(57)【要約】  本発明は、Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子を標的にするＲＮＡｉ剤、例えば二本鎖ＲＮＡｉ剤、ならびにＳｅｒｐｉｎａ１の発現を阻害するためにかかるＲＮＡｉ剤を用いる方法およびＳｅｒｐｉｎａ１関連疾患、例えば肝障害を有する対象を治療する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
セリンペプチダーゼ阻害剤、クレードＡ、メンバー１（Ｓｅｒｐｉｎａ１）遺伝子の発現を阻害する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤であって、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
ここで前記センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列とは３以下のヌクレオチド分異なる少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含み、かつ前記アンチセンス鎖が、配列番号１５のヌクレオチド配列から３以下のヌクレオチド分異なる少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含み、
ここで前記アンチセンス鎖が、５’領域の最初の９つのヌクレオチド位置内に前記二本鎖領域の少なくとも１つの熱不安定化修飾またはその前駆物質を含み、
ここで前記センス鎖が、ＡＳＧＰＲリガンドを含み、また
ここで前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の各々が、独立して１４〜４０ヌクレオチド長である、二本鎖ＲＮＡ剤。
【請求項２】
セリンペプチダーゼ阻害剤、クレードＡ、メンバー１（Ｓｅｒｐｉｎａ１）遺伝子の発現を阻害する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤であって、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖は、Ｓｅｒｐｉｎａ１をコードするｍＲＮＡに対する相補性領域を含み、ここで前記相補性領域は、配列番号１５のヌクレオチド配列から３以下のヌクレオチド分異なる少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含み、
ここで前記アンチセンス鎖が、５’領域の最初の９つのヌクレオチド位置内に少なくとも１つの熱不安定化修飾またはその前駆物質を含み、
ここで前記センス鎖が、ＡＳＧＰＲリガンドを含み、
ここで前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の各々が、独立して１４〜４０ヌクレオチド長である、二本鎖ＲＮＡ剤。
【請求項３】
２’−フルオロ修飾を含む少なくとも４つのヌクレオチドを含む、請求項１または２に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項４】
以下の特徴：
ａ）前記熱不安定化修飾が、前記アンチセンス鎖の５’領域の４〜８位に位置する；
ｂ）前記センスおよびアンチセンス鎖の各々が、独立して、２’−フルオロ修飾を含む少なくとも２つのヌクレオチドを含む；および
ｃ）前記センス鎖の片末端に結合されたＡＳＧＰＲリガンド
を有する、請求項１または２に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項５】
前記アンチセンス鎖が、以下の特徴：
ａ）前記熱不安定化修飾が前記アンチセンス鎖の４〜８位に位置する；
ｂ）少なくとも２つのヌクレオチドが２’−フルオロ修飾を含む；
ｃ）ヌクレオチドの（５’末端から数えて）１および２位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合；
ｄ）１８〜３５ヌクレオチド長
の少なくとも２つを有する、請求項１または２に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項６】
前記センス鎖が、以下の特徴：
ａ）前記センス鎖の片末端に結合された前記ＡＳＧＰＲリガンド；
ｂ）少なくとも２つのヌクレオチドが２’−フルオロ修飾を含む；
ｃ）前記二本鎖領域が少なくとも１９のヌクレオチド位置に及び、かつ前記熱不安定化修飾が前記二本鎖領域内に位置する、
の少なくとも１つを有する、請求項１または２に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項７】
前記熱不安定化修飾が、
【化１】
2020500929.tif 000054
（式中、Ｂは核酸塩基である）
からなる群から選択される、請求項１または２に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項８】
前記不安定化修飾が、前記アンチセンス鎖の７位に位置する、請求項１または２に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項９】
前記ＡＳＧＰＲリガンドが、二価または三価分岐状リンカーを通じて結合される１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である、請求項１または２に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項１０】
前記ＡＳＧＰＲリガンドが、
【化２】
2020500929.tif 000055
である、請求項９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項１１】
以下の模式図
【化３】
2020500929.tif 000056
（式中、ＸはＯまたはＳである）
に示されるようなリガンドにコンジュゲートされる、請求項１０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項１２】
セリンペプチダーゼ阻害剤、クレードＡ、メンバー１（Ｓｅｒｐｉｎａ１）標的遺伝子配列の発現を阻害する二本鎖ＲＮＡ分子であって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
ここで前記センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列とは３以下のヌクレオチド分異なる少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含み、かつ前記アンチセンス鎖が、配列番号１５のヌクレオチド配列から３以下のヌクレオチド分異なる少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含み、
ここで前記アンチセンス鎖が、５’領域の最初の９つのヌクレオチド位置内に少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、
ここで前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の各々が、独立して１４〜４０ヌクレオチド長であり、また
ここで前記ｄｓＲＮＡが、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有する、
二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項１３】
セリンペプチダーゼ阻害剤、クレードＡ、メンバー１（Ｓｅｒｐｉｎａ１）標的遺伝子配列の発現を阻害する二本鎖ＲＮＡ分子であって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、Ｓｅｒｐｉｎａ１をコードするｍＲＮＡに対する相補性領域を含み、ここで前記相補性領域が、配列番号１５のヌクレオチド配列から３以下のヌクレオチド分異なる少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含み、
ここで前記アンチセンス鎖が、５’領域の最初の９つのヌクレオチド位置内に少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、
ここで前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の各々が、独立して１４〜４０ヌクレオチド長であり、また
ここで前記ｄｓＲＮＡが、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有する、
二本鎖ＲＮＡ分子。
【請求項１４】
前記ｄｓＲＮＡが、約５５℃〜約６７℃の融解温度を有する、請求項１２または１３に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項１５】
前記ｄｓＲＮＡが、約６０℃〜約６７℃の融解温度を有する、請求項１４に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項１６】
ＡＳＧＰＲリガンドをさらに含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項１７】
前記ＡＳＧＰＲリガンドが、二価または三価分岐状リンカーを通じて結合される１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である、請求項１６に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項１８】
前記ＡＳＧＰＲリガンドが、
【化４】
2020500929.tif 000057
である、請求項１７に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項１９】
以下の模式図
【化５】
2020500929.tif 000058
（式中、ＸはＯまたはＳである）
に示されるようなリガンドにコンジュゲートされる、請求項１８に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
【請求項２０】
前記ｄｓＲＮＡが、以下の特徴：
（ｉ）前記アンチセンス鎖が、２’−フルオロ修飾を含む、２、３、４、５または６ヌクレオチドを含む；
（ｉｉ）前記アンチセンス鎖が、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；
（ｉｉｉ）前記センス鎖が、リガンドとコンジュゲートされる；
（ｉｖ）前記センス鎖が、２’−フルオロ修飾を含む、２、３、４または５のヌクレオチドを含む；
（ｖ）前記センス鎖が、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；
（ｖｉ）前記ｄｓＲＮＡが、２’−フルオロ修飾を含む、少なくとも４つのヌクレオチドを含む；
（ｖｉｉ）前記ｄｓＲＮＡが、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域領域を含む；および
（ｖｉｉｉ）前記アンチセンス鎖の５’末端の平滑末端
の少なくとも１つをさらに有する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項２１】
各鎖が１５〜３０ヌクレオチドを有する、請求項１〜４または７〜２０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項２２】
各鎖が１９〜３０ヌクレオチドを有する、請求項１〜４または７〜２０のいずれか一項に記載のｄｄＲＮＡ薬剤。
【請求項２３】
前記センス鎖が２１ヌクレオチドを有し、かつ前記アンチセンス鎖が２３ヌクレオチドを有する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項２４】
前記アンチセンス鎖が、配列番号１のヌクレオチド１４４０〜１４８０とは３以下のヌクレオチド分異なる少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含む相補性領域を含む、請求項２に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項２５】
前記相補性領域が、ヌクレオチド配列５’−ＵＵＵＵＧＵＵＣＡＡＵＣＡＵＵＡＡＧＡＡＧＡＣ−３’（配列番号４１９）とは３以下のヌクレオチド分異なる少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含む、請求項２に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項２６】
前記センス鎖が、ヌクレオチド配列５’−ＣＵＵＣＵＵＡＡＵＧＡＵＵＧＡＡＣＡＡＡＡ−３’（配列番号４１７）を含み、かつ前記アンチセンス鎖が、ヌクレオチド配列５’−ＵＵＵＵＧＵＵＣＡＡＵＣＡＵＵＡＡＧＡＡＧＡＣ−３’（配列番号４１９）を含む、請求項１または２に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項２７】
前記センス鎖が、ヌクレオチド配列５’−ｃｓｕｓｕｃｕｕＡｆａＵｆＧｆＡｆｕｕｇａａｃａａａａ−３’（配列番号３３）を含み、かつ前記アンチセンス鎖が、ヌクレオチド配列５’−ｕｓＵｆｓｕｕｇｕ（Ｔｇｎ）ｃａａｕｃａＵｆｕＡｆａｇａａｇｓａｓｃ−３’（配列番号３４）を含み、
ここでａ、ｇ、ｃ、およびｕは各々、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、ＣｆおよびＵｆは各々、２’−フルオロＡ、Ｇ、ＣおよびＵであり；ｓは、ホスホロチオエート結合であり；かつ（Ｔｇｎ）は、チミジン−グリコール核酸（ＧＮＡ）Ｓ−異性体である、
請求項１または２に記載のｄｓＲＮＡ剤。
【請求項２８】
セリンペプチダーゼ阻害剤、クレードＡ、メンバー１（Ｓｅｒｐｉｎａ１）遺伝子の発現を阻害する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子であって、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここで前記センス鎖は、ヌクレオチド配列５’−ｃｓｕｓｕｃｕｕＡｆａＵｆＧｆＡｆｕｕｇａａｃａａａａＬ９６−３’（配列番号３５）を含み、かつ前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’−ｕｓＵｆｓｕｕｇｕ（Ｔｇｎ）ｃａａｕｃａＵｆｕＡｆａｇａａｇｓａｓｃ−３’（配列番号３４）を含み、
ここでａ、ｇ、ｃ、およびｕは各々、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、ＣｆおよびＵｆは各々、２’−フルオロＡ、Ｇ、ＣおよびＵであり；ｓは、ホスホロチオエート結合であり；（Ｔｇｎ）は、チミジン−グリコール核酸（ＧＮＡ）Ｓ−異性体であり；かつＬ９６は、Ｎ−［トリス（ＧａｌＮＡｃ−アルキル）−アミドデカノイル）］−４−ヒドロキシプロリノールである、ｄｓＲＮＡ分子。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を有するベクター。
【請求項３０】
請求項１〜２８のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を有する細胞。
【請求項３１】
請求項１〜２８のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を含む医薬組成物。
【請求項３２】
ＲＮＡｉ剤が非緩衝液中で投与される、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記非緩衝液が、生理食塩水または水である、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記ｓｉＲＮＡが、緩衝液を用いて投与される、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
前記緩衝液が、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、またはリン酸塩またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記緩衝液が、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である、請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
細胞におけるＳｅｒｐｉｎａ１発現を阻害する方法であって、前記細胞を、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤、請求項２９に記載のベクター、または請求項３１〜３６のいずれか一項に記載の医薬組成物と接触させ、それにより前記細胞における前記Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子の発現を阻害することを含む、方法。
【請求項３８】
前記細胞が、対象内に存在する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記対象がヒトである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記Ｓｅｒｐｉｎａ１発現が、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、または約１００％阻害される、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
Ｓｅｒｐｉｎａ１関連疾患を有する対象を治療する方法であって、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤、請求項２９に記載のベクター、または請求項３１〜３６のいずれか一項に記載の医薬組成物を治療有効量で前記対象に投与し、それにより前記対象を治療することを含む、方法。
【請求項４２】
前記対象がヒトである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記Ｓｅｒｐｉｎａ１関連疾患が、肝障害である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記肝障害が、慢性肝疾患、肝臓炎、硬変症、肝線維症、および／または肝細胞がんからなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇまたは約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、皮下に投与される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４８】
前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、静脈内に投与される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＲＮＡｉ剤が、２回以上の用量で投与される、請求項４１に記載の方法。
【請求項５０】
Ｓｅｒｐｉｎａ１欠損変異体を有する対象における肝細胞がんの発現を阻害する方法であって、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤、請求項２９に記載のベクター、または請求項３１〜３６のいずれか一項に記載の医薬組成物を治療有効量で前記対象に投与し、それにより前記対象における肝細胞がんの発現を阻害することを含む、方法。
【請求項５１】
前記対象が、霊長類または齧歯類である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記対象がヒトである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇまたは約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＲＮＡｉ剤が、２回以上の用量で投与される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】
前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、皮下に投与される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５７】
前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、静脈内に投与される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５８】
Ｓｅｒｐｉｎａ１欠損変異体を有する対象の肝臓におけるミスフォールドしたＳｅｒｐｉｎａ１の蓄積を低減する方法であって、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤、請求項２９に記載のベクター、または請求項３１〜３６のいずれか一項に記載の医薬組成物を治療有効量で前記対象に投与し、それにより前記対象の肝臓におけるミスフォールドしたＳｅｒｐｉｎａ１の蓄積を低減することを含む、方法。
【請求項５９】
前記対象が、霊長類または齧歯類である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記対象がヒトである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇまたは約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＲＮＡｉ剤が、２回以上の用量で投与される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６４】
前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、皮下に投与される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６５】
前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、静脈内に投与される、請求項５８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は２０１６年１１月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／４２５，９０７号明細書（代理人整理番号ＡＬＮ−２６０ＰＲＯ１）；２０１７年８月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／５４８，５８９号明細書（代理人整理番号ＡＬＮ−２６０ＰＲＯ２）；２０１７年８月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／５４９，０９９号明細書（代理人整理番号ＡＬＮ−２７３ＰＲＯ１）；および２０１７年９月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／５６１，５１４号明細書（代理人整理番号ＡＬＮ−２６０ＰＲＯ３）に対する優先権の利益を主張する。前出願の各々の全内容は、ここで参照により本明細書中に援用される。
【０００２】
本願は、２０１３年５月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／８２６，１２５号明細書、２０１３年１１月１日に出願された米国仮特許出願第６１／８９８，６９５号明細書；２０１４年４月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／９７９，７２７号明細書；２０１４年５月６日に出願された米国仮特許出願第６１／９８９，０２８号明細書；２０１７年２月２１日に交付され、現在では米国特許第９，５７４，１９２号明細書として交付されている米国特許出願第１４／２８４，７４５号明細書；２０１７年１月６日に出願された米国特許出願第１５／３９９，８２０号明細書；および２０１４年５月２２日に出願された国際特許出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３９１０９号パンフレットに関する。前出願の各々の全内容は、ここで参照により本明細書中に援用される。
【０００３】
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出されている配列表を含み、ここでその全体は参照により援用される。２０１７年１１月１６日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、１２１３０１−０７８２０＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズが１２９，２３６バイトである。
【背景技術】
【０００４】
Ｓｅｒｐｉｎａ１は、主に、肝細胞、単核単球、肺胞マクロファージ、腸細胞、および骨髄系細胞によって産生される好中球エラスターゼと複合体を形成し、その活性を阻害するα−１アンチトリプシンをコードする。Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子の一方または両方のコピーにおける変異を有する対象は、α−１アンチトリプシン欠損を患うことがあり、肺および肝臓における正常を上回るエラスターゼ活性に起因し、肺気腫および／または慢性肝疾患を発現するリスクがある。
【０００５】
冒された対象では、α−１アンチトリプシンにおける欠損は、野生型の機能的なα−１アンチトリプシンの欠損である。場合によっては、Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子の一方または両方のコピーにおける変異を有する対象は、ヌル対立遺伝子を保有している。他の場合では、Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子の一方または両方のコピーにおける変異を有する対象は、欠損対立遺伝子を保有している。
【０００６】
例えば、Ｓｅｒｐｉｎａ１の欠損対立遺伝子、例えばＰＩＺ対立遺伝子を有する対象は、体内で合成部位から作用部位へ適切に輸送され得ないミスフォールドタンパク質を産生していることがある。かかる対象は、典型的には、肺および／または肝疾患を発現するリスクがある。Ｓｅｒｐｉｎａ１ヌル対立遺伝子、例えばＰＩＮＵＬＬ（Ｇｒａｎｉｔｅ  Ｆａｌｌｓ）を有する対象は、典型的には専ら肺疾患を発現するリスクがある。
【０００７】
α−１アンチトリプシン欠損に起因する肝疾患は、ミスフォールドにより、容易には細胞外に輸送されない、肝細胞において産生されるα−１アンチトリプシンの変異体形態の結果である。これは、肝細胞におけるミスフォールドタンパク質の集積をもたらし、限定はされないが、慢性肝疾患、肝臓炎、硬変症、肝線維症、および／または肝細胞がんを含む、肝臓の１つ以上の疾患または障害の原因となり得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
現在、α−１アンチトリプシン欠損に起因する肝疾患を有する患者の治療における選択肢は非常に限られており、例えば、肝炎ワクチン接種、支持療法、および傷害性薬剤（例えば、アルコールおよびＮＳＡＩＤ）の回避が挙げられる。置換α−１アンチトリプシン療法は利用可能であるが、かかる治療は、これらの対象における肝疾患に対して影響力を有することなく、また肝移植は有効なこともあるが、それは困難、高価で、かつ危険な方法であり、肝臓は容易に入手できない。
【０００９】
したがって、当該技術分野では、Ｓｅｒｐｉｎａ１関連疾患、例えば、慢性肝疾患、肝臓炎、硬変症、肝線維症、および／または肝細胞がんに対する効果的治療に対して需要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
以下により詳述されるように、本明細書で開示されるのは、Ｓｅｒｐｉｎａ１を標的にする薬剤、例えばＲＮＡｉ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤を含む組成物である。さらに開示されるのは、Ｓｅｒｐｉｎａ１の発現を阻害するため、またＳｅｒｐｉｎａ１関連疾患、例えば、慢性肝疾患、肝臓炎、硬変症、肝線維症、および／または肝細胞がんを治療するため、本発明の組成物を用いる方法である。
【００１１】
本発明は、少なくとも部分的には、オフターゲット遺伝子サイレンシング効果を低減しつつ、標的遺伝子発現の阻害にとって有利である、Ｓｅｒｐｉｎａ１を標的にするｄｓＲＮＡ剤、ならびに治療用途に適したかかる薬剤を含む組成物にとって有効なヌクレオチドまたは化学的モチーフの発見に基づく。より詳細には、特に、Ｓｅｒｐｉｎａ１を標的にするｄｓＲＮＡ剤が、アンチセンス鎖がシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端から数えて５’末端の２〜９位に）二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、かつ／またはｄｓＲＮＡ剤が約４０℃〜約８０℃の範囲内の融解温度を有する場合、ＲＮＡ干渉を媒介するのに、不安定化修飾を欠いている親ｄｓＲＮＡ剤よりも有効であり得ることが発見されている。
【００１２】
したがって、一態様では、本発明は、セリンペプチダーゼ阻害剤、クレードＡ、メンバー１（Ｓｅｒｐｉｎａ１）標的遺伝子配列の発現を阻害する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤であって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、前記アンチセンス鎖は、５’領域の最初の９つのヌクレオチド位置内に少なくとも１つの熱不安定化修飾またはその前駆物質を含み、ここで前記センス鎖は、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）リガンドを含み、またセンス鎖およびアンチセンス鎖の各々は、独立して１４〜４０ヌクレオチド長である、ｄｓＲＮＡ剤を提供する。
【００１３】
別の態様では、本発明は、セリンペプチダーゼ阻害剤、クレードＡ、メンバー１（Ｓｅｒｐｉｎａ１）遺伝子の発現を阻害する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤であって、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここでセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列とは３以下のヌクレオチド分異なる少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含み、かつアンチセンス鎖は、配列番号１５のヌクレオチド配列から３以下のヌクレオチド分異なる少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖は、５’領域の最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖領域の少なくとも１つの熱不安定化修飾またはその前駆物質を含み、前記センス鎖は、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）リガンドを含み、またセンス鎖およびアンチセンス鎖の各々は、独立して１４〜４０ヌクレオチド長である、ｄｓＲＮＡ剤を提供する。
【００１４】
さらに別の態様では、本発明は、セリンペプチダーゼ阻害剤、クレードＡ、メンバー１（Ｓｅｒｐｉｎａ１）遺伝子の発現を阻害する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤であって、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖は、Ｓｅｒｐｉｎａ１をコードするｍＲＮＡに対する相補性領域を含み、ここで相補性領域は、配列番号１５のヌクレオチド配列から３以下のヌクレオチド分異なる少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含み、前記アンチセンス鎖は、５’領域の最初の９つのヌクレオチド位置内に少なくとも１つの熱不安定化修飾またはその前駆物質を含み、
ここで前記センス鎖は、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）リガンドを含み、センス鎖およびアンチセンス鎖の各々は、独立して１４〜４０ヌクレオチド長である、ｄｓＲＮＡ剤を提供する。
【００１５】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、２’−フルオロ修飾を含む少なくとも４つのヌクレオチドを含む。
【００１６】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、以下の特徴：ａ）熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’領域の４〜８位に位置する；およびｂ）センスおよびアンチセンス鎖の各々は、独立して２’−フルオロ修飾を含む少なくとも２つのヌクレオチドを含む；およびｃ）センス鎖の片末端に結合されるＡＳＧＰＲリガンド、を有する。
【００１７】
別の実施形態では、アンチセンス鎖は、以下の特徴：ａ）熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の４〜８位に位置する；ｂ）少なくとも２つのヌクレオチドは、２’−フルオロ修飾を含む；ｃ）ヌクレオチドの（５’末端から数えて）１および２位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合；ｄ）１８〜３５ヌクレオチド長、の少なくとも２つを有する。
【００１８】
一実施形態では、センス鎖は、以下の特徴：ａ）センス鎖の片末端に結合されるＡＳＧＰＲリガンド；ｂ）少なくとも２つのヌクレオチドは、２’−フルオロ修飾を含む；ｃ）センス鎖およびアンチセンス鎖は、少なくとも１９のヌクレオチド位置にわたる二本鎖領域を形成し、ここで熱不安定化修飾は前記二本鎖領域内に位置する、の少なくとも１つを有する。
【００１９】
一実施形態では、熱不安定化修飾は、
【化１】
2020500929.tif 000002
（式中、Ｂは核酸塩基である）
からなる群から選択される。
【００２０】
一実施形態では、不安定化修飾は、アンチセンス鎖の７位に位置する。
【００２１】
一実施形態では、ＡＳＧＰＲリガンドは、二価または三価分岐リンカーを通じて結合される１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。
【００２２】
一実施形態では、ＡＳＧＰＲリガンドは、
【化２】
2020500929.tif 000003
である。
【００２３】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、以下の模式図
【化３】
2020500929.tif 000004
（式中、Ｘは、ＯまたはＳである）
に示されるようなリガンドにコンジュゲートされる。
【００２４】
一態様では、本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む、セリンペプチダーゼ阻害剤、クレードＡ、メンバー１（Ｓｅｒｐｉｎａ１）標的遺伝子配列の発現を阻害する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤であって、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、５’領域の最初の９つのヌクレオチド位置内に少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここでセンス鎖およびアンチセンス鎖の各々は、独立して１４〜４０ヌクレオチド長である、ｄｓＲＮＡ剤を提供する。
【００２５】
別の態様では、本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む、セリンペプチダーゼ阻害剤、クレードＡ、メンバー１（Ｓｅｒｐｉｎａ１）標的遺伝子配列の発現を阻害する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤であって、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、ここでセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列から３以下のヌクレオチド分異なる少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含み、かつアンチセンス鎖は、配列番号１５のヌクレオチド配列から３以下のヌクレオチド分異なる少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含み、ここでアンチセンス鎖は、５’領域の最初の９つのヌクレオチド位置内に少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここでセンス鎖およびアンチセンス鎖の各々は、独立して１４〜４０ヌクレオチド長である、ｄｓＲＮＡ剤を提供する。
【００２６】
さらに別の態様では、本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む、セリンペプチダーゼ阻害剤、クレードＡ、メンバー１（Ｓｅｒｐｉｎａ１）標的遺伝子配列の発現を阻害する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤であって、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、前記アンチセンス鎖は、Ｓｅｒｐｉｎａ１をコードするｍＲＮＡに対する相補性領域を含み、ここで相補性領域は、配列番号１５のヌクレオチド配列から３以下のヌクレオチド分異なる少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含み、ここでアンチセンス鎖は、５’領域の最初の９つのヌクレオチド位置内に少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここでセンス鎖およびアンチセンス鎖の各々は、独立して１４〜４０ヌクレオチド長である、ｄｓＲＮＡ剤を提供する。
【００２７】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、約５５℃〜約６７℃の融解温度を有する。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、約６０℃〜約６７℃の融解温度を有する。
【００２８】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）リガンドをさらに含む。
【００２９】
一実施形態では、ＡＳＧＰＲリガンドは、二価または三価分岐状リンカーを通じて結合される１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。
【００３０】
一実施形態では、ＡＳＧＰＲリガンドは、
【化４】
2020500929.tif 000005
である。
【００３１】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、以下の模式図
【化５】
2020500929.tif 000006
（式中、Ｘは、ＯまたはＳである）
で示されるようなリガンドにコンジュゲートされる。
【００３２】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、以下の特徴：（ｉ）アンチセンス鎖は、２’−フルオロ修飾を含む、２、３、４、５または６のヌクレオチドを含む；（ｉｉ）アンチセンス鎖は、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２’−フルオロ修飾を含む、２、３、４または５のヌクレオチドを含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、２’−フルオロ修飾を含む、少なくとも４つのヌクレオチドを含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域領域を含む；および（ｖｉｉｉ）アンチセンス鎖の５’末端での平滑末端、の少なくとも１つをさらに有する。
【００３３】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤の各鎖は、１５〜３０ヌクレオチド、１９〜３０ヌクレオチドを有してもよく；またはセンス鎖は、２１ヌクレオチドを有してもよく、アンチセンス鎖は、２３ヌクレオチドを有してもよい。
【００３４】
一実施形態では、アンチセンス鎖は、配列番号１のヌクレオチド１４４０〜１４８０；または配列番号１のヌクレオチド１４４１〜１４７９；または配列番号１のヌクレオチド１４４２〜１４７８；または配列番号１のヌクレオチド１４４３〜１４７７；または配列番号１のヌクレオチド１４４４〜１４７６；または配列番号１のヌクレオチド１４４５〜１４７５；または配列番号１のヌクレオチド１４４６〜１４７４；または配列番号１のヌクレオチド１４４７〜１４７３；または配列番号１のヌクレオチド１４４８〜１４７３；または配列番号１のヌクレオチド１４４８〜１４７２；または配列番号１のヌクレオチド１４４８〜１４７１；または配列番号１のヌクレオチド１４４８〜１４７０；または配列番号１のヌクレオチド１４４７〜１４６９；または配列番号１のヌクレオチド１４４６〜１４７８；または配列番号１のヌクレオチド１４４９〜１４７１；または配列番号１のヌクレオチド１４５０〜１４７２；または配列番号１のヌクレオチド１４４０〜１４７５；または配列番号１のヌクレオチド１４４５〜１４８０；または配列番号１のヌクレオチド１４４５〜１４７５とは３以下のヌクレオチド分異なる少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含む相補性の領域を含む。
【００３５】
一実施形態では、相補性の領域は、ヌクレオチド配列５’−ＵＵＵＵＧＵＵＣＡＡＵＣＡＵＵＡＡＧＡＡＧＡＣ−３’（配列番号４１９）と３以下のヌクレオチド分異なる少なくとも１５の隣接ヌクレオチドを含む。
【００３６】
一実施形態では、センス鎖は、ヌクレオチド配列５’−ＣＵＵＣＵＵＡＡＵＧＡＵＵＧＡＡＣＡＡＡＡ−３’（配列番号４１７）を含み、かつアンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’−ＵＵＵＵＧＵＵＣＡＡＵＣＡＵＵＡＡＧＡＡＧＡＣ−３’（配列番号４１９）を含む。
【００３７】
一実施形態では、センス鎖は、ヌクレオチド配列
５’−ｃｓｕｓｕｃｕｕＡｆａＵｆＧｆＡｆｕｕｇａａｃａａａａ−３’（配列番号３３）を含み、かつアンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’−ｕｓＵｆｓｕｕｇｕ（Ｔｇｎ）ｃａａｕｃａＵｆｕＡｆａｇａａｇｓａｓｃ−３’（配列番号３４）を含み、ここでａ、ｇ、ｃ、およびｕは各々、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、ＣｆおよびＵｆは各々、２’−フルオロＡ、Ｇ、ＣおよびＵであり；ｓは、ホスホロチオエート結合であり；かつ（Ｔｇｎ）は、チミジン−グリコール核酸（ＧＮＡ）Ｓ−異性体である。
【００３８】
一態様では、本発明は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む、セリンペプチダーゼ阻害剤、クレードＡ、メンバー１（Ｓｅｒｐｉｎａ１）遺伝子の発現を阻害する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を提供し、ここでセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’−ｃｓｕｓｕｃｕｕＡｆａＵｆＧｆＡｆｕｕｇａａｃａａａａＬ９６−３’（配列番号３５）を含み、かつアンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列５’−ｕｓＵｆｓｕｕｇｕ（Ｔｇｎ）ｃａａｕｃａＵｆｕＡｆａｇａａｇｓａｓｃ−３’（配列番号３４）を含み、ここでａ、ｇ、ｃ、およびｕは各々、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵであり；Ａｆ、Ｇｆ、ＣｆおよびＵｆは各々、２’−フルオロＡ、Ｇ、ＣおよびＵであり；ｓはホスホロチオエート結合であり；（Ｔｇｎ）は、チミジン−グリコール核酸（ＧＮＡ）Ｓ−異性体であり；かつＬ９６ｉｓＮ−［トリス（ＧａｌＮＡｃ−アルキル）−アミドデカノイル）］−４−ヒドロキシプロリノールである。
【００３９】
一態様では、本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む、セリンペプチダーゼ阻害剤、クレードＡ、メンバー１（Ｓｅｒｐｉｎａ１）遺伝子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ剤であって、各鎖は１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的Ｓｅｒｐｉｎａ１配列、例えば配列番号１のヌクレオチド１４４０〜１４８０に対して十分な相補性を有し、かつアンチセンス鎖は、シード領域（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて２〜９位）内部に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、またｄｓＲＮＡ剤は、以下の特徴：（ｉ）約４０℃〜約８０℃の融解温度（Ｔｍ）；（ｉｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉｉ）アンチセンスは、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｖ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉ）センス鎖は、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；および（ｉｘ）アンチセンス鎖の５’末端の平滑末端、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８または９全部）をさらに有する、ｄｓＲＮＡ剤を提供する。
【００４０】
一部の実施形態では、本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む、セリンペプチダーゼ阻害剤、クレードＡ、メンバー１（Ｓｅｒｐｉｎａ１）遺伝子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ剤であって、各鎖は１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的Ｓｅｒｐｉｎａ１配列、例えば配列番号１のヌクレオチド１４４０〜１４８０に対して十分な相補性を有し、かつアンチセンス鎖は、シード領域（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて２〜９位）内部に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、またｄｓＲＮＡ剤は、以下の特徴：（ｉ）約４０℃〜約８０℃の融解温度（Ｔｍ）；（ｉｉ）アンチセンスは、６、７、８、９、１０、１１または１２の２’−ＯＭｅ修飾を含む；（ｉｉｉ）アンチセンスは、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｖ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｖ）センス鎖は、６、７、８、９、１０、１１または１２の２’−ＯＭｅ修飾を含む；（ｖｉ）センス鎖は、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも１、２、３、４または５の２’−デオキシ修飾を含む；（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；および（ｉｘ）アンチセンス鎖の５’末端の平滑末端、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８または９全部）をさらに有する、ｄｓＲＮＡ剤を提供する。
【００４１】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃または６５℃からの範囲の下端、および約７０℃、７５℃または８０℃からの範囲の上端の融解温度を有する。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約５５℃〜約７０℃の範囲内の融解温度を有する。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約５７℃〜約６７℃の範囲内の融解温度を有する。一部の特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約６０℃〜約６７℃の範囲内の融解温度を有する。一部のさらなる実施形態では、ｄｓＲＮＡは、約６２℃〜約６６℃の範囲内の融解温度を有する。
【００４２】
少なくとも６０℃の融解温度を有するｄｓＲＮＡ剤が、インビボおよびインビトロでより有効であることも発見されている。したがって、一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、少なくとも６０℃の融解温度を有する。
【００４３】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的Ｓｅｒｐｉｎａ１配列、例えば配列番号１のヌクレオチド１４４０〜１４８０に対して十分な相補性を有し、かつアンチセンス鎖は、シード領域（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて２〜９位）内部に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度（Ｔｍ）を有し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；および（ｖｉｉｉ）アンチセンス鎖の５’末端の平滑末端、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８全部）をさらに有する。
【００４４】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を有し、ここでアンチセンス鎖は、シード領域（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて２〜９位）内部に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃のＴｍを有し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；およびｖｉｉ）アンチセンス鎖の５’末端の平滑末端、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６または７全部）をさらに有する。
【００４５】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、１９、２１、２２または２３ヌクレオチド塩基対長の二本鎖領域を有し、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、またｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有する。
【００４６】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、１９、２１、２２または２３ヌクレオチド塩基対長の二本鎖領域を有し、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、またｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃（例えば、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃または８０℃）の融解温度を有する。
【００４７】
一部の特定の実施形態では、二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から数えてアンチセンス鎖の５、６、７、または８位に存在する。
【００４８】
一部の特定の実施形態では、二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から数えてアンチセンス鎖の６位に存在する。
【００４９】
一部の特定の実施形態では、二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から数えてアンチセンス鎖の７位に存在する。
【００５０】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、Ｓｅｒｐｉｎａ１標的配列、例えば配列番号１のヌクレオチド１４４０〜１４８０に対して十分な相補性を有し、かつアンチセンス鎖は、シード領域（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の、５’末端から数えて２〜９位）内部に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、かつアンチセンス鎖は、以下の特徴：
（ｉ）２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾；および
（ｉｉ）１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合
の一方または双方をさらに含み；かつ
センス鎖は、以下の特徴：
（ｉ）センス鎖とコンジュゲートされるリガンド；
（ｉｉ）２、３、４または５の２’−フルオロ修飾；および
（ｉｉｉ）１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合
の１つ、２つまたは３つを含む。
【００５１】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、Ｓｅｒｐｉｎａ１標的配列、例えば配列番号１のヌクレオチド１４４０〜１４８０に対して十分な相補性を有し、かつアンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、またリガンドはセンス鎖とコンジュゲートされ、またｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有する。
【００５２】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、Ｓｅｒｐｉｎａ１標的配列、例えば配列番号１のヌクレオチド１４４０〜１４８０に対して十分な相補性を有し、かつアンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、リガンドはセンス鎖とコンジュゲートされ、またｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む。
【００５３】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、Ｓｅｒｐｉｎａ１標的配列、例えば配列番号１のヌクレオチド１４４０〜１４８０に対して十分な相補性を有し、またｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、前記センス鎖はリガンドを含み、またｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有する。この一部のさらなる実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＰＲリガンドである。
【００５４】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、Ｓｅｒｐｉｎａ１標的配列、例えば配列番号１のヌクレオチド１４４０〜１４８０に対して十分な相補性を有し、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて４〜８位に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、前記センス鎖は、リガンドを含み、ここでセンスおよびアンチセンス鎖の各々は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含み、またｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有する。この一部のさらなる実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＰＲリガンドである。
【００５５】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、Ｓｅｒｐｉｎａ１標的配列、例えば配列番号１のヌクレオチド１４４０〜１４８０に対して十分な相補性を有し、ここでｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、かつ前記センス鎖は、リガンドを含み、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、かつアンチセンスは、以下の特徴：（ｉ）二本鎖の熱不安定化修飾はアンチセンス鎖の４〜８位に位置する；（ｉｉ）少なくとも２つの２’−フルオロ修飾；（ｉｉｉ）ヌクレオチドの（５’末端から数えて）１および２位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、およびアンチセンス鎖は１８〜３５ヌクレオチド長を有する、の少なくとも２つをさらに含む。一部のさらなる実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＰＲリガンドである。
【００５６】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、Ｓｅｒｐｉｎａ１標的配列、例えば配列番号１のヌクレオチド１４４０〜１４８０に対して十分な相補性を有し、ここでｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、かつ前記センス鎖は、リガンドを含み、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またセンス鎖は、以下の特徴：（ｉ）リガンドは、センス鎖の片末端に結合される；（ｉｉ）センス鎖は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含む；および（ｉｉｉ）センス鎖およびアンチセンス鎖は、少なくとも１９のヌクレオチド位置にわたる二本鎖領域を形成するための十分な相補性を示し、ここで二本鎖の熱不安定化修飾は前記二本鎖領域内に位置する、の少なくとも１つを有する。
【００５７】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、Ｓｅｒｐｉｎａ１標的配列、例えば配列番号１のヌクレオチド１４４０〜１４８０に対して十分な相補性を有し、ここでｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、ここで前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、かつ前記センス鎖は、リガンドを含み、またｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、また二本鎖の熱不安定化修飾は、
【化６】
2020500929.tif 000007
（式中、Ｂは、修飾または非修飾核酸塩基であり、各構造上のアスタリスクは、Ｒ、Ｓまたはラセミのいずれかを表す）
からなる群から選択される。
【００５８】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、Ｓｅｒｐｉｎａ１標的配列、例えば配列番号１のヌクレオチド１４４０〜１４８０に対して十分な相補性を有し、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて４〜８位に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、前記センス鎖は、リガンドを含み、またセンスおよびアンチセンス鎖の各々は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含み、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、また二本鎖の熱不安定化修飾は、
【化７】
2020500929.tif 000008
（式中、Ｂは、修飾または非修飾核酸塩基であり、各構造上のアスタリスクは、Ｒ、Ｓまたはラセミのいずれかを表す）
からなる群から選択される。
【００５９】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、Ｓｅｒｐｉｎａ１標的配列、例えば配列番号１のヌクレオチド１４４０〜１４８０に対して十分な相補性を有し、ここでｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、前記アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて７位に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、前記センス鎖は、リガンドを含み、またｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有する。
【００６０】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、Ｓｅｒｐｉｎａ１標的配列、例えば配列番号１のヌクレオチド１４４０〜１４８０に対して十分な相補性を有し、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて７位に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、前記センス鎖は、リガンドを含み、またセンスおよびアンチセンス鎖の各々は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含み、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、また二本鎖の熱不安定化修飾は、
【化８】
2020500929.tif 000009
（式中、Ｂは修飾または非修飾核酸塩基であり、各構造上のアスタリスクは、Ｒ、Ｓまたはラセミのいずれかを表す）
からなる群から選択される。
【００６１】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、Ｓｅｒｐｉｎａ１標的配列、例えば配列番号１のヌクレオチド１４４０〜１４８０に対して十分な相補性を有し、ここでｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、前記センス鎖は、リガンドを含み、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またここでリガンドは、二価または三価分岐状リンカーを通じて結合される１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。
【００６２】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０のヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、Ｓｅｒｐｉｎａ１標的配列、例えば配列番号１のヌクレオチド１４４０〜１４８０に対して十分な相補性を有し、ここでｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、かつ前記センス鎖は、リガンドを含み、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またここでリガンドは、構造：
【化９】
2020500929.tif 000010
のＡＳＧＰＲリガンドである。
【００６３】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３または４の２’−フルオロ修飾を含み、かつ０、１または２のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでアンチセンス鎖は、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含み、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。
【００６４】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０および１１位または７、９、１０および１１位に２’−フルオロ修飾を含み、また任意選択的には、ヌクレオチドの１および２位の間、およびヌクレオチドの２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでアンチセンス鎖は、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含み、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。
【００６５】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３または４の２’−フルオロ修飾を含み、かつ０または２のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでアンチセンス鎖は、２、６、８、９、１４もしくは１６位、または２、６、１４もしくは１６位、または２、１４および１６位に２’−フルオロ修飾を含み；またアンチセンスは、ヌクレオチドの２１および２２位の間、およびヌクレオチドの２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。
【００６６】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３または４の２’−フルオロ修飾を含み、かつ０または２のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでアンチセンス鎖は、２、６、８、９、１４もしくは１６位、または２、６、１４もしくは１６位、または２、１４および１６位に２’−フルオロ修飾を含み；またアンチセンスは、ヌクレオチドの２１および２２位の間、ヌクレオチドの２２および２３位の間、ヌクレオチドの１および２位の間、ヌクレオチドの２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。
【００６７】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０および１１位または７、９、１０および１１位に２’−フルオロ修飾を含み、また任意選択的には、ヌクレオチドの１および２位の間、およびヌクレオチドの２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでアンチセンス鎖は、２、６、８、９、１４もしくは１６位、または２、６、１４もしくは１６位、または２、１４および１６位に２’−フルオロ修飾を含み；またアンチセンスは、ヌクレオチドの２１および２２位の間、およびヌクレオチドの２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。
【００６８】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり、ここでアンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１８、１９、２１、２２、２３、２４または２４のヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；および（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、センス鎖の５’末端に平滑末端を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８全部）をさらに有する。一部の特定の実施形態では、センス鎖は、１９、２０または２１または２２ヌクレオチド長であり、かつアンチセンス鎖は、２０、２１または２２ヌクレオチド長である。
【００６９】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０および１１位または７、９、１０および１１位に２’−フルオロ修飾を含み、また任意選択的には、ヌクレオチドの１および２位の間、およびヌクレオチドの２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでアンチセンス鎖は、２、６、８、９、１４もしくは１６位、または２、６、１４もしくは１６位、または２、１４および１６位に２’−フルオロ修飾を含み；またアンチセンスは、ヌクレオチドの２１および２２位の間、ヌクレオチドの２２および２３位の間、ヌクレオチドの１および２位の間、ヌクレオチドの２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。
【００７０】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡの一方の末端は、平滑末端であり、かつ他方の末端は、オーバーハングを有し、ここでアンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；および（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６または７全部）をさらに有する。一部の実施形態では、オーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端上に存在し、かつ平滑末端は、アンチセンス鎖の５’末端に存在する。一部の特定の実施形態では、オーバーハングは、２、３または４ヌクレオチド長である。
【００７１】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、１９、２１、２２または２３ヌクレオチド塩基対長の二本鎖領域を有し、ここでｄｓＲＮＡの一方の末端は、平滑末端であり、かつ他方の末端は、オーバーハングを有し、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；および（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、５または６全部）をさらに有し、また任意選択的には、２ヌクレオチドオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端上に存在し、平滑末端は、アンチセンス鎖の５’末端に存在する。一部の実施形態では、オーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端上に存在し、平滑末端は、アンチセンス鎖の５’末端に存在する。
【００７２】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤はまた、ｄｓＲＮＡ二本鎖の両末端に２つの平滑末端を有してもよい。
【００７３】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、二本鎖の両末端に平滑末端を有し、ここでアンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；および（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６または７全部）をさらに有する。
【００７４】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、１９、２１、２２または２３ヌクレオチド塩基対長の二本鎖領域を有し、かつ二本鎖の両末端に平滑末端を有し、ここでｄｓＲＮＡの一方の末端は、平滑末端であり、かつ他方の末端は、オーバーハングを有し、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；および（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、５または６全部）をさらに有する。
【００７５】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、２１ヌクレオチド（ｎｔ）センス鎖および２３ヌクレオチド（ｎｔ）アンチセンスを含み、ここでアンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、ここでｄｓＲＮＡの一方の末端は、平滑末端である一方、他方の末端は、２ｎｔオーバーハングを含み、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；および（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６または７全部）をさらに有する。好ましくは、２ｎｔオーバーハングは、アンチセンスの３’末端に存在する。
【００７６】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖を含む本発明のｄｓＲＮＡ剤において、センス鎖は、２５〜３０ヌクレオチド残基長であり、ここで前記センス鎖の５’末端ヌクレオチド（１位）から始まる１〜２３位は、少なくとも８つのリボヌクレオチドを含み；アンチセンス鎖は、３６〜６６ヌクレオチド残基長であり、３’末端ヌクレオチドから始まる、その位置内の少なくとも８つのリボヌクレオチドがセンス鎖の１〜２３位と対合することで、二本鎖を形成し；ここで少なくとも、アンチセンス鎖の３’末端ヌクレオチドは、センス鎖と対合せず、最大で６つの連続する３’末端ヌクレオチドは、センス鎖と対合せず、それにより１〜６ヌクレオチドの３’一本鎖オーバーハングを形成し；ここでアンチセンス鎖の５’末端は、センス鎖と対合しない１０〜３０の連続するヌクレオチドを含み、それにより１０〜３０ヌクレオチドの一本鎖５’オーバーハングを形成し；ここで少なくとも、センス鎖の５’末端および３’末端ヌクレオチドは、センスおよびアンチセンス鎖が最大相補性のために整列されるとき、アンチセンス鎖のヌクレオチドと塩基対合され、それによりセンスおよびアンチセンス鎖間で実質的に二本鎖の領域を形成し；また前記二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるとき、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖長の少なくとも１９のリボヌクレオチドに沿って標的ＲＮＡに対して十分に相補的であることで、Ｓｅｒｐｉｎａ１標的遺伝子発現を低減し；またここでアンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、またここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有する。例えば、熱不安定化ヌクレオチドは、センス鎖の５’末端の１４〜１７位に対して対向的または相補的な位置の間に存在し、またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；および（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；および（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜３０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６または７全部）をさらに有する。
【００７７】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センスおよびアンチセンス鎖を含み、ここで前記ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも２５、最大で２９ヌクレオチドの長さを有するセンス鎖を含み、最大で３０ヌクレオチドの長さを有するアンチセンス鎖は、センス鎖とともに、５’末端から１１位で酵素分解を受けやすい修飾ヌクレオチドを含み、ここで前記センス鎖の３’末端および前記アンチセンス鎖の５’末端は、平滑末端を形成し、前記アンチセンス鎖は、その３’末端でセンス鎖よりも１〜４ヌクレオチド長く、ここで少なくとも２５ヌクレオチド長である二本鎖領域では、前記ｄｓＲＮＡ剤が哺乳動物細胞に導入されるとき、前記アンチセンス鎖は、前記アンチセンス鎖長の少なくとも１９ｎｔに沿ってＳｅｒｐｉｎａ１標的ｍＲＮＡに対して十分に相補的であることで、標的遺伝子の発現を低減し、またここで前記ｄｓＲＮＡのダイサー切断により、前記アンチセンス鎖の前記３’末端を含むｓｉＲＮＡが優先的にもたらされ、それにより哺乳動物における標的遺伝子の発現が低減され、ここでアンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；および（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；および（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２９ヌクレオチド対長の二本鎖領域を有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６または７全部）をさらに有する。
【００７８】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、ヌクレオチドの２１および２２位の間、およびヌクレオチドの２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；および（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８全部）をさらに有する。
【００７９】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、ヌクレオチドの１および２位の間、ヌクレオチドの２および３位の間、ヌクレオチドの２１および２２位の間、およびヌクレオチドの２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｉｉ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｖ）センス鎖は、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；および（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８全部）をさらに有する。
【００８０】
一部の実施形態では、センス鎖は、ヌクレオチドの１および２位の間、およびヌクレオチドの２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；および（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８全部）をさらに有する。
【００８１】
一部の実施形態では、センス鎖は、ヌクレオチドの１および２位の間、およびヌクレオチドの２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、アンチセンス鎖は、ヌクレオチドの１および２位の間、ヌクレオチドの２および３位の間、ヌクレオチドの２１および２２位の間、およびヌクレオチドの２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、ここでｄｓＲＮＡは、約４０℃〜約８０℃の融解温度を有し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｉｉ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｖ）センス鎖は、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；および（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６または７全部）をさらに有する。
【００８２】
一態様では、本発明は、Ｓｅｒｐｉｎａ１標的配列、例えば配列番号１のヌクレオチド１４４０〜１４８０の発現を阻害する能力があるｄｓＲＮＡ剤であって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖が１４〜４０ヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖が、ＲＮＡ干渉を媒介するため、Ｓｅｒｐｉｎａ１標的配列、例えば配列番号１のヌクレオチド１４４０〜１４８０に対して十分な相補性を有し、かつアンチセンス鎖が、シード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端から数えて５’末端の２〜９位に）二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、またｄｓＲＮＡが、以下の特徴：
（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；
（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；
（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；
（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；
（ｖ）センス鎖は、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；
（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；
（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；および
（ｖｉｉｉ）アンチセンス鎖の５’末端の平滑末端
の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８全部）をさらに有する、ｄｓＲＮＡ剤を提供する。
【００８３】
一部の特定の実施形態では、二本鎖の熱不安定化修飾アンチセンス鎖の、アンチセンス鎖の５’末端から数えて７位に存在する。
【００８４】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０ヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、標的配列に対して十分な相補性を有し、かつアンチセンス鎖は、シード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端から数えて５’末端の２〜９位に）二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、かつアンチセンス鎖は、以下の特徴：
（ｉｉｉ）２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾；および
（ｉｖ）１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合
の一方または双方をさらに含み、かつ
センス鎖は、以下の特徴：
（ｉｖ）センス鎖とコンジュゲートされたリガンド；
（ｖ）２、３、４または５の２’−フルオロ修飾；および
（ｖｉ）１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合
の１、２または３つを含む。
【００８５】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０ヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、Ｓｅｒｐｉｎａ１標的配列、例えば配列番号１のヌクレオチド１４４０〜１４８０に対して十分な相補性を有し、かつアンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、またリガンドは、センス鎖とコンジュゲートされる。
【００８６】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０ヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、Ｓｅｒｐｉｎａ１標的配列、例えば配列番号１のヌクレオチド１４４０〜１４８０に対して十分な相補性を有し、かつアンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、リガンドは、センス鎖とコンジュゲートされ、またｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む。
【００８７】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０ヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、Ｓｅｒｐｉｎａ１標的配列、例えば配列番号１のヌクレオチド１４４０〜１４８０に対して十分な相補性を有し、ここでｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、かつ前記センス鎖は、リガンドを含む。この一部のさらなる実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＰＲリガンドである。
【００８８】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０ヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、Ｓｅｒｐｉｎａ１標的配列、例えば配列番号１のヌクレオチド１４４０〜１４８０に対して十分な相補性を有し、ここで前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて４〜８位に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、前記センス鎖は、リガンドを含み、またここでセンスおよびアンチセンス鎖の各々は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含む。この一部のさらなる実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＰＲリガンドである。
【００８９】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０ヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、Ｓｅｒｐｉｎａ１標的配列、例えば配列番号１のヌクレオチド１４４０〜１４８０に対して十分な相補性を有し、ここでｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、かつ前記センス鎖は、リガンドを含み、かつアンチセンスは、以下の特徴：（ｉ）二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の４〜８位に位置する；（ｉｉ）少なくとも２つの２’−フルオロ修飾；（ｉｉｉ）ヌクレオチドの（５’末端から数えて）１および２位の間のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、の少なくとも２つをさらに含み、かつアンチセンス鎖は、１８〜３５ヌクレオチド長を有する。一部のさらなる実施形態では、リガンドは、ＡＳＧＰＲリガンドである。
【００９０】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０ヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、Ｓｅｒｐｉｎａ１標的配列、例えば配列番号１のヌクレオチド１４４０〜１４８０に対して十分な相補性を有し、ここでｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、かつ前記センス鎖は、リガンドを含み、またセンス鎖は、以下の特徴：（ｉ）リガンドは、センス鎖の片末端に結合される；（ｉｉ）センス鎖は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含む；および（ｉｉｉ）センス鎖およびアンチセンス鎖は、少なくとも１９のヌクレオチド位置にわたる二本鎖領域を形成するのに十分な相補性を示し、ここで二本鎖の熱不安定化修飾は前記二本鎖領域内に位置する、の少なくとも１つを有する。
【００９１】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０ヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、Ｓｅｒｐｉｎａ１標的配列、例えば配列番号１のヌクレオチド１４４０〜１４８０に対して十分な相補性を有し、ここでｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、かつ前記センス鎖は、リガンドを含み、ここで二本鎖の熱不安定化修飾は、
【化１０】
2020500929.tif 000011
（式中、Ｂは修飾または非修飾核酸塩基であり、各構造上のアスタリスクは、Ｒ、Ｓまたはラセミのいずれかを表す）
からなる群から選択される。
【００９２】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０ヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、Ｓｅｒｐｉｎａ１標的配列、例えば配列番号１のヌクレオチド１４４０〜１４８０に対して十分な相補性を有し、前記アンチセンス鎖５’末端から数えて４〜８位に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、前記センス鎖は、リガンドを含み、またここでセンスおよびアンチセンス鎖の各々は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含み、また二本鎖の熱不安定化修飾は、
【化１１】
2020500929.tif 000012
（式中、Ｂは修飾または非修飾核酸塩基であり、各構造上のアスタリスクは、Ｒ、Ｓまたはラセミのいずれかを表す）
からなる群から選択される。
【００９３】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０ヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、Ｓｅｒｐｉｎａ１標的配列、例えば配列番号１のヌクレオチド１４４０〜１４８０に対して十分な相補性を有し、ここでｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、前記アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて７位に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、かつ前記センス鎖は、リガンドを含む。
【００９４】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０ヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、Ｓｅｒｐｉｎａ１標的配列、例えば配列番号１のヌクレオチド１４４０〜１４８０に対して十分な相補性を有し、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて７位に位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、ここで前記センス鎖は、リガンドを含み、またセンスおよびアンチセンス鎖の各々は、少なくとも２つの２’−フルオロ修飾を含み、また二本鎖の熱不安定化修飾は、
【化１２】
2020500929.tif 000013
（式中、Ｂは修飾または非修飾核酸塩基であり、各構造上のアスタリスクは、Ｒ、Ｓまたはラセミのいずれかを表す）
からなる群から選択される。
【００９５】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０ヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、Ｓｅｒｐｉｎａ１標的配列、例えば配列番号１のヌクレオチド１４４０〜１４８０に対して十分な相補性を有し、ここでｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、かつ前記センス鎖は、リガンドを含み、ここでリガンドは、二価または三価分岐状リンカーを通じて結合される１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。
【００９６】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、各鎖は１４〜４０ヌクレオチドを有し、ここでアンチセンス鎖は、ＲＮＡ干渉を媒介するため、Ｓｅｒｐｉｎａ１標的配列、例えば配列番号１のヌクレオチド１４４０〜１４８０に対して十分な相補性を有し、ここでｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロを含み、前記アンチセンス鎖は、５’末端から数えて最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、かつ前記センス鎖は、リガンドを含み、ここでリガンドは、構造：
【化１３】
2020500929.tif 000014
のＡＳＧＰＲリガンドである。
【００９７】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３または４の２’−フルオロ修飾を含み、かつ０、１または２のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでアンチセンス鎖は、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含み、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。
【００９８】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０および１１位または７、９、１０および１１位に２’−フルオロ修飾を含み、また任意選択的には、ヌクレオチドの１および２位の間、およびヌクレオチドの２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでアンチセンス鎖は、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含み、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。
【００９９】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３または４の２’−フルオロ修飾を含み、かつ０または２のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでアンチセンス鎖は、２、６、８、９、１４もしくは１６位、または２、６、１４もしくは１６位、または２、１４および１６位に２’−フルオロ修飾を含み；またアンチセンスは、ヌクレオチドの２１および２２位の間、およびヌクレオチドの２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。
【０１００】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、３または４の２’−フルオロ修飾を含み、かつ０または２のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでアンチセンス鎖は、２、６、８、９、１４もしくは１６位、または２、６、１４もしくは１６位、または２、１４および１６位に２’−フルオロ修飾を含み；またアンチセンスは、ヌクレオチドの２１および２２位の間、ヌクレオチドの２２および２３位の間、ヌクレオチドの１および２位の間、ヌクレオチドの２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。
【０１０１】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０および１１位または７、９、１０および１１位に２’−フルオロ修飾を含み、また任意選択的には、ヌクレオチドの１および２位の間、およびヌクレオチドの２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでアンチセンス鎖は、２、６、８、９、１４もしくは１６位、または２、６、１４もしくは１６位、または２、１４および１６位に２’−フルオロ修飾を含み；またアンチセンスは、ヌクレオチドの２１および２２位の間、およびヌクレオチドの２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。
【０１０２】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり；アンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し；ここでセンス鎖は、リガンドとコンジュゲートされ、（センス鎖の５’末端から数えて）７、１０および１１位または７、９、１０および１１位に２’−フルオロ修飾を含み、また任意選択的には、ヌクレオチドの１および２位の間、およびヌクレオチドの２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；ここでアンチセンス鎖は、２、６、８、９、１４もしくは１６位、または２、６、１４もしくは１６位、または２、１４および１６位に２’−フルオロ修飾を含み；またアンチセンスは、ヌクレオチドの２１および２２位の間、ヌクレオチドの２２および２３位の間、ヌクレオチドの１および２位の間、ヌクレオチドの２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み；またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２５ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む；および（ｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端に少なくとも２ヌクレオチドオーバーハングを有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２または３全部）をさらに有する。
【０１０３】
特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、
（ａ）（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）３’末端に結合される、三価分岐状リンカーを通じて結合される３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含むＡＳＧＰＲリガンド；および
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）７、１０、および１１位に２’−Ｆ修飾；
を有するセンス鎖と、
（ｂ）（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）２、６〜８、９、１４、および１６位に２’−Ｆ修飾；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチドの２１および２２位の間、およびヌクレオチドの２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合；および
（ｉｖ）（５’末端から数えて）７位に二本鎖の熱不安定化修飾；
を有するアンチセンス鎖と、を含み、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドオーバーハング、およびアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
【０１０４】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、
（ａ）（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）３’末端に結合される、三価分岐状リンカーを通じて結合される３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含むＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）７、９、１０、および１１位に２’−Ｆ修飾；および
（ｉｖ）（５’末端から数えて）ヌクレオチドの１および２位の間、およびヌクレオチドの２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合；
を有するセンス鎖と、
（ｂ）（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）２、６、１４、および１６位に２’−Ｆ修飾；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチドの１および２位の間、ヌクレオチドの２および３位の間、ヌクレオチドの２１および２２位の間、およびヌクレオチドの２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合；および
（ｉｖ）（５’末端から数えて）７位に二本鎖の熱不安定化修飾；
を有するアンチセンス鎖と、を含み、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドオーバーハング、およびアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
【０１０５】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、
（ａ）（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）３’末端に結合される、三価分岐状リンカーを通じて結合される３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含むＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）７、９、１０、および１１位に２’−Ｆ修飾；および
（ｉｖ）（５’末端から数えて）ヌクレオチドの１および２位の間、およびヌクレオチドの２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合；
を有するセンス鎖と、
（ｂ）（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）２、１４、および１６位に２’−Ｆ修飾；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチドの１および２位の間、ヌクレオチドの２および３位の間、ヌクレオチドの２１および２２位の間、およびヌクレオチドの２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合；および
（ｉｖ）（５’末端から数えて）６または７位に二本鎖の熱不安定化修飾；
を有するアンチセンス鎖と、を含み、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドオーバーハング、およびアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
【０１０６】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、
（ａ）（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）３’末端に結合される、三価分岐状リンカーを通じて結合される３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含むＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）７、９、１０、および１１位に２’−Ｆ修飾；および
（ｉｖ）（５’末端から数えて）ヌクレオチドの１および２位の間、およびヌクレオチドの２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合；
を有するセンス鎖と、
（ｂ）（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）２、６、８、９、１４、および１６位に２’−Ｆ修飾；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチドの１および２位の間、ヌクレオチドの２および３位の間、ヌクレオチドの２１および２２位の間、およびヌクレオチドの２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合；および
（ｉｖ）（５’末端から数えて）７位に二本鎖の熱不安定化修飾；
を有するアンチセンス鎖と、を含み、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドオーバーハング、およびアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
【０１０７】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、
（ａ）（ｉ）２１ヌクレオチド長；
（ｉｉ）３’末端に結合される、三価分岐状リンカーを通じて結合される３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含むＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）７、９、１０、および１１位に２’−Ｆ修飾；および
（ｉｖ）（５’末端から数えて）ヌクレオチドの１および２位の間、およびヌクレオチドの２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合；
を有するセンス鎖と、
（ｂ）（ｉ）２３ヌクレオチド長；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）２、１４、および１６位に２’−Ｆ修飾；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチドの１および２位の間、ヌクレオチドの２および３位の間、ヌクレオチドの２１および２２位の間、およびヌクレオチドの２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合；および
（ｉｖ）（５’末端から数えて）７位に二本鎖の熱不安定化修飾；
を有するアンチセンス鎖と、を含み、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドオーバーハング、およびアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
【０１０８】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、
（ｉ）（５’末端から数えて）２、１４、および１６位に２’−Ｆ修飾；および
（２）（５’末端から数えて）６または７位に二本鎖の熱不安定化修飾
を有するアンチセンス鎖を含む。
【０１０９】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、
（ａ）（ｉ）前記ＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチドの１および２位の間、およびヌクレオチドの２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合；
を有するセンス鎖と、
（ｂ）（ｉ）（５’末端から数えて）２、１４、および１６位に２’−Ｆ修飾；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）６または７位に二本鎖の熱不安定化修飾；
を有するアンチセンス鎖と、を含む。
【０１１０】
別の特定の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、
（ａ）（ｉ）３’末端に結合される、三価分岐状リンカーを通じて結合される３つのＧａｌＮＡｃ誘導体を含むＡＳＧＰＲリガンド；
（ｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチドの１および２位の間、およびヌクレオチドの２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合；
を有するセンス鎖と、
（ｂ）（ｉｉ）（５’末端から数えて）２、１４、および１６位に２’−Ｆ修飾；
（ｉｉｉ）（５’末端から数えて）ヌクレオチドの１および２位の間、ヌクレオチドの２および３位の間、ヌクレオチドの２１および２２位の間、およびヌクレオチドの２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合；および
（ｉｖ）（５’末端から数えて）６または７位に二本鎖の熱不安定化修飾；
を有するアンチセンス鎖と、を含み、アンチセンス鎖の３’末端に２ヌクレオチドオーバーハング、およびアンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する。
【０１１１】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つのＡＳＧＰＲリガンドをさらに含む。例えば、ＡＳＧＰＲリガンドは、二価または三価分岐状リンカーを通じて結合される１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体、例えば：
【化１４】
2020500929.tif 000015
である。
【０１１２】
一例では、ＡＳＧＰＲリガンドは、センス鎖の３’末端に結合される。
【０１１３】
本明細書に記載のｄｓＲＮＡ剤のいずれかによって標的化されるＳｅｒｐｉｎａ１  ｍＲＮＡの領域は、配列番号１のヌクレオチド１４４０〜１４８０；または配列番号１のヌクレオチド１４４１〜１４７９；または配列番号１のヌクレオチド１４４２〜１４７８；または配列番号１のヌクレオチド１４４３〜１４７７；または配列番号１のヌクレオチド１４４４〜１４７６；または配列番号１のヌクレオチド１４４５〜１４７５；または配列番号１のヌクレオチド１４４６〜１４７４；または配列番号１のヌクレオチド１４４７〜１４７３；または配列番号１のヌクレオチド１４４８〜１４７３；または配列番号１のヌクレオチド１４４８〜１４７２；または配列番号１のヌクレオチド１４４８〜１４７１；または配列番号１のヌクレオチド１４４８〜１４７０；または配列番号１のヌクレオチド１４４７〜１４６９；または配列番号１のヌクレオチド１４４６〜１４７８；または配列番号１のヌクレオチド１４４９〜１４７１；または配列番号１のヌクレオチド１４５０〜１４７２；または配列番号１のヌクレオチド１４４０〜１４７５；または配列番号１のヌクレオチド１４４５〜１４８０；または配列番号１のヌクレオチド１４４５〜１４７５であってもよい。
【０１１４】
本発明はまた、本発明のｄｓＲＮＡ剤を含むベクター、細胞、および医薬組成物を提供する。
【０１１５】
本発明の医薬組成物は、非緩衝液、例えば生理食塩水もしくは水；または緩衝液、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、もしくはリン酸塩またはそれらの任意の組み合わせを含む緩衝液、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）であってもよい。
【０１１６】
一態様では、本発明は、細胞におけるＳｅｒｐｉｎａ１の発現を阻害する方法を提供する。この方法は、該細胞を本発明の前述のｄｓＲＮＡ剤または医薬組成物のいずれかと接触させ、それにより細胞におけるＳｅｒｐｉｎａ１遺伝子の発現を阻害することを含む。
【０１１７】
一実施形態では、該細胞は、対象、例えばヒト対象に存在する。
【０１１８】
一実施形態では、Ｓｅｒｐｉｎａ１の発現は、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、または約１００％阻害される。
【０１１９】
一態様では、本発明は、Ｓｅｒｐｉｎａ１関連疾患を有する対象を治療する方法を提供する。この方法は、本発明の前述のｄｓＲＮＡ剤または医薬組成物のいずれかを治療有効量で対象に投与し、それにより前記対象を治療することを含む。
【０１２０】
一実施形態では、該対象は、ヒトである。
【０１２１】
一実施形態では、Ｓｅｒｐｉｎａ１関連疾患は、肝障害である。
【０１２２】
一実施形態では、肝障害は、慢性肝疾患、肝臓炎、硬変症、肝線維症、および／または肝細胞がんからなる群から選択される。
【０１２３】
別の態様では、本発明は、Ｓｅｒｐｉｎａ１欠損変異体を有する対象における肝細胞がんの発現を阻害する方法を提供する。この方法は、本発明の前述のｄｓＲＮＡ剤または医薬組成物のいずれかを治療有効量で対象に投与し、それにより対象における肝細胞がんの発現を阻害することを含む。
【０１２４】
さらに別の態様では、本発明は、Ｓｅｒｐｉｎａ１欠損変異体を有する対象の肝臓におけるミスフォールドしたＳｅｒｐｉｎａ１の蓄積を低減する方法を提供する。この方法は、本発明の前述のｄｓＲＮＡ剤または医薬組成物のいずれかを治療有効量で対象に投与し、それにより対象の肝臓におけるミスフォールドしたＳｅｒｐｉｎａ１の蓄積を低減することを含む。
【０１２５】
ｄｓＲＮＡ剤は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇもしくは約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量；または約１０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの用量で対象に投与されてもよい。
【０１２６】
ｄｓＲＮＡ剤は、皮下または静脈内に対象に投与されてもよい。
【０１２７】
ｄｓＲＮＡ剤は、２以上の用量で対象に投与されてもよい。
【０１２８】
本発明は、以下の詳細な説明および図面によりさらに例示される。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１Ａ】ＡＤ−６１４４４；ＡＤ−７５９９４；およびＡＤ−７５９９５の修飾されたセンスおよびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を模式的に示す。各々、配列番号３６〜３７、３６、３８、３６および３９を出現順序で開示する。
【図１Ｂ】指定のｄｓＲＮＡ剤の投与のＡＡＴ（Ｓｅｒｐｉｎａ）の発現レベルに対するインビボ効果を表すグラフである。示されるＡＡＴの発現レベルは、ＡＡＴの発現の出血前レベルと比較される。
【図１Ｃ】ＡＤ−６１４４４；ＡＤ−７７４０４；およびＡＤ−７７４１２の修飾されたセンスおよびアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を模式的に示す。各々、配列番号３６〜３７、３６〜３７、３６および３９を出現順序で開示する。
【図１Ｄ】指定のｄｓＲＮＡ剤の投与のＡＡＴ（Ｓｅｒｐｉｎａ）の発現レベルに対するインビボ効果を表すグラフである。
【図２Ａ】治療から１６時間後、１０ｎＭのｄｓＲＮＡ剤がトランスフェクトされたＨｅｐ３Ｂ細胞におけるＡＤ−６１４４４のオフターゲット効果を表すグラフである。
【図２Ｂ】治療から１６時間後、１０ｎＭのｄｓＲＮＡ剤がトランスフェクトされたＨｅｐ３Ｂ細胞におけるＡＤ−７７４１２のオフターゲット効果を表すグラフである。
【図３Ａ】指定薬剤が０．３ｍｇ／ｋｇの単回用量で投与された非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるＡＡＴサイレンシングの有効性および耐久性を表すグラフである。示されるＡＡＴの発現レベルは、投与前の−７および−１日目に測定されたＡＡＴの発現の出血前レベルと比較される。
【図３Ｂ】指定薬剤が１ｍｇ／ｋｇの単回用量で投与された非ヒト霊長類におけるＡＡＴサイレンシングの耐久性を表すグラフである。示されるＡＡＴの発現レベルは、投与前の−７および−１日目に測定されたＡＡＴの発現の出血前レベルと比較される。
【図３Ｃ】指定薬剤が３ｍｇ／ｋｇの単回用量で投与された非ヒト霊長類におけるＡＡＴサイレンシングの耐久性を表すグラフである。示されるＡＡＴの発現レベルは、投与前の−７および−１日目に測定されたＡＡＴの発現の出血前レベルと比較される。
【図３Ｄ】指定薬剤が１０ｍｇ／ｋｇの単回用量で投与された非ヒト霊長類におけるＡＡＴサイレンシングの耐久性を表すグラフである。示されるＡＡＴの発現レベルは、投与前の−７および−１日目に測定されたＡＡＴの発現の出血前レベルと比較される。
【発明を実施するための形態】
【０１３０】
本発明は、Ｓｅｒｐｉｎａ１を標的にする薬剤、例えばＲＮＡｉ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤を含む組成物を提供する。さらに開示されるのは、Ｓｅｒｐｉｎａ１の発現を阻害し、かつＳｅｒｐｉｎａ１関連疾患、例えば肝障害、例えば、慢性肝疾患、肝臓炎、硬変症、肝線維症、および／または肝細胞がんを治療するため、本発明の組成物を用いる方法である。
【０１３１】
本発明は、少なくとも部分的には、オフターゲット遺伝子サイレンシング効果を低減しつつ、標的遺伝子発現の阻害にとって有利である、Ｓｅｒｐｉｎａ１を標的にするｄｓＲＮＡ剤、ならびに治療用途に適したかかる薬剤を含む組成物にとって有効なヌクレオチドまたは化学的モチーフの発見に基づく。より詳細には、特に、Ｓｅｒｐｉｎａ１を標的にするｄｓＲＮＡ剤が、アンチセンス鎖がシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端から数えて５’末端の２〜９位に）二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、かつ／またはｄｓＲＮＡ剤が約４０℃〜約８０℃の範囲内の融解温度を有する場合、ＲＮＡ干渉を媒介するのに、不安定化修飾を欠いている親ｄｓＲＮＡ剤よりも有効であり得ることが発見されている。
【０１３２】
Ｉ．定義
本発明がより容易に理解されるように、特定の用語を最初に定義する。これに加えて、パラメータの値または値範囲が列挙される場合は常に、列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図されることに留意すべきである。
【０１３３】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の１つまたは２つ以上（すなわち少なくとも１つ）の文法的目的に言及するために、本明細書で使用される。一例として「因子（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの因子、または例えば複数の因子などの２つ以上の因子を意味する。
【０１３４】
「含む」という用語は、本明細書では、「をはじめとするが、これに限定されるものではない」という用語を意味するために使用され、またそれと区別なく使用される。
【０１３５】
「または」という用語は、本明細書では、文脈上、明確に別の意味でない限り、「および／または」という用語を意味するために使用され、またそれと区別なく使用される。
【０１３６】
本明細書で用いられるとき、「Ｓｅｒｐｉｎａ１」は、セルピンペプチダーゼ阻害剤、クレードＡ、メンバー１遺伝子またはタンパク質を指す。Ｓｅｒｐｉｎａ１は、アルファ−１アンチトリプシン、α−１−アンチトリプシン、ＡＡＴ、プロテアーゼ阻害剤１、ＰＩ、ＰＩ１、抗エラスターゼ、およびアンチトリプシンとしても公知である。
【０１３７】
Ｓｅｒｐｉｎａ１という用語は、ヒトＳｅｒｐｉｎａ１を含み、そのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、例えばジェンバンク受入番号ＧＩ：１８９１６３５２４（配列番号１）、ＧＩ：１８９１６３５２５（配列番号２）、ＧＩ：１８９１６３５２６（配列番号３）、ＧＩ：１８９１６３５２７（配列番号４）、ＧＩ：１８９１６３５２９（配列番号５）、ＧＩ：１８９１６３５３１（配列番号６）、ＧＩ：１８９１６３５３３（配列番号７）、ＧＩ：１８９１６３５３５（配列番号８）、ＧＩ：１８９１６３５３７（配列番号９）、ＧＩ：１８９１６３５３９（配列番号１０）、および／またはＧＩ：１８９１６３５４１（配列番号１１）中に見出されることがあり；アカゲザルＳｅｒｐｉｎａ１を含み、そのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、例えばジェンバンク受入番号ＧＩ：４０２７６６６６７（配列番号１２）、ＧＩ：２９７２９８５１９（配列番号１３）、および／またはＧＩ：２９７２９８５２０（配列番号１４）中に見出されることがあり；マウスＳｅｒｐｉｎａ１を含み、そのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、例えばジェンバンク受入番号ＧＩ：３５７５８８４２３および／またはＧＩ：３５７５８８４２６中に見出されることがあり；またラットを含み、そのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、例えばジェンバンク受入番号ＧＩ：７７０２０２４９中に見出されることがある。Ｓｅｒｐｉｎａ１  ｍＲＮＡ配列のさらなる例が、例えばジェンバンクおよびＯＭＩＭを用いて容易に利用可能である。
【０１３８】
Ｓｅｒｐｉｎａ１の１２０を超える対立遺伝子が同定されており、「Ｍ」対立遺伝子は、野生型または「正常な」対立遺伝子（例えば、「ＰＩＭ１−ＡＬＡ２１３」（ＰＩ、Ｍ１Ａとしても公知）、「ＰＩＭ１−ＶＡＬ２１３」（ＰＩ，ＭＩＶとしても公知）、「ＰＩＭ２」、「ＰＩＭ３」、およびＰＩＭ４」）と考えられる。さらなる変異体が、例えば、Ａ（１）ＡＴＶａｒデータベース（例えば、Ｚａｉｍｉｄｏｕ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ．２３０（３）：３０８−１３およびｗｗｗ．ｇｏｌｄｅｎｈｅｌｉｘ．ｏｒｇ／Ａ１ＡＴＶａｒを参照）中に見出されることがある。
【０１３９】
本明細書で用いられるとき、用語「Ｓｅｒｐｉｎａ１欠損対立遺伝子」は、適切にフォールディングせず、細胞内で凝集することがあり、ひいては肝臓における合成部位から体内の作用部位へ適切に輸送されないタンパク質を産生する変異体対立遺伝子を指す。
【０１４０】
例示的なＳｅｒｐｉｎａ１欠損対立遺伝子は、「Ｚ対立遺伝子」、「Ｓ対立遺伝子、「ＰＩＭ（Ｍａｌｔｏｎ）対立遺伝子」、および「ＰＩＭ（Ｐｒｏｃｉｄａ）対立遺伝子」を含む。
【０１４１】
本明細書で用いられるとき、用語「Ｚ対立遺伝子」、「ＰＩＺ」および「Ｚ−ＡＡＴ」は、タンパク質の３４２位のアミノ酸が、関連のコドンがＧＡＧからＡＡＧへ変更されている結果としてグルタミンからリジンへ変更される場合のＳｅｒｐｉｎａ１の変異体対立遺伝子を指す。Ｚ対立遺伝子についてホモ接合性の対象は、「ＰＩＺＺ」と称され得る。Ｚ−ＡＡＴ突然変異は、Ｓｅｒｐｉｎａ１欠損患者の９５％を占め、米国の１００，０００人および全世界の約３百万人において存在すると評価されている。Ｚ対立遺伝子は、コーカサス人においては多型頻度に達し、アジア人および黒人においては希少または不在である。ホモ接合性ＺＺ表現型は、気腫および肝疾患の双方が高リスクであることに関連する。Ｚ−ＡＡＴタンパク質は、小胞体において正確にフォールディングせず、凝集し、分泌を低減するループシートポリマーに至り、アンフォールドタンパク質応答、アポトーシス、小胞体過負荷応答、オートファジー、ミトコンドリアストレス、および改変された肝細胞機能を誘発する。
【０１４２】
本明細書で用いられるとき、用語「ＰＩＭ（Ｍａｌｔｏｎ）」および「Ｍ（Ｍａｌｔｏｎ）−ＡＡＴ」は、成熟タンパク質の５１または５２位の隣接するフェニルアラニン残基の一方が欠失される場合のＳｅｒｐｉｎａ１の変異体対立遺伝子を指す。この１つのアミノ酸の欠失により、βシートＢ６の１本の鎖が短縮され、肝臓における正常なプロセシングおよび分泌が阻止され、それは肝細胞封入体および肝臓からのタンパク質の分泌障害に関連する。
【０１４３】
本明細書で用いられるとき、用語「ＰＩＳ」は、２６４位のグルタミン酸がバリンと置換される場合のＳｅｒｐｉｎａ１の変異体対立遺伝子を指す。この変異体タンパク質の大部分は細胞内で分解されるが、コーカサス集団内ではＰＩＳ対立遺伝子が高頻度で存在し、それ故、Ｚまたはヌル対立遺伝子とのヘテロ接合化合物が多く認められる。
【０１４４】
本明細書で用いられるとき、「標的配列」は、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡを含む、Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子の転写の間に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の隣接部分を指す。
【０１４５】
本明細書で用いられるとき、用語「配列を含む鎖」は、標準のヌクレオチド命名法を用いて参照される配列によって記述されるヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。
【０１４６】
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」および「Ｕ」は各々、一般に、塩基としてグアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルを各々有するヌクレオチドを表す。「Ｔ」および「ｄＴ」は、本明細書中で交換可能に用いられ、核酸塩基が、チミン、例えば、デオキシリボチミン、２’−デオキシチミジンまたはチミジンであるようなデオキシリボヌクレオチドを指す。しかし、用語「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」または「デオキシリボヌクレオチド」がまた、以下にさらに詳述される通り、修飾ヌクレオチド、または代替置換部分を指し得ることは理解されるであろう。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルが、かかる置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成特性を実質的に変更することなく、他の部分で置換されてもよいことは十分に理解している。例えば、限定はされないが、自らの塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを有するヌクレオチドと塩基対合してもよい。したがって、ウラシル、グアニン、またはアデニンを有するヌクレオチドは、本発明のヌクレオチド配列内で、例えばイノシンを有するヌクレオチドで置換されてもよい。かかる置換部分を含む配列は、本発明の実施形態である。  
【０１４７】
「オリゴヌクレオチド」とも称される「ポリヌクレオチド」は、隣接ヌクレオシドの相互の共有結合を介して形成され、直鎖状の多量体オリゴヌクレオチドを形成する。ポリヌクレオチド構造内部のリン酸基は、一般に、ポリヌクレオチドのヌクレオシド間結合を形成するものとして示される。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであってもよく、例えば、約１００、２００、３００、または約４００ヌクレオチド長未満である。
【０１４８】
「ｉＲＮＡ」、「ＲＮＡｉ剤」、「ｉＲＮＡ剤」、「ＲＮＡ干渉剤」という用語は、本明細書で同義的に使用され、本明細書定義で定義されるＲＮＡを含有して、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を通じたＲＮＡ転写物の標的切断を媒介する薬剤を指す。ｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られている過程を通じて、ｍＲＮＡの配列特異的分解を誘発する。ｉＲＮＡは、例えば哺乳類対象などの対象内の細胞などの細胞内で、Ｓｅｒｐｉｎａ１発現を調節し、例えば阻害する。
【０１４９】
本明細書で用いられるとき、語句「ＲＮＡｉを媒介する」は、配列特異的様式で標的ＲＮＡをサイレンシングする能力を指す。理論によって拘束されることを望まないが、サイレンシングでは、ＲＮＡｉ機構またはプロセス、およびガイドＲＮＡ、例えば２１〜２３ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ剤が用いられることが考えられる。
【０１５０】
一実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤としては、例えばＳｅｒｐｉｎａ１標的ｍＲＮＡ配列などの標的ＲＮＡ配列と相互作用して、標的ＲＮＡの切断を誘導する一本鎖ＲＮＡが挙げられる。理論に拘束されたくないが、細胞に導入される長い二本鎖ＲＮＡが、ダイサーとして公知のＩＩＩ型エンドヌクレアーゼにより、分解され、ｓｉＲＮＡが得られると考えられる（Ｓｈａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：４８５）。ダイサーのリボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素は、このｄｓＲＮＡを処理して、２塩基の３’オーバーハングを特徴とする１９〜２３塩基対の短い干渉ＲＮＡをもたらす（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３）。次に、このｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）中に組み込まれ、ここでは１つ以上のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二本鎖を巻き戻し、相補的なアンチセンス鎖が標的認識を導くことを可能にする（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｃｅｌｌ  １０７：３０９）。適切な標的ｍＲＮＡへの結合時、ＲＩＳＣ内部の１つ以上のエンドヌクレアーゼが標的を切断して、サイレンシングを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：１８８）。したがって、一態様では、本発明は、細胞内部で生成され、かつＲＩＳＣ複合体の形成を促進して標的遺伝子、すなわちＳｅｒｐｉｎａ１遺伝子のサイレンシングを行う、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓｓｉＲＮＡ）に関する。したがって、用語「ｓｉＲＮＡ」はまた、上記のようなＲＮＡｉを指すように本明細書で用いられる。
【０１５１】
別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、標的ｍＲＮＡを阻害するため、細胞または生物に導入される一本鎖ＲＮＡｉ剤であってもよい。一本鎖ＲＮＡｉ剤（ｓｓＲＮＡｉ）は、ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼのアルゴノート２に結合し、次に標的ｍＲＮＡを切断する。一本鎖ｓｉＲＮＡは、一般に１５〜３０個のヌクレオチドであり、化学的に修飾されている。一本鎖ＲＮＡｉ剤のデザインおよび試験は、そのそれぞれの内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第８，１０１，３４８号明細書、およびＬｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ  １５０：８８３−８９４に記載される。本明細書に記載されるあらゆるアンチセンスヌクレオチド配列は、本明細書に記載される一本鎖ｓｉＲＮＡとして、またはＬｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ  １５０：８８３−８９４に記載される方法で化学的に修飾して、使用してもよい。
【０１５２】
別の実施形態では、本発明の組成物、および方法で使用される「ｉＲＮＡ」は、二本鎖ＲＮＡであり、本明細書で「二本鎖ＲＮＡｉ剤」、「二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子」、「ｄｓＲＮＡ剤」または「ｄｓＲＮＡ」と称される。「ｄｓＲＮＡ」という用語は、標的ＲＮＡ、すなわちＳｅｒｐｉｎａ１遺伝子に関して「センス」および「アンチセンス」配向を有すると言及される、２本の逆平行で実質的に相補的な核酸鎖を含む、二本鎖構造を有するリボ核酸分子複合体を指す。本発明のいくつかの実施形態では、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、本明細書でＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉと称される転写後遺伝子サイレンシング機序を通じて、例えばｍＲＮＡなどの標的ＲＮＡ分解を引き起こす。
【０１５３】
一般に、ｄｓＲＮＡ剤の各鎖のヌクレオチドの大部分はリボヌクレオチドであるが、本明細書で詳述される通り、各鎖または両鎖はまた、１つ以上の非リボヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドを含み得る。さらに、本願中で用いられる通り、「ＲＮＡｉ剤」は化学修飾を有するリボヌクレオチドを含んでもよく；ＲＮＡｉ剤は複数のヌクレオチドに実質的修飾を含んでもよい。
本明細書で用いられるとき、用語「修飾ヌクレオチド」は、独立して、修飾糖部分、修飾ヌクレオチド間結合、および／または修飾核酸塩基を有するヌクレオチドを指す。したがって、修飾ヌクレオチドという用語は、ヌクレオシド間結合、糖部分、または核酸塩基に対する、例えば官能基または原子の置換、付加または除去を包含する。本発明の作用物質における使用に適した修飾は、本明細書に開示または当該技術分野で公知のすべてのタイプの修飾を含む。任意のかかる修飾は、本願および特許請求の範囲を目的として、ｓｉＲＮＡ型分子中で用いられるとき、「ＲＮＡｉ剤」によって包含される。
【０１５４】
二本鎖領域は、ＲＩＳＣ経路を通じた所望の標的ＲＮＡ特異的分解を可能にするあらゆる長さであってもよく、約９〜３６塩基対長さなどの範囲であってもよく、例えば約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６塩基対長さなどの約１５〜３０塩基対長さ、例えば約１５〜３０、１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１５〜１７、１８〜３０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜３０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２９、２０〜２８、２０〜２７、２０〜２６、２０〜２５、２０〜２４，２０〜２３、２０〜２２、２０〜２１、２１〜３０、２１〜２９、２１〜２８、２１〜２７、２１〜２６、２１〜２５、２１〜２４、２１〜２３、または２１〜２２塩基対長さなどである。列挙された範囲および長さの中間の範囲および長さもまた、本発明の一部であることが意図される。
【０１５５】
二本鎖構造を形成する２本の鎖は、より大型のＲＮＡ分子の異なる部分であってもよく、またはそれらは別のＲＮＡ分子であってもよい。２本の鎖が１つのより大型の分子の部分であり、したがって二本鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端と、それぞれの他方の鎖の５’末端との間が中断されていないヌクレオチド鎖によって結合される場合、結合ＲＮＡ鎖は「ヘアピンループ」と称される。ヘアピンループは、少なくとも１つの不対ヌクレオチドを含み得て；いくつかの実施形態では、ヘアピンループは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも２３以上の不対ヌクレオチドを含み得る。
【０１５６】
ｄｓＲＮＡの２本の実質的に相補的な鎖が、別のＲＮＡ分子によって構成されている場合、これらの分子は共有結合的に連結され得るが、必ずしもそうである必要はない。２本の鎖が、二本鎖構造を形成する１本の鎖の３’末端と、それぞれの他方の鎖の５’末端との間で、中断されていないヌクレオチド鎖以外の手段によって共有結合される場合、結合構造は「リンカー」と称される。ＲＮＡ鎖は、同じまたは異なるヌクレオチド数を有してもよい。最大塩基対数は、ｄｓＲＮＡの最短鎖中のヌクレオチド数から、二本鎖中に存在するあらゆるオーバーハングを差し引いた数である。二本鎖構造に加えて、ＲＮＡｉは、１つまたは複数のヌクレオチドオーバーハングを含んでもよい。
【０１５７】
一実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、標的ＲＮＡの切断を誘導するため、標的ＲＮＡ配列、例えばＳｅｒｐｉｎａ１標的ｍＲＮＡ配列と相互作用するｄｓＲＮＡであり、その各鎖は１９〜２３ヌクレオチドを含む。理論に拘束されたくないが、細胞に導入される長い二本鎖ＲＮＡは、ダイサーとして公知のＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによりｓｉＲＮＡに分解される（Ｓｈａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：４８５）。ダイサーのリボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素は、ｄｓＲＮＡを処理して、特徴的な２塩基の３’オーバーハングを有する１９〜２３塩基対の短い干渉ＲＮＡをもたらす（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３）。次に、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）中に組み込まれ、ここでは１つ以上のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二本鎖を巻き戻し、相補的なアンチセンス鎖が標的認識を誘導することを可能にする（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｃｅｌｌ  １０７：３０９）。適切な標的ｍＲＮＡへの結合時、ＲＩＳＣ内部の１つ以上のエンドヌクレアーゼが標的を切断して、サイレンシングを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：１８８）。
【０１５８】
本明細書の用法では、「ヌクレオチドオーバーハング」という用語は、例えばｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡの二本鎖構造から突出する、少なくとも１つの不対ヌクレオチドを指す。例えばｄｓＲＮＡの１本の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を越えて伸びる、またはその逆の場合、ヌクレオチドオーバーハングがある。ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーハングを含み得て；代案としては、オーバーハングは、少なくとも２つのヌクレオチド、少なくとも３つのヌクレオチド、少なくとも４つのヌクレオチド、少なくとも５つ以上のヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシリボヌクレオチド／ヌクレオシドをはじめとする、ヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含み得て、またはそれからなる。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、またはそのあらゆる組み合わせの上にあり得る。さらにオーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンスまたはセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端、または双方の末端上に存在し得る。
【０１５９】
一実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、例えば３’末端および／または５’末端でオーバーハングする、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドなどの１〜１０ヌクレオチドを有する。一実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、例えば３’末端および／または５’末端でオーバーハングする、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドなどの１〜１０ヌクレオチドを有する。別の実施形態では、オーバーハング中の１つまたは複数のヌクレオチドは、チオリン酸ヌクレオシドで置換されている。
【０１６０】
特定の実施形態では、センス鎖またはアンチセンス鎖、または双方におけるオーバーハングは、１０より長く拡張されたヌクレオチド長、例えば、１０〜３０ヌクレオチド長、１０〜２５ヌクレオチド長、１０〜２０ヌクレオチド長、または１０〜１５ヌクレオチド長を含み得る。特定の実施形態では、拡張されたオーバーハングは、二本鎖のセンス鎖上に存在する。特定の実施形態では、拡張されたオーバーハングは、二本鎖のセンス鎖の３’末端上に存在する。特定の実施形態では、拡張されたオーバーハングは、二本鎖のセンス鎖の５’末端上に存在する。特定の実施形態では、拡張されたオーバーハングは、二本鎖のアンチセンス鎖上に存在する。特定の実施形態では、拡張されたオーバーハングは、二本鎖のアンチセンス鎖の３’末端上に存在する。特定の実施形態では、拡張されたオーバーハングは、二本鎖のアンチセンス鎖の５’末端上に存在する。特定の実施形態では、拡張されたオーバーハング中のヌクレオチドの１つ以上がヌクレオシドチオリン酸と置き換えられる。
【０１６１】
用語「平滑」または「平滑末端化された」は、ｄｓＲＮＡに関連して本明細書で用いられるとき、ｄｓＲＮＡの所与の末端に不対ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が存在しない、すなわちヌクレオチドオーバーハングが存在しないことを意味する。ｄｓＲＮＡの片または両末端は、平滑末端化され得る。ｄｓＲＮＡの両末端が平滑である場合、ｄｓＲＮＡは、平滑末端化されていると言われる。明らかにするため、「平滑末端化された」ｄｓＲＮＡは、両末端が平滑である、すなわち該分子の片末端にヌクレオチドオーバーハングが存在しないようなｄｓＲＮＡである。ほとんどの場合、かかる分子は、その全長にわたり二本鎖となる。
【０１６２】
用語「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」は、標的配列、例えばＳｅｒｐｉｎａ１  ｍＲＮＡに実質的に相補的な領域を含むｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡの鎖を指す。
【０１６３】
本明細書で用いられるとき、用語「相補性領域」は、本明細書で定義される通り、配列、例えば標的配列、例えばＳｅｒｐｉｎａ１ヌクレオチド配列に実質的に相補的であるアンチセンス鎖上の領域を指す。相補性領域の標的配列に対する相補性が完全でない場合、ミスマッチは分子の内部または末端領域内に存在し得る。一般に、最も許容的なミスマッチは、末端領域内、例えば、ｉＲＮＡの５’末端および／または３’末端の５、４、３、もしくは２つのヌクレオチドの中に存在する。
【０１６４】
用語「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」は、本明細書で用いられるとき、本明細書中で定義される通りのアンチセンス鎖の領域に実質的に相補的である領域を含むｉＲＮＡの鎖を指す。
【０１６５】
本明細書で用いられるとき、用語「切断領域」は、切断部位に直に隣接して存在する領域を指す。切断部位は、切断がなされる標的上の部位である。一部の実施形態では、切断領域は、切断部位のいずれかの端上に直に隣接して３つの塩基を含む。一部の実施形態では、切断領域は、切断部位のいずれかの端上に直に隣接して２つの塩基を含む。一部の実施形態では、切断部位は、アンチセンス鎖のヌクレオチド１０および１１によって結合される部位に特に存在し、かつ切断領域は、ヌクレオチド１１、１２および１３を含む。
【０１６６】
本明細書の用法では、特に断りのない限り、「相補的」という用語は、第２のヌクレオチド配列との関連で第１のヌクレオチド配列を記述するのに使用される場合、当業者に理解されるであろうように、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、特定条件下で、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズして、二本鎖構造を生成する能力を指す。このような条件は、例えばストリンジェントな条件であり得て、ストリンジェントな条件としては、４００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．４の４０ｍＭのＰＩＰＥＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２〜１６時間と、それに続く洗浄が挙げられる。生物中で遭遇し得る生理学的に妥当な条件などのその他の条件が、適用され得る。例えば、相補的配列は、核酸の関連機能、例えばＲＮＡｉの進行を可能にするのに十分である。当業者は、２つの配列の相補性の試験にとって最適な条件セットを、ハイブリダイズされたヌクレオチドの最終的な適用に従って決定することができるであろう。
【０１６７】
配列は、最初のヌクレオチド配列のヌクレオチドと２番目のヌクレオチド配列のヌクレオチドとの塩基対形成が最初および２番目のヌクレオチド配列の全長にわたり存在するとき、各々に対して「完全に相補的」であり得る。しかし本明細書で第１の配列が第２の配列に関して「実質的に相補的」と称される場合、２つの配列は完全に相補的であり得て、またはそれらはハイブリダイゼーションに際して、それらの最終用途に最も妥当な条件下でハイブリダイズする能力を保ちながら、１つまたは複数であるが概して４、３または２以下のミスマッチ塩基対を形成し得る。しかしハイブリダイゼーションに際して、１つまたは複数の一本鎖オーバーハングを形成するように、２つのオリゴヌクレオチドがデザインされる場合、このようなオーバーハングは、相補性の判定に関してミスマッチと見なされないものとする。例えば２１ヌクレオチド長の１つのオリゴヌクレオチドと、２３ヌクレオチド長の別のオリゴヌクレオチドとを含み、より長いオリゴヌクレオチドがより短いオリゴヌクレオチドと完全に相補的な２１ヌクレオチドの配列を含むｄｓＲＮＡは、本明細書に記載される目的では、なおも「完全に相補的」と称される。
【０１６８】
「相補的」配列は、本明細書の用法ではまた、それらのハイブリダイズ能力に関する上の要件が満たされる限りにおいて、非ワトソン・クリック塩基対および／または非天然および修飾ヌクレオチドから形成される塩基対も含み、またはそれから完全に形成され得る。このような非ワトソン・クリック塩基対としては、Ｇ：Ｕゆらぎ塩基対またはフーグスティーン型塩基対が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１６９】
本明細書では、「相補的」、「完全に相補的」、および「実質的に相補的」という用語は、それらが使用される文脈から理解されるであろうように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖間の、またはｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列間の塩基整合に関して使用し得る。
【０１７０】
本明細書で用いられるとき、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）「の少なくとも一部に対して実質的に相補的」であるポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、または３’ＵＴＲを含む、目的のｍＲＮＡ（例えば、Ｓｅｒｐｉｎａ１をコードするｍＲＮＡ）の隣接部分に対して実質的に相補的であるポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、Ｓｅｒｐｉｎａ１  ｍＲＮＡの少なくとも一部に対して、該配列がＳｅｒｐｉｎａ１をコードするｍＲＮＡの非中断部分に対して実質的に相補的である場合、相補的である。
【０１７１】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、Ｓｅｒｐｉｎａ１標的ＲＮＡ、例えば標的ｍＲＮＡに対して「十分に相補的」であることで、該ｄｓＲＮＡ剤は、標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の産生をサイレンシングする。別の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、標的ＲＮＡに対して「正確に相補的」または完全に相補的であり、例えば、標的ＲＮＡおよびｄｓＲＮＡ二本鎖剤はアニールし、例えば、専ら正確な相補性の領域内でワトソン・クリック塩基対からなるハイブリッドを形成する。「十分に相補的な」標的ＲＮＡは、標的ＲＮＡに対して正確に相補的な（例えば、少なくとも１０ヌクレオチドの）内部領域を含み得る。さらに、一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、単一ヌクレオチド差異を特異的に区別する。この場合、ｄｓＲＮＡ剤は、正確な相補性が単一ヌクレオチド差異（例えば、その７ヌクレオチド以内の）領域内に見出される場合に限り、ＲＮＡｉを媒介する。
【０１７２】
用語「ＢＮＡ」は、架橋化核酸を指し、制約された、または接近困難なＲＮＡとして示されることが多い。ＢＮＡは、「固定された」Ｃ３’エンドの糖パッカリングを伴う、５員、６員、またはさらに７員架橋構造を有し得る。架橋は、典型的にはリボースの２’位、４’位に取り込まれ、２’、４’ＢＮＡヌクレオチド（例えば、ＬＮＡ、またはＥＮＡ）をもたらす。ＢＮＡヌクレオチドの例として、以下のヌクレオシド：
【化１５】
2020500929.tif 000016
が挙げられる。
【０１７３】
用語「ＬＮＡ」は、ロックド核酸を指し、制約された、または接近困難なＲＮＡとして示されることが多い。ＬＮＡは、修飾されたＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２’ヒドロキシルを同じリボース糖の４’炭素に連結する余分な架橋（例えば、メチレン架橋またはエチレン架橋）で修飾される。例えば、架橋は、３’エンドＮｏｒｔｈ）立体構造：
【化１６】
2020500929.tif 000017
においてリボースを「ロックし」得る。
【０１７４】
用語「ＥＮＡ」は、エチレン架橋核酸を指し、制約された、または接近困難なＲＮＡとして参照されることが多い。
【０１７５】
用語「阻害する」は、本明細書で用いられるとき、「低減する」、「サイレンシングする」、「下方制御する」、「抑制する」および他の類似用語と交換可能に用いられ、任意のレベルの阻害を含む。
【０１７６】
語句「Ｓｅｒｐｉｎａ１の発現を阻害する」は、本明細書で用いられるとき、任意のＳｅｒｐｉｎａ１遺伝子（例えば、マウスＳｅｒｐｉｎａ１遺伝子、ラットＳｅｒｐｉｎａ１遺伝子、サルＳｅｒｐｉｎａ１遺伝子、またはヒトＳｅｒｐｉｎａ１遺伝子など）および変異体（例えば、天然に存在する変異体）、またはＳｅｒｐｉｎａ１遺伝子の突然変異体の発現の阻害を含む。したがって、Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子は、野生型Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子、Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子変異体、Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子突然変異体、または遺伝子操作された細胞、細胞群、もしくは生物と関連したトランスジェニックＳｅｒｐｉｎａ１遺伝子であってもよい。
【０１７７】
「Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子の発現を阻害すること」は、Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子の任意のレベルの阻害、例えば、Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制、例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の阻害を含む。
【０１７８】
Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子の発現は、Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子発現に関連した任意の変数のレベル、例えば、Ｓｅｒｐｉｎａ１のｍＲＮＡレベル、Ｓｅｒｐｉｎａ１のタンパク質レベル、または血清ＡＡＴレベルに基づいて評価されてもよい。阻害は、これら変数の１つ以上の対照レベルと比べての絶対的または相対的レベルにおける低下により評価されてもよい。対照レベルは、当該技術分野で用いられる任意のタイプの対照レベル、例えば、投与前ベースラインレベル、または未治療もしくは対照（例えば、緩衝液単独対照または活性薬剤対照など）で治療された類似の対象、細胞、または試料から測定されるレベルであってもよい。
【０１７９】
語句「細胞を二本鎖ＲＮＡｉ剤と接触させる」は、本明細書で用いられるとき、細胞を任意の可能な手段により接触させることを含む。細胞を二本鎖ＲＮＡｉ剤と接触させることは、細胞をインビトロでＲＮＡｉ剤と接触させること、または接触・ａ細胞をインビボでＲＮＡｉ剤と接触させることを含む。接触は、直接的または間接的に行われてもよい。したがって、例えば、ＲＮＡｉ剤は、この方法の個別な実施により、細胞と物理的接触状態にされてもよい、または代替的には、ＲＮＡｉ剤は、後に細胞との接触状態になることを許容する、もしくは引き起こすような状況に置かれてもよい。
【０１８０】
細胞のインビトロでの接触は、例えば細胞をＲＮＡｉ剤とともにインキュベートすることにより行われてもよい。細胞のインビボでの接触は、例えば、ｂｙｔｈｅＲＮＡｉ剤を細胞が位置する組織もしくはその近傍に注射することにより、またはＲＮＡｉ剤を別の領域、血流または皮下空間に注射し、薬剤が後に接触されるべき細胞が位置する組織に達するようにすることにより行われてもよい。例えば、ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ剤を目的の部位、例えば肝臓に誘導するリガンド、例えばＧａｌＮＡｃ３リガンドを含有してもよく、かつ／またはそれにカップリングされてもよい。インビトロおよびインビボでの接触方法の組み合わせもまた可能である。本発明の方法と関連して、細胞はまた、インビトロでＲＮＡｉ剤と接触され、その後に対象に移植されてもよい。
【０１８１】
「患者」または「対象」は、本明細書で用いられるとき、ヒトまたは非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、例えばサルのいずれかを含むように意図される。最も好ましくは、対象または患者は、ヒトである。
【０１８２】
「Ｓｅｒｐｉｎａ１関連疾患」は、本明細書で用いられるとき、Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子またはタンパク質に関連した任意の疾患、障害、または状態を含むように意図される。かかる疾患は、例えば、Ｓｅｒｐｉｎａ１タンパク質のミスフォールディング、Ｓｅｒｐｉｎａ１タンパク質（例えば、ミスフォールドしたＳｅｒｐｉｎａ１タンパク質）の細胞内蓄積、Ｓｅｒｐｉｎａ１タンパク質の過剰な産生、Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子変異体、Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子突然変異、Ｓｅｒｐｉｎａ１タンパク質の異常な切断、Ｓｅｒｐｉｎａ１と他のタンパク質または他の内因性もしくは外因性物質との間の異常な相互作用に起因してもよい。Ｓｅｒｐｉｎａ１関連疾患は、肝疾患および／または肺疾患であってもよい。
【０１８３】
「肝疾患」は、本明細書で用いられるとき、肝臓および／またはその機能を冒す疾患、障害、または状態を含む。肝障害は、肝臓および／または肝細胞におけるＳｅｒｐｉｎａ１タンパク質の蓄積の結果であり得る。肝障害の例として、ウイルス感染、寄生虫感染、遺伝的素因、自己免疫性疾患、放射線への曝露、肝毒性化合物への曝露、機械的損傷、様々な環境毒素、アルコール、アセトアミノフェン、アルコールとアセトアミノフェンとの組み合わせ、吸入麻酔薬、ナイアシン、化学療法剤、抗生物質、鎮痛薬、制吐薬およびハーブサプリメントのキャバ、およびそれらの組み合わせに起因する肝障害が挙げられる。
【０１８４】
例えば、Ｓｅｒｐｉｎａ１欠損に関連した肝障害は、特定の対立遺伝子（例えば、ＰＩＺ、ＰｉＭ（Ｍａｌｔｏｎ）、および／またはＰＩＳ対立遺伝子）の１つ以上のコピーを有する対象において生じることがより多い。理論によって拘束されることを望まないが、α−１アンチトリプシン肝疾患を発現するリスクの増大に関連する対立遺伝子は、ミスフォールディングを受け、肝細胞から適切に分泌されないようなＳｅｒｐｉｎａ１の形態をコードすると考えられる。これらのミスフォールドタンパク質に対する細胞応答は、アンフォールドタンパク質応答（ＵＰＲ）、小胞体関連分解（ＥＲＡＤ）、アポトーシス、ＥＲ過負荷応答、オートファジー、ミトコンドリアストレスおよび改変された肝細胞機能を含み得る。肝細胞に対する損傷は、限定はされないが、炎症、胆汁うっ滞、線維症、硬変症、遷延性閉塞性黄疸、トランスアミナーゼ増加、門脈圧亢進症および／または肝細胞がんなどの症状をもたらし得る。理論によって拘束されることを望まないが、この疾患の非常に変化しやすい臨床経過は、症状の発現または重症度の進行に寄与するものとしての修飾因子または「第２のヒット」を示唆する。
【０１８５】
例えば、ＰＩＺ対立遺伝子を有する対象は、かかる因子に曝露される場合、Ｃ型肝炎感染またはアルコール乱用に対して感受性がより高い可能性があり、肝障害を発現させる可能性がより高い。加えて、ＰＩＺ対立遺伝子を保有する嚢胞性線維症（ＣＦ）対象は、門脈圧亢進症を伴う重篤な肝疾患を発現させるリスクがより高い。Ｓｅｒｐｉｎａ１の欠損はまた、若年性気腫、壊死性脂肪織炎、気管支拡張症、および／または遷延性新生児黄疸の発現の原因になり得、またはそれに寄与し得る。α−１アンチトリプシンの欠損を有するかまたは有するリスクがある一部の患者は、α−１アンチトリプシン欠損に冒された家族を有するとき、スクリーニングにより同定される。
【０１８６】
例示的な肝障害として、限定はされないが、肝臓炎、慢性肝疾患、硬変症、肝線維症、肝細胞がん、肝壊死、脂肪肝、胆汁うっ滞および／または肝細胞機能の低下および／もしくは喪失が挙げられる。
【０１８７】
「硬変症」は、肝臓における広範な線維症および再生結節を含む、慢性肝損傷に関連した病態である。
【０１８８】
「線維症」は、肝臓における線維芽細胞の増殖および瘢痕組織の形成である。
【０１８９】
語句「肝機能」は、肝臓によって遂行される多数の生理学的機能の１つ以上を指す。かかる機能として、限定はされないが、血糖レベルの調節、内分泌調節、酵素系、代謝産物（例えば、ケトン体、ステロールおよびステロイドおよびアミノ酸）の相互変換；フィブリノーゲン、血清アルブミン、およびコリンエステラーゼなどの血液タンパク質の製造、赤血球新生機能、無毒化、胆汁形成、およびビタミン貯蔵が挙げられる。肝機能を検査するための幾つかの試験は、当該技術分野で公知であり、例えば、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アルカリホスファターゼ、ビリルビン、プロトロンビン、およびアルブミンの測定が挙げられる。
【０１９０】
「治療有効量」は、本明細書で用いられるとき、Ｓｅｒｐｉｎａ１関連疾患を治療するために患者に投与されるとき、（例えば、既存の疾患または疾患の１つ以上の症状を低減、寛解または維持することにより）疾患の治療をもたらすのに十分であるＲＮＡｉ剤の量を含むように意図される。「治療有効量」は、ＲＮＡｉ剤、該薬剤がいかに投与されるか、疾患およびその重症度、ならびに病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、Ｓｅｒｐｉｎａ１の発現によって媒介される病理学的過程の段階、先行または併用治療のタイプ（存在する場合）、ならびに治療予定の患者の他の個別の特徴に応じて変動してもよい。
【０１９１】
「予防有効量」は、本明細書で用いられるとき、Ｓｅｒｐｉｎａ１関連疾患の症状をまだ経験していないかまたは呈していないが、疾患の素因になることがある対象に投与されるとき、疾患または疾患の１つ以上の症状を予防または寛解するのに十分であるＲＮＡｉ剤の量を含むように意図される。疾患の寛解は、疾患の経過を緩徐化すること、または後から発症する疾患の重症度を低減することを含む。「予防有効量」は、ＲＮＡｉ剤、該薬剤がいかに投与されるか、疾患リスクの程度、ならびに病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、先行または併用治療のタイプ（もしあれば）、ならびに治療予定の患者の他の個別の特徴に応じて変動してもよい。
【０１９２】
「治療有効量」または「予防有効量」はまた、任意の治療に適用できる合理的なリスク・ベネフィット比で幾らかの所望される局所または全身効果をもたらすＲＮＡｉ剤の量を含む。本発明の方法にて用いられるＲＮＡｉ剤は、かかる治療に適用できる合理的なリスク・ベネフィット比をもたらすのに十分な量で投与されてもよい。
【０１９３】
用語「試料」は、本明細書で用いられるとき、対象から単離される類似の体液、細胞、または組織の収集物、ならびに対象中に存在する体液、細胞、または組織を含む。体液の例として、血液、血清および漿膜液、血漿、尿、リンパ、脳脊髄液、眼液、唾液などが挙げられる。組織試料は、組織、臓器または局在性領域からの試料を含んでもよい。例えば、試料は、特定臓器、臓器の部分、またはそれら臓器内部の体液もしくは細胞に由来してもよい。特定の実施形態では、試料は、肝臓（例えば、全肝臓または肝臓の特定セグメントまたは肝臓における特定タイプの細胞、例えば肝細胞など）に由来してもよい。好ましい実施形態では、「対象に由来する試料」は、対象から採取される血液または血漿を指す。さらなる実施形態では、「対象に由来する試料」は、対象に由来する肝組織（またはその小成分）を指す。
【０１９４】
ＩＩ．本発明のｉＲＮＡ
本明細書に記載されるのは、細胞、例えば、対象、例えば、Ｓｅｒｐｉｎａ１関連疾患、例えば肝疾患、例えば慢性肝疾患、肝臓炎、硬変症、肝線維症、および／または肝細胞がんを有するヒトなどの哺乳動物の内部の細胞において、Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子の発現を阻害する、改善された二本鎖ＲＮＡｉ剤である。
【０１９５】
したがって、本発明は、インビボで標的遺伝子（すなわちＳｅｒｐｉｎａ１遺伝子）の発現を阻害する能力がある化学修飾を有する二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。本発明の特定の態様では、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの実質的にすべてが修飾される。本発明の他の実施形態では、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドのすべてが修飾される。「ヌクレオチドの実質的にすべてが修飾される」場合の本発明のｉＲＮＡは、修飾が大規模であってもすべてではなく、５以下、４、３、２、または１の非修飾ヌクレオチドを含み得る。
【０１９６】
ＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。ＲＮＡｉ剤の各鎖は、１２〜３０ヌクレオチド長の範囲であってもよい。例えば、各鎖は、１４〜３０ヌクレオチド長、１７〜３０ヌクレオチド長、１９〜３０ヌクレオチド長、２５〜３０ヌクレオチド長、２７〜３０ヌクレオチド長、１７〜２３ヌクレオチド長、１７〜２１ヌクレオチド長、１７〜１９ヌクレオチド長、１９〜２５ヌクレオチド長、１９〜２３ヌクレオチド長、１９〜２１ヌクレオチド長、２１〜２５ヌクレオチド長、または２１〜２３ヌクレオチド長の間であってもよい。
【０１９７】
センス鎖およびアンチセンス鎖は、典型的には、本明細書中で「ＲＮＡｉ剤」とも称される、二重二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）を形成する。ＲＮＡｉ剤の二本鎖領域は、１２〜３０ヌクレオチド対長であってもよい。例えば、二本鎖領域は、１４〜３０ヌクレオチド対長、１７〜３０ヌクレオチド対長、２７〜３０ヌクレオチド対長、１７〜２３ヌクレオチド対長、１７〜２１ヌクレオチド対長、１７〜１９ヌクレオチド対長、１９〜２５ヌクレオチド対長、１９〜２３ヌクレオチド対長、１９〜２１ヌクレオチド対長、２１〜２５ヌクレオチド対長、または２１〜２３ヌクレオチド対長の間であり得る。別の例では、二本鎖領域は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、および２７ヌクレオチド長から選択される。
【０１９８】
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、片鎖または両鎖の３’末端、５’末端、または両末端に１つ以上のオーバーハング領域および／またはキャッピング基を有してもよい。オーバーハングは、１〜６ヌクレオチド長、例えば、２〜６ヌクレオチド長、１〜５ヌクレオチド長、２〜５ヌクレオチド長、１〜４ヌクレオチド長、２〜４ヌクレオチド長、１〜３ヌクレオチド長、２〜３ヌクレオチド長、または１〜２ヌクレオチド長であり得る。オーバーハングは、一方の鎖が他方よりも長いことの結果、または同じ長さの２本の鎖がねじれ形であることの結果であり得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとミスマッチを形成し得る、または標的化されている遺伝子配列に対して相補的であり得る、または別の配列であり得る。第１鎖と第２鎖はまた、例えば、ヘアピンを形成するための追加的塩基により、または他の非塩基リンカーにより連結され得る。
【０１９９】
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のオーバーハング領域内のヌクレオチドは、各々独立して、修飾または非修飾ヌクレオチド、例えば限定はされないが、２’−糖修飾、例えば２−Ｆ、２’−Ｏ−メチル、チミジン（Ｔ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、およびそれらの任意の組み合わせであり得る。例えば、ＴＴは、片鎖上の片末端におけるオーバーハング配列であり得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとミスマッチを形成し得る、または標的化されている遺伝子配列に対して相補的であり得る、または別の配列であり得る。
【０２００】
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖、アンチセンス鎖または両鎖での５’または３’オーバーハングは、リン酸化されてもよい。一部の実施形態では、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチド間にホスホロチオエートを有する２つのヌクレオチドを含み、ここで２つのヌクレオチドは、同じであるかまたは異なり得る。一実施形態では、オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、または両鎖の３’末端に存在する。一実施形態では、この３’オーバーハングは、アンチセンス鎖内に存在する。一実施形態では、この３’オーバーハングは、センス鎖内に存在する。
【０２０１】
ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉの干渉活性を、その全体的安定性に影響することなく強化し得るような単一オーバーハングのみを含んでもよい。例えば、一本鎖オーバーハングは、センス鎖の３’末端、または代替的にはアンチセンス鎖の３’末端に位置してもよい。ＲＮＡｉはまた、アンチセンス鎖の５’末端（またはセンス鎖の３’末端）またはその逆に位置する平滑末端を有してもよい。一般に、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖は、３’末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、５’末端は平滑末端である。理論によって拘束されることを望まないが、アンチセンス鎖の５’末端およびアンチセンス鎖の３’末端オーバーハングでの非対称平滑末端は、ＲＩＳＣプロセスに負荷するガイド鎖を支持する。
【０２０２】
本発明で取り上げる核酸はいずれも、参照によって本明細書に援用する、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されるものなどの当該技術分野で確立された方法によって、合成および／または修飾し得る。例えば修飾としては、例えば５’末端修飾（リン酸化、共役結合、逆転結合）または３’末端修飾（共役結合、ＤＮＡヌクレオチド、逆転結合など）などの末端修飾；例えば安定化塩基での、不安定化塩基での、または拡大パートナーのレパートリーと塩基対形成する塩基での置換、塩基除去（脱塩基ヌクレオチド）、または共役結合塩基などの塩基修飾；糖修飾（例えば２’位または４’位における）または糖置換；リン酸ジエステル結合の修飾または置換をはじめとする主鎖修飾が挙げられる。本明細書に記載される実施形態で有用なｉＲＮＡ化合物の特定の例としては、修飾主鎖を含有するＲＮＡ、または天然ヌクレオシド間結合を含有しないＲＮＡが挙げられるが、これに限定されるものではない。修飾主鎖を有するＲＮＡとしては、特に主鎖中にリン原子を有しないものが挙げられる。本明細書の目的では、そして当該技術分野で時に言及されるように、それらのヌクレオシド間主鎖中にリン原子を有しない修飾ＲＮＡもまた、オリゴヌクレオシドであると見なされる。いくつかの実施形態では、修飾ｉＲＮＡは、そのヌクレオシド間主鎖中にリン原子を有する。
【０２０３】
その中にリン原子を含まない修飾ＲＮＡ主鎖は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子または複素環式ヌクレオシド間結合によって形成された主鎖を有する。これらとしては、モルホリノ結合（一部はヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖を有するもの；および混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２構成成分を有するその他のものが挙げられる。
【０２０４】
上記オリゴヌクレオシドの調製を教示する、代表的な米国特許としては、その全体がそれぞれ参照によって本明細書によりここに援用される、米国特許第５，０３４，５０６号明細書；米国特許第５，１６６，３１５；５，１８５，４４４号明細書；米国特許第５，２１４，１３４号明細書；米国特許第５，２１６，１４１号明細書；米国特許第５，２３５，０３３号明細書；米国特許第５，６４，５６２号明細書；米国特許第５，２６４，５６４号明細書；米国特許第５，４０５，９３８号明細書；米国特許第５，４３４，２５７号明細書；米国特許第５，４６６，６７７号明細書；米国特許第５，４７０，９６７号明細書；米国特許第５，４８９，６７７号明細書；米国特許第５，５４１，３０７号明細書；米国特許第５，５６１，２２５号明細書；米国特許第５，５９６，０８６号明細書；米国特許第５，６０２，２４０号明細書；米国特許第５，６０８，０４６号明細書；米国特許第５，６１０，２８９号明細書；米国特許第５，６１８，７０４号明細書；米国特許第５，６２３，０７０号明細書；米国特許第５，６６３，３１２号明細書；米国特許第５，６３３，３６０号明細書；米国特許第５，６７７，４３７号明細書；および米国特許第５，６７７，４３９号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０２０５】
別の実施形態では、適切なＲＮＡ模倣物がｉＲＮＡ中での使用のために検討され、その中では、糖およびヌクレオシド間結合の双方、すなわち、ヌクレオチド単位の骨格が、新しいグループで置換されている。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。このような１つのオリゴマー化合物であり、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているＲＮＡ模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物中では、ＲＮＡの糖主鎖が、アミド含有主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖で置換されている。核酸塩基は保持されて、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子と直接または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、そのそれぞれの内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第５，５３９，０８２号明細書；米国特許第５，７１４，３３１号明細書；および米国特許第５，７１９，２６２号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに本発明のｉＲＮＡ中で使用するのに適するＰＮＡ化合物は、例えばＮｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００に記載される。
【０２０６】
本発明で取り上げるいくつかの実施形態は、ホスホロチオエート主鎖があるＲＮＡ、および特に先述の米国特許第５，４８９，６７７号明細書の−−ＣＨ２−−ＮＨ−−ＣＨ２−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｏ−−ＣＨ２−−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ主鎖として知られている］、−−ＣＨ２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、および−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−［天然リン酸ジエステル主鎖は−−Ｏ−−Ｐ−−Ｏ−−ＣＨ２−−として表される］であるヘテロ原子主鎖がある、および先述の米国特許第５，６０２，２４０号明細書のアミド主鎖がある、オリゴヌクレオシドとを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で取り上げるＲＮＡは、先述の米国特許第５，０３４，５０６号明細書のモルホリノ主鎖構造を有する。
【０２０７】
修飾ＲＮＡはまた、１つまたは複数の置換糖部分を含有し得る。例えば本明細書で取り上げるｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡは、２’位に、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルの１つを含み得て、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、またはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。例示的な適切な修飾としては、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）．ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２（式中、ｎおよびｍは１〜約１０である）が挙げられる。別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、２’位に以下の１つを含む：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカアリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、介入物、ｉＲＮＡの薬物動態特性を改善する基、またはｉＲＮＡの薬力学的特性を改善する基、および同様の特性を有するその他の置換基。いくつかの実施形態では、修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしてもまた知られている）（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８：４８６−５０４）、すなわちアルコキシ−アルコキシ基を含む。別の例示的な修飾は、以下に本明細書の実施例で記載されるように、２’−ＤＭＡＯＥとしてもまた知られている、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および、２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野で２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても公知である）、すなわち２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２である。さらなる例示的修飾は、５’−Ｍｅ−２’−Ｆヌクレオチド、５’−Ｍｅ−２’−ＯＭｅヌクレオチド、５’−Ｍｅ−２’−デオキシヌクレオチド、（これら３つのファミリーにおけるＲおよびＳ異性体の双方）；２’−アルコキシアルキル；および２’−ＮＭＡ（Ｎ−メチルアセトアミド）を含む。
【０２０８】
その他の修飾としては、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が挙げられる。同様の修飾はまた、具体的には３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位、または２’−５’結合ｄｓＲＮＡ中、および５’末端ヌクレオチドの５’位など、ｉＲＮＡのＲＮＡ上のその他の位置でも行い得る。ｉＲＮＡはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有してもよい。上記修飾糖構造の調製を教示する、代表的な米国特許としては、特定のものは本出願と所有者が共通である、米国特許第４，９８１，９５７号明細書；米国特許第５，１１８，８００号明細書；米国特許第５，３１９，０８０号明細書；米国特許第５，３５９，０４４号明細書；米国特許第５，３９３，８７８号明細書；米国特許第５，４４６，１３７号明細書；米国特許第５，４６６，７８６号明細書；米国特許第５，５１４，７８５号明細書；米国特許第５，５１９，１３４号明細書；米国特許第５，５６７，８１１号明細書；米国特許第５，５７６，４２７号明細書；米国特許第５，５９１，７２２号明細書；米国特許第５，５９７，９０９号明細書；米国特許第５，６１０，３００号明細書；米国特許第５，６２７，０５３号明細書；米国特許第５，６３９，８７３号明細書；米国特許第５，６４６，２６５号明細書；米国特許第５，６５８，８７３号明細書；米国特許第５，６７０，６３３号明細書；および米国特許第５，７００，９２０号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。上記のそれぞれの内容全体を参照によって本明細書によりここに援用する。
【０２０９】
本発明のｉＲＮＡはまた、核酸塩基（当該技術分野では単に「塩基」と称されることが多い）修飾または置換を含み得る。本明細書の用法では、「未修飾」または「天然」核酸塩基としては、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、およびピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。修飾核酸塩基としては、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）；５−ヒドロキシメチルシトシン；キサンチン；ヒポキサンチン；２−アミノアデニン；アデニンおよびグアニンの６−メチルおよびその他のアルキル誘導体；アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよびその他のアルキル誘導体；２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン；５−ハロウラシルおよびシトシン；５−プロピニルウラシルおよびシトシン；６−アゾウラシル、シトシン、およびチミン；５−ウラシル（プソイドウラシル）；４−チオウラシル；８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよびその他の８置換アデニンおよびグアニン；５−ハロ、具体的には５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、およびその他の５置換ウラシルおよびシトシン；７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン；８−アザグアニンおよび８−アザアデニン；７−デアザグアニンおよび７−ダアザアデニン（ｄａａｚａａｄｅｎｉｎｅ）；および３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンなどのその他の合成および天然核酸塩基が挙げられる。さらに核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号明細書で開示されるもの、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００８で開示されるもの；Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ  ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９０で開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，３０：６１３によって開示されるもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ  Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，ｄｓＲＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ  ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９３によって開示されるものが挙げられる。これらの核酸塩基のいくつかは、本発明で取り上げるオリゴマー化合物の結合親和性を増大させるのに特に有用である。これらとしては、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンをはじめとする、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、およびＮ−２、Ｎ−６および０−６置換プリンが挙げられる。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６〜１．２℃増大させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ｄｓＲＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、模範的な塩基置換であり、なおもより特に、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされた場合にそうである。
【０２１０】
上記の特定の修飾核酸塩基ならびにその他の修飾核酸塩基の調製を教示する、代表的な米国特許としては、その内容全体をそれぞれ参照によって本明細書によりここに援用する、上記の米国特許第３，６８７，８０８号明細書、米国特許第４，８４５，２０５号明細書；米国特許第５，１３０，３０号明細書；米国特許第５，１３４，０６６号明細書；米国特許第５，１７５，２７３号明細書；米国特許第５，３６７，０６６号明細書；米国特許第５，４３２，２７２号明細書；米国特許第５，４５７，１８７号明細書；米国特許第５，４５９，２５５号明細書；米国特許第５，４８４，９０８号明細書；米国特許第５，５０２，１７７号明細書；米国特許第５，５２５，７１１号明細書；米国特許第５，５５２，５４０号明細書；米国特許第５，５８７，４６９号明細書；米国特許第５，５９４，１２１、５，５９６，０９１号明細書；米国特許第５，６１４，６１７号明細書；米国特許第５，６８１，９４１号明細書；米国特許第５，７５０，６９２号明細書；米国特許第６，０１５，８８６号明細書；米国特許第６，１４７，２００号明細書；米国特許第６，１６６，１９７号明細書；米国特許第６，２２２，０２５号明細書；米国特許第６，２３５，８８７号明細書；米国特許第６，３８０，３６８号明細書；米国特許第６，５２８，６４０号明細書；米国特許第６，６３９，０６２号明細書；米国特許第６，６１７，４３８号明細書；米国特許第７，０４５，６１０号明細書；米国特許第７，４２７，６７２号明細書；および米国特許第７，４９５，０８８号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０２１１】
本発明のｉＲＮＡはまた、１つ以上のロックド核酸（ＬＮＡ）を含むように修飾され得る。ロックド核酸は、リボース部分が２’および４’炭素を接続する余分な架橋を含むような修飾リボース部分を有するヌクレオチドである。この構造は、３’エンド構造の立体構造においてリボースを有効に「ロックする」。ロックド核酸のｓｉＲＮＡへの付加は、血清中でのｓｉＲＮＡの安定性を増強し、オフターゲット効果を低減することが示されている（Ｅｌｍｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｍｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３３（１）：４３９−４４７；Ｍｏｏｋ，ＯＲ．ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ  Ｃａｎｃ  Ｔｈｅｒ  ６（３）：８３３−８４３；Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｍｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１（１２）：３１８５−３１９３）。
【０２１２】
本発明のｉＲＮＡはまた、１つ以上の二環式糖部分を含むように修飾され得る。「二環式糖」は、２つの原子の架橋によって修飾されたフラノシル環である。「二環式ヌクレオシド」（「ＢＮＡ」）は、糖環の２つの炭素原子を接続する架橋を含む糖部分を有し、それにより二環式環系を形成する、ヌクレオシドである。特定の実施形態では、架橋は、糖環の４’−炭素と２’−炭素とを接続する。したがって、一部の実施形態では、本発明の作用物質は、１つ以上のロックド核酸（ＬＮＡ）を含んでもよい。ロックド核酸は、リボース部分が２’および４’炭素を接続する余分な架橋を含むような修飾リボース部分を有するヌクレオチドである。換言すれば、ＬＮＡは、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’架橋を含む二環式糖部分を含むヌクレオチドである。この構造は、リボースを３’−エンド立体構造内に効果的に「ロック」する。ｓｉＲＮＡへのロックド核酸の追加は、血清中のｓｉＲＮＡ安定性を増大させ、非特異的効果を低下させることが示されている（Ｅｌｍｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３３（１）：４３９−４４７；Ｍｏｏｋ，ＯＲ．ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ  Ｃａｎｃ  Ｔｈｅｒ  ６（３）：８３３−８４３；Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１（１２）：３１８５−３１９３）。本発明のポリヌクレオチドにおいて用いられる二環式ヌクレオシドの例として、限定はされないが、４’および２’リボシル環原子の間に架橋を含むヌクレオシドが挙げられる。特定の実施形態では、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド剤は、４’から２’への架橋を含む１つ以上の二環式ヌクレオシドを含む。かかる４’から２’に架橋された二環式ヌクレオシドの例として、限定はされないが、４’−（ＣＨ２）−Ｏ−２’（ＬＮＡ）；４’−（ＣＨ２）−Ｓ−２’；４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’（ＥＮＡ）；４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’（「束縛エチル」または「ｃＥｔ」とも称される）および４’−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）−Ｏ−２’（およびそのアナログ；例えば米国特許第７，３９９，８４５号明細書を参照）；４’−Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）−Ｏ−２’（およびそのアナログ；例えば米国特許第８，２７８，２８３号明細書を参照）；４’−ＣＨ２−Ｎ（ＯＣＨ３）−２’（およびそのアナログ；例えば米国特許第８，２７８，４２５号明細書を参照）；４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−２’（例えば米国特許出願公開第２００４／０１７１５７０号明細書を参照）；４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’（式中、ＲはＨ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、または保護基）（例えば米国特許第７，４２７，６７２号明細書を参照）；４’−ＣＨ２−Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）−２’（例えば、Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００９，７４，１１８−１３４を参照）；および４’−ＣＨ２−Ｃ（＝ＣＨ２）−２’（およびそのアナログ；例えば米国特許第８，２７８，４２６号明細書を参照）が挙げられる。前述の各々の内容全体はここで参照により本明細書中に援用される。
【０２１３】
ロックド核酸ヌクレオチドの調製について教示するさらなる代表的な米国特許および米国特許出願公開として、限定はされないが、以下、すなわち、米国特許第６，２６８，４９０号明細書；第６，５２５，１９１号明細書；第６，６７０，４６１号明細書；第６，７７０，７４８号明細書；第６，７９４，４９９号明細書；第６，９９８，４８４号明細書；第７，０５３，２０７号明細書；第７，０３４，１３３号明細書；第７，０８４，１２５号明細書；第７，３９９，８４５号明細書；第７，４２７，６７２号明細書；第７，５６９，６８６号明細書；第７，７４１，４５７号明細書；第８，０２２，１９３号明細書；第８，０３０，４６７号明細書；第８，２７８，４２５号明細書；第８，２７８，４２６号明細書；第８，２７８，２８３号明細書；米国特許出願公開第２００８／００３９６１８号明細書；および米国特許出願公開第２００９／００１２２８１号明細書が挙げられ、それら各々の内容全体はここで参照により本明細書中に援用される。前述の二環式ヌクレオシドのいずれかは、例えばα−Ｌ−リボフラノースおよびβ−Ｄ−リボフラノースを含む１つ以上の立体化学的糖配置を有するように調製され得る（国際公開第９９／１４２２６号パンフレットを参照）。
【０２１４】
本発明のｉＲＮＡはまた、１つ以上の束縛エチルヌクレオチドを含むように修飾され得る。本明細書で用いられるとき、「束縛エチルヌクレオチド」または「ｃＥｔ」は、４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’架橋を含む二環式糖部分を含むロックド核酸である。一実施形態では、束縛エチルヌクレオチドは、本明細書中で「Ｓ−ｃＥｔ」と称されるＳ立体配置をなす。
【０２１５】
本発明のｉＲＮＡはまた、１つ以上の「立体構造的に制限されたヌクレオチド」（「ＣＲＮ」）を含んでもよい。ＣＲＮは、リボースのＣ２’およびＣ４’炭素またはリボースのＣ３およびＣ５’炭素を接続するリンカーを伴うヌクレオチドアナログである。ＣＲＮは、リボース環を安定な立体配置にロックし、ｍＲＮＡへのハイブリダイゼーション親和性を増加させる。リンカーは、酸素を安定性および親和性にとって最適な位置に配置し、リボース環のパッカリングの低減をもたらすのに十分な長さを有する。
【０２１６】
特定の上記のＣＲＮの調製について教示する代表的な公開として、限定はされないが、米国特許第出願公開第２０１３／０１９０３８３号明細書；およびＰＣＴ公開の国際公開第２０１３／０３６８６８号パンフレット（それら各々の内容全体はここで参照により本明細書中に援用される）が挙げられる。
【０２１７】
一部の実施形態では、本発明のｉＲＮＡは、ＵＮＡ（アンロックド核酸）ヌクレオチドである１つ以上の単量体を含む。ＵＮＡは、糖の結合のいずれかが除去されており、アンロックド「糖」残基を形成する、アンロックド非環状核酸である。一例では、ＵＮＡはまた、Ｃ１’−Ｃ４’間の結合（すなわち、Ｃ１’およびＣ４’炭素間の炭素−酸素−炭素の共有結合）が除去されている単量体を包含する。別の例では、糖のＣ２’−Ｃ３’結合（すなわち、Ｃ２’およびＣ３’炭素間の炭素−炭素の共有結合）が除去されている（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒｉｅｓ，５２，１３３−１３４（２００８）およびＦｌｕｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．，２００９，１０，１０３９（ここで参照により援用される）を参照）。
【０２１８】
ＵＮＡの調製について教示する代表的な米国公開として、限定はされないが、米国特許第８，３１４，２２７号明細書；および米国特許出願公開第２０１３／００９６２８９号明細書；第２０１３／００１１９２２号明細書；および第２０１１／０３１３０２０号明細書（それら各々の内容全体はここで参照により本明細書中に援用される）が挙げられる。
【０２１９】
ＲＮＡ分子末端に対する潜在的安定化修飾としては、Ｎ−（アセチルアミノカプロイル）−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−Ｃ６−ＮＨＡｃ）、Ｎ−（カプロイル−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−Ｃ６）、Ｎ−（アセチル−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−ＮＨＡｃ）、チミジン−２’−０−デオキシチミジン（エーテル）、Ｎ−（アミノカプロイル）−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−Ｃ６−アミノ）、２−ドコサノイル−ウリジン−３”−リン酸、逆転塩基ｄＴ（ｉｄＴ）などが挙げられる。この修飾の開示は、国際公開第２０１１／００５８６１号パンフレットにある。
【０２２０】
本発明のｉＲＮＡの他の修飾は、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖上の５’リン酸または５’リン酸模倣物、例えば５’末端リン酸またはリン酸模倣物を含む。好適なリン酸模倣物は、例えば米国特許出願公開第２０１２／０１５７５１１号明細書（その内容全体は参照により本明細書中に援用される）に開示されている。
【０２２１】
Ａ．熱不安定化修飾を含むｉＲＮＡ
本明細書に記載の通り、特に、Ｓｅｒｐｉｎａ１を標的にするｄｓＲＮＡ剤のオフターゲット効果が、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖内の特定位置に熱不安定化ヌクレオチドを取り込むことにより減少または阻害され得ることが発見されている。アンチセンス鎖内の特定位置でのこれらの熱不安定化修飾に伴い、ｄｓＲＮＡ剤は、オフターゲット遺伝子サイレンシングの低下を有する一方で、親ｄｓＲＮＡと類似した遺伝子サイレンシング活性を保持することができた。さらに、これらの熱不安定化修飾を含むｄｓＲＮＡ剤により、下方制御または上方制御されるオフターゲット遺伝子の数もまた、親ｄｓＲＮＡと比較されるとき、低減される。
【０２２２】
そのようなことから、一態様では、本発明は、Ｓｅｒｐｉｎａ１標的遺伝子の発現を阻害する能力がある二本鎖ＲＮＡｉ（ｄｓＲＮＡ）剤を提供する。一般に、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、オフターゲット遺伝子サイレンシングおよび／または毒性を低減または最小化する一方で、高いオンターゲット遺伝子サイレンシングを示す。限定はされないが、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、そのｄｓＲＮＡ剤に代わることができ、限定はされないがインビトロまたはインビボ適用を含む、ＲＮＡ干渉に基づく遺伝子サイレンシング技術において、用いることができる。
【０２２３】
一般に、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖（パッセンジャー鎖とも称される）およびアンチセンス鎖（ガイド鎖とも称される）を含む。ｄｓＲＮＡ剤の各鎖は、１２〜４０ヌクレオチド長の範囲であり得る。例えば、各鎖は、１４〜４０ヌクレオチド長、１７〜３７ヌクレオチド長、２５〜３７ヌクレオチド長、２７〜３０ヌクレオチド長、１７〜２３ヌクレオチド長、１７〜２１ヌクレオチド長、１７〜１９ヌクレオチド長、１９〜２５ヌクレオチド長、１９〜２３ヌクレオチド長、１９〜２１ヌクレオチド長、２１〜２５ヌクレオチド長、または２１〜２３ヌクレオチド長の間であり得る。限定はされないが、センスおよびアンチセンス鎖は、等しい長さまたは不等な長さであり得る。
【０２２４】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、１８〜３５ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、２１〜２５、１９〜２５、１９〜２１または２１〜２３ヌクレオチド長である。一部の特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、２３ヌクレオチド長である。アンチセンス鎖と同様、センス鎖は、一部の実施形態では、１８〜３５ヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態では、センス鎖は、２１〜２５、１９〜２５、１９〜２１または２１〜２３ヌクレオチド長である。一部の特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、２１ヌクレオチド長である。
【０２２５】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立して、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり、ここでアンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１８、１９、２１、２２、２３、２４または２４ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；および（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、センス鎖の５’末端に平滑末端を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８全部）をさらに有する。一部の特定の実施形態では、センス鎖は、１９、２０または２１または２２ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖は、２０、２１または２２ヌクレオチド長である。
【０２２６】
センス鎖およびアンチセンス鎖は、典型的には、二本鎖ｄｓＲＮＡを形成する。ｄｓＲＮＡ剤の二本鎖領域は、１２〜４０ヌクレオチド対長であってもよい。例えば、二本鎖領域は、１４〜４０ヌクレオチド対長、１７〜３０ヌクレオチド対長、２５〜３５ヌクレオチド長、２７〜３５ヌクレオチド対長、１７〜２３ヌクレオチド対長、１７〜２１ヌクレオチド対長、１７〜１９ヌクレオチド対長、１９〜２５ヌクレオチド対長、１９〜２３ヌクレオチド対長、１９〜２１ヌクレオチド対長、２１〜２５ヌクレオチド対長、または２１〜２３ヌクレオチド対長の間であり得る。別の例では、二本鎖領域は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、および２７ヌクレオチド対長から選択される。
【０２２７】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を有し、ここでアンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；および（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；および（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６または７全部）をさらに有する。一部の特定の実施形態では、二本鎖領域は、１８、１９、２０、２１、２２または２３ヌクレオチド対長である。特定の実施形態では、二本鎖領域は、２１ヌクレオチド対長である。
【０２２８】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、鎖の３’末端、または５’末端または両末端に、ｄｓＲＮＡ剤の１つ以上のオーバーハング領域および／またはキャッピング基を含む。オーバーハングは、１〜１０ヌクレオチド長、１〜６ヌクレオチド長、例えば２〜６ヌクレオチド長、１〜５ヌクレオチド長、２〜５ヌクレオチド長、１〜４ヌクレオチド長、２〜４ヌクレオチド長、１〜３ヌクレオチド長、２〜３ヌクレオチド長、または１〜２ヌクレオチド長であり得る。オーバーハングは、一方の鎖が他方の鎖よりも長いことの結果、または同じ長さの２本の鎖がねじれ形であることの結果であり得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとミスマッチを形成し得る、または標的化されている遺伝子配列に対して相補的であり得る、または他の配列であり得る。第１鎖と第２鎖はまた、例えば、ヘアピンを形成するための追加的塩基により、または他の非塩基リンカーにより連結され得る。
【０２２９】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤のオーバーハング領域内のヌクレオチドは、各々独立して、修飾または非修飾ヌクレオチド、例えば限定はされないが、２’−糖修飾、例えば２−Ｆ２’−Ｏ−メチル、チミジン（Ｔ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、およびそれらの任意の組み合わせであり得る。例えば、ＴＴは、片鎖上の片末端におけるオーバーハング配列であり得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとミスマッチを形成し得る、または標的化されている遺伝子配列に対して相補的であり得る、または他の配列であり得る。
【０２３０】
本発明のｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖、アンチセンス鎖または両鎖での５’または３’オーバーハングは、リン酸化されてもよい。一部の実施形態では、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチド間にホスホロチオエートを有する２つのヌクレオチドを含み、ここで２つのヌクレオチドは、同じであるかまたは異なり得る。一部の実施形態では、オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、または両鎖の３’末端に存在する。一部の実施形態では、この３’オーバーハングは、アンチセンス鎖内に存在する。一部の実施形態では、この３’オーバーハングは、センス鎖内に存在する。
【０２３１】
本発明のｄｓＲＮＡ剤は、ｄｓＲＮＡの干渉活性を、その全体的安定性に影響することなく強化し得るような単一オーバーハングのみを含んでもよい。例えば、一本鎖オーバーハングは、センス鎖の３’末端、または代替的にはアンチセンス鎖の３’末端に位置する。ｄｓＲＮＡはまた、アンチセンス鎖の５’末端（またはセンス鎖の３’末端）またはその逆に位置する平滑末端を有してもよい。一般に、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、５’末端は平滑末端である。理論によって拘束されないが、アンチセンス鎖の５’末端およびアンチセンス鎖の３’末端オーバーハングでの非対称平滑末端は、ＲＩＳＣプロセスに負荷するガイド鎖を支持する。例えば、単一オーバーハングは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長を含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の５’末端での平滑末端に２ヌクレオチドオーバーハングを有する。
【０２３２】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡの一方の末端は、平滑末端であり、かつ他方の末端は、オーバーハングを有し、ここでアンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、また少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；および（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６または７全部）をさらに有する。一部の実施形態では、オーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端上に存在し、平滑末端は、アンチセンス鎖の５’末端に存在する。一部の特定の実施形態では、オーバーハングは、２、３または４ヌクレオチド長である。
【０２３３】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、１９、２１、２２または２３ヌクレオチド塩基対長の二本鎖領域を有し、ここでｄｓＲＮＡの一方の末端は、平滑末端であり、かつ他方の末端は、オーバーハングを有し、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；および（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む、および任意選択的には、２ヌクレオチドオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端上に存在し、かつ平滑末端は、アンチセンス鎖の５’末端に存在する、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、５または６全部）をさらに有する。一部の実施形態では、オーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端上に存在し、かつ平滑末端は、アンチセンス鎖の５’末端に存在する。
【０２３４】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤はまた、ｄｓＲＮＡ二本鎖の両末端に２つの平滑末端を有してもよい。
【０２３５】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、二本鎖の両末端に平滑末端を有し、ここでアンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを有し、また少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；および（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６または７全部）をさらに有する。
【０２３６】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、１９、２１、２２または２３ヌクレオチド塩基対長の二本鎖領域を有し、二本鎖の両末端に平滑末端を有し、ここでｄｓＲＮＡの一方の末端は、平滑末端であり、かつ他方の末端は、オーバーハングを有し、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；および（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、５または６全部）をさらに有する。
【０２３７】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’領域の最初の９つのヌクレオチド位置内に二本鎖の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５またはそれ以上）の熱不安定化修飾を含む。一部の実施形態では、二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から２〜９位、または好ましくは４〜８位に位置する。一部のさらなる実施形態では、二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から６、７または８位に位置する。さらに一部のさらなる実施形態では、二本鎖の熱不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から７位に位置する。用語「熱不安定化修飾」は、より低い完全融解温度（Ｔｍ）（好ましくは、かかる修飾を有しない場合のｄｓＲＮＡのＴｍよりも１、２、３または４℃低いＴｍを有するｄｓＲＮＡをもたらすことになる修飾を含む。
【０２３８】
熱不安定化修飾は、限定はされないが、脱塩基修飾；逆鎖における対向するヌクレオチドとのミスマッチ；および糖修飾、例えば２’−デオキシ修飾または非環状ヌクレオチド、例えばアンロックド核酸（ＵＮＡ）またはグリコール核酸（ＧＮＡ）を含み得る。
【０２３９】
例示される脱塩基修飾として、限定はされないが、以下：
【化１７】
2020500929.tif 000018
（式中、Ｒ＝Ｈ、Ｍｅ、ＥｔまたはＯＭｅ；Ｒ’＝Ｈ、Ｍｅ、ＥｔまたはＯＭｅ；Ｒ”＝Ｈ、Ｍｅ、ＥｔまたはＯＭｅ）
【化１８】
2020500929.tif 000019
（式中、Ｂは修飾または非修飾核酸塩基である）
が挙げられる。
【０２４０】
例示される糖修飾として、限定はされないが、以下：
【化１９】
2020500929.tif 000020
（式中、Ｂは修飾または非修飾核酸塩基である）
が挙げられる。
【０２４１】
一部の実施形態では、二本鎖の熱不安定化修飾は、
【化２０】
2020500929.tif 000021
（式中、Ｂは修飾または非修飾核酸塩基である）
からなる群から選択される。
【０２４２】
用語「非環状ヌクレオチド」は、例えば、リボース炭素間の結合のいずれか（例えば、Ｃ１’−Ｃ２’、Ｃ２’−Ｃ３’、Ｃ３’−Ｃ４’、Ｃ４’−Ｏ４’、またはＣ１’−Ｏ４’）が不在であり、かつ／またはリボース炭素もしくは酸素の少なくとも１つ（例えば、Ｃ１’、Ｃ２’、Ｃ３’、Ｃ４’またはＯ４’）が独立してまたは組み合わせてヌクレオチドから不在である場合、非環状リボース糖を有する任意のヌクレオチドを指す。一部の実施形態では、非環状ヌクレオチドは、
【化２１】
2020500929.tif 000022
（式中、Ｂは、修飾または非修飾核酸塩基であり、Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｈ、ハロゲン、ＯＲ３、またはアルキルであり；かつＲ３は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖である）である。用語「ＵＮＡ」は、アンロックド非環状核酸を指し、ここで糖の結合のいずれかは除去されており、アンロックド「糖」残基を形成する。一例では、ＵＮＡはまた、Ｃ１’−Ｃ４’の間の結合（すなわち、Ｃ１’およびＣ４’炭素間の炭素−酸素−炭素共有結合）が除去されている単量体を包含する。別の例では、糖のＣ２’−Ｃ３’結合（すなわち、Ｃ２’およびＣ３’炭素間の炭素−炭素共有結合）が除去される（Ｍｉｋｈａｉｌｏｖｅｔ．ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６（１７）：２０５９（１９８５）；およびＦｌｕｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．，１０：１０３９（２００９）（ここでそれら全体が参照により援用される）を参照）。非環状誘導体は、ワトソン・クリック対合に影響することなく、より大きい骨格の柔軟性をもたらす。非環状ヌクレオチドは、２’−５’または３’−５’結合を介して連結され得る。
【０２４３】
用語「ＧＮＡ」は、ＤＮＡまたはＲＮＡに類似するが、その「骨格」の組成においてホスホジエステル結合によって連結される反復グリセロール単位から構成される点で異なるポリマーであるグリコール核酸を指す。
【化２２】
2020500929.tif 000023
【０２４４】
二本鎖の熱不安定化修飾は、ｄｓＲＮＡ二本鎖内で、熱不安定化ヌクレオチドと逆鎖内の対向するヌクレオチドとの間でミスマッチ（すなわち非相補性塩基対）であり得る。例示的なミスマッチ塩基対として、Ｇ：Ｇ、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕ、Ｇ：Ｔ、Ａ：Ａ、Ａ：Ｃ、Ｃ：Ｃ、Ｃ：Ｕ、Ｃ：Ｔ、Ｕ：Ｕ、Ｔ：Ｔ、Ｕ：Ｔ、またはそれらの組み合わせが挙げられる。当該技術分野で公知の他のミスマッチ塩基対形成もまた、本発明に従う。ミスマッチは、天然に存在するヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドのいずれかのヌクレオチド間で生じ得、すなわちミスマッチ塩基対形成は、ヌクレオチドのリボース糖上の修飾と独立して、各々のヌクレオチドからの核酸塩基間で生じ得る。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、２’−デオキシ核酸塩基である、ミスマッチ対合における少なくとも１つの核酸塩基を有し；例えば、２’−デオキシ核酸塩基は、センス鎖内に存在する。
【０２４５】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖のシード領域内の二本鎖の熱不安定化修飾は、標的ｍＲＮＡ上の相補性塩基に対する障害されたＷ−Ｃ  Ｈ結合を有するヌクレオチドを含み、例えば、
【化２３】
2020500929.tif 000024
が挙げられる。
【０２４６】
脱塩基ヌクレオチド、非環状ヌクレオチド修飾（ＵＮＡおよびＧＮＡを含む）、およびミスマッチ修飾のより多くの例が、国際公開第２０１１／１３３８７６号パンフレット（その全体が参照により本明細書中に援用される）中に詳述されている。
【０２４７】
熱不安定化修飾はまた、対向塩基と水素結合を形成する能力が低下または消失したユニバーサル塩基、およびリン酸修飾を含んでもよい。
【０２４８】
一部の実施形態では、二本鎖の熱不安定化修飾は、限定はされないが、逆鎖内の塩基と水素結合を形成する能力が損なわれるかまたは完全に失われた核酸塩基修飾などの非標準塩基を有するヌクレオチドを含む。これらの核酸塩基修飾は、国際公開第２０１０／００１１８９５号パンフレット（その全体が参照により本明細書中に援用される）中に記載の通り、ｄｓＲＮＡ二本鎖の中心的領域の不安定化について評価されている。例示的な核酸塩基修飾は次の通りである。
【化２４】
2020500929.tif 000025
【０２４９】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖のシード領域内の二本鎖の熱不安定化修飾は、標的ｍＲＮＡ上の塩基に対して相補的な１つ以上のα−ヌクレオチド、例えば、
【化２５】
2020500929.tif 000026
（式中、Ｒは、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、Ｆ、ＮＨ２、ＮＨＭｅ、ＮＭｅ２またはＯ−アルキルである）
を含む。
【０２５０】
天然リン酸ジエステル結合と比べて、ｄｓＲＮＡ二本鎖の熱安定性を低下させることで知られる例示的なリン酸修飾として、
【化２６】
2020500929.tif 000027
が挙げられる。
【０２５１】
Ｒ基におけるアルキルは、Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。Ｒ基における具体的なアルキルとして、限定はされないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ペンチルおよびヘキシルが挙げられる。
【０２５２】
熱不安定化修飾を含むアンチセンス鎖に加えて、ｄｓＲＮＡはまた、１つ以上の安定化修飾を含み得る。例えば、ｄｓＲＮＡは、少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）の安定化修飾を含み得る。限定はされないが、安定化修飾はすべて、片鎖内に存在し得る。一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖の双方は、少なくとも２つの安定化修飾を含む。安定化修飾は、センス鎖またはアンチセンス鎖の任意のヌクレオチド上に存在し得る。例えば、安定化修飾は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖上のすべてのヌクレオチド上に存在し得；各安定化修飾は、センス鎖またはアンチセンス鎖上に交互パターンで存在し得；またはセンス鎖またはアンチセンス鎖は、両方の安定化修飾を交互パターンで含む。センス鎖上の安定化修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同じであってもまたは異なってもよく、センス鎖上の安定化修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上の安定化修飾の交互パターンに対する変化を有し得る。
【０２５３】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）の安定化修飾を含む。限定はされないが、アンチセンス鎖における安定化修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、アンチセンスは、５’末端から２、６、８、９、１４および１６位に安定化修飾を含む。一部の他の実施形態では、アンチセンスは、５’末端から２、６、１４および１６位に安定化修飾を含む。さらに一部の他の実施形態では、アンチセンスは、５’末端から２、１４および１６位に安定化修飾を含む。
【０２５４】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾に隣接した少なくとも１つの安定化修飾を含む。例えば、安定化修飾は、不安定化修飾の５’末端または３’末端、すなわち不安定化修飾の位置から−１または＋１位のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の５’末端および３’末端の各々、すなわち不安定化修飾の位置から−１および＋１位に安定化修飾を含む。
【０２５５】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の３’末端、すなわち不安定化修飾の位置から＋１および＋２位に少なくとも２つの安定化修飾を含む。
【０２５６】
一部の実施形態では、センス鎖は、少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）の安定化修飾を含む。限定はされないが、センス鎖における安定化修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、センス鎖は、５’末端から７、１０および１１位に安定化修飾を含む。一部の他の実施形態では、センス鎖は、５’末端から７、９、１０および１１位に安定化修飾を含む。一部の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えてアンチセンス鎖の１１、１２および１５位に対して対向的または相補的な位置に安定化修飾を含む。一部の他の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えてアンチセンス鎖の１１、１２、１３および１５位に対して対向的または相補的な位置に安定化修飾を含む。一部の実施形態では、センス鎖は、２、３または４つの安定化修飾の遮断を含む。
【０２５７】
一部の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖における二本鎖の熱不安定化修飾に対して対向的または相補的な位置に安定化修飾を含まない。
【０２５８】
例示的な熱安定化修飾として、限定はされないが、２’−フルオロ修飾が挙げられる。
【０２５９】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、少なくとも４つ（例えば、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）の２’−フルオロヌクレオチドを含む。限定はされないが、２’−フルオロヌクレオチドの全部が片鎖に存在し得る。一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖の双方は、少なくとも２つの２’−フルオロヌクレオチドを含む。２’−フルオロ修飾は、センス鎖またはアンチセンス鎖の任意のヌクレオチド上に存在し得る。例えば、２’−フルオロ修飾は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖上のすべてのヌクレオチド上に存在し得；各２’−フルオロ修飾は、センス鎖またはアンチセンス鎖上に交互パターンで存在し得；またはセンス鎖またはアンチセンス鎖は、両方の２’−フルオロ修飾を交互パターンで含む。センス鎖上の安定化修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同じであってもまたは異なってもよく、センス鎖上での２’−フルオロ修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上の２’−フルオロ修飾の交互パターンに対する変化を有し得る。
【０２６０】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）の２’−フルオロヌクレオチドを含む。限定はされないが、アンチセンス鎖における２’−フルオロ修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、アンチセンスは、５’末端から２、６、８、９、１４および１６位に２’−フルオロヌクレオチドを含む。一部の他の実施形態では、アンチセンスは、５’末端から２、６、１４および１６位に２’−フルオロヌクレオチドを含む。さらに一部の他の実施形態では、アンチセンスは、５’末端から２、１４および１６位に２’−フルオロヌクレオチドを含む。
【０２６１】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾に隣接した少なくとも１つの２’−フルオロヌクレオチドを含む。例えば、２’−フルオロヌクレオチドは、不安定化修飾の５’末端または３’末端、すなわち不安定化修飾の位置から−１または＋１位のヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の５’末端および３’末端の各々、すなわち不安定化修飾の位置から−１および＋１位に２’−フルオロヌクレオチドを含む。
【０２６２】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の３’末端、すなわち不安定化修飾の位置から＋１および＋２位に少なくとも２つの２’−フルオロヌクレオチドを含む。
【０２６３】
一部の実施形態では、センス鎖は、少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）の２’−フルオロヌクレオチドを含む。限定はされないが、センス鎖における２’−フルオロ修飾は、任意の位置に存在し得る。一部の実施形態では、アンチセンスは、５’末端から７、１０および１１位に２’−フルオロヌクレオチドを含む。一部の他の実施形態では、センス鎖は、５’末端から７、９、１０および１１位に２’−フルオロヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えてアンチセンス鎖の１１、１２および１５位に対して対向的または相補的な位置に２’−フルオロヌクレオチドを含む。一部の他の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えてアンチセンス鎖の１１、１２、１３および１５位に対して対向的または相補的な位置に２’−フルオロヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、センス鎖は、２、３または４つの２’−フルオロヌクレオチドの遮断を含む。
【０２６４】
一部の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖における二本鎖の熱不安定化修飾に対して対向的または相補的な位置に２’−フルオロヌクレオチドを含まない。
【０２６５】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、２１ヌクレオチド（ｎｔ）のセンス鎖および２３ヌクレオチド（ｎｔ）のアンチセンスを含み、ここでアンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位）に存在し、ここでｄｓＲＮＡの一方の末端は平滑である一方、他方の末端は、２ｎｔオーバーハングを含み、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；および（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６または７全部）をさらに有する。好ましくは、２ｎｔオーバーハングは、アンチセンスの３’末端に存在する。
【０２６６】
一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖を含む本発明のｄｓＲＮＡ剤において、センス鎖は、２５〜３０ヌクレオチド残基長であり、ここで前記センス鎖の５’末端ヌクレオチド（１位）から始まる１〜２３位は、少なくとも８つのリボヌクレオチドを含み；アンチセンス鎖は、３６〜６６ヌクレオチド残基長であり、３’末端ヌクレオチドから始まる、その位置内の少なくとも８つのリボヌクレオチドがセンス鎖の１〜２３位と対合することで、二本鎖を形成し；ここで少なくとも、アンチセンス鎖の３’末端ヌクレオチドは、センス鎖と対合せず、最大で６つの連続する３’末端ヌクレオチドは、センス鎖と対合せず、それにより１〜６ヌクレオチドの３’一本鎖オーバーハングを形成し；ここでアンチセンス鎖の５’末端は、センス鎖と対合しない１０〜３０の連続するヌクレオチドを含み、それにより１０〜３０ヌクレオチドの一本鎖５’オーバーハングを形成し；ここで少なくとも、センス鎖の５’末端および３’末端ヌクレオチドは、センスおよびアンチセンス鎖が最大相補性のために整列されるとき、アンチセンス鎖のヌクレオチドと塩基対合され、それによりセンスおよびアンチセンス鎖間で実質的に二本鎖の領域を形成し；また前記二本鎖核酸が哺乳動物細胞に導入されるとき、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖長の少なくとも１９のリボヌクレオチドに沿って標的ＲＮＡに対して十分に相補的であることで、標的遺伝子発現を低減し；またここでアンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在する。例えば、熱不安定化ヌクレオチドは、センス鎖の５’末端の１４〜１７位に対して対向的または相補的な位置の間に存在し、またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；および（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；および（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜３０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６または７全部）をさらに有する。
【０２６７】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センスおよびアンチセンス鎖を含み、ここで前記ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも２５、最大で２９ヌクレオチドの長さを有するセンス鎖を含み、最大で３０ヌクレオチドの長さを有するアンチセンス鎖は、センス鎖とともに、５’末端から１１位で酵素分解を受けやすい修飾ヌクレオチドを含み、ここで前記センス鎖の３’末端および前記アンチセンス鎖の５’末端は、平滑末端を形成し、前記アンチセンス鎖は、その３’末端でセンス鎖よりも１〜４ヌクレオチド長く、ここで少なくとも２５ヌクレオチド長である二本鎖領域では、前記ｄｓＲＮＡ剤が哺乳動物細胞に導入されるとき、前記アンチセンス鎖は、前記アンチセンス鎖長の少なくとも１９ｎｔに沿って標的ｍＲＮＡに対して十分に相補的であることで、標的遺伝子の発現を低減し、またここで前記ｄｓＲＮＡのダイサー切断により、前記アンチセンス鎖の前記３’末端を含むｓｉＲＮＡが優先的にもたらされ、それにより哺乳動物における標的遺伝子の発現が低減され、ここでアンチセンス鎖は、少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドを含み、ここで少なくとも１つの熱不安定化ヌクレオチドは、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）存在し、またここでｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；および（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；および（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜２９ヌクレオチド対長の二本鎖領域を有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６または７全部）をさらに有する。
【０２６８】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖におけるすべてのヌクレオチドは、修飾されてもよい。各ヌクレオチドは、同じまたは異なる修飾で修飾されてもよく、その修飾は、非結合リン酸酸素および／または１つ以上の結合リン酸酸素の一方または両方の１つ以上の変更；リボース糖の成分、例えばリボース糖の２’ヒドロキシルの変更；リン酸部分の「デホスホ」リンカーでの大量の置換；天然塩基の修飾または置換；およびリボース−リン酸骨格の置換または修飾を含み得る。
【０２６９】
核酸がサブユニットのポリマーであることから、例えば、塩基、またはリン酸部分、またはリン酸部分の非連結Ｏの修飾といった修飾の多くは、核酸内部で反復される位置で生じる。場合によっては、修飾は核酸中のあらゆる対象位置で生じることになるが、多くの場合、そうならない。例として、修飾は、３’もしくは５’末端位置に限って生じてもよく、末端領域内、例えば末端ヌクレオチド上のある位置または鎖の最後の２、３、４、５、もしくは１０ヌクレオチド中に限って生じてもよい。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、またはその双方において生じてもよい。修飾は、ＲＮＡの二本鎖領域内に限って生じてもよく、またはＲＮＡの一本鎖領域内に限って生じてもよい。例えば、非連結Ｏ位置でのホスホロチオエート修飾は、一末端または両末端に限って生じてもよく、末端領域内、例えば末端ヌクレオチド上のある位置または鎖の最後の２、３、４、５、もしくは１０ヌクレオチド中に限って生じてもよく、または二本鎖および一本鎖領域内、特に末端で生じてもよい。５’末端は、リン酸化され得る。
【０２７０】
例えば、安定性を増強させるか、オーバーハング中に特定塩基を含めるか、または一本鎖オーバーハング中、例えば５’もしくは３’オーバーハング中、または双方に修飾ヌクレオチドもしくはヌクレオチド代替物を含めることは可能であり得る。例えば、オーバーハング中にプリンヌクレオチドを含めることが望ましい可能性がある。一部の実施形態では、３’もしくは５’オーバーハング中の塩基の全部もしくは一部を、例えば本明細書に記載の修飾で修飾してもよい。修飾は、例えばリボース糖の２’位での当該技術分野で公知の修飾による修飾の使用、例えば核酸塩基のリボ糖に代わるデオキシリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロ（２’−Ｆ）もしくは２’−Ｏ−メチル修飾の使用、およびリン酸基における修飾、例えばホスホロチオエート修飾を含み得る。オーバーハングは、標的配列と相同である必要はない。
【０２７１】
一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、独立してＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−メトキシエチル、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、２’−デオキシ、または２’−フルオロで修飾される。それらの鎖は、２つ以上の修飾を含み得る。一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、独立して２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロで修飾される。これらの修飾が、アンチセンス鎖に存在する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾に加えて存在することは理解されるべきである。
【０２７２】
少なくとも２つの異なる修飾は、典型的にはセンス鎖およびアンチセンス鎖上に存在する。それら２つの修飾は、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロ修飾、非環状ヌクレオチドまたはその他であってもよい。一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各々は、２’−Ｏ−メチルまたは２’−デオキシから選択される、２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、独立して、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、２’−デオキシフルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）ヌクレオチド、または２’−アラ−Ｆヌクレオチドで修飾される。再び、これらの修飾が、アンチセンス鎖に存在する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾に加えて存在することは理解されるべきである。
【０２７３】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、特に、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、Ｂ４’領域内に交互パターンの修飾を含む。用語「交互モチーフ」又は「交互パターン」は、本明細書で用いられるとき、１つ以上の修飾を有するモチーフであって、各修飾が１本の鎖の交互ヌクレオチド上で生じるものを指す。交互ヌクレオチドは、１つ置きのヌクレオチドごとに１つまたは３つのヌクレオチドごとに１つ、または類似パターンを指してもよい。例えば、Ａ、ＢおよびＣの各々がヌクレオチドに対する１つの修飾タイプを表す場合、交互モチーフは、「ＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢ…」、「ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ…」、「ＡＡＢＡＡＢＡＡＢＡＡＢ…」、「ＡＡＡＢＡＡＡＢＡＡＡＢ…」、「ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ…」、または「ＡＢＣＡＢＣＡＢＣＡＢＣ…」などであり得る。
【０２７４】
交互モチーフ内に含まれる修飾のタイプは、同じであってもまたは異なってもよい。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの各々がヌクレオチドに対する１つの修飾タイプを表す場合、交互パターン、すなわち１つ置きのヌクレオチドに対する修飾は、同じであってもよいが、センス鎖またはアンチセンス鎖の各々は、例えば「ＡＢＡＢＡＢ…」、「ＡＣＡＣＡＣ…」、「ＢＤＢＤＢＤ…」または「ＣＤＣＤＣＤ…」など、交互モチーフ内部の幾つかの修飾の可能性から選択され得る。
【０２７５】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖上の交互モチーフにおける修飾パターンが、アンチセンス鎖上の交互モチーフにおける修飾パターンに対して変化することを含む。センス鎖のヌクレオチドの修飾基がアンチセンス鎖のヌクレオチドの異なる修飾基に対応し、またその逆もいえるような変化であってもよい。例えば、センス鎖がｄｓＲＮＡ二本鎖におけるアンチセンス鎖と対合するとき、二本鎖領域内部で、センス鎖内の交互モチーフは鎖の５’−３’から「ＡＢＡＢＡＢ」で開始してもよく、かつアンチセンス鎖内の交互モチーフは鎖の３’−５’から「ＢＡＢＡＢＡ」で開始してもよい。別の例として、二本鎖領域内部で、センス鎖内の交互モチーフは鎖の５’−３’から「ＡＡＢＢＡＡＢＢ」で開始してもよく、かつアンチセンス鎖内の交互モチーフは鎖の３’−５’から「ＢＢＡＡＢＢＡＡ」で開始してもよく、それによりセンス鎖とアンチセンス鎖との間に修飾パターンの完全な変化または部分的変化が存在する。
【０２７６】
本発明のｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合をさらに含んでもよい。ホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖または両方の、鎖の任意の位置における任意のヌクレオチド上に生じてもよい。例えば、ヌクレオチド間結合修飾は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖上のすべてのヌクレオチド上に生じてもよい；各ヌクレオチド間結合修飾は、センス鎖またはアンチセンス鎖上に交互パターンで生じてもよい；またはセンス鎖もしくはアンチセンス鎖は、両方のヌクレオチド間結合修飾を交互パターンで含む。センス鎖上のヌクレオチド間結合修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同じでもまたは異なってもよく、またセンス鎖上のヌクレオチド間結合修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上のヌクレオチド間結合修飾の交互パターンに対して変化を有してもよい。
【０２７７】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、オーバーハング領域内にホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾を含む。例えば、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチド間にホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合を有する２つのヌクレオチドを含む。ヌクレオチド間結合修飾はまた、オーバーハングヌクレオチドを二本鎖領域内部の末端の対合ヌクレオチドと連結するために設けられてもよい。例えば、少なくとも２、３、４、もしくはすべてのオーバーハングヌクレオチドは、ホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合を通じて連結されてもよく、任意選択的には、オーバーハングヌクレオチドをオーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドと連結する、追加的なホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合が存在してもよい。例えば、末端の３つのヌクレオチド間に少なくとも２つのホスホロチオエートのヌクレオチド間結合が存在してもよく、ここで３つのうちの２つのヌクレオチドはオーバーハングヌクレオチドであり、かつ３つ目はオーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。好ましくは、これら末端の３つのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端に存在してもよい。
【０２７８】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６のリン酸ヌクレオチド間結合によって分離される、２から１０のホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の１〜１０のブロックを含み、ホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の一方は、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記センス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸およびリン酸のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むアンチセンス鎖、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホン酸もしくはリン酸の結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【０２７９】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８のリン酸ヌクレオチド間結合によって分離される２つのホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ここでホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の一方は、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸およびリン酸のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホン酸もしくはリン酸の結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【０２８０】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６のリン酸ヌクレオチド間結合によって分離される３つのホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ここでホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の一方は、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸およびリン酸のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホン酸もしくはリン酸の結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【０２８１】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４のリン酸ヌクレオチド間結合によって分離される４つのホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ここでホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の一方は、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸およびリン酸のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホン酸もしくはリン酸の結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【０２８２】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のリン酸ヌクレオチド間結合によって分離される５つのホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ここでホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の一方は、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸およびリン酸のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホン酸もしくはリン酸の結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【０２８３】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のリン酸ヌクレオチド間結合によって分離される６つのホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ここでホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の一方は、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸およびリン酸のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホン酸もしくはリン酸の結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【０２８４】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７または８のリン酸ヌクレオチド間結合によって分離される７つのホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ここでホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の一方は、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸およびリン酸のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホン酸もしくはリン酸の結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【０２８５】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５または６のリン酸ヌクレオチド間結合によって分離される８つのホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ここでホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の一方は、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸およびリン酸のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホン酸もしくはリン酸の結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【０２８６】
一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、１、２、３または４のリン酸ヌクレオチド間結合によって分離される９つのホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の２つのブロックを含み、ここでホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合の一方は、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、前記アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸およびリン酸のヌクレオチド間結合の任意の組み合わせを含むセンス鎖、またはホスホロチオエートもしくはメチルホスホン酸もしくはリン酸の結合のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
【０２８７】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センスおよび／またはアンチセンス鎖の末端位置の１〜１０以内に１つ以上のホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０のヌクレオチドは、センスおよび／またはアンチセンス鎖の一端または両端でホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合を通じて連結されてもよい。
【０２８８】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センスおよび／またはアンチセンス鎖各々の二本鎖の内部領域の１〜１０以内に１つ以上のホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０のヌクレオチドは、二本鎖領域のセンス鎖の５’末端から数えて８〜１６位でホスホロチオエートメチルホスホン酸ヌクレオチド間結合を通じて連結されてもよく；ｄｓＲＮＡ剤は、任意選択的には、１つ以上のホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾を末端１〜１０位以内にさらに含んでもよい。
【０２８９】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の（５’末端から数えて）１〜５位以内に１〜５のホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に１〜５のホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に１〜５のホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に１〜５のホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２９０】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の（５’末端から数えて）１〜５位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートまたはメチルホスホン酸のヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２９１】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の（５’末端から数えて）１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２９２】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の（５’末端から数えて）１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２９３】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の（５’末端から数えて）１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２９４】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の（５’末端から数えて）１〜５位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２９５】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の（５’末端から数えて）１〜５位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２９６】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の（５’末端から数えて）１〜５位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２９７】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の（５’末端から数えて）１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２９８】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の（５’末端から数えて）１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０２９９】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の（５’末端から数えて）１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０３００】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の（５’末端から数えて）１〜５位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と１８〜２３位以内に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０３０１】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２０および２１位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０３０２】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の（５’末端から数えて）１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２０および２１位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０３０３】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２１および２２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０３０４】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の（５’末端から数えて）１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２１および２２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０３０５】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２２および２３位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾および２１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０３０６】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖の（５’末端から数えて）１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２１位に１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾と２３および２３位に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合修飾をさらに含む。
【０３０７】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、ヌクレオチドの２１および２２位の間とヌクレオチド２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；および（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８全部）をさらに有する。
【０３０８】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖は、ヌクレオチドの１および２位の間、ヌクレオチドの２および３位の間、ヌクレオチドの２１および２２位の間、ならびにヌクレオチドの２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｉｉ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｖ）センス鎖は、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；および（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８全部）をさらに有する。
【０３０９】
一部の実施形態では、センス鎖は、ヌクレオチドの１および２位の間とヌクレオチドの２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｖ）センス鎖は、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；および（ｖｉｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８全部）をさらに有する。
【０３１０】
一部の実施形態では、センス鎖は、ヌクレオチドの１および２位の間とヌクレオチドの２および３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、アンチセンス鎖は、ヌクレオチドの１および２位の間、ヌクレオチドの２および３位の間、ヌクレオチドの２１および２２位の間、ならびにヌクレオチドの２２および２３位の間にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、ここでアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖のシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２〜９位に）位置する二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を有し、またｄｓＲＮＡは、任意選択的には、以下の特徴：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる；（ｉｉｉ）センス鎖は、２、３、４または５の２’−フルオロ修飾を含む；（ｉｖ）センス鎖は、３または４のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む；（ｖ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも４つの２’−フルオロ修飾を含む；（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、１２〜４０ヌクレオチド対長の二本鎖領域を含む；および（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を有する、の少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６または７全部）をさらに有する。
【０３１１】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、二本鎖内部に、標的とのミスマッチ、またはその組み合わせを含む。ミスマッチは、オーバーハング領域内または二本鎖領域内に存在してもよい。塩基対は、解離または融解を促進するその傾向に基づいて順位付けされてもよい（例えば、最も簡単な手法は、特定の対合の会合または解離の自由エネルギーについて、その対合を個別の対合に基づいて検討することであるが、酷似または類似の分析もまた用いることができる）。解離を促進する観点では、Ａ：ＵはＧ：Ｃよりも好ましく；Ｇ：ＵはＧ：Ｃよりも好ましく；かつＩ：ＣはＧ：Ｃよりも好ましい（Ｉ＝イノシン）。ミスマッチ、例えば非基準もしくは基準以外の対合（本明細書中の他の箇所で記載の通り）は、基準（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）対合よりも好ましく；またユニバーサル塩基を含む対合は、基準の対合よりも好ましい。
【０３１２】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、二本鎖の５’末端でのアンチセンス鎖の解離を促進するため、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｕ、Ｉ：Ｃ、およびミスマッチ対、例えば非基準もしくは基準以外の対合またはユニバーサル塩基を含む対合の群から独立して選択することができる、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内部の最初の１、２、３、４、もしくは５つの塩基対の少なくとも１つを含む。
【０３１３】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖における５’末端からの二本鎖領域内部の１位のヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、Ｕ、およびｄＴからなる群から選択される。あるいは、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内部の最初の１、２もしくは３つの塩基対の少なくとも１つはＡＵ塩基対である。例えば、アンチセンス鎖の５’末端からの二本鎖領域内部の最初の塩基対はＡＵ塩基対である。
【０３１４】
４’修飾および／または５’修飾ヌクレオチドを、一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドの任意の位置でジヌクレオチドのリン酸ジエステル（ＰＯ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）、および／またはジチオリン酸（ＰＳ２）結合の３’末端に導入することが、ヌクレオチド間結合に対して立体効果を発揮し、ひいてはそれをヌクレアーゼに対して保護または安定化し得ることが発見されている。
【０３１５】
一部の実施形態では、５’修飾ヌクレオシドは、一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡの任意の位置でジヌクレオチドの３’末端に導入される。例えば、一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡの任意の位置でジヌクレオチドの３’末端に５’−アルキル化ヌクレオシドが導入されてもよい。リボース糖の５’位置のアルキル基は、ラセミまたはキラル純粋なＲもしくはＳ異性体であり得る。例示的な５’−アルキル化ヌクレオシドが、５’−メチルヌクレオシドである。５’−メチルは、ラセミまたはキラル純粋なＲもしくはＳ異性体のいずれかであり得る。
【０３１６】
一部の実施形態では、４’修飾ヌクレオシドは、一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡの任意の位置でジヌクレオチドの３’末端に導入される。例えば、４’−アルキル化ヌクレオシドは、一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡの任意の位置でジヌクレオチドの３’末端に導入されてもよい。リボース糖の４’位置のアルキル基は、ラセミまたはキラル純粋なＲもしくはＳ異性体であり得る。例示的な４’−アルキル化ヌクレオシドは、４’−メチルヌクレオシドである。４’−メチルは、ラセミまたはキラル純粋なＲもしくはＳ異性体のいずれかであり得る。あるいは、４’−Ｏ−アルキル化ヌクレオシドは、一本鎖または二本鎖ｓｉＲＮＡの任意の位置でジヌクレオチドの３’末端に導入されてもよい。リボース糖の４’−Ｏ−アルキルは、ラセミまたはキラル純粋なＲもしくはＳ異性体であり得る。例示的な４’−Ｏ−アルキル化ヌクレオシドは、４’−Ｏ−メチルヌクレオシドである。４’−Ｏ−メチルは、ラセミまたはキラル純粋なＲもしくはＳ異性体のいずれかであり得る。
【０３１７】
一部の実施形態では、５’−アルキル化ヌクレオシドは、ｄｓＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖上の任意の位置に導入され、かかる修飾は、ｄｓＲＮＡの効力を維持または改善する。５’−アルキルは、ラセミまたはキラル純粋なＲもしくはＳ異性体のいずれかであり得る。例示的な５’−アルキル化ヌクレオシドは、５’−メチルヌクレオシドである。５’−メチルは、ラセミまたはキラル純粋なＲもしくはＳ異性体のいずれかであり得る。
【０３１８】
一部の実施形態では、４’−アルキル化ヌクレオシドは、ｄｓＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖上の任意の位置に導入され、かかる修飾は、ｄｓＲＮＡの効力を維持または改善する。４’−アルキルは、ラセミまたはキラル純粋なＲもしくはＳ異性体のいずれかであり得る。例示的な４’−アルキル化ヌクレオシドは、４’−メチルヌクレオシドである。４’−メチルは、ラセミまたはキラル純粋なＲもしくはＳ異性体のいずれかであり得る。
【０３１９】
一部の実施形態では、４’−Ｏ−アルキル化ヌクレオシドは、ｄｓＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖上の任意の位置に導入され、かかる修飾は、ｄｓＲＮＡの効力を維持または改善する。５’−アルキルは、ラセミまたはキラル純粋なＲもしくはＳ異性体のいずれかであり得る。例示的な４’−Ｏ−アルキル化ヌクレオシドは、４’−Ｏ−メチルヌクレオシドである。４’−Ｏ−メチルは、ラセミまたはキラル純粋なＲもしくはＳ異性体のいずれかであり得る。
【０３２０】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、２’−５’結合（２’−Ｈ、２’−ＯＨおよび２’−ＯＭｅを有し、かつＰ＝ＯまたはＰ＝Ｓを有する）を含み得る。例えば、２’−５’結合修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するかもしくはセンス鎖のアンチセンス鎖への結合を阻害するため、用いることができ、またはＲＩＳＣによるセンス鎖活性化を回避するため、センス鎖の５’末端で用いることができる。
【０３２１】
別の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、Ｌ糖（例えば、２’−Ｈ、２’−ＯＨおよび２’−ＯＭｅを有するＬリボース、Ｌ−アラビノース）を含み得る。例えば、これらのＬ糖修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するかもしくはセンス鎖のアンチセンス鎖への結合を阻害するため、用いることができ、またはＲＩＳＣによるセンス鎖活性化を回避するため、センス鎖の５’末端で用いることができる。
【０３２２】
様々な出版物にて、本発明のｄｓＲＮＡとともにすべてを用いることができる多量体ｓｉＲＮＡが記載されている。かかる出版物は、国際公開第２００７／０９１２６９号パンフレット、米国特許第７８５８７６９号明細書、国際公開第２０１０／１４１５１１号パンフレット、国際公開第２００７／１１７６８６号パンフレット、国際公開第２００９／０１４８８７号パンフレットおよび国際公開第２０１１／０３１５２０号パンフレット（それら全体がここで援用される）を含む。
【０３２３】
下記に考察される通り、１つ以上の炭水化物部分のｄｓＲＮＡ剤への結合を含むｄｓＲＮＡ剤は、ｄｓＲＮＡ剤の１つ以上の特性を最適化し得る。多くの場合、炭水化物部分は、ｄｓＲＮＡ剤の修飾サブユニットに結合されることになる。例えば、ｄｓＲＮＡ剤の１つ以上のリボヌクレオチドサブユニットのリボース糖は、別の部分、例えば炭水化物リガンドが結合した非炭水化物（好ましくは環状）担体と置換され得る。サブユニットのリボース糖がそのように置換されているリボヌクレオチドサブユニットは、本明細書中でリボース置換修飾サブユニット（ＲＲＭＳ）と称される。環状担体は炭素環式環系であってもよく、すなわちすべての環原子は炭素原子であるか、または複素環式環系、すなわち１つ以上の環原子は、ヘテロ原子、例えば、窒素、酸素、硫黄であってもよい。環状担体は、単環式環系であってもよく、または２つ以上の環、例えば融合環を含んでもよい。環状担体は、完全飽和環系であってもよく、または１つ以上の二重結合を含んでもよい。
【０３２４】
リガンドは、担体によってポリヌクレオチドに付着されてもよい。担体は、（ｉ）少なくとも１つの「骨格付着点（ｂａｃｋｂｏｎｅ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｐｏｉｎｔ）」、好ましくは２つの「骨格付着点」、および（ｉｉ）少なくとも１つの「テザー付着点（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｐｏｉｎｔ）」を含む。「骨格付着点」は、本明細書で用いられるとき、官能基、例えばヒドロキシル基、または一般に、リボ核酸の骨格、例えばリン酸塩の骨格、もしくは例えば硫黄を含有する修飾リン酸塩の骨格への担体の組み込みに利用可能であり、かつ適した結合を指す。「テザー付着点」（ＴＡＰ）は、一部の実施形態では、選択された部分を接続する環状担体の構成環原子、例えば炭素原子またはヘテロ原子（骨格付着点を提供する原子とは異なる）を指す。その部分は、例えば糖質、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、および多糖であり得る。任意選択的には、選択された部分は、介在テザー（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ  ｔｅｔｈｅｒ）によって環状担体に接続される。したがって、環状担体は、官能基、例えばアミノ基を含むことが多く、または一般に、別の化学的実体、例えばリガンドの構成環への組み込みまたは繋留に適した結合を可能にする。
【０３２５】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、担体を介してリガンドに結合されてもよく、ここで担体は、環式基または非環式基であり得；好ましくは、環式基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリルおよびデカリンから選択され；好ましくは、非環式基は、セリノール骨格またはジエタノールアミン骨格から選択される。
【０３２６】
本発明の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）剤は、任意選択的には、１つ以上のリガンドにコンジュゲートされてもよい。リガンドは、３’末端、５’末端または両末端で、センス鎖、アンチセンス鎖または両鎖に結合され得る。例えば、リガンドは、センス鎖、特にセンス鎖の３’末端にコンジュゲートされてもよい。
【０３２７】
一部の実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、５’リン酸化される、または５’プライム末端にホスホリル類似体を含む。５’−リン酸修飾は、ＲＩＳＣ媒介遺伝子サイレンシングに適合するものを含む。好適な修飾は、５’−一リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−二リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−三リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、および任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−モノチオリン酸（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−モノジチオリン酸（ジチオリン酸；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−ホスホロチオラート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）；酸素／硫黄が置換された一リン酸、二リン酸および三リン酸の任意のさらなる組み合わせ（例えば、５’−α−チオ三リン酸、５’−γ−チオ三リン酸など）、５’−ホスホロアミド酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−アルキルホスホネート（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−、５’−アルケニルホスホネート（すなわち、ビニル、置換ビニル）、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２−）、５’−アルキルエーテルホスホネート（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２−）、エトキシメチルなど、例えばＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−）を含む。一例では、修飾は、ｄｓＲＮＡ剤のアンチセンス鎖内に配置され得る。
【０３２８】
ＩＩＩ．リガンド共役ｉＲＮＡ
本発明のｉＲＮＡのＲＮＡの別の修飾は、ｉＲＮＡの活性、細胞分布、または細胞内取り込みを高める、例えば細胞への、１つまたは複数のリガンド、部分または複合体を、ｉＲＮＡに化学的に連結することを伴う。このような部分としては、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３−６５５６）などの脂質部分が挙げられるが、これに限定されるものではない。他の実施形態では、リガンドは、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４：１０５３−１０６０）；例えばベリル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９９２，２０：５３３−５３８）などのチオエーテル；例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ，１９９１，１０：１１１１−１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９−５４）などの脂肪族鎖；例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチル−アンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１−３６５４；Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７−３７８３）などのリン脂質；ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９−９７３）；またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１−３６５４）；パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９−２３７）；またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３−９３７）である。
【０３２９】
特定の実施形態では、リガンドは、それが組み込まれたｉＲＮＡ剤の分布、標的化または寿命を変化させる。好ましい実施形態では、リガンドは、例えばこのようなリガンドが不在である化学種と比較して、例えば分子、細胞または細胞型、例えば細胞内または器官内区画などの区画、身体の組織または器官または領域などの選択された標的に対する、改善された親和性を提供する。好ましいリガンドは、二重鎖化核酸中の二本鎖対合形成に加わらない。
【０３３０】
リガンドは、タンパク質（例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ：ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ：ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）、またはグロブリン）；炭水化物（例えばデキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、またはヒアルロン酸）；または脂質などの天然物質を含み得る。リガンドはまた、例えば合成ポリアミノ酸などの合成ポリマーなど、組換えまたは合成分子であり得る。ポリアミノ酸の例はポリアミノ酸を含み、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物共重合体、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド（ｇｌｙｃｏｌｉｅｄ））共重合体、ジビニルエーテル−無水マレイン酸共重合体、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド共重合体（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬ペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミン四級塩、またはαらせんペプチドである。
【０３３１】
リガンドはまた、例えばレクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質など、例えば腎細胞などの特定細胞型に結合する抗体である、細胞または組織標的化剤などの標的化基を含み得る。標的化基は、甲状腺刺激ホルモン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤プロテインＡ、ムチン炭水化物、多価乳糖、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビタミンＡ、ビオチン、またはＲＧＤペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣体であり得る。
【０３３２】
一実施形態では、リガンドは、アシアロ糖タンパク質受容体リガンドである。本明細書で用いられるとき、「アシアロ糖タンパク質受容体リガンド」または「ＡＳＧＰＲリガンド」は、本発明のｄｓＲＮＡ剤を肝細胞に標的化するリガンド、例えば炭水化物リガンド（下記に考察）である。特定の実施形態では、リガンドは、１つ以上のガラクトース、例えばＮ−アセチル−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）または１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。
【０３３３】
リガンドのその他の例としては、染料、挿入剤（例えばアクリジン）、架橋剤（例えばソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎｅ）、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えばフェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えばＥＤＴＡ）、例えばコレステロールなどの親油性分子、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合体（例えばアンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えばＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えばビオチン）、輸送／吸収促進薬（例えばアスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えばイミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザ大環状化合物のＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、またはＡＰが挙げられる。
【０３３４】
リガンドは、例えば糖タンパク質などのタンパク質；または例えば共リガンドに特異的親和性を有する分子などのペプチド；または例えば肝臓細胞などの指定された細胞型に結合する抗体などの抗体であり得る。リガンドはまた、ホルモンおよびホルモン受容体を含んでもよい。それらはまた、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補助因子、多価乳糖、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、または多価フコースなどの非ペプチド化学種を含み得る。リガンドは、例えばリポ多糖、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ活性化因子、またはＮＦ−κＢ活性化因子であり得る。
【０３３５】
リガンドは、例えば細胞の微小管、微小繊維、または中間径フィラメントを破壊することで、例えば細胞の細胞骨格を破壊することにより、細胞へのｉＲＮＡ剤の取り込みを増大させ得る薬剤などの物質であり得る。薬剤は、例えばタキソン（ｔａｘｏｎ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビンであり得る。
【０３３６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｉＲＮＡに付着するリガンドは、薬物動態調節因子（ＰＫ調節因子）を指す。ＰＫ調節因子としては、親油性物質、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどが挙げられる。例示的なＰＫ調節因子としては、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。いくつかのホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドもまた、血清タンパク質に結合することが、知られており、したがって例えば、主鎖中に複数のホスホロチオエート結合を含む、約５塩基、１０塩基、１５塩基、または２０塩基オリゴヌクレオチドなどの短鎖オリゴヌクレオチドもまた、リガンドとして（例えばＰＫ調節リガンドとして）本発明に適している。これに加えて、血清成分（例えば血清タンパク質）に結合するアプタマーもまた、本明細書に記載される実施形態中で、ＰＫ調節リガンドとして使用するのに適する。
【０３３７】
本発明のリガンド共役ｉＲＮＡは、結合分子のオリゴヌクレオチド上への付加から誘導されるものなどの、ペンダント反応性官能基を有するオリゴヌクレオチドの使用によって、合成してもよい（下述）。この反応性オリゴヌクレオチドは、市販のリガンド、多様な保護基のいずれかを有する合成されたリガンド、または付着する結合部分を有するリガンドと、直接反応させてもよい。
【０３３８】
本発明の複合体で使用されるオリゴヌクレオチドは、好都合に、そして慣例的に、周知の固相合成技術を通じて生成されてもよい。このような合成のための装置は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）をはじめとする、いくつかの供給業者によって販売される。それに加えて、または代案として、当該技術分野で公知のこのような合成のためのその他のあらゆる方法を用いてもよい。同様の技術を使用して、ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などのその他のオリゴヌクレオチドを調製することもまた知られている。
【０３３９】
本発明のリガンド共役ｉＲＮＡ、およびリガンド分子を保有する配列特異的結合ヌクレオシド中では、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドは、標準ヌクレオチドまたはヌクレオシド前駆体、または既に結合部分を保有するヌクレオチドまたはヌクレオシド複合体前駆体、既にリガンド分子を保有するリガンド−ヌクレオチドまたはヌクレオシド−複合体前駆体、または非ヌクレオシドリガンドを保有する基本単位を使用して、適切なＤＮＡ合成機上で組み立ててもよい。
【０３４０】
既に結合部分を有するヌクレオチド複合体前駆体を使用する場合、配列特異的結合ヌクレオシドの合成が典型的に完了し、次にリガンド分子が結合部分と反応されて、リガンド共役オリゴヌクレオチドが生成する。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたは結合ヌクレオシドは、市販されて、慣例的にオリゴヌクレオチド合成で使用される、標準ホスホラミダイトおよび非標準ホスホラミダイトに加えて、リガンド−ヌクレオシド複合体から誘導されるホスホラミダイトを使用して、自動合成装置によって合成される。
【０３４１】
Ａ．脂質複合体
特定の実施形態では、リガンドまたは複合体は、脂質または脂質ベースの分子である。このような脂質または脂質ベースの分子は、好ましくは、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの血清タンパク質と結合する。ＨＳＡ結合リガンドは、例えば身体の非腎臓標的組織などの標的組織への複合体の分布を可能にする。例えば標的組織は、肝臓の実質細胞をはじめとする肝臓であり得る。ＨＳＡに結合し得るその他の分子もまた、リガンドとして使用し得る。例えばナプロキセンまたはアスピリンを使用し得る。脂質または脂質ベースのリガンドは、（ａ）複合体の分解耐性を増大させ得て、（ｂ）標的細胞または細胞膜の標的化またはそれへの輸送を増大させ得て、または（ｃ）例えばＨＳＡなどの血清タンパク質の結合を調節するのに使用し得る。
【０３４２】
例えば複合体の標的組織への結合を制御するなど、阻害のために、脂質ベースのリガンドを使用し得る。例えばより強力にＨＳＡに結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、腎臓に標的化される可能性がより低く、したがって身体から除去される可能性がより低い。より弱くＨＳＡに結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、複合体を腎臓に標的化するのに使用し得る。
【０３４３】
特定実施形態では、脂質ベースのリガンドはＨＳＡに結合する。好ましくは、それは、複合体が好ましくは非腎臓組織に分布するように、十分な親和性でＨＳＡと結合する。しかし親和性は、ＨＳＡリガンド結合が逆転され得ない程度にまで、強力ではないことが好ましい。
【０３４４】
他の実施形態では、複合体が好ましくは腎臓に分布するように、脂質ベースのリガンドはＨＳＡと弱く結合し、または全く結合しない。腎細胞を標的とするその他の部分もまた、脂質ベースのリガンドに代えて、またはそれに加えて使用し得る。
【０３４５】
別の態様では、リガンドは、例えば増殖細胞などの標的細胞に取り込まれる、ビタミンなどの部分である。これらは、例えばがん細胞などの悪性または非悪性型などの望まれない細胞増殖によって特徴付けられる障害を治療するのに、特に有用である。例示的なビタミンとしては、ビタミンＡ、Ｅ、およびＫが挙げられる。その他の例示的なビタミンとしては、例えば葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサールなどのＢビタミン、または肝臓細胞などの標的細胞に取り込まれるその他のビタミンまたは栄養素が挙げられる。またＨＳＡおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）も挙げられる。
【０３４６】
Ｂ．細胞透過剤
別の態様では、リガンドは細胞透過剤であり、好ましくはらせん細胞透過剤である。好ましくは、細胞透過剤は両親媒性である。例示的な細胞透過剤は、ｔａｔまたはアンテノペディア（ａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａ）などのペプチドである。細胞透過剤がペプチドである場合、それはペプチジル模倣薬、逆転異性体、非ペプチドまたは偽ペプチド結合、およびＤ−アミノ酸使用をはじめとする、修飾を受け得る。らせん剤は、好ましくは親油性および疎油性相を有するα−らせん剤である。
【０３４７】
リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣薬（本明細書においてオリゴペプチド模倣薬とも称される）は、天然ペプチドに類似する定義された三次元構造に折り畳み可能な分子である。ペプチドおよびペプチド模倣薬のｉＲＮＡ剤への付加は、細胞認識と吸収の促進などにより、ｉＲＮＡの薬物動態分布に影響を及ぼし得る。ペプチドまたはペプチド模倣薬部分は、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長など、約５〜５０アミノ酸長であり得る。
【０３４８】
ペプチドまたはペプチド模倣薬は、例えば細胞透過性ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド（例えば主にＴｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、束縛ペプチドまたは架橋ペプチドであり得る。別の代案では、ペプチド部分は、疎水性膜移行配列（ＭＴＳ）を含み得る。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号２９）を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えばアミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号３０））もまた、標的部分であり得る。ペプチド部分は、細胞膜を越えて、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質をはじめとする、多数の極性分子を輸送し得る「送達」ペプチドであり得る。例えばＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号３１））およびショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）アンテナペディアタンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号３２））からの配列は、送達ペプチドとして機能できることが分かっている。ペプチドまたはペプチド模倣薬は、ファージ−ディスプレイライブラリー、または１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリーから同定されるペプチドなどの、ＤＮＡのランダム配列によってコードされ得る（Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２−８４，１９９１）。細胞標的化目的のために、組み込まれたモノマー単位を通じて、ｄｓＲＮＡ作用物質に係留されるペプチドまたはペプチド模倣体の例は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）−ペプチド、またはＲＧＤ模倣体である。ペプチド部分は、約５アミノ酸〜約４０アミノ酸長に及び得る。ペプチド部分は、安定性を増大させ、または立体構造特性を誘導するような、構造修飾を有し得る。下述の構造修飾のいずれかを使用し得る。
【０３４９】
本発明の組成物および方法で使用されるＲＧＤペプチドは、直鎖または環状であってもよく、例えばグリコシル化またはメチル化により修飾して、特定組織への標的化を容易にしてもよい。ＲＧＤ含有ペプチドおよびペプチド模倣剤（ｐｅｐｔｉｄｉｏｍｉｍｅｍｔｉｃｓ）としては、Ｄ−アミノ酸、ならびに合成ＲＧＤ模倣体が挙げられる。ＲＧＤに加えて、インテグリンリガンドを標的にするその他の部分を使用し得る。このリガンドの好ましい複合体は、ＰＥＣＡＭ−１またはＶＥＧＦを標的にする。
【０３５０】
「細胞透過性ペプチド」は、例えば細菌または真菌細胞などの微生物細胞、またはヒト細胞などの哺乳類細胞などの細胞に浸透できる。微生物細胞透過性ペプチドは、例えばα−らせん直鎖ペプチド（例えばＬＬ−３７またはセクロピン（Ｃｅｒｏｐｉｎ）Ｐ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えばα−デフェンシン、β−デフェンシンまたはバクテネシン）、または１つまたは２つの主要アミノ酸（例えばＰＲ−３９またはインドリシジン）のみを含有するペプチドであり得る。細胞透過性ペプチドはまた、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含み得る。例えば細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１の融合ペプチドドメインおよびＳＶ４０大型Ｔ抗原のＮＬＳに由来する、ＭＰＧなどの二分両親媒性ペプチドであり得る（Ｓｉｍｅｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２７１７−２７２４，２００３）。
【０３５１】
Ｃ．炭水化物複合体
本発明の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ｉＲＮＡは、炭水化物をさらに含む。炭水化物共役ｉＲＮＡは、本明細書に記載されるような、核酸ならびに生体内治療用途に適する組成物の生体内送達に、有利である。本明細書の用法では、「炭水化物」は、各炭素原子に結合する酸素、窒素またはイオウ原子がある、少なくとも６個の炭素原子（直鎖、分枝または環状であり得る）を有する、１つまたは複数の単糖単位で構成される炭水化物それ自体；各炭素原子に結合する酸素、窒素またはイオウ原子がある、少なくとも６個の炭素原子（直鎖、分枝または環状であり得る）をそれぞれ有する、１つまたは複数の単糖単位で構成される炭水化物部分をその一部として有する化合物のいずれかである化合物を指す。代表的な炭水化物としては、糖類（単糖類、二糖類、三糖類、および約４、５、６、７、８、または９個の単糖単位を含有するオリゴ糖類）、およびデンプン、グリコーゲン、セルロース、および多糖類ガムなどの多糖類が挙げられる。特定の単糖類としては、Ｃ５以上（例えばＣ５、Ｃ６、Ｃ７、またはＣ８）の糖類が挙げられ；二および三糖類としては、２または３個の単糖単位を有する糖類が挙げられる（例えばＣ５、Ｃ６、Ｃ７、またはＣ８）。
【０３５２】
特定の実施形態では、本発明の組成物および方法で使用される炭水化物複合体は単糖である。
【０３５３】
一実施形態では、本発明の組成物および方法において用いるための炭水化物コンジュゲートは、
【化２７】
2020500929.tif 000028
【化２８】
2020500929.tif 000029
【化２９】
2020500929.tif 000030
【化３０】
2020500929.tif 000031
【化３１】
2020500929.tif 000032
（式中、ＹはＯまたはＳであり、ｎは３〜６である）（式ＸＸＩＶ）；
【化３２】
2020500929.tif 000033
（式中、ＹはＯまたはＳであり、ｎは３〜６である）（式ＸＸＶ）；
【化３３】
2020500929.tif 000034
（式中、ＸはＯまたはＳである）（式ＸＸＶＩＩ）；
【化３４】
2020500929.tif 000035
【化３５】
2020500929.tif 000036
【化３６】
2020500929.tif 000037
からなる群から選択される。
【０３５４】
別の実施形態では、本発明の組成物および方法において用いるための炭水化物コンジュゲートは、単糖である。一実施形態では、単糖は、Ｎ−アセチルガラクトサミン、例えば
【化３７】
2020500929.tif 000038
である。
【０３５５】
本明細書に記載の実施形態において用いるための別の代表的な炭水化物コンジュゲートとして、限定はされないが、
【化３８】
2020500929.tif 000039
（ＸまたはＹの一方がオリゴヌクレオチドであるとき、他方は水素である）
が挙げられる。
【０３５６】
本発明の特定の実施形態では、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、一価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合される。一部の実施形態では、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、二価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合される。本発明のさらに他の実施形態では、ＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体は、三価リンカーを介して本発明のｉＲＮＡ剤に結合される。
【０３５７】
一実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、ｉＲＮＡ剤、例えば、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖の５’末端、または本明細書に記載のような二重標的化ＲＮＡｉ剤の一方または双方のセンス鎖の５’末端に結合された１つのＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。別の実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、複数（例えば、２、３、４、５、または６）のＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含み、各々は独立して、複数の一価リンカーを介して二本鎖ＲＮＡｉ剤の複数のヌクレオチドに結合される。
【０３５８】
一部の実施形態では、例えば、本発明のｉＲＮＡ剤の２本の鎖が、複数の不対ヌクレオチドを含むヘアピンループを形成する、一方の鎖の３’末端と他方の各鎖の５’末端との間のヌクレオチドの非中断鎖によって接続された１つのより大きい分子の一部であるとき、ヘアピンループ内部の各不対ヌクレオチドは、独立して一価リンカーを介して結合されたＧａｌＮＡｃまたはＧａｌＮＡｃ誘導体を含んでもよい。
【０３５９】
一部の実施形態では、炭水化物複合体は、上記のような１つ以上のさらなるリガンド、例えば限定はされないが、ＰＫ修飾因子または細胞浸透ペプチドをさらに含む。
【０３６０】
本発明における使用に適したさらなる炭水化物複合体および／リンカーは、ＰＣＴ公開の国際公開第２０１４／１７９６２０号パンフレットおよび国際公開第２０１４／１７９６２７号パンフレット（それら各々の内容全体は参照により本明細書中に援用される）に記載されるものを含む。
【０３６１】
Ｄ．リンカー
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される複合体またはリガンドは、切断可能または切断不能であり得る、様々なリンカーによって、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドに付着し得る。
【０３６２】
「リンカー」または「連結基」という用語は、例えば化合物の２つの部分に共有結合するなどの、化合物の２つの部分を結合する有機部分を意味する。リンカーは、典型的に、直接結合、または酸素またはイオウなどの原子、ＮＲ８、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨなどの単位、または置換または非置換アルキル、置換または非置換アルケニル、置換または非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘレロシクリルアルキニル（ａｌｋｙｌｈｅｒｅｒｏｃｙｃｌｙｌａｌｋｙｎｙｌ）、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘレロアリール（ａｌｋｙｎｙｌｈｅｒｅｒｏａｒｙｌ）などであるが、これに限定されるものではない原子鎖を含み、その１つまたは複数のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ８）、Ｃ（Ｏ）、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、または置換または非置換複素環（式中、Ｒ８は水素、アシル、脂肪族または置換脂肪族である）によって中断されまたは終結され得る。一実施形態では、リンカーは、約１〜２４個の原子、２〜２４個の原子、３〜２４個の原子、４〜２４個の原子、５〜２４個の原子、６〜２４個の原子、６〜１８個の原子、７〜１８個の原子、８〜１８個の原子、７〜１７個の原子、８〜１７個の原子、６〜１６個の原子、７〜１７個の原子、または、８〜１６個の原子である。
【０３６３】
切断可能連結基は、細胞外で十分に安定しているが、標的細胞への侵入時に切断されて、リンカーがつなぎ止めている２つの部分を放出するものである。好ましい実施形態では、切断可能連結基は、標的細胞中で、または第１の標準状態下（例えば細胞内条件を模倣し、またはそれに相当するように選択し得る）で、対象の血中において、または第２の標準状態下（例えば血中または血清に見られる条件を模倣し、またはそれに相当するように選択し得る）よりも、少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍以上、または少なくとも１００倍より迅速に切断される。
【０３６４】
切断可能連結基は、例えばｐＨ、酸化還元電位または分解性分子の存在などの切断作用物質の影響を受けやすい。一般に切断作用物質は、血清または血液中よりも細胞中でより一般的であり、またはより高いレベルまたは活性で見られる。このような分解性作用物質の例としては、例えば還元によって酸化還元切断可能連結基を分解し得る、細胞中に存在する、酸化または還元酵素またはメルカプタンなどの還元剤をはじめとする、特定の基質のために選択された、または基質特異性がない酸化還元剤；エステラーゼ；エンドソームまたは例えば５以下のｐＨをもたらすものなどの酸性環境をもたらし得る作用物質；一般酸、ペプチダーゼ（基質特異性であり得る）、およびホスファターゼとして作用することで、酸切断可能連結基を加水分解または分解し得る酵素が挙げられる。
【０３６５】
ジスルフィド結合などの切断可能連結基は、ｐＨに対する感受性が高くあり得る。ヒト血清のｐＨが７．４であるのに対し、細胞内平均ｐＨはわずかにより低く、約７．１〜７．３の範囲にわたる。エンドソームは、５．５〜６．０の範囲のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、約５．０のさらにより酸性のｐＨを有する。いくつかのリンカーは、好ましいｐＨで切断される切断可能連結基を有し、それによって細胞中のリガンドから、または細胞の所望の区画へ、カチオン性脂質が放出される。
【０３６６】
リンカーは、特定の酵素によって切断可能な切断可能連結基を含み得る。リンカーに組み込まれる切断可能連結基のタイプは、標的とされる細胞に左右され得る。例えば肝臓を標的化するリガンドは、エステル基を含むリンカーを通じてカチオン性脂質に連結し得る。肝細胞はエステラーゼに富み、したがってリンカーは、エステラーゼが豊富でない細胞型よりも、肝細胞中でより効率的に切断される。エステラーゼに富むその他の細胞型としては、肺、腎皮質、および精巣の細胞が挙げられる。
【０３６７】
ペプチド結合を含有するリンカーは、肝細胞および滑膜細胞などのペプチダーゼに富んだ細胞型を標的化する際に使用し得る。
【０３６８】
一般に切断可能連結基の候補の適合性は、候補連結基を切断する分解性作用物質（条件）の能力を検査することで評価し得る。切断可能連結基の候補は、血中において、またはその他の非標的組織との接触時に、切断に抵抗する能力についてもまた検査することもまた望ましい。したがって第１の条件が標的細胞中での切断を示すように選択され、第２の条件がその他の組織または例えば血液または血清などの生体液中での切断を示すように選択される、第１および第２の条件間の切断の相対的感受性を判定し得る。評価は、無細胞系中、細胞中、細胞培養中、臓器または組織培養中、または全身の動物中で実施し得る。無細胞または培養条件で最初の評価を行い、全身の動物中でのさらなる評価によって確認することが有用なこともあり得る。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液または血清（または細胞外条件を模倣するように選択された生体外条件下）と比較して、細胞中（または細胞内条件を模倣するように選択された生体外条件下）で、少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００倍より迅速に切断される。
【０３６９】
ｉ．酸化還元切断可能連結基
特定の実施形態では、切断可能連結基は、還元または酸化に際して切断される酸化還元切断可能連結基である。還元的切断可能連結基の一例は、ジスルフィド連結基（−Ｓ−Ｓ−）である。切断可能連結基候補が、適切な「還元的切断可能連結基」か、または例えば特定のｉＲＮＡ部分および特定の標的作用物質と共に使用するのに適するかどうかを判定するために、本明細書に記載される方法に頼ることができる。例えば候補は、例えば標的細胞などの細胞中で観察される切断速度を模倣する、当該技術分野で公知の試薬を使用して、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、またはその他の還元剤とのインキュベーションによって評価し得る。候補はまた、血液または血清条件を模倣するように選択される条件下で評価し得る。１つの候補化合物は、血中で最大で約１０％切断される。他の実施形態では、有用な候補化合物は、血液（または細胞外条件を模倣するように選択された生体外条件下）と比較して、細胞中（または細胞内条件を模倣するように選択された生体外条件下）で、少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または約１００倍より迅速に分解される。候補化合物の切断速度は、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下で標準酵素動態アッセイを使用して、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較して判定し得る。
【０３７０】
ｉｉ．リン酸ベースの切断可能連結基
特定の実施形態では、切断可能なリンカーは、リン酸ベースの切断可能連結基を含む。リン酸ベースの切断可能連結基は、リン酸基を分解または加水分解する作用物質によって切断され得る。細胞中でリン酸基を切断する作用物質の一例は、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。リン酸ベースの連結基の例は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｓ−である。好ましい実施形態は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｓ−である。好ましい実施形態は、および−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
【０３７１】
ｉｉｉ．酸切断可能連結基
他の実施形態では、切断可能なリンカーは、酸切断可能連結基を含む。酸切断可能連結基は、酸性条件下で切断される連結基である。好ましい実施形態では、酸切断可能連結基は、ｐＨ約６．５以下（例えば約６．０、５．５、５．０以下）の酸性環境内において、または一般酸として作用し得る酵素などの作用物質によって切断される。細胞内では、エンドソームおよびリソソームなどの特定の低ｐＨ細胞小器官が、酸切断可能連結基の切断環境を提供し得る。酸切断可能連結基の例としては、ヒドラゾン、エステル、およびアミノ酸エステルが挙げられるが、これに限定されるものではない。酸切断可能基は、一般式−Ｃ＝ＮＮ−、Ｃ（Ｏ）Ｏ、または−ＯＣ（Ｏ）を有し得る。好ましい実施形態は、炭素がエステルの酸素に付着する場合（アルコキシ基）は、アリール基、置換アルキル基、またはジメチルペンチルまたはｔ−ブチルなどの三級アルキル基である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
【０３７２】
ｉｖ．エステルベースの連結基
他の実施形態では、切断可能なリンカーは、エステルベースの切断可能連結基を含む。エステルベースの切断可能連結基は、細胞内でエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素によって切断される。エステルベースの切断可能連結基の例としては、アルキレン、アルケニレン、およびアルキニレン基のエステルが挙げられるが、これに限定されるものではない。エステル切断可能連結基は、一般式−Ｃ（Ｏ）Ｏ−または−ＯＣ（Ｏ）−を有する。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
【０３７３】
ｖ．ペプチドベースの切断基
さらに他の実施形態では、切断可能なリンカーは、ペプチドベースの切断可能連結基を含む。ペプチドベースの切断可能連結基は、細胞内で、ペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素によって切断される。ペプチドベースの切断可能連結基は、アミノ酸の間に形成されて、オリゴペプチド（例えばジペプチド、トリペプチドなど）およびポリペプチドを生じる、ペプチド結合である。ペプチドベースの切断可能基には、アミド基（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）は含まれない。アミド基は、あらゆるアルキレン、アルケニレンまたはアルキニレン（ａｌｋｙｎｅｌｅｎｅ）間に形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸の間に形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じる特殊なタイプのアミド結合である。ペプチドベースの切断基は、一般にアミノ酸の間に形成されて、ペプチドおよびタンパク質を生じるペプチド結合（すなわちアミド結合）に限定され、アミド官能基全体は含まない。ペプチドベースの切断可能連結基は、一般式−ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）−を有し、式中、ＲＡおよびＲＢは２つの隣接するアミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上述したものと類似の方法を使用して評価し得る。
【０３７４】
一部の実施形態では、本発明のｉＲＮＡは、リンカーを通じて炭水化物と共役する。本発明の組成物および方法のリンカーと共役するｉＲＮＡ炭水化物の非限定的例としては、
【化３９】
2020500929.tif 000040
【化４０】
2020500929.tif 000041
（式中、
ＸまたはＹの一方はオリゴヌクレオチドであり、他方は水素である）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０３７５】
本発明の組成物および方法の特定の実施形態では、リガンドは、二価または三価の分枝リンカーを通じて付着する１つまたは複数の「ＧａｌＮＡｃ」（Ｎ−アセチルガラクトサミン）誘導体である。
【０３７６】
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、
式（ＸＬＶ）〜（ＸＬＶＩ）、
【化４１】
2020500929.tif 000042
（式中、
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ、およびｑ５Ｃは、独立して、０〜２０の各出現を表し、反復単位は、同一であるかまたは異なり得て；
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃは、各出現についてそれぞれ独立して、不在、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨまたはＣＨ２Ｏであり；
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃは、各出現についてそれぞれ独立して、不在、アルキレン、置換アルキレンであり、１つまたは複数のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’’）、Ｃ≡ＣまたはＣ（Ｏ）の１つまたは複数によって中断または終結され得て；
Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃは、各出現についてそれぞれ独立して、不在、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒａ）−ＮＨ−、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
【化４２】
2020500929.tif 000043
またはヘテロシクリルであり；
Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５ＢおよびＬ５Ｃはリガンドを表し；すなわち各出現についてそれぞれ独立して、単糖（ＧａｌＮＡｃなど）、二糖類、三糖、四糖、オリゴ糖、または多糖類であり；Ｒａは、Ｈまたはアミノ酸側鎖である）のいずれかで示される構造群から選択される、二価または三価の分枝リンカーと共役する。三価の共役ＧａｌＮＡｃ誘導体は、
式（ＸＬＩＸ）、
【化４３】
2020500929.tif 000044
（式中、
Ｌ５Ａ、Ｌ５ＢおよびＬ５Ｃは、ＧａｌＮＡｃ誘導体などの単糖を表す）などの標的遺伝子の発現を阻害するために、ＲＮＡｉ剤と共に使用するのに特に有用である。
【０３７７】
ＧａｌＮＡｃ誘導体に共役する適切な二価および三価の分枝リンカー基の例としては、式ＩＩ、ＶＩＩ、ＸＩ、Ｘ、およびＸＩＩＩとして、上で列挙された構造が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０３７８】
ＲＮＡ複合体の調製を教示する、代表的な米国特許としては、そのそれぞれの内容全体を参照によって本明細書によりここに援用する、米国特許第４，８２８，９７９号明細書；米国特許第４，９４８，８８２号明細書；米国特許第５，２１８，１０５号明細書；米国特許第５，５２５，４６５号明細書；米国特許第５，５４１，３１３号明細書；米国特許第５，５４５，７３０号明細書；米国特許第５，５５２，５３８号明細書；米国特許第５，５７８，７１７号明細書、米国特許第５，５８０，７３１号明細書；米国特許第５，５９１，５８４号明細書；米国特許第５，１０９，１２４号明細書；米国特許第５，１１８，８０２号明細書；米国特許第５，１３８，０４５号明細書；米国特許第５，４１４，０７７号明細書；米国特許第５，４８６，６０３号明細書；米国特許第５，５１２，４３９号明細書；米国特許第５，５７８，７１８号明細書；米国特許第５，６０８，０４６号明細書；米国特許第４，５８７，０４４号明細書；米国特許第４，６０５，７３５号明細書；米国特許第４，６６７，０２５号明細書；米国特許第４，７６２，７７９号明細書；米国特許第４，７８９，７３７号明細書；米国特許第４，８２４，９４１号明細書；米国特許第４，８３５，２６３号明細書；米国特許第４，８７６，３３５号明細書；米国特許第４，９０４，５８２号明細書；米国特許第４，９５８，０１３号明細書；米国特許第５，０８２，８３０号明細書；米国特許第５，１１２，９６３号明細書；米国特許第５，２１４，１３６号明細書；米国特許第５，０８２，８３０号明細書；米国特許第５，１１２，９６３号明細書；米国特許第５，２１４，１３６号明細書；米国特許第５，２４５，０２２号明細書；米国特許第５，２５４，４６９号明細書；米国特許第５，２５８，５０６号明細書；米国特許第５，２６２，５３６号明細書；米国特許第５，２７２，２５０号明細書；米国特許第５，２９２，８７３号明細書；米国特許第５，３１７，０９８号明細書；米国特許第５，３７１，２４１号明細書、米国特許第５，３９１，７２３号明細書；米国特許第５，４１６，２０３号明細書、米国特許第５，４５１，４６３号明細書；米国特許第５，５１０，４７５号明細書；米国特許第５，５１２，６６７号明細書；米国特許第５，５１４，７８５号明細書；米国特許第５，５６５，５５２号明細書；米国特許第５，５６７，８１０号明細書；米国特許第５，５７４，１４２号明細書；米国特許第５，５８５，４８１号明細書；米国特許第５，５８７，３７１号明細書；米国特許第５，５９５，７２６号明細書；米国特許第５，５９７，６９６号明細書；米国特許第５，５９９，９２３号明細書；米国特許第５，５９９，９２８号明細書；米国特許第５，６８８，９４１号明細書；米国特許第６，２９４，６６４号明細書；米国特許第６，３２０，０１７号明細書；米国特許第６，５７６，７５２号明細書；米国特許第６，７８３，９３１号明細書；米国特許第６，９００，２９７号明細書；米国特許第７，０３７，６４６号明細書；および米国特許第８，１０６，０２２号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０３７９】
所与の化合物中の全ての位置が一様に修飾される必要はなく、事実上、前述の修飾の２つ以上が、単一化合物中に、またはｉＲＮＡ内の単一ヌクレオシド中にさえ、組み込まれ得る。本発明は、キメラ化合物であるｉＲＮＡ化合物もまた含む。
【０３８０】
「キメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）」ｉＲＮＡ化合物または「キメラ（ｃｈｉｍｅｒａｓ）」は、本発明の文脈で、それぞれ少なくとも１つのモノマー単位から、すなわちｄｓＲＮＡ化合物の場合はヌクレオチドから構成される、２つ以上の化学的に異なる領域を含有するｉＲＮＡ化合物、好ましくはｄｓＲＮＡ剤である。これらのｉＲＮＡは、典型的に、ｉＲＮＡに、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増大、細胞内取り込みの増大、または標的核酸に対する結合親和性の増大を与えるように、ＲＮＡが修飾される少なくとも１つの領域を含有する。ｉＲＮＡの追加的な領域が、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断できる、酵素基質の役割を果たしてもよい。一例として、ＲＮａｓｅ  Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。したがってＲＮａｓｅ  Ｈの活性化はＲＮＡ標的の切断をもたらし、それによって遺伝子発現のｉＲＮＡ阻害効率を大幅に高める。その結果、同一標的領域とハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、キメラｄｓＲＮＡが使用される場合、より短いｉＲＮＡによって、比較できる結果が得られることが多い。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動、そして必要ならば当該技術分野で公知の関連核酸ハイブリダイゼーション技術によって、慣例的に検出し得る。
【０３８１】
場合によっては、ｉＲＮＡのＲＮＡは、非リガンド基によって修飾し得る。ｉＲＮＡの活性、細胞分布または細胞内取り込みを高めるために、いくつかの非リガンド分子がｉＲＮＡに共役結合されており、このような共役結合を実施する手順は、学術文献で入手できる。このような非リガンド部分は、コレステロールなどの脂質部分（Ｋｕｂｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２００７，３６５（１）：５４−６１；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４：１０５３）、例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオールなどのチオエーテル（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３）、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基などの脂肪族鎖（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９１，１０：１１１；Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９）、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネートなどのリン脂質（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１；Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９）、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３）を含む。このようなＲＮＡ複合体の調製を教示する代表的な米国特許は、上に列挙した。典型的な共役結合プロトコルは、配列の１つまたは複数の位置にアミノリンカーを有するＲＮＡの合成を伴う。次に適切なカップリングまたは活性化試薬を使用して、アミノ基を共役結合する分子と反応させる。共役結合反応は、溶液相中で、ＲＮＡが固体支持体になおも結合する間に、またはＲＮＡ切断に続いて実施することができる。ＨＰＬＣによるＲＮＡ複合体精製は、典型的に純粋な複合体を与える。
【０３８２】
ＩＶ．本発明のｉＲＮＡの送達
例えばヒト対象などの対象内の細胞などの細胞への本発明のｉＲＮＡの送達は、いくつかの異なる方法で達成し得る。例えば送達は、試験管内または生体内のどちらかで、細胞を本発明のｉＲＮＡに接触させることで実施してもよい。生体内送達はまた、例えばｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡを含む組成物を対象に投与することで直接実施してもよい。代案としては、生体内送達は、ｉＲＮＡをコードして発現を誘導する、１つまたは複数のベクターを投与することで、間接的に実施してもよい。これらの代替案は、下でさらに考察される。
【０３８３】
一般に、（試験管内または生体内で）核酸分子を送達するあらゆる方法が、本発明のｉＲＮＡで使用するために適応させ得る（例えば、その内容全体を参照によって本明細書に援用する、Ａｋｈｔａｒ  Ｓ．ａｎｄ  Ｊｕｌｉａｎ  ＲＬ．（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２（５）：１３９−１４４および国際公開第９４／０２５９５号パンフレットを参照されたい）。生体内送達では、ｉＲＮＡ分子を送達するために検討すべき要素としては、例えば、送達分子の生物学的安定性、非特異的効果の防止、および標的組織中の送達分子の蓄積が挙げられる。ｉＲＮＡの非特異的効果は、例えば組織内への直接注射または移植または製剤を局所投与するなどの局所投与によって最小化し得る。治療部位への局所投与は、作用物質の局所濃度を最大化し、そうしなければ作用物質によって害を被り得る、または作用物質を分解し得る、全身組織の作用物質への曝露を限定し、ｉＲＮＡ分子のより低い総用量での投与を可能にする。いくつかの研究は、ｄｓＲＮＡｉ剤が局所的に投与された場合に、成功裏の遺伝子産物ノックダウン示している。例えばカニクイザルにおける硝子体内注射による（Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ，ＭＪ，ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｒｅｔｉｎａ  ２４：１３２−１３８）、およびマウスにおける網膜下注射による（Ｒｅｉｃｈ，ＳＪ．，  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．９：２１０−２１６）、ＶＥＧＦ  ｄｓＲＮＡの眼内送達は、どちらも加齢黄斑変性の実験モデルで新血管形成を防止することを示した。これに加えて、マウスにおけるｄｓＲＮＡの直接腫瘍内注射は、腫瘍体積を低下させ（Ｐｉｌｌｅ，Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：２６７−２７４）、腫瘍を有するマウスの生存期間を延長し得た（Ｋｉｍ，ＷＪ．，ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：３４３−３５０；Ｌｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：５１５−５２３）。ＲＮＡ干渉は、直接注射によるＣＮＳへの（Ｄｏｒｎ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ３２：ｅ４９；Ｔａｎ，ＰＨ．，ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：５９−６６；Ｍａｋｉｍｕｒａ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ（２００２）ＢＭＣ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：１８；Ｓｈｉｓｈｋｉｎａ，ＧＴ．，ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １２９：５２１−５２８；Ｔｈａｋｋｅｒ，ＥＲ．，ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：１７２７０−１７２７５；Ａｋａｎｅｙａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．９３：５９４−６０２）、および鼻腔内投与による肺への（Ｈｏｗａｒｄ，ＫＡ．，ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：４７６−４８４；Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１０６７７−１０６８４；Ｂｉｔｋｏ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：５０−５５）局所性送達の成功が示されている。感染を予防するために、ｉＲＮＡを全身的に投与するために、ＲＮＡは修飾され、または代案としては薬物送達系を使用して送達され得て；どちらの方法も、生体内エンド−およびエキソ−ヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡの迅速な分解を防止するように作用する。ＲＮＡまたは薬学的担体の修飾はまた、標的組織へのｉＲＮＡの標的化も可能にし得て、望ましくない非特異的効果が回避される。コレステロールなどの親油性基の化学的結合によってｉＲＮＡ分子を修飾し、細胞内取り込みを高め分解を防止し得る。例えば親油性コレステロール部分に共役結合されたＡｐｏＢに対抗するｉＲＮＡがマウスに全身注射され、肝臓および空腸の双方でａｐｏＢ  ｍＲＮＡノックダウンがもたらされた（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：１７３−１７８）。ｉＲＮＡのアプタマーへの共役結合は、前立腺がんのマウスモデルにおいて腫瘍増殖を抑制し、腫瘍退縮を媒介することが示されている。（ＭｃＮａｍａｒａ，ＪＯ，ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：１００５−１０１５）。代案の実施形態では、ｉＲＮＡは、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、またはカチオン性送達系などの薬物送達システムを使用して送達され得る。正に帯電したカチオン性送達系は、ｉＲＮＡ分子（負に帯電）の結合を容易にして、負に帯電した細胞膜における相互作用もまた高めて、細胞によるｉＲＮＡの効率的な取り込みを可能にする。カチオン性脂質、デンドリマー、またはポリマーは、ｉＲＮＡに結合され、またはｉＲＮＡを包む小胞またはミセルを形成するように誘導され得る（例えばＫｉｍ  ＳＨ，ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １２９（２）：１０７−１１６を参照されたい）。小胞またはミセルの形成は、全身投与した際にｉＲＮＡの分解をさらに防止する。カチオン性ｉＲＮＡ複合体を作成して投与する方法は、十分に当業者の能力の範囲内である（例えばその内容全体を参照によって本明細書に援用する、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ，ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ３２７：７６１−７６６；Ｖｅｒｍａ，ＵＮ，ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９：１２９１−１３００；Ａｒｎｏｌｄ，ＡＳ  ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２５：１９７−２０５を参照されたい）。ｉＲＮＡの全身性送達に有用な薬物送達系のいくつかのの非限定的例としては、ＤＯＴＡＰ（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ  ａｌ（２００３），前出；Ｖｅｒｍａ，ＵＮ，ｅｔ  ａｌ（２００３），前出）、オリゴフェクトアミン（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、“ｓｏｌｉｄ  ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ  ｌｉｐｉｄｐａｒｔｉｃｌｅｓ”（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ＴＳ，ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：１１１−１１４）、カルジオリピン（Ｃｈｉｅｎ，ＰＹ，ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：３２１−３２８；Ｐａｌ，Ａ，ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｉｎｔ  Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２６：１０８７−１０９１）、ポリエチレンイミン（Ｂｏｎｎｅｔ  ＭＥ，ｅｔ  ａｌ（２００８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．８月１６日オンライン先行発表；Ａｉｇｎｅｒ，Ａ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７１６５９）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド（Ｌｉｕ，Ｓ．（２００６）��ｏｌ．Ｐｈａｒｍ．３：４７２−４８７）、およびポリアミドアミン（Ｔｏｍａｌｉａ，ＤＡ，ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３５：６１−６７；Ｙｏｏ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１７９９−１８０４）が挙げられる。いくつかの実施形態では、全身投与のために、ｉＲＮＡはシクロデキストリンと複合体を形成する。ｉＲＮＡおよびシクロデキストリンの投与方法および医薬組成物は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する米国特許第７，４２７，６０５号明細書にある。
【０３８４】
Ａ．本発明のｉＲＮＡをコードするベクター
Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子標的化ｉＲＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入された転写単位から発現され得る（例えばＣｏｕｔｕｒｅ，Ａ，ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＧ．（１９９６），１２：５−１０；Ｓｋｉｌｌｅｒｎ，Ａ，ｅｔ  ａｌ．国際公開第００／２２１１３号パンフレット；Ｃｏｎｒａｄ、国際公開第００／２２１１４号パンフレット；およびＣｏｎｒａｄ、米国特許第６，０５４，２９９号明細書を参照されたい）。発現は、使用される特定のコンストラクトおよび標的組織または細胞型次第で、一過性（数時間から数週間程度）または持続性（数週間から数ヶ月以上）であり得る。これらの導入遺伝子は、組み込み型または非組み込み型ベクターであり得る、直鎖コンストラクト、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入し得る。導入遺伝子はまた、それが染色体外プラスミドとして遺伝するのを可能にするよう構築し得る（Ｇａｓｓｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：１２９２）。
【０３８５】
個々のｉＲＮＡ鎖または鎖群は、発現ベクター上のプロモータから転写され得る。２つの別個の鎖を発現させて、例えばｄｓＲＮＡを生成させる場合、（例えば形質移入または感染によって）２つの別個の発現ベクターを標的細胞に同時導入し得る。代案としては、そのどちらも同一発現プラスミド上に位置するプロモータによって、ｄｓＲＮＡの個々の鎖を転写し得る。一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡがステムループ構造を有するように、リンカーポリヌクレオチド配列によって連結する逆位反復ポリヌクレオチドとして発現される。
【０３８６】
ｉＲＮＡ発現ベクターは、一般にＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。真核生物細胞に適合し、好ましくは脊椎動物細胞に適合する発現ベクターを使用して、本明細書に記載されるｉＲＮＡ発現のための組換えコンストラクトを生成し得る。真核細胞発現ベクターは当該技術分野で周知であり、いくつかの商業的供給元から入手できる。典型的にこのようなベクターは、所望の核酸断片を挿入するための都合良い制限酵素認識部位を含有させて、提供される。ｉＲＮＡ発現ベクターの送達は、静脈内または筋肉内投与などによる全身投与、患者から外植された標的細胞への投与とそれに続く患者への再導入、または所望の標的細胞に導入できるようにするあらゆる別の手段などであり得る。
【０３８７】
本明細書に記載される方法および組成物と共に利用し得るウイルスベクターシステムとしては、（ａ）アデノウイルスベクター；（ｂ）レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスなどをはじめとするが、これに限定されるものではないレトロウイルスベクター；（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター；（ｄ）単純ヘルペスウイルスベクター；（ｅ）ＳＶ４０ベクター；（ｆ）ポリオーマウイルスベクター；（ｇ）乳頭腫ウイルスベクター；（ｈ）ピコルナウィルスベクター；（ｉ）例えばワクシニアウイルスベクターなどのオルソポックス、または例えばカナリア痘または鶏痘などのアビポックスなどのポックスウイルスベクター；および（ｊ）ヘルパー依存性またはガットレスアデノウイルスが挙げられるが、これに限定されるものではない。複製欠陥ウイルスもまた、有利であり得る。異なるベクターは、細胞のゲノムに組み込まれ、または組み込まれない。コンストラクトは、所望ならば、形質移入のためのウイルス配列を含み得る。代案としては、コンストラクトは、例えばＥＰＶおよびＥＢＶベクターなどのエピソーム複製ができるベクターに組み込まれ得る。ｉＲＮＡの組換え発現のためのコンストラクトは、一般に、標的細胞中のｉＲＮＡ発現を確実にするための、例えばプロモータ、エンハンサーなどの調節因子を必要とする。ベクターおよびコンストラクトについて検討されるその他の態様は、当該技術分野で周知である。
【０３８８】
Ｖ．本発明の医薬組成物
本発明はまた、本発明のｉＲＮＡを含む医薬組成物および製剤を含む。一実施形態では、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のようなｉＲＮＡを含有する医薬組成物、および薬学的に許容できる担体である。ｉＲＮＡを含有する医薬組成物は、Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子の発現または活性に関連した疾患または障害、例えばＳｅｒｐｉｎａ１欠損関連障害、例えばＳｅｒｐｉｎａ１欠損肝障害を治療するのに有用である。かかる医薬組成物は、送達様式に基づいて製剤化される。一例が、非経口送達、例えば静脈内（ＩＶ）送達を介した全身投与用に製剤化される組成物である。別の例が、例えば脳への注入による、例えば連続ポンプ注入による脳実質への直接送達用に製剤化される組成物である。
【０３８９】
本発明のＲＮＡｉ剤を含む医薬組成物は、例えば、緩衝液の存在下もしくは不在下の溶液、または薬学的に許容できる担体を含有する組成物であってもよい。かかる組成物は、例えば、水性または結晶組成物、リポソーム製剤、ミセル製剤、乳剤、および遺伝子療法ベクターを含む。
【０３９０】
本発明の方法において、該ＲＮＡｉ剤は、溶液中で投与されてもよい。遊離ＲＮＡｉ剤は、非緩衝液中、例えば、生理食塩水中または水中で投与されてもよい。あるいは、遊離ｓｉＲＮＡはまた、好適な緩衝液中で投与されてもよい。緩衝液は、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、もしくはリン酸塩、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。好ましい実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。ＲＮＡｉ剤を含有する緩衝液のｐＨおよび容積モル浸透圧濃度は、それが対象への投与に適するように調節され得る。
【０３９１】
一部の実施形態では、緩衝液は、溶液の容積モル浸透圧濃度を所望される値、例えばヒト血漿の生理値で維持されるように調節するための薬剤をさらに含む。容積モル浸透圧濃度を調節するために緩衝液に添加され得る溶質として、限定はされないが、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、非代謝性ポリマー、ビタミン、イオン、糖、代謝産物、有機酸、脂質、または塩が挙げられる。一部の実施形態では、溶液の容積モル浸透圧濃度を調節するための薬剤は、塩である。特定の実施形態では、溶液の容積モル浸透圧濃度を調節するための薬剤は、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである。
【０３９２】
本発明の医薬組成物は、Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子の発現を阻害するのに十分な用量で投与されてもよい。一般に、本発明のｉＲＮＡの好適な用量は、１日あたりレシピエントの体重あたり約０．００１〜約２００．０ｍｇ／ｋｇの範囲内、一般には約１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲内となる。例えば、ｄｓＲＮＡは、単回用量あたり、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、または約５０ｍｇ／ｋｇで投与され得る。
【０３９３】
医薬組成物は、毎日１回投与し得て、またはｉＲＮＡは、一日を通して適切な間隔で、２、３回以上の部分用量として投与し得て、または持続注入または放出制御製剤を通じた送達さえも使用して、投与し得る。その場合、各部分用量に含有されるｉＲＮＡは、１日あたり総用量を達成するために、対応してより少量でなくてはならない。投薬単位はまた、例えば数日間にわたってｉＲＮＡの徐放を提供する、従来型の徐放性製剤を使用して、数日間にわたる送達のために配合し得る。徐放性製剤は当該技術分野で周知であり、特に、本発明の作用物質で使用し得る、特定部位への作用物質送達のために有用である。この実施形態では、投薬単位は、相当する複数の１日量を含有する。
【０３９４】
別の実施形態では、医薬組成物の単回投与は、引き続く用量が、３、４、もしくは５日間以下の間隔で、または１、２、３、もしくは４週間以下の間隔で投与されるように、長期にわたり得る。本発明のいくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物の単回投与は、週１回投与される。本発明の別の実施形態では、本発明の医薬組成物の単回投与は、月２回投与される。
【０３９５】
当業者は、疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の総体的な健康および／または年齢、および存在するその他の疾患をはじめとするが、これに限定されるものではない、特定の要因が、対象を効果的に治療するのに要求される用量およびタイミングに影響し得ることを理解するであろう。さらに治療有効量の組成物による対象の治療は、単回治療または一連の治療を含み得る。本発明に包含される個々のｉＲＮＡの有効投与量および生体内半減期は、本明細書の他の箇所で記載されるように、従来の手順を使用して、または適切な動物モデルを使用した生体内試験に基づいて、推定し得る。
【０３９６】
マウス遺伝的性質における進歩により、Ｓｅｒｐｉｎａ１の発現における低下から利益を得るであろう、様々なヒト疾患、例えば肝障害の試験用の幾つかのマウスモデルが得られている。かかるモデルは、ｉＲＮＡのインビボ試験のためや、治療有効量を決定するため、用いることができる。好適なマウスモデルは、当該技術分野で公知であり、例えばヒトＳｅｒｐｉｎａ１を発現する導入遺伝子を含有するマウスを含む。
【０３９７】
本発明の医薬組成物は、局所性または全身性の治療が所望されるかどうかに応じて、そして治療領域次第で、いくつかの方法で投与し得る。投与は、局所（例えば経皮パッチによる）、例えばネブライザーをはじめとする、粉末または煙霧剤の吸入または吹送による経肺；気管内、鼻腔内、経表皮および経皮、経口または非経口であってもよい。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射または点滴；例えば埋め込みデバイスを通じた真皮下投与；または例えば脳実質内、クモ膜下腔内または脳室内などの頭蓋内投与が挙げられる。ｉＲＮＡは、肝臓（例えば肝臓の実質細胞）などの特定組織を標的化する様式で、送達され得る。
【０３９８】
局所投与のための医薬組成物および製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体、および粉末が挙げられる。従来の薬学的担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤などが、必要でありまたは望ましい可能性もある。被覆コンドーム、手袋などもまた、有用であり得る。適切な局所製剤としては、その中で、本発明で取り上げるｉＲＮＡが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化作用物質、および界面活性剤などの局所送達作用物質との混和材料中にあるものが挙げられる。適切な脂質およびリポソームとしては、中性（例えばジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロリホスファチジル（ｄｉｓｔｅａｒｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ）コリン）、陰性（例えばジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）およびカチオン性（例えばジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が挙げられる。本発明で取り上げるｉＲＮＡは、リポソーム内にカプセル化されることができ、またはそれと、特にカチオン性リポソームと、複合体形成することができる。代案としては、ｉＲＮＡは、脂質、特にカチオン性脂質と複合体形成することができる。適切な脂肪酸およびエステルとしては、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはＣ１〜２０アルキルエステル（例えばイソプロピルミリスチン酸ＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド、または薬学的に許容可能なその塩）が挙げられるが、これに限定されるものではない。局所製剤は、参照によって本明細書に援用する、米国特許第６，７４７，０１４号明細書に詳述される。
【０３９９】
Ａ．膜様分子アセンブリーを含むｉＲＮＡ製剤
本発明の組成物および方法で使用されるｉＲＮＡは、例えばリポソームまたはミセルなどの膜様分子アセンブリー内の送達のために調合し得る。本明細書の用法では、「リポソーム」という用語は、例えば１つの二重層または複数の二重層などの、少なくとも１つの二重層に配列された両親媒性脂質から構成される小胞を指す。リポソームは、親油性材料と水性内部から形成される膜を有する、単層のまたは多重膜小胞を含む。水性部分は、ｉＲＮＡ組成物を含有する。親油性材料は、水性内部を水性外部から隔離し、水性外部は、典型的にｉＲＮＡ組成物を含まないが、場合によっては含んでもよい。リポソームは、活性成分の作用部位への移行と送達のために有用である。リポソーム膜は生体膜と構造的に類似するので、リポソームを組織に適用すると、リポソーム性二重層は細胞膜の二重層と融合する。リポソームと細胞の融合が進行するにつれて、ｉＲＮＡを含む内部水性内容物が細胞内に送達され、そこではｉＲＮＡが標的ＲＮＡに特異的に結合し得て、ＲＮＡｉを媒介し得る。場合によっては、リポソームもまた特異的に標的化され、例えばｉＲＮＡを特定の細胞型に誘導する。
【０４００】
ＲＮＡｉ剤を含有するリポソームは、多様な方法によって調製し得る。一例では、リポソームの脂質成分は、脂質成分なしでミセルが形成されるように、洗剤に溶解される。例えば脂質成分は、両親媒性カチオン性脂質または脂質複合体であり得る。洗剤は、高い臨界ミセル濃度を有し得て、非イオン性であってもよい。例示的な洗剤としては、コール酸、ＣＨＡＰＳ、オクチルグルコシド、デオキシコール酸、およびラウロイルサルコシンが挙げられる。次にＲＮＡｉ剤調製物は、脂質成分を含むミセルに添加される。脂質上のカチオン基はＲＮＡｉ剤と相互作用して、ＲＮＡｉ剤周囲で凝縮してリポソームを形成する。凝縮後、例えば透析によって洗剤を除去し、ＲＮＡｉ剤のリポソーム調製物を得る。
【０４０１】
必要ならば、例えば凝縮を助ける担体化合物を、制御された添加によって縮合反応中に添加し得る。例えば担体化合物は、核酸以外のポリマー（例えばスペルミンまたはスペルミジン）であり得る。ｐＨもまた調節して、凝縮を支援し得る。
【０４０２】
送達ビヒクルの構造的構成要素としてポリヌクレオチド／カチオン性脂質複合体を組み込む、安定したポリヌクレオチド送達ビヒクルを生成する方法は、例えばその内容全体を参照によって本明細書に援用する、国際公開第９６／３７１９４号パンフレットにさらに記載される。リポソーム形成は、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８：７４１３−７４１７，１９８７；米国特許第４，８９７，３５５号明細書；米国特許第５，１７１，６７８号明細書；Ｂａｎｇｈａｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３：２３８，１９６５；Ｏｌｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ５５７：９，１９７９；Ｓｚｏｋａ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５：４１９４，１９７８；Ｍａｙｈｅｗ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ７７５：１６９，１９８４；Ｋｉｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ７２８：３３９，１９８３；およびＦｕｋｕｎａｇａ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１５：７５７，１９８４に記載される例示的な方法の１つまたは複数の態様も含み得る。送達ビヒクルとして使用される適切なサイズの脂質凝集体を調製する一般に使用される技術としては、超音波処理、および凍結解凍と押出の組み合わせが挙げられる（例えばＭａｙｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ８５８：１６１，１９８６を参照されたい）。一貫して小型（５０〜２００ｎｍ）で比較的均一な凝集体が所望される場合は、顕微溶液化を使用し得る（Ｍａｙｈｅｗ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ７７５：１６９，１９８４）。これらの方法は、リポソーム内のＲＮＡｉ剤調製品の詰め込みに容易に適応される。
【０４０３】
リポソームは、２つの大まかなクラスに分類される。カチオン性リポソームは、負に帯電した核酸分子と相互作用して安定した複合体を形成する、正に帯電したリポソームである。正に帯電した核酸／リポソーム複合体は、負に帯電した細胞表面に結合してエンドソーム内部に取り入れられる。エンドソーム内の酸性ｐＨのためにリポソームは破裂して、それらの内容物を細胞質内へ放出する（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８７，１４７，９８０−９８５）。
【０４０４】
ｐＨ感受性または負電荷のリポソームは、核酸と複合体を形成せず、むしろそれを封入する。核酸と脂質は、どちらも同様の荷電を持つため、複合体形成ではなく反発が起きる。それでもなおいくらかの核酸は、これらのリポソームの水性内部に封入される。ｐＨ感受性リポソームは、培養中で、チミジンキナーゼ遺伝子をコードする核酸を細胞単層に送達するのに使用されている。外来性遺伝子の発現は、標的細胞内で検出された（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１９９２，１９，２６９−２７４）。
【０４０５】
１つの主要タイプのリポソーム組成物は、天然由来ホスファチジルコリン以外に、リン脂質を含む。例えば中性リポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成され得る。アニオン性リポソーム組成物が、一般にジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるのに対し、アニオン性融合性リポソームは、主にジオレオイルスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、例えばダイズＰＣ、および卵ＰＣなどのホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。別のタイプは、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
【０４０６】
試験管内および生体内でリポソームを細胞内に導入するその他の方法の例としては、米国特許第５，２８３，１８５号明細書；米国特許第５，１７１，６７８号明細書；国際公開第９４／００５６９号パンフレット；国際公開第９３／２４６４０号パンフレット；国際公開第９１／１６０２４号パンフレット；Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０，１９９４；Ｎａｂｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１１３０７，１９９３；Ｎａｂｅｌ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：６４９，１９９２；Ｇｅｒｓｈｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：７１４３，１９９３；およびＳｔｒａｕｓｓ  ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：４１７，１９９２が挙げられる。
【０４０７】
非イオン性リポソーム系、特に非イオン性界面活性剤とコレステロールを含む系が研究され、皮膚への薬剤送達におけるそれらの効用が判定されている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ（商標）Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ（商標）ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤を使用して、マウス皮膚真皮内へシクロスポリンＡが送達された。結果は、このような非イオン性リポソーム系が、皮膚の異なる層内へのシクロスポリンＡの沈着を容易にする上で、効果的であることを示唆した（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．，１９９４，４，６，４６６）。
【０４０８】
リポソームはまた、「立体的安定化」リポソームを含み、この用語は本明細書の用法では、１つまたは複数の特殊化された脂質を含むリポソームを指し、それは、リポソーム中に組み込まれると、このような特殊化された脂質を欠くリポソームと比較して、改善された循環寿命をもたらす。立体的安定化リポソームの例は、その中で、リポソームの小胞形成脂質部分の一部が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧＭ１などの１つまたは複数の糖脂質を含み、または（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの１つまたは複数の親水性ポリマーで誘導体化されているものである。いかなる特定の理論による拘束も望まないが、当該技術分野では、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧ誘導体化脂質を含有する立体的安定化リポソームでは、これらの立体的安定化リポソームの循環半減期の改善は、細網内皮系（ＲＥＳ：ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｓｙｓｔｅｍ）細胞への取り込み低下に由来するものと考えられる（Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８７，２２３，４２；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９３，５３，３７６５）。
【０４０９】
１つまたは複数の糖脂質を含む様々なリポソームが、当該技術分野で公知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８７，５０７，６４）は、モノシアロガングリオシドＧＭ１、ガラクトセレブロシドサルフェートおよびホスファチジルイノシトールが、リポソームの血液半減期を改善する能力を報告した。これらの知見は、Ｇａｂｉｚｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８８，８５，６９４９）によって詳しく説明された。どちらもＡｌｌｅｎらに付与された、米国特許第４，８３７，０２８号明細書および国際公開第８８／０４９２４号パンフレットは、（１）スフィンゴミエリンと、（２）ガングリオシドＧＭ１またはガラクトセレブロシド硫酸エステルとを含む、リポソームを開示する。米国特許第５，５４３，１５２号明細書（Ｗｅｂｂら）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示する。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、国際公開第９７／１３４９９号パンフレット（Ｌｉｍら）で開示される。
【０４１０】
一実施形態では、カチオン性リポソームが使用される。カチオン性リポソームは、細胞膜に融合できる利点を有する。非カチオン性リポソームは、原形質膜と効率的に融合できないが、生体内でマクロファージに取り込まれ、ＲＮＡｉ剤をマクロファージに送達するのに使用され得る。
【０４１１】
リポソームのさらなる利点としては、以下が挙げられる。天然リン脂質から得られるリポソームは、生体適合性かつ生分解性であり；リポソームには、幅広い水および脂質可溶性薬剤を組み込み得て；リポソームは、それらの内部区画にカプセル化されたＲＮＡｉ剤を代謝および分解から保護し得る（Ｒｏｓｏｆｆ，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，”Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２４５）。リポソーム製剤の調製における重要な考察は、リポソームの脂質表面電荷、小胞サイズ、および水性容量である。
【０４１２】
正に帯電した合成カチオン性脂質であるＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＴＭＡ）を使用して、小型リポソームを形成し得て、それは核酸と自然発生的に相互作用して、組織培養細胞の細胞膜の負に帯電した脂質と融合できる脂質−核酸複合体を形成し、ＲＮＡｉ剤送達をもたらす（ＤＯＴＭＡおよびそのＤＮＡとの併用の説明については、例えばＦｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８：７４１３−７４１７，１９８７および米国特許第４，８９７，３５５号明細書を参照されたい）。
【０４１３】
ＡＤＯＴＭＡ類似体である１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）をリン脂質と組み合わせて使用し、ＤＮＡ錯化小胞を形成し得る。リポフェクチン（商標）Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）は、生体組織培養細胞に、高アニオン性核酸を送達するための効果的薬剤であり、それは負に帯電したポリヌクレオチドと自然発生的に相互作用して複合体を形成する、正に帯電したＤＯＴＭＡリポソームを含む。十分に正に帯電したリポソームを使用すれば、得られる複合体上の正味電荷もまた正である。このようにして調製された正に帯電した複合体は、負に帯電した細胞表面に自然発生的に付着して、原形質膜と融合し、例えば組織培養細胞内に機能性核酸を効率的に送達する。別の市販のカチオン性脂質、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３，３−（トリメチルアンモニア）プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）は、オレオイル部分がエーテル結合でなくエステルによって結合することで、ＤＯＴＭＡと異なる。
【０４１４】
その他の報告されたカチオン性脂質化合物としては、２つの脂質タイプの１つと共役するカルボキシスペルミンをはじめとする、多様な部分と共役しているものが挙げられ、例えば、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタオレオイルアミド（「ＤＯＧＳ」）（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標），Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５−カルボキシスペルミル−アミド（「ＤＰＰＥＳ」）などの化合物が挙げられる（例えば米国特許第５，１７１，６７８号明細書を参照されたい）。
【０４１５】
別のカチオン性脂質複合体は、ＤＯＰＥと組み合わされてリポソームに調合されているコレステロール（「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」）による、脂質の誘導体化を含む（Ｇａｏ，Ｘ．ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７９：２８０，１９９１を参照されたい）。ポリリジンをＤＯＰＥに共役させて生成されるリポポリリジンが、血清存在下における形質移入に効果的であると報告されている（Ｚｈｏｕ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０６５：８，１９９１）。特定の細胞系では、共役するカチオン性脂質を含有するこれらのリポソームは、ＤＯＴＭＡ含有組成物より低い毒性を示し、より効率的な形質移入を提供すると言われている。その他の市販のカチオン性脂質製品としては、ＤＭＲＩＥおよびＤＭＲＩＥ−ＨＰ（Ｖｉｃａｌ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、およびリポフェクタミン（ＤＯＳＰＡ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）が挙げられる。オリゴヌクレオチドの送達に適したその他のカチオン性脂質は、国際公開第９８／３９３５９号パンフレットおよび国際公開第９６／３７１９４号パンフレットに記載される。
【０４１６】
リポソーム製剤は局所投与に特に適しており、リポソームはその他の製剤に優るいくつかの利点を示す。このような利点としては、投与薬剤の高い全身性吸収に関連した副作用の低下、所望標的における投与薬剤の蓄積増大、およびＲＮＡｉ剤を皮膚内に投与する能力が挙げられる。いくつかの実装では、リポソームは、ＲＮＡｉ剤を表皮細胞に送達するのに、また例えば皮膚内などの皮膚組織内へのＲＮＡｉ剤の浸透を高めるのに使用される。例えばリポソームは、局所的に塗布し得る。リポソームとして調合された治療薬の皮膚への局所送達が、実証されている（例えば、Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９２，ｖｏｌ．２，４０５−４１０およびｄｕ  Ｐｌｅｓｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，１９９２，２５９−２６５；Ｍａｎｎｉｎｏ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ  Ｆｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，Ｓ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６８２−６９０，１９８８；Ｉｔａｎｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ５６：２６７−２７６．１９８７；Ｎｉｃｏｌａｕ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１４９：１５７−１７６，１９８７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ  Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１０１：５１２−５２７，１９８３；Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｙ．ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７８５１−７８５５，１９８７を参照されたい）。
【０４１７】
非イオン性リポソームシステム、特に非イオン性界面活性剤とコレステロールを含むシステムが研究され、皮膚への薬剤送達におけるそれらの効用が判定されている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ  Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ  ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤が、マウスの皮膚の真皮内に薬剤を送達するのに使用された。ＲＮＡｉ剤を含むこのような製剤は、皮膚疾患を治療するのに有用である。
【０４１８】
ｉＲＮＡを含むリポソームは、高度に変形可能にし得る。このような変形能は、リポソームの平均半径よりも小さい孔を通り抜けて、リポソームが浸透できるようにし得る。例えばトランスファーソームは、変形可能なリポソームの一種である。トランスファーソーム（Ｔｒａｎｓｆｅｒｏｓｏｍｅｓ）は、通常は界面活性剤である表面エッジ活性化剤を、標準リポソーム組成物に添加して、作成し得る。ＲＮＡｉ剤を含むトランスファーソームは、皮膚内のケラチノサイトにＲＮＡｉ剤を送達するために、例えば感染によって皮下送達し得る。無傷の哺乳類皮膚を越えるために、脂質小胞は、適切な経皮勾配の影響下で、それぞれ直径が５０ｎｍ未満の一連の細孔を通過しなくてはならない。さらに脂質特性のために、これらのトランスファーソーム（Ｔｒａｎｓｆｅｒｏｓｏｍｅｓ）は、自己最適化し（例えば皮膚孔の形状に適応する）、自己修復し得て、断片化することなく頻繁にそれらの標的に到達し得て、自己装填することが多い。
【０４１９】
本発明に適する他の製剤が、２００８年１月２日に出願された米国仮特許出願第６１／０１８，６１６号明細書；２００８年１月２日に出願された米国仮特許出願第６１／０１８，６１１号明細書；２００８年３月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／０３９，７４８号明細書；２００８年４月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／０４７，０８７号明細書および２００８年５月８日に出願された米国仮特許出願第６１／０５１，５２８号明細書に記載されている。２００７年１０月３日に出願されたＰＣＴ出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８０３３１号パンフレットもまた、本発明に適する製剤について記載している。
【０４２０】
トランスファーソームはなおも別のタイプのリポソームであり、薬物送達ビヒクルのための魅力的な候補である、高度に変形可能な脂質凝集体である。トランスファーソームは、非常に高度に変形可能であるために、小滴よりも小さい孔を通じて容易に浸透できる脂肪滴と説明され得る。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適応でき、例えばそれらは自己最適化し（皮膚孔形状に適応する）、自己修復し、しばしば断片化することなくそれらの標的に到達し、自己装填することが多い。トランスファーソームを作成するために、通常は界面活性剤である表面縁活性化剤を標準リポソーム組成物に添加することができる。トランスファーソームは、血清アルブミンを皮膚に送達するのに使用されている。血清アルブミンのトランスファーソーム媒介送達は、血清アルブミンを含有する溶液の皮下注射と同程度に、効果的であることが示されている。
【０４２１】
界面活性剤には、（マイクロエマルションをはじめとする）エマルションおよびリポソームなどの製剤における、幅広い応用がある。天然および合成双方の多数の異なる界面活性剤型の特性の分類および格付けの最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ：ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ／ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ  ｂａｌａｎｃｅ）の使用による。親水性基（「ヘッド」としてもまた知られている）の性質は、製剤中で使用される異なる界面活性剤を分類する、最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ”，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
【０４２２】
界面活性剤分子がイオン化されない場合、それは非イオン性界面活性剤に分類される。非イオン性界面活性剤には、医薬および美容製品における幅広い用途があり、広いｐＨ価範囲にわたって使用できる。一般にそれらのＨＬＢ値は、それらの構造に応じて２〜約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤としては、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシル化エステルなどの非イオン性エステルが挙げられる。脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコールおよびエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーなどの非イオン性アルカノールアミドおよびエーテルもまた、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤クラスの最も良く見られる構成員である。
【０４２３】
界面活性剤分子が、水への溶解または分散時に負電荷を保有する場合、界面活性剤はアニオン性に分類される。アニオン性界面活性剤としては、石鹸などのカルボン酸塩、ラクチル酸アシル、アミノ酸のアシルアミド、硫酸アルキルおよびエトキシル化硫酸アルキルなどの硫酸エステル、アルキルベンゼンスルホネートなどのスルホネート、イセチオン酸アシル、タウリン酸アシルおよびスルホコハク酸アシル、およびリン酸アシルが挙げられる。アニオン性界面活性剤クラスの最も重要な構成員は、硫酸アルキルおよび石鹸である。
【０４２４】
界面活性剤分子が、水への溶解または分散時に正電荷を保有する場合、界面活性剤はカチオン性に分類される。カチオン性界面活性剤としては、四級アンモニウム塩およびエトキシル化アミンが挙げられる。四級アンモニウム塩が、このクラスで最も良く使用される構成員である。
【０４２５】
界面活性剤分子が、陽性または陰性電荷のいずれかを有する能力を有する場合、界面活性剤は両性に分類される。両性界面活性剤としては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタイン、およびリン脂質が挙げられる。
【０４２６】
医薬品、製剤中およびエマルション中の界面活性剤の使用については、概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ”，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
【０４２７】
本発明の方法で使用されるｉＲＮＡはまた、ミセル製剤として提供し得る。「ミセル」は、その中で、分子の疎水性部分が全て内側を向き、親水性部分が周囲の水性相に接したままであるように、両親媒性分子が球状構造に配列される、特定タイプの分子アセンブリーと、本明細書で定義される。環境が疎水性であれば、逆の配置が存在する。
【０４２８】
経皮膜を通じた送達に適した混合ミセル調合物は、ｓｉＲＮＡ組成物、アルカリ金属Ｃ８〜Ｃ２２アルキル硫酸塩、およびミセル形成化合物の水溶液を混合して、調製してもよい。例示的なミセル形成化合物としては、レシチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の薬学的に許容可能な塩、グリコール酸、乳酸、カモミール抽出物、キュウリ抽出物、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノオレイン、モノオレアート、モノラウレート、ルリヂサ油、月見草油、メントール、トリヒドロキシオキソコラニルグリシンとその薬学的に許容可能な塩、グリセリン、ポリグリセリン、リジン、ポリリジン、トリオレイン、ポリオキシエチレンエーテルおよびその類似体、ポリドカノールアルキルエーテルおよびその類似体、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、およびそれらの混合物が挙げられる。ミセル形成化合物は、アルカリ金属アルキル硫酸塩の添加と同時に、またはその後に添加してもよい。混合ミセルは、成分を実質的にどのように混合しても形成するが、より小型のミセルを提供するためには、激しく混合される。
【０４２９】
一方法では、ｓｉＲＮＡ組成物と、少なくともアルカリ金属アルキル硫酸塩とを含有する、第１のミセル組成物が調製される。次に第１のミセル組成物は、少なくとも３つのミセル形成化合物と混合されて、混合ミセル組成物が形成する。別の方法では、ミセル組成物は、ｓｉＲＮＡ組成物、アルカリ金属アルキル硫酸塩、および少なくとも１つのミセル形成化合物を混合して調製され、激しい混合を伴う残りのミセル形成化合物の添加がそれに続く。
【０４３０】
フェノールおよび／またはｍ−クレゾールを混合ミセル組成物に添加して、調合物を安定化し、細菌増殖から保護してもよい。代案としては、ミセル形成成分と共に、フェノールおよび／またはｍ−クレゾールを添加してもよい。グリセリンなどの等張剤もまた、混合ミセル組成物形成後に添加してもよい。
【０４３１】
ミセル調合物を噴霧として送達するためには、調合物を煙霧剤計量分配装置に入れて、計量分配装置に噴霧剤を装填し得る。加圧下にある噴霧剤は、計量分配装置内で液体形態である。成分の比率は、水性相と噴霧剤相が１つになるように、すなわち１つの相になるように調節される。２つの相がある場合、例えば定量バルブを通じて内容物の一部を分散する前に、計量分配装置を振盪する必要がある。医薬品の分注用量は、定量バルブから精微噴霧で噴射される。
【０４３２】
噴霧剤としては、水素含有クロロフルオロカーボン、水素含有フルオロカーボン、ジメチルエーテル、およびジエチルエーテルが挙げられる。特定の実施形態では、ＨＦＡ  １３４ａ（１，１，１，２ーテトラフルオロエタン）を使用してもよい。
【０４３３】
必須成分の特定濃度は、比較的簡単な実験法によって判定し得る。口腔を通じた吸収のためには、注射を通じた用量、または胃腸管を通じた投与の例えば少なくとも２倍または３倍に増大させることが、往々にして望ましい。
【０４３４】
Ｂ．脂質粒子
例えば本発明のｄｓＲＮＡなどのｉＲＮＡは、例えばＬＮＰまたはその他の核酸−脂質粒子などの脂質製剤中で完全にカプセル化して形成してもよい。
【０４３５】
本明細書の用法では、「ＬＮＰ」という用語は、安定核酸−脂質粒子を指す。ＬＮＰは、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を妨げる脂質（例えばＰＥＧ脂質複合体）を含有する。ＬＮＰは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射に続いて長期循環寿命を示し、遠位部位（例えば部位投与から物理的に離れた部位）に蓄積するので、全身的用途のために極めて有用である。ＬＮＰとしては、国際公開第００／０３６８３号パンフレットに記載のカプセル化縮合剤−核酸複合体を含む「ｐＳＰＬＰ」が挙げられる。本発明の粒子は、典型的に約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、より典型的に約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、より典型的に約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、最も典型的に約７０ｎｍ〜約９０ｎｍの平均径を有して、実質的に無毒である。これに加えて、本発明の核酸−脂質粒子中に存在する場合、核酸は、水溶液中でヌクレアーゼ分解耐性である。核酸−脂質粒子、およびそれらを調製する方法は、例えば米国特許第５，９７６，５６７号明細書；米国特許第５，９８１，５０１号明細書；米国特許第６，５３４，４８４号明細書；米国特許第６，５８６，４１０号明細書；米国特許第６，８１５，４３２号明細書；米国特許出願公開第２０１０／０３２４１２０号明細書；および国際公開第９６／４０９６４号パンフレットで開示される。
【０４３６】
一実施形態では脂質と薬剤の比率（質量／質量比）（例えば脂質対ｄｓＲＮＡ比）は、約１：１〜約５０：１、約１：１〜約２５：１、約３：１〜約１５：１、約４：１〜約１０：１、約５：１〜約９：１、または約６：１〜約９：１の範囲である。上記に引用した範囲の中間にある範囲も、本発明の一部と考えられる。
【０４３７】
カチオン性脂質は、例えばＮ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム臭化物（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルカルバモイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジリノレイオキシ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｏｘｙ）−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレイオキシ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｏｘｙ）−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）、または３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパンジオ（ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏ）（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキソ−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）またはそのアナログ、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン（ＡＬＮ１００）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル−４−（ジメチルアミノ）ブタン酸（ＭＣ３）、１，１’−（２−（４−（２−（（２−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン−１−イル）エチルアザンジイル）ジドデカン−２−オール（Ｔｅｃｈ  Ｇ１）、またはその混合物であり得る。カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約２０モル％〜約５０モル％または約４０モル％を構成し得る。
【０４３８】
別の実施形態では、化合物２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランを使用して、脂質−ｓｉＲＮＡナノ粒子を作成し得る。２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランの合成は、参照によって本明細書に援用する、２００８年１０月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／１０７，９９８号明細書に記載される。
【０４３９】
一実施形態では、脂質−ｓｉＲＮＡ粒子は、４０％の２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン：１０％のＤＳＰＣ：４０％のコレステロール：１０％のＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ（モル百分率）を含み、粒度６３．０±２０ｎｍのおよびｓｉＲＮＡ／脂質比０．０２７である。
【０４４０】
イオン性／非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセリン（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセリン（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ），ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−ｔｒａｎｓＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、またはその混合物をはじめとすることができるが、これに限定されるものではない、アニオン性脂質または中性脂質とすることもできる。コレステロールが含まれる場合、非カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約５モル％〜約９０モル％、約１０モル％、または約５８モル％であり得る。
【０４４１】
粒子凝集を阻害する共役結合脂質は、例えば制限なしに、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ−リン脂質、ＰＥＧ−セラミド（Ｃｅｒ）をはじめとする、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質、またはその混合物であり得る。ＰＥＧ−ＤＡＡ複合体は、例えばＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃｉ２）、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃｉ４）、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃｉ６）、またはＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ］８）であり得る。粒子凝集を妨げる共役結合脂質は、粒子中に存在する総脂質の０モル％〜約２０モル％または約２モル％であり得る。
【０４４２】
いくつかの実施形態では、核酸−脂質粒子は、例えば、粒子中に存在する総脂質の約１０モル％〜約６０モル％または約４８モル％のコレステロールをさらに含む。
【０４４３】
一実施形態では、リピドイドＮＤ９８・４ＨＣｌ（ＭＷ  １４８７）（その内容を参照によって本明細書に援用する、２００８年３月２６日に出願された米国特許出願第１２／０５６，２３０号明細書を参照されたい）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＰＥＧ−セラミドＣ１６（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）を使用して、脂質−ｄｓＲＮＡナノ粒子（すなわちＬＮＰ０１粒子）を作成し得る。エタノール中の各原液は、次のように調製し得る：ＮＤ９８、１３３ｍｇ／ｍｌ；コレステロール、２５ｍｇ／ｍｌ；ＰＥＧ−セラミドＣ１６、１００ｍｇ／ｍｌ。次にＮＤ９８、コレステロール、およびＰＥＧ−セラミドＣ１６の原液を例えば４２：４８：１０のモル比で合わせ得る。合わせた脂質溶液は、最終エタノール濃度が約３５〜４５％で最終酢酸ナトリウム濃度が約１００〜３００ｍＭになるように、（例えばｐＨ５の酢酸ナトリウム中で）水性ｄｓＲＮＡと混合し得る。脂質−ｄｓＲＮＡナノ粒子は、典型的に、混合に際して自然発生的に形成する。所望の粒度分布次第で、結果として生じるナノ粒子混合物は、例えばＬｉｐｅｘ  Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ）などのサーモバレル押出機を使用して、ポリカーボネートメンブラン（例えば１００ｎｍカットオフ）を通じて押出し得る。場合によっては、押出ステップは省き得る。エタノール除去および同時緩衝液交換は、例えば透析または接線流濾過によって達成し得る。緩衝液は、例えば約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、または約ｐＨ７．４など、約ｐＨ７のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）で交換し得る。
【化４４】
2020500929.tif 000045
【０４４４】
ＬＮＰ０１製剤は、例えば参照によって本明細書に援用する、国際公開第２００８／０４２９７３号パンフレットに記載される。
【０４４５】
さらなる例示的な脂質−ｄｓＲＮＡ製剤が表Ａに記載される。
【０４４６】
【表１】
2020500929.tif 000046
【０４４７】
【表２】
2020500929.tif 000047
【０４４８】
ＬＮＰ（１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ））を含む製剤は、国際公開の２００９年４月１５日に出願された国際公開第２００９／１２７０６０号パンフレット（ここで参照により援用される）に記載されている。
【０４４９】
ＸＴＣを含む製剤は、例えば、２００９年１月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／１４８，３６６号明細書；２００９年３月２日に出願された米国仮特許出願第６１／１５６，８５１号明細書；２００９年６月１０日に出願された米国仮特許出願第号明細書；２００９年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／２２８，３７３号明細書；２００９年９月３日に出願された米国仮特許出願第６１／２３９，６８６号明細書、および２０１０年１月２９日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２２６１４号パンフレット（ここで参照により援用される）に記載されている。
【０４５０】
ＭＣ３を含む製剤は、例えば２０１０年６月１０日に出願された米国特許出願公開第２０１０／０３２４１２０号明細書（その全内容はここで参照により援用される）に記載されている。
【０４５１】
ＡＬＮＹ−１００を含む製剤は、例えば２００９年１１月１０日に出願された国際特許出願番号の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０９／６３９３３号パンフレット（ここで参照により援用される）に記載されている。
【０４５２】
Ｃ１２−２００を含む製剤は、２００９年５月５日に出願された米国仮特許出願第６１／１７５，７７０号明細書および２０１０年５月５日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１０／３３７７７号パンフレット（ここで参照により援用される）に記載されている。
【０４５３】
イオン化可能／カチオン性脂質の合成
本発明の核酸−脂質粒子中に用いられる化合物のいずれか、例えば、カチオン性脂質などは、実施例にてより詳細に記載される方法を含む公知の有機合成技術により調製され得る。すべての置換基は、他に指示されない限り、下に定義される通りである。
【０４５４】
「アルキル」は、直鎖または分岐、非環状または環状の、１〜２４の炭素原子を有する飽和脂肪族炭化水素を意味する。代表的な飽和直鎖アルキルは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルなどを含む一方；飽和分岐アルキルは、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチルなどを含む。代表的な飽和環状アルキルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどを含む一方；不飽和環状アルキルは、シクロペンテニルおよびシクロヘキセニルなどを含む。
【０４５５】
「アルケニル」は、隣接する炭素原子間に少なくとも１つの二重結合を有する、上で定義されるようなアルキルを意味する。アルケニルは、シスおよびトランス異性体の双方を含む。代表的な直鎖および分岐アルケニルは、エチルエニル、プロピルエニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチルエニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、２，３−ジメチル−２−ブテニルなどを含む。
【０４５６】
「アルキニル」は、隣接する炭素原子間に少なくとも１つの三重結合をさらに有する、上で定義されるような任意のアルキルまたはアルケニルを意味する。代表的な直鎖および分岐アルキニルは、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−メチル−１ブチニルなどを含む。
【０４５７】
「アシル」は、下に定義される通り、結合点の炭素がオキソ基と置換された、任意のアルキル、アルケニル、またはアルキニルを意味する。例えば、−Ｃ（＝Ｏ）アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）アルケニル、および−Ｃ（＝Ｏ）アルキニルは、アシル基である。
【０４５８】
「ヘテロ環」は、飽和、不飽和、または芳香族のいずれかである、５〜７員の単環式、または７〜１０員二環式ヘテロ環を意味し、窒素、酸素および硫黄から独立に選択される１または２のヘテロ原子を含み、また窒素および硫黄ヘテロ原子が任意選択的には酸化され得、かつ窒素ヘテロ原子が任意選択的には四級化され得、例えば上記ヘテロ環のいずれかがベンゼン環に融合された二環式環が挙げられる。ヘテロ環は、任意のヘテロ原子または炭素原子を介して結合され得る。ヘテロ環は、下に定義されるようなヘテロアリールを含む。ヘテロ環は、モルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル（ｐｉｐｅｒｉｚｙｎｙｌ）、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニルなどを含む。
【０４５９】
用語「任意選択的に置換されたアルキル」、「任意選択的に置換されたアルケニル」、「任意選択的に置換されたアルキニル」、「任意選択的に置換されたアシル」、および「任意選択的に置換されたヘテロ環」は、置換の際、少なくとも１つの水素原子が置換基と置き換えられることを意味する。オキソ置換基（＝Ｏ）の場合、２個の水素原子が置き換えられる。この点では、置換基は、オキソ、ハロゲン、ヘテロ環、−ＣＮ、−ＯＲｘ、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘおよび−ＳＯｎＮＲｘＲｙ（式中、ｎは０、１または２であり、ＲｘおよびＲｙは、同じであるかまたは異なり、独立して水素、アルキルまたはヘテロ環であり、かつ前記アルキルおよびヘテロ環置換基の各々は、オキソ、ハロゲン、−ＯＨ、−ＣＮ、アルキル、−ＯＲｘ、ヘテロ環、−ＮＲｘＲｙ、−ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ、−ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、−ＳＯｎＲｘおよび−ＳＯｎＮＲｘＲｙの１つ以上とさらに置換され得る。
【０４６０】
「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを意味する。
【０４６１】
一部の実施形態では、本発明の方法は、保護基の使用を必要とし得る。保護基の方法は、当業者に周知である（例えば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｇｒｅｅｎ，Ｔ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｉｔｙ，１９９９を参照）。つまり、本発明と関連する範囲内の保護基は、官能基の望まれない反応性を低減または排除する任意の基である。保護基は、官能基に、特定の反応中にその反応性を遮蔽するために付加され、次に元の官能基を顕わにするために除去され得る。一部の実施形態では、「アルコール保護基」が用いられる。「アルコール保護基」は、アルコール官能基の望まれない反応性を低減または排除する任意の基である。保護基は、当該技術分野で周知の技術を用いて付加または除去され得る。
【０４６２】
経口投与のための組成物および製剤としては、粉末または顆粒、微小粒子、ナノ微粒子、水または非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、ゲルカプセル、サッシェ剤、錠剤またはミニ錠剤が挙げられる。増粘剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤またはバインダーが望ましい可能性がある。いくつかの実施形態では、経口製剤は、その中で本発明で取り上げるＤｓＲＮＡが、１つまたは複数の浸透促進界面活性剤およびキレート化剤と併せて投与されるものである。適切な界面活性剤としては、脂肪酸および／またはエステルまたはそれらの塩、胆汁酸および／またはそれらの塩が挙げられる。適切な胆汁酸／塩としては、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ：ｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ：ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム、およびグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。適切な脂肪酸としては、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはモノグリセリド、ジグリセリド、または薬学的に許容可能なその塩（例えばナトリウム）が挙げられる。いくつかの実施形態では、例えば胆汁酸／塩と組み合わされた脂肪酸／塩などの浸透促進剤の組み合わせが使用される。１つの例示的組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸、およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。浸透促進剤としては、さらにポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが挙げられる。本発明で取り上げるＤｓＲＮＡは、噴霧乾燥粒子をはじめとする顆粒形態で、経口的に送達されてもよく、または複合体化してマイクロまたはナノ粒子を形成してもよい。ＤｓＲＮＡ複合化剤としては、ポリアミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；アクリル酸ポリアルキル、ポリオキセタン、ポリアルキルシアノアクリル酸；カチオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデンプン；ポリアルキルシアノアクリル酸；ＤＥＡＥ誘導体化ポリイミン、プルラン（ｐｏｌｌｕｌａｎｓ）、セルロースおよびデンプンが挙げられる。適切な複合化剤としては、キトサン、Ｎ−トリメチルキトサン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えばｐ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリル酸）、ポリ（エチルシアノアクリル酸）、ポリ（ブチルシアノアクリル酸）、ポリ（イソブチルシアノアクリル酸）、ポリ（イソヘキシルシナオアクリル酸（ｉｓｏｈｅｘｙｌｃｙｎａｏａｃｒｙｌａｔｅ��）、ＤＥＡＥ−メタクリレート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミンおよびＤＥＡＥ−デキストラン、ポリアクリル酸メチル、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸‐コ‐グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギン酸塩、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ｄｓＲＮＡの経口製剤およびそれらの調製は、そのそれぞれを参照によって本明細書に援用する、米国特許第６，８８７，９０６号明細書、米国特許出願公開第２００３００２７７８０号明細書、および米国特許第６，７４７，０１４号明細書に詳細に記載される。
【０４６３】
非経口、脳実質内（脳内）、クモ膜下腔内、脳室内または肝臓内投与のための組成物および製剤は無菌水溶液を含むことができ、それはまた、緩衝液と、希釈剤と、浸透促進剤、担体化合物、およびその他の薬学的に許容可能な担体または賦形剤などをはじめとするが、これに限定されるものではないその他の適切な添加剤とを含有し得る。
【０４６４】
本発明の医薬組成物としては、溶液、エマルション、およびリポソーム含有製剤．が挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの組成物は、既製液体、自己乳化固体および自己乳化半固体をはじめとするが、これに限定されるものではない、多様な成分から生成され得る。肝臓がんなどの肝臓の障害を治療する場合、特に好ましいのは、肝臓を標的とする製剤である。
【０４６５】
好都合には単位剤形で提示され得る本発明の医薬製剤は、製薬産業で周知の従来の技術に従って調製され得る。このような技術は、活性成分を薬学的担体または賦形剤に組み合わせるステップを含む。一般に、製剤は、活性成分を液体担体または超微粒子固体担体またはその双方と一様に密接に組み合わせ、次に、必要ならば生成物を整形することで調製される。
【０４６６】
本発明の組成物は、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、軟質ゲル、坐薬、および浣腸などであるが、これに限定されるものではない、多数の可能な剤形のいずれかに調合され得る。本発明の組成物は、また、水性、非水性または混合媒体中の懸濁液として調合され得る。水性懸濁液は、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランをはじめとする、懸濁液の粘度を増大させる物質をさらに含有し得る。懸濁液は、安定剤もまた含有し得る。
【０４６７】
Ｃ．追加的な製剤
ｉ．エマルション
本発明の組成物は、エマルションとして調製し調合し得る。エマルションは、典型的に、通常、直径が０．１μｍを超える小滴形態で、別の液体中に分散する１つの液体の不均一系である（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，ａｎｄ  Ａｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．１９９；Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  ２，ｐ．３３５；Ｈｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．３０１を参照されたい）。エマルションは、密接に混合して互いに分散する、２つの不混和性液体相を含む、二相性システムであることが多い。一般にエマルションは、油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）のいずれかであり得る。水性相がバルク油性相中に微細分散して、微小滴として分散される場合、得られた組成物は、油中水型（ｗ／ｏ）エマルションと称される。代案としては、油性相がバルク水性相中に微細分散して、微小滴として分散される場合、得られた組成物は、水中油型（ｏ／ｗ）エマルションと称される。エマルションは、分散相と、水性相および油性相いずれかの中の溶液として、またはそれ自体が別個の相として存在し得る、活性薬剤とに加えて、追加的な成分を含有し得る。乳化剤、安定剤、染料、および抗酸化物質などの医薬品賦形剤はまた、必要に応じてエマルション中に存在し得る。医薬品エマルションはまた、例えば油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）および水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）エマルションなどの場合、２つを超える相を含む複数エマルションであり得る。このような複合体製剤は、単純な二成分エマルションが提供しない、特定の利点を提供することが多い。その中でｏ／ｗエマルションの個々の油滴が小さな水滴を囲い込む複数エマルションは、ｗ／ｏ／ｗエマルションを構成する。同様に、水の小球中に封入されて、油性連続相内で安定化される油滴システムは、ｏ／ｗ／ｏエマルションを提供する。
【０４６８】
エマルションは、熱力学的安定性がわずかまたは皆無であることによって、特徴付けられる。頻繁に、エマルションの分散または不連続相は、外部または連続相内に良く分散し、乳化剤または製剤粘度の手段を通じて、この形態に保たれる。エマルション様式の軟膏基剤およびクリームの場合のように、エマルション相のいずれかが、半固体または固体であり得る。エマルションを安定化する別の手段は、エマルション相のいずれかに組み込まれ得る、乳化剤の使用を伴う。乳化剤は、広義に４つのカテゴリー分類され得る：合成界面活性剤、天然乳化剤、吸収基剤、および微細分散固体（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，ａｎｄ  Ａｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．１９９を参照されたい）。
【０４６９】
表面活性剤としてもまた知られている合成界面活性剤は、エマルション製剤において幅広い用途があり、文献で概説されている（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，ａｎｄ  Ａｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２８５；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．１９９を参照されたい）。界面活性剤は典型的に両親媒性であり、親水性および疎水性部分を含む。親水性と疎水性の比率は、界面活性剤の親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と称され、製剤の調製において界面活性剤を分類し選択する上での有益な手段である。界面活性剤は、親水性基の性質に基づいて、異なるクラスに分類され得る：非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両性（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，ａｎｄ  Ａｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２８５を参照されたい）。
【０４７０】
エマルション製剤で使用される天然乳化剤としては、ラノリン、蜜蝋、リン脂質、レシチン、およびアカシアが挙げられる。無水ラノリンおよび親水性ペトロラタムなどの、水を吸い上げてｗ／ｏエマルションを形成し得るような親水特性を有する吸収基剤は、なおもそれらの半固体粘稠度を維持する。微細分散固体はまた、優れた乳化剤として、特に界面活性剤と組み合わされて、粘稠な調製品中で使用されている。これらとしては、重金属水酸化物などの極性無機固体、ベントナイトなどの非膨張性粘土、アタパルガイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、ケイ酸アルミニウムのコロイドおよびケイ酸アルミニウムマグネシウムのコロイド、顔料、および炭素またはトリステアリン酸グリセリルなどの非極性固形分が挙げられる。
【０４７１】
多岐にわたる非乳化材料もまたエマルション製剤に含まれて、エマルションの特性に寄与する。これらとしては、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、湿潤剤、親水性コロイド、保存料、および抗酸化剤が挙げられる（Ｂｌｏｃｋ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．３３５；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．１９９）。
【０４７２】
親水性コロイドまたは親水コロイドとしては、多糖類（例えばアカシア、寒天、アルギン酸、カラゲナン、グアーガム、カラヤガム、およびトラガカント）、セルロース誘導体（例えばカルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）、および合成ポリマー（例えばカルボマー、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー）などの天然ガムおよび合成ポリマーが挙げられる。これらは水中に分散しまたは水中で膨張して、分散相小滴周囲に強力な界面膜を形成することで、および外部相の粘度を増大させることで、エマルションを安定化するコロイド溶液を形成する。
【０４７３】
エマルションは、微生物の増殖を容易に支持し得る、炭水化物、タンパク質、ステロール、およびリン脂質などのいくつかの成分を含有することが多いので、これらの製剤には保存料が組み込まれることが多い。エマルション製剤に含まれる一般に使用される保存料としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、四級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル、およびホウ酸が挙げられる。抗酸化剤もまた、一般にエマルション製剤に添加されて、製剤の劣化を防止する。使用される抗酸化剤は、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなどのフリーラジカルスカベンジャー；またはアスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウムなどの還元剤；およびクエン酸、酒石酸、およびレシチンなどの抗酸化剤共力剤であり得る。
【０４７４】
皮膚、経口、および非経口経路を通じたエマルション製剤の適用と、それらを製造する方法については、文献で概説されている。（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，ａｎｄ  Ａｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．１９９を参照されたい）。経口送達のためのエマルション製剤は、調合の容易さ、ならびに吸収および生物学的利用能の観点からの効率のために、非常に広く使用されている（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，ａｎｄ  Ａｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２４５；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．１９９を参照されたい）。鉱物油ベースの緩下剤、油溶性ビタミン、および高脂肪栄養剤は、一般にｏ／ｗエマルションとして経口投与されている材料の一つである。
【０４７５】
ｉｉ．マイクロエマルション
本発明の一実施形態では、ｉＲＮＡと核酸の組成物は、マイクロエマルションとして調合される。マイクロエマルションは、単一の光学的に等方性で熱力学的に安定している溶液である、水、油、および両親媒性物質のシステムと定義され得る（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，ａｎｄ  Ａｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２４５を参照されたい）。典型的に、マイクロエマルションは、最初に油を水性界面活性剤溶液に分散して、次に一般に中間鎖長のアルコールである、十分な量の第４の成分を添加し、透明なシステムを形成することで、調製されるシステムである。したがって、マイクロエマルションは、界面活性分子の界面膜によって安定化された、２つの不混和性液体の熱力学的に安定した等方的に透明な分散体として記述されている（Ｌｅｕｎｇ  ａｎｄ  Ｓｈａｈ，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ａｇｇｒｅｇａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．，Ｅｄ．，１９８９，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐａｇｅｓ  １８５−２１５）。マイクロエマルションは、通常、油、水、界面活性剤、共界面活性剤、および電解質をはじめとする、３〜５成分の組み合わせを通じて調製される。マイクロエマルションが、油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）であるかどうかは、使用される油および界面活性剤の特性と、界面活性剤分子の極性頭部および炭化水素尾部の構造および幾何学的充填とに左右される（Ｓｃｈｏｔｔ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．２７１）。
【０４７６】
状態図を利用した現象学的アプローチは、広範に研究されており、マイクロエマルションの調合法に関する包括的知識が、当業者にもたらされている（例えばＡｎｓｅｌ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ  ＮＧ．，ａｎｄ  Ａｎｓｅｌ  ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐ．３３５を参照されたい）。従来のエマルションと比較して、マイクロエマルションは、水不溶性薬剤を自然発生的に形成される熱力学的に安定した小滴の配合物に可溶化する利点を提供する。
【０４７７】
マイクロエマルションの調製で使用される界面活性剤としては、単独のまたは共界面活性剤と組み合わされた、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ  ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレアート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレアート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレアート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセキオレアート（ｓｅｑｕｉｏｌｅａｔｅ）（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレアート（ＤＡＯ７５０）が挙げられるが、これに限定されるものではない。通常、エタノール、１−プロパノール、および１−ブタノールなどの短鎖アルコールである共界面活性剤は、界面活性剤塗膜に浸透することにより界面流動性を増大させるのに役立ち、その結果、界面活性剤分子間に生じる隙間に起因する不規則塗膜を作り出す。しかしマイクロエマルションは、共界面活性剤の使用なしに調製され得、アルコール非含有自己乳化マイクロエマルション系は、当該技術分野で公知である。水性相は、典型的に、水、薬剤水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコール誘導体であり得るが、これに限定されるものではない。油相としては、Ｃａｐｔｅｘ  ３００、Ｃａｐｔｅｘ  ３５５、Ｃａｐｍｕｌ  ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）モノ、ジ、およびトリ−グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｚｅｄ）グリセリド、飽和ポリグリコール化（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｚｅｄ）Ｃ８−Ｃ１０グリセリド、植物油、およびシリコーン油などの材料が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０４７８】
マイクロエマルションは、薬剤可溶化と薬剤吸収改善の観点から、特に興味深い。脂質ベースのマイクロエマルション（ｏ／ｗおよびｗ／ｏの双方）が、ペプチドをはじめとする薬剤の経口バイオアベイラビリティを高めるために、提案されている（例えば米国特許第６，１９１，１０５号明細書；米国特許第７，０６３，８６０号明細書；米国特許第７，０７０，８０２号明細書；米国特許第７，１５７，０９９号明細書；Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５−１３９０；Ｒｉｔｓｃｈｅｌ，Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９３，１３，２０５を参照されたい）。マイクロエマルションは、薬剤可溶化改善、酵素加水分解からの薬剤保護、界面活性剤が誘発する膜の流動性と透過度の変化に起因する予想される薬剤吸収増強、調製の容易さ、固体剤形に比べた経口投与の容易さ、臨床効力改善、および毒性低下の利点をもたらす（例えば米国特許第６，１９１，１０５号明細書；米国特許第７，０６３，８６０号明細書；米国特許第７，０７０，８０２号明細書；米国特許第  ７，１５７，０９９号明細書；Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５；Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９６，８５，１３８−１４３を参照されたい）。マイクロエマルションは多くの場合、それらの成分を周囲温度で一緒に合わせた場合に、自然発生的に形成することができる。これは、熱不安定性薬剤、ペプチドまたはｉＲＮＡを調合する場合に、特に有利となり得る。マイクロエマルションは、美容および医薬用途の双方で、活性成分の経皮送達に効果的であった。本発明のマイクロエマルション組成物および製剤は、ｉＲＮＡおよび核酸の胃腸管からの全身性吸収の増大を容易にし、ならびにｉＲＮＡおよび核酸の局所性細胞内取り込みを改善することが期待される。
【０４７９】
本発明のマイクロエマルションは、ソルビタンモノステアレート（Ｇｒｉｌｌ  ３）、Ｌａｂｒａｓｏｌ、および浸透促進剤などの追加的な成分および添加剤もまた含有して、製剤の特性を改善し、本発明のｉＲＮＡおよび核酸の吸収を高め得る。本発明のマイクロエマルション中で使用される浸透促進剤は、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、および非キレート化非界面活性剤の５つの広義のカテゴリーの１つに属すると分類され得る（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。これらの各クラスについては、上で論じた。
【０４８０】
ｉｉｉ．微粒子
本発明のＲＮＡｉ剤は、例えば微粒子などの粒子に組み込まれてもよい。微粒子は、噴霧乾燥によって製造し得るが、それはまた、凍結乾燥、蒸発、流動床乾燥、真空乾燥、またはこれらの技術の組み合わせをはじめとする、その他の方法によって製造してもよい。
【０４８１】
ｉｖ．浸透促進剤
一実施形態では、本発明は、様々な浸透促進剤を用いて、核酸、特にｉＲＮＡの動物皮膚への効率的な送達をもたらす。ほとんどの薬剤は、イオン化および非イオン化形態の双方で、溶液中に存在する。しかし通常、脂質可溶性または親油性薬剤のみが、細胞膜を容易に通過する。通過する膜が浸透促進剤で処理されれば、非親油性薬剤でさえも細胞膜を通過し得ることが発見されている。細胞膜横切る非親油性薬剤の拡散を助けるのに加えて、浸透促進剤はまた、親油性薬剤の透過性を高める。
【０４８２】
浸透促進剤は、５つの広義のカテゴリー、すなわち界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化作用物質、および非キレート化非界面活性剤の１つに属すると、分類され得る（例えばＭａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２を参照されたい）。前述の浸透促進剤の各クラスについては、以下でより詳しく説明される。
【０４８３】
界面活性剤（または「表面活性剤」）は、水溶液に溶解すると、溶液の表面張力、または水溶液と別の液体との界面張力を低下させて、粘膜を通じたｉＲＮＡ吸収の改善をもたらす、化学物質である。胆汁塩と脂肪酸に加えて、これらの浸透促進剤としては、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル）（例えばＭａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２を参照されたい）；およびＦＣ−４３などのペルフルオロ化合物エマルション．Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８，４０，２５２）が挙げられる。
【０４８４】
浸透促進剤として作用する様々な脂肪酸およびそれらの誘導体としては、例えばオレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、そのＣ１〜２０アルキルエステル（例えばメチル、イソプロピル、およびｔ−ブチル）、およびそのモノ−およびジ−グリセリド（すなわちオレアート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレアートなど）が挙げられる。（例えばＴｏｕｉｔｏｕ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｅｌ  Ｈａｒｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４，６５１−６５４を参照されたい）。
【０４８５】
胆汁の生理学的役割としては、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が挙げられる（例えばＭａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３８，Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ  Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６，ｐｐ．９３４−９３５を参照されたい）。様々な天然胆汁酸塩、およびそれらの合成誘導体が、浸透促進剤として作用する。したがって「胆汁酸塩」という用語は、胆汁の天然成分のいずれかならびにそれらの合成誘導体のいずれかを含む。適切な胆汁酸塩としては、例えばコール酸（またはその薬学的に許容可能なナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリココール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ：ｓｏｄｉｕｍ  ｔａｕｒｏ−２４，２５−ｄｉｈｙｄｒｏｆｕｓｉｄａｔｅ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、およびポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が挙げられる。（例えばＭａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ  ９２；Ｓｗｉｎｙａｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３９，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０，ｐａｇｅｓ  ７８２−７８３；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９２，２６３，２５；Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９０，７９，５７９−５８３を参照されたい）。
【０４８６】
本発明との関連で使用されるキレート化剤は、金属イオンと複合体を形成することによって、それを溶液から除去して、粘膜を通したｉＲＮＡ吸収の改善をもたらす化合物と定義され得る。本発明における浸透促進剤としてのそれらの使用に関して、ほとんどのＤＮＡヌクレアーゼは、触媒作用のために二価の金属イオンを要し、キレート化剤によって阻害されるので、キレート化作用物質は、デオキシリボヌクレアーゼ阻害物質の役割も果たすという追加的利点を有する（Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９３，６１８，３１５−３３９）。  適切なキレート化作用物質としては、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ：ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔａｔｅ）、クエン酸、サリチル酸塩（例えばサリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチル酸、およびホモバニレート（ｈｏｍｏｖａｎｉｌａｔｅ））、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９、およびβ−ジケトン（エナミン）のＮ−アミノアシル誘導体が挙げられるが、これに限定されるものではない。（例えばＫａｔｄａｒｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ  ９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｂｕｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ．，１９９０，１４，４３−５１を参照されたい）。
【０４８７】
本明細書の用法では、非キレート化非界面活性剤浸透促進化合物は、キレート化作用物質としてまたは界面活性剤として有意でない活性を実証するが、それでもなお消化器粘膜を通じてｉＲＮＡの吸収を高める化合物と定義し得る（例えばＭｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３を参照されたい）。このクラスの浸透促進剤としては、例えば不飽和環式尿素、１−アルキル−および１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ  ９２）；およびジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾンなどの非ステロイド性抗炎症剤（Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９，６２１−６２６）が挙げられる。
【０４８８】
細胞レベルのｉＲＮＡ取り込みを高める作用物質もまた、本発明医薬およびその他の組成物に添加し得る。例えばリポフェクチンなどのカチオン性脂質（Ｊｕｎｉｃｈｉらに付与された米国特許第５，７０５，１８８号明細書）、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリリジンなどのポリカチオン性分子（Ｌｏｌｌｏらに付与された国際公開第９７／３０７３１号パンフレット）もまた、ｄｓＲＮＡの細胞内取り込みを高めることが知られている。市販される形質移入試薬の例としては、例えば特に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００  ＣＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｐｔｉｆｅｃｔ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  Ｑ２  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ；Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＴＡＰ  Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＳＰＥＲ  Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、またはＦｕｇｅｎｅ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＴｒａｎｓＦａｓｔ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）−２０  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）−５０  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＤｒｅａｍＦｅｃｔ（商標）（ＯＺ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＥｃｏＴｒａｎｓｆｅｃｔ（ＯＺ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＴｒａｎｓＰａｓｓａ  Ｄ１  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＬｙｏＶｅｃ（商標）／ＬｉｐｏＧｅｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＰｅｒＦｅｃｔｉｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳ���）、ＮｅｕｒｏＰＯＲＴＥＲ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ  ２  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＢａｃｕｌｏＰＯＲＴＥＲ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＴｒｏｇａｎＰＯＲＴＥＲ（商標）ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＲｉｂｏＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＰｌａｓＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＵｎｉＦＥＣＴＯＲ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＳｕｒｅＦＥＣＴＯＲ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、またはＨｉＦｅｃｔ（商標）（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）が挙げられる。
【０４８９】
エチレングリコールおよびプロピレングリコールなどのグリコール；２−ピロールなどのピロール；アゾン；およびリモネンおよびメントンなどのテルペンをはじめとするその他の作用物質が、投与された核酸の浸透を高めるのに利用され得る。
【０４９０】
ｖ．担体
本発明の特定の組成物は、また配合中に担体化合物が組み込まれる。本明細書の用法では、「担体化合物」または「担体」は、不活性（すなわちそれ自体は生物学的活性を有しない）であるが、例えば生物学的に活性の核酸を分解し、またはその循環からの除去を促進することで、生物学的活性を有する核酸の生物学的利用能を低下させる、生体内過程によって、核酸と認識される、核酸、またはその類似体を指し得る。核酸および担体化合物の、典型的に後者の物質の過剰量での同時投与は、恐らく通常の受容体に対する担体化合物と核酸間の競合のために、肝臓、腎臓またはその他の循環外貯蔵所で回収される核酸量の実質的低下をもたらし得る。例えば肝臓組織内の部分的ホスホロチオエートｄｓＲＮＡの回収は、それが、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジック（ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｉｃ）または４−アセトアミド−４’−イソチオシアノ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸と同時投与された場合に、低下し得る（Ｍｉｙａｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＤｓＲＮＡ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，１９９５，５，１１５−１２１；Ｔａｋａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ＤｓＲＮＡ  ＆  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．，１９９６，６，１７７−１８３。
【０４９１】
ｖｉ．賦形剤
担体化合物とは対照的に、「薬学的担体」または「賦形剤」は、１つまたは複数の核酸を動物に送達するための、薬学的に許容可能な溶媒、懸濁剤またはあらゆるその他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は液体または固体であり得、核酸および所与の医薬組成物のその他の成分と組み合わせた際に、所望の嵩、粘稠度などを提供するように、計画される投与様式を念頭に置いて選択される。典型的な薬学的担体としては、結合剤（例えばα化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；増量剤（例えば乳糖およびその他の糖類、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、滑石、シリカ、二酸化ケイ素のコロイド、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、水素化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（例えばデンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）；および湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０４９２】
核酸と有害反応しない、経口投与に適する、薬学的に許容可能な有機または無機賦形剤を使用して、本発明の組成物を調合し得る。適切な薬学的に許容可能な担体としては、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、滑石、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０４９３】
核酸の局所投与のための製剤は、無菌および非無菌水性溶液、アルコールなどの共通溶剤中の非水性溶液、または液体または固体油基剤中の核酸溶液を含み得る。溶液はまた、緩衝液、希釈剤、およびその他の適切な添加剤も含有し得る。核酸有害反応しない、経口投与に適する、薬学的に許容可能な有機または無機賦形剤を使用し得る。
【０４９４】
適切な薬学的に許容可能な賦形剤としては、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、滑石、ケイ酸、粘稠なパラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０４９５】
ｖｉｉ．その他の成分
本発明の組成物は、医薬組成物中に従来法で見られるその他の補助剤成分を、技術分野で確立されたそれらの使用レベルで、さらに含有し得る。したがって例えば組成物は、例えば、止痒剤、渋味剤、局所麻酔薬または抗炎症剤などの追加的な適合性薬理的活性材料を含有することができ、または染料、着香剤、保存料、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤、および安定剤などの本発明の組成物の様々な剤形を物理的に調合する上で有用な追加的材料を含有し得る。しかしこのような材料は、添加した場合に、本発明の組成物の成分の生物学的活性に過度に干渉すべきでない。製剤は滅菌され得て、所望ならば、製剤の核酸と有害に相互作用しない、例えば、潤滑剤、保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧圧力に影響を及ぼす塩、緩衝液、着色料、着香料および／または芳香族物質などなどの助剤と混合される。
【０４９６】
水性懸濁液は、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランをはじめとする、懸濁液の粘度を増大させる物質を含有し得る。懸濁液は、安定剤もまた含有し得る。
【０４９７】
いくつかの実施形態では、本発明で取り上げる医薬組成物は、（ａ）１つまたは複数のｉＲＮＡ化合物、および（ｂ）非ＲＮＡｉ機序によって機能し、出血性障害の治療に有用な１つまたは複数の薬剤を含む。このような薬剤の例としては、抗炎症剤、抗脂肪症薬、抗ウイルス、および／または抗線維症薬が挙げられるが、これに限定される（ｌｍｉｔｅｄ）ものではない。それに加えて、シリマリンなどの肝臓を保護するのに一般に使用されるその他の物質もまた、本明細書に記載されるｉＲＮＡと併用し得る。肝臓疾患の治療に有用なその他の薬剤としては、テルビブジンと、エンテカビルと、テラプレビルおよび例えばＴｕｎｇらに付与された米国特許出願公開第２００５／０１４８５４８号明細書、米国特許出願公開第２００４／０１６７１１６号明細書、および米国特許出願公開第２００３／０１４４２１７号明細書；およびＨａｌｅらに付与された米国特許出願公開第２００４／０１２７４８８号明細書で開示されたものなどのプロテアーゼインヒビターが挙げられる。
【０４９８】
このような化合物の毒性および治療効果は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に致死性の用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）を判定するための細胞培養物または実験動物中などで、標準薬学的手順によって判定し得る。毒性および治療効果間の用量比が治療指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０比として表し得る。高い治療指数を示す化合物が、好ましい。
【０４９９】
細胞培養アッセイと動物実験から得られるデータは、ヒトで使用するための投与範囲を策定するのに使用し得る。本発明で取り上げる組成物の投与量は、一般に、毒性がわずかまたは皆無であるＥＤ５０をはじめとする、循環濃度の範囲内にある。投与量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。本発明で取り上げる方法で使用されるあらゆる化合物について、最初に、治療有効用量を細胞培養アッセイから推定し得る。用量は、細胞培養中で判定される、ＩＣ５０（すなわち症状の最大半量阻害を達成する試験化合物濃度）をはじめとする、化合物の、または適切な場合には標的配列のポリペプチド産物の、循環血漿濃度範囲を達成する（例えばポリペプチド濃度の低下を達成する）ように、動物モデル中で策定されてもよい。このような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量をより正確に判定し得る。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定し得る。
【０５００】
本明細書で取り上げるｉＲＮＡは、上で考察されるそれらの投与に加えて、Ｓｅｒｐｉｎａ１発現によって媒介される病理過程の治療に効果的なその他の既知の作用物質と組み合わせて、投与し得る。いずれにしても処置を行う医師は、当該技術分野で公知のまたは本明細書に記載される、有効性の標準的手段を使用して観察される結果に基づいて、ｉＲＮＡ投与の量およびタイミングを調節し得る。
【０５０１】
ＶＩ．Ｓｅｒｐｉｎａ１の発現を阻害するための方法
本発明は、細胞内でのＳｅｒｐｉｎａ１の発現を阻害する方法を提供する。本方法は、細胞をＲＮＡｉ剤、例えば二本鎖ＲＮＡｉ剤と細胞内でのＳｅｒｐｉｎａ１の発現を阻害するのに有効な量で接触させるステップを含み、それにより細胞内でのＳｅｒｐｉｎａ１の発現を阻害する。
【０５０２】
細胞を二本鎖ＲＮＡｉ剤と接触させることは、試験管内または生体内で行われてもよい。細胞を生体内でＲＮＡｉ剤と接触させることは、対象、例えばヒト対象内部の細胞または細胞群をＲＮＡｉ剤と接触させるステップことを含む。接触させる試験管内および生体内での方法の組み合わせもまた可能である。接触させることは、上で論じられた通り、直接的または間接的であってもよい。さらに、細胞を接触させることは、標的リガンド、例えば本明細書に記載されるまたは当該技術分野で公知である任意のリガンドを介して行われてもよい。好ましい実施態様では、標的リガンドは、炭水化物部分、例えばＧａｌＮＡｃ３リガンド、またはＲＮＡｉ剤を目的の部位、例えば対象の肝臓に誘導する任意の他のリガンドである。
【０５０３】
用語「阻害する」は、本明細書で用いられるとき、「低減する」、「発現停止させる」、「下方制御する」、および他の類似用語と交換可能に用いられ、任意レベルの阻害を含む。
【０５０４】
語句「Ｓｅｒｐｉｎａ１の発現を阻害する」は、任意のＳｅｒｐｉｎａ１遺伝子（例えば、マウスＳｅｒｐｉｎａ１遺伝子、ラットＳｅｒｐｉｎａ１遺伝子、サルＳｅｒｐｉｎａ１遺伝子、またはヒトＳｅｒｐｉｎａ１遺伝子など）およびＳｅｒｐｉｎａ１遺伝子の変異体または突然変異体の発現の阻害を指すように意図される。したがって、Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子は、野生型Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子、突然変異体Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子、または遺伝子操作された細胞、細胞群、または生物との関連でのトランスジェニックＳｅｒｐｉｎａ１遺伝子であってもよい。
【０５０５】
「Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子の発現を阻害する」は、Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子の任意レベルの阻害、例えばＳｅｒｐｉｎａ１遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を含む。Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子の発現は、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子発現に関連した任意の変数のレベル、またはそのレベルにおける変化、例えば、Ｓｅｒｐｉｎａ１  ｍＲＮＡレベル、Ｓｅｒｐｉｎａ１タンパク質レベル、または脂質レベルに基づいて評価されてもよい。このレベルは、例えば対象由来のサンプルを含む、個別の細胞または細胞群にて評価されてもよい。
【０５０６】
阻害は、対照レベルと比べてのＳｅｒｐｉｎａ１の発現に関連した１つ以上の変数の絶対的または相対的レベルにおける低下により評価されてもよい。対照レベルは、当該技術分野で利用される任意のタイプの対照レベル、例えば投与前ベースラインレベル、または対照（例えば、緩衝液のみの対照または不活性剤対照など）で治療されないかまたは治療される類似の対象、細胞、もしくはサンプルから決定されるレベルであってもよい。
【０５０７】
本発明の方法の一部の実施形態では、Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子の発現は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％．少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％まで阻害される。
【０５０８】
Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子の発現の阻害は、Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子が転写され、Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子の発現が阻害されるように、（例えば、１つもしくは複数の細胞を本発明のＲＮＡｉ剤と接触させることにより、または本発明のＲＮＡｉ剤を細胞が存在するかもしくは存在した対象に投与することにより）治療されている第１の細胞または細胞群（かかる細胞は例えば対象由来のサンプル中に存在してもよい）によって発現されるｍＲＮＡの量の、第１の細胞もしくは細胞群と実質的に同一であるがそのように治療されていない第２の細胞または細胞群（対照細胞）と比べたときの減少によって示されてもよい。好ましい実施態様では、阻害は、以下の式：
【数１】
2020500929.tif 000048
を用いて、処置細胞内でのｍＲＮＡのレベルを対照細胞内でのｍＲＮＡのレベルの百分率として表すことにより評価される。
【０５０９】
あるいは、Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子の発現の阻害は、Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子発現に機能的に関連するパラメータ、例えばＳｅｒｐｉｎａ１タンパク質発現、例えば、ＡＬＴ、アルカリホスファターゼ、ビリルビン、プロトロンビンおよびアルブミンの減少の観点で評価されてもよい。Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子のサイレンシングは、構成的にまたはゲノムエンジニアリングによりＳｅｒｐｉｎａ１を発現する任意の細胞において、また当該技術分野で公知の任意のアッセイにより測定されてもよい。肝臓は、Ｓｅｒｐｉｎａ１発現の主要な部位である。他の有意な発現部位は、肺および腸を含む。
【０５１０】
Ｓｅｒｐｉｎａ１タンパク質の発現の阻害は、細胞または細胞群によって発現されるＳｅｒｐｉｎａ１タンパク質のレベル（例えば、対象由来のサンプル中で発現されるタンパク質のレベル）における低下によって示されてもよい。ｍＲＮＡ抑制の評価について上で説明される通り、治療された細胞または細胞群におけるタンパク質発現レベルの阻害は、同様に対照細胞または細胞群におけるタンパク質のレベルの百分率として表されてもよい。
【０５１１】
Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子の発現の阻害を評価するために用いられてもよい対照細胞または細胞群は、本発明のＲＮＡｉ剤とまだ接触されていない細胞または細胞群を含む。例えば、対照細胞または細胞群は、対象のＲＮＡｉ剤による治療に先立つ個別対象（例えば、ヒトまたは動物対象）に由来してもよい。
【０５１２】
細胞または細胞群によって発現されるＳｅｒｐｉｎａ１  ｍＲＮＡのレベルは、ｍＲＮＡの発現を評価するための当該技術分野で公知の任意の方法を用いて測定されてもよい。一実施形態では、サンプル中のＳｅｒｐｉｎａ１の発現のレベルは、転写されたポリヌクレオチド、またはその一部、例えばＳｅｒｐｉｎａ１遺伝子のｍＲＮＡを検出することにより測定される。ＲＮＡは、ＲＮＡ抽出技術を用いて、例えば、フェノール／グアニジンイソチオシアン酸抽出（ＲＮＡｚｏｌ  Ｂ；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、ＲＮｅａｓｙ  ＲＮＡ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）またはＰＡＸｇｅｎｅ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）などを用いて、細胞から抽出されてもよい。リボ核酸ハイブリダイゼーションを利用する典型的なアッセイ形式は、核ランオンアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ、リボヌクレアーゼ保護アッセイ（Ｍｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：７０３５）、ノーザンブロッティング、原位置ハイブリダイゼーション、およびマイクロアレイ分析を含む。
【０５１３】
一実施形態では、Ｓｅｒｐｉｎａ１の発現レベルは、核酸プローブを用いて測定される。用語「プローブ」は、本明細書で用いられるとき、特定のＳｅｒｐｉｎａ１に選択的に結合する能力がある任意の分子を指す。プローブは、当業者によって合成され得るか、または適切な生物学的製剤から誘導され得る。プローブは、標識されることに特化して設計されてもよい。プローブとして利用可能な分子の例として、限定はされないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体、および有機分子が挙げられる。
【０５１４】
単離されたｍＲＮＡは、限定はされないが、サザンまたはノーザン解析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析およびプローブアレイを含む、ハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイにて用いることができる。ｍＲＮＡレベルを測定するための一方法は、単離されたｍＲＮＡを、Ｓｅｒｐｉｎａ１  ｍＲＮＡとハイブリダイズ可能な核酸分子（プローブ）と接触させることを含む。一実施形態では、ｍＲＮＡは、固体表面上に固定化され、プローブと接触されるが、それは例えば、単離されたｍＲＮＡをアガロースゲル上で走らせ、そのｍＲＮＡをゲルから膜、例えばニトロセルロースへ移すことによる。他の実施形態では、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップアレイで、プローブが固体表面上に固定化され、ｍＲＮＡがプローブと接触される。当業者は、公知のｍＲＮＡ検出方法を、Ｓｅｒｐｉｎａ１  ｍＲＮＡのレベルを測定するような用途に容易に適応させることができる。
【０５１５】
サンプル中のＳｅｒｐｉｎａ１の発現レベルを測定するための代替方法は、サンプル中の例えばｍＲＮＡの（ｃＤＮＡを調製するための）核酸増幅および／または逆転写酵素、例えばＲＴ−ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ，１９８７、米国特許第４，６８３，２０２号明細書に示される実験実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８９−１９３）、自己持続配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−Ｂｅｔａレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７）、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，８５４，０３３号明細書）または任意の他の核酸増幅方法によるもの、それに続く当業者に周知の技術を用いた増幅分子の検出のプロセスを含む。これらの検出スキームは、核酸分子の検出において、かかる分子が極めて少ない数で存在する場合、特に有用である。本発明の特定の態様では、Ｓｅｒｐｉｎａ１の発現のレベルは、定量蛍光発生ＲＴ−ＰＣＲ（すなわちＴａｑＭａｎ（商標）システム）により測定される。
【０５１６】
Ｓｅｒｐｉｎａ１  ｍＲＮＡの発現レベルは、膜ブロット（例えば、ノーザン、サザン、ドットなどのハイブリダイゼーション分析において用いられる）、またはマイクロウェル、サンプルチューブ、ゲル、ビーズまたは線維（または結合核酸を含む任意の固体支持体）を用いて監視されてもよい。米国特許第５，７７０，７２２号明細書、第５，８７４，２１９号明細書、第５，７４４，３０５号明細書、第５，６７７，１９５号明細書および第５，４４５，９３４号明細書（参照により本明細書中に援用される）を参照のこと。Ｓｅｒｐｉｎａ１発現レベルの測定はまた、溶液中での核酸プローブの使用を含んでもよい。
【０５１７】
好ましい実施態様では、ｍＲＮＡ発現のレベルは、分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイまたはリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて評価される。これらの方法の使用は、本明細書中に提示される実施例中に説明および例示される。
【０５１８】
Ｓｅｒｐｉｎａ１タンパク質発現のレベルは、タンパク質レベルの測定用の当該技術分野で公知の任意の方法を用いて測定されてもよい。かかる方法は、例えば、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、超拡散クロマトグラフィー、流体もしくはゲル沈降反応、吸収分光学、比色アッセイ、分光光度アッセイ、フローサイトメトリー、免疫拡散（一重または二重）、免疫電気泳動、ウエスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、電気化学発光アッセイなどを含む。
【０５１９】
用語「サンプル」は、本明細書で用いられるとき、対象から単離される類似の体液、細胞、または組織の収集物、ならびに対象内部に存在する体液、細胞、または組織を指す。生体液の例として、血液、血清および漿膜液、血漿、リンパ液、尿、脳脊髄液、唾液、眼液などが挙げられる。組織サンプルは、組織、臓器または局所領域に由来するサンプルを含んでもよい。例えば、サンプルは、特定臓器、臓器の一部、またはそれら臓器内部の体液もしくは細胞に由来してもよい。特定の実施形態では、サンプルは、肝臓（例えば、全肝臓または肝臓の特定セグメントまたは肝臓における特定タイプの細胞、例えば肝細胞など）に由来してもよい。好ましい実施態様では、「対象に由来するサンプル」は、対象から採取される血液または血漿を指す。さらなる実施形態では、「対象に由来するサンプル」は、対象に由来する肝組織を指す。
【０５２０】
本発明の方法の一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ剤が対象内部の特定部位に送達されるように対象に投与される。Ｓｅｒｐｉｎａ１の発現の阻害は、対象内部の特定部位からの体液もしくは組織に由来するサンプル中でのＳｅｒｐｉｎａ１  ｍＲＮＡもしくはＳｅｒｐｉｎａ１タンパク質のレベルまたはレベルにおける変化の測定を用いて評価されてもよい。好ましい実施態様では、その部位は、肝臓である。その部位はまた、上述部位のいずれか１つからの細胞のサブセクションまたはサブグループであってもよい。その部位はまた、特定タイプの受容体を発現する細胞を含んでもよい。
【０５２１】
ＶＩＩ．Ｓｅｒｐｉｎａ１関連疾患を治療または予防するための方法
本発明はまた、Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子発現を下方制御することにより調節可能である疾患および状態を治療または予防するための方法を提供する。例えば、本明細書に記載の組成物は、Ｓｅｒｐｉｎａ１関連疾患、例えば肝疾患、例えば、慢性肝疾患、肝臓炎、硬変症、肝線維症、および／または肝細胞がん、ならびにこれらの障害に伴うことがある他の病態、例えば、肺炎症、気腫、およびＣＯＰＤを治療するため、用いることができる。
【０５２２】
本発明はまた、対象、例えばＳｅｒｐｉｎａ１欠損変異体を有する対象における肝細胞がんの発現を阻害するための方法を提供する。この方法は、本発明の組成物を治療有効量で該対象に投与することを含み、それにより対象における肝細胞がんの発現を阻害する。
【０５２３】
対象、例えばＳｅｒｐｉｎａ１欠損変異体を有する対象の肝臓におけるミスフォールドしたＳｅｒｐｉｎａ１の蓄積を低減するための本発明の方法および組成物の使用もまた、本発明により提供される。この方法は、本発明の組成物を治療有効量で対象に投与することを含み、それにより対象の肝臓におけるミスフォールドしたＳｅｒｐｉｎａ１の蓄積を低減する。
【０５２４】
本明細書で用いられるとき、「対象」は、ヒトまたは非ヒト動物、好ましくは脊椎動物、またより好ましくは哺乳動物を含む。対象は、トランスジェニック生物を含んでもよい。最も好ましくは、対象は、ヒト、例えばＳｅｒｐｉｎａ１関連疾患を患うかまたはそれを発現しやすいヒトである。一実施形態では、Ｓｅｒｐｉｎａ１関連疾患を患うかまたはそれを発現しやすい対象は、１つ以上のＳｅｒｐｉｎａ１欠損対立遺伝子、例えば、ＰＩＺ、ＰＩＳ、またはＰＩＭ（Ｍａｌｔｏｎ）対立遺伝子を有する。
【０５２５】
本発明のさらなる実施形態では、本発明のｉＲＮＡ剤は、追加的な治療薬と組み合わせて投与される。ＩＲＮＡ剤および追加的な治療薬は、同じ組成物中に組み合わせて、例えば非経口的に投与され得る、または追加的な治療薬は、別の組成物の一部として、または本明細書に記載の別の方法により投与され得る。
【０５２６】
本発明の方法における使用に適した追加的な治療薬の例として、肝障害、例えば肝硬変を治療することで知られる薬剤が挙げられる。例えば、本発明で注目されるｉＲＮＡ剤は、例えば、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、免疫抑制剤、メトトレキサート、コルチコステロイド、シクロスポリン、コルヒチン、鎮痒薬、例えば、抗ヒスタミン薬、コレスチラミン、コレスチポール、リファンピン、ドロナビノール（マリノール）、および血漿交換、予防的抗生物質、紫外線、亜鉛サプリメント、ならびにＡ型肝炎、インフルエンザおよび肺炎球菌予防接種とともに投与され得る。
【０５２７】
本発明の方法の一部の実施形態では、Ｓｅｒｐｉｎａ１の発現は、延長された持続時間、例えば、少なくとも１週、２週、３週、または４週もしくはそれ以上にわたり低下する。例えば、場合によっては、Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子の発現は、本明細書に記載のｉＲＮＡ剤の投与により、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、または５５％抑制される。一部の実施形態では、Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子は、ｉＲＮＡ剤の投与により、少なくとも約６０％、７０％、または８０％抑制される。一部の実施形態では、Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子は、ｉＲＮＡ剤の投与により、少なくとも約８５％、９０％、または９５％抑制される。
【０５２８】
本発明のｉＲＮＡ剤は、限定はされないが、皮下、静脈内、筋肉内、眼内、気管支内、胸膜内、腹腔内、動脈内、リンパ管、脳脊髄、およびそれらの任意の組み合わせを含む、当該技術分野で公知の任意の投与様式を用いて、対象に投与されてもよい。好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、皮下に投与される。
【０５２９】
いくつかの実施形態では、投与は、蓄積注射による。蓄積注射は、長期にわたり、一貫性を持ってｉＲＮＡ剤を放出してもよい。したがって蓄積注射は、例えば所望のＳｅｒｐｉｎａ１阻害、または治療的または予防的効果などの所望の効果を得るのに、必要な投薬頻度を低下させてもよい。蓄積注射はまた、より一貫した血清濃度を提供してもよい。蓄積注射としては、皮下注射または筋肉内注射が挙げられる。好ましい実施形態では、蓄積注射は皮下注射である。
【０５３０】
いくつかの実施形態では、投与は、ポンプによる。ポンプは、外部ポンプ、または外科的に埋め込まれたポンプであってもよい。特定の実施形態では、ポンプは、皮下移植浸透圧ポンプである。別の実施形態では、ポンプは、点滴ポンプである。点滴ポンプは、静脈内、皮下、動脈、または硬膜外輸液のために使用してもよい。好ましい実施形態では、点滴ポンプは、皮下点滴ポンプである。別の実施形態では、ポンプは、ｉＲＮＡｉを肝臓に送達する、外科的に埋め込まれたポンプである。
【０５３１】
他の投与様式として、硬膜外、脳内、脳室内、経鼻投与、動脈内、心臓内、骨内注入、髄腔内、および硝子体内、および肺が挙げられる。投与様式は、局所または全身治療が所望されるか否かに基づき、また治療されるべき領域に基づき、選択されてもよい。投与の経路および部位は、標的化を増強するように選択されてもよい。
【０５３２】
本発明の方法は、ｉＲＮＡ剤をＳｅｒｐｉｎａ１  ｍＲＮＡのレベルを抑制する／低下させるのに十分な用量で少なくとも５日間、より好ましくは７、１０、１４、２１、２５、３０または４０日間投与すること；また任意選択的には、ｉＲＮＡ剤を第２単回用量で投与することを含み、それにより対象におけるＳｅｒｐｉｎａ１遺伝子の発現を阻害し、ここで第２単回用量は、第１単回用量の投与の少なくとも５日後、より好ましくは７、１０、１４、２１、２５、３０または４０日後に投与される。
【０５３３】
一実施形態では、本発明のｉＲＮＡ剤の用量は、４週ごとに１回以下、３週ごとに１回以下、２週ごとに１回以下、または１週ごとに１回以下投与される。別の実施形態では、投与は、１、２、３、もしくは６か月、または１年以上にわたり維持され得る。  
【０５３４】
一般に、ｉＲＮＡ剤は、免疫系を活性化せず、例えばそれは、サイトカインレベル、例えばＴＮＦ−αまたはＩＦＮ−αレベルを上昇させない。例えば、ＴＮＦ−αまたはＩＦＮ−αのレベルにおける上昇は、例えば本明細書に記載のようなインビトロＰＢＭＣアッセイなどのアッセイにより測定されるとき、対照ｉＲＮＡ剤、例えばＳｅｒｐｉｎａ１を標的にしないｉＲＮＡ剤で処置される対照細胞の３０％未満、２０％、または１０％である。
【０５３５】
例えば、対象には、治療量のｉＲＮＡ剤、例えば、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、または２．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡが投与され得る。ｉＲＮＡ剤は、長時間にわたり、例えば、５分、１０分、１５分、２０分、または２５分の時間かけて、静脈内注入により投与され得る。投与は、例えば、定期的に、例えば隔週で（すなわち２週ごとに）１か月、２か月、３か月、４か月またはそれ以上の間、反復される。
【０５３６】
初期治療計画後、治療は、より少ない頻度を基本に実施され得る。例えば、隔週で３か月間の投与後、投与は、１月１回で６か月もしくは１年またはそれ以上の間、反復され得る。ｉＲＮＡ剤の投与により、例えば、患者の細胞、組織、血液、尿、臓器（例えば肝臓）、または他の区画におけるＳｅｒｐｉｎａ１レベルが、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％またはそれ以上だけ低下し得る。
【０５３７】
総用量のｉＲＮＡ剤の投与前、患者は、より少ない用量が投与され、有害作用、例えばアレルギー性反応について、または上昇した脂質レベルまたは血圧について監視され得る。別の例では、患者は、望まれない免疫刺激効果、例えば上昇したサイトカイン（例えば、ＴＮＦ−αまたはＩＮＦ−α）レベルについて監視され得る。例示的なより少ない用量は、５％以下の注入反応の発生率をもたらすものである。
【０５３８】
疾患の治療または予防の有効性は、例えば、疾患進行、疾患寛解、症状重症度、疼痛の低減、生活の質、治療効果を維持するのに必要な投薬用量、疾患マーカーのレベルまたは治療されているかもしくは予防の標的にされている所与の疾患に対する適切な任意の他の測定可能なパラメータを測定することにより評価され得る。かかるパラメータのいずれか１つ、またはパラメータの任意の組み合わせを測定することにより治療または予防の有効性を監視することは、十分に当業者の能力の範囲内である。例えば、肝線維症の治療の有効性または肝線維症の寛解は、例えば、肝線維症マーカー：ａ−２−マクログロブリン（ａ−ＭＡ）、トランスフェリン、アポリポタンパク質Ａｌ、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ラミニン、Ｎ末端プロコラーゲンＩＩＩ（ＰＩＩＩＮＰ）、７ＳコラーゲンＩＶ（７Ｓ−ＩＶ）、総ビリルビン、間接ビリルビン、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、ＡＳＴ／ＡＬＴ、ｇ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アルブミン、アルブミン／グロブリン、血液尿素性窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン（Ｃｒ）、中性脂肪、コレステロール、高密度リポタンパク質および低密度リポタンパク質、および肝穿刺生検の定期的監視により評価され得る。肝線維症マーカーは測定可能であり、かつ／または肝穿刺生検は、治療前（初期読み取り）とその後（後期読み取り）、治療計画中に実施され得る。
【０５３９】
後期読み取りと初期読み取りとの比較は、医師に治療が有効であるか否かの指標を提示する。かかるパラメータのいずれか１つ、またはパラメータの任意の組み合わせを測定することにより治療または予防の有効性を監視することは、十分に当業者の能力の範囲内である。Ｓｅｒｐｉｎａ１またはその医薬組成物を標的化するｉＲＮＡ剤の投与と関連して、Ｓｅｒｐｉｎａ１関連疾患、例えば肝疾患、例えば肝線維症状態「に対する有効な」は、本発明のｉＲＮＡ剤の臨床的に適切な様式での投与が、患者の少なくとも統計学的に有意な割合における有益な効果、例えば、症状の改善、治癒、疾患負荷の減少、腫瘍の質量または細胞数における減少、延命、生活の質における改善、または肝疾患治療に精通した医師により一般に陽性と認識される他の効果をもたらすことを示す。
【０５４０】
本発明の方法において、本明細書に記載のようなｉＲＮＡ剤は、Ｓｅｒｐｉｎａ１関連疾患、例えば肝疾患、例えば、肝臓炎、硬変症、肝線維症、および／または肝細胞がんの徴候、症状および／またはマーカーを有している、またはそれと診断されている、またはそれを有するリスクがある個体を治療するため、用いることができる。当業者は、容易に、本明細書に記載のようなｉＲＮＡ剤を用いる治療を受けている対象におけるかかる障害の徴候、症状、および／またはマーカーを監視し、またこれらの徴候、症状および／またはマーカーにおける少なくとも１０％の、好ましくは肝疾患の低リスクを表す臨床レベルまでの減少についてアッセイすることができる。
【０５４１】
治療または予防効果は、病状の１つ以上のパラメータにおける統計学的に有意な改善が認められるとき、または症状の、通常であれば予測されるような悪化または発現がないことにより明らかである。例として、（上記の肝機能など）疾患の測定可能なパラメータにおける少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上の好ましい変化が、効果的治療を意味し得る。
【０５４２】
本発明の所与のｉＲＮＡ剤またはそのｉＲＮＡ剤の製剤における有効性はまた、当該技術分野で公知であるような所与の疾患用の実験動物モデルを用いて判断され得る。実験動物モデルを用いると、治療の有効性は、マーカーまたは症状における統計学的に有意な低下が認められるとき、証明される。
【０５４３】
治療または予防効果はまた、１つ以上の症状が低減または緩和されるとき、明らかである。例えば、治療または予防効果は、脱力、疲労、体重減少、悪心、嘔吐、腹部腫脹、四肢腫脹、過剰なかゆみ、ならびに眼および／または皮膚の黄疸の１つ以上が低減または緩和されるとき、有効である。
【０５４４】
特定指標として、有効性は、Ｓｅｒｐｉｎａ１タンパク質の血清レベルにおける上昇により測定され得る。例として、適切にフォールドされたＳｅｒｐｉｎａ１の血清レベルの、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％を上回る上昇は、効果的治療を意味し得る。
【０５４５】
あるいは、有効性は、臨床的に認められた疾患重症度の評価尺度、一例にすぎないがＣｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈスコア（場合により、Ｃｈｉｌｄ−Ｔｕｒｃｏｔｔｅ−Ｐｕｇｈスコア）に基づき、診断の当業者によって判定されるような疾患の重症度における低下により評価され得る。この例では、慢性肝疾患、主に硬変症の予後は、５つの臨床尺度、ビリルビン、血清アルブミン、ＩＮＲ、腹水症、および肝性脳症の総スコアにより評価される。各マーカーに１〜３の値が割り当てられ、値の合計が、１年および２年生存率と相関され得る、Ａ（５〜６ポイント）、Ｂ（７〜９ポイント）、またはＣ（１０〜１５ポイント）として分類されたスコアを提供するために用いられる。Ｃｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈスコアの判定および分析のための方法は、当該技術分野で周知である（Ｆａｒｎｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ，Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ２００４  １８８：５８０−５８３；Ｃｈｉｌｄ  ａｎｄ  Ｔｕｒｃｏｔｔｅ．Ｓｕｒｇｅｒｙ  ａｎｄ  ｐｏｒｔａｌ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．Ｉｎ：Ｔｈｅ  ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  ｐｏｒｔａｌ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  ＣＧ  Ｃｈｉｌｄ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｓａｕｎｄｅｒｓ  １９６４：５０−６４；Ｐｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｒ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  １９７３；６０：６４８−５２）。有効性は、この例では、患者の例えば「Ｂ」から「Ａ」への移動により評価され得る。例えば適切な尺度を用いて評価された疾患の重症度の低下をもたらす任意の陽性変化は、本明細書に記載のようなｉＲＮＡまたはｉＲＮＡ製剤を用いての十分な治療を表す。
【０５４６】
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、約０．２５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの間、例えば、約０．２５ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇの間、約０．２５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの間、約０．２５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの間、約０．２５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの間、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの間、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇの間、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの間、約１５ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇの間、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの間、約２５ｍｇ／ｋｇ〜約３５ｍｇ／ｋｇの間、または約４０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの間の用量で投与される。
【０５４７】
対象に投与されるＲＮＡｉ剤の用量は、例えば、（上で定義される通り、例えば、Ｓｅｒｐｉｎａ１  ｍＲＮＡ抑制、Ｓｅｒｐｉｎａ１タンパク質発現）所望されるレベルのＳｅｒｐｉｎａ１遺伝子抑制または所望される治療的もしくは予防的効果を達成する一方、望ましくない副作用を同時に回避するため、特定用量のリスクおよび利益を平衡させるという目的に合わせてもよい。
【０５４８】
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、２回以上の用量で投与される。反復または頻回注入を促進することが所望される場合、送達装置、例えば、ポンプ、半永久ステント（例えば、静脈内、腹腔内、大槽内または関節内）、またはリザーバーの移植が得策であり得る。一部の実施形態では、後続用量の数または量は、所望される効果の達成、例えばＳｅｒｐｉｎａ１遺伝子の抑制、または治療的もしくは予防的効果の達成、例えば肝臓疾患の症状の軽減に依存する一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、スケジュールに従って投与される。例えば、ＲＮＡｉ剤は、週１回、週２回、週３回、週４回、または週５回投与されてもよい。一部の実施形態では、スケジュールは、所定間隔ごと、例えば、１時間ごと、４時間ごと、６時間ごと、８時間ごと、１２時間ごと、毎日、２日ごと、３日ごと、４日ごと、５日ごと、毎週、隔週ごとの投与を含む。他の実施形態では、スケジュールは、密な間隔での投与と、その後の作用物質が投与されない期間の長期化を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、設けられた投与間隔が密である「負荷段階」を含み、それにＲＮＡｉ剤がより長く設けられた間隔で投与される「維持段階」が続くことがある投与計画にて投与される。
【０５４９】
これらのスケジュールのいずれかは、任意選択的には１回以上反復されてもよい。反復回数は、所望される効果の成果、例えばＳｅｒｐｉｎａ１遺伝子の抑制、、および／または治療的もしくは予防的効果の成果、例えばＳｅｒｐｉｎａ１疾患、例えば肝臓疾患の症状の軽減に依存してもよい。
【０５５０】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のｉＲＮＡ剤をいかに投与するかについて、エンドユーザー、例えば介護者または対象に指示する方法を特徴とする。この方法は、任意選択的には、エンドユーザーに１回以上の用量のｉＲＮＡ剤を提供することと、エンドユーザーにｉＲＮＡ剤を本明細書に記載の投与計画で投与するように指示し、それによりエンドユーザーに指示することと、を含む。
【０５５１】
遺伝的素因は、標的遺伝子関連疾患、例えば肝疾患の発現における役割を担う。したがって、ｓｉＲＮＡを必要とする患者は、家族歴を取る、または例えば、１つ以上の遺伝子マーカーまたは変異体についてスクリーニングすることにより同定され得る。したがって、一態様では、本発明は、患者がＳｅｒｐｉｎａ１欠損またはＳｅｒｐｉｎａ１欠損遺伝子変異体、例えば、ＰＩＺ、ＰＩＳ、またはＰＩＭ（Ｍａｌｔｏｎ）対立遺伝子の１つ以上を有することに基づいて患者を選択することにより、患者を治療する方法を提供する。この方法は、ｉＲＮＡ剤を治療有効量で患者に投与することを含む。
【０５５２】
医療提供者、例えば、医師、看護師、または家族は、本発明のｉＲＮＡ剤を処方または投与する前に、家族歴を取ることができる。さらに、遺伝子型または表現型を決定するための試験が実施されてもよい。例えば、Ｓｅｒｐｉｎａ１  ｄｓＲＮＡが患者に投与される前にＳｅｒｐｉｎａ１遺伝子型および／または表現型を同定するため、患者からの試料、例えば血液試料に対してＤＮＡ試験が実施されてもよい。
【０５５３】
ＶＩＩＩ．キット
本発明はまた、ｉＲＮＡ剤の使用および／または本発明の方法の実施のいずれかのためのキットを提供する。かかるキットは、１つ以上のＲＮＡｉ剤および使用説明書、例えば細胞内でのＳｅｒｐｉｎａ１の発現を、細胞をＲＮＡｉ剤とＳｅｒｐｉｎａ１の発現を阻害するのに有効な量で接触させることにより阻害するための使用説明書を含む。キットは、任意選択的には、細胞をＲＮＡｉ剤と接触させるための手段（例えば、注射デバイス）、またはＳｅｒｐｉｎａ１の阻害を測定するための手段（例えば、Ｓｅｒｐｉｎａ１  ｍＲＮＡの阻害を測定するための手段）をさらに含んでもよい。Ｓｅｒｐｉｎａ１の阻害を測定するためのかかる手段は、サンプル、例えば血漿サンプルなどを対象から得るための手段を含んでもよい。本発明のキットは、任意選択的には、ＲＮＡｉ剤を対象に投与するための手段または治療有効量もしくは予防有効量を決定するための手段をさらに含んでもよい。
【０５５４】
別段の定義がない限り、本明細書で用いられるすべての科学技術用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料に類似または相当するものは、本発明の特徴とされるｉＲＮＡおよび方法の実施または試験において用いることができるが、好適な方法および材料が以下に説明される。本明細書で言及されるすべての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それら全体が参照により援用される。衝突が生じた場合には、定義を含む本明細書が支配することになる。さらに、材料、方法、および例は、あくまで例示的であり、限定することは意図されない。
【実施例】
【０５５５】
実施例１．オフターゲット効果およびインビボ毒性の緩和
ＲＮＡ干渉すなわち「ＲＮＡｉ」は、二本鎖ＲＮＡｉ（ｄｓＲＮＡ）が遺伝子発現を遮断し得るという観察を記述するため、Ｆｉｒｅと同僚らによって最初に造られた用語である（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３９１，８０６−８１１；Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５，１８８−２００）。短いｄｓＲＮＡは、脊椎動物を含む多くの生物において遺伝子特異的な転写後サイレンシングを誘導し、遺伝子機能を試験するための新しいツールを提供している。ＲＮＡｉは、そのサイレンシングトリガーに相同なメッセンジャーＲＮＡを破壊する配列特異的な多成分ヌクレアーゼのＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によって媒介される。ＲＩＳＣは、その二本鎖ＲＮＡトリガーに由来する短いＲＮＡ（約２２ヌクレオチド）を有することが知られるが、この活性のタンパク質成分は未知のままであった。
【０５５６】
ｓｉＲＮＡのオフターゲット効果の１つが、ｍｉＲＮＡ様効果であり、ここではＲＮＡ干渉におけるコアエフェクターであるアルゴノートタンパク質が、ＲＮＡ干渉を誘導するために人工的に導入されるｓｉＲＮＡをｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）として処理する（Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（２０１５）４，ｅ２５２）。ｍｉＲＮＡは、遺伝子抑制のため、シード領域（５’末端から２〜７位）と標的ｍＲＮＡとの間の塩基対合を通じて標的遺伝子の多くを認識する。ｓｉＲＮＡによって引き起こされるオフターゲットは、ｓｉＲＮＡのＲＩＳＣ負荷アンチセンス鎖のシード領域と１つ以上のｍＲＮＡとの塩基相補性に起因する。ｓｉＲＮＡにおけるｍｉＲＮＡ様オフターゲット効果は、幾つかの試験において報告されており、シード領域の配列に応じて多数の遺伝子の発現に影響し、ｓｉＲＮＡに基づく表現型スクリーニングにおいて最大３０％の陽性ヒットの原因になる程に重大である。加えて、ｍｉＲＮＡの場合、シード領域と標的との間の相互作用が弱くなるとき、それらの３’末端領域内での相補的対合（３’相補的対合）を通じて標的遺伝子をサイレンシングすることも報告されており、それはｍｉＲＮＡ様オフターゲット効果がかかる機構によって媒介される可能性が高いことを意味する。
【０５５７】
下記の通り、ｄｓＲＮＡ剤が、アンチセンス鎖がシード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端から数えて５’末端の２〜９位に）二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含み、かつ／またはｄｓＲＮＡ剤が約４０℃〜約８０℃の範囲内の融解温度を有する場合、ＲＮＡ干渉を媒介するのに、不安定化修飾を欠いている親ｄｓＲＮＡ剤よりも有効であり得ることが発見されている。かかる薬剤は、治療用途に適したＲＮＡｉ組成物同様、オフターゲット遺伝子サイレンシング効果を低減しつつ、標的遺伝子発現の阻害にとって有利である。
【０５５８】
材料および方法
本実施例では、以下の材料および方法を用いた。
【０５５９】
ｓｉＲＮＡ設計
本明細書に記載の実験における評価用に、セリンペプチダーゼ阻害剤、クレードＡ、メンバー１（Ｓｅｒｐｉｎａ１）（ＡＡＴ）を標的にするリード発現候補ｄｓＲＮＡ剤を選択した。親リード発現候補の修飾されたヌクレオチド配列を有し、シード領域内に（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端から数えて５’末端の２〜９位に）二本鎖の少なくとも１つの熱不安定化修飾を含むアンチセンス鎖を有し、かつ／または約４０℃〜約８０℃の範囲内の融解温度を有する、Ｓｅｒｐｉｎａ１を標的にするｄｓＲＮＡ剤を、下記のように設計し、合成し、評価した。
【０５６０】
詳細には、２０１３年５月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／８２６，１２５号明細書、２０１３年１１月１日に出願された米国仮特許出願第６１／８９８，６９５号明細書；２０１４年４月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／９７９，７２７号明細書；２０１４年５月６日に出願された米国仮特許出願第６１／９８９，０２８号明細書；２０１７年２月２１日に交付され、米国特許第９，５７４，１９２号明細書として現在交付されている米国特許出願第１４／２８４，７４５号明細書；２０１７年１月６日に出願された米国特許出願第１５／３９９，８２０号明細書；および２０１４年５月２２日に出願された国際特許出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３９１０９号パンフレットに記載の通り、ＡＤ−６１４４４は、インビトロとインビボとでＡＡＴを有効かつ持続的に阻害することが同定され、示された。ＡＤ−６１４４４の非修飾センス鎖ヌクレオチド配列は、５’−ＣＵＵＣＵＵＡＡＵＧＡＵＵＧＡＡＣＡＡＡＡ−３’（配列番号４１７）であり、かつＡＤ−６１４４４の非修飾ヌクレオチド配列は、５’−ＵＵＵＵＧＵＵＣＡＡＵＣＡＵＵＡＡＧＡＡＧＡＣ−３’（配列番号４１９）である。ＡＤ−６１４４４の修飾センス鎖ヌクレオチド配列は、５’−ｃｓｕｓｕｃｕｕａａｕＧｆＡｆｕｕｇａａｃａａａａＬ９６−３’（配列番号４１８）であり、かつＡＤ−６１４４４の修飾アンチセンス鎖ヌクレオチド配列は、５’−ｕｓＵｆｓｕＵｆｇＵｆｕＣｆａＡｆｕｃａＵｆｕＡｆａＧｆａＡｆｇｓａｓｃ−３’（配列番号４２０）である。
【０５６１】
【表３】
2020500929.tif 000049
【０５６２】
【表４】
2020500929.tif 000050
【０５６３】
合成および精製
すべてのオリゴヌクレオチドは、汎用的または習慣的サポートを用いて、１μモルの規模で、ＭｅｒＭａｄｅ１９２シンセサイザー上で調製した。すべてのホスホラミダイトは、カップリング時間を４００秒に延長した点を除き、２−シアノエチルホスホラミダイト用の標準プロトコルを用いて、１００％アセトニトリルまたは９：１のアセトニトリル：ＤＭＦにおける１００ｍＭの濃度で用いた。新規に形成された結合の酸化を、９：１のアセトニトリル：水における５０ｍＭ  Ｉ２の溶液を用いて行い、リン酸結合をもたらし、９：１のピリジン：アセトニトリルにおける１００ｍＭ  ＤＤＴＴにより、ホスホロチオエート結合をもたらした。トリチルオフの合成後、カラムを４０％水性メチルアミン１５０μＬとともに４５分間インキュベートし、溶液を真空を介して９６ウェルプレートに流した。インキュベーションを反復し、水性メチルアミンの新しい部分を流した後、粗オリゴヌクレオチド溶液を含有するプレートを密封し、室温でさらに６０分間振盪し、すべての保護基を完全に除去した。９：１アセトニトリル：ＥｔＯＨを１．２ｍＬで各ウェルに添加することにより粗オリゴヌクレオチドを得た後、−２０℃で一晩インキュベートした。次に、プレートを３０００ＲＰＭで４５分間遠心分離し、各ウェルから上清を除去し、ペレットを９５０μＬの２０ｍＭ水性ＮａＯＡｃに再懸濁した。最後に、水を用いてＧＥ  Ｈｉ−Ｔｒａｐ脱塩カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５  Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ）上で各未精製溶液を脱塩し、最終オリゴヌクレオチド生成物を溶出させた。すべての同一性および純度は、各々、ＥＳＩ−ＭＳおよびＩＥＸ  ＨＰＬＣを用いて確認した。
【０５６４】
温度依存性ＵＶ分光学
融解試験は、サーモプログラマーを備えたＢｅｃｋｍａｎ  ＤＵ８００分光光度計上での経路長が１ｃｍの石英セルにおいて、０．３３×ＰＢＳ（３．３ｍＭ  Ｎａ／Ｋリン酸緩衝液、ｐＨ７．４、４６ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．９ｍＭ  ＫＣｌを有する）中、（相補的非修飾ＲＮＡセンス鎖と対合した修飾アンチセンス鎖からなる）１μＭの二本鎖濃度で実施した。試料溶液２００μＬを含有する各キュベットを、軽鉱油１２５μＬでカバーした。１℃／分の加熱速度、１５〜９０℃での融解曲線を２６０ｎｍで監視した。融解温度（Ｔｍ）は、平滑化された加熱曲線の最初の派生物から算出し、報告された値は、少なくとも２つの独立した測定の結果である。
【０５６５】
インビトロレポーターアッセイ
１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃、５％ＣＯ２でＣＯＳ−７細胞を培養した。細胞を、２μｇ／ｍＬのリポフェクタミン２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、製造業者の使用説明書に従い、１０ｎｇのルシフェラーゼレポータープラスミドおよび１０倍希釈中の５０ｆＭ〜５０ｎＭのｓｉＲＮＡとともに９６ウェルプレートに同時トランスフェクトした（１５，０００細胞／ウェル）。製造業者の使用説明書に従い、二重ルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のため、細胞をトランスフェクションの４８時間後に収集した。オンターゲットレポータープラスミドは、ウミシイタケルシフェラーゼの３’非翻訳（３’ＵＴＲ）におけるアンチセンス鎖に対して完全に相補的な単一の部位を含有した。オフターゲットレポータープラスミドは、ウミシイタケルシフェラーゼの３’ＵＴＲにおける２１〜２８ヌクレオチドによって分かれた、４つのタンデムシード相補的部位を含有した。両方のプラスミドが、ホタルルシフェラーゼをトランスフェクション対照として同時発現した。
【０５６６】
遺伝子発現分析
凍結保存したラットおよびヒト肝細胞（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ）を、Ｔｏｒｐｅｄｏ抗生物質混合物を有するＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ  ＣＰ培地中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。細胞を、２μｇ／ｍＬのリポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、製造業者の使用説明書に従い、１０ｎＭ  ｓｉＲＮＡとともに９６ウェルプレートにトランスフェクトした（２０，０００細胞／ウェル）。ＲＮＡ抽出のため、ｍｉＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者の使用説明書に従い、細胞をトランスフェクションの２４時間後に収集した。ＴｒｕＳｅｑ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてｃＤＮＡライブラリーを調製し、ＮｅｘｔＳｅｑ  ５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で配列決定した。
【０５６７】
インビボマウスおよびラット試験
すべての試験は、適用可能なものとしての地方、州および連邦規制に合致し、かつＡｌｎｙｌａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓでの動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ））によって認可されたプロトコルを用いて実施した。
【０５６８】
マウス薬力学試験では、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、単回用量の媒体対照（０．９％塩化ナトリウム、生理食塩水）を投与するか、または０．５もしくは１ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡを上背に皮下投与した。８日目、ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ分析のため、肝臓を収集し、冷生理食塩水ですすぎ、直ぐに液体窒素で急速凍結し、−８０℃で貯蔵した。
【０５６９】
ラット毒性試験では、雄スプラーグドーリーラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に週あたり３回の反復用量（ｑｗ×３）の媒体対照（０．９％塩化ナトリウム、生理食塩水）を投与するか、または３０ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡを上背に皮下投与した。１６日目、臨床病理学的評価のため、血清を収集し、病理組織学的評価とｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ分析のため、肝臓を収集した。
【０５７０】
ｍＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの定量
ｍｉＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者の使用説明書に従い、ＲＮＡを抽出し、高性能ｃＤＮＡ逆転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、製造業者の使用説明書に従い、ｃＤＮＡに変換し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を用いるＲｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０  ＩＩで、遺伝子特異的なＴａｑｍａｎプローブ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いる定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）により、ｍＲＮＡレベルを評価した。
【０５７１】
ｓｉＲＮＡへの曝露を定量化するため、細胞ペレットを０．２５％トリトンＸ１００を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、９５℃で１０分間加熱し、１４，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、ＴａｑＭａｎマイクロＲＮＡ逆転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、製造業者の使用説明書に従い、上清に対して逆転写を実施した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を用いるＲｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０  ＩＩで、製造業者の使用説明書に従い、ｑＰＣＲを実施した。
【０５７２】
結果
１．インビトロ試験
インビトロレポーターアッセイの結果を表１にまとめる。表１中のデータが示す通り、アンチセンス鎖の７位でのグリコール核酸（ＧＮＡ）修飾は、インビトロでオフターゲット活性を緩和しつつ、オンターゲット活性を保持する。
【０５７３】
【表５】
2020500929.tif 000051
【０５７４】
ルシフェラーゼレポータープラスミドがｓｉＲＮＡとともにＣＯＳ−７細胞に同時トランスフェクトされ、４８時間後にルシフェラーゼアッセイが実施された。
【０５７５】
２．遺伝子発現分析
インビトロ遺伝子発現分析の結果を表２にまとめる。表２から明らかなように、アンチセンス鎖の７位でのＧＮＡ修飾は、インビトロでオフターゲット活性を緩和した。
【０５７６】
【表６】
2020500929.tif 000052
【０５７７】
ヒト幹細胞（ＡＡＴ）にｓｉＲＮＡがトランスフェクトされ、ＲＮＡ配列決定の２４時間後にＲＮＡが収集された。
【０５７８】
３．インビボマウス試験
インビボ試験の結果を表３にまとめる。明らかなように、アンチセンス鎖の７位でのＧＮＡ修飾は、インビボで効力を保持する（表３）。
【０５７９】
【表７】
2020500929.tif 000053
【０５８０】
マウスにＡＡＴを標的にするｓｉＲＮＡが１  ｍｇ／ｋｇの単回用量で投与され、８日目に肝臓でのｍＲＮＡのノックダウンが評価された。
【０５８１】
実施例２．Ｓｅｒｐｉｎａ１を標的にするｄｓＲＮＡ剤のインビボおよびインビトロ分析
ＡＤ−６１４４４中にＧＮＡヌクレオチドを取り込むインビボ効果をさらに評価するため、ＡＤ−６１４４４をアンチセンスの６位（ＡＤ−７５９９４）または７位（ＡＤ−７５９９５）にＧＮＡヌクレオチドでさらに修飾し（図１Ａ）、ヒトＡＡＴについてトランスジェニックのマウスに、薬剤を１ｍｇ／ｋｇの単回用量で皮下投与した。投与前と図１Ｂに示される時点とに、循環ＡＡＴの定量化のため、血清を得た。ＡＡＴタンパク質レベルをサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定し、データをＡＡＴタンパク質レベルのベースライン値に正規化した。
【０５８２】
図１Ｂに示す通り、ＡＤ−６１４４４のアンチセンス鎖の６位または７位のいずれかへのＧＮＡヌクレオチドの取り込みにより、親分子と比べて活性の低下がもたらされた。
【０５８３】
したがって、ＡＤ−６１４４４における２’−フルオロ修飾ヌクレオチドの総数は減少し、ＡＤ−７７４０７が得られ、ＧＮＡヌクレオチドをＡＤ−７７４０７のアンチセンス７位に取り込むことでＡＤ−７７４１２が得られた（図１Ｃ）。ヒトＡＡＴについてトランスジェニックのマウスに、薬剤を１ｍｇ／ｋｇの単回用量で皮下投与した。投与前と図１Ｄに示される時点とに、循環ＡＡＴの定量化のため、血清を得た。ＡＡＴタンパク質レベルをサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定し、データをＡＡＴタンパク質レベルのベースライン値に正規化した。
【０５８４】
図１Ｄは、ＡＤ−６１４４４の２’フルオロ含量の減少（すなわち、ＡＤ−７７４０７）により、マウスにおける活性の顕著な改善が得られたことを示す。さらに、この内容物へのＧＮＡヌクレオチドの取り込み（ＡＤ−７７４１２）により、親分子ＡＤ−６１４４４に対して正味の改善が得られた。
【０５８５】
オフターゲット効果に対する、ＡＤ−６１４４４の２’−フルオロ含量の減少およびアンチセンス鎖の７位へのＧＮＡヌクレオチドの取り込みの効果を判定するため、Ｈｅｐ３Ｂ細胞に、リポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘを用いて、１０ｎＭのＡＤ−６１４４４またはＡＤ−７７４１２をトランスフェクトした。１６時間後、転写プロファイリングのため、細胞を溶解および調製した。図２Ａおよび２Ｂに示す通り、得られたデータをグラフ化し、発現がモック処置細胞に対して統計学的に有意に異なる転写物を黒丸で、また発現がモック処置細胞に対して統計学的に有意に異ならない転写物を灰丸で示した。ＡＡＴ転写物を円で示し、強調した。
【０５８６】
図２Ａおよび２Ｂに表すデータは、ＡＤ−６１４４４での細胞の処置により、ＡＡＴを含む、５２の転写物の下方制御がもたらされたことを示す。比較すると、ＧＮＡを有する二本鎖のＡＤ−７７４１２により、ＡＡＴを含む、３つの転写物のみについて転写物の下方制御がもたらされた。したがって、ＧＮＡヌクレオチドの取り込みにより、インビトロでＡＤ−６１４４４により下方制御された、観察されるオフターゲットの数が実質的に減少した。
【０５８７】
ＡＤ−７７４１２の効果を、非ヒト霊長類においても評価した。カニクイザルに、ＡＤ−６１４４４またはＡＤ−７７４１２のいずれかを、０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇの単回用量で皮下投与した。投与前と図３Ａ〜３Ｄに示される時点とに、循環ＡＡＴの定量化のため、血清を得た。ＡＡＴタンパク質レベルをサンドイッチＥＬＩＳＡにより測定し、データをＡＡＴタンパク質レベルのベースライン値に正規化した。
【０５８８】
図３Ａ〜３Ｄに示す通り、すべての用量のＡＤ−６１４４４およびＡＤ−７７４１２が、ＡＡＴの発現を、ほぼ最大レベルのサイレンシングで有効にサイレンシングした。
【０５８９】
要するに、これらのアッセイは、親分子ＡＤ−６１４４４のアンチセンスシード領域へのＧＮＡヌクレオチドの取り込みにより、親分子と比べて活性の低下がもたらされず、オフターゲット効果を有意に低減することを示す。
【図１】
2020500929.tif 000059
【図２】
2020500929.tif 000060
【図３】
2020500929.tif 000061
【配列表】
2020500929000001.app
【国際調査報告】
2020500929.tif 000062
2020500929.tif 000063