(57)【要約】  本発明は、媒体（５０）中の生体分子（１１４）の検出システムを製造する方法に関する。本方法は、第１のチャネル領域（２１５）を備えた第１の検出器部（２１０）および第２のチャネル領域（２２５）を備えた第２の検出器部（２２０）を提供すること（Ｓ１１０）と、少なくとも１つの細孔（１１０）を有する膜（１２０）を提供すること（Ｓ１２０）と、第１のチャネル領域（２１５）および第２のチャネル領域（２２５）の少なくとも一部が膜（１２０）によって分離され、第１のチャネル領域（２１５）および第２のチャネル領域（２２５）は、媒体（５０）が膜（１２０）の少なくとも１つの細孔（１１０）を通る流路（１３０）を形成するために、互いに接続されて、チャネルシステムを形成するように、第１の検出器部（２１０）および第２の検出器部（２２０）を膜（１２０）の両側に配置すること（Ｓ１３０）と、を含む。膜を通る流路（１３０）に沿ってバイオレセプター（１１２）が膜（１２０）に結合および／または連結し、流路（１３０）に沿った流れを測定することによって媒体（５０）中の生体分子（１１４）の濃度を決定する。
2020525795.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
媒体（５０）中の生体分子（１１４）の検出システムを製造する方法であって、
第１のチャネル領域（２１５）を備えた第１の検出器部（２１０）および第２のチャネル領域（２２５）を備えた第２の検出器部（２２０）を提供するステップ（Ｓ１１０）と、
少なくとも１つの細孔（１１０）を備えた膜（１２０）を提供するステップ（Ｓ１２０）と、
前記第１のチャネル領域（２１５）および前記第２のチャネル領域（２２５）の少なくとも一部が前記膜（１２０）によって分離され、前記第１のチャネル領域（２１５）および前記第２のチャネル領域（２２５）は、前記媒体（５０）が前記膜（１２０）の前記少なくとも１つの細孔（１１０）を通る流路（１３０）を形成するために、互いに接続されて、チャネルシステムを形成するように、前記第１の検出器部（２１０）および前記第２の検出器部（２２０）を前記膜（１２０）の両側に配置するステップ（Ｓ１３０）と、を含み、
前記膜を通る前記流路（１３０）に沿って、バイオレセプター（１１２）を前記膜（１２０）上に形成して、前記流路（１３０）に沿った流れを測定することによって前記媒体（５０）中の前記生体分子（１１４）の濃度を決定する、方法。
【請求項２】
前記配置ステップ（Ｓ１３０）が、
前記第１の検出器部（２１０）または前記第２の検出器部（２２０）上に前記膜（１２０）を配置することと、次いで
検出器領域（１２５）の外側の前記膜（１２０）の一部を除去することと、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記膜（１２０）と接触する粘着層（６８０）を形成することを更に含み、前記粘着層（６８０）は、前記細孔（１１０）の少なくとも数個を前記粘着層（６８０）によって閉じられるような様式で前記膜（１２０）と接触させ、それにより前記媒体（５０）の流量測定のための前記細孔（１１０）の数を減らすことによって前記膜（１２０）の感度を上げる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
機能化によって前記膜（１２０）に前記バイオレセプター（１１２）を付着させることを更に含み、前記機能化は、前記膜（１２０）の両側の前記第１の検出器部（２１０）および前記第２の検出器部（２２０）の前記配置の前または後に行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記機能化は、少なくとも以下の機能化ステップ：
−アミン反応性中間体を得るためにカルボキシ末端基を活性化するステップと、
−前記膜（１２０）上に所望のバイオレセプター（１１２）を形成するために前記アミン反応性中間体をアミド化するステップと、を含み、
前記機能化が前記膜（１２０）のすべての領域で同じ様式で起こるか、あるいは、前記膜（１２０）が異なった生体分子（１１４）に感受性となるように、前記機能化中に、異なったバイオレセプター（１１２）が異なった領域内の前記細孔（１１０）で形成される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の検出器部（２１０）および／または前記第２の検出器部（２２０）上に前記膜（１２０）を積層することを更に含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の検出器部（２１０）および前記第２の検出器部（２２０）が、少なくとも５０℃または少なくとも６５℃の温度での熱処理によって前記膜（１２０）の両側で互いに接続される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記媒体（５０）中の前記生体分子（１１４）の前記濃度が、以下の測定：（ｉ）前記少なくとも１つの細孔（１１０）を通る流量測定、（ｉｉ）インピーダンス測定、および（ｉｉｉ）動電測定、特に電気泳動測定または電気浸透測定、のうちの少なくとも１つによって決定される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記生体分子（１１４）が、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）を含み、前記バイオレセプター（１１２）が、特に以下のアプタマー：
ｄ）ＮＨ２−Ｃ６−ＣＣＧＵＣＡＧＧＵＣＡＣＧＧＣＡＧＣＧＡＡＧＣＵＣＵＡＧＧＣＧＣＧ
ＧＣＣＡＧＵＵＧＣ−ＯＨ、
ｅ）ＮＨ２−Ｃ６−ＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＡＡＧＣＴＣＧＣＣＡＴＣＡＡＡＴＡＧＣＴＴＴ−ＯＨ、
ｆ）ＮＨ２−Ｃ６−ＡＣＧＣＴＣＧＧＡＴＧＣＣＡＣＴＡＣＡＧＧＴＴＧＧＧＧＴＣＧＧＧＣＡＴＧＣＧＴＣＣＧＧＡＧＡＡＧＧＧＣＡＡＡＣＧＡＧＡＧＧＴＣＡＣＣＡＧＣＡＣＧＴＣＣＡＴＧＡＧ−ＯＨのうちの１つであるアプタマーを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
媒体（５０）中の生体分子（１１４）のための検出システムであって、
前記媒体（５０）を導入することができ、かつ、第１の電極（３１５）および第２の電極（３２５）を有する第１のチャネル領域（２１５）および第２のチャネル領域（２２５）と、
少なくとも１つの細孔（１１０）を含み、前記第１のチャネル領域（２１５）を前記第２のチャネル領域（２２５）から分離し、前記第１の電極（３１５）と前記第２の電極（３２５）との間に流動的に配置される、膜（１２０）と、を含み、
バイオレセプター（１１２）が前記細孔（１１０）上またはその中に形成され、特に以下のアプタマー：
（ｉｖ）ＮＨ２−Ｃ６−ＣＣＧＵＣＡＧＧＵＣＡＣＧＧＣＡＧＣＧＡＡＧＣＵＣＵＡＧＧＣＧＣＧＧＣＣＡＧＵＵＧＣ−ＯＨ、
（ｖ）ＮＨ２−Ｃ６−ＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＡＡＧＣＴＣＧＣＣＡＴＣＡＡＡＴＡＧＣＴＴＴ−ＯＨ、
（ｖｉ）ＮＨ２−Ｃ６−ＡＣＧＣＴＣＧＧＡＴＧＣＣＡＣＴＡＣＡＧＧＴＴＧＧＧＧＴＣＧＧ
ＧＣＡＴＧＣＧＴＣＣＧＧＡＧＡＡＧＧＧＣＡＡＡＣＧＡＧＡＧＧＴＣＡＣ
ＣＡＧＣＡＣＧＴＣＣＡＴＧＡＧ−ＯＨのうちの１つを含み、
それによって、前記媒体（５０）中のＰＳＡ濃度が、前記第１の電極（３１５）と前記第２の電極（３２５）との間の前記媒体（５０）の流路（１３０）に沿った抵抗測定によって測定できる、検出システム。
【請求項１１】
前記膜（１２０）内の前記少なくとも１つの細孔（１１０）が前記流路（１３０）に沿ってテーパー状または円筒状のプロファイルを有する、請求項１０に記載の検出システム。
【請求項１２】
異なった生体分子（１１４）の同時検出を可能にするために、異なった領域の前記膜が異なったレセプター（１１２）またはアプタマーを含む、請求項１０または１１に記載の検出システム。
【請求項１３】
前記第１のチャネル領域（２１５）および／または前記第２のチャネル領域（２２５）は、前記流路（１３０）に垂直な、最大１ｍｍまたは最大５０ミクロンもしくはせいぜい１０ミクロンの最大チャネル幅を有する、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の検出システム。
【請求項１４】
検出に必要な媒体（５０）の量を減らすために、媒体（５０）を分析物注入口（５３０）に、また電解質を電解質注入口（５２０）に導入できるように、前記第２の電極（３２５）に前記電解質注入口（５２０）および前記第１の電極（３１５）に前記分析物注入口（５３０）を更に含む、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の検出システム。
【請求項１５】
前記電極（３１５）と前記第２の電極（３２５）との間の電気抵抗の関数である電気変数を測定することによって、媒体（５０）中の生体分子（１１４）を検出するための、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の検出システムの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検出システムおよびその製造方法に関し、より具体的には非生物系および生物系における（生体）分子（分析物、リガンドなど）の検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
膨大な生物医薬研究の努力にもかかわらず、癌は、依然として高い死亡率を有している。加えて、各々の種の癌は、治療を行う医師に治療上および診断上の課題となる。残念なことに、使用される治療手段の文脈において疾患の経過がどの程度進展するかについての信頼できる予測は、依然として高いエラー率を伴う。このような状況において、初期の診断的手段は非常に重要である。
【０００３】
例えば前立腺癌（ＰＣａ）は、西洋では男性に最も一般的な癌である。ドイツだけでも、毎年、約６３，０００の新しい例が診断されている。意味のある結果を正確に出す迅速なオンサイト診断は、ＰＣａ患者の治癒の機会を顕著に増加させ、多くの場合に救命するはずである。前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の濃度は、ＰＣａの早期検出のために測定することができる。これは、血清中で検出することができるグリコシル化タンパク質である。通常の操作では、高コストに加えて、しばしば擬陽性結果をも生じるＰＳＡの検出は主に抗体型検出方法を用いる。この事実は、ＰＳＡの検出のための別の測定方法の検索の出発点である。
【０００４】
１つのアプローチは、ＰＳＡを特異的に認識し、高い親和性で結合することができる、核酸生体高分子、例えばアプタマーに基づく。それらは、血中のＰＳＡ濃度を測定し、それによって可能性のある前立腺癌を検出するための、ハンディセンサーシステムで使用することができる。このようなアプタマーがフィルターフイルムのナノスケール細孔／チャネルの内壁に固定されている場合には、ＰＳＡ検出のための簡単なセンサーが製造できる。
【０００５】
この種の検出の例は、刊行物：Ａｌｉ  Ｍ，Ｎａｓｉｒ  Ｓ，Ｅｎｓｉｎｇｅｒ  Ｗ．：「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｏｎｉｃ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｒｅｃｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｐｔａｍｅｒ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａｌ  Ｐｏｒｅｓ」；Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２０１５，５１：３４５４−３４５９に見られる。電位差は、測定可能なイオン電流を生成するためにプラスチックフィルムの両側に生じる。血清が検出されるべき生体高分子を含む場合には、これらの分子は、細孔内のアプタマーに結合され、これによって細孔の断面積が狭くなる。このことは、アプタマー複合体の濃度に依って個々の細孔の電気抵抗を増加させる。その結果、生体分子の濃度は、測定されたイオン電流の減少から直接推測することができる。
【０００６】
これらのセンサーの製造において、使用されるアプタマーは、多孔性フィルム、特に細孔の領域に適用される。このステップは機能化と言われる。それによって、得られるフィルムは特定の機能（生体分子の検出）に対して予め決定されるからである。これまで使用されてきた製造法では、フィルムは先ず機能化され、次いで縮小され、最終的に所望の検出領域に配置される。このいわゆる「ピックアンドプレース」プロセスは複雑であり、限定された程度でのみ自動化することができる。機能化膜は統合化プロセス（設置）中に損傷を受ける可能性があり、そのため、その機能性を再度失う。そのため、その統合後のエッチングされた膜の機能化は利点を与える。
【０００７】
したがって、これらのセンサーの改善された製造プロセスの必要性がある。また、ＰＳＡに高度に感受性であり、そのため、結果を顕著に改善する、改善されたアプタマーの必要性もある。
【発明の概要】
【０００８】
上記の問題の少なくとも一部は、請求項１に記載の検出システムの製造方法、請求項１０に記載の検出システム、および請求項１５に記載のその使用によって解決される。従属項は、独立項の目的の更に有利な実施形態を定義する。
【０００９】
本発明は、媒体中の生体分子の検出システムの製造方法に関する。本方法は、
−第１のチャネル領域を備えた第１の検出器部および第２のチャネル領域を備えた第２の検出器部を提供するステップと、
−少なくとも１つの細孔を備えた膜を提供するステップと、
−第１のチャネル領域および第２のチャネル領域の少なくとも一部が膜によって分離され、第１のチャネル領域および第２のチャネル領域は、媒体が膜の少なくとも１つの細孔を通る流路を形成するために、互いに接続されて、チャネルシステムを形成するように、第１の検出器部および第２の検出器部を膜の両側に配置するステップと、を含み、
膜を通る流路に沿って、バイオレセプターを膜（例えば、細孔領域内に）上に形成して、流路に沿った流れを測定することによって媒体中の生体分子の濃度を決定する。
【００１０】
用語「生体分子」は、本発明の範囲内で広く解釈されるべきであり、特にリガンド、分析物などを含む。使用される媒体は任意の体液（特に血液）でよい。本システムはまた、特定の物質を検出するための、水分析、食品産業、医薬産業などのために使用することができる。膜は１つ以上の部分で形成することができるため、用語「膜」は様々な膜も含むべきである。同様に、用語「細孔」は、広く解釈されるべきであり、開口部／チャネルが流れを許容する限り、任意の開口部またはチャネルを指すべきである。特に、細孔は特定のアスペクト比（長さ対直径）に限定されるべきではない。
【００１１】
任意に、配置ステップは、第１の検出器部または第２の検出器部上に膜を配置することと、次いで、検出器領域の外側の膜の一部を除去することと、を含む。例えば、膜は、最初に検出器部の１つに領域全体にわたって適用され、次いで、第１のチャネル領域と第２のチャネル領域との間の１つの検出領域のみに配置されるように、構造化（例えばそのような大きさに切断）することができる。
【００１２】
任意に、本方法は、膜と接触する粘着層を形成することを更に含む。粘着層は、細孔の少なくとも一部が粘着層によって閉じられるような様式で膜と接触し、それにより媒体の流量測定のための細孔の数を減らすことによって膜の感度を上げることができる。例えば、粘着層は、一部の細孔を選択的に閉じる（封鎖する）ために使用することができる。
【００１３】
任意に、本方法は、機能化によって膜にバイオレセプターを付着させることを更に含み、当該機能化は、膜の両側への第１の検出器部および第２の検出器部の配置の前後に行われる。言うまでなく、当該付着させることは、レセプターの連結および／または結合も含むべきである。機能化は、例えば、少なくとも以下の機能化ステップ：アミン反応性中間体を得るためにカルボキシ末端基を活性化するステップと、膜上に所望のバイオレセプターを形成するために当該アミン反応性中間体をアミド化するステップと、を含む。
【００１４】
機能化は膜のすべての領域で同じ様式で起こり得る。しかしながら、膜が異なった領域の異なった生体分子に感受性となるように、異なったバイオレセプターは、膜の異なった領域で機能化中に細孔内で形成（または連結もしくは結合）することもできる。加えて、様々な機能化ステップは、単一膜上で行うことができる。しかしながら、膜は数個の部分を有するか、あるいは数個の膜が検出に使用されることもでき、それらは異なって機能化されることになる。
【００１５】
任意に、本方法は、第１の検出器部および／または第２の検出器部に膜を積層することを更に含む。
【００１６】
第１の検出器部および第２の検出器部は、少なくとも５０℃または少なくとも６５℃の温度で熱処理によって膜の両側で互いに接続することができる。このようにして十分な不透過性が達成され得る。温度処理なしに、例えば糊付けによって不浸透性の接続を得ることもできる。
【００１７】
任意に、媒体中の生体分子の濃度は、以下の測定：（ｉ）少なくとも１つの細孔を通る流量測定、（ｉｉ）インピーダンス測定、および（ｉｉｉ）動電測定、特に電気泳動測定または電気浸透測定、のうちの少なくとも１つによって決定することができる。簡単なケースでは、細孔を通って媒体の流れに比例する電気抵抗測定が実施できる。このようにして、単位時間当たりの細孔を通過する電流強度、したがって電荷キャリア（すなわち媒体中のイオン）の数を測定することができる。
【００１８】
任意に、生体分子は前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）およびバイオレセプターであるアプタマーを含む。使用されるアプタマーは、特に以下のアプタマー：
ａ）ＮＨ２−Ｃ６−ＣＣＧＵＣＡＧＧＵＣＡＣＧＧＣＡＧＣＧＡＡＧＣＵＣＵＡＧＧＣＧＣＧ
ＧＣＣＡＧＵＵＧＣ−ＯＨ、
ｂ）ＮＨ２−Ｃ６−ＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＡＡＧＣＴＣＧＣＣＡＴＣＡＡＡＴＡＧＣＴＴＴ−ＯＨ、
ｃ）ＮＨ２−Ｃ６−ＡＣＧＣＴＣＧＧＡＴＧＣＣＡＣＴＡＣＡＧＧＴＴＧＧＧＧＴＣＧＧＧＣＡＴＧＣＧＴＣＣＧＧＡＧＡＡＧＧＧＣＡＡＡＣＧＡＧＡＧＧＴＣＡＣＣＡＧＣＡＣＧＴＣＣＡＴＧＡＧ−ＯＨのうちの１つのアプタマーでよい。
【００１９】
本発明は、媒体中の生体分子のための検出システムにも関する。当該検出システムは、媒体を導入することができる第１のチャネル領域および第２のチャネル領域と、少なくとも１つの細孔を含み、第１のチャネル領域を第２のチャネル領域から分離する膜と、を含む。加えて、第１の電極および第２の電極は膜の両側で膜の流れ方向に沿って形成される。バイオレセプターは、細孔内で形成されるか連結されるか接続され、以下のアプタマー：
（ｉ）ＮＨ２−Ｃ６−ＣＣＧＵＣＡＧＧＵＣＡＣＧＧＣＡＧＣＧＡＡＧＣＵＣＵＡＧＧＣＧＣＧ
ＧＣＣＡＧＵＵＧＣ−ＯＨ、
（ｉｉ）ＮＨ２−Ｃ６−ＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＡＡＧＣＴＣＧＣＣＡＴＣＡＡＡＴＡＧＣＴＴＴ−ＯＨ、
（ｉｉｉ）ＮＨ２−Ｃ６−ＡＣＧＣＴＣＧＧＡＴＧＣＣＡＣＴＡＣＡＧＧＴＴＧＧＧＧＴＣＧＧ
ＧＣＡＴＧＣＧＴＣＣＧＧＡＧＡＡＧＧＧＣＡＡＡＣＧＡＧＡＧＧＴＣＡＣ
ＣＡＧＣＡＣＧＴＣＣＡＴＧＡＧ−ＯＨのうちの少なくとも１つを含む。
【００２０】
したがって、媒体中のＰＳＡ濃度は、第１の電極と第２の電極との間の媒体のための流路に沿った抵抗測定によって測定することができる。最も簡単なケースでは、電解流の電気抵抗は（電極間に電圧を印加することによって）測定することができる。
【００２１】
膜内の少なくとも１つの細孔は、流路に沿ってテーパー状または円筒状のプロファイルを有してよい。
【００２２】
任意に、膜は、異なった生体分子の同時検出を可能にするために、異なった領域の膜が異なったレセプターまたはアプタマーを含む。
【００２３】
任意に、流路に垂直な、第１のチャネル領域および／または第２のチャネル領域は、５０ミクロンまたはせいぜい１０ミクロンの最大チャネル幅を有する。このことは、膜を湿らすことによって単孔膜を効率的に達成させ（例えば、膜内の細孔密度がそれによって選択される）、それは感度を高める。チャネル幅は最大１ｍｍでもよい。下限は典型的には使用される材料について１ミクロンであるが、シリコンまたは他の材料が使用される場合にはより低くなってもよい。
【００２４】
任意に、検出システムは、媒体を分析物注入口におよび電解質を電解質注入口に導入できるように、第２の電極に電解質注入口をおよび第１の電極に分析物注入口を更に含む。その結果、検出に必要な媒体の量を減らすことができる。
【００２５】
本発明は、媒体中の生体分子の検出のために記載された検出システムの１つの使用または使用方法であって、当該検出が電極と第２の電極との間の電気抵抗に依る電気変数を測定することによって実施される、使用または使用方法にも関する。
【００２６】
したがって、例示的実施形態は、特に、生物的および非生物的リガンド（生体分子）の検出のための電気化学的センサーに関する。これらは任意の分子、任意の種類の有機および無機化合物、環境毒素、農薬、ホルモン、タンパク質、抗生物質、神経毒を含む。これは、生物群の一部であり得るバクテリア、ウイルスおよび寄生虫をも含む。
【００２７】
例示的実施形態の利点は、より高い選択性および感度を有する、先行技術に対する費用効果の高い代替物がそれによって達成されるとの事実にある。本発明は、更に、上記のような様々な用途のための携帯型移動分析システムとして使用することができるマイクロ流体システムへのナノセンサーの統合を可能にする。例示的実施形態の広範囲の可能な用途のため、本発明は、特にこれまで分析され得なかったまたは非常に複雑な様式で分析できるにすぎなかった用途にも使用することができる。
【００２８】
加えて、ＰＳＡのみが細孔に連結または結合されるので、機能化は高い選択性を有する。
【００２９】
特に、例示的実施形態は、前立腺（ＰＣａ）の早期診断を顕著に簡便化し、よって促進することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
本発明の例示的実施形態は、以下の詳細な説明および様々な実施形態の添付図面からより理解されるだろう。これらの詳細な説明および添付図面は、本開示を具体的な例示的実施形態に限定するものと解釈するべきでなく、説明および理解の目的のみである。
【００３１】
【図１】本発明の例示的実施形態による、生体分子の検出システムを製造する方法の流れ図を示す。
【図２】少なくとも１つの細孔を有する膜を用いる基礎となる測定原理を例証する。
【図３】図３Ａおよび図３Ｂは、図２の測定原理に基づく例示的検出システムおよび測定値取得を示す。
【図４】膜の例示的機能化を例証する。
【図５】本発明の例示的実施形態の検出システムを示す。
【図６】図６Ａ〜Ｍは、例示的実施形態の検出システムを製造するためのプロセスフローを示す。
【図７】図７Ａおよび図７Ｂは、本発明の更なる例示的実施形態による、図６のプロセスフローで完了した検出システムを示す。
【発明の具体的説明】
【００３２】
図１は、本発明の例示的な実施形態に従う生体分子の検出システムを製造する方法のフローチャートを示す。本方法は、
−第１のチャネル領域を備えた第１の検出器部および第２のチャネル領域を備えた第２の検出器部を提供すること（Ｓ１１０）と、
−少なくとも１つの細孔を備えた膜を提供すること（Ｓ１２０）と、
−第１のチャネル領域および第２のチャネル領域の少なくとも一部は膜によって分離され、第１のチャネル領域および第２のチャネル領域は、媒体が膜の少なくとも１つの細孔を通る流路を形成するために、互いに接続されて、チャネルシステムを形成するように、第１の検出器部および第２の検出器部を膜の両側に配置すること（Ｓ１３０）と、を含む。
【００３３】
このリストは任意の順序を意味するものではないと理解される。記載の製造ステップは、互いに独立にまたは並行して実施することができる。膜バイオレセプターは、流路に沿った流れ（例えば抵抗）を測定することによって媒体中の生体分子の濃度を決定するために、流路に沿った膜上に形成される。
【００３４】
図２は、少なくとも１つの細孔１１０を有する膜１２０を用いる基本的な測定原理を例証する。この細孔１１０は、例えば、１ミクロン未満の（最大）直径（例えば、わずか数ナノメートルまたは１００ｎｍ未満でもよい）を有するナノチャネルである。膜１２０は、例えば、単孔のプラスチックフィルムである。
【００３５】
細孔１１０を通る断面図は図２の左側に示されており、バイオレセプター１１２が細孔１１０内に付着しているか、または形成されている。これらのバイオレセプター１１２は、膜１２０を介してイオン電流１３０が形成されると、検出されるべき分子１１４（生体分子または分析物分子）が付着または結合するような様式で設計されている（図２の右側を参照）。イオン電流１３０は、例えば、イオン電流１３０内の荷電イオンに作用する電場によって生成することができる。生体分子１１４をバイオレセプター１１２に連結および／または結合することにより、細孔１１０を通るイオン電流１３０の抵抗が変化する。この変化は、電気測定によって測定することができる。
【００３６】
図３Ａは、図２に記載された測定原理に基づく例示的な検出システムを示し、例として、単孔プラスチックフィルム１２０を有する電気化学測定セルの構造が示されている。この方法で測定できる電流−電圧特性（Ｉ／Ｕ特性）を図３Ｂに示す。特性の変化は、媒体５０内の分析物の濃度によってもたらされる。したがって、分析物／リガンド分子１１２＋１１４の、機能化ナノポア１１０への結合は、（定性的）Ｉ／Ｕ測定を使用して決定することができる。
【００３７】
検出システムは、詳細には、第１のチャネル領域２１５および第２のチャネル領域２２５を含み、それらの間に膜１２０が配置されている（図３Ａを参照）。本発明はこれに限定されることを意図するものではないが、第１および第２のチャネル領域２１５、２２５は、典型的には、媒体５０が移動するチャネルシステムの一部を表すと理解される。媒体は、例えば、生体分子を含むまたは含まない電解質（例えば、０．１Ｍ  ＫＣｌ、Ｍ＝ｍｏｌ／Ｌ）でよい。測定セットアップは、膜１２０によって２つの半分２１５、２２５に分割される電解質容器も含んでよい。膜１２０は、細孔として１つ以上のナノチャネル１１０を含むことができ、これは、共有結合したレセプター分子１１２で、表面上で誘導体化することができる。共有結合したレセプター分子１１２は、膜１２０上のどこにでも（ほぼ）任意に存在することができる。ナノチャネル１１０の電気抵抗は、リガンド分子１１４の濃度の関数として増加する結果、レセプター１１２は、生体分子（分析物、リガンド）１１４を選択的にかつ高い親和性で結合することができる。
【００３８】
媒体５０は、イオン（例えば電解質の一部として）および検出されるべき生体分子１１４を含み、生体分子１１４はイオンであってもよい（しかし、そうである必要はない）。また、第１のチャネル領域２１５に第１の電極３１５があり、第２のチャネル領域２２５に第２の電極３２５がある。第１の電極３１５と第２の電極３２５との間に電圧Ｕを印加することにより、電流Ｉがナノチャネル１１０を通って流れる（図２を参照）。電流Ｉは、生体分子１１４を細孔１１０内のレセプター分子１１２に付着させ、前述のように、存在する生体分子１１４の量の関数として電気抵抗を変化させる。より多くの生体分子１１４が存在するほど、細孔１１０内により潜在的に残り、したがって、イオン電流１３０が利用できるそれらの断面を減少させる。
【００３９】
電気抵抗の変化は、電流電圧を測定することで判断することができる。対応する特性を図３Ｂに示す。２つの特性曲線を例として示す。第１の特性曲線３１０は、媒体５０に生体分子１１４がない場合の印加電圧Ｕの関数として測定された電流Ｉを示す。第２の特性曲線３２０は、培地５０に多数の生体分子１１４が存在する場合の電流−電圧依存性を示している。示されるように、生体分子１１４の結果として、電流Ｉは、所定の電圧Ｕに対して減少し、これは、細孔１１０を通過するときの抵抗の増加の結果である。
【００４０】
最初に述べたように、膜が検出されるべき特定の分子に非常に敏感になるように、対応するバイオレセプター１１２が細孔１１０内に付着する膜の対応する機能化が必要とされる。細孔自体も機能化中に作成できる。
【００４１】
図４は、例示的な機能化を例証する。まず、カルボン酸／カルボキシレート末端基の生成は、照射およびエッチングプロセスにより細孔表面上で実施される。これは、例えば、示されている３つのステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）で実施することができる。第１のステップ（ｉ）では、例えば、イオンが膜１２０に入り、膜１２０全体を貫通し、それにより開口部を形成するか、少なくともそこの化学結合を破壊するように、膜１２０は重イオンで照射される。第２のステップ（ｉｉ）はエッチングステップであり、これによりイオントラックが広くなり、テーパー状の細孔１１０が得られる。最後に、カルボキシレート末端基は、検出されるべき分子１１４に敏感であるか、あるいは検出されるべき分子１１４のレセプターを付着させるためのアンカーポイントとして機能するまたは機能することができる、細孔１１０の表面に形成することができる。
【００４２】
表面特性は、核酸アプタマー（ＤＮＡ／ＲＮＡ）などの様々なレセプター分子１１２との共有結合によって調整することができる。Ａｌｉら（Ａｌｉ  Ｍ，  Ｎａｓｉｒ  Ｓ，  Ｅｎｓｉｎｇｅｒ  Ｗ．２０１５，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｏｎｉｃ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｒｅｃｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｐｔａｍｅｒ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａｌ  ｎａｎｏｐｏｒｅｓ．，Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ  ５１：１５  ３４５４−３４５９）によれば、カップリングは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびスルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド）を使用した２ステップ反応で実施することができる。ＥＤＣ／ＮＨＳカップリング化学により、表面に位置するカルボン酸／カルボン酸基と生物学的レセプター１１２（例えばアプタマー）と結合する反応メカニズムは、次のように実現することができる：
【化１】
2020525795.tif 000003
【００４３】
本発明の例示的な実施形態によれば、反応はマイクロ流体システム内で行われ、その構成および製造は以下により詳細に説明される。
【００４４】
第１のステップ（活性化）：ここでは、ＥＤＣを使用したＮＨＳのエステル化により、カルボキシ末端基が活性化される。Ｏ−アシル化尿素中間体が最初に形成され、アミン反応性ＮＨＳエステルに変換される。この目的のために、膜１２０はマイクロ流体システムに組み込まれている。次に、システムに、新しく調製した０．２ｍＭ  ＥＤＣおよび０．４ｍＭ  ＮＨＳの水溶液（ｐＨ７）を満たす。細孔１１０の表面の活性化は、１時間後に完了する。
【００４５】
第２のステップ（アミド化）：これは、レセプター分子１１２（アプタマー）で機能化が行われる場所であり、その化学構造は少なくとも１つの１次アミノ基（−ＮＨ２）を含む。このアミノ基は、室温で活性化カルボン酸エステルと反応して、アミド結合を形成する（−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−）。この目的のために、マイクロ流体システムは、レセプター分子１１２（アプタマー）の０．１ｍＭ水溶液で満たされ、一晩放置される。
【００４６】
非機能化および機能化細孔１１０は、異なる電流強度により同じ電位で異なるため、成功した機能化は、電流−電圧特性を測定することによって検証される。この感覚の原理は、図２および３ですでに説明されている。
【００４７】
以下の分子は、バイオレセプター１１２としてＰＳＡ特異的アプタマーとして使用される。
１．ＲＮＡアプタマー（参照：Ｊｅｏｎｇ  Ｓ、Ｈａｎ  ＳＲ、Ｌｅｅ  ＹＪ、Ｌｅｅ  ＳＷ，  ２０１０，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ａｐｔａｍｅｒｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｏ  ａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ３２：３７９−３８５）配列（５’−３’）：
ＮＨ２−Ｃ６−ＣＣＧＵＣＡＧＧＵＣＡＣＧＧＣＡＧＣＧＡＡＧＣＵＣＵＡＧＧＣＧＣＧＧＣＣＡＧＵＵＧＣ−ＯＨ
２．ＤＮＡ  Ａｐｔａｍｅｒ−０１（参照：Ｓａｖｏｒｙ  Ｎ、Ａｂｅ  Ｋ、Ｓｏｄｅ  Ｋ、Ｉｋｅｂｕｋｕｒｏ  Ｋ．２０１０，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｐｔａｍｅｒ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｓｅｎｓｉｎｇ，Ｂｉｏｓｅｎｓ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ  ２６：１３８６−１３９１）配列（５’−３’）：
ＮＨ２−Ｃ６−ＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＡＡＧＣＴＣＧＣＣＡＴＣＡＡＡＴＡＧＣＴＴＴ−ＯＨ
３．ＤＮＡアプタマー−０２（参照：Ｄｕａｎ  Ｍ、Ｌｏｎｇ  Ｙ、Ｙａｎｇ  Ｃ、Ｗｕ  Ｘ、Ｓｕｎ  Ｙ、Ｌｉ  Ｊ、Ｈｕ  Ｘ、Ｌｉｎ  Ｗ、Ｈａｎ  Ｄ、Ｚｈａｏ  Ｙ、Ｌｉｕ  Ｊ、Ｙｅ  Ｍ、Ｔａｎ  Ｗ．２０１６，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｐｔａｍｅｒ  ｆｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｍａｇｉｎｇ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ７：３６４３６−３６４４６）配列（５’−３’）：
ＮＨ２−Ｃ６−ＡＣＧＣＴＣＧＧＡＴＧＣＣＡＣＴＡＣＡＧＧＴＴＧＧＧＧＴＣＧＧ
ＧＣＡＴＧＣＧＴＣＣＧＧＡＧＡＡＧＧＧＣＡＡＡＣＧＡＧＡＧＧＴＣＡＣＣＡＧＣＡＣＧＴＣＣＡＴＧＡＧ−ＯＨ。
【００４８】
機能化された（単孔）プラスチックフィルム１２０の感覚特性は、マクロセルで検査することができる。この目的のために、例示的な単孔プラスチックフィルム１２０を使用することができ、これは各検査の前に２つの液体チャンバー２１５、２２５の間に手動で固定される。有利な単孔プラスチックフィルム１２０は製造が困難である。これに対して、マルチポアプラスチックフィルムは大量生産が可能である。しかしながら、それらは、個々の細孔と比べて低い感度を有する。
【００４９】
両方のフィルムの利点を組み合わせるために、マルチポアフィルム１２０の湿潤面積は、単孔が液体とまだ接触している程度にまで縮小される。これはマイクロシステムへの統合によって行われるため、トレーニングを受けていないユーザーによる検出システムの使用を可能にする。
【００５０】
図５は、異なる分析（異なる生体分子の検出）に使用できる２つの検出器領域５００Ａおよび５００Ｂを含む可能な検出システムの例を示す。２つの検出器領域５００Ａ、５００Ｂのそれぞれは、３つの接続電極５１０、電解質用の注入口５２０、および分析物用の２つの注入口５３０を含む。分析物は、例えば、生体分子１１４（分析物）で検査されるべき媒体５０であり、電解質はイオンを含み（電流をサポートするため）、結果を偽造しない任意の液体でよい。
【００５１】
図５のマイクロ流体システムでは、電解質分子のチャネルと生体分子１１４との間にマルチポアプラスチックフィルム１２０が組み込まれる。すべての個々のパーツは、粘着層によってまとめられる。マイクロ流体システム、テーブルデバイスの形で電子測定システムに統合することができる。
【００５２】
第２の検出器領域５００Ｂは図５の右側に拡大して示されており、膜１２０は２つの分析物注入口５３０と関連する電解質注入口５２０に通じるチャネル５２１との間に形成される。言うまでもなく、すべての入口を出口にすることもできる。必要なのは、流れの方向を逆にすることのみである。したがって、分析物注入口５３０および電解質注入口５２０は、対応する出口を表すこともできる。本発明は、特定の流れ方向に制限されることを意図していない。例えば、２つの分析物注入口５３０の間で膜１２０の片側への流体接続がある。膜１２０の反対側は、例えば、電解質注入口５２０に流体的に接続することができる。加えて、電極は分析物注入口５３０に形成され、その各々は接続電極５１０の１つに接続される。電極も電解質注入口５２０に形成され、接続電極５１０の１つに接続される。電解質注入口５２０の電極と分析物注入口５３０の電極の１つとの間の電圧の標的印加は、それぞれの注入口５３０から電解質注入口５２０への分析物５０＋１１４の流れを生成する。
【００５３】
膜１２０は、例えば、水平に設計され、分析物注入口５３０の１つからの分析物の流れは、例えば、膜１２０を通って、電解質注入口５２０に通じるチャネル５２１への垂直方向に生じる。この流れは、対応する電極に電圧を印加することにより、垂直に下向きまたは垂直に上向きに生成することができる。検出システムの動作モードは、生産物の表示によって以下で更に例証する。いくつかの分析物注入口５３０があるので、異なる測定を並行してまたは連続して実行することができる（例えば異なる生体分子１１４に対して）。このようにして、異なる生体分子１１４の分析を並行して行うことができるように、異なる分析物注入口５３０を膜１２０の異なる領域に導くことができ、それは異なって機能化される。
【００５４】
図６Ａ〜６Ｍは、図５に示されているような例示的な検出システムの製造における様々なステップを例証する。
【００５５】
図６Ａ〜６Ｃは、最初に電極の製造を例証する。この目的のために、フォトレジスト層６２０は、基板６１０（例えばガラス基板）上の部分に適用される。その後、中間層（例えばクロム層）６３０および電極層６４０（例えば銀層）がフォトレジスト層６２０および露出したガラス基板部分６１０上に堆積される。堆積は、例えば、物理蒸着（ＰＶＤ）、例えば、スパッタリングまたは蒸着により実施することができる。最後に、フォトレジスト層６２０は、その上に形成された例示的なクロム層および銀層とともに除去され、その結果、図６Ｃに示すように、構造化電極３１５、３２５を備えたガラス基板６１０が形成される。電極は、例えば、第１の電極３１５および／または第２の電極３２５を表すことができる。
【００５６】
図６Ｄ〜６Ｆは、電極を形成する別の方法を例証する。ここでも、例示的な中間層６３０（例えばクロム層）が最初に基板６１０に適用され、電極層６４０がその上に適用され、この例示的な実施形態では金を含むことができる。当該層は、領域内で基板６１０に適用することができる。次いで、構造化が実施され、すなわち、例示的な金およびクロム層６３０、６４０が異なる領域で除去され、その結果、電極３１５、３２５のみが残る。
【００５７】
このようにして製造された電極構造は、様々な接続電極５１０が、電解質および分析物用の対応する注入口５２０、５３０の電極に接続されている図５でも見ることができる。次に、電極は、第１の電極３１５および／または第２の電極３２５を表すことができる。
【００５８】
図６Ｇ〜６Ｍは、検出システムの製造を例証する。例示的な実施形態によれば、第１の検出器部２１０および第２の検出器部２２０が作製され（図６Ｉを参照）、次いでこれらは一緒にされて検出システムを形成する。この目的のために、第１の検出器部２１０および第２の検出器部２２０にチャネル構造が形成され、これらは最終的に分析物および／または電解質のチャネルを表す。
【００５９】
図６Ｇでは、第１の電極３１５および第２の電極３２５がその上に形成された基板６１０は、図６Ａ〜図６Ｆまでのステップでどのように製造できるかを左側に一例として最初に見ることができる。これは後に第１の検出器部２１０になることができる。第２の検出器部２２０は、図６Ｇの右側に作成され、基板６１０が再び最初に示される。次に、粘着中間層６６０が図示の部分に形成される。粘着中間層６６０は、例えばチタン材料を有してもよく、０．５ミクロンの例示的な厚さを有してもよい。
【００６０】
図６Ｈからの製造ステップでは、マスク層６７０（例えば、エポキシで作られたドライレジスト）が図６Ｇからの構造に適用される。
【００６１】
図６Ｉからの後続の製造ステップでは、マスク層６７０が構造化され、マスク層６７０は、第１の検出器部２１０および第２の検出器部２２０の中央領域の電極３１５、３２５の位置で除去される。その結果、第１の検出部２１０の第１の電極３１５および第２の電極３２５と、第２の検出部２２０の基板６１０が露出する。結果として生じるチャネルの特性（特に親水性）は、コーティングによって変更することができる。
【００６２】
結果は図６Ｊの空間表現で示される。したがって、例えば図５に示されるように、複数の電極が第１の検出部２１０に形成される。
【００６３】
図６Ｋでは、粘着層６８０（例えば、粘着中間層またはラミネート層、特に乾燥エポキシラミネート層）が、一例として図６Ｉからの構造に適用される。
【００６４】
次のステップ（図６Ｌを参照）では、膜１２０が図６Ｋから製造された構造に適用される。実施形態によれば、膜１２０は、例えば、全領域に適用され、熱ラミネートされる（約Ｔ＝６５℃で）；図６Ｌの右側を参照。また、部分的にのみ適用する必要があり（図６Ｌの左側を参照）、マルチポア膜１２０はチャネルまたはチャネル範囲の間に配置され、その後、熱的に積層される。
【００６５】
膜１２０が図６Ｋの構造全体にわたって適用される場合（図６Ｌの右側を参照）、膜１２０は、例えば、チャネル領域（例えば、第１のおよび第２のチャネル領域２１５、２２５）間の第１の検出器部２１０および第２の検出器部２２０（図６Ｍを参照）をその後接続するべきそれらの部分で、続いて構造化または除去される。最後に、（構造化）膜１２０が第１の検出器部２１０と第２の検出器部２２０の間に配置されるように、第１の検出器部２１０と第２の検出器部２２０が互いの上に配置される。最後に、すべての層を相互に接続し、それらを完全に密閉するために、製造された検出器を積層することができる。
【００６６】
図６Ｍに示されるチャネル領域２１５、２２５は、例えば、分析物注入口５３０と、膜１２０を通り、チャネル５２１を介して電解質注入口５２０（図５を参照）との間の流体接続を表す。第１の電極３１５は、例えば、図５の分析物注入口５３０の下に形成され、第２の電極３２５は、例えば、チャネル５２１を介して電解質注入口５２０に導かれる中間電極である
【００６７】
例示的な実施形態によれば、膜１２０の上述の機能化が行われる（例えば、図６Ｍからの製造ステップ中）。
【００６８】
図７Ａ、Ｂは、本発明の例示的な実施形態による完成した検出システムを示す。
【００６９】
図７Ａの例示的な実施形態は、膜１２０が第１の検出器部２１０と第２の検出器部２２０との間に、具体的には、第１のチャネル領域２１５と第２のチャネル領域２２５とを分離する１つの検出領域１２５（固定用の支持面を除く）においてのみ、（例えば、５０％超または８０％超）形成される検出システムを示す。
【００７０】
図６で説明したように、第１の検出器部２１０および第２の検出器部２２０の両方は、基板６１０ａ、６１０ｂをそれぞれ含み、その間にすべての更なる層が形成される。第２の検出器部２２０は、基板なしで製造することもできる。第１の検出部２１０から始めて、粘着中間層６６０ａが対応する基板６１０ａ上に最初に形成され（図６Ｇ〜６Ｉ参照）、マスク層６７０ａが粘着中間層上に形成され、粘着層６８０ａがその上に形成される。第２の検出部２２０の基板６１０ｂの下に、粘着層６８０ｂが順に塗布されるマスク層６７０ｂを含む粘着中間層６６０ｂが最初に塗布される。
【００７１】
加えて、第１の電極３１５および第２の電極３２５は、第１の検出部２１０の基板６１０ａ上に形成される（図６Ａ〜Ｃを参照）。したがって、流路１３０は、第１の電極３１５と第２の電極３２５との間に膜１２０を介して形成され、第１の電極３１５と第２の電極３２５との間に電圧が印加されると電流を誘発し、細孔を通るその抵抗（図７Ａに示されていない）を測定することができ、培地５０中の生体分子１１４の濃度を決定するために使用することができる。
【００７２】
図７Ｂの例示的な実施形態は、（配置されていたときに）第１の検出器部２１０と第２の検出器部２２０との間にあった膜１２０が、（本質的に）第１の電極３１５から始まる流路１３０が、第１の検出器部２１０を出て膜１２０に向かい、第２の検出器部２２０に入る点でのみ除去される点でのみ、図７Ａの例示的な実施形態と異なる。そうでなければ、特に第１の検出器部２１０および第２の検出器部２２０の一部として形成された粘着層６８０ａ、ｂの間の膜１２０は依然として存在する。
【００７３】
したがって、図７Ｂの例示的な実施形態では、第１の粘着層６８０ａは、膜１２０によって第２の粘着層６８０ｂから少なくとも部分的にまたは大部分、−特に検出領域１２５の外側でも分離される。
【００７４】
本発明の例示的な実施形態の有利な態様は、特に以下に関する：
−大／全表面細孔プラスチックフィルム１２０は、２つの流体チャネル２１５、２２５の間のラボオンチップシステムに統合される（例えば、バッチプロセスで）。
−フィルム１２０は、レーザー切断、電子写真法、またはエッチングにより、流体チャネル２１５、２２５の領域で除去される（右の図６Ｌ、６Ｍを参照）。
使用される細孔フィルム１２０は、再現可能な幾何学的形状を有する円錐状細孔１１０を含む。
−粘着層６８０は、細孔１１０を一体化することおよび細孔を機能不全にする（閉じる）ことの両方に役立つ。統計的に言えば、１つのみの細孔が電解質と接触できる。単孔プラスチックフィルム１２０の高感度は、複数孔プラスチックフィルムの助けにより達成される。
−細孔１１０の機能化は、チップ製造後に行われるが、機能化の前に行うこともできる。
【００７５】
チップ製造後の機能化には、事前に機能化された細孔を超える次の利点がある：
−統合後のマルチポアプラスチックフィルム１２０の機能化には、少量のレセプター分子１１２のみが必要である。
−以前に機能化された細孔を統合することにより、細孔を汚染または詰まらせる可能性がある。
【００７６】
例示的な実施形態はまた、以下の利点を提供する。
−新しいシステムは、Ｍｉｃｒｏ  Ｔｏｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（μＴＡＳ）に拡張される可能性を有する。これにより、複数のリガンド分子１１４の同時検出が可能になる。
−マイクロシステムの感度は、単細孔測定に匹敵する。
−従来の粘着層は液体ＵＶ粘着剤である。これは、細孔の目詰まりを引き起こすため、細孔または機能化細孔の統合には適していない。これらの従来の方法の助けを借りて、システムの不浸透性を保証することはできない。フィルムの機能化は、ＵＶ暴露によっても破壊される。これとは反対に、本発明の例示的な実施形態では、多孔質プラスチックフィルム１２０は熱的に一体化される（Ｔ＝６５℃で）。
−使用されるマルチポアプラスチックフィルムは、統合後と統合前の両方で機能化できる。この方法で１００％の収率が達成された。
【００７７】
２，５００μｍ２の濡れ面積に対応する５０ミクロンのチャネル幅を使用することができる。湿潤領域は、１００μｍ２まで更に低減することができる。従来のプロセスでは、３１，４１６μｍ２の濡れ面積のみが達成された。
【００７８】
これまでに説明した機能原理は、ボルタンメトリー法に基づく。他の測定原理が更なる例示的な実施形態で使用される。これらは例えば次のとおりである。
（ｉ）細孔１１０を通る流量測定、
（ｉｉ）インピーダンス測定、
および（ｉｉｉ）界面動電測定（電気泳動、電気浸透など）。
【００７９】
しかし、最終的に、これらの測定原理は、細孔１１０を通る生体分子１１４の流れを妨げる抵抗も測定する。測定された変数のみが以下において変化する：（ｉ）媒体５０の流速；（ｉｉ）電気インピーダンス；（ｉｉｉ）界面動電量。
【００８０】
複雑な様式でそれぞれの分析物／リガンド分子を検出する現在の方法と比較して、本発明の例示的な実施形態は、現在利用可能な分析方法と比較してより高い選択性および感度で濃度測定を可能にする。これにより、生物系および非生物系における様々なリガンドを検出できる。これらは、次の生物群およびその成分を含む。
−任意の種類の低分子有機および無機化合物
−環境毒素
−農薬
−ホルモン
−タンパク質
−抗生物質
−神経毒
−バクテリア
−ウイルス
−寄生虫。
【００８１】
本発明により、ナノセンサーの、大量生産可能なラボオンチップシステムへの統合が可能になり、これは上記の用途のためのコンパクトで携帯可能な分析システムとして使用できる。これにより、数分以内に測定を実行できるようになり、選択された場合に人命を救うことができる。本検出システムは、個々のテストごとに１回使用されるように、使い捨てマイクロ流体システムとして使用できる。したがって、当該システムは大量に生産できる。
【００８２】
説明、特許請求の範囲および図面に記載された本発明の特徴は、個々にまたは任意の組み合わせのいずれかで本発明の実現化のために必須である。
【００８３】
符号の説明
５０  媒体
１１０  細孔
１１２  バイオレセプター
１１４  生体分子
１２０  膜
１２５  検出範囲
１３０  流路
２１０、２２０  検出器部
２１５、２２５  チャネル地域
３１０、３２０  電圧特性
３１５  第１の電極
３２５  第２の電極
５００Ａ、５００Ｂ  検出器領域
５１０  接続電極
５２０  電解質注入口
５２１  チャネル
５３０  分析物注入口
６１０  基板
６２０  フォトレジスト層
６３０  中間層（例えばクロム製）
６４０  電極層（例えば銀または金製）
６６０  粘着中間層
６７０  マスク層
６８０  粘着層
【図１】
2020525795.tif 000004
【図２】
2020525795.tif 000005
【図３Ａ】
2020525795.tif 000006
【図３Ｂ】
2020525795.tif 000007
【図４】
2020525795.tif 000008
【図５】
2020525795.tif 000009
【図６（Ａ）】
2020525795.tif 000010
【図６（Ｂ）】
2020525795.tif 000011
【図６（Ｃ）】
2020525795.tif 000012
【図６（Ｄ）】
2020525795.tif 000013
【図６（Ｅ）】
2020525795.tif 000014
【図６（Ｆ）】
2020525795.tif 000015
【図６（Ｇ）】
2020525795.tif 000016
【図６（Ｈ）】
2020525795.tif 000017
【図６（Ｉ）】
2020525795.tif 000018
【図６（Ｊ）】
2020525795.tif 000019
【図６（Ｋ）】
2020525795.tif 000020
【図６（Ｌ）】
2020525795.tif 000021
【図６（Ｍ）】
2020525795.tif 000022
【図７Ａ】
2020525795.tif 000023
【図７Ｂ】
2020525795.tif 000024
【配列表】
2020525795000001.app
【国際調査報告】
2020525795.tif 000025
2020525795.tif 000026
2020525795.tif 000027
2020525795.tif 000028
2020525795.tif 000029
2020525795.tif 000030
2020525795.tif 000031