(57)【要約】本発明は、診断学の分野に含まれ得る。本発明は、試料中のカンピロバクター属の細菌の検出のためのハイブリドーマ、抗体および試験デバイスを提供する。さらに、本発明は、カンピロバクター属の細菌を検出するための抗体の使用および方法を開示する。本発明の抗体は、飢餓細胞由来ＤＮＡ結合タンパク質（Ｄｐｓ）に特異的であり、免疫クロマトグラフィー試験デバイスにおいて用いられた際に、カンピロバクター属の細菌を検出するために用いられる他の抗体よりも少ない偽陽性およびより高い感度を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、カンピロバクター・コリおよび／またはカンピロバクター・ジェジュニのＤｐｓ（飢餓細胞由来ＤＮＡ結合タンパク質）に特異的に結合するモノクローナル抗体であって、ＶＬが、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＶＨが、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ここで、ＬＣＤＲ１は、ＳＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）であり、ＬＣＤＲ２は、ＲＴＳＮＬＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）であり、ＬＣＤＲ３は、ＱＱＷＳＧＹＰＦＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）であり、ＨＣＤＲ１は、ＧＦＳＬＴＳＳＧＶＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）であり、ＨＣＤＲ２は、ＶＩＷＲＧＧＳＴＤＹＮＡＡＦＭＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）であり、ＨＣＤＲ３は、ＮＹＹＹＧＴＳＰＤＹＦＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）である、上記抗体。
【請求項２】
抗体が、ＶＬおよびＶＨを含み、ＶＬが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７であり、ＶＨが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
抗体が、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、ＬＣが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９であり、ＨＣが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０である、先行する請求項のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４】
以下：
（ａ）Ｄｐｓ（飢餓細胞由来ＤＮＡ結合タンパク質）に特異的に結合する第１抗体；
（ｂ）Ｄｐｓ（飢餓細胞由来ＤＮＡ結合タンパク質）に特異的に結合する第２抗体；および
（ｃ）支持膜；
を含む免疫クロマトグラフィー試験デバイスであって、第１抗体が、支持膜上に固定されており、第２抗体が、標識されており、第１抗体が、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体であり、かつ／または第２抗体が、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体である、上記試験デバイス。
【請求項５】
第２抗体が、着色された合成ポリマー粒子および／またはコロイド性金属粒子で標識されている、請求項４に記載の試験デバイス。
【請求項６】
抗体が、ポリスチレンを含む着色された合成ポリマー粒子で標識されている、請求項５に記載の試験デバイス。
【請求項７】
分離された試料中のカンピロバクター属の細菌を検出するための方法であって、該試料を請求項４〜６のいずれか１項に記載の試験デバイスと接触させることを含む、上記方法。
【請求項８】
カンピロバクター属の細菌が、カンピロバクター・ジェジュニおよび／またはカンピロバクター・コリである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
分離された試料が、分離された便試料である、請求項７または８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
カンピロバクター属の細菌の検出のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体のインビトロでの使用。
【請求項１１】
カンピロバクター属の細菌が、カンピロバクター・ジェジュニおよび／またはカンピロバクター・コリである、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
免疫アッセイ試験デバイス、好ましくは請求項４〜６のいずれか１項に記載の免疫クロマトグラフィー試験デバイスの製造のための請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項１３】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体を産生する、ハイブリドーマ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断学の分野に含まれ得る。具体的には、本発明は、カンピロバクター属の細菌の飢餓細胞由来ＤＮＡ結合タンパク質（Ｄｐｓ）に特異的である抗体および前記の抗体を産生するハイブリドーマを提供する。その抗体は、免疫クロマトグラフィー試験デバイスにおいておよびカンピロバクター属の細菌を検出するための方法において用いられることができる。
【背景技術】
【０００２】
ヒトにおいて、カンピロバクター属の種による感染症の８５％〜９５％は、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）を含み、一方でカンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉ）は、その他の症例の大部分に関わっている。Ｃ．ジェジュニは、米国における、および欧州における食中毒の最も一般的な原因の１つである。症例の圧倒的大部分は、認識されたアウトブレイクの一部としてではなく孤立した事象として起こる。食品由来疾患アクティブサーベイランスネットワーク（ＦｏｏｄＮｅｔ）によるアクティブサーベイランスは、毎年集団中のそれぞれの１００，０００人に関して約１４の症例が診断されていることを示している。欧州食品安全機関は、２０１１年に、欧州連合において１年あたりおおよそ９００万のヒトカンピロバクター病の症例が存在すると推定した。
【０００３】
カンピロバクター属の種により引き起こされた食中毒は、重篤に衰弱させ得るが、生命を脅かすことは稀にしかない。それは、その後のギランバレー症候群の発現と関連付けられており、それは、通常は最初の疾患の２〜３週間後に発現する。最近のＣ．ジェジュニ感染症を有する個人は、１０００件の感染症あたり０．３件の比率でギランバレー症候群を発現し、それは、一般集団よりも約１００倍高い頻度である。
【０００４】
従って、カンピロバクター属の種を検出する必要性が、現在存在する。便試料中のカンピロバクター・ジェジュニの検出のための以前のデバイスは、カンピロバクター・ジェジュニの表面タンパク質を検出する免疫クロマトグラフィー試験デバイスの使用を含んでいた（ＪＰ５４６７２２８Ｂ２；ＪＰ２００９０７７６５８  （Ａ）; Granato et al., 2010. Comparison of Premier CAMPY Enzyme Immnunoassay (EIA), ProSpecT Campylobacter EIA, and Immuno Card STAT! CAMPY test with culture for laboratory diagnosis of campylobacter enteric infections. J.Clin. Microb. 4022-4027）。しかし、現在の検出デバイスは、偽陽性を引き起こし得る特異性の欠如に悩まされている（Bessede et al., 2011. New Methods for Detection of Campylobacters in Stool samples in comparation to culture. J.Clin. Microb. 941-944; Couturier et al., 2003. Detection of non -jejuni and campylobacter species from stool specimens with an immunochromatographic antigen detection assay. J. Clin Microbiol. (6):1935-7）。さらに、これらのデバイスは、感度の欠如に悩まされている可能性がある。
【０００５】
より少ない偽陽性をもたらし、かつ現在利用可能な試験デバイスよりも高感度である試験デバイスに関する必要性が、存在する。Ｃ．ジェジュニおよびＣ．コリの飢餓細胞由来ＤＮＡ結合タンパク質（Ｄｐｓ）に結合する抗体の使用により、本出願の発明者らは、より少ない偽陽性をもたらし、かつ現在利用可能な他のデバイスよりも高感度である試験デバイスを開発した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＪＰ５４６７２２８Ｂ２
【特許文献２】ＪＰ２００９０７７６５８  （Ａ）
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Granato et al., 2010. Comparison of Premier CAMPY Enzyme Immnunoassay (EIA), ProSpecT Campylobacter EIA, and Immuno Card STAT! CAMPY test with culture for laboratory diagnosis of campylobacter enteric infections. J.Clin. Microb. 4022-4027
【非特許文献２】Bessede et al., 2011. New Methods for Detection of Campylobacters in Stool samples in comparation to culture. J.Clin. Microb. 941-944
【非特許文献３】Couturier et al., 2003. Detection of non -jejuni and campylobacter species from stool specimens with an immunochromatographic antigen detection assay. J. Clin Microbiol. (6):1935-7
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図  図１：免疫クロマトグラフィー試験デバイスの図解。Ａ）細片の形態の免疫クロマトグラフィー試験デバイスの鳥瞰図。試験デバイスは、以下の要素を含む：吸収性材料（１）、支持膜（２）（検出区画（３）および対照区画（４）、試料添加区画（５）および標識された抗体を含むデバイスの区画（６）を有する）。矢印は、流れの方向を示す。Ｂ）細片の形態の免疫クロマトグラフィー試験デバイスの側面図。試験デバイスは、さらにプラスチックの支持体（７）を含む。（ｃ）免疫クロマトグラフィー試験デバイスの角度を有する側面図。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、Ｄｐｓに特異的に結合する抗体、本発明の抗体を産生するハイブリドーマならびに以下：（ａ）Ｄｐｓに特異的に結合する第１抗体、（ｂ）Ｄｐｓに特異的に結合する第２抗体および（ｃ）支持膜を含む免疫クロマトグラフィー試験デバイスを提供し、ここで、第１抗体は、支持膜上に固定されており、第２抗体は、標識されている。さらに、本発明は、試料を本発明の試験デバイスと接触させることを含む分離された試料中のカンピロバクター属の細菌を検出するための方法、カンピロバクター属の細菌の検出のための本発明の抗体の使用、および免疫アッセイ試験デバイスの製造のための本発明の抗体の使用を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
抗体
第一側面において、本発明は、Ｄｐｓに特異的に結合する抗体を提供する。
本明細書で用いられる際、用語“抗体”は、少なくとも１個の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質を指す。抗体という用語は、例えば完全長の成熟抗体および抗体の抗原結合フラグメントを含む。例えば、抗体分子は、重（Ｈ）鎖可変ドメイン配列（本明細書においてＶＨと略される）および軽（Ｌ）鎖可変ドメイン配列（本明細書においてＶＬと略される）を含み得る。別の例において、抗体は、２個の重（Ｈ）鎖可変ドメイン配列および２個の軽（Ｌ）鎖可変ドメイン配列を含み、それにより２個の抗原結合部位を形成し（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆｄ、Ｆｄ’、Ｆｖ、単鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）、単一可変ドメイン抗体、ダイアボディ（Ｄａｂ）（二価および二重特異性）およびキメラ（例えばヒト化）抗体）、それは、抗体全体の改変により生成されることができ、または組み換えＤＮＡ技術を用いて新規に合成されたものであることができる。これらの機能性抗体フラグメントは、それらのそれぞれの抗原または受容体と選択的に結合する能力を保持している。抗体および抗体フラグメントは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥを含むがそれらに限定されないあらゆるクラスからのものならびに抗体のあらゆる下位クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）からのものであることができる。本発明の抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであることができる。抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、ＣＤＲ移植抗体またはインビトロで生成された抗体であることもできる。抗体は、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４から選択された重鎖定常領域を有することができる。抗体は、例えばカッパまたはラムダから選択された軽鎖を有することもできる。抗原結合フラグメントの例は、以下のものを含む：（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメントであるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド結合により連結された２個のＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるダイアボディ（ｄＡｂ）フラグメント；（ｖｉ）ラクダ類またはラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）可変ドメイン；（ｖｉｉ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（例えばBird et al. (1988) Science 242:423-426;およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照）；（ｖｉｉｉ）単一ドメイン抗体。これらの抗体フラグメントは、当業者に既知の従来の技法を用いて得られ、フラグメントは、完全な抗体がスクリーニングされる方法と同じ方法で有用性に関してスクリーニングされる。
【００１１】
用語“抗体”は、完全な抗体を含む。抗体の定常領域は、抗体の特性を改変するために（例えばＦｃ受容体結合、抗体のグリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞機能または補体機能の１以上を増大または低下させるために）変化している、例えば変異していることができる。
【００１２】
抗体分子は、単一ドメイン抗体であることもできる。単一ドメイン抗体は、その相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である抗体を含むことができる。例は、重鎖抗体、天然に軽鎖を欠いている抗体、従来の４鎖抗体由来の単一ドメイン抗体、操作された抗体および抗体由来の骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）以外の単一ドメイン骨格を含むが、それらに限定されない。単一ドメイン抗体は、当該技術の単一ドメイン抗体のいずれであることもでき、またはあらゆる将来の単一ドメイン抗体であることができる。単一ドメイン抗体は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、魚類、サメ、ヤギ、ウサギおよびウシを含むがそれらに限定されないあらゆる種に由来することができる。本発明の別の側面によれば、単一ドメイン抗体は、軽鎖を欠く重鎖抗体として知られている天然存在単一ドメイン抗体である。そのような単一ドメイン抗体は、例えば国際公開第９４０４６７８号において開示されている。明確にするために、天然に軽鎖を欠いている重鎖抗体由来のこの可変ドメインは、本明細書においてそれを４鎖免疫グロブリンの従来のＶＨと区別するためにＶＨＨまたはナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）として知られている。そのようなＶＨＨ分子は、ラクダ科の種において、例えばラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカおよびグアナコにおいて産生された抗体に由来することができる。ラクダ科以外の他の種が、天然に軽鎖を欠く重鎖抗体を産生する可能性があり；そのようなＶＨＨは、本発明の範囲内である。
【００１３】
ＶＨおよびＶＬ領域は、“相補性決定領域”（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に細分されることができ、それは、より保存されており“フレームワーク領域”（ＦＲまたはＦＷ）と呼ばれる領域により散在させられている。
【００１４】
フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は、いくつかの方法により正確に定義されている（Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第５版,アメリカ合衆国保健福祉省, NIH Publication No.91-3242; Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol.196:901-917；およびＯｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用されているＡｂＭ定義を参照）。一般に、例えばAntibody Engineering Lab Manual（編者：Duebel, S.およびKontermann, R.Springer-Verlag, ハイデルベルグ）中のProtein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domainsを参照。
【００１５】
用語“相補性決定領域”および“ＣＤＲ”は、本明細書において用いられる際、抗原特異性および結合親和性を与える抗体可変領域内のアミノ酸の配列を指す。一般に、それぞれの重鎖可変領域中に３個のＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）およびそれぞれの軽鎖可変領域中に３個のＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）が存在する。
【００１６】
所与のＣＤＲの正確なアミノ酸配列境界は、いくつかの周知のスキームのいずれかを用いて決定されることができ、それは、Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 第５版  公衆衛生局、国立衛生研究所（メリーランド州ベセスダ）により記載されたスキーム（“Ｋａｂａｔ”番号付けスキーム）、Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948により記載されたスキーム（“Ｃｈｏｔｈｉａ”番号付けスキーム）を含む。本明細書において用いられる際、“Ｃｈｏｔｈｉａ”番号付けスキームに従って定義されたＣＤＲは、時々“超可変ループ”とも呼ばれる。
【００１７】
用語“モノクローナル抗体”は、本明細書において用いられる際、単一の分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、単一の結合特異性および特定のエピトープに関する親和性を示す。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術により、またはハイブリドーマ技術を使用しない方法（例えば組み換え的方法）により作製され得る。
【００１８】
その抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であることができる。他の態様において、抗体は、組み換え的に生成される、例えばファージディスプレイにより、または組合せ的方法により生成されることができる。好ましくは、抗体は、モノクローナル抗体である。
【００１９】
抗体を生成するためのファージディスプレイおよび組合せ的方法は、当該技術で既知である（例えば以下の文献に記載されている：Ladner et al. 米国特許第５，２２３，４０９号; Kang et al. 国際公開第９２／１８６１９号; Dower et al. 国際公開第９１／１７２７１号; Winter et al. 国際公開第９２／２０７９１号; Markland et al. 国際公開第９２／１５６７９号; Breitling et al. 国際公開第９３／０１２８８号; McCafferty et al. 国際公開第９２／０１０４７号; Garrard et al. 国際公開第９２／０９６９０号; Ladner et al. 国際公開第９０／０２８０９号; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137;およびBarbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982、その全ての内容は、参照により本明細書に援用される）。
【００２０】
一態様において、抗体は、完全ヒト抗体（例えばヒト免疫グロブリン配列から抗体を産生するように遺伝子操作されているマウス中で作られた抗体）または非ヒト抗体、例えば齧歯類（マウスまたはラット）、ヤギ、霊長類（例えばサル）、ラクダ抗体である。好ましくは、非ヒト抗体は、齧歯類（マウスまたはラット抗体）である。齧歯類抗体を生成する方法は、当該技術で既知である。
【００２１】
ヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスを用いて生成されることができる。対象の抗原で免疫されたこれらのトランスジェニックマウスからの脾臓細胞は、ヒトタンパク質からのエピトープに関する特異的な親和性を有するヒトｍＡｂを分泌するハイブリドーマを生成するために用いられる（例えば、Wood et al. 国際公開第９１／００９０６号, Kucherlapati et al. 国際公開第９１／１０７４１号; Lonberg et al. 国際公開第９２／０３９１８号; Kay et al. 国際公開第９２／０３９１７号; Lonberg, N. et al.1994 Nature 368:856-859; Green, L.L. et al.1994 Nature Genet. 7:13-21; Morrison, S.L. et al.1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Bruggeman et al. 1993 Year Immunol 7:33-40; Tuaillon et al.1993 PNAS 90:3720-3724; Bruggeman et al.1991 Eur J Immunol 21:1323-1326を参照）。
【００２２】
抗体は、可変領域、またはその一部、例えばＣＤＲが非ヒト生物、例えばラットまたはマウス中で生成される抗体であることができる。キメラ、ＣＤＲ移植およびヒト化抗体は、本発明の範囲内である。非ヒト生物、例えばラットまたはマウス中で生成され、次いで例えば可変フレームワークまたは定常領域においてヒト中での抗原性を低下させるために改変された抗体は、本発明の範囲内である。
【００２３】
キメラ抗体は、当該技術で既知の組み換えＤＮＡ技法により生成されることができる（Robinson et al., 国際特許公開第ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号; Akira, et al., 欧州特許出願第１８４，１８７号; Taniguchi, M., 欧州特許出願第１７１，４９６号; Morrison et al., 欧州特許出願第１７３，４９４号; Neuberger et al., 国際公開第８６／０１５３３号; Cabilly et al. 米国特許第４，８１６，５６７号; Cabilly et al., 欧州特許出願第１２５，０２３号; Better et al. (1988 Science 240:1041-1043); Liu et al. (1987) PNAS 84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol.139:3521-3526; Sun et al. (1987) PNAS 84:214-218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res.47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449;およびShaw et al., 1988, J. Natl Cancer Inst.80:1553-1559を参照）。
【００２４】
ヒト化またはＣＤＲ移植抗体は、ドナーＣＤＲで置き換えられた少なくとも１または２個であるが一般に３個全部の（免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖の）レシピエントＣＤＲを有するであろう。その抗体は、非ヒトＣＤＲの少なくとも一部で置き換えられていることができ、またはＣＤＲの一部のみが、非ヒトＣＤＲで置き換えられていることができる。ヒト化抗体のＤｓｐへの結合に必要とされる数のＣＤＲを置き換えさえすれば十分である。好ましくは、ドナーは、齧歯類抗体、例えばラットまたはマウス抗体であると考えられ、レシピエントは、ヒトフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークであろう。典型的には、ＣＤＲを提供する免疫グロブリンは、“ドナー”と呼ばれ、フレームワークを提供する免疫グロブリンは、“アクセプター”と呼ばれる。一態様において、ドナー免疫グロブリンは、非ヒト（例えば齧歯類）免疫グロブリンである。アクセプターフレームワークは、天然存在（例えばヒト）フレームワークもしくはコンセンサスフレームワークまたはそれに対して約８５％以上、好ましくは９０％、９５％、９９％以上同一である配列である。
【００２５】
本明細書において用いられる際、用語“コンセンサス配列”は、関連する配列のファミリー中で最も頻繁に存在するアミノ酸（またはヌクレオチド）から形成された配列を指す（例えばWinnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, ヴァインハイム、ドイツ 1987)を参照）。タンパク質のファミリーにおいて、コンセンサス配列中のそれぞれの位置は、そのファミリー中でその位置において最も頻繁に存在するアミノ酸で占められている。２種類のアミノ酸が等しい頻度で存在する場合、両方がコンセンサス配列中に含まれることができる。“コンセンサスフレームワーク”は、コンセンサス免疫グロブリン配列中のフレームワーク領域を指す。
【００２６】
抗体は、当該技術で既知の方法によりヒト化されることができる（例えばMorrison, S. L., 1985, Science 229:1202-1207, Oi et al.による1986, BioTechniques 4:214、ならびにQueen et al.による米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許第５，６９３，７６１号および米国特許第５，６９３，７６２号を参照、その全ての内容は、参照により本明細書に援用される）。
【００２７】
ヒト化またはＣＤＲ移植抗体は、ＣＤＲ移植またはＣＤＲ置換により生成されることができ、ここで、免疫グロブリン鎖の１個、２個または全部のＣＤＲが、置き換えることができる。例えば米国特許第５，２２５，５３９号; Jones et al.1986 Nature 321:552-525; Verhoeyan et al.1988 Science 239:1534; Beidler et al.1988 J. Immunol.141:4053-4060; Winter 米国特許第５，２２５，５３９号を参照、その全ての内容は、参照により明確に本明細書に援用される。Ｗｉｎｔｅｒは、ＣＤＲ移植法を記載しており、それは、本発明のヒト化抗体を調製するために用いられることができる（１９８７年３月２６日に出願された英国特許出願第２１８８６３８Ａ号；Winter 米国特許第５，２２５，５３９号、その内容は、参照により明確に援用される）。
【００２８】
特定のアミノ酸が置換、削除または付加されているヒト化抗体も、本発明の範囲内である。ドナーからのアミノ酸を選択するための基準は、米国特許第５，５８５，０８９号、例えば米国特許第５，５８５，０８９号の第１２〜１６欄、例えば米国特許第５，５８５，０８９号の第１２〜１６欄において記載されており、その内容は、参照により本明細書に援用される。抗体をヒト化するための他の技法が、１９９２年１２月２３日に公開されたPadlan et al. 欧州特許第５１９５９６  Ａ１号において記載されている。
【００２９】
抗体は、単鎖抗体であることができる。単鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、設計されることができる（例えば、Colcher, D. et al. (1999) Ann N Y Acad Sci 880:263-80;およびReiter, Y. (1996) Clin Cancer Res 2:245-52を参照）。単鎖抗体は、同じ標的タンパク質の異なるエピトープに関する特異性を有する多価抗体を生成するために二量体化または多量体化されることができる。
【００３０】
さらに他の態様において、抗体は、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥの重鎖定常領域から選択される；特に例えば（例えばヒトの）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の重鎖定常領域から選択される重鎖定常領域を有する。別の態様において、抗体は、例えば（例えばヒトの）カッパまたはラムダの軽鎖定常領域から選択される軽鎖定常領域を有する。定常領域は、抗体の特性を改変するために（例えばＦｃ受容体結合、抗体のグリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞機能および／または補体機能の１以上を増大または低下させるために）変更されている、例えば変異していることができる。一態様において、抗体は、エフェクター機能を有し、補体を固定することができる。他の態様において、抗体は、エフェクター細胞を招集せず、補体も固定しない。別の態様において、抗体は、Ｆｃ受容体に結合する低減した能力を有するか、または能力を有しない。例えば、それは、Ｆｃ受容体への結合を支持しないイソ型もしくは亜型、フラグメントまたは他の変異体であり、例えば、それは、変異した、または欠失したＦｃ受容体結合領域を有する。
【００３１】
抗体定常領域を変化させるための方法は、当該技術で既知である。変化した機能、例えばエフェクターリガンド、例えば細胞上のＦｃＲまたは補体のＣ１構成要素に関する変化した親和性は、抗体の定常部分中の少なくとも１個のアミノ酸残基を異なる残基で置き換えることにより生成されることができる（例えば、欧州特許第３８８，１５１  Ａ１号、米国特許第５，６２４，８２１号および米国特許第５，６４８，２６０号を参照、その全ての内容は、参照により本明細書に援用される）。マウスまたは他の種の免疫グロブリンに適用された場合にこれらの機能を低減または除去するであろう類似のタイプの変化が、記載され得る。
【００３２】
抗体は、誘導体化される、または別の機能性分子（例えば別のペプチドまたはタンパク質）に連結されることができる。本明細書で用いられる際、“誘導体化された”抗体分子は、改変されている抗体分子である。誘導体化の方法は、蛍光部分、放射性ヌクレオチド、毒素、酵素または親和性リガンド、例えばビオチンの付加を含むが、それらに限定されない。従って、本発明の抗体分子は、本明細書で記載される抗体の誘導体化された、または他の方法で改変された形態を含むことが意図されている（イムノアドヘシン分子を含む）。例えば、抗体分子は、他の分子実体、例えば別の抗体（例えば二重特異性抗体またはダイアボディ）、検出可能な薬剤、細胞毒性薬剤、医薬および／または抗体もしくは抗体部分の別の分子（例えばストレプトアビジンコア領域またはポリヒスチジンタグ）との会合を媒介することができるタンパク質もしくはペプチドに（化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合的会合または他の方法により）機能的に連結されることができる。
【００３３】
誘導体化された抗体分子の１タイプは、（例えば二重特異性抗体を作製するために、同じタイプの、または異なるタイプの）２個以上の抗体を架橋することにより生成される。適切な架橋剤は、ヘテロ二官能性であり適切なスペーサーにより隔てられた２つの別々に反応する基を有する架橋剤（例えばｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）またはホモ二官能性である架橋剤（例えばジスクシンイミジルスベレート）を含む。そのようなリンカーは、Pierce Chemical Company, Rockford, Illから入手可能である。
【００３４】
抗体分子は、別の分子実体、典型的には標識または療法的（例えば細胞毒性または細胞増殖抑制性）薬剤もしくは部分にコンジュゲートされていることができる。放射性同位体は、診断または療法的適用において用いられることができる。そのような放射性同位体は、ヨウ素（１３１Ｉまたは１２５Ｉ）、イットリウム（９０Ｙ）、ルテチウム（１７７Ｌｕ）、アクチニウム（２２５Ａｃ）、プラセオジミウム、アスタチン（２１１Ａｔ）、レニウム（１８６Ｒｅ）、ビスマス（２１２Ｂｉまたは２１３Ｂｉ）、インジウム（１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９ｍＴｃ）、リン（３２Ｐ）、ロジウム（１８８Ｒｈ）、硫黄（３５Ｓ）、炭素（１４Ｃ）、トリチウム（３Ｈ）、クロム（５１Ｃｒ）、塩素（３６Ｃｌ）、コバルト（５７Ｃｏまたは５８Ｃｏ）、鉄（５９Ｆｅ）、セレニウム（７５Ｓｅ）、またはガリウム（６７Ｇａ）を含むが、それらに限定されない。例えば診断における使用のための標識として有用な放射性同位体は、ヨウ素（１３１Ｉまたは１２５Ｉ）、インジウム（１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９ｍＴｃ）、リン（３２Ｐ）、炭素（１４Ｃ）およびトリチウム（３Ｈ）または上記で列挙された療法用同位体の１以上を含む。
【００３５】
本発明は、放射性標識された抗体分子およびその同じものを標識する方法を提供する。一態様において、抗体分子を標識する方法が、開示される。その方法は、抗体分子をキレート剤と接触させ、それによりコンジュゲートした抗体を生成することを含む。コンジュゲートした抗体は、放射性同位体、例えば１１１インジウム、９０イットリウムおよび１７７ルテチウムで放射性標識され、それにより標識された抗体分子を生成する。
【００３６】
用語“Ｄｐｓ”または“飢餓細胞由来ＤＮＡ結合タンパク質”は、フェリチンスーパーファミリーからのタンパク質を指し、それは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベース中の受入番号Ｑ０Ｐ８９１（Ｃ．ジェジュニ）および／またはＡ０Ａ０Ｑ２ＪＢＵ３（Ｃ．コリ）の下での登録により特性付けられることができる。Ｄｐｓは、好ましくはＣ．ジェジュニのＤｐｓおよび／またはＣ．コリのＤｐｓを指す。
【００３７】
好ましい態様において、抗体は、Ｄｐｓの非存在下ではサンドイッチ免疫アッセイにおいて信号を一切生成せず、かつ／または抗体は、サンドイッチ免疫アッセイにおいて用いられた際に３ｎｇ／ｍｌ未満のＤｐｓを検出することができる。好ましくは、サンドイッチ免疫アッセイは、免疫クロマトグラフィーアッセイである。より好ましくは、サンドイッチ免疫アッセイにおいて用いられる２つの抗体は、本発明の抗体である。実施例の表１において、ＣＬ３０Ｃａｍｐとの組み合わせでのＣＬ３０Ｃａｍｐは、ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡを含む試料が免疫クロマトグラフィー試験デバイスに適用された際にバックグラウンドノイズを生じない。実施例の表２および３において、免疫クロマトグラフィー試験デバイスは、３ｎｇ／ｍｌ未満のＣ．ジェジュニおよびＣ．コリ由来のＤｐｓを検出することが示されている。
【００３８】
好ましい態様において、抗体は、サンドイッチ免疫アッセイ、好ましくは免疫クロマトグラフィーアッセイにおいて用いられた際に３ｎｇ／ｍｌ未満のＤｐｓを検出することができる。好ましくは、抗体は、２または１．５ｎｇ／ｍｌ未満のＤｐｓを検出することができる。より好ましくは、抗体は、１ｎｇ／ｍｌ未満のＤｐｓを検出することができる。
【００３９】
好ましい態様において、抗体は、天然または組み換えＤｐｓを用いて動物を免疫することにより得られるか、または得ることができる。代替の態様において、抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２を含む免疫原で動物を免疫することにより得られるか、または得ることができる。好ましい態様において、抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に特異的に結合する。
【００４０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１は、Ｃ．ジェジュニのＤｐｓであり、以下の配列を有する：
【００４１】
【化１】
2020536117.tif 000002
【００４２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２は、Ｃ．コリのＤｐｓであり、以下の配列を有する：
【００４３】
【化２】
2020536117.tif 000003
【００４４】
好ましい態様において、抗体は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ここで、前記のＶＬは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＶＨは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ここで、ＬＣＤＲ１は、ＳＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）であり、ＬＣＤＲ２は、ＲＴＳＮＬＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）であり、ＬＣＤＲ３は、ＱＱＷＳＧＹＰＦＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）であり、ＨＣＤＲ１は、ＧＦＳＬＴＳＳＧＶＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）であり、ＨＣＤＲ２は、ＶＩＷＲＧＧＳＴＤＹＮＡＡＦＭＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）であり、ＨＣＤＲ３は、ＮＹＹＹＧＴＳＰＤＹＦＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）である。
【００４５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７は、ＣＬ３０Ｃａｍｐ中に存在するＶＬフラグメントであり、以下の配列を有する：
【００４６】
【化３】
2020536117.tif 000004
【００４７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８は、ＣＬ３０Ｃａｍｐ中に存在するＶＨフラグメントであり、以下の配列を有する：
【００４８】
【化４】
2020536117.tif 000005
【００４９】
好ましい態様において、抗体は、ＶＬおよびＶＨを含み、ここで、ＶＬは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７であり、ＶＨは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８である。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９は、ＣＬ３０Ｃａｍｐ中に存在するＬＣであり、以下の配列を有する：
【００５０】
【化５】
2020536117.tif 000006
【００５１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０は、ＣＬ３０Ｃａｍｐ中に存在するＨＣであり、以下の配列を有する：
【００５２】
【化６】
2020536117.tif 000007
【００５３】
好ましい態様において、抗体は、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、ＬＣは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９であり、ＨＣは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０である。好ましい態様において、抗体は、２本のＬＣおよび２本のＨＣを含み、ここで、ＬＣは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９であり、ＨＣは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０である。
【００５４】
好ましい態様において、抗体は、モノクローナル抗体である。
抗Ｄｐｓ抗体は、標識されることができる。標識は、あらゆる通常の方法を用いることにより実施されることができる。標識のために用いられる標識物質は、好ましくは不溶性粒子である。適切な粒子の例は、以下のものを含む：合成ポリマー、例えばラテックス、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、スチレン−ブタジエンコポリマー、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、スチレン−メタクリレートコポリマー、ポリメタクリル酸グリシジルおよびアクロレイン−エチレングリコールジメタクリレートコポリマーを色素分子で標識することにより得られた着色された合成ポリマー粒子；コロイド性金属粒子（金、銀、銅、鉄、白金、パラジウムおよびそれらの混合物（例えば金および白金の混合物、金および銀の混合物ならびにパラジウムおよび白金の混合物））；ならびに赤血球。好ましくは、粒子は、変化が視覚的検査により容易かつ迅速にチェックされることを可能にする。着色された合成ポリマー粒子またはコロイド性金属粒子は、この目的のために用いられることができる。粒子は、着色された合成ポリマー粒子に関して例えば１５〜４００ｎｍ、好ましくは１００〜４００ｎｍ、またはコロイド性金属粒子に関して３０〜８０ｎｍの粒径を有する。コロイド性金属粒子は、商業的に入手可能な製品であり、または通常の方法を用いることにより調製されることができる。
【００５５】
コロイド性金属粒子で標識する場合、０．１〜１００ｍｇ、好ましくは０．５〜２０ｍｇの抗Ｄｐｓ抗体が、典型的には１Ｌのコロイド性金属粒子溶液に添加され（典型的には５４０ｎｍにおいて約２．０の吸光度）、その混合物は、冷蔵され、または室温で５分間〜２４時間攪拌される。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；典型的には０．０１〜１０ｇ、好ましくは０．１〜２ｇ）でのブロッキング後、溶液は、遠心分離され、結果として沈殿がコロイド性金属粒子で標識された抗Ｄｐｓ抗体として得られる。
【００５６】
好ましい態様において、抗体は、着色された合成ポリマー粒子および／またはコロイド性金属粒子で標識される。好ましくは、着色された合成ポリマー粒子は、ポリスチレンを含む。
【００５７】
免疫クロマトグラフィー試験デバイス
第２側面において、本発明は、以下のものを含む免疫クロマトグラフィー試験デバイスを提供し：（ａ）Ｄｐｓに特異的に結合する第１抗体、（ｂ）Ｄｐｓに特異的に結合する第２抗体、および（ｃ）支持膜、ここで、第１抗体は、支持膜上に固定されており、第２抗体は、標識されている。
【００５８】
本明細書で用いられる際、用語“固定する”は、抗体を支持体、例えば膜の上に、その抗体がもはや支持体上のその位置から動くことができないように取り付けることを指す。第１抗体は、捕捉抗体であり、支持体上に固定されることにより検出区画を構成する。本明細書で用いられる際、“検出区画”は、第２抗体に取り付けられている、または付着している試料抗原を捕捉することにより抗原の存在が検出される部位を指す。
【００５９】
支持膜は、第１抗体が静電相互作用、疎水性相互作用または化学的カップリングにより固定されることを可能にするあらゆる材料のものであることができ、その上で物質、例えば試料および第２抗体が、検出部位へと移動することができる。適切な支持膜の例は、ニトロセルロース、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）およびアセチルセルロースを含む。
【００６０】
好ましい態様において、支持膜は、試料が適切に現像されているかどうかをチェックするための対照区画を含む。対照物質に結合することができる物質が、対照区画上に固定されている。支持体上の検出区画および対照区画の位置は、特に制限されない。典型的には、対照区画は、検出区画の下流である。
【００６１】
本発明の試験デバイスにおいて、デバイスの試料添加区画上に滴加された液体試料は、第２抗体を含むデバイスの区画に向かって毛管作用で運ばれ（ｗｉｃｋｓ）、試料および標識された抗体の混合物は、支持膜を通って移動し、信号が、検出部位において発現する（図１Ａ参照）。抗原および標識された抗体は、試料がＤｐｓを含有する場合、免疫複合体を形成する。検出区画において、第１抗体は、その複合体を抗原抗体相互作用により捕捉し、コンジュゲートが蓄積し、色を発する。次いで、試料中の抗原の存在または非存在は、検出区画における色の程度を視覚的にチェックすることにより決定され得る。支持体が対照区画を有する場合、試験デバイスは、さらに第２抗体を含むデバイスの区画の中または隣りに対照の標識された物質を含むことができる。対照の標識された物質は、対照区画において対照の標識された物質に結合することができる物質により捕捉されることができ、対照の標識された物質が蓄積し、色を発する。第２抗体も対照の標識された物質として用いられる場合、試料中の抗原と複合体を形成しなかった残留する第２抗体は、検出部位を通過し、下流の対照区画において固定されている物質により捕捉される。標識された抗体が蓄積し、色を発する。
【００６２】
一態様において、第１抗体は、本発明の抗体、すなわち前記で開示された抗体の態様のいずれか１つである。代替の態様において、第２抗体は、本発明の抗体である。好ましい態様において、第１および第２抗体の両方が、本発明の抗体である。より好ましくは、第１および第２抗体は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ここで、前記のＶＬは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ＶＨは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３ポリペプチドを含み、ここで、ＬＣＤＲ１は、ＳＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）であり、ＬＣＤＲ２は、ＲＴＳＮＬＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）であり、ＬＣＤＲ３は、ＱＱＷＳＧＹＰＦＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）であり、ＨＣＤＲ１は、ＧＦＳＬＴＳＳＧＶＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）であり、ＨＣＤＲ２は、ＶＩＷＲＧＧＳＴＤＹＮＡＡＦＭＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）であり、そしてＨＣＤＲ３は、ＮＹＹＹＧＴＳＰＤＹＦＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）である。さらにもっと好ましくは、第１および第２抗体は、ＶＬおよびＶＨを含み、ここで、ＶＬは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７であり、ＶＨは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８である。より好ましくは、第１および第２抗体は、ＬＣおよびＨＣを含み、ここで、ＬＣは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９であり、ＨＣは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０である。
【００６３】
好ましい態様において、第２抗体は、好ましくは着色された合成ポリマー粒子および／またはコロイド性金属粒子で標識されている。より好ましくは、第２抗体は、着色された合成ポリマー粒子で標識されている。
【００６４】
方法
第３側面において、本発明は、分離された試料中のカンピロバクター属の細菌を検出するための方法を提供し、それは、試料を本発明の試験デバイスと接触させることを含む。
【００６５】
好ましい態様において、カンピロバクター属の細菌は、カンピロバクター・ジェジュニおよび／またはカンピロバクター・コリ種の細菌である。
好ましい態様において、分離された試料は、分離された便試料である。便試料は、便試料をｐＨ８．４のトリス塩基緩衝液中で分散させることにより調製されることができ、その後、試料を本発明の試験デバイスと接触させる。
【００６６】
抗体の使用
第４側面において、本発明は、カンピロバクター属の細菌の検出のための本発明の抗体の使用を提供する。好ましくは、カンピロバクター属の細菌は、カンピロバクター・ジェジュニおよび／またはカンピロバクター・コリ種の細菌である。
【００６７】
好ましい態様において、本発明の抗体は、便試料中のカンピロバクター属の細菌を検出するために用いられる。好ましくは、カンピロバクター属の細菌は、カンピロバクター・ジェジュニおよび／またはカンピロバクター・コリ種の細菌である。
【００６８】
第５側面において、本出願は、免疫アッセイ試験デバイスの製造のための本発明の抗体の使用を提供する。用語“免疫アッセイ試験デバイス”は、少なくとも１種類の抗体を含むあらゆる試験デバイスを指すことができる。試験デバイスの例は、免疫クロマトグラフィー試験デバイス、ＥＬＩＳＡ試験デバイスおよび免疫沈降試験デバイスを含む。次いで、免疫アッセイ試験デバイスは、試料を免疫アッセイ試験デバイスと接触させることを含む分離された試料中のカンピロバクター属の細菌を検出するための方法において用いられることができる。好ましくは、カンピロバクター属の細菌は、カンピロバクター・ジェジュニおよび／またはカンピロバクター・コリ種の細菌である。より好ましくは、カンピロバクター属の細菌は、カンピロバクター・ジェジュニおよび／またはカンピロバクター・コリ種の細菌であり、分離された試料は、分離された便試料である。
【００６９】
好ましい態様において、本発明の抗体は、本発明の免疫クロマトグラフィー試験デバイスを製造するために用いられる。
ハイブリドーマ
第６側面において、本発明は、本発明の抗体を産生するハイブリドーマを提供する。
【００７０】
モノクローナル抗体は、Ｄｐｓ由来抗原を用いてマウスを免疫することにより生成されることができる。対象の抗原で免疫されたこれらのマウスからの脾臓細胞は、エピトープに関する特異的親和性を有するｍＡｂを分泌するハイブリドーマを生成するために用いられる（例えば、Wood et al. 国際公開第号９１／００９０６号、Kucherlapati et al. 国際公開第号９１／１０７４１号; Lonberg et al. 国際公開第号９２／０３９１８号; Kay et al. 国際公開第号９２／０３９１７号; Lonberg, N. et al.1994 Nature 368:856-859; Green, L.L. et al.1994 Nature Genet. 7:13-21; Morrison, S.L. et al.1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Bruggeman et al. 1993 Year Immunol 7:33-40; Tuaillon et al.1993 PNAS 90:3720-3724; Bruggeman et al.1991 Eur J Immunol 21:1323-1326を参照）。
【実施例】
【００７１】
実施例１：Ｄｐｓに特異的に結合するモノクローナル抗体の生成
ＣＬ３０Ｃａｍｐモノクローナル抗体を、同じ名前のハイブリドーマから得た。簡潔には、モノクローナル抗体ＣＬ３０Ｃａｍｐを産生するハイブリドーマを、当該技術で既知の標準的なプロトコルを実施することにより得た（KOEHLER G Milstein C Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity Nature 1975 Aug 7 0028-0836 256 5517 495-497）。
【００７２】
ＢＡＬＢ／ｃ型マウスを、精製された天然Ｄｐｓで免疫した（精製された天然Ｄｐｓは、Ishikawa et al., 2003. J. Bacteriol. 185(3): 1010-1017において記載された方法により得られた）。免疫されたマウスからのリンパ球を、骨髄腫細胞株、具体的にはＳＰ２０細胞株と融合させ、得られたハイブリドーマを、Ｄｐｓに結合する抗体を産生するクローンを見付けるためにＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。ＥＬＩＳＡを実施するため、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルを１００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９）中のウサギポリクローナル抗Ｄｐｓ抗体で３７℃で２時間コートした。ウェルを洗浄し、次いで１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含有するＰＢＳ中のＤｐｓ溶液を添加した。ウェルを再度洗浄し、次いでハイブリドーマ細胞株培養物の上清をそれぞれのウェルに添加した。Ｄｐｓに結合することができる抗体の存在は、抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および対応する基質を用いて明らかにされた。
【００７３】
Ｄｐｓに関する高い特異性および親和性を有する抗体を分泌したハイブリドーマを選択した。選択されたハイブリドーマの中で、熱的ストレス試験において有利な性能を示した良好な力価の抗体を産生するハイブリドーマを、さらに選択した。
【００７４】
抗体を、当該技術で一般的である方法を用いるプロテインＡ親和性クロマトグラフィーを用いて精製した（GE Healthcare Bio-Sciences ABにより04/2016に刊行された“Affinity Chromatography Vol. 1: Antibodies”ハンドブック18103746 AFを参照）。
【００７５】
ＣＬ３０Ｃａｍｐを、それがＥＬＩＳＡ試験においてならびに免疫クロマトグラフィー試験において高い特異性および感度を有していたため、選択した（表１、用いられた試料は、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有するＰＢＳであった）。
【００７６】
【表１】
2020536117.tif 000008
【００７７】
実施例２：コンジュゲート抗体の調製
抗Ｄｐｓ抗体を、着色されたポリスチレンナノ粒子（Ｋ１  ０２０  Ｅｓｔａｐｏｒ（登録商標），Ｍｅｒｃｋ，ダルムシュタット、ドイツ）で標識した。着色されたナノ粒子は、表面上にカルボキシル基を含んでおり、約３００ｎｍの平均直径を有していた。抗体を、以下のように標識した：１０％（ｗ／ｖ）粒子を含有する１ｍＬの溶液を洗浄し、遠心分離し、６．０のｐＨを有する１０ｍＭ  ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）緩衝液中で再懸濁した。次いでＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）を５ｍＭの終濃度になるように添加した。その溶液を３７℃で１時間インキュベートし、次いで溶液を遠心分離して上清を除去することにより過剰な試薬を除去した。
【００７８】
活性化された粒子を１０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６）中で再懸濁し、抗体を２ｍｇ／ｍ２の表面濃度になるように添加した。次いで、溶液を２５℃で４時間インキュベートし、次いで標識された抗体を０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する溶液で洗浄した。標識された抗体を、１０％（ｗ／ｖ）スクロース、２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、１％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ−６０００および２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する０．０５％（ｗ／ｖ）トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）ｐＨ８．０緩衝溶液中で希釈した。
【００７９】
この溶液を１５μｌ／ｃｍの速度で２９ｍｍの幅を有するポリエステル繊維織物上に堆積させた（ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ）。ポリエステル繊維をチャンバー中で３０℃および２０％相対湿度において２４時間乾燥させた。
【００８０】
実施例３：検出および対照区画の調製
１ｍｇ／ｍＬの抗Ｄｐｓ抗体を含有するＰＢＳ緩衝液を、２５ｍｍの薄層状の幅（ｌａｍｉｎａｔｅｄ  ｗｉｄｔｈ）および１０〜３０ミクロンの孔径を有するニトロセルロース膜上に線状の様式で堆積させた。抗体溶液を、１μＬ／ｃｍの速度で堆積させた。次いで、膜をチャンバー中で３０℃および２０％相対湿度において２４時間乾燥させた。
【００８１】
ポリクローナルウサギ抗マウスＩｇＧを、対照区画上に、検出区画上の抗Ｄｐｓ抗体の堆積に対して平行に堆積させた。同じ条件を、ニトロセルロース膜上のポリクローナルウサギ抗マウスＩｇＧの堆積に関して用いた。
【００８２】
実施例４．免疫クロマトグラフィー試験デバイスの組み立て
コンジュゲート材料（試料添加区画および標識された抗体を含む区画）、支持膜および吸収性材料を、図１Ｂおよび１Ｃにおいて示されているように、接着性ホイルを有するプラスチック支持体上で組み立てた。その細片を、４ｍｍの幅になるように横方向に切断した。
【００８３】
便試料を分散させるために用いられた溶液は、８．４のｐＨを有する２００ｍＭトリス緩衝剤の水溶液で構成されていた。この分散溶液を、試料採取のためにバイアル中に分配した。それぞれのバイアルは、１ｍＬの溶液を含有していた。
【００８４】
実施例５：Ｃ．ジェジュニおよびＣ．コリのＤｐｓに関する試験デバイスの検出限界
Ｄｐｓの１／２系列希釈物を、上記の分散溶液中で調製した。１００μｌの試料を本発明の免疫クロマトグラフィー試験デバイスに適用した。試験デバイスを、室温で１０分間現像させた後、結果を視覚的に評価した。同じ実験を、同じ緩衝液中で分散させた便試料中でＤｐｓを希釈することにより実施した。結果が、表２および３において示されている。解釈：＋＝陽性反応；−＝陰性反応；＋／−＝弱い陽性反応。
【００８５】
【表２】
2020536117.tif 000009
【００８６】
【表３】
2020536117.tif 000010
【００８７】
実施例６：偽陽性の検出
Ｃ．コリまたはＣ．ジェジュニに関して陽性または陰性であることが示された便試料２０ｍｇを、実施例４で記載された分散溶液１ｍＬ中で分散させた。１００μｌの試料を本発明の免疫クロマトグラフィー試験デバイスに適用した。試験デバイスを室温で１０分間現像させた後、結果を視覚的に評価した。解釈：＋＝陽性反応；−＝陰性反応；＋／−＝弱い陽性反応。
【００８８】
【表４】
2020536117.tif 000011
【００８９】
【表５】
2020536117.tif 000012
【図１】
2020536117.tif 000013
【国際調査報告】
2020536117.tif 000014
2020536117.tif 000015
2020536117.tif 000016