(57)【要約】  本発明は、直接再プログラム化を用いたナチュラルキラー細胞の製造方法及びそれから製造されたナチュラルキラー細胞、上記ナチュラルキラー細胞に特異的なバイオマーカー、上記ナチュラルキラー細胞を含む細胞治療剤、癌治療及び予防用組成物、上記ナチュラルキラー細胞を保管する凍結保存用細胞バイアル、上記直接再プログラム化誘導用培地キットに関する。上記製造方法を用いて製造されたナチュラルキラー細胞は、増殖能及び癌細胞の殺傷能に優れているところ、大量生産、癌治療及び予防用組成物として有効に活用することができる。
2020534019.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)分離した細胞に再プログラム化因子(Reprogramming factor)を導入する段階;
(b)上記(a)段階の細胞をi)サイトカイン、成長因子及びGSK3β阻害剤を含む第一培地、及びii)サイトカイン及び成長因子を含む第二培地で培養してナチュラルキラー細胞(Natural killer cell)に直接再プログラム化させる段階を含むナチュラルキラー細胞の製造方法。
【請求項２】
前記(a)段階の再プログラム化因子は、Lin28, Asc11, Pitx3, Nurr1, Lmx1a, Nanog, Oct4, Oct3, Sox2, Klf4及びMycからなる群から選択された一つ以上である、請求項１に記載のナチュラルキラー細胞の製造方法。
【請求項３】
前記(b)段階の第一培地にステムレゲニンI(StemRegenin I)、インターロイキン7、インターロイキン15またはこれらの組み合わせをさらに含む、請求項１に記載のナチュラルキラー細胞の製造方法。
【請求項４】
前記(b)段階の第二培地にステムレゲニンI(StemRegenin I)、CH-223191、またはこれらの組み合わせをさらに含む、請求項１に記載のナチュラルキラー細胞の製造方法。
【請求項５】
前記分離した細胞は、ナチュラルキラー細胞を除いた体細胞である、請求項１に記載のナチュラルキラー細胞の製造方法。
【請求項６】
前記製造されたナチュラルキラー細胞は、CD56、CD16またはこれらの組み合わせを発現することを特徴とする、請求項１に記載のナチュラルキラー細胞の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法により製造されたナチュラルキラー細胞。
【請求項８】
前記ナチュラルキラー細胞は、凍結保存した後、解凍時においてもナチュラルキラー細胞の特性が維持される、請求項７に記載のナチュラルキラー細胞。
【請求項９】
前記ナチュラルキラー細胞は、ヒトから分離したナチュラルキラー細胞と比較して造血細胞系統(Hematopoietic cell lineage)またはナチュラルキラー細胞媒介細胞傷害性(Natural killer cell-mediated cytotoxicity)に関連するバイオマーカーを高発現することを特徴とする、請求項７に記載のナチュラルキラー細胞。
【請求項１０】
前記造血細胞系統に関連するバイオマーカーは、CSF1, ITGA2, TFRC, CD3e, TNF, M-SCF, CD59及びCD9からなる群から選ばれる一つ以上である、請求項９に記載のナチュラルキラー細胞。
【請求項１１】
前記ナチュラルキラー細胞媒介細胞傷害性に関連したバイオマーカーは、KIR2DL, KIR2DS, NKp30, FCER1G, ULBP3, SAP, TNFa, TNFSF10, IFNg, TRAIL, FAS及びCASPからなる群から選択される一つ以上である、請求項９に記載のナチュラルキラー細胞。
【請求項１２】
請求項７に記載のナチュラルキラー細胞を有効成分として含む、細胞治療剤。
【請求項１３】
請求項７に記載のナチュラルキラー細胞を有効成分として含む、癌治療または予防用薬学的組成物。
【請求項１４】
前記癌は、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、乳癌、大腸癌、骨髄癌、肝臓癌、脳癌、前立腺癌、胃癌、結腸癌、神経膠腫、黒色腫、リンパ腫、直腸癌、血液癌またはこれらの組み合わせであることを特徴とする、請求項１３に記載の癌治療または予防用薬学的組成物。
【請求項１５】
前記組成物は、癌幹細胞に対する殺傷能力を有することを特徴とする、請求項１３に記載の癌治療または予防用薬学的組成物。
【請求項１６】
(a)分離した細胞に再プログラム化因子(Reprogramming factor)を導入する段階;
(b)上記(a)段階の細胞をi)サイトカイン、成長因子及びGSK3β阻害剤を含む第一培地、ii)サイトカイン及び成長因子を含む第二培地で培養してナチュラルキラー細胞(Natural killer cell)に直接再プログラム化させる段階を含む、凍結保存用細胞バイアルの製造方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法により製造された凍結保存用細胞バイアルであって、凍結保存した後、解凍時においてもナチュラルキラー細胞の特性が維持される、凍結保存用細胞バイアル。
【請求項１８】
(a)サイトカイン、成長因子、GSK3β阻害剤、ステムレゲニンI(StemRegenin I)、インターロイキン7、及びインターロイキン15を第一培地として含む第一容器;及び
(b) サイトカイン、成長因子、ステムレゲニンI(StemRegenin I)、及びCH-223191を第二培地として含む第二容器;を含む直接再プログラム化誘導用培地キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、直接再プログラム化を用いたナチュラルキラー細胞の製造方法及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
先天免疫を担当する重要な細胞であるナチュラルキラー細胞は、癌細胞-特異的な抗原を認識し、癌細胞の増殖や転移を抑制する能力を有する細胞である。ナチュラルキラー細胞は、接触依存性(Contact-dependent)細胞傷害性を有し、免疫調節に関するサイトカインを生産することにより、異常細胞を除去する重要な役割を果たす。標的腫瘍細胞死滅(Apoptosis)は、パーフォリン(Perforin、Prf1)、グランザイムB(Granzyme B, GzmB)、インターフェロンガンマ(Interferon-γ)、及び腫瘍壊死因子-アルファ(Tumor-necrosis factor-α, TNF-α)のようなサイトカインの分泌により腫瘍細胞を選択的に殺害することにより媒介される[Yoon SR, et al(2015), Exp Mol Med 47:e141]（非特許文献１）。このようなナチュラルキラー細胞の特性により、ナチュラルキラー細胞は、癌治療剤及び癌再発抑制剤など、既存の癌治療法の限界を克服するための有用な資源として、これらの活用を極大化するための技術の開発が活発に進められている。
【０００３】
既存の研究において、休止期のリンパ球をIL-2と共に生体外(In vitro)培養すると、腫瘍細胞を殺傷できるリンホカイン活性化キラー細胞(Lymphokine-activated killer)を確保することができ、これを利用して黒色腫、腎臓癌、大腸癌細胞と共培養する場合、約30％の癌細胞が殺傷されることを確認することにより、リンパ球が抗癌効果を有していることを明らかにした[Rosenberg(1988), A review. Ann Surg 208 (2):121-135]（非特許文献２）。しかし、リンホカイン活性化キラー細胞は、大量培養が困難であり、殺傷効果を持続させるために添加される高濃度のIL-2により低血圧及び呼吸困難などの毛細血管漏出症候群(Capillary leak syndrome)を伴う副作用が問題点として浮上した。
【０００４】
過去数十年間、ナチュラルキラー細胞を用いた免疫治療剤の開発及び活用分野は急速に成長しており、技術需要に対する量的ニーズは急速に増加しており、同種及び自己ヒトナチュラルキラー細胞の大量生産技術は免疫治療剤開発の核心技術として浮上してきた。ヒトナチュラルキラー細胞資源のソースとしては、末梢血液からナチュラルキラー細胞を分離、増殖して使用する方法が主であり、分化能に優れたヒト造血幹細胞、胚性幹細胞及び誘導万能幹細胞など幹細胞から分化誘導培養を通じてナチュラルキラー細胞を生産する技術も活発に多次元的に発展している。しかし、幹細胞からナチュラルキラー細胞を分化誘導するのに時間が長くかかり、費用が多く要される点、効率が低い点などは改善すべき問題点として指摘されている。近年、幹細胞分化能を利用して標的細胞を、分化誘導培養を通じて生産する技術以外に、体細胞再プログラム化技術を利用して比較的確保が容易な初期ヒト体細胞から異なる系統特性を有する高付加価値ヒト組織特異標的細胞を直接生産する技術が急発展している。これは、ヒト体細胞の確保のための従来技術の問題点を克服できる新たな代案として浮上し、学術または臨床適用、新薬開発の活用など無限の適用可能性を提示しており、多様な細胞タイプを対象に広範囲に技術開発が進められている。しかし、現在のところ、本発明のように直接再プログラム化を通じてナチュラルキラー細胞を直接生産する技術開発の成果は報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Yoon SR, et al(2015), Exp Mol Med 47:e141
【非特許文献２】Rosenberg(1988), A review. Ann Surg 208 (2):121-135
【非特許文献３】Liu(2013), J Clin Invest 123 (10):4410-4422
【非特許文献４】Dahlberg(2015), Front Immunol 6:605
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、ヒトナチュラルキラー細胞を高効率で生産する方法を開発すべく鋭意努力した結果、分離したヒト体細胞から直接再プログラム化誘導培養を通じて高効率で比較的短期間でナチュラルキラー細胞を生産することができ、生産されたナチュラルキラー細胞は、癌治療剤のための免疫細胞治療剤としての効果を有することを確認することにより本発明を完成した。
【０００７】
本発明の目的は、(a)分離した細胞に再プログラム化因子(Reprogramming factor)を導入する段階;(b)上記(a)段階の細胞をi)サイトカイン、成長因子及びGSK3β阻害剤を含む第一培地、及びii)サイトカイン及び成長因子を含む第二培地で培養し、ナチュラルキラー細胞(Natural killer cell)に直接再プログラム化させる段階を含むナチュラルキラー細胞の製造方法を提供することにある。
【０００８】
本発明の他の目的は、前記方法により製造されたナチュラルキラー細胞を提供することにある。
【０００９】
本発明のもう一つの目的は、前記方法により製造されたナチュラルキラー細胞を有効成分として含む細胞治療剤を提供することにある。
【００１０】
本発明のもう一つの目的は、前記方法により製造されたナチュラルキラー細胞を有効成分として含む、癌治療または予防用薬学的組成物を提供することにある。
【００１１】
本発明のもう一つの目的は、(a)分離した細胞に再プログラム化因子(Reprogramming factor)を導入する段階;(b)上記(a)段階の細胞をi)サイトカイン、成長因子及びGSK3β阻害剤を含む第一培地、ii)サイトカイン及び成長因子を含む第二培地で培養し、ナチュラルキラー細胞(Natural killer cell)に直接再プログラム化させる段階を含む、 凍結保存用細胞バイアルの製造方法を提供することにある。
【００１２】
本発明のもう一つの目的は、前記方法により製造された凍結保存用細胞バイアルを提供することにある。
【００１３】
本発明のもう一つの目的は、(a)サイトカイン、成長因子、GSK3β阻害剤、ステムレゲニンI (StemRegenin I)、インターロイキン7、及びインターロイキン15を第一培地として含む第一容器;及び(b)サイトカイン、成長因子、ステムレゲニンI (StemRegenin I)、及びCH-223191を第二培地として含む第二容器;を含む直接再プログラム化誘導用培地キットを提供することにある。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の直接再プログラム化を用いてナチュラルキラー細胞を製造する方法は、既存の幹細胞分化過程を通じてナチュラルキラー細胞を得る方法より初期(患者)細胞の使用量が著しく少なく、かつ短時間で多量のナチュラルキラー細胞の確保を可能とし、確保されたナチュラルキラー細胞が癌細胞殺傷能に優れるところ、ナチュラルキラー細胞の大量生産に有効に活用することができ、上記ナチュラルキラー細胞を含む細胞治療剤及び薬学的組成物を癌治療または予防に活用することができる。
【００１５】
また、本発明において、前記製造方法で製造されたナチュラルキラー細胞に特異的なバイオマーカーを選別したところ、これを通じて細胞分化及び抗癌メカニズムと関連のある造血細胞系統及びナチュラルキラー細胞媒介細胞傷害性因子の上方調節される遺伝子を確認し、凍結保存後、解凍時に特性が維持されることを確認したところ、前記ナチュラルキラー細胞は癌治療及び予防用組成物として有用に活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Aは直接再プログラム化によるナチュラルキラー細胞の製造方法について簡略に説明した図面であり、Bは4個の再プログラム化因子の導入有無によるナチュラルキラー細胞の製造を示す図面である。
【図２】GSK3β阻害剤の効果を示す図面である。
【図３ａ】NKIM-I培地の組成による直接再プログラム化の効率を示す図面である。
【図３ｂ】NKIM-II培地の組成による直接再プログラム化の効率を示す図面である。
【図４】Aは再プログラム化誘導ナチュラルキラー細胞の増殖能を示す図面であり、Bは再プログラム化因子の導入有無によるナチュラルキラー細胞の製造を示す図面である。
【図５】Aは再プログラム化因子による細胞増殖能を示す図面であり、Bは再プログラム化因子によるナチュラルキラー細胞の製造を示す図面である。
【図６】Aはナチュラルキラー細胞の製造方法a及びbについて簡略に説明した図面であり、B及びCはそれぞれヒト皮膚線維芽細胞及びヒト歯髄腔細胞においてa及びb方法によるナチュラルキラー細胞の製造を示す図面である。
【図７】再プログラム化誘導ナチュラルキラー細胞の標識マーカー発現パターンを示す図面である。
【図８】再プログラム化誘導ナチュラルキラー細胞(iNK)と臍帯血細胞由来のナチュラルキラー細胞(CB-NK)の標識マーカー発現パターンを比較実験した結果を示す図面である。
【図９ａ】末梢血液ナチュラルキラー細胞と誘導ナチュラルキラー細胞の細胞表面受容体の発現特性に関するフローサイトメトリーを示す図面である。
【図９ｂ】上記両細胞の活性化程度の比較を示す図面である。
【図９ｃ】誘導ナチュラルキラー細胞において上方または下方調節される遺伝子を確認したマイクロアレイ分析を示す図面である。
【図９ｄ】造血細胞系統に関連した遺伝子の発現を分析した図面である。
【図９ｅ】ナチュラルキラー細胞の媒介細胞傷害性に関連した遺伝子の発現を分析した図面である。
【図１０】血液癌、脳癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、乳癌、大腸癌、及び卵巣癌の細胞株に対するナチュラルキラー細胞の癌細胞殺傷能を示す図面である。
【図１１】再プログラム化誘導ナチュラルキラー細胞(iNK)と既存のナチュラルキラー細胞(NK92)の癌細胞殺傷能を比較実験した結果を示す図面である。
【図１２ａ】大腸癌細胞であるSW620及びHCT116の癌幹細胞の収得率を示す図面である。
【図１２ｂ】上記癌細胞及び癌幹細胞に対する誘導ナチュラルキラー細胞の殺傷能の比較を示す図面である。
【図１３ａ】誘導ナチュラルキラー細胞の生体内で抗癌効果を確認するための実験実施日を示す図面である。
【図１３ｂ】誘導ナチュラルキラー細胞の抗癌効果を確認した腫瘍の大きさの変化を示す図面である。
【図１３ｃ】誘導ナチュラルキラー細胞の抗癌効果を確認した腫瘍の大きさの変化を示す図面である。
【図１４】再プログラム化誘導ナチュラルキラー細胞(iNK)と臍帯血細胞由来のナチュラルキラー細胞(CB-NK)の癌細胞殺傷能との比較実験を示す図面である。
【図１５】Aは既存のナチュラルキラー細胞と記述された癌細胞の共培養時にサイトカインINF-γとGranzyme Bの分泌能の比較実験した結果を示す図面である。Bは記述された癌細胞との共培養時に、サイトカインINF-γ、Granzyme B、及びTNF-αの分泌能を示す図面である。
【図１６】Aは非挿入性エピソーマルベクターを用いて直接再プログラム化されたナチュラルキラー細胞の製造を示す図面であり、Bは上記ナチュラルキラー細胞の癌細胞殺傷能を示す図面である。
【図１７】凍結保存された誘導ナチュラルキラー細胞の特性を示す図面である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本出願で開示されたそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれの異なる説明及び実施形態にも適用することができる。すなわち、本出願で開示された多様な要素のすべての組み合わせが本出願の範疇に属する。なお、下記具体的な記述により、本出願の範疇は制限されない。
【００１８】
本発明の目的を達成するための一つの態様として、本発明は、(a)分離した細胞に再プログラム化因子(Reprogramming factor)を導入する段階;(b)上記(a)段階の細胞をi)サイトカイン、成長因子及びGSK3β阻害剤を含む第一培地、及びii)サイトカイン及び成長因子を含む第二培地で培養し、ナチュラルキラー細胞(Natural killer cell)に直接再プログラム化させる段階を含むナチュラルキラー細胞の製造方法を提供する。
【００１９】
本発明において、(a)段階は、(i)分離した細胞に一つ以上の再プログラム化因子(Reprogramming factor))を導入する段階である。
【００２０】
本発明における用語、「分離した細胞」とは、特に制限はないが、具体的には、生殖細胞、体細胞(Somatic cell)または前駆細胞(Progenitor cell)など、既に系統(Lineage)が特定された細胞であってもよい。その例としてヒト由来の細胞であってもよいが、多様な個体に由来する細胞も本発明の範囲内に属する。
【００２１】
また、本発明の分離した細胞には生体内または生体外の細胞がいずれも含まれてもよく、具体的には、生体から分離した細胞であってもよい。
【００２２】
前記「体細胞」とは、生殖細胞を除く動・植物を構成する分化が完結したすべての細胞を意味し、前記「前駆細胞」とは、子孫に該当する細胞が特定の分化形質を発現することが明らかになった場合、分化形質を発現しないが、その分化運命(Fate)を有している母細胞をいう。例えば、神経細胞(ニューロン)に対しては神経芽細胞(ニューロン幹細胞)が前駆細胞に該当し、筋管細胞に対しては筋芽細胞が前駆細胞に該当する。
【００２３】
本発明の具体的な一実施例では、末梢血液単核細胞(実施例1)、線維芽細胞及び歯髄腔細胞(実施例6)の直接再プログラム化によりナチュラルキラー細胞が製造されることを確認した。
【００２４】
本発明における用語、「再プログラム化因子(Reprogramming factor)」とは、細胞に導入され、再プログラム化を誘導する遺伝子(あるいはこれをコードするポリヌクレオチド)、またはタンパク質を意味する。前記再プログラム化因子は、再プログラム化を誘導しようとするその目的細胞に応じて、そして再プログラム化が誘導される分離された細胞の種類によって異なり得る。例えば、ナチュラルキラー細胞を製造する場合における再プログラム化因子は、Lin28、Asc11、Pitx3、Nurr1、Lmx1a、Nanog、Oct3、Oct4、Sox2、Klf4及びMycからなる群から選択された一つ以上の因子を含むものであってもよく、それ以外にもナチュラルキラー細胞を製造するものとして当業界において公知となったすべての因子を含んでもよい。また、前記再プログラム化因子を利用してナチュラルキラー細胞への直接再プログラム化を誘導することができる。直接再プログラム化方法論において再プログラム化遺伝因子を利用する方法があるが、本発明のベクターは、このような用途として活用することができる。したがって、当業者は、その目的細胞及び再プログラム化する前の細胞の種類に応じて適切な因子を選択することができ、これは、当業界において公知となった範囲内であれば、すべて本発明の範囲に含まれるもので、その種類に特に制限されない。再プログラム化遺伝因子を用いた再プログラム化は、細胞が有する全遺伝子発現パターンを調節して目的細胞への転換を誘導するものであるため、前記再プログラム化遺伝因子が細胞に導入され、細胞を一定期間培養することにより、目的とする種類の細胞の遺伝子発現パターンを有する目的細胞に初期細胞を再プログラム化させることができる。
【００２５】
本発明の具体的な一実施例では、Oct4、Sox2、Klf4及びMycからなる群から選択された一つ以上の遺伝子を含む再プログラム化因子群を分離した細胞に導入し、直接再プログラム化を誘導した。その結果、Oct4、Sox2、Klf4及びMyc;Klf4、Oct4及びSox2;Klf4及びMyc;Klf4;Mycが導入された細胞において、直接再プログラム化を通じてナチュラルキラー細胞が製造されることを確認した(実施例1及び実施例5)。
【００２６】
本発明において「再プログラム化因子を導入する段階」とは、細胞内に存在する再プログラム化因子、特に、Oct4、Sox2、Klf4、及びc-Myc遺伝子の発現水準を増加させる方法;または発現ベクター、遺伝子組換え、外来発現遺伝子の導入、発現誘導効果を有する物質の処理などを通じて細胞内の再プログラム化因子の発現水準を増加させる方法であってもよいが、再プログラム化因子の発現水準を増加させるものであれば、制限されない。特に、再プログラム化因子を導入する段階は、所望の時間及び条件の下で再プログラム化因子の発現を誘導する方法であってもよい。
【００２７】
具体的には、上記(a)段階の再プログラム化因子を細胞に導入する方法は、当業界において通常使用される細胞に核酸分子(DNAまたはRNA)またはタンパク質を提供することに制限なく使用することができる。例えば、再プログラム化因子を細胞の培養液に投与する方法、再プログラム化因子を細胞に直接注入する方法または再プログラム化因子の遺伝子を有する発現ベクターを用いて細胞を形質転換させる方法を使用することができる。
【００２８】
前記再プログラム化因子を細胞に直接注入する方法は、当業界において公知となった任意の方法を選択して使用することができ、これに制限されないが、微細注入法(Microinjection)、電気穿孔法(Electroporation)、粒子噴射法(Particle bombardment)、直接筋肉注入法、インシュレーター(Insulator)及びトランスポゾンを用いた方法の中から適切に選択して適用することができる。
【００２９】
本発明における用語「発現ベクター」とは、適当な宿主細胞において目的のタンパク質を発現するベクターであり、遺伝子挿入物が発現するように作用可能に連結された必須の調節要素を含む遺伝子作製物を言う。
【００３０】
本発明の発現ベクターは、プロモーター、オペレータ、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナル、エンハンサーのような発現調節要素以外にも、膜標的化または分泌のための信号配列またはリーダー配列を含み、目的に応じて多様に製造することができる。発現ベクターのプロモーターは、構成的または誘導性であってもよい。なお、発現ベクターは、ベクターを含有する宿主細胞を選択するための選択性マーカーを含み、複製可能な発現ベクターの場合、複製起源を含む。発現ベクターは、自己複製したり、または宿主DNAに統合することができる。
【００３１】
前記発現ベクターは、ウイルスベクター、エピソーマルベクター、プラスミドベクター、コスミドベクターなどを含むことができるが、これに制限されない。
【００３２】
具体的には、前記ウイルスベクターは、レンチウイルス(Lentivirus)、レトロウイルス(Retrovirus)、例えば、HIV(Human immunodeficiency virus), MLV(Murineleukemia virus), ASLV(Avian sarcoma/Leukosis), SNV(Spleen necrosis virus), RSV(Rous sarcoma virus), MMTV(Mouse mammary tumor virus)など、 アデノウイルス(Adenovirus)、アデノ随伴ウイルス(Adeno-associated virus)、単純ヘルペスウイルス(Herpes simplex virus)などに由来するベクターを含むことができる。また、より具体的には、RNAベースのウイルスベクターであってもよいが、これに制限されない。
【００３３】
また、本発明のエピソーマルベクター(Episomal vector)は、非ウイルス性非挿入性ベクターであり、染色体内に挿入されずにベクターに含まれた遺伝子を発現させる特性を有することが知られている。本発明の目的上、エピソーマルベクターを含む細胞は、エピソーマルベクターがゲノム内に挿入されたり、またはゲノム内に挿入されない状態で細胞内に存在する場合をいずれも含む。また、エピソーマルベクターは、一つ以上の再プログラム化因子を含むことができる。
【００３４】
本発明における用語「作動可能に連結された(Operably linked)」とは、一般的な機能を果たすように核酸発現調節配列と目的とするタンパク質をコードする核酸配列が機能的に連結(Functional linkage)されていることをいう。組換えベクターとの作動的連結は、当該技術分野においてよく知られている遺伝子組換え技術を利用して製造することができ、部位特異的DNA切断及び連結は、当該技術分野において一般に知られている酵素などを使用する。
【００３５】
次に、(b)段階は、上記(a)段階の細胞をi)サイトカイン、成長因子及びGSK3β阻害剤を含む第一培地、ii)サイトカイン及び成長因子を含む第二培地で培養してナチュラルキラー細胞(Natural killer cell)に直接再プログラム化させる段階である。
【００３６】
(b)段階の上記第一培地には、ステムレゲニンＩ、インターロイキン7、インターロイキン15またはこれらの組み合わせをさらに含むことができ、(b)段階の第二培地にはステムレゲニンＩ、CH-223191またはこれらの組み合わせをさらに含むことができる。
【００３７】
本発明における用語、「サイトカイン」とは、細胞から生産され、細胞信号伝達に使われる比較的小さいサイズの多様なタンパク質であり、自己を含む他の細胞に影響を及ぼすことができる。一般に、炎症または感染に対する免疫反応と関連があるが、これに制限されない。具体的には、上記サイトカインは、IL-2、IL-3、IL-5、IL-6、IL-7、IL-11、IL-15、BMP4、Acivin A、Notch ligand、G-CSF、SDF-1であってもよいが、これに制限されない。
【００３８】
本発明における用語、「成長因子」とは、種々の細胞の分裂、成長及び分化を促進するポリペプチドを意味し、上皮細胞成長因子(EGF)、血小板由来成長因子-AA(PDGF-AA)、インスリン様成長因子-1(IGF-1)、形質転換成長因子-β(TGF-β)または線維芽細胞成長因子(FGF)を含むが、これに制限されるものではない。
【００３９】
本発明の目的上、サイトカイン及び成長因子は、分離した細胞を系統が転換した細胞に直接再プログラム化する培地に含まれるものであり、直接再プログラム化に用いられるものであれば、サイトカイン及び成長因子の種類に限らない。
【００４０】
本発明における用語、「GSK3β阻害剤」とは、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3(Glycogen synthase kinase-3、GSK3)の二つの同型タンパク質の一つであるGSK3βの活性を抑制または阻害する物質であり、リチウム、SB216763, CHIR-98014, TWS119, AR-A014418などを含むことができ、具体的には、CT99021であってもよいが、これに制限されない。
【００４１】
本発明の具体的な一実施例では、(b)段階の第一培地にGSK3β阻害剤が含まれた場合が、含まれていない場合よりもナチュラルキラー細胞の製造効率に優れていることを確認した(実施例2)。これは、GSK3β阻害剤が直接再プログラム化を通じたナチュラルキラー細胞の製造方法において重要な役割を果たすことを示唆するものである。
【００４２】
本発明における用語、「培養」とは、細胞を適度に調節した環境条件下で生育させることを意味し、本発明の培養過程は、当業界において知られている適当な培地と培養条件によって行われてもよい。このような培養過程は、選択される細胞によって当業者が容易に調整して使用することができる。
【００４３】
特に、(b)段階は、再プログラム化因子が導入された細胞を第一培地及び第二培地で培養する過程であるため、細胞を培養する第一培地及び第二培地の組成は、上記再プログラム化因子が導入された細胞をナチュラルキラー細胞に直接再プログラム化するのに適した組成を有し、具体的には、上記第一培地は、サイトカイン、成長因子及びGSK3β阻害剤を含むことができ、第二培地は、サイトカイン及び成長因子を含むことができるが、これに制限されない。
【００４４】
本発明における用語、「培地」とは、細胞の培養時に使用される公知となった培地を意味し、公知となった細胞培養用培地またはそれらの変形した培地をすべて包括する意味である。
【００４５】
上記第一培地における用語、「ステムレゲニンI (StemRegenin I)」とは、アリール炭化水素受容体抑制剤であり、(4-(2-ベンゾ[b]チオフェン-3-イル)-9-イソプロピル-9H-プリン-6-イルアミノ)エチル)フェノールヒドロクロリド)(4-(2-((2-Benzo[b]thiophen-3-yl)-9-isopropyl-9H-purin-6-yl)amino)ethyl)phenol hydrochloride)を意味する。前記ステムレゲニンIは、第一培地のサイトカイン、成長因子、GSK3β阻害剤以外に、インターロイキン7、インターロイキン15 とともに追加的に含まれ、直接再プログラム化の効率を増加させるのに使用することができる。
【００４６】
前記第二培地における用語、「CH-223191」とは、アリール炭化水素受容体抑制剤であり、1-メチル-N-[2-メチル-4-[2-(2-メチルフェニル)ジアゼニル]フェニル-1H-ピラゾール-5-カルボキサミド](1-Methyl-N-[2-methyl-4-[2-(2-methylphenyl)diazenyl]phenyl-1H-pyrazole-5-carboxamide)である。上記「アリール炭化水素受容体阻害剤」とは、ヒトにおけるAHR遺伝子によりコードされたタンパク質またはその変形であるアリール炭化水素受容体の活性を下方調節したり、減少させる化合物を意味し、直接再プログラム化効率を高める役割をするものであれば、制限なく使用することができる。本発明の目的上、アリール炭化水素受容体抑制剤であるCH-223191は、第二培地のサイトカイン、成長因子以外にステムレゲニンIとともに追加的に含まれ、直接再プログラム化の効率を増加させるのに使用することができる。
【００４７】
具体的には、前記第一培地及び第二培地は、直接再プログラム化の効率を増加させてナチュラルキラー細胞の生産を促進させるものであり、上記第一培地は、サイトカイン、成長因子、GSK3β阻害剤、StemRegenin I、インターロイキン7、及びインターロイキン15 を含み、上記第二培地は、サイトカイン、成長因子、ステムレゲニン I(StemRegenin I)、及びCH-223191を含むことができるが、直接再プログラム化の効率を増加させる培地組成物であれば、これに制限されない。
【００４８】
本発明の具体的な一実施例では、前記第一培地の3種の混合添加物(SRI+IL-7+IL-15)が単一の添加物、2種の添加物に比べてCD56+、CD3-誘導ナチュラルキラー細胞の生産を促進する効果が高いことを確認した。また、前記第二培地のアリール炭化水素受容体拮抗剤(ステムレゲニンI(StemRegenin I)、CH-223191)を処理した群において誘導ナチュラルキラー細胞の収得率が著しく増加することを確認した(実施例3)。
【００４９】
これは、誘導ナチュラルキラー細胞の大量生産に上記混合添加物の培地組成物が、効果があることを示唆するものである。
【００５０】
本発明における用語、「再プログラム化(Reprogramming)」とは、特定の細胞が有する全遺伝子発現パターン(Global gene expression pattern)などを調節し、目的とする細胞に転換させる方法を意味する。言い換えれば、本発明において再プログラム化は、細胞の運命を人為的に操作し、全く異なる特性を有する細胞に転換させる方法を意味し、本発明の目的上、上記再プログラム化は、外来遺伝子あるいはDNAを含むベクターを細胞に導入することによりなされるものであってもよい。一例として、再プログラム化は、細胞の逆分化(Dedifferentiation)、直接再プログラム化(Direct reprogrammingまたは Direct conversion)、または直接分化転換(Trans-differentiation)を含むことができるが、これに制限されるものではない。
【００５１】
本発明における用語「直接再プログラム化(Direct reprogramming)」とは、再プログラム化過程を通じて全分化能を有する誘導万能幹細胞を製作する技術とは差別化され、再プログラム化培養を通じて直接に所望の目的細胞への直接転換を誘導する技術である。既存の誘導万能幹細胞の再プログラム化技術を用いて目的細胞であるナチュラルキラー細胞を生産するためには、優先的に分離された体細胞から誘導万能幹細胞を作製し、中間体である造血幹(前駆)細胞を分化して生産しなければならない。誘導万能幹細胞から分化誘導された造血幹(前駆)細胞から再び最終の目的細胞であるナチュラルキラー細胞を分化生産しなければならない複雑な生産培養過程を順次経なければならないため、生産効率が低く、時間的、費用的消耗が大きいという短所がある。また、胎生的に全分化能幹細胞を経由して生産されるため、未分化細胞の残留有無、安全性確保の有無が検証されなければならない重要な争点となっている。しかし、本発明は、直接再プログラム化技術を通じて目的細胞であるナチュラルキラー細胞を初期細胞から直接生産することにより、生産時間、コスト、効率、安全性など、前記技術の問題点を克服する代案を提供することができると期待される。本発明の目的上、直接再プログラム化は、直接逆分化、直接分化、直接転換、直接分化転換、分化転換などと混用されてもよい。本発明において、直接再プログラム化は、特に、ナチュラルキラー細胞への直接逆分化または分化転換を意味してもよい。
【００５２】
本発明における用語、「分化した細胞」とは、構造や機能が特殊化された細胞を言う。すなわち、生物の細胞、組織などがそれぞれに与えられる役割を遂行するために適合な形態及び機能に変化した状態をいう。例えば、胚性幹細胞のような全分化能幹細胞に由来する外胚葉、中胚葉、及び内胚葉細胞が分化した細胞であり、狭義には、造血幹細胞に由来する赤血球、白血球、血小板なども分化した細胞である。
【００５３】
本発明における用語、「中間体細胞」または「ナチュラルキラー前駆細胞」とは、ナチュラルキラー細胞に分化する前段階の細胞であり、リンパ系幹細胞であってもよいが、ナチュラルキラー細胞に分化される可能性があれば、これに制限されない。
【００５４】
本発明における用語、「ナチュラルキラー細胞(Natural killer cell)」とは、先天免疫を担当する重要なリンパ球細胞であり、全リンパ球細胞中、5-10％を占め、T細胞とは異なって肝臓や骨髄で成熟する。ナチュラルキラー細胞は、多様な先天免疫受容体を細胞表面に発現し、正常細胞と異常細胞を区別できるものとして知られており、ウイルス感染細胞や腫瘍細胞など標的細胞を認知すれば、直ちに攻撃して除去できることが知られている。異常細胞を認知したナチュラルキラー細胞は、パーフォリンを分泌して標的細胞の細胞膜に穴を開け、グランザイムを細胞膜内に分泌して細胞質を解体することにより細胞死滅(Apoptosis)を起こしたり、細胞の内部に水と塩分を注入して細胞壊死(Necrosis)を起こす。また、間接的な方法として、サイトカインを分泌して細胞傷害性T細胞、B細胞を活性化させることができる。このようなナチュラルキラー細胞に媒介する免疫作用効果は、ナチュラルキラー細胞の数と高い活性度の両方が極めて重要な尺度となることが知られているが、高活性度を有するナチュラルキラー細胞を大量に確保するための技術開発はまだ不十分であるのが現状である。
【００５５】
本発明者らは、前記のようなナチュラルキラー細胞の特性により、免疫疾患の治療及び癌治療に利用するナチュラルキラー細胞を大量に製造しようとし、その結果、直接再プログラム化を通じてナチュラルキラー細胞を直接大量に生産する方法を初めて突き止めた。
【００５６】
特に、本発明の方法により製造されたナチュラルキラー細胞は、既存のナチュラルキラー細胞より多様な種類の癌細胞に対する殺傷能に優れ、サイトカイン分泌能に優れていることを確認した。
【００５７】
本発明により製造されたナチュラルキラー細胞は、CD56、CD16またはこれらの組み合わせを発現することができるが、これに制限されない。
【００５８】
上記CD56及びCD16はナチュラルキラー細胞の表面にある指標であり、本発明ではCD56、CD16またはそれらの組み合わせの発現をフローサイトメトリー(Flow cytometry)により分析し、ナチュラルキラー細胞が製造されたことを確認した(実施例1)。
【００５９】
本発明の他の様態は、前記方法により製造されたナチュラルキラー細胞を提供する。
本発明の直接再プログラム化により誘導されたナチュラルキラー細胞の特性を従来のナチュラルキラー細胞であるNK-92及び臍帯血由来のナチュラルキラー細胞と比較分析した結果、本発明のナチュラルキラー細胞は増殖能に優れており(実施例4)、多様な癌細胞に対する殺傷能に優れており(実施例8)、サイトカイン分泌能も優れていること(実施例9)を確認した。これにより、本発明のナチュラルキラー細胞の製造方法を通じて製造されたナチュラルキラー細胞は、従来のナチュラルキラー細胞より優れた効果を有するところ、多様な疾患、具体的には、癌治療及び免疫疾患治療などに、より効果的に使用できることが分かった。
【００６０】
本発明の目的上、前記方法により製造されたナチュラルキラー細胞は、特異的なバイオマーカーを発現することを特徴とする。具体的には、前記ナチュラルキラー細胞に特異的なバイオマーカーは、ヒトから分離したナチュラルキラー細胞と比較して造血細胞系統に関連した遺伝子またはナチュラルキラー細胞媒介細胞傷害性に関連した遺伝子を上方発現するものであってもよいが、これに制限されない。
【００６１】
上記「造血細胞系統に関連した遺伝子」とは、一般に、細胞分化の過程または造血幹細胞から特定化した血液細胞の形成に関連した遺伝子を意味する。造血は、発達中に胎児の肝臓から骨髄に転位し、その後、骨髄は成人期中に造血部位として残る。また、造血組織は、受任された多能性、オリゴ能性、及び単分化能性前駆細胞だけでなく、長期間及び短期間の再生能力を有する細胞を意味する。
【００６２】
本発明において、ナチュラルキラー細胞に特異的に発現が増加した造血細胞系統に関連するバイオマーカー遺伝子は、CD71、CD3e、TNF、M-SCF、CD59及びCD9からなる群から選択される一つ以上のものであってもよいが、造血細胞系統に関連する遺伝子中、前記ナチュラルキラー細胞において特異的に発現が増加する遺伝子は制限なく含むことができる。
【００６３】
また、前記「ナチュラルキラー細胞媒介細胞傷害性」とは、ナチュラルキラー細胞の細胞傷害性的な効果を通じてウイルスに感染したり、異常に変形した細胞を認知し、除去する特性を意味し、活性化受容体と付着分子の協力を通じて刺激され、活性化の信号伝達はナチュラルキラー細胞を刺激して細胞傷害性的な顆粒を分泌することを意味する。
【００６４】
本発明において、ナチュラルキラー細胞に特異的に発現が増加したナチュラルキラー細胞媒介細胞傷害性に関連するバイオマーカー遺伝子は、KIR2DL、KIR2DS、NKp30、FCER1G、ULBP3、SAP、TNFa、IFNg、TRAIL、FAS及びCASPからなる群から選択される一つ以上のものであってもよいが、ナチュラルキラー細胞媒介細胞傷害性関連の遺伝子中、前記ナチュラルキラー細胞で特異的に発現が増加する遺伝子は、制限なく含むことができる。
【００６５】
本発明の具体的な一実施例では、本発明の方法で製造された誘導ナチュラルキラー細胞は、従来公知となった培養方法で培養されたナチュラルキラー細胞や、ヒトから分離されたナチュラルキラー細胞(wild type)と比較してナチュラルキラー細胞への分化及び活性と関連のある造血細胞系統遺伝子及び抗癌メカニズムと関連のあるナチュラルキラー細胞媒介細胞傷害性遺伝子が上方調節されることを確認したところ、前記上方調節された遺伝子は、バイオマーカーとして機能することを確認した(実施例7-3)。
【００６６】
これにより、本発明の方法で製造された誘導ナチュラルキラー細胞が、従来公知となった培養方法で培養されたナチュラルキラー細胞やヒトから分離されたナチュラルキラー細胞(wild type)と比較してナチュラルキラー細胞の活性化の程度が高いナチュラルキラー細胞を新たに分離したものであることが分かる。
【００６７】
なお、前記方法により製造されたナチュラルキラー細胞は、凍結保存した後、解凍時においてもナチュラルキラー細胞の特性が維持されることを特徴とする。
【００６８】
本発明の一実施例では、凍結保存された誘導ナチュラルキラー細胞の特性を検証するために、解凍した後に新鮮な(fresh)誘導ナチュラルキラー細胞と細胞表面受容体発現の様相をフローサイトメトリー(FACS)を用いて比較分析した結果、CD56、CD16、CD69、DNAM-I、NKG2D、NKp46などの発現が新鮮な誘導ナチュラルキラー細胞と凍結保存された誘導ナチュラルキラー細胞で類似することを確認することにより、凍結保存した後に細胞の特性が変わらないことを確認した（実施例11）。
【００６９】
本発明のまた他の様態は、前記方法により製造されたナチュラルキラー細胞を有効成分として含む細胞治療剤を提供する。
【００７０】
本発明における用語「細胞治療剤」とは、個体から分離、培養及び特殊な操作を通じて製造された細胞及び組織で、治療、診断及び予防の目的で使用される医薬品(米国FDA 規定)であり、細胞あるいは組織の機能を復元させるために生きている自己、同種、または異種細胞を体外で増殖選別したり、他の方法で細胞の生物学的特性を変化させるなどの一連の行為を通じて治療、診断及び予防の目的で使用される医薬品を意味する。
【００７１】
本発明のまた他の様態は、前記方法により製造されたナチュラルキラー細胞を有効成分として含む、癌治療または予防用薬学的組成物を提供する。
【００７２】
前記癌は、ナチュラルキラー細胞の免疫反応などにより、治療または予防の結果を示す癌であってもよく、具体的には、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、乳癌、大腸癌、骨髄癌、肝臓癌、脳癌、前立腺癌、胃癌、結腸癌、神経膠腫、黒色腫、リンパ腫、直腸癌、血液癌であってもよいが、これに制限されるものではない。
【００７３】
また、ナチュラルキラー細胞は、前立腺癌[Liu(2013), J Clin Invest 123 (10):4410-4422（非特許文献３）]、胃癌、結腸癌、神経膠腫、黒色腫、リンパ腫及び直腸癌[Dahlberg(2015), Front Immunol 6:605（非特許文献４）]の治療または予防に効果があることが知られている。
【００７４】
また、前記組成物は、癌幹細胞に対する殺傷能力を有することを特徴とする。
本発明の具体的な一実施例では、誘導ナチュラルキラー細胞と大腸癌細胞であるSW620、HCT116癌細胞、前記誘導ナチュラルキラー細胞とそれぞれ癌幹細胞を1:1の割合で4時間反応した後、殺傷能を示す指標としてCD107a発現をフローサイトメトリー(FACS)で測定した結果、それぞれSW620、HCT116の癌細胞と癌幹細胞に対して前記誘導ナチュラルキラー細胞の発現が癌幹細胞で、より高いことを確認した（実施例8-3）。
【００７５】
これにより、前記誘導ナチュラルキラー細胞が癌細胞だけでなく、癌幹細胞に、さらに高い殺傷能を有していることを示唆する。
【００７６】
本発明における用語「予防」とは、前記組成物の投与により癌を抑制したり、発生を遅延させる全ての行為を意味する。
【００７７】
本発明における用語、「治療」とは、前記組成物の投与により癌による症状が好転したり、有利に変更される全ての行為を意味する。
【００７８】
前記組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。
【００７９】
前記「薬学的に許容可能な担体」とは、生物体を刺激せずに、注入される化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体または希釈剤を意味してもよい。本発明に使用可能な前記担体の種類は、特に制限されず、当該技術分野において通常使用され、薬学的に許容される担体であれば、いずれのものでも使用することができる。前記担体の非制限的な例としては、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールなどが挙げられる。これらは単独で使用したり、または２種以上を混合して使用することができる。
【００８０】
薬学的に許容可能な担体を含む上記組成物は、経口または非経口の多様な剤形であってもよい。製剤化する場合は、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調製される。
【００８１】
詳しくは、経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、前記化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、カルシウムカーボネート、スクロース、ラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調製することができる。また、単純な賦形剤以外に、マグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も使用することができる。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当されるが、よく使われる単純希釈剤である水、液体パラフィン以外に種々の賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもよい。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤及び坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性オイル、エチルオレートのような注射可能なエステルなどが用いられてもよい。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール、マクロゴール、ツイーン61、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用可能である。
【００８２】
前記組成物は薬学的に有効な量で投与することができる。
【００８３】
前記「薬学的に有効な量」とは、医学的治療に適用可能な合理的な受益／リスクの比率で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量のレベルは個体の種類及び重症度、年齢、性別、感染されたウイルスの種類、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出割合、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素及びその他の医学分野によく知られている要素によって決定されてもよい。例えば、前記組成物またはこれらの薬学的に許容可能な塩は、それぞれ1日0.0001〜1000mg/kgであり、望ましくは0.001〜100mg/kgで投与することができる。
【００８４】
前記投与は、任意の適切な方法で患者に本発明の組成物を導入することを意味し、前記組成物の投与経路は、目的の組織に到達できる限り、如何なる一般的な経路を通じて投与されてもよい。腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻内投与されてもよいが、これに制限されるものではない。
【００８５】
本発明の組成物を毎日投与または間欠的に投与しても良く、１日当たりの投与回数は１回または２〜３回に分けて投与することが可能である。両有効成分がそれぞれ単剤の場合の投与回数は同じ回数でもよく、異なる回数にしてもよい。また、本発明の組成物は、癌の予防または治療のために、単独で、または他の薬物治療と併用して使用することができる。前記要素をすべて考慮し、副作用なしに最低限の量で最大効果が得られる量を投与することが重要であり、当業者により容易に決定されてもよい。
【００８６】
前記個体とは、癌が発症したり、または発症し得るヒト、猿、牛、馬、羊、豚、鶏、七面鳥、ウズラ、猫、犬、マウス、ラット、ウサギまたはモルモットを含むあらゆる動物を意味する。本発明の薬学的組成物を個体に投与することにより、上記疾患を効果的に予防または治療することができれば、個体の種類は制限なく含まれる。
【００８７】
本発明のもう一つの様態は、前記薬学的組成物を、これを必要とする個体に投与する段階を含む、癌の予防または治療方法を提供する。
【００８８】
前記「個体」、「投与」、「癌」、及び「治療」は前述の通りである。
【００８９】
本発明の具体的な一実施例では、本発明の直接再プログラム化により製造されたナチュラルキラー細胞が膵臓癌、肺癌、卵巣癌、乳癌、大腸癌、骨髄癌、肝臓癌、脳癌または血液癌の多様な癌細胞に対して優れた殺傷能を有することを確認し、従来のナチュラルキラー細胞との癌細胞殺傷能の比較実験の結果、本発明のナチュラルキラー細胞の癌細胞殺傷能がより優れていることを確認した(実施例8)。
【００９０】
これにより、従来のナチュラルキラー細胞より本発明の直接再プログラム化により製造されたナチュラルキラー細胞の方が癌細胞の治療に、より優れていることが分かった。
【００９１】
本発明のまた他の様態は、(a)分離した細胞に再プログラム化因子(Reprogramming factor)を導入する段階;(b)上記(a)段階の細胞をi)サイトカイン、成長因子及びGSK3β阻害剤を含む第一培地、ii)サイトカイン及び成長因子を含む第二培地で培養してナチュラルキラー細胞(Natural killer cell)に直接再プログラム化させる段階を含む凍結保存用細胞バイアルの製造方法を提供する。
【００９２】
また、前記方法により製造された凍結保存用細胞バイアルは、凍結保存した後の解凍時にもナチュラルキラー細胞の特性が維持される凍結保存用細胞バイアルを提供する。
【００９３】
前記「分離した細胞」、「再プログラム化因子」、「サイトカイン」、「成長因子」、「GSK3β阻害剤」、「培養」、「ナチュラルキラー細胞」及び「直接再プログラム化」は前述した通りである。
【００９４】
本発明における用語「凍結保存(cryopreservation)」とは、凍結により長時間にわたって細胞を安定して維持させることを意味する。細胞は、一般に、培養において１万個のうち１個程度の割合で突然変異が起きており、長期間にわたって細胞の継代を続けると、本来の細胞集団とは異なる細胞集団に変わり、甚だしくは、細胞が有する特定の機能が継代培養により消失する場合もある。また、継代培養中にマイコプラズマなどに感染されることもある。このような問題により細胞固有の特性が消失する前に細胞を凍結させ、これを保存し、必要時に取り出して使用できるように細胞の凍結保存を行う。特に、幹細胞の場合、治療剤として利用するためには、必要な状況において健康な幹細胞を直ちに使用することができなければならないため、効果的な凍結保存は、幹細胞において一層重要とされている。凍結保存は、細胞を凍結させて保存する当業界の通常の方法で行われ、その例として、ガラス化凍結法(Vitrification method)または緩慢凍結法(Slow freezing method)が含まれてもよいが、これに制限されない。
【００９５】
本発明における用語「バイアル」とは、凍結保存液を使い分ける場合に使用される容器を意味する。前記バイアルは、無菌状態で密閉して保存するが、これに制限されない。
【００９６】
また、前記細胞凍結保存方法は、適正濃度の細胞を上記バイアルに含めて行うことができる。前記バイアルに含まれた細胞の濃度は、1バイアル当たり1×104〜1×108 cell/mlであってもよいが、これに限定されず、特に、1×108 cell/mlであってもよい。
【００９７】
本発明の具体的な一実施例では、凍結保存された誘導ナチュラルキラー細胞の特性を検証するために、解凍した後に新鮮な(fresh)誘導ナチュラルキラー細胞と細胞表面受容体の発現様相を、フローサイトメトリー(FACS)を用いて比較分析した。
【００９８】
その結果、CD56、CD16、CD69、DNAM-I、NKG2D、NKp46などの発現が新鮮な誘導ナチュラルキラー細胞と凍結保存された誘導ナチュラルキラー細胞で類似していることを確認することにより、凍結保存した後の細胞の特性が変わらないことを確認した(実施例11)。
【００９９】
これにより、前記製造方法で製造された凍結保存用細胞バイアルを用いて凍結保存した後、解凍時にもナチュラルキラー細胞の特性が維持されることを示唆する。
【０１００】
本発明のまた他の様態は、(a)サイトカイン、成長因子、GSK3β阻害剤、ステムレゲニンI(StemRegenin I)、インターロイキン7、及びインターロイキン15を第一培地として含む第一容器;及び(b)サイトカイン、成長因子、ステムレゲニンI(StemRegenin I)、及びCH-223191を第二培地として含む第二容器;を含む直接再プログラム化誘導用培地キットを提供する。
【０１０１】
上記「サイトカイン」、「成長因子」、「GSK3β阻害剤」、「培地」、「ステムレゲニンI (StemRegenin I)」、「CH-223191」、「インターロイキン7」、及び「インターロイキン15」は前述した通りである。
【０１０２】
本発明における用語、「培地キット」とは、任意の実施形態を含む細胞培養に必要な培地組成物を含む装置である。本発明の培地キットは、上記第一培地を含む第一容器;及び上記第二培地を含む第二容器を含み、第一容器及び第二容器を順次使用することにより、直接再プログラム化の効率を増加させることができる。
【発明を実施するための形態】
【０１０３】
以下、本発明を実施例及び実験例を通じてより詳しく説明する。しかし、これら実施例及び実験例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例及び実験例に限定されるものではない。
【０１０４】
実施例1:PBMCからナチュラルキラー細胞への直接再プログラム化
分離した末梢血液単核細胞(Peripheral blood mononuclear cell: PBMC)を培養液で2日に1回ずつ培地交換を行って4日間培養した後、CD34 isolation microbeads kit (Miltenyl Biotec)及び CD56 isolation microbeads kit(Miltenyl Biotec)を使用した Magnetic activated cell sorting(MACS)技術を利用して全末梢血液単核細胞からCD34-positive細胞及びCD56-positive細胞を除去し、NK細胞などの免疫細胞を除去したPBMC（CD34-CD56-）細胞を回収した。
【０１０５】
上記分離したPBMC(CD34-CD56-)細胞に再プログラム化因子(Oct4、Sox2、Klf4及びMyc)を形質転換するために、ウイルスシステム[Oct4、Sox2、Klf4及びMyc発現RNAベースのセンダイウイルス(CytoTune 2.0 Sendai reprogramming kit、 Thermo Scientific)]を用いた(図1A)。
【０１０６】
具体的には、上記再プログラム化因子を形質転換させるために、上記ウイルス(5MOI、KOS基準)、分離したPBMC(CD34-CD56-)細胞及びポリブレン(4μg/ml)を共に1日間培養した後、新鮮な培地に交換した。
【０１０７】
翌日、24ウェル培養皿に2×105個の上記形質転換された細胞をNKIM-I培地(10％ FBS, 1％ Penicillin/Streptomycin, 5μM CT 99021, 20ng/ml Human IL-3, 20ng/ml Human IL-6, 20ng/ml Human SCF, 20ng/ml Human FLT3, 20ng/ml Human TPOを含むStemSpan SFEM II)で9日間培養した(図1A; STEP I)。培養10日目に、上記培養から生成されたコロニー(ナチュラルキラー細胞前駆体)を分離した後、分離されたコロニーを NKIM-II培地(10％ FBS, 1％ Penicillin/Streptomycin, 25ng/ml Human IL-2, 20ng/ml Human IL-7 20ng/ml Human IL-15, 20ng/ml Human SCF, 20ng/ml Human FLT3, 2μM StemRegenin I を含むStemSpan SFEM II)で14日間培養してナチュラルキラー細胞に誘導した（図1A; STEP II）。
【０１０８】
上記直接再プログラム化によりナチュラルキラー細胞が製造されたかを確認するために、ナチュラルキラー細胞のマーカーであるCD56、CD16またはCD4で上記細胞を染色した後、フローサイトメトリー(Flow cytometry)を用いてナチュラルキラー細胞(CD56+及びCD16+またはCD56+及びCD4-)群を分析した。
【０１０９】
具体的には、単一細胞に分離した誘導された細胞を蛍光付きCD56、CD16及びCD4に対する抗体が添加されたFACS buffer(1％BSA、2mM EDTAを含むリン酸塩緩衝液)で常温で20分間反応した後、上記細胞を、遠心分離機を利用して洗浄及び回収した後、FACS(BD Bioscience)で分析した。
【０１１０】
再プログラム化因子(Oct4、Sox2、Klf4及びMyc)が導入された末梢血液単核細胞が直接再プログラム化(図1A)によりヒトナチュラルキラー細胞に誘導されることを確認した。
再プログラム化因子を形質転換していない対照群では、ナチュラルキラー細胞の指標を発現する細胞群が0.3％であるのに対し、実験群では約80％がナチュラルキラー細胞の指標発現細胞群であることを確認した(図1B)。
【０１１１】
これにより、再プログラム化因子の導入による直接再プログラム化によりナチュラルキラー細胞が製造されることを確認した。
【０１１２】
実施例2:PBMCからナチュラルキラー細胞への直接再プログラム化におけるGSK3β阻害剤の役割
上記実施例1においてNKIM-I培地に含まれたGSK3β阻害剤である、CT99021の役割を確認するために、実施例1のようにPBMC(CD34-CD56-)細胞を回収した後、1日目に細胞をNKIM-I培地(10％ FBS, 1％ Penicillin/Streptomycin, 5μM CT99021, 20ng/ml Human IL-3, 20ng/ml Human IL-6, 20ng/ml Human SCF, 20ng/ml Human FLT3, 20ng/ml Human TPOを含むStemSpan SFEM II)でCT99021を添加した場合及び添加していない場合との比較実験を行った。
【０１１３】
実施例1のように、直接再プログラム化が開始されてから24日目に細胞を回収し、蛍光付きCD56及びCD4に対する抗体を利用して染色した後、フローサイトメトリー(Flow cytometry)でナチュラルキラー細胞(CD56+及びCD4-)群を分析した。
【０１１４】
その結果、CT99021を添加していない場合、ナチュラルキラー細胞への分化が著しく低くなることを確認した(図2)。これは、ナチュラルキラー細胞への直接再プログラム化の開始段階でCT99021が重要な役割を果たすことを示唆するものである。
【０１１５】
実施例3.NKIM-I培地及びNKIM-II培地の組成による直接再プログラム化の効率
上記NKIM-I培地及びNKIM-II培地で培養されたPBMCに再プログラム化因子(Oct4、Sox2、Klf4及びMyc)の導入後、直接再プログラム化により製造されたナチュラルキラー細胞の生産能を促進させるために、上記培地に混合添加物を添加して分析した。
【０１１６】
実施例3-1:NKIM-I培地の組成による直接再プログラム化の効率
具体的には、NKIM-I培地の場合、PBMCにOSKMを導入した後、翌日、48ウェル培養皿に1×105個の形質転換された細胞をNKIM-I培地に5μM CHIR 99021, 2 mM LiCl, 20ng/ml 2μM ステムレゲニンＩ(StemRegenin I)、ヒトIL-7、20ng/mlヒトIL-15を互いに異なる組み合わせで再プログラム化の培養過程に添加してCD56+誘導ナチュラルキラー細胞の生成能を確認した 。
【０１１７】
その結果、それぞれのCHIR 99021、LiCl、ステムレゲニンI、IL-7、IL-15添加物は、添加物を入れていない条件と比較し、添加した場合、CD56+CD3-誘導ナチュラルキラー細胞の生産を促進する効果があることを確認し、IL7+SRI、IL15+IL-7、SRIZIL-15の2種の混合添加物、 SRI+IL-7+IL15の3種の化合物が単一添加物に比べて高い生産促進効果があることを確認した。特に、SRI+IL-7+IL-15の3種の混合添加物が単一添加物、2種の添加物に比べてCD56+CD3-誘導ナチュラルキラー細胞の生産を促進する効果が高いことを確認した(図3a)。
【０１１８】
実施例3-2:NKIM-II培地の組成による直接再プログラム化の効率  
NKIM-II培地の場合、PBMC細胞にOSKMを導入した後、翌日、48ウェル培養皿に1×105個の形質転換された細胞をNKIM-I培地で6日間培養した後に、NKIM-IIにアリール炭化水素受容体拮抗剤(Aryl Hydrocarbon Receptor Antagonist)であるステムレゲニンＩ、CH-223191またはアリール炭化水素受容体拮抗剤（Aryl Hydrocarbon Receptor Agonist）であるFICZを添加した培地に29日間培養した 。
【０１１９】
その結果、アリール炭化水素受容体拮抗剤(ステムレゲニンＩ(StemRegenin I)、CH-223191)を処理した群において誘導ナチュラルキラー細胞の収得率が著しく増加することを確認した。アリール炭化水素受容体拮抗剤であるFICZを添加した場合、誘導ナチュラルキラー細胞の収得率が著しく減少することを確認した(図3b)。
【０１２０】
これにより、本発明により製造される誘導ナチュラルキラー細胞の収得率は、培地の組成と関連があり、NKIM-I培地に上記混合物の添加またはNKIM-II培地に上記拮抗剤を処理した場合、誘導ナチュラルキラー細胞の増加した生産能を確認したところ、これにより誘導ナチュラルキラー細胞の大量生産に上記培地組成物が、効果があることが分かった。
【０１２１】
実施例4:直接再プログラム化されたナチュラルキラー細胞の増殖能の測定
本発明により製造されたナチュラルキラー細胞の増殖能を評価するために、以下のような実験を行った。
【０１２２】
具体的には、実施例1のように、NKIM-I培地により誘導された系統が転換された細胞をNKIM-II培地(10％ FBS, 1％ Penicillin/Streptomycin, 25ng/ml Human IL-2, 20ng/ml Human IL-7 20ng/ml Human IL-15, 20ng/ml Human SCF, 20ng/ml Human FLT3, 2μM StemRegenin I を含むStemSpan SFEM II）で3日おきに新鮮な培地に交換しながら、39日間Hemocytometerを利用して生長速度を測定して増殖能を確認した結果、再プログラム化因子が形質転換された実験群の場合、49日目に初期細胞数に比べて約1200倍に増加することを確認した（図4A）。
【０１２３】
上記実験群及び対照群を実施例1のように、蛍光付きCD56及びCD16に対する抗体を利用して染色した後、フローサイトメトリー(Flow cytometry)でナチュラルキラー細胞(CD56+及びCD16+)群を分析した。
【０１２４】
その結果、対照群の場合、ナチュラルキラー細胞の指標であるCD56が陽性の細胞群が0.3％であるのに対し、実験群では93.6％がCD56陽性のナチュラルキラー細胞群であることを確認した(図4B)。
【０１２５】
これにより、本発明により製造されたナチュラルキラー細胞は、優れた増殖能を有するところ、ナチュラルキラー細胞の大量生産に有用であると判断される。
【０１２６】
実施例5:再プログラム化因子による増殖能の測定
再プログラム化によるナチュラルキラー細胞誘導の最少再プログラム化因子の組み合わせ条件を確認するために、Oct4、Sox2、Klf4、及びMyc因子の異なる組み合わせを末梢血液単核細胞に導入し、直接再プログラム化によりナチュラルキラー細胞に誘導されるかどうかを確認するために、次のような実験を行った。
【０１２７】
具体的には、実施例1のようなPBMC細胞に4個セット(a:Klf4、Oct4及びSox2;b:Klf4及びMyc;c:Klf4;d:Myc)の再プログラム化因子の組み合わせをそれぞれ形質転換させた。
【０１２８】
翌日、24ウェル培養皿に2×105個のそれぞれのセットに形質転換された細胞をNKIM-I培地(10％ FBS, 1％ Penicillin/Streptomycin, 5μM CT99021, 20ng/ml Human IL-3, 20ng/ml Human IL-6, 20ng/ml Human SCF, 20ng/ml Human FLT3, 20ng/ml Human TPO を含むStemSpan SFEM II) で9日間培養した。培養10日目に、上記培養で生成されたコロニー（系統が転換された細胞）を分離した後、分離されたコロニーをNKIM-II培地（10％FBS、1％Penicillin/ Streptomycin、25ng/ ml Human IL-2、20ng/ ml Human IL-7 20ng/ ml Human IL-15、20ng/ ml Human SCF、20ng/ ml Human FLT3、2μΜ StemRegenin Iを含むStemSpan SFEM II）で18日間培養した。
【０１２９】
その結果、再プログラム化因子、Oct4、Sox2、Klf4、及びMycのすべてが導入されていない場合でも、ナチュラルキラー細胞が製造されることを確認した(図5)。
【０１３０】
実施例6:多様な細胞からナチュラルキラー細胞への直接再プログラム化  
末梢血液単核細胞以外の他の細胞を用いて、直接再プログラム化により誘導されたナチュラルキラー細胞を製造することができるかどうかを確認するために、次の実験を行った。
【０１３１】
具体的には、再プログラム化因子(Oct4、Sox2、Klf4及びMyc)が形質転換したヒト皮膚線維芽細胞またはヒト歯髄腔細胞が直接再プログラム化によりナチュラルキラー細胞に誘導されることを確認した(図6)。
【０１３２】
上記ヒト皮膚線維芽細胞またはヒト歯髄腔細胞を2つの方法(図5A;aとb)でそれぞれ培養してナチュラルキラー細胞に誘導した(図6A)。共通して、FF培地(FBS 15％が含まれたMEM-α培地)で4日間培養した後、実施例1のように4個の再プログラム化因子(Oct4、Sox2、Klf4及びMyc)を形質転換した。形質転換した後、4日間IM-I培地(FBS 5％, KSR 10％, NEAA 1％, β-mercaptoethanol 0.11mM, bFGF 10ng/ml, CT99021 3μM, Na-butyrate 0.1mM, Parnate 2μM, RG108 0.5μM, NECA 0.5μMを含むDMEM/F12培地)で培養した。
【０１３３】
その後、方法aの場合には、IM-II培地(StemPro-34 supplement, Ascorbate 1mM, MTG 1mM, Glutamax-I 1％, Human transferrin 150ug/ml, SB431542 6μM, CT99021 3μM, IL-3 30ng/ml, IL-6 10ng/ml, IL-11 5ng/ml, SCF 50ng/ml, FLT3 10ng/ml, TPO 30ng/ml, EPO 2Uを含むStempro-34培地）で11日間培養した後、培養16日目に、上記培養で生成されたコロニー（ナチュラルキラー細胞前駆体）を分離した後、分離されたコロニーをNKIM-II培地（10％ FBS, 1％ Penicillin/Streptomycin, 25ng/ml Human IL-2, 20ng/ml Human IL-7 20ng/ml Human IL-15, 20ng/ml Human SCF, 20ng/ml Human FLT3, 2μM StemRegenin I を含むStemSpan SFEM II)で14日間培養した。
【０１３４】
方法bの場合には、IM-III培地(N2 0.5％, B27 1％, BSA 0.05％, Ascorbate 1mM, MTG 1nM, Glutamax-I 1％, Human transferrin 150ug/ml, BMP4 50ng/ml, bFGF 5ng/ml, SB431542 6μM, CT99021 3μMを含有するIMDM/F12=75％/25％培地）で2日間培養した後、上記IM-II培地（StemPro-34 supplement, Ascorbate 1mM, MTG 1nM, Glutamax-I 1％, Human transferrin 150μg/ml, SB431542 6μM, CT99021 3μM, IL-3 30ng/ml, IL-6 10ng/ml, IL-11 5ng/ml, SCF 50ng/ml, FLT3 10ng/ml, TPO 30ng/ml, EPO 2Uを含むStempro-34培地)で9日間培養した。その後、培養16日目に、上記培養で生成されたコロニー(系統が転換された細胞)を分離した後、分離されたコロニーをNKIM-II培地(10％ FBS, 1％ Penicillin/Streptomycin, 25ng/ml Human IL-2, 20ng/ml Human IL-7 20ng/ml Human IL-15, 20ng/ml Human SCF, 20ng/ml Human FLT3, 2μM StemRegenin Iを含むStemSpan SFEM II) で14日間培養した。
【０１３５】
上記方法aまたは方法bにより培養されたヒト皮膚線維芽細胞またはヒト歯髄腔細胞を実施例1のように、蛍光付きCD56に対する抗体を用いて染色した後、フローサイトメトリー(Flow cytometry)でナチュラルキラー細胞(CD56+)群を分析した。
【０１３６】
その結果、ヒト皮膚線維芽細胞の場合、方法aの場合には、ナチュラルキラー細胞の指標であるCD56が陽性の細胞群が71.7％であり、方法bの場合には、CD56が陽性の細胞群が58.6％であることが確認された(図6B)。また、ヒト歯髄腔細胞の場合、方法aの場合には、ナチュラルキラー細胞の指標であるCD56が陽性の細胞群が42.4％であり、方法bの場合には、CD56が陽性の細胞群が32.7％であることが確認された(図6C)。
【０１３７】
実施例7:ナチュラルキラー細胞の活性度の測定
実施例7-1: ナチュラルキラー細胞の特異的マーカーの発現態様の測定
実施例1のように、NKIM-I培地により誘導された系統が転換された細胞をNKIM-II培地で28日間培養された細胞において多様なナチュラルキラー細胞に関連する活性化及び抑制受容体の発現を、フローサイトメトリーを用いて分析した。CD16、NKG2D、NKp46、NKG2A、DNAM1のような活性化受容体及び抑制受容体であるKIR2DL1、KIR3DL1、KIR2DL4などが高頻度の発現を示すことを確認した(図7)。
【０１３８】
実施例7-2:臍帯血細胞由来のナチュラルキラー細胞との比較実験
臍帯血(CB)においてRosettsepを利用してCD3陽性T細胞が除去されたCB-CD3を得た後、初期濃度を1×106個の細胞/mlとし、1％のペニシリン/ストレプトマイシン、10ng/mlのヒトIL-21、10ng/mlのヒトIL-15、10nMのヒドロコルチゾンを含むQ-MEMに浮遊し、T75フラスコで培養を開始した。2-3日ごとに新たな培地に交換し、細胞数の測定及びCD3、CD56などの指標測定を通じてナチュラルキラー細胞の分化を測定し、ナチュラルキラー細胞の分化を2-3週間確認した。
【０１３９】
実施例1のように、NKIM-I培地により誘導された系統が転換された細胞をNKIM-II培地で28日間培養した細胞と、上記のように臍帯血から得たCB-ナチュラルキラー細胞(CB-NK)で多様なナチュラルキラー細胞に関連する活性化及び抑制受容体(CD16, NKG2D, NKp46, NKG2A, DNAM1, KIR2DL1, KIR3DL1, KIR2DL4)の発現をフローサイトメトリーを用いて比較分析した。その結果、臍帯血細胞由来のナチュラルキラー細胞と類似して本発明の誘導ナチュラルキラー細胞においてナチュラルキラー細胞-特異標識マーカー受容体が有意に発現していることを確認した(図8)。
【０１４０】
実施例 7-3. 誘導ナチュラルキラー細胞の特異的バイオマーカー
末梢血液ナチュラルキラー細胞と誘導ナチュラルキラー細胞の細胞表面受容体の発現特性と差異をフローサイトメトリーを利用してCD56, CD16, CD69, NKG2D, DNAM-I, NKp46, NKG2A, KIR2DL2/3, KIR2DL1, KIR3DL1などの発現様相を分析した。特異的に、末梢血液に自然に存在するナチュラルキラー細胞に比べて誘導ナチュラルキラー細胞においてナチュラルキラー細胞の活性化の程度を示すCD69及びNKG2Dの発現が著しく高い特性を確認することができた。したがって、誘導ナチュラルキラー細胞は、CD56+, CD3-, CD16+, CD69+, NKG2D+の特性を有する細胞であることを確認した(図9a及び9b)。
【０１４１】
また、一次培養ナチュラルキラー細胞(pNK、wild type)と誘導ナチュラルキラー細胞(iNK)(28日)のグローバル遺伝子発現の様相を見るために、cDNAマイクロアレイ遺伝子チップ分析を実施した。計21,448個の遺伝子中、二つのグループ間で上方または下方調節され、2倍以上有意な差を示す遺伝子1,523個を確認した(図9c)。全体的に誘導ナチュラルキラー細胞において細胞分裂、免疫反応に対する遺伝子が上方調節されており、細胞信号伝達に関連した遺伝子は下方調節されていることを確認した。誘導ナチュラルキラー細胞のみで約15倍以上が上方調節される遺伝子を確認し(表1)、造血細胞系統(Hematopoietic cell lineage)に関連する遺伝子、CD71(3.1倍)、CD3e(4.5倍)、TNF(7.1倍)、M-SCF(44.0倍)、CD59(3.1倍)及びCD9(4.5倍)の発現の差を確認し(図9d)、ナチュラルキラー細胞媒介細胞傷害性(Natural killer cell-mediated cytotoxicity)に関連する遺伝子、KIR2DL(8.7倍)、KIR2DS(4.7倍)、NKp30(2.8倍)、FCER1G(2.0倍)、ULBP3(2.2倍)、SAP(2.2倍)、TNFa(7.1倍)、IFNg(3.1倍)、TRAIL(5.9倍)、FAS(3.6倍)及びCASP(2.6倍)の発現の差を確認した(表2及び図9e)。
【０１４２】
これにより、本発明の誘導ナチュラルキラー細胞は、一次培養ナチュラルキラー細胞と比較してナチュラルキラー細胞への分化及び活性と関連のある造血細胞系統遺伝子;及び抗癌メカニズムと関連があるナチュラルキラー細胞媒介細胞傷害性遺伝子が上方調節されることを確認したところ、上記上方調節された遺伝子はバイオマーカーとして機能することを確認した。また、上記誘導ナチュラルキラー細胞は、上記遺伝子の調節により癌細胞殺傷能の効果を高めることを確認した。
【０１４３】
【表１】
2020534019.tif 000003
【０１４４】
【表２】
2020534019.tif 000004
【０１４５】
実施例8:ナチュラルキラー細胞の癌細胞殺傷能の測定
上記実施例を通じて検討した結果、再プログラム化因子を用いて末梢血液単核細胞から分離したPBMC(CD34-CD56-)細胞から再プログラム化誘導されたナチュラルキラー細胞の増殖能及び活性が優れているところ、上記ナチュラルキラー細胞を用いて多様な癌細胞に対する殺傷能を測定した。
【０１４６】
具体的には、実施例1のように、NKIM-I培地により誘導された系統が転換された細胞をNKIM-II培地で14日間または35日間培養して誘導されたナチュラルキラー細胞の癌細胞殺傷能を測定した。癌細胞殺傷能は、Calcein-AMを用いた細胞殺傷能測定法で評価した。
【０１４７】
癌細胞をそれぞれ1×105個の細胞/mlになるように10％のウシ胎児血清を含むDMEM培地に希釈した後、25μMになるようにCalcein-AMを添加して37℃で1時間培養した後に、DMEM培地で洗浄した細胞をCalcein標識の標的細胞とした。
【０１４８】
実施例8-1:多様な癌細胞に対する癌細胞殺傷能の測定
多様な腫瘍細胞を標的細胞とし、本発明で製造されたナチュラルキラー細胞の癌細胞殺傷能を測定した(表3)。
【０１４９】
【表３】
2020534019.tif 000005
【０１５０】
ナチュラルキラー細胞をそれぞれ0.25×105個の細胞/ml、1×105個の細胞/ml、2.5×105個の細胞/mlの細胞数密度でNKIM-IIで希釈して準備した後に、96ウェル細胞培養プレートにそれぞれ100μlずつ分注した。調製したCalcein標識の上記標的細胞(1×105個の細胞/ml)を100μl/wellずつ96ウェルプレートに添加した後、400gで1分間遠心分離して4時間で37℃、5％のCO2の存在の下で、細胞培養機で培養した。その後、各ウェルから上澄み液100μlを取り、蛍光プレートリーダ(485nm/535nm)で測定した。細胞殺傷能(％)は、以下の数式により算出した。
【０１５１】
癌細胞殺傷能(％)=(測定値-最小値)/(最大値-最小値)×100
【０１５２】
上記式において、最小値はCalcein標識の標的細胞のみ存在するウェルの測定値であり、最大値はCalcein標識の標的細胞に0.1％ TritonX-100 を添加して細胞を完全に溶解したウェルの測定値である。
【０１５３】
その結果、多様な癌細胞に対して高い殺傷能を有することを確認した(図10)。
【０１５４】
実施例8-2:本発明のナチュラルキラー細胞及び既存のナチュラルキラー細胞の癌細胞殺傷能の比較実験
本発明で製造されたナチュラルキラー細胞の癌細胞殺傷能の優秀性を確認するために、従来のヒトナチュラルキラー細胞との比較実験を行った。
【０１５５】
具体的には、実施例1のように、NKIM-I培地により誘導された系統が転換された細胞をNKIM-II培地で28日間培養して誘導されたナチュラルキラー細胞(実験群)及び既存のNK92ヒトナチュラルキラー細胞(ATCC)(対照群)のK562及びHepG2癌細胞に対する癌細胞殺傷能を実施例7-1のように、Calcein-AMを用いた細胞殺傷能測定法で評価した。
【０１５６】
その結果、実験群の癌細胞殺傷能が対照群に比べて約3.8〜5.8倍以上優れていることを確認した(図11)。
【０１５７】
実施例8-3.本発明のナチュラルキラー細胞の癌幹細胞に対する殺傷能及び生体内効果の検証
本発明で製造されたナチュラルキラー細胞の癌細胞殺傷能だけでなく、癌幹細胞の殺傷能の優秀性を確認するために、癌細胞及び癌幹細胞の比較実験を行った。
【０１５８】
実施例8-2で実験した血液癌(K562)と肝臓癌(HepG2)以外の大腸癌細胞であるSW620及びHCT116の2種から癌幹細胞を増殖培養するために、10,000細胞数を35mmの培養皿にプレーティングし、97％のDMEM/F12、1％のpenicillin/streptomycin、10ng/mlのbFGF、20ng/mlのEGF及び2％のB27の無血清培養培地で浮遊培養した（Sci Rep. 2014 Dec 15;4:7481）。浮遊培養された細胞は、3次元的スフェロイド(spheroid)構造を形成して培養され、3〜4日ごとに既存の培養液の1/2を添加して培養した。7〜10日間培養されたスフェロイドは、継代培養のために、5分間1,000rpmの条件で遠心分離して回収し、trypsin/EDTAを処理して単一細胞に解離した後、単一細胞を上記培養培地で浮遊培養した。
【０１５９】
大腸癌細胞から増殖培養された癌肝細胞は、代表的な癌肝細胞の標識マーカーであるCD133の発現の有無をフローサイトメトリー(FACS)で分析することにより確認した。
【０１６０】
その結果、SW620細胞とHCT116細胞から上記癌幹細胞の培養過程を経た細胞群においてそれぞれ79.5％、80.4％の細胞群がCD133+陽性である癌幹細胞が得られることを確認した。
【０１６１】
誘導ナチュラルキラー細胞とそれぞれSW620、HCT116癌細胞、誘導ナチュラルキラー細胞とそれぞれSW620、HCT116癌幹細胞を1:1の割合で4時間反応した後、殺傷能を示す指標としてCD107aの発現をフローサイトメトリー(FACS)で測定した結果、それぞれSW620癌細胞と癌幹細胞に対して誘導ナチュラルキラー細胞が6.8％、12.8％の発現を示し、癌幹細胞に対して高発現を示すことを確認した。HCT116癌細胞と癌幹細胞に対して誘導ナチュラルキラー細胞が4.7％、8.6％の発現を示し、癌幹細胞に対して高発現を示した。これにより、誘導ナチュラルキラー細胞が癌幹細胞に対して高い殺傷能を有していることが分かった(図12a及び12b)。
【０１６２】
また、誘導ナチュラルキラー細胞の抗癌効果を検証するために、マウスを利用して生体内実験を行った。生後8週齢のヌードマウス(Nudemouse)(Balb/c-nudemouse、平均体重20-25g)などに2×106 Sw620の皮下注入(subcutaneous injection)した翌日に誘導ナチュラルキラー細胞(5×106、1.5×107)とドキソルビシン(Doxorubicin)2mg/kgを注入した。誘導ナチュラルキラー細胞は、D1とD4に2回静脈注射(intravenous、i.v)し、ドキソルビシンは2日に1回ずつ(隔日)、2週間腹腔注射(intraperitoneal、i.p)した。28日目に各グループのマウスを頚椎脱骨技法で犠牲にした後、各グループのマウスの皮下で形成され、突出した癌の塊を摘出した。摘出したSw620癌をグループ別に比較し、誘導ナチュラルキラー細胞の抗癌効果を確認した(図13a)。
【０１６３】
SW620を皮下注射し、グループごとに(PBS、iNK500、iNK1500、ドキソルビシン)比較した結果、28日目においてPBSを注入した条件で形成された腫瘍サイズ(1369mm3)に比べて誘導ナチュラルキラー細胞[iNK500 (5×106)-262mm3, iNK1500 (1.5 ×107)-183mm3]を注入したマウスの腫瘍が著しく減っていることを確認することができた。特に、ドキソルビシン(262mm3)を注入した条件に比べて1.5×107誘導ナチュラルキラー細胞を注入した条件において高い抗癌効果を示すことを確認した(図13b及び13c)。
【０１６４】
実施例8-4:本発明のナチュラルキラー細胞及び臍帯血由来のナチュラルキラー細胞の癌細胞殺傷能の比較実験
本発明で製造されたナチュラルキラー細胞の癌細胞殺傷能の優秀性を確認するために、臍帯血由来のナチュラルキラー細胞との比較実験を行った。
【０１６５】
具体的には、実施例1のように、NKIM-I培地により誘導された系統が転換された細胞をNKIM-II培地において28日間培養して誘導されたナチュラルキラー細胞(実験群)及び臍帯血由来のナチュラルキラー細胞(ATCC)(対照群)のK562及びHepG2癌細胞に対する癌細胞殺傷能を実施例7-1のようにCalcein-AMを用いた細胞殺傷能測定法で評価した。
【０１６６】
その結果、本発明のナチュラルキラー細胞の癌細胞殺傷能が臍帯血由来のナチュラルキラー細胞に比べて約1.4〜2.13倍以上優れていることを確認した(図14)。
【０１６７】
実施例9:サイトカイン分泌能の測定
本発明で製造されたナチュラルキラー細胞のサイトカイン分泌能の優秀性を確認するために、次のような実験を行った。
【０１６８】
まず、条件培地(Conditioned medium)を得るために、実施例7のように多様な癌細胞に対してそれぞれ1×105個の細胞/ml 0.5ml及び同一の細胞濃度及び同一量のナチュラルキラー細胞を混合した。16時間後、上記培養された培養液1mlは、0.22μmのフィルター(Millipore)を利用してフィルタリングした。分泌されたサイトカイン(IFN-γ, Granzyme B,及びTNF-α)の濃度を測定するために、製作者のプロトコル(Abcam)により対照群(No target)及び実験群由来の条件培養液でELISAを行った。
【０１６９】
その結果、本発明のナチュラルキラー細胞のサイトカイン分泌能が、K562及びHepG2癌細胞との共培養条件において、従来のNK92ヒトナチュラルキラー細胞に比べて著しく優れていることを確認した(図15A)。また、K562及びHepG2癌細胞以外の多様な癌細胞u373mg, THP_1, A549, Hep3B, 及びMCF7などとの共培養の条件でもサイトカイン分泌が著しく促進されることを確認した(図15B)。
【０１７０】
実施例10:非挿入性エピソーマルベクターを用いて誘導されたナチュラルキラー細胞の特性
ウイルスシステムを利用して再プログラム化因子を導入した実施例1〜8とは異なり、再プログラム化因子の異なる伝達体である非挿入性エピソーマルベクターを利用して再プログラム化因子を形質転換させる実験を行った。
【０１７１】
具体的には、実施例1のようにPBMC-34-56 細胞を回収した後、1×106個の細胞数で NeonRtransfectionsystem(Invitrogen)を使用し、メーカーが提供するプロトコルで hOCT3/4, hSOX2, hKLF4, hLIN28, hL-MYCの5個の再プログラム化因子と再プログラム化の効率を増進させる因子であるshp53を発現するoriP/EBNA1ベースのpCEP4エピソーマルベクターを電気穿孔法（Electroporation）で1650Vパルス電圧、10msパルス幅、3パルス数の基本条件に設定して形質転換した。24ウェル培養皿に、上記形質転換された細胞をプレーティングし、PBMC培地に培養した。
【０１７２】
翌日、NKIM-I培地(10％ FBS, 1％ Penicillin/Streptomycin, 5μM CT99021, 20ng/ml Human IL-3, 20ng/ml Human IL-6, 20ng/ml Human SCF, 20ng/ml Human FLT3, 20ng/ml Human TPO を含む StemSpan SFEM II)で5日間培養した。培養6日目に、上記培養で生成されたコロニー(系統が転換された細胞)を分離した後、分離されたコロニーをNKIM-II培地(10％ FBS, 1％ Penicillin/Streptomycin, 25ng/ml Human IL-2, 20ng/ml Human IL-7 20ng/ml Human IL-15, 20ng/ml Human SCF, 20ng/ml Human FLT3, 2μM StemRegenin Iを含むStemSpan SFEM II)で14日間培養し、ナチュラルキラー細胞に誘導した。
【０１７３】
上記直接再プログラム化によりナチュラルキラー細胞が製造されたかを確認するために、実施例1のように、蛍光付きCD56及びCD3に対する抗体を利用して染色した後、フローサイトメトリー(Flow cytometry)でナチュラルキラー細胞(CD56+及びCD3-)群を分析した。
【０１７４】
その結果、対照群の場合、ナチュラルキラー細胞の指標であるCD56が陽性の細胞群が0.8％であるのに対し、実験群では24.6％がCD56陽性のナチュラルキラー細胞群であることを確認した(図16A)。
【０１７５】
また、上記エピソーマルベクターを用いて誘導されたナチュラルキラー細胞の癌細胞殺傷能を評価するために、実施例7-1のようにCalcein-AMを用いた細胞殺傷能測定法で評価した結果、K562細胞またはHepG2に対してそれぞれ40.32％または49.23％の癌細胞殺傷能を示した(図16B)。
【０１７６】
これにより、ウイルスを利用せずに非挿入性エピソーマルベクターを用いて、直接再プログラム化で誘導されたナチュラルキラー細胞を製造できることを確認した。
【０１７７】
実施例11.凍結保存された誘導ナチュラルキラー細胞の特性
誘導ナチュラルキラー細胞の長期保存及び特性の維持のために凍結保存し、解凍時に上記誘導ナチュラルキラー細胞の特性が維持されるかどうかを確認するために新鮮な誘導ナチュラルキラー細胞と比較実験を行った。
【０１７８】
上記誘導ナチュラルキラー細胞の保存及び特性の維持のために、液体窒素に1×108細胞の誘導ナチュラルキラー細胞を1mlのRecoveryTM細胞培養凍結培地である凍結保存用細胞バイアルに保管した。凍結保存された誘導ナチュラルキラー細胞の特性を検証するために、解凍後の新鮮な(fresh)誘導ナチュラルキラー細胞と細胞表面受容体の発現様相を、フローサイトメトリー(FACS)を利用して比較分析した。
【０１７９】
その結果、CD56、CD16、CD69、DNAM-I、NKG2D、NKp46などの発現が新鮮な誘導ナチュラルキラー細胞と凍結保存された誘導ナチュラルキラー細胞において類似することを確認することにより、凍結保存した後に細胞の特性が変わらないことを検証した(図17)。
【０１８０】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されうることが理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は上記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈すべきである。
【図１】
2020534019.tif 000006
【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図９ｄ】
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【図９ｅ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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