(57)【要約】  網膜分離症の動物モデルとしての使用に適した非ヒト動物が提供される。一部の実施形態では、レチノスキシン−１遺伝子座の破損により特徴付けられる非ヒト動物が提供される。一部の実施形態では、変異型レチノスキシン−１遺伝子により特徴付けられる非ヒト動物が提供される。一部の実施形態では、非ヒト動物は、網膜分離症に関連付けられた一つ以上の症状または表現型の発生を含む表現型を有するものとして記述されうる。網膜分離症あるいは眼関連疾患、障害、または状態を防止、遅延または治療するために使用されうる治療候補を特定する方法も提供されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
齧歯類であって、そのゲノムが、内因性齧歯類レチノスキシン−１（Ｒｓ１）遺伝子座における内因性齧歯類Ｒｓ１遺伝子のコード配列の全部または一部の欠失を有する、齧歯類。
【請求項２】
前記欠失が、Ｒｓ１遺伝子座から産生された機能的ＲＳ１ポリペプチドの欠如を引き起こす、請求項１に記載の齧歯類。
【請求項３】
前記欠失が少なくともエクソン２〜３の欠失である、請求項１または２に記載の齧歯類。
【請求項４】
前記欠失が、少なくともエクソン１の一部分およびエクソン２〜３の欠失である、請求項１または２に記載の齧歯類。
【請求項５】
前記Ｒｓ１遺伝子座がレポーター遺伝子を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の齧歯類。
【請求項６】
前記レポーター遺伝子が、Ｒｓ１プロモーターに動作可能に連結されている、請求項５に記載の齧歯類。
【請求項７】
前記Ｒｓ１プロモーターが内因性プロモーターである、請求項６に記載の齧歯類。
【請求項８】
前記Ｒｓ１遺伝子座が、エクソン１のＡＴＧ開始コドンのすぐ３’側からのコード部分を欠き、エクソン２〜３を欠き、およびＲｓ１遺伝子の開始（ＡＴＧ）コドンにインフレームで融合されたレポーター遺伝子コード配列を有する、請求項２に記載の齧歯類。
【請求項９】
前記レポーター遺伝子が、ｌａｃＺまたは、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、強化黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、強化青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、およびＭｍＧＦＰからなる群から選択されたタンパク質をコードする遺伝子である、請求項５〜８のいずれか１項に記載の齧歯類。
【請求項１０】
前記レポーター遺伝子の発現パターンが、野生型非ヒト動物の内因性齧歯類Ｒｓ１遺伝子座での野生型齧歯類Ｒｓ１遺伝子の発現パターンに類似している、請求項５〜９のいずれか１項に記載の齧歯類。
【請求項１１】
前記齧歯類がオスの齧歯類である、請求項１に記載の齧歯類。
【請求項１２】
前記齧歯類がメスの齧歯類である、請求項１に記載の齧歯類。
【請求項１３】
前記齧歯類が、前記欠失に対しホモ接合性である、請求項１２に記載の齧歯類。
【請求項１４】
前記齧歯類が、前記欠失に対しヘテロ接合性である、請求項１２に記載の齧歯類。
【請求項１５】
齧歯類であって、そのゲノムが、操作されたＲｓ１遺伝子を有し、前記操作されたＲｓ１遺伝子が、エクソン中に一つ以上の点変異を有し、野生型ＲＳ１ポリペプチドと比較して少なくとも一つのアミノ酸置換を有するＲＳ１ポリペプチドをコードする、齧歯類。
【請求項１６】
前記少なくとも一つのアミノ酸置換が、シグナル配列中の置換である、請求項１５に記載の齧歯類。
【請求項１７】
前記少なくとも一つのアミノ酸置換が、疎水性残基のプロリンとの置換、または親水性もしくは荷電残基との置換である、請求項１６に記載の齧歯類。
【請求項１８】
前記少なくとも一つのアミノ酸置換が、ディスコイジンドメインに隣接するＲＳ１領域またはＣ末端セグメントにおける置換である、請求項１５に記載の齧歯類。
【請求項１９】
前記少なくとも一つのアミノ酸置換が、３８、４０、５９および２２３からなる群から選択される位置でのシステインの置換である、請求項１８に記載の齧歯類。
【請求項２０】
前記少なくとも一つのアミノ酸置換が、Ｃ５９Ｓ置換である、請求項１９に記載の齧歯類。
【請求項２１】
前記少なくとも一つのアミノ酸置換が、ディスコイジンドメインでの置換である、請求項１５に記載の齧歯類。
【請求項２２】
前記少なくとも一つのアミノ酸置換が、６３、８３、１１０、１４２および２１９からなる群から選択される位置でのシステインの置換である、請求項２１に記載の齧歯類。
【請求項２３】
前記少なくとも一つのアミノ酸置換が、システインを用いた前記ディスコイジンドメインにおける非システイン残基の置換である、請求項２１に記載の齧歯類。
【請求項２４】
前記少なくとも一つのアミノ酸置換がＲ１４１Ｃ置換である、請求項２３に記載の齧歯類。
【請求項２５】
前記少なくとも一つのアミノ酸置換が、前記ディスコイジンドメインにおける荷電残基の非荷電残基との置換、非荷電残基の荷電残基との置換、または荷電残基の逆荷電残基との置換である、請求項２１に記載の齧歯類。
【請求項２６】
前記少なくとも一つのアミノ酸置換が、プロリンの挿入または除去による前記ディスコイジンドメインでの置換である、請求項２１に記載の齧歯類。
【請求項２７】
前記少なくとも一つのアミノ酸置換が、極性残基の挿入または除去による前記ディスコイジンドメインでの置換である、請求項２１に記載の齧歯類。
【請求項２８】
前記操作されたＲｓ１  遺伝子が、一つ以上の選択マーカーをさらに有する、請求項１５〜２７のいずれか１項に記載の齧歯類。
【請求項２９】
前記操作されたＲｓ１遺伝子が、一つ以上の部位特異的リコンビナーゼ認識部位をさらに有する、請求項１５〜２７のいずれか１項に記載の齧歯類。
【請求項３０】
前記操作されたＲｓ１遺伝子が、前記一つ以上の部位特異的リコンビナーゼ認識部位に隣接したリコンビナーゼ遺伝子と選択マーカーとをさらに有し、前記部位特異的リコンビナーゼ認識部位は、除去を指示するよう方向づけられる、請求項２９に記載の齧歯類。
【請求項３１】
前記リコンビナーゼ遺伝子が、分化細胞において前記リコンビナーゼ遺伝子の発現を誘導するが、未分化細胞では前記リコンビナーゼ遺伝子の発現を誘導しないプロモーターに動作可能に連結される、請求項３０に記載の齧歯類。
【請求項３２】
前記プロモーターが、配列番号３０、配列番号３１、または配列番号３２であるか、あるいは配列番号３０、配列番号３１、または配列番号３２を含む、請求項２０または２１に記載の齧歯類。
【請求項３３】
前記操作されたＲｓ１遺伝子が、内因性齧歯類Ｒｓ１遺伝子座にある、請求項１５〜３２のいずれか１項に記載の齧歯類。
【請求項３４】
前記点変異が前記内因性齧歯類Ｒｓ１遺伝子座の前記内因性齧歯類Ｒｓ１遺伝子のエクソン内にある、請求項３３に記載の齧歯類。
【請求項３５】
前記齧歯類がオス齧歯類である、請求項３３および３４のいずれか１項に記載の齧歯類。
【請求項３６】
前記齧歯類がメス齧歯類である、請求項３３および３４のいずれか１項に記載の齧歯類。
【請求項３７】
前記齧歯類が、前記操作されたＲｓ１遺伝子に対しホモ接合性である、請求項３６に記載の齧歯類。
【請求項３８】
前記齧歯類が、前記操作されたＲｓ１遺伝子に対しヘテロ接合性である、請求項３６に記載の齧歯類。
【請求項３９】
Ｃ５９Ｓ置換またはＲ１４１Ｃ置換を含むＲＳ１ポリペプチドを発現する齧歯類。
【請求項４０】
前記齧歯類が、任意で出生後１５日、１８日、２１日、または２４日までに網膜分離症の一つ以上の症状を生じる、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の齧歯類。
【請求項４１】
前記齧歯類が、ラットまたはマウスである、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の齧歯類。
【請求項４２】
単離齧歯類細胞または組織であって、そのゲノムが、
（ｉ）内因性齧歯類Ｒｓ１遺伝子座における内因性齧歯類Ｒｓ１遺伝子のコード配列の全部または一部の欠失、または
（ｉｉ）一つ以上の点変異をエクソンに有する操作されたＲｓ１遺伝子を有し、一つ以上のアミノ酸置換を有するＲＳ１ポリペプチドをコードする、単離齧歯類細胞または組織。
【請求項４３】
請求項４２に記載の単離齧歯類細胞から作製された不死化細胞。
【請求項４４】
齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞であって、そのゲノムが、
（ｉ）内因性齧歯類Ｒｓ１遺伝子座における内因性齧歯類Ｒｓ１遺伝子のコード配列の全部または一部の欠失、または
（ｉｉ）一つ以上の点変異をエクソンに有する操作されたＲｓ１遺伝子を有し、一つ以上のアミノ酸置換を有するＲＳ１ポリペプチドをコードする、齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞。
【請求項４５】
請求項４４に記載の胚性幹細胞から作製された齧歯類胚。
【請求項４６】
請求項１〜４１のいずれか１項に記載の齧歯類、請求項４２に記載の単離齧歯類細胞、請求項４３に記載の不死化細胞、請求項４４に記載の齧歯類胚性幹細胞、または請求項４５に記載の齧歯類胚を含む、キット。
【請求項４７】
遺伝子改変齧歯類を作製する方法であって、前記方法が、
改変ゲノムが、
（ｉ）内因性齧歯類Ｒｓ１遺伝子座における内因性齧歯類Ｒｓ１遺伝子のコード配列の全部または一部の欠失、または
（ｉｉ）アミノ酸置換を有するＲＳ１ポリペプチドをコードする操作されたＲｓ１遺伝子、を有するように、齧歯類ゲノムを改変すること、および
前記改変ゲノムを備える遺伝子改変齧歯類を作製すること、を含む、方法。
【請求項４８】
前記齧歯類ゲノムが、
（ａ）そのゲノムが（ｉ）の欠失または（ｉｉ）の前記操作されたＲｓ１遺伝子を有する、遺伝子改変齧歯類ＥＳ細胞を得るために、齧歯類ＥＳ細胞のゲノム内に核酸配列を導入すること、および
（ｂ）（ａ）の前記遺伝子改変齧歯類ＥＳ細胞を使用して齧歯類を作製すること、を含むプロセスにより改変される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記操作されたＲｓ１遺伝子が、内因性齧歯類Ｒｓ１遺伝子座における内因性齧歯類Ｒｓ１遺伝子のエクソンに点変異を生成する齧歯類ＥＳ細胞のゲノムへの核酸配列の導入から生じる、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記内因性齧歯類Ｒｓ１遺伝子のエクソン３が、Ｃ５９Ｓ置換を含むＲＳ１ポリペプチドをコードするように突然変異される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記内因性齧歯類Ｒｓ１遺伝子のエクソン５が、Ｒ１４１Ｃ置換を含むＲＳ１ポリペプチドをコードするように突然変異される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記欠失が、前記Ｒｓ１遺伝子座における前記Ｒｓ１遺伝子のコード配列のエクソン１の一部分およびエクソン２〜３の欠失である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
前記核酸配列が、一つ以上の選択マーカーをさらに有する、請求項４８〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記核酸配列が、一つ以上の部位特異的リコンビナーゼ認識部位をさらに有する、請求項４８〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記核酸配列が、一つ以上の部位特異的リコンビナーゼ認識部位に隣接したリコンビナーゼ遺伝子と選択マーカーとをさらに有し、前記部位特異的リコンビナーゼ認識部位は除去を指示するよう方向づけられる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記核酸配列が、前記選択マーカーの下流にあるレポーター遺伝子をさらに有する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記リコンビナーゼ遺伝子が、発生的に制御されるプロモーターに動作可能に連結される、請求項５５または５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記プロモーターが、配列番号３０、配列番号３１、または配列番号３２であるか、あるいは配列番号３０、配列番号３１、または配列番号３２を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記Ｒｓ１遺伝子座が、レポーター遺伝子をさらに有する前記欠失を有する、請求項５２に記載の方法。
【請求項６０】
前記レポーター遺伝子が、齧歯類Ｒｓ１プロモーターに動作可能に連結されている、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記齧歯類Ｒｓ１プロモーターが、前記Ｒｓ１遺伝子座で内因性Ｒｓ１プロモーターである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記欠失が、エクソン１のＡＴＧ開始コドンの直後から始まり、Ｒｓ１遺伝子のエクソン３の最後の６つのヌクレオチドまでのヌクレオチドの欠失であり、および前記レポーター遺伝子のコード配列が、前記Ｒｓ１遺伝子のエクソン１の開始（ＡＴＧ）コドンにインフレームで融合される、請求項５９〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記レポーター遺伝子が、ｌａｃＺまたは、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＢＦＰ、ｅＢＦＰ、ＤｓＲｅｄ、およびＭｍＧＦＰからなる群から選択されたタンパク質をコードする遺伝子である、請求項５６または請求項５９〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記レポーター遺伝子の発現パターンが、内因性齧歯類Ｒｓ１遺伝子座における野生型齧歯類Ｒｓ１遺伝子の発現パターンに類似している、請求項５６または５９〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記齧歯類がオス齧歯類である、請求項４７〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記齧歯類がメス齧歯類である、請求項４７〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記齧歯類が、前記欠失または前記操作されたＲｓ１遺伝子に対してホモ接合性である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
請求項４７〜６７のいずれか１項に記載の方法から取得可能な齧歯類。
【請求項６９】
齧歯類における網膜分離症の治療のための治療剤を特定する方法であって、前記方法が、
（ａ）一つ以上の薬剤を齧歯類に投与することであって、前記齧歯類のゲノムが、
（ｉ）内因性齧歯類Ｒｓ１遺伝子座における内因性齧歯類Ｒｓ１遺伝子のコード配列の全部または一部の欠失、または
（ｉｉ）アミノ酸置換を有するＲＳ１ポリペプチドをコードする操作されたＲｓ１遺伝子を有する、投与することと、
（ｂ）一つ以上の薬剤が、網膜分離症に関連した一つ以上の兆候、症状および／または状態に対する効果を有するかどうかを決定するためのアッセイを１種以上実施することと、
（ｃ）網膜分離症に関連した前記一つ以上の兆候、症状および／または状態に対する効果を有する前記一つ以上の薬剤を、前記治療剤として特定することと、を含む方法。
【請求項７０】
齧歯類における眼に関連する疾患、障害、または状態の治療のための治療剤を特定する方法であって、前記方法が、
（ａ）一つ以上の薬剤を齧歯類に投与することであって、前記齧歯類のゲノムが、
（ｉ）内因性齧歯類Ｒｓ１遺伝子座における内因性齧歯類Ｒｓ１遺伝子のコード配列の全部または一部の欠失、または
（ｉｉ）アミノ酸置換を有するＲＳ１ポリペプチドをコードする、操作されたＲｓ１遺伝子を有する、投与することと、
（ｂ）前記一つ以上の薬剤が、前記眼に関連した前記疾患、障害、または状態に関連した兆候、症状および／または状態の一つ以上に対する効果を有するかどうかを決定するためのアッセイを１種以上実施することと、
（ｃ）前記眼に関連した前記疾患、障害、または状態に関連した兆候、症状および／または状態の一つ以上に対する効果を有する前記一つ以上の薬剤を、前記治療剤として特定することと、を含む、方法。
【請求項７１】
前記齧歯類の前記ゲノムが、Ｃ５９Ｓ置換を有するＲＳ１ポリペプチドをコードする操作されたＲｓ１遺伝子を有する、請求項６９または７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記齧歯類の前記ゲノムが、Ｒ１４１Ｃ置換を有するＲＳ１ポリペプチドをコードする操作されたＲｓ１遺伝子を有する、請求項６９または７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記齧歯類の前記ゲノムが、内因性齧歯類Ｒｓ１遺伝子座における内因性齧歯類Ｒｓ１遺伝子のコード配列の少なくともエクソン１の一部分およびエクソン２〜３の欠失を有する、請求項６９または７０に記載の方法。
【請求項７４】
前記一つ以上の薬剤が、出生時または出生直後に前記齧歯類に投与される、請求項６９または７０に記載の方法。
【請求項７５】
前記一つ以上のアッセイが、出生後１５〜２４日で実施される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記齧歯類がラットまたはマウスである、請求項４７〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
核酸構築物であって、前記核酸構築物が、
齧歯類Ｒｓ１遺伝子座のヌクレオチド配列に相同な５’ヌクレオチド配列および３’ヌクレオチド配列に隣接する、前記齧歯類Ｒｓ１遺伝子座の齧歯類Ｒｓ１遺伝子に組み込まれる核酸配列を含み、前記核酸配列の前記齧歯類Ｒｓ１遺伝子への組み込みが、
（ｉ）前記齧歯類Ｒｓ１遺伝子のコード配列の全部または一部の欠失、または
（ｉｉ）アミノ酸置換を有するＲＳ１ポリペプチドをコードする操作されたＲｓ１遺伝子を生じる、核酸構築物。
【請求項７８】
前記核酸配列がレポーター遺伝子を有し、前記核酸配列の前記組み込みがエクソン１の一部分およびエクソン２〜３の欠失をもたらす、請求項７７に記載の核酸構築物。
【請求項７９】
前記核酸配列が変異型Ｒｓ１エクソンを有し、それにより、前記核酸配列の前記齧歯類Ｒｓ１遺伝子への組み込みが、アミノ酸置換を有するＲＳ１ポリペプチドをコードする操作されたＲｓ１遺伝子をもたらす、請求項７７に記載の核酸構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年２月２７日出願の米国仮特許出願第６２／４６３，８７２号、および２０１７年１０月２４日出願の米国仮特許出願第６２／５７６，２５６号、の利益を主張するものであり、これらの仮特許出願の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表の参照による組み込み
２０１８年２月５日に作製され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して米国特許商標庁に提出された３５５１８＿１０３２８ＷＯ０１＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称の１１７ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルの形態をとる配列表が、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
世界保健機関（ＷＨＯ）は、世界中の約１億８０００万人が視覚障碍者であると推定しており、そのうちほぼ６００万人の原因が小児期失明である（Ｂｌｉｎｄｎｅｓｓ：Ｖｉｓｉｏｎ  ２０２０、Ｔｈｅ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｖｏｉｄａｂｌｅ  Ｂｌｉｎｄｎｅｓｓ、Ｆａｃｔ  Ｓｈｅｅｔ  Ｎｏ．２１３、Ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ、ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ２０００）。レチノスキシン−１（Ｒｓ１）遺伝子における突然変異によって引き起こされるＸ連鎖性若年網膜分離症（ＸＬＲＳ）は、網膜の内層の分裂によって特徴付けられる男性の子供における早期発症型黄斑変性であり、結果として重大な視覚喪失をもたらす。現在の治療オプションは、光学（例えば、拡大鏡）、非光学（例えば、作業照明、読書用スタンドなど）、および電子装置などの低視力補助具に限定される。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、新しい治療薬、および一部の実施形態では、網膜分離症（例えば、Ｘ連鎖性網膜分離症）の治療および／または予防のために使用され得る治療レジメンの特定および開発のための、改善されたインビボシステムを提供する非ヒト動物を設計することが望ましいという認識を包含する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるインビボシステムは、眼関連疾患、障害、および／または状態の治療のための新たな治療薬の特定および開発に使用され得る。一部の実施形態では、提供されるインビボシステムは、視覚喪失に関連する疾患、障害、および／または状態を治療するための新しい治療薬を特定および開発するためにも使用できる。一部の実施形態では、提供される非ヒト動物は、宿主ＲＳ１ポリペプチドが発現も産生もされないように、Ｒｓ１遺伝子に、および／またはその他の機能的にサイレンシングされたＲｓ１遺伝子に破損を含み、例えば網膜構造および／または機能を、復元および／または改善する治療薬の特定および開発における使用のために望ましい。バリアントまたは変異型ＲＳ１ポリペプチドが、操作されたバリアントまたは変異型Ｒｓ１遺伝子から産生されるように、操作されたバリアントまたは変異型Ｒｓ１遺伝子を含む非ヒト動物も提供されており、例えば、網膜構造および／または機能を復元および／または改善する治療薬の特定および開発における使用のために望ましい。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、網膜分離症のための改善されたインビボシステム（またはモデル）を提供する。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、眼関連疾患、障害および／または状態のための改善されたインビボシステム（またはモデル）を提供する。
【０００５】
一部の実施形態では、網膜分離症のための動物モデルとして使用するために望ましい非ヒト動物が提供される。
様々な実施形態では、提供される非ヒト動物は、Ｒｓ１遺伝子における破損（例えば、コード領域の欠失、全部または一部）または突然変異（例えば、コード配列における一つ以上の点変異）によって特徴付けられる。一部の実施形態では、Ｒｓ１遺伝子における破損または突然変異は、破損または突然変異を含む非ヒト動物の一つ以上の網膜に影響する。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物のＲｓ１遺伝子における破損または突然変異は、非ヒト動物における以下の表現型のうちの一つ以上の形成、発達、または出芽をもたらす。網膜分離症様表現型（例えば、内側網膜層の分裂、網膜変性および視力の低下など）、黄斑または網膜のスキシス（亀裂（ｓｃｈｉｓｉｓ））、視力の劣化、網膜線維症、および網膜色素沈着、ならびに特定の実施形態では、表現型は、内網膜内の嚢胞構造の発生を含み、野生型非ヒト動物と比較してＥＲＧｂ波およびａ波応答を減少させ、その後に光受容体細胞の損失をもたらす。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物のＲｓ１遺伝子における破損または突然変異は、非ヒト動物の網膜の機能的および形態学的表現型を早期発症（例えば、生後１５、１８、２１、２４または２７日目に、あるいは生後１５、１８、２１、２４または２７日目までに）する。一部の実施形態では、網膜の早期発症機能的欠陥は、野生型非ヒト動物と比較して、（ｉ）暗順応および明順応されたＥＲＧ分析において、ａ波に対してｂ波を減少させる（結果として負電荷のＥＲＧ）、（ｉｉ）ＥＲＧｂ波の最大応答および感度値の減少、（ｉｉｉ）ＥＲＧａ波の最大応答値の減少、または（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の組み合わせによって反映されうる。一部の実施形態では、野生型非ヒト動物と比較して、網膜の早期発症の形態的欠陥は、亀裂、より広いエリプソイド帯（ＥＺ）、より薄い外側網膜、またはそれらの組み合わせによって反映されうる。
【０００６】
一部の実施形態では、非ヒトＲｓ１遺伝子の破損（例えば、欠失）または突然変異は、内因性Ｒｓ１遺伝子座での内因性Ｒｓ１遺伝子の破損または突然変異である。一部の実施形態では、非ヒトＲｓ１遺伝子の破損（例えば、欠失）は、一部のある実施形態では、レポーター遺伝子を含む内因性Ｒｓ１遺伝子座の内因性Ｒｓ１遺伝子への核酸配列の挿入から生じる。一部の実施形態では、破損は、遺伝子産物（たとえばｍＲＮＡまたはポリペプチド）の発現または産生を除去する内因性Ｒｓ１遺伝子の全部または一部の欠失であるか、またはこれを含む。一部の実施形態では、非ヒトＲｓ１遺伝子における突然変異（例えば、点変異）は、一部のある実施形態では、合成エクソン（例えば、点変異を含む合成エクソン）を含む内因性Ｒｓ１遺伝子座の内因性Ｒｓ１遺伝子への核酸配列の挿入から生じる。一部の実施形態では、突然変異は、野生型ＲＳ１ポリペプチドと比較して機能が低減または変化したバリアントＲＳ１ポリペプチドの発現をもたらすＲｓ１遺伝子における一つ以上の点変異であるか、またはこれを含み、一部のある実施形態では、非ヒト動物におけるバリアントＲＳ１ポリペプチドのレベルは、野生型非ヒト動物における野生型ＲＳ１ポリペプチドのレベルよりも小さい。一部の実施形態では、本明細書に記載されるバリアントＲＳ１ポリペプチドは、野生型ＲＳ１ポリペプチドと比較して、一つ以上のアミノ酸置換を含む。
【０００７】
一部の実施形態では、提供される非ヒト動物は、操作されたＲｓ１遺伝子を含むゲノムを有する。一部の実施形態では、操作されたＲｓ１遺伝子は、内因性Ｒｓ１遺伝子座に位置し、その他の実施形態では、操作されたＲｓ１遺伝子は異なる遺伝子座に位置する。一部の実施形態では、操作されたＲｓ１遺伝子は、異種Ｒｓ１遺伝子（例えば、ヒトＲｓ１遺伝子）であるか、またはこれを含む。一部の実施形態では、操作されたＲｓ１遺伝子は、異種ＲＳ１ポリペプチドの全部または一部をコードする遺伝物質を含む。一部の実施形態では、操作されたＲｓ１遺伝子は、異種ポリペプチドのディスコイジンドメインをコードする遺伝物質を含み、そのディスコイジンドメインは、野生型または親異種Ｒｓ１ポリペプチドと比較して、アミノ酸置換を含有する。一部の実施形態では、操作されたＲｓ１遺伝子は、バリアントＲＳ１ポリペプチドの発現をもたらす野生型または親Ｒｓ１遺伝子（例えば、内因性またはホモログ）と比較して、一つ以上の突然変異を含む。一部の実施形態では、操作されたＲｓ１遺伝子は、齧歯類ＲＳ１ポリペプチドのディスコイジンドメインをコードする遺伝物質を含み、そのディスコイジンドメインは、野生型または親齧歯類ＲＳ１ポリペプチドと比較して、アミノ酸置換を含有する。一部の実施形態では、操作されたＲｓ１遺伝子は、異種ＲＳ１ポリペプチドのディスコイジンドメインをコードする遺伝物質を含み、このディスコイジンドメインは、野生型または親異種ＲＳ１ポリペプチドと比較して、アミノ酸置換を含有し、例えば操作されたＲｓ１遺伝子は、ヒトＲＳ１ポリペプチドのディスコイジンドメインをコードするヌクレオチド配列を含み、このディスコイジンドメインは、野生型ヒトＲＳ１ポリペプチドと比較して、アミノ酸置換を含有する。一部の実施形態では、本明細書に記載される操作されたＲｓ１遺伝子によってコードされたＲＳ１ポリペプチドのディスコイジンドメインが、野生型または親ＲＳ１ポリペプチドと比較して、一つ以上のアミノ酸置換を含む。ゆえに、一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物の操作されたＲｓ１遺伝子は、アミノ酸置換を含むディスコイジンドメインにより特徴付けられるＲＳ１ポリペプチド（例えば、バリアントＲＳ１ポリペプチド）をコードする。
【０００８】
一部の実施形態では、内因性Ｒｓ１遺伝子座の内因性Ｒｓ１遺伝子のコード配列の全部または一部の欠失をそのゲノムに含む非ヒト動物が提供されている。いくつかの実施形態では、欠失はＲｓ１遺伝子座から作成された機能的ＲＳ１ポリペプチドの欠如を引き起こす。一部の実施形態では、欠失は、少なくともエクソン２〜３の欠失である。一部のある実施形態では、欠失は、少なくともエクソン１の一部分およびエクソン２〜３の欠失である。一部の実施形態では、欠失は、両端を含む開始（ＡＴＧ）コドンのすぐ３’側からエクソン３の最後の６つのヌクレオチドまで広がる内因性Ｒｓ１遺伝子のヌクレオチドであるか、またはこれを含む。一部の実施形態では、欠失を含むＲｓ１遺伝子座は、レポーター遺伝子をさらに含む。一部の実施形態では、レポーター遺伝子はＲｓ１プロモーターと動作可能に連結される。一部の実施形態では、Ｒｓ１プロモーターは内因性Ｒｓ１プロモーターである（例えば、欠失を含むＲｓ１遺伝子座の内因性Ｒｓ１プロモーター）である。一部の実施形態では、Ｒｓ１プロモーターは異種Ｒｓ１プロモーターである。
【０００９】
一部の実施形態では、Ｒｓ１遺伝子座は、エクソン１の一部分およびエクソン２〜３を欠く（またはエクソン１の一部分およびエクソン２〜３の欠失を含む）、例えば、開始（ＡＴＧ）コドンのすぐ３’側からエクソン２を通りエクソン３の最後の６つのヌクレオチドまでヌクレオチドを欠く、および、Ｒｓ１遺伝子座の開始（ＡＴＧ）コドンにインフレームで融合されたレポーター遺伝子コード配列を含む。一部のある実施形態では、レポーター遺伝子コード配列（例えば、ｌａｃＺ遺伝子のコード配列）は、Ｒｓ１遺伝子座の内因性Ｒｓ１プロモーターと動作可能に連結される（または、その転写制御下に入る）。
【００１０】
一部の実施形態では、レポーター遺伝子は、ｌａｃＺ遺伝子である。一部の実施形態では、レポーターは、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、強化黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、強化青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、およびＭｍＧＦＰからなる群から選択される。一部の実施形態では、レポーター遺伝子の発現パターンは、Ｒｓ１遺伝子（例えば、Ｒｓ１遺伝子座の野生型Ｒｓ１遺伝子）の発現パターンと類似している。一部の実施形態では、レポーター遺伝子の発現は、野生型または親ＲＳ１ポリペプチドの発現パターンに類似している。
【００１１】
一部の実施形態では、そのゲノムが操作されたＲｓ１遺伝子を含む非ヒト動物が提供され、その操作されたＲｓ１遺伝子は、エクソン中の一つ以上の点変異を含み、野生型ＲＳ１ポリペプチドと比較して一つ以上のアミノ酸置換を有するＲＳ１ポリペプチドをコードする。野生型ＲＳ１ポリペプチドと比較して一つ以上のアミノ酸置換を有するＲＳ１ポリペプチドも、本明細書ではバリアントまたは変異型ＲＳ１ポリペプチドと呼ばれる。
【００１２】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるアミノ酸置換により、例えば、タンパク質の誤まった折り畳みによる非ヒト動物で産生された機能的ＲＳ１ポリペプチドのレベルの除去または著しい減少がもたらされる。このタンパク質の誤まった折り畳みにより、本明細書に記載される非ヒト動物の小胞体内に局在化されたバリアント（または変異型）ＲＳ１ポリペプチドの凝集、欠陥のあるジスルフィド結合型サブユニットアセンブリ、およびタンパク質分泌プロセスの一部としてＥＲの膜にＲＳ１ポリペプチドが挿入されることができないことが生じる。
【００１３】
一部の実施形態では、バリアントＲＳ１ポリペプチドは、シグナル配列の中にアミノ酸置換を含む、例えば、疎水性残基のプロリンとの置換、または親水性もしくは荷電残基との置換。
【００１４】
一部の実施形態では、バリアントＲＳ１ポリペプチドは、ディスコイジンドメインに隣接する領域におけるアミノ酸置換、すなわち、ＲＳ１領域およびＲＳ１ポリペプチドのＣ末端セグメントにおけるアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、バリアントＲＳ１ポリペプチドは、３８、４０、５９および２２３からなる群から選択される位置でシステインを置換することを含む。一部の実施形態では、バリアントＲＳ１ポリペプチドは、Ｃ５９Ｓ置換を含む。
【００１５】
一部の実施形態では、バリアントＲＳ１ポリペプチドは、ディスコイジンドメインにおけるアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、バリアントＲＳ１ポリペプチドは、６３、８３、１１０、１４２および２１９からなる群から選択される位置でシステインの非システイン残基との置換を含む。他の実施形態では、バリアントＲＳ１ポリペプチドは、ディスコイジンドメインにおける非システイン残基のシステインとの置換を含む。特定の実施形態では、置換はＲ１４１Ｃ置換である。一部の実施形態では、バリアントＲＳ１ポリペプチドは、ディスコイジンドメインにおける荷電残基の非荷電残基との置換、非荷電残基の荷電残基との置換、または荷電残基の逆荷電残基との置換を含む。その他の実施形態では、バリアントＲＳ１ポリペプチドは、ディスコイジンドメインにおけるプロリンの挿入または除去による置換（すなわち、プロリン残基を別の残基と置き換えること、またはその逆も同様）を含む。さらに他の実施形態では、バリアントＲＳ１ポリペプチドは、ディスコイジンドメインにおける極性残基の挿入または除去による置換（すなわち、極性残基を非極性残基と置き換えること、またはその逆も同様）を含む。
【００１６】
一部の実施形態では、アミノ酸置換を含むＲＳ１ポリペプチドを発現する非ヒト動物が提供され、一部のある実施形態では、このアミノ酸置換はＣ５９ＳまたはＲ１４１Ｃ置換である。一部の実施形態では、操作されたＲｓ１遺伝子は、エクソン３における点変異を含み、Ｃ５９Ｓ置換を有するＲＳ１ポリペプチドをコードする。一部のある実施形態では、エクソン３における点変異は、ＴＧＴのＡＧＴへのコドン変化であるか、またはこれを含む。一部の実施形態では、操作されたＲｓ１遺伝子は、エクソン５における点変異を含み、Ｒ１４１Ｃ置換を有するＲＳ１ポリペプチドをコードする。一部のある実施形態では、エクソン５における点変異は、ＣＧＣのＴＧＣへのコドン変化であるか、またはこれを含む。
【００１７】
一部の実施形態では、本明細書に開示される非ヒト動物は、オス動物である。Ｘ染色体上の内因性Ｒｓ１遺伝子座のＲｓ１遺伝子に破損または突然変異を含むオス動物は、破損または突然変異に対してヘミ接合性であるとも理解される。
【００１８】
一部の実施形態では、提供される非ヒト動物は、メス動物である。一部の実施形態では、メス非ヒト動物は、本明細書に記載される内因性Ｒｓ１遺伝子座のＲｓ１遺伝子における欠失に対してホモ接合性またはヘテロ接合性である。一部の実施形態では、メス非ヒト動物は、本明細書に記載される操作された（または変異型）Ｒｓ１遺伝子、一部の実施形態では、これは内因性Ｒｓ１遺伝子座にある、に対してホモ接合性またはヘテロ接合性である。
【００１９】
一部の実施形態では、操作されたＲｓ１遺伝子は、一つ以上の選択マーカーをさらに備える。一部の実施形態では、操作されたＲｓ１遺伝子は、一つ以上の部位特異的リコンビナーゼ認識部位をさらに備える。一部の実施形態では、操作されたＲｓ１遺伝子は、一つ以上の部位特異的リコンビナーゼ認識部位に隣接したリコンビナーゼ遺伝子と、選択マーカーとをさらに備えており、その部位特異的リコンビナーゼ認識部位は、除去を指示するよう方向づけられる。
【００２０】
一部の実施形態では、一つ以上の部位特異的リコンビナーゼ認識部位としては、ｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ２３７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、ｌｏｘ５１７１、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ＦＲＴ、Ｄｒｅ、ｒｏｘ、またはそれらの組み合わせが挙げられる。一部の実施形態では、リコンビナーゼ遺伝子は、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ（例えば、Ｆｌｐｅ、Ｆｌｐｏ）およびＤｒｅからなる群から選択される。一部のある実施形態では、一つ以上の部位特異的リコンビナーゼ認識部位は、ｌｏｘ（例えば、ｌｏｘＰ）部位であり、リコンビナーゼ遺伝子は、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする。
【００２１】
一部の実施形態では、リコンビナーゼ遺伝子は、分化細胞においてリコンビナーゼ遺伝子の発現を誘導するが、未分化細胞ではリコンビナーゼ遺伝子の発現を誘導しないプロモーターに動作可能に連結される。一部の実施形態では、リコンビナーゼ遺伝子は、転写によって能力を有し、発生的に制御されるプロモーターに動作可能に連結される。
【００２２】
プロモーターに動作可能に連結されたリコンビナーゼ遺伝子のいくつかの実施形態では、プロモーターは、プロタミン（Ｐｒｏｔ、例えばＰｒｏｔ１またはＰｒｏｔ５）、Ｂｌｉｍｐ１、Ｂｌｉｍｐ１（１ｋｂの断片）、Ｂｌｉｍｐ１（２ｋｂの断片）、Ｇａｔａ６、Ｇａｔａ４、Ｉｇｆ２、Ｌｈｘ２、Ｌｈｘ５、およびＰａｘ３からなる群から選択される。プロモーターに動作可能に連結されたリコンビナーゼ遺伝子のいくつかの実施形態では、プロモーターは、配列番号３０、配列番号３１、または配列番号３２であるか、またはこれを含む。プロモーターに動作可能に連結されたリコンビナーゼ遺伝子のいくつかの実施形態では、プロモーターは、配列番号３０であるか、または配列番号３０を含む。
【００２３】
一部の実施形態では、選択マーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏＲ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇＲ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏＲ）、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒＲ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）からなる群から選択される。一部の実施形態では、選択マーカーは、ＵｂＣプロモーター、Ｕｂｉプロモーター、ｈＣＭＶプロモーター、ｍＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター、ＥＦ１プロモーター、ｐｇｋ１プロモーター、β−アクチンプロモーター、およびＲＯＳＡ２６プロモーターからなる群から選択されるプロモーターの転写制御下にある。一部のある実施形態では、選択マーカーはｎｅｏＲまたはｈｙｇＲであり、Ｕｂｉプロモーターの転写制御下である。
【００２４】
一部の実施形態では、提供される非ヒト動物は、網膜分離症の（または網膜分離症に関連する）一つ以上の兆候、症状および／または状態を発症する。
一部の実施形態では、単離非ヒト細胞または組織が提供されており、そのゲノムは（ｉ）内因性Ｒｓ１遺伝子座の内因性Ｒｓ１遺伝子のコード配列の、全部または一部の欠失、または（ｉｉ）エクソン中の一つ以上の点変異を含む操作されたＲｓ１遺伝子を含み、および一つ以上のアミノ酸置換を持つＲＳ１ポリペプチドをコードし、ここにおいて、この操作されたＲｓ１遺伝子は、いくつかの実施形態では、内因性Ｒｓ１遺伝子座にある。一部の実施形態では、細胞はリンパ球である。一部の実施形態では、細胞は、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、単球、およびＴ細胞から選択される。一部の実施形態では、細胞は、眼または網膜の細胞タイプに由来するか、またはそれに関連する。一部のある実施形態では、細胞は、眼神経節細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、錐体細胞、桿状細胞、または網膜色素上皮細胞である。一部の実施形態では、組織は、脂肪、膀胱、脳、乳房、骨髄、目、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、筋肉、膵臓、血漿、血清、皮膚、脾臓、胃、胸腺、精巣、卵子、およびこれらの組み合わせから選択される。一部のある実施形態では、眼組織は、強膜、脈絡膜または網膜から選択される。
【００２５】
一部の実施形態では、本明細書に記載される単離非ヒトの細胞または組織から作製される、作成される、産生される、または取得される不死化細胞が提供される。
一部の実施形態では、非ヒト胚性幹細胞が提供されており、そのゲノムは（ｉ）Ｒｓ１遺伝子座の内因性Ｒｓ１遺伝子のコード配列の、全部または一部の欠失、または（ｉｉ）エクソン中の一つ以上の点変異を含む操作されたＲｓ１遺伝子を含み、および一つ以上のアミノ酸置換を持つＲＳ１ポリペプチドをコードし、ここにおいて、この操作されたＲｓ１遺伝子は、いくつかの実施形態では、内因性Ｒｓ１遺伝子座にある。一部の実施形態では、非ヒト胚性幹細胞は、齧歯類の胚性幹細胞である。一部のある実施形態では、齧歯類の胚性幹細胞はマウス胚性幹細胞であり、１２９系、Ｃ５７ＢＬ系またはこれらの混合物からのものである。一部のある実施形態では、齧歯類胚性幹細胞はマウス胚性幹細胞であり、１２９系およびＣ５７ＢＬ系の混合物である。一部のある実施形態では、齧歯類胚性幹細胞はマウス胚性幹細胞であり、そのゲノムがＣｒｂ１ｒｄ８突然変異を欠如している（すなわち、そのゲノムが野生型Ｃｒｂｓ１遺伝子を含む）、Ｃ５７ＢＬ系由来である。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒトＥＳ細胞は、配列番号２３、配列番号２６、および配列番号２８のいずれか一つを備える。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒトＥＳ細胞は、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３９、および配列番号４０のいずれか一つを備える。
【００２６】
一部の実施形態では、非ヒト動物を作るための本明細書に記載された非ヒト胚性幹細胞の利用法が提供される。一部のある実施形態では、非ヒトＥＳ細胞は、マウスＥＳ細胞であり、および（ｉ）Ｒｓ１遺伝子座の内因性Ｒｓ１遺伝子のコード配列の全部または一部の欠失、または、（ｉｉ）エクソンにおける一つ以上の点変異を含む操作されたＲｓ１遺伝子を含むマウスを作るために使用され、本明細書に記載される一つ以上のアミノ酸置換を有するＲＳ１ポリペプチドをコードし、ここにおいて、操作されたＲｓ１遺伝子が、一部の実施形態では内因性Ｒｓ１遺伝子座にある。一部のある実施形態では、非ヒトＥＳ細胞は、ラットＥＳ細胞であり、および（ｉ）Ｒｓ１遺伝子座の内因性Ｒｓ１遺伝子のコード配列の全部または一部の欠失、または、（ｉｉ）エクソンにおける一つ以上の点変異を含む操作されたＲｓ１遺伝子を含むラットを作るために使用され、本明細書に記載される一つ以上のアミノ酸置換を有するＲＳ１ポリペプチドをコードし、ここにおいて、操作されたＲｓ１遺伝子が、一部の実施形態では内因性Ｒｓ１遺伝子座にある。
【００２７】
一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒトＥＳ細胞から作製される、産生される、作成される、または取得される非ヒト胚が提供される。一部のある実施形態では、非ヒト胚は齧歯類胚であり、一部の実施形態ではマウス胚、一部の実施形態ではラット胎芽である。一部のある実施形態では、提供される非ヒト胚は、配列番号２５、配列番号２７、または配列番号２９を含む。一部のある実施形態では、提供される非ヒト胚は、配列番号３５、配列番号３８、または配列番号４１を含む。
【００２８】
一部の実施形態では、本発明は、非ヒト動物を作るための本明細書に記述された非ヒト胚の利用法を提供する。一部のある実施形態では、非ヒト胚は、マウス胚であり、および（ｉ）Ｒｓ１遺伝子座の内因性Ｒｓ１遺伝子のコード配列の全部または一部の欠失、または、（ｉｉ）エクソンにおける一つ以上の点変異を含む操作されたＲｓ１遺伝子を含むマウスを作製するために使用され、および本明細書に記載される一つ以上のアミノ酸置換を有するＲＳ１ポリペプチドをコードし、ここにおいて、操作されたＲｓ１遺伝子が、一部の実施形態では内因性Ｒｓ１遺伝子座にある。一部のある実施形態では、非ヒト胚は、ラット胚であり、および（ｉ）Ｒｓ１遺伝子座の内因性Ｒｓ１遺伝子のコード配列の全部または一部の欠失、または、（ｉｉ）エクソンにおける一つ以上の点変異を含む操作されたＲｓ１遺伝子を含むラットを作製するために使用され、および本明細書に記載される一つ以上のアミノ酸置換を有するＲＳ１ポリペプチドをコードし、ここにおいて、操作されたＲｓ１遺伝子が、一部の実施形態では内因性Ｒｓ１遺伝子座にある。
【００２９】
一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物、単離非ヒト細胞もしくは組織、不死化細胞、非ヒトＥＳ細胞、または非ヒト胚を備えたキットが提供される。一部の実施形態では、治療または診断のための薬剤（例えば、抗体またはその抗原結合断片）の製造および／または開発における使用のための、本明細書に記載されるキットが提供される。一部の実施形態では、疾患、障害もしくは状態の治療、予防、または改善のための薬剤（例えば、抗体またはその抗原結合断片）の製造および／または開発における使用のための、本明細書に記載されるキットが提供される。
【００３０】
一部の実施形態では、本明細書に記載される核酸構築物、または標的化ベクターが提供される。一部のある実施形態では、提供される核酸構築物、または標的化ベクターは、本明細書に記載されるＲｓ１遺伝子（または遺伝子座）の全部または一部を備える。一部のある実施形態では、提供される核酸構築物、または標的化ベクターは、本明細書に記載されるＲｓ１遺伝子（または遺伝子座）の全部または一部を含むＤＮＡ断片を備える。一部の実施形態では、齧歯類Ｒｓ１遺伝子座のヌクレオチド配列に相同な５’ヌクレオチド配列および３’ヌクレオチド配列に隣接する、齧歯類Ｒｓ１遺伝子座の齧歯類Ｒｓ１遺伝子に組み込まれる核酸配列を含む核酸構築物が提供され、ここにおいて、核酸配列の齧歯類Ｒｓ１遺伝子への組み込みは、（ｉ）齧歯類Ｒｓ１遺伝子のコード配列の全部または一部の欠失、または（ｉｉ）アミノ酸置換を有するＲＳ１ポリペプチドをコードする操作されたＲｓ１遺伝子を生じさせる。一部の実施形態では、組み込まれる核酸配列は、レポーター遺伝子を含み、および核酸配列の組み込みは、エクソン１の一部分およびエクソン２〜３の欠失をもたらす。一部の実施形態では、組み込まれる核酸配列は、変異型Ｒｓ１エクソンを含み、それにより、核酸配列の齧歯類Ｒｓ１遺伝子への組み込みが、アミノ酸置換を有するＲＳ１ポリペプチドをコードする操作されたＲｓ１遺伝子をもたらす。一部のある実施形態では、提供される核酸構築物または標的化ベクターは、配列番号２３、配列番号２６、および配列番号２８のいずれか一つを備える。一部のある実施形態では、提供される核酸構築物または標的化ベクターは、配列番号３３および配列番号３５、配列番号３６および配列番号３７、または配列番号３９および配列番号４０を備える。一部のある実施形態では、提供される核酸構築物または標的化ベクターは、一つ以上の選択マーカーを備える。一部のある実施形態では、提供される核酸構築物または標的化ベクターは、一つ以上の部位特異的組換え部位（例えば、ｌｏｘＰ、Ｆｒｔ、またはそれらの組み合わせ）を備える。一部のある実施形態では、提供される核酸構築物または標的化ベクターは、図示される。
【００３１】
一部の実施形態では、非ヒトＥＳ細胞、非ヒト細胞、非ヒト胚、および／または非ヒト動物を作製するための、本明細書に記載される核酸構築物または標的化ベクターの使用が提供される。
【００３２】
一部の実施形態では、非ヒト動物を作製する方法が提供され、その方法は、（ａ）非ヒト胚性幹細胞のゲノムに核酸配列を導入して、それにより（ｉ）Ｒｓ１遺伝子座の内因性Ｒｓ１遺伝子のコード配列の全部または一部が欠失されて、または（ｉｉ）Ｒｓ１遺伝子座の内因性Ｒｓ１遺伝子のエクソンが突然変異されて、アミノ酸置換を含むＲＳ１ポリペプチドをコードするようにすることであって、この核酸配列は、Ｒｓ１遺伝子座で配列に相同なポリヌクレオチドを含み、（ｂ）（ａ）から遺伝子改変された非ヒト胚性幹細胞を得ること、および（ｃ）（ｂ）の遺伝子改変された非ヒト胚性幹細胞を使用して非ヒト動物を生成することを含む。
【００３３】
非ヒト動物を作製する方法の一部の実施形態では、Ｒｓ１遺伝子のエクソン３は、Ｃ５９Ｓ置換を含むＲＳ１ポリペプチドをコードするように突然変異される。非ヒト動物を作製する方法の一部のある実施形態では、Ｒｓ１遺伝子のエクソン３は、Ｃ５９Ｓ置換を含むＲＳ１ポリペプチドをコードするように突然変異され、２５ｂｐの欠失がＲｓ１遺伝子のイントロン２に作製され、および２８ｂｐの欠失が、Ｒｓ１遺伝子のイントロン３に作製される。非ヒト動物を作製する方法の一部の実施形態では、Ｒｓ１遺伝子のエクソン５が、Ｒ１４１Ｃ置換を含むＲＳ１ポリペプチドをコードするように突然変異される。非ヒト動物を作製する方法の一部の実施形態では、Ｒｓ１遺伝子のエクソン５が、Ｒ１４１Ｃ置換を含むＲＳ１ポリペプチドをコードするように突然変異され、１０ｂｐの欠失が、Ｒｓ１遺伝子のイントロン４に作製され、および２９ｂｐの欠失が、Ｒｓ１遺伝子のイントロン５に作製される。非ヒト動物を作製する方法の一部の実施形態では、Ｒｓ１遺伝子座のコード配列のエクソン１の一部分およびエクソン２〜３は欠失される。非ヒト動物を作製する方法の一部のある実施形態では、Ｒｓ１遺伝子座のＲｓ１遺伝子の１３，７１６ｂｐは欠失される。
【００３４】
非ヒト動物を作製する方法の一部の実施形態では、核酸配列は一つ以上の選択マーカーをさらに含む。非ヒト動物を作製する方法の一部の実施形態では、核酸配列は一つ以上の部位特異的リコンビナーゼ認識部位をさらに含む。非ヒト動物を作製する方法の一部の実施形態では、核酸配列は、一つ以上の部位特異的リコンビナーゼ認識部位に隣接するリコンビナーゼ遺伝子と、選択マーカーとをさらに備えており、その部位特異的リコンビナーゼ認識部位は、除去を指示するよう方向づけられる。非ヒト動物を作製する方法の一部の実施形態では、核酸配列は、選択マーカーの下流にあるレポーター遺伝子をさらに含む。
【００３５】
非ヒト動物を作製する方法の一部の実施形態では、リコンビナーゼ遺伝子は、分化細胞においてリコンビナーゼ遺伝子の発現を誘導するが、未分化細胞ではリコンビナーゼ遺伝子の発現を誘導しないプロモーターに動作可能に連結される。非ヒト動物を作製する方法の一部の実施形態では、リコンビナーゼ遺伝子は、転写によって能力を有し、発生的に制御されるプロモーターに動作可能に連結される。
【００３６】
非ヒト動物を作製する方法の一部の実施形態では、この方法は、（ｃ）で作成された非ヒト動物を交配させ、欠失に対しホモ接合性の、あるいは変異型（または操作された）Ｒｓ１遺伝子に対しホモ接合性の非ヒト動物を生成する工程をさらに含む。
【００３７】
一部の実施形態では、非ヒト動物を作製する方法が提供され、この方法は、改変ゲノムが、（ｉ）内因性Ｒｓ１遺伝子座の内因性Ｒｓ１遺伝子のコード配列の全部または一部の欠失、または（ｉｉ）アミノ酸置換を有するＲＳ１ポリペプチドをコードする操作されたＲｓ１遺伝子、ここにおいて、この操作されたＲｓ１遺伝子は、一部の実施形態では、内因性Ｒｓ１遺伝子座にある、を含むように、非ヒト動物ゲノムを改変すること、および改変ゲノムを含む非ヒト動物を作製することを含む。一部の実施形態では、非ヒト動物ゲノムは、胚性幹（ＥＳ）細胞を利用することによって改変される、すなわち、ＥＳ細胞のゲノムが改変され、および改変ゲノムを有するＥＳ細胞が使用され、改変ゲノムを含む非ヒト動物を作製する。非ヒト動物を作製する方法の一部の実施形態では、ゲノムは、Ｃ５９Ｓ置換またはＲ１４１Ｃ置換を有するＲＳ１ポリペプチドをコードする操作されたＲｓ１遺伝子を含むように改変される。非ヒト動物を作製する方法の一部の実施形態では、ゲノムは、Ｒｓ１遺伝子座のコード配列の、少なくともエクソン１の一部分およびエクソン２〜３の欠失を含むように、一部のある実施形態では、Ｒｓ１遺伝子座のＲｓ１遺伝子の１３，７１６ｂｐの欠失を含むように、改変される。
【００３８】
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法から作製される、作成される、産生される、取得される、または取得可能である非ヒト動物が提供される。
一部の実施形態では、非ヒト動物における網膜分離症（または眼に関連する疾患、障害、または症状）の治療のための治療剤を特定する方法であって、この方法が、（ａ）そのゲノムが、（ｉ）Ｒｓ１遺伝子座の内因性Ｒｓ１遺伝子のコード配列の全部または一部の欠失、または（ｉｉ）アミノ酸置換を有するＲＳ１ポリペプチドをコードする操作されたＲｓ１遺伝子、ここにおいて、この操作されたＲｓ１遺伝子は、一部の実施形態では、内因性Ｒｓ１遺伝子座にある、を含む非ヒト動物に、一つ以上の薬剤を投与すること、（ｂ）一つ以上の薬剤が、網膜分離症（または眼に関連する疾患、障害、または状態）に関連する一つ以上の兆候、症状および／または状態に効果を持つかどうかを判断するための一つ以上のアッセイを実施すること、および（ｃ）治療剤として、網膜分離症（または眼に関連する疾患、障害、または状態）に関連する一つ以上の兆候、症状および／または状態に効果を持つ一つ以上の薬剤を特定すること、を含む。
【００３９】
一部の実施形態では、そのゲノムがＲｓ１遺伝子の開始（ＡＴＧ）コドンに動作可能に連結するレポーター遺伝子を含む、非ヒト動物が提供され、ここにおいて、このレポーター遺伝子が、Ｒｓ１遺伝子のエクソン１の一部分およびエクソン２〜３の位置に位置して、Ｒｓ１遺伝子配列の１３，７１６ｂｐの欠失を生じる。
【００４０】
一部の実施形態では、そのゲノムが、ＴＧＴのＡＧＴへのエクソン３における点変異、イントロン２での２５ｂｐの欠失、およびイントロン３での２８ｂｐ欠失の存在によって特徴付けられる操作されたＲｓ１遺伝子を含む、非ヒト動物が提供され、この操作されたＲｓ１遺伝子は、Ｃ５９Ｓ置換を有するＲＳ１ポリペプチドをコードする。
【００４１】
一部の実施形態では、そのゲノムが、ＣＧＣのＴＧＣへのエクソン５での点変異、イントロン４での１０ｂｐの欠失、およびイントロン５での２９ｂｐの欠失の存在によって特徴付けられる操作されたＲｓ１遺伝子を含む、非ヒト動物が提供され、この操作されたＲｓ１遺伝子は、Ｒ１４１Ｃ置換を有するＲＳ１ポリペプチドをコードする。
【００４２】
一部の実施形態では、網膜分離症の非ヒト動物モデルが提供され、この非ヒト動物は、本明細書に記載されるアミノ酸置換を有するＲＳ１ポリペプチドを発現、または産生する。
【００４３】
一部の実施形態では、網膜分離症の非ヒト動物モデルが提供され、この非ヒト動物は、本明細書に記載される操作されたＲｓ１遺伝子を備えたゲノムを有する。
一部の実施形態では、網膜分離症の非ヒト動物モデルが提供され、この非ヒト動物は、本明細書に記載されるＲｓ１遺伝子（または遺伝子座）におけるコード配列の全部または一部の欠失を含むゲノムを有する。
【００４４】
一部の実施形態では、網膜分離症の非ヒト動物モデルが提供され、非ヒト動物を提供することにより得られ、この非ヒト動物は、（ｉ）本明細書に記載される操作されたＲｓ１遺伝子を含むゲノムを有し、（ｉｉ）本明細書に記載されるＲｓ１遺伝子（または遺伝子座）におけるコード配列の全部または一部の欠失を含むゲノムを有し、または（ｉｉｉ）は、本明細書に記載されるアミノ酸置換を有するＲＳ１ポリペプチドを発現し、それによって、前述の網膜分離症の非ヒト動物モデルを提供する。
【００４５】
一部の実施形態では、治療または診断のための薬剤の製造および／または開発における使用のための、本明細書に記載される非ヒト動物または細胞が提供される。
一部の実施形態では、疾患、障害または状態の治療、予防または改善のための医薬の製造における使用のための、本明細書に記載される非ヒト動物または細胞が提供される。
【００４６】
一部の実施形態では、薬品としての使用など医療で使用するための薬剤またはワクチンの製造および／または開発における、本明細書に記載される非ヒト動物または細胞の使用が提供される。
【００４７】
一部の実施形態では、網膜分離症のための遺伝子治療薬の製造および／または開発における、本明細書に記載される非ヒト動物または細胞の使用が提供される。
一部の実施形態では、疾患、障害、または状態は、網膜分離症である。一部の実施形態では、疾患、障害または状態は、眼関連疾患、障害、または状態であり、あるいはＲｓ１機能および／または活性の欠失から生じる。
【００４８】
様々な実施形態において、本明細書に記載される一つ以上の表現型は、参照または対照と比較される。一部の実施形態において、参照または対照としては、本明細書に記載される改変を有する非ヒト動物、本明細書に記載される改変とは異なる改変を有する非ヒト動物、または改変を有さない非ヒト動物（例えば、野生型非ヒト動物）が挙げられる。
【００４９】
様々な実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は齧歯類であり、一部の実施形態ではマウスであり、一部の実施形態ではラットである。一部の実施形態では、本明細書に記載のマウスは、１２９系、ＢＡＬＢ／Ｃ系、Ｃ５７ＢＬ／６系、及び混合１２９ｘＣ５７ＢＬ／６系からなる群から選択され、一部のある実施形態ではＣ５７ＢＬ／６系である。
【００５０】
特許または出願の書類は、色付きで描かれた少なくとも一つの図面を含有する。色付きの図面（複数含む）を伴う本特許または特許出願公開の写しは、要求により、および必要な料金を支払うことにより当局から提供される。
【００５１】
以下の図から成る本明細書に含まれる図面は、例示目的のみであり限定を目的としない。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、非ヒト（例えば、マウス）レチノスキシン−１（Ｒｓ１）遺伝子（上部）および遺伝子産物（底部）の、正確な縮尺ではない編成図である。上部：各エクソンの下に数値が付され、非翻訳領域（白抜き四角）とコード配列（縦線記号）も示される。底部：リーダー配列（ＬＳ）、Ｒｓ１ドメイン（Ｒｓ１）、ディスコイジンドメイン（ＤＤ）およびＣ末端領域（ＣＴ）は、選択されたシステインの場所および疾患関連のミスセンス変異と共に示されている（出典：Ｗｕ、Ｗ．Ｗ．Ｈ．ら、２００３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（３０）：２８１３９−１４６の図１）。
【図２】図２は、実施例１に記載される、齧歯類においてＲｓ１遺伝子の欠失を生成するための標的化ベクターの、正確な縮尺ではない図を示す。ｌａｃＺレポーター遺伝子は、エクソン１のマウスＲｓ１開始（ＡＴＧ）コドンに動作可能に連結されて挿入され、マウスＲｓ１遺伝子座のエクソン１からエクソン３の最後の６つのヌクレオチドの残りの部分を欠失する（１３，７１６ｂｐの欠失）。Ｒｓ１−ｌａｃＺ−ＳＤＣ標的化ベクターは、自動削除薬剤選択カセット（例えば、ｌｏｘＰ配列に隣接したネオマイシン耐性遺伝子、米国特許第８，６９７，８５１号、第８，５１８，３９２号および第８，３５４，３８９号を参照のこと。これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる）を含む。相同組換えが行われると、示されるように、標的化ベクター中に含有される配列は、内因性マウスＲｓ１遺伝子座のエクソン１〜３の位置に挿入される。薬剤選択カセットは発生依存性の様式で除去される。すなわち、その生殖系細胞に上述のＲｓ１遺伝子座の破損を含むマウスから派生した子孫は、発生中に分化細胞から選択マーカーを脱落させる。連続的なエクソン（縦線記号）は、各エクソンの上の数値により示されており、非翻訳領域（白抜き四角）とコード配列（閉じた斜線）も示される。ｌａｃＺ：β−ガラクトシダーゼ遺伝子；Ｃｒｅ：Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子；Ｎｅｏ：ネオマイシン抵抗性遺伝子。
【図３】図３は、実施例１に記載される例示的な破損（たとえば、エクソン１〜３の１３，７１６ｂｐの欠失）を図示する、マウスＲｓ１遺伝子のゲノム構造の正確な縮尺ではない図を示す。エクソン（閉じた斜線）は各エクソンの上に番号付けされ、非翻訳領域（白抜き四角）も示されている。実施例１に記載されるスクリーニングアッセイに使用されるプローブ（すなわち、Ｒｓ１ＫＯｍＴＵ，Ｒｓ１ＫＯｍＴＤ）のおよその位置は、太い縦線記号により示される。
【図４】図４は、実施例１に記載される例示的な破損されたマウスＲｓ１遺伝子の正確な縮尺ではない図を示す。マウスＲｓ１開始（ＡＴＧ）コドンに動作可能に連結されたｌａｃＺレポーター遺伝子の挿入から生じた、マウスＲｓ１遺伝子座のエクソン１〜３の欠失（１３，７１６ｂｐの欠失）が示される。エクソン（縦線記号）は、各エクソンの上に数値が付され、非翻訳領域（白抜き四角）と残りのコード配列（縞模様の長方形）も示される。選択されたヌクレオチド接合部の場所は各接合部の下の線で示され、配列番号で示される。
【図５】図５は、実施例１に記載される、齧歯類（たとえばマウス）において変異型Ｒｓ１遺伝子を生成するための標的化ベクターの、正確な縮尺ではない図を示す。連続的なエクソン（縦線記号）は、各エクソンの上下の数値により示される。エクソン３の例示的な点変異（Ｃ５９Ｓ）；ＴＧＴからＡＧＴ）は、相同組換えによる合成ＤＮＡ断片およびカセット要素の挿入により、エクソン３の上方に示されている。Ｒｓ１Ｃ５９Ｓ−ＳＤＣ標的化ベクターは、自動削除薬剤選択カセット（例えば、ｌｏｘＰ配列に隣接したハイグロマイシン耐性遺伝子、米国特許第８，６９７，８５１号、第８，５１８，３９２号および第８，３５４，３８９号を参照のこと。これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる）を含む。相同組換えが行われると、示されるように、標的化ベクター中に含有される合成ＤＮＡ断片は、内因性マウスＲｓ１遺伝子座のエクソン３の位置に挿入される。薬剤選択カセットは発生依存性の様式で除去される。すなわち、その生殖系細胞に上述のＲｓ１遺伝子座の破損を含むマウスから派生した子孫は、発生中に分化細胞から選択マーカーを脱落させる。選択されたヌクレオチド接合部の場所は各接合部の下の線で示され、配列番号で示される。
【図６】図６は、マウスＲｓ１遺伝子のエクソン３のクローズアップ図の、および図５に図示した変異型Ｒｓ１遺伝子の設計の、正確な縮尺ではない図を示す（実施例１も参照）。標的の点変異（Ｃ５９Ｓ）を持つエクソン３（黒の長方形）、および周囲のイントロンは、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイ上に落下するように設計された二つの小規模な欠失と共に示されている。相同組換えによる標的化ベクターの組み込みにより、変異型Ｒｓ１遺伝子の周囲のイントロンにＣ５９Ｓ置換および二つの小規模な欠失（２５ｂｐおよび２８ｂｐ）を持つＲＳ１ポリペプチドの一部分をコードするエクソン３を生じる。実施例１に記載されるスクリーニングアッセイに使用されるプローブ（すなわち、Ｒｓ１−Ｃ５９ＳｍＴＵおよびＲｓ１−Ｃ５９ＳｍＴＤ）のおよその位置は、太い縦線記号により示される。
【図７】図７は、実施例１に記載される、標的化ベクター内に含有されるカセットがリコンビナーゼ介在除去された後に生成された、齧歯類（たとえばマウス）中の変異型Ｒｓ１遺伝子の、正確な縮尺ではないクローズアップ図を示す。エクソン３が点変異を有し、その結果、Ｒｓ１遺伝子産物におけるＣ５９Ｓ置換が、残りのｌｏｘＰ部位とともに示される。カセットのリコンビナーゼ介在除去後に残留したヌクレオチド接合部の位置は、その接合部の下の線で示され、および配列番号により示される。
【図８】図８は、実施例１に記載される、齧歯類（たとえばマウス）において変異型Ｒｓ１遺伝子を生成するための標的化ベクターの、正確な縮尺ではない図を示す。連続的なエクソン（縦線記号）は、各エクソンの上下の数値により示される。エクソン５の例示的な点変異（Ｒ１４１Ｃ；ＣＧＣからＴＧＣ）は、相同組換えによる合成ＤＮＡ断片およびカセット要素の挿入により、エクソン５の上方に示されている。Ｒｓ１Ｒ１４１Ｃ−ＳＤＣ標的化ベクターは、自動削除薬剤選択カセット（例えば、ｌｏｘＰ配列に隣接したハイグロマイシン耐性遺伝子、米国特許第８，６９７，８５１号、第８，５１８，３９２号および第８，３５４，３８９号を参照のこと。これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる）を含む。相同組換えが行われると、示されるように、標的化ベクター中に含有される合成ＤＮＡ断片は、内因性マウスＲｓ１遺伝子座のエクソン５の位置に挿入される。薬剤選択カセットは発生依存性の様式で除去される。すなわち、その生殖系細胞に上述のＲｓ１遺伝子座の破損を含むマウスから派生した子孫は、発生中に分化細胞から選択マーカーを脱落させる。選択されたヌクレオチド接合部の場所は各接合部の下の線で示され、配列番号で示される。
【図９】図９は、マウスＲｓ１遺伝子のエクソン５のクローズアップ図の、および図８に図示した変異型Ｒｓ１遺伝子の設計の、正確な縮尺ではない図を示す（実施例１も参照）。標的の点変異（Ｒ１４１Ｃ）を持つエクソン５（黒の長方形）、および周囲のイントロンは、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイ上に落下するように設計された二つの小規模な欠失と共に示されている。相同組換えによる標的化ベクターの組み込みにより、変異型Ｒｓ１遺伝子の周囲のイントロンにＲ１４１Ｃ置換および二つの小規模な欠失（１０ｂｐおよび２９ｂｐ）を持つＲＳ１ポリペプチドの一部分をコードするエクソン５を生じる。実施例１に記載されるスクリーニングアッセイに使用されるプローブ（すなわち、Ｒｓ１−Ｒ１４１ＣｍＴＵおよびＲｓ１−Ｒ１４１ＣｍＴＤ）のおよその位置は、太い縦線記号により示される。
【図１０】図１０は、実施例１に記載される、標的化ベクター内に含有されるカセットがリコンビナーゼ介在除去された後に生成された、齧歯類（たとえばマウス）中の変異型Ｒｓ１遺伝子の、正確な縮尺ではないクローズアップ図を示す。エクソン５が点変異を有し、その結果、Ｒｓ１遺伝子産物におけるＲ１４１Ｃ置換が、残りのｌｏｘＰ部位とともに示される。カセットのリコンビナーゼ介在除去後に残留したヌクレオチド接合部の位置は、その接合部の下の線で示され、および配列番号により示される。
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｃは、ｌａｃＺ発現、ＲＮＡＳＣＯＰＥ（登録商標）および免疫組織化学（ＩＨＣ）による、Ｒｓ１  ｎｕｌｌ（Ｒｓ１ＫＯ）ならびにＲｓ１変異型（Ｒｓ１Ｃ５９Ｓ、Ｒｓ１Ｒ１４１Ｃ）動物の網膜における、Ｒｓ１  ｍＲＮＡ、およびタンパク質発現の分布を表示する。Ａ、Ｒｓ１ＫＯ動物のＯＮＬおよび光受容体ＩＳにおけるポジティブなＸ−ｇａｌシグナルを示すｌａｃＺ染色。Ｂ、野生型（ＷＴ）動物における内因性Ｒｓ１  ｍＲＮＡ発現を示すＲＮＡＳＣＯＰＥ（登録商標）を介したＲｓ１ｍＲＮＡ発現。Ｒｓ１ＫＯ動物の網膜からＲｓ１  ｍＲＮＡは検出されなかった。Ｃ、ＷＴ動物の網膜層全てにおけるＲＳ１タンパク質分布を示すＩＨＣ。Ｒｓ１ＫＯ動物にＲＳ１タンパク質発現は検出されなかった、ならびに、Ｒｓ１Ｃ５９ＳおよびＲｓ１Ｒ１４１Ｃ動物のＯＮＬおよびＩＳに限定された（ＧＣＬ：神経節細胞層；ＩＰＬ：内側網状層；ＩＮＬ：内側核層；ＯＰＬ：外側網状層；ＯＮＬ：外側核層；ＩＳ：内側セグメント；ＲＰＥ：網膜色素上皮）。Ｒｓ１：赤；ＤＡＰＩ：青色。
【図１２−１】図１２Ａ〜図１２Ｄは、ウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡアッセイによる、Ｒｓ１  ｎｕｌｌ（Ｒｓ１ＫＯ）およびＲｓ１変異型（Ｒｓ１Ｃ５９Ｓ，Ｒｓ１Ｒ１４１Ｃ）動物の網膜におけるＲＳ１タンパク質発現を示す。Ａ、Ｒｓ１ＫＯおよびＣ５７ＢＬ／６由来オス株における、ＲＳ１発現を示す還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウェスタンブロット。Ｂ、野生型（ＷＴ）およびＲｓ１Ｃ５９Ｓオス動物でのＲＳ１発現を示す還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウェスタンブロット。Ｃ、野生型（ＷＴ）およびＲｓ１Ｒ１４１Ｃオス動物でのＲＳ１発現を示す還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウェスタンブロット。Ｄ、野生型（ＷＴ）、Ｒｓ１ＫＯ、Ｒｓ１Ｃ５９Ｓ、およびＲｓ１Ｒ１４１Ｃオス動物におけるＲＳ１タンパク質のレベルを示すＥＬＩＳＡアッセイ。野生型の同腹仔と比較した、Ｒｓ１変異動物に発現したＲＳ１タンパク質のパーセントは、各バー上に示されている。Ｄ、ウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡアッセイの、Ｒｓ１ノックアウトメス動物網膜でのＲＳ１タンパク質発現。ＫＯ：ホモ接合性Ｒｓ１ノックアウト（Ｒｓ１−／−）；ＨＥＴ：ヘテロ接合性Ｒｓ１ノックアウト（Ｒｓ１−／＋）。ＲＳ１  ＨＥＴメス動物は、野生型（「ＷＴ」）オスおよびメス動物と同様の量のＲＳ１タンパク質を有していた。
【図１２−２】同上。
【図１３−１】図１３Ａ〜図１３Ｄは、組織学的、ＩＨＣおよび光干渉断層撮影（ＯＣＴ）解析による、Ｒｓ１  ｎｕｌｌ（Ｒｓ１ＫＯ）およびＲｓ１変異型（Ｒｓ１Ｃ５９Ｓ，Ｒｓ１Ｒ１４１Ｃ）動物の網膜における、病理学的変化を示す。Ａ、Ｒｓ１ＫＯ、Ｒｓ１Ｃ５９Ｓ、およびＲｓ１Ｒ１４１Ｃオス動物における、ＩＮＬ（赤色三角形）における表示された空洞および分裂、およびＩＮＬとＯＰＬとの全体的な組織の破壊、ＯＮＬ（垂直赤色の二重矢印）および内側／外側セグメント（垂直赤色線）が薄くなることによる光受容体の変性の組織学的検査。Ｂ、Ｒｓ１ＫＯオス動物において、網膜特異的細胞マーカー（ＧＦＡＰ−グリア線維性酸性タンパク質およびビメンチン）を用いたＩＨＣによって、ＩＮＬのグリオーシス（＊活性化ミュラー細胞が示された）が明らかになった。Ｃ、スペクトラリスハイデルベルグ（Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）光干渉断層撮影（ＯＣＴ）を用いたインビボイメージングによって、Ｒｓ１ＫＯ、Ｒｓ１Ｃ５９Ｓ、およびＲｓ１Ｒ１４１Ｃオス動物に、網膜分離症、および光受容体の変性が観察された。Ｄ、ヘテロ接合性ＲＳ１ノックアウトメス（Ｒｓ１−／＋）（「Ｈｅｔ」）では、スキシス（亀裂（ｓｃｈｉｓｉｓ））は観察されなかった、一方、ホモ接合性ＲＳ１ノックアウトメス（Ｒｓ１−／−）（「ＫＯ」）では、ヘミＫＯオスに一致する表現型があった。
【図１３−２】同上。
【図１４−１】図１４Ａ〜Ｄは、２０週齢の動物における、暗順応（ＤＡ−）および明順応（ＬＡ−）全視野網膜電図（ＥＲＧ）による外側網膜機能の分析を示す。Ａ、代表的なＥＲＧは、野生型（ＷＴ）、Ｒｓ１ＫＯ（ＫＯ）、Ｒｓ１Ｃ５９Ｓ（Ｃ５９Ｓ）およびＲｓ１Ｒ１４１Ｃ（Ｒ１４１Ｃ）オス動物から、暗順応条件下で得られた。Ｂ、代表的なＥＲＧは、野生型（ＷＴ）、Ｒｓ１ＫＯ（ＫＯ）、Ｒｓ１Ｃ５９Ｓ（Ｃ５９Ｓ）およびＲｓ１Ｒ１４１Ｃ（Ｒ１４１Ｃ）オス動物から、明順応条件下で得られた。Ｃ、刺激輝度の関数としてプロットした暗および明順応ＥＲＧの主要構成要素の代表的な振幅。データ点は、６つのオス動物に対して平均（±ＳＤ）を示す。野生型と比較して、Ｒｓ１ＫＯ、Ｒｓ１Ｃ５９ＳおよびＲｓ１Ｒ１４１Ｃ（Ｒ１４１Ｃ）オス動物のａ波およびｂ波ともに振幅を減少させた。刺激輝度（ＡおよびＢ）は、左端の波形グラフの左に注記される。Ｄ、代表的なＥＲＧは、野生型Ｒｓ１＋／＋）、ホモ接合性ノックアウト（Ｒｓ１−／−）およびヘテロ接合性ノックアウト（Ｒｓ１−／＋）メス動物から、暗順応および明順応条件下で得られた。担体（ヘテロ接合性）メスのＥＲＧは、全ての条件下でＷＴ対照のそれと一致した。比較すると、ホモ接合性ノックアウトメスのＥＲＧ表現型は、負電荷の波形および減少した振幅ａ波で、ヘミ接合性ノックアウトオスのものと同等であった。
【図１４−２】同上。
【図１５】図１５は、Ｒｓ１  ＫＯマウスにおける網膜の早期発症表現型を調査する実施例４に記載された研究の実験計画を示す。♂Ｒｓ１（−／Ｙ）またはＲｓ１（＋／Ｙ）および♀Ｒｓ１（＋／−）マウスを交配して得たＲｓ１  ＫＯマウス：Ｒｓ１（−／Ｙ）またはＲｓ１（−／−）、およびＲｓ１  ＷＴマウス：Ｒｓ１（＋／Ｙ）またはＲｓ１（＋／＋）。ＥＲＧは、Ｐ１５、１８、２１および２４で行われ、各マウスは６日間の間隔で２回以下のＥＲＧまたはＯＣＴを受けた。
【図１６−１】図１６Ａ〜図１６Ｆは、ＥＲＧおよびＯＣＴ解析におけるＲｓ１ＫＯマウスの早期発症表現型を説明する。外側網膜機能は、暗順応（ＤＡ−）（ＡおよびＤ）および明順応（ＬＡ−）（ＢおよびＥ）全視野ＥＲＧによって評価され、ａ波に対して減少したｂ波を示し、すべての時点で負電荷ＥＲＧ（定量データを示さない）をもたらした。網膜分離症表現型は、観察時間コース（Ｐ１５−Ｐ２４）全体に存在していた（ＣおよびＦ、黄色三角形で示されている）。
【図１６−２】同上。
【図１７−１】図１７Ａ〜図１７Ｂは、Ｒｓ１  ＫＯマウスおよび野生型（ＷＴ）マウスの、経時的なＥＲＧパラメーターの変化を表示する（ナカ・ラシュトン解析）。ＷＴ対照と比較して、Ｐ１５でのａ波およびｂ波の両方のＲｍａｘ値は、Ｒｓ１ＫＯマウスにおいて、より低かった、ＤＡ−ＥＲＧおよびＬＡ−ＥＲＧｂ波のＲｍａｘ値および感度値の両方は、Ｐ１５でのＲｓ１  ＫＯマウスにおいて、減少した。より年長の年齢で、Ｒｓ１  ＫＯおよびＷＴマウスにおいてＲｍａｘ値の減少が続いたが、感度値は同等だった。
【図１７−２】同上。
【図１８】図１８は、時間経過に伴うＯＣＴ画像の変化を示す。Ｐ１５で、ＩＮＬおよびＯＰＬ（アスタリスク）における顕著なスキシス（亀裂（ｓｃｈｉｓｉｓ））が観察され、およびＥＬＭの根拠は観察されず、これは後の時点では緩和する傾向があった。Ｒｓ１  ＫＯ網膜のエリプソイド帯（ＥＺ）は期間中、ＷＴよりも広かった。
【図１９】図１９Ａ〜図１９Ｃは、定量的ＯＣＴ解析の結果を示す。ＷＴマウスにおける網膜（外側網膜を含む）は、発育期間（Ｃ）の間にわずかに薄くなった。Ｒｓ１  ＫＯマウスにおける網膜（ＡおよびＢ）は、主に緩和されたスキシス（亀裂（ｓｃｈｉｓｉｓ））に関係して、より薄くなり、およびＲｓ１  ＫＯ網膜における外側網膜は期間（Ｃ）の間、ＷＴよりも薄かった。
【図２０】図２０は、マウス、ラットおよびヒトのＲＳ１ポリペプチドのアラインメントを示す。シグナル配列は下線付きで示される。配列が異なる位置は、「＊」で識別される。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
定義
破損：一部の実施形態では、破損は、ＤＮＡ配列の挿入、欠失、置換、交換、ミスセンス変異、もしくはフレームシフト、またはこれらの任意の組み合わせを達成または示す場合がある。挿入は、遺伝子全体または遺伝子の断片（例えば、エクソン）の挿入を含む場合があり、これは内因性配列以外の起源のもの（例えば、異種配列）であってもよい。一部の実施形態では、破損は遺伝子または遺伝子産物の（例えば、遺伝子によってコードされたタンパク質の）発現および／または活性を増加する場合がある。一部の実施形態では、破損は遺伝子または遺伝子産物の発現および／または活性を減少する場合がある。一部の実施形態では、破損は遺伝子またはコードされた遺伝子産物（例えば、コードされたポリペプチド）の配列を変える場合がある。一部の実施形態では、破損は遺伝子またはコードされた遺伝子産物（例えば、コードされたタンパク質）を切断または断片化する場合がある。一部の実施形態では、破損は遺伝子またはコードされた遺伝子産物を伸長させる場合がある。一部のかかる実施形態では、破損は融合ポリペプチドの組立を遂行する場合がある。一部の実施形態では、破損は遺伝子または遺伝子産物のレベルに影響するが、その活性には影響しない場合がある。一部の実施形態では、破損は遺伝子または遺伝子産物の活性に影響するが、そのレベルには影響しない場合がある。一部の実施形態では、破損は遺伝子または遺伝子産物のレベルに対して顕著な効果を持たない場合がある。一部の実施形態では、破損は遺伝子または遺伝子産物の活性に対して顕著な効果を持たない場合がある。一部の実施形態では、破損は遺伝子または遺伝子産物のレベルまたは活性のいずれに対しても顕著な効果を持たない場合がある。
【００５４】
非ヒト動物：本明細書で使用される場合、ヒトではない任意の脊椎動物を指す。一部の実施形態では、非ヒト動物は、円口類、硬骨魚、軟骨魚（例えば、サメまたはエイ）、両生類、は虫類、哺乳類、および鳥である。一部の実施形態では、非ヒト動物は哺乳類である。一部の実施形態では、非ヒト哺乳類は、霊長類、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ウシ、または齧歯類である。一部の実施形態では、非ヒト動物はラットまたはマウスなどの齧歯類である。
【００５５】
実質的な相同性：本明細書で使用される場合、アミノ酸配列間または核酸配列間の比較を指す。当業者であれば理解するように、二つの配列はそれらが対応する位置に相同な残基を含む場合、「実質的に相同」であると一般的にみなされる。相同残基は同一の残基である場合がある。あるいは、相同残基は、適度に類似した構造および／または機能的特徴を持つ非同一残基であってもよい。例えば、当業者には周知のように、特定のアミノ酸は「疎水性」または「親水性」アミノ酸、および／または「極性」または「非極性」側鎖を持つものとして一般的に分類される。一つのアミノ酸の同じタイプの別のアミノ酸での置換は、「相同」置換とみなされる場合がよくある。一般的なアミノ酸分類を下記に要約する。
【００５６】
【表１】
2020508073.tif 000002
【００５７】
【表２】
2020508073.tif 000003
【００５８】
当技術分野で周知のように、アミノ酸または核酸配列は、ヌクレオチド配列に対するＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、およびアミノ酸配列に対するＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどの市販のコンピュータプログラムで利用可能なものを含む、様々なアルゴリズムの任意のものを使用して比較することができる。かかるプログラムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，Ａ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｂ．Ｆ．Ｆ．Ｏｕｅｌｌｅｔｔｅ（編）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；およびＭｉｓｅｎｅｒら（編）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９８に記載されている。相同配列を特定することに加えて、上述のプログラムは相同性の程度の指標を一般的に提供する。一部の実施形態では、二つの配列は、残基の関連する区間に渡って、その対応残基の少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上が相同の場合、実質的に相同であるとみなされる。一部の実施形態では、関連する区間は完全配列である。一部の実施形態では、関連する区間は少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７またはそれ以上の残基である。一部の実施形態では、関連する区間は完全配列に沿った隣接残基を含む。一部の実施形態では、関連する区間は完全配列に沿って不連続な残基を含み、例えばポリペプチドまたはその一部のフォールディングされた構造により引き合わされた非隣接残基を含む。一部の実施形態では、関連する区間は少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれ以上の残基である。
【００５９】
実質的な同一性：本明細書で使用される場合、アミノ酸配列間または核酸配列間の比較を指す。当業者であれば理解するように、二つの配列はそれらが対応する位置に同一な残基を含む場合、「実質的に同一」であると一般的にみなされる。当技術分野で周知のように、アミノ酸または核酸配列は、ヌクレオチド配列に対するＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、およびアミノ酸配列に対するＰＳＩ−ＢＬＡＳＴなどの市販のコンピュータプログラムで利用可能なものを含む、様々なアルゴリズムの任意のものを使用して比較することができる。かかるプログラムの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３−１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９６，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：４６０−８０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−４０２；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，Ａ．Ｄ．ａｎｄ  Ｂ．Ｆ．Ｆ．Ｏｕｅｌｌｅｔｔｅ（編）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；およびＭｉｓｅｎｅｒら（編）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９８に解説されている。同一配列の特定に加え、上述のプログラムは多くの場合、同一性の程度の指標も提供する。一部の実施形態では、二つの配列は、残基の関連する区間に渡って、その対応残基の少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上が同一の場合、実質的に同一であるとみなされる。一部の実施形態では、関連する区間は完全配列である。一部の実施形態では、関連する区間は少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれ以上の残基である。
【００６０】
「標的化ベクター」または「標的化構築物」は、本明細書で使用される場合、標的化領域を備えるポリヌクレオチド分子を指す。標的化領域は、標的の細胞、組織または動物の配列と同一または実質的に同一の配列を備え、相同組換えを介して標的化構築物（および／またはその中に含有される配列）を、その細胞、組織または動物のゲノム内の位置に統合する。部位特異的リコンビナーゼ認識部位（たとえばｌｏｘＰ部位またはＦｒｔ部位）を使用し、リコンビナーゼ介在カセット交換を介して細胞、組織または動物の位置内へと標的化する標的化領域もまた含まれる。一部の実施形態では、本明細書に記載される標的化構築物は、特定の対象の核酸配列または遺伝子（たとえばレポーター遺伝子、同種遺伝子、異種遺伝子、または変異型遺伝子）、選択マーカー、対照配列および／または制御配列、ならびにリコンビナーゼまたは組換え誘導性ポリペプチドをコードする他の核酸配列をさらに備える。一部の実施形態では、標的化構築物は、対象の遺伝子の全部または一部をさらに備えていてもよく、この場合において対象の遺伝子は、内因性配列によってコードされるタンパク質と類似の機能を有するポリペプチドの全部または一部をコードする。一部の実施形態では、標的化構築物は、対象の変異型遺伝子の全部または一部を備えていてもよく、この場合において対象の変異型遺伝子は、内因性配列によってコードされるポリペプチドと類似の機能を有するバリアントポリペプチドの全部または一部をコードする。一部の実施形態では、標的化構築物は、レポーター遺伝子の全部または一部を備えていてもよく、この場合においてそのレポーター遺伝子は、当分野に公知の技術を使用して容易に特定される、および／または測定されるポリペプチドをコードする。
【００６１】
バリアント：本明細書で使用される場合、参照実体とかなりの構造的同一性を示すが、参照実体と比較して、一つ以上の化学的部分の存在またはレベルにおいて、参照実体とは構造的に異なる実体を指す。一部の実施形態では、「バリアント」は、その参照実体とは機能的にも異なる。例えば、「バリアントポリペプチド」は、アミノ酸配列の一つ以上の差異および／またはポリペプチド骨格に共有結合した化学的部分（例えば、炭化水素、脂質など）の一つ以上の差異の結果として、参照ポリペプチドとは異なる場合がある。一部の実施形態では、「バリアントポリペプチド」は、参照ポリペプチドと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％の全体的配列同一性を示す。あるいはまたはさらに、一部の実施形態では、「バリアントポリペプチド」は、少なくとも一つの特徴的配列要素を参照ポリペプチドと共有しない。一部の実施形態では、参照ポリペプチドは一つ以上の生物活性を持つ。一部の実施形態では、「バリアントポリペプチド」は参照ポリペプチドの生物活性の一つ以上を共有する。一部の実施形態では、「バリアントポリペプチド」は参照ポリペプチドの生物活性の一つ以上を欠く。一部の実施形態では、「バリアントポリペプチド」は参照ポリペプチドと比べて一つ以上の生物活性のレベル減少を示す。一部の実施形態で、対象のポリペプチドは、特定位置での少数の配列変更以外は、親のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する場合、対象のポリペプチドは、親または参照ポリペプチドの「バリアント」であるとみなされる。一般的に、親と比べて、バリアントの残基の１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、または２％未満が置換される。一部の実施形態では、「バリアント」は、親と比べて、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個、または１個の置換残基を有する。しばしば、「バリアント」は、非常に少数の（例えば、５、４、３、２、または１未満）の置換された機能残基（すなわち、特定の生物活性に参加する残基）を持つ。さらに、「バリアント」は一般的には５、４、３、２、または１以下の付加または欠失を持ち、親と比べて付加または欠失を持たないことがよくある。さらに、任意の付加または欠失は一般的には、約１０、約９、約８、約７、約６未満であり、通常は約５、約４、約３、または約２未満の残基である。一部の実施形態では、親または参照ポリペプチドは自然界に存在するものである。当業者であれば理解するように、特に対象のポリペプチドが感染因子ペプチドである時、対象の特定ポリペプチドの複数のバリアントは、通常は自然界に見られる場合がある。
【００６２】
実施形態の詳細な説明
齧歯類（例えば、マウスまたはラット）などの非ヒト動物は、レチノスキシン−１（ＲＳ１）ポリペプチドをコードする遺伝物質中の破損または突然変異を持つものを提供する。特に、非ヒト動物にＲＳ１ポリペプチドを産生しない変異型Ｒｓ１遺伝子を生じる、Ｒｓ１遺伝子のコード配列の全部または一部の欠失を有する非ヒト動物が提供される。また、野生型ＲＳ１ポリペプチド（すなわち、突然変異がないＲｓ１遺伝子によってコードされたＲＳ１ポリペプチド）と比較して、一つ以上のアミノ酸置換を含むバリアントまたは変異型ＲＳ１ポリペプチドをコードする変異型Ｒｓ１遺伝子を生じる、Ｒｓ１遺伝子のコード配列における一つ以上の突然変異を有する非ヒト動物が提供される。かかる一つ以上のアミノ酸置換は、本明細書に記載されるように、非ヒト動物に、産生された機能的ＲＳ１ポリペプチドの除去、または著しい減少、ならびに網膜分離症（例えば、Ｘ連鎖性網膜分離症、ＸＬＲＳ）と関連する病理学的特徴および機能的特徴の形成をもたらす。したがって、本明細書に開示される非ヒト動物は、網膜分離症の治療および／または改善のための治療候補の開発および特定に特に有用である。かかる非ヒト動物は、網膜分離症の治療および／または改善のための治療（例えば、遺伝子治療）を特定および開発するための細胞源を提供する。さらに、かかる非ヒト動物は、眼関連疾患、障害、およびそれに関する状態の治療のための治療剤の開発のための有用な動物モデル系となる能力を提供する。
【００６３】
一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物はオス動物である。一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物はメス動物である。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、本明細書に記載されるＲｓ１遺伝子における破損または突然変異に対しヘテロ接合性である、メス動物である。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、本明細書に記載されるＲｓ１遺伝子における破損または突然変異に対しホモ接合性である、メス動物である。
【００６４】
本開示の様々な態様が以下のセクションに詳細に記載される。こうしたセクションの使用は制限することを意図していない。各セクションは、本明細書に記載した一つ以上の実施形態に適用することができる。本明細書では、特に指定のない限り、「または」の使用は「および／または」を意味する。
【００６５】
レチノスキシン−１および網膜分離症
レチノスキシン−１は、染色体Ｘｐ２２．２上にある６つのエクソンおよび５つのイントロンを含有する約３２．４ｋｂの長さの小さな遺伝子であり、レチノスキシンと呼ばれる２２４−アミノ酸前駆体ポリペプチドに翻訳される３．１ｋｂのｍＲＮＡをコードする。レチノスキシンは、四つの異なるドメインを含むモノマーとして発現される：細胞の外部にタンパク質移行を方向付けるＮ末端シグナル配列（２３アミノ酸）；独特のＲｓ１ドメイン（長く／高度な保存配列モチーフ３９アミノ酸長）；網膜細胞アーキテクチャを保存し、適切なシナプス接続性を確立するために、ＲＳ１の接着機能に寄与するディスコイジンドメイン（１５７アミノ酸）；およびＣ末端セグメント（５アミノ酸）。
【００６６】
レチノスキシンは、小胞体内で集合し、機能的ジスルフィド結合型ホモ八量体として分泌される（Ｃｙｓ５９−Ｃｙｓ２２３ジスルフィド結合によって一緒に結合される８つのサブユニット。八量体内のサブユニットは、Ｃｙｓ（４０）−Ｃｙｓ（４０）ジスルフィド結合によって媒介される二量体にさらに組織化される。ＲＳ１は、イオン力によって、光受容体内側セグメント血漿膜の外葉（ｏｕｔｅｒ  ｌｅａｆｌｅｔ）に結合され、細胞間相互作用および細胞接着における機能が得られる。ＲＳ１は、顕著に桿状および錐体の内側セグメント、ならびに双極細胞、ならびに松果腺によって、網膜内で発現される。網膜における免疫染色は、レチノスキシンを、光受容体の内部セグメント、双極細胞、ならびに内側および外側の網状層に局在化させる。高い配列相同性は、ヒト、マウス、ラットおよびウサギに存在する（９６％の同一性と、マウスとヒトとの間の９７．８％の類似性。図２０も参照）。
【００６７】
網膜分離症は、変性、遺伝性、牽引性および滲出性形態に分類される重度の眼疾患である。特に、Ｘ連鎖性若年網膜分離症（ＸＬＲＳ）は、網膜分離症の遺伝性形態であり、視力の損失、網膜の神経感覚層の異常分裂、および網膜電図（ＥＲＧ）のｂ波の減少によって特徴付けられる初期発症性黄斑変性症である。ＸＬＲＳは、レチノスキシン−１ＲＳ１）遺伝子の突然変異によって引き起こされ、オスのみに疾患を引き起こすＸ連鎖劣性パターンで伝達される。ＲＳ１遺伝子産物における突然変異が、ＲＳ１ポリペプチドの完全な欠如、あるいは機能が低減されたまたは機能しない欠陥のあるＲＳ１ポリペプチドの産生をもたらす。ＲＳ１遺伝子におけるほぼ２００の突然変異は、ＸＬＲＳと関連性があることが報告されており、個人間で非常に可変である表現型が現れる（例えば、Ｋｉｍ、Ｄ．Ｙ．およびＳ．Ｍｕｋａｉ、２０１３、Ｓｅｍ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２８（５−６）：３９２−６に見直される）。報告されたほぼ２００突然変異のうち、疾患の原因となる突然変異の約４０％は、ナンセンス突然変異またはフレームシフト突然変異であり、これは完全長ポリペプチドの欠如につながると予測される。ただし、疾患を引き起こす突然変異の約５０％（１００／１９１）はミスセンス変異であるが、これは完全長変異ポリペプチドの産生を可能にする（Ｍｏｌｄａｙ、Ｒ．Ｓ．ら、２０１２、Ｐｒｏｇ．Ｒｅｔｉｎ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．３１：１９５−２１２）。これらの突然変異のほとんど（８５／１９１）はディスコイジンドメインに見られ、機能的に無能力な誤って折り畳まれたポリペプチドをもたらす。
【００６８】
ＸＬＲＳの表現型のスペクトルがある。中心窩が関与する嚢胞性黄斑病変は、ＸＲＬＳの特徴的な臨床的特徴である。特に、「カートホイール」または「スポークホイール」パターンを有する中心窩スキシスは、ほぼ１００％のケースで提示される眼底検査での特徴的な発見であり、またスキシスは患者または網膜剥離の最大で５０％で周辺に発生しうる。周辺のスキシスは、サポートされていない立体交差した血管から出血する可能性がある内葉（ｉｎｎｅｒ  ｌｅａｆ）の穴および裂けにつながりうる。さらなる周辺変化には、網膜色素変性症、網膜線維症および白点（ｗｈｉｔｅ  ｆｌｅｃｋｓ）、および硝子体網膜ジストロフィーに類似した色素沈着が含まれる。ＥＲＧは、際立ったｂ波の低減、および一部の患者における異常なａ波を示しているが、多くの場合、ａ波は正常なままである。
【００６９】
ＸＬＲＳおよび疾患経過の臨床像は、出生時のような早期から後の軽度の視覚的症状のみを持つ学校年齢まで、変化して提示される。これらの変形および臨床重症度は、遺伝子型と相関するとは見なされず、メスの担体は無症状である。現在、スペクトラルドメインＯＣＴ（ＳＤ−ＯＣＴ）は、この疾患の主な診断技術であり、既存の管理オプションは低視力補助具に限定されている。炭酸脱水酵素阻害薬（ＣＡＩ、局所および口腔、緑内障における使用に承認されている）は、報告された小さな研究で治療された眼の約５０％の視力の改善を示している。
【００７０】
変異型または操作されたＲｓ１遺伝子を有する非ヒト動物
ＸＬＲＳの理解における著しい進歩が達成されているが、ＸＬＲＳの正確な機構の多くは未知である。本開示は、確立されたシステムに現在存在しない独特の遺伝的構造に依存するＸＬＲＳの治療を作成および開発するための改善されたインビボシステムの作成に基づく。従って、本開示は、ＸＬＲＳの治療を作成および開発するための改善されたインビボシステムは、齧歯類（例えば、マウス）などの非ヒト動物の内因性Ｒｓ１遺伝子座における遺伝子改変を作り出すことによって提供されうるとの認識に基づく。本明細書に記載されるように、本開示は、とりわけ、ヒトＸＬＲＳ疾患表現型を再現するＲｓ１−欠失およびＲｓ１−操作された（例えば、変異型Ｒｓ１）非ヒト動物（例えば、マウスなどの齧歯類動物）を生成する例示的戦略を特に実証する。いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、本明細書に記載される戦略は、所望されるその他のＲｓ１−欠失および／またはＲｓ１−操作された非ヒト動物を生成するために用いられうる。たとえば、Ｒｓ１−操作された非ヒト動物は、以下の実施例のセクションに記載されているもの以外の突然変異または突然変異の組み合わせを含む操作されたＲｓ１遺伝子を含むように生成されうる。内因性Ｒｓ１遺伝子内に操作されうる突然変異の例は、Ｘ連鎖性網膜分離症配列変異データベース（ＲＥＴＩＮＯＳＣＨＩＳＩＳＤＢ（登録商標））で見つけることができる。
【００７１】
一部の実施形態では、本明細書に開示される非ヒト動物は、内因性Ｒｓ１遺伝子座におけるＲｓ１遺伝子のコード配列の全部または一部の欠失をゲノムに持ち、非ヒト動物で産生される機能的ＲＳ１ポリペプチドの欠如をもたらす。一部の実施形態では、欠失は、少なくともＲｓ１遺伝子のエクソン２〜３を含む。エクソン２は、ＲＳ１ポリペプチドのアミノ酸１８〜２６をコードする（シグナル配列の最後の５つのアミノ酸であるアミノ酸１８〜２３で）。エクソン３は、ＲＳ１ポリペプチドのアミノ酸２７〜６１をコードする。一部の実施形態では、欠失はＲｓ１遺伝子の少なくともエクソン１の一部分およびエクソン２〜３を含む。例えば、ＡＴＧ開始コドンのすぐ３’側から始まりエクソン１の３’末端まで、およびＲＳ１ポリペプチドのアミノ酸２〜１７をコードする、エクソン１の部分は、欠失に含めることができる。特定の実施形態では、欠失は、エクソン１のＡＴＧ開始コドンの直後に始まり、エクソン２を通って、エクソン３の３’末端まで、またはＲｓ１遺伝子のエクソン３の３’末端まで、またはエクソン３の３’末端の６つのヌクレオチドまでの連続ゲノム断片の欠失である。
【００７２】
Ｒｓ１遺伝子座がＲｓ１遺伝子のコード配列の全部または一部の欠失を有する一部の実施形態では、Ｒｓ１遺伝子座はレポーター遺伝子を含む。一部の実施形態では、レポーター遺伝子は、Ｒｓ１プロモーター、例えば、Ｒｓ１遺伝子のコード配列の全部または一部の欠失を有するＲｓ１遺伝子座の内因性Ｒｓ１プロモーターに、動作可能に連結される。一部の実施形態では、Ｒｓ１遺伝子座は、Ｒｓ１遺伝子のエクソン１のＡＴＧ開始コドンの直後から始まり、エクソン３の３’末端まで（またはエクソン３の３’末端における６つのヌクレオチドまで）の連続ゲノム断片の欠失を有し、およびレポーター遺伝子のコード配列は、フレーム内でＲｓ１遺伝子のＡＴＧ開始コドンに融合される。Ｒｓ１遺伝子座での内因性Ｒｓ１プロモーターへの動作可能な連結の結果として、レポーター遺伝子の発現が、Ｒｓ１遺伝子の発現パターンと類似している。本明細書の使用に適したレポーター遺伝子には、例えば、ｌａｃＺ、およびルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、強化黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、強化青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、およびＭｍＧＦＰなどのレポータータンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
【００７３】
他の実施形態では、本明細書に開示される非ヒト動物は、Ｒｓ１遺伝子（例えば、内因性Ｒｓ１遺伝子または異種Ｒｓ１遺伝子）のコード配列に一つ以上の点変異を有し、（点変異なしでＲｓ１遺伝子によってコードされた）野生型ＲＳ１ポリペプチドに対する一つ以上のアミノ酸置換を含むバリアントＲＳ１ポリペプチド、例えば、野生型齧歯類ＲＳ１ポリペプチドに対する一つ以上のアミノ酸置換を含むバリアント齧歯類（例えば、マウスまたはラット）ＲＳ１ポリペプチド、または野生型ヒトＲＳ１ポリペプチドに対して一つ以上のアミノ酸置換を含む、バリアントヒトＲＳ１ポリペプチドをもたらす。
【００７４】
本明細書に記載されるアミノ酸置換が、Ｒｓ１変異型対立遺伝子（すなわち、欠失または点変異を有するＲｓ１遺伝子）から産生された機能的ＲＳ１ポリペプチドのレベルの除去または著しい減少をもたらす。アミノ酸置換は、例えば、ポリペプチドの誤った折り畳み、欠陥のあるサブユニットまたはオリゴマー集合体、およびタンパク質分泌プロセスの一部としてポリペプチドがＥＲの膜に挿入されることができないことの結果として産生された機能的ＲＳ１ポリペプチドのレベルの除去または著しい減少につながりうる。
【００７５】
一部の実施形態では、アミノ酸置換はシグナル配列にあり、アミノ酸置換を有するバリアントＲＳ１ポリペプチドが分泌のためのＥＲの膜に挿入されることができないということをひき起こす。例えば、プロリンまたは親水性／荷電残基とのシグナル配列での疎水性残基の置換は、シグナル配列がＥＲ膜への挿入に必要なαらせん二次構造を選ぶことを防止しうる。特定の実施形態では、アミノ酸置換はＬ１３（例えば、Ｌ１３Ｐ）の置換である。
【００７６】
一部の実施形態では、アミノ酸置換は、ディスコイジンドメインに隣接する領域にあり、すなわち、アミノ酸２４〜６２およびＣ末端セグメント（アミノ酸２２０〜２２４から構成される）から構成されるＲｓ１領域にある。特定の実施形態では、置換は、非システイン残基、例えば、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＧｌｙとの、位置３８、４０、４２、５９または２２３におけるシステインの置換である。Ｃ４０は、Ｃ４０−Ｃ４０ジスルフィド結合型二量体を形成する責任があり、ならびにＣ５９およびＣ２２３は分子間ジスルフィド結合を形成し、これはＲＳ１二量体の集合体を八量体へ可能にする。したがって、４０、５９または２２３におけるＣｙｓの置換は、タンパク質折り畳みおよび分泌に限定された効果のみを有してもよく、それでもまだそのような置換を含む変異型ＲＳ１ポリペプチドが細胞接着タンパク質として機能することができない場合もある。一部の実施形態では、位置４０、５９または２２３におけるシステインは、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＧｌｙで置換されている。置換の具体的な例には、Ｃ３８Ｓ、Ｃ４０Ｓ、Ｃ４２Ｓ、Ｃ５９Ｓ、Ｃ２２３Ｓ、Ｃ２２３ＲおよびＣ２２３Ｙが含まれる。
【００７７】
他の実施形態では、アミノ酸置換はＲＳ１ポリペプチドのディスコイジンドメインにあり、アミノ酸６３〜２１９から構成される。
一部の実施形態では、ディスコイジンドメイン内の置換は、ディスコイジンドメイン内の５つのＣｙｓ残基、Ｃ６３、Ｃ８３、Ｃ１１０、Ｃ１４２、およびＣ２１９のうちの一つの置換である。Ｃｙｓ６３およびＣｙｓ２１９、およびＣｙｓ１１０〜Ｃｙｓ１４２は、タンパク質折り畳みに重要な二つの分子内ジスルフィド結合を形成する。一部の実施形態では、位置６３、８３、１１０、１４２または２１９のうちの一つにおけるシステインは、非システイン残基、例えば、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＧｌｙで置換されている。置換の具体的な例には、Ｃ６３Ｓ、Ｃ８３Ｓ、Ｃ１１０Ｓ、Ｃ１１０Ｙ、Ｃ１４２Ｓ、Ｃ１４２Ｒ、Ｃ１４２Ｗ、Ｃ２１９Ｓ、Ｃ２１９Ｒ、Ｃ２１９Ｗ、およびＣ２１９Ｇが含まれる。
【００７８】
一部の実施形態では、ディスコイジンドメイン内の置換は、ジスルフィド結合の形成に直接関与しないが、タンパク質折り畳み、ディスコイジンドメインの形成または安定性、および／あるいは隣接するサブユニット間の分子間相互作用に重要なアミノ酸残基の置換である。このような残基の例には、Ｅ７２、Ｇ１０９、Ｅ１４６、Ｒ１８２、およびＰ２０３、ならびにＲ１４１およびＤ１４３などの高度に保存された、溶媒が到達しにくいコア残基が含まれる。一部の特定の実施形態では、置換は、非システイン残基をシステインと置換するものであり、チオール交換に影響を及ぼしうる、例えば、Ｗ９２Ｃ、Ｗ９６Ｃ、Ｒ１４１Ｃ、Ｒ１８２Ｃ、Ｒ２００Ｃ、Ｐ２０３Ｃ、およびＲ２０９Ｃである。一部のその他の特定の実施形態では、置換は、アミノ酸残基の電荷を排除または逆転させることによって、またはチオール残基に影響を与えることなく荷電残基で非荷電残基を置換することによってタンパク質電荷に影響を与えるものである。例えば、Ｅ７２Ｋ、Ｗ９６Ｒ、Ｒ１０２Ｗ、Ｒ１０２Ｑ、Ｇ１０９Ｅ、Ｇ１０９Ｒ、Ｒ１４１Ｈ、Ｄ１４３Ｖ、Ｎ１７９ＤおよびＲ２１３Ｗ。他の実施形態では、置換は、プロ残基の挿入または除去によって構造安定性に影響を及ぼす可能性があるものである。例えば、Ｓ７３Ｐ、Ｌ１２７Ｐ、Ｐ１９２Ｓ、Ｐ１９２Ｔ、Ｐ１９３ＳおよびＰ２０３Ｌ。さらに他の実施形態では、置換は、極性残基の挿入または除去（すなわち、疎水性残基の極性残基との置換、または極性残基の疎水性残基との置換）によって疎水性コアに影響を及ぼしうる置換で、例えば、Ｉ１３６ＴおよびＮ１６３Ｙである。
【００７９】
一部の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、Ｒｓ１遺伝子に一つ以上の点変異を含み、コードされたＲＳ１ポリペプチド中のシステイン［Ｃｙｓ、Ｃ］のセリン［Ｓｅｒ、Ｓ］での置換、またはアルギニン［Ａｒｇ、Ｒ］のシステイン［Ｃｙｓ、Ｃ］での置換をもたらす。一部の特定の実施形態では、置換はＣ５９Ｓ置換である。一部の特定の実施形態では、置換はＲ１４１Ｃ置換である。
【００８０】
一部の実施形態では、内因性Ｒｓ１遺伝子または操作されたＲｓ１遺伝子に破損、または突然変異を含む、本明細書に記載される非ヒト動物は、異種（たとえばヒト）由来の遺伝物質をさらに備える。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、変異型ヒトＲｓ１遺伝子である、操作されたＲｓ１遺伝子を含み、ここにおいて、この変異型ヒトＲｓ１遺伝子は、上記、本明細書に記載の置換、例えば、Ｃ５９Ｓ置換またはＲ１４１Ｃ置換を含むヒトＲＳ１ポリペプチドをコードする。一部の特定の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、非ヒト動物のゲノム内に無作為に挿入され、それによりヒトＲＳ１ポリペプチドが発現し、それが本明細書に記載される置換、例えばＣ５９Ｓ置換またはＲ１４１Ｃ置換を含む、変異型ヒトＲｓ１遺伝子を含む。
【００８１】
レチノスキシン−１配列
例示的なヒトおよび非ヒトＲｓ１配列は、配列番号１〜２２で示され、表１に概説する。
【００８２】
ｌａｃＺレポーター遺伝子、マウスプロタミン１プロモーターの転写制御下のＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子、およびユビキチンプロモーターの転写制御下のｌｏｘＰ部位に隣接するネオマイシン耐性遺伝子を含む、非ヒト（例えば、マウス）Ｒｓ１対立遺伝子の破損に使用される例示的な自己欠失カセットは、配列番号２３（８，２０２ｂｐ）に記載されている。
【００８３】
非ヒト（例えば、マウス）Ｒｓ１対立遺伝子の例示的欠失（内因性齧歯類Ｒｓ１遺伝子座から欠失されたエクソン１〜３の配列）は、配列番号２４（１３，７１６ｂｐ）に記載されている。
【００８４】
選択カセットのリコンビナーゼ介在除去後の破壊されたマウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）Ｒｓ１対立遺伝子の例示的な部分は、配列番号２５に記載されている。
自己削除ハイグロマイシン選択カセットを含むＣ５９Ｓアミノ酸置換をコードする変異型非ヒト（例えば、マウス）Ｒｓ１対立遺伝子の例示的部分は、配列番号２６に記載されている。
【００８５】
選択カセットのリコンビナーゼ介在除去後のＣ５９Ｓアミノ酸置換をコードする変異型非ヒト（例えば、マウス）Ｒｓ１対立遺伝子の例示的部分は、配列番号２７に記載されている。
【００８６】
自己削除ハイグロマイシン選択カセットを含むＲ１４１Ｃアミノ酸置換をコードする変異型非ヒト（例えば、マウス）Ｒｓ１対立遺伝子の例示的部分は、配列番号２８に記載されている。
【００８７】
選択カセットのリコンビナーゼ介在除去後のＲ１４１Ｃアミノ酸置換をコードする変異型非ヒト（例えば、マウス）Ｒｓ１対立遺伝子の例示的部分は、配列番号２９に記載されている。
【００８８】
【表３−１】
2020508073.tif 000004
【００８９】
【表３−２】
2020508073.tif 000005
【００９０】
【表３−３】
2020508073.tif 000006
【００９１】
【表３−４】
2020508073.tif 000007
【００９２】
非ヒト動物の産生
本明細書に記載されるＲｓ１遺伝子における破損または突然変異を有する非ヒト動物作製のためのＤＮＡ構築物、標的化ベクター、および方法を本明細書に提供する。
【００９３】
ＤＮＡ配列を使用して、ノックアウト動物（たとえばＲｓ１ＫＯ）用の標的化ベクターを調製することができる。典型的には、レポーター遺伝子もしくは変異型（または操作された）Ｒｓ１遺伝子の全部、または一部をコードするポリヌクレオチド分子（たとえば挿入核酸）は、ベクター、好ましくはＤＮＡベクターに挿入され、適切な宿主細胞中でそのポリヌクレオチド分子が複製される。
【００９４】
ポリヌクレオチド分子（または挿入核酸）は、標的の遺伝子座または遺伝子に組み込まれることが望まれるＤＮＡのセグメントを備える。一部の実施形態では、挿入核酸は、対象のポリヌクレオチドを一つ以上含む。一部の実施形態では、挿入核酸は、一つ以上の発現カセットを含む。一部のある実施形態では、発現カセットは、対象のポリヌクレオチドを備えており、ポリヌクレオチドは選択マーカー、および／またはレポーター遺伝子を、一部のある実施形態では発現に影響を与える様々な制御構成要素（たとえばプロモーター、エンハンサーなど）とともにコードする。事実上、すべての対象のポリヌクレオチドが挿入核酸内に含有されることができ、それにより、標的のゲノムの遺伝子座で統合されることができる。本明細書において開示される方法は、標的とされるＲｓ１遺伝子（または遺伝子座）に組み込まれる、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個またはそれ以上の対象のポリヌクレオチドを提供する。
【００９５】
一部の実施形態では、挿入核酸中に含有される対象ポリヌクレオチドは、レポーターをコードする。一部の実施形態では、挿入核酸中に含有される対象のポリヌクレオチドは、異種、バリアントまたは異種バリアントＲＳ１ポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、挿入核酸中に含有される対象ポリヌクレオチドは、選択マーカー、および／またはリコンビナーゼをコードする。
【００９６】
一部の実施形態では、対象ポリヌクレオチドは、部位特異的組換え部位（たとえば、ｌｏｘＰ、Ｆｒｔなど）に隣接し、またはこれを含む。一部のある実施形態では、部位特異的組換え部位は、レポーターをコードするＤＮＡセグメント、選択マーカーをコードするＤＮＡセグメント、リコンビナーゼをコードするＤＮＡセグメント、およびそれらの組み合わせに隣接する。挿入核酸内に含有されることができる選択マーカー、レポーター遺伝子、およびリコンビナーゼ遺伝子を含有する対象ポリヌクレオチドの例が本明細書に記載される。
【００９７】
サイズに応じてＲｓ１遺伝子またはＲＳ１コード配列は、業者により入手可能なｃＤＮＡ源から直接クローニングされてもよく、またはＧｅｎＢａｎｋから入手可能な公開配列（上記を参照）に基づいてｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで設計されてもよい。あるいは、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリーが、対象遺伝子からＲｓ１配列を提供することができる（例えば、齧歯類または異種Ｒｓ１遺伝子）。ＢＡＣライブラリーは、１００〜１５０ｋｂの平均インサートサイズを含み、３００ｋｂの大きさのインサートを保有することができる（Ｓｈｉｚｕｙａ，Ｈ．ら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：８７９４−７；Ｓｗｉａｔｅｋ，Ｐ．Ｊ．およびＴ．Ｇｒｉｄｌｅｙ，１９９３，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．７：２０７１−８４；Ｋｉｍ，Ｕ．Ｊ．ら、１９９６，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３４：２１３−８、参照により本明細書に援用される）。例えばヒトおよびマウスのゲノムＢＡＣライブラリーが構築されており、市販されている（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールスバッド、カリフォルニア州）。ゲノムＢＡＣライブラリーは、齧歯類または異種Ｒｓ１配列および転写制御領域の源として利用することもできる。
【００９８】
あるいは、齧歯類または異種Ｒｓ１配列は、酵母人工染色体（ＹＡＣ）から単離、クローニング、および／または移転させてもよい。完全な齧歯類または異種Ｒｓ１遺伝子をクローニングし、１個または数個のＹＡＣ内に含有させてもよい。複数のＹＡＣが使用され、重複相同性の領域を含有する場合、それらを酵母宿主株内で再結合させて、完全な遺伝子座を提示する一つの構築物を生成してもよい。哺乳類選択カセットを用いた改良によりＹＡＣのアームをさらに改変し、当技術分野に公知の方法および／または本明細書に記載される方法により、構築物を胚性幹細胞または胚に導入することを補助してもよい。
【００９９】
本明細書に記載されるＲｓ１配列を含有するＤＮＡ構築物または標的化ベクターは、一部の実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物における発現用に非ヒトの制御配列（たとえば齧歯類のプロモーター）に動作可能に連結された野生型または親の齧歯類ＲＳ１ポリペプチドと比較して、一つ以上のアミノ酸置換を含有する齧歯類ＲＳ１ポリペプチドをコードする齧歯類Ｒｓ１ゲノム配列を備える。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＲｓ１配列を含有するＤＮＡ構築物または標的化ベクターは、齧歯類Ｒｓ１プロモーターに動作可能に連結される野生型または親の齧歯類Ｒｓ１ポリペプチドと比較して、アミノ酸置換（例えば、Ｃ５９Ｓ、またはＲ１４１Ｃ）を含有するバリアント齧歯類ＲＳ１ポリペプチドをコードする齧歯類Ｒｓ１ゲノム配列を備える。所望のアミノ酸置換の例を本明細書に記載する。本明細書に記載されるＤＮＡ構築物中に含有される齧歯類および／または異種の配列は、自然界に存在する齧歯類および／または異種の配列（たとえばゲノム）と同一または実質的に同一であってもよい。あるいは、かかる配列は人工であってもよく（たとえば合成）、またはヒトの手により操作されていてもよい。一部の実施形態では、Ｒｓ１配列は、合成起源であり、自然界に存在する齧歯類または異種Ｒｓ１遺伝子中に存在する配列を含む。一部の実施形態では、Ｒｓ１配列は、齧歯類または異種Ｒｓ１遺伝子と自然に関連する配列を備える。一部の実施形態では、Ｒｓ１配列は、齧歯類または異種Ｒｓ１遺伝子と自然には関連していない配列を備える。一部の実施形態では、Ｒｓ１配列は、非ヒト動物における発現に最適化された配列を含む。もし本明細書に記載される変異型（またはバリアント）Ｒｓ１遺伝子の発現の最適化に追加的配列が有用である場合、かかる配列は、既存の配列をプローブとして使用してクローニングされることができる。変異型Ｒｓ１遺伝子またはＲＳ１コード配列の発現を最大化するために必要な追加的配列は、ゲノム配列、または所望される結果に応じて他の源から取得することができる。
【０１００】
ＤＮＡ構築物または標的化ベクターは、当技術分野に公知の方法を使用して調製することができる。例えば、ＤＮＡ構築物は、大きなプラスミドの一部として調製することができる。そのような調製により、当技術分野で公知のような効率的な方法での正しい構築物のクローニングと選択を考慮する。本明細書に記載される配列を含有するＤＮＡ断片は、プラスミド上の便利な制限酵素部位の間に位置づけることができ、それによって、所望される動物への組み込みのために、残りのプラスミド配列からそれらを簡便に単離することができる。プラスミド、ＤＮＡ構築物、および／または標的化ベクターの調製、ならびに宿主生物の形質転換に使用される様々な方法が当技術分野に公知である。原核細胞と真核細胞の両方に適した他の発現システム、ならびに一般的な組換え法に関しては、以下を参照のこと：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９を参照のこと。
【０１０１】
上述のように、破損された、または操作されたＲｓ１遺伝子を含有する、非ヒト動物用の標的化ベクターの構築における使用のための非ヒトＲｓ１核酸およびアミノ酸配列の例が、上記に提供されている。その他の非ヒトＲｓ１配列も、ＧｅｎＢａｎｋデータベース中に見出すことができる。一部の実施形態では、Ｒｓ１標的化ベクターは、トランスジェニック非ヒト動物のゲノム内への挿入用のレポーター遺伝子、選択マーカー、リコンビナーゼ遺伝子（またはそれらの組み合わせ）、および非ヒトＲｓ１配列（すなわち、標的領域の隣接配列）をコードするＤＮＡ配列を備える。一つの例では、開始コドンのすぐ下流（３’）に欠失開始点が設定されてもよく、それにより、挿入核酸が、内因性制御配列（たとえばプロモーター）に動作可能に連結されることが可能となる。図２〜図４は、開始コドンを除く、コード配列（たとえばエクソン１〜３）マウスＲｓ１遺伝子の一部の標的化された欠失を作製するための、およびβ−ガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺ遺伝子由来の配列を含有するカセットと、Ｇ４１８抵抗性胚性幹（ＥＳ）細胞コロニーの選択用のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（Ｎｅｏ）をコードする薬剤選択カセットとの置換を行うための方法および標的化ベクターの例を図示する。標的化ベクターは、ＥＳ細胞特異的マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）または生殖細胞特異的プロモーター（たとえば、プロタミン１プロモーター；Ｐｒｏｔ−Ｃｒｅ−ＳＶ４０）により制御されるリコンビナーゼ（たとえば、Ｃｒｅ）をコードする配列も含有する。ネオマイシン選択カセットおよびＣｒｅリコンビナーゼコード配列は、ｌｏｘＰリコンビナーゼ認識部位に隣接され、これにより発生依存性の様式でネオマイシン選択カセットのＣｒｅ介在性除去が可能となる。すなわち、その生殖細胞が上述の破損されたＲｓ１遺伝子を含有する齧歯類から派生した子孫は、発生の間に選択マーカーを脱落させる（米国特許第８，６９７，８５１号、第８，５１８，３９２号、第８，３５４，３８９号、第８，９４６，５０５号、および第８，９４６，５０４号を参照のこと。それらすべては、参照により本明細書に援用される）。これにより、特に、分化細胞または生殖細胞のいずれかから、ネオマイシン選択カセットの自動削除が可能となる。ゆえに、表現型解析の前に、ネオマイシン選択カセットは、マウスＲｓ１プロモーターに動作可能に連結された（マウスＲｓ１開始コドンに融合された）ｌａｃＺレポーター遺伝子のみを残しながら、除去される（図４）。
【０１０２】
本明細書に記載される非ヒト動物を生成するための方法は、自己削除選択カセット技術を使用する（米国特許第８，６９７，８５１、８，５１８，３９２号および第８，３５４，３８９号参照、その全てが参照により本明細書に組み込まれる）。この技術の使用により、非ヒト動物のゲノム中の選択カセットの存在からの欠点を考慮し、これは回避されるべき薬剤耐性クローンの選択を容易にする。かかる自己削除選択カセット技術は、一部の実施形態では、標的化ベクター内のリコンビナーゼ遺伝子に動作可能に連結されたプロモーターを含めることによって特徴付けられる。プロモーターは、未分化細胞に制限されたプロモーター活性によって発生的に依存する様式でリコンビナーゼ遺伝子の発現をプロモーターが制御するように、転写によって能力を有する（すなわち、ＥＳ細胞；転写能力については、例えば、Ｒａｍ、Ｒ．およびＥ．Ｍｅｓｈｏｒｅｒ、２００９、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２３：２７９３−９８も参照のこと。；Ｘｕ、Ｊ．ら、２００９、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２３：２８２４−３８）。結果として、リコンビナーゼポリペプチドは、ＥＳ細胞が分化する（すなわち、発生する）ために存在した後にのみ発現される。本明細書に記載される標的化ベクターを組み込んであるＥＳ細胞は、リコンビナーゼ遺伝子の発現を制御する（すなわち、リコンビナーゼ遺伝子に動作可能に連結する）プロモーターの不活動を理由に、選択カセットを保持するが、一旦リコンビナーゼ発現の開始の結果としてＥＳ細胞が分化し始めると、選択カセットの切除を促進する。したがって、意図的に、ゲノム内に標的化ベクターを含有するＥＳ細胞から発生した子孫は、早い発生段階でリコンビナーゼを発現し、かつ、選択カセットに隣接する部位特異的リコンビナーゼ認識部位上のリコンビナーゼポリペプチドの作用によって媒介される分化（すなわち、発生）の際に、選択マーカーが切除される。
【０１０３】
未分化ＥＳ細胞で不活性である適切なプロモーターが本明細書に提供される。かかるプロモーターをリコンビナーゼ遺伝子に動作可能に連結することは、分化の際に特異的に発現を提供する。本明細書に記載されるように、標的化ベクターは、選択マーカーに隣接する平行配向に部位特異的リコンビナーゼ認識部位を用いて設計され、その結果、リコンビナーゼポリペプチドが発現に伴う選択マーカーの除去（すなわち、欠失）を指示する。また、部位特異的リコンビナーゼ認識部位は、リコンビナーゼポリペプチドが発現に伴い選択マーカーの逆転を指示するように、選択マーカーに隣接する逆方向に配置されてもよい。一部の選択マーカーについては、不活性化のために逆転が十分であってもよい。しかし、選択マーカーの完全な除去も望ましい場合がある。選択カセットが平行配向で部位特異的リコンビナーゼ認識部位に隣接する場合、分化細胞内のリコンビナーゼポリペプチドの発現は、細胞に選択マーカーをゲノムから切り離させることになる。分化細胞が選択され続けている場合、その分化細胞は、ゲノムからの選択マーカーの欠失によって死滅する。このようにして、未分化のＥＳ細胞は、後でドナー細胞として宿主胚に使用するために培養物中で維持され、富化される。
【０１０４】
本明細書に記載されるように、Ｒｓ１遺伝子の破損には、挿入核酸を用いた、Ｒｓ１遺伝子またはその一部の置換、あるいはＲｓ１遺伝子またはその一部への挿入／付加が含まれてもよい。一部の実施形態では、挿入核酸は、レポーター遺伝子を備える。一部のある実施形態では、レポーター遺伝子は、内因性Ｒｓ１プロモーターに動作可能に連結されて配置される。かかる改変により、内因性Ｒｓ１プロモーターにより誘導されるレポーター遺伝子の発現が可能となる。あるいは、レポーター遺伝子は、内因性Ｒｓ１プロモーターと動作可能に連結されて配置されていず、別のプロモーターと動作可能に連結される。
【０１０５】
様々なレポーター遺伝子（または検出可能部分）が、本明細書に記載される標的化ベクターにおいて使用されることができる。レポーター遺伝子の例としては、たとえば、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ遺伝子によりコードされる）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化型緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ：ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＭｍＧＦＰ、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、強化型青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ：ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｂｌｕｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、強化型黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ：ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、またはこれらの組み合わせが挙げられる。本明細書に記載される方法は、β−ガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺレポーター遺伝子を使用した標的化ベクターの構築を示すが、本開示を読んだ当業者であれば、本明細書に記載される非ヒト動物は、レポーター遺伝子が無くても作成されることができ、または当分野に公知の任意のレポーター遺伝子を用いて作成されることを理解するであろう。
【０１０６】
一部の実施形態では、Ｒｓ１標的化ベクターは、変異型（またはバリアント）Ｒｓ１遺伝子、選択マーカーおよびリコンビナーゼ、ならびにトランスジェニック非ヒト動物のゲノム内への挿入用の非ヒトＲｓ１配列（すなわち、標的領域の隣接配列）をコードするＤＮＡ配列を備える。一つの例では、一つ以上の点変異が、Ｒｓ１遺伝子のコード配列またはＲＳ１コード配列（たとえばエクソン）内に（たとえば部位特異的変異誘導により）導入されてもよく、それにより、変異型Ｒｓ１遺伝子またはＲＳ１コード配列により、所望されるＲＳ１ポリペプチド（たとえばバリアントＲＳ１ポリペプチド）がコードされる。かかる変異型Ｒｓ１配列は、内因性制御配列（たとえばプロモーター）または所望される場合には構造性プロモーターに動作可能に連結されていてもよい。図５〜図７、および図８〜図１０は、変異型胚性幹（ＥＳ）細胞コロニー選択用のハイグロマイシン（Ｈｙｇ）をコードする薬剤選択マーカーを含有するカセットを用いて、マウスＲｓ１遺伝子のエクソンの（例えば、エクソン３および５、それぞれ）選択された点変異、および周囲のイントロンに小規模な欠失を作るための二つの標的化ベクターの例を図示する。実施例のセクションに記載されるように、各点変異のための周囲のマウスＲｓ１イントロンに導入された小規模な欠失は、変異型（または、バリアント）ＥＳ細胞コロニーのスクリーニングを容易にするために設計された。図５および図８に示されるように、標的化ベクターは各々、ＥＳ細胞特異的ｍｉＲＮＡまたは生殖細胞特異的プロモーター（たとえば、プロタミン１プロモーター；Ｐｒｏｔ−Ｃｒｅ−ＳＶ４０）により制御されるリコンビナーゼ（たとえば、Ｃｒｅ）をコードする配列も含有する。ハイグロマイシン選択カセットおよびＣｒｅリコンビナーゼコード配列は、ｌｏｘＰリコンビナーゼ認識部位に隣接され、これにより発生依存性の様式でハイグロマイシン選択カセットのＣｒｅ介在性除去が可能となり、例えば、その生殖細胞が上述の変異型（または、バリアント）Ｒｓ１遺伝子を含有する齧歯類から派生した子孫は、発生の間に選択マーカーを脱落させる（米国特許第８，６９７，８５１号、第８，５１８，３９２号、第８，３５４，３８９号、第８，９４６，５０５号、および第８，９４６，５０４号を参照のこと。それらすべては、参照により本明細書に援用される）。これにより、特に、分化細胞または生殖細胞のいずれかから、ハイグロマイシン選択カセットの自動削除が可能となる。ゆえに、表現型解析の前に、変異型Ｒｓ１エクソンが、マウスＲｓ１プロモーターに動作可能に連結された状態で、ハイグロマイシン選択カセットは除去される（図７および１０）。
【０１０７】
Ｒｓ１標的化ベクターは、一部の実施形態では、上述の変異型（またはバリアント）Ｒｓ１遺伝子に対応するＤＮＡ配列を含みうる。この変異型（またはバリアント）Ｒｓ１遺伝子は異種Ｒｓ１遺伝子または異種ＲＳ１コード配列を含む。適切な異種Ｒｓ１配列が本明細書に提供され、以下の実施例のセクションに例示される配列に置換されてもよい。こうした異種配列はまた、野生型または親異種ＲＳ１ポリペプチド配列と比較してアミノ酸置換をコードする点変異を含むように操作されてもよい。
【０１０８】
適切な場合、レポーターポリペプチド（および／または選択マーカー、および／またはリコンビナーゼ）の全部もしくは一部、またはＲＳ１ポリペプチド（たとえばバリアントＲＳ１ポリペプチド）をコードする遺伝物質またはポリヌクレオチド配列のコード領域は、非ヒト動物における発現に最適化されたコドンを含むように改変されてもよい（たとえば、米国特許第５，６７０，３５６号および第５，８７４，３０４号を参照）。コドン最適化配列は合成配列であり、非コドン最適化親ポリヌクレオチドによってコードされる同一ポリペプチド（または完全長ポリペプチドと実質的に同じ活性を有する完全長ポリペプチドの生物学的に活性な断片）をコードすることが好ましい。一部の実施形態では、レポーターポリペプチド（たとえば、ｌａｃＺ）の全部または一部をコードする遺伝物質のコード領域は、特定の細胞型（例えば、齧歯類細胞）に対して、コドン利用を最適化するように変更された配列を含んでもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＲＳ１ポリペプチド（たとえばバリアントＲＳ１ポリペプチド）の全部または一部をコードする遺伝物質のコード領域は、特定の細胞型（例えば、齧歯類細胞）に対して、コドン利用を最適化するように変更された配列を含んでもよい。一つの例ではあるが、非ヒト動物（たとえば齧歯類）のゲノム内に挿入されるレポーターまたは変異型Ｒｓ１遺伝子のコドンは、その非ヒト動物の細胞における発現に対し最適化されてもよい。このような配列はコドン最適化配列として記述される場合がある。
【０１０９】
本明細書に記載のＲｓ１遺伝子に破損または突然変異を備えた非ヒト動物を作製するための組成物および方法が提供され、この組成物および方法は、Ｒｓ１プロモーターのようなＲｓ１制御配列の制御下でレポーター遺伝子を発現する非ヒト動物、およびＲｓ１プロモーターのようなＲｓ１制御配列の制御下のバリアントＲＳ１ポリペプチドを発現する非ヒト動物法を作製するための組成物および方法を含む。一部の実施形態では、内因性プロモーター（例えば、内因性Ｒｓ１プロモーター）のような内因性制御配列の制御下でレポーターまたはバリアントＲＳ１ポリペプチドを発現する非ヒト動物を作製するための組成物および方法も提供される。方法は、レポーター遺伝子（例えば、ｌａｃＺ、図２〜図４を参照）を含む、本明細書に記載される、標的化ベクターを、非ヒト動物のゲノム内に挿入することを含み、それにより、Ｒｓ１遺伝子のコード配列部分の一部分が、全部または一部、欠失される。一部の実施形態では、方法は、標的化ベクターを非ヒト動物のゲノム内に挿入することを含み、それによりＲｓ１遺伝子のエクソン１〜３が欠失される。
【０１１０】
Ｒｓ１プロモーター（たとえば内因性Ｒｓ１プロモーター）に動作可能に連結されたレポーター遺伝子の挿入は、比較的最小限のゲノム改変を利用し、非ヒト動物においてＲｓ１特異的な様式でレポーターポリペプチドの発現をもたらす（例えば、図１１を参照）。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物または細胞は、本明細書に記載される標的化ベクターを備えたＲｓ１遺伝子を備える。一部のある実施形態では、標的化ベクターは図２または図４に示されるものである。
【０１１１】
様々な実施形態では、本明細書に記載される破損されたＲｓ１遺伝子は、レポーター遺伝子の挿入から生じた挿入接合部一つ以上（たとえば第１および第２の挿入接合部）を含む。
【０１１２】
様々な実施形態では、本明細書に記載される破損されたＲｓ１遺伝子は、配列番号３３に対し、少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）同一である配列を含む第１の挿入接合部、および配列番号３４に対し、少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）同一である配列を含む第２の挿入接合部を含む。様々な実施形態では、本明細書に記載される破損されたＲｓ１遺伝子は、配列番号３３に対し、実質的に同一であるか、または同一である配列を含む第１の挿入接合部と、配列番号３４に対し、実質的に同一であるか、または同一である配列を含む第２の挿入接合部とを含む。
【０１１３】
様々な実施形態では、本明細書に記載される破損されたＲｓ１遺伝子は、配列番号３３に対し、少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）同一である配列を含む第１の挿入接合部、および配列番号３５に対し、少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）同一である配列を含む第２の挿入接合部を含む。様々な実施形態では、本明細書に記載される破損されたＲｓ１遺伝子は、配列番号３３に対し、実質的に同一であるか、または同一である配列を含む第１の挿入接合部と、配列番号３５に対し、実質的に同一であるか、または同一である配列を含む第２の挿入接合部とを含む。
【０１１４】
様々な実施形態では、本明細書に記載される破損されたＲｓ１遺伝子または対立遺伝子は、配列番号２３、または配列番号２５に対し、少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）同一である配列を含む。様々な実施形態では、本明細書に記載される破損されたＲｓ１遺伝子または対立遺伝子は、配列番号２３、または配列番号２５と実質的に同一であるか、または同一である配列を含む。
【０１１５】
様々な実施形態では、本明細書に記載される破損されたＲｓ１遺伝子または対立遺伝子は、内因性Ｒｓ１遺伝子または対立遺伝子の１３，７１６ｂｐの欠失を含む。様々な実施形態では、本明細書に記載される破損されたＲｓ１遺伝子または対立遺伝子は、配列番号２４と実質的に同一であるか、または同一である配列を欠く。
【０１１６】
方法は、バリアントＲＳ１ポリペプチド（図５〜図７、および図８〜図１０を参照）の全部または一部をコードする、本明細書に記載される標的化ベクターを、非ヒト動物のゲノム内に挿入することを含み、それにより、Ｒｓ１遺伝子のコード配列の一部分（たとえば、エクソン）が変更される。一部の実施形態では、方法は、標的化ベクターを非ヒト動物のゲノム内に挿入することを含み、それにより、Ｒｓ１遺伝子のエクソンを、バリアントＲＳ１ポリペプチドをコードするよう突然変異させる。
【０１１７】
Ｒｓ１プロモーター（たとえば内因性Ｒｓ１プロモーター）に動作可能に連結された変異型Ｒｓ１遺伝子の挿入は、比較的最小限のゲノム改変を利用し、非ヒト動物において、野生型非ヒト動物に存在するＲＳ１ポリペプチドと機能的および構造的に異なるバリアントＲＳ１ポリペプチドの発現を生じさせる。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物または細胞は、本明細書に記載される標的化ベクターを備えたＲｓ１遺伝子を備える。一部のある実施形態では、標的化ベクターは図５または図８に示されるものである。
【０１１８】
様々な実施形態では、本明細書に記載される変異型Ｒｓ１遺伝子は、本明細書に記載される標的化ベクターの挿入から生じた挿入接合部を一つ以上（たとえば第１および第２の挿入接合部）含む。
【０１１９】
様々な実施形態では、本明細書に記載される変異型Ｒｓ１遺伝子は、配列番号３６に対し、少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）同一である配列を含む第１の挿入接合部、および配列番号３７に対し、少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）同一である配列を含む第２の挿入接合部を含む。様々な実施形態では、本明細書に記載される変異型Ｒｓ１遺伝子は、配列番号３６に対し、実質的に同一であるか、または同一である配列を含む第一の挿入接合部と、配列番号３７に対し、実質的に同一であるか、または同一である配列を含む第二の挿入接合部とを含む。
【０１２０】
様々な実施形態では、本明細書に記載される変異型Ｒｓ１遺伝子は、配列番号３８に対し、少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）同一である配列を含む挿入接合部を含む。様々な実施形態では、本明細書に記載される変異型Ｒｓ１遺伝子は、配列番号３８に対し、実質的に同一であるか、または同一である配列を含む挿入接合部を含む。
【０１２１】
様々な実施形態では、本明細書に記載の変異型Ｒｓ１遺伝子は、点変異を含む第３のエクソンを備え、それにより変異型Ｒｓ１遺伝子が、Ｃ５９Ｓアミノ酸置換を有するＲＳ１ポリペプチドをコードする。様々な実施形態では、本明細書に記載される変異型Ｒｓ１遺伝子は、ＴＧＴのＡＧＴへのコドン突然変異を含む第３のエクソンを含み、その結果、変異型Ｒｓ１遺伝子は、Ｃ５９Ｓアミノ酸置換を有するＲＳ１ポリペプチドをコードする。
【０１２２】
様々な実施形態では、本明細書に記載される変異型Ｒｓ１遺伝子は、配列番号３９に対し、少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）同一である配列を含む第１の挿入接合部、および配列番号４０に対し、少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）同一である配列を含む第２の挿入接合部を含む。様々な実施形態では、本明細書に記載される変異型Ｒｓ１遺伝子は、配列番号３９に対し、実質的に同一であるか、または同一である配列を含む第１の挿入接合部と、配列番号４０に対し、実質的に同一であるか、または同一である配列を含む第２の挿入接合部とを含む。
【０１２３】
様々な実施形態では、本明細書に記載される変異型Ｒｓ１遺伝子は、配列番号４１に対し、少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）同一である配列を含む挿入接合部を含む。様々な実施形態では、本明細書に記載される変異型Ｒｓ１遺伝子は、配列番号４１に対し、実質的に同一であるか、または同一である配列を含む挿入接合部を含む。
【０１２４】
様々な実施形態では、本明細書に記載の変異型Ｒｓ１遺伝子は、点変異を含む第４のエクソンを備え、それにより変異型Ｒｓ１遺伝子が、Ｒ１４１Ｃアミノ酸置換を有するＲＳ１ポリペプチドをコードする。様々な実施形態では、本明細書に記載される変異型Ｒｓ１遺伝子は、ＣＧＣのＴＧＣへのコドン突然変異を含む第５のエクソンを含み、それにより変異型Ｒｓ１遺伝子は、Ｒ１４１Ｃアミノ酸置換を有するＲＳ１ポリペプチドをコードする。
【０１２５】
様々な実施形態では、本明細書に記載される変異型Ｒｓ１遺伝子または対立遺伝子は、配列番号２７、または配列番号２９に対し、少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）同一である配列を備える。様々な実施形態では、本明細書に記載される変異型Ｒｓ１遺伝子または対立遺伝子は配列番号２７、または配列番号２９と実質的に同一であるか、または同一である配列を備える。
【０１２６】
あるいは、他のＲｓ１遺伝子またはＲＳ１コード配列が、本明細書に記載される方法において利用され、そのゲノムが、本明細書に記載される変異型Ｒｓ１遺伝子を含有する非ヒト動物が生成されてもよい。例えば、異種Ｒｓ１遺伝子は、非ヒト動物に導入されてもよく、その異種Ｒｓ１遺伝子は、本明細書に記載されるバリアントＲＳ１ポリペプチドをコードする（すなわち、非ヒト動物における網膜分離症様の表現型を確立する突然変異を含む）。別の例では、トランスジェニックＲｓ１遺伝子が、非ヒト動物のゲノム内に無作為に挿入され、内因性Ｒｓ１遺伝子は、（たとえばＤＮＡまたはＲＮＡのオリゴヌクレオチドを用いた遺伝的改変、遺伝子ノックダウンを介して）機能しない状態となってもよい。代替的なＲｓ１遺伝子またはＲＳ１コード配列の例が本明細書に提供される。本開示を読んだ当業者であれば、かかるＲｓ１遺伝子またはＲＳ１コード配列が、本明細書に記載される方法において利用され、非ヒト動物を作製し得ることを理解するであろう。
【０１２７】
本明細書に記載される標的化ベクターは、ＥＳ細胞内に導入され、Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ，Ｄ．，ら、２０１０，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７６：２９５−３０７．において、本明細書に記載されるように、破損されたまたは変異型Ｒｓ１遺伝子を担持するＥＳクローンがスクリーニングされてもよい。様々な宿主胚が、本明細書に開示される方法および組成物において利用されることができる。たとえば、標的の遺伝子改変を有する多能性および／または分化全能性の細胞が、対応する生物から、前−桑実胚段階の胚（たとえば、８細胞期の胚）に導入されてもよい。たとえば、米国特許第７，５７６，２５９号、第７，６５９，４４２号、第７，２９４，７５４号、および米国特許出願公開２００８−００７８０００  Ａ１を参照のこと。これらすべてはその全体で参照により本明細書に援用される。他の例では、ドナーＥＳ細胞は、２細胞期、４細胞期、８細胞期、１６細胞期、３２細胞期、または６４細胞期の宿主胚に移植されてもよい。また宿主胚は、胚盤胞であってもよく、または前−胚盤胞の胚、前−桑実胚の段階の胚、桑実胚段階の胚、非小型化（ｕｎｃｏｍｐａｃｔｅｄ）桑実胚の段階の胚、または小型化（ｃｏｍｐａｃｔｅｄ）桑実胚段階の胚であってもよい。
【０１２８】
一部の実施形態では、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法（Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕ，Ｗ．Ｔ．ら、２００７，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：９１−９９）を適用して、８細胞期の胚に陽性ＥＳ細胞を注入し、完全ＥＳ細胞由来Ｆ０世代のヘテロ接合性マウスを作製してもよく、このマウスが、ｌａｃＺ発現プロファイリングを行う、または交配させてホモ接合性とさせることができる。破損された、または変異型Ｒｓ１遺伝子を有する非ヒト動物を作成する方法の例を、実施例のセクションにおいて提供する。
【０１２９】
ノックアウトおよびノックインを含む、トランスジェニック非ヒト動物を作製する方法が当分野に公知である（たとえば、Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｄ．ら、１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５０：４２３−６；Ｋｏｍｏｒｉ，Ｔ．ら、１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１１７１−５；Ｓｈｉｎｋａｉ，Ｙ．ら、１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：８２２−５；Ｍａｎｓｏｕｒ，Ｓ．Ｌ．ら、１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：３４８−５２；Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｊｏｙｎｅｒ，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，２０００；Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｄ．Ｍ．ら、，２００３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（６）：６５２−９；Ａｄａｍｓ，Ｎ．Ｃ．およびＮ．Ｗ．Ｇａｌｅによる、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ａｎｄ  Ａｖｉａｎ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ−Ｎｅｗ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ，ｅｄ．Ｌｏｉｓ，Ｓ．Ｐ．ａ．Ｃ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，２００６を参照）。たとえば、トランスジェニック齧歯類の作製は、内因性齧歯類遺伝子の遺伝子座位の破損と、その齧歯類ゲノム内へのレポーター遺伝子の導入を含んでもよく、一部の実施形態では、その内因性齧歯類遺伝子と同じ位置での導入であり、または内因性齧歯類遺伝子の遺伝子座位の改変と、その齧歯類ゲノム内への一つ以上の突然変異の導入を含んでもよく、一部の実施形態では、その内因性齧歯類遺伝子と同じ位置での導入であり、それにより、バリアントポリペプチドの発現が生じる。
【０１３０】
マウスＲｓ１遺伝子のゲノム構造の（正確な縮尺ではない）概略図が、図１に提示される。レポーター遺伝子を使用して、マウスＲｓ１遺伝子のコード配列の一部を欠失するための標的化ベクターの例が、図２に提示される。図示されるように、マウスＲｓ１遺伝子のエクソン１〜３（エクソン１のＡＴＧ開始コドンの除外とともに）を含有するゲノムＤＮＡは、レポーター遺伝子と部位特異的リコンビナーゼ認識部位に隣接した自動削除薬剤選択カセットとを用いて欠失され、置換される。標的化ベクターは、未分化細胞においてリコンビナーゼが発現されるよう発生的に制御されたプロモーターに動作可能に連結されたリコンビナーゼコード配列を含む。相同組換えが行われると、内因性マウスＲｓ１遺伝子のエクソン１〜３は、示される標的化ベクター中に含有される配列により欠失され（または置換され）、図４に図示される構造を有するＲｓ１遺伝子を有する遺伝子操作マウスが、発生の間にネオマイシンカセットのＣｒｅ介在性除去を介して生成され、マウスＲｓ１プロモーターに動作可能に連結された（マウスＲｓ１開始コドンに融合された）ｌａｃＺレポーター遺伝子はそのまま残っている。
【０１３１】
マウスＲｓ１遺伝子における突然変異（例えば、置換変異）を生成するための標的化ベクターの例は図５〜図７および図８〜図１０に提供されている。図示されるように、変異型マウスＲｓ１遺伝子（すなわち、エクソン３または５に点変異を有する変異型Ｒｓ１遺伝子）が、標的化ベクターを用いて生成され、この標的化ベクターは、変異型Ｒｓ１エクソンの下流にあり、Ｒｓ１イントロン内に位置する部位特異的リコンビナーゼ認識部位に隣接する自動削除薬剤選択カセットを含む（図５または図８も参照）。標的化ベクターは、未分化細胞においてリコンビナーゼが発現されるよう発生的に制御されたプロモーターに動作可能に連結されたリコンビナーゼコード配列を含む。相同組換えが行われると、内因性マウスＲｓ１遺伝子の単一エクソン（および周囲のイントロンの部分）は、示される標的化ベクター中に含有される配列により置換され、図７または図１０に図示される構造を有する変異型Ｒｓ１遺伝子を有する操作されたマウスが、発生の間に選択カセットのＣｒｅ介在性除去を介して生成され、マウスＲｓ１プロモーターに動作可能に連結された単一エクソン中に点変異と、連接するイントロン内に（固有ｌｏｘＰ部位とともに）小規模な欠失とを有する変異型Ｒｓ１遺伝子は、そのまま残っている。結果として生じる変異型Ｒｓ１遺伝子はそれぞれ、アミノ酸置換（例えば、Ｃ５９ＳまたはＲ１４１Ｃ）を含むＲＳ１ポリペプチドをコードする。
【０１３２】
本明細書に記載の標的化ベクターに含まれ得るプロモーターの例は、プロタミン１（Ｐｒｍ１）プロモーター（配列番号３０に示されるものなど）、Ｂｌｉｍｐ１プロモーター１ｋｂ（配列番号３１に示されるものなど）、およびＢｌｉｍｐ１プロモーター２ｋｂ（配列番号３２に示されるものなど）を含む。本明細書に記載される標的化ベクター中に使用され得る追加の適切なプロモーターとしては、米国特許第８，６９７，８５１号、第８，５１８，３９２号、および第８，３５４，３８９号に記載されるプロモーターが挙げられる。これらすべては参照により本明細書に援用される。
【０１３３】
創始トランスジェニック非ヒト動物は、そのゲノム中のレポーター遺伝子の存在（またはＲｓ１の非存在）に基づいて、ならびに／または当該非ヒト動物の組織もしくは細胞におけるレポーターの発現（またはＲＳ１発現の欠落）に基づいて、またはそのゲノム中のＲｓ１コード配列（たとえばエクソン）中の一つ以上の点変異の存在および／もしくは非コードＲｓ１配列（たとえばイントロン）の欠失に基づいて、ならびに／または当該非ヒト動物の組織もしくは細胞中のバリアントＲＳ１ポリペプチドの発現（または野生型ＲＳ１ポリペプチドの発現の欠落）に基づいて、特定されることができる。次いで創始トランスジェニック非ヒト動物を使用して、レポーター遺伝子または変異型Ｒｓ１遺伝子を担持する追加の非ヒト動物と交配させ、それにより、各々が本明細書に記載される破損されたまたは変異型Ｒｓ１遺伝子のコピーを一つ以上担持する一連の非ヒト動物を生成することができる。
【０１３４】
トランスジェニック非ヒト動物はまた、導入遺伝子またはポリヌクレオチド分子（たとえば挿入核酸）の発現の制御または管理を可能とする選択システムを含有するよう作製されてもよい。システムの例としては、バクテリオファージＰ１のＣｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステム（例えば、Ｌａｋｓｏ，Ｍ．ら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６２３２−６２３６を参照のこと）および出芽酵母のＦＬＰ／Ｆｒｔリコンビナーゼシステム（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．ら、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３５１−１３５５）が挙げられる。そのような動物は、例えば１種は選択されたポリペプチド（たとえばレポーター、バリアントまたは異種ＲＳ１ポリペプチド）をコードする導入遺伝子を含有し、他方はリコンビナーゼ（例えばＣｒｅリコンビナーゼ）をコードする導入遺伝子を含有する、２種のトランスジェニック動物を交配することにより、「二重の」トランスジェニック動物を構築することにより提供され得る。
【０１３５】
マウス中のＲｓ１遺伝子の破損または突然変異を利用した実施形態が本明細書において詳細に検討されているが、Ｒｓ１遺伝子座位にかかる改変（または変更）を備えた他の非ヒト動物も提供される。一部の実施形態では、かかる非ヒト動物は、Ｒｓ１遺伝子中に破損を備えており（たとえばＲｓ１コード配列の一部の欠失を伴うマウス）、その破損は、内因性Ｒｓ１プロモーターに動作可能に連結されたレポーターの挿入が特徴であり、またはＲｓ１遺伝子中の突然変異を備えており（たとえば一つ以上のＲｓ１エクソン中に一つ以上の点変異を伴うマウス）、その点変異は、内因性Ｒｓ１プロモーターに動作可能に連結された変異型Ｒｓ１エクソン（たとえば一つ以上の点変異を含有するエクソン）の挿入が特徴である。かかる非ヒト動物としては、本明細書に開示されるＲｓ１遺伝子のコード配列を破損するように、または突然変異させるように遺伝子改変されることができる任意の非ヒト動物が挙げられ、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ（例えば、雌牛、未去勢オスウシ、バッファロー）、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）などの哺乳類が挙げられる。好適な遺伝子改変可能ＥＳ細胞が直ちに利用可能でない非ヒト動物については、遺伝子改変を含む非ヒト動物を作製するために他の方法が採用される。このような方法には、例えば、非ＥＳ細胞ゲノム（例えば、線維芽細胞または人工多能性細胞）を改変すること、および体細胞核移植（ＳＣＮＴ）を利用して好適な細胞、例えば除核卵母細胞、に遺伝子改変されたゲノムを導入すること、および改変された細胞（例えば、改変された卵母細胞）を胚の形成に好適な条件下で非ヒト動物に懐胎させることが挙げられる。
【０１３６】
簡潔に述べると、核移植の方法は、（１）卵母細胞を除核する工程；（２）除核された卵母細胞と組み合わされるドナー細胞またはドナー核を単離する工程；（３）その細胞または核を、除核卵母細胞に注入し、再構成細胞を形成させる工程；（４）再構成細胞を動物の子宮に移植し、胚を形成させる工程；および（５）胚を発生させる工程、を含む。かかる方法において、卵母細胞は通常、死亡した動物から採取されるが、生きた動物の卵管および／または卵巣のいずれかから単離してもよい。卵母細胞は、除核の前に当分野の当業者に公知の様々な培地中で成熟されてもよい。卵母細胞の除核は、当分野の当業者に公知の様々な方法で行うことができる。再構成細胞を形成させるために、除核卵母細胞にドナー細胞またはドナー核を挿入することは、典型的には、融合前の透明帯下にドナー細胞をマイクロインジェクションすることにより行われる。融合は、接触／融合面の全体にわたりＤＣ電気パルスを与えること（エレクトロフュージョン）により、たとえばポリエチレングリコールなどの融合促進化学物質に細胞を暴露することにより、またはたとえばセンダイウイルスなどの不活化ウイルスを用いることにより、誘導されてもよい。再構成細胞は、典型的には、核ドナーとレシピエント卵母細胞の融合の前、融合の間、および／または融合の後に、電気的および／または非電気的手段により活性化される。活性化の方法としては、電気パルス、化学誘導ショック、精子の侵入、卵母細胞中の二価カチオン値の上昇、および卵母細胞中の細胞タンパク質のリン酸化の減少（キナーゼ阻害物質によるものとして）が挙げられる。活性化された再構成細胞または胚は、典型的には、当分野の当業者に公知の培地中で培養され、その後、動物の子宮に移される。たとえば、米国特許第７，６１２，２５０号、米国特許出願公開２００４−０１７７３９０Ａ１および２００８−００９２２４９Ａ１、ならびに国際特許出願公開ＷＯ１９９９／００５２６６Ａ２およびＷＯ２００８／０１７２３４Ａｌを参照のこと。それら各々は、参照により本明細書に援用される。
【０１３７】
非ヒト動物ゲノム（例えば、ブタ、メスウシ、齧歯類、ニワトリなどのゲノム）の改変方法には、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ、ＴＡＬＥＮ）、またはＣａｓタンパク質（すなわち、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）を用いて、ゲノムを改変し、本明細書に記載される破損された、または変異型Ｒｓ１遺伝子を含ませる方法が挙げられる。
【０１３８】
一部の実施形態では、本開示の非ヒト動物は哺乳動物である。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、例えばトビネズミ上科またはネズミ上科の小さな哺乳類である。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、齧歯類である。一部の実施形態では、本明細書に記載される齧歯類はマウス、ラット、ハムスターから選択される。一部の実施形態では、本明細書に記載される齧歯類はネズミ上科から選択される。一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変動物は、ヨルマウス科（例えば、マウス様のハムスター）、キヌゲネズミ科（例えば、ハムスター、Ｎｅｗ  Ｗｏｒｌｄラット及びマウス、ハタネズミ）、ネズミ科（純種のマウス及びラット、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ）、アシナガマウス科（キノボリマウス、ロックマウス、オジロラット、マダガスカルラット及びマウス）、トゲヤマネ科（例えば、トゲヤマネ）、及びメクラネズミ科（例えば、メクラネズミ、タケネズミ、及び高原モグラネズミ）から選択された科からのものである。一部のある実施形態では、本明細書に記載される齧歯類は、純種のマウスまたはラット（ネズミ科）、アレチネズミ、トゲマウス、およびタテガミネズミから選択される。一部のある実施形態では、本明細書に記載されるマウスは、ネズミ科の１種である。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、齧歯類である。一部のある実施形態では、本明細書に記載される齧歯類は、マウスおよびラットから選択される。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、マウスである。
【０１３９】
一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、及びＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系のマウスである齧歯類である。一部のある実施形態では、本明細書に記載されるマウスは、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９／ＳｖＪａｅ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２である系から成る群から選択される１２９系である（例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇら、１９９９，Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  １０：８３６；Ａｕｅｒｂａｃｈ，Ｗ．ら、２０００，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９（５）：１０２４−１０２８，１０３０，１０３２を参照）。一部のある実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変マウスは、前述の１２９系と前述のＣ５７ＢＬ／６系との混合である。一部のある実施形態では、本明細書に記載されるマウスは、前述の１２９系の混合、または前述のＢＬ／６系の混合である。一部のある実施形態では、本明細書に記載されるマウスは、前述のＢＬ／６系統の混合またはそれに由来するものであり、Ｃｒｂ１ｒｄ８突然変異を含まない（または欠く）（すなわち、野生型Ｃｒｂ１を含む）。一部の実施形態では、本明細書に記述された混合の１２９系は１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系である。一部の実施形態では、本明細書に記載されるマウスは、例えばＢＡＬＢ／ｃ系などのＢＡＬＢ系である。一部の実施形態では、本明細書に記載されるマウスは、ＢＡＬＢ系統及び前述の別系統の混合である。
【０１４０】
一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、ラットである。一部のある実施形態では、本明細書に記載されるラットは、ウィスターラット、ＬＥＡ系統、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ系統、フィッシャー系統、Ｆ３４４、Ｆ６、及びＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉから選択される。一部の実施形態では、本明細書に記述されたラット系は、ウィスター、ＬＥＡ、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、フィッシャー、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉから成る群から選択された二つ以上の系の混合である。
【０１４１】
ラット多能性細胞および／または分化全能性細胞は、たとえばＡＣＩラット系統、Ｄａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統、Ｗｉｓｔａｒラット系統、ＬＥＡラット系統、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット系統、またはたとえばＦｉｓｈｅｒ  Ｆ３４４もしくはＦｉｓｈｅｒ  Ｆ６などのＦｉｓｃｈｅｒラット系統をはじめとする任意のラット系統由来であってもよい。ラット多能性細胞及び／または分化全能性細胞は、上記の二つ以上の系統の混合から誘導された系統から取得されたものであってもよい。例えば、ラット多能性細胞及び／または分化全能性細胞は、ＤＡ系統またはＡＣＩ系統由来のものであってもよい。ＡＣＩラット系統は、黒色のアグーチを有し、腹部と足は白色で、ＲＴ１ａｖ１ハプロタイプであることが特徴である。当該系統は、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓをはじめとする様々な供給源から入手可能である。ＡＣＩラット由来のラットＥＳ細胞株の例は、ＡＣＩ．Ｇ１ラットＥＳ細胞である。Ｄａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統は、アグーチの毛色を有し、ＲＴ１ａｖ１ハプロタイプであることが特徴である。当該ラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ及びＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓをはじめとする様々な供給源から入手可能である。ＤＡラット由来のラットＥＳ細胞株の例は、ＤＡ．２ＢラットＥＳ細胞株と、ＤＡ．２ＣラットＥＳ細胞株である。一部の例では、ラットの多能性細胞及び／または分化全能性細胞は、近交系ラット由来である。例えば、米国特許出願公開２０１４−０２３５９３３Ａ１を参照のこと。当該出願公開は本明細書に参照により組み込まれる。ラットＥＳ細胞および遺伝子改変ラットを作製する方法も当該技術分野において記載されている。例えば、ＵＳ２０１４／０２３５９３３Ａ１、ＵＳ２０１４／０３１０８２８Ａ１、Ｔｏｎｇら（２０１０年）Ｎａｔｕｒｅ  ４６７：２１１−２１５、およびＴｏｎｇら（２０１１年）Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．６（６）：ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１１．３３８を参照（その全てが参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１４２】
Ｒｓ１遺伝子中に破損または突然変異を備えた非ヒト動物が提供される。一部の実施形態では、Ｒｓ１  遺伝子中の破損または突然変異により、機能消失がもたらされる。特に、機能消失性の突然変異としては、ＲＳ１発現の低下または欠落を生じさせる突然変異、および／またはＲＳ１の活性／機能の低下または欠落を生じさせる突然変異が挙げられる。一部の実施形態では、機能消失性の突然変異は、野生型の非ヒト動物と比較し、一つ以上の表現型が生じる。ＲＳ１の発現は、たとえば本明細書に記載される非ヒト動物の細胞または組織におけるＲＳ１値の評価などにより直接測定されてもよい。
【０１４３】
典型的には、ＲＳ１の発現値および／または活性は、ＲＳ１の発現および／または活性の値が、同じ破損（たとえば欠失）を備えていない適切な対照細胞または非ヒト動物中のＲＳ１値よりも統計的に低い（ｐ≦０．０５）場合に、低下している。一部の実施形態では、ＲＳ１の濃度および／または活性は、同じ破損（たとえば欠失）が無い対照細胞または非ヒト動物と比較して、ホモ接合性メスまたはヘミ接合性オス動物において、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上まで低下している。
【０１４４】
他の実施形態では、ＲＳ１の発現値および／または活性を低下させる、Ｒｓ１遺伝子中の破損または突然変異を有する細胞または生物は、限定されないが、サザンブロット分析、ＤＮＡ配列解析、ＰＣＲ分析、または表現型分析をはじめとする方法を使用して選択される。その後、かかる細胞または非ヒト動物を、本明細書に記載される様々な方法および組成物において利用する。
【０１４５】
一部の実施形態では、内因性Ｒｓ１遺伝子は欠失されていない（すなわち、本来のままである）。一部の実施形態では、内因性Ｒｓ１遺伝子は、変更され、破損され、欠失され、または異種配列（たとえばレポーター遺伝子コード配列）と置換される。一部の実施形態では、内因性Ｒｓ１遺伝子のすべて、または実質的にすべてが、挿入核酸で置換される。一部のある実施形態では、置換は、内因性Ｒｓ１遺伝子のコード配列の一部と、レポーター遺伝子（たとえば、ｌａｃＺ）の置換を含み、それにより、そのレポーター遺伝子は、Ｒｓ１プロモーター（たとえば内因性Ｒｓ１プロモーター）と動作可能に連結される。一部の実施形態では、レポーター遺伝子の一部（たとえばその機能性断片）は、内因性非ヒトＲｓ１遺伝子内に挿入される。一部の実施形態では、レポーター遺伝子は、ｌａｃＺ遺伝子である。一部の実施形態では、レポーター遺伝子は、メス非ヒト動物の内因性Ｒｓ１遺伝子の２コピーのうちの一つに挿入され、そのレポーター遺伝子に関してヘテロ接合性の非ヒトメス動物が生成される。一部の実施形態では、レポーター遺伝子に対してホモ接合性の非ヒトメス動物が提供される。
【０１４６】
Ｒｓ１遺伝子中に突然変異を備えた非ヒト動物が提供される。一部の実施形態では、Ｒｓ１遺伝子中の突然変異により、バリアントＲＳ１ポリペプチド（たとえば、野生型ＲＳ１ポリペプチドと比較して一つ以上のアミノ酸置換を含むＲＳ１ポリペプチド）の発現が生じる。バリアントＲＳ１の発現は、たとえば本明細書に記載される非ヒト動物の細胞または組織におけるバリアントＲＳ１値の評価などにより直接測定されてもよい。
【０１４７】
他の実施形態では、Ｒｓ１遺伝子中に突然変異を有する細胞または生物は、限定されないが、サザンブロット分析、ＤＮＡ配列解析、ＰＣＲ分析、または表現型分析をはじめとする方法を使用して選択される。その後、かかる細胞または非ヒト動物を、本明細書に記載される様々な方法および組成物において利用する。
【０１４８】
一部の実施形態では、内因性Ｒｓ１遺伝子は、変異型Ｒｓ１配列（たとえば、変異型ＲＳ１コード配列の全部または一部）と変更され、または置換される。いくつかの実施形態では、すべてまたは実質的にすべての内因性Ｒｓ１遺伝子は挿入核酸と置き換えられる。一部のある実施形態では、変異型Ｒｓ１エクソンが、Ｒｓ１プロモーター（例えば、内因性Ｒｓ１プロモーター）およびその他の内因性Ｒｓ１エクソンと動作可能に連結であるように、置換は、内因性Ｒｓ１エクソン（例えば、エクソン３または５）の変異型Ｒｓ１エクソン（例えば、合成エクソン３または合成エクソン５）との置換を含む。一部の実施形態では、変異型Ｒｓ１エクソンは、内因性Ｒｓ１遺伝子内に挿入され、その変異型Ｒｓ１エクソンは一つ以上の点変異を含有し、一部のある実施形態では、一つの点変異を含有する。一部の実施形態では、変異型Ｒｓ１エクソンは、メス非ヒト動物の内因性Ｒｓ１遺伝子の２コピーのうちの一つに挿入され、その変異型Ｒｓ１エクソンに関してヘテロ接合性のメス非ヒト動物が生成される。一部の実施形態では、変異型Ｒｓ１エクソンに対してホモ接合性のメス非ヒト動物が提供される。一部の実施形態では、変異型内因性Ｒｓ１遺伝子を備えた非ヒト動物は、欠失および／または部位特異的リコンビナーゼ認識部位（たとえば、ｌｏｘＰ）を含む一つ以上のＲｓ１イントロンをさらに備える。
【０１４９】
網膜分離症の非ヒト動物モデルおよび使用方法
本明細書に記載される非ヒト動物は、網膜分離症に対する改善された動物モデルを提供する。特に、本明細書に記載される非ヒト動物は、例えば、網膜の変性による中心視野および周辺視野の進行性損失により特徴付けられる、Ｘ連鎖性網膜分離症の疾患病状に移行する改善された動物モデルを提供する。
【０１５０】
たとえば本明細書に記載されるＲｓ１遺伝子の破損または突然変異は、本明細書に提供される非ヒト動物において様々な症状（または表現型）を生じさせ得る。一部の実施形態では、Ｒｓ１遺伝子の破損または突然変異は、出生時、肉眼的には正常であるが、たとえば、約８週、９週、１０週、１１週、１２週、１３週、１４週、１５週、１６週、１７週、１８週、１９週、２０週、２１週、２２週、２３週、２４週、２５週、２６週、２７週、２８週、２９週、３０週、３１週、３２週、３３週、３４週、３５週、３６週、３７週、３８週、３９週、４０週、４１週、４２週、４３週、４４週、４５週、４６週、４７週、４８週、４９週、５０週、５１週、５２週、５３週、５４週、５５週、５６週、５７週、５８週、５９週、６０週後など、加齢に伴い一つ以上の症状を発生させる非ヒト動物を生じさせる。一部の実施形態では、Ｒｓ１  遺伝子の破損または突然変異は、網膜の一方または両方の異常な構造および／または機能を有する非ヒト動物を生じさせる。一部の実施形態では、Ｒｓ１  遺伝子の破損または突然変異は、網膜分離症と関連した一つ以上の症状（または表現型）を示す非ヒト動物を生じさせる。このような症状（または表現型）としては、例えば、一方または両方の網膜が２層に分裂すること、網膜および／または黄斑の異常な構造もしくはアーキテクチャ、中心窩（黄斑の中心）における放射状のストリーク（ｓｐｏｋｅ−ｌｉｋｅ  ｓｔｒｅａｋｓ）、一方または両方の網膜が２層に分裂することによってできた空間における水疱の存在および／または血管の破裂、一方または両方の網膜の硝子体への血液の漏れ、視力喪失および／または視覚の悪化、失明、網膜色素沈着および／または網膜変性症、硝子体の網膜からの変性および分離、ならびに網膜剥離が挙げられうる。特定の実施形態では、症状または表現型は、内側網膜内の嚢胞構造の発生を含み、野生型非ヒト動物と比較してＥＲＧｂ波およびａ波応答を減少させ、その後に光受容体細胞の損失をもたらす。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物のＲｓ１遺伝子座における破損または突然変異は、非ヒト動物の網膜の機能的および形態学的表現型を早期発症（例えば、生後１５、１８、２１、２４または２７日目に、あるいは生後１５、１８、２１、２４または２７日目までに）する。一部の実施形態では、網膜の早期発症の機能的欠陥は、野生型非ヒト動物と比較して、（ｉ）暗順応および明順応されたＥＲＧ分析において、ａ波に対してｂ波を減少させる（結果として負電荷のＥＲＧ）、（ｉｉ）ＥＲＧｂ波の最大応答および感度値の減少、（ｉｉｉ）ＥＲＧａ波の最大応答値の減少、または（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の組み合わせによって反映されうる。一部の実施形態では、野生型非ヒト動物と比較して、網膜の早期発症の形態的欠陥は、亀裂、より広いエリプソイド帯（ＥＺ）、より薄い外側網膜、またはそれらの組み合わせによって反映されうる。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、網膜分離症（例えば、Ｘ連鎖性網膜分離症）の治療のための候補治療法の特定および開発のための改善されたインビボシステムを提供する。ゆえに、少なくとも一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、Ｘ連鎖性網膜分離症および／または眼疾患のための改善された動物モデルを提供するものであり、眼関連疾患、障害もしくは状態の治療および／または予防のための治療剤の開発ならびに／あるいは特定に使用することができる。
【０１５１】
本明細書に記載される非ヒト動物は、ＲＳ１の発現を欠く、または様々なアッセイに有用なバリアントＲＳ１ポリペプチドを発現する、改善されたインビボシステム、および生体物質（例えば、細胞）の供給源を提供する。様々な実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物を使用して、ＲＳ１の発現および／または活性の欠落に関連した一つ以上の症状を治療、予防、および／または阻害する治療剤が開発される（例えば、遺伝子治療／置換）。様々な実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物を使用して、バリアントＲＳ１ポリペプチドの発現に関連した一つ以上の症状を治療、予防、および／または阻害する治療剤が開発される。バリアントＲＳ１ポリペプチドの発現を理由に、本明細書に記載される非ヒト動物は、網膜構造および発達に対する機能的因果関係を決定するための様々なアッセイにおける使用に有用である。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、ＲＳ１構造および／または機能に関与する分子をスクリーニングするための動物モデルを提供する。
【０１５２】
本明細書に記載される非ヒト動物はまた、一方または両方の網膜の構造および／または機能の変性から生じる進行性の視覚喪失を治療、予防、および／または阻害する治療剤の特定のためのインビボシステムを提供する。一部の実施形態では、治療剤の効果は、そのゲノムが本明細書に記載されるＲｓ１遺伝子を備える非ヒト動物に前述の治療剤を投与することにより、インビボで決定される。
【０１５３】
本明細書に記載される非ヒト動物はまた、眼関連疾患、障害、または状態に対し改善された動物モデルを提供する。特に、本明細書に記載される非ヒト動物は、一方または両方の網膜の神経知覚層における細胞間接着の分解によって特徴付けられる状態に移行する改善された動物モデルを提供する。
【０１５４】
非ヒト動物に、たとえば静脈内注射、腹腔内注射、または硝子体内注射などの任意の簡便な経路で、試験される治療剤を投与してもよい。かかる動物を免疫研究に含ませてもよく、それにより、治療剤を投与されなかった適切な対照非ヒト動物と比較した、非ヒト動物の視力に対する治療剤の効果（たとえば、網膜の神経知覚機能への効果）が決定される。動物組織（たとえば眼組織）の生検または解剖学的な評価を行ってもよく、および／または血液サンプルを採取してもよい。
【０１５５】
様々な実施形態において、本明細書に記載の非ヒト動物を使用して、一方または両方の網膜の光受容体機能を救済する候補治療法（例えば抗体）が特定、スクリーニング、および／または開発される。様々な実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、光受容体へのＲｓ１遺伝子送達の有効性を決定するために使用される。一部の実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、ＲＳ１ポリペプチドをコードする一つ以上の網膜遺伝子治療のベクター設計を決定および／または最適化するために使用される。
【０１５６】
様々な実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物を使用して、候補薬剤、例えば、Ｒｓ１遺伝子治療薬の薬物動態プロファイルが決定される。様々な実施形態で、本明細書に記載される一つ以上の非ヒト動物、および一つ以上の対照非ヒト動物または参照非ヒト動物がそれぞれ、一つ以上の候補薬剤、例えば、Ｒｓ１遺伝子治療薬に、様々な用量（たとえば、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｍｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上）で曝露される。候補薬剤、例えば、Ｒｓ１遺伝子治療薬は、本明細書に記載される非ヒト動物における評価のための非経口経路投与および経口経路（ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｒｏｕｔｅｓ）投与を含む任意の望ましい投与経路を介して投与されうる。非経口経路は、例えば、静脈内、動脈内、門脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、髄腔内、くも膜下腔内、側脳室内、頭蓋内、胸腔内または注入のその他の経路を含む。非注射経路は、例えば、経口、経鼻、経皮、肺、直腸、口腔、膣、眼を含む。投与は、連続注入、局所投与、インプラント（ゲル、膜など）からの持続放出、および／または静脈内注射による場合もある。非ヒト動物から血液が様々な時点（例えば、０時間、６時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、または最大３０日もしくはそれ以上の日数）で単離される。本明細書に記載される非ヒト動物から取得されたサンプルを使用して様々なアッセイが行われ、投与薬剤の、限定されないが総ＩｇＧ、抗薬剤応答、凝集などをはじめとする薬物動態プロファイルが決定されてもよい。
【０１５７】
様々な実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、一つ以上の候補薬剤、例えば、Ｒｓ１遺伝子治療薬、の治療有効性を決定するために使用される。様々な実施形態では、本明細書に記載される一つ以上の非ヒト動物および一つ以上の対照または参照非ヒト動物はそれぞれ、一つ以上の候補薬剤、例えば、Ｒｓ１遺伝子治療薬に、種々の用量で、（例えば、０．１ｍｇ／μＬ、０．２ｍｇ／μＬ、０．３ｍｇ／μＬ、０．４ｍｇ／μＬ、０．５ｍｇ／μＬ、０．６ｍｇ／μＬ、０．７ｍｇ／μＬ、０．８ｍｇ／μＬ、０．９ｍｇ／μＬ、１．０ｍｇ／μＬ、１．１ｍｇ／μＬ、１．２ｍｇ／μＬ、１．３ｍｇ／μＬ、１．４ｍｇ／μＬ、１．５ｍｇ／μＬ、１．６ｍｇ／μＬ、１．７ｍｇ／μＬ、１．８ｍｇ／μＬ、１．９ｍｇ／μＬ、２．０ｍｇ／μＬ、２．１ｍｇ／μＬ、２．２ｍｇ／μＬ、２．３ｍｇ／μＬ、２．４ｍｇ／μＬ、２．５ｍｇ／μＬ、２．６ｍｇ／μＬ、２．７ｍｇ／μＬ、２．８ｍｇ／μＬ、２．９ｍｇ／μＬ、３．０ｍｇ／μＬ、３．１ｍｇ／μＬ、３．２ｍｇ／μＬ、３．３ｍｇ／μＬ、３．４ｍｇ／μＬ、３．５ｍｇ／μＬ、３．６ｍｇ／μＬ、３．７ｍｇ／μＬ、３．８ｍｇ／μＬ、３．９ｍｇ／μＬ、４．０ｍｇ／μＬ、４．１ｍｇ／μＬ、４．２ｍｇ／μＬ、４．３ｍｇ／μＬ、４．４ｍｇ／μＬ、４．５ｍｇ／μＬ、４．６ｍｇ／μＬ、４．７ｍｇ／μＬ、４．８ｍｇ／μＬ、４．９ｍｇ／μＬまたは５．０ｍｇ／μＬ以上）で曝露される。一部の実施形態では、候補薬剤、例えば、Ｒｓ１遺伝子治療薬は、出生時または出生直後、例えば、出生後１８、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１日以内に、本明細書に記載される非ヒト動物に与えられる。候補薬剤、例えば、Ｒｓ１遺伝子治療薬は、硝子体経路を介して優先的に投与されるが、非経口経路投与および経口経路（ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｒｏｕｔｅｓ）投与（上記を参照）を含む任意の望ましい投与経路は、本明細書に記載される非ヒト動物で評価されうる。様々な実施形態では、一つ以上の候補薬剤、例えば、Ｒｓ１遺伝子治療薬は、様々な体積で硝子体内経路を介して注入される（例えば、１μＬ、２μＬ、３μＬ、４μＬ、５μＬ、６μＬ、７μＬ、８μＬ、９μＬ、１０μＬ、１１μＬ、１２μＬ、１３μＬ、１４μＬ、１５μＬ、１６μＬ、１７μＬ、１８μＬ、１９μＬ、２０μＬ、２１μＬ、２２μＬ、２３μＬ、２４μＬ、２５μＬ、２６μＬ、２７μＬ、２８μＬ、２９μＬ、３０μＬ、３１μＬ、３２μＬ、３３μＬ、３４μＬ、３５μＬ、３６μＬ、３７μＬ、３８μＬ、３９μＬ、４０μＬ、４１μＬ、４２μＬ、４３μＬ、４４μＬ、４５μＬ、４６μＬ、４７μＬ、４８μＬ、４９μＬまたは５０μＬ以上）。注射は、連続的であるか、または特定の時間コース（例えば、毎週、隔週、月単位など）に従ってもよい。網膜機能および／または視力は、当該技術分野で知られている、および／または本明細書に記載されるアッセイを使用して様々な時点（例えば、０時間、６時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１５、１８、２１、２４、または最大３０日、またはそれ以上）で決定される。さまざまな機能的および／または形態学的解析は、一つ以上の候補薬剤、例えば、Ｒｓ１遺伝��治療薬の投与後、本明細書に記載される非ヒト動物、および一つ以上の対照または参照非ヒト動物から採取された網膜および／または眼杯上で行われて、ＲＳ１機能および／またはＲＳ１依存性プロセスに対する効果を決定してもよい。
【０１５８】
様々な実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、Ｒｓ１活性の復元の治療効果、ならびに眼の細胞変化の結果としての網膜構造および／または機能への効果を測定するために使用される。様々な実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物またはそこから単離された細胞は、候補薬剤、例えば、Ｒｓ１遺伝子治療薬に曝露され、およびその後の期間後、Ｒｓ１依存性プロセス（または相互作用）に対する効果について分析される。
【０１５９】
本明細書に記載の非ヒト動物からの細胞（例えば、網膜細胞）は、その場限りで単離して使用するか、または多世代にわたって培養物中で維持することができる。様々な実施形態で、本明細書に記載される非ヒト動物からの細胞は、（例えば、ウイルスの使用を介して、細胞融合を介して、などで）不死化され、培養（例えば、連続培養）で、無期限に維持される。
【０１６０】
本明細書に記載の非ヒト動物は、薬剤またはワクチンの分析および検査のためのインビボシステムを提供する。種々の実施形態では、候補薬剤またはワクチンが本明細書に記載の一つ以上の非ヒト動物に送達され、その後、該非ヒト動物をモニターして、薬剤もしくはワクチンに対する免疫反応、薬剤もしくはワクチンの安全性プロファイル、または疾患もしくは症状に対する効果および／もしくは疾患もしくは症状の一つ以上の兆候に対する効果のうちの一つ以上を算出してもよい。安全性プロファイルを決定するために使用される方法の例は、毒性、最適な用量濃度、薬剤またはワクチンの有効性、及び潜在的リスク因子の測定を含む。このような薬剤またはワクチンはこのような非ヒト動物で改善および／または開発される場合がある。
【０１６１】
ワクチンの有効性は、数多くの方法で算出され得る。簡潔に述べると、本明細書に記載の非ヒト動物は当分野に公知の方法を使用してワクチン接種され、その後、ワクチンでチャレンジされるか、またはすでに感染した非ヒト動物にワクチンが投与される。ワクチンに対する非ヒト動物の応答を、その非ヒト動物（またはそれらから単離された細胞）のモニタリングを行うことにより、および／またはそれらに対して一つ以上のアッセイを行うことにより測定して、ワクチンの有効性を決定することができる。ワクチンに対する非ヒト動物の応答は、続いて、当技術分野に公知の、および／または本明細書に記載の一つ以上の手段を使用して、対照動物と比較される。
【０１６２】
ワクチンの有効性は、ウイルス中和アッセイによりさらに算出されてもよい。簡潔に述べると、本明細書に記載の非ヒト動物が免疫化され、免疫後の様々な日に血清が採取される。血清の連続希釈物をウイルスとプレインキュベートし、その間に、そのウイルスに特異的な血清中の抗体が、ウイルスに結合することになる。続いて、ウイルス／血清の混合物を許容細胞に添加して、プラークアッセイまたはマイクロ中和アッセイにより感染性を算出する。血清中の抗体がウイルスを中和する場合、対照群と比較して、プラーク数が少ないか、または相対ルシフェラーゼ単位が低くなる。
【０１６３】
本明細書に記載される非ヒト動物は、薬剤（例えば、Ｒｓ１遺伝子送達剤）の薬物動態特性および／または有効性を評価するためのインビボシステムを提供する。様々な実施形態では、薬剤は、本明細書に記載される一つ以上の非ヒト動物に送達または投与され、その後、当該非ヒト動物（またはそれらから単離された細胞）をモニターするか、または一つ以上のアッセイを実施して、当該非ヒト動物に対する薬剤の効果を決定してもよい。薬物動態特性としては、非ヒト動物がどのように薬剤を処理して様々な代謝物にするか（または、限定されないが有毒代謝物を含む一つ以上の薬剤代謝物の有無の検出）、薬剤半減期、投与後の薬剤の循環レベル（例えば、薬剤の血清濃度）、抗薬物反応（例えば、抗薬物抗体）、薬剤の吸収および分布、投与経路、薬剤の排泄および／またはクリアランスの経路が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、薬剤の薬物動態および薬力学特性は、本明細書に記載される非ヒト動物において、またはその使用を通してモニターされる。
【０１６４】
一部の実施形態では、アッセイを行うことには、薬剤が投与される非ヒト動物の表現型及び／または遺伝子型への効果を決定することを含む。一部の実施形態では、アッセイを行うことには、薬剤のロット間変動を決定することを含む。一部の実施形態では、アッセイの実施は、本明細書に記載される非ヒト動物に投与された薬剤の効果と、参照非ヒト動物に投与された薬剤の効果の間の差異を決定することを含む。様々な実施形態では、参照非ヒト動物は、本明細書に記載された改変を有するか、本明細書に記載される改変とは異なる改変を有するか、または改変を有しない（すなわち、野生型非ヒト動物）場合がある。
【０１６５】
薬剤の薬物動態特性を評価するために非ヒト動物で（またはそれらから単離された細胞でおよび／またはそれらを使用して）測定されうるパラメーターの例には、凝集、オートファジー、細胞分裂、細胞死、補体介在性溶血、ＤＮＡ完全性、薬物特異抗体力価、薬剤代謝、遺伝子発現アレイ、代謝活性、ミトコンドリア活性、酸化ストレス、食作用、タンパク質生合成、タンパク質分解、タンパク質分泌、ストレス反応、標的組織薬剤濃度、標的外組織薬剤濃度、転写活性などが挙げられるが、これらに限定されない。様々な実施形態で、本明細書に記載された非ヒト動物は、薬剤の薬学的有効量を決定するために使用される。
【０１６６】
キット
本開示はさらに、本明細書に記載される、少なくとも一つの非ヒト動物、非ヒト細胞、ＤＮＡ断片、および／または標的化ベクターで満たされた容器を一つ以上備えたパックまたはキットを提供する。キットは、任意の適用可能な方法（例えば調査方法）において使用されてもよい。医薬品および生物製品の製造、使用または販売を規制する政府機関により規定されたフォームの通知書を、任意でかかる容器に関連づけてもよく、その通知書は、（ａ）ヒト投与に関する製造、使用または販売に関する当局による承認、（ｂ）使用に関する説明書、またはその両方、または二つ以上の実体の間の物質および／または生物製品（例えば本明細書に記載される非ヒト動物または非ヒト細胞）の輸送を支配する契約書、を反映している。
【０１６７】
本開示の他の特徴は、例示のために与えられ、かつ限定を意図しない例示的な実施形態の以下の記載の過程で明らかになるであろう。
【実施例】
【０１６８】
以下の実施例は、本開示の方法及び組成物をどのように作製し、使用するかを当業者に説明するために提供されており、発明者がその開示として見なすものの範囲を限定することを意図していない。別途示されていない限り、温度は摂氏で示され、圧力は大気圧またはその近くである。
【０１６９】
実施例１．操作されたレチノスキシン−１齧歯類系統の生成
本実施例は、齧歯類のレチノスキシン−１（Ｒｓ１）遺伝子座における改変を生成するための一連の標的化ベクターの構築を示すものである。特に、本実施例は、Ｒｓ１遺伝子座（すなわち、ヌル対立遺伝子）における破損を生成し、および一つ以上の点変異をＲｓ１遺伝子座のコード配列の一つ以上のエクソンに導入し、結果として、親ＲＳ１ポリペプチドと比較して一つ以上のアミノ酸置換を有するバリアントＲＳ１ポリペプチドをコードする変異型Ｒｓ１遺伝子の産生を生じさせるための標的化ベクターの構築を具体的に記載するものである。変異型対立遺伝子は、点変異を含有する単一のエクソンを含む合成ＤＮＡ断片を使用して構築された（以下を参照）。以下に記載されるように、シーケンシングオリゴヌクレオチドは、マウス相同性ボックスおよびライゲーションＱＣ用に設計された。ハイグロマイシン耐性遺伝子を含む自己削除カセット（ＳＤＣ）をクローニングし、細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンを標的化するためのドナーを作成した。各点変異に特異的な二つの別個のドナーが、ＰＣＲおよびサンガーシーケンシングによって確認された。ドナーを、骨格を除去するために直線化し、および齧歯類Ｒｓ１遺伝子を含有するＢＡＣクローンＤＮＡを標的化することに使用して、変異型Ｒｓ１遺伝子を生成した。改変されたＢＡＣは、薬剤選択、相同接合部に渡るＰＣＲおよびサンガーシーケンシング、ＰＦＧ電気泳動、ならびにＩｌｌｕｍｉｎａ分析によって確認された。
【０１７０】
簡潔に述べると、ヌル対立遺伝子については、マウスＲｓ１遺伝子のコード配列のエクソン１〜３の欠失（すなわち、エクソン１のＡＴＧコドンの３’から始まり、エクソン３の３’末端までであり、１３，７１６ｂｐの欠失が生じる）は、マウスＲｓ１プロモーターと動作可能な連結に配置された（つまり、エクソン１のＡＴＧコドンとともにフレーム内にある）ｌａｃＺレポーター構築物を使用して作製された。内因性マウスＲｓ１遺伝子座の破損を生成するためのＲｓ１−ｌａｃＺ−ＳＤＣ標的化ベクターは、従前に記載されるように構築された（たとえば、米国特許第６，５８６，２５１号、Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、２００３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（６）：６５２−６５９、ならびにＡｄａｍｓ，Ｎ．Ｃ．およびＮ．Ｗ．ＧａｌｅによるＭａｍｍａｌｉａｎ  ａｎｄ  Ａｖｉａｎ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ−Ｎｅｗ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ，ｅｄ．Ｌｏｉｓ，Ｓ．Ｐ．ａ．Ｃ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，２００６を参照）。Ｒｓ１ヌル対立遺伝子を生成するための標的化ベクター（またはＤＮＡ構築物）の例を図２に示す。
【０１７１】
簡潔に述べると、Ｒｓ１−ｌａｃＺ−ＳＤＣ標的化ベクターは、従前に記載されるように（たとえば、米国特許第８，６９７，８５１号、第８，５１８，３９２号、および第８，３５４，３８９号を参照のこと。これらすべては参照により本明細書に援用される）、マウス細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンのＲＰ２３−２１３Ｏ８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と、自動削除ネオマイシン選択カセット（ｌａｃＺ−ｐＡ−ＩＣｅｕＩ−ｌｏｘＰ−ｍＰｒｍ１−Ｃｒｅｉ−ＳＶ４０ｐＡ−ｈＵｂ１−ｅｍ７−Ｎｅｏ−ＰＧＫｐＡ−ｌｏｘＰ）とを使用して作製された。Ｒｓ１−ｌａｃＺ−ＳＤＣ標的化ベクターは、未分化細胞においてリコンビナーゼが発現されるよう発生的に制御されたマウスプロタミン１プロモーターに動作可能に連結されたＣｒｅリコンビナーゼコード配列を含有した。相同組換えが行われると、内因性マウスＲｓ１遺伝子のエクソン１のＡＴＧコドンのヌクレオチド３’から、エクソン３の３’末端前の最後の６つのヌクレオチドまでを含む欠失（１３，７１６ｂｐ）が、標的化ベクターに含有される配列（約８，２０２ｂｐ）に置換えられる。薬剤選択カセットは発生依存性の様式で除去される、すなわち、その生殖系細胞に上述の破壊されたＲｓ１遺伝子を含むマウスから派生した子孫は、発生中に分化細胞から選択マーカーを脱落させる（米国特許第８，６９７，８５１号、第８，５１８，３９２号、および第８，３５４，３８９号を参照。これらすべては参照により本明細書に援用される）。
【０１７２】
第１の変異型対立遺伝子については、Ｃ５９Ｓアミノ酸置換を有するＲＳ１ポリペプチドが、結果として生じる変異型Ｒｓ１遺伝子によってコードされるように、マウス細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンＲＰ２３−２１３Ｏ８を改変して、内因性Ｒｓ１遺伝子のエクソン３における点変異（ＴＧＴからＡＧＴ）を導入した（図５）。追加的な欠失をイントロン２（２５ｂｐ）およびイントロン３の（２８ｂｐ）で行い、陽性クローンのスクリーニングを促進した（図６）。点変異および欠失は、デノボＤＮＡ合成（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）によって作製された合成断片を使用して導入された。変異型エクソン３および周囲のイントロン配列（５’および３’）を含む合成断片は、プラスミド骨格内に含まれ、アンピシリンで選択されると細菌内で増殖された。ハイグロマイシン耐性遺伝子を合成断片に結合し、制限酵素を用いて相同アームを付加し、ＲＰ２３−２１３Ｏ８ＢＡＣとの相同組換え用の標的化ベクターを生成した（図５）。次いで、得られた改変ＲＰ２３−２１３Ｏ８  ＢＡＣクローンをＥＳ細胞内に電気穿孔した（以下を参照）。Ｒｓ１Ｃ５９Ｓ−ＳＤＣ標的化ベクターは、未分化細胞においてリコンビナーゼが発現されるよう発生的に制御されたマウスプロタミン１プロモーターに動作可能に連結されたＣｒｅリコンビナーゼコード配列を含有した（図５、また米国特許第８，６９７，８５１号、第８，５１８，３９２号、および第８，３５４，３８９号を参照。それらすべて参照により本明細書に援用される）。相同組換えに伴い、合成変異型Ｒｓ１エクソン３は、内因性マウスＲｓ１遺伝子座のエクソン３の場所に挿入され、および周辺のイントロン（すなわち、イントロン２および３）の小規模な欠失は、標的化ベクター中に含まれる配列によって作製される。薬剤選択カセットは発生依存性の様式で除去される、すなわち、その生殖系細胞に上述の変異型Ｒｓ１遺伝子を含むマウスから派生した子孫は、発生中に分化細胞から選択マーカーを脱落させる（図７、また米国特許第８，６９７，８５１号、第８，５１８，３９２号、および第８，３５４，３８９号も参照のこと。これらすべては参照により本明細書に援用される）。周辺のエクソン、イントロン及び非翻訳領域（ＵＴＲ）を含有する内因性ＤＮＡは、突然変異および選択カセットにより変更されなかった。標的化ベクターの配列解析により、変異型Ｒｓ１遺伝子のすべてのエクソン、イントロン、スプライシングシグナル、およびオープンリーディングフレームが確認された。
【０１７３】
第２の変異型対立遺伝子については、Ｒ１４１Ｃアミノ酸置換を有するＲＳ１ポリペプチドが結果として生じる変異型Ｒｓ１遺伝子によって生成されるように、マウス細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンＲＰ２３−２１３Ｏ８を改変し、内因性Ｒｓ１遺伝子のエクソン５における点変異（ＣＧＣからＴＧＣ）を導入した（図８）。特に、上述のＲ１４１Ｃ点変異を含有する合成エクソン５は、イントロン４（１０ｂｐ）および５（２９ｂｐ）の追加的欠失とともに、野生型エクソン５の代わりに挿入され、それらは陽性クローンのスクリーニングを促進するために含まれた（図９）。デノボＤＮＡ合成（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）によって作製された合成断片。変異型エクソン５および周囲のイントロン配列（５’および３’）を含む合成断片は、プラスミド骨格内に含まれ、アンピシリンで選択されると細菌内で増殖された。ハイグロマイシン耐性遺伝子を含むカセット（ｌｏｘＰ−ｍＰｒｍ１−Ｃｒｅｉ−ｐＡ−ｈＵｂ１−ｅｍ７−Ｈｙｇｒｏ−ｐＡ−ｌｏｘＰを使用して、５，０３２ｂｐ）を合成断片に結合し、制限酵素を用いて相同アームを付加し、ＲＰ２３−２１３Ｏ８ＢＡＣとの相同組換え用の標的化ベクターを生成した（図８）。次いで、得られた改変ＲＰ２３−２１３Ｏ８  ＢＡＣクローンをＥＳ細胞内に電気穿孔した（以下を参照）。Ｒｓ１Ｒ１４１Ｃ−ＳＤＣ標的化ベクターは、未分化細胞においてリコンビナーゼが発現されるよう発生的に制御されたマウスプロタミン１プロモーターに動作可能に連結されたＣｒｅリコンビナーゼコード配列を含有した（図８、また米国特許第８，６９７，８５１号、第８，５１８，３９２号、および第８，３５４，３８９号も参照のこと。それらすべて参照により本明細書に援用される）。相同組換えに伴い、合成変異型Ｒｓ１エクソン５は、内因性マウスＲｓ１遺伝子座のエクソン５の場所に挿入され、および周辺のイントロン（すなわち、イントロン４および５）の小規模な欠失は、標的化ベクター中に含まれる配列によって作製される。薬剤選択カセットは発生依存性の様式で除去される、すなわち、その生殖系細胞に上述の変異型Ｒｓ１遺伝子を含むマウスから派生した子孫は、発生中に分化細胞から選択マーカーを脱落させる（図１０、また米国特許第８，６９７，８５１号、第８，５１８，３９２号、および第８，３５４，３８９号も参照のこと。これらすべては参照により本明細書に援用される）。周辺のエクソン、イントロン及び非翻訳領域（ＵＴＲ）を含有する内因性ＤＮＡは、突然変異および選択カセットにより変更されなかった。標的化ベクターの配列解析により、変異型Ｒｓ１遺伝子のすべてのエクソン、イントロン、スプライシングシグナル、およびオープンリーディングフレームが確認された。
【０１７４】
標的化ベクターのそれぞれの構築は、ポリメラーゼ連鎖反応および配列解析によって確認され、次いでマウス胚性幹（ＥＳ）細胞を電気穿孔してヌルおよび変異型Ｒｓ１遺伝子を含む改変ＥＳ細胞を生成するために使用した。電気穿孔に使用されたマウスＥＳ細胞は、ハイブリッド骨格からのものであった（５０％  １２９／Ｓ６／ＳｖＥｖ／Ｔａｃ、５０％  Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ；Ａｕｅｒｂａｃｈ、Ｗ．ら（２０００）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９（５）：１０２４−８、１０３０、１０３２）。電気穿孔の１０日後、薬剤抵抗性クローンを採取し、内因性  Ｒｓ１遺伝子内へのｌａｃＺレポーター遺伝子または点変異の適切な導入を検出するプライマー／プローブのセットを使用し、従前に記載されるように（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、上記；Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ，Ｄ．ら、２０１０，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７６：２９５−３０７）、正しい標的化に関しＴＡＱＭＡＮ（登録商標）および核型解析によるスクリーニングを行った（表１および図３、図６、および図９）。陽性ＥＳ細胞クローンは、シーケンシングにより確認された。
【０１７５】
次いで、陽性ＥＳ細胞クローは、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法（たとえば、米国特許第７，２９４，７５４号、ＤｅＣｈｉａｒａ，Ｔ．Ｍ．ら、２０１０，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．４７６：２８５−９４；ＤｅＣｈｉａｒａ，Ｔ．Ｍ．，２００９，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５３０：３１１−２４；Ｐｏｕｅｙｍｉｒｏｕら、２００７，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５：９１−９を参照のこと）を使用して、メスマウスに移植するために使用した。その標的とされたＥＳ細胞は、非小型化８細胞期のＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ胚に注入され、ヌルまたは変異型Ｒｓ１遺伝子に関しヘテロ接合性で、健常で、完全にＥＳ細胞由来であるＦ０世代のマウスが作製された。Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス系統は突然変異（Ｃｒｂ１ｒｄ８）を含むことが報告されており、そのことが網膜変性の形成動物モデルでのそれらの使用を複雑にする（例えば、Ｍａｔｔａｐａｌｌｉｌ、Ｍ．Ｊ．ら、２０１２、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５３（６）：２９２１−７；Ｍｅｈａｌｏｗ、Ａ．Ｋ．ら、２００３、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２：２１７９−８９を参照）。この突然変異は、Ｆ０世代ヘテロ接合性オスをＣ５７Ｂｌ６／ＮＴａｃＣｒｂｓ１メスと交配することによって補正され、この突然変異による起こりうるあらゆる複雑さを回避した。その後、これらの繁殖から得られたＦ１ヘテロ接合体を相互交配させ、表現型解析のためのＦ２世代ホモ接合体および野生型マウスを産生した。
【０１７６】
上述の操作されたＲｓ１マウス系統の作成によって、各操作されたＲｓ１遺伝子座に一意のヌクレオチド接合部が生成された。ヌル対立遺伝子に対し、上流接合部を越えるヌクレオチド配列は、以下を含み、それらは内因性マウスＲｓ１５’配列と、マウスＲｓ１ＡＴＧコドン（大文字で、カッコで示されたＡＴＧコドンとともに括弧内に含まれた）を示し、ｌａｃＺコード配列（小文字）と隣接する。（ＧＣＴＣＴＣＣＡＣＴ  ＴＣＡＣＴＴＡＧＡＴ  ＣＴＴＧＣＴＧＴＧＡ  ＣＣＡＡＧＧＡＣＡＡ  ＧＧＡＧＡＡＡ［ＡＴＧ］）ｇｇｔａｃｃｇａｔｔ  ｔａａａｔｇａｔｃｃ  ａｇｔｇｇｔｃｃｔｇ  ｃａｇａｇｇａｇａｇ  ａｔｔｇｇｇａｇａａ（配列番号３３）。下流接合点を越えるヌクレオチド配列は以下のものを含み、これはエクソン３の最後の６つのヌクレオチドとマウスＲｓ１遺伝子のイントロン４の始まり（大文字で括弧内に含まれる）とに隣接しているカセット配列（小文字で、ＮｈｅＩ部分が付随しカッコで示す）を示す。ｃａｇｃｃｃｃｔａｇ  ａｔａａｃｔｔｃｇｔ  ａｔａａｔｇｔａｔｇ  ｃｔａｔａｃｇａａｇ  ｔｔａｔ［ｇｃｔａｇｃ］（ＴＴＣＣＡＧＧＴＧＡ  ＧＴＧＧＣＴＣＡＡＣ  ＧＣＣＣＴＡＧＣＡＴ  ＴＣＣＴＣＣＴＴＣＣ  ＡＡＣＴＣＴＴＡＡＴ）（配列番号３４）。選択カセットのリコンビナーゼ介在除去後の下流接合点を越えるヌクレオチド配列は以下を含み、これは、マウスＲｓ１配列（大文字で括弧内に含まれる）と隣接している残りのｌａｃＺ配列（小文字で、ＩＣｅｕ−Ｉ、ｌｏｘＰおよびＮｈｅＩ部位が付随しカッコによって示される）を示す。
【０１７７】
【化１】
2020508073.tif 000008
【０１７８】
Ｃ５９Ｓ対立遺伝子に対し、上流接合部を越えるヌクレオチド配列は、以下を含み、それらは、挿入点でカセット配列（小文字であり、カッコ内のＸｈｏＩ部位と、太字体のｌｏｘＰ部位とを付随）と隣接する内因性マウスＲｓ１エクソン３および周囲のイントロン配列（大文字で、カッコで示されたエクソン３と太字体の変異型コドンとともに以下の括弧内に含有される）を示す。
【０１７９】
【化２】
2020508073.tif 000009
【０１８０】
下流接合部を越えるヌクレオチド配列は、以下を含み、それらは、挿入点の下流のマウスＲｓ１イントロン３配列（以下の括弧内に含まれる大文字）に隣接するカセット配列（小文字で示され、両方ともカッコ内のＩ−ＣｅｕＩとＮｈｅＩ部位、および太字のｌｏｘＰ部位が付随）を示す。
【０１８１】
【化３】
2020508073.tif 000010
【０１８２】
選択カセットのリコンビナーゼ介在除去後の挿入点を越えるヌクレオチド配列は以下を含み、それらは残りのカセット配列（小文字で以下の括弧内に含まれ、カッコ内のＸｈｏＩ、Ｉ−ＣｅｕＩおよびＮｈｅＩ部位と、太字のｌｏｘＰ部位が付随）と並置されたマウスＲｓ１エクソン３配列および残りのイントロン３配列（大文字でカッコで示されたエクソン３が付随）を示す。
【０１８３】
【化４】
2020508073.tif 000011
【０１８４】
Ｒ１４１Ｃ対立遺伝子に対し、上流接合部を越えるヌクレオチド配列は、以下を含み、それらは、挿入点でカセット配列（小文字であり、カッコ内のＸｈｏＩ部位と、太字体のｌｏｘＰ部位とを付随）と隣接する内因性マウスＲｓ１エクソン５および周囲のイントロン配列（大文字で、カッコ内のエクソン５と太字体の変異型コドンとともに以下の括弧内に含有される）を示す。
【０１８５】
【化５】
2020508073.tif 000012
【０１８６】
下流接合部を越えるヌクレオチド配列は、以下を含み、それらは、挿入点の下流のマウスＲｓ１イントロン５配列（以下の括弧内に含まれる大文字）に隣接するカセット配列（小文字で示され、両方ともカッコ内のＩ−ＣｅｕＩとＮｈｅＩ部位、および太字のｌｏｘＰ部位が付随）を示す。
【０１８７】
【化６】
2020508073.tif 000013
【０１８８】
選択カセットのリコンビナーゼ介在除去後の挿入点を越えるヌクレオチド配列（イントロン５に７８ｂｐ残留）は以下を含み、それらは残りのカセット配列（小文字で括弧内に含まれる、イントロン５に残ったｌｏｘＰおよびクローニング部位［７８ｂｐ］；カッコ内のＸｈｏＩ、Ｉ−ＣｅｕＩおよびＮｈｅＩ部位、太字体のｌｏｘＰ部位）とともにマウスＲｓ１配列（大文字でイントロン４、エクソン５およびイントロン５）を示す。
【０１８９】
【化７】
2020508073.tif 000014
【０１９０】
まとめると、本実施例は、そのゲノムが、操作されたＲｓ１遺伝子座を含む、三つの齧歯類（例えば、マウス）系統の産生を図示したものである。そのような操作されたＲｓ１齧歯類系統は、網膜分離症の生物学的機構および分子学的機構の解明のための、およびこのような疾患を効果的に治療または改善するための治療薬の開発のためのインビボシステムを提供する。
【０１９１】
【表４】
2020508073.tif 000015
【０１９２】
実施例２．操作されたＲｓ１齧歯類系統の特徴付け
本実施例では、実施例１に従って作製された操作されたＲｓ１齧歯類系統の特徴付けを記載する。特に、本実施例は、これらの操作されたマウスの網膜内のＲＳ１タンパク質の局在化および分布を示す。網膜アーキテクチャもまたすべての操作されたＲｓ１系統について記載されている。
【０１９３】
ＬａｃＺ発現プロファイリング  ＣＯ２吸入によってマウスを安楽死させた。眼は、除核され、ＰＢＳ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）中で３時間、４℃で４％のパラホルムアルデヒドによって固定された。１ｘＰＢＳ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で３回洗浄した後、眼を解剖顕微鏡下で解剖した。前部部分およびレンズが取り外された；残りの眼（眼杯）を、ＨｉｓｔｏＭａｒｋ  Ｘ−Ｇａｌ  基材Ｓｅｔ（ＫＰＬ）で、２日間３７℃で穏やかに回転して染色した。染色後、眼杯を１×ＰＢＳで完全に洗浄し、次いで３０％のスクロースに一晩移した。眼杯をＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（登録商標）Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物（ＶＷＲ）に包埋し、ドライアイスで凍結させた。Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ（登録商標）Ｐｌｕｓ  マイクロスライドで、２０ミクロンのクリオスタット切片を調製した。切片を室温で３０分間乾燥し、次いで１ｘＰＢＳで３回洗浄し、Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物を取り除き、ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｍｏｕｎｔａｎｔ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて封入処理した。オスマウスからの代表的な結果を図１１Ａに記載する。
【０１９４】
Ｒｓ１  ｍＲＮＡ発現  実施例１に記載された、操作されたＲｓ１マウス系統のＲｓ１ｍＲＮＡの発現パターンは、製造業者の説明書（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）に従って、ＲＮＡＳＣＯＰＥ（登録商標）を使用してｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって決定した。簡潔に述べると、ホルマリンまたは４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）固定およびパラフィンまたはＯ．Ｃ．Ｔ．に包埋されたマウスの眼杯を５〜１０μｍの切片に切断し、ＳＵＰＥＲＦＲＯＳＴ（登録商標）Ｐｌｕｓガラススライド上に取り付けた。手順は、室温で１０分の前処理（Ｐｒｅｔｒｅａｔ）１（ＡＣＤ、３２００３７）で始まった、その後は、前処理（Ｐｒｅｔｒｅａｔ）２（ＡＣＤ，３２００４３）でＯｓｔｅｒスチーマー（ＩＨＣ  Ｗｏｒｌｄ、ＬＬＣ、モデル  ５７０９）で２０分間の煮沸、および４０℃で３０分間、ＨｙＢｅＺオーブン（ＡＣＤ、３１００１０）での前処理（ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ）３（ＡＣＤ、３２００３７）。染色体ＤＮＡでプローブハイブリダイゼーションからの潜在的なバックグラウンドを減少させるために、追加的なＤＮａｓｅ処理工程が含まれた。前処理３の後、スライドを水で３回洗浄し、ＤＮａｓｅ  Ｉ（１ｘ  ＤＮａｓｅ  Ｉ緩衝液中５０ｕ／ｍｌ、ＡＭ２２２４、Ａｍｂｉｏｎ）の溶液を、４０℃で３０分間のインキュベーションのために眼組織に加えた。その後、スライドを水で５回洗浄し、ＲＮＡＳＣＯＰＥ（登録商標）プローブで４０℃で２時間ハイブリダイズし、製造業者のアッセイプロトコルの残りの部分が増幅１から増幅６まで実施された（ＡＣＤ、３２２３６０）。スライドをＲＮＡＳＣＯＰＥ（登録商標）洗浄緩衝液によって各ステップで２回（室温で２分ずつ）洗浄した（ＡＣＤ、３１００９１）。増幅された工程の後、信号は、光がない場合で室温で１０分間のインキュベーション赤色の作動溶液（赤色Ｂと赤色Ａの比率が１：６０）によって検出され、その後、水中のスライドを数回洗浄し、顕微鏡下で表示した。いくつかの実験では、ＩＨＣ技術が行われ、蛍光信号を視覚化し、オープンフィールドニコンＥｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ−Ｅ顕微鏡を使用して捕捉した。オスマウスからの代表的な結果を図１１Ｂに記載する。
【０１９５】
ＲＳ１タンパク質発現  野生型および操作されたＲｓ１齧歯類の網膜の様々な層のタンパク質発現レベルは、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡアッセイによって決定された。オスマウスからの代表的な結果を図１１Ｃおよび図１２Ａ〜図１２Ｄに記載する。メス型ホモ接合性ＫＯ（Ｒｓ１−／−）およびＲｓ１ヘテロ接合性ＫＯ（Ｒｓ１−／＋）系統は、図１２Ｅに記載する。
【０１９６】
免疫組織化学（ＩＨＣ）  簡潔に述べると、動物はＣＯ２吸入によって安楽死させた。眼は、除核され、１ｘＰＢＳ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）中の４％のＰＦＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）によって、３時間、４℃で固定された。１ｘＰＢＳで３回洗浄した後、眼を解剖顕微鏡下で解剖した。前部セグメントおよびレンズを取り外し、残りの眼（眼杯）を４℃で一晩、３０％のスクロース中でインキュベートした。眼杯をＴＩＳＳＵＥ−ＴＥＫ（登録商標）Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物（ＶＷＲ）に包埋し、ドライアイスで急速凍結させた。免疫蛍光染色用に使用されるＳＵＰＥＲＦＲＯＳＴ（登録商標）Ｐｌｕｓ  マイクロスライドで、１０ミクロンのクリオスタット切片を調製した。スライド上の切片は、リキッドブロッカースーパーパップペン（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で取り囲まれ、および室温で３０分間にわたり空気乾燥された。ブロッキング溶液を、５％正常ヤギ血清（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓ社）、１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）および０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）として１ｘＰＢＳ中で調製した。洗浄溶液を０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（アムレスコ）として１ｘＰＢＳ中で調製した。スライドを黒い蓋付きの染色容器に配置し、１ｘＰＢＳで３回洗浄して、Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物を除去した。ブロッキング溶液をスライドに加え、室温で１時間維持した。ブロッキング溶液を除去した後、一次抗体をブロッキング溶液中で希釈し、４℃で一晩切片に適用した。第２の日に、スライドを洗浄溶液で３回洗浄した。フルオロフォア結合二次抗体を１×ＰＢＳ中で１：１０００で希釈し、室温（光退色を避けるために暗い状態で）で１時間、切片上で適用した。スライドを１ｘＰＢＳで３回洗浄し、ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｍｏｕｎｔａｎｔ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて封入処置した。
【０１９７】
ＥＬＩＳＡ  簡潔に述べると、解剖顕微鏡下でマウス網膜を単離し、オムニホモジナイザーを有する金属ビードチューブでカクテルプロテアーゼ阻害剤を用いて、網膜当たり１００μｌのＲＩＰＡ緩衝液中で均質化した。タンパク質濃度をＢＣＡキットで決定し、次いで、使用するまで−８０℃に保存した（ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット）。ＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ）は、３部のＲＳ１標準タンパク質（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社、０〜４０ｎｇ／ｍｌ）および総網膜タンパク質試料（ＰＢＳ中の１：２０００希釈）で４℃で一晩被覆された。Ｔ−ＴＢＳ溶液（Ｔ−ＴＢＳ緩衝液、ＴＢＳ溶液中０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて３回洗浄した後、室温で１時間、ブロッキング緩衝液（ＴＢＳ中、１％ＢＳＡ、５％ヤギ血清）でプレートをブロッキングした。３回洗浄した後、抗ＲＳ１ポリクローナル抗体（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社米国、ブロッキング緩衝液中の１：４０００）をプレートに加え、室温で２時間インキュベートした後、ビオチン結合ヤギ抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ社、１：５０００）およびＳｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ、１：２００）を加え、最終的には基質作用溶液（Ｒ＆Ｄ  システムズ社）を光が無い状態で添加した。反応は２Ｎ  ＨＣｌで停止した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓシステム（モレキュラーデバイス社）で光学的密度（ＯＤ）を記録した。
【０１９８】
ウェスタンブロット  １０〜２０μｇの総網膜タンパク質を、タンパク質分離の４％ＳＤＳを含む試料緩衝液（Ｎｕｐａｇｅ  ＬＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ）中の４％〜１２％のビス−トリスゲルにロードし、次いで、ニトロセルロース膜（０．４５  μｍ  の空孔サイズ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移し、その後、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ  Ｔ２０（ＴＢＳ、Ｔｈｅｒｍｏ）で、室温で１時間、ブロッキングした。ブロットを抗ＲＳ１抗体（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ社米国、１：４０００）と共に室温で２時間、または４℃で一晩インキュベートした。抗ＲＳ１抗体を用いたインキュベーション後、ＨＲＰコンジュゲート抗マウスポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）を、室温で１時間、１：５０００で加えた。タンパク質バンドは、Ｃ−Ｄｏｇｉｔ  ブロットスキャナー  （Ｌｉ−Ｃｏｒ社）によって、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して視覚化し、撮像した。
【０１９９】
組織学  簡潔に述べると、動物はＣＯ２吸入によって安楽死させた。眼は除核され、ダビッドソン固定液（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）によって室温で１時間固定され、組織処理包埋カセット（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ  Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ）（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に移動し、室温で５分間、水道水で洗浄した。カセットを、リン酸緩衝液（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）中に１０％中性緩衝ホルマリンで固定した。眼はエタノールの段階希釈、キシレンの三つの交換、および包埋のためのパラフィンの二つの交換を通して処理された。５ミクロンのパラフィン切片をＳＵＰＥＲＦＲＯＳＴ（登録商標）Ｐｌｕｓ  Ｍｉｃｒｏスライド（ＶＷＲ）上で調製し、製造業者の説明書に従ってヘマトキシリンおよびエオシンで染色した（ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色（退行性）リッカケミカル社）。オスマウスからの代表的な結果を図１３Ａ〜図１３Ｂに記載する。
【０２００】
まとめると、本実施例は、Ｘ連鎖性網膜分離症に関連する疾患表現型の典型的な病理学的特徴が、実施例１に従って作製された操作されたＲｓ１齧歯類系統で再現されたことを示している。したがって、こうした操作された齧歯類系統は、治療法（例えば、実験的遺伝子療法）の評価および開発に有用である。
【０２０１】
実施例３．操作されたＲｓ１齧歯類系統の機能的および形態学的分析
本実施例は、実施例１に従って作製された操作されたＲｓ１齧歯類系統の網膜表現型の特徴付けを説明する。特に、実施例１で作製されたヌルおよび変異型Ｒｓ１齧歯類系統での外側網膜機能は、暗順応（ＤＡ−）および明順応（ＬＡ−）全視野網膜電図（ＥＲＧ）によって評価された。網膜アーキテクチャも光干渉断層撮影（ＯＣＴ）によって評価された。オスマウスからの代表的な結果を、図１３Ｃおよび図１４Ａ〜図１４Ｃに記載する。メス型ホモ接合性ＫＯ（Ｒｓ１−／−）およびヘテロ接合性ＫＯ（Ｒｓ１−／＋）系統の代表的な結果は、図１３Ｄおよび図１４Ｄに記載する。
【０２０２】
光干渉断層撮影（ＯＣＴ）  簡潔に述べると、生存中の眼科検査は、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ  ＨＲＡ＋ＯＣＴシステム（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ社、米国マサチューセッツ州フランクリン）を用いて指定時点で実施された。動物をケタミン（１２０ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）で腹腔内で麻酔した。瞳孔は０．５％トロピカミド点眼剤（ボシュロム、ニューヨーク州ローチェスター）を用いて拡張された。赤外眼底像を中心および選択された四半部（通常は鼻側上部と耳側上部）から取得し、網膜形態評価に対する一連の６１の横方向光学スキャンを得た。
【０２０３】
網膜電図写真（ＥＲＧ）  簡潔に述べると、動物は一晩暗順応させ、麻酔をかけた（ケタミン：８０ｍｇ／ｋｇ、キシラジン：１６ｍｇ／ｋｇ）、その後瞳孔拡張のために点眼薬を使用し（１％トロピカミド、２．５％塩酸フェニレフリン）、角膜表面（１％塩酸プロパラカイン）を麻酔した。１％のカルボキシメチルセルロースで湿らせたステンレス鋼電極を使用して、基準（ほお）および接地（尾部）として使用された針電極、およびＥＲＧを記録した。ストロボ発光刺激を暗順応した眼に提示し、少なくとも５分間の明順応の後、定常順応フィールドに重ね合わせた（２０ｃｄ／ｍ２）。刺激は−３．６〜２．１ｌｏｇ  ｃｄ／ｍ２の範囲であった。応答は増幅（０．０３〜１０００Ｈｚ）であり、ＬＫＣ（メリーランド州、ゲイザースバーグ）ＵＴＡＳ  Ｅ−３０００信号平均システムを使用して保存された。プレ刺激ベースラインからのフラッシュ開始後８ｍｓでのａ波の振幅を測定し、一方ｂ波の振幅は、ａ波からｂ波ピークまで測定した。
【０２０４】
まとめると、本実施例では、本明細書に記載される操作されたＲｓ１齧歯類系統に示される表現型は、Ｘ連鎖性網膜分離症を有する患者で観察されたものを反復することを示している。さらに、この表現型の変動性は、遺伝子突然変異の性質と相関する。本明細書は特に、網膜分離症の非ヒト動物モデルの作成を示す。光受容体細胞の喪失につながる、内側網膜内の嚢胞構造の発生ならびに、特徴的な減少したＥＲＧｂおよびａ波応答を含む、Ｘ連鎖性網膜分離症に一般的に関連付けられた病理学的および機能的特徴は、本明細書に記載の三つの操作されたＲｓ１齧歯類系統すべてにおいて再現された。そのような操作された系統は、網膜構造の細胞分解の根底にある分子機構のさらなる理解に有用であり、Ｘ連鎖性若年網膜分離症の治療のための遺伝子治療の開発のための適切なインビボシステムを提供する。
【０２０５】
実施例４．Ｒｓ１  ＫＯマウスの網膜の初期発症表現型。
本実施例は、実施例１に記載されたＲｓ１ノックアウト（ＫＯ）マウスの網膜の早期発症機能的および形態学的表現型を調査するために実施された実験について説明している。
【０２０６】
Ｒｓ１ＫＯマウスおよび野生型（ＷＴ）同腹仔の網膜を、生後１５日目〜２４日目（Ｐ１５、Ｐ１８、Ｐ２１およびＰ２４）の間で３日ごとに調べた（図１５）。外側網膜機能は、暗順応（ＤＡ−）および明順応（ＬＡ−）全視野ＥＲＧによって評価された。ナカ・ラシュトン方程式を用いてＥＲＧａ波およびｂ波振幅を分析し、最大応答（Ｒｍａｘ）および感度（Ｋ）パラメーターを生じさせた。網膜アーキテクチャは光干渉断層撮影（ＯＣＴ）によって評価された。
【０２０７】
オスマウスからの結果を図１６Ａ〜図１９Ｃに示す。暗順応および明順応ＥＲＧよって評価された外側網膜機能は、すべての時点でａ波に対するｂ波の減少を示し、および網膜分離症表現型は観察時間コース（Ｐ１５〜Ｐ２４）全体にわたって提示された。このＲｓ１ＫＯ網膜はまた早期光受容体欠陥、特にａ波振幅の減少、より広いＥＺ、およびより薄い外側網膜（ＯＮＬ＋ＰＲＬ）を示した。Ｒｓ１ＫＯ網膜においては、振幅および感度の両方に対するｂ波の関与はａ波より大きく、シナプスでのＲｓ１欠失の早期の影響を示している。
【０２０８】
これらの観察は、レチノスキシンが早期の網膜発達中に重要な役割を果たすことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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