(57)【要約】  非ペプチド性重合体の一末端に、グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドと結合可能な作用基が導入され、他の一末端に、クリック反応可能な作用基が導入された化合物；生理活性ポリペプチドが、該化合物の一末端に結合されたポリペプチド連結体；生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンＦｃ領域が、該化合物をリンカーにして、両末端に結合された生理活性ポリペプチド結合体；及びそれらの製造方法を提供する。
2020508366.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１の化合物、その立体異性体、溶媒化物、及び薬剤学的に許容可能な塩のうちから選択された化合物：
【化１】
2020508366.tif 000077
前記化学式１で、
Ｒ１は、２，５−ジオキソピロリジニル、２，５−ジオキソピロリル、アルデヒド、マレイミド、Ｃ６−Ｃ２０アリールジスルフィド、Ｃ５−Ｃ２０ヘテロアリールジスルフィド、ビニルスルホン、チオール、ハロゲン化アセトアミド、スクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、及びそれらの誘導体からなる群のうちから選択される作用基を含む脂肪族炭化水素基であり、
該非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（polylactic acid）、ＰＬＧＡ（polylactic−glycolic acid）、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸及び多糖類によって構成された群のうちから選択され、
Ｘは、−（ＣＨ２）ｊＮＨＣＯ−または−（ＣＨ２）ｊＮＨＣＳ−であり、ここで、ｊは、０ないし６の整数であり、
Ｒ２は、−（Ｒ３）ｋ−（Ｚ）ｌ−（Ｒ４）ｍ−（ＣＺ）ｐ−Ｙであり、
ここで、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、Ｃ１−Ｃ６アルキレン、Ｃ６−Ｃ２０アリーレン、または１個ないし３個のＮ、Ｏ及びＳのうちから選択されたヘテロ原子を有するＣ５−Ｃ２０ヘテロアリーレンであり、
Ｚは、ＯまたはＳであり、
Ｙは、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、シクロアルキニル、ビシクロアルキニル、アリールシクロアルキニル、ジアリールシクロアルキニル、ヘテロシクロアルキニルまたはジアリールヘテロシクロアルキニルであり（ここで、それぞれのシクロアルキニルは、３個ないし８個の炭素原子を有し、それぞれのアリールは、５個ないし８個の炭素原子を有し、それぞれのヘテロシクロアルキニルは、３個ないし８個の原子を含み、環原子のうち１個ないし３個に、Ｎ、Ｏ及びＳのうちから選択されたヘテロ原子を有する飽和環である）、
ｋ、ｌ、ｍ及びｐは、それぞれ独立して、０ないし３の整数であり、いずれも同時に０ではなく、
前述のアルキニル、シクロアルキニル、ビシクロアルキニル、アリールシクロアルキニル、ジアリールシクロアルキニル、ヘテロシクロアルキニルまたはジアリールヘテロシクロアルキニルは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル、オキソまたはハロゲンで置換もしくは非置換のものでもある。
【請求項２】
前記Ｒ１は、アルデヒド基を含むＣ１−Ｃ６脂肪族炭化水素基であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記Ｙは、ＢＣＮ（bicyclo［６．１．０］nonyne）、ＤＢＣＯ（dibenzocyclooctyne）、ＤＩＦＯ（difluorinated cyclooctyne）、ＤＩＦＯ２、ＤＩＦＯ３、ＤＩＢＯ（dibenzoannulated cyclooctyne）、ＢＡＲＡＣ（biarylazacyclooctynone）、ＯＣＴ（cyclooctyne）、ＡＬＯ（aryl−less cyclooctyne）、ＭＯＦＯ（monofluorinated cyclooctyne）、ＤＩＭＡＣ（dimethoxyazacyclooctyne）、ＴＭＤＩＢＯ（２，３，６，７−tetramethoxy−ＤＩＢＯ）、ＣＯＭＢＯ（carboxymethylmonobenzocyclooctyne）、ＰＹＲＲＯＣ（pyrrolocyclooctyne）、ＤＩＢＡＣ（dibenzo−aza−cyclooctyne）、ＴＭＴＨ（３，３，６，６−tetramethylthiacycloheptyne）、Sondheimerジイン及びＳ−ＤＩＢＯ（sulfonylated ＤＩＢＯ）によって構成された群のうちから選択されることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
前記化学式１は、下記化学式１ａであることを特徴とする請求項１に記載の化合物：
【化１ａ】
2020508366.tif 000078
前記化学式１ａで、
ｎは、２０ないし１，０００の整数であり、
ｊは、０ないし６の整数であり、
Ｒ１は、２，５−ジオキソピロリジニル、２，５−ジオキソピロリル、アルデヒド、マレイミド、Ｃ６−Ｃ２０アリールジスルフィド、Ｃ５−Ｃ２０ヘテロアリールジスルフィド、ビニルスルホン、チオール、ハロゲン化アセトアミド、スクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、及びそれらの誘導体からなる群のうちから選択される作用基を含む脂肪族炭化水素基であり、
Ｒ２は、−（Ｒ３）ｋ−（Ｚ）ｌ−（Ｒ４）ｍ−（ＣＺ）ｐ−Ｙであり、
ここで、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、Ｃ１−Ｃ６アルキレン、Ｃ６−Ｃ２０アリーレン、または１個ないし３個のＮ、Ｏ及びＳのうちから選択されたヘテロ原子を有するＣ５−Ｃ２０ヘテロアリーレンであり、
Ｚは、ＯまたはＳであり、
Ｙは、ＢＣＮ（bicyclo［６．１．０］nonyne）、ＤＢＣＯ（dibenzocyclooctyne）、ＤＩＦＯ（difluorinated cyclooctyne）、ＤＩＦＯ２、ＤＩＦＯ３、ＤＩＢＯ（dibenzoannulated cyclooctyne）、ＢＡＲＡＣ（biarylazacyclooctynone）、ＯＣＴ（cyclooctyne）、ＡＬＯ（aryl−less cyclooctyne）、ＭＯＦＯ（monofluorinated cyclooctyne）、ＤＩＭＡＣ（dimethoxyazacyclooctyne）、ＴＭＤＩＢＯ（２，３，６，７−tetramethoxy−ＤＩＢＯ）、ＣＯＭＢＯ（carboxymethylmonobenzocyclooctyne）、ＰＹＲＲＯＣ（pyrrolocyclooctyne）、ＤＩＢＡＣ（dibenzo−aza−cyclooctyne）、ＴＭＴＨ（３，３，６，６−tetramethylthiacycloheptyne）、Sondheimerジイン及びＳ−ＤＩＢＯ（sulfonylated ＤＩＢＯ）によって構成された群のうちから選択され、
ｋ、ｌ、ｍ及びｐは、それぞれ独立して、０ないし３の整数であり、いずれも同時に０ではない。
【請求項５】
前記化学式１ａは、下記の化学式２ａないし２ｎのうちいずれか一つであることを特徴とする請求項４に記載の化合物：
【化２ａ】
2020508366.tif 000079
【化２ｂ】
2020508366.tif 000080
【化２ｃ】
2020508366.tif 000081
【化２ｄ】
2020508366.tif 000082
【化２ｅ】
2020508366.tif 000083
【化２ｆ】
2020508366.tif 000084
【化２ｇ】
2020508366.tif 000085
【化２ｈ】
2020508366.tif 000086
【化２ｉ】
2020508366.tif 000087
【化２ｊ】
2020508366.tif 000088
【化２ｋ】
2020508366.tif 000089
【化２ｌ】
2020508366.tif 000090
【化２ｍ】
2020508366.tif 000091
【化２ｎ】
2020508366.tif 000092
前述の化学式２ａないし２ｎで、
ｎは、２０ないし１，０００の整数であり、
ｊは、０ないし６の整数であり、
Ｒ１は、アルデヒド基を含むＣ１−Ｃ６脂肪族炭化水素基である。
【請求項６】
非ペプチド性重合体の一末端に、アミノ基（−ＮＨ２）を導入した後、前記アミノ基とのアミド結合により、非ペプチド性重合体の一末端に、Ｒ２を導入する工程であり、前記Ｒ２は、請求項１で定義されたものである、工程と、
前記Ｒ２が導入された非ペプチド性重合体の他の一末端に、２，５−ジオキソピロリジニル、２，５−ジオキソピロリル、アルデヒド、マレイミド、Ｃ６−Ｃ２０アリールジスルフィド、Ｃ５−Ｃ２０ヘテロアリールジスルフィド、ビニルスルホン、チオール、ハロゲン化アセトアミド、スクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、及びそれらの誘導体からなる群のうちから選択される作用基を含む脂肪族炭化水素基を導入する工程と、
を含む、請求項１ないし５のうちいずれか１項に記載の化合物の製造方法。
【請求項７】
請求項１ないし５のうちいずれか１項に記載の化合物に作用基Ｙを介して、生理活性ポリペプチドが結合されたものである生理活性ポリペプチド連結体。
【請求項８】
生理活性ポリペプチドにアジド基が導入された後、前記アジド基と、化学式１の化合物の作用基Ｙのエチニレン基（−Ｃ≡Ｃ−）とが互いにクリック反応による環付加反応により、１，２，３−トリアゾールを形成することによって結合されたことを特徴とする請求項７に記載の生理活性ポリペプチド連結体。
【請求項９】
前記生理活性ポリペプチド連結体が、下記の化学式３ａないし３ｌのうちいずれか１つの構造式を有することを特徴とする請求項７に記載の生理活性ポリペプチド連結体：
【化３ａ】
2020508366.tif 000093
【化３ｂ】
2020508366.tif 000094
【化３ｃ】
2020508366.tif 000095
【化３ｄ】
2020508366.tif 000096
【化３ｅ】
2020508366.tif 000097
【化３ｆ】
2020508366.tif 000098
【化３ｇ】
2020508366.tif 000099
【化３ｈ】
2020508366.tif 000100
【化３ｉ】
2020508366.tif 000101
【化３ｊ】
2020508366.tif 000102
【化３ｋ】
2020508366.tif 000103
【化３ｌ】
2020508366.tif 000104
前述の化学式３ａないし３ｌで、
ｎは、２０ないし１，０００の整数であり、
ｊは、０ないし６の整数であり、
Ｒ１は、２，５−ジオキソピロリジニル、２，５−ジオキソピロリル、アルデヒド、マレイミド、Ｃ６−Ｃ２０アリールジスルフィド、Ｃ５−Ｃ２０ヘテロアリールジスルフィド、ビニルスルホン、チオール、ハロゲン化アセトアミド、スクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、及びそれらの誘導体からなる群のうちから選択される作用基を含む脂肪族炭化水素基であり、
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、Ｃ１−Ｃ６アルキレン、Ｃ６−Ｃ２０アリーレン、または１個ないし３個のＮ、Ｏ及びＳのうちから選択されたヘテロ原子を有するＣ５−Ｃ２０ヘテロアリーレンであり、
Ｚは、ＯまたはＳであり、
ｋ、ｌ、ｍ及びｐは、それぞれ独立して、０ないし３の整数であり、いずれも同時に０ではなく、
［アミノ酸］は、天然状態の前記生理活性ポリペプチド配列を構成するアミノ酸のうちいずれか一つであるか、あるいはそれに属さない追加または置換されたアミノ酸である。
【請求項１０】
前記［アミノ酸］は、前記生理活性ポリペプチドの天然配列のリシン残基からイプシロン−アミノ基を除いた部分であり、前述の化学式３ａないし３ｌのトリアゾール窒素は、前記リシン側鎖のイプシロン炭素に連結されていることを特徴とする請求項９に記載の生理活性ポリペプチド連結体。
【請求項１１】
前記生理活性ポリペプチド連結体は、下記の化学式４ａないし化学式４ｎのうちいずれか１つの構造式を有することを特徴とする請求項７に記載の生理活性ポリペプチド連結体：
【化４ａ】
2020508366.tif 000105
【化４ｂ】
2020508366.tif 000106
【化４ｃ】
2020508366.tif 000107
【化４ｄ】
2020508366.tif 000108
【化４ｅ】
2020508366.tif 000109
【化４ｆ】
2020508366.tif 000110
【化４ｇ】
2020508366.tif 000111
【化４ｈ】
2020508366.tif 000112
【化４ｉ】
2020508366.tif 000113
【化４ｊ】
2020508366.tif 000114
【化４ｋ】
2020508366.tif 000115
【化４ｌ】
2020508366.tif 000116
【化４ｍ】
2020508366.tif 000117
【化４ｎ】
2020508366.tif 000118
前述の化学式４ａないし４ｎで、
ｎは、２０ないし１，０００の整数であり、
ｊは、０ないし６の整数であり、
Ｒ１は、アルデヒド基を含むＣ１−Ｃ６脂肪族炭化水素基であり、
［アミノ酸］は、天然状態の前記生理活性ポリペプチド配列を構成するアミノ酸のうちいずれか一つであるか、あるいはそれに属さない追加または置換されたアミノ酸である。
【請求項１２】
前記［アミノ酸］は、前記生理活性ポリペプチドの天然配列のリシン残基からイプシロン−アミノ基を除いた部分であり、前述の化学式４ａないし４ｎのトリアゾール窒素は、前記リシン側鎖のイプシロン炭素に連結されていることを特徴とする請求項１１に記載の生理活性ポリペプチド連結体。
【請求項１３】
前記生理活性ポリペプチドが、ホルモン、サトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、インシュリン分泌ペプチド、ニューロペプチド、脳下垂体ホルモン、抗肥満ペプチド、抗ウイルスペプチド、生理活性を有する非天然型ペプチド誘導体、構造蛋白質、リガンド蛋白質、及び受容体からなる群のうちから選択されることを特徴とする請求項７に記載の生理活性ポリペプチド連結体。
【請求項１４】
前記生理活性ポリペプチドが、グルカゴン、ＧＩＰ（gastric inhibitory polypeptide）、キセニン（Xenin）、インシュリン、ＣＣＫ（cholecystokinin）、アミリン（amylin）、ガストリン（gastrin）、グレリン（ghrelin）、胃や腸で血糖及び体重を調節するインクレチン類（incretins）、脂肪（adipose）から分泌されるアジポキン類（adipokines）、脳分泌ニューロペプチド類（neuropeptides）、筋肉分泌ペプチドあるいは蛋白質類、血管作用腸ペプチド（vasoactive intestinal peptide）、ナトリウム利尿ペプチド（natriuretic peptide）、ソマトスタチン、ＮＰＹ（neuropeptide Ｙ）、ＧＬＰ−１（glucagon−like peptide−１）、ＧＬＰ−２（glucagon−like peptide−２）、エキセンジン−４（exendin−４）、オキシントモジュリン（Oxyntomodulin）、線維芽細胞成長因子（fibroblast growth factor）、アンジオテンシン、ブレジキニン、カルシトニン、副腎皮質刺激ホルモン（corticotropin）、エレドイシン（eledoisin）、オキシトシン（oxytocin）、バソプレッシン（vasopressin）、黄体形成ホルモン、黄体刺激ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、濾胞刺激ホルモン、副甲状線ホルモン、セクレチン（secretin）、セルモレリン（sermorelin）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、成長ホルモン放出ペプチド、コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）類、インターフェロン（ＩＦＮ）類、インターフェロン受容体、インターロイキン（interleukin）類、インターロイキン受容体、インターロイキン結合蛋白質、プロラクチン放出ペプチド、オレキシン（orexin）、甲状腺放出ペプチド、コレシストキニン（cholecystokinin）、ガストリン抑制ペプチド、カルモジュリン、ガストリン遊離ペプチド（gastric releasing peptide）、モチリン（motilin）、血管活性腸管ペプチド（vasoactive intestinal peptide）、心房ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ：atrial natriuretic peptide）、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ：Ｂ−type natriuretic peptide）、Ｃ−型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ：Ｃ−type natriuretic peptide）、ニューロキニン（neurokinin）Ａ、ニューロメジン（neuromedin）、レニン（renin）、エンドセリン（endothelin）、サラホトキシンペプチド（sarafotoxin peptide）、カルソモルフィンペプチド（carsomorphin peptide）、デルモルフィン（dermorphin）、ダイノルフィン（dynorphin）、エンドルフィン（endorphin）、エンケファリン（enkepalin）、腫瘍懐死因子、腫瘍懐死因子受容体、ウロキナーゼ受容体、腫瘍抑制因子、コルラゲナーゼ抑制剤、チモポイエチン（thymopoietin）、チムリン（thymulin）、チモペンチン（thymopentin）、チモシン（tymosin）、胸腺体液性因子（thymichumoral factor）、アドレノモジュリン（adrenomodullin）、アラトスタチン（allatostatin）、アミロイドベータ−プロテイン断片（amyloid beta−protein fragment）、抗菌性ペプチド、抗酸化剤ペプチド、ボンベシン（bombesin）、オステオカルシン（osteocalcin）、ＣＡＲＴペプチド、Ｅ−セレクチン（Ｅ−selectin）、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ロイコカイン（leucokine）、クリングル−５（kringle−５）、ラミニン（laminin）、インヒビン（inhibin）、ガラニン（galanin）、ピブロネクチン（fibronectin）、パンクレアスタチン（pancreastatin）、フゼオン（Fuzeon）、グルカコン−類似ペプチド、オキシントモジュリン、Ｇプロテイン関連受容体（Ｇ protein−coupled receptor）、酵素類、サトカイン結合蛋白質、マクロファージ活性因子���マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、蛋白質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞懐死糖蛋白質、免疫毒素、リンパ毒素、転移成長因子、アルファ−１アンチトリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン、アポリポ蛋白質−Ｅ、赤血球生成因子、高糖鎖化赤血球生成因子、アンジオポエチン類、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン、血液因子ＶＩＩ，ＶＩＩａ，ＶＩＩＩ，ＩＸ及びＸＩＩＩ、プラスミノーゲン活性因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、蛋白質Ｃ、Ｃ−反応性蛋白質、レニン抑制剤、スーパーオキサイドジスムターゼ、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンジオスタチン、骨形成成長因子、骨形成促進蛋白質、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路抑制剤、神経成長因子、リラクシン、ソマトメジン、インシュリン類似成長因子、副腎皮質ホルモン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、細胞表面抗原、ウイルス由来ワクチン抗原、単一クローン抗体、多重クローン抗体及び抗体断片、赤血球増殖因子、白血球増殖因子、及びそれらの類似体（analogs）からなる群のうちから選択されることを特徴とする請求項７に記載の生理活性ポリペプチド連結体。
【請求項１５】
請求項１ないし５のうちいずれか１項に記載の化合物をリンカーにし、生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンＦｃ領域が結合された生理活性ポリペプチド結合体。
【請求項１６】
生理活性ポリペプチドにアジド基が導入された後、前記アジド基と、化学式１の化合物の作用基Ｙのエチニレン基とがクリック反応による環付加反応により、１，２，３−トリアゾールを形成することによって結合され、前記免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ酸が、化学式１の化合物のＲ１と共有結合によって結合されたことを特徴とする請求項１５に記載の生理活性ポリペプチド結合体。
【請求項１７】
前記生理活性ポリペプチド結合体は、下記の化学式５ａないし５ｌのうちいずれか１つの構造式を有することを特徴とする請求項１５に記載の生理活性ポリペプチド結合体：
【化５ａ】
2020508366.tif 000119
【化５ｂ】
2020508366.tif 000120
【化５ｃ】
2020508366.tif 000121
【化５ｄ】
2020508366.tif 000122
【化５ｅ】
2020508366.tif 000123
【化５ｆ】
2020508366.tif 000124
【化５ｇ】
2020508366.tif 000125
【化５ｈ】
2020508366.tif 000126
【化５ｉ】
2020508366.tif 000127
【化５ｊ】
2020508366.tif 000128
【化５ｋ】
2020508366.tif 000129
【化５ｌ】
2020508366.tif 000130
前述の化学式５ａないし５ｌで、
ｎは、２０ないし１，０００の整数であり、
ｊは、０ないし６の整数であり、
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、Ｃ１−Ｃ６アルキレン、Ｃ６−Ｃ２０アリーレン、または１個ないし３個のＮ、Ｏ及びＳのうちから選択されたヘテロ原子を有するＣ５−Ｃ２０ヘテロアリーレンであり、
Ｚは、ＯまたはＳであり、
ｋ、ｌ、ｍ及びｐは、それぞれ独立して、０ないし３の整数であり、いずれも同時に０ではなく、
［アミノ酸］は、天然状態の前記生理活性ポリペプチド配列を構成するアミノ酸のうちいずれか一つであるか、あるいはそれに属さない追加または置換されたアミノ酸であり、
ｑは、１ないし６の整数である。
【請求項１８】
前記［アミノ酸］は、前記生理活性ポリペプチドの天然配列のリシン残基からイプシロン−アミノ基を除いた部分であり、前述の化学式５ａないし５ｌのトリアゾール窒素は、前記リシン側鎖のイプシロン炭素に連結されていることを特徴とする請求項１７に記載の生理活性ポリペプチド結合体。
【請求項１９】
前記生理活性ポリペプチド結合体は、下記の化学式６ａないし６ｎのうちいずれか１つの構造式を有する構造を有することを特徴とする請求項１５に記載の生理活性ポリペプチド結合体：
【化６ａ】
2020508366.tif 000131
【化６ｂ】
2020508366.tif 000132
【化６ｃ】
2020508366.tif 000133
【化６ｄ】
2020508366.tif 000134
【化６ｅ】
2020508366.tif 000135
【化６ｆ】
2020508366.tif 000136
【化６ｇ】
2020508366.tif 000137
【化６ｈ】
2020508366.tif 000138
【化６ｉ】
2020508366.tif 000139
【化６ｊ】
2020508366.tif 000140
【化６ｋ】
2020508366.tif 000141
【化６ｌ】
2020508366.tif 000142
【化６ｍ】
2020508366.tif 000143
【化６ｎ】
2020508366.tif 000144
前述の化学式６ａないし６ｎで、
ｎは、２０ないし１，０００の整数であり、
ｊは、０ないし６の整数であり、
［アミノ酸］は、天然状態の前記生理活性ポリペプチド配列を構成するアミノ酸のうちいずれか一つであるか、あるいはそれに属さない追加または置換されたアミノ酸であり、
ｑは、１ないし６の整数である。
【請求項２０】
前記［アミノ酸］は、前記生理活性ポリペプチドの天然配列のリシン残基からイプシロン−アミノ基を除いた部分であり、前述の化学式６ａないし６ｎのトリアゾール窒素は、前記リシン側鎖のイプシロン炭素に連結されていることを特徴とする請求項１９に記載の生理活性ポリペプチド結合体。
【請求項２１】
前記生理活性ポリペプチドが、ホルモン、サトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、インシュリン分泌ペプチド、ニューロペプチド、脳下垂体ホルモン、抗肥満ペプチド、抗ウイルスペプチド、生理活性を有する非天然型ペプチド誘導体、構造蛋白質、リガンド蛋白質、及び受容体からなる群のうちから選択されることを特徴とする請求項１５に記載の生理活性ポリペプチド結合体。
【請求項２２】
前記生理活性ポリペプチドが、グルカゴン、ＧＩＰ（gastric inhibitory polypeptide）、キセニン（Xenin）、インシュリン、ＣＣＫ（cholecystokinin）、アミリン（amylin）、ガストリン（gastrin）、グレリン（ghrelin）、胃や腸で血糖及び体重を調節するインクレチン類（incretins）、脂肪（adipose）から分泌されるアジポキン類（adipokines）、脳分泌ニューロペプチド類（neuropeptides）、筋肉分泌ペプチドあるいは蛋白質類、血管作用腸ペプチド（vasoactive intestinal peptide）、ナトリウム利尿ペプチド（natriuretic peptide）、ソマトスタチン、ＮＰＹ（neuropeptide Ｙ）、ＧＬＰ−１（glucagon−like peptide−１）、ＧＬＰ−２（glucagon−like peptide−２）、エキセンジン−４（exendin−４）、オキシントモジュリン（Oxyntomodulin）、線維芽細胞成長因子（fibroblast growth factor）、アンジオテンシン、ブレジキニン、カルシトニン、副腎皮質刺激ホルモン（corticotropin）、エレドイシン（eledoisin）、オキシトシン（oxytocin）、バソプレッシン（vasopressin）、黄体形成ホルモン、黄体刺激ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、濾胞刺激ホルモン、副甲状線ホルモン、セクレチン（secretin）、セルモレリン（sermorelin）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、成長ホルモン放出ペプチド、コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）類、インターフェロン（ＩＦＮ）類、インターフェロン受容体、インターロイキン（interleukin）類、インターロイキン受容体、インターロイキン結合蛋白質、プロラクチン放出ペプチド、オレキシン（orexin）、甲状腺放出ペプチド、コレシストキニン（cholecystokinin）、ガストリン抑制ペプチド、カルモジュリン、ガストリン遊離ペプチド（gastric releasing peptide）、モチリン（motilin）、血管活性腸管ペプチド（vasoactive intestinal peptide）、心房ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ：atrial natriuretic peptide）、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ：Ｂ−type natriuretic peptide）、Ｃ−型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ：Ｃ−type natriuretic peptide）、ニューロキニン（neurokinin）Ａ、ニューロメジン（neuromedin）、レニン（renin）、エンドセリン（endothelin）、サラホトキシンペプチド（sarafotoxin peptide）、カルソモルフィンペプチド（carsomorphin peptide）、デルモルフィン（dermorphin）、ダイノルフィン（dynorphin）、エンドルフィン（endorphin）、エンケファリン（enkepalin）、腫瘍懐死因子、腫瘍懐死因子受容体、ウロキナーゼ受容体、腫瘍抑制因子、コルラゲナーゼ抑制剤、チモポイエチン（thymopoietin）、チムリン（thymulin）、チモペンチン（thymopentin）、チモシン（tymosin）、胸腺体液性因子（thymichumoral factor）、アドレノモジュリン（adrenomodullin）、アラトスタチン（allatostatin）、アミロイドベータ−プロテイン断片（amyloid beta−protein fragment）、抗菌性ペプチド、抗酸化剤ペプチド、ボンベシン（bombesin）、オステオカルシン（osteocalcin）、ＣＡＲＴペプチド、Ｅ−セレクチン（Ｅ−selectin）、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ロイコカイン（leucokine）、クリングル−５（kringle−５）、ラミニン（laminin）、インヒビン（inhibin）、ガラニン（galanin）、ピブロネクチン（fibronectin）、パンクレアスタチン（pancreastatin）、フゼオン（Fuzeon）、グルカコン−類似ペプチド、オキシントモジュリン、Ｇプロテイン関連受容体（Ｇ protein−coupled receptor）、酵素類、サトカイン結合蛋白質、マクロファージ活性因子���マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、蛋白質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞懐死糖蛋白質、免疫毒素、リンパ毒素、転移成長因子、アルファ−１アンチトリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン、アポリポ蛋白質−Ｅ、赤血球生成因子、高糖鎖化赤血球生成因子、アンジオポエチン類、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン、血液因子ＶＩＩ，ＶＩＩａ，ＶＩＩＩ，ＩＸ及びＸＩＩＩ、プラスミノーゲン活性因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、蛋白質Ｃ、Ｃ−反応性蛋白質、レニン抑制剤、スーパーオキサイドジスムターゼ、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンジオスタチン、骨形成成長因子、骨形成促進蛋白質、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路抑制剤、神経成長因子、リラクシン、ソマトメジン、インシュリン類似成長因子、副腎皮質ホルモン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、細胞表面抗原、ウイルス由来ワクチン抗原、単一クローン抗体、多重クローン抗体及び抗体断片、赤血球増殖因子、白血球増殖因子、及びそれらの類似体（analogs）からなる群のうちから選択されることを特徴とする請求項１５に記載の生理活性ポリペプチド結合体。
【請求項２３】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、非糖鎖化されたことを特徴とする請求項１５に記載の生理活性ポリペプチド結合体。
【請求項２４】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＣＨ１，ＣＨ２，ＣＨ３及びＣＨ４ドメインからなる基から選択された１個ないし４個のドメインからなることを特徴とする請求項１５に記載の生理活性ポリペプチド結合体。
【請求項２５】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒンジ領域を追加して含むことを特徴とする請求項１５に記載の生理活性ポリペプチド結合体。
【請求項２６】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、それらの組み合わせ、及びそれらのハイブリッドによるＦｃ領域からなる群のうちから選択されることを特徴とする請求項１５に記載の生理活性ポリペプチド結合体。
【請求項２７】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、それらの組み合わせ、及びそれらのハイブリッドのＦｃ領域からなる群のうちから選択されることを特徴とする請求項１５に記載の生理活性ポリペプチド結合体。
【請求項２８】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ４Ｆｃ領域であることを特徴とする請求項１５に記載の生理活性ポリペプチド結合体。
【請求項２９】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒト非糖鎖化ＩｇＧ４Ｆｃ領域であることを特徴とする請求項１５に記載の生理活性ポリペプチド結合体。
【請求項３０】
生理活性ポリペプチドにアジド基を導入させる工程と、
前記アジド基と、下記化学式１の化合物のＲ２のエチニレン基（−Ｃ≡Ｃ−）とをクリック反応による環付加反応させ、１，２，３−トリアゾールを形成させることによって結合させる工程と、
免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ酸を、前記化学式１の化合物のＲ１と共有結合させる工程と、
を含む、化学式１の化合物をリンカーにして、生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンＦｃ領域が結合された生理活性ポリペプチド結合体の製造方法：
【化１−１】
2020508366.tif 000145
前記化学式１で、
Ｒ１は、２，５−ジオキソピロリジニル、２，５−ジオキソピロリル、アルデヒド、マレイミド、Ｃ６−Ｃ２０アリールジスルフィド、Ｃ５−Ｃ２０ヘテロアリールジスルフィド、ビニルスルホン、チオール、ハロゲン化アセトアミド、スクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、及びそれらの誘導体からなる群のうちから選択される作用基を含む脂肪族炭化水素基であり、
Ｘは、−（ＣＨ２）ｊＮＨＣＯ−または−（ＣＨ２）ｊＮＨＣＳ−であり、ここで、ｊは、０ないし６の整数であり、
Ｒ２は、−（Ｒ３）ｋ−（Ｚ）ｌ−（Ｒ４）ｍ−（ＣＺ）ｐ−Ｙであり、ここで、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、Ｃ１−Ｃ６アルキレン、Ｃ６−Ｃ２０アリーレン、または１個ないし３個のＮ、Ｏ及びＳのうちから選択されたヘテロ原子を有するＣ５−Ｃ２０ヘテロアリーレンであり、Ｚは、ＯまたはＳであり、
Ｙは、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、シクロアルキニル、ビシクロアルキニル、アリールシクロアルキニル、ジアリールシクロアルキニル、ヘテロシクロアルキニルまたはジアリールヘテロシクロアルキニルであり（ここで、それぞれのシクロアルキニルは、３個ないし８個の炭素原子を有し、それぞれのアリールは、５個ないし８個の炭素原子を有し、それぞれのヘテロシクロアルキニルは、３個ないし８個の原子を含み、環原子のうち１個ないし３個に、Ｎ、Ｏ及びＳのうちから選択されたヘテロ原子を有する飽和環である）、
ｋ、ｌ、ｍ及びｐは、それぞれ独立して、０ないし３の整数であり、いずれも同時に０ではなく、
前述のアルキニル、シクロアルキニル、ビシクロアルキニル、アリールシクロアルキニル、ジアリールシクロアルキニル、ヘテロシクロアルキニルまたはジアリールヘテロシクロアルキニルは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル、オキソまたはハロゲンで置換もしくは非置換のものでもある。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非ペプチド性重合体化合物、その化合物を含む結合体、及びそれらの製造方法に係り、さらに具体的には、生理活性ポリペプチドの半減期を増大させるためのリンカーとして使用される非ペプチド性重合体化合物、その化合物をリンカーにして、生理活性ポリペプチドが連結された結合体、及びそれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛋白質薬物は、人体への投与時、血中半減期が短く、薬効を維持するために、折々に投与しなければならないという不都合がある。そのような問題点を解決するための方案として、蛋白質薬物の血中半減期を増大させるための目的として、ポリエチレングリコールを蛋白質薬物と結合させるＰＥＧ化（peglyation）が利用されている。そのようなＰＥＧ化により、蛋白質薬物の血中半減期が増大されるだけではなく、蛋白質薬物の抗原性が低下されもし、蛋白質治療剤側面で広く使用されている。
【０００３】
前記ポリエチレングリコールは、蛋白質薬物及び免疫グロブリンＦｃ領域を結合するリンカーとしても使用され、蛋白質薬物と結合する作用基（functional group）以外にも、蛋白質薬物の半減期を向上させることが知られている免疫グロブリンＦｃ領域を結合するための作用基を追加で含むポリエチレングリコール誘導体の形態を有する。また、蛋白質薬物及び免疫グロブリンＦｃ領域のリンカー化合物として、前記ポリエチレングリコール誘導体以外にも、生体適合性を有する多様な非ペプチド性重合体が、蛋白質薬物と共に結合体を形成することができるリンカーとしての使用可能性が提起されている（特許文献１）。
【０００４】
前記非ペプチド性重合体は、蛋白質薬物及び免疫グロブリンＦｃと結合するために、両末端にそれぞれ独立して、作用基として、アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド（maleimide）基、スクシンイミド（succinimide）誘導体（スクシンイミジルプロピオネート、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチルまたはスクシンイミジルカーボネート）などを有することができる。
ところで、前記作用基が蛋白質薬物と結合する際に、結合を所望する蛋白質の特定アミノ酸位置への反応において、反応に投入された全ての物質が、結合体へと変換されるわけではないので、結合体の製造収率が低下するという短所があり、更には、一部の反応基の場合には、血中で安定性が低下する短所があることが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】韓国特許公開２０１４−００１８４６２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の一様相は、生理活性ポリペプチドと安定して結合し、生理活性ポリペプチドの血中半減期を増大させることができるだけではなく、高い収率で結合することができる非ペプチド性重合体化合物を提供するものである。
【０００７】
本発明の他の一様相は、生理活性ポリペプチドが、前記非ペプチド性重合体化合物の一末端に結合された生理活性ポリペプチド連結体を提供するものである。
【０００８】
本発明のさらに他の一様相は、生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンＦｃ領域が、前記非ペプチド性重合体化合物の両末端に結合された生理活性ポリペプチド結合体を提供するものである。
【０００９】
本発明のさらに他の一様相は、前記非ペプチド性重合体化合物、生理活性ポリペプチド連結体、及び生理活性ポリペプチド結合体の製造方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一様相は、
非ペプチド性重合体の一末端に、免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドと結合可能な作用基が導入され、他の一末端に、クリック反応可能な作用基が導入された化合物を提供するものである。
【００１１】
前記化合物は、下記化学式１の化合物、その立体異性体、または薬剤学的に許容可能なその塩を含む：
【化１】
2020508366.tif 000003
前記化学式１で、
Ｒ１は、２，５−ジオキソピロリジニル、２，５−ジオキソピロリル、アルデヒド、マレイミド、Ｃ６−Ｃ２０アリールジスルフィド、Ｃ５−Ｃ２０ヘテロアリールジスルフィド、ビニルスルホン、チオール、ハロゲン化アセトアミド、スクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、及びそれらの誘導体からなる群のうちから選択される作用基を含む脂肪族炭化水素基であり、
該非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（polylactic acid）、ＰＬＧＡ（polylactic−glycolic acid）、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸及び多糖類（polysaccharide）によって構成された群のうちから選択され、
Ｘは、−（ＣＨ２）ｊＮＨＣＯ−または−（ＣＨ２）ｊＮＨＣＳ−であり、ここで、ｊは、０ないし６の整数であり、
Ｒ２は、−（Ｒ３）ｋ−（Ｚ）ｌ−（Ｒ４）ｍ−（ＣＺ）ｐ−Ｙであり、
ここで、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、Ｃ１−Ｃ６アルキレン、Ｃ６−Ｃ２０アリーレン、または１個ないし３個のＮ、Ｏ、及びＳのうちから選択されたヘテロ原子を有するＣ５−Ｃ２０ヘテロアリーレンであり、
Ｚは、ＯまたはＳであり、
Ｙは、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、シクロアルキニル、アリールシクロアルキニル、ジアリールシクロアルキニル、ヘテロシクロアルキニルまたはジアリールヘテロシクロアルキニルであり（ここで、それぞれのシクロアルキニルは、３個ないし８個の炭素原子を有し、それぞれのアリールは、５個ないし８個の炭素原子を有し、それぞれのヘテロシクロアルキニルは、３個ないし８個の原子を含み、環原子のうち１個ないし３個に、Ｎ、Ｏ及びＳのうちから選択されたヘテロ原子を有する飽和環である）、
ｋ、ｌ、ｍ及びｐは、それぞれ独立して、０ないし３の整数であり、いずれも同時に０ではなく、
前述のアルキニル、シクロアルキニル、アリールシクロアルキニル、ジアリールシクロアルキニル、ヘテロシクロアルキニルまたはジアリールヘテロシクロアルキニルは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル、オキソまたはハロゲンで置換もしくは非置換のものでもある。
【００１２】
本発明の他の一様相は、
非ペプチド性重合体の一末端に、クリック反応可能な作用基を導入する工程と、
前記非ペプチド性重合体の他の一末端に、免疫グロブリンＦｃ領域あるいは生理活性ポリペプチドと結合可能な作用基を導入する工程と、を含む、前述の本発明の一様相による化合物の製造方法を提供するものである。
【００１３】
本発明のさらに他の一様相は、前述の一様相による化合物の一末端のクリック反応可能な作用基に、生理活性ポリペプチドが結合されたものである生理活性ポリペプチド連結体を提供するものである。
【００１４】
本発明のさらに他の一様相は、前述の一様相による化合物の一末端のクリック反応可能な作用基に、免疫グロブリンＦｃ領域が結合されたものである免疫グロブリンＦｃ領域連結体を提供するものである。
【００１５】
本発明のさらに他の一様相は、前述の一様相による化合物をリンカーにして、生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンＦｃ領域が結合された生理活性ポリペプチド結合体を提供するものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の一様相による化合物は、従来のリンカー化合物に比べ、生理活性ポリペプチドの所望する位置に安定して結合させることができるだけではなく、結合体を、さらに高い生産収率と安定性とを有するように形成させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】一実施例によるリンカー化合物６（ＭＷ＝１０，０００）の１Ｈ ＮＭＲ結果である。
【図２】一実施例によるリンカー化合物６（ＭＷ＝５，０００）の１Ｈ ＮＭＲ結果である。
【図３】一実施例によるリンカー化合物６（ＭＷ＝３，４００）の１Ｈ ＮＭＲ結果である。
【図４】一実施例によるリンカー化合物６（ＭＷ＝２，０００）の１Ｈ ＮＭＲ結果である。
【図５】一実施例によるリンカー化合物９（ＭＷ＝１０，０００）の１Ｈ ＮＭＲ結果である。
【図６】一実施例によるリンカー化合物１４（ＭＷ＝１０，０００）の１Ｈ ＮＭＲ結果である。
【図７】一実施例によるリンカー化合物１６（ＭＷ＝１０，０００）の１Ｈ ＮＭＲ結果である。
【図８】リンカー化合物ＡＬＤ−ＰＥＧ １０Ｋ−ＤＢＣＯの質量分析結果である。
【図９】リンカー化合物ＡＬＤ−ＰＥＧ ５Ｋ−ＤＢＣＯの質量分析結果である。
【図１０】リンカー化合物ＡＬＤ−ＰＥＧ ３．４Ｋ−ＤＢＣＯの質量分析結果である。
【図１１】リンカー化合物ＡＬＤ−ＰＥＧ ２Ｋ−ＤＢＣＯの質量分析結果である。
【図１２】リンカー化合物ＰｅＡＬＤ−ＰＥＧ １０Ｋ−ＢＣＮの質量分析結果である。
【図１３】リンカー化合物ＰｅＡＬＤ−ＰＥＧ １０Ｋ−ＤＢＣＯの質量分析結果である。
【図１４】リンカー化合物ＡＬＤ−ＰＥＧ １０Ｋ−ＢＣＮの質量分析結果である。
【図１５】ＨＭＴ２１１−ａｚｉｄｏ−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ純度分析結果である。Ｍ：marker、１：ＨＭＴ２１１−azidoペプチド、２：モノＰＥＧ化された（mono−pegylated）ＨＭＴ２１１−azido−ＰＥＧ、３：免疫グロブリンＦｃ、４：ＨＭＴ２１１−azidoと免疫グロブリンＦｃとをＡＬＤ−ＰＥＧ １０Ｋ−ＢＣＮリンカーに連結したＨＭＴ２１１−azido−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦＣ結合体。
【図１６】ＧＬＰ−２類似体−azido−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体に対する非還元条件（non−reducing）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ純度分析結果である。Ｍ：marker、１：ＧＬＰ−２類似体、２：モノＰＥＧ化された（mono−pegylated）ＧＬＰ−２類似体、３：免疫グロブリンＦｃ、４：ＧＬＰ−２類似体−azidoと免疫グロブリンＦｃとをＡＬＤ−ＰＥＧ １０Ｋ−ＤＢＣＯリンカーに連結したＧＬＰ−２類似体−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体。
【図１７】グルカゴン類似体−azido−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体に対する非還元条件（non−reducing）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ純度分析結果である。Ｍ：marker、１：グルカゴン類似体、２：モノＰＥＧ化された（mono−pegylated）グルカゴン類似体、３：免疫グロブリンＦｃ、４：グルカゴン類似体−azidoと免疫グロブリンＦｃとをＰｅＡＬ−ＰＥＧ１０Ｋ−ＢＣＮリンカーに連結したグルカゴン類似体−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
【００１９】
本発明で使用される全ての技術用語は、異なって定義されない以上、本発明の関連分野において、当業者が一般的に理解するような意味で使用される。また、本明細書には、望ましい方法や試料が記載されるが、それらと類似していたり、同等であったりするものも、本発明の範疇に含まれる。また、本明細書に記載された数値は、明示なしにも、「約」の意味を含むものであると見なす。本明細書に参考文献として記載される全刊行物の内容は、全体が本明細書に参照として統合される。
【００２０】
本発明者らは、生理活性ポリペプチドと結合し、生理活性ポリペプチドの生体内安定性を高め、半減期を増大させることができるリンカー化合物を開発するために研究した結果、生理活性ポリペプチドと、さらに安定して結合可能なリンカー化合物を開発するに至った。
【００２１】
本発明の一様相は、前記リンカー化合物であり、非ペプチド性重合体の一末端に、免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドと結合可能な作用基が導入され、他の一末端に、クリック反応可能な作用基が導入された化合物を提供する。
【００２２】
本明細書において、「免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドと結合可能な作用基」は、免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの任意部位のアミノ酸の作用基と結合可能な作用基を意味する。前記「免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドの任意部位のアミノ酸の作用基」には、例えば、リシンのアミノ（−ＮＨ２）、プロリンのアミン（−ＮＨ−）、システインのチオール（−ＳＨ）などがある。一具体例において、免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドと結合可能な作用基は、Ｎ末端アミノ酸、リシンまたはシステインの作用基（アミン基、アミノ基またはチオール基）と結合可能な作用基を意味する。前記免疫グロブリンＦｃ領域または生理活性ポリペプチドと結合可能な作用基は、例えば、２，５−ジオキソピロリジニル、２，５−ジオキソピロリル、アルデヒド、マレイミド、Ｃ６−Ｃ２０アリールジスルフィド、Ｃ５−Ｃ２０ヘテロアリールジスルフィド、ビニルスルホン、チオール、ハロゲン化アセトアミド、スクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、及びそれらの誘導体からなる群のうちからも選択されるが、それらに限定されるものではない。
【００２３】
本明細書において、用語「クリック反応可能な作用基」とは、有機化学分野において、いわゆる、クリック反応（click reaction）と呼ばれる反応が可能な作用基を意味し、前記クリック反応は、アルキン−アジドまたはアルキン−ニトロンの環化付加反応（cycloaddition）、チオール−エン（thiol−ene）クリック反応（Hoyle, Charles E.ら, 2010, “Thiol-Ene Click Chemistry”, Angewandte Chemie International Edition． 49 (9): 1540-1573）、ジエノファイル（dienophile）とジエン（diene）とのディールス・アルダー反応（Diels-Alder reaction）（Houk et al, 2013, 135, 15642-15649）、イソニトリルとテトラジンとの環化付加反応（Henningら, 2011, “Exploring isonitrile-based click chemistry for ligation with biomolecules”, Organic & Biomolecular Chemistry． 9: 7303）などがあるが、それらに限定されるものではない。前述のアルキン−アジドまたはアルキン−ニトロンの環化付加反応は、ＣｕＡＡＣ（copper（Ｉ）−catalyzed azide−alkyne cycloaddition）、ＳＰＡＡＣ（strain−promoted azide−alkyne cycloaddition）またはＳＰＡＮＣ（strain−promoted alkyne−nitrone cycloaddition）を含む。前記クリック反応は、有機化学分野に広く公知されている。
【００２４】
前記「クリック反応可能な作用基」は、具体的には、アルキニル、ジエニル（dienyl）、イソニトリル（isonitrile）などがあるが、それらに限定されるものではなく、前記アルキニルは、線状または分枝状のアルキニル、シクロアルキニル、アリールシクロアルキニル、ジアリールシクロアルキニル、ヘテロシクロアルキニル、アリールヘテロシクロアルキニルまたはジアリールヘテロシクロアルキニルを含む。前記化合物の一末端に存在するクリック反応可能な作用基は、生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンＦｃ領域に導入されうるアジド（azide）またはニトロン（nitrone）などの作用基と共にクリック反応がなされる。
【００２５】
本明細書において、「作用基が導入」されるということは、当該作用基を含む任意の結合可能な原子団が結合されるということを意味する。
【００２６】
本明細書において、「非ペプチド性重合体」とは、生理活性ポリペプチドと結合し、生理活性ポリペプチドの生体内半減期を増大させることができ、ペプチド構造を有さない当該技術分野に公知された任意の重合体を意味する。前記非ペプチド性重合体は、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（polylactic acid）、ＰＬＧＡ（polylactic−glycolic acid）、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸及び多糖類（polysaccharide）によって構成された群のうちからも選択されるが、それらに限定されるものではない。
【００２７】
本明細書において、用語「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードを意味する。
【００２８】
前述の一様相による化合物は、下記化学式１の化合物、その立体異性体、溶媒化物、及び薬剤学的に許容可能な塩のうちから選択された化合物を含む：
【化１−１】
2020508366.tif 000004
前記化学式１で、
Ｒ１は、２，５−ジオキソピロリジニル、２，５−ジオキソピロリル、アルデヒド、マレイミド、Ｃ６−Ｃ２０アリールジスルフィド、Ｃ５−Ｃ２０ヘテロアリールジスルフィド、ビニルスルホン、チオール、ハロゲン化アセトアミド、スクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、及びそれらの誘導体からなる群のうちから選択される作用基を含む脂肪族炭化水素基であり、
該非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ、ＰＬＧＡ、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸及び多糖類（polysaccharide）によって構成された群のうちから選択され、
Ｘは、−（ＣＨ２）ｊＮＨＣＯ−または−（ＣＨ２）ｊＮＨＣＳ−であり、ここで、ｊは、０ないし６の整数であり、
Ｒ２は、−（Ｒ３）ｋ−（Ｚ）ｌ−（Ｒ４）ｍ−（ＣＺ）ｐ−Ｙであり、
ここで、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、Ｃ１−Ｃ６アルキレン、Ｃ６−Ｃ２０アリーレン、または１個ないし３個のＮ、Ｏ及びＳのうちから選択されたヘテロ原子を有するＣ５−Ｃ２０ヘテロアリーレンであり、
Ｚは、ＯまたはＳであり、
Ｙは、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、シクロアルキニル、ビシクロアルキニル、アリールシクロアルキニル、ジアリールシクロアルキニル、ヘテロシクロアルキニルまたはジアリールヘテロシクロアルキニルであり（ここで、それぞれのシクロアルキニルは、３個ないし８個の炭素原子を有し、それぞれのアリールは、５個ないし８個の炭素原子を有し、それぞれのヘテロシクロアルキニルは、３個ないし８個の原子を含み、環原子のうち１個ないし３個に、Ｎ、Ｏ及びＳのうちから選択されたヘテロ原子を有する飽和環である）、前述のｋ、ｌ、ｍ及びｐは、それぞれ独立して、０ないし３の整数であり、いずれも同時に０ではなく、
前述のアルキニル、シクロアルキニル、ビシクロアルキニル、アリールシクロアルキニル、ジアリールシクロアルキニル、ヘテロシクロアルキニルまたはジアリールヘテロシクロアルキニルは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル、オキソまたはハロゲンで置換もしくは非置換のものでもある。
【００２９】
前記Ｒ１で、脂肪族炭化水素基は、線状または分枝状の炭素数が１ないし２０、具体的には、１ないし１２、さらに具体的には、１ないし６であるアルキル；１以上の炭素・炭素二重結合を含み、線状または分枝状であり、炭素数が２ないし１５、具体的には、２ないし１２、さらに具体的には、２ないし６であるアルケニル；１以上の炭素・炭素三重結合を含み、線状または分枝状であり、炭素数が２ないし１５、具体的には、２ないし１２、さらに具体的には、２ないし６であるアルキニルを含む。前記アルキルは、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ヘプチル、ノニル及びデシルによって構成された群のうちからも選択される。前記アルケニルは、例えば、エテニル、プロペニル、ｎ−ブテニル、３−メチルブト−２−エニル、ｎ−ペンテニル、オクテニル及びデセニルによって構成された群のうちからも選択される。前記アルキニルは、例えば、エチニル、プロピニル、２−ブチニル、３−メチルブチニル、ｎ−ペンチニル及びデシニルによって構成された群のうちからも選択される。前述のアルキル、アルケニル、アルキニルは、Ｃ１−Ｃ６アルキル及びハロゲンによって構成された群のうちから選択された基で置換されたり置換されなかったりする。
【００３０】
前記Ｒ１は、アルデヒド基を含むＣ１−Ｃ６脂肪族炭化水素基でもある。一具体例において、前記Ｒ１は、アルデヒド基を含むＣ１−Ｃ６アルキル（すなわち、ＨＣ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ６アルキル）であり、例えば、ｎ−ペントアルデヒド（pentaldehyde）、ｎ−ブチルアルデヒド（butyraldehyde）、プロピオンアルデヒドまたはアセトアルデヒドである。
【００３１】
前記Ｙは、ＢＣＮ（bicyclo［６．１．０］nonyne）、ＤＢＣＯ（dibenzocyclooctyne）、ＤＩＦＯ（difluorinated cyclooctyne）、ＤＩＦＯ２、ＤＩＦＯ３、ＤＩＢＯ（dibenzoannulated cyclooctyne）、ＢＡＲＡＣ（biarylazacyclooctynone）、ＯＣＴ（cyclooctyne）、ＡＬＯ（aryl−less cyclooctyne）、ＭＯＦＯ（monofluorinated cyclooctyne）、ＤＩＭＡＣ（dimethoxyazacyclooctyne）、ＴＭＤＩＢＯ（２，３，６，７−tetramethoxy−ＤＩＢＯ）、ＣＯＭＢＯ（carboxymethylmonobenzocyclooctyne）、ＰＹＲＲＯＣ（pyrrolocyclooctyne）、ＤＩＢＡＣ（dibenzo−aza−cyclooctyne）、ＴＭＴＨ（３，３，６，６−tetramethylthiacycloheptyne）、Sondheimerジイン及びＳ−ＤＩＢＯ（sulfonylated ＤＩＢＯ）によって構成された群のうちからも選択されるが、それらに限定されるものではない。
【００３２】
一具体例において、前記化学式１は、前記非ペプチド性重合体が、ポリエチレングリコール構造を有する下記化学式１ａの構造を有することができる：
【化１ａ】
2020508366.tif 000005
前記化学式１ａで、
ｎは、２０ないし１，０００、具体的には、２０ないし５００、さらに具体的には、２０ないし２５０の整数であり、
ｊは、０ないし６の整数、具体的には、０または２であり、
Ｒ１は、２，５−ジオキソピロリジニル、２，５−ジオキソピロリル、アルデヒド、マレイミド、Ｃ６−Ｃ２０アリールジスルフィド、Ｃ５−Ｃ２０ヘテロアリールジスルフィド、ビニルスルホン、チオール、ハロゲン化アセトアミド、スクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、及びそれらの誘導体からなる群のうちから選択される作用基を含む脂肪族炭化水素基であり、
Ｒ２は、前記Ｒ２は、−（Ｒ３）ｋ−（Ｚ）ｌ−（Ｒ４）ｍ−（ＣＺ）ｐ−Ｙであり、
ここで、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、Ｃ１−Ｃ６アルキレン、Ｃ６−Ｃ２０アリーレン、または１個ないし３個のＮ、Ｏ及びＳのうちから選択されたヘテロ原子を有するＣ５−Ｃ２０ヘテロアリーレンであり、
Ｚは、ＯまたはＳであり、
Ｙは、ＢＣＮ（bicyclo［６．１．０］nonyne）、ＤＢＣＯ（dibenzocyclooctyne）、ＤＩＦＯ（difluorinated cyclooctyne）、ＤＩＦＯ２、ＤＩＦＯ３、ＤＩＢＯ（dibenzoannulated cyclooctyne）、ＢＡＲＡＣ（biarylazacyclooctynone）、ＯＣＴ（cyclooctyne）、ＡＬＯ（aryl−less cyclooctyne）、ＭＯＦＯ（monofluorinated cyclooctyne）、ＤＩＭＡＣ（dimethoxyazacyclooctyne）、ＴＭＤＩＢＯ（２，３，６，７−tetramethoxy−ＤＩＢＯ）、ＣＯＭＢＯ（carboxymethylmonobenzocyclooctyne）、ＰＹＲＲＯＣ（pyrrolocyclooctyne）、ＤＩＢＡＣ（dibenzo−aza−cyclooctyne）、ＴＭＴＨ（３，３，６，６−tetramethylthiacycloheptyne）、Sondheimerジイン及びＳ−ＤＩＢＯ（sulfonylated ＤＩＢＯ）によって構成された群のうちから選択され、
前述のｋ、ｌ、ｍ及びｐは、それぞれ独立して、０ないし３の整数であり、いずれも同時に０ではない。
【００３３】
前記化学式１及び１ａで、
Ｃ６−Ｃ２０アリーレンは、例えば、ベンゼン、ビフェニレン、トリフェニレン、ナフタレン、アントラセン、ビナフチレン、フェナントレン、ピレン、ジヒドロピレン、クリセン、ペリレン、テトラセン、ペンタセン、ベンズピレン、フルオレン、インデン、インデノフルオレン、スピロビフルオレンのような芳香族基の二価形態でもあり、さらに具体的には、ベンゼンの二価形態でもあり、
Ｃ５−Ｃ２０ヘテロアリーレンは、例えば、５員環（例：ピロール、ピラゾール、イミダゾール、１，２，３−トリアゾール、１，２，４−トリアゾール、テトラゾール、フラン、チオフェン、セレノフェン、オキサゾール、イソオキサゾール、１，２−チアゾール、１，３−チアゾール、１，２，３−オキサジアゾール、１，２，４−オキサジアゾール、１，２，５−オキサジアゾール、１，３，４−オキサジアゾール、１，２，３−チアジアゾール、１，２，４−チアジアゾール、１，２，５−チアジアゾール、１，３，４−チアジアゾール）；６員環（例：ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、１，３，５−トリアジン、１，２，４−トリアジン、１，２，３−トリアジン、１，２，４，５−テトラジン、１，２，３，４−テトラジン、１，２，３，５−テトラジン）；または融合された基（例：カルバゾール、インドール、イソインドール、インドリジン、インダゾール、ベンズイミダゾール、ベンゾトリアゾール、プリン、ナフトイミダゾール、フェナントロイミダゾール、ピリドイミダゾール、ピラジンイミダゾール、キノキサリンイミダゾール、ベンズオキサゾール、ナフトオキサゾール、アントルオキサゾール、フェナントロオキサゾール、イソオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾフラン、イソベンゾフラン、ジベンゾフラン、キノリン、イソキノリン、プテリジン、ベンゾ−５，６−キノリン、ベンゾ−６，７−キノリン、ベンゾ−７，８−キノリン、ベンゾイソキノリンアクリジン、フェノチアジン、フェノキサジン、ベンゾピリダジン、ベンゾピリミジン、キノキサリン、フェナジン、ナフチリジン、アザカルバゾール、ベンゾカルボリン、フェナントリジン、フェナントロリン、チエノ［２，３−ｂ］チオフェン、チエノ［３，２−ｂ］チオフェン、ジチエノチオフェン、ジチエノピリジン、イソベンゾチオフェン、ジベンゾチオフェン、ベンゾチアジアゾチオフェン）のようなヘテロ芳香族基の二価形態でもある。
【００３４】
一具体例において、化学式１ａは、下記の化学式２ａないし２ｎのうちいずれか１つの構造を有することができる：
【化２ａ】
2020508366.tif 000006
【化２ｂ】
2020508366.tif 000007
【化２ｃ】
2020508366.tif 000008
【化２ｄ】
2020508366.tif 000009
【化２ｅ】
2020508366.tif 000010
【化２ｆ】
2020508366.tif 000011
【化２ｇ】
2020508366.tif 000012
【化２ｈ】
2020508366.tif 000013
【化２ｉ】
2020508366.tif 000014
【化２ｊ】
2020508366.tif 000015
【化２ｋ】
2020508366.tif 000016
【化２ｌ】
2020508366.tif 000017
【化２ｍ】
2020508366.tif 000018
【化２ｎ】
2020508366.tif 000019
前述の２ａないし２ｎで、
ｎは、２０ないし１，０００、具体的には、２０ないし５００、さらに具体的には、２０ないし２５０の整数でもあり、
ｊは、０ないし６の整数、具体的には、０または２でもあり、
Ｒ１は、アルデヒド基を含むＣ１−Ｃ６脂肪族炭化水素基でもある。
【００３５】
前述の一様相による化合物は、薬学的に許容可能な塩形態で存在することができる。塩としては、薬学的に許容可能な遊離酸（free acid）によって形成された酸付加塩が有用である。本発明の用語「薬学的に許容可能な塩」とは、患者に比較的非毒性であって無害な有効作用を有する濃度であり、この塩に起因した副作用が、化学式１，１ａ、または化学式２ａないし２ｎに表示される化合物の利となる効能を低下させない前記化合物の任意の全ての有機または無機の付加塩を意味する。該酸付加塩は、通常の方法、例えば、化合物を過量の酸水溶液に溶解させ、この塩を、水混和性有機溶媒、例えば、メタノール、エタノール、アセトンまたはアセトニトリルを使用し、沈澱させて製造する。同モル量の化合物、及び水中の酸またはアルコール（例えば、グリコールモノメチルエーテル）を加熱し、次に、前記混合物を蒸発させて乾燥させるか、あるいは析出された塩を吸引濾過させることができる。
【００３６】
また、塩基を使用し、薬学的に許容可能な金属塩を作ることができる。アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩は、例えば、化合物を、過量のアルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物溶液の中に溶解させ、非溶解化合物塩を濾過した後、濾液を蒸発、乾燥させて得る。
【００３７】
また、本発明は、前記化学式１，１ａ、または化学式２ａないし２ｎの化合物、及びその薬学的に許容可能な塩だけではなく、そこから製造されうる可能な溶媒化物を含む。
【００３８】
また、前記化学式１，１ａ、または化学式２ａないし２ｎの化合物は、その置換基に、非対称炭素中心（不斉炭素）を有する場合、鏡像異性体（Ｒ異性体またはＳ異性体）、ラセミ体または部分立体異性体、またはそれらの任意混合物の形態で存在することもできる。また、前記化学式１，１ａ、または化学式２ａないし２ｎの化合物は、ブリッジされた環（bridged ring）を含む場合、エキソ異性体またはエンド異性体として存在することもでき、例えば、前記化学式２ａの化合物は、エキソ異性体またはエンド異性体として存在することもできる。
【００３９】
前述の一様相による化合物は、分子量が０．１ないし１００ｋＤａ範囲、具体的には、０．１ないし５０ｋＤａ範囲、さらに具体的には、０．３ないし１０ｋＤａ範囲でもあるが、それらに限定されるものではない。
【００４０】
本発明の他の一様相は、
非ペプチド性重合体の一末端に、クリック反応可能な作用基を導入する工程と、
前記非ペプチド性重合体の他の一末端に、免疫グロブリンＦｃ領域あるいは生理活性ポリペプチドと結合可能な作用基を導入する工程と、を含む、前述の本発明の一様相による化合物の製造方法を提供する。
【００４１】
前記製造方法の詳細は、本発明の一様相による化合物に係わる前記説明がそのまま適用される。
【００４２】
前記製造方法は、１）非ペプチド性重合体の一末端に、アミノ基（−ＮＨ２）を導入した後、前記アミノ基とのアミド結合により、非ペプチド性重合体の一末端に、Ｒ２を導入する工程と、
２）前記Ｒ２が導入された非ペプチド性重合体の他の一末端に、２，５−ジオキソピロリジニル、２，５−ジオキソピロリル、アルデヒド、マレイミド、Ｃ６−Ｃ２０アリールジスルフィド、Ｃ５−Ｃ２０ヘテロアリールジスルフィド、ビニルスルホン、チオール、ハロゲン化アセトアミド、スクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、及びそれらの誘導体からなる群のうちから選択される作用基を含む脂肪族炭化水素基を導入する工程と、を含んでもよく、前記Ｒ２は、前記化学式１または１ａで定義された通りである。
【００４３】
一具体例において、前記工程１）の非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコールでもある。
【００４４】
一具体例において、前記工程１）の非ペプチド性重合体は、分子量が０．１ないし１００ｋＤａ範囲、具体的には、０．１ないし５０ｋＤａ範囲、さらに具体的には、０．３ないし１０ｋＤａ範囲でもあるが、それらに限定されるものではない。
【００４５】
一具体例において、前記工程２）は、前記Ｒ２が導入された非ペプチド性重合体の他の一末端に、アルデヒド基を含むＣ１−Ｃ６脂肪族炭化水素基を導入する工程でもある。
【００４６】
前記非ペプチド性重合体の一末端に、クリック反応可能な作用基を導入する方法、及び前記非ペプチド性重合体の他の一末端に、免疫グロブリンＦｃ領域あるいは生理活性ポリペプチドと結合可能な作用基を導入する方法の具体的な反応条件は、有機化学分野において当業者が、公知された技術を利用して適切に遂行することができる。
【００４７】
前記製造方法は、前述の一様相による化合物の製造方法の例示に過ぎず、前述の一様相による化合物の製造方法は、それに限定されるものではなく、当該技術分野に公知された技術を利用して適切に変更することができる。
【００４８】
本発明のさらに他の一様相は、前述の一様相による化合物の一末端のクリック反応可能な作用基に、生理活性ポリペプチドが結合されたものである生理活性ポリペプチド連結体を提供する。
【００４９】
本発明のさらに他の一様相は、前述の一様相による化合物の一末端のクリック反応可能な作用基に、免疫グロブリンＦｃ領域が結合されたものである免疫グロブリンＦｃ領域連結体を提供する。
【００５０】
本明細書において、用語「生理活性ポリペプチド連結体」は、生理活性ポリペプチドと、前述の一様相による化合物とが結合された構造物を意味し、「免疫グロブリンＦｃ領域連結体」は、免疫グロブリンＦｃ領域と、前述の一様相による化合物とが結合された構造物を意味し、前記結合は、共有結合でもあるが、それに制限されるものではない。以下では、生理活性ポリペプチド連結体または免疫グロブリンＦｃ領域連結体を包括し、「生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンＦｃ領域の連結体」ともする。
【００５１】
前記生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンＦｃ領域の連結体は、前記化学式１または１ａの化合物の作用基Ｙを介して、生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンＦｃ領域が、化学式１または１ａの化合物に結合されたものである生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンＦｃ領域の連結体を含む。
【００５２】
前記クリック反応可能な作用基、具体的には、前記化学式１の作用基Ｙに、生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンＦｃ領域を結合させるために、前記生理活性ポリペプチドに、作用基Ｙとクリック反応が可能な作用基を導入した後、クリック反応により、前記連結体を形成させることができる。前記生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンＦｃ領域に導入されうるクリック反応が可能な作用基は、例えば、アジドまたはニトロンなどでもある。前述のアジドまたはニトロンを、前記生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンＦｃ領域に導入するために、アジドまたはニトロンが結合されたアミノ酸を、前記生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンＦｃ領域に、アミノ酸間のペプチド結合で結合させることができる。前述のアジドまたはニトロンが結合されたアミノ酸は、直接製造することもでき、商業的に入手することもできる。一具体例において、アジドリシン（Ｎ３−リシン）を、前記生理活性ポリペプチドに、アミド結合で結合させ、前記アジドリシンは、商業的に入手可能である（Sigma Aldrich、Ｆｍｏｃ−azidolysine）。一具体例において、アジドリシン（Ｎ３−リシン）を、前記生理活性ポリペプチドのＣ末端に、アミド結合で結合させることができる。
【００５３】
他の具体例において、前述のアジドまたはニトロンを、別途のアミノ酸なしに、直接生理活性ポリペプチド内または免疫グロブリンＦｃ領域内に存在するアミノ酸を介して結合させることもでき、このために、前述のアジドまたはニトロンを結合させようとするアミノ酸と結合可能な作用基を、前述のアジドまたはニトロンに結合させた後、結合させることもできる。例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルアジド（例：ＮＨＳ−azide、ＮＨＳ−ＰＥＧ４−azide）を、生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンＦｃ領域と反応させ、直接生理活性ポリペプチド内または免疫グロブリンＦｃ領域内に存在するアミノ酸（例：リシン、Ｎ末端アミノ酸）を介して結合させることもできる。
【００５４】
他の具体例において、前述のアジドまたはニトロンを、生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンＦｃ領域に追加するか、あるいは置換されたアミノ酸を介して結合させることもでき、このために、前述のアジドまたはニトロンを結合させようとするアミノ酸を、生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンＦｃ領域に追加または置換させた後、追加または置換されたアミノ酸と結合可能な作用基を、前述のアジドまたはニトロンに結合させた後で結合させることができる。例えば、生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンＦｃ領域にリシンを追加または置換させ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルアジド（例：ＮＨＳ−azide、ＮＨＳ−ＰＥＧ４−azide）を、前記追加または置換されたリシンを介して結合させることもできる。
【００５５】
前述のアジドまたはニトロンなどが導入された生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンＦｃ領域は、前述の一様相によるリンカー化合物の一末端のクリック反応可能な作用基、例えば、前記化学式１または１ａの化合物の作用基Ｙと共に、クリック反応による環付加反応により、トリアゾール（アジドと、Ｙのエチニレン基−Ｃ≡Ｃ−との反応時）またはイソオキサゾリジン（ニトロンと、Ｙのエチニレン基−Ｃ≡Ｃ−との反応時）などを形成することにより、前記リンカー化合物とも連結される。具体的な製造方法の条件は、当業者が公知された知識を利用して適切に決定することができるのである。
【００５６】
一具体例において、前記生理活性ポリペプチド連結体は、生理活性ポリペプチドにアジド基が導入された後、前記アジド基と、化学式１または１ａの化合物の作用基Ｙのエチニレン基とが互いにクリック反応（click reaction）による環付加反応（cycloaddition）により、１，２，３−トリアゾールを形成することによって結合されたものである生理活性ポリペプチド連結体でもある。
【００５７】
一具体例において、前記生理活性ポリペプチド連結体は、下記の化学式３ａないし３ｌのうちいずれか１つの化学式を有することができる：
【化３ａ】
2020508366.tif 000020
【化３ｂ】
2020508366.tif 000021
【化３ｃ】
2020508366.tif 000022
【化３ｄ】
2020508366.tif 000023
【化３ｅ】
2020508366.tif 000024
【化３ｆ】
2020508366.tif 000025
【化３ｇ】
2020508366.tif 000026
【化３ｈ】
2020508366.tif 000027
【化３ｉ】
2020508366.tif 000028
【化３ｊ】
2020508366.tif 000029
【化３ｋ】
2020508366.tif 000030
【化３ｌ】
2020508366.tif 000031
前述の化学式３ａないし３ｌで、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｚ、ｊ、ｋ、ｌ、ｍ、ｎ及びｐは、前記化学式１ａで定義された通りであり、
［アミノ酸］は、天然状態の前記生理活性ポリペプチド配列を構成するアミノ酸のうちいずれか一つであるか、あるいはそれに属さない追加または置換されたアミノ酸である。
【００５８】
一具体例において、前述の化学式３ａないし３ｌの［アミノ酸］は、前記生理活性ポリペプチドの天然配列のリシン残基からイプシロン−アミノ基を除いた部分であり、前述の化学式３ａないし３ｌのトリアゾール窒素が、前記リシン側鎖のイプシロン炭素にも連結される。
【００５９】
他の具体例において、前述の化学式３ａないし３ｌの［アミノ酸］は、前記生理活性ポリペプチドの天然配列のＮ末端アミノ酸からアルファ−アミノ基を除いた部分であり、前述の化学式３ａないし３ｌのトリアゾール窒素が、前記Ｎ末端アミノ酸のアルファ炭素にも連結される。
【００６０】
一具体例において、前記生理活性ポリペプチド連結体は、下記の化学式４ａないし４ｎのうちいずれか１つの構造式を有する生理活性ポリペプチド連結体でもある：
【化４ａ】
2020508366.tif 000032
【化４ｂ】
2020508366.tif 000033
【化４ｃ】
2020508366.tif 000034
【化４ｄ】
2020508366.tif 000035
【化４ｅ】
2020508366.tif 000036
【化４ｆ】
2020508366.tif 000037
【化４ｇ】
2020508366.tif 000038
【化４ｈ】
2020508366.tif 000039
【化４ｉ】
2020508366.tif 000040
【化４ｊ】
2020508366.tif 000041
【化４ｋ】
2020508366.tif 000042
【化４ｌ】
2020508366.tif 000043
【化４ｍ】
2020508366.tif 000044
【化４ｎ】
2020508366.tif 000045
前述の化学式４ａないし４ｎで、
Ｒ１、ｊ及びｎは、前記化学式１ａで定義された通りであり、
［アミノ酸］は、天然状態の前記生理活性ポリペプチド配列を構成するアミノ酸のうちいずれか一つであるか、あるいはそれに属さない追加または置換されたアミノ酸である。
【００６１】
一具体例において、前述の化学式４ａないし４ｎの［アミノ酸］は、前記生理活性ポリペプチドの天然配列のリシン残基からイプシロン−アミノ基を除いた部分であり、前述の化学式４ａないし４ｎのトリアゾール窒素が、前記リシン側鎖のイプシロン炭素にも連結される。
【００６２】
他の具体例において、前述の化学式４ａないし４ｎの［アミノ酸］は、前記生理活性ポリペプチドの天然配列のＮ末端アミノ酸からアルファ−アミノ基を除いた部分であり、前述の化学式４ａないし４ｎのトリアゾール窒素が、前記Ｎ末端アミノ酸のアルファ炭素にも連結される。
【００６３】
本発明のさらに他の一様相は、前述の一様相による化合物の一末端の作用基Ｒ１を介して、生理活性ポリペプチドが結合されたものである生理活性ポリペプチド連結体を提供する。
【００６４】
本発明のさらに他の一様相は、前述の一様相による化合物の一末端の作用基Ｒ１に、免疫グロブリンＦｃ領域が結合されたものである免疫グロブリンＦｃ領域連結体を提供する。
【００６５】
前記生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンＦｃ領域は、任意部位のアミノ酸が、前述の化学式１または１ａの化合物のＲ１の作用基と共有結合がなされる。具体的には、２，５−ジオキソピロリジニル、２，５−ジオキソピロリル、アルデヒド、マレイミド、Ｃ６−Ｃ２０アリールジスルフィド、Ｃ５−Ｃ２０ヘテロアリールジスルフィド、ビニルスルホン、チオール、ハロゲン化アセトアミド、スクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、及びそれらの誘導体からなる群のうちから選択される作用基を含む脂肪族炭化水素基であるＲ１が、生理活性ポリペプチドまたは免疫グロブリンＦｃ領域の任意部位のアミノ酸の作用基（例：リシンのアミノ（−ＮＨ２）、プロリンのアミン（−ＮＨ−）、システインのチオール（−ＳＨ）など）、さらに具体的には、Ｎ末端のアミノ酸の作用基とも共有結合される。一具体例において、生理活性ポリペプチドのＮ末端が、アミン基またはアミノ基を有する場合、アルデヒド作用基を含むＲ１との還元的アミン化反応により、共有結合がなされる。本明細書において、用語「還元的アミン化反応」とは、反応物のアミン基またはアミノ基が、他反応物のアルデヒド（すなわち、還元的アミン化が可能な作用基）と反応してイミンを生成した後、還元反応によってアミン結合を形成させる反応を意味し、当該技術分野に周知されている有機合成反応である。
【００６６】
本発明の他の一様相は、前述の一様相による化合物をリンカーにして、生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンＦｃ領域が結合された生理活性ポリペプチド結合体を提供する。
【００６７】
本明細書において、用語「生理活性ポリペプチド結合体」は、生理活性ポリペプチドと免疫グロブリンＦｃ領域とが、前述の一様相による化合物をリンカーにして、１つの物質に結合された構造物を意味し、前記結合は、共有結合でもあるが、それに制限されるものではない。
【００６８】
前記生理活性ポリペプチド結合体は、前述の化学式１または１ａの化合物をリンカーにして、生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンＦｃ領域が結合された生理活性ポリペプチド結合体を含む。
【００６９】
該生理活性ポリペプチド結合体は、前記生理活性ポリペプチドが、前述の化学式１または１ａの化合物を含んだリンカー化合物の両末端のうち、任意の一末端に結合され、前記免疫グロブリンＦｃ領域が、前述の化学式１または１ａの化合物を含んだリンカー化合物の他の一末端にも結合される。
【００７０】
前記結合体において、生理活性ポリペプチドが、前述の化学式１または１ａの化合物を含んだリンカー化合物の任意末端に結合する方式は、前述の一様相による化合物の一末端の作用基Ｙを介して、あるいはＲ１を介して、前記生理活性ポリペプチド連結体で説明したような方式によって結合することができる。
【００７１】
前記結合体において、免疫グロブリンＦｃ領域が、前述の化学式１または１ａの化合物を含んだリンカー化合物の任意末端に結合する方式は、前述の一様相による化合物の一末端の作用基Ｙを介して、またはＲ１を介して、前記免疫グロブリンＦｃ領域連結体で説明したような方式によって結合することができる。
【００７２】
一具体例において、前記生理活性ポリペプチド結合体は、生理活性ポリペプチドにアジド基が導入された後、前記アジド基と、化学式１のＲ２のエチニレン基とが互いにクリック反応（click reaction）による環付加反応により、１，２，３−トリアゾールを形成することによって連結され、前記免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ酸が、化学式１の化合物のＲ１との共有結合によって結合されたものである生理活性ポリペプチド結合体でもある。他の具体例において、前記生理活性ポリペプチド結合体は、生理活性ポリペプチドにアジド基が導入された後、前記アジド基と、化学式１のＲ２のエチニレン基とが互いにクリック反応（click reaction）による環付加反応により、１，２，３−トリアゾールを形成することによって連結され、前記免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端のプロリンが、前記化学式１のＲ１との還元的アミン化反応により、アミン結合がなされた生理活性ポリペプチド結合体でもある。
【００７３】
一具体例において、前記生理活性ポリペプチド結合体は、下記の化学式５ａないし５ｌのうちいずれか１つの構造式を有した生理活性ポリペプチド結合体でもある：
【化５ａ】
2020508366.tif 000046
【化５ｂ】
2020508366.tif 000047
【化５ｃ】
2020508366.tif 000048
【化５ｄ】
2020508366.tif 000049
【化５ｅ】
2020508366.tif 000050
【化５ｆ】
2020508366.tif 000051
【化５ｇ】
2020508366.tif 000052
【化５ｈ】
2020508366.tif 000053
【化５ｉ】
2020508366.tif 000054
【化５ｊ】
2020508366.tif 000055
【化５ｋ】
2020508366.tif 000056
【化５ｌ】
2020508366.tif 000057
前述の化学式５ａないし５ｌで、
Ｒ３、Ｒ４、Ｚ、ｊ、ｋ、ｌ、ｍ、ｎ及びｐは、前記化学式１ａで定義された通りであり、
［アミノ酸］は、天然状態の前記生理活性ポリペプチド配列を構成するアミノ酸のうちいずれか一つであるか、あるいはそれに属さない追加または置換されたアミノ酸であり、
ｑは、１ないし６の整数である。
【００７４】
一具体例において、前述の化学式５ａないし５ｌの［アミノ酸］は、前記生理活性ポリペプチドの天然配列のリシン残基からイプシロン−アミノ基を除いた部分であり、前述の化学式５ａないし５ｌのトリアゾール窒素が、前記リシン側鎖のイプシロン炭素にも連結される。
【００７５】
他の具体例において、前述の化学式５ａないし５ｌの［アミノ酸］は、前記生理活性ポリペプチドの天然配列のＮ末端アミノ酸からアルファ−アミノ基を除いた部分であり、前述の化学式５ａないし５ｌのトリアゾール窒素が、前記Ｎ末端アミノ酸のアルファ炭素にも連結される。
【００７６】
一具体例において、前記生理活性ポリペプチド結合体は、下記の化学式６ａないし６ｎのうちいずれか１つの構造式を有する生理活性ポリペプチド結合体でもある：
【化６ａ】
2020508366.tif 000058
【化６ｂ】
2020508366.tif 000059
【化６ｃ】
2020508366.tif 000060
【化６ｄ】
2020508366.tif 000061
【化６ｅ】
2020508366.tif 000062
【化６ｆ】
2020508366.tif 000063
【化６ｇ】
2020508366.tif 000064
【化６ｈ】
2020508366.tif 000065
【化６ｉ】
2020508366.tif 000066
【化６ｊ】
2020508366.tif 000067
【化６ｋ】
2020508366.tif 000068
【化６ｌ】
2020508366.tif 000069
【化６ｍ】
2020508366.tif 000070
【化６ｎ】
2020508366.tif 000071
前述の化学式６ａないし６ｎで、
ｊ及びｎは、前記化学式１ａで定義された通りであり、
［アミノ酸］は、天然状態の前記生理活性ポリペプチド配列を構成するアミノ酸のうちいずれか一つであるか、あるいはそれに属さない追加または置換されたアミノ酸であり、
ｑは、１ないし６の整数である。
【００７７】
一具体例において、前述の化学式６ａないし６ｎの［アミノ酸］は、前記生理活性ポリペプチドの天然配列のリシン残基からイプシロン−アミノ基を除いた部分であり、前述の化学式６ａないし６ｎのトリアゾール窒素が、前記リシン側鎖のイプシロン炭素にも連結される。
【００７８】
他の具体例において、前述の化学式６ａないし６ｎの［アミノ酸］は、前記生理活性ポリペプチドの天然配列のＮ末端アミノ酸からアルファ−アミノ基を除いた部分であり、前述の化学式６ａないし６ｎのトリアゾール窒素が、前記Ｎ末端アミノ酸のアルファ炭素にも連結される。
【００７９】
本明細書において、用語「生理活性ポリペプチド」とは、生体内で、特に、人体内で生理活性を示すポリペプチド構造を有する任意の物質を意味し、当該ポリペプチドの生理活性を有するポリペプチドの前駆物質（precursors）、類似体（analogs）、誘導体（derivatives）、断片（fragments）または変異体（variants）なども含まれる概念である。
【００８０】
前記生理活性ポリペプチドは、ホルモン、サトカイン、酵素、抗体、成長因子、転写調節因子、血液因子、ワクチン、インシュリン分泌ペプチド、ニューロペプチド（neuropeptide）、脳下垂体ホルモン、抗肥満ペプチド、抗ウイルスペプチド、生理活性を有する非天然型ペプチド誘導体、構造蛋白質、及び受容体からなる群のうちからも選択されるが、それらに限定されるものではない。
【００８１】
前記生理活性ポリペプチドは、例えば、グルカゴン、ＧＩＰ（gastric inhibitory polypeptide）、キセニン（Xenin）、インシュリン、ＣＣＫ（cholecystokinin）、アミリン（amylin）、ガストリン（gastrin）、グレリン（ghrelin）、胃や腸で血糖及び体重を調節するインクレチン類（incretins）（例：ペプチドＹＹ（ＰＹＹ））、脂肪（adipose）から分泌されるアジポキン類（adipokines）（例：レプチン（leptin）、アジポネクチン（adiponectin）、アジポリン（adipolin）、アペリン（apelin）、カルトネクチン（cartonectin））、脳分泌ニューロペプチド類（neuropeptides）（例：キスペプチン（kisspeptin）、ネスファチン−１（nesfatin−１））、筋肉分泌ペプチドあるいは蛋白質類（例：イリシン（irisin）、ミオネクチン（myonectin）、デコリン（decorin）、フォリスタチン（follistatin）、マスクリン（musclin））、血管作用腸ペプチド（vasoactive intestinal peptide）、ナトリウム利尿ペプチド（natriuretic peptide）、ソマトスタチン、ＮＰＹ（neuropeptide Ｙ）、ＧＬＰ−１（glucagon−like peptide−１）、ＧＬＰ−２（glucagon−like peptide−２）、エキセンジン−４（exendin−４）、オキシントモジュリン（Oxyntomodulin）、線維芽細胞成長因子（fibroblast growth factor）、アンジオテンシン、ブレジキニン、カルシトニン、副腎皮質刺激ホルモン（corticotropin）、エレドイシン（eledoisin）、オキシトシン（oxytocin）、バソプレッシン（vasopressin）、黄体形成ホルモン、黄体刺激ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、濾胞刺激ホルモン、副甲状線ホルモン、セクレチン（secretin）、セルモレリン（sermorelin）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、成長ホルモン放出ペプチド、コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）類、インターフェロン（ＩＦＮ）類、インターフェロン受容体、インターロイキン（interleukin）類、インターロイキン受容体、インターロイキン結合蛋白質、プロラクチン放出ペプチド、オレキシン（orexin）、甲状腺放出ペプチド、コレシストキニン（cholecystokinin）、ガストリン抑制ペプチド、カルモジュリン、ガストリン遊離ペプチド（gastric releasing peptide）、モチリン（motilin）、血管活性腸管ペプチド（vasoactive intestinal peptide）、心房ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ：atrial natriuretic peptide）、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ：Ｂ−type natriuretic peptide）、Ｃ−型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ：Ｃ−type natriuretic peptide）、ニューロキニン（neurokinin）Ａ、ニューロメジン（neuromedin）、レニン（renin）、エンドセリン（endothelin）、サラホトキシンペプチド（sarafotoxin peptide）、カルソモルフィンペプチド（carsomorphin peptide）、デルモルフィン（dermorphin）、ダイノルフィン（dynorphin）、エンドルフィン（endorphin）、エンケファリン（enkepalin）、腫瘍懐死因子、腫瘍懐死因子受容体、ウロキナーゼ受容体、腫瘍抑制因子、コルラゲナーゼ抑制剤、チモポイエチン（thymopoietin）、チムリン（thymulin）、チモペンチン（thymopentin）、チモシン（tymosin）、胸腺体液性因子（thymichumoral factor）、アドレノモジュリン（adrenomodullin）、アラトスタチン（allatostatin）、アミロイドベータ−プロテイン断片（amyloid beta−protein fragment）、抗菌性ペプチド、抗酸化剤ペプチド、ボンベシン（bombesin）、オステオカルシン（osteocalcin）、ＣＡＲＴペプチド、Ｅ−セレクチン（Ｅ−selectin）、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ロイ���カイン（leucokine）、クリングル−５（kringle−５）、ラミニン（laminin）、インヒビン（inhibin）、ガラニン（galanin）、ピブロネクチン（fibronectin）、パンクレアスタチン（pancreastatin）、フゼオン（Fuzeon）、グルカコン−類似ペプチド、オキシントモジュリン、Ｇプロテイン関連受容体（Ｇ protein−coupled receptor）、酵素類、サトカイン結合蛋白質、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、蛋白質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞懐死糖蛋白質、免疫毒素、リンパ毒素、転移成長因子、アルファ−１アンチトリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン、アポリポ蛋白質−Ｅ、赤血球生成因子、高糖鎖化赤血球生成因子、アンジオポエチン類、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン、血液因子ＶＩＩ，ＶＩＩａ，ＶＩＩＩ，ＩＸ及びＸＩＩＩ、プラスミノーゲン活性因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、蛋白質Ｃ、Ｃ−反応性蛋白質、レニン抑制剤、スーパーオキサイドジスムターゼ、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンジオスタチン、骨形成成長因子、骨形成促進蛋白質、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子、組織因子経路抑制剤、神経成長因子、リラクシン、ソマトメジン、インシュリン類似成長因子、副腎皮質ホルモン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、細胞表面抗原、ウイルス由来ワクチン抗原、単一クローン抗体、多重クローン抗体及び抗体断片、赤血球増殖因子、白血球増殖因子、及びそれらの類似体（analogs）からなる群のうちからも選択されるが、それらに限定されるものではない。
【００８２】
一具体例において、前記生理活性ポリペプチドは、その種類を制限せず、例えば、国際公開公報ＷＯ２０１７−１１６２０５Ａ１に公開されたグルカゴン、ＧＬＰ−１受容体及びＧＩＰ受容体のいずれにも活性を有する三重活性体（triple agonist）；国際公開公報ＷＯ２０１７−００３１９１Ａ１に公開されたグルカゴン類似体（analog）などを含んでもよい。
【００８３】
一具体例において、前記生理活性ポリペプチドは、ＧＬＰ−２類似体を含んでもよい。例えば、前記ＧＬＰ−２類似体は、天然型ＧＬＰ−２のＣ末端に、チオール基（例えば、システイン）が導入され、２番目アミノ酸であるアラニンがグリシンで置換され、Ｎ末端最初アミノ酸であるヒスチジン残基のアルファ炭素が除去されたものであるＧＬＰ−２類似体；天然型ＧＬＰ−２のＣ末端にアミン基（例えば、リシン）が導入され、２番目アミノ酸であるアラニンがグリシンで置換され、Ｎ末端最初アミノ酸であるヒスチジン残基のアルファ炭素が除去されたものであるＧＬＰ−２類似体；天然型ＧＬＰ−２のＣ末端にアミン基（例えば、リシン）が導入され、天然型ＧＬＰ−２の２番目アミノ酸であるアラニンがグリシンで置換され、３０番目アミノ酸であるリシンがアルジニンで置換され、Ｎ末端最初アミノ酸であるヒスチジン残基のアルファ炭素が除去されたものであるＧＬＰ−２類似体；天然型ＧＬＰ−２のＣ末端にアジド基（例えば、アジドリシン）が導入され、２番目アミノ酸であるアラニンがグリシンで置換され、Ｎ末端最初アミノ酸であるヒスチジン残基のアルファ炭素が除去されたものであるＧＬＰ−２類似体などを含んでもよい。
【００８４】
本明細書において、用語「免疫グロブリンＦｃ領域」は、免疫グロブリン内において抗原に結合し、多くの配列上変異を有する可変領域を除いた固定配列を有する部分を意味し、当該部分は、補体系を活性化させ、胎盤を通過する能力を付与したり、各種免疫関連細胞が有する受容体に係わるリガンドと作用したりするというようなエフェクター機能を有することを特徴とし、「免疫グロブリン不変領域」と同一意味にも使用される。
【００８５】
具体的には、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖との可変領域、重鎖不変領域１（ＣＨ１）と軽鎖不変領域１（ＣＬ１）とを除いた、重鎖不変領域２（ＣＨ２）及び重鎖不変領域３（ＣＨ３）の部分を意味し、重鎖不変領域に、ヒンジ（hinge）部分を含みもする。また、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型と実質的に同等であるか、あるいはそれより向上した効果を有する限り、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖との可変領域だけを除き、一部または全体の重鎖不変領域１（ＣＨ１）及び／または軽鎖不変領域１（ＣＬ１）を含んだ拡張されたＦｃ領域でもある。また、ＣＨ２及び／またはＣＨ３に該当する相当に長い一部アミノ酸配列が除去された領域でもある。すなわち、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン、２）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、５）１個または２個以上のドメインと、免疫グロブリンヒンジ領域（または、ヒンジ領域の一部）との組み合わせ、または６）重鎖不変領域各ドメインと軽鎖不変領域との二量体でもある。
【００８６】
また、免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型アミノ酸配列だけではなく、その配列誘導体（mutant）を含んでもよい。本明細書において、用語「アミノ酸配列誘導体」とは、天然アミノ酸配列のうち１以上のアミノ酸残基が、欠失、挿入、非補填的置換または補填的置換、あるいはそれらの組み合わせにより、異なる配列を有することを意味する。例えば、ＩｇＧ Ｆｃの場合、結合に重要であると知られている２１４ないし２３８番アミノ酸残基、２９７ないし２９９番アミノ酸残基、３１８ないし３２２番アミノ酸残基、または３２７ないし３３１番アミノ酸残基が、変形のために適切な部位としても利用される。
【００８７】
また、免疫グロブリンＦｃ領域は、二硫化結合を形成することができる部位が除去されるか、あるいは天然型Ｆｃ領域から、Ｎ末端のいくつかのアミノ酸が除去されるか、あるいは天然型ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加されもするというように、多種の誘導体が可能である。また、エフェクター機能（effector function）をなくすために、補体結合部位、例えば、Ｃ１ｑ結合部位が除去されもし、ＡＤＣＣ（antibody dependent cell mediated cytotoxicity）部位が除去されもする。そのような免疫グロブリンＦｃ領域の配列誘導体の製造方法は、国際特許公開ＷＯ９７／３４６３１、国際特許公開ＷＯ９６／３２４７８などを参照することができる。
【００８８】
分子の活性を全体的に変更させない蛋白質及びペプチドでのアミノ酸交換は、当該分野に公知されている（H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979）。最も一般的に起こる交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ，Ｖａｌ／Ｉｌｅ，Ａｓｐ／Ｇｌｕ，Ｔｈｒ／Ｓｅｒ，Ａｌａ／Ｇｌｙ，Ａｌａ／Ｔｈｒ，Ｓｅｒ／Ａｓｎ，Ａｌａ／Ｖａｌ，Ｓｅｒ／Ｇｌｙ，Ｔｈｙ／Ｐｈｅ，Ａｌａ／Ｐｒｏ，Ｌｙｓ／Ａｒｇ，Ａｓｐ／Ａｓｎ，Ｌｅｕ／Ｉｌｅ，Ｌｅｕ／Ｖａｌ，Ａｌａ／Ｇｌｕ，Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。場合によっては、リン酸化（phosphorylation）、硫化（sulfation）、アクリル化（acrylation）、糖化（glycosylation）、メチル化（methylation）、ファルネシル化（farnesylation）、アセチル化（acetylation）及びアミル化（amidation）などによっても修飾（modification）される。
【００８９】
免疫グロブリンＦｃ領域の配列誘導体は、免疫グロブリンＦｃ領域と同一生物学的活性を示し、Ｆｃ領域の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性を増大させた誘導体でもある。前記Ｆｃ免疫グロブリン領域は、ヒト、牛、ヤギ、豚、マウス、ラビット、ハムスター、ラットまたはギニーピッグのような動物の生体内で分離した天然型からも得られ、形質転換された動物細胞または微生物から得られた組み換え型でもあり、あるいはそれらの誘導体でもある。ここで、天然型から獲得する方法は、全体免疫グロブリンを、ヒトまたは動物の生体から分離した後、蛋白質分解酵素を処理して獲得する方法でもある。パパインを処理する場合には、Ｆａｂ及びＦｃで切断し、ペプシンを処理する場合には、ｐＦ’ｃ及びＦ（ａｂ）２で切断する。それを大きさ排除クロマトグラフィ（size-exclusion chromatography）などを利用し、ＦｃまたはｐＦ’ｃを分離することができる。
【００９０】
一具体例において、免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒト由来のＦｃ領域を微生物から得られた組み換え型免疫グロブリンＦｃ領域でもある。
【００９１】
また、該免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型糖鎖、天然型に比べ、増大された糖鎖、天然型に比べ、低減された糖鎖、または糖鎖が除去された形態でもある。そのような免疫グロブリンＦｃ領域糖鎖の増減または除去には、化学的方法、酵素学的方法、及び微生物を利用した遺伝工学的方法のような一般的な方法が利用される。ここで、糖鎖が除去された免疫グロブリンＦｃ領域は、補体（ｃ１ｑ）との結合力が顕著に低下し、抗体依存性細胞毒性または補体依存性細胞毒性が低下または除去されるので、生体内において、不要な免疫反応を誘発しない。従って、薬物のキャリアとしての本来目的にさらに符合する形態は、糖鎖が除去されたり、非糖鎖化されたりする免疫グロブリンＦｃ領域でもある。
【００９２】
本明細書において、用語「糖鎖の除去（deglycosylation）」とは、酵素で糖を除去した免疫グロブリンＦｃ領域を言い、非糖鎖化（aglycosylation）は、原核動物、具体的には、大腸菌において生産し、糖鎖化されていない免疫グロブリンＦｃ領域を意味する。
【００９３】
該免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒト、牛、ヤギ、豚、マウス、ラビット、ハムスター、ラットまたはギニーピッグなどの動物起源でもあり、具体的には、ヒト起源でもある。
【００９４】
また、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＭ由来、あるいはそれらの組み合わせ（combination）、またはそれらの混成（hybrid）によるＦｃ領域でもある。具体的には、ヒト血液に最も豊富であるＩｇＧ由来またはＩｇＭ由来であり、最も具体的には、結合蛋白質の半減期を向上させると公知されたＩｇＧ由来である。
【００９５】
本明細書において、前記用語「組み合わせ（combination）」とは、二量体または多量体を形成するとき、同一起源一本鎖免疫グロブリンＦｃ領域を暗号化するポリペプチドが、異なる起源の一本鎖ポリペプチドと結合を形成することを意味する。すなわち、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＤ Ｆｃ及びＩｇＥのＦｃ断片からなる基から選択された２個以上の断片から、二量体または多量体の製造が可能である。
【００９６】
本明細書において、前記用語「ハイブリッド（hybrid）」とは、一本鎖の免疫グロブリンＦｃ領域内に、２個以上の異なる起源の免疫グロブリンＦｃ断片に該当する配列が存在することを意味する用語である。前記ハイブリッドは、さまざまな形態のハイブリッドが可能であり、すなわち、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＥＦｃ及びＩｇＤ ＦｃのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４からなる基から選択された１個ないし４個のドメインからなるドメインのハイブリッドが可能であり、選択的に、ヒンジを含んでもよい。
【００９７】
前記ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のサブクラスに分けることができ、それらの組み合わせ、またはそれらのハイブリッドが、免疫グロブリンＦｃ領域としても利用される。免疫グロブリンＦｃ領域は、具体的には、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４のサブクラスであり、最も具体的には、補体依存的毒性（ＣＤＣ：complement dependent cytotoxicity）のようなエフェクター機能（effector function）がほとんどないＩｇＧ４のＦｃ領域である。
【００９８】
一具体例において、免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４由来の非糖鎖化されたＦｃ領域でもある。ヒト由来のＦｃ領域は、ヒト生体で抗原として作用し、それに対する新たな抗体を生成するというような望ましくない免疫反応を起こしうる非ヒト由来のＦｃ領域に比べて望ましい。
【００９９】
本発明の他の一様相は、
生理活性ポリペプチドにアジド基を導入させる工程と、
前記アジド基と、下記化学式１の化合物のＲ２のエチニレン基（−Ｃ≡Ｃ−）とをクリック反応（click reaction）による環付加反応させ、１，２，３−トリアゾールを形成させることによって結合させる工程と、
免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ酸を、前記化学式１の化合物のＲ１と共有結合させる工程と、を含む、化学式１の化合物をリンカーにして、生理活性ポリペプチド及び免疫グロブリンＦｃ領域が結合された生理活性ポリペプチド結合体の製造方法を提供する：
【化１−２】
2020508366.tif 000072
前記化学式１で、
Ｒ１は、２，５−ジオキソピロリジニル、２，５−ジオキソピロリル、アルデヒド、マレイミド、Ｃ６−Ｃ２０アリールジスルフィド、Ｃ５−Ｃ２０ヘテロアリールジスルフィド、ビニルスルホン、チオール、ハロゲン化アセトアミド、スクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、及びそれらの誘導体からなる群のうちから選択される作用基を含む脂肪族炭化水素基であり、
Ｘは、−（ＣＨ２）ｊＮＨＣＯ−または−（ＣＨ２）ｊＮＨＣＳ−であり、ここで、ｊは、０ないし６の整数であり、
Ｒ２は、−（Ｒ３）ｋ−（Ｚ）ｌ−（Ｒ４）ｍ−（ＣＺ）ｐ−Ｙであり、ここで、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、Ｃ１−Ｃ６アルキレン、Ｃ６−Ｃ２０アリーレン、または１個ないし３個のＮ、Ｏ及びＳのうちから選択されたヘテロ原子を有するＣ５−Ｃ２０ヘテロアリーレンであり、Ｚは、ＯまたはＳであり、
Ｙは、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、シクロアルキニル、ビシクロアルキニル、アリールシクロアルキニル、ジアリールシクロアルキニル、ヘテロシクロアルキニルまたはジアリールヘテロシクロアルキニルであり（ここで、それぞれのシクロアルキニルは、３個ないし８個の炭素原子を有し、それぞれのアリールは、５個ないし８個の炭素原子を有し、それぞれのヘテロシクロアルキニルは、３個ないし８個の原子を含み、環原子のうち１個ないし３個に、Ｎ、Ｏ及びＳのうちから選択されたヘテロ原子を有する飽和環である）、
ｋ、ｌ、ｍ及びｐは、それぞれ独立して、０ないし３の整数であり、いずれも同時に０ではなく、
前述のアルキニル、シクロアルキニル、ビシクロアルキニル、アリールシクロアルキニル、ジアリールシクロアルキニル、ヘテロシクロアルキニルまたはジアリールヘテロシクロアルキニルは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシカルボニル、オキソまたはハロゲンで置換もしくは非置換のものでもある。
【０１００】
前記製造方法の詳細は、前述の本発明の一様相による生理活性ポリペプチド結合体に係わる前述の説明がそのまま適用される。
【０１０１】
前記生理活性ポリペプチドにアジド基を導入する方法は、有機化学分野に公知された方法によって遂行することができる。
【０１０２】
一具体例において、前記生理活性ポリペプチドのＣ末端位置のアミノ酸をリシンで置換させ、置換されたリシン位置にアジド基を導入することができる。
【０１０３】
一具体例において、前記生理活性ポリペプチドのＣ末端にアジドリシン（Ｎ３−リシン）を結合させることができる。
【０１０４】
前記アジド基と、下記化学式１の化合物のＲ２のエチニレン基とのクリック反応（click reaction）による環付加反応は、Ｒ２の構造により、有機化学分野に広く公知されたＣｕＡＡＣ（copper（Ｉ）−catalyzed azide−alkyne cycloaddition）反応またはＳＰＡＡＣ（strain-promoted azide-alkyne cycloaddition）反応により、環付加反応が行われる。前記Ｒ２のＹがＣ２−Ｃ６アルキニルである場合、一価銅触媒の存在下で反応させるＣｕＡＡＣにより、クリック反応を行うことができ、前記Ｒ２のＹが、シクロアルキニル、アリールシクロアルキニル、ヘテロシクロアルキニル、アリールヘテロシクロアルキニル、ジアリールシクロアルキニルまたはジアリールヘテロシクロアルキニルのような環構造である場合、一価銅触媒の不在下で反応させるＳＰＡＡＣ反応により、環付加反応が行われる。
【０１０５】
前記生理活性ポリペプチドのアジド基と、化学式１の化合物のＲ２のエチニレン基とのクリック反応工程において、生理活性ポリペプチドと、化学式１の化合物との反応モル比は、１：１ないし１：２０の範囲で選択される比率でもあるが、それに限定されるものではない。一具体例において、生理活性ポリペプチドと、化学式１の化合物との反応モル比は、１：２ないし１：２０でもある。
【０１０６】
前記免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ酸を、前記化学式１の化合物のＲ１と共有結合させる工程においては、２，５−ジオキソピロリジニル、２，５−ジオキソピロリル、アルデヒド、マレイミド、Ｃ６−Ｃ２０アリールジスルフィド、Ｃ５−Ｃ２０ヘテロアリールジスルフィド、ビニルスルホン、チオール、ハロゲン化アセトアミド、スクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、及びそれらの誘導体からなる群のうちから選択される作用基を含む脂肪族炭化水素基であるＲ１が、免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端のアミノ酸のアミン基、アミノ基またはチオール基のような作用基とも共有結合される。一具体例において、免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ酸のアミン基またはアミノ基は、アルデヒド作用基を含むＲ１との還元的アミン化反応により、共有結合がなされる。一具体例において、前記免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端のアミノ酸を、化学式１の化合物のＲ１と共有結合させることができる。
【０１０７】
前記免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ酸を、前記化学式１の化合物のＲ１と共有結合させる工程において、生理活性ポリペプチドと結合された化学式１の化合物と、免疫グロブリンＦｃとの反応モル比は、１：１ないし１：２０の範囲で選択される比率でもあるが、それに限定されるものではない。一具体例において、生理活性ポリペプチドと結合された化学式１の化合物と、免疫グロブリンＦｃとの反応モル比は、１：２ないし１：２０でもある。
【０１０８】
本発明のさらに他の一様相は、前記化学式１の化合物、その立体異性体、溶媒化物、及び薬剤学的に許容可能な塩のうちから選択された化合物を、生理活性ポリペプチド連結体を製造するために使用する方法を提供する。すなわち、前記化学式１の化合物などにより、生理活性ポリペプチド連結体を製造するための用途を提供する。
【０１０９】
本発明のさらに他の一様相は、前記化学式１の化合物、その立体異性体、溶媒化物、及び薬剤学的に許容可能な塩のうちから選択された化合物を、生理活性ポリペプチド接合体を製造するためにリンカーとして使用する方法を提供する。すなわち、前記化学式１の化合物などを、生理活性ポリペプチド結合体を製造するためのリンカーとする用途を提供する。
【０１１０】
以下、本発明を実施例を介して、さらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例に限定されるものではない。
【０１１１】
実施例１：リンカー化合物の製造（１）
【化７】
2020508366.tif 000073
【０１１２】
１−１：化合物２（ＭＷ＝１０，０００）の製造
反応容器に、化合物１（ＭＷ＝１０，０００）２０ｇとジクロロメタン６０ｍＬとを投入した。反応温度を１０℃以下に維持しながら、トリエチルアミン１．１１ｇとメタンスルホニルクロリド１．１５ｇを添加した後、室温で３時間撹拌した。反応完結後、水１００ｍＬとジクロロメタン４０ｍＬとを投入し、５分間撹拌した。有機層を分離した後、水層にさらにジクロロメタン１００ｍＬを投入し、追加抽出した。有機層を集め、水１００ｍＬで洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して残った濾液を減圧蒸溜した。濃縮液に、ジクロロメタン２０ｍＬを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテル３００ｍＬを２０分間滴加した。生成された結晶を濾過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥させ、目的化合物である化合物（２）（ＭＷ＝１０，０００）１７．２ｇを得た。
【０１１３】
１−２：化合物３（ＭＷ＝１０，０００）の製造
反応容器に、アンモニア水溶液２００ｍＬと塩化アンモニウム２０ｇとを投入した。化合物２（ＭＷ＝１０，０００）１０ｇを添加した後、室温で４日間撹拌した。反応完結後、ジクロロメタン２００ｍＬを投入し、５分間撹拌した。有機層を分離した後、水層にさらにジクロロメタン２００ｍＬを投入し、追加抽出した。有機層を集め、水２００ｍＬで洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して残った濾液を減圧蒸溜した。濃縮液にジクロロメタン１０ｍＬを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテル１５０ｍＬを２０分間滴加した。生成された結晶を濾過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥させ、目的化合物である化合物（３）（ＭＷ＝１０，０００）８．５ｇを得た。
【０１１４】
１−３：化合物５（ＭＷ＝１０，０００）の製造
反応容器に、化合物３（ＭＷ＝１０，０００）１．６６ｇとジクロロメタン１７ｍＬとを投入した。化合物４ ２００ｍｇ、トリエチルアミン５０ｍｇを添加した後、室温で３時間撹拌した。反応完結後、溶媒を減圧蒸溜し、水３５ｍＬを投入して溶解させた。酢酸エチル（３５ｍＬｘ３）を投入し、５分撹拌後、水層を分離し、ジクロロメタン３５ｍＬを利用して２回抽出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して減圧蒸溜した。濃縮液にジクロロメタン２ｍＬを投入して溶かした後、メチルｔ−ブチルエーテル３０ｍＬを２０分間滴加した。生成された結晶を濾過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、窒素乾燥させ、目的化合物である化合物（５）（ＭＷ＝１０，０００）１．０ｇを得た。
【０１１５】
１−４：化合物６（ＭＷ＝１０，０００）の製造
反応容器に、化合物５（ＭＷ＝１０，０００）０．８ｇと蒸溜水１４．４ｍＬとを投入した。０．１Ｎ ＨＣｌ １．６ｍＬを添加し、室温で２時間撹拌した後、ＮＭＲを利用し、反応完結を確認した。反応液を５％（ｗ／ｖ）重曹水溶液で中和し、ジクロロメタン２０ｍＬを利用して２回抽出した。硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して減圧蒸溜した。濃縮液に、ジクロロメタン１ｍＬを投入して溶かした後、メチルｔ−ブチルエーテル１５ｍＬを２０分間滴加した。生成された結晶を濾過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、窒素乾燥させ、目的化合物である化合物（６）（ＭＷ＝１０，０００）４９８ｍｇを得た。化合物６（ＭＷ＝１０，０００）は、ＡＬＤ−ＰＥＧ １０Ｋ−ＤＢＣＯと命名した。図１は、リンカー化合物６（ＭＷ＝１０，０００）の１Ｈ ＮＭＲ結果である。
【０１１６】
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ） δ ９．７８（ｓ，１Ｈ）、７．６５（ｄ，１Ｈ）、７．５１（ｄ，１Ｈ）、７．３８−７．２５（ｍ，６Ｈ）、６．１１（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、５．１４（ｄ，１Ｈ）、３．８５−３．４３（ｍ，９１５Ｈ）、３．３１（ｍ，２Ｈ）、２．８０（ｍ，１Ｈ）、２．６７（ｔ，２Ｈ）、２．４５（ｍ，１Ｈ）、２．１５（ｍ，１Ｈ）、１．９３（ｍ，１Ｈ）
【０１１７】
実施例２：リンカー化合物の製造（２）
２−１：化合物２（ＭＷ＝５，０００）の製造
反応容器に、化合物１（ＭＷ＝５，０００）２０ｇとジクロロメタン６０ｍＬとを投入した。反応温度を１０℃以下に維持しながら、トリエチルアミン２．２３ｇとメタンスルホニルクロリド２．２９ｇとを添加した後、室温で３時間撹拌した。反応完結後、水１００ｍＬとジクロロメタン４０ｍＬとを投入し、５分間撹拌した。有機層を分離した後、水層にさらにジクロロメタン１００ｍＬを投入し、追加抽出した。有機層を集め、水１００ｍＬで洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して残った濾液を減圧蒸溜した。濃縮液に、ジクロロメタン２０ｍＬを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテル３００ｍＬを２０分間滴加した。生成された結晶を濾過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥させ、目的化合物である化合物（２）（ＭＷ＝５，０００）１６．２ｇを得た。
【０１１８】
２−２：化合物３（ＭＷ＝５，０００）の製造
反応容器に、アンモニア水溶液２００ｍＬと塩化アンモニウム２０ｇとを投入した。化合物２（ＭＷ＝５，０００）１０ｇを添加した後、室温で４日間撹拌した。反応完結後、ジクロロメタン２００ｍＬを投入し、５分間撹拌した。有機層を分離した後、水層にさらにジクロロメタン２００ｍＬを投入し、追加抽出した。有機層を集め、水２００ｍＬで洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して残った濾液を減圧蒸溜した。濃縮液に、ジクロロメタン１０ｍＬを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテル１５０ｍＬを２０分間滴加した。生成された結晶を濾過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥させ、目的化合物である化合物（３）（ＭＷ＝５，０００）８．１ｇを得た。
【０１１９】
２−３：化合物５（ＭＷ＝５，０００）の製造
反応容器に、化合物３（ＭＷ＝５，０００）２ｇとジクロロメタン２０ｍＬとを投入した。化合物４ ４８３ｍｇ、トリエチルアミン１２２ｍｇを添加した後、室温で３時間撹拌した。反応完結後、溶媒を減圧蒸溜し、水３０ｍＬを投入して溶解させた。酢酸エチル（３０ｍＬｘ３）を投入し、５分撹拌後、水層を分離し、ジクロロメタン３０ｍＬを利用して２回抽出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して減圧蒸溜した。濃縮液に、ジクロロメタン２ｍＬを投入して溶かした後、メチルｔ−ブチルエーテル３０ｍＬを２０分間滴加した。生成された結晶を濾過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、窒素乾燥させ、目的化合物である化合物（５）（ＭＷ＝５，０００）１．２ｇを得た。
【０１２０】
２−４：化合物６（ＭＷ＝５，０００）の製造
反応容器に、化合物５（ＭＷ＝１０，０００）０．８ｇと蒸溜水１４．４ｍＬとを投入した。０．１Ｎ ＨＣｌ １．６ｍＬを添加し、室温で２時間撹拌した後、ＮＭＲを利用し、反応完結を確認した。反応液を５％（ｗ／ｖ）重曹水溶液で中和し、ジクロロメタン２０ｍＬを利用して２回抽出した。硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して減圧蒸溜した。濃縮液に、ジクロロメタン１ｍＬを投入して溶かした後、メチルｔ−ブチルエーテル１５ｍＬを２０分間滴加した。生成された結晶を濾過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、窒素乾燥させ、目的化合物である化合物（６）（ＭＷ＝５，０００）５００ｍｇを得た。化合物６（ＭＷ＝５，０００）は、ＡＬＤ−ＰＥＧ ５Ｋ−ＤＢＣＯと命名した。図２は、リンカー化合物６（ＭＷ＝５，０００）の１Ｈ ＮＭＲ結果である。
【０１２１】
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ） δ ９．７８（ｓ，１Ｈ）、７．６６（ｄ，１Ｈ）、７．５０（ｄ，１Ｈ）、７．４０−７．２５（ｍ，６Ｈ）、６．１０（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、５．１３（ｄ，１Ｈ）、３．８２−３．４１（ｍ，４５９Ｈ）、３．３２（ｍ，２Ｈ）、２．８０（ｍ，１Ｈ）、２．６７（ｔ，２Ｈ）、２．４５（ｍ，１Ｈ）、２．１６（ｍ，１Ｈ）、１．９２（ｍ，１Ｈ）
【０１２２】
実施例３：リンカー化合物の製造（３）
３−１：化合物２（ＭＷ＝３４００）の製造
反応容器に、化合物１（ＭＷ＝３，４００）２０ｇとジクロロメタン６０ｍＬとを投入した。反応温度を１０℃以下に維持しながら、トリエチルアミン３．２７ｇとメタンスルホニルクロリド３．３７ｇとを添加した後、室温で３時間撹拌した。反応完結後、水１００ｍＬとジクロロメタン４０ｍＬとを投入し、５分間撹拌した。有機層を分離した後、水層にさらにジクロロメタン１００ｍＬを投入し、追加抽出した。有機層を集め、水１００ｍＬで洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して残った濾液を減圧蒸溜した。濃縮液に、ジクロロメタン４０ｍＬを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテル４００ｍＬを２０分間滴加した。生成された結晶を濾過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥させ、目的化合物である化合物（２）（ＭＷ＝３，４００）１７．１ｇを得た。
【０１２３】
３−２：化合物３（ＭＷ＝３，４００）の製造
反応容器に、アンモニア水溶液２００ｍＬと塩化アンモニウム２０ｇとを投入した。化合物２（ＭＷ＝３，４００）１０ｇを添加した後、室温で４日間撹拌した。反応完結後、ジクロロメタン２００ｍＬを投入し、５分間撹拌した。有機層を分離した後、水層にさらにジクロロメタン２００ｍＬを投入し、追加抽出した。有機層を集め、蒸溜水２００ｍＬで洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して残った濾液を減圧蒸溜した。濃縮液に、ジクロロメタン２０ｍＬを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテル２００ｍＬを２０分間滴加した。生成された結晶を濾過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥させ、目的化合物である化合物（３）（ＭＷ＝３，４００）８．７ｇを得た。
【０１２４】
３−３：化合物５（ＭＷ＝３，４００）の製造
反応容器に、化合物３（ＭＷ＝３，４００）１．７ｇとジクロロメタン１７ｍＬとを投入した。化合物４ ６０４ｍｇ、トリエチルアミン１５２ｍｇを添加した後、室温で３時間撹拌した。反応完結後、溶媒を減圧蒸溜し、水３５ｍＬを投入して溶解させた。酢酸エチル（３５ｍＬｘ３）を投入し、５分撹拌後、水層を分離し、ジクロロメタン３５ｍＬを利用して２回抽出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して減圧蒸溜した。濃縮液に、ジクロロメタン３．５ｍＬを投入して溶かした後、メチルｔ−ブチルエーテル３５ｍＬを２０分間滴加した。生成された結晶を濾過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、窒素乾燥させ、目的化合物である化合物（５）（ＭＷ＝３，４００）１．１ｇを得た。
【０１２５】
３−４：化合物６（ＭＷ＝３，４００）の製造
反応容器に、化合物５（ＭＷ＝１０，０００）０．９ｇと蒸溜水１６．２ｍＬとを投入した。０．１Ｎ ＨＣｌ １．８ｍＬを添加し、室温で２時間撹拌した後、ＮＭＲを利用し、反応完結を確認した。反応液を５％（ｗ／ｖ）重曹水溶液で中和し、ジクロロメタン２０ｍＬを利用して２回抽出した。硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して減圧蒸溜した。濃縮液に、ジクロロメタン２ｍＬを投入して溶かした後、メチルｔ−ブチルエーテル２０ｍＬを２０分間滴加した。生成された結晶を濾過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、窒素乾燥させ、目的化合物である化合物（６）（ＭＷ＝３，４００）５９０ｍｇを得た。化合物６（ＭＷ＝５，０００）は、ＡＬＤ−ＰＥＧ ３．４Ｋ−ＤＢＣＯと命名した。図３は、リンカー化合物６（ＭＷ＝３，４００）の１Ｈ ＮＭＲ結果である。
【０１２６】
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ） δ ９．７７（ｓ，１Ｈ）、７．６５（ｄ，１Ｈ）、７．５０（ｄ，１Ｈ）、７．３８−７．２４（ｍ，６Ｈ）、６．１１（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、５．１３（ｄ，１Ｈ）、３．８０−３．３９（ｍ，３１５Ｈ）、３．３２（ｍ，２Ｈ）、２．８０（ｍ，１Ｈ）、２．６６（ｔ，２Ｈ）、２．４４（ｍ，１Ｈ）、２．１５（ｍ，１Ｈ）、１．９２（ｍ，１Ｈ）
【０１２７】
実施例４：リンカー化合物の製造（４）
４−１：化合物２（ＭＷ＝２，０００）の製造
反応容器に、化合物１（ＭＷ＝２，０００）２９．３ｇとジクロロメタン９０ｍＬとを投入した。反応温度を１０℃以下に維持しながら、トリエチルアミン８．２ｇとメタンスルホニルクロリド８．４ｇとを添加した後、室温で３時間撹拌した。反応完結後、水１５０ｍＬとジクロロメタン６０ｍＬとを投入し、５分間撹拌した。有機層を分離した後、水層にさらにジクロロメタン１５０ｍＬを投入し、追加抽出した。有機層を集め、水１５０ｍＬで洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して残った濾液を減圧蒸溜した。濃縮液に、ジクロロメタン３０ｍＬを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテル９００ｍＬを２０分間滴加した。生成された結晶を濾過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥させ、目的化合物である化合物（２）（ＭＷ＝２，０００）２３．０ｇを得た。
【０１２８】
４−２：化合物３（ＭＷ＝２，０００）の製造
反応容器に、アンモニア水溶液２００ｍＬと塩化アンモニウム２０ｇとを投入した。化合物２（ＭＷ＝２，０００）１０ｇを添加した後、室温で４日間撹拌した。反応完結後、ジクロロメタン２００ｍＬを投入し、５分間撹拌した。有機層を分離した後、水層にさらにジクロロメタン２００ｍＬを投入し、追加抽出した。有機層を集め、蒸溜水２００ｍＬで洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して残った濾液を減圧蒸溜した。濃縮液に、ジクロロメタン１０ｍＬを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテル３００ｍＬを２０分間滴加した。生成された結晶を濾過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥させ、目的化合物である化合物（３）（ＭＷ＝２，０００）８．１ｇを得た。
【０１２９】
４−３：化合物５（ＭＷ＝２，０００）の製造
反応容器に、化合物３（ＭＷ＝２，０００）１．５ｇとジクロロメタン１５ｍＬとを投入した。化合物４ ９０５ｍｇ、トリエチルアミン２２８ｍｇを添加した後、室温で３時間撹拌した。反応完結後、溶媒を減圧蒸溜し、水３０ｍＬを投入して溶解させた。酢酸エチル（３０ｍＬｘ３）を投入し、５分撹拌後、水層を分離し、ジクロロメタン３０ｍＬを利用して２回抽出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して減圧蒸溜した。濃縮液に、ジクロロメタン２ｍＬを投入して溶かした後、メチルｔ−ブチルエーテル６０ｍＬを２０分間滴加した。生成された結晶を濾過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、窒素乾燥させ、目的化合物である化合物（５）（ＭＷ＝２，０００）１．０ｇを得た。
【０１３０】
４−４：化合物６（ＭＷ＝２，０００）の製造
反応容器に、化合物５（ＭＷ＝１０，０００）０．６５ｇと蒸溜水１２．６ｍＬとを投入した。０．１Ｎ ＨＣｌ １．６ｍＬを添加し、室温で２時間撹拌した後、ＮＭＲを利用し、反応完結を確認した。反応液を５％（ｗ／ｖ）重曹水溶液で中和し、ジクロロメタン２０ｍＬを利用して２回抽出した。硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して減圧蒸溜した。濃縮液に、ジクロロメタン１ｍＬを投入して溶かした後、メチルｔ−ブチルエーテル３０ｍＬを２０分間滴加した。生成された結晶を濾過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、窒素乾燥させ、目的化合物である化合物（６）（ＭＷ＝２，０００）４１０ｍｇを得た。化合物６（ＭＷ＝２，０００）は、ＡＬＤ−ＰＥＧ ２Ｋ−ＤＢＣＯと命名した。図４は、リンカー化合物６（ＭＷ＝２，０００）の１Ｈ ＮＭＲ結果である。
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ） δ ９．７８（ｓ，１Ｈ）、７．６５（ｄ，１Ｈ）、７．５１（ｄ，１Ｈ）、７．３８−７．２４（ｍ，６Ｈ）、６．１１（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、５．１３（ｄ，１Ｈ）、３．８２−３．３７（ｍ，１８７Ｈ）、３．３２（ｍ，２Ｈ）、２．６７（ｍ，１Ｈ）、２．６７（ｔ，２Ｈ）、２．４５（ｍ，１Ｈ）、２．１５（ｍ，１Ｈ）、１．９３（ｍ，１Ｈ）
【０１３１】
実施例５：リンカー化合物の製造（５）
【化８】
2020508366.tif 000074
【０１３２】
５−１：化合物２（ＭＷ＝１０，０００）の製造
前記実施例１−１と同一方法を遂行し、化合物２（ＭＷ＝１０，０００）を得た。
【０１３３】
５−２：化合物３（ＭＷ＝１０，０００）の製造
前記実施例１−２と同一方法を遂行し、化合物３（ＭＷ＝１０，０００）を得た。
【０１３４】
５−３：化合物８（ＭＷ＝１０，０００）の製造
反応容器に、化合物３（ＭＷ＝１０，０００）１．７６ｇとジクロロメタン１７ｍＬとを投入した。化合物７ １５４ｍｇ、トリエチルアミン５４ｍｇを添加した後、室温で３時間撹拌した。反応完結後、溶媒を減圧蒸溜し、蒸溜水３５ｍＬを投入して溶解させた。酢酸エチル（３５ｍＬｘ３）を投入し、５分撹拌後、水層を分離し、ジクロロメタン３５ｍＬを利用して２回抽出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して減圧蒸溜した。濃縮液に、ジクロロメタン２ｍＬを投入して溶かした後、メチルｔ−ブチルエーテル３０ｍＬを２０分間滴加した。生成された結晶を濾過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、窒素乾燥させ、目的化合物である化合物（８）（ＭＷ＝１０，０００）１．０ｇを得た。
【０１３５】
５−４：化合物９（ＭＷ＝１０，０００）の製造
反応容器に、化合物５（ＭＷ＝１０，０００）０．４ｇと蒸溜水７．２ｍＬとを投入した。０．１Ｎ ＨＣｌ ０．８ｍＬを添加し、室温で２時間撹拌した後、ＮＭＲを利用し、反応完結を確認した。反応液を５％（ｗ／ｖ）重曹水溶液で中和し、ジクロロメタン１０ｍＬを利用して２回抽出した。硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して減圧蒸溜した。濃縮液に、ジクロロメタン１ｍＬを投入して溶かした後、メチルｔ−ブチルエーテル１５ｍＬを２０分間滴加した。生成された結晶を濾過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、窒素乾燥させ、目的化合物である化合物（９）（ＭＷ＝１０，０００）２６０ｍｇを得た。化合物９（ＭＷ＝１０，０００）は、ＡＬＤ−ＰＥＧ １０Ｋ−ＢＣＮと命名した。図５は、リンカー化合物９（ＭＷ＝１０，０００）の１Ｈ ＮＭＲ結果である。
【０１３６】
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ） δ ９．７８（ｓ，１Ｈ）、５．２３（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、４．１３（ｄ，２Ｈ）、３．８１−３．４１（ｍ，９１４Ｈ）、３．３６（ｍ，２Ｈ）、２．６７（ｔ，２Ｈ）、２．２６−２．１８（ｍ，６Ｈ）、１．５７（ｍ，２Ｈ）、１．３５（ｍ，１Ｈ）、０．９３（ｍ，２Ｈ）
【０１３７】
実施例６：リンカー化合物の製造（６）
６−１：化合物２（ＭＷ＝５，０００）の製造
前記実施例２−１と同一方法を遂行し、化合物２（ＭＷ＝５，０００）を得た。
【０１３８】
６−２：化合物３（ＭＷ＝５，０００）の製造
前記実施例２−２と同一方法を遂行し、化合物３（ＭＷ＝５，０００）を得た。
【０１３９】
６−３：化合物８（ＭＷ＝５，０００）の製造
反応容器に、化合物３（ＭＷ＝５，０００）３ｇとジクロロメタン３０ｍＬとを投入した。化合物７ ５２４ｍｇ、トリエチルアミン１８２ｍｇを添加した後、室温で３時間撹拌した。反応完結後、溶媒を減圧蒸溜し、水３０ｍＬを投入して溶解させた。酢酸エチル（３０ｍＬｘ３）を投入し、５分撹拌後、水層を分離し、ジクロロメタン３０ｍＬを利用して２回抽出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して減圧蒸溜した。濃縮液に、ジクロロメタン３ｍＬを投入して溶かした後、メチルｔ−ブチルエーテル４５ｍＬを２０分間滴加した。生成された結晶を濾過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、窒素乾燥させ、目的化合物である化合物（８）（ＭＷ＝５，０００）２．０ｇを得た。
【０１４０】
６−４：化合物９（ＭＷ＝５，０００）の製造
反応容器に、化合物５（ＭＷ＝５，０００）１．７ｇと蒸溜水３０．６ｍＬとを投入した。０．１Ｎ ＨＣｌ ３．４ｍＬを添加し、室温で２時間撹拌した後、ＮＭＲを利用し、反応完結を確認した。反応液を５％（ｗ／ｖ）重曹水溶液で中和し、ジクロロメタン３４ｍＬを利用して２回抽出した。硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して減圧蒸溜した。濃縮液に、ジクロロメタン２ｍＬを投入して溶かした後、メチルｔ−ブチルエーテル３０ｍＬを２０分間滴加した。生成された結晶を濾過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、窒素乾燥させ、目的化合物である化合物（９）（ＭＷ＝５，０００）１．２５ｇを得た。化合物９（ＭＷ＝５，０００）は、ＡＬＤ−ＰＥＧ ５Ｋ−ＢＣＮと命名した。
【０１４１】
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ） δ ９．７８（ｓ，１Ｈ）、５．２６（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、４．１５（ｄ，２Ｈ）、３．８１−３．４１（ｍ，４５８Ｈ）、３．３６（ｍ，２Ｈ）、２．６８（ｔ，２Ｈ）、２．２６−２．１８（ｍ，６Ｈ）、１．５７（ｍ，２Ｈ）、１．３７（ｍ，１Ｈ）、０．９３（ｍ，２Ｈ）
【０１４２】
実施例７：リンカー化合物の製造（７）
７−１：化合物２（ＭＷ＝３，４００）の製造
前記実施例３−１と同一方法を遂行し、化合物２（ＭＷ＝３，４００）を得た。
【０１４３】
７−２：化合物３（ＭＷ＝３，４００）の製造
前記実施例３−２と同一方法を遂行し、化合物３（ＭＷ＝３，４００）を得た。
【０１４４】
７−３：化合物８（ＭＷ＝３，４００）の製造
反応容器に、化合物３（ＭＷ＝３，４００）２．５ｇとジクロロメタン５０ｍＬとを投入した。化合物７ ６４３ｍｇ、トリエチルアミン２２３ｍｇを添加した後、室温で３時間撹拌した。反応完結後、溶媒を減圧蒸溜し、水５０ｍＬを投入して溶解させた。酢酸エチル（５０ｍＬｘ３）を投入し、５分撹拌後、水層を分離し、ジクロロメタン５０ｍＬを利用して２回抽出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して減圧蒸溜した。濃縮液に、ジクロロメタン５ｍＬを投入して溶かした後、メチルｔ−ブチルエーテル５０ｍＬを２０分間滴加した。生成された結晶を濾過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、窒素乾燥させ、目的化合物である化合物（８）（ＭＷ＝３，４００）１．４ｇを得た。
【０１４５】
７−４：化合物９（ＭＷ＝３，４００）の製造
反応容器に、化合物５（ＭＷ＝３，４００）１ｇと蒸溜水１８ｍＬとを投入した。０．１Ｎ ＨＣｌ ２ｍＬを添加し、室温で２時間撹拌した後、ＮＭＲを利用し、反応完結を確認した。反応液を５％（ｗ／ｖ）重曹水溶液で中和し、ジクロロメタン２０ｍＬを利用して２回抽出した。硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して減圧蒸溜した。濃縮液に、ジクロロメタン２ｍＬを投入して溶かした後、メチルｔ−ブチルエーテル２０ｍＬを２０分間滴加した。生成された結晶を濾過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、窒素乾燥させ、目的化合物である化合物（９）（ＭＷ＝３，４００）６３０ｍｇを得た。化合物９（ＭＷ＝３，４００）は、ＡＬＤ−ＰＥＧ ３．４Ｋ−ＢＣＮと命名した。
【０１４６】
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ） δ ９．７８（ｓ，１Ｈ）、５．２６（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、４．１５（ｄ，２Ｈ）、３．８１−３．４１（ｍ，３１４Ｈ）、３．３６（ｍ，２Ｈ）、２．６８（ｔ，２Ｈ）、２．２６−２．１８（ｍ，６Ｈ）、１．５７（ｍ，２Ｈ）、１．３７（ｍ，１Ｈ）、０．９３（ｍ，２Ｈ）
【０１４７】
実施例８：リンカー化合物の製造（８）
８−１：化合物２（ＭＷ＝２，０００）の製造
前記実施例４−１と同一方法を遂行し、化合物２（ＭＷ＝２，０００）を得た。
【０１４８】
８−２：化合物３（ＭＷ＝２，０００）の製造
前記実施例４−２と同一方法を遂行し、化合物３（ＭＷ＝２，０００）を得た。
【０１４９】
８−３：化合物８（ＭＷ＝２，０００）の製造
反応容器に、化合物３（ＭＷ＝２，０００）１．５ｇとジクロロメタン３０ｍＬとを投入した。化合物７ ６５５ｍｇ、トリエチルアミン２３０ｍｇを添加した後、室温で３時間撹拌した。反応完結後、溶媒を減圧蒸溜し、水３０ｍＬを投入して溶解させた。酢酸エチル（３０ｍＬｘ３）を投入し、５分撹拌後、水層を分離し、ジクロロメタン３０ｍＬを利用して２回抽出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して減圧蒸溜した。濃縮液に、ジクロロメタン３ｍＬを投入して溶かした後、メチルｔ−ブチルエーテル９０ｍＬを２０分間滴加した。生成された結晶を濾過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、窒素乾燥させ、目的化合物である化合物（８）（ＭＷ＝２，０００）９００ｍｇを得た。
【０１５０】
８−４：化合物９（ＭＷ＝２，０００）の製造
反応容器に、化合物５（ＭＷ＝２，０００）０．８ｇと蒸溜水１４．４ｍＬとを投入した。０．１Ｎ ＨＣｌ １．６ｍＬを添加し、室温で２時間撹拌した後、ＮＭＲを利用し、反応完結を確認した。反応液を５％（ｗ／ｖ）重曹水溶液で中和し、ジクロロメタン２０ｍＬを利用して２回抽出した。硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して減圧蒸溜した。濃縮液に、ジクロロメタン２ｍＬを投入して溶かした後、メチルｔ−ブチルエーテル６０ｍＬを２０分間滴加した。生成された結晶を濾過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、窒素乾燥させ、目的化合物である化合物（９）（ＭＷ＝２，０００）５４９ｍｇを得た。化合物９（ＭＷ＝２，０００）は、ＡＬＤ−ＰＥＧ ２Ｋ−ＢＣＮと命名した。
【０１５１】
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ） δ ９．７８（ｓ，１Ｈ）、５．２６（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、４．１５（ｄ，２Ｈ）、３．８１−３．４１（ｍ，１８６Ｈ）、３．３６（ｍ，２Ｈ）、２．６８（ｔ，２Ｈ）、２．２６−２．１８（ｍ，６Ｈ）、１．５７（ｍ，２Ｈ）、１．３７（ｍ，１Ｈ）、０．９３（ｍ，２Ｈ）
【０１５２】
実施例９：リンカー化合物の製造（９）
【化９】
2020508366.tif 000075
【０１５３】
９−１：化合物１１（ＭＷ＝１０，０００）の製造
反応容器に、化合物１０（ＭＷ＝１０，０００）２７．７ｇとジクロロメタン８３ｍＬとを投入した。反応温度を１０℃以下に維持しながら、トリエチルアミン１．５４ｇとメタンスルホニルクロリド１．５９ｇとを添加した後、室温で３時間撹拌した。反応完結後、水１４０ｍＬとジクロロメタン５７ｍＬとを投入し、５分間撹拌した。有機層を分離した後、水層にさらにジクロロメタン１４０ｍＬを投入し、追加抽出した。有機層を集め、水１４０ｍＬで洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して残った濾液を減圧蒸溜した。濃縮液に、ジクロロメタン３０ｍＬを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテル４５０ｍＬを２０分間滴加した。生成された結晶を濾過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥させ、目的化合物である化合物（１１）（ＭＷ＝１０，０００）２５．５ｇを得た。
【０１５４】
９−２：化合物１２（ＭＷ＝１０，０００）の製造
反応容器に、アンモニア水溶液２００ｍＬと塩化アンモニウム２０ｇとを投入した。化合物１１（ＭＷ＝１０，０００）１０ｇを添加した後、室温で４日間撹拌した。反応完結後、ジクロロメタン２００ｍＬを投入し、５分間撹拌した。有機層を分離した後、水層にさらにジクロロメタン２００ｍＬを投入し、追加抽出した。有機層を集め、蒸溜水２００ｍＬで洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して残った濾液を減圧蒸溜した。濃縮液に、ジクロロメタン１０ｍＬを添加して溶解させた後、メチルｔ−ブチルエーテル１５０ｍＬを２０分間滴加した。生成された結晶を濾過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、室温で窒素乾燥させ、目的化合物である化合物（１２）（ＭＷ＝１０，０００）８．１ｇを得た。
【０１５５】
９−３：化合物１３（ＭＷ＝１０，０００）の製造
反応容器に、化合物１２（ＭＷ＝１０，０００）３ｇとジクロロメタン３０ｍＬとを投入した。化合物４ ３６２ｍｇ、トリエチルアミン９１ｍｇを添加した後、室温で３時間撹拌した。反応完結後、溶媒を減圧蒸溜し、水３０ｍＬを投入して溶解させた。酢酸エチル（３０ｍＬｘ３）を投入し、５分撹拌後、水層を分離し、ジクロロメタン３０ｍＬを利用して２回抽出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して減圧蒸溜した。濃縮液に、ジクロロメタン３ｍＬを投入して溶かした後、メチルｔ−ブチルエーテル４５ｍＬを２０分間滴加した。生成された結晶を濾過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、窒素乾燥させ、目的化合物である化合物（１３）（ＭＷ＝１０，０００）１．７ｇを得た。
【０１５６】
９−４：化合物１４（ＭＷ＝１０，０００）の製造
反応容器に、化合物５（ＭＷ＝１０，０００）１．６ｇと蒸溜水２８．８ｍＬとを投入した。０．１Ｎ ＨＣｌ ３．２ｍＬを添加し、室温で２時間撹拌した後、ＮＭＲを利用し、反応完結を確認した。反応液を５％（ｗ／ｖ）重曹水溶液で中和し、ジクロロメタン３２ｍＬを利用して２回抽出した。硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して減圧蒸溜した。濃縮液に、ジクロロメタン２ｍＬを投入して溶かした後、メチルｔ−ブチルエーテル３０ｍＬを２０分間滴加した。生成された結晶を濾過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、窒素乾燥させ、目的化合物である化合物（１４）（ＭＷ＝１０，０００）１．２ｇを得た。化合物１４（ＭＷ＝１０，０００）は、ＰｅＡＬ−ＰＥＧ １０Ｋ−ＤＢＣＯと命名した。図６は、リンカー化合物１４（ＭＷ＝１０，０００）の１Ｈ ＮＭＲ結果である。
【０１５７】
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ） δ ９．７５（ｓ，１Ｈ）、７．６５（ｄ，１Ｈ）、７．５１（ｄ，１Ｈ）、７．３７−７．１９（ｍ，６Ｈ）、６．１１（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、５．１２（ｄ，１Ｈ）、３．８５−３．４２（ｍ，９１５Ｈ）、３．３２（ｍ，２Ｈ）、２．８０（ｍ，１Ｈ）、２．４７−２．４１（ｍ，３Ｈ）、２．１６（ｍ，１Ｈ）、１．９２（ｍ，１Ｈ）、１．７０（ｍ，２Ｈ）、１．６１（ｍ，２Ｈ）
【０１５８】
実施例１０：リンカー化合物の製造（１０）
【化１０】
2020508366.tif 000076
【０１５９】
１０−１：化合物１１（ＭＷ＝１０，０００）の製造
前記実施例９−１と同一方法を遂行し、化合物１１（ＭＷ＝１０，０００）を得た。
【０１６０】
１０−２：化合物１２（ＭＷ＝１０，０００）の製造
前記実施例９−２と同一方法を遂行し、化合物１２（ＭＷ＝１０，０００）を得た。
【０１６１】
１０−３：化合物１５（ＭＷ＝１０，０００）の製造
反応容器に、化合物１２（ＭＷ＝１０，０００）３ｇとジクロロメタン３０ｍＬとを投入した。化合物７ ２６２ｍｇ、トリエチルアミン９１ｍｇを添加した後、室温で３時間撹拌した。反応完結後、溶媒を減圧蒸溜し、水３０ｍＬを投入して溶解させた。酢酸エチル（３０ｍＬｘ３）を投入し、５分撹拌後、水層を分離し、ジクロロメタン３０ｍＬを利用して２回抽出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して減圧蒸溜した。濃縮液に、ジクロロメタン３ｍＬを投入して溶かした後、メチルｔ−ブチルエーテル４５ｍＬを２０分間滴加した。生成された結晶を濾過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、窒素乾燥させ、目的化合物である化合物（１５）（ＭＷ＝１０，０００）１．６ｇを得た。
【０１６２】
１０−４：化合物１６（ＭＷ＝１０，０００）の製造
反応容器に、化合物５（ＭＷ＝１０，０００）１．５ｇと蒸溜水２７ｍＬとを投入した。０．１Ｎ ＨＣｌ ３ｍＬを添加し、室温で２時間撹拌した後、ＮＭＲを利用し、反応完結を確認した。反応液を５％（ｗ／ｖ）重曹水溶液で中和し、ジクロロメタン３０ｍＬを利用して２回抽出した。硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過して減圧蒸溜した。濃縮液に、ジクロロメタン２ｍＬを投入して溶かした後、メチルｔ−ブチルエーテル３０ｍＬを２０分間滴加した。生成された結晶を濾過し、メチルｔ−ブチルエーテルで洗浄した後、窒素乾燥させ、目的化合物である化合物（１６）（ＭＷ＝１０，０００）１．１ｇを得た。化合物１６（ＭＷ＝１０，０００）は、ＰｅＡＬ−ＰＥＧ １０Ｋ−ＢＣＮと命名した。図７は、リンカー化合物１６（ＭＷ＝１０，０００）の１Ｈ ＮＭＲ結果である。
【０１６３】
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ） δ ９．７５（ｓ，１Ｈ）、５．２０（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、４．１２（ｄ，２Ｈ）、３．８５−３．４４（ｍ，９１４Ｈ）、３．３６（ｍ，２Ｈ）、２．４５（ｔ，２Ｈ）、２．２８−２．１６（ｍ，６Ｈ）、１．７０（ｍ，２Ｈ）、１．６２−１．５９（ｍ，４Ｈ）、１．１８（ｍ，１Ｈ）、０．９３（ｍ，２Ｈ）
【０１６４】
実験例１：リンカー化合物の質量分析
前記実施例で製造したリンカー化合物に対して、マルディトフ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析機を使用し、質量分析を行った。その結果は、ポリツールソフトウェア（Polytool software）を使用して分析した。
図８は、リンカー化合物ＡＬＤ−ＰＥＧ １０Ｋ−ＤＢＣＯの質量分析結果である。
図９は、リンカー化合物ＡＬＤ−ＰＥＧ ５Ｋ−ＤＢＣＯの質量分析結果である。
図１０は、リンカー化合物ＡＬＤ−ＰＥＧ ３．４Ｋ−ＤＢＣＯの質量分析結果である。
図１１は、リンカー化合物ＡＬＤ−ＰＥＧ ２Ｋ−ＤＢＣＯの質量分析結果である。
図１２は、リンカー化合物ＰｅＡＬＤ−ＰＥＧ １０Ｋ−ＢＣＮの質量分析結果である。
図１３は、リンカー化合物ＰｅＡＬＤ−ＰＥＧ １０Ｋ−ＤＢＣＯの質量分析結果である。
図１４は、リンカー化合物ＡＬＤ−ＰＥＧ １０Ｋ−ＢＣＮの質量分析結果である。
【０１６５】
実施例１１：生理活性ポリペプチド連結体の製造（１）
実施例５のＡＬＤ−ＰＥＧ １０Ｋ−ＢＣＮリンカーに、生理活性ポリペプチドを結合させ、生理活性ポリペプチド連結体を製造した。
【０１６６】
具体的には、該生理活性ポリペプチドは、ＷＯ２０１７／１１６２０５Ａ１に配列番号４２で開示されたグルカゴン、ＧＬＰ−１受容体及びＧＩＰ受容体のいずれにも活性を有する三重活性体（triple agonist）を使用した。前記三重活性体のＣ末端位置のアミノ酸をリシンで置換し、リシン位置にアジド基を導入し、アジド基が導入された三重活性体を製造し、それをＨＭＴ２１１−azidoと命名した。
【０１６７】
前記製造されたＨＭＴ２１１−azido粉末を、１０％（ｖ／ｖ）１０ｍＭ ＨＣｌに溶解させた後、ＨＭＴ２１１−azidoと、実施例５のＡＬＤ−ＰＥＧ １０Ｋ−ＢＣＮリンカーとのモル比が１：５になるようにし、ＨＭＴ２１１−azidoの最終濃度を５ｍｇ／ｍｌにし、４℃で約２時間反応させた。このとき、反応は、５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で、６０％（ｖ／ｖ）イソプロパノールの混合溶媒で反応させた。
【０１６８】
反応液は、クエン酸ナトリウム（sodium phosphate）（ｐＨ３．０）、４５％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨが含まれたバッファ、及びＫＣｌ濃度勾配を利用したＳＰ−ＨＰ（ＧＥ Healthcare）カラムを使用して精製した。その結果、モノＰＥＧ化された（mono−pegylated）ＨＭＴ２１１−azido−ＰＥＧを得た。
【０１６９】
実施例１２：生理活性ポリペプチド結合体の製造（１）
次に、前記実施例１１で精製されたモノＰＥＧ化された（mono−pegylated）ＨＭＴ２１１−azido−ＰＥＧと、免疫グロブリンＦｃとのモル比が１：４になるようにし、最終濃度を１０ｍｇ／ｍｌにし、２５゜Ｃで１５時間反応させた。このとき、反応液は、１０ｍＭリン酸化カリウム（potassium phosphate）（ｐＨ６．０）と、還元剤として、２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。
【０１７０】
反応終結後、反応液は、tris−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）バッファとＮａＣｌ濃度勾配とを利用し、Ｓ．１５Ｑ（ＧＥ、米国）カラムに適用し、ＨＭＴ２１１−azido−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体を精製した。
【０１７１】
溶出されたＨＭＴ２１１−azido−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分析し、純度を確認した。
【０１７２】
図１５は、ＨＭＴ２１１−azido−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥ純度分析結果である。Ｍ：marker、１：ＨＭＴ２１１−azidoペプチド、２：モノＰＥＧ化された（mono−pegylated）ＨＭＴ２１１−azido−ＰＥＧ、３：免疫グロブリンＦｃ、４：ＨＭＴ２１１−azidoと免疫グロブリンＦｃとをＡＬＤ−ＰＥＧ １０Ｋ−ＢＣＮリンカーに連結したＨＭＴ２１１−azido−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦＣ結合体。
【０１７３】
図１５から分かるように、実施例５によるリンカー化合物を使用すれば、生理活性ポリペプチドと免疫グロブリンＦｃとが両末端に結合された生理活性ポリペプチド結合体を高い収率で得ることができるということを確認した。
【０１７４】
実施例１３：生理活性ポリペプチド連結体の製造（２）
実施例１のＡＬＤ−ＰＥＧ １０Ｋ−ＤＢＣＯリンカーに、生理活性ポリペプチドを結合させ、生理活性ポリペプチド連結体を製造した。
【０１７５】
具体的には、生理活性ポリペプチドは、ＧＬＰ−２のＣ末端にアジドリシンが導入されたＧＬＰ−２誘導体−azidoを使用した。例示的には、本実施例において、ＧＬＰ−２誘導体−azidoは、天然型ＧＬＰ−２において、Ｃ末端にアジドリシンが導入され、２番目アミノ酸であるアラニンがグリシンで置換され、Ｎ末端最初アミノ酸であるヒスチジン残基のアルファ炭素が除去されたものを使用した。
【０１７６】
実施例１のＡＬＤ−ＰＥＧ １０Ｋ−ＤＢＣＯ（１０ｋＤａ）を、前記ＧＬＰ−２誘導体−azidoにＰＥＧ化させるために、前記ＧＬＰ−２誘導体−azido粉末：ＡＬＤ−ＰＥＧ １０Ｋ−ＤＢＣＯのモル比が１：５になるように、ＧＬＰ−２誘導体−azidoの濃度を５ｍｇ／ｍｌにし、４℃で約４時間反応させた。このとき、反応は、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で、６０％（ｖ／ｖ）イソプロパノールの混合溶媒で反応させた。
【０１７７】
反応液は、ビス−トリス（bis−tris）（ｐＨ６．２）と塩化ナトリウム（sodium chloride）濃度勾配とを利用したＱ Sepharose High Performance（ＧＥ Healthcare、米国）カラムを適用して精製した。その結果、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を介して、モノＰＥＧ化された（mono−pegylated）ＧＬＰ−２誘導体−azido−ＰＥＧが精製されたことを確認した（図１６）。
【０１７８】
実施例１４：生理活性ポリペプチド結合体の製造（２）
次に、前記実施例１３の方法で精製されたモノＰＥＧ化された（mono−pegylated）ＧＬＰ−２類似体−azido−ＰＥＧと、免疫グロブリンＦｃとのモル比が１：４になるようにし、最終濃度を１０ｍｇ／ｍｌにし、２〜８℃で１２〜１８時間反応させた。このとき、反応液は、１００ｍＭリン酸カリウム（potassium phosphate）、２０％（ｖ／ｖ）イソプロパノール（isopropanol）（ｐＨ６．０）に、還元剤である２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウム（sodium cyanoborohydride（ＮａＣＮＢＨ３））が添加された環境下で行われた。
【０１７９】
反応終結後、反応液は、塩化ナトリウム（sodium chloride）、トリス（tris）（ｐＨ７．５）、及びイソプロパノールバッファの濃度勾配を利用し、Butyl Sepharose ４ Fast Flow（ＧＥ Healthcare、米国）カラムに適用し、ＧＬＰ−２類似体−azido−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体を精製した。
【０１８０】
溶出されたＧＬＰ−２類似体−azido−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分析し、純度を確認した。
【０１８１】
図１６は、ＧＬＰ−２類似体−azido−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体に対する非還元条件（non−reducing）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ純度分析結果である。Ｍ：marker、１：ＧＬＰ−２類似体、２：モノＰＥＧ化された（mono−pegylated）ＧＬＰ−２類似体、３：免疫グロブリンＦｃ、４：ＧＬＰ−２類似体−azidoと免疫グロブリンＦｃとをＡＬＤ−ＰＥＧ １０Ｋ−ＤＢＣＯリンカーに連結したＧＬＰ−２類似体−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体。
【０１８２】
図１６から分かるように、実施例１によるリンカー化合物を使用すれば、生理活性ポリペプチドと免疫グロブリンＦｃとが両末端に結合された生理活性ポリペプチド結合体を高い収率で得ることができるということを確認した。
【０１８３】
実施例１５：生理活性ポリペプチド連結体の製造（３）
実施例１０のＰｅＡＬ−ＰＥＧ １０Ｋ−ＢＣＮリンカーに、生理活性ポリペプチドを結合させ、生理活性ポリペプチド連結体を製造した。
【０１８４】
具体的には、生理活性ポリペプチドは、ＷＯ２０１７／００３１９１Ａ１に配列番号３７で開示されたグルカゴン類似体を使用した。前記グルカゴン類似体のＣ末端位置のアミノ酸をリシンで置換し、リシン位置にアジド基を導入し、アジド基が導入されたグルカゴン類似体を製造し、それをグルカゴン類似体−azidoと命名した。
【０１８５】
実施例１０のＰｅＡＬ−ＰＥＧ １０Ｋ−ＢＣＮ（１０ｋＤａ）を、前記グルカゴン類似体−azidoにＰＥＧ化させるために、前記グルカゴン類似体−azido：ＰｅＡＬ−ＰＥＧ １０Ｋ−ＢＣＮのモル比が１：５になるように、グルカゴン類似体−azidoの濃度を５ｍｇ／ｍｌにし、４℃で約４時間反応させた。このとき、反応は、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で、６０％（ｖ／ｖ）イソプロパノールと２０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯとの混合溶媒で反応させた。
【０１８６】
反応液はクエン酸ナトリウム（sodium citrate）（ｐＨ３．０）と、４５％（ｖ／ｖ）エタノール（ethanol）が含まれた塩化カリウム（potassium chloride）濃度勾配とを利用したＳＰ Sepharose High Performance（ＧＥ Healthcare、米国）カラムを適用して精製した。その結果、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を介して、モノＰＥＧ化された（mono−pegylated）グルカゴン類似体−azido−ＰＥＧが精製されたことを確認した（図１７）。
【０１８７】
実施例１６：生理活性ポリペプチド結合体の製造（３）
次に、前記実施例１５の方法で精製されたモノＰＥＧ化された（mono−pegylated）グルカゴン類似体−azido−ＰＥＧと、免疫グロブリンＦｃとのモル比が１：４になるようにし、最終濃度を１０ｍｇ／ｍｌにし、２〜８℃で１２〜１８時間反応させた。このとき、反応液は１００ｍＭリン酸カリウム（potassium phosphate）、２０％（ｖ／ｖ）イソプロパノール（isopropanol）（ｐＨ６．０）に還元剤である２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウム（sodium cyanoborohydride（ＮａＣＮＢＨ３））が添加された環境下で行われた。
【０１８８】
反応終結後、反応液は、トリス（tris）（ｐＨ７．５）が含まれた緩衝液と、塩化ナトリウム（sodium chloride）の濃度勾配とを利用し、Source １５Ｑ（ＧＥ Healthcare、米国）カラムに適用し、グルカゴン類似体−azido−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体を精製した。
【０１８９】
溶出されたグルカゴン類似体−azido−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分析し、純度を確認した。
【０１９０】
図１７は、グルカゴン類似体−azido−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体に対する非還元条件（non−reducing）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ純度分析結果である。Ｍ：marker、１：グルカゴン類似体、２：モノＰＥＧ化された（mono−pegylated）グルカゴン類似体、３：免疫グロブリンＦｃ、４：グルカゴン類似体−azidoと免疫グロブリンＦｃとをＰｅＡＬ−ＰＥＧ １０Ｋ−ＢＣＮリンカーに連結したグルカゴン類似体−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体。
【０１９１】
図１７から分かるように、実施例１０によるリンカー化合物を使用すれば、生理活性ポリペプチドと免疫グロブリンＦｃとが両末端に結合された生理活性ポリペプチド結合体を高い収率で得ることができるということを確認した。
【０１９２】
以上、本発明について、その実施例を中心に説明した。本発明が属する技術分野において当業者であるならば、本発明が、本発明の本質的な特性から外れない範囲で変形された形態に具現されるということを理解するであろう。従って、前述の実施例は、限定的な観点ではなく、説明的な観点から考慮されなければならない。本発明の範囲は、前述の説明ではなく、特許請求の範囲に示されており、それと同等な範囲内にある全ての差異は、本発明に含まれたものであると解釈されなければならないのである。
【図１】
2020508366.tif 000146
【図２】
2020508366.tif 000147
【図３】
2020508366.tif 000148
【図４】
2020508366.tif 000149
【図５】
2020508366.tif 000150
【図６】
2020508366.tif 000151
【図７】
2020508366.tif 000152
【図８】
2020508366.tif 000153
【図９】
2020508366.tif 000154
【図１０】
2020508366.tif 000155
【図１１】
2020508366.tif 000156
【図１２】
2020508366.tif 000157
【図１３】
2020508366.tif 000158
【図１４】
2020508366.tif 000159
【図１５】
2020508366.tif 000160
【図１６】
2020508366.tif 000161
【図１７】
2020508366.tif 000162
【国際調査報告】
2020508366.tif 000163
2020508366.tif 000164
2020508366.tif 000165
2020508366.tif 000166
2020508366.tif 000167
2020508366.tif 000168
2020508366.tif 000169
2020508366.tif 000170