(57)【要約】本発明は、トポグラフィを有する試料の表面を、共焦点顕微鏡法としての共焦点ラマンおよび／または蛍光顕微鏡法を用いて撮像する方法であって、ラマン散乱光および／または蛍光のための励起放射を生成するために使用される機器としての第１のレーザ光源、および、第１の光源とは独立に制御可能な焦点位置を有する第２の機器としての第２のレーザ光源またはスーパールミネセントダイオード（ＳＬＥＤ）が準備される方法に関する。本発明は、第１の光源が第１の波長範囲の光を放射し、第２の光源が第２の波長範囲の光を放射し、第１および第２の光源の第１および第２の波長範囲が重ならず、第２の光源の焦点面が、別個に制御可能な焦点位置によって、試料の表面内／上に、第２の光源の焦点位置の信号を用いて試料のトポグラフィが確立されるように、移動させられ、および／または、試料が、この信号のために、第１の光源の焦点面内に移動させられる。【選択図】図１ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
トポグラフィを有する試料の表面を、共焦点顕微鏡法、具体的には共焦点ラマンおよび／または蛍光顕微鏡法によって撮像する方法であって、ラマン散乱光および／または蛍光のための励起放射を生成するのに使用される機器、具体的には第１の光源、好ましくは第１のレーザ光源、並びに、第２の機器、具体的には第２の光源、好ましくは前記第１の光源とは独立に制御可能な焦点位置を有する第２のレーザ光源またはスーパールミネセントダイオード（ＳＬＥＤ）が準備され、
−  前記第１の光源は、第１の波長範囲内の光を放射し、
−  前記第２の光源は、第２の波長範囲内の光を放射し、
前記第１および第２の光源の前記第１および第２の波長範囲は互いに重ならず、
−  前記第２の光源の焦点面は、別個に制御可能な焦点位置によって前記試料の前記表面内／上にもたらされ、それにより、
−  前記試料の前記トポグラフィは、前記第２の光源の前記焦点位置の信号を用いて決定され、および／または、前記試料は、この信号に基づいて前記第１の光源の焦点面内にもたらされる、
ことを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記第１の光源の前記焦点面内への導入は、顕微鏡対物レンズと試料との間の距離を変えることによって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１および第２の光源からの光は、同じ顕微鏡対物レンズを通して誘導されることを特徴とする、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記第２の光源の前記制御可能な焦点位置の制御は、前記第２の光源の前記焦点が前記顕微鏡の光軸に沿って移動させられるように、基本的に達成されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記第２の光源の前記制御可能な焦点位置は周期的に変化させられ、前記試料の前記トポグラフィは、前記試料の前記表面において、前記第２の光源の反射された光および／または散乱された光の強度の極大の時間的推移から決定されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第２の光源の前記制御可能な焦点位置は、前記第２の光源のビーム経路内の合焦可能レンズによって制御されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記合焦可能レンズは、焦点距離が電圧の印加によりまたは電流によって制御される電気的合焦可能レンズであることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第２の光源の前記制御可能な焦点位置は、少なくとも１つの移動可能なレンズによって制御されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
顕微鏡対物レンズと試料との間の前記距離は、前記試料を前記顕微鏡の光軸の方向に移動させることによって変えられることを特徴とする、請求項２〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第２の光源の前記波長範囲は、検出されるラマン散乱光および／または蛍光の波長範囲とは重ならないことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１の機器、具体的にはラマン散乱光および／または蛍光のための励起放射を生成するための第１の光源は、前記第２の機器、具体的には前記第２の光源と同時に放射、具体的には光を放射することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１の機器、具体的には前記第１の光源によって励起されたラマン散乱光および／または蛍光の測定、および、前記第２の機器、具体的には前記第２の光源による前記試料の前記トポグラフィの測定は、実質的に同時に行われることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の機器、具体的には前記第１の光源は、第１の焦点サイズを有する第１の焦点を備え、前記第２の機器、具体的には前記第２の光源は、第２の焦点サイズを有する第２の焦点を備え、前記第１および第２の焦点サイズは実質的に同一であることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
トポグラフィを有する試料の表面を、共焦点顕微鏡法、具体的には共焦点ラマンおよび／または蛍光顕微鏡法によって撮像するための機器（１）であり、
第１の光源、具体的にはラマン散乱光および／または蛍光のための励起放射を生成するためのレーザ光源を備える、機器（１）であって、
前記機器は第２の光源、好ましくはレーザ光源またはスーパールミネセントダイオード（ＳＬＥＤ）を備え、前記第１の光源は第１の波長範囲の放射を放射し、前記第２の光源は第２の波長範囲の放射を放射し、前記第１の波長範囲と前記第２の波長範囲とは重ならず、前記機器は、前記第２の光源の焦点面が前記試料の表面内／上にもたらされるように、前記第２の光源の焦点位置を制御するためのユニットを備え、
前記第２の光源の前記焦点位置の信号から前記試料のトポグラフィ値を決定し、この信号に基づいて、前記試料を前記第１の光源の焦点面内にもたらす制御／調整機器を備える、
ことを特徴とする、機器。
【請求項１５】
前記機器は、
共焦点ラマン顕微鏡、
共焦点蛍光顕微鏡、
共焦点ラマン／蛍光顕微鏡、
共焦点光学顕微鏡、
のうちの１つであることを特徴とする、請求項１４に記載の機器。
【請求項１６】
前記機器は、共焦点ラマン顕微鏡および／または蛍光顕微鏡であり、前記第１の光源を用いて前記試料内で光放射が励起され、前記機器は、前記試料によって放射された光子、具体的には放射されたラマンおよび／または蛍光の光子を検出するための検出器を備えることを特徴とする、請求項１５に記載の機器。
【請求項１７】
前記共焦点ラマンおよび／または蛍光顕微鏡は、光学要素、具体的には対物レンズ（２０２９）を備え、それにより、前記第１および／または第２の光源の光が前記試料上に集束されることを特徴とする、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の機器。
【請求項１８】
前記機器は、前記第２の光源の焦点位置を制御するための合焦可能レンズを、前記第２の光源から撮像される前記表面までのビーム経路内に備えることを特徴とする、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の機器。
【請求項１９】
前記合焦可能レンズは、電気的合焦可能レンズまたは機械的閉鎖可能レンズであることを特徴とする、請求項１８に記載の機器。
【請求項２０】
前記第１の波長範囲は、調査される前記試料の放射される発光スペクトルおよび／またはラマンスペクトルの範囲によって定められ、前記第２の波長範囲は、前記第１の波長範囲と重なることなく前記第１の波長範囲の上または下にあることを特徴とする、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の機器。
【請求項２１】
前記第１の波長範囲は、３５０ｎｍ〜１０００ｎｍ、具体的には５００ｎｍ〜１０００ｎｍの波長を含み、前記第２の波長範囲は、１０００ｎｍ〜２０００ｎｍ、具体的には１０００ｎｍ〜１５００ｎｍの波長を含むことを特徴とする、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載の機器。
【請求項２２】
前記機器は、昇降式テーブルおよび／またはピエゾ素子を有するテーブルを備えることを特徴とする、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の機器。
【請求項２３】
特に、多孔性および／または粗い試料のラマンおよび／または蛍光信号の高分解能測定のための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項２４】
特に、熱的および／または機械的ドリフトを伴う試料のラマンおよび／または蛍光信号の測定のための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項２５】
特に、乾燥する試料または蒸発する液体のラマンおよび／または蛍光信号の測定のための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項２６】
試料のラマンおよび／または蛍光信号並びに表面トポグラフィの同時測定のための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面、特にトポグラフィを有する試料の表面を、共焦点顕微鏡法を用いて表面の多数の領域を走査することによって撮像するための方法および機器に関する。共焦点顕微鏡法においては、表面の領域の共焦点像が結像面内に配置された検出器によって生成される。具体的には、本発明は、いわゆる共焦点ラマンおよび／または蛍光顕微鏡、或いは、共焦点蛍光および／またはラマン顕微鏡法のための機器に関するが、それらに限定されない。
【０００２】
表面、具体的にはトポグラフィを有する試料の表面を撮像する方法に加えて、共焦点顕微鏡法或いは共焦点ラマンおよび／または蛍光顕微鏡法を用いる、試料を撮像するための機器がさらに説明される。ラマン測定または蛍光測定は、光源によって試料を励起し、試料によって放射される光に基づいて化学的に異なる材料を撮像するために用いることができる。
【背景技術】
【０００３】
共焦点顕微鏡法において、光源からの光は、対物レンズを通して試料まで誘導され、試料表面の基本的に点状の領域（エアリディスク）に集束される。同時に、対物レンズは、試料によって放射される光、具体的には放射されるラマン光または蛍光を捕捉し、それを検出器に送るように使用することができる。従って、この対物レンズを用いて、領域、すなわち、照明および／またはビーム検出経路の方向に基本的に垂直な、試料の基本的に点状の領域を共焦点撮像することが可能になる。試料或いは対物レンズまたは照明が動かされる場合、ｘ−ｙ方向の走査、従って試料全体を走査することが可能である。
【０００４】
共焦点撮像において、光源、好ましくは基本的に点状の光源、好ましくはレーザ光源が、基本的に点状の領域の上、理想的には試料の一点の上の、光の波動性から生じる焦点に結像される（アッベ（Ａｂｂｅ）の条件）。次に、このピクセルが、好ましくは同じ光学系、すなわち同じ対物レンズにより、検出器の前のピンホール上に焦点を結ばれる。検出器の前に分離したピンホールを配置する代わりに、検出器自体がピンホールを表すことも可能である。共焦点撮像が顕微鏡のために用いられる場合、対物レンズの焦点面からの光だけが撮像に寄与するために、画像コントラストの著しい増加が実現される。
【０００５】
共焦点光学顕微鏡法に関して、共焦点対物レンズを有する顕微鏡が詳しく記載されている特許文献１が参照される。
【０００６】
共焦点測定は、存在する散乱光背景が非常に強く抑制されるので、多くの用途、例えば、ラマンおよび／または蛍光測定において利点を有する。焦点面からの光だけが測定されるので、共焦点顕微鏡法は、透明な試料の場合には、実際の試料表面の下の試料領域を測定することも可能にする。
【０００７】
共焦点ラマンおよび／または蛍光顕微鏡は、公開された特許文献２によって知られている。
【０００８】
しかし、共焦点測定または共焦点顕微鏡法の問題は、ドリフト、トポグラフィ、試料の不均一性、粗さにより、しかしさらに、試料の傾きにより、撮像される面または領域、特に表面が、試料が走査されるときに焦点面内に留まらないことが多いことである。
【０００９】
従って、満足できる結果のために、多くの用途は、測定される表面による焦点安定性または焦点追跡のための拡張された方法および機器を必要とする。
【００１０】
共焦点顕微鏡と組み合わせられる、ＡＦＭ顕微鏡またはＳＴＭ顕微鏡が、特許文献３から知られている。ＡＦＭまたはＳＴＭチップを用いると、試料は特にｚ方向に走査することもできる。
【００１１】
特許文献３によれば、ＡＦＭチップを用いて、深さ情報が得られる。ＡＦＭ測定、具体的にはＡＦＭトポグラフィ測定中に、ＡＦＭトポグラフィ測定から得られるトポグラフィデータを光学データと相関させることができるように、光学信号もまた記録される。特許文献３によれば、共焦点測定は常に、トポグラフィ測定と同時に行われる。特許文献３の不利点は、ｘ−ｙ面内における１００μｍから最大で３００μｍまでの範囲にある、限定された走査範囲である。さらに、ＡＦＭチップは、ｚ方向において最大で５〜１０μｍの範囲における深さ情報のみを与えることができる。従って、特許文献３は、＞３００μｍの試料領域および＞１０μｍの粗さの測定を可能にしない。
【００１２】
表面、特に大きい試料領域、特に＞３００μｍ、および工芸表面上の、共焦点顕微鏡法、特に共焦点ラマン顕微鏡法および／または蛍光顕微鏡法において、十分に平坦な試料トポグラフィが存在しないことが多いため、画像を得ることが非常に難しいという問題が生じる。所与の面内の走査、いわゆるＸ−Ｙ走査中に、試料の表面は、顕微鏡の焦点面から繰り返し離れるので、試料表面または試料の簡単かつ完全な撮像が可能でなくなる。
【００１３】
特許文献４には、初めに、試料の表面トポグラフィを共焦点顕微鏡法のために決定し、次いで、撮像される表面を、表面トポグラフィ値を用いて共焦点面に移動させることを可能とする方法および機器が記載されている。特許文献４は、この目的にための表面トポグラフィセンサを有する機器を提案している。その表面トポグラフィセンサは、好ましくは反射および／または回折コンポーネントを有する光学系を有する共焦点センサとすることができる。代替的に、特許文献４は、粗面計、ＡＦＭ、白色光干渉計、三角測量センサまたはレーザ走査システムなどの、接触センサを明示している。特許文献４のシステムの不利点は、初めに試料全体の表面トポグラフィが決定され、次に、決定された表面トポグラフィを考慮に入れて、実際の蛍光またはラマン測定が行われることである。これは、トポグラフィと蛍光またはラマン測定との間の比較的大きな時間のずれをもたらす。機器または試料のドリフト或いは時間変動する試料（例えば、試料の蒸発または乾燥による）がこの方法に大変な困難さをもたらす可能性がある。
【００１４】
上記の逐次測定、すなわち、トポグラフィ決定後のラマンまたは蛍光測定に対する代替物として、特許文献４はさらに単一経路方法を記載している。この場合、初めに、各々のラスタ点において、表面トポグラフィセンサ、具体的には色センサを用いて距離測定が行われ、それから表面トポグラフィ特有の距離信号が決定され、この距離信号が次に、共焦点顕微鏡、具体的には共焦点ラマン顕微鏡、の焦点面または共焦点面を追跡するために、この１つのラスタ点に関して直接使用され、その後、このサイクルが次のラスタ点において繰り返される。このことは、各ラスタ点において初めにトポグラフィが測定されること、および、この測定の完了後およびトポグラフィによる追跡の完了後にのみ、共焦点測定、具体的には共焦点ラマンまたは蛍光測定が開始されることを意味する。共焦点ラマンまたは蛍光信号は、サイクルの大きい時間範囲、特に全体のトポグラフィ測定および１つのラスタ点から次のラスタ点への試料の移動中には、検出されない。
【００１５】
要約すると、特許文献４に記載されているこの単一経路方法はまた、種々の測定モードおよび測定サイクルの複雑な行きつ戻りつの切り替えによって特徴付けられる。これは、その間には共焦点信号、具体的にはラマンまたは蛍光信号を検出できない大きい時間間隔を伴う。さらに、この方法は、非常に遅くかつ複雑である。
【００１６】
特許文献４に記載された方法の別の不利点は、例えば、使用される共焦点色センサは、その測定原理のために、短い測定時間で十分なトポグラフィ分解能を達成するために可能な限り広帯域で同時に非常に強い白色光源を必要とすることである。通常、ラマンまたは蛍光測定に使用されるレーザのような単色光源とは対照的に、強い広帯域光源は、普通は点光源ではなく、明らかに巨視的な広がりを有する。しかし、点光源からの光だけが最小の回折限界焦点に投射され得る。これは、実際問題として、回折限界ラマンまたは蛍光測定とは対照的に、共焦点色センサによるトポグラフィ測定の達成し得る横方向分解能を約１０μｍに制限する。トポグラフィ測定の横方向分解能の、回折限界ラマンおよび／または蛍光測定の横方向分解能に対する、およそ１桁の明白な差異は、特に、微細な構造または粗い多孔性表面の高分解能測定の場合に、ラマンまたは蛍光測定のための焦点面を、横方向に小さい試料のトポグラフィによって正確に追跡することができないという事実につながる。
【００１７】
特許文献４において示唆されているように、特にラマンまたは蛍光測定並びにトポグラフィ測定が同じレンズによって行われる場合には、ラマンおよび蛍光測定の両方、並びに共焦点色トポグラフィ測定が、可能な限り広いスペクトル周波数範囲、理想的には実際的に全可視スペクトル範囲を使用することが、さらに別の不利点である。従って、スペクトルの重なりを避けることが困難である。トポグラフィ測定並びにラマンおよび蛍光測定の波長範囲を、特許文献４に記載されているように、２つの重ならないスペクトル範囲に分離する場合には、これは、レンズが、全体の結果として得られる合計されたスペクトル範囲に対して最適化される必要があるので、共通の光学系のコーティングに対して極端に高い要求を課す。
【００１８】
従って、特許文献４はさらに、拡張された焦点法と呼ばれる、より簡単な単一経路法を導入している。第１の励起光源の他には、表面検出のための他の光源は不要である。その代わりに、試料がｚ方向において調節され、反射されたローリー光（Ｒａｌｅｉｇｈ  ｌｉｇｈｔ）に特徴的な信号が記録される。試料が焦点内にある場合、最大のローリー光が検出される。調節の間、ローリー光に特徴的な信号は、次に、その周りで試料トポグラフィを用いて調節が行われる、試料の平均ｚ位置を追跡するのに用いられる。従って、少なくとも中央ｚ位置が焦点内に残る。ラマンまたは蛍光測定は、全調節期間中に行われる。
【００１９】
このことは、試料が、比較的長い時間、ラマンまたは蛍光信号のための実際の焦点の外部に在り得ることを示し、それ故に、長い時間の間にラマンまたは蛍光信号が何も検出されないか、または望ましくないラマンまたは蛍光信号のみが検出され、弱いまたはぼやけたラマンまたは蛍光信号をもたらす。同時に、この調節は、関心のある試料表面の上下の領域もまた測定されるラマンまたは蛍光信号に寄与するので、測定の共焦点性を損なう。
【００２０】
従って、視野のより高い空間分解能および高深度などの共焦点光学顕微鏡法の証明された利点は、この方法においては失われている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】独国特許出願公開第１９９  ０２  ２３４（Ａ１）号
【特許文献２】独国特許出願公開第１０  ２００９  ０１５  ９４５（Ａ１）号
【特許文献３】米国特許第５,５８１,０８２（Ｂ１）号
【特許文献４】国際公開第２０１１／１３１３１１（Ａ１）号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
従って、本発明の目的は、従来技術の不利点、特に国際公開第２０１１／１３１３１１（Ａ１）号において提示された従来技術の不利点、を避けることができる方法および機器を提供することである。具体的には、不均一な試料表面についても簡単かつ迅速なラマンおよび／または蛍光測定を可能にする方法および機器が提供されることになる。さらに、本発明は、平面または表面、具体的には試料の表面を共焦点撮像することを、すなわち、共焦点顕微鏡法を用いて、可能にする。このことは、試料が、全測定中、例えば湾曲した試料の不十分に平坦な試料トポグラフィがあっても、常に焦点内に保持されることを必要とする。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明によれば、この目的は、平面または表面、具体的にはトポグラフィを有する表面を、共焦点顕微鏡法、具体的には共焦点ラマンおよび／または蛍光顕微鏡法を用いて撮像するための方法において解決され、ここで、この方法を実行するための機器は、ラマンおよび／または蛍光顕微鏡法のための励起放射を生成する第１の光源、並びに、第１の光源の波長範囲、または例えば、ラマン光／蛍光などの検出される波長範囲、とは一致しない狭い波長範囲の放射を生成するための第２の同時に活動状態にある光源を有する。この用途において、「同時に」は、第１および第２の光源が試料上に光を同時に、すなわち一緒に、放射すること、並びに、一方で焦点追跡のための試料のトポグラフィ測定、他方でラマンまたは蛍光測定、を同時に行うことができることを意味する。さらに、第２の光源の焦点面は、試料の表面内／上に、別個の制御可能な焦点位置によって移動させられ、このようにして決定された試料のトポグラフィは、制御可能焦点位置の制御信号から、第１の光源の焦点面を制御／調整するために用いられる。本発明による方法により、ラマンおよび／または蛍光測定は常に活動状態で焦点内に留まり、同時に行われる焦点追跡のための試料のトポグラフィ測定によって影響されない。従って、この方法は、ラマンおよび／または蛍光測定、並びにトポグラフィ測定が同時に行われることで特徴付けられる。第１の光源および第２の光源の両方は、それに限定することなしに、レーザ光源とすることができる。光源としてスーパールミネセントダイオード（ＳＬＥＤ：Ｓｕｐｅｒ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｄｉｏｄｅｓ）もまた可能であろう。レーザダイオードと同様に、ＳＬＥＤはｐ−ｎ接合に基づき、貫通方向において操作される。放射される平均波長は、バンドギャップに基づき、インジウムヒ素（ＩｎＡｓ）、インジウムガリウムヒ素（ＩｎＧａＡｓ）またはリン化インジウム（ＩｎＰ）などの種々異なる半導体材料を選択することによって影響され得る。レーザダイオードとは対照的に、ＳＬＥＤは、ミラーによる光学的フィードバックを示す共振器を有しない。
【００２４】
本発明による方法において、近似的に同じサイズの２つの横方向焦点、すなわち、第１および第２の焦点の焦点サイズが近似的に同じであり、それ故に同一の試料領域を評価することができる、２つの横方向焦点が用いられる。第１の焦点は、第１の光源、すなわち、ラマンまたは蛍光励起のためのレーザ光源、の焦点である。第２の焦点は、第２の光源の焦点であり、トポグラフィを決定するために役立つ。第２の光源の焦点面は、別個に制御可能な焦点位置によって試料の表面上に移動させられる。別個に制御可能な焦点位置は、例えば、電気的に合焦可能なレンズを用いて調節することができる。レンズの周期的励起が特に好ましく、これがその焦点位置をｚ方向において周期的に変化させる。第２の光源の焦点が、試料の表面内に位置するときはいつでも、信号が検出される。これは、共焦点原理の結果として、第２の光源の焦点が表面上に位置するときにのみ、光が、信号を検出することができるのに十分な強度で、検出器上に後方反射されるという事実による。制御可能な焦点位置の制御信号から決定された試料のトポグラフィは、試料を、共焦点ラマンおよび／または蛍光顕微鏡法の焦点面内に移動させるのに使用される。従って、本発明により、第２の光源の焦点面を連続的に評価することによって、試料をラマンおよび／または蛍光測定の共焦点面内に持続的に保持することが可能になる。同時に、ラマンおよび／または蛍光測定は、トポグラフィの決定および調整によって妨げられず、持続的に活動状態に留まることができる。このことは、追跡システムを提示するのみの国際公開第２０１１／１３１３１１（Ａ１）号による制御システムによって達成されるものと比べて、ラマンおよび／または蛍光信号を著しく増幅する。従って、本発明による方法を用いると、熱的および／または機械的ドリフトを補償することが可能となり、その結果、国際公開第２０１１／１３１３１１（Ａ１）号から知られる方法に比べて、熱的および機械的ドリフトが補償されるために、より長い測定時間が可能になる。高分解能測定、或いは、多孔質または粗い試料の測定もまた、トポグラフィ並びにラマンおよび／または蛍光測定の同等の横方向分解能によって大きく改善される。
【００２５】
例えば、測定中に乾燥するかまたは液体が蒸発する試料のラマンおよび／または蛍光測定もまた、本発明による調整が表面の連続的な追跡をもたらすために、可能となる。
【００２６】
本発明によれば、試料を、ラマンおよび／または蛍光測定のための焦点面内に保持するために、特定の調整／制御が使用される。
【００２７】
平面または表面、具体的には試料の表面を、共焦点顕微鏡法、具体的にはラマンおよび／または蛍光顕微鏡法によって、撮像するステップは、平面または表面、特に表面の複数の領域を、平面または表面、特に表面の領域を共焦点撮像するための機器を用いて、走査することによって達成される。
【００２８】
本出願において、表面のトポグラフィまたは試料トポグラフィによって意味されるものは、一例として、しかし断定的ではなく、共焦点ラマン顕微鏡に関して説明されることになる。そのような構成において、試料トポグラフィは、１ｎｍより大きく、特に１０ｎｍより大きく、好ましくは１００ｎｍより大きい試料の不均一さを意味する。試料の不規則性は試料表面のｚ方向における偏差であり、これはまた粗さとも呼ばれる。
【００２９】
走査される平面はｘ／ｙ平面である。ラマン顕微鏡または蛍光顕微鏡のｘ／ｙ平面内の分解能は、少なくとも０.１μｍ、好ましくは少なくとも１μｍ、好ましくは１μｍ〜５０μｍである。
【００３０】
本発明によれば、第２の光源の焦点面の位置は絶えず決定される。このために、第２の光源の焦点位置は、例えば、電気的合焦可能レンズを用いて変化させることができ、ここでそのレンズは、例えば２００Ｈｚ〜８００Ｈｚの周波数で周期的に励起されることが好ましい。焦点が電気的に変えられるレンズに加えて、レンズを機械的に周期的に動かすことも可能である。２００Ｈｚ〜８００Ｈｚに明示された周波数範囲の代替は、５０ｋＨｚ〜１ＭＨｚの周波数範囲である。第２の光源の焦点位置を変化させることによって、焦点面の位置を決定するとき、焦点の調節深さ、或いは、試料の荒さまたはトポグラフィの焦点位置を調節することが必要である。
【００３１】
試料は、第２の光源および、例えば、電気的合焦可能レンズを用いて決定された第２の光源の焦点面に基づいて、共焦点ラマンまたは蛍光顕微鏡法の共焦点面に移動させられる。この、ラマン／蛍光顕微鏡法の共焦点面内への移動は、従って、第２の光源の焦点位置の測定と同時にまたは同じ時間に行われる。
【００３２】
第２の光源、具体的には第２のレーザ光源を用い、電気的合焦可能レンズを用いて第２の光源の焦点を通過させることによって、例えば、ラマン顕微鏡を、ラマン顕微鏡の焦点面または共焦点面に持続的に保持し、および従って、顕著な、すなわち、非平面の試料トポグラフィの場合にも、共焦点ラマン顕微鏡法を動作させることが可能になる。
【００３３】
本発明の特に好ましい実施形態において、ラマンおよび／または蛍光顕微鏡法のための第１の光源の焦点面の再調節は、例えば、顕微鏡対物レンズと試料との間の距離を変えることによって、行われることが定められる。これは、試料テーブルおよび／または顕微鏡対物レンズを動かすことによって行うことができる。
【００３４】
本発明の別の好ましい実施形態は、第１および第２の光源からの光が、同じ顕微鏡対物レンズを通るように誘導されることである。
【００３５】
特に簡単な光学装置は、第２の光源の焦点位置が、基本的に、第２の光源の焦点が顕微鏡の光軸に沿って移動するように制御される場合に、実現することができる。
【００３６】
試料のトポグラフィの簡単な決定は、第２の光源の焦点位置が周期的に変えられ、試料のトポグラフィが第２の光源の反射または散乱された光の強度の極大の時間的推移によって決定される場合に、可能となる。
【００３７】
第２の光源の焦点位置が、ビーム経路内の、第２の光源のビーム経路のみに影響を与える合焦可能レンズによって制御される場合が有利である。焦点距離が電圧の印加によりまたは電流によって決定される電気的合焦可能レンズは、焦点位置を変化させるために使用できる特に簡単な設計である。
【００３８】
代替的に、第２の光源の焦点位置を、摺動レンズまたは数個のレンズを用いて制御することが可能である。
【００３９】
第２の光源の横方向の焦点サイズが、第１の光源の横方向の焦点サイズに基本的に対応する場合が特に好ましい。これは、一方でトポグラフィ決定が、他方でラマンまたは蛍光測定が、同じ試料範囲および同じ試料容積を評価するという利点を有する。他方、２つの光源の横方向の焦点サイズが大きく異なったとすると、特に、第１の光源の焦点サイズが、第２の光源の焦点サイズより著しく大きかったとすると、第１の光源の焦点サイズより小さい試料の細孔または粒子などの全てのトポグラフィ細部が、それらの小さいサイズのためにトポグラフィ決定から漏れ、従って、これらの試料位置におけるラマンまたは蛍光測定が焦点内に保持されないことになる。第１および第２の光源の、基本的に同一の横方向焦点サイズにより、理想的なトポグラフィ補償が達成され、その理由は正確に同じトポグラフィ細部が修正または釣り合わされるためであり、このことはまたラマンまたは蛍光測定によっても解決される。
【００４０】
制御／調整によって決定された、顕微鏡対物レンズと試料との間の距離の必要な変化は、試料を顕微鏡の光軸の方向に移動させることによって達成することができる。代替的に、顕微鏡を顕微鏡の光軸の方向に移動させることができ、または、顕微鏡対物レンズを顕微鏡の光軸の方向に移動させることができる。
【００４１】
第２の光源の波長範囲が、検出されるラマン散乱光および／または蛍光の波長範囲と重ならない場合が特に好ましい。
【００４２】
方法に加えて、本発明はさらに、ｘ／ｙ面内において表面の複数の領域を走査することにより試料の表面を撮像するための機器であって、焦点面内の表面の領域を検出器上に共焦点結像するための手段を備え、第１および第２の光源を有する、機器を提供する。
【００４３】
共焦点ラマンおよび／または蛍光顕微鏡の光、すなわち、第１の光源の光は、本発明により第１の波長範囲にあるように出現し、第２の光源の光は第２の波長範囲にあり、ここで、第１および第２の波長範囲は重ならない。第１の波長範囲は、普通、第１の波長範囲が、調査される試料の、放射される発光スペクトルおよび／またはラマンスペクトルの範囲によって定められるように、選択され、第２の波長範囲は、第１の波長範囲と重ならない第１の波長範囲より上またはより下にある。例えば、調査される試料の放射される発光スペクトルおよび／またはラマンスペクトルの第１の波長範囲は、３５０ｎｍ〜１０００ｎｍ、好ましくは５００ｎｍ〜１０００ｎｍ、特に５３２ｎｍ〜６５０ｎｍの範囲とすることができる。第２の波長範囲は、１０００ｎｍ〜２０００ｎｍ、好ましくは１０００ｎｍ〜１５００ｎｍの範囲とすることができる。
【００４４】
上述のように、共焦点顕微鏡法において、ラマンおよび／または蛍光測定のための単色の第１の光源の光が、試料に向かう途中にある対物レンズを通るように誘導され、従って、試料表面の基本的に一点に集束される。特に、機器が共焦点ラマン顕微鏡である場合、分光計が、試料によって放射される光、すなわち、ラマン光または蛍光をスペクトル分解すると定めることができる。そのようなスペクトル分解は、例えば、回折格子またはプリズムを有する分光計内で行うことができる。このように分解された光がＣＣＤカメラで記録される場合、試料によって散乱されたラマン光または蛍光の完全なスペクトルを記録することが可能になる。ラマン顕微鏡内でのラマン光のスペクトル分解の利点は、例えば、分光計内で回折格子を回転させることにより、測定のための検出器に対して任意のスペクトル範囲を選択することができることである。
【００４５】
機器、具体的には共焦点顕微鏡、好ましくは共焦点ラマンおよび／または共焦点蛍光顕微鏡は、ｘ／ｙ方向に移動させることができる試料テーブルを有することができ、これが、例えば、試料を走査することによって試料表面を撮像することを可能にする。代替的にまたは付加的に、試料の画像を得るために対物レンズまたは顕微鏡自体を移動させることができる。また、試料のスペクトル特性の空間マップを記録することも可能である。特に共焦点撮像により、非常に高い深さ分解能が達成される。
【００４６】
第２の光源を用い、特に電気的合焦可能レンズと組み合わせて、第２の光源の焦点面を、本発明により、別個に制御可能な焦点位置により試料の表面内／上に移動させることができる。制御可能な焦点位置の制御信号から、ラマン顕微鏡法のための第１の光源の焦点面を制御するために、試料のトポグラフィが決定される。この制御／調整は、試料表面を、走査中に共焦点ラマン顕微鏡法のための共焦点面内に絶えず保持することを可能にする。このために、試料のｘ−ｙ走査はｘ−ｙ−ｚ走査に拡張され、ここでｚ走査は試料トポグラフィを補償するのに役立つ。このために、試料テーブルおよび／またはレンズを、ｘ／ｙ方向に加えてｚ方向に移動させることができる。
【００４７】
国際公開第２０１１／１３１３１１（Ａ１）号とは対照的に、本発明による方法においては、制御／調整のための表面トポログラフィを初めに記録し、次いでその後に試料面を焦点内まで追跡する必要がない。その代わりに、第２の光源を用いた焦点位置の連続的な決定が、試料を同時に、共焦点ラマンおよび／または蛍光顕微鏡法のための対物レンズの焦点面内に移動させることを可能にする。これは、国際公開第２０１１／１３１３１１（Ａ１）号におけるような単なる追跡によるよりも遥かに強いラマンおよび／または蛍光信号が得られるという利点を有する。
【００４８】
本発明は、以下で、実施形態の例を参照しながら詳細に説明されることになる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１ａ】第１および第２の光源を有し、第１および第２の光源のビーム経路が描かれている、ラマン顕微鏡の主要な構造を示す。
【図１ｂ】第１および第２の光源を有し、ラマン測定のための第１の光源の励起焦点が、第２の光源の焦点と同じ対物レンズを通して誘導される、ラマン顕微鏡の主要な構造を示す。
【図２ａ】第２の光源のための電気的合焦可能レンズの調節および検出される信号を示す。
【図２ｂ】第２の光源のための電気的合焦可能レンズの調節および検出される信号を示す。
【図２ｃ】第１および第２の光源の焦点並びに不均一な試料表面の主要な表示を示す。
【図３】調査される試料のトポグラフィを示す。
【図４】調整によらずに、ラマンおよび／または蛍光分光法の共焦点内に試料を移動させる、図３による試料の画像を示す。
【図５】調整により、ラマンおよび／または蛍光分光法の共焦点内に試料を移動させる、図３による試料の画像を示す。
【図６】調整によるおよびよらないラマン信号の強度プロファイル、並びに試料の表面トポグラフィを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本発明は、以下で、特に散乱されるラマン光を用いて試料表面を撮像するための機器、いわゆる共焦点ラマン顕微鏡の実施形態の例に関して説明されるが、本発明はこれに限定されない。むしろ、本発明は全ての共焦点顕微鏡、具体的には共焦点光学顕微鏡または蛍光顕微鏡を含む。電気的合焦可能レンズを有する第２の光源はさらに、表面トポグラフィに応じて、試料をラマン顕微鏡法の共焦点面内に移動させるためにこのような共焦点顕微鏡のために使用することができる。
【００５１】
図１ａは、試料表面を記録するための共焦点ラマン顕微鏡の第１の実施形態の主要な構造を示す。共焦点ラマン顕微鏡法は、液体および固体コンポーネントの化学的性質および相を、約２００ナノメートルの回折限界分解能範囲に至るまで、分析するために使用することができる。試料を、蛍光顕微鏡法において使用されるような蛍光物質でマーク付けする必要はない。共焦点構造は、試料を、例えば、切断する必要なく、深さ方向に分析することを可能にする深さ分解能をもたらす。
【００５２】
共焦点顕微鏡法においては、点状光源、好ましくはレーザが、試料の一点に結像される。次に、このピクセルが、好ましくは同じ光学系により、検出器の前のピンホール上に焦点を合わせられる。ピンホール開口のサイズは、照明画像の回折限界画像に適合させる必要がある。この画像は、ここで、試料上の測定点を走査する、すなわち、試料を１点ずつ走査することによって生成される。このタイプの撮像により、レンズの焦点面だけが撮像に寄与するので、画像コントラストの著しい増加が達成される。さらに分解能は、回折点とピンホールの開口との畳み込みのために、√２から約λ／３までの因子だけ減少され得る。さらに、試料構造の３次元画像を、約１波長の距離分解能で得ることができる。
【００５３】
共焦点顕微鏡法に関して、例えば、独国特許出願公開第１９９ ０２ ２３４（Ａ１）号が引用される。
【００５４】
図１ａは、共焦点ラマン顕微鏡、例えば、ドイツ国、Ｄ−８９０８１ウルム所在のＷＩＴｅｃ  ＧｍｂＨのアルファ３００Ｒ型顕微鏡の可能な構造を示す。共焦点ラマン顕微鏡１により、第１の光源１０の光が、ビーム拡大器１４の後のビームスプリッタミラー１２において、試料１６の方向にある試料テーブル１８の上に差し向けられる。第１の光源、具体的には第１のレーザの光は、好ましくはラマンまたは蛍光発光のための励起光であり、３５０ｎｍ〜１０００ｎｍ、好ましくは５００ｎｍ〜１０００ｎｍの波長範囲にある。励起光の屈折された光ビーム１９は、適切な光学系２１によって、試料１６上の基本的に点状の領域２０に集束される。第１の光源、具体的にはレーザ光源１０の光は、試料１６の物質と相互作用する。一方で、後方散乱された、入射光と同じ波長のローリー光が生成される。この光はビームスプリッタ１２を介してエッジフィルタまたはノッチフィルタ１３の方へ屈折され、検出光学系には到達しない。
【００５５】
試料によって放射される、ローリー光とは異なる周波数または複数の周波数を有する光、すなわち、ラマン光はビームスプリッタ１２を通過する。ビームスプリッタ１２の後方で、ラマン光は参照番号２２でマーク付けされている。ラマン光２２はピンホール（図示せず）を介して光ファイバ３０内に注入され、分光計４０に達する。分光計４０の中で、ラマン光のビームが、適切な光学系によって再び広げられ、ビーム４２を生じ、これが回折格子型スペクトルフィルタ４４に当たる。回折格子型スペクトルフィルタ４４は光を、その波長によって異なる方向に回折し、それによりスペクトル信号がＣＣＤチップ５０上でその位置に依存して捕捉され得る。例えば、ＣＣＤチップ５０は１０２４個のチャネルを有し、その結果、ＣＣＤチップの合計で１０２４個のチャネルが異なる波長の光を吸収することができる。
【００５６】
試料の画像は、矢印１３０の方向においてｘ／ｙ面内で走査することによって創出される。
【００５７】
白色光源１２０からの光もまた、調節または観測のために試料１６上に注入することができる。
【００５８】
共焦点ラマン顕微鏡１はさらに第２の光源８０を備える。第２の光源８０は、共焦点ラマン顕微鏡１の第１の光源の他に存在する。第２の光源は、図１ａに示されるように、それ自体の独立したビーム経路を備え、これがミラー８２を介してレンズの光学系２１内に結合する。第２の光源のビーム経路は、第１のレーザ光源のラマンおよび／または蛍光測定のための励起光ビームと同じ光学系２１を介して試料に当たり、ミラー８２を介してビームスプリッタに差し向けられ、ビームスプリッタは第２の光源からの光をミラー８２および光学系２１の方向に通過させ、試料表面から後方反射された光が、光ダイオード８６に差し向けられるように、光学系２１によって表面から後方反射された光を分離する。そこで、反射信号が検出され、評価ユニット（図示せず）に与えられる。評価ユニットは、反射信号から、電気的合焦可能レンズ８４の励起信号に対する光ダイオード信号の極大の位相位置を決定する。この位相位置は、試料の表面の高さ変化の尺度となる。位相位置に応じて、次に試料テーブルが、試料がラマンおよび／または蛍光顕微鏡法の焦点面内に連続的に配置されるように、移動させられる。試料テーブルの進行は、位相位置に応じて制御または調整される。
【００５９】
さらに、第２の光源８０の後に、電気的合焦可能レンズ８４がビーム経路内に挿入され、これが第２の光源８０の焦点位置を変化させるように働く。電気的合焦可能レンズは、例えば、オプトチューン（Ｏｐｔｏｔｕｎｅ、スイス  ＡＧ、Ｂｅｒｎｓｔｒａｓｓｅ  ３８８，ＣＨ-８９５３  Ｄｉｅｔｉｋｏｎ）からの電気的に調節可能な、すなわち、合焦可能なレンズＥＬ−１６−４０ＴＣとすることができ、これは３０℃において−２〜＋３ジオプトリの範囲内の離調を可能にする。このレンズはまた、所望の位置へのレンズの調節のために使用することができる。電気的合焦可能レンズＥＬ−１６−４０ＴＣの口径は１６ｍｍであり、波長範囲４５０ｎｍ〜９５０ｎｍにおける透過率は９０％超である。説明された電気的レンズは例示的であって限定的ではない。電気的調整可能レンズに関するオプトチューン  スイスＡＧの技術データシートの開示内容は、本出願の開示内容に含まれる。電気的合焦可能レンズは、周期的に、特に２００〜５００Ｈｚの範囲の周波数で励起されることが好ましい。他の周波数もまた可能である。第２の光源の焦点位置は、電気的合焦可能レンズの周期的励起によって周期的に変化する。焦点面が試料内／上に留まるときは必ず、光ダイオード８６において信号が検出される。この信号から、電気的合焦可能レンズの励起信号に対する光ダイオード信号の位相位置を決定することができ、従って、試料トポグラフィから推測することができる。位相位置に応じて、次に試料テーブルが、試料の表面トポグラフィが釣り合わされて試料が常にラマンおよび／または蛍光顕微鏡法の焦点面内に存在するように、移動させられる。このことは図２ａ〜図２ｂに詳細に記載されている。
【００６０】
図１ｂは、共焦点ラマン顕微鏡の主要な構造を示し、ここでラマン測定用の第１の光源２０１０すなわちレーザからの光は、トポグラフィ測定のための第２の光源２０８０からの光と平行に誘導される。以前の図１ａにおけるのと同じコンポーネントは、２０００だけ増した参照数字でマーク付けされている。図１ｂに示されるラマン顕微鏡２００１においては、ラマン効果を励起するための第１の光源２０１０からの光と、第２の光源２０８０からの光との両方が、２０２９内の同じ光学系により、試料２０１６の基本的に同じ横方向領域２０２０に集束される。ラマン測定のための焦点位置、すなわち、第１の光源２０１０の励起レーザ光の共焦点は、ラマン効果の励起のために選択される。第１の光源２０１０からの光は、試料２０１６内に、ビームスプリッタ２０１２．１によって注入される。光ビーム２０１９はビームスプリッタ２０１２．１内で試料２０１６の方向に差し向け直され、さらに別のビームスプリッタ２０１２．２を通過する。試料との相互作用によって生成されたラマン光は、ビームスプリッタ２０１２．１およびビームスプリッタ２０１２．２の両方を通過し、ビームスプリッタ２０１２．２の後ろの参照数字２０２２で示される。ビームスプリッタ２０１２．２の後ろで、光ビーム２０２２は、検出器（図示せず）の前のピンホール２０１３の上に集束される。第２の光源の光路は参照数字２０９２でマーク付けされる。第２の光源２０８０から試料２０１６までの光路の中には、電気的合焦可能レンズ２０９４が配置される。
【００６１】
試料内のラマン効果を励起するために使用される光源２０１０からの光に加えて、さらに別のビームスプリッタ２０１２.２が第２の光源２０８０からの光２０９２を、ラマン効果を励起するための光と同じ光学系２０２９を通して試料２０１６に差し向ける。この光ビームは参照数字２０１９でマーク付けされる。試料に照射される第２の光源２０８０の光は、試料によって反射される。この反射光２０８９は、さらに別のビームスプリッタ２０１２.２を介して、再びビームスプリッタの上に差し向けられ、そこからダイオード２０９６の上に差し向けられる。ダイオード２０９６によって記録される信号は、評価ユニット２１００に与えられる。評価ユニット２１００は同時にスキャナの調整器であり、スキャナは光ダイオードの信号によってｚ方向に移動させられる。
【００６２】
光信号を捕捉するダイオード２０９６は、例えば、ＩｎＧａＡｓダイオードである。
【００６３】
ラマン効果の励起用の光と第２の光源の光との両方を同じ光学系を通過させるために、異なるスペクトル範囲または時分割多重機器を使用することが有利である。例えば、第２の光源の光を１０００ｎｍ〜２０００ｎｍの波長範囲にし、ラマン効果の励起のための光の波長を５３２ｎｍ、すなわち、３５０ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲にすることができる。そのような配置は、通常５３２ｎｍより上のラマンスペクトルの記録を可能にすることになる。もちろん、他の波長の選択も考えられるであろう。
【００６４】
図１ｂに示される構造は、試料表面をラマン測定の共焦点面内に、第２の光源２０８０および合焦可能レンズ２０９４、特に電気的合焦可能レンズを用いる調整方法によって、移動させることを可能にする。スキャナの調整および／または制御は、調整器および／または制御器によって行うことができる。
【００６５】
ラマン測定のための調整／制御に加えて、純粋なトポグラフィ測定のみも可能である。非接触トポグラフィ測定は、傷つきやすい試料、またはそのトポグラフィがＡＦＭのためには既に高過ぎる（＞５μｍ）試料、またはその横方向構造がピエゾスキャナの典型的な走査範囲、例えば、１００μｍより遥かに大きい試料に特に適している。
【００６６】
図２ａは、第２の光源のレンズの焦点の正弦変調を示す。この例において選択された変調周波数は４００Ｈｚである。レンズの焦点の正弦変調により、第２の光源の焦点位置もまた、図２ａに示されるように正弦曲線的に進む。図２ａにおいて、調査された表面の２つの高さが、正弦変調された進路内に描かれている。第１の高さはＨ１、第２の高さはＨ２とマーク付けされる。第２の光源の正弦曲線状焦点が試料の高さＨ１の表面上にある場合、共焦点条件が満たされ、図２ｂに示される信号１０００がダイオードにおいて検出される。信号１０００の位相位置は約１５°である。試料の高さが、例えば、熱膨張によって増加する場合、高さはＨ１からＨ２へ変化する。今度は、信号１０００の代わりに信号１１００が検出される。図２ｂに示されるように、信号１１００は、信号１０００に対して右方へ変化し、信号１１００の位相位置は３０°であり、第１の信号と第２の信号との間の位相位置の差異は１５°である。第２の光源の焦点が高さＨ２の表面に来るとき、信号１１００が再び検出される。従って、ダイオードにおいて検出された第２の光源の信号の位相変化は、試料の高さが変化する仕方の尺度となり、試料の高さの差異を補償するため、および試料をラマンおよび／または蛍光顕微鏡法のための第１の光源の焦点面に移動させるために、試料を制御または調整するための調整または制御変数として使用することができる。図２ｂに示されるように、光ダイオードにおける信号は、Ｈ１からＨ２への高さ変化において、１０００から１１００へ、右方へ（信号群１）および左方へ（信号群２）動く。しかし、調整のためには一方向における移動のみが用いられ、この場合、信号群１による右方への移動が用いられる。
【００６７】
図２ｃは、高さＨ試料を有する試料であって、高さＨ試料がラマン顕微鏡法の焦点の高さＨ焦点より低い試料を示す。第２の光源の焦点は参照数字４０００で示され、例えば、４１００と４２００との間の捕捉範囲内で正弦変調される。このことは、試料の高さＨ試料を第２の光源の焦点位置から決定することを可能にする。図示される例におけるように、例えば、Ｈ試料の後ろへのＨ焦点の深化により、高さが減少する場合、ラマン測定の焦点５０００は試料の外部にあることになる。第２の光源の焦点位置の限界４１００と４２００との間の正弦変調のために、高さＨ試料が検出され、位相位置によって、試料が、制御または調整により、ラマン測定の焦点５０００に戻される。Ｈ試料からＨ焦点への試料の移動は、参照数字１００００でマーク付けされている。
【００６８】
図３は、試料のトポログラフィを示す。この試料は、ｘ方向において５０００μｍの膨らみを有する。ｚ方向において、試料は±３０μｍの深さで湾曲している。
【００６９】
図４は、図３に示された高さプロファイルを有する試料の、共焦点ラマン顕微鏡法による画像であって、試料が動かされずおよび共焦点面内への試料の調整が行われなかった画像を示す。ラマン測定の焦点内に試料の狭縁領域のみがあり、その結果この領域のみが鮮明に撮像されていることが明瞭に分かる。撮像された鮮明な領域が明るい領域であり、ぼやけた領域は暗い。
【００７０】
図５は、図３に示された表面のラマン測定を示し、ここで図４とは対照的に、試料は、第２の光源の焦点により制御される仕方で共焦点面内に移動させられた。この結果は完全に鮮明な明るい画像である。
【００７１】
図６は、本発明による調整の効果を示す。図６は、試料の表面の進路を参照数字２０００で示す。試料の表面は、７０００μｍのｘ展開にわたって１００μｍの深さまたはｚ偏差を有する。曲線２１００は、調整なしのラマン強度を表す。曲線２１００から分かるように、ラマン信号は、試料がラマン測定の共焦点面内にあるときにだけ生じる。これはまさに２つの表面値に対する場合である。表面のより高いまたはより低い領域は共焦点面の外部にあり、信号を示さない。しかし、第２の光源を用いて、表面を常にラマンおよび／または蛍光測定の共焦点面内に保持することが、本発明による調整による第２の光源の焦点位置の評価によって、可能であるので、ラマン信号２２００が試料全体にわたって検出される。
【００７２】
図に示されように、調整によるラマン信号２２００は、試料が焦点内に調整なしに動かされるときに検出される２つのピーク２１００と同様に強度が大きい。このことは、焦点内の試料の信号に対応する信号が、調整の間、２０００の表面進路にも関わらず、試料全体にわたって得られることを意味する。
【００７３】
本発明は、第１に、試料の表面に関する情報を、共焦点顕微鏡法を用いて迅速かつ容易に得ることを可能にする機器を提供する。具体的には、これは第２の励起および検出経路を用いて達成され、第２の励起および検出経路は、共焦点主要測定を、最も難しい試料を用いても、持続的に焦点内に保持することを可能にする。表面トポグラフィは、第２の励起および検出経路にのみ影響を及ぼす合焦可能レンズを調節することによって決定することが好ましい。
【図１ａ】
2020509408.tif 000003
【図１ｂ】
2020509408.tif 000004
【図２ａ】
2020509408.tif 000005
【図２ｂ】
2020509408.tif 000006
【図２ｃ】
2020509408.tif 000007
【図３】
2020509408.tif 000008
【図４】
2020509408.tif 000009
【図５】
2020509408.tif 000010
【図６】
2020509408.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成31年3月28日(2019.3.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トポグラフィを有するサンプルの表面を、共焦点ラマンおよび／または蛍光顕微鏡法によって撮像する方法であって、ラマン散乱光および／または蛍光のための励起放射を生成するための第１の光源、並びに、第２の光源が準備され、
−  前記第１の光源は、第１の波長範囲内の光を放射し、前記第１の波長範囲の限界は、調査される前記サンプルの放射される発光スペクトルおよび／またはラマンスペクトルの限界によって定められ、
−  前記第１の光源からの光は、光学系によって前記サンプルの上に差し向けられ、
−  前記第２の光源は、第２の波長範囲内の光を放射し、前記第２の波長範囲は、前記第１の波長範囲と重なることなく前記第１の波長範囲の上または下にあり、
−  前記光学系および周期的に励起されるレンズを伴う前記第２の光源の光は、前記サンプルの表面上にもたらされ、結果として周期的な焦点が得られ、それにより、
−  前記サンプルの前記トポグラフィは、前記第２の光源の焦点面の信号、および、制御／調整機器を用いて検出された前記第２の光源の検出光から決定され、前記第１の光源の焦点は、この信号に基づき前記光学系によって追跡されかつ前記サンプルに適用され、前記第２の光源の周期的な焦点の変調範囲は、前記信号に基づき前記光学系によって追跡される、
ことを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記第１の光源の前記焦点面内への導入は、顕微鏡対物レンズとサンプルとの間の距離を変えることによって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１および第２の光源からの光は、同じ顕微鏡対物レンズを通して誘導されることを特徴とする、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記第２の光源の焦点面は周期的に変化させられ、前記サンプルの前記トポグラフィは、前記サンプルの前記表面において、前記第２の光源の反射された光および／または散乱された光の強度の極大の時間的推移から決定されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記周期的に励起されるレンズは、焦点距離が電圧の印加によりまたは電流によって制御される電気的合焦可能レンズであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
顕微鏡対物レンズとサンプルとの間の前記距離の変化は、前記サンプルを前記顕微鏡の光軸の方向に移動させることによって達成されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の機器、具体的にはラマン散乱光および／または蛍光のための励起放射を生成するための第１の光源は、前記第２の機器、具体的には前記第２の光源と同時に放射、具体的には光を放射することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の光源によって励起されたラマン散乱光および／または蛍光の測定、および、前記第２の光源による前記サンプルの前記トポグラフィの測定は、実質的に同時に起こることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の光源は、第１の焦点サイズを有する第１の焦点を備え、前記第２の光源は、第２の焦点サイズを有する第２の焦点を備え、前記第１および第２の焦点サイズは実質的に同一であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
トポグラフィを有するサンプルの表面を、共焦点ラマンおよび／または蛍光顕微鏡法によって撮像するための機器（１）であり、
ラマン散乱光および／または蛍光のための第１の光源、および第２の光源を備える、機器（１）であって、
−  前記第１の光源は第１の波長範囲の光を放射し、前記第１の波長範囲の限界は、調査される前記サンプルの放射される発光スペクトルおよび／またはラマンスペクトルの限界によって定められ、
−  前記第２の光源は第２の波長範囲の放射を放射し、前記第２の波長範囲は、前記第１の波長範囲と重なることなく前記第１の波長範囲の上または下にあり、
−  前記第１の光源および前記第２の光源からの光は、同じ光学系を通して誘導され、
−  前記機器は、前記第２の光源の焦点面を前記サンプルの表面内／上にもたらすための合焦可能レンズ、並びに、
前記第２の光源の前記焦点面の信号から前記サンプルのトポグラフィを決定し、この信号および前記第２の光源の検出された光に基づいて、前記サンプルを前記第１の光源の焦点面内に移動させる制御／調整機器、を備える、
ことを特徴とする、機器。
【請求項１１】
前記機器は、
共焦点ラマン顕微鏡、
共焦点蛍光顕微鏡、
共焦点ラマン／蛍光顕微鏡、
のうちの１つであることを特徴とする、請求項１０に記載の機器。
【請求項１２】
前記機器は、共焦点ラマン顕微鏡および／または蛍光顕微鏡であり、前記第１の光源を用いて前記サンプル内で光放射が励起され、前記機器は、前記サンプルによって放射された光子、具体的には放射されたラマンおよび／または蛍光の光子を検出するための検出器を備えることを特徴とする、請求項１１に記載の機器。
【請求項１３】
前記共焦点ラマンおよび／または蛍光顕微鏡は、光学要素、具体的には対物レンズ（２０２９）を備え、それにより、前記第１および／または第２の光源の光が前記サンプル上に集束されることを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の機器。
【請求項１４】
前記合焦可能レンズは、電気的合焦可能レンズまたは機械的変位可能レンズであることを特徴とする、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の機器。
【請求項１５】
前記第１の波長範囲は、３５０ｎｍ〜１０００ｎｍ、具体的には５００ｎｍ〜１０００ｎｍの波長を含み、前記第２の波長範囲は、１０００ｎｍ〜２０００ｎｍ、具体的には１０００ｎｍ〜１５００ｎｍの波長を含むことを特徴とする、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の機器。
【請求項１６】
前記機器は、昇降式テーブルおよび／またはピエゾ素子を有するテーブルを備えることを特徴とする、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の機器。
【請求項１７】
特に、多孔性および／または粗いサンプルのラマンおよび／または蛍光信号の高分解能測定のための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項１８】
特に、熱的および／または機械的ドリフトを伴うサンプルのラマンおよび／または蛍光信号の測定のための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項１９】
特に、乾燥するサンプルまたは蒸発する液体のラマンおよび／または蛍光信号の測定のための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項２０】
サンプルのラマンおよび／または蛍光信号並びに表面トポグラフィの同時測定のための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法の使用。
【国際調査報告】
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