(57)【要約】  癌治療の方法は、ＩＬ−６またはその受容体に対する抗体などのＩＬ−６アンタゴニストと組み合わせたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または細胞株の投与を含み、特に、ＩＬ−６受容体を発現し、そして疾患中にＰＤＬ−１および／またはＰＤＬ−２などのチェックポイント抑制性受容体が発現／アップレギュレートされる癌の治療用である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の治療に使用するためのＩＬ−６アンタゴニストと組み合わせたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または細胞株。
【請求項２】
前記癌がＩＬ−６受容体を発現する、請求項１に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項３】
前記癌がＰＤＬ−１および／またはＰＤＬ−２を発現する、請求項１または２に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項４】
前記ＩＬ−６アンタゴニストが、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒまたはｇｐ１３０のうちの１つに結合する抗体である、先行する請求項のいずれかに記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項５】
前記ＩＬ−６抗体が、シルツキシマブ、オロキズマブ（ＣＤＰ６０３８）、エルシリモマブ、ＢＭＳ−９４５４２９（ＡＬＤ５１８）、ＭＨ−１６６およびシルクマブ（ＣＮＴＯ  １３６）から選択される、請求項４に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項６】
前記ＩＬ−６Ｒ抗体が、トシリズマブ、サリルマブ、ＰＭ−１およびＡＵＫ１２−２０から選択される、請求項５または６に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項７】
前記ｇｐ１３０抗体がＡＭ６４である、請求項４に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項８】
別の抗癌療法と組み合わせた、先行する請求項のいずれかに記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項９】
前記別の抗癌療法が、免疫エフェクター細胞として内因性ＮＫ細胞を利用する、請求項８に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項１０】
前記別の抗癌療法が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である、請求項８または９に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項１１】
前記癌が血液癌である、先行する請求項のいずれかに記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項１２】
前記血液癌が、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ホジキンリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫およびＢ細胞リンパ腫を含む非ホジキンリンパ腫、無症候性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、または軽鎖骨髄腫である、請求項１１に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項１３】
前記ＮＫ細胞または細胞株が、１つまたはそれ以上のチェックポイント抑制性受容体の発現を減少するように遺伝子改変されている、先行する請求項のいずれかに記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項１４】
前記チェックポイント抑制性受容体が、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ−３）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＩＧＩＴ、およびＴＩＭ−３から選択される、請求項１３に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項１５】
前記ＮＫ細胞または細胞株が、変異体ＴＲＡＩＬリガンドを発現するように遺伝的に改変されている、先行する請求項のいずれかに記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項１６】
前記変異体ＴＲＡＩＬリガンドが、ＴＲＡＩＬ受容体（例えば、ＤＲ４および／またはＤＲ５）に対して増大した親和性を有する、請求項１５に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項１７】
前記変異体ＴＲＡＩＬリガンドが、デコイＴＲＡＩＬ受容体に対して減少した親和性を有する、請求項１５または１６に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項１８】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する、先行する請求項のいずれかに記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項１９】
前記ＣＡＲが二重特異性ＣＡＲである、請求項１８に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項２０】
前記二重特異性ＣＡＲが、１つの細胞型上の２つのリガンドに結合する、請求項１９に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項２１】
前記二重特異性ＣＡＲが、２つの異なる細胞型のそれぞれ上の１つのリガンドに結合する、請求項１９に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項２２】
前記ＣＡＲまたは二重特異性ＣＡＲに対する１つまたは複数の前記リガンドが癌細胞上に発現される、請求項１１および２２に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項２３】
前記二重特異性ＣＡＲに対する前記リガンドが、両方とも癌細胞上で発現される、請求項２２に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項２４】
前記二重特異性ＣＡＲに対する前記リガンドが、癌細胞および免疫エフェクター細胞上に発現される、請求項２２に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項２５】
前記ＮＫ細胞または細胞株が、ＩＬ−６受容体の発現を減少するように遺伝子改変されている、先行する請求項のいずれかに記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項２６】
前記ＮＫ細胞株がＫＨＹＧ−１である、先行する請求項のいずれかに記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項２７】
前記癌の細胞がＩＬ−６受容体を発現する、癌の治療に使用するためのＩＬ−６アンタゴニスト。
【請求項２８】
前記癌がＰＤＬ−１および／またはＰＤＬ−２を発現する、請求項２７に記載の使用のためのＩＬ−６アンタゴニスト。
【請求項２９】
前記ＩＬ−６アンタゴニストが、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒまたはｇｐ１３０のうちの１つに結合する抗体である、請求項２７から２８に記載の使用のためのＩＬ−６アンタゴニスト。
【請求項３０】
前記ＩＬ−６抗体が、シルツキシマブ、オロキズマブ（ＣＤＰ６０３８）、エルシリモマブ、ＢＭＳ−９４５４２９（ＡＬＤ５１８）、ＭＨ−１６６およびシルクマブ（ＣＮＴＯ１３６）から選択される、請求項２９に記載の使用のためのＩＬ−６アンタゴニスト。
【請求項３１】
前記ＩＬ−６Ｒ抗体が、トシリズマブ、サリルマブ、ＰＭ−１およびＡＵＫ１２−２０から選択される、請求項２９に記載の使用のためのＩＬ−６アンタゴニスト。
【請求項３２】
前記ｇｐ１３０抗体がＡＭ６４である、請求項２９に記載の使用のためのＩＬ−６アンタゴニスト。
【請求項３３】
前記ＩＬ−６アンタゴニストが別の抗癌療法と組み合わせて使用される、請求項２７から３２のいずれかに記載の使用のためのＩＬ−６アンタゴニスト。
【請求項３４】
前記別の抗癌療法が、免疫エフェクター細胞として内因性ＮＫ細胞を利用する、請求項３３に記載の使用のためのＩＬ−６アンタゴニスト。
【請求項３５】
前記別の抗癌療法、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である、請求項３３または３４に記載の使用のためのＩＬ−６アンタゴニスト。
【請求項３６】
前記癌が血液癌である、請求項２７から３６のいずれかに記載の使用のためのＩＬ−６アンタゴニスト。
【請求項３７】
前記血液癌が、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ホジキンリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫およびＢ細胞リンパ腫を含む非ホジキンリンパ腫、無症候性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、または軽鎖骨髄腫である、請求項３６に記載の使用のためのＩＬ−６アンタゴニスト。
【請求項３８】
癌を治療する方法であって、患者に有効量のＮＫ細胞とＩＬ−６アンタゴニストとの組み合わせを投与する工程を含む、方法。
【請求項３９】
前記癌がＩＬ−６受容体を発現する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記癌がＰＤＬ−１および／またはＰＤＬ−２を発現する、請求項３８から３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記ＮＫ細胞または細胞株が、予め結合されたＩＬ−６アンタゴニストとともに提供される、請求項３８から４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
前記ＩＬ−６アンタゴニストが、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒまたはｇｐ１３０のうちの１つに結合する抗体である、請求項３８から４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＩＬ−６抗体が、シルツキシマブ、オロキズマブ（ＣＤＰ６０３８）、エルシリモマブ、ＢＭＳ−９４５４２９（ＡＬＤ５１８）、ＭＨ−１６６およびシルクマブ（ＣＮＴＯ  １３６）から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＩＬ−６Ｒ抗体が、トシリズマブ、サリルマブ、ＰＭ−１およびＡＵＫ１２−２０から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記ｇｐ１３０抗体がＡＭ６４である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
別の抗癌療法と組み合わせて使用される、請求項３８から４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記別の抗癌療法が、免疫エフェクター細胞として内因性ＮＫ細胞を利用する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記別の抗癌療法が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である、請求項４６または４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記癌が血液癌である、請求項３８から４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
前記血液癌が、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ホジキンリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫およびＢ細胞リンパ腫を含む非ホジキンリンパ腫、無症候性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）または軽鎖骨髄腫である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＮＫ細胞または細胞株が、１つまたはそれ以上のチェックポイント抑制性受容体の発現を減少するように遺伝子改変されている、請求項３８から５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
前記チェックポイント抑制性受容体が、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ−３）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＩＧＩＴおよびＴＩＭ−３から選択される、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
前記ＮＫ細胞または細胞株が、変異体ＴＲＡＩＬリガンドを発現するように遺伝子改変されている、請求項３８から５２のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
前記変異体ＴＲＡＩＬリガンドが、ＴＲＡＩＬ受容体（例えば、ＤＲ４および／またはＤＲ５）に対して増大した親和性を有する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記変異体ＴＲＡＩＬリガンドが、デコイＴＲＡＩＬ受容体に対して減少した親和性を有する、請求項５３または５４のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
前記ＮＫ細胞または細胞株がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する、請求項３８から５５のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】
前記ＣＡＲが二重特異性ＣＡＲである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記二重特異性ＣＡＲが、１つの細胞型上の２つのリガンドに結合する、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記二重特異性ＣＡＲが、２つの異なる細胞型のそれぞれ上の１つのリガンドに結合する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＣＡＲまたは二重特異性ＣＡＲに対する１つまたは複数の前記リガンドが癌細胞上で発現される、請求項５８または５９のいずれかに記載の方法。
【請求項６１】
前記二重特異性ＣＡＲに対する前記リガンドが、両方とも癌細胞上で発現される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記二重特異性ＣＡＲに対する前記リガンドが癌細胞および免疫エフェクター細胞上に発現される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＮＫ細胞または細胞株が、ＩＬ−６受容体の発現を減少するように遺伝子改変されている、請求項３８から６２のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
前記ＮＫ細胞系がＫＨＹＧ−１である、請求項３８から６３のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
ＮＫ細胞または細胞株およびＩＬ−６アンタゴニストを含み、ＮＫ細胞は本明細書に記載されるように必要に応じて改変されている、医薬組成物。
【請求項６６】
ＩＬ−６受容体の機能が低下しているかまたは存在しないように改変された、ＮＫ細胞または細胞株。
【請求項６７】
ＩＬ−６Ｒの発現が減少されているかまたは存在しないように遺伝子改変された、請求項６６に記載のＮＫ細胞または細胞株。
【請求項６８】
ヒト患者において、（ｉ）ＩＬ−６受容体発現多発性骨髄腫および（ｉｉ）ＩＬ−６受容体発現白血病から選択される癌を治療する方法であって、ＮＫ細胞とＩＬ−６を中和する抗体との組合せの有効量を該患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項６９】
前記抗体が、シルツキシマブ、オロキズマブ（ＣＤＰ６０３８）、エルシリモマブ、ＢＭＳ−９４５４２９（ＡＬＤ５１８）、ＭＨ−１６６およびシルクマブ（ＣＮＴＯ１３６）から選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＮＫ細胞がＫＨＹＧ−１である、請求項６８または６９のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の治療のために、エフェクターとしてナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または細胞株を使用する療法に関する。それは、特に血液癌の治療のための組み合わせ療法、治療方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な理学療法、製薬療法、およびその他の療法への多大な投資にもかかわらず、ヒトの癌は依然としてあらゆる年齢層にわたる重大な死亡原因となっている。
【０００３】
一例として、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、骨髄発生に方向づけられた前駆細胞を含む造血器悪性腫瘍であり、成人（９０％）および小児（１５〜２０％）の両方において急性白血病のかなりの割合を占める（Ｈｕｒｗｉｔｚ、Ｍｏｕｎｃｅら、１９９５年；Ｌｏｗｅｎｂｅｒｇ、Ｄｏｗｎｉｎｇら、１９９９年）。患者の８０％が標準的な化学療法で寛解を達成しているにもかかわらず（Ｈｕｒｗｉｔｚ、Ｍｏｕｎｃｅら、１９９５；Ｒｉｂｅｉｒｏ、Ｒａｚｚｏｕｋら、２００５）、最小残存病変（ＭＲＤ）からの再発率が高いため生存率は依然として不十分である。５年生存率は、小児で６０％（Ｒｕｂｎｉｔｚ  ２０１２年）、６５歳未満の成人で４０％（Ｌｏｗｅｎｂｅｒｇ、Ｄｏｗｎｉｎｇら、１９９９年）、６５歳以上の成人で１０％（ＦｅｒｒａｒａおよびＳｃｈｉｆｆｅｒ  ２０１３年）と年齢に依存する。患者に適切な造血細胞ドナーがあるならば、これらの結果は改善されることができるが、多くは持っておらず、治療への代替のアプローチの必要性が強調される。
【０００４】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、細胞傷害性リンパ球であり、ナチュラルキラーＴ（ＮＫ−Ｔ）細胞とは異なる表現型およびエフェクター機能を有する。例えば、ＮＫ−Ｔ細胞はＣＤ３およびＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）の両方を発現するが、ＮＫ細胞は発現しない。ＮＫ細胞は一般にマーカーＣＤ１６およびＣＤ５６を発現することが見出されており、ここでＣＤ１６はＦｃ受容体として機能し、そして以下に考察される抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する。この点でＫＨＹＧ−１は注目に値する例外である。
【０００５】
ＮＫ細胞は天然に細胞傷害性であるにもかかわらず、細胞傷害性が増加したＮＫ細胞株が開発されてきた。ＮＫ−９２およびＫＨＹＧ−１は、広く研究されており癌治療において有望であることが示されている２つのＮＫ細胞株を表す（Ｓｗｉｆｔら、２０１１年；Ｓｗｉｆｔら、２０１２年）。
【０００６】
癌治療における使用のための養子細胞免疫療法は、一般に、天然および改変Ｔ細胞の患者への投与を含む。Ｔ細胞は、特定の標的癌細胞に特異的に結合する受容体および／またはリガンドを発現するように、様々な方法で（例えば、遺伝的に）改変することができる。癌細胞抗原に特異的な高親和性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を用いたＴ細胞のトランスフェクションは、高度に反応性の癌特異的Ｔ細胞応答を引き起こし得る。この免疫療法アプローチの主な制限は、自己由来のエクスビボ拡大（expansion）のためにＴ細胞を患者から入手しなければならないか、あるいは細胞を患者に移した直後の免疫学的根絶またはいくつかの場合では移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発症を回避するためにＭＨＣ適合Ｔ細胞を使用しなければならないことである。さらに、首尾よく移入されたＴ細胞はしばしば循環中で長期間生存し、治療から生じる持続的な副作用を制御することを困難にする。
【０００７】
ハプロタイプ移植において、移植片対白血病の効果は、ＫＩＲ抑制性受容体−リガンドのミスマッチがある場合にはＮＫ細胞によって媒介されると考えられており、それはＡＭＬの治療における生存率の改善をもたらし得る（Ｒｕｇｇｅｒｉ、Ｃａｐａｎｎｉら、２００２年；Ｒｕｇｇｅｒｉ、Ｍａｎｃｕｓｉら、２００５年）。さらに、迅速なＮＫ回復は、ＡＭＬにおいてハプロタイプＴ枯渇造血細胞移植（ＨＣＴ）を受けている患者におけるより良好な結果およびより強い移植片対白血病（ＧＶＬ）効果と関連する（Ｓａｖａｎｉ、Ｍｉｅｌｋｅら、２００７年）。他の試験では、成人（Ｍｉｌｌｅｒ、Ｓｏｉｇｎｉｅｒら、２００５年）および小児（Ｒｕｂｎｉｔｚ、Ｉｎａｂａら、２０１０年）においてＡＭＬを治療するためにエクスビボで拡大させたハプロタイプ一致ＮＫ細胞が用いられた。
【０００８】
いくつかの恒久的なＮＫ細胞株が樹立されており、最も注目すべきは、ＣＤ１６（Ｆｃγ受容体ＩＩＩ）を除いて、典型的なＮＫ細胞マーカーを発現する非ホジキンリンパ腫患者に由来するＮＫ−９２（上記）である。ＮＫ−９２は広範な前臨床試験を受けており、活性化ＮＫ細胞およびリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞と比較して広範囲の腫瘍に対して優れた溶解を示す（Ｇｏｎｇ、Ｍａｋｉら、１９９４年）。初代ＡＭＬに対するＮＫ−９２細胞の細胞傷害性が確立されている（Ｙａｎ、Ｓｔｅｉｎｈｅｒｚら、１９９８年）。
【０００９】
別のＮＫ細胞株、ＫＨＹＧ−１は臨床使用のための潜在的な候補として同定されている（Ｓｕｃｋら、２００５年）が、細胞傷害性が低下しているのでＮＫ−９２よりも注目されていない。ＫＨＹＧ−１細胞は予め活性化されていることが知られている。内在性ＮＫ細胞とは異なり、ＫＨＹＧ−１細胞は常に極性化されているため、細胞傷害性が高まり、外部刺激に対する反応が早くなる。ＮＫ−９２細胞は、ＫＨＹＧ−１細胞よりも高いベースライン細胞傷害性を有する。
【００１０】
Ｃｉｆａｌｄｉら（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ，２０１５年１１月；６７（１１）：３０３７−４６）は、ＩＬ−６がマウスおよびヒト関節炎患者においてＮＫ細胞の細胞傷害性を減少させることを報告した。Ｋａｎｇら（Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ．２０１４年１０月１０日；２９（１０）：２１７６−８９）は、子宮内膜症患者の腹水中のＮＫ細胞傷害性がＩＬ−６中和抗体を用いて逆転できることを示した。癌治療においてＩＬ−６／ＳＴＡＴ３経路を標的とすることは、Ｗａｎｇら（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１３年１０月７日；８（１０）：ｅ７５７８８）により推測されており、証明データは提供されていない。さらに、ＩＬ−６は、特定の骨髄腫細胞株におけるＰＤ−Ｌ１発現のアップレギュレーションにおいて役割を果たすことも以前に示されている（Ｔａｍｕｒａら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２０１３年２月；２７（２）：４６４−７２）。別として、他のものは、ＩＬ−６アンタゴニストが腫瘍制御の低下をもたらしたことを報告している（Ｉｄｏｒｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１７年５月；６６（５）：６６７−６７１）。
【００１１】
そのようなＮＫ細胞を使用して、そして一般にＮＫ細胞を使用して、代替のそして好ましくは改善された癌療法に対する必要性が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、ＮＫ細胞のみに依存する治療法よりも効果的である（例えば細胞傷害性が高い）、ＮＫ細胞およびＮＫ細胞株を使用する組み合わせ療法を提供することである。より特定の実施形態は、同定された癌（例えば白血病などの血液癌）の治療法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本明細書においてＮＫ細胞と組み合わせてＩＬ−６に対するアンタゴニストを使用する癌の治療方法が提供される。細胞は患者のものであり得、その場合、介入(intervention)はアンタゴニストを投与することを含み得、したがって患者のすでに存在するＮＫ細胞に依拠する。細胞は治療の一部として投与されてもよく、その場合それらは自己由来、同種異系、初代細胞または細胞株などであってもよい。一緒になってこれらの治療はＮＫ細胞およびアンタゴニストの両方が必要であるという点で組み合わせと呼ばれる。
【００１４】
本発明は、アンタゴニストを投与する工程を含む治療方法を提供し、アンタゴニストおよび細胞を投与する工程を含む、ならびに細胞（抗体が、例えば関連する治療の一部として、別々に存在する）を投与する工程を含む。本発明は、癌の治療に使用するための組み合わせを提供する。本発明はさらに、細胞とアンタゴニストとの両方を含む組成物を提供する。
【００１５】
さらに、本発明は、ＩＬ−６受容体の発現が減少するかまたは存在しないように改変されたＮＫ細胞を提供する。
【００１６】
本明細書中に記載されるＮＫ細胞を使用して本発明に従って特に治療可能な疾患には、癌（例えば血液癌（例えば白血病、特に急性骨髄性白血病および骨髄腫））が挙げられる。特にヒトの腫瘍および癌は治療することができる。本明細書における腫瘍への言及は新生物への言及を含む。
【００１７】
本発明は、添付の図面を参照して特定の実施形態において説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ＬＩＲ２遺伝子標的領域のＤＮＡ配列を示し、そしてｇＲＮＡフランキング領域をマークする。
【図２】図２は、ＣＴＬＡ４遺伝子標的領域のＤＮＡ配列を示し、そしてｇＲＮＡフランキング領域をマークする。
【図３】図３は、トランスフェクションに用いたｇＲＮＡ構築物（発現ベクター）を示す。
【図４】図４は、トランスフェクションの前および後の、親および変異型ＬＩＲ２  ＤＮＡのゲル電気泳動バンドを示す。
【図５】図５は、トランスフェクション前および後の、親および変異型ＣＴＬＡ４  ＤＮＡのゲル電気泳動バンドを示す。
【図６Ａ】図６Ａは、エレクトロポレーションを用いた成功したＣＤ９６ノックダウンを示すＦＡＣＳプロットである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、エレクトロポレーションを用いた成功したＣＤ９６ノックダウンを示すＦＡＣＳプロットである。
【図７】図７は、様々なＥ：Ｔ比でのＫ５６２細胞に対するＣＤ９６ノックダウンＫＨＹＧ−１細胞の細胞傷害性の増加を示す棒グラフである。
【図８】図８は、ＮＫ−９２細胞におけるＣＤ３２８（Ｓｉｇｌｅｃ−７）のノックダウンを示す。
【図９】図９は、ＣＤ３２８（Ｓｉｇｌｅｃ−７）ノックダウンによるＮＫ細胞の細胞傷害性の増強を示す。
【図１０】図１０は、ＫＨＹＧ−１細胞におけるＴＲＡＩＬのベースライン発現のＦＡＣＳプロットを示す。
【図１１】図１１は、ＫＨＹＧ−１細胞のトランスフェクション後のＴＲＡＩＬおよびＴＲＡＩＬ改変体の発現のＦＡＣＳプロットを示す。
【図１２】図１２は、ＫＨＹＧ−１細胞のトランスフェクション後のＣＤ１０７ａの発現のＦＡＣＳプロットを示す。
【図１３】図１３は、細胞生存率に対するＴＲＡＩＬおよびＴＲＡＩＬ改変体でのＫＨＹＧ−１細胞のトランスフェクションの効果を示す。
【図１４】図１４は、ＫＨＹＧ−１細胞およびＮＫ−９２細胞の両方に対するＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１およびＤｃＲ２のベースライン発現のＦＡＣＳプロットを示す。
【図１５】図１５、１６および１７は、３つの標的細胞集団：それぞれＫ５６２、ＲＰＭＩ８２２６およびＭＭ１．Ｓのアポトーシスに対するＫＨＹＧ−１細胞におけるＴＲＡＩＬまたはＴＲＡＩＬ改変体の発現の効果を示す。
【図１６】図１５、１６および１７は、３つの標的細胞集団：それぞれＫ５６２、ＲＰＭＩ８２２６およびＭＭ１．Ｓのアポトーシスに対するＫＨＹＧ−１細胞におけるＴＲＡＩＬまたはＴＲＡＩＬ改変体の発現の効果を示す。
【図１７】図１５、１６および１７は、３つの標的細胞集団：それぞれＫ５６２、ＲＰＭＩ８２２６およびＭＭ１．Ｓのアポトーシスに対するＫＨＹＧ−１細胞におけるＴＲＡＩＬまたはＴＲＡＩＬ改変体の発現の効果を示す。
【図１８】図１８は、それぞれＲＰＭＩ８２２６細胞およびＭＭ１．Ｓ細胞におけるＤＲ５発現の２つのＦＡＣＳプロットを示し、ここでＤＲ５発現に対するボルテゾミブ処理の効果を示す。
【図１９】図１９は、ＴＲＡＩＬ改変体を含む／含まないＫＨＹＧ−１細胞と共培養したボルテゾミブ前処理した／処理なしのＭＭ１．Ｓ細胞におけるアポトーシスのＦＡＣＳプロットを示す。
【図２０】図２０は、１００ｎＭ  ＣＭＡで２時間処理したＫＨＹＧ−１細胞におけるパーフォリン発現レベルのＦＡＣＳプロットを示す。
【図２１】図２１は、１００ｎＭのＣＭＡまたはビヒクルで処理した後のＫＨＹＧ−１細胞生存率のＦＡＣＳプロットを示す。
【図２２】図２２は、ＴＲＡＩＬ改変体を含む／含まないＫＨＹＧ−１細胞と共培養され、ＣＭＡでの前処理あり／なしのＭＭ１．Ｓ細胞におけるアポトーシスのＦＡＣＳプロットを示す。
【図２３】図２３は、ＣＤ９６−ｓｉＲＮＡおよび／またはＴＲＡＩＬ改変体発現を有するＫＨＹＧ−１細胞と共培養したＫ５６２細胞におけるアポトーシスのＦＡＣＳプロットを示す。
【図２４】図２４は、ＣＤ９６−ｓｉＲＮＡおよび／またはＴＲＡＩＬ改変体発現を有するＫＨＹＧ−１細胞と共培養したＭＭ１．Ｓ細胞におけるアポトーシスのＦＡＣＳプロットを示す。
【図２５】図２５は、ＫＨＹＧ−１細胞と共培養したかまたは以前に１２時間ＩＬ−６に曝露したＫＨＹＧ−１細胞と共培養したＲＰＭＩ８２２６細胞におけるアポトーシスのＦＡＣＳプロットを示す。
【図２６】図２６は、ＫＨＹＧ−１細胞と共培養した、１２時間のＩＬ−６への事前の曝露あり／なしのＲＰＭＩ８２２６細胞におけるアポトーシスのＦＡＣＳプロットを示す。
【図２７】図２７は、ＫＨＹＧ−１細胞と共培養したかまたは以前に１２時間ＩＬ−６に曝露したＫＨＹＧ−１細胞と共培養したＭＭ１．Ｓ細胞におけるアポトーシスのＦＡＣＳプロットを示す。
【図２８】図２８は、ＫＨＹＧ−１細胞と共培養した、１２時間のＩＬ−６への事前の曝露あり／なしのＭＭ１．Ｓ細胞におけるアポトーシスのＦＡＣＳプロットを示す。
【図２９】図２９は、ＫＨＹＧ−１細胞と共培養したかまたは以前に１２時間ＩＬ−６に曝露したＫＨＹＧ−１細胞と共培養したＫ５６２細胞におけるアポトーシスのＦＡＣＳプロットを示す。
【図３０】図３０は、ＫＨＹＧ−１細胞と共培養した、１２時間のＩＬ−６への事前の曝露あり／なしのＫ５６２細胞におけるアポトーシスのＦＡＣＳプロットを示す。
【図３１】図３１および３２は、ＫＨＹＧ−１細胞上のＩＬ−６Ｒ（ＣＤ１２６）発現のＦＡＣＳプロットを示す。
【図３２】図３１および３２は、ＫＨＹＧ−１細胞上のＩＬ−６Ｒ（ＣＤ１２６）発現のＦＡＣＳプロットを示す。
【図３３】図３３および３４は、ＫＨＹＧ−１細胞上のｇｐ１３０（ＣＤ１３０）発現のＦＡＣＳプロットを示す。
【図３４】図３３および３４は、ＫＨＹＧ−１細胞上のｇｐ１３０（ＣＤ１３０）発現のＦＡＣＳプロットを示す。
【図３５】図３５は、ＮＫ−２細胞上のＩＬ−６Ｒ（ＣＤ１２６）発現のＦＡＣＳプロットを示す。
【図３６】図３６は、ＮＫ−９２細胞上のｇｐ１３０（ＣＤ１３０）発現のＦＡＣＳプロットを示す。
【図３７】図３７は、Ｕ２６６細胞上のＩＬ−６Ｒ（ＣＤ１２６）およびｇｐ１３０（ＣＤ１３０）発現のＦＡＣＳプロットを示す。
【図３８】図３８は、ＲＰＭＩ８２２６細胞上のＩＬ−６Ｒ（ＣＤ１２６）およびｇｐ１３０（ＣＤ１３０）発現のＦＡＣＳプロットを示す。
【図３９】図３９は、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞上のＩＬ−６Ｒ（ＣＤ１２６）およびｇｐ１３０（ＣＤ１３０）発現のＦＡＣＳプロットを示す。
【図４０】図４０は、ＫＭＳ１１細胞上のＩＬ−６Ｒ（ＣＤ１２６）およびｇｐ１３０（ＣＤ１３０）発現のＦＡＣＳプロットを示す。
【図４１】図４１は、ＭＭ１．Ｓ細胞上のＩＬ−６Ｒ（ＣＤ１２６）およびｇｐ１３０（ＣＤ１３０）発現のＦＡＣＳプロットを示す。
【図４２】図４２および４３は、Ｋ５６２細胞上のＩＬ−６Ｒ（ＣＤ１２６）発現のＦＡＣＳプロットを示す。
【図４３】図４２および４３は、Ｋ５６２細胞上のＩＬ−６Ｒ（ＣＤ１２６）発現のＦＡＣＳプロットを示す。
【図４４】図４４は、Ｋ５６２細胞上のｇｐ１３０（ＣＤ１３０）発現のＦＡＣＳプロットを示す。
【図４５】図４５は、４８時間のＩＬ−６の存在下または非存在下でのＲＰＭＩ８２２６細胞上のＰＤ−Ｌ１発現のＦＡＣＳプロットを示す。
【図４６】図４６は、４８時間のＩＬ−６の存在下または非存在下でのＲＰＭＩ８２２６細胞上のＰＤ−Ｌ２発現のＦＡＣＳプロットを示す。
【図４７】図４７は、４８時間のＩＬ−６の存在下または非存在下でのＮＣＩ−Ｈ９２９細胞上のＰＤ−Ｌ１発現のＦＡＣＳプロットを示す。
【図４８】図４８は、４８時間のＩＬ−６の存在下または非存在下でのＮＣＩ−Ｈ９２９細胞上のＰＤ−Ｌ２発現のＦＡＣＳプロットを示す。
【図４９】図４９および５０は、４８時間のＩＬ−６の存在下または非存在下でのＭＭ１．Ｓ細胞上のＰＤ−Ｌ１発現のＦＡＣＳプロットを示す。
【図５０】図４９および５０は、４８時間のＩＬ−６の存在下または非存在下でのＭＭ１．Ｓ細胞上のＰＤ−Ｌ１発現のＦＡＣＳプロットを示す。
【図５１】図５１および５２は、４８時間のＩＬ−６の存在下または非存在下でのＭＭ１．Ｓ細胞上のＰＤ−Ｌ２発現のＦＡＣＳプロットを示す。
【図５２】図５１および５２は、４８時間のＩＬ−６の存在下または非存在下でのＭＭ１．Ｓ細胞上のＰＤ−Ｌ２発現のＦＡＣＳプロットを示す。
【図５３】図５３および５４は、４８時間のＩＬ−６の存在下または非存在下でのＵ２６６細胞上のＰＤ−Ｌ１発現のＦＡＣＳプロットを示す。
【図５４】図５３および５４は、４８時間のＩＬ−６の存在下または非存在下でのＵ２６６細胞上のＰＤ−Ｌ１発現のＦＡＣＳプロットを示す。
【図５５】図５５および５６は、４８時間のＩＬ−６の存在下または非存在下でのＵ２６６細胞上のＰＤ−Ｌ２発現のＦＡＣＳプロットを示す。
【図５６】図５５および５６は、４８時間のＩＬ−６の存在下または非存在下でのＵ２６６細胞上のＰＤ−Ｌ２発現のＦＡＣＳプロットを示す。
【図５７】図５７〜６０は、４８時間のＩＬ−６遮断抗体の存在下または非存在下でのＵ２６６細胞上のＰＤ−Ｌ１発現のＦＡＣＳプロットを示す。
【図５８】図５７〜６０は、４８時間のＩＬ−６遮断抗体の存在下または非存在下でのＵ２６６細胞上のＰＤ−Ｌ１発現のＦＡＣＳプロットを示す。
【図５９】図５７〜６０は、４８時間のＩＬ−６遮断抗体の存在下または非存在下でのＵ２６６細胞上のＰＤ−Ｌ１発現のＦＡＣＳプロットを示す。
【図６０】図５７〜６０は、４８時間のＩＬ−６遮断抗体の存在下または非存在下でのＵ２６６細胞上のＰＤ−Ｌ１発現のＦＡＣＳプロットを示す。
【図６１】図６１〜６４は、４８時間のＩＬ−６遮断抗体の存在下または非存在下でのＵ２６６細胞上のＰＤ−Ｌ２発現のＦＡＣＳプロットを示す。
【図６２】図６１〜６４は、４８時間のＩＬ−６遮断抗体の存在下または非存在下でのＵ２６６細胞上のＰＤ−Ｌ２発現のＦＡＣＳプロットを示す。
【図６３】図６１〜６４は、４８時間のＩＬ−６遮断抗体の存在下または非存在下でのＵ２６６細胞上のＰＤ−Ｌ２発現のＦＡＣＳプロットを示す。
【図６４】図６１〜６４は、４８時間のＩＬ−６遮断抗体の存在下または非存在下でのＵ２６６細胞上のＰＤ−Ｌ２発現のＦＡＣＳプロットを示す。
【図６５】図６５は、ＩＬ−２へのＫＨＹＧ−１細胞曝露後のＳＴＡＴ３−Ｓ７２７、ＳＴＡＴ３−Ｔｙｒ７０５、総ＳＴＡＴ３、ＳＨＰ−１、ＳＨＰ−２およびＰ４４／４２のゲル電気泳動を示す。
【図６６】図６６は、ＩＬ−６へのＫＨＹＧ−１細胞曝露後のＳＴＡＴ３−Ｓ７２７、ＳＴＡＴ３−Ｔｙｒ７０５、総ＳＴＡＴ３、ＳＨＰ−１、ＳＨＰ−２、Ｐ４４／４２および総ｐ４４／４２のゲル電気泳動を示す。
【図６７】図６７は、ＩＬ−２およびＩＬ−６へのＫＨＹＧ−１細胞曝露後のＰ４４／４２、総ｐ４４／４２およびアクチンのゲル電気泳動を示す。
【図６８】図６８は、単独培養した、および２４時間Ｋ５６２、Ｕ９３７、ＨＬ６０、Ｒａｊｉ、ＲＰＭＩ８２２６、Ｕ２６６またはＭＭ１．Ｓ細胞と共培養した後の、ＫＨＹＧ−１細胞のＰＤ−１発現のＦＡＣＳプロットを示す。
【図６９】図６９は、中和ＩＬ−６がＵ２６６細胞に対するＫＨＹＧ−１細胞の細胞傷害性を改善することを示す。
【図７０】図７０は、ＩＬ−６がＮＫＧ２Ｄ発現を減少させること（７０Ａ）およびＮＫＧ２Ａ発現を増加させること（７０Ｂ）によってＫＨＹＧ−１細胞の細胞傷害性を直接阻害することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
したがって、本発明は、組み合わせ療法においてナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはＮＫ細胞株を使用する。以下に詳細に記載されるように、ＮＫ細胞およびＮＫ細胞株はまた、そのような療法において癌に対するそれらの細胞傷害性活性を増大させるように遺伝的に改変され得る。一緒に、初代ＮＫ細胞およびＮＫ細胞株は、（文脈が他を必要としない限り）ＮＫ細胞と呼ばれる。本明細書に記載のＮＫ細胞はさらに、単独で、またはＮＫ細胞との組み合わせで、ＩＬ−６シグナル伝達のアンタゴニストを使用する。
【００２０】
したがって、本発明は、とりわけ、癌を治療するのに使用するためのＩＬ−６アンタゴニストと組み合わせたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または細胞株を提供する。癌は、適切には、ＩＬ−６受容体を発現し、かつ／または１つまたはそれ以上のチェックポイント抑制性受容体リガンド（例えば、ＰＤＬ−１および／またはＰＤＬ−２）を発現する。
【００２１】
同様に、本発明は、有効量のＮＫ細胞とＩＬ−６アンタゴニストとの組み合わせを患者に投与する工程を含む、癌を治療する方法を提供する。なお、癌は、適切には、ＩＬ−６受容体を発現し、かつ／または１つまたはそれ以上のチェックポイント抑制性受容体リガンド（例えばＰＤＬ−１および／またはＰＤＬ−２）を発現する。
【００２２】
ＮＫ細胞または細胞株は、必要に応じて、予め結合したＩＬ−６アンタゴニストと共に提供される。アンタゴニストおよび細胞はまた、予め結合されていないように、単一の製剤で、または別々の製剤で提供され得る。
【００２３】
この組み合わせ療法はまた、免疫エフェクター細胞として内因性ＮＫ細胞を利用するもののような、他の別個の抗癌療法に対するアジュバントとしても使用され得る。したがって、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を含む癌治療は、本明細書に記載の方法および組成物を使用することによって補足することができる。
【００２４】
本発明に従って使用するためのＮＫ細胞または細胞株は、ＩＬ−６受容体の発現を減少するように遺伝子改変することができる。別として、ＮＫ細胞株は、既知の株（例えば以下の例で使用されるＮＫ−９２またはＫＨＹＧ−１）から選択され得る。細胞または細胞株は、細胞表面Ｅ−セレクチンリガンドの高レベルの発現を示す。Ｅ−セレクチンリガンド発現は、ＨＥＣＡ−４５２抗体を用いて決定される。特定の実施形態では、ＮＫ細胞または細胞株は、Ｅ−セレクチンリガンドの高レベルの細胞表面発現を示す。好ましくは、Ｅ−セレクチンリガンドの高レベルの細胞表面発現は、アイソタイプ対照抗体結合と比較してＨＥＣＡ−４５２抗体結合の少なくとも２、４、６、８、または１０倍の増加によって示される。この発現は、例えばフローサイトメトリーによって測定され得る。ＫＨＹＧ−１細胞株は、ＮＫ−９２細胞などの他のＮＫ細胞株と比較して高レベルのＨＥＣＡ−４５２抗原を発現するそのような細胞株の１つである。細胞を改変して高レベルのＥ−セレクチンリガンドを発現させる他の方法には、例えば１）ＧＤＰ−フコース基質およびα１，３フコシルトランスフェラーゼＶＩ酵素による化学処理；および２）ＦＵＴ６またはＦＵＴ７の発現または過剰発現；が挙げられる。さらに、細胞株は、ＴＲＡＩＬ受容体、例えばＤＲ４またはＤＲ５の低レベルの細胞表面発現を示し得る。例えば、ＫＨＹＧ−１細胞は、ＮＫ−９２細胞と比較して低レベルのＤＲ４またはＤＲ５を発現する。細胞表面ＴＲＡＩＬ受容体発現は、実施例に詳述されているように、例えばフローサイトメトリーを使用して定量され得る。
【００２５】
本明細書でさらに提供されるのは、ＮＫ細胞がすでに患者に存在する治療法である。したがって、本発明は、その癌の細胞がＩＬ−６受容体を発現する、癌の治療に使用するためのＩＬ−６アンタゴニスト、および有効量のＩＬ−６アンタゴニストを投与する工程を含む癌の治療方法を提供する。
【００２６】
実施例においてより詳細に記載されるように、この組み合わせは、インビトロでの癌モデルにおいて、そして特に癌がＩＬ−６受容体を発現する場合に有効であることが見出された。さらに、１つまたはそれ以上のチェックポイント抑制性受容体リガンドを（例えば、治療に応答して、または治療の過程で）発現する癌が、本発明によって治療可能である。特定の例において、ＰＤＬ−１および／またはＰＤＬ−２は、本発明の組み合わせを用いて治療された癌によって発現された。
【００２７】
本発明はまた、ＮＫ細胞または細胞株およびＩＬ−６アンタゴニストを含む組成物を提供する。組成物において、細胞は、必要に応じて、本明細書の他の箇所に記載されている１つまたはそれ以上または全部の改変に従って改変されている。
【００２８】
本発明の実施において、ＩＬ−６のアンタゴニストは、ＩＬ−６シグナル伝達を遮断することによって作用し、そしてそれ故にＩＬ−６活性を阻害する。
【００２９】
本発明において有用なＩＬ−６アンタゴニストの例には、適切には以下に定義されるような抗体が含まれる。これらは、例えば、ＩＬ−６抗体、ＩＬ−６Ｒ抗体およびｇｐ１３０抗体を含む。これらの抗体は、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、またはｇｐ１３０に結合して、ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒとの間、またはＩＬ−６Ｒとｇｐ１３０との間の結合を阻害する。
【００３０】
したがって、抗体はＩＬ−６シグナル伝達を遮断し、ＩＬ−６活性を阻害し、それ故ＮＫ細胞および／または標的（癌）細胞におけるＩＬ−６シグナル伝達を減少させる。
【００３１】
それ故、有用な抗体は、ＩＬ−６シグナルならびにＮＫ細胞／標的に対する下流効果を減少または停止させる。本発明の特定の実施形態の特徴は、ＮＫ細胞に対する直接のＩＬ−６作用を遮断することにおける第１の効果（ＩＬ−６はそうでなければＮＫ活性を低下させる）に加えて、標的（癌）細胞に対するＩＬ−６作用の効果を遮断することにおける第２の効果があることである（そうでなければ、ＩＬ−６は、ＮＫ細胞の細胞傷害性活性を弱める標的における応答を促進（promote）または促進（facilitate）する）。具体的には、標的細胞に対するＩＬ−６作用の遮断は、標的上のチェックポイント抑制性受容体リガンドの発現を妨げることが示された。したがって、標的はＮＫ細胞の細胞傷害性に対してより脆弱である。
【００３２】
本発明の組み合わせ療法での使用に適したＩＬ−６抗体の例には、シルツキシマブ（ＦＤＡ承認抗体）、オロキズマブ（ＣＤＰ６０３８）、エルシリモマブ、ＢＭＳ−９４５４２９（クラザキズマブ／ＡＬＤ５１８）ＭＨ−１６６およびシルクマブ（ＣＮＴＯ１３６）が含まれる。ＩＬ−６Ｒ抗体の例には、トシリズマブ（ＦＤＡ承認抗体）、サリルマブ、ＰＭ−１およびＡＵＫ１２−２０が挙げられる。ｇｐ１３０抗体の例はＡＭ６４である。
【００３３】
本発明の組み合わせ療法での使用に適したさらなるＩＬ−６アンタゴニストには、ｍＡｂ  １３３９（ＯＰ−Ｒ００３）、ＰＦ−０４２３６９２１、ＭＥＤＩ  ５１１７、Ｃ３２６（ＡＭＧ−２２０）、６ａ、ｓｇｐ１３０Ｆｃ（ＦＥ３０１）、ＡＬＸ−００６１、ＮＲＩ、ＳＡＮＴ−７、ＥＲＢＦ、ＥＲＢＡ、ＭＤＬ−Ａ、ＳＣ１４４、ラロキシフェン（ケオキシフェン／ＬＹ１５６７５８／エビスタ）、バゼドキシフェン（ビビアント）およびＬＭＴ−２８が含まれる。
【００３４】
モノクローナル抗体は、例えば、免疫の感作抗原としてＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒまたはｇｐ１３０の１つを用いて、従来の技術によって調製される。
【００３５】
ＩＬ−６Ｒに特異的な抗体は、存在する２種類のＩＬ−６Ｒ、すなわち膜結合型ＩＬ−６Ｒおよび可溶性ＩＬ−６Ｒ（ｓＩＬ−６Ｒ）（これは、細胞膜から分離されている）の一方または両方に結合することができる。ｓＩＬ−６Ｒは、主に細胞膜に結合しているＩＬ−６Ｒの細胞外ドメインからなり、それは膜貫通ドメインおよび／または細胞内ドメインを欠いているという点で膜結合ＩＬ−６Ｒとは異なる。
【００３６】
ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒまたはｇｐ１３０に特異的な抗体は、本発明のＮＫ細胞またはＮＫ細胞株と別々にまたは同時に投与され得る。ＮＫ細胞およびＮＫ細胞株の最適薬物動態は抗体の最適薬物動態とは異なり得るので、ＮＫ細胞およびＮＫ細胞株はＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒまたはｇｐ１３０抗体とは異なるスケジュールで投与され得る。例えば、ＮＫ細胞および細胞株は週に２回投与され得る一方で、本発明の抗体は毎週投与され得る。別の例は、ＮＫ細胞および細胞株が毎週投与され得る一方で、本発明の抗体を２週間毎に投与され得る。
【００３７】
本明細書で使用されるように、他に示さない限り、「抗体」という用語は、抗体の抗原結合フラグメント、すなわち全長抗体によって結合される抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体フラグメント、例えば１つまたはそれ以上のＣＤＲ領域を保持するフラグメントを含む。抗体フラグメントの例としては、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；ダイアボディ；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子（例えば一本鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ））、ナノボディ、および二重特異性抗体などの別々の特異性を有する抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられる。好ましくは、抗体は、抗体に対する個体の免疫応答を低下させるようにヒト化されている。例えば、抗体は、キメラ（例えば、ヒト定常領域を有する非ヒト可変領域）、またはＣＤＲグラフト（例えば、ヒト定常領域および可変領域フレームワーク配列を有する非ヒトＣＤＲ領域）であり得る。
【００３８】
上記のように、現在の所見は、ＮＫ細胞に対する活性に加えて、癌細胞におけるＩＬ−６シグナル伝達が癌細胞膜上のチェックポイント抑制性受容体（ｃＩＲ）リガンドをアップレギュレートすることによりＮＫ細胞の細胞傷害性を間接的に抑制するということである。そして、ＩＬ−６シグナル伝達のこの他の効果もまた防止または減少させることができる。これらのｃＩＲリガンドはＮＫ細胞上のｃＩＲに結合し、ＮＫ細胞の細胞傷害性を弱める。
【００３９】
ＩＬ−６Ｒを発現する癌によって発現されるチェックポイント抑制性受容体リガンドとしては、ｃＩＲ、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ−３）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＩＧＩＴおよびＴＩＭ−３に対するリガンドが挙げられる。
【００４０】
本発明によれば、ＩＬ−６アンタゴニストは単独で有効用量で患者に投与され得る。ＩＬ−６アンタゴニストは、癌の細胞および内因性ＮＫ細胞におけるＩＬ−６シグナル伝達を妨げることができる。ＮＫ細胞の細胞傷害性に対するＩＬ−６の抑制効果は、直接的に（ＮＫ細胞におけるシグナル伝達を介して）、および間接的に（癌細胞におけるシグナル伝達を介して）、ＩＬ−６アンタゴニストによって妨げられる。
【００４１】
したがって、本発明は、ＩＬ−６Ｒを発現するものなどの癌の治療に使用するためのＩＬ−６アンタゴニストを提供する。治療される癌は固形組織腫瘍、例えば肝細胞癌を含む肝腫瘍；肺腫瘍；非小細胞肺がん；膵臓腺癌または膵臓の腺房細胞癌を含む膵臓腫瘍；結腸癌、胃癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）および移行上皮癌（ＴＣＣ、尿路上皮細胞癌としても知られる）を含む腎臓癌；卵巣がん；前立腺がん；乳がん; または子宮頸がん；であり得る。治療される癌は、好ましくは白血病、骨髄腫およびリンパ腫を含む血液癌(blood cancers)とも呼ばれる血液癌(hematological cancers)である。より好ましくは、治療される癌は、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、有毛細胞白血病、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、大顆粒型リンパ性白血病、ホジキンリンパ腫、（Ｔ細胞リンパ腫およびＢ細胞リンパ腫を含む）非ホジキンリンパ腫、無症候性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）または軽鎖骨髄腫から選択される。
【００４２】
本発明の組み合わせ療法は、一般にＮＫ細胞を用いて行うことができ、限定されないが、自己細胞もしくは同種異系細胞、またはＮＫ９２もしくはＫＨＹＧ−１もしくは他のものなどの特定の系統を含む。以下の特定の実施例は、説明目的のためだけに選択されたＮＫ細胞を利用する。治療法は、今記載されているように改変ＮＫ細胞を利用することができる。
【００４３】
そのような改変細胞の第一の例では、チェックポイント抑制性受容体（ｃＩＲ）機能が低下しているかまたは存在しないＮＫ細胞が提供／使用される。したがって、以下の実施例では、ノックアウトされた１つまたはそれ以上のｃＩＲ遺伝子を有するＮＫ細胞が産生される。好ましくは、これらの受容体は特異的ｃＩＲである。さらに好ましくは、これらのチェックポイント抑制性受容体は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ−３）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＩＧＩＴおよび／またはＴＩＭ−３の１つまたはそれ以上あるいは全部である。
【００４４】
１つまたはそれ以上の抑制性受容体シグナル伝達経路がノックアウトされるかまたは機能低下を示す（その結果、やはり抑制性受容体機能が低下するかまたは存在しない）ＮＫ細胞もまた提供／使用され得る。例えば、ＳＨＰ−１、ＳＨＰ−２および／またはＳＨＩＰによって媒介されるシグナル伝達経路は、細胞の遺伝子改変によってノックアウトされる。
【００４５】
得られたＮＫ細胞は改善された細胞傷害性を示し、したがって癌治療、特に血液癌治療、特に白血病および多発性骨髄腫の治療においてより有用である。
【００４６】
１つの実施形態では、細胞がＮＫ細胞に分化する前に遺伝子改変が起こる。例えば、多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ）は、１つまたはそれ以上のチェックポイント抑制性受容体を発現する能力を失うように遺伝子改変され得る。次いで、改変ｉＰＳＣを分化させて、細胞傷害性が増大した遺伝子改変ＮＫ細胞を産生する。
【００４７】
ＮＫ細胞活性化後の前者の発現により、他の抑制性受容体よりもチェックポイント抑制性受容体の機能を低下させることが好ましい。大部分のＫＩＲファミリー、ＮＫＧ２ＡおよびＬＩＲ−２のような正常または「古典的」抑制性受容体はＭＨＣクラスＩに結合し、それ故に主に自己標的化の問題を減少させることに関与している。したがって、好ましくは、チェックポイント抑制性受容体はノックアウトされている。本発明によるこれらの受容体の機能の低下または欠如は、癌細胞が免疫エフェクター機能（そうでなければ受容体が完全に機能的である場合に起こり得る）を抑制するのを妨げる。したがって、本発明のこれらの実施形態の重要な利点は、癌細胞によるそれらの細胞傷害性活性の抑制を受けにくいＮＫ細胞にある。結果として、それらは癌治療に有用である。
【００４８】
本明細書中で使用されるように、抑制性受容体とは、一般に、免疫エフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞）の原形質膜上に発現される受容体をいい、その相補的リガンドと結合して生じる細胞内シグナルが、当該免疫エフェクター細胞の細胞傷害性を低下させる原因となる。これらの抑制性受容体は、免疫エフェクター細胞の「休止」状態および「活性化」状態の両状態の間で発現され、しばしば身体の細胞および組織に対する細胞傷害性応答を抑制する「自己寛容」機構を免疫系に提供することを伴う。一例は抑制性受容体ファミリー「ＫＩＲ」であり、これは、ＮＫ細胞上に発現され、そして身体の健常細胞上に発現されるＭＨＣクラスＩを認識する。
【００４９】
また本明細書中で使用されるように、チェックポイント抑制性受容体は通常上記の抑制性受容体のサブセットと見なされる。しかし、他の抑制性受容体とは異なり、チェックポイント抑制性受容体は、免疫エフェクター細胞（例えばＮＫ細胞）の長期化した活性化および細胞傷害性の間に、より高いレベルで発現される。この現象は、例えば炎症部位における慢性細胞傷害性を弱めるのに有用である。例としては、チェックポイント抑制性受容体ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ９６が含まれ、それらのすべてがＮＫ細胞上で発現される。
【００５０】
したがって、本発明はまた、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ−３）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＩＧＩＴおよびＴＩＭ−３から選択されるチェックポイント抑制性受容体をコードする遺伝子を欠くＮＫ細胞を使用し得る。特定の実施形態では、ＮＫ細胞または細胞株は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ−３）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＩＧＩＴおよびＴＩＭ−３のうち２つまたはそれ以上を欠く。特定の実施形態では、ＮＫ細胞または細胞株は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、またはＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）のうちの２つまたはそれ以上を欠く。特定の実施形態では、ＮＫ細胞または細胞株は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、またはＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）のうちの３つまたはそれ以上を欠く。特定の実施形態では、ＮＫ細胞または細胞株はＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）およびＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）を欠く。
【００５１】
あるいは、ＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ−３）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＩＧＩＴおよびＴＩＭ−３から選択されるチェックポイント抑制性受容体の低下した発現を示し得る。特定の実施形態では、ＮＫ細胞または細胞株は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ−３）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＩＧＩＴおよびＴＩＭ−３のうち２つまたはそれ以上の低下した発現を示す。特定の実施形態では、ＮＫ細胞または細胞株は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、またはＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）のうちの２つまたはそれ以上の低下した発現を示す。特定の実施形態では、ＮＫ細胞または細胞株は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、またはＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）のうちの３つまたはそれ以上の低下した発現を示す。特定の実施形態では、ＮＫ細胞または細胞株は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）およびＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）の低下した発現を示す。ＮＫ細胞は、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ構築物（プラスミドまたはウイルスベクター）、またはアンチセンス技術を使用することによってチェックポイント抑制性受容体の発現を減少させるように改変され得る。
【００５２】
遺伝子を欠くＮＫ細胞は、機能的遺伝子産物が発現されない結果を生じる、完全なもしくは部分的な欠失、変異、またはそれ以外のものを意味し得る。実施形態では、ＮＫ細胞は、抑制性受容体の２つまたはそれ以上のものをコードする遺伝子を欠く。
【００５３】
より具体的な実施形態は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）およびＣＤ２７９（ＰＤ−１）から選択されるチェックポイント抑制性受容体をコードする遺伝子を欠くＮＫ細胞を含む。以下により詳細に記載される特定の実施形態は、ＫＨＹＧ−１の誘導体であるＮＫ細胞を含む。
【００５４】
以下に記載する実施例において、本発明者らは、ＫＨＹＧ−１細胞におけるチェックポイント抑制性受容体ＣＤ９６の発現をノックダウンするためにｓｉＲＮＡを使用することの細胞傷害性効果を確実に示した。ＣＤ９６ノックダウン（ＫＤ）ＫＨＹＧ−１細胞は、様々なエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で白血病細胞に対して増強された細胞傷害性を示した。
【００５５】
他の実施形態では、ＴＲＡＩＬリガンド、または好ましくは変異体（改変体）ＴＲＡＩＬリガンドを発現する改変ＮＫ細胞が提供／使用される。以下の実施例にさらに記載されるように、ＮＫ細胞の細胞傷害性増強改変は、それ故、ＴＲＡＩＬリガンドおよび／または変異型ＴＲＡＩＬリガンド改変体の両方の発現増加も含む。
【００５６】
得られたＮＫ細胞はＴＲＡＩＬ受容体への結合の増加を示し、そしてその結果として、癌、特に血液癌、特に白血病に対する細胞傷害性の増加を示す。
【００５７】
変異体／改変体は、野生型ＴＲＡＩＬのデコイ受容体への結合と比較して、「デコイ」受容体に対する親和性が低い（または事実上親和性がない）ことが好ましい。このようなデコイ受容体は、ＴＲＡＩＬリガンドに結合するが細胞死を開始させる能力を持たず、場合によっては、細胞死シグナル伝達経路に拮抗するように作用するＴＲＡＩＬ受容体のクラスを表す。変異体／改変体ＴＲＡＩＬリガンドは、ＷＯ２００９／０７７８５７に従って調製され得る。
【００５８】
変異体／改変体は、ＴＲＡＩＬ受容体（例えば、ＤＲ４およびＤＲ５）に対する親和性が別々に増加していてもよい。野生型ＴＲＡＩＬは、ＤＲ４について＞２ｎＭ、ＤＲ５について＞５ｎＭ、デコイ受容体ＤｃＲ１について＞２０ｎＭ（ＷＯ２００９／０７７８５７；表面プラズモン共鳴により測定）、またはＤＲ４について約５０〜１００ｎＭ、ＤＲ５につい１〜１０ｎＭ、およびＤｃＲ１について１７５〜２２５ｎＭ（Ｔｒｕｎｅｈ、Ａ．ら、２０００年；等温滴定熱量測定およびＥＬＩＳＡにより測定）のＫＤを有することが典型的に知られている。したがって、ＤＲ４に対する増加した親和性はそれぞれ＜２ｎＭまたは＜５０ｎＭのＫＤとして適切に定義され、一方ＤＲ５に対する増加した親和性はそれぞれ＜５ｎＭまたは＜１ｎＭのＫＤとして適切に定義される。デコイ受容体ＤｃＲ１に対する低下した親和性は、それぞれ＞５０ｎＭまたは＞２２５ｎＭのＫＤとして適切に定義される。いずれの場合においても、ＴＲＡＩＬ改変体／変異体によって示される親和性の増加または減少は、野生型ＴＲＡＩＬによって示されるベースラインの親和性に対するものである。親和性は、野生型ＴＲＡＩＬによって示される親和性と比較して、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２５％、少なくとも５０％または１００％増加する。
【００５９】
ＴＲＡＩＬ改変体は、好ましくは、ＤＲ４、ＤｃＲ１およびＤｃＲ２に対する親和性と比較して、ＤＲ５に対する増加した親和性を有する。好ましくは、親和性は、ＤＲ４、ＤｃＲ１およびＤｃＲ２のうちの１つまたはそれ以上に対するよりも、ＤＲ５に対して少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍、またはさらに１，０００倍以上である。より好ましくは、親和性は、ＤＲ４、ＤｃＲ１およびＤｃＲ２の少なくとも２つ、好ましくは全部に対してよりも、ＤＲ５に対して少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍、またはさらに１０００倍以上である。
【００６０】
本発明のこれらの実施形態の重要な利点は、癌細胞を殺すことにおいてより高い効力を有するＮＫ細胞にある。
【００６１】
この組み合わせ療法は、癌に対する効果においてさらにさらなる進歩の可能性を提供する。
【００６２】
さらなる特定の実施形態は、ＴＲＡＩＬデコイ受容体に対する親和性が減少したかまたは全くない変異体ＴＲＡＩＬリガンドを発現するＮＫ細胞を含む／使用する。好ましくは、このＮＫ細胞はＫＨＹＧ−１の誘導体である。さらなる特定の実施形態は、ＴＲＡＩＬデコイ受容体に対する親和性が減少しているかまたは全くなく、かつＤＲ４および／またはＤＲ５に対する親和性が増加している変異体ＴＲＡＩＬリガンドを発現するＮＫ細胞を含む。特定の実施形態では、ＴＲＡＩＬ受容体改変体は、ヒトＴＲＡＩＬの２アミノ酸変異、Ｄ２６９ＨおよびＥ１９５Ｒを含む。別の実施形態では、ＴＲＡＩＬ受容体改変体は、ヒトＴＲＡＩＬの３アミノ酸変異、Ｇ１３１Ｒ、Ｎ１９９Ｒ、およびＫ２０１Ｈを含む。
【００６３】
以下により詳細に記載される本発明の実施例において、ＮＫ細胞は変異体ＴＲＡＩＬを発現するように遺伝子改変された。改変ＫＨＹＧ−１細胞は変異体ＴＲＡＩＬを発現し、ＮＫ−９２は変異体ＴＲＡＩＬを発現した。この改変ＫＨＹＧ−１細胞は、インビトロで癌細胞株に対して改善された細胞傷害性を示した。ＫＨＹＧ−１細胞はＴＲＡＩＬ受容体（例えばＤＲ４およびＤＲ５）を発現するが、低レベルである。改変ＮＫ細胞の他の好ましい実施形態は、ＴＲＡＩＬ受容体を全くまたは実質的に全く発現しないか、または低レベル（改変ＮＫ細胞の生存率が変異体ＴＲＡＩＬの発現によって悪影響を受けないほど十分に低い）でのみ発現する。
【００６４】
任意の実施形態では、ＴＲＡＩＬまたはＴＲＡＩＬ改変体を発現する改変ＮＫ細胞を用いた癌の治療は、癌細胞上のＴＲＡＩＬ細胞死受容体の発現をアップレギュレートすることができる薬剤を患者に投与することによって増強される。この薬剤は、改変ＮＫ細胞の投与の前に、それと組み合わせて、またはその後に投与することができる。しかし、この薬剤は改変ＮＫ細胞を投与する前に投与されることが好ましい。
【００６５】
好ましい実施形態において、この薬剤は癌細胞上のＤＲ５の発現をアップレギュレートする。この薬剤は必要に応じて化学療法薬（例えばボルテゾミブ）であり得、そして癌におけるＤＲ５発現をアップレギュレートすることができる低用量で投与され得る。
【００６６】
本発明は、ＤＲ５発現をアップレギュレートすることができるいかなる特定の薬剤にも限定されないが、ＤＲ５誘導剤の例としては、ボルテゾミブ、ゲフィチニブ、ピペロングミン、ドキソルビシン、α−トコフェリルスクシネートおよびＨＤＡＣ阻害剤が挙げられる。
【００６７】
本発明の好ましい実施形態によれば、変異体／改変型ＴＲＡＩＬリガンドは、１つまたはそれ以上のＮＫ細胞共刺激ドメイン（例えば、４１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ３ζ／ＣＤ２４７、ＤＡＰ１２またはＤＡＰ１０）に連結される。したがって、改変体の標的細胞上のその受容体への結合は、標的細胞内でのアポトーシスシグナルを促進するとともに、ＮＫ細胞内の細胞傷害性シグナルを刺激する。
【００６８】
本発明のさらなる好ましい実施形態によれば、これらのそれぞれのＮＫ細胞改変に関して上記でより詳細に記載されているように、両方ともチェックポイント抑制性受容体機能を低下し、かつ変異体ＴＲＡＩＬリガンドも発現するＮＫ細胞が提供および／または使用される。さらにより好ましい実施形態では、ＴＲＡＩＬデコイ受容体に対する親和性が減少しているかまたは親和性がなく、かつＫＨＹＧ−１の誘導体であり得る変異体ＴＲＡＩＬリガンドを発現するＮＫ細胞は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ−３）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＩＧＩＴおよびＴＩＭ−３から選択されるチェックポイント抑制性受容体をコードする遺伝子をさらに欠く。
【００６９】
本発明はまた、１つまたはそれ以上のＣＡＲを発現するように改変された、ＮＫ細胞およびＮＫ細胞株、好ましくはＫＨＹＧ−１細胞およびその誘導体を提供および／または使用する。一般に、ＣＡＲは、癌関連抗原（例えばＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、メソテリン、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、Ｔｎ抗原、ＮＥＵ５ＧＣ、ＮｅｕＧｃＧＭ３、ＧＤ２、ＣＬＬ−１、ＨＥＲＶ−Ｋ）に結合する。さらに、ＣＤ３８、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ−７、ＴＮＦＲＳＦ１７／ＢＣＭＡ、ＳＹＮＤ１／ＣＤ１３８、ＣＤ２２９、ＣＤ４７、ＣＤ１２３／ＩＬ３−ＲＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＧＤ２、ＣＬＬ−１、ＨＥＲＶ−Ｋのような血液癌抗原に特異的に結合するＣＡＲも考えられる。
【００７０】
癌治療用途に適切には、ＣＡＲは癌細胞上の１つまたはそれ以上のリガンド（例えば、骨髄腫細胞上のＣＳ１（ＳＬＡＭＦ７））に特異的に結合する。特定の癌（例えば多発性骨髄腫）の治療に使用するために、ＣＡＲはＣＤ３８に結合し得る。例えば、ＣＡＲは、例えば、公知のモノクローナル抗体ダラツムマブ由来のものに由来するか、類似するか、または同一である可変領域の結合特性を含み得る。このようなＮＫ細胞は、血管新生を阻害する薬剤（例えばレナリドマイド）と組み合わせて癌治療に使用され得る。癌、特に白血病および特にＡＭＬの治療における使用のために、ＣＡＲはＣＬＬ−１に結合し得る。
【００７１】
ＣＡＲ−ＮＫは二重特異性であり得、ここでそれらの親和性は２つの異なるリガンド／抗原に対するものである。二重特異性ＣＡＲ−ＮＫは、癌細胞上の潜在的な結合部位の数を増加させるために、あるいはＮＫ−ＣＡＲに特異的なリガンドを発現する他の免疫エフェクター細胞に癌細胞を局在化させるために使用され得る。癌治療における使用のために、二重特異性ＣＡＲは、標的腫瘍細胞およびエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞またはマクロファージ）に結合し得る。したがって、例えば、多発性骨髄腫の場合、二重特異性ＣＡＲはＴ細胞抗原（例えばＣＤ３など）および腫瘍細胞マーカー（例えばＣＤ３８など）に結合し得る。あるいは、二重特異性ＣＡＲは２つの別々の腫瘍細胞マーカーに結合し得、標的腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の全体的な結合親和性を増大させる。これは、標的抗原のうちの１つをダウンレギュレートすることによって癌細胞が耐性を発達させる危険性を減少させ得る。この場合の例は、多発性骨髄腫では、ＣＤ３８とＣＳ−１／ＳＬＡＭＦ７の両方に結合するＣＡＲである。ＣＡＲによって適切に標的化されている別の腫瘍細胞マーカーは、ＣＤ４７によって例示される、腫瘍上の「食べない」タイプのマーカーである。
【００７２】
本発明の任意の特徴は、上記のＮＫ細胞およびＮＫ細胞株にさらなる改変を提供することを含み、例えば、Ｆｃ受容体（ＣＤ１６、ＣＤ３２またはＣＤ６４であり得、サブタイプおよび誘導体を含む）が細胞表面に発現される。使用において、これらの細胞は抗体被覆癌細胞の認識の増加を示し、細胞傷害性応答の活性化を改善することができる。
【００７３】
本発明のさらなる任意の特徴は、改変ＮＫ細胞およびＮＫ細胞株を身体の特定の標的領域によりよくホーミングするように適合させることを含む。本発明のＮＫ細胞は、特定の癌細胞位置を標的とし得る。血液癌の治療のための好ましい実施形態では、本発明のＮＫエフェクターは骨髄にホーミングするように適合される。特定のＮＫ細胞は、フコシル化および／またはシアリル化によって骨髄にホーミングするように改変される。これは、適切なフコシルトランスフェラーゼおよび／またはシアリルトランスフェラーゼをそれぞれ発現するようにＮＫ細胞を遺伝子改変することによって達成され得る。腫瘍部位へのＮＫエフェクター細胞のホーミングの増加もまた、腫瘍血管系の破壊によって可能になり得る。例えば、メトロノーム化学療法によって、または血管新生を標的とする薬物を使用することによって（Ｍｅｌｅｒｏら、２０１４年）、癌血管を介したＮＫ細胞浸潤を正常化する。
【００７４】
本発明のさらに別の任意の特徴は、培養物中での急速な増殖（growth）および増殖（proliferation）のための固有の能力を増大した改変ＮＫ細胞およびＮＫ細胞株を提供／使用することである。これは、例えば、増殖誘導サイトカインＩＬ−２およびＩＬ−１５を過剰発現するように細胞をトランスフェクトすることによって、達成され得る。さらに、この任意の変更は、増殖培地にサイトカインを連続的に補給することに対する費用効果の高い代替法を提供する。
【００７５】
本発明はさらに、細胞傷害性を増大させるために、本明細書に記載されるような細胞または細胞株を遺伝子改変する工程を含む、改変ＮＫ細胞またはＮＫ細胞株を作製する方法を提供／使用する。この遺伝子改変は、遺伝子の安定的なノックアウト（例えば、ＣＲＩＳＰＲによる）、または遺伝子の一過性ノックダウン（例えばｓｉＲＮＡによる）であり得る。
【００７６】
好ましい実施形態では、増加した細胞傷害性を有する新しいＮＫ細胞株（例えばＫＨＹＧ−１細胞の誘導体）を提供するために、安定的な遺伝子改変技術（例えばＣＲＩＳＰＲ）が使用される。
【００７７】
実施形態では、この方法は、抑制性受容体機能を低下させるように改変されたＮＫ細胞またはＮＫ細胞株を作製するためのものである。好ましくは、これらの抑制性受容体はチェックポイント抑制性受容体である。
【００７８】
より具体的な実施形態は、抑制性受容体機能を低下したＮＫ細胞またはＮＫ細胞株を作製する方法を含み、チェックポイント抑制性受容体は、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ−３）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＩＧＩＴおよびＴＩＭ−３から選択される。
【００７９】
好ましい実施形態では、この方法は、ＮＫ細胞を改変して抑制性受容体の２つまたはそれ以上のものの機能を低下させることを含む。
【００８０】
本発明はさらに、ＴＲＡＩＬリガンドまたは変異体ＴＲＡＩＬ（改変体）リガンドを発現するように細胞または細胞株を遺伝子改変する工程を含む、改変ＮＫ細胞またはＮＫ細胞株を作製する方法を提供／使用する。
【００８１】
実施形態では、この方法は、ＴＲＡＩＬ受容体に対して増大した親和性を有する変異体ＴＲＡＩＬリガンドを発現するようにＮＫ細胞またはＮＫ細胞株を改変することを含む。好ましくは、ＴＲＡＩＬ受容体はＤＲ４および／またはＤＲ５である。好ましい実施形態は、デコイＴＲＡＩＬ受容体に対して減少した親和性を有する変異体ＴＲＡＩＬリガンドを発現するようにＮＫ細胞またはＮＫ細胞株を改変する方法を提供する。
【００８２】
さらなる好ましい実施形態において、この方法は、チェックポイント抑制性受容体の機能を除去し、そしてデコイＴＲＡＩＬ受容体に対して減少した結合親和性または結合親和性が全くない変異体ＴＲＡＩＬリガンドを発現するようにＮＫ細胞またはＮＫ細胞株を改変することを含む。
【００８３】
さらなる典型的な実施形態は、ＮＫ細胞またはＮＫ細胞株の製造方法を提供し、１つまたはそれ以上のチェックポイント抑制性受容体の機能が除去され、かつ／または、デコイＴＲＡＩＬ受容体に対する結合親和性が減少しているかまたは結合親和性がない変異体ＴＲＡＩＬリガンドが発現され、そして細胞は、ＣＡＲまたは二重特異性ＣＡＲを発現するようにさらに改変される。ＣＡＲの特性は、任意に上記の通りである。
【００８４】
実施形態では、この方法は、ＮＫ細胞またはＮＫ細胞株を作製することを含み、１つまたはそれ以上のチェックポイント抑制性受容体の機能が除去されており、かつ／またはデコイＴＲＡＩＬ受容体に対する結合親和性が減少しているかまたは全くない変異体ＴＲＡＩＬリガンドが発現され、そして細胞は、必要に応じてＣＡＲまたは二重特異性ＣＡＲを発現するように改変され、そして細胞は、１つまたはそれ以上のＦｃ受容体を発現するようにさらに改変される。適切なＦｃ受容体は、ＣＤ１６（ＦｃＲＩＩＩ）、ＣＤ３２（ＦｃＲＩＩ）およびＣＤ６４（ＦｃＲＩ）から選択される。
【００８５】
上記すべての好ましい態様は、ＫＨＹＧ−１の誘導体であるＮＫ細胞およびＮＫ細胞株を作製する方法を含む。
【００８６】
本発明の目的に従って、細胞傷害性が増加した改変ＮＫ細胞、ＮＫ細胞株またはそれらの組成物は、患者の癌、特に血液癌の治療に使用するためのものである。
【００８７】
さらにより好ましい態様において、本発明は、血液癌の治療における使用のために、ＫＨＹＧ−１細胞におけるチェックポイント抑制性受容体機能を低下させることによって、またはＫＨＹＧ−１細胞において変異体ＴＲＡＩＬリガンドを発現させることによって、ＫＹＨＧ−１の誘導体として得られるＮＫ細胞株である。
【００８８】
本明細書の上記および下記に記載の改変ＮＫ細胞、ＮＫ細胞株およびそれらの組成物は、癌、特にヒトの癌、例えば血液細胞の癌または固形癌の治療に適している。ＮＫ細胞および誘導体は、好ましくはヒトＮＫ細胞である。ヒト治療のためには、ヒトＮＫ細胞が好ましくは使用される。
【００８９】
本発明はさらに、ＩＬ−６Ｒ機能が低下しているかまたは存在しないＮＫ細胞それ自体（例えばＩＬ−６受容体機能を欠く遺伝子改変ＮＫ細胞）を提供する。本発明のＮＫ細胞はまた、１つまたはそれ以上のｃＩＲの機能を減少しているかもしくはこれを存在しないようにする、変異体ＴＲＡＩＬを発現させる、またはこれらの改変の３つ全部を行うために、本明細書中に記載されるように改変され得る。
【００９０】
活性剤およびそれらの組み合わせを必要としている患者に送達するための様々な投与経路が当業者に知られている。本発明の実施形態は血液癌治療用である。改変ＮＫ細胞および／またはＮＫ細胞株の投与は、全身的または局所的（例えば、腹腔内経路を介するなど）であり得る。
【００９１】
他の実施形態では、活性剤はより直接的に投与される。したがって、投与は腫瘍内に直接投与することができ、特に固形腫瘍に適している。
【００９２】
一般にＮＫ細胞は、本発明の方法、使用および組成物に適していると考えられる。本明細書の特定の実施例で使用される細胞に従って、ＮＫ細胞は癌細胞株から得られたＮＫ細胞であり得る。有利には、好ましくはその腫瘍形成性を低下させるように（例えば致死的および／または分裂不能にすることによって）処理されたＮＫ細胞を血液癌細胞株から得ることができ、血液癌を治療するために本発明の方法において使用することができる。
【００９３】
癌由来の細胞を治療的使用に対してより許容可能にするために、それは一般に、患者において腫瘍を形成する傾向を低減または除去するために何らかの方法で治療または前治療される。実施例で使用された特定の改変ＮＫ細胞株は分裂不能にされているので安全である。それらは放射線を照射されそしてそれらの殺傷能力を保持するが、およそ３〜４日以内に死滅する。したがって、特定の細胞および細胞株は（例えば、放射線照射の結果として）増殖することができない。本明細書の方法で使用するための潜在的ＮＫ細胞の治療は、インビボでそれらが分裂して腫瘍を形成するのを防ぐための放射線照射、および腫瘍形成性を減らすための遺伝的改変（例えば、細胞が分裂してインビボで腫瘍を形成するのを防ぐために活性化することができる自殺遺伝子をコードする配列を挿入する）を含む。自殺遺伝子は、外因性（例えば循環中の）薬剤によって活性化され得る（この薬剤は次いで、この遺伝子を発現している細胞において細胞死を引き起こす）。さらなる代替は、治療法の特定のＮＫ細胞を標的とするモノクローナル抗体の使用である。例えば、ＣＤ５２はＫＨＹＧ−１細胞上で発現され、このマーカーへのモノクローナル抗体の結合は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）およびＫＨＹＧ−１細胞死をもたらし得る。
【００９４】
Ｓｕｃｋら、２００６年に発行された論文に論じられているように、癌由来ＮＫ細胞および細胞株は、Ｇａｍｍａｃｅｌｌ  ３０００  Ｅｌａｎのような放射線照射器を用いて容易に照射される。セシウム１３７の線源を使用して放射線量を制御し、例えば１Ｇｙから５０Ｇｙの間の線量反応曲線が、増加した細胞傷害性の利点を維持しながら細胞の増殖能を排除するための最適線量を決定するために使用され得る。これは、各線量の放射線を照射した後に細胞の細胞傷害性をアッセイすることによって達成される。
【００９５】
十分に確立された自己由来またはＭＨＣ適合Ｔ細胞アプローチを超える養子細胞免疫療法のために照射ＮＫ細胞株を使用することの大きな利点がある。第一に、高度に増殖性の性質を有するＮＫ細胞株の使用は、改変ＮＫ細胞株の拡大がより容易にそして商業的レベルで達成され得ることを意味する。次いで、細胞を患者に投与する前に、改変ＮＫ細胞株の放射線照射を実施することができる。それらの有用な細胞傷害性を保持しているこれらの照射された細胞は限られた寿命を有し、そして改変されたＴ細胞とは異なり、持続的な副作用を引き起こす長期間にわたって循環しない。
【００９６】
さらに、同種異系改変ＮＫ細胞およびＮＫ細胞株の使用は、患者におけるＭＨＣクラスＩ発現細胞が、自己由来のＮＫ細胞傷害性応答に対するのと同様にＮＫ細胞傷害性応答を阻害することができないことを意味する。癌細胞殺傷のための同種異系ＮＫ細胞および細胞株の使用は、前述のＧＶＬ効果から利益を得、そしてＴ細胞に対するのとは異なり、同種異系ＮＫ細胞および細胞株はＧＶＨＤの発症を刺激せず、それらを養子細胞免疫療法による癌の治療についての非常に好ましい選択肢にする。
【００９７】
改変ＮＫ細胞は、約１×１０６細胞／ｋｇ、約１×１０７細胞／ｋｇ、約１×１０８細胞／ｋｇ、約１×１０９細胞／ｋｇ、および約１×１０１０細胞／ｋｇより多い量で投与することができる。特定の実施形態では、改変ＮＫ細胞は、約１×１０６〜約１×１０１１細胞／ｋｇの量で投与される。特定の実施形態では、改変ＮＫ細胞は、約１×１０７〜約１×１０１０細胞／ｋｇの量で投与される。特定の実施形態では、改変ＮＫ細胞は、約１×１０８〜約１×１０１０細胞／ｋｇの量で投与される。特定の実施形態では、改変ＮＫ細胞は、約１×１０９〜約１×１０１０細胞／ｋｇの量で投与される。特定の実施形態では、改変ＮＫ細胞は、約１×１０７〜約１×１０９細胞／ｋｇの量で投与される。特定の実施形態では、改変ＮＫ細胞は約１×１０７〜約１×１０８細胞／ｋｇの量で投与される。特定の実施形態では、改変ＮＫ細胞は、約１×１０８〜約１×１０９細胞／ｋｇの量で投与される。血液癌の場合、細胞は脈内投与され得る。固形組織癌については、細胞は腫瘍内または腹腔内に投与され得る。
【００９８】
ＩＬ−６アンタゴニスト抗体、ならびにそれらの組み合わせは、約０．１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば約０．４ｍｇ／ｋｇ体重、約０．８ｍｇ／ｋｇ体重、約１．６ｍｇ／ｋｇ体重、または約４ｍｇ／ｋｇ体重の濃度で被験体に投与され得る。好ましい実施形態では、本明細書に記載のＩＬ−６アンタゴニスト抗体、およびその組み合わせは、レシピエント被験体に、２６週またはそれ未満ごとに１回、例えば１６週またはそれ未満ごとに１回、８週間またはそれ未満ごとに１回、または４週間又はそれ未満ごとに１回の頻度で投与される。別の好ましい実施形態において、ＩＬ−６アンタゴニスト抗体は、約１週間の期間ごとに約１回、約２週間の期間ごとに１回、約３週間の期間ごとに１回、または約４週間の期間ごとに１回の頻度でレシピエント被験体に投与される。
【００９９】
有効用量は、例えば、年齢、性別、妊娠状態、肥満度指数、除脂肪体重、組成物が与えられる状態、組成物の代謝または耐性に影響を及ぼし得る他の健康状態、レシピエント被験体中のＩＬ−６のレベル、および組成物に対する耐性（例えば、組成物に対する抗体を生じる患者から生じる）などのレシピエント被験体属性に依存し得ることが理解される。
【０１００】
ＩＬ−６アンタゴニストと共に投与される改変ＮＫ細胞はまた、特定のアジュバント、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、またはボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、イクサゾミブ、またはそれらの組み合わせなどのプロテアソーム阻害剤とともに投与され得る。特定の実施形態では、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、またはプロテアソーム阻害剤のいずれかが、改変ＮＫ細胞の投与前に患者に投与され得る。特定の実施形態では、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、またはプロテアソーム阻害剤のいずれかが、改変ＮＫ細胞の投与の間の患者に投与され得る。特定の実施形態では、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、またはプロテアソーム阻害剤のいずれかが、改変ＮＫ細胞の投与後に患者に投与され得る。特定の実施形態では、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５の活性は、ＩＬ−２、ＩＬ８、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１５受容体に対する非インターロイキンアゴニストによって供給され得る。例えば、インターロイキン−１２アゴニストは、ＡＬＴ−８０３またはＡＬＴ−８０１であり得る。インターロイキン１５アゴニストはＮＩＺ９８５であり得る。
【０１０１】
本明細書においてまた想定されるのは、特定の治療アジュバント、主にメトロノームシクロホスファミドまたはテトラサイクリン抗生物質の使用である。これらのアジュバントのいずれも、改変ＮＫ細胞による治療の前または治療中に投与され得る。それらはまた、治療過程の間に改変ＮＫ細胞およびＩＬ−６抗体のようなＩＬ−６アンタゴニストと同時に投与され得る。
【０１０２】
ドキシサイクリンなどのテトラサイクリン抗体は、経口または静脈内のいずれかで、１日あたり約５０ｍｇから約３００ｍｇの間の濃度で、または１日あたり約１００ｍｇから２００ｍｇの間の濃度で投与され得る。テトラサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、チゲサイクリン、デメクロサイクリン、メタサイクリン、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、リメサイクリン、メクロサイクリン、またはロリテトラサイクリンなどの他の同等のテトラサイクリン抗生物質も同様に使用され得る。
【０１０３】
シクロホスファミドは経口的にまたは静脈内に投与され得る。特定の実施形態では、シクロホスファミドはメトロノーム様式で、例えば、持続的な低用量のシクロホスファミドで投与される。特定の実施形態において、シクロホスファミドは、１日、または１週間、２週間、３週間、４週間、またはそれ以上の週の間、１日または隔日毎に約１００ｍｇから約２５ｍｇの間の用量で経口投与される。特定の実施形態において、シクロホスファミドは、１週間、２週間、３週間、４週間、またはそれ以上の週の間、１日に約５０ｍｇの用量で経口投与される。特定の実施形態において、シクロホスファミドは、１週間、２週間、３週間、４週間、またはそれ以上の週の間、週に約１０００ｍｇから約２５０ｍｇの間の用量で静脈内投与される。特定の実施形態において、シクロホスファミドは、１週間、２週間、３週間、４週間、またはそれ以上の週の間、週に約７５０ｍｇ、５００ｍｇ、２５０ｍｇまたはそれ未満の用量で静脈内投与される。
【０１０４】
本発明によれば、有効量のＮＫ細胞とＩＬ−６アンタゴニストとの組み合わせを患者に投与する工程を含む、癌を治療する方法がさらに提供される。この方法は、本明細書に記載の本発明の他の局面の好ましいおよび任意の特徴を含む。
【０１０５】
本明細書に記載の本発明によれば、有効量の（ａ）ＮＫ細胞、および（ｂ）ＩＬ−６アンタゴニストを患者に投与する工程を含む、癌を治療する方法である。ＮＫ細胞およびＩＬ−６アンタゴニストは場合により別々に投与される。さらに場合により、患者は、ＮＫ細胞の投与の前にＩＬ−６アンタゴニストで予め治療されている。
【０１０６】
本発明によれば、ＮＫ細胞または細胞株およびＩＬ−６アンタゴニストを含む医薬組成物がさらに提供される。医薬組成物は、本明細書に記載の本発明の他の局面の好ましいおよび任意の特徴を含む。
【０１０７】
本明細書で使用される「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」などの単数形の冠詞は、文脈が明らかにそうでないと指示しない限り、複数形を含む。
【０１０８】
本明細書で使用されるとき、用語「約」は、記載された量に約１０％、５％、または１％近い量を指す。
【０１０９】
本明細書で使用されるように、他に示さない限り、「抗体」という用語は、抗体の抗原結合フラグメント、すなわち全長抗体によって結合される抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体フラグメント、例えば１つまたはそれ以上のＣＤＲ領域を保持するフラグメントを含む。抗体フラグメントの例としては、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；ダイアボディ；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子（例えば一本鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ））、ナノボディ、二重特異性抗体などの別々の特異性を有する抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられる。好ましくは、抗体は、抗体に対する個体の免疫応答を低下させるようにヒト化されている、例えば、抗体は、キメラ（例えばヒト定常領域を有する非ヒト可変領域）またはＣＤＲグラフト（例えば、例えばヒト定常領域および可変領域フレームワーク配列を有する非ヒトＣＤＲ領域）であり得る。
【０１１０】
特許請求の範囲および本明細書の他の箇所に記載されているように、本発明は以下の実施形態を提供する：
１．癌の治療に使用するためのＩＬ−６アンタゴニストと組み合わせたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または細胞株。
２．癌がＩＬ−６受容体を発現する、実施形態１に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
３．癌がＰＤＬ−１および／またはＰＤＬ−２を発現する、実施形態１または２に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
４．ＩＬ−６アンタゴニストが、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、またはｇｐ１３０のうちの１つに結合する抗体である、先行する実施形態のいずれかに記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
５．ＩＬ−６抗体が、シルツキシマブ、オロキズマブ（ＣＤＰ６０３８）、エルシリモマブ、ＢＭＳ−９４５４２９（ＡＬＤ５１８）、ＭＨ−１６６およびシルクマブ（ＣＮＴＯ  １３６）から選択される、実施形態４に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
６．ＩＬ−６Ｒ抗体が、トシリズマブ、サリルマブ、ＰＭ−１およびＡＵＫ１２−２０から選択される、実施形態５または６に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
７．ｇｐ１３０抗体がＡＭ６４である、実施形態４に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
８．別の抗癌療法と組み合わせた、先行するいずれかの実施形態に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
９．別の抗癌療法が、内因性ＮＫ細胞を免疫エフェクター細胞として利用する、実施形態８に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
１０．別の抗癌療法が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である、実施形態８または９のいずれかに記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
１１．癌が血液癌である、先行する実施形態のいずれかに記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
１２．血液癌が、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ホジキンリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫およびＢ細胞リンパ腫を含む非ホジキンリンパ腫、無症候性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、または軽鎖骨髄腫である、実施形態１１に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
１３．ＮＫ細胞または細胞株が、１つまたはそれ以上のチェックポイント抑制性受容体の発現を減少するように遺伝子改変されている、先行する実施形態のいずれかに記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
１４．チェックポイント抑制性受容体が、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ−３）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＩＧＩＴ、およびＴＩＭ−３から選択される、実施形態１３に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
１５．ＮＫ細胞または細胞株が、変異体ＴＲＡＩＬリガンドを発現するように遺伝子改変されている、先行する実施形態のいずれか記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
１６．変異体ＴＲＡＩＬリガンドが、ＴＲＡＩＬ受容体（例えばＤＲ４および／またはＤＲ５）に対して増大した親和性を有する、実施形態１５に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
１７．変異体ＴＲＡＩＬリガンドが、デコイＴＲＡＩＬ受容体に対して減少した親和性を有する、実施形態１５または１６に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
１８．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する、先行する実施形態のいずれかに記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
１９．ＣＡＲが二重特異性ＣＡＲである、実施形態１８に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
２０．二重特異性ＣＡＲが、１つの細胞型上の２つのリガンドに結合する、実施形態１９に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
２１．二重特異性ＣＡＲが、２つの異なる細胞型のそれぞれ上の１つのリガンドに結合する、実施形態１９に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
２２．ＣＡＲまたは二重特異性ＣＡＲに対する１つまたは複数のリガンドが癌細胞上に発現される、実施形態１１および２２に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
２３．二重特異性ＣＡＲに対するリガンドが、両方とも癌細胞上で発現される、実施態様２２に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
２４．二重特異性ＣＡＲに対するリガンドが、癌細胞および免疫エフェクター細胞上に発現される、実施形態２２に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
２５．ＮＫ細胞または細胞株が、ＩＬ−６受容体の発現を低減するように遺伝子改変されている、先行する実施形態のいずれかに記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
２６．ＮＫ細胞株がＫＨＹＧ−１である、先行する実施形態のいずれかに記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
２７．癌の細胞がＩＬ−６受容体を発現する、癌の治療に使用するためのＩＬ−６アンタゴニスト。
２８．癌がＰＤＬ−１および／またはＰＤＬ−２を発現する、実施形態２７に記載の使用のためのＩＬ−６アンタゴニスト。
２９．ＩＬ−６アンタゴニストが、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒまたはｇｐ１３０のうちの１つに結合する抗体である、実施形態２７〜２８に記載の使用のためのＩＬ−６アンタゴニスト。
３０．ＩＬ−６抗体が、シルツキシマブ、オロキズマブ（ＣＤＰ６０３８）、エルシリモマブ、ＢＭＳ−９４５４２９（ＡＬＤ５１８）、ＭＨ−１６６およびシルクマブ（ＣＮＴＯ１３６）から選択される、実施形態２９に記載の使用のためのＩＬ−６アンタゴニスト。
３１．ＩＬ−６Ｒ抗体が、トシリズマブ、サリルマブ、ＰＭ−１およびＡＵＫ１２−２０から選択される、実施形態２９に記載の使用のためのＩＬ−６アンタゴニスト。
３２．ｇｐ１３０抗体がＡＭ６４である、実施形態２９に記載の使用のためのＩＬ−６アンタゴニスト。
３３．ＩＬ−６アンタゴニストが別の抗癌療法と組み合わせて使用される、実施形態２７〜３２のいずれかに記載の使用のためのＩＬ−６アンタゴニスト。
３４．別の抗癌療法が、内因性ＮＫ細胞を免疫エフェクター細胞として利用する、実施態様３３に記載の使用のためのＩＬ−６アンタゴニスト。
３５．別の抗癌療法が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である、実施形態３３または３４のいずれかに記載の使用のためのＩＬ−６アンタゴニスト。
３６．癌が血液癌である、実施形態２７〜３６のいずれかに記載の使用のためのＩＬ−６アンタゴニスト。
３７．血液癌が、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ホジキンリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫およびＢ細胞リンパ腫を含む非ホジキンリンパ腫、無症候性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、または軽鎖骨髄腫である、実施形態３６に記載の使用のためのＩＬ−６アンタゴニスト。
３８．癌を治療する方法であって、患者に有効量のＮＫ細胞とＩＬ−６アンタゴニストとの組み合わせを投与する工程を含む、方法。
３９．癌がＩＬ−６受容体を発現する、実施形態３８に記載の方法。
４０．癌がＰＤＬ−１および／またはＰＤＬ−２を発現する、実施形態３８〜３９のいずれかに記載の方法。
４１．ＮＫ細胞または細胞株が、予め結合されたＩＬ−６アンタゴニストとともに提供される、実施形態３８〜４０のいずれかに記載の方法。
４２．ＩＬ−６アンタゴニストが、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒまたはｇｐ１３０のうちの１つに結合する抗体である、実施形態３８〜４１に記載の方法。
４３．ＩＬ−６抗体が、シルツキシマブ、オロキズマブ（ＣＤＰ６０３８）、エルシリモマブ、ＢＭＳ−９４５４２９（ＡＬＤ５１８）、ＭＨ−１６６およびシルクマブ（ＣＮＴＯ１３６）から選択される、実施形態４２に記載の方法。
４４．ＩＬ−６Ｒ抗体がトシリズマブ、サリルマブ、ＰＭ−１およびＡＵＫ１２−２０から選択される、実施形態４２に記載の方法。
４５．ｇｐ１３０抗体がＡＭ６４である、実施形態４２に記載の方法。
４６．別の抗癌療法と組み合わせて使用される、実施形態３８〜４５のいずれかに記載の方法。
４７．別の抗癌療法が、免疫エフェクター細胞として内因性ＮＫ細胞を利用する、実施形態４６に記載の方法。
４８．別の抗癌療法が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である、実施形態４６または４７のいずれかに記載の方法。
４９．癌が血液癌である、実施形態３８〜４８のいずれかに記載の方法。
５０．血液癌が、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ホジキンリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫およびＢ細胞リンパ腫を含む非ホジキンリンパ腫、無症候性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）または軽鎖骨髄腫である、実施形態４９に記載の方法。
５１．ＮＫ細胞または細胞株が、１つまたはそれ以上のチェックポイント抑制性受容体の発現を減少するように遺伝子改変されている、実施形態３８〜５０のいずれかに記載の方法。
５２．チェックポイント抑制性受容体が、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ−３）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＩＧＩＴおよびＴＩＭ−３から選択される、実施形態５１記載の方法。
５３．ＮＫ細胞または細胞株が、変異体ＴＲＡＩＬリガンドを発現するように遺伝子改変されている、実施形態３８〜５２のいずれかに記載の方法。
５４．変異体ＴＲＡＩＬリガンドが、ＴＲＡＩＬ受容体（例えば、ＤＲ４および／またはＤＲ５）に対して増大した親和性を有する、実施形態５３に記載の方法。
５５．変異体ＴＲＡＩＬリガンドが、デコイＴＲＡＩＬ受容体に対して減少した親和性を有する、実施形態５３または５４のいずれかに記載の方法。
５６．ＮＫ細胞または細胞株がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する、実施形態３８〜５５のいずれかに記載の方法。
５７．ＣＡＲが二重特異性ＣＡＲである、実施形態５６に記載の方法。
５８．二重特異性ＣＡＲが、１つの細胞型上の２つのリガンドに結合する、実施形態５７に記載の方法。
５９．二重特異性ＣＡＲが、２つの異なる細胞型のそれぞれ上の１つのリガンドに結合する、実施形態５８に記載の方法。
６０．ＣＡＲまたは二重特異性ＣＡＲに対する１つまたは複数のリガンドが癌細胞上で発現される、実施形態５８または５９のいずれかに記載の方法。
６１．二重特異性ＣＡＲのリガンドが、両方とも癌細胞上に発現される、実施形態６０に記載の方法。
６２．二重特異性ＣＡＲのリガンドが、癌細胞および免疫エフェクター細胞上に発現される、実施形態６０に記載の方法。
６３．ＮＫ細胞または細胞株が、ＩＬ−６受容体の発現を減少するように遺伝子改変されている、実施形態３８〜６２のいずれかに記載の方法。
６４．ＮＫ細胞株がＫＨＹＧ−１である、実施形態３８〜６３のいずれかに記載の方法。
６５．ＮＫ細胞または細胞株およびＩＬ−６アンタゴニストを含み、ＮＫ細胞は本明細書に記載のように必要に応じて改変されている、組成物。
６６．ＩＬ−６受容体の機能が低下しているかまたは存在しないように改変された、ＮＫ細胞または細胞株。
６７．ＩＬ−６Ｒの発現が減少されているかまたは存在しないように遺伝子改変された、実施形態６６に記載のＮＫ細胞または細胞株。
【実施例】
【０１１１】
本発明を、細胞傷害性活性およびそれ故にヒトにおいて白血病細胞死を引き起こす能力を示すように改変されたＮＫ細胞株ＫＨＹＧ−１誘導体の製造に関して、ならびにＮＫ細胞の細胞傷害性を高め、標的（癌）誘発性の抗ＮＫ細胞の細胞傷害性応答を減らすためにＩＬ−アンタゴニストの使用に関連して、より詳細かつ具体的に記載する。
【０１１２】
ＤＮＡ、ＲＮＡおよびアミノ酸配列を以下に言及する。
配列番号１は、完全なＬＩＲ２  ＤＮＡ配列であり；
配列番号２は、ＬＩＲ２アミノ酸配列であり；
配列番号３は、ＬＩＲ２  ｇ９  ｇＲＮＡ配列であり；
配列番号４は、ＬＩＲ２  ｇ１８  ｇＲＮＡ配列であり；
配列番号５は、ＬＩＲ２フォワードプライマー配列であり；
配列番号６は、ＬＩＲ２リバースプライマー配列であり；
配列番号７は、完全なＣＴＬＡ４  ＤＮＡ配列であり；
配列番号８は、ＣＴＬＡ４アミノ酸配列であり；
配列番号９は、ＣＴＬＡ４  ｇ７  ｇＲＮＡ配列であり；
配列番号１０は、ＣＴＬＡ４  ｇ１５  ｇＲＮＡ配列であり；
配列番号１１は、ＣＴＬＡ４フォワードプライマー配列であり；そして
配列番号１２は、ＣＴＬＡ４リバースプライマー配列である。
【０１１３】
（実施例１：抑制性受容体機能のノックアウト）
（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）
抑制性受容体機能を除去した細胞を以下のように調製した。ｇＲＮＡ構築物を、ＮＫ細胞のヒトゲノム中の「古典的」抑制性受容体ＬＩＲ２および「チェックポイント」抑制性受容体ＣＴＬＡ４をコードする遺伝子を標的とするように設計および調製した。次いで、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集を使用して、ＬＩＲ２およびＣＴＬＡ４標的遺伝子をノックアウトした。
【０１１４】
各標的遺伝子について２つのｇＲＮＡ候補を選択し、そしてＫ５６２細胞におけるそれらの切断効率を決定した。ｇＲＮＡ候補の配列を表１に示し、そしてプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）は配列の最後の３塩基に関する。ＬＩＲ２遺伝子（配列番号１）およびＣＴＬＡ４遺伝子（配列番号７）上のｇＲＮＡ配列のフランキング領域をそれぞれ図１および２に示す。
【０１１５】
【表１】
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【０１１６】
Ｋ５６２細胞を調製したｇＲＮＡ構築物でトランスフェクトし（図３）、続いてＰＣＲ増幅のために回収した。ＧＦＰ発現の存在を用いて、ｇＲＮＡ構築物のＫ５６２細胞への組み込みの成功を報告した。これにより、Ｃａｓ９遺伝子の発現、したがってＬＩＲ２およびＣＴＬＡ４遺伝子の発現をノックアウトする能力を確認した。
【０１１７】
ｇＲＮＡ構築物の切断活性を、インビトロミスマッチ検出アッセイを用いて測定した。Ｔ７Ｅ１エンドヌクレアーゼＩは、不完全にマッチしたＤＮＡを認識して切断し、親のＬＩＲ２およびＣＴＬＡ４遺伝子を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９トランスフェクションおよび非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の後の変異遺伝子と比較することを可能にする。
【０１１８】
図４は、ｇ９およびｇ１８のｇＲＮＡ配列を用いてＬＩＲ２遺伝子をノックアウトした後のアガロースゲル電気泳動後に得られたバンドを示す。各変異に対応する３本のバンドは、親遺伝子とトランスフェクション後のＤＮＡ配列におけるミスマッチの検出後に生じる２本の鎖に関する。ｇ９  ｇＲＮＡ配列は１１％のトランスフェクションの成功率をもたらしたが、ｇ１８  ｇＲＮＡは１０％をもたらした。
【０１１９】
図５は、ｇ７およびｇ１５のｇＲＮＡ配列を用いてＣＴＬＡ４遺伝子をノックアウトした後のアガロースゲル電気泳動後に得られたバンドを示す。ｇ７  ｇＲＮＡ配列は３２％のトランスフェクション成功率をもたらしたが、ｇ１５  ｇＲＮＡは２６％をもたらした。
【０１２０】
Ｋ５６２細胞におけるＬＩＲ２およびＣＴＬＡ４のノックアウトが成功した後、ＫＨＹＧ−１細胞をｇＲＮＡ構築物でトランスフェクトした。
【０１２１】
ホモ接合性欠失を有するＫＨＹＧ−１誘導体クローンを選択した。Ｃａｓ９／ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＣ）発現ベクターをこの目的に使用した。抗生物質ピューロマイシンに対するそれらの耐性に基づいて、首尾よくトランスフェクトされた細胞を選択した。
【０１２２】
（Ｃａｓ９  ＲＮＰ）
ＮＫ細胞におけるチェックポイント抑制性受容体のノックアウトのために使用された他のプロトコルは、Ｃａｓ９  ＲＮＰトランスフェクションのそれであった。このプロトコルを使用する利点は、同様のトランスフェクション効率が達成可能であったが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プロトコルのＤＮＡプラスミドを使用した場合と比較して毒性が有意に低いことであった。
【０１２３】
各トランスフェクション実験のために１×１０６個のＫＨＹＧ１細胞を回収した。細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離機で遠心した。次いで上清を捨てた。次いで、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＰ（ＲＮＡ結合タンパク質）材料を以下のように調製した：
（１）必要な合成ｃｒＲＮＡおよびｔＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎより購入）の２０μＭ溶液を調製した。
（２）４μＬのｃｒＲＮＡ（２０μＭ）および４μＬのｔＲＮＡ（２０μＭ）を混合した。
（３）次いでこの混合物を２μＬのＣａｓ９タンパク質（５μｇ／μＬ）に添加した。
（４）全成分を混合し、室温で１０分間インキュベートした。
【０１２４】
Ｎｅｏｎ（登録商標）トランスフェクションシステムに従って、細胞をＣａｓ９  ＲＮＰと混合し、以下のパラメーターを用いてエレクトロポレーションを行った：
電圧：１４５０Ｖ
パルス幅：３０ｍ秒
パルス数：１。
【０１２５】
次いで、細胞を、増殖培地（ＩＬ−２およびＩＬ−１５含有）を含む１２ウェルプレートの１つのウェルに移した。
【０１２６】
細胞を４８〜７２時間後に回収し、Ｔ７エンドヌクレアーゼアッセイおよび／またはＳａｎｇｅｒ配列決定により遺伝子編集効率を確認した。インデルの存在が確認され、ＫＨＹＧ１細胞におけるＣＴＬＡ４、ＰＤ１およびＣＤ９６のノックアウトが成功したことを示した。
【０１２７】
（部位特異的ヌクレアーゼ）
ＮＫ細胞におけるチェックポイント抑制性受容体のノックアウトのために使用された他のプロトコルは、ＸＴＮ  ＴＡＬＥＮトランスフェクションのそれであった。このプロトコルを使用する利点は、野生型ＣＲＩＳＰＲと比較して、特に高いレベルの特異性が達成可能であることであった。
【０１２８】
（ステップ１：試薬の調製）
ＫＨＹＧ−１細胞をトランスフェクション効率、単一細胞クローニング効率および核型／コピー数を含む特定の属性についてアッセイした。次いで、細胞を供給元の推奨に従って培養した。
【０１２９】
ノックアウトされているチェックポイント抑制性受容体に応じて、ヌクレアーゼを少なくとも２対のＸＴＮ  ＴＡＬＥＮのカスタムデザインによって調製した。カスタムデザインのステップは、遺伝子座の評価、コピー数および機能的評価（すなわち相同体、オフターゲット評価）を含む。
【０１３０】
（ステップ２：細胞株の設計）
細胞をステップ１のヌクレアーゼでトランスフェクトした。高レベルの切断を得るためにこのステップを３回まで繰り返し、そして各トランスフェクションの前に培養物を分割しそして中間培養物を維持した。
【０１３１】
各トランスフェクションの数日後に最初のスクリーニングを行った。細胞プールをＣｅｌ−１アッセイにより切断効率について試験した。反復トランスフェクション後に切断レベルが許容レベルまたはプラトーに達した後、細胞を単一細胞クローニングの準備ができていると見なした。
【０１３２】
プールした細胞を９６ウェルプレートの１ウェルあたり１細胞に選別した。各プールのプレート数は、ステップ１で決定した単一細胞クローニング効率に依存した。プレートを放置し、３〜４週間インキュベートした。
【０１３３】
（ステップ３：スクリーニングおよび拡大）
細胞が９６ウェルプレート中でコンフルエントになったら、培養物を統合し、そして三連の９６ウェルプレートに分割した。１つのプレートをバックアップとして凍結し、１つのプレートをクローンの拡大を続けるために再プレートし、そして最終プレートを遺伝子型確認のために使用した。
【０１３４】
遺伝子型プレート中の各クローンをｑＰＣＲシグナルの喪失について分析した。これは全ての対立遺伝子が改変されたことを示す。陰性クローンをＰＣＲ増幅し、クローン化してインデルの性質および野生型またはインフレームインデルの欠如を決定した。
【０１３５】
確認されたノックアウトを有するクローンを、せいぜい１つの２４ウェルプレートにまとめ、そしてさらに拡大させた。典型的には、５個までの個々のクローンについて１バイアルあたり１×１０６個の細胞を含有する５〜１０個の凍結クリオバイアルをノックアウトあたりに作製した。
【０１３６】
（ステップ４：検証）
無菌条件下で細胞を貯蔵した。
【０１３７】
すべてのバンク細胞の基本的な放出基準は、生存細胞数（凍結前および解凍後）、ＳＴＲによる同一性の確認、基本的な無菌性保証およびマイコプラズマ試験を含んだ。必要に応じて他の放出基準を適用した（核型、表面マーカーの発現、高レベルの無菌性、転写産物またはタンパク質のノックアウト評価など）。
【０１３８】
（実施例２：ＲＮＡｉを介したチェックポイント抑制性受容体ＣＤ９６機能のノックダウン）
ＫＨＹＧ−１細胞におけるＣＤ９６のｓｉＲＮＡノックダウンを、エレクトロポレーションにより行った。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｔを、Ｌｏｎｚａ社のＡｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＩＩと組み合わせて使用した。細胞株での使用に適しており、分裂細胞と非分裂細胞の両方をうまくトランスフェクトでき、最大９０％のトランスフェクション効率を達成するためである。
【０１３９】
対照ｓｉＲＮＡ（カタログ番号：ｓｃ−３７００７）およびＣＤ９６  ｓｉＲＮＡ（カタログ番号：ｓｃ−４５４６０）を、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ＢｉｏｔｅｃｈｎｏＬｏｇｙから入手した。１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミンを含有する抗生物質を含まないＲＰＭＩ−１６４０をヌクレオフェクション後の培養に使用した。染色のためにマウス抗ヒトＣＤ９６−ＡＰＣ（カタログ番号：３３８４０９）をＢｉｏＬｅｇｅｎｄから入手した。
【０１４０】
２０μＭのｓｉＲＮＡストック溶液を調製した。凍結乾燥したｓｉＲＮＡ二重鎖を、ＦＩＴＣ−対照／対照−ＳｉＲＮＡに対し３３μＬのＲＮＡｓｅフリー水（ｓｉＲＮＡ希釈緩衝液：ｓｃ−２９５２７）中に、標的遺伝子ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ  ＣＤ９６）については１６５μＬのＲＮＡｓｅフリー水中に、再懸濁した。管を９０℃で１分間加熱し、次いで３７℃で６０分間インキュベートした。その後、必要になるまでｓｉＲＮＡストックを−２０℃で保存した。
【０１４１】
細胞は対数増殖期になければならないので、ＫＨＹＧ−１細胞をヌクレオフェクションの１〜２日前に継代した。
【０１４２】
Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液を室温に加温した（サンプル当たり１００μＬ）。血清および補充物を含有する培地のアリコートもまた、５０ｍＬ管中で３７℃に予熱した。血清および補充物を含む培地１．５ｍＬを添加することによって６ウェルプレートを調製した。プレートを加湿した３７℃／５％ＣＯ２インキュベーター中でプレインキュベートした。
【０１４３】
１００μＬのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ溶液中の２×１０６細胞を４μＬの２０μＭｓｉＲＮＡ溶液（１．５μｇ  ｓｉＲＮＡ）と穏やかに混合した。混合中の気泡を避けた。混合物をＡｍａｘａ認定キュベットに移し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキュベットホルダーに入れ、プログラムＵ−００１を選択した。
【０１４４】
プログラムを終了させ、キュベット内のサンプルを直ちに取り出した。次いで、５００μＬの予め平衡化した培地を各キュベットに添加した。次いで、各キュベット中のサンプルを、調製した６ウェルプレートの対応するウェルに静かに移して、１ウェルあたり２ｍＬの最終容量を確立した。
【０１４５】
次いで、トランスフェクション分析を行うまで、細胞を加湿した３７℃／５％ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。ＣＤ９６発現レベルを測定するために、エレクトロポレーションの１６〜２４時間後にフローサイトメトリー分析を行った。このエレクトロポレーションプロトコルを複数回実施し、そしてＫＨＹＧ−１細胞において確実にＣＤ９６ノックダウンを生じることを見出した（例えば図６Ａおよび６Ｂ参照）。
【０１４６】
（実施例３：ＣＤ９６ノックダウンによるＮＫ細胞の細胞傷害性の増強）
ＣＤ９６ノックダウンありおよびノックダウンなしのＫＨＹＧ−１細胞を、異なるエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比でＫ５６２細胞と共培養した。
【０１４７】
細胞傷害性を、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒからのＤＥＬＦＩＡ  ＥｕＴＤＡ細胞傷害性キット（カタログ番号：ＡＤ０１１６）を使用して、共培養の４時間後に測定した。
【０１４８】
標的細胞Ｋ５６２を１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび抗生物質を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。９６ウェルＶ底プレート（カタログ番号：８３．３９２６）をＳＡＲＳＴＥＤＴから購入した。エッペンドルフ遠心分離機５８１０Ｒ（プレートローター付き）を用いてプレートをスピンダウンさせた。ＶＡＲＩＯＳＫＡＮ  ＦＬＡＳＨ（ＳｃａｎＩｔソフトウェア２．４．３を含む）を使用して、溶解したＫ５６２細胞によって生成された蛍光シグナルを測定した。
【０１４９】
Ｋ５６２細胞を培地で洗浄し、細胞数を培地で１×１０６細胞／ｍＬに調整した。２〜４ｍＬの細胞を５μＬのＢＡＴＤＡ試薬に添加し、そして３７℃で１０分間インキュベートした。細胞内で、エステル結合を加水分解して親水性リガンドを形成した（これはもはや膜を通過しない）。細胞を１５００ＲＰＭで５分間遠心分離し、ロードしたＫ５６２細胞を洗浄した。１ｍＭのプロベネシド（Ｓｉｇｍａ  Ｐ８７６１）を含有する培地を用いてこれを３〜５回繰り返した。最後の洗浄後、細胞ペレットを培地に再懸濁し、そして約５×１０４細胞／ｍＬに調整した。
【０１５０】
バックグラウンド、自然放出および最大放出の検出のためにウェルを準備した。１：１から２０：１までの範囲のエフェクター対標的比を生成するために、１００μＬのロードした標的細胞（５，０００細胞）をＶ底プレートのウェルに移し、１００μＬのエフェクター細胞（ＫＨＹＧ−１細胞）を様々な細胞濃度で添加した。プレートを１００×ｇで１分間遠心分離し、そして３７℃の加湿５％ＣＯ２雰囲気中で４時間インキュベートした。最大放出ウェルについては、培地を回収する１５分前に１０μＬの溶解緩衝液を各ウェルに添加した。プレートを５００×ｇで５分間遠心した。
【０１５１】
２０μＬの上清を平底９６ウェルプレートに移し、２００μＬの予熱したユウロピウム溶液を加えた。これをプレートシェーカーを用いて室温で１５分間インキュベートした。Ｋ５６２細胞はＫＨＹＧ−１細胞によって溶解されるので、それらは培地中にリガンドを放出する。次いで、このリガンドはユウロピウム溶液と反応して溶解した細胞の量と直接相関する蛍光キレートを形成する。
【０１５２】
次いで、ＶＡＲＩＯＳＫＡＮ  ＦＬＡＳＨを用いて時間分解蛍光光度計で蛍光を測定した。以下の式を用いて比放出（specific release）を計算した。
％比放出＝実験放出−自然放出／最大放出−自然放出
【０１５３】
Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０４ソフトウェアを用いて統計分析を行った。対応のあるｔ検定を用いて、ｓｉＲＮＡ  ＣＤ９６ノックダウンＫＨＹＧ−１細胞と対照群との間の差を比較した（ｎ＝３）。
【０１５４】
比放出は、ＣＤ９６ノックダウンＫＨＹＧ−１細胞を含む共培養物において有意に増加することを見出した。これは、すべてのＥ：Ｔ比で当てはまった（図７を参照）。
【０１５５】
蛍光は細胞溶解と直接相関するので、ＫＨＹＧ−１細胞におけるＣＤ９６発現のノックダウンは、それらがＫ５６２癌標的細胞を殺傷する能力の増加をもたらすことを確認した。
【０１５６】
（実施例４：ＣＤ３２８（Ｓｉｇｌｅｃ−７）ノックダウンによるＮＫ細胞の細胞傷害性の増強）
（ＮＫ−９２細胞におけるＣＤ３２８のｓｉＲＮＡ媒介ノックダウン）
（材料、試薬および器具）
対照ｓｉＲＮＡ（カタログ番号：ｓｃ−３７００７）およびＣＤ３２８  ｓｉＲＮＡ（カタログ番号：ｓｃ−１０６７５７）を、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＴＭ  Ｄｅｖｉｃｅ（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＩＩ、Ｌｏｎｚａ）を用いてＮＫ−９２細胞において高い細胞生存率（＞７５％）で最大９０％のトランスフェクション効率を達成するために、Ｌｏｎｚａ製のＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＴＭ  Ｋｉｔ  Ｔを使用した。抗生物質を含まない、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミンを含むＲＰＭＩ−１６４０を、ヌクレオフェクション後培養に使用した。マウス抗ヒトＣＤ３２８−ＡＰＣ（カタログ番号：３３９２０６）はＢｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した。
【０１５７】
（プロトコル）
１０μＭのｓｉＲＮＡストック溶液を作成するために：
・凍結乾燥したｓｉＲＮＡ二本鎖を、ＦＩＴＣ−対照／対照−ＳｉＲＮＡに対して６６μＬのＲＮＡｓｅフリー水（ｓｉＲＮＡ希釈緩衝液：ｓｃ−２９５２７）中に、標的遺伝子ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ  ＣＤ３２８）については３３０μＬのＲＮＡｓｅフリー水中に、再懸濁する。
・管を９０℃で１分間加熱する。
・３７℃で６０分間インキュベートする。
・直接使用しない場合は、ｓｉＲＮＡストックを−２０℃で保存する。
・１つのヌクレオフェクションサンプルが含む（１００μＬの標準キュベット用）
・細胞数：２×１０６細胞
・ｓｉＲＮＡ：４μＬの１０μＭストック
・Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液：１００μＬ。
【０１５８】
（ヌクレオフェクション）
・必要な数の細胞を培養する（ヌクレオフェクションの１〜２日前に継代する。細胞は対数増殖期になければならない）。
・各サンプル用のｓｉＲＮＡを調製する。
・Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液を室温に予熱する（サンプルあたり１００μＬ）。
・血清と補充物とを含む培地のアリコートを５０ｍＬ管に入れて３７℃に加温する。血清および補充物を含む１．５ｍＬの培養培地で満たすことによって６ウェルプレートを準備し、加湿３７℃／５％ＣＯ２インキュベーターでプレートをプレインキュベートする。
・細胞培養物のアリコートを採取し、細胞密度を決定するために細胞数を数える。
・必要な数の細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心する。残りの培地が細胞ペレットを覆わないように上清を完全に捨てる。
・細胞ペレットを室温のＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液に２×１０６細胞／１００μＬの終濃度で再懸濁する。細胞生存率および遺伝子導入効率が低下するため、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液に１５〜２０分より長く保存することは避ける。
・細胞懸濁液１００μＬをｓｉＲＮＡと混合する。
・サンプルをａｍａｘａ認定キュベットに移す。サンプルがキュベットの底を覆っていることを確認し、ピペッティング中の気泡を避ける。青いキャップでキュベットを閉じる。
・適切なＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒプログラム（ＮＫ−９２細胞の場合はＡ−０２４）を選択する。キュベットをキュベットホルダーに挿入し（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＩＩ：カルーセルを時計回りに最終位置まで回転させる）、「ｘ」ボタンを押してプログラムを開始する。
・細胞への損傷を防ぐため、プログラムの終了後すぐにキュベットからサンプルを取り出す（ディスプレイが“ＯＫ”と表示する）。５００μＬの予熱した培養培地をキュベットに添加し、準備した６ウェルプレートにサンプルを移す。
・加湿した３７℃／５％ＣＯ２インキュベーター内で細胞をインキュベートする。１６〜２４時間後にフローサイトメトリー分析および細胞傷害性アッセイを行う。
【０１５９】
結果：上記のプロトコルに従い、ＮＫ−９２細胞におけるＣＤ３２８発現レベルのフローサイトメトリー分析を行った。１つの代表的な実験の結果を図８に示し、ノックダウンの成功を確認した。
【０１６０】
（ＣＤ３２８のノックダウンが細胞傷害性を高める）
（材料、試薬および器具）
蛍光増強リガンド（カタログ番号：ＡＤ０１１６）に基づくＤＥＬＦＩＡ  ＥｕＴＤＡ細胞傷害性キットをＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒから購入した。標的細胞Ｋ５６２を１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび抗生物質を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。９６ウェルＶ底プレート（カタログ番号：８３．３９２６）をＳＡＲＳＴＥＤＴから購入した。（プレートローターを備えた）エッペンドルフ遠心分離機５８１０Ｒを用いてプレートをスピンダウンさせた。ＶＡＲＩＯＳＫＡＮ  ＦＬＡＳＨ（ＳｃａｎＩｔソフトウェア２．４．３を使用）を使用して、溶解したＫ５６２細胞によって生成された蛍光シグナルを測定した。
【０１６１】
（プロトコル）
・標的Ｋ５６２細胞に蛍光増強リガンドＤＥＬＦＩＡ  ＢＡＴＤＡ試薬をロードする。
・Ｋ５６２細胞を培地で洗浄し、細胞数を培地で１×１０６細胞／ｍＬに調整する。細胞２〜４ｍＬをＢＡＴＤＡ試薬５μＬに添加し、３７℃で１０分間インキュベートする。
・１５００ｒｐｍで５分間スピンダウンし、ロードしたＫ５６２細胞を１ｍＭのプロベネシド（Ｓｉｇｍａ  Ｐ８７６１）を含む培地で３〜５回洗浄する。
・最後の洗浄後、細胞ペレットを培地に再懸濁し、約５×１０４細胞／ｍＬに調整する。
【０１６２】
（細胞傷害性アッセイ）
・バックグラウンド、自然放出、最大放出の検出のためのウェルをセットアップする。
・１００μＬのロードした標的細胞（５，０００個の細胞）をＶ底プレートにピペットで移す。
・種々の細胞濃度の１００μＬのエフェクター細胞（ＮＫ−９２）を添加する。エフェクター：標的比は、１：１から２０：１の範囲である。
・１００×ｇのＲＣＦで１分間プレートをスピンダウンする。
・３７℃にて加湿５％ＣＯ２雰囲気で２時間インキュベートする。最大放出ウェルについては、培地を回収する１５分前に各ウェルに１０μＬの溶解緩衝液を添加する。
・５００×ｇで５分間プレートをスピンダウンする。
・２０μＬの上清を平底９６ウェルプレートに移し、２００μＬの予熱したユウロピウム溶液を添加し、プレートシェーカーを用いて１５分間室温でインキュベートする。
・ＶＡＲＩＯＳＫＡＮ  ＦＬＡＳＨを使用して時間分解蛍光光度計で蛍光を測定する。以下の式を使用して比放出を計算した。
・％比放出＝実験放出−自然放出／最大放出−自然放出
【０１６３】
結果：上記に従って、ＣＤ３２８ノックダウンの細胞傷害性に対する効果を測定した。１つの代表的な実験の結果を図９に示す。示されるように、標的細胞に対する細胞傷害性はＣＤ３２８ノックダウンを有する細胞において増加した。
【０１６４】
（実施例５：チェックポイント抑制性受容体のノックダウン／ノックアウトによる血液癌治療のためのプロトコル）
上記の実施例で実証されたように、チェックポイント抑制性受容体機能は様々な方法でノックダウンまたはノックアウトすることができる。以下のプロトコルを、血液がん患者の治療に使用するために開発した。
【０１６５】
本明細書に記載の方法で治療するのに適した癌を有する患者の診断後、改変ＮＫ細胞のアリコートを患者に投与する前に解凍および培養することができる。
【０１６６】
あるいは、一過性変異は、例えば、上記のように１日または２日以内にｓｉＲＮＡを用いて調製され得る。ＭａｘＣｙｔｅ  Ｆｌｏｗ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎプラットフォームは、診療所での高速大規模トランスフェクションを達成するための適切なソリューションを提供する。
【０１６７】
特定のチェックポイント抑制性受容体の除去は、他のものよりも有益であり得る。これは患者および癌による。このため、必要に応じて癌を生検し、癌細胞をエクスビボで培養で増殖させる。したがって、異なるチェックポイント抑制性受容体改変を有する一連のＮＫ細胞を、特定の癌に対する細胞傷害性について試験することができる。この工程は、治療のために最も適切なＮＫ細胞またはその誘導体を選択するために使用され得る。
【０１６８】
改変が成功した後、細胞を患者への静脈内および／または腫瘍内注射のために適切な担体（例えば生理食塩水）に再懸濁する。
【０１６９】
（実施例６：ＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬ改変体のＫＨＹＧ−１ノックイン）
トランスフェクション後のそれらの生存率および癌細胞を殺す能力を評価するために、ＫＨＹＧ−１細胞をＴＲＡＩＬおよびＴＲＡＩＬ改変体の両方を用いてトランスフェクトした。
【０１７０】
使用したＴＲＡＩＬ改変体は、ＷＯ２００９／０７７８５７に記載されているものである。それは、Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ変異を含む野生型ＴＲＡＩＬ遺伝子によってコードされている。この変異は、両方のデコイ受容体（ＤｃＲ１およびＤｃＲ２）に対する親和性を減少させながら、ＴＲＡＩＬ改変体のＤＲ５に対する親和性を有意に増大させる。
【０１７１】
（ベースラインＴＲＡＩＬ発現）
ＫＨＹＧ−１細胞におけるベースラインＴＲＡＩＬ（ＣＤ２５３）発現をフローサイトメトリーを用いてアッセイした。
【０１７２】
マウス抗ヒトＣＤ２５３−ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号：３０８２１０）およびアイソタイプ対照（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号：４００１２２）を用いて細胞サンプルを染色し、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーターで分析した。
【０１７３】
ＫＨＹＧ−１細胞を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）／ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍＬ）およびＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）を含有するＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養した。０．５〜１．０×１０６細胞／試験を遠心分離（１５００ｒｐｍ×５分）によって収集し、上清を吸引した。細胞（単細胞懸濁液）を４ｍＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、０．５〜１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３アジ化ナトリウム）で洗浄した。細胞を１００μＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、５μＬの抗体を各管に添加し、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を１５００ｒｐｍで５分間の遠心分離により３回洗浄した。次いで、細胞を５００μＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、一時的に氷上で暗所に保った。
【０１７４】
続いて細胞をフローサイトメーター（ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ）で分析し、得られたデータをＦｌｏｗＪｏ  ７．６．２ソフトウェアを用いて処理した。
【０１７５】
図１０に示すように、ＦＡＣＳ分析は、ＫＨＹＧ−１細胞表面上のＴＲＡＩＬの弱いベースライン発現を示した。
【０１７６】
（エレクトロポレーションによるＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬ改変体ノックイン）
野生型ＴＲＡＩＬ  ｍＲＮＡおよびＴＲＡＩＬ改変体（Ｄ２６９Ｈ／１９５Ｒ）ｍＲＮＡを、ＴｒｉＬｉｎｋ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成し、等分して−８０℃で保存した。マウス抗ヒトＣＤ２５３−ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号：３０８２１０）およびアイソタイプ対照（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号：４００１２２）、およびマウス抗ヒトＣＤ１０７ａ−ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号：１２−１０７９−４２）およびアイソタイプ対照（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号：１２−４７１４）抗体を用いて細胞サンプルを染色し、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーターで分析した。ＤＮＡ染料ＳＹＴＯＸ−Ｇｒｅｅｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号：Ｓ７０２０；５ｍＭ  ＤＭＳＯ溶液）を使用した。ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＴＭ  Ｄｅｖｉｃｅ（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＩＩ、Ｌｏｎｚａ）を用いてＫＨＹＧ−１細胞において高い細胞生存率で最大９０％のトランスフェクション効率を達成するために、ＬｏｎｚａからのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＴＭＫｉｔ  Ｔを使用した。ヌクレオフェクション後の培養には、１０％ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、およびＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）を含む抗生物質を含まないＲＰＭＩ  １６４０を使用した。
【０１７７】
細胞は対数増殖期になければならないので、ＫＨＹＧ−１およびＮＫ−９２細胞をヌクレオフェクションの１または２日前に継代した。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液を室温に予め温め（サンプル当たり１００μｌ）、血清および補充物を含む培地のアリコートと共に５０ｍＬ管中で３７℃においた。血清および補充物を含有する１．５ｍＬの培養培地を充填することによって６ウェルプレートを調製し、そして加湿した３７℃／５％ＣＯ２インキュベーター中でプレインキュベートした。細胞培養物のアリコートを調製し、細胞密度を決定するために細胞を数えた。上清を完全に捨てる前に、必要な数の細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞ペレットを室温のＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液に２×１０６細胞／１００μＬの最終濃度になるように再懸濁した（最大懸濁時間＝２０分）。１００μＬの細胞懸濁液を１０μｇのｍＲＮＡ（１０μＬ以下のＲＮＡ量）と混合した。サンプルをＡｍａｘａ認定キュベットに移した（サンプルがキュベットの底を覆っていることを確認し、気泡を避けた）。適切なＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒプログラムを選択した（すなわち、ＫＨＹＧ−１細胞についてはＵ−００１）。次いでキュベットをキュベットホルダーに挿入した。５００μＬの予熱した培地をキュベットに添加し、そして細胞への損傷を避けるために、プログラムが終了した直後に、調製した６ウェルプレートにサンプルを移した。細胞を加湿した３７℃／５％ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。フローサイトメトリー分析および細胞傷害性アッセイをエレクトロポレーションの１２〜１６時間後に行った。フローサイトメトリー染色を上記のように行った。
【０１７８】
図１１および１２に見られるように、ＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬ改変体およびＣＤ１０７ａ（ＮＫ活性化マーカー）の発現はトランスフェクション後に増加し、ＴＲＡＩＬ遺伝子のＫＨＹＧ−１細胞へのノックインの成功を確認した。
【０１７９】
図１３は、エレクトロポレーションによるトランスフェクションの前および後のＫＨＹＧ−１細胞生存率の証拠を提供する。ＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬ改変体による細胞のトランスフェクション後の細胞生存率に統計的に有意な差が観察されないことが分かる。このことは、野生型または変異体ＴＲＡＩＬの発現が細胞に対して毒性がないことを確認する。この観察は、ＮＫ−９２細胞における対応する知見（これはＴＲＡＩＬ改変体遺伝子ノックインが細胞に対して毒性であることを示唆している（データは示さず））と矛盾する。それにもかかわらず、これは、ＮＫ−９２細胞表面上のＴＲＡＩＬ受容体ＤＲ４およびＤＲ５の比較的高い発現レベルによって説明される可能性が高い（図１４参照）。
【０１８０】
（ＫＨＹＧ−１細胞の細胞傷害性に対するＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬ改変体の効果）
マウス抗ヒトＣＤ２−ＡＰＣ抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎカタログ番号：５６０６４２）を使用した。アネキシンＶ−ＦＩＴＣ抗体（ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓカタログ番号：３１４９００１３）を使用した。ＤＮＡ色素ＳＹＴＯＸ−Ｇｒｅｅｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号：Ｓ７０２０）を使用した。２４ウェル細胞培養プレート（ＳＡＲＳＴＥＤＴ  ＡＧカタログ番号：８３．３９２２）を使用した。骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２、多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６およびＭＭ１．Ｓを標的細胞として使用した。Ｋ５６２、ＲＰＭＩ８２２６、ＭＭ１．Ｓを、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよびペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）／ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍＬ）を含有するＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養した。
【０１８１】
上記で説明したように、ＫＨＹＧ−１細胞をＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬ改変体でトランスフェクトした。
【０１８２】
標的細胞を洗浄し、１５００ｒｐｍで５分間の遠心分離によりペレット化した。トランスフェクトしたＫＨＹＧ−１細胞を０．５×１０６／ｍＬに希釈した。次いで、標的細胞密度を、１：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比を生成するために、予め温めたＲＰＭＩ  １６４０培地中で調整した。
【０１８３】
次いで、０．５ｍＬのＫＨＹＧ−１細胞および０．５ｍＬの標的細胞を２４ウェル培養プレート中で混合し、そして加湿した３７℃／５％ＣＯ２インキュベーター中に１２時間置いた。次いで、フローサイトメトリー分析を用いてＫＨＹＧ−１細胞の細胞傷害性をアッセイした。共培養細胞（異なる時点で）を洗浄し、次いでアネキシンＶ結合緩衝液を用いてＣＤ２−ＡＰＣ抗体（５μＬ／試験）、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ（５μＬ／試験）およびＳＹＴＯＸ−Ｇｒｅｅｎ（５μＬ／試験）で染色した。
【０１８４】
ＦｌｏｗＪｏ  ７．６．２ソフトウェアを用いてデータをさらに分析した。ＣＤ２陽性およびＣＤ２陰性ゲートを設定した。これらはそれぞれＫＨＹＧ−１細胞および標的細胞集団を表す。次いで、ＣＤ２陰性集団中のアネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびＳＹＴＯＸ−Ｇｒｅｅｎ陽性細胞をＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスについて分析した。
【０１８５】
図１５、１６および１７は、３つの標的細胞株：それぞれＫ５６２、ＲＰＭＩ８２２６およびＭＭ１．Ｓについてのアポトーシスに対するＴＲＡＩＬまたはＴＲＡＩＬ改変体を発現する両方のＫＨＹＧ−１細胞の効果を示す。全ての標的細胞集団にとって、ＫＨＹＧ−１細胞上のＴＲＡＩＬ発現が、正常なＫＨＹＧ−１細胞（ＴＲＡＩＬでトランスフェクトされていない）と比較した場合、アポトーシスのレベルを増加させたことは明らかである。さらに、ＫＨＹＧ−１細胞上のＴＲＡＩＬ改変体発現は、野生型ＴＲＡＩＬをトランスフェクトしたＫＨＹＧ−１細胞と比較した場合、全ての標的細胞株においてアポトーシスをさらに増加させた。
【０１８６】
ＴＲＡＩＬ改変体を発現する本発明の細胞は、細胞死受容体ＤＲ５に対してより高い親和性を示すため、癌療法において有意な利点を提供する。これらの細胞に攻撃されると、癌細胞は、特定の経路を介して死を回避するための防御戦略の進展を妨げられる。したがって、ＮＫ細胞はそれらがそのような状況において細胞傷害性を維持するように改変されるので、癌はＴＲＡＩＬデコイ受容体をアップレギュレートすることによってＴＲＡＩＬ誘導細胞死を効果的に回避することはできない。
【０１８７】
（実施例７：ＴＲＡＩＬ改変体をノックインしたＮＫ細胞を用いた血液癌治療のためのプロトコル）
ＫＨＹＧ−１細胞を、実施例６に上記したようにＴＲＡＩＬ改変体でトランスフェクトした。以下のプロトコルを血液癌患者の治療に使用するために開発した。
【０１８８】
ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒまたはｇｐ１３０を発現している癌を有する患者の診断後、ＤＲ５誘導剤（例えば、ボルテゾミブ）は、改変ＮＫ細胞の投与前に投与され、それ故、癌におけるＤＲ５の発現をアップレギュレートするために低用量で使用され、改変ＮＫ細胞療法をより効果的にする。
【０１８９】
次いで、改変ＮＫ細胞のアリコートを解凍し、培養し、そして患者に投与する。
【０１９０】
治療に使用されるＮＫ細胞によって発現されるＴＲＡＩＬ改変体は野生型ＴＲＡＩＬよりもおとり受容体に対する親和性が低いため、癌細胞表面上の細胞死受容体の結合が増加し、したがって結果として癌細胞アポトーシスが増加する。
【０１９１】
上記のプロトコルを実施する前の別の選択肢は、癌を生検し、癌細胞をエクスビボで培養することである。この工程は、ＤＲ５誘導剤が所与の患者に適切であるかどうかを決定するのを助けるために、特に高レベルのデコイ受容体および／または低レベルの細胞死受容体を発現する癌を同定するために使用され得る。所与の癌は、例えば、それのＤＲ５の発現を減少するように適応することが可能であり得るので、この工程はまた、上記のプロトコルによる治療中に行われ得、したがって、治療の途中でＤＲ５誘導剤による治療が適切になる可能性がある。
【０１９２】
（実施例８：低用量ボルテゾミブがＴＲＡＩＬ改変体を発現するＮＫ細胞に対して癌細胞を感作する）
ボルテゾミブ（Ｂｔ）は、多発性骨髄腫（ＭＭ）の治療に有用なプロテアソーム阻害薬（化学療法薬）である。ボルテゾミブは、ＭＭ細胞を含むいくつかの異なる種類の癌細胞においてＤＲ５発現をアップレギュレートすることが知られている。
【０１９３】
ボルテゾミブへの曝露ありまたは曝露なしのＭＭ細胞を標的化するために使用する前に、実施例６に上記したように、ＫＨＹＧ−１細胞をＴＲＡＩＬ改変体でトランスフェクトした。
【０１９４】
（ボルテゾミブ誘導性ＤＲ５発現）
ボルテゾミブをＭｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから購入した。マウス抗ヒトＤＲ５−ＡＦ６４７（カタログ番号：５６５４９８）を、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入した。染色した細胞サンプルをＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩで分析した。
【０１９５】
（１）ＭＭ細胞株ＲＰＭＩ８２２６およびＭＭ１．Ｓを、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気中で、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２４ｍＭの重炭酸ナトリウム、０．０１％の抗生物質および１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）中で増殖させた。
（２）ＭＭ細胞を１×１０６／ｍＬ、２ｍＬ／ウェルで６ウェルプレートに播種した。
（３）次いで、ＭＭ細胞を異なる用量のボルテゾミブで２４時間処理した。
（４）ボルテゾミブ処理／未処理ＭＭ細胞におけるＤＲ５発現をフローサイトメトリーにより分析した（図１８）。
【０１９６】
低用量ボルテゾミブ処理は、両方のＭＭ細胞株においてＤＲ５発現を増加させることを見出した（図１８）。ＤＲ５のアップレギュレーションは、アポトーシスのわずかな誘導と関連していた（データは示さず）。しかし、毒性が高いため、ＤＲ５発現は高用量のボルテゾミブではアップレギュレートできず、その結果ほとんどのＭＭ細胞が死滅することがわかった。
【０１９７】
（癌細胞のボルテゾミブ誘導感作）
実施例６で上述したように、ＫＨＹＧ−１細胞をＴＲＡＩＬ改変体（ＴＲＡＩＬ  Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ）でトランスフェクトした。
【０１９８】
（１）ボルテゾミブ処理／未処理のＭＭ１．Ｓ細胞を標的細胞として使用した。ＭＭ１．Ｓ細胞を２．５ｎＭのボルテゾミブまたはビヒクル（対照）で２４時間処理した。
（２）ＴＲＡＩＬ改変体ｍＲＮＡのエレクトロポレーションの６時間後に、ＫＨＹＧ−１細胞を１２ウェルプレート中でＭＭ細胞とともに培養した。洗浄後、細胞濃度を１×１０６／ｍＬに調整した後、ＫＨＹＧ−１細胞とＭＭ１．Ｓ細胞を１：１の比率で混合し、１２時間培養した。
（３）ＫＨＹＧ−１細胞の細胞傷害性のフローサイトメトリー分析を行った。共培養細胞を集め、洗浄し、そして次にアネキシンＶ結合緩衝液を用いてＣＤ２−ＡＰＣ抗体（５μＬ  ／試験）、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ（５μＬ／試験）およびＳＹＴＯＸ−Ｇｒｅｅｎ（５μＬ／試験）で染色した。
（４）ＦｌｏｗＪｏ  ７．６．２ソフトウェアを用いてデータをさらに分析した。ＣＤ２陰性集団はＭＭ１．Ｓ細胞を表す。ＫＨＹＧ−１細胞はＣＤ２に対し強い陽性である。最後に、ＣＤ２陰性集団におけるアネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびＳＹＴＯＸ−Ｇｒｅｅｎ陽性細胞を分析した。
【０１９９】
アポトーシスのフローサイトメトリー分析を、ＴＲＡＩＬ改変体を用いて／用いずにエレクトロポレーションしたＫＨＹＧ−１細胞と共培養したボルテゾミブ前処理／未処理ＭＭ１．Ｓ細胞において行った（図１９）。
【０２００】
ボルテゾミブは、ＴＲＡＩＬ改変体を発現するＫＨＹＧ−１細胞に対するＭＭ細胞の感受性を誘導することを見出した。したがって、データは、ＤＲ５発現を誘導する薬剤が癌細胞に対する細胞傷害性を増加させるのにモデルにおいて有効であり、したがって癌治療を増強するのに有用であり得ることを示した。
【０２０１】
（実施例９：ＴＲＡＩＬ改変体による誘導アポトーシスの確認）
先の実施例におけるＴＲＡＩＬ改変体発現から生じるＮＫ細胞の細胞傷害性の増加の決定的証拠にもかかわらず、細胞傷害性の増加が癌細胞アポトーシスの誘導から生じたものか（おそらく）、または細胞傷害性の高い表現型を示すためにＮＫ細胞を誤って活性化したためにパーフォリン分泌を介して癌細胞を死滅させることによって生じたのかを確認した。
【０２０２】
コンカナマイシンＡ（ＣＭＡ）は、ＮＫ細胞のパーフォリン媒介性細胞傷害性活性を阻害することが実証されており、これは主に溶解性顆粒のｐＨの上昇によるパーフォリンの分解の加速によるものである。パーフォリン媒介細胞傷害性がＣＭＡで部分的に廃止された場合、ＴＲＡＩＬ改変体を発現するＫＨＹＧ−１細胞の細胞傷害性が強調され得るかどうかを調べた。
【０２０３】
（パーフォリン発現のＣＭＡ誘導減少）
マウス抗ヒトパーフォリンＡＦ６４７（カタログ番号：５６３５７６）をＢＤ  ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入した。コンカナマイシンＡ（カタログ番号：ＳＣ−２０２１１１）を、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ＢｉｏｔｅｃｈｎｏＬｏｇｙから購入した。染色された細胞サンプルをＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩを用いて分析した。
【０２０４】
（１）１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、２ｍＭのＬ−グルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）／ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍＬ）、およびＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地でＫＨＹＧ−１細胞を培養した。
（２）ＫＨＹＧ−１細胞（エレクトロポレーションの６時間後、ペニシリン／ストレプトマイシンを含まないＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した）をさらに１００ｎＭのＣＭＡまたは等容量のビヒクル（ＤＭＳＯ）で２時間処理した。
（３）遠心分離（１５００ｒｐｍ×５分）により細胞を回収し（１×１０６細胞／試験）、上清を吸引した。
（４）細胞をＰＢＳ溶液中４％パラホルムアルデヒド中、室温で１５分間固定した。
（５）細胞を４ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、０．５〜１％ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウム）で２回洗浄した。
（６）細胞を１ｍＬのＰＢＳ／０．１％サポニン緩衝液で室温にて３０分間透過処理した。
（７）細胞を４ｍＬのＰＢＳ／０．１％サポニン緩衝液で洗浄した。
（８）各管に５μＬの抗体を添加し、氷上で３０分間インキュベートする前に、細胞を１００μＬのＰＢＳ／０．１％サポニン緩衝液に再懸濁した。
（９）細胞をＰＢＳ／０．１％サポニン緩衝液で１５００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより３回洗浄した。
（１０）細胞を５００μＬの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、分析まで短時間氷上または冷蔵庫中４℃で暗所に保った。
（１１）細胞をフローサイトメーター（ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ）で分析した。データはＦｌｏｗＪｏ  ７．６．２ソフトウェアを用いて処理した。
【０２０５】
ＣＭＡ処理は、ＫＨＹＧ−１細胞におけるパーフォリン発現レベルを有意に低下させ（図２０）、ＫＨＹＧ−１細胞の生存率に悪影響を及ぼさなかった（図２１）。
【０２０６】
（ＣＭＡ存在下でのＮＫ細胞ＴＲＡＩＬ改変体の細胞傷害性）
実施例６で上述したように、ＫＨＹＧ−１細胞をＴＲＡＩＬ改変体（ＴＲＡＩＬ  Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ）でトランスフェクトした。
【０２０７】
（１）ＭＭ１．Ｓ細胞を標的細胞として用いた。
（２）ＴＲＡＩＬ  ｍＲＮＡのエレクトロポレーションの６時間後、ＫＨＹＧ−１細胞を１００ｍＭのＣＭＡまたは等容量のビヒクルで２時間処理した。
（３）ＫＨＹＧ−１細胞を遠心分離によりＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄し、ＩＬ−２を含むＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁し、細胞濃度を１×１０６／ｍＬに調整した。
（４）ＭＭ１．Ｓ細胞をＩＬ−２を含むＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁し、細胞濃度を１×１０６／ｍＬに調整した。
（５）ＫＨＹＧ−１とＭＭ１．Ｓ細胞とを１：１の割合で混合し、１２時間共培養した。
（６）ＫＨＹＧ−１細胞の細胞傷害性のフローサイトメトリー分析を行った。共培養細胞を洗浄し、ＣＤ２−ＡＰＣ抗体（５μＬ／試験）で染色した。
（７）洗浄後、アネキシンＶ結合緩衝液を用いて、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ（５μＬ／試験）およびＳＹＴＯＸ−Ｇｒｅｅｎ（５μＬ／試験）でさらに染色を行った。
（８）ＦｌｏｗＪｏ  ７．６．２ソフトウェアを用いてデータをさらに分析した。ＣＤ２陰性集団はＭＭ１．Ｓ細胞を表す。ＫＨＹＧ−１細胞はＣＤ２に対し強い陽性である。次いで、ＣＤ２陰性集団におけるアネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびＳＹＴＯＸ−Ｇｒｅｅｎ陽性細胞を分析した。
【０２０８】
ＴＲＡＩＬ改変体を発現するＮＫ細胞は、ＴＲＡＩＬ改変体の発現を欠く対照細胞よりも高い細胞傷害性を示すことが再び示された（図２２）。しかし、この実施例では、ＣＭＡで処理した対照ＮＫ細胞についての知見とは対照的に、ＣＭＡはＴＲＡＩＬ改変体を発現するＮＫ細胞の細胞傷害性活性を有意に減少させることができないことをさらに示した。
【０２０９】
ＴＲＡＩＬ改変体を含まないＮＫ細胞（対照またはモックＮＫ細胞）は、ＣＭＡの非存在下で４８％の癌細胞死およびＣＭＡの存在下で３５．９％の癌細胞死を誘導することを示した（図２２）。ＴＲＡＩＬ改変体を発現するＮＫ細胞は、ＣＭＡの存在下および非存在下の両方において、対照ＮＫ細胞よりも多くの癌細胞死を誘導することができた。事実、ＣＭＡが存在していても、ＴＲＡＩＬ改変体を発現するＮＫ細胞は、ＣＭＡの非存在下で対照ＮＫ細胞よりも多くの癌細胞死を誘導した。
【０２１０】
したがって、このデータは、パーフォリン関連のダウンレギュレーションを受けにくいメカニズムを介して癌細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害性を増加させることにおけるＴＲＡＩＬ改変体の重要性を示す。パーフォリンは標的細胞を殺傷するためにＮＫ細胞によって一般的に使用され、そして多くの癌細胞は、細胞傷害性攻撃を回避するためにＮＫ細胞パーフォリン発現を減少させるためのメカニズムを発達させているので、本発明のＮＫ細胞は、癌細胞による減弱を受けにくい強力な代替物を表す。
【０２１１】
（実施例１０：ＫＨＹＧ−１細胞における変異体ＴＲＡＩＬ改変体の発現とチェックポイント抑制性受容体ＣＤ９６のノックダウン）
チェックポイント抑制性受容体ＣＤ９６発現をノックダウンする際、そしてまたＴＲＡＩＬ改変体を発現する際に、ＮＫ細胞の細胞傷害性の増加を観察した。また、ＮＫ細胞の細胞傷害性に対する相乗効果を引き起こすために、２つの遺伝子改変を組み合わせて試験した。
【０２１２】
実施例２に記載したように、ＫＨＹＧ−１細胞においてＣＤ９６発現をノックダウンした。
【０２１３】
実施例６で上述したように、ＫＨＹＧ−１細胞をＴＲＡＩＬ改変体（ＴＲＡＩＬ  Ｄ２６９Ｈ／Ｅ１９５Ｒ）でトランスフェクトした。
【０２１４】
（１）エレクトロポレーションの１２時間後、ＫＨＹＧ−１細胞を、１２ウェルプレート（２ｍＬ／ウェル）中で１×１０６／ｍＬの濃度で標的細胞（Ｋ５６２またはＭＭ１．Ｓ）と１２時間共培養した。Ｅ：Ｔ比は１：１であった。
（２）共培養の１２時間後、細胞を回収し、洗浄し、ＣＤ２−ＡＰＣで染色し、再度洗浄し、さらにアネキシンＶ結合緩衝液を用いてアネキシンＶ−ＦＩＴＣ（５μＬ／試験）およびＳＹＴＯＸ−Ｇｒｅｅｎ（５μＬ／試験）で染色した。
（３）ＢＤ  ＦＡＣＳ  ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーターを用いて細胞サンプルを分析した。ＦｌｏｗＪｏ  ７．６．２ソフトウェアを用いてデータをさらに分析した。ＣＤ２陰性集団はＭＭ１．Ｓ細胞を表す。ＫＨＹＧ−１細胞はＣＤ２に対して強い陽性である。次いで、ＣＤ２陰性集団におけるアネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびＳＹＴＯＸ−Ｇｒｅｅｎ陽性細胞を分析した。
【０２１５】
ＫＨＹＧ−１細胞におけるＣＤ９６発現のノックダウンとＴＲＡＩＬ改変体の発現は、Ｋ５６２標的細胞（図２３）とＭＭ１．Ｓ標的細胞（図２４）の両方に対する細胞傷害性を相乗的に増強することがわかった。これは、両方の標的細胞群において、単独での個々の改変から生じるよりも同時の遺伝子改変からより多くの細胞死がもたらされるという事実によって示された。
【０２１６】
同時に、ＴＲＡＩＬ変異体／改変体の発現がＮＫ細胞の細胞傷害性を増加させることを示すさらなる証拠（図２３および２４）に加えて、ＣＤ９６のノックダウンによってＮＫ細胞の細胞傷害性が増加することを示すさらなる証拠が得られた（図２３および２４）。
【０２１７】
（実施例１１：ＮＫ細胞の細胞傷害性に対するＩＬ−６の直接および間接の効果）
（材料および方法）
組換えヒトＩＬ−２（カタログ：２００−０２）およびＩＬ−６（カタログ：２００−０６）を、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨから購入した。ＩＬ−２を１００ｍＭ酢酸溶液中で再構成し、等分して−８０℃で保存した。ＩＬ−６を０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中で再構成し、等分しそして−８０℃で貯蔵した。
【０２１８】
ＲＰＭＩ１６４０培地（カタログ：Ｒ８７５８）をＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨから購入した。ウシ胎児血清をＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ（カタログ：Ｆ７５２４）から購入した。１０，０００単位のペニシリンおよび１０ｍｇのストレプトマイシン／ｍＬで安定化された１００Ｘペニシリン−ストレプトマイシン溶液（カタログ：Ｐ４３３３）をＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨから購入した。細胞培養用のウマ血清（カタログ：Ｈ１１３８−５００ＭＬ）をＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨから購入した。Ａｌｐｈａ  ＭＥＭ培地（カタログ番号：１２５６１０５６）をＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。
【０２１９】
ＰＥ標識マウス抗ヒトＣＤ１２６（ＩＬ−６受容体α鎖）（カタログ番号：５５１８５０）、ＰＥ標識マウス抗ヒトＣＤ１３０（ｇｐ１３０、ＩＬ−６受容体関連シグナルトランスデューサー）（カタログ番号：５５５７５７）、ＰＥ標識マウスＩｇＧ１  κアイソタイプ対照（カタログ：５５５７４９）、ＡＰＣ標識マウス抗ヒトＣＤ２（カタログ：５６０６４２）、ＦＩＴＣ標識マウス抗ヒトＣＤ２（カタログ：５５５３２６）、ＡＰＣ標識マウス抗ヒトＰＤ−Ｌ１（カタログ：５６３７４１）およびＡＰＣ標識マウス抗ヒトＰＤ−Ｌ２（カタログ：５５７９２６）をＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入した。ＡＰＣ標識マウス抗ヒトＰＤ１抗体（カタログ番号：３２９９０７）はＢｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した。Ｐｈｏｓｐｈｏｒ−Ｓｔａｔ３（Ｓｅｒ７２７）マウスｍＡｂ（カタログ：９１３６）、Ｐｈｏｓｐｈｏｒ−Ｓｈｐ−１（Ｔｙｒ５６４）ウサギｍＡｂ（カタログ；  ８８４９）、Ｐｈｏｓｐｈｏｒ−Ｓｈｐ−２（Ｔｙｒ５８０）ウサギｍＡｂ（カタログ：５４３１）、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）ウサギｍＡｂ（カタログ番号：４３７０）およびｐ４４／４２  ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）ウサギｍＡｂをＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。Ｐｈｏｓｐｈｏｒ−Ｓｔａｔ３（Ｔｙｒ７０５）マウスｍＡｂ（カタログ番号：ｓｃ−８１５２３）およびウサギ抗ヒトＳｔａｔ３ポリクローナル抗体（カタログ番号：ｓｃ−７１７９）を、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。マウス抗ベータアクチン（カタログ番号：Ａ５４４１）をＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨから購入した。機能的ＩＬ−６遮断抗体（カタログ：５０１１１０）および関連のアイソタイプ対照抗体（カタログ：４００４１４）をＢｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した。
【０２２０】
死細胞のフローサイトメトリー分析用のＤＮＡ色素ＳＹＴＯＸ（登録商標）ｇｒｅｅｎ（カタログ番号：ｓ３４８６０）を、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。アポトーシス細胞のフローサイトメトリー分析のためのアネキシンＶ−ＦＩＴＣ抗体（カタログ番号：５５６４１９）をＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入した。
【０２２１】
ＮＫ細胞株ＫＨＹＧ−１を１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン／１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で培養し、そして維持した。ＮＫ細胞株ＮＫ−９２を、１０％ウマ血清、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン／１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２を含有するアルファＭＥＭ中で培養した。２〜３日毎に、ＫＨＹＧ−１およびＮＫ−９２細胞を培養するための培地を交換するか、または細胞を１：２または１：３希釈で分割した。
【０２２２】
Ｋ５６２、Ｕ９３７、ＨＬ６０、Ｒａｊｉ、ＲＰＭＩ８２２６、Ｕ２６６、ＭＭ１．Ｓ、ＮＣＩ−Ｈ９２９およびＫＭＳ１１細胞を、１０％ＦＢＳおよび１００Ｕ／ｍＬのペニシリン／１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ−１６４０中で培養した。
【０２２３】
（ＩＬ−６受容体発現）
フローサイトメトリーを使用して、様々なエフェクター細胞および標的細胞におけるＩＬ−６受容体およびｇｐ１３０の発現レベルを定量した。
【０２２４】
細胞（対数期）を遠心分離（１５００ｒｐｍで５分間）によって収集し、１００万細胞／試験の密度を用いた。細胞を、０．１％ＢＳＡおよび０．１％アジ化ナトリウムを含有する氷冷ＰＢＳで洗浄した。細胞を最後に、氷上で３０分間、０．１％ＢＳＡおよび０．１％アジ化ナトリウムを含有する５０μＬのＰＢＳ中のＰＥ標識ＣＤ１２６、ＣＤ１３０またはアイソタイプ対照抗体（２．５μＬ／試験）に曝露した。細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄した後、サンプルをＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で取得した。ＦｌｏｗＪｏ  ７．６．１ソフトウェアを使用して結果を分析した。
【０２２５】
図３１〜４４は、ＫＨＹＧ−１、ＮＫ−９２、ＲＰＭＩ８２２６、ＭＭ１．Ｓ、ＮＣＩ−Ｈ９２９、Ｕ２６６、ＫＭＳ１１およびＫ５６２細胞におけるＩＬ−６受容体（ＣＤ１２６）およびｇｐ１３０（ＣＤ１３０）の発現を示す。
【０２２６】
ＫＨＹＧ−１細胞は低レベルのＣＤ１２６（図３１および３２）およびＣＤ１３０（図３３および３４）を発現した。
【０２２７】
ＮＫ−９２細胞は低レベルのＣＤ１２６（図３５）およびＣＤ１３０（図３６）を発現した。
【０２２８】
ＭＭ細胞（Ｕ２６６、ＲＰＭＩ８２２６、ＮＣＩ−Ｈ９２９、ＫＭＳ１１およびＭＭ１．Ｓ）は比較的高レベルのＣＤ１２６およびＣＤ１３０を発現した（それぞれ図３７〜４１）。
【０２２９】
しかし、白血病Ｋ５６２細胞はＣＤ１２６陰性であった（図４２および４３）が、比較的高レベルのＣＤ１３０を発現した（図４４）。
【０２３０】
（ＩＬ−６によるＮＫ細胞の細胞傷害性の直接阻害）
上記のように、ＫＨＹＧ−１、ＲＰＭＩ８２２６、ＭＭ１．ＳおよびＫ５６２細胞を培養し、そして維持した。細胞を対数増殖期に収穫し、洗浄し、そして細胞濃度を１００万／ｍＬに調整する前に、予め温めた適切な培地に再懸濁した。標的細胞の濃度をＥ：Ｔ（エフェクター：標的）比に従って調整した。０．５ｍＬのＫＨＹＧ−１細胞および０．５ｍＬの標的細胞を２４ウェルプレートの１つのウェルに添加した。ＩＬ−６を１００ｎｇ／ｍＬの最終濃度でウェルに添加した。次にプレートを加湿した３７℃／５％ＣＯ２インキュベーターに１２時間入れた（Ｋ５６２細胞では６または４時間）。０時間の時点でのＫＨＹＧ−１と標的細胞の同じ混合物を対照として使用した。
【０２３１】
フローサイトメトリーを用いてＫＨＹＧ−１細胞の細胞傷害性を測定した。共培養細胞を（異なる時点で）収集し、洗浄し、次いでアネキシンＶ結合緩衝液を用いて、最初にＣＤ２−ＡＰＣ抗体（２．５μＬ／試験）で染色し、次いでアネキシンＶ−ＦＩＴＣ（２．５μＬ／試験）およびＳＹＴＯＸ−Ｇｒｅｅｎ（０．５μＬ）で染色した。ＦｌｏｗＪｏ  ７．６．１ソフトウェアを用いてデータをさらに分析した。それぞれＫＨＹＧ−１細胞および標的細胞を表すＣＤ２陽性およびＣＤ２陰性ゲートを設定した。ＫＨＹＧ−１細胞はＣＤ２に対して１００％陽性であったが、Ｋ５６２、ＲＰＭＩ８２２６およびＭＭ１．Ｓ細胞はＣＤ２陰性であった。最後に、ＣＤ２陰性集団におけるアネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびＳＹＴＯＸ−Ｇｒｅｅｎ陽性細胞（死細胞）の割合を分析した。
【０２３２】
図２５〜３０は、ＩＬ−６が、１：１のＥ：Ｔ比でＲＰＭＩ８２２６、ＭＭ１．ＳおよびＫ５６２標的細胞に対するＫＨＹＧ−１細胞の細胞傷害性を抑制したことを示す。
【０２３３】
ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍＬ）の存在下では、死滅した標的細胞の割合は、ＫＨＹＧ−１細胞と共培養すると減少した。これは１２時間のインキュベート後のＲＰＭＩ８２２６細胞（図２５および２６）、１２時間のインキュベート後のＭＭ１．Ｓ細胞（図２７および２８）または６時間のインキュベート（図２９）または４時間インキュベート（図３０）後のＫ５６２細胞の場合であった。
【０２３４】
Ｋ５６２細胞はＣＤ１２６陰性であるので、結果は、ＫＨＹＧ−１細胞の細胞傷害性に対する阻害効果がＫＨＹＧ−１細胞上のＩＬ−６受容体を介して直接媒介されたことを示す。
【０２３５】
観察されたＩＬ−６誘導性のＫＨＹＧ−１細胞傷害性の阻害の背後にあるメカニズムをさらに調べるために、ＫＨＹＧ１細胞をＩＬ−２の存在下で２４時間、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６で刺激し、次いでＮＫＧ２Ｄ（活性化受容体）およびＮＫＧ２Ａ（抑制性受容体）発現レベルをフローサイトメトリーによって分析した。陰性対照はＦＭＯを意味する。ＡＰＣ抗ヒトＮＫＧ２Ｄ抗体（カタログ番号＃３２０８０７）をＢｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した。ＡＰＣ抗ヒトＮＫＧ２Ａ抗体（カタログ番号ＦＡＢ１０５９Ａ）をは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。
【０２３６】
図７０に示すように、ＩＬ−６は、活性化受容体ＮＫＧ２Ｄ（７０Ａ）の発現レベルを減少させることによってＫＨＹＧ−１細胞の細胞傷害性を直接阻害する一方、抑制性受容体ＮＫＧ２Ａ（７０Ｂ）の発現を増加させる。
【０２３７】
（ＩＬ−６によるＮＫ細胞の細胞傷害性の間接的阻害）
対数期のＭＭ細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地に５０万／ｍＬで播種した。最終濃度１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６または同容量のビヒクル（ＰＢＳ）を用いて、ＭＭ細胞を４８時間処理した。次にＭＭ細胞を採取し、洗浄し、そしてＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２抗体で染色した（２．５μＬ／試験）。フローサイトメトリーデータをＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩを用いて取得し、そして結果をＦＡＣＳＤＩＶＡ  ８．０．１ソフトウェアによりさらに分析した。
【０２３８】
図４５〜５６は、ＩＬ−６がＲＰＭＩ８２２６細胞、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞、ＭＭ１．Ｓ細胞およびＵ２６６細胞上でＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の発現を増加させたことを示す。
【０２３９】
ＰＤ−Ｌ１のＩＬ−６誘導アップレギュレーションを、ＲＰＭＩ８２２６細胞（図４５）、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞（図４７）、ＭＭ１．Ｓ細胞（図４９および５０）およびＵ２６６細胞（図５３および５４）で観察した。
【０２４０】
ＰＤ−Ｌ２のＩＬ−６誘導アップレギュレーションは、ＲＰＭＩ８２２６細胞（図４６）、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞（図４８）、ＭＭ１．Ｓ細胞（図５１および５２）およびＵ２６６細胞（図５５および５６）で観察した。
【０２４１】
ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２はＮＫ細胞上のチェックポイント抑制性受容体（ｃＩＲ）ＰＤ−１に結合することが周知であるので、これらのデータは、ＩＬ−６が癌細胞にも作用することによってＮＫ細胞の細胞傷害性を抑制する第２の（間接的な）メカニズムを明確に示す。
【０２４２】
これらの２つの解明されたメカニズムは、癌細胞の生存に関与する重要なサイトカインとしてＩＬ−６を示した。
【０２４３】
（ＩＬ−６拮抗作用の効果）
対数期のＵ２６６細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地に５０万／ｍＬで播種した。Ｕ２６６細胞によって分泌されたＩＬ−６を遮断するために、最終濃度１０μｇ／ｍＬのラット抗ヒトＩＬ−６  ｍＡｂまたはアイソタイプ対照抗体を添加した。４８時間の時点で、Ｕ２６６細胞を採取し、洗浄し、そしてＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２抗体（２．５μＬ／試験）で染色した。フローサイトメトリーデータをＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩを用いて取得し、そして結果をＦＡＣＳＤＩＶＡ  ８．０．１ソフトウェアを用いてさらに分析した。
【０２４４】
図５７〜６０は、Ｕ２６６細胞上のＰＤ−Ｌ１発現がＩＬ−６遮断抗体の存在下で有意に減少したことを示す。
【０２４５】
図６１〜６４は、Ｕ２６６細胞上のＰＤ−Ｌ２発現がＩＬ−６遮断抗体の存在下で有意に減少したことを示す。
【０２４６】
したがって、ＩＬ−６シグナル伝達の拮抗作用は、ＩＬ−６遮断抗体を使用することによって達成可能であることが示されている。
【０２４７】
これらのデータは、ＩＬ−６シグナル伝達が癌細胞上のＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の発現の調節に関与していることを裏付けている。
【０２４８】
したがって、直接的および間接的なＩＬ−６誘導性のＮＫ細胞の細胞傷害性の抑制が防止されるので、本発明によるＩＬ−６シグナル伝達の遮断は癌の治療に有用である。さらに、癌細胞に対するＩＬ−６の直接的な増殖作用または抗アポトーシス作用もまた、ＩＬ−６シグナル伝達を遮断することによって防止される。
【０２４９】
これをさらに実証するために、ＫＨＹＧ−１細胞を２μｇ／ｍＬのＩＬ−６遮断ｍＡｂ（ＬＥＡＦＴＭ精製抗ヒトＩＬ−６抗体、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号＃５０１１１０）または同用量のアイソタイプ対照抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号＃４００４１３）の存在下で上記のようにＵ２６６細胞で刺激した。
【０２５０】
図６９に示すように、ｍＡｂを用いてＩＬ−６を遮断すると、Ｕ２６６細胞に対するＫＨＹＧ−１細胞傷害性が回復した（１：１のＥ：Ｔ比；１２時間のインキュベート）。したがって、ＲＰＭＩ８２２６、ＭＭ１．ＳおよびＫ５６２標的細胞についての上記のデータに加えて、これは、ＩＬ−６シグナル伝達を阻害することが、ＫＨＹＧ−１細胞が別の癌細胞株における標的癌細胞を殺す能力を高めることを示した。
【０２５１】
（ＮＫ細胞におけるＩＬ−６シグナル伝達）
ＫＨＹＧ−１細胞を上記のように培養し維持した。ＩＬ−６単独の効果を試験する場合、ＫＨＹＧ−１細胞を１０％ＦＢＳ（ＩＬ−２なし）を補充したＲＰＭＩ１６０培地中で６時間飢餓状態にし、次いで１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２および／または１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６で刺激した。
【０２５２】
通常の条件で増殖するＫＨＹＧ−１細胞は、細胞増殖を促進し細胞傷害性を維持するためにＩＬ−２を必要とする。
【０２５３】
図６５に示すように、ＩＬ−２単独ではｐ−ＳＴＡＴ３およびｐ−Ｐ４４／４２を活性化したが、ｐ−ＳＨＰ１およびｐ−ＳＨＰ２の発現は減少したことを見出した。
【０２５４】
図６６に示すように、ＩＬ−６単独ではｐ−ＳＴＡＴ３、ｐ−ＳＨＰ１、およびｐ−ＳＨＰ２を活性化したが、ｐ−Ｐ４４／４２の発現は減少した。
【０２５５】
図６７に示されるように、ＩＬ−２の存在下で、ＩＬ−６は、ｐ−Ｐ４４／４２発現を減少させ、そしてｐ−ＳＨＰ１およびｐ−ＳＨＰ２発現を増加させることができるままであった。
【０２５６】
モデル（ＮＫ細胞を含む）において、ｐ−ＳＴＡＴ３がＩＬ−６シグナル伝達経路の主要な下流エフェクターであり、そしてｐ−Ｐ４４／４２のレベルがＮＫ細胞の細胞傷害性と正に関連することが実証されている。
【０２５７】
上記のデータは、ｐ−ＳＨＰ１およびｐ−ＳＨＰ２がｐ−Ｐ４４／４２のレベルを調節するのに重要な役割を果たすことを示している。さらに、ＩＬ−６抗細胞傷害性シグナル伝達がＩＬ−２プロ細胞傷害性シグナル伝達のそれを克服し、ＮＫ細胞の細胞傷害性の全体的な減少をもたらし、そして効果的に逆転させることができる。したがって、ＩＬ−６拮抗作用は癌治療として提供することができる。
【０２５８】
（癌細胞はＮＫ細胞におけるＰＤ−１発現のアップレギュレーションを誘導した）
ＫＨＹＧ−１細胞を１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で培養し、そして維持した。Ｋ５６２、Ｕ９３７、ＨＬ６０、Ｒａｊｉ、ＲＰＭＩ８２２６、Ｕ２６６およびＭＭ１．Ｓ細胞を、１０％ＦＢＳおよび１００Ｕ／ｍＬペニシリン／１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０中で培養した。細胞を対数増殖期に収穫し、洗浄し、そして細胞濃度を１００万／ｍＬに調整する前に、ＩＬ−２を含む予め温めたＲＰＭＩ１６４０培地（ＫＨＹＧ−１細胞を培養するための培地）に再懸濁した。標的細胞の濃度はＥ：Ｔ（エフェクター：標的）比に従って調整した。０．５ｍＬのＫＨＹＧ−１細胞および０．５ｍＬの標的細胞を２４ウェルプレートの１つのウェルに添加し、そして２４時間培養した。細胞を採取し、洗浄し、そしてＣＤ２−ＦＩＴＣ（２．５μＬ／試験）およびＰＤ１−ＡＰＣ（２．５μＬ／試験）抗体で染色した。サンプルをＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩを用いて取得し、そしてＦＡＣＳＤｉｖａ  ８．０．１ソフトウェアを用いて分析した。ＣＤ２陽性およびＣＤ２陰性ゲートは、それぞれＫＨＹＧ−１細胞および標的細胞を表す。ＫＨＹＧ−１細胞はＣＤ２に対して１００％陽性であるが、ＭＭ細胞および他の悪性血液癌細胞株はＣＤ２陰性である。ＣＤ２陽性集団（すなわちＫＨＹＧ−１細胞）におけるＰＤ−１発現をこのようにして分析した。
【０２５９】
図６８から分かるように、異なる血液癌細胞株と共培養したＫＨＹＧ−１細胞におけるＰＤ−１発現のフローサイトメトリー分析（Ｅ：Ｔ比＝１：１）は、ＰＤ−１発現が試験したすべての血液癌細胞株によって有意に誘導されることを明らかにした。
【０２６０】
ＮＫ細胞上でのより高いＰＤ−１発現がＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２を発現するそれらの癌によるより大きな程度の細胞傷害性阻害をもたらすので、これらのデータは、ＮＫ細胞の細胞傷害性に対する癌細胞の抑制効果を強調する。
【０２６１】
したがって、癌細胞はＮＫ細胞上のｃＩＲ  ＰＤ−１の発現をアップレギュレートし、一方ＩＬ−６は癌細胞上のＮＫ細胞の細胞傷害性を直接低下させ、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の発現をアップレギュレートする。ＮＫ細胞上でのＰＤ−１発現の増加と癌細胞上でのＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２発現の増加とが、ＮＫ細胞傷害性を有意に抑制するために共に働く。さらに、ＩＬ−６は癌細胞の増殖を直接促進する。
【０２６２】
上記のように、ＩＬ−６シグナル伝達を遮断することは、癌細胞、特にＩＬ−６受容体を発現する癌細胞の生存を減少させることにおいて治療的用途を有する。
【０２６３】
（ＩＬ−６アンタゴニスト治療プロトコル）
以下のプロトコルを、多発性骨髄腫患者の治療に使用するために開発した。それにもかかわらず、本発明が、ＩＬ−６Ｒ発現癌を含む多くの異なる癌患者を治療するのに適していることは明らかである。
【０２６４】
ＩＬ−６Ｒ陽性癌（この場合は多発性骨髄腫）を有する患者の診断後、有効量で患者に投与する前に、一定分量のＮＫ細胞を解凍し、培養する。等分した細胞は、本明細書の他の箇所に記載のように改変することができる。あるいは、一過性トランスフェクションは、例えばウイルス手段、エレクトロポレーションなどを用いて調製することができる。エレクトロポレーションのために、ＭａｘＣｙｔｅ  Ｆｌｏｗ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎプラットフォームは、診療所での高速大規模トランスフェクションを達成するための適切なソリューションを提供する。ＮＫ細胞をトランスフェクトした後、それらは、改変の発現を可能にするように培養され、次いで患者に静脈内投与される。
【０２６５】
ＮＫ細胞の投与の前に、それと同時に、またはその後に、ＩＬ−６アンタゴニストを患者に有効量で投与する。このＩＬ−６アンタゴニストは、１つのアンタゴニストまたはそれらの組み合わせであり得る。結合の結果がＩＬ−６シグナル伝達を低下させる（拮抗する）のであれば、１つまたは複数のＩＬ−６アンタゴニストはＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ｇｐ１３０などに結合してもよい。
【０２６６】
したがって、本発明は、ＮＫ細胞に基づく癌治療におけるＩＬ−６シグナル伝達の拮抗作用を提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
2020500940.tif 000071
【図６８】
2020500940.tif 000072
【図６９】
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【図７０】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年1月8日(2019.1.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液癌の治療に使用するための、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒまたはｇｐ１３０に対する抗体アンタゴニストと組み合わせたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または細胞株。
【請求項２】
前記血液癌がＩＬ−６受容体を発現する、請求項１に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項３】
前記血液癌がＰＤＬ−１および／またはＰＤＬ−２を発現する、請求項１または２に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項４】
前記ＩＬ−６抗体が、シルツキシマブ、オロキズマブ（ＣＤＰ６０３８）、エルシリモマブ、ＢＭＳ−９４５４２９（ＡＬＤ５１８）、ＭＨ−１６６およびシルクマブ（ＣＮＴＯ  １３６）から選択される、先行する請求項のいずれかに記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項５】
前記ＩＬ−６Ｒ抗体が、トシリズマブ、サリルマブ、ＰＭ−１およびＡＵＫ１２−２０から選択される、請求項１から３のいずれかに記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項６】
前記ｇｐ１３０抗体がＡＭ６４である、請求項１から３のいずれかに記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項７】
別の抗癌療法と組み合わせた、先行する請求項のいずれかに記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項８】
前記別の抗癌療法が、免疫エフェクター細胞として内因性ＮＫ細胞を利用する、請求項７に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項９】
前記別の抗癌療法が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である、請求項７または８に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項１０】
前記血液癌が、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ホジキンリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫およびＢ細胞リンパ腫を含む非ホジキンリンパ腫、無症候性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、または軽鎖骨髄腫である、先行する請求項のいずれかに記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項１１】
前記ＮＫ細胞または細胞株が、１つまたはそれ以上のチェックポイント抑制性受容体の発現を減少するように遺伝子改変されている、先行する請求項のいずれかに記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項１２】
前記チェックポイント抑制性受容体が、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ−３）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＩＧＩＴ、およびＴＩＭ−３から選択される、請求項１１に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項１３】
前記ＮＫ細胞または細胞株が、変異体ＴＲＡＩＬリガンドを発現するように遺伝的に改変されている、先行する請求項のいずれかに記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項１４】
前記変異体ＴＲＡＩＬリガンドが、ＴＲＡＩＬ受容体（例えば、ＤＲ４および／またはＤＲ５）に対して増大した親和性を有する、請求項１３に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項１５】
前記変異体ＴＲＡＩＬリガンドが、デコイＴＲＡＩＬ受容体に対して減少した親和性を有する、請求項１３または１４に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項１６】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する、先行する請求項のいずれかに記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項１７】
前記ＣＡＲが二重特異性ＣＡＲである、請求項１６に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項１８】
前記二重特異性ＣＡＲが、１つの細胞型上の２つのリガンドに結合する、請求項１７に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項１９】
前記二重特異性ＣＡＲが、２つの異なる細胞型のそれぞれ上の１つのリガンドに結合する、請求項１７に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項２０】
前記ＣＡＲまたは二重特異性ＣＡＲに対する１つまたは複数の前記リガンドが癌細胞上に発現される、請求項１６および１７に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項２１】
前記二重特異性ＣＡＲに対する前記リガンドが、両方とも癌細胞上で発現される、請求項２０に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項２２】
前記二重特異性ＣＡＲに対する前記リガンドが、癌細胞および免疫エフェクター細胞上に発現される、請求項２０に記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項２３】
前記ＮＫ細胞または細胞株が、ＩＬ−６受容体の発現を減少するように遺伝子改変されている、先行する請求項のいずれかに記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項２４】
前記ＮＫ細胞株がＫＨＹＧ−１である、先行する請求項のいずれかに記載の使用のためのＮＫ細胞または細胞株。
【請求項２５】
血液癌を治療する方法であって、患者に有効量のＮＫ細胞とＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒまたはｇｐ１３０に対する抗体アンタゴニストとの組み合わせを投与する工程を含む、方法。
【請求項２６】
前記血液癌がＩＬ−６受容体を発現する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記血液癌がＰＤＬ−１および／またはＰＤＬ−２を発現する、請求項２５または２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記ＮＫ細胞または細胞株が、予め結合されたＩＬ−６アンタゴニストとともに提供される、請求項２５から２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記ＩＬ−６抗体が、シルツキシマブ、オロキズマブ（ＣＤＰ６０３８）、エルシリモマブ、ＢＭＳ−９４５４２９（ＡＬＤ５１８）、ＭＨ−１６６およびシルクマブ（ＣＮＴＯ  １３６）から選択される、請求項２５から２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記ＩＬ−６Ｒ抗体が、トシリズマブ、サリルマブ、ＰＭ−１およびＡＵＫ１２−２０から選択される、請求項２５から２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記ｇｐ１３０抗体がＡＭ６４である、請求項２５から２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
別の抗癌療法と組み合わせて使用される、請求項２５から３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記別の抗癌療法が、免疫エフェクター細胞として内因性ＮＫ細胞を利用する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記別の抗癌療法が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記血液癌が、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ホジキンリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫およびＢ細胞リンパ腫を含む非ホジキンリンパ腫、無症候性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）または軽鎖骨髄腫である、請求項２５から３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記ＮＫ細胞または細胞株が、１つまたはそれ以上のチェックポイント抑制性受容体の発現を減少するように遺伝子改変されている、請求項２５から３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記チェックポイント抑制性受容体が、ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ−３）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ３２８（ＳＩＧＬＥＣ７）、ＳＩＧＬＥＣ９、ＴＩＧＩＴおよびＴＩＭ−３から選択される、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記ＮＫ細胞または細胞株が、変異体ＴＲＡＩＬリガンドを発現するように遺伝子改変されている、請求項２５から３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
前記変異体ＴＲＡＩＬリガンドが、ＴＲＡＩＬ受容体（例えば、ＤＲ４および／またはＤＲ５）に対して増大した親和性を有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記変異体ＴＲＡＩＬリガンドが、デコイＴＲＡＩＬ受容体に対して減少した親和性を有する、請求項３８または３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記ＮＫ細胞または細胞株がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する、請求項２５から４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
前記ＣＡＲが二重特異性ＣＡＲである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記二重特異性ＣＡＲが、１つの細胞型上の２つのリガンドに結合する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記二重特異性ＣＡＲが、２つの異なる細胞型のそれぞれ上の１つのリガンドに結合する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＣＡＲまたは二重特異性ＣＡＲに対する１つまたは複数の前記リガンドが癌細胞上で発現される、請求項４１または４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
前記二重特異性ＣＡＲに対する前記リガンドが、両方とも癌細胞上で発現される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記二重特異性ＣＡＲに対する前記リガンドが癌細胞および免疫エフェクター細胞上に発現される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＮＫ細胞または細胞株が、ＩＬ−６受容体の発現を減少するように遺伝子改変されている、請求項２５から４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記ＮＫ細胞系がＫＨＹＧ−１である、請求項２５から４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
ヒト患者において、（ｉ）ＩＬ−６受容体発現多発性骨髄腫および（ｉｉ）ＩＬ−６受容体発現白血病から選択される癌を治療する方法であって、ＮＫ細胞とＩＬ−６を中和する抗体との組合せの有効量を該患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項５１】
前記抗体が、シルツキシマブ、オロキズマブ（ＣＤＰ６０３８）、エルシリモマブ、ＢＭＳ−９４５４２９（ＡＬＤ５１８）、ＭＨ−１６６およびシルクマブ（ＣＮＴＯ１３６）から選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＮＫ細胞がＫＨＹＧ−１である、請求項５０または５１のいずれかに記載の方法。
【国際調査報告】
2020500940.tif 000075
2020500940.tif 000076