗ヒトＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８抗体で染色し、養子移入したＣＡＲ  Ｔ細胞の浸潤量を評価した。
【０１０２】
救済試験の生体内異種移植実験
上記に記載されているように、ＳＫＯＶ３．ＣＤ１９腫瘍をＮＳＧマウスに移植した。腫瘍が生着した後、マウスすべてに３×１０６個のＣＡＲＴ．ｔＥＧＦＲ細胞を注射した。最初の養子ＣＡＲ  Ｔ細胞移入の１０日後、マウスは無作為に割り当てられ、以下の処置：（１）ＰＢＳ；（２）ＣＡＲ−Ｔ細胞；（３）空のｃＭＬＶｓに結合されたＣＡＲ−Ｔ細胞（ＣＡＲＴ．ｃＭＬＶ）；（４）ＣＡＲ−Ｔ細胞とｃＭＬＶ（ＳＣＨ）との混合物（ＣＡＲＴ＋ｃＭＬＶ（ＳＣＨ））；及び（５）ＳＣＨを負荷したｃＭＬＶｓに結合されたＣＡＲ−Ｔ細胞（ＣＡＲＴ．ｃＭＬＶ（ＳＣＨ））を受けた。各マウスに２．５×１０６個のＣＡＲ陽性Ｔ細胞を注射した。未結合のｃＭＬＶで処置したマウスについては、１０９の薬剤負荷ｃＭＬＶをＣＡＲ−Ｔ細胞と共に同時注入した。２回目の養子Ｔ細胞移入の４８時間後、マウスを屠殺した。生体外アッセイのために脾臓及び腫瘍を摘出した。
【０１０３】
図１０Ａ及び１０Ｂに対応して、ＰＢＳ溶液中の合計３×１０６個のＳＫＯＶ３−ＣＤ１９＋細胞をＮＯＤ／ｓｃｉｄ／ＩＬ２ｒγ−／−（ＮＳＧ）マウスの脇腹に注射した。腫瘍が生着した後（１００〜１５０ｍｍ３）、マウスすべてに２０×１０６個のＣＡＲＴ細胞を注射した。最初の養子ＣＡＲＴ細胞移入の１０日後、マウスは無作為に割り当てられ、以下の処置：（ｉ）生理食塩水またはＰＢＳ、（ｉｉ）ＣＡＲ  Ｔ細胞、（ｉｉｉ）空のｃＭＬＶｓに結合されたＣＡＲ  Ｔ細胞及び（ｉｖ）ＳＣＨ５８２６１を負荷したｃＭＬＶに結合されたＣＡＲ  Ｔ細胞を受けた。ＣＡＲ  Ｔ細胞処置群のすべてでマウスに５×１０６個のＣＡＲ  Ｔ細胞（５０％形質導入）を注入した。２回目の養子Ｔ細胞移入の４８時間後、マウスを屠殺した。生体外アッセイのために脾臓及び腫瘍を摘出した。Ｔ細胞浸潤の程度を評価するために、腫瘍及び脾臓を細かく切り刻み、７０μｍのナイロンメッシュを通した。単個細胞浮遊液から合計０．５×１０６個の細胞を９６穴丸底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に入れ、抗ヒトＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８抗体で染色し、養子移入したＣＡＲ  Ｔ細胞の浸潤量を評価した。
【０１０４】
生体外ＴＩＬの分析
３つの分析：（１）抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８が誘導する細胞内ＩＦＮ−γサイトカイン染色、（２）ホスホ−ＣＲＥＢ及び（３）ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＫｉ−６７の発現を行った。細胞内ＩＦＮ−γ染色については、合計０．５×１０６個の細胞をヒトＣＤ３／ＣＤ２８抗体及び１０ｎｇ／ｍＬのブレフェルジンＡで刺激した。９６穴丸底プレートにおいて培養物を３７℃で６時間インキュベートした。蛍光色素分子を結合したヒトＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ４及びＣＤ８の抗体を免疫染色に使用した。Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて細胞膜を透過化し、製造元の指示書に従って細胞内染色を行った。
【０１０５】
細胞内ホスホ−ＣＲＥＢの染色については、細胞を４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、その後、氷上で３０分間メタノール中で透過化した。次いで細胞をＡｌｅｘａ４８８結合の抗ヒトホスホ−ＣＲＥＢで４℃にて３０分間染色した。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）のＭＡＣＳＱｕａｎｔ（登録商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを用いてフローサイトメトリー解析を行った。
【０１０６】
Ｋｉ−６７染色については、蛍光色素分子を結合したヒトＣＤ３、ＣＤ４５及びＥＧＦＲで染色した細胞を８０％エタノールで固定し、−２０℃で４８時間インキュベートした。細胞を染色緩衝液（１％ＦＢＳ、０．０９％ＮａＮ３を伴ったＰＢＳ）で２回洗浄し、２００×ｇで１０分間遠心分離し、１０７個／ｍＬの濃度に浮遊させた。次いで室温で暗所にて３０分間、細胞を抗Ｋｉ−６７抗体で染色し、染色緩衝液で２回洗浄し、２００×ｇで５分間遠心分離し、フローサイトメトリーによって解析した。
【０１０７】
図５Ｌ及び５Ｍに対応して、２つの異なるアッセイ：（ｉ）細胞内サイトカイン染色によるＣＤ３及びＣＤ２８が誘導するＩＦＮγの発現、（ｉｉ）ＴＩＬにおけるホスホ−ＣＲＥＢの発現において機能的解析を行った。単個細胞浮遊液から合計０．５×１０６個の細胞を９６穴丸底プレートに入れ、ＯＫＴ３、抗ヒトＣＤ２８抗体及び１０ｎｇ／ｍＬのブレフェルジンで刺激した。培養物を３７℃で６時間インキュベートした。インキュベートの後、細胞を抗ヒトＣＤ３、ＣＤ４５及びＣＤ８の抗体で標識した。次いで１００μｌのＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中で４℃で２０分間、細胞を透過化し、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で洗浄し、ＰＥを結合した抗ヒトＩＦＮγによって４℃で３０分間染色した。ＢＤ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのＦＡＣＳｏｒｔ機器を用いてフローサイトメトリー解析を行った。
【０１０８】
生体内蛍光共焦点画像化及び生体内生体分布試験
生体内でのナノ粒子の生体分布試験については、異種移植腫瘍モデルを使用した。腫瘍を生着させるために、ＰＢＳ溶液中のＳＫＯＶ３．ＣＤ１９細胞をＮＯＤ／ｓｃｉｄ／ＩＬ２Ｒγ−／−（ＮＳＧ）マウスの脇腹に皮下注射した。ＤｉＤ標識したｃＭＬＶｓ（ｃＭＬＶ）、ＤｉＤ標識したｃＭＬＶと混合したＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞（５×１０６）（ＣＡＲＴ＋ｃＭＬＶ）、ＤｉＤ標識したｃＭＬＶｓと表面結合したＣＤ１９ＣＡＲ−Ｔ細胞（５×１０６）（ＣＡＲＴ．ｃＭＬＶ）、またはＰＢＳを担癌マウスに静脈内注射した。２４及び４８時間後、示した組織を取り出し、秤量し、ハサミでくずした。Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳスペクトル画像化システムを用い、群について盲検化されたＵＳＣ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｅの科学者によってＤｉＤ特異的な組織蛍光（Ａｂｓ６４４ｎｍ、Ｅｍ６６５ｎｍ）が各臓器について定量され、組織１グラム当たりの注射した用量の比率（％ＩＤ／ｇ）が算出された。
【０１０９】
図３Ｃに対応して、ＤｉＤ標識したナノ粒子と表面結合したＣＤ１９＋ＣＡＲ  Ｔ細胞（１０×１０６）をＮＯＤ／ｓｃｉｄ／ＩＬ２ｒγ−／−（ＮＳＧ）のＳＫＯＶ３  ＣＤ１９＋腫瘍の担癌マウスに静脈内注射した。４８時間後、示した組織を取り出し、秤量し、ハサミでくずした。発明者らは、蛍光光学画像化システムを用いて各臓器について特異的なＤｉＤ組織蛍光を定量し、最終読み取りとして蛍光シグナルのバックグラウンドに対する比を算出した。
【０１１０】
生体内共焦点画像化について、６０×／１．４９Ａｐｏ  ＴＩＲＦ油浸対物レンズとＣａｓｃａｄｅ  ＩＩ：５１２ＥＭＣＣＤカメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ，ＵＳＡ）とを備えたＮｉｋｏｎエクリプスＴｉ−Ｅ顕微鏡を用いたＹｏｋｏｇａｗａ回転ディスク共焦点スキャナーシステム（Ｓｏｌａｍｅｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ，Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ，ＵＴ）で蛍光画像を取得した。ＡＯＴＦ（音響光学的可変フィルター）で制御するレーザーマージシステム（Ｓｏｌａｍｅｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．）を用いて以下のレーザー線：４９１ｎｍ、５６１ｎｍ、及び６４０ｎｍの固体レーザー（各レーザーについて５０ｍＷ）のそれぞれでの光力を提供した。リポソーム粒子を標識するために、ＤｉＤ脂溶性色素をクロロホルム中の脂質混合物に０．０１：１（ＤｉＤ：脂質）の比で加え、脂質混合物における有機溶媒をアルゴン気体のもとで蒸発させ、小胞の脂質二重層にＤｉＤ色素を組み込んだ。
【０１１１】
腫瘍部位で蓄積したナノ粒子の定量
上記に記載されているように、ＳＫＯＶ３．ＣＤ１９腫瘍をＮＳＧマウスに移植した。ＣＦＳＥ標識したＣＡＲ−Ｔ細胞及びＤｉＤ標識したｃＭＬＶを担癌マウスに注射した。示した時間に、腫瘍を摘出し、固定し、凍結し、凍結切片を作製し、ガラススライド上で標本にした。Ｚｅｉｓｓ  ７００共焦点レーザー走査顕微鏡（倒立）（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＣＦＳＥ標識したＣＡＲ−Ｔ細胞及びＤｉＤ標識したｃＭＬＶを可視化した。Ｚｅｉｓｓ  Ｚｅｎ顕微鏡ソフトウェアを用いて定量分析を行った。
【０１１２】
腫瘍を摘出し、固定し、凍結し、凍結切片を作製し、ガラススライド上で標本にした。
【０１１３】
生体外での腫瘍内ＰＴＸ濃度の測定
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、以前詳述された（３５）ように、凍結腫瘍組織においてＰＴＸの濃度を定量した。手短には、解凍した腫瘍組織を酢酸エチルにホモジネートし、既知の濃度の対照薬剤を内部標準として各試料に加えた。試料を遠心分離し、有機層をきれいな試験管に移した。有機層をアルゴンの流れのもとで蒸発させ、希釈したアセトニトリルで再水和した。試料をＨＰＬＣにかけた後、ピークの高さを解析して腫瘍内のＳＣＨ濃度を決定した。
【０１１４】
統計
２群間の差異はスチューデントのｔ検定で判定した。３以上の群間での差異は一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）で判定した。
【０１１５】
試験管内での薬剤封入及び放出のプロファイル
ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）に封入されたＳＣＨの量はＣ−１８ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィー（Ｂａｃｋｍａｎ）によって決定した。０．５ｍＬの合計容量まで水及びアセトニトリルを加えることによってｃＭＬＶ（ＳＣＨ）の浮遊液を希釈した。ＳＣＨの抽出は、５ｍＬのｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルを加え、試料を１分間ボルテックスで混合することによって達成した。次いで、混合物を遠心分離し、有機層をガラス試験管に移し、アルゴンのもとで乾燥するまで蒸発させた。緩衝液Ａ（９５％水、５％アセトニトリル）を用いて乾燥した有機層を再水和した。ＳＣＨの濃度を決定するために、１ｍＬの溶液をＣ１８カラムに注入し、３９２ｎｍでＳＣＨを検出した（流速：１ｍＬ／分）。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する培地で３７℃にてインキュベートされたｃＭＬＶから放出培地を取り出し、毎日新鮮な培地で置き換えることによってｃＭＬＶからのＳＣＨの放出動態を検討した。取り出した培地は毎日、（ＨＰＬＣによって）ＳＣＨの蛍光について定量した。細胞への結合の前及び後でのｃＭＬＶからのＳＣＨの放出動態を得るために、ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）及びＣＡＲＴ．ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）を１０％ＦＢＳ含有の培地おいて３７℃でインキュベートし、毎日遠沈し、新鮮な培地で再浮遊させた。回収した培地から毎日ＨＰＬＣによってＳＣＨを定量した。
【０１１６】
実施例２
細胞表面への安定なナノ粒子の連結
ＣＡＲ操作したＴ細胞療法の有効性を改善するために、発明者らはＴＭＥにおける免疫抑制性のメカニズムを阻害することができる薬剤であるＳＣＨ−５８２６１を負荷したナノ粒子を運ぶシャペロンとしてＣＡＲ−Ｔ細胞を使用した。Ｔ細胞上でＣＡＲを発現させるために、活性化したヒトＰＢＭＣにレンチウイルスで形質導入し、ＣＤ２８及びＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインから成る抗ＣＤ１９  ＣＡＲを作り出した。表面ＣＡＲ発現のＦＡＣＳ解析は５０％の形質導入効率を示した（図９）。
【０１１７】
合成したｃＭＬＶナノ粒子は、脂質二重層の表面に存在するチオール反応性のマレイミド頭基を介して細胞表面に存在する還元されたチオール基に安定してカップリングされた。以前の報告によれば、高レベルの遊離のチオールがＴ細胞、Ｂ細胞及び造血幹細胞（ＨＳＣ）の表面で検出された。結合は２つの工程で行われる。先ず、ＣＡＲ−Ｔ細胞とマレイミドが官能化された脂質を伴うｃＭＬＶとが同時にインキュベートされて細胞表面上の遊離のチオールへのカップリングを可能にした。最初のカップリング反応の後、結合された細胞はインサイチュでのペグ化を受けて残りの反応基の反応を止めた（図１Ａ）。Ｔ細胞１個当たり結合されてもよい粒子の最大数を決定するために、発明者らは、様々な比（５０００対１、１０００対１、５００対１、２５０対１及び１００対１）での結合のためのナノ粒子の連続希釈を行った。１０００：１の比で、ｃＭＬＶの結合は、細胞１個当たり平均２８７±４９個の表面結合ナノ粒子を生じる飽和点に達した（図１Ｂ及び表１）。
【０１１８】
Ｔ細胞集団に対するナノ粒子の平均結合効率は５５．９％だった（図１Ｃ及び１Ｄ）。さらに、ＣＡＲＴ．ｃＭＬＶの単一細胞画像化及び三次元再構築は、ナノ粒子が細胞表面上で幾つかのクラスターで分布することを実証した（図１Ｅ）。
【０１１９】
（表１）様々な結合比でのＴ細胞１個当たりの結合したナノ粒子（ｃＭＬＶ）の数
2020511147.tif 000003
【０１２０】
ナノ粒子と結合したＣＡＲ−Ｔ細胞はＴ細胞のエフェクター機能を維持する
発明者らは次に表面に結合したｃＭＬＶが、たとえば、細胞のサイトカイン分泌、細胞傷害性、及び移動のようなＣＡＲ−Ｔ細胞の重要な細胞性の機能に影響を与え得るかどうかを調べようとした。ｃＭＬＶ結合を有するまたは有さないＣＡＲＴ細胞をＳＫＯＶ３．ＣＤ１９またはＫ５６２．ＣＤ１９標的細胞と共に４時間共培養した。ＳＫＯＶ３．ＣＤ１９標的細胞で刺激したＣＡＲＴ及びＣＡＲＴ.ｃＭＬＶがそれぞれ１７．０５±０．０７％及び１９．１５±１．６３％のＩＦＮ−γ＋のＴ細胞集団を誘導したということは、ＣＡＲＴ及びＣＡＲＴ.ｃＭＬＶの双方が類似の効率でＩＦＮ−γを分泌することができたことを示している（図２Ａ及び２Ｂ）。ｃＭＬＶをＤｉＤ色素で標識した場合、ＩＦＮ−γは表面結合したｃＭＬＶの有無にかかわらず双方の細胞から分泌された（図１０）。さらに、ｃＭＬＶの表面結合はＳＫＯＶ３．ＣＤ１９細胞（図２Ｄ）またはＫ５６２．ＣＤ１９細胞（図２Ｃ）に対するＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞傷害性を低下させなかった。最後に、発明者らは試験管内でのＣＡＲ−Ｔ細胞の遊走の能力を評価した。同等の比率の結合した細胞及び未結合の細胞がトランスウェル共培養系の下側チャンバーに移動したということは、ＣＡＲＴ.ｃＭＬＶ細胞がその遊走の能力を維持していることを示している（図２Ｅ、２Ｆ）。したがって、ｃＭＬＶの細胞表面結合は標的細胞の認識、ＩＦＮ−γの分泌、細胞の細胞傷害性、または移動を妨害しない。
【０１２１】
ＣＡＲ−Ｔ細胞への結合はｃＭＬＶの腫瘍への局在化及び全身性の循環を増やす
ｃＭＬＶのＣＡＲ  Ｔ細胞への結合がナノ粒子の腫瘍部位での蓄積を改善し得るかどうかを判定するために、発明者らは、ＤｉＤ色素を含有するｃＭＬＶを合成することによって生体分布アッセイを行った。ＤｉＤで標識したｃＭＬＶのみ（ｃＭＬＶ（ＤｉＤ））、ＣＡＲ−Ｔ細胞と混合したＤｉＤで標識したｃＭＬＶ（ＣＡＲＴ＋ｃＭＬＶ（ＤｉＤ））、またはＣＡＲ−Ｔ細胞に結合したＤｉＤで標識したｃＭＬＶ（ＣＡＲＴ．ｃＭＬＶ（ＤｉＤ））をＳＫＯＶ３．ＣＤ１９腫瘍のＮＳＧ担癌マウスに静脈内注射し、ＤｉＤでタグをつけたｃＭＬＶの蓄積を様々な臓器でモニターした。２４時間で、腫瘍（ｐ＜０．００１）、脾臓（ｐ＜０．００１）、リンパ節（ｐ＜０．０１）及び肺（ｐ＜０．０１）においてｃＭＬＶ群及びＣＡＲＴ＋ｃＭＬＶ群と比べてＣＡＲＴ．ｃＭＬＶ（ＤｉＤ）群から有意に高いｃＭＬＶの蓄積が検出された。いずれの組織においてもｃＭＬＶ（ＤｉＤ）群とＣＡＲＴ＋ｃＭＬＶ（ＤｉＤ）群との間ではｃＭＬＶの蓄積に有意差は指摘されなかった。さらに、任意の群における循環血では２４時間でＤｉＤのシグナルに有意差は検出されなかった（図３Ａ）。４８時間では、ｃＭＬＶ（ＤｉＤ）群及びＣＡＲＴ＋ｃＭＬＶ（ＤｉＤ）群の双方と比べてＣＡＲＴ．ｃＭＬＶ（ＤｉＤ）は血液（ｐ＜０．０５）、腫瘍（ｐ＜０．０５）、脾臓（ｐ＜０．０５）及び肺（ｐ＜０．０５）において高いｃＭＬＶの蓄積を明らかにした（図３Ｂ）。特に、ｃＭＬＶへのＣＡＲ−Ｔ細胞の結合は、２４時間（ｐ＜０．０５）及び４８時間（ｐ＜０．００１）でｃＭＬＶ（ＤｉＤ）群及びＣＡＲＴ＋ｃＭＬＶ（ＤｉＤ）群の双方と比べて肝臓において有意に低いｃＭＬＶの蓄積を生じた。
【０１２２】
リポソームは注入に先立ってＣＡＲ  Ｔ細胞に結合された、または遊離のリポソームとして注入された。４８時間後、マウスを屠殺し、光学顕微鏡検査のために臓器、すなわち、腫瘍、肝臓、脾臓、血液、腎臓、肺、心臓及びリンパ節を単離した。結果は、遊離のリポソームと結合されたリポソームの間では腫瘍を除くあらゆる臓器で有意ではないホーミングの差異があることを示したが、腫瘍ではＣＡＲ  Ｔ細胞に結合されたリポソームは遊離のリポソームと比べて有意に高いホーミングを示した（図３Ｃ）。このことは、ｃＭＬＶのＣＡＲ  Ｔ細胞への結合がリポソームの腫瘍への局在化を高めるという発明者らの仮設を裏付けている。
【０１２３】
表面結合したｃＭＬＶは腫瘍塊の内部でＣＡＲ−Ｔ細胞と共に共局在化する
発明者らは次に、ｃＭＬＶを結合したまたは未結合の蛍光で標識したＣＡＲ−Ｔ細胞で処置したＳＫＯＶ３.ＣＤ１９腫瘍の組織切片の共焦点画像化によって、キャリアＣＡＲ−Ｔ細胞の腫瘍浸潤特性を評価した。代表的な共焦点画像は、ｃＭＬＶの表面結合は腫瘍内ＣＡＲ−Ｔ細胞の移動を妨げないことを実証している。ＣＡＲＴ．ｃＭＬＶ及びＣＡＲＴ＋ｃＭＬＶの双方がＴ細胞の同等の浸潤を有した（図４Ａ、４Ｂ）。ＣＡＲＴ．ｃＭＬＶ及びＣＡＲＴ＋ｃＭＬＶで処置した腫瘍におけるＣＡＲ−Ｔ細胞の密度はそれぞれ０．２６±０．１個／ｍｍ２及び０．３５±０．２個／ｍｍ２だった。しかしながら、ＣＡＲ−Ｔ細胞とｃＭＬＶの共局在化はＣＡＲＴ．ｃＭＬＶで処置した腫瘍の内部でしか観察されなかった。ＣＡＲＴ＋ｃＭＬＶで処置した腫瘍で検出できなかったことと比べてＣＡＲＴ．ｃＭＬＶで処置した腫瘍では共局在化の比率は７８．５７±２６．７％だった（図４Ｃ、４Ｄ）。これらの結果は、ＣＡＲ−Ｔ細胞へのｃＭＬＶの結合がＴ細胞の移動を妨害することなく腫瘍に送達されるｃＭＬＶの量を増やすことができることを示している。
【０１２４】
Ａ２ａＲアンタゴニストが封入されたナノ粒子と結合されたＣＡＲ−Ｔ細胞は改善された生体内での抗腫瘍応答を示す
Ａ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）の薬理学的な阻害が、アデノシンの豊富なＴＭＥにおいてＣＡＲ−Ｔ細胞の機能低下を防ぐかどうかを調べるために、発明者らは、生体内での腫瘍増殖及びＴ細胞増殖をモニターした。ＳＫＯＶ３.ＣＤ１９担癌マウスを図５Ａで示すように６つの異なる群に割り当てた。処置群すべてにおいて動物は腫瘍の進行を示した。ＣＡＲＴ、ＣＡＲＴ．ｃＭＬＶ、ＣＡＲＴ＋ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）及びＣＡＲＴ．ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）の処置群は、ＰＢＳ処置群と比べると、ＡＣＴ後の２日目から１７日目までで統計的に有意な腫瘍の増殖制御を示した（図５Ｂ及び表２）。他の処置群に比べて、ＣＡＲＴ．ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）処置は、ＡＣＴの後、調べたすべての日について有意に小さな腫瘍を生じる最も際立った腫瘍増殖の抑制を実証した（図５Ｂ）。その結果、ＣＡＲＴ．ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）処置はＣＡＲＴ（ｐ＜０．０００１、ログ・ランク検定）、ＣＡＲＴ．ｃＭＬＶ（ｐ＜０．０００１、ログ・ランク検定）、及びＣＡＲＴ＋ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）（ｐ＝０．０００８、ログ・ランク検定）の処置群と比べてマウスの生存率を顕著に改善した。ＣＡＲＴ、ＣＡＲＴ．ｃＭＬＶ、ＣＡＲＴ＋ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）及びＣＡＲＴ．ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）はそれぞれ処置後、２２、２２、２４及び３６日の生存期間の中央値を有した（図５Ｃ）。ＰＢＳ及びｃＭＬＶの処置は２２日の生存期間の中央値を有した。ＣＡＲＴ．ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）処置のみが、ＰＢＳ群及びｃＭＬＶ群と比べて生存期間の中央値を有意に改善した（ＰＢＳについてはｐ＝０．０００３及びｃＭＬＶについてはｐ＝０．０００２、ログ・ランク検定）。
【０１２５】
（表２）ＰＢＳ対照と比べた各時点での腫瘍増殖曲線の統計的解析
2020511147.tif 000004
【０１２６】
ＳＣＨが腫瘍に浸潤しているＴ細胞にどのように影響を及ぼしたかを検証するために、発明者らはＴ細胞の生着及び機能性を分析した。腫瘍におけるＣＤ３＋及びＣＤ４５＋Ｔ細胞の生着を処置後２日目に評価した。ＣＡＲＴ．ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）は、ＣＡＲＴ（１５．０６±１．２％、ｐ＝０．０１３４）、ＣＡＲＴ．ｃＭＬＶ（１５．３６±１．９％、ｐ＝０．０１３９）及びＣＡＲＴ＋ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）（１６．９３±０．６％、ｐ＝０．０１５７）処置群と比べて最も高いＴ細胞の生着（５２．９６±１５．５％）を有した（図５Ｄ）。さらに我々は、生体内でアデノシンが豊富な免疫抑制性のＴＭＥに暴露された、腫瘍に浸潤しているＴ細胞の機能性を評価した。ＣＡＲＴ．ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）処置群は、ＣＡＲＴ（ＭＦＩ＝３３５．８±９１．２、ｐ＝０．００２３）、ＣＡＲＴ．ｃＭＬＶ（ＭＦＩ＝３０７．５７±５３．６、ｐ＝０．０００４）及びＣＡＲＴ＋ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）（６１１．５２±２６．２１、ｐ＝０．０１１８）処置群と比べてＣＤ４５＋Ｔ細胞において有意に高い細胞内ＩＦＮ−γの発現（ＭＦＩ＝７４４．２４±４５．３）を示した。遊離のｃＭＬＶ（ＳＣＨ）処置群であるＣＡＲＴ＋ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）もＣＡＲＴ（ｐ＝０．００７３）及びＣＡＲＴ．ｃＭＬＶ（ｐ＝０．０００９）と比べて高いＩＦＮ−γの発現を生じた（図５Ｅ）が、そのレベルはＣＡＲＴ．ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）処置で観察されたものより低い。
【０１２７】
腫瘍に浸潤しているＴ細胞の機能温存が少なくともある程度、Ａ２ａ受容体の遮断の結果であるのかどうかを判定するために、発明者らは単離されたＴ細胞におけるＡ２ａＲの下流のリン酸化されたＣＲＥＢのレベルを調べた。発明者らのデータは、ＣＡＲＴ処置群及びＣＡＲＴ.ｃＭＬＶ処置群に由来するＣＤ４５＋Ｔ細胞がＣＡＲＴ＋ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）処置群及びＣＡＲＴ.ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）処置群から回収されたＴ細胞と比べて有意に高いリン酸化されたＣＲＥＢを有することを示した。これは、表面操作されたＣＡＲ−Ｔ細胞から放出されたＳＣＨがＴＭＥにおけるアデノシンが介在するＡ２ａ受容体のシグナル伝達を阻止し得ることを示している。特に、ＣＡＲＴ.ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）はＣＡＲＴ＋ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）に比べて低いリン酸化されたＣＲＥＢを生じた（ｐ＜０．０００１）（図５Ｆ）．全般的に見れば、遊離のｃＭＬＶ（ＳＣＨ）処置に比べて、ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）のＣＡＲ−Ｔ細胞への結合が腫瘍増殖の抑制を有意に延ばしたということは、Ａ２ａ受容体経路を遮断すること及びＣＡＲ−Ｔ細胞の機能低下を防ぐことでの高い効率性を示している。
【０１２８】
図５Ｇに対応して、ＣＤ１９標的を過剰発現するように操作されている卵巣癌細胞（ＳＫＯＶ３−ＣＤ１９＋）をマウスに接種した。腫瘍が１００〜１５０ｍｍ３に達した時点で、ｃＭＬＶと未結合の、ｃＭＬＶと結合した、または小分子阻害剤を負荷したｃＭＬＶと結合した５×１０６個のＣＡＲ  Ｔ細胞を尾静脈注射を介して養子移入した。陰性対照の担癌マウスをＰＢＳで処置した。陰性対照は、実験の持続時間全体を通して腫瘍増殖に何ら制御を示さなかった。ＣＡＲＴ群及びＣＡＲＴ−Ｅｍｐ群は養子移入後、最初の７日以内に軽い制御を示したが、７日目以降、陰性対照と同様に速く増殖は進行した。特に、実験群ＣＡＲＴ−ＳＣＨは実験全体を通して有意な腫瘍増殖の制御を示した。養子移入後１４日目までに、ＣＡＲＴ−ＳＣＨの腫瘍サイズは２６５±４３ｍｍ３だった。ＰＢＳ、ＣＡＲＴ及びＣＡＲＴ−Ｅｍｐの１４日目での平均腫瘍サイズはそれぞれ、８５９（±２４５）、７５９（±２６３）及び６４９（±４８）ｍｍ３だった（図５Ｇ）。
【０１２９】
Ｔリンパ球の腫瘍及び脾臓への生着を養子Ｔ細胞移入後２日目及び１４日目で評価した。養子移入後２日目では、ＣＤ３＋ＣＤ４５＋Ｔ細胞は腫瘍及び脾臓の双方で検出された。ＣＡＲＴ−ＳＣＨはＣＡＲＴ（２．９８％±０．４６）及びＣＡＲＴ−Ｅｍｐ（３．２６％±０．５１）の双方よりも有意に高いＴ細胞の生着（５．３７％±０．５２）を有した（図５Ｈ）。一方、脾臓におけるＴ細胞の生着はＣＡＲＴ群（０．０３％±０．０３）、ＣＡＲＴ−Ｅｍｐ群（０．１３％±０．０２）及びＣＡＲＴ−ＳＣＨ群（０．２２％±０．０６）の間で有意差を示さなかった（図５Ｉ）。養子移入後１４日目では、ＣＤ３＋ＣＤ４５＋Ｔ細胞は腫瘍及び脾臓の双方でまだ存在していた。ＣＡＲＴ−ＳＣＨは、ＣＡＲＴ（５．０％±０．４５）及びＣＡＲＴ−Ｅｍｐ（５．２６％±０．３９）の双方よりも有意に高いＴ細胞の生着（８．１６％±０．６２）を有した（図５Ｊ）。養子移入後１４日目までに、ＣＡＲＴ（５．２９％±０．７５）及びＣＡＲＴ−Ｅｍｐ（５．２７％±０．３２）と比べてＣＡＲＴ−ＳＣＨ（１０．３５％±１．６）で処置したマウスの脾臓において有意に高いＴ細胞の生着があった（図５Ｋ）。
【０１３０】
いったん腫瘍に浸潤したＴ細胞の機能性を評価するために、発明者らは生体外ＴＩＬ再刺激アッセイを行って、高アデノシンの免疫抑制性の微小環境に暴露された後でのＴ細胞エフェクター機能の低下を評価した。エフェクター機能を、マウス当たり５×１０６個のＴ細胞の養子移入を受けた非担癌マウスの脾細胞である陽性対照と比較した。養子移入後２日目に、実験群（ＰＢＳ、ＣＡＲＴ、ＣＡＲＴ−Ｅｍｐ及びＣＡＲＴ−ＳＣＨ）のＴＩＬ及び陽性対照の脾細胞を抗ヒトＣＤ３／ＣＤ２８で刺激し、細胞内ＩＦＮγサイトカインの分泌について染色した。注目すべきことには、養子細胞移入の４８時間後、実験群すべてに由来するＴＩＬは陽性対照と比べて機能の低下をすでに示した。ＣＡＲＴ−ＳＣＨ処置を受けた群のＴＩＬはＣＡＲＴ（ＭＦＩ６１２±２０）及びＣＡＲＴ−Ｅｍｐ（ＭＦＩ７８８±１３８）の処置群と比べて有意に高い細胞内ＩＦＮγの分泌（ＭＦＩ３７３３±７８１）を有する（図５Ｌ）。
【０１３１】
ＴＩＬ機能の温存が小分子阻害剤ＳＣＨによるＡ２Ａ受容体の遮断によるかどうかを判定するために、発明者らは環状ＡＭＰ応答配列結合タンパク質（ＣＲＥＢ）の細胞内リン酸化レベルを検出した。アデノシンのＡ２ＡＲへの結合はＧタンパク質共役受容体を活性化し、それはｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＡ）の上流のシグナル伝達要素であるｃＡＭＰの蓄積をもたらす。基礎的な状態では、ＰＫＡは対合した調節性（Ｒ）サブユニットと触媒（Ｃ）サブユニットの不活性ヘテロ四量体として細胞質に存在する。ｃＡＭＰの上方調節はＣサブユニットを遊離し、それは受動的にヌクレアーゼに拡散し、セリン残基１３３でＣＲＥＢをリン酸化する。したがって、アデノシンに遭遇するＴリンパ球はｃＡＭＰを上方調節することになり、さらにＣＲＥＢのリン酸化を誘導する。それとは反対に、Ａ２Ａ受容体のアンタゴニストによる思い通りの遮断はｃＡＭＰの細胞内での蓄積を妨害し、それはＣＲＥＢリン酸化の低下を生じる。発明者らのデータは、ＣＡＲ及びＣＡＲ−Ｅｍｐの処置群のＴＩＬはＣＡＲ−ＳＣＨ処置群のＴＩＬと比べて有意に高いリン酸化されたＣＲＥＢを有した（図５Ｍ）。
【０１３２】
Ａ２ａＲアンタゴニストを封入したナノ粒子と結合したＣＡＲ−Ｔ細胞は生体内で腫瘍に存在する機能低下したＴ細胞を救済することができる
腫瘍に浸潤したＣＡＲ−Ｔ細胞は腫瘍塊に移動することはできるが、それらはアデノシンが豊富な腫瘍微小環境に入った後、腫瘍殺傷能力及び炎症性サイトカイン分泌能力を徐々に失う傾向がある。発明者らは、腫瘍に存在する機能低下したＴ細胞がＳＣＨによるＡ２ａＲシグナル伝達の遮断の状態で、そのエフェクター機能を取り戻し得るという仮説を立てた。本出願における発明者らの結合システムの潜在力を実証するために、発明者らは、切断型表皮増殖因子受容体（ｔＥＧＦＲ）を発現しているＣＤ１９ＣＡＲ−Ｔ細胞の担癌マウスへの最初の静脈内注入によって、ＴＭＥにおいて腫瘍に存在する機能低下したＣＡＲ−Ｔ細胞を伴う生体内モデルを確立した（図１１Ａ）；これらのＣＡＲ−Ｔ細胞をＣＡＲＴ.ｔＥＧＦＲと名付ける。ＥＧＦＲ表面マーカーを用いて腫瘍に存在する機能低下したＣＡＲ−Ｔ細胞の当初の集団を追跡し、ＥＧＦＲを欠く表面操作したＣＡＲ−Ｔ細胞のその後の処置投与からそれらを区別できるようにした。当初のＣＡＲＴ.ｔＥＧＦＲ細胞移入の１０日後、５つの異なる群において救済処置がマウスに注入された（図６Ａ）。
【０１３３】
処置の２日後、ＣＡＲＴ.ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）処置を受けた６匹の担癌マウスのうち５匹は腫瘍サイズで５０％を超える縮小を示し、１匹のマウスは４４％の縮小を示した。ＣＡＲＴ＋ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）の組み合わせ処置群は６匹のマウスのうち２匹の腫瘍サイズで２５％を超える縮小を示した。ＣＡＲＴまたはＣＡＲＴ.ｃＭＬＶ処置を受けた担癌マウスは腫瘍サイズで有意な縮小は有さず、ＰＢＳ処置を受けた担癌マウスは腫瘍サイズで全体的な増大を示した（図６Ｂ、１１Ｃ及び１１Ｄ）。ＣＡＲ陽性細胞を含む腫瘍に浸潤しているＴ細胞をさらなる生体外分析のために腫瘍から単離した。図６Ｄに示すように、ＣＡＲＴ.ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）処置は１０．７９±０．３％の合計Ｔ細胞集団を生じたが、それは他の処置群すべて（ＣＡＲＴ、ＣＡＲＴ．ｃＭＬＶ、及びＣＡＲＴ＋ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）、ｐ＜０．００１）よりも有意に高かった。
【０１３４】
発明者らはさらに、当初の機能低下したＣＡＲＴ.ｔＥＧＦＲ細胞に対するこれらの処置の効果を検討した。ＣＡＲＴ、ＣＡＲＴ．ｃＭＬＶ、及びＣＡＲＴ＋ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）で処置した腫瘍はそれぞれ２５．６５±２．８％、２５．３５±０．５％及び２８．９０±３．１％の腫瘍内ＣＡＲＴ.ｔＥＧＦＲを有した一方で、ＣＡＲＴ.ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）処置した腫瘍は６３．０８±５．８％のＣＡＲＴ.ｔＥＧＦＲ細胞を有し、それは他の群すべてよりも有意に高かった（ｐ＜０．００１）（図６Ｃ及び６Ｅ）。ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖をＫｉ−６７の発現によって評価した。ＣＡＲＴ.ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）は他の処置群：ＣＡＲＴ（ＭＦＩ＝１０６６．１±２５３．５、ｐ＝０．０００４）、ＣＡＲＴ．ｃＭＬＶ（ＭＦＩ＝１１６２．５±１２９．５、ｐ＝０．０００２）及びＣＡＲＴ＋ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）（ＭＦＩ＝１０４４．３２±２２４．８、ｐ＝０．０００３）と比べて有意に高いＫｉ−６７の発現レベル（ＭＦＩ＝３４４２．４±２７２．３）を示した（図６Ｆ）。
【０１３５】
次に、我々は機能低下したＣＡＲＴ.ｔＥＧＦＲ集団の炎症性機能を元に戻すこのＣＡＲＴでシャペロン化された薬剤の能力を評価した。ＣＡＲＴ.ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）処置群は、ＣＡＲＴ、ＣＡＲＴ．ｃＭＬＶ、及びＣＡＲＴ＋ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）の群よりもＣＡＲＴ.ｔＥＧＦＲ細胞において有意に高いＩＦＮ−γの分泌を示した（ｐ＜０．００１）（図６Ｇ）。ＣＡＲＴ．ｔＥＧＦＲ細胞におけるｐＣＲＥＢの発現レベルの評価は、ＣＡＲＴ、ＣＡＲＴ．ｃＭＬＶ、及びＣＡＲＴ＋ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）の処置群と比べて、ＣＡＲＴ.ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）処置がＣＡＲＴ．Ｔｅｇｆｒ細胞集団においてｐＣＲＥＢのレベルを有意に低下させる（ｐ＜０．００１）（図６Ｈ）ことを示した。総合すれば、この集団的証拠は、表面操作されたＣＡＲＴシステムがＡ２Ａｒの小分子阻害剤を効果的にＴＭＥに送達することができ、それによって生体内で腫瘍に存在する機能低下したＴ細胞を救済することを示唆している。
【０１３６】
図８に対応して、腫瘍微小環境に存在するＴＩＬがすでにある場合、発明者らは送達システムとしてｃＭＬＶと結合したＣＡＲＴ細胞を利用して、ＴＩＬの機能低下を救済する目的で腫瘍微小環境にＡ２ＡＲのアンタゴニストを放出する（図８に係るスキーム）。発明者らが以前示している（図５Ｌ及び５Ｍ）ので、ＴＩＬはアデノシンが豊富な腫瘍微小環境に入ったほとんど直後、低下した機能性を有する。それらは依然として腫瘍内部に生着しているが、その細胞傷害性、増殖能及び炎症性サイトカインの分泌を喪失している。小分子阻害剤でアデノシン・Ａ２ＡＲの活性化を妨害することによって、特定の理論に束縛されないで、発明者らは機能低下したＴＩＬが、たとえば、細胞傷害性、増殖及び炎症性サイトカインの分泌のようなエフェクター機能を取り戻すことになるという仮説を立てた。本出願のＣＡＲＴ−ｃＭＬＶ結合システムの潜在力を実証するために、発明者らはＮＳＧマウスにＳＫＯＶ３−ＣＤ１９＋を接種し、担癌マウスすべてを１５×１０６個のＣＡＲ  Ｔ細胞で処置した。ＣＡＲ  Ｔ細胞の最初の養子移入の目的は腫瘍微小環境において機能低下したＴＩＬを生着させることである。腫瘍部位へのＴ細胞の浸潤のほとんど直後、機能性は低下するが、発明者らは、様々な処置、すなわち、ＰＢＳ、ＣＡＲＴ、ＣＡＲＴ−Ｅｍｐ及びＣＡＲＴ−ＳＣＨ（マウス当たり５×１０６個）を伴った２回目の養子細胞移入を行う前に１０日間余裕を持たせた。処置の４８時間後、ＴＩＬのエフェクター機能の分析のためにマウスを屠殺した（図６Ｉ）。
【０１３７】
最初に養子移入されたＣＡＲ  Ｔ細胞、Ａ２Ａ受容体アンタゴニスト（ＳＣＨ５８２６１）を含有するｃＭＬＶが結合したCAR  Tは、ＴＩＬの増殖を促進し、エフェクターＴ細胞の機能を改善することによって処置後４８時間以内に腫瘍サイズの縮小を誘導することができた。最初の養子ＣＡＲ  Ｔ細胞の移入（図６Ｉに示すような０日目）は未処置の担癌マウスと比べて腫瘍増殖を有意に制御しなかった（図６Ｊ）。特に、２回目のＣＡＲ  Ｔ細胞療法の４８時間後、ＣＡＲＴ−ＳＣＨ処置を受けた担癌マウスは処置前に比べて腫瘍サイズで１／２倍の縮小を示した（図６Ｊ）。ＣＡＲＴまたはＣＡＲＴ−Ｅｍｐを受けた担癌マウスは養子細胞移入の４８時間後、腫瘍サイズで有意ではない縮小を示し、２回目の処置でＰＢＳを受け入れた担癌マウスは腫瘍サイズの増大を示した（図６Ｊ）。全体で、腫瘍サイズの有意な縮小は２回目の注入においてＣＡＲＴ−ＳＣＨで処置した群のみで観察された。
【０１３８】
発明者らはさらに、２回目の細胞注入処置の腫瘍におけるＣＤ３＋ＣＤ４５＋Ｔリンパ球集団に対する効果を検討した。腫瘍組織から単離した細胞を生体外で抗ヒトＣＤ３及びＣＤ４５抗体によって染色した。ＣＡＲＴ−ＳＣＨで処置したマウスの腫瘍は腫瘍において３９．２７％（±６．５７）のＴ細胞の生着を示したが、それはそれぞれ１９．０４％（±８．６３）及び１７．８２％（±８．３１）であるＣＡＲＴ及びＣＡＲＴ−Ｅｍｐ処置群の腫瘍で見いだされたＴ細胞の比率の２倍である（図６Ｋ）。２回目の処置でＰＢＳのみを受け入れた群は依然としてＴ細胞の生着（６．０９％±１．６８）を有したが、比率は２回目のＣＡＲＴ注入を受けた他の群よりも低い（図６Ｋ及び６Ｍ）。さらに、発明者らは各群のＴリンパ球のＣＤ８のＣＤ４に対する比を測定し、ＣＡＲＴ−ＳＣＨによる処置が高いＣＤ８／ＣＤ４の比（１．２４±０．０５）またはＣＤ８に偏ったＴ細胞集団を誘導することを見いだした。それとは反対に、ＰＢＳ、ＣＡＲＴ及びＣＡＲＴ−Ｅｍｐの処置は、それぞれ０．４２７±０．１５、０．５６±０．１７及び０．４９±０．０８のＣＤ８／ＣＤ４の比を伴ったＣＤ４に偏った集団を生じた（図６Ｌ）。
【０１３９】
次に、Ｔリンパ球をＣＤ３／ＣＤ２８抗体で再刺激して炎症性サイトカインの分泌を誘導し、細胞内ＩＦＮγの発現を検出する生体外アッセイにおいてＴＩＬのエフェクター機能を評価した。ＣＡＲＴ細胞注入を受けた非担癌マウスの脾細胞を陽性対照として使用した。あらゆる群からのＴＩＬは陽性対照に比べて機能の低下を示したが、ＣＡＲＴ−ＳＣＨ処置群はＣＡＲＴ及びＣＡＲＴ−Ｅｍｐと比べて有意に高いＩＦＮγの分泌を示した（図６Ｎ）．
【０１４０】
Ｔリンパ球におけるリン酸化されたＣＲＥＢの評価も行って小分子阻害剤がＡ２Ａ受容体活性を妨害していることを決定した。ＰＢＳ処置群に由来するＴＩＬを陰性対照として使用したが、これはこれらのＴリンパ球が機能低下の特徴を示し、Ｔ細胞は阻害されたエフェクター機能を有することによる。ＰＢＳ群に由来するＴＩＬは高度にリン酸化されたＣＲＥＢを示す。ＣＡＲＴ−ＳＣＨによる処置はＣＡＲＴ処置及び陰性対照群の双方と比べてリン酸化されたＣＲＥＢのレベルを有意に低下させた（図６Ｏ）。Ａ２Ａ受容体の小分子阻害剤を送達するためのｃＭＬＶ−ＣＡＲＴ結合システムの使用は生体内で機能低下したＴＩＬを救済するのに効果的だった。Ａ２Ａ受容体を介したアデノシン活性化の妨害は、たとえば、腫瘍細胞の殺傷（細胞傷害性）及び炎症性サイトカインの分泌のようなＴ細胞のエフェクター機能を回復させ、それは腫瘍サイズの縮小及びＴリンパ球の増殖をもたらす。
【０１４１】
がんの養子免疫療法は長い間関心が持たれてきたが、実験はかなり様々な成功を示している。免疫系が抗腫瘍効果を有することを示唆した最初の観察は、１８９０年代に重度の細菌感染に続く肉腫の退縮を検出したＷｉｌｌｉａｍ  Ｃｏｌｅｙによって報告された。患者自身の免疫系を利用して疾患に対抗する可能性及び手順を探るために研究が行われたが、成功は予測できず、且つ散発的だった。ＣＡＲ特異的なＴ細胞は臨床開発にとって例外的な関心だった。このアプローチの潜在性は、ＣＡＲを発現しているＴ細胞をＢ細胞悪性腫瘍、神経芽細胞腫及び肉腫の成人及び小児の患者に点滴した臨床試験で実証された。ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の成功は血液由来のがんに限定されている。以前の治療法を改善するために、戦略の１つは、アジュバントを全身性に点滴して養子注入されたＣＡＲ  Ｔ細胞の機能を持続させ、強化することだった。
【０１４２】
アジュバントとの併用療法は、たとえば、アジュバント自体の有効性及びアジュバントがとくかく効果を示すのに必要である高い投与用量に付いてくる毒性のような複数の複雑さをもたらした。たとえば、ＩＬ−２の点滴は、たとえば、抗腫瘍免疫を高めるのに使用される広く研究された方法の１つである。各研究は、好適な投与経路、投与量及び投与の頻度を見つけ出そうとした。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）はＩＬ−２治療が静脈内及び皮下投与の双方で腫瘍の退縮をもたらさず、実際、治療後、ＰＢＭＣ計数の数を減らすことを実証した。無効性に加えて、副作用または毒性が報告された。患者は、たとえば、発熱、低血圧、及び風邪のような症状のような用量限定の症状を示した［２９］。全身注入の毒性は研究者らが回避するまたは出来るだけ抑えるために検討している主要な懸念である。
【０１４３】
リポソームまたは他のナノ粒子（たとえば、高分子ナノ粒子）の薬剤キャリアとしての利用は、過去１０年間の間、がんの治療法で魅力的な送達法として出現している。リポソームの合成は、高度に疎水性であるパクリタキセルやドキソルビシンのような多重薬剤封入法でありふれたことになっている。リポソームの主要な欠点は、化学療法剤の高速バースト放出を引き起こす、血清成分の存在下でのその不安定性であり、それは結果的に化学療法剤の送達についてのその有用性を限定する。従来のリポソーム合成を改善するために、Ｍｏｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）及びＪｏｏ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）は全身性の毒性を低下させ、治療有効性を高めることができる架橋された多重膜リポソーム（ｃＭＬＶ）を合成する方法を開発した。さらに、特定の腫瘍部位へのナノ粒子の送達を高めるために、Ｓｔｅｐｈａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）は、免疫原性を引き起こすことなく、またはエフェクターＴ細胞機能を低下させることなく、リポソームナノ粒子のマウス脾細胞及び造血幹細胞（ＨＳＣ）の表面への結合が試験管内及び生体内の双方で安定であることを実証した。
【０１４４】
ＣＡＲで修飾したリンパ球または腫瘍特異的なリンパ球へのｃＭＬＶの結合はこれらナノ粒子の腫瘍特異的なホーミングを強化する有効な方法であり、その結果、化学療法剤及びアジュバントの全身注入によって引き起こされる毒性を低下させる。細胞に結合されたナノ粒子の送達システムを幾つかの適用について調べた。先ず、それは抗腫瘍Ｔ細胞の標的化サイトカインサポートとして利用された。生体内でＴ細胞増殖を促進するＩＬ−１５及びＩＬ−２１をナノ粒子に負荷した。システムは、７日間にわたって生物活性のあるサイトカインを放出することができ、その結果完全な腫瘍のクリアランスを促進することができた。同じ研究において、Ｓｔｅｐｈａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）はドナーのＨＳＣの再増殖を高める治療薬の積み荷としてＧＳＫ−３β小分子阻害剤を封入することによってシステムを調べ始めた。第３の研究はＨｕａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）によって行われ、トポイソメラーゼＩ毒物ＳＮ３８をナノ粒子に負荷し、ナノ粒子をマウスのリンパ球に結合してリンパ節のリンパ腫を処置した。
【０１４５】
本明細書で、発明者らは積み荷である薬剤、タンパク質またはペプチドが治療用細胞に対して毒性を引き起こさないことを実証した。種々の実施形態では、発明者らは、一般に腫瘍及び組織を破壊するのに他者によって一般に使用される化学療法剤の送達を除外した。
【０１４６】
Ｓｔｅｐｈａｎ，ｅｔ  ａｌ.（２０１０）で開発されたナノ粒子・細胞の表面結合の手順に基づいて、発明者らは、表面に結合したナノ粒子を有する治療用細胞としてＣＡＲで操作したヒトＰＢＭＣの利用を先駆けた。ナノ粒子は、高度に疎水性であり、一般に全身注入に適さないＡ２ａ受容体の小分子阻害剤、たとえば、ＳＣＨ５８２６１を封入する。発明者らの試験管内のＸＴＴアッセイはＳＣＨ５８２６１がＰＢＭＣまたは腫瘍細胞（ＳＫＯＶ３−ＣＤ１９＋）に対して細胞傷害性効果を有さないことを示した。したがって、ＳＣＨ５８２６１は、同一ユニットで治療用細胞とアジュバントを同時送達することによってＣＡＲ  Ｔ細胞療法を強化する目的でこのＴ細胞・ナノ粒子の積み荷システムの利点を説明する好適な薬剤である。Ａ２ａＲ経路を遮断する他の組成物またはシステム、たとえば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系または受容体ｓｉＲＮＡノックダウンを伴った遺伝子操作されたＣＡＲ−Ｔ細胞と比べて、現在開示されている組成物及び方法の主要な利点は、キャリアＣＡＲ−Ｔ細胞自体と同様に、内在性のＴ細胞及び循環しているＣＡＲ−Ｔ細胞に影響を及ぼす薬剤の能力である。
【０１４７】
試験管内で、発明者らは、ｃＭＬＶナノ粒子が、負荷された薬剤を持続的に放出する能力を維持しながらＣＡＲ−Ｔ細胞の表面に安定して結合することができ、ＣＡＲ−Ｔ細胞のエフェクター機能を壊さないことを実証した。
【０１４８】
ナノ粒子はヒトＰＢＭＣの表面上に上手く結合された。Ｓｔｅｐｈａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）による以前の研究は、１４０（±３０）の約２００ｎｍのナノ粒子が７．６μｍの平均直径を有するマウス脾細胞の表面に安定して結合することができることを示した。一方、活性化されたＰＢＭＣは、１０００：１のナノ粒子のＴ細胞に対する結合反応比で表面上に最大２８０（±３０）まで安定して結合することができるが、発明者らが５０００：１まで反応比を増やすようには増えない。これは、１０μｍの平均直径を有する活性化されたＰＢＭＣの大きなサイズに起因する。結合のこの量は、たとえば、Ｔ細胞の移動、サイトカインの分泌及び細胞の細胞傷害性のようなエフェクターＴ細胞の機能を障害しない。ナノ粒子を結合した各Ｔ細胞は発明者らの計算によれば、２８ｎｇのＳＣＨ５８２６１を封入することができ、その半量は結合後最初の４８時間以内に放出される。この量は、Ｈｕａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）で報告されたナノ粒子を結合したマウス脾細胞当たりで封入される薬剤、ＧＳＫ−３β阻害剤であるＳＮ−３８の量（約０．４ｐｇ）より多い。高い用量にもかかわらず、薬剤を負荷したナノ粒子の結合はＴ細胞に対して毒性を示さなかったし、Ｔ細胞のエフェクター機能も低下させなかった。
【０１４９】
発明者らの生体分布試験はさらに、生体内での腫瘍部位に薬剤負荷したナノ粒子を積極的に向けること、腫瘍関連のケモカインの誘引を介して腫瘍塊に移動するＣＡＲ−Ｔ細胞の能力により動かされる事象によってＣＡＲ−Ｔ細胞が治療薬剤の有効性を高めることを示している。全体で、ＣＡＲＴ.ｃＭＬＶＳ（ＤｉＤ）が２４時間及び４８時間の双方で腫瘍部位において最高の粒子蓄積を有したということは、細胞が介在する送達の重要性を再び強調している。さらに、ｃＭＬＶ（ＤｉＤ）及びＣＡＲＴ＋ｃＭＬＶ（ＤｉＤ）の双方は、リポソームナノ粒子が通常、クッパー細胞及び内皮細胞によってシステムから一掃される肝臓において有意に高いｃＭＬＶの蓄積を生じた。ＣＡＲＴ.ｃＭＬＶ（ＤｉＤ）が肝臓での有意に低いｃＭＬＶの蓄積を示す一方で、上昇したレベルはリンパ節のようなリンパ系組織、脾臓及び肺で観察された。これらのデータは、ＣＡＲ−Ｔ細胞に結合したナノ粒子は肝臓によるナノ粒子のクリアランスの低下のせいで遊離のナノ粒子よりも長い時間、循環中に保持されうるという証拠を提供している。
【０１５０】
ＣＡＲ  Ｔ細胞へのｃＭＬＶの結合は腫瘍においてナノ粒子をさらに効率的に局在化させた。発明者らは、結合したｃＭＬＶが未結合のｃＭＬＶと比べて腫瘍組織において有意に高い蓄積を有することを実証した。ナノ粒子の一般的な短所は、腫瘍微小環境における血管透過性・滞留性亢進（ＥＰＲ）効果へのその依存である。これらの血管は、適正なリンパ排液を有さない腫瘍マトリクスにおいてナノ粒子を捕捉する散在性の隙間を持つ欠陥のある内皮細胞によって形成される。その結果、ナノ粒子によるがんの治療は、腫瘍微小環境にがんの化学療法剤を送達するこの特性を活用する。しかしながら、ほとんど低酸素であり、且つ免疫監視に不都合である腫瘍の大部分は、低い血管形成を有することが多いという限定に変わりはなく、その結果、疾患の予後不良をもたらす。さらに、ＥＰＲ効果は不均質であり、一部の腫瘍では完全に欠損している可能性があり、それはナノ粒子による治療を無効にする。一方で、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、それが生得的な移動能を有するので腫瘍塊の内部に結合した積み荷を送達することができるから、ＥＰＲ効果を当てにしない。他の治療上関連する組織（すなわち、肝臓、脾臓、腎臓、肺、心臓、リンパ節、及び血液）に関して、遊離のリポソームは脾臓と腫瘍を除いてどれでもやや高いホーミングを示したが、遊離のリポソームとＣＡＲＴ細胞に結合したリポソームとの間で浸潤量に有意差はない。さらに、発明者らの結果は、Ｓｔｅｐｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）で以前報告されたようなリポソームの結合が肝臓への浸潤を減らすことを示さなかった。
【０１５１】
ＴＭＥ内で機能低下したＴ細胞に対して最大の薬剤作用を達成するために、薬剤負荷したナノ粒子は腫瘍塊内の深くの免疫細胞に到達することができなければならない。この点で、ＣＡＲＴ.ｃＭＬＶ薬剤送達システムは、ＴＭＥ内に薬剤を送達する腫瘍内でのＴ細胞の生得的な移動性のせいで、腫瘍塊内部でのナノ粒子とＣＡＲ−Ｔ細胞の共局在化を促進する（２９,４４）。共焦点顕微鏡像は、ＣＡＲＴ.ｃＭＬＶ群に由来するｃＭＬＶが腫瘍の内部に深く浸透し、ＣＡＲ−Ｔ細胞と共に共局在化することができることを示した。ｃＭＬＶのこの最大の腫瘍内局在化がＣＡＲＴ.ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）療法の高い効能に寄与する主要な因子であってもよい。
【０１５２】
ＳＣＨ５８２６１を含有するｃＭＬＶのＣＡＲ  Ｔ細胞への結合は生体内での腫瘍への浸潤及びそれらの細胞傷害性を有意に改善した。ＣＡＲＴ細胞及び空のリポソームに結合したＣＡＲＴ細胞は生体内で腫瘍細胞に対して限定された細胞傷害性を示した。Ｔ細胞は腫瘍微小環境において検出されたが、マウスがＣＡＲＴ及びＣＡＲＴ−Ｅｍｐの養子移入を受けた後、腫瘍増殖は抑制されなかった。生体外機能性アッセイは、ＣＡＲＴ及びＣＡＲＴ−Ｅｍｐの細胞群のＴＩＬがＣＡＲＴ−ＳＣＨと比べて有意に低い炎症性サイトカイン（ＩＦＮγ）の分泌を有することを示した。養子移入の４８時間後での抗ヒトＣＤ３／ＣＤ２８によるＴＩＬの生体外再刺激は、ＣＡＲＴ細胞のエフェクター機能が腫瘍に浸潤した直後に失われることを示した。Ｍｏｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）による以前の研究はＴ細胞の機能低下に対する腫瘍微小環境の類似の効果を観察した。細胞の細胞傷害性は養子細胞移入後５日目から低下し、ＴＩＬ増殖の継続にもかかわらず、３９日目まで低下し続けることが報告された。ここで発明者らも、腫瘍サイズは増大し続けるが、腫瘍におけるＴＩＬの比率が養子Ｔ細胞移入後２日目から１４日目で全群において増加することも観察した。Ａ２ａ受容体の下流のシグナル伝達経路のさらなる解析は、ＣＲＥＢがＣＡＲＴ及びＣＡＲＴ−Ｅｍｐで処置された群において高度にリン酸化され、ＣＡＲＴ−ＳＣＨで処置した腫瘍では有意に少なくリン酸化されたＣＲＥＢが検出されることを示した。このことは、腫瘍に浸潤したＣＡＲ  Ｔ細胞上のＡ２ａ受容体を介して、ＳＣＨ５８２６１がアデノシンのシグナル伝達を阻害することを実証しており、その結果、それは未処置のＣＡＲＴ細胞と比べて生体内での優れた腫瘍増殖抑制と増殖を示した。
【０１５３】
腫瘍を標的としたＣＡＲＴ.ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）治療システムはナノ粒子を結合したＣＡＲ−Ｔ細胞の機能低下を防ぐことで効果的だった。ＣＡＲＴ.ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）で処置した群は薬剤を未結合の群と比べて有意な腫瘍増殖抑制を実証した。予防的なＣＡＲＴ.ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）処置がＣＲＥＢの低いリン酸化を伴うＴ細胞の高い腫瘍生着を示したということは、Ｔ細胞増殖の増加をもたらすＡ２ａＲ遮断のメカニズム上の重要性を示している。これは、ＣＡＲＴ.ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）が他の群に比べて腫瘍に浸潤したＴ細胞の高い比率及び高いＩＦＮ−γの産生を有したという発明者らの観察によって支持されている。しかしながら、発明者らの最も成功した処置群におけるＩＦＮ−γの最大レベルが非担癌マウスから単離した対照Ｔ細胞よりも依然として有意に低かったということは、Ａ２ａＲシグナル伝達に加えて、ＣＡＲ−Ｔ細胞はこのＳＫＯＶ３腫瘍モデルにおいては免疫抑制に関する他のメカニズムに暴露され得ることを示唆していることが言及されるべきである。
【０１５４】
治療用ＣＡＲＴ細胞の機能低下を防ぐことにおける細胞に結合した薬剤キャリアｃＭＬＶの効果に付け加えて、ｃＭＬＶに封入された薬剤の積み荷を腫瘍に存在するＴ細胞に送達する単純にシャペロンとしてのＣＡＲＴ細胞を本明細書では機能低下したＴＩＬを回復させる「救済」目的として検討する。この適用については、発明者らの結果は、ＳＣＨ５８２６１を含有するｃＭＬＶのシャペロンＣＡＲ  Ｔ細胞への結合が腫瘍に存在するＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖を刺激し、細胞傷害性を高めることができることを示した。これらの腫瘍に存在するＣＡＲ  Ｔ細胞は免疫抑制性の腫瘍微小環境のせいで機能低下し、低下した細胞傷害性を有すると報告されている。この状況で、薬剤の積み荷はシャペロンＣＡＲ  Ｔ細胞及び腫瘍に存在するＴ細胞の双方に向けられる。
【０１５５】
治療用ＣＡＲＴ−ＳＣＨが腫瘍増殖を制御できた発明者らの予防的試験とは異なって、シャペロンＣＡＲＴ−ＳＣＨは養子ＣＡＲＴ細胞移入後最初の４８時間以内に腫瘍サイズを劇的に縮小することができた。この有意な低下は、Ａ２ａ受容体の遮断に起因してもよく、それは結果的に腫瘍に存在するＴ細胞の増殖及び高いエフェクター機能を誘導した。２回目の「救済」注入を受けなかったＰＢＳ対照群は、最初のＣＡＲＴ注入後、１０日目で平均６％の腫瘍に存在するＴ細胞があることを示した。ＣＡＲＴまたはＣＡＲＴ−Ｅｍｐによる２回目の「救済」注入はＴＩＬ集団をそれぞれ１９．２％及び１８．３％にやや増やした。特に、ＣＡＲＴ−ＳＣＨによる「救済」注入はＴ細胞集団を増やし、摘出した腫瘍に由来する全細胞の３９．３％に達した。ＣＡＲＴ−ＳＣＨ救済処置群に由来するＴＩＬはＣＤ８＋に偏ったＴ細胞集団を示したが、それはＣＡＲＴまたはＣＡＲＴ−Ｅｍｐの処置群では観察されなかった。ＣＤ８＋集団は腫瘍微小環境ではＩＦＮγのレベルにさらに感受性であると報告された。高いＩＦＮγ分泌がＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を有意に強化する一方で、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団にはあまり効果を有さない。これらの観察に一致して、ＣＡＲＴ−ＳＣＨ群から回収されたＴＩＬは抗ヒトＣＤ３／ＣＤ２８による生体外再刺激の際、さらに多くのＩＦＮγを発現した。最後に、リン酸化されたＣＲＥＢレベルのさらなる解析はＣＡＲＴ−ＳＣＨが回収したＴＩＬのｐＣＲＥＢを有意に低下させることを示した。
【０１５６】
この救済処置は、患者が前から存在しているＴＩＬを有するまたは以前ＣＡＲ−Ｔ細胞療法を受けたことがある場合の臨床設定に酷似する。ＣＡＲＴ.ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）処置は、他の処置群に比べて生体外再刺激の際、当初機能低下したＣＡＲＴ.ｔＥＧＦＲ細胞集団において有意に高いＩＦＮγの分泌を生じた。ＣＡＲＴ.ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）処置群では、ＣＡＲＴ.ｔＥＧＦＲ集団はまた、たぶんＴ細胞増殖のＡ２ａＲが介在する阻害の解除のせいで、他の群と比べてリン酸化が低いＣＲＥＢ及び有意に多い細胞数も示した。発明者らはＳＫＯＶ３.ＣＤ１９細胞がＳＣＨによって直接影響を受けないことも確認したということは、ＳＫＯＶ３.ＣＤ１９腫瘍の縮小は腫瘍に浸潤したＣＡＲ−Ｔ細胞に対するＳＣＨの効果によって主として達成されたことを示している。さらに、ＣＡＲＴ.ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）処置の直後の腫瘍組織量の低下はＣＡＲＴ.ｔＥＧＦＲ細胞集団によって誘導された細胞傷害性の回復が原因で生じる可能性が最も高い。このことは、１）発明者らの予防試験における同じ投与量でのＣＡＲＴ.ｃＭＬＶ（ＳＣＨ）処置のみは腫瘍増殖を抑制するに過ぎず、縮小はしない；２）直ちに注入されたＴ細胞が介在する腫瘍サイズの縮小は５〜６日かかり、それはこの試験で発明者らが観察した２日よりも長いという事実によって支持される。
【０１５７】
Ａ２ａ受容体のシグナル伝達を壊すＳＣＨ５８２６１の適用は、生体内で、特にＣＤ３９及びＣＤ７３の高い発現を伴う固形腫瘍の場合、機能低下したＴＩＬを元に戻す非常に有望な方法として現れている。
【０１５８】
この送達プラットフォームは柔軟性が高く、他の薬剤、サイトカイン、抗体またはそれらの組み合わせに適用することができる。様々な治療用細胞、たとえば、腫瘍特異的Ｔリンパ球及び造血幹細胞（ＨＳＣ）の標的化送達媒体としての使用、またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のような他の「シャペロン」細胞の使用は、サイトカイン及び小分子阻害剤の治療有効性を顕著に高めうる。さらに、免疫調節性薬剤を免疫チェックポイント遮断剤、たとえば、抗ＰＤ−１と組み合わせて送達して抗腫瘍免疫をさらに促進してもよい。たとえば、組成物は細胞表面に結合されるナノ粒子中にＶＥＧＦ及びＥＧＦＲの小分子阻害剤を組み込んでもよく、組成物はαＰＤ１及びαＰＤ−Ｌ１と共に投与される。
【０１５９】
ナノ粒子を伴うＣＡＲ−Ｔ細胞の表面操作による細胞が介在する薬剤送達はキャリア細胞に対する制御された薬剤効果を可能にするだけでなく、対象とする組織を積極的に標的とすることも可能にする。ＣＡＲ−Ｔ細胞をシャペロンとして使用することによって、発明者らは腫瘍、脾臓、肺及びリンパ節を含む、Ｔ細胞のホーミングに好都合な特定の組織にナノ粒子を効率的に局在化させることができた。ＣＡＲ−Ｔ細胞免疫療法をＡ２ａＲの小分子アンタゴニストと組み合わせるこの方法は、種々の型のがん、たとえば、乳癌、前立腺癌、脳腫瘍及び白血病に適用されてもよい。これらのがんは予後不良と関連するＣＤ７３を発現していると報告されている。全般的に見れば、これは固形腫瘍の治療法の有効性及び特異性を潜在的に改善することができる有望なプラットフォームである。
【０１６０】
上記に記載されている種々の方法及び技法は本出願を実施する多数の方法を提供する。当然、記載されている目的及び利点のすべてを本明細書に記載されている特定の実施形態に従って必ずしも達成できるわけではないことが理解されるべきである。したがって、たとえば、当業者は、本明細書で教示され、または示唆されているような他の目的または利点を必ずしも達成することなく、本明細書で教示されているような１つの利点または利点の群を達成するまたは最適化するやり方で方法を実施することができることを認識するであろう。種々の代替が本明細書で言及されている。一部の好ましい実施形態は１つの、別のまたは幾つかの特徴を具体的に含む一方で、他の実施形態は１つの、別のまたは幾つかの特徴を具体的に排除する一方で、さらに他の実施形態は１つの、別のまたは幾つかの有利な特徴の包含によって特定の特徴を軽減することが理解されるべきである。
【０１６１】
さらに、技量のある熟練者は様々な実施形態に由来する種々の特徴の適用可能性を認識するであろう。同様に、上記で議論された種々の要素、特徴及び工程と同様にそのような要素、特徴または工程のそれぞれについての他の既知の同等物が当業者によって種々の組み合わせで採用されて、本明細書に記載されている原理に従って方法を実施することができる。種々の要素、特徴及び工程の間では、多様な実施形態にて一部は具体的に含まれるであろうし、他は具体的に排除されるであろう。
【０１６２】
本出願は特定の実施形態及び実施例の文脈で開示されているが、本出願の実施形態は具体的に開示されている実施形態を超えて他の代替の実施形態及び／またはそれらの使用及び修正及び同等物まで拡大することが当業者によって理解されるであろう。
【０１６３】
本出願を実施するための本発明者らに知られる最良の方法を含む本出願の好ましい実施形態が本明細書に記載されている。それらの好ましい実施形態における変化は前述の説明を読む際に当業者に明らかになるであろう。技量のある熟練者が適宜そのような変化を採用し得ることが熟考され、本出願は本明細書に具体的に記載されている以外に実践することができる。したがって、本出願の多数の実施形態は、適用法令によって許可されるような本明細書に添付されたクレームにて引用されている主題の修正及び同等物をすべて含む。さらに、考えられるその変化のすべてにおける上述の要素の組み合わせが、本明細書で特に指示されない限り、または文脈によって明瞭に否定されない限り、本出願によって包含される。
【０１６４】
本明細書で言及されている特許、特許出願、特許出願の公開、及び他の資料、たとえば、論文、書籍、明細書、出版物、文書、事物等はすべて、それらに関連する出願審査履歴、本文書と矛盾するもしくは対立するそれらのいずれか、または本文書に今やもしくは後で関連するクレームの最も広い範囲に関して限定的影響を有する可能性があるそれらのいずれかを除いて、あらゆる目的で全体として参照によって本明細書に組み入れられる。例として、組み込まれた資料のいずれかと関連する用語の記載、定義及び／または使用と本文書に関連するそれとの間で矛盾または対立があれば、本文書における用語の記載、定義及び／または使用が優先すべきである。
【０１６５】
本明細書で開示されている本出願の実施形態は本出願の実施形態の原理の説明に役立つことが理解されるべきである。採用することができる他の修正は本出願の範囲の中にあることができる。したがって、例として、しかし、限定ではなく、本明細書の教示に従って本出願の実施形態の代わりの構成を利用することができる。したがって、本出願の実施形態は、まさに示され、且つ記載されているものに限定されない。
【０１６６】
本発明の種々の実施形態は詳細な説明にて上記に記載されている。これらの説明が上記実施形態を直接記載している一方で、当業者は本明細書で示され、且つ記載されている具体的な実施形態に対する修正及び／または変化を思い付いてもよいことが理解される。本説明の範囲内に入るそのような修正または変化は同様にその中に含まれるように意図される。具体的に言及されない限り、本明細書及びクレームにおける単語及び語句には適用できる当該技術（複数可）における当業者にとって普通の且つ慣れた意味が与えられることは本発明者らの意図である。
【０１６７】
本出願を出願するこの時点で出願者に既知の本発明の種々の実施形態の前述の説明が提示されており、説明及び記載の目的向けである。本記載は、包括的であるようには意図されず、開示されている正確な形態に本発明を限定するようにも意図されず、上記の教示の観点から多数の修正及び変化が可能である。記載されている実施形態は本発明の原理及びその実践的な適用を説明するのに役立ち、他の当業者が熟考される特定の使用に合うように種々の実施形態にて及び種々の修正と共に本発明を利用するのを可能にするのに役立つ。したがって、本発明は、発明を実行するために開示されている特定の実施形態に限定されないことが意図される。
【０１６８】
本発明の特定の実施形態が示され、且つ記載されている一方で、本明細書の教示に基づいて、本発明及びその広い態様から逸脱することなく変更及び修正が行われてもよいので、添付のクレームは本発明の真の精神及び範囲の範囲内にあるようにそのような変更及び修正すべてをその範囲内に包含すべきであることが当業者に明白であるであろう。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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