(57)【要約】ナノポアを用いて検体を特徴付ける方法。一態様は、例えば二本鎖ポリヌクレオチドの鋳型と補体を連結するヘアピンを使用せずに、ナノポアを用いて二本鎖ポリヌクレオチドを特徴付ける方法を特徴とする。別の態様は、向上した感度及び／又はより高いスループットでタグ修飾ナノポアを用いて検体を特徴付ける方法を特徴とする。該方法で使用することができる、例えば二本鎖ポリヌクレオチド及びタグ修飾ナノポアへの結合のためのアダプターを含む、組成物及びシステムも提供される。
2020500528.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドを特徴付ける方法であって、
（ｉ）溶液中で、
ａ）共有結合していない鋳型鎖及び相補鎖を有する二本鎖ポリヌクレオチドを含む構築物と、
ｂ）前記構築物の一部に結合する一つ以上のタグが、ナノポアに接合しているナノポアと、を組み合わせることであって、
前記構築物が前記ナノポアに結合する条件下で、前記構築物と前記ナノポアが組み合わされる、組み合わせることと、
（ｉｉ）前記構築物の前記鋳型鎖が前記ナノポアに入ることを可能し、前記鋳型鎖の分離及び前記ナノポアを通る前記鋳型鎖の少なくとも一部の転座を可能にするような条件を提供することと、
（ｉｉｉ）前記ナノポアを介して前記鋳型鎖の転座を示す性質の変化を測定することと、
（ｉｖ）鋳型鎖がナノポアを通って転座する際に測定された特性の変化に基づいてポリヌクレオチドを特徴付けることと、を含む方法。
【請求項２】
前記溶液がイオン性であり、測定された特性が前記ナノポアを通るイオン電流の流れである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アダプターが前記二本鎖ポリヌクレオチドの両端の一方又は両方に付着され、各アダプターが二本鎖ステム及び前記二本鎖ステムから延伸する第一の一本鎖を含み、一つのアダプターの第一の一本鎖は鋳型鎖と隣接し、もう一つのアダプターの第一の一本鎖は相補鎖と隣接する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
一つ以上のタグが前記ナノポアの外縁に結合している、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
条件が前記ナノポアを横切る電位差である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ナノポアが膜内に配置している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記アダプターの一部に結合する一つ以上のタグが前記ナノポアに接合している、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記一つ以上のタグが前記ナノポアの外縁に接合している請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ステップｉｉ）が、前記構築物の前記鋳型鎖と隣接する前記第一の一本鎖が前記ナノポアに入ることを可能にするように、膜を横切って電位差を印加することと、前記鋳型鎖の分離及び前記鋳型鎖の少なくとも一部のナノポアを通る転座を可能にするように、十分な期間にわたってナノポアを横切る電位差を維持することと、を含む、請求項３〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップｉｉｉ）が、前記鋳型鎖が前記ナノポアを通って転座するときのナノポアを通るイオン電流の変化を測定することを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップｉｖ）が、前記鋳型鎖が前記ナノポアを通って転座するときに測定される、ナノポアを通る前記イオン電流の変化に基づいてポリヌクレオチドを特徴付けることを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ポリヌクレオチド巻き戻し酵素が、前記溶液中の前記ナノポアのシス開口側に存在する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
一つ以上のポリヌクレオチド巻き戻し酵素が、前記ポリヌクレオチドにあらかじめ結合している、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ポリヌクレオチド巻き戻し酵素が両方のアダプターのうちの一つ又は両方にあらかじめ結合している、請求項３〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ポリヌクレオチド巻き戻し酵素が前記ナノポアのルーメン内に設けられている、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ナノポアがまた、前記ポリヌクレオチドを巻き戻すように機能する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ナノポアがモータータンパク質ナノポアであり、任意選択でφ２９である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
各アダプターについて、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素が前記二本鎖ステムから延伸する第一の一本鎖に結合している、請求項３〜１７のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
前記鋳型鎖の巻き戻しがその対応する結合ポリヌクレオチド巻き戻し酵素によって促進される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記構築物の一部に結合する一つ又は複数のタグの少なくとも一つが、前記構築物の一部に対して配列相補性を有する核酸である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記アダプターの一部に結合する一つ以上のタグのうちの少なくとも一つが、前記アダプターの一部に対して配列相補性を有する核酸である、請求項３から２０のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
前記核酸が非荷電である、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記核酸が、ＰＮＡ又はモルフォリノである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ポリヌクレオチドがＲＮＡ及び／又はＤＮＡを含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリヌクレオチドの巻き戻しがタグとのハイブリダイゼーションのための相補鎖の一部を明らかにする、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記オリゴヌクレオチドが相補性を有する前記アダプターの部分が、第一の一本鎖と隣接する鎖上の二本鎖ステム内にあり、前記相補鎖と隣接する第一の一本鎖を有する前記アダプターの一部が、タグとのハイブリダイゼーションに利用可能である程度まで、前記ポリヌクレオチドの巻き戻しを可能にするのに十分な時間にわたって電位差を維持する、請求項９から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ナノポアを通る前記鋳型鎖の転座に続き、前記相補鎖が前記ナノポアに入り、転座するのを可能にするのに十分な時間条件を維持することをさらに含む、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ナノポアを通る前記鋳型鎖の転座に続き、前記相補鎖と隣接する第一の一本鎖が前記ナノポアに入り、前記ナノポアを通る前記相補鎖の転座を可能にするのに十分な時間にわたって電位差を維持することを更に含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記ナノポアを通る前記相補鎖の転座を示す特性の変化を測定することをさらに含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記特性が、前記相補鎖が前記ナノポアを通って転座するときに前記ナノポアを通るイオン電流である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ナノポアを介して前記相補鎖の転座の指標と測定された特性の変化に更に基づいて、前記ポリヌクレオチドを特徴付けることをさらに含む、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ナノポアを通る前記相補鎖と前記鋳型鎖の両方の転座を示す測定された特性を示すデータが得られ、前記ポリヌクレオチドを特徴付けるために使用される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ポリヌクレオチドを特徴付けるために、鋳型鎖データを相補鎖データと比較する又は組み合わせる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ナノポアが第一のタグと第二のタグを含み、前記第一のタグと前記第二のタグが、前記鋳型鎖に隣接する前記アダプターの第一の一本鎖の部分、及び前記相補鎖に隣接する前記アダプターの第一の一本鎖の部分にそれぞれ結合する、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
各アダプターが前記二本鎖ステムから延伸する第二一本鎖を含み、一方のアダプターの第二の一本鎖が前記相補鎖と隣接し、及び／又は他方のアダプターの第二の一本鎖が前記鋳型鎖と隣接する、請求項３〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記アダプターの一部に結合する一つ以上のタグのうちの少なくとも一つが、第二の一本鎖内の前記アダプターの一部に対して配列相補性を有するオリゴヌクレオチドである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記アダプターの一部に結合する複数のタグのうち二つ以上が、第二一本鎖内の前記アダプターの一部に対して配列相補性を有するオリゴヌクレオチドである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記鋳型鎖が前記ポアを通って転座する際に、前記測定された特性の変化の測定に基づいて前記鋳型鎖の配列を決定することと、
前記相補鎖が前記ポアを通って転座する際に、前記測定された特性の変化の測定に基づいて相補鎖の配列を決定することと、及び
鋳型鎖の配列を相補鎖の配列と比較してポリヌクレオチドの配列を確立することと、を更に含む、請求項１から３７のいずれか一項に記載の方法。
方法。
【請求項３９】
ポリヌクレオチドを特徴付けるためのシステムであって、該システムが、
（ｉ）鋳型鎖と相補鎖を有するポリヌクレオチドを含む構築物と、
（ｉｉ）アダプターの一部と配列相補性を有する少なくとも一つの核酸と接合している外縁を含む膜内に配置されたナノポアと、を含むシステム。
【請求項４０】
前記鋳型鎖と前記相補鎖が共有結合しておらず、
前記アダプターが前記ポリヌクレオチドの各両端に付着しており、
各アダプターが二本鎖ステム及び二本鎖ステムから延伸する第一の一本鎖を含み、
一方のアダプターの第一の一本鎖が前記鋳型鎖と隣接し、他方のアダプターの第一の一本鎖が前記相補鎖と隣接し、
各アダプターについて、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素が前記二本鎖ステムから延伸する第一の一本鎖に結合している、請求項３９に記載のシステム。
【請求項４１】
前記アダプターの一部が前記第一の一本鎖と隣接する鎖上の前記二本鎖ステム内にある、請求項４０に記載のシステム。
【請求項４２】
前記各アダプターが前記二本鎖ステムから延伸する第二一本鎖を含み、一方のアダプターの第二の一本鎖が前記相補鎖と隣接し、他方のアダプターの第二の一本鎖が前記鋳型鎖と隣接する、請求項４０に記載のシステム。
【請求項４３】
前記アダプターの一部が第二の一本鎖内にある、請求項４０に記載のシステム。
【請求項４４】
少なくとも一つの核酸が、
（ａ）第一の一本鎖と隣接する鎖上の二本鎖ステム内にあるアダプターの一部と配列相補性を有し、及び
（ｂ）第二一本鎖内にあるアダプターの一部と更なる配列相補性を有する、請求項４２に記載のシステム。
【請求項４５】
少なくとも二つの核酸が前記ナノポアに接合しており、少なくとも前記二つの核酸のうちの一つが第一の一本鎖と隣接する鎖上の二本鎖ステム内にあるアダプターの一部と配列相補性を有し、少なくとも二つの核酸の他方が第二の一本鎖内にある前記アダプターの一部と配列相補性を有する、請求項４２に記載のシステム。
【請求項４６】
前記少なくとも二つの核酸が前記ナノポアの外縁に接合している、請求項４５に記載のシステム。
【請求項４７】
ポリヌクレオチドを特徴付けるためのシステムを製造するための方法であって、該方法が、
（ｉ）鋳型鎖及び相補鎖が共有結合していない鋳型鎖及び相補鎖を有するポリヌクレオチドを含む構築物を取得することと、
（ｉｉ）アダプターの一部と配列相補性を有する少なくとも一つの核酸が結合しているナノポアの外縁に構築物が露出される条件下で、構築物を膜中に配置されたナノポアと組み合わせることと、を含む方法。
【請求項４８】
アダプターが前記ポリヌクレオチドの各両端に付着しており、
各アダプターが二本鎖ステム及び前記二本鎖ステムから延伸する第一の一本鎖を含み、
一方のアダプターの第一の一本鎖が鋳型鎖と隣接し、他方のアダプターの第一の一本鎖が相補鎖と隣接し、
各アダプターについて、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素が前記二本鎖ステムから延伸する第一の一本鎖に結合している、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
複合体であって、
ｉ．タグを有するナノポアと、
ｉｉ．タグを介して前記ナノポアに結合した相補ポリヌクレオチド鎖と、  
ｉｉｉ．前記相補ポリヌクレオチド鎖と部分的にハイブリダイズし、前記ナノポアのルーメン内に部分的に配置されている鋳型ポリヌクレオチド鎖と、を含む、複合体。
【請求項５０】
複合体であって、
ｉ．二つ以上のタグを有するナノポアと、  
ｉｉ．各鎖が二つ以上のタグのうちの一つに結合している鋳型鎖及び相補鎖を含む二本鎖ポリヌクレオチドと、を含む、複合体。
【請求項５１】
前記タグがそのルーメンの外側の外縁にある、請求項４９又は５０に記載の複合体。
【請求項５２】
検体を特徴付けるためのシステムであって、該システムが、
（ｉ）膜内に配置されたナノポアであって、少なくとも一つの共通のタグが存在する外縁を含む、ナノポアと、
（ｉｉ）複数の異なる検体であって、各異なる検体が少なくとも一つのタグの結合パートナーに付着している検体と、を含むシステム。
【請求項５３】
各検体がバイオポリマーである、請求項５２に記載のシステム。
【請求項５４】
前記バイオポリマーがポリヌクレオチド、ポリペプチド、多糖、及び脂質から選択される、請求項５２に記載のシステム。
【請求項５５】
各検体がポリヌクレオチドである、請求項５４に記載のシステム。
【請求項５６】
結合パートナーが前記ポリヌクレオチドに付着しているアダプターのヌクレオチド配列であり、少なくとも一つの共通のタグが、前記アダプターの前記ヌクレオチド配列と配列相補性を有する核酸である、請求項５５に記載のシステム。
【請求項５７】
ナノポアを用いた検体の特性を決定するための方法であって、該方法が、
ｉ．検体を提供することと、
ｉｉ．一つ以上の前記検体を前記ナノポアのルーメンの外側にあるナノポアの外縁に結合させることと、
ｉｉｉ．前記ナノポアに対して前記検体を移動させながら、前記ナノポアに結合した検体の測定値を取得することであって、前記測定値が前記検体の一つ以上の特性を示す、取得することと、  
ｉｖ．ステップｉｉｉで得られた前記測定値に基づいて前記検体を特徴付けることと、を含む方法。
【請求項５８】
一つ以上の検体が、前記ナノポアのルーメンの外側にあるナノポアの外縁に結合する、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
複数の検体が前記ナノポアに接合した複数のタグにそれぞれ結合する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
一つ以上のタグがナノポアのルーメンの外側にあるナノポアの外縁に接合されている、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
第一の検体がポリヌクレオチドである、請求項５７〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記ナノポアに対して第二の検体を移動させながら、前記ナノポアに結合した前記第二の検体の測定値を取得することであって、前記第二の検体について得られた前記測定値が、前記第二の検体の一つ以上の特性を示す、取得することと、
得られた前記第二の検体の前記測定値に基づいて、前記第二の検体を特徴付けることと、をさらに含む、請求項５７〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記ナノポアに対する前記第一の検体の移動中に、第二の検体が前記ナノポアに結合している、請求項５７に記載の方法。
【請求項６４】
前記第二の検体がポリヌクレオチドである、請求項６２又は６３に記載の方法。
【請求項６５】
複合体であって、
複数のタグを有するナノポアであって、前記ナノポアのルーメン内に部分的に存在する第一の検体及び第二検体が、捕捉部分の一つに結合している、ナノポア、を含む、複合体。
【請求項６６】
複数のタグがそのルーメンの外側にある外縁上にある、請求項６５に記載の複合体。
【請求項６７】
前記第一の検体及び前記第二検体がポリヌクレオチドである、請求項６５又は６６に記載の複合体。
【請求項６８】
ナノポアを通って二つの非共有結合分子を逐次転座させるための方法であって、該方法が、
前記ナノポアを通る一対の非共有結合分子の第一のメンバーの転座を促進する条件下で、一対の非共有結合分子をナノポアに接触させることを含み、
前記ナノポアを通る第一のメンバーの転座中に、前記一対の第二のメンバー上の結合部位が露出され、
前記結合部位が前記ナノポア上に存在するタグに可逆的に結合する、方法。
【請求項６９】
非共有結合分子が相補的核酸鎖である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記ナノポア上のタグがオリゴヌクレオチドであり、第二メンバー上の結合部位がタグと相補的な配列を有する核酸の一部である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
一対の非共有結合分子がアダプターに付着した標的核酸を含み、結合部位がアダプター上に存在する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
ポリヌクレオチドを特徴付ける方法であって、該方法が、
一対の非共有結合分子の第二メンバーの転位が後に続く、前記一対の非共有結合分子の第一のメンバーのナノポアを通る転座を促進する条件下で、一対の非共有結合分子をナノポアに接触させることと、
前記一対の第一及び第二のメンバーの転座を示す特性を測定し、そして測定された特性を示すデータを取得することと、
第一及び第二のメンバーの両方の得られたデータに基づいて、特性を決定することと、を含む方法。
【請求項７３】
標的ポリヌクレオチドを配列決定する方法であって、該方法が、
（ａ）膜貫通孔を、
（ｉ）標的ポリヌクレオチド及び標的ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含む二本鎖ポリヌクレオチドであって、前記標的ポリヌクレオチド及び前記標的ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドが、それぞれ一本鎖リーダー配列を含む、二本鎖ポリヌクレオチドと、
（ｉｉ）前記二本鎖ポリヌクレオチドの鎖を分離し、かつ膜貫通孔を通るポリヌクレオチドの動きを制御することができるポリヌクレオチド結合タンパク質と、に接触させることと、
（ｂ）前記ポアを通って転座するポリヌクレオチドを検出するために、前記ポアを通るイオン流に対応する信号を検出することと、
（ｃ）前記標的ポリヌクレオチドの転座に対応する信号及び前記標的ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドの別個の転座に対応する配列信号を同定することと、  
（ｄ）（ｃ）で同定された信号を解析することと、
それによって前記標的ポリヌクレオチドを配列決定することと、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書で提供されるのはナノポアを用いて検体を特徴付ける方法に関する。例えば、二本鎖ポリヌクレオチドなどの検体への付着のためのアダプター、及び該方法で使用することができるタグ修飾ナノポアを含む組成物及びシステムも提供される。いくつかの実施形態では、膜貫通孔を用いて一つ以上の標的ポリヌクレオチド配列を決定する方法が本明細書に提供される。
【背景技術】
【０００２】
現在、幅広い用途にわたる迅速かつ安価なポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）配列決定及び同定技術が必要とされている。
【０００３】
膜貫通孔（ナノポアなど）は、小分子又は折り畳まれたタンパク質を同定し、単一分子レベルで化学反応又は酵素反応をモニターするために使用されてきた。膜貫通孔（ナノポアなど）は、ポリマー及び様々な小分子用の直接的な電気バイオセンサーとして大きな将来性を有する。特に、最近は、潜在的ＤＮＡ配列決定技術及びバイオマーカー認識とするナノポアが注目されている。
【０００４】
ナノポアを通るイオン流は、ナノポアを横切って印加される電位差で測定してもよい。検体とナノポアとの相互作用はイオン流に特徴的な変化を生じさせることができ、得られた信号の測定は検体を特徴付けるために使用することができる。例えば、測定された信号は電流であってもよく、例えば、ポリヌクレオチドの配列を決定するために使用してもよい。ポアを通してポリヌクレオチド鎖を転座させてもよく、配列などのヌクレオチドの同一性は測定された信号から得てもよい。そのような配列決定法は、例えば、ＷＯ０１４２７８２、ＷＯ２０１６０３４５９１、ＷＯ２０１３０４１８７８、ＷＯ２０１４０６４４４３及びＷＯ２０１３１５３３５９に開示されている。
【０００５】
ヘアピンによって連結された鋳型及び相補鎖の両方の転座などが関わる、二本鎖ポリヌクレオチドを配列決定するための方法が開発されている。鎖配列決定は、通常は、ナノポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御するためのヘリカーゼなどのポリヌクレオチド結合タンパク質の使用が関わる。そのような方法は、例えばＷＯ２０１３０５７４９５に開示されている。ナノポアの寸法は、一本鎖ポリヌクレオチドの転座のみを可能にするものであってもよい。二本鎖ポリヌクレオチドは、ナノポアを通る転座の前に、一本鎖ポリヌクレオチドを提供するために鎖を分離することによって決定してもよい。二本鎖ポリヌクレオチドを同時に分離し、得られた一本鎖のナノポアを通る転座速度を制御するために、ヘリカーゼなどのポリヌクレオチド結合タンパク質を使用してもよい。二本鎖ポリヌクレオチドの二本鎖は、ヘアピンループ構造などの架橋部分によって連結されていてもよく、そのような構築物を製造する方法は、例えばＷＯ２０１３０５７４９５に記載されている。これにより、フォワード（鋳型）鎖の転座に続いてリバース（相補）鎖の転座が起こることが確実になる。このように両方の鎖を測定することは、二つの相補結合鎖からの情報を組み合わせて使用し、鋳型鎖のみの測定から得られるものより信頼性の高い測定結果を提供することができるため、有利である。しかしながら、そのようなヘアピン結合ポリヌクレオチドの製造は、試料製造時間を長くし、貴重な検体の損失を招くおそれがある。さらに、ヘアピン結合鋳型及び補体ポリヌクレオチド鎖のナノポアを通る転座は、ナノポアの反対側（トランス）での鎖の再ハイブリダイゼーションを引き起こすおそれがある。これは転座速度を変えて配列決定の精度を低下させるおそれがある。また、鋳型鎖と相補鎖の現在時刻データが異なるため、二つのアルゴリズムが計算に使用される。それは、計算をより複雑かつ集中的にする。
【０００６】
したがって、より高い精度及びより高い効率／スループットで、検体、例えば二本鎖ポリヌクレオチドを特徴付けるための改善された方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
本開示は、概して、ナノポア及び組成物、例えば本明細書に記載の方法で使用することができるアダプター及びナノポアを用いて検体を特徴付けるための方法に関する。本開示は、部分的には、ヘアピンループ構造などの架橋部分を介して二本の鎖を共有結合させる必要がなく、二本鎖ポリヌクレオチドの両方の鎖が逐次ナノポアを通って転座して、配列情報を提供することができるという予想外の発見に基づいている。例えば、いくつかの実施形態では、ナノポアに結合したポアタグに相補的な捕捉配列を含む二本鎖ステムを有するアダプターを二本鎖ポリヌクレオチドの各末端に提供することができる。ここで、捕捉配列は鎖の巻き戻し時にのみ示される。したがって、二本鎖ポリヌクレオチドの第一鎖がタグ修飾ナノポアを通過するときに、それはアダプターの二本鎖ステムを解離して二本鎖ポリヌクレオチドの第二鎖上の捕捉配列を露出させ、次いでナノポアのポアタグで捕捉する。このような方法は、第二鎖をナノポアの近傍に保持するだけでなく、また第一鎖と第二鎖を読み取る間の時間遅延も短縮するため、配列決定法の全体的な精度及び効率を向上させる。その後ナノポアを通って転座するナノポアにおける複数の検体の捕捉は、検体を特徴付ける感度及び／又はスループットを向上させることができることも発見された。
【０００８】
本発明者らはまた以下のことを発見した：膜貫通孔を通る鎖のうちの一本の動きを制御しながら、ポリヌクレオチド結合タンパク質が二本鎖ポリヌクレオチドの二本の鎖を分離するために使用された場合、ポアを通る第一鎖の転座の後に、第二鎖はポアの近傍にとどまっていてもよく、第二鎖はポアによって捕捉してもよく、ポリヌクレオチド結合タンパク質をポアを通る第二鎖の動きを制御するために使用してもよい。
【０００９】
したがって、本発明の一実施形態は、以下の工程を含む、標的ポリヌクレオチドを配列決定する方法を提供する：
【００１０】
（ａ）膜貫通孔を以下のものと接触させる：
【００１１】
（ｉ）それぞれ一本鎖リーダー配列を含む標的ポリヌクレオチド及び標的ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含む二本鎖ポリヌクレオチド、並びに
【００１２】
（ｉｉ）二本鎖ポリヌクレオチドの鎖を分離し、膜貫通孔を通るポリヌクレオチドの動きを制御することができるポリヌクレオチド結合タンパク質。
【００１３】
（ｂ）ポアを通って転座するポリヌクレオチドを検出するために、ポアを通るイオン流に対応する信号を検出する。
【００１４】
（ｃ）標的ポリヌクレオチドの転座に対応する信号及び標的ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドの別個の転座に対応する配列信号を同定する。
【００１５】
（ｄ）（ｃ）で同定された信号を解析する。
それによって標的ポリヌクレオチドを配列決定する。
【００１６】
この態様では、二本鎖バーコード配列は、標的二本鎖ポリヌクレオチドの一端又は両端に付着してもよい。リーダー配列はアダプターに含まれてもよい。アダプターは二本鎖領域及び少なくとも一つの一本鎖領域を含んでもよい。アダプターは二本鎖バーコード配列を含んでもよい。アダプターは膜テザー又はポアテザーを含んでもよい。標的二本鎖ポリヌクレオチドの両端に付着したリーダー配列は異なってもよい。二本鎖ポリヌクレオチドはその両端に異なるアダプターを有してもよく、及び／又はヘリカーゼ若しくはポリメラーゼなどのポリヌクレオチド結合タンパク質は、リーダー配列に結合してもよい。ポリヌクレオチド結合タンパク質がリーダー配列に結合している場合、ポリヌクレオチド結合タンパク質の活性はポリヌクレオチドが膜貫通孔と接触するまで失速し得る。二本鎖バーコード配列が標的二本鎖ポリヌクレオチドの一端又は両端に付着している場合、特有のバーコード配列が試料中の各二本鎖ポリヌクレオチドに付着してもよい。この態様では、二本鎖ポリヌクレオチドが微粒子に付着していてもよく、及び／又はポリヌクレオチドの捕捉を促進するためにポアを修飾してもよい。例えば、ポリヌクレオチド又はアダプターを、引き付ける又は結合する一つ以上の分子をポアに結合してもよい。そのような分子は、例えば、ＰＮＡタグ、ＰＥＧリンカー、短いオリゴヌクレオチド、正荷電を持つアミノ酸及びアプタマーから選択してもよい。この態様では、膜貫通孔は、例えば、Ｍｓｐ、α−ヘモリシン（α−ＨＬ）、リセニン、ＣｓｇＧ、ＣｌｙＡ、Ｓｐ１若しくはＦｒａＣに由来する若しくはそれらに基づくポアなどのタンパク質孔であってもよい。又は固体ポア及び／又は膜は、両親媒性層又は固体層であってもよい。
【００１７】
該方法はヘアピンループ構造などの架橋部分を用いて二本の鎖が連結されている二本鎖ポリヌクレオチドを配列決定する既知の方法よりも有利である。該方法はまた、鋳型ポリヌクレオチド鎖のみを測定する既知の方法よりも有利である。特に、本発明の方法は、ヘアピンループ方法の言及された欠点がなく、鋳型鎖のみの測定方法とヘアピンループ方法の両方の利点を組み合わせる。
【００１８】
例えば、ＷＯ２０１３／０１４４５１に開示されている方法は、複数のアダプターを使用し、試料中の二本鎖ポリヌクレオチドの一部のみが、一端に追加されたＹアダプター、及び他端に架橋部分を含むアダプターを有し、試料中の他のポリヌクレオチドは廃棄される。本発明の方法は、二本鎖ポリヌクレオチドの両端に付加することができる単一のリーダー配列又はアダプターを用いて実施することができる。そのような単一リーダー配列／アダプターシステムを使用するとき、もしあれば、より少ない試料を廃棄する必要がある。
【００１９】
該方法では、二本鎖標的ポリヌクレオチドのいずれの末端もポアによって捕捉することができる。該方法は、架橋部分を含まない二本鎖ポリヌクレオチドの末端のみがポアで捕捉することができ、ＷＯ２０１３／０１４４５１に開示された方法と比較して感度を向上させる。
【００２０】
本発明はまた、二本鎖バーコード配列、一本鎖リーダー配列、及び二本鎖ポリヌクレオチドの鎖を分離し、そして膜貫通孔を通るポリヌクレオチドの動きを制御することができるポリヌクレオチド結合タンパク質を含むアダプターの個体群も提供する。個体群内の各アダプターのバーコード配列は唯一である。
【００２１】
本明細書で提供される別の態様は、ポリヌクレオチドを特徴付ける方法に関する。ポリヌクレオチドはＤＮＡ又はＲＮＡを含んでもよい。該方法は以下を含む：
【００２２】
（ｉ）溶液中で、
（ａ）鋳型鎖と相補鎖を有し、鋳型鎖と相補鎖が共有結合していない二本鎖ポリヌクレオチドを含む構築物と、
【００２３】
（ｂ）構築物の一部に結合する一つ以上のタグがナノポアに接合しているナノポアとを組み合わせることであって、
【００２４】
構築物がナノポアに結合する条件下で構築物とナノポアを組み合わせること、
【００２５】
（ｉｉ）構築物の鋳型鎖がナノポアに入ることを可能にし、鋳型鎖の分離及びナノポアを通る鋳型鎖の少なくとも一部の転座を可能にするような条件を提供すること、
【００２６】
（ｉｉｉ）ナノポアを通る鋳型鎖の転座を示す特性の変化を測定すること、及び
【００２７】
（ｉｖ）鋳型鎖がナノポアを通って転座する際に測定された特性の変化に基づいてポリヌクレオチドを特徴付けること。
【００２８】
いくつかの実施形態では、溶液はイオン性であり、測定された特性はナノポアを通したイオン電流である。
【００２９】
いくつかの実施形態では、アダプターは二本鎖ポリヌクレオチドの両端の一方又は両方に付着し、各アダプターは二本鎖ステム及び二本鎖ステムから延伸する第一の一本鎖を含む。ここで、一つのアダプターの第一の一本鎖は鋳型鎖と隣接し、もう一つのアダプターの第一の一本鎖は相補鎖と隣接する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、構築物の鋳型鎖と隣接する第一の一本鎖がナノポアに入ることを可能にするように膜を横切って電位差を印加する。鋳型鎖の分離及び鋳型鎖の少なくとも一部の転座を可能にするように、十分な期間にわたってナノポアを横切る電位差を維持することを含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素はアダプターの片方又は両方に予め結合している。ポリヌクレオチド巻き戻し酵素はナノポアのルーメン内に設けられてもよい。
【００３２】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドが相補性を有するアダプターの一部は第一の一本鎖と隣接する鎖上の二本鎖ステム内にあってもよい。相補鎖と隣接する第一の一本鎖を有するアダプターの部分がタグとのハイブリダイゼーションに利用可能である程度まで、ポリヌクレオチドの巻き戻しを可能にするのに十分な時間にわたって電位差を維持することができる。
【００３３】
いくつかの実施形態では、一つ以上のタグはナノポアの外縁に接合される。いくつかの実施形態では、アダプターの一部に結合する一つ以上のタグがナノポアに接合される。いくつかの実施形態では、構築物の一部に結合する一つ以上のタグの少なくとも一つは構築物の一部に対して配列相補性を有する核酸である。いくつかの実施形態では、アダプターの一部に結合する一つ以上のタグの少なくとも一つはアダプターの一部に対して配列相補性を有する核酸である。核酸は荷電されていなくてもよく、ＰＮＡ又はモルフォリノなどを含むが、これらに限定されない。
【００３４】
いくつかの実施形態では、ナノポアを横切る電位差の状態である。
【００３５】
当技術分野において既知の任意のナノポアを本明細書に記載の方法で使用してもよい。いくつかの実施形態では、ナノポアはまた、ポリヌクレオチドを巻き戻すように機能する。いくつかの実施形態では、ナノポアはφ２９モータータンパク質ナノポアなどのモータータンパク質ナノポアであってもよい。いくつかの実施形態では、ナノポアは膜内に配置されている。
【００３６】
いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）は、鋳型鎖がナノポアを通って転座するときに、ナノポアを通るイオン電流の流れの変化を測定することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｖ）、鋳型鎖がナノポアを通って転座するときに測定されるナノポアを通るイオン電流の流れの変化に基づいてポリヌクレオチドを特徴付けることを含む。
【００３７】
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素は、ナノポアのシス開口側の溶液中に存在する。いくつかの実施形態では、一つ以上のポリヌクレオチド巻き戻し酵素は、ポリヌクレオチドに予め結合している。
【００３８】
いくつかの実施形態では、各アダプターについて、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素は、二本鎖ステムから伸びる第一の一本鎖に結合している。いくつかの実施形態では、鋳型鎖の巻き戻しは、その対応する結合ポリヌクレオチド巻き戻し酵素によって促進されてもよい。
【００３９】
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの巻き戻しは、タグとのハイブリダイゼーションのための相補鎖の一部を明らかにしてもよい。
【００４０】
本明細書に記載の様々な態様のいくつかの実施形態では、該方法は、ナノポアを通る鋳型鎖の転座に続いて、相補鎖がナノポアに入って転座することを可能にするのに十分な時間の条件を維持することをさらに含むことができる。例えば、該方法は、ナノポアを通る鋳型鎖の転座に続いて、相補鎖と隣接する第一の一本鎖がナノポアに入るのを可能にし、そしてナノポアを通る相補鎖の転座を可能にするのに十分な時間の間、電位差を維持することをも含むことができる。
【００４１】
本明細書に記載の様々な形態のいくつかの実施形態では、該方法は、ナノポアを通る相補鎖の転座を示す特性の変化を測定することをさらに含むことができる。この特性は、相補鎖がナノポアを通って転座するときにナノポアを通るイオン電流であってもよい。いくつかの実施形態では、該方法は、ナノポアを通る相補鎖の転座を示す測定された特性の変化にさらに基づいて、ポリヌクレオチドを特徴付けることをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、ナノポアを通る相補鎖と鋳型鎖の両方の転座を示す測定された特性を示すデータを取得し、それをポリヌクレオチドを特徴付けるために使用することができる。ポリヌクレオチドを特徴付けるために、鋳型鎖データを相補鎖データと比較しても、又は組み合わせてもよい。
【００４２】
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、ナノポアは第一のタグ及び第二のタグを含むことができる。第一のタグ及び第二のタグは、鋳型鎖と隣接するアダプターの第一の一本鎖の一部及び相補鎖と隣接するアダプターの第一の一本鎖の一部にそれぞれ結合することができる。
【００４３】
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、各アダプターは二本鎖ステムから延伸する第二一本鎖を含むことができる。一方のアダプターの第二の一本鎖は相補鎖と隣接し、及び／又は他方のアダプターの第二の一本鎖は鋳型鎖と隣接する。いくつかの実施形態では、アダプターの一部に結合する一つ以上のタグのうちの少なくとも一つは、第二一本鎖内のアダプターの一部に対して配列相補性を有するオリゴヌクレオチドであってもよい。いくつかの実施形態では、アダプターの一部に結合する一つ以上のタグのうちの二つ以上のタグは、第二一本鎖内のアダプターの一部に対して配列相補性を有するオリゴヌクレオチドである。
【００４４】
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、該方法は以下をさらに含むことができる：鋳型鎖がポアを通って転座する際に測定された特性の変化の測定に基づいて鋳型鎖の配列を決定すること、相補鎖がポアを通って転座する際に測定された特性の変化の測定に基づいて相補鎖の配列を決定すること、及びポリヌクレオチドの配列を確立するために鋳型鎖の配列を相補鎖の配列と比較すること。
【００４５】
例えば、本明細書に記載の方法の任意の態様で使用することができる、ポリヌクレオチドを特徴付けるためのシステムも提供される。このシステムは以下を含む：（ｉ）鋳型鎖及び相補鎖を有するポリヌクレオチドを含む構築物、及び（ｉｉ）膜に配置されたナノポアであって、アダプターの一部に配列相補性を有する少なくとも一つの核酸に接合している外縁を含む、ナノポア。
【００４６】
いくつかの実施形態では、鋳型鎖と相補鎖は共有結合していない。アダプターは、ポリヌクレオチドの各二つの末端に付着してもよく、各アダプターは二本鎖ステム及び二本鎖ステムから延伸する第一の一本鎖を含む。一つのアダプターの第一の一本鎖は、鋳型鎖と隣接してもよく、他のアダプターの第一の一本鎖は相補鎖と隣接してもよい。各アダプターについて、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素は、二本鎖ステムから延伸する第一の一本鎖に結合してもよい。いくつかの実施形態では、アダプターの一部は第一の一本鎖と隣接する鎖上の二本鎖ステム内にある。
【００４７】
いくつかの実施形態では、各アダプターは二本鎖ステムから延伸する第二の一本鎖を含んでもよい。ここで、一方のアダプターの第二一本鎖は相補鎖と隣接し、他方のアダプターの第二の一本鎖は鋳型鎖と隣接する。いくつかの実施形態では、アダプターの一部は第二の一本鎖内にあってもよい。
【００４８】
いくつかの実施形態では、ナノポアに接合している少なくとも一つの核酸は、（ａ）第一の一本鎖と隣接する鎖上の二本鎖ステム内にあるアダプターの一部と配列相補性を有し、（ｂ）第二の一本鎖内にあるアダプターの一部とさらなる配列相補性を有する。
【００４９】
いくつかの実施形態では、少なくとも二つの核酸がナノポアに接合しており、少なくとも二つの核酸のうちの一つは、第一の一本鎖と隣接する鎖上の二本鎖ステム内にあるアダプターの一部に対する配列相補性を有し、少なくとも二つの核酸の他方は、第二の一本鎖内にあるアダプターの一部に対して配列相補性を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも二つの核酸はナノポアの外縁に接合してもよい。
【００５０】
さらなる態様は、ポリヌクレオチドを特徴付けるためのシステムを製造する方法に関する。該方法は以下を含む：（ｉ）共有結合していない鋳型鎖と相補鎖を有するポリヌクレオチドを含む構築物を取得すること、及び（ｉｉ）アダプターの一部に対し配列相補性を有する少なくとも一つの核酸はナノポアの外縁に接合し、構築物がナノポアの外縁に露出される条件下で、構築物を膜中に配置されたナノポアと組み合わせること。
【００５１】
いくつかの実施形態では、アダプターはポリヌクレオチドの各二つの末端に付着してもよく、各アダプターは二本鎖ステム及び二本鎖ステムから延伸する第一の一本鎖を含む。ここで、一方のアダプターの第一の一本鎖は鋳型鎖と隣接し、他方のアダプターの第一の一本鎖は相補鎖と隣接する。各アダプターについて、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素は二本鎖ステムから延伸する第一の一本鎖に結合してもよい。
【００５２】
本明細書に記載の方法の任意の態様において形成される複数の構成要素を含む複合体も、本開示の範囲内である。いくつかの実施形態では、複合体は以下を含む：（ｉ）タグを有するナノポア、（ｉｉ）タグを介してナノポアに結合した相補ポリヌクレオチド鎖、及び（ｉｉｉ）相補ポリヌクレオチド鎖と部分的にハイブリダイズした、ナノポアのルーメン内に部分的に配置される鋳型ポリヌクレオチド鎖。他の実施形態では、複合体は以下を含んでもよい：（ｉ）複数のタグを有するナノポア、及び（ｉｉ）各鎖が複数のタグのうちの一つに結合している、鋳型鎖及び相補鎖を含む二本鎖ポリヌクレオチド。本明細書に記載の複合体の任意の実施形態では、タグはそのルーメンの外側の外縁に存在することができる。
【００５３】
本明細書は、検体の特性を決定するための方法及びシステムも提供する。一態様では、システムは以下を含む：（ｉ）少なくとも一つの共通タグがある外縁を含む、膜内に配置されたナノポア、及び（ｉｉ）各異なる検体は少なくとも一つのタグの結合パートナーに付着している、複数の異なる検体。いくつかの実施形態では、各検体はバイオポリマーであってもよい。そのようなバイオポリマーの例としては、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、多糖、及び脂質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
いくつかの実施形態では、各検体はポリヌクレオチドである。各検体がポリヌクレオチドであるいくつかの実施形態では、結合パートナーはポリヌクレオチドに付着しているアダプターのヌクレオチド配列であってもよく、少なくとも一つの共通タグはアダプターのヌクレオチド配列と配列相補性を有する核酸であってもよい。
【００５５】
別の態様では、ナノポアを用いた検体の特性を決定するための方法は以下を含む：（ｉ）検体を提供すること、（ｉｉ）一つ以上の検体をナノポアのルーメンの外側にあるナノポアの外縁に結合させること、（ｉｉｉ）ナノポアに対して検体を移動させながら、ナノポアに結合した検体の一つ以上の特徴を示す測定値を取得すること、及び（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で得られた測定値に基づいて検体を特徴付けること。
【００５６】
いくつかの実施形態では、一つ以上の検体はナノポアのルーメンの外側にあるナノポアの外縁に結合することができる。いくつかの実施形態では、複数の検体はナノポアに接合している複数のタグにそれぞれ結合することができる。いくつかの実施形態では、一つ以上のタグはナノポアのルーメンの外側にあるナノポアの外縁に接合してもよい。
【００５７】
いくつかの実施形態では、第一の検体はポリヌクレオチドであってもよい。
【００５８】
いくつかの実施形態では、該方法は以下を更に含んでもよい：ナノポアに対して第二の検体を移動させながら、ナノポアに結合した第二の検体の測定値を取得することであって、得られた第二の検体の測定値は第二の検体の一つ以上の特徴を示す、取得すること、及び得られた第二の検体の測定値に基づいて第二の検体を特徴付けること。第二の検体はポリヌクレオチドであってもよい。
【００５９】
いくつかの実施形態では、第二の検体はナノポアに対して、第一の検体が移動する間にナノポアに結合してもよい。第二の検体はポリヌクレオチドであってもよい。
【００６０】
本明細書は複数のタグを有するナノポアを含む複合体も提供し、第一の検体はナノポアのルーメン内に部分的に存在し、第二の検体は捕捉部分の一つに結合している。
【００６１】
いくつかの実施形態では、複数のタグはそのルーメンの外側にある外縁にあってもよい。いくつかの実施形態では、第一の検体及び第二の検体はポリヌクレオチドである。
【００６２】
ナノポアを通して二つの非共有結合分子を逐次転座させるための方法も本開示の範囲内である。該方法は以下を含む：ナノポアを通る一対の非共有結合分子のうちの第一のメンバーの転座を促進する条件下で、一対の非共有結合分子をナノポアに接触させ、一対の第二のメンバー上の結合部位は、ナノポアを通る第一のメンバーの転座の間に露出され、結合部位はナノポア上にあるタグに可逆的に結合する。
【００６３】
いくつかの実施形態では、非共有結合分子は相補的核酸鎖である。いくつかの実施形態では、一対の非共有結合分子はアダプターに結合した標的核酸を含んでもよく、結合部位はアダプター上にあってもよい。
【００６４】
いくつかの実施形態では、ナノポア上のタグはオリゴヌクレオチドであり得、第二のメンバー上の結合部位はタグに相補的な配列を有する核酸の一部であり得る。
【００６５】
ポリヌクレオチドを特徴付ける方法は本明細書にも提供され、以下を含む：ナノポアを通る一対の非共有結合分子の第一のメンバーの転座を逐次促進する条件下で、一対の非共有結合分子をナノポアに接触させ、続いて一対の非共有結合分子の第二メンバーの転座を行うこと；一対の第一及び第二のメンバーの転座を示す特性を測定し、そして測定された特性を示すデータを取得すること；及び得られた第一及び第二のメンバーの両方のデータに基づいて特性を決定すること。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
以下の図面は、本明細書の一部を構成し、本開示の特定の実施形態を更に実証するために含まれており、本明細書に提示された特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の一つ以上を参照することによってよりよく理解することができる。
【００６７】
例示のみを目的として、本明細書に記載の図中の鎖はどちらの末端が捕捉されたかに応じて、「鋳型」及び「補体」と分類される。ナノポアを通過する第一鎖は鋳型と分類され、第一鎖に続く相補鎖は補体と分類される。二本鎖ポリヌクレオチドの実際の鋳型及び補体は、第一鎖及び第二鎖から得られた配列情報を解析した後に決定される。
【００６８】
【図１Ａ】図１Ａ−Ｂは、膜貫通孔を用いて二本鎖ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）構築物を配列決定する先行技術の方法を示す。図中、鋳型鎖及び相補鎖はヘアピンループ構造を介して付着され、鋳型鎖は５´リーダー配列を含む。図１Ａは、酵素の制御下でナノポアを通って転座するポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）構築物の概略図である。鋳型がナノポアに入り、鋳型に続く補体の動きを制御するために、同一の酵素がヘアピンの周りを進む。ヘアピン領域がナノポアを通って転座した時点で、ヘアピンはナノポアのトランス側で再形成されてもよい。図１Ｂは、鋳型の転座及び補体の転座から得られた配列情報を、アルゴリズム的に組み合わせた際の鋳型の転座及び補体の転座から得られた配列情報の精度を表すピークを示す。
【図１Ｂ】図１Ａ−１Ｂは、膜貫通孔を用いて二本鎖ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）構築物を配列決定する先行技術の方法を示す。図中、鋳型鎖及び相補鎖はヘアピンループ構造を介して付着され、鋳型鎖は５´リーダー配列を含む。図１Ａは、酵素の制御下でナノポアを通って転座するポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）構築物の概略図である。鋳型がナノポアに入り、鋳型に続く補体の動きを制御するために、同一の酵素がヘアピンの周りを進む。ヘアピン領域がナノポアを通って転座した時点で、ヘアピンはナノポアのトランス側で再形成されてもよい。図１Ｂは、鋳型の転座及び補体の転座から得られた配列情報を、アルゴリズム的に組み合わせた際の鋳型の転座及び補体の転座から得られた配列情報の精度を表すピークを示す。
【００６９】
【図２Ａ】図２Ａ−２Ｂは、本明細書に記載の一実施形態によるヘアピンを使用せずに、二本鎖ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）構築物を「後続」配列決定する方法を示す。鋳型及び相補ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）鎖の両方は、リーダー配列を含むアダプターを各末端に含む。図２Ａは、酵素制御下でナノポアを通って転座する二本鎖ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）構築物の概略図である。二本鎖ポリヌクレオチドの鋳型及び補体は共有結合しておらず、各鎖はアダプターにロードされた酵素を有する。鋳型鎖がナノポアを通過した（及び酵素が解離した）後、相補鎖はポアによって別々に捕捉され、配列決定される。鋳型を補体に結合するヘアピンがない場合、ナノポアのトランス側に形成される二次ヘアピン構造はほとんど又は全くない。図２Ｂは、鋳型の転座及び補体の転座から得られた配列情報を、アルゴリズム的に組み合わせた際の鋳型の転座及び補体の転座から得られた配列情報の精度を表すピークを示す。
【図２Ｂ】図２Ａ−２Ｂは、本明細書に記載の一実施形態によるヘアピンを使用せずに、二本鎖ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）構築物を「後続」配列決定する方法を示す。鋳型及び相補ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）鎖の両方は、リーダー配列を含むアダプターを各末端に含む。図２Ａは、酵素制御下でナノポアを通って転座する二本鎖ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）構築物の概略図である。二本鎖ポリヌクレオチドの鋳型及び補体は共有結合しておらず、各鎖はアダプターにロードされた酵素を有する。鋳型鎖がナノポアを通過した（及び酵素が解離した）後、相補鎖はポアによって別々に捕捉され、配列決定される。鋳型を補体に結合するヘアピンがない場合、ナノポアのトランス側に形成される二次ヘアピン構造はほとんど又は全くない。図２Ｂは、鋳型の転座及び補体の転座から得られた配列情報を、アルゴリズム的に組み合わせた際の鋳型の転座及び補体の転座から得られた配列情報の精度を表すピークを示す。
【００７０】
【図３Ａ】図３Ａ−３Ｂは、本明細書に記載の一実施形態による酵素担持アダプターの構造を示す。図３Ａは酵素担持アダプターの概略図である。標識は以下を表す：（１）スペーサー（例えば、リーダー配列）、（２）ヘリカーゼ（例えば、Ｄｄａヘリカーゼ）などのポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）、（３）スペーサー、及び（４）コレステロールアンカーなどのアンカー。他の実線はポリヌクレオチド配列を表す。図３Ｂは、各アダプター上にロードされたポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）を有する、ゲノムＤＮＡの断片などの二本鎖ポリヌクレオチドの各末端に付着したアダプターを示す。
【図３Ｂ】図３Ａ−３Ｂは、本明細書に記載の一実施形態による酵素担持アダプターの構造を示す。図３Ａは酵素担持アダプターの概略図である。標識は以下を表す：（１）スペーサー（例えば、リーダー配列）、（２）ヘリカーゼ（例えば、Ｄｄａヘリカーゼ）などのポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）、（３）スペーサー、及び（４）コレステロールアンカーなどのアンカー。他の実線はポリヌクレオチド配列を表す。図３Ｂは、各アダプター上にロードされたポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）を有する、ゲノムＤＮＡの断片などの二本鎖ポリヌクレオチドの各末端に付着したアダプターを示す。
【００７１】
【図４】ナノポアを通るポリヌクレオチド鎖の転座中に経時的に測定された電流信号の概略図である。
【００７２】
【図５】ナノポア界面での二本鎖ポリヌクレオチドの分離及びナノポアを通る一本鎖ポリヌクレオチドのその後の転座の説明図である。
【００７３】
【図６】ポリヌクレオチドを配列決定する間の図４の現在時刻信号の一部のイベント検出の説明図である。
【００７４】
【図７】リカレントニューラルネットワーク（ＲＮＮ）モデルを用いた信号測定値の解析の概略図である。
【００７５】
【図８】どのようにビタビアルゴリズムを用いて可能性が最も高い遷移を通る経路を決定するかの説明図である。
【００７６】
【図９Ａ】図９Ａ−９Ｂは、本明細書に記載の一実施形態に係る酵素担持アダプターの構造を示す。図９Ａは酵素担持アダプターの概略図である。標識は以下を表す：（１）スペーサー（例えば、リーダー配列）、（２）ヘリカーゼ（例えば、Ｄｄａヘリカーゼ）などのポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）、（３）スペーサー、（４）コレステロールアンカーなどの任意選択のアンカー、及び（５）（１）スペーサー（例えば、リーダー配列）の反対側の末端に位置する二重鎖ステムであって、二本鎖ステムは（１）スペーサー（例えば、リーダー配列）と整列している鎖上の捕捉配列を含み、捕捉配列はナノポアの外縁に接合したタグ（例えば、捕捉ポリヌクレオチド）に相補的である、二重鎖ステム。他の実線はポリヌクレオチド配列を表す。図９Ｂは、各アダプター上にロードされたポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）を有する、アダプターが二本鎖ポリヌクレオチドの各末端に付着している場合の構築物を示す。
【図９Ｂ】図９Ａ−９Ｂは、本明細書に記載の一実施形態に係る酵素担持アダプターの構造を示す。図９Ａは酵素担持アダプターの概略図である。標識は以下を表す：（１）スペーサー（例えば、リーダー配列）、（２）ヘリカーゼ（例えば、Ｄｄａヘリカーゼ）などのポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）、（３）スペーサー、（４）コレステロールアンカーなどの任意選択のアンカー、及び（５）（１）スペーサー（例えば、リーダー配列）の反対側の末端に位置する二重鎖ステムであって、二本鎖ステムは（１）スペーサー（例えば、リーダー配列）と整列している鎖上の捕捉配列を含み、捕捉配列はナノポアの外縁に接合したタグ（例えば、捕捉ポリヌクレオチド）に相補的である、二重鎖ステム。他の実線はポリヌクレオチド配列を表す。図９Ｂは、各アダプター上にロードされたポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）を有する、アダプターが二本鎖ポリヌクレオチドの各末端に付着している場合の構築物を示す。
【００７７】
【図１０】図１０（パネルＡ〜Ｄ）は、本明細書に記載の一実施形態によるナノポアを用いて、二本鎖ポリヌクレオチドを配列決定するための方法の概略図を示す。該方法は、（ｉ）各末端がアダプター（例えば、図９Ａに示すように、アンカー（４）がない）に付着している二本鎖ポリヌクレオチド及びアダプター上にロードされたポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）に結合している二本鎖ポリヌクレオチド、及び（ｉｉ）ナノポアの外縁に接合した捕捉ポリヌクレオチドを有するナノポアを提供することを含む。第二鎖に付着しているアダプターの捕捉配列をナノポアの外縁に接合したタグ（例えば、捕捉ポリヌクレオチド）に結合することによって、二本鎖ポリヌクレオチドの第二鎖（補体）をナノポアに結合する。
【００７８】
【図１１Ａ】図１１Ａ−１１Ｂは、本明細書に記載の一実施形態による方法で得られた鎖データの例を示す。鎖データは、単一チャンネルの電気データの電流（ｐＡ）対時間（秒）を示す。図１１Ａは、鎖データの例を示し、それは鎖が電流を遮断していない開孔レベルが約２００ｐＡであることを示す。鎖が捕捉されると、配列組成に応じて、電流は５０〜１００ｐＡの範囲に減少する。鎖がポアを通過し終えると、電流は２００ｐＡの開放ポアレベルに戻る。別個の鎖は、鋳型鎖と相補鎖のペアについては、Ｔｎ（例えば、Ｔ１，Ｔ２，．．．）及びＣｎ（例えば、Ｃ１，Ｃ２，．．．）と標識付けされ、Ｔの後にその相補のペアが続かない鎖については、Ｔと標識付けされる。標識及びデータは表４のデータに対応する。図１１Ａは、ペアの相補的な第二鎖は、通常鎖間は非常に短い時間で鋳型の直後に続くことを示す。図１１Ｂは、鋳型１及び補体１と標識付けされた後続のペアの一つを強調表示する、電気トレースの拡大部分を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ａ−１１Ｂは、本明細書に記載の一実施形態による方法で得られた鎖データの例を示す。鎖データは、単一チャンネルの電気データの電流（ｐＡ）対時間（秒）を示す。図１１Ａは、鎖データの例を示し、それは鎖が電流を遮断していない開孔レベルが約２００ｐＡであることを示す。鎖が捕捉されると、配列組成に応じて、電流は５０〜１００ｐＡの範囲に減少する。鎖がポアを通過し終えると、電流は２００ｐＡの開放ポアレベルに戻る。別個の鎖は、鋳型鎖と相補鎖のペアについては、Ｔｎ（例えば、Ｔ１，Ｔ２，．．．）及びＣｎ（例えば、Ｃ１，Ｃ２，．．．）と標識付けされ、Ｔの後にその相補のペアが続かない鎖については、Ｔと標識付けされる。標識及びデータは表４のデータに対応する。図１１Ａは、ペアの相補的な第二鎖は、通常鎖間は非常に短い時間で鋳型の直後に続くことを示す。図１１Ｂは、鋳型１及び補体１と標識付けされた後続のペアの一つを強調表示する、電気トレースの拡大部分を示す。
【００７９】
【図１２Ａ】図１２Ａ−１２Ｄは、本明細書に記載の一実施形態による方法で得られた鎖データの例を示す。鎖データは、ＭｉｎＩＯＮチップ上の単一チャンネルの電気データの電流（ｐＡ）対時間（秒）を示す。図１２Ａは、後続の鋳型−補体ペアの更なる例示的な電気トレースを示す。図１２Ｂ、１２Ｃ、及び１２Ｄはポアタグ（例えば、ナノポアの外縁に接合した捕捉ポリヌクレオチド）への結合を可能にするために鎖に付加された二本鎖ステム（例えば、相補的タグ部）中のｓｐ１８スペーサーを星印でマークした図１２Ａのトレースのズームを示す。図１２Ｂは、鋳型鎖の開始時のｓｐ１８を示す。図１２Ｃは鋳型の末端及び補体の始まりにおけるｓｐ１８を示し、図１２Ｄは補体の末端におけるｓｐ１８を示す。これらのマーカーは、ｄｓＤＮＡ基質がｄｓＤＮＡの両端に付着した酵素アダプターを有することを実証し、付着の効率を測定するために使用することができる。
【図１２Ｂ】図１２Ａ−１２Ｄは、本明細書に記載の一実施形態による方法で得られた鎖データの例を示す。鎖データは、ＭｉｎＩＯＮチップ上の単一チャンネルの電気データの電流（ｐＡ）対時間（秒）を示す。図１２Ａは、後続の鋳型−補体ペアの更なる例示的な電気トレースを示す。図１２Ｂ、１２Ｃ、及び１２Ｄはポアタグ（例えば、ナノポアの外縁に接合した捕捉ポリヌクレオチド）への結合を可能にするために鎖に付加された二本鎖ステム（例えば、相補的タグ部）中のｓｐ１８スペーサーを星印でマークした図１２Ａのトレースのズームを示す。図１２Ｂは、鋳型鎖の開始時のｓｐ１８を示す。図１２Ｃは鋳型の末端及び補体の始まりにおけるｓｐ１８を示し、図１２Ｄは補体の末端におけるｓｐ１８を示す。これらのマーカーは、ｄｓＤＮＡ基質がｄｓＤＮＡの両端に付着した酵素アダプターを有することを実証し、付着の効率を測定するために使用することができる。
【図１２Ｃ】図１２Ａ−１２Ｄは、本明細書に記載の一実施形態による方法で得られた鎖データの例を示す。鎖データは、ＭｉｎＩＯＮチップ上の単一チャンネルの電気データの電流（ｐＡ）対時間（秒）を示す。図１２Ａは、後続の鋳型−補体ペアの更なる例示的な電気トレースを示す。図１２Ｂ、１２Ｃ、及び１２Ｄはポアタグ（例えば、ナノポアの外縁に接合した捕捉ポリヌクレオチド）への結合を可能にするために鎖に付加された二本鎖ステム（例えば、相補的タグ部）中のｓｐ１８スペーサーを星印でマークした図１２Ａのトレースのズームを示す。図１２Ｂは、鋳型鎖の開始時のｓｐ１８を示す。図１２Ｃは鋳型の末端及び補体の始まりにおけるｓｐ１８を示し、図１２Ｄは補体の末端におけるｓｐ１８を示す。これらのマーカーは、ｄｓＤＮＡ基質がｄｓＤＮＡの両端に付着した酵素アダプターを有することを実証し、付着の効率を測定するために使用することができる。
【図１２Ｄ】図１２Ａ−１２Ｄは、本明細書に記載の一実施形態による方法で得られた鎖データの例を示す。鎖データは、ＭｉｎＩＯＮチップ上の単一チャンネルの電気データの電流（ｐＡ）対時間（秒）を示す。図１２Ａは、後続の鋳型−補体ペアの更なる例示的な電気トレースを示す。図１２Ｂ、１２Ｃ、及び１２Ｄはポアタグ（例えば、ナノポアの外縁に接合した捕捉ポリヌクレオチド）への結合を可能にするために鎖に付加された二本鎖ステム（例えば、相補的タグ部）中のｓｐ１８スペーサーを星印でマークした図１２Ａのトレースのズームを示す。図１２Ｂは、鋳型鎖の開始時のｓｐ１８を示す。図１２Ｃは鋳型の末端及び補体の始まりにおけるｓｐ１８を示し、図１２Ｄは補体の末端におけるｓｐ１８を示す。これらのマーカーは、ｄｓＤＮＡ基質がｄｓＤＮＡの両端に付着した酵素アダプターを有することを実証し、付着の効率を測定するために使用することができる。
【００８０】
【図１３】連続鎖がポア（ＭｉｎＩＯＮチップ上の全てのチャネルから集められた）を通過するときの後続鎖（ｘ軸）間の開孔時間の分布のヒストグラムを示す。上部パネル、対照アダプター（実施例２に記載）は、ポアタグに結合することができるポリヌクレオチド構築物中の捕捉配列（例えば、捕捉ポリヌクレオチド）無しで配列決定した場合、時間の分布が鎖間で平均約３秒であることを示す。下部パネル、後続アダプター２（実施例４に記載）は、鎖がポアタグに結合することができる補体に捕捉配列（例えば、捕捉ポリヌクレオチド）を含む場合、約５０ミリ秒の新しい個体群が観察されることを示す。短い５０ミリ秒の個体群は、その鋳型対直後の相補鎖の速い捕捉からのものである。ポアタグへの補体の結合を介して相補鎖をポアに非常に近接して保持し、その結果、拡散して離れることは不可能なので、捕捉は速い。
【００８１】
【図１４】鋳型の転座及び補体の転座から得られた配列情報をアルゴリズム的に組み合わせた際の鋳型の転座及び補体の転座から得られた配列情報（ランダムに断片化された大腸菌）のベースコール精度の分布のヒストグラムを示す。図１０に示す方法で配列情報を取得した。
【００８２】
【図１５】二種類以上のタグを有するナノポアの例示的な実施形態を示す。例えば、あるタグは、検体を特徴付ける方法の感度を高め（「感度タグ」）、一方で別のタグは、二本鎖ポリヌクレオチドの鋳型鎖に続く相補鎖の配列決定の可能性を高める（「後続タグ」）。ポアタグは、いくつかの方法で構成することができる。例えば、オリゴマーポアの各モノマーは、同一のタイプのタグ構成（例えば、タグＡ及びタグＢによって示されるように、複数の結合部位を有するなど）を有することができる。単一タグを形成するために、タグＡとタグＢを組み合わせることができ、各モノマーはタグ−Ａ／タグ−Ｂ組み合わせタグを含む。あるいは、少なくとも一つのモノマーが他のモノマーからの異なるタグ構成を有するように、オリゴマーポアは異なるタグが付着した混合モノマーを含むことができる。別の例では、タグ−Ａ及びタグ−Ｂは別個のタグのままであってもよく、各モノマーは両方の個々のタグを含むことができる。回路図アダプター設計の下部パネルに示すように、感度タグと後続タグは、アダプターで使用される固有配列に相補的である場合、別々に組み合わせることができる。
【００８３】
【図１６】二つの異なるタグタイプを有するナノポアを用いて溶液から鎖を捕捉する方法（感度向上のため）の概略図である。二本鎖ポリヌクレオチドの末端に付着しているアダプターは、第一のポアタグと結合するために利用可能な捕捉配列（例えば、Ｙアダプターの非相補的アームを形成する）を含む一方、解離した場合にのみ明らかになる二本鎖ステム内の別個の捕捉配列は、補体が第二のポアタグに結合することを可能にし、その結果、後続の配列決定のための補体捕捉を可能にする。
【００８４】
【図１７Ａ】図１７Ａ−１７Ｂは、同一の捕捉配列をアダプターの２箇所で使用することができる方法の概略図であって、１箇所は感度を向上させるために、鎖が溶液からのナノポアのポアタグに結合することを可能にしたものであり、もう１箇所は最初は明らかにされておらず、鋳型がポアを通って解離すると露出され、後続の配列決定を可能にするように、ポア上の複数のタグの別のタグ（１種類のタグのみを有するポア）に結合できるようになる。図１７Ｂはそのような目的に使用することができるいくつかの例示的な配列を提供する。一番上の構成はＹアダプターの例の一部を示す。「ＦＯ００１／ＦＯ００２」及び「ＦＯ００３／ＦＯ００４」配列は、本明細書に記載の一つ以上の実施形態による方法を可能にする単一のアダプター構築物を生成するための、例示のＹアダプターに連結可能な二本鎖ステムの例である。「ＦＯ００１／ＦＯ００２」及び「ＦＯ００３／ＦＯ００４」配列中の水色配列は、ナノポアの結合配列部位である紫色配列と同一の配列を有する。ナノポアに対する同一の結合配列部位は、水色配列が露出していないアダプターの二本鎖ステム内で複数回（例えば、二回）使用することができる。
【図１７Ｂ】図１７Ａ−１７Ｂは、同一の捕捉配列をアダプターの２箇所で使用することができる方法の概略図であって、１箇所は感度を向上させるために、鎖が溶液からのナノポアのポアタグに結合することを可能にしたものであり、もう１箇所は最初は明らかにされておらず、鋳型がポアを通って解離すると露出され、後続の配列決定を可能にするように、ポア上の複数のタグの別のタグ（１種類のタグのみを有するポア）に結合できるようになる。図１７Ｂはそのような目的に使用することができるいくつかの例示的な配列を提供する。一番上の構成はＹアダプターの例の一部を示す。「ＦＯ００１／ＦＯ００２」及び「ＦＯ００３／ＦＯ００４」配列は、本明細書に記載の一つ以上の実施形態による方法を可能にする単一のアダプター構築物を生成するための、例示のＹアダプターに連結可能な二本鎖ステムの例である。「ＦＯ００１／ＦＯ００２」及び「ＦＯ００３／ＦＯ００４」配列中の水色配列は、ナノポアの結合配列部位である紫色配列と同一の配列を有する。ナノポアに対する同一の結合配列部位は、水色配列が露出していないアダプターの二本鎖ステム内で複数回（例えば、二回）使用することができる。
【００８５】
【図１８】後続の配列決定及び感度の向上を可能にするアダプター設計の概略図を示す。ポア結合配列（図１８において「モルフォリノポアタグのためのＨｙｂ副子」と表示されている）は、周囲の溶液にさらされ、最初はポアタグへの結合に利用可能であるため、感度を向上させる。付着したとき、ポア結合部位は相補鎖とも隣接し、そのため鋳型鎖がポアを通過したとき、相補鎖はポアに結合したままである。このプロセスは図１９に概略的に示す。
【００８６】
【図１９】各末端に付着した図１８のアダプターを有する二本鎖ポリヌクレオチドを示す概略図である。鎖は、露出したポア結合部位を介して溶液からのナノポアに結合され、その結果、近傍の鋳型鎖の後続捕捉の感度を向上させる。結合部位も相補鎖と隣接するので、鋳型がナノポアを通過したとき、補体はナノポアに結合したままである。補体は、後続の配列決定を可能にする最終的な捕捉及び配列決定の前に、示すように、多くの可能な立体配座へ進む可能性がある。図１９では、検出される鎖の両端にそれぞれ結合した緑色及び黄色の相補的セグメントは、鎖を含むヘアピン構造を形成するように一緒に結合することができ、配列決定効率を高めるために鎖をナノポアに近づけることによって配列決定プロセスを容易にする。これは、検出される鎖が長鎖である場合、特に有益である。
【００８７】
【図２０】図２１に示す後続の方法を可能にするために、示すように、二本鎖ステム内の同一の配列（緑色）が、アダプターの異なる位置で繰り返されるアダプター設計の概略図を示す。
【００８８】
【図２１】各末端に付着した図２０のアダプターを有する二本鎖ポリヌクレオチドを示す概略図である。図２０に記載されるように、ｄｓＤＮＡ鎖は、アダプターに付着したサイドアーム上の結合部位を介して示すようにポアに結合する。鋳型がポア内に捕捉されるとき、サイドアーム配列は解離され、示すようにポアタグに結合したままである。後に、同一の配列で第二部位を解離した鋳型は、サイドアームに結合することが明らかにされている。このようにして、ポア上の単一のタグは捕捉感度を向上させるために使用することができ、後に基材の補体の追跡を可能にするために再使用することができる。最後に、ポアタグはサイドアーム配列を保持するが、サイドアーム自体はポアによって捕捉され、ポアタグから剥がされて別のサイクルのためにポアタグを放出する。
【００８９】
【図２２】鋳型酵素が鋳型鎖の末端に近づくにつれて、明らかにされた配列がポアタグとの結合のためにどのように露出されるかを示す。例えば、スペーサー（例えば、４個のｓｐ１８スペーサー、例えば、示された配列でのヘキサエチレングリコール）、又は結合のためのより多くの時間を可能にする酵素を一時停止させる類似の特性又は最適化された形状又は柔軟性を有する特性を含めることによって、後続プロセスの効率を高めることができる。明らかにされた部分における二重結合部もまた、ポアタグへの結合の可能性を改善する。
【００９０】
【図２３】図２１に開示された方法を可能にする例示的なアダプター／配列を提供する。
【００９１】
【図２４】図２１に開示された方法を可能にし、酵素を一時停止させる点でより最適化されている更なるアダプター／配列を提供する。
【００９２】
【図２５】図１９に開示された方法を可能にする例示的なアダプター／配列を提供する。
【００９３】
【図２６】上記図に記載されているアダプターを構成する構成要素の配列の例を提供する。
【００９４】
【図２７Ａ】モルフォリノポアタグの有無にかかわらず、修飾されたＣｓｇＧのモノマー及びオリゴマーナノポアを示すＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙタンパク質ゲルを示す。
【図２７Ｂ】ピリジル−ジチオモルフォリノで修飾されたナノポアの概略図を示す。
【００９５】
【図２８】ピリジル−ジチオモルフォリノ修飾ポアに対する検体のハイブリダイゼーションを示すＣｙ３蛍光ゲルを示す。
【００９６】
【図２９】ピリジル−ジチオモルフォリノ修飾ポアに対する検体のハイブリダイゼーションを示すＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ核酸ゲル染色を示す。
【００９７】
【図３０】ピリジル−ジチオモルフォリノ修飾ポアに対する検体のハイブリダイゼーションを示すＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙタンパク質ゲルを示す。
【００９８】
【図３１】ポアタグへの結合のためにシステインを付加することができる位置で強調表示されたナノポア（例えば、ＣｓｇＧナノポア）のコンピューターレンダリングを示す図を図示する。ナノポアが膜内に配置された場合、ポアタグは、ナノポアの外面、例えば、膜のシス側又はトランス側に接合することができる。
【００９９】
【図３２Ａ】一つがポアテザー用（赤色）であり、もう一つが膜又はビーズテザー用（青色）である二つのハイブリダイゼーション部位を含むＹアダプター設計の一実施形態を示す。この設計では、ポアテザーはリーダー配列の隣にある。
【図３２Ｂ】結合した検体、例えば、両端にＹアダプターを有する二本鎖ポリヌクレオチドを示す。
【０１００】
【図３３】図３２Ａに示すＹアダプター設計の例示的な配列を示す概略図である。
【０１０１】
【図３４Ａ】一つがポアテザー用（赤）であり、もう一つが膜又はビーズテザー用（青）である二つのハイブリダイゼーション部位を含むＹアダプター設計の別の実施形態を示す。この設計では、膜テザーはリーダー配列の隣にある。
【図３４Ｂ】結合した検体、例えば、両端にＹアダプターを有する二本鎖ポリヌクレオチドを示す。
【０１０２】
【図３５】図３４Ａに示したＹアダプター設計の例示的な配列を示す概略図である。
【０１０３】
【図３６】一つがポアテザー用（赤）であり、もう一つが膜又はビーズテザー用（青）である二つのハイブリダイゼーション部位を含むＹアダプター設計の代替実施形態を示す概略図である。この設計では、ビーズは、一つが解析対象物（青）へのものであり、もう一つがポアへのもの（赤）である二つの異なるテザーを有する。
【０１０４】
【図３７】図３６に示したＹアダプター設計の例示的な配列を示し、かつポアへの検体の間接的付着を示す概略図である。
【０１０５】
【図３８】後続の配列決定を可能にする鎖に結合することができるポアタグなしで、ナノポアを通って転座する連続鎖の例示的なトレースを示す。鎖間の時間は赤いバーで示され、これらの例では、鎖間の時間は２〜５秒の範囲である。
【０１０６】
【図３９】本明細書に記載の一実施形態による、修飾されたポアを転座させる連続鎖の例示的なトレースを示す。鎖間の時間は赤いバーで示され、これらの例では、鎖間の時間は０．０２〜３秒の範囲である。
【０１０７】
【図４０】対数目盛での連続鎖の間の時間を図示するヒストグラムを示す。左のグラフは、鎖間の時間が１秒を超える単一分布を有するナノポア（例えば、ＣｓｇＧポア）を示す。右のグラフは、結合したポアを通って転座する鎖間の時間を示す。これは二つの個体群、０．１秒以下の鎖間の時間の速い捕捉個体群を示す。
【０１０８】
【図４１】２０ｎｇの入力ＤＮＡから６時間にわたって１チップごとに配列決定された塩基数を示すグラフである。赤い線は結合したポアを表し、青い線は結合していないナノポアを表す。
【０１０９】
【図４２】結合したポアを有する後続鎖の数の増加を示す大腸菌実験からのデータ表を示す。
【図４３】一本鎖核酸と二本鎖核酸の両方を連結するために使用することができる方法を示す。
【０１１０】
【図４４】多くの二本鎖標的ポリヌクレオチドを特徴付け、連結する方法を示す。ここで、第一の二本鎖標的ポリヌクレオチドの相補鎖は、他の多くの二本鎖標的ポリヌクレオチドを補充し、それらをポアの局所濃度に入れる。これは、一般的なバルク溶液中よりもポアの周りにより高い局所濃度を提供し、したがって、二本鎖標的ポリヌクレオチドは鎖間の最短時間で開放ポアを通って相互に追従する。これは二本鎖標的ポリヌクレオチドの濃度が低い場合に特に有用である。一本鎖結合タンパク質に結合したオリゴからなるテザーが使用される。第一の二本鎖標的ポリヌクレオチドの鋳型鎖を配列決定するときに、相補鎖をｓｓＤＮＡとして溶液中に放出する。他の二本鎖標的ポリヌクレオチドの一本鎖結合タンパク質はｓｓＤＮＡに結合することができる。相補鎖を配列決定するときに、相補鎖の３´をポアへ引き戻す。ｓｓＤＮＡ相補鎖上の一本鎖結合タンパク質は、モータータンパク質に遭遇するとき、相補鎖から置換されるため、ポアの周りに沈着し、局所濃度を上げる。
【発明を実施するための形態】
【０１１１】
膜貫通孔（例えば、タンパク質ナノポア又は固体ナノポア）は、バイオポリマーを検出又は特徴付けるためのセンサーとして有用であるが、膜貫通孔を用いた検出方法の精度及び／又は効率を高めるという課題は依然として存在する。例えば、ナノポアを通るヘアピンによって連結された二本鎖ポリヌクレオチドの鋳型鎖及び相補鎖の両方の転座には様々な欠点がある。このように両方の鎖を測定することは、二つの相補結合鎖からの情報を組み合わせて使用し、鋳型鎖のみの測定から得られるものより高い精度を提供することができるため、有利であるが、そのようなヘアピン結合ポリヌクレオチドの製造は、より複雑で時間がかかり、貴重な検体の損失をもたらすおそれがある。さらに、ヘアピン結合鋳型及び補体ポリヌクレオチド鎖のナノポアを通る転座は、ナノポアの反対側（トランス）での鎖の再ハイブリダイゼーションを引き起こすおそれがある。これは転座速度を変えて配列決定の精度を低下させるおそれがある。ヘアピン構造を有する鎖はまた、単一直鎖のように速く転座することがより困難である。さらに、鋳型鎖と相補鎖の現在時刻データが異なるため、二つのアルゴリズムが計算に使用される。そのため、計算をより複雑で集中的にする。
【０１１２】
検体検出のために、通常は、一つの検体の転座と次の検体の転座との間に時間遅延がある。この遅延は数秒から数分のオーダーであり得、これはより遅い特徴付け、参照電極をより急速に消耗するより高いポア開放電流、及び／又はポアが開放される際にナノポアが塞がれる可能性の増大をもたらすおそれがある。したがって、ナノポアを用いて検体を特徴付けるための精度及び／又は効率又はスループットを向上させる方法及び組成物を開発する必要がある。
【０１１３】
本開示は、部分的には、ヘアピンループ構造などの架橋部分を介して二本の鎖を共有結合させる必要がなく、二本鎖ポリヌクレオチドの両方の鎖が順次ナノポアを通って転座して、配列情報を提供することができるという予想外の発見に基づいている。例えば、一態様では、本発明者らは、膜貫通孔を通る一本の鎖の動きを制御しながら、ポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）を用いて二本の鎖ポリヌクレオチドの二本鎖を分離する場合、ポアを通る第一鎖の転座の後に、第二鎖はポアの近傍にとどまってもよく、第二鎖はポアによって捕捉することができ、ポリヌクレオチド結合タンパク質はポアを通る第二鎖の動きを制御するために使用してもよいことを発見した。
【０１１４】
別の態様では、本発明者らは、ナノポアに接合したポアタグに相補的な捕捉配列を含む二本鎖ステム付きアダプターは、二本鎖ポリヌクレオチドの各末端に提供され得、捕捉配列は鎖の分離又は巻き戻し時にのみ明らかにされることを発見した。したがって、二本鎖ポリヌクレオチドの第一鎖がタグ修飾ナノポアを通過するときに、それはアダプターの二本鎖ステムを解離して二本鎖ポリヌクレオチドの第二鎖上の捕捉配列を露出させ、次いでナノポアのポアタグで捕捉する。そのような方法は、そうでなければ通常は拡散する第二鎖を、配列決定される鋳型に続く配列決定のためにナノポアに接近するように保つ。特に、本明細書に記載の方法は、典型的なナノポア配列決定における、典型的に観察される時間の０．１％〜１％と比較して、鋳型転座後の補体の後続転座の可能性を、少なくとも時間の約６０％まで大幅に高めることができる。
【０１１５】
検体をナノポアによって特徴付ける間に、一つ以上の検体が結合部位を介してナノポアに結合することができるように、複数の検体のための複数の結合部位を含むナノポアの修飾は、検体を特徴付けるための感度及び／又はスループットを高めることができることも発見された。理論に縛られることを望むことなく、ナノポアの外縁での検体の結合又は捕捉は、ポアにおける検体の局所濃度を高めることができる。さらに、特徴付けのためのナノポアの近傍の少なくとも一つ以上の検体は、次々にナノポアに容易に入ることができるため、各検体の特徴付けの間の時間遅延を減少し、その結果開孔電流時間を減少する。
【０１１６】
したがって、本明細書の様々な態様は、ナノポア及び本明細書に記載の方法で使用することができるアダプター及びナノポアを含む組成物及びシステムを用いて、一つ以上の検体を特徴付ける方法に関する。いくつかの態様は、例えば、鋳型と二本鎖ポリヌクレオチドの補体とを接続するヘアピンを使用せずに、ナノポアを用いて二本鎖ポリヌクレオチドを特徴付けるための方法及び組成物を特徴とする。他の態様は、増大した感度及び／又はより高いスループットを有するタグ修飾ナノポアを用いて検体を特徴付けるための方法及び組成物を特徴とする。
【０１１７】
検体（例えば、二本鎖ポリヌクレオチド）を特徴付けるための方法
【０１１８】
一態様では、開示は標的ポリヌクレオチドを配列決定する方法を提供し、以下を含む：
【０１１９】
（ａ）膜貫通孔を以下のものと接触させること：
【０１２０】
（ｉ）それぞれ一本鎖リーダー配列を含む標的ポリヌクレオチド及び標的ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドが含まれている二本鎖ポリヌクレオチド、並びに
【０１２１】
（ｉｉ）二本鎖ポリヌクレオチドの鎖を分離し、膜貫通孔を通るポリヌクレオチドの動きを制御することができるポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）；
【０１２２】
（ｂ）ポアを通って転座するポリヌクレオチドを検出するために、ポアを通るイオンの流れに対応する信号を検出すること；
【０１２３】
（ｃ）標的ポリヌクレオチドの転座に対応する信号及び標的ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドの別個の転座に対応する配列信号を同定すること；
【０１２４】
（ｄ）（ｃ）で同定された信号を解析すること、
【０１２５】
それによって標的ポリヌクレオチドを配列決定すること。
【０１２６】
該方法は、ステップ（ａ）の前に、一本鎖リーダー配列を標的及び相補的ポリヌクレオチドに付着させるステップをさらに含んでもよい。該方法は、ステップ（ａ）の前に、標的ポリヌクレオチドの一端を消化して相補鎖上にリーダー配列を生成するステップ、及び／又は相補ポリヌクレオチドの一端を消化して標的鎖上にリーダー配列を生成するステップをさらに含んでもよい。該方法は、ポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）をリーダー配列に結合させることをさらに含んでもよい。（ａ）（ｉｉ）中のポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）は、（ａ）（ｉ）中のリーダー配列に結合されてもよい。
【０１２７】
この態様では、第一のポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）は、二本鎖ポリヌクレオチドの標的鎖と相補鎖を分離し、膜貫通孔を通る標的ポリヌクレオチド又は相補ポリヌクレオチドのいずれかの動きを制御する。第二のポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）は、第一のポリヌクレオチド結合タンパク質と同一種類の別のタンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）であってもよい、又は異なる種類のポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）であってもよく、相補的ポリヌクレオチドが既にポアを通って転座した標的ポリヌクレオチド、又は標的ポリヌクレオチドが既にポアを通って転座した相補的ポリヌクレオチドのいずれかの膜貫通孔を通る動きを制御する。二本鎖ポリヌクレオチドの二本の鎖はすでに分離しているので（第一のポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）は、一本の鎖をポアに通過させながら二本の鎖を分離した）、第二のポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）は、標的ポリヌクレオチドと相補的ポリヌクレオチドを分離する必要はない。第一のポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）は、通常は、二本鎖ポリヌクレオチドを処理するものである。第二ポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）は、通常は、一本鎖ポリヌクレオチドを処理するものである。第一及び／又は第二のポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）は、二本鎖ポリヌクレオチド及び一本鎖ポリヌクレオチドを処理することが可能であってもよい。
【０１２８】
本明細書に記載の別の態様は、ナノポアを通って二つの非共有結合分子を逐次転座させるための方法を特徴とする。該方法は、ナノポアを通る非共有結合分子対の第一のメンバーの転座を促進する条件下で、一対の非共有結合分子をナノポアに接触させることを含む。ここで、ナノポアを通る第一のメンバーの転座の間に、一対の第二メンバー上の結合部位は露出し、露出した結合部位はナノポア上に存在しているタグ又はテザーに結合する。第二メンバー上の結合部位は、ナノポアを通る第一のメンバーの転座の前に露出されていない（又は遮蔽されている）。
【０１２９】
本明細書では、用語「非共有結合分子」とは、第一のメンバー及び第二のメンバーを含む分子を指す。ここで、第一のメンバー及び第二メンバーは非共有付着方式で相互に関連しており、別個の実体として相互に分離することができる。第一のメンバーと第二メンバーとの間の分離及び結合過程は可逆的である。非共有付着の手段の例として、相補的塩基対合、イオン相互作用、疎水性相互作用、及び／又はファンデルワールス相互作用が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、非共有結合分子は相補的ポリヌクレオチド鎖を含む。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、ナノポア上のタグはオリゴヌクレオチドであり、第二メンバー上の結合部位はタグに相補的な配列を有する核酸の一部である。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、一対の非共有結合分子は、アダプター核酸に結合した標的核酸（例えば、標的二本鎖ポリヌクレオチド）を含み、結合部位はアダプター核酸上にある。
【０１３３】
一例としてのみ、図９Ｂは、相補的ポリヌクレオチド鎖（例えば、鋳型鎖及び相補鎖）及び各末端に結合したアダプター（例えば、アダプター核酸）を含む非共有結合分子を示す。図９Ａに示すように、アダプターは、二本鎖ステム（５）及び二本鎖ステムの鋳型鎖から延伸する第一の一本鎖ポリヌクレオチド（１）を含む。二本鎖ステム（５）は第一の一本鎖ポリヌクレオチド（１）と整列している鎖上の捕捉配列を含む。ここで、捕捉配列はナノポアの外縁に接合したタグ（例えば、捕捉ポリヌクレオチド）に相補的である。いくつかの実施形態では、第一の一本鎖ポリヌクレオチド（１）はリーダー配列をも含んでもよい。図９Ａは、二本鎖ステムの相補鎖（例えば、相補鎖）から延伸する第二一本鎖ポリヌクレオチドを示すが、必須ではない。しかしながら、いくつかの実施形態では、固体基板、例えば、膜又はビーズ、及び／又はナノポアのための一つ以上のテザーを含む一つ以上の第二一本鎖ポリヌクレオチドを有することが望ましい可能性がある。第二一本鎖ポリヌクレオチドが第一の一本鎖ポリヌクレオチドと相補的でない場合、例えば図９Ａに示すように、Ｙ−アダプターが形成される。
【０１３４】
図９Ａは、固体基板（例えば、膜又はビーズ）用の少なくとも一つのアンカーを含む例示的なアダプターを示し、図１５は、少なくとも二つのアンカーを含む例示的なアダプターを示す。第一のアンカーは固体基板、例えば、膜又はビーズに係留することができ、第二のアンカーはナノポアに係留することができる。ナノポアに結合したタグに結合するように、ナノポア用の第二アンカーを構成することができる。いくつかの実施形態では、ナノポアに結合したタグに直接結合するように、ナノポア用の第二アンカーを構成することができる。例えば、ナノポア用の第二アンカーは、ナノポアに結合した捕捉ポリヌクレオチドタグに相補的な配列を含むことができる。代替的な実施形態では、ナノポアに接合したタグに間接的に結合するように、ナノポア用の第二のテザーを構成することができる。例えば、図３６は、検体に付着したアダプターは、微粒子を介してナノポア上のタグに結合することができることを示し、それは以下の「微粒子」の節でさらに詳細に説明される。
【０１３５】
本明細書に記載のアダプターは、二本鎖ポリヌクレオチドの一方又は両方の末端に付着することができることに留意すべきである。いくつかの実施形態では、同一のアダプターが二本鎖ポリヌクレオチドの両端に付着している。いくつかの実施形態では、二本鎖ポリヌクレオチドの末端に異なるアダプターを付着することができる。例えば、異なるアダプターの複数の個体群を二本鎖ポリヌクレオチドと一緒に混合することによって、二本鎖ポリヌクレオチドの末端への異なるアダプターの付着を達成することができる。通常は、異なるアダプターと付着した二本鎖ポリヌクレオチドの混合物が形成されるが、所望のヘテロアダプター混合物（例えば、精製によるか、又は二本鎖ポリヌクレオチドの末端へのアダプターの付着を制御することによる）を取得するための方法もある。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、二本鎖ポリヌクレオチドは、その３´末端又は５´末端にアダプターを有することができる。
【０１３７】
平滑末端二本鎖ポリヌクレオチドは、ナノポア内に捕捉されて解離することができる。したがって、いくつかの実施形態では、アダプターを持たない平滑末端構築物（例えば、本明細書に記載のもの）は、本明細書に記載の方法の任意の態様に使用することができる。必須ではないが、いくつかの実施形態では、例えば、ナノポアによって捕捉効率を高めるために、二本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも一端に結合したリーダー配列を有することが望ましい。
【０１３８】
アダプターが二本鎖ポリヌクレオチドの両端に付着しているいくつかの実施形態では、当業者であれば、一つのアダプターの第一の一本鎖ポリヌクレオチドが二本鎖ポリヌクレオチドの一端で鋳型鎖に結合している場合、別のアダプターの第一の一本鎖ポリヌクレオチドは、二本鎖ポリヌクレオチドの反対側の末端で相補鎖に結合していることを容易に認識するであろう。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、アダプターは、標的ポリヌクレオチドの各末端にあらかじめ結合したポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）を有することができる。いくつかの実施形態では、該方法は、標的ポリヌクレオチドの各末端でアダプターに結合するように、ポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）を溶液中に添加することをさらに含むことができる。図１０に示すように、二本鎖ポリヌクレオチドの各末端は本明細書に記載のようにアダプターに付着され、ポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）はアダプターにロードされる。アダプターは、ナノポアに結合したタグに相補的な捕捉配列を有する二本鎖ステムを含む（例えば、アダプターの例として図９Ａを参照）。二本鎖ポリヌクレオチドを含む構築物から延伸する一本鎖ポリヌクレオチド（任意でリーダー配列を含んでもよい）がナノポア（パネルＡ）に入る。ナノポアに入る第一の鎖は鋳型（Ｔ）として標識付けされ、捕捉された第一の鎖の逆相補鎖は補体（Ｃ）として標識付けされる。第一の鋳型鎖がポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ヘリカーゼモーターなどのポリヌクレオチド巻き戻し酵素）の制御下でポアを通過すると、補体は徐々に解離される。パネルＢは、鋳型鎖の末端に向き、補体上の二本鎖ステム内の捕捉配列は解離によって露出し、それにより、ナノポア上のタグ（例えば、捕捉ポリヌクレオチド）に結合することを示す。パネルＣにおいて、鋳型鎖が最終的にナノポアを通過し、酵素が解離するとき、相補鎖はナノポア上のタグ（例えば、捕捉ポリヌクレオチド）への結合を介してナノポアに結合したままである。しばらくして、相補鎖はそのリーダー配列によって捕捉される。パネルＤにおいて、相補鎖は、第二ロードポリヌクレオチド結合タンパク質、例えば、ヘリカーゼモーターなどのポリヌクレオチド巻き戻し酵素の制御下でナノポアを通過する。相補鎖がナノポアを通過しているときに、捕捉配列はある時点でナノポアのタグ（例えば、捕捉ポリヌクレオチド）から解離され、その結果、次の鎖に利用可能となるように、ナノポアのタグ（例えば、捕捉ポリヌクレオチド）を放出する。この実施形態では、両方のポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）は二本鎖ポリヌクレオチドを処理することができる。いくつかの実施形態では、両端にロードされるポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）は、同一でも異なっていてもよい。
【０１４０】
図１０（パネルＢ）は、二本鎖内の捕捉配列（ナノポア上のタグへの結合用）は鋳型鎖の転座の終わりに向かって露出され（例えば、遠端アダプターを捕捉し、それを局所的にポアに保持する）、より一般的には、二本鎖ポリヌクレオチドのナノポアへの結合（例えば、端部又は尾部を介して）が解離プロセスの開始時にすぐに起こり得るように、鎖を設計することができることを示す。この場合、捕捉配列は、解離の全期間又は解離期間の前にナノポアへの結合のために捕捉配列が露出するように、アダプター（例えば、Ｙアダプター部分の非相補的アームとして）内に配置することができる。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドに付着したアダプターにポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）を結合させる代わりに、ポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）をナノポアのルーメン内に固定することができる。それによって、ナノポアを通る両方の鎖の動きを制御するために、単一のポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）を使用することができる。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、一方の鎖がナノポアを通って転座するときの鎖の巻き戻し又は分離は、ポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）によって制御される。いくつかの実施形態では、一方の鎖がナノポアを通って転座するときの鎖の巻き戻し又は分離は、ポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）の非存在下で起こる。ポリヌクレオチドの両方の鎖の動き及び／又は分離を制御するような酵素遊離方法は、当該分野において既知である。例えば、Ｗｅｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ.「膜適合型φ２９モータータンパク質ナノポアを通る二本鎖ＤＮＡの転座」Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ、４（２００９）、７６５〜７７２頁、に記載されている、φ２９モータータンパク質ナノポアを含むモータータンパク質ナノポア、及び／又は米国特許第８，９８６，５２８号に記載されているナノポアなど、特定のナノポア自体がポリヌクレオチドを巻き戻すための力を提供することができ、それぞれの内容は参照により本明細書に全体的に組み込まれる。
【０１４３】
本明細書では、用語「転座する」又は「転座」は、ナノポアの少なくとも一部に沿った動きを指す。いくつかの実施形態では、転座はナノポアのシス側からナノポアのトランス側への動きである。
【０１４４】
標的ポリヌクレオチドは、通常は、標的ポリヌクレオチドの複数のコピーを含む試料中及び／又は複数の異なるポリヌクレオチドを含む試料中に存在する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の任意の態様の方法は、試料中の一つ以上の標的ポリヌクレオチドの配列を決定することを含んでもよい。該方法は、ポアを複数の二本鎖ポリヌクレオチドと接触させることを含んでもよい。例えば、該方法は、実質的に全ての二本鎖ポリヌクレオチドがそれらの二本鎖のそれぞれに一本鎖リーダー配列を有する試料とポアを接触させることを含んでもよい。いくつかの実施形態では、二本鎖ポリヌクレオチドは相補的塩基対合を介してのみ相互に結合している。これらの実施形態では、二本鎖ポリヌクレオチドはポリヌクレオチド鎖の末端である四つの遊離端を有することができる。ポリヌクレオチド鎖の末端は、一本鎖、例えば一本鎖オーバーハング又は別のポリヌクレオチド鎖に対合する塩基であってもよい。いくつかの実施形態では、配列決定されている二本鎖ポリヌクレオチドの二本の鎖は共有付着していない（例えば、ヘアピン又は他の共有付着がない）。しかしながら、鋳型及び補体ポリヌクレオチドを架橋しない部分は、一つ以上の遊離端に付加されてもよい。
【０１４５】
本明細書に記載の様々な態様のいくつかの実施形態では、該方法は、ナノポアと接触させる前に、試料中の実質的に全ての二本鎖ポリヌクレオチドの両方の鎖に一本鎖リーダー配列を生成する又は付着するステップをも含んでもよい。付加されたリーダー配列は、それに付着した一つ以上のポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）を有してもよい。それにより、二本鎖ポリヌクレオチドの個体群はそれぞれポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）がその二本の鎖のそれぞれの片端に付着したリーダー配列を含む。
【０１４６】
標的ポリヌクレオチド（例えば、鋳型）及び標的ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド（例えば、相補体）を含む二本鎖ポリヌクレオチドは、その各末端に付着した一本鎖リーダー配列を含むアダプターを有してもよい。いくつかの実施形態では、様々な態様の方法は、ポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）を含む。該方法は、同一でも異なっていてもよい複数のポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）とポアを接触させることを含んでもよい。異なるポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）は、同一でも異なっていてもよい別個のリーダー配列に結合していてもよい。例えば、５´から３´への方向に作用するポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）は、標的ポリヌクレオチドの５´末端及び／又は相補的ポリヌクレオチドの５´末端でリーダー配列に結合していてもよい。３´から５´への方向に作用するポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）は、標的ポリヌクレオチドの３´末端及び／又は相補的ポリヌクレオチドの３´末端でリーダー配列に結合していてもよい。
【０１４７】
本明細書に記載の様々な態様の方法で使用されるアダプターは、特徴付け方法の感度及び／又はスループットを向上させるために、検体（例えば、標的ポリヌクレオチド又は非共有結合分子）のナノポアへの結合を可能にするように、さらに構成されてもよい。これは、アダプターの二本鎖ステム内の捕捉配列が、非共有結合分子の第二メンバー（例えば、二本鎖ポリヌクレオチドの相補鎖）の結合を可能にするために露出している実施形態とは目的が異なり、例えば、図１０に示すように、鋳型転座後の補体転座の可能性を高め、それにより配列決定情報の精度を高める。図１６に示すように、アダプターは、例えば、検体の捕捉を容易にするために、ナノポアに結合するためのテザーを含むようにさらに構成されている。したがって、検体の第一のメンバー（例えば、二本鎖ポリヌクレオチドの鋳型鎖）がナノポアに入る前に、検体はそのナノポアに結合した第一のタグに結合する。第一のメンバーがポアを通って転座し、二本鎖ステムを解離して第二のメンバー上の捕捉配列を露出させるときに、第一のメンバーの後続の特徴付けのためにナノポアの近傍に保持されるように、第二のメンバーはナノポアに接合した第二のタグに結合する。アダプターの設計に応じて、ナノポア上の第一のタグと第二タグは異なっていてもよく（例えば、図１６に示すように）、又は同一であってもよい（例えば、図１７Ａに示すように）。
【０１４８】
したがって、本明細書で提供されるさらなる態様は、ナノポアを用いた検体の特性を決定するための方法に関し、それは以下を含む：（ａ）ナノポアのルーメンの外側に少なくとも複数のタグを含むように修飾されたナノポアを提供し、タグは少なくとも複数の検体に対する結合部位を提供すること、及び（ｂ）複数の検体からの一つがナノポアを通って転座している間に、少なくとも一つ以上（例えば、少なくとも一つ、少なくとも二つ、少なくとも三つ、少なくとも四つ、少なくとも五つ、少なくとも六つ、少なくとも七つ、少なくとも八つ、少なくとも九つ、又はそれ以上）の検体がナノポア上のタグに結合するような条件下で、複数の検体をナノポアに接触させること。
【０１４９】
例えば、ナノポアのルーメン内のアミノ酸の電荷及び／又は疎水性を変えることによって標的検体とナノポアの相互作用を改善するように修飾されたナノポアと異なり、本明細書に記載のナノポアは、特徴付けのために検体がナノポアを通って転座している間に、複数の検体を捕捉するための複数のタグを提供するように修飾されている。これにより、各検体の特徴付けの間の開孔時間を短縮し、また、検体の局所的濃度も増加し、それによって該方法の感度を向上させる。いくつかの実施形態では、下記「タグ又はテザー修飾ナノポア（例えば、ポリヌクレオチド捕捉などの検体捕捉を促進するための）」の部分に記載のタグ修飾ナノポアは、そのような目的を達成するために使用することができる。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、検体は、ナノポア上のタグに結合するように修飾されてもよい。いくつかの実施形態では、検体は本明細書に記載のアダプター、例えば、ナノポア用のアンカーを含むアダプターを含む。
【０１５１】
ナノポア上のタグと検体上の結合部位（例えば、検体に付着したアダプター中にある結合部位であり、結合部位はアダプターのアンカー若しくはリーダー配列によって、又はアダプターの二本鎖ステム内の捕捉配列によって提供することができる）との間の相互作用は可逆的であってもよい。例えば、検体は、例えばそのアダプターを介してナノポア上のタグに結合し、例えばナノポアによる検体の特徴付け中のある時点で放出することができる。強い非共有結合（例えば、ビオチン／アビジン）は依然として可逆的であり、本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において有用である。例えば、鋳型の転座に続く二本鎖ポリヌクレオチドの補体の転座を確実にするために、補体が（ナノポアから分離してテンプレートの移動中に拡散することなく）ナノポアの近傍に保持されるが、ナノポアを通って転座するときにナノポアから放出できるように、二本鎖ポリヌクレオチドの補体（又はその補体に結合しているアダプターの一部）とナノポアとの間の十分な相互作用を提供するために、タグと検体アダプターのペアを設計することが望ましいかもしれない。
【０１５２】
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法で使用される一対のポアタグと検体アダプターは、検体上の結合部位（例えば、検体に付着したアダプターに存在する結合部位であって、結合部位は、アダプターのアンカー又はリーダー配列によって、又はアダプターの二本鎖ステム内の捕捉配列によって提供することができる）のナノポア上のタグへの結合強度又は親和性が、加えられた力がかかり結合した検体をナノポアから放出するまでの間、ナノポアと検体の間の結合を維持するのに十分であるように、構成することができる。いくつかの実施形態では、検体が二本鎖ポリヌクレオチドである場合、加えられた力はナノポアを通る相補鎖の末端の転座であってもよい。
【０１５３】
本明細書に記載の様々な態様のいくつかの実施形態では、該方法は、膜をわたる電位の印加時に、ナノポアを通過する検体（例えば、ポリヌクレオチド）に応答して信号を検出することを更に含んでもよい。いくつかの実施形態では、電位差をイオン流をもたらす浸透圧の不均衡によって引き起こすことができる。いくつかの実施形態では、ナノポアの両側に配置された二つの電極間のナノポアにわたって電位差を印加してもよい。信号は電気測定及び／又は光学的測定であってもよい。利用可能な電気測定は、電流測定、電気抵抗測定、トンネリング又は電子トンネリング測定（Ｉｖａｎｏｖ  ＡＰ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２０１１年１月１２日；１１（１）：２７９−８５）、及びＦＥＴ測定（国際出願第ＷＯ２００５／１２４８８８号）、例えば、電圧ＦＥＴ測定を含む。いくつかの実施形態では、信号は固体ナノポアを横切る電子トンネリング又は固体ナノポアを横切る電圧ＦＥＴ測定であってもよい。光学的測定は電気測定と組み合わせてもよい（Ｓｏｎｉ  ＧＶ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｖ  Ｓｃｉ  Ｉｎｓｔｒｕｍ．２０１０年１月；８１（１）：０１４３０１）。測定はポアを通過するイオン電流の測定などの膜貫通電流測定であってもよい。図１１Ａ〜１１Ｂは、本明細書に記載の方法を用いてポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）の制御下でナノポアを通って二本鎖ポリヌクレオチドを配列決定する間に経時的に測定される典型的な電流信号を示す。
【０１５４】
あるいは、測定は、Ｈｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００９，１３１（５），１６５２−１６５３によって開示されているようなチャネルを通るイオン流を示す蛍光測定、又はＦＥＴを用いた膜を横切る電圧の測定であってもよい。いくつかの実施形態では、該方法は、膜を横切る電位を印加すると、ポリヌクレオチドがナノポアと相互作用する及び／又はナノポアを通って動く際にナノポアをイオン電流を検出することをも含んでもよい。いくつかの実施形態では、該方法はパッチクランプ又は電圧クランプを用いて実行してもよい。いくつかの実施形態では、該方法は電圧クランプを用いて実行してもよい。電気測定はＳｔｏｄｄａｒｔ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、１２；  １０６（１９）：７７０２−７、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ＫＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２０１０；１３２（５０）：１７９６１−７２、及び国際出願第ＷＯ２０００／２８３１２号に記載の標準的な単一チャネル記録装置を用いて実行してもよい。任意選択で、電気測定は、例えば、国際出願第ＷＯ２００９／０７７７３４号及び国際出願第ＷＯ２０１１／０６７５５９号に記載のマルチチャネルシステムを用いて実行してもよい。
【０１５５】
スループットを向上させ、そして内容が参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＷＯ２０１４／０６４４４３号に開示されているものなどのポリヌクレオチド鎖の測定を向上させるために、ナノポアのアレイを設けてもよい。
【０１５６】
信号測定の解析
【０１５７】
いくつかの実施形態では、該方法は相互作用、例えば、ポアを通るポリヌクレオチドの転座を示すポアを通るイオン流に対応する信号を検出することを含む。いくつかの実施形態では、電位差はイオン流をもたらす浸透圧の不均衡によって引き起こすことができる。いくつかの実施形態では、ポアの両側に配置される二つの電極間で膜貫通孔を横切る電位差を印加してもよい。あるいは、測定は、Ｈｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００９，１３１（５），１６５２−１６５３によって開示されているようなチャネルを通るイオン流を示す蛍光測定であってもよい。ＷＯ２０１４０６４４４３に開示されているように、スループットを向上させ、そしてポリヌクレオチド鎖の測定を向上させるために、ナノポアのアレイを設けてもよい。図４は酵素制御下でナノポアを通るポリヌクレオチドの転座中に経時的に測定された典型的な電流信号を示す。ポリヌクレオチドがヘアピン、非ヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドで結合されている場合、ヘアピンを示す信号を提供するために、ヘアピン中で提供してもよい。電流信号は、それがナノポアを転座するときにポリヌクレオチドの配列を過剰に反映する。したがって、信号のどの部分が鋳型及び相補を表すのかを決定することが可能である。通常は、酵素はナノポアを通るポリヌクレオチドをラチェットして特徴的な電流レベルを上昇させる。経時的な信号の大きさはナノポアの性質に依存し、複数のヌクレオチドが特定の時間に電流に影響を与えることができる。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、特定の時間に電流に影響を与えるヌクレオチドの数は、ｋ個のヌクレオチド単位の群に依存してもよい。ここで、ｋは複数の整数であり、以下「ｋ−ｍｅｒ」という。これはナノポアが測定されているポリマー単位よりも大きい「鈍いリーダーヘッド」を有すると概念的に考えられるかもしれない。そのような状況では、分解されるべき異なるｋ−ｍｅｒの数はｋの累乗に増加する。例えば、ｎ個の可能なポリマー単位がある場合、分解されるべき異なるｋ−ｍｅｒの数はｎｋである。多数のｋ−ｍｅｒを用いると、異なるｋ−ｍｅｒによって生成された測定値を処理することが困難になり、ポリマー単位の基礎となる配列を推定することを損ねる可能性がある。
【０１５９】
電流対サンプリングデータ点は、信号の局所平均の変化を見つけようと試みる、実行中の「ｔ−ｔｅｓｔ」などの既知の解析技法を実行することによって、隣接するグループに関連付けてもよい。これらのグループはイベントと呼ばれる。特定のｋ−ｍｅｒを示すイベントは図６に示すように決定してもよい。イベントは、いくつかの要約特徴（関連するグループ内のデータ点の平均電流及びその平均電流に関する標準偏差）で表される。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列を決定するために、ｋ−ｍｅｒ間の可能な遷移の数を考慮に入れても、また電流レベルも考慮に入れるモデルを参照してもよい。そのような解析技術は、ＷＯ２０１３０４１８７８に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。ここで、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）などの確率論的解析技術を参照し、可能な遷移の総数を決定するために用いられる。最も可能性の高い遷移はその後ビタビアルゴリズムなどの解析技術によって決定される。リカレントニューラルネットワーク（ＲＮＮ）は、ＨＭＭに代わるものとして使用してもよく、それは例えば、イベントとイベントを起こすヌクレオチドの数との潜在的な関係を記述することにおいて、ＨＭＭよりも数学的表現の自由度が高い。ＲＮＮを用いたそのような方法は、図７の例で示されており、そこでは、イベントから、他の隣接するイベントからの情報を組み込む特徴が導き出される。これは、ＲＮＮ（出力が一連のデータの以前の計算に依存する数学モデル）に追加情報を提供する。最も可能性の高い遷移を通る経路を決定するためにビタビアルゴリズムがどのように使用されるかの例を図８に概略的かつ素朴に示す。
【０１６１】
ｋ−ｍｅｒ間の最も可能性の高い遷移は、ｋ−ｍｅｒ配列、従ってヌクレオチド鎖のヌクレオチド配列を決定するために用いてもよい。用いられる数学的方法の性質のため、ヌクレオチド配列は多くの場合、％精度の観点から述べられる。
【０１６２】
鋳型鎖のみの測定を含む方法では、鋳型配列を決定するために上記方法を用いてもよい。だだし、鋳型及びその逆相補体が測定される場合には、鋳型とその相補体との間の対合関係は、配列決定測定にさらなる力を提供する可能性がある。この関係を利用する特定の技術の例は、ＷＯ２０１３０４１８７８に開示されており、鋳型イベントｔｉ対可能なｋ−ｍｅｒ状態ｓｋ及び補体イベントｃｊ対可能なｋ−ｍｅｒ状態の二つの行列を組み合わせて、三次元マトリクス（２Ｄ）モデルを形成する。２Ｄモデルは、これらの観察を説明するｋ−ｍｅｒとともに、二つの一連のイベントの最も可能性の高いアラインメントを見出す。このモデルは鋳型と相補配列の組み合わせを考慮する。
【０１６３】
原則として、２Ｄベースコール側は必ず、（ｔ  ｉ  、ｃ  ｊ  、ｓ  ｋ  ）の全てのトリプルと、鋳型イベント、補体パス、及びｋ−ｍｅｒ間の可能な関連付けの数を調べなければならない。ＷＯ２０１５１４０３５に開示されているように、実際には、完全な２Ｄ計算はかなり時間がかかり計算上非実用的になるため、有用な近似は２Ｄモデルを制約することである。
【０１６４】
あるいは、ヌクレオチド配列は、鋳型及び補体のイベントデータ又はヌクレオチド配列を比較し、鋳型と補体との間の最適な関連付けを決定することによって決定することができる。しかしながら、該方法は、鋳型鎖と相補鎖との間の組み合わせの最も高い可能性を考慮しないので、２Ｄモデルの改善された精度を提供しないことになる。鋳型ベースコールと補体ベースコールを比較するコンセンサス方式の例は開示されている。
【０１６５】
鋳型鎖及び相補鎖がヘアピンによって結合されている場合とは異なり、相補鎖は常にナノポア内へ逐次鋳型鎖をたどるとは限らない。例えば、二本鎖構築物の鋳型鎖の転座に続き、第二二本鎖構築物からの鋳型鎖がナノポアを転位させる可能性がある。さらに、鋳型（第一）鎖の転座に続き、相補（第二）鎖がナノポアの結合部位によって捕捉されない可能性がある。それは、例えば、ナノポアの一つ以上の結合部位が一つ以上の相補鎖によって既に占有されているため、結合部位が相補鎖に利用可能ではないことが原因である可能性がある。ナノポアによって捕捉されていない任意の相補鎖は、ナノポアから離れて拡散し、ナノポアによって捕捉されない可能性が高い。したがって、鋳型及び相補鎖の付加された力を利用するために、信号測定値が鋳型及びその対応する補体に対応するか否かを判断することは不可欠な第一歩である。
【０１６６】
本明細書に記載の様々な態様のいくつかの実施形態では、該方法は標的ポリヌクレオチドの転座に対応する信号及び標的ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドの別個の転座に対応する配列信号を同定すること、及びこうして同定された信号を解析することをも含んでもよい。上記の数学的方法で同定されたそれらの信号は、標的のヌクレオチド配列を決定するために使用してもよく、該方法は標的（鋳型）の情報及びそれに関連する利点を伴う補体の両方を利用する。
【０１６７】
標的に対応する信号（例えば、配列信号）及びその補体であるか否かを同定するために、アラインメントの程度を決定するためにイベントを相互に位置合わせてもよい。アラインメントの程度に応じて、信号が実際に標的及びその補体に対応するか否かを決定してもよい。正の相関を作るために使用されるアラインメント％は任意に選択してもよく、例えば、９５％を超えてもよい。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ又はＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムのような既知のペアワイズ整列法を用いてもよい。使用可能な整列法の適切な例は、ＷＯ２０１５／１４０５３５又はＷＯ２０１６／０５９４２７に開示されている。
【０１６８】
一般的には、相補鎖はその鋳型鎖を逐次的な順序でナノポア内にたどること、又はナノポアから離れて拡散することが観察されている。その特定の相補鎖と関連付けられていない更なる鎖がナノポアに入った後に相補鎖がその鋳型鎖に続く可能性ははるかに低い。鋳型と補体の対には独特の特性がある。例えば、鋳型／補体対は一般に同一の長さのヌクレオチド（イベント数）を共有する傾向がある。また、対の後続鎖は、新しい鎖よりもはるかに速くナノポアに入る可能性があり、及び／又は補体の配列決定はより速くなるなどの傾向がある。一つ以上のこれらの特性は複雑な計算解析がなくて鋳型／補体対を同定するために使用することができる。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、計算上の要求を減らすために、整列を鎖の隣接した測定値に制限してもよい。鎖間の鋳型−補体関係が確立されると、配列の決定は鋳型又は相補鎖の測定値、あるいは鋳型及び相補鎖の測定値を利用することができる。例えば、配列決定の精度は十分に高いとは考えられない、鋳型鎖の配列を決定し得る。そのような状況下では、該方法は、鋳型配列のみの決定によって得られるものよりも高い配列精度を提供するために、鋳型及び相補配列データの両方を考慮して配列を決定することを選択してもよい。あるいは、鋳型鎖の配列精度は十分に良いと考えられるため、鋳型及び相補配列データの両方を考慮する必要がないと考えられる。鋳型配列データが使用されているか否か、又は鋳型及び相補配列データの両方が使用されているか否かを決定する要因は、例えば、基礎となる配列に正確に呼び出すのが難しい塩基又は塩基のグループがあるか否か、又は特定の塩基が一塩基多型変異体であるか否かであってもよい。
【０１７０】
イベントで順序関係が決定されない場合には、その特定の鎖の配列は、鋳型のみの鎖の測定に用いられるのと同一の方法で決定してもよい。イベントは順序関係が決定された場合には、その特定の鎖の配列は、鋳型鎖及び相補鎖の測定に用いられるのと同じ方法で決定してもよい。全体的な配列決定を提供するために、この情報を組み合わせてもよい。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、第一鎖に相補的な第二鎖が同一のナノポアを通って転座するときに生じる信号とともに、第一鎖（例えば、標的ポリヌクレオチド）が膜貫通孔を通って転座するときに生じる信号を解析することをも含んでもよい。第一鎖（例えば、標的ポリヌクレオチド）及びその相補鎖（第二鎖）は、塩基対合によって結合されている。したがって、一旦第一のポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）が二本鎖ポリヌクレオチドの長さに沿って移動したなら、第一鎖と第二鎖はもはや結合されない。例えば、図１０を参照のこと。したがって、ナノポアを通る第二鎖の転座は、例えば、図１１に示すように、ナノポアを通る第一鎖の転座とは別個のイベントであり、ここで、第一鎖と第二鎖の転座の間に約２００ｐＡの開孔電流（電流を遮断する鎖はない）が観察された。必須ではないが、第二鎖の転座は例えば、第一鎖の転座後すぐに、例えば直ちに（例えば、１秒未満）、起こることが望ましい。例えば、図１３を参照のこと。
【０１７２】
該方法は、標的ポリヌクレオチド及び標的ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドの逐次転座に対応する信号を同定するステップを含む。逐次転座は、相補的ポリヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドと同一のポアを通って転座する場所を含む。標的ポリヌクレオチド及び相補的ポリヌクレオチドは、どちらか一方の順序でポアを通って転座してもよい。１、２、３、４又は５〜約１０個のポリヌクレオチドなどの他のポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドと相補的ポリヌクレオチドとの間のポアを通過してもよい。好ましくは、標的ポリヌクレオチド及び相補的ポリヌクレオチドはどちらか一方の順序で連続的にポアを通過する。ポアは、好ましくは、ポアを通る第一の標的ポリヌクレオチド及び相補的ポリヌクレオチドの転座と、ポアを通る第二の標的ポリヌクレオチド及び相補的ポリヌクレオチドの転座との間で開放状態に戻る。
【０１７３】
標的及び相補的ポリヌクレオチドがポアを通って連続的に通過することは、標的ポリヌクレオチド及び／又は相補的ポリヌクレオチドを膜及び／又はポアにつなぐことによって促進してもよい。二本鎖ポリヌクレオチドの二本鎖の連続的な転座を促進する他の方法は、標的ポリヌクレオチド及び／又は相補的ポリヌクレオチドを微粒子に付着させること、及び／又はポアを修飾してポリヌクレオチド捕捉を増加／増強することを含む。
【０１７４】
標的ポリヌクレオチドの転座に対応する信号及び標的ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドの別個の転座に対応する配列信号の同定は、バーコードを用いて促進してもよい。通常は、二本鎖バーコードは二本鎖ポリヌクレオチドに含まれる、又は二本鎖ポリヌクレオチドに付着する。標的ポリヌクレオチドと相補的ポリヌクレオチドが分離されている場合（ポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）によって）、バーコードは標的ポリヌクレオチドと相補的ポリヌクレオチドの両方に保持されている。膜貫通孔を通るバーコードの転座は、そのバーコードに信号特性を作ることになる。ポアを通って転座するバーコードの二回目以降の検出は、標的ポリヌクレオチド及びその補体がポアを通って逐次転座したことを決定するために使用することができる。それによって、標的ポリヌクレオチドの転座及び標的ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドの別個の転座に対応する信号を同定してもよい。
【０１７５】
タグ−又はテザー−修飾ナノポア（例えば、ポリヌクレオチド捕捉などの検体捕捉を増強するため）
【０１７６】
本明細書に記載する方法で使用するためのナノポアは、一つ以上の検体に結合するための一つ以上の結合部位を含むように修飾されている。いくつかの実施形態では、ナノポアは、検体に付着したアダプターに結合するための一つ以上の結合部位を含むように修飾してもよい。例えば、いくつかの実施形態では、ナノポアは、検体に結合したアダプターのリーダー配列に付着してもよい。いくつかの実施形態では、ナノポアは、検体に結合したアダプター中の一本鎖配列に付着してもよい。いくつかの実施形態では、ナノポアは、検体に結合したアダプターの二本鎖ステム内の捕捉配列に付着してもよく、ここで、捕捉配列は二本鎖ステムの巻き戻し時にのみ明らかにされる。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、ナノポアは、例えば、膜貫通孔を通る第一鎖及び第二鎖の逐次転座を容易にするために、二本鎖オリゴヌクレオチドの第一鎖又は第二鎖に付着したアダプターに結合するための一つ以上の結合部位を含むように修飾してもよい。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、ナノポアは、一つ以上のタグ又はテザーを含むように修飾されており、各タグ又はテザーは検体に対する結合部位を含む。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、ナノポアは、複数のタグ又はテザーを含むように修飾されている。例えば、ポリヌクレオチドなどの検体を特徴付ける方法（「感度タグ」）の感度を高めるために、一つのタグ又はテザーを設けることができ、一方、ポリヌクレオチドの鋳型鎖に続く相補鎖の配列決定の可能性を高めるために、別のタグ又はテザーを設けることができる（「後続タグ」）。図１５に示すように、ポアタグは、いくつもの方法で構成することができる。一例として、いくつかの実施形態では、オリゴマーポアの各モノマーは、（例えば、タグＡ及びタグＢで示されるように、複数の結合部位を有する）同じタイプのタグ構成を有することができる。タグＡとタグＢを単一のタグを形成するように組み合わせることができ、少なくとも一つ以上のモノマーがタグＡ／タグＢ複合タグを含む。あるいは、少なくとも一つのモノマーが他のモノマーからの異なるタグ構成を有するように、オリゴマーポアは異なるタグが付着した混合モノマーを含むことができる。別の例では、タグＡ及びタグＢは別個のタグのままにすることができ、少なくとも一つ以上のモノマーは両方の個々のタグを含むことができる。本明細書に記載のように、感度タグ及び後続タグは、アダプターで使用される一意の配列に相補的である場合、別々に組み合わせることができる。
【０１８０】
図１６は二つの異なるタグタイプを有するナノポアを用いて溶液から鎖を捕捉する方法（感度向上のため）の概略図である。二本鎖ポリヌクレオチドの末端に付着しているアダプターは、第一のポアタグと結合するために利用可能な捕捉配列（例えば、Ｙアダプターの非相補的アームを形成する）を含む。解離した場合にのみ明らかになる二本鎖ステム内の別個の捕捉配列は、補体が第二のポアタグに結合することを可能にし、そして後続の配列決定のための補体捕捉を可能にする。
【０１８１】
ナノポア上のタグと検体上の結合部位（例えば、検体に付着したアダプター中にある結合部位。ここで、結合部位はアダプターのアンカー若しくはリーダー配列によって、又はアダプターの二本鎖ステム内の捕捉配列によって提供することができる）との間の相互作用は可逆的であってもよい。例えば、検体は、例えばそのアダプターを介してナノポア上のタグに結合し、例えばナノポアによる検体の特徴付け中のある時点で放出することができる。強い非共有結合（例えば、ビオチン／アビジン）は依然として可逆的であり、本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態において有用である。例えば、鋳型の転座に続く二本鎖ポリヌクレオチドの補体の転座を確実にするために、補体が（ナノポアから分離してテンプレートの移動中に拡散することなく）ナノポアの近傍に保持されるが、ナノポアを通って転座するときにナノポアから放出できるように、二本鎖ポリヌクレオチドの補体（又はその補体に付着しているアダプターの一部）とナノポアとの間の十分な相互作用を提供するために、タグと検体アダプターのペアを設計することが望ましいかもしれない。
【０１８２】
したがって、本明細書に記載の様々な態様のいくつかの実施形態では、一対のポアタグと検体アダプターは、ナノポア上のタグへの検体上の結合部位（例えば、検体に付着したアダプターに存在する結合部位であって、結合部位はアダプターのアンカー又はリーダー配列、又はアダプターの二本鎖ステム内の捕捉配列によって提供することができる）のナノポア上のタグへの結合強度又は親和性が、加えられた力がかかり結合した検体をナノポアから放出するまで、ナノポアと検体の間の結合を維持するのに十分であるように、構成することができる。いくつかの実施形態では、検体が二本鎖ポリヌクレオチドである場合、加えられた力はナノポアを通る相補鎖の末端の転座であってもよい。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、タグ又はテザーは荷電されていない。これにより、電位差の影響下でタグ又はテザーがナノポア内に引き込まれないことを確実にすることができる。
【０１８４】
ポリヌクレオチド又はアダプターを、引き付ける又は結合する一つ以上の分子はポアに結合していてもよい。アダプター及び／又は標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする任意の分子を用いてもよい。ポアに付着した分子は、ＰＮＡタグ、ＰＥＧリンカー、短いオリゴヌクレオチド、正荷電アミノ酸及びアプタマーから選択してもよい。そのような分子がポアに結合していることは当該分野において既知である。例えば、短いオリゴヌクレオチドが付着したポアは、Ｈｏｗａｒｋａら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：６３６〜６３９及びＷＯ２０１０／０８６６２０に開示されている。ポアのルーメン内に付着したＰＥＧを含むポアは、Ｈｏｗａｒｋａら（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２（１１）：２４１１−２４１６に記載されている。
【０１８５】
本明細書に記載の任意の態様の方法において、オリゴヌクレオチドがリーダー配列内の配列に相補的な配列又はアダプター内の別の一本鎖配列を含む膜貫通孔に付着した短いオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド及び／又は相補的ポリヌクレオチドの捕捉を増強するために用いてもよい。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、タグ又はテザーは、オリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＢＮＡ、ＰＮＡ又はモルフォリノ）を含んでも、又はそれであってもよい。オリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＢＮＡ、ＰＮＡ又はモルフォリノ）は、長さが約１０〜３０ヌクレオチド又は約１０〜２０ヌクレオチドを有することができる。例示的なオリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＢＮＡ、ＰＮＡ又はモルフォリノ）は、配列番号８に記載の配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、タグ又はテザーに使用するためのオリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＢＮＡ、ＰＮＡ又はモルフォリノ）は、他の修飾箇所又は例えばビーズを含む固体基材表面への接合のために修飾された少なくとも一つの末端（例えば、３´−又は５´−末端）を有することができる。末端修飾剤は、結合に使用することができる反応性官能基を付加してもよい。付加することができる官能基の例としては、アミノ、カルボキシル、チオール、マレイミド、アミノオキシ、及びそれらの任意の組合わせが挙げられるが、これらに限定されない。官能基は、オリゴヌクレオチド配列の末端から官能基の物理的距離を加えるために、異なる長さのスペーサー（例えば、Ｃ３、Ｃ９、Ｃ１２、スペーサー９及び１８）と組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、タグ又はテザーは、配列番号８に記載の配列を有する５´−マレイミド修飾されたオリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＢＮＡ、ＰＮＡ又はモルフォリノ）であってもよい。いくつかの実施形態では、タグ又はテザーは、配列番号８に記載の配列を有する３´−マレイミド修飾されたオリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＢＮＡ、ＰＮＡ又はモルフォリノ）であってもよい。いくつかの実施形態では、タグ又はテザーは、配列番号８に記載の配列を有する５´−Ｃ９−チオール修飾されたオリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＢＮＡ、ＰＮＡ又はモルフォリノ）であってもよい。いくつかの実施形態では、タグ又はテザーは、配列番号８に記載の配列を有する３´−Ｃ９−チオール修飾されたオリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＢＮＡ、ＰＮＡ又はモルフォリノ）であってもよい。いくつかの実施形態では、タグ又はテザーは、配列番号８に記載の配列を有する５´−チオール修飾されたオリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＢＮＡ、ＰＮＡ又はモルフォリノ）であってもよい。いくつかの実施形態では、タグ又はテザーは、配列番号８に記載の配列を有する３´−チオール修飾されたオリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＢＮＡ、ＰＮＡ又はモルフォリノ）であってもよい。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、タグ又はテザーは、モルフォリノオリゴヌクレオチドを含んでもよい、又はモルフォリノオリゴヌクレオチドであってもよい。モルフォリノオリゴヌクレオチドは、約１０〜３０ヌクレオチド又は約１０〜２０ヌクレオチドの長さを有することができる。例示的なモルフォリノオリゴヌクレオチドは、配列番号８に記載の配列を含んでもよい。モルフォリノオリゴヌクレオチドは、修飾されていても修飾されていなくてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、モルフォリノオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３´及び／又は５´末端で修飾されてもよい。モルフォリノオリゴヌクレオチドの３´及び／又は５´末端修飾の例としては、化学結合のための３´親和性タグ及び官能基（例えば、３´−ビオチン、３´−第一級アミン、３´−ジスルフィドアミド、３´−ピリジルジチオ、及びそれらの任意の組み合わせを含む）、５´末端修飾（例えば、５´−第一級アンミン、及び／又は５´−ダブチルを含む）、クリックケミストリーのための修飾（例えば、３´−アジド、３´−アルキン、５´−アジド、５´−アルキンを含む）、及びそれらの任意の組合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、タグ又はテザーは、配列番号８に記載の配列を有する５´−アジド修飾されたモルフォリノオリゴヌクレオチドであってもよい。いくつかの実施形態では、タグ又はテザーは、配列番号８に記載の配列を有する３´−アジド修飾されたモルフォリノオリゴヌクレオチドであってもよい。いくつかの実施形態では、タグ又はテザーは、配列番号８に記載の配列を有する５´−アルキン修飾されたモルフォリノオリゴヌクレオチドであってもよい。いくつかの実施形態では、タグ又はテザーは、配列番号８に記載の配列を有する３´−アルキン修飾されたモルフォリノオリゴヌクレオチドであってもよい。いくつかの実施形態では、タグ又はテザーは、配列番号８に記載の配列を有する３´−ピリジルジチオ修飾されたモルフォリノオリゴヌクレオチドであってもよい。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、タグ又はテザーは、例えば、ナノポアへの結合を容易にするために、ポリマーリンカーをさらに含んでもよい。例示的なポリマーリンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むが、これに限定されない。ポリマーリンカーは、約５００Ｄａ〜約１０ｋＤａ（両端を含む）、又は約１ｋＤａ〜約５ｋＤａ（両端を含む）の分子量を有してもよい。ポリマーリンカー（例えば、ＰＥＧ）は、例えば、これらに限定されないが、マレイミド、ＮＨＳエステル、ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、アジド、ビオチン、アミン、アルキン、アルデヒド、及びそれらの任意の組合わせを含む異なる官能基で官能化することができる。いくつかの実施形態では、タグ又はテザーは、５´−マレイミド基及び３´−ＤＢＣＯ基を有する１ｋＤａのＰＥＧをも含んでもよい。いくつかの実施形態では、タグ又はテザーは、５´−マレイミド基及び３´−ＤＢＣＯ基を有する２ｋＤａのＰＥＧをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、タグ又はテザーは、５´−マレイミド基及び３´−ＤＢＣＯ基を有する３ｋＤａのＰＥＧをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、タグ又はテザーは、５´−マレイミド基及び３´−ＤＢＣＯ基を有する５ｋＤａのＰＥＧを更に含んでもよい。
【０１８９】
タグ又はテザーの他の例には、Ｈｉｓタグ、ビオチン又はストレプトアビジン、検体に結合する抗体、検体に結合するアプタマー、ＤＮＡ結合ドメインなどの検体結合ドメイン（例えば、ロイシンジッパーのようなペプチドジッパー、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）を含む）、及びそれらの任意の組合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０１９０】
当分野で既知の任意の方法を用いて、タグ又はテザーをナノポアの外面、例えば、膜のシス側上に付着させてもよい。例えば、一つ以上のタグ又はテザーは、一つ以上のシステイン（システイン結合）、一つ以上のリジンなどの第一級アミン、一つ以上の非天然アミノ酸、一つ以上のヒスチジン（Ｈｉｓタグ）、一つ以上のビオチン又はストレプトアビジン、一つ以上の抗体に基づいたタグ、エピトープの一つ以上の酵素修飾（例えば、アセチルトランスフェラーゼを含む）、及びそれらの任意の組み合わせを介してナノポアに付着することができる。そのような修飾を実施するための適切な方法は当技術分野において既知である。適切な非天然アミノ酸は、４−アジド−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆａｚ）及びＬｉｕ  Ｃ．Ｃ．及びＳｃｈｕｌｔｚ  Ｐ．Ｇ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０１０，７９，４１３−４４４の図１における１〜７１が附番されたいずれかのアミノ酸を含むが、これらに限定されない。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、一つ以上のタグ又はテザーがシステイン結合（複数可）を介してナノポアに付着している場合、一つ以上のシステインを置換によりナノポアを形成する一つ以上のモノマーに導入することができる。いくつかの実施形態では、ナノポアは、以下の付着によって化学的に修飾してもよい：（ｉ）４−フェニルアゾマレイナニル、１．Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）マレイミド、Ｎ−シクロヘキシルマレイミド、１．３−マレイミドプロピオン酸、１．１−４アミノフェニル−１Ｈ−ピロール，２，５，ジオン、Ｎ−エチルマレイミド、Ｎ−メトキシカルボニルマレイミド、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルマレイミド、Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミド、３−マレイミド−プロキシル、Ｎ−（４−クロロフェニル）マレイミド、１−［４−（ジメチルアミノ）−３，５−ジニトロフェニル］−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン、Ｎ−［４−（２−ベンズイミダゾリル）フェニル］マレイミド、Ｎ−［４−（２−ベンゾオキサゾリル）フェニル］マレイミド、Ｎ−（１−ナフチル）−マレイミド、Ｎ−（２，４−キシリル）マレイミド、Ｎ−（２，４−ジフルオロフェニル）マレイミド、Ｎ−（３−クロロ−パラ−トリル）−マレイミド、１−（２−アミノ−エチル）−ピロール−２，５−ジオンヒドロクロリド、１−シクロペンチル−３−メチル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン、１−（３−アミノプロピル）−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンヒドロクロリド、３−メチル−１−［２−オキソ−２−（ピペラジン−１−イル）エチル］−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンヒドロクロリド、１−ベンジル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン、３−メチル−１−（３，３，３−トリフルオロプロピル）−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン、１−［４−（メチルアミノ）シクロヘキシル］−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオントリフルオロ酢酸、ＳＭＩＬＥＳ  Ｏ＝Ｃ１Ｃ＝ＣＣ（＝Ｏ）Ｎ１ＣＣ＝２Ｃ＝ＣＮ＝ＣＣ２、ＳＭＩＬＥＳ  Ｏ＝Ｃ１Ｃ＝ＣＣ（＝Ｏ）Ｎ１ＣＮ２ＣＣＮＣＣ２、１−ベンジル−３−メチル−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン、１−（２−フルオロフェニル）−３−メチル−２，５−ジヒドロ１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン、Ｎ−（４−フェノキシフェニル）マレイミド、Ｎ−（４−ニトロフェニル）マレイミドなどのジアブロモマレイミドを含むマレイミド、（ｉｉ）３−（２−ヨードアセトアミド）−プロピル、Ｎ−（シクロプロピルメチル）−２−ヨードアセトアミド、２−ヨード−Ｎ−（２−フェニルエチル）アセトアミド、２−ヨード−Ｎ−（２，２，２−トリフルオロエチル）アセトアミド、Ｎ−（４−アセチルフェニル）−２−ヨードアセトアミド、Ｎ−（４−（アミノスルホニル）フェニル）−２−ヨードアセトアミド、Ｎ−（１，３−ベンゾチアゾール−２−ＹＬ）−２−ヨードアセトアミド、Ｎ−（２、６−（ジエチルフェニル）−２−ヨードアセトアミド、Ｎ−（２−ベンゾイル−４−クロロフェニル）−２−ヨードアセトアミドなどのヨードアセトアミド、（ｉｉｉ）  Ｎ−（４−（アセチルアミノ）フェニル）−２−ブロモアセトアミド、Ｎ−（２−アセチルフェニル）−２−ブロモアセトアミド、２−ブロモ−Ｎ−（２−シアノフェニル）アセトアミド、２−ブロモ−Ｎ−（３−（（トリフルオロメチル）フェニル）アセトアミド、Ｎ−（２−ベンゾイルフェニル）−２−ブロモアセトアミド、２−ブロモ−Ｎ−（４−フルオロフェニル）−３−メチルブタンアミド、Ｎ−ベンジル−２−ブロモ−Ｎ−フェニルプロピオンアミド、Ｎ−（２）−ブロモ−ブチル）−４−クロロ−ベンゼンスルホンアミド、２−ブロモ−Ｎ−メチル−Ｎ−フェニルアセトアミド、２−ブロモ−Ｎ−フェネチル−アセトアミド、２−アダマンタン−１−イル−２−ブロモ−Ｎ−シクロヘキシル−アセタミド、２−ブロモ−Ｎ−（２−メチルフェニル）ブタンアミド、モノブロモアセトアニリドなどのブロモアセトアミド、（ｉｖ）アルドリチオール−２、アルドリチオール−４、イソプロピルジスルフィ、１−（イソブチルジスルファニル）−２−メチルプロパン、ジベンジルジスルフィド、４−アミノフェニルジスルフィド、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸ヒドラジド、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル、ａｍ６ａｍＰＤＰ１−βＣＤなどのジスルフィド、
【０１９２】
及び（ｖ）４−フェニルチアゾール−２−チオール、プルパルド、５，６，７，８−テトラキノゾリン−２−チオールなどのチオール。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、タグ又はテザーは、ナノポアに直接又は一つ以上のリンカーを介して付着してもよい。タグ又はテザーは、ＷＯ２０１０／０８６６０２に記載のハイブリリンカーを用いてナノポアに付着してもよい。あるいは、ペプチドリンカーを使用してもよい。ペプチドリンカーはアミノ酸配列である。ペプチドリンカーの長さ、可撓性及び親水性は、通常は、モノマー及びポアの機能を妨げないように設計される。好ましい可撓性ペプチドリンカーは２〜２０個、例えば、４、６、８、１０又は１６個のセリン及び／又はグリシンアミノ酸のストレッチである。より好ましい可撓性リンカーとしては、（ＳＧ）１、（ＳＧ）２、（ＳＧ）３、（ＳＧ）４、（ＳＧ）５及び（ＳＧ）８であって、Ｓはセリンであり、Ｇはグリシンである。好ましい剛性リンカーは、２〜３０個、例えば４、６、８、１６又は２４個のプロリンアミノ酸のストレッチである。より好ましい剛性リンカーは、Ｐがプロリンである、（Ｐ）１２を含む。
【０１９４】
膜貫通孔は、ポリヌクレオチドの捕捉を増強するように修飾されてもよい。例えば、ポアは、ポアの入口内及び／又はポアのバレル内にある正電荷を増加させるように修飾されてもよい。そのような修飾は当技術分野において既知である。例えば、ＷＯ２０１０／０５５３０７はポアのバレル内の正電荷を増加させるα溶血素の突然変異を開示している。
【０１９５】
ポリヌクレオチド捕捉を増強する突然変異を含む修飾ＭｓｐＡ、リセニン及びＣｓｇＧポアはそれぞれＷＯ２０１２／１０７７７８、ＷＯ２０１３／１５３３５９及びＷＯ２０１６／０３４５９１に開示されている。これらの刊行物に開示されている修飾ポアはいずれも本明細書で用いてもよい。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、ＣｓｇＧナノポアは、本明細書に記載のように、一つ以上のタグ又はテザーを含むように修飾してもよい。一つ以上のタグ又はテザー（複数可）は、以下の一つ以上のアミノ酸修飾により、ＣｓｇＧナノポアの一つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又はそれ以上）のモノマーに付着することができる：配列番号７のＴ３、Ｋ７、Ｒ１１、Ｑ１９、Ｋ２２、Ａ２９、Ｔ３１、Ｒ７６、Ｎ１０２、Ｇ１０３、Ｎ１０８、Ｒ１１０、Ｑ１１４、Ｅ１７０、Ｃ２１５、Ｌ２１６、Ｄ２３８、Ａ２４３、Ｄ２４８、及びＨ２５５。いくつかの実施形態では、一つ以上のタグ又はテザー（複数可）は、以下の一つ以上のアミノ酸置換により、ＣｓｇＧナノポアの一つ以上のモノマー（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又はそれ以上）に付着することができる：配列番号７のＴ３Ｃ、Ｋ７Ｃ、Ｒ１１Ｃ、Ｑ１９Ｃ、Ｋ２２Ｃ、Ａ２９Ｃ、Ｔ３１Ｃ、Ｒ７６Ｃ、Ｅ１７０Ｃ、Ｄ２３８Ｃ、Ａ２４３Ｃ、Ｄ２４８Ｃ、Ｈ２５５Ｃ、Ｃ２１５Ａ／Ｔ／Ｓ／Ｍ／Ｇ／Ｉ／Ｌ、Ｌ２１６Ｖ。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、ＣｓｇＧナノポアは、ナノポアを通る検体の捕捉及び／又は転座を改善し、検体（例えば、ポリヌクレオチド）認識又は識別を改善し、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素との相互作用を改善し、及び／又は信号対雑音比を改善するために、更に修飾することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ＣｓｇＧナノポアを形成するモノマーのうちの少なくとも一つは、ＷＯ２０１６／０３４５９１に開示されているように、一つ以上の突然変異を含むことができる。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、ＣｓｇＧナノポアは、アミノ酸置換の以下の組合わせのうちの一つ（配列番号７を参照）を含むことができる：（Ｔ３Ｃ）；（Ｋ７Ｃ）；（Ｒ１１Ｃ）；（Ｑ１９Ｃ）；（Ｋ２２Ｃ）；（Ａ２９Ｃ）；（Ｔ３１Ｃ）；（Ｒ７６Ｃ）；（Ｅ１７０Ｃ）；（Ｄ２３８Ｃ）；（Ａ２４３Ｃ）；（Ｄ２４８Ｃ）；（Ｈ２５５Ｃ）；（Ｃ２１５Ａ）；（Ｃ２１５Ｔ）；（Ｃ２１５Ｓ）；（Ｃ２１５Ｍ）；（Ｃ２１５Ｇ）；（Ｃ２１５Ｉ）；（Ｃ２１５Ｌ）；（Ｃ２１５Ａ，Ｌ２１６Ｖ）；（Ａ２９Ｃ，Ｃ２１５Ｔ）；（Ｔ３１Ｃ，Ｃ２１５Ｔ）；（Ｒ７６Ｃ，Ｃ２１５Ｔ）；（Ｔ３Ｃ，Ｃ２１５Ａ）；（Ｋ７Ｃ，Ｃ２１５Ａ）；（Ｒ１１Ｃ，Ｃ２１５Ａ）；（Ｑ１９Ｃ，Ｃ２１５Ａ）；（Ｋ２２Ｃ，Ｃ２１５Ａ）；（Ａ２９Ｃ，Ｃ２１５Ａ）；（Ｔ３１Ｃ，Ｃ２１５Ａ）；（Ｒ７６Ｃ，Ｃ２１５Ａ）；（Ｅ１７０Ｃ，Ｃ２１５Ａ）；（Ｃ２１５Ａ，Ｄ２３８Ｃ）；（Ｃ２１５Ａ，Ａ２４３Ｃ）；（Ｃ２１５Ａ，Ｄ２４８Ｃ）；（Ｃ２１５Ａ，Ｈ２５５Ｃ）；（Ｒ７６Ｃ，Ｎ９１Ｒ，Ｃ２１５Ａ）；（Ｒ７６Ｃ，Ｎ９１Ｒ，Ｃ２１５Ａ）；（Ｒ７６Ｃ，Ｃ２１５Ａ）；及び（Ｒ７６Ｃ，Ｃ２１５Ｔ）。
【０１９９】
ポリヌクレオチド
【０２００】
ポリヌクレオチドはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）などの核酸であり得る。標的ポリヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズした一本鎖ＲＮＡを含むことができる。ポリヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、又はヌクレオチド側鎖を有する他の合成ポリマーなどの当該技術分野において既知の任意の合成核酸であってもよい。ＰＮＡ骨格はペプチド結合によってリンクした繰り返しＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位からなる。ＧＮＡ骨格はホスホジエステル結合によってリンクした繰り返しグリコール単位からなる。ＴＮＡ骨格はホスホジエステル結合によって相互にリンクした繰り返しトレオース糖からなる。ＬＮＡは、上記のように、リボース部分における２´酸素及び４´炭素を連結する余分な架橋を有するリボヌクレオチドから形成される。
【０２０１】
ポリヌクレオチドは、好ましくはＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡハイブリッド、最も好ましくはＤＮＡである。標的ポリヌクレオチドは二本鎖であってもよい。標的ポリペプチドは、一本鎖領域及びヘアピンループ、三重鎖及び／又は四重鎖などの他の構造を有する領域を含んでもよい。ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは同一鎖上にＤＮＡ及びＲＮＡを含んでもよい。好ましくは、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドはＲＮＡ鎖にハイブリダイズした一本のＤＮＡ鎖を含む。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドはヘアピン構造又は鋳型と補体を連結するためのいかなる共有結合も含まない。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド（例えば、鋳型）及び標的ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド（例えば、補体）は、ヘアピンループ構造などの架橋部分によってリンクされていない。しかしながら、いくつかの実施形態では、一本鎖（例えば、鋳型又は補体）がナノポアを通って転座するとき、鎖自体はその両端でのアダプターの相互作用によってヘアピン構造を形成することができる。例えば、図１９を参照のこと。そのようなアダプター設計は、例えば、鎖の他端をナノポアの近傍に維持することによって、長いポリヌクレオチドを特徴付けるのに有益である。
【０２０３】
標的ポリヌクレオチドは任意の長さであり得る。例えば、ポリヌクレオチドは、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００、又は少なくとも５００のヌクレオチド又はヌクレオチド対の長さであり得る。標的ポリヌクレオチドは、１０００以上のヌクレオチド若しくはヌクレオチド対、又は５０００以上のヌクレオチド若しくはヌクレオチド対の長さ、又は１０００００以上のヌクレオチド若しくはヌクレオチド対の長さ、又は５００，０００以上のヌクレオチド若しくはヌクレオチド対の長さ、又は１，０００，０００以上のヌクレオチド又はヌクレオチド対の長さ、又は１０，０００，０００以上のヌクレオチド若しくはヌクレオチド対の長さ、又は１００，０００，０００以上のヌクレオチド若しくはヌクレオチド対の長さ、又は２００，０００，０００以上のヌクレオチド若しくはヌクレオチド対の長さ、又は染色体の全長であり得る。標的ポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドは、通常は、５０以下のヌクレオチド、例えば４０以下、３０以下、２０以下、１０以下、又は５以下のヌクレオチドを有する短いヌクレオチドポリマーである。標的オリゴヌクレオチドは、好ましくは、約１５〜約３０ヌクレオチド長、例えば約２０〜約２５ヌクレオチド長である。例えば、オリゴヌクレオチドは、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、又は約３０ヌクレオチド長であり得る。
【０２０４】
標的ポリヌクレオチドはより長い標的ポリヌクレオチドの断片であってもよい。この実施形態では、より長い標的ポリヌクレオチドは、通常は、複数のより短い標的ポリヌクレオチドなどの、複数に断片化される。本発明の方法は、２、３、４、５又はそれ以上のそのようなより短い標的ポリヌクレオチドなどの一つ以上を配列決定するために使用することができる。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の様々な態様の方法を、試料中の２、３、４又は５〜１０、１５、２０又はそれ以上のポリヌクレオチドなどの複数の標的ポリヌクレオチドをサンプリングするために使用してもよい。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の様々な態様の方法を、試料中に二本鎖の形で存在しているポリヌクレオチドを配列決定するために使用してもよい。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、二本鎖ポリヌクレオチドを生成するように、一本鎖ポリヌクレオチドの補体の最初の合成によって一本鎖ポリヌクレオチドを配列決定するために、本明細書に記載の様々な態様の方法を使用してもよい。例えば、一本鎖ポリヌクレオチドはｍＲＮＡなどのＲＮＡであってもよく、本発明の方法における配列決定用の二本鎖ポリヌクレオチドを生成するために、相補的ｃＤＮＡ鎖を合成してもよい。例えば、一本鎖ポリヌクレオチドはＤＮＡであってもよく、本発明の方法における配列決定用の二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドを生成するために、相補鎖を合成してもよい。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは連結されたポリヌクレオチドであってもよい。ポリヌクレオチドを連結する方法はＰＣＴ／ＧＢ２０１７／０５１４９３に記載されている。一実施形態では、ポリヌクレオチドを結合するために使用される付着方法はクリックケミストリーである。この実施形態では、第一の二本鎖ポリヌクレオチドの鋳型（捕捉された第一鎖）及び補体（第一鎖の逆相補体）は、鋳型及び補体が共有結合していないときにナノポアを用いて特徴付けられる。鋳型及び補体が分離されると、第一の二本鎖ポリヌクレオチドに連結された後続アダプター中のポアテザーに相補的な配列が補体中に露出され、補体はナノポアに付着したポアテザーに結合する。この実施形態では、相補鎖が第二の二本鎖ポリヌクレオチドに連結することができるように、連結アダプターもまた第一の二本鎖ポリヌクレオチドに連結される。
【０２０９】
モータータンパク質と放出タンパク質を含む連結アダプター複合体を製造してもよい。この連結アダプターは、標的ポリヌクレオチドの両端に連結してもよい。モータータンパク質及び放出タンパク質の両方は、ポリヌクレオチドがポアによって捕捉されるまで、連結アダプター複合体上に失速し得る。第一のポリヌクレオチドが捕捉されると、ブロッキングケミストリーは両タンパク質によって克服され、モータータンパク質は以前のように、ポリヌクレオチドとポアとの相互作用を制御する。モータータンパク質よりも速く転座することができる放出タンパク質は、連結アダプター複合体のリーダー鎖の５´核酸配列に相補的なハイブリダイゼーション部位を放出するために第一のポリヌクレオチドの３´に達する。このハイブリダイゼーション部位が明らかになると、第二のポリヌクレオチドが、次いで、明らかにされた部位にハイブリダイズし、第一のポリヌクレオチドの３´末端から第二のポリヌクレオチドの５´への共有結合が起こり得る（図４３）。標的ポリヌクレオチドの更なる連結のために、次いで、このプロセスを繰り返す。
【０２１０】
一実施形態では、二本鎖標的ポリヌクレオチドを特徴付けかつ連結する方法を提供し、ここで、付着方法は非共有的である。この実施形態では、第一の二本鎖標的ポリヌクレオチドの相補鎖は、第二の二本鎖標的ポリヌクレオチドを補充し、それをポアに局所的に集中させる。次に、第一の相補鎖が配列決定されると、補充された第二の二本鎖標的ポリヌクレオチドは相補鎖から脱ハイブリダイズし、代わりにポアテザーにハイブリダイズする。これにより、第一及び第二（及びそれに続く、第三、第四、第五など）の二本鎖標的ポリヌクレオチドが鎖間が最短時間でポアを通って相次いで続くことを可能にする。第一の標的ポリヌクレオチドが配列決定されている間に第二標的ポリヌクレオチドを補充することができるため、二本鎖標的ポリヌクレオチドの濃度が低い場合、これは特に有用である。
【０２１１】
別の実施形態では、二本鎖標的ポリヌクレオチドを特徴付け、連結する方法は、例えば、付着方法が非共有的である場合は、二成分型フィッシングテザーを用いて実行してもよい。それは観察されるイベントの割合を増やすために、後続の配列及びポアテザーのための第二のハイブリダイゼーション部位を提供する。
【０２１２】
一実施形態では、例えば、付着方法が非共有的である場合に、多くの二本鎖標的ポリヌクレオチドを特徴付け連結する方法を、２〜２０個、例えば４、５、６、８、１０、１２又は１５個などの複数の二本鎖標的ポリヌクレオチドをポアにもたらすために、使用してもよい。第一の二本鎖標的ポリヌクレオチドの相補鎖は、他の二本鎖標的ポリヌクレオチドを補充し、それらをポアの近傍に集中させ得る。これは、一般的なバルク溶液中よりもポアの周りにより高い局所濃度を提供し、その結果、二本鎖標的ポリヌクレオチドは鎖間の最短時間で開放ポアを通って相次いで追従する。これは二本鎖標的ポリヌクレオチドの濃度が低い場合に特に有用である。この実施形態では、一本鎖結合タンパク質に結合したオリゴからなるテザーを使用してもよい。第一の二本鎖標的ポリヌクレオチドの鋳型鎖を配列決定するとき、相補鎖をｓｓＤＮＡとして溶液中に放出する。他の二本鎖標的ポリヌクレオチドの一本鎖結合タンパク質はｓｓＤＮＡに結合することができる。後続プロセスの一部として、相補鎖を配列決定するとき、相補鎖の３´をポアに向かって引き戻す。ｓｓＤＮＡ相補鎖上の一本鎖結合タンパク質は、ポアを通る補体の動きを制御するモータータンパク質に遭遇したとき、相補鎖から置換され、そしてポアの周囲に堆積して局所濃度を増加させる。これを図４４に示す。標的ポリヌクレオチドの配列が既知の場合、相補鎖のタイル部分に使用することができるポアテザーの３´にも相補的配列が付加されている限り、そのような検体のトロールを実行することができる。
【０２１３】
試料
【０２１４】
検体（タンパク質、ペプチド、分子、ポリペプチド、ポリヌクレオチドなどを含む）は試料中に存在してもよい。試料は任意の適切な試料であってもよい。試料は生体試料であってもよい。本明細書に記載される方法の任意の実施形態は、任意の有機体又は微生物から得られた又は抽出された試料に対してインビトロで実施してもよい。有機体又は微生物は、通常は、古細菌、原核生物、又は真核生物であり、通常は、植物界、動物界、真菌界、モネラ界、及び原生生物界の五界のうちの一つに属する。本明細書に記載の様々な態様の方法は、任意のウイルスから得られた又は抽出された試料に対してインビトロで実施してもよい。
【０２１５】
試料は、好ましくは、流体試料である。試料は、通常は、体液を含む。体液はヒト又は動物から取得してもよい。ヒト又は動物は、疾患を有する、疾患を有する疑いがある、又は疾患の危険性があるものであってもよい。試料は尿、リンパ液、唾液、粘液、精液、又は羊水であってもよいが、好ましくは、全血、血漿、又は血清である。通常は、試料はヒト由来のものであるが、代わりに、別の哺乳動物由来のもの、例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ又はブタなどの商業的に飼育されている動物由来のもの、あるいはネコ又はイヌなどのペットであってもよい。
あるいは、植物由来の試料は、通常は、穀物、豆類、果物、又は野菜などの市販の作物、例えば、小麦、大麦、オート麦、セイヨウアブラナ、トウモロコシ、大豆、米、バナナ、リンゴ、トマト、ジャガイモ、ブドウ、タバコ、豆、レンズ豆、サトウキビ、ココア、綿、茶又はコーヒーから取得する。
【０２１６】
試料は非生体試料であってもよい。非生体試料は、好ましくは、液状試料である。非生体試料の例には、外科用流体、飲料水、海水又は河川水などの水、及び臨床検査用の試薬が含まれる。
【０２１７】
アッセイする前に、例えば、遠心分離によって、又は赤血球などの不要な分子又は細胞を除去する膜を通過させることによって、試料を処理してもよい。採取した直後に試料を測定してもよい。試料はまた、通常は、アッセイ前に、好ましくは−７０°以下で保存してもよい。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、試料はゲノムＤＮＡを含んでもよい。ゲノムＤＮＡは断片化してもよく、本明細書に記載の方法はいずれもゲノムＤＮＡを断片化することをさらに含んでもよい。ＤＮＡは任意の適当な方法によって断片化してもよい。例えば、ＤＮＡを断片化する方法は当該技術分野において既知である。そのような方法は、ＭｕＡトランスポザーゼなどのトランスポザーゼ又は市販のＧチューブを使用してもよい。
【０２１９】
リーダー配列
【０２２０】
リーダー配列は、通常は、ポリマーを含む。ポリマーは、好ましくは、負に荷電されている。ポリマーは、好ましくは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどのポリヌクレオチド、（無塩基ＤＮＡなどの）修飾ポリヌクレオチド、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリペプチドである。リーダーは、好ましくは、ポリヌクレオチドを含み、より好ましくは、一本鎖ポリヌクレオチドを含む。一本鎖リーダー配列は、最も好ましくは、ポリｄＴ切片などのＤＮＡの一本鎖を含む。リーダー配列は、好ましくは、一つ以上のスペーサーを含む。
【０２２１】
リーダー配列は任意の長さであり得るが、通常は、２０〜１５０ヌクレオチド長などの１０〜１５０ヌクレオチド長である。リーダーの長さは、通常は、該方法で使用される膜貫通孔に依存する。
【０２２２】
リーダー配列は、膜貫通孔中に優先的に入り、それによってポアを通るポリヌクレオチドの移動を促進する。リーダー配列は、また、本明細書で論じるように、ポリヌクレオチドを一つ以上のアンカーにリンクするために使用することができる。
【０２２３】
通常は、リーダー配列は、標的ポリヌクレオチドの一端及び標的ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドの一端にある。リーダー配列は、標的ポリヌクレオチドの５´末端及び標的ポリヌクレオチドの補体の５´末端に存在してもよい。あるいは、リーダー配列は、標的ポリヌクレオチドの３´末端及び標的ポリヌクレオチドの補体の３´末端に存在してもよい。リーダー配列は、標的ポリヌクレオチドの５´末端及び相補的ポリヌクレオチドの３´末端に存在してもよく、又はその逆でもよい。これらの後者の実施形態では、二つの異なるポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）が通常は、使用され、ここで、第一のポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）は５´から３´の方向にポリヌクレオチドに沿って移動する。ポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）は、３´から５´の方向にポリヌクレオチドに沿って移動する。
【０２２４】
リーダー配列は、任意の適切な方法によって二本鎖ポリヌクレオチドに付着してもよい。例えば、リーダー配列は、標的ポリヌクレオチド及び／又はその補体に連結してもよい。あるいは、リーダー配列は、他方の鎖上に一本鎖オーバーハングを生成するように二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖を消化することによって、生成してもよい。
【０２２５】
ポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）は、標的ポリヌクレオチド又はその補体への付着の前に、リーダー配列に結合してもよい。ポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）は、二本鎖ポリヌクレオチド中に存在するリーダー配列に結合してもよい。リーダー配列に結合したポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）の活性は、ポリヌクレオチドが膜貫通孔に接触するまで失速し得る。ポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）を失速させる方法は、当技術分野において、例えばＷＯ２０１４／１３５８３８で知られている。
【０２２６】
アダプター
【０２２７】
リーダー配列はアダプター中に存在してもよく、ここで、アダプターは二本鎖領域（例えば、二本鎖ステム）及び少なくとも一つの一本鎖領域を含む。一本鎖領域の少なくとも一つはリーダー配列であってもよい。アダプターは少なくとも一つの非ポリヌクレオチド領域を含んでもよい。標的二本鎖ポリヌクレオチドの両端に付着したアダプターは同一でも異なっていてもよい。好ましくは、対となるアダプターは同一である。
【０２２８】
リーダー配列はアダプターの一方の鎖の５´末端（又は３´末端）の第一の一本鎖領域に存在するのが好ましい。第二の一本鎖の領域は、アダプターの他方の鎖の３´末端（又は５´末端）に存在してもよい。第一及び第二の一本鎖領域は相補的ではない。この実施形態では、アダプターはＹアダプターと呼ばれることがある。
【０２２９】
Ｙアダプターは、通常は、（ａ）二本鎖領域（例えば、二本鎖ステム）、及び（ｂ）一本鎖領域又は他方の末端に相補的ではない領域を含む。Ｙアダプターは、一本鎖領域を含む場合、オーバーハングを有すると記載してもよい。二本鎖部分と異なり、二本の鎖が通常は相互にハイブリダイズしないので、Ｙアダプター中の非相補領域の存在はアダプターにそのＹ形状を与える。Ｙアダプターは一つ以上のアンカーを含んでもよい。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、アダプターは、ナノポア上の一つ以上（例えば、少なくとも一つ、少なくとも二つ、少なくとも三つ又はそれ以上）のタグに対する一つ以上（例えば、少なくとも一つ、少なくとも二つ、少なくとも三つ又はそれ以上）の結合部位を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ナノポア上のタグに対する結合部位は、二本鎖領域の二本の鎖の分離時に結合部位が露出するように、二本鎖領域（例えば、二本鎖ステム）内にあってもよい。例えば、図１０を参照のこと。追加的又は代替的に、ナノポア上のタグに対する結合部位は、アダプターの一本鎖部分上にあってもよい。一例としてのみ、図９Ａは固体基板、例えば膜又はビーズ用の少なくとも一つのアンカーを含む例示的なアダプターを示す一方、図１５は少なくとも二つのアンカーを含む例示的なアダプターを示し、第一のアンカーは固体膜、例えば膜又はビーズに結合することができ、第二のアンカーはナノポアに結合することができる。ナノポアに接合したタグに結合するように、ナノポア用の第二アンカーを構成することができる。
【０２３１】
Ｙアダプターは、好ましくは、ポア内に優先的に入るリーダー配列を含む。
【０２３２】
Ｙアダプターは当該分野で既知の任意の方法を用いてポリヌクレオチドに付着していてもよい。例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、大腸菌ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｍａ  ＤＮＡリガーゼ及び９°Ｎ  ＤＮＡリガーゼなどのリガーゼなどを用いて、アダプターの一方又は両方を連結してもよい。
【０２３３】
好ましい実施形態では、二本鎖ポリヌクレオチド、例えば、試料中の二本鎖ポリヌクレオチドは、両端にＹアダプターを含むために修飾される。任意の修飾方法を使用することができる。該方法は、アダプターを付加することによって二本鎖標的ポリヌクレオチドを修飾することを含んでもよい。
【０２３４】
二本鎖ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドをＭｕＡトランスポザーゼ及び二本鎖ＭｕＡ基質の個体群と接触させることによって、Ｙアダプターなどのアダプター、又はアンカーを備えていてもよい。トランスポザーゼは二本鎖ポリヌクレオチドを断片化し、ＭｕＡ基質を断片の一方又は両方の末端に連結する。これにより、アダプター又はアンカーを含む複数の修飾二本鎖ポリヌクレオチドを生成する。次いで、本発明の方法を用いて修飾二本鎖ポリヌクレオチドを調査してもよい。
【０２３５】
これらのＭｕＡに基づく方法はＷＯ２０１５／０２２５４４及びＷＯ２０１６／０５９３６３に開示されている。それらは、ＷＯ２０１５／１５０７８６でも詳論されている。
【０２３６】
アダプターは、標的ポリヌクレオチドを含む二本鎖ポリヌクレオチドを結合するためのアンカー及び／又は膜貫通孔又は孔を含む膜に対するその補体をも含んでもよい。すなわち、アダプターは膜テザー又はポアテザーをも含んでもよい。アンカーは、好ましくは、リーダー配列ではない一本鎖領域に付着している。
【０２３７】
ポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）はアダプター中のリーダー配列に結合していてもよく、又はポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）はアダプターが二本鎖ポリヌクレオチドに付着された後に付加してもよい。リーダー配列に結合したポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）の活性は、ポリヌクレオチドが膜貫通孔に接触するまで失速する可能性がある。
【０２３８】
リーダー配列又はアダプターは、任意の適切な方法によって二本鎖ポリヌクレオチドに付着してもよい。例えば、リーダー配列は標的ポリヌクレオチド及び／又はその補体に連結してもよく、又はアダプターは二本鎖ポリヌクレオチドに連結してもよい。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、二本鎖バーコード配列は、標的二本鎖ポリヌクレオチドの一方又は両方の末端に連結してもよい。バーコード配列は、リーダー配列又はアダプターが付加される前に、二本鎖ポリヌクレオチドに付加してもよい。例えば、バーコード配列は、標的二本鎖ポリヌクレオチドの末端とアダプターとの間に位置してもよい。好ましくは、バーコード配列はアダプターに含まれている。
【０２４０】
一意のバーコード配列は、試料中の各二本鎖ポリヌクレオチドに付着、例えば、連結してもよい。バーコード配列は、標的ポリヌクレオチド及び標的ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドのポアを通る逐次転座に対応する信号を同定するために用いてもよい。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のアダプターは、あらかじめ結合したポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）が、二本鎖ポリヌクレオチドに沿って移動したり巻き戻したりするのを防ぐための一つ以上のスペーサーを含むことができる。これらのスペーサーは、ポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）がポアに位置し、ポアを横切って電位差を印加するまで、ポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）の更なる動きを防ぐ。電位差による追加の力は、ポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）をスペーサー上に押し、巻き戻してナノポアを通るポリヌクレオチドの動きを制御することを可能にする。したがって、ポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）による動きは、通常は、ポリヌクレオチドがナノポア内に場合にのみ起こり、それ以前では起こらない。ポリヌクレオチドがナノポア内に入るまで、あらかじめ結合したポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）が二本鎖ポリヌクレオチドに沿って移動したり巻き出したりするのを防ぐためのスペーサー及び方法の例は、例えば、ＷＯ２０１５／１１０８１３に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２４２】
バーコード
【０２４３】
ポリヌクレオチドバーコードは、当該技術分野において既知である（Ｋｏｚａｒｅｗａ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ.，（２０１１），Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７３３，ｐ２７９−２９８）。バーコードは、特定の既知の方法でポアを通る電流に影響を与えるポリヌクレオチドの特定の配列である。
【０２４４】
バーコードはヌクレオチド配列を含んでもよい。ヌクレオチドは、通常は、核酸塩基、糖、及び少なくとも一つのリン酸基を含む。核酸塩基は、通常は、複素環である。核酸塩基は、プリン及びピリミジン、より具体的にはアデニン、グアニン、チミン、ウラシル及びシトシンを含むが、これらに限定されない。糖は、通常は、ペントース糖である。ヌクレオチド糖は、リボース及びデオキシリボースを含むが、これらに限定されない。ヌクレオチドは、通常は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドである。ヌクレオチドは、通常は、一リン酸、二リン酸、又は三リン酸を含む。リン酸は、ヌクレオチドの５´又は３´側に付着してもよい。
【０２４５】
ヌクレオチドは、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、５−メチルシチジン一リン酸、５−メチルシチジン二リン酸、５−メチルシチジン三リン酸、５−ヒドロキシメチルシチジン一リン酸、５−ヒドロキシメチルシチジン二リン酸、５−ヒドロキシメチルシチジン三リン酸、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、５−メチル−２´−デオキシシチジン一リン酸、５−メチル−２´−デオキシシチジン二リン酸、５−メチル−２´−デオキシシチジン三リン酸、５−ヒドロキシメチル−２´−デオキシシチジン一リン酸、５−ヒドロキシメチル−２´−デオキシシチジン二リン酸、及び５−ヒドロキシメチル−２´−デオキシシチジン三リン酸を含むが、これらに限定されない。アダプター中のヌクレオチドは、好ましくは、ＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ又はｄＣＭＰから選択される。ヌクレオチドは脱塩基（すなわち、核酸塩基を欠く）であってもよい。ヌクレオチドは追加の修飾を含んでもよい。特に、適切な修飾ヌクレオチドは、２´−アミノピリミジン（例えば、２´−アミノシチジン及び２´−アミノウリジン）、２´−ヒドロキシルプリン（例えば、２´−フルオロピリミジン（例えば、２´−フルオロシチジン及び２´フルオロウリジン）、ヒロドキシルピリミジン（例えば、５´−α−Ｐ−ボラノウリジン）、２´−Ｏ−メチルヌクレオチド（例えば、２´−Ｏ−メチルアデノシン、２´−Ｏ−メチルグアノシン、２´−Ｏ−メチルシチジン、及び２´−Ｏ−メチルウリジン）、４´−チオピリミジン（例えば、４´−チオウリジン及び４´−チオシチジン）を含むが、これらに限定されない。ヌクレオチドは核酸塩基の修飾を有する（例えば、５−ペンチニル−２´−デオキシウリジン、５−（３−アミノプロピル）−ウリジン及び１，６−ジアミノヘキシル−Ｎ−５−カルバモイルメチルウリジン）。
【０２４６】
バーコードは、一つ以上の異なるヌクレオチド種を含んでもよい。例えば、Ｔ  ｋ−ｍｅｒｓ（すなわち、中心ヌクレオチドがチミンベースであるｋ−ｍｅｒ、例えば、ＴＴＡ、ＧＴＣ、ＧＴＧ、及びＣＴＡなど）は、通常は、最も低い電流状態を有する。Ｔヌクレオチドの修飾版は、電流状態を更に低下させ、それによってアダプターがポアを通過する際に見られる全電流範囲を広げるために、修飾ポリヌクレオチドに導入してもよい。
【０２４７】
Ｇ  ｋ−ｍｅｒ（すなわち、中心ヌクレオチドがグアニンベースであるｋ−ｍｅｒ、例えば、ＴＧＡ、ＧＧＣ、ＴＧＴ、及びＣＧＡなど）は、ｋ−ｍｅｒ中の他のヌクレオチドから影響を強く受ける傾向があるため、修飾ポリヌクレオチド中のＧヌクレオチドを修飾することはそれらがより多くの独立した電流位置を有するのを助け得る。
【０２４８】
三つの異なる種の代わりに同一のヌクレオチド種の三つのコピーを含むことは、例えば、修飾ポリヌクレオチド中の３ヌクレオチドｋ−ｍｅｒをマッピングすることのみ必要であるため、特徴付けを容易にするかもしれない。しかし、そのような修飾はバーコードによる情報を確実に減らす。
【０２４９】
一つ以上の無塩基ヌクレオチドがバーコードに含まれてもよい。一つ以上の無塩基ヌクレオチドを使用すると、特徴的な電流スパイクが発生する。それにより、バーコード中の一つ以上のヌクレオチド種の位置の明確な強調表示を可能にする。
【０２５０】
バーコード中のヌクレオチド種はプロピニル基、チオ基、オキソ基、メチル基、ヒドロキシメチル基、ホルミル基、カルボキシ基、カルボニル基、ベンジル基、プロパルギル基又はプロパルギルアミン基などの化学原子又は化学基を含んでもよい。化学基又は原子は蛍光分子、ビオチン、ジゴキシゲニン、ＤＮＰ（ジニトロフェノール）、光不安定基、アルキン、ＤＢＣＯ、アジド、遊離アミノ基、レドックス染料、水銀原子又はセレン原子であってもよく、又はそれらを含んでもよい。
【０２５１】
バーコードは、ハロゲン原子を含むヌクレオチド種を含んでもよい。ハロゲン原子は、核酸塩基及び／又は糖などの異なるヌクレオチド種上の任意の位置に付着してもよい。ハロゲン原子は、好ましくは、フッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、又はヨウ素（Ｉ）である。ハロゲン原子は、最も好ましくは、Ｆ又はＩである。
【０２５２】
アンカー
【０２５３】
標的ポリヌクレオチドはアンカー（膜テザー）を用いて膜に結合していてもよい。一つ以上のアンカーを用いて標的ポリヌクレオチドを膜に結合してもよい。通常は、一つ以上のアンカーは標的ポリヌクレオチドの各鎖に付着している。アンカーはアダプターの一部であってもよい。
【０２５４】
膜がトリブロックコポリマー膜のような両親媒性層である場合、一つ以上のアンカーは、好ましくは、膜に挿入することができるポリペプチドアンカー及び／又は疎水性アンカーを含む。疎水性アンカーは、好ましくは、脂質、脂肪酸、ステロール、カーボンナノチューブ、ポリペプチド、タンパク質又はアミノ酸、例えばコレステロール、パルミテート又はトコフェロールである。好ましい実施形態では、一つ以上のアンカーはポアではない。
【０２５５】
両親媒性分子、コポリマー又は脂質などの膜の成分は、一つ以上のアンカーを形成するために、化学的に修飾又は官能化されてもよい。膜の成分を官能化するための適切な化学修飾及び適切な方法の例は、以下に更に詳細に説明されている。任意の割合、例えば、少なくとも０．０１％、少なくとも０．１％、少なくとも１％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％又は１００％の膜成分を官能化してもよい。
【０２５６】
一つ以上のアンカーは、好ましくは、リンカーを含む。一つ以上のアンカーは、一つ以上、例えば二つ、三つ、四つ又はそれ以上のリンカーを含んでもよい。
【０２５７】
好ましいリンカーはポリマー、例えばポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、多糖類、及びポリペプチドを含むが、これらに限定されない。これらのリンカーは直鎖状、分岐状又は環状であってもよい。例えば、リンカーは環状ポリヌクレオチドであってもよい。ポリヌクレオチドは、環状ポリヌクレオチドリンカー上の相補的配列にハイブリダイズしてもよい。
【０２５８】
一つ以上のアンカー又は一つ以上のリンカーは、例えば制限部位又は光解離性基などの切断又は分解することができる成分を含んでもよい。
【０２５９】
官能化リンカー及びそれらが分子を結合することができる方法は、当該技術分野において既知である。例えば、マレイミド基で官能化されたリンカーはタンパク質中のシステイン残基と反応して付着する。
【０２６０】
ポリヌクレオチドの架橋は「ロックアンドキー」配置を用いて回避することができる。各リンカーの一方の末端のみが相互に反応してより長いリンカーを形成し、リンカーの他方の末端はポリヌクレオチド又は膜とそれぞれ反応する。そのようなリンカーはＷＯ２０１０／０８６６０２に記載されている。
【０２６１】
リンカーの使用は本発明の配列決定方法において好ましい。ポアと相互作用するときに分離しないという意味で、ポリヌクレオチドが永久的に膜に直接結合している場合、膜とポアとの間の距離のために、配列決定実行がポリヌクレオチドの末端まで続くことができないので、いくつかの配列データは失われることになる。リンカーが使用された場合、ポリヌクレオチドは完全に処理され得る。
【０２６２】
結合は恒久的又は安定的であってもよい。言い換えれば、結合はポアと相互作用するときにポリヌクレオチドが膜に結合したままのものであってもよい。
【０２６３】
結合は一時的であってもよい。言い換えれば、結合はポアとの相互作用のときにポリヌクレオチドが膜から分離可能なものであってもよい。ポリヌクレオチド配列決定のためには、結合の一時的性質が好ましい。恒久的又は安定的なリンカーがポリヌクレオチドの５´又は３´末端のいずれかに直接付着し、リンカーが膜と膜貫通孔のチャネルとの間の距離よりも短い場合、配列決定実行はポリヌクレオチドの末端まで継続することができないので、いくらかの配列データは失われることになる。結合が一時的である場合、結合した末端がランダムに膜から分離されると、ポリヌクレオチドは完全に処理され得る。恒久的／安定的又は一時的なリンクを形成する化学基は以下でより詳細に説明されている。標的ポリヌクレオチド及び／又はその補体は、両親媒性層などの膜、例えば、コレステロール又は脂肪アシル鎖を用いたトリブロックコポリマー膜又は脂質膜に一時的に結合していてもよい。ヘキサデカン酸などの６〜３０個の炭素原子の長さを有する任意の脂肪アシル鎖を用いてもよい。
【０２６４】
好ましい実施形態では、アンカーは標的ポリヌクレオチド及び／又はその補体をトリブロックコポリマー膜又は脂質二分子層などの両親媒性層に結合させる。合成脂質二分子層への核酸の結合は様々な異なるテザリング戦略で以前から実施されてきた。これらを以下の表１にまとめる。
【表１】
2020500528.tif 000003
【０２６５】
合成ポリヌクレオチド及び／又はリンカーは、コレステロール、トコフェロール、パルミテート、チオール、脂質及びビオチン基などの適切な固定基の直接付加に容易に適合する、合成反応での修飾ホスホルアミダイトを用いて官能化することができる。これらの異なる付着化学はポリヌクレオチドへの付着のための一連の選択肢を与える。各異なる修飾基はわずかに異なる方法でポリヌクレオチドを結合し、結合は常に恒久的ではないため、膜へのポリヌクレオチドに異なる滞留時間を与える。
【０２６６】
ポリヌクレオチドのリンカー又は官能化膜への結合はまた、相補的反応性基又はアンカー基がポリヌクレオチドに付加することができることを条件とするいくつかの他の手段によって達成することができる。ポリヌクレオチドのいずれかの末端への反応性基の付加は以前に報告されている。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ及びＡＴＰγＳを用いて、チオール基をｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡの５´に付加することができる（Ｇｒａｎｔ，  Ｇ．Ｐ．ａｎｄ  Ｐ．Ｚ．Ｑｉｎ  （２００７）。「核酸の５´末端にニトロキシドスピンの標識付けをするための簡単な方法」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３５（１０）：ｅ７７）。Ｔ４  ポリヌクレオチドキナーゼ及びγ−［２−アジドエチル］−ＡＴＰ又はγ−［６−アジドヘキシル］−ＡＴＰを用いて、アジド基をｓｓＤＮＡのｄｓＤＮＡの５´−リン酸に付加することができる。チオール又はクリックケミストリーを用いて、チオール、ヨードアセトアミドＯＰＳＳ又はマレイミド基（チオールに対して反応性）又はＤＩＢＯ（ジベンゾシクロオキシン）若しくはアルキン基（アジドに対して反応性）のいずれかを含むテザーは、ポリヌクレオチドに共有的に付着され得る。ビオチン、チオール、及びフルオロフォアなどの化学基のより多様な選択は、末端トランスフェラーゼを用いて、修飾オリゴヌクレオチドをｓｓＤＮＡの３´に組み込むために付加することができる（Ｋｕｍａｒ，Ａ．，Ｐ．Ｔｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）。「末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによる合成オリゴヌクレオチドプローブの非放射性の標識付け」Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １６９（２）：３７６−８２）。ストレプトアビジン／ビオチン及び／又はストレプトアビジン／デスチオビオチンの結合は、他の任意のポリヌクレオチドに使用してもよい。また、適切に修飾されたヌクレオチド（例えば、コレステロール又はパルミチン酸）を有する末端トランスフェラーゼを用いて、アンカーをポリヌクレオチドに直接付加することが、可能かもしれない。
【０２６７】
一つ以上のアンカーは、ハイブリダイゼーションを介して標的ポリヌクレオチド及び／又はその補体を膜に結合してもよい。ハイブリダイゼーションは、一つ以上のアンカーと標的ポリヌクレオチド及び／又はその補体との間、一つ以上のアンカー内、又は一つ以上のアンカーと膜との間であってもよい。一つ以上のアンカーにおけるハイブリダイゼーションは上述したように一時的な結合を可能にする。例えば、リンカーは、一緒にハイブリダイズした３、４又は５個のポリヌクレオチドなどの２個以上のポリヌクレオチドを含んでもよい。一つ以上のアンカーは、標的ポリヌクレオチド又は標的ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズしてもよい。一つ以上のアンカーは、標的ポリヌクレオチド及び／又はその補体に付着したＹアダプター及び／又はリーダー配列に直接ハイブリダイズしてもよい。あるいは、一つ以上のアンカーは、２つ又は３つなどの一つ以上の中間ポリヌクレオチド又は「スプリント」）、標的ポリヌクレオチド及び／又はその相補体に付着したＹアダプター及び／又はリーダー配列にハイブリダイズしてもよい。
【０２６８】
一つ以上のアンカーは一本鎖又は二本鎖ポリヌクレオチドを含んでもよい。アンカーの一部は一本鎖又は二本鎖ポリヌクレオチド検体に連結してもよい。ｓｓＤＮＡの短い断片の連結はＴ４  ＲＮＡリガーゼＩを用いて報告されている（Ｔｒｏｕｔｔ，Ａ．Ｂ．，Ｍ．Ｇ．ＭｃＨｅｙｚｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）。「連結アンカーＰＣＲ：片側特異性を有する単純な増幅技術」Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９（２０）：９８２３−５）。あるいは、一本鎖又は二本鎖ポリヌクレオチドのいずれかを二本鎖ポリヌクレオチドに連結し、次いで二本鎖を熱変性又は化学変性によって分離することができる。二本鎖ポリヌクレオチドに対して、片方の一本鎖ポリヌクレオチドを二本鎖の一方又は両方の末端に付加する、又は二本鎖ポリヌクレオチドを一方又は両方の末端に付加することが可能である。一本鎖ポリヌクレオチドの二本鎖ポリヌクレオチドへの付加については、これは一本鎖ポリヌクレオチドの他の領域への連結のためのＴ４  ＲＮＡリガーゼＩを用いて達成することができる。二本鎖ポリヌクレオチドの二本鎖ポリヌクレオチドへの付加については、次いで、ポリヌクレオチド及び付加されたポリヌクレオチドにそれぞれ相補的な３´ｄＡ／ｄＴテイル（コンカテマー又はダイマーの形成を防ぐために多くの試料製造用途で日常的に行われているように）、又はポリヌクレオチドの制限消化及び適合性アダプターの連結によって生成された「粘着末端」を用いて、連結を「平滑末端」にすることができる。次いで、二本鎖が融解したとき、各一本鎖は、一本鎖ポリヌクレオチドを連結に使用した場合の５´又は３´のいずれかの修飾、あるいは二本鎖ポリヌクレオチドを連結に使用した場合の５´端、３´端、又はその両方での修飾を有する。
【０２６９】
アダプター、又は標的ポリヌクレオチドの補体が合成鎖である場合、アダプター又は補体の化学合成中に一つ以上のアンカーを組み込むことができる。例えば、アダプター又は補体は、反応基が付着したプライマーを用いて合成することができる。
【０２７０】
アデニル化ポリヌクレオチドは、アデノシン一リン酸がポリヌクレオチドの５´−リン酸に付着している連結反応における中間体である。この中間体の生成には、ＮＥＢの５´ＤＮＡ  Ａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔなど、様々なキットが利用可能である。反応中に修飾ヌクレオチド三リン酸をＡＴＰで置換することによって、ポリヌクレオチドの５´に反応性基（例えば、チオール、アミン、ビオチン、アジドなど）を付加することも可能である。また、好適に修飾されたヌクレオチド（例えば、コレステロール又はパルミチン酸）を有する５´ＤＮＡアデニル化キットを用いて、アンカーをポリヌクレオチドに直接付加してもよい。
【０２７１】
ゲノムＤＮＡの一部を増幅するための一般的な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することである。この場合、二つの合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＤＮＡの同一部分の多数のコピーを生成することができる。各コピーについて、二本鎖中の各鎖の５´が合成ポリヌクレオチドであることになる。ポリメラーゼを用いることにより、単一又は複数のヌクレオチドを一本鎖又は二本鎖ＤＮＡの３´末端に付加することができる。使用できるポリメラーゼの例としては、ターミナルトランスフェラーゼ、クレノウ、及び大腸菌ポリＡポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。反応中に修飾ヌクレオチド三リン酸をＡＴＰで置換することにより、コレステロール、チオール、アミン、アジド、ビオチン又は脂質などのアンカーを二本鎖ポリヌクレオチドに組み込むことができる。したがって、増幅ポリヌクレオチドの各コピーはアンカーを含むことになる。
【０２７２】
理想的には、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドを官能化することを必要とせずに膜に結合する。これは、ポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）又は化学基などの一つ以上のアンカーを膜に結合し、そして一つ以上のアンカーをポリヌクレオチドと相互作用させることによって、又は膜を官能化することによって達成することができる。一つ以上のアンカーは本明細書に記載の方法のいずれかによって膜に結合してもよい。特に、一つ以上のアンカーは、マレイミド官能化リンカーなどの一つ以上のリンカーを含んでもよい。この実施形態では、ポリヌクレオチドは、通常は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＴＮＡ、又はＬＮＡであり、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。この実施形態はゲノムＤＮＡポリヌクレオチドに特に適している。
【０２７３】
一つ以上のアンカーは、一本鎖又は二本鎖ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド内の特定のヌクレオチド配列、又はポリヌクレオチド内の修飾ヌクレオチドのパターンに結合する（ｃｏｕｐｌｅ）、結合する（ｂｉｎｄ）、若しくは相互作用する任意の基、又はポリヌクレオチド上に存在する任意の他のリガンドを含んでもよい。
【０２７４】
アンカーに使用するのに適した結合タンパク質は、大腸菌一本鎖結合タンパク質、Ｐ５一本鎖結合タンパク質、Ｔ４  ｇｐ３２一本鎖結合タンパク質、ＴＯＰＯ  Ｖ  ｄｓＤＮＡ結合領域、ヒトヒストンタンパク質、大腸菌ＨＵ  ＤＮＡ結合タンパク質及び他の古細菌、原核生物、又は真核生物の一本鎖又は二本鎖ポリヌクレオチド（又は核酸）結合タンパク質、下記のリストに含まれるもの、が含まれるが、これらに限定されない。
【０２７５】
特定のヌクレオチド配列は、転写因子、リボソーム、エンドヌクレアーゼ、トポイソメラーゼ又は複製開始因子によって認識される配列であり得る。修飾ヌクレオチドのパターンはメチル化又は損傷のパターンであり得る。
【０２７６】
一つ以上のアンカーは、ポリヌクレオチドに結合する（ｃｏｕｐｌｅ）、結合する（ｂｉｎｄ）、挿入する、又はポリヌクレオチドと相互作用する任意の基を含むことができる。基は静電気、水素結合、又はファンデルワールス相互作用を介してポリヌクレオチドに挿入してもよく、又はポリヌクレオチドと相互作用してもよい。そのような基にはリジンモノマー、ポリ−リジン（ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡと相互作用することになる）、臭化エチジウム（ｄｓＤＮＡにインターカレートすることになる）、ユニバーサル塩基又はユニバーサルヌクレオチド（任意のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる）、及びオスミウム錯体（メチル化塩基と反応することができる）が含まれる。したがって、ポリヌクレオチドは膜に付着した一つ以上のユニバーサルヌクレオチドを用いて膜に結合してもよい。各ユニバーサルヌクレオチドは一つ以上のリンカーを用いて膜に結合してもよい。ユニバーサルヌクレオチドは、好ましくは、以下の核酸塩基のうちの一つを含む：ヒポキサンチン、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、６−ニトロインドール、ホルミルインドール、３−ニトロピロール、ニトロイミダゾール、４−ニトロピラゾール、４−ニトロベンゾイミダゾール、５−ニトロインダゾール、４−アミノベンゾイミダゾール又はフェニル（Ｃ６芳香族環）。ユニバーサルヌクレオチドは、より好ましくは、以下のヌクレオシドのうちの一つを含む：２´−デオキシイノシン、イノシン、７−デアザ−２´−デオキシイノシン、７−デアザ−イノシン、２−アザ−デオキシイノシン、２−アザ−イノシン、２−Ｏ´−メチルイノシン、４−ニトロインドール２´−デオキシリボヌクレオシド、４−ニトロインドールリボヌクレオシド、５−ニトロインドール  ２´−デオキシリボヌクレオシド、５−ニトロインドールリボヌクレオシド、６−ニトロインドール  ２´−デオキシリボヌクレオシド、６−ニトロインドールリボヌクレオシド、３−ニトロピロール２´−デオキシリボヌクレオシド、３−ニトロピロールリボヌクレオシド、ヒポキサンチンの非環状糖、ニトロイミダゾール２´−デオキシリボヌクレオシド、ニトロイミダゾールリボヌクレオシド、４−ニトロピラゾール２´−デオキシリボヌクレオシド、４−ニトロピラゾールリボヌクレオシド、４−ニトロベンゾイミダゾール２´−デオキシリボヌクレオシド、４−ニトロベンゾイミダゾールリボヌクレオシド、５−ニトロインダゾール２´−デオキシリボヌクレオシド、５−ニトロインダゾールリボヌクレオシド、４−アミノベンゾイミダゾール２´−デオキシリボヌクレオシド、４−アミノベンゾイミダゾールリボヌクレオシド、フェニルＣ−リボヌクレオシド、フェニルＣ−２´−デオキシリボシルヌクレオシド、２´−デオキシネブラリン、２´−デオキシイソグアノシン、Ｋ−２´−デオキシリボース、Ｐ−２´−デオキシリボース及びピロリジン。ユニバーサルヌクレオチドは、より好ましくは、２´−デオキシイノシンを含む。ユニバーサルヌクレオチドは、より好ましくは、ＩＭＰ又はｄＩＭＰである。ユニバーサルヌクレオチドは、最も好ましくは、ｄＰＭＰ（２´−デオキシ−Ｐ−ヌクレオシド一リン酸）又はｄＫＭＰ（Ｎ６−メトキシ−２，６−ジアミノプリン一リン酸）である。
【０２７７】
一つ以上のアンカーは、フーグスティーン水素結合（二つの核酸塩基が水素結合によって結合している場合）、又は逆フーグスティーン水素結合（一方の核酸塩基が他方の核酸塩基に対して１８０°回転している場合）を介して、ポリヌクレオチドに結合（ｃｏｕｐｌｅ）（又は結合（ｂｉｎｄ））してもよい。例えば、一つ以上のアンカーは、ポリヌクレオチドとフーグスティーン水素結合又は逆フーグスティーン水素結合を形成する一つ以上のヌクレオチド、一つ以上のオリゴヌクレオチド、又は一つ以上のポリヌクレオチドを含んでもよい。これらの種類の水素結合は、第三ポリヌクレオチド鎖が二本鎖ヘリックスに巻き付き、三本鎖を形成することを可能にする。一つ以上のアンカーは、二本鎖構造とともに三本鎖を形成することによって、二本鎖ポリヌクレオチドに結合（ｃｏｕｐｌｅ）（又は結合（ｂｉｎｄ））してもよい。
【０２７８】
この実施形態では、膜成分の少なくとも１％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、又は１００％の膜成分は官能化することができる。
【０２７９】
一つ以上のアンカーがタンパク質を含む場合、それらは、例えば、膜と適合可能である外部疎水性領域を既に有する場合、更に官能化することなく膜中に直接アンカリングできるかもしれない。そのようなタンパク質の例としては、膜貫通タンパク質、膜内タンパク質、及び膜タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、タンパク質は膜と適合性のある遺伝的に融合した疎水性領域で表現してもよい。そのような疎水性タンパク質領域は当技術分野において既知である。
【０２８０】
一つ以上のアンカーは、好ましくは、膜への送達の前にポリヌクレオチドと混合されるが、一つ以上のアンカーは、膜と接触し、続いてポリヌクレオチドと接触してもよい。
【０２８１】
別の態様では、特異的結合基によって認識できるように、上記の方法を用いてポリヌクレオチドを官能化してもよい。具体的には、ビオチン（ストレプトアビジンへの結合用）、アミロース（マルトース結合タンパク質又は融合タンパク質への結合用）、Ｎｉ−ＮＴＡ（ポリヒスチジン又はポリヒスチジンタグ付きタンパク質への結合用）などのリガンド、又はペプチド（抗原など）でポリヌクレオチドを官能化してもよい。
【０２８２】
好ましい実施形態によれば、ポリヌクレオチドが優先的にポアに入り込むリーダー配列に付着している場合、ポリヌクレオチドを膜に結合させるように、一つ以上のアンカーを用いてもよい。好ましくは、ポリヌクレオチドは、ポア内に優先的に入るリーダー配列に付着（例えば連結）している。そのようなリーダー配列はホモポリマーポリヌクレオチド又は無塩基領域を含んでもよい。リーダー配列は、通常は、直接又は一つ以上の中間ポリヌクレオチド（若しくはスプリント）を介して一つ以上のアンカーにハイブリダイズするように設計される。そのような場合、一つ以上のアンカーは、通常は、リーダー配列中の配列又は一つ以上の中間ポリヌクレオチド（若しくはスプリント）中の配列に相補的なポリヌクレオチド配列を含む。そのような場合、一つ以上のスプリントは、通常は、リーダー配列中の配列に相補的なポリヌクレオチド配列を含む。
【０２８３】
以上に論じられた、ポリヌクレオチドを両親媒性層などの膜に結合するための方法のいずれも、もちろん、他のポリヌクレオチド及び膜の組み合わせに適用することができる。いくつかの実施形態では、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質はトリブロックコポリマー層又は脂質二分子層などの両親媒性層に結合している。そのようなポリヌクレオチドの化学的付着のための様々な方法論が利用可能である。化学的付着に使用される分子の例は、ＥＤＣ１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩である。市販のキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｐｉｅｒｃｅ、品番２２９８０）を用いて反応性基をポリヌクレオチドの５´に付加することもできる。適切な方法には、ヒスチジン残基及びＮｉ−ＮＴＡを用いた一時的親和性付着、並びに反応性システイン、リジン又は非天然型アミノ酸によるより強固な共有付着が含まれるが、これらに限定されない。
【０２８４】
微粒子
【０２８５】
微粒子は、通常はビーズであり、検体（例えば、ポリヌクレオチド又はポリペプチド）を膜貫通孔に送達するために使用してもよい。これはＷＯ２０１６／０５９３７５に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明の方法では、任意の数の微粒子を使用することができる。例えば、本発明の方法は単一の微粒子、又は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０、１００、１，０００、５，０００、１０，０００、１００，０００、５００，０００若しくは１，０００，０００個以上の微粒子を使用してもよい。複数の微粒子が使用される場合、微粒子は同一であってもよい。あるいは、異なる微粒子の混合物を使用してもよい。
【０２８６】
各微粒子は、付着した一つの検体（例えば、ポリヌクレオチド又はポリペプチド）を有してもよい。あるいは、各微粒子は付着した二つ以上の検体（例えば、ポリヌクレオチド又はポリペプチド）、例えば、三つ以上、四つ以上、五つ以上、六つ以上、七つ以上、八つ以上、九つ以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、５０個以上、１００個以上、５００個以上、１，０００個以上、５，０００個以上、１０，０００個以上、１００，０００個以上、１，０００，０００個以上又は５，０００，０００個以上の検体を有してもよい。微粒子は、検体（例えば、ポリヌクレオチド又はポリペプチド）で実質的に又は完全にコーティング又は被覆してもよい。微粒子は、その表面の実質的に全部又は全部に付着した検体（例えば、ポリヌクレオチド又はポリペプチド）を有してもよい。微粒子は、アダプターを介して検体（例えば、ポリヌクレオチド又はポリペプチド）に付着してもよい。アダプターは、例えば図３６に示すように、Ｙアダプターであってもよい。
【０２８７】
適切な結合部分の例は、タンパク質結合タグ（ストレプトアビジンタグ、フラッグタグなど）、共役付着（ポリヌクレオチド、ポリマー、ビオチン、ペプチド）及びアミノ酸（システイン、Ｆａｚなど）を含む。
【０２８８】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、二つ以上の微粒子に付着してもよい。
【０２８９】
微粒子は、そのサイズが通常はマイクロメートル（μｍ）で測定される微小粒子である。微粒子は、マイクロスフェア又はマイクロビーズとしても知られている場合がある。微粒子はナノ粒子であってもよい。ナノ粒子は、そのサイズが通常はナノメートル（ｎｍ）で測定される微小粒子である。
【０２９０】
微粒子は、通常は、約０．００１μｍ〜約５００μｍの粒径を有する。例えば、ナノ粒子は、約０．０１μｍ〜約２００μｍ又は約０．１μｍ〜約１００μｍの粒径を有してもよい。より多くの場合、微粒子は、約０．５μｍ〜約１００μｍ、又は例えば約１μｍ〜約５０μｍの粒径を有する。微粒子は、約１ｎｍ〜約１０００ｎｍ、例えば約１０ｎｍ〜約５００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約２００ｎｍ、又は約３０ｎｍ〜約１００ｎｍの粒径を有してもよい。
【０２９１】
微粒子は球状又は非球状であってもよい。球状微粒子はマイクロスフェアと呼ばれることがある。非球状粒子は、例えば板状、針状、不規則又は管状であってもよい。本明細書で使用される語「粒径」は、粒子が球状である場合は粒子の直径を意味し、粒子が非球状である場合は体積基準の粒小サイズを意味する。体積基準の粒径は問題の非球状粒子と同一の体積を有する球の直径である。
【０２９２】
この方法において二つ以上の微粒子が使用される場合、微粒子の平均粒径は、約０．５μｍ〜約５００μｍなどの、上述の粒径のいずれでもよい。複数の微粒子の個体群は、好ましくは、５％以下又は２％以下などの、１０％以下の変動係数（平均に対する標準偏差の比率）を有する。
【０２９３】
微粒子のサイズを決定するために任意の方法を使用してもよい。適切な方法としては、フローサイトメトリーが挙げられるが、これに限定されない（例えば、Ｃｈａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．２０１１年６月；９（６）：１２１６−２４参照）。
【０２９４】
微粒子は任意の材料から形成してもよい。微粒子は、好ましくは、セラミック、ガラス、シリカ、ポリマー又は金属から形成される。ポリマーはポリヒドロキシアルカノエート、デキストラン、ポリラクチド、アガロース、セルロース、デンプン又はキトサンなどの天然ポリマー、又はポリウレタン、ポリスチレン、ポリ（塩化ビニル）、シラン又はメタクリレートなどの合成ポリマーであってもよい。適切な微粒子は、当技術分野において既知であり、市販されている。セラミック及びガラスマイクロスフェアは、３Ｍ（登録商標）から市販されている。シリカ及びポリマー微粒子は、ＥＰＲＵＩ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ＆Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  Ｃｏ．Ｌｔｄから市販されている。微粒子は、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．及びＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからも市販されている。
【０２９５】
微粒子は固体であってもよい。微粒子は中空であってもよい。微粒子はポリマー繊維から形成してもよい。
【０２９６】
微粒子は検体（例えば、ポリヌクレオチド又はポリペプチド）を抽出及び単離するために使用されるキットに由来してもよい。
【０２９７】
微粒子の表面は検体と相互作用して付着してもよい。表面は、官能化せずに、ポリヌクレオチドなどの検体と自然に相互作用する可能性がある。微粒子の表面は、通常は、検体の付着を容易にするために官能化される。適切な官能化は当技術分野において既知である。例えば、微粒子の表面は、ポリヒスチジンタグ（ヘキサヒスチジンタグ、６×Ｈｉｓタグ、Ｈｉｓ６タグ又はＨｉｓ−ｔａｇ（登録商標））、Ｎｉ−ＮＴＡ、ストレプトアビジン、ビオチン、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＧＮＡ、ＴＮＡ、又はＬＮＡなど）、カルボキシル基、第四級アミン基、チオール基、アジド基、アルキン基、ＤＩＢＯ、脂質、ＦＬＡＧ−タグ（ＦＬＡＧオクタペプチド、ポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素））（後述のもののいずれかを含む）、ペプチド、タンパク質、抗体又は抗体断片で官能化してもよい。微粒子はまた、本明細書で論じられるリンカー又は基のいずれかで官能化してもよい。
【０２９８】
微粒子は、ポリヌクレオチドに特異的に結合する分子又は基で官能化してもよい。この場合、微粒子に付着し、膜貫通孔に送達されることになるポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドと呼ばれることがある。これにより、微粒子は他のポリヌクレオチドを含む試料から標的ポリヌクレオチドを選択又は捕捉することが可能になる。分子又は基は、標的ポリヌクレオチドに優先的に又は高い親和性で結合するが、他のポリヌクレオチド又は異なるポリヌクレオチドには結合しない、又は低い親和性でのみ結合する場合、標的ポリヌクレオチドに特異的に結合する。分子又は基は、１×１０−６Ｍ以下、より好ましくは１×１０−７Ｍ以下、５×１０−８Ｍ以下、より好ましくは１×１０−８Ｍ以下、又はより好ましくは５×１０−９Ｍ以下のＫｄで結合する場合、優先的に又は高い親和性で結合する。分子又は基は、１×１０−６Ｍ以上、より好ましくは１×１０−５Ｍ以上、より好ましくは１×１０−４Ｍ以上、より好ましくは１×１０−３Ｍ以上、さらにより好ましくは１×１０−２Ｍ以上のＫｄで結合する場合、低い親和性で結合する。
【０２９９】
好ましくは、分子又は基は、他のポリヌクレオチドについてその親和性よりも大きい、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも１０００、又は少なくとも１０，０００倍などの、少なくとも１０倍の親和性で標的ポリヌクレオチドに結合する。親和性は、蛍光及び放射性同位体を利用するものなどの既知の結合アッセイを用いて測定することができる。競合結合アッセイも当該分野において既知である。ペプチド又はタンパク質とポリヌクレオチドとの間の結合強度は、Ｈｏｒｎｂｌｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．４：３１５−３１７．（２００７）に記載されているように、ナノポア力分光法を用いて測定することができる。
【０３００】
微粒子は、標的ポリヌクレオチド若しくはガイドポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズ、又は標的ポリヌクレオチド若しくはガイドポリヌクレオチドの一部若しくは領域、又はアダプターに相補的な部分又は領域を含む、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドで官能化してもよい。これにより、微粒子は他のポリヌクレオチドを含む試料から標的ポリヌクレオチドを選択又は捕捉することが可能になる。
【０３０１】
オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドに対して優先的に又は高い親和性でハイブリダイズするが、他のポリヌクレオチドに実質的にハイブリダイズしない、ハイブリダイズしない、又は低い親和性でハイブリダイズするとき、標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、他の配列のＴｍよりも、少なくとも２℃、例えば少なくとも３℃、少なくとも４℃、少なくとも５℃、少なくとも６℃、少なくとも７℃、少なくとも８℃、少なくとも９℃、又は少なくとも１０℃高い融解温度（Ｔｍ）で標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合、特異的にハイブリダイズする。より好ましくは、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、他の核酸のＴｍよりも、少なくとも２℃、例えば少なくとも３℃、少なくとも４℃、少なくとも５℃、少なくとも６℃、少なくとも７℃、少なくとも８℃、少なくとも９℃、少なくとも１０℃、少なくとも２０℃、少なくとも３０℃、又は少なくとも４０℃高いＴｍで標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする。好ましくは、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、１、２、３、４又は５以上のヌクレオチドなどの一つ以上のヌクレオチドによる標的ポリヌクレオチドと異なる配列のＴｍよりも、少なくとも２℃、例えば少なくとも３℃、少なくとも４℃、少なくとも５℃、少なくとも６℃、少なくとも７℃、少なくとも８℃、少なくとも９℃、少なくとも１０℃、少なくとも２０℃、少なくとも３０℃、又は少なくとも４０℃高いＴｍで標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする。オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、通常は、少なくとも９０℃、例えば少なくとも９２℃又は少なくとも９５℃のＴｍで標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする。Ｔｍは、ＤＮＡマイクロアレイの使用を含む既知の技術を用いて実験的に測定することができ、又はインターネット上で入手可能なものなどの公的に入手可能なＴｍ計算機を用いて計算することができる。
【０３０２】
ハイブリダイゼーションを可能にする条件は、当該技術分野において既知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  実験室マニュアル、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２章，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５））。ハイブリダイゼーションは、低ストリンジェンシー条件下、例えば３７℃の３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ及び１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝液の存在下で実施し、続いて５０℃で１×（０．１６５０Ｍ  Ｎａ＋）から２×（０．３３Ｍ  Ｎａ＋）のＳＳＣ（標準クエン酸ナトリウム）の２０洗浄を実施することができる。ハイブリダイゼーションは、中程度のストリンジェンシー条件下、例えば３７℃の４０〜４５％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ及び１％ＳＤＳの緩衝液の存在下で実施し、続いて５５℃の０．５×（０．０８２５Ｍ  Ｎａ＋）から１×（０．１６５０Ｍ  Ｎａ＋）のＳＳＣで洗浄することができる。ハイブリダイゼーションは、高ストリンジェンシー条件下、例えば３７℃の５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％のＳＤＳの緩衝液の存在下で実施し、続いて６０℃の０．１×（０．０１６５Ｍ  Ｎａ＋）のＳＳＣで洗浄することができる。
【０３０３】
オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド又はガイドポリヌクレオチドの一部又は領域に実質的に相補的な一部又は領域を含んでもよい。したがって、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの領域又は一部は、標的ポリヌクレオチド中の一部又は領域と比較し、５、１０、１５、２０、２１、２２、３０、４０又は５０ヌクレオチドの領域にわたって１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のミスマッチを有してもよい。
【０３０４】
領域の一部は、通常は、５０ヌクレオチド以下、例えば４０ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下、１０ヌクレオチド以下、又は５ヌクレオチド以下である。
【０３０５】
微粒子は、好ましくは、常磁性又は磁性である。微粒子は、好ましくは、常磁性又は超常磁性材料、又は鉄などの常磁性又は超常磁性金属を含む。任意の適切な磁性微粒子を使用してもよい。例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、及びＮＥＢから市販されている磁気ビーズを使用してもよい。いくつかの実施形態では、微粒子はニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）などの金属キレート基などの有機基が付着した磁性粒子を含む。有機成分は、例えば、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｃ−Ｏ−Ｃ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−Ｉ、−Ｓ（＝Ｏ）２−及び−Ｓ−から選択される基を含んでもよい。有機成分は、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）などの金属キレート基を含んでもよい。通常、金、鉄、ニッケル、又はコバルトなどの金属も金属キレート基に付着している。この種の磁性ビーズは、Ｈｉｓタグ付きタンパク質を捕捉するために一般的に使用されているが、本発明での使用にも適している。
【０３０６】
微粒子は、最も好ましくは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されているＨｉｓ−Ｔａｇ  Ｄｙｎａｂｅａｄ（登録商標）、ＩＢＡからのＭａｇ  Ｓｔｒｅｐビーズ、ＮＥＢからのストレプトアビジン磁性ビーズ、又はＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ又はＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅＴＭストレプトアビジンＣ１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）からの固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）ビーズ又はＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズである。
【０３０７】
ポリヌクレオチド結合タンパク質（例、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）
【０３０８】
ポリヌクレオチド結合タンパク質は、ポリヌクレオチドに結合し、かつポアを通るその動きを制御することができる任意のタンパク質であってもよい。タンパク質がポリヌクレオチドに結合するか否かを判定することは、当該技術分野において容易である。タンパク質は、通常は、ポリヌクレオチドの少なくとも一つの特性と相互作用し、それを修飾する。タンパク質は、個々のヌクレオチド又はヌクレオチドのより短い鎖、例えばジヌクレオチド又はトリヌクレオチドを形成するために、ポリヌクレオチドを切断することによってポリヌクレオチドを修飾してもよい。該部分は、ポリヌクレオチドを配向する又は特定の位置に移動させることによって、すなわちその動きを制御することによって、ポリヌクレオチドを修飾してもよい。
【０３０９】
ポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）は、好ましくは、ポリヌクレオチドハンドリング酵素に由来する。ポリヌクレオチドハンドリング酵素は、の少なくとも一つの特性と相互作用すること、かつそれを修飾することができるポリペプチドである。酵素は、個々のヌクレオチド又はヌクレオチドのより短い鎖、例えばジ−又はトリヌクレオチドを形成するために、ポリヌクレオチドを切断することによってポリヌクレオチドを修飾してもよい。酵素は、それを配向する又はそれを特定の位置に移動させることによって、ポリヌクレオチドを修飾してもよい。ポリヌクレオチドハンドリング酵素は、ポリヌクレオチドを結合し、ポアを通るその動きを制御することができる限り、酵素活性を示す必要はない。例えば、酵素を、その酵素活性を除去するために修飾してもよく、又は酵素として作用することを防ぐ条件下で使用してもよい。そのような条件は以下でより詳論される。
【０３１０】
ポリヌクレオチドハンドリング酵素は、好ましくは、核酸分解酵素に由来する。酵素の構築物に使用されるポリヌクレオチドハンドリング酵素は、より好ましくは、酵素分類（ＥＣ）群３．１．１１、３．１．１３、３．１．１４、３．１．１５、３．１．１６、３．１．２１、３．１．２２、３．１．２５、３．１．２６、３．１．２７、３．１．３０及び３．１．３１のいずれかのメンバーに由来する。酵素は、ＷＯ２０１０／０８６６０３に開示されているもののいずれかであってもよい。
【０３１１】
好ましい酵素は、ポリメラーゼ、ヘリカーゼ、トランスロカーゼ及びトポイソメラーゼ、例えばジャイレースである。ポリメラ（登録商標）ゼは、ＰｙｒｏＰｈａｇｅ（登録商標）３１７３  ＤＮＡポリメラーゼ（これはＬｕｃｉｇｅｎ（登録商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されている）、ＳＤポリメラーゼ（Ｂｉｏｒｏｎ（登録商標）から市販されている）又はそれらの変異体であってもよい。酵素は、好ましくは、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ又はその変異体である。トポイソメラーゼは、好ましくは、部分分類（ＥＣ）群５．９９．１．２及び５．９９．１．３のいずれかのメンバーである。
【０３１２】
酵素は、最も好ましくは、ヘリカーゼに由来する。ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８ヘリカーゼ、ＴｒａＩヘリカーゼ又はＴｒｗＣヘリカーゼなどのＲｅｃＤヘリカーゼ、ＸＰＤヘリカーゼ又はＤｄａヘリカーゼであっても、又はそれに由来するものであってもよい。ヘリカーゼは、Ｈｅｌ３０８  Ｍｂｕ、Ｈｅｌ３０８  Ｃｓｙ  Ｈｅｌ３０８  Ｔｇａ、Ｈｅｌ３０８  Ｍｈｕ、ＴｒａＩ  Ｅｃｏ、ＸＰＤ  Ｍｂｕ、又はそれらの変異体であっても、又はそれに由来するものであってもよい。
【０３１３】
ヘリカーゼは、ＷＯ２０１３／０５７４９５、ＷＯ２０１３／０９８５６２、ＷＯ２０１３／０９８５６１、ＷＯ２０１４／０１３２６０、ＷＯ２０１４／０１３２５９、ＷＯ２０１４／０１３２６２、及びＷＯ／２０１５／０５５９８１に開示されているヘリカーゼ、修飾ヘリカーゼ又はヘリカーゼ構築物のいずれかであってもよい。
【０３１４】
Ｄｄａヘリカーゼは、好ましくは、ＷＯ／２０１５／０５５９８１、及びＷＯ２０１６／０５５７７７に開示されている修飾のいずれかを含む。
【０３１５】
本発明に従い、任意の数のヘリカーゼを使用してもよい。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のヘリカーゼを使用してもよい。いくつかの実施形態では、異なる数のヘリカーゼを使用してもよい。上記ヘリカーゼのうちの複数の任意の組み合わせを使用してもよい。複数のヘリカーゼは、複数のＤｄａヘリカーゼであってもよい。二つ以上のヘリカーゼは、一つ以上のＤｄａヘリカーゼ及び一つ以上のＴｒｗＣヘリカーゼであってもよい。二つ以上のヘリカーゼは同一のヘリカーゼの異なる変異体であってもよい。
【０３１６】
二つ以上のヘリカーゼは、好ましくは、互いに付着している。二つ以上のヘリカーゼは、より好ましくは、互いに共有的に付着している。ヘリカーゼは任意の順序で任意の方法を用いて付着してもよい。本発明で使用される好ましいヘリカーゼ構築物は、ＷＯ２０１４／０１３２６０、ＷＯ２０１４／０１３２５９、ＷＯ２０１４／０１３２６２、及びＷＯ２０１５／０５５９８１に記載されている。
【０３１７】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド結合タンパク質は、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素である。ポリヌクレオチド巻き戻し酵素は、二本鎖ポリヌクレオチドを一本鎖に巻き戻すことができる酵素である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素は、二本鎖ＤＮＡを一本鎖に巻き戻すことができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素はヘリカーゼ活性を有する酵素である。ポリヌクレオチド巻き戻し酵素の例には、例えば、本明細書に記載のヘリカーゼが含まれる。
【０３１８】
ポリヌクレオチド結合能は、当該技術分野において既知の任意の方法を用いて測定することができる。例えば、タンパク質をポリヌクレオチドと接触させることができ、ポリヌクレオチドに結合してポリヌクレオチドに沿って移動する能力を測定することができる。タンパク質は、ポリヌクレオチドの結合を促進する修飾、及び／又は高塩濃度及び／又は室温でその活性を促進する修飾を含んでもよい。タンパク質は、ポリヌクレオチドに結合する（すなわち、ポリヌクレオチド結合能を保持する）が、ヘリカーゼとして機能しない（すなわち、移動を促進するために必要な全ての構成要素、例えばＡＴＰ及びＭｇ２＋を備えている場合、ポリペプチドに沿って移動しない）ように修飾してもよい。そのような修飾は当技術分野において既知である。例えば、ヘリカーゼにおけるＭｇ２＋結合ドメインの修飾は、通常は、ヘリカーゼとして機能しない変異体をもたらす。これらの種類の変異体は分子ブレーキとして作用してもよい。
【０３１９】
酵素はポアに共有的に付着していてもよい。任意の方法を用いて酵素をポアに共有的に結合させてもよい。
【０３２０】
鎖配列決定において、ポリヌクレオチドは印加電位とともに又はそれに対向し、ポアを通って転座する。二本鎖ポリヌクレオチドに漸進的又は進行的に作用するエキソヌクレアーゼを、印加電位下で残りの一本鎖を通過させるために、ポアのシス側、又は逆電位下でトランス側で使用することができる。同様に、二本鎖ＤＮＡを巻き戻すヘリカーゼも類似の方法で使用することができる。ポリメラーゼを使用してもよい。印加電位に対する鎖転座を必要とする配列決定用途の可能性もあるが、ＤＮＡは最初に逆電位又は非電位下で酵素によって「捕捉され」なければならない。結合後に元に戻る可能性がある中で、鎖は、シスからトランスへポアを通過し、電流の流れによって伸長した配座に保持される。一本鎖ＤＮＡエキソヌクレアーゼ又は一本鎖ＤＮＡ依存性ポリメラーゼは、印加電位に対して、直近の転座した一本鎖を、制御された段階的様式でポアを通ってトランスからシスへと引き戻すように、分子モーターとして作用することができる。
【０３２１】
本発明において、任意のヘリカーゼを使用してもよい。ヘリカーゼは、ポアに関して二つのモードで動作してもよい。まず、該方法は、好ましくは、印加電位から生じる電界でポアを通ってポリヌクレオチドを移動させるように、ヘリカーゼを用いて実施される。このモードでは、ポリヌクレオチドの５´末端が最初にポアに捕捉され、ヘリカーゼは、それが最後に膜のトランス側を通って転座するまで電界でポアを通るように、ポリヌクレオチドをポア内に移動させる。あるいは、該方法は、好ましくは、ヘリカーゼが印加電位から生じる電界に対して、ポリヌクレオチドをポアを通って移動させるように実施される。このモードでは、ポリヌクレオチドの３´末端が最初にポアに捕捉され、ヘリカーゼは、膜のシス側に戻って最終的に排出されるまで、印加された電界に対してポアから引き出されるように、ポアを通ってポリヌクレオチドを移動させる。
【０３２２】
この方法はまた、逆方向に実施してもよい。ポリヌクレオチドの３´末端が最初にポア内に捕捉されてもよく、ヘリカーゼは、それが最後に膜のトランス側を通って移行するまで、電界でポアを通るように、ポリヌクレオチドをポアに移動させてもよい。
【０３２３】
ヘリカーゼは、移動を促進するために必要な構成要素を備えてない場合、又はその移動を妨げるか若しくは妨げるように修飾されている場合、ポリヌクレオチドに結合することができ、印加電界によってポアに引き込まれる際に、ポリヌクレオチドの動きを遅くするブレーキとして作用する。不活性モードでは、ポリヌクレオチドが３´又は５´下のいずれに捕捉されるかにかかわらず、酵素がブレーキとして機能し、ポリヌクレオチドをトランス側に向かってポア内に引き込むのは印加電界である。不活性モードにあるとき、ヘリカーゼによるポリヌクレオチドの移動制御は、ラチェット、スライド及びブレーキを含むいくつかの方法で説明することができる。ヘリカーゼ活性を欠くヘリカーゼ変異体もまたこのように使用することができる。
【０３２４】
ポリヌクレオチドは、任意の順序でポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）及びポアと接触させてもよい。ポリヌクレオチドがヘリカーゼなどのポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）及びポアと接触しているとき、ポリヌクレオチドは最初にポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）と複合体を形成することが好ましい。ポアを横切って電圧が印加されると、ポリヌクレオチド／ポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）複合体は、ポアと複合体を形成し、かつポアを通るポリヌクレオチドの移動を制御する。
【０３２５】
ポリヌクレオチド結合タンパク質を使用する方法における任意のステップは、通常は、遊離ヌクレオチド又は遊離ヌクレオチド類似体及びポリヌクレオチド結合タンパク質の作用を促進する酵素補因子の存在下で実施される。遊離ヌクレオチドは上述の各ヌクレオチドのいずれかの一つ以上であってもよい。遊離ヌクレオチドには、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）、及びデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。遊離ヌクレオチドは、好ましくは、ＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ、又はｄＣＭＰから選択される。遊離ヌクレオチドは、好ましくは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）である。酵素補因子は、構築物が機能することを可能にする因子である。酵素補因子は、好ましくは、二価金属カチオンである。二価金属カチオンは、好ましくは、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、又はＣｏ２＋である。酵素補因子は、最も好ましくは、Ｍｇ２＋である。
【０３２６】
分子ブレーキは、ポリヌクレオチドに結合し、かつポアを通るポリヌクレオチドの移動を遅くする任意の化合物又は分子であってもよい。分子ブレーキは上記に論じられるもののいずれかであってもよい。分子ブレーキは、好ましくは、ポリヌクレオチドに結合する化合物を含む。化合物は、好ましくは、大員環化合物である。適切な大員環化合物には、シクロデキストリン、カリックスアレーン、環状ペプチド、クラウンエーテル、ククルビツリル、ピララレン、それらの誘導体又はそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。シクロデキストリン又はその誘導体は、Ｅｌｉｓｅｅｖ，Ａ．  Ｖ．，及びＳｃｈｎｅｉｄｅｒ，  Ｈ−Ｊ．（１９９４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６、６０８１〜６０８８．に開示されているもののいずれかであってもよい。シクロデキストリンは、より好ましくは、ヘプタキス−６−アミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ７−βＣＤ）、６−モノデオキシ−６−モノアミノ−β−シクロデキストリン（ａｍ１−βＣＤ）、又はヘプタキス−（６−デオキシ−６−グアニジノ）−シクロデキストリン（ｇｕ７−βＣＤ）である。
【０３２７】
膜
【０３２８】
本明細書に記載の様々な態様に従って、任意の膜を使用してもよい。適切な膜は当技術分野において既知である。膜は、好ましくは、両親媒性層又は固体層である。
【０３２９】
両親媒性層は、親水性と親油性の両方の特性を有するリン脂質などの両親媒性分子から形成される層である。両親媒性分子は合成又は天然であってもよい。天然に存在しない両親媒性物質及び単分子層を形成する両親媒性物質は、当該分野において既知であり、例えば、ブロックコポリマーを含む（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００９，２５，１０４４７−１０４５０）。ブロックコポリマーは、二つ以上のモノマーサブユニットがともに重合されて単一高分子鎖を形成するポリマー材料である。ブロックコポリマーは、通常は、各モノマーサブユニットによって寄与される特性を有する。しかしながら、ブロックコポリマーは、個々のサブユニットから形成されたポリマーを保有していないという一意の性質を有し得る。ブロックコポリマーは、一方のモノマーサブユニットが疎水性（すなわち、親油性）であり、他方のサブユニットが水性媒体中で親水性であるように操作することができる。この場合、ブロックコポリマーは両親媒性を有してもよく、生体膜を模倣する構造を形成してもよい。ブロックコポリマーはジブロック（二つのモノマーサブユニットからなる）であってもよいが、両親媒性物質として作用するより複雑な配置を形成するように、二つ以上のモノマーサブユニットから構築してもよい。コポリマーはトリブロック、テトラブロック又はペンタブロックコポリマーであってもよい。膜は、好ましくは、トリブロックコポリマー膜である。
【０３３０】
古細菌二極性テトラエーテル脂質は、脂質が単分子層膜を形成するように構築される天然型脂質である。これらの脂質は一般的に過酷な生物学的環境で生き残る極限微生物、好熱菌、好塩菌、及び好酸菌に見られる。それらの安定性は、最終的な二分子層の融合した性質に由来すると考えられる。一般的なモチーフ親水性−疎水性−親水性を有するトリブロックポリマーを生成することによって、これらの生物学的実体を模倣するブロックコポリマー材料を構築することは簡単である。この材料は、脂質二分子層と同様に挙動し、ベシクルから層状膜までの範囲の相挙動を包含する単量体膜を形成してもよい。これらのトリブロックコポリマーから形成された膜は、生体脂質膜に対していくつかの利点を有する。トリブロックコポリマーは合成されているので、膜を形成するためかつポア及び他のタンパク質と相互作用するために必要な正しい鎖長及び特性を提供するように、慎重に制御することができる。
【０３３１】
ブロックコポリマーはまた、脂質サブ材料として分類されないサブユニットから構築してもよい。例えば、疎水性ポリマーはシロキサン又は他の非炭化水素系モノマーから生成してもよい。ブロックコポリマーの親水性サブセクションはまた、低いタンパク質結合特性も保有することができ、それは生の生体試料にさらされた際に高度な耐性である膜の生成を可能にする。この頭部基単位はまた、非古典的な脂質頭部基に由来してもよい。
【０３３２】
トリブロックコポリマー膜はまた、生体脂質膜と比較して増大した機械的安定性及び環境安定性、例えば、はるかに高い動作温度又はｐＨ範囲を有する。ブロックコポリマーの合成性質は、幅広い用途向けにポリマーベースの膜をカスタマイズするためのプラットフォームを提供する。
【０３３３】
膜は、最も好ましくは、ＷＯ２０１４／０６４４４３、又はＷＯ２０１４／０６４４４４に開示されている膜の一つである。
【０３３４】
両親媒性分子はポリヌクレオチドの結合を促進するために化学修飾又は官能化してもよい。
【０３３５】
両親媒性層は、単分子層又は二分子層であってもよい。両親媒性層は、通常は、平面状である。両親媒性層は湾曲していてもよい。両親媒性層は支持されていてもよい。両親媒性層は凹面であってもよい。両親媒性層は両親媒性層の周辺領域（ピラーに付着している）が両親媒性層領域よりも高くなるように、隆起ピラーから吊り下げてもよい。これにより、上記のように微粒子が膜に沿って進み、移動する、スライドする、又は転動することが可能になる。
【０３３６】
両親媒性膜は、通常は、自然に移動可能であり、本質的に、脂質拡散速度が約１０−８ｃｍ  ｓ−１の二次元流体として作用する。これは、ポア及び結合したポリヌクレオチドが、通常は、両親媒性膜内で移動できることを意味する。
【０３３７】
膜は脂質二分子層であってもよい。脂質二分子層は細胞膜のモデルであり、一連の実験研究のための優れたプラットフォームとして機能する。例えば、脂質二分子層は、シングルチャネル記録による膜タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究に使用することができる。あるいは、脂質二分子層は、幅広い物質の存在を検出するためのバイオセンサーとして使用することができる。この脂質二分子層は任意の脂質二分子層であってもよい。適切な脂質二分子層としては、平面脂質二分子層、支持二分子層、又はリポソームが挙げられるが、これらに限定されない。脂質二分子層は、好ましくは、平面脂質二分子層である。適切な脂質二分子層はＷＯ２００８／１０２１２１、ＷＯ２００９／０７７７３４、及びＷＯ２００６／１００４８４に開示されている。
【０３３８】
脂質二分子層を形成するための方法は当該技術分野において既知である。脂質二分子層は、一般に、Ｍｏｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｍｕｅｌｌｅｒ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１９７２；６９：３５６１−３５６６）の方法で形成される。該方法において、脂質一分子層はその界面に対して垂直な開口部のいずれかの側を通過して水溶液／空気界面上に担持される。脂質は通常、最初にそれを有機溶媒に溶解し、次に少量の溶媒を開口部の両側にある水溶液の界面上で蒸発させることによって、電解質水溶液の表面に添加される。有機溶媒が蒸発すると、開口部の両側の溶液／空気界面は二分子層が形成されるまで開口部を通過して物理的に上下に移動する。平面脂質二分子層は、膜の開口部を横切って又は陥凹部への開口部を横切って形成されてもよい。
【０３３９】
Ｍｏｎｔａｌ＆Ｍｕｅｌｌｅｒの方法は、タンパク質ポア挿入に適した良質の脂質二分子層を形成するための費用対効果が高く、比較的簡単な方法であるので、人気がある。二分子層形成の他の一般的な方法には、先端浸漬（ｔｉｐ−ｄｉｐｐｉｎｇ）、二分子層の塗装（ｐａｉｎｔｉｎｇ  ｂｉｌａｙｅｒｓ）、及びリポソーム二分子層のパッチクランプが含まれる。
【０３４０】
先端浸漬二分子層形成は、脂質の単分子層を担持している試験溶液の表面上に開口面（例えば、ピペットチップ）を接触させることを伴う。ここでも、脂質一分子層は、有機溶媒中に溶解した少量の脂質を溶液表面で蒸発させることによって最初に溶液／空気界面で生成される。次いで、二分子層はラングミュア−シェーファー法によって形成され、溶液表面に対して開口部を移動させるための機械的自動化を必要とする。
【０３４１】
二分子層の塗装については、有機溶媒中に溶解した少量の脂質を試験水溶液に浸されている開口部に直接適用する。脂質溶液は絵筆又は同等物を用いて開口部の上に薄く広げられる。溶媒を薄くすることは脂質二分子層の形成につながる。しかしながら、二分子層から溶媒を完全に除去することは困難であり、その結果、この方法によって形成された二分子層は安定性が低く、電気化学的測定中にノイズを生じやすい。
【０３４２】
パッチクランプは、一般的に、生体細胞膜の研究に使用されている。細胞膜は吸引によりピペットの端部に留められ、膜のパッチが開口部の上に付着するようになる。該方法は、リポソームを留めてから破裂させて脂質二分子層をピペットの開口部を覆って密封することにより、脂質二分子層を生成するために採用されてきた。該方法は、安定している巨大で単分子層のリポソーム、及びガラス表面を有する材料に小さな開口部を作製することを必要とする。
【０３４３】
リポソームは超音波処理、押出、又はＭｏｚａｆａｒｉ法によって形成することができる（Ｃｏｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）  Ｍｉｃｒｏｎ  ３８：８４１−８４７）。
【０３４４】
好ましい実施形態では、脂質二分子層はＷＯ２００９／０７７７３４に記載のように形成される。この方法では有利に、脂質二分子層は乾燥脂質から形成される。最も好ましい実施形態では、脂質二分子層は、ＷＯ２００９／０７７７３４に記載されるように、開口部を横切って形成される。
【０３４５】
脂質二分子層は脂質の二つの対向する層から形成される。二つの脂質層は、それらの疎水性尾部基が互いに向き合って疎水性内部を形成するように配置される。脂質の親水性ヘッド基は、二分子層の両側で水性環境に向かって外側に向いている。二分子層は、液体無秩序相（流体層状）、液体秩序相、固体秩序相（ラメラゲル相、櫛型ゲル相）、及び平面二分子層結晶（ラメラサブゲル相、ラメラ結晶相）を含むがこれらに限定されない、いくつかの脂質相に存在してもよい。
【０３４６】
脂質二分子層を形成する任意の脂質組成物を使用してもよい。脂質組成物は、表面電荷、膜タンパク質を支持する能力、充填密度又は機械的性質などの必要な性質を有する脂質二分子層が形成されるように選択される。脂質組成物は一つ以上の異なる脂質を含んでもよい。例えば、脂質組成物は１００個までの脂質を含んでもよい。脂質組成物は、好ましくは、１〜１０個の脂質を含む。脂質組成物は、天然型脂質及び／又は人工脂質を含んでもよい。
【０３４７】
脂質は、通常は、ヘッド基、界面部分、及び同一でも異なってもよい二つの疎水性尾部基を含む。適切なヘッド基には、ジアシルグリセリド（ＤＧ）及びセラミド（ＣＭ）などの中性頭部基、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）及びスフィンゴミエリン（ＳＭ）などの双性イオン頭部基、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）などの負に帯電した頭部基、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）及びカルジオリピン（ＣＡ）、並びにトリメチルアンモニウム−プロパン（ＴＡＰ）などの正に帯電した頭部基が含まれるが、これらに限定されない。適切な界面部分には、グリセロール系又はセラミド系部分などの天然に存在する界面部分が含まれるが、これらに限定されない。適切な疎水性尾部基には、ラウリン酸（ｎ−ドデカノール酸）、ミリスチン酸（ｎ−テトラデコン酸）、パルミチン酸（ｎ−ヘキサデカン酸）、ステアリン酸（ｎ−オクタデカン酸）、アラキジン酸（ｎ−エイコサン酸）などの飽和炭化水素鎖、オレイン酸（シス−９−オクタデカン）などの不飽和炭化水素鎖、及びフィタノイルなどの分岐炭化水素鎖が含まれるが、これらに限定されない。不飽和炭化水素鎖中の鎖の長さ、並びに二重結合の位置及び数は変更することができる。分岐炭化水素鎖中の鎖の長さ並びにメチル基などの分岐の位置及び数は変更することができる。疎水性尾部基は、エーテル又はエステルとして界面部分に結合することができる。脂質はミコール酸であってもよい。
【０３４８】
脂質は化学的に修飾することもできる。脂質の頭部基又は尾部基は化学的に修飾してもよい。頭部基が化学的に修飾されている適切な脂質には、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］などのＰＥＧ修飾脂質、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［ビオチニル（ポリエチレングリコール）２０００］などの官能化ＰＥＧ脂質、及び１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（スクシニル）かつ１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（ビオチニル）などの共役のために修飾された脂質が含まれるが、これらに限定されない。尾部基が化学的に修飾されている適切な脂質には、１，２−ビス（１０，１２−トリコサジイノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンなどの重合性脂質、１−パルミトイル−２−（１６−フルオロパルミトイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンなどのフッ素化脂質、１，２−ジパルミトイル−Ｄ６２−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンなどの重水素化脂質、及び１，２−ジ−Ｏ−フィタニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンなどのエーテル結合脂質が含まれるが、これらに限定されない。脂質はポリヌクレオチドの結合を促進するために化学的に修飾又は官能化されてもよい。
【０３４９】
両親媒性層、例えば、脂質組成物は、通常は、層の特性に影響を与える一つ以上の添加剤を含む。適切な添加剤には、パルミチン酸、ミリスチン酸、オレイン酸などの脂肪酸、パルミチンアルコール、ミリスチンアルコール及びオレインアルコールなどの脂肪アルコール、コレステロール、エルゴステロール、ラノステロール、シトステロール及びスチグマステロールなどのステロール、１−アシル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンなどのリゾリン脂質、及びセラミドが含まれるが、これらに限定されない。
【０３５０】
固体層は、マイクロ電子材料、Ｓｉ３Ｎ４、Ａ１２Ｏ３及びＳｉＯなどの絶縁材料、ポリアミドなどの有機及び無機ポリマー、テフロン（登録商標）などのプラスチック又は二成分付加硬化型シリコーンゴムなどのエラストマー、及びガラスを含むがこれらに限定されない有機材料及び無機材料の両方から形成することができる。固体層はグラフェンから形成してもよい。適切なグラフェン層は、ＷＯ２００９／０３５６４７に開示されている。Ｙｕｓｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１；６：２５３−２６０、及び米国特許出願第２０１３／００４８４９９号は、微粒子を使用しない固体層中の膜貫通孔へのタンパク質の送達を記載している。本発明の方法は、これらの文献に開示されている方法での送達を改善するために使用してもよい。
【０３５１】
該方法は、通常は、（ｉ）ポアを含む人工両親媒性層、（ｉｉ）ポアを含む単離された天然に存在する脂質二分子層、又は（ｉｉｉ）ポアが内部に挿入された細胞を用いて実施される。該方法は、通常は、人工トリブロックコポリマー層などの人工両親媒性層を用いて実施される。層は、ポアに加えて、他の膜貫通タンパク質及び／又は膜内タンパク質、並びに他の分子を含んでもよい。適切な装置及び条件は以下に詳論される。本発明の方法は、通常は、インビトロで実施される。
【０３５２】
本発明の方法に従ってポリヌクレオチドが送達される膜は液体に含まれている。液体は、膜を「濡れた」状態に保ち、乾燥するのを止める。液体は、通常は、水溶液である。水溶液は、通常は、水と同一の密度を有する。水溶液の密度は、通常は、約１ｇ／ｃｍ３である。溶液の密度は、溶液の温度及び正確な組成に応じて変わる。水溶液は、通常は、約０．９７〜約１．０３ｇ／ｃｍ３の密度を有する。
【０３５３】
膜は、通常は、二つの体積の水溶液を分離する。膜は、体積間の電流の流れに抵抗する。膜中に挿入された膜貫通孔は、膜をわたるイオンの通過を選択的に可能にし、これは二つの体積の水溶液中の電極によって検出された電気信号として記録することができる。標的ポリヌクレオチドの存在は、イオンの流れを調節し、得られる電気信号の変動を観察することによって検出される。
【０３５４】
アレイ
【０３５５】
膜は、通常は、膜のアレイの一部であって、各膜は好ましくは膜貫通孔を含む。したがって、本発明は膜のアレイを用いて標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。
【０３５６】
膜は、アレイが試験試料から並行して測定する多くの個々のセンサーと同等であるように、それぞれ独自の電極を用いて個別にアドレスされる、電気的に絶縁した膜のアレイを有する装置に含まれてもよい。膜は比較的高密度に充填されていてもよく、それにより、所定量の試験試料に多数の膜を使用することを可能にする。膜及び装置の適切なアレイは、当該技術分野、例えばＷＯ２００９／０７７７３４、及びＷＯ２０１２／０４２２２６に記載されている。ＷＯ２００９／０７７７３４は、例えば、マイクロウェル開口部のアレイを横切って形成された複数の個別にアドレス可能な脂質二分子層を開示し、各マイクロウェルは脂質二分子層と接触する電極及び水性媒体を含む。
【０３５７】
装置は、通常は、膜及び膜貫通孔があらかじめ挿入されている「準備完了」状態でエンドユーザーに提供される。「準備完了」状態で提供される典型的な装置は、各膜が膜貫通孔を含み、液体を含むウェルを横切って提供される、両親媒性膜のアレイを含む。そのような装置及びその製造方法はＷＯ２０１４／０６４４４３に開示されている。解析対象の試験液は両親媒性膜の上面に塗布される。
【０３５８】
ただし、装置を「準備完了」状態で提供するには、性能の損失又はセンサーの損傷をもたらすおそれがあるため、センサーが乾燥しない、すなわち、両親媒性膜を通過することによって液体がウェルから失われないように注意する必要があるという追加の考慮事項がある。センサーの乾燥の問題に対処するための一つの解決策は、膜の表面からの蒸発を最小限に抑え、膜のいずれかの側に提供される液体が浸透効果を低減するために同一のイオン強度を有するように、両親媒性膜の表面上に緩衝液を有する装置を提供することである。使用時に、緩衝液を両親媒性膜の表面から除去してもよい、そして解析対象の試験液を表面に接触するように導入する。
【０３５９】
いくつかの用途は、膜を横切る電気的特性、例えばイオン電流の流れの測定を用いてもよい。そのような測定を提供するために、装置は、極性媒体を含む容積と電気的に接触する各区画内の各電極をさらに含んでもよい。他の種類の測定、例えば、蛍光測定及びＦＥＴ測定などの光学的測定を実施してもよい。光学的測定及び電気測定を同時に実施してもよい（Ｈｅｒｏｎ  ＡＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２００９；１３１（５）：１６５２−３）。
【０３６０】
装置は共通電極をさらに含んでもよい。装置は、共通電極と各区画内の各電極との間に接続された電気回路をさらに含んでもよい。電気回路は電気測定を行うように配置されている。そのような電気測定は、膜で起こるプロセス又は膜を通って起こるプロセスに依存してもよい。
【０３６１】
装置はナノポアアレイの測定を行うためのＦＥＴアレイを含んでもよい。
【０３６２】
膜貫通ポア
【０３６３】
膜貫通ポアは膜をある程度横切る構造である。それは印加電位によって駆動される水和イオンが膜を横切って流れる又は膜内に流れることを可能にする。膜貫通孔は、通常は、水和イオンが膜の片側から膜の反対側へ流れるように膜全体を横切る。しかしながら、膜貫通孔は膜を横切る必要はない。一方の末端は閉じていてもよい。例えば、ポアは、それに沿って又はその中に水和イオンが流れてもよい膜中のウェル、ギャップ、チャネル、トレンチ、又はスリットであってもよい。
【０３６４】
本発明では任意の膜貫通孔を使用してもよい。ポアは生物学的又は人工的であってもよい。適切なポアには、タンパク質ポア、ポリヌクレオチドポア、及び固体ポアが含まれるが、これらに限定されない。ポアはＤＮＡ折り紙ポアであってもよい（Ｌａｎｇｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２；３３８：９３２−９３６）。ポアはモータータンパク質ナノポア、例えば、二本鎖ポリヌクレオチドの転座を可能にするナノポアであってもよい。いくつかの実施形態では、モータータンパク質ナノポア、二本鎖ポリヌクレオチドを巻き戻すことができる。例示的なモータータンパク質ナノポアは、例えば、Ｗｅｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、「膜適合型φ２９モータータンパク質ナノポアを通る二本鎖ＤＮＡの転座」Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ、４（２００９）、７６５〜７７２頁に記載されているように、φ２９モータータンパク質ナノポアを含むが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｆｅｎｇら「ナノポアベースの第４世代ＤＮＡ配列決定技術」Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ＆Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（２０１５）第１３巻、第１号、４〜１６頁に記載又は参照されている任意のナノポアは、本明細書に記載の様々な態様に使用することができる。
【０３６５】
膜貫通孔は、好ましくは、膜貫通タンパク質ポアである。膜貫通タンパク質ポアは、ポリヌクレオチドなどの水和イオンが膜の片側から反対側へ流れることを可能にするポリペプチド又はポリペプチドの集合体である。本発明では、膜貫通タンパク質ポアは、印加電位によって駆動される水和イオンが膜の片側から反対側へ流れることを可能にするポアを形成することができる。膜貫通タンパク質ポアは、好ましくは、ポリヌクレオチドがトリブロックコポリマー膜などの膜の片側から反対側へ流れることを可能にする。膜貫通タンパク質ポアは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどのポリヌクレオチドがポアを通って移動することを可能にする。
【０３６６】
膜貫通タンパク質ポアはモノマー又はオリゴマーであってもよい。ポアは、好ましくは、少なくとも六つ、少なくとも七つ、少なくとも八つ、少なくとも九つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、又は少なくとも１６個のサブユニットなどのいくつかの繰り返しサブユニットからなる。ポアは、好ましくは、六量体、七量体、八量体又は九量体のポアである。ポアは、ホモオリゴマー又はヘテロオリゴマーであってもよい。
【０３６７】
膜貫通タンパク質ポアは、通常は、イオンが流れてもよいバレル又はチャネルを含む。ポアのサブユニットは、通常は、中心軸を取り囲み、鎖を膜貫通βバレル若しくはチャネル又は膜貫通α−ヘリックスバンドル若しくはチャネルに寄与する。
【０３６８】
膜貫通タンパク質ポアのバレル又はチャネルは、通常は、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド又は核酸との相互作用を促進するアミノ酸を含む。これらのアミノ酸は、好ましくは、バレル又はチャネルの狭窄部の近傍に位置する。膜貫通タンパク質ポアは、通常は、アルギニン、リジン、若しくはヒスチジンなどの一つ以上の正電荷アミノ酸、又はチロシン若しくはトリプトファンなどの芳香族アミノ酸を含む。これらのアミノ酸は、通常は、ポアとヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又は核酸との間の相互作用を促進する。
【０３６９】
本発明に従って使用するための膜貫通タンパク質ポアは、β−バレルポア又はα−ヘリックスバンドルポアに由来することができる。β−バレルポアは、β−鎖から形成されるバレル又はチャネルを含む。適切なβ−バレルポアとしては、α−ヘモリシン、炭疽菌毒素、及びロイコシジンなどのβ−毒素、並びにＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ  ポリン（Ｍｓｐ）、例えばＭｓｐＡ、ＭｓｐＢ、ＭｓｐＣ、又はＭｓｐＤ、ＣｓｇＧ、外膜ポリンＦ（ＯｍｐＦ）、外膜ポリンＧ（ＯｍｐＧ）、外膜ホスホリパーゼＡ及びＮｅｉｓｓｅｒｉａオートトランスポーターリポタンパク質（ＮａｌＰ）などの細菌の外膜タンパク質／ポリン、並びにリセニンなどの他のポアが挙げられるが、これらに限定されない。α−ヘリックスバンドルポアは、α−ヘリックスから形成されるバレル又はチャネルを含む。適切なα−ヘリックスバンドルポアは、ＷＺＡ及びＣｌｙＡ毒素などの内膜タンパク質及びα外膜タンパク質を含むが、これらに限定されない。
【０３７０】
膜貫通孔は、Ｍｓｐ、α−溶血毒（α−ＨＬ）、リセニン、ＣｓｇＧ、ＣｌｙＡ、Ｓｐ１、及び溶血性タンパク質フラガセトキシンＣ（ＦｒａＣ）に由来しても、又はそれらに基づいてもよい。膜貫通タンパク質ポアは、好ましくはＣｓｇＧ、より好ましくは大腸菌Ｓｔｒ．Ｋ−１２亜種ＭＣ４１００からのＣｓｇＧに由来する。ＣｓｇＧ由来の適切なポアは、ＷＯ２０１６／０３４５９１に開示されている。膜貫通孔はリセニンに由来してもよい。リセニン由来の適切なポアは、ＷＯ２０１３／１５３３５９に開示されている。
【０３７１】
野生型α溶血毒ポアは、七つの同一のモノマー又はサブユニット（すなわち、七量体である）からなる。α−溶血毒−ＮＮの一つのモノマー又はサブユニットの配列は、例えば、ＷＯ２０１６／０５９３７５に開示されている。
【０３７２】
膜貫通タンパク質ポアは、好ましくはＭｓｐ、より好ましくはＭｓｐＡに由来する。ＭｓｐＡ由来の適切なポアは、ＷＯ２０１２／１０７７７８に開示されている。
【０３７３】
膜貫通タンパク質ポアなどの本明細書に記載のタンパク質はいずれも、例えば、ヒスチジン残基（ｈｉｓタグ）、アスパラギン酸残基（ａｓｐタグ）、ストレプトアビジンタグ、フラッグタグ、ＳＵＭＯタグ、ＧＳＴタグ、若しくはＭＢＰタグの付加によって、又はポリペプチドがそのような配列を天然に含まない場合、細胞からのそれらの分泌を促進するための信号配列の付加によって、同定又は精製を補助するために修飾してもよい。遺伝子タグを導入する代わりの方法は、ポア又は構築物上の天然位置又は操作位置上にタグを化学的に反応させることである。この一つの例は、ゲルシフト試薬をポアの外側に操作されたシステインに反応させることである。これは、溶血毒ヘテロオリゴマーを分離するための方法として実証されている（Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．１９９７年７月．４（７）：４９７−５０５）。
【０３７４】
ポアは、リピーリング標識で標識付けすることができる。リピーリング標識は、ポアを検出することを可能にする任意の適切な標識であってもよい。適切な標識としては、蛍光分子、放射性同位体、例えば１２５Ｉ、３５Ｓ、酵素、抗体、抗原、ポリヌクレオチド、及びビオチンなどのリガンドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７５】
膜貫通タンパク質ポアなどの本明細書に記載のタンパク質はいずれも、合成的に又は組み換え手段によって生成してもよい。例えば、ポアは、インビトロ翻訳及び転写（ＩＶＴＴ）によって合成してもよい。ポアのアミノ酸配列は、非自然発生のアミノ酸を含む、又はタンパク質の安定性を高めるために修飾してもよい。タンパク質が合成手段によって生成される場合、そのようなアミノ酸は生成中に導入してもよい。ポアはまた、合成生成又は組換え生成のいずれかの後に変更してもよい
【０３７６】
膜貫通タンパク質ポアなどの本明細書に記載のタンパク質はいずれも、当該技術分野において既知の標準的な方法を用いて生成することができる。ポア又は構築物をコードするポリヌクレオチド配列は、当該技術分野における標準的な方法を用いて誘導及び複製してもよい。ポア又は構築物をコードするポリヌクレオチド配列は、当該技術分野における標準的な方法を用いて細菌宿主細胞において発現させてもよい。ポアは、組み換え発現ベクターからのポリペプチドのｉｎ  ｓｉｔｕ発現によって細胞中に生成してもよい。発現ベクターは、ポリペプチドの発現を制御するために場合により誘導性プロモーターを担持する。これらの方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｄ．（２００１）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載されている。
【０３７７】
ポアは、タンパク質生成有機体からの任意のタンパク質液体クロマトグラフィーシステムによる精製後に、又は組み換え発現後に大規模に生成されてもよい。典型的なタンパク質液体クロマトグラフィーシステムには、ＦＰＬＣ、ＡＫＴＡシステム、Ｂｉｏ−Ｃａｄシステム、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＢｉｏＬｏｇｉｃシステム、及びＧｉｌｓｏｎ  ＨＰＬＣシステムが含まれる。
【０３７８】
イオン流の測定
【０３７９】
膜貫通孔を通るイオン流は、電気測定及び／又は光学的測定を用いて監視されてもよい。
【０３８０】
電気測定は、電流測定、インピーダンス測定、トンネル効果測定、又は電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）測定であってもよい。
【０３８１】
ポリペプチドがポアを通って転座するときに膜貫通孔を通るイオン流の変化は、電流、抵抗又は光学特性の変化として検出してもよい。測定された効果は、膜貫通孔を横切る電子のトンネル効果であり得る。測定された効果は、ポリヌクレオチドと膜貫通孔との相互作用による電位の変化であり得る。ここで、効果は、ＦＥＴ測定における局所電位センサーを用いて監視される。
【０３８２】
様々な異なる種類の測定を行ってもよい。これは電気測定及び光学的測定を含むが、これらに限定されない。蛍光の測定を含む適切な光学的方法はＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００９，１３１  １６５２−１６５３によって開示されている。利用可能な電気測定は以下を含む：電流測定、インピーダンス測定、トンネル効果測定（Ｉｖａｎｏｖ  ＡＰ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２０１１年１月１２日；１１（１）：２７９−８５）、及びＦＥＴ測定（国際出願第ＷＯ２００５／１２４８８８号）。光学的測定は電気測定と組み合わせてもよい（Ｓｏｎｉ  ＧＶ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｖ  Ｓｃｉ  Ｉｎｓｔｒｕｍ．２０１０年１月；８１（１）：０１４３０１）。測定はポアを通過するイオン電流の測定などの膜貫通電流測定であってもよい。
【０３８３】
電気測定は標準的な単一チャンネル記録を用いて行ってもよい。
【０３８４】
電気測定は、Ｓｔｏｄｄａｒｔ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，１２；１０６（１９）：７７０２−７、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ＫＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２０１０年１３２（５０）：１７９６１−７２、及び国際出願第ＷＯ２０００／２８３１２号に記載されているような標準的な単一チャネル記録装置を用いて行ってもよい。あるいは、例えば、ＷＯ２００９／０７７７３４及びＷＯ２０１１／０６７５５９に記載されているようなマルチチャネルシステムを用いて電気測定を行ってもよい。
【０３８５】
該方法は、好ましくは、膜を横切って電位が印加される状態で実施される。印加電位は電圧電位であってもよい。あるいは、印加電位は化学的電位であってもよい。いくつかの実施形態では、印加電位は浸透圧の不均衡によって引き起こされてもよい。この例は、両親媒性層などの膜を横切る塩勾配を使用することである。塩勾配は、Ｈｏｌｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２００７年７月１１日；１２９（２７）：８６５０−５に開示されている。いくつかの実例では、ポリヌクレオチドの配列を推定又は判定するために、ポリヌクレオチドがポアに対して移動するときにポアを通過する電流を使用する。
【０３８６】
ポリヌクレオチドの特徴付け
【０３８７】
本明細書に記載の様々な態様のいくつかの実施形態では、方法は標的ポリヌクレオチドをさらに特徴付けることを含んでもよい。標的ポリヌクレオチドがポアと接触するとき、標的ポリヌクレオチドの一つ以上の特徴を示す一つ以上の測定は、ポリヌクレオチドがポアに対して転座する際に行われる。
【０３８８】
該方法は、ポリヌクレオチドが修飾されているか否かを決定することに関与してもよい。いかなる修飾の有無を測定してもよい。該方法は、好ましくは、メチル化によって、酸化によって、損傷によって、一つ以上のタンパク質、又は一つ以上の標識、タグ、若しくはスペーサーでポリヌクレオチドが修飾されているか否かを判定することを含む。特異的修飾は、ポアとの特異的相互作用をもたらすことになり、それは下記の方法を用いて測定することができる。例えば、メチルシトシンを、各ヌクレオチドとの相互作用中にポアを通るイオン流に基づいて、シトシンと区別してもよい。
【０３８９】
装置
【０３９０】
該方法はポアが膜中にある膜／ポアシステムを調査するのに適した任意の装置を用いて実施してもよい。該方法は膜貫通孔センシングに適した任意の装置を用いて実施してもよい。例えば、装置は水溶液を含むチャンバ、及びチャンバを二つの部分に分ける障壁を備える。障壁は、通常は、ポアを含む膜が形成される開口部を有する。あるいは、障壁がポアが存在する膜を形成する。
【０３９１】
該方法は、ＷＯ２００８／１０２１２０に記載されている装置を用いて実施してもよい。
【０３９２】
様々な異なる種類の測定を行ってもよい。これは電気測定及び光学的測定を含むが、これらに限定されない。蛍光測定を含む適切な光学的方法は、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００９，１３１  １６５２−１６５３によって開示されている。利用可能な電気測定は以下を含む：電流測定、インピーダンス測定、トンネル効果測定（Ｉｖａｎｏｖ  ＡＰ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２０１１年１月１２日；１１（１）：２７９−８５）、及びＦＥＴ測定（国際出願第ＷＯ２００５／１２４８８８号）。光学的測定を電気測定と組み合わせてもよい（Ｓｏｎｉ  ＧＶ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｖ  Ｓｃｉ  Ｉｎｓｔｒｕｍ．２０１０年１月；８１（１）：０１４３０１）。測定はポアを通過するイオン電流の測定などの膜貫通電流測定であってもよい。
【０３９３】
電気測定はＳｔｏｄｄａｒｔ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，１２；１０６（１９）：７７０２−７、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ＫＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２０１０；１３２（５０）：１７９６１−７２、及び国際出願第ＷＯ２０００／２８３１２号に記載されているように、標準シングルチャンネル記録装置を用いて行ってもよい。任意選択で、電気測定を、例えば、国際出願第ＷＯ２００９／０７７７３４号、及び国際出願第ＷＯ２０１１／０６７５５９号に記載のマルチチャネルシステムを用いて実行してもよい。
【０３９４】
該方法は、好ましくは、膜を横切って電位が印加される状態で実施される。印加電位は電圧電位であってもよい。あるいは、印加電位は化学的電位であってもよい。この例は両親媒性層などの膜を横切る塩勾配を使用することである。塩勾配は、Ｈｏｌｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２００７年７月１１日；１２９（２７）：８６５０−５に開示されている。いくつかの実例では、ポリヌクレオチドの配列を推定又は判定するために、ポリヌクレオチドがポアに対して移動するときにポアを通過する電流を使用する。
【０３９５】
該方法は、ポリヌクレオチドがポアに対して移動するときにポアを通過する電流の測定に関与してもよい。したがって、装置はまた、電位を印加し、膜及びポアを横切って電気信号を測定することができる電気回路を含んでもよい。該方法は、パッチクランプ又は電圧クランプを用いて実施してもよい。該方法は、好ましくは、電圧クランプの使用を含む。
【０３９６】
本発明の方法は、ポリヌクレオチドがポアに対して移動するときにポアを通過する電流を測定に関与してもよい。膜貫通タンパク質ポアを通るイオン電流を測定するために適切な条件は、当該技術分野において既知であり、実施例に開示されている。該方法は、通常は、膜及びポアを横切って電圧が印加される状態で実施される。使用される電圧は、通常は、＋４Ｖ〜−４Ｖ、＋３Ｖ〜−３Ｖ、又は＋２Ｖ〜−２Ｖなどの、＋５Ｖ〜−５Ｖである。使用される電圧は、通常は、−６００  ｍＶ〜＋６００ｍＶ、又は−４００ｍＶ〜＋４００ｍＶである。使用される電圧は、好ましくは、−４００ｍＶ、−３００ｍＶ、−２００ｍＶ、−１５０ｍＶ、−１００ｍＶ、−５０ｍＶ、−２０ｍＶ、及び０ｍＶから選択される下限と、＋１０ｍＶ、＋２０ｍＶ、＋５０ｍＶ、＋１００ｍＶ、＋１５０ｍＶ、＋２００ｍＶ、＋３００ｍＶ、及び＋４００ｍＶから独立して選択される上限とを有する範囲内にある。使用される電圧は、より好ましくは１００ｍＶ〜２４０ｍＶの範囲、最も好ましくは１２０ｍＶ〜２２０ｍＶの範囲である。増加された印加電位を用いることにより、ポアごとに異なるヌクレオチド間の識別性を高めることが可能である。
【０３９７】
該方法は、通常は、金属塩、例えばアルカリ金属塩、ハロゲン塩、例えばアルカリ金属塩化物塩などの塩化物塩のような任意の電荷担体の存在下で実施される。電荷担体は、イオン性液体又は有機塩、例えば、塩化テトラメチルアンモニウム、塩化トリメチルフェニルアンモニウム、塩化フェニルトリメチルアンモニウム、又は１−エチル−３−メチルイミダゾリウムクロリドを含んでもよい。上述の例示的な装置では、塩はチャンバ内の水溶液中に存在する。通常は、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）、又はフェロシアン化カリウムとフェリシアン化カリウムとの混合物を使用する。ＫＣｌ、ＮａＣｌ、及びフェロシアン化カリウムとフェリシアン化カリウムとの混合物が好ましい。電荷担体は膜を横切って不斉であってもよい。例えば、電荷担体の種類及び／又は濃度は膜の各側で異なっていてもよい。
【０３９８】
塩濃度は飽和状態にあってもよい。塩濃度は、３Ｍ以下であってもよく、好ましくは、０．１〜２．５  Ｍ、０．３〜１．９  Ｍ、０．５〜１．８  Ｍ、０．７〜１．７  Ｍ、０．９〜１．６  Ｍ、又は１  Ｍ〜１．４  Ｍである。塩濃度は、好ましくは、１５０ｍＭ〜１Ｍである。該方法は、好ましくは少なくとも０．３Ｍ、例えば少なくとも０．４Ｍ、少なくとも０．５Ｍ、少なくとも０．６Ｍ、少なくとも０．８Ｍ、少なくとも１．０Ｍ、少なくとも１．５Ｍ、少なくとも少なくとも２．０Ｍ、少なくとも少なくとも２．５Ｍ、又は少なくとも３．０Ｍの塩濃度を用いて行われる。高い塩濃度は高い信号対雑音比をもたらし、ヌクレオチドの存在を示す電流を通常の電流変動の背景に対して同定することを可能にする。
【０３９９】
該方法は、通常は、緩衝液の存在下で実施される。上述の例示的な装置では、緩衝液はチャンバ内の水溶液中に存在する。本発明の方法において、任意の緩衝液を使用してもよい。通常は、緩衝液はリン酸緩衝液である。他の適切な緩衝液はＨＥＰＥＳ及びＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液である。該方法は、通常は、４．０〜１２．０、４．５〜１０．０、５．０〜９．０、５．５〜８．８、６．０〜８．７、又は７．０〜８．８、又は７．５〜８．５のｐＨで実施される。使用されるｐＨは、好ましくは、約７．５である。
【０４００】
該方法は、０℃〜１００℃、１５℃〜９５℃、１６℃〜９０℃、１７℃〜８５℃、１８℃〜８０℃、１９℃〜７０℃、又は２０℃〜６０℃で実施される。該方法は、通常は、室温で実施される。該方法は、約３７℃などの酵素機能をサポートする温度で任意に実施される。
【０４０１】
遊離ヌクレオチド及び補因子
【０４０２】
該方法は、遊離ヌクレオチド若しくは遊離ヌクレオチド類似体、及び／又はポリヌクレオチド結合タンパク質の作用を促進する酵素補因子の存在下で実施してもよい。該方法はまた、遊離ヌクレオチド又は遊離ヌクレオチド類似体の非存在下で及び酵素補因子の非存在下で実施してもよい。遊離ヌクレオチドは上述の各ヌクレオチドのいずれか一つ以上であってもよい。遊離ヌクレオチドとしては、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）、及びデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。遊離ヌクレオチドは、好ましくは、ＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰ、又はｄＣＭＰから選択される。遊離ヌクレオチドは、好ましくは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）である。酵素補因子は、ポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）が機能することを可能にする因子である。酵素補因子は、好ましくは、二価金属カチオンである。二価金属カチオンは、好ましくは、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、又はＣｏ２＋である。酵素補因子は、最も好ましくは、Ｍｇ２＋である。
【０４０３】
キット
【０４０４】
本発明はまた、二本鎖バーコード配列、一本鎖リーダー配列、及び二本鎖ポリヌクレオチドの鎖を分離し、ポリヌクレオチドの移動を制御することができるポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）を含むアダプターの個体群を提供する。ここで、個体群中の各アダプターのバーコード配列は一意のものである。
【０４０５】
本発明は、本発明の方法において使用するためのキットをも提供する。キットは、通常は、本発明によるアダプターの個体群を含む。キットは、一つ以上の膜アンカー、ポリヌクレオチド結合タンパク質（例えば、ポリヌクレオチド巻き戻し酵素）（これはアダプターに予め結合されていてもよい）、リガーゼ、ポリメラーゼ及び／又は遊離ヌクレオチド若しくは補因子を追加的に含んでもよい。
【０４０６】
キットは、両親媒性層又はトリブロックコポリマー膜などの、上に開示された膜のいずれかの構成要素を含んでもよい。キットは、膜貫通孔をさらに含んでもよい。本発明の方法を参照して上述した実施形態は、いずれもキットに同様に適用される。
【０４０７】
本発明のキットは、上述の実施形態のいずれかを実行することを可能にする一つ以上の他の試薬又は器具を追加的に含んでもよい。係る試薬又は器具は以下の一つ以上を含む：適切な緩衝液（複数可）（水溶液）、対象から試料を得るための手段（容器又は針を含む器具など）、ポリヌクレオチドを増幅及び／又は発現させるための手段、上記に定義された膜、又は電圧若しくはパッチクランプ装置。試薬は、試薬を再懸濁するために流体試料が使用されるように乾燥状態でキット中に存在してもよい。キットはまた、任意選択で、キットを本発明の方法において使用することを可能にするための説明書を含んでもよい。キットは磁石又は電磁石を含んでもよい。キットは、必要に応じて、ヌクレオチドを含んでもよい。
【０４０８】
以下の実施例は、本出願の非限定的な態様を例を挙げて説明する。
【実施例】
【０４０９】
[実施例１]
【０４１０】
この実施例は、鋳型鎖及び相補鎖に付着した一本鎖リーダー配列を有する二本鎖ゲノムＤＮＡをＣｓｇＧナノポアと接触させると、鋳型鎖及び相補鎖が、Ｄｄａヘリカーゼの制御下で、ナノポアを通って逐次しかし別々に（鋳型はヘアピンを介して相補体に結合されない）転座することを示す。ヘアピンによって一緒に結合されたとき、同一の鋳型／補体配列の転座と比較して、配列決定精度の向上が観察された。
【０４１１】
材料及び方法
【０４１２】
試料の製造
【０４１３】
ゲノムＤＮＡを以下のように断片化した。４６μＬ中の１μｇのゲノムＤＮＡをＣｏｖａｒｉｓ  ｇ−ＴＵＢＥに移した。次いで、製造元のプロトコルの推奨に従って、必要とされるフラグメントサイズの速度で、ｇ−ＴＵＢＥを室温で１分間回転させた。そして、ｇ−ＴＵＢＥを反転させ、更に１分間回転させて断片化されたＤＮＡを回収した。断片化したＤＮＡを清潔な１．５ｍｌのエッペンドルフＤＮＡ  ＬｏＢｉｎｄチューブに移した。製造元のプロトコルに従い、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  １２０００  ＤＮＡチップを用いて１μＬの試料を解析することにより、断片化プロセスの成功を評価した。
【０４１４】
回収したＤＮＡをＮＥＢのＦＦＰＥ修復キットで製造元のプロトコルに従って６２μＬの容量で処理し、１ｘＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを用いてＤＮＡを精製した後、４６μＬのヌクレアーゼフリー水で溶出した。
【０４１５】
次いで、ＦＦＰＥ修復ＤＮＡをＮＥＢのＵｌｔｒａ  ＩＩ  Ｅｎｄ−ｐｒｅｐモジュールで処理して、断片化ＤＮＡの各末端に５´リン酸及びシングルｄＡ−ヌクレオチドを付加した。製造元のプロトコルに従い、４５μＬのＦＦＰＥ修復ＤＮＡを用いて６０μＬの容量で反応を行い、その後１×Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを用いて精製し、３１μＬのヌクレアーゼフリー水で溶出した。ＱｕＢｉｔ蛍光光度計を用いて１μＬの回収した末端プレップＤＮＡを定量した。
【０４１６】
次に、３０μＬの末端プレップＤＮＡを清潔な１．５ｍｌのエッペンドルフＤＮＡ  ＬｏＢｉｎｄチューブに添加した。次に、Ｄｄａヘリカーゼが付着した図３Ａに示すアダプターを含む溶液（図３Ａに示すように、各アダプターにＤｄａヘリカーゼが付着した、２０μｌのＯｘｆｏｒｄ  ＮａｎｏｐｏｒｅのＳＱＫ−ＬＳＫ１０８  Ａｄａｐｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されているＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  １Ｄ（Ｒ９．４）の成分））を添加し（Ａｄａｐｔｅｒ  Ｍｉｘのこの量は８  ｋｂ以上のフラグメントサイズを有する約３５０  ｎｇのＤＮＡに最適化されている）、続いて、５倍の反転で混合する前に、５０μｌのＮＥＢ’ｓ  Ｂｌｕｎｔ／ＴＡライゲーションマスターミックスを添加した。次いで反応物を室温で１０分間放置した。
【０４１７】
ＤＮＡを精製するために、４０μＬのＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを前の工程からのアダプター連結反応に添加し、そして５倍の反転により混合した。次いで、回転ミキサー（フラミキサー）上でチューブを室温で５分間インキュベートした。次いでチューブを磁気ラックに置き、上清をピペットで除去する前に、ビーズをペレット化した。アダプタービーズ結合緩衝液（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されている１４０μＬのＯｘｆｏｒｄ  ＮａｎｏｐｏｒｅのＳＱＫ−ＬＳＫ１０８アダプタービーズ結合緩衝液（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  １Ｄ（Ｒ９．４）の構成要素））を添加する前に、チューブをラックから取り出した。次いで、チューブを軽く叩くことによってビーズを再懸濁した。その後、チューブを磁気ラックに戻し、上清をピペット操作で除去する前に、ビーズをペレット化した。このステップをもう一度繰り返した。洗浄ステップの後、チューブを磁気ラックから取り出し、ペレットを溶出緩衝液に再懸濁した（２５μｌのＯｘｆｏｒｄ  ＮａｎｏｐｏｒｅのＳＱＫ−ＬＳＫ１０８  Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ）（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されているＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  １Ｄ（Ｒ９．４）の構成要素）。その後、チューブを室温で１０分間インキュベートし、ビーズをペレット化するために磁気ラックに戻した。溶出液を清潔な１．５ｍｌのエッペンドルフＤＮＡ  ＬｏＢｉｎｄチューブに移した。
【０４１８】
次に配列決定反応混合物を製造し、図３Ｂに示すゲノムＤＮＡ構築物を生成した。配列決定反応混合物は、オックスフォードナノポアのＳＱＫ−ＬＳＫ１０８キット（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されているＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  １Ｄ（Ｒ９．４）の構成要素）からの３７．５μＬのＲＢＦと２５．５μＬのＬＬＢを、１２．０μＬの回収ライブラリーに加えることによって製造した。
【０４１９】
鋳型を補体に結合するヘアピンを有する二本鎖ゲノムＤＮＡを生成するために（図１Ａの構築物の概略図を参照）、上記と同様の手順に従った。同様の手順で、上記のアダプター混合物の代わりに、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＳＱＫ−ＬＳＫ  １０２  Ａｄａｐｔｅｒ  Ｍｉｘ及びＳＱＫ−ＬＳＫ  ２０８  ＨＰ  Ａｄａｐｔｅｒ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されているＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  ２Ｄ（Ｒ９．４）の構成要素）を使用した。他の全てのステップ及び使用した成分は上記と同一である。
【０４２０】
ナノポア配列決定
【０４２１】
電気測定値は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＭｉｎＩＯＮ  Ｒ９．４フローセルを用いて取得した。二本鎖ゲノムＤＮＡ（鋳型を補体に結合するヘアピンの有無にかかわらず）をナノポアシステムに添加した。実験を行い、かつヘリカーゼ制御ＤＮＡ移動を監視した。
【０４２２】
解析
【０４２３】
イベントの整列
【０４２４】
ＷＯ２０１６０５９４２７に開示されている方法を用いて信号の整列を行った。９５％以上のアラインメント値は、それぞれのイベントが鋳型及びそのそれぞれの補体を示していることを示していた。
整列信号の解析
【０４２５】
ヌクレオチド配列を決定するために、整列信号のその後の解析を上記のように２Ｄ法を用いて実施した。
【０４２６】
結果
【０４２７】
図１は、酵素の制御下でＹ−アダプター及びナノポアを通って転座するヘアピンに付着した鋳型及び相補ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物の概略図（図１Ａ）、及び得られた配列決定精度を示すグラフ（図１Ｂ）を含む。図２Ａ及び図２Ｂは、酵素の制御下でナノポアを通って転座するリーダー配列に付着した鋳型及び相補ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物の漫画表現（図２Ａ）、及び得られた配列決定精度を示すグラフ（図２Ｂ）を含む。図１Ｂ及び図２Ｂは、鋳型単独、補体単独、並びに鋳型及び補体からの組み合わされた情報を用いた配列決定精度を説明するピークを示す。図１Ｂと図２Ｂを比較することにより、鋳型と補体がヘアピンループ構造を介して結合されていない場合、補体単独の精度が向上し（〜７５％から＞８５％まで）、さらに鋳型と補体からの情報が組み合わされたときも、鋳型と補体が結合していない場合に精度が向上したことが明らかに分かった。
[実施例２]
【０４２８】
（対照：修飾ポア、検体に結合部位を付加しない）
この実施例は、鋳型と補体が共有結合していない場合に二本鎖ポリヌクレオチドの鋳型（捕捉された第一鎖）及び補体（第一鎖の逆相補体）を特徴付ける方法を説明する。後述のようにデータ解析の後に決定された鋳型及び補体の同定は、実施例において「後続対」として言及される。いくつかの実施形態では、対が互いに１分以内に起こる＞８０％の重複があるときに、潜在的な後続対が同定される。いくつかの実施形態では、潜在的な後続対は、後続対がすぐに発生したときに同定され、９５〜１００％の重複がある。
【０４２９】
鋳型のみの鎖（すなわち、後続対に属すると分類されなかったもの）は、本明細書において「Ｔ」と呼ばれる。後続対に属する鋳型鎖は本明細書において「Ｔｎ」と呼ばれ、後続対に属する相補鎖は本明細書において「Ｃｎ」と呼ばれる。「ｎ」は後続対のＴｎ及びＣｎ構成要素を同定するために使用することができ、例えば、Ｔ１及びＣ１は後続対である。
【０４３０】
この例では、修飾ナノポアに付着したポアタグ（例えば、捕捉ポリヌクレオチド）に相補的ではないポリヌクレオチド配列を含む対照アダプターは、修飾ナノポアを用いて後続対を検出する頻度を説明するために使用される。
【０４３１】
例示的な材料及び方法
【０４３２】
ゲノムＤＮＡへの対照アダプターの連結
【０４３３】
対照アダプターは、バーコードトップ鎖（配列番号１）及びバーコードボトム鎖（配列番号２）を含むＮＢ０１（ネイティブバーコード１）である。
【０４３４】
配列番号１
／５Ｐｈｏｓ／ＡＡＧＧＴＴＡＡＣＡＣＡＡＡＧＡＣＡＣＣＧＡＣＡＡＣＴＴＴＣＴＴＣＡＧＣＡＣＣＴ
【０４３５】
配列番号２
／５Ｐｈｏｓ／ＧＧＴＧＣＴＧＡＡＧＡＡＡＧＴＴＧＴＣＧＧＴＧＴＣＴＴＴＧＴＧＴＴＡＡＣＣＴＴＡＧＣＡＡＴ
【０４３６】
ゲノムＤＮＡへの対照アダプターの連結は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ配列決定キットを用いて、操作ガイドラインに従って行った。１０００ｎｇの末端修復ＯｄＡテイル大腸菌ゲノムＤＮＡを１×Ｂｒｕｎｔ／ＴＡマスターミックス（ＮＥＢ  Ｍ０３６７Ｌ）中において、１００°μＬで５．５μＬの６４０ｎＭ対照アダプターと、室温で２０分間連結した。試料のＳＰＲＩ精製を以下のように実施した：４０μＬのＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を添加し、試料をピペットで混合し、室温で５分間インキュベートした。７０％エタノール溶液を、ヌクレアーゼフリー水（ＡｍｂｉｏｎＴＭ）及びＡｂｓｏｌｕｔｅエタノール（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて製造し、この溶液を氷上で保存した。
【０４３７】
ビーズを磁気ラック上でペレット化し、上清を除去した。ペレットを乱すことなく、ペレット化したビーズを上記の５００μＬの７０％エタノール溶液で洗浄した。上清を除去し、ペレット化したビーズを５００μＬの７０％エタノール溶液で再度洗浄した。７０％エタノール溶液を除去し、ペレットを遠心分離機で短時間パルスしてから磁気ラックに戻した後、７０％エタノール溶液の最後の残留物を除去した。
【０４３８】
ペレットを５０μＬのヌクレアーゼフリー水（ＡｍｂｉｏｎＴＭ）にピペットで混合することによって再懸濁し、試料を氷上で１０分間ビーズから溶出させた。ビーズをペレット化し、試料を含む上清を新しいＤＮＡ  ＬｏＢｉｎｄチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に移した。この試料は対照−アダプター−ゲノム−ＤＮＡと呼ばれる。
【０４３９】
制御アダプターゲノムＤＮＡへの酵素アダプター複合体の連結
【０４４０】
Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されている配列決定キットＢＡＭ（Ｂａｒｃｏｄｅ  Ａｄａｐｔｅｒ  Ｍｉｘ）のアリコートを氷上で解凍した。２０μＬのＢＡＭを、５０μＬの対照アダプターゲノムＤＮＡ、２０μＬのＮＥＢＮｅｘｔクイック連結反応緩衝液及び１０μＬのクイックＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｅ６０５６Ｌ）とともに、１００μＬ中、室温で１０分間連結した。ＳＰＲＩ精製２を以下のように実施した。４０μＬのＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を添加し、試料をピペットで混合し、室温で５分間インキュベートした。ビーズを磁気ラック上でペレット化し、上清を除去した。ペレット化したビーズを１４０μＬのアダプタービーズ結合緩衝液で洗浄し、磁気ラック上のエッペンドルフチューブを二回連続して１８０°回転させることによってビーズをアダプタービーズ結合緩衝液中に再懸濁した。ビーズを磁気ラック上でペレット化し、上清を除去した。ペレット化したビーズを再度１４０μＬの緩衝液で洗浄し、磁気ラック上でエッペンドルフチューブを２回連続して１８０°回転させることによりビーズを緩衝液に再懸濁した。ビーズを磁気ラック上でペレット化し、緩衝液を除去し、ペレットを磁気ラックに戻す前に遠心分離機で短時間パルスし、次いで緩衝液の最後の残余物を除去した。
【０４４１】
ペレットを２５μＬのヌクレアーゼフリー水（ＡｍｂｉｏｎＴＭ）にピペットで混合することによって再懸濁し、このライブラリーを氷上で１０分間ビーズから溶出させた。
【０４４２】
タグ修飾ナノポアの製造
【０４４３】
ポアタグの接合を可能にするように、修飾ＣｓｇＧナノポアを製造した。例えば、システイン、非天然塩基などのようなＣｓｇＧモノマーが（例えば、アミノ酸置換によって）修飾され、ポアタグの接合のために提供される。修飾ＣｓｇＧモノマーを、本明細書に記載のように、一つ以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列番号７をコード化するプラスミドを含むＰＴ７ベクターを用いて製造した。
【０４４４】
配列番号７：信号配列を含まない野生型大腸菌ＣｓｇＧのアミノ酸配列（ユニポート受入番号Ｐ０ＡＥＡ２）
【０４４５】
ＣＬＴＡＰＰＫＥＡＡＲＰＴＬＭＰＲＡＱＳＹＫＤＬＴＨＬＰＡＰＴＧＫＩＦＶＳＶＹＮＩＱＤＥＴＧＱＦＫＰＹＰＡＳＮＦＳＴＡＶＰＱＳＡＴＡＭＬＶＴＡＬＫＤＳＲＷＦＩＰＬＥＲＱＧＬＱＮＬＬＮＥＲＫＩＩＲＡＡＱＥＮＧＴＶＡＩＮＮＲＩＰＬＱＳＬＴＡＡＮＩＭＶＥＧＳＩＩＧＹＥＳＮＶＫＳＧＧＶＧＡＲＹＦＧＩＧＡＤＴＱＹＱＬＤＱＩＡＶＮＬＲＶＶＮＶＳＴＧＥＩＬＳＳＶＮＴＳＫＴＩＬＳＹＥＶＱＡＧＶＦＲＦＩＤＹＱＲＬＬＥＧＥＶＧＹＴＳＮＥＰＶＭＬＣＬＭＳＡＩＥＴＧＶＩＦＬＩＮＤＧＩＤＲＧＬＷＤＬＱＮＫＡＥＲＱＮＤＩＬＶＫＹＲＨＭＳＶＰＰＥＳ
【０４４６】
プラスミドをＢＬ２１誘導体細胞系に形質転換し、内因性ＣｓｇＧ遺伝子をカナマイシン耐性で置換するように突然変異させた。細胞をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を含有する寒天プレート上に播種し、３７℃で１６時間インキュベートした。シングルコロニーを、カルベネシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を含有する１００ｍｌのＬＢ培地を植菌するために使用し、そしてスターター培養物を３７℃／２５０ｒｐｍで１６時間増殖させた。４×２５ｍｌのスターター培養物を用いてカルベネシリン（１００μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）３ｍＭ  ＡＴＰ、１５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、及び０．５ｍＭラムノースを植菌４×５００ｍｌのＬＢに植菌した。培養物を定常期に達するまで増殖させ、そして３７℃／２５０ｒｐｍで更に２時間増殖させた。グルコースを０．２％になるまで添加して、温度を１８℃に低下させ、培養物が１８℃になると、１％α−ラクトース一水和物を添加することによってタンパク質発現を誘導した。培養物を１８℃／２５０ｒｐｍで１６時間インキュベートした。
【０４４７】
細胞を遠心分離により採取し、そして界面活性剤溶解（Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ）にかけた。溶解したら、試料は初期連鎖球菌精製（５ミｍｌのＨＰの連鎖球菌トラップ）のために持ち越した。溶出した画分を６０℃に加熱し、回転させ、上清をｑＩＥＸ精製（１ｍｌ  Ｈｉ  ｔｒａｐ  Ｑ  ＨＰ）のために持ち越した。正しいタンパク質を含む画分をプールし、濃縮し、そして２４ｍｌのＳｕｐｅｒｄｅｘで最終磨きのために持ち越した。
【０４４８】
上記のナノポアのアリコートを、以下のように、モルフォリノオリゴ（配列番号８）で修飾した。
【０４４９】
配列番号８：ＧｅｎｅＴｏｏｌｓから提供されたモルフォリノオリゴ。
／５´／−ＧＧＡＡＣＣＴＣＴＣＴＧＡＣＡＡ／−３´−ピリジル−ジチオ／
【０４５０】
１．３μＬの１Ｍ  ＤＴＴ（ジチオトレイトール）を、約９．７５μｇのナノポアを含む１３０μＬの上からのナノポアに添加し、室温で１時間インキュベートした。製造元のガイドラインに従い、０．５ｍＬの７ＭＷＣＯ  Ｚｅｂａ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてこの試料を反応緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ及び０．１％Ｂｒｉｊ５８、ｐＨ７）に緩衝液交換した。製造元のガイドラインに従って７ＭＷＣＯ  Ｚｅｂａ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてこの試料を再び反応緩衝液に緩衝液交換した。モルフォノオリゴ（配列番号８）の２ｍＭストックは、ＧｅｎｅＴｏｏｌｓが提供する３００ｎｍｏｌのモルフォノオリゴを１５０μＬのヌクレアーゼフリー水（ＡｍｂｉｏｎＴＭ）に溶解することによって製造した。これを上記緩衝液交換試料に添加して最終濃度を５００μＭとし、室温で一晩インキュベートした。これは修飾ナノポアとして知られている。  
【０４５１】
電気測定
【０４５２】
電気測定値は、リン酸緩衝液（例えば、フェロシアン化カリウム（ＩＩ）及びフェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）を含む、ｐＨ８．０）中のブロックコポリマーに挿入された単一修飾ナノポアから取得した。ブロックコポリマー中に挿入された単一の修飾ナノポアを達成した後、２ｍＬの緩衝液ですすぐことによって過剰の修飾ナノポアを除去した。
【０４５３】
プライミング緩衝液をナノポアシステムに流した。シークエンシングミックス、４００ｎＭテザー（配列番号９）、回収されたビーズ精製ライブラリー、及びライブラリーローディングビーズを、製造元の指示に従って緩衝液中で混合した。その後、配列決定混合物をナノポアシステムに添加した。実験は１８０ｍＶで行い、ヘリカーゼ制御ＤＮＡの移動を監視した。
【０４５４】
配列番号９
／５Ｃｈｏｌ−ＴＥＧ／ＴＴ／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／ＴＴＧＡＣＣＧＣＴＣＧＣＣＴＣ
【０４５５】
データ解析
【０４５６】
ＤＮＡ鎖が修飾ナノポアを通過する際に、ナノポアを通る電流の変化を測定し収集した。次に、ｆａｓｔｑデータを得るために、ベースコールアルゴリズム、例えば再帰型ニューラルネット（ＲＮＮ）アルゴリズムを用いて鎖の配列を決定した。その後、当技術分野で既知の配列位置合せツールを用いてｆａｓｔｑ配列データを参照ゲノムに整列させた。
【０４５７】
相互に相補的である鎖の対（鋳型と相補鎖の対）を同定するために、鎖間の分数重複を計算した。分数重複は、二本の鎖がまたがる（必ずしも重複することなく）ゲノムの部分の長さ（塩基単位）によって正規化された、二本の鎖が共有するゲノム内の塩基の隣接する部分の長さ（塩基単位）として定義される。各鎖の最大分数重複は、１分以内にポアを通過した鎖の他の全てのものと鎖との間の最大重複として計算した。したがって、高い最大分数は所与の鎖（鋳型又は相補物として）が相補対に属したことを示し、一方、低い分数重複は鎖が相補対に属していなかったことを示す。
【０４５８】
表２は、本明細書に記載の未修飾又は修飾ナノポアを用いた、異なる最大分数重複値を有する鎖のパーセントを示す。
【表２】
2020500528.tif 000004
【０４５９】
結果
【０４６０】
その内容全体が参照により本明細書に組み込まれている国際特許出願公開第２０１５／０５５９８１号パンフレットに記載されているようなヘリカーゼ、例えばＤｄａヘリカーゼを、修飾ナノポア（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ２０１６／０３４５９１に記載の修飾ＣｓｇＧナノポア）を通るポリヌクレオチドの移動を制御するために使用した。表３は本明細書に記載の実施例２〜５からのデータを示す。それは、上記のデータ解析の節で説明したように、Ｔ、Ｔｎ及びＣｎ分類に属するように割り当てられた（例えば、当技術分野で既知のマッピング方法を用いて）マッピングされた鎖の数の一覧である。以下の表３の２行目は、実施例２からの対照アダプターを用いた実施例におけるデータ解析によって割り当てられたＴ、Ｔｎ及びＣｎ鎖の数を示す。鎖の２．９％が後続対として分類されている。
【０４６１】
非修飾ナノポアを用いた実施例５では、後続対の頻度はより低く（表３、列５）、わずか０．６％であった。このことは、検体が正確な配列を含まない場合でも、ナノポア上のタグの使用が後続のイベントを増強することを示している。理論に束縛されることを望むものではないが、これはおそらく、ポアタグが補体の露出されたｓｓＤＮＡに対して（規定された部位に対して）低効率で結合することができるからであろう。
[実施例３]
【０４６２】
（修飾ポア及び後続アダプターの実施形態１）
この実施例は、鋳型と補体が共有結合していない場合に、二本鎖ポリヌクレオチドの鋳型（捕捉された第一鎖）及び補体（第一鎖の逆相補体）を特徴付ける方法を説明する。後述のようにデータ解析の後に決定された鋳型及び補体の同定は、実施例において「後続対」として言及される。いくつかの実施形態では、対が互いに１分以内に起こる＞８０％の重複がある際に、潜在的な後続対が同定される。いくつかの実施形態では、潜在的な後続対は、後続対がすぐに発生した際に同定され、９５〜１００％の重複がある。
【０４６３】
鋳型のみの鎖（すなわち、後続対に属すると分類されなかったもの）は、本明細書において「Ｔ」と呼ばれる。後続対に属する鋳型鎖は本明細書において「Ｔｎ」と呼ばれ、後続対に属する相補鎖は本明細書において「Ｃｎ」と呼ばれる。「ｎ」は後続対のＴｎ及びＣｎ構成要素を同定するために使用することができ、例えば、Ｔ１及びＣ１は後続対である。
【０４６４】
この例では、後続対を検出する頻度の増加は、本明細書に記載の一実施形態による後続アダプターの連結によって達成される。図９〜１０に示すように、アダプターは、捕捉ポリヌクレオチド配列が鎖の巻き戻し時にのみ明らかにされるように、二本鎖ステム内の捕捉ポリヌクレオチド配列を含む。捕捉ポリヌクレオチド配列は修飾ナノポアに付着したポリヌクレオチド配列と相補的である。この実施例では、捕捉ポリヌクレオチド配列は二本鎖ステム内にスペーサー、例えば、ｓｐ１８を含まず、そのようなアダプターは約１０％の追跡効率（すなわち、全鎖の後続％〜約１０％）を生じた。
【０４６５】
材料及び方法
【０４６６】
ゲノムＤＮＡへの後続アダプターの連結
【０４６７】
後続アダプターの一実施形態は、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８、１００ｍＭ酢酸カリウム中、それぞれ１０μＭ及び１１μＭで、毎分２℃で、９５℃から２２℃まで一緒にアニールされたバーコードトップ鎖（配列番号３）及びバーコードボトム鎖（配列番号４）を含む。ハイブリダイズしたＤＮＡは、バーコードアダプター２として知られている。６４０ｎＭに希釈した後続アダプター１を製造するために、６．４μＬのフォローオンアダプターを、９３．６μＬの５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、２０  ｍＭ塩化ナトリウムに添加した。
【０４６８】
配列番号３
【０４６９】
／５Ｐｈｏｓ／ＧＧＣＧＴＣＴＧＣＴＴＧＧＧＴＧＴＴＴＡＡＣＣＴＴＴＴＴＧＴＣＡＧＡＧＡＧＧＴＴＣＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＡＧＧＴＴＣＣＴ
【０４７０】
配列番号４
【０４７１】
／５Ｐｈｏｓ／ＧＧＡＡＣＣＴＣＴＣＴＧＡＣＴＴＧＧＡＡＣＣＴＣＴＣＴＧＡＣＡＡＡＡＡＧＧＴＴＡＡＡＣＡＣＣＣＡＡＧＣＡＧＡＣＧＣＣＡＧＣＡＡＴ
【０４７２】
ゲノムＤＮＡへの後続アダプターの連結は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ配列決定キットを用いて操作ガイドラインに従って行った。１０００ｎｇの末端修復及びｄＡテイル大腸菌ゲノムＤＮＡを、１×Ｂｌｕｎｔ／ＴＡマスターミックス（ＮＥＢ  Ｍ０３６７Ｌ）中で、上記からの５．５μＬの６４０ｎＭの後続アダプターとともに１００μＬ中に室温で２０分間連結した。次に、実施例２に記載の通りＳＰＲＩ精製を実施した。この試料は後続アダプターゲノムＤＮＡと呼ばれる。
【０４７３】
後続アダプターゲノムＤＮＡへの酵素−アダプター複合体の連結
【０４７４】
Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されている配列決定キットＢＡＭ（Ｂａｒｃｏｄｅ  Ａｄａｐｔｅｒ  Ｍｉｘ）のアリコートを氷上で解凍した。２０μＬのＢＡＭを、５０μＬの後続アダプターゲノムＤＮＡ、２０μＬのＮＥＢＮｅｘｔクイック連結反応緩衝液及び１０μＬのクイックＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｅ６０５６Ｌ）とともに１００μＬ中で、室温で１０分間連結した。次に、実施例２に記載の通りＳＰＲＩ精製２を実施した。
【０４７５】
タグ修飾ナノポアの生成
【０４７６】
アダプターの捕捉ポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列を含むように修飾されているナノポアを生成する方法は、上記の実施例２に記載したのと同様の方法で実施した。
【０４７７】
電気測定
【０４７８】
鎖がナノポアを通過する際に電気測定値を測定し取得する方法は、上記の実施例２に記載したのと同様の方法で実施した。
【０４７９】
データ解析
【０４８０】
収集した電気測定値のデータ処理及び解析は、上記の実施例２に記載したのと同様の方法で実施した。
【０４８１】
結果
【０４８２】
その内容全体が参照により本明細書に組み込まれている国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１５／０５５９８１に記載されているようなヘリカーゼ、例えばＤｄａヘリカーゼを、修飾ナノポア、例えばその内容全体が参照により本明細書に組み入れられる国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ２０１６／０３４５９１に記載の修飾ＣｓｇＧナノポアを通るポリヌクレオチドの動きを制御するために使用した。表３の３行目は、この実施例に記載されている後続アダプターを用いて実施例におけるデータ解析によって割り当てられたＴ、Ｔｎ及びＣｎ鎖の数を示す。全鎖の７．７％が後続対として分類されている。
[実施例４]
【０４８３】
（修飾ポア及び後続アダプター実施形態２）
この実施例は、鋳型と補体が共有結合していない場合に、二本鎖ポリヌクレオチドの鋳型（捕捉された第一鎖）及び補体（第一鎖の逆相補体）を特徴付ける方法を説明する。後述のようにデータ解析の後に決定された鋳型及び補体の同定は、実施例において「後続対」として言及される。いくつかの実施形態では、対が互いに１分以内に起こる＞８０％の重複がある際に、潜在的な後続対が同定される。いくつかの実施形態では、潜在的な後続対は、後続対がすぐに発生した際に同定され、９５〜１００％の重複がある。
【０４８４】
鋳型のみの鎖（すなわち、後続対に属すると分類されなかったもの）は、本明細書において「Ｔ」と呼ばれる。後続対に属する鋳型鎖は本明細書において「Ｔｎ」と呼ばれ、後続対に属する相補鎖は本明細書において「Ｃｎ」と呼ばれる。「ｎ」は後続対のＴｎ及びＣｎ構成要素を同定するために使用することができ、例えば、Ｔ１及びＣ１は後続対である。
【０４８５】
この例では、後続対を検出する頻度の増加は、本明細書に記載の一実施形態に係る後続アダプターの連結によって達成される。アダプターは、捕捉ポリヌクレオチド配列が鎖の巻き戻し時にのみ明らかにされるような二本鎖ステム内の捕捉ポリヌクレオチド配列を含む。捕捉ポリヌクレオチド配列は、修飾ナノポアに結合したポリヌクレオチド配列と相補的である。このアダプターはまた、Ｃｎの捕捉効率を高める化学的性質も含む。例えば、この実施例では、捕捉ポリヌクレオチド配列は、二本鎖ステム内にスペーサー、例えばｓｐ１８、を含み、そのようなアダプターは約６０％の追跡効率（すなわち、全鎖の追跡％〜約６０％）を生じた。理論に束縛されることを望むものではないが、この向上は、ｓｐ１８に遭遇すると酵素は短時間休止し、結合のためのより長い時間を与え、従って捕捉ポリヌクレオチド配列の修飾ナノポア上の相補的配列タグへのハイブリダイゼーション効率を高めるため、及び／又はｓｐ１８は結合の配置の柔軟性を高めるため、及び／又はｓｐ１８ｓの付加された長さはより良い幾何学的構造であり、ポアタグにより近い配列を表示するため（例えば、捕捉効率が改善され、及び／又はＴが捕捉されないように閉塞／停止されるようにＣｎの向きが変わる）、などのいくつかの理由に起因し得る。
【０４８６】
材料及び方法
【０４８７】
ゲノムＤＮＡへの後続アダプターの連結
【０４８８】
後続アダプターの一実施形態は、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８、１００ｍＭ酢酸カリウム中、それぞれ１０μＭ及び１１μＭで、毎分２℃で、９５℃〜から２℃まで、一緒にアニールされたバーコードトップ鎖（配列番号５）及びバーコードボトム鎖（配列番号６）を含む。ハイブリダイズしたＤＮＡはバーコードアダプター２として知られている。６４０ｎＭに希釈した後続アダプター２を製造するために、６．４μＬの後続アダプターを９３．６μＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、２０ｍＭ塩化ナトリウムに添加した。
【０４８９】
配列番号５
【０４９０】
／５Ｐｈｏｓ／ＧＧＣＧＴＣＴＧＣＴＴＧＧＧＴＧＴＴＴＡＡＣＣ／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／ＴＴＴＴＴＧＴＣＡＧＡＧＡＧＧＴＴＣＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＡＧＧＴＴＣＣＴ
【０４９１】
配列番号６
【０４９２】
／５Ｐｈｏｓ／ＧＧＡＡＣＣＴＣＴＣＴＧＡＣＴＴＧＧＡＡＣＣＴＣＴＣＴＧＡＣＡＡＡＡＡ／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／ＧＧＴＴＡＡＡＣＡＣＣＣＡＡＧＣＡＧＡＣＧＣＣＡＧＣＡＡＴ
【０４９３】
ゲノムＤＮＡへの後続アダプターの連結は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ配列決定キットを用いて操作ガイドラインに従って行った。１０００ｎｇの末端修復及びｄＡテイル大腸菌ゲノムＤＮＡを、１×Ｂｌｕｎｔ／ＴＡマスターミックス（ＮＥＢ  Ｍ０３６７Ｌ）中、５．５μＬの上記からの６４０ｎＭの後続アダプターを用いて１００μＬ中で、室温で２０分間連結した。次に、実施例２に記載の通りにＳＰＲＩ精製を実施した。この試料は後続アダプターゲノムＤＮＡと呼ばれる。
【０４９４】
後続アダプターゲノムＤＮＡへの酵素−アダプター複合体の連結
【０４９５】
Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されている配列決定キットＢＡＭ（Ｂａｒｃｏｄｅ  Ａｄａｐｔｅｒ  Ｍｉｘ）のアリコートを氷上で解凍した。２０μＬのＢＡＭを、５０μＬの後続アダプターゲノムＤＮＡ、２０μＬのＮＥＢＮｅｘｔクイック連結反応緩衝液及び１０μＬのクイックＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｅ６０５６Ｌ）とともに１００μＬ中で、室温で１０分間連結した。次に、実施例２に記載の通りにＳＰＲＩ精製２を実施した。
【０４９６】
タグ修飾ナノポアの生成
【０４９７】
アダプターの捕捉ポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列を含むように修飾されているナノポアを生成する方法は、上記の実施例２に記載したのと同様の方法で実施した。
【０４９８】
電気測定
【０４９９】
鎖がナノポアを通過する際に電気測定値を測定し取得する方法は、上記の実施例２に記載したのと同様の方法で実施した。
【０５００】
データ解析
【０５０１】
収集した電気測定値のデータ処理及び解析は、上記実施例２に記載したのと同様の方法で実施した。
【０５０２】
結果
【０５０３】
その内容全体が参照により本明細書に組み込まれている国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１５／０５５９８１に記載されているようなヘリカーゼ、例えばＤｄａヘリカーゼを、修飾ナノポア、例えばその内容全体が参照により本明細書に組み込まれている国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１６／０３４５９１に記載の修飾ＣｓｇＧナノポアを通るポリヌクレオチドの動きを制御するために使用した。表３の４行目は、この実施例に記載したような後続アダプターを用いた実施例におけるデータ解析によって割り当てられたＴ、Ｔｎ及びＣｎ鎖の数を示す。４５．１％の鎖が後続対として分類されている。
【０５０４】
図１１Ａ〜１１Ｂは、この実施例に記載された実験からの電流トレースを示す。Ｔ、Ｔｎ及びＣｎは、下記の表４に示されるデータと一致するように標識付けされる。以下の表４に示されるデータは、データ解析の節に記載される通りに得られたものであり、実施例２、３及び４について表３に要約されるデータの例示的部分である。
【０５０５】
図１２Ａ〜１２Ｄは、修飾ナノポアを通って転座したときの後続対ポリヌクレオチドの鋳型（Ｔｎ）及び補体（Ｃｎ）の電流トレースを示す。ナノポアは、図１２Ａにおいて配列決定されている鋳型と補体との間の開放ポアに戻り（図１２Ｃを参照）、鋳型と相補鎖が共有結合していないという事実を説明している。
【０５０６】
配列番号１０及び配列番号１１は、図１２Ａ〜１２ＤからのポリヌクレオチドのＲＮＮアルゴリズムをベースとするＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに由来する配列である。ランダムに断片化された二本鎖ポリヌクレオチド断片からの鋳型及び補体が、修飾ナノポアによって配列決定されたことを実証するために、これらを高い忠実度で整列させることができる。
【０５０７】
図１２Ａ〜図１２Ｄにおいて、＊で印を付けた位置は、配列番号５及び配列番号６に見られるＳｐ１８スペーサーであり、このモチーフの存在は、この実施例に記載の後続アダプターがポリヌクレオチドに連結されることと、この後続アダプターの存在が（表３に見られるように）後続対の割合を非常に高めることを示す。
【０５０８】
図１３は対数目盛での「鎖間の時間」を秒単位で示す。標識「鎖」は、ナノポアを通るポリヌクレオチド配列のヘリカーゼ制御移動の電気信号を分類するために使用される。これは当業界で知られている方法を用いて分類される。鎖は開放ポアに戻ることによって容易に分割される。この実施例に記載されているように後続アダプターを用いて、矢印は実施例４からのデータ内の顕著な個体群を示す。実施例２及び４では、ＴｎとＣｎの間の時間がＴとＴ、又はｂＴとＴｎ、又はＣｎとＴの間の時間より一般に短いので、この個体群は後続対の割合の増加を示している。これは、鎖間の時間が短縮されるので、後続アダプターを用いてスループットを向上させることもできることを示している。
[実施例５]
【０５０９】
この実施例は、鋳型と補体が共有結合していない場合に二本鎖ポリヌクレオチドの鋳型（捕捉された第一鎖）及び補体（第一鎖の逆相補体）を特徴付ける方法を説明する。後述のようにデータ解析の後に決定された鋳型及び補体の同定は、実施例において「後続対」として言及される。いくつかの実施形態では、対が互いに１分以内に起こる＞８０％の重複がある際に、潜在的な後続対が同定される。いくつかの実施形態では、潜在的な後続対は、後続対がすぐに発生した際に同定され、９５〜１００％の重複がある。
【０５１０】
鋳型のみの鎖（すなわち、後続対に属すると分類されなかったもの）は、本明細書において「Ｔ」と呼ばれる。後続対に属する鋳型鎖は本明細書において「Ｔｎ」と呼ばれ、後続対に属する相補鎖は本明細書において「Ｃｎ」と呼ばれる。「ｎ」は後続対のＴｎ及びＣｎ構成要素を同定するために使用することができ、例えば、Ｔ１及びＣ１は後続対である。
【０５１１】
この実施例では、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ配列決定キットからの標準的な構成要素を、Ｍｉｎｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｌｏｗｃｅｌｌ（本明細書に記載のポアタグを含むように修飾されていないナノポアのアレイを含むＳｐｏｔＯＮフローセル）とともに、本明細書中に記載されるように、修飾ナノポア及び後続アダプターの非存在下で、後続対の検出の頻度を実証するために使用した。
【０５１２】
材料及び方法
【０５１３】
ゲノムＤＮＡへの制御アダプターの連結
【０５１４】
対照アダプターのゲノムＤＮＡへの連結（例えば、実施例２に記載されているように）は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ配列決定キットを用いて製造ガイドラインに従って行った。１０００ｎｇの末端修復及びｄＡテイル大腸菌ゲノムＤＮＡを、１×Ｂｌｕｎｔ／ＴＡマスターミックス（ＮＥＢ  Ｍ０３６７Ｌ）中、５．５μＬの上記からの６４０ｎＭの後続アダプターを用いて１００μＬ中で、室温で２０分間連結した。次に、実施例２に記載の通りＳＰＲＩ精製を実施した。この試料は後続アダプターゲノムＤＮＡと呼ばれる。
【０５１５】
後続アダプターゲノムＤＮＡへの酵素−アダプター複合体の連結
【０５１６】
Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されている配列決定キットＢＡＭ（Ｂａｒｃｏｄｅ  Ａｄａｐｔｅｒ  Ｍｉｘ）のアリコートを氷上で解凍した。２０μＬのＢＡＭを、５０μＬの対照アダプターゲノムＤＮＡ、２０μＬのＮＥＢＮｅｘｔクイック連結反応緩衝液及び１０μＬのクイックＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｅ６０５６Ｌ）とともに１００μＬ中で、室温で１０分間連結した。次に、実施例２に記載の通りＳＰＲＩ精製２を実施した。
【０５１７】
電気測定
【０５１８】
鎖がナノポアを通過する際に電気測定値を測定し取得する方法は、上記の実施例２に記載したのと同様の方法で実施した。
【０５１９】
データ解析
【０５２０】
収集した電気測定値のデータ処理及び解析は、上記の実施例２に記載したのと同様の方法で実施した。
【０５２１】
結果
【０５２２】
その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１５／０５５９８１に記載されているようなヘリカーゼ、例えばＤｄａヘリカーゼを、修飾ナノポアを通るポリヌクレオチドの動きを制御するために使用した。例えば、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１６／０３４５９１に記載の修飾ＣｓｇＧナノポアであり、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。以下の表３の行５は、この例におけるデータ解析によって割り当てられたＴ、Ｔｎ及びＣｎ鎖の数を示す。全鎖の０．６％は後続対として分類されている。
【表３】
2020500528.tif 000005
【０５２３】
表３は、本明細書中の実施例２〜５における、鋳型のみ（その相補対が続かない）、鋳型−ｎ（後続対の第一鎖）及び相補−ｎ（後続対の逆相補体）であると決定された鎖の数を示す。
【表４】
2020500528.tif 000006
【０５２４】
表４は図１１に示されている、ＭｉｎＩＯＮ後続実行のシングルチャンネル（チャンネル２４１）からの鎖の解析データを含む。表には、次の列が含まれている。
【０５２５】
Ｆａｓｔ５＝ＭｉｎＩＯＮ実行中にｆａｓｔ５の出力に保存される、鎖の一意のファイル名
【０５２６】
開始/秒＝鎖の開始時間（秒）
【０５２７】
終了/秒＝鎖の終了時間（秒）
【０５２８】
期間/秒＝鎖の持続期間（秒）
【０５２９】
ゲノム＿開始＿位置＝ベースとなる鎖を大腸菌基準に整列させた後、鎖の部分が整列したゲノム基準の開始位置。
【０５３０】
ゲノム＿終了＿位置＝ベースとなる鎖を大腸菌基準に整列させた後、鎖の部分が整列したゲノム基準の終了位置。
【０５３１】
時間間隔/秒＝対の場合、鎖間の時間（秒）
【０５３２】
重複率＝対の場合、整列のオーバーラップを比較する重複率（各対のゲノム＿開始＿位置とゲノム＿終了＿位置の間）
【０５３３】
対は、鎖間の非常に短い時間で同定され、基準に整列されたときに重複する。
[実施例６]
【０５３４】
この実施例は、低濃度のＤＮＡが配列決定装置に添加されたときに、配列決定されたＤＮＡ分子の数を増加させる方法を記載する。
【０５３５】
この実施例では、これは修飾型ナノポアに付着したポリヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ配列を含む修飾型ＤＮＡ酵素アダプターの生成によって達成される。この実施例で使用された例示的なアダプターは図３２Ａ〜３５に示されている。
【０５３６】
例示的な材料及び方法
【０５３７】
アダプターの準備（例えば、図３２Ａに示すような、アダプター設計Ａ）
【０５３８】
トップ鎖（配列番号１２）、ブロッカー鎖（配列番号１３）及びボトム鎖（配列番号１４）を、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１００ｍＭのＫＯＡｃ、ｐＨ８（総容量４０μＬ）中で、それぞれ１０μＭ、１１μＭ及び１１μＭで、毎分２℃で温度を９５℃から２２℃に調節することによってアニールした。アニールした鎖を８００μＬの２．８μＭヘリカーゼ（例えば、当該技術分野において既知の野生型又はその変異体を含むＤｄａヘリカーゼ）と混合し、室温で５分間インキュベートした。１０μＬの８．１ｍＭのテトラメチルアゾジカルボキサミドを溶液に添加し、３５℃で１時間インキュベートした。最終濃度５００ｍＭになるようにＮａＣｌを添加し、ＭｇＣｌ２を最終濃度１０ｍＭまで添加し、ＡＴＰを最終濃度１ｍＭまで添加し、そして溶液を室温で３０分間インキュベートした。試料をＨＰＬＣで精製した。
【０５３９】
配列番号１２
【０５４０】
／５ＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／ＧＧＣＧＴＣＴＧＣＴＴＧＧＧＴＧＴＴＴＡＡＣＣ  ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ／ｉＳｐ１８／ＡＡＴＧＴＡＣＴＴＣＧＴＴＣＡＧＴＴＡＣＧＴＡＴＴＧＣＴ
【０５４１】
配列番号１３
【０５４２】
／５ＢＮＡ−Ｇ／／ｉＢＮＡ−Ｇ／／ｉＢＮＡ−Ｔ／／ｉＢＮＡ−Ｔ／／ｉＢＮＡ−Ａ／ＡＡＣＡＣＣＣＡＡＧＣＡＧＡＣＧＣＣ  ＴＡＡＧＴＣＡＧＡＧＡＧＧＴＴＣＣ
【０５４３】
配列番号１４
【０５４４】
／５Ｐｈｏｓ／ＧＣＡＡＴ  ＡＣＧＴＡＡＣＴＧＡＡＣＧＡＡＧＴ／ｉＢＮＡ−Ａ／／ｉＢＮＡ−ｍｅＣ／／ｉＢＮＡ−Ａ／／ｉＢＮＡ−Ｔ／／ｉＢＮＡ−Ｔ／ＴＴＴ  ＧＡＧＧＣＧＡＧＣＧＧＴＣＡＡ
【０５４５】
アダプターの準備（例えば、図３４Ａに示すような、アダプター設計Ｂ）
【０５４６】
トップ鎖（配列番号１２）、ブロッカー鎖（配列番号１５）及びボトム鎖（配列番号１６）を、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１００ｍＭ  ＫＯＡｃ、ｐＨ  ８（総容量４０μＬ）中で、毎分２℃で、９５℃から２２℃に温度を調節することによって、それぞれ１０μＭ、１１μＭ及び１１μＭでアニールした。アニールした鎖を８００μＬの２．８μＭヘリカーゼ（例えば、当技術分野で既知の野生型又はその変異体を含むＤｄａヘリカーゼ）と混合し、室温で５分間インキュベートした。１０μＬの８．１ｍＭテトラメチルアゾジカルボキサミドを溶液に添加し、そして３５℃で１時間インキュベートした。ＮａＣｌを５００ｍＭ最終濃度まで添加し、ＭｇＣｌ２を１０ｍＭ最終濃度まで添加し、ＡＴＰを１ｍＭ最終濃度まで添加し、そして溶液を室温で３０分間インキュベートした。試料をＨＰＬＣで精製した。
【０５４７】
配列番号１５
【０５４８】
ＧＧＴＴＡＡＡＣＡＣＣＣＡＡＧＣＡＧＡＣＧＣＣ  ＴＴＴ  ＧＡＧＧＣＧＡＧＣＧＧＴＣＡＡ
【０５４９】
配列番号１６
【０５５０】
／５Ｐｈｏｓ／ＧＣＡＡＴ  ＡＣＧＴＡＡＣＴＧＡＡＣＧＡＡＧＴ／ｉＢＮＡ−Ａ／／ｉＢＮＡ−ｍｅＣ／／ｉＢＮＡ−Ａ／／ｉＢＮＡ−Ｔ／／ｉＢＮＡ−Ｔ／ＴＴＴ  ＴＡＡＧＴＣＡＧＡＧＡＧＧＴＴＣＣ
【０５５１】
連結の準備
【０５５２】
アダプター設計Ａは、７５μＬの７ｋ  ＭＷＣＯゼバスピンカラム、カラムあたり１０μＬの２カラムを用いて、製造元のプロトコルに従って、５０ｍＭトリス、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８に交換した緩衝液である。試料をＱｕｂｉｔ（登録商標）ｄｓＤＮＡ  ＨＳ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを用いて測定して２．６５  ｎｇ／μＬに希釈した。以下の成分を１．５ｍＬのＤＮＡ低結合チューブ（エッペンドルフにより供給）中で組み合わせ、混合し、そして室温で１０分間インキュベートした：１１．３μＬのアダプター（５０ｍＭのトリス、２０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８、２．６５ｎｇ／μＬ中）、８．７μＬの５０ｍＭのトリス、２０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ８、０．９μＬの３．６ｋｂ  ｄＡ−ｔａｉｌｅｄ  ＤＮＡ（４０ｎｇ／μＬ；配列番号２６））、２９．１μＬの蒸留水、及び５０μＬのＴＡリガーゼマスターミックス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＵＫ）により供給）。
【０５５３】
次に、４０μＬのＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を添加し、試料をピペットで混合し、室温で５分間インキュベートした。ビーズを磁気ラック上でペレット化し、上清を除去した。ペレット化したビーズを１４０μＬのアダプタービーズ結合緩衝液で洗浄し、磁気ラック上でエッペンドルフチューブを２回連続して１８０°回転させることによってビーズをアダプタービーズ結合緩衝液中に再懸濁した。ビーズを磁気ラック上でペレット化し、上清を除去した。ペレット化したビーズを再度１４０μＬの緩衝液で洗浄し、磁気ラック上でエッペンドルフチューブを２回連続して１８０°回転させることによりビーズを緩衝液に再懸濁した。ビーズを磁気ラック上でペレット化し、緩衝液を除去し、ペレットを磁気ラックに戻す前に遠心分離機中で短時間パルスし、そして緩衝液の最後の残留物を除去した。
【０５５４】
ペレットを、テザー（配列番号９）を含有する２５μＬの溶出緩衝液中でピペット混合することによって再懸濁し、このライブラリーを氷上で１０分間ビーズから溶出させるために放置した。
【０５５５】
ポア修飾
【０５５６】
ポアタグの結合を可能にするように修飾ＣｓｇＧナノポアを生成した。例えば、システイン、非天然塩基などのようなＣｓｇＧモノマーが（例えば、アミノ酸置換によって）修飾され、ポアタグの接合のために提供される。修飾ＣｓｇＧモノマーを、本明細書に記載のように、一つ以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列番号７をコード化するプラスミドを含むＰＴ７ベクターを用いて生成した。プラスミドをＢＬ２１誘導体細胞系に形質転換し、内因性ＣｓｇＧ遺伝子をカナマイシン耐性で置換するように突然変異させた。細胞を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を含む寒天プレート上でプレーティングし、３７℃で１６時間インキュベートした。カルベネシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を含有する１００ｍｌのＬＢ培地を植菌するために、シングルコロニーを使用し、そしてスターター培養物を３７℃／２５０ｒｐｍで１６時間増殖させた。４×２５ｍｌのスターター培養物を用いて、カルベネシリン（１００μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）３ｍＭ  ＡＴＰ、１５ｍＭ  ＭｇＳＯ  ４、０．５ｍＭラムノースを含む４×５００ｍｌ  ＬＢに植菌した。培養物を定常期に達するまで増殖させ、次いで３７℃／２５０ｒｐｍで更に２時間増殖させた。グルコースを０．２％になるまで添加して温度を１８℃に低下させ、培養物が１８℃になると、１％α−ラクトース一水和物を添加することによってタンパク質発現を誘導した。培養物を１８℃／２５０ｒｐｍで１６時間インキュベートした。
【０５５７】
細胞を遠心分離により採取し、そして界面活性剤溶解（Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ）にかけた。溶解したら、試料を初期連鎖球菌精製（５ｍｌ  ＨＰの連鎖球菌トラップ）のために繰り越し、溶出画分を６０℃に加熱し、回転させ、上清をｑＩＥＸ精製のために繰り越した（１ｍｌ  Ｈｉ  ｔｒａｐ  Ｑ  ＨＰ）。正しいタンパク質を含む画分をプールし、濃縮し、そして２４ｍｌのＳｕｐｅｒｄｅｘで最終磨きのために繰り越した。
【０５５８】
上記のナノポアのアリコートを以下のようにモルフォリノオリゴ（配列番号８）で修飾した。１．３μＬの１Ｍ  ＤＴＴ（ジチオトレイトール）を、上からの約９．７５μｇのナノポアを含有する１３０μＬのナノポアに添加し、室温で１時間インキュベートした。製造元のガイドラインに従い、０．５ｍＬの７ＭＷＣＯ  Ｚｅｂａ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてこの試料を反応緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ及び０．１％Ｂｒｉｊ５８、ｐＨ７）に緩衝液交換した。製造元のガイドラインに従って７ＭＷＣＯ  Ｚｅｂａ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてこの試料を再び反応緩衝液に緩衝液交換した。２ｍＭのモルフォリノオリゴヌクレオチド（配列番号８）のストックを、ＧｅｎｅＴｏｏｌｓによって供給された３００ｎｍｏｌのモルフォリノオリゴを１５０μＬのヌクレアーゼフリー水（ＡｍｂｉｏｎＴＭ）に溶解することによって製造した。これを上記の緩衝液交換試料に添加して最終濃度を５００μＭにし、室温で一晩インキュベートした。これは修飾ナノポアとして知られている。
【０５５９】
電気測定
【０５６０】
電気測定値は、緩衝液（２５ｍＭ  Ｋリン酸緩衝液、１５０ｍＭ  フェロシアン化カリウム（ＩＩ）、１５０ｍＭ  フェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８．０）中のブロックコポリマーに挿入された単一修飾ナノポアから取得した。ブロックコポリマーに挿入された単一修飾ナノポアを達成した後に、２ｍＬの緩衝液（２５ｍＭ  Ｋリン酸緩衝液、１５０ｍＭ  フェロシアン化カリウム（ＩＩ）、及び１５０ｍＭ  フェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）、ｐＨ８．０）をシステムに流して過剰の修飾ナノポアを除去した。
【０５６１】
プライミング緩衝液をナノポアシステムに流した。配列決定ミックスを製造するために、プライミング緩衝液、ライブラリー（Ｑｕｂｉｔ（登録商標）のｄｓＤＮＡ  ＨＳアッセイキットを用いて測定した場合）及び蒸留水を一緒に混合した。その後、配列決定混合物をナノポアシステムに添加した。
【０５６２】
結果
【０５６３】
ヘリカーゼ（例えば、当技術分野で既知の野生型又はその変異体を含むＤｄａヘリカーゼ）を用いて修飾ナノポアを通るポリヌクレオチドの動きを制御した。図３８は、未修飾ナノポアを通って転座するときのポリヌクレオチドの電流トレースを示す。すなわち、これはナノポアと検体との間にオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションがないシステムである。このシステムでは、鎖間の時間は約１秒に均等に分布する（図４０を参照）。
【０５６４】
図３９は、それらが配列番号８で修飾ナノポアを通って転座するときのポリヌクレオチドの現在の電流トレースを示す。すなわち、これはナノポアと検体との間のハイブリダイゼーションを可能にするシステムである。このシステムでは、鎖間に（ａ）約１秒に均等に分布した（ｂ）検体の迅速な捕捉（＜０．１秒）の二つの時間個体群がある（図４０を参照）。これは、ポアが別の鎖を配列決定している間に検体がポアにハイブリダイズすることを示す。
【０５６５】
二つのシステム（ポアと検体の間にハイブリダイゼーションがないもの、ポアと検体の間にハイブリダイゼーションを可能にするもの）間のこの違いは図４０にまとめられており、それは二つのシステムの鎖間時間のヒストグラムを示す。これは、ハイブリダイゼーションの非存在下で一つの捕捉タイプのみが観察され、検体がポアにハイブリダイズできる場合、検体が前の検体の後に迅速に捕捉される（＜０．１秒）更なる捕捉タイプがあることを実証する。鎖間のこの短縮された時間は、図４１に配列決定された鎖の総数を増加させた。
【０５６６】
検体の両端はポアに繋がることができる。
[実施例７]
【０５６７】
以下は、ピリジルジチオモルフォリノを用いてナノポア（例えば、ＣｓｇＧナノポア）をナノポアの外面に付着させるための修飾のための例示的なプロトコルである。
【０５６８】
タグ修飾ナノポアの生成
【０５６９】
ポアタグの結合を可能にするために修飾ナノポア（例えば、ＣｓｇＧナノポア）を生成した。例えば、システイン、非天然塩基などのようなＣｓｇＧモノマーが（例えば、アミノ酸置換によって）修飾され、ポアタグの結合のために提供される。修飾ＣｓｇＧモノマーを、本明細書に記載のように、一つ以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列番号７をコード化するプラスミドを含むＰＴ７ベクターを用いて生成した。プラスミドをＢＬ２１誘導体細胞系に形質転換し、内因性ＣｓｇＧ遺伝子をカナマイシン耐性で置換するように突然変異させた。細胞をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を含有する寒天プレート上に播種し、３７℃で１６時間インキュベートした。カルベネシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を含有する１００ｍｌのＬＢ培地に植菌するために、シングルコロニーを使用し、そしてスターター培養物を３７℃／２５０ｒｐｍで１６時間増殖させた。カルベネシリン（１００μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）３ｍＭ  ＡＴＰ、１５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、及び０．５ｍＭラムノースを植菌４×５００ｍｌのＬＢに植菌するために、４×２５ｍｌのスターター培養物を使用した。培養物を定常期に達するまで増殖させ、そして３７℃／２５０ｒｐｍで更に２時間増殖させた。グルコースを０．２％になるまで添加して温度を１８℃に低下させ、培養物が１８℃になると、１％α−ラクトース一水和物を添加することによってタンパク質発現を誘導した。培養物を１８℃／２５０ｒｐｍで１６時間インキュベートした。
【０５７０】
細胞を遠心分離により採取し、そして界面活性剤溶解（Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ）にかけた。溶解したら、試料は初期連鎖球菌精製（５ミｍｌのＨＰの連鎖球菌トラップ）のために持ち越した。溶出した画分を６０℃に加熱し、回転させ、上清をｑＩＥＸ精製（１ｍｌ  Ｈｉ  ｔｒａｐ  Ｑ  ＨＰ）のために持ち越した。正しいタンパク質を含む画分をプールし、濃縮し、そして２４ｍｌのＳｕｐｅｒｄｅｘで最終磨きのために持ち越した。
【０５７１】
上記のナノポアのアリコートを、以下のようにモルフォリノオリゴなどのポアタグで（例えば、配列番号８に示すように）修飾した。１．３μＬの１Ｍ  ＤＴＴ（ジチオトレイトール）を、約９．７５μｇのナノポアを含む１３０μＬの上記からのナノポアに添加し、室温で１時間インキュベートした。製造元のガイドラインに従い、０．５ｍＬの７ＭＷＣＯ  Ｚｅｂａ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてこの試料を反応緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ及び０．１％Ｂｒｉｊ５８、ｐＨ７）に緩衝液交換した。製造元のガイドラインに従って、７ＭＷＣＯ  Ｚｅｂａ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、この試料を再び反応緩衝液に緩衝液交換した。モルフォリノオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号８に示されるような）などの２ｍＭのポアタグのストックを、ヌクレアーゼフリー水（ＡｍｂｉｏｎＴＭ）中で製造した。これを上記緩衝液交換試料に最終濃度５００μＭまで添加し、室温で一晩インキュベートしたままにして修飾ナノポアを得た。
【０５７２】
解析と品質管理
【０５７３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−プロトコル
【０５７４】
２μＬの修飾及び未修飾ナノポアを８μＬの反応緩衝液に添加した。試料をＰＣＲブロックで９５℃に４分間加熱して、試料をオリゴマーからモノマーに分解した。１０μＬの２×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（６５．８ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、２６．３％（ｗ／ｖ）グリセロール、２．１％ＳＤＳ、０．０１％ブロモフェノールブルー）を各試料に添加した。試料を４〜２０％ＴＧＸゲル上で３００ｍＶで２３分間泳動させ、そしてＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇｅｌを用いて染色した。ゲルの結果を図２７Ａに示す。
【０５７５】
ピリジル−ジチオモルフォリノ修飾ポアへのハイブリダイゼーション−プロトコル
【０５７６】
１０μＬの修飾ナノポアは、修飾ナノポアに対して２倍過剰で付加された対応する蛍光ハイブリダイゼーション配列を有した。試料は総量２０μＬであった。各試料を室温で１時間放置した。５μＬの５×無色素ローディング（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５％グリセロール、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加した。試料を４〜２０％ＴＢＥゲル上で１６０ｍＶで８０分間泳動させた。ゲルをＣｙ３蛍光用ゲルスキャナーで泳動させ、ＳＹＢＲゴールド核酸ゲル染色を用いて染色し、そしてＳＹＰＲＯルビープロテインゲルを用いて染色した。ゲルの結果を図２８〜３０に示す。
[実施例７]
【０５７７】
この実施例は、ポリヌクレオチドを一緒に結合するために使用される付着方法がクリックケミストリーである場合の連結ポリヌクレオチドを特徴付ける方法を記載している。この実施例では、鋳型及び補体が共有結合していない場合、第一の二本鎖ポリヌクレオチドの鋳型（捕捉された第一鎖）及び補体（第一鎖の逆相補体）は、ナノポアを用いて特徴付けられる。鋳型及び補体が分離されると、第一の二本鎖ポリヌクレオチドに連結された後続アダプター中のポアテザーに相補的な配列が補体中に露出され、補体はナノポアに付着したポアテザーに結合する。相補鎖が第二の二本鎖ポリヌクレオチドに連結することができるように、連結アダプターも第一の二本鎖ポリヌクレオチドに連結される。
【０５７８】
材料及び方法
【０５７９】
ゲノムＤＮＡへの後続アダプターの連結
【０５８０】
後続アダプターは、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ８、１００ｍＭの酢酸カリウム中で、毎分２℃で９５℃から２２℃まで、それぞれ１０μＭ及び１１μＭで一緒にアニールされたバーコードトップ鎖（配列番号１７）及びバーコードボトム鎖（配列番号１８）を含む。ハイブリダイズしたＤＮＡは後続アダプターとして知られている。６．４μＬの後続アダプターを、後続アダプターの６４０ｎＭ希釈物を生成するために、９３．６μＬの５０ｍＭ  トリス塩酸  ｐＨ７．５、２０ｍＭ  塩化ナトリウムに添加した。
【０５８１】
配列番号１７：後続アダプタートップ鎖
【０５８２】
／５Ｐｈｏｓ／ＴＡＡＣＧＡＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＣＧＧＣＧＴＣＴＧＣＴＴＧＧＧＴＧＴＴＴＡＡＣＣ／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／ＴＴＴＴＴＧＴＣＡＧＡＧＡＧＧＴＴＣＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＡＧＧＴＴＣＣＴ
【０５８３】
配列番号１８：後続アダプターボトム鎖
【０５８４】
／５Ｐｈｏｓ／ＧＧＡＡＣＣＴＣＴＣＴＧＡＣＴＴＧＧＡＡＣＣＴＣＴＣＴＧＡＣＡＡＡＡＡ／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／ＧＧＴＴＡＡＡＣＡＣＣＣＡＡＧＣＡＧＡＣＧＣＣＧＡＧＡＴＡＧＡＡＡＣＡＡＣＣＣＡＴＣＡＧＡＴＴＧＴＧＴＴＴＧＴＴＡＧＴＣＧＣＴ／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／ＡＧＣＧＡＣＴＡＡＣＡＡＡＣＡＣＡＡＴＣＴＧＡＴＧ／ＤＢＣＯ／
【０５８５】
ゲノムＤＮＡへの後続アダプターの連結は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ配列決定キットを用いて操作ガイドラインに従って行った。１０００ｎｇの末端修復及びｄＡテイル大腸菌ゲノムＤＮＡを、１×Ｂｌｕｎｔ／ＴＡマスターミックス（ＮＥＢ  Ｍ０３６７Ｌ）中、５．５μＬの上記からの６４０ｎＭの後続アダプターを用いて１００μＬ中で、室温で２０分間連結した。試料のＳＰＲＩ精製を実施例２に記載の通りに行った。この試料は後続アダプターゲノムＤＮＡと呼ばれる。
【０５８６】
後続アダプターゲノムＤＮＡへの連結酵素−アダプター複合体の連結
【０５８７】
リーダー鎖（配列番号１９）、ブロッカー鎖（配列番号２０）及びボトム鎖（配列番号２１）を５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８、１００ｍＭ酢酸カリウム中で、それぞれ５．５μＭ、６μＭ及び６μＭで、毎分２℃で、９５℃から２２℃までアニールした。ハイブリダイズしたＤＮＡは連結酵素−アダプター複合体として知られている。
【０５８８】
配列番号１９：連結配列決定アダプタートップ鎖
【０５８９】
／Ａｚｉｄｅ／ＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＡＴＣＴＣ／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／ＧＧＣＧＴＣＴＧＣＴＴＧＧＧＴＧＴＴＴＡＡＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ／ｉＳｐ１８／ＡＡＴＧＴＡＣＴＴＣＧＴＴＣＡＧＴＴＡＣＧＴ
【０５９０】
配列番号２０：連結配列決定アダプターブロッカー鎖
【０５９１】
ＧＧＴＴＡＡＡＣＡＣＣＣＡＡＧＣＡＧＡＣＧＣＣＴＴＴＧＡＧＧＣＧＡＧＣＧＧＴＣＡＡ
【０５９２】
配列番号２１：連結配列決定アダプターボトム鎖
【０５９３】
／５Ｐｈｏｓ／ＴＣＧＴＴＡＡＣＧＴＡＡＣＴＧＡＡＣＧＡＡＧＴ／ｉＢＮＡ−Ａ／／ｉＢＮＡ−ｍｅＣ／／ｉＢＮＡ−Ａ／／ｉＢＮＡ−Ｔ／／ｉＢＮＡ−Ｔ／
【０５９４】
製造元の指示に従って、Ｔ４Ｄｄａのアリコート−（Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ）（配列番号２４：突然変異Ｅ９４Ｃ／Ｆ９８Ｗ／Ｃ１０９Ａ／Ｃ１３６Ａ／Ａ３６０Ｃ、次いで（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２（ここで（ΔＭ１）Ｇ１Ｇ２＝Ｍ１の欠失、次いで付加Ｇ１及びＧ２））を氷上で解凍した後、０．５ｍｌのＺｅｂａカラムを通して５０μｌを５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８、１００ｍＭ  酢酸カリウム、２ｍＭ  ＥＤＴＡに緩衝液交換した。Ａ２８０ｎｍ値を用いて回収したタンパク質を定量し、同一の緩衝液を用いて０．２５ｍｇ  ｍｌ−１に調整した。
【０５９５】
２７μＬの緩衝液交換タンパク質を、ＤＮＡ低結合エッペンドルフ中で３μＬの連結酵素−アダプター複合体と混合し、そして３５℃で１０分間インキュベートした。次に、０．３７μＬの８．１ｍＭ  ＴＭＡＤを添加し、試料を３５℃で６０分間インキュベートした。そして、３０μＬの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８、１Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ｒＡＴＰを添加し、室温でさらに２０分間放置した。
【０５９６】
２２２μＬのＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を添加し、回転子上で試料を室温で５分間インキュベートした。ビーズを磁気ラック上でペレット化し、上清を除去した。まだ磁気ラック上にある間に、ビーズを５００ｕｌの５０ｍＭのトリスｐＨ７．５、２．５ＭのＮａＣｌ、２０％ＰＥＧ（重量／体積）８，０００で洗浄し、３６０°回転させてラック上でペレットを浸した。洗浄緩衝液を除去し、ペレットを遠心分離機で短時間パルスした後、溶液の最後の残留物を除去するために磁気ラックに戻した。ペレットを、プレロード連結酵素−アダプター複合体として知られている精製アダプターを回収するために磁気ラック上に置く前に、３０μｌの５０ｍＭ  トリス  ｐＨ７．５、２０ｍＭ  ＮａＣｌで室温で５分間再懸濁した。
【０５９７】
２０μＬのプレロード連結酵素−アダプター複合体を、５０μＬの後続アダプターゲノム−ＤＮＡ、２０μＬのＮＥＢＮｅｘｔ  Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ緩衝液及び１０μＬのＱｕｉｃｋ  Ｔ４  ＤＮＡ  リガーゼ（Ｅ６０５６Ｌ）とともに１００μＬ中、室温で１０分間連結した。ＳＰＲＩ精製を以下のように実施した。４０μＬのＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を添加し、試料をピペットで混合し、室温で５分間インキュベートした。ビーズを磁気ラック上でペレット化し、上清を除去した。ペレット化したビーズを１４０μＬのアダプタービーズ結合緩衝液で洗浄し、磁気ラック上のエッペンドルフチューブを二回連続して１８０°回転させることによってビーズをアダプタービーズ結合緩衝液中に再懸濁した。ビーズを磁気ラック上でペレット化し、上清を除去した。ペレット化したビーズを再度１４０μＬの緩衝液で洗浄し、磁気ラック上でエッペンドルフチューブを２回連続して１８０°回転させることによりビーズを緩衝液に再懸濁した。ビーズを磁気ラック上でペレット化し、緩衝液を除去し、ペレットを磁気ラックに戻す前に遠心分離機で短時間パルスし、次いで緩衝液の最後の残余物を除去した。
【０５９８】
ペレットを２５μＬのヌクレアーゼフリー水（ＡｍｂｉｏｎＴＭ）にピペットで混合することによって再懸濁し、このライブラリーを氷上で１０分間ビーズから溶出させた。
【０５９９】
タグ修飾ナノポアの生成
【０６００】
アダプターの捕捉ポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列を含むように修飾されているナノポアを生成する方法は、上記の実施例２に記載したのと同様の方法で実施した。
【０６０１】
電気測定
【０６０２】
鎖がナノポアを通過する際に電気測定値を測定し取得する方法は、上記の実施例２に記載したのと同様の方法で実施した。
【０６０３】
データ解析
【０６０４】
ＤＮＡ鎖が修飾ナノポアを通過する際に、ナノポアを通る電流の変化を測定し収集した。次に、ｆａｓｔｑデータを得るために、ベースコールアルゴリズム、例えばリカレントニューラルネットワーク（ＲＮＮ）アルゴリズムを用いて鎖の配列を決定した。その後、当技術分野で既知の配列位置合せツールを用いてｆａｓｔｑ配列データを参照ゲノムに整列させた。
[実施例８]
【０６０５】
この実施例は、付着方法が非共有的である、二本鎖標的ポリヌクレオチドを特徴付け、連結する方法を記載している。第一の二本鎖標的ポリヌクレオチドの相補鎖は第二の二本鎖標的ポリヌクレオチドを補充し、それをポアに局所的に集中させる。次に、第一の相補鎖が配列決定されると、補充された第二の二本鎖標的ポリヌクレオチドは、実施例２で生じるのと同様の方法で、相補鎖から脱ハイブリダイズし、代わりにポアテザーにハイブリダイズする。これにより、第一及び第二（及びそれに続く、第三、第四、第五など）の二本鎖標的ポリヌクレオチドが、鎖間の最短時間でポアを通って相互に続くことを可能にする。第一の標的ポリヌクレオチドが配列決定されている間に第二標的ポリヌクレオチドを補充することができるため、二本鎖標的ポリヌクレオチドの濃度が低い場合、これは特に有用である。
【０６０６】
検体は実施例７に記載したのと同じ方法で生成した。ただし配列番号１７〜２１ではなく、配列番号５、６、２２、１５及び２３のものを用いた。他の全ての手順、試薬及び条件は実施例７に記載のものと同じである。
【０６０７】
配列番号５：後続アダプタートップ鎖
【０６０８】
／５Ｐｈｏｓ／ＧＧＣＧＴＣＴＧＣＴＴＧＧＧＴＧＴＴＴＡＡＣＣ／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／ＴＴＴＴＴＧＴＣＡＧＡＧＡＧＧＴＴＣＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＡＧＧＴＴＣＣＴ
【０６０９】
配列番号６：後続アダプターボトム鎖
【０６１０】
／５Ｐｈｏｓ／ＧＧＡＡＣＣＴＣＴＣＴＧＡＣＴＴＧＧＡＡＣＣＴＣＴＣＴＧＡＣＡＡＡＡＡ／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／ＧＧＴＴＡＡＡＣＡＣＣＣＡＡＧＣＡＧＡＣＧＣＣＡＧＣＡＡＴ
【０６１１】
配列番号２２：フィッシングアダプタートップ鎖
【０６１２】
／５ＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／ＴＴＧＴＣＡＧＡＧＡＧＧＴＴＣＣ／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／／ｉＳｐＣ３／ＧＧＣＧＴＣＴＧＣＴＴＧＧＧＴＧＴＴＴＡＡＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ／ｉＳｐ１８／ＡＡＴＧＴＡＣＴＴＣＧＴＴＣＡＧＴＴＡＣＧＴ
【０６１３】
配列番号１５：フィッシングアダプターブロッカー鎖
【０６１４】
ＧＧＴＴＡＡＡＣＡＣＣＣＡＡＧＣＡＧＡＣＧＣＣＴＴＴＧＡＧＧＣＧＡＧＣＧＧＴＣＡＡ
【０６１５】
配列番号２３：フィッシングアダプターボトム鎖
【０６１６】
／５Ｐｈｏｓ／ＡＣＧＴＡＡＣＴＧＡＡＣＧＡＡＧＴ／ｉＢＮＡ−Ａ／／ｉＢＮＡ−ｍｅＣ／／ｉＢＮＡ−Ａ／／ｉＢＮＡ−Ｔ／／ｉＢＮＡ−Ｔ／
[実施例９]
【０６１７】
これは付着方法が非共有的である、二本鎖標的ポリヌクレオチドを特徴付け、連結する方法を記載する別の実施例である。該方法は実施例８と全く同様に実施されるが、配列番号９に異なる結合鎖を用いる。二成分フィッシングテザーは、見られるイベントの割合を増加させるために、後続の配列及びポアテザーのための第二の除湿部位を提供する。
【０６１８】
配列決定ミックスを形成するとき、配列番号９は４００ｎＭのアニールされた配列番号２４及び配列番号２５で置き換えられる。他の全ての手順、試薬及び条件は実施例８に記載のものと同一である。
【０６１９】
配列番号２４：フィッシングテザートップ鎖
【０６２０】
ＴＴＧＴＣＡＧＡＧＡＧＧＴＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＧＴＴＧＧＴＧＣＴＧＡＴＡＴＴＧＣＴＴＴＴＴＴＧＡＣＣＧＣＴＣＧＣＣＴＣ
【０６２１】
配列番号２５：フィッシングテザーボトム鎖
【０６２２】
ＧＣＡＡＴＡＴＣＡＧＣＡＣＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＡＡＣＣＴＴ／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／／ｉＳｐ１８／ＴＴ／３ＣｈｏｌＴＥＧ／
[実施例１０]
【０６２３】
この実施例は、付着方法が非共有的である、多くの二本鎖標的ポリヌクレオチドを特徴付け、連結する方法を記載している。第一の二本鎖標的ポリヌクレオチドの相補鎖は他の多くの二本鎖標的ポリヌクレオチドを補充し、それらをポアの近傍に集中させる。これは、一般的なバルク溶液中よりもポアの周りにより高い局所濃度を提供し、したがって、二本鎖標的ポリヌクレオチドは鎖間の最短時間で開放ポアを通って相互に追従する。これは二本鎖標的ポリヌクレオチドの濃度が低い場合に特に有用である。この実施例は実施例８と同様に実施される。しかしながら、配列番号９をアニーリングするよりもむしろ、一本鎖結合タンパク質に結合したオリゴからなるテザーが使用される。
【０６２４】
第一の二本鎖標的ポリヌクレオチドの鋳型鎖を配列決定するとき、相補鎖をｓｓＤＮＡとして溶液中に放出する。他の二本鎖標的ポリヌクレオチドの一本鎖結合タンパク質はｓｓＤＮＡに結合することができる。後続プロセスの一部として、相補鎖を配列決定すると、相補鎖の３´がポアに向かって引き戻される。ｓｓＤＮＡ相補鎖上の一本鎖結合タンパク質は、ポアを通る補体の動きを制御するモータータンパク質に遭遇したとき、相補鎖から追放され、そしてポアの周囲に堆積して局所濃度を増加させる。
【０６２５】
他の実施形態
【０６２６】
本明細書に開示されている全ての特徴は、任意の組合わせで組み合わせてもよい。本明細書に開示されている各特徴は、同一の、同等の、又は類似の目的を果たす代替特徴によって置き換えてもよい。したがって、他に明示的に述べられていない限り、開示された各特徴は、包括的な一連の同等の又は類似の特徴の一例にすぎない。
【０６２７】
上記の説明から、当業者は本開示の本質的な特徴を容易に確認することができ、そして本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本開示を様々な使用及び条件に適合させるために様々な変更及び修正を加えることができる。したがって、他の実施形態も特許請求の範囲内にある。
【０６２８】
等価物
【０６２９】
本開示のいくつかの実施形態を本明細書で記載及び図示してきたが、当業者は、機能を実行し、及び／又は結果を得るための様々な他の手段及び／又は構造及び／又は説明した利点のいずれか又は複数を容易に想到するであろう。そのような変形及び／又は修正の各々は、本明細書に記載の発明の実施形態の範囲内にあるとみなされる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載された全てのパラメータ、寸法、材料、及び構成が例示的であることを意味し、実際のパラメータ、寸法、材料、及び／又は構成は、本開示の教示が使用されている特定の用途に依存することを容易に理解するであろう。当業者であれば、本明細書に記載の特定の発明の実施形態に対する多くの等価物を認識し、又は日常的な実験のみを用いて確かめることができるであろう。したがって、前述の実施形態は実施例としてのみ提示されており、添付の特許請求の範囲及びその等価物の範囲内で、本発明は具体的に記載及び特許請求されている以外にも実施され得ることを理解すべきである。本開示の発明の実施形態は本明細書に記載の個々の特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法に関する。さらに、そのような特徴、システム、物品、材料、及び／又は方法が互いに矛盾しない場合、二つ以上のそのような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法の任意の組合わせは本開示の発明の範囲内に含まれる。
【０６３０】
本明細書で定義及び使用される全ての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文書中の定義、及び／又は定義された語の通常の意味を支配すると理解されるべきである。
【０６３１】
本明細書に開示されている全ての参考文献、特許及び特許出願は、それぞれが引用されている主題に関して参照により組み込まれており、それは場合によっては文書の全体を包含することがある。
【０６３２】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、そうでないことが明確に示されていない限り、「少なくとも一つ」を意味すると理解されるべきである。
【０６３３】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される「及び／又は」という句は、そのように結合された要素、すなわち場合によっては接続的に存在し、他の場合には非接続的にある要素の「いずれか又は両方」を意味すると理解されるべきである。「及び／又は」で列挙される複数の要素は、同じように解釈されるべきであり、すなわち、そのように結合される要素の「一つ又は複数」である。具体的に特定される要素に関連するか無関係であるかにかかわらず、「及び／又は」節によって具体的に特定される要素以外の他の要素が任意に存在してもよい。したがって、非限定的な例として、「含む」などの開放型言語とともに使用されたときの「Ａ及び／又はＢ」への言及は、一つの実施形態では、Ａのみ（場合によりＢ以外の要素を含む）を指すことができる。別の実施形態では、Ｂのみ（場合によりＡ以外の要素を含む）を指すことができる。さらに別の実施形態では、ＡとＢの両方（場合により他の要素を含む）などを指すことができる。
【０６３４】
本明細書及び特許請求の範囲で使用されるように、「又は」は上で定義された「及び／又は」と同一の意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト内の項目を分離するとき、「又は」又は「及び／又は」は包括的、すなわち、少なくとも一つの、しかし複数の要素のリストの包含も含むものとして解釈されるものとする。また、任意に、リストに含まれていない追加の項目もある。「の一つのみ」又は「ちょうど一つの」、又は請求項で使用されている場合は「からなる」など、反対のことを明確に示している語のみ、多数又はリストされた要素のうちのちょうど一つの要素のみを含むことを示す。一般に、本明細書で使用される「又は」という語は、「いずれか」、「一つ」、「一つのみ」、又は「ちょうど一つの」などの排他性の語が先行する場合にのみ排他的な選択肢を示すものとして解釈される。「から本質的になる」は、特許請求の範囲で使用されるとき、特許法の分野で使用されるその通常の意味を有するものとする。
【０６３５】
本明細書及び特許請求の範囲で使用されるように、「少なくとも一つ」という句は、一つ以上の要素のリストを参照し、要素のリスト中の任意の一つ以上の要素から選択された少なくとも一つの要素を意味すると理解されるべきであり、必ずしも、要素リスト内に具体的にリストされた全ての要素の各々を少なくとも一つ含む必要はなく、要素リスト中の要素の任意の組合わせを除外しない。この定義はまた、「少なくとも一つ」という句が言及する要素リスト中で具体的に同定されている要素以外に、具体的に同定される要素と関連するか関連しないかに関わらず、要素が任意に存在し得ることを可能にする。非限定的な例として、「Ａ及びＢの少なくとも一方」（又は、同等に、「Ａ又はＢの少なくとも一方」、又は同等に「Ａ及び／又はＢの少なくとも一方」）を指すことができる。一実施形態では、少なくとも一つの、場合により複数のＡを含む、Ｂを含まない（そして場合によりＢ以外の元素を含む）。別の実施形態では、Ａが存在しない（そして場合によりＡ以外の元素を含む）少なくとも一つ、場合により複数Ｂを含む。さらに別の実施形態では、少なくとも一つの、場合により複数のＡを含む、少なくとも一つの、場合により複数を含むＢ（及び場合により他の元素を含む）。など。
【０６３６】
そうでないことが明確に示されていない限り、複数のステップ又は行為を含む本明細書で請求される方法において、方法のステップ又は行為の順序は、必ずしも方法のステップ又は行為が列挙されている順序に限定されないことも理解されるべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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