(57)【要約】単離又は精製されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩ分子によって提示される変異型Ｋｉｒｓｔｅｎラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）に対して抗原特異性を有するＴＣＲが開示される。関連するポリペプチド及びタンパク質、並びに関連する核酸、組み換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、及び医薬組成物も提供される。また、哺乳類におけるがんの存在を検出する方法及び哺乳類におけるがんを治療又は予防する方法も開示される。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離又は精製されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、前記ＴＣＲが、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩ分子によって提示される変異型ヒトＲＡＳアミノ酸配列に対して抗原特異性を有し、
前記変異型ヒトＲＡＳアミノ酸配列が、変異型ヒトＫｉｒｓｔｅｎラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、変異型ヒトＨａｒｖｅｙラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ（ＨＲＡＳ）、又は変異型ヒト神経芽細胞腫ラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ（ＮＲＡＳ）のアミノ酸配列であるＴＣＲ。
【請求項２】
前記ＨＬＡクラスＩＩ分子が、ＨＬＡ−ＤＲ分子である、請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項３】
前記ＨＬＡクラスＩＩ分子がＨＬＡ−ＤＲＢ１分子である、請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項４】
前記ＨＬＡクラスＩＩ分子が、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０７：０１分子又はＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１：０１分子である、請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項５】
前記変異型ヒトＲＡＳアミノ酸配列が、１２位のグリシンが置換されている、野生型ヒトＫＲＡＳ、野生型ヒトＨＲＡＳ、又は野生型ヒトＮＲＡＳのアミノ酸配列を含み、１２位が、前記野生型ヒトＫＲＡＳ、野生型ヒトＨＲＡＳ、又は野生型ヒトＮＲＡＳのタンパク質をそれぞれ参照することによって定義される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項６】
前記置換が、１２位のグリシンのバリン又はシステインによる置換である、請求項５に記載のＴＣＲ。
【請求項７】
（ａ）配列番号１〜３の全て、
（ｂ）配列番号４〜６の全て、
（ｃ）配列番号７〜９の全て、
（ｄ）配列番号１０〜１２の全て、
（ｅ）配列番号１〜６の全て、又は
（ｆ）配列番号７〜１２の全て
のアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項８】
（ｉ）配列番号１３、
（ｉｉ）配列番号１４、
（ｉｉｉ）配列番号１５、
（ｉｖ）配列番号１６、
（ｖ）配列番号１３〜１４の両方、又は
（ｖｉ）配列番号１５〜１６の両方
のアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項９】
（ａ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むα鎖定常領域であって：
（ｉ）配列番号３０の４８位のＸが、Ｔｈｒ若しくはＣｙｓであり；
（ｉｉ）配列番号３０の１１２位のＸが、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐであり；
（ｉｉｉ）配列番号３０の１１４位のＸが、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、若しくはＴｒｐであり；かつ
（ｉｖ）配列番号３０の１１５位のＸが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐであるα鎖定常領域；
（ｂ）配列番号３１の５７位のＸがＳｅｒ若しくはＣｙｓである、配列番号３１のアミノ酸配列を含むβ鎖定常領域；又は
（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方
を更に含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＴＣＲ。
【請求項１０】
（ａ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むα鎖であって：
（ｉ）配列番号３４の１７９位のＸが、Ｔｈｒ若しくはＣｙｓであり；
（ｉｉ）配列番号３４の２４３位のＸが、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐであり；
（ｉｉｉ）配列番号３４の２４５位のＸが、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、若しくはＴｒｐであり；かつ
（ｉｖ）配列番号３４の２４６位のＸが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐであるα鎖；
（ｂ）配列番号３５の１８９位のＸがＳｅｒ若しくはＣｙｓである、配列番号３５のアミノ酸配列を含むβ鎖；
（ｃ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むα鎖であって：
（ｉ）配列番号３６の１８０位のＸが、Ｔｈｒ若しくはＣｙｓであり；
（ｉｉ）配列番号３６の２４４位のＸが、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐであり；
（ｉｉｉ）配列番号３６の２４６位のＸが、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、若しくはＴｒｐであり；かつ
（ｉｖ）配列番号３６の２４７位のＸが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐであるα鎖；
（ｄ）配列番号３７の１９４位のＸがＳｅｒ若しくはＣｙｓである、配列番号３７のアミノ酸配列を含むβ鎖；
（ｅ）（ａ）及び（ｂ）の両方；又は
（ｆ）（ｃ）及び（ｄ）の両方
を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離又は精製されたＴＣＲ。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＴＣＲの機能的部分を含む、単離又は精製されたポリペプチドであって、前記機能的部分が：
（ａ）配列番号１〜３の全て、
（ｂ）配列番号４〜６の全て、
（ｃ）配列番号７〜９の全て、
（ｄ）配列番号１０〜１２の全て、
（ｅ）配列番号１〜６の全て、又は
（ｆ）配列番号７〜１２の全て
のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項１２】
前記機能的部分が：
（ｉ）配列番号１３、
（ｉｉ）配列番号１４、
（ｉｉｉ）配列番号１５、
（ｉｖ）配列番号１６、
（ｖ）配列番号１３〜１４の両方、又は
（ｖｉ）配列番号１５〜１６の両方
のアミノ酸配列（複数可）を含む、請求項１１に記載の単離又は精製されたポリペプチド。
【請求項１３】
（ａ）配列番号３０のアミノ酸配列であって：
（ｉ）配列番号３０の４８位のＸが、Ｔｈｒ若しくはＣｙｓであり；
（ｉｉ）配列番号３０の１１２位のＸが、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐであり；
（ｉｉｉ）配列番号３０の１１４位のＸが、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、若しくはＴｒｐであり；かつ
（ｉｖ）配列番号３０の１１５位のＸが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐであるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号３１の５７位のＸがＳｅｒ若しくはＣｙｓである、配列番号３１のアミノ酸配列；又は
（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方
を更に含む、請求項１１又は１２に記載の単離又は精製されたポリペプチド。
【請求項１４】
（ａ）配列番号３４のアミノ酸配列であって：
（ｉ）配列番号３４の１７９位のＸが、Ｔｈｒ若しくはＣｙｓであり；
（ｉｉ）配列番号３４の２４３位のＸが、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐであり；
（ｉｉｉ）配列番号３４の２４５位のＸが、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、若しくはＴｒｐであり；かつ
（ｉｖ）配列番号３４の２４６位のＸが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐであるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号３５の１８９位のＸがＳｅｒ若しくはＣｙｓである、配列番号３５のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３６のアミノ酸配列であって：
（ｉ）配列番号３６の１８０位のＸが、Ｔｈｒ若しくはＣｙｓであり；
（ｉｉ）配列番号３６の２４４位のＸが、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐであり；
（ｉｉｉ）配列番号３６の２４６位のＸが、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、若しくはＴｒｐであり；かつ
（ｉｖ）配列番号３６の２４７位のＸが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐであるアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号３７の１９４位のＸがＳｅｒ若しくはＣｙｓである、配列番号３７のアミノ酸配列；
（ｅ）（ａ）及び（ｂ）の両方；又は
（ｆ）（ｃ）及び（ｄ）の両方
を含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の単離又は精製されたポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチドのうちの少なくとも１つを含む、単離又は精製されたタンパク質。
【請求項１６】
（ａ）配列番号１〜３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号４〜６のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；又は
（ｂ）配列番号７〜９のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１０〜１２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖
を含む、請求項１５に記載の単離又は精製されたタンパク質。
【請求項１７】
（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；又は
（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖
を含む、請求項１５又は１６に記載の単離又は精製されたポリペプチド。
【請求項１８】
（ａ）配列番号３０のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖であって：
（ｉ）配列番号３０の４８位のＸが、Ｔｈｒ若しくはＣｙｓであり；
（ｉｉ）配列番号３０の１１２位のＸが、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐであり；
（ｉｉｉ）配列番号３０の１１４位のＸが、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、若しくはＴｒｐであり；かつ
（ｉｖ）配列番号３０の１１５位のＸが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐである第１のポリペプチド鎖；
（ｂ）配列番号３１の５７位のＸがＳｅｒ若しくはＣｙｓである、配列番号３１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；又は
（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方
を更に含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の単離又は精製されたタンパク質。
【請求項１９】
（ａ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖であって：
（ｉ）配列番号３４の１７９位のＸが、Ｔｈｒ若しくはＣｙｓであり；
（ｉｉ）配列番号３４の２４３位のＸが、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐであり；
（ｉｉｉ）配列番号３４の２４５位のＸが、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、若しくはＴｒｐであり；かつ
（ｉｖ）配列番号３４の２４６位のＸが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐである第１のポリペプチド鎖；
（ｂ）配列番号３５の１８９位のＸがＳｅｒ若しくはＣｙｓである、配列番号３５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；
（ｃ）配列番号３６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖であって：
（ｉ）配列番号３６の１８０位のＸが、Ｔｈｒ若しくはＣｙｓであり；
（ｉｉ）配列番号３６の２４４位のＸが、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐであり；
（ｉｉｉ）配列番号３６の２４６位のＸが、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、若しくはＴｒｐであり；かつ
（ｉｖ）配列番号３６の２４７位のＸが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐである第１のポリペプチド鎖；
（ｄ）配列番号３７の１９４位のＸがＳｅｒ若しくはＣｙｓである、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；
（ｅ）（ａ）及び（ｂ）の両方；又は
（ｆ）（ｃ）及び（ｄ）の両方
を含む、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の単離又は精製されたタンパク質。
【請求項２０】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＴＣＲ、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチド、又は請求項１５〜１９のいずれか一項に記載のタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む、単離又は精製された核酸。
【請求項２１】
請求項２０に記載の核酸を含む、組み換え発現ベクター。
【請求項２２】
請求項２１に記載の組み換え発現ベクターを含む、単離又は精製された宿主細胞。
【請求項２３】
請求項２２に記載の宿主細胞を含む、単離又は精製された細胞の集団。
【請求項２４】
（ａ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＴＣＲ、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項２０に記載の核酸、請求項２１に記載の組み換え発現ベクター、請求項２２に記載の宿主細胞、又は請求項２３に記載の細胞の集団と、（ｂ）薬学的に許容し得る担体と、を含む医薬組成物。
【請求項２５】
哺乳類におけるがんの存在を検出する方法であって、
（ａ）前記がんの細胞を含むサンプルを、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＴＣＲ、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項２０に記載の核酸、請求項２１に記載の組み換え発現ベクター、請求項２２に記載の宿主細胞、請求項２３に記載の細胞の集団、又は請求項２４に記載の医薬組成物と接触させ、それによって、複合体を形成させることと；
（ｂ）前記複合体を検出することと、
を含み、
前記複合体の検出が、前記哺乳類におけるがんの存在を示す方法。
【請求項２６】
哺乳類におけるがんの治療又は予防において使用するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＴＣＲ、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項２０に記載の核酸、請求項２１に記載の組み換え発現ベクター、請求項２２に記載の宿主細胞、請求項２３に記載の細胞の集団、又は請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記がんが、変異型ヒトＲＡＳアミノ酸配列を発現し、前記変異型ヒトＲＡＳアミノ酸配列が、変異型ヒトＫＲＡＳ、変異型ヒトＨＲＡＳ、又は変異型ヒトＮＲＡＳのアミノ酸配列である、請求項２５に記載の方法、又は請求項２６に従って使用するためのＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組み換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、若しくは医薬組成物。
【請求項２８】
前記変異型ヒトＲＡＳアミノ酸配列が、１２位のグリシンが置換されている、野生型ヒトＫＲＡＳ、野生型ヒトＨＲＡＳ、又は野生型ヒトＮＲＡＳのアミノ酸配列を含み、１２位が、前記野生型ヒトＫＲＡＳ、野生型ヒトＨＲＡＳ、又は野生型ヒトＮＲＡＳのアミノ酸配列をそれぞれ参照することによって定義される、請求項２７に記載の方法、又は請求項２７に従って使用するためのＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組み換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、若しくは医薬組成物。
【請求項２９】
前記置換が、１２位のグリシンのバリン又はシステインによる置換である、請求項２８に記載の方法、又は請求項２８に従って使用するためのＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組み換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、若しくは医薬組成物。
【請求項３０】
前記変異型ヒトＲＡＳアミノ酸配列が、変異型ヒトＫｉｒｓｔｅｎラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）アミノ酸配列である、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法、又は請求項２７〜２９のいずれか一項に従って使用するためのＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組み換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、若しくは医薬組成物。
【請求項３１】
前記変異型ヒトＲＡＳアミノ酸配列が、変異型ヒト神経芽細胞腫ラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ（ＮＲＡＳ）アミノ酸配列である、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法、又は請求項２７〜２９のいずれか一項に従って使用するためのＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組み換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、若しくは医薬組成物。
【請求項３２】
前記変異型ヒトＲＡＳアミノ酸配列が、変異型ヒトＨａｒｖｅｙラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ（ＨＲＡＳ）アミノ酸配列である、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法、又は請求項２７〜２９のいずれか一項に従って使用するためのＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組み換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、若しくは医薬組成物。
【請求項３３】
前記がんが、膵臓、結腸直腸、肺、子宮内膜、卵巣、又は前立腺のがんである、請求項２５〜３２のいずれか一項に記載の方法、又は請求項２６〜３２のいずれか一項に従って使用するためのＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組み換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、若しくは医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、２０１７年９月２０日出願の米国仮特許出願第６２／５６０，９３０号の利益を主張する。
【０００２】
連邦支援の研究又は開発に関する記述
本発明は、米国国立衛生研究所、国立がん研究所によって、プロジェクト番号ＢＣ０１０９８４の下、政府の支援を受けて成された。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
電子的に提出された文献の参照による援用
本明細書と同時に提出され、以下の通り特定されるコンピュータ可読ヌクレオチド／アミノ酸配列表は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる：２０１８年９月５日付の「７３９６６４＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称の５９，７５３バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル。
【背景技術】
【０００４】
幾つかのがんは、特に該がんが転移性かつ切除不能になったとき、非常に限られた治療法の選択肢しか有しない場合がある。例えば、外科手術、化学療法、及び放射線療法等の治療法の進歩にもかかわらず、多くのがん、例えば、膵臓、結腸直腸、肺、子宮内膜、卵巣、及び前立腺のがんの予後は不良である場合がある。従って、がんの更なる治療法に対するアンメットニーズが存在する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の実施形態は、単離又は精製されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、該ＴＣＲが、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩ分子によって提示される変異型ヒトＲａｓアミノ酸配列に対して抗原特異性を有し、該変異型ヒトＲＡＳアミノ酸配列が、変異型ヒトＫｉｒｓｔｅｎラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、変異型ヒトＨａｒｖｅｙラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ（ＨＲＡＳ）、又は変異型ヒト神経芽細胞腫ラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ（ＮＲＡＳ）のアミノ酸配列であるＴＣＲを提供する。
【０００６】
本発明の別の実施形態は、本発明のＴＣＲの機能的部分を含む単離又は精製されたポリペプチドであって、該機能的部分が、（ａ）配列番号１〜３の全て、（ｂ）配列番号４〜６の全て、（ｃ）配列番号７〜９の全て、（ｄ）配列番号１０〜１２の全て、（ｅ）配列番号１〜６の全て、又は（ｆ）配列番号７〜１２の全てのアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
【０００７】
本発明の更に別の実施形態は、本発明のポリペプチドのうちの少なくとも１つを含む単離又は精製されたタンパク質を提供する。
【０００８】
本発明の実施形態は、更に、本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、及びタンパク質に関連する核酸、組み換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、及び医薬組成物を提供する。
【０００９】
更に、本発明の実施形態によって、哺乳類におけるがんの存在を検出する方法及び哺乳類におけるがんを治療又は予防する方法も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】フローサイトメトリーによる、アイソタイプ（対照）について染色された細胞又はＰＤ−１及び／若しくはＯＸ４０の発現について染色された細胞の検出を示す実験データ（ドットプロット）を示す。ヒストグラム中の数字は、ＰＤ−１を発現している細胞の百分率を表す。
【図２】プールしたエフェクタ自己Ｔ細胞の培養物（培養物番号Ｗ１〜Ｗ１６）を、表示した２５ｍｅｒペプチド（ＰＰ）のプール又は様々な腫瘍特異的変異を包含する２５ｍｅｒタンデムミニ遺伝子（ＴＭＧ）によってコードされているペプチドのプールをパルスした標的ＤＣと共培養した際に検出された、１ウェルあたりのインターフェロンガンマ（ＩＦＮｇ）陽性スポットの数を示すグラフである。単独で、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と共に、又はＯＫＴ３抗体と共に培養した自己Ｔ細胞が対照の役割を果たした。四角で囲まれた記号（▼）は、それからＴＣＲを単離した、プールした培養物（７及び８）を示す。
【図３】培養物番号７（Ｗ７）の自己Ｔ細胞を、ペプチドプール１（ＰＰ１）由来のペプチド１〜１７（Ｐ１〜Ｐ１７）のそれぞれをパルスした自己ＤＣと共培養した際に検出された、２×１０４（２Ｅ４）細胞あたりのＩＦＮγ陽性スポットの数を示すグラフである。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と共に又はＯＫＴ３抗体と共に培養した自己Ｔ細胞が対照の役割を果たした。
【図４】ＨＬＡ遮断抗体Ｗ６／３２（抗ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ）、ＩＶＡ１２（汎特異的、抗ＨＬＡクラスＩＩ）、Ｂ７／２１（抗ＨＬＡ−ＤＰ）、ＨＢ５５（抗ＨＬＡ−ＤＲ）、又はＳＰＶ−Ｌ３（ＨＬＡ−ＤＱ）（標的細胞）の存在下で、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチド（１ｎｇ／ｍＬ）をパルスした標的自己ＡＰＣと共培養した際に４−１ＢＢを発現した、実施例２のＴＣＲを形質導入したエフェクタＴ細胞の百分率を示すグラフである。単独で、ＤＭＳＯと共に、又は酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）と共に培養したエフェクタ形質導入細胞が対照の役割を果たした。１ｎｇ／ｍＬ  ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチドをパルスした標的自己ＡＰＣと共培養した、空ベクターを形質導入したエフェクタ細胞（モック）が更に別の対照の役割を果たした。
【図５】実施例２のＴＣＲを形質導入したＴ細胞を自己ＡＰＣ（４１４８ＭＢ）と、又はＫＲＡＳＧ１２Ｖペプチド若しくはＷＴ  ＫＲＡＳペプチドをパルスしたＤＲＢ１  ０１：０１若しくはＤＲＢ１  ０７：０１ハプロタイプを有するドナー由来のＡＰＣと共培養した際の、（ｉ）ＥＬＩＳＰＯＴによって測定された２×１０４細胞あたりのＩＦＮγ数、及び（ｉｉ）フローサイトメトリーによって測定されたｍＴＣＲβ＋ＣＤ８＋４−１ＢＢ＋細胞の百分率を示すグラフである。エフェクタ細胞を、対照としてのＨＬＡ−ＤＲＢ１陽性ドナー由来のＡＰＣ（「ＤＲＢ不一致」）と共培養した。単独で、ＤＭＳＯと共に、又は酢酸ミリスチン酸ホルボール−イオノマイシン（ＰＭＡ：Ｉｏｎｏ）と共に培養したエフェクタ細胞が更なる対照の役割を果たした。
【図６】実施例２のＴＣＲを形質導入したＴ細胞を、以下のＫＲＡＳ  Ｇ１２変異：Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、又はＧ１２Ｖのうちの１つを発現している腫瘍細胞株の細胞溶解物をパルスした自己ＤＣと共培養した際の、ｉ）ＥＬＩＳＰＯＴによって測定された２×１０４細胞あたりのＩＦＮγ数（網掛けバー）、並びに（ｉｉ）フローサイトメトリーによって測定された４−１ＢＢ及び／又はＯＸ４０を発現している細胞の百分率（黒色バー）を示すグラフである。ＷＴ  ＫＲＡＳを発現している腫瘍細胞株の細胞溶解物をパルスした自己ＤＣと共培養した形質導入細胞が対照の役割を果たした。単独で、又はＰＭＡと共に、又はＤＭＳＯと共に培養した形質導入細胞が更なる対照の役割を果たした。
【図７】一晩共培養した実施例２のＴＣＲを形質導入したＴ細胞を、表示した濃度のＫＲＡＳＧ１２Ｖペプチド（三角形）又はＷＴ  ＫＲＡＳペプチド（四角形）をパルスした自己ＤＣと共培養した際の、フローサイトメトリーによって測定されたｍＴＣＲβ＋ＣＤ８＋４−１ＢＢ＋細胞の百分率を示すグラフである。
【図８】実施例２のＴＣＲを形質導入したＴ細胞を、表示した濃度の表９のペプチドをパルスした自己ＤＣと共培養した際の、ＥＬＩＳＰＯＴによって測定された２×１０４細胞あたりのＩＦＮ−γ数を示すグラフである。
【図９】ＫＲＡＳＧ１２ＣＴＣＲをコードしているＭＳＧＶ−１レトロウイルスを形質導入した細胞を、ＤＭＳＯ（対照）又は表示した濃度の表示したＷＴ  ＫＲＡＳ若しくはＫＲＡＳＧ１２ＣのペプチドをロードしたＤＣと共培養した後の、マウスＴＣＲベータ鎖及び４−１ＢＢを発現している細胞の百分率を示す実験データ（ドットプロット）を示す。ドットプロットは、以下の通り、ｍＴＣＲβ＋／４−１ＢＢ−（左上象限（Ｑ１））；ｍＴＣＲβ＋／４−１ＢＢ＋（右上象限（Ｑ２））；ｍＴＣＲβ−／４−１ＢＢ＋（右下象限（Ｑ３））；ｍＴＣＲβ−／４−１ＢＢ−（左下象限（Ｑ４））である細胞の百分率を示す（括弧内は百分率）：ＤＭＳＯ：Ｑ１（７１．０）、Ｑ２（０．９６）、Ｑ３（０．２０）、Ｑ４（２７．９）。ＷＴ  １０μｇ／ｍＬ：Ｑ１（６４．５）、Ｑ２（４．２７）、Ｑ３（０．４３）、Ｑ４（３０．８）。ＷＴ  １μｇ／ｍＬ：Ｑ１（７０．６）、Ｑ２（１．１３）、Ｑ３（０．２０）、Ｑ４（２８．１）。Ｇ１２Ｃ  １０μｇ／ｍＬ：Ｑ１（１３．６）、Ｑ２（５１．７）、Ｑ３（１．６１）、Ｑ４（３３．０）。Ｇ１２Ｃ  １μｇ／ｍＬ：Ｑ１（１９．７）、Ｑ２（４６．９）、Ｑ３（１．６７）、Ｑ４（３１．７）。
【図１０】ＨＬＡ−ＤＱ、ＤＲ、ＤＰに対する抗体又はＨＬＡ−ＤＱ、ＤＲ、及びＤＰの全てに対する抗体を用いてその膜ＭＨＣ−ＩＩ分子を遮断した後に、ＫＲＡＳＧ１２ＣＴＣＲを形質導入したＴ細胞を、自己ＤＣ又はＫＲＡＳＧ１２Ｃ２４−ｍｅｒペプチドをパルスした単一のＨＬＡ−ＤＲＢ１５：０１若しくはＨＬＡ−ＤＲＢ１１：０１のアリルに一致する同種ＤＣと共培養した後の、ＣＤ３及び４−１ＢＢを発現している細胞の百分率を示すグラフである。ＷＴ  ＫＲＡＳペプチドをパルスしたＤＣと共培養した形質導入細胞が対照の役割を果たした。ＰＭＡ／イオノマイシン（ＰＭＡ／ｉｏｎ）と共培養した形質導入細胞が更なる対照の役割を果たした。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
ＲＡＳファミリーのタンパク質は、低分子ＧＴＰａｓｅの大きなファミリーに属する。特定の理論又は機序に縛られるものではないが、変異したとき、ＲＡＳタンパク質は、多くのヒトがんの発がん初期におけるシグナル伝達に関与する可能性があると考えられる。単一のアミノ酸置換が、タンパク質を活性化させ得る。変異型ＲＡＳタンパク質産物は、構成的に活性化され得る。変異型ＲＡＳタンパク質は、例えば、膵臓がん（例えば、膵がん）、結腸直腸がん、肺がん（例えば、肺腺がん）、子宮内膜がん、卵巣がん（例えば、上皮性卵巣がん）、及び前立腺がんなどの様々なヒトのがんのいずれかで発現し得る。ヒトＲＡＳファミリーのタンパク質としては、Ｋｉｒｓｔｅｎラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、Ｈａｒｖｅｙラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ（ＨＲＡＳ）、及び神経芽細胞腫ラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ（ＮＲＡＳ）が挙げられる。
【００１２】
ＫＲＡＳは、ＧＴＰａｓｅ  ＫＲａｓ、Ｖ−Ｋｉ−Ｒａｓ２  Ｋｉｒｓｔｅｎラット肉腫ウイルスがん遺伝子、又はＫＲＡＳ２とも称される。ＫＲＡＳには２つの転写物バリアントが存在する：ＫＲＡＳバリアントＡ及びＫＲＡＳバリアントＢ。野生型（ＷＴ）ＫＲＡＳバリアントＡは、配列番号１７のアミノ酸配列を有する。野生型（ＷＴ）ＫＲＡＳバリアントＢは、配列番号１８のアミノ酸配列を有する。以後、「ＫＲＡＳ」（変異型又は非変異型（ＷＴ））に対する言及は、特に規定のない限り、バリアントＡ及びバリアントＢの両方を指す。活性化されたとき、変異型ＫＲＡＳは、グアノシン−５’−三リン酸（ＧＴＰ）に結合し、そして、ＧＴＰをグアノシン５’−二リン酸（ＧＤＰ）に変換する。
【００１３】
ＨＲＡＳは、ＲＡＳタンパク質ファミリーの別のメンバーである。また、ＨＲＡＳは、Ｈａｒｖｅｙラット肉腫ウイルスがんタンパク質、Ｖ−Ｈａ−Ｒａｓ  Ｈａｒｖｅｙラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログ、又はＲａｓファミリー低分子ＧＴＰ結合タンパク質Ｈ−Ｒａｓとも称される。ＷＴ  ＨＲＡＳは、配列番号１９のアミノ酸配列を有する。
【００１４】
ＮＲＡＳは、ＲＡＳタンパク質ファミリーの更に別のメンバーである。ＮＲＡＳは、ＧＴＰａｓｅ  ＮＲａｓ、Ｖ−Ｒａｓ神経芽細胞腫ＲＡＳウイルスがん遺伝子ホモログ、又はＮＲＡＳ１とも称される。ＷＴ  ＮＲＡＳは、配列番号２０のアミノ酸配列を有する。
【００１５】
本発明の実施形態は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩ分子によって提示される変異型ヒトＲＡＳアミノ酸配列（以後、「変異型ＲＡＳ」）に対して抗原特異性を有する、単離又は精製されたＴＣＲであって、該変異型ヒトＲＡＳアミノ酸配列が、変異型ヒトＫＲＡＳ、変異型ヒトＨＲＡＳ、又は変異型ヒトＮＲＡＳのアミノ酸配列であるＴＣＲを提供する。以後、「ＴＣＲ」に対する言及は、特に規定のない限り、ＴＣＲの機能的部分及び機能的バリアントも指す。
【００１６】
本発明のＴＣＲは、任意の変異型ヒトＲＡＳのタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドのアミノ酸配列に対する抗原特異性を有し得る。本発明の実施形態では、変異型ヒトＲＡＳアミノ酸配列は、変異型ヒトＫＲＡＳアミノ酸配列、変異型ヒトＨＲＡＳアミノ酸配列、又は変異型ヒトＮＲＡＳアミノ酸配列である。ＷＴヒトのＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、及びＨＲＡＳのタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ、１８８〜１８９アミノ酸残基長を有し、互いに対して高度の同一性を有する。例えば、ＷＴヒトＮＲＡＳタンパク質のアミノ酸配列は、ＷＴヒトＫＲＡＳタンパク質のアミノ酸配列と８６．８％同一である。ＷＴヒトＮＲＡＳタンパク質及びＷＴヒトＫＲＡＳタンパク質のアミノ酸残基１〜８６は、１００％同一である。ＷＴヒトＨＲＡＳタンパク質のアミノ酸配列は、ＷＴヒトＫＲＡＳタンパク質のアミノ酸配列と８６．３％同一である。ＷＴヒトＨＲＡＳタンパク質及びＷＴヒトＫＲＡＳタンパク質のアミノ酸残基１〜９４は、１００％同一である。以後、「ＲＡＳ」（変異型又は非変異型（ＷＴ））に対する言及は、特に規定のない限り、まとめてＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、及びＮＲＡＳを指す。
【００１７】
本発明の実施形態では、変異型ヒトＲＡＳアミノ酸配列は、１２位のグリシンが置換されているＷＴ  ＲＡＳアミノ酸配列を含み、１２位は、それぞれ、ＷＴ  ＲＡＳタンパク質を参照して定義される。ＷＴ  ＲＡＳタンパク質は、ＷＴ  ＫＲＡＳタンパク質（配列番号１７又は１８）、ＷＴ  ＨＲＡＳタンパク質（配列番号１９）、又はＷＴ  ＮＲＡＳタンパク質（配列番号２０）のいずれであってもよいが、その理由は、上に説明した通り、ＷＴヒトＮＲＡＳタンパク質及びＷＴヒトＫＲＡＳタンパク質のアミノ酸残基１〜８６が１００％同一であり、ＷＴヒトＨＲＡＳタンパク質及びＷＴヒトＫＲＡＳタンパク質のアミノ酸残基１〜９４も１００％同一であるためである。従って、ＷＴ  ＫＲＡＳ、ＷＴ  ＨＲＡＳ、及びＷＴ  ＮＲＡＳのタンパク質のそれぞれの１２位のアミノ酸残基は同じ、すなわち、グリシンである。
【００１８】
ＷＴ  ＲＡＳアミノ酸配列の１２位のグリシンは、グリシン以外の任意のアミノ酸残基で置換され得る。本発明の実施形態では、該置換は、ＷＴ  ＲＡＳアミノ酸配列の１２位のグリシンのバリン又はシステインによる置換である。これに関して、本発明の実施形態は、Ｇ１２Ｖ変異又はＧ１２Ｃ変異を有する任意のＷＴ  ＲＡＳのタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドのアミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴＣＲを提供する。
【００１９】
ＲＡＳの変異及び置換は、本明細書では、ＷＴ  ＲＡＳタンパク質のアミノ酸配列を参照して定義される。従って、ＲＡＳの変異及び置換は、本明細書では、ＷＴ  ＲＡＳタンパク質の特定の位置に存在するアミノ酸残基、続いて、位置番号、続いて、検討中の特定の変異又は置換においてその残基に置き換わったアミノ酸残基を参照して記載される。ＲＡＳアミノ酸配列（例えば、ＲＡＳペプチド）は、完全長のＷＴ  ＲＡＳタンパク質の全アミノ酸残基よりも少ないアミノ酸を含み得る。従って、ＲＡＳアミノ酸配列の具体例では対応する残基の実際の位置が異なる場合もあるという理解の下、本明細書では、１２位は、ＷＴ完全長ＲＡＳタンパク質（すなわち、配列番号１７〜２０のいずれか１つ）を参照して定義される。位置が配列番号１７〜２０のいずれか１つによって定義される通りである場合、用語「Ｇ１２」とは、配列番号１７〜２０のいずれか１つの１２位に通常存在するグリシンを指し、「Ｇ１２Ｖ」は、配列番号１７〜２０のいずれか１つの１２位に通常存在するグリシンがバリンに置き換わっていることを示す。例えば、ＲＡＳアミノ酸配列の具体例が、例えば、
【００２０】
【化１】
2020534828.tif 000003
【００２１】
（配列番号２９）（配列番号１７の連続アミノ酸残基２〜２４に対応する例示的なＷＴ  ＫＲＡＳペプチド）である場合、「Ｇ１２Ｖ」とは、たとえ配列番号２９における下線付きグリシンの実際の位置が１１であろうと、配列番号２９における下線付きのグリシンのバリンによる置換を指す。
【００２２】
Ｇ１２Ｖ又はＧ１２Ｃの変異を有する完全長ＲＡＳタンパク質の例を、以下の表１に記載する。
【００２３】
【表１】
2020534828.tif 000004
【００２４】
本発明の実施形態では、ＴＣＲは、上記Ｇ１２Ｖ変異又はＧ１２Ｃ変異を有するＲＡＳペプチドに対して抗原特異性を有し、該変異型ＲＡＳペプチドは、任意の長さを有する。本発明の実施形態では、変異型ＲＡＳペプチドは、本明細書に記載のＨＬＡクラスＩＩ分子のいずれかに結合するのに好適な任意の長さを有する。例えば、ＴＣＲは、Ｇ１２Ｖ変異又はＧ１２Ｃ変異を有するＲＡＳペプチドであって、約１１〜約３０アミノ酸残基、約１２〜約２４アミノ酸残基、又は約１８〜約２０アミノ酸残基の長さを有するＲＡＳペプチドに対して抗原特異性を有し得る。変異型ＲＡＳペプチドは、Ｇ１２Ｖ又はＧ１２Ｃの変異を有する変異型ＲＡＳタンパク質の任意の連続アミノ酸残基を含み得る。本発明の実施形態では、ＴＣＲは、Ｇ１２Ｖ変異又はＧ１２Ｃ変異を有するＲＡＳペプチドであって、約３０アミノ酸残基、約２９アミノ酸残基、約２８アミノ酸残基、約２７アミノ酸残基、約２６アミノ酸残基、約２５アミノ酸残基、約２４アミノ酸残基、約２３アミノ酸残基、約２２アミノ酸残基、約２１アミノ酸残基、約２０アミノ酸残基、約１９アミノ酸残基、約１８アミノ酸残基、約１７アミノ酸残基、約１６アミノ酸残基、約１５アミノ酸残基、約１４アミノ酸残基、約１３アミノ酸残基、約１２アミノ酸残基、約１１アミノ酸残基、又は上記値のうちのいずれか２つの範囲の長さを有する変異型ＲＡＳペプチドに対して抗原特異性を有し得る。本発明のＧ１２Ｖ  ＴＣＲによって認識され得る、それぞれがＧ１２Ｖ変異を有する特異的ペプチドの例を表９に記載する。
【００２５】
本発明の実施形態では、本発明のＴＣＲは、ＨＬＡクラスＩＩ分子によって提示される変異型ＲＡＳを認識することができる。これに関して、ＴＣＲは、ＨＬＡクラスＩＩ分子の枠内で変異型ＲＡＳに結合した際に免疫応答を惹起し得る。本発明のＴＣＲは、ＨＬＡクラスＩＩ分子によって提示される変異型ＲＡＳを認識することができ、変異型ＲＡＳに加えてＨＬＡクラスＩＩ分子にも結合することができる。
【００２６】
本発明の実施形態では、ＨＬＡクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ−ＤＲ分子である。ＨＬＡ−ＤＲ分子は、α鎖とβ鎖とのヘテロ二量体である。ＨＬＡ−ＤＲのα鎖は、ＨＬＡ−ＤＲＡ遺伝子によってコードされていてよい。ＨＬＡ−ＤＲのβ鎖は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子、ＨＬＡ−ＤＲＢ３遺伝子、ＨＬＡ−ＤＲＢ４遺伝子、又はＨＬＡ−ＤＲＢ５遺伝子によってコードされていてよい。ＨＬＡ−ＤＲ分子は、任意のＨＬＡ−ＤＲ分子であってよい。ＨＬＡ−ＤＲ分子の例としては、ＨＬＡ−ＤＲ１、ＨＬＡ−ＤＲ２、ＨＬＡ−ＤＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ５、ＨＬＡ−ＤＲ６、ＨＬＡ−ＤＲ７、ＨＬＡ−ＤＲ８、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ１０、ＨＬＡ−ＤＲ１１、ＨＬＡ−ＤＲ１２、ＨＬＡ−ＤＲ１３、ＨＬＡ−ＤＲ１４、ＨＬＡ−ＤＲ１５、及びＨＬＡ−ＤＲ１６を挙げることができるが、これらに限定されない。好ましくは、ＨＬＡ−ＤＲ分子は、ＨＬＡ−ＤＲ７又はＨＬＡ−ＤＲ１１である。
【００２７】
本発明の実施形態では、ＨＬＡクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１分子である。ＨＬＡ−ＤＲＢ１分子は、任意のＨＬＡ−ＤＲＢ１分子であってよい。ＨＬＡ−ＤＲＢ１分子の例としては、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１：０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１：０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１：０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３：０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０４、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０５、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０７、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０７：０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０８：０１  ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０８：０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９：０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１０：０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１：０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１：０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１：０４、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１２：０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３：０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３：０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３：０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１４：０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０２、及びＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１６：０１を挙げることができるが、これらに限定されない。好ましくは、ＨＬＡクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０７：０１分子又はＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１：０１分子である。
【００２８】
本発明のＴＣＲは、養子細胞移入に使用される細胞によって発現された場合を含む、様々な利点のうちのいずれか１つ以上を提供し得る。変異型ＲＡＳは、がん細胞で発現し、正常非がん細胞では発現しない。特定の理論又は機序に縛られるものではないが、本発明のＴＣＲは、有利には、がん細胞の破壊を標的とするが、一方、例えば毒性を最小化又は排除することによって、正常非がん細胞の破壊を最小化又は排除し、それによって、低減すると考えられる。更に、本発明のＴＣＲは、有利には、例えば化学療法、外科手術、又は放射線照射等の他の種類の治療には応答しない変異型ＲＡＳ陽性がんを成功裏に治療又は予防することができる。例えば、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ変異は、膵臓及び結腸直腸のがんの患者のそれぞれ約２７％及び約８％で発現し、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｃ変異は、肺がんの患者の約１５％で発現する。更に、本発明のＴＣＲは、操作されていない腫瘍細胞（例えば、インターフェロン（ＩＦＮ）−γで処理されていない、変異型ＲＡＳ及びＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０７：０１の一方又は両方、変異型ＲＡＳ及びＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１：０１の一方又は両方をコードしているベクターをトランスフェクトしていない、Ｇ１２Ｖ変異を有するＲＡＳペプチドをパルスしていない、Ｇ１２Ｃ変異を有するＲＡＳペプチドをパルスしていない、又はこれらの組み合わせの腫瘍細胞）を認識する能力を提供し得る、変異型ＲＡＳの高い結合活性での（ｈｉｇｈｌｙ  ａｖｉｄ）認識を提供することができる。更に、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０７：０１及びＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１：０１のアリルは、それぞれ、米国における白人の民族性を有する個体の約２５％及び約１０．５％で発現する。従って、本発明のＴＣＲは、他のＭＨＣ分子によって提示されるＲＡＳを認識するＴＣＲを使用する免疫療法の適格性を有しない場合がある、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０７：０１及びＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１：０１アリルの一方又は両方を発現する患者を含めるように、免疫療法適格性がん患者の数を増加させることができる。
【００２９】
語句「抗原特異性」とは、本明細書で使用するとき、ＴＣＲが、高い結合活性で変異型ＲＡＳに特異的に結合し、免疫学的に認識できることを意味する。例えば、ＴＣＲは、（ａ）低濃度の変異型ＲＡＳペプチド（例えば、約０．０５ｎｇ／ｍＬ〜約１０ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、又は上記値のうちのいずれか２つによって規定される範囲）をパルスした抗原陰性ＨＬＡクラスＩＩ分子陽性標的細胞又は（ｂ）標的細胞が変異型ＲＡＳを発現するように該変異型ＲＡＳをコードしているヌクレオチド配列が導入された抗原陰性ＨＬＡクラスＩＩ分子陽性標的細胞と共培養した際に、該ＴＣＲを発現している約１×１０４〜約１×１０５個のＴ細胞が少なくとも約２００ｐｇ／ｍＬ以上（例えば、２００ｐｇ／ｍＬ以上、３００ｐｇ／ｍＬ以上、４００ｐｇ／ｍＬ以上、５００ｐｇ／ｍＬ以上、６００ｐｇ／ｍＬ以上、７００ｐｇ／ｍＬ以上、１０００ｐｇ／ｍＬ以上、５，０００ｐｇ／ｍＬ以上、７，０００ｐｇ／ｍＬ以上、１０，０００ｐｇ／ｍＬ以上、２０，０００ｐｇ／ｍＬ以上、又は上記値のうちのいずれか２つによって規定される範囲）のＩＦＮ−γを分泌した場合、変異型ＲＡＳについて「抗原特異性」を有するとみなしてよい。本発明のＴＣＲを発現している細胞は、より高濃度の変異型ＲＡＳペプチドをパルスした抗原陰性ＨＬＡクラスＩＩ分子陽性標的細胞と共培養した際にもＩＦＮ−γを分泌することができる。ＨＬＡクラスＩＩ分子は、本明細書に記載のＨＬＡクラスＩＩ分子のいずれか（例えば、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０７：０１分子又はＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１：０１分子）であってよい。
【００３０】
あるいは又は更に、ＴＣＲは、ネガティブコントロールが発現するＩＦＮ−γの量と比較して、（ａ）低濃度の変異型ＲＡＳペプチドをパルスした抗原陰性ＨＬＡクラスＩＩ分子陽性標的細胞又は（ｂ）標的細胞が変異型ＲＡＳを発現するように該変異型ＲＡＳをコードしているヌクレオチド配列が導入された抗原陰性ＨＬＡクラスＩＩ分子陽性標的細胞と共培養した際に、該ＴＣＲを発現しているＴ細胞が少なくとも２倍多いＩＦＮ−γを分泌した場合、変異型ＲＡＳについて「抗原特異性」を有するとみなしてよい。ネガティブコントロールは、例えば、（ｉ）（ａ）同濃度の無関係のペプチド（例えば、変異型ＲＡＳペプチドとは異なる配列を有する幾つかの他のペプチド）若しくは（ｂ）標的細胞が無関係のペプチドを発現するように該無関係のペプチドをコードしているヌクレオチド配列が導入された抗原陰性ＨＬＡクラスＩＩ分子陽性標的細胞と共培養した、該ＴＣＲを発現しているＴ細胞、又は（ｉｉ）（ａ）同濃度の変異型ＲＡＳペプチドをパルスした抗原陰性ＨＬＡクラスＩＩ分子陽性標的細胞若しくは（ｂ）標的細胞が変異型ＲＡＳを発現するように該変異型ＲＡＳをコードしているヌクレオチド配列が導入された抗原陰性ＨＬＡクラスＩＩ分子陽性標的細胞と共培養した、形質導入されていないＴＣＲ細胞（例えば、該ＴＣＲを発現しないＰＢＭＣ由来）であってよい。ネガティブコントロールの標的細胞が発現するＨＬＡクラスＩＩ分子は、試験するＴ細胞と共培養した標的細胞が発現するのと同じＨＬＡクラスＩＩ分子である。ＨＬＡクラスＩＩ分子は、本明細書に記載のＨＬＡクラスＩＩ分子のいずれか（例えば、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０７：０１分子又はＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１：０１分子）であってよい。ＩＦＮ−γ分泌は、当技術分野において公知の方法、例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定することができる。
【００３１】
あるいは又は更に、ＴＣＲは、ＩＦＮ−γを分泌するネガティブコントロールＴ細胞の数と比較して、（ａ）低濃度の変異型ＲＡＳペプチドをパルスした抗原陰性ＨＬＡクラスＩＩ分子陽性標的細胞又は（ｂ）標的細胞が変異型ＲＡＳを発現するように該変異型ＲＡＳをコードしているヌクレオチド配列が導入された抗原陰性ＨＬＡクラスＩＩ分子陽性標的細胞と共培養した際に、少なくとも２倍多い数の該ＴＣＲを発現しているＴ細胞がＩＦＮ−γを分泌した場合、変異型ＲＡＳについて「抗原特異性」を有するとみなしてよい。ＨＬＡクラスＩＩ分子、ペプチドの濃度、及びネガティブコントロールは、本発明の他の態様に関して本明細書に記載の通りであってよい。ＩＦＮ−γを分泌する細胞の数は、当技術分野において公知の方法、例えば、ＥＬＩＳＰＯＴによって測定することができる。
【００３２】
あるいは又は更に、ＴＣＲは、変異型ＲＡＳを発現している標的細胞で刺激した後に例えばフローサイトメトリーによって測定したとき、該ＴＣＲを発現しているＴ細胞が１つ以上のＴ細胞活性化マーカーの発現をアップレギュレートした場合、変異型ＲＡＳについて「抗原特異性」を有するとみなしてよい。Ｔ細胞活性化マーカーの例としては、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ６９、及び抗原刺激した際にアップレギュレートされるサイトカイン（例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン（ＩＬ）−２等）が挙げられる。
【００３３】
本発明の実施形態は、例えば、ＴＣＲのアルファ（α）鎖、ＴＣＲのベータ（β）鎖、ＴＣＲのガンマ（γ）鎖、ＴＣＲのデルタ（δ）鎖、又はこれらの組み合わせ等の２つのポリペプチド（すなわち、ポリペプチド鎖）を含むＴＣＲを提供する。本発明のＴＣＲのポリペプチドは、ＴＣＲが変異型ＲＡＳに対して抗原特異性を有する限り、任意のアミノ酸配列を含んでいてよい。
【００３４】
本発明の実施形態では、ＴＣＲは、ＴＣＲの相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む可変領域をそれぞれ含む、２本のポリペプチド鎖を含む。本発明の実施形態では、ＴＣＲは、配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１（α鎖のＣＤＲ１）、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２（α鎖のＣＤＲ２）、及び配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３（α鎖のＣＤＲ３）を含む第１のポリペプチド鎖と、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１（β鎖のＣＤＲ１）、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２（β鎖のＣＤＲ２）、及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３（β鎖のＣＤＲ３）を含む第２のポリペプチド鎖とを含む。
【００３５】
本発明の別の実施形態では、ＴＣＲは、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１（α鎖のＣＤＲ１）、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２（α鎖のＣＤＲ２）、及び配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３（α鎖のＣＤＲ３）を含む第１のポリペプチド鎖と、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１（β鎖のＣＤＲ１）、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２（β鎖のＣＤＲ２）、及び配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３（β鎖のＣＤＲ３）を含む第２のポリペプチド鎖とを含む。
【００３６】
これに関して、本発明のＴＣＲは、配列番号１〜１２からなる群から選択されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つ以上を含み得る。本発明の実施形態では、ＴＣＲは、（ａ）配列番号１〜３の全て、（ｂ）配列番号４〜６の全て、（ｃ）配列番号７〜９の全て、（ｄ）配列番号１０〜１２の全て、（ｅ）配列番号１〜６の全て、又は（ｆ）配列番号７〜１２の全てのアミノ酸配列を含む。特に好ましい実施形態では、ＴＣＲは、（ｉ）配列番号１〜６の全て又は（ｉｉ）配列番号７〜１２の全てのアミノ酸配列を含む。
【００３７】
本発明の実施形態では、ＴＣＲは、上記ＣＤＲを含むＴＣＲの可変領域のアミノ酸配列を含む。これに関して、ＴＣＲは、配列番号１３（α鎖の可変領域）；配列番号１４（β鎖の可変領域）；配列番号１５（α鎖の可変領域）；配列番号１６（β鎖の可変領域）；配列番号１３及び１４の両方；又は配列番号１５及び１６の両方のアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、ＴＣＲは、（ｉ）配列番号１３及び１４の両方又は（ｉｉ）配列番号１５及び１６の両方のアミノ酸配列を含む。
【００３８】
本発明のＴＣＲは、α鎖定常領域及びβ鎖定常領域を更に含み得る。定常領域は、例えばヒト又はマウス等の任意の好適な種に由来していてよい。本発明の実施形態では、ＴＣＲは、マウスのα及びβ鎖定常領域又はヒトのα及びβ鎖定常領域を更に含む。本明細書で使用するとき、用語「マウス」又は「ヒト」は、本明細書に記載のＴＣＲ又はＴＣＲの任意の構成要素（例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ）、可変領域、定常領域、α鎖、及び／又はβ鎖）に言及するとき、それぞれマウス又はヒト由来のＴＣＲ（又はその構成要素）、すなわち、それぞれマウスＴ細胞又はヒトＴ細胞を起源とするか又は該細胞によってかつて発現されたＴＣＲ（又はその構成要素）を意味する。
【００３９】
本発明の実施形態は、ヒト可変領域及びマウス定常領域を含むキメラＴＣＲであって、ＨＬＡクラスＩＩ分子によって提示される変異型ヒトＲＡＳアミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴＣＲを提供する。マウス定常領域は、任意の１つ以上の利点を提供し得る。例えば、マウス定常領域は、本発明のＴＣＲが導入される宿主細胞の内因性ＴＣＲと本発明のＴＣＲとの不対合を減少させることができる。あるいは又は更に、マウス定常領域は、ヒト定常領域を有する同じＴＣＲと比較して、本発明のＴＣＲの発現を増加させることができる。キメラＴＣＲは、配列番号３２（野生型（ＷＴ）マウスα鎖定常領域）、配列番号３３（ＷＴマウスβ鎖定常領域）、又は配列番号３２及び３３の両方のアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、本発明のＴＣＲは、配列番号３２及び３３の両方のアミノ酸配列を含む。キメラＴＣＲは、本発明の他の態様に関して本明細書に記載のＣＤＲ領域のいずれかと組み合わせて、本明細書に記載のマウス定常領域のいずれかを含み得る。これに関して、ＴＣＲは、（ａ）配列番号１〜３及び３２の全て；（ｂ）配列番号４〜６及び３３の全て；（ｃ）配列番号７〜９及び３２の全て；（ｄ）配列番号１０〜１２及び３３の全て；（ｅ）配列番号１〜６及び３２〜３３の全て；又は（ｆ）配列番号７〜１２及び３２〜３３の全てのアミノ酸配列を含み得る。本発明の別の実施態様では、キメラＴＣＲは、本発明の他の態様に関して本明細書に記載の可変領域のいずれかと組み合わせて、本明細書に記載のマウス定常領域のいずれかを含み得る。これに関して、ＴＣＲは、（ｉ）配列番号１３及び３２の両方；（ｉｉ）配列番号１４及び３３の両方；（ｉｉｉ）配列番号１５及び３２の両方；（ｉｖ）配列番号１６及び３３の両方；（ｖ）配列番号１３〜１４及び３２〜３３の全て；又は（ｖｉ）配列番号１５〜１６及び３２〜３３の全てのアミノ酸配列を含み得る。
【００４０】
本発明の別の実施形態では、ＴＣＲは、配列番号３８（ＷＴマウス定常領域を含むα鎖）、配列番号３９（ＷＴマウス定常領域を含むβ鎖）、配列番号４０（ＷＴマウス定常領域を含むα鎖）、配列番号４１（ＷＴマウス定常領域を含むβ鎖）、配列番号３８〜３９の両方、又は配列番号４０〜４１の両方のアミノ酸配列（複数可）を含む。
【００４１】
本発明の実施形態では、ＴＣＲは、可変領域及び定常領域を含むα鎖と、可変領域及び定常領域を含むβ鎖とを含む。これに関して、ＴＣＲは、（ａ）（ｉ）配列番号３４の１７９位のＸが、Ｔｈｒ若しくはＣｙｓであり；（ｉｉ）配列番号３４の２４３位のＸが、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐであり；（ｉｉｉ）配列番号３４の２４５位のＸが、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、若しくはＴｒｐであり；（ｉｖ）配列番号３４の２４６位のＸが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐである、配列番号３４のアミノ酸配列を含むα鎖；（ｂ）配列番号３５の１８９位のＸがＳｅｒ若しくはＣｙｓである、配列番号３５のアミノ酸配列を含むβ鎖；（ｃ）（ｉ）配列番号３６の１８０位のＸが、Ｔｈｒ若しくはＣｙｓであり；（ｉｉ）配列番号３６の２４４位のＸが、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐであり；（ｉｉｉ）配列番号３６の２４６位のＸが、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、若しくはＴｒｐであり；（ｉｖ）配列番号３６の２４７位のＸが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐである、配列番号３６のアミノ酸配列を含むα；（ｄ）配列番号３７の１９４位のＸがＳｅｒ若しくはＣｙｓである、配列番号３７のアミノ酸配列を含むβ鎖；（ｅ）（ａ）及び（ｂ）の両方；又は（ｆ）（ｃ）及び（ｄ）の両方を含み得る。
【００４２】
本発明の実施形態では、ＴＣＲは、置換定常領域を含む。これに関して、ＴＣＲは、α鎖及びβ鎖の一方又は両方の定常領域に１、２、３、又は４つのアミノ酸置換（複数可）を含む、本明細書に記載のＴＣＲのいずれかのアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、ＴＣＲは、α鎖及びβ鎖の一方又は両方のマウス定常領域に１、２、３、又は４つのアミノ酸置換（複数可）を含むマウス定常領域を含む。特に好ましい実施形態では、α鎖のマウス定常領域に１、２、３、又は４つのアミノ酸置換（複数可）を含み、β鎖のマウス定常領域に１つのアミノ酸置換を含む、マウス定常領域を含む。幾つかの実施形態では、置換定常領域を含むＴＣＲは、有利には、非置換（野生型）定常領域を含む親ＴＣＲと比較して、変異型ＲＡＳ＋標的の認識の増大、宿主細胞による発現の増加、内因性ＴＣＲとの誤対合の減少、及び抗腫瘍活性の増大のうちの１つ以上を提供する。一般に、ＴＣＲのα鎖及びβ鎖のマウス定常領域の置換されたアミノ酸配列、それぞれ配列番号３０及び３１は、それぞれ配列番号３２及び３３の非置換マウス定常領域アミノ酸配列の全て又は一部に対応し、配列番号３０は、配列番号３２と比較して１、２、３、又は４つのアミノ酸置換（複数可）を有し、配列番号３１は、配列番号３３と比較して１つのアミノ酸配列を有する。これに関して、本発明の実施形態は、（ａ）（ｉ）４８位のＸが、Ｔｈｒ若しくはＣｙｓであり；（ｉｉ）１１２位のＸが、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐであり；（ｉｉｉ）１１４位のＸが、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、若しくはＴｒｐであり；（ｉｖ）１１５位のＸが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐである配列番号３０（α鎖の定常領域）；（ｂ）５７位のＸがＳｅｒ若しくはＣｙｓである配列番号３１（β鎖の定常領域）；又は（ｃ）配列番号３０及び３１の両方のアミノ酸配列を含むＴＣＲを提供する。本発明の実施形態では、配列番号３０を含むＴＣＲは、配列番号３２（α鎖の非置換マウス定常領域）を含まない。本発明の実施形態では、配列番号３１を含むＴＣＲは、配列番号３３（β鎖の非置換マウス定常領域）を含まない。
【００４３】
本発明の実施形態では、置換定常領域は、システイン置換ＴＣＲを提供するために、α鎖及びβ鎖の一方又は両方の定常領域にシステイン置換を含む。α鎖及びβ鎖における対向するシステインは、置換されたＴＣＲのα鎖及びβ鎖の定常領域を互いに連結させ、非置換マウス定常領域を含むＴＣＲには存在しない、ジスルフィド結合を提供する。これに関して、ＴＣＲは、配列番号３２の４８位のネイティブなＴｈｒ（Ｔｈｒ４８）及び配列番号３３の５７位のネイティブなＳｅｒ（Ｓｅｒ５７）の一方又は両方がＣｙｓで置換されていてよい、システイン置換ＴＣＲであり得る。好ましくは、配列番号３２のネイティブなＴｈｒ４８及び配列番号３３のネイティブなＳｅｒ５７がＣｙｓで置換されている。システイン置換ＴＣＲの定常領域配列の例を表２に記載する。本発明の実施形態では、システイン置換ＴＣＲは、（ｉ）配列番号３０、（ｉｉ）配列番号３１、又は（ｉｉｉ）配列番号３０及び３１の両方を含み、配列番号３０及び３１はいずれも表２に定義される通りである。本発明のシステイン置換ＴＣＲは、本明細書に記載のＣＤＲ又は可変領域のいずれかに加えて、置換定常領域を含み得る。
【００４４】
本発明の実施形態では、システイン置換キメラＴＣＲは、完全長アルファ鎖及び完全長ベータ鎖を含む。システイン置換キメラＴＣＲのアルファ鎖及びベータ鎖の配列の例を表２に記載する。本発明の実施形態では、ＴＣＲは、（ｉ）配列番号３４、（ｉｉ）配列番号３５、（ｉｉｉ）配列番号３６、（ｉｖ）配列番号３７、（ｖ）配列番号３４及び３５の両方、又は（ｖｉ）配列番号３６及び３７の両方を含み、配列番号３４〜３７は全て表２に定義される通りである。
【００４５】
【表２】
2020534828.tif 000005
【００４６】
本発明の実施形態では、置換されたアミノ酸配列は、疎水性アミノ酸で置換されたＴＣＲ（本明細書では「ＬＶＬ修飾ＴＣＲ」とも称される）を提供するために、α鎖及びβ鎖の一方又は両方の定常領域の膜貫通（ＴＭ）ドメインにおける１、２、又は３つのアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換を含む。ＴＣＲのＴＭドメインにおける疎水性アミノ酸置換（複数可）は、ＴＭドメインに疎水性アミノ酸置換（複数可）を有しないＴＣＲと比較して、ＴＣＲのＴＭドメインの疎水性を増大させることができる。これに関して、ＴＣＲは、配列番号３２のネイティブなＳｅｒ１１２、Ｍｅｔ１１４、及びＧｌｙ１１５のうちの１、２、又は３つが、独立して、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐ；好ましくはＬｅｕ、Ｉｌｅ、又はＶａｌで置換されていてよい、ＬＶＬ修飾ＴＣＲである。好ましくは、配列番号３２のネイティブなＳｅｒ１１２、Ｍｅｔ１１４、及びＧｌｙ１１５の３つ全てが、独立して、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐ；好ましくはＬｅｕ、Ｉｌｅ、又はＶａｌで置換されていてよい。本発明の実施形態では、ＬＶＬ修飾ＴＣＲは、（ｉ）配列番号３０、（ｉｉ）配列番号３１、又は（ｉｉｉ）配列番号３０及び３１の両方を含み、配列番号３０及び３１はいずれも表３に定義される通りである。本発明のＬＶＬ修飾ＴＣＲは、本明細書に記載のＣＤＲ又は可変領域のいずれかに加えて、置換定常領域を含み得る。
【００４７】
本発明の実施形態では、ＬＶＬ修飾キメラＴＣＲは、完全長アルファ鎖及び完全長ベータ鎖を含む。ＬＶＬ修飾ＴＣＲのアルファ鎖及びベータ鎖の配列の例を表３に記載する。本発明の実施形態では、ＬＶＬ修飾ＴＣＲは、（ｉ）配列番号３４、（ｉｉ）配列番号３５、（ｉｉｉ）配列番号３６、（ｉｖ）配列番号３７、（ｖ）配列番号３４及び３５の両方、又は（ｖｉ）配列番号３６及び３７の両方を含み、配列番号３４〜３７は全て表３に定義される通りである。
【００４８】
【表３−１】
2020534828.tif 000006
【００４９】
【表３−２】
2020534828.tif 000007
【００５０】
本発明の実施形態では、置換されたアミノ酸配列は、α鎖及びβ鎖の一方又は両方の定常領域の膜貫通（ＴＭ）ドメインにおける１、２、又は３つのアミノ酸の疎水性アミノ酸による置換（複数可）と組み合わせて、α鎖及びβ鎖の一方又は両方の定常領域にシステイン置換を含む（本明細書では、「システイン置換ＬＶＬ修飾ＴＣＲ」とも称される）。これに関して、ＴＣＲは、配列番号３２のネイティブなＴｈｒ４８がＣｙｓで置換されており；配列番号３２のネイティブなＳｅｒ１１２、Ｍｅｔ１１４、及びＧｌｙ１１５のうちの１、２、又は３つが、独立して、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐ；好ましくはＬｅｕ、Ｉｌｅ、又はＶａｌで置換されており；配列番号３３のネイティブなＳｅｒ５７がＣｙｓで置換されている、システイン置換ＬＶＬ修飾キメラＴＣＲである。好ましくは、配列番号３２のネイティブなＳｅｒ１１２、Ｍｅｔ１１４、及びＧｌｙ１１５の３つ全てが、独立して、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、又はＴｒｐ；好ましくはＬｅｕ、Ｉｌｅ、又はＶａｌで置換されていてよい。本発明の実施形態では、システイン置換ＬＶＬ修飾ＴＣＲは、（ｉ）配列番号３０、（ｉｉ）配列番号３１、又は（ｉｉｉ）配列番号３０及び３１の両方を含み、配列番号３０及び３１はいずれも表４に定義される通りである。本発明のシステイン置換ＬＶＬ修飾ＴＣＲは、本明細書に記載のＣＤＲ又は可変領域のいずれかに加えて、置換定常領域を含み得る。
【００５１】
実施形態では、システイン置換ＬＶＬ修飾ＴＣＲは、完全長アルファ鎖及び完全長ベータ鎖を含む。本発明の実施形態では、システイン置換ＬＶＬ修飾ＴＣＲは、（ｉ）配列番号３４、（ｉｉ）配列番号３５、（ｉｉｉ）配列番号３６、（ｉｖ）配列番号３７、（ｖ）配列番号３４及び３５の両方、又は（ｖｉ）配列番号３６及び３７の両方を含み、配列番号３４〜３７は全て表４に定義される通りである。
【００５２】
【表４−１】
2020534828.tif 000008
【００５３】
【表４−２】
2020534828.tif 000009
【００５４】
また、本明細書に記載のＴＣＲのいずれかの機能的部分を含むポリペプチドが本発明によって提供される。用語「ポリペプチド」は、本明細書で使用するとき、オリゴペプチドを含み、そして、１つ以上のペプチド結合によって連結された一本鎖のアミノ酸を指す。
【００５５】
本発明のポリペプチドに関して、機能的部分は、変異型ＲＡＳに特異的に結合する限り、該機能的部分がその一部であるＴＣＲの連続アミノ酸を含む任意の部分であってよい。用語「機能的部分」は、ＴＣＲに関連して使用されるとき、本発明のＴＣＲの任意の部分又は断片であって、該部分又は断片がその一部であるＴＣＲ（親ＴＣＲ）の生物活性を保持している部分又は断片を指す。機能的部分は、例えば、親ＴＣＲと同様の程度、同一程度、又はより高程度、（例えば、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０７：０１分子又はＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１：０１分子の枠内で）変異型ＲＡＳに特異的に結合するか又はがんを検出、治療、若しくは予防する能力を保持しているＴＣＲの部分を包含する。親ＴＣＲに関連して、機能的部分は、例えば、親ＴＣＲの約１０％、約２５％、約３０％、約５０％、約６８％、約８０％、約９０％、約９５％、又はそれ以上を構成し得る。
【００５６】
機能的部分は、該部分のアミノ若しくはカルボキシ末端又は両末端に、親ＴＣＲのアミノ酸配列にはみられない追加のアミノ酸を含んでいてもよい。望ましくは、追加のアミノ酸は、例えば、変異型ＲＡＳに特異的に結合する、及び／又はがんを検出する、がんを治療若しくは予防する能力を有する等の機能的部分の生物学的機能に干渉しない。より望ましくは、追加のアミノ酸は、親ＴＣＲの生物活性と比較して、生物活性を増強する。
【００５７】
ポリペプチドは、本発明のＴＣＲのα鎖及びβ鎖のいずれか又は両方の機能的部分、例えば、本発明のＴＣＲのα鎖及び／又はβ鎖の可変領域（複数可）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のうちの１つ以上を含む機能的部分を含み得る。本発明の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１（α鎖のＣＤＲ１）、配列番号２（α鎖のＣＤＲ２）、配列番号３（α鎖のＣＤＲ３）、配列番号４（β鎖のＣＤＲ１）、配列番号５（β鎖のＣＤＲ２）、配列番号６（β鎖のＣＤＲ３）、又はこれらの組み合わせのアミノ酸配列を含み得る。本発明の別の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号７（α鎖のＣＤＲ１）、配列番号８（α鎖のＣＤＲ２）、配列番号９（α鎖のＣＤＲ３）、配列番号１０（β鎖のＣＤＲ１）、配列番号１１（β鎖のＣＤＲ２）、配列番号１２（β鎖のＣＤＲ３）、又はこれらの組み合わせのアミノ酸配列を含み得る。
【００５８】
これに関して、本発明のポリペプチドは、配列番号１〜１２からなる群から選択されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つ以上を含み得る。本発明の実施形態では、ＴＣＲは、（ａ）配列番号１〜３の全て、（ｂ）配列番号４〜６の全て、（ｃ）配列番号７〜９の全て、（ｄ）配列番号１０〜１２の全て、（ｅ）配列番号１〜６の全て、又は（ｆ）配列番号７〜１２の全てのアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、（ｉ）配列番号１〜６の全て又は（ｉｉ）配列番号７〜１２の全てのアミノ酸配列を含む。
【００５９】
本発明の実施形態では、本発明のポリペプチドは、例えば、上記ＣＤＲ領域の組み合わせを含む本発明のＴＣＲの可変領域を含み得る。これに関して、ポリペプチドは、（ｉ）配列番号１３（α鎖の可変領域）、（ｉｉ）配列番号１４（β鎖の可変領域）、（ｉｉｉ）配列番号１３及び１４の両方、（ｉｖ）配列番号１５（α鎖の可変領域）、（ｖ）配列番号１６（β鎖の可変領域）、又は（ｖｉ）配列番号１５及び１６の両方のアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、ポリペプチドは、（ｉ）配列番号１３及び１４の両方、又は（ｉｉ）配列番号１５及び１６の両方のアミノ酸配列を含む。
【００６０】
本発明の実施形態では、本発明のポリペプチドは、上記本発明のＴＣＲの定常領域を更に含み得る。これに関して、ポリペプチドは、配列番号３２（α鎖のＷＴマウス定常領域）、配列番号３３（β鎖のＷＴマウス定常領域）、配列番号３０（α鎖の置換マウス定常領域）、配列番号３１（β鎖の置換マウス定常領域）、配列番号３２及び３３の両方、又は配列番号３０及び３１の両方のアミノ酸配列を更に含み得る。好ましくは、ポリペプチドは、本発明の他の態様に関して本明細書に記載のＣＤＲ領域又は可変領域のいずれかと組み合わせて、配列番号３０及び３１の両方又は配列番号３２及び３３の両方のアミノ酸配列を更に含む。本発明の実施形態では、ポリペプチドの配列番号３０及び３１の一方又は両方は、表２〜４のいずれか１つに定義される通りである。
【００６１】
本発明の実施形態では、本発明のポリペプチドは、本明細書に記載のＴＣＲのα鎖又はβ鎖の全長を含み得る。これに関して、本発明のポリペプチドは、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、及び配列番号３７のアミノ酸配列を含み得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、本明細書に記載のＴＣＲの両鎖を含み得る。
【００６２】
例えば、本発明のポリペプチドは、（ａ）（ｉ）配列番号３４の１７９位のＸが、Ｔｈｒ若しくはＣｙｓであり；（ｉｉ）配列番号３４の２４３位のＸが、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐであり；（ｉｉｉ）配列番号３４の２４５位のＸが、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、若しくはＴｒｐであり；（ｉｖ）配列番号３４の２４６位のＸが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐである、配列番号３４のアミノ酸配列；（ｂ）配列番号３５の１８９位のＸがＳｅｒ若しくはＣｙｓである、配列番号３５のアミノ酸配列；（ｃ）（ｉ）配列番号３６の１８０位のＸが、Ｔｈｒ若しくはＣｙｓであり；（ｉｉ）配列番号３６の２４４位のＸが、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐであり；（ｉｉｉ）配列番号３６の２４６位のＸが、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、若しくはＴｒｐであり；（ｉｖ）配列番号３６の２４７位のＸが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐである、配列番号３６のアミノ酸配列；（ｄ）配列番号３７の１９４位のＸがＳｅｒ若しくはＣｙｓである、配列番号３７のアミノ酸配列；（ｅ）（ａ）及び（ｂ）の両方；又は（ｆ）（ｃ）及び（ｄ）の両方を含み得る。本発明の実施形態では、ポリペプチドの配列番号３４〜３７のうちのいずれか１つ以上は、表２〜４のいずれか１つに定義される通りである。
【００６３】
本発明は、更に、本明細書に記載のポリペプチドのうちの少なくとも１つを含むタンパク質を提供する。「タンパク質」とは、１本以上のポリペプチド鎖を含む分子を意味する。
【００６４】
実施形態では、本発明のタンパク質は、（ａ）配列番号１〜３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号４〜６のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；又は（ｂ）配列番号７〜９のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１０〜１２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖を含み得る。
【００６５】
本発明の別の実施形態では、タンパク質は、（ｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；又は（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖を含み得る。
【００６６】
本発明のタンパク質は、本発明の他の態様に関して本明細書に記載の定常領域のいずれかを更に含み得る。これに関して、本発明の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は、配列番号３０又は配列番号３２のアミノ酸配列を更に含み得、第２のポリペプチド鎖は、配列番号３１又は配列番号３３のアミノ酸配列を更に含み得る。本発明の実施形態では、タンパク質の配列番号３０及び３１の一方又は両方は、表２〜４のいずれか１つに定義される通りである。
【００６７】
あるいは又は更に、本発明の実施形態のタンパク質は、（ａ）（ｉ）配列番号３４の１７９位のＸが、Ｔｈｒ若しくはＣｙｓであり；（ｉｉ）配列番号３４の２４３位のＸが、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐであり；（ｉｉｉ）配列番号３４の２４５位のＸが、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、若しくはＴｒｐであり；（ｉｖ）配列番号３４の２４６位のＸが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐである、配列番号３４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖；（ｂ）配列番号３５の１８９位のＸがＳｅｒ若しくはＣｙｓである、配列番号３５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（ｃ）（ｉ）配列番号３６の１８０位のＸが、Ｔｈｒ若しくはＣｙｓであり；（ｉｉ）配列番号３６の２４４位のＸが、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐであり；（ｉｉｉ）配列番号３６の２４６位のＸが、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、若しくはＴｒｐであり；（ｉｖ）配列番号３６の２４７位のＸが、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、若しくはＴｒｐである、配列番号３６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖；（ｄ）配列番号３７の１９４位のＸがＳｅｒ若しくはＣｙｓである、配列番号３７のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖；（ｅ）（ａ）及び（ｂ）の両方；又は（ｆ）（ｃ）及び（ｄ）の両方を含み得る。本発明の実施形態では、配列番号３４〜３７のうちの１つ以上は、表２〜４のいずれか１つに定義される通りである。
【００６８】
本発明のタンパク質は、ＴＣＲであってよい。あるいは、例えば、タンパク質が配列番号３４及び３５の両方、配列番号３６及び３７の両方のアミノ酸配列を含む１本のポリペプチド鎖を含む場合、又はタンパク質の第１の及び／若しくは第２のポリペプチド鎖（複数可）が、他のアミノ酸配列、例えば、免疫グロブリン若しくはその一部をコードしているアミノ酸配列を更に含む場合、本発明のタンパク質は、融合タンパク質であってもよい。これに関して、本発明は、また、少なくとも１つの他のポリペプチドと共に、本明細書に記載の本発明のポリペプチドのうちの少なくとも１つを含む融合タンパク質を提供する。他のポリペプチドは、融合タンパク質の別々のタンパク質として存在してもよく、又は本明細書に記載の本発明のポリペプチドのうちの１つとインフレームで（タンデムに）発現するポリペプチドとして存在してもよい。他のポリペプチドは、免疫グロブリン、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＭＨＣ分子、ＣＤ１分子、例えば、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ等が挙げられるがこれらに限定されない、任意のペプチド性若しくはタンパク質性の分子、又はこれらの一部をコードしていてよい。
【００６９】
融合タンパク質は、１コピー以上の本発明のポリペプチド及び／又は１コピー以上の他のポリペプチドを含み得る。例えば、融合タンパク質は、１、２、３、４、５、又はそれ以上のコピーの本発明のポリペプチド及び／又は他のポリペプチドを含み得る。融合タンパク質を作製する好適な方法は、当技術分野において公知であり、例えば、組み換え法が挙げられる。
【００７０】
本発明の幾つかの実施形態では、本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、及びタンパク質は、α鎖及びβ鎖を連結するリンカーペプチドを含む単一のタンパク質として発現し得る。これに関して、本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、及びタンパク質は、リンカーペプチドを更に含み得る。リンカーペプチドは、有利には、宿主細胞における組み換え体のＴＣＲ、ポリペプチド、及び／又はタンパク質の発現を促進し得る。リンカーペプチドは、任意の好適なアミノ酸配列を含み得る。例えば、リンカーペプチドは、配列番号５４のアミノ酸配列を含むフューリン−ＳＧＳＧ−Ｐ２Ａリンカーであってよい。リンカーペプチドを含むコンストラクトが宿主細胞によって発現されたら、リンカーペプチドを切断してもよく、その結果、分離されたα鎖及びβ鎖が得られる。本発明の実施形態では、ＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質は、完全長α鎖、完全長β鎖、及びα鎖とβ鎖との間に位置するリンカーペプチドを含むアミノ酸配列を含み得る。
【００７１】
本発明のタンパク質は、本明細書に記載の本発明のポリペプチドのうちの少なくとも１つを含む、組み換え抗体又はその抗原結合部分であってよい。本明細書で使用するとき、「組み換え抗体」とは、本発明のポリペプチドのうちの少なくとも１つ、及び抗体のポリペプチド鎖、又はその抗原結合部分を含む組み換え（例えば、遺伝的に操作された）タンパク質を指す。抗体のポリペプチド又はその抗原結合部分は、抗体の重鎖、軽鎖、重鎖若しくは軽鎖の可変領域若しくは定常領域、単鎖可変領域（ｓｃＦｖ）、又はＦｃ、Ｆａｂ、若しくはＦ（ａｂ）２’の断片であってよい。抗体のポリペプチド鎖又はその抗原結合部分は、組み換え抗体の別々のポリペプチドとして存在してよい。あるいは、抗体のポリペプチド鎖又はその抗原結合部分は、本発明のポリペプチドとインフレームで（タンデムに）発現するポリペプチドとして存在してもよい。抗体のポリペプチド又はその抗原結合部分は、本明細書に記載の抗体及び抗体断片のいずれかを含む、任意の抗体又は任意の抗体断片のポリペプチドであってよい。
【００７２】
本明細書に記載の本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質の機能的バリアントは、本発明の範囲に含まれる。用語「機能的バリアント」とは、本明細書で使用するとき、親のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質に対して実質的な又は著しい配列の同一性又は類似性を有するＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質を指し、該機能的バリアントは、該バリアントがそのバリアントであるＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質の生物活性を保持している。機能的バリアントは、例えば、親のＴＣＲ、ポリペプチド、若しくはタンパク質と同様の程度、同一程度、又はより高程度、親ＴＣＲが抗原特異性を有するか又は親のポリペプチド若しくはタンパク質が特異的に結合する変異型ＲＡＳに特異的に結合する能力を保持している、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質（親のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質）のバリアントを包含する。親のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質に関連して、機能的バリアントは、例えば、それぞれ親のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質に対してアミノ酸配列が少なくとも約３０％、約５０％、約７５％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又はそれ以上同一であってよい。
【００７３】
機能的バリアントは、例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する親のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質のアミノ酸配列を含み得る。保存的アミノ酸置換は、当技術分野において公知であり、特定の物理的及び／又は化学的特性を有するあるアミノ酸が、同じ化学的又は物理的特性を有する別のアミノ酸に交換されるアミノ酸置換を含む。例えば、保存的アミノ酸置換は、酸性アミノ酸の別の酸性アミノ酸（例えば、Ａｓｐ又はＧｌｕ）による置換、非極性側鎖を有するアミノ酸の、別の非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ等）による置換、塩基性アミノ酸の別の塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ等）による置換、極性側鎖を有するアミノ酸の、別の極性側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ等）による置換等であってよい。
【００７４】
あるいは又は更に、機能的バリアントは、少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換を有する親のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質のアミノ酸配列を含み得る。この場合、非保存的アミノ酸置換が機能的バリアントの生物活性に干渉もせず、阻害もしないことが好ましい。好ましくは、非保存的アミノ酸置換は機能的バリアントの生物活性を増強することができ、その結果、機能的バリアントの生物活性が、親のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質と比べて増大する。
【００７５】
ＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質は、本明細書に記載の特定のアミノ酸配列（複数可）から本質的になっていてよく、その結果、該ＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質の他の構成要素、例えば、他のアミノ酸が、該ＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質の生物活性を実質的に変化させることはない。これに関して、本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質は、例えば、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３４〜３５の両方、又は配列番号３６〜３７の両方のアミノ酸配列から本質的になっていてよい。また、例えば、本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質は、（ｉ）配列番号１３、（ｉｉ）配列番号１４、（ｉｉｉ）配列番号１５、（ｉｖ）配列番号１６、（ｖ）配列番号１３及び１４の両方、又は（ｖｉ）配列番号１５及び１６の両方のアミノ酸配列（複数可）から本質的になっていてよい。更に、本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質は、（ａ）配列番号１〜１２のいずれか１つ以上；（ｂ）配列番号１〜３の全て；（ｃ）配列番号４〜６の全て；（ｄ）配列番号７〜９の全て；（ｅ）配列番号１０〜１２の全て；（ｆ）配列番号１〜６の全て；又は（ｇ）配列番号７〜１２の全てのアミノ酸配列から本質的になっていてよい。
【００７６】
本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質は、任意の長さであってよい、すなわち、該ＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質が、その生物活性、例えば、変異型ＲＡＳに特異的に結合する；哺乳類におけるがんを検出する；又は哺乳類におけるがんを治療若しくは予防する能力等を保持している限り、任意の数のアミノ酸を含み得る。例えば、ポリペプチドは、約５０〜約５０００アミノ酸長の範囲、例えば、約５０、約７０、約７５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００又はそれ以上のアミノ酸長であってよい。これに関して、本発明のポリペプチドは、オリゴペプチドも含む。
【００７７】
本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質は、１つ以上の天然に存在するアミノ酸の代わりに合成アミノ酸を含んでいてもよい。このような合成アミノ酸は、当技術分野において公知であり、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、α−アミノｎ−デカン酸、ホモセリン、Ｓ−アセチルアミノメチル−システイン、トランス−３−及びトランス−４−ヒドロキシプロリン、４−アミノフェニルアラニン、４−ニトロフェニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、４−カルボキシフェニルアラニン、β−フェニルセリンβ−ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α−ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン−２−カルボン酸、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ’−ベンジル−Ｎ’−メチル−リジン、Ｎ’，Ｎ’−ジベンジル−リジン、６−ヒドロキシリジン、オルニチン、α−アミノシクロペンタンカルボン酸、α−アミノシクロヘキサンカルボン酸、α−アミノシクロヘプタンカルボン酸、α−（２−アミノ−２−ノルボルナン）−カルボン酸、α，γ−ジアミノ酪酸、α，β−ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、及びα−ｔｅｒｔ−ブチルグリシンが挙げられる。
【００７８】
本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質を、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、Ｎ−アシル化、例えばジスルフィド架橋を介して環化、又は酸付加塩に変換、及び／又は任意で二量体化若しくは多量体化、又はコンジュゲートしてもよい。
【００７９】
本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、及び／又はタンパク質は、当技術分野において公知の方法、例えば、デノボ合成によって得ることができる。また、ポリペプチド及びタンパク質は、標準的な組み換え法を使用し、本明細書に記載の核酸を使用して組み換え的に生成することができる。例えば、Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照。あるいは、例えば、Ｓｙｎｐｅｐ（Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡ）、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、及びＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）等の企業が、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、及び／又はタンパク質を商業的に合成することもできる。これに関して、本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、及びタンパク質は、合成であってもよく、組み換え体であってもよく、単離されていてもよく、及び／又は精製されていてもよい。
【００８０】
本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質（これらの機能的部分又はバリアントのいずれかを含む）、核酸、組み換え発現ベクター、宿主細胞、又は宿主細胞の集団、又は抗体若しくはその抗原結合部分のいずれかを含むコンジュゲート、例えばバイオコンジュゲートも本発明の範囲に含まれる。コンジュゲート、及び一般にコンジュゲートを合成する方法は、当技術分野において公知である。
【００８１】
本発明の実施形態は、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質のいずれかをコードしているヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。「核酸」は、本明細書で使用するとき、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、及び「核酸分子」を含み、一般的に、ＤＮＡ又はＲＮＡのポリマーを意味し、これらは、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、天然の、非天然の、又は改変されたヌクレオチドを含有していてもよく、そして、改変されていないオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間にみられるホスホジエステルの代わりに、天然の、非天然の、又は改変されたヌクレオチド間結合、例えば、ホスホロアミデート結合又はホスホロチオエート結合を含有していてもよい。実施形態では、核酸は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含む。核酸は、任意の挿入、欠失、逆位、及び／又は置換を含まないことが一般に好ましい。しかし、幾つかの例では、本明細書で論じた通り、核酸が１つ以上の挿入、欠失、逆位、及び／又は置換を含むことが好適である場合もある。
【００８２】
好ましくは、本発明の核酸は、組み換え体である。本明細書で使用するとき、用語「組み換え体」とは、（ｉ）天然若しくは合成の核酸セグメントを生細胞で複製可能な核酸分子に連結させることによって生細胞の外部で構築される分子、又は（ｉｉ）上記（ｉ）に記載されているものの複製によって得られる分子を指す。本明細書における目的のために、複製は、インビトロ複製であってもインビボ複製であってもよい。
【００８３】
核酸は、当技術分野において公知の手順を使用して、化学合成及び／又は酵素ライゲーション反応に基づいて構築され得る。例えば、Ｇｒｅｅｎ及びＳａｍｂｒｏｏｋら、前記を参照。例えば、核酸は、天然に存在するヌクレオチド、又は分子の生物学的安定性を増大させるか若しくはハイブリダイゼーションの際に形成される二本鎖の物理的安定性を増大させるために設計された様々に改変されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチド）を使用して、化学的に合成することができる。核酸を作製するために使用することができる改変ヌクレオチドの例としては、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキュェオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−置換アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキュェオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キュェオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、及び２，６−ジアミノプリンが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、本発明の核酸のうちの１つ以上は、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（Ｆｏｒｔ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）及びＳｙｎｔｈｅｇｅｎ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）等の企業から購入することができる。
【００８４】
核酸は、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質のいずれかをコードしている任意のヌクレオチド配列を含み得る。本発明の実施形態では、配列番号４２〜４５のいずれか１つのヌクレオチド配列を含み得る（表５）。本発明の実施形態では、核酸は、配列番号４２〜４３の両方又は配列番号アミノ酸配列４４〜４５の両方のヌクレオチド配列を含む。
【００８５】
【表５−１】
2020534828.tif 000010
【００８６】
【表５−２】
2020534828.tif 000011
【００８７】
本発明の実施形態では、核酸は、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質のいずれかをコードしている、コドン最適化されたヌクレオチド配列を含む。特定の理論又は機序に縛られるものではないが、ヌクレオチド配列のコドン最適化は、ｍＲＮＡ転写物の翻訳効率を増大させると考えられる。ヌクレオチド配列のコドン最適化は、ネイティブなコドンを、同じアミノ酸をコードしているが細胞内でより容易に利用可能なｔＲＮＡによって翻訳され得る別のコドンで置換し、それによって、翻訳効率を増大させることを伴い得る。また、ヌクレオチド配列の最適化は、翻訳に干渉するｍＲＮＡの二次構造を低減し、それによって、翻訳効率を増大させることもできる。
【００８８】
また、本発明は、本明細書に記載の核酸のいずれかのヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列、又は本明細書に記載の核酸のいずれかのヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００８９】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列は、好ましくは、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。「高ストリンジェントな条件」とは、ヌクレオチド配列が、非特異的ハイブリダイゼーションよりも検出可能に多い量で、標的配列（本明細書に記載の核酸のいずれかのヌクレオチド配列）に特異的にハイブリダイズすることを意味する。高ストリンジェントな条件は、正確な相補的配列を有するポリヌクレオチド又は幾つかの散在している不一致しか含有していないものを、該ヌクレオチド配列に一致している幾つかの小さな領域（例えば、３〜１０塩基）を偶然有するランダム配列と識別する条件を含む。このような相補的な小さな領域は、１４〜１７又はそれ以上の塩基の完全長相補体よりも容易に融解するので、高ストリンジェントなハイブリダイゼーションによって容易に識別可能になる。比較的高ストリンジェントな条件は、例えば、約０．０２〜０．１Ｍ  ＮａＣｌ又は当量、約５０〜７０℃の温度によって提供されるもの等の低塩及び／又は高温条件を含む。このような高ストリンジェントな条件は、ヌクレオチド配列とテンプレート又は標的鎖との間の（もし存在するとしても）わずかな不一致しか許容せず、本発明のＴＣＲのいずれかの発現を検出するのに特に好適である。一般的に、漸増量のホルムアミドを添加することによって、条件をよりストリンジェントにすることができると理解される。
【００９０】
また、本発明は、本明細書に記載の核酸のいずれかと少なくとも約７０％以上、例えば、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。これに関して、核酸は、本明細書に記載のヌクレオチド配列のいずれかから本質的になっていてよい。
【００９１】
本発明の核酸は、組み換え発現ベクターに組み込むことができる。これに関して、本発明は、本発明の核酸のいずれかを含む組み換え発現ベクターを提供する。本発明の実施形態では、組み換え発現ベクターは、α鎖、β鎖、及びリンカーペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む。
【００９２】
本明細書における目的のために、用語「組み換え発現ベクター」は、コンストラクトがｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含み、宿主細胞内で該ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを発現させるのに十分な条件下でベクターを該細胞と接触させたときに、該細胞に該ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを発現させる、遺伝的に改変されたオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドのコンストラクトを意味する。本発明のベクターは、全体として天然には存在しない。しかし、ベクターの一部が天然に存在していてもよい。本発明の組み換え発現ベクターは、任意の種類のヌクレオチドを含んでいてよく、ＤＮＡ及びＲＮＡが挙げられるがこれらに限定されず、該ＤＮＡ及びＲＮＡは、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、合成されても天然源から部分的に入手されてもよく、天然の、非天然の、又は改変されたヌクレオチドを含有していてもよい。組み換え発現ベクターは、天然に存在するヌクレオチド間結合、天然には存在しないヌクレオチド間結合、又は両方の種類の結合を含んでいてよい。好ましくは、天然には存在しないか又は改変されたヌクレオチド又はヌクレオチド間結合は、ベクターの転写も複製も妨げない。
【００９３】
本発明の組み換え発現ベクターは、任意の好適な組み換え発現ベクターであってよく、任意の好適な宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトするために使用することができる。好適なベクターとしては、プラスミド及びウイルス等、伝播及び増殖用、若しくは発現用、又は両方のために設計されたものが挙げられる。ベクターは、ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、及びｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）からなる群から選択され得る。λＧＴ１０、λＧＴ１１、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、λＥＭＢＬ４、及びλＮＭ１１４９等のバクテリオファージベクターを使用してもよい。植物発現ベクターの例としては、ｐＢＩ０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ１２１、及びｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。動物発現ベクターの例としては、ｐＥＵＫ−Ｃｌ、ｐＭＡＭ、及びｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。好ましくは、組み換え発現ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターである。特に好ましい実施形態では、組み換え発現ベクターは、ＭＳＧＶ１ベクターである。
【００９４】
本発明の組み換え発現ベクターは、例えば、Ｇｒｅｅｎ及びＳａｍｂｒｏｏｋら、前記に記載されている標準的な組み換えＤＮＡ技術を使用して調製することができる。環状又は線状である発現ベクターのコンストラクトは、原核又は真核の宿主細胞において機能する複製系を含有するように調製することができる。複製系は、例えば、ＣｏｌＥｌ、２μプラスミド、λ、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス等に由来していてよい。
【００９５】
望ましくは、組み換え発現ベクターは、必要に応じて、そして、ベクターがＤＮＡベースであるかＲＮＡベースであるかを考慮して、ベクターが導入される宿主細胞の種類（例えば、細菌、真菌、植物、又は動物）に特異的な転写の、並びに翻訳の開始及び終止のコドン等の、調節配列を含む。
【００９６】
組み換え発現ベクターは、形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞の選別を可能にする１つ以上のマーカー遺伝子を含んでいてよい。マーカー遺伝子は、殺生物剤耐性、例えば、抗生物質、重金属等に対する耐性、原栄養性を与えるための栄養要求性宿主における補完等を含む。本発明の発現ベクターに好適なマーカー遺伝子は、例えば、ネオマイシン／Ｇ４１８耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、及びアンピシリン耐性遺伝子を含む。
【００９７】
組み換え発現ベクターは、ＴＣＲ、ポリペプチド、若しくはタンパク質をコードしているヌクレオチド配列に、又はＴＣＲ、ポリペプチド、若しくはタンパク質をコードしているヌクレオチド配列に相補的であるか若しくはハイブリダイズするヌクレオチド配列に動作可能に連結しているネイティブ又は非ネイティブのプロモータを含んでいてよい。例えば、強い、弱い、誘導性、組織特異的、及び発生段階特異的なプロモータの選別は、当業者の技能の範囲内である。同様に、ヌクレオチド配列とプロモータとの組み合わせも当業者の技能の範囲内である。プロモータは、非ウイルスプロモータであってもよく、ウイルスプロモータ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ＲＳＶプロモータ、及びマウス幹細胞ウイルスの末端反復配列にみられるプロモータであってもよい。
【００９８】
本発明の組み換え発現ベクターは、一過的発現用、安定的発現用、又は両方のために設計することができる。また、組み換え発現ベクターは、構成的発現用又は誘導性発現用に作製することができる。
【００９９】
更に、組み換え発現ベクターは、自殺遺伝子を含むように作製してもよい。本明細書で使用するとき、用語「自殺遺伝子」とは、自殺遺伝子を発現している細胞を死に至らしめる遺伝子を指す。自殺遺伝子は、該遺伝子が発現する細胞に対して剤、例えば薬物に対する感受性を付与し、そして、該細胞が該剤と接触したとき又は該剤に曝露されたときに該細胞を死に至らしめる遺伝子であってよい。自殺遺伝子は、当技術分野において公知であり、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、ニトロレダクターゼ、及び誘導性カスパーゼ９遺伝子系を含む。
【０１００】
本発明の別の実施形態は、更に、本明細書に記載の組み換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を提供する。本明細書で使用するとき、用語「宿主細胞」とは、本発明の組み換え発現ベクターを含有し得る任意の種類の細胞を指す。宿主細胞は、真核細胞、例えば、植物、動物、真菌、又は藻類であってもよく、原核細胞、例えば、細菌又は原生動物であってもよい。宿主細胞は、培養細胞又は初代細胞、すなわち、生物、例えばヒトから直接単離された細胞であってよい。宿主細胞は、接着細胞又は懸濁細胞、すなわち、懸濁液中で成長する細胞であってよい。好適な宿主細胞は、当技術分野において公知であり、例えば、ＤＨ５α大腸菌細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、サルＶＥＲＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞等が挙げられる。組み換え発現ベクターを増幅又は複製する目的のために、宿主細胞は、好ましくは、原核細胞、例えばＤＨ５α細胞である。組み換え体のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質を生成する目的のために、宿主細胞は、好ましくは、哺乳類細胞である。最も好ましくは、宿主細胞は、ヒト細胞である。宿主細胞は、任意の細胞型であってよく、任意の種類の組織に由来していてよく、任意の発生段階であってよいが、宿主細胞は、好ましくは、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。より好ましくは、宿主細胞は、Ｔ細胞である。
【０１０１】
本明細書における目的のために、Ｔ細胞は、任意のＴ細胞、例えば、培養Ｔ細胞、例えば初代Ｔ細胞、又は培養Ｔ細胞株由来のＴ細胞、例えばＪｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴ１等、又は哺乳類から得られたＴ細胞であってよい。哺乳類から得られる場合、Ｔ細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺、又は他の組織若しくは流体を含むがこれらに限定されない多数の供給源から得ることができる。また、Ｔ細胞は、濃縮又は精製されていてもよい。好ましくは、Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞である。Ｔ細胞は、任意の種類のＴ細胞であってよく、任意の発生段階であってよく、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、例えば、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、メモリＴ細胞（例えば、セントラルメモリＴ細胞及びエフェクタメモリＴ細胞）、ナイーブＴ細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０２】
また、本明細書に記載の少なくとも１つの宿主細胞を含む細胞の集団が本発明によって提供される。細胞の集団は、組み換え発現ベクターのいずれも含まない少なくとも１つの他の細胞、例えば宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）、又はＴ細胞以外の細胞、例えばＢ細胞、マクロファージ、好中球、赤血球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋肉細胞、脳細胞等に加えて、記載される組み換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を含む不均質な集団であってよい。あるいは、細胞の集団は、組み換え発現ベクターを含む（例えば、から本質的になる）宿主細胞を主に含む、実質的に均質な集団であってもよい。また、集団は、該集団の全ての細胞が、組み換え発現ベクターを含む１つの宿主細胞のクローンであり、その結果、該集団の全ての細胞が組み換え発現ベクターを含む、細胞のクローン集団であってもよい。本発明の一実施形態では、細胞の集団は、本明細書に記載の組み換え発現ベクターを含む宿主細胞を含むクローン集団である。
【０１０３】
本発明の実施形態では、集団内の細胞数を、急速に拡大させることができる。Ｔ細胞数の拡大は、例えば、米国特許第８，０３４，３３４号、同第８，３８３，０９９号、米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３号、Ｄｕｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２６：３３２−４２（２００３）、及びＲｉｄｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２８：１８９−２０１（１９９０）に記載されている通り、当技術分野において公知の多数の方法のいずれかによって実現することができる。実施態様では、Ｔ細胞数の拡大は、該Ｔ細胞をＯＫＴ３抗体、ＩＬ−２、及びフィーダーＰＢＭＣ（例えば、放射線照射された同種ＰＢＭＣ）と共に培養することによって実施される。
【０１０４】
本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組み換え発現ベクター、及び宿主細胞（その集団を含む）は、単離及び／又は精製されてもよい。用語「単離された」は、本明細書で使用するとき、その天然環境から取り出されていることを意味する。用語「精製された」は、本明細書で使用するとき、純度が増大したことを意味し、「純度」は相対的な用語であり、必ずしも絶対純度と解釈される訳ではない。例えば、純度は、少なくとも約５０％であってよく、約６０％超、約７０％超、約８０％超、約９０％超、約９５％超であってもよく、約１００％であってもよい。
【０１０５】
本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組み換え発現ベクター、及び宿主細胞（その集団を含む）（以後、これらの全てをまとめて「本発明のＴＣＲ材料」と称する）は、医薬組成物等の組成物に製剤化してもよい。これに関して、本発明は、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、発現ベクター、及び宿主細胞（その集団を含む）のいずれかと、薬学的に許容し得る担体とを含む医薬組成物を提供する。本発明のＴＣＲ材料のいずれかを含有する本発明の医薬組成物は、１つを超える本発明のＴＣＲ材料、例えば、ポリペプチド及び核酸又は２つ以上の異なるＴＣＲを含んでいてもよい。あるいは、医薬組成物は、別の薬学的活性剤（複数可）又は薬物（複数可）、例えば、化学療法剤、例えば、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン等と組み合わせて、本発明のＴＣＲ材料を含み得る。
【０１０６】
好ましくは、担体は、薬学的に許容し得る担体である。医薬組成物に関して、担体は、検討中の具体的な本発明のＴＣＲ材料に従来使用されているもののいずれかであってよい。投与可能な組成物を調製する方法は、当業者に公知であるか又は明らかであり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（２０１２）により詳細に記載されている。薬学的に許容し得る担体は、使用条件下で有害な副作用も毒性も有しないものであることが好ましい。
【０１０７】
担体の選択は、具体的な本発明のＴＣＲ材料によって、並びに本発明のＴＣＲ材料を投与するために使用される具体的な方法によって部分的に決定される。従って、本発明の医薬組成物の様々な好適な製剤が存在する。好適な製剤は、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、腫瘍内、又は腹腔内に投与するもののいずれかを含み得る。１つを超える経路を使用して本発明のＴＣＲ材料を投与してよく、特定の例では、特定の経路が別の経路よりも即時かつより有効な応答を提供し得る。
【０１０８】
好ましくは、本発明のＴＣＲ材料は、例えば静脈内に注射することによって投与される。本発明のＴＣＲ材料が、本発明のＴＣＲを発現している宿主細胞（又はその集団）であるとき、注射用の細胞のための薬学的に許容し得る担体は、任意の等張担体、例えば、通常生理食塩水（水中約０．９０％ｗ／ｖ  ＮａＣｌ、水中約３００ｍＯｓｍ／Ｌ  ＮａＣｌ、又は水１リットルあたり約９．０ｇ  ＮａＣｌ）、ＮＯＲＭＯＳＯＬ  Ｒ電解質溶液（Ａｂｂｏｔｔ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）、ＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ（Ｂａｘｔｅｒ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）、水中約５％デキストロース、又は乳酸リンゲル液を含んでいてよい。実施形態では、薬学的に許容し得る担体にヒト血清アルブメン（albumen）を補給する。
【０１０９】
本発明の目的のために、投与される本発明のＴＣＲ材料の量又は用量（例えば、本発明のＴＣＲ材料が１つ以上の細胞である場合は細胞数）は、適切な時間枠にわたって被験体又は動物において例えば治療的又は予防的応答をもたらすのに十分でなければならない。例えば、本発明のＴＣＲ材料の用量は、投与時点から約２時間以上、例えば、１２〜２４時間又はそれ以上の期間、がん抗原（例えば、変異型ＲＡＳ）に結合するか又はがんを検出、治療、若しくは予防するのに十分でなければならない。特定の実施形態では、期間は更に長くてもよい。用量は、具体的な本発明のＴＣＲ材料の有効性及び動物（例えば、ヒト）の状態、並びに治療される動物（例えば、ヒト）の体重によって決定される。
【０１１０】
投与される用量を決定するための多くのアッセイが、当技術分野において公知である。本発明の目的のために、例えば、それぞれ異なる用量のＴ細胞を与えた哺乳類のセットの中で、所与の用量の本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、又はタンパク質を発現しているＴ細胞を哺乳類に投与した際にこのようなＴ細胞によって標的細胞が溶解する又はＩＦＮ−γが分泌される程度を比較することを含むアッセイを使用して、哺乳類に投与する開始用量を決定することができる。特定の用量を投与した際に標的細胞が溶解する及び／又はＩＦＮ−γが分泌される程度は、当技術分野において公知の方法によってアッセイすることができる。
【０１１１】
本発明のＴＣＲ材料の用量は、具体的な本発明のＴＣＲ材料の投与に付随し得る任意の有害な副作用の存在、性質、及び程度によっても決定される。典型的には、主治医は、様々な要因、例えば、年齢、体重、全体的な健康状態、食生活、性別、投与される本発明のＴＣＲ材料、投与経路、及び治療されるがんの重篤度を考慮して、各個々の患者を治療するための本発明のＴＣＲ材料の投与量を決定する。本発明のＴＣＲ材料が細胞の集団である実施形態では、注入１回あたりに投与される細胞数は、例えば、約１×１０６〜約１×１０１２細胞又はそれ以上で変動し得る。特定の実施形態では、１×１０６細胞未満を投与してもよい。
【０１１２】
当業者は、本発明のＴＣＲ材料を任意の数の方法で修飾してよく、その結果、該修飾を通して本発明のＴＣＲ材料の治療又は予防の有効性が増大することを容易に理解するであろう。例えば、本発明のＴＣＲ材料を、直接又は架橋を介して間接的に化学療法剤にコンジュゲートしてもよい。化合物の化学療法剤へのコンジュゲートの実施は、当技術分野において公知である。当業者は、架橋及び／又は化学療法剤が本発明のＴＣＲ材料に結合した時点で本発明のＴＣＲ材料の機能、すなわち、変異型ＲＡＳに結合するか又はがんを検出、治療、若しくは予防する能力には干渉しない限り、本発明のＴＣＲ材料の機能に必須ではない本発明のＴＣＲ材料の部位が、架橋及び／又は化学療法剤を結合させるのに好適な部位であることを認識する。
【０１１３】
本発明の医薬組成物、ＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組み換え発現ベクター、宿主細胞、及び細胞の集団は、がんを治療又は予防する方法において使用できることが企図される。特定の理論に縛られるものではないが、本発明のＴＣＲは変異型ＲＡＳに特異的に結合し、その結果、ＴＣＲ（又は関連する本発明のポリペプチド若しくはタンパク質）は、細胞によって発現されたとき、変異型ＲＡＳを発現している標的細胞に対する免疫応答を媒介することができると考えられる。これに関して、本発明は、哺乳類におけるがんを治療又は予防する方法であって、本明細書に記載の医薬組成物、ＴＣＲ、ポリペプチド、若しくはタンパク質のいずれか、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質のいずれかをコードしているヌクレオチド配列を含む任意の核酸若しくは組み換え発現ベクター、又は本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、若しくはタンパク質のいずれかをコードしている組み換えベクターを含む任意の宿主細胞若しくは細胞の集団を、哺乳類におけるがんを治療又は予防するのに有効な量、該哺乳類に投与することを含む方法を提供する。
【０１１４】
本発明の実施形態は、哺乳類におけるがんの治療又は予防において使用するための、本明細書に記載の医薬組成物、ＴＣＲ、ポリペプチド、若しくはタンパク質のいずれか、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質のいずれかをコードしているヌクレオチド配列を含む任意の核酸若しくは組み換え発現ベクター、又は本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、若しくはタンパク質のいずれかをコードしている組み換えベクターを含む任意の宿主細胞若しくは細胞の集団を提供する。
【０１１５】
用語「治療する」及び「予防する」、並びにそれから派生する語は、本明細書で使用するとき、必ずしも１００％、すなわち、完全な治療又は予防を意味するものではない。どちらかといえば、当業者が潜在的な利点又は治療効果を有すると認識する、様々な程度の治療又は予防が存在する。これに関して、本発明の方法は、哺乳類における任意の量の任意のレベルのがんの治療又は予防を提供することができる。更に、本発明の方法によって提供される治療又は予防は、治療又は予防されるがんの１つ以上の病態又は症状の治療又は予防を含み得る。例えば、治療又は予防は、腫瘍の退縮を促進することを含み得る。また、本明細書における目的のために、「予防」は、がん又はその症状若しくは病態の発生を遅らせることを包含し得る。あるいは又は更に、「予防」は、がん又はその症状若しくは病態の再発を防ぐ又は遅らせることを包含し得る。
【０１１６】
また、哺乳類におけるがんの存在を検出する方法も提供される。方法は、（ｉ）本明細書に記載の本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組み換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、又は医薬組成物のいずれかを、哺乳類由来の１つ以上の細胞を含むサンプルと接触させ、それによって、複合体を形成させることと、該複合体を検出することとを含み、該複合体の検出が、哺乳類におけるがんの存在を示す。
【０１１７】
哺乳類におけるがんを検出する本発明の方法に関して、細胞のサンプルは、全細胞、その溶解物、又は全細胞溶解物の画分、例えば、核若しくは細胞質の画分、全タンパク質画分、又は核酸画分を含むサンプルであってよい。
【０１１８】
がんを検出する本発明の方法の目的のために、接触は、哺乳類に対してインビトロ又はインビボで行ってよい。好ましくは、インビトロで接触させる。
【０１１９】
また、複合体の検出は、当技術分野において公知の任意の数の方法を通して行うことができる。例えば、本明細書に記載の本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組み換え発現ベクター、宿主細胞、又は細胞の集団を、検出可能な標識、例えば、放射性同位体、フルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ）、及び元素粒子（例えば、金粒子）等で標識してよい。
【０１２０】
宿主細胞又は細胞の集団が投与される本発明の方法の目的のために、細胞は、哺乳類に対して同種又は自己である細胞であってよい。好ましくは、細胞は、哺乳類に対して自己である。
【０１２１】
本発明の方法に関して、がんは、急性リンパ球性がん、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、骨がん、脳がん、乳がん、肛門、肛門管、又は肛門直腸のがん、眼のがん、肝内胆管のがん、関節のがん、頸部、胆嚢、又は胸膜のがん、鼻、鼻腔、又は中耳のがん、口腔のがん、膣のがん、外陰部のがん、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、子宮頸がん、消化管カルチノイド腫瘍、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、肝臓がん、肺がん、悪性中皮腫、黒色腫、多発性骨髄腫、上咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、中咽頭のがん、卵巣がん、陰茎のがん、膵臓がん、腹膜、網、及び腸間膜のがん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎がん、皮膚がん、小腸がん、軟組織がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、子宮のがん、尿管がん、並びに膀胱がんのいずれかを含む任意のがんであってよい。好ましいがんは、膵臓、結腸直腸、肺、子宮内膜、卵巣、又は前立腺のがんである。好ましくは、肺がんは肺腺がんであり、卵巣がんは上皮性卵巣がんであり、膵臓がんは膵臓腺がんである。本発明の実施形態では、がんは、変異型ヒトＲＡＳアミノ酸配列を発現し、該変異型ヒトＲＡＳアミノ酸配列は、変異型ヒトＫＲＡＳ、変異型ヒトＨＲＡＳ、又は変異型ヒトＮＲＡＳのアミノ酸配列である。がんが発現する変異型ヒトＫＲＡＳ、変異型ヒトＨＲＡＳ、及び変異型ヒトＮＲＡＳは、本発明の他の態様に関して本明細書に記載の通りであってよい。
【０１２２】
本発明の方法において言及される哺乳類は、任意の哺乳類であってよい。本明細書で使用するとき、用語「哺乳類」とは、げっ歯目の哺乳類、例えばマウス及びハムスター、並びにウサギ目の哺乳類、例えばウサギを含むがこれらに限定されない任意の哺乳類を指す。哺乳類は、ネコ及びイヌを含む食肉目の哺乳類であることが好ましい。哺乳類は、ウシ及びブタを含む偶蹄目、又はウマを含む奇蹄目の哺乳類であることがより好ましい。哺乳類は、霊長目、サル目（Ｃｅｂｏｉｄｓ又はＳｉｍｏｉｄｓ）（サル）、又は真猿亜目（ヒト及び類人猿）の哺乳類であることが最も好ましい。特に好ましい哺乳類は、ヒトである。
【実施例】
【０１２３】
以下の実施例は、本発明を更に説明するが、無論、いかなる方法でもその範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【０１２４】
実施例１
この実施例は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０７：０１によって提示されるＧ１２Ｖ変異を有するヒトＫＲＡＳに対して抗原特異性を有するＴＣＲの単離を示す。
【０１２５】
ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０７：０１分子によって提示されるＧ１２Ｖ変異を有するヒトＫＲＡＳに対する抗原特異性を有するＴＣＲを、患者由来の子宮内膜腫瘍サンプルから単離した。簡潔に述べると、腫瘍サンプルを刻み、消化させ、冷凍した。細胞選別前に、腫瘍消化物を解凍し、サイトカイン無しで一晩静置した。ＦＡＣＳを使用し、ＰＤ−１及び／又はＯＸ４０の発現に基づいて、腫瘍消化物からＴ細胞を選別した（ＰＩ−（生細胞）＞ＣＤ３＋でゲートをかけた）。ＦＡＣＳ結果を図１に示す。アイソタイプについて染色された細胞が対照の役割を果たした。
【０１２６】
３．５週間にわたる急速拡大プロトコル（ＲＥＰ）に従って、選別された細胞の数を拡大させた。ＲＥＰのために、ＯＫＴ３抗体、ＩＬ−２、及び放射線照射された同種ＰＢＭＣの存在下で９６ウェルマイクロタイタープレート（３細胞／ウェル）内においてＴ細胞を培養した。
【０１２７】
拡大した数の細胞をプールし、プールされた２５ｍｅｒのペプチド又は患者の腫瘍で検出された様々な腫瘍特異的変異を包含する２５ｍｅｒのタンデムミニ遺伝子（ＴＭＧ）によってコードされているペプチドをパルスした自己樹状細胞（ＤＣ）に対する反応性について試験した。各プールは、１７〜２１のペプチド又はＴＭＧをそれぞれ含んでいた。酵素免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）によってインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）分泌を測定した。結果を図２に示す。図２に示す通り、培養物番号７及び８のプールされたエフェクタ自己Ｔ細胞は、ペプチドプール１（ＰＰ１）及びペプチドプール２（ＰＰ２）をパルスした標的ＤＣを認識した。
【０１２８】
変異反応性Ｔ細胞培養物を、関係するペプチドプール由来の各単一ペプチドをパルスした自己ＤＣに対して試験した。図３は、培養物番号７の自己Ｔ細胞（Ｗ７）を、ペプチドプール１（ＰＰ１）由来のペプチド１〜１７（Ｐ１〜Ｐ１７）のそれぞれをパルスした自己ＤＣと共培養した際に得られた結果を示す。図３に示す通り、培養物番号７のＴ細胞は、ペプチドＰ１７に対して高い特異性を示した。ペプチド１７（Ｐ１７）は、ＫＲＡＳＧ１２Ｖ変異をコードしている。
【０１２９】
培養物番号７の自己Ｔ細胞（Ｗ７）の細胞から全ＲＮＡを単離した。次いで、ＴＣＲのアルファ及びベータ鎖の定常プライマーを使用して５’相補的ＤＮＡ末端の迅速増幅（５’ＲＡＣＥ）に該全ＲＮＡを供した。次いで、標準的なアガロースゲル電気泳動及びゲル抽出によって、ＴＣＲのＰＣＲ産物を単離した。生成物を直接シーケンスした。ＴＣＲのアルファ及びベータ鎖の可変領域のヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号４２及び４３であった。ＴＣＲのアルファ及びベータ鎖の可変領域のアミノ酸配列を表６に示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を引く。
【０１３０】
【表６】
2020534828.tif 000012
【０１３１】
実施例２
この実施例は、実施例１で単離したＴＣＲが、ＨＬＡ−ＤＲ分子の枠内で提示されるＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチド抗原を認識することを示す。
【０１３２】
実施例１の単離されたＧ１２Ｖ反応性ＴＣＲをコードしており（配列番号４２及び配列番号４３のヌクレオチド配列を含む）、システイン置換ＬＶＬ修飾マウス定常領域を含む核酸配列を、レトロウイルス発現ベクターにクローニングした。α鎖マウス定常領域は、４８位のＸがＣｙｓであり、１１２位のＸがＬｅｕであり、１１４位のＸがＩｌｅであり、１１５位のＸがＶａｌである配列番号３０のアミノ酸配列を含んでいた。β鎖定常領域は、５７位のＸがＣｙｓである配列番号３１のアミノ酸配列を含んでいた。配列番号５４のアミノ酸配列を含むリンカーは、α鎖定常領域とβ鎖定常領域との間に位置していた。同種Ｔ細胞にレトロウイルス発現ベクターを形質導入した。
【０１３３】
形質導入された細胞（エフェクタ細胞）を、ＨＬＡ遮断抗体Ｗ６／３２（抗ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ）、ＩＶＡ１２（汎特異的、抗ＨＬＡクラスＩＩ）、Ｂ７／２１（抗ＨＬＡ−ＤＰ）、ＨＢ５５（抗ＨＬＡ−ＤＲ）、又はＳＰＶ−Ｌ３（ＨＬＡ−ＤＱ）（標的細胞）と共に、ＫＲＡＳＧ１２Ｖペプチド（１ｎｇ／ｍＬ）をパルスした標的自己抗原提示細胞（ＡＰＣ）と共培養した。単独で、ＤＭＳＯと共に、又は酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）と共に培養したエフェクタ形質導入細胞が対照の役割を果たした。１ｎｇ／ｍＬ  ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチド（配列番号５３）をパルスした標的自己ＡＰＣと共培養した空ベクターを形質導入したエフェクタ細胞（モック）が更に別の対照の役割を果たした。
【０１３４】
標的細胞に対するエフェクタ細胞の反応性を、フローサイトメトリー（ＣＤ３＋ｍＴＣＲベータ鎖＋細胞でゲートをかけた）によって検出された４−１ＢＢ発現によって測定した。結果を図４に示す。図４に示す通り、ＩＶＡ１２及びＨＢ５５の抗体は、標的細胞に対するエフェクタ細胞の反応性を遮断し、このことは、形質導入されたエフェクタ細胞が、ＨＬＡ−ＤＲ分子の枠内で提示されるＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチド抗原を認識したことを示す。
【０１３５】
実施例３
この実施例は、実施例２のＴＣＲが、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊７：０１分子の枠内で提示されるＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖペプチド抗原を認識することを示す。
【０１３６】
実施例２のＴＣＲが形質導入された同種Ｔ細胞（エフェクタ細胞）を、実施例１の患者の自己ＡＰＣ又はＤＲＢ１  ０１：０１若しくはＤＲＢ１  ０７：０１のハプロタイプを有するドナー由来のＡＰＣ（標的細胞）と共培養した。標的細胞に、ＫＲＡＳＧ１２Ｖペプチド（配列番号５３）又はＷＴ  ＫＲＡＳペプチド（配列番号５５）をパルスした。エフェクタ細胞を、対照としてのＨＬＡ−ＤＲＢ１陽性ドナー（ドナーのアリルの一方がＤＲＢ１＊０７：０１であるが、両方がそうではない）（「ＤＲＢ不一致」）由来のＡＰＣと共培養した。単独で、ＤＭＳＯと共に、又はＰＭＡ−イオノマイシンと共に培養したエフェクタ細胞が更なる対照の役割を果たした。ＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＰＯＴによって測定した。陽性ウェルの数をカウントした。結果を表７及び図５に示す。表７中、「ＴＮＴＣ」は、「多すぎてカウントできない」を意味する。４−１ＢＢを発現するｍＴＣＲ発現細胞の百分率もフローサイトメトリーによって測定した。結果を図５に示す。結果は、ＨＬＡ−ＤＲＢ＊０７：０１によって提示される変異型ＫＲＡＳに対してＴＣＲが特異的に反応することを示す。
【０１３７】
【表７】
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【０１３８】
実施例４
この実施例は、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１：０１分子によって提示されるＧ１２Ｃ変異を有するヒトＫＲＡＳに対して抗原特異性を有するＴＣＲの単離を示す。
【０１３９】
ＫＲＡＳＧ１２Ｃ発現腫瘍を有する卵巣がん患者由来の末梢血Ｔ細胞サブセットの反復体外感作（ＩＶＳ）を使用して、ＫＲＡＳＧ１２Ｃ反応性ＴＣＲを同定した。
【０１４０】
自己ＤＣにＧ１２Ｃ変異型ペプチド（配列番号５６）をパルスし、選別されたＴ細胞サブセットと１０日間共培養し、次いで、実施例１に記載の通り反応性を試験した。
【０１４１】
反応性細胞を更に濃縮するために、ＫＲＡＳ変異型ペプチドに対する反応性画分を４−１ＢＢ／ＯＸ４０発現に基づいて選別し、変異型ペプチドで再度刺激した。反応性Ｔ細胞を４−１ＢＢ／ＯＸ４０発現に基づいて選別し、シーケンスした。
【０１４２】
細胞から全ＲＮＡを単離した。次いで、ＴＣＲのアルファ及びベータ鎖の定常プライマーを使用して５’相補的ＤＮＡ末端の迅速増幅（５’ＲＡＣＥ）に該全ＲＮＡを供した。次いで、標準的なアガロースゲル電気泳動及びゲル抽出によって、ＴＣＲのＰＣＲ産物を単離した。生成物を直接シーケンスした。ＴＣＲのアルファ及びベータ鎖の可変領域のヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号４４及び４５であった。ＴＣＲのアルファ及びベータ鎖の可変領域のアミノ酸配列を表８に示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線を引く。
【０１４３】
【表８】
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【０１４４】
実施例５
この実施例は、実施例４で単離したＴＣＲが、ＨＬＡ−ＤＲ分子の枠内で提示されるＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｃペプチド抗原を認識することを示す。
【０１４５】
実施例４の単離されたＧ１２Ｃ反応性ＴＣＲをコードしており（配列番号４４及び配列番号４５のヌクレオチド配列を含む）、システイン置換ＬＶＬ修飾マウス定常領域を含む核酸配列を、レトロウイルス発現ベクターにクローニングした。α鎖マウス定常領域は、４８位のＸがＣｙｓであり、１１２位のＸがＬｅｕであり、１１４位のＸがＩｌｅであり、１１５位のＸがＶａｌである配列番号３０のアミノ酸配列を含んでいた。β鎖定常領域は、５７位のＸがＣｙｓである配列番号３１のアミノ酸配列を含んでいた。配列番号５４のアミノ酸配列を含むリンカーは、α鎖定常領域とβ鎖定常領域との間に位置していた。同種Ｔ細胞にレトロウイルス発現ベクターを形質導入した。
【０１４６】
ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲ、若しくはＨＬＡ−ＤＰに対する抗体、又はＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＲ、及びＨＬＡ−ＤＱの全てに対する汎特異的抗体を使用して、その膜ＭＨＣクラスＩＩ分子を遮断した後、標的自己ＤＣ、又はＫＲＡＳＧ１２Ｃ２４−ｍｅｒペプチド（配列番号５６）をパルスした単一のＨＬＡ−ＤＲＢ１５：０１若しくはＨＬＡ−ＤＲＢ１１：０１のアリルに一致する同種ＤＣと、形質導入された細胞（エフェクタ細胞）を共培養した。酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）又はＷＴ  ＫＲＡＳ（配列番号５５）と共に培養したエフェクタ形質導入細胞が、対照の役割を果たした。
【０１４７】
標的細胞に対するエフェクタ細胞の反応性を、フローサイトメトリー（ＣＤ３＋ｍＴＣＲベータ鎖＋細胞でゲートをかけた）によって検出された４−１ＢＢ発現によって測定した。結果を図１０に示す。図１０に示す通り、ＴＣＲは、ＨＬＡ−ＤＲＢ＊１１：０１によって提示されるＫＲＡＳＧ１２Ｃに対して特異的に反応する。
【０１４８】
実施例６
この実施例は、実施例５のＫＲＡＳＧ１２ＣＴＣＲを形質導入したＰＢＭＣが、ＫＲＡＳＧ１２Ｃペプチドをパルスした自己ＤＣを認識することを示す。
【０１４９】
実施例５のＫＲＡＳＧ１２ＣＴＣＲをコードしているＭＳＧＶ−１−レトロウイルスを用いて、同種Ｔ細胞を遺伝的に操作した。自己ＤＣにＷＴ  ＫＲＡＳ（配列番号５５）又はＫＲＡＳＧ１２Ｃペプチド（配列番号５６）をロードし、ＴＣＲ形質導入細胞と１８時間共培養し、続いて、４−１ＢＢのアップレギュレートについてフローサイトメトリー解析した。結果を図９に示す。図９に示す通り、実施例５のＫＲＡＳＧ１２ＣＴＣＲを形質導入したＰＢＭＣは、ＫＲＡＳＧ１２Ｃペプチドをパルスした自己ＤＣを認識した。
【０１５０】
実施例７
この実施例は、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ変異型タンパク質が、ＤＣによってプロセシング及び提示され、実施例２のＴＣＲによって認識されることを示す。
【０１５１】
実施例２のＧ１２Ｖ−ＤＲＢ１＊０７：０１が形質導入された同種Ｔ細胞を、以下のＫＲＡＳ  Ｇ１２変異：Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、又はＧ１２Ｖのうちの１つを発現する腫瘍細胞株の細胞溶解物をパルスした自己ＤＣと一晩共培養した。ＷＴ  ＫＲＡＳを発現する腫瘍細胞株の細胞溶解物をパルスした自己ＤＣと共培養した形質導入細胞が対照の役割を果たした。単独で、又はＰＭＡと共に、又はＤＭＳＯと共に培養した形質導入細胞が更なる対照の役割を果たした。４−１ＢＢ及び／又はＯＸ４０をアップレギュレートする細胞の百分率をフローサイトメトリーによって測定した。ＩＦＮγを発現している細胞数（２×１０４細胞あたりのスポット）をＥＬＩＳＰＯＴによって測定した。結果を図６に示す。図６に示す通り、ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｖ変異型タンパク質は、ＤＣによってプロセシング及び提示され、実施例２のＴＣＲによって認識される。
【０１５２】
実施例８
この実施例は、実施例２のＧ１２Ｖ−ＤＲＢ１＊０７：０１  ＴＣＲを形質導入した細胞が、ＫＲＡＳＧ１２Ｖペプチドを特異的に認識することを示す。
【０１５３】
実施例２のＧ１２Ｖ−ＤＲＢ１＊０７：０１  ＴＣＲが形質導入された同種Ｔ細胞を、様々な濃度の２４−ｍｅｒペプチドＫＲＡＳＧ１２Ｖ（配列番号５３）又はＷＴ  ＫＲＡＳ（配列番号５５）をパルスした自己ＤＣと一晩共培養した。ｍＴＣＲβ＋ＣＤ８＋４−１ＢＢ＋細胞の百分率をフローサイトメトリーによって測定した。結果を図７に示す。図７に示す通り、実施例２のＧ１２Ｖ−ＤＲＢ１＊０７：０１  ＴＣＲを形質導入した細胞は、ＫＲＡＳＧ１２Ｖペプチドを特異的に認識した。
【０１５４】
実施例９
実施例２のＧ１２Ｖ−ＤＲＢ１＊０７：０１  ＴＣＲを形質導入した細胞は、様々なＫＲＡＳＧ１２Ｖペプチドを特異的に認識する。
【０１５５】
実施例２のＧ１２Ｖ−ＤＲＢ１＊０７：０１  ＴＣＲが形質導入された同種Ｔ細胞を、様々な濃度の以下の表９に列挙するペプチドをパルスした自己ＤＣと一晩共培養した。ＩＦＮγ分泌をＥＬＩＳＰＯＴによって測定した。結果を図８に示す。図８に示す通り、実施例２のＧ１２Ｖ−ＤＲＢ１＊０７：０１  ＴＣＲを形質導入した細胞は、ＫＲＡＳＧ１２Ｖペプチドの全てを特異的に認識したが、配列番号５２が最良であった。
【０１５６】
【表９】
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【０１５７】
本明細書に引用した刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての参照文献は、各参照文献が個々にかつ具体的に参照によって組み入れられると示されており、その全体が本明細書に記載されているかのように、参照によって本明細書に組み入れられる。
【０１５８】
本発明の説明に関連して（特に以下の特許請求の範囲に関連して）用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び「少なくとも１つ」、並びに類似の参照対象の使用は、本明細書において他の指定がない限り又は文脈から明らかに矛盾していない限り、単数形及び複数形の両方を網羅すると解釈されるべきである。１つ以上の項目のリストの後の用語「少なくとも１つ」の使用（例えば、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」）は、本明細書において他の指定がない限り又は文脈から明らかに矛盾していない限り、列挙される項目から選択される１つの項目（Ａ又はＢ）又は列挙される項目のうちの２つ以上の任意の組み合わせ（Ａ及びＢ）を意味すると解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特に断らない限り、オープンエンドな用語である（すなわち、「含むがこれらに限定されない」を意味する）と解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において他の指定がない限り、単に、範囲内の各別個の値を個々に参照する省略法として機能することを意図し、各別個の値が、本明細書に個々に列挙されているかのように明細書に組み込まれる。本明細書に記載の全ての方法は、本明細書において他の指定がない限り又は文脈から明らかに矛盾していない限り、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書に提供される任意の及び全ての例又は例示的な表現（例えば、「など」）の使用は、特に主張しない限り、単に本発明をより深く解明することを意図し、本発明の範囲の限定を提起するものではない。明細書中の表現はいずれも、任意の請求されていない要素が本発明の実施に必須であることを示すと解釈されるべきではない。
【０１５９】
本発明の好ましい実施形態は、本発明を実施するための本発明者らに公知の最良の形態を含む、本明細書に記載される。好ましい実施形態の変形は、前述の記載を読んだときに当業者に明らかになり得る。本発明者らは、当業者がこのような変形を適宜使用すると予想し、そして、本発明者らは、本明細書に具体的に記載されているのとは別の方法で本発明が実施されることを意図している。従って、本発明は、準拠法によって認められている通り、本明細書に添付される特許請求の範囲に列挙される発明主題の全ての変形及び等価物を含む。更に、その全ての可能な変形における上記要素の任意の組み合わせは、本明細書において他の指定がない限り又は文脈から明らかに矛盾していない限り、本発明によって包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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