(57)【要約】タンパク質系網膜下インプラントは、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）および網膜色素変性症（ＲＰ）などの状態により失明した患者の視力を回復する新たなアプローチを提供する。本発明は、変性光受容細胞を置き換えるために網膜下位置に移植され得るバクテリオロドプシン系（ＢＲ系）網膜インプラントに関する。一局面において、網膜細胞の喪失により引き起こされる視力喪失を有する患者を処置するための方法が提供され、この方法は、（ａ）上記患者の目にバクテリオロドプシン系網膜インプラントを移植すること、および（ｂ）上記インプラントを光源で活性化することを含む。
2020519379.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
網膜細胞の喪失により引き起こされる視力喪失を有する患者を処置するための方法であって、
（ａ）前記患者の目にバクテリオロドプシン系網膜インプラントを移植すること、および
（ｂ）前記インプラントを光源で活性化すること
を含み、
約５００μｍ未満、または約３５０μｍ未満、または約２５０μｍ未満、または約２００μｍ未満、または約１５０μｍ未満、または約１００μｍ未満、または約７５μｍ未満、または約５０μｍ未満、または約４０μｍ未満、または約３０μｍ未満、または約２５μｍ未満のピクセル寸法を有する分解能で刺激が提供されるように、前記インプラントが網膜細胞を刺激する、方法。
【請求項２】
網膜細胞の喪失により引き起こされる視力喪失を有する患者を処置するための方法であって、
（ａ）前記患者の目にバクテリオロドプシン系網膜インプラントを移植すること、および
（ｂ）前記インプラントを光源で活性化すること
を含み、
（ｉ）前記光源の回折限界、または（ｉｉ）前記網膜インプラントがイオン透過性担体をさらに含む場合には、前記イオン透過性担体の開口直径および密度により制限される分解能で刺激が提供されるように、前記インプラントが網膜細胞を刺激する、方法。
【請求項３】
網膜細胞の喪失により引き起こされる視力喪失を有する患者を処置するための方法であって、
（ａ）前記患者の目にバクテリオロドプシン系網膜インプラントを移植すること、および
（ｂ）前記インプラントを光源で活性化すること
を含み、
約４ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約５００μｍのピクセル寸法、または約８ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約３５０μｍのピクセル直径、または約１６ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約２５０μｍのピクセル直径、または約２５ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約２００μｍのピクセル直径、または約４４ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約１５０μｍのピクセル直径、または約１００ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約１００μｍのピクセル直径、または約１７８ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約７５μｍのピクセル直径、または約４００ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約５０μｍのピクセル直径、または約６２５ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約４０μｍのピクセル直径、または約１１１１ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約３０μｍのピクセル直径、または約１６００ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約２５μｍのピクセル直径を有する分解能で刺激が提供されるように、前記インプラントが網膜細胞を刺激する、方法。
【請求項４】
前記バクテリオロドプシン系網膜インプラントが少なくとも１つの担体層およびバクテリオロドプシンフィルムを含み、前記バクテリオロドプシンフィルムが天然バクテリオロドプシンまたはバクテリオロドプシン変異体の複数の個別層を含み、前記天然バクテリオロドプシンまたはバクテリオロドプシン変異体の各個別層がカチオン性ポリマーの層と交互に存在し、前記バクテリオロドプシン変異体がクロリドポンプ変異体、双極子変異体、光サイクル変異体、金結合変異体、イオンポンプ変異体、Ｑ状態変異体およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記光源がヒト可視波長、すなわち約４００ｎｍ〜約７００ｎｍを放射する光源である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記光源が、約１００ｍＷ／ｃｍ２未満、５０ｍＷ／ｃｍ２、４０ｍＷ／ｃｍ２、または約３０ｍＷ／ｃｍ２未満、または約２０ｍＷ／ｃｍ２未満、または約１０ｍＷ／ｃｍ２未満、または約５ｍＷ／ｃｍ２未満、または約１ｍＷ／ｃｍ２未満の強度を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記光源がパルス光源である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記光源が連続光源である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記インプラントが生体適合性イオン透過性網膜インプラントである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記インプラントが、多層アセンブリを使用して作製されたものである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記インプラントを、網膜下位置または網膜上位置から選択される位置に移植する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記インプラントを網膜下位置に移植する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記インプラントを網膜上位置に移植する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記網膜細胞が、網膜神経節細胞、網膜双極細胞、網膜光受容細胞およびそれらの組み合わせから選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記網膜細胞が網膜神経節細胞から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記網膜細胞が網膜双極細胞から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記網膜細胞が網膜光受容細胞から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記網膜インプラントが、少なくとも約１００層の天然バクテリオロドプシンもしくはバクテリオロドプシン変異体、または少なくとも約１５０層の天然バクテリオロドプシンもしくはバクテリオロドプシン変異体、または少なくとも約２００層の天然バクテリオロドプシンもしくはバクテリオロドプシン変異体を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記網膜インプラントが、少なくとも約３０ミリ秒の時間分解能をさらに提供する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記網膜インプラントが、少なくとも約２０ミリ秒の時間分解能をさらに提供する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記網膜インプラントが、少なくとも約１０ミリ秒の時間分解能をさらに提供する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記網膜インプラントが、前記細胞に約４０μＶの活動電位を惹起する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記網膜インプラントが、前記細胞に約３０μＶの活動電位を惹起する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記網膜インプラントが、前記細胞に約２０μＶの活動電位を惹起する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記網膜インプラントが一方向プロトン勾配を提供する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記一方向プロトン勾配が前記網膜細胞に指向され、前記網膜細胞が網膜神経節細胞または網膜双極細胞から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記インプラントを、網膜下位置または網膜上位置から選択される位置に移植する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記バクテリオロドプシン系網膜インプラントが、均一に配向されるようなバクテリオロドプシン分子を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記網膜インプラントを生理的温度またはそれ未満で使用する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記網膜インプラントを生理的ｐＨで使用する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記視力喪失が網膜光受容細胞の喪失により引き起こされる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記担体層がイオン透過性層であり、前記インプラントの片側または両側にある、請求項４に記載の方法。
【請求項３３】
前記担体層が、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、２−フェニルエチルメタクリレート（ＰＥＭ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチルメタクリレート（ＭＭＡ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）マクロマー、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（ｐ−キシリレン）（パリレンとしても公知）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）ヒドロゲルおよびそれらの組み合わせから選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記担体層が１００μｍ未満の厚さであり、約１００μｍ未満の直径の均等に分布した開口部のアレイを含有する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記バクテリオロドプシン系網膜インプラントが天然バクテリオロドプシンをベースとする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記バクテリオロドプシン系網膜インプラントがバクテリオロドプシン変異体をベースとする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記変異体がＱ状態変異体である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記変異体が、高双極子モーメントを有するように最適化されている、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記変異体が、効率的なＱ状態形成のために最適化されている、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
網膜細胞を刺激するための方法であって、
（ａ）前記網膜細胞をバクテリオロドプシン系網膜インプラントと接触させること、
（ｂ）前記インプラントを光源で活性化すること
を含み、
（ｉ）約５００μｍ未満、または約３５０μｍ未満、または約２５０μｍ未満、または約２００μｍ未満、または約１５０μｍ未満、または約１００μｍ未満、または約７５μｍ未満、または約５０μｍ未満、または約４０μｍ未満、または約３０μｍ未満、または約２５μｍ未満のピクセル寸法を有する分解能で刺激が提供されるように、前記インプラントが網膜細胞を刺激するか；あるいは
（ｉｉ）（ｉ）前記光源の回折限界、または（ｉｉ）前記網膜インプラントがイオン透過性担体をさらに含む場合には、前記イオン透過性担体の開口直径および密度により制限される分解能で刺激が提供されるように、前記インプラントが網膜細胞を刺激するか；あるいは
（ｉｉｉ）約４ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約５００μｍのピクセル寸法、または約８ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約３５０μｍのピクセル直径、または約１６ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約２５０μｍのピクセル直径、または約２５ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約２００μｍのピクセル直径、または約４４ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約１５０μｍのピクセル直径、または約１００ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約１００μｍのピクセル直径、または約１７８ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約７５μｍのピクセル直径、または約４００ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約５０μｍのピクセル直径、または約６２５ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約４０μｍのピクセル直径、または約１１１１ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約３０μｍのピクセル直径、または約１６００ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約２５μｍのピクセル直径を有する分解能で刺激が提供されるように、前記インプラントが網膜細胞を刺激する、方法。
【請求項４１】
網膜細胞の喪失により引き起こされる視力喪失を有する患者を処置するための網膜インプラントであって、約５００μｍ未満、または約３５０μｍ未満、または約２５０μｍ未満、または約２００μｍ未満、または約１５０μｍ未満、または約１００μｍ未満、または約７５μｍ未満、または約５０μｍ未満、または約４０μｍ未満、または約３０μｍ未満、または約２５μｍ未満のピクセル寸法を有する分解能で刺激が提供されるように、網膜細胞を刺激する網膜インプラントを含む、網膜インプラント。
【請求項４２】
網膜細胞の喪失により引き起こされる視力喪失を有する患者を処置するための網膜インプラントであって、（ｉ）前記光源の回折限界、または（ｉｉ）前記網膜インプラントがイオン透過性担体をさらに含む場合には、前記イオン透過性担体の開口直径および密度により制限される分解能で刺激が提供されるように、網膜細胞を刺激する網膜インプラントを含む、網膜インプラント。
【請求項４３】
網膜細胞の喪失により引き起こされる視力喪失を有する患者を処置するための網膜インプラントであって、約４ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約５００μｍのピクセル寸法、または約８ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約３５０μｍのピクセル直径、または約１６ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約２５０μｍのピクセル直径、または約２５ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約２００μｍのピクセル直径、または約４４ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約１５０μｍのピクセル直径、または約１００ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約１００μｍのピクセル直径、または約１７８ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約７５μｍのピクセル直径、または約４００ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約５０μｍのピクセル直径、または約６２５ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約４０μｍのピクセル直径、または約１１１１ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約３０μｍのピクセル直径、または約１６００ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約２５μｍのピクセル直径を有する分解能で刺激が提供されるように、網膜細胞を刺激する網膜インプラントを含む、網膜インプラント。
【請求項４４】
前記バクテリオロドプシン系網膜インプラントが少なくとも１つの担体層およびバクテリオロドプシンフィルムを含み、前記バクテリオロドプシンフィルムが天然バクテリオロドプシンまたはバクテリオロドプシン変異体の複数の個別層を含み、前記天然バクテリオロドプシンまたはバクテリオロドプシン変異体の各個別層がカチオン性ポリマーの層と交互に存在し、前記バクテリオロドプシン変異体がクロリドポンプ変異体、双極子変異体、光サイクル変異体、金結合変異体、イオンポンプ変異体、Ｑ状態変異体およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項４１〜４３のいずれかに記載の網膜インプラント。
【請求項４５】
前記光源がヒト可視波長、すなわち約４００ｎｍ〜約７００ｎｍを放射する光源である、請求項４４に記載の網膜インプラント。
【請求項４６】
前記光源が、約１００ｍＷ／ｃｍ２未満、５０ｍＷ／ｃｍ２、４０ｍＷ／ｃｍ２、または約３０ｍＷ／ｃｍ２未満、または約２０ｍＷ／ｃｍ２未満、または約１０ｍＷ／ｃｍ２未満、または約５ｍＷ／ｃｍ２未満、または約１ｍＷ／ｃｍ２未満の強度を有する、請求項４４に記載の網膜インプラント。
【請求項４７】
前記光源がパルス光源である、請求項４５に記載の網膜インプラント。
【請求項４８】
前記光源が連続光源である、請求項４５に記載の網膜インプラント。
【請求項４９】
生体適合性イオン透過性網膜インプラントである、請求項４１〜４３のいずれかに記載の網膜インプラント。
【請求項５０】
多層アセンブリを使用して作製されたものである、請求項４９に記載の網膜インプラント。
【請求項５１】
網膜下位置または網膜上位置から選択される位置に移植される、請求項４１〜４３のいずれかに記載の網膜インプラント。
【請求項５２】
網膜下位置に移植される、請求項５１に記載の網膜インプラント。
【請求項５３】
網膜上位置に移植される、請求項５１に記載の網膜インプラント。
【請求項５４】
前記網膜細胞が、網膜神経節細胞、網膜双極細胞、網膜光受容細胞およびそれらの組み合わせから選択される、請求項４１〜４３のいずれかに記載の網膜インプラント。
【請求項５５】
前記網膜細胞が網膜神経節細胞から選択される、請求項５４に記載の網膜インプラント。
【請求項５６】
前記網膜細胞が網膜双極細胞から選択される、請求項５４に記載の網膜インプラント。
【請求項５７】
前記網膜細胞が網膜光受容細胞から選択される、請求項５４に記載の網膜インプラント。
【請求項５８】
少なくとも約１００層の天然バクテリオロドプシンもしくはバクテリオロドプシン変異体、または少なくとも約１５０層の天然バクテリオロドプシンもしくはバクテリオロドプシン変異体、または少なくとも約２００層の天然バクテリオロドプシンもしくはバクテリオロドプシン変異体を含む、請求項４１〜４３のいずれかに記載の網膜インプラント。
【請求項５９】
少なくとも約３０ミリ秒の時間分解能をさらに提供する、請求項４１〜４３のいずれかに記載の網膜インプラント。
【請求項６０】
少なくとも約２０ミリ秒の時間分解能をさらに提供する、請求項４１〜４３のいずれかに記載の網膜インプラント。
【請求項６１】
少なくとも約１０ミリ秒の時間分解能をさらに提供する、請求項４１〜４３のいずれかに記載の網膜インプラント。
【請求項６２】
前記細胞に約４０μＶの活動電位を惹起する、請求項４１〜４３のいずれかに記載の網膜インプラント。
【請求項６３】
前記細胞に約３０μＶの活動電位を惹起する、請求項４１〜４３のいずれかに記載の網膜インプラント。
【請求項６４】
前記細胞に約２０μＶの活動電位を惹起する、請求項４１〜４３のいずれかに記載の網膜インプラント。
【請求項６５】
一方向プロトン勾配を提供する、請求項４１〜４３のいずれかに記載の網膜インプラント。
【請求項６６】
前記一方向プロトン勾配が前記網膜細胞に指向され、前記網膜細胞が網膜神経節細胞または網膜双極細胞から選択される、請求項６５に記載の網膜インプラント。
【請求項６７】
網膜下位置または網膜上位置から選択される位置に移植される、請求項６６に記載の網膜インプラント。
【請求項６８】
前記バクテリオロドプシン系網膜インプラントが、均一に配向されるようなバクテリオロドプシン分子を含む、請求項６５に記載の網膜インプラント。
【請求項６９】
生理的温度またはそれ未満で使用される、請求項４１〜４３のいずれかに記載の網膜インプラント。
【請求項７０】
生理的ｐＨで使用される、請求項４１〜４３のいずれかに記載の網膜インプラント。
【請求項７１】
前記視力喪失が網膜光受容細胞の喪失により引き起こされる、請求項４１〜４３のいずれかに記載の網膜インプラント。
【請求項７２】
前記担体層がイオン透過性層であり、前記インプラントの片側または両側にある、請求項４４に記載の網膜インプラント。
【請求項７３】
前記担体層が、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、２−フェニルエチルメタクリレート（ＰＥＭ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチルメタクリレート（ＭＭＡ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）マクロマー、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（ｐ−キシリレン）（パリレンとしても公知）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）ヒドロゲルおよびそれらの組み合わせから選択される、請求項７２に記載の網膜インプラント。
【請求項７４】
前記担体層が１００μｍ未満の厚さであり、約１００μｍ未満の直径の均等に分布した開口部のアレイを含有する、請求項７２に記載の網膜インプラント。
【請求項７５】
前記バクテリオロドプシン系網膜インプラントが天然バクテリオロドプシンをベースとする、請求項４１〜４３のいずれかに記載の網膜インプラント。
【請求項７６】
前記バクテリオロドプシン系網膜インプラントがバクテリオロドプシン変異体をベースとする、請求項４１〜４３のいずれかに記載の網膜インプラント。
【請求項７７】
前記変異体がＱ状態変異体である、請求項７６に記載の網膜インプラント。
【請求項７８】
前記変異体が、高双極子モーメントを有するように最適化されている、請求項７７に記載の網膜インプラント。
【請求項７９】
前記変異体が、効率的なＱ状態形成のために最適化されている、請求項７７に記載の網膜インプラント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府支援の研究に関する記載
この発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＧＭ−３４５４８、１Ｒ４１  ＥＹ０２３４６１−０１）およびＮａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＩＩＰ−１４４８２４４、ＩＩＰ−１６３２４６５）からの助成金の下で、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
タンパク質系網膜下インプラントは、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）および網膜色素変性症（ＲＰ）などの状態により失明した患者の視力を回復する新たなアプローチを提供する。本発明は、変性光受容細胞を置き換えるために網膜下位置に移植され得るバクテリオロドプシン系（ＢＲ系）網膜インプラントに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
網膜は、眼の背部の凹状内表面を裏打ちする多層組織である。網膜内の光受容細胞は、眼に入る光により活性化され、光信号を電気化学信号に変換し、これが網膜ニューロンに伝達される。次に、網膜ニューロンは、視神経を介して信号を脳の視覚中心に中継し、それにより、脳による視像の知覚を可能にする。光受容細胞は、それらの形状に由来して命名された桿体細胞および錐体細胞に大きく分類される。錐体細胞は、色覚に必要な光色素を含有するのに対して、桿体細胞は、光に対して高感受性の光色素ロドプシンを含有するので、薄明かり条件、例えば夜間条件下における視覚を可能にする。桿体細胞は、光の単一光子により活性化されるために十分に感受性であるのに対して、錐体細胞は、活性化されるために数十〜数百の光子を必要とする。
【０００４】
ロドプシン（桿体細胞の光受容色素）は、光の光子により活性化されるとコンフォメーション変化を受ける。ロドプシンは、レチナール（ビタミンＡの誘導体）と称される補欠分子族に共有結合するオプシンと称される７回膜貫通タンパク質からなる。非活性化レチナールは１１−シス形態で存在するのに対して、光による刺激は、オールトランス形態へのコンフォメーション変化を誘導する。網膜のコンフォメーション変化は、共有結合オプシンポリペプチドの対応するコンフォメーション変化を誘導し、それにより、光受容細胞内の二次メッセンジャーカスケードをトリガーし、適切な網膜ニューロンへの信号の伝達をもたらす。これらの信号は、視神経に沿って脳の視覚中心に送られ、脳による視覚入力の処理および視像の知覚を可能にする。
【０００５】
網膜の光受容細胞を破壊する様々な疾患および状態は、部分的または完全な視力喪失を引き起こす。網膜の２つの主な疾患は、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）および網膜色素変性症（ＲＰ）である。高齢者における視力喪失および失明の主な原因として、ＡＭＤは、網膜中心の黄斑内に位置する桿体光受容細胞および錐体光受容細胞の両方の悪化を引き起こす。さらに、ＡＭＤは中心視力に影響を与えるので、読書、運転、および高コントラスト視力を必要とする他の仕事の困難を引き起こす。
【０００６】
他方の疾患ＲＰは、桿体光受容細胞が変性し、それにより、視力喪失および失明を引き起こす遺伝性状態である。桿体細胞の喪失は、薄明かりにおける視力を損ない、患者がトンネル視および最終的には失明に悩まされるまで、周辺視力を徐々に低下させる。
【０００７】
これまで、このような網膜の疾患および状態の処置のために、多くの人工網膜プロトタイプが調査されているが、それぞれが明確な欠点を有する。最も有望な設計の１つは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａの研究者により設計され、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｓｉｇｈｔにより商品化された網膜上インプラントＡｒｇｕｓ  ＩＩである。前記補綴物は、眼鏡に取り付けられ、接続ケーブルにより微小電極アレイに接続された外部カメラの使用を採用する。電極アレイは、直接電気刺激を神経節細胞に提供する。臨床試験では、被験者は、８×８電極アレイを使用して光を知覚することができ、動作を検出し、単純な形状を認識することができた。しかしながら、この設計は、外部ハードウェア、例えば眼鏡および外科的に移植された外部デバイスを必要とするという明らかな欠点を有する。また、前記補綴物が提供する低分解能は、機能的視力を回復するためには不十分であり、移植に必要な外科手術の複雑性は、網膜外科医界による採用を制限する。
【０００８】
必要とされるものは、網膜疾患または損傷の結果として光受容細胞の喪失に起因する視力喪失を患っている患者に対して高品質の視力を少なくとも部分的に回復し得る低い外科的侵襲性の高分解能網膜インプラントである。
【０００９】
上記から、視力喪失を処置するための安全かつ有効な方法を開発する継続的な必要性があることは明らかである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明のタンパク質系網膜下インプラントは、ＡＭＤおよびＲＰにより失明した患者の視力を回復するための新たなアプローチを提供する。Ｐ２３Ｈトランスジェニックラットを用いたエクスビボ細胞外記録実験を用いて、変性網膜の双極細胞および神経節細胞を刺激するこのようなイオン媒介性タンパク質系補綴物の能力を実証した。
【００１１】
本発明は、高分解能で機能することができるインプラントであって、屋内環境照明と同様の光条件、例えば網膜細胞を刺激して視力喪失を処置するための高ピクセル分解能方法により活性化され得るインプラントを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、タンパク質系網膜インプラントの適用を示す。ＡＭＤおよびＲＰを含む網膜変性疾患は、網膜内の光受容細胞の喪失を特徴とする。これらの疾患に罹患した個体は視力を喪失し、最終的には失明するであろう。バクテリオロドプシン系（ＢＲ系）網膜インプラントは変性光受容細胞に置き換わり、網膜下の位置に配置される。光の吸収により、インプラントは、残りの網膜組織を刺激するイオン勾配を生成する。Ｗａｇｎｅｒ，Ｎ．Ｌら、Ｉｎ  Ｂｉｏｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｂ．Ａ．Ｒｅｈｍ，ｅｄ．Ｃａｉｓｔｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｏｒｆｏｌｋ，ＵＫ  ２０１３，２０５−２４０；Ｇｒｅｃｏ，Ｊ．Ａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｉｇｈ  Ｓｐｅｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ．Ｓｙｓｔ．２０１７，２６，１７４００１２−１−１７４００１２０−２０；およびＣｈｅｎ，Ｚ．；Ｂｉｒｇｅ，Ｒ．Ｒ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９９３，１１，２９２−３００を参照のこと。
【００１３】
【図２】図２は、網膜インプラントの概略図と、ＢＲおよびポリカチオンの交互層の配置を示す図とを示す。Ｈｅ，Ｊ．−Ａら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １９９８，１４，１６７４−１６７９を参照のこと。タンパク質系網膜インプラントは、イオン透過膜、ポリカチオンおよびＢＲ間の静電相互作用に基づく。得られる多層フィルムは、変性網膜組織を刺激するために使用される一方向イオン勾配を生成する。
【００１４】
【図３】図３は、Ｐ２３Ｈラット緑色錐体色素および明順応バクテリオロドプシン［ｂＲ（ＬＡ）］の吸収スペクトルと、実験において使用した３つのＬＥＤからの出力との比較を示す。赤色ＬＥＤは、ｂＲ（ＬＡ）吸収スペクトルに対して妥当な効率でカップリングするが、ラット緑色錐体に対してほとんどカップリングしないことに留意する。ラットは赤色錐体を有しておらず、Ｐ２３Ｈラット網膜は変性しているで、本発明者らは、赤色ＬＥＤでインプラントを選択的に活性化し得る。
【００１５】
【図４Ａ】図４Ａおよび４Ｂは、イオン媒介性網膜インプラントを活性化する光に応じた切除Ｐ２３Ｈラット網膜の活性化効率を示す。図４Ａは、プロトンが網膜に向けてポンピングされるように配向すると、高い光学密度（ＯＤ）を有する網膜インプラントが高効率で網膜組織を刺激することができることを実証する（黒色四角および三角を伴うトレース、図４Ａの上のトレース、図４Ｂの下のトレース）。より低いＯＤを有するインプラントを使用した場合（白色四角および三角を伴うトレース、図４Ａの下のトレース、図４Ｂの上のトレース）、効率は有意に減少する。図４Ｂにおいて、プロトンが網膜から離れてポンピングされるようにインプラントの配向を逆にすると、活動はほとんどまたは全く測定されない。四角および三角のデータポイントは、それぞれ正および負の振幅を有する測定活動電位を指す。すべてのデータは、３０μＶ閾値を分析に使用する。
【図４Ｂ】図４Ａおよび４Ｂは、イオン媒介性網膜インプラントを活性化する光に応じた切除Ｐ２３Ｈラット網膜の活性化効率を示す。図４Ａは、プロトンが網膜に向けてポンピングされるように配向すると、高い光学密度（ＯＤ）を有する網膜インプラントが高効率で網膜組織を刺激することができることを実証する（黒色四角および三角を伴うトレース、図４Ａの上のトレース、図４Ｂの下のトレース）。より低いＯＤを有するインプラントを使用した場合（白色四角および三角を伴うトレース、図４Ａの下のトレース、図４Ｂの上のトレース）、効率は有意に減少する。図４Ｂにおいて、プロトンが網膜から離れてポンピングされるようにインプラントの配向を逆にすると、活動はほとんどまたは全く測定されない。四角および三角のデータポイントは、それぞれ正および負の振幅を有する測定活動電位を指す。すべてのデータは、３０μＶ閾値を分析に使用する。
【００１６】
【図５−１】図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄ、５Ｅおよび５Ｆは、網膜インプラントの光活性化後のＰ２３Ｈラットの測定ＲＧＣの潜時の分布を示す。図５Ａ、５Ｃおよび５Ｅは、プロトンを神経組織に向けてポンピングするようにインプラントを配向した場合に対応する（［Ｈ＋］増加）。図５Ｂ、５Ｄおよび５Ｆは対照用であり、インプラントを逆配向で配置した（［Ｈ＋］減少）。ｙ軸は、１００回の掃引当たりの平均観察数になるように調整されている。入射光（６３０ｎｍ、１ミリ秒パルス）強度は、上から下に増加する（５Ａ／５Ｂ：２０．５ｍＷ／ｃｍ２；５Ｃ／５Ｄ：２９．５ｍＷ／ｃｍ２；５Ｅ／５Ｆ：４９．８９ｍＷ／ｃｍ２）。
【図５−２】図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄ、５Ｅおよび５Ｆは、網膜インプラントの光活性化後のＰ２３Ｈラットの測定ＲＧＣの潜時の分布を示す。図５Ａ、５Ｃおよび５Ｅは、プロトンを神経組織に向けてポンピングするようにインプラントを配向した場合に対応する（［Ｈ＋］増加）。図５Ｂ、５Ｄおよび５Ｆは対照用であり、インプラントを逆配向で配置した（［Ｈ＋］減少）。ｙ軸は、１００回の掃引当たりの平均観察数になるように調整されている。入射光（６３０ｎｍ、１ミリ秒パルス）強度は、上から下に増加する（５Ａ／５Ｂ：２０．５ｍＷ／ｃｍ２；５Ｃ／５Ｄ：２９．５ｍＷ／ｃｍ２；５Ｅ／５Ｆ：４９．８９ｍＷ／ｃｍ２）。
【図５−３】図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄ、５Ｅおよび５Ｆは、網膜インプラントの光活性化後のＰ２３Ｈラットの測定ＲＧＣの潜時の分布を示す。図５Ａ、５Ｃおよび５Ｅは、プロトンを神経組織に向けてポンピングするようにインプラントを配向した場合に対応する（［Ｈ＋］増加）。図５Ｂ、５Ｄおよび５Ｆは対照用であり、インプラントを逆配向で配置した（［Ｈ＋］減少）。ｙ軸は、１００回の掃引当たりの平均観察数になるように調整されている。入射光（６３０ｎｍ、１ミリ秒パルス）強度は、上から下に増加する（５Ａ／５Ｂ：２０．５ｍＷ／ｃｍ２；５Ｃ／５Ｄ：２９．５ｍＷ／ｃｍ２；５Ｅ／５Ｆ：４９．８９ｍＷ／ｃｍ２）。
【００１７】
【図６Ａ】図６Ａおよび６Ｂは、タンパク質系網膜インプラントの空間分解能を定量するための細胞外記録実験に使用した多電極アレイ（ＭＥＡ）の概略図を示す（図６Ａ）。８×８ＭＥＡの列Ｅの電極５の選択的活性化の実証（図６Ｂ）。光誘導性活動電位は、アレイ内の電極５により測定したＲＧＣに限定されるのに対して、すべての他の信号は自発的な活動によるものである。入射光ビームは２００μｍの直径を有し、電極５を中心としていた。ｙ軸は、照射ビームの正規化振幅および１１０．２秒にわたる正規化時間範囲である。
【図６Ｂ】図６Ａおよび６Ｂは、タンパク質系網膜インプラントの空間分解能を定量するための細胞外記録実験に使用した多電極アレイ（ＭＥＡ）の概略図を示す（図６Ａ）。８×８ＭＥＡの列Ｅの電極５の選択的活性化の実証（図６Ｂ）。光誘導性活動電位は、アレイ内の電極５により測定したＲＧＣに限定されるのに対して、すべての他の信号は自発的な活動によるものである。入射光ビームは２００μｍの直径を有し、電極５を中心としていた。ｙ軸は、照射ビームの正規化振幅および１１０．２秒にわたる正規化時間範囲である。
【００１８】
【図７Ａ】図７Ａおよび７Ｂは、Ｐ２３Ｈラット緑色錐体（図７Ａ）および明順応ＢＲ（ｂＲ；図７Ｂ）の吸収スペクトルと、用いた緑色または赤色干渉フィルタのいずれかを有するプロジェクター光からの出力との比較を示す。光源とスペクトルとのカップリング効率は、プロットの右側に示されている。赤色干渉フィルタはｂＲ吸収スペクトルとカップリングするが、ラット緑色錐体色素に対してはるかに低効率であることがわかる。
【図７Ｂ】図７Ａおよび７Ｂは、Ｐ２３Ｈラット緑色錐体（図７Ａ）および明順応ＢＲ（ｂＲ；図７Ｂ）の吸収スペクトルと、用いた緑色または赤色干渉フィルタのいずれかを有するプロジェクター光からの出力との比較を示す。光源とスペクトルとのカップリング効率は、プロットの右側に示されている。赤色干渉フィルタはｂＲ吸収スペクトルとカップリングするが、ラット緑色錐体色素に対してはるかに低効率であることがわかる。
【００１９】
【図８Ａ】図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃは、ＭＥＡアレイ内の単一電極を中心としたＰ２３Ｈラット網膜の標的化照射を示す。図８Ａ、図８Ｂおよび図８Ｃは、それぞれ電極Ｅ３、Ｅ４およびＥ５の選択活性化に対応する。各パネルにおける上のプロットは、照射後の各電極の％信号率を示しており、各プロットは最大値に対して正規化されている。各パネルにおける下のプロットは、位置および相対ビームスポットサイズを示す。
【図８Ｂ】図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃは、ＭＥＡアレイ内の単一電極を中心としたＰ２３Ｈラット網膜の標的化照射を示す。図８Ａ、図８Ｂおよび図８Ｃは、それぞれ電極Ｅ３、Ｅ４およびＥ５の選択活性化に対応する。各パネルにおける上のプロットは、照射後の各電極の％信号率を示しており、各プロットは最大値に対して正規化されている。各パネルにおける下のプロットは、位置および相対ビームスポットサイズを示す。
【図８Ｃ】図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃは、ＭＥＡアレイ内の単一電極を中心としたＰ２３Ｈラット網膜の標的化照射を示す。図８Ａ、図８Ｂおよび図８Ｃは、それぞれ電極Ｅ３、Ｅ４およびＥ５の選択活性化に対応する。各パネルにおける上のプロットは、照射後の各電極の％信号率を示しており、各プロットは最大値に対して正規化されている。各パネルにおける下のプロットは、位置および相対ビームスポットサイズを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、網膜細胞の喪失により引き起こされる視力喪失を有する患者を処置するための方法であって、
（ａ）前記患者の目にバクテリオロドプシン系網膜インプラントを移植すること、および
（ｂ）前記インプラントを光源で活性化すること
を含み、
約５００μｍ未満、または約３５０μｍ未満、または約２５０μｍ未満、または約２００μｍ未満、または約１５０μｍ未満、または約１００μｍ未満、または約７５μｍ未満、または約５０μｍ未満、または約４０μｍ未満、または約３０μｍ未満、または約２５μｍ未満のピクセル寸法を有する分解能で刺激が提供されるように、前記インプラントが網膜細胞を刺激する方法に関する。
【００２１】
別の態様では、本発明は、網膜細胞の喪失により引き起こされる視力喪失を有する患者を処置するための方法であって、
（ａ）前記患者の目にバクテリオロドプシン系網膜インプラントを移植すること、および
（ｂ）前記インプラントを光源で活性化すること
を含み、
（ｉ）前記光源の回折限界、または（ｉｉ）前記網膜インプラントがイオン透過性担体（ｉｏｎ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）（足場）をさらに含む場合には、前記イオン透過性担体（足場）の開口直径および密度により制限される分解能で刺激が提供されるように、前記インプラントが網膜細胞を刺激する、方法に関する。
【００２２】
別の態様では、本発明は、網膜細胞の喪失により引き起こされる視力喪失を有する患者を処置するための方法であって、
（ａ）前記患者の目にバクテリオロドプシン系網膜インプラントを移植すること、および
（ｂ）前記インプラントを光源で活性化すること
を含み、
約４ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約５００μｍのピクセル寸法、または約８ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約３５０μｍのピクセル直径、または約１６ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約２５０μｍのピクセル直径、または約２５ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約２００μｍのピクセル直径、または約４４ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約１５０μｍのピクセル直径、または約１００ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約１００μｍのピクセル直径、または約１７８ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約７５μｍのピクセル直径、または約４００ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約５０μｍのピクセル直径、または約６２５ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約４０μｍのピクセル直径、または約１１１１ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約３０μｍのピクセル直径、または約１６００ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約２５μｍのピクセル直径を有する分解能で刺激が提供されるように、前記インプラントが網膜細胞を刺激する方法に関する。
【００２３】
別の態様では、本発明は、前記バクテリオロドプシン系網膜インプラントが少なくとも１つの担体層（足場）およびバクテリオロドプシンフィルムを含み、前記バクテリオロドプシンフィルムが天然バクテリオロドプシンまたはバクテリオロドプシン変異体の複数の個別層を含み、前記天然バクテリオロドプシンまたはバクテリオロドプシン変異体の各個別層がカチオン性ポリマーの層と交互に存在し、前記バクテリオロドプシン変異体がクロリドポンプ変異体（ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｐｕｍｐ  ｍｕｔａｎｔ）、双極子変異体（ｄｉｐｏｌｅ  ｍｕｔａｎｔ）、光サイクル変異体（ｐｈｏｔｏｃｙｃｌｅ  ｍｕｔａｎｔ）、金結合変異体、イオンポンプ変異体、Ｑ状態変異体（Ｑ−ｓｔａｔｅ  ｍｕｔａｎｔ）およびそれらの組み合わせからなる群より選択される方法に関する。
【００２４】
別の態様では、本発明は、前記光源がヒト可視波長、すなわち約４００ｎｍ〜約７００ｎｍを放射する光源である方法に関する。
【００２５】
別の態様では、本発明は、前記光源が、約１００ｍＷ／ｃｍ２未満、５０ｍＷ／ｃｍ２、４０ｍＷ／ｃｍ２、または約３０ｍＷ／ｃｍ２未満、または約２０ｍＷ／ｃｍ２未満、または約１０ｍＷ／ｃｍ２未満、または約５ｍＷ／ｃｍ２未満、または約１ｍＷ／ｃｍ２未満の強度（出力密度）を有する方法に関する。
【００２６】
別の態様では、本発明は、前記光源がパルス光源である方法に関する。
【００２７】
別の態様では、本発明は、前記光源が連続光源である方法に関する。
【００２８】
別の態様では、本発明は、前記インプラントが生体適合性イオン透過性網膜インプラントである方法に関する。
【００２９】
別の態様では、本発明は、前記インプラントが、多層アセンブリ（ｌａｙｅｒ−ｂｙ−ｌａｙｅｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）を使用して作製されたものである方法に関する。
【００３０】
別の態様では、本発明は、前記インプラントを、網膜下位置または網膜上位置から選択される位置に移植する方法に関する。
【００３１】
別の態様では、本発明は、前記インプラントを網膜下位置に移植する方法に関する。
【００３２】
別の態様では、本発明は、前記インプラントを網膜上位置に移植する方法に関する。
【００３３】
別の態様では、本発明は、前記網膜細胞が、網膜神経節細胞、網膜双極細胞、網膜光受容細胞およびそれらの組み合わせから選択される方法に関する。
【００３４】
別の態様では、本発明は、前記網膜細胞が網膜神経節細胞から選択される方法に関する。
【００３５】
別の態様では、本発明は、前記網膜細胞が網膜双極細胞から選択される方法に関する。
【００３６】
別の態様では、本発明は、前記網膜細胞が網膜光受容細胞から選択される方法に関する。
【００３７】
別の態様では、本発明は、前記網膜インプラントが、少なくとも約１００層の天然バクテリオロドプシンもしくはバクテリオロドプシン変異体、または少なくとも約１５０層の天然バクテリオロドプシンもしくはバクテリオロドプシン変異体、または少なくとも約２００層の天然バクテリオロドプシンもしくはバクテリオロドプシン変異体を含む方法に関する。
【００３８】
別の態様では、本発明は、前記網膜インプラントが、少なくとも約３０ミリ秒の時間分解能をさらに提供する方法に関する。
【００３９】
別の態様では、本発明は、前記網膜インプラントが、少なくとも約２０ミリ秒の時間分解能をさらに提供する方法に関する。
【００４０】
別の態様では、本発明は、前記網膜インプラントが、少なくとも約１０ミリ秒の時間分解能をさらに提供する方法に関する。
【００４１】
別の態様では、本発明は、前記網膜インプラントが、前記細胞に約４０μＶの活動電位を惹起する（提供する）方法に関する。
【００４２】
別の態様では、本発明は、前記網膜インプラントが、前記細胞に約３０μＶの活動電位を惹起する（提供する）方法に関する。
【００４３】
別の態様では、本発明は、前記網膜インプラントが、前記細胞に約２０μＶの活動電位を惹起する（提供する）方法に関する。
【００４４】
別の態様では、本発明は、前記網膜インプラントが一方向プロトン勾配を提供する方法に関する。
【００４５】
別の態様では、本発明は、前記一方向プロトン勾配が前記網膜細胞に指向され、前記網膜細胞が網膜神経節細胞または網膜双極細胞から選択される方法に関する。
【００４６】
別の態様では、本発明は、前記インプラントを、網膜下位置または網膜上位置から選択される位置に移植する方法に関する。
【００４７】
別の態様では、本発明は、前記バクテリオロドプシン系網膜インプラントが、均一に（均質に）配向したバクテリオロドプシン分子を含む方法に関する。
【００４８】
別の態様では、本発明は、前記網膜インプラントを生理的温度（約３７℃）またはそれ未満で使用する方法に関する。
【００４９】
別の態様では、本発明は、前記網膜インプラントを生理的ｐＨ（約７．０〜約７．２）で使用する方法に関する。
【００５０】
別の態様では、本発明は、前記視力喪失が網膜光受容細胞の喪失により引き起こされる方法に関する。
【００５１】
別の態様では、本発明は、前記担体層がイオン透過性層であり、前記インプラントの片側または両側にある方法に関する。
【００５２】
別の態様では、本発明は、前記担体層が、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、２−フェニルエチルメタクリレート（ＰＥＭ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチルメタクリレート（ＭＭＡ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）マクロマー、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（ｐ−キシリレン）（パリレンとしても公知）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）ヒドロゲルおよびそれらの組み合わせから選択される方法に関する。
【００５３】
別の態様では、本発明は、前記担体層（足場）が１００μｍ未満の厚さであり、約１００μｍ未満の直径の均等に分布した開口部のアレイを含有する方法に関する。
【００５４】
別の態様では、本発明は、前記バクテリオロドプシン系網膜インプラントが天然バクテリオロドプシンをベースとする方法に関する。
【００５５】
別の態様では、本発明は、前記バクテリオロドプシン系網膜インプラントがバクテリオロドプシン変異体をベースとする方法に関する。
【００５６】
別の態様では、本発明は、前記変異体がＱ状態変異体である方法に関する。
【００５７】
別の態様では、本発明は、前記変異体が、高双極子モーメントを有するように最適化されている方法に関する。
【００５８】
別の態様では、本発明は、前記変異体が、効率的なＱ状態形成のために最適化されている方法に関する。
【００５９】
別の態様では、本発明は、網膜細胞を刺激するための方法であって、
（ａ）前記網膜細胞をバクテリオロドプシン系網膜インプラントと接触させること、
（ｂ）前記インプラントを光源で活性化すること
を含み、ここで
（ｉ）約５００μｍ未満、または約３５０μｍ未満、または約２５０μｍ未満、または約２００μｍ未満、または約１５０μｍ未満、または約１００μｍ未満、または約７５μｍ未満、または約５０μｍ未満、または約４０μｍ未満、または約３０μｍ未満、または約２５μｍ未満のピクセル寸法を有する分解能で刺激が提供されるように、前記インプラントが網膜細胞を刺激するか；または
（ｉｉ）（ｉ）前記光源の回折限界、または（ｉｉ）前記網膜インプラントがイオン透過性担体（足場）をさらに含む場合には、前記イオン透過性担体（足場）の開口直径および密度により制限される分解能で刺激が提供されるように、前記インプラントが網膜細胞を刺激するか；または
（ｉｉｉ）
約４ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約５００μｍのピクセル寸法、または約８ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約３５０μｍのピクセル直径、または約１６ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約２５０μｍのピクセル直径、または約２５ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約２００μｍのピクセル直径、または約４４ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約１５０μｍのピクセル直径、または約１００ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約１００μｍのピクセル直径、または約１７８ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約７５μｍのピクセル直径、または約４００ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約５０μｍのピクセル直径、または約６２５ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約４０μｍのピクセル直径、または約１１１１ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約３０μｍのピクセル直径、または約１６００ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約２５μｍのピクセル直径を有する分解能で刺激が提供されるように、前記インプラントが網膜細胞を刺激する方法に関する。
【００６０】
別の態様では、本発明は、網膜細胞の喪失により引き起こされる視力喪失を有する患者を処置するための網膜インプラントであって、約５００μｍ未満、または約３５０μｍ未満、または約２５０μｍ未満、または約２００μｍ未満、または約１５０μｍ未満、または約１００μｍ未満、または約７５μｍ未満、または約５０μｍ未満、または約４０μｍ未満、または約３０μｍ未満、または約２５μｍ未満のピクセル寸法を有する分解能で刺激が提供されるように、網膜細胞を刺激する網膜インプラントを含む網膜インプラントに関する。
【００６１】
別の態様では、本発明は、網膜細胞の喪失により引き起こされる視力喪失を有する患者を処置するための網膜インプラントであって、（ｉ）前記光源の回折限界、または（ｉｉ）前記網膜インプラントがイオン透過性担体（足場）をさらに含む場合には、前記イオン透過性担体（足場）の開口直径および密度により制限される分解能で刺激が提供されるように、網膜細胞を刺激する網膜インプラントを含む網膜インプラントに関する。
【００６２】
別の態様では、本発明は、網膜細胞の喪失により引き起こされる視力喪失を有する患者を処置するための網膜インプラントであって、約４ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約５００μｍのピクセル寸法、または約８ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約３５０μｍのピクセル直径、または約１６ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約２５０μｍのピクセル直径、または約２５ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約２００μｍのピクセル直径、または約４４ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約１５０μｍのピクセル直径、または約１００ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約１００μｍのピクセル直径、または約１７８ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約７５μｍのピクセル直径、または約４００ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約５０μｍのピクセル直径、または約６２５ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約４０μｍのピクセル直径、または約１１１１ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約３０μｍのピクセル直径、または約１６００ピクセル／ｍｍ２のピクセル密度および約２５μｍのピクセル直径を有する分解能で刺激が提供されるように、網膜細胞を刺激する網膜インプラントを含む網膜インプラントに関する。
【００６３】
別の態様では、本発明は、前記バクテリオロドプシン系網膜インプラントが少なくとも１つの担体層（足場）およびバクテリオロドプシンフィルムを含み、前記バクテリオロドプシンフィルムが天然バクテリオロドプシンまたはバクテリオロドプシン変異体の複数の個別層を含み、前記天然バクテリオロドプシンまたはバクテリオロドプシン変異体の各個別層がカチオン性ポリマーの層と交互に存在し、前記バクテリオロドプシン変異体がクロリドポンプ変異体、双極子変異体、光サイクル変異体、金結合変異体、イオンポンプ変異体、Ｑ状態変異体およびそれらの組み合わせからなる群より選択される網膜インプラントに関する。
【００６４】
別の態様では、本発明は、前記光源がヒト可視波長、すなわち約４００ｎｍ〜約７００ｎｍを放射する光源である網膜インプラントに関する。
【００６５】
別の態様では、本発明は、前記光源が、約１００ｍＷ／ｃｍ２未満、５０ｍＷ／ｃｍ２、４０ｍＷ／ｃｍ２、または約３０ｍＷ／ｃｍ２未満、または約２０ｍＷ／ｃｍ２未満、または約１０ｍＷ／ｃｍ２未満、または約５ｍＷ／ｃｍ２未満、または約１ｍＷ／ｃｍ２未満の強度（出力密度）を有する網膜インプラントに関する。
【００６６】
別の態様では、本発明は、前記光源がパルス光源である網膜インプラントに関する。
【００６７】
別の態様では、本発明は、前記光源が連続光源である網膜インプラントに関する。
【００６８】
別の態様では、本発明は、生体適合性イオン透過性網膜インプラントである網膜インプラントに関する。
【００６９】
別の態様では、本発明は、多層アセンブリを使用して作製されたものである網膜インプラントに関する。
【００７０】
別の態様では、本発明は、網膜下位置または網膜上位置から選択される位置に移植される網膜インプラントに関する。
【００７１】
別の態様では、本発明は、網膜下位置に移植される網膜インプラントに関する。
【００７２】
別の態様では、本発明は、網膜上位置に移植される網膜インプラントに関する。
【００７３】
別の態様では、本発明は、前記網膜細胞が、網膜神経節細胞、網膜双極細胞、網膜光受容細胞およびそれらの組み合わせから選択される網膜インプラントに関する。
【００７４】
別の態様では、本発明は、前記網膜細胞が網膜神経節細胞から選択される網膜インプラントに関する。
【００７５】
別の態様では、本発明は、前記網膜細胞が網膜双極細胞から選択される網膜インプラントに関する。
【００７６】
別の態様では、本発明は、前記網膜細胞が網膜光受容細胞から選択される網膜インプラントに関する。
【００７７】
別の態様では、本発明は、少なくとも約１００層の天然バクテリオロドプシンもしくはバクテリオロドプシン変異体、または少なくとも約１５０層の天然バクテリオロドプシンもしくはバクテリオロドプシン変異体、または少なくとも約２００層の天然バクテリオロドプシンもしくはバクテリオロドプシン変異体を含む網膜インプラントに関する。
【００７８】
別の態様では、本発明は、少なくとも約３０ミリ秒の時間分解能をさらに提供する網膜インプラントに関する。
【００７９】
別の態様では、本発明は、少なくとも約２０ミリ秒の時間分解能をさらに提供する網膜インプラントに関する。
【００８０】
別の態様では、本発明は、少なくとも約１０ミリ秒の時間分解能をさらに提供する網膜インプラントに関する。
【００８１】
別の態様では、本発明は、前記細胞に約４０μＶの活動電位を惹起する（提供する）網膜インプラントに関する。
【００８２】
別の態様では、本発明は、前記細胞に約３０μＶの活動電位を惹起する（提供する）網膜インプラントに関する。
【００８３】
別の態様では、本発明は、前記細胞に約２０μＶの活動電位を惹起する（提供する）網膜インプラントに関する。
【００８４】
別の態様では、本発明は、一方向プロトン勾配を提供する網膜インプラントに関する。
【００８５】
別の態様では、本発明は、前記一方向プロトン勾配が前記網膜細胞に指向され、前記網膜細胞が網膜神経節細胞または網膜双極細胞から選択される網膜インプラントに関する。
【００８６】
別の態様では、本発明は、網膜下位置または網膜上位置から選択される位置に移植される網膜インプラントに関する。
【００８７】
別の態様では、本発明は、前記バクテリオロドプシン系網膜インプラントが、均一に（均質に）配向したバクテリオロドプシン分子を含む網膜インプラントに関する。
【００８８】
別の態様では、本発明は、生理的温度（約３７℃）またはそれ未満で使用される網膜インプラントに関する。
【００８９】
別の態様では、本発明は、生理的ｐＨ（約７．０〜約７．２）で使用される網膜インプラントに関する。
【００９０】
別の態様では、本発明は、前記視力喪失が網膜光受容細胞の喪失により引き起こされる網膜インプラントに関する。
【００９１】
別の態様では、本発明は、前記担体層がイオン透過性層であり、前記インプラントの片側または両側にある網膜インプラントに関する。
【００９２】
別の態様では、本発明は、前記担体層が、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、２−フェニルエチルメタクリレート（ＰＥＭ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチルメタクリレート（ＭＭＡ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）マクロマー、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（ｐ−キシリレン）（パリレンとしても公知）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）ヒドロゲルおよびそれらの組み合わせから選択される網膜インプラントに関する。
【００９３】
別の態様では、本発明は、前記担体層（足場）が１００μｍ未満の厚さであり、約１００μｍ未満の直径の均等に分布した開口部のアレイを含有する網膜インプラントに関する。
【００９４】
別の態様では、本発明は、前記バクテリオロドプシン系網膜インプラントが天然バクテリオロドプシンをベースとする網膜インプラントに関する。
【００９５】
別の態様では、本発明は、前記バクテリオロドプシン系網膜インプラントがバクテリオロドプシン変異体をベースとする網膜インプラントに関する。
【００９６】
別の態様では、本発明は、前記変異体がＱ状態変異体である網膜インプラントに関する。
【００９７】
別の態様では、本発明は、前記変異体が、高双極子モーメントを有するように最適化されている網膜インプラントに関する。
【００９８】
別の態様では、本発明は、前記変異体が、効率的なＱ状態形成のために最適化されている網膜インプラントに関する。
【００９９】
本発明のこれらのおよび他の態様は、本明細書の開示から明らかになるであろう。
【０１００】
バクテリオロドプシン系網膜インプラント：
本発明の網膜インプラント（図１）は、光活性媒体として光活性化タンパク質バクテリオロドプシン（ＢＲ）を使用して、入射光を吸収し、変性網膜の残りの神経回路を活性化するプロトン駆動力を惹起して、視覚反応を刺激する。Ｂｉｒｇｅ，Ｒ．Ｒ．；Ｎｏｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｒａｎａｇｈａｎ，Ｍ．Ｊ．；Ｓａｎｄｂｅｒｇ，Ｄ．Ｊ．；Ｗａｇｎｅｒ，Ｎｉｃｏｌｅ  Ｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｂａｓｅｄ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｒｅｔｉｎａｓ  ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ８，５６３，０２６；ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，Ｚ．；Ｂｉｒｇｅ，Ｒ．Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂａｓｅｄ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｒｅｔｉｎａｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９９３，１１，２９２−３００を参照のこと。タンパク質のプロトンポンピング機能は、天然視覚色素であるロドプシンと同一の高い量子効率（６５％）で作動するので、バクテリオロドプシンはこの適用の優れた候補である。前記タンパク質はまた、高温（＞８０℃）、高光強度および高塩分環境下で機能する。網膜インプラントのアーキテクチャは、十分な入射光を吸収して網膜刺激のイオン勾配を生成することができるタンパク質の光学密度を可能にする。この性能上の特徴は、高度に均一なフィルムを生成するために使用される多層（ＬＢＬ）静電吸着アプローチにより促進される。結果は、一方向プロトン勾配を作ることができるフィルムである。自動ＬＢＬシステムは、多層インプラントを生成するためのこのボトムアップ製造方法のために開発された。網膜インプラントの高い光学密度は、変性網膜における光捕獲のために同様の光活性タンパク質を発現させようとする遺伝子治療および光遺伝学的アプローチに伴う固有の発現レベル問題を回避する。Ｐ２３Ｈトランスジェニックラットを用いたエクスビボ細胞外記録実験を用いて、変性網膜の双極細胞および神経節細胞を刺激するこれらのイオン媒介性タンパク質系補綴物の能力を実証する。
【０１０１】
網膜インプラント構築物の層内のＢＲタンパク質の分子パッキングは高いピクセル密度をもたらし、これが、イオン透過性足場を介したプロトンの拡散速度および側方拡散によってのみ制限される空間分解能につながる。重要なことに、網膜インプラントは入射光により駆動されるが、これは、外部ケーブル、電極または電源を必要とする他の電子タイプインプラントと比較して有利である。したがって、本発明の網膜インプラントは、外科的に侵襲性が低く、移植に必要な時間および機械的固定による感染可能性を大きく減少させる。インプラントはまた、患者が自然な眼球運動を使用して情景をスキャンすることを可能にし、信号伝送の遅延を伴わずに正常な視覚知覚を提供するであろう。
【０１０２】
多層薄膜の構築および設計：本発明のＢＲ系網膜インプラント（図２）は、特注ＬＢＬ浸漬機を使用した逐次的ＬＢＬ静電吸着により生成された多層ＢＲ薄膜から構成される。ＢＲのＬＢＬ沈着は、網膜インプラントの足場として、Ｄａｃｒｏｎ（登録商標）として公知の市販のイオン透過性マイクロファイバーを使用する。Ｄａｃｒｏｎ（登録商標）は目への適用に成功しており、前記タンパク質を表面上に直接付着および配向させるために使用され得る。網膜刺激のための十分なｐＨ勾配を生成するＢＲの能力を活用するために、前記タンパク質は、最適密度でＤａｃｒｏｎ（登録商標）表面積全体に均一に配向され、ｐＨ勾配も生成しながら入射光を適切に吸収するために十分なＢＲ層を含有する。さらに、本発明者らは、以下に記載されているように、適切なサイズ間隔で足場を提供することが有用であることを見出した。
【０１０３】
網膜インプラントの安定性および生体適合性：文献では、熱分解および光化学分解に対するＢＲの長期安定性が十分に証明されている。前記タンパク質は、通常のヒト体温をはるかに超える８０℃超の温度に耐えることができる。また、前記タンパク質の周期性（すなわち、サンプルが１／ｅ分解するまでに、前記タンパク質を光化学的に循環させ得る回数）は約１０６である。この値は、ほとんどの合成フォトクロミック材料よりもかなり大きい。この安定性は、天然脂質膜により取り囲まれた三量体の二次元結晶格子（紫膜）内におけるタンパク質の単離により達成される。ＬＢＬアセンブリ網膜インプラントは、ＢＲをポリカチオンに結合させる効率的な静電相互作用により互いに保持される。
【０１０４】
作用機構の概要：微生物ロドプシンは、遺伝性網膜障害を処置するための潜在的な光遺伝学的ツールとして機能する。光遺伝学的アプローチは、双極細胞および神経節細胞に指向されたＡＡＶで発現される光活性化タンパク質（チャンネルロドプシン−２（ＣｈＲ−２）およびハロロドプシン（ＨＲ）を含む）を使用して、変性光受容細胞の光感受性を置き換える。これらの治療は、ＲＰおよびＡＭＤでは両方とも、光受容細胞の喪失にもかかわらず、神経ネットワークの大部分が依然としてインタクトなままであるという事実を利用する。網膜細胞を取り囲むＮａ＋、Ｋ＋およびＣｌ−イオンのイオン濃度の変化は神経インパルスをトリガーすることができ、光活性化イオンチャネルおよびポンプ、例えばＣｈＲ−２（Ｎａ＋／Ｋ＋チャネル）およびＨＲ（Ｃｌ−ポンプ）を使用して神経細胞をそれぞれ脱分極および過分極することができることが、理論モデルを使用して示されている。網膜神経節細胞（ＲＧＣ）は、神経細胞膜に包埋された上皮Ｎａ＋チャネルのプロトン依存性類似体を含有する。その結果として、ＢＲなどのプロトンポンプはまた、網膜変性を有する患者に対して視力を回復するための光遺伝学的ツールとして考えられている。Ｌｉｌｌｅｙらは、プロトン誘導性網膜刺激の閾値（約ｐＨ６．５）を測定し、細胞外酸性化の急速なミリ秒パルスがＲＧＣの電気活動の正常パターンを誘起することを再現可能に実証した。Ｌｉｌｌｅｙ，Ｓ．；ＬｅＴｉｓｓｉｅｒ，Ｐ．；Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｊ．，Ｔｈｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｐｒｏｔｏｎ−Ｇａｔｅｄ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｉｎ  Ｒａｔ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｇａｎｇｌｉｏｎ  Ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００４，２４，１０１３−１０２２；Ｌｉｌｌｅｙ，Ｓ．；Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｊ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｐｒｏｔｏｎ−Ｇａｔｅｄ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｉｎ  Ｒａｔ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｇａｎｇｌｉｏｎ  Ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００１，５３１，８３Ｐ−８４Ｐを参照のこと。ＢＲ光サイクルの約１０ミリ秒の持続時間および局所的な酸性度を調節する能力により、ＢＲは、網膜のイオン媒介性刺激のための別の実行可能な候補となる。本発明は、光受容細胞における天然色素と同じ効率で機能する安定な生体適合性移植可能補綴物を作出することにより、この原理を利用する。
【０１０５】
本発明のＢＲ系網膜インプラントは、イオン媒介性光遺伝子治療と同じ原理のいくつかを用いるが、しかしながら、遺伝子療法アプローチの固有の欠点を克服する補綴物のいくつかの重要な利点がある。第１に、光遺伝子治療が主に標的とするＲＰＥ６５遺伝子変異は、世界中で約６，０００人に影響を及ぼすにすぎないのに対して、本発明は、様々な遺伝子変異により影響を受ける世界中の１５０万人のＲＰ集団を処置する可能性を有する。加えて、ＣｈＲ−２などの光遺伝学的ツールは、可視スペクトルの青色端（約４７０ｎｍ）にあるλｍａｘ値を有するが、ＢＲは、可視スペクトルの中心部の大部分に及ぶ５７０ｎｍにおいて広範なλｍａｘを有する。この特徴は、スペクトルのＵＶ領域に隣接するより短い波長に依拠する必要性も取り除きながら、より大きな感度を提供する。最後に、非天然ＣｈＲ−２およびＨＲタンパク質の発現レベルは限定的かつ不安定であり得るので、標的化された神経細胞を活性化するための危険な高強度光源が必要になる。多層タンパク質系網膜補綴物は、十分なイオン勾配を生成するために必要とする光強度がより低い数百のＢＲ層を使用することにより、この問題を回避する。
【０１０６】
Ｑ状態変異体を使用したピクセル媒介：光活性化タンパク質のプロトンポンプ機構を規定する光化学に加えて、ＢＲは、逐次的二光子プロセスを介して分枝光サイクルにアクセスすることができる。Ｑ状態は、（ＢＲ静止状態のオールトランスとは対照的に）９−シス網膜発色団（これは、タンパク質から加水分解され、周囲温度において数年間の程度で安定な単離された青方偏移光産物をもたらす）を含有する。Ｂｉｒｇｅ，Ｒ．Ｒ．；Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ，Ｎ．Ｂ．；Ｉｚａｇｕｉｒｒｅ，Ｅ．Ｗ．；Ｋｕｓｎｅｔｚｏｗ，Ａ．；Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ａ．Ｆ．；Ｓｉｎｇｈ，Ｄ．；Ｓｏｎｇ，Ｑ．Ｗ．；Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｅ．；Ｓｔｕａｒｔ，Ｊ．Ａ．；Ｓｅｅｔｈａｒａｍａｎ，Ｓら、Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ：Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｂａｓｅｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｖｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ  Ｍｅｍｏｒｉｅｓ．Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  １９９９，１０３，１０７４６−１０７６６を参照のこと。Ｑ状態は、前記タンパク質が光誘導性光サイクルを受けることを防止するが、これは、タンパク質系網膜インプラントのアクティブピクセルを非アクティブピクセルに変換する手段を提供する。この特徴は、インプラントのピクセル密度を調節し、特定の領域を非活性化して、外科移植の前または後のいずれかに光受容細胞への干渉を防止するために有利であり得る。天然野生型タンパク質はこの光産物に効率的にアクセスすることができず、Ｑ状態のより大きなアクセスおよび安定性を提供する様々なＢＲ変異体が同定されている。Ｂｉｒｇｅ，Ｒ．Ｒ．；Ｒａｎｇａｒａｊａｎ，Ｒ．；ＭｃＣｌｅａｒｙ，Ｋ．Ｎ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｒｈｏｄｏｐｓｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｕｓｅ  ｆｏｒ  ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍ  ｄａｔａ  ｓｔｏｒａｇｅ．米国特許第８８８３７１９号。本発明に記載される網膜インプラントは、タンパク質の野生型を使用して、またはＱ状態変異体を使用して同等に製造することができ、本明細書の本発明に記載される刺激の機能および方法は、このユニークな光化学に基づいて調節することができる。
【実施例】
【０１０７】
以下の実施例は、本発明の範囲内の実施形態をさらに説明および実証する。実施例は単に例示目的で示されており、本発明の限定として解釈されるべきではなく、本発明の精神および範囲から逸脱せずに、その多くの変形物が可能である。
【０１０８】
エクスビボ研究設計：競合技術よりも改善された分解能を実証するために、本発明のタンパク質系網膜インプラントの評価は、これらのインプラントの空間感度の定量に焦点を当てた。これらの競合技術、すなわち電極系網膜補綴物は、人工的な手段を利用して像を捕獲し、その光エネルギーを電気信号に変換し、変性網膜の残りの神経回路を刺激する。いくつかの電極系網膜インプラントが開発中であり、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｓｉｇｈｔ、Ｐｉｘｉｕｍ  ＶｉｓｉｏｎおよびＲｅｔｉｎａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔ  ＡＧにより、最も注目すべき技術が開発されている。電極アレイ、ハードウェアインターフェースおよび外科手術の製造の改善にもかかわらず、これらの網膜インプラントは固有の欠点を有する。最も重要なことに、正常な視覚知覚を促進する神経感覚ネットワークの時空間パターンの再現は、より高い視力に必要な電極の小サイズ要件により困難である。この問題は、電極アレイに関連する限定的な分解能により悪化し、その結果、視力の改善はわずかにすぎない。
【０１０９】
本発明のタンパク質系補綴物の重要な態様は高分解能視力を回復する能力であり、これは、電極系技術により極めて達成困難である。酸検知イオンチャネル（ＡＳＩＣ）を刺激するために本発明において使用されるプロトンの指向性勾配は、双極細胞および神経節細胞を刺激するためのユニークなアプローチを提供する。しかしながら、刺激機構は、電極との直接接触ではなく指向性イオン雲を介するものであるので、損傷神経ネットワークの活性化は複雑であり、タンパク質の分子パッキング、ＢＲの光サイクルの持続時間、網膜下空間における拡散速度、および側方拡散の程度を含む複数の要因に依拠する。本明細書では、本発明者らは、イオン媒介性網膜インプラントが、本来の視覚知覚に近い応答性を促進するために必要な空間感度および時間分解能を可能にすることを実証する。
【０１１０】
加えて、これらの実験により、これらのｐＨ媒介性網膜下インプラントの一時的活性化をモニタリングして、ＲＧＣ活性化のタイミングが天然非障害組織と同様の約１５０ミリ秒の程度であることを示す能力が実証された。本発明者らはまた、屋内環境光強度と同様の７．２ｍＷ／ｃｍ２未満の光強度で、２００層のタンパク質系網膜インプラントの相対活性化効率を測定した。また、多電極アレイ（ＭＥＡ）を使用した一連の細胞外記録実験の結果により、本発明のイオン媒介性刺激アプローチについての活性化の空間感度および潜時を定量した。これまでの実験では、タンパク質系網膜インプラントは、屋内環境光と同程度の光強度で網膜を刺激し得ることが実証されている。側方拡散がＲＧＣの隣接クラスタに影響を及ぼす程度を実験的に決定するために、狭い光線（約２００μｍのＦＷＨＭ直径）を使用して、ＭＥＡ内の個々の電極の周辺領域を選択的に活性化した。本発明者らの知見は、実験のために選択した電極間隔について、約２００μｍの上限を有する高い感度を実証している。選択した電極間隔およびアレイに応じて、さらなる感度を達成し得る。
【０１１１】
網膜インプラントの活性化効率および時間分解能の分析：Ｐ２３Ｈトランスジェニックラットを用いたエクスビボ細胞外記録実験を用いて、変性網膜の双極細胞および神経節細胞を刺激するイオン媒介性タンパク質系網膜補綴物の能力を実証した。細胞外記録実験により、１５０層または２００層のＢＲ系網膜インプラントは、Ｐ２３Ｈラット網膜の変性網膜を刺激し得ることが明らかになった。この調査では、常染色体優性ＲＰのヒト形態のモデルであるＰ２３Ｈ系統１ホモ接合ラットを使用した。使用したラットは８〜１２月齢の範囲であり、その時点において、光受容体の大部分（＞９８％）が喪失している。動物および組織調製のプロトコールは、Ｊｅｎｓｅｎ  ａｎｄ  Ｒｉｚｚｏに詳細に記載されている。Ｊｅｎｓｅｎ，Ｒ．Ｊ．；Ｒｉｚｚｏ  ＩＩＩ，Ｊ．Ｆ．，Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｇａｂａ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｇｏｎｉｓｔｓ  ｏｎ  Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｓ  ｏｆ  Ｐ２３Ｈ  Ｒａｔ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｇａｎｇｌｉｏｎ  Ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｅｔｉｎａ．Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ  Ｅｎｇ．２０１１，８，１−８を参照のこと。網膜の除去後、網膜インプラントを網膜下構成に配置し、プロトンポンピングの指向性が双極細胞に向かうかまたは双極細胞から離れるように配向した。パルスＬＥＤ光の吸収後、網膜インプラントにより惹起される活動電位について、ＲＧＣをモニタリングする。これらの研究の間、単一の記録電極を使用し、複数のＰ２３Ｈラット由来の多数の神経節細胞をモニタリングして、網膜インプラントのアーキテクチャおよび時間分解能の有効性を試験した。
【０１１２】
タンパク質系網膜インプラントを刺激し、残りの光受容細胞が入射光の吸収に関与していないことを実証するために、パルスＬＥＤ装置を使用し、屋内環境光（７．２ｍＷ／ｃｍ２）から正午の屋外日光（１００ｍＷ／ｃｍ２）までをシミュレートする範囲のパルスエネルギーを使用して、３つの波長（緑色（５３０ｎｍ）、琥珀色（５９０ｎｍ）または赤色（６３０ｎｍ））で光エネルギーの正確なパルスを生成した（図３）。このパルスＬＥＤ装置は、網膜インプラントの選択的刺激のための神経モニタリング電気生理学機器とインターフェースをとった。生成された信号がインプラントからのものであり、残りの光受容細胞からのものではないことを確実にするために、高強度緑色光で網膜を３分間ブリーチした。この工程はまた、インプラント内でＢＲを明順応するという利点を有しており、光吸収後のプロトンポンプの効率を改善した。次に、ラット緑色錐体色素との低いカップリング効率（０．００４、図３）と比較して、ＢＲとの高いカップリング効率（０．１７３、図３）を有する赤色光でインプラントをパルスした。ブリーチプロセス、および赤色光と残りのラット緑色錐体色素とのあまり有効ではないカップリングは、赤色光を使用して生成された信号が網膜インプラントに関連することを確実にするために役立つ。
【０１１３】
これらの結果は、残りの双極細胞の細胞外ドメインを取り囲むｐＨを調節することにより、網膜インプラントがＲＧＣを再現可能に刺激し得ることを示している。この分析では、適切な閾値（３０μＶ）を選択して、光誘導性活動電位と、調査中の変性網膜に固有のバックグラウンドノイズとを区別することが必要であった。これらの神経細胞上のＡＳＩＣの活性化により、環境中の［Ｈ＋］の増加により生成されるポジティブな応答を促進し、視覚を誘導する可能性を有するシグナル伝達カスケードを引き起こした。図４は、赤色光（６３０ｎｍ）励起を用いたこれらの実験から収集したデータのレビューを示しており、ここでは、プロトンがＰ２３Ｈラットの変性網膜組織に向けてポンピングされるかまたはそこから離れてポンピングされるように、様々な多層密度を有するインプラントを配置した。図４Ａは、高ＯＤ（１５０層）インプラントでは、光強度の増加により高い活性化効率が達成されるのに対して、低ＯＤ（１００層）インプラントでは効率が半減することを示す。この結果は、十分な数の層が再現可能な活性化に必要であることをさらに正当化している。この最小値は、一般に、約１５０〜２００層である。利用した層の最小数と、達成される再現可能な活性化との間にバランスが存在することを認識すべきである。（インプラントの配向を逆にすることにより）［Ｈ＋］を減少させた対照実験では、神経回路の活性化はほとんどまたは全く生成されなかった（図４Ｂ）。この結果は、本研究において調査した高ＯＤサンプルおよび低ＯＤサンプルの両方で明らかである。
【０１１４】
また、これらの単一記録実験において得られたデータを使用して、網膜インプラントの時間分解能の定量的特性を得た。ＢＲ光サイクルの約１０ミリ秒の持続時間および局所的な酸性度を調節する能力により、ＢＲ系薄膜は、イオン媒介性網膜インプラントの優れた候補となる。以前に、Ｌｉｌｌｅｙらは、約ｐＨ６．５でプロトン誘導性網膜刺激の閾値を測定し、ミリ秒時間スケールで酸性刺激をパルスする際の再現可能な活動電位の制御を実証した。Ｌｉｌｌｅｙ，Ｓ．；ＬｅＴｉｓｓｉｅｒ，Ｐ．；Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｊ．，Ｔｈｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｐｒｏｔｏｎ−Ｇａｔｅｄ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｉｎ  Ｒａｔ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｇａｎｇｌｉｏｎ  Ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００４，２４，１０１３−１０２２；およびＬｉｌｌｅｙ，Ｓ．；Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｊ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｐｒｏｔｏｎ−Ｇａｔｅｄ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｉｎ  Ｒａｔ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｇａｎｇｌｉｏｎ  Ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００１，５３１，８３Ｐ−８４Ｐを参照のこと。しかしながら、これまで、ＡＳＩＣを活性化する時間経過は不明であり、網膜インプラントにより生成されるｐＨ勾配は、光強度および入射光パルスの持続時間に大きく依存する。換言すれば、タンパク質層内に含まれるＢＲは、複数の光サイクルを受けて、十分なＨ＋イオンを双極細胞環境の周囲に構築することが必要である可能性がある。これらの実験を行って、視力の促進に関連する時間スケールでＲＧＣ活性化が起こることを示した。
【０１１５】
図５は、光活性化後の時間の関数として、観察された活動電位を示す一連のヒストグラムを示す。６３０ｎｍ光源からの各１ミリ秒光パルスの後、観察数を１００回の測定（または掃引）ごとに平均化し、多くのラットおよび神経節細胞をモニタリングしてデータを平均化した。図５Ａ、５Ｃおよび５Ｅのトレースは、網膜下配置を使用して双極細胞に向けてプロトンをポンピングする方向で網膜インプラントを配向した際のデータを要約したものである。ヒストグラムは、光強度の増加と共に活性化が増加することを示しているが（左パネル、上から下）、これは、以前に報告されている活性化効率と同様である。各測定光強度の活性化の平均潜時は約１５０ミリ秒であるが、これは、天然機能性網膜による時間分解能のオーダーである。プロトンが網膜組織から離れてポンピングされるように、インプラントを逆配向に配置した場合（図５Ｂ、５Ｄおよび５Ｆ）、プロットしたすべてのヒストグラムに存在するバックグラウンドノイズを超える明らかな活性化は観察されない。これらの結果は、達成されたＲＧＣ活性化のタイミングが典型的な視覚知覚を支援し得ることを実証している。
【０１１６】
多電極アレイ（ＭＥＡ）を使用したタンパク質系網膜インプラントの閾値化および活性化効率：全視野照明（ｆｕｌｌ  ｆｉｅｌｄ  ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）を使用して一連の実験を実施して、網膜インプラントの活性化効率を試験し、６４個の電極の同時モニタリングを可能にする多電極アレイ（ＭＥＡ）（３０μｍの電極直径、２００μｍの間隔、８×８長方形格子）を単一電極デバイスに代えて使用した（図６Ａを参照のこと）。切除網膜／インプラント／ＭＥＡアセンブリの真上の顕微鏡対物レンズを光線が通過するように、これらの実験において使用した光源を改変した。一連の干渉フィルタおよび減光フィルタを用いて、それぞれ入射波長および光強度を調節する光源プロジェクターにより、全視野照明を提供した。また、絞り開口部を使用してビームスポットサイズを調節したが、しかしながら、この分析では、電極アレイ全体を照射した。図７は、ラット緑色錐体色素のスペクトルおよびＢＲのスペクトルとの緑色および赤色干渉フィルタのカップリング効率を実証する。パルス赤色光を使用して、変性網膜内のあらゆる残りの緑色錐体（図７Ａ；カップリング効率＝０．００４１）のＢＲ（図７Ｂ；カップリング効率＝０．２３３７）を選択的に活性化する。その結果として、ＭＥＡにより測定されたあらゆる活性化はおそらく、ＢＲ系インプラントにより生成されたイオン勾配を介して誘導された。
【０１１７】
上記実験のように、Ｐ２３Ｈラット網膜を切除した。以前の実験では、エクスビボ細胞外記録を使用して、１５０層〜２００層のタンパク質系網膜インプラントの配向の性能効率が確認されている。パルス赤色光（１００ミリ秒パルス、６４０ｎｍ）を使用して、電極アレイ内の電極の全視野を活性化した。
【０１１８】
多電極アレイ（ＭＥＡ）を使用した網膜インプラントの空間分解能の決定：
全視野刺激に使用したビームスポットを減少させて、電極アレイ内の単一電極のみを活性化することにより、本発明の網膜インプラントの空間感度を決定した（図６Ａを参照のこと）。絞り開口部および顕微鏡対物レンズを使用して入射ビームを限局して、この減少を実施した。また、ｘ、ｙ、ｚ、θマウントを使用して、高い選択性を有するビームスポットを配置した。使用した電極直径は３０μｍであり、各電極間の間隔は２００μｍであったので、照射しなかった電極は活動の変化を示さないと予想して、直径２００μｍの光線で個々の電極を標的化し、電極アレイ全体を同時にモニタリングした。次いで、応答性および分解能をさらに実証するために、ビームを隣接電極間で移動させた。
【０１１９】
図８に示されている結果は、ＭＥＡ内の３つの電極の連続するセットに関するものである。これらの測定期間を通じて、８×８ＭＥＡの列Ｅに沿って照射した電極を並進させた。赤色ＬＥＤのスポットサイズは、約２００ｕｍの直径および半波高全幅値（ＦＷＨＭ）（これは、電極間の分離距離に相当する）を有していた。照射の位置は、図の各パネルの下のプロットに表されている。各パネルの上のプロットは、ＭＥＡ内の各電極の相対活性化率（信号／秒）を示す。図８Ａは、電極Ｅ３のみを照射すると、高い相対信号率により占められた１つのスポットにＲＧＣ活性化が限局したことを実証する。いくらかの活動は、電極Ｅ３に隣接して、および電極Ｅ３からかなり離れて観察されたが、しかしながら、この活動はおそらく、収集期間中の網膜内の自発活動によるものであった。ビームスポットを電極Ｅ４およびＥ５に並進させると（それぞれ図８Ｂおよび８Ｃ）、結果が再現され、目的の電極は最高の活性化率を測定し、他の場所では信号がほとんどまたは全く観察されなかった。
【０１２０】
図８は、各パネルにおける正規化信号により表される最大信号率を示す。電極Ｅ３、Ｅ４およびＥ５は、それぞれ１２．０６／秒、９．６２／秒および３．１７／秒の信号率を測定した。照射した電極の最大信号率（信号／秒）に対して、各プロットを正規化した。観察された最大の率は、各パネルにおいて観察された最大ノイズと直接相関せず、これらの率はＲＧＣの相対効率とも相関しない。
【０１２１】
図６Ｂは、正規化持続時間（１１０．２秒）を通じた活動電位のプロットからの空間感度効果をさらに実証しており、８電極列アレイにおける電極Ｅ５（列Ｅ）を狭い光線（約２００μｍの直径）で標的化して、この電極と接触したＲＧＣを選択的に活性化した。神経節細胞から測定した光活性化活動電位は、この１つの電極に限局していることが示され、隣接電極では、活動がほとんどまたは全く観察されなかった。単一電極と接触した標的化されたニューロンのみが光応答を示したので、ＲＧＣ収集領域は直径２００μｍの上限を有すると推定され得る。これらの結果は、生成されたイオン勾配が網膜インプラントの照射領域に限局していたことを裏付けている。装置内の電極の最小間隔に対応する２００μｍの直径で、感度の最大面積を測定した。また、これらの結果により、網膜インプラントの界面では側方拡散が起こること、および双極細胞が最小限に抑えられて光活性化中に周囲神経組織に影響を与えないこと、およびインプラントが回折限界に近い分解能をもたらし得ることが確認された。
【０１２２】
これらの結果は、本発明のタンパク質系網膜インプラントが、電極系網膜インプラントと対比して増加した空間分解能を達成することができることを実証している。
【０１２３】
網膜細胞の刺激
方法：多層静電吸着を使用して、イオン透過性膜と、ＢＲおよびポリカチオン結合剤の交互層とから構成される網膜インプラント構築物を製造した。光の吸収により、ＢＲ層は一方向プロトン勾配を生成し、これが双極細胞および神経節細胞の外膜に存在するＡＳＩＣを活性化する。Ｐ２３Ｈトランスジェニックラットの切除網膜に対して網膜下位置に網膜インプラントを配置し、パルスＬＥＤシステムを使用して、ＢＲを選択的に活性化する波長で正確なパルスを生成した。単一電極および多電極アレイの両方を使用した細胞外記録を行って、イオン媒介性作用機構を検証し、網膜補綴物の空間感度を調査した。
【０１２４】
本明細書で有用な網膜インプラントおよびバクテリオロドプシン変異体は、２０１３年１０月２２日に発行されたＢｉｒｇｅらの米国特許第８，５６３，０２６号および２０１４年１１月１１日に発行されたＢｉｒｇｅらの米国特許第８，８８３，７１９号（これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）にさらに記載されている。
【０１２５】
結果：切除Ｐ２３Ｈラット網膜の網膜神経節細胞の細胞外記録を使用した研究は、指向性プロトン勾配を介して、本発明の網膜下インプラントが網膜組織を刺激することができることを示している。前記タンパク質系補綴物の活性化効率は、入射赤色光（約６４０ｎｍ）の強度の増加と共に増加する。実験は、屋内環境光と同程度の光強度（約７．２ｍＷ／ｃｍ２）を使用して、インプラントが網膜を刺激することができることを示唆しており、補綴物の時間分解能が活性化の生理的潜時（約１５０ミリ秒）と同様であることも実証している。また、多電極アレイを使用して、活性化を２００μｍのピクセル直径に集中させることができることを示す。これらの結果は、ＢＲ系網膜インプラントがＰ２３Ｈ網膜の残りの神経回路を刺激することができることを示しており、ＡＭＤおよびＲＰの処置における潜在的な有効性を実証している。
【０１２６】
参照による組み込み
訂正証明書、特許出願書類、科学論文、政府報告書、ウェブサイト、および本明細書で言及される他の参考文献を含む各特許文献の全開示は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。用語が矛盾する場合、本明細書が優先する。
【０１２７】
均等物
本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱せずに、他の特定の形態で具現化され得る。前述の実施形態は、本明細書に記載される本発明を限定するものではなく、すべての点において例示的であるとみなされるべきである。含むという用語が使用される本発明の様々な実施形態では、実施形態は、記載されている工程または構成要素から本質的になるまたはそれらからなることも企図される。さらに、本発明が依然として作動可能である限り、工程の順序または特定の行動の実施順序は重要ではない。また、２つまたはそれを超える工程または行動が同時に行われ得る。
【０１２８】
本明細書では、文脈上特に明確な指示がない限り、単数形は複数形も含む。特に定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書が優先する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【国際調査報告】
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