(57)【要約】【課題】ヒト以外の被験体の非Ｂ非Ｃ型肝細胞癌の治療投与方法および組成物を提供する。【解決手段】本発明は、ヒト以外の被験体におけるＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス）／ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）陰性の肝細胞癌（ＨＣＣ）すなわち非Ｂ非Ｃ型肝細胞癌（ＮＢＮＣ−ＨＣＣ）を治療するための方法および医薬組成物に関し、特に治療を必要とするヒト以外の被験体に治療有効量の阻害剤を投与して、ＣＤ３６増幅およびＡＢＣＧ４欠失を含む脂質ホメオスタシス関連遺伝子の遺伝的変化を制御することを含む。本発明によれば、脂質代謝経路を標的とする医薬は、ＣＤ３６増幅および／またはＡＢＣＧ４欠失を有する被験体における非Ｂ非Ｃ型肝細胞癌（ＮＢＮＣ−ＨＣＣ）を治療するために開発される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト以外の被験体におけるＢ型／Ｃ型肝炎ウイルス感染陰性の肝細胞癌の予防または治療のため、前記被験体に、脂質ホメオスタシス関連遺伝子の遺伝的変化を制御するための調節剤の治療有効量を投与することを含む、投与方法。
【請求項２】
前記遺伝的変化がＣＤ３６増幅を含む、請求項１に記載の投与方法。
【請求項３】
前記遺伝的変化がＡＢＣＧ４欠失を含む、請求項１に記載の投与方法。
【請求項４】
前記遺伝的変化がＣＤ３６増幅およびＡＢＣＧ４欠失を含む、請求項１に記載の投与方法。
【請求項５】
脂質ホメオスタシス関連遺伝子の遺伝的変化を阻害または促進するための治療有効量の調節剤を含む、被験体におけるＢ型／Ｃ型肝炎ウイルス感染陰性の肝細胞癌を予防または治療するための組成物。
【請求項６】
前記調節剤がＣＤ３６の過剰発現を抑制するための薬剤である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記調節剤が前記肝細胞癌の癌細胞における脂質取り込みをブロックする薬剤である、請求項５または６に記載の組成物。
【請求項８】
前記調節剤が抗ＣＤ３６抗体である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記調節剤がＡＢＣＧ４発現を誘導する薬剤である、請求項５に記載の組成物。
【請求項１０】
前記調節剤が前記肝細胞癌の癌細胞内のコレステロール輸送を促進する薬剤である、請求項５または９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記調節剤がＡＢＣＧ４タンパク質である、請求項１０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、肝炎ウイルス感染の病歴を欠くヒト以外の被験体における肝細胞癌（以下、ＨＣＣ）を処置するための方法に関する。特に、本発明は、脂質ホメオスタシス関連遺伝子の遺伝的変化を標的とすることによって、特にＣＤ３６増幅および／またはＡＢＣＧ４欠失の制御を調節することによって、ヒト以外の被験体におけるＢ型肝炎ウイルス（以下、ＨＢＶ）／Ｃ型肝炎ウイルス（以下、ＨＣＶ）感染）陰性のＨＣＣすなわち非Ｂ非Ｃ型ＨＣＣ（以下、ＮＢＮＣ−ＨＣＣ）を治療するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞癌（ＨＣＣ）は肝臓の高度悪性腫瘍である。世界がん罹患率で5位であり、年間660,000例以上の死亡を引き起こしている（Jemal、A et al.、CA Cancer J Clin. 57、43-66、2007; El-Serag、HBN Engl J Med. 365、1118-1127、2011）。ＨＣＣは通常、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）による感染と関連している（Farazi、PA.、DePinho、R A.、Nat Rev Cancer 6、674-687、2006）。しかし最近、代謝障害によって誘導されるＨＣＣの発生率が増加している（Starley、BQ et al. Hepatology 51、1820-1832、2010; Fujiwara、N et al. J Hepatol. S0168-8278、32328-32340、2017）。ウイルス性肝炎の既往がない患者群では、ＨＣＣに至る分子事象は明らかではない。
【０００３】
世界的に、ワクチン接種プログラムおよび抗ウイルス薬の開発はウイルス性肝疾患の管理に重大な影響を与えており、これらの因子は肝臓悪性腫瘍の状況を変化させている。米国、日本、欧州、豪州では、非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）の有病率が上昇傾向にあり、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）の結果、糖尿病や肥満の流行の増加と並行してＨＣＣが増加することが予想される。
【０００４】
ゲノム不安定性は多くの癌の特徴であり、これにはＨＣＣが含まれ（Niu、ZS et al. World J Gastroenterol. 22、9069-9095、2016）、重要なことにいくつかの癌関連遺伝子が同定され、染色体不安定性を調べることにより検証されている。しかしこのような研究において、ＨＣＣに関連する様々な異なる危険因子に関連したゲノム変化はまだ解析されていない。
【０００５】
本発明は、ウイルス性肝炎感染に関して異なる背景履歴を有するＨＣＣの臨床的およびゲノム的特徴を検討した。特に脂質ホメオスタシスに関連する2つの遺伝子であるＣＤ３６およびＡＢＣＧ４の変化は、ＨＢＶ）／ＨＣＶ感染歴のないＨＣＣであるＮＢＮＣ−ＨＣＣで高頻度に検出される分化マーカーとして同定されている。公開されているゲノムデータレポジトリーで利用可能な情報は、ＣＤ３６およびＡＢＣＧ４を含む脂質ホメオスタシス遺伝子がＨＣＣ発癌において重要な役割を果たすとの結論を支持する独立した証拠を提供する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明では、ＣＤ３６遺伝子増幅が一貫してＨＣＣサンプルの25%で検出され、BGIデータセットからのＨＢＶ−ＨＣＣサンプルよりもＮＢＮＣ−ＨＣＣサンプルにおいてより一般的であることが見出される。ＣＤ３６およびＡＢＣＧ４のコピー数変化を調べることにより、ＣＤ３６遺伝子増幅およびＡＢＣＧ４遺伝子欠失は、ＩＣＧＣ ＨＣＣサンプルのそれぞれ15.6%および10.3%で検出され、ＴＣＧＡ ＨＣＣサンプルのそれぞれ15.3%および9.7%で検出される。
【０００７】
したがって本発明は、脂質ホメオスタシス関連遺伝子の遺伝的変化を調節制御するために阻害剤を投与することを含め、ヒト以外の被験体におけるＢ型／Ｃ型肝炎ウイルス感染陰性の肝細胞癌の予防または治療のための投与方法を提供する。本発明の一実施形態において、遺伝的変化はＣＤ３６増幅を含む。本発明の別の実施形態において、遺伝的変化はＡＢＣＧ４欠失を含む。本発明のさらに別の実施形態において、遺伝的変化はＣＤ３６増幅およびＡＢＣＧ４欠失を含む。ＨＣＣにおけるＣＤ３６増幅およびＡＢＣＧ４欠失の調節制御は、ＨＣＣ被験者の生存率を改善するために有用である。
【０００８】
別の態様では、本発明が脂質ホメオスタシス関連遺伝子の遺伝的変化を制御する調節剤を含む、被験体におけるＢ型／Ｃ型肝炎ウイルス感染陰性の肝細胞癌を予防または治療するための組成物を提供する。本発明の一実施形態では、調節剤はＣＤ３６過剰発現を抑制することを目的とする。本発明の別の実施形態において、調節剤はＨＣＣ細胞における脂質取り込みをブロックすることを目的とする。本発明の例示的な実施形態では、調節剤は抗ＣＤ３６抗体である。
【０００９】
本発明の一実施形態では、調節剤がＡＢＣＧ４発現を誘導することを目的とする。本発明の別の実施形態では、調節剤がＨＣＣ細胞内のコレステロール輸送を促進することを目的とする。本発明の好ましい実施形態において、調節剤はＡＢＣＧ４タンパク質である。
【００１０】
以上の概要ならびに以下の本発明の詳細な説明は、添付の図面と併せて読めば、より良く理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１Ａ〜１Ｂは、ＨＣＣ腫瘍の様々なサブタイプ間の対比較を示す。ＤＮＡコピー数の変化をPennCNVによって分析する。ＨＣＣサブタイプ間のＤＮＡコピー数変化の差の統計解析は、フィッシャーの直接確率検定を用いて得られる。（Ａ）ＨＣＣサブタイプ間のＤＮＡコピー数増加の異なるパターン。（Ｂ）ＨＣＣサブタイプ間のＤＮＡコピー数喪失の異なるパターン。有意水準は、赤色の水平線を用いてマークされる。SNPアレイから得られたペアＨＣＣサンプルの遺伝子型の結果は、それらのウイルス感染歴に基づいて表示される。PennCNVは、（Ａ）ＤＮＡコピー数増加と（Ｂ）ＤＮＡコピー数減少を分析する。赤い線は、P<0.001の有意性を示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｄは、SNP遺伝子型タイピングアレイによって検出されたＣＤ３６増幅およびＡＢＣＧ４欠失を示す。（Ａ）7番染色体上のＤＮＡコピー数増加。7番染色体領域に影響を及ぼすＤＮＡ増幅の程度を腫瘍ごとに図示した。色は、ＨＣＣ腫瘍の様々なサブタイプを示す。青色：ＨＢＶ−ＨＣＣ、緑色：ＨＣＶ−ＨＣＣ、橙色：ＮＢＮＣ−ＨＣＣ。（Ｂ）ＣＤ３６遺伝子領域（Chr7：80.23Mb-80.30Mb）に影響する体細胞増幅事象は、ＮＢＮＣ−ＨＣＣ腫瘍と関連することがわかる。（Ｃ）11番染色体上のＤＮＡコピー数の消失。11番染色体領域に影響を及ぼすＤＮＡ欠失の程度を腫瘍ごとに図示する。（Ｄ）ＡＢＣＧ４遺伝子領域内の体細胞欠失事象（Chr11：119.02Mb-119.03Mb）は、ＮＢＮＣ−ＨＣＣと関連することがわかる。*P<0.05。
【図３】図３Ａ〜３Ｄは、ＮＢＮＣ−ＨＣＣにおけるＣＤ３６遺伝子のＲＮＡとタンパク質発現を示したものである。図３Ａでは、定量的PCR法を用いて、HBCまたはＨＣＶ感染の既往がない5対のＨＣＣ試料のＣＤ３６ ＤＮＡコピー数およびｍＲＮＡ発現レベルを測定する。ＤＮＡコピー数分析は、PCRプライマーとしてＣＤ３６遺伝子の5’末端（5’CN）および3’末端（3’CN）配列を使用するように設計される。結果は、三重測定（平均・標準偏差）を用いて得られる。図３Ｂは、症例235からのサンプル中のＣＤ３６タンパク質発現を検出するための、抗ＣＤ３６抗体を使用する免疫組織化学染色である。試料を10倍の倍率で、光学顕微鏡下で評価する。特定の領域のさらなる詳細が示される：図３Ｃの腫瘍組織切片（赤いボックス）および図３Ｄの非腫瘍組織切片（青いボックス）。
【図４】図４は、BGIデータセットからの88個のＨＣＣについてのＣＤ３６ ＤＮＡコピー数増幅比を示す。ＣＤ３６遺伝子増幅を有する症例の割合は、ＨＢＶ−ＨＣＣ腫瘍組織と比較して、ＮＢＮＣ−ＨＣＣ腫瘍組織で有意に高い。**P<0.01、フィッシャーの直接確率検定。
【図５】図５は、ICGCおよびTCGA肝癌データセットから得られたＣＤ３６遺伝子増幅およびＡＢＣＧ４遺伝子欠失事象を示す。2つの遺伝子変異に陽性を示すＨＣＣ症例の割合は、ICGC収集およびTCGA収集に関して類似している。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、ＨＣＣ患者の生存および腫瘍サイズに対するＣＤ３６遺伝子増幅およびＡＢＣＧ４遺伝子欠失の効果を示す。分析したデータは、ＣＤ３６増幅およびＡＢＣＧ４欠失のために腫瘍サンプルが遺伝子型決定されたＨＣＣ患者から得られる。腫瘍組織におけるＣＤ３６増幅およびＡＢＣＧ４欠失の両方を有する患者の生存率中央値は、ＣＤ３６増幅のみを有する患者またはＡＢＣＧ４欠失のみを有する患者よりも有意に短い（P<0.0001）。統計解析は、図６Ａに示されるデータについてのログランク検定を用いて行われる。図６Ｂでは、ＣＤ３６増幅およびＡＢＣＧ４欠失の両方を含むＨＣＣにおいて、腫瘍サイズが有意に増加する。エラーバーは標準偏差を示す。有意水準は以下のように示される：*P<0.05および**P<0.01であり、対応のないMann-WhitneyのU検定を用いて得られる。
【図７】図７Ａ〜７Ｄは、ＨＣＣ細胞増殖に対する抗ＣＤ３６抗体の効果を示す。（Ａ）３つのＨＣＣ細胞株の細胞生存率は、72時間、40μg/mlの抗ＣＤ３６抗体の存在下で有意に減少することが見出される。（Ｂ）抗ＣＤ３６抗体処理がHuH-7細胞生存率に及ぼす影響は用量依存性である。（Ｃ）20μg/mlの抗ＣＤ３６抗体処理を経た後、HuH-7細胞の細胞生存能力は時間依存的に低下する。（Ｄ）HuH-7細胞のアポトーシス比率は対照抗体（IgG）と比較して40μg/mlの抗ＣＤ３６抗体存在時に上昇する。すべてのグラフについて、エラーバーは平均標準偏差を示す。有意水準は以下のように示される：*P<0.05、**P<0.01および***P<0.001であり、対応のない両側t検定を用いて得られる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００１３】
本明細書で使用される場合、単数形「a」、「an」および「the」は明らかに文脈に沿わないことが示されない限り、複数の指示対象を含む（原文（英語）に関する指示）。したがって例えば「サンプル」への言及は、そのような複数のサンプルおよび当業者に公知の等価物を含む。
【００１４】
本発明はヒト以外の被験体におけるＨＢＶ／ＨＣＶ感染（ＮＢＮＣ−ＨＣＣ）陰性のＨＣＣを予防または治療するための投与方法であって、脂質ホメオスタシス関連遺伝子の遺伝的変化を制御するために、特にＨＣＣ患者におけるＣＤ３６遺伝子増幅および／またはＡＢＣＧ４遺伝子欠失に影響を及ぼすために阻害剤を投与することを含む方法を提供する。
【００１５】
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝的変化」は特定の遺伝子の正常なＤＮＡ配列における変化をいう。遺伝暗号が変化すると、機能不全により異常に活性化されたタンパク質がつくられてがんになることがある。異常に活性化されたタンパク質や機能不全のタンパク質は正常な生物学的過程や細胞を調節して増殖させ、癌化させることがある。遺伝的変化のゲノムワイド検出のための現在の方法には、以下が含まれる。
１．染色体異常および再配列の分子細胞遺伝学的評価。
２．ヘテロ接合性喪失（LOH）または対立遺伝子不均衡を検出するためのＤＮＡ多型分析。
３．セグメントコピー数変化を同定するための比較ゲノムハイブリダイゼーション（CGH）アプローチ。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、用語「ＣＤ３６遺伝子増幅」は他の遺伝子の比例的な増加なくＣＤ３６遺伝子のコピー数が増加することをいう。これは、ＤＮＡ複製および修復機構の誤りを介してＣＤ３６遺伝子を含むＤＮＡ領域が重複することによって起こりうる。
【００１７】
本明細書中で使用される用語「ＡＢＣＧ４遺伝子欠失」は、「ＡＢＣＧ４遺伝子欠失」または「ＡＢＣＧ４欠失突然変異」とも呼ばれ、染色体の一部またはＤＮＡの配列がＤＮＡ複製中に失われる突然変異（遺伝的異常）を意味する。任意の数のヌクレオチドを単一の塩基から染色体の断片全体まで欠失させることができる。遺伝的欠失はガン（https://www.medicinenet.com/cancer/article.htm）の発達において生まれた異常（https://www.medicinenet.com/birth_defects/article.htm）に関与する。
【００１８】
本発明に従って使用するための医薬組成物は、医薬的に使用することができる製剤への活性化合物の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む１つ以上の生理学的に許容される担体を使用し、従来の様式で製剤化できる。適切な処方は、選択される投与経路に依存する。
【００１９】
非経口投与については筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮下を含む注射が好ましい。注射のため、本発明の組成物は水溶液中、好ましくはハンクス溶液、リンガー溶液、または生理食塩水緩衝液などの生理的に適合性の緩衝液中にて製剤化されてもよい。さらに化合物は固体形態で処方されてもよく、使用の直前に再溶解または懸濁されてもよい。凍結乾燥形態も含まれる。
【００２０】
経口投与のため、組成物は活性化合物を当該分野で周知の薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせることによって処方され得る。このような担体は、本発明の組成物を患者による経口摂取のための錠剤、丸剤、トローチ、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして製剤化することを可能にする。経口使用のための医薬製剤は固体賦形剤を使用し、任意に得られた混合物を粉砕し、所望により他の適切な補助剤を添加した後に顆粒の混合物を加工することで、錠剤または糖衣錠コアが得られる。有用な賦形剤は、特にラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤、例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプンおよびジャガイモデンプンなどのセルロース調製物、ならびにゼラチン、トラガントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（PVP）などの他の材料である。所望であれば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸などの崩壊剤を添加してもよい。アルギン酸ナトリウムのような塩も使用できる。
【００２１】
用語「有効量」は所望の効果を達成するため、すなわちＨＢＶ／ＨＣＶ感染（ＮＢＮＣ−ＨＣＣ）に対し陰性ＨＣＣを予防または処置するために計算された所定量をいう。本発明の特定の実施形態では医薬組成物は、ＣＤ３６増幅を伴う、ＨＣＣ被験体における脂質取り込み阻害を制御するための有効量の抗ＣＤ３６抗体を含む。
【００２２】
本発明は、限定目的でなく実証目的で提供される以下の実施例によってさらに説明される。
以下、図中の"deletion"は「欠失」、"amplification"は「増幅」、"tumor tissue"は「腫瘍組織」、"tumor adjacent tissue"は「腫瘍隣接組織」、"cell viability"は「細胞生存率」をそれぞれ意味する。
【００２３】
（実施例）
本発明の他の特徴および利点は、以下の実施例においてさらに例示され、記載される。本明細書に記載される実施例は例示のために使用されるものであって本発明を限定するために使用されるものではない。
【００２４】
本発明の実施は細胞生物学、細胞培養および遺伝子工学の従来技術を含む技術を使用する。これらは当技術分野の通常の技術の範囲内である。このような技術は文献により全て説明されている。
【００２５】
（CoreExome-24 SNPアレイ）
Infinium CoreExome-24 BeadChip（Illumina）を用いて遺伝子型タイピングを行い、選択した115組のＨＣＣサンプルの遺伝子型を決定する。手順は製造業者の指示に従う。簡潔には、ＨＣＣ症例のＨＣＣ腫瘍組織または非腫瘍組織のいずれかからの約200ngのゲノムＤＮＡを増幅し、断片化し、沈殿させ、ハイブリダイゼーション緩衝液に懸濁する。変性後、サンプルをBeadChipsに48℃で16時間ハイブリダイズさせる。
次に単一塩基伸長を行い、チップを染色し、Illumina Bead Array Reader上でスキャンする。
次いで画像データセットをIllumina GenomeStudio v2ソフトウェアおよび標準パラメータを使用して分析する。
次いで、生の遺伝子型データは、ＤＮＡコピー数を計算するためテキストファイルに出力される。遺伝子型決定チップからのデータを用いてＤＮＡコピー数変化を検出するために、B対立遺伝子頻度（BAF）およびlog R比（LRR）をGenomeStudio v2ソフトウェアを用いて抽出し、PennCNV v1.0.3によって分析し、WGAViewerによって可視化する。SNPアレイ結果上にあるＤＮＡコピー数解析の妥当性は、ＨＣＣ試料についてqPCRアッセイを行うことによって確認される。
【００２６】
（ＣＤ３６ ＤＮＡコピー数分析）
ＨＣＣ腫瘍組織サンプル中のＣＤ３６のＤＮＡコピー数を測定するため、定量的PCRを実施し、腫瘍サンプルと隣接する非腫瘍組織との間でＣＤ３６ ＤＮＡコピー数と参照ＤＮＡコピー数を比較する。5’末端領域、ＣＤ３６遺伝子の3’末端領域、および参照配列をそれぞれ増幅するため、3つのプライマーが設計される。ＣＤ３６配列を増幅するために使用されるプライマーの配列は、以下の通りである。
１．5’末端領域については、5’GGCTCATTCACCAAGGAC（順方向、配列番号1）および5’GACTTAATGAGAAGGAACAAC（逆方向、配列番号2）、
２．3’末端領域については、5’GTTACTACCTTCTCTTCTG（順方向、配列番号3）および5’GTAAAGTGAATCCAGTTATC（逆方向、配列番号4）、
３．参照配列については、5’GAAACTGTTTTCCTTGTCTG（順方向、配列番号5）および5’GCTTTGTACTGGGAGGAG（逆方向、配列番号6）。
定量的なPCRアッセイはすべてABI StepOneリアルタイムPCRシステムでSensiFAST SYBR（登録商標）Hi-ROXキット（バイオライン）を使用して実行される。腫瘍組織と隣接する非腫瘍組織とのΔCTの差を用い、ＣＤ３６ ＤＮＡコピー数を算出する。
【００２７】
（ＣＤ３６発現の定量分析）
腫瘍（T）組織および非腫瘍（N）組織試料の相対的発現レベルを、逆転写定量PCR（RT‐qPCR）を用いて測定する。100対のＨＣＣ試料からの全ＲＮＡを、製造業者の説明書に従ってSuperScriptII（Invitrogen）を用いてｃＤＮＡに逆転写する。その後、標的遺伝子およびGAPDHに対するqPCR反応は、SensiFAST SYBR（登録商標）Hi-ROXキットを使用して、リアルタイムPCRシステムABI StepOneで三段階的に実行される。
RT−qPCRに使用されるプライマーの配列は以下の通りである。
１．ＣＤ３６は、5’GAACCTATAACTGGATTCAC（順方向、配列番号7）および5’GTCCCAGTCTCATTAAGC（逆方向、配列番号8）、
２．ＧＡＰＤＨは、5’GTGAAGCAGGCGTCGGAG（順方向、配列番号9）および5’GTTGTCATACCAGGAAATG（逆方向、配列番号10）。
全ての試料を分析し、内部対照遺伝子GAPDHの発現レベルを用いて正規化する。倍率変化に関する相対定量は、腫瘍組織サンプルのΔCTを隣接する非腫瘍組織サンプルのΔCTと比較することによって得られる。
【００２８】
（パブリックドメインデータセットを用いたＤＮＡコピー数解析）
国際がんゲノムコンソーシアム（ICGC）およびがんゲノムアトラス（TCGA）肝がんデータセットのゲノムデータをhttp://xena.ucsc.eduからダウンロードしている。88対のＨＣＣ症例の全ゲノム配列決定（WGS）データをNCBIシークエンスリードアーカイブ（SRA）からダウンロードし、受付番号はPRJEB2869である。
WGSデータを用いてＣＤ３６とＡＢＣＧ４のＤＮＡコピー数（CN）変化を解析するために、生のリードをIsacc変異型カルラー20によりヒトゲノムhg19に並べ、ＤＮＡコピー数をCNVSegにより解析した。
【００２９】
（統計解析）
Mann-WhitneyのU検定を行い、年齢、腫瘍サイズ、腫瘍数、AFP値などの臨床データの意義を算出する。フィッシャーの直接確率検定を用いて、肝硬変比、脂肪肝比、およびＤＮＡコピー数の変化のＨＣＣ群間の有意差を決定する。抗ＣＤ３６抗体治療データについては、両側対応のないStudentのt検定を用いて、異なるＨＣＣ群間の大きさ、または抗ＣＤ３６抗体で治療されたもの間または対照IgGで治療されたもの間の増殖阻害効果を比較する。ＨＣＣ患者の生存分析はログランク検定により行う。全てのデータは、平均標準偏差および代表的な3つの独立した実験として提示される。Prism（GraphPad）をこれらの分析に使用する。
【００３０】
（実施例１：ＮＢＮＣ−ＨＣＣ腫瘍に連鎖する第7染色体および第11染色体のＤＮＡコピー数の変化）
（症例選択）
ウイルス性肝炎感染の既往がないＨＣＣ症例に関連する遺伝的特徴を同定するため、台湾肝癌ネットワーク（TLCN）を介した250例のＨＣＣ症例の肝組織試料を得、これらのＨＣＣ組織試料のゲノムプロファイルを調査した。このバイオリポジトリは、臨床的および病理学的情報につながる研究を支援するために広範な同意を得て確立される（Chang、IC et al. Medicine（Baltimore）95、e3284、2016）。
試験症例は、ＨＢＶ感染歴（ＨＢＶ−ＨＣＣ）のある被験者100例（男性50例、女性50例）とＨＣＣ感染歴（ＨＣＶ−ＨＣＣ）のある被験者100例（男性50例、女性50例）である。残りの50例（男性25例、女性25例）のＨＣＣ患者には、ＨＢＶ感染またはＨＣＶ感染の既往歴はない（すなわちＮＢＮＣ−ＨＣＣ患者）。これらのＨＣＣ症例の臨床的特徴を表１に示す。
【表１】
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【００３１】
肝硬変の発生率は、ＮＢＮＣ−ＨＣＣ群（8%）では他の2群よりも有意に低い（P<0.0001）。さらにＮＢＮＣ−ＨＣＣ群の男性患者についてはＨＢＶ−ＨＣＣ群（19.1%）またはＨＣＶ−ＨＣＣ群（20.9%）のいずれかよりも脂肪肝変化を有する個人の頻度の方が有意に高い（52.4%）。
【００３２】
（ゲノム解析）
ゲノム解析を行うため、TP53変異状態に基づいて115症例を選択した。これらは38人のＨＢＶ−ＨＣＣ、42人のＨＣＶ−ＨＣＣ、および35人のＮＢＮＣ−ＨＣＣで構成された（表１）。一般的なTP53ホットスポット変異についてスクリーニングするため、ＤＮＡ質量分析を使用する検出パネルを設計する。PCRおよび伸長プライマーは、MassArray Assay Design 3.1ソフトウェア（Sequenom）を使用して設計される。
【表２】
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【００３３】
Infinium CoreExome-24 BeadChip（Illumina）を用いて遺伝子型タイピングを行い、選択した115組のＨＣＣサンプルの遺伝子型を決定する。手順は製造業者の指示に従う。簡潔には、ＨＣＣ症例のＨＣＣ腫瘍組織または非腫瘍組織のいずれかからの約200ngのゲノムＤＮＡを増幅し、断片化し、沈殿させ、ハイブリダイゼーション緩衝液に懸濁する。変性後、サンプルをBeadChipsに48℃で16時間ハイブリダイズさせる。
次に単一塩基伸長を行い、チップを染色し、Illumina Bead Array Reader上でスキャンする。
次いで、画像データセットをIllumina GenomeStudio v2ソフトウェアおよび標準パラメータを使用して分析する。
次いで、生の遺伝子型データはＤＮＡコピー数を計算するために、テキストファイルに出力される。遺伝子型決定チップからのデータを用いてＤＮＡコピー数変化を検出するため、B対立遺伝子頻度（BAF）およびlog R比（LRR）をGenomeStudio v2ソフトウェアを用いて抽出し、PennCNV v1.0.3によって分析し、WGAViewerによって可視化する。SNPアレイ結果上にあるＤＮＡコピー数解析の妥当性は、ＨＣＣ試料についてqPCRアッセイを行うことによって確認される。
【００３４】
PennCNVソフトウェアを適用することにより、ＨＣＣ症例の遺伝子におけるＤＮＡコピー変化を検出することができるプローブを同定することができる。異なるカテゴリーのＨＣＣ間の対比較を行った結果を図１に示す。ＤＮＡコピーの増加を同定するという点では、ＨＢＶ−ＨＣＣ患者に関連する13番染色体上のピークとＮＢＮＣ−ＨＣＣ患者に関連する7番染色体上のピークがある（図１Ａ）。ＤＮＡコピーの消失を同定するという点ではＨＢＶ−ＨＣＣ患者に関連する第2染色体上のピーク、およびＮＢＮＣ−ＨＣＣ患者に関連する第11染色体上のピークがある（図１Ｂ）。
【００３５】
以上、本試験から、ＨＢＶ／ＨＣＶ感染を伴わないＨＣＣはＨＢＶ／ＨＣＶに関連するＨＣＣと比較して、異なる臨床症状ならびに異なる染色体プロファイルを示すと結論付けられる。
【００３６】
（実施例２：ＨＢＶ／ＨＣＶ感染陰性のＨＣＣ症例ではＣＤ３６増幅とＡＢＣＧ４欠失が高頻度に検出される）
ＤＮＡコピー数の変化に関連するピークを本実施例においてさらに調査する。本発明はＮＢＮＣ−ＨＣＣに最も関心があるため、79.1Mbから80.7Mbまで拡大した第7色素の領域を詳細に分析する。
図２Ａに示すように、この領域を標的とするプローブはＤＮＡコピー数増加を検出した。全ての陽性例において、増幅は80.3Mb付近の位置で、特異的遺伝子、ＣＤ３６を含む。ＣＤ３６はスカベンジャー受容体として機能し、それは複数の機能を有する。それらの１つは、脂肪酸取り込みを容易にすることである。このＤＮＡ増幅事象の性質を解析すると、コピーの変化は腫瘍組織サンプルでのみ起こることがわかる。さらにこの事象は、ＮＢＮＣ−ＨＣＣ個体において最も顕著である（図２Ｂ）。
【００３７】
最近の研究により、ATP結合カセット（ABC）輸送体が細胞および全身脂質ホメオスタシスの制御において重要な役割を果たし得ることが報告されている（Baldan、A.ら、Curr Opin Lipidol. 17,227−232,2006）。これらのトランスポーター中、ABCG1およびＡＢＣＧ４はヘテロダイマーを形成でき、このヘテロダイマーは細胞内のコレステロールの輸送を媒介して脂質化リポタンパク質を形成することが示されている（Hegyi、Z et al. PLoS One 11、e0156516、2016）。
11番染色体上のＤＮＡ欠失に影響される領域の遺伝子座を検索すると、ＡＢＣＧ４遺伝子領域に及ぶ体細胞欠失（図２Ｃ）を同定することができ、ＮＢＮＣ−ＨＣＣ症例の40%にＡＢＣＧ４の欠失が生じた（図２Ｄ）。ＮＢＮＣ−ＨＣＣ症例におけるこの所見を上記に概説したＣＤ３６遺伝子増幅所見と統合すると、ウイルス性肝炎感染の既往がない場合に脂質ホメオスタシス経路を含む遺伝的変化がＨＣＣの病因に何らかの役割を果たしている可能性が高いという仮説を支持している。
【００３８】
（qPCR法）
SNPアレイから得られた遺伝子型データを検証するため、qPCRアッセイを開発してＨＣＣ組織サンプル中のＣＤ３６のＤＮＡコピー数およびｍＲＮＡ発現レベルを調べる。
図３Ａに示すように、腫瘍組織サンプル中にＣＤ３６の3つ以上のコピーを有するＨＣＣサンプル（症例235、243、および247）は、ペアの非腫瘍組織サンプルと比較すると、サンプル中のＣＤ３６ ｍＲＮＡ発現レベルが上昇していることが見出される。さらにＣＤ３６遺伝子発現は症例235、243および247において、非腫瘍隣接組織（N）に対し、腫瘍組織（T）において上昇し、その各々はＣＤ３６遺伝子の3コピー以上を有する。
一方、症例241および242ではＣＤ３６コピー数が二倍体ゲノムについて予測されるものから逸脱せず、腫瘍と非腫瘍隣接組織との間のＣＤ３６ ｍＲＮＡ発現比は1に近い。
図３に示すように、抗ＣＤ３６抗体は腫瘍組織中の癌細胞を強く染色できる（図３Ｃ）。これは、ＣＤ３６タンパク質がＨＣＣ癌細胞で過剰発現していることを示唆している。しかし、比較してみると、ＣＤ３６タンパク質は類洞内皮細胞に豊富に発現しているのに対し、良性肝細胞は非常に弱いＣＤ３６発現しか示さないことがわかる（図３Ｄ）。非腫瘍組織試料中の類洞内皮細胞を、内部陽性対照として用いる。
【００３９】
図４に示したように、ＣＤ３６遺伝子増幅はこれらのＨＣＣの25%で一貫して検出され、ＨＢＶ−ＨＣＣサンプルよりもＮＢＮＣ−ＨＣＣサンプルでより一般的である。
次に、ICGCおよびTCGAデータベースからの遺伝子型データを調査し、ＣＤ３６およびＡＢＣＧ４におけるコピー数変化を得る。
図５に示すように、ＣＤ３６遺伝子増幅およびＡＢＣＧ４遺伝子欠失は、ＩＣＧＣ ＨＣＣサンプルのそれぞれ15.6%および10.3%で検出され、TCGA ＨＣＣサンプルのそれぞれ15.3%および9.7%で検出される。したがって、公開されているゲノムデータレポジトリーで利用可能な情報は、これら2つの脂質ホメオスタシス遺伝子がＨＣＣ発癌において重要な役割を果たすというわれわれの結論を支持する独立した証拠を提供する。
【００４０】
ＣＤ３６が肝細胞への脂質の輸送に関与していること、およびＣＤ３６が腫瘍転移に役割を果たしているとの報告（Nath、A & Chan、CSci Rep.6、18669、2016）を踏まえ、本例ではＣＤ３６増幅および／またはＡＢＣＧ４欠失がＨＣＣの臨床像および患者の転帰に及ぼす影響についてさらに検討する。
図６Ａに示すように、ＣＤ３６増幅およびＡＢＣＧ４欠失の両方を有する患者の生存期間中央値は1385日であり、これはＣＤ３６増幅のみ（2344日）またはＡＢＣＧ４欠失（2045日）のみを有する患者よりも有意に短い（P<0.0001）。ＣＤ３６増幅は一貫して高α-フェトプロテインレベルと関連し（表３参照）、ＣＤ３６増幅とＡＢＣＧ４欠失の両方を含むＨＣＣでは腫瘍サイズが有意に増加していることがわかる（図６Ｂ）。
【表３】
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【００４１】
ＣＤ３６および／またはＡＢＣＧ４に影響を及ぼす遺伝子変化は脂質ホメオスタシス経路に影響を及ぼす。これはＨＣＣ発癌において役割を果たす可能性がある。われわれは脂質代謝経路を標的とする薬剤がＣＤ３６増幅および／またはＡＢＣＧ４欠失を有するＨＣＣ患者を治療するために開発できると予想する。
【００４２】
（実施例３：抗ＣＤ３６抗体はＨＣＣ細胞株の増殖を阻害した）
最近の研究により、ＣＤ３６が転移細胞のマーカーであることが報告されている。われわれは、肝がん細胞における脂質取り込みを遮断することで抗ＣＤ３６抗体が細胞増殖を阻害できると仮定する。これに基づき、本実施例では培養肝癌細胞を用いた実験を行った。
【００４３】
（細胞増殖アッセイ）
肝細胞癌細胞株を96ウェルプレート（1ウェル当たり104細胞）に24時間播種し、次いで3%FBSおよび抗ＣＤ３６抗体（Cayman、CAY188150）を含むDMEM培地で72時間処理する。次いで細胞増殖アッセイをユーザマニュアルに従ってalamarBlue細胞生存試薬（Thermo Fisher Scientific）を使用して実施する。
【００４４】
図７に示すように、72時間40μg/mlの濃度で抗ＣＤ３６抗体を加えると、HuH-7、HepG2、Hep3Bセルラインの細胞生存能力が低下する（図７Ａ）。HuH-7細胞を用いた場合、抗ＣＤ３６抗体の効果は濃度に依存し（図７Ｂ）、また時間に依存していることが判明した（図７Ｃ）。
【００４５】
（アポトーシスアッセイ）
HuH−7細胞をトリプシン処理して200μlの氷冷PBSに再懸濁する。アポトーシスアッセイのため、100μlの細胞懸濁液を微量遠心管にアリコートし、300gで5分間の遠心分離によって収集する。次いで細胞を100μlのアネキシンV FITCアポトーシス検出キット（BD Biosciences）インキュベーション緩衝液に再懸濁し、1μlのアネキシンV+1μlのPIと共に室温で15分間インキュベートする。アポトーシス検出の前に、500μlのインキュベーション緩衝液を細胞に添加する。結果はサンプル当たり5,000事象を記録するように設定されたBD FACSCaliburフローサイトメーターシステム（BD Biosciences）を使用して得られる。
図７Ｄに示したデータはまた、この効果がおそらくアポトーシス関連機構を介して媒介されることを示唆している。
【００４６】
要約すると、本発明はウイルス性肝炎感染に関して異なる背景履歴を有するＨＣＣの臨床的およびゲノム的特徴を検討した。特に脂質ホメオスタシスに関連する2つの遺伝子であるＣＤ３６およびＡＢＣＧ４の変化は、ＨＢＶ／ＨＢＣ感染歴を欠くＨＣＣにおいてより頻繁に検出される分化マーカーとして同定されている。著者らの知見はまた、ＨＣＣ患者におけるＣＤ３６増幅および／またはＡＢＣＧ４欠失と生存率の低下、高α‐フェトプロテインレベルおよび腫瘍サイズの増加との関連を開示する。したがってＣＤ３６およびＡＢＣＧ４遺伝子の変化は、高リスクの個人におけるＨＣＣの発見および予防のための診断因子を提供できる可能性がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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