(57)【要約】本発明は、養子免疫療法に適した単離細胞組成物、ならびに細胞組成物の製造方法及び細胞組成物を用いた治療方法を提供する。組成物は、薬学的に許容される担体中に、標的ペプチド抗原（複数可）に特異的な少なくとも約１０６個のＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。様々な実施形態において、組成物は、主にＣＤ８＋Ｔ細胞であり、組成物中の少なくとも約２０％のＴ細胞は、セントラルメモリー表現型またはエフェクターメモリー表現型を示し、自然選択を受けている天然Ｔ細胞レパートリーから、強固で持続的な養子療法を提供する。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
養子免疫療法に適した単離細胞組成物であって、薬学的に許容される担体中に、１個以上の標的ペプチド抗原に特異的な少なくとも１０６個のＣＤ８＋Ｔ細胞を含み、組成物中の少なくとも２０％のＴ細胞がセントラルメモリー表現型またはエフェクターメモリー表現型を示す、前記組成物。
【請求項２】
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞が、１〜１００個の標的ペプチド抗原に特異的である、請求項１に記載の単離細胞組成物。
【請求項３】
前記組成物中の標的ペプチド抗原に向けられたＴ細胞特異度が、ＭＨＣ多量体染色によって定義される、請求項１に記載の単離細胞組成物。
【請求項４】
前記標的ペプチド抗原が腫瘍関連抗原である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離細胞組成物。
【請求項５】
１個以上の標的ペプチド抗原が、腫瘍由来または腫瘍特異的新生抗原である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離細胞組成物。
【請求項６】
１個以上の標的ペプチド抗原が、細菌、ウイルス、真菌、または寄生虫抗原である、請求項１〜３のいずれかに一項に記載の単離細胞組成物。
【請求項７】
少なくとも１、２、３、４または５個の標的ペプチド抗原に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離細胞組成物。
【請求項８】
前記標的ペプチド抗原のうちの少なくとも１個が低頻度前駆Ｔ細胞により認識される、請求項７に記載の単離細胞組成物。
【請求項９】
前記細胞組成物は少なくとも９０％がＴ細胞である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離細胞組成物。
【請求項１０】
前記細胞組成物は少なくとも９８％がＴ細胞である、請求項９に記載の単離細胞組成物。
【請求項１１】
前記細胞組成物は少なくとも５％が前記標的ペプチド抗原に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離細胞組成物。
【請求項１２】
前記細胞組成物は少なくとも１０％が前記標的ペプチド抗原に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項１１に記載の単離細胞組成物。
【請求項１３】
前記細胞組成物は少なくとも１５％が前記標的ペプチド抗原に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項１２に記載の単離細胞組成物。
【請求項１４】
前記細胞組成物が、細菌、ウイルス及び／または真菌病原体に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を更に含む、請求項４または５のいずれか一項に記載の単離細胞組成物。
【請求項１５】
前記細菌、ウイルス、または真菌病原体に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞が、インフルエンザ、ＣＭＶ、ＥＢＶ及び／またはアデノウイルスの抗原に特異的なＴ細胞を含む、請求項１４に記載の単離細胞組成物。
【請求項１６】
前記Ｔ細胞では少なくとも３０％がセントラルメモリーＴ細胞及びエフェクターメモリーＴ細胞である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の単離細胞組成物。
【請求項１７】
前記Ｔ細胞は少なくとも５０％がセントラルメモリーＴ細胞及びエフェクターメモリーＴ細胞である、請求項１６に記載の単離細胞組成物。
【請求項１８】
前記Ｔ細胞は少なくとも７０％がセントラルメモリーＴ細胞及びエフェクターメモリーＴ細胞である、請求項１６に記載の単離細胞組成物。
【請求項１９】
前記Ｔ細胞では少なくとも８０％がセントラルメモリーＴ細胞及びエフェクターメモリーＴ細胞である、請求項１６に記載の単離細胞組成物。
【請求項２０】
前記１個以上の標的抗原に特異的なＴ細胞は少なくとも５０％がセントラルメモリーＴ細胞及びエフェクターメモリーＴ細胞である、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の単離細胞組成物。
【請求項２１】
前記１個以上の標的抗原に特異的なＴ細胞は少なくとも６０％がセントラルメモリーＴ細胞及びエフェクターメモリーＴ細胞である、請求項２０に記載の単離細胞組成物。
【請求項２２】
前記１個以上の標的抗原に特異的なＴ細胞は少なくとも７０％がセントラルメモリーＴ細胞及びエフェクターメモリーＴ細胞である、請求項２０に記載の単離細胞組成物。
【請求項２３】
前記１個以上の標的抗原に特異的なＴ細胞は少なくとも８０％がセントラルメモリーＴ細胞及びエフェクターメモリーＴ細胞である、請求項２０に記載の単離細胞組成物。
【請求項２４】
前記セントラル及びエフェクターメモリーＴ細胞が、１０：９０〜９０：１０のセントラルメモリーＴ細胞対エフェクターのメモリー細胞である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の単離細胞組成物。
【請求項２５】
前記セントラル及びエフェクターメモリーＴ細胞が、２５：７５〜７５：２５のセントラルメモリーＴ細胞対エフェクターのメモリー細胞である、請求項２４に記載の単離細胞組成物。
【請求項２６】
前記セントラル及びエフェクターメモリー細胞が、４０：６０〜６０：４０のセントラルメモリーＴ細胞対エフェクターのメモリーＴ細胞である、請求項２４に記載の単離細胞組成物。
【請求項２７】
前記Ｔ細胞では２０％未満の末端分化がある、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の単離細胞組成物。
【請求項２８】
前記Ｔ細胞は１０％未満の末端分化がある、請求項２７に記載の単離細胞組成物。
【請求項２９】
前記Ｔ細胞は１０％未満の末端分化がある、請求項２７に記載の単離細胞組成物。
【請求項３０】
前記組成物が２０％未満の未変性細胞を含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の単離細胞組成物。
【請求項３１】
前記組成物が１０％未満の未変性細胞を含む、請求項３０に記載の単離組成物。
【請求項３２】
前記組成物が５％未満の未変性細胞を含む、請求項３０に記載の単離組成物。
【請求項３３】
前記組成物が１．５％未満の未変性細胞を含む、請求項３０に記載の単離組成物。
【請求項３４】
Ｔメモリー幹細胞を更に含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の単離組成物。
【請求項３５】
約５％〜約２５％のＴメモリー幹細胞を含む、請求項３４に記載の単離組成物。
【請求項３６】
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞が、活性化されると多機能性表現型を表示する、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の単離細胞組成物。
【請求項３７】
前記細胞組成物が１０％未満のＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の単離細胞組成物。
【請求項３８】
前記細胞組成物は５％未満がＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項３７に記載の単離細胞組成物。
【請求項３９】
前記細胞組成物は２％未満がＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項３７に記載の単離細胞組成物。
【請求項４０】
前記細胞組成物は１．５％未満がＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項３７に記載の単離細胞組成物。
【請求項４１】
前記細胞組成物は１％未満がＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項３７に記載の単離細胞組成物。
【請求項４２】
前記組成物が、キメラ抗原受容体または組み換えＴＣＲを発現するＴ細胞を含まない、請求１〜４１のいずれか一項に記載の細胞組成物。
【請求項４３】
前記組成物が、細胞源の標的ペプチド抗原に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の濃縮によって及び／または細胞源の標的ペプチド抗原に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大によって産生される、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の細胞組成物。
【請求項４４】
細胞源が、患者からのもの、またはＨＬＡ適合ドナーからのものである、請求項４３に記載の細胞組成物。
【請求項４５】
前記ドナー細胞が白血球搬出法によって単離される、請求項４３に記載の細胞組成物。
【請求項４６】
前記細胞源が患者の腫瘍から単離されたものである、請求項４３に記載の細胞組成物。
【請求項４７】
前記細胞源がバフィーコート画分である、請求項４３に記載の細胞組成物。
【請求項４８】
前記細胞源が、濃縮の前または拡大の前にＣＤ４＋Ｔ細胞について枯渇している、請求項４３〜４７のいずれか一項に記載の単離細胞組成物。
【請求項４９】
前記細胞源ではＣＤ８＋が濃縮されている、請求項４３〜４８のいずれか一項に記載の単離細胞組成物。
【請求項５０】
前記細胞源ではＮＫ細胞が枯渇されている、請求項４３〜４９のいずれか一項に記載の単離細胞組成物。
【請求項５１】
前記抗原特異的Ｔ細胞が、ＭＨＣクラスＩリガンド及び任意選択で共刺激リガンドを有するａＡＰＣによって濃縮される、請求項４３〜５０のいずれか一項に記載の単離細胞組成物。
【請求項５２】
前記ａＡＰＣが、ＣＤ２８に結合するリガンドである共刺激リガンドを含む、請求項５１に記載の単離細胞組成物。
【請求項５３】
前記共刺激リガンドが、ＣＤ２８のアゴニストであるモノクローナル抗体またはその一部分である、請求項５２に記載の単離細胞組成物。
【請求項５４】
前記濃縮が常磁性ａＡＰＣによる磁気濃縮であり、前記細胞及びａＡＰＣが、磁場の存在下で少なくとも１分間にわたって任意選択でインキュベートされる、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の単離細胞組成物。
【請求項５５】
前記濃縮が常磁性ａＡＰＣによる磁気濃縮であり、前記細胞及びａＡＰＣが、磁場の存在下で少なくとも５時間または培養の持続する間にわたって任意選択でインキュベートされる、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の単離細胞組成物。
【請求項５６】
前記細胞及びａＡＰＣが、磁場の存在下で約５時間以下にわたってインキュベートされる、請求項１〜５５のいずれか一項に記載の単離細胞組成物。
【請求項５７】
前記抗体特異的Ｔ細胞が、磁場を使用することなく濃縮及び／または拡大される、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の単離細胞組成物。
【請求項５８】
前記濃縮細胞が、培養により１〜４週間にわたって拡大される、請求項４３〜５３のいずれか一項に記載の単離細胞組成物。
【請求項５９】
前記細胞が、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１及びＩＮＦ−γ、ならびに任意選択でＩＬ−１０のうちの１個以上の存在下での培養で拡大される、請求項５８に記載の単離細胞組成物。
【請求項６０】
前記細胞が、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１及びＩＮＦ−γ、ならびに任意選択でＩＬ−１０のうちの２または３個の存在下での培養で拡大される、請求項５８に記載の単離細胞組成物。
【請求項６１】
前記細胞が、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−２１及びＩＮＦ−γ、ならびに任意選択でＩＬ−１０うちの１、２、３、４または５個の存在下での培養で拡大される、請求項６０に記載の単離細胞組成物。
【請求項６２】
前記細胞が、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−１β及びＩＬ−６、ならびに任意選択でＩＬ−１０から選択される少なくとも１個のサイトカインの存在下での培養で拡大される、請求項６０に記載の単離細胞組成物。
【請求項６３】
前記細胞が、ＩＬ−４の存在下で拡大される、請求項６０に記載の単離細胞組成物。
【請求項６４】
前記細胞が、ＩＬ−４及びＩＬ−６の存在下で拡大される、請求項６０に記載の単離細胞組成物。
【請求項６５】
前記細胞が、ＩＬ−４及びＩＬ−１βの存在下で拡大される、請求項６０に記載の単離細胞組成物。
【請求項６６】
前記細胞が、ＩＬ−４、ＩＬ−６及びＩＬ−１βの存在下で拡大される、請求項６０に記載の単離細胞組成物。
【請求項６７】
前記細胞が、ＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＬ−６の存在下で拡大される、請求項６０に記載の単離細胞組成物。
【請求項６８】
前記細胞が、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＮＦ−γ及びＩＬ−１β、ならびに任意選でＩＬ−１０の存在下で拡大される、請求項６０に記載の単離細胞組成物。
【請求項６９】
機能的ａＡＰＣが前記組成物中で検出不可能である、または前記組成物が１％未満のａＡＰＣ物質を含む、請求項１〜６８のいずれか一項に記載の単離細胞組成物。
【請求項７０】
１個以上の標的ペプチド抗原が、サバイビン、ＷＴ−１、ＰＲＡＭＥ、サイクリンＡ１及びＰＲ３のペプチドエピトープから選択される、請求項１〜６９のいずれか一項に記載の単離細胞組成物。
【請求項７１】
養子免疫療法に適した単離細胞組成物であって、薬学的に許容される担体中に、
少なくとも９０％のＣＤ８＋Ｔ細胞及び５％未満のＣＤ４＋Ｔ細胞を含み、
ＣＤ８＋細胞が、１〜１０個の標的ペプチド抗原に特異的な少なくとも１０６個のＣＤ８＋Ｔ細胞、ならびに細菌、ウイルス、真菌及び／または寄生性病原体に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞から構成され、
少なくとも３０％の前記ＣＤ８＋Ｔ細胞が、比が２５：７５〜７５：２５のセントラルメモリーＴ細胞及びエフェクターメモリーＴ細胞であり、１０％未満の前記ＣＤ８＋Ｔ細胞が末端分化Ｔ細胞であり、１０％未満の前記ＣＤ８＋細胞が未変性細胞であり、
前記標的ペプチド抗原に特異的な前記ＣＤ８＋Ｔ細胞の少なくとも５０％が、比が２５：７５〜７５：２５のセントラルメモリーＴ細胞及びエフェクターメモリーＴ細胞であり、１０％未満が、末端分化Ｔ細胞であり、１０％未満が未変性細胞である、前記組成物。
【請求項７２】
少なくとも９５％のＣＤ８＋Ｔ細胞及び２％未満のＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、請求項７１に記載の単離細胞組成物。
【請求項７３】
前記標的ペプチド抗原に特異的な、少なくとも１０７個または１０８個のＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、請求項７１または７２に記載の単離細胞組成物。
【請求項７４】
５％未満の末端分化Ｔ細胞及び／または５％未満の未変性細胞を含む、請求項７１〜７３のいずれか一項に記載の単離細胞組成物。
【請求項７５】
５％〜約２０％のＴメモリー幹細胞を更に含む、請求項７１〜７３のいずれか一項に記載の単離細胞組成物。
【請求項７６】
前記標的ペプチド抗原が腫瘍関連抗原であり、任意選択で血液悪性腫瘍に関連する、請求項７１〜７５のいずれか一項に記載の単離細胞組成物。
【請求項７７】
１個以上の標的ペプチド抗原が、サバイビン、ＷＴ−１、ＰＲＡＭＥ、サイクリンＡ１及びＰＲ３のペプチドエピトープから選択される、請求項７１〜７６のいずれか一項に記載の単離細胞組成物。
【請求項７８】
がんを有する患者の治療方法であって、必要とする患者に請求項１〜７７のいずれか一項に記載の細胞組成物を投与することを含む、方法。
【請求項７９】
前記患者が血液癌を有する、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記血液癌が、同種幹細胞移植後に再発している、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記患者が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または骨髄異形成症候群を有する、請求項７９または８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記患者が、リンパ球欠失療法、または細胞減少療法、または細胞療法投与前の免疫調節療法も受けている、請求項７８〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記細胞療法が、治療後サイトカイン支持を伴って、または伴うことなく更に提供され得る、請求項７８〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、２０１７年９月２０日出願の米国特許仮出願第６２／５６１，０４４号の利益及び２０１８年４月１２日出願の米国特許仮出願第６２／６５６，６７９号の利益を主張し、それぞれ、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
ドナーリンパ球注入などの養子免疫療法は、移植片対白血病（ＧＶＬ）効果を高める、白血病再発後造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）の治療のために使用される。これらの手法は、効果を発揮するのに大抵数か月かかり、非常に大きな用量の細胞を必要とし、そのことが移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の実質的な危険性をもたらす。ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｏｐｔｉｖｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｆｏｒ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ／ｒｅｌａｐｓｅｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｎｄ  ｌｙｍｐｈｏｍａ；ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ．Ｔｈｅｒ．Ａｄｖ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０１５  Ｖｏｌ．６（６）２９５−３０７を参照すること。
【０００３】
現在の治療選択肢では、例えばＨＳＣＴの後に再発する白血病患者の転帰は暗いものである。養子細胞療法は、いくつかの利点を提供することができるが、提供され得る多数の標的特異的細胞は、しばしば不十分であり、非常にばらつきがあり、とりわけ、健常者の末梢血中においてしばしば極めて低く検出不能でもある癌特異的ＣＴＬ前駆体に関して、エキソビボでドナーリンパ球から未変性Ｔ細胞集団を活性化及び拡大することは困難である。Ｑｕｉｎｔａｒｅｌｌｉ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｏｆ  ｍｅｌａｎｏｍａ（ＰＲＡＭＥ）ｔａｒｇｅｔ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ  ２００８；１１２：１８７６−１８８５。更に、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞療法などの細胞療法は、インビボにおいて十分に強固ではない及び／または限定された残留性を有する消耗した細胞表現型を誘導する傾向があり、オフターゲット組織毒性を示すことがある。Ｃｒｕｚ  ａｎｄ  Ｂｏｌｌａｒｄ，Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｆｏｒ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ  ａｆｔｅｒ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ；ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｅｆｆｅｃｔ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ２０１５；１００（６）７０９−７１９を参照すること。更に、これらの療法は、改変単一標的のために、一般に限定された柔軟性を有する。
【０００４】
細胞組成物には、より効果的かつ安全な養子免疫療法の選択肢を提供することが必要とされ、白血病またはリンパ腫（急性もしくは慢性白血病を含む）に罹患している患者、ならびに養子免疫療法から利益を得ることができる他の患者ためのものが挙げられる。様々な態様及び実施形態において、本発明はこれらの必要性に対処する。
【発明の概要】
【０００５】
様々な態様及び実施形態において、本発明は、養子免疫療法に適した単離細胞組成物、ならびに細胞組成物の製造方法及び細胞組成物を用いた治療方法を提供する。組成物は、薬学的に許容される担体中に、標的ペプチド抗原（複数可）に特異的な少なくとも約１０６個のＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。様々な実施形態において、組成物は、主にＣＤ８＋Ｔ細胞であり、組成物中の少なくとも約２０％のＴ細胞は、セントラルメモリー表現型またはエフェクターメモリー表現型を示し、自然選択を受けている天然Ｔ細胞レパートリーから、強固で持続的（ｄｕｒａｂｌｅ）な養子療法を提供する。細胞組成物は、キメラ抗原受容体または組み換えＴＣＲを発現するＴ細胞を含まず、したがって、様々な実施形態において、より消耗したＴ細胞の表現型、より少ない持続的応答及びより大きな毒性をしばしば生じるこれらの技術に対して代替案を提供する。
【０００６】
様々な実施形態において、細胞組成物は、標的ペプチド抗原に特異的な、少なくとも約１０７個のＣＤ８＋Ｔ細胞、または標的ペプチド抗原に特異的な少なくとも約１０８個、少なくとも約１０９個、もしくは少なくとも約１０１０個のＣＤ８＋Ｔ細胞を含み、インビボにおける標的細胞の強固な破壊及び長い残留性を提供する。例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または骨髄異形成症候群の治療のために、細胞組成物は、ＷＴ１、ＰＲＡＭＥ、サバイビン及びサイクリンＡ１ペプチド抗原に特異的なＴ細胞を含むことができる。
【０００７】
様々な実施形態において、組成物中のＴ細胞（及び／または標的抗原に特異的なＴ細胞）は、少なくとも約５０％がセントラルもしくはエフェクターメモリーＴ細胞、いくつかの実施形態では少なくとも約７０％がセントラルもしくはエフェクターメモリーＴ細胞、または少なくとも約８０％がセントラルもしくはエフェクターメモリーＴ細胞である。いくつかの実施形態において、メモリー細胞は、約２５：７５〜約７５：２５のセントラルメモリー細胞対エフェクターメモリー細胞である。細胞組成物は、約２０％未満の末端分化メモリーＴ細胞（例えば、Ｔｅｍｒａ細胞）及び約２０％以下の未変性細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞組成物は、約５〜約２５％のＴメモリー幹細胞（ＴＳＣＭ）を含む。この細胞表現型は、常磁性人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）及び組み換えＴ細胞増殖因子カクテルを用いる濃縮及び拡大プロセスの使用によって、作成及び／または制御され得る。
【０００８】
様々な実施形態において、細胞組成物は、少なくとも９０％がＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、ＣＤ３＋  ＣＤ８＋細胞）である。例えば、単離細胞組成物は、約１０％未満または約５％未満のＣＤ４＋Ｔ細胞を有することによって特徴付けることができる。ＣＤ８＋Ｔ細胞をエキソビボで拡大すると、ＣＤ４＋細胞は、ＣＤ８＋細胞を過剰増殖し、かつ増殖シグナルと競合する傾向を有し、強固で持続的なインビボ応答ために必要ではない。
【０００９】
様々な実施形態において、抗原特異的Ｔ細胞は、活性化されると、多機能性表現型を表示する。例えば、活性化すると、Ｔ細胞は、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ産生、ＴＮＦ−α産生及びＣＤ１０７Ａに対する細胞内染色の２つ以上が陽性である。様々な実施形態において、少なくとも５０％または少なくとも７０％の抗原特異的Ｔ細胞は、これらのマーカーのうちの少なくとも２つを表示する。様々な実施形態において、少なくとも５０％または少なくとも７０％の抗原特異的Ｔ細胞は、これらのマーカーのうちの少なくとも３つ、いくつかの実施形態では、これらのマーカーのうちの４つ全てを表示する。
【００１０】
様々な実施形態の細胞組成物は、濃縮及拡大プロセスによって調製することができる。いくつかの実施形態では、標的抗原（複数可）（例えば、腫瘍関連抗原またはウイルス関連抗原）に特異的なＣＤ８＋細胞が濃縮される。この細胞集団は、主にリンパ球源の未変性細胞であっても、培養で急速に拡大して、本明細書に記載されている細胞組成物にすることができる。濃縮は、陽性選択された細胞集団に対して常磁性ビーズを使用して行うことができ、Ｔ細胞表面受容体の強力な磁気クラスタリングによって、未変性細胞を活性化するという追加の利点を有することができる。例えば、常磁性ビーズまたはナノ粒子は、ＣＤ２８のアゴニスト（例えば、ＣＤ２８の抗体アゴニスト）などの、同じ、または異なる粒子に対する共刺激シグナルと共にペプチド抗原を提示する単量体または多量体（例えば、二量体）ＨＬＡリガンドを含有することができる。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８＋細胞も濃縮され、これは抗原特異的濃縮と同時であり得る。
【００１１】
様々な実施形態において、標的ペプチド抗原は腫瘍または癌関連抗原であり、腫瘍由来抗原、腫瘍特異的抗原及び新生抗原が挙げられる。腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞は、しばしば非常にまれであり、多くの場合、健常者の末梢血中において検出不能である。これは、ウイルス特異的及び腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の間でしばしば観察される相違である。
【００１２】
いくつかの実施形態において、標的ペプチド抗原には、ウイルス、細菌、真菌または寄生虫病原体などの病原体に関連または由来する少なくとも１個が挙げられる。例えば、少なくとも１個のペプチド抗原は、ＨＩＶ、肝炎（例えば、Ｂ、Ｃ、またはＤ）ＣＭＶ、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）、インフルエンザ、ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ１もしくはＨＳＶ２、または水痘帯状疱疹）及びアデノウイルスに関連し得る。ＣＭＶは、例えば、臓器移植患者に見られる最も一般的なウイルス病原体であり、骨髄または末梢血幹細胞移植を受けた患者における罹患率及び死亡率の主要な原因である。ウイルスの活性化は、癌生物学に関与することが知られている。
【００１３】
さらに他の実施形態において、細胞組成物は、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞を含み、病原体関連Ｔ細胞はバイスタンダー細胞として提供される。具体的には、ＨＬＡペプチドと抗ＣＤ２８の両方の選択に基づいてＣＤ８＋Ｔ細胞を濃縮することにより、特に、これらの細胞のいくらかの非特異的拡大を抗原特異的活性化なしで誘導できるＴ細胞増殖因子カクテルを使用する場合、バイスタンダー細胞は濃縮及び拡大される。これらの実施形態において、組成物の大部分は標的ペプチドに特異的なＴ細胞（例えば、５％〜７５％）であり、残りのＴ細胞（約０．２５％〜約２５％）は、一般的な病原体に対する免疫系にいくらかの再構成を提供し、このことは、特に、移植後に有益である、またはウイルス病因を有する癌に有益である。
【００１４】
いくつかの実施形態は、拡大の際にＴ細胞増殖因子を用い、このことは、Ｔ細胞の増殖及び／または分化に影響を与える。特に有用なサイトカインには、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＦＮ−γが挙げられる。これら、または他の実施形態において、細胞は、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−１β及びＩＬ−６から選択される１、２または３個のサイトカインの存在下での培養で拡大される。いくつかの実施形態において、サイトカインには、ＩＬ−１０が更に含まれる。細胞は、約１０〜約２１日間などの１〜４週間にわたる培養で拡大され得る。
【００１５】
他の態様において、本発明は細胞組成物の製造方法を提供し、本明細書に記載されているａＡＰＣによる濃縮及び拡大が挙げられる。具体的には、リンパ球源から（例えば、健康なドナーから）ＣＤ４＋細胞を枯渇した後、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞では、標的ペプチド抗原に特異的なＴ細胞、ならびに、いくつかの実施形態においてＣＤ２８＋細胞が濃縮される。標的細胞は、細胞表面受容体の磁場誘導クラスタリングによりＴ細胞をエキソビボで活性化する常磁性粒子などの、ナノ粒子または微小粒子ａＡＰＣを使用して濃縮され得る。ラテックスまたはその他のポリマー系粒子が挙げられる他の材料を使用して、細胞表面受容体を（磁気誘導クラスタリングを用いることなく）クラスター化することもできる。次いで、濃縮されたＴ細胞は、その後、エキソビボで急速に拡大され、再構成されたＴ細胞増殖因子（例えば、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＦＮ−γから選択される因子を含む）の使用を挙げることができる。いくつかの実施形態において、細胞は、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−１β及びＩＬ−６、ならびに任意選択でＩＬ−１０から選択される１、２または３個のサイトカインの存在下での培養で拡大される。いくつかの実施形態において、増殖因子は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＮＦ−γ及びＩＬ−１βから構成される、または、から実質的になる。
【００１６】
他の態様において、本発明は養子細胞療法の方法を提供し、癌を有する患者及び／または、同種幹細胞移植を受けた患者を、リンパ球欠失療法（ｌｙｍｐｈｏ−ｄｅｌｅｔｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｙ）、細胞減少療法、免疫調節療法（細胞療法の投与前）を伴って、または伴うことなく治療する方法が挙げられる。更に細胞療法は、治療後サイトカイン支持を伴って、または伴うことなく提供されてもよい。いくつかの実施形態において、患者は血液癌を有し、いくつかの実施形態では、同種幹細胞移植の後に再発した血液癌を有する。いくつかの実施形態において、患者は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または骨髄異形成症候群を有する。例えば、いくつかの実施形態において、細胞組成物は、ＷＴ１、ＰＲＡＭＥ、サバイビン及びサイクリンＡペプチド抗原に特異的なＴ細胞を含む。しかし、他の実施形態において、がんには、癌腫、肉腫及びリンパ腫を含む固形腫瘍の様々な種類が挙げられる。例示的な標的ペプチド抗原は、本明細書に記載されている。
【００１７】
いくつかの実施形態において、患者は、感染症を有する、または感染症の危険性がある。例えば、ＨＳＣＴを受けた患者は、免疫無防備状態を考慮すると、特に感染症の危険性がある。治療または予防され得る感染症には、細菌、ウイルス、プリオン、真菌、寄生虫、蠕虫等によって引き起こされるものが挙げられる。そのような疾患には、ＡＩＤＳ、Ｂ／Ｃ型肝炎、ＣＭＶ感染症、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ウイルス（ＥＢＶ）感染症、インフルエンザ、ヘルペスウイルス感染症（帯状疱疹を含む）及びアデノウイルス感染症が挙げられる。
【００１８】
他の態様および実施形態は、以下の詳細な説明によって明白となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ドナーリンパ球からエキソビボで濃縮及び拡大されたＭＡＲＴ−１特異的Ｔ細胞が、多機能性表現型を示し、ＩＬ−２（増殖及びメモリー）、ＩＦＮ−γ（他のＴ細胞の活性化、メモリー、ＭＨＣの上方制御）、ＴＮＦ−α（炎症促進性（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ））及びＣＤ１０７Ａ（グランザイムの放出、細胞傷害活性）の細胞内染色が挙げられることを示す。大多数のＴ細胞は、少なくとも３つの機能的表現型を示す。
【図２】常磁性ａＡＰＣを使用してドナーリンパ球からエキソビボで濃縮及び拡大されたＭＡＲＴ−１及びＡＭＬ特異的Ｔ細胞が、主に、セントラルメモリー（Ｔｃｍ）及びエフェクターメモリー（Ｔｅｍ）表現型であることを示す。
【図３】抗原特異的Ｔ細胞が、バッチにより濃縮及び拡大され得ることを示す。この図は、Ｐｒａｍｅ１００ＲＨＡＭＭ、ＷＴ１及びサバイビン抗原ペプチドに特異的なＴ細胞のバッチ濃縮及び拡大も示す。
【図４】個別の刺激及び拡大を伴う組成物が、ＡＭＬ抗原特異的Ｔ細胞の一貫性したレベルを有することを示す。個別の刺激及び拡大のプロセスは、一貫して約１５％の抗原特異的Ｔ細胞を生成する。
【図５】同時の刺激／拡大プロセスが、個別の刺激／拡大に匹敵するＡＭＬ特異的Ｔ細胞頻度を生成することを示す。バッチ刺激／拡大プロセスにより調製されたことが示される組成物は、約４７％の抗原特異的Ｔ細胞を有する。
【図６】生成されたＴ細胞が、ＡＭＬ腫瘍細胞（ＴＨＰ−１細胞系）の抗原特異的死滅を実証することを示す。ＡＭＬ特異的Ｔ細胞は、ＷＴ−１、ＰＲＡＭＥ及びサバイビンにおける５個のエピトープに向けられる。
【図７】エキソビボ拡大に使用されたサイトカインカクテルが、得られた細胞の数及び表現型に影響を与えることを示す。再構成されたＴ細胞増殖因子（ＴＦ）には、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−２１、ＩＦＮ−γ及びＭＩＰ１βが挙げられる。
【図８】ＭＡＲＴ−１特異的濃縮及び拡大の７日後の、ウイルス特異的バイスタンダーＴ細胞の存在を示す。
【図９】ＭＡＲＴ−１特異的濃縮及び拡大の１４日後の、ウイルス特異的バイスタンダーＴ細胞の存在を示す。
【図１０】ＡＭＬ特異的濃縮及び拡大の１４日後の、ウイルス特異的バイスタンダーＴ細胞の存在を示す。これらの細胞は、体部分がメモリー表現型であった。
【図１１】ＭＡＲＴ−１特異的濃縮及び拡大プロセスの最中のＣＭＶ特異的バイスタンダーＴ細胞の検出を示す。ウイルス特異的バイスタンダー細胞の率は、１４日目まで一定のままであるが、ＭＡＲＴ−１特異的Ｔ細胞の数及び率は劇的に上昇している。
【図１２】バイスタンダー細胞の拡大を改善する、組み換えＴ細胞増殖因子カクテル（ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−２１、ＩＦＮ−γ及びＭＩＰ１−β）を使用したＭＡＲＴ−１特異的濃縮及び拡大の後の、１４日目のウイルス特異的バイスタンダー細胞の検出を示す。
【図１３】組み換えＴ細胞増殖因子カクテル（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ及びＩＬ１−β）を使用する濃縮プロセス及び拡大プロセスにより生成されたＭＡＲＴ−１特異的Ｔ細胞の特異度及び表現型を示す、２つのパネル（図１３Ａ及び図１３Ｂ）を有する。ＭＡＲＴ−１特異的Ｔ細胞（図１３Ａ、右パネル）は、培養の約３５％を構成し、セントラルメモリー（約８９％）及びエフェクターメモリー（約９％）表現型を示した。全培養物は、約６６％のセントラルメモリー表現型及び約３２％のエフェクターメモリー表現型を示した。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
様々な態様及び実施形態において、本発明は、養子免疫療法に適した単離細胞組成物、ならびに細胞組成物の製造方法及び細胞組成物を用いた治療方法を提供する。組成物は、薬学的に許容される担体中に、標的ペプチド抗原（複数可）に特異的な少なくとも約１０６個のＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。様々な実施形態において、組成物中の少なくとも約２０％のＴ細胞は、セントラルメモリー表現型またはエフェクターメモリー表現型を示し、強固で持続的な養子療法を提供する。細胞組成物は、キメラ抗原受容体または組み換えＴＣＲを発現するＴ細胞を含まず、したがって、様々な実施形態において、より消耗したＴ細胞の表現型及びより少ない持続的応答をしばしば生じるこれらの技術に対して代替案を提供する。
【００２１】
本明細書で使用するとき、用語「標的ペプチド抗原（複数可）」または「標的抗原」は、所望のＣＤ８＋細胞集団を、例えば、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）またはプロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）プラットフォーム（例えば、樹状細胞）に関連して、濃縮及び／または拡大するためにエキソビボで用いられたペプチド抗原を指す。ａＡＰＣまたはｐＡＰＣは、ドナーまたは患者のリンパ球からのＣＴＬを活性化及び拡大するために用いられる。いくつかの実施形態において、標的ペプチド抗原は、特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のエキソビボでの濃縮及び拡大のために、ａＡＰＣにロードされたペプチドエピトープである。このように、用語「標的ペプチド抗原に特異的」とは、Ｔ細胞が、標的抗原を経験した抗原であることを意味する。
【００２２】
様々な実施形態において、細胞組成物は、標的ペプチド抗原に特異的な少なくとも約１０７個のＣＤ８＋Ｔ細胞、または標的ペプチド抗原に特異的な少なくとも約１０８個、少なくとも約１０９個、もしくは少なくとも約１０１０個のＣＤ８＋Ｔ細胞を含み、標的細胞の強固な破壊を提供する。いくつかの実施形態において、細胞組成物は、標的抗原に特異的な１×１０７〜１×１０９個のＣＤ８＋Ｔ細胞、またはいくつかの実施形態では、標的抗原に特異的な５×１０７〜５×１０８個のＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する。例えば、組成物は、５０〜２００ｍｌの体積で１ｍｌあたり約５×１０５〜約５×１０６個の細胞を含むことができる。特定の実施形態において、組成物の体積は≦１００ｍｌ（例えば、５０〜１００ｍｌ）である。様々な実施形態における組成物の細胞は、少なくとも７０％が生存可能であり、滅菌媒体中に提供され、これは凍結保護培地（例えば、１０％のＤＭＳＯ）であってもよい。
【００２３】
主にＣＤ８＋細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）である組成物の細胞は、また、実質的にセントラルメモリー表現型またはエフェクターメモリー表現型のものである。ＣＴＬには一般に以下の表現型集団が挙げられ、未変性Ｔメモリー幹細胞（Ｔｓｃｍ）、セントラルメモリー、エフェクターメモリー細胞及び末端分化メモリー細胞である。本発明の実施形態によると、標的抗原に特異的なＴ細胞は、実質的にセントラルメモリー及びエフェクターメモリー表現型から構成される。いくつかの実施形態において、標的抗原に特異的なＴ細胞は、更にＴメモリー幹細胞（ＴＳＣＭ）を含む。それによって細胞組成物は、持続的な応答を提供し、少なくとも約１か月間、または少なくとも約３か月間、または少なくとも約６か月間、または少なくとも約１２か月間、または少なくとも約１８か月間、またはいくつかの実施形態において少なくとも約２年間にわたる抗原特異的Ｔ細胞のインビボ残留性が挙げられる。
【００２４】
未変性Ｔ細胞は、骨髄中で分化し、胸腺において中枢性選択の正の工程及び負の工程を正常に受けている。未変性Ｔ細胞は成熟していると考慮され、活性化またはメモリーＴ細胞とは異なり、その同族抗原に遭遇していない。未変性Ｔ細胞は、Ｌ−セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）の表面発現及び活性化マーカーの不在によって特徴付けることができる。未変性状態において、Ｔ細胞は、一般に、静止状態であり、非分裂性である。本開示によると、未変性Ｔ細胞は、ＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ４５ＲＡ＋と定義される。
【００２５】
メモリーＴ細胞には、Ｔメモリー幹細胞（Ｔｓｃｍ）、セントラルメモリー及びエフェクターメモリーＴ細胞が挙げられる。メモリーＴ細胞は、これらの同族抗原に予め応答している。同族抗原を有する第２の遭遇では、メモリーＴ細胞は、より速く、より強力な免疫応答の開始を再現することができる。メモリーＴ細胞は、少なくともエフェクターメモリーのサブタイプ及びセントラルメモリーのサブタイプを含む。メモリーＴ細胞のサブタイプは、長寿命であり、これらの同族抗原に再暴露されると、多数のエフェクターＴ細胞を迅速に拡大することができる。
【００２６】
Ｔメモリー幹細胞（Ｔｓｃｍ）は、本明細書においてＣＤ４５ＲＡ＋と定義され、ＣＸＣＲ３＋、ＣＤ９５＋、ＣＤ１１ａ＋及びＣＤ５８＋から選択される少なくとも２つのマーカー（または、いくつかの実施形態では少なくとも３つ、もしくは４つ全てのマーカー）を有すると定義される。このメモリー亜集団は、自己再生する幹細胞様能力、ならびにメモリー及びエフェクターＴ細胞の亜集団を再構成する多分化能力を有する。Ｔｓｃｍ細胞は、循環Ｔリンパ球の小さな画分（例えば、＞５％）を表すことができ、急速に増殖し、抗原への再暴露に応答して炎症性サイトカインを放出する能力を有することができる。したがって、Ｔｓｃｍ細胞は、メモリーＴ細胞亜集団のサブセットである。Ｔｓｃｍ細胞表現型は、本明細書に開示されているように、常磁性人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）及び組み換えＴ細胞増殖因子カクテルを用いる濃縮及び拡大工程の使用によって、作成及び／または制御され得る。
【００２７】
本開示によると、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ細胞）は、ＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ４５ＲＡ−と定義される。このメモリー亜集団は、一般的にリンパ節及び末梢循環中に見出される。エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔｅｍ細胞）はＣＤ６２Ｌ−及びＣＤ４５ＲＡ−と定義される。これらのメモリーＴ細胞は、リンパ節ホーミング受容体を欠いており、したがって末梢循環及び組織中に見出される。ＴＥＭＲＡは、ＣＤ４５ＲＡを再発現する末端分化エフェクターメモリー細胞の略語である。これらの細胞は分裂する能力を有さず、ＣＤ６２Ｌ−及びＣＤ４５ＲＡ＋である。
【００２８】
Ｔｃｍ細胞は、自己再生する能力を表示し、本発明の実施形態によると、長寿効果を得るために重要である。Ｔｅｍ細胞は、また、いくらかの自己再生能力を有し、細胞傷害性機能に必須の遺伝子を強力に発現する。Ｔｅｍｒａ細胞は、強固な細胞傷害性機能も提供するが、自己再生能力は表示しない。
【００２９】
様々な実施形態の組成物は、Ｔｓｃｍ、Ｔｃｍ及びＴｅｍ細胞から実質的に構成されるＣＴＬを含み、効果の持続時間と悪性腫瘍または他の標的細胞の強力な破壊とのバランスを保つ。
【００３０】
様々な実施形態において、組成物中のＴ細胞は、少なくとも約３０％がセントラルメモリー細胞及びエフェクターメモリー細胞、または少なくとも約４０％がセントラルメモリー細胞もしくはエフェクターメモリー細胞、または少なくとも約５０％がセントラルメモリー細胞もしくはエフェクターメモリーＴ細胞、またはいくつかの実施形態では少なくとも約７０％がセントラルメモリー細胞もしくはエフェクターメモリーＴ細胞、または少なくとも約８０％がセントラルメモリー細胞もしくはエフェクターメモリーＴ細胞である。いくつかの実施形態において、メモリー細胞は、約１０：９０〜約９０：１０のセントラルメモリー細胞対エフェクターメモリー細胞である。いくつかの実施形態において、これらのＴ細胞は、約２５：７５〜約７５：２５のセントラルメモリー細胞対エフェクターメモリー細胞である。いくつかの実施形態において、メモリーＴ細胞は、約４０：６０〜約６０：４０のセントラルメモリー細胞対エフェクターメモリーＴ細胞である。細胞組成物は、約２０％未満の末端分化メモリーＴ細胞（例えば、Ｔｅｍｒａ細胞）、または約１０％未満、約５％未満、もしくは、いくつかの実施形態では約４％未満の末端分化メモリーＴ細胞を含む。様々な実施形態において、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、約２０％以下の未変性細胞、あるいはいくつかの実施形態では、約１５％以下の未変性細胞、または約１０％以下の未変性細胞、または約５％未満の未変性細胞、または約４％未満の未変性細胞、または約３％未満の未変性細胞、または約２％以下の未変性細胞、または約１．５％以下もしくは約１％以下の未変性細胞を含有する。様々な実施形態において、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、約５％〜約２５％のＴｓｃｍ細胞、またはいくつかの実施形態では、約５％〜約２０％のＴｓｃｍ細胞もしくは約５％〜約１５％のＴｓｃｍ細胞を含有する。
【００３１】
様々な実施形態において、標的抗原に特異的なＴ細胞は、少なくとも約３０％がセントラルメモリー細胞及びエフェクターメモリー細胞、または少なくとも約４０％がセントラルメモリー細胞もしくはエフェクターメモリー細胞、または少なくとも約５０％がセントラルメモリー細胞もしくはエフェクターメモリーＴ細胞、またはいくつかの実施形態では少なくとも約７０％がセントラルメモリー細胞もしくはエフェクターメモリーＴ細胞、または少なくとも約８０％がセントラルメモリー細胞もしくはエフェクターメモリーＴ細胞である。いくつかの実施形態において、これらのメモリー細胞は、約１０：９０〜約９０：１０のセントラルメモリー細胞対エフェクターメモリー細胞である。いくつかの実施形態において、これらのＴ細胞は、約２５：７５〜約７５：２５のセントラルメモリー細胞対エフェクターのメモリー細胞である。いくつかの実施形態において、メモリーＴ細胞は、約４０：６０〜約６０：４０のセントラル対エフェクターメモリーＴ細胞である。標的抗原（複数可）に特異的なＴ細胞は、約２０％未満が末端分化メモリーＴ細胞（例えば、ＴＥＭＲＡ細胞）、または約１０％未満、約５％未満、もしくは約４％未満が末端分化メモリーＴ細胞である。様々な実施形態において、標的抗原に特異的なＴ細胞は、約２０％以下の未変性細胞、あるいはいくつかの実施形態では、約１５％未満の未変性細胞、または約１０％未満の未変性細胞、または約５％未満の未変性細胞、または約２％、１．５％もしくは１％以下の未変性細胞を含有する。様々な実施形態において、標的抗原に特異的なＴ細胞は、約５％〜約２５％のＴｓｃｍ細胞、またはいくつかの実施形態では、約５％〜約２０％のＴｓｃｍ細胞、もしくは約５％〜約１５％のＴｓｃｍ細胞を含有する。この表現型は、常磁性人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を用いる濃縮及び拡大工程によって作成され得る。
【００３２】
様々な実施形態において、細胞組成物は、少なくとも９０％がＴ細胞、または少なくとも９５％がＴ細胞、または少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％がＴ細胞である。本開示の目的のため、Ｔ細胞はＣＤ３＋細胞と特徴付けられる。Ｔ細胞は、一般にＣＤ８＋である。例えば、単離細胞組成物は、約１０％未満もしくは約５％未満のＣＤ４＋Ｔ細胞、またはいくつかの実施形態において、約２％未満、約１．５％未満もしくは約１％未満のＣＤ４＋Ｔ細胞を有すると特徴付けることができる。ＣＤ８＋Ｔ細胞をエキソビボで拡大すると、ＣＤ４＋細胞は、ＣＤ８＋細胞を過剰増殖し、かつ増殖シグナルと競合する傾向を有し、強固で持続的応答ために必要ではない。
【００３３】
多機能性ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の存在は、ペプチド新性抗原を用いる癌ワクチン療法への応答と相関することが記載されている。Ｏｔｔ  ＰＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｐｅｒｓｏｎａｌ  ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｌａｎｏｍａ，Ｎａｔｕｒｅ  ５４７（７６６２）：２１７−２２１（２０１７）。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、腫瘍細胞の破壊を媒介するために重要であることが更に記載されている。Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４４，６４１−６４５（２０１４）；Ｓａｈｉｎ  Ｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ＲＮＡ  ｍｕｔａｎｏｍｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｍｏｂｉｌｉｚｅ  ｐｏｌｙ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃａｎｃｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ５４７（７６６２）：２２２−２２６（２０１７）を参照すること。本開示に関して、養子細胞組成物は、強固で持続的な応答のために相当数の抗体特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を提供することのみを必要とし、特に、抗体特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は十分な数で提供され、実質的にセントラルメモリー表現型及びエフェクターメモリー表現型であることが考えられる。様々な実施形態において、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｔメモリー幹細胞を更に含む。
【００３４】
様々な実施形態において、細胞組成物は実質的にＣＤ２８＋である。
【００３５】
様々な実施形態において、抗原特異的Ｔ細胞は、活性化されると、多機能性表現型を表示する。例えば、活性化すると、Ｔ細胞は、増殖及びメモリーのマーカーであるＩＬ−２；他のＴ細胞を活性化し、メモリー及びＭＨＣ上方制御を誘導するＩＦＮ−γ産生；炎症促進性マーカーであるＴＮＦ−αの産生；ならびにグランザイム放出及び細胞傷害活性のマーカーであるＣＤ１０７Ａの細胞内染色のうちの２つ以上について陽性である。様々な実施形態において、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％の抗原特異的Ｔ細胞は、これらのマーカーのうちの少なくとも３つを表示する。様々な実施形態において、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％の抗原特異的Ｔ細胞は、これらのマーカーの４つ全てを表示する。いくつかの実施形態において、多機能性は標的死滅アッセイを使用して評価または定量化され、標的死滅アッセイは、ＭＨＣとの複合体においてペプチド抗原を提示する標的細胞を溶解する、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の能力を評価する。
【００３６】
様々な実施形態による細胞組成物は、標的抗原（複数可）（例えば、腫瘍関連抗原またはウイルス関連抗原）に特異的なＣＤ８＋細胞の濃縮によって調製され得る。リンパ球源中の主に未変性細胞であっても、この細胞集団を培養で急速に拡大して、本明細書に記載されている細胞組成物にすることができる。ＣＤ４＋細胞は、ＣＤ４＋細胞枯渇マイクロビーズを用いてリンパ球から（抗原特異的濃縮の前または後に）枯渇させることができる。ＣＤ８＋細胞の抗原特異濃縮は、陽性選択された細胞集団に対して常磁性ビーズを使用して行うことができ、Ｔ細胞表面受容体の強力な磁気クラスタリングによって、未変性細胞を活性化するという追加の利点を有することができる。例えば、常磁性ビーズまたはナノ粒子は、いくつかの実施形態において、ＣＤ２８のアゴニスト（例えば、ＣＤ２８の抗体アゴニスト）などの、共刺激シグナルと共にペプチド抗原を提示する単量体または多量体（例えば、二量体）ＨＬＡリガンドを含有することができる。これらの実施形態による例示的な方法は、ＷＯ２０１６／０４４５３０及びＰＣＴ／ＵＳ２０１７／２２６６３に記載されており、これらはその全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【００３７】
いくつかの実施形態において、ＣＤ２８＋細胞も濃縮され、これは抗原特異的濃縮と同時であり得る。ＣＤ２８はＴ細胞において発現し、Ｔ細胞活性化及び生存のために必要な共刺激シグナルである。ＣＤ２８は、未変性Ｔ細胞に構成的発現する唯一のＢ７受容体である。ＣＤ２８による共刺激のない、未変性Ｔ細胞のＴＣＲとＭＨＣ抗原複合体との関連は、アレルギー性のＴ細胞をもたらし得る。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８＋細胞は濃縮されないが、ＣＤ２８アゴニストは、濃縮工程中に可溶性形態で添加される、または非常磁性ビーズに抱合されて添加される。いくつかの実施形態において、ＣＤ２８（抱合または非抱合形態）は、拡大期の細胞を活性化するため、抗原特異的濃縮の後に細胞に添加される。
【００３８】
様々な実施形態において、標的抗原に（例えば、ａＡＰＣまたはｐＡＰＣにより表示されたペプチドによって）特異的なＴ細胞は、１〜約１００個の標的抗原、または１〜約７５個の標的抗原、または１〜５０個の標的抗原約、または１〜約２５の標的抗原、または１〜約２０個の標的抗原、または１〜約１５個の標的抗原、または１〜１０個の標的抗原、または１〜５個の標的抗原に特異的である。様々な実施形態において、少なくとも３個、または少なくとも４個、または少なくとも５個の標的抗原が存在する。別個の標的抗原は、いくつかの実施形態において重複ペプチドエピトープを含むことができる。これらのペプチド抗原に特異的なＴ細胞をバッチで濃縮及び拡大することができ、細胞組成物の急速な並行産生を可能にする。いくつかの実施形態において、組成物は、５〜１５個または５〜１０個のペプチド抗原に特異的なＴ細胞を含有する。組成物中の標的ペプチド抗原に対するＴ細胞特異度は、当該分野に周知のＭＨＣ多量体染色（例えば、二量体または三量体染色）によって定義される。
【００３９】
例えば、それぞれのａＡＰＣが異なる別個の標的抗原を提示するナノａＡＰＣのカクテルを使用して、多数の抗原に対してＴ細胞を同時に濃縮することができる。例えば、２〜１０個の抗原に特異的なＴ細胞を、リンパ球源から同時に濃縮することができる。この実施形態において、それぞれ異なるＭＨＣペプチドを持つ、複数の異なるナノａＡＰＣバッチは組み合わされ、目的の抗原に対する各Ｔ細胞を同時に濃縮することに使用される。得られたＴ細胞プールは、これらの抗原のそれぞれに対して活性化され、培養で一緒に拡大される。これらの抗原は、例えば、複数の抗原が単一の腫瘍または悪性細胞に存在する、単一治療介入に関連し得る。
【００４０】
標的ペプチド抗原は、一般に、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、またはＨＬＡ−Ｃ分子複合体、いくつかの実施形態ではＨＬＡ−Ａ２分子複合体による提示に適している。
【００４１】
様々な実施形態において、標的ペプチド抗原は腫瘍または癌関連抗原であり、腫瘍由来抗原または腫瘍特異的抗原が挙げられる。腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞は、しばしば非常にまれであり、多くの場合、健常者の末梢血中において検出不能である。更に、細胞は、特にドナーＴリンパ球を使用した場合、しばしば未変性表現型のものである。
Ｑｕｉｎｔａｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｏｆ  ｍｅｌａｎｏｍａ（ＰＲＡＭＥ）ｔａｒｇｅｔ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ  ２００８；１１２：１８７６−１８８５を参照すること。これは、ウイルス特異的及び腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の間でしばしば観察される相違である。
【００４２】
「腫瘍関連抗原」または「癌特異的抗原」には、由来する腫瘍または悪性細胞によって排他的に発現される特有の腫瘍または癌抗原、多くの腫瘍で発現するが正常な成人組織では発現しない共通腫瘍抗原（癌胎児性抗原）及び腫瘍が生じる正常組織によっても発現される組織特異的抗原が挙げられる。腫瘍関連抗原は、例えば、胚性抗原、異常な翻訳後修飾を有する抗原、分化抗原、変異癌遺伝子もしくは腫瘍抑制因子の産物、融合タンパク質、またはオンコウイルスタンパク質であり得る。
【００４３】
いくつかの実施形態において、標的ペプチド抗原には、白血病、リンパ腫、または骨髄腫などの血液癌に関連または由来する１個以上が挙げられる。例えば、血液悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、小児急性白血病、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ球性白血病、骨髄異形成症候群、悪性皮膚Ｔ細胞、菌状息肉症、非ＭＦ皮膚Ｔ細胞リンパ腫、リンパ腫様丘疹症及びＴ細胞リッチ皮膚リンパ過形成であり得る。他の実施形態において、標的ペプチド抗原には、黒色腫、結腸癌、十二指腸癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、腺管癌、肝癌、膵癌、腎癌、子宮内膜癌、精巣癌、胃癌、口腔粘膜異形成、ポリポーシス、頭頸部癌、浸潤性口腔癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、中皮腫、膀胱移行及び扁平上皮癌、脳癌、神経芽細胞腫、ならびに経膠腫を含む固形腫瘍に関連または由来する１個以上が挙げられる。
【００４４】
様々な腫瘍関連抗原が当該技術に知られている。胎児性及び胚性抗原には、癌胎児抗原及びアルファ−フェトプロテイン（通常は発育中の胚で高度に発現するが、肝臓及び結腸の腫瘍においてそれぞれ頻繁に高度に発現する）、ＭＡＧＥ−１及びＭＡＧＥ−３（黒色腫、乳癌及び神経膠腫に発現）、胎盤アルカリホスファターゼシアリルルイスＸ（腺癌に発現）、ＣＡ−１２５及びＣＡ−１９（胃腸管、肝臓及び婦人科の腫瘍に発現）、ＴＡＧ−７２（結腸直腸腫瘍に発現）、上皮糖タンパク質２（多くの癌腫に発現）、膵癌胎児性抗原、５Ｔ４（胃癌に発現）、アルファフェトプロテイン受容体（複数の腫瘍型、特に乳腺腫瘍に発現）、ならびにＭ２Ａ（生殖細胞新生物に発現）が挙げられる。
【００４５】
腫瘍関連分化抗原には、チロシナーゼ（黒色腫に発現）及び特定の表面免疫グロブリン（リンパ腫に発現）が挙げられる。
【００４６】
変異癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子産物には、両方とも多くの腫瘍型で発現するＲａｓ及びｐ５３、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（乳癌及び婦人科癌に発現）、ＥＧＦ−Ｒ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、網膜芽細胞腫遺伝子産物、ｍｙｃ（肺癌に関連）、ｒａｓ、ｐ５３、乳房腫瘍に関連する非変異体、ＭＡＧＥ−１及びＭＡＧＥ−３（黒色腫、肺癌及び他のがんに関連）が挙げられる。融合タンパク質にはＢＣＲ−ＡＢＬが挙げられ、これは慢性骨髄性白血病において発現する。オンコウイルスタンパク質には、ＨＰＶタイプ１６、Ｅ６及びＥ７が挙げられ、子宮頸癌に見出される。
【００４７】
組織特異的抗原には、メラノトランスフェリン及びＭＵＣ１（膵癌及び乳癌に発現）；ＣＤ１０（以前に共通急性リンパ芽球性白血病抗原もしくはＣＡＬＬＡとしても知られている）または表面免疫グロブリン（Ｂ細胞白血病及びリンパ腫に発現）；ＩＬ−２受容体のα鎖、Ｔ細胞受容体、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋（Ｔ細胞白血病及びリンパ腫に発現）；前立腺特異的抗原及び前立腺酸性ホスファターゼ（前立腺癌に発現）；ＧＰ−１００、ＭｅｌａｎＡ／Ｍａｒｔ−１、チロシナーゼ、ｇｐ７５／ｂｒｏｗｎ、ＢＡＧＥ及びＳ−１００（黒色腫に発現）；サイトケラチン（様々な癌腫に発現）；ならびにＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ３７（リンパ腫に発現）が挙げられる。
【００４８】
腫瘍関連抗原には、ノイラミン酸含有スフィンゴ糖脂質などの改変糖脂質及び糖タンパク質抗原（例えば、ＧＭ２及びＧＤ２、黒色腫及びいくつかの脳腫瘍に発現）；癌腫に異常に発現し得る血液型抗原、特にＴ及びシアリル化Ｔｎの抗原；ならびにＣＡ−１２５及びＣＡ−１９−９（卵巣癌に発現）または不十分にグリコシル化されたＭＵＣ−１（乳癌及び膵癌に発現）などのムチンも挙げられる。
【００４９】
例えば、いくつかの実施形態において、１個以上の標的抗原は膀胱癌に関連し、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ−Ａ１０及びＭＵＣ−１抗原のうちの１個以上である。いくつかの実施形態において、１個以上の標的抗原は脳癌に関連し、ＮＹ−ＥＳＯ−１、サバイビン及びＣＭＶ抗原のうちの１個以上を挙げることができる。いくつかの実施形態において、１個以上の標的抗原は乳癌に関連し、ＭＵＣ−１、サバイビン、ＷＴ−１、ＨＥＲ−２及びＣＥＡ抗原のうちの１個以上を挙げることができる。いくつかの実施形態において、１個以上の標的抗原は子宮頸癌に関連し、ＨＰＶ抗原を挙げることができる。いくつかの実施形態において、１個以上の標的抗原は結腸直腸癌に関連し、ＮＹ−ＥＳＯ−１、サバイビン、ＷＴ−１、ＭＵＣ−１及びＣＥＡ抗原のうちの１個以上を挙げることができる。いくつかの実施形態において、１個以上の標的抗原は食道癌に関連し、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原を挙げることができる。いくつかの実施形態において、１個以上の標的抗原は頭頸部癌に関連し、ＨＰＶ抗原を挙げることができる。いくつかの実施形態において、標的抗原は腎癌または肝癌に関連し、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原を挙げることができる。いくつかの実施形態において、標的抗原は肺癌に関連し、ＮＹ−ＥＳＯ−１、サバイビン、ＷＴ−１、ＭＡＧＥ−Ａ１０及びＭＵＣ−１抗原のうちの１個以上を挙げることができる。いくつかの実施形態において、１個以上の標的抗原は黒色腫に関連し、ＮＹ−ＥＳＯ−１、サバイビン、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＲＴ−１及びＧＰ−１００のうちの１個以上を挙げることができる。いくつかの実施形態において、１個以上のペプチド抗原は卵巣癌に関連し、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１及びメソテリン抗原のうちの１個以上を挙げることができる。いくつかの実施形態において、１個以上の標的抗原は前立腺癌に関連し、サバイビン、ｈＴＥＲＴ、ＰＳＡ、ＰＡＰ及びＰＳＭＡ抗原のうちの１個以上を挙げることができる。いくつかの実施形態において、標的抗原は肉腫に関連し、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原を挙げることができる。いくつかの実施形態において、１個以上の標的抗原はリンパ腫に関連し、ＥＢＶ抗原を挙げることができる。いくつかの実施形態において、１個以上の標的抗原は多発性骨髄腫に関連し、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＷＴ−１及びＳＯＸ２抗原のうちの１個以上を挙げることができる。
【００５０】
いくつかの実施形態において、１個以上の標的抗原は、急性骨髄性白血病または骨髄異形成症候群に関連し、サバイビン、ＷＴ−１、ＰＲＡＭＥ、ＲＨＡＭＭ、ＰＲ３及びサイクリンＡ１抗原のうちの１個以上（１、２、３、４または５個を含む）を挙げることができる。いくつかの実施形態において、標的抗原には、下記の表１の標的抗原の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、または全てが挙げられる。
【表１】
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【００５１】
いくつかの実施形態において、１個以上の標的ペプチド抗原は新生新抗原である。例えば、いくつかの実施形態では、患者に特異的な新生抗原が同定され、ａＡＰＣにロードするために合成される。いくつかの実施形態において、３〜１０個の新生抗原が、患者の悪性腫瘍の遺伝学的解析（例えば、悪性細胞の核酸の配列決定により）、続いて予測バイオインフォマティクスによって同定される。いくつかの実施形態において、抗原は天然の非変異癌抗原であり、多くのものが知られている。
【００５２】
様々な実施形態において、少なくとも１個の標的ペプチド抗原は、低頻度前駆Ｔ細胞により認識される。これらの実施形態によると、本発明は、これらの細胞を養子療法のために急速に活性化及び拡大することができる。
【００５３】
いくつかの実施形態において、標的ペプチド抗原には、ウイルス、細菌、真菌または寄生虫病原体などの病原体に関連または由来する少なくとも１個が挙げられる。例えば、少なくとも１個のペプチド抗原は、ＨＩＶ、肝炎（例えば、Ａ、Ｂ、ＣまたはＤ）ＣＭＶ、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）、インフルエンザ、ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ１もしくはＨＳＶ２、または水痘帯状疱疹）及びアデノウイルスに関連し得る。ＣＭＶは、例えば、臓器移植患者に見られる最も一般的なウイルス病原体であり、骨髄または末梢血幹細胞移植を受けた患者における罹患率及び死亡率の主要な原因である。このことは、これらの患者の免疫不全状態が原因であり、これらが血清陽性患者における潜伏ウイルスの再活性化及び血清陰性個人における日和見感染症を許容する。これらの実施形態において、患者は、病原体の抗原に特異的なＴ細胞を含む養子免疫療法を受けることができる。この方法は、患者由来または移植処置の開始前に適切なドナー由来のウイルス特異的ＣＴＬの生成を伴うことができる。
【００５４】
いくつかの実施形態において、少なくとも１個の標的抗原は病原体関連抗原であり、原生動物、細菌、真菌（単細胞及び多細胞の両方）、ウイルス、プリオン、細胞内寄生虫、蠕虫及び他の感染因子に関連する抗原が挙げられる。
【００５５】
細菌抗原には、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ、Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｅ、Ｃａｐｔｏｐｈａｇａｃｅａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａｃｅａｅ、Ｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅの科の生物、ならびにＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ、Ｅｗｉｎｇｅｌｌａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｅｖｉｎｅａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ及びＴｒｏｐｈｅｒｙｍａの属の生物などの、グラム陽性球菌、グラム陰性桿菌、グラム陰性細菌、嫌気性菌の抗原が挙げられる。
【００５６】
原動物感染性因子の抗原には、マラリアプラスモジウム（ｍａｌａｒｉａｌ  ｐｌａｓｍｏｄｉａ）、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ種、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ種及びＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ種の抗原が挙げられる。
【００５７】
真菌抗原には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｃｉｏｉｄｅｓ、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ、Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ目の生物、黒色真菌症及び菌腫を誘発する生物、ならびにＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ及びＭａｌａｓｓｅｚｉａ属の生物が挙げられる。
【００５８】
ウイルスペプチド抗原には、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ポックスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、ＥＢＶ、肝炎及びＣＭＶが挙げられるが、これらに限定されない。特に有用なウイルスペプチド抗原には、ＨＩＶタンパク質、例えば、ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質（膜アンカー（ＭＡ）タンパク質、コアカプシド（ＣＡ）タンパク質及びヌクレオカプシド（ＮＣ）タンパク質が含まれるが、これらに限定されない）、ＨＩＶポリメラーゼ、インフルエンザウイルスマトリックス（Ｍ１）タンパク質及びインフルエンザウイルスヌクレオカプシド（ＮＰ）タンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、Ｂ型肝炎コアタンパク質（ＨＢｃＡｇ）、Ｅ型肝炎タンパク質（ＨＢｅＡｇ）、Ｂ型肝炎ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃ型肝炎抗原等が挙げられる。
【００５９】
いくつかの実施形態において、標的ペプチド抗原には、抗腫瘍応答を提供し、同時に、ＨＳＣＴ後の回復を複雑にする一般的な病原体に対する保護を提供する、１個以上の腫瘍関連抗原及び１個以上のウイルス関連抗原（例えば、ＣＭＶ、ＥＢＶ、インフルエンザ、またはアデノウイルス）が挙げられる。
【００６０】
ＨＳＣＴを受けた患者は、免疫無防備状態を考慮すると、特に感染症の危険性がある。これらの患者の免疫不全状態は、血清陽性患者における潜伏ウイルスの再活性化または血清陰性個人における日和見感染症を許容する。例えば、移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）は、有意な割合の移植患者に発生し、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）感染によってもたらされる。ＥＢＶ感染は、米国の成人人口のおよそ９０％に存在すると考えられる。能動的なウイルス複製及び感染は、免疫系によってチェックを受け続けているが、ＣＭＶの場合、移植療法により免疫無防備状態になった個人は、制御性Ｔ細胞集団を失い、ウイルスの再活性化を許容する。このことは、移植プロトコルに対して重大な障害となる。ＥＢＶは、様々な血液学的及び非血液学的癌の腫瘍促進に関与することもある。
【００６１】
さらに他の実施形態において、細胞組成物は、腫瘍関連抗原に特異的なＴ細胞を含み、病原体関連Ｔ細胞はバイスタンダー細胞として提供される。具体的には、ＨＬＡペプチド複合体と抗ＣＤ２８バイスタンダー細胞の両方の選択に基づいてＣＤ８＋Ｔ細胞を濃縮することにより、特に、これらの細胞のいくらかの非特異的拡大を抗原特異的活性化なしで誘導できるＴ細胞増殖因子カクテルを使用する場合、バイスタンダー細胞は濃縮及び拡大される。これらの実施形態において、組成物の大部分は標的ペプチドに特異的なＴ細胞（例えば、５％〜７５％または１０％〜５０％）であり、残りのＴ細胞は、一般的な病原体に対する免疫系にいくらかの再構成を提供し、このことは、特に、移植後に有益である。例えば、組成物は、ＣＭＶ、ＥＢＶ、インフルエンザ及びアデノウイルスに特異的なＴ細胞を含むことができる。それぞれの場合に、病原体特異的Ｔ細胞は、組成物に０．１％〜約４％で存在してもよい。
【００６２】
様々な実施形態において、本発明は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の濃縮及び拡大により調製される組成物を伴う。前駆Ｔ細胞は、患者から、または適切なＨＬＡ適合ドナーから得ることができる。Ｔ細胞源は、新たな試料または凍結試料のいずれかであり得る。前駆Ｔ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄、リンパ節組織、脾臓組織、バフィーコート画分及び腫瘍が挙げられるＷＢＣを含む多数の源から得ることができる。いくつかの実施形態において、前駆Ｔ細胞は、当業者に既知の任意の数の技術を使用して対象から採取した血液のユニットから得られる。例えば、個人の循環血の前駆Ｔ細胞は、アフェレーシスまたは白血球搬出法によって得ることができる。アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞及び前駆Ｔ細胞を含むリンパ球、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、ならびに血小板を含有する。白血球搬出法は、白血球が血液試料から分離される検査手法である。
【００６３】
アフェレーシスによって採取された細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、細胞をその後の処理ステップに適切な緩衝液または培地中に置くことができる。洗浄ステップは、半自動「フロースルー」遠心分離機を使用するなど、当業者に既知の方法によって達成することができる。洗浄した後、細胞は、例えば、Ｃａ無含有、Ｍｇ無含有ＰＢＳなどの様々な生体適合性緩衝液に再懸濁され得る。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない成分が除去され、細胞が培養培地に直接再懸濁され得る。
【００６４】
望ましい場合、前駆Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離により単球を枯渇させることによって、末梢血リンパ球から単離され得る。
【００６５】
特定の実施形態において、白血球は、白血球搬出法によって採取され、続いて、例えば、ＣＤ４＋細胞の試料を枯渇させることにより及び／またはＣＤ８＋細胞を能動的濃縮することにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞を濃縮することができる。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞などの他の種類の細胞が枯渇される。次いで、ＣＤ８濃縮細胞を、抗原特異的Ｔ細胞について更に濃縮することができる。
【００６６】
様々な実施形態では、免疫細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）を含む試料を、磁気特性を有する人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）と接触させる。常磁性材料は、磁場に対して小さな正の磁化率を有する。これらの材料は磁場によって吸引され、外部磁界が取り除かれたとき、材料は磁気特性を保持しない。例示的な常磁性材料には、限定されることなく、マグネシウム、モリブデン、リチウム、タンタル及び酸化鉄が挙げられる。磁気濃縮に適した常磁性ビーズは市販されている（ＤＹＮＡＢＥＡＤ（商標）、ＭＡＣＳ  ＭＩＣＲＯＢＥＡＤＳ（商標）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）。いくつかの実施形態において、ａＡＰＣ粒子は、鉄デキストランビーズ（例えば、デキストラン被覆酸化鉄ビーズ）である。
【００６７】
抗原提示複合体は、抗原結合裂溝（ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃｌｅｆｔ）を含み、一般にＭＨＣクラスＩであり、連結または繋留されて、二量体または多量体ＭＨＣを提供することができる。いくつかの実施形態において、ＭＨＣは単量体であるが、ナノ粒子との密接な関連性が、結合活性及び活性化のために十分である。いくつかの実施形態において、ＭＨＣは二量体である。二量体ＭＨＣクラスＩリガンドは、免疫グロブリン重鎖配列への融合によって構築され、次いで、１つ以上のジスルフィド結合を介して（関連する軽鎖を伴って、また伴うことなく）関連付けられる。ＭＨＣ多量体は、ペプチドもしくは化学リンカーを介する直接的繋留によって作成され得る、またはビオチン部分を介するストレプトアビジンとの関連付けを介して多量体となり得る。いくつかの実施形態において、抗原提示複合体は、免疫グロブリン配列との融合体を含むＭＨＣクラスＩ複合体である。
【００６８】
免疫グロブリン配列を有するＭＨＣクラスＩ分子複合体は米国特許第６，２６８，４１１号に記載されており、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。これらのＭＨＣクラスＩ分子複合体は、免疫グロブリン重鎖の末端に立体構造的に完全な様式で形成され得る。抗原ペプチドが結合しているＭＨＣクラスＩ分子複合体を、抗原特異的リンパ球受容体（例えば、Ｔ細胞受容体）に安定して結合することができる。様々な実施形態において、免疫グロブリン重鎖配列は、完全長ではないが、Ｉｇのヒンジ領域を含み、ＣＨ１、ＣＨ２及び／またはＣＨ３ドメインの１つ以上を含む。Ｉｇの配列は、可変領域を含んでも含まなくてもよいが、可変領域配列が存在する場合、可変領域は、完全または部分的であってもよい。複合体は、免疫グロブリン軽鎖を更に含むことができる。その全体が参照として本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１６／１０５５４２に記載されているように、可変鎖配列を欠いている（及び任意の軽鎖を欠いている）ＭＨＣクラスＩリガンド（例えば、ＨＬＡ−Ｉｇ）を粒子への部位特異的抱合に用いることができる。
【００６９】
例示的なＭＨＣクラスＩ分子複合体は、少なくとも２つの融合タンパク質を含む。第１の融合タンパク質は、第１のＭＨＣクラスＩα鎖及び第１の免疫グロブリン重鎖（または、そのヒンジ領域を含む部分）を含み、第２の融合タンパク質は、第２のＭＨＣクラスＩα鎖及び第２の免疫グロブリン重鎖（または、そのヒンジ領域を含む部分）を含む。第１及び第２の免疫グロブリン重鎖は関連して、２つのＭＨＣクラスＩペプチド結合裂溝を含むＭＨＣクラスＩ分子複合体を形成する。免疫グロブリン重鎖は、ＩｇＭ抗体、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、ＩｇＧ２β、ＩｇＧ２α、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、またはＩｇＡの重鎖であり得る。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ重鎖は、ＭＨＣクラスＩ分子複合体の形成に使用される。多価ＭＨＣクラスＩ分子複合体が望ましい場合、ＩｇＭまたはＩｇＡの重鎖は、それぞれ、五価または四価分子を提供するために使用され得る。
【００７０】
例示的なクラスＩ分子には、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅが挙げられ、これらを個別に、または任意の組み合わせで使用することができる。いくつかの実施形態において、抗原提示複合体はＨＬＡ−Ａ２リガンドである。本明細書で使用される用語ＭＨＣは、それぞれの場合にＨＬＡに置き換えることができる。
【００７１】
免疫グロブリン配列は、いくつかの実施形態において、ヒト化モノクローナル抗体の配列である。
【００７２】
ａＡＰＣは、抗ＣＤ２８リガンドなどの「シグナル２」を含有してもよい。シグナル２は、一般に、Ｔ細胞影響分子、すなわち、前駆Ｔ細胞または抗原特異的Ｔ細胞に生物学的効果を有する分子である。特定の実施形態において、シグナル２はＴ細胞共刺激分子である。Ｔ細胞共刺激分子は、抗原特異的Ｔ細胞の活性化に寄与する。このような分子には、ＣＤ２８（抗体を含む）、ＣＤ８０（Ｂ７−１）、ＣＤ８６（Ｂ７−２）、Ｂ７−Ｈ３、４−１ＢＢ、４−１ＢＢＬ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ１３４（ＯＸ−４０Ｌ）、Ｂ７ｈ（Ｂ７ＲＰ−１）、ＣＤ４０、ＬＩＧＨＴに特異的に結合する分子、ＨＶＥＭに特異的に結合する抗体、ＣＤ４０Ｌに特異的に結合する抗体及びＯＸ４０に特異的に結合する抗体が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、共刺激分子（シグナル２）は、抗体（例えば、モノクローナル抗体）もしくはＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなどのその一部、または一本鎖抗体、または他の抗原結合フラグメントである。いくつかの態様において、抗体は、ヒト化モノクローナル抗体もしくは抗原結合活性を有するその一部である、または完全ヒト抗体もしくは抗原結合活性を有するその一部である。
【００７３】
用いることができる（同じ、または別個のナノ粒子に対して）共刺激リガンドの組み合わせには、抗ＣＤ２８／抗ＣＤ２７及び抗ＣＤ２８／抗４１ＢＢが挙げられる。これらの共刺激リガンドの比は、拡大を実行するために変わり得る。
【００７４】
例示的なシグナル１及びシグナル２リガンドは、ＷＯ２０１４／２０９８６８に記載されており、定常領域が、適切な化学機能性を有するナノ粒子支持体に結合され得るように遊離スルフヒドリル（例えば、不対システイン）を有するリガンドを記載している。
【００７５】
ナノａＡＰＣに有用な接着分子を使用して、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体へのナノａＡＰＣの接着を媒介することができる。有用な接着分子には、例えば、ＩＣＡＭ−１及びＬＦＡ−３が挙げられる。
【００７６】
いくつかの実施形態において、シグナル１はペプチドＨＬＡ−Ａ２複合体によって提供され、シグナル２はＢ７．１−Ｉｇまたは抗ＣＤ２８によって提供される。例示的な抗ＣＤ２８モノクローナル抗体は、９．３ｍＡｂであり（Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９３１７７：１６５）、特定の実施形態において、ヒト化されてもよい及び／または完全に無傷の抗体もしくはその抗原結合フラグメントとしてビーズに抱合されてもよい。
【００７７】
磁気活性化は、２分間〜５時間または５分間〜２時間にわたって実施され、続いて少なくとも５日間〜２週間まで、またはいつかの実施形態では３週間まで培養で拡大され得る。いくつかの実施形態において、磁気活性化は、少なくとも２分間であるが、３０分未満（例えば、約５または１０分間）にわたって行われる。得られたＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｔメモリー幹細胞（Ｔｓｃｍ）、ならびに多くのセントラル及びエフェクターメモリー表現型の存在の確認によって表現型的に特徴付けることができる。
【００７８】
いくつかの実施形態は、拡大の際にＴ細胞増殖因子を用い、このことは、Ｔ細胞の増殖及び／または分化に影響を与える。Ｔ細胞増殖因子の例には、サイトカイン（例えば、インターロイキン、インターフェロン）及びスーパー抗原が挙げられる。望ましい場合、サイトカインは、融合タンパク質を含む分子複合体に存在することができる、またはａＡＰＣによってカプセル化され得る、もしくは可溶性形態で提供され得る。特に有用なサイトカインには、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＦＮ−γ及びＣＸＣＬ１０が挙げられる。いくつかの実施形態において、増殖因子には、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１及びＩＮＦ−γのうちの３、４、５または６個が挙げられる。これら、または他の実施形態において、細胞は、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−１β及びＩＬ−６、ならびに任意選択でＩＬ−１０から選択される１，２、３個のサイトカインの存在下での培養で拡大される。いくつかの実施形態において、細胞は、ＩＬ−７、及び／またはＩＬ−２１、及び／またはＩＬ−１５の存在下で培養されない。細胞は、約２週間（約１４日間）または約３週間など、１〜４週間にわたる培養により拡大され得る。
【００７９】
いくつかの実施形態において、細胞は、４〜８個のサイトカインの存在下での培養で拡大されて、Ｔ細胞拡大（抗原特異的Ｔ細胞拡大を含む）、活性化及びメモリー表現型のバランスを達成する。いくつかの実施形態において、細胞は、ＩＬ−４の存在下で拡大される。いくつかの実施形態において、細胞は、ＩＬ−４及びＩＬ−６の存在下で拡大される。いくつかの実施形態において、細胞は、ＩＬ−４及びＩＬ−１βの存在下で拡大される。いくつかの実施形態において、細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−６及びＩＬ−１βの存在下で拡大される。いくつかの実施形態において、細胞は、ＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＬ−６の存在下で拡大される。いくつかの実施形態において、細胞は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＮＦ−γ及びＩＬ−１βの存在下で拡大される。いくつかの実施形態において、細胞は、ＩＬ−１０の存在下で拡大される。
【００８０】
いくつかの実施形態において、増殖因子は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＮＦ−γ及びＩＬ−１β、ならびに任意選択でＩＬ−１０から構成される、または実質的に構成される。
【００８１】
いくつかの実施形態において、ＩＬ−２は、培養の開始時に１ｍｌあたり１０〜２００国際単位（ＩＵ）、例えば、約２０〜約１００ＩＵ／ｍｌまたは約２０〜約６０ＩＵ／ｍｌで存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２は、培養の開始時に約３０〜約５０ＩＵ／ｍｌ（例えば、約４０ＩＵ／ｍｌ）で存在する。ＩＬ−２のＩＵ（８６／５００  ＮＩＢＳＣ）は、増殖アッセイを使用して（例えば、ＣＴＬＬ−２細胞系を使用して）決定することができ、例えば、Ｇｅａｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂｉｒｄ（１９８７）ｉｎ  Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｃｌｅｍｅｎｓ，ＭＪ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）：ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ．２９５に記載されている。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２は、培養の開始時に約２〜約２５ｎｇ／ｍｌ、例えば、約５〜約１５ｎｇ／ｍｌで存在する。
【００８２】
これらの、または独立した実施形態において、ＩＬ−４は、培養の開始時に１ｍｌあたり０．２〜２５国際単位（ＩＵ）、例えば、約０．５〜約１０ＩＵ／ｍｌまたは約０．５〜約５ＩＵ／ｍｌで存在する。いくつかの実施形態において、ＩＬ−４は、培養の開始時に約１ＩＵ／ｍｌで存在する。ＩＬ−４のＩＵ（８８／６５６  ＮＩＢＳＣ）は、増殖アッセイを使用して（例えば、ＴＦ−１細胞系を使用して）決定することができ、例えば、Ｋｉｔａｍｕｒａ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）ＩＬ−１  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｏｎ  ａ  ｆａｃｔｏｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ，ＴＦ−１．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：５７１−５７７に記載されている。いくつかの実施形態において、ＩＬ−４は、培養の開始時に約０．２〜約２ｎｇ／ｍｌ、例えば、約０．２〜約１ｎｇ／ｍｌ（例えば、約０．５ｎｇ／ｍｌ）で存在する。
【００８３】
これらの、または独立した実施形態において、ＩＬ−６は、培養の開始時に１ｍｌあたり１０〜２００国際単位（ＩＵ）、例えば、約２５〜約１００ＩＵ／ｍｌ、例えば、約２５〜７５ＩＵ／ｍｌで存在してもよい。いくつかの実施形態において、ＩＬ−６は、培養の開始時に約４０〜約６０ＩＵ／ｍｌ（例えば、約５０ＩＵ／ｍｌ）で存在する。ＩＬ−６のＩＵ  （８９／５４８  ＮＩＢＳＣ）は、増殖アッセイを使用して（例えば、Ｂ９細胞系を使用して）確定することができ、例えば、Ｇａｉｎｅｓ−Ｄａｓ  ＲＥ  ａｎｄ  Ｐｏｏｌｅ  Ｓ．（１９９３）Ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｎ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １６０：１４７−１５３に記載されている。いくつかの実施形態において、ＩＬ−６は、培養の開始時に約０．２〜約１０ｎｇ／ｍｌ、例えば、約０．２〜約５ｎｇ／ｍｌ（例えば、約０．５〜２ｎｇ／ｍｌ）で存在する。
【００８４】
これらの、または独立した実施形態において、インターフェロンガンマ（ＩＮＦ−γ）は、培養の開始時に１ｍｌあたり１０〜２００国際単位（ＩＵ）、例えば、約２０〜約１００ＩＵ／ｍｌ、例えば、約２０〜６０ＩＵ／ｍｌで存在する。いくつかの実施形態において、ＩＮＦ−γは、培養の開始時に約３０〜約５０ＩＵ／ｍｌ（例えば、約４０ＩＵ／ｍｌ）で存在する。ＩＮＦ−γのＩＵ（８７／５８６  ＮＩＢＳＣ）は、抗ウイルスアッセイを使用して（例えば、ＥＭＣに感染したＨｅｌａ細胞を用いて）確定することができ、例えば、Ｍｅａｇｅｒ  Ａ．（１９８７）ｉｎ  Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ，ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｃｌｅｍｅｎｓ，ＭＪ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ）：ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ．１２９．に記載されている。いくつかの実施形態において、ＩＮＦ−γは、培養の開始時に約０．５〜約２０ｎｇ／ｍｌ、例えば、約１〜約１０ｎｇ／ｍｌ（例えば、１〜５ｎｇ／ｍｌ）で存在する。
【００８５】
ＩＬ−１βは、培養の開始時に１ｍｌあたり５〜１００国際単位（ＩＵ）、例えば、約１０〜約５０ＩＵ／ｍｌ、例えば、約１０〜約３０ＩＵ／ｍｌで存在してもよい。いくつかの実施形態において、ＩＬ−１βは、培養の開始時に約１０〜約２０ＩＵ／ｍｌ（例えば、約１５ＩＵ／ｍｌ）で存在する。ＩＬ−１βのＩＵ（８６／６８０  ＮＩＢＳＣ）は、増殖アッセイを使用して（例えば、Ｄ．１０．Ｇ４．１細胞を使用して）確定することができ、例えば、Ｐｏｏｌｅ，Ｓ．及びＧａｉｎｅｓ−Ｄａｓ，ＲＥ（１９９１）Ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｂｅｔａ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｎ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４２：１−１３に記載されている。いくつかの実施形態において、ＩＬ−１βは、培養の開始時に約０．２〜約５ｎｇ／ｍｌ、例えば、約０．２〜約２ｎｇ／ｍｌまたは約０．２〜約１ｎｇ／ｍｌで存在する。
【００８６】
様々な実施形態において、細胞は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＮＦ−γ及びＩＬ−１βを含む、またはからなる増殖因子カクテルの存在下で培養される。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２とＩＮＦ−γの相対的活性（それぞれのＩＵによって定義される）は、約０．５：１〜約１：０．５（例えば、約１：１）である。これらの、または独立した実施形態において、ＩＬ−２とＩＬ−６の相対的活性（それぞれＩＵによって定義される）は、約０．５：１〜１：０．５である。これらの、または独立した実施形態において、ＩＬ−１βと、ＩＬ−２、ＩＬ−６及び／またはＩＦＮ−γとの相対活性（それぞれのＩＵによって定義される）は、１：４〜１：２（例えば、約１：３）である。これらの、または独立した実施形態において、ＩＬ−４と、ＩＬ−２、ＩＬ−６及び／またはＩＦＮ−γとの相対活性（それぞれのＩＵによって定義される）は、１：３０〜１：６０である。これらの、または独立した実施形態において、ＩＬ−４とＩＬ−１βの相対活性（それぞれのＩＵによって定義される）は、約１：５〜約１：２５、例えば、約１：１０〜約１：２０である。
【００８７】
いくつかの実施形態において、培養の開始時の各増殖因子（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＮＦ−γ及びＩＬ−１β）の特異的活性（ＩＵで）は、培養物中の全ての増殖因子の合計のＩＵの合計が１００％と考慮される率で示すことができる。例えば、いくつかの実施形態において、培養物中の各増殖因子の率を以下のようにすることができる。
２０％〜４０％のＩＬ−２（例えば、２０〜３０％のＩＬ−２）；
０．５％〜５％のＩＬ−４（例えば、１〜３％のＩＬ−４）；
２５％〜５０％のＩＬ−６（例えば、３０〜４０％のＩＬ−６）；
２０％〜４０％のＩＦＮ−γ（例えば、２０〜３０％のＩＦＮ−γ）；及び
５％〜２０％のＩＬ−１β（例えば、５〜１５％のＩＬ−１β）。
【００８８】
ａＡＰＣナノ粒子は、任意の材料から作ることができ、材料は、所望の磁気特性によって適切に選択することができ、例えば、鉄、ニッケル、コバルト、または希土類金属の合金などの金属を含むことができる。常磁性材料には、マグネシウム、モリブデン、リチウム、タンタル及び酸化鉄も挙げられる。材料（細胞を含む）の濃縮に適した常磁性ビーズは、市販されており、デキストラン被覆酸化鉄ビーズなどの鉄デキストランビーズが挙げられる。磁気特性が必要とされない本発明の態様において、ナノ粒子は、セルロース、セラミック、ガラス、ナイロン、ポリスチレン、ゴム、プラスチックまたはラテックスなどの非金属または有機（例えば、ポリマー）材料から作ることもできる。ナノ粒子を調製する例示的な材料には、ポリ（乳酸グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）またはＰＬＡ及びこれらのコポリマーがあり、これらの実施形態に関連して使用することができる。用いることができるポリマー及びコポリマーを含む他の材料には、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／２５８８９に記載されているものが挙げられる。
【００８９】
様々な実施形態において、粒子は、約１０〜約５００ｎｍ以内、または約４０〜約４００ｎｍ以内、または約１００ｎｍ〜４００ｎｍ以内のサイズ（例えば、平均直径）を有する。磁気クラスタリングのために、いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、１０〜２５０ｎｍ、または２０〜１００ｎｍの範囲のサイズを有することが好ましい。細胞ナノ粒子界面での受容体リガンド相互作用は、よく理解されていない。しかし、ナノ粒子結合および細胞活性化は、Ｔ細胞活性化の際に特に重要である膜空間構成に敏感であり、磁場を使用して、クラスター結合ナノ粒子が活性化を増強するように操作することができる。例えば、Ｔ細胞活性化は、持続的に強化されたナノスケールＴＣＲクラスタリングの状態を誘導し、ナノ粒子は、より大きい粒子では敏感ではないこのクラスタリングに対して敏感である。
【００９０】
更に、ナノ粒子とＴＣＲクラスターとの相互作用は、トリガー受容体を増強するために利用することができる。Ｔ細胞の活性化は、最初にＴ細胞ＡＰＣ接触部位の周囲に形成され、内側に移行する、数百ナノメートにわたる「シグナリングクラスター」を伴うシグナル伝達タンパク質の凝集によって媒介される。本明細書に記載されるように、外部磁場を使用して、抗原特異的Ｔ細胞（希少な未変性細胞を含む）を濃縮し、ＴＣＲに結合した磁気ナノａＡＰＣの凝集を誘導して、ＴＣＲクラスターの凝集及び未変性Ｔ細胞の活性化の増強をもたらすことができる。磁場は、常磁性粒子に対して適切で強い力を発揮するが、それ以外は生物学的に不活性であり、粒子の挙動を制御するための強力なツールとなる。常磁性ナノａＡＰＣに結合したＴ細胞は、外部適用された磁場の存在下で活性化される。ナノａＡＰＣは、それ自体が磁化されており、磁界源及び磁界にあるナノ粒子の近接の両方に吸引され、ビーズを誘導し、したがってＴＣＲの凝集を誘導して、ａＡＰＣ媒介活性化を押し上げる。
【００９１】
活性化化学を使用して、ナノ粒子の表面への分子の特異的で安定した結合を可能にすることができる。タンパク質を官能基に結合させることに使用できる、多くの方法が存在する。例えば、一般的な架橋グルタルアルデヒドを使用して、タンパク質アミン基をアミノ化ナノ粒子表面に２ステップ工程で結合させることができる。得られる連結は加水分解的に安定している。他の方法には、タンパク質のアミンと反応するｎ−ヒドロスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを含有する架橋、アミン−、スルフヒドリル−またはヒスチジン含有タンパク質と反応する活性ハロゲンを含有する架橋、アミンまたはスルフヒドリル基と反応するエポキシドを含有する架橋、マレイミド基とスルフヒドリル基との抱合、及びペンダント糖部分の過ヨウ素酸酸化、続く還元性アミノ化によるタンパク質アルデヒド基の形成の使用が挙げられる。
【００９２】
同じ、または異なる粒子に同時に使用される特定のリガンドの比を変化させて、抗原または共刺激リガンド提示におけるナノ粒子の有効性を高めることができる。例えば、ナノ粒子を、ＨＬＡ−Ａ２−Ｉｇ及び抗ＣＤ２８（または、他のシグナル２リガンド）と、約３０：１、約２５：１、約２０：１、約１５：１、約１０：１、約５：１、約３：１、約２：１、約１：１、約０．５：１、約０．３：１、約０．２：１、約  ０．１：１、または約０．０３：１などの多様な比で結合させることができる。いくつかの実施形態において、比は、２：１〜１：２である。支持体に結合されたタンパク質の総量は、例えば、粒子の約２５０ｍｇ／ｍｌ、約２００ｍｇ／ｍｌ、約１５０ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌ、または約５０ｍｇ／ｍｌであってもよい。そのようなサイトカイン放出および増殖などのエフェクター機能は、Ｔ細胞活性化及び分化よりシグナル１対シグナル２における要件が異なることがあるため、これらの機能を別々に決定することができる。
【００９３】
特定の実施形態において、ａＡＰＣは、５０〜１５０ｎｍの範囲の常磁性粒子であり、ＰＤＩ（サイズ分布）が０．２未満、いくつかの実施形態では０．１未満である。ａＡＰＣは、０〜−１０ｍＶ、例えば約−２〜−６ｍＶの表面電荷を有してもよい。ａＡＰＣは、粒子１個あたり１０〜１２０個のリガンド、例えば粒子１個あたり約２５〜約１００個のリガンドを有してもよく、リガンドは、免疫グロブリン配列のＦｃ領域に導入された遊離システインを介して粒子に抱合されている。粒子は、約１：１の比でＨＬＡ二量体：抗ＣＤ２８を含有してもよく、これらは、粒子の同じ、または異なる集団に存在してもよい。ナノ粒子は、同族Ｔ細胞の強力な拡大を提供し、同時に、ペプチド抗原の受動的ローディングを伴っていても、非同族ＴＣＲの刺激を示さない。粒子は、少なくとも２年間または３年間の凍結乾燥形態で安定している。
【００９４】
濃縮及び拡大した後、試料の抗原特異的Ｔ細胞成分は、少なくとも約５％、または少なくとも約１０％、または少なくとも約１５％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約２５％が抗原特異的Ｔ細胞である。更に、これらのＴ細胞は、一般にメモリー表現型（セントラルメモリーとエフェクターメモリーの両方、ならびにＴメモリー幹細胞を含む）を表示する。患者から分離された元の試料から、抗原特異的Ｔ細胞は、約１００倍〜約１０，０００倍、例えば、少なくとも約１００倍または少なくとも約２００倍に（約７日間で）拡大される。２週間後、抗原特異的Ｔ細胞は、様々な実施形態において、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約２０００倍、少なくとも約３，０００倍、少なくとも約４，０００倍、または少なくとも約５，０００倍に拡大される。いくつかの実施形態において、抗原特異的Ｔ細胞は、２週間後に５０００倍を超えて、または１０，０００倍を超えて拡大される。拡大の１〜２週間後に、少なくとも約１０６個、または少なくとも約１０７個、または少なくとも約１０８個、または少なくとも約１０９個の抗原特異的Ｔ細胞が得られる。
【００９５】
適切なインキュベーション条件（培養培地、温度、等）には、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体の培養に使用されるもの、ならびにＤＣまたは人工抗原提示細胞を使用して抗原特異的Ｔ細胞の形成を誘導する当該技術に既知のものが挙げられる。
【００９６】
細胞組成物は、静脈内注入、動脈内投与、リンパ管内投与及び腫瘍内投を含む任意の適切な経路によって患者に投与され得る。
【００９７】
いくつかの実施形態において、患者は、養子移入によって細胞組成物を受容する前に（または任意選択で、受容した後に）、１つ以上のチェックポイント阻害剤で免疫療法を受ける。様々な実施形態において、チェックポイント阻害剤（複数可）は、１個以上のＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１を標的にし、そのような標的に対して、モノクローナル抗体もしくはその一部、またはそのヒト化もしくは完全ヒトバージョンなどの抗体を含むことができる。いくつかの実施形態において、チェックポイント阻害剤療法は、イピリムマブまたはＫｅｙｔｒｕｄａ（ペンブロリズマブ）を含む。
【００９８】
いくつかの実施形態において、患者は、１〜５回（例えば、１、２、３、４、または５回）の養子免疫療法を受ける。いくつかの実施形態において、養子免疫療法のそれぞれの投与は、一連のチェックポイント阻害剤療法と、同時に、またはその後に（例えば、約１日〜約１週間後に）実施される。いくつかの実施形態において、養子免疫療法は、チェックポイント阻害剤投与の約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、または約１週間後に提供される。いくつかの実施形態において、患者は、細胞組成物の単回投与のみを受ける。
【００９９】
いくつかの態様において、本発明は、個別化癌免疫療法の方法を提供する。この方法は、ａＡＰＣを使用して、患者が応答する抗原を同定し、続いて、適切なペプチドロードｓＡＰＣを患者に投与すること、または抗原特異的Ｔ細胞をエキソビボで濃縮及び拡大することによって達成される。
【０１００】
ゲノムワイド配列決定は、癌生物学に対する理解を劇的に変えた。がんの配列決定は、多くのヒト癌の発症に関与する分子過程に関する重要なデータを生じた。変異の推進力は、３つの主要な細胞過程（１）細胞の運命、（２）細胞生存及び（３）ゲノム維持の調節経路に関与する重要な遺伝子において同定されている。Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，１５４６−５８（２０１３）。
【０１０１】
ゲノムワイド配列決定は、また、癌免疫療法の手法に革命をもたらす可能性を有する。配列決定データは、癌免疫療法のための共有標的と個別化標的の両方に関する情報を提供することができる。原則的に、変異タンパク質は、免疫系にとって異物であり、推定上の腫瘍特異的抗原である。事実、配列決定の努力は、何千ではなくとも何百もの潜在的に関連する免疫標的を確定している。限定された検査では、これらにネオエピトープに対するＴ細胞応答が、癌患者で見られること、または癌ワクチンにより誘導されることを示している。しかし、特定のがんに対する応答の頻度及び癌患者間で共有されるような応答の程度は、よく知られていない。腫瘍特異的免疫応答に関する限られた理解の主な理由の１つは、潜在的な免疫学的に関連する標的を検証する現在の手法は、煩雑で時間がかかることである。
【０１０２】
中枢性免疫寛容は、自己タンパク質に対するＴ細胞応答を抑止するが、発癌性変異は、Ｔ細胞応答を形成することができるネオエピトープを誘導する。全エクソーム配列に由来する変異カタログは、そのようなネオエピトープを同定する出発点を提供する。ＨＬＡ結合予測アルゴリズム（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ４，ｅ６０９４（２００９））を使用して、それぞれのがんが７〜１０個までのネオエピトープを有し得ることが予測されている。同様の手法は、数百個の腫瘍ネオエピトープを推定した。しかし、そのようなアルゴリズムは、Ｔ細胞応答を予測する精度が低いことがあり、予測されたＨＬＡ結合エピトープの１０％のみが、ＨＬＡの文脈において結合することが予測される（Ｌｕｎｄｅｇａａｒｄ  Ｃ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３０，３０９−１８（２０１０））。このように、予測されたエピトープは、それらの潜在的なネオエピトープに対するＴ細胞応答の存在を検証しなければならない。
【０１０３】
特定の実施形態において、ナノａＡＰＣ系は、様々な癌または特定の患者のがんにおいてＴ細胞応答を誘導するネオエピトープをスクリーンするために使用される。がんは、例えば全エクソーム配列決定によって、遺伝的に分析されてもよい。
【０１０４】
候補ペプチドのリストは、変異タンパク質における９個のアミノ酸ウインドウの重複によって生成することができる。変異アミノ酸を含有する９個全てのＡＡウインドウ及びそれぞれのタンパク質における２個の非変異「対照」が選択される。これらの候補ペプチドは、Ｎｅｔ  ＭＨＣ及び安定化マトリックス方法（ＳＭＭ）を含むＭＨＣ予測アルゴリズのコンセンサスを使用して、ＭＨＣ結合について計算評価する。ナノａＡＰＣ及びＭＨＣ結合アルゴリズムは、主にＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子のために開発されている。コンセンサス予測の感度カットオフは、ペプチドを含有する変異（約５００）及び非変異対照ペプチド（約５０）の扱いやすい数が同定されるまで調整することができる。
【０１０５】
例示的な実施形態において、細胞組成物は、薬学的に許容される担体中に、少なくとも９０％のＣＤ８＋Ｔ細胞及び５％未満のＣＤ４＋Ｔ細胞；１〜１０個の腫瘍関連標的ペプチド抗原に特異的な少なくとも１０６個のＣＤ８＋Ｔ細胞、ならびに細菌、ウイルス及び／または真菌病原体に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を含み、ここで、少なくとも３０％のＣＤ８＋Ｔ細胞は比が２７：７５〜７５：２５のセントラルメモリーＴ細胞及びエフェクターメモリーＴ細胞であり、１０％未満のＣＤ８＋Ｔ細胞は末端分化Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、腫瘍関連標的ペプチド抗原に特異的な少なくとも５０％のＣＤ８＋Ｔ細胞は、比が２５：７５〜７５：２５のセントラルメモリー及びエフェクターメモリーＴ細胞であり、１０％未満のＣＤ８＋Ｔ細胞は末端分化Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、細胞組成物は、約５％〜約２０％のＴメモリー幹細胞（Ｔｓｃｍ）または５％〜約１５％のＴメモリー幹細胞を含む。
【０１０６】
細胞組成物は、静脈内注入に適切であり、凍結保護物質として適切であり得る薬学的に許容される担体を更に含む。例示的な担体は、ＤＭＳＯ（例えば、約１０％）である。細胞組成物は、バイアルまたはバッグの単位で提供され、使用されるまで凍結保存され得る。単位用量は、５０〜２００ｍｌの体積で１ｍｌあたり約５×１０５〜約５×１０６個の細胞を含むことができる。特定の実施形態において、組成物の体積は≦１００ｍｌ（例えば、５０〜１００ｍｌ）である。
【０１０７】
いくつかの態様において、本発明は、がん有する患者の治療方法であって、必要とする患者に、本明細書に記載の細胞組成物を投与することを含む方法を提供する。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、患者は血液癌を有し、いくつかの実施形態では、同種幹細胞移植の後に再発した血液癌を有する。いくつかの実施形態において、患者は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または骨髄異形成症候群を有する。
【０１０９】
本開示により治療され得る他のがんには、歴史的に不十分な免疫応答を誘発する、または高い再発率を有する癌があげられる。例示的ながんには、癌腫、肉腫及びリンパ腫を含む固形腫瘍の様々な種類が挙げられる。様々な実施形態において、がんは、黒色腫（転移性黒色腫を含む）、結腸癌、十二指腸癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、腺管癌、肝癌、膵癌、腎癌、子宮内膜癌、精巣癌、胃癌、口腔粘膜異形成、ポリポーシス、頭頸部癌、浸潤性口腔癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、中皮腫、膀胱移行及び扁平上皮癌、脳癌、神経芽細胞腫、ならびに経膠腫である。様々な実施形態において、がんは、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、またはステージＩＶのものである。いくつかの実施形態において、がんは、転移性及び／もしくは再発性のもの、及び／または切除不能なものである。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、患者は、化学療法及び／またはチェックポイント阻害剤療法に対して難治性である。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、患者は、残留性及びインビボ応答を改善しうる低用量サイトカイン療法を更に受ける。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、がんは、白血病、リンパ腫または骨髄腫を含む血液悪性腫瘍である。例えば、血液悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、小児急性白血病、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ球性白血病、骨髄異形成症候群、悪性皮膚Ｔ細胞、菌状息肉症、非ＭＦ皮膚Ｔ細胞リンパ腫、リンパ腫様丘疹症及びＴ細胞リッチ皮膚リンパ過形成であり得る。例示的な実施形態において、患者は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または骨髄異形成症候群などの血液癌を有し、くつかの実施形態では、患者は、同種幹細胞移植後に再発している。いくつかの実施形態において、療法はＧＶＨＤを誘導しない。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、患者は、同種幹細胞移植に加えて、リンパ球欠失療法、細胞減少療法、または免疫調節療法（細胞療法の投与前）も受けている。いくつかの実施形態において、細胞療法は、更に、治療後サイトカイン支持を伴って、または伴うことなく提供されてもよい。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、患者は、感染症を有する、または感染症の危険性がある。例えば、ＨＳＣＴを受けた患者は、免疫無防備状態を考慮すると、特に感染症の危険性がある。治療または予防され得る感染症には、細菌、ウイルス、プリオン、真菌、寄生虫、蠕虫等によって引き起こされるものが挙げられる。そのような疾患には、ＡＩＤＳ、Ｂ／Ｃ型肝炎、ＣＭＶ感染症、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）感染症、インフルエンザ、ヘルペスウイルス感染症（帯状疱疹を含む）及びアデノウイルス感染症が挙げられる。ＣＭＶは、例えば、臓器移植患者に見られる最も一般的なウイルス病原体であり、骨髄または末梢血幹細胞移植を受けた患者における罹患率及び死亡率の主要な原因である。このことは、これらの患者の免疫不全状態が原因であり、これらが血清陽性患者における潜伏ウイルスの再活性化または血清陰性個人における日和見感染症を許容する。これらの実施形態において、患者は、病原体の抗原に特異的なＴ細胞を含む養子免疫療法を受けることができる。この方法は、患者由来または移植処置の開始前に適切なドナー由来のウイルス特異的ＣＴＬの生成を伴うことができる。
【０１１５】
ＰＴＬＤは、有意な割合の移植患者に発生し、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）感染によってもたらされる。ＥＢＶ感染は、米国の成人人口のおよそ９０％に存在すると考えられる。能動的なウイルス複製及び感染は、免疫系によってチェックを受け続けているが、ＣＭＶの場合、移植療法により免疫無防備状態になった個人は、制御性Ｔ細胞集団を失い、ウイルスの再活性化を許容する。このことは、移植プロトコルに対して重大な障害となる。ＥＢＶは、様々な血液学的及び非血液学的癌の腫瘍促進に関与することもある。
【０１１６】
本発明の他の態様及び実施形態は当業者に明白である。
【実施例】
【０１１７】
抗原特異的Ｔ細胞を、白血球搬出によって単離されたドナー細胞から濃縮及び拡大した。細胞では、ＣＤ４マイクロビーズを用いた陰性選択によってＣＤ４＋細胞を枯渇した。得られた細胞を常磁性ナノ粒子（デキストラン被覆酸化鉄ナノ粒子、直径約８０〜２００ｎｍ）とインキュベートして、抗原特異的Ｔ細胞を濃縮した。ナノ粒子は、表面（標的ペプチド抗原を提示している）と、アゴニスト抗ＣＤ２８モノクローナル抗体に抱合した二量体ＨＬＡリガンドを有する。二量体ＨＬＡリガンドは、それぞれＩｇヒンジ領域のアームに融合された、ペプチド結合裂溝を含む２つのＨＬＡ−Ａ２ドメインを含有する。二量体ＨＬＡ−Ｉｇは、β２ミクログロブリンと同時発現する。リガンドとａＡＰＣの構築物はＷＯ２０１６／０４４５３０及びＷＯ２０１６／１０５５４２に記載されており、これらは全体が参考により本明細書に組み込まれる。
【０１１８】
細胞を常磁性ａＡＰＣの存在下、次いで磁場の存在下で約５分間インキュベートした。粒子に関連する細胞を回収し、様々な時間（一般に、１〜２週間）にわたってエキソビボで拡大させた。拡大は、増殖因子の存在下で実施した。２週間の培養期間に、増殖因子を１日目及び７日目に加えた。細胞を７日目にａＡＰＣで再刺激した。
【０１１９】
抗原特異的Ｔ細胞も、バッチで濃縮及び拡大した。例えば、図３は、ＡＭＬ特異的ペプチドのＰｒａｍｅ１００  ＲＨＡＭＭ、ＷＴ１及びサバイビンのバッチ濃縮及び拡大を示す。７日目に、細胞は、Ｐｒａｍａに対して１．４％の特性、ＲＨＡＭＭに対して１．８％の特性、ＷＴ１に対して７．０％の特異性及びサバイビンに対して２．３％の特性を含む。合計の抗原特異的Ｔ細胞成分は、この実施形態では１２．５％である。Ｔ細胞を四量体染色によって特徴付けた。
【０１２０】
図４は、２週間にわたる個別の刺激及び拡大を伴う組成物が、ＡＭＬ抗原特異的Ｔ細胞の一貫性したレベルを有することを示す。個別の刺激及び拡大のプロセスは、一貫して約１５％の抗原特異的Ｔ細胞を生成する。
【０１２１】
図５は、同時の刺激／拡大プロセスが、個別の刺激／拡大に匹敵するＡＭＬ特異的Ｔ細胞頻度を生成することを示す。バッチ刺激／拡大プロセスにより調製されたことが示される組成物は、約４７％の抗原特異的Ｔ細胞を有する。
【０１２２】
図６は、生成されたＴ細胞が、ＡＭＬ腫瘍細胞（ＴＨＰ−１細胞系）の抗原特異的死滅を実証することを示す。ＡＭＬ特異的Ｔ細胞は、ＷＴ−１、ＰＲＡＭＥ及びサバイビンにおける５個のエピトープに向けられる。１対１００（標的対エフェクター比）では、約４０％の標的細胞が死滅した。
【０１２３】
図７に示されているように、エキソビボ拡大に使用されたサイトカインカクテルは、得られた細胞の数及び表現型に影響を与えることができる。
【０１２４】
細胞は、いずれかの未変性（ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＡ＋）、セントラルメモリー（ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４５ＲＡ−）、エフェクターメモリー（ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ４５ＲＡ−）及び末端分化メモリー（ＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ４５ＲＡ＋）のこれらの表現型について更に特徴付けた。ドナーリンパ球からエキソビボで濃縮及び拡大されたＭＡＲＴ−１及びＡＭＬ特異的Ｔ細胞は、主に、セントラルメモリー表現型及びエフェクターメモリー表現型である。図２を参照すること。特にＡＭＬのペプチドについて、３つの代表的な実験において、未変性細胞は、３．８２％、１４．２％及び１４．８％で存在した。末端分化メモリー細胞は、３．８２％、３％及び６．７％で存在した。一方、抗原特異的細胞のセントラルメモリー成分及びエフェクターメモリー成分は、９２．３％、８２．８％及び７８．５２％で存在した。
【０１２５】
細胞は、活性化表現型によって、すなわち、ＩＬ−２（増殖及びメモリー）、ＩＦＮ−γ（他のＴ細胞の活性化、メモリー、ＭＨＣの上方制御）、ＴＮＦ−α（炎症促進性）及びＣＤ１０７ａ（グランザイムの放出、細胞傷害活性）を染色することによって特徴付けた。図１を参照すること、示されるように、大部分の細胞が３つ、またはさらに４つの機能を有する。例えば、３２．５％の細胞は、活性化されるとＩＬ−２とＩＦＮ−γの両方を産生し、９４．２％の細胞は、活性化されるとＴＮＦ−α及びＣＤ１０７ａを産生する。
【０１２６】
ウイルス抗原に特異的なバイスタンダー細胞を、四量体染色によって更に定量化した。図８は、ＭＡＲＴ−１特異的濃縮及び拡大の７日後の、ウイルス特異的バイスタンダーＴ細胞の存在を示す。図９は、ＭＡＲＴ−１特異的濃縮及び拡大の１４日後の、ウイルス特異的バイスタンダーＴ細胞の存在を示す。これらの細胞は、また、大部分が主にセントラルメモリー表現型及びエフェクターメモリー表現型である。図１０は、ＡＭＬ特異的濃縮及び拡大の１４日後の、ウイルス特異的バイスタンダーＴ細胞の存在を示す。図１１は、ＭＡＲＴ−１特異的濃縮及び拡大プロセスの最中のＣＭＶ特異的バイスタンダーＴ細胞の検出を示す。ウイルス特異的バイスタンダー細胞の率は、１４日目まで一定のまま（０．５〜１％）であるが、ＭＡＲＴ−１特異的Ｔ細胞の数及び率は劇的に上昇している。
【０１２７】
図１２は、組み換えＴ細胞増殖因子カクテル（ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−２１、ＩＦＮ−γ及びＭＩＰ１−β）を使用したＭＡＲＴ−１特異的濃縮及び拡大の後の、１４日目のウイルス特異的バイスタンダー細胞の検出が、アデノウイルス、ＣＭＶ、ＥＢＶ及びインフルエンザにおける多数のエピトープに向けられたウイルス特異的Ｔ細胞の維持及びバイスタンダー拡大を実証することを示す。
【０１２８】
図１３Ａ及び図１３Ｂに示されるように、Ｍａｒｔ−１特異的Ｔ細胞は、拡大時の以下のＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ及びＩＬ１−βのサイトカインの存在下での濃縮及び拡大過程によって生成した。このサイトカインカクテルの組成を表１に示す。
【表２】
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【０１２９】
この実験では、健康なドナーからの６．７４×１０９個のＣＤ８＋リンパ球を上記のように濃縮した。濃縮した後、細胞の合計は２．８１×１０８個であった。拡大の１４日目には、細胞の合計が５．２８×１０８個であり、全細胞の１．８８倍の拡大を示した。これらの１４日目に拡大された細胞は、ＭＡＲＴ−１に対して約３５％の特異性があり、約９４％が生存可能であった（図１３Ｂ）。ＭＡＲＴ−１特異的細胞は、約２７７６倍に拡大され、１０５個の前駆細胞あたり約１個がＭＡＲＴ−１特異的であると推定された。
【０１３０】
全培養物を評価すると、Ｔ細胞は、約６６％がセントラルメモリー表現型及び約３２％がエフェクターメモリー表現型を有した。２％未満の細胞が未変性であり、ＴＥＭＲＡ細胞はごくわずかであった。更に、ＭＡＲＴ−１特異的細胞は、約８９％がセントラルメモリー及び約９％がエフェクターであり、２％未満が未変性であり、ＴＥＭＲＡ細胞の数はごくわずかであった。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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