(57)【要約】本発明は、細胞治療剤の有効性の評価方法に関するものである。本発明の細胞治療剤の有効性を判断する基準として、（ａ）ＴＧＦ−βで形質転換した哺乳類細胞の第１集団と、（ｂ）前記遺伝子で形質転換していない哺乳類細胞の第２集団内のＴＧＦ−β及び／又はＴＳＰ−１の発現量及び／又は発現有無を用いると、個々の細胞治療剤の有効性を治療開始前に確実に判定することができ、治療効果を均一に維持することが可能である。また、効果が得られない細胞治療剤の使用を回避できるので、不必要な手術および副作用を回避することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
次のステップを含む細胞治療剤の有効性の評価方法：
（１）（ａ）ＴＧＦ−β（Transforming growth factor beta）で形質転換した哺乳類細胞の第１集団と、（ｂ）前記遺伝子で形質転換していない哺乳類細胞の第２集団とをそれぞれ用意するステップと、
（２）前記ステップ（１）の第１集団及び第２集団をそれぞれバイアル内に充填するステップと、
（３）前記ステップ（２）の第１集団を不活性化するステップと、
（４）前記ステップ（３）の第１集団を培養するステップと、
（５）前記ステップ（４）の前記第１集団からＴＧＦ−βの濃度を測定するステップと、
（６）前記ステップ（５）で測定されたＴＧＦ−βの濃度に基づいて、細胞組成物の治療剤としての有効性を評価するステップであり、
前記ステップ（６）でのＴＧＦ−βの発現量が０．６５ｎｇ／１０５ｃｅｌｌ／２４ｈｒ以上である場合、治療剤として有効であると判断する、方法。
【請求項２】
前記ステップ（４）の不活性化は、放射線照射によるものである、請求項１に記載の方法。 
【請求項３】
前記放射線照射は、ガンマ線、Ｘ線または電子線である、請求項２に記載の方法。 
【請求項４】
前記ステップ（２）のバイアルは、凍結保存液を含む、請求項１に記載の方法。 
【請求項５】
前記ステップ（２）の凍結保存液は、ＤＭＳＯ（Dimethyl sulphoxide）を含む、請求項４に記載の方法。 
【請求項６】
前記ステップ（２）の凍結保存液は、ＤＭＳＯを５〜１５体積％で含む、請求項５に記載の方法。 
【請求項７】
前記ステップ（３）の不活性化は、バイアルを凍結する前または後に行われる、請求項１に記載の方法。 
【請求項８】
前記凍結は、−２０〜−１９６℃で行われる、請求項７に記載の方法。 
【請求項９】
前記ステップ（４）の培養は、凍結されたバイアルを解凍後に行われる、請求項７に記載の方法。 
【請求項１０】
前記解凍は、１５〜４０℃で１〜９０分間放置する、請求項９に記載の方法。 
【請求項１１】
前記ステップ（４）の培養は、６時間〜９６時間行われる、請求項１に記載の方法。 
【請求項１２】
前記治療は、骨関節炎の治療である、請求項１に記載の方法。 
【請求項１３】
前記第２集団のＴＳＰ−１（thrombospondin 1）の発現量を確認するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。 
【請求項１４】
前記ＴＳＰ−１の発現量が３１ｎｇ／１０５ｃｅｌｌ／２４ｈｒ以上である場合、治療剤として有効であると判断する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳類細胞は、軟骨細胞または軟骨前駆細胞である、請求項１に記載の方法。 
【請求項１６】
次のステップを含む骨関節炎治療剤の製造方法：
（１）（ａ）ＴＧＦ−β（Transforming growth factor beta）で形質転換した哺乳類細胞の第１集団と、（ｂ）前記遺伝子で形質転換していない哺乳類細胞の第２集団とをそれぞれ用意するステップと、
（２）前記ステップ（１）の第１集団及び第２集団をそれぞれバイアル内の凍結保存液内に充填するステップと、
（３）前記ステップ（２）の第１集団をバイアルを凍結する前または後に不活性化するステップと、
（４）前記ステップ（３）の前記第１集団を解凍するステップと、
（５）前記ステップ（４）の第１集団を培養するステップと、
（６）前記ステップ（５）の第１集団からＴＧＦ−βの発現量を測定するステップと、
（７）前記ステップ（６）で測定されたＴＧＦ−βの発現量が０．６５ｎｇ／１０５ｃｅｌｌ／２４ｈｒ以上である細胞を選別するステップ。
【請求項１７】
前記方法は、ステップ（８）として、前記第２集団のＴＳＰ−１（thrombospondin-1）の発現量を測定し、前記ＴＳＰ−１の発現量が３１ｎｇ／１０５ｃｅｌｌ／２４ｈｒ以上である細胞を選別するステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞治療剤の有効性の評価方法および骨関節炎治療剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
退行性関節炎とも呼ばれる骨関節炎は、軟骨の損傷または退行性変化により、関節をなす骨、軟骨及び靭帯などに損傷が起こり、炎症と痛みが生じる慢性疾患である。骨関節炎は指、膝（膝関節）、尻（股関節）、腰（腰椎関節）、首（頸椎の関節）などの体中のほぼすべての関節で発症する。骨関節炎の発症原因はまだ明確には解明されていないが、年齢、遺伝的素因、外傷、環境的な影響などの複合的な原因で発生することが知られている。過去には、その発生が年齢と関連し、関節の過度の使用や老化による軟骨の摩耗により発生するものと考えられてきたが、軟骨の代謝に関与する様々な物質（サイトカイン、分解酵素など）が明らかになるにつれて、様々な原因によってこれらの物質が軟骨細胞の代謝バランスの異常、炎症免疫反応などを起こして軟骨を損傷させることと理解されている。
【０００３】
骨関節炎の主な症状は、反復的な痛み、関節の強直感、機動力の低下および機能喪失である。臨床的な経過は、通常、徐々に進行していく。ある程度病気が進行するにつれて、関節軟骨の消失と変性によって関節面が不規則になると、痛みの程度が増強し、漸進的な運動障害のために日常生活に大きな支障をきたすことになる。また、関節の変形も起こる。軟骨の成長に関連する調節因子（modulator）及び生化学的因子（biochemical factor）を標的とした研究が進行中である。これらの因子は、骨形成の効果的な刺激因子であるＢＭＰ（bone morphogenic protein）、及び細胞成長と細胞外基質（extracellular matrix、ＥＣＭ）の形成を刺激するＴＧＦ−β（transforming growth factor beta）を含む。特に、ＴＧＦ−βは、コラーゲン（collagen）とプロテオグリカン（proteoglycan）の合成、軟骨細胞の生長及び組織再生に関与することが知られている。また、ＴＧＦ−βは、免疫抑制および抗炎症機能を有することが知られている。ＥＧＦ（epidermal growth factor）、ＩＧＦ−I（insulin-like growth factor I）、ＢＦＧＦ（basic fibroblast growth factor）のような他の成長因子もまた軟骨の再生を刺激するが、これらの成長因子は、軟骨の損傷に効果を示さなかった。
【０００４】
前記のような成長因子は、投与において、濃度、放出速度および伝達方法などの決定に困難がある。研究者らは、動物実験で証明された結果に基づいて、これらの因子をリポソーム（liposome）を介して、または培地に溶解して伝達しようとする努力を継続的に行ってきた。しかし、これらの因子の人間への適用は、大きく進んでいない状況である。
【０００５】
遺伝的に変形された軟骨細胞の利用は、細胞媒介遺伝子治療法と組み合わせて軟骨の再生を成功的に導いた非常に新規な技術である（Lee KHらHum Gene Ther 2001；12：1805-1813、SUN U．SONGらTissue Engineering 2005；11：1516-1526）。この方法は、ＴＧＦ−β遺伝子を有するレトロウイルスベクターで形質導入（transduction）された同種（allogeneic）ヒト軟骨細胞と同種正常軟骨細胞とを混合して使用する。この方法は、外科的方法を最小限に抑えるとともに、軟骨の再生を誘導することができる。
【０００６】
一方、生きている細胞を生産して提供する細胞治療剤の場合、培地変更などの生産条件や温度などの作業環境の変化により、医薬品に差異が発生し得る。このため、細胞治療剤の生産時、実質的に患者に適用可能なレベルで治療有効性が確保されたかを確認するための品質管理基準が不可欠な状況である。しかし、有効性が確保された細胞治療剤であるかを検証できる一貫した手順と技術を確保することは非常に難しい。したがって、各細胞治療剤に適合するように有効性を検証できる方法と基準を確立する段階が必ず必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このような状況の下で、本発明者らは、特定の疾患、特に骨関節炎に対する細胞治療剤の有効性を評価する方法を開発し、優れた効果を有する骨関節炎治療剤を製造できる方法を確立するために鋭意努力した。その結果、ＴＧＦ−βタンパク質を発現するように形質転換した組換え細胞でＴＧＦ−βが特定の数値以上の発現量を示す場合に、当該細胞治療剤が骨関節炎の治療に有意な効果を示すことを確認した。また、形質転換していない細胞でＴＳＰ−１（thrombospondin 1）が特定の数値以上の発現量を示す場合に、当該細胞治療剤が骨関節炎の治療に有意な効果を奏することを確認し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、細胞治療剤の有効性の評価方法を提供することにある。 
【０００９】
また、本発明の他の目的は、骨関節炎治療剤を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
以下、本発明についてより詳細に説明する。 
【００１１】
本発明の一態様によると、本発明は、次のステップを含む細胞治療剤の有効性の評価方法を提供する： 
（１）（ａ）ＴＧＦ−β（Transforming growth factor beta）で形質転換した哺乳類細胞の第１集団と、（ｂ）前記遺伝子で形質転換していない哺乳類細胞の第２集団とをそれぞれ用意するステップと、
（２）前記ステップ（１）の第１集団及び第２集団をそれぞれバイアル（vial）内に充填するステップと、 
（３）前記ステップ（２）の第１集団を不活性化するステップと、 
（４）前記ステップ（３）の第１集団を培養するステップと、 
（５）前記ステップ（４）の前記第１集団からＴＧＦ−βの濃度を測定するステップと、
（６）前記ステップ（５）で測定されたＴＧＦ−βの濃度に基づいて、細胞組成物の治療剤としての有効性を評価するステップであり、 
前記ステップ（６）でのＴＧＦ−βの発現量が０．６５ｎｇ／１０５ｃｅｌｌ／２４ｈｒ以上である場合、治療剤として有効であると判断する。
【００１２】
これに関し、前記第１集団は、ＴＧＦ−βで形質転換して遺伝形質が変形された細胞である。このように、遺伝形質が変形された細胞を医薬品として提供するにあたり、予期せぬ状況を防止し、安全性を確保するためには、細胞を複製不能（replication incompetent）状態にする不活性化過程（例えば、放射線照射）を経ることが好ましい。しかし、不活性化の過程は、細胞のＴＧＦ−βの分泌および細胞に影響を及ぼすので、不活性化後も治療剤として有効であるか、その有効性を判断するための判断基準が必須的に求められる。
【００１３】
したがって、本発明の最大の特徴は、ＴＧＦ−βで形質転換した哺乳類細胞の第１集団と、前記遺伝子で形質転換していない哺乳類細胞の第２集団とで構成される細胞治療剤（混合細胞）の第１集団内のＴＧＦ−β発現量を基準に用いて前記第１集団の品質を確認することにより、細胞治療剤としての有効性有無を決定することにある。
【００１４】
本発明において、ＴＧＦ−βで形質転換した哺乳類細胞の第１集団に含まれる細胞または細胞群は、好ましくは、ＴＧＦ−β１を発現する細胞または細胞群である。 
【００１５】
本発明において、本発明の細胞治療剤の有効性を判断する基準となる前記第１集団のＴＧＦ−βの発現量は、目的とする効果を達成する限り、これらに限定されないが、好ましくは０．６５ｎｇ／１０５ｃｅｌｌ／２４ｈｒ以上であり、より好ましくは１．０ｎｇ／１０５ｃｅｌｌ／２４ｈｒ以上であり、最も好ましくは１．７ｎｇ／１０５ｃｅｌｌ／２４ｈｒ以上である。
【００１６】
本発明の一実施形態では、ＴＧＦ−βの発現量が０．６３ｎｇ／１０５ｃｅｌｌ／２４ｈｒのとき、有意な痛みの緩和および軟骨構造の改善効果がないことを確認することにより、少なくとも０．６５ｎｇ／１０５ｃｅｌｌ／２４ｈｒ以上のＴＧＦ−β発現量が求められることを確認した。
【００１７】
本発明の細胞治療剤の有効性の指標は、指標としての精度および信頼性に優れるので、骨関節炎治療剤の有効性の決定に用いることができる。 
【００１８】
本発明で前記ＴＧＦ−βタンパク質の発現程度を意味する用語としては、発現量または分泌量を使用することができる。 
【００１９】
本明細書で使用される用語「有効性の判断」は、本願で細胞治療剤の治療効果について有利または不利に反応する可能性を指すのに使用される。本発明で前記判断は、この反応の程度に関するものである。例えば、有効性の判断は、細胞治療剤を処置後の骨関節炎の治療効果の有無、及び／又はその確率に関するものである。
【００２０】
本発明の好ましい具現例によると、前記ステップ（３）の不活性化は放射線照射によるものであり、前記放射線照射はガンマ線、Ｘ線または電子線であってもよいが、これらに限定されず、当業界で公知の様々な技術を用いて容易に行うことができる。 
【００２１】
本発明の好ましい具現例によると、前記ステップ（２）のバイアルは、凍結保存液を含み、前記凍結保存液は、ＤＭＳＯ（Dimethyl sulphoxide）を含む。 
【００２２】
好ましくは、前記凍結保存液は、ＤＭＳＯを５〜１５体積％で含むことができる。 
【００２３】
また、前記ステップ（３）の不活性化は、バイアルを凍結する前または後に行うことができ、前記凍結は−２０〜−１９６℃で行うことができる。 
【００２４】
前記ステップ（４）の培養は、凍結されたバイアルを解凍した後に行われる。前記解凍は１５〜４０℃で１〜９０分間放置して行うことができる。 
【００２５】
前記ステップ（４）の培養は、６〜９６時間行うことができる。 
【００２６】
本発明の好ましい具現例によると、前記哺乳類細胞は、軟骨細胞または軟骨前駆細胞であってもよい。 
【００２７】
また、本発明は、さらに、前記第２集団のＴＳＰ−１遺伝子の発現有無を確認するステップを含む。例えば、正常な軟骨細胞、軟骨前駆細胞または幹細胞は、ＴＳＰ−１を発現することが公知されている。本発明の一実施形態では、ＴＳＰ−１の発現有無が前記第２集団を含む細胞治療剤の治療効果に重要な役割を果たすことを確認した。
【００２８】
したがって、前記第２集団内のＴＳＰ−１遺伝子の産物であるＲＮＡまたはタンパク質を検出することにより、前記遺伝子の発現有無を確認することができ、第２集団の有効性を評価することができる。 
【００２９】
本発明の細胞治療剤の有効性を判断する基準となる前記第２集団のＴＳＰ−１発現量は、目的とする効果を達成する限り、これらに限定されないが、好ましくは３１ｎｇ／１０５ｃｅｌｌ／２４ｈｒ以上であり、より好ましくは５０ｎｇ／１０５ｃｅｌｌ／２４ｈｒ以上であり、最も好ましくは９０ｎｇ／１０５ｃｅｌｌ／２４ｈｒ以上である。
【００３０】
本発明の一実施形態では、ＴＳＰ−１の発現量が３０．５３ｎｇ／１０５ｃｅｌｌ／２４ｈｒのとき、有意な痛みの緩和および軟骨構造の改善効果がないことを確認することにより、少なくとも３１ｎｇ／１０５ｃｅｌｌ／２４ｈｒ以上のＴＳＰ−１発現量が求められることを確認した。
【００３１】
本発明の一具現例によると、前記（ａ）ＴＧＦ−βで形質転換した哺乳類細胞の第１集団と、（ｂ）前記遺伝子で形質転換していない哺乳類細胞の第２集団とで構成される細胞治療剤の前記第１集団内のＴＧＦ−β発現量が０．６５ｎｇ／１０５ｃｅｌｌ／２４ｈｒ以上であり、前記第２集団内のＴＳＰ−１発現量が３１ｎｇ／１０５ｃｅｌｌ／２４ｈｒ以上に検出（確認）された場合、前記細胞治療剤は骨関節炎の治療効果があると判断する。
【００３２】
前記検出は、通常、試料からＲＮＡまたはタンパク質を抽出し、抽出物中のＲＮＡまたはタンパク質の特定の部分を検出することにより行うことができる。このＲＮＡまたはタンパク質の検出は、免疫分析学的な方法、ハイブリッド化反応および増幅反応によって測定できるが、これらに限定されず、当業界で公知の様々な技術を用いて容易に行うことができる。
【００３３】
前記検出製剤は、前記遺伝子に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、プライマーペア、プローブ及びこれらの組み合わせからなる群より選択される。つまり、核酸の検出は、遺伝子を暗号化する核酸分子、または前記核酸分子の相補物にハイブリッド化される１つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを使用する増幅反応によって行うことができる。
【００３４】
例えば、プライマーを用いた核酸の検出は、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）などの増幅方法を用いて遺伝子配列を増幅した後、当業界で公知の方法で遺伝子の増幅有無を確認することで行うことができる。 
【００３５】
また、前記検出製剤は、前記タンパク質のアミノ酸部位に対して特異的に結合する抗体であってもよく、多クローン抗体、単クローン抗体、組換え抗体、及びこれらの組み合わせをすべて含む。 
【００３６】
前記抗体は、多クローン抗体、単クローン抗体、組換え抗体、および２つの全長の軽鎖および２つの全長の重鎖を有する完全な形態だけでなく、抗体分子の機能的な断片、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖをすべて含む。抗体の生産は、当業界で公知の技術を用いて容易に製造することができ、商業的に販売される抗体を用いることができる。
【００３７】
また、本発明の他の態様によると、本発明は、次のステップを含む骨関節炎治療剤の製造方法を提供する： 
（１）（ａ）ＴＧＦ−βで形質転換した哺乳類細胞の第１集団と、（ｂ）前記遺伝子で形質転換していない哺乳類細胞の第２集団とをそれぞれ用意するステップと、
（２）前記ステップ（１）の第１集団および第２集団をそれぞれバイアル内の凍結保存液内に充填するステップと、 
（３）前記ステップ（２）の第１集団をバイアルを凍結する前または後に不活性化するステップと、 
（４）前記ステップ（３）の前記第１集団を解凍するステップと、
（５）前記ステップ（４）の第１集団を培養するステップと、 
（６）前記ステップ（５）の第１集団からＴＧＦ−βの発現量を測定するステップと、
（７）前記ステップ（６）で測定されたＴＧＦ−βの発現量が０．６５ｎｇ／１０５ｃｅｌｌ／２４ｈｒ以上である細胞を選別するステップ。
【００３８】
本発明の好ましい具現例によると、前記方法は、ステップ（８）として、前記第２集団のＴＳＰ−１の発現量を測定し、前記ＴＳＰ−１の発現量が３１ｎｇ／１０５ｃｅｌｌ／２４ｈｒ以上である細胞を選別するステップをさらに含む。
【００３９】
すなわち、本発明の方法は、前記第１集団のＴＧＦ−β発現量が０．６５ｎｇ／１０５ｃｅｌｌ／２４ｈｒ以上であり、前記第２集団のＴＳＰ−１発現量が３１ｎｇ／１０５ｃｅｌｌ／２４ｈｒ以上である細胞を選別し、治療剤として有効であると判断して製造する。
【００４０】
本発明の骨関節炎治療剤の製造方法は、前述した（ａ）ＴＧＦ−βで形質転換した哺乳類細胞の第１集団と、（ｂ）前記遺伝子で形質転換していない哺乳類細胞の第２集団内のＴＧＦ−β及び／又はＴＳＰ−１の発現量に基づいて有効性を判断する構成を含むので、重複する内容は、本明細書の過度の複雑さを避けるためにその記載を省略する。
【発明の効果】
【００４１】
本発明の細胞治療剤の有効性を判断する基準として、（ａ）ＴＧＦ−βで形質転換した哺乳類細胞の第１集団内のＴＧＦ−β発現レベルと、（ｂ）前記遺伝子で形質転換していない哺乳類細胞の第２集団内のＴＳＰ−１発現レベルを用いると、個々の細胞治療剤の治療有効性を、治療開始前に確実に判定することができ、治療効果を向上させることが可能となる。また、効果が得られない細胞治療剤の使用を回避できるので、不必要な手術および副作用を回避することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、ＴＣ細胞におけるＴＧＦ−β１タンパク質の発現量を示す。
【図２】図２は、細胞生産ｂａｔｃｈごとのＴＧＦ−β１の発現量を確認した結果を示す。
【図３ａ】図３ａは、ＭＩＡ誘導骨関節炎動物モデルに混合細胞及び／又はａｎｔｉ−ＴＧＦ−β１中和抗体（anti-TGF−β1 neutralizing antibody）を処理したときのフォンフレイフィラメント（von Frey filament）テストの結果を示す。
【図３ｂ】図３ｂは、前記フォンフレイフィラメントの結果をＡＵＣ（area under the curve）で表すものである。
【図４】図４は、ＨＣ及びＴＣ細胞におけるＴＳＰ−１タンパク質の発現量を示す。
【図５】図５は、細胞生産ｂａｔｃｈごとのＴＳＰ−１の発現量を確認した結果を示す。
【図６ａ】図６ａは、ＭＩＡ誘導骨関節炎動物モデルに混合細胞及び／又はａｎｔｉ−ＴＳＰ−１中和抗体を処理したときのフォンフレイフィラメントテストの結果を示す。
【図６ｂ】図６ｂは、前記フォンフレイフィラメントの結果をＡＵＣ（area under the curve）で計数した結果を示す。
【図７ａ】図７ａは、ＭＩＡ骨関節炎動物モデルに様々な値のＴＧＦ−β１発現を示す混合細胞を処理したときのフォンフレイフィラメントテストの結果を示す。
【図７ｂ】図７ｂは、前記フォンフレイフィラメントの結果をＡＵＣ（area under the curve）で表すものである。
【図７ｃ】図７ｃは、Ｈ＆Ｅ染色組織の分析結果を示す。
【図８ａ】図８ａは、ＴＧＦ−β１の有効最小値を確認するために行った、１２０Ｇｙ混合細胞１、２ ＶＦＦ ｔｅｓｔの結果を示す。
【図８ｂ】図８ｂは、ＡＵＣで計数した結果を示す。
【図９ａ】図９ａは、ＴＳＰ−１の有効最小値を確認するために行った、１２０Ｇｙ混合細胞１、２ ＶＦＦ ｔｅｓｔの結果を示す。
【図９ｂ】図９ｂは、ＡＵＣで計数した結果を示す。
【図９ｃ】図９ｃは、Ｈ＆Ｅ染色組織の分析結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
以下、本発明を具体的な実施例を挙げて説明する。本発明による実施例は本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲が後述する実施例に限定されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって自明である。
【００４４】
実施例１．細胞治療剤の用意 
本発明で用いられる細胞治療剤は、ＴＧＦ−β１（NCBI Reference Sequence：NM_000660.6）を発現するように形質転換した細胞集団（第１集団；「ＴＣ」）と、前記遺伝子で形質転換していない正常な細胞集団（第２集団；「ＨＣ」）とを含む混合細胞である。 
【００４５】
前記ＴＣは、ＴＧＦ−β１のｃＤＮＡを公知の方法により細胞に注入して製造することができる。例えば、ＴＧＦ−β１のｃＤＮＡを、アンピシリン、ネオマイシンなどの抵抗遺伝子を有する公知のベクター［例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ社製のｐＣＩ（アンピシリン抵抗遺伝子を含有）］に含ませて、ＴＧＦ−β１のｃＤＮＡを含むベクターを製造した後、軟骨細胞にリン酸カルシウム（calcium phosphate）方法またはリポペクチン（lipofectin）方法などの公知の方法で前記ベクターを注入することにより製造できる。
【００４６】
また、前記ＨＣ及びＴＣは、ヒト由来軟骨細胞であって、ＨＣは正常軟骨細胞であり、ＴＣはＴＧＦ−β１が分泌されるように形質転換した軟骨細胞である。ＨＣ及びＴＣの作製方法は、［Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１２ Ｆｅｂ；１４（２）：２４７−２５６］、並びに米国特許第７，００５，１２７号および米国特許第７，２８２，２００号に開示されている。
【００４７】
前記ＨＣ及びＴＣの混合比は、細胞数を基準に３：１で混合して以下の実施例に適用した。 
【００４８】
作製されたＴＣ及びＨＣは、それぞれバイアルに充填した後、凍結し、混合細胞治療剤としての使用のために準備・保管した。このとき、ＴＣは凍結前または凍結後、放射線照射により不活性化した。
【００４９】
実施例２．細胞治療剤におけるＴＧＦ−β１の発現の確認 
本発明者らは、実施例１と同様にして用意した細胞治療剤である混合細胞に対して、その有効性を判断する基準を構築するために、製造工程に従って製造されたＴＣ細胞がＴＧＦ−β１を発現するかどうかを確認した。 
【００５０】
ＴＣ細胞をバイアルに充填した後、凍結させた状態で不活性化を行った。不活性化を行った後、凍結保存中の細胞バイアルを取り出し、３７℃水槽で解凍した。その後、細胞をバイアルから取り出し、培地が添加されたコニカルチューブに入れた。細胞を２１０ｘｇで５分間遠心分離して上澄み液を除去した。細胞沈殿物を十分に混ぜて培養培地で懸濁した後、６−ウェルプレートに１．０ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように３つのウェル（well）に接種し、２ｍＬ培養培地を入れた後、２４時間、３７℃のＣＯ２培養器で培養した。
【００５１】
２４時間後、培地を入れ替えて、再度３７℃のＣＯ２培養器で２４時間培養した後、１ｍＬずつ培養液をサンプリングした。このとき、３つのウェルには培地のみを単独で２ｍＬ入れ、陰性対照群として用いた。サンプリングした培養液内のＴＧＦ−β１の量をＥＬＩＳＡ方法で測定し、陰性対照群も同様に測定した。ＴＧＦ−β１分泌水準の計算は、「サンプルのＴＧＦ−β１の平均分泌量−陰性対照群のＴＧＦ−β１の平均分泌量」より計算した。
【００５２】
その結果、図１及び下記表１に示すように、ＴＣ細胞では平均５．０７ｎｇ／１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／２４ｈｒのＴＧＦ−β１が発現されることを確認することができた。
【００５３】
【表１】
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【００５４】
実施例３．バッチ（batch）ごとのＴＧＦ−β１発現量の確認 
ＴＣ細胞において、細胞治療剤としての有効性を示すＴＧＦ−β１発現の基準を構築するために、製造バッチ（batch）ごとにＴＧＦ−β１の発現量を調べた。 
【００５５】
その結果、図２及び下記表２に示すように、バッチごとにＴＧＦ−β１タンパク質の発現量に差があることが分かった。 
【００５６】
【表２】
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【００５７】
このように、生産バッチごとにＴＧＦ−β１タンパク質の発現量に差が生じるので、工程が変わるなどの変化があった場合に、より大きな差が発生する可能性も存在する。したがって、有効な効果を同じように再現できる細胞治療剤の品質管理のためには、ＴＧＦ−β１発現の基準濃度が構築されるべきである。
【００５８】
実施例４．細胞治療剤におけるＴＧＦ−β１の発現と治療効果との関連性の検証 
本発明者らは、実質的にＴＣのＴＧＦ−β１発現量と治療効果との間に密接な関連性が存在するかどうかを検証するために、ＭＩＡ骨関節炎動物モデルを作成し、混合細胞および／またはａｎｔｉ−ＴＧＦ−β１中和抗体を処理し、痛みの変化を観測した。
【００５９】
ＭＩＡ投与２週間後、骨関節炎が誘発された個体を対象に、対照群であるＣＳ−１０投与群（vehicle）、またはＨＣとＴＣを３：１で混ぜた混合細胞（１．２ｘ１０６）を左膝の関節腔内に投与した。中和抗体実験のために、対照抗体（ＩｇＧ、５００ｎｇ／３０μＬ）及びＴＧＦ−β１中和抗体（ａｎｔｉ−ＴＧＦ−β１、５００ｎｇ／３０μＬ）を、混合細胞投与当日と３日目に左膝の関節腔内に投与した。
【００６０】
その後、フォンフレイフィラメントテストを測定した。前記テストでは、１９８０年Ｄｉｘｏｎ（Chaplan SR et al.，Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw，Journal of Neuroscience Methods，1994，53：55-63；及び、Dixon WJ，Efficient analysis of experimental observations，Annual Reviews Pharmacology and Toxicology，1980，20：441-62）が確立した５０％ｕｐ＆ｄｏｗｎ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ法を使用した。Ｎ値がそれぞれ０．４、０．６、１、２、４、６、８、１５ｇｒａｍ（ｇ）である合計９つのフィラメントを用いて痛みの反応を調査し、定められたパターンに従って閾値（threshold）を計算した。
【００６１】
その結果、図３ａ及び図３ｂに示すように、実験後７日目にＣＳ−１０投与群（vehicle）で１．４６±０．５４、混合細胞投与群で４．８７±０．８の測定結果を確認した。このような鎮痛効果は、細胞投与後４２日目まで類似した傾向で見られ、ＣＳ−１０投与群と比較して、すべての測定値から統計的有意性のある鎮痛効果が観察された（Ｐ＜０．０５）。
【００６２】
また、混合細胞投与時、ＴＣから分泌されるＴＧＦ−β１が鎮痛効果にどのような影響を及ぼすかを確認するために、ＴＧＦ−β１タンパク質の活性を中和および抑制してその効果を遮断するａｎｔｉ−ＴＧＦ−β１中和抗体を共に処理した。このとき、混合細胞投与群で示された痛みの治療効果は、投与後７日目にＴＧＦ−β１中和抗体投与群（混合細胞＋ａｎｔｉ−ＴＧＦ−β１）で１．４３±０．３８であり、ＣＳ−１０投与群と類似した程度の痛みが示されることを確認でき、４２日目まで差が見られなかった。これに対して、対照抗体（ＩｇＧ）を使用した群（混合細胞＋ＩｇＧ）は、混合細胞投与群と類似した程度の痛みの治療効果を維持した。
【００６３】
前述のことから、ＴＣから分泌されるＴＧＦ−β１が骨関節炎の治療に重要な影響を及ぼすことが分かる。 
【００６４】
実施例５．細胞治療剤におけるＴＳＰ−１の発現の確認 
ＨＣ及びＴＣ細胞におけるＴＳＰ−１（NCBI Reference Sequence：NM_003246.3）タンパク質の発現有無および発現量を調査するために、前記実施例２と同様にして凍結保存中の各細胞バイアルを解凍し、ＥＬＩＳＡ方法でＴＳＰ−１の量を測定した。 
【００６５】
その結果、図４及び下記表３に示すように、ＨＣ細胞では１８０．３７ｎｇ／１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／２４ｈｒのＴＳＰ−１が発現されたが、ＴＣ細胞では０．２９ｎｇ／１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／２４ｈｒであり、ＴＳＰ−１の発現が阻害されることが確認できた。
【００６６】
【表３】
2020525804.tif 000005
【００６７】
実施例６．バッチ（batch）ごとのＴＳＰ−１発現量の確認 
ＨＣ細胞において、細胞治療剤としての有効性を示すＴＳＰ−１発現の基準を構築するために、前記実施例２と同様にして細胞培養バッチ（batch）ごとにＴＳＰ−１の発現量を調べた。 
【００６８】
その結果、図５及び下記表４に示すように、バッチごとにＴＳＰ−１の発現量に差があることが分かった。 
【００６９】
【表４】
2020525804.tif 000006
【００７０】
このように、生産バッチごとにＴＳＰ−１タンパク質の発現量に差が生じるので、工程が変わるなどの変化があった場合に、より大きな差が発生する可能性も存在する。したがって、有効な効果を同じように再現できる細胞治療剤の品質管理のためには、ＴＳＰ−１の発現の基準濃度が構築されるべきである。
【００７１】
実施例７．細胞治療剤におけるＴＳＰ−１の発現と治療効果との関連性の検証 
本発明者らは、混合細胞の治療効果を検証するために、前記実施例４と同様にしてＭＩＡ骨関節炎動物モデルを作成した後、混合細胞およびａｎｔｉ−ＴＳＰ−１中和抗体を処理し、痛みの変化を観測した。 
【００７２】
その結果、図６ａ及び６ｂに示すように、投与後７日目にＣＳ−１０投与群（Vehicle）で１．１９±０．２３、混合細胞投与群で６．７９±１．０３の測定結果を確認した。このような痛みの治療効果は、混合細胞投与後４２日目まで類似した傾向で見られ、ＣＳ−１０投与群と比較して、すべての測定値から統計的有意性のある鎮痛効果が観察された（Ｐ＜０．０５）。
【００７３】
また、混合細胞投与時、ＨＣから分泌されるＴＳＰ−１が鎮痛効果にどのような影響を及ぼすかを確認するために、ＴＳＰ−１タンパク質の活性を中和および抑制してその効果を遮断するａｎｔｉ−ＴＳＰ−１中和抗体を共に処理した。このとき、混合細胞投与群で示された痛みの治療効果は、投与後７日目にＴＳＰ−１中和抗体投与群（anti-ＴＳＰ−１＋混合細胞）で２．２８±０．５４であり、ＣＳ−１０投与群と類似した程度の痛みが示されることを確認でき、４２日目まで類似した傾向が維持された。これに対して、対照抗体（ＩｇＭ）を使用した群（ＩｇＭ＋混合細胞）では、混合細胞投与群と類似した程度の鎮痛効果が示された（ｐ＜０．０５）。
【００７４】
このことから、ＨＣから分泌されるＴＳＰ−１が骨関節炎の治療に重要な影響を及ぼすことが分かる。 
【００７５】
実施例８．細胞治療剤におけるＴＧＦ−β１の最小容量の検証 
本発明者らは、混合細胞の構成細胞であるＴＣのＴＧＦ−β１の最小値を確認するために、ＭＩＡ投与２週間後、骨関節炎が誘発された個体を対象に、それぞれ異なるＴＧＦ−β１の値を示すＴＣを用いて、ＨＣとＴＣを３：１の細胞数の割合で混ぜた混合細胞（２．８ｘ１０５ｃｅｌｌｓ）を処理し、痛みの変化を観察した。
【００７６】
このとき、互いに異なる条件などの影響でＴＧＦ−β１発現量が異なるＴＣの状況を具現するために、それぞれ異なるＴＧＦ−β１の値を示すＴＣを用意した。それぞれＴＧＦ−β１に対するｓｈＲＮＡ処理および１５０Ｇｙガンマ線照射を用いて作製し、表５に示すようなＴＧＦ−β１（ｎｇ／１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／２４ｈｒ）の平均値を確認した。
【００７７】
【表５】
2020525804.tif 000007
【００７８】
その結果、図７ａ及び図７ｂに示すように、実験後１４日目にＣＳ−１０投与群（Vehicle）で１．１７±０．５３、混合細胞投与群で６．０６±１．９１の測定結果を確認した。このような痛みの治療効果は、細胞投与後４２日目まで類似した傾向で見られ、ＣＳ−１０投与群と比較して、すべての測定値から統計的有意性のある鎮痛効果が観察された（Ｐ＜０．０５）。
【００７９】
また、細胞投与後１４日目にｓｈＲＮＡ ｃｏｎｔｒｏｌ（shCON）処理投与群で６．２１±１．５９、１５０ Ｇｙガンマ線照射されたＴＣを用いた混合細胞投与群で１．３９±０．２３、ＴＧＦ−β１に対するｓｈＲＮＡを共に処理した混合細胞投与群で０．８６±０．４９の測定結果を確認した。このような効果は、細胞投与後４２日目まで類似した傾向で見られた。
【００８０】
フォンフレイフィラメントの測定結果をＡＵＣ値で表示した場合にも、対照群であるＣＳ−１０投与群（Vehicle）に比べて、混合細胞投与群とｓｈＲＮＡ対照群（shCON）処理投与群で統計的に有意な結果を確認した（ｐ＜０．０５ ）。 
【００８１】
同じ動物モデルから分離した組織のＨ＆Ｅ染色分析の結果、図７ｃに示すように、混合細胞投与群とｓｈＣＯＮ処理投与群で軟骨構造の改善が観察された。 
【００８２】
これに対して、対照物質であるＣＳ−１０投与群（Vehicle）とＴＧＦ−β１に対するｓｈＲＮＡを共に処理した混合細胞投与群、および１５０ Ｇｙガンマ線照射されたＴＣを用いた混合細胞投与群では、軟骨構造の改善が観察されなかった。 
【００８３】
さらに、ＴＣから分泌されるＴＧＦ−β１の痛み緩和および軟骨構造改善の有効最小値を確認するために、別のバッチで生産されたＴＣを用いた混合細胞の鎮痛効果および軟骨構造の改善を確認した。 
【００８４】
用意したＴＣのＴＧＦ−β１の値は、９ｎｇ／１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／２４ｈｒおよび１．７ｎｇ／１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／２４ｈｒであり、これらをそれぞれ混合細胞の調製に使用した。調製された混合細胞は、それぞれ９ｎｇ_混合細胞および１．７ｎｇ_混合細胞で表示した。
【００８５】
その結果、図８ａ及び図８ｂに示すように、９ｎｇ_混合細胞、１．７ｎｇ_混合細胞および対照群であるＣＳ−１０投与群（Vehicle）において、投与後１４日目にＣＳ−１０投与群（Vehicle）で１．４８±０．２６、９ｎｇ_混合細胞で５．５７±１．１３、１．７ｎｇ_混合細胞で７．４１±１．２１の測定結果を確認した。細胞投与後４２日目まで類似した傾向が見られ、ＣＳ−１０投与群と比較して、９ｎｇ_混合細胞および１．７ｎｇ_混合細胞投与群の両方において、統計的有意性のある測定値が得られた（Ｐ＜０．０５）。
【００８６】
フォンフレイフィラメントの測定結果をＡＵＣ値で表示した場合にも、対照群であるＣＳ−１０投与群（Vehicle）と比較して、９ｎｇ_混合細胞および１．７ｎｇ_混合細胞投与群で統計的有意性が観察された（ｐ＜０．０５）。 
【００８７】
したがって、ＴＣから分泌されるそれぞれ異なるＴＧＦ−β１を用いた混合細胞を投与して確認した結果、痛みの緩和および軟骨構造改善に有効なＴＧＦ−β１の最小値は、１５０ Ｇｙガンマ線照射−混合細胞投与群で確認された０．６３ｎｇ／１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／２４ｈｒよりも大きい値、すなわち０．６５ｎｇ／１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／２４ｈｒ以上と確認された。
【００８８】
実施例９．細胞治療剤におけるＴＳＰ−１の最小容量の検証 
本発明者らは、混合細胞の構成細胞であるＨＣのＴＳＰ−１の最小値を確認するために、ＭＩＡ投与２週間後、骨関節炎が誘発された個体を対象に、それぞれ異なるＴＳＰ−１の値を示すＨＣを用いて、ＨＣとＴＣを３：１で混ぜた混合細胞（２．８ｘ１０５）を処理し、痛みの変化を観測した。
【００８９】
このとき、互いに異なる条件などの影響でＴＳＰ−１の発現量が異なるＨＣの状況を具現するために、それぞれ異なるＴＳＰ−１発現を示すＨＣを用意した。 
【００９０】
それぞれ異なるＴＳＰ−１の値のＨＣは、ＴＳＰ−１に対するｓｉＲＮＡを用いて作製し、表６に示すようなＴＳＰ−１（ｎｇ／１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／２４ｈｒ）の平均値を確認した。
【００９１】
【表６】
2020525804.tif 000008
【００９２】
その結果、図９ａ及び図９ｂに示すように、投与後１４日目にＣＳ−１０投与群（Vehicle）で０．６±０．１９、混合細胞投与群で４．７±１．０３、混合細胞＋ｓｉＲＮＡ Ｃｏｎｔｒｏｌ投与群で４．７±１．６７の測定結果を確認した。このような効果は、細胞投与後４２日目まで類似した傾向で見られ、ＣＳ−１０投与群と比較して、測定値から統計的有意性のある鎮痛効果が観察された（Ｐ＜０．０５）。
【００９３】
また、細胞投与後１４日目に混合細胞＋ｓｉＲＮＡ １投与群で３．９５±０．９４、混合細胞＋ｓｉＲＮＡ ２投与群で１．８９±０．９の測定結果を確認した。ＣＳ−１０投与群と比較して、混合細胞＋ｓｉＲＮＡ １投与群で統計的有意性のある鎮痛効果が観察された。このような痛みの治療効果は、細胞投与後４２日目まで類似した傾向で見られた。
【００９４】
また、フォンフレイフィラメントの測定結果をＡＵＣ値で表示した場合にも、対照群であるＣＳ−１０投与群（Vehicle）に比べて、混合細胞投与群、ｓｉＲＮＡ ｃｏｎｔｒｏｌ処理投与群、および混合細胞＋siＲＮＡ １投与群で統計的に有意な結果を確認した（ｐ＜０．０５）。 
【００９５】
さらに、同じ動物モデルから分離した組織のＨ＆Ｅ染色分析の結果、図９ｃに示すように、混合細胞投与群とｓｉＲＮＡ ｃｏｎｔｒｏｌ処理投与群、混合細胞＋ｓｉＲＮＡ １投与群で軟骨構造の改善が観察された。これに対して、対照群であるＣＳ−１０投与群（Vehicle）と混合細胞＋ｓｉＲＮＡ ２投与群では、軟骨構造の改善が観察されなかった。
【００９６】
これらのことから、ＨＣから分泌されるＴＳＰ−１の痛みの緩和および軟骨構造改善の有効最小値は、混合細胞＋ｓｉＲＮＡ ２投与群で確認された３０．５３ｎｇ／１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／２４ｈｒよりも大きい値、すなわち３１ｎｇ／１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／２４ｈｒ以上と確認された。
【００９７】
結論として、本発明に基づいて確立された、（ａ）第１集団であるＴＧＦ−βで形質転換した哺乳類細胞の特定のレベルのＴＧＦ−β発現量と、（ｂ）第２集団である前記遺伝子で形質転換していない哺乳類細胞の特定のレベルのＴＳＰ−１の発現量に基づいて骨関節炎細胞治療剤の有効性を評価する方法を用いると、個々の細胞治療剤の有効性を治療開始前に確実に判定することができ、均一な治療効果を示すようにすることができる。
【図１】
2020525804.tif 000009
【図２】
2020525804.tif 000010
【図３ａ】
2020525804.tif 000011
【図３ｂ】
2020525804.tif 000012
【図４】
2020525804.tif 000013
【図５】
2020525804.tif 000014
【図６ａ】
2020525804.tif 000015
【図６ｂ】
2020525804.tif 000016
【図７ａ】
2020525804.tif 000017
【図７ｂ】
2020525804.tif 000018
【図７ｃ】
2020525804.tif 000019
【図８ａ】
2020525804.tif 000020
【図８ｂ】
2020525804.tif 000021
【図９ａ】
2020525804.tif 000022
【図９ｂ】
2020525804.tif 000023
【図９ｃ】
2020525804.tif 000024
【国際調査報告】
2020525804.tif 000025
2020525804.tif 000026
2020525804.tif 000027
2020525804.tif 000028
2020525804.tif 000029
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