(57)【要約】  本発明は、（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、（ｂ）上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分とを含む、新規な二重特異性抗原結合分子、およびこれらの分子を作製する方法、および同分子を使用する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含むＯＸ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と
を含む二重特異性抗原結合分子。
【請求項２】
（ｃ）安定に会合することができる第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃ領域
をさらに含む、請求項１に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項３】
ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、配列番号１のアミノ酸配列を含む、またはからなるポリペプチドに結合し、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分が、配列番号４９のアミノ酸配列を含む、またはからなるポリペプチドに結合してもよい、請求項１または２に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項４】
ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、
（ｉ）配列番号４および配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号６および配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、ならびに
（ｉｉｉ）配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨと、
（ｉｖ）配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、ならびに
（ｖｉ）配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５および配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬと
を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項５】
ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３および配列番号４５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４および配列番号４６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項６】
ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、
（ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｉｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｉｖ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｖ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４２のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｖｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｖｉｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項７】
ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分が、
（ｉ）アミノ酸配列、配列番号５１を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）アミノ酸配列、配列番号５２を含むＣＤＲ−Ｈ２、および
（ｉｉｉ）アミノ酸配列、配列番号５３を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨと、
（ｉｖ）アミノ酸配列、配列番号５４を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｖ）アミノ酸配列、配列番号５５を含むＣＤＲ−Ｌ２、および
（ｖｉ）アミノ酸配列、配列番号５６を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬと
を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項８】
ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分が、配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項９】
（ｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＯＸ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と
を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１０】
ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、配列番号２のアミノ酸配列を含む、またはからなるポリペプチドに結合し、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分が、配列番号５０のアミノ酸配列を含む、またはからなるポリペプチドに結合してもよい、請求項１または２に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１１】
ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、
（ｉ）アミノ酸配列、配列番号２７を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）アミノ酸配列、配列番号２８を含むＣＤＲ−Ｈ２、および
（ｉｉｉ）アミノ酸配列、配列番号２９を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨと、
（ｉｖ）アミノ酸配列、配列番号３０を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｖ）アミノ酸配列、配列番号３１を含むＣＤＲ−Ｌ２、および
（ｖｉ）アミノ酸配列、配列番号３２を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬと
を含む、請求項１、２または１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１２】
ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む、請求項１、２、１０または１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１３】
ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分が、
（ｉ）アミノ酸配列、配列番号５７を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）アミノ酸配列、配列番号５８を含むＣＤＲ−Ｈ２、および
（ｉｉｉ）アミノ酸配列、配列番号５９を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨと、
（ｉｖ）アミノ酸配列、配列番号６０を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｖ）アミノ酸配列、配列番号６１を含むＣＤＲ−Ｌ２、および
（ｖｉ）アミノ酸配列、配列番号６２を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬと
を含む、請求項１、２または１０から１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１４】
ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分が、配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む、請求項１、２または１０から１３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１５】
Ｆｃ領域が、（ｉ）アミノ酸突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を有するヒトＩｇＧ１サブクラス、または（ｉｉ）アミノ酸突然変異Ｄ２６５ＡおよびＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を有するマウスＩｇＧ１サブクラスのものである、請求項２から１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１６】
（ｉ）Ｆｃ領域の第１のサブユニットが、アミノ酸置換Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含み、Ｆｃ領域の第２のサブユニットが、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６ＳおよびＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む、または
（ｉｉ）Ｆｃ領域の第１のサブユニットが、アミノ酸置換Ｋ３９２ＤおよびＫ４０９Ｄ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含み、Ｆｃ領域の第２のサブユニットが、アミノ酸置換Ｅ３５６ＫおよびＤ３９９Ｋ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む、
請求項２から１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１７】
請求項１から１６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１７に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１７に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２０】
二重特異性抗原結合分子を作製する方法であって、請求項１９に記載の宿主細胞を、二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で培養することと、二重特異性抗原結合分子を単離することとを含む方法。
【請求項２１】
請求項１から１６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子と、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物。
【請求項２２】
医薬として使用するための、請求項１から１６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子または請求項２１に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
（ｉ）Ｔ細胞応答の刺激、
（ｉｉ）活性化Ｔ細胞の生存の支持、
（ｉｉｉ）感染症の治療、
（ｉｖ）がんの治療、
（ｖ）がんの進行の遅延、または
（ｖｉ）がんを患っている患者の生存の延長
における使用のための、請求項１から１６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子または請求項２１に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
がんの治療における使用のための、請求項１から１６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子または請求項２１に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
がんを治療するための医薬の製造における、請求項１から１６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子または請求項２１に記載の薬学的組成物の使用。
【請求項２６】
がんを有する個体を治療する方法であって、有効量の請求項１から１６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子または請求項２１に記載の薬学的組成物を個体に投与することを含む方法。
【請求項２７】
がんを有する個体における細胞傷害性Ｔ細胞活性を上方制御または延長する方法であって、有効量の請求項１から１６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子または請求項２１に記載の薬学的組成物を個体に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、（ｂ）上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分とを含む、新規な二重特異性抗原結合分子に関する。本発明はさらに、これらの分子を作製する方法および同分子を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーのいくつかのメンバーは、初期Ｔ細胞活性化後に、Ｔ細胞応答を維持するよう機能するので、免疫系の組織化および機能において中心的役割を有する。ＣＤ２７、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＨＶＥＭ、ＣＤ３０およびＧＩＴＲは、Ｔ細胞に対する共刺激効果を有することができ、これは、これらが初期Ｔ細胞活性化後にＴ細胞応答を維持することを意味する（Ｗａｔｔｓ  Ｔ．Ｈ．（２００５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３、２３〜６８）。これらの共刺激ＴＮＦＲファミリーメンバーの効果は、ＣＤ２８の効果からおよび互いに、機能的に、時間的にまたは空間的に分離され得ることが多い。様々な共刺激因子によるＴ細胞活性化／生存シグナルの連続的および一過的調節は、Ｔ細胞生存の密な制御を維持しながら、応答の長寿命を可能にするよう機能し得る。疾患状態に応じて、共刺激ＴＮＦファミリーメンバーを介した刺激は、疾患を憎悪させるまたは改善することができる。これらの複雑性にもかかわらず、ＴＮＦＲファミリー共刺激因子の刺激または遮断は、がん、感染性疾患、移植および自己免疫を含むいくつかの治療用途への見込みを示す。
【０００３】
いくつかの共刺激分子の中でも、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリーメンバーＯＸ４０（ＣＤ１３４）は、エフェクターおよびメモリーＴ細胞の生存およびホメオスタシスにおいて重要な役割を果たす（Ｃｒｏｆｔ  Ｍ．ら（２００９）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２２９、１７３〜１９１）。ＯＸ４０（ＣＤ１３４）は、いくつかの細胞型で発現され、感染症、腫瘍および自己抗原に対する免疫応答を調節し、その発現がＴ細胞、ＮＫＴ細胞およびＮＫ細胞ならびに好中球の表面上で実証されており（Ｂａｕｍａｎｎ  Ｒ．ら（２００４）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４、２２６８〜２２７５）、種々の刺激性シグナルに応答して厳密に誘導性であるまたは強力に上方制御されることが示されている。分子の機能的活性は、全てのＯＸ４０発現細胞型で実証されており、インビボでのＯＸ４０媒介活性の複雑な調節を示唆している。Ｔ細胞受容体誘因と合わせて、その天然リガンドまたはアゴニスト抗体によるＴ細胞上のＯＸ４０エンゲージメントが、ＰＩ３ＫおよびＮＦκＢシグナル伝達経路の相乗的活性化をもたらす（Ｓｏｎｇ  Ｊ．ら（２００８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １８０（１１）、７２４０〜７２４８）。今度は、これが増殖増強、サイトカイン受容体およびサイトカイン産生増加ならびに活性化Ｔ細胞のより優れた生存をもたらす。エフェクターＣＤ４＋またはＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるその共刺激活性に加えて、ＯＸ４０誘因は、Ｔ調節性細胞の発達および免疫抑制機能を阻害することが近年示されている。この効果は、少なくとも一部は、抗腫瘍または抗微生物免疫応答に対するＯＸ４０の増強活性を担うようである。ＯＸ４０エンゲージメントがＴ細胞集団を拡大し、サイトカイン分泌を促進し、Ｔ細胞記憶を支持するので、抗体およびリガンドＯＸ４０Ｌの可溶性型を含むアゴニストが種々の前臨床腫瘍モデルに首尾よく使用されてきた（Ｗｅｉｎｂｅｒｇら（２０００）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４、２１６０〜２１６９）。
【０００４】
入手可能な前臨床および臨床データは、がんに対する有効な内因性免疫応答を誘導および増強することができるＯＸ４０および４−１ＢＢなどの共刺激ＴＮＦＲファミリーメンバーの有効なアゴニストの高い臨床的必要性が存在することを明確に実証している。しかしながら、これらの効果は単一細胞型に限定されることも単一機構を介して作用することもほとんど全くなく、細胞間および細胞内シグナル伝達機構を解明するよう設計された研究によって明らかになった複雑性のレベルは増加し続けている。よって、単一細胞型に優先的に作用する「標的化」アゴニストの必要性がある。本発明の抗原結合分子は、腫瘍特異的または腫瘍関連標的に優先的に結合することができる部分と、共刺激ＴＮＦ受容体に作動的に結合することができる部分を組み合わせる。本発明の抗原結合分子は、ＴＮＦ受容体を有効にだけでなく、所望の部位で極めて選択的に誘因し、それによって望ましくない副作用を減少させることができる。
【０００５】
腫瘍関連カルシウムシグナル伝達因子（ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）１（ＴＡＣＳＴＤ１）、１７−１ＡおよびＣＤ３２６としても知られている上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）は、上皮がんで高度に、および正常な単層上皮で低レベルに発現されるＩ型の約４０ｋＤａの膜貫通糖タンパク質である。ＥｐＣＡＭの構造および機能は、例えば、Ｓｃｈｎｅｌｌら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ−Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ（２０１３）、１８２８（８）：１９８９〜２００１；Ｔｒｚｐｉｓら  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．（２００７）１７１（２）：３８６〜３９５ならびにＢａｅｕｅｒｌｅおよびＧｉｒｅｓ、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、（２００７）９６：４１７〜４２３に概説されている。
【０００６】
ＥｐＣＡＭは、側底膜で発現され、カルシウム非依存性同種親和性細胞接着で役割を果たす。成熟ＥｐＣＡＭ分子（２３個のアミノ酸シグナルペプチドを除去するプロセシング後）は、上皮成長因子様反復領域、ヒトサイログロブリン（ＴＹ）反復領域およびシステインに乏しい領域、単回通過２３アミノ酸膜貫通ドメインを含むＮ末端２４２アミノ酸細胞外ドメインと、α−アクチニンおよびＮＰＸＹ内部移行モチーフのための２つの結合部位を含むＣ末端２６アミノ酸細胞質ドメインとを含む。
【０００７】
ＥｐＣＡＭは、上皮起源のがんで頻繁に過剰発現され、がん幹細胞によって発現されるので、治療および診断のための重要な目的となる分子である。細胞外ドメインＥｐＣＡＭを切断して、可溶性細胞外ドメイン分子ＥｐＥＸおよび細胞内分子ＥｐＩＣＤを得ることができる。ＥｐＩＣＤは、他のタンパク質と会合して、細胞増殖を促進する遺伝子の発現を上方制御する核複合体を形成することが示されている（Ｍａｅｔｚｅｌら、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（２００９）１１（２）：１６２〜１７１）。ＥｐＣＡＭはまた、上皮細胞から間葉細胞転換（ＥＭＴ）に関与し、大きな転移の形成に寄与し得る（Ｉｍｒｉｃｈら、Ｃｅｌｌ  Ａｄｈ  Ｍｉｇｒ．（２０１２）６（１）：３０〜３８）。
【０００８】
種々の癌を治療するための抗ＥｐＣＡＭ抗体の使用について、いくつかの臨床試験が行われている（例えば、Ｍｕｅｎｚら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔ．（２０１０）１０：４４ならびにＢａｅｕｅｒｌｅおよびＧｉｒｅｓ、上記に概説されている）。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、
（ａ）抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含むＯＸ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００１０】
本発明の新規な二重特異性抗原結合分子は、ＥｐＣＡＭに対するその結合能により、ＥｐＣＡＭが発現される部位で非常に選択的にＯＸ４０を誘因することができる。そのため、副作用が劇的に減少し得る。
【００１１】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子が、
（ｃ）安定に会合することができる第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃ領域
をさらに含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、配列番号１のアミノ酸配列を含む、またはからなるポリペプチドに結合する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分が、配列番号４９のアミノ酸配列を含む、またはからなるポリペプチドに結合する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、
（ｉ）配列番号４および配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号６および配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、ならびに
（ｉｉｉ）配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
（ｉｖ）配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、ならびに
（ｖｉ）配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５および配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と
を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３および配列番号４５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４および配列番号４６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、
（ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｉｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｉｖ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｖ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４２のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｖｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｖｉｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分が、
（ｉ）アミノ酸配列、配列番号５１を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）アミノ酸配列、配列番号５２を含むＣＤＲ−Ｈ２、および
（ｉｉｉ）アミノ酸配列、配列番号５３を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨと、
（ｉｖ）アミノ酸配列、配列番号５４を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｖ）アミノ酸配列、配列番号５５を含むＣＤＲ−Ｌ２、および
（ｖｉ）アミノ酸配列、配列番号５６を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬと
を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分が、配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分が、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子が、
（ｉ）配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３および配列番号４５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４および配列番号４６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＯＸ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と
を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子が、
（ｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＯＸ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と
を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、配列番号２のアミノ酸配列を含む、またはからなるポリペプチドに結合する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分が、配列番号５０のアミノ酸配列を含む、またはからなるポリペプチドに結合する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、
（ｉ）アミノ酸配列、配列番号２７を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）アミノ酸配列、配列番号２８を含むＣＤＲ−Ｈ２、および
（ｉｉｉ）アミノ酸配列、配列番号２９を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨと、
（ｉｖ）アミノ酸配列、配列番号３０を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｖ）アミノ酸配列、配列番号３１を含むＣＤＲ−Ｌ２、および
（ｖｉ）アミノ酸配列、配列番号３２を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬと
を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分が、
（ｉ）アミノ酸配列、配列番号５７を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）アミノ酸配列、配列番号５８を含むＣＤＲ−Ｈ２、および
（ｉｉｉ）アミノ酸配列、配列番号５９を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨと、
（ｉｖ）アミノ酸配列、配列番号６０を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｖ）アミノ酸配列、配列番号６１を含むＣＤＲ−Ｌ２、および
（ｖｉ）アミノ酸配列、配列番号６２を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬと
を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分が、配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分が、配列番号６５のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子が、
（ｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＯＸ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と
を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域がＩｇＧ、特にＩｇＧ１  Ｆｃ領域またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。
【００３２】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域が、Ｆｃ受容体に対する抗体の結合親和性および／またはエフェクター機能を減少させる１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域が、（ｉ）アミノ酸突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含むヒトＩｇＧ１サブクラス、または（ｉｉ）アミノ酸突然変異Ｄ２６５ＡおよびＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含むマウスＩｇＧ１サブクラスのものである。
【００３４】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域が、Ｆｃ領域の第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。
【００３５】
いくつかの実施形態では、ノブ・イントゥ・ホール法に従って、Ｆｃ領域の第１のサブユニットがノブを含み、Ｆｃ領域の第２のサブユニットがホールを含む。
【００３６】
いくつかの実施形態では、（ｉ）Ｆｃ領域の第１のサブユニットが、アミノ酸置換Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含み、Ｆｃ領域の第２のサブユニットが、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６ＳおよびＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む、または（ｉｉ）Ｆｃ領域の第１のサブユニットが、アミノ酸置換Ｋ３９２ＤおよびＫ４０９Ｄ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含み、Ｆｃ領域の第２のサブユニットが、アミノ酸置換Ｅ３５６ＫおよびＤ３９９Ｋ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【００３７】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子が、
（ａ）Ｆｃ領域に接続されたＯＸ４０に特異的に結合することができる少なくとも２つのＦａｂ断片と、
（ｂ）Ｆｃ領域のＣ末端に接続されたＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と
を含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子が、
（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片およびＦｃ領域を含む抗体の２つの軽鎖および２つの重鎖と、
（ｂ）ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分のＶＨおよびＶＬであって、ＶＨが（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されており、ＶＬが（ａ）の２つの重鎖の他方のＣ末端に接続されているＶＨおよびＶＬと
を含む。
【００３９】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子が、
（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片およびＦｃ領域を含む抗体の２つの軽鎖および２つの重鎖と、
（ｂ）ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片であって、Ｆａｂ断片の一方が（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されており、Ｆａｂ断片の他方が（ａ）の２つの重鎖の他方のＣ末端に接続されている２つのＦａｂ断片と
を含む。
【００４０】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子が、
（ａ）各重鎖がＯＸ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＨおよびＣＨ１ドメインならびにＦｃ領域サブユニットを含む、２つの重鎖と、
（ｂ）各軽鎖がＯＸ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＬおよびＣＬドメインを含む、２つの軽鎖と、
（ｃ）ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分のＶＨおよびＶＬであって、ＶＨが（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されており、ＶＬが（ａ）の２つの重鎖の他方のＣ末端に接続されている、ＶＨおよびＶＬと
を含む。
【００４１】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子が、
（ａ）各重鎖がＯＸ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＨおよびＣＨ１ドメインならびにＦｃ領域サブユニットを含む、２つの重鎖と、
（ｂ）各軽鎖がＯＸ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＬおよびＣＬドメインを含む、２つの軽鎖と、
（ｃ）ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片であって、Ｆａｂ断片の一方が（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されており、Ｆａｂ断片の他方が（ａ）の２つの重鎖の他方のＣ末端に接続されている２つのＦａｂ断片と
を含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片が、各々がＶＬ−ＣＨ１鎖およびＶＨ−ＣＬ鎖を含み、ＶＬ−ＣＨ１鎖の一方が（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されており、ＶＬ−ＣＨ１鎖の他方が（ａ）の２つの重鎖の他方のＣ末端に接続されている、クロスオーバーＦａｂ断片である。
【００４３】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子が、ＯＸ４０に特異的に結合することができる４つのＦａｂ断片を含む。
【００４４】
いくつかの実施形態では、（ａ）の２つの重鎖の各々が、ＯＸ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片の２つのＶＨドメインおよび２つのＣＨ１ドメインを含む。
【００４５】
いくつかの実施形態では、ＯＸ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片の１つまたは複数が、
１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸のアルギニン（Ｒ）および１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸のリジン（Ｋ）を含むＣＬドメインと、
１４７位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸のグルタミン酸（Ｅ）および２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸のグルタミン酸（Ｅ）を含むＣＨ１ドメインと
を含む。
【００４６】
本発明はまた、
配列番号１８３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、
配列番号１８４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、
各々が配列番号１８２のアミノ酸配列を含む、４つの軽鎖と
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００４７】
本発明はまた、
各々が配列番号１８６のアミノ酸配列を含む、２つの重鎖と、
各々が配列番号１８７のアミノ酸配列を含む、２つの軽鎖と、
各々が配列番号１８５のアミノ酸配列を含む、４つの軽鎖と
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００４８】
本発明はまた、
配列番号１９２のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、
配列番号１９３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、
各々が配列番号１９１のアミノ酸配列を含む、４つの軽鎖と
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００４９】
本発明はまた、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００５０】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【００５１】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００５２】
本発明はまた、二重特異性抗原結合分子を作製する方法であって、本発明の宿主細胞を、二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で培養することと、二重特異性抗原結合分子を単離することとを含む方法を提供する。
【００５３】
本発明はまた、本発明の二重特異性抗原結合分子と、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物を提供する。
【００５４】
本発明はまた、医薬として使用するための、本発明の二重特異性抗原結合分子または本発明の薬学的組成物を提供する。
【００５５】
本発明はまた、
（ｉ）Ｔ細胞応答の刺激、
（ｉｉ）活性化Ｔ細胞の生存の支持、
（ｉｉｉ）感染症の治療、
（ｉｖ）がんの治療、
（ｖ）がんの進行の遅延、または
（ｖｉ）がんを患っている患者の生存の延長
に使用するための、本発明の二重特異性抗原結合分子または本発明の薬学的組成物を提供する。
【００５６】
本発明はまた、がんの治療に使用するための、本発明の二重特異性抗原結合分子または本発明の薬学的組成物を提供する。
【００５７】
本発明はまた、がんを治療するための医薬の製造における、本発明の二重特異性抗原結合分子または本発明の薬学的組成物の使用を提供する。
【００５８】
本発明はまた、がんを有する個体を治療する方法であって、有効量の本発明の二重特異性抗原結合分子または本発明の薬学的組成物を個体に投与することを含む方法を提供する。
【００５９】
本発明はまた、細胞傷害性Ｔ細胞活性を上方制御または延長するのに使用するための、本発明の二重特異性抗原結合分子または本発明の薬学的組成物を提供する。
【００６０】
本発明はまた、細胞傷害性Ｔ細胞活性を上方制御または延長するための医薬の製造における、本発明の二重特異性抗原結合分子または本発明の薬学的組成物の使用を提供する。
【００６１】
本発明はまた、がんを有する個体の細胞傷害性Ｔ細胞活性を上方制御または延長する方法であって、有効量の本発明の二重特異性抗原結合分子または本発明の薬学的組成物を個体に投与することを含む方法を提供する。
【００６２】
本発明の種々の態様によるいくつかの実施形態では、個体が哺乳動物、特にヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】抗ヒトＯＸ４０抗体を調製するために使用したＦｃ結合ヒトＯＸ４０抗原ＥＣＤのモノマー型を示す図である。
【図２Ａ−Ｂ】Ａは、二重特異性、四価抗ＯＸ４０、一価抗ＥｐＣＡＭ  ｈｕ／ｍｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ／ＤＡＰＧ  ｋｉｈ４＋１コンストラクトの概略図である。Ｂは、二重特異性、四価抗ヒトＯＸ４０、二価抗ヒトＥｐＣＡＭ  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ｋｉｈ４＋２コンストラクトの概略図である。荷電残基を星印として示す。
【図３Ａ−Ｄ】二重特異性、四価抗マウスＯＸ４０、一価抗マウスＥｐＣＡＭ（４＋１  ｍｕＥｐＣＡＭ）；単一特異性、四価抗マウスＯＸ４０、非標的化（４＋１対照）；または単一特異性、二価抗マウスＥｐＣＡＭ  ＩｇＧ（ｍｕＥｐＣＡＭ  ＩｇＧ）と静止および活性化マウスＣＤ４＋ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞の結合を示す図である。図３Ａは活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞への結合を示し、図３Ｂは活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞への結合を示し、図３Ｃは静止ＣＤ４＋Ｔ細胞への結合を示し、図３Ｄは静止ＣＤ８＋Ｔ細胞への結合を示す。結合を、二次検出抗体として使用される、ＰＥコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃγ−断片特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片の蛍光強度（ＭＦＩ）の中央値として示す。ＭＦＩをフローサイトメトリーによって測定し、ブランク対照のＭＦＩを減じることによって、ベースライン補正した。ｘ軸は抗原結合分子の濃度を示す。ＯＸ４０結合ドメインを含む抗原結合分子の全てが、活性化ＯＸ４０発現マウスＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に結合する。ＯＸ４０は、静止マウスＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上で発現されない（図３Ｃおよび図３Ｄ）。活性化後、ＯＸ４０は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上で上方制御される（図３Ａおよび図３Ｂ）。
【図４Ａ−Ｂ】二重特異性、四価抗マウスＯＸ４０、一価抗マウスＥｐＣＡＭ（４＋１  ｍｕＥｐＣＡＭ）；二重特異性、四価抗マウスＯＸ４０、非標的化（４＋１対照）；または単一特異性、二価抗マウスＥｐＣＡＭ  ＩｇＧ（ｍｕＥｐＣＡＭ  ＩｇＧ）分子とＣＴ２６ｍｕＥｐＣＡＭおよびＣＴ２６ｍｕＦＡＰ細胞の結合を示す図である。図４Ａは、マウスＥｐＣＡＭを安定に発現するＣＴ２６ｍｕＥｐＣＡＭ細胞への結合を示す。図４Ｂは、マウスＦＡＰを安定に発現し、マウスＥｐＣＡＭを発現しない、ＣＴ２６ｍｕＦＡＰ細胞への結合を示す。結合を、二次検出抗体として使用される、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ  Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片の蛍光強度（ＭＦＩ）の中央値として示す。ＭＦＩをフローサイトメトリーによって測定し、ブランク対照のＭＦＩを減じることによって、ベースライン補正した。ｘ軸は抗原結合分子の濃度を示す。マウスＥｐＣＡＭ結合ドメインを含む抗原結合分子は、ＣＴ２６ｍｕＥｐＣＡＭ細胞に結合するが、ＣＴ２６ｍｕＦＡＰ細胞には結合しない。
【図５Ａ−Ｄ】細胞サイズおよび細胞数の分析によって決定される、ＣＴ２６ｍｕＥｐＣＡＭ細胞による架橋の存在下での、二重特異性、四価抗マウスＯＸ４０、一価抗マウスＥｐＣＡＭ（４＋１  ｍｕＥｐＣＡＭ）；単一特異性、四価抗マウスＯＸ４０、非標的化（４＋１対照）；または単一特異性、二価抗マウスＥｐＣＡＭ  ＩｇＧ（ｍｕＥｐＣＡＭ  ＩｇＧ）分子による、事前活性化マウスＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の最適以下ＴＣＲ再刺激のレスキューを示す図である。図５Ａは、順方向散乱（ＦＳＣ）によって決定されるＣＤ４＋Ｔ細胞サイズを示し、図５Ｂは、ＦＳＣによって決定されるＣＤ８＋Ｔ細胞サイズを示し、図５Ｃは、ＣＤ４＋Ｔ細胞イベント数を示し、図５Ｄは、ＣＤ８＋Ｔ細胞イベント数を示す。値を、抗マウスＣＤ３のみを含有する（そしてＯＸ４０／ＥｐＣＡＭ標的化コンストラクトを含有しない）試料についての値にベースライン補正した。
【図６Ａ−Ｄ】ＣＤ２５発現の分析によって決定される、ＣＴ２６ｍｕＥｐＣＡＭ細胞による架橋の存在下での、二重特異性、四価抗マウスＯＸ４０、一価抗マウスＥｐＣＡＭ（４＋１  ｍｕＥｐＣＡＭ）；単一特異性、四価抗マウスＯＸ４０、非標的化（４＋１対照）；または単一特異性、二価抗マウスＥｐＣＡＭ  ＩｇＧ（ｍｕＥｐＣＡＭ  ＩｇＧ）分子による、事前活性化マウスＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の最適以下ＴＣＲ再刺激のレスキューを示す図である。図６Ａは、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団内のＣＤ２５＋細胞の割合を示し、図６Ｂは、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団内のＣＤ２５＋細胞の割合を示し、図６Ｃは、ＣＤ４＋Ｔ細胞上で発現されるＣＤ２５についての平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示し、図６Ｄは、ＣＤ８＋Ｔ細胞上で発現されるＣＤ２５についてのＭＦＩを示す。値を、抗マウスＣＤ３のみを含有する（そしてＯＸ４０／ＥｐＣＡＭ標的化コンストラクトを含有しない）試料についての値にベースライン補正した。
【図７Ａ−Ｄ】二重特異性、四価抗ヒトＯＸ４０、二価または一価抗ヒトＥｐＣＡＭ（すなわち、４＋２または４＋１フォーマット）；単一特異性、四価抗ヒトＯＸ４０、非標的化（４＋１対照）；または単一特異性、二価抗ヒトＥｐＣＡＭ  ＩｇＧ（ｈｕＥｐＣＡＭ  ＩｇＧ）分子と静止および活性化ヒトＣＤ４＋ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞の結合を示す図である。図７Ａは、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞への結合を示し、図７Ｂは、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞への結合を示し、図７Ｃは、静止ＣＤ４＋Ｔ細胞への結合を示し、図７Ｄは、静止ＣＤ８＋Ｔ細胞への結合を示す。結合を、二次検出抗体として使用される、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片特異性ヤギＩｇＧＦ（ａｂ’）２断片の蛍光強度（ＭＦＩ）の中央値として示す。ＭＦＩをフローサイトメトリーによって測定し、ブランク対照のＭＦＩを減じることによって、ベースライン補正した。ｘ軸は抗原結合分子の濃度を示す。ＯＸ４０結合ドメインを含む抗原結合分子の全てが、活性化ＯＸ４０発現ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に結合し、活性化ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞に低い程度に結合する。ＯＸ４０は静止ヒトＰＢＭＣ上で発現されない（図７Ｃおよび図７Ｄ）。活性化後、ＯＸ４０はＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上で上方制御される（図７Ａおよび図７Ｂ）。ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞上のＯＸ４０発現は、ＣＤ４＋Ｔ細胞上より低い。
【図８】フローサイトメトリーによって決定される、ＫＡＴＯ−ＩＩＩ、ＮＩＨ／３Ｔ３ｈｕＥｐＣＡＭクローン４４細胞およびＨｅＬａ＿ｈｕＯＸ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１レポーター細胞上のヒトＥｐＣＡＭの発現の分析を示す図である。ｈｕＥｐＣＡＭへの結合を、試験する３つの細胞株で、ＰＥコンジュゲート抗ｈｕＥｐＣＡＭ抗体クローンＥＢＡ−１を使用したフローサイトメトリーによって分析した。ＨｅＬａ＿ｈｕＯＸ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１レポーター細胞はヒトＥｐＣＡＭについて陰性であり、ＮＩＨ／３Ｔ３ｈｕＥｐＣＡＭクローン４４細胞はヒトＥｐＣＡＭを発現し、ＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞は高レベルのヒトＥｐＣＡＭを発現する。
【図９Ａ−Ｂ】二重特異性、四価抗ヒトＯＸ４０、一価抗ヒトＥｐＣＡＭ（４＋１  ｈｕＥｐＣＡＭ）；二重特異性、四価抗ヒトＯＸ４０、二価抗ヒトＥｐＣＡＭ（４＋２  ｈｕＥｐＣＡＭ）；単一特異性、四価抗マウスＯＸ４０、非標的化（４＋１対照）；および単一特異性、二価抗ヒトＥｐＣＡＭ  ＩｇＧ（ｈｕＥｐＣＡＭ  ＩｇＧ）分子とＫＡＴＯ−ＩＩ細胞およびＡ５４９  ＮＬＲ細胞の結合を示す図である。図９Ａは、ヒトＥｐＣＡＭを発現するＫＡＴＯ−ＩＩ細胞への結合を示す。図９Ｂは、ヒトＥｐＣＡＭを発現しないＡ５４９  ＮＬＲ細胞への結合を示す。結合を、二次検出抗体として使用される、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片特異性ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片の蛍光強度（ＭＦＩ）の中央値として示す。ＭＦＩをフローサイトメトリーによって測定し、ブランク対照のＭＦＩを減じることによって、ベースライン補正した。ｘ軸は抗原結合分子の濃度を示す。
【図１０Ａ−Ｄ】二重特異性、四価抗ヒトＯＸ４０、一価抗ヒトＥｐＣＡＭ（４＋１  ｈｕＥｐＣＡＭ）；二重特異性、四価抗ヒトＯＸ４０、二価抗ヒトＥｐＣＡＭ（４＋２  ｈｕＥｐＣＡＭ）；単一特異性、四価抗マウスＯＸ４０、非標的化（４＋１対照）；および単一特異性、二価抗ヒトＥｐＣＡＭ  ＩｇＧ（ｈｕＥｐＣＡＭ  ＩｇＧ）分子によるＮＦκＢの活性化を示す図である。図１０Ａは、架橋の非存在下での、抗原結合分子によるＯＸ４０＋ＨｅＬａレポーター細胞におけるＮＦκＢ活性化を示す。図１０Ｂは、抗ヒトＦｃ特異的二次抗体による架橋の存在下での、抗原結合分子によるＯＸ４０＋ＨｅＬａレポーター細胞におけるＮＦκＢ活性化を示す。図１０Ｃは、３Ｔ３ｈｕＥｐＣＡＭ細胞による架橋の存在下での、抗原結合分子によるＯＸ４０＋ＨｅＬａレポーター細胞におけるＮＦκＢ活性化を示す。ＮＦκＢ媒介ルシフェラーゼ活性を、抗原結合分子の濃度（ｎＭ）に対して、５００ｍｓ間測定した放出相対光単位（ＲＬＵ）をプロットすることによって、特徴を明らかにした。ＲＬＵは、ルシフェリンのオキシルシフェリンへのルシフェラーゼ媒介酸化によって放出される。値を、「ブランク対照」条件についてのＲＬＵを減じることによって、ベースライン補正した。図１０Ｄは、曲線下面積（ＡＵＣ）として表される、図１０Ａ〜図１０Ｃのデータを示す。
【図１１Ａ−Ｄ】細胞サイズおよび細胞数の分析によって決定される、ヒトＥｐＣＡＭ発現ＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞による架橋の存在下での、二重特異性、四価抗ヒトＯＸ４０、一価抗ヒトＥｐＣＡＭ（４＋１  ｈｕＥｐＣＡＭ）；二重特異性、四価抗ヒトＯＸ４０、二価抗ヒトＥｐＣＡＭ（４＋２  ｈｕＥｐＣＡＭ）；単一特異性、四価抗ヒトＯＸ４０、非標的化（４＋１対照）；または単一特異性、二価抗ヒトＥｐＣＡＭ  ＩｇＧ（ｈｕＥｐＣＡＭ  ＩｇＧ）による、事前活性化ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の最適以下ＴＣＲ再刺激（ｒｅｓｔｉｈｕｌａｔｉｏｎ）のレスキューを示す図である。図１１Ａは、順方向散乱（ＦＳＣ）によって決定されるＣＤ４＋Ｔ細胞サイズを示し、図１１Ｂは、ＦＳＣによって決定されるＣＤ８＋Ｔ細胞サイズを示し、図１１Ｃは、ＣＤ４＋Ｔ細胞イベント数を示し、図１１Ｄは、ＣＤ８＋Ｔ細胞イベント数を示す。値を、抗ヒトＣＤ３のみを含有する（そしてＯＸ４０／ＥｐＣＡＭ標的化コンストラクトを含有しない）試料についての値にベースライン補正した。
【図１２Ａ−Ｄ】ＣＤ２５発現の分析によって決定される、ヒトＥｐＣＡＭ発現ＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞による架橋の存在下での、二重特異性、四価抗ヒトＯＸ４０、一価抗ヒトＥｐＣＡＭ（４＋１  ｈｕＥｐＣＡＭ）；単一特異性、四価抗ヒトＯＸ４０、非標的化（４＋１対照）；または単一特異性、二価抗ヒトＥｐＣＡＭ  ＩｇＧ（ｈｕＥｐＣＡＭ  ＩｇＧ）による、事前活性化ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の最適以下ＴＣＲ再刺激（ｒｅｓｔｉｈｕｌａｔｉｏｎ）のレスキューを示す図である。図１２Ａは、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団内のＣＤ２５＋細胞の割合を示し、図１２Ｂは、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団内のＣＤ２５＋細胞の割合を示し、図１２Ｃは、ＣＤ４＋Ｔ細胞上で発現されるＣＤ２５についての平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示し、図１２Ｄは、ＣＤ８＋Ｔ細胞上で発現されるＣＤ２５についてのＭＦＩを示す。値を、抗ヒトＣＤ３のみを含有する（そしてＯＸ４０／ＥｐＣＡＭ標的化コンストラクトを含有しない）試料についての値にベースライン補正した。
【図１３Ａ−Ｄ】細胞サイズおよび細胞数の分析によって決定される、ヒトＥｐＣＡＭ発現３Ｔ３ｈｕＥｐＣＡＭ細胞による架橋の存在下での、二重特異性、四価抗ヒトＯＸ４０、一価抗ヒトＥｐＣＡＭ（４＋１  ｈｕＥｐＣＡＭ）；二重特異性、四価抗ヒトＯＸ４０、二価抗ヒトＥｐＣＡＭ（４＋２  ｈｕＥｐＣＡＭ）；単一特異性、四価抗ヒトＯＸ４０、非標的化（４＋１対照）；または単一特異性、二価抗ヒトＥｐＣＡＭ  ＩｇＧ（ｈｕＥｐＣＡＭ  ＩｇＧ）による、事前活性化ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の最適以下ＴＣＲ再刺激（ｒｅｓｔｉｈｕｌａｔｉｏｎ）のレスキューを示す図である。図１３Ａは、順方向散乱（ＦＳＣ）によって決定されるＣＤ４＋Ｔ細胞サイズを示し、図１３Ｂは、ＦＳＣによって決定されるＣＤ８＋Ｔ細胞サイズを示し、図１３Ｃは、ＣＤ４＋Ｔ細胞イベント数を示し、図１３Ｄは、ＣＤ８＋Ｔ細胞イベント数を示す。値を、抗ヒトＣＤ３のみを含有する（そしてＯＸ４０／ＥｐＣＡＭ標的化コンストラクトを含有しない）試料についての値にベースライン補正した。
【図１４Ａ−Ｄ】ＣＤ２５発現の分析によって決定される、ヒトＥｐＣＡＭ発現３Ｔ３ｈｕＥｐＣＡＭ細胞による架橋の存在下での、二重特異性、四価抗ヒトＯＸ４０、一価抗ヒトＥｐＣＡＭ（４＋１  ｈｕＥｐＣＡＭ）；単一特異性、四価抗ヒトＯＸ４０、非標的化（４＋１対照）；または単一特異性、二価抗ヒトＥｐＣＡＭ  ＩｇＧ（ｈｕＥｐＣＡＭ  ＩｇＧ）による、事前活性化ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の最適以下ＴＣＲ再刺激（ｒｅｓｔｉｈｕｌａｔｉｏｎ）のレスキューを示す図である。図１４Ａは、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団内のＣＤ２５＋細胞の割合を示し、図１４Ｂは、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団内のＣＤ２５＋細胞の割合を示し、図１４Ｃは、ＣＤ４＋Ｔ細胞上で発現されるＣＤ２５についての平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示し、図１４Ｄは、ＣＤ８＋Ｔ細胞上で発現されるＣＤ２５についてのＭＦＩを示す。値を、抗ヒトＣＤ３のみを含有する（そしてＯＸ４０／ＥｐＣＡＭ標的化コンストラクトを含有しない）試料についての値にベースライン補正した。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
定義
別途定義のない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する分野で一般的に使用されるのと同じ意味を有する。本明細書を説明する目的で、以下の定義を適用し、適当な場合は、単数形で使用される用語は複数も含み、逆もまた同様である。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「抗原結合分子」という用語は、広義に、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、抗体、抗体断片およびスキャフォールド抗原結合タンパク質である。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）に特異的に結合することができる部分」という用語は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合するポリペプチド分子を指す。特定の態様では、抗原結合部分が、結合する実体、標的部位、例えばＥｐＣＡＭを有する特定の種類の腫瘍細胞または腫瘍間質に向くことができる。ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分は、本明細書でさらに定義される抗体およびその断片を含む。さらに、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分は、本明細書でさらに定義されるスキャフォールド抗原結合タンパク質、例えば設計された反復タンパク質または設計された反復ドメインに基づく結合ドメインを含む（例えば、国際公開第２００２／０２０５６５号参照）。
【００６７】
抗体またはその断片に関して、「上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）に特異的に結合することができる部分」という用語は、ＥｐＣＡＭの一部または全部に特異的に結合し、これと相補的な領域を含む分子の部分を指す。ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分は、例えば、１つまたは複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）によって提供され得る。特に、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分は、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施形態では、「上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）に特異的に結合することができる部分」が、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ断片またはクロスＦａｂ断片であり得る。
【００６８】
「ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分」という用語は、ＯＸ４０に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一態様では、抗原結合部分が、ＯＸ４０を通してシグナル伝達を活性化することができる。ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、本明細書でさらに定義される抗体およびその断片を含む。さらに、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、本明細書でさらに定義されるスキャフォールド抗原結合タンパク質、例えば設計された反復タンパク質または設計された反復ドメインに基づく結合ドメインを含む（例えば、国際公開第２００２／０２０５６５号参照）。特に、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。特定の態様では、「ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分」が、Ｆａｂ断片、クロスＦａｂ断片またはｓｃＦｖであり得る。
【００６９】
本明細書における「抗体」という用語は、広義で使用され、それだけに限らないが、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性および多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ならびに抗体断片を含む種々の抗体構造を包含する。
【００７０】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指す、すなわち、例えば、一般的に微量に存在する変異体などの、天然に存在するまたはモノクローナル抗体調製物の作製中に生じる突然変異を含む考えられる変異抗体を除いて、集団を構成する個々の抗体が同一である、および／または同じエピトープに結合する。典型的に様々な決定基（エピトープ）に対する様々な抗体を含むポリクローナル抗体調製物と対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一決定基に対するものである。
【００７１】
「単一特異性」抗体という用語は、本明細書で使用される場合、各々が同じ抗原の同じエピトープに結合する１つまたは複数の結合部位を有する抗体を示す。「二重特異性」という用語は、抗原結合分子が少なくとも２つの別個の抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。二重特異性抗原結合分子は、各々が異なる抗原決定基に特異的な、少なくとも２つの抗原結合部位を含む。一定の実施形態では、二重特異性抗原結合分子が、２つの抗原決定基、特に２つの別個の細胞上で発現される２つの抗原決定基に同時に結合することができる。例えば、本発明の抗原結合分子は二重特異性であり、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分と、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分とを含む。
【００７２】
本出願内で使用される「価」という用語は、抗原結合分子中の指定された数の結合部位の存在を示す。よって、「二価」、「四価」および「六価」という用語は、それぞれ抗原結合分子中の２つの結合部位、４つの結合部位および６つの結合部位の存在を示す。抗原結合分子の結合価はまた、所与の抗原決定基についての結合部位の数に関して表され得る。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合分子が、ＯＸ４０に関して四価であり、ＥｐＣＡＭに関して二価である（すなわち、４＋２）。
【００７３】
「全長抗体」、「インタクトな抗体」および「全抗体」という用語は、本明細書では互換的に、天然抗体構造に実質的に類似する構造を有する抗体を指すために使用される。「天然抗体」は、種々の構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧクラス抗体は、ジスルフィド結合した２つの軽鎖および２つの重鎖で構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）、引き続いて重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）、引き続いて軽鎖定常領域とも呼ばれる軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を有する。抗体の重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）またはμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つの型の１つに割り当てられ、そのいくつかはサブタイプ、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）およびα２（ＩｇＡ２）にさらに分けられ得る。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの型の１つに割り当てられ得る。
【００７４】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、それだけに限らないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボティ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、クロスＦａｂ断片；線状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および単一ドメイン抗体が挙げられる。一定の抗体断片の概説については、Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９、１２９〜１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、２６９〜３１５頁（１９９４）を参照されたい。また、国際公開第９３／１６１８５号ならびに米国特許第５，５７１，８９４号および同第５，５８７，４５８号も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボ半減期が増加したＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。二価または二重特異性であり得る２つの抗原結合部位を有するダイアボティおよび抗体断片は、例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９、１２９〜１３４（２００３）；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０、６４４４〜６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディおよびテトラボディはまた、Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９、１２９〜１３４（２００３）にも記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部または抗体の軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む抗体断片である。一定の実施形態では、単一ドメイン抗体が、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６号参照）。抗体断片は、それだけに限らないが、本明細書に記載される、インタクトな抗体のタンパク質消化ならびに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはファージ）による産生を含む種々の技術によって作製され得る。
【００７５】
インタクトな抗体のパパイン消化は、各々が重鎖および軽鎖可変ドメインならびに軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一な抗原結合断片をもたらす。よって、本明細書で使用される場合、「Ｆａｂ断片」という用語は、ＶＬおよび軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）を含む軽鎖断片ならびにＶＨおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つまたは複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加によってＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ’断片である。ペプシン処理は、２つの抗原組み合わせ部位（２つのＦａｂ断片）およびＦｃ領域の一部を有するＦ（ａｂ’）２断片をもたらす。本発明によると、「Ｆａｂ断片」という用語はまた、以下で定義される「クロスＦａｂ断片」または「クロスオーバーＦａｂ断片」を含む。
【００７６】
「クロスＦａｂ断片」または「ｘＦａｂ断片」または「クロスオーバーＦａｂ断片」という用語は、重鎖および軽鎖の可変領域または定常領域のいずれかが交換されているＦａｂ断片を指す。クロスＦａｂ分子の２つの異なる鎖組成が可能であり、本発明の二重特異性抗体に含まれる。一方では、Ｆａｂ重鎖および軽鎖の可変領域が交換される、すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖定常領域（ＣＨ１）で構成されるペプチド鎖、ならびに重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成されるペプチド鎖を含む。このクロスオーバーＦａｂ分子はクロスＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも呼ばれる。他方では、Ｆａｂ重鎖および軽鎖の定常領域が交換されると、クロスオーバーＦａｂ分子は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成されるペプチド鎖、ならびに軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖定常領域（ＣＨ１）で構成されるペプチド鎖を含む。このクロスオーバーＦａｂ分子はクロスＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも呼ばれる。
【００７７】
「単鎖Ｆａｂ断片」または「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）およびリンカーからなるポリペプチドであって、前記抗体ドメインおよび前記リンカーが、Ｎ末端からＣ末端方向に以下の順序のうちの１つを有し：ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１またはｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬ；前記リンカーが少なくとも３０個のアミノ酸、好ましくは３２〜５０個のアミノ酸のポリペプチドである、ポリペプチドである。前記単鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合を介して安定化されている。さらに、これらの単鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基の挿入を介した鎖間ジスルフィド結合の生成によってさらに安定化され得るだろう（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによる可変重鎖の４４位および可変軽鎖の１００位）。
【００７８】
「クロスオーバー単鎖Ｆａｂ断片」または「ｘ−ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）およびリンカーからなるポリペプチドであり、前記抗体ドメインおよび前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に以下の順序のうちの１つを有し：ａ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１およびｂ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬ；ＶＨおよびＶＬは一緒になって、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、前記リンカーは少なくとも３０個のアミノ酸のポリペプチドである。さらに、これらのｘ−ｓｃＦａｂ分子は、システイン残基の挿入を介した鎖間ジスルフィド結合の生成によってさらに安定化され得るだろう（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによる可変重鎖の４４位および可変軽鎖の１００位）。
【００７９】
「単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は、１０個〜約２５個のアミノ酸の短いリンカーペプチドで接続された、抗体の重鎖の可変領域（ＶＨ）と軽鎖の可変領域（ＶＬ）の融合タンパク質である。リンカーは通常、フレキシビリティのためにグリシンに富むと同時に可溶性のためにセリンまたはスレオニンに富み、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と接続することができる、または逆もまた同様である。このタンパク質は、定常領域を除去し、リンカーを導入したにもかかわらず、元の抗体の特異性を保持している。ｓｃＦｖ抗体は、例えばＨｏｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３（１９９１）４６〜９６に記載されている。さらに、抗体断片は、ＶＨの特性を有する、すなわちＶＬと集合して機能的抗原結合部位となることでき、またはＶＬの特性を有する、すなわちＶＨと集合して機能的抗原結合部位となることでき、それによって全長抗体の抗原結合特性を提供する単鎖ポリペプチドを含む。
【００８０】
「スキャフォールド抗原結合タンパク質」は、当技術分野で公知であり、例えば、フィブロネクチンおよび設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）は、抗原結合ドメインのための代替スキャフォールドとして使用されている。例えば、ＧｅｂａｕｅｒおよびＳｋｅｒｒａ、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ａｓ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  １３：２４５〜２５５（２００９）およびＳｔｕｍｐｐら、Ｄａｒｐｉｎｓ：Ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  １３：６９５〜７０１（２００８）を参照されたい。本発明の一態様では、スキャフォールド抗原結合タンパク質が、ＣＴＬＡ−４（エビボディ（Ｅｖｉｂｏｄｙ））、リポカリン（アンチカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎ））、プロテインＡ由来分子、例えばプロテインＡのＺドメイン（アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ））、Ａドメイン（アビマー（Ａｖｉｍｅｒ）／マキシボディ（Ｍａｘｉｂｏｄｙ））、血清トランスフェリン（トランスボディ（ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｙ））；設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、抗体軽鎖または重鎖の可変ドメイン（単一ドメイン抗体、ｓｄＡｂ）、抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、ａＶＨ）、ＶＮＡＲ断片、フィブロネクチン（アドネクチン（ＡｄＮｅｃｔｉｎ））、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン（Ｔｅｔｒａｎｅｃｔｉｎ））；新抗原受容体βラクタマーゼの可変ドメイン（ＶＮＡＲ断片）、ヒトγクリスタリンまたはユビキチン（アフィリン（Ａｆｆｉｌｉｎ）分子）；ヒトプロテアーゼ阻害剤のクニッツ型ドメイン、ミクロボディ、例えばノッチンファミリーのタンパク質、ペプチドアプタマーおよびフィブロネクチン（アドネクチン）からなる群から選択される。ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４）は、主にＣＤ４＋Ｔ細胞上で発現されるＣＤ２８ファミリー受容体である。その細胞外ドメインは、可変ドメイン様Ｉｇフォールドを有する。抗体のＣＤＲに対応するループは、異なる結合特性を与える異種配列で置換され得る。異なる結合特異性を有するよう操作されたＣＴＬＡ−４分子は、エビボディとしても知られている（例えば、米国特許第７１６６６９７号）。エビボディは、抗体（例えば、ドメイン抗体）の単離可変領域とほぼ同じサイズである。さらなる詳細については、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８（１〜２）、３１〜４５（２００１）を参照されたい。リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイドおよび脂質などの小型疎水性分子を輸送する細胞外タンパク質のファミリーである。これらは、異なる標的抗原に結合するよう操作され得る円錐構造のオープンエンドのいくつかのループを有する強固なβシート二次構造を有する。アンチカリンはサイズが１６０〜１８０個のアミノ酸であり、リポカリンに由来する。さらなる詳細については、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １４８２：３３７〜３５０（２０００）、米国特許第７２５０２９���号および米国特許出願公開第２００７０２２４６３３号を参照されたい。アフィボディは、抗原に結合するよう操作され得る黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）のプロテインＡに由来するスキャフォールドである。ドメインは、およそ５８個のアミノ酸の三重らせん束からなる。表面残基のランダム化によってライブラリーが作成されている。さらなる詳細については、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２００４、１７、４５５〜４６２および欧州特許第１６４１８１８号を参照されたい。アビマーは、Ａドメインスキャフォールドファミリーに由来するマルチドメインタンパク質である。およそ３５個のアミノ酸の天然ドメインは、定義されたジスルフィド結合構造を採用している。Ａドメインのファミリーによって示される天然変異のシャフリングによって多様性が生まれる。さらなる詳細については、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３（１２）、１５５６〜１５６１（２００５）およびＥｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｕｇｓ  １６（６）、９０９〜９１７（２００７年１月）を参照されたい。トランスフェリンはモノマー血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは、ペプチド配列を許容的な表面ループに挿入することによって、様々な標的抗原に結合するよう操作することができる。操作されたトランスフェリンスキャフォールドの例としてはトランスボディが挙げられる。さらなる詳細については、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７４、２４０６６〜２４０７３（１９９９）を参照されたい。設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）は、膜内在性タンパク質の細胞骨格への付着を媒介するタンパク質のファミリーであるアンキリンに由来する。単一アンキリンリピートは２つのαヘリックスおよび１つのβターンからなる３３残基モチーフである。これらは、各リピートの第１のαヘリックスおよびβターン中の残基をランダム化することによって様々な標的抗原に結合するよう操作することができる。モジュールの数を増加させることによって、その結合面を増加させることができる（親和性成熟の方法）。さらなる詳細については、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２、４８９〜５０３（２００３）、ＰＮＡＳ  １００（４）、１７００〜１７０５（２００３）およびＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６９、１０１５〜１０２８（２００７）および米国特許出願公開第２００４０１３２０２８号を参照されたい。単一ドメイン抗体は、単一モノマー可変抗体ドメインからなる抗体断片である。第１の単一ドメインは、ラクダの抗体重鎖の可変ドメインから誘導された（ナノボディまたはＶＨＨ断片）。さらに、単一ドメイン抗体という用語は、自律ヒト重鎖可変ドメイン（ａＶＨ）またはサメに由来するＶＮＡＲ断片を含む。フィブロネクチンは、抗原に結合するよう操作され得るスキャフォールドである。アドネクチンは、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）の１５反復単位の１０番目のドメインの天然アミノ酸配列の骨格からなる。βサンドイッチの一端の３つのループは、アドネクチンが目的の治療標的を特異的に認識することができるようにするように操作することができる。さらなる詳細につ��ては、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１８、４３５〜４４４（２００５）、米国特許出願公開第２００８０１３９７９１号、国際公開第２００５０５６７６４号および米国特許第６８１８４１８号を参照されたい。ペプチドアプタマーは、定常スキャフォールドタンパク質、典型的には活性部位で挿入された限定された可変ペプチドループを含むチオレドキシン（ＴｒｘＡ）からなるコンビナトリアル認識分子である。さらなる詳細については、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．５、７８３〜７９７（２００５）を参照されたい。マイクロボディは、３〜４個のシステイン架橋を含む、長さ２５〜５０アミノ酸の天然に存在する微小タンパク質（ｍｉｃｒｏｐｒｏｔｅｉｎ）に由来し、微小タンパク質の例としてはＫａｌａｔａＢＩおよびコノトキシンおよびノッチンが挙げられる。微小タンパク質は、微小タンパク質の全体フォールドに影響を及ぼすことなく、最大２５個のアミノ酸を含むよう操作され得るループを有する。操作されたノッチンドメインについてのさらなる詳細については、国際公開第２００８０９８７９６号を参照されたい。
【００８１】
参照分子としての「同じエピトープに結合する抗原結合分子」は、競合アッセイで参照分子とその抗原の結合を５０％以上ブロックする抗原結合分子を指し、逆に、参照分子は、競合アッセイで抗原結合分子とその抗原の結合を５０％以上ブロックする。
【００８２】
「抗原結合ドメイン」または「抗原結合部位」という用語は、抗原の一部または全部に特異的に結合し、これと相補的な領域を含む抗原結合分子の一部を指す。抗原が大きい場合、抗原結合分子は、エピトープと呼ばれる抗原の特定の部分にのみ結合し得る。抗原結合ドメインは、例えば、１つまたは複数の可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）によって提供され得る。好ましくは、抗原結合ドメインが、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「抗原決定基」という用語は、「抗原」および「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合して、抗原結合部分−抗原複合体を形成するポリペプチド高分子上の部位（例えば、アミノ酸の近接する伸長または非近接アミノ酸の様々な領域で構成されるコンフォメーション形状）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上、ウイルス感染細胞の表面上、他の病気にかかった細胞の表面上、免疫細胞の表面上、血清中に遊離で、および／または細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に見出され得る。別途指示がない限り、本明細書中で抗原として有用なタンパク質は、霊長類（例えば、ヒト）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来のタンパク質の任意の天然型であり得る。特定の実施形態では、抗原がヒトタンパク質である。本明細書で特定のタンパク質について言及される場合、この用語は、「全長」非プロセシングタンパク質ならびに細胞中でのプロセシングから得られた任意のタンパク質型を包含する。この用語はまた、タンパク質の天然に存在する変異体、例えばスプライシング変異体または対立遺伝子変異体を包含する。
【００８４】
「特異的結合」によって、結合が抗原について選択的であり、不要なまたは非特異的相互作用から識別され得ることが意味される。抗原結合分子が特異的抗原に結合する能力は、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）または当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ機器で分析される）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄら、Ｇｌｙｃｏ  Ｊ  １７、３２３〜３２９（２０００））および伝統的な結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ、Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｓ  ２８、２１７〜２２９（２００２））を通して測定することができる。一実施形態では、抗原結合分子が非関連タンパク質に結合する程度が、例えばＳＰＲによって測定すると、抗原結合分子と抗原の結合の約１０％未満である。一定の実施形態では、抗原に結合する分子が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭまたは≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば１０−８〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。
【００８５】
「親和性」または「結合親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の合計の強度を指す。別途指示がない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般的に解離速度定数の結合速度定数（それぞれｋｏｆｆとｋｏｎ）に対する比である解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。よって、等価な親和性は、速度定数の比が同じである限り、異なる速度定数を含み得る。親和性は、本明細書に記載されるものを含む、当技術分野で公知の一般的な方法によって測定することができる。親和性を測定するための具体的な方法は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
【００８６】
「親和性成熟」抗体は、１つまたは複数の超可変領域（ＨＶＲ）の１つまたは複数の変化を有さない親抗体と比較した、このような変化を有する抗体を指し、このような変化は抗体の抗原に対する親和性の改善をもたらす。
【００８７】
別途指示がない限り、「上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）」という用語は、霊長類（例えば、ヒト）非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＥｐＣＡＭを指す。この用語は、「全長」非プロセシングＥｐＣＡＭならびに細胞中でのプロセシングから得られた任意のＥｐＣＡＭ型を包含する。この用語はまた、ＥｐＣＡＭの天然に存在する変異体、例えばスプライシング変異体または対立遺伝子変異体を包含する。一実施形態では、本発明の抗原結合分子が、ヒト、マウスおよび／またはカニクイザルＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる。ヒトＥｐＣＡＭのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）寄託番号Ｐ１６４２２（バージョン１６７、配列番号６８）またはＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿００２３４５．２に示される。マウスＥｐＣＡＭのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）寄託番号Ｑ９９ＪＷ５（バージョン１１１、配列番号７５）またはＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿０３２５５８．２に示される。
【００８８】
一定の実施形態では、本発明の抗原結合分子が、ＥｐＣＡＭの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に特異的に結合することができる部分を含む。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分が、配列番号４９に結合する。いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分が、配列番号５０に結合する。
【００８９】
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗原結合分子と抗原の結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨおよびＶＬ）は一般的に類似の構造を有し、各ドメインが４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）および３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。例えば、Ｋｉｎｄｔら、Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第６版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、９１頁（２００７）を参照されたい。単一ＶＨまたはＶＬが抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。
【００９０】
「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は、本明細書で使用される場合、配列が超可変である、および／または構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの領域の各々を指す。一般的に、天然四本鎖抗体は、６つのＨＶＲ；ＶＨ３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）およびＶＬ３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。ＨＶＲは一般に、超可変ループのアミノ酸残基および／または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）のアミノ酸残基を含み、後者は最高の配列可変性である、および／または抗原認識に関与している。例示的超可変ループは、アミノ酸残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）で生じる。（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７（１９８７））。例示的ＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基２４〜３４、Ｌ２の５０〜５６、Ｌ３の８９〜９７、Ｈ１の３１〜３５Ｂ、Ｈ２の５０〜６５およびＨ３の９５〜１０２で生じる。（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１））。超可変領域（ＨＶＲ）は相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれ、これらの用語は、本明細において、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に関して互換的に使用される。この特定の領域は、定義が互いと比較した場合、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含むＫａｂａｔら、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）およびＣｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７（１９８７）によって記載されている。それにもかかわらず、いずれかの定義の抗体またはその変異体のＣＤＲの言及への適用は、本明細書で定義および使用される用語の範囲内にあることを意図している。上に引用される参考文献の各々によって定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基を、比較として表Ａで以下に示す。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列およびサイズに応じて変化するだろう。当業者であれば、抗体の可変領域アミノ酸配列が与えられれば、どの残基が特定のＣＤＲを構成するかを日常的に決定することができる。
2020515262.tif 000002
【００９１】
Ｋａｂａｔらはまた、任意の抗体に適用可能な可変領域配列のための番号付けシステムを定義した。当業者であれば、配列自体を超えた実験データに依存することなく、「Ｋａｂａｔ番号付け」のこのシステムを任意の可変領域配列に明白に割り当てることができる。本明細書で使用される場合、「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Ｋａｂａｔら、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）によって示される番号付けシステムを指す。別途断りのない限り、抗体可変領域の特定のアミノ酸残基位置の番号付けへの言及は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従う。
【００９２】
ＶＨのＣＤＲ１を除いて、ＣＤＲは一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲはまた、抗原と接触する残基である「特異性決定残基」または「ＳＤＲ」を含む。ＳＤＲは、短縮ＣＤＲまたはａ−ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に含まれる。例示的ａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２およびａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基３１〜３４、Ｌ２のアミノ酸残基５０〜５５、Ｌ３のアミノ酸残基８９〜９６、Ｈ１のアミノ酸残基３１〜３５Ｂ、Ｈ２のアミノ酸残基５０〜５８およびＨ３のアミノ酸残基９５〜１０２で生じる。（ＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９〜１６３３（２００８）参照）。別途指示がない限り、ＨＶＲ残基および可変ドメインの他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本発明書では、Ｋａｂａｔら、上記に従って番号付けされる。
【００９３】
「フレームワーク」または「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲおよびＦＲ配列は、一般に、ＶＨ（またはＶＬ）中に以下の配列で現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００９４】
「キメラ」抗体という用語は、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の源または種に由来し、重鎖および／または軽鎖の残りが異なる源または種に由来する抗体を指す。
【００９５】
抗体の「クラス」は、その重鎖によって所有される定常ドメインまたは定常領域の型を指す。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。様々なクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。
【００９６】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基およびヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。一定の実施形態では、ヒト化抗体が、少なくとも１つ、および典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のものに相当し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のものに相当する。ヒト化抗体は、場合によりヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含み得る。抗体、例えば非ヒト抗体の「ヒト化型」は、ヒト化を受けた抗体を指す。本発明によって包含される「ヒト化抗体」の他の型は、定常領域が、特にＣ１ｑ結合および／またはＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して、元の抗体のものからさらに修正または変化して本発明による特性をもたらすものである。
【００９７】
「ヒト」抗体は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生されるまたはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト源に由来する抗体の配列に相当するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。
【００９８】
本明細書の「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含む抗体重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域および変異Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ  Ｆｃ領域は、ＩｇＧ  ＣＨ２およびＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含む。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、約２３１位のアミノ酸残基から約３４０位のアミノ酸残基まで広がる。一実施形態では、炭水化物鎖が、ＣＨ２ドメインに結合している。本明細書におけるＣＨ２ドメインは、天然配列ＣＨ２ドメインまたは変異ＣＨ２ドメインであり得る。「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインに対してＣ末端の残基の伸長を含む（すなわち、ＩｇＧの約３４１位のアミノ酸残基から約４４７位のアミノ酸残基まで）。本明細書におけるＣＨ３領域は、天然配列ＣＨ３ドメインまたは変異ＣＨ３ドメイン（例えば、その一方の鎖に「隆起」（「ノブ」）が導入され、その他方の鎖に対応する「空洞」（「ホール」）が導入されたＣＨ３ドメイン；参照により本明細書に明示的に組み込まれる、米国特許第５，８２１，３３３号参照）であり得る。このような変異ＣＨ３ドメインを使用して、本明細書に記載される２つの非同一抗体重鎖のヘテロ二量体化を促進することができる。一実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域が、Ｃｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端まで広がる。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在しても存在しなくてもよい。本明細書で別途明示しない限り、Ｆｃ領域または定常領域のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
【００９９】
「ノブ・イントゥ・ホール」技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号；米国特許第７，６９５，９３６号；Ｒｉｄｇｗａｙら、Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ  ９、６１７〜６２１（１９９６）およびＣａｒｔｅｒ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  ２４８、７〜１５（２００１）に記載されている。一般的に、本方法は、第１のポリペプチドの界面の隆起（「ノブ」）および第２のポリペプチドの界面の対応する空洞（「ホール」）を導入して、隆起が、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げるように空洞内に位置することができるようにすることを含む。隆起は、第１のポリペプチドの界面の小さなアミノ酸側鎖を大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えることによって構築される。隆起と同一または類似のサイズの代償的空洞は、大きなアミノ酸側鎖を小さなもの（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置き換えることによって、第２のポリペプチドの界面に作り出される。隆起および空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変化させることによって、例えば部位特異的突然変異誘発によって、またはペプチド合成によって生成され得る。特定の実施形態では、ノブ修飾が、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方のアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ホール修飾が、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの他方のアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含む。さらなる特定の実施形態では、ノブ修正を含むＦｃドメインのサブユニットが、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃをさらに含み、ホール修飾を含むＦｃドメインのサブユニットが、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃをさらに含む。これらの２つのシステイン残基の導入によって、Ｆｃ領域の２つのサブユニット間のジスルフィド架橋の形成がもたらされ、よって二量体がさらに安定化する（Ｃａｒｔｅｒ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８、７〜１５（２００１））。
【０１００】
「免疫グロブリンのＦｃ領域と同等の領域」は、免疫グロブリンのＦｃ領域の天然に存在する対立遺伝子変異体、ならびに置換、付加または欠失をもたらすが、免疫グロブリンがエフェクター機能（抗体依存性細胞傷害性など）を媒介する能力を実質的に低下させない変化を有する変異体を含むことを意図している。例えば、１つまたは複数のアミノ酸を、生物学的機能を実質的に喪失することなく、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端から欠失させることができる。このような変異体は、活性に対する効果が最小となるように当技術分野で公知の一般規則に従って選択することができる（例えば、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６〜１０（１９９０）参照）。
【０１０１】
「エフェクター機能」という用語は、抗体アイソタイプによって異なる抗体のＦｃ領域に起因する生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御およびＢ細胞活性化が挙げられる。
【０１０２】
Ｆｃ受容体結合依存性エフェクター機能は、抗体のＦｃ領域と、造血細胞上の特殊細胞表面受容体であるＦｃ受容体（ＦｃＲ）の相互作用によって媒介され得る。Ｆｃ受容体は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、免疫複合体の食作用による抗体被覆病原体の除去と、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介した、赤血球および対応する抗体で被覆された種々の他の細胞標的（例えば、腫瘍細胞）の溶解の両方を媒介することが示されている（例えば、Ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｊ．Ｇ．ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｌ．、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．４９（１９９１）５１１〜５２４参照）。ＦｃＲは、免疫グロブリンアイソタイプについての特異性によって定義される：ＩｇＧ抗体についてのＦｃ受容体はＦｃγＲと呼ばれる。Ｆｃ受容体結合は、例えばＲａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．およびＫｉｎｅｔ，Ｊ．Ｐ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９（１９９１）４５７〜４９２；Ｃａｐｅｌ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４（１９９４）２５〜３４；ｄｅ  Ｈａａｓ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６（１９９５）３３０〜３４１；およびＧｅｓｓｎｅｒ，Ｊ．Ｅ．ら、Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．７６（１９９８）２３１〜２４８に記載されている。
【０１０３】
ＩｇＧ抗体のＦｃ領域の受容体（ＦｃγＲ）の架橋は、食作用、抗体依存性細胞傷害性および炎症性メディエーターの放出、ならびに免疫複合体クリアランスおよび抗体産生の調節を含む多種多様なエフェクター機能を誘因する。ヒトでは、３つのクラスのＦｃγＲが特徴を明らかにされており、以下の通りである：
−  ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）は、高い親和性でモノマーＩｇＧに結合し、マクロファージ、単球、好中球および好酸球上で発現される。アミノ酸残基Ｅ２３３〜Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７およびＰ３２９（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）の少なくとも１つのＦｃ領域ＩｇＧの修飾は、ＦｃγＲＩへの結合を減少させる。ＩｇＧ１およびＩｇＧ４に代入された２３３〜２３６位のＩｇＧ２残基は、ＦｃγＲＩへの結合を１０３倍減少させ、抗体感作赤血球に対するヒト単球応答を排除した（Ａｒｍｏｕｒ，Ｋ．Ｌ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（１９９９）２６１３〜２６２４）。
−  ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）は、複合体化ＩｇＧと中程度〜低い親和性で結合し、広く発現される。この受容体は２つのサブタイプ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＢに分けることができる。ＦｃγＲＩＩＡは、殺傷に関与する多くの細胞（例えば、マクロファージ、単球、好中球）上で見られ、殺傷過程を活性化することができるように思われる。ＦｃγＲＩＩＢは、阻害過程で役割を果たすように思われ、Ｂ細胞、マクロファージおよび肥満細胞および好酸球上で見られる。Ｂ細胞上では、これはさらなる免疫グロブリン産生および例えば、ＩｇＥクラスへのアイソタイプスイッチを抑制するよう機能するように思われる。マクロファージ上では、ＦｃγＲＩＩＢは、ＦｃγＲＩＩＡを通して媒介される食作用を阻害するように作用する。好酸球および肥満細胞上では、Ｂ型はＩｇＥと別の受容体の結合を通してこれらの細胞の活性化を抑制するのを助け得る。ＦｃγＲＩＩＡに対する結合減少は、例えば、アミノ酸残基Ｅ２３３〜Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｒ２９２およびＫ４１４（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）の少なくとも１つでの突然変異を有するＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む抗体について見られる。
−  ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は、ＩｇＧと中程度〜低い親和性で結合し、２つの型として存在する。ＦｃγＲＩＩＩＡは、ＮＫ細胞、マクロファージ、好酸球およびいくつかの単球およびＴ細胞上で見られ、ＡＤＣＣを媒介する。ＦｃγＲＩＩＩＢは、好中球上で高度に発現される。ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合の減少は、例えば、アミノ酸残基Ｅ２３３〜Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｓ２３９、Ｅ２６９、Ｅ２９３、Ｙ２９６、Ｖ３０３、Ａ３２７、Ｋ３３８およびＤ３７６（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）の少なくとも１つでの突然変異を有するＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む抗体について見られる。
【０１０４】
Ｆｃ受容体についてのヒトＩｇＧ１上の結合部位のマッピング、上述の突然変異部位ならびにＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＡへの結合を測定する方法は、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）６５９１〜６６０４に記載されている。
【０１０５】
「ＡＤＣＣ」または「抗体依存性細胞傷害」という用語は、Ｆｃ受容体結合によって媒介される機能であり、エフェクター細胞の存在下での本明細書で報告される抗体による標的細胞の溶解を指す。抗体がＡＤＣＣを媒介する初期ステップを誘導する能力は、ＦｃγＲＩおよび／またはＦｃγＲＩＩＡを組換え発現する細胞、あるいはＮＫ細胞（本質的にＦｃγＲＩＩＩＡを発現する）などのＦｃγ受容体発現細胞への結合を測定することによって調べられる。特に、ＮＫ細胞上のＦｃγＲへの結合が測定される。
【０１０６】
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃ領域によるエンゲージメント後に、受容体保有細胞がエフェクター機能を行うよう刺激するシグナル伝達イベントを誘発するＦｃ受容体である。活性化Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）およびＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）を含む。特定の活性化Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ０８６３７、バージョン１４１参照）。
【０１０７】
「腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー」または「ＴＮＦ受容体スーパーファミリー」は現在、２７個の受容体からなる。これは、細胞外システインリッチドメイン（ＣＲＤ）を介して腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に結合する能力を特徴とするサイトカイン受容体の群である。これらのシュードリピート（ｐｓｅｕｄｏｒｅｐｅａｔ）は、受容体鎖内の高度に保存されたシステイン残基によって生成される鎖内ジスルフィドによって定義される。神経成長因子（ＮＧＦ）を除いて、全てのＴＮＦは、原型ＴＮＦαと相同である。その活性型では、ＴＮＦ受容体の大部分が、原形質膜で三量体複合体を形成する。したがって、ほとんどのＴＮＦ受容体は、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）を含む。これらの受容体のいくつかはまた、リガンド結合後にカスパーゼ相互作用タンパク質を採用してカスパーゼ活性化の外因性経路を開始する細胞内デスドメイン（ＤＤ）を含む。デスドメインを欠く他のＴＮＦスーパーファミリー受容体は、ＴＮＦ受容体関連因子に結合し、増殖または分化をもたらすことができる細胞内シグナル伝達経路を活性化する。これらの受容体はまた、アポトーシスを開始することができるが、間接的機構を介してそうする。アポトーシスを調節することに加えて、いくつかのＴＮＦスーパーファミリー受容体は、Ｂ細胞ホメオスタシスおよび活性化、ナチュラルキラー細胞活性化、ならびにＴ細胞共刺激などの免疫細胞機能の調節に関与する。いくつかのその他のものは、毛包発達および破骨細胞発達などの細胞型特異的反応を調節する。ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーには以下が含まれる：腫瘍壊死因子受容体１（１Ａ）（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＣＤ１２０ａ）、腫瘍壊死因子受容体２（１Ｂ）（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＣＤ１２０ｂ）、リンフォトキシンβ受容体（ＬＴＢＲ、ＣＤ１８）、ＯＸ４０（ＴＮＦＲＳＦ４、ＣＤ１３４）、ＣＤ４０（Ｂｐ５０）、Ｆａｓ受容体（Ａｐｏ−１、ＣＤ９５、ＦＡＳ）、デコイ受容体３（ＴＲ６、Ｍ６８、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ）、ＣＤ２７（Ｓ１５２、Ｔｐ５５）、ＣＤ３０（Ｋｉ−１、ＴＮＦＲＳＦ８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＴＮＦＲＳＦ９）、ＤＲ４（ＴＲＡＩＬＲ１、Ａｐｏ−２、ＣＤ２６１、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）、ＤＲ５（ＴＲＡＩＬＲ２、ＣＤ２６２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ）、デコイ受容体１（ＴＲＡＩＬＲ３、ＣＤ２６３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ）、デコイ受容体２（ＴＲＡＩＬＲ４、ＣＤ２６４、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ）、ＲＡＮＫ（ＣＤ２６５、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ）、オステオプロテジェリン（ＯＣＩＦ、ＴＲ１、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）、ＴＷＥＡＫ受容体（Ｆｎ１４、ＣＤ２６６、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ）、ＴＡＣＩ（ＣＤ２６７、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ）、ＢＡＦＦ受容体（ＣＤ２６８、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ）、ヘルペスウイルスエントリーメディエーター（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ｅｎｔｒｙ  ｍｅｄｉａｔｏｒ）（ＨＶＥＭ、ＴＲ２、ＣＤ２７０、ＴＮＦＲＳＦ１４）、神経成長因子受容体（ｐ７５ＮＴＲ、ＣＤ２７１、ＮＧＦＲ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＣＤ２６９、ＴＮＦＲＳＦ１７）、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連（ＧＩＴＲ、ＡＩＴＲ、ＣＤ３５７、ＴＮＦＲＳＦ１８）、ＴＲＯＹ（ＴＮＦＲＳＦ１９）、ＤＲ６（ＣＤ３５８、Ｔ���ＦＲＳＦ２１）、ＤＲ３（Ａｐｏ−３、ＴＲＡＭＰ、ＷＳ−１、ＴＮＦＲＳＦ２５）およびエクトジスプラシンＡ２受容体（ＸＥＤＡＲ、ＥＤＡ２Ｒ）。
【０１０８】
腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーのいくつかのメンバーは、初期Ｔ細胞活性化後に、Ｔ細胞応答を維持するよう機能する。「共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバー」または「共刺激ＴＮＦファミリー受容体」という用語は、Ｔ細胞の増殖およびサイトカイン産生を共刺激することができるＴＮＦ受容体ファミリーメンバーのサブグループを指す。別途指示がない限り、この用語は、霊長類（例えば、ヒト）、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＴＮＦファミリー受容体を指す。本発明の特定の実施形態では、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーが、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ（ＣＤ２７０）、ＣＤ３０およびＧＩＴＲからなる群から選択され、その全てがＴ細胞に対する共刺激効果を有することができる。より具体的には、本発明の抗原結合分子は、少なくとも共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＯＸ４０に特異的に結合することができる部分を含む。
【０１０９】
ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーのさらなる情報、特に配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）などの公的に入手可能なデータベースから得ることができる。例えば、ヒト共刺激ＴＮＦ受容体は、以下のアミノ酸配列を有する：ヒトＯＸ４０（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ４３４８９、配列番号６７）、ヒト４−１ＢＢ（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｑ０７０１１、配列番号６９）、ヒトＣＤ２７（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ２６８４２、配列番号７０）、ヒトＨＶＥＭ（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｑ９２９５６、配列番号７１）、ヒトＣＤ３０（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ２８９０８、配列番号７２）およびヒトＧＩＴＲ（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｑ９Ｙ５Ｕ５、配列番号７３）。
【０１１０】
別途指示がない限り、「ＯＸ４０」という用語は、本明細書で使用される場合、霊長類（例えば、ヒト）およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＯＸ４０を指す。この用語は、「全長」非プロセシングＯＸ４０ならびに細胞中でのプロセシングから得られた任意のＰＸ４０型を包含する。この用語はまた、ＯＸ４０の天然に存在する変異体、例えばスプライシング変異体または対立遺伝子変異体を包含する。例示的ヒトＯＸ４０のアミノ酸配列は配列番号６７（ＵｎｉＰｒｏｔＰ４３４８９、バージョン１１２）に示され、例示的マウスＯＸ４０のアミノ酸配列は配列番号７４（ＵｎｉＰｒｏｔＰ４７７４１、バージョン１０１）に示される。
【０１１１】
「抗ＯＸ４０抗体」、「抗ＯＸ４０」、「ＯＸ４０抗体」および「ＯＸ４０に特異的に結合する抗体」という用語は、抗体がＯＸ４０の標的化における診断剤および／または治療剤として有用になるように、十分な親和性でＯＸ４０に結合することができる抗体を指す。一実施形態では、抗ＯＸ４０抗体と非関連非ＯＸ４０タンパク質の結合の程度が、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）またはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって測定すると、抗体とＯＸ４０の結合の約１０％未満である。一定の実施形態では、ＯＸ４０に結合する抗体が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭまたは≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−６Ｍ以下、例えば１０−６８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−８Ｍ〜１０−１０Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
【０１１２】
「抗ＥｐＣＡＭ抗体」および「ＥｐＣＡＭに結合する抗体」という用語は、抗体が上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）の標的化における診断剤および／または治療剤として有用になるように、十分な親和性でＥｐＣＡＭに結合することができる抗体を指す。一実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ抗体と非関連非ＥｐＣＡＭタンパク質の結合の程度が、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定すると、抗体とＥｐＣＡＭの結合の約１０％未満である。一定の実施形態では、ＥｐＣＡＭに結合する抗体が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦５ｎＭ、≦２ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭまたは≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０ｎＭ〜０．１ｎＭ、例えば５ｎＭ〜０．１ｎＭ、例えば２ｎＭ〜０．１ｎＭ）の解離定数（ＫＤ）を有する。一定の実施形態では、抗ＥｐＣＡＭ抗体が、様々な種のＥｐＣＡＭ間で保存されているＥｐＣＡＭのエピトープに結合する。一定の実施形態では、ＥｐＣＡＭのエピトープに結合する抗体が、ＥｐＣＡＭの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に特異的である。一定の実施形態では、配列番号４９に特異的な抗体が提供される。一定の実施形態では、配列番号５０に特異的な抗体が提供される。
【０１１３】
「ペプチドリンカー」という用語は、１つまたは複数のアミノ酸、典型的には約２〜２０個のアミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは、当技術分野で公知であるまたは本明細書に記載される。適切な、非免疫原性リンカーペプチドは、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎまたはＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカー（式中、「ｎ」は一般的に１〜１０、典型的には２〜４、特に２の数である）、すなわち、ＧＧＧＧＳ（配列番号７６）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７７）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号７８）およびＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号８０）からなる群から選択されるペプチドであるが、配列ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号８２）、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号７９）、（Ｇ４Ｓ）４（配列番号８１）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号８３）、ＧＳＧＳＧＮＧＳ（配列番号８４）、ＧＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号８５）、ＧＧＳＧＳＧ（配列番号８６）、ＧＧＳＧ（配列番号８７）、ＧＧＳＧＮＧＳＧ（配列番号８８）、ＧＧＮＧＳＧＳＧ（配列番号８９）およびＧＧＮＧＳＧ（配列番号９０）も含む。（Ｇ４Ｓ）（配列番号７６）、（Ｇ４Ｓ）２またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７７）およびＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号８２）が特に目的のペプチドリンカーである。
【０１１４】
「アミノ酸」という用語は、本出願で使用される場合、アラニン（３文字表記：ａｌａ、１文字表記：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）およびバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に存在するカルボキシα−アミノ酸の群を示す。
【０１１５】
「融合した（ｆｕｓｅｄ）」または「接続された（ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ）」とは、成分（例えば、抗体の重鎖およびＦａｂ断片）が、ペプチド結合によって、直接的に、または１つもしくは複数のペプチドリンカーを介して結合していることを意味する。
【０１１６】
参照ポリペプチド（タンパク質）配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、最大パーセント配列同一性を達成するために必要に応じて配列を整列させ、ギャップを導入した後の、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義され、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさない。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的でのアラインメントは、当業者が備えている技能の範囲内にある種々の方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ．ＳＡＷＩまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較している配列の完全長にわたる最大のアラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的のために、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して作成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．によって作成され、ソースコードは、米国著作権局、ワシントンＤ．Ｃ．、２０５５９で利用者文書でファイリングされており、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、カリフォルニアから公的に入手可能である、またはソースコードからコンパイルされ得る。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ  Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステムで使用するためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変化しない。ＡＬＩＧＮ−２をアミノ酸配列比較に使用する状況では、所与のアミノ酸配列Ｂに対する（ｔｏ，  ｗｉｔｈ，  ｏｒ  ａｇａｉｎｓｔ）所与のアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列同一性（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂに対して（ｔｏ，  ｗｉｔｈ，  ｏｒ  ａｇａｉｎｓｔ）一定の％アミノ酸配列同一性を有するまたは含む所与のアミノ酸配列Ａとして表現され得る）は、以下の通り計算される：
１００×分数Ｘ／Ｙ
（式中、Ｘは、ＡおよびＢのプログラムのアラインメントにおける配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２による同一の一致としてスコアリングされるアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性は、Ａに対するＢの％アミノ酸配列同一性と等しくないことが認識されるだろう。別途指定のない限り、本明細書で使用される全ての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して直前の段落に記載されるように得られる。
【０１１７】
一定の実施形態では、本明細書で提供される抗原結合分子のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗原結合分子の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましいだろう。抗原結合分子のアミノ酸配列変異体は、適切な修飾を、分子をコードするヌクレオチド配列に導入することによって、またはペプチド合成によって調製され得る。このような修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／または抗体のアミノ酸配列内の残基への挿入、および／または抗体のアミノ酸配列内の残基の置換が含まれる。最終的なコンストラクトが所望の特性、例えば抗原結合を有する限り、欠失、挿入および置換の任意の組み合わせを行って最終コンストラクトに到達することができる。置換突然変異誘発のための目的の部位には、ＨＶＲおよびフレームワーク（ＦＲ）が含まれる。保存的置換を「好ましい置換」という見出しで表Ｂに提供し、アミノ酸側鎖クラス（１）〜（６）に関して以下にさらに記載する。アミノ酸置換を目的の分子に導入し、産物を所望の活性、例えば保持された／改善した抗原結合、減少した免疫原性または改善したＡＤＣＣもしくはＣＤＣについてスクリーニングすることができる。
2020515262.tif 000003
【０１１８】
アミノ酸を共通の側鎖特性に従って分類することができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１１９】
非保存的置換は、これらのクラスのあるもののメンバーと別のクラスの交換を伴う。
【０１２０】
「アミノ酸配列変異体」という用語は、親抗原結合分子（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の１つまたは複数の超可変領域残基中にアミノ酸置換が存在する実質的な変異体を含む。一般的に、さらなる試験のために選択される得られた変異体（複数可）は、親抗原結合分子に対して一定の生物学的特性の修飾（例えば、改善）（例えば、増加した親和性、減少した免疫原性）を有する、および／または実質的に保持された親抗原結合分子の一定の生物学的特性を有する。例示的置換変異体は親和性成熟抗体であり、これは簡便には、例えば、本明細書に記載されるものなどのファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を使用して作製され得る。手短に述べれば、１つまたは複数のＨＶＲ残基を突然変異させ、変異抗原結合分子をファージ上にディスプレイさせ、特定の生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。一定の実施形態では、置換、挿入または欠失が、このような変化が、抗原結合分子が抗原に結合する能力を実質的に低下させない限り、１つまたは複数のＨＶＲ内で起こり得る。例えば、結合親和性を実質的に減少させない保存的変化（例えば、本明細書で提供される保存的置換）をＨＶＲ中で行ってもよい。突然変異誘発のために標的化され得る抗体の残基または領域を同定するのに有用な方法は、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１〜１０８５によって記載されるように「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、ＬｙｓおよびＧｌｕなどの荷電残基）の残基または群を同定し、中性または負に帯電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）によって置き換えて、抗体と抗原の相互作用が影響を及ぼされるかどうかを決定する。さらなる置換を、初期置換に対する機能的感受性を実証するアミノ酸位置で導入することができる。あるいはまたはさらに、抗原−抗原結合分子複合体の結晶構造により抗体と抗原との間の接点を同定する。このような接触残基および隣接残基を、置換のための候補として標的化または排除することができる。変異体をスクリーニングして、所望の特性を含むかどうかを決定することができる。
【０１２１】
アミノ酸配列挿入は、長さが１個の残基から１００個以上の残基を含むポリペプチドに及ぶアミノ−および／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する本発明の二重特異性抗原結合分子が挙げられる。分子の他の挿入変異体には、二重特異性抗原結合分子の血清半減期を増加させるポリペプチドとのＮまたはＣ末端融合体が含まれる。
【０１２２】
一定の実施形態では、本明細書で提供される二重特性抗原結合分子を変化させて、抗体がグリコシル化されている程度を増加または減少させる。分子のグリコシル化変異体は、簡便には１つまたは複数のグリコシル化部位が作り出されるまたは除去されるようにアミノ酸配列を変化させることによって得ることができる。二重特異性抗原結合分子がＦｃ領域を含む場合、そこに結合している炭水化物を変化させることができる。哺乳動物細胞によって産生される天然抗体は典型的には、一般的にＮ結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に結合している分岐した二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔら  ＴＩＢＴＥＣＨ  １５：２６〜３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖は、二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合した種々の炭水化物、例えばマンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトースおよびシアル酸ならびにフコースを含み得る。いくつかの実施形態では、一定の改善された特性を有する変異体を作り出すために、抗原結合分子中のオリゴ糖の修飾を行うことができる。一態様では、Ｆｃ領域に（直接的にまたは間接的に）結合したフコースを欠く炭水化物構造を有する本発明の二重特異性抗原結合分子または抗体の変異体が提供される。このようなフコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）または米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照されたい。別の態様では、二分オリゴ糖を含む、例えば、Ｆｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている、本発明の二重特異性抗原結合分子または抗体の変異体が提供される。このような変異体は、減少したフコシル化および／または改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔら）；米国特許第６６０２６８４号（Ｕｍａｎａら）；および米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａら）を参照されたい。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖中の少なくとも１個のガラクトース残基を有する変異体も提供される。このような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有することができ、例えば国際公開第１９９７／３００８７号（Ｐａｔｅｌら）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）；および国際公開第１９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
【０１２３】
一定の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のシステイン操作変異体、例えば分子の１つまたは複数の残基がシステイン残基で置換されている「チオＭＡｂ」を作り出すことが望ましいだろう。特定の態様では、置換残基が分子の接触可能部位で生じる。それによると、これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基を抗体の接触可能部位に位置させ、これを使用して抗体を他の部分、例えば薬物部分またはリンカー−薬物部分にコンジュゲートしてイムノコンジュゲートを作り出すことができる。一定の態様では、以下の残基のいずれか１つまたは複数がシステインで置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；および重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン操作抗原結合分子は、例えば米国特許第７５２１５４１号に記載されるように作製され得る。
【０１２４】
「ポリヌクレオチド」という用語は、単離核酸分子またはコンストラクト、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来ＲＮＡまたはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、慣用的なホスホジエステル結合または非慣用的な結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含み得る。「核酸分子」という用語は、ポリヌクレオチド中に存在する、任意の１つまたは複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ断片を指す。
【０１２５】
「単離」核酸分子またはポリヌクレオチドとは、その天然環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意図している。例えば、ベクターに含まれるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されていると考えられる。単離ポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種宿主細胞中に維持される組換えポリヌクレオチドまたは溶液中の精製（部分的もしくは実質的）ポリヌクレオチドが挙げられる。単離ポリヌクレオチドには、ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞内に含まれるポリヌクレオチド分子が含まれるが、ポリヌクレオチド分子が、染色体外またはその自然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。単離ＲＮＡ分子には、本発明のインビボまたはインビトロＲＮＡ転写産物、ならびにプラス鎖およびマイナス鎖型、ならびに二本鎖型が含まれる。本発明による単離ポリヌクレオチドまたは核酸には、合成的に産生されたこのような分子がさらに含まれる。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位または転写ターミネーターなどの調節エレメントであり得る、またはこれらを含み得る。
【０１２６】
本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば９５％「同一である」ヌクレオチド配列を有する核酸またはポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列の各１００個のヌクレオチド当たり最大５個の点突然変異を含んでもよいことを除いて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることを意図する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中のヌクレオチドの最大５％を欠失させるもしくは別のヌクレオチドで置換してもよい、または参照配列中の全ヌクレオチドの最大５％までのいくつかのヌクレオチドを参照配列に挿入してもよい。参照配列のこれらの変化は、参照ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端位置で、またはこれらの末端位置間のどこでも、参照配列中の残基の間に個々に散在して、または参照配列内の１つもしくは複数の近接する群で起こり得る。実際問題として、任意の特定のポリヌクレオチド配列が本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるかどうかは、慣習的にはポリペプチドについて上に論じられるもの（例えば、ＡＬＩＧＮ−２）などの公知のコンピュータプログラムを使用して決定することができる。
【０１２７】
「発現カセット」という用語は、標的細胞内での特定の核酸の転写を可能にする一連の指定された核酸エレメントを含む、組換え的にまたは合成的に作製されたポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットを、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウイルスまたは核酸断片に組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、数ある配列の中でも、転写される核酸配列およびプロモーターを含む。一定の実施形態では、本発明の発現カセットが、本発明の二重特異性抗原結合分子またはその断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【０１２８】
「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、「発現コンストラクト」と同義であり、それが標的細胞内で動作可能に会合された特定の遺伝子を導入し、その発現を指示するために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、ならびに導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、多量の安定なｍＲＮＡの転写を可能にする。いったん発現ベクターが標的細胞の内側にくると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子またはタンパク質が、細胞転写および／または翻訳機構によって産生される。一実施形態では、本発明の発現ベクターが、本発明の二重特異性抗原結合分子またはその断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。
【０１２９】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養物」という用語は互換的に使用され、このような細胞の子孫を含む、外因性核酸が導入された細胞を指す。宿主細胞には、初代形質転換細胞および継代数にかかわらずこれに由来する子孫を含む、「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれる。子孫は、親細胞と核酸含量が完全に同一でなくてもよく、突然変異を含んでもよい。元の形質転換細胞でスクリーニングまたは選択されるのと同じ機能または生物活性を有する突然変異体子孫が本明細書に含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を作製するために使用され得る任意の型の細胞系である。宿主細胞には、培養細胞、例えば哺乳動物培養細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞またはハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞および植物細胞、ほんの少し例を挙げれば、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物または培養植物もしくは動物組織内に含まれる細胞も含まれる。
【０１３０】
薬剤の「有効量」は、投与された細胞または組織中で生理的変化をもたらすのに必要な量を指す。
【０１３１】
薬剤、例えば薬学的組成物の「治療的有効量」は、所望の治療的または予防的結果を達成するのに必要な投与量および期間で有効な量を指す。薬剤の治療的有効量は、例えば疾患の有害作用を排除させる、減少させる、遅延させる、最小化するまたは予防する。
【０１３２】
「個体」または「対象」は哺乳動物である。哺乳動物には、それだけに限らないが、飼育動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌおよびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよび非ヒト霊長類、例えばサル）、ウサギ、およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が含まれる。特に、個体または対象はヒトである。
【０１３３】
「薬学的組成物」という用語は、そこに含有される有効成分の生物活性が有効になるのを可能にするような形態であり、製剤が投与される対象にとって許容できないほど毒性である追加の成分を含有しない調製物を指す。
【０１３４】
「薬学的に許容される賦形剤」は、対象にとって非毒性の、有効成分以外の薬学的組成物中の成分を指す。薬学的に許容される賦形剤には、それだけに限らないが、バッファー、安定剤または防腐剤が含まれる。
【０１３５】
「添付文書」という用語は、治療用製品の適応症、使用法、投与量、投与、併用療法、禁忌および／または使用に関する警告についての情報を含む、治療用製品の市販のパッケージに慣習的に含まれる説明書を指すために使用される。
【０１３６】
本明細書で使用される場合、「治療」（および「治療する」または「治療すること」などのその文法的変形）は、治療している個体の自然経過を変化させようとする臨床的介入を指し、臨床病理学の予防のためまたはその経過中に行うことができる。望ましい治療効果には、それだけに限らないが、疾患の発生または再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的病理学的帰結の減弱、転移の予防、疾患の進行速度の減少、疾患状態の改善または緩和、および寛解または予後改善が含まれる。いくつかの実施形態では、本発明の分子を使用して、疾患の発症を遅延させるまたは疾患の進行を遅延させる。
【０１３７】
「がん」という用語は、本明細書で使用される場合、リンパ腫、リンパ性白血病、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頚部がん、皮膚もしくは眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓もしくは尿管がん、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、脊椎軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫およびユーイング肉腫（上記がんのいずれかの難治性型、または上記がんの１つもしくは複数の組み合わせを含む）などの増殖性疾患を指す。
【０１３８】
本発明の二重特異性抗原結合分子
本発明は、製造可能性、安定性、結合親和性、生物活性、標的化効率および減少した毒性などの特に有利な特性を有する新規な二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１３９】
本発明は、
（ａ）抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含むＯＸ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合分子が、（ｃ）安定に会合することができる第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃ領域をさらに含む。
【０１４１】
特定の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子が、ＯＸ４０とのアゴニスト結合を特徴とする。
【０１４２】
ＯＸ４０に結合する二重特異性抗原結合分子
一態様では、本発明は、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、配列番号１のアミノ酸配列を含む、またはからなるポリペプチドに結合する、二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１４３】
一態様では、ＯＸ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分を含む二重特異性抗原結合分子であって、前記部分が
（ｉ）配列番号４および配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号６および配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、ならびに
（ｉｉｉ）配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨと、
（ｉｖ）配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、ならびに
（ｖｉ）配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５および配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と
を含むＶＬ
を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１４４】
特に、ＯＸ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分を含む二重特異性抗原結合分子であって、前記部分が
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨと配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２および配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ、
（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨと配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ、
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨと配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２および配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ、
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨと配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２および配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ、
（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨと配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２および配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ、
（ｆ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨと配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２および配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ、または
（ｇ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨと配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２および配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ
を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１４５】
一態様では、本発明は、ＯＸ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分を含む二重特異性抗原結合分子であって、前記部分が配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨと、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２および配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬとを含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１４６】
別の態様では、本発明は、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３および配列番号４５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４および配列番号４６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１４７】
特に、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、
（ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｉｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｉｖ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｖ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４２のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｖｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｖｉｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１４８】
特定の態様では、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１４９】
一態様では、本発明は、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、配列番号２のアミノ酸配列を含む、またはからなるポリペプチドに結合する、二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１５０】
一態様では、ＯＸ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分を含む二重特異性抗原結合分子であって、前記部分が、
（ｉ）アミノ酸配列、配列番号２７を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）アミノ酸配列、配列番号２８を含むＣＤＲ−Ｈ２、および
（ｉｉｉ）アミノ酸配列、配列番号２９を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨと、
（ｉｖ）アミノ酸配列、配列番号３０を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｖ）アミノ酸配列、配列番号３１を含むＣＤＲ−Ｌ２、および
（ｖｉ）アミノ酸配列、配列番号３２を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬと
を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１５１】
別の態様では、本発明は、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも約約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１５２】
特に、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１５３】
ＥｐＣＡＭに結合する二重特異性抗原結合分子
一態様では、本発明は、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）に特異的に結合することができる部分が、配列番号４９のアミノ酸配列を含む、またはからなるポリペプチドに結合する、二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１５４】
一態様では、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる少なくとも１つの部分を含む二重特異性抗原結合分子であって、前記部分が、
（ｉ）アミノ酸配列、配列番号５１を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）アミノ酸配列、配列番号５２を含むＣＤＲ−Ｈ２、および
（ｉｉｉ）アミノ酸配列、配列番号５３を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨと、
（ｉｖ）アミノ酸配列、配列番号５４を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｖ）アミノ酸配列、配列番号５５を含むＣＤＲ−Ｌ２、および
（ｖｉ）アミノ酸配列、配列番号５６を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬと
を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１５５】
別の態様では、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分が、配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１５６】
特に、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分が、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１５７】
一態様では、本発明は、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）に特異的に結合することができる部分が、配列番号５０のアミノ酸配列を含む、またはからなるポリペプチドに結合する、二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１５８】
一態様では、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる少なくとも１つの部分を含む二重特異性抗原結合分子であって、前記部分が、
（ｉ）アミノ酸配列、配列番号５７を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）アミノ酸配列、配列番号５８を含むＣＤＲ−Ｈ２、および
（ｉｉｉ）アミノ酸配列、配列番号５９を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨと、
（ｉｖ）アミノ酸配列、配列番号６０を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｖ）アミノ酸配列、配列番号６１を含むＣＤＲ−Ｌ２、および
（ｖｉ）アミノ酸配列、配列番号６２を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬと
を含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１５９】
別の態様では、本発明は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分が、配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも約約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む、二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１６０】
特に、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分が、配列番号６５のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む、二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１６１】
ＯＸ４０およびＥｐＣＡＭに結合する二重特異性抗原結合分子
さらなる態様では、
（ｉ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３および配列番号４５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４および配列番号４６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含み、
（ｉｉ）ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分が、配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む、
二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１６２】
特定の態様では、
（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含み、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分が、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含み、
（ｂ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬとを含み、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分が、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含み、
（ｃ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＬとを含み、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分が、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含み、
（ｄ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＬとを含み、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分が、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含み、
（ｅ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＶＬとを含み、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分が、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含み、
（ｆ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含み、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分が、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含み、
（ｇ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＬとを含み、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分が、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む、
二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１６３】
特定の態様では、本発明は、
ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬとを含み、
ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分が、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む、
二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１６４】
さらなる態様では、
（ｉ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含み、
（ｉｉ）ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分が、配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む、
二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１６５】
特定の態様では、
ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＬとを含み、
ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分が、配列番号６５のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む、
二重特異性抗原結合分子が提供される。
【０１６６】
ＯＸ４０との四価結合およびＥｐＣＡＭとの一価結合を有する二重特異性抗原結合分子（４＋１フォーマット）
一態様では、二重特異性抗原結合分子が、ＯＸ４０について四価であり、ＥｐＣＡＭについて一価である。
【０１６７】
一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子が、
（ａ）Ｆｃ領域に接続されたＯＸ４０に特異的に結合することができる４つのＦａｂ断片と、
（ｂ）Ｆｃ領域のＣ末端に接続された抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含むＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分と
を含む。
【０１６８】
一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子が、
（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる４つのＦａｂ断片およびＦｃ領域を含む抗体の２つの軽鎖および２つの重鎖と、
（ｂ）ＶＨが（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されており、ＶＬが（ａ）の２つの重鎖の他方のＣ末端に接続されている、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分のＶＨおよびＶＬと
を含む。
【０１６９】
一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子が、
（ａ）各重鎖がＯＸ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片の２つのＶＨドメインおよび２つのＣＨ１ドメインならびにＦｃ領域サブユニットとを含む、２つの重鎖と、
（ｂ）各軽鎖がＯＸ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＬおよびＣＬドメインを含む、４つの軽鎖と、
（ｃ）ＶＨが（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されており、ＶＬが（ａ）の２つの重鎖の他方のＣ末端に接続されている、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分のＶＨおよびＶＬと
を含む。
【０１７０】
本発明の種々の態様によるいくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分のＶＨが、ペプチドリンカーを介して（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されている。本発明の種々の態様によるいくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分のＶＬが、ペプチドリンカーを介して（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されている。特定の実施形態では、ペプチドリンカーが（Ｇ４Ｓ）４（配列番号８１）である。
【０１７１】
特定の態様では、本発明は、配列番号１８３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１８４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１８２のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１７２】
特定の態様では、本発明は、
配列番号１８３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、
配列番号１８４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、
各々が配列番号１８２のアミノ酸配列を含む、４つの軽鎖と
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１７３】
特定の態様では、本発明は、配列番号１９２のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号１９３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、配列番号１９１のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１７４】
特定の態様では、本発明は、
配列番号１９２のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、
配列番号１９３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、
各々が配列番号１９１のアミノ酸配列を含む、４つの軽鎖と
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１７５】
一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子が、第１、第２、第３、第４および第５の抗原結合部分を形成する第１および第２の重鎖と４つの軽鎖を含み、第１、第２、第３および第４の抗原結合部分それぞれが、ＯＸ４０に特異的に結合することができ、第５の抗原結合部分が、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができ、
（ｉ）第１のポリペプチド鎖が、アミノ（Ｎ）末端からカルボキシル（Ｃ）末端方向に、ＶＨ（ＯＸ４０）、ＣＨ１、ＶＨ（ＯＸ４０）、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３（Ｆｃノブ）およびＶＨ（ＥｐＣＡＭ）を含み、
（ｉｉ）第２のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端方向に、ＶＨ（ＯＸ４０）、ＣＨ１、ＶＨ（ＯＸ４０）、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３（Ｆｃホール）およびＶＬ（ＥｐＣＡＭ）を含み、
（ｉｉｉ）４つの軽鎖が、Ｎ末端からＣ末端方向に、ＶＬ（ＯＸ４０）およびＣＬを含む。
【０１７６】
別の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子が、第１、第２、第３、第４および第５の抗原結合部分を形成する第１および第２の重鎖と４つの軽鎖を含み、第１、第２、第３および第４の抗原結合部分がそれぞれ、ＯＸ４０に特異的に結合することができ、第５の抗原結合部分が、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができ、
（ｉ）第１のポリペプチド鎖が、アミノ（Ｎ）末端からカルボキシル（Ｃ）末端方向に、ＶＨ（ＯＸ４０）、ＣＨ１、ＶＨ（ＯＸ４０）、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３（Ｆｃノブ）およびＶＬ（ＥｐＣＡＭ）を含み、
（ｉｉ）第２のポリペプチド鎖が、Ｎ末端からＣ末端方向に、ＶＨ（ＯＸ４０）、ＣＨ１、ＶＨ（ＯＸ４０）、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３（Ｆｃホール）およびＶＬ（ＥｐＣＡＭ）を含み、
（ｉｉｉ）４つの軽鎖が、Ｎ末端からＣ末端方向に、ＶＬ（Ｏｘ４０）およびＣＬを含む。
【０１７７】
ＯＸ４０との四価結合およびＥｐＣＡＭとの二価結合を有する二重特異性抗原結合分子（４＋２フォーマット）
一態様では、二重特異性抗原結合分子が、ＯＸ４０について四価であり、ＥｐＣＡＭについて二価である。
【０１７８】
一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子が、
（ａ）Ｆｃ領域に接続されたＯＸ４０に特異的に結合することができる４つのＦａｂ断片と、
（ｂ）Ｆｃ領域のＣ末端に接続された抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含むＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分と
を含む。
【０１７９】
一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子が、
（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる４つのＦａｂ断片およびＦｃ領域を含む、抗体の４つの軽鎖および２つの重鎖と、
（ｂ）Ｆａｂ断片の一方が（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されており、Ｆａｂ断片の他方が（ａ）の２つの重鎖の他方のＣ末端に接続されている、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片と
を含む。
【０１８０】
一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子が、
（ａ）各重鎖がＯＸ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片の２つのＶＨドメインおよび２つのＣＨ１ドメインならびにＦｃ領域サブユニットを含む、２つの重鎖と、
（ｂ）各軽鎖がＯＸ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＬおよびＣＬドメインを含む、４つの軽鎖と、
（ｃ）Ｆａｂ断片の一方が（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されており、Ｆａｂ断片の他方が（ａ）の２つの重鎖の他方のＣ末端に接続されている、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片と
を含む。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片が、各々がＶＬ−ＣＨ１鎖およびＶＨ−ＣＬ鎖を含むクロスオーバーＦａｂ断片であり、ＶＬ−ＣＨ１鎖の一方が、（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されており、ＶＬ−ＣＨ１鎖の他方が、（ａ）の２つの重鎖の他方のＣ末端に接続されている。
【０１８２】
本発明の種々の態様によるいくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができるＦａｂ断片が、ペプチドリンカーを介して（ａ）の重鎖のＣ末端に接続されている。本発明の種々の態様によるいくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができるクロスオーバーＦａｂ断片のＶＬ−ＣＨ１鎖が、ペプチドリンカーを介して（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されている。特定の実施形態では、ペプチドリンカーが（Ｇ４Ｓ）４（配列番号８１）である。
【０１８３】
特定の態様では、本発明は、各々が配列番号１８６のアミノ酸配列を含む、２つの重鎖と、配列番号１８５のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖と、配列番号１８７のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖とを含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１８４】
特定の態様では、本発明は、
各々が配列番号１８６のアミノ酸配列を含む、２つの重鎖と、
各々が配列番号１８７のアミノ酸配列を含む、２つの軽鎖と、
各々が配列番号１８５のアミノ酸配列を含む、４つの軽鎖と
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１８５】
一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子が、第１、第２、第３、第４、第５および第６の抗原結合部分を形成する第１および第２の重鎖と、６つの軽鎖とを含み、第１、第２、第３および第４の抗原結合部分がそれぞれ、ＯＸ４０に特異的に結合することができ、第５および第６の抗原結合部分がそれぞれ、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができ、
（ｉ）第１および第２のポリペプチド鎖が、アミノ（Ｎ）末端からカルボキシル（Ｃ）末端方向に、ＶＨ（ＯＸ４０）、ＣＨ１＊、ＶＨ（ＯＸ４０）、ＣＨ１＊、ＣＨ２、ＣＨ３、ＶＬ（ＥｐＣＡＭ）およびＣＨ１を含み、
（ｉｉ）４つの軽鎖が、Ｎ末端からＣ末端方向に、ＶＬ（ＯＸ４０）およびＣＬ＊を含み、
（ｉｉｉ）２つの軽鎖が、Ｎ末端からＣ末端方向に、ＶＨ（ＥｐＣＡＭ）およびＣＬを含み、
ＣＨ１＊およびＣＬ＊が、より良いペアリングを可能にするアミノ酸突然変異を含む。
【０１８６】
Ｆｃ受容体結合および／またはエフェクター機能を減少させるＦｃ領域修飾
本発明の種々の態様による実施形態では、二重特異性抗原結合分子が、安定に会合することができる第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃ領域をさらに含む。
【０１８７】
一定の態様では、１つまたは複数のアミノ酸修飾を本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入して、それによってＦｃ領域変異体を作製することができる。Ｆｃ領域変異体は、１つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含み得る。
【０１８８】
Ｆｃ領域は、標的組織中での優れた蓄積に寄与する長い血清半減期および好ましい組織−血液分配比を含む、好ましい薬物動態特性を本発明の二重特異性抗体に付与する。しかしながら、同時に、これは、本発明の二重特異性抗体の、好ましい抗原保有細胞よりもむしろ、Ｆｃ受容体を発現している細胞への望ましくない標的化につながり得る。したがって、特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗体のＦｃ領域が、天然ＩｇＧ  Ｆｃ領域、特にＩｇＧ１  Ｆｃ領域またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域と比較して、減少したＦｃ受容体に対する結合親和性および／または減少したエフェクター機能を示す。特に、Ｆｃ領域はＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。
【０１８９】
１つのこのような態様では、Ｆｃ領域（または前記Ｆｃ領域を含む本発明の二重特異性抗原結合分子）が、天然ＩｇＧ１  Ｆｃ領域（もしくは天然ＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む本発明の二重特異性抗原結合分子）と比較して、５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満のＦｃ受容体に対する結合親和性、および／または天然ＩｇＧ１  Ｆｃ領域（もしくは天然ＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む本発明の二重特異性抗原結合分子）と比較して、５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満のエフェクター機能を示す。一態様では、Ｆｃ領域（または前記Ｆｃ領域を含む本発明の二重特異性抗原結合分子）が、実質的にＦｃ受容体に結合しない、および／またはエフェクター機能を誘導しない。特定の態様では、Ｆｃ受容体がＦｃγ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体がヒトＦｃ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体が活性化Ｆｃ受容体である。具体的な態様では、Ｆｃ受容体が活性化ヒトＦｃγ受容体、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩまたはＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一態様では、Ｆｃ受容体が抑制性Ｆｃ受容体である。具体的な態様では、Ｆｃ受容体が抑制性ヒトＦｃγ受容体、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＢである。一態様では、エフェクター機能が、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよびサイトカイン分泌の１つまたは複数である。特定の態様では、エフェクター機能がＡＤＣＣである。一態様では、Ｆｃ領域ドメインが、天然ＩｇＧ１  Ｆｃ領域と比較して、実質的に類似の新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性を示す。実質的に類似のＦｃＲｎへの結合は、Ｆｃ領域（または前記Ｆｃ領域を含む本発明の二重特異性抗原結合分子）が、天然ＩｇＧ１  Ｆｃ領域（または天然ＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む本発明の二重特異性抗原結合分子）のＦｃＲｎに対する結合親和性の約７０％超、特に約８０％超、さらに特に約９０％超を示す場合に達成される。
【０１９０】
特定の態様では、Ｆｃ領域を、非操作Ｆｃ領域と比較して、減少したＦｃ受容体に対する結合親和性および／または減少したエフェクター機能を有するよう操作する。特定の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃ領域が、Ｆｃ領域のＦｃ受容体に対する結合親和性および／またはエフェクター機能を減少させる１つまたは複数のアミノ酸突然変異を含む。典型的には、Ｆｃ領域の２つのサブユニットの各々に同じ１つまたは複数のアミノ酸突然変異が存在する。一態様では、アミノ酸突然変異が、Ｆｃ領域のＦｃ受容体に対する結合親和性を減少させる。別の態様では、アミノ酸突然変異が、Ｆｃ領域のＦｃ受容体に対する結合親和性を少なくとも２倍、少なくとも５倍または少なくとも１０倍減少させる。一態様では、操作Ｆｃ領域を含む本発明の二重特異性抗原結合分子が、非操作Ｆｃ領域を含む本発明の二重特異性抗体と比較して、２０％未満、特に１０％未満、さらに特に５％未満のＦｃ受容体に対する結合親和性を示す。特定の態様では、Ｆｃ受容体がＦｃγ受容体である。他の態様では、Ｆｃ受容体がヒトＦｃ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体が抑制性Ｆｃ受容体である。具体的な態様では、Ｆｃ受容体が抑制性ヒトＦｃγ受容体、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＢである。いくつかの態様では、Ｆｃ受容体が活性化Ｆｃ受容体である。具体的な態様では、Ｆｃ受容体が活性化ヒトＦｃγ受容体、より具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩまたはＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これらの受容体の各々への結合が減少する。いくつかの態様では、補体成分に対する結合親和性、具体的にはＣ１ｑに対する結合親和性も減少する。一態様では、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性が減少しない。実質的に類似のＦｃＲｎへの結合、すなわち、Ｆｃ領域の前記受容体に対する結合親和性の保存は、Ｆｃ領域（または前記Ｆｃ領域を含む本発明の二重特異性抗原結合分子）が、Ｆｃ領域の非操作型（または前記Ｆｃ領域の非操作型を含む本発明の二重特異性抗原結合分子）のＦｃＲｎに対する結合親和性の約７０％超を示す場合に、達成される。Ｆｃ領域、または前記Ｆｃ領域を含む本発明の二重特異性抗原結合分子は、このような親和性の約８０％超、さらには約９０％超を示し得る。一定の実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃ領域を、非操作Ｆｃ領域と比較して、減少したエフェクター機能を有するよう操作する。減少したエフェクター機能には、それだけに限らないが、以下の１つまたは複数が含まれ得る：減少した補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、減少した抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）、減少した抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、減少したサイトカイン分泌、減少した抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み、減少したＮＫ細胞への結合、減少したマクロファージへの結合、減少した単球への結合、減少した多形核細胞への結合、減少したアポトーシスを誘導する直接シグナル伝達、減少した樹状細胞成熟または減少したＴ細胞プライミング。
【０１９１】
減少したエフェクター機能を有する抗体には、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７および３２９の１つまたは複数の置換を有するものが含まれる（米国特許第６，７３７，０５６号）。このようなＦｃ突然変異体には、残基２６５および２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含む、アミノ酸２６５位、２６９位、２７０位、２９７位および３２７位の２つ以上での置換を有するＦｃ突然変異体が含まれる（米国特許第７，３３２，５８１号）。改善したまたは減少したＦｃＲｓへの結合を有する一定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号およびＳｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）６５９１〜６６０４）。
【０１９２】
本発明の一態様では、Ｆｃ領域が、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１およびＰ３２９位でのアミノ酸置換を含む。いくつかの態様では、Ｆｃ領域が、アミノ酸置換Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（「ＬＡＬＡ」）を含む。１つのこのような実施形態では、Ｆｃ領域がＩｇＧ１  Ｆｃ領域、特にヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。一態様では、Ｆｃ領域が、Ｐ３２９位でのアミノ酸置換を含む。さらに具体的な態様では、アミノ酸置換がＰ３２９ＡまたはＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである。一実施形態では、Ｆｃ領域が、Ｐ３２９位でのアミノ酸置換、およびＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７ＤまたはＰ３３１Ｓからなる群から選択されるさらなるアミノ酸置換を含む。さらに特定の実施形態では、Ｆｃ領域がアミノ酸突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」）を含む。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」組み合わせは、ＰＣＴ特許出願番号、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されるように、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域のＦｃγ受容体結合をほぼ完全に消滅させる。前記文献はまた、このような突然変異Ｆｃ領域を調製する方法およびＦｃ受容体結合またはエフェクター機能などのその特性を決定する方法も記載している。このような抗体は、突然変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを有する、または突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇを有するＩｇＧ１である（ＫａｂａｔらのＥＵインデックスによる番号付け、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１）。
【０１９３】
本発明の一態様では、Ｆｃ領域が、Ｄ２６５位およびＰ３２９位でのアミノ酸置換を含む。いくつかの態様では、Ｆｃ領域が、ＣＨ２ドメインにアミノ酸置換Ｄ２６５ＡおよびＰ３２９Ｇ（「ＤＡＰＧ］）を含む。１つのこのような実施形態では、Ｆｃ領域がＩｇＧ１  Ｆｃ領域、特にマウスＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。ＤＡＰＧ突然変異は、例えば国際公開第２０１６／０３０３５０号に記載されており、これを重鎖のＣＨ２領域に導入して、抗原結合分子とマウスＦｃγ受容体の結合を抑止することができる。
【０１９４】
一態様では、Ｆｃ領域がＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。さらに具体的な実施形態では、Ｆｃ領域が、Ｓ２２８位（Ｋａｂａｔ番号付け）でのアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。さらに具体的な実施形態では、Ｆｃ領域が、アミノ酸置換Ｌ２３５ＥおよびＳ２２８ＰおよびＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。このアミノ酸置換は、ＩｇＧ４抗体のインビボＦａｂアーム交換を減少させる（Ｓｔｕｂｅｎｒａｕｃｈら、Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ３８、８４〜９１（２０１０）参照）。
【０１９５】
母方ＩｇＧの胎児への移行を担う（Ｇｕｙｅｒ，Ｒ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７（１９７６）５８７〜５９３、およびＫｉｍ，Ｊ．Ｋ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４（１９９４）２４２９〜２４３４）、増加した半減期および改善した新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合を有する抗体は、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号に記載されている。これらの抗体は、Ｆｃ領域とＦｃＲｎの結合を改善する１つまたは複数の置換をその中に有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体には、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４または４３４の１つまたは複数での置換、例えばＦｃ領域残基４３４の置換を有するものが含まれる（米国特許第７３７１８２６号）。Ｆｃ領域変異体の他の例に関するＤｕｎｃａｎ，Ａ．Ｒ．およびＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３２２（１９８８）７３８〜７４０；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；および国際公開第９４／２９３５１号も参照されたい。
【０１９６】
Ｆｃ受容体との結合は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な計装および組換え発現によって得られ得るようなＦｃ受容体を使用したＥＬＩＳＡ、または表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって容易に決定することができる。適切なこのような結合アッセイは本明細書に記載される。あるいは、Ｆｃ領域またはＦｃ領域を含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃ受容体に対する結合親和性を、ＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞などの特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株を使用して評価することができる。Ｆｃ領域またはＦｃ領域を含む本発明の二重特異性抗体のエフェクター機能は、当技術分野で公知の方法によって測定することができる。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは本明細書に記載される。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの他の例は、米国特許第５，５００，３６２号；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３、７０５９〜７０６３（１９８６）およびＨｅｌｌｓｔｒｏｍら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２、１４９９〜１５０２（１９８５）；米国特許第５，８２１，３３７号；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６６、１３５１〜１３６１（１９８７）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を使用してもよい（例えば、ＡＣＴＩ（商標）フローサイトメトリーのための非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）；およびＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）参照）。このようなアッセイのための有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいはまたはさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性をインビボで、例えばＣｌｙｎｅｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５、６５２〜６５６（１９９８）に開示されるような動物モデルで評価することができる。
【０１９７】
以下の節は、Ｆｃ受容体結合および／またはエフェクター機能を減少させるＦｃ領域修飾を含む本発明の二重特異性抗原結合分子の好ましい態様を記載する。一態様では、本発明は、二重特異性抗原結合分子（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、（ｂ）ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる少なくとも１つの部分、ならびに（ｃ）安定に会合することができる第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃ領域（Ｆｃ領域が、抗体のＦｃ受容体、特にＦｃγ受容体に対する結合親和性を減少させる１つまたは複数のアミノ酸置換を含む）に関する。別の態様では、本発明は、（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、（ｂ）ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、（ｃ）安定に会合することができる第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃ領域とを含む二重特異性抗原結合分子であって、Ｆｃ領域が、エフェクター機能を減少させる１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、二重特異性抗原結合分子に関する。特定の態様では、Ｆｃ領域が、アミノ酸突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を有するヒトＩｇＧ１サブクラスのものである。特定の態様では、Ｆｃ領域が、アミノ酸突然変異Ｄ２６５ＡおよびＰ３２９Ｇを有するマウスＩｇＧ１サブクラスのものである。
【０１９８】
ヘテロ二量体化を促進するＦｃ領域修飾
本発明の二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃ領域の２つのサブユニットの一方または他方に融合した、異なる抗原結合部位を含み、よって、Ｆｃ領域の２つのサブユニットが２つの非同一ポリペプチド鎖に含まれ得る。これらのポリペプチドの組換え共発現およびその後の二量体化が、２つのポリペプチドのいくつかの可能な組み合わせをもたらす。よって、組換え産生における本発明の二重特異性抗体の収率および純度を改善するために、所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃ領域に導入することが有利であるだろう。
【０１９９】
したがって、特定の態様では、本発明は、（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、（ｂ）ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、（ｃ）安定に会合することができる第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃ領域とを含む二重特異性抗原結合分子であって、Ｆｃ領域が、Ｆｃ領域の第１のサブユニットおよび第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む、二重特異性抗原結合分子に関する。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域の２つのサブユニット間の最も広範なタンパク質−タンパク質相互作用の部位は、Ｆｃ領域のＣＨ３ドメイン内にある。よって、一態様では、前記修飾がＦｃ領域のＣＨ３ドメイン内にある。
【０２００】
特定の態様では、前記修飾が、Ｆｃ領域の２つのサブユニットの一方の「ノブ」修飾およびＦｃ領域の２つのサブユニットの他方の「ホール」修飾を含む、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」修飾である。よって、本発明は、（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、（ｂ）ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、（ｃ）安定に会合することができる第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃ領域とを含む二重特異性抗原結合分子であって、ノブ・イントゥ・ホール法により、Ｆｃ領域の第１のサブユニットがノブを含み、Ｆｃ領域の第２のサブユニットがホールを含む、二重特異性抗原結合分子に関する。特定の態様では、Ｆｃ領域の第１のサブユニットが、アミノ酸置換Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）を含み、Ｆｃ領域の第２のサブユニットが、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６ＳおよびＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０２０１】
ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば米国特許第５，７３１，１６８号；米国特許第７，６９５，９３６号；Ｒｉｄｇｗａｙら、Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ  ９、６１７〜６２１（１９９６）およびＣａｒｔｅｒ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  ２４８、７〜１５（２００１）に記載されている。一般的に、本方法は、第１のポリペプチドの界面の隆起（「ノブ」）および第２のポリペプチドの界面の対応する空洞（「ホール」）を導入して、隆起が、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げるように空洞内に位置することができるようにすることを含む。隆起は、第１のポリペプチドの界面の小さなアミノ酸側鎖を大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えることによって構築される。隆起と同一または類似のサイズの代償的空洞は、大きなアミノ酸側鎖を小さなもの（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置き換えることによって、第２のポリペプチドの界面に作り出される。
【０２０２】
したがって、一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃ領域の第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン中で、アミノ酸残基がより大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞内に位置することができる隆起が第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に生成され、Ｆｃ領域の第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン中で、アミノ酸残基がより小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の隆起が位置することができる空洞が第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に生成される。隆起および空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変化させることによって、例えば部位特異的突然変異誘発またはペプチド合成によって作り出され得る。具体的な態様では、Ｆｃ領域の第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン中で、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基で置き換えられており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃ領域の第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン中で、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置き換えられている（Ｙ４０７Ｖ）。一態様では、Ｆｃ領域の第２のサブユニット中で、さらに、３６６位のスレオニン残基がセリン残基で置き換えられており（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられている（Ｌ３６８Ａ）。
【０２０３】
なおさらなる態様では、Ｆｃ領域の第１のサブユニット中で、さらに、３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられており（Ｓ３５４Ｃ）、Ｆｃ領域の第２のサブユニット中で、さらに、３４９位のチロシン残基がシステイン残基によって置き換えられている（Ｙ３４９Ｃ）。これらの２個のシステイン残基の導入によって、Ｆｃ領域の２つのサブユニット間にジスルフィド架橋が形成され、二量体がさらに安定化される（Ｃａｒｔｅｒ（２００１）、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８、７〜１５）。特定の態様では、Ｆｃ領域の第１のサブユニットがアミノ酸置換Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗを含み（ＥＵ番号付け）、Ｆｃ領域の第２のサブユニットがアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６ＳおよびＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０２０４】
さらなる態様では、Ｆｃ領域の第１のサブユニットが、３９２位および４０９位にアスパラギン酸残基（Ｄ）を含み、Ｆｃ領域の第２のサブユニットが、３５６位および３９９位にリジン残基（Ｋ）を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域の第１のサブユニット中で、３９２位および４０９位のリジン残基がアスパラギン酸残基で置き換えられており（Ｋ３９２Ｄ、Ｋ４０９Ｄ）、Ｆｃ領域の第２のサブユニット中で、３５６位のグルタミン酸残基および３９９位のアスパラギン酸残基がリジン残基で置き換えられている（Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３９９Ｋ）。「ＤＤＫＫ」ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば国際公開第２０１４／１３１６９４号に記載されており、相補的アミノ酸残基を提供する重鎖保有サブユニットの組み立てを支持する。
【０２０５】
代替態様では、Ｆｃ領域の第１のサブユニットおよび第２のサブユニットの会合を促進する修飾が、例えばＰＣＴ公開、国際公開第２００９／０８９００４号に記載されるように、静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。一般的に、この方法は、ホモ二量体形成が静電気的に好ましくなくなるが、ヘテロ二量体化が静電気的に好ましくなるように、２つのＦｃ領域サブユニットの界面の１つまたは複数のアミノ酸残基の荷電アミノ酸残基による置き換えを伴う。
【０２０６】
本明細書で報告される二重特異性抗体の重鎖のＣ末端は、アミノ酸残基ＰＧＫを有する完全なＣ末端終末であり得る。重鎖のＣ末端は、Ｃ末端アミノ酸残基の１つまたは２つが除去されている短縮Ｃ末端であり得る。１つの好ましい態様では、重鎖のＣ末端が短縮Ｃ末端終末ＰＧである。本明細書で報告される全ての態様の一態様では、本明細書で特定されるＣ末端ＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む二重特異性抗体が、Ｃ末端グリシン−リジンジペプチドを含む（Ｇ４４６およびＫ４４７、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。本明細書で報告される全ての態様の一実施形態では、本明細書で特定されるＣ末端ＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む二重特異性抗体が、Ｃ末端グリシン残基を含む（Ｇ４４６、Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【０２０７】
Ｆａｂドメインの修飾
一態様では、本発明は、（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片と、（ｂ）ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片と、（ｃ）安定に会合することができる第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃ領域とを含む二重特異性抗原結合分子であって、Ｆａｂ断片の一方で、可変ドメインＶＨおよびＶＬ、または定常ドメインＣＨ１およびＣＬが交換されている、二重特異性抗原結合分子に関する。二重特異性抗体は、Ｃｒｏｓｓｍａｂ技術に従って調製される。
【０２０８】
１つの結合アーム中にドメイン置換／交換を有する多重特異性抗体（ＣｒｏｓｓＭａｂ  ＶＨ−ＶＬまたはＣｒｏｓｓＭａｂ  ＣＨ−ＣＬ）は、国際公開第２００９／０８０２５２号およびＳｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．ら、ＰＮＡＳ、１０８（２０１１）１１１８７〜１１９１に詳細に記載されている。これらは明らかに、第１の抗原に対する軽鎖と第２の抗原に対する誤った重鎖のミスマッチによって引き起こされる副産物を減少させる（このようなドメイン交換のないアプローチと比較して）。
【０２０９】
一態様では、本発明は、（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片と、（ｂ）ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片と、（ｃ）安定に会合することができる第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃ領域とを含む二重特異性抗原結合分子であって、Ｆａｂ断片の一方で、ＣＨ１ドメインが軽鎖の一部となり、ＣＬドメインが重鎖の一部となるように、定常ドメインＣＬおよびＣＨ１が互いに置き換えられている、二重特異性抗原結合分子に関する。さらに特に、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片で、ＣＨ１ドメインが軽鎖の一部となり、ＣＬドメインが重鎖の一部となるように、定常ドメインＣＬおよびＣＨ１が互いに置き換えられている。
【０２１０】
特定の態様では、本発明は、（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片と、（ｂ）ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片とを含む二重特異性抗原結合分子であって、ＣＨ１ドメインが軽鎖の一部となり、ＣＬドメインが重鎖の一部となるように、定常ドメインＣＬおよびＣＨ１が互いに置き換えられている、二重特異性抗原結合分子に関する。このような分子は、一価二重特異性抗原結合分子と呼ばれる。
【０２１１】
別の態様では、本発明は、（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片およびＦｃ領域を含む抗体の２つの軽鎖および２つの重鎖と、（ｂ）ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる２つの追加のＦａｂ断片とを含む二重特異性抗原結合分子であって、前記追加のＦａｂ断片がそれぞれ、ペプチドリンカーを介して（ａ）の重鎖のＣ末端に接続されている、二重特異性抗原結合分子に関する。特定の態様では、追加のＦａｂ断片が、ＶＨが軽鎖の一部となり、ＶＬが重鎖の一部となるように、可変ドメインＶＬおよびＶＨが互いに置き換えられている、Ｆａｂ断片である。
【０２１２】
よって、特定の態様では、本発明は、（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片およびＦｃ領域を含む抗体の２つの軽鎖および２つの重鎖と、（ｂ）ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる２つの追加のＦａｂ断片とを含む二重特異性抗原結合分子であって、前記ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる２つの追加のＦａｂ断片が、可変ドメインＶＬおよびＶＨが互いに置き換えられており、ＶＬ−ＣＨ鎖がそれぞれ、ペプチドリンカーを介して（ａ）の重鎖のＣ末端に接続されているクロスオーバーＦａｂ断片である、二重特異性抗原結合分子を含む。
【０２１３】
別の態様では、正確なペアリングをさらに改善するために、（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる第１のＦａｂ断片と、（ｂ）ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる第２のＦａｂ断片と、（ｃ）安定に会合することができる第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃ領域とを含む二重特異性抗原結合分子が、異なる荷電アミノ酸置換（いわゆる「荷電残基」）を含むことができる。これらの修飾は交差または非交差ＣＨ１およびＣＬドメインに導入される。特定の態様では、本発明は、ＣＬドメインの１つで、１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）によって置き換えられており、１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており、ＣＨ１ドメインの１つで、１４７位（ＥＵ番号付け）および２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている、二重特異性抗原結合分子に関する。
【０２１４】
さらに特に、本発明は、ＣＬドメインで、１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）によって置き換えられており、１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており、ＣＨ１ドメインで、１４７位（ＥＵ番号付け）および２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている、Ｆａｂを含む二重特異性抗原結合分子に関する。
【０２１５】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦａｂ断片（例えば、ＯＸ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片）の１つまたは複数が、１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸にアルギニン（Ｒ）および１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸にリジン（Ｋ）を含むＣＬドメインと、１４７位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸にグルタミン酸（Ｅ）および２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸にグルタミン酸（Ｅ）を含むＣＨ１ドメインとを含む。
【０２１６】
ポリヌクレオチド
本発明はさらに、本明細書に記載される本発明の二重特異性抗原結合分子またはその断片をコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
【０２１７】
本発明の二重特異性抗原結合分子をコードする単離ポリヌクレオチドは、抗原結合分子全体をコードする単一ポリヌクレオチドとして、または共発現される複数の（例えば、２つ以上の）ポリヌクレオチドとして発現され得る。共発現されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えばジスルフィド結合または他の手段を通して会合して、機能的抗原結合分子を形成し得る。例えば、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分の軽鎖部分は、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる重鎖部分とは別のポリヌクレオチドによってコードされ得る。共発現されると、重鎖ポリペプチドが軽鎖ポリペプチドと会合して、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分を形成する。同様に、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分の軽鎖部分は、ＯＸ４０に特異的に結合することができる重鎖部分とは別のポリヌクレオチドによってコードされ得る。共発現されると、重鎖ポリペプチドが軽鎖ポリペプチドと会合して、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分を形成する。
【０２１８】
一定の実施形態では、ポリヌクレオチドまたは核酸がＤＮＡである。他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドがＲＮＡである、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態である。本発明のＲＮＡは一本鎖または二本鎖であり得る。
【０２１９】
本発明の別の態様によると、本明細書で前に定義される二重特異性抗原結合分子または本明細書で前に定義される融合ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドが提供される。本発明はさらに、本発明の単離ポリヌクレオチドを含むベクター、特に発現ベクター、および本発明の単離ポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、宿主細胞が真核細胞、特に哺乳動物細胞である。
【０２２０】
別の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子を作製する方法であって、（ｉ）本発明の宿主細胞を、前記抗原結合分子の発現に適した条件下で培養する工程と、（ｉｉ）前記二重特異性抗原結合分子を単離する工程とを含む方法が提供される。本発明はまた、本発明の方法によって作製された二重特異性抗原結合分子を包含する。
【０２２１】
組換え方法
本発明の二重特異性抗原結合分子は、例えば固相ペプチド合成（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成）または組換え産生によって得ることができる。組換え産生のために、例えば上記の抗原結合分子またはそのポリペプチド断片をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを単離し、さらなるクローニングおよび／または宿主細胞中での発現のために１つまたは複数のベクターに挿入する。このようなポリヌクレオチドを容易に単離し、慣用的な手順を使用して配列決定することができる。本発明の一態様では、本発明のポリヌクレオチドの１つまたは複数を含むベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を使用して、適切な転写／翻訳制御シグナルと共に二重特異性抗原結合分子（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術およびインビボ組換え／遺伝子組換えが含まれる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載される技術を参照されたい。発現ベクターはプラスミド、ウイルスの一部であり得る、または核酸断片であり得る。発現ベクターは、プロモーターおよび／または他の転写もしくは翻訳制御エレメントと動作可能に会合した、二重特異性抗原結合分子またはそのポリペプチド断片（すなわち、コード領域）をコードするポリヌクレオチドをクローニングする発現カセットを含む。本明細書で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部とみなすことができるが、存在する場合、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’および３’非翻訳領域などはコード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が単一ポリヌクレオチドコンストラクト、例えば単一ベクター、または別個のポリヌクレオチドコンストラクト、例えば別個の（異なる）ベクターに存在してもよい。さらに、任意のベクターは単一コード領域を含み得る、または２つ以上のコード領域を含み得る、例えば本発明のベクターは１つまたは複数のポリペプチドをコードすることができ、これがタンパク質分解切断を介して最終タンパク質に翻訳後にまたは翻訳と同時に分離される。さらに、本発明のベクター、ポリヌクレオチドまたは核酸は、本発明の二重特異性抗原結合分子もしくはそのポリペプチド断片、またはその変異体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合したまたは融合していない、異種コード領域をコードし得る。異種コード領域は、限定されないが、分泌シグナルペプチドまたは異種機能ドメインなどの特殊エレメントまたはモチーフを含む。動作可能な会合は、遺伝子産物、例えばポリペプチドのコード領域が、遺伝子産物の発現を調節配列（複数可）の影響または制御下に置くように１つまたは複数の調節配列と会合している場合である。プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、および２つのＤＮＡ断片間の結合の性質が、発現調節配列が遺伝子産物の発現を指示する能力を妨害もせず、ＤＮＡ鋳型が転写される能力も妨害しない場合に、２つのＤＮＡ断片（ポリペプチドコード領域およびこれと会合したプロモーターなど）が「動作可能に会合されている」。よって、プロモーターが、ポリペプチドをコードする核酸の転写を行うことができる場合に、プロモーター領域はその核酸と動作可能に会合されているだろう。プロモーターは、所定の細胞内でのみＤＮＡの実質的な転写を指示する細胞特異的プロモーターであり得る。プロモーターに加えて、他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサーおよび転写終結シグナルをポリヌクレオチドと動作可能に会合させて、細胞特異的転写を指示することができる。
【０２２２】
適切なプロモーターおよび他の転写制御領域が本明細書で開示される。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらには、それだけに限らないが、サイトメガロウイルス（例えば、イントロンＡと連結した最初期プロモーター）、シミアンウイルス４０（例えば、初期プロモーター）およびレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルスなど）由来のプロモーターおよびエンハンサーセグメントなどの脊椎動物細胞で機能する転写制御領域が含まれるが、これらに限定されない。他の転写制御領域には、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモンおよびウサギαグロブリンなどの脊椎動物遺伝子由来のもの、ならびに真核細胞中で遺伝子発現を制御することができる他の配列が含まれる。追加の適切な転写制御領域には、組織特異的プロモーターおよびエンハンサーならびに誘導性プロモーター（例えば、テトラサイクリン誘導性プロモーター）が含まれる。同様に、種々の翻訳制御エレメントが当業者に知られている。これらには、それだけに限らないが、リボソーム結合部位、翻訳開始および終止コドン、ならびにウイルス系に由来するエレメント（特に、配列内リボソーム進入部位またはＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる）が含まれる。発現カセットはまた、複製起点、および／または染色体組込エレメント、例えばレトロウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）もしくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位配列（ＩＴＲ）などの他の特徴を含み得る。
【０２２３】
本発明のポリヌクレオチドおよび核酸コード領域を、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する、分泌またはシグナルペプチドをコードする追加のコード領域と会合させることができる。例えば、二重特異性抗原結合分子またはそのポリペプチド断片の分泌が望まれる場合、シグナル配列をコードするＤＮＡを、本発明の二重特異性抗原結合分子またはそのポリペプチド断片をコードする核酸の上流に配置することができる。シグナル仮説によると、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、いったん粗面小胞体を横切る成長タンパク質鎖の輸送が開始されると成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有する。当業者であれば、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが、一般的にポリペプチドのＮ末端に融合したシグナルペプチドを有し、これが翻訳ポリペプチドから切断されてポリペプチドの分泌または「成熟」型が産生されることを認識している。一定の実施形態では、天然シグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖シグナルペプチド、またはポリペプチドと動作可能に会合されたポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチドまたはその機能的誘導体を使用することができる。例えば、野生型リーダー配列をヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）またはマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換してもよい。
【０２２４】
後の精製を促進する（例えば、ヒスチジンタグ）または融合タンパク質の標識を助けるために使用され得る短いタンパク質配列をコードするＤＮＡを、本発明の二重特異性抗原結合分子またはそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチド内にまたはその末端に含めてもよい。
【０２２５】
本発明のさらなる態様では、本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。一定の実施形態では、本発明の１つまたは複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチドおよびベクターは、それぞれポリヌクレオチドおよびベクターに関して本明細書に記載される特徴のいずれかを単独でまたは組み合わせて組み込み得る。一態様では、宿主細胞が、本発明の二重特異性抗原結合分子（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えば、ベクターで形質転換されているまたはトランスフェクトされている）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本発明の融合タンパク質またはその断片を産生するよう操作することができる任意の種類の細胞系を指す。抗原結合分子を複製するおよびその発現を支持するのに適した宿主細胞は当技術分野で周知である。このような細胞を特定の発現ベクターで必要に応じてトランスフェクトまたは形質導入することができ、多量のベクター含有細胞を播種大規模発酵槽で増殖させて、臨床用途にとって十分な量の抗原結合分子を得ることができる。適切な宿主細胞には、原核微生物、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または種々の真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞、昆虫細胞などが含まれる。例えば、特にグリコシル化が必要とされない場合、ポリペプチドを細菌中で産生させることができる。発現後、ポリペプチドを細菌細胞ペーストから可溶性画分で単離し、さらに精製することができる。原核生物に加えて、そのグリコシル化経路を「ヒト化」して、部分的または完全ヒトグリコシル化パターンを有するポリペプチドの産生をもたらす、真菌および酵母株を含む、糸状菌または酵母などの真核微生物がポリペプチドコードベクターに適したクローニングまたは発現宿主である。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２２、１４０９〜１４１４（２００４）およびＬｉら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２４、２１０〜２１５（２００６）を参照されたい。
【０２２６】
（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物および脊椎動物）にも由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物および昆虫細胞が挙げられる。特にヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と合わせて使用され得る多数のバキュロウイルス株が同定されている。植物細胞培養物を宿主として利用することもできる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号および同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物で抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載している）を参照されたい。脊椎動物細胞を宿主として使用してもよい。例えば、懸濁で培養するよう適合された哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７）；ヒト胚腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ３６、５９（１９７７）に記載される２９３または２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ  ２３、２４３〜２５１（１９８０）に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）、マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ  ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ３８３、４４〜６８（１９８２）に記載されている）、ＭＲＣ５細胞およびＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７７、４２１６（１９８０））を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；ならびにＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３およびＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が含まれる。タンパク質産生に適した一定の哺乳動物宿主細胞株の概要については、例えば、ＹａｚａｋｉおよびＷｕ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２４８巻（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）、２５５〜２６８頁（２００３）を参照されたい。宿主細胞には、培養細胞、例えば、ほんの少し例を挙げれば、哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞および植物細胞が含まれるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物または培養植物もしくは動物組織に含まれる細胞も含まれる。一実施形態では、宿主細胞が真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞またはリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。これらの系で外来遺伝子を発現させるための標準的な技術が当技術分野で知られている。抗原結合ドメインの重鎖または軽鎖を含むポリペプチドを発現する細胞を操作して、発現産物が重鎖と軽鎖の両方を有する抗原結合ドメインとなるように免疫グロブリン鎖の他方も発現するようにすることができる。
【０２２７】
別の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子を作製する方法であって、（ｉ）本発明の宿主細胞を、前記抗原結合分子の発現に適した条件下で培養する工程と、（ｉｉ）宿主細胞または宿主細胞培養培地から前記二重特異性抗原結合分子を単離する工程とを含む方法が提供される。
【０２２８】
二重特異性抗原結合分子の成分を互いに遺伝子融合する。二重特異性抗原結合分子を、その成分が互いに直接的にまたはリンカー配列を通して間接的に融合するように設計することができる。リンカーの組成および長さは当技術分野で周知の方法に従って決定することができ、有効性について試験することができる。二重特異性抗原結合分子の異なる成分間のリンカー配列の例は、本明細書に提供される配列に見出される。所望であれば、例えばエンドペプチダーゼ認識配列などの追加の配列を含めて切断部位を組み込んで融合体の個々の成分を分離することもできる。
【０２２９】
一定の実施形態では、抗原結合分子の一部を形成するＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分（例えば、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖ）が、少なくともＥｐＣＡＭに結合することができる免疫グロブリン可変領域を含む。同様に、一定の実施形態では、抗原結合分子の一部を形成するＯＸ４０に特異的に結合することができる部分（例えば、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖ）が、少なくともＯＸ４０に結合することができる免疫グロブリン可変領域を含む。可変領域は、天然に存在するまたは天然に存在しない抗体およびその断片の一部を形成することができ、これに由来することができる。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製する方法は当技術分野で周知である（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８参照）。天然に存在しない抗体は、固相ペプチド合成を使用して構築することができ、組換え的に産生することができ（例えば、米国特許第４，１８６，５６７号に記載される）、または例えば可変重鎖および可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙの米国特許第５，９６９，１０８号参照）。
【０２３０】
任意の動物種の免疫グロブリンを本発明に使用することができる。本発明で有用な非限定的な免疫グロブリンは、マウス、霊長類またはヒト由来のものであり得る。融合タンパク質をヒト使用のために意図する場合、免疫グロブリンの定常領域がヒトのものであるキメラ型の免疫グロブリンを使用することができる。ヒト化または完全ヒト型の免疫グロブリンを、当技術分野で周知の方法に従って調製することもできる（例えば、Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，５６５，３３２号参照）。ヒト化は、それだけに限らないが、（ａ）非ヒト（例えば、ドナー抗体）ＣＤＲを、重要なフレームワーク残基（例えば、優れた抗原結合親和性または抗体機能を保持するのに重要なもの）を保持するまたは保持しないで、ヒト（例えば、レシピエント抗体）フレームワークおよび定常領域に移植すること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲまたはａ−ＣＤＲ；抗体−抗原相互作用に重要な残基）のみを、ヒトフレームワークおよび定常領域に移植すること、または（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置き換えによってこれらをヒト様分泌で「クローキングする（ｃｌｏａｋｉｎｇ）」ことを含む、種々の方法によって達成することができる。ヒト化抗体およびこれらを作製する方法は、例えばＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ  １３、１６１９〜１６３３（２００８）に概説されており、例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２、３２３〜３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６、１００２９〜１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号および同第７，０８７，４０９号；Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１、５２２〜５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８１、６８５１〜６８５５（１９８４）；ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＯｉ、Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４４、６５〜９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９、１５３４〜１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃ  Ｉｍｍｕｎ  ３１（３）、１６９〜２１７（１９９４）；Ｋａｓｈｍｉｒｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６、２５〜３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）移植を記載している）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２８、４８９〜４９８（１９９１）（「リサーフェイシング」を記載している）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６、４３〜６０（２００５）（「ＦＲシャフリング」を記載している）；ならびにＯｓｂｏｕｒｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６、６１〜６８（２００５）およびＫｌｉｍｋａら、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ８３、２５２〜２６０（２０００）（ＦＲシャフリングへの「誘導選択」アプローチを記載している）にさらに記載されている。本発明による特定の免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンである。ヒト抗体およびヒト可変領域は、当技術分野で公知の種々の技術を使用して作製することができる。ヒト抗体は、ｖａｎ  Ｄｉｊｋおよびｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５、３６８〜７４（２００１）ならびにＬｏ��ｂｅｒｇ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０、４５０〜４５９（２００８）に一般的に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されたヒトモノクローナル抗体の一部を形成することができ、これに由来することができる（例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１〜６３頁（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、１９８７）参照）。ヒト抗体およびヒト可変領域はまた、免疫原を、抗原曝露に応じてインタクトなヒト抗体またはヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように修飾したトランスジェニック動物に投与することによって調製することができる（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２３、１１１７〜１１２５（２００５）参照）。ヒト抗体およびヒト可変領域はまた、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変領域配列を単離することによっても作製することができる（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８、１〜３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら編、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、２００１）；およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８、５５２〜５５４；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２、６２４〜６２８（１９９１）参照）。ファージは、典型的には単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片またはＦａｂ断片として抗体断片を示す。
【０２３１】
一定の態様では、本発明の抗原結合分子に含まれる関連標的（例えば、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖ）に特異的に結合することができる部分を、例えばＰＣＴ公開、国際公開第２０１２／０２０００６号（親和性成熟に関連する実施例参照）または米国特許出願公開第２００４／０１３２０６６号に開示される方法に従って、増強した結合親和性を有するように操作する。本発明の抗原結合分子が特異的抗原決定基に結合する能力は、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）または当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴技術（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄら、Ｇｌｙｃｏ  Ｊ  １７、３２３〜３２９（２０００））および伝統的な結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ、Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｓ  ２８、２１７〜２２９（２００２））を通して測定することができる。競合アッセイを使用して、特定の抗原への結合について参照抗体と競合する抗原結合分子を同定することができる。一定の実施形態では、このような競合抗原結合分子が、参照抗原結合分子が結合するのと同じエピトープ（例えば、直鎖状またはコンフォメーションエピトープ）に結合する。抗原結合分子が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法は、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）「Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第６６巻（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）に提供される。例示的競合アッセイでは、固定化抗原を、抗原に結合する第１の標識抗原結合分子と、抗原への結合について第１の抗原結合分子と競合する能力を試験している第２の非標識抗原結合分子とを含む溶液中でインキュベートする。第２の抗原結合分子はハイブリドーマ上清中に存在し得る。対照として、固定化抗原を、第１の標識抗原結合分子を含むが、第２の非標識抗原結合分子を含まない溶液中でインキュベートする。第１の抗体と抗原の結合について許容的な条件下でのインキュベーション後、過剰な非結合抗体を除去し、固定化抗原と会合した標識の量を測定する。固定化抗原と会合した標識の量が対照試料に対して試験試料中で実質的に減少した場合、それは、第２の抗原結合分子が、抗原への結合について第１の抗原結合分子と競合していることを示す。ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第１４章（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）を参照されたい。
【０２３２】
本明細書に記載されるように調製される本発明の二重特異性抗原結合分子は、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどの当技術分野で公知の技術によって精製することができる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、部分的には、正味荷電、疎水性、親水性等などの因子に依存し、当業者に明らかであるだろう。アフィニティークロマトグラフィー精製のために、二重特異性抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体または抗原を使用することができる。例えば、本発明の融合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー精製のために、プロテインＡまたはプロテインＧを含むマトリックスを使用することができる。連続的なプロテインＡまたはＧアフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、実施例に本質的に記載されるように抗原結合分子を単離することができる。二重特異性抗原結合分子またはその断片の純度を、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む種々の周知の分析法のいずれかによって決定することができる。例えば、実施例に記載されるように発現される二重特異性抗原結合分子は、還元または非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって実証されるように、インタクトであり、適切に組み立てられていることが示された。
【０２３３】
本発明はまた、本発明の方法によって作製された二重特異性抗原結合分子を包含する。
【０２３４】
アッセイ
本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子を、当技術分野で公知の種々のアッセイによって、その物理的／化学的特性および／または生物活性について、同定、スクリーニングまたは特徴を明らかにすることができる。
【０２３５】
１．親和性アッセイ
本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子のＯＸ４０またはＥｐＣＡＭに対する親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な計装、および組換え発現によって得ることができるような受容体または標的タンパク質を使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって実施例に示される方法に従って決定することができる。一態様によると、ＫＤを、２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して表面プラズモン共鳴によって測定する。
【０２３６】
２．結合アッセイおよび他のアッセイ
本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子と対応するＯＸ４０および／またはＥｐＣＡＭ発現細胞の結合は、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって、特定の受容体または標的抗原を発現する細胞株を使用して評価することができる。一態様では、ＯＸ４０を発現する新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を結合アッセイに使用する。これらの細胞を、単離直後（ナイーブＰＭＢＣ）または刺激後（活性化ＰＭＢＣ）に使用する。別の態様では、活性化マウス脾細胞（ＯＸ４０を発現する）を使用して、本発明の二重特異性抗原結合分子と対応するＯＸ４０発現細胞の結合を実証することができる。
【０２３７】
さらなる態様では、ＥｐＣＡＭを発現するがん細胞株を使用して、抗原結合分子とＥｐＣＡＭの結合を実証した。
【０２３８】
別の態様では、競合アッセイを使用して、それぞれＥｐＣＡＭまたはＯＸ４０への結合について、特定の抗体または抗原結合分子と競合する抗原結合分子を同定することができる。一定の実施形態では、このような競合抗原結合分子が、特定の抗ＥｐＣＡＭ抗体または特定の抗ＯＸ４０抗体が結合するのと同じエピトープ（例えば、直鎖状またはコンフォメーションエピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法は、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）「Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第６６巻（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ）に提供される。
【０２３９】
３．活性アッセイ
一態様では、生物活性を有するＥｐＣＡＭおよびＯＸ４０に結合する二重特異性抗原結合分子を同定するためのアッセイが提供される。生物活性には、例えばＯＸ４０を発現する細胞でのＯＸ４０を通したアゴニストシグナル伝達が含まれ得る。インビトロでこのような生物活性を有するとしてアッセイによって同定される二重特異性抗原結合分子も提供される。特に、ヒトＯＸ４０を発現し、ヒトＥｐＣＡＭ発現腫瘍細胞と共培養されるＨｅｌａ細胞でＮＦ−κＢ活性化を検出するレポーター細胞アッセイが提供される（例えば、実施例６．１参照）。
【０２４０】
一定の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子をこのような生物活性について試験する。本発明の分子の生物活性を検出するためのアッセイは実施例４または実施例６に記載されるものである。さらに、細胞溶解（例えば、ＬＤＨ放出の測定による）、誘導アポトーシス動態（例えば、Ｃａｓｐａｓｅ  ３／７活性の測定による）またはアポトーシス（例えば、ＴＵＮＥＬアッセイを使用）を検出するためのアッセイは当技術分野で周知である。さらに、このような複合体の生物活性は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞もしくはγδＴ細胞などの種々のリンパ球サブセットの生存、増殖およびリンホカイン分泌に対する効果を評価する、または樹状細胞、単球／マクロファージもしくはＢ細胞などの抗原提示細胞の表現型および機能を調節する能力を評価することによって評価することができる。
【０２４１】
薬学的組成物、製剤および投与経路
さらなる態様では、本発明は、例えば以下の治療方法のいずれかに使用するための、本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。一実施形態では、薬学的組成物が、二重特異性抗原結合分子と、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤とを含む。別の実施形態では、薬学的組成物が、本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子のいずれかと、例えば以下に記載される、少なくとも１種の追加の治療剤とを含む。
【０２４２】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される賦形剤に溶解または分散された治療的有効量の１種または複数の二重特異性抗原結合分子を含む。「薬学的にまたは薬理的に許容される」という句は、使用される投与量および濃度でレシピエントにとって一般的に非毒性である、すなわち、例えば必要に応じてヒトなどの動物に投与した場合に、有害な、アレルギー性のまたは他の都合の悪い反応をもたらさない分子実体および組成物を指す。少なくとも１種の二重特異性抗原結合分子と、場合により追加の有効成分とを含有する薬学的組成物の調製物は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版  Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０によって例示されるように、本開示に照らして当業者に知られているだろう。特に、組成物は凍結乾燥製剤または水溶液である。本明細書で使用されるように、「薬学的に許容される賦形剤」は、当業者に知られるように、任意のおよび全ての溶媒、バッファー、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、塩、安定剤およびこれらの組み合わせを含む。
【０２４３】
非経口組成物は、注射、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内筋肉内、髄腔内または腹腔内注射によって投与するために設計されたものを含む。注射用に、本発明の二重特異性抗原結合分子を、水溶液、好ましくは生理学的に適合するバッファー、例えばハンクス液、リンゲル液または生理的食塩水バッファーに製剤化することができる。溶液は、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤などの配合剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）を含有してもよい。あるいは、融合タンパク質は、使用前に、適切なビヒクル、例えば滅菌パイロジェンフリー水で構成するための粉末形態であり得る。滅菌注射液は、必要量の本発明の融合タンパク質または二重特異性抗原結合分子を、必要に応じて、種々の以下に列挙される他の成分を含む適切な溶媒に組み込むことによって調製される。無菌状態は、例えば滅菌濾過膜を通した濾過によって、容易に達成することができる。一般的に、分散液は、種々の滅菌有効成分を、塩基性分散媒および／または他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射液、懸濁液またはエマルジョンを調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、前に滅菌濾過したその液体媒体からの、有効成分と任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす真空乾燥または凍結乾燥技術である。液体媒体は、必要に応じて適切に緩衝化すべきであり、液体希釈剤はまず、十分な食塩水またはグルコースで注射前に等張性を付与されるべきである。組成物は、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護すべきである。エンドトキシン汚染を安全なレベルに最小限に、例えば０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満に維持すべきであることが認識されるだろう。適切な薬学的に許容される賦形剤には、それだけに限らないが、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖類、二糖類および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなどの懸濁液の粘度を増加させる化合物を含有してもよい。場合により、懸濁液はまた、適切な安定剤または化合物の溶���度を増加させて高度濃縮溶液の調製を可能にする薬剤を含有してもよい。さらに、活性化合物の懸濁液を、適切な油性注射懸濁液として調製してもよい。適切な親油性溶媒またはビヒクルには、ゴマ油などの脂肪油、またはエチルクリート（ｅｔｈｙｌ  ｃｌｅａｔ）もしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが含まれる。
【０２４４】
有効成分を、例えば、コアセルベーション技術もしくは界面重合によって調製したマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）、またはマクロエマルジョンに封入してもよい。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版  Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０）に開示されている。徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の適切な例としては、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは成形物品、例えば膜またはマイクロカプセルの形態である。特定の実施形態では、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチンまたはこれらの組み合わせなどの吸収を遅延させる薬剤を組成物に使用することによって、注射用組成物の延長された吸収をもたらすことができる。
【０２４５】
本明細書における例示的な薬学的に許容される賦形剤にはさらに、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えばヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などの間質性薬物分散剤が含まれる。ｒＨｕＰＨ２０を含む一定の例示的ｓＨＡＳＥＧＰおよび使用方法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号および同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰがコンドロイチナーゼなどの１種または複数の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
【０２４６】
例示的凍結乾燥抗体製剤は米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体製剤には、米国特許第６，１７１，５８６号および国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されるものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸塩バッファーを含む。
【０２４７】
上記組成物に加えて、二重特異性抗原結合分子をデポー調製物として製剤化してもよい。このような長時間作用性製剤は、移植（例えば、皮下もしくは筋肉内）または筋肉内注射によって投与され得る。よって、例えば、二重特異性抗原結合分子を、適切なポリマーもしくは疎水性物質（例えば、薬学的に許容される油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂を用いて、あるいは難溶性誘導体、例えば難溶性塩として製剤化してもよい。
【０２４８】
本発明の二重特異性抗原結合分子を含む薬学的組成物は、慣用的な混合、溶解、乳化、カプセル化、捕捉または凍結乾燥方法によって製造され得る。薬学的組成物は、タンパク質の、薬学的に使用することができる調製物への加工を容易にする１種または複数の生理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤または補助剤を使用して慣用的な様式で製剤化され得る。適切な製剤は選択される投与経路に依存する。
【０２４９】
二重特異性抗原結合分子を遊離酸または塩基、中性または塩型の組成物に製剤化してもよい。薬学的に許容される塩は、遊離酸または塩基の生物活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えばタンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されるもの、あるいは例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸もしくはマンデル酸のような有機酸で形成されるものが含まれる。遊離カルボキシル基で形成される塩はまた、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムもしくは水酸化第二鉄などの無機塩基；またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジンもしくはプロカインのような有機塩基から誘導することもできる。薬学的塩は、対応する遊離塩基型よりも水性および他のプロトン性溶媒に可溶性である傾向がある。
【０２５０】
薬学的組成物はまた、治療している特定の適応症に必要な２種以上の有効成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含有してもよい。このような有効成分は、適切には意図した目的に有効な量で組み合わせて存在する。一態様では、薬学的組成物が、二重特異性抗原結合分子と、別の活性抗がん剤とを含む。
【０２５１】
インビボ投与に使用するための製剤は一般的に滅菌である。無菌状態は、例えば滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成され得る。
【０２５２】
治療方法および組成物
本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子のいずれも治療方法に使用され得る。治療方法に使用するために、本発明の抗原結合分子を、優れた医療行為に一致した様式で製剤化、服用および投与することができる。本文脈において検討する因子には、治療している特定の障害、治療している特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュールおよび医師に知られている他の因子が含まれる。
【０２５３】
一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子が医薬として使用するために提供される。さらなる態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子が、疾患の治療に使用するため、特にがんの治療に使用するために提供される。一定の実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合分子が、治療方法に使用するために提供される。一実施形態では、本発明は、それを必要とする個体の疾患の治療に使用するための、本明細書に記載される二重特異性抗原結合分子を提供する。一定の実施形態では、本発明は、治療的有効量の二重特異性抗原結合分子を個体に投与することを含む、疾患を有する個体を治療する方法に使用するための二重特異性抗原結合分子を提供する。一定の実施形態では、治療される疾患が、がんである。一定の実施形態では、治療される疾患が、増殖性障害、特にがんである。がんの例としては、膀胱がん、脳がん、頭頚部がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮癌、骨がんおよび腎臓がんが挙げられる。本発明の二重特異性抗原結合分子を使用して治療することができる他の細胞増殖性障害には、それだけに限らないが、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌線（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頚部、神経系（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟部組織、脾臓、胸部領域および泌尿生殖器系に位置する新生物が含まれる。前がん性状態または病変およびがん転移も含まれる。一定の実施形態では、がんが、腎細胞がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳がん、頭頚部がんからなる群から選択される。治療を必要とする対象、患者または「個体」は、典型的には哺乳動物、より具体的にはヒトである。
【０２５４】
細胞傷害性Ｔ細胞活性を上方制御または延長するのに使用するための、本発明の二重特異性抗原結合分子または本発明の薬学的組成物も本発明に包含される。
【０２５５】
さらなる態様では、本発明は、それを必要とする個体の疾患を治療するための医薬の製造または調製における本発明の二重特異性抗原結合分子の使用を提供する。一態様では、医薬が、治療的有効量の医薬を、疾患を有する個体に投与することを含む、疾患を治療する方法に使用するためのものである。一定の実施形態では、治療される疾患が増殖性障害、特にがんである。がんの例としては、膀胱がん、脳がん、頭頚部がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮癌、骨がんおよび腎臓がんが挙げられる。本発明の二重特異性抗原結合分子を使用して治療することができる他の細胞増殖性障害には、それだけに限らないが、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌線（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頚部、神経系（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟部組織、脾臓、胸部領域および泌尿生殖器系に位置する新生物が含まれる。前がん性状態または病変およびがん転移も含まれる。一定の実施形態では、がんが、腎細胞がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳がん、頭頚部がんからなる群から選択される。当業者であれば、多くの場合、二重特異性抗原結合分子が治癒を提供することができず、部分的利益を提供することができるのみであることを容易に認識する。いくつかの実施形態では、ある利益を有する生理的変化も治療的に有益であるとみなされる。よって、いくつかの実施形態では、生理的変化をもたらす二重特異性抗原結合分子の量が「有効量」または「治療的有効量」とみなされる。上記実施形態のいずれにおいても、個体が好ましくは哺乳動物、特にヒトである。
【０２５６】
さらなる態様では、本発明は、個体の疾患を治療する方法であって、治療的有効量の本発明の二重特異性抗原結合分子を前記個体に投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、薬学的に許容される形態の本発明の融合タンパク質を含む組成物を前記個体に投与する。一定の実施形態では、治療される疾患が増殖性障害である。特定の実施形態では、疾患が、がんである。一定の実施形態では、本方法が、治療的有効量の少なくとも１種の追加の治療剤、例えば治療される疾患ががんである場合、抗がん剤を個体に投与することをさらに含む。上記実施形態のいずれかによる「個体」は哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。
【０２５７】
疾患を予防または治療するため、（単独でまたは１種もしくは複数の他の追加の治療剤と組み合わせて使用する場合）本発明の二重特異性抗原結合分子の適切な投与量は、治療される疾患の種類、投与経路、患者の体重、融合タンパク質の種類、疾患の重症度および経過、融合タンパク質を予防目的で投与するか治療目的で投与するか、以前のまたは同時の治療介入、患者の臨床歴および融合タンパク質に対する反応、ならびに担当医の裁量に依存する。投与を担う実務家は、いずれにしても、個々の対象のための組成物中の有効成分（複数可）の濃度および適切な用量（複数可）を決定する。それだけに限らないが、単回投与または種々の時点にわたる複数回投与、ボーラス投与およびパルス注入を含む種々の投与スケジュールが本明細書で企図される。
【０２５８】
二重特異性抗原結合分子は、適切には一度にまたは一連の治療にわたって患者に投与される。疾患の種類および重症度に応じて、例えば１回もしくは複数回の別個の投与、または連続注入のいずれにしても、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）の抗原結合分子が、患者に投与するための初期候補投与量となり得る。１つの典型的な１日投与量は、上述の因子に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上に及び得る。数日以上にわたる反復投与については、状態に応じて、治療が一般的に、疾患症状の所望の抑制が生じるまで維持されるだろう。融合タンパク質の１つの例示的投与量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であるだろう。他の例では、用量が、１投与当たり約１μｇ／ｋｇ体重、約５μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ／ｋｇ体重、約２００μｇ／ｋｇ体重、約３５０μｇ／ｋｇ体重、約５００μｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ／ｋｇ体重、約５ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約２００ｍｇ／ｋｇ体重、約３５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５００ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０００ｍｇ／ｋｇ体重またはそれ以上、およびその中の任意の導出可能な範囲も含み得る。本明細書に列挙される数値から導出可能な範囲の例では、上記の数値に基づいて、約５ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約５μｇ／ｋｇ体重〜約５００ｍｇ／ｋｇ体重等の範囲を投与することができる。よって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ（またはこれらの任意の組み合わせ）の１つまたは複数の用量が患者に投与され得る。このような用量は、間欠的に、例えば１週間毎または３週間毎に投与され得る（例えば、患者が約２回〜約２０回、または例えば約６回の二重特異性抗原結合分子の投与を受けるように）。初期のより高い負荷用量、引き続いて１回または複数回の低用量が投与され得る。しかしながら、他の投与レジメンも有用となり得る。この治療の進行は、慣用的な技術およびアッセイによって容易に監視される。
【０２５９】
本発明の二重特異性抗原結合分子は、一般的に意図した目的を達成するのに有効な量で使用される。疾患状態を治療または予防するために使用するために、本発明の二重特異性抗原結合分子またはその薬学的組成物は、治療的有効量で投与または施用される。治療的有効量の決定は、特に本明細書で提供される詳細な開示に照らして、十分当業者の能力の範囲内にある。
【０２６０】
全身投与については、治療的有効用量を、最初に細胞培養アッセイなどのインビトロアッセイから推定することができる。次いで、用量を動物モデルに処方して、細胞培養物中で決定されるＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成することができる。このような情報を使用して、ヒトで有用な用量をより正確に決定することができる。
【０２６１】
初期投与量は、当技術分野で周知の技術を使用して、インビボデータ、例えば動物モデルから推定することもできる。当業者であれば、動物データに基づいて、ヒトへの投与を容易に最適化することができるだろう。
【０２６２】
投与量および間隔を個々に調節して、治療効果を維持するのに十分な二重特異性抗原結合分子の血漿レベルをもたらすことができる。注射による投与のための通常の患者の投与量は、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５〜１ｍｇ／ｋｇ／日に及ぶ。治療的有効血漿レベルは、各日に複数回用量を投与することによって達成され得る。血漿中のレベルは、例えばＨＰＬＣによって測定され得る。
【０２６３】
局所投与または選択的取り込みの場合、二重特異性抗原結合分子の有効局所濃度は、血漿濃度に関連し得ない。当業者であれば、不当な実験をすることなく治療的有効局所投与量を最適化することができるだろう。
【０２６４】
本明細書に記載される二重特異性抗原結合分子の治療的有効用量は一般的に、実質的な毒性を引き起こすことなく治療利益を提供する。融合タンパク質の毒性および治療有効性は、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。細胞培養アッセイおよび動物試験を使用して、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な用量）を決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は治療指数であり、これは比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示す二重特異性抗原結合分子が好ましい。一実施形態では、本発明による二重特異性抗原結合分子が高い治療指数を示す。細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータを、ヒトへの使用に適した投与量の範囲を製剤化するのに使用することができる。投与量は、好ましくは毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、種々の因子、例えば使用される剤形、利用される投与経路、対象の状態などに応じて、この範囲内で変化し得る。正確な製剤、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して、個々の医師によって選択され得る（例えば、Ｆｉｎｇｌら、１９７５、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第１章、１頁、全体が参照により本明細書に組み込まれる、参照）。
【０２６５】
本発明の二重特異性抗原結合分子で治療される患者の担当医であれば、毒性、臓器機能不全などにより投与をいつどのように終結、中断または調節するか分かるだろう。逆に、担当医であれば、（毒性を排除しながら）臨床反応が十分でない場合に、治療をより高レベルに調節することも分かっているだろう。目的の障害の管理において投与される用量の大きさは、治療される状態の重症度、投与経路などで変化する。状態の重症度は、例えば、一部は標準的な予後評価方法によって評価され得る。さらに、用量およびもしかすると投与頻度も、個々の患者の年齢、体重および反応によって変化するだろう。
【０２６６】
他の薬剤および治療
本発明の二重特異性抗原結合分子は、療法で１種または複数の他の薬剤と組み合わせて投与され得る。例えば、本発明の融合タンパク質は、少なくとも１種の追加の治療剤と共投与され得る。「治療剤」という用語は、このような治療を必要とする個体の症状または疾患を治療するために投与することができる任意の薬剤を包含する。このような追加の治療剤は、治療している特定の適応症に適した任意の有効成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含み得る。一定の実施形態では、追加の治療剤が別の抗がん剤である。
【０２６７】
このような他の薬剤は、適切には意図した目的に有効な量で組み合わせて存在する。このような他の薬剤の有効量は、使用される融合タンパク質の量、障害または治療の種類、および上で論じられる他の因子に依存する。二重特異性抗原結合分子は、一般的に同じ投与量および本明細書に記載される投与経路で、または本明細書に記載される投与量の約１〜９９％で、または適切であると経験的／臨床的に決定された任意の投与量および任意の経路によって使用される。
【０２６８】
上記のこのような併用療法は、組み合わせ投与（２種以上の治療剤が同じまたは別個の組成物に含まれる）、および別個の投与（この場合、本発明の二重特異性抗原結合分子の投与が、追加の治療剤および／またはアジュバントの投与の前、これと同時および／またはこの後に行われ得る）を包含する。
【０２６９】
製造品
本発明の別の態様では、上記の障害の治療、予防および／または診断に有用な物質を含有する製造品が提供される。製造品は、容器と、容器上のまたは容器に結合したラベルまたは添付文書とを含む。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、注射器、ＩＶ溶液バッグ等が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成され得る。容器は、単独のあるいは状態を治療、予防および／または診断するのに有効な別の組成物と組み合わせた組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針によって穴開け可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は本発明の二重特異性抗原結合分子である。
【０２７０】
ラベルまたは添付文書は、組成物が選択された状態を治療するために使用されることを示す。さらに、製造品は、（ａ）組成物を中に含有する第１の容器であって、組成物が本発明の二重特異性抗原結合分子を含む容器と；（ｂ）組成物を中に含有する第２の容器であって、組成物がさらなる細胞傷害剤または治療剤を含む容器とを含み得る。本発明の実施形態の製造品は、組成物を使用して特定の状態を治療することができることを示す添付文書をさらに含み得る。
【０２７１】
あるいはまたはさらに、製造品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液などの薬学的に許容されるバッファーを含む第２の（または第３の）容器をさらに含んでもよい。これは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針および注射器を含む、商業的観点および使用者観点から望ましい他の物質をさらに含んでもよい。
表C. 配列
2020515262.tif 000004
2020515262.tif 000005
2020515262.tif 000006
2020515262.tif 000007
2020515262.tif 000008
2020515262.tif 000009
2020515262.tif 000010
2020515262.tif 000011
【０２７２】
以下の番号付けされたパラグラフ（パラ）は、本発明の態様を記載する：
１．（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と
を含む二重特異性抗原結合分子。
２．（ｃ）安定に会合することができる第１のサブユニットおよび第２のサブユニットで構成されるＦｃ領域
をさらに含む、パラ１に記載の二重特異性抗原結合分子。
３．ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、配列番号１のアミノ酸配列を含む、またはからなるポリペプチドに結合する、パラ１またはパラ２に記載の二重特異性抗原結合分子。
４．ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分が、配列番号４９のアミノ酸配列を含む、またはからなるポリペプチドに結合する、パラ１から３のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
５．ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、
（ｉ）配列番号４および配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号６および配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、ならびに
（ｉｉｉ）配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨと、
（ｉｖ）配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、ならびに
（ｖｉ）配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５および配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬと
を含む、パラ１から４のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
６．ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３および配列番号４５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４および配列番号４６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む、パラ１から５のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
７．ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、
（ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｉｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｉｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｉｖ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｖ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４２のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｖｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ｖｉｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号４６のアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む、パラ１から６のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
８．ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分が、
（ｉ）アミノ酸配列、配列番号５１を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）アミノ酸配列、配列番号５２を含むＣＤＲ−Ｈ２、および
（ｉｉｉ）アミノ酸配列、配列番号５３を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨと、
（ｉｖ）アミノ酸配列、配列番号５４を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｖ）アミノ酸配列、配列番号５５を含むＣＤＲ−Ｌ２、および
（ｖｉ）アミノ酸配列、配列番号５６を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬと
を含む、パラ１から７のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
９．ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分が、配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む、パラ１から８のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
１０．ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分が、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む、パラ１から９のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
１１．（ｉ）配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３および配列番号４５からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４および配列番号４６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＯＸ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と
を含む、パラ１から１０のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
１２．（ｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＯＸ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号６４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と
を含む、パラ１から１１のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
１３．ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、配列番号２のアミノ酸配列を含む、またはからなるポリペプチドに結合する、パラ１またはパラ２に記載の二重特異性抗原結合分子。
１４．ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分が、配列番号５０のアミノ酸配列を含む、またはからなるポリペプチドに結合する、パラ１、２または１３のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
１５．ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、
（ｉ）アミノ酸配列、配列番号２７を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）アミノ酸配列、配列番号２８を含むＣＤＲ−Ｈ２、および
（ｉｉｉ）アミノ酸配列、配列番号２９を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨと、
（ｉｖ）アミノ酸配列、配列番号３０を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｖ）アミノ酸配列、配列番号３１を含むＣＤＲ−Ｌ２、および
（ｖｉ）アミノ酸配列、配列番号３２を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬと
を含む、パラ１、２、１３または１４のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
１６．ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む、パラ１、２または１３から１５のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
１７．ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む、パラ１、２または１３から１６のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
１８．ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分が、
（ｉ）アミノ酸配列、配列番号５７を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）アミノ酸配列、配列番号５８を含むＣＤＲ−Ｈ２、および
（ｉｉｉ）アミノ酸配列、配列番号５９を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨと、
（ｉｖ）アミノ酸配列、配列番号６０を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｖ）アミノ酸配列、配列番号６１を含むＣＤＲ−Ｌ２、および
（ｖｉ）アミノ酸配列、配列番号６２を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬと
を含む、パラ１、２または１３から１７のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
１９．ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分が、配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む、パラ１、２または１３から１８のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
２０．ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分が、配列番号６５のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む、パラ１、２または１３から１９のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
２１．（ｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＯＸ４０に特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と、
（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と
を含む、パラ１、２または１３から２０のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
２２．Ｆｃ領域がＩｇＧ、特にＩｇＧ１  Ｆｃ領域またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域である、パラ２から２１のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
２３．Ｆｃ領域が、Ｆｃ受容体に対する抗体の結合親和性および／またはエフェクター機能を減少させる１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、パラ２から２２のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
２４．Ｆｃ領域が、（ｉ）アミノ酸突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含むヒトＩｇＧ１サブクラス、または（ｉｉ）アミノ酸突然変異Ｄ２６５ＡおよびＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含むマウスＩｇＧ１サブクラスのものである、パラ２から２３のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
２５．Ｆｃ領域が、Ｆｃ領域の第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む、パラ２から２４のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
２６．ノブ・イントゥ・ホール法に従って、Ｆｃ領域の第１のサブユニットがノブを含み、Ｆｃ領域の第２のサブユニットがホールを含む、パラ２から２５のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
２７．（ｉ）Ｆｃ領域の第１のサブユニットが、アミノ酸置換Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含み、Ｆｃ領域の第２のサブユニットが、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６ＳおよびＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む、または
（ｉｉ）Ｆｃ領域の第１のサブユニットが、アミノ酸置換Ｋ３９２ＤおよびＫ４０９Ｄ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含み、Ｆｃ領域の第２のサブユニットが、アミノ酸置換Ｅ３５６ＫおよびＤ３９９Ｋ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む、
パラ２から２６のいずれか１つに記載の二重特異性抗体。
２８．（ａ）Ｆｃ領域に接続されたＯＸ４０に特異的に結合することができる少なくとも２つのＦａｂ断片と、
（ｂ）Ｆｃ領域のＣ末端に接続されたＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる少なくとも１つの部分と
を含む、パラ１から２７のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
２９．（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片およびＦｃ領域を含む抗体の２つの軽鎖および２つの重鎖と、
（ｂ）ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分のＶＨおよびＶＬであって、ＶＨが（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されており、ＶＬが（ａ）の２つの重鎖の他方のＣ末端に接続されているＶＨおよびＶＬと
を含む、パラ１から２８のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
３０．（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片およびＦｃ領域を含む抗体の２つの軽鎖および２つの重鎖と、
（ｂ）ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片であって、Ｆａｂ断片の一方が（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されており、Ｆａｂ断片の他方が（ａ）の２つの重鎖の他方のＣ末端に接続されている、２つのＦａｂ断片と
を含む、パラ１から２９のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
３１．（ａ）各重鎖がＯＸ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＨおよびＣＨ１ドメインならびにＦｃ領域サブユニットを含む、２つの重鎖と、
（ｂ）各軽鎖がＯＸ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＬおよびＣＬドメインを含む、２つの軽鎖と、
（ｃ）ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる部分のＶＨおよびＶＬであって、ＶＨが（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されており、ＶＬが（ａ）の２つの重鎖の他方のＣ末端に接続されている、ＶＨおよびＶＬと
を含む、パラ１から３０のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
３２．（ａ）各重鎖がＯＸ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＨおよびＣＨ１ドメインならびにＦｃ領域サブユニットを含む、２つの重鎖と、
（ｂ）各軽鎖がＯＸ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片のＶＬおよびＣＬドメインを含む、２つの軽鎖と、
（ｃ）ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片であって、Ｆａｂ断片の一方が（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されており、Ｆａｂ断片の他方が（ａ）の２つの重鎖の他方のＣ接続に結合している、２つのＦａｂ断片と
を含む、パラ１から２８またはパラ３０のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
３３．ＥｐＣＡＭに特異的に結合することができる２つのＦａｂ断片が、各々がＶＬ−ＣＨ１鎖およびＶＨ−ＣＬ鎖を含み、ＶＬ−ＣＨ１鎖の一方が（ａ）の２つの重鎖の一方のＣ末端に接続されており、ＶＬ−ＣＨ１鎖の他方が（ａ）の２つの重鎖の他方のＣ末端に接続されている、クロスオーバーＦａｂ断片である、パラ３０またはパラ３２に記載の二重特異性抗原結合分子。
３４．ＯＸ４０に特異的に結合することができる４つのＦａｂ断片を含む、パラ１から３３のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
３５．（ａ）の２つの重鎖の各々が、ＯＸ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片の２つのＶＨドメインおよび２つのＣＨ１ドメインを含む、パラ２９から３４のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
３６．ＯＸ４０に特異的に結合することができるＦａｂ断片の１つまたは複数が、
１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸のアルギニン（Ｒ）および１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸のリジン（Ｋ）を含むＣＬドメインと、
１４７位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸のグルタミン酸（Ｅ）および２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸のグルタミン酸（Ｅ）を含むＣＨ１ドメインと
を含む、パラ２８から３５のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子。
３７．配列番号１８３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、
配列番号１８４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、
各々が配列番号１８２のアミノ酸配列を含む、４つの軽鎖と
を含む二重特異性抗原結合分子。
３８．各々が配列番号１８６のアミノ酸配列を含む、２つの重鎖と、
各々が配列番号１８７のアミノ酸配列を含む、２つの軽鎖と、
各々が配列番号１８５のアミノ酸配列を含む、４つの軽鎖と
を含む二重特異性抗原結合分子。
３９．配列番号１９２のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、
配列番号１９３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、
各々が配列番号１９１のアミノ酸配列を含む、４つの軽鎖と
を含む二重特異性抗原結合分子。
４０．パラ１から３９のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド。
４１．パラ４０に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
４２．パラ４０に記載のポリヌクレオチドまたはパラ４１に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
４３．二重特異性抗原結合分子を作製する方法であって、パラ４２に記載の宿主細胞を、二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で培養することと、二重特異性抗原結合分子を単離することとを含む方法。
４４．パラ１から３９のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子と、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物。
４５．医薬として使用するための、パラ１から３９のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子またはパラ４４に記載の薬学的組成物。
４６．（ｉ）Ｔ細胞応答の刺激、
（ｉｉ）活性化Ｔ細胞の生存の支持、
（ｉｉｉ）感染症の治療、
（ｉｖ）がんの治療、
（ｖ）がんの進行の遅延、または
（ｖｉ）がんを患っている患者の生存の延長
に使用するための、パラ１から３９のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子またはパラ４４に記載の薬学的組成物。
４７．がんの治療に使用するための、パラ１から３９のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子またはパラ４４に記載の薬学的組成物。
４８．がんを治療するための医薬の製造における、パラ１から３９のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子またはパラ４４に記載の薬学的組成物の使用。
４９．がんを有する個体を治療する方法であって、有効量のパラ１から３９のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子またはパラ４４に記載の薬学的組成物を個体に投与することを含む方法。
５０．細胞傷害性Ｔ細胞活性を上方制御または延長するのに使用するための、パラ１から３９のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子またはパラ４４に記載の薬学的組成物。
５１．細胞傷害性Ｔ細胞活性を上方制御または延長するための医薬の製造における、パラ１から３９のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子またはパラ４４に記載の薬学的組成物の使用。
５２．がんを有する個体の細胞傷害性Ｔ細胞活性を上方制御または延長する方法であって、有効量のパラ１から３９のいずれか１つに記載の二重特異性抗原結合分子またはパラ４４に記載の薬学的組成物を個体に投与することを含む方法。
【実施例】
【０２７３】
以下は、本発明の方法および組成物の例である。上に提供される一般的な説明を考慮すると、種々の他の実施形態を行うことができることが理解される。
【０２７４】
組換えＤＮＡ技術
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク、１９８９に記載されるように、標準的な方法を使用してＤＮＡを操作した。製造業者の指示に従って分子生物学試薬を使用した。ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  番号９１−３２４２に示される。
【０２７５】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列を二本鎖配列決定によって決定した。
【０２７６】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントを、適切な鋳型を使用してＰＣＲによって作製した、または自動化遺伝子合成によって合成オリゴヌクレオチドおよびＰＣＲ産物からＧｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ）によって合成した。正確な遺伝子配列が入手可能でない場合、オリゴヌクレオチドプライマーを最も近いホモログからの配列に基づいて設計し、遺伝子を、適切な組織に由来するＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって単離した。単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位が隣接した遺伝子セグメントを標準的クローニング／配列決定ベクターにクローニングした。プラスミドＤＮＡを形質転換細菌から精製し、濃度をＵＶ分光法によって決定した。サブクローニング遺伝子断片のＤＮＡ配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントを適切な制限部位を用いて設計して、それぞれの発現ベクターへのサブクローニングを可能にした。全てのコンストラクトを、真核細胞中で分泌するためのタンパク質を標的化するリーダーペプチドをコードする５’末端ＤＮＡ配列を用いて設計した。
【０２７７】
タンパク質精製
タンパク質を、標準的なプロトコルを参照して濾過細胞培養物上清から精製した。手短に述べれば、抗体をプロテインＡセファロースカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライし、ＰＢＳで洗浄した。抗体の溶出をｐＨ２．８で達成し、引き続いて直ちに試料を中和した。凝集タンパク質を、ＰＢＳまたは２０ｍＭ  ヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．０中、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によってモノマー抗体から分離した。モノマー抗体画分をプールし、例えばＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（３０ＭＷＣＯ）遠心濃縮機を使用して濃縮し（必要であれば）、冷凍し、−２０℃または−８０℃で保存した。試料の一部を、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）または質量分析によるその後のタンパク質分析および分析特徴づけに供した。
【０２７８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
製造業者の指示に従って、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。特に、１０％または４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ−ＴＲＩＳ  Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）およびＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ泳動バッファー添加剤を含む）またはＭＯＰＳ（非還元ゲル）泳動バッファーを使用した。
【０２７９】
分析サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集およびオリゴマー状態を決定するためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）をＨＰＬＣクロマトグラフィーによって行った。手短に述べれば、プロテインＡ精製抗体を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ  １１００システムで、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．５中Ｔｏｓｏｈ  ＴＳＫゲル  Ｇ３０００ＳＷカラムに、またはＤｉｏｎｅｘ  ＨＰＬＣ−Ｓｙｓｔｅｍで２×ＰＢＳ中Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライした。溶出タンパク質を、ＵＶ吸光度またはピーク面積の積分によって定量化した。ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  １５１−１９０１が標準として役立った。
【０２８０】
実施例１
ＯＸ４０抗体の作製
１．１  抗原の調製、精製および特徴づけ、ならびにファージディスプレイによる新規なＯＸ４０バインダーの作製のためのスクリーニングツール
ヒト、マウスまたはカニクイザルＯＸ４０の外部ドメイン（表１）をコードするＤＮＡ配列を、ノブ上のヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２およびＣＨ３ドメインとインフレームでサブクローニングした（Ｍｅｒｃｈａｎｔら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９８）１６、６７７〜６８１）。ＡｃＴＥＶプロテアーゼ切断部位を抗原外部ドメインとヒトＩｇＧ１のＦｃとの間に導入した。指示されたビオチン化用のＡｖｉタグを抗原ＦｃノブのＣ末端に導入した。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異を含む抗原−Ｆｃノブ鎖と、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異を含むＦｃホール鎖を組み合わせることによって、ＯＸ４０外部ドメイン含有鎖の単一コピーを含むヘテロ二量体を作製し、よってＦｃ−結合抗原のモノマー型を作り出すことが可能になる（図１）。表１は、種々のＯＸ４０外部ドメインのアミノ酸配列を示す。表２は、図１に描かれるモノマー抗原Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列である。
表1.抗原外部ドメイン(ECD)のアミノ酸番号付けおよびその起源
2020515262.tif 000012
表2. モノマー抗原Fc(kih)融合分子(1つのFcホール鎖と1つの抗原Fcノブ鎖の組み合わせによって作製)のcDNAおよびアミノ酸配列
2020515262.tif 000013
2020515262.tif 000014
2020515262.tif 000015
2020515262.tif 000016
【０２８１】
全てのＯＸ４０−Ｆｃ−融合体コード配列を、ＭＰＳＶプロモーターからのインサートの発現を駆動し、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡシグナル配列を含むプラスミドベクターにクローニングした。さらに、ベクターは、プラスミドのエピソーム維持のためのＥＢＶ  ＯｒｉＰ配列を含んでいた。
【０２８２】
ビオチン化モノマー抗原／Ｆｃ融合分子を調製するために、指数関数的に増殖する懸濁ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞に、融合タンパク質の２つの成分（ノブ鎖およびホール鎖）ならびにＢｉｒＡ、ビオチン化反応に必要な酵素をコードする３つのベクターをコトランスフェクトした。対応するベクターを２：１：０．０５比（「抗原ＥＣＤ−ＡｃＴＥＶ−Ｆｃノブ」：「Ｆｃホール」：「ＢｉｒＡ」）で使用した。
【０２８３】
５００ｍｌ振盪フラスコ中でのタンパク質産生のために、４億個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を、トランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｇで５分間遠心分離し、上清を、予熱したＣＤ  ＣＨＯ培地と交換した。発現ベクターを、２００μｇのベクターＤＮＡを含む２０ｍＬのＣＤ  ＣＨＯ培地に再懸濁した。５４０μＬのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を添加した後、溶液を１５秒間ボルテックスし、室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞をＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬ振盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気でインキュベーター中、３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、１６０ｍＭのＦ１７培地を添加し、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの１日後、１ｍＭバルプロ酸および７％フィードを培養物に添加した。７日間の培養後、細胞上清を、細胞を２１０ｇで１５分間スピンダウンすることによって回収した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍフィルター）、アジ化ナトリウムを補足して最終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）にし、４℃で維持した。
【０２８４】
分泌タンパク質を、プロテインＡを使用したアフィニティークロマトグラフィー、引き続いてサイズ排除クロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、４０ｍＭ  ２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム  ｐＨ７．５で平衡化したＨｉＴｒａｐ  プロテインＡ  ＨＰカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。少なくとも１０カラム体積の２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウムおよび０．５Ｍクエン酸ナトリウムを含有するバッファー（ｐＨ７．５）で洗浄することによって、未結合タンパク質を除去した。２０カラム体積の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ３．０に対して作り出された線形ｐＨ勾配の塩化ナトリウム（０〜５００ｍＭ）を使用して、結合タンパク質を溶出した。次いで、１０カラム体積の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウムおよび０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する溶液、ｐＨ３．０でカラムを洗浄した。
【０２８５】
１／４０（ｖ／ｖ）の２Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０を添加することによって、回収した画分のｐＨを調整した。タンパク質を濃縮し、ｐＨ７．４の２ｍＭ  ＭＯＰＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム溶液で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードする前に濾過した。
【０２８６】
１．２  一般的Ｆａｂおよび一般的軽鎖ライブラリーからのＯＸ４０特異的８Ｈ９、２０Ｂ７、４９Ｂ４、１Ｇ４、ＣＬＣ−５６３、ＣＬＣ−５６４および１７Ａ９抗体の選択
抗ＯＸ４０抗体を、３つの異なる一般的ファージディスプライライブラリー：ＤＰ８８−４（クローン２０Ｂ７、８Ｈ９  １Ｇ４および４９Ｂ４）、一般的軽鎖ライブラリーＶｋ３＿２０／ＶＨ３＿２３（クローンＣＬＣ−５６３およびＣＬＣ−５６４）およびλ−ＤＰ４７（クローン１７Ａ９）から選択した。
【０２８７】
軽鎖のＣＤＲ３（Ｌ３、３つの異なる長さ）および重鎖のＣＤＲ３（Ｈ３、３つの異なる長さ）にランダム化配列スペースを含むＶドメインペアリングＶｋ１＿５（κ軽鎖）とＶＨ１＿６９（重鎖）を使用して、ヒト生殖系列遺伝子に基づいて、Ｄ８８−４ライブラリーを構築した。重複伸長によるスプライシング（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）（ＳＯＥ）ＰＣＲを適用して３つのＰＣＲ増幅断片の組み立てによってライブラリー作製を行った。断片１はランダム化Ｌ３を含む抗体遺伝子の５’末端を含み、断片２はＬ３からＨ３に広がる中心定常断片であるが、断片３はランダム化Ｈ３および抗体遺伝子の３’部分を含む。以下のプライマー組み合わせを使用して、ＤＰ８８−４ライブラリーのためにこれらのライブラリー断片を作製した：それぞれ、断片１（逆方向プライマーＶｋ１＿５＿Ｌ３ｒ＿ＳまたはＶｋ１＿５＿Ｌ３ｒ＿ＳＹまたはＶｋ１＿５＿Ｌ３ｒ＿ＳＰＹと組み合わせた順方向プライマーＬＭＢ３）、断片２（逆方向プライマーＲＪＨ３２と組み合わせた順方向プライマーＲＪＨ３１）および断片３（逆方向プライマーｆｄｓｅｑｌｏｎｇと組み合わせた順方向プライマーＤＰ８８−ｖ４−４またはＤＰ８８−ｖ４−６またはＤＰ８８−ｖ４−８）。ライブラリー断片を作製するためのＰＣＲパラメータは、９４℃で５分間の初期変性、２５サイクルの９４℃で１分、５８℃で１分、７２℃で１分および７２℃で１０分間の末端伸長とした。アセンブリーＰＣＲのために、鋳型として等モル比のゲル精製単一断片を使用して、パラメータを９４℃で３分間の初期変性および５サイクルの９４℃で３０秒間、５８℃で１分間、７２℃の２分間とした。この段階で、外側プライマー（ＬＭＢ３およびｆｄｓｅｑｌｏｎｇ）を添加し、７２℃で１０分間の末端伸長前に追加の２０サイクルを行った。十分な量の完全長ランダム化Ｆａｂコンストラクトの組み立て後、これらをＮｃｏＩ／ＮｈｅＩ消化し、同様に処理したアクセプターファージミドベクターに連結した。精製したライゲーションを、約６０回のエレクトロコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１への形質転換に使用した。Ｆａｂライブラリーを提示するファージミド粒子をレスキューし、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製によって精製して選択に使用した。これらのライブラリー構築ステップを３回繰り返して、最終ライブラリーサイズ４．４×１０９を得た。ドットブロットでＣ末端タグ検出によって決定される機能的クローンの割合は、それぞれ軽鎖については９２．６％および重鎖については９３．７％であった。
【０２８８】
定常非ランダム化一般的軽鎖Ｖｋ３＿２０および重鎖（Ｈ３、３つの異なる長さ）のＣＤＲ３のランダム化配列スペースを含むＶドメインペアリングＶｋ３＿２０（κ軽鎖）とＶＨ３＿２３（重鎖）を使用して、ヒト生殖系列遺伝子に基づいて、一般的軽鎖ライブラリーＶｋ３＿２０／ＶＨ３＿２３を構築した。重複伸長によるスプライシング（ＳＯＥ）ＰＣＲを適用して２つのＰＣＲ増幅断片の組み立てによってライブラリー作製を行った。断片１はＬ３からＨ３に広がる定常断片であるが、断片２はランダム化Ｈ３および抗体遺伝子の３’部分を含む。以下のプライマー組み合わせを使用して、Ｖｋ３＿２０／ＶＨ３＿２３一般的軽鎖ライブラリーのためにこれらのライブラリー断片を作製した：それぞれ、断片１（逆方向プライマーＤＰ４７ＣＤＲ３＿ｂａ（ｍｏｄ．）と組み合わせた順方向プライマーＭＳ６４）および断片２（逆方向プライマーｆｄｓｅｑｌｏｎｇと組み合わせた順方向プライマーＤＰ４７−ｖ４−４、ＤＰ４７−ｖ４−６、ＤＰ４７−ｖ４−８）。ライブラリー断片を作製するためのＰＣＲパラメータは、９４℃で５分間の初期変性、２５サイクルの９４℃で１分、５８℃で１分、７２℃で１分および７２℃で１０分間の末端伸長とした。アセンブリーＰＣＲのために、鋳型として等モル比のゲル精製単一断片を使用して、パラメータを９４℃で３分間の初期変性および５サイクルの９４℃で３０秒間、５８℃で１分間、７２℃の２分間とした。この段階で、外側プライマー（ＭＳ６４およびｆｄｓｅｑｌｏｎｇ）を添加し、７２℃で１０分間の末端伸長前に追加の１８サイクルを行った。十分な量の完全長ランダム化ＶＨコンストラクトの組み立て後、これらをＭｕｎＩ／ＮｏｔＩ消化し、同様に処理したアクセプターファージミドベクターに連結した。精製したライゲーションを、約６０回のエレクトロコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１への形質転換に使用した。Ｆａｂライブラリーを提示するファージミド粒子をレスキューし、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製によって精製して選択に使用した。最終ライブラリーサイズ３．７５×１０９を得た。ドットブロットでＣ末端タグ検出によって決定される機能的クローンの割合は、それぞれ軽鎖については９８．９％および重鎖については８９．５％であった。
【０２８９】
以下のＶドメインペアリング：Ｖｌ３＿１９λ軽鎖とＶＨ３＿２３重鎖を使用して、ヒト生殖系列遺伝子に基づいて、λ−ＤＰ４７ライブラリーを構築した。ライブラリーを軽鎖（Ｌ３）のＣＤＲ３および重鎖（Ｈ３）のＣＤＲ３にランダム化し、「重複伸長によるスプライシング」（ＳＯＥ）ＰＣＲによって３つの断片から組み立てた。断片１はランダム化Ｌ３を含む抗体遺伝子の５’末端を含み、断片２はＬ３の末端からＨ３の始まりまで広がる中心定常断片であるが、断片３はランダム化Ｈ３およびＦａｂ断片の３’部分を含む。以下のプライマー組み合わせを使用して、ライブラリーのためにライブラリー断片を作製した：それぞれ、断片１（ＬＭＢ３−Ｖｌ＿３＿１９＿Ｌ３ｒ＿Ｖ／Ｖｌ＿３＿１９＿Ｌ３ｒ＿ＨＶ／Ｖｌ＿３＿１９＿Ｌ３ｒ＿ＨＬＶ）、断片２（ＲＪＨ８０−ＤＰ４７ＣＤＲ３＿ｂａ（ｍｏｄ））および断片３（ＤＰ４７−ｖ４−４／ＤＰ４７−ｖ４−６／ＤＰ４７−ｖ４−８−ｆｄｓｅｑｌｏｎｇ）。ライブラリー断片を作製するためのＰＣＲパラメータは、９４℃で５分間の初期変性、２５サイクルの９４℃で６０秒間、５５℃で６０秒間、７２℃で６０秒間および７２℃で１０分間の末端伸長とした。アセンブリーＰＣＲのために、鋳型として等モル比の３つの断片を使用して、パラメータを９４℃で３分間の初期変性および５サイクルの９４℃で６０秒間、５５℃で６０秒間、７２℃の１２０秒間とした。この段階で、外側プライマーを添加し、７２℃で１０分間の末端伸長前に追加の２０サイクルを行った。十分な量の完全長ランダム化Ｆａｂ断片の組み立て後、これらを、同様に処理したアクセプターファージミドベクターと並んでＮｃｏＩ／ＮｈｅＩ消化した。１５μｇのＦａｂライブラリーインサートを１３．３μｇのファージミドベクターと連結した。精製したライゲーションを６０回の形質転換に使用して、１．５×１０９個の形質転換体を得た。Ｆａｂライブラリーを提示するファージミド粒子をレスキューし、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製によって精製して選択に使用した。
【０２９０】
ファージディスプレイ選択のための抗原としてのヒトＯＸ４０（ＣＤ１３４）を、ＨＥＫ  ＥＢＮＡ細胞中でＮ末端モノマーＦｃ融合体として一過的に発現させ、受容体鎖（Ｆｃノブ鎖）を有するＦｃ部分のＣ末端に位置するａｖｉ−タグ認識配列でＢｉｒＡビオチンリガーゼの共発現を介してインビボで部位特異的にビオチン化した。
【０２９１】
選択ラウンド（バイオパニング）を、以下のパターンに従って溶液中で行った：
１．１０μｇ／ｍｌの非関連ヒトＩｇＧでコーティングしたｍａｘｉｓｏｒｐプレート上で約１０１２個のファージミド粒子を事前洗浄して、抗原のＦｃ部分を認識する抗体のライブラリーを枯渇させる、
２．総体積１ｍｌでＦｃバインダーをさらに枯渇させるために１００ｍＭ非関連非ビオチン化Ｆｃノブ・イントゥ・ホールコンストラクトの存在下で、非結合ファージミド粒子を１００ｎＭビオチン化ヒトＯＸ４０と０．５時間インキュベートする、
３．ビオチン化ｈｕＯＸ４０を捕捉し、４ウェルのニュートラアビジンプレコーティングマイクロタイタープレートに１０分間移すことによって結合ファージに特異的に結合させる（ラウンド１および３）、
４．５×ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０および５×ＰＢＳを使用してそれぞれのウェルを洗浄する、
５．１ウェル当たり２５０μｌの１００ｍＭ  ＴＥＡ（トリエチルアミン）を添加し１０分間置くことによって、ファージ粒子を溶出し、５００μｌ  １Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．４を４つのウェルのプールした溶出液に添加することによって中和する、
６．Ｆｃバインダーを最終的に除去するために、１００ｎＭビオチン捕捉Ｆｃノブ・イントゥ・ホールコンストラクトとニュートラアビジンプレコーティングマイクロタイタープレートをインキュベートすることによって、中和溶出液を後洗浄する、
７．対数期の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１細胞を溶出ファージ粒子の上清で再感染させ、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３で感染させ、３０℃で一晩、振盪機上でインキュベートし、その後ファージミド粒子をＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿させて次の選択ラウンドに使用する。
【０２９２】
１００ｎＭの一定抗原濃度を使用して、３または４ラウンドにわたって選択を行った。カニクイザルＯＸ４０だけでなく、マウスＯＸ４０にも交差反応性であるバインダーの可能性を増加させるために、いくつかの選択ラウンドで、ヒトＯＸ４０の代わりにマウス標的を使用した。ラウンド２および４で、ニュートラアビジンに対するバインダーの濃縮を回避するために、５．４×１０７個のストレプトアビジンコーティング磁気ビーズを添加することによって、抗原：ファージ複合体の捕捉を行った。以下の通り、ＥＬＩＳＡによって特異的バインダーを同定した：１００μｌの２５ｎＭビオチン化ヒトＯＸ４０および１０μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧを、それぞれニュートラアビジンプレートおよびｍａｘｉｓｏｒｐプレート上にコーティングした。Ｆａｂ含有細菌上清を添加し、結合Ｆａｂを、抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を使用してＦｌａｇ−タグを介して検出した。ヒトＯＸ４０上でシグナルを示し、ヒトＩｇＧ上で陰性のクローンをさらなる分析のための候補一覧に入れ、カニクイザルおよびマウスＯＸ４０に対しても同様に試験した。これらを０．５ｌ培養体積で細菌的に発現させ、親和性精製し、Ｂｉｏ  ＲａｄのＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６バイオセンサーを使用してＳＰＲ分析によってさらに特徴を明らかにした。
【０２９３】
表３は一般的ファージディスプレイ抗体ライブラリー（ＤＰ８８−４）の配列を示し、表４はライブラリーＤＰ８８−４生殖系列鋳型のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列を提供し、表５はＤＰ８８−４生殖系列鋳型を作製するために使用したプライマー配列を示す。
表3. 一般的ファージディスプレイ抗体ライブラリー(DP88-4)の配列
2020515262.tif 000017
表4. ライブラリーDP88-4生殖系列鋳型のcDNAおよびアミノ酸配列
2020515262.tif 000018
2020515262.tif 000019
表5. DP88-4ライブラリーを作製するために使用したプライマー配列
2020515262.tif 000020
2020515262.tif 000021
【０２９４】
表６は一般的ファージディスプレイ抗体一般的軽鎖ライブラリー（Ｖｋ３＿２０／ＶＨ３＿２３）の配列を示す。表７は一般的軽鎖ライブラリー（Ｖｋ３＿２０／ＶＨ３＿２３）生殖系列鋳型のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列を提供し、表８は一般的軽鎖ライブラリー（Ｖｋ３＿２０／ＶＨ３＿２３）を作製するために使用したプライマー配列を示す。
表6. PCRに使用した一般的ファージディスプレイ抗体一般的軽鎖ライブラリー(Vk3_20/VH3_23)鋳型の配列
2020515262.tif 000022
表7. 一般的軽鎖ライブラリー(Vk3_20/VH3_23)生殖系列鋳型のcDNAおよびアミノ酸配列
2020515262.tif 000023
2020515262.tif 000024
表8. 一般的軽鎖ライブラリー(Vk3_20/VH3_23)を作製するために使用したプライマー配列
2020515262.tif 000025
【０２９５】
表９はＰＣＲに使用した一般的ファージディスプレイλ−ＤＰ４７ライブラリー（Ｖｌ３＿１９／ＶＨ３＿２３）鋳型の配列を示す。表１０はλ−ＤＰ４７ライブラリー（Ｖｌ３＿１９／ＶＨ３＿２３）生殖系列鋳型のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列を提供し、表１１はλ−ＤＰ４７ライブラリー（Ｖｌ３＿１９／ＶＨ３＿２３）を作製するために使用したプライマー配列を示す。
表9: PCRに使用した一般的ファージディスプレイλ-DP47ライブラリー(Vl3_19/VH3_23)鋳型の配列
2020515262.tif 000026
表10. λ-DP47ライブラリー(Vl3_19/VH3_23)生殖系列鋳型のcDNAおよびアミノ酸配列
2020515262.tif 000027
表11. λ-DP47ライブラリー(Vl3_19/VH3_23)を作製するために使用したプライマー配列
2020515262.tif 000028
【０２９６】
λ−ＤＰ４７ライブラリーを構築するために使用した追加のプライマー、すなわちＤＰ４７ＣＤＲ３＿ｂａ（ｍｏｄ．）、ＤＰ４７−ｖ４−４、ＤＰ４７−ｖ４−６、ＤＰ４７−ｖ４−８およびｆｄｓｅｑｌｏｎｇは、一般的軽鎖ライブラリー（Ｖｋ３＿２０／ＶＨ３＿２３）を構築するために使用したプライマーと同一であり、表８で既に列挙している。
【０２９７】
クローン８Ｈ９、２０Ｂ７、４９Ｂ４、１Ｇ４、ＣＬＣ−５６３、ＣＬＣ−５６４および１７Ａ９は、上記の手順を通してヒトＯＸ４０特異的バインダーとして同定された。これらの可変領域のｃＤＮＡ配列を以下の表１２に示し、対応するアミノ酸配列を表Ｃに見出すことができる。
表12. ファージ誘導抗OX40抗体についての可変領域塩基対配列。下線は相補性決定領域(CDR)である。
2020515262.tif 000029
2020515262.tif 000030
2020515262.tif 000031
【０２９８】
１．３  抗ＯＸ４０  ＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ抗体の調製、精製および特徴づけ
選択された抗ＯＸ４０バインダーの重鎖および軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、ヒトＩｇＧ１の定常重鎖または定常軽鎖とインフレームでサブクローニングした。Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４ＡｌａおよびＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異を、国際特許出願公開第２０１２／１３０８３１号に記載される方法に従って、ノブおよびホール重鎖の定常領域に導入してＦｃγ受容体への結合を抑止した。
【０２９９】
抗ＯＸ４０クローンのｃＤＮＡおよびアミノ酸配列を表１３に示す。全ての抗ＯＸ４０−Ｆｃ融合体コード配列を、ＭＰＳＶプロモーターからのインサートの発現を駆動し、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡシグナル配列を含むプラスミドベクターにクローニングした。さらに、ベクターは、プラスミドのエピソーム維持のためのＥＢＶ  ＯｒｉＰ配列を含む。
表13. P329GLALAヒトIgG1フォーマットにおける抗OX40クローンの配列
2020515262.tif 000032
2020515262.tif 000033
2020515262.tif 000034
2020515262.tif 000035
2020515262.tif 000036
2020515262.tif 000037
2020515262.tif 000038
2020515262.tif 000039
2020515262.tif 000040
【０３００】
ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に、ポリエチレンイミンを使用して哺乳動物発現ベクターをコトランスフェクトすることによって、抗ＯＸ４０抗体を作製した。細胞に、１：１比（「ベクター重鎖」：「ベクター軽鎖」）で対応する発現ベクターをトランスフェクトした。
【０３０１】
５００ｍｌ振盪フラスコ中での産生のために、４億個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を、トランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０×ｇで５分間遠心分離し、上清を、予熱したＣＤ  ＣＨＯ培地と交換した。発現ベクター（２００μｇの総ＤＮＡ）を、２０ｍＬのＣＤ  ＣＨＯ培地中で混合した。５４０μＬのＰＥＩを添加した後、溶液を１５秒間ボルテックスし、室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞をＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬ振盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気でインキュベーター中、３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、１６０ｍＭのＦ１７培地を添加し、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの１日後、１ｍＭバルプロ酸および補足物を含む７％フィードを添加した。７日間の培養後、上清を２１０×ｇで１５分間の遠心分離によって回収した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍフィルター）、アジ化ナトリウムを補足して最終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）にし、４℃で維持した。
【０３０２】
抗原Ｆｃ融合体の精製について上記のプロテインＡを使用して、細胞培養上清からの抗体分子の精製をアフィニティークロマトグラフィーによって行った。
【０３０３】
タンパク質を濃縮し、２０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．０の１４０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードする前に濾過した。
【０３０４】
アミノ酸配列に基づいて計算したモル吸光係数を使用して、２８０ｎｍでＯＤを測定することによって、精製抗体のタンパク質濃度を決定した。ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を使用して、還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）の存在および非存在下で、ＣＥ−ＳＤＳによって抗体の純度および分子量を分析した。２５℃で２５ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  Ｌ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ６．７泳動バッファーで平衡化したＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ  ＸＬ分析サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を使用して、抗体試料の凝集体含量を分析した。
【０３０５】
表１４は、抗ＯＸ４０  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ  ＩｇＧ１抗体の収量および最終含量を要約している。
表14: 抗OX40 P329G LALA IgG1クローンの生化学分析
2020515262.tif 000041
【０３０６】
実施例２
ＯＸ４０および上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を標的化する二重特異性抗体の作製
２．１  ヒトＯＸ４０およびヒト上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を標的化する二重特異性抗体の作製
ＯＸ４０についての四価結合およびＥｐＣＡＭについての一価結合を有する二重特異性アゴニストＯＸ４０コンストラクト（すなわち、「４＋１」コンストラクト）を調製した。
【０３０７】
この例では、抗原結合分子は、抗ＯＸ４０  ４９Ｂ４  Ｆｃノブ（Ｐ３２９Ｇ／ＬＡＬＡ）のＶＨＣＨ１＿ＶＨＣＨ１、引き続いて（Ｇ４Ｓ）４リンカーおよび抗ＥｐＣＡＭ抗体クローン３−１７ｌのＶＬを含む第１の重鎖（ＨＣ１）と；抗ＯＸ４０  ４９Ｂ４  Ｆｃホール（Ｐ３２９Ｇ／ＬＡＬＡ）のＶＨＣＨ１＿ＶＨＣＨ１、引き続いて（Ｇ４Ｓ）４リンカーおよび抗ＥｐＣａｍ３−１７ｌのＶＨを含む第２の重鎖（ＨＣ２）とを含んでいた。
【０３０８】
抗ＥｐＣＡＭ抗体３−１７ｌの作製は、例えば国際公開第２０１０１４２９９０号に記載されている。ｓｃＦｖの３−１７ｌおよびＩｇＧ１フォーマットについてのヌクレオチドおよびアミノ酸配列（ならびにそのＶＨおよびＶＬ配列）は、例えば国際公開第２０１０１４２９９０号の表１および図１で開示されている。
【０３０９】
ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば米国特許第５，７３１，１６８号および米国特許第７，６９５，９３６号に記載されており、ＨＣ１およびＨＣ２の組み立てを可能にする。国際特許出願公開第２０１２／１３０８３１号に記載されている方法に従って、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４ＡｌａおよびＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異を重鎖の定常領域に導入してＦｃγ受容体への結合を抑止した。
【０３１０】
重鎖融合ポリペプチドＨＣ１およびＨＣ２を、抗ＯＸ４０クローン４９Ｂ４の軽鎖（ＣＬＶＬ）と共発現して、ＯＸ４０についての四価結合およびＥｐＣＡＭについての一価結合を有する分子（すなわち、「４＋１」コンストラクト）を作製した。図２Ａを参照されたい。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ表１５および表１６に示す。
【０３１１】
ＯＸ４０についての四価結合およびＥｐＣＡＭについての二価結合を有する二重特異性アゴニストＯＸ４０コンストラクト（すなわち、「４＋２」コンストラクト）も調製した。
【０３１２】
４＋２コンストラクトについては、重鎖は、抗ＯＸ４０  ４９Ｂ４＿Ｆｃ（Ｐ３２９Ｇ／ＬＡＬＡ）のＶＨＣＨ１＿ＶＨＣＨ１、引き続いて（Ｇ４Ｓ）４リンカーおよびＦｃのＣ末端に融合したＥｐＣＡＭ結合抗体３−１７ｌの交差Ｆａｂユニット（ＶＬＣＨ１）を含む。重鎖融合ポリペプチドを抗ＯＸ４０クローン４９Ｂ４（ＣＬＶＬ）の軽鎖（ＬＣ１）と共発現した。抗ＯＸ４０  ＦａｂのＣＨおよびＣＬは、Ｂｅｎｃｅ  Ｊｏｎｅｓタンパク質の産生を防ぎ、ＬＣ１とＨＣの正しいペアリングをさらに安定化するための荷電残基を含んでいた。具体的には、置換Ｅ１２３ＲおよびＱ１２４Ｋ（ＥＵ番号付けによる残基）を、ＯＸ４０（４９Ｂ４）ＶＬＣＬ軽鎖のＣＬドメイン中に作り出し、軽鎖配列、配列番号１８５を得た；また置換Ｋ１４７ＥおよびＫ２１３Ｅ（ＥＵ番号付けによる残基）を、ＯＸ４０（４９Ｂ４）のＣＨ１ドメイン中に作り出し、重鎖配列、配列番号１８６を得た。
【０３１３】
この場合、両ＨＣは同じドメインを含むので、ノブをホールに導入することが必要でなかった。重鎖融合ポリペプチドおよびＬＣ１ポリペプチドを、抗ＥｐＣＡＭ結合クローン３−１７ｌのＶＨおよびＣＬをコードするポリペプチドと共発現させた。
【０３１４】
ＯＸ４０についての四価結合およびＥｐＣＡＭについての二価結合有する得られた分子（すなわち、「４＋２」コンストラクト）を図２Ｂに示す。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ表１５および表１６に示す。
表15. 成熟二重特異性、四価抗OX40、一価および二価抗EpCAM huIgG1 P329GLALA分子の塩基対配列
2020515262.tif 000042
2020515262.tif 000043
2020515262.tif 000044
2020515262.tif 000045
2020515262.tif 000046
2020515262.tif 000047
2020515262.tif 000048
表16. 成熟二重特異性、四価抗OX40、一価および二価抗EpCAM huIgG1 P329GLALA分子のアミノ酸配列
2020515262.tif 000049
2020515262.tif 000050
【０３１５】
２．２  マウスＯＸ４０およびマウス上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を標的化する二重特異性抗体の作製
マウスＯＸ４０についての四価結合およびマウスＥｐＣＡＭについての一価結合を有する二重特異性コンストラクト（すなわち、「４＋１」コンストラクト）も調製した。
【０３１６】
この例では、抗原結合分子が、抗マウスＯＸ４０抗体クローンＯＸ８６Ｆｃノブ（ＤＡＰＧ）のＶＨＣＨ１＿ＶＨＣＨ１、引き続いて（Ｇ４Ｓ）４リンカーおよび抗マウスＥｐＣＡＭ抗体クローンＧ８．８のＶＬを含む第１の重鎖（ＨＣ１）と；抗マウスＯＸ４０  ＯＸ８６  Ｆｃホール（ＤＡＰＧ）のＶＨＣＨ１＿ＶＨＣＨ１、引き続いて（Ｇ４Ｓ）４リンカーおよび抗マウスＥｐＣＡＭ  Ｇ８．８のＶＨを含む第２の重鎖（ＨＣ２）とを含んでいた。
【０３１７】
ラット抗マウスＯＸ４０抗体クローンＯＸ８６の作製は、例えばＡｌ−Ｓｈａｍｋｈａｎｉら  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｈｅｍ（１９９６）２６：１６９５〜１６９９または国際公開第２０１６／０５７６６７号に記載されている。
【０３１８】
ラット抗マウスＥｐＣＡＭ抗体Ｇ８．８の作製は、例えばＦａｒｒら、Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．（１９９１）３９（５）：６４５〜５３に記載されており、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ、アイオワ大学、アイオワシティ、ＩＡから入手可能である。抗体は国際公開第２０１３／１１３６１５号にも記載されている。
【０３１９】
「ＤＤＫＫ」ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば国際公開第２０１４／１３１６９４号に記載されており、ＨＣ１およびＨＣ２の組み立てを可能にする。手短に述べれば、アスパラギン酸残基（Ｄ）を、３９２位および４０９位（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け；すなわちＫ３９２ＤおよびＫ４０９Ｄ）に相当する位置で重鎖の一方（ＨＣ１）のＦｃ領域サブユニットに提供し、リジン（Ｋ）残基を、３５６位および３９９位（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け；すなわち、Ｅ３５６ＫおよびＤ３９９Ｋ）に相当する位置で重鎖の他方（ＨＣ２）のＦｃ領域サブユニットに提供する。
【０３２０】
例えばＢａｕｄｉｎｏら  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００８）、１８１、６６６４〜６６６９または国際公開第２０１６／０３０３５０号に記載される方法に従って、ＤＡＰＧ突然変異を重鎖の定常領域に導入して、マウスＦｃγ受容体への結合を抑止した。手短に述べれば、アラニン（Ａ）を２６５位に相当する位置でＦｃ領域に提供し、グリシン（Ｇ）を３２９位に相当する位置でＦｃ領域に提供する（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け；すなわち、Ｄ２６５Ａ、Ｐ３２９Ｇ）。
【０３２１】
重鎖融合ポリペプチドＨＣ１およびＨＣ２を抗ＯＸ４０クローンＯＸ８６の軽鎖（ＣＬＶＬ）と共発現させて、マウスＯＸ４０についての四価結合およびマウスＥｐＣＡＭについての一価結合を有する分子（すなわち、「４＋１」コンストラクト）を作製した。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ表１７および表１８に示す。
表17. 成熟二重特異性、四価抗muOX40、一価抗muEpCAM huIgG1 DAPG kih 4+1分子の塩基対配列
2020515262.tif 000051
2020515262.tif 000052
2020515262.tif 000053
2020515262.tif 000054
表18. 成熟二重特異性、四価抗muOX40、一価抗muEpCAM muIgG1 DAPG kih 4+1分子のアミノ酸配列
2020515262.tif 000055
2020515262.tif 000056
【０３２２】
異なる二重特異性抗ＯＸ４０、抗ＥｐＣＡＭ抗原結合分子を作製するために、全ての遺伝子を、ＣＭＶプロモーターエンハンサー断片と組み合わせたＭＰＳＶコアプロモーターからなるキメラＭＰＳＶプロモーターの制御下で一過的に発現させた。発現ベクターはまた、ＥＢＮＡ（エプスタイン・バーウイルス由来核抗原）含有宿主細胞中でのエピソーム複製用のｏｒｉＰ領域を含む。
【０３２３】
ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に、ポリエチレンイミンを使用して哺乳動物発現ベクターをコトランスフェクトすることによって、二重特異性抗ＯＸ４０、抗ＥｐＣａｍ分子を作製した。細胞に、１：１：４比（４＋２分子については「ベクター重鎖」：「ベクター軽鎖１」：「ベクター軽鎖２」）および１：１：４（４＋１分子については「ベクター重鎖１」：「ベクター重鎖２」：「ベクター軽鎖」）で対応する発現ベクターをトランスフェクトした。
【０３２４】
５００ｍＬ振盪フラスコ中での２００ｍＬ産生のために、２億５千万個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を、補足物を含むＥｘｃｅｌｌ培地にトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０×ｇで５分間遠心分離し、上清を、予熱したＣＤ  ＣＨＯ培地と交換した。発現ベクターを、２０ｍＬのＣＤ  ＣＨＯ培地中で混合して、最終的な量を２００μｇ  ＤＮＡとした。５４０μＬのＰＥＩ（１ｍｇ／ｍＬ）を添加した後、溶液を１５秒間ボルテックスし、室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞をＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍＬ振盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気および１６５ｒｐｍでの振盪でインキュベーター中、３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、１６０ｍＭの補足物を含むＥｘｃｅｌｌ培地を添加し、細胞を２４時間培養した。この時点で、バルプロ酸濃度は１ｍＭである（培地中に、５ｇ／Ｌ  ＰｅｐＳｏｙおよび６ｍＭ  Ｌ−グルタミンも存在する）。トランスフェクションの２４時間後、細胞に、１２％最終体積（２４ｍＬ）のＦｅｅｄ７および３ｇ／Ｌグルコース（５００ｇ／Ｌストックから１．２ｍＬ）を補足した。７日間の培養後、細胞上清を２０００〜３０００×ｇで４５分間の遠心分離によって回収した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍフィルター）、アジ化ナトリウムを補足して最終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）にし、４℃で維持した。
【０３２５】
抗ヒトＯＸ４０、抗ヒトＥｐＣＡＭ分子のアフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、３０ｍＬ  ２０ｍＭクエン酸ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で平衡化したＰｒｏｔＡ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。６〜１０カラム体積の２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウムを含有するバッファー、ｐＨ７．５で洗浄することによって、未結合タンパク質を除去した。８ＣＶの２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０で段階溶出を使用して、結合タンパク質を溶出した。
【０３２６】
抗マウスＯＸ４０、抗マウスＥｐＣＡＭ分子のアフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、３０ｍＬ  １Ｍグリシン、０．３Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ８．６で平衡化したＰｒｏｔＡ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。６〜１０カラム体積の平衡化バッファーで洗浄することによって、未結合タンパク質を除去した。２０〜１００％の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ｐＨ２．５からの勾配溶出を使用して、１５ＣＶで結合タンパク質を溶出した。
【０３２７】
抗ヒトＯＸ４０、抗ヒトＥｐＣＡＭ分子と抗マウスＯＸ４０、抗マウスＥｐＣＡＭ分子の両方について、１／１０（ｖ／ｖ）の０．５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ８．０を添加することによって、回収した画分のｐＨを調整した。タンパク質を濃縮し、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ６．０で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードする前に濾過した。
【０３２８】
アミノ酸配列に基づいて計算したモル吸光係数を使用して、２８０ｎｍでＯＤを測定することによって、精製二重特異性四価４＋１および４＋２コンストラクトのタンパク質濃度を決定した。ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を使用して、還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）の存在および非存在下で、ＣＥ−ＳＤＳによって二重特異性コンストラクトの純度および分子量を分析した。２５℃で２５ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  Ｌ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、ｐＨ６．７泳動バッファーで平衡化したＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ  ＸＬ分析サイズ排除カラム（Ｔｏｓｏｈ）を使用して、二重特異性コンストラクトの凝集体含量を分析した。
表19. 二重特異性、四価抗OX40、抗EpCAM IgG1 4+1および4+2コンストラクトの生化学分析
2020515262.tif 000057
【０３２９】
２．３  抗ＯＸ４０、抗ＥｐＣＡＭ  ４＋１および４＋２コンストラクトの凝集温度の決定
全てのフォーマットを直接比較するために、静的光散乱（ＳＬＳ）および印加した温度応力に応じた固有タンパク質蛍光を測定することによって、熱安定性を監視した。１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度の３０μｇの濾過タンパク質試料を２連でＯｐｔｉｍ  ２機器（Ａｖａｃｔａ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｌｔｄ）に適用した。温度を０．１℃／分で２５℃から８５℃に傾斜して、半径および総散乱強度を回収した。固有タンパク質蛍光を決定するために、試料を２６６ｎｍで励起させ、発光を２７５ｎｍ〜４６０ｎｍで回収した。
表20. 二重特異性、抗OX40、抗EpCAM 4+1および4+2コンストラクトについての凝集温度
2020515262.tif 000058
【０３３０】
実施例３
マウスＯＸ４０およびマウス上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を標的化する二重特異性抗体の結合
３．１  マウスＯＸ４０発現細胞：ナイーブ脾細胞および活性化脾細胞への結合の分析
マウス脾臓をＣ５７Ｂｌ／６雌マウスから得て、３ｍＬ  ＤＰＢＳに回収した。注射器の背面を使用して７０μｍ細胞ストレーナー上で脾臓をすりつぶすことによって、単一細胞懸濁物を作製した。１０％熱不活性化ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１６１４０−０７１、ロット番号１７９７３０６Ａ）、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸＩ（ＧＩＢＣＯ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号３５０５００３８）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｓ８６３６）、１％（ｖ／ｖ）非必須アミノ酸（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｍ７１４５）および５０μＭ  β−メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ、Ｍ３１４８）を補足したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号４２４０１−０４２）からなる１０ｍｌのＴ細胞培地でフィルターを洗浄し、細胞を３５０×ｇで４℃で７分間遠心分離した。遠心分離後、細胞ペレットを６ｍｌの１×溶解バッファー（ＢＤ  Ｐｈａｒｍ  Ｌｙｓｅ（商標）：濃縮（１０×）塩化アンモニア系溶解試薬、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５５８９９）に再懸濁し、室温で３分間インキュベートした。１０ｍｌのＴ細胞培地を添加することによって、赤血球溶解を停止した。細胞をＸ−Ｖｉｖｏ  １５培地（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号０４−７４４Ｑ）で１回洗浄し、１０ｍｌのＸ−Ｖｉｖｏ  １５培地に再懸濁し、７０μｍ細胞ストレーナーを通して濾過してデブリを除去した。
【０３３１】
脾細胞を、６ウェルプレート中１＊１０６個細胞／ｍＬの密度で抗ＣＤ３［クローン１４５−２Ｃ１１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５５３０５７  １μｇ／ｍＬ］および抗ＣＤ２８［クローン３７．５１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号１０２１０２  １μｇ／ｍＬ］抗体を含有するＸ−Ｖｉｖｏ  １５培地中で活性化してマウスＯＸ４０を上方制御し、３７℃、５％ＣＯ２で２日間インキュベートした。ＯＸ４０を検出するために、ナイーブ脾細胞と活性化脾細胞を混合した。ナイーブ脾細胞を活性化脾細胞と区別することを可能にするために、ｅＦｌｕｏｒ６７０細胞増殖色素（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５−０８４０−８５）を使用して結合アッセイ前にナイーブ細胞を標識した。
【０３３２】
標識のために、細胞を収集し、予熱した（３７℃）ＤＰＢＳで洗浄し、ＤＰＢＳ中１×１０７個細胞／ｍＬの細胞密度に調整した。ｅＦｌｕｏｒ６７０細胞増殖色素（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５−０８４０−８５）を、最終濃度２．５μＭおよび最終細胞密度ＤＰＢＳ中０．５×１０７個細胞／ｍＬで、ナイーブ脾細胞の懸濁物に添加した。次いで、細胞を暗所中、室温で１０分間インキュベートした。標識反応を停止するために、４ｍＬの熱不活性化ＦＢＳを添加し、細胞をＴ細胞培地で３回洗浄した。次いで、１×１０５個の静止ｅＦｌｕｏｒ６７０標識脾細胞と１×１０５個の非標識活性化脾細胞の混合物を、丸底懸濁９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）のウェルに添加した。
【０３３３】
生細胞と死細胞を識別するために、試料を、室温で１０分間、ＤＰＢＳ中Ｚｏｍｂｉｅ  Ａｑｕａ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２３１０２）で染色した。次いで、細胞をＦＡＣＳバッファーで１回洗浄し、その後、滴定抗ＯＸ４０抗原結合分子を含有する５０μＬ／ウェル  ４℃  ＦＡＣＳバッファー中、暗所中、４℃で９０分間染色した。過剰なＦＡＣＳバッファーで３回洗浄した後、細胞を、蛍光標識抗マウスＣＤ４（クローンＧＫ１．５、ラットＩｇＧ２ｂ、κ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００４３８）、抗マウスＣＤ８（クローン５３−６．７、ラットＩｇＧ２ａ、κ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００７４８）およびＰＥコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５−６−７１）の混合物を含有する２５μＬ／ウェル  ４℃  ＦＡＣＳバッファー中、暗所で、４℃で３０分間染色した。
【０３３４】
プレートを最後に８５μＬ／ウェルのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、４レーザーＬＳＲ−ＩＩサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＤＩＶＡソフトウェアを使用）を使用して同じ日に取得した。
【０３３５】
図３Ａ〜図３Ｄに示されるように、ＯＸ４０特異性抗原結合分子のいずれも、ＯＸ４０について陰性の静止マウスＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞への結合を示さなかった。対照的に、ＯＸ４０特異的抗原結合分子の全てが、ＯＸ４０を発現する活性化ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞への結合を示した。マウスＯＸ４０についての四価結合を有する異なる二重特異性抗マウスＯＸ４０分子が、ＯＸ４０について同等の結合強度を示した（ＥＣ５０値  表２１）。ｍｕＥｐＣＡＭ結合部分の存在は、４＋１  ＯＸ４０分子のＯＸ４０結合に対して最小限の影響しか有さなかった（三角形と白丸を比較）。
【０３３６】
３．２  マウスＥｐＣＡＭ発現細胞およびＥｐＣＡＭ陰性腫瘍細胞への結合
マウスＥｐＣＡＭを安定的に発現するマウスＥｐＣＡＭ陽性ＣＴ２６ｍｕＥｐＣＡＭ  ｃｌ２５細胞を使用して、細胞表面マウスＥｐＣＡＭへの結合を分析した。マウスＦＡＰを安定的に発現するｍｕＥｐＣＡＭ陰性細胞株ＣＴ２６ｍｕＦＡＰへの結合を決定することによって、結合の特異性を分析した。
【０３３７】
抗原結合分子の結合を分析するために、０．５×１０５個のＣＴ２６ｍｕＥｐＣＡＭまたは０．５×１０５個のＣＴ２６ｍｕＦＡＰ細胞を、丸底懸濁細胞９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、Ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）のウェルに添加した。生細胞と死細胞を識別するために、試料を、室温で１０分間、ＰＢＳ中Ｚｏｍｂｉｅ  Ａｑｕａ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２３１０２）で染色した。次いで、細胞をＦＡＣＳバッファーで１回洗浄し、その後、滴定抗ＯＸ４０抗原結合分子を含有する５０μＬ／ウェル  ４℃  ＦＡＣＳバッファー（ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１４１９０３２６）ｗ／ＢＳＡ（０．１％ｖ／ｗ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ９４１８）中、暗所中、４℃で９０分間染色した。過剰なＦＡＣＳバッファーで３回洗浄した後、細胞を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５−０９６−０７１）を含有する２５μＬ／ウェル  ４℃  ＦＡＣＳバッファー中、暗所中、４℃で３０分間染色した。
【０３３８】
プレートを最後に８５μＬ／ウェル  ＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、４レーザーＬＳＲ−ＩＩサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＤＩＶＡソフトウェアを使用）を使用して同じ日に取得した。
【０３３９】
図４Ａおよび図４Ｂに示されるように、マウスＥｐＣＡＭ標的化抗原結合分子は、ｍｕＥｐＣＡＭ陰性ＣＴ２６ｍｕＦＡＰ細胞への結合を示さなかった一方、マウスＥｐＣＡＭ結合ドメインを含む分子は、ＣＴ２６ｍｕＥｐＣＡＭ細胞への結合を示した。親二価抗ｍｕＥｐＣＡＭ抗体（ｍｕＥｐＣＡＭ  ＩｇＧ；白三角形）は、ＣＴ２６ｍｕＥｍＣＡＭ細胞上のｍｕＥｐＣＡＭへの強力な結合を示し、マウスＥｐＣＡＭについて一価結合を有する４＋１分子（黒三角形）は、二価ＩｇＧと比較すると、比較的減少した結合能力を示した。しかしながら、ＶＨ／ＶＬ融合は結合を妨げなかった。
【０３４０】
活性化マウスＣＤ４＋ＴおよびＣＤ８＋Ｔ細胞ならびにｍｕＥｐＣＡＭ陽性腫瘍細胞への結合のＥＣ５０値を表２１に要約する。
表21. 抗マウスOX40、抗マウスEpCAM抗原結合分子とマウスOX40またはマウスEpCAMを発現する細胞の結合についてのEC50値
2020515262.tif 000059
【０３４１】
実施例４
マウスＯＸ４０およびマウスＥｐＣＡＭを標的化する二重特異性抗原結合分子の生物活性
４．１  最適以下ＴＣＲ誘因マウス脾細胞のＯＸ４０媒介共刺激および細胞表面マウスＥｐＣＡＭによる超架橋
マウスＥｐＣＡＭ標的化四価抗ＯＸ４０抗原結合分子が静止マウス脾細胞の最適以下ＴＣＲ刺激をレスキューする能力を分析した。ＣＴ２６ｍｕＥｐＣＡＭ  ｃｌ２５細胞を、抗体を架橋するアッセイに使用した。
【０３４２】
新たに単離したマウス脾細胞は、（１）静止ＯＸ４０陰性ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、ならびに（２）細胞表面上に種々のＦｃ−γ受容体分子を有する抗原提示細胞、例えばＢ細胞および単球を含有している。抗マウスＣＤ３抗体（クローン１４５−２Ｃ１１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号５５３０５７）は、そのＦｃ部分で提示Ｆｃ−γ受容体分子に結合し、静止ＯＸ４０陰性ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＴＣＲ活性化延長を媒介することができる。次いで、これらの細胞は数時間以内にＯＸ４０を発現し始める。ＯＸ４０に対する機能的アゴニスト化合物は、活性化ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞上に存在するＯＸ４０受容体を介してシグナル伝達し、ＴＣＲ媒介刺激を支持することができる。
【０３４３】
静止ＣＦＳＥ標識マウス脾細胞を、照射ＣＴ２６ｍｕＥｐＣＡＭ  ｃｌ２５細胞の存在下で、最適以下濃度の抗ＣＤ３抗体で３日間刺激し、ＯＸ４０抗原結合分子を滴定した。Ｔ細胞生存および増殖に対する効果を、フローサイトメトリーによって生細胞中でＦＳＣ免疫、総細胞数およびＣＦＳＥ希釈を監視することによって分析した。さらに、細胞をＴ細胞活性化マーカーＣＤ２５に対する蛍光標識抗体で共染色した。
【０３４４】
細胞解離バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１３１５１−０１４）を使用して３７℃で１０分間、ＣＴ２６ｍｕＥｐＣＡＭ  ｃｌ２５細胞を収集した。細胞を、ＤＰＢＳで１回洗浄し、４，５００ＲＡＤの線量でｘ線照射器で照射して、腫瘍細胞株による脾細胞の後の過剰増殖を防止した。インキュベーター（ＳｔｅｒｉＣｙｃｌｅｉ１６０）中３７℃および５％ＣＯ２で一晩、滅菌９６ウェル丸底接着組織培養プレート（ＴＰＰ、カタログ番号９２０９７）のウェル中、Ｘ−Ｖｉｖｏ  １５培地で、１ウェル当たり０．２＊１０５個細胞の密度で照射細胞を培養した。
【０３４５】
マウス脾細胞を上記のように単離し、以下の通りＣＦＳＥで標識した。新たに単離したＰＢＭＣを予熱した（３７℃）ＤＰＢＳで洗浄し、ＤＰＢＳ中２×１０６個細胞／ｍＬの細胞密度に調整した。Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  ＣＦＳＥ増殖色素（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｃ３４５５４）を、最終濃度０．２μＭおよび最終細胞密度ＤＰＢＳ中１×１０６個細胞／ｍＬで脾細胞の懸濁物に添加した。次いで、細胞を暗所中、３７℃／５％ＣＯ２で１０分間インキュベートした。標識反応を停止するために、２０ｍＬの熱不活性化ＦＢＳを添加し、細胞をＴ細胞培地で３回洗浄し、最後にＸ−Ｖｉｖｏ  １５培地に再懸濁した。脾細胞増殖およびその生存能力の維持に最適のアッセイ培地として選択されたので、Ｘ−Ｖｉｖｏ  １５培地で全ての抗体希釈を行った。
【０３４６】
次いで、ＣＦＳＥ標識脾細胞を、１ウェル当たり１＊１０５個細胞の密度でウェルに添加した。抗マウスＣＤ３抗体（クローン１４５−２Ｃ１１）を最終濃度０．５μｇ／ｍｌで添加し、抗ＯＸ４０分子を指示される濃度で添加した。細胞を、インキュベーター（ＳｔｅｒｉＣｙｃｌｅｉ１６０）で、５％ＣＯ２雰囲気中３７℃で３日間活性化した。
【０３４７】
生細胞と死細胞を識別するために、試料を、室温で１０分間、ＰＢＳ中Ｚｏｍｂｉｅ  Ａｑｕａ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２３１０２）で染色した。次いで、細胞をＦＡＣＳバッファーで１回洗浄し、その後、４℃で２０分間、蛍光色素コンジュゲート抗体抗マウスＣＤ４（クローンＧＫ１．５、ラットＩｇＧ２ｂ、κ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００４３８）、抗マウスＣＤ８（クローン５３−６．７、ラットＩｇＧ２ａ、κ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１００７４８）および抗マウスＣＤ２５（クローン３Ｃ７、ラットＩｇＧ２ｂ、κ  ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号１０１９１２）で表面染色した。細胞ペレットをＦＡＣＳバッファーで１回洗浄し、８５μＬ／ウェルのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、４レーザーＬＳＲ−ＩＩサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＤＩＶＡソフトウェアを使用）を使用して同じ日に取得した。
【０３４８】
結果を図５Ａ〜図５Ｄおよび図６Ａ〜図６Ｄに示す。ＣＴ２６ｍｕＥｐＣＡＭ細胞の存在下での培養によるＯＸ４０に結合した抗原結合分子の超架橋は、成熟（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞のサイズの増加によって証明される）（図５Ａおよび図５Ｂ）、および細胞増殖（図５Ｃおよび図５Ｄ）を強力に促進し、マウスＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞で活性化（ＣＤ２５＋）表現型増強（図６Ａ〜図６Ｄ）を誘導した。非標的化４＋１対照分子は最小限の活性しか示さず、架橋の重要性を実証した。対照ｍｕＥｐＣＡＭ  ＩｇＧは、抗ＣＤ３刺激単独と比較して追加の活性を示さなかった。
【０３４９】
結果は、ＯＸ４０受容体オリゴマーの細胞表面固定化が、四価抗マウスＯＸ４０抗原結合分子の最適アゴニスト活性を得るために重要であることを示唆している。
【０３５０】
実施例５
ヒトＯＸ４０およびヒト上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を標的化する二重特異性抗体の結合
５．１  ヒトＯＸ４０発現細胞：ナイーブＰＢＭＣおよび活性化ＰＢＭＣへの結合の分析
バフィーコートをチューリッヒ献血センターから得た。新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離するために、バフィーコートを等体積のＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１４１９０３２６）で希釈した。５０ｍＬポリプロピレン遠心管（ＴＰＰ、カタログ番号９１０５０）に、１５ｍＬのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０７７（ＳＩＧＭＡ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１０７７１、ポリスクロースおよびジアトリゾ酸ナトリウム、密度１．０７７ｇ／ｍＬに調整）を供給し、バフィーコート溶液をＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０７７の上に積層した。管を、低加速で中断なしに、室温で、４００×ｇで３０分間遠心分離した。その後、ＰＢＭＣを中間相から回収し、ＤＰＢＳで３回洗浄し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号１６０００−０４４、ロット９４１２７３、ガンマ線照射、マイコプラズマフリー、５６℃で３５分間熱不活性化）、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｉ（ＧＩＢＣＯ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号３５０５００３８）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｓ８６３６）、１％（ｖ／ｖ）ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｍ７１４５）および５０μＭ  β−メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ、Ｍ３１４８）を補足したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号４２４０１−０４２）からなるＴ細胞培地に再懸濁した。
【０３５１】
単離直後（静止ヒトＰＢＭＣへの結合の分析用）、またはＴ細胞の細胞表面上でのヒトＯＸ４０発現の高発現をもたらす刺激後（活性化ヒトＰＢＭＣへの結合の分析用）の実験にＰＢＭＣを使用した。刺激のために、ナイーブＰＢＭＣを、３７℃および５％ＣＯ２で、６ウェル組織培養プレートのウェルにおいて、４００Ｕ／ｍＬのプロロイキン（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）および２μｇ／ｍＬのＰＨＡ−Ｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｌ２７６９−１０）を供給したＴ細胞培地中で２日間培養した。
【０３５２】
ＯＸ４０を検出するために、ナイーブヒトＰＢＭＣと活性化ヒトＰＢＭＣを混合した。ナイーブヒトＰＢＭＣを活性化ヒトＰＢＭＣと識別することを可能にするために、ナイーブ細胞を、ｅＦｌｕｏｒ６７０細胞増殖色素（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５−０８４０−８５）を使用して結合アッセイの前に標識した。
【０３５３】
標識のために、細胞を収集し、予熱した（３７℃）ＤＰＢＳで洗浄し、細胞密度ＤＰＢＳ中１×１０７個細胞／ｍＬに調整した。ｅＦｌｕｏｒ６７０細胞増殖色素（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号６５−０８４０−８５）を、最終濃度２．５μＭおよび最終細胞密度ＤＰＢＳ中０．５×１０７個細胞／ｍＬで、ナイーブヒトＰＢＭＣの懸濁物に添加した。次いで、細胞を暗所中、室温で１０分間インキュベートした。標識反応を停止するために、４ｍＬの熱不活性化ＦＢＳを添加し、細胞をＴ細胞培地で３回洗浄した。次いで、１×１０５個の静止ｅＦｌｕｏｒ６７０標識ヒトＰＢＭＣと１×１０５個の非標識活性化ヒトＰＢＭＣの混合物を、丸底懸濁９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、Ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）の各ウェルに添加した。
【０３５４】
生細胞と死細胞を識別するために、試料を、室温で１０分間、ＤＰＢＳ中Ｚｏｍｂｉｅ  Ａｑｕａ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２３１０２）で染色した。次いで、細胞をＦＡＣＳバッファーで１回洗浄し、その後、滴定抗ＯＸ４０抗原結合分子を含有する５０μＬ／ウェルの４℃冷却ＦＡＣＳバッファー中、暗所中、４℃で９０分間染色した。過剰なＦＡＣＳバッファーで３回洗浄した後、細胞を、蛍光標識抗ヒトＣＤ４（クローンＲＰＡ−Ｔ４、マウスＩｇＧ１  ｋ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００５３２）、抗ヒトＣＤ８（クローンＲＰａ−Ｔ８、マウスＩｇＧ１ｋ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０１０４４１）およびフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９０９６０９８）の混合物を含有する２５μＬ／ウェル  ４℃  ＦＡＣＳバッファー中、暗所中、４℃で３０分間染色した。
【０３５５】
次いで、細胞を８５μＬ／ウェルのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、４レーザーＬＳＲ−ＩＩサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＤＩＶＡソフトウェアを使用）を使用して同じ日に取得した。
【０３５６】
図７Ａ〜図７Ｄに示されるように、ＯＸ４０に特異的な抗原結合分子のいずれも、細胞表面でＯＸ４０を発現していない静止ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞に結合しなかった。対照的に、二重特異性抗ＯＸ４０、抗ＥｐＣＡＭ分子の全てが、ＯＸ４０を発現する活性化ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞への結合を示した。ＣＤ４＋Ｔ細胞への結合は、ＣＤ８＋Ｔ細胞への結合よりもはるかに強力であった。活性化ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞は、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞による発現のレベルよりもはるかに低レベルでＯＸ４０を発現する。ＯＸ４０についての発現レベルは刺激の動態および強度に依存し、条件がここではＣＤ４＋Ｔ細胞上でのＯＸ４０の発現について最適化されていたが、ＣＤ８＋Ｔ細胞については最適化されていなかった。４＋１および４＋２フォーマットにおける四価、二重特異性抗ＯＸ４０抗原結合分子は、ＯＸ４０発現細胞との比較できる結合強度を示した（そのＥＣ５０値によって示される、表２２参照）。ｈｕＥｐＣＡＭ結合部分の存在は、（単一特異性、四価、抗ＯＸ４０非標的化対照と比較して）４＋１  ＯＸ４０バインダーのＯＸ４０結合に影響を及ぼさなかった。
【０３５７】
５．２  ヒトＥｐＣＡＭ発現腫瘍細胞およびＥｐＣＡＭ陰性腫瘍細胞への結合
ｈｕＥｐＣＡＭ陽性ＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１０３）を使用して、二重特異性抗ヒトＯＸ４０、抗ヒトＥｐＣＡＭ抗原結合分子が細胞表面で発現されたヒトＥｐＣＡＭに結合する能力を分析した。ヒトＥｐＣＡＭ陰性細胞株Ａ５４９  ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄ（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号４４９１）への結合を分析することによって、結合の特異性を決定した。Ａ５４９細胞は赤色タンパク質を発現し、ＫＡＴＯ−ＩＩＩとＡ５４９  ＮＬＲ細胞を識別するのを可能にした。
【０３５８】
抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体（クローンＥＢＡ−１、ＢＤカタログ番号３４７１９８）を使用して、腫瘍細胞上のｈｕＥｐＣＡＭの発現を分析した。ヒトＥｐＣＡＭはＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞上で高レベルで発現され、ＮＩＨ／３Ｔ３  ｈｕＥｐＣＡＭクローン４４細胞（細胞表面でヒトＥｐＣＡＭを安定的に発現している）上でより低い程度に発現されたが、ＨｅＬａ＿ｈｕＯＸ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１細胞上では発現されなかった（図８）。
【０３５９】
抗原結合分子とヒトＥｐＣＡＭ陽性細胞およびヒトＥｐＣＡＭ陰性細胞の結合を決定するために、０．５×１０５個のＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞および０．５×１０５個のＡ５４９  ＮＬＲ細胞を、丸底懸濁細胞９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、Ｃｅｌｌｓｔａｒ、カタログ番号６５０１８５）のウェルに添加した。生細胞と死細胞を識別するために、試料を、室温で１０分間、ＰＢＳ中Ｚｏｍｂｉｅ  Ａｑｕａ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２３１０２）で染色した。次いで、細胞をＦＡＣＳバッファーで１回洗浄し、その後、滴定抗ＯＸ４０抗原結合分子を含有する５０μＬ／ウェル  ４℃  ＦＡＣＳバッファー（ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１４１９０３２６）ｗ／ＢＳＡ（０．１％ｖ／ｗ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ９４１８）中、暗所中、４℃で９０分間染色した。過剰なＦＡＣＳバッファーで３回洗浄した後、細胞を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９０９６０９８）を含有する２５μＬ／ウェル  ４℃  ＦＡＣＳバッファー中、暗所中、４℃で３０分間染色した。
【０３６０】
次いで、細胞を８５μＬ／ウェルのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、４レーザーＬＳＲ−ＩＩサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＤＩＶＡソフトウェアを使用）を使用して同じ日に取得した。
【０３６１】
結果を図９Ａおよび図９Ｂに示す。ヒトＥｐＣＡＭ標的化分子とｈｕＥｐＣＡＭ陰性Ａ５４９  ＮＬＲ細胞の結合は観察されなかった（図９Ｂ）。親二価抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体（クローン３−１７ｌ、Ａｆｆｉｔｅｃｈ）は、ＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞上で発現されたヒトＥｐＣＡＭへの強力な結合を示した（図９Ａ；白三角形）。二重特異性四価抗ヒトＯＸ４０、二価抗ヒトＥｐＣＡＭ  ４＋２分子は、親二価抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体と比較して低下したレベルのＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞への結合を示した（図９Ａ；黒三角形と白三角形を比較）。二重特異性四価抗ヒトＯＸ４０、一価抗ヒトＥｐＣＡＭ  ４＋１分子とＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞の結合は観察されず、この標的に対するＶＨ／ＶＬ融合のフォーマット制約を示唆している。
【０３６２】
活性化ヒトＣＤ４  ＴおよびＣＤ８  Ｔ細胞ならびにｈｕＥｐＣＡＭ陽性腫瘍細胞への結合のＥＣ５０値を表２２に要約する。
表22. 抗ヒトOX40、抗ヒトEpCAM抗原結合分子とヒトOX40またはヒトEpCAMを発現する細胞の結合についてのEC50値
2020515262.tif 000060
【０３６３】
実施例６
ヒトＯＸ４０およびヒトＥｐＣＡＭを標的化する二重特異性抗原結合分子の生物活性
６．１  ヒトＯＸ４０およびレポーター遺伝子ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼを発現するＨｅＬａ細胞
Ｏｘ４０とそのリガンドのアゴニスト結合は、核因子κＢ（ＮＦκＢ）の活性化を介して下流シグナル伝達を誘導する（Ａ．Ｄ．Ｗｅｉｎｂｅｒｇら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．２００４、７５（６）、９６２〜９７２）。その表面上でヒトＯＸ４０を発現する組換えレポーター細胞株ＨｅＬａ＿ｈｕＯＸ４０＿ＮＦκＢ＿Ｌｕｃ１を作製した。この細胞株は、ＮＦκＢ感受性エンハンサーセグメントの制御下でルシフェラーゼ遺伝子を含むレポータープラスミドを抱える。ＯＸ４０の結合および活性化はＮＦκＢの用量依存性活性化を誘導し、次いでＮＦκＢが核に移行し、ここでレポータープラスミドのＮＦκＢ感受性エンハンサーに結合して、ルシフェラーゼタンパク質の発現を増加させる。ルシフェラーゼは、ルシフェリン酸化を触媒して、オキシルシフェリンをもたらし、これが発光する。ルミノメーターを使用して光を検出および定量化することができる。よって、ＨｅＬａ＿ｈｕＯＸ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１レポーター細胞を使用して、抗ＯＸ４０分子がＮＦκＢ活性化を誘導する能力を生理活性の尺度として分析することができる。
【０３６４】
３７℃で１０分間、細胞解離バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１３１５１−０１４）を使用して、接着ＨｅＬａ＿ｈｕＯＸ４０＿ＮＦｋＢ＿ＬｕｃＩ細胞を収集した。細胞をＤＰＢＳで１回洗浄し、ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号２２５６１−０２１）、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ＦＢＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１％（ｖ／ｖ）非必須アミノ酸を含むアッセイ培地中、細胞密度２×１０５に調整した。細胞を蓋付きの滅菌白色９６ウェル平底組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ、カタログ番号６５５０８３）に１ウェル当たり０．３×１０５個細胞の密度で播種し、インキュベーター（Ｈｅｒａ  Ｃｅｌｌ  １５０）中、５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で一晩インキュベートした。
【０３６５】
翌日、種々のＯＸ４０を標的化する滴定二重特異性抗原結合分子を含有するアッセイ培地を添加することによって、ＨｅＬａ＿ｈｕＯＸ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１細胞を５時間刺激した。生理活性に対する超架橋の効果を分析するために、二次抗体抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１０９−００６−０９８）を含有する２５μＬ／ウェルの培地を１：２比で添加した（一次抗ＯＸ４０抗原結合分子より２倍多い二次抗体）。ＮＩＨ／３Ｔ３ｈｕＥｐＣＡＭ  ｃｌ４４細胞を含有する２５μＬ／ウェルの培地を３：１比で添加することによって（１ウェル当たり、レポーター細胞の３倍のＥｐＣＡＭ＋腫瘍細胞）、細胞表面ヒトＥｐＣＡＭ＋細胞によるコンストラクトの超架橋を試験した。
【０３６６】
インキュベーション後、アッセイ上清を吸引し、プレートをＤＰＢＳで２回洗浄した。製造業者の指示に従って、ルシフェラーゼ１００アッセイシステムおよびレポーター溶解バッファー（共にＰｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ４５５０およびカタログ番号Ｅ３９７１）を使用して、発光の定量化を行った。手短に述べれば、１ウェル当たり３０μＬの１×溶解バッファーを添加することによって、細胞を−２０℃で１０分間溶解した。細胞を３７℃で２０分間解凍した後、１ウェル当たり９０μＬのルシフェラーゼアッセイ試薬を添加した。全ての波長を回収するためにいかなるフィルターも使用することなく、５００ｍｓの積分時間を使用して、ＴＥＣＡＮ  ＳＰＡＲＫ  １０Ｍプレートリーダーで発光を直ちに定量化した。発せられた相対光単位（ＲＬＵ）を、ＨｅＬａ＿ｈｕＯＸ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１細胞の基礎発光によって補正し、Ｐｒｉｓｍ６（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、米国）を使用して対数一次抗体濃度に対してプロットした。生得のシグモイド曲線用量反応を使用して、曲線をデータに当てはめた。全てのフォーマットをより良く比較するために、それぞれの用量反応曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）を、各コンストラクトのアゴニスト能力についてのマーカーとして定量化した（図１０Ｄ）。
【０３６７】
図１０に示されるように、抗ＯＸ４０抗原結合分子の全てが、限定されたＮＦｋＢ活性化を誘導した（図１０Ａ）。抗ヒトＦｃ特異的二次抗体による架橋は、標的化部分と独立に生理活性を強力に増強した（図１０Ｂ）。二重特異性、四価抗ヒトＯＸ４０、二価抗ヒトＥｐＣＡＭ  ４＋２分子を使用した場合にのみ、ヒトＥｐＣＡＭ発現腫瘍細胞はＮＦκＢ媒介ルシフェラーゼ活性化の誘導を増加させ、二重特異性、四価抗ヒトＯＸ４０、一価抗ヒトＥｐＣＡＭ  ４＋１分子を使用した場合には増加させなかった（図１０Ｃおよび図１０Ｄ参照）；これは、二重特異性、四価抗ヒトＯＸ４０、一価抗ヒトＥｐＣＡＭ  ４＋１分子が、ヒトＥｐＣＡＭ発現細胞への結合を示さないという知見と一致する（図９Ａ参照）。
【０３６８】
これらの結果は、ＥｐＣＡＭによる超架橋およびＯＸ４０についての高い結合価がＯＸ４０アゴニスト活性にとって重要な決定因子であることを示している。
【０３６９】
６．２  最適以下ＴＣＲ誘因静止ヒトＰＢＭＣのＯＸ４０媒介共刺激および細胞表面ヒトＥｐＣＡＭによる超架橋
図６．１および図１０に示されるように、ｈｕＥｐＣＡＭ＋腫瘍細胞の添加は、ＯＸ４０受容体の強力なオリゴマー化を提供することによって、ｈｕＥｐＣＡＭ標的化四価抗ＯＸ４０抗原結合分子により、ヒトＯＸ４０陽性レポーター細胞株でＮＦκＢ活性化を強力に増加させることができる。ＥｐＣＡＭ標的化四価抗ＯＸ４０抗原結合分子を、ヒトＥｐＣＡＭ発現ＫＡＴＯ−ＩＩＩまたはＮＩＨ／３Ｔ３ｈｕＥｐＣＡＭクローン４４細胞の存在下で、静止ヒトＰＢＭＣの最適以下ＴＣＲ刺激をレスキューするその能力について分析した。
【０３７０】
ヒトＰＢＭＣ調製物は、（１）静止、ＯＸ４０陰性ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、ならびに（２）その細胞表面上に種々のＦｃ受容体分子を有する抗原提示細胞、例えばＢ細胞および単球を含有する。ヒトＩｇＧ１アイソタイプの抗ヒトＣＤ３抗体は、そのＦｃを通して、Ｆｃ−γ受容体分子に結合し、静止ＯＸ４０陰性ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＴＣＲ活性化延長を誘因する。次いで、これらの細胞は、数時間以内にＯＸ４０を発現し始める。ＯＸ４０に対する機能的アゴニスト化合物は、活性化ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞上に存在するＯＸ４０受容体を介してシグナル伝達し、ＴＣＲ媒介刺激を支持することができる。
【０３７１】
静止ＣＦＳＥ標識ヒトＰＢＭＣを、照射ＫＡＴＯ−ＩＩＩまたはＮＩＨ／３Ｔ３ｈｕＥｐＣＡＭ  ｃｌ４４細胞の存在下で、最適以下濃度の抗ＣＤ３抗体で５日間刺激し、抗ＯＸ４０抗原結合分子を滴定した。Ｔ細胞生存および増殖に対する効果を、フローサイトメトリーによって生細胞中の総細胞数およびＣＦＳＥ希釈を監視することによって分析した。さらに、細胞を、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５に対する蛍光標識抗体で共染色した。
【０３７２】
３７℃で１０分間、細胞解離バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１３１５１−０１４）を使用して、ＫＡＴＯ−ＩＩＩおよびＮＩＨ／３Ｔ３ｈｕＥｐＣＡＭ  ｃｌ４４細胞を収集した。細胞をＤＰＢＳで１回洗浄した。ＫＡＴＯ−ＩＩＩおよびＮＩＨ／３Ｔ３ｈｕＥｐＣＡＭ  ｃｌ４４細胞を、４，５００ＲＡＤの線量を使用してｘ線照射器で照射して、後の腫瘍細胞株によるヒトＰＢＭＣの過剰増殖を防いだ。照射細胞を、インキュベーター（ＳｔｅｒｉＣｙｃｌｅｉ１６０）中、３７℃および５％ＣＯ２で一晩、滅菌９６ウェル丸底接着組織培養プレート（ＴＰＰ、カタログ番号９２０９７）で、Ｔ細胞培地中１ウェル当たり０．２＊１０５個細胞の密度で培養した。
【０３７３】
ヒトＰＢＭＣをｆｉｃｏｌｌ密度遠心分離によって単離し、以下の通りＣＦＳＥで標識した。新たに単離したＰＢＭＣを予熱した（３７℃）ＤＰＢＳで洗浄し、細胞密度ＤＰＢＳ中２×１０６個細胞／ｍＬに調整した。Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  ＣＦＳＥ増殖色素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｃ３４５５３）を、最終濃度０．２μＭおよび最終細胞密度ＤＰＢＳ中１×１０６個細胞／ｍＬで静止ヒトＰＢＭＣの懸濁物に添加した。次いで、細胞を暗所中、３７℃および５％ＣＯ２で１０分間インキュベートした。標識反応を停止するために、２０ｍＬの熱不活性化ＦＢＳを添加し、細胞をＴ細胞培地で３回洗浄した。次いで、細胞を、１ウェル当たり０．６＊１０５個細胞の密度で各ウェルに添加した。最終濃度１０ｎＭの抗ヒトＣＤ３抗体（クローンＶ９、ヒトＩｇＧ１）、および指示される抗ＯＸ４０抗原結合分子を指示される濃度で添加した。細胞をインキュベーター（ＳｔｅｒｉＣｙｃｌｅｉ１６０）中、３７℃および５％ＣＯ２で５日間活性化した。生細胞と死細胞を識別するために、試料を、室温で１０分間、ＰＢＳ中Ｚｏｍｂｉｅ  Ａｑｕａ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２３１０２）で染色した。次いで、細胞をＦＡＣＳバッファーで１回洗浄し、その後、４℃で２０分間、蛍光色素コンジュゲート抗体抗ヒトＣＤ４（クローンＲＰＡ−Ｔ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００５３２）、抗ＣＤ８（クローンＲＰＡ−Ｔ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０１０４４１）および抗ＣＤ２５で表面染色した。その後、細胞をＦＡＣＳバッファーで１回洗浄し、８５μＬ／ウェルのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、４レーザーＬＳＲ−ＩＩサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＤＩＶＡソフトウェアを使用）を使用して同じ日に取得した。
【０３７４】
実験の結果を図１１〜図１４に示す。
【０３７５】
二重特異性、四価抗ヒトＯＸ４０、二価抗ヒトＥｐＣＡＭ（４＋２）分子のＫＡＴＯ−ＩＩＩ細胞による超架橋は、ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖および成熟を強力に促進し（図１１；黒三角形）、活性化（ＣＤ２５＋）表現型増強を誘導した（図１２；黒三角形）。他方、二重特異性、四価抗ヒトＯＸ４０、一価抗ヒトＥｐＣＡＭ（４＋１）分子は、単一特異性、四価抗ヒトＯＸ４０、非標的化（４＋１）対照分子の活性と類似の活性を示した（図１１および図１２；白丸と比較した黒丸）。この知見は、二重特異性、四価抗ヒトＯＸ４０、一価抗ヒトＥｐＣＡＭ４＋１分子がヒトＥｐＣＡＭ発現細胞への結合を示さないという知見と一致していた（図９Ａ参照）。
【０３７６】
ＮＩＨ／３Ｔ３ｈｕＥｐＣＡＭ  ｃｌ４４細胞を使用して、二重特異性、四価抗ヒトＯＸ４０、二価抗ヒトＥｐＣＡＭ（４＋２）分子を架橋した場合に、同様の知見が得られた。二重特異性、四価抗ヒトＯＸ４０、二価抗ヒトＥｐＣＡＭ（４＋２）分子は、ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖および成熟を強力に促進し（図１３；黒三角形）、活性化（ＣＤ２５＋）表現型増強を誘導した（図１４；黒三角形）。これらの実験では、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞が、５日後により急速に増殖し、抗原結合分子による堅牢な追加の効果を見ることがより困難になった。
【０３７７】
これらの結果は、Ｔ細胞での最適なＯＸ４０アゴニズムのために、ＯＸ４０の十分なオリゴマー化が必要なだけでなく、さらに、ＯＸ４０オリゴマーの細胞表面固定化も必要であることを示唆している。
【図１】
2020515262.tif 000061
【図２Ａ−Ｂ】
2020515262.tif 000062
【図３Ａ−Ｄ】
2020515262.tif 000063
【図４Ａ−Ｂ】
2020515262.tif 000064
【図５Ａ−Ｄ】
2020515262.tif 000065
【図６Ａ−Ｄ】
2020515262.tif 000066
【図７Ａ−Ｄ】
2020515262.tif 000067
【図８】
2020515262.tif 000068
【図９Ａ−Ｂ】
2020515262.tif 000069
【図１０Ａ−Ｄ】
2020515262.tif 000070
【図１１Ａ−Ｄ】
2020515262.tif 000071
【図１２Ａ−Ｄ】
2020515262.tif 000072
【図１３Ａ−Ｄ】
2020515262.tif 000073
【図１４Ａ−Ｄ】
2020515262.tif 000074
【配列表】
2020515262000001.app
【国際調査報告】
2020515262.tif 000075
2020515262.tif 000076
2020515262.tif 000077
2020515262.tif 000078
2020515262.tif 000079