(57)【要約】本発明は、複数の微小試料（１）を光学的に検査する方法に関する。複数の試料（１）は、試料が流れ方向（２３）に沿って進行する少なくとも一つの流路（３）への流れによって、次々に供給され案内される。試料（１）を照明し、試料（１）から放出される光を検出して分析する。本発明はまた、方法を実施するための機器に関する。本発明によれば、光シート面（１９）を有する少なくとも１つの光シート（２２）が少なくとも１つの流路（３）上に向けられた状態で試料（１）が照明され、光シート（１９）は交差領域（２０）において少なくとも１つの流路（３）と交差するように配向され、光シート面（２１）の垂線（２２）は交差領域（２３）において流れ方向（２０）に対してヌルとは異なる角度を形成する。試料（１）から放出された光は、結像光学検出部（１０）により結像され、該光学検出部（１０）の焦点面は、交差領域（２０）にある。
2020535421.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多数の微小試料（１）を光学的に検査する方法であって、
複数の試料（１）は、前記多数の微小試料から供給され、流れによって少なくとも１つの流路（３）において連続して案内され、特定の流れ方向（２３）に沿って移動し、
前記複数の試料（１）は照明され、
前記複数の試料（１）から放出される光が検出されて分析される、前記方法において、
前記複数の試料（１）は、少なくとも１つの流路（３）上に向けられた光シート面（２２）を有する少なくとも１つの光シート（１９）によって照明され、前記光シート（１９）は、交差領域（２０）において前記流路（３）と交差するように位置付けられ、前記光シート面（２２）の垂線（２１）は、前記交差領域（２０）において前記流れ方向（２３）に対してゼロではない角度を含み、
前記複数の試料（１）から放出された光は、結像検出光学ユニット（１０）によって記録され、前記結像検出光学ユニット（１０）の焦点面は、前記交差領域（２０）にあることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記検出光学ユニット（１０）は、前記交差領域（２０）を流れる試料（１）のそれぞれについて、画像を検出するかまたは個々の画像からなる画像スタックを時間内に連続的に検出することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記画像スタックの個々の画像は、空間表現を形成するように組み合わされることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記複数の試料（１）は、検査前に蛍光マーカーで標識され、前記少なくとも１つの光シート（１９）によって励起されて複数の蛍光シグナルを放出し、前記複数の蛍光シグナルが検出されて分析されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記複数の試料（１）は、前記検出光学ユニットによって検出された光の分析に基づいて、場合によっては、複数の画像および複数の蛍光シグナルからの情報に基づいて、分類されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの光シート（１９）は、前記複数の試料の経時的な挙動を検査するために、複数の交差領域（２０）において前記少なくとも１つの流路（３）と複数回交差することを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つの光シート（１９）は、複数の流路（３）と交差することを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記複数の試料（１）は、複数の光シート（１９）、好ましくは異なる波長の複数の光シートによって照明されることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
複数の微小試料（１）を光学的に検査する機器であって、
前記複数の試料（１）を供給して少なくとも１つの流路（３）に連続的に送るチャネリング装置（２）であって、前記少なくとも１つの流路（３）において、前記複数の試料（１）は、特定の流れ方向に沿って移動する、前記チャネリング装置（２）と、
検出光を放出するために、前記少なくとも１つの流路（３）内の前記複数の試料（１）を照明する照明手段と、
前記複数の試料（１）から放出される検出光を検出する検出手段と、
前記検出光を分析する分析手段と、を備える前記機器において、
前記照明手段は、光シート面（２２）を有する少なくとも１つの光シート（１９）を生成する照明光学ユニット（９）を備え、前記光シート（１９）は、交差領域（２０）において前記流路（３）と交差するように前記流路（３）に対して位置合わせされ、前記光シート面（２２）の垂線（２１）は、前記交差領域（２３）において流れ方向（２０）に対してゼロではない角度を含み、これにより、前記複数の試料（１）は、前記交差領域（２０）において照明され、
前記検出手段は、結像検出光学ユニット（１０）を備え、該結像検出光学ユニット（１０）の焦点面は、前記交差領域（２０）にあることを特徴とする機器。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの流路（３）は、交換可能なチャネル担体（４）上に設けられていることを特徴とする請求項９に記載の機器。
【請求項１１】
前記チャネル担体（４）上には複数の平行流路（３）が配置されており、好ましくは、前記複数の平行流路は、互いに分離された供給ラインおよび排出ラインの少なくとも一方と、前記光シート（１９）との交差領域（２０）と、をそれぞれ有することを特徴とする請求項９または１０に記載の機器。
【請求項１２】
前記流れ方向（２３）に対して、前記光シート（１９）の下流側には分類ユニットが設けられ、前記光シート（１９）の上流側および下流側の少なくとも一方にはマニピュレーションユニットが設けられていることを特徴とする請求項９〜１１のいずれか一項に記載の機器。
【請求項１３】
前記照明手段は、蛍光マーカーで標識された複数の試料（１）を励起して複数の蛍光シグナルを放出させるために光を照射するように構成されることを特徴とする請求項９〜１２のいずれか一項に記載の機器。
【請求項１４】
前記検出手段は、前記複数の蛍光シグナルおよび迷光を検出するさらなる検出器を含むことを特徴とする請求項９〜１３のいずれか一項に記載の機器。
【請求項１５】
前記照明手段は、複数の光シート（１９）を生成する照明光学ユニット（９）又は複数の照明光学ユニット（９）を備え、前記複数の光シートの光シート面は、互いに平行であり、好ましくは、各光シートは異なる色を有することを特徴とする請求項９〜１４のいずれか一項に記載の機器。
【請求項１６】
前記少なくとも一つの流路（３）は、複数の交差領域（２０）を形成するために、前記流れ方向（２３）に沿って直径が変化するように構成されること、及び前記光シート（１９）の相対位置に対して蛇行するように構成されることのうちの少なくとも１つを特徴とする請求項９〜１５のいずれか一項に記載の機器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の微小試料、より具体的には、生物試料を光学的に検査し、より具体的にはマニピュレーションし、撮像し、分析するための光学的検査方法に関し、複数の微小試料は、多数の微小試料から供給され、流れによって少なくとも１つの流路に連続的に案内され、これら試料は、所定の流れ方向に沿って該流路内を移動する。複数の微小試料は流路内で照明され、該試料から放出される光が検出および分析される。本発明はまた、複数の微小試料を光学的に検査する機器に関し、機器は、特に前述の方法を実施するのに適している。このような機器は、複数の微小試料を供給し、それら試料を少なくとも１つの流路に連続的に送るチャネリング装置を備え、複数の微小試料は、例えば、ポンプおよび排出装置によって特定される特定の流れ方向に沿って移動する。機器は、さらに、検出光を放出させるために流路内の複数の試料を照明する照明手段を備え、さらにまた、該試料から放出される検出光を検出する検出手段と、検出光を分析する分析手段とを備える。
【背景技術】
【０００２】
過去５０年間、フローサイトメトリーは、細胞の種類と数に関する定量的な情報を取得するために、多数の細胞集団を検査するための最も重要な測定方法の１つとして確立された。このプロセスでは、複数の細胞は、本質的に個別に、比較的高速で、照明用の光ビームを通過するか、または試料マニピュレーションの手段、例えば電圧を通過する。細胞の構造、形状または染色などの細胞の特性に応じて、例えば蛍光マーカーを用いて、マニピュレーションによって、検出されかつ細胞の特性についての結論を引き出すことができる異なる結果がもたらされる。例えば、光ピンセットによる機械的または準機械的介入に加えて、マニピュレーションという用語は、外部介入による試料の特性の変化も意味するべきである。例えば、試料が蛍光マーカーで標識され、蛍光光を放出するために光ビームによって励起される場合に、光ビームは、試料をマニピュレーションすることができる。従来のフローサイトメトリーにおいてはシグナルのみが検出され、しかし、より正確な分析及び／又はより多様な分類のために望ましい二次元又は三次元の画像情報は収集できない。
【０００３】
フローサイトメトリーでは、複数の試料は、複数の微小試料を含む一群の試料から分離され、このことは、典型的には、チャンネリング装置によってキャリア流体中にあり、一般に、いわゆるシースフローを用いて、マイクロチャネルに導かれる個々の対象、例えば、個々の細胞を意味すると理解される。例として、分離は、マイクロチャネルへの漏斗状開口部によって行うことができ、これは、その直径について調節可能であり得る。最近マイクロ流体チップ上に全体的に搭載されているマイクロチャネルは、一般的に、典型的な寸法１μｍ〜３０μｍを有する細胞がそこに付着しないように大きく選択された直径を有するが、マイクロチャネルを通過する全ての細胞もマニピュレーション媒体、例えば、レーザービームによって取得されるように小さく選択され、ただし、レーザービームとの交差線上のチャネル内に流体集束が存在しないことを条件とする。レーザービームの周波数が蛍光マーカーに一致する場合、マーカーで標識された試料は、レーザービームを通過するときに励起されて蛍光シグナルを放出し、蛍光シグナルは、レーザービームと流路との間の交差領域に位置合わせされた検出器によって記録される。定量分析には結像光学ユニットによる結像は必要ないので、原則として簡易な光検出器で十分である。蛍光マーカーで標識されていないか、または蛍光に加えて標識されていない試料については、複数の試料の散乱光を異なる方向に位置付けることができる。
【０００４】
検出された複数の測定値は分析ユニットで評価され、分析された各細胞に関する定量的情報が得られる。毎秒分析することができる試料の数は１０４のオーダーであり、従って、個々の試料、例えば、多数の試料において生じる細胞集団についての代表的な情報は、非常に短い時間内に得られる。ここでは、各々が異なる波長で光を照射する複数のレーザーは、流路に位置されかつ対応する検出器に結合されて、多数の異なる試料の分析を可能にすることができる。散乱光の分析もまた、蛍光シグナルの分析に加えて選択できる。
【０００５】
分類装置による分類は、フローサイトメトリー測定に続くことができる。複数の試料は、分析結果に基づいて異なるチャネルに分類される。これが分析の前にまだ行われていない場合には、複数の試料は、例えば、蛍光のための励起の場合には励起手段とも呼称される照明手段の流れ方向における下流に配置され、通常単一の細胞のみを含有する複数の小液滴に液体の流れを分割する振動器を用いて分離され、これに続いて静電分類が行われる。分類メカニズムを含むフローサイトメトリー法の概要は、例えば、非特許文献１の記事において与えられる。
【０００６】
これらの方法では高い試料スループットを達成することができるが、これらの速度ではフォーカシングを行うことができないので、一般に結像が実行されない。一つの解決策は、固定焦点距離および小さな開口を有する光学ユニットの使用にあり、被写界深度が深くなるが、イメージが暗くなる。この欠点は、特別な画像処理によって少なくとも部分的に補償される。しかしながら、このいわゆる「被写界深度の拡張」（Extended-Depth-of-Field : EDOF）アプローチは、技術的複雑性を増大させ、つまりコストを増大させ、画像において達成可能な解像度は、小さい開口のために低い。複合イメージングを備えたフローサイトメーターは、たとえば、Merck KGaAのImageStreamX Mark IIイメージングフローサイトメーターである。
【０００７】
現代のフローサイトメーターは、しばしば「ラボオンチップ（Lab-On-Chip）」アプローチを使用し、これは、流入および流出を有する複数の微細構造チャネルを備えた特別な試料キャリアを使用するマイクロ流体システムに関する。複数の微細構造チャネルは、用途に応じて異なる実施形態を有し得る。一例として、複数の微細構造チャネルは、複数の反応を生成するために交差することができ、単純なフローサイトメトリー分析には、単純なチャネルで十分である。複数のチャネル担体とも呼称される複数の微細構造チャネルを有する複数の試料キャリアは、対応する試料ホルダ上に配置されるかまたは複数のチャネルが倒立顕微鏡によって観察されるように倒立顕微鏡の試料ステージ上に配置され、例えば、非特許文献２の記事に記載されている。観察は主に共焦点であるため、狭い複数の領域に限定される。
【０００８】
さらに、複数の生物試料を検査するための光シート顕微鏡法および機器が、従来技術において現在確立されている。この場合、複数の試料は、光シートによって、つまり、光シート面の実質的には１つの面内でのみ照明される。光シートは、原則として検出対物レンズの光軸に対応する検出方向において、ゼロではない角度、通常は直角を含む。ＳＰＩＭ（selective plane illumination microscopy：選択的平面照明顕微鏡）と呼称されるこの技術を用いて、比較的厚い複数の試料でも比較的短時間で空間記録を行うことができる。光シート顕微鏡法を使用すると、断面に垂直な方向における試料の相対的な移動と組み合わされた複数の光学断面に基づく複数の試料の視覚的、空間的に拡張された表現が可能である。
【０００９】
ＳＰＩＭ技術は、ＬＳＦＭ（Light Sheet Fluorescence Microscopy：光シート蛍光顕微鏡）と呼称される蛍光顕微鏡で使用されることが好ましい。ＬＳＦＭ技術は、共焦点レーザー走査顕微鏡又は二光子顕微鏡など、他の確立された方法よりも多くの利点を有する。広い領域で検出できるため、比較的大きな試料領域がより迅速に捕捉され得る。分解能は共焦点レーザー走査顕微鏡よりもわずかに低いが、静的試料の場合には侵入深さが大きいため、ＬＳＦＭ法を用いてより厚い試料が分析され得る。さらに、この方法は、複数の試料の露光量が最も低く、試料が検出方向に対してゼロではない角度で薄い光シートによってのみ照明されるので、退色のリスク、特に試料への光損傷のリスクを低減する。
【００１０】
光シートは、例えば複数のシリンドリカルレンズを用いて静的に生成されるか、または試料が光ビームによって１つの平面内で迅速に走査されることによって準静的に生成され得る。光シート型の照明は、光ビームが観察中の試料に対して非常に速い相対移動を行い、それが一列に並ぶように時間的に連続して複数回繰り返される。光シートを成形するための様々な方法があり、例えば、特許文献１の場合のように、いわゆるｓｉｎｃ３光シート、マシュー（Mathieu）光線又はベッセル光線に基づいて生成された光シート、又は格子を用いて生成された光シートを使用することができる。
【００１１】
準静的光シートを用いる場合、試料が最終的に撮像されるセンサの接続されたカメラの積分時間（Integrationszeit）は、走査が積分時間内に完了するように選択される。また、二次元センサを備えたカメラの代わりに、ラインセンサが、検出光学ユニットにおける新たな走査と組み合わせて用いられ得る。ＳＰＩＭ技術は、現在、文献、例えば、特許文献２およびそれに基づく特許文献３において、または非特許文献３において、広く記載されている。特許文献４および特許文献５は、照明対物レンズと検出対物レンズとが互いに垂直であり、各々が４５°の角度で上方から試料に向けられる構造を記載している。次に、試料は、例えばペトリ皿にある。例えば、特許文献６、特許文献７、特許文献８または特許文献９から、倒立光シート顕微鏡配置（inverse lichtblattmikroskopische Anordnungen）も従来技術において知られている。倒立配置の光シート顕微鏡では、光が試料キャリアを斜めに通過するため、文献に開示されているように、この斜めの光通過による収差を補正素子で補正するために、補正素子を用いる必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１３／２８６１８１号明細書
【特許文献２】独国特許出願公開第１０２５７４２３号明細書
【特許文献３】国際公開第２００４／０５３５５８号
【特許文献４】国際公開第２０１２／１１０４８８号
【特許文献５】国際公開第２０１２／１２２０２７号
【特許文献６】独国特許出願公開第１０２０１３１０７２９７号明細書
【特許文献７】独国特許出願公開第１０２０１３１０７２９８号明細書
【特許文献８】独国特許出願公開第１０２０１３１１２５９６号明細書
【特許文献９】独国特許出願公開第１０２０１３１１２６００号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】C. W. Shields IV等著、「マイクロフルーディックセルソーティング：デブルキングから希少細胞分離までの細胞分離の進歩のレビュー（Microfluidic Cell Sorting: A Review of the Advances in the Separation of Cells from Debulking to Rare Cell Isolation)」、Lab Chip. 15(5)、２０１５年、１２３０−１２４９頁
【非特許文献２】F.-U. Gast等著、「微小細胞（MicCell）、細胞生物学、生体材料研究、ナノテクノロジー向けの多用途のモジュール式フロースルーシステム（The microscopy cell (MicCell), a versatile modular flowthrough System for cell biology, biomaterial research, and nanotechnology）」、Microfluid Na- nofluid 2、２００６年、２１−３６頁
【非特許文献３】J.Huisken等著、「発生生物学における選択的平面照明顕微鏡技術（Selective Plane Illumination Microscopy Techni- ques in Developmental Biology）」、雑誌Development、２００９年、１３６号、１９６３頁以降
【発明の概要】
【００１４】
本発明の目的は、第１に、従来技術で知られているフローサイトメトリー法および機器と比較して、感度および柔軟性が増大し、第２に、最も詳細な画像情報が同時に利用可能になるように、冒頭に説明されるタイプの方法および装置を開発することである。
【００１５】
冒頭に説明されるタイプの方法では、この目的は、少なくとも１つの流路上に向けられる少なくとも１つの光シート面を有する少なくとも１つの光シートによって照明される複数の試料によって達成され、光シートは、交差領域内の少なくとも１つの流路と交差するように配置され、光シート面の垂線は、交差領域内の流れ方向に対してゼロではない角度を含む。試料から放出された光は、結像検出光学ユニット、すなわち、焦点面が交差領域にある領域を結像して検出する検出光学ユニットによって記録される。
【００１６】
例として、放出される光は、散乱光または反射光であり、この場合、複数の試料は、この目的のために励起されることなく受動的に発光する。特に好ましくは、この方法は、検査前に複数の蛍光マーカーで標識された複数の試料にも使用でき、これにより、例えば複数の細胞の識別が容易になる。複数の試料は少なくとも１つの光シートによって励起されて複数の蛍光シグナルを放出し、複数の蛍光シグナルは、検出光学ユニットによって記録される。この場合、複数の試料は、動的に発光する。
【００１７】
したがって、複数の蛍光マーカーを備えた複数の試料の照明または励起は、この場合、単純なレーザービームによって実行されるのではなく、交差領域内の少なくとも１つの流路と交差するように配向されたレーザー光によって同様に生成された光シートを用いて行われる。交差領域という用語は、理想的な光シートの場合、光シート面の垂線方向に沿った厚さが微小であり、交差領域は、流路の体積を通る光シートの断面からの光シート面内の２次元交差領域であり、交差領域はチャネル端部によって区画されるように理解すべきである。しかし、実際には、光シートは光シート面の垂線に沿って有限の範囲を有し、光シートの厚さの上限は５μｍ〜３０μｍであり、これは、光シート面における範囲よりもかなり小さいが、交差領域が、これらの値を含めて、最良の焦点合わせの領域における光シート面の垂線に沿った厚さが約０．４μｍ〜３μｍである交差体積であることを確実にする。光シートの使用の実質的な利点は、適切な焦点合わせの場合、その面積の範囲にあり、それは同時に複数のチャネルの分析を可能にし、例えば、並列に配置された複数の流路を有する複数のチャネル担体を使用すべきである。
【００１８】
原理的には、照明目的のために、特に、定量分析のみが必要な場合には、複数の蛍光シグナルを生成するために、光シートが、流れ方向に対して垂直に位置合わされ、複数の蛍光シグナルは、例えば、複数の光検出器によって、すなわち、結像検出光学ユニットなしで、通常の方法で検出および分析することができ、単一のレーザービームの使用と比較して、複数の流路を同時に分析することが有利である。次に、光シートのみがＳＰＩＭ構成から取得され、結像検出光学ユニット、すなわち、画像生成検出光学ユニットは不要である。
【００１９】
しかしながら、本発明の特に有利な態様は、光シートの傾斜配置を含み、これは、光シート面の垂線が流れ方向に対してゼロではない角度を含むことを意味すると理解される。ほぼ管状の流路の流れ方向は、流路の長手方向に沿って、すなわち、断面に垂直に向けられており、流路を通る流れ方向にも依存する。流れ方向、特に流速の絶対値は、例えば、適切なポンプ装置を使用して、外部から制御され得る。
【００２０】
ゼロではない角度は、光シート顕微鏡で通常使用されるような検出光学ユニットの使用、および焦点面が交差領域内にあるような方法、理想的には光シート面内に直接的にまたはそれに少なくとも平行であるような方法でのその位置決めを可能にし、流路の全体の斜め断面が、焦点面内の交差領域内にある。流路の断面全体が捕捉されるので、比較的大きな複数のチャネルを使用することもでき、すなわち、チャネルサイズは、試料サイズとは無関係に選択され得る。このことは、交差領域における光シート顕微鏡に典型的な試料の断面画像のスナップショット、すなわち、交差領域を通過する試料の二次元画像の記録を可能にする。流路の大きなまたは全体の斜めの断面をカバーすることに加えて、マイクロ流体内の流れ方向に対する光シートの斜めの位置合わせは、有利には、高い開口数および短い作動距離で対物レンズの使用を可能にする。検出光学ユニットは、画像の生成のためだけでなく、フローサイトメトリー検査で行われるように、定量分析のための蛍光シグナルの記録のためにも使用することができ、追加の検出装置は必要ない。このように、結像検出光学ユニットは、複数の蛍光シグナルを記録するだけでなく、焦点面の交差領域を通過する試料を少なくともスナップショットで対応する領域センサに結像させるので、試料が交差領域を通過する際に、試料の少なくとも１つの２次元の記録を生成することができる。
【００２１】
流れの方向に対して光シートが斜めになっているため、スナップショットでも試料全体の断面画像が取得される。ただし、流速と流れ方向に関連して、交差領域を流れる複数の試料の個々の画像の画像スタックは時間内に連続して記録され、次に、画像スタックの個々の画像は、任意選択的に組み合わせされて空間表現を形成することができる。
【００２２】
さらに、検出光学ユニットは、さらなる手段なしで常に光シート面または交差領域の面に焦点を合わせられ、したがって、たとえば、被写界深度（ＥＤＯＦ）を増大させるための追加の手段を省略することができる。レーザービームを使用したフローサイトメトリーでは、原則としてレーザービームは流路の一部分のみをカバーし、複数の粒子は適切なフローフォーカシングによってこの部分に焦点を合わせる必要があるが、光シートは原則として断面または交差領域内の流路全体、または少なくともその大部分をカバーして、この場合、粒子の焦点合わせは省略することができる。したがって、原則として、撮像のために、比較的断面積の大きい流路では、スナップショットの交差領域に同時に位置されている複数の試料（特に、複数の細胞）をマニピュレーションおよび分析することも可能である。従来のフローサイトメトリーとは対照的に、励起レーザービームは、流路の直径を焦点合わせされたレーザービームの直径まで小さくすることができないため、その場合、粒子の焦点合わせを必要にするようにする最大信号を生成するように焦点合わされる必要がない。
【００２３】
フローサイトメトリーにおける結像は、結像のための小さな開口の使用を必要とする拡大された被写界深度アプローチ（ＥＤＯＦアプローチ）で使用される場合にのみ従来技術で可能であるが、照明および検出目的のために光シート顕微鏡構成を使用する場合には、そのような手段は不要である。検出対物レンズは、光シート面に焦点合わせされ、被写界深度は、光シート面の垂線方向に沿った交差領域の厚さに対応し、試料の範囲よりも実質的に小さい。このため、検出光学ユニットの開口角が大きい対物レンズを用いることができ、原理的には対物レンズの開口角に応じて大きくなる高分解能が得られる。浸漬媒体を使用することによって、対物レンズの開口数をさらに増加させ、分解能をさらに増加させることができる。
【００２４】
この方法は、コントラストを増加させるために、マスク照明または軸外照明（斜め照明）の方法と組み合わせることができる。この場合、軸外照明は、例えば異なる色で照明対物レンズに結合され、代替的には、別の対物レンズが用いられ得る。試料のコントラスト記録がこのようにして作成され、その目的のために、照明および検出のためにスペクトル的に分離したチャネルが使用される。画像データは、より高いコントラストで試料の全体画像に組み合わされ得る。
【００２５】
これらのシグナルに基づく複数の蛍光シグナルの分析後に、複数の試料は、先行技術から公知の測定値を用いて分類され得る。
光シートは、マイクロ流体のための流路の直径よりも実質的に大きな面積をカバーすることができるので、多数の流路と交差するように光シートを位置合わせすることが容易にできる。このことは、スループットを実質的に増加させることを可能にし、フローサイトメトリーおよび画像分析のためのプロセスの効率の向上をもたらす。
【００２６】
さらに、複数の試料は、複数の光シートによって照明され、複数の光シート面は、好ましくは、互いに平行である。ここで、流れ方向に沿って同様の複数の光シートを連続して配置することができ、試料群から分離された試料である同一の対象物を繰り返し観察することが可能となる。異なるスペクトル特性を有する複数の光シートは、例えば、多色励起を観察するために使用され得る。これらの光シートは互いに重ねられて、同時に多色励起が行われる。同様の又は異なる光シートを連続して配置することにより、経時的な光マニピュレーションの観察も可能になる。一例として、第１の光シートは、試料の反応に導くマニピュレーションを実施することができる。第２の光シートは、第１の特性を観察するために使用され、必要であれば、さらなる光シートを使用して、さらに別の特性を観察することができ、これらを重ねることもできる。試料が第１の光シートと第２の光シートとの間の距離を移動するのに必要な時間は、例えば、複数のバルブを用いて流速を設定することによって設定されることができる。
【００２７】
検査される特性のタイプに応じて、第２の光シートおよび任意選択的にさらに別の光シートは、互いに重ねられるか、または流れ方向においてそれらの間に距離を空けて配置され得る。第１の光シートと第２の光シートとの間には空間的な距離が存在する。少なくとも１つの流路の適切な構成の場合、光シートが複数の交差領域において少なくとも１つの流路と複数回交差することも可能であり、これにより、試料の経時的な挙動を検査することができる。例として、これは、複数の蛇行流路によって達成することができ、複数の流路の円弧状配置も考えられる。
【００２８】
多数の流路が使用される場合、特別なフィルタ構成または勾配放出フィルタ（Verlaufs-Emissionsfilter）を使用することによって、個々のスペクトル特性を並列チャネルまたは１群のチャネルのそれぞれにさらに割り当てることができる。
【００２９】
また、本発明の目的は、光の面を有する少なくとも１枚の光シートを生成する照明光学ユニットを備えた照明手段によって、冒頭に説明したタイプの装置において達成され、光シートは、交差領域において流路と交差するように流路に対して位置合わせされ、光シート面の垂線は、交差領域において流れ方向に対してゼロではない角度を含み、その結果、複数の試料が交差領域において照明される。検出手段は、結像検出光学ユニットを含み、結像検出光学ユニットの焦点面が、交差領域にある。
【００３０】
機器の特徴に関する説明は、これらの特徴に関して対応する方法に同様に適用可能であり、一方、方法の特徴は、説明される装置の機能的特徴を対応して示す。
好適には、照明手段は、複数の蛍光マーカーで標識された複数の試料を励起するために、特定の波長または波長範囲で光を放出するように具体化され、この場合、複数の試料は、蛍光シグナルを放出する。そして、複数の蛍光シグナルは、結像検出光学ユニットによって検出され得る。しかしながら、検出手段は、さらに別の検出器、例えば、単純な光検出器を含むこともでき、この検出器によって、定量分析に注目している場合には、蛍光シグナルおよび／または散乱光を検出することができる。
【００３１】
本発明による装置において、少なくとも１つの流路は、有利には、交換可能なチャネル担体、例えば、マイクロ流体チップ上に具体化される。このことは、異なる試料および分析プロセスへの対象とする適応を可能にする。一例として、光シートと交差する多数の平行流路は、チャネル担体上に配置され、すなわち、各流路は、光シートと交差する領域を有する。このことは、並列化のために複数の試料のより高いスループットを可能にし、特に、多数の試料が分析されるべきであり、焦点が画像表現にない場合に使用され、しかし、後者は同様に、領域検出器を用いて容易に積分され得る。検出光学ユニットおよびそれに接続されたカメラを用いて、検出器上の特定の領域は、カメラの領域検出器上の複数の特定のチャネルに一意的に割り当てられ、その結果、各フローチャネルは別々に評価され得る。定量的な分析のみが重要な場合、チャネル担体に関するすべての流路は、共通の供給ラインおよび共通の排出ラインを有することができる。しかしながら、実施される分析に応じて、各チャネルまたは複数のグループへの組み合わせに対して専用の供給および／または排出ラインを設けることも可能である。
【００３２】
分類ユニットは、少なくとも１つの流路において光シートの流れ方向の下流に配置され、該分類ユニットは、分析の結果に応じて、複数の試料を流路に隣接する複数の分岐チャネルのうちの１つに案内する。この分類は、従来技術から知られているプロセスを用いて、例えば、光学的、音響的または電気泳動的に実施され得る。
【００３３】
標識またはマニピュレーションされた複数の試料の挙動を経時的に観察するためには、試料を複数回観察しなければならない。したがって、照明手段は、本発明の好適な構成において、複数の光シートを生成するための照明光学ユニットまたは複数の照明光学ユニットを含む。複数の光シートは、複数の光シート面で互いに平行に配置される。実験の種類に応じて、複数の照明光学ユニットは、それぞれ異なる色の光シートまたは同じ色の光シートを生成する。多色の光シートは、少なくとも１つの流路で複数の励起を生成するために一致させることもできる。そうでなければ、第１の光シートと少なくとも１つの流路との交差領域においてマニピュレーションが実行され、例えば、第２の光シートで観察される反応が生成されるかまたは蛍光が励起される。特に好ましい構成では、複数の光シートは、同じ照明光学ユニットによって生成される。２つの光シートの場合、これは、たとえば、平行に配置された２つの光シート面を切り替える制御されたスキャナを使用して具体化され得る。ここでは、スキャナは、コントローラを介して、切り替えプロセスにおいて光シートがオフに切り替えられるようにする切り替え装置に接続される。
【００３４】
代替として、またはそれに加えて、流路は、例えば、蛇行の実施形態を有する少なくとも１つの流路によって具体化され得る光シートとの複数の交差領域を形成するように、チャネル担体上に具体化され得る。この場合、光シートのスペクトル範囲が励起および検出に等しく適していれば、１つの光シートのみが、経時的に反応のシーケンスを観察するために必要とされ、そうでなければ、異なる色の複数の光シートが重ねられる。
【００３５】
別の構成では、流路は、流れ方向に沿って変化する直径で具体化され、変形の目的の範囲内での複数の試料の機械的マニピュレーションを可能にする。そして、試料は、例えば、変形前に１回、変形状態において１回観察され、その目的のために、流れ方向が変化しない場合には２つの光シートが用いられ、流路の蛇行実施形態のように、流れ方向が上位座標系（uebergeordnetes Koordinatensystem）に対して変化するように少なくとも１つの流路が具体化される場合には１つの光シートが用いられる。
【００３６】
有利には、少なくとも１つの流路内の流速の絶対値は、速度制御装置によって可変に設定され、実験条件に適応させることもできる。速度は、たとえば、供給ラインおよび／または排出ラインの複数のバルブを用いて調整され得る。
【００３７】
強度輸送方程式（Transport of Intensity Equation : TIE）などのいわゆる位相回復アルゴリズムが用いられて、例えば、画像スタックが対象内の異なる位置の少なくとも３つの画像から生成される場合に、検出された光に関する位相情報を決定する。試料、すなわち対象は、検出光学ユニットの焦点面を通る流れと共に移動するので、試料または対物レンズが光軸に沿って変位しなければならない従来の顕微鏡法とは対照的に、少なくとも３つの画像だけが、適切な時間間隔で取得されなければならない。さらに、この機器は、例えば、垂直入射光学顕微鏡またはさらなる光シート顕微鏡構成などの他の検出デバイスおよびカメラと組み合わせることができる。
【００３８】
なお、本発明の範囲を逸脱しない範囲で、上述した特徴及び後述する特徴は、特定の組み合わせだけでなく、他の組み合わせや単独でも用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
本発明は、例えば、本発明に不可欠な特徴も開示する添付の図面を参照して、以下により詳細に説明される。
【図１】多数の試料を光学的にマニピュレーションする装置の概略構造を示す。
【図２】チャネル担体の詳細および光シートの相対位置を示す。
【図３】そのような装置の第２の構成を示す。
【図４】そのような装置の第３の構成を示す。
【図５】チャネル担体の構成を示す。
【図６】チャネル担体の第２の構成を示す。
【図７】チャネル担体の第３の構成を示す。
【図８ａ−８ｂ】チャネル担体のさらなる２つの構成を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
まず、図１は、複数の蛍光マーカーで標識された多数の生物試料１の光マニピュレーション（optischen Manipulation）のための装置の基本構造を示す。複数の試料１は、概して、例えば組織試料からの多数の異なる細胞からのキャリア液体中の一群の試料中にあり、最初に準備され、すなわち、蛍光マーカーで標識され、次いで、チャネリング装置２に供給され、ここで、複数の試料１は、少なくとも１つの流路３に案内され供給される。分離装置とも呼称されるチャネリング装置２は、例えば、流路３の方向に漏斗状の開口部を有することができ、この開口部は、複数の試料が個別にしか通過できないような寸法になっている。これは、流体測定によって補助することができ、有利には、開口部の直径も変化させることができる。典型的な試料は、概して、１μｍ〜３０μｍのサイズを有する細胞であり、少なくとも１つの流路３の直径は、概して、管状形状であり、これらの細胞サイズに適合しており、多くの場合、検査される試料１の最大直径よりわずかに大きいだけであり、後者が流路３を詰まらせないようにする。ここでは、例えば４０μｍ以上の比較的大きな直径を有する流路３は、例えば５μｍ未満の直径を有する比較的小さな試料に対しても、試料１が可能な限り連続して少なくとも１つの流路３に入ることを確実にするための適切な手段が講じられるならば、使用することができ、一例として、これは、チャネリング部２から流路３への移動時における可変サイズの入口開口部によって達成することができる。しかしながら、以下により詳細に説明される特定の照明および検出のために、複数の試料１が同時にまたは隣接して流路３に位置していても問題はない。さらに、少なくとも１つの流路３は、流れ方向２３で示される流れを生成する役割を有するポンプ装置（ここでは図示せず）にも結合される。適切な制御とバルブの利用によって、実行される分析に応じて、流速および／または流れの方向を変えることができる。
【００４１】
少なくとも１つの流路３は、例えば、マイクロ流体チップ（Mikrofluidik-Chip）であり得るチャネル担体（Kanaltraeger）４の上または中に具体化される。そのようなマイクロ流体チップは、対象とされる方法で多数の分析および／または実験用に構成または製造され、したがって、チャネル担体４は交換可能であることが好ましい。流路３は、管路５を介してチャネリング装置２に結合され、試料１を排出するための管路５は、チャネル担体４の流路３の他端に取り付けられ、その後、必要に応じて、複数の試料を分類したり、さらなる分析や実験に送ったり、あるいは廃棄したりすることもできる。
【００４２】
チャネル担体４は、３つの空間方向すべてに変位可能であり、その目的のために、チャネル担体４は、対応して変位可能な試料ステージ６上に配置され、試料ステージ６の支持面７によって画定される平面内で試料ステージをさらに回転可能である。少なくとも１つの流路３内の流れ方向２３は、この平面内、少なくとも分析が行われる領域内にある。
【００４３】
複数の試料１は、少なくとも１つの流路３内の供給ラインと排出ラインとの間の平均流速で流れ方向２３に沿って移動し、複数の試料１がまた、速度が操作されるときに短時間の間所定の位置に留まることを妨げない。管状断面を有する流路３の場合、流れ方向２３は、流路に沿って、すなわち、いずれの場合も管状流路の長手軸に平行である。
【００４４】
分析を実行するために、機器は、複数の試料１を照明するために使用される照明手段を有し、照明手段は、この場合、蛍光シグナル（Fluoreszenzsignale）を放出するために少なくとも１つの流路３内の複数の試料１を励起する励起手段として構成されることが好ましい。複数の試料は検出シグナルを放出し、これは、散乱光の形式で受動的に行うことも、放出される蛍光シグナルの形式で能動的に行うこともできる。検出光は、機器の一部分でもある検出手段によって検出される。機器はさらに、例えば、検出された蛍光シグナルなどの検出された検出光を分析するための分析手段を有する。ここでは、これは、例えば、モニターなどの出力ユニットを備えた評価ユニットとして適切にプログラムされたコンピューターであり得る。
【００４５】
図１に示される機器において、照明または励起手段および検出手段は、ここでは倒立構成（inversen Konfiguration）で示される光シート顕微鏡８によって具体化される。このような倒立構成は、試料ステージ６の上の構造が、たとえば複数の管路５とそれに接続されている装置のために必要なスペースが大きすぎる場合に役立ち、ただし、これは必須ではなく、チャネル担体４の上に光シート顕微鏡を配置することも考えられる。ここに示される光シート顕微鏡８は、照明光学ユニット９と検出光学ユニット１０とを備えている。照明光学ユニット９は、図１の左側に示されている。レーザーモジュール１１からの光、例えば、異なる波長を有する複数のレーザーをここで提供することができ、異なる波長間で選択を行うことができ、複数の波長を同時に選択することも可能であり、ビーム成形モジュール１２及び走査モジュール１３を用いて、例えば、準静的光シートを生成し及び／又は角度を設定するために使用され、照明対物レンズ１４に導かれ、照明対物レンズ１４は、この場合、照明対物レンズの光軸に対応する光シート面内の光シートをチャネル担体４及び流路３内に結像する。照明対物レンズ１４の焦点、すなわち、光シートが最も薄い範囲を有する点は、駆動部を用いて、例えば、ピエゾ駆動部（Piezoantriebs）１５を用いて制御され、例えば、一つの流路だけが使用される場合には、焦点は流路内にある。代替として、またはそれに加えて、試料ステージ６は調整され得る。
【００４６】
例示的な検出光学ユニット１０は右側に示されており、後者は検出対物レンズ１６で構成されており、この対物レンズ１６は駆動部によって照明対物レンズ１４と同様に調整され、この場合は同様にピエゾ駆動部１７によって調整される。検出対物レンズ１６の光軸は、照明対物レンズ１４の光軸がある光シート面に対してゼロではない角を含み、この場合は直角を含む。ただし、これは必須ではない。この方法が機能するためには、光シートの面と検出対物レンズ１６の光軸との間のゼロではない角度があれば十分である。しかしながら、前記対物レンズの２つの光軸を互いに対して９０°の角度で配置することは、検出対物レンズ１６の焦点面が光シート面と同一であるという利点を提供し、従って、光シート面の全ての領域、すなわち、この場合、流路３を通る斜め断面の全体は、その領域が検出物体レンズ１６によって捕捉されるならば、焦点を合わせて結像され得る。試料１から放出された検出光、例えば適切な励起に続いて後者から放出された蛍光光は、検出対物レンズ１６によって検出モジュール１８上に導かれ、ここでは、複数の検出モジュールは、複数のビームスプリッタを用いて使用され得る。試料が複数の波長を含む光シートによって同時にまたは準同時に照明される場合、検出は、例えば、異なる波長に従って実行され得る。原則として、検出モジュール１８は、強度および適用可能な場合には色を記録し、これを対応する電気信号に変換する面検出器を含み、次いで、電気信号は分析ユニットおよび画像処理ユニットに送られ、そこで処理される。
【００４７】
図２に、チャネル担体４の詳細を示す。少なくとも１つの流路３は、チャネル担体４、例えばマイクロ流体チップに組み込まれており、ここでは、概して、これは、互いに平行な２つの大きな表面、及び２つの大きな表面を接続する複数の端面を有する透明な板状本体である。少なくとも１つの流路３は、透明な板状本体の２つの側面で開口している空洞として具体化されている。図示される機器では、光シート１９は、交差領域２０内の少なくとも１つの流路３と交差し、光シート面２２の垂線２１が、交差領域２０内の流れ方向２３に対してゼロではない角度を含むように位置合わされ、例として、ここでは、試料１は励起されて、交差領域２０において蛍光シグナルを放出する。交差領域２０と照明対物レンズ１４との間、および交差領域と検出対物レンズ１６との間には、チャネル担体４の透明物質が存在し、選択された配置により、検出対物レンズ１６および照明対物レンズ１４の光軸は、チャネル担体４と流路３との間の界面、およびチャネル担体４の下側とその下に位置する媒体との間の界面に対して直角ではなく斜めに位置合わされる。これにより、複数の収差が生じる。これらの収差を補正するために、光シート顕微鏡８は、図１に例示的に示すように、個々に又は組み合わせて使用することができる種々の補正手段を有することができる。例として、いわゆる「仮想リレー（virtuelle Relays）」と呼ばれる特別な複数のレンズを対物レンズの上流に配置することができる。前記仮想リレーは、複数の自由形状レンズ（Freiform linsen）であり、チャネル担体４の所与の厚さ、この場合、流路３と基部との間、すなわち、チャネル担体４の下側のために、および自由形状レンズとチャネル担体との間に位置する所与の媒体、例えば、空気または浸漬媒体のために収差を補正するように構成されている。浸漬媒体に起因する収差は、複数のメニスカスレンズを用いて補正され、複数の浸漬媒体に対する補正は、その構成に応じて単一のメニスカスレンズによっても行うことができる。しかしながら、チャネル担体４の下側と流路３との間の光の斜め通過による収差は、メニスカスレンズによって補正することはできない。最後に、複数の波面マニピュレータ（Wellenfrontmanipulatoren）、いわゆるアルバレス板（Alvarez-Platten）は、両方のタイプの収差を補正するために使用され得る。たとえば、仮想リレーの厚さ範囲は、複数の波面マニピュレータ（Wellenfrontmanipulatoren）を使用して拡張され得る。
【００４８】
第１に、ここに示される構成では、それぞれの波面マニピュレータ２４（調整可能な波面マニピュレータ）が、照明対物レンズ１４および検出対物レンズ１６内に配置される。第２に、光シート顕微鏡８の対物レンズとチャネル担体４との間に仮想リレー２５があり、この仮想リレーは、ここでは１つのレンズとして示されているが、複数のレンズを含むこともできる。例として、媒体としての空気２６または浸漬液２７は、仮想リレー２５とチャネル担体４の下側との間に位置している。補正手段（仮想リレー２５またはメニスカスレンズ２８および複数の波面マニピュレータ２４）は、必要に応じて、チャネル担体４の下側に位置する媒体に応じて、組み合わせてまたは個別に使用され得る。さらに、前記対物レンズに組み込まれたさらなる補助レンズまたは自由形状レンズなどのさらなる補正機構も当然使用できる。
【００４９】
図２に示されるように流れ方向２３に沿って少なくとも１つの流路３内を移動する試料１は、それに応じて予め標識されている場合には、交差領域２０の光シート１９によって励起されて蛍光を放出する。交差領域１９は、光シートが最大焦点の領域において光シート面に垂直な有限の範囲を有するが、その範囲は、前記面内の光シートの範囲よりもはるかに小さく、それに関連して無視することができる。ただし、わかりやすくするために、ここでは交差領域をやや拡大して示している。複数の蛍光シグナルは、従来技術でも一般的であるように、検出光学ユニット１０によって検出され、分析手段（図示せず）により定量的に評価される。しかしながら、複数の蛍光シグナルに加えて試料１の完全な画像を記録することもでき、さらにまた、試料１は、流速に応じて、概して光シート面２２に対応する検出対物レンズ１６の焦点面を通過して流れ方向２３に沿って移動するので、複数の部品を機械的に移動させることなく画像スタックを記録することができる。記録された画像データ、例えば、形状、形態、空間構造は、ここでは従来技術で可能であるよりも高い解像度で利用可能であり、さらなる分析のために使用することができ、また、適用可能であれば、蛍光に加えてさらなるパラメータに基づいて複数の試料の対応する分類のためにも使用することができる。試料に対する個別の焦点合わせは必要ない。光シート１９が流路３の断面を覆っているので、複数の試料を流路３に流体的に集中させる必要もない。このことは、特に空間イメージングが使用される場合、比較的大きな複数の流路３でも使用でき、より高い細胞密度を測定できるという利点を有する。
【００５０】
この機器は、さらなる検出装置と組み合わせることができ、そのための複数の例が図３，４に示される。ここでは簡略化され示された光シート顕微鏡８に加えて、図３は、カメラ３０に接続された従来のように配置された顕微鏡対物レンズ２９を示す。流路３または透明な板状チャネル担体４に関して、それは、この場合、斜めの光入射によって生じる収差の補正が必要ないように、複数の界面に対して垂直に配向されるように配置される。低解像度の二次元画像は、このようにして、ビーム経路に導入され且つビーム経路から除去され得る被写界深度を増大させるための要素（ＥＤＯＦ要素）３１を用いて生成され得る。図４は、倒立光シート顕微鏡８に加えて、流路３の上に配置されたさらなる光シート顕微鏡３２を示しており、複数の光シートが交差している。同じ構成を両方の光シート顕微鏡８、３２に使用できるが、しかし、異なる構成がすべての手段で使用することができる。この場合、複数の補正手段及び対物レンズと流路３との間の媒体は異なる。複数の光シート１９は異なる色を有することができ、さまざまな方法で生成され得る。一例として、複数のシリンドリカルレンズを用いて生成される複数の静的光シートを用いることができ、または他の形状に基づく複数の光シート、いわゆるｓｉｎｃ３光シート、マシュー（Ｍａｔｈｉｅｕ）光線又はベッセル光線に基づいて生成された光シート、又は格子を用いて生成された格子光シートを用いることができる。
【００５１】
広い光シート照明での使用に特に適しているさまざまなチャネル担体またはマイクロ流体チップを以下に説明する。このようなチャネル担体は図５〜８に例示されている。
面の光シートは、複数の流路３の直径よりも広い範囲（たとえば、選択した照明光学ユニットに応じて、幅４００μｍ以上、長さ２０μｍ〜２００μｍの範囲）を有しているため、また、検出対物レンズ１６の焦点面は光シート面２２にあるため、多数の平行な流路３が配置されたチャネル担体４を使用することができる。このような例が図５に示される。ここでは、すべての試料１が単一の大きな試料に由来する場合、複数の流路３は、共通の供給ラインおよび排出ラインを含み得る。しかしながら、複数の流路３は同様に複数のグループにグループ化され、各グループの要素は同じ供給ラインと排出ラインを有するが、各グループに対して供給ラインと排出ラインがある。これにより、異なる群の試料の試料１を並行して検査できる。さらに、各流路３は、専用の供給ラインおよび専用の排出ラインを有してもよい。さらに、排出ラインは、これらが異なるグループである場合でも、全ての流路３に対して共通にすることができ、例として、このことは、複数の試料１がその後使用されなくなったが、共通の廃棄物容器に供給されるべき場合に適用可能である。
【００５２】
光シート１９は、複数の色の光シートとすることができ、このことは、種々の異なる標識された複数の試料群からの複数の試料１を並行して検査すべき場合、または単一の試料１、例えば細胞が、励起波長に依存して異なる波長で蛍光を放出する複数の色素によって標識された場合に、特に有利であり、さらに、同じ光シート又は異なる色の光シートが所定間隔で並列に配置され、適切な構成であれば共通の検出光学ユニットを用いてその光シートを検出することができる。
【００５３】
また、検出光学ユニット１０によって検出されたデータの解析結果を用いて、複数の試料１が光シートを通過した後に、分類ユニットによって分類することもできる。このようなチャネル担体４の一例は図６に示される。分類ユニットは、分類機構３３および複数の分岐チャネル３４を備える。分類機構３３は、先行技術から公知の方法で構成することができ、一例として、複数の試料１は電気泳動的、音響的または光学的にマニピュレーションするか、または流れ方向から前記複数の試料を偏向して、これらが複数の分岐チャネル３４のうちの一つに導かれるようにすることができる。次に、このことは、光シートが大きな面積を有するため、複数のチャネルに対して同時に実行することができる。
【００５４】
光シートがチャネル断面積に比べて大きな面範囲を有するということは、例えば、流れ方向２３に連続して配置されたある数の交差領域２０が流路３内に生じるように、光シート１９と複数回交差する蛇行流路３を有するチャネル担体４を用いる場合に、複数の試料１の経時的な挙動を検査するために用いることができる。このことは、図７に例示的に示されている。複数の交差領域２０はハッチングで示されている。説明された装置に関連して、チャネル担体４のそのような構成は、マニピュレーション後の経時的な試料の挙動を検査するのに特に適している。この目的のために、異なる色の光シートを重ね合わせることが有利であり得、適用可能な場合には、実験または分析のタイプから必要と見なされる場合にそれらを時間内に制御することが有利であり得る。図７に示す構造では、試料は、最初に左から流路３に入り、最初の交差領域２０を通過する。そこでマニピュレーションが行われ、例として、これは単に蛍光発光の励起で構成されてもよい。他の可能なマニピュレーションプロセスは、例えば、光活性化（すなわち、試料１を蛍光可能な状態にすること）およびアンケージング（Uncaging）光変換（試料１を第１の波長の蛍光シグナルが放出される第１の状態から試料１が第２の波長の蛍光シグナルを放出する第２の状態に変換することまたはＦＲＡＰ（fluorescence recovery after photobleaching：光退色後の蛍光回復））を含む。ここでは、局所的に高い強度が、試料１、例えば細胞に放射され、この時点で蛍光に関して光退色プロセスを局所的に生じさせる。短時間後、さらなる位置で弱い励起があり、複数の画像が記録され、これら画像は、蛍光が局所的な拡散によって再確立された程度の効果について分析される。必要に応じて、さらなる反応が、さらに重ねられた光シートによって生じさせることができる。試料１は、再び交差領域２０を離脱し、次の交差領域２０と交わるまで流路３に沿って流路を案内される。そこで、第１の観察またはさらなるマニピュレーションは、同一または異なる光シートを用いて実施され得る。さらなる観察は、さらなる交差領域２０において実施され、任意選択的にはさらに別の光シートで実施され得る。原則として、重ねられたすべての色の光シートは、永久的にオンのままにしておくことができ、しかしながら、流れ速度及び２つの交差領域２０の間の流路３の区間の長さに依存して、試料１が交差領域２０を通過するときに、そこで必要とされる光シートのみがオンされるように、光シートの時間制御もあり得る。この手順は、特に、比較的低速で流路３を流れるいくつかの試料を検査するときに使用され得る。
【００５５】
チャネル担体４の２つのさらなる構成が、図８ａ，８ｂに示されている。ここでは、少なくとも１つの流路３は、流れ方向２３の直径について変化し、この場合は狭くなっている。このくびれ部は、試料１、特に細胞を機械的に変形させるように使用され得る。図８ａに例示的な態様で示されるように、複数の光シートの適切な位置決めの結果として、変形前の試料の画像および変形中の画像を記録することが可能であり、この場合、流れの結果として変形された細胞の空間像が容易に生成され得る。あるいは、流路３は、収縮後に偏向され案内されて、変形された試料が再び同じ光シートを通過するようにすることができる。流路３が再び拡大すると、さらなる画像が記録され、この画像が使用されて永久的な変形が生じたかどうかを分析することができる。
【００５６】
上述した機器は、複数の蛍光マーカーによって標識される複数の生物試料の、特に短時間で多数の試料の光マニピュレーションおよび分析のために使用され得る。定量的な分析に加えて、高解像度の画像がより詳細な解析にも利用できるように、二次元および空間表現の両方の画像データを高解像度で生成することが可能である。その結果、複数の試料を分類するための複数のパラメータをさらに生成することができる。ここでは、分析のための高いサンプルスループットと、個々の試料の詳細な分析の両方が可能である。
【符号の説明】
【００５７】
１  試料
２  チャネリング装置
３  流路
４  チャネル担体
５  管路
６  試料ステージ
７  支持面
８  光シート顕微鏡
９  照明光学ユニット
１０  検出光学ユニット
１１  レーザーモジュール
１２  ビーム成形モジュール
１３  走査モジュール
１４  照明対物レンズ
１５  ピエゾ駆動部
１６  検出対物レンズ
１７  ピエゾ駆動部
１８  検出モジュール
１９  光シート
２０  交差領域
２１  光シート面の垂線
２２  光シート面
２３  流れ方向
２４  波面マニピュレータ
２５  仮想リレー
２６  空気
２７  浸漬液
２８  メニスカスレンズ
２９  顕微鏡対物レンズ
３０  カメラ
３１  ＥＤＯＦ要素
３２  別の光シート顕微鏡
３３  分類機構
３４  分岐チャネル
【図１】
2020535421.tif 000003
【図２】
2020535421.tif 000004
【図３】
2020535421.tif 000005
【図４】
2020535421.tif 000006
【図５】
2020535421.tif 000007
【図６】
2020535421.tif 000008
【図７】
2020535421.tif 000009
【図８ａ】
2020535421.tif 000010
【図８ｂ】
2020535421.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月10日(2020.6.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多数の微小試料（１）を光学的に検査する方法であって、
複数の試料（１）は、前記多数の微小試料から供給され、流れによって少なくとも１つの流路（３）において連続して案内され、特定の流れ方向（２３）に沿って移動し、
前記複数の試料（１）は照明され、
前記複数の試料（１）から放出される光が検出されて分析される、前記方法において、
前記複数の試料（１）は、少なくとも１つの流路（３）上に向けられた光シート面（２２）を有する少なくとも１つの光シート（１９）によって照明され、前記光シート（１９）は、交差領域（２０）において前記流路（３）と交差するように位置付けられ、前記光シート面（２２）の垂線（２１）は、前記交差領域（２０）において前記流れ方向（２３）に対してゼロではない角度を含み、
前記複数の試料（１）から放出された光は、結像検出光学ユニット（１０）によって記録され、前記結像検出光学ユニット（１０）の焦点面は、前記少なくとも１つの流路（３）の断面が前記焦点面における前記交差領域（２０）内に完全に位置するように、前記光シート面（２２）における前記交差領域（２０）内に位置するかまたは前記光シート面（２２）と平行であることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記検出光学ユニット（１０）は、前記交差領域（２０）を流れる試料（１）のそれぞれについて、画像を検出するかまたは個々の画像からなる画像スタックを時間内に連続的に検出することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記画像スタックの個々の画像は、空間表現を形成するように組み合わされることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記複数の試料（１）は、検査前に蛍光マーカーで標識され、前記少なくとも１つの光シート（１９）によって励起されて複数の蛍光シグナルを放出し、前記複数の蛍光シグナルが検出されて分析されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記複数の試料（１）は、前記検出光学ユニットによって検出された光の分析に基づいて、場合によっては、複数の画像および複数の蛍光シグナルからの情報に基づいて、分類されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの光シート（１９）は、前記複数の試料の経時的な挙動を検査するために、複数の交差領域（２０）において前記少なくとも１つの流路（３）と複数回交差することを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つの光シート（１９）は、複数の流路（３）と交差することを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記複数の試料（１）は、複数の光シート（１９）、好ましくは異なる波長の複数の光シートによって照明されることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
複数の微小試料（１）を光学的に検査する機器であって、
前記複数の試料（１）を供給して少なくとも１つの流路（３）に連続的に送るチャネリング装置（２）であって、前記少なくとも１つの流路（３）において、前記複数の試料（１）は、特定の流れ方向に沿って移動する、前記チャネリング装置（２）と、
検出光を放出するために、前記少なくとも１つの流路（３）内の前記複数の試料（１）を照明する照明手段と、
前記複数の試料（１）から放出される検出光を検出する検出手段と、
前記検出光を分析する分析手段と、を備える前記機器において、
前記照明手段は、光シート面（２２）を有する少なくとも１つの光シート（１９）を生成する照明光学ユニット（９）を備え、前記光シート（１９）は、交差領域（２０）において前記流路（３）と交差するように前記流路（３）に対して位置合わせされ、前記光シート面（２２）の垂線（２１）は、前記交差領域（２３）において流れ方向（２０）に対してゼロではない角度を含み、これにより、前記複数の試料（１）は、前記交差領域（２０）において照明され、
前記検出手段は、結像検出光学ユニット（１０）を備え、該結像検出光学ユニット（１０）の焦点面は、前記少なくとも１つの流路（３）の断面が前記焦点面における前記交差領域（２０）内に完全に位置するように、前記光シート面（２２）における前記交差領域（２０）内に位置するかまたは前記光シート面（２２）と平行であることを特徴とする機器。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの流路（３）は、交換可能なチャネル担体（４）上に設
けられていることを特徴とする請求項９に記載の機器。
【請求項１１】
前記チャネル担体（４）上には複数の平行流路（３）が配置されており、好ましくは、前記複数の平行流路は、互いに分離された供給ラインおよび排出ラインの少なくとも一方と、前記光シート（１９）との交差領域（２０）と、をそれぞれ有することを特徴とする請求項１０に記載の機器。
【請求項１２】
前記流れ方向（２３）に対して、前記光シート（１９）の下流側には分類ユニットが設けられ、前記光シート（１９）の上流側および下流側の少なくとも一方にはマニピュレーションユニットが設けられていることを特徴とする請求項９〜１１のいずれか一項に記載の機器。
【請求項１３】
前記照明手段は、蛍光マーカーで標識された複数の試料（１）を励起して複数の蛍光シグナルを放出させるために光を照射するように構成されることを特徴とする請求項９〜１２のいずれか一項に記載の機器。
【請求項１４】
前記検出手段は、前記複数の蛍光シグナルおよび迷光を検出するさらなる検出器を含むことを特徴とする請求項１３に記載の機器。
【請求項１５】
前記照明手段は、複数の光シート（１９）を生成する照明光学ユニット（９）又は複数の照明光学ユニット（９）を備え、前記複数の光シートの光シート面は、互いに平行であり、好ましくは、各光シートは異なる色を有することを特徴とする請求項９〜１４のいずれか一項に記載の機器。
【請求項１６】
前記少なくとも一つの流路（３）は、複数の交差領域（２０）を形成するために、前記流れ方向（２３）に沿って直径が変化するように構成されること、及び前記光シート（１９）の相対位置に対して蛇行するように構成されることのうちの少なくとも１つを特徴とする請求項９〜１５のいずれか一項に記載の機器。
【国際調査報告】
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