(57)【要約】本発明は、タンパク質の調節かつ制御された発現のための組成物及び方法に関する。対象における抗がん免疫応答を誘導するための方法もまた、提供される。本発明は、免疫療法のための組成物及び方法を提供する。本組成物は、細胞または対象における抗がん免疫応答を誘導する調節可能なシステム及び薬剤に関する。調節可能なシステム及び薬剤は、少なくとも１つの刺激に応答する少なくとも１つのエフェクターモジュールを含むバイオサーキットシステムであり得る。バイオサーキットシステムは、不安定化ドメイン（ＤＤ）バイオサーキットシステム、二量化バイオサーキットシステム、受容体バイオサーキットシステム、及び細胞バイオサーキットシステムであり得るが、これらに限定されない。【選択図】図１９Ｈ
2020525536.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エフェクターモジュールを含む細胞または対象における免疫応答を誘導する組成物であって、前記エフェクターモジュールが、
（ａ）刺激応答エレメント（ＳＲＥ）と、
（ｂ）前記ＳＲＥに結合する、付加される、またはそれと関連する、少なくとも１つのペイロードと、を含み、
前記ＳＲＥが、不安定化ドメイン（ＤＤ）を含み、前記ＤＤが、全体的または部分的に、ｃＧＭＰ特異的３’，５’−環式ホスホジエステラーゼ（ｈＰＤＥ５；配列番号１）を含む、前記組成物。
【請求項２】
前記ペイロードが、前記ＳＲＥに付加される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＤＤが、ｈＰＤＥ５の触媒ドメイン（配列番号３）を含み、前記触媒ドメインが、ｈＰＤＥ５（配列番号１）のアミノ酸５３５〜８６０を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＤＤが、配列番号１の７３２位（Ｒ７３２）のアミノ酸の変異を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記７３２位（Ｒ７３２）のアミノ酸の変異が、Ｒ７３２Ｌ、Ｒ７３２Ａ、Ｒ７３２Ｇ、Ｒ７３２Ｖ、Ｒ７３２Ｉ、Ｒ７３２Ｐ、Ｒ７３２Ｆ、Ｒ７３２Ｗ、Ｒ７３２Ｙ、Ｒ７３２Ｈ、Ｒ７３２Ｓ、Ｒ７３２Ｔ、Ｒ７３２Ｄ、Ｒ７３２Ｅ、Ｒ７３２Ｑ、Ｒ７３２Ｎ、Ｒ７３２Ｍ、Ｒ７３２Ｃ、及びＲ７３２Ｋからなる群から選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＤＤが、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｌ）（配列番号１２）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ａ）（配列番号３８４）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｇ）（配列番号３８３）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｖ）（配列番号３８５）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｉ）（配列番号３８６）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｐ）（配列番号３８７）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｆ）（配列番号３８８）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｗ）（配列番号３８９）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｙ）（配列番号３９０）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｈ）（配列番号３９１）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｓ）（配列番号３９２）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｔ）（配列番号３９３）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｄ）（配列番号３９４）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｅ）（配列番号３９５）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｑ）（配列番号３９６）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｎ）（配列番号３９７）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｍ）（配列番号３９８）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｃ）（配列番号３９９）、及びｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｋ）（配列番号４００）からなる群から選択される、請求項４または請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記Ｒ７３２位のアミノ酸の変異が、Ｒ７３２Ｌであり、前記ＤＤが、配列番号１２のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
前記Ｒ７３２位のアミノ酸の変異が、Ｒ７３２Ａであり、前記ＤＤが、配列番号３８４のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項９】
前記Ｒ７３２位のアミノ酸の変異が、Ｒ７３２Ｇであり、前記ＤＤが、配列番号３８３を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＤＤが、Ｈ６５３Ａ、Ｆ７３６Ａ、Ｄ７６４Ａ、Ｄ７６４Ｎ、Ｙ６１２Ｆ、Ｙ６１２Ｗ、Ｙ６１２Ａ、Ｗ８５３Ｆ、Ｉ８２１Ａ、Ｙ８２９Ａ、Ｆ７８７Ａ、Ｄ６５６Ｌ、Ｙ７２８Ｌ、Ｍ６２５Ｉ、Ｅ５３５Ｄ、Ｅ５３６Ｇ、Ｑ５４１Ｒ、Ｋ５５５Ｒ、Ｆ５５９Ｌ、Ｆ５６１Ｌ、Ｆ５６４Ｌ、Ｆ５６４Ｓ、Ｋ５９１Ｅ、Ｎ５８７Ｓ、Ｋ６０４Ｅ、Ｋ６０８Ｅ、Ｎ６０９Ｈ、Ｋ６３０Ｒ、Ｋ６３３Ｅ、Ｎ６３６Ｓ、Ｎ６６１Ｓ、Ｙ６７６Ｄ、Ｙ６７６Ｎ、Ｃ６７７Ｒ、Ｈ６７８Ｒ、Ｄ６８７Ａ、Ｔ７１２Ｓ、Ｄ７２４Ｎ、Ｄ７２４Ｇ、Ｌ７３８Ｈ、Ｎ７４２Ｓ、Ａ７６２Ｓ、Ｄ７６４Ｇ、Ｄ７６４Ｖ、Ｓ７６６Ｆ、Ｋ７９５Ｅ、Ｌ７９７Ｆ、Ｉ７９９Ｔ、Ｔ８０２Ｐ、Ｓ８１５Ｃ、Ｍ８１６Ａ、Ｉ８２４Ｔ、Ｃ８３９Ｓ、Ｋ８５２Ｅ、Ｓ５６０Ｇ、Ｖ５８５Ａ、Ｉ５９９Ｖ、Ｉ６４８Ｖ、Ｓ６６３Ｐ、Ｌ６７５Ｐ、Ｔ７１１Ａ、Ｆ７４４Ｌ、Ｌ７４６Ｓ、Ｆ７５５Ｌ、Ｌ８０４Ｐ、Ｍ８１６Ｔ、及びＦ８４０Ｓからなる群から独立して選択される、１つ以上の変異をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＤＤが、前記変異Ｈ６５３Ａを含み、かつ前記ＤＤが、配列番号５０９のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ＤＤが、前記変異Ｆ７３６Ａを含み、かつ前記ＤＤが、配列番号２２７のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ＤＤが、前記変異Ｄ７６４Ａを含み、かつ前記ＤＤが、配列番号５１０のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＤＤが、前記変異Ｙ６１２Ｆを含み、かつ前記ＤＤが、配列番号５０６のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ＤＤが、前記変異Ｙ６１２Ｗを含み、かつ前記ＤＤが、配列番号５０７のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ＤＤが、前記変異Ｙ６１２Ａを含み、かつ前記ＤＤが、配列番号５０８のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ＤＤが、前記変異Ｄ７６４Ｎを含み、かつ前記ＤＤが、配列番号５０５のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ペイロードが、免疫治療剤である、請求項２に記載の組成物。
【請求項１９】
前記免疫治療剤が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びサイトカイン−サイトカイン受容体融合ポリペプチドから選択される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記免疫治療剤が、キメラ抗原受容体であり、
前記キメラ抗原受容体が、
（ａ）細胞外標的部分と、
（ｂ）ヒンジ及び膜貫通ドメインと、
（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、
（ｄ）任意に、１つ以上の共刺激ドメインと、を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ＣＡＲが、標準ＣＡＲ、スプリットＣＡＲ、オフスイッチＣＡＲ、オンスイッチＣＡＲ、第一世代ＣＡＲ、第二世代ＣＡＲ、第三世代ＣＡＲ、または第四世代ＣＡＲである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ＣＡＲ部分の細胞外標的が、がん細胞の表面上の標的分子に対する親和性を有するか、または前記標的分子に結合する、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ＣＡＲの前記細胞外標的部分が、ｓｃＦｖである、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記標的分子が、ＣＤ１９である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ＣＡＲの前記細胞外標的部分が、ＣＤ１９  ｓｃＦｖ（配列番号８２３３）である、請求項２３または請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ＣＡＲの前記ヒンジ及び前記膜貫通ドメインが、対合され、
前記対合されたヒンジ及び前記膜貫通ドメインが、
（ａ）ＣＤ８ａ、ＣＤ５、ＣＤ４、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１４８、ＤＡＰ１０、ＥｐｏＲＩ、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ、Ｈｅｒ２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＰＤ−１、またはＣＴＬＡ−４から選択される分子と、
（ｂ）Ｔ細胞受容体のＣＤ３イプシロン鎖と、
（ｃ）Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、またはゼータ鎖の膜貫通領域と、
（ｄ）ＩｇＧ１、ＩｇＤ、ＩｇＧ４、及びＩｇＧ４  Ｆｃ領域から選択される免疫グロブリンと、からなる群のメンバーのうちのいずれかに由来する、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２７】
前記ＣＡＲの前記対合されたヒンジ及び膜貫通ドメインが、ＣＤ８ａに由来し、前記対合されたヒンジ及び膜貫通ドメインが、配列番号８２３５のアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
（ａ）前記ＣＡＲの前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ、またはＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄからなる群から選択される細胞表面分子に由来するシグナル伝達ドメインであり、
（ｂ）前記共刺激ドメインが、存在し、かつ４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）２Ｂ４、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、及びＢ７−Ｈ３からなる群に由来する、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２９】
前記ＣＡＲの前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータに由来し、前記細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号８２３６のアミノ酸配列を含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ＣＡＲの前記共刺激ドメインが、存在し、前記共刺激ドメインが、４−１ＢＢに由来し、前記共刺激ドメインが、配列番号８２３７のアミノ酸配列を含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３１】
前記キメラ抗原受容体が、シグナル配列をさらに含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記シグナル配列が、ＣＤ８αに由来し、前記シグナル配列が、配列番号２７８のアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記免疫治療剤が、サイトカイン−サイトカイン受容体融合ポリペプチドである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項３４】
前記サイトカイン−サイトカイン受容体融合ポリペプチドが、ＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａ融合ポリペプチドを生成するために、ＩＬ１５Ｒａの全体またはその一部に融合したＩＬ１５の全体またはその一部を含む、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記サイトカイン−サイトカイン受容体融合ポリペプチドが、融合ポリペプチドを生成するために、配列番号８３２９のアミノ酸配列に融合した配列番号８３２４のアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記エフェクターモジュールが、配列番号８２８３、配列番号８２７１〜８２８２、及び配列番号８２８４からなる群から選択されるＤＤ−ＣＤ１９  ＣＡＲ融合ポリペプチドである、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３７】
前記エフェクターモジュールが、配列番号８３３８、配列番号８３３４〜８３３７、及び配列番号８３３９〜８３４３からなる群から選択されるＤＤ−ＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａ融合ポリペプチドである、請求項１〜１９及び請求項３３〜３５に記載の組成物。
【請求項３８】
前記ＳＲＥが、１つ以上の刺激物質に応答する、請求項１〜３７に記載の組成物。
【請求項３９】
前記刺激物質が、小分子であり、前記小分子が、タダラフィル、バルデナフィル、シルデナフィル、アバナフィル、ロデナフィル、ミロデナフィル、ウデナフィル、ベンザミデナフィル、ダサンタフィル、及びベミナフィルから選択される、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記小分子が、タダラフィルである、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
請求項１〜４０のいずれか１項に記載の組成物と、薬学的に許容される賦形剤と、を含む、薬学的組成物。
【請求項４２】
請求項１〜４０に記載の組成物のいずれか、または請求項４１に記載の薬学的組成物をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項４３】
請求項４２に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項４４】
請求項１〜４０のいずれかに記載の組成物、請求項４１に記載の薬学的組成物、請求項４２に記載のポリヌクレオチドを発現する、及び／または請求項４３に記載のベクターで形質導入もしくはトランスフェクトされる、養子細胞移入（ＡＣＴ）のための免疫細胞。
【請求項４５】
細胞における免疫応答を誘導する方法であって、
（ａ）前記細胞に、治療上有効量の請求項４１に記載の薬学的組成物のいずれかを投与することと、
（ｂ）前記免疫治療剤の発現を調節するために、前記細胞に、治療上有効量の刺激物質を投与することであって、前記刺激物質がリガンドであり、前記免疫治療剤が、前記刺激物質に応答して、前記細胞における免疫応答を誘導することができる、前記刺激物質を投与することと
を含む、前記方法。
【請求項４６】
対象における腫瘍負荷を軽減する方法であって、
（ａ）前記対象に、治療上有効量の請求項４４に記載の免疫細胞を投与することと、
（ｂ）前記免疫治療剤の発現を調節し、前記腫瘍負荷を軽減するように、前記対象に、治療上有効量のリガンドである刺激物質を投与することと、を含む、前記方法。
【請求項４７】
前記リガンドが、タダラフィルである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
タダラフィルが、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ（前記対象の体重）の範囲の用量で、前記対象に投与される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記タダラフィルが、１０ｍｇ／ｋｇ（前記対象の体重）の用量で、前記対象に投与される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記タダラフィルが、３０ｍｇ／ｋｇ（前記対象の体重）の用量で、前記対象に投与される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記タダラフィルが、１００ｍｇ／ｋｇ（前記対象の体重）の用量で、前記対象に投与される、請求項４８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年６月１２日に出願された「ＰＤＥ５  Ｔｕｎａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ」という表題の６２／５１８，０７８、２０１７年６月２３日に出願された「ＰＤＥ５  Ｔｕｎａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ」という表題の６２／５２３，８５０、２０１７年６月２３日に出願された「ＰＤＥ５  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」という表題の６２／５２３，８６２、２０１７年９月７日に出願された「ＰＤＥ５  Ｔｕｎａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ」という表題の６２／５５５，３１３の優先権を主張し、当該出願の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表への参照
本出願は、電子形式での配列表とともに出願されている。配列表は、サイズが１８，０７４，９７２バイトである、２０１８年６月１２日に作成された、２０９５＿１００３ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔという表題のファイルとして提供されている。配列表の電子形式での情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
【０００３】
本発明は、制御及び／または調節された治療システムの開発のための調節可能なバイオサーキットシステムに関する。特に、変異体ヒトｃＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ５型（ＰＤＥ５）に由来する不安定化ドメイン（ＤＤ）を含有する調節可能なバイオサーキットが、開示されている。本発明はまた、免疫療法のための組成物及び方法に関する。
【０００４】
バイオサーキットシステム、エフェクターモジュール、刺激応答エレメント（ＳＲＥ）、及び免疫治療剤のポリペプチド、それらをコードするポリヌクレオチド、がん免疫療法で用いるためのポリペプチド及び／またはポリヌクレオチドを含有するベクター及び細胞が、本発明に提供される。一実施形態において、本組成物は、タンパク質安定性を調節する不安定化ドメイン（ＤＤ）を含む。
【背景技術】
【０００５】
安全かつ有効な遺伝子療法は、トランスジェニック産物（例えば、タンパク質産物）の高度に調節された発現を必要とする。同様に、開発における遺伝子機能、細胞分化、及び他の生理学的活性の分析は、開発中でタンパク質の制御可能な発現を必要とする。しかしながら、現行の技術は、誘導された標的タンパク質または誘導の動態のレベルの滴定を許容しない。不適切な外因性及び／または内因性遺伝子制御は、エクスビボ及びインビボ遺伝子治療を含む多くの設定において重大な問題である。この同調性の欠如もまた、狭いまたは不確定の治療ウィンドウまたはより滴定され、制御される、もしくは一時的発現を必要とするものを有するタンパク質を安全に発現するのを困難にする。
【０００６】
調節されたタンパク質の発現または機能に対する１つのアプローチが、不安定化ドメイン（ＤＤ）の使用である。不安定化ドメインは、対象となるタンパク質（ＰＯＩ）などのペイロードに付加され得る低分子タンパク質ドメインである。ＤＤは、タンパク質が、細胞のユビキチン−プロテアソームシステムによって急速に分解されるように、ＤＤ結合リガンドの不在下で、結合した対象となるタンパク質（ＰＯＩ）を不安定にし、それによりタンパク質が、細胞のユビキチン−プロテアソームシステムによって急速に分解される（Ｓｔａｎｋｕｎａｓ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １２，１６１５−１６２４、Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ，Ｌ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｃｅｌｌ；１２６（５）：９９５−１００４、Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ，Ｌ．Ａ．，ａｎｄ  Ｗａｎｄｌｅｓｓ，Ｔ．Ｊ．（２００６）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３，１１−２１における総説、Ｉｗａｍｏｔｏ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．１７（９）：９８１−８、Ｅｇｅｌｅｒ，Ｅ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｊ  ＢｉｏｌＣｈｅｍ．２８６（３６）：３１３２８−３６、及びＲａｋｈｉｔ  Ｒ，Ｎａｖａｒｒｏ  Ｒ，Ｗａｎｄｌｅｓｓ  ＴＪ（２０１４）Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．Ｓｅｐ  １８；２１（９）：１２３８−５２、Ｎａｖａｒｒｏ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２０１６）ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．１１（８）：２１０１−２１０４）。場合によっては、対象となるタンパク質は、完全に処理されず、ＤＤ結合リガンドの不在下では、分泌されない、または膜上に提示されない場合がある（Ｓｅｌｌｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２），ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００４３２９７、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。しかしながら、特定の小分子リガンドがリガンド結合パートナーとしてその意図されたＤＤに結合すると、不安定性が覆され、タンパク質機能が復元され、または場合によっては、処理が復元され、対象となるタンパク質が膜上に提示もしくは分泌される。このようなシステムは、本明細書では、バイオサーキットと称され、上記の正準なＤＤを含有するバイオサーキットがプロトタイプのモデルバイオサーキットである。
【０００７】
ＤＤを含有するものを含むバイオサーキットの改善が、遺伝子発現及び機能の同調可能な時間的制御を用いる新種の細胞及び遺伝子治療の基礎を形成し得る。このような新規の部分は、刺激物質から生じ、最終的にシグナルまたは結果をもたらすバイオサーキットを完成するために、エフェクターモジュールとの関連を示す刺激応答エレメント（ＳＲＥ）として本発明者らによって説明されている。ポリペプチドペイロードを適切にフォーマットするとき、及び特定の刺激物質、例えば、小分子によって活性化されるとき、バイオサーキットシステムは、安定化シグナルまたは不安定化シグナルを持続させることによって上方または下方のいずれかでトランス遺伝子及び／またはタンパク質レベルを調節するために使用することができる。このアプローチは、現在、誘導性プロモーターを介した最上位の転写調節に集中している、タンパク質の機能及び／または発現を調節する既存の方法を上回る多くの利点がある。
【０００８】
本発明は、新規のタンパク質ドメイン、具体的には、変異体ヒトｃＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ５型（ＰＤＥ５）に由来する不安定化ドメイン（ＤＤ）、特に、小分子依存性の安定性、このようなＤＤを含むバイオサーキットシステム及びエフェクターモジュールを示すヒトＰＤＥ５の触媒ドメインを提供する。それを使用したトランス遺伝子機能を同調するための方法もまた、提供される。
【０００９】
がん免疫療法は、腫瘍反応性免疫細胞、主にＴ細胞の殺腫瘍性機能を活性化することによってがん細胞を根絶することを目的とする。チェックポイント封鎖、養子細胞移入（ＡＣＴ）、及び抗腫瘍免疫エフェクター細胞を増大させることができるがんワクチンを含むがん免疫療法の戦略は、いくつかの腫瘍において目覚ましい結果をもたらしている。
【００１０】
宿主抗腫瘍免疫及びがん免疫療法の効果は、１）クローン除去による腫瘍抗原特異的なＴ細胞の低下、２）腫瘍内微小環境における先天性免疫細胞の活性化及び寛容原性抗原提示細胞の蓄積の不足、ならびに３）免疫抑制性の腫瘍内微小環境の形成、の３つの主な障害によって妨げられている。特に、固形腫瘍において、免疫療法レジメンの治療効果は、免疫抑制性の腫瘍内微小環境における有効な抗腫瘍応答の欠如により不十分なままである。腫瘍細胞は、しばしば、免疫寛容または抑制を誘導し、このような寛容は、事実の通りに外来腫瘍抗原が寛容であるため、必要とされる。このような寛容はまた、がんワクチン及び予め活性化された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の養子移入が、腫瘍内微小環境（ＴＭＥ）における阻害因子による抑制に供されるため、活性かつ有力である。
【００１１】
加えて、操作したＴ細胞の投与は、オン／オフターゲット毒性ならびにサイトカイン放出症候群をもたらし得る（Ｔｅｙ  Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１４，３：ｅ１７  １０．１０３８による総説）。
【００１２】
トランスジェニック免疫治療剤発現を始めるまたは中止することができる同調可能なスイッチの開発は、もし有害事象が起こった場合に必要とされる。例えば、養子細胞療法は、非常に長い、無期限の半減期を有し得る。毒性が進行性であり得るため、安全スイッチは、注入された細胞を除去するために求められている。高い柔軟性を有するトランスジェニックタンパク質レベル及び発現ウィンドウを同調し得るシステム及び方法は、治療的有用性を増強し、潜在的な副作用を軽減し得る。
疾患療法、特にがん免疫療法のための調節可能な治療剤を開発する目的で、本発明は、免疫治療剤の発現を制御するためにバイオサーキットシステムを提供する。バイオサーキットシステムは、刺激物質及び刺激物質に応答する少なくとも１つのエフェクターモジュールを含む。エフェクターモジュールは、ＳＲＥに作動可能に連結された刺激物質及び免疫治療剤と結合し、それらに応答する刺激応答エレメント（ＳＲＥ）を含み得る。一例では、ＳＲＥは、その特定のリガンドの不在下で不安定化されており、その特定のリガンドに結合することによって安定化され得る、不安定化ドメイン（ＤＤ）である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｓｔａｎｋｕｎａｓ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １２，１６１５−１６２４
【非特許文献２】Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ，Ｌ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｃｅｌｌ；１２６（５）：９９５−１００４
【非特許文献３】Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ，Ｌ．Ａ．，ａｎｄ  Ｗａｎｄｌｅｓｓ，Ｔ．Ｊ．（２００６）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３，１１−２１
【非特許文献４】Ｉｗａｍｏｔｏ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．１７（９）：９８１−８
【非特許文献５】Ｅｇｅｌｅｒ，Ｅ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｊ  ＢｉｏｌＣｈｅｍ．２８６（３６）：３１３２８−３６
【非特許文献６】Ｒａｋｈｉｔ  Ｒ，Ｎａｖａｒｒｏ  Ｒ，Ｗａｎｄｌｅｓｓ  ＴＪ（２０１４）Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．Ｓｅｐ  １８；２１（９）：１２３８−５２
【非特許文献７】Ｎａｖａｒｒｏ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２０１６）ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．１１（８）：２１０１−２１０４
【非特許文献８】Ｓｅｌｌｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２），ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００４３２９７
【非特許文献９】Ｔｅｙ  Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１４，３：ｅ１７  １０．１０３８
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、免疫療法のための組成物及び方法を提供する。本組成物は、細胞または対象における抗がん免疫応答を誘導する調節可能なシステム及び薬剤に関する。調節可能なシステム及び薬剤は、少なくとも１つの刺激に応答する少なくとも１つのエフェクターモジュールを含むバイオサーキットシステムであり得る。バイオサーキットシステムは、不安定化ドメイン（ＤＤ）バイオサーキットシステム、二量化バイオサーキットシステム、受容体バイオサーキットシステム、及び細胞バイオサーキットシステムであり得るが、これらに限定されない。これらのシステムは、２０１６年４月１１日に出願された共同所有の米国仮特許出願第６２／３２０，８６４号、２０１７年３月３日に出願された第６２／４６６，５９６号、及び国際特許公開第ＷＯ２０１７／１８０５８７号（当該出願の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）においてさらに教示されている。
【００１５】
本発明は、細胞または対象における誘導する免疫応答のための組成物を提供する。いくつかの実施形態において、本組成物は、刺激応答エレメント（ＳＲＥ）及び少なくとも１つのペイロードを含み得る。いくつかの実施形態において、ペイロードは、ＳＲＥに結合し、付加し、またはそれと関連し得る。ＳＲＥは、不安定化ドメイン（ＤＤ）を含み得る。いくつかの実施形態において、ＤＤは、全体的または部分的に、ｃＧＭＰ特異的３’，５’−環式ホスホジエステラーゼ（ｈＰＤＥ５；配列番号１）を含み得る。いくつかの実施形態において、ペイロードは、ＳＲＥに付加し得る。
【００１６】
いくつかの実施形態において、ＤＤは、ｈＰＤＥ５の触媒ドメイン（配列番号３）を含み得る。いくつかの態様において、触媒ドメインは、ｈＰＤＥ５（配列番号１）のアミノ酸５３５〜８６０を含み得る。いくつかの実施形態において、ＤＤは、配列番号１の７３２位（Ｒ７３２）のアミノ酸の変異を含み得る。Ｒ７３２位の変異は、Ｒ７３２Ｌ、Ｒ７３２Ａ、Ｒ７３２Ｇ、Ｒ７３２Ｖ、Ｒ７３２Ｉ、Ｒ７３２Ｐ、Ｒ７３２Ｆ、Ｒ７３２Ｗ、Ｒ７３２Ｙ、Ｒ７３２Ｈ、Ｒ７３２Ｓ、Ｒ７３２Ｔ、Ｒ７３２Ｄ、Ｒ７３２Ｅ、Ｒ７３２Ｑ、Ｒ７３２Ｎ、Ｒ７３２Ｍ、Ｒ７３２Ｃ、及びＲ７３２Ｋを含み得るが、これらに限定されない。
【００１７】
いくつかの態様において、ＤＤは、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｌ）（配列番号１２）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ａ）（配列番号３８４）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｇ）（配列番号３８３）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｖ）（配列番号３８５）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｉ）（配列番号３８６）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｐ）（配列番号３８７）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｆ）（配列番号３８８）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｗ）（配列番号３８９）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｙ）（配列番号３９０）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｈ）（配列番号３９１）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｓ）（配列番号３９２）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｔ）（配列番号３９３）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｄ）（配列番号３９４）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｅ）（配列番号３９５）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｑ）（配列番号３９６）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｎ）（配列番号３９７）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｍ）（配列番号３９８）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｃ）（配列番号３９９）、及びｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｋ）（配列番号４００）を含むが、これらに限定されない、群から選択され得る。
【００１８】
いくつかの実施形態において、Ｒ７３２位のアミノ酸の変異は、Ｒ７３２Ｌであり得る。一実施形態において、ＤＤは、配列番号１２のアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、Ｒ７３２位のアミノ酸の変異は、Ｒ７３２Ａであり得る。一実施形態において、ＤＤは、配列番号３８４のアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、Ｒ７３２位のアミノ酸の変異は、Ｒ７３２Ｇであり得る。一実施形態において、ＤＤは、配列番号３８３のアミノ酸配列を含み得る。
【００１９】
本発明のＤＤは、Ｈ６５３Ａ、Ｆ７３６Ａ、Ｄ７６４Ａ、Ｄ７６４Ｎ、Ｙ６１２Ｆ、Ｙ６１２Ｗ、Ｙ６１２Ａ、Ｗ８５３Ｆ、Ｉ８２１Ａ、Ｙ８２９Ａ、Ｆ７８７Ａ、Ｄ６５６Ｌ、Ｙ７２８Ｌ、Ｍ６２５Ｉ、Ｅ５３５Ｄ、Ｅ５３６Ｇ、Ｑ５４１Ｒ、Ｋ５５５Ｒ、Ｆ５５９Ｌ、Ｆ５６１Ｌ、Ｆ５６４Ｌ、Ｆ５６４Ｓ、Ｋ５９１Ｅ、Ｎ５８７Ｓ、Ｋ６０４Ｅ、Ｋ６０８Ｅ、Ｎ６０９Ｈ、Ｋ６３０Ｒ、Ｋ６３３Ｅ、Ｎ６３６Ｓ、Ｎ６６１Ｓ、Ｙ６７６Ｄ、Ｙ６７６Ｎ、Ｃ６７７Ｒ、Ｈ６７８Ｒ、Ｄ６８７Ａ、Ｔ７１２Ｓ、Ｄ７２４Ｎ、Ｄ７２４Ｇ、Ｌ７３８Ｈ、Ｎ７４２Ｓ、Ａ７６２Ｓ、Ｄ７６４Ｇ、Ｄ７６４Ｖ、Ｓ７６６Ｆ、Ｋ７９５Ｅ、Ｌ７９７Ｆ、Ｉ７９９Ｔ、Ｔ８０２Ｐ、Ｓ８１５Ｃ、Ｍ８１６Ａ、Ｉ８２４Ｔ、Ｃ８３９Ｓ、Ｋ８５２Ｅ、Ｓ５６０Ｇ、Ｖ５８５Ａ、Ｉ５９９Ｖ、Ｉ６４８Ｖ、Ｓ６６３Ｐ、Ｌ６７５Ｐ、Ｔ７１１Ａ、Ｆ７４４Ｌ、Ｌ７４６Ｓ、Ｆ７５５Ｌ、Ｌ８０４Ｐ、Ｍ８１６Ｔ、及びＦ８４０Ｓからなる群から独立して選択される１つ以上の変異をさらに含み得る。
【００２０】
一実施形態において、ＤＤは、変異Ｈ６５３Ａを含み得る。一実施形態において、ＤＤは、配列番号５０９のアミノ酸配列を含み得る。一実施形態において、ＤＤは、変異Ｆ７３６Ａを含み得る。一実施形態において、ＤＤは、配列番号２２７のアミノ酸配列を含み得る。一実施形態において、ＤＤは、変異Ｄ７６４Ａを含み得る。一実施形態において、ＤＤは、配列番号５１０を含み得る。一実施形態において、ＤＤは、変異Ｙ６１２Ｆを含み得る。一態様において、ＤＤは、配列番号５０６のアミノ酸配列を含み得る。一実施形態において、ＤＤは、Ｙ６１２Ｗ変異を含み得る。一態様において、ＤＤは、配列番号５０７のアミノ酸配列を含み得る。一実施形態において、ＤＤは、変異Ｙ６１２Ａを含み得る。一実施形態において、ＤＤは、配列番号５０８のアミノ酸配列を含み得る。一実施形態において、ＤＤは、変異Ｄ６４Ｎを含み得る。いくつかの態様において、ＤＤは、配列番号５０５のアミノ酸配列を含み得る。
【００２１】
いくつかの実施形態において、本発明のＳＲＥは、ペイロードに付加され得る。いくつかの態様において、ペイロードは、免疫治療剤であり得る。いくつかの態様において、免疫治療剤は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びサイトカイン−サイトカイン受容体融合ポリペプチドから選択され得る。
【００２２】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、細胞外標的部分、ヒンジ及び膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、ならびに任意に、１つ以上の共刺激ドメインを含み得る。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、標準ＣＡＲ、スプリットＣＡＲ、オフスイッチＣＡＲ、オンスイッチＣＡＲ、第一世代ＣＡＲ、第二世代ＣＡＲ、第三世代ＣＡＲ、または第四世代ＣＡＲであり得る。
【００２３】
ＣＡＲの細胞外標的部分は、がん細胞の表面上の標的分子への結合の親和性を有し得る。いくつかの態様において、ＣＡＲの細胞外標的部分は、ｓｃＦｖであり得る。一態様において、標的分子は、ＣＤ１９であり得る。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞外標的部分は、ＣＤ１９  ｓｃＦｖ（配列番号８２３３）である。いくつかの実施形態において、ＣＡＲのヒンジ及び膜貫通ドメインは、対合され得る。対合されたヒンジ及び膜貫通ドメインは、ＣＤ８ａ、ＣＤ５、ＣＤ４、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１４８、ＤＡＰ１０、ＥｐｏＲＩ、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ、Ｈｅｒ２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＰＤ−１、またはＣＴＬＡ−４に由来し得る。いくつかの実施形態において、対合されたドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、もしくはゼータ鎖の膜貫通領域、またはＩｇＧ１、ＩｇＤ、ＩｇＧ４、及びＩｇＧ４  Ｆｃ領域から選択される免疫グロブリン、またはＴ細胞受容体のＣＤ３イプシロン鎖に由来し得る。一実施形態において、ＣＡＲの対合されたヒンジ及び膜貫通ドメインは、ＣＤ８ａに由来し得る。一態様において、対合されたヒンジ及び膜貫通ドメインは、配列番号８２３５のアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲは、細胞内ドメインを含み得る。細胞内ドメインは、ＣＤ３ゼータ、またはＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄからなる群から選択される、細胞表面分子に由来し得る。いくつかの実施形態において、共刺激ドメインは、存在し得る。共刺激ドメインは、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）２Ｂ４、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、及びＢ７−Ｈ３に由来し得る。一態様において、細胞内ドメインは、ＣＤ３ゼータ配列番号８２３６に由来し得る。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、４−１ＢＢ（配列番号８２３７）に由来する共刺激ドメインを含み得る。いくつかの態様において、さらなるＣＡＲはまた、シグナル配列を含み得る。シグナル配列は、ＣＤ８αに由来し得る。いくつかの態様において、シグナル配列は、配列番号２７８のアミノ酸配列を含み得る。
【００２４】
いくつかの実施形態において、免疫治療剤は、サイトカイン−サイトカイン受容体融合ポリペプチドであり得る。サイトカイン−サイトカイン受容体融合ポリペプチドは、ＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａ融合ポリペプチドを生成するために、ＩＬ１５Ｒａの全体または一部に融合したＩＬ１５の全体または一部を含み得る。一実施形態において、サイトカイン−サイトカイン受容体融合ポリペプチドは、融合ポリペプチドを生成するために、配列番号８３２４のアミノ酸配列に融合した配列番号８３２４のアミノ酸配列を含み得る。
【００２５】
いくつかの実施形態において、本発明のエフェクターモジュールは、ＤＤ−ＣＤ１９  ＣＡＲ融合ポリペプチドであり得る。融合ポリペプチドは、配列番号８２８３、８２７１〜８２８２、または８２８４のアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、本発明のエフェクターモジュールは、ＤＤ−ＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａ融合ポリペプチド（配列番号８３３８、８３３４〜８３３７、または８３３９〜８３４３）であり得る。
【００２６】
いくつかの実施形態において、ＳＲＥは、１つ以上の刺激物質に応答し得る。刺激は、タダラフィル、バルデナフィル、シルデナフィル、アバナフィル、ロデナフィル、ミロデナフィル、ウデナフィル、ベンザミデナフィル、ダサンタフィル、及びベミナフィルなどであるが、これらに限定されない、小分子であり得る。一態様において、小分子は、タダラフィルであり得る。
【００２７】
本発明はまた、本明細書に記載の組成物及び薬学的に許容される賦形剤を含み得る薬学的組成物も提供する。
【００２８】
本発明はまた、本明細書に記載の組成物及び薬学的組成物をコードするポリヌクレオチドも提供する。
【００２９】
養子移入のための免疫細胞もまた、本明細書に提供される。免疫細胞は、本明細書に記載の組成物、薬学的組成物、ポリヌクレオチド、またはベクターを発現し得る。
【００３０】
本発明はまた、細胞における免疫応答を誘導する方法も提供する。このような方法は、免疫治療剤の発現を調節するために、細胞に、治療上有効量の薬学的組成物のうちのいずれかを投与することと、細胞に、治療上有効量の刺激物質を投与することと、を含み得る。いくつかの実施形態において、刺激物質は、リガンドであり得る。いくつかの態様において、免疫治療剤は、刺激物質に応答して、細胞における免疫応答を誘導可能であり得る。
【００３１】
本明細書に記載の組成物を使用して腫瘍負荷を軽減する方法もまた、提供される。このような方法は、対象に、治療上有効量の本明細書に記載の免疫細胞を投与することと、対象に、治療上有効量の刺激物質を投与することと、を含み得る。いくつかの実施形態において、刺激物質は、リガンドであり得る。いくつかの実施形態において、刺激物質は、免疫治療剤の発現を調節し、それによって腫瘍負荷を軽減することができ得る。いくつかの実施形態において、リガンドは、タダラフィルである。いくつかの態様において、タダラフィルは、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ（対象の体重の）範囲の用量で、対象に投与され得る。いくつかの態様において、タダラフィルは、１０ｍｇ／ｋｇ（対象の体重）の用量で、対象に投与され得る。いくつかの態様において、タダラフィルは、３０ｍｇ／ｋｇ（対象の体重）の用量で、対象に投与され得る。いくつかの態様において、タダラフィルは、１００ｍｇ／ｋｇ（対象の体重）の用量で、対象に投与され得る。
【００３２】
上述及び他の目的、特性、及び利点は、添付の図面に例示されるように、本発明の特定の実施形態の以下の図面から明らかであろう。図面は、必ずしも縮尺ではなく、むしろ本発明の様々な実施形態の原理を例示することに重点が置かれている。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明のバイオサーキットシステムの総括ダイヤグラムを示す。バイオサーキットは、刺激物質への応答は、シグナルまたは結果をもたらす場合、刺激物質及び刺激物質に応答する少なくとも１つのエフェクターモジュールを含む。エフェクターモジュールは、少なくとも１つの刺激応答エレメント（ＳＲＥ）及び１つのペイロードを含む。
【図２】ペイロードを運ぶ代表的なエフェクターモジュールを示す。シグナル配列（ＳＳ）、ＳＲＥ、及びペイロードは、切断部位がない（Ａ〜Ｆ）または切断部位がある（Ｇ〜Ｚ、及びＡＡ〜ＤＤ）様々な配置に位置し得るか、または配置され得る。任意のリンカーは、エフェクターモジュールの各成分間に挿入され得る。
【図３】切断部位がない２つのペイロードを運ぶ代表的なエフェクターモジュールを示す。２つのペイロードは、互いに直接連結され得るか、または分離され得る。
【図４】切断部位がある２つのペイロードを運ぶ代表的なエフェクターモジュールを示す。一実施形態において、ＳＳは、構築物のＮ末端で配置されるが、他の成分：ＳＲＥ、２つのペイロード及び切断部位は、異なる位置（Ａ〜Ｌ）に位置され得る。別の実施形態において、切断部位は、構築物（Ｍ〜Ｘ）のＮ末端で配置される。任意のリンカーは、エフェクターモジュールの各成分間に挿入され得る。
【図５】ＳＲＥが構築物（Ａ〜Ｌ）のＮ末端で配置されるが、ＳＳ、２つのペイロード及び切断部位が、任意の配置であり得る場合の、２つのペイロードを運ぶ本発明のエフェクターモジュールを示す。任意のリンカーは、エフェクターモジュールの各成分間に挿入され得る。
【図６】２つのペイロード（Ａ〜Ｆ）または２つのペイロードの１つ（Ｇ〜Ｘ）が、構築物（Ａ〜Ｌ）のＮ末端で配置されるが、ＳＳ、ＳＲＥ、及び切断部位が、任意の配置であり得る場合、２つのペイロードを運ぶ本発明のエフェクターモジュールを示す。任意のリンカーは、エフェクターモジュールの各成分間に挿入され得る。
【図７】バイオサーキットシステム内の刺激及びエフェクターモジュールの代表的な構造を示す。膜貫通エフェクターモジュールは、刺激がない（Ａ）またはＳＲＥに結合する膜結合刺激（Ｂ）によって活性化される。刺激物質への応答は、細胞内シグナル／ペイロードの切断を引き起こし、下流エフェクター／ペイロードを活性化する。
【図８】２つの異なるプレゼンター（例えば、異なる細胞）からの２つの結合刺激物質（Ａ及びＢ）が、単一のレシーバー（例えば、別の単一細胞）における２つの異なるエフェクターモジュールに同時に結合し、下流ペイロードへの二重シグナルを形成する、二重刺激物質−二重プレゼンターのバイオサーキットシステムを示す。
【図９】同じプレゼンター（例えば、単一細胞）からの２つの結合刺激物質（Ａ及びＢ）が、別の単一細胞における２つの異なるエフェクター分子に同時に結合し、二重シグナルを形成する、二重刺激物質−単一プレゼンターのバイオサーキットシステムを示す。
【図１０】単一刺激物質を架橋したレシーバーのバイオサーキットシステムを示す。この構造において、結合刺激物質（Ａ）は、架橋細胞におけるエフェクターモジュールに結合し、最終レシーバー（例えば、別の細胞）における別のエフェクターモジュールに対する刺激物質（Ｂ）であるペイロードを活性化するシグナルを生じる。
【図１１】単一レシーバーが、単一刺激物質によって連続的に活性化される、２つのエフェクターモジュールを含む、単一刺激物質−単一レシーバーのバイオサーキットシステムを示す。
【図１２】二重活性化を必要とするバイオサーキットシステムを示す。この実施形態において、ある刺激物質は、まず、膜貫通エフェクターモジュールに結合して、他の刺激物質によって活性化されるレシーバー細胞を準備しなければならない。レシーバーは、両方の刺激物質（Ｂ）を感知するときにのみ活性化する。
【図１３】ＳＲＥとして抗原結合ドメインと、ペイロードとしてシグナル伝達ドメイン（複数可）とを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）システムの標準エフェクターモジュールを示す。
【図１４】膜貫通エフェクターモジュールは、抗原を感知する抗原結合ドメイン及び第１のスイッチドメインを含み、細胞内モジュールは、第２のスイッチドメイン及びシグナル伝達ドメインを含む、調節可能なＣＡＲシステムの構造設計を示す。刺激物質（例えば、二量化小分子）は、第１及び第２のスイッチドメインを二量化し、活性化ＣＡＲシステムを組み立てることができる。
【図１５】エフェクターモジュールに組み込まれる１つ（Ａ）または２つ（Ｂ及びＣ）のＳＲＥを有する、ＣＡＲシステムの概略図を示す。
【図１６】二重刺激物質（例えば、抗原及び小分子）によってＴ細胞の活性化を制御するためのスプリットＣＡＲ設計を示す。（Ａ）は、ＴＣＲ及び共刺激受容体の二重の活性化を必要とする正常なＴ細胞の活性化を示す。一般のＣＡＲ設計（Ｂ）は、単一分子において、抗原認識ドメインを、ＴＣＲシグナル伝達モチーフ及び共刺激モチーフと組み合わせる。スプリットＣＡＲシステムは、一般のＣＡＲの成分を、２つの別々のエフェクターモジュールに分離して、ヘテロ二量化小分子（刺激物質）が存在するときに再び組み立てることができる。
【図１７】ＣＡＲ操作したＴ細胞の活性化の正及び負の調節を示す。第２の刺激物質の存在または不在は、Ｔ細胞の活性化を負に（Ａ）または正に（Ｂ）制御することができる。
【図１８】ＣＡＲ操作したＴ細胞のゲート活性化の概略図を示す。刺激物質（例えば、抗原）を有しない正常細胞（Ａ）、または膜貫通エフェクターモジュールに結合することができない抗原を有する正常細胞（Ｂ）、またはエフェクターモジュールを活性化し、第２のエフェクターを発現するようにレシーバーＴ細胞を準備する抗原のみを有する正常細胞（Ｃ）である場合、レシーバーＴ細胞が、不活性なままである。膜貫通エフェクターモジュール及びプライミングエフェクターに結合する両方の刺激物質（例えば、２つの抗原）が、プレゼンター細胞（例えば、がん細胞）に提示されると、Ｔ細胞は、活性化される（Ｄ）。
【図１９Ａ】ＣＡＲ構築物に関連する異なる体積のウイルスで形質導入される細胞で得られたＣＡＲ陽性細胞の割合を示す。
【図１９Ｂ】バルデナフィル処理によるＣＡＲ陽性細胞の割合を示す。
【図１９Ｃ】ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ再刺激によるＣＡＲの発現を示す。
【図１９Ｄ】ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ再刺激の存在または不在下で、異なる濃度のウイルスによるＣＡＲ陽性細胞の割合を示す。
【図１９Ｅ】シルデナフィル、バルデナフィル、及びタダラフィルに対するＣＤ１９  ＣＡＲ構築物の用量応答を示す。
【図１９Ｆ】異なるリガンドに対して及びリガンド処理の持続時間に応じて異なる、ＣＤ１９  ＣＡＲ構築物の用量応答を示す。
【図１９Ｇ】バルデナフィルの存在下で、エフェクター及び標的細胞の共培養の上清から得られたＩＬ２及びＩＦＮγレベルを示す。
【図１９Ｈ】タダラフィル処理によるＣＡＲ陽性細胞の割合を示す。
【図１９Ｉ】タダラフィルの存在下で、エフェクター及び標的細胞の共培養の上清から得られたＩＬ２及びＩＦＮγレベルを示す。
【図１９Ｊ】バルデナフィルの存在下で、Ｔ細胞を発現するＣＡＲによる標的細胞死滅を示す。
【図１９Ｋ】バルデナフィルの存在下で、Ｔ細胞を発現するＣＡＲで共培養した標的細胞の増殖を示す。
【図２０Ａ】タダラフィルの存在下で、マウスにおける全フラックスのＮａｌｍ６  ｌｕｃ細胞を示す。
【図２０Ｂ】指示された用量でリガンドの注入後に、マウスの血漿中のバルデナフィル及びタダラフィルの薬物動態を示す。
【図２０Ｃ】指示された用量でリガンドの注入後に、マウスの血漿中のバルデナフィル及びタダラフィルの薬物動態を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、以下の添付の説明に記載されている。本明細書に記載のものと同様または同等の任意の材料及び方法は、本発明の実践または試験において使用することができるが、好ましい材料及び方法及び材料をこれより説明する。本発明の他の特性、目的、及び利点は、説明から明白になるであろう。説明において、単数形はまた、文脈上例外が明記されていない限り、複数形も含む。特に定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。不一致の場合、本発明の説明が、制御するであろう。
【００３５】
Ｉ．序論
タンパク質調節
タンパク質レベルを条件付きで制御する能力は、遺伝子及び細胞療法において有力なツールである。遺伝子レベルにおけるタンパク質発現を制御する技術は、幅広く研究されている。Ｃｒｅ−Ｌｏｘ技術は、遺伝子を活性化または不活性化するのに有用なアプローチを提供する。組織または細胞特異的プロモーターは、対象となる遺伝子の空間的及び時間的発現を制御するために使用することができる。しかしながら、このシステムは、擾乱の不可逆的性質により適用において制限されている。対象となる遺伝子の転写は、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）誘導性システムなどのツールを使用して条件付きで調節され得る。あるいは、ｍＲＮＡの安定性は、ＲＮＡ干渉技術を使用して調節され得る。しかしながら、ＤＮＡまたはＲＮＡを標的化する方法は、遅効性かつ不可逆的であり、低効率を有する。
【００３６】
タンパク質レベルで活性の直接操作は、柔軟性、可逆性、及び速度において重要な利点を提供する。細胞の天然分解システムを直接引き起こす戦略が、開発されている。Ｓｚｏｓｔａｋらは、小ペプチド配列が、タンパク質安定性を調節するために、対象となるタンパク質のＮ末端に融合し得る（Ｐａｒｋ，Ｅ−Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９２，８９：１２４９−１２５２）。Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙらは、非許容温度でジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の半減期を著しく低下させる温度感受性ペプチド配列を単離した（Ｄｏｈｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９４，２６３：１２７３−１２７６）。これらの変異体は、酵母菌におけるタンパク質機能を試験するために幅広く使用されている（Ｌａｂｉｂ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００，２８８：１６４３−１６４６及びＫａｎｅｍａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００３，４２３：７２０−７２４）。
【００３７】
その後、ＦＲＢドメイン（ＦＲＢ＊）の不安定な三重変異体に融合したＧＳＫ−３βキナーゼの調節のためにラパマイシン誘導体を用いる可逆的システムが、開発された。ラパマイシン誘導体は、ＦＲＢ＊−ＧＳＫ−３β及び内因性ＦＫＢＰ１２の二量化を誘導し、ＦＲＢ＊融合を安定化し、そのため、融合キナーゼの機能を回復する。（Ｓｔａｎｋｕｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２００３；１２：１６１５−１６２４及びＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００７；  ４４６：７９−８２）。
【００３８】
ＦＲＢ＊ドメインシステムにおいて構築して、Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉらは、高親和性リガンドの不在下で不安定であるように操作されたＦＫＢＰ１２タンパク質の変異体、Ｓｈｉｅｌｄ−１を使用して細胞透過性リガンドシステムを開発した。（Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２００６；  １２６：９９５−１００４）。それらは、これらの不安定なドメイン、不安定化ドメイン（ＤＤ）と呼ばれる。
【００３９】
ＦＫＢＰ／ｓｈｉｅｌｄ−１調節システムは、標的タンパク質を制御するためにいくつかの研究において首尾よく使用されている。例えば、Ｄｅｔｔｗｉｅｒらは、ＮＡＤＰＨ  Ｐ４５０酸化還元酵素（ＰＯＲ）の発現を調節するようにＦＫＢＰを融合した（Ｄｅｔｔｗｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１４，９（１１）：ｅ１１３５４０）。
【００４０】
ＦＫＢＰ  ＤＤ−ｓｈｉｅｌｄシステムは、対象となるタンパク質の活性を調査するために、細胞株、トランスジェニックマウス、ｐｒｏｔｏｚｏａｎ  Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、ｆｌａｔｗｏｒｍ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ、ｍｅｄａｋａ、及びトランスジェニック異種移植片において使用されている（Ｍａｙｎａｒｄ−Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  ＢｉｏｌＣｈｅｍ．２００７，２８２（３４）：２４８６６−２４８７２、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．２０１４，４４（１０）：７２９−７３５、Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１３，８（８）：ｅ７２３９３）、Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００８，１４（１０）：１１２３−１１２７、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｗｏｌｆｇａｎｇ，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０１１，１９（３）：３９１−３９８、及びＦｒｏｓｃｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１５，１０（７）：ｅ０１３１２５２）、ｉＰＳＣ再プログラミングにおいては（Ｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ．，２０１４，２（５）：７２１−７３３）。
【００４１】
加えて、不安定化ドメインは、不安定化ドメインで融合した標的遺伝子の条件付きのノックダウンまたはノックアウトのために使用されている。Ｐａｒｋらは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性相同的組換えならびに耐性カセット及びＤＤタグ付きＴＣＯＦ１配列をコードするドナー鋳型によって、このゲノム工学を達成した（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１４，９（４）：ｅ９５１０１）。
【００４２】
つい最近では、バイオセンサーとして有用なタンパク質スイッチ、ならびに新規のキメラ抗原受容体及び他の小分子安定化フレームワークが、開示されている（Ａｎ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，２０１５，１０（１２）：ｅ０１４５７８３．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１４５７８３、Ｎｉｃｈｏｌｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２０１６，ｖｏｌ．２９  ｎｏ．２，ｐｐ．７７−８５、Ｎａｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０１６，４７０：４１１ｅ４１６）、Ｓｔｅｖｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１６，ｖｏｌ．１１９，ｎｏ．９，ｐｐ．Ｅ１１２−１１６１、Ｊｕｉｌｌｅｒａｔ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．２０１６，６：１８９５０、Ｒｏｙｂａｌ，Ｃｅｌｌ，２０１６，ｖｏｌ．１６４，ｐｐ．１−１０、及びＭｏｒｓｕｔ，Ｃｅｌｌ，２０１６，ｖｏｌ．１６４，ｐｐ．１−１２）。
【００４３】
ＦＫＢＰ／Ｓｈｉｅｌｄ−１の１つの欠点は、Ｓｈｉｅｌｄ−１が、生体内分布が完全に特徴付けられず、Ｓｈｉｅｌｄ−１が血液脳関門をどの程度まで横断することが知られていない、新規の薬物であることである。
【００４４】
他のＤＤリガンド対は、いくつかのエストロゲン受容体アンタゴニストによって調節され得るエストロゲン受容体（Ｍｉｙａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  ＡｍＣｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０１２，１３４（９）：３９４２−３９４５）を含み、蛍光性不安定化ドメイン（ＦＤＤ）は、ビリルビン誘導性蛍光タンパク質、ＵｎａＧに由来する。ＦＤＤ及びその同種リガンドビリルビン（ＢＲ）は、ＦＤＤに融合したタンパク質の分解を含み得る（Ｎａｖａｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．，２０１６，Ｊｕｎｅ  ６，Ｅｐｕｂ）。タンパク質安定性における他の既知のＤＤ及びそれらの適用は、米国特許第８，１７３，７９２号及び米国特許第８，５３０，６３６号（これらの内容は、それぞれ、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００４５】
直行アプローチでは、細菌性ジヒドロ葉酸還元酵素（ｅｃＤＨＦＲ）の不安定化ドメインが、研究された。（Ｉｗａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０１０，１７（９）：９８１−９８８及びＴａｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１２，７（９）：ｅ４６２６９）。ＤＨＦＲの多数の阻害剤は、薬物として開発されており、１つのこのような阻害剤トリメトプリム（ＴＭＰ）は、相互作用への特異性を提供する哺乳動物ＤＨＦＲよりもさらに強力にｅｃＤＨＦＲを阻害する。さらに、ＴＭＰは、市販されており、バイオサーキットとして使用のための開発に理想的なこのタンパク質−リガンド対を作製する望ましい薬理学的特性を有する（Ｉｗａｍｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．（２０１０）Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２４；  １７（９）：９８１−９８８）。
【００４６】
本発明は、小分子依存性の安定性を示す新規のタンパク質ドメインを提供する。このようなタンパク質ドメインは、不安定化ドメイン（ＤＤ）と呼ばれる。その結合リガンドの不在下で、ＤＤは、不安定であり、ＤＤ（例えば、対象となるタンパク質（ＰＯＩ）に融合したペイロードの分解を引き起こすが、その結合リガンドの存在下で、融合したＤＤ及びペイロードは、安定化し得、その安定性は、用量依存性である。本発明のＤＤ、エフェクターモジュール、バイオサーキットシステム、及び組成物を使用した対象となるタンパク質の発現レベル及び活性を調節するための方法もまた、提供される。いくつかの実施形態において、ＳＲＥは、不安定化ドメイン（ＤＤ）であり得る。いくつかの例では、ＤＤは、ヒトタンパク質ＰＤＥ５の一部または領域であり得る。この文脈において、バイオサーキットシステムは、ＤＤバイオサーキットシステムである。
【００４７】
本発明は、ヒトＰＤＥ５タンパク質に由来する新規の不安定化ドメインを使用してタンパク質の安定性を調節する技術をさらに説明する。対象となるタンパク質の不安定化及び安定化、例えば、遺伝子療法のためのトランス遺伝子は、不安定化または安定化の特性及びそれらのリガンドを有するＰＤＥ５変異体ＤＤ、例えば、シルデナフィル及びバルデナフィルによって制御され得る。小分子リガンドの存在及び／または不在は、不安定化ドメインに作動可能に連結されたペイロード（例えば、対象となるタンパク質）の活性を調節することができる。
【００４８】
免疫療法
がん免疫療法は、がんに関する免疫系の反応性の誘導または回復を目的とする。免疫療法研究における有意な進歩は、広範には、能動免疫療法及び受動免疫療法に分類され得る様々な戦略の開発につながる。全般に、これらの戦略は、がん細胞を直接死滅させるか、または免疫抑制性腫瘍内微小環境に対抗するために利用され得る。能動免疫療法は、内因性の長続きする腫瘍抗原特異性免疫応答の誘導を目的とする。応答は、さらに、サイトカインなどの免疫応答修飾因子の非特異的な刺激によって増強され得る。対照的に、受動免疫療法は、腫瘍抗原特異的な細胞毒性Ｔ細胞または抗体などの免疫エフェクター分子が宿主に投与される場合のアプローチを含む。このアプローチは、長続きせず、複合投与を必要とする。
【００４９】
大幅な進歩にもかかわらず、現行の免疫療法戦略の効力は、関連した毒性によって制限される。これらは、しばしば、免疫療法と関連する狭い治療窓に関し、一部分において、臨床的に重要な治療効果を得るために、命にかかわる可能性のある毒性寸前まで用量療法を強いる必要性から抜け出す。さらに、養子導入免疫細胞が、しばしば、予測できないほど、患者内で急速に増殖し続けるため、用量は、インビボで拡大する。
【００５０】
免疫療法に関与する主なリスクは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の正常な組織発現に応答して、Ｔ細胞の活性化から生じる的確であるが、的外れである腫瘍の副作用である。特異的ＴＡＡに対するＴ細胞受容体を発現するＴ細胞を利用する臨床試験は、免疫療法に応答して皮疹、大腸炎、及び難聴を報告した。
【００５１】
免疫療法はまた、腫瘍細胞が、免疫療法に応答して死滅した場合に出現する的確な腫瘍内毒性を生じ得る。有害影響は、腫瘍溶解症候群、サイトカイン放出症候群、及び関連マクロファージ活性化症候群を含む。重要なことには、これらの有害影響は、腫瘍の破壊時に生じ得、したがって、成功した腫瘍内免疫療法でさえ、毒性をもたらし得る。したがって、免疫療法が、毒性を軽減し、効力を最大限にする可能性を有するため、免疫療法を調節可能に制御するアプローチが、非常に望ましい。
【００５２】
本発明は、がん免疫療法のためのシステム、組成物、免疫治療剤、及び方法を提供する。これらの組成物は、免疫療法における遺伝子発現及び機能の調節可能な調節を提供する。本発明はまた、バイオサーキットシステム、エフェクターモジュール、刺激応答エレメント（ＳＲＥ）、及びペイロード、ならびに前述のうちのいずれかをコードするポリヌクレオチドも提供する。一態様において、本発明のシステム、組成物、免疫治療剤、及び他の成分は、がん免疫療法を調節するための有意な柔軟性を提供する別々に加えられた刺激によって制御することができる。さらに、本発明のシステム、組成物、及び方法はまた、化学療法剤などの治療剤、小分子、遺伝子療法、及び抗体と組み合わせてもよい。
【００５３】
本発明のシステム及び組成物の調節可能な性質は、免疫療法の効力の潜在性及び持続を改善する可能性を有する。本発明の組成物を使用した養子導入細胞の生物学的活性を可逆的にサイレンシングすることは、回復できないほど死滅させ、治療法を終止させることなく細胞療法の可能性を最大限にする。
【００５４】
具体的には、本発明は、患者への投与後、免疫療法の微調整のための方法を提供する。次いで、これは、免疫療法の安全性及び効力を改善し、免疫療法が有効であり得る対象の集団を増大させる。
【００５５】
ＩＩ．本発明の組成物
タンパク質、例えば、トランス遺伝子、発現、及び機能を直接制御し得る様々な戦略が、利用可能である。本発明は、小分子依存性の安定性を示す新規のタンパク質ドメインを提供する。このようなタンパク質ドメインは、不安定化ドメイン（ＤＤ）と呼ばれる。その結合リガンドの不在下で、ＤＤは、ＤＤに作動可能に連結された対象となるタンパク質（ＰＯＩ）などのペイロードの分解を引き起こすが、その結合リガンドの存在下で、融合したＤＤ及びペイロードは、安定化し得、その安定性は、用量依存性である。
【００５６】
本発明によれば、ヒトｈＰＤＥ５（ｃＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ５型；ｃＧＭＰ特異的３’，５’−環式ホスホジエステラーゼ）タンパク質に由来する新規の不安定化ドメインが、提供される。不安定化ドメイン（ＤＤ）変異体は、（配列番号２の核酸配列によってコードされる）配列番号１のアミノ酸配列を含む、ヒトＰＤＥ５タンパク質に由来する。ｈＰＤＥ５  ＤＤ変異体はまた、配列番号３３９の核酸配列によってコードされるヒトＰＤＥ５の触媒ドメイン（配列番号３）の１つを超える変異、例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上の変異も含み得る。これらのｈＰＤＥ５  ＤＤは、シルデナフィル及び／またはバルデナフィルに結合し、安定化され得る。いくつかの実施形態において、ｈＰＤＥ５  ＤＤは、配列番号４によってコードされる、触媒ドメイン（配列番号２３７）のＮ末端に付加されるメチオニンを含み得る。
【００５７】
本発明によれば、それらのコアで少なくとも１つのエフェクターモジュールシステムを含むバイオサーキットシステムが、提供される。このようなエフェクターモジュールシステムは、１つ以上の刺激応答エレメント（ＳＲＥ）と関連するまたは一体となる、少なくとも１つのエフェクターモジュールを含む。本発明のバイオサーキットシステムの全体構造を、図１中に例示する。全般に、刺激応答エレメント（ＳＲＥ）は、エフェクターモジュールを形成するために、任意の対象となるタンパク質（ＰＯＩ）（例えば、免疫治療剤）であり得るペイロード構築物に作動可能に連結され得る。特定の刺激物質、例えば、小分子によって活性化されるとき、ＳＲＥは、安定化シグナルまたは不安定化シグナルを持続させることによって上方または下方のいずれかで連結したペイロードの転写及び／またはタンパク質レベルを調節するために、あるいは任意の他のタイプの調節へのシグナルまたは結果をもたらすことができる。バイオサーキットシステムのさらに詳細な説明は、２０１６年４月１１日に出願された共同所有の米国仮特許出願第６２／３２０，８６４号、２０１７年３月３日に出願された第６２／４６６，５９６号、及び国際特許公開第ＷＯ２０１７／１８０５８７号（当該出願の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）において見出され得る。本発明に従って、免疫療法のために使用される任意の薬剤の発現レベル及び活性を調節する、バイオサーキットシステム、エフェクターモジュール、ＳＲＥ、及び成分が、提供される。具体的には、本明細書で論じられる新規のｈＰＤＥ５不安定化ドメインを含むバイオサーキットシステム及びエフェクターモジュールが、提供される。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「バイオサーキット」または「バイオサーキットシステム」は、刺激物質への応答が、生物学的システム内の、生物学的システムの間の、生物学的システムのインジケータとして、または生物学的システム上に少なくとも１つのシグナルまたは結果をもたらす場合には、刺激物質及び刺激物質に応答する少なくとも１つのエフェクターモジュールを含む生物学的システム内のまたは生物学的システムにおいて有用なサーキットとして定義される。生物学的システムは、概して、任意の細胞、組織、臓器、臓器系、または生物、動物、植物、菌、細菌、またはウイルス性であり得ることが理解される。また、バイオサーキットが、本発明によって教示され、例えば、診断的、レポーターシステム、デバイス、アッセイ、またはキットを用いて、無細胞環境においてシグナルまたは結果に影響を及ぼす、刺激物質またはエフェクターモジュールを使用する人工サーキットであり得ることも理解される。人工サーキットは、１つ以上の電子、磁気性、または放射性成分もしくは部品と連通し得る。
【００５９】
本発明に従って、バイオサーキットシステムは、不安定化ドメイン（ＤＤ）バイオサーキットシステム、二量化バイオサーキットシステム、受容体バイオサーキットシステム、及び細胞バイオサーキットシステムであり得る。これらのシステムのいずれかは、これらのバイオサーキットシステムの任意の他のシステムへのシグナルとしての役割を果たし得る。いくつかの実施形態において、本発明は、本発明のＤＤを含む、バイオサーキットシステム、エフェクターモジュール、及び組成物を提供する。一態様において、バイオサーキットシステムは、ＤＤバイオサーキットシステムである。
【００６０】
本発明の一態様において、バイオサーキットシステムは、ＤＤバイオサーキットシステムである。ＤＤは、ｈＰＤＥ５由来のＤＤである。
【００６１】
免疫療法のためのエフェクターモジュール及びＳＲＥ
本発明に従って、免疫療法のために使用される任意の薬剤の発現レベル及び活性を調節する、バイオサーキットシステム、エフェクターモジュール、ＳＲＥ、及び成分が、提供される。非限定的な例として、免疫治療剤は、抗体ならびにそれらの断片及びバリアント、癌特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びそのバリアント、抗腫瘍特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、キメラスイッチ受容体、共抑制性受容体もしくはリガンドの阻害剤、共刺激受容体及びリガンドのアゴニスト、サイトカイン、ケモカイン、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、可溶性成長因子、代謝因子、自殺遺伝子、ホーミング受容体、または細胞及び対象における免疫応答を誘導する任意の薬剤であり得る。
【００６２】
上記のように、本発明のバイオサーキットは、エフェクターモジュールシステムの成分として少なくとも１つのエフェクターモジュールを含む。本明細書で使用される場合、「エフェクターモジュール」は、少なくとも（ａ）１つ以上の刺激応答エレメント（ＳＲＥ）及び（ｂ）１つ以上のペイロード（すなわち、対象となるタンパク質（ＰＯＩ））を含む、単一または多成分構築物または複合体である。本発明との関係においては、ＳＲＥは、ヒトＰＤＥ５タンパク質に由来するＤＤである。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「刺激応答エレメント（ＳＲＥ）」は、エフェクターモジュールの１つ以上のペイロードに接合、結合、連結、または連通するエフェクターモジュールの成分であり、場合によっては、１つ以上の刺激物質へのエフェクターモジュールの応答性に関与する。本明細書で使用される場合、刺激へのＳＲＥの「応答性」の性質は、共有結合性相互作用または非共有結合性相互作用、直接もしくは間接連通、または刺激への構造的もしくは化学反応に特徴付けられ得る。さらに、刺激物質への任意のＳＲＥの応答は、程度または種類の問題であり得る。応答は、部分応答であり得る。応答は、可逆的応答であり得る。応答は、最終的に、調節シグナルまたは出力をもたらし得る。このような出力シグナルは、刺激物質への相対的な性質、例えば、１％〜１００％の調節効果、または例えば、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍またはそれ以上の要因の増加または減少をもたらし得る。
【００６４】
いくつかの実施形態において、本発明の刺激物質及びエフェクターモジュールを含む本発明のバイオサーキットシステム。エフェクターモジュールのＤＤは、刺激物質に結合し、連結したペイロードの安定性を調節する。ＤＤは、０〜０．０９の不安定化の比率によって対象となるタンパク質を不安定化し得、不安定化の比率は、ＤＤに特異的な刺激物質の不在下で、対象となるタンパク質の発現、機能、またはレベルと、構造的に発現しており、ＤＤに特異的な刺激物質の不在下で、対象となるタンパク質の発現、機能、またはレベルの比率を含む。いくつかの実施形態において、ＤＤは、１以上の安定化の比率によって対象となるタンパク質を安定化し得、安定化の比率は、刺激物質の存在下で、対象となるタンパク質の発現、機能、またはレベルと、刺激物質の不在下で、対象となるタンパク質の発現、機能、またはレベルの比率を含む。
【００６５】
いくつかの実施形態において、本発明は、タンパク質の発現、機能、またはレベルを調節するための方法を提供する。いくつかの態様において、タンパク質の発現、機能、またはレベルの調節は、少なくとも約２０％、例えば、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、及び１００％、または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜１００％、３０〜４０％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜１００％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜１００％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜１００％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜１００％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜１００％、９０〜９５％、９０〜１００％、または９５〜１００％の発現、機能、またはレベルの調節を指す。
【００６６】
本発明によれば、本発明のバイオサーキットシステム及びエフェクターモジュールは、バイオサーキットシステム及びエフェクターモジュール内に一体化されたＤＤに特異的に結合するリガンの存在または不在に応答してペイロードの発現及び活性を調節するために使用することができる。
【００６７】
いくつかの態様において、本発明のＤＤ、エフェクターモジュール、及びバイオサーキットシステムは、細胞または対象におけるペイロードの発現、機能、及び活性を調節するために使用され得る。調節は、少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％、または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜１００％、３０〜４０％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜１００％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜１００％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜１００％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜１００％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜１００％、９０〜９５％、９０〜１００％、または９５〜１００％のその発現、機能、及び活性の変化のレベルを指す。
【００６８】
いくつかの実施形態において、本発明のバイオサーキットの変異係数はまた、タンパク質の発現、機能、またはレベルを調節するためのＤＤの能力を評価する手段として測定され得る。本明細書で使用される場合、「変異係数」は、ＳＲＥに特異な刺激の不在下で、特定のＤＤ変異体に付加される、対象となるタンパク質の発現、機能、またはレベル、及び刺激の不在下で、特定のＤＤ変異体が由来する対応する野生型配列に付加される対象となるタンパク質のタンパク質発現、機能、またはレベルを指す。変異係数は、対応する野生型タンパク質は、いかなる変異もなく、不安定であり得るかどうかに無関係であるタンパク質の基本的発現に対して不安定化する変異の貢献を示す。いくつかの態様において、変異係数比は、少なくとも０、例えば、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または少なくとも、０〜０．１、０〜０．２、０〜０．３、０〜０．４、０〜０．５、０〜０．６、０〜０．７、０〜０．８、０〜０．９、０．１〜０．２、０．１〜０．３、０．１〜０．４、０．１〜０．５、０．１〜０．６、０．１〜０．７、０．１〜０．８、０．１〜０．９、０．２〜０．３、０．２〜０．４、０．２〜０．５、０．２〜０．６、０．２〜０．７、０．２〜０．８、０．２〜０．９、０．３〜０．４、０．３〜０．５、０．３〜０．６、０．３〜０．７、０．３〜０．８、０．３〜０．９、０．４〜０．５、０．４〜０．６、０．４〜０．７、０．４〜０．８、０．４〜０．９、０．５〜０．６、０．５〜０．７、０．５〜０．８、０．５〜０．９、０．６〜０．７、０．６〜０．８、０．６〜０．９、０．７〜０．８、０．７〜０．９、または０．８〜０．９である。
【００６９】
いくつかの実施形態において、本発明は、安定化比、不安定化比、及び／または不安定化変異係数を測定することによってタンパク質、発現、機能、またはレベルを調節するための方法を提供する。本明細書で使用される場合、「安定化比」は、刺激に応答して対象となるタンパク質の発現、機能、またはレベルと、ＳＲＥに特異的な刺激の不在下で、対象となるタンパク質の発現、機能、またはレベルの比率である。いくつかの態様において、安定化比は、少なくとも１、例えば、少なくとも１〜１０、１〜２０、１〜３０、１〜４０、１〜５０、１〜６０、１〜７０、１〜８０、１〜９０、１〜１００、２０〜３０、２０〜４０、２０〜５０、２０〜６０、２０〜７０、２０〜８０、２０〜９０、２０〜９５、２０〜１００、３０〜４０、３０〜５０、３０〜６０、３０〜７０、３０〜８０、３０〜９０、３０〜９５、３０〜１００、４０〜５０、４０〜６０、４０〜７０、４０〜８０、４０〜９０、４０〜９５、４０〜１００、５０〜６０、５０〜７０、５０〜８０、５０〜９０、５０〜９５、５０〜１００、６０〜７０、６０〜８０、６０〜９０、６０〜９５、６０〜１００、７０〜８０、７０〜９０、７０〜９５、７０〜１００、８０〜９０、８０〜９５、８０〜１００、９０〜９５、９０〜１００、または９５〜１００である。本明細書で使用される場合、「不安定化比」は、エフェクターモジュールに特異的な刺激の不在下で、対象となるタンパク質の発現、機能、またはレベルと、ＳＲＥに特異的な刺激の不在下で、構造的に発現する、対象となるタンパク質の発現、機能、またはレベルの比率である。本明細書で使用される場合、「構造的に」とは、ＳＲＥに連結されず、したがって、ＳＲＥへの刺激の存在及び不在下で発現される対象となるタンパク質の発現、機能、またはレベルを指す。本明細書で使用される場合、「不安定化変異係数」は、エフェクターモジュールに特異的な刺激の不在下で、ＤＤに付加される対象となるタンパク質の発現、機能、またはレベルと、ＤＤが由来する野生型タンパク質に付加されるタンパク質の発現、機能、またはレベルの比率として定義され得る。いくつかの態様において、不安定化比及び／または不安定化変異係数は、少なくとも０、例えば、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または少なくとも、０〜０．１、０〜０．２、０〜０．３、０〜０．４、０〜０．５、０〜０．６、０〜０．７、０〜０．８、０〜０．９、０．１〜０．２、０．１〜０．３、０．１〜０．４、０．１〜０．５、０．１〜０．６、０．１〜０．７、０．１〜０．８、０．１〜０．９、０．２〜０．３、０．２〜０．４、０．２〜０．５、０．２〜０．６、０．２〜０．７、０．２〜０．８、０．２〜０．９、０．３〜０．４、０．３〜０．５、０．３〜０．６、０．３〜０．７、０．３〜０．８、０．３〜０．９、０．４〜０．５、０．４〜０．６、０．４〜０．７、０．４〜０．８、０．４〜０．９、０．５〜０．６、０．５〜０．７、０．５〜０．８、０．５〜０．９、０．６〜０．７、０．６〜０．８、０．６〜０．９、０．７〜０．８、０．７〜０．９、または０．８〜０．９である。
【００７０】
エフェクターモジュールのＳＲＥは、ペプチド、ペプチド複合体、ペプチド−タンパク質複合体、タンパク質、タンパク質複合体、タンパク質−タンパク質複合体から選択され得るが、これらに限定されない。ＳＲＥは、任意の天然または変異タンパク質または抗体に由来する１つ以上の領域を含み得る。この態様において、ＳＲＥは、刺激に応答するとき、細胞内局在性、分子内活性化、及び／またはペイロードの分解を調節することができるエレメントである。
【００７１】
いくつかの実施形態において、本発明のエフェクターモジュールは、１つ以上のシグナル配列（ＳＳ）、１つ以上の切断及び／または加工部位、１つ以上の標的及び／または浸透性ペプチド、１つ以上のタグ、及び／または１つ以上のリンカーなどのエフェクターモジュールの発現及び調節を促進するというさらなる特性を含み得る。さらに、本発明のエフェクターモジュールは、誘導性プロモーター、エンハンサー配列、マイクロＲＮＡ部位、及び／またはマイクロＲＮＡ標的部位などの他の調節部分をさらに含み得る。各態様または同調したモダリティは、エフェクターモジュールまたはバイオサーキットを特異的に同調した特性にし得る。例えば、ＳＲＥは、不安定化ドメインを表し得るが、一方、タンパク質ペイロードにおける変異体は、その切断部位または二量化特性または半減期を変化させ得、１つ以上のマイクロＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ結合部位の封入体は、細胞の脱標的化またはトラフィッキング特性に影響を及ぼし得る。その結果、本発明は、それらの持続可能性において多因子であるバイオサーキットを包含する。このようなバイオサーキットは、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の同調特性を含むように操作され得る。
【００７２】
図２に示すように、１つのペイロード、すなわち、１つの免疫治療剤を含む代表的なエフェクターモジュールが、例示される。エフェクターモジュールの各成分は、切断部位がない（Ａ〜Ｆ）または切断部位がある（Ｇ〜Ｚ、及びＡＡ〜ＤＤ）様々な配置に位置し得るか、または配置され得る。任意のリンカーは、エフェクターモジュールの各成分間に挿入され得る。
【００７３】
図３〜６は、２つのペイロード、すなわち、２つの免疫治療剤を含む代表的なエフェクターモジュール実施形態を例示する。いくつかの態様において、２つを超える免疫治療剤（ペイロード）は、同じＳＲＥ（例えば、同じＤＤ）の調節下で、エフェクターモジュールに含まれ得る。２つ以上の薬剤は、互いに直接連結され得るか、または分離され得る（図３）。ＳＲＥは、構築物のＮ末端で、または構築物のＣ末端で、または内部位置に配置され得る。
【００７４】
いくつかの態様において、２種以上の免疫治療剤は、２つの抗体などの同じタイプ、またはＣＡＲ構築物及びサイトカインＩＬ１２などの異なるタイプであり得る。バイオサーキット及びこのようなエフェクターモジュールを使用する成分を、図７〜１２に示されている。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「ペイロード」または「標的ペイロード」は、機能が変化されている任意のタンパク質または核酸として定義される。ペイロードは、任意のコードするもしくは非コードの遺伝子、任意のタンパク質もしくはその断片、または融合構築物、または抗体を含み得る。
【００７６】
ペイロードは、しばしば、１つ以上のＳＲＥ（例えば、ＤＤ）と関連しており、本発明のポリヌクレオチドにおいて、単独でまたは１つ以上のＤＤと組み合わせてコードされ得る。ペイロード自体が、（タンパク質または核酸レベルで）変化され、それによってエフェクターモジュールの持続可能性のさらなる層を提供し得る。例えば、ペイロードは、分解、切断、またはトラフィッキングに対してペイロードの安定性またはその感受性に影響を及ぼす、単一または多重の変異体を含むように操作または設計され得る。出力シグナル、例えば、発現レベルの様々な応答または階調を示すように変化されるペイロードによる刺激物質への応答のスペクトルを有し得るＤＤの組み合わせは、当該技術分野におけるものよりも優れているバイオサーキットを提供する。例えば、ＷＯ２０１６０４８９０３（具体的には、その中の実施例１において）（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）においてＩＬ１２のために作製されたものなどの変異体または置換型設計は、二重の同調可能なバイオサーキットを作製するために、本発明のＤＤと併せて任意のタンパク質ペイロードにおいて使用され得る。ＤＤ及びペイロードの両方を独立して同調する能力は、本発明のエフェクターモジュールの使用の範囲を大いに増大させる。
【００７７】
エフェクターモジュールは、１つ以上のペイロード、１つ以上のＤＤ、１つ以上の切断部位、１つ以上のシグナル配列、１つ以上のタグ、１つ以上の標的化ペプチド、及び１つ以上のリンカーの存在または不在を含む１つ以上のさらなる特性を含むように設計され得る。本発明の代表的なエフェクターモジュール実施形態を、図２〜６中に例示する。いくつかの態様において、ＤＤは、エフェクターモジュール構築物のＮ末端、またはＣ末端、または内部に配置され得る。ＤＤ、ペイロード、及びさらなる特性などのエフェクターモジュールの異なる成分は、１つの構築物において直線的に組織されるか、または別々の構築物において別々に構成される。
【００７８】
さらに、本発明のエフェクターモジュールは、ペイロードの活性を制御する際に柔軟性を提供する、誘導性プロモーター、エンハンサー配列、マイクロＲＮＡ部位、及び／またはマイクロＲＮＡ標的部位などの他の調節部分をさらに含み得る。本発明のペイロードは、任意の天然タンパク質及びそれらのバリアント、または融合ポリペプチド、抗体及びそれらのバリアント、トランス遺伝子、ならびに治療剤であり得る。
【００７９】
バイオサーキットシステムの刺激は、リガンド、小分子、環境シグナル（例えば、ｐＨ、温度、光、及び細胞内位置）、ペプチド、または代謝産物であり得るが、これらに限定されない。本発明の一態様において、刺激物質は、シルデナフィル及びバルデナフィルを含むｈＰＤＥ５  ＤＤ結合リガンドである。
【００８０】
ＤＤのポリペプチド、このようなＤＤ及びペイロード構築物を含むバイオサーキットシステム及びエフェクターモジュール、これらのポリペプチド及びそれらのバリアントをコードする他の成分、ポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチドを含むベクターが、本発明において提供される。ベクターは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、組換えＡＡＶベクター、及び腫瘍溶解性ウイルスベクターを含むが、これらに限定されない、プラスミドまたはウイルスベクターであり得る。
【００８１】
ＳＲＥ内のＤＤに対するペイロードの位置は、最適なＤＤ調節を達成するように異なり得る。いくつかの実施形態において、ペイロードは、ＤＤのＮ末端に融合し得る。別の実施形態において、ペイロードは、ＤＤのＣ末端に融合し得る。メチオニンをコードする任意の開始コドンヌクレオチド配列は、ＤＤ及び／またはペイロードに付加され得る。
【００８２】
いくつかの実施形態において、１つを超えるバイオサーキットシステムは、同じ細胞または生物において様々なタンパク質機能を制御するように組み合わせて使用され得、これらの各々は、異なるＤＤ及びリガンド対を使用し、別々に調節され得る。
【００８３】
いくつかの実施形態において、本発明のバイオサーキットは、それらの免疫原性を軽減するように修飾され得る。免疫原性は、外来として受容している物質に対する複雑な一連の応答の結果であり、中和抗体及び非中和抗体の生成、免疫複合体の形成、補体活性化、肥満細胞の活性化、炎症、過敏性反応、ならびにアナフィラキシーを含み得る。いくつかの因子は、タンパク質配列、投与の経路及び頻度、ならびに患者集団が含まれるが、これらに限定されない、タンパク質免疫原性に寄与し得る。好ましい実施形態において、プロテインエンジニアリングは、本発明の組成物の免疫原性を軽減するために使用され得る。いくつかの実施形態において、免疫原性を軽減するための修飾は、ＭＨＣタンパク質への、本発明の組成物の配列に由来する処理ペプチドの結合を軽減するものを含み得る。例えば、アミノ酸は、任意の一般的なＭＨＣ対立遺伝子に結合することが予想される免疫エピトープがほとんどないまたは最小数の免疫エピトープが本発明の組成物中に存在するように修飾され得る。既知のタンパク質配列のＭＨＣ結合エピトープを特定するためのいくつかの方法が、当該技術分野で周知であり、本発明の組成物中のエピトープを採点するために使用され得る。このような方法は、米国特許出願第ＵＳ２００２０１１９４９２号、同第ＵＳ２００４０２３０３８０号、及び同第ＵＳ２００６０１４８００９号（当該出願の各々の内容は、参照によりそれらの全体が組み込まれる）において開示されている。
【００８４】
エピトープの特定及びその後の配列修飾は、免疫原性を軽減するために適用され得る。免疫原性エピトープの特定は、物理的にまたは計算論的に達成され得る。エピトープの特定の物理的方法は、例えば、質量分析法及び組織培養／細胞技術を含み得る。抗原処理、負荷、及び提示に関連する情報、抗原処理をもたらし得るペプチドを特定するための構造及び／またはプロテオミクスデータを利用し、かつＭＨＣの溝において良好な結合特徴付けを有する可能性がある計算論的アプローチもまた、利用してもよい。１つ以上の変異体は、特定されたエピトープが、機能性を維持しつつ、免疫原性がより少ないまたは免疫原性がないことを示すように、本発明のバイオサーキットに導入され得る。
【００８５】
いくつかの実施形態において、グリコシル化及びＰＥＧ化などの抗原処理及びペプチド負荷を妨げるように本発明の組成物の構造に操作されたタンパク質修飾もまた、本発明において有用であり得る。本発明の組成物はまた、非古典的なアミノ酸側鎖を含むように操作され得る。免疫原性を軽減するための国際特許公開第ＷＯ２００５０５１９７５号で論じられる方法のうちのいずれかは、本発明において有用であり得る（当該出願の内容は、参照によりその全体が組み込まれる）。
【００８６】
一実施形態において、患者はまた、それらの免疫細胞によって提示される免疫原性ペプチドに従って層別化され得、本発明の組成物が治療的に有効であり得る患者コホートを決定するためのパラメータとして利用され得る。
【００８７】
いくつかの実施形態において、免疫原性の軽減は、免疫プロテアソーム処理を制限することによって達成され得る。プロテアソームは、すべての細胞型において発現され、かつ触媒サブユニットを含む構造的プロテアソームと、造血系の細胞において発現され、かつ低分子量タンパク質（ＬＭＰ）と称される異なる活性サブユニット、すなわち、ＬＭＰ−２、ＬＭＰ−７、及びＬＭＰ−１０を含む免疫プロテアソームの２つの形態で見出される重要な細胞プロテアーゼである。免疫プロテアソームは、多くのＭＨＣクラスＩエピトープのより有効な遊離をもたらす改変ペプチダーゼ活性及び切断部位選択を示す。免疫プロテアソームのよく説明された機能は、ＭＨＣクラスＩ分子の溝に適合するように処理され得る疎水性Ｃ末端でペプチドを生成することである。Ｄｅｏｌ  Ｐらは、免疫プロテアソームが、特定のペプチド結合の頻繁な切断をもたらし、それによって抗原提示細胞の表面上にある特定のペプチドのより迅速な出現、及びペプチド量の増強をもたらし得る（Ｄｅｏｌ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７８（１２）７５５７−７５６２、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。この研究は、免疫プロテアソーム処理の軽減は、免疫原性の軽減を伴い得る。いくつかの実施形態において、本発明の組成物の免疫原性は、免疫プロテアソームを妨げるために本発明の組成物をコードする配列を修飾することによって軽減され得る。本発明のバイオサーキットはまた、免疫プロテアソーム選択的阻害剤と組み合わせて、同じ効果を達成し得る。本発明において有用な阻害剤の例は、ＵＫ−１０１（Ｂ１ｉ選択的化合物）、ＩＰＳＩ−００１、ＯＮＸ  ０９１４（ＰＲ−９５７）、及びＰＲ−９２４（ＩＰＳＩ）を含む。
【００８８】
いくつかの実施形態において、本発明のエフェクターモジュールは、発現を同調するために１つ以上のデグロンを含んでもよい。本明細書で使用される場合、「デグロン」は、タンパク質分解システムによる認識及び分解に十分であるタンパク質内の最小配列を指す。デグロンの重要な特性は、デグロンが移入可能であり、すなわち、配列へのデグロンの付加は、配列の分解をもたらす。いくつかの実施形態において、デグロンは、不安定化ドメイン、ペイロードまたは両方に付加され得る。本発明のエフェクターモジュール内のデグロンの組み込みは、エフェクターモジュールへのさらなるタンパク質不安定性をもたらし、基本的発現を軽減するために使用してもよい。いくつかの実施形態において、デグロンは、Ｎ−デグロン、ホスホデグロン、熱誘導性デグロン、感光性デグロン、酸素依存性デグロンであり得る。非限定的な例として、デグロンは、Ｔａｋｅｕｃｈｉらによって記載される、オルニチンデカルボキシラーゼデグロンであり得る（Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２００８  Ｍａｒ  １；４１０（２）：４０１−７、その内容は、参照によりその全体が組み込まれる）。本発明において有用なデグロンの他の例は、国際特許公開第ＷＯ２０１７００４０２２号、同第ＷＯ２０１６２１０３４３号、及び同第ＷＯ２０１１０６２９６２号（当該出願の内容は、参照によりそれらの全体が組み込まれる）において記載されるデグロンを含む。
【００８９】
いくつかの実施形態において、本発明のエフェクターモジュールは、それらのＣ末端でデグロンを含み得る。デグロンは、ＳＲＥの最後から２番目として−ＧＧ、−ＲＧ、−ＫＧ、−ＱＧ、−ＷＧ、−ＰＧ、及び−ＡＧ、ならびに最終的なアミノ酸として含み得る。さらに、ある特定の−２  アミノ酸（Ｄ、Ｅ、Ｖ、Ｉ、及びＬ）は、エフェクターモジュールのＣ末端においてより濃縮され得る。他のデグロンには、ＲｘｘＧモチーフ（式中、ｘは任意のアミノ酸である、Ｃ末端の対のグルタミン酸（ＥＥ）モチーフ、及び−３位でアルギニンを含むモチーフが含まれるが、これらに限定されない。デグロンはまた、Ｒ−３モチーフ、Ｇ末端、−３でＲ、Ａ端、−２でＡ、−２位でＶから選択され得る。Ｋｏｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，Ｃｅｌｌ  １７３，１−１４に記載されるデグロンのうちのいずれかは、本発明において有用であり得る（その内容は、参照によりその全体が組み込まれる）。いくつかの態様において、エフェクターモジュールの発現は、その全体のアミノ酸組成を変化させることによって同調され得る。いくつかの態様において、エフェクターモジュールのアミノ酸組成は、基本的発現を軽減するために同調され得る。いくつかの実施形態において、基本的発現は、エフェクターモジュールにおけるトリプトファン（Ｗ）、フェニルアラニン（Ｆ）、及びチロシン（Ｙ）などの大量の芳香族残基の数を増加させることによって同調され得る。このような大量のアミノ酸は、タンパク質安定性を軽減することが周知である。いくつかの実施形態において、ＳＲＥのアミノ酸組成は、ＳＲＥの基本的発現の像化が望ましい場合、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）、ならびに正電荷を持つリジン（Ｋ）などであるが、これらに限定されない、酸性残基で濃縮され得る。
【００９０】
いくつかの実施形態において、小胞体関連分解（ＥＲＡＤ）経路は、本明細書に記載のペイロード、例えば、分泌及び膜カーゴの分解を最適化するために使用され得る。一実施形態において、本発明のエフェクターモジュールは、アダプタータンパク質またはタンパク質ドメインを使用することによってＥＲ  Ｅ３リガーゼを対象にし得る。小胞体は、遠位分泌経路に配備されているタンパク質が天然オリゴマー複合体に正しく折り畳まれ、組み立てられることを確実にするために特殊化した機構に恵まれている。この立体配座標準を満たすことができないタンパク質は、折り畳み欠陥タンパク質が選択され、ユビキチンプロテアソームシステムによって最終的に分解されるプロセスであるＥＲＡＤ経路によって分解される。ＥＲＡＤは、基質選択、ＥＲ膜を横断する転位、ポリユビキチンとの共有結合、及びプロテアソーム分解を含む４つの主なステップを通して始める。これらのステップのうちのいずれかは、本明細書に記載のペイロードの分解及びエフェクターモジュールを最適化するために調節され得る。ＥＲ膜内のタンパク質アダプターは、基質認識を、ＥＲからのタンパク質の転位を生じるＥＲＡＤ機構（本明細書では、「ｄｉｓｌｏｃｏｎ」と称される）に結び付ける。ＥＲＡＤ経路の分解を最適化するために使用され得るタンパク質アダプターの非限定的な例には、ＳＥＬ１Ｌ（グリカン認識をｄｉｓｌｏｃｏｎに結び付けるアダプター）、Ｅｒｌｉｎｓ（膜間基質アダプター）、Ｉｎｓｉｇ（クライアント特異的アダプター）、Ｆ−Ｂｏｘタンパク質（細胞質において転位した糖タンパク質のためのアダプターとして作用する）、及びウイルスコードしたアダプターが含まれるが、これらに限定されない。
【００９１】
本発明によれば、ヒトｈＰＤＥ５（ｃＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ５型）タンパク質に由来する新規の不安定化ドメインが、提供される。不安定化変異体は、（配列番号２の核酸配列によってコードされる）配列番号１のアミノ酸配列を含む、ヒトＰＤＥ５タンパク質に由来する。ｈＰＤＥ５  ＤＤ変異体はまた、（配列番号３３９の核酸配列によってコードされる）配列番号３のヒトＰＤＥ５の触媒ドメインの１つを超える変異、例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上の変異も含み得る。これらのｈＰＤＥ５  ＤＤは、シルデナフィル及び／またはバルデナフィルに結合し、安定化され得る。
【００９２】
不安定化ドメイン（ＤＤ）
本明細書で使用される場合、「不安定化ドメイン（ＤＤ）」という用語は、リガンドの不在下で、不安定かつ分解するが、安定性が、高親和性細胞透過性リガンドに結合することによって救助される、タンパク質ドメインを指す。不安定化ドメイン（ＤＤ）は、対象となる標的タンパク質（ＰＯＩ）に付加され得、タンパク質分解を引き起こす、対象となるタンパク質へのその不安定化の特定を伝える。ＤＤに結合するまたはそれと相互作用する小分子リガンドの存在、不在、または量は、結合または相互作用の際に、ペイロード（複数可）の安定性、続いて、ペイロードの機能を調節し得る。不安定化特性を有するタンパク質ドメイン（例えば、ＤＤ）を、細胞透過性リガンドと併せて使用して、不安定化ドメインで融合するとき、任意の対象となるタンパク質を調節する。ＤＤは、タンパク質が、細胞のユビキチン−プロテアソームシステムによって急速に分解されるように、ＤＤ結合リガンドの不在下で不安定な結合した対象となるタンパク質を表す。しかしながら、特定の小分子リガンドを回復し、タンパク質機能を復元する。ＤＤ安定性の条件付き性質は、急速かつ非摂動スイッチが、安定したタンパク質から不安定な基質に分解を可能にする。さらに、そのリガンドの濃度におけるその依存性は、分解率の調節可能な制御をさらに提供する。結合の度合い及び／または相互作用に応じて、ペイロードの変化した機能は、変化し得、そのため、ペイロード機能の「同調性」を提供する。
【００９３】
タンパク質レベルにおけるその可逆性、特異性、ならびに迅速及び容易な調節により、転写後の同調システムは、遺伝子調節に有用なシステムを提供する。さらに、調節は、用量依存性であり得、それによってタンパク質の代謝回転率を変化させて、短期間または検出不可能なタンパク質を、正確に制御された期間中機能するタンパク質に変換する（Ｉｗａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１０，１７：９８１−９８８）。
【００９４】
いくつかの実施形態において、ＤＤの所望の特徴付けは、ＤＤのリガンドの不在下で低いタンパク質レベル（すなわち、低い基本的安定性）、広範なダイナミックレンジ、ロバストかつ予測可能な用量反応挙動、及び分解の迅速な動力学を含み得るが、これらに限定されない。所望のリガンドに結合するが、内因性分子に結合しない候補ＤＤは、好ましくあり得る。
【００９５】
既知の野生型タンパク質（鋳型として）のタンパク質ドメインから特定された候補不安定化ドメイン配列は、鋳型候補ドメイン配列に基づいて変異体のライブラリーを生成するように変異され得る。ＤＤライブラリーを生成するために使用される変異誘発戦略は、例えば、構造に指南された情報を使用することによって部位特異的突然変異誘発、または例えば、変異性ＰＣＲを使用したランダム変異誘発、または両方の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、ランダム変異誘発を使用して特定される不安定化ドメインは、不安定化に必要とされ得る候補ＤＤの構造特性を特定するために使用され得、次いで、部位特異的突然変異誘発を使用して変異体のライブラリーをさらに生成するために使用され得る。
【００９６】
いくつかの実施形態において、新規のＤＤは、候補不安定化ドメイン中の１つ以上のアミノ酸を、変異部位に隣接するアミノ酸に変異することによって特定され得る。本明細書で使用される場合、隣接アミノ酸は、候補不安定化ドメインの直鎖状配列及び／または結晶構造において変異部位の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のアミノ酸の上流もしくは下流に位置するアミノ酸を指す。いくつかの実施形態において、隣接アミノ酸は、保存アミノ酸（変異部位でアミノ酸として類似の物理化学特性を有する）、半保存アミノ酸（例えば、負電荷から正電荷を持つアミノ酸）、または非保存アミノ酸（変異部位でアミノ酸とは異なる物理化学特性を有する）であり得る。
【００９７】
いくつかの実施形態において、ＤＤ変異体ライブラリーは、野生型タンパク質と比較して、リガンドに対して変化した、好ましくはより高い結合親和性を有する変異に対してスクリーニングし得る。ＤＤライブラリーはまた、２つ以上のリガンドを使用してスクリーニングされ得、他のリガンドではなく一部のリガンドによって安定化されるＤＤ変異体は、優先的に選択され得る。天然タンパク質と比較して、リガンドに優先的に結合するＤＤ変異体もまた、選択され得る。このような方法は、ＤＤのリガンド選択及びリガンド結合親和性を最適化するために使用され得る。さらに、このようなアプローチは、オフターゲットリガンド結合によって生じる有害な効果を最小限にするために使用することができる。
【００９８】
いくつかの実施形態において、好適なＤＤは、バーコードを使用する変異体ライブラリーをスクリーニングすることによって特定され得る。このような方法は、異種変異体ライブラリー内で個々の変異体クローンを検出し、特定し、定量化するために使用され得る。ライブラリー内の各ＤＤ変異体は、異なるバーコード配列（互いに対して）を有し得る。他の例では、ポリヌクレオチドはまた、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０またはそれ以上の核酸対に対して異なるバーコード配列も有し得る。ライブラリー内の各ＤＤ変異体はまた、複数のバーコード配列も有し得る。複数のバーコードで使用されるときには、各バーコードが任意の他のバーコードに特有であるように使用され得る。あるいは、使用された各バーコードは、特有であり得るが、使用されたバーコードの組み合わせは、個々に追跡され得る固有の配列を生成し得る。バーコード配列は、ＳＲＥの上流、ＳＲＥの下流に置かれ得るか、または場合によっては、ＳＲＥ内に置かれ得る。ＤＤ変異体は、Ｓａｎｇｅｒシークエンシング及び次世代シークエンシングなどのシークエンシングアプローチを使用したバーコードによってだけでなく、ポリメラーゼ連鎖反応及び定量的ポリメラーゼ連鎖反応によっても特定され得る。いくつかの実施形態において、各バーコードに対して異なるサイズ産物を増幅するポリメラーゼ連鎖反応プライマーは、アガロースゲル上の各バーコードを特定するために使用され得る。他の例では、各バーコードは、各バーコードの標的化された増幅を可能にする固有の定量的ポリメラーゼ連鎖反応を有し得る。
【００９９】
本発明の発明者らは、いくつかのヒトタンパク質を研究し、融合したペイロードへのその不安定な特性をもたらし、そのリガンドの不在下で融合ポリペプチドの急速分解を促進するが、そのリガンドへの結合に応答して融合したペイロードを安定させ得る、新規のヒトＤＤを特定した。具体的には、新規のＤＤは、ヒトＰＤＥ５タンパク質に由来する。
【０１００】
ヒトＰＤＥ５変異体
いくつかの実施形態において、本発明のＤＤは、ヒトｃＧＭＰ特異的ホスホジエステラーゼ５型（ＰＤＥ５）；遺伝子名：ＰＤＥ５Ａ（本明細書では、「ｈＰＤＥ５」と称される）に由来し得る。ｈＰＤＥ５（ホスホジエステラーゼ５）は、環式ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）をその不活性形ＧＭＰに分解／加水分解し、ｃＧＭＰシグナル伝達を調節する３，５’−環式ヌクレオチドホスホジエステラーゼファミリーのメンバーである。ｃＧＭＰ／ＰＤＥ  ５シグナル伝達は、血管系、中枢神経系、及び腎臓の高血圧の発症の一因となる。ｈＰＤＥ５は、シルデナフィル、バルデナフィル、タダラフィル、アバナフィル、ロデナフィル、ミロデナフィル、ウデナフィル、ベンザミデナフィル、ダサンタフィル、ベミナフィル、ＳＬｘ−２１０１、ＬＡＳ  ３４１７９、ＵＫ−３４３，６６４、ＵＫ−３５７９０３、ＵＫ−３７１８００、及びＢＭＳ−３４１４００などの小分子に結合することが知られている。シルデナフィル、バルデナフィル、アバナフィル、及びタダラフィルは、勃起障害の治療用に臨床的に認可されているｈＰＤＥ５阻害剤である。具体的には、これらの小分子のｈＰＤＥ５への結合は、触媒ドメイン内に生じる。いくつかの実施形態において、本発明のＤＤは、ｈＰＤＥ５の小分子阻害剤などのリガンド、例えば、シルデナフィル及びバルデナフィルによって安定化され得るｈＰＤＥ５（配列番号１；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号０７６０７４．２）の残基５３５〜８６０を含むｈＰＤＥ５の触媒ドメイン（配列番号３）に由来し得る。本明細書で使用される場合、「ＰＤＥ５  ＷＴ」または「ｈＰＤＥ５  ＷＴ」という用語は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号０７６０７４．２を有する配列番号１として定義される、ヒト野生型ＰＤＥ５タンパク質配列を指す。いくつかの実施形態において、本発明のＤＤは、ｈＰＤＥ５阻害剤のカクテルを使用することによって特定され得る。他の例では、好適なＤＤは、まず、１つのｈＰＤＥ５阻害剤でスクリーニングし、その後、第２のｈＰＤＥ５阻害剤でスクリーニングすることによって特定され得る。
【０１０１】
一実施形態において、ｈＰＤＥ５由来のＤＤは、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｏ７６０７４（配列番号１）のアミノ酸配列またはその一部もしくは断片を含み得る。別の実施形態において、ｈＰＤＥ５由来のＤＤは、アミノ酸５３５位〜８６０位（配列番号３）に及び、配列番号３３９によってコードされる、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｏ７６０７４の触媒ドメインを含み得る。触媒ドメインに加えて、ｈＰＤＥ５由来のＤＤはまた、１つ以上のＧＡＦドメイン及び／または触媒ドメインを超えて拡大するＣ末端部も含み得る。いくつかの実施形態において、ｈＰＤＥ５由来のＤＤは、ｈＰＤＥ５の５’及び／または３’末端を切断することによって生成される構築物を試験することによって特定され得る。一実施形態において、ｈＰＤＥ５由来のＤＤは、切断され得、最小のｈＰＤＥ５ベースのＤＤは、特定され得る。別の実施形態において、ｈＰＤＥ５由来のＤＤは、Ｃ末端らせんを除去する配列番号１の５３５〜８３６位からのアミノ酸を含み得る。別の実施形態において、ｈＰＤＥ５由来のＤＤは、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｏ７６０７４（配列番号１）の５６７〜８６０位、またはＮ末端ドメインの一部を除去するＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｏ７６０７４（配列番号１）の５９０〜８６０位からのアミノ酸からなり得る。別の実施形態において、ｈＰＤＥ５由来のＤＤは、Ｎ末端ドメイン及びＣ末端らせんの一部を除去するＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｏ７６０７４（配列番号１）の５９０〜８３６位からのアミノ酸からなり得る。ＤＤは、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｏ７６０７４（配列番号１）の５３５位〜８７５位からのアミノ酸を含み得る。別の実施形態において、ｈＰＤＥ５由来のＤＤは、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｏ７６０７４（配列番号１）の４６６〜８７５位またはＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｏ７６０７４（配列番号１）の４２０〜８７５位からのアミノ酸からなり得る。
【０１０２】
本発明によれば、いくつかのｈＰＤＥ５不安定化変異体は、部位特異的突然変異誘発を使用した野生型ヒトＰＤＥ５の触媒ドメインの部位特異的突然変異誘発によって発見された。その結合リガンドの不在下で変異体の不安定化が、試験される。ｈＰＤＥ５リガンド、シルデナフィル、タダラフィル、及びバルデナフィルへのヒトＰＤＥ５への結合を試験し、リガンド依存性の安定化が、特徴付けられた。シルデナフィルに結合したｈＰＤＥ５の構造的分析に基づいて、いくつかの残基は、変異誘発のために選択された。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の残基のうちの１つ以上に、変異を起こさせて、ｈＰＤＥ５由来のＤＤを得ることができる。配列番号１の８５３位のトリプトファンは、フェニルアラニンに変異して、結合部位付近に疎水性パッキングを誘導するが、７７２位の近隣のトリプトファンでπ結合を維持し得る。８２１位のイソロイシンは、バリンまたはアラニンに変異して、結合部位付近に疎水性パッキングをもたらし得る。８２９位のチロシンは、イソロイシン、バリン、またはアラニンに変異して、結合部位付近に疎水性パッキングをもたらし得る。６５６位のアスパルテートは、アスパラギンまたはロイシンに変異して、ループ／らせん上の電荷及び塩架橋を破壊し得る。７２８位のチロシンは、フェニルアラニンまたはロイシンに変異して、７３２位の塩架橋を破壊し、疎水性パッキングに影響を及ぼし得る。あるいは、７３２位のアルギニンは、リジンまたはロイシンに変異して、７２８位のチロシンを変異する効果の逆を生じ得る。６２５位のメチオニンは、ロイシンまたはイソロイシンに変異して、結合部位から離れて疎水性パッキングを変化させ得る。いくつかの実施形態において、リガンド結合に影響を及ぼさない不安定化変異体が、優先的に選択され得る。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、本発明の新規の不安定化ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を含むヒトＰＤＥ５タンパク質の触媒ドメインに由来する。いくつかの態様において、不安定化変異体ドメインは、Ｍ６２５Ｉ、Ｄ６５６Ｌ、Ｙ７２８Ｌ、Ｒ７３２Ｌ、Ｆ７３６Ａ、Ｆ７８７Ａ、Ｉ８２１Ａ、Ｙ８２９Ａ、及びＷ８５３Ｆなどであるが、これらに限定されない、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上を含み得る。本発明のＤＤは、さらなる変異体、例えば、Ｅ５３５Ｄ、Ｅ５３６Ｇ、Ｑ５４１Ｒ、Ｋ５５５Ｒ、Ｓ５６０Ｇ、Ｆ５５９Ｌ、Ｆ５６１Ｌ、Ｆ５６４Ｌ、Ｆ５６４Ｓ、Ｓ７６６Ｆ、Ｖ５８５Ａ、Ｎ５８７Ｓ、Ｋ５９１Ｅ、Ｉ５９９Ｖ、Ｋ６０４Ｅ、Ｋ６０８Ｅ、Ｎ６０９Ｈ、Ｋ６３０Ｒ、Ｋ６３３Ｅ、Ｎ６３６Ｓ、Ｉ６４８Ｖ、Ｎ６６１Ｓ、Ｓ６６３Ｐ、Ｌ６７５Ｐ、Ｙ６７６Ｄ、Ｙ６７６Ｎ、Ｃ６７７Ｒ、Ｈ６７８Ｒ、Ｄ６８７Ａ、Ｔ７１１Ａ、Ｔ７１２Ｓ、Ｄ７２４Ｎ、Ｌ７３８Ｈ、Ｎ７４２Ｓ、Ｆ７４４Ｌ、Ｌ７４６Ｓ、Ｆ７５５Ｌ、Ａ７６２Ｓ、Ｄ７６４Ｖ、Ｄ７６４Ｎ、Ｄ７６４Ｇ、Ｋ７９５Ｅ、Ｌ７９７Ｆ、Ｉ７９９Ｔ、Ｌ８０４Ｐ、Ｔ８０２Ｐ、Ｓ８１５Ｃ、Ｍ８１６Ａ、Ｍ８１６Ｔ、Ｉ８２４Ｔ、Ｃ８３９Ｓ、Ｆ８４０Ｓ、及びＫ８５２Ｅをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される変異部位のいずれかは、ヒスチジン、アラニン、イソロイシン、アルギニン、ロイシン、アスパラギン酸、リジン、システイン、メチオニン、グルタミン酸、フェニルアラニン、グルタミン、スレオニン、グリシン、トリプトファン、プロリン、バリン、セリン、チロシン、アスパラギン、セレノシステイン、ピロリシンなどの既知のアミノ酸のいずれかに変異され得る。いくつかの実施形態において、本発明のＤＤは、シルデナフィル、バルデナフィル、タダラフィル、アバナフィル、ロデナフィル、ミロデナフィル、ウデナフィル、ベンザミデナフィル、ダサンタフィル、及びベミナフィルなどのリガンドによって安定化され得る。
【０１０４】
本発明に包含される不安定化ドメインのアミノ酸配列は、その中に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも約４０％、５０、または６０％の同一性、さらに少なくとも約７０％の同一性、好ましくは少なくとも約７５％または８０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、または９０％の同一性、及びさらに好ましくは少なくとも約９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。同一性の割合は、例えば、国立衛生研究所から入手できるバージョンＭａｇｉｃ−ＢＬＡＳＴ  １．２．０を含む、最新のＢＬＡＳＴコンピュータプログラムを使用して配列情報を比較することによって決定され得る。ＢＬＡＳＴプログラムは、Ｋａｒｌ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８７：２２６４−６８（その内容は、参照によりその全体が組み込まれる）において論じられているアライメント法に基づいている。
【０１０５】
いくつかのｈＰＤＥ５不安定化変異体が、特定され、表１中に提供される。表１中に列挙された変異アミノ酸の位置は、配列番号１の完全長ｈＰＤＥ５に関連している。表１中に記載されるドメインは、ｈＰＤＥ５の触媒ドメイン（例えば、配列番号１の５３５〜８６０）を含む。いくつかの実施形態において、表１中に記載されるｈＰＤＥ５  ＤＤは、ｈＰＤＥ５の触媒ドメイン、すなわち、ＰＤＥ５  ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０のＮ末端にメチオニンを含み得る。表１中において、変異アミノ酸は、太字に下線が付いている。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【０１０６】
いくつかの実施形態において、ｈＰＤＥ５に由来するＤＤは、前述の表（表１）中に記載される変異のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上を含み得る。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、ｈＰＤＥ５に由来するＤＤは、ｈＰＤＥ５の触媒ドメインに対して１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上をさらに含み得、（表２中に列挙されるように）Ｅ５３５Ｄ、Ｅ５３６Ｇ、Ｑ５４１Ｒ、Ｋ５５５Ｒ、Ｓ５６０Ｇ、Ｆ５５９Ｌ、Ｆ５６１Ｌ、Ｆ５６４Ｌ、Ｆ５６４Ｓ、Ｓ７６６Ｆ、Ｖ５８５Ａ、Ｎ５８７Ｓ、Ｋ５９１Ｅ、Ｉ５９９Ｖ、Ｋ６０４Ｅ、Ｋ６０８Ｅ、Ｎ６０９Ｈ、Ｋ６３０Ｒ、Ｋ６３３Ｅ、Ｎ６３６Ｓ、Ｉ６４８Ｖ、Ｎ６６１Ｓ、Ｓ６６３Ｐ、Ｌ６７５Ｐ、Ｙ６７６Ｄ、Ｙ６７６Ｎ、Ｃ６７７Ｒ、Ｈ６７８Ｒ、Ｄ６８７Ａ、Ｔ７１１Ａ、Ｔ７１２Ｓ、Ｄ７２４Ｎ、Ｌ７３８Ｈ、Ｎ７４２Ｓ、Ｆ７４４Ｌ、Ｌ７４６Ｓ、Ｆ７５５Ｌ、Ａ７６２Ｓ、Ｄ７６４Ｖ、Ｄ７６４Ｎ、Ｄ７６４Ｇ、Ｋ７９５Ｅ、Ｌ７９７Ｆ、Ｉ７９９Ｔ、Ｌ８０４Ｐ、Ｔ８０２Ｐ、Ｓ８１５Ｃ、Ｍ８１６Ａ、Ｍ８１６Ｔ、Ｉ８２４Ｔ、Ｃ８３９Ｓ、Ｆ８４０Ｓ、及びＫ８５２Ｅから選択され得る。変異アミノ酸の位置は、配列番号１のｈＰＤＥ５に関連している。表２中において、変異アミノ酸は、太字に下線が付いている。表２中に列挙された変異アミノ酸の位置は、配列番号１の完全長ｈＰＤＥ５に関連している。
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【表２−８】
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【表２−９】
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【表２−１０】
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【０１０８】
いくつかの実施形態において、ｈＰＤＥ５に由来するＤＤは、表１中に列挙される少なくとも０、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の変異体と、表２中に列挙される少なくとも０、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の変異体の組み合わせを含み得る。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、ＤＤは、ヒトＰＤＥ５（配列番号１）の触媒ドメインの５３０〜５５０位、５５０〜５７０位、５７０〜５９０位、５９０〜６１０位、６２０〜６４０位、６４０〜６６０位、６６０〜６８０位、６８０〜７００位、７１０〜７３０位、７３０〜７５０位、７５０〜７７０位、７７０〜７９０位、７９０〜８１０〜８３０位、８３０〜８５０位、８５０〜８６０位の１つ以上のアミノ酸残基を変異することによって、ｈＰＤＥ５（配列番号３）に由来し得る。いくつかの実施形態において、変異は、保存（変異部位でアミノ酸として類似の物理化学特性を有する）、半保存（例えば、負電荷から正電荷を持つアミノ酸）、または非保存（変異部位でアミノ酸とは異なる物理化学特性を有するアミノ酸）であり得る。いくつかの実施形態において、アミノ酸リジンは、グルタミン酸もしくはアルギニンに変異され得る、アミノ酸フェニルアラニンは、ロイシンに変異され得る、アミノ酸ロイシンは、フェニルアラニンに変異され得るか、またはアミノ酸アスパラギンは、セリンに変異され得る。野生型タンパク質の領域または一部またはドメインは、全体的または部分的に、ＳＲＥ／ＤＤとして使用され得る。それらは、組み合わせて、または再配置されて、新規のペプチド、タンパク質、領域、またはドメインを作製することができ、これらのうち、いずれかは、ＳＲＥ／ＤＤとして、あるいはさらなるＳＲＥ及び／またはＤＤの設計の出発点として使用することができる。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、ＤＤは、ＰＤＥファミリーのすべてのメンバー内に保存されるアミノ酸残基を変異することによって、ｈＰＤＥ５に由来し得る。例示的な保存残基には、完全長ヒトＰＤＥ５（配列番号１）のＥ６８２、Ｈ６１３、Ｈ６１７、Ｈ６５３、Ｄ６５４、及びＨ６５７残基が含まれるが、これらに限定されず、Ｓｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２００３）４２５，９８−１０２（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）において教示されている。他の実施形態において、亜鉛及びマグネシウムなどの金属に結合するために重要である残基は、変異して、新規のｈＰＤＥ５  ＤＤを特定し得る。いくつかの実施形態において、ｈＰＤＥ５由来のＤＤは、変異性ＰＣＲ及びランダム変異誘発を介したヌクレオチド類似体の変異誘発の組み合わせを使用して生成されたｈＰＤＥ５触媒ドメインの変異体のライブラリーから特定され得る。部位特異的突然変異誘発によって特定された変異体のうちのいずれかは、ランダム変異誘発によって特定された変異体と組み合わせられ得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＤＤは、ｈＰＤＥ５（配列番号１）のＹ６１２アミノ酸を変異することによって得られ得る。いくつかの実施形態において、Ｙ６１２アミノ酸に対する変異体は、本明細書に記載の変異体のうちのいずれかと組み合わせられ得る。ｈＰＤＥ５とバルデナフィルと及びシルデナフィルとの独立した共結晶は、両方のリガンドの環の１つが、ｈＰＤＥ５のＹ６１２、ｈＰＤＥ５の触媒部位内に位置するアミノ酸と相互作用することを示す。相互作用は、水分子との水素結合を介して及び疎水結合を介して生じる。水素結合潜在性を除去するＹ６１２Ｆ変異体は、両方のリガンドによってｈＰＤＥ５活性の阻害を増大させる。Ｙ６１２Ａ変異体は、水素結合及び疎水結合潜在性の両方の除去をもたらし、バルデナフィル及びシルデナフィルによってより少ない程度までｈＰＤＥ５触媒活性の阻害を弱めることを示している。これらの研究は、Ｙ６１２を含む疎水結合がシルデナフィルに対してよりもバルデナフィルに対してより強力であることを示唆している（Ｃｏｒｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２００６，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｐｏｔｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８，２５１−２５７、その内容は、参照によりその全体が組み込まれる）。
【０１１１】
本明細書に記載の不安定化ドメインはまた、保存置換、非保存置換、及びまたは多型性を含む、安定性に影響を及ぼさないアミノ酸置換及びヌクレオチド置換も含み得る。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のｈＰＤＥ５  ＤＤはまた、バリアントアミノ酸配列を含む断片を含む、上記の不安定化ドメインの断片であり得る。好ましい断片は、刺激物質の不在下で不安定であり、刺激物質の添加時に安定化される。好ましい断片は、本明細書に記載のＤＤと同様の効率を有する刺激物質と相互作用する能力を保持する。
【０１１３】
一実施形態において、ｈＰＤＥ５変異体は、融合構築物のＮ末端またはＣ末端のいずれかのリンカー配列を通してＡｃＧＦＰに融合する。Ｕｎｉｐｒｏｔ番号ＢＡＥ９３１４１（配列番号３６３）のＡｃＧＦＰは、ＧＦＰ鋳型として使用してもよく、ＡｃＧＦＰの野生型または「ＷＴ」バージョンと称される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のｈＰＤＥ５変異体はまた、蛍ルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）またはウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）などのルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子に作動可能に連結されてもよい。本明細書に記載のＦｌｕｃタンパク質配列中の変異体の位置は、配列番号２２３と、配列番号３６４のアミノ酸配列を含む、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ（Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０８６５９．１）の野生型ルシフェラーゼ配列または「Ｆｌｕｃ  ＷＴ」との比較に基づいている。融合タンパク質の不安定化及びリガンド依存性安定化特性は、ウェスタンブロット及びＦＡＣＳなどの方法によって評価され得る。ＧＦＰのＮ末端に融合するｈＰＤＥ５変異体を、表３に提供する。すべての構築物は、ｐＬＶＸ．ＩＲＥＳ  Ｐｕｒｏベクターなどであるが、これに限定されない、当該技術分野で周知の及び／または本明細書に記載の任意のベクターにクローン化され得る。ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｃ−０３６（ＯＴ−００１２３２）は、ＥＦ１ａプロモーターの転写制御下に置かれたが、一方、表３に記載の他の構築物は、ＣＭＶプロモーターの転写制御下に置かれた。表３において、アスタリスクは、終止コドンの翻訳を示す。表３はまた、所与の構築物番号の代替のエイリアスも提供する。これらのエイリアスは、接頭辞ＯＴによって特定される。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表３−８】
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【表３−９】
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【表３−１０】
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【０１１４】
ヒトＰＤＥ５に加えて、他のホスホジエステラーゼもまた、新規の不安定化ドメインを生成するために使用され得る。ヒトＰＤＥスーパーファミリーは、１１の構造的に関連しているが、機能的に異なる遺伝子ファミリー（ｈＰＤＥ１〜ｈＰＤＥ１１）を含む。これらは、それらの細胞機能、一次構造、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰに対する親和性、特定の活性剤、阻害剤、エフェクター、及び調節機構に対する触媒特性及び応答が異なる。調節タンパク質として、ｈＰＤＥは、分岐アミノ末端調節領域及び保存カルボキシ末端触媒コアを有する一般的な構造的構成を示す。ｈＰＤＥファミリータンパク質は、Ｎ末端調節領域及びＣ末端触媒領域を含む。Ｎ末端調節領域は、個々のｈＰＤＥを異なる細胞内部位に標的とする構造的決定要因を含み、個々のｈＰＤＥが異なる翻訳後修飾に対して特異的に応答することが可能である。構造要素は、二量化ドメイン、自己阻害モジュール、リガンド及びアロステリックエフェクターの結合部位を含む。対照的に、９つのｈＰＤＥファミリー（ｈＰＤＥ１〜ｈＰＤＥ５及びｈＰＤＥ７〜ｈＰＤＥ１０）のＸ線結晶構造を単離した触媒ドメインは、ｈＰＤＥの触媒ドメインが１６のらせんに折り畳まれた約３５０個のアミノ酸からなる同様の地形を共有することを示している。ｈＰＤＥファミリーにわたって、活性部位は、ｈＰＤＥ特異的なヒスチジンを含有するシグネチャーモチーフ、ＨＤ（Ｘ２）Ｈ（Ｘ４）Ｎ（配列番号８３７７）と、触媒機能に必須である２つの二価金属イオンのための結合部位とを含む深い疎水性ポケットを形成する。特定の環式ヌクレオチドに対するｈＰＤＥの親和性は、ｃＡＭＰを特異的に加水分解する一部のファミリーｈＰＤＥ（ｈＰＤＥ４、ｈＰＤＥ７、及びｈＰＤＥ８）によって異なるが、一方、他は、ｃＧＭＰに加水分解し（ｈＰＤＥ５、ｈＰＤＥ６、及びｈＰＤＥ９）、一部は、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの両方を加水分解する（ｈＰＤＥ１、ｈＰＤＥ２、ｈＰＤＥ３、ｈＰＤＥ１０、及びｈＰＤＥ１１）。
【０１１５】
ｈＰＤＥ５と同様に、任意のｈＰＤＥファミリーメンバーの触媒ドメインまたは他の機能ドメインは、不安定化変異体に対して変異し、スクリーニングされ得る。各ｈＰＤＥタンパク質に対して既知の阻害剤はまた、リガンド依存性安定化に対して試験され得る。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、タンパク質安定性に影響を及ぼすホスホジエステラーゼにおける既知の変異体は、新規のｈＰＤＥ由来のＤＤを特定するために利用され得る。予め特定された変異としては、ｈＰＤＥ５（Ｉ７７８Ｔ）、またはｈＰＤＥ６Ｃ（Ｈ６０２Ｌ）、ｈＰＤＥ６Ｃ（Ｅ７９０Ｋ）、ｈＰＤＥ６Ｃ（Ｒ１０４Ｗ）、ｈＰＤＥ６Ｃ（Ｙ３２３Ｎ）、及びｈＰＤＥ６Ｃ（Ｐ３９１Ｌ）またはｈＰＤＥ４Ｄ（Ｓ７５２Ａ）、ｈＰＤＥ４Ｄ（Ｓ７５４Ａ）、ｈＰＤＥ４Ｄ（Ｓ７５２Ａ、Ｓ７５４Ａ）、及びｈＰＤＥ４Ｄ（Ｅ７５７Ａ、Ｅ７５８Ａ、Ｄ７５９Ａ）が挙げられるが、これらに限定されない（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４３７９−４３９０、Ａｌｅｘａｎｄｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｌａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  ２２（４）：５１９−３０、Ｃｈｅｇｕｒｕ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ；６４：１−８、その内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、新規のＤＤは、カルシウム及びカルモジュリン依存性ホスホジエステラーゼとしても周知であるｈＰＤＥ１から生成され得る。ｈＰＤＥ１は、３つのサブタイプであるｈＰＤＥ１Ａ、ｈＰＤＥ１Ｂ、及びｈＰＤＥ１Ｃを有する。酵素は、３つの機能ドメインである保存触媒コア、調節Ｎ末端及びＣ末端を含む。ｈＰＤＥ１の触媒ドメインは、３つのらせんサブドメインであるＮ末端サイクリン折り畳み領域、リンカー領域、及びＣ末端らせん束を有する。ビンポセチンは、ｈＰＤＥ１の既知の阻害剤である。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、新規のＤＤは、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの両方を加水分解する二重基質酵素であるｈＰＤＥ２から生成され得る。このｈＰＤＥの特徴的な特性は、そのＧＡＦドメインのうちの１つに結合するｃＧＭＰによってアロステリックに刺激されることである。ｈＰＤＥ２  ＧＡＦ−Ｂドメインの結晶構造は、ＧＡＦ−Ｂドメインが高い親和性及び選択性を有するｃＧＭＰに結合することを示す。例示的なｈＰＤＥ２阻害剤は、ＥＨＮＡ（エリスロ−９−（２−ヒドロキシ−３−ノニル）アデニン）、オキシインドール、ＰＤＰ、及びＢＡＹ６０−７５５０を含む。ｈＰＤＥ２アイソフォームを選択的に阻害する阻害剤はまた、例えば、ｈＰＤＥ２Ａ選択的阻害作用を有する置換されたピリド（２，３−ｂ）ピラジンを使用してもよい（例えば、米国特許第９，５２７，８４１号、当該出願の内容は、参照によりその全体が組み込まれる）。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、新規のＤＤは、ｃＡＭＰを優先的に加水分解するｈＰＤＥ３から生成され得る。他のｈＰＤＥファミリーメンバーと同様に、このＤＤは、３つの機能ドメインである保存触媒コア、調節末端、及びＣ末端を含む。ｈＰＤＥの触媒コアは、固有の４４−アミノ酸挿入に特徴付けられる。アムリノン、シロスタゾール、ミルリノン、エノキシモン、及びピモベンダンは、ｈＰＤＥ３酵素に対する阻害剤である。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、新規のＤＤは、免疫応答調節のための主要な二次メッセンジャーであるｈＰＤＥ４から生成され得、ｃＡＭＰの加水分解に関与する。ｈＰＤＥ４の４つのアイソフォームは、各アイソフォームが上流保存領域（ＵＣＲ）をさらに含み得る足場タンパク質との相互作用を媒介することによって細胞局在を特定する固有のＮ末端領域を有して存在する。すべてのアイソフォームは、不変の触媒ドメインを共有する。触媒ポケットは、基質と極めて重要な水素結合を形成する不変のグルタミン（Ｑ３６９）を含む、高度に保存され、不変の残基が並んでいる。ｈＰＤＥ阻害剤複合体の結晶構造の分析は、２つの保存残基が阻害剤結合に必須であることを示唆している。不変のグルタミンによる水素結合の形成は、阻害剤の配向性を決定し、保存された疎水性残基（Ｉ３３６及びＦ３４０）は、ポケット中で阻害剤を固定する疎水性クランプを形成する。多くの小分子は、ｈＰＤＥ４活性を阻害することができ、これらのいくつかは、ＦＤＡに承認されており、例えば、ＡＮ２７２８（４−［（１−ヒドロキシ−１，３−ジヒドロ−２，１−ベンゾオキサボロール−５−イル）オキシ］ベンゾニトリル）、Ａｐｒｅｍｉｌａｓｔ／ＣＣ１０００４（Ｎ−｛２−［（１Ｓ）−１−（３−エトキシ−４−メトキシフェニル）−２−（メチルスルホニル）エチル］−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イソインドール−４−イル｝アセトアミド）、及びロフルミラストである。ｈＰＤＥ４を阻害する他の小分子はまた、Ｅ６００５／ＲＶＴ５０１、シロミラスト／ＳＢ−２０７、４９９、イブジラスト（ＡＶ−４１１またはＭＮ−１６６）、メセンブレノン、ピクラミラスト／ＲＰ７３４０１、ロリプラム、アチゾラム／ＣＰ−８０６３３、アロフィリン、ＣＣ−１０８８、カトラミラスト、ＣＧＨ−２４６６、シパンフィリン、ドロタベリン、フィラミナスト／ＷＡＹ−ＰＤＡ  ６４１、ＨＴ−０７１２、ＤＮＳ−００１、ＩＣＩ−６３１９７、インディミラスト、イルソグラジン／ＭＮ１６９５、リリミラスト／ＢＡＹ１９−８００４、オグレミラスト、レバミラスト、Ｒｏ２０−１７２４、ロノミラスト、ＧＳＫ２５６０６６、ＤＣ−ＴＡ−４６、ＡＷＤ  １２−２８１、及びＹＭ−９７６も含む。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、新規のＤＤは、ｈＰＤＥ６から生成され得る。このホロ酵素は、ｈＰＤＥ６アルファ、ｈＰＤＥ６ベータ、及び／またはｈＰＤＥ６ガンマの２つの同一の阻害サブユニットを含む。ｈＰＤＥ６アルファ及びベータ型は、２つのＮ末端ＧＡＦドメイン及び１つのＣ末端触媒ドメインの３つのドメインを含む。非触媒ＧＡＦドメインは、ｃＧＭＰ結合に関与する。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、新規のＤＤは、ｈＰＤＥ７Ａ及びｈＰＤＥ７Ｂの２つの遺伝子からなるｃＡＭＰ特異的ｈＰＤＥであるｈＰＤＥ７から生成され得る。コンセンサスＰＫＡリン酸化部位がこの領域に存在するが、他のｈＰＤＥファミリーの大部分に構築されるため、Ｎ末端上に既知の調節ドメインが存在しない。いくつかの小分子は、ＢＲＬ−５０４８１（Ｎ，Ｎ，２−トリメチル−５−ニトロベンゼンスルホンアミド）及びＡＳＢ１６１６５（１Ｈ−チエノ（２，３−Ｃ）ピラゾール−５−カルボキサミド、１−シクロヘキシル−Ｎ−（６−（４−ヒドロキシ−１−ピペリジニル）−３−ピリジニル）−３−メチル）を含む、ＰＤＥ７を阻害し得る。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、新規のＤＤは、ｈＰＤＥ８から生成され得る。ｈＰＤＥ８の２つのサブファミリーが存在し、それらは共に、基質ｃＡＭＰに対して非常に高い親和性を有し、非特異的ＰＤＥ阻害剤ＩＢＭＸに無感受性である。各タンパク質は、触媒コア、ＰＡＳ（Ｐｅｒ、Ａｒｎｔ、及びＳｉｍ）ならびにＲＥＣ（レシーバー）ドメインを含む。ｈＰＤＥ８の触媒コアの結晶構造は、ｈＰＤＥ８阻害剤結合と阻害剤に結合した他のｈＰＤＥタンパク質を区別する固有の残基として、Ｔｙｒ７４８残基を特定した。ＰＦ−０４９５７３２５（Ｐｆｉｚｅｒ）は、ｈＰＤＥ８の小分子阻害剤である。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、新規のＤＤは、ｃＧＭＰに対して最高の親和性を有するｈＰＤＥ９から生成され得る。ｈＰＤＥ９Ａの一次構造は、いかなるＧＡＦドメインも他のｈＰＤＥに見出される他のＮ末端調節配列も含むとは思われないため、単純である。触媒ポケットは、基質と極めて重要な水素結合を形成するｈＰＤＥ９Ａ２中に不変のグルタミンＧｌｎ４５３を含む、高度に保存され、不変の残基が並んでいる。不変のグルタミンによる水素結合の形成は、阻害剤の配向性を決定し、保存された疎水性残基は、ポケット中で阻害剤を固定する疎水性クランプを形成し、ｈＰＤＥ９Ａ中のＦ４５６に対してそれらの環構造を押し込む。試験したｈＰＤＥ９阻害剤は、ＢＡＹ７３−６６９１（１−（２−クロロフェニル）−６−［（２Ｒ）−３，３，３−トリフルオロ−２−メチルプロピル］−１，５−ジヒドロ−４Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン）、ＰＦ−０４４４７９４３（６−［（３Ｓ，４Ｓ）−４−メチル−１−（ピリミジン−２−イルメチル）ピロリジン−３−イル］−１−（オキサン−４−イル）−２Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン）、及びＷＹＱ−Ｃ２８Ｌを含んでもよい。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、新規のＤＤは、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの両方を加水分解することができるｈＰＤＥ１０から生成され得る。いくつかの他のｈＰＤＥファミリータンパク質と同様に、ｈＰＤＥ１０は、Ｎ末端領域に２つのＧＡＦドメイン、タンパク質キナーゼＡリン酸化部位及び触媒ドメインを含む。触媒ポケットは、基質と極めて重要な水素結合を形成する、ｈＰＤＥ１０Ａ２中に不変のグルタミンＱ７２６を含む、高度に保存され、不変の残基が並んでいる。いくつかのＰＤＥ１０阻害剤は、臨床試験下で、ＯＭＳ８２４、パパベリン、及びＰＦ−２５４５９２０（２−（４−（１−メチル−４−ピリジン−４−イル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）フェノキシメチル）キノロン）を含んでいる。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、新規のＤＤは、ｈＰＤＥ１１から生成され得る。ｈＰＤＥ１０と同様に、最近発見されたｈＰＤＥ１１は、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの両方を加水分解することができる。それは、４つのアイソフォームバリアントを有する１つの遺伝子のみからなる。最長のバリアントであるｈＰＤＥ１１Ａ４は、２つのＮ末端ＧＡＦドメインを有するが、一方、他のバリアントは、可変長のこのバリアントを切断する。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のｈＰＤＥ５に関連する不安定化変異は、不安定化ドメインを生成するために他のホスホジエステラーゼに構造的にマッピングされ得る。一実施形態において、ｈＰＤＥ５を不安定化し、続いて、シルデナフィル及び／またはバルデナフィルの存在下で安定化をもたらす変異は、ｈＰＤＥ６に操作され得る。一実施形態において、ｈＰＤＥ５を不安定化し、続いて、タダラフィルの存在下で安定化をもたらす変異は、ｈＰＤＥ１１に操作され得る。
【０１２８】
新規のＤＤを得るために利用され得る完全長ｈＰＤＥ及びそれらの触媒ドメインを、表４に列挙する。
【表４−１】
2020525536.tif 000027
【表４−２】
2020525536.tif 000028
【表４−３】
2020525536.tif 000029
【表４−４】
2020525536.tif 000030
【表４−５】
2020525536.tif 000031
【表４−６】
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【表４−７】
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【表４−８】
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【表４−９】
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【表４−１０】
2020525536.tif 000036
【表４−１１】
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【０１２９】
いくつかの実施形態において、ｈＰＤＥ５由来の不安定化ドメインは、ｈＰＤＥ５のバリアント及び／またはアイソフォームに由来し得る。ｈＰＤＥ５アイソフォーム１、ｈＰＤＥ５アイソフォーム２、及びｈＰＤＥ５アイソフォーム３の３つのアイソフォームは、それらのＮ末端領域が異なり、３つすべて、固有の第１のエクソン、続いて、８２３個のアミノ酸の一般的な配列を有する。したがって、ｈＰＤＥ５由来のＤＤは、ｈＰＤＥ５アイソフォーム１（配列番号２のヌクレオチド配列によってコードされる、配列番号１、ｈＰＤＥ５アイソフォーム２（配列番号１４８のヌクレオチド配列もしくは配列番号３８０のヌクレオチド配列のヌクレオチド１１３〜２６１１によってコードされる、配列番号１４７）、及び／またはｈＰＤＥ５アイソフォーム３（配列番号１５０もしくは配列番号３８１のヌクレオチド９５〜２５６３によってコードされる、配列番号１４９）に由来し得る。いくつかの実施形態において、ｈＰＤＥ５  ＤＤは、ｈＰＤＥ５アイソフォームＸ１（配列番号３８２）に由来し得る。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、本明細書で特定されるＤＤ変異は、ｈＰＤＥ５配列に戻ってマッピングして、ＤＤホットスポットを特定することができる。本明細書で使用される、ＤＤホットスポットは、変異がｈＰＤＥ５から生成された刺激応答エレメントの「応答性」の性質をもたらす配列番号１のｈＰＤＥ５内のアミノ酸を指す。ＤＤ特徴付けは、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、メチオニン、トリプトファン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、バリン、プロリン、及びグリシンを含むが、これらに限定されない、既知のアミノ酸のうちのいずれかに、ホットスポット位置でアミノ酸を変異することを含む、飽和突然変異誘発によって改善され得る。場合によっては、ホットスポット変異のライブラリーは、部位特異的突然変異誘発によって生成され得、ライブラリー内の変異体のそれぞれが、レポータータンパク質、例えば、ＳＧなどのリンカーを介してＡｃＧＦＰ（配列番号７９）に融合する。ＤＤの特定は、シルデナフィル、バルデナフィル、及びタダラフィルなどのリガンドの存在及び不在下で分析され得る。いくつかの実施形態において、配列番号１のｈＰＤＥ５の７３２位（Ｒ７３２とも称される）のアルギニンを、既知のアミノ酸のうちのいずれかに変異し得、表５Ａに提供する。アミノ酸Ｒ７３２の変異は、Ｒ７３２Ｌ、Ｒ７３２Ａ、Ｒ７３２Ｇ、Ｒ７３２Ｖ、Ｒ７３２Ｉ、Ｒ７３２Ｐ、Ｒ７３２Ｆ、Ｒ７３２Ｗ、Ｒ７３２Ｙ、Ｒ７３２Ｈ、Ｒ７３２Ｓ、Ｒ７３２Ｔ、Ｒ７３２Ｄ、Ｒ７３２Ｅ、Ｒ７３２Ｑ、Ｒ７３２Ｎ、Ｒ７３２Ｍ、Ｒ７３２Ｃ、及びＲ７３２Ｋを含み得るが、これらに限定されない。Ｎ末端またはＣ末端のいずれかでリンカー及びＧＦＰに融合したｈＰＤＥ５変異体を、表６に提供する。表５Ａ中において、変異は、太字である。表５Ｂは、表６に記載される構築物を生成するために、表５Ａに列挙された変異体と組み合わせてもよいさらなる成分を提供する。表６において、アスタリスクは、終止コドンの翻訳を示す。表６はまた、所与の構築物番号の代替のエイリアスも提供する。これらのエイリアスは、接頭辞ＯＴによって特定される。
【表５Ａ−１】
2020525536.tif 000038
【表５Ａ−２】
2020525536.tif 000039
【表５Ａ−３】
2020525536.tif 000040
【表５Ａ−４】
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【表５Ａ−５】
2020525536.tif 000042
【表５Ａ−６】
2020525536.tif 000043
【表５Ａ−７】
2020525536.tif 000044
【表５Ｂ】
2020525536.tif 000045
【表６−１】
2020525536.tif 000046
【表６−２】
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【表６−３】
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【表６−４】
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【表６−５】
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【表６−６】
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【表６−７】
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【表６−８】
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【表６−９】
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【表６−１０】
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【表６−１１】
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【表６−１２】
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【表６−１３】
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【表６−１４】
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【表６−１５】
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【表６−１６】
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【表６−１７】
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【表６−１８】
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【表６−１９】
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【表６−２０】
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【表６−２１】
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【表６−２２】
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【表６−２３】
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【表６−２４】
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【表６−２５】
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【表６−２６】
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【０１３１】
いくつかの実施形態において、表１、２、及び５Ａで教示された変異のうちのいずれかが、組み合わせられ得る。一実施形態において、組み合わせ変異を、表７に提供する。組み合わせ変異は、配列番号３７２のヌクレオチド配列によってコードされるＡｃＧＦＰ（ＷＴのアミノ酸２〜２３９）（配列番号７９）、配列番号９４のヌクレオチド配列によってコードされるＡｃＧＦＰ（ＷＴのアミノ酸１〜２３９）（配列番号３６５）、または配列番号２２４のヌクレオチド配列によってコードされる蛍ルシフェラーゼ、Ｆｌｕｃ（Ｎ５０Ｄ、Ｎ１１９Ｇ、Ｓ５４８Ｉ、Ｋ５４９Ａ、Ｌ５５０Ｖ）（配列番号２２３）に連結され得る。いくつかの実施形態において、構築物の部分は、例えば、ヌクレオチド配列によってコードされるＳＧリンカー（ＡＧＴＧＧＴ）を通して連結され得る。いくつかの実施形態において、表７に記載される構築物は、ヌクレオチド配列によってコードされる、Ｘｂａ  Ｉ制限酵素認識部位であるＳＲ、ＴＣＴＡＧＡを含み得る。表７は、組み合わせ変異を含む構築物を提供する。表７において、終止コドンの翻訳は、アスタリスクによって示される。所与の構築物番号の代替のエイリアスも、表７に提供する。これらのエイリアスは、接頭辞ＯＴによって特定される。
【表７−１】
2020525536.tif 000072
【表７−２】
2020525536.tif 000073
【表７−３】
2020525536.tif 000074
【表７−４】
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【表７−５】
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【表７−６】
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【表７−７】
2020525536.tif 000078
【表７−８】
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【表７−９】
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【表７−１０】
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【０１３２】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の変異は、切断型ｈＰＤＥ５ドメインとの関連において試験され得る。本明細書で使用される場合、切断型ｈＰＤＥ５ドメインは、配列番号１のｈＰＤＥ５の領域及び／または部分を指し、表８に例示される。リンカーを介してＡｃＧＦＰに融合したｈＰＤＥ５の領域または部分を使用する構築物も、表８に提供する。表８において、終止コドンの翻訳は、アスタリスクによって示される。表８はまた、所与の構築物番号の代替のエイリアスも提供する。これらのエイリアスは、接頭辞ＯＴによって特定される。
【表８−１】
2020525536.tif 000082
【表８−２】
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【表８−３】
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【表８−４】
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【表８−５】
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【表８−６】
2020525536.tif 000087
【０１３３】
刺激物質
本発明のバイオサーキットは、１つ以上の刺激物質によって引き起こされる。刺激物質は、リガンド、外部から加えられたまたは内因性の代謝産物、明確なリガンド、ｐＨ、温度、光、イオン強度、放射能、細胞部位、対象部位、微環境の存在または不在、１つ以上の金属イオンの存在または濃度から選択され得る。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、刺激物質は、リガンドである。リガンドは、核酸ベース、タンパク質ベース、リガンドベース、有機、無機、または上述の任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、リガンドは、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、脂質誘導体、ステロール、代謝産物誘導体、及び小分子からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、刺激物質は、小分子である。いくつかの実施形態において、小分子は、細胞透過性である。本発明において有用なリガンドは、２０１６年４月１１日に出願された共同所有の米国仮特許出願第６２／３２０，８６４号、２０１７年３月３日に出願された第６２／４６６，５９６号、及び国際特許公開第ＷＯ２０１７／１８０５８７号（当該出願の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）において教示されているもののうちのいずれかを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、小分子は、ＦＤＡで承認されており、安全に経口投与される。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、リガンドは、ホスホジエステラーゼに結合する。いくつかの実施形態において、リガンドは、ホスホジエステラーゼに結合し、ホスホジエステラーゼ機能を阻害し、これは、本明細書において、ホスホジエステラーゼ阻害剤と称される。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、リガンドは、ホスホジエステラーゼ５に結合する小分子である。一実施形態において、小分子は、ｈＰＤＥ５阻害剤である。ｈＰＤＥ５阻害剤の例としては、シルデナフィル、バルデナフィル、タダラフィル、アバナフィル、ロデナフィル、ミロデナフィル、ウデナフィル、ベンザミデナフィル、ダサンタフィル、ベミナフィル、ＳＬｘ−２１０１、ＬＡＳ  ３４１７９、ＵＫ−３４３，６６４、ＵＫ−３５７９０３、ＵＫ−３７１８００、及びＢＭＳ−３４１４００が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、リガンドは、ｈＰＤＥ５への結合を媒介することが周知であるリガンドの部分を含むシルデナフィル由来のリガンドを含む。リガンドはまた、ホスホジエステラーゼへのオフターゲット結合を軽減し、ｈＰＤＥ５に特異的な結合を増加させるように修飾されてもよい。
【０１３８】
ｈＰＤＥ５阻害剤は、承認された用量及び作用のそれらの持続時間に対して広範な薬物動態空間を網羅し、表９に記載されている。表９において、ＰＯは、経口（すなわち、口によって）を表し、ＱＤは、ｑｕａｑｕｅ  ｄｉｅ（すなわち、毎日）を表し、ＩＶは、静脈内を表し、ＴＩＤは、ｔｅｒ  ｕｎ  ｄｉｅ（すなわち、１日３回）を表し、Ｃｍａｘは、投与後に、薬物が達成するピーク血清濃度を表す。
【表９】
2020525536.tif 000088
【０１３９】
いくつかの実施形態において、リガンドの選択は、表９に記載のＰＫパラメータを使用して本発明のエフェクターモジュールの発現の大きさ及び持続時間によって決定される。いくつかの実施形態において、ペイロードの高いレベルの発現は、短期の持続時間、所望であり得る。このような場合に、バルデナフィルが、リガンドとして選択され得る。いくつかの実施形態において、ペイロードの高いレベルの発現は、長期の持続時間、所望であり得る。このような場合に、リガンドであるタダラフィルが、選択され得る。いくつかの実施形態において、ペイロードの低いレベルの発現が、長期の持続時間、所望であり得る。このような場合に、シルデナフィルが、リガンドとして選択され得る。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、さらなるｈＰＤＥ５阻害剤は、特定のホスホジエステラーゼタンパク質に対する選択性を示すため、リガンドによる処理の持続時間を軽減または増加させるため、リガンドの発現率を向上させるために開発され得る。
【０１４１】
リガンドはまた、構造活性相関（ＳＡＲ）研究を通して、その分子／化学構造における既知のｈＰＤＥ５リガンドの活性への依存性の分析から選択され得る。当該技術分野で既知のＳＡＲに関連した方法のうちのいずれかは、本発明の安定化リガンドを特定するために利用され得る。ＳＡＲは、特異性、有効性、薬物動態、バイオアベイラビリティ、及び安定性などのリガンドの特性を向上させるように利用され得る。既知のｈＰＤＥ５阻害剤のＳＡＲ分析はまた、リガンドと複合体形成されたｈＰＤＥ５の高解像度Ｘ線構造と組み合わせられ得る。シルデナフィル、タダラフィル、及びバルデナフィルと共結晶化したｈＰＤＥ５のＸ線構造が、研究され、阻害剤の結合様式が、特定されている（Ｚｈａｎｇ，Ｋ．Ｙ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，１５，２７９、Ｃａｒｄ，Ｇ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．１２，２２３３、それらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。記載のいくつかのクラスのｈＰＤＥ５阻害剤がある。これらは、異なる骨格構造を有するアリール、ベリル、ヘテロアリール、またはヘテロビアリールのクラスを含む。アリールクラスは、置換ニトロアニリンを含み、ビアリールクラスは、置換ナフタレンを含む。ヘテロビアリール及びヘテロトリアリールは、その融合システムに基づいて、ピラゾロピリミジノン、トリアゾロピリミジノン、イミダゾトリアジン、プリン、ピロロピリミジノン、トリアゾロトリジノン、イソキサゾロピリミジノン、β−カルボリン、ピロロキノロン、イソキノリン、キナゾリン、イミダゾキナゾリノン、ピラゾロピリジン、ピラゾロピリドピリミジノンにさらに亜分類される。これらの大きく異なる化学構造は、ｈＰＤＥ５酵素の結合部位で異なる配向性を有することが示唆されている。シルデナフィルは、ピラゾロピリミジノン環、エトキシフェニル環、及びメチルピペラジン環の３つの主な化学基を有する。ピラゾロピリミジノン基は、ｈＰＤＥ５の活性結合部位への薬物の結合に関与する。
【０１４２】
多くのｈＰＤＥ阻害剤は、酵素の触媒部位において、基質ｃＧＭＰと競合することによって作用する。シルデナフィル及びバルデナフィルは、ｃＧＭＰのプリン環を模倣するために使用される複素環式環系が異なる。それらはまた、ピペラジン側鎖の置換基（エチル／メチル）も異なる。これらは、唯一の構造差であるが、バルデナフィルは、シルデナフィルよりもさらに強力である。いくつかの実施形態において、ｈＰＤＥの異なる既知の阻害剤の間の構造差は、より良好なｈＰＤＥ阻害剤ベースのリガンドを設計するために利用され得る。例えば、Ｃｏｒｂｉｎらは、シルデナフィル環系を含むが、バルデナフィルに見出される付加されたエチル基を有するシルデナフィルの類似体を合成し、バルデナフィル環系を含むが、シルデナフィルに見出される付加されたメチル基を有するバルデナフィル（ジメチル−バルデナフィル）もまた生成された。これらの研究は、この環系が、シルデナフィルを上回ってバルデナフィルのより高度な力価において重要な役割を担うことを特定した（Ｃｏｒｂｉｎ  ＪＤ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  Ｉｎｔ；４５（６）：８５９−６３、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。シルデナフィルと複合体形成されたｈＰＤＥのＸ線結晶構造に基づいて、活性部位領域は、参照リガンドであるシルデナフィルから６．５オングストローム内の球として定義された。ｈＰＤＥ５活性部位の潜在的に物理化学的な特性マップである表面疎水性（親油性）が、この情報に基づいて生成され得る。シルデナフィルのエトキシフェニル基は、Ｐｈｅ７８６、Ａｌａ７８３、Ｌｅｕ８０４、及びＶａｌ７８２によって形成された疎水性ポケットに適合し、ピラゾロピリミジノン環はまた、結合ポケットにおいて、Ｖａｌ７８２、Ｔｙｒ６１２、及びＰｈｅ８２０の側鎖との疎水性相互作用も形成する。
【０１４３】
新規のｈＰＤＥ５阻害剤はまた、既知のｈＰＤＥ５阻害剤の一連の類似体を使用して開発され得る。３Ｄ−定量的構造活性分析（ＱＳＡＲ）、ＣｏＭＦＡ（比較分子磁場分析）、及びＣｏＭＳＩＡ（比較分子類似性指数）は、この目的のために実施され得る。一実施形態において、ｈＰＤＥ５阻害剤の構造は、Ｎ５位でピロロピリミジノン環中のＮエチル基及び置換基を担持するプロポキシフェニル基、シルデナフィルの対応する位置と比較して、それぞれ、より長い１つのメチレンユニットを優先的に組み込み得る。Ｋｏｏ  Ｊらによって教示されるシルデナフィル構造への修飾のうちのいずれかは、本発明において有用であり得る（Ｋｏｏ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｂｉｏｏｒｇ．＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ  １７；４２７１−４２７４、その内容は、参照によりその全体が組み込まれる）。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、刺激物質は、１つを超えるホスホジエステラーゼに結合するリガンドであり得る。一実施形態において、刺激物質は、２つ以上のｈＰＤＥ、例えば、アミノフィリン、パラキサンチン、ペントキシフィリン、テオブロミン、ジピリダモール、テオフィリン、ザプリナスト、イカリイン、ＣＤＰ−８４０、エタゾレート、及びグラウシンに結合し得る、汎ホスホジエステラーゼ阻害剤である。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、リガンドは、ｈＰＤＥ１阻害剤である。例示的なｈＰＤＥ１阻害剤であるビンポセチンは、場合によっては、本発明におけるリガンドとして使用してもよい。いくつかの実施形態において、リガンドは、ｈＰＤＥ２阻害剤である。例示的なｈＰＤＥ２阻害剤は、ＥＨＮＡ（エリスロ−９−（２−ヒドロキシ−３−ノニル）アデニン）、オキシインドール、ＰＤＰ、及びＢＡＹ６０−７５５０を含む。ｈＰＤＥ２アイソフォームを選択的に阻害する阻害剤はまた、例えば、ｈＰＤＥ２Ａ選択的阻害作用を有する置換ピリド（２，３−ｂ）ピラジンを使用してもよい（例えば、米国特許第９，５２７，８４１号、当該出願の内容は、参照によりその全体が組み込まれる）。いくつかの実施形態において、リガンドは、ｈＰＤＥ３阻害剤である。本発明において有用なｈＰＤＥ３阻害剤には、アムリノン、シロスタゾール、ミルリノン、エノキシモン、及びピモベンダンが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、リガンドは、ｈＰＤＥ４阻害剤である。例示的なｈＰＤＥ４阻害剤は、ＡＮ２７２８（４−［（１−ヒドロキシ−１，３−ジヒドロ−２，１−ベンゾオキサボロール−５−イル）オキシ］ベンゾニトリル）、Ａｐｒｅｍｉｌａｓｔ／ＣＣ１０００４（Ｎ−｛２−［（１Ｓ）−１−（３−エトキシ−４−メトキシフェニル）−２−（メチルスルホニル）エチル］−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イソインドール−４−イル｝アセトアミド）、及びロフルミラストなどであるが、これらに限定されない、ＦＤＡで承認された小分子を含む。他の例示的なｈＰＤＥ４阻害剤は、ｈＰＤＥ４を阻害する他の小分子はまた、Ｅ６００５／ＲＶＴ５０１、シロミラスト／ＳＢ−２０７、４９９、イブジラスト（ＡＶ−４１１またはＭＮ−１６６）、メセンブレノン、ピクラミラスト／ＲＰ７３４０１、ロリプラム、アチゾラム／ＣＰ−８０６３３、アロフィリン、ＣＣ−１０８８、カトラミラスト、ＣＧＨ−２４６６、シパンフィリン、ドロタベリン、フィラミナスト／ＷＡＹ−ＰＤＡ  ６４１、ＨＴ−０７１２、ＤＮＳ−００１、ＩＣＩ−６３１９７、インディミラスト、イルソグラジン／ＭＮ１６９５、リリミラスト／ＢＡＹ１９−８００４、オグレミラスト、レバミラスト、Ｒｏ２０−１７２４、ロノミラスト、ＧＳＫ２５６０６６、ＤＣ−ＴＡ−４６、ＡＷＤ  １２−２８１、及びＹＭ−９７６を含む。も含む。国際特許公開第ＷＯ２０１４０７８２２０Ａ１号及び米国特許公開第ＵＳ２０１７０１２９８８７Ａ１号に記載のｈＰＤＥ４阻害剤のうちのいずれかは、本発明において有用され得る（当該出願の各々の内容は、参照によりそれらの全体が組み込まれる）。いくつかの実施形態において、リガンドは、ｈＰＤＥ６阻害剤である。いくつかの実施形態において、リガンドは、ｈＰＤＥ７阻害剤である。例示的なｈＰＤＥ７阻害剤は、ＢＲＬ−５０４８１（Ｎ，Ｎ，２−トリメチル−５−ニトロベンゼンスルホンアミド）及びＡＳＢ１６１６５（１Ｈ−チエノ（２，３−Ｃ）ピラゾール−５−カルボキサミド、１−シクロヘキシル−Ｎ−（６−（４−ヒドロキシ−１−ピペリジニル）−３−ピリジニル）−３−メチル）を含む。いくつかの実施形態にお��て、リガンドは、ＰＦ−０４９５７３２５（Ｐｆｉｚｅｒ）などのｈＰＤＥ８阻害剤である。いくつかの実施形態において、リガンドは、ｈＰＤＥ９阻害剤である。例示的なｈＰＤＥ９阻害剤には、ＢＡＹ７３−６６９１（１−（２−クロロフェニル）−６−［（２Ｒ）−３，３，３−トリフルオロ−２−メチルプロピル］−１，５−ジヒドロ−４Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン）、ＰＦ−０４４４７９４３（６−［（３Ｓ，４Ｓ）−４−メチル−１−（ピリミジン−２−イルメチル）ピロリジン−３−イル］−１−（オキサン−４−イル）−２Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４−オン）、及びＷＹＱ−Ｃ２８Ｌが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、リガンドは、ｈＰＤＥ１０阻害剤である。例示的なＰＤＥ１０阻害剤には、ＯＭＳ８２４、パパベリン、及びＰＦ−２５４５９２０（２−（４−（１−メチル−４−ピリジン−４−イル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）フェノキシメチル）キノロン）、及びＧＳ−５７５９（Ｇｉｌｅａｄ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４６】
一実施形態において、本発明の刺激物質は、特異性ＤＤまたはＤＤ内の標的領域に結合することができるＦＤＡで承認されたリガンドであり得る。他の実施形態において、ＦＤＡで承認されたリガンドは、ヒトタンパク質における潜在的な結合剤をスクリーニングするために使用してもよい。ＤＤは、リガンドに結合するタンパク質の一部を使用してスクリーニングからのポジティブヒットに基づいて設計されてもよい。一実施形態において、オフターゲット相互作用としてＦＤＡで承認されたリガンドに結合するタンパク質は、本発明のＤＤを設計するために使用してもよい。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、免疫細胞及び／またはキメラ抗原受容体の活性に影響を及ぼさないリガンドは、ＳＲＥの不在下で優先的に選択され得る。
【０１４８】
安定化ドメイン
いくつかの実施形態において、刺激応答エレメントは、刺激物質の不在下で安定化され得るが、刺激物質によって不安定化され得る。いくつかの実施形態において、ＳＲＥは、少なくとも１つのタンパク質間相互作用を含むタンパク質複合体に由来し得る。他の態様において、ＳＲＥは、細胞内の天然タンパク質を用いてタンパク質間相互作用を形成し得る。タンパク質複合体は、遊離単量体状態の濃度を軽減することによって望ましくないオリゴマー化のリスクに構成タンパク質の曝露を軽減する。このようなＳＲＥに付加されたペイロードは、刺激物質の不在下で安定化され得る。いくつかの態様において、刺激物質は、ＳＲＥに関連したタンパク質間相互作用を妨げるまたは分断することができる小分子であり得る。このような場合に、刺激物質の付加は、ペイロードの軽減した発現及び／または機能をもたらす。いくつかの実施形態において、ＳＲＥの構造変化を誘導する刺激物質が、使用され得る。一態様において、ＳＲＥは、構造変化によって安定化され得る。別の態様において、ＳＲＥは、構造変化によって不安定化され得る。刺激物質はまた、ＳＲＥに関連したタンパク質間相互作用の分断をもたらし得るＳＲＥの翻訳後修飾を分断する小分子であり得る。いくつかの実施形態において、ＳＲＥは、当該技術分野で周知のタンパク質相互作用技術を使用して特定され得る。このような方法は、治療的に関連性のあるタンパク質相互作用の特定を可能にし得る。国際特許公開第ＷＯ２０１７２１０４２７Ａ１号、同第ＷＯ２０１６１９６９９４Ａ９号、及び同第ＷＯ２０１４２００９８７Ａ３号に記載の大規模の定量的プロテオミクス法のうちのいずれかは、本発明において有用され得る（当該出願の各々の内容は、参照によりそれらの全体が組み込まれる）。
【０１４９】
ペイロード
いくつかの実施形態において、ペイロードは、生物ゲノム、融合ポリペプチド、抗体、またはそのバリアント、変異体、及び誘導体における任意の天然タンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、本発明のエフェクターモジュールは、少なくとも１つのペイロードに作動可能に連結された本発明のＤＤを含む融合構築物である。一態様において、ペイロードは、任意の天然の対象となるタンパク質（ＰＯＩ）もしくはそれらのバリアント、抗体及びそれらのバリアント、治療剤、または任意の人工ペプチドもしくはポリペプチドであり得る。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、免疫治療剤であり得る。本明細書で使用される場合、免疫治療剤は、生物における免疫応答を誘導する任意の薬剤である。免疫治療剤は、生物における天然タンパク質であり得るか、またはそれは、融合タンパク質もしくは抗体などの人工タンパク質であり得る。免疫治療剤は、抗体ならびにそれらの断片及びバリアント、ＭＨＣ分子、その抗原及び断片、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、腫瘍特異的ＴＣＲ及びそのバリアント、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、キメラスイッチ受容体、共刺激分子、共抑制性分子、共抑制性受容体もしくはリガンドの阻害剤、共刺激受容体及びリガンドのアゴニスト、サイトカイン、ケモカイン、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、可溶性成長因子、代謝因子、ホーミング受容体、安全スイッチ（例えば、自殺遺伝子）、または免疫応答を誘導する任意の薬剤であり得るが、これらに限定されない。一実施形態において、免疫治療剤は、細胞または対象における抗がん免疫応答を誘導する。いくつかの態様において、免疫治療剤は、対象における腫瘍負荷を軽減する。
【０１５１】
ペイロードは、がん免疫療法のために使用される任意の免疫治療剤、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ剤受容体（ＣＡＲ）、例えば、腫瘍細胞の任意の分子を標的にするＣＤ１９  ＣＡＲ、抗体、抗原結合ドメインまたは抗原結合ドメインの組み合わせ、サイトカイン、例えば、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１５、またはＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ融合体、免疫チェックポイントのアンタゴニスト、共刺激分子のアゴニスト、キメラスイッチ受容体、安全スイッチ、代謝因子、成長因子、ケモカイン、ケモカイン受容体、ホーミング受容体、または免疫応答を誘導することができる任意の薬剤であり得る。ＳＲＥ及びペイロードは、１つ以上のリンカーを通して作動可能に連結され得、成分の位置は、エフェクターモジュール内で変化し得る。
【０１５２】
１．対象となるタンパク質
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、生物ゲノム、またはそのバリアント、変異体、及び誘導体における天然タンパク質であり得る。天然タンパク質は、例えば、哺乳動物生物、細菌、及びウイルスからのものであり得る。
【０１５３】
一例において、ペイロードは、対象となるタンパク質、またはヒトゲノムからのポリペプチドであり得る。
【０１５４】
２．抗体
いくつかの実施形態において、抗体、その断片及びバリアントは、本発明のペイロードである。抗体は、無傷抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、抗体断片、抗体バリアント、または抗体誘導体であり得る。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、抗体またはその断片であり得る。この方法において有用な抗体は、２０１６年４月１１日に出願された共同所有の米国仮特許出願第６２／３２０，８６４号、２０１７年３月３日に出願された第６２／４６６，５９６号、及び国際特許公開第ＷＯ２０１７／１８０５８７号（当該出願の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）において教示されているもののうちのいずれかを含むが、これらに限定されない。
【０１５６】
抗体断片及びバリアント
いくつかの実施形態において、抗体断片及びバリアントは、無傷抗体からの抗原結合領域を含み得る。抗体断片及びバリアントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ；線形抗体；単一鎖抗体分子、例えば、単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ）；ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体を含み得るが、これらに限定されない。抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片を生成し、それぞれ、単一抗原結合部位を有する。名称が容易に結晶化するための能力に反映する、残渣の「Ｆｃ」断片もまた、生成される。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原により架橋結合することができる、Ｆ（ａｂ’）２断片を得る。本発明の、薬学的組成物、バイオサーキット、バイオサーキット成分、エフェクターモジュール（それらのＳＲＥまたはペイロードを含む）は、これらの断片のうちの１つ以上を含み得る。
【０１５７】
本明細書での目的のために、「抗体」は、重鎖及び軽鎖可変ドメイン、ならびにＦｃ領域を含み得る。本明細書で使用される場合、「天然抗体」という用語は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖からなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質を指す。抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子は、周知であり、作製するセグメントは、それぞれ、よく特徴付けられ、説明されている（Ｍａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１９９８，１８８（１１）：２１５１−６２及びＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００４，１０３（１２）：４６０２−４６０９、それらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。各軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結されているが、一方、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖中でジスルフィド結合の数は、異なる。各重鎖及び軽鎖はまた、規則的に離間した鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）、続いて、多くの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を、他端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列している。
【０１５８】
本明細書で使用される場合、「可変ドメイン」という用語は、抗体間で配列が広範に異なる抗体重鎖及び軽鎖の両方に見出される特定の抗体ドメインを指し、特定の抗原に対する各特定の抗体の結合及び特異性において使用される。可変ドメインは、超可変領域を含む。本明細書で使用される場合、「超可変領域」という用語は、抗原結合に関与するアミノ酸残基を含む可変ドメイン内での領域を指す。超可変領域内に存在するアミノ酸は、抗体の抗原結合部位の一部となる相補性決定領域（ＣＤＲ）の構造を決定する。本明細書で使用される場合、「ＣＤＲ」という用語は、その標的抗原またはエピトープに対して相補的な構造を含む抗体の領域を指す。抗原と相互作用しない、可変ドメインの他の部分は、フレームワーク（ＦＷ）領域と称される。抗原結合部位（抗原結合部位またはパラトープとしても知られている）は、特定の抗原と相互作用することが必要であるアミノ酸残基を含む。抗原結合部位を作製する正確な残基は、典型的には、結合抗原と共結晶によって解明されるが、他の抗体との比較に基づいて計算評価はまた、使用することができる（Ｓｔｒｏｈｌ，Ｗ．Ｒ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｗｏｏｄｈｅａｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ＰＡ．２０１２．Ｃｈ．３，ｐ４７−５４、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＣＤＲを作製する残基の決定は、Ｋａｂａｔ（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＥＭ，１９７０，１３２（２）：２１１−２５０及びＪｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０００，２８（１）：２１４−２１８、それらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８７，１９６，９０１、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３４２，８７７、及びＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７，２７３（４）：９２７−９４８、それらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）、Ｌｅｆｒａｎｃ（Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２００５，１：３）、及びＨｏｎｅｇｇｅｒ（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００１，３０９（３）：６５７−７０、それらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）によって教示されるものが含まれるが、これらに限定されない、番号付けスキームの使用を含み得る。
【０１５９】
ＶＨ及びＶＬドメインは、それぞれ、３つのＣＤＲを有する。ＶＬ  ＣＤＲは、可変ドメインポリペプチドの間でＮ末端からＣ末端に移動するときの出現の順に、本明細書では、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３と称する。ＶＨ  ＣＤＲは、可変ドメインポリペプチドの間でＮ末端からＣ末端に移動するときの出現の順に、本明細書では、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３と称する。ＣＤＲの各々は、抗原結合ドメインにおける様々な三次元構造をもたらす抗体間の配列及び長さにおいて高度に可変し得るアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を除いて、好ましい標準的構造を有する（Ｎｉｋｏｌｏｕｄｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＰｅｅｒＪ．２０１４，２：ｅ４５６）。場合によっては、ＣＤＲ−Ｈ３は、抗体多様性を評価するために関連抗体のパネル間で分析され得る。ＣＤＲ配列を決定する様々な方法は、当該技術分野で周知であり、既知の抗体配列に適用され得る（Ｓｔｒｏｈｌ，Ｗ．Ｒ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｗｏｏｄｈｅａｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ＰＡ．２０１２．Ｃｈ．３，ｐ４７−５４、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１６０】
本明細書で使用される場合、「Ｆｖ」という用語は、完全抗原結合部位を形成するために要求とされる抗体上の最小限の断片を含む抗体断片を指す。これらの領域は、密に非共有会合において、１つの重鎖及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。Ｆｖ断片は、タンパク質分解的切断によって生成され得るが、大部分は不安定である。組換え方法は、典型的には、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメイン（単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を形成するために）の間の可撓性リンカーの挿入を介して、または重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの間にジスルフィド架橋の導入を通して安定したＦｖ断片を生成するために当該技術分野で周知である（Ｓｔｒｏｈｌ，Ｗ．Ｒ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｗｏｏｄｈｅａｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ＰＡ．２０１２．Ｃｈ．３，ｐ４６−４７、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１６１】
本明細書で使用される場合、「軽鎖」という用語は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ及びラムダと呼ばれる、２つの明らかに異なる型のうちの１つに割り当てられる任意の脊椎動物種からの抗体の成分を指す。それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、抗体は、異なるクラスに割り当てられ得る。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭの５つの主なクラスの無傷抗体があり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（イソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２にさらに分類され得る。
【０１６２】
本明細書で使用される場合、「単一鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、ＶＨ及びＶＬ抗体ドメインの融合タンパク質を指し、これらのドメインは、可撓性ペプチドリンカーによって単一のポリペプチド鎖に一緒に連結される。いくつかの実施形態において、Ｆｖポリペプチドリンカーは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、または他のディスプレイ方法と併せて利用され、これらは、表面メンバー（例えば、ファージコートタンパク質）と関連して発現し、所与の抗原についての高親和性ペプチドの同定において使用され得る。
【０１６３】
分子遺伝子学を使用して、２つのｓｃＦｖは、リンカードメインによって分離され「タンデムｓｃＦｖ」（ｔａｓｃＦｖ）と呼ばれる、単一ポリペプチドに縦一列で操作することができる。２つの異なるｓｃＦｖに対する遺伝子を有するｔａｓｃＦｖの構造により、「二重特異性単一鎖可変断片」（ｂｉｓ−ｓｃＦｖ）を得る。ただ、２つのｔａｓｃＦｖが、商業的な企業によって臨床的に開発され、両方は腫瘍兆候に対してＭｉｃｒｏｍｅｔによる活性初期段階発達において二重特異性製剤であり、「二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ｅｎｇａｇｅｒ）」（ＢｉＴＥ）として記載されている。ブリナツモマブは、２相でＢ細胞非ホジキンリンパ腫に対するＴ細胞応答を強化させる抗ＣＤ１９／抗ＣＤ３二重特異性ｔａｓｃＦｖである。ＭＴ１１０は、１相で固形腫瘍に対するＴ細胞応答を強化させる抗ＥＰ−ＣＡＭ／抗ＣＤ３二重特異性ｔａｓｃＦｖである。二重特異性、４価「ＴａｎｄＡｂｓ」はまた、Ａｆｆｉｍｅｄによって研究されている（Ｎｅｌｓｏｎ，Ａ．Ｌ．，ＭＡｂｓ．，２０１０，Ｊａｎ−Ｆｅｂ；２（１）：７７−８３）。ＩｇＧのマキシボディ（Ｆｃ（ＣＨ２−ＣＨ３ドメインのアミノ末端に融合した２価ｓｃＦｖ）もまた、含まれ得る。
【０１６４】
本明細書で使用される場合、「二重特異性抗体」という用語は、２つの異なる抗原を結合することができる抗体を指す。このような抗体は、典型的には、少なくとも２つの異なる抗体からの領域を含む。二重特異性抗体は、Ｒｉｅｔｈｍｕｌｌｅｒ，Ｇ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０１２，１２：１２−１８、Ｍａｒｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５．Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ．２００５，２６（６）：６４９−６５８、及びＳｃｈａｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ．２０１１，１０８（２７）：１１１８７−１１１９２（それらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載されたもののうちのいずれかを含む。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、三官能性抗体（３ｆｕｎｃｔ）及びＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）であり得る。
【０１６５】
本明細書で使用される場合、「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体断片を指す。ダイアボディは、官能性二重特異性単一鎖抗体（ｂｓｃＡｂ）である。ダイアボディは、同じポリペプチド鎖上で軽鎖可変ドメインＶＬに接続された重鎖可変ドメインＶＨを含む。同じ鎖上で２つのドメイン間での対合を可能にするには短いリンカーを使用することで、ドメインを、別の鎖の相補的なドメインと対合させ、２つの抗原結合部位を生じさせることができる。ダイアボディは、例えば、ＥＰ  ４０４，０９７、ＷＯ９３／１１１６１、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ”：Ｓｍａｌｌ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｄ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．ＰＮＡＳ，１９９３．９０：６４４４−６４４８）（それらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）にさらに十分に記載されている。
【０１６６】
「イントラボディ」という用語は、これが生成される細胞から分泌されず、代わりに１つ以上の細胞内タンパク質を標的にする抗体の形態を指す。イントラボディは、細胞内輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）、転写、翻訳、代謝過程、増殖シグナル伝達、及び細胞分裂を含むが、これらに限定されない、多数の細胞過程に影響を及ぼすために使用され得る。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、イントラボディに基づいた治療法を含み得る。いくつかのこのような実施形態において、本明細書に開示される可変ドメイン配列及び／またはＣＤＲ配列は、細胞内抗体に基づいた治療法のために１つ以上の構造体に組み込まれ得る。
【０１６７】
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な細胞（またはクローン）の集団から得られた抗体を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、モノクローナル抗体の生成中に発生し得る可能なバリアント、一般的に少量に存在するようなバリアントを除いて、同一である、及び／または同じエピトープに結合する。典型的に異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。
【０１６８】
「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均質な抗体集団から得られた抗体の特性を示し、任意の特定の方法によって抗体の産生を要求するとは解釈されない。本出願において、モノクローナル抗体は、重鎖及び／または軽鎖の一部が特定の種に由来する、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体に対応する配列と同一であるか、または相同性であるが、鎖（複数可）の残りは、他の種に由来する、または他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、ならびにこのような抗体の断片に対応する配列と同一であるか、または相同性である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含む。
【０１６９】
本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、１つ以上のヒト免疫グロブリンに由来する残りを用いて１つ以上の非ヒト（例えば、マウス）抗体源（複数可）からの最小限の部分を含むキメラ抗体を指す。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの抗体からの超可変領域からの残基が、マウス、ラット、ウサギ、または所望の特異性、親和性、及び／または能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種の抗体（ドナー抗体）からの超可変領域からの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一実施形態において、抗体は、ヒト化完全長抗体であり得る。非限定的な例として、抗体は、米国特許出願第ＵＳ２０１３０３０３３９９号（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に教示される方法を使用してヒト化され得る。
【０１７０】
本明細書で使用される場合、「抗体バリアント」という用語は、修飾抗体（天然または開始抗体に関して）、あるいは生体分子構造及び／または機能において天然または開始抗体に類似している（例えば、抗体模倣体）を指す。抗体バリアントは、天然抗体と比較して、それらのアミノ酸配列、組成、または構造において変化され得る。抗体バリアントは、変化したイソタイプを有する抗体（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、またはＩｇＭ）、ヒト化バリアント、最適化バリアント、多重特異性抗体バリアント（例えば、二重特異性バリアント）、及び抗体断片が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、本発明の、薬学的組成物、バイオサーキット、バイオサーキット成分、エフェクターモジュール（それらのＳＲＥまたはペイロードを含む）は、抗体模倣体であり得る。本明細書で使用される場合、「抗体模倣体」という用語は、抗体の機能または効果を模倣して、この分子標的に特異的に及び高親和性で結合する任意の分子を指す。いくつかの実施形態において、抗体模倣体は、タンパク質骨格としてフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（Ｆｎ３）に組み込むように設計されたモノボディであり得る（ＵＳ  ６，６７３，９０１、ＵＳ６，３４８，５８４）。いくつかの実施形態において、抗体模倣体は、アフィボディ分子、アフィリン、アフィチン、アンチカリン、アビマー、Ｃｅｎｔｙｒｉｎｓ、ＤＡＲＰＩＮＳＴＭ、フィノマー及びクニッツ及びドメインペプチドを含むが、これらに限定されない、当該技術分野で周知のものであり得る。他の実施形態において、抗体模倣体は、１つ以上の非ペプチド領域を含み得る。
【０１７２】
一実施形態において、抗体は、修飾されたＦｃ領域を含み得る。非限定的な例として、修飾されたＦｃ領域は、米国特許出願第ＵＳ２０１５００６５６９０号（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載の方法によって作製され得るか、またはそれに記載の領域のうちのいずれかであり得る。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、１つを超えるエピトープに結合する多重特異性抗体をコードし得る。本明細書で使用される場合、「マルチボディ」または「多重特異性抗体」という用語は、２つ以上の可変領域が異なるエピトープに結合する抗体を指す。エピトープは、同じまたは異なる標的上に存在し得る。一実施形態において、多重特異性抗体は、国際特許公開第ＷＯ２０１１１０９７２６号及び米国特許出願第ＵＳ２０１５０２５２１１９号（当該出願の各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載の方法によって作製及び最適化され得る。これらの抗体は、高特異性及び高親和性を有する複数の抗原に結合することができる。
【０１７４】
ある特定の実施形態において、多重特異性抗体は、同じまたは異なる抗原上に２つの異なるエピトープを認識する「二重特異性抗体」である。一態様において、二重特異性抗体は、２つの異なる抗原に結合することができる。このような抗体は、典型的には、少なくとも２つの異なる抗体からの抗原結合領域を含む。例えば、二重特異性モノクローナル抗体（ＢｓＭＡｂ、ＢｓＡｂ）は、２つの異なるモノクローナル抗体の断片からなり、それ故に、ＢｓＡｂが２つの異なるタイプの抗原に結合させる、人工タンパク質である。二重特異性抗体フレームワークは、Ｒｉｅｔｈｍｕｌｌｅｒ，Ｇ．，２０１２．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０１２，１２：１２−１８、Ｍａｒｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ．２００５，２６（６）：６４９−６５８、及びＳｃｈａｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ．２０１１，１０８（２７）：１１１８７−１１１９２（それらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載されたもののうちのいずれかを含み得る。「三官能性二重特異性」抗体と呼ばれるＢｓＭＡｂの新世代が、開発されている。これらは、２つの重鎖及び２つの軽鎖からなり、２つの異なる抗体のそれぞれの１つで、２つのＦａｂ領域（腕）は、２つの抗原に対して向けられており、Ｆｃ領域（足）は、２つの重鎖を含み、第３の結合部位を形成する。
【０１７５】
いくつかの実施形態において、ペイロードは、単一の抗原結合ドメインを含む抗体をコードし得る。これらの分子は、極小であり、フルサイズｍＡｂにおいて観察されている分子量の約１０分の１の分子量を有する。さらなる抗体は、軽鎖を欠いている、ラクダ及びラマに見出される重鎖抗体の抗原結合可変重鎖領域（ＶＨＨ）に由来する「ナノボディ」を含み得る（Ｎｅｌｓｏｎ，Ａ．Ｌ．，ＭＡｂｓ．２０１０．Ｊａｎ−Ｆｅｂ；  ２（１）：７７−８３）。
【０１７６】
いくつかの実施形態において、抗体は、「小型化」され得る。ｍＡｂ小型化の最も良い例は、Ｔｒｕｂｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓからの小分子免疫増強因子（ＳＭＩＰ）である。１価または２価であり得るこれらの分子は、１つのＶＬ、１つのＶＨ抗原結合ドメイン、１つまたは２つの定常「エフェクター」ドメインを含有し、このすべてがリンカードメインによって連結されている組換え単一鎖分子である。おそらく、このような分子は、定常ドメインによって与えられた免疫エフェクター機能を保有するとともに、断片によって主張された増加した組織または腫瘍浸透の利点を提供し得る。少なくとも３つの「小型化」ＳＭＩＰは、臨床開発段階に進入している。Ｗｙｅｔｈと共同で開発した抗ＣＤ２０  ＳＭＩＰであるＴＲＵ−０１５は、リウマチ性関節炎（ＲＡ）に対する２相を進行中の最も発展されたプロジェクトである。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）及びＢ細胞リンパ腫における初期の試みは、結局中断された。Ｔｒｕｂｉｏｎ及びＦａｃｅｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙは、ＣＬＬ及びその他のリンパ性腫瘍の治療のために抗ＣＤ３７  ＳＭＩＰであるＴＲＵ−０１６の開発を共同で進めており、このプロジェクトは２相に到達している。Ｗｙｅｔｈは、ＲＡ、ＳＬＥ、及び可能性がある多発性硬化症を含む自己免疫疾患の治療のための抗ＣＤ２０  ＳＭＩＰ  ＳＢＩ−０８７の許可を取得したが、このようなプロジェクトは臨床試験の初期段階にとどまっている（Ｎｅｌｓｏｎ，Ａ．Ｌ．，ＭＡｂｓ，２０１０．Ｊａｎ−Ｆｅｂ；  ２（１）：７７−８３）。
【０１７７】
小型化された抗体の例は、ヒンジ領域がＩｇＧ４分子から除去された、「ユニーボディ（ｕｎｉｂｏｄｙ）」と呼ばれる。ＩｇＧ４分子は、不安定であり、互いに軽鎖−重鎖のヘテロ二量体を交換することができるが、ヒンジ領域の除去は、重鎖−重鎖の対合を完全に遮断して、高度に特異的な１価軽鎖／重鎖ヘテロ二量体が残されるが、インビボでの安定性及び半減期を保障するＦｃ領域は維持される。この形態は、ＩｇＧ４がＦｃＲと不良に相互作用して１価のユニーボディが細胞内シグナル伝達複合体の形成を促進させないことにより、免疫活性化または発がん成長の危険を最小限に抑えることができる（例えば、Ｎｅｌｓｏｎ，Ａ．Ｌ．，ＭＡｂｓ，２０１０．Ｊａｎ−Ｆｅｂ；２（１）：７７−８３を参照のこと）。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片である単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂまたはナノボディ）をコードし得る。全抗体と同様に、特異的抗原に選択的に結合することができる。一態様において、ｓｄＡｂは、「ラクダＩｇ」または「ラクダ科ＶＨＨ」であり得る。本明細書で使用される場合、「ラクダＩｇ」という用語は、重鎖抗体の最小の既知の抗原結合ユニットを指す（Ｋｏｃｈ−Ｎｏ  ｌｔｅ，ｅｔ  ａｌ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，２００７，２１：３４９０−  ３４９８）。「重鎖抗体」または「ラクダ科抗体」は、２つのＶＨドメインを含み、軽鎖がない抗体を指す（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９９，２３１：２５−３８、国際特許公開第ＷＯ１９９４／０４６７８号及び同第Ｗ０１９９４／０２５５９１号、ならびに米国特許第６，００５，０７９号）。別の態様において、ｓｄＡｂは、「免疫グロブリン新規抗原受容体」（ＩｇＮＡＲ）であり得る。本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン新規抗原受容体」という用語は、１つの可変新規抗原受容体（ＶＮＡＲ）ドメイン及び５つの定常新規抗原受容体（ＣＮＡＲ）ドメインのホモ二量体からなるサメ免疫レパートリーからの抗体のクラスを指す。ＩｇＮＡＲは、最小の既知の免疫グロブリンに基づくタンパク質骨格のいくつかを表し、高度に安定であり、効率的な結合特性を有する。固有の安定性は、（ｉ）マウス抗体において見出される従来の抗体ＶＨ及びＶＬドメインと比較して、相当数の、荷電しかつ表面に露出した親水性の残基をもたらす、基礎をなすＩｇ骨格、ならびに（ｉｉ）ループ間ジスルフィド架橋、及びループ内水素結合のパターンを含む相補性決定領域（ＣＤＲ）ループ内の安定化構造的特徴の両方に起因し得る。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、イントラボディをコードし得る。イントラボディは、これが生成さ「細胞内抗体」という用語はれる細胞から分泌されず、代わりに１つ以上の細胞内タンパク質を標的にする抗体の形態である。イントラボディは、細胞内に発現し、機能し、細胞内輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）、転写、翻訳、代謝過程、増殖シグナル伝達、及び細胞分裂を含むが、これらに限定されない、多数の細胞過程に影響を及ぼすために使用され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、イントラボディに基づいた治療法を含む。いくつかのこのような実施形態において、本明細書に開示される可変ドメイン配列及び／またはＣＤＲ配列は、イントラボディに基づいた治療法のために１つ以上の構造体に組み込まれる。例えば、イントラボディは、１つ以上の糖化された細胞内タンパク質を標的することができるか、または１つ以上の糖化された細胞内タンパク質と代替のタンパク質間の相互作用を調節することができる。
【０１８０】
哺乳動物細胞の異なる区画におけるイントラボディの細胞内の発現は、内因性分子の機能を遮断または調節することができる（Ｂｉｏｃｃａ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯＪ．１９９０，９：１０１−１０８、Ｃｏｌｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００４，１０１：１７６１６−１７６２１）。イントラボディは、タンパク質の折り畳み、タンパク質−タンパク質、タンパク質−ＤＮＡ、タンパク質−ＲＮＡの相互作用及びタンパク質修飾を変更させることができる。これらは、表現型ノックアウトを誘導し得、標的抗原に直接結合するか、またはこれの細胞内の輸送を迂回するか、またはこれの結合パートナーとの結合を抑制することによって中和剤として働き得る。標的抗原に対する高特異性及び親和性を有する、イントラボディは、他の分子を節約しつつ、特定の標的分子のある特定の結合相互作用を遮断する利点を有する。
【０１８１】
ドナー抗体からの配列は、イントラボディを開発するために使用してもよい。イントラボディは、しばしば、例えば、単離されたＶＨ及びＶＬドメインなどの単一ドメイン断片としてまたは細胞内の単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体として組換え的に発現される。例えば、イントラボディは、しばしば、可撓性リンカーのポリペプチドによって結合された重鎖及び軽鎖の可変ドメインを含む単一鎖抗体を形成するために単一ポリペプチドとして発現される。イントラボディは、典型的には、ジスルフィド結合が欠如されており、この特異的な結合活性を通して標的遺伝子の発現または活性を調節することができる。単一鎖イントラボディは、しばしば、組換え核酸分子から発現され、細胞内に保持される（例えば、細胞質、小胞体、またはペリプラズムに保持される）ように操作される。イントラボディは、例えば、以下に開示されて検討されたもののような、当該技術分野で周知の方法を使用して生成され得る（Ｍａｒａｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９９３，９０：７８８９−７８９３、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９９４，５：５９５−６０１、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＰＮＡＳ，９１：５９３２−５９３６、Ｍａｃｉｅｊｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，１：６６７−６７３、Ｍａｒａｓｃｏ，１９９５，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，１：１−１９、Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ＥＭＢＯＪ．１４：１５４２−５１、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐ．，７：１５１５−１５２５、Ｍａｒａｓｃｏ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：１１−１５，１９９７、Ｒｏｎｄｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｒａｓｃｏ，１９９７，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５１：２５７−２８３、Ｃｏｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １７：２４４５−５６、Ｐｒｏｂａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７５：２４５−２５３、Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １７：２４４５−２４５６、Ｈａｓｓａｎｚａｄｅｈ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４３７：８１−６、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：６３５−４４、Ｏｈａｇｅ  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｐｅ，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９１：１１１９−１１２８、Ｏｈａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９１：１１２９−１１３４、Ｗｉｒｔｚ  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｐｅ，１９９９，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．８：２２４５−２２５０、Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：２０７−２２２、Ａｒａｆａｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１２５０−６、ｄｅｒ  Ｍａｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４５０７５−８５、Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：３０７−１９、及びＷｈｅｅｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，ＦＡＳＥＢＪ．１７：１７３３−５、ならびにこれらに引用された参照文献）。
【０１８２】
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、米国特許第５，０９１，５１３号（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載の生合成抗体をコードし得る。このような抗体は、生合成抗体結合部位（ＢＡＢＳ）として働く領域を構成するアミノ酸の１つ以上の配列を含み得る。これらの部位は、１）非共有結合的に結合されているか、もしくはジスルフィドで結合された合成ＶＨ及びＶＬ二量体、２）ＶＨ及びＶＬがポリペプチドリンカーによって付着されたＶＨ−ＶＬもしくはＶＬ−ＶＨ単一鎖、または３）個々のＶＨもしくはＶＬドメインを含む。結合ドメインは、別々の免疫グロブリンに由来し得る連結されたＣＤＲ及びＦＲ領域を含む。生合成抗体はまた、例えば、酵素、毒素、結合部位、または固定化媒質または放射性原子に対する付着部位として機能する他のポリペプチド配列も含み得る。生合成を生成するため、インビボでの抗体の作製によって引き起こされ得る任意の特異性を有するＢＡＢＳを設計するため、及びその類似体を生成するための方法が、開示されている。
【０１８３】
いくつかの実施形態において、ペイロードは、米国特許第８，３９９，６２５号に教示される抗体受容体フレームワークを有する抗体をコードし得る。このような抗体受容体フレームワークは、対象となる抗体からの特に適切に受容するＣＤＲであり得る。
【０１８４】
一実施形態において、抗体は、条件付きで活性な生物学的タンパク質であり得る。抗体は、野生型の正常な生理学的条件で、ならびにこのような条件付きで活性な生物学的タンパク質に可逆的または不可逆的に不活性化される、条件付きで活性な生物学的タンパク質を作製するために使用され得、このような条件付きで活性な生物学的タンパク質の使用が提供される。このような方法及び条件付きで活性なタンパク質は、例えば、国際特許出願第ＷＯ２０１５１７５３７５号及び同第ＷＯ２０１６０３６９１６号ならびに米国特許出願第ＵＳ２０１４０３７８６６０号（当該出願の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）において教示される。
【０１８５】
抗体調製物
モノクローナルまたはポリクローナルである、抗体の調製物は、当該技術分野で周知である。抗体の生成のための技術は、当該技術分野で公知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  “Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  “Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９  ａｎｄ  “Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  Ｄｒｉｖｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓｔｒｏｎｇｅｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａｒｅａ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ”  Ｗｏｏｄｈｅａｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０１２において記載されている。
【０１８６】
本明細書に記載の抗体ならびにそれらの断片及びバリアントは、組換えポリヌクレオチドを使用して生成され得る。一実施形態において、ポリヌクレオチドは、抗体ならびにそれらの断片及びバリアントのうちの少なくとも１つをコードするための分子設計を有する。非限定的な例として、ポリヌクレオチド構築物は、（１）抗体の重鎖、（２）抗体の軽鎖、（３）抗体の重鎖及び軽鎖、（４）リンカーによって分離された重鎖及び軽鎖、（５）ＶＨ１、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３ドメイン、リンカー、及び軽鎖、または（６）ＶＨ１、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３ドメイン、ＶＬ領域、及び軽鎖、の設計のうちのいずれかをコードし得る。これらの設計のうちのいずれかはまた、任意のドメイン及び／または領域の間で任意のリンカーも含み得る。本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載の抗体または出発分子としてその成分部分のうちのいずれかを使用して任意の標準クラスの免疫グロブリンを生成するために操作され得る。
【０１８７】
免疫療法のために使用される抗体
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的である、抗体、それらの断片及びバリアントであり得る。抗体は、ＴＳＡ／ＴＡＡを見出し、それらに結合するまで本体を通して循環する。一旦結合すると、それらは、免疫系の他の部分を動員し、腫瘍細胞を破壊するためにＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）及びＡＤＣＰ（抗体依存性細胞媒介性ファゴサイトーシス）を増加させる。本明細書で使用される場合、「腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）」という用語は、宿主生物において抗腫瘍免疫応答を引き起こし得る、腫瘍細胞に生成される抗原性物質を意味する。一実施形態において、ＴＳＡは、腫瘍新抗原であり得る。腫瘍抗原特異性抗体は、同じ抗原を発現する腫瘍細胞に対して補体依存性細胞毒性応答を媒介する。
【０１８８】
乳癌抗原、卵巣癌抗原、前立腺癌抗原、子宮頸癌抗原、膵臓癌抗原、肺癌抗原、膀胱癌抗原、結腸癌抗原、精巣癌抗原、膠芽腫癌抗原、Ｂ細胞悪性腫瘍と関連する抗原、多発性骨髄腫と関連する抗原、非ホジキンリンパ腫と関連する抗原、または慢性リンパ球性白血病と関連する抗原であるＴＳＡが、特に興味深い。
【０１８９】
ＴＳＡに免疫活性に結合することができる好適な抗体は、５Ｔ４、７０７−ＡＰ、Ａ３３、ＡＦＰ（α−フェトプロテイン）、ＡＫＡＰ−４（Ａキナーゼアンカータンパク質４）、ＡＬＫ、α５β１−インテグリン、アンドロゲン受容体、アネキシンＩＩ、アルファ−アクチニン−４、ＡＲＴ−４、Ｂ１、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＢＡＧＥ（Ｂメラノーマ抗原）、ＢＣＭＡ、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質、ベータ−カテニン、ＢＫＴ−抗原、ＢＴＡＡ、ＣＡ−Ｉ（カルボニックアンヒドラーゼＩ）、ＣＡ５０（癌抗原５０）、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、カルレチニン、ＣＡＩＸ（カルボニックアンヒドラーゼ）、ＣＡＭＥＬ（メラノーマ上の細胞毒性Ｔ−リンパ球認識抗原）、ＣＡＭ４３、ＣＡＰ−１、カスパーゼ−８／ｍ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７／ｍ、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４０／ＣＤ１５４、ＣＤ４１、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ４５、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ６８／ＫＰ１、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１０３、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ｃｄｃ２７／ｍ、ＣＤＫ４（サイクリン依存性キナーゼ４）、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＳ、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、クロモグラニン、ｃ−Ｍｅｔ、ｃ−Ｍｙｃ、ｃｏａ−１、ＣＳＡｐ、ＣＴ７、ＣＴ１０、サイクロフィリンＢ、サイクリンＢ１、細胞質チロシンキナーゼ、サイトケラチン、ＤＡＭ−１０、ＤＡＭ−６、ｄｅｋ−ｃａｎ融合タンパク質、デスミン、ＤＥＰＤＣ１（ＤＥＰドメイン含有１）、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、ＥＢＮＡ、ＥＧＦ−Ｒ（上皮成長因子受容体）、ＥＧＰ−１（上皮糖タンパク質−１）（ＴＲＯＰ−２）、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＦ−２、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）、ＥｐｈＡ２、エプスタインバーウイルス抗原、Ｅｒｂ（ＥｒｂＢ１；ＥｒｂＢ３；ＥｒｂＢ４）、ＥＴＡ（上皮腫瘍抗原）、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１融合タンパク質、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）、ＦＢＰ（葉酸結合タンパク質）、ＦＧＦ−５、葉酸受容体α、ＦＯＳ関連抗原１、フコシルＧＭ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ（ＧＡＧＥ−１；ＧＡＧＥ−２）、ガラクチン、ＧＤ２（ガングリオシド）、ＧＤ３、ＧＦＡＰ（グリア細胞繊維性酸性タンパク質）、ＧＭ２（腫瘍胎児抗原−免疫原性−１；ＯＦＡ−Ｉ−１）、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇｐ１００、Ｈ４−ＲＥＴ、ＨＡＧＥ（ヘリカーゼ抗原）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＩＦ（低酸素誘導因子）、ＨＩＦ−１α、ＨＩＦ−２α、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−Ｒ１７０Ｉ、ＨＬＡ−Ａｌｌ、ＨＭＷＭＡＡ、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ−４０、ＨＳＰ７０−２Ｍ（熱ショックタンパク質７０）、ＨＳＴ−２、ＨＴｇｐ−１７５、ｈＴＥＲＴ（またはｈＴＲＴ）、ヒトパピローマウイルス−Ｅ６／ヒトパピローマウイルス−Ｅ７及びＥ６、ｉＣＥ（免疫捕捉ＥＩＡ）、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ５、ＩＬＫ（インテグリン結合キナーゼ）、ＩＭＰ３（インスリン様成長因子ＩＩ  ｍＲＮＡ結合タンパク���３）、ＩＲＦ４（インターフェロン調節因子４）、ＫＤＲ（キナーゼ挿入ドメイン受容体）、ＫＩＡＡ０２０５、ＫＲＡＢ−亜鉛フィンガータンパク質（ＫＩＤ）−３；ＫＩＤ３１、ＫＳＡ（１７−１Ａ）、Ｋ−ｒａｓ、ＬＡＧＥ、ＬＣＫ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ（ＬＤＬＲ−フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質）、ＬｅＹ（ルイスＹ）、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＧＥ（チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原）（ＭＡＧＥ−１；ＭＡＧＥ−３）、メラン−Ａ腫瘍抗原（ＭＡＲＴ）、ＭＡＲＴ−２／Ｓｋｉ、ＭＣ１Ｒ（メラノコルチン１受容体）、ＭＤＭ２、メソテリン、ＭＰＨＯＳＰＨ１、ＭＳＡ（筋肉特異的アクチン）、ｍＴＯＲ（ラパマイシンの哺乳動物標的）、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＭＵＭ−１（メラノーマ関連抗原（変異）１）、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ミオシン／ｍ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、ＮＡ８８−Ａ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ネオ−ＰＡＰ、ＮＦ−ＫＢ（核因子カッパＢ）、ニューロフィラメント、ＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）、ノッチ受容体、ＮｕＭａ、Ｎ−Ｒａｓ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＮＹ−ＣＯ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、オンコスタチンＭ、ＯＳ−９、ＯＹ−ＴＥＳ１、ｐ５３変異体、ｐ１９０  ｍｉｎｏｒ  ｂｃｒ−ａｂｌ、ｐｌ５（５８）、ｐｌ８５ｅｒｂＢ２、ｐｌ８０ｅｒｂＢ−３、ＰＡＧＥ（前立腺関連遺伝子）、ＰＡＰ（前立腺酸性ホスファターゼ）、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＤＧＦＲ（血小板由来成長因子受容体）、ピペリジン及びピロリジンの利用（ＰＩＰＡ）に関与するチトクロームＰ４５０、Ｐｍｌ−ＲＡＲアルファ融合タンパク質、ＰＲ−３（プロテイナーゼ３）、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）、ＰＳＭ、ＰＳＭＡ（前立腺幹細胞抗原）、ＰＲＡＭＥ（メラノーマ優先発現抗原）、ＰＴＰＲＫ、ＲＡＧＥ（腎腫瘍抗原）、Ｒａｆ（Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ、及びＣ−Ｒａｆ）、Ｒａｓ、受容体チロシンキナーゼ、ＲＣＡＳ１、ＲＧＳＳ、ＲＯＲ１（受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１）、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−３、ＳＣＰ−１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＳＰ−１７（精子タンパク質１７）、ｓｒｃファミリー、ＳＳＸ（滑膜肉腫Ｘブレークポイント）−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−３、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＴＡＴ−３、ＳＴＡＴ−５、ＳＴＡＴ−６、ＳＴＥＡＤ、ＳＴｎ、スルビビン、ｓｙｋ−ＺＡＰ７０、ＴＡ−９０（Ｍａｃ−２結合タンパク質￥サイクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＣＳＴＤ１（腫瘍関連カルシウムシグナル伝達物質１）、ＴＡＣＳＴＤ２、ＴＡＧ−７２−４、ＴＡＧＥ、ＴＡＲＰ（Ｔ細胞受容体ガンマ代替リーディングフレームタンパク質）、ＴＥＬ／ＡＭＬ１融合タンパク質、ＴＥＭ１、ＴＥＭ８（エンドシアリンもしくはＣＤ２４８）、ＴＧＦβ、ＴＩＥ２、ＴＬＰ、ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子、ＴＮＦ受容体（ＴＮＦ−α受容体、ＴＮＦ−β受容体；またはＴＮＦ−γ受容体）、トランスフェリン受容体、ＴＰＳ、ＴＲＰ−１（チロシン関連タンパク質１）、ＴＲＰ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、ＴＳＰ−１８０、ＶＥＧＦ受容体、ＷＮＴ、ＷＴ−１（ウィルム腫瘍抗原）、ならびにＸＡＧＥに特異的なものを含��得るが、これらに限定されない。
【０１９０】
一実施形態において、本発明のペイロードは、抗ＣＤ４７抗体であり得る。ＣＤ４７は、免疫系によって健康な細胞の食細胞の除去を防ぐ遍在的に発現した免疫調節タンパク質である。ＣＤ４７は、多くの型のがん細胞の表面上に発現し、それによって抗がん免疫応答を破壊する。ＣＤ４７はまた、様々な他の重要な細胞過程、例えば、血管新生、がん細胞死、及びＴ細胞免疫の調節に関与する。いくつかの臨床前研究における抗ＣＤ４７抗体は、固形がん及び最も顕著にＢ細胞悪性腫瘍において治療的有用性を示している。
【０１９１】
一実施形態において、本発明のペイロードは、抗ＣＤ２２抗体であり得る。非限定的な例として、抗ＣＤ２２抗体は、米国特許出願第ＵＳ２０１５００８６５６２号に記載の抗体、その断片またはバリアントのうちのいずれかである。抗ＣＤ２２抗体は、ＵＳ２０１５００８６５６２の配列番号４９〜６４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び／またはＵＳ２０１５００８６５６２の配列番号１７〜３２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含み得、当該出願の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１９２】
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、免疫阻害シグナルを特異的に遮断することができる、抗体、それらの断片及びバリアントであり得る。これらの遮断抗体（アンタゴニストとも称される）は、共抑制性受容体に結合し、したがって、それらのシグナル変換を遮断する。非限定的な例として、遮断抗体は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、及びＰＤ−Ｌ１／Ｌ２に特異的であり得る。一実施形態において、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、イピリムマブである。別の実施形態において、抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブである。ＰＤ−Ｌ１に結合し、Ｔ細胞免疫応答を増強する抗体は、米国特許出願第２０１６／０１０８１２３号（当該出願の内容は、参照によりその全体が組み込まれる）に教示される抗体を含み得る。他の阻害免疫調節標的は、グルコース取り込み及び乳酸産生などのがん細胞代謝を増加し得る、Ｂ７−Ｈ３を含み得る（Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２０１６，７６（８）：１−１２）。Ｂ７−Ｈ３を遮断する抗体は、米国特許第９，１５０，６５６号（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）において開示されている。
【０１９３】
一態様において、本発明のペイロードは、米国特許出願第ＵＳ２０１６／０１５９９２７号（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の配列番号１、２、及び３のアミノ酸配列を含むＶＳＩＧ８（８を含有するｖ−ｓｅｔ及び免疫グロブリンドメイン）に特異的な拮抗抗体であり得る。拮抗抗体はまた、キメラＩＬ２受容体（ＣＤ２５）抗体（バシリキシマブ）（米国特許出願第２００８０１７１０１７号（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）及びヒトＴＩＭ−３に結合する拮抗抗体（米国特許出願第ＵＳ２０１５／０２１８２７４号（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、及びＬＡＧ−３（例えば、米国特許出願第ＵＳ２０１５／０２５９４２０号（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）も含み得る。
【０１９４】
一態様において、本発明のペイロードは、ヒトＣＳＦ−ＩＲの細胞外ドメインの二量化ドメインＤ４〜Ｄ５への結合に特徴付けられる抗ＣＳＦ−ＩＲ抗体であり得る。この抗体阻害剤は、ＣＳＦ−ＩＲリガンド依存性及びＣＳＦ−１リガンド依存性ＣＳＦ−ＩＲ発現腫瘍細胞、単球、及び浸潤性マクロファージにおいて細胞増殖及び生存を阻害し得る（例えば、国際特許公開第ＷＯ２０１３／１３２０４４号（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
【０１９５】
別の態様において、本発明のペイロードは、ＣＸＣＬ１２に対する拮抗抗体であり得る。抗ＣＸＣＬ１２抗体は、その受容体ＣＸＣＲ４とのＣＸＣＬ１２の相互作用を遮断し、それによってＣＸＣＲ４シグナル伝達を阻害する。ＣＸＣＲ４シグナル伝達阻害剤は、腫瘍組織中のがん細胞におけるＴ細胞の近接性または頻度を増加させる（国際特許公開第ＷＯ２０１５／０１９２８４号（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
【０１９６】
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、及びＣＤ２７が含まれるが、これらに限定されない、共刺激分子に特異的な抗体を含む、免疫応答を引き起こす、アゴニスト抗体、それらの断片及びバリアントであり得る。
【０１９７】
一実施形態において、本発明のペイロードは、アゴニストＣＤ４０抗体であり得る。別の実施形態において、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）に特異的なアゴニスト抗体は、ウレマブ、免疫細胞を発現し、免疫応答、特に、腫瘍細胞に対する細胞毒性Ｔ細胞応答を刺激する４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）に特異的に結合し、活性化する完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体、またはウトミルマブ、完全ヒトＩｇＧ２モノクローナル抗体、または国際特許公開第ＷＯ２００６／０８８４４７号（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載の抗ＣＤ１３７抗体であり得る。
【０１９８】
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、アンフィレグリンに対するアンタゴニスト抗体であり得る。アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）は、ＥＧＦＲ受容体に結合し、Ｔ細胞調節機能を増強するＥＧＦ様成長因子である。ＡＲＥＧは、異なるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）レパートリーを有し、ＩＬ３３Ｒを発現する、表現的及び機能的に異なるサブタイプのＣＤ４＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に生成される。ＡＲＥＧは、腫瘍環境内に免疫抑制を促進する。抗アンフィレグリン抗体は、米国特許第７，２２３，３９３号の配列番号２、４、及び１２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、及び／または米国特許第７，２２３，３９３号の配列番号３、５、及び１４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含み得、当該出願の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１９９】
いくつかの実施形態において、共抑制性分子及び共刺激分子に特異的な抗体は、ｓｃＦｖ抗体を分泌され得る。
【０２００】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体ペイロードは、Ｔ細胞二重特異性抗体（例えば、Ｔ細胞エンゲージャーＢｉＴＥ（商標）抗体ＣＤＳ−ＣＤ１９、ＣＤ３−ＥｐＣａｍ、及びＣＤ３−ＥＧＦＲ）であり得る。免疫療法のために使用された他の二重特異性抗体はまた、本発明のペイロード、例えば、二重特異性抗ＴＮＦ−α及び抗ＩＬ６抗体（ＥＰ３０６２８１８）、免疫細胞抗原及びＴＡＧ−７２への二重特異性抗体（ＷＯ２０１６／０８９６１０）、米国特許第７，２６２，２７６号における抗卵巣及びＤ３二重特異性抗体ＷＯ２０１４／１２８１８５におけるＣＤ１３３及びＣＤ３に対する二重特異性抗体、ＵＳ２０１６／０１４５３５５において論じられるＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１に対する二重特異性抗体、ＷＯ２０１５／００６７４９、米国特許第７，６３５，４７２号、同第７，１１２，３２４号において論じられるＣＤ３及びＣＤ１９に対する二重特異性抗体、ＵＳ２０１４／０１７０１４９におけるＨｅｒ２及びＣＤ３に対する二重特異性抗体、ＵＳ２００５／００８９５１９におけるＣＤ１９及びＣＤ１６に対する二重特異性抗体として含まれ得る。
【０２０１】
いくつかの実施形態において、親和性の低下を有する抗体は、同じ抗原に対して高親和性を有する抗体に選択され得る。このような低親和性抗体は、より低いレベルで同じ抗原を発現する高いレベルの抗原及び正常組織を発現する腫瘍を識別するが、同様の抗腫瘍応答を維持するのにより効果的である。
【０２０２】
いくつかの実施形態において、本発明の標的部分は、表１０中のものから選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖及び可変軽鎖を含んでもよい。
【表１０−１】
2020525536.tif 000089
【表１０−２】
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【表１０−３】
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【表１０−４】
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【表１０−５】
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【表１０−６】
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【表１０−７】
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【表１０−８】
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【表１０−９】
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【表１０−１０】
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【表１０−１１】
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【表１０−１２】
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【表１０−１３】
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【表１０−１４】
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【表１０−１５】
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【表１０−１６】
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【表１０−１７】
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【表１０−１８】
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【表１０−１９】
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【表１０−２０】
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【表１０−２１】
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【表１０−２２】
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【表１０−２３】
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【表１０−２４】
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【表１０−２５】
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【表１０−２６】
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【表１０−２７】
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【表１０−２８】
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【表１０−２９】
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【表１０−３０】
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【表１０−３１】
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【表１０−３２】
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【表１０−３３】
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【表１０−３４】
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【表１０−３５】
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【表１０−３６】
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【表１０−３７】
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【表１０−３８】
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【表１０−３９】
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【表１０−４０】
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【表１０−４１】
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【表１０−４２】
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【表１０−４３】
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【表１０−４４】
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【表１０−４５】
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【表１０−４６】
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【表１０−４７】
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【表１０−４８】
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【表１０−４９】
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【表１０−５０】
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【表１０−５１】
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【表１０−５２】
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【表１０−５３】
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【表１０−５４】
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【表１０−５５】
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【表１０−５６】
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【表１０−５７】
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【表１０−５８】
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【表１０−５９】
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【表１０−６０】
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【表１０−６１】
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【表１０−６２】
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【表１０−６３】
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【表１０−６４】
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【表１０−６５】
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【表１０−６６】
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【表１０−６７】
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【表１０−６８】
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【表１０−６９】
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【表１０−７０】
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【表１０−７１】
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【表１０−７２】
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【表１０−７３】
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【表１０−７４】
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【表１０−７５】
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【表１０−７６】
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【表１０−７７】
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【表１０−７８】
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【表１０−７９】
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【表１０−８０】
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【表１０−８１】
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【表１０−８２】
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【表１０−８３】
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【表１０−８４】
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【表１０−８５】
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【表１０−８６】
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【表１０−８７】
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【表１０−８８】
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【表１０−８９】
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【表１０−９０】
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【表１０−９１】
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【表１０−９２】
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【表１０−９３】
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【表１０−９４】
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【表１０−９５】
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【表１０−９６】
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【表１０−９７】
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【表１０−９８】
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【表１０−１６８】
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【０２０３】
イントラボディ
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、免疫細胞を調節する際のプレーヤーに対するイントラボディであり得る。イントラボディは、細胞内で発現するように設計され、細胞内輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）／局在化ペプチド配列とのインフレーム融合を通して、細胞質ゲル、核、小胞体（ＥＲ）、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、原形質、及びトランス−ゴルジネットワーク（ＴＧＮ）を含む、様々な細胞内位置に存在する特定の標的抗原に指向され得る、抗体である。最も一般的に使用された形式は、リンカー、最も頻繁には、可変重鎖（ＶＨ）と可変軽鎖（ＶＬ）との間の１５−アミノ酸リンカー（例えば、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号３０７））を用いて、重鎖及び軽鎖の抗原結合可変ドメインを合わせることによって生成される、単一鎖抗体（ｓｃＦｖ）である。細胞内イントラボディは、がん関連標的の機能または局在化に結合する、中和する、または修飾し、それによって、悪性の表現型に影響を及ぼすように開発されている。
【０２０４】
免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を調節するプレーヤーは、任意の細胞内シグナル伝達チェックポイントであり得る。例示的なプレーヤーは、共抑制性リガンド、Ｃａｓｉｔａｓ  Ｂ系統リンパ腫癌原遺伝子ｂ（Ｃｂｌ−ｂ）（Ｅ３リガーゼ）、タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）、例えば、Ｓｒｃホモロジー２ドメイン含有タンパク質チロシンホスファターゼ１（ＳＨＰ−１）、及びＲａｓを含み得る。例えば、イントラボディは、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ２００４／０４６１８６（当該出願の内容は、参照によりその全体が組み込まれる）に開示されるＲＡＳの発がん性形態に対するイントラボディであり得る。
【０２０５】
治療的抗体
いくつかの実施形態において、本発明の抗体ペイロードは、治療的抗体であり得る。非限定的な例として、抗体、ならびにそれらの断片及びバリアントは、腫瘍関連抗原に特異的であり得るか、または腫瘍特異的抗原、または病原体抗原であり得る。いくつかの態様において、抗体は、遮断抗体（アンタゴニスト抗体とも称される）、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、及び他の阻害分子に対する遮断抗体であり得る。他の態様において、抗体は、アゴニスト抗体、例えば、刺激分子、例えば、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、及びＣＤ２７に特異的なアゴニスト抗体であり得る。
【０２０６】
他の例示的な治療的抗体には、アバゴボマブ、アボクスマブ（ａｂｃｘｍａｂ）、アビツズマブ、アブリルマブ、アクトクスマブ、アダリムマブ、アデカツムマブ、アファセビクマブ、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブ、アレムツズマブ、アリロクマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アネツマブ、アニフロルマブ、アポリズマブ、アルシツモマブ、アスクリンバクマブ、アセリズマブ、アテゾリズマブ、アチヌマブ、アトリズマブ、アトロリムマブ、アベルマブ、バピネウズマブ、バシリキシマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベゲロマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベルチリムマブ、ベシレソマブ、ベバシズマブ、ベズロトクスマブ、ビシロマブ、ビマグルマブ、ビメキズマブ、ビバツズマブ、ブレセルマブ、ブリナツモマブ、ブロソズマブ、ボコシズマブ、ブレンツキシマブ、ブリアキヌマブ、ブロダルマブ、ブロルシズマブ、ブロンチクツズマブ、カナキヌマブ、カンツズマブ、カンツズマブ、カプラシズマブ、カプロマブ、カルルマブ、カツマキソマブ、ｃＢＲ９６−ドキソルビシン免疫複合体、セデリズマブ、セルグツズマブ、セルトリズマブペゴール、セツキシマブ、シタツズマブ、シクスツムマブ、クラザキズマブ、クレノリキシマブ、クリバツズマブ、コドリツズマブ、コルツキシマブ、コンタツムマブ（Ｃｏｎｔａｔｕｍｕｍａｂ）、コンシズマブ、クレネズマブ、クロテデュマブ（Ｃｒｏｔｅｄｕｍａｂ）、ＣＲ６２６１、ダセツマブ、ダクリズマブ、ダロツズマブ、ダピロリズマブペゴール、ダラツムマブ、デクトレクマブ、デムシズマブ、デニンツズマブ、デノスマブ、デルロツキシマブビオチン、デツモマブ、ジヌツキシマブ、ジリダブマブ、ドマグロズマブ、ドルリモマブアリトクス、ドロジツマブ、デュリゴツマブ、デュピルマブ、デュルバルマブ、デュシギツマブ、エクロメキシマブ、エクリズマブ、エドバコマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エフングマブ、エルデルマブ、エルゲムツマブ、エロツズマブ、エルシリモマブ、エマクツズマブ、エミベツズマブ、エナバツズマブ、エンフォルツマブベドチン、エンリモマブペゴール、エノブリツズマブ、エノキズマブ、エノチクマブ、エンシツキシマブ、エピツモマブシツキセタン、エプラツズマブ、エルリズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、エトロリズマブ、エビナクマブ、エボロクマブ、エキスビビルマブ、ファノレソマブ、ファラリモマブ、ファルレツズマブ、ファシヌマブ、ＦＢＴＡ０５、フェルビズマブ、フェザキヌマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フィリブマブ、フランボツマブ、フレチクマブ、フォントリズマブ、フォラルマブ、フォラビルマブ、フレソリムマブ、フルラヌマブ、フツキシマブ、ガルカネズマブ、ガリキシマブ、ガニツマブ、ガンテネルマブ、ガビリモマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゲボキズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブベドチン、ゴリムマブ、ゴミリキシマブ、グセルクマブ、イバリズマブ、イブリツモマブチウキセタン、イクルクマブ、イダルシズマブ、イゴボマブ、ＩＭＡＢ３６２、イマルマブ、イムシロマブ、イムガツズマブ、インクラクマブ、インダツキシマブ、インデュサツマブ、イネビリズマブ、インフリキシマブ、インテツムマブ、イノリモマブ、イノツズマブ、イピリムマブ、イラツムマブ、イサツキシマブ、イトリズマブ、イキセキズマブ、ケリキシマブ、ラベツズマブ、ラムブロリズマブ、ラムパリズマブ、ラナデルマブ、ランドグロズマブ、ラプリツキシマブ、レブリキズマブ、レマレソマブ、レンダリズマブ、レンジルマブ、レルデリムマブ、レキサツムマブ、リビビルマブ、リファスツズマブ、リゲリズマブ、リロトマブ、リンツズマブ、リリルマブ、ロデルシズマブ、ロキベトマブ、ロルボツズマブ、ルカツムマブ、ルリズマブペゴール、ルミリキシマブ、ルムレツズマブ、マパツムマブ、マルゲツキシマブ、マスリモマブ、マブリリムマブ、マツズマブ、メポリズマブ、メテリムマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミルベツキシマブ、ミツモマブ、モガムリズマブ、モナリズマブ、モロリムマブ、モタビズマブ、モキセツモマブパスドトクス、ムロモナブ−ＣＤ３、ナコロマブタフェナトクス、ナミルマブ、ナプツモマブ、ナラツキシマブ、ナルナツマブ、ナタリズマブ、ナビシキシズマブ、ナビブマブ、ネバクマブ、ネシツムマブ、ネモリズマブ、ネレリモマブ、ネスバクマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、ノフェツモマブ、オビルトキサキシマブ、オビヌツズマブ、オカラツズマブ、オクレリズマブ、オデュリモマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オララツマブ、オロキズマブ、オマリズマブ、オナルツズマブ、オンツキシズマブ、オピシヌマブ、オポルツズマブモナトクス、オレゴボマブ、オルチクマブ、オテリキシズマブ、オトレルツズマブ、オキセルマブ、オザネズマブ、オゾラリズマブ、パギバキシマブ、パリビズマブ、パムレブルマブ、パニツムマブ、パンコマブ、パノバクマブ、パルサツズマブ、パスコリズマブ、パソツキシズマブ、パテクリズマブ、パトリツマブ、ペムブロリズマブ、ペムツモマブ、ペラキズマブ、ペルツズマブ、ペキセリズマブ、ピジリズマブ、ピナツズマブ、ピンツモマブ、プラクルマブ、プロザリズマブ、ポガリズマブ、ポラツズマブ、ポネズマブ、プレザリズマブ、プリリキシマブ、プリトキサキシマブ、プリツムマブ、ＰＲＯ１４０、クイリズマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラフィビルマブ、ラルパンシズマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、レファネズマブ、レガビルマブ、レスリズマブ、リロツムマブ、リヌクマブ、リサンキズマブ、リツキシマブ、リババズマブペゴール、ロバツムマブ、ロレデュマブ、ロモソズマブ、ロンタリズマブ、ロベリズマブ、ロベリズマブ（Ｒｏｖｅｌｉｚｕｍａｂ）、ルプリズマブ、サシツズマブ、サマリズマブ、サペリズマブ、サリルマブ、サツモマブペンデチド、セクキヌマブ、セリバンツマブ、セトキサキシマブ、セヴィルマブ、シブロツズマブ、ＳＧＮ−ＣＤ１９Ａ、ＳＧＮ−ＣＤ３３Ａ、シファリムマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、シプリズマブ、シルクマブ、ソフィツズマブベドチン、ソラネズマブ、ソリトマブ、ソネプシズマブ、ソンツズマブ、スタムルマブ、スレソマブ、スビズマブ、タバルマブ、タカツズマブ、タドシズマブ、タリズマブ、タムツベツマブ、タネズマブ、タプリツモマブ、タレクスツマブ、テフィバズマブ、テリモマブアリトクス、テナツモマブ、テネリキシマブ、テプリズマブ、テプロツムマブ、テシドルマブ、テツロマブ、テゼペルマブ、ＴＧＮ１４１２、チシリムマブ、チルドラキズマブ、チガツズマブ、チモルマブ、チソツマブベドチン、ＴＮＸ−６５０、トシリズマブ、トラリズマブ、トサトクスマブ、トシツモマブ、トベツマブ、トラロキヌマブ、トラスツズマブ、ＴＲＢＳ０７、トレガリズマブ、トレメリムマブ、トレボグルマブ、ツコツズマブ、ツビルマブ、ウブリツキシマブ、ウルコクプルマブ（Ｕｌｃｏｃｕｐｌｕｍａｂ）、ウレルマブ、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ、バダスツキシマブタリリン、バンドルツズマブベドチン、バンチクツマブ、バヌシズマブ、バパリキシマブ、バルリルマブ、バテリズマブ、ベドリズマブ、ベルツズマブ、ベパリモマブ、ベセンクマブ、ビシリズマブ、ボバリリズマブ、ボロシキシマブ、ボルセツズマブ、ボツムマブ、キセンツズマブ、ザルツムマブ、ザノリムマブ、ザツキシマブ、ジラリムマブ、及びゾリモマブアリトクスが含まれ得るが、これらに限定されない。
【０２０７】
バイシストロン及び／または偽バイシストロン抗体ペイロード
本発明によれば、バイシストロンペイロードは、単一ポリヌクレオチド鎖上に２つのタンパク質鎖抗体をコードするポリヌクレオチドである。偽バイシストロンペイロードは、単一ポリヌクレオチド鎖上に不連続的に単一鎖抗体をコードするポリヌクレオチドである。バイシストロンペイロードについては、コードした２つの鎖または２つの部分／領域及び／またはドメイン（偽バイシストロンと同様に）は、鎖またはドメインをコードしない少なくとも１つのヌクレオチドによって分離される。より頻繁には、分離は、切断シグナルもしくは部位またはヌクレオチドの非コード領域を含む。このような切断部位は、例えば、得られたポリペプチドまたは本明細書に教示されるもののうちのいずれかにおいて、「ＲＫＲ」部位としてコードされるフリン切断部位、または修飾されたフリン切断部位を含む。
【０２０８】
本発明によれば、単一のドメインペイロードは、単一の単量体可変抗体ドメインをコードする１つまたは２つのポリヌクレオチドを含む。典型的には、単一のドメイン抗体は、重鎖抗体の１つの可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
【０２０９】
本発明によれば、単一鎖Ｆｖペイロードは、少なくとも２つのコード領域及びリンカー領域をコードするポリヌクレオチドである。ｓｃＦｖペイロードは、１０〜約２５のアミノ酸の短いリンカーペプチドと接続した、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質をコードし得る。このリンカーは、通常、可撓性のためのグリシン、ならびに可溶性のためのセリンまたはスレオニンに富んでおり、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と接続すること、またはその逆のいずれかを行うことができる。他のリンカーは、当該技術分野で周知であり、本明細書に開示されるものを含む。
【０２１０】
本発明によれば、バイシストロンペイロードは、２つの異なる抗体の部分または領域をコードするポリヌクレオチドである。二重特異性ペイロードは、２つの異なる抗原に結合し得るポリペプチドをコードする。本発明のポリヌクレオチドはまた、３つの抗原に対して親和性を有する三重特異性抗体をコードし得る。
【０２１１】
３．腫瘍及び病原体特異的抗原
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、病原体関連抗原、またはそれらの断片であり得る。抗原は、ペプチドとしてまたは無傷タンパク質もしくはその部分として発現され得る。無傷タンパク質もしくはその部分は、天然または変異であり得る。本明細書に記載のがんまたはウイルス誘導性がんと関連する抗原は、当該技術分野で公知である。このようなＴＳＡまたはＴＡＡは、がんと予め関連し得るか、または当該技術分野で周知の任意の方法によって特定され得る。
【０２１２】
腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）は、腫瘍新抗原であり得る。新抗原は、タンパク質コード配列を変化する転写における遺伝子変異または変化のため、腫瘍細胞によってのみ発現される変異抗原であり、したがって、新規の外来抗原を生成する。遺伝子変化は、遺伝子置換、挿入、欠失、または天然同族タンパク質（すなわち、正常な細胞に発現される分子）の任意の他の遺伝子変化から生じる。
【０２１３】
非限定的な例として、新抗原は、アルファ−アクチニン−４、ＡＲＴＣ１、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質（ｂ３ａ２）、Ｂ−ＲＡＦ、ＣＡＳＰ−５、ＣＡＳＰ−８、ベータ−カテニン、Ｃｄｃ２７、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＬＰＰ、ＣＭＬ−６６、ＣＯＡ−１、コネキシン３７、ｄｅｋ−ｃａｎ融合タンパク質、ＥＦＴＵＤ２、伸長因子２、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１融合タンパク質、フィブロネクチン、ＦＬＴ３−ＩＴＤ、ＦＮ１、ＧＰＮＭ８、ＬＤＬＲ−フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ１１、Ｈｓｐ−７０−１Ｂ、ＭＡＲＴ−２、ＭＥ１、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ミオシンクラスＩ、ＮＦＹＣ、ネオ−ＰＡＰ、ＯＧＴ、ＯＳ−９、ｐ５３、ｐｍｌ−ＲＡＲアルファ  融合タンパク質、ＰＲＤＸ５、ＰＴＰＲＫ、Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、ＲＢＡＦ６００、サーチュイン−２、ＳＮＲＰＤ１、ＳＹＴ−ＳＳＸ１／ＳＳＸ２融合タンパク質、ＴＧＦ−ベータ受容体ＩＩなどに由来する変異した新しいペプチドを含み得る。さらなる新抗原ペプチドは、米国特許公開第２０１１０２９３６３７号（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示される、ＳＦ３Ｂ１ペプチド、ＭＹＤペプチド、ＴＰ５３ペプチド、Ａｂｌペプチド、ＦＢＸＷ７ペプチド、ＭＡＰＫペプチド、及びＧＮＢ１ペプチドを含み得る。
【０２１４】
大規模なシークエンシング及びアルゴリズム計算を通して特定される新しい新抗原はまた、含まれ得る。例えば、国際特許公開第ＷＯ２０１４／１６８８７４号、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．２０１５，１０６（５）：５０５−５１１、及びＬｉｎｎｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２０１５，２１（１）：８１−８５（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【０２１５】
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、正常組織と新生物組織の両方によって発現され、発現のレベルががん組織において高度に上昇している過剰発現または蓄積した抗原であり得る。多くのタンパク質（例えば、がん遺伝子）は、アジポフィリン、ＡＩＭ−２、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＢＣＬＸ（Ｌ）、ＢＩＮＧ−４、ＣＡＬＣＡ、ＣＤ４５、ＣＤ２７４、ＣＰＳＦ、サイクリンＤ１、ＤＫＫ１、ＥＮＡＨ、ｅｐＣＡＭ、ｅｐｈＡ３、ＥＺＨ２、ＦＧＦ５、Ｇ２５０、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ヘプシン、ＩＤＯ１、ＩＧＦＢ３、ＩＬ１３Ｒアルファ２、腸管カルボキシルエステラーゼ、カリクレイン４、ＫＩＦ２０Ａ、レンシン、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＣＳＰ、ｍｄｍ−２、Ｍｅｌｏｅ、ミッドカイン、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ５ＡＣ、ｐ５３、Ｐａｘ５、ＰＢＦ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ−１、ＲＧＳ５、ＲｈｏＣ、ＲＮＦ４３、ＲＵ２Ａ５、ＳＥＣＥＲＮＩＮ  １、ＳＯＸ１０、ＳＴＥＡＰ１、スルビビン、テロメラーゼ、ＴＰＢＧ、ＶＥＧＦ、及びＷＴ１が含まれるが、これらに限定されない、腫瘍組織において上方調節される。
【０２１６】
ＴＡＡは、典型的に、胎児の発達中の異なる段階で及びがん性体細胞内でのみ発現される腫瘍胎児抗原であり得る。多くのタンパク質が胎児の発達中に正常に発現されるが、出生後または乳児期初期に転写抑制され、したがって、対応する正常な成体組織内で存在しないか、またはかなり低いレベルで発現される。これらの発達タンパク質の一部は、ある特定の腫瘍細胞内で再発現され、癌胎児性抗原になる。がん胎児性抗原の例としては、結腸直腸癌におけるＣＥＡ（癌胎児性抗原）、腎細胞癌（ＲＣＣ）におけるｉＬＲＰ／ＯＦＡ（未熟ラミニン受容体タンパク質／癌胎児性抗原）、前立腺癌におけるＴＡＧ−７２（腫瘍関連糖タンパク質−７２）、肝細胞癌腫（ＨＣＣ）におけるＡＦＰ（アルファ−フェトプロテイン）、脳腫瘍などの多くの悪性細胞におけるＲＯＲ１（受容体チロシンキナーゼ）、精子のタンパク質１７、卵巣癌におけるＨＭＧＡ２（高移動度群Ａ２）、癌胎児性Ｈ１９、ＣＲ−１（上皮増殖因子（ＥＧＦ）−ＣＦＣファミリーのメンバーであるクリプト−１）、ＨＣＣにおけるトロホブラスト糖タンパク質前駆体及びＧＰＣ−３（へパラン硫酸プロテオグリカンのメンバーであるグリピカン−３）が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０２１７】
ＴＡＡは、ＢＡＧＥファミリー、ＣＡＧＥファミリー、ＨＡＧＥファミリー、ＧＡＧＥファミリー、ＭＡＧＥファミリー（例えば、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ６、及びＭＡＧＥ−Ａ１３）、ＳＡＧＥファミリー、ＸＡＧＥファミリー、ＭＣＡＫ、ＮＡ８８−Ａ（癌／精巣抗原８８）、ＰＳＡＤ１、ＳＳＸ−２、及びＳＬＬＰ−１からの抗原を含むが、これらに限定されない、精巣及び胎盤などのがん細胞及び成人生殖組織によってのみ発現されるがん−精巣抗原であり得る。
【０２１８】
ＴＡＡは、メラノーマにおけるメラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１、Ｇｐ１００／ｐｍｅｌ１７、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１／−２、Ｐ．ポリペプチド、ＭＣ１Ｒ、及び前立腺癌における前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）などの単一のがん組織型によって主に発現される系列制限抗原であり得る。
【０２１９】
ＴＡＡは、腫瘍発生形質転換ウイルス（発がん性ウイルスとも呼ばれる）によってコードされる腫瘍ウイルス抗原であり得る。発がん性ウイルスは、宿主細胞に感染するとき、それ自体のＤＮＡ（またはＲＮＡ）を宿主細胞のそれに挿入し得る。ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡは、宿主細胞の遺伝子を侵すとき、それは、細胞をがん化させ得る。発がん性ウイルスとしては、ＲＮＡウイルス及びＤＮＡウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。一般に知られている腫瘍ウイルスのいくつかの例には、子宮頸癌の主な原因であるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、鼻咽頭癌、いくつかのタイプの急激に成長するリンパ腫（例えば、バーキットリンパ腫）及び胃癌の主な原因であるエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、肝細胞癌腫（ＨＣＣ）におけるＢ型肝炎、Ｃ型肝炎、及びＤ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ、ＨＣＶ、及びＨＤＶ）、多くのタイプのがん（例えば、肝臓癌、肛門癌、及びホジキン癌）になるリスクを増加させるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、リンパ腫に関連するカポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ；ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８）としても周知である）、ヒトＴリンパ球指向性ウイルス（ＨＴＬＶ−１）及びメルケル細胞ポリマウイルス（ＭＣＶ）が含まれる。ウイルス抗原は、ヒトにおけるがんと関連するウイルスの任意の定義された抗原であり得る。例えば、ＥＢＶからの抗原には、エプスタイン−バー核抗原−１（ＥＢＮＡ１）、潜在膜タンパク質１（ＬＭＰ１）、または潜在膜タンパク質２（ＬＭＰ２）が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０２２０】
ＴＡＡは、腫瘍細胞が、特異的な「クローン型」を発現する高度に多型の遺伝子から生じる、すなわち、Ｂ細胞、Ｔ細胞リンパ腫／白血病などのクローン異常をもたらす免疫グロブリン及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）などのような、イディオタイプ抗原であり得る。イディオタイプ抗原は、非病原体関連新抗原のクラスである。例えば、悪性Ｂ細胞は、再配置され、多重変異した表面免疫グロブリン（Ｉｇ）を発現する。腫瘍特異的イディオタイプ（例えば、免疫グロブリンイディオタイプ）は、免疫療法によって首尾よく標的化され得る特に魅力的な腫瘍特異的抗原と見なされる（例えば、Ａｌｅｊａｎｄｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｏｎｃｏｌ．，２０１２，２：１５９）。
【０２２１】
４．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であり得る。ＴＣＲαβヘテロ二量体を一緒に形成する特定のα鎖及びβ鎖を有するか、またはＴＣＲγδヘテロ二量体を一緒に形成する特定のγ鎖及びδ鎖を有する、ＴＣＲは、がん抗原に特異的であり得る。ＴＣＲは、組換え抗原特異的なＴ細胞受容体であり得る。
【０２２２】
α鎖及びβ鎖の可変領域は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ及びＩＩ分子によって提示される抗原ペプチドへのＴ細胞特異性を決定する。ＴＣＲによるＭＨＣ分子によって提示される腫瘍細胞の表面上に腫瘍抗原のＴＣＲ認識は、Ｔ細胞の活性化を引き起こす。ＴＣＲ遺伝子療法の使用は、所望の特異性を有する対象自体のＴ細胞を装備させて、腫瘍細胞を全滅させるのに十分な数のＴ細胞を生成し得る。いくつかの実施形態において、腫瘍特異的なＴＣＲを含む、バイオサーキットまたはエフェクターモジュールは、Ｔ細胞に形質導入され得、ＴＣＲ操作されたＴ細胞は、化学療法または放射線治療によってリンパ球減少症またはリンパ球減少症を有するがん患者に注入され、効率的な生着を可能にするが、免疫抑制を阻害するであろう。
【０２２３】
ＴＣＲ鎖を認識する腫瘍抗原をコードする配列は、腫瘍反応性Ｔ細胞（例えば、患者の腫瘍から単離する腫瘍浸潤リンパ球）から得ることができる。
【０２２４】
本発明によれば、腫瘍細胞に特異的なＴＣＲは、国際特許公開第ＷＯ２０１４／０８３１７３号（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載の方法によって生成され得る。変異腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）を提示することが可能であることが周知であるまたは可能であると思われるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）型のトランス遺伝子を発現する宿主生物は、再配置されないヒトＴＣＲ遺伝子座を発現するように形質導入される。好ましくは、これらの遺伝子座は、ＴＣＲα及びβ鎖をコードし、好ましくは、複数の、理想的にはすべてのヒトＴＣＲ  Ｖ、Ｄ、Ｊ、及び／またはＣ遺伝子を含む。宿主生物は、ＴＳＡに由来するがん特異的なＴＳＡまたはペプチドエピトープの免疫を持ち、ＴＳＡに対して特異的に再配置されたＴＣＲを発現する細胞を単離し、クローン化する。クローン化したＴ細胞からのＴＣＲが、配列決定される（国際特許公開第ＷＯ２０１４／０８３１７３号（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２２５】
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、ＭＨＣ分子と複合体形成された、ＴＳＡ、ＴＡＡ、またはそれらのエピトープを特異的に認識するＴＣＲであり得る。
【０２２６】
ＴＣＲによって認識することができる例示的な腫瘍抗原は、少なくとも以下のものを含み得る：５Ｔ４、７０７−ＡＰ、Ａ３３、ＡＦＰ（α−フェトプロテイン）、ＡＫＡＰ−４（Ａキナーゼアンカータンパク質４）、ＡＬＫ、α５β１−インテグリン、アンドロゲン受容体、アネキシンＩＩ、アルファ−  アクチニン−４、ＡＲＴ−４、Ｂ１、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＢＡＧＥ（Ｂメラノーマ抗原）、ＢＣＭＡ、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質、ベータ−カテニン、ＢＫＴ−抗原、ＢＴＡＡ、ＣＡ−Ｉ（カルボニックアンヒドラーゼＩ）、ＣＡ５０（癌抗原５０）、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、カルレチニン、ＣＡＩＸ（カルボニックアンヒドラーゼ）、ＣＡＭＥＬ（メラノーマ上の細胞毒性Ｔ−リンパ球認識抗原）、ＣＡＭ４３、ＣＡＰ−１、カスパーゼ−８／ｍ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７／ｍ、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４０／ＣＤ１５４、ＣＤ４１、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ４５、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ６８／ＫＰ１、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂ，ＣＤ１０３、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ｃｄｃ２７／ｍ、ＣＤＫ４（サイクリン依存性キナーゼ４）、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＳ、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、クロモグラニン、ｃ−Ｍｅｔ、ｃ−Ｍｙｃ、ｃｏａ−１、ＣＳＡｐ、ＣＴ７、ＣＴ１０、サイクロフィリンＢ、サイクリンＢ１、細胞質チロシンキナーゼ、サイトケラチン、ＤＡＭ−１０、ＤＡＭ−６、ｄｅｋ−ｃａｎ融合タンパク質、デスミン、ＤＥＰＤＣ１（ＤＥＰドメイン含有１）、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、ＥＢＮＡ、ＥＧＦ−Ｒ（上皮成長因子受容体）、ＥＧＰ−１（上皮糖タンパク質−１）（ＴＲＯＰ−２）、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＦ−２、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）、ＥｐｈＡ２、エプスタインバーウイルス抗原、Ｅｒｂ（ＥｒｂＢ１；ＥｒｂＢ３；ＥｒｂＢ４）、ＥＴＡ（上皮腫瘍抗原）、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１融合タンパク質、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）、ＦＢＰ（葉酸結合タンパク質）、ＦＧＦ−５、葉酸受容体α、ＦＯＳ関連抗原１、フコシルＧＭ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ（ＧＡＧＥ−１；ＧＡＧＥ−２）、ガラクチン、ＧＤ２（ガングリオシド）、ＧＤ３、ＧＦＡＰ（グリア細胞繊維性酸性タンパク質）、ＧＭ２（腫瘍胎児抗原−免疫原性−１；ＯＦＡ−Ｉ−１）、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇｐ１００、Ｈ４−ＲＥＴ、ＨＡＧＥ（ヘリカーゼ抗原）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＩＦ（低酸素誘導因子）、ＨＩＦ−１α、ＨＩＦ−２α、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−Ｒ１７０Ｉ、ＨＬＡ−Ａｌｌ、ＨＭＷＭＡＡ、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ−４０、ＨＳＰ７０−２Ｍ（熱ショックタンパク質７０）熱ショックタンパク質ＨＳＴ−２、ＨＴｇｐ−１７５、ｈＴＥＲＴ（またはｈＴＲＴ）、ヒトパピローマウイルス−Ｅ６／ヒトパピローマウイルス−Ｅ７及びＥ６、ｉＣＥ（免疫捕捉ＥＩＡ）、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ５、ＩＬＫ（インテグリン結合キナーゼ）、Ｉ���Ｐ３（インスリン様成長因子ＩＩ  ｍＲＮＡ結合タンパク質３）、ＩＲＦ４（インターフェロン調節因子４）、ＫＤＲ（キナーゼ挿入ドメイン受容体）、ＫＩＡＡ０２０５、ＫＲＡＢ−亜鉛フィンガータンパク質（ＫＩＤ）−３；ＫＩＤ３１、ＫＳＡ（１７−１Ａ）、Ｋ−ｒａｓ、ＬＡＧＥ、ＬＣＫ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ（ＬＤＬＲ−フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質）、ＬｅＹ（ルイスＹ）、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＧＥ（チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原）（ＭＡＧＥ−１；ＭＡＧＥ−３）、メラン−Ａ腫瘍抗原（ＭＡＲＴ）、ＭＡＲＴ−２／Ｓｋｉ、ＭＣ１Ｒ（メラノコルチン１受容体）、ＭＤＭ２、メソテリン、ＭＰＨＯＳＰＨ１、ＭＳＡ（筋肉特異的アクチン）、ｍＴＯＲ（ラパマイシンの哺乳動物標的）、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＭＵＭ−１（メラノーマ関連抗原（変異）１）、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ミオシン／ｍ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、ＮＡ８８−Ａ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ネオ−ＰＡＰ、ＮＦ−ＫＢ（核因子カッパＢ）、ニューロフィラメント、ＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）、ノッチ受容体、ＮｕＭａ、Ｎ−Ｒａｓ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＮＹ−ＣＯ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、オンコスタチンＭ、ＯＳ−９、ＯＹ−ＴＥＳ１、ｐ５３変異体、ｐ１９０  ｍｉｎｏｒ  ｂｃｒ−ａｂｌ、ｐｌ５（５８）、ｐｌ８５ｅｒｂＢ２、ｐｌ８０ｅｒｂＢ−３、ＰＡＧＥ（前立腺関連遺伝子）、ＰＡＰ（前立腺酸性ホスファターゼ）、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＤＧＦＲ（血小板由来成長因子受容体）、ピペリジン及びピロリジンの利用（ＰＩＰＡ）に関与するチトクロームＰ４５０、Ｐｍｌ−ＲＡＲアルファ融合タンパク質、ＰＲ−３（プロテイナーゼ３）、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）、ＰＳＭ、ＰＳＭＡ（前立腺幹細胞抗原）、ＰＲＡＭＥ（メラノーマ優先発現抗原）、ＰＴＰＲＫ、ＲＡＧＥ（腎腫瘍抗原）、Ｒａｆ（Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ、及びＣ−Ｒａｆ）、Ｒａｓ、受容体チロシンキナーゼ、ＲＣＡＳ１、ＲＧＳＳ、ＲＯＲ１（受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１）、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−３、ＳＣＰ−１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＳＰ−１７（精子タンパク質１７）、ｓｒｃファミリー、ＳＳＸ（滑膜肉腫Ｘブレークポイント）−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−３、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＴＡＴ−３、ＳＴＡＴ−５、ＳＴＡＴ−６、ＳＴＥＡＤ、ＳＴｎ、スルビビン、ｓｙｋ−ＺＡＰ７０、ＴＡ−９０（Ｍａｃ−２結合タンパク質／サイクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＣＳＴＤ１（腫瘍関連カルシウムシグナル伝達物質１）、ＴＡＣＳＴＤ２、ＴＡＧ−７２−４、ＴＡＧＥ、ＴＡＲＰ（Ｔ細胞受容体ガンマ代替リーディングフレームタンパク質）、ＴＥＬ／ＡＭＬ１融合タンパク質、ＴＥＭ１、ＴＥＭ８（エンドシアリンもしくはＣＤ２４８）、ＴＧＦβ、ＴＩＥ２、ＴＬＰ、ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子、ＴＮＦ受容体（ＴＮＦ−α受容体、ＴＮＦ−β受容体；またはＴＮＦ−γ受容体）、トランスフェリン受容体、ＴＰＳ、ＴＲＰ−１（チロシン関連タンパク質１）、ＴＲＰ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、ＴＳＰ−１８０、ＶＥＧＦ受容体、ＷＮＴ、ＷＴ−１（ウィルム腫瘍抗原）、ならびにＸＡＧＥ。
【０２２７】
一態様において、本発明のペイロードは、米国特許公開第ＵＳ２０１１０２８０８９４号及び国際特許公開第ＷＯ２０１６１３３７７９Ａ１号（当該出願の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に開示される、α鎖及びβ鎖の核酸配列を有するＨｅｒ２／ｎｅｕエピトープを特異的に認識するＴＣＲであり得る。別の態様において、本発明のペイロードは、ＴＳＡチロシナーゼに特異的なＴＣＲ（米国特許第８，６９７，８５４号（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）であり得る。
【０２２８】
他の態様において、本発明のペイロードは、滑膜肉腫Ｘブレークポイント（ＳＳＸ）−２抗原（米国特許第９，３４５，７４８号）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６  Ｅ６抗原（国際特許公開第ＷＯ２０１５／００９６０６号）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）リンタンパク質ｐｐ６５（米国特許第８，７２２，０４８号）に特異的なポリペプチド配列を有するＴＣＲ、ならびに米国特許出願第ＵＳ２０１６／００８３４４９号（当該出願の各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示される、配列番号５〜８のうちのいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を有するＴＣＲα鎖を含み、配列番号１２または１３に記載されるアミノ酸配列を有するＴＣＲβ鎖を含む、ＷＴ−１に特異的なＴＣＲであり得る。
【０２２９】
いくつかの実施形態において、ＴＳＡに特異的なＴＣＲは、ＴＳＡへの非特異的結合を軽減する親和性を弱体化するモチーフをコードする配列を有するように修飾され得る。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ  ＣＤＲ１またはＣＤＲ２領域への修飾を有する親和性を弱体化するモチーフは、ＴＣＲタンパク質とＨＬＡタンパク質との間の相互作用を弱体化するために使用され得る（国際特許公開第ＷＯ２０１６／０１４７２５号（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２３０】
いくつかの実施形態において、ＴＳＡに特異的なＴＣＲは、標的抗原に対する結合特異性及び親和性を増強させる親和性を増強するモチーフを有するように修飾され得る。いくつかの実施形態において、そのような高親和性ＴＣＲは、増強したＴＣＲを形成するために、インビトロでＴ細胞の成長中に抗原に特異的なＴＣＲα鎖と対合するデノボ生成したＴＣＲβ鎖を選択するためにＴＣＲα鎖を使用することによって生成され得る（国際特許公開第ＷＯ２０１３／１６６３２１号（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。他の実施形態において、修飾されたＴＣＲはまた、ＴＣＲとＴＳＡとの間の相互作用を強化する親和性を増強する修飾ＣＤＲ３領域をコードする配列も有し得る。
【０２３１】
一実施形態において、ＴＳＡに特異的なＴＣＲは、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して修飾される。ＴＣＲα鎖及びβ鎖は、ヌクレアーゼの標的部位を含み得る。ヌクレアーゼは、ＴＣＲのある程度の破壊を生じるＴＣＲ配列を切断することができる（米国特許出願第ＵＳ２０１４／０３０１９９０号（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
【０２３２】
一実施形態において、ＴＳＡに特異的なＴＣＲは、国際特許公開第ＷＯ２０１１／０４４１８６号（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に論じられるように、構造：Ｖα２−Ｌ−ＶβまたはＶβ−Ｌ−Ｖα２（式中、Ｌは、ＴＣＲ可変β領域（Ｖβ）を、ファミリー２（Ｖα２）のＴＣＲ可変α領域と連結するリンカーペプチドである）を有する、可溶性単一鎖ＴＣＲであり得る。
【０２３３】
一実施形態において、ＴＳＡに特異的なＴＣＲは、米国特許出願第ＵＳ２０１４／００６５１１１号（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載の方法に従ってＴＳＡに対するその親和性を増大させるように変異され得る。
【０２３４】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、抗体のＦｃドメイン（例えば、ＦｃｇＲｌａ）に特異的であり、国際特許公開第ＷＯ２０１５／１７９８３３号（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に論じられるように、抗体媒介性療法の有効性を増強するために使用され得る。
【０２３５】
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、Ｔ細胞受容体を通して天然に生じるシグナル伝達を模倣する三官能性Ｔ細胞シグナル伝達カプラー（ＴｒｉＴＡＣ）の役割を果たす組換え構築物であり得る。ＴｒｉＴＡＣは、キメラ受容体活性を増強するが、ＭＨＣを制限しない標的化を保持する。いくつかの態様において、組換え構築物は、例えば、国際特許公開第ＷＯ２０１５／１１７２２９号（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、標的特異的な結合リガンド、例えば、ＴＳＡに特異的なｓｃＦＶ、または設計されたアンキリン反復（ＤＡＲＰｉｎ）、ＴＣＲ複合体及びＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドと関連するタンパク質に結合するリガンドを含み得る。ＴＣＲ関連タンパク質は、ＣＤ３、ＺＡＰ７０  ９ゼータ鎖関連タンパク質キナーゼ７０）、ＴＹＮ、及びＣＤ２４７から選択され得る。いくつかの態様において、ＴＣＲ関連タンパク質に結合するＴｒｉＴＡＣのリガンドは、抗体または抗体断片（例えばｓｃＦｖ）であり得る。他の態様において、ＴｒｉＴＡＣのＴＣＲシグナル伝達ドメインポリペプチドは、ＣＤ４の膜貫通及び細胞質ドメインを含み得る。
【０２３６】
本発明によれば、本発明のＴＣＲのα鎖及びβ鎖は、別々の構築物、例えば、２つのエフェクターモジュールのペイロードとして含まれ得る。他の実施形態において、本発明のＴＣＲのα鎖及びβ鎖は、例えば、図３〜６に示されるように、同じエフェクターモジュールの２つのペイロードとして単一のエフェクターモジュールに含まれ得る。
【０２３７】
５．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞及びＮＫ細胞）に形質導入されるとき、ＣＡＲの細胞外標的部分によって認識される分子を発現する標的物（例えば、腫瘍細胞）に対して免疫細胞を再指向することができる、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり得る。
【０２３８】
本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」という用語は、Ｔ細胞の表面上にＴＣＲを模倣する合成受容体を指す。全般に、ＣＡＲは、細胞外標的ドメイン、膜貫通ドメイン／領域、及び細胞内シグナル伝達／活性化ドメインからなる。標準ＣＡＲ受容体において、成分：細胞外標的ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達／活性化ドメインは、単一の融合タンパク質として直線的に構成される。細胞外領域は、特定の腫瘍抗原または他の腫瘍細胞表面分子を認識する標的ドメイン／部分（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。細胞内領域は、ＴＣＲ複合体のシグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζの単一領域）、及び／または１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、及びＯＸ−４０（ＣＤ１３４）からのものを含み得る。例えば、「第一世代ＣＡＲ」は、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインのみを有するが、Ｔ細胞の持続性及び増殖を増大させる目的で、共刺激細胞内ドメインが加えられ、ＣＤ３ζシグナルドメイン及び１つの共刺激シグナル伝達ドメインを有する第二世代ＣＡＲ、ならびにＣＤ３ζシグナルドメイン及び２つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを有する第三世代ＣＡＲを生じる。ＣＡＲが、Ｔ細胞によって発現されるとき、ＣＡＲの細胞外標的化部分によって決定される抗原特異性を有するＴ細胞を得る。近年、第四世代ＣＡＲと呼ばれる、ＣＡＲのより優秀かつ安全な構造を開発するために、ホーミング及び自殺遺伝子などの１つ以上のエレメントを加えることもまた、望ましい。
【０２３９】
ＣＡＲを発現するように操作されたＴ細胞などの細胞は、ＣＡＲの標的化部分によって認識することができる分子を発現する標的細胞を攻撃するように再指向することができる。
【０２４０】
いくつかの実施形態において、細胞外標的ドメインは、ヒンジ（スペースドメインまたはスペーサーとも呼ばれる）及び膜貫通領域を通して細胞内シグナル伝達ドメインに結合される。ヒンジは、細胞外標的ドメインを、細胞膜を横断する膜貫通ドメインに接続し、細胞内シグナル伝達ドメインに接続する。ヒンジは、標的化部分が結合する標的タンパク質のサイズ、ならびに標的ドメインそれ自体のサイズ及び親和性のため、がん細胞に対してＣＡＲを形質転換した細胞の有効性を最適化するように変化させる必要であり得る。標的細胞への標的化部分を認識及び結合すると、細胞内シグナル伝達ドメインは、活性化シグナルをＣＡＲ  Ｔ細胞にもたらし、１つ以上の細胞内共刺激ドメインから「第２のシグナル」によってさらに増幅される。活性化すると、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、標的細胞を破壊し得る。
【０２４１】
いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲは、二量化を引き起こす入力が無傷機能的受容体の組み立てを促進するように、２つの部分に分裂され得、各部分は、二量体ドメインに連結される。Ｗｕ及びＬｉｍは、近年、細胞外ＣＤ１９結合ドメイン及び細胞内シグナル伝達エレメントが、ラパマイシン類似体ＡＰ２１９６７の存在下でヘテロ二量化する、ＦＫＢＰドメイン及びＦＲＢ＊（ＦＫＢＰ−ラパマイシン結合のＴ２０８９Ｌ変異体）ドメインに分離され、連結される、スプリットＣＡＲを報告した。スプリット受容体は、ＡＰ２１９６７の存在下で、特定の抗原結合と一緒に組み立てられ、Ｔ細胞を活性化する（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１５，６２５（６２５８）：ａａｂ４０７７）。
【０２４２】
いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲは、誘導性ＣＡＲとして設計され得る。Ｓａｋｅｍｕｒａらは、近年、Ｔｅｔ−Ｏｎ誘導性システムのＣＤ１９  ＣＡＲ構築物への組み込みを報告した。ＣＤ１９  ＣＡＲは、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）の存在下でのみ活性化される。Ｓａｋｅｍｕｒａ氏は、Ｔｅｔ−ＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞が、Ｄｏｘの存在下で、ＣＤ１９＋細胞株に対して同等に細胞毒性があり、従来のＣＤ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞と比較して、ＣＤ１９刺激時に、同等のサイトカイン産生及び増殖を有したことを報告した（Ｓａｋｅｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏ．Ｒｅｓ．，２０１６，Ｊｕｎ  ２１、印刷版掲載前）。一例において、このＴｅｔ−ＣＡＲは、本発明のＳＲＥ（例えば、ＤＤ）の制御下で、エフェクターモジュールのペイロードであり得る。二重システムは、形質導入したＴ細胞におけるＣＡＲ発現をオンオフするためにさらに可撓性を提供する。
【０２４３】
本発明によれば、本発明のペイロードは、第一世代ＣＡＲ、または第二世代ＣＡＲ、または第三世代ＣＡＲ、または第四世代ＣＡＲであり得る。ＣＡＲ構築物を含む代表的なエフェクターモジュールの実施形態を、図１３〜１８に例示する。いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、細胞外ドメイン、ヒンジ及び膜貫通ドメイン、ならびに細胞内シグナル伝達領域からなる完全なＣＡＲ構築物であり得る。他の実施形態において、本発明のペイロードは、細胞外標的化部分、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、１つ以上の共刺激ドメインを含む完全なＣＡＲ構築物の成分、ならびにリーダー配列、ホーミングエレメント及び安全スイッチ、またはこのような成分の組み合わせを含むが、これらに限定されない、ＣＡＲ構造及び機能性を改善する他のさらなるエレメントであり得る。
【０２４４】
本発明のバイオサーキット及び組成物によって調節されたＣＡＲは、同調可能であり、それによって、いくつかの利点を提供する。可逆性のオンオフスイッチ機構は、過度のＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖によって生じる急性毒性の管理を可能にする。本発明のＳＲＥを使用する脈動性のＣＡＲ発現は、リガンドレベルを循環させることによって達成され得る。ＣＡＲのリガンドを与えた調節は、抗原欠損、慢性抗原曝露による緊張性シグナル伝達によって生じる機能的疲弊を避けること、及びＣＡＲを発現する細胞の持続性をインビボで改善させることによって誘導される腫瘍回避を消失するのに有効であり得る。
【０２４５】
いくつかの実施形態において、本発明のバイオサーキット及び組成物は、腫瘍溶解症候群によって引き起こされる組織毒性における標的を制限するために、ＣＡＲ発現を下方調節するのに利用され得る。抗腫瘍効果後の本発明の抗腫瘍のＣＡＲの発現の下方調節は、（１）正常組織中の抗原発現によって引き起されるオンターゲットオフ腫瘍毒性（２）インビボで抗原非依存性活性化を防ぎ得る。
【０２４６】
細胞外標的化ドメイン／部分
本発明によれば、ＣＡＲの細胞外標的部分は、所与の標的分子、例えば、高特異性及び親和性を有する、腫瘍細胞における新抗原を認識し、かつそれに結合する任意の薬剤であり得る。標的部分は、腫瘍細胞の標的分子に特異的に結合するそのバリアントもしくは断片、または腫瘍細胞の標的分子に結合するその能力に基づいてランダム配列プールから選択されるペプチドアプタマー、または腫瘍細胞の標的分子に結合することができるそのバリアントもしくは断片、または天然のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）からの抗原認識ドメイン（例えば、ＨＩＶ感染細胞を認識するためのＣＤ４細胞外ドメイン）、またはサイトカイン受容体を持つ標的細胞の認識をもたらす連結サイトカインなどの外来認識成分、または受容体の天然リガンドであり得る。
【０２４７】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲの標的化ドメインは、Ｉｇ  ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、単一鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（ｄｓＦｖ）、ユニットボディ、ナノボディ、または標的分子を特異的に認識する抗体に由来する抗原結合領域、例えば、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）であり得る。一実施形態において、標的化部分は、ｓｃＦｖ抗体である。ｓｃＦｖドメインが、ＣＡＲ  Ｔ細胞の表面上に発現され、その後、がん細胞上の標的タンパク質に結合するとき、それは、がん細胞に隣接してＣＡＲ  Ｔ細胞を維持し、Ｔ細胞の活性化を引き起こすことができる。ｓｃＦｖは、一般的な組換えＤＮＡ技術の技法を使用して生成され得、本発明において論じられる。
【０２４８】
一実施形態において、ＣＡＲ構築物の標的化部分は、対象となる標的分子に特異的に結合するペプチドアプタマーなどのアプタマーであり得る。ペプチドアプタマーは、対象となる標的分子に結合するその能力に基づいてランダム配列プールから選択され得る。
【０２４９】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲ構築物の標的化部分は、標的分子の天然リガンド、または標的分子に結合することができるそのバリアント及び／または断片であり得る。いくつかの態様において、ＣＡＲの標的化部分は、標的分子の受容体であり得、例えば、ＣＤ７０受容体として完全長ヒトＣＤ２７は、ＣＤ７０陽性悪性腫瘍に対する免疫治療剤としてＣＤ２７キメラ受容体を形成するＣＤ３  ζのシグナル伝達ドメインに対するフレームで融合し得る（例えば、米国特許出願ＵＳ２０１３０３２３２１４号（当該出願の内容は、参照によりその全体が組み込まれる）。
【０２５０】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲの標的化部分は、腫瘍特異性抗原（ＴＳＡ）、例えば、腫瘍細胞上に制限的に発現されるがん新抗原を認識し得る。
【０２５１】
非限定的な例として、本発明のＣＡＲは、５Ｔ４、７０７−ＡＰ、Ａ３３、ＡＦＰ（α−フェトプロテイン）、ＡＫＡＰ−４（Ａキナーゼアンカータンパク質４）、ＡＬＫ、α５β１−インテグリン、アンドロゲン受容体、アネキシンＩＩ、アルファ−  アクチニン−４、ＡＲＴ−４、Ｂ１、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＢＡＧＥ（Ｂメラノーマ抗原）、ＢＣＭＡ、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質、ベータ−カテニン、ＢＫＴ−抗原、ＢＴＡＡ、ＣＡ−Ｉ（カルボニックアンヒドラーゼＩ）、ＣＡ５０（癌抗原５０）、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、カルレチニン、ＣＡＩＸ（カルボニックアンヒドラーゼ）、ＣＡＭＥＬ（メラノーマ上の細胞毒性Ｔ−リンパ球認識抗原）、ＣＡＭ４３、ＣＡＰ−１、カスパーゼ−８／ｍ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７／ｍ，ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４０／ＣＤ１５４、ＣＤ４１、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ４５，ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ６８／ＫＰ１、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ／ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１０３、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ｃｄｃ２７／ｍ、ＣＤＫ４（サイクリン依存性キナーゼ４）、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＳ、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、クロモグラニン、ｃ−Ｍｅｔ、ｃ−Ｍｙｃ、ｃｏａ−１、ＣＳＡｐ、ＣＴ７、ＣＴ１０、サイクロフィリンＢ、サイクリンＢ１、細胞質チロシンキナーゼ、サイトケラチン、ＤＡＭ−１０、ＤＡＭ−６、ｄｅｋ−ｃａｎ融合タンパク質、デスミン、ＤＥＰＤＣ１（ＤＥＰドメイン含有１）、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、ＥＢＮＡ、ＥＧＦ−Ｒ（上皮成長因子受容体）、ＥＧＰ−１（上皮糖タンパク質−１）（ＴＲＯＰ−２）、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＦ−２、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）、ＥｐｈＡ２、エプスタインバーウイルス抗原、Ｅｒｂ（ＥｒｂＢ１；ＥｒｂＢ３；ＥｒｂＢ４）、ＥＴＡ（上皮腫瘍抗原）、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１融合タンパク質、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）、ＦＢＰ（葉酸結合タンパク質）、ＦＧＦ−５、葉酸受容体α、ＦＯＳ関連抗原１、フコシルＧＭ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ（ＧＡＧＥ−１；ＧＡＧＥ−２）、ガラクチン、ＧＤ２（ガングリオシド）、ＧＤ３、ＧＦＡＰ（グリア細胞繊維性酸性タンパク質）、ＧＭ２（腫瘍胎児抗原−免疫原性−１；ＯＦＡ−Ｉ−１）、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇｐ１００、Ｈ４−ＲＥＴ、ＨＡＧＥ（ヘリカーゼ抗原）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＩＦ（低酸素誘導因子）、ＨＩＦ−１α、ＨＩＦ−２α、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−Ｒ１７０Ｉ、ＨＬＡ−Ａｌｌ、ＨＭＷＭＡＡ、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ−４０、ＨＳＰ７０−２Ｍ（熱ショックタンパク質７０）、ＨＳＴ−２、ＨＴｇｐ−１７５、ｈＴＥＲＴ（またはｈＴＲＴ）、ヒトパピローマウイルス−Ｅ６／ヒトパピローマウイルス−Ｅ７及びＥ６、ｉＣＥ（免疫捕捉ＥＩＡ）、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ５、ＩＬＫ（インテグリン結合キナーゼ）、ＩＭＰ３（インスリン様成長因子ＩＩ  ｍＲＮＡ結合タンパク質３）、ＩＲ��４（インターフェロン調節因子４）、ＫＤＲ（キナーゼ挿入ドメイン受容体）、ＫＩＡＡ０２０５、ＫＲＡＢ−亜鉛フィンガータンパク質（ＫＩＤ）−３；ＫＩＤ３１、ＫＳＡ（１７−１Ａ）、Ｋ−ｒａｓ、ＬＡＧＥ、ＬＣＫ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ（ＬＤＬＲ−フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合タンパク質）、ＬｅＹ（ルイスＹ）、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＧＥ（チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原）（ＭＡＧＥ−１；ＭＡＧＥ−３）、メラン−Ａ腫瘍抗原（ＭＡＲＴ）、ＭＡＲＴ−２／Ｓｋｉ、ＭＣ１Ｒ（メラノコルチン１受容体）、ＭＤＭ２、メソテリン、ＭＰＨＯＳＰＨ１、ＭＳＡ（筋肉特異的アクチン）、ｍＴＯＲ（ラパマイシンの哺乳動物標的）、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＭＵＭ−１（メラノーマ関連抗原（変異）１）、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ミオシン／ｍ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、ＮＡ８８−Ａ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、ネオ−ＰＡＰ、ＮＦ−ＫＢ（核因子カッパＢ）、ニューロフィラメント、ＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）、ノッチ受容体、ＮｕＭａ、Ｎ−Ｒａｓ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＮＹ−ＣＯ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、オンコスタチンＭ、ＯＳ−９、ＯＹ−ＴＥＳ１、ｐ５３変異体、ｐ１９０  ｍｉｎｏｒ  ｂｃｒ−ａｂｌ、ｐｌ５（５８）、ｐｌ８５ｅｒｂＢ２、ｐｌ８０ｅｒｂＢ−３、ＰＡＧＥ（前立腺関連遺伝子）、ＰＡＰ（前立腺酸性ホスファターゼ）、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＤＧＦＲ（血小板由来成長因子受容体）、ピペリジン及びピロリジンの利用（ＰＩＰＡ）に関与するチトクロームＰ４５０、Ｐｍｌ−ＲＡＲアルファ融合タンパク質、ＰＲ−３（プロテイナーゼ３）、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）、ＰＳＭ、ＰＳＭＡ（前立腺幹細胞抗原）、ＰＲＡＭＥ（メラノーマ優先発現抗原）、ＰＴＰＲＫ、ＲＡＧＥ（腎腫瘍抗原）、Ｒａｆ（Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ、及びＣ−Ｒａｆ）、Ｒａｓ、受容体チロシンキナーゼ，ＲＣＡＳ１、ＲＧＳＳ、ＲＯＲ１（受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１）、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−３、ＳＣＰ−１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＳＰ−１７（精子タンパク質１７）、ｓｒｃファミリー、ＳＳＸ（滑膜肉腫Ｘブレークポイント）−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−３、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＴＡＴ−３、ＳＴＡＴ−５、ＳＴＡＴ−６、ＳＴＥＡＤ、ＳＴｎ、スルビビン、ｓｙｋ−ＺＡＰ７０、ＴＡ−９０（Ｍａｃ−２結合タンパク質／サイクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＣＳＴＤ１（腫瘍関連カルシウムシグナル伝達物質１）、ＴＡＣＳＴＤ２、ＴＡＧ−７２−４、ＴＡＧＥ、ＴＡＲＰ（Ｔ細胞受容体ガンマ代替リーディングフレームタンパク質）、ＴＥＬ／ＡＭＬ１融合タンパク質、ＴＥＭ１、ＴＥＭ８（エンドシアリンもしくはＣＤ２４８）、ＴＧＦβ、ＴＩＥ２、ＴＬＰ、ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子、ＴＮＦ受容体（ＴＮＦ−α受容体、ＴＮＦ−β受容体；またはＴＮＦ−γ受容体）、トランスフェリン受容体、ＴＰＳ、ＴＲＰ−１（チロシン関連タンパク質１）、ＴＲＰ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、ＴＳＰ−１８０，ＶＥＧＦ受容体、ＷＮＴ、ＷＴ−１（ウィルム腫瘍抗原）、ならびにＸＡＧＥから選択される腫瘍特異的抗原に結合することができる細胞外標的化ドメインを含み得る。
【０２５２】
いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲは、標識抗原に結合することができる標的化部分を有する万能な免疫受容体を含み得る。万能な免疫受容体ＣＡＲを生成する方法は、国際特許公開第ＷＯ２０１３０４４２２５Ａ１号（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）において論じられる。
【０２５３】
いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲは、病原体抗原に結合することができる標的化部分を含み得る。
【０２５４】
いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲは、腫瘍関連糖脂質及び炭水化物などの非タンパク質分子に結合することができる標的化部分を含み得る。ＴＳＡはまた、脂質分子、多糖、単糖、核酸、ハプテン、炭水化物、またはこれらの組み合わせであり得る。
【０２５５】
いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲは、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、未成熟単球、未成熟樹状細胞、免疫抑制性ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）及びＭＤＳＣを含む、様々な腫瘍間質細胞において発現されるタンパク質を含む、腫瘍微環境内で成分に結合することができる標的化部分を含み得る。動物モデルを使用した最近の研究は、全身移植後、ＶＥＧＦＲ−２  ＣＡＲ及びＩＬ１２を発現するＴ細胞が、腫瘍を浸潤し、腫瘍退縮をもたらす腫瘤内で拡大し、持続することを示した。抗腫瘍効果は、ＶＥＧＦＲ−２  ＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化及びＩＬ１２の放出を介してＩＬ１２応答性宿主細胞の標的化に依存した（Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１２，１８：１６７２−１６８３）。
【０２５６】
いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲは、細胞表面接着分子、自己免疫疾患において見られる炎症細胞の表面分子、または自己免疫を引き起こすＴＣＲに結合することができる標的化部分を含み得る。
【０２５７】
非限定的な例として、本発明の標的化部分は、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）を認識するｓｃＦｖ抗体、例えば、ヒトメソテリンに特異的に認識し、結合する抗体ＳＳ、ＳＳ１、及びＨＮ１のｓｃＦｖ（米国特許第９，３５９，４４７号）、ＧＤ２の抗体のｓｃＦｖ（米国特許第９，３１５，５８５号）、ＣＤ１９抗原結合ドメイン（米国特許第９，３２８，１５６号）ＮＫＧ２Ｄリガンド結合ドメイン（米国特許第９，２７３，２８３号、米国特許公開第ＵＳ２０１６０３１１９０６Ａ１号）；米国特許第９，２７２，００２号の配列番号１１及び１２のアミノ酸配列を含むヒト抗メソテリンｓｃＦｖ；抗ＣＳ１結合剤（米国特許公開第ＵＳ２０１６００７５７８４号）；抗ＢＣＭＡ結合ドメイン（国際特許公開第ＷＯ２０１６／０１４５６５号）；米国特許第９，１０２，７６１号の配列番号２０の抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ抗体；国際特許公開第２０１６／０２５８８０号の配列番号５９及び７９のアミノ酸配列を有するＧＦＲアルファ４抗原結合断片；国際特許公開第ＷＯ２０１６０１４５３５号の配列番号４７、４４、４８、４９、５０、３９、４０、４１、４２、４３、４５、４６、５１、７３、７０、７４、７５、７６、６５、６６、６７、６８、６９、７１、７２、７７、１９５、８６、８３、８７、８８、８９、７８、７９、８０、８１、８２、８４、８５、９０、及び１９６を有する抗ＣＬＬ−１（Ｃ型レクチン様分子１）結合ドメイン）；国際特許公開第ＷＯ２０１６０１４５７６号の配列番号３９〜４６のアミノ酸配列を有するＣＤ３３結合ドメイン；ＧＰＣ３（グリピカン−３）結合ドメイン（国際特許公開第ＷＯ２０１６０３６９７３号の配列番号２及び配列番号４）；ＧＦＲアルファ４（グリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合型ＧＤＮＦファミリーα−受容体４細胞表面受容体）結合ドメイン（国際特許公開第ＷＯ２０１６０２５８８０）；国際特許公開第ＷＯ２０１６０２５８８９６号の配列番号４８０、４８３、４８５、４７８、１５８、１５９、１６０、１５７、２１７、２１８、２１９、２１６、２７６、２７７、２７８、及び２７５のアミノ酸配列を有するＣＤ１２３結合ドメイン；抗ＲＯＲ１抗体またはその断片（国際特許公開第ＷＯ２０１６０１６３４４号）；ＧＰＣ−３に特異的なｓｃＦｖ（国際特許公開第ＷＯ２０１６０４９４５９号の配列番号１及び２４）；ＣＳＰＧ４のためのｓｃＦｖ（国際特許公開第ＷＯ２０１５０８０９８１号の配列番号２；葉酸受容体アルファのためのｓｃＦｖ（米国特許公開第ＵＳ２０１７０００２０７２Ａ１号）（当該出願の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）であり得る。
【０２５８】
いくつかの実施形態において、天然リガンドは、本発明のＣＡＲの標的部分として使用され得る。そのような天然リガンドは、ｓｃＦｖの範囲内で親和性を有する抗原に結合することができ得、相補的受容体を発現する標的細胞に対してＴ細胞の特異性及びエフェクター機能を再指向することができる。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの標的化部分は、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４に対して天然リガンドであるニューレグリン−１（ＮＲＧ１）；ＶＥＧＦＲの天然リガンドであるＶＥＧＦ；ＩＬ１３野生型タンパク質またはＩＬ１３変異タンパク質、例えば、ＩＬ１３Ｒａ２に結合するＥ１３Ｙ；ＮＫＧ２Ｄ受容体の天然リガンドであるＮＫＧ２Ｄリガンド；ＣＤ２７のリガンドであるＣＤ７０；ならびにＢＣＭＡ８及び膜貫通活性化因子及びＣＡＭＬ相互作用物質（ＴＡＣＩ）に対して天然の高親和性リガンドである増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）であり得る。米国特許出願第ＵＳ２０１６０３６２４６７Ａ１号（当該出願の内容は、参照によりその全体が組み込まれる）において教示されるリガンドベースのＢＣＭＡ  ＣＡＲのうちのいずれか。
【０２５９】
いくつかの実施形態において、本発明の標的部分は、表１１中にアミノ酸配列を含むｓｃＦｖであり得る。
【表１１−１】
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【表１１−２】
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【表１１−３】
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【表１１−４】
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【表１１−５】
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【表１１−６】
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【表１１−７】
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【表１１−８】
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【表１１−９】
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【表１１−１０】
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【表１１−１１】
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【表１１−１２】
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【表１１−１３】
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【表１１−１４】
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【表１１−１５】
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【表１１−１６】
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【表１１−１７】
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【表１１−１８】
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【表１１−１９】
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【表１１−２０】
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【表１１−２１】
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【表１１−２２】
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【表１１−２３】
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【表１１−２４】
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【表１１−２５】
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【表１１−２６】
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【表１１−２７】
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【表１１−２８】
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【表１１−２９】
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【表１１−３０】
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【表１１−３１】
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【表１１−３２】
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【表１１−３３】
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【表１１−３４】
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【表１１−３５】
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【表１１−３６】
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【表１１−３７】
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【表１１−３８】
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【表１１−３９】
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【表１１−４０】
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【表１１−４１】
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【表１１−４２】
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【０２６０】
一実施形態において、ＣＡＲの標的化部分は、ＣＤ１９を認識し得る。ＣＤ１９は、Ｂ細胞受容体の活性化は、Ｂ細胞抗原受容体によって誘導されたシグナル伝達及びＢ細胞集団の拡大を増強する、公知のＢ細胞表面分子である。ＣＤ１９は、正常Ｂ細胞及び腫瘍性Ｂ細胞の両方で広範に発現される。慢性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、及び多くの非ホジキンリンパ腫などのＢ細胞に由来する悪性腫瘍は、しばしば、ＣＤ１９の発現を保持する。単一細胞系統に対してこのほぼ万能な発現及び特異性は、免疫療法に対してＣＤ１９を魅力的な標的にする。ヒトＣＤ１９は、１４個のエクソンを有し、エクソン１−４は、ＣＤ１９の細胞外部分をコードし、エクソン５は、ＣＤ１９の膜貫通部分をコードし、エクソン６−１４は、細胞質尾部をコードする。一実施形態において、標的化部分は、ＦＭＣ６３抗体の可変領域に由来するｓｃＦｖを含み得る。ＦＭＣ６３は、Ｂ系統の細胞上のＣＤ１９抗原と反応させるＣＤ１９抗原に特異的なＩｇＧ２ａマウスモノクローナル抗体クローンである。ＦＭＣ６３抗体によって認識されるＣＤ１９のエピトープは、エクソン２にある（Ｓｏｔｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ；５（１２）：１２８２−９５（その内容は、参照によりその全体が組み込まれる）。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの標的化部分は、４Ｇ７、ＳＪ２５Ｃ１、ＣＶＩＤ３／４２９、ＣＶＩＤ３／１５５、ＨＩＢ１９、及びＪ３−１１９を含むが、これらに限定されない、他のＣＤ１９モノクローナル抗体クローンの可変領域に由来し得る。
【０２６１】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲの標的化部分は、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）、例えば、タンパク質コード配列を変化する転写における遺伝子変異または変化のため、腫瘍細胞によってのみ発現されるがん新抗原を認識し、したがって、新規の外来抗原を生成することができる。遺伝子変化は、遺伝子置換、挿入、欠失、または天然同族タンパク質（すなわち、正常な細胞に発現される分子）の任意の他の遺伝子変化から生じる。ＣＤ１９との関連において、ＴＳＡは、エクソン２を欠いているまたはエクソン５〜６を欠いているまたは両方を欠いているヒトＣＤ１９の転写バリアントを含み得る（国際特許公開第ＷＯ２０１６０６１３６８号（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＦＭＣ６３結合エピトープは、エクソン２にあるため、エクソン２を欠いているＣＤ１９は、ＦＭＣ６３抗体によって認識されない。したがって、いくつかの実施形態において、ＣＡＲの標的化部分は、ＦＭＣ６３とは異なるｓｃＦＶであり得る。本明細書で使用される場合、「ＦＭＣ６３とは異なる」とは、ＦＭＣ６３とは異なる、ＣＤ１９抗原のエピトープ、またはＦＭＣ６３によって結合されるＣＤ１９抗原のエピトープとは異なって、免疫学的に特異的であり、それに結合する、抗体、ｓｃＦｖ、またはその断片を指す。場合によっては、標的化部分は、エクソン２を欠いているＣＤ１９抗原を認識し得る。一実施形態において、標的化部分は、エクソン１、３、及び／または４によってコードされるＣＤ１９の断片を認識する。一例において、標的化部分は、エクソン１によってコードされるＣＤ１９の部分及びエクソン３によってコードされるＣＤ１９の部分を架橋するエピトープを認識する。
【０２６２】
細胞内シグナル伝達ドメイン
ＣＡＲ融合ポリペプチドの細胞内ドメインは、その標的分子に結合した後、細胞溶解活性（例えば、サイトカイン分泌）またはヘルパー活性を含む、免疫エフェクター細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも１つを活性化する、シグナルを免疫エフェクター細胞に伝送する。したがって、細胞内ドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の「細胞内シグナル伝達ドメイン」を含む。
【０２６３】
いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を使用することができる。他の態様において、細胞内シグナル伝達ドメインの切断された部分は、エフェクター機能シグナルを形質導入する限り、無傷鎖の代わりに使用され得る。
【０２６４】
いくつかの実施形態において、本発明の細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）として知られているシグナル伝達モチーフを含み得る。ＩＴＡＭを含む細胞質シグナル伝達配列の例は、ＴＣＲ  ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来するものを含む。一例において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメインである。
【０２６５】
いくつかの実施形態において、本発明の細胞内領域は、さらなるシグナルを免疫エフェクター細胞に提供する１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含む。これらの共刺激シグナル伝達ドメインは、シグナル伝達ドメインと組み合わせて、ＣＡＲを操作した免疫細胞（例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞）の拡大、活性化、メモリ、持続性、及び腫瘍を根絶する効率をさらに改善することができる。場合によっては、共刺激シグナル伝達領域は、１つ以上の細胞内シグナル伝達及び／または共刺激分子のうちの１つ、２つ、３つ、または４つの細胞質ドメインを含む。共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体）、ＬＦＡ−１（リンパ球機能関連抗原−１）、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３を含むが、これらに限定されない、共刺激分子の細胞内／細胞質ドメインであり得る。一例において、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８の細胞質ドメインに由来する。別例において、共刺激シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）の細胞質ドメインに由来する。別例において、共刺激シグナル伝達ドメインは、米国特許第９，１７５，３０８号（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）において教示される、ＧＩＴＲの細胞内ドメインであり得る。
【０２６６】
いくつかの実施形態において、本発明の細胞内領域は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化タンパク質（ＳＬＡＭ）、例えば、ＣＤ４８、ＣＤ２２９、２Ｂ４、ＣＤ８４、ＮＴＢ−Ａ、ＣＲＡＣＣ、ＢＬＡＭＥ、ＣＤ２Ｆ−１０、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ７、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒ  ベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＬ１５Ｒａ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ，ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＤ２Ｃ  ＳＬＰ７６、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１，ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、ＤＡＰ１０、ＴＲＩＭ、ＺＡＰ７０、キラー免疫グロブリン受容体（ＫＩＲ）、例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／Ｌ３，ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＬ１／Ｓ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、及びＫＩＲ２ＤＰ１；レクチン関連ＮＫ細胞受容体、例えば、Ｌｙ４９、Ｌｙ４９Ａ、及びＬｙ４９Ｃからなる群から選択されるタンパク質からの機能的シグナル伝達ドメインを含み得る。
【０２６７】
いくつかの実施形態において、本発明の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＪＡＫ−ＳＴＡＴに由来するシグナル伝達ドメインを含み得る。他の実施形態において、本発明の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＤＡＰ−１２（死関連タンパク質１２）（Ｔｏｐｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１５，１９４：３２０１−３２１２及びＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１５，３：８１５−８２６）に由来するシグナル伝達ドメインを含み得る。ＤＡＰ−１２は、ＮＫ細胞における主要なシグナル変換受容体である。ＤＡＰ−１２によって媒介される活性化シグナルは、ある特定の腫瘍細胞及びウイルス感染した細胞に対して、ＮＫ細胞の細胞毒性応答を引き起こすのに重要な役割を果たす。ＤＡＰ１２の細胞質ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。したがって、ＤＡＰ１２由来のシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲは、ＮＫ細胞の養子免疫伝達のために使用することができる。
【０２６８】
いくつかの実施形態において、異なる共刺激ドメインを組み込み、異なるＤＤによって調節された２つ以上のＣＡＲで操作したＴ細胞は、下流シグナル伝達の動的制御を提供するために使用することができる。
【０２６９】
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、本明細書に記載の共刺激分子及び／または細胞内ドメインのうちのいずれかであり得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の共刺激分子は、それぞれ、異なるＳＲＥの制御下で、本発明に使用することができる。ＳＲＥで調節した共刺激分子はまた、第一世代ＣＡＲ、第二世代ＣＡＲ、第三世代ＣＡＲ、第四世代と組み合わせて、または本明細書に記載の任意の他のＣＡＲ設計であり得る。
【０２７０】
いくつかの実施形態において、本発明の細胞内ドメインは、表１２のアミノ酸配列を含み得る。
【表１２−１】
2020525536.tif 000299
【表１２−２】
2020525536.tif 000300
【表１２−３】
2020525536.tif 000301
【表１２−４】
2020525536.tif 000302
【表１２−５】
2020525536.tif 000303
【表１２−６】
2020525536.tif 000304
【表１２−７】
2020525536.tif 000305
【表１２−８】
2020525536.tif 000306
【０２７１】
膜貫通ドメイン
いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲは、膜貫通ドメインを含み得る。本明細書で使用される場合、「膜貫通ドメイン（ＴＭ）」という用語は、概して、原形質膜に広がる約１５残基長さのアミノ酸配列を指す。より好ましくは、膜貫通ドメインは、少なくとも２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、または４５アミノ酸残基を含み、原形質膜に広がる。いくつかの実施形態において、本発明の膜貫通ドメインは、天然または合成源のいずれかに由来し得る。ＣＡＲの膜貫通ドメインは、任意の天然の膜結合または膜貫通タンパク質に由来し得る。例えば、膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、またはゼータ鎖、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、またはＣＤ１５４に由来し（すなわち、それらの少なくとも膜貫通領域（複数可）を含み）得る。
【０２７２】
あるいは、本発明の膜貫通ドメインは、合成であり得る。いくつかの態様において、合成配列は、主に、ロイシン及びバリンなどの疎水性残基を含み得る。
【０２７３】
いくつかの実施形態において、本発明の膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ４膜貫通ドメイン、ＣＤ  ２８膜貫通ドメイン、ＣＴＬＡ−４膜貫通ドメイン、ＰＤ−１膜貫通ドメイン、及びヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域からなる群から選択され得る。非限定的な例として、膜貫通ドメインは、国際特許公開第ＷＯ２０１４／１００３８５号の配列番号１〜５のアミノ酸配列を含むＣＴＬＡ−４膜貫通ドメイン、及び国際特許公開第ＷＯ２０１４１００３８５号の配列番号６〜８のアミノ酸配列を含むＰＤ−１膜貫通ドメインであり得、当該出願の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０２７４】
いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲは、任意のヒンジ領域（スペーサーとも呼ばれる）を含み得る。ヒンジ配列は、標的結合ドメインをエフェクター細胞表面から移動させて、適切な細胞／細胞接触、標的結合、及びエフェクター細胞の活性化を可能にする、細胞外標的化ドメインの柔軟性を高めるアミノ酸の短い配列である（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９９；６：４１２−４１９）。ヒンジ配列は、標的化部分と膜貫通ドメインとの間に位置付けされ得る。ヒンジ配列は、任意の好適な分子に由来するまたはそれから得られた任意の好適な配列であり得る。ヒンジ配列は、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）ヒンジ領域、すなわち、免疫グロブリンのＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインの間に含む配列、例えば、ＩｇＧ４  Ｆｃヒンジ、野生型配列または誘導体であり得る、ＣＤ８α  ＣＤ４、ＣＤ２８、及びＣＤ７などの１型膜タンパク質の細胞外領域のすべてまたはその一部に由来し得る。いくつかのヒンジ領域は、免疫グロブリンＣＨ３ドメインまたはＣＨ３ドメイン及びＣＨ２ドメインの両方を含む。ある特定の実施形態において、ヒンジ領域は、１つ以上のアミノ酸残基、例えば、非修飾ヒンジに存在するものとは異なるアミノ酸残基と置換する、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの残基を含む、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４から修飾され得る。表１３は、本明細書に記載のＣＡＲに使用することができる様々な膜貫通領域を提供する。
【表１３−１】
2020525536.tif 000307
【表１３−２】
2020525536.tif 000308
【表１３−３】
2020525536.tif 000309
【表１３−４】
2020525536.tif 000310
【表１３−５】
2020525536.tif 000311
【０２７５】
本発明に有用なヒンジ領域を、表１４に提供する。
【表１４−１】
2020525536.tif 000312
【表１４−２】
2020525536.tif 000313
【表１４−３】
2020525536.tif 000314
【表１４−４】
2020525536.tif 000315
【表１４−５】
2020525536.tif 000316
【表１４−６】
2020525536.tif 000317
【０２７６】
いくつかの実施形態において、ヒンジドメイン及び膜貫通ドメインは、対合され得る。ヒンジドメインは、膜貫通ドメインのＮ末端で、膜貫通ドメインのＣ末端で、または膜貫通ドメイン内に存在し得る。本発明において有用であり得るヒンジ及び膜貫通領域配列を、表１５に提供する。
【表１５】
2020525536.tif 000318
【０２７７】
いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲは、ＣＡＲのドメインのうちのいずれかの間に１つ以上のリンカーを含み得る。リンカーは、１〜３０アミノ酸長であってもよい。この点において、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０アミノ酸長であってもよい。他の実施形態において、リンカーは、可撓性であってもよい。
【０２７８】
いくつかの実施形態において、本発明の標的化部分、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む成分は、単一融合ポリペプチドに構成され得る。融合ポリペプチドは、本発明のエフェクターモジュールのペイロードであってもよい。いくつかの実施形態において、１つを超えるＣＡＲ融合ポリペプチドは、エフェクターモジュールに含まれ得、例えば、２つ、３つまたはそれ以上のＣＡＲは、単一のＳＲＥ（例えば、ＤＤ）の調節下で、エフェクターモジュールに含まれ得る。ＣＡＲペイロードを含む代表的なエフェクターモジュールを、図２〜６に例示する。
【０２７９】
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、当該技術分野で教示される、周知の細胞外標的化ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、ＣＡＲ構築物を含み得る。例えば、ＣＡＲ標的化メソテリン（米国特許第９，２７２，００２号及び同第９，３５９，４４７号）；米国特許第９，２６６，９６０号のＥＧＦＲｖＩＩＩ特異性ＣＡＲ；米国特許第９，２３３，１２５号の抗ＴＡＧ  ＣＡＲ；米国特許出願第２０１６０１４５３３号のＣＤ１９  ＣＡＲ；米国特許第９，３２８，１５６号の配列番号２４のアミノ酸配列を有するＣＤ１９  ＣＡＲ；米国特許第８，９１１，９９３号、同第８，９７５，０７１号、同第９，１０１，５８４号、同第９，１０２，７６０号、及び同第９，１０２，７６１号のＣＤ１９  ＣＡＲ；国際特許公開第ＷＯ２０１６／０１４５６５号（配列番号１０９−１１３及び２１３−２３３）及びＷＯ２０１６／０１４７８９に開示されているＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）特異性ＣＡＲ；国際特許公開第ＷＯ２０１６０１４５３５号に開示されている配列番号９９、９６、１００、１０１、１０２、９１、９２、９３、９４、９５、９７、９８、１０３、及び１９７のアミノ酸配列を含むＣＬＬ−１（Ｃ型レクチン様分子１）ＣＡＲ；国際特許公開第ＷＯ２０１６０１４５７６号の配列番号４８〜５６のアミノ酸配列を含むＣＤ３３特異性ＣＡＲ；国際特許公開第ＷＯ２０１５１５０５２６号の配列番号１９〜２２、２７〜３０、及び３５〜３８のアミノ酸配列を含むＣＤ３３特異性ＣＡＲ；米国特許出願第ＵＳ２０１５０３２９６４０号の配列番号１〜５の核酸によってコードされるＣＤ３７特異性ＣＡＲ；ＧＰＣ３  ＣＡＲ（国際特許公開第ＷＯ２０１６０３６９７３号）、国際特許公開第ＷＯ２０１６０２５８８０号の配列番号８５、８６、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、及び１０４のアミノ酸配列を有するＧＦＲアルファ４  ＣＡＲ；国際特許公開第ＷＯ２０１６０２８８９６号の配列番号９８、９９、１００、及び１０１のアミノ酸配列を含むＣＤ１２３  ＣＡＲ；国際特許公開第ＷＯ２０１５１９３４０６号のＣＤ１２３特異性多鎖ＣＡＲ；国際特許公開第ＷＯ２０１６／１２０２２０号の配列番号１６０、１７１、１８８〜１９７のアミノ酸配列を含むＣＤ１２３  ＣＡＲ；国際特許公開第ＷＯ２０１６／０１６３４４号の配列番号９３、９５、及び１１７のアミノ酸配列を含むＲＯＲ−１特異性ＣＡＲ；国際特許公開第ＷＯ２０１６／０１６３４３号のＲＯＲ−１特異性多鎖ＣＡＲ；国際特許公開第ＷＯ２０１６０３４６６６号の配列番号２１、２７、３３、３９、２３、２９、３４、４１、１９、２５、３１、３７、２０、２６、３２、３８、２２、２８、３４、４０、２４、３０、３６、及び４２のアミノ酸配列を含むトロホブラスト糖タンパク質（５Ｔ４、ＴＰＢＧ）特異性ＣＡＲ；国際特許公開第ＷＯ２０１６０１６３４１号の配列番号１５、１７、２４、２５、２６、及び２７のアミノ酸配列を含むＥＧＦＲｖＩＩＩ特異性ＣＡＲ；国際特許公開第ＷＯ２０１４１６４５４４号の配列番号１のアミノ酸配列を含むＴＥＭ  ８  ＣＡＲ、国際特許公開第ＷＯ２０１４１６４５４４号の配列番号２のアミノ酸配列を含むＴＥＭｌ  ＣＡ��；国際特許公開第ＷＯ２０１６／０４９４５９号の配列番号３及び２６  のアミノ酸配列を有するＧＰＣ−３  ＣＡＲ；国際特許公開第ＷＯ２０１５／０８０９８１号のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン−４（ＣＳＰＧ４）ＣＡＲ；国際特許公開第ＷＯ２０１５／１６４７３９号のカッパ／ラムダＣＡＲ；国際特許公開第ＷＯ２０１６／１３４２８４号のＧＤ２  ＣＡＲ；国際特許公開第ＷＯ２０１６１２０２１８号のＣＬＬ１  ＣＡＲ；国際特許公開第ＷＯ２０１６１２０２１９号のＣＬＬ１マルチサブユニットＣＡＲ；国際特許公開第ＷＯ２０１６１２０２１７号のＨｓｐ７０  ＣＡＲ；国際特許公開第ＷＯ２０１６１２０２１６号のｍＡｂによるＣＡＲを含むＣＡＲ構築物を含み得、当該出願の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０２８０】
いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲ構築物は、ＣＡＩＸ（カルボキシ−脱水酵素−ＩＸ（ＣＡＩＸ）特異性ＣＡＲ（Ｌａｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ，２０１６，４４（３）：９５１−９５９）、ＨＩＶ−１特異性ＣＡＲ（Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．，２０１６，Ｍａｙ  ２５，ｐｉｉ：ＪＶＩ．００８０５−１６）、ＣＤ２０特異性ＣＡＲ（Ｒｕｆｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．，２０１６，４（６）：５０９−５１９）、ＣＤ２０／ＣＤ１９二重特異性ＣＡＲ（Ｚａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．，２０１６，４（６）：４９８−５０８）、ＣＤ２２／ＣＤ１９  ＣＡＲ（国際特許公開第ＷＯ２０１６／１４９５７８号）、ＣＤ１３８／ＢＣＭＡ二重特異性ＣＡＲ（国際特許公開第ＷＯ２０１６／１３０５９８号）、ＥＧＦＲ特異性ＣＡＲ及び抗ＥＧＦＲ  ｖｉｉｉ特異性ＣＡＲを含み得、当該出願の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０２８１】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲ配列は、表１６から選択され得る。
【表１６−１】
2020525536.tif 000319
【表１６−２】
2020525536.tif 000320
【表１６−３】
2020525536.tif 000321
【表１６−４】
2020525536.tif 000322
【表１６−５】
2020525536.tif 000323
【表１６−６】
2020525536.tif 000324
【表１６−７】
2020525536.tif 000325
【表１６−８】
2020525536.tif 000326
【表１６−９】
2020525536.tif 000327
【表１６−１０】
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【表１６−１１】
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【表１６−１２】
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【表１６−１３】
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【表１６−１４】
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【表１６−１５】
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【表１６−１６】
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【表１６−１７】
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【表１６−１８】
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【表１６−１９】
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【表１６−２０】
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【表１６−２１】
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【表１６−２２】
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【表１６−２３】
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【表１６−２４】
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【表１６−２５】
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【表１６−２６】
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【表１６−２７】
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【表１６−２８】
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【表１６−２９】
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【表１６−３０】
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【表１６−３１】
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【表１６−３２】
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【表１６−３３】
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【表１６−３４】
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【表１６−３５】
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【表１６−３６】
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【表１６−３７】
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【表１６−３８】
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【表１６−３９】
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【表１６−４０】
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【表１６−４１】
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【表１６−４２】
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【０２８２】
本発明の一実施形態において、本発明のペイロードは、異なるＢ細胞悪性腫瘍を標的化するＣＤ１９特異性ＣＡＲ、ならびに肉腫、膠芽腫、及び進行性Ｈｅｒ２陽性肺悪性腫瘍を標的化するＨＥＲ２特異性ＣＡＲである。
【０２８３】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ１９  ＣＡＲである。ＣＤ１９  ＣＡＲ成分及びＣＤ１９  ＣＡＲ構築物のアミノ酸配列を、表１７Ａ及び表１７Ｂに示す。表１７Ｂはまた、所与の構築物番号の代替のエイリアスも提供する。これらのエイリアスは、接頭辞ＯＴによって特定される。
【表１７Ａ−１】
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【表１７Ａ−２】
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【表１７Ａ−３】
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【表１７Ａ−４】
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【表１７Ｂ−１】
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【表１７Ｂ−２】
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【表１７Ｂ−３】
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【表１７Ｂ−４】
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【表１７Ｂ−５】
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【表１７Ｂ−６】
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【表１７Ｂ−７】
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【表１７Ｂ−８】
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【０２８４】
タンデムＣＡＲ（ＴａｎＣＡＲ）
いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲは、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の腫瘍特異性抗原を標的にすることができるタンデムキメラ抗原受容体（ＴａｎＣＡＲ）であり得る。いくつかの態様において、ＣＡＲは、腫瘍細胞において２つの異なるＴＳＡを認識する２つの標的化ドメインを含む二重特異性ＴａｎＣＡＲである。二重特異性ＣＡＲは、第１の腫瘍抗原に特異的な標的化ドメイン（例えば、抗原認識ドメイン）と、第２の腫瘍抗原に特異的な標的化ドメイン（例えば、抗原認識ドメイン）とを含む細胞外領域としてさらに定義され得る。他の態様において、ＣＡＲは、タンデム配列に設定されている３つ以上の標的化ドメインを含む多重特異性ＴａｎＣＡＲである。ＴａｎＣＡＲにおける標的化ドメイン間のスペースは、約５〜約３０アミノ酸長さ、例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、及び３０アミノ酸であり得る。
【０２８５】
スプリットＣＡＲ
いくつかの実施形態において、本発明の標的化部分、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む成分は、無傷機能的受容体の組み立てを促進する多重入力に依存するように、２つ以上の部分に分割され得る。一実施形態において、活性化したＣＡＲ受容体の組み立ては、ＳＲＥ（例えば、小分子）へのリガンドの結合及び標的化部分に対して特異的な抗原に依存する、スプリット合成ＣＡＲシステムが、構成され得る。非限定的な例として、スプリットＣＡＲは、小分子依存性様式において組み立てられる２つの部分からなり、受容体のある部分が、細胞外抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）を特色とし、もう一方の部分が、ＣＤ３ζ細胞内ドメインなどの細胞内シグナル伝達ドメインを有する。
【０２８６】
他の態様において、ＣＡＲシステムのスプリット部分は、シグナルを増加させるようにさらに修飾され得る。一例において、細胞質断片の第２の部分は、膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８α膜貫通ドメイン）を構築物に組み込むことによって原形質膜に固定され得る。さらなる細胞外ドメインはまた、ＣＡＲシステムの第２の部分、例えば、ホモ二量化を媒介する細胞外ドメインに加えられ得る。これらの修飾は、受容体出力の活性、すなわち、Ｔ細胞の活性化を増大させ得る。
【０２８７】
いくつかの態様において、スプリットＣＡＲシステムの２つの部分は、ヘテロ二量化小分子の結合に条件付きで相互作用するヘテロ二量化ドメインを含む。したがって、受容体成分は、小分子の存在下でアセンブルして、無傷システムを形成し、これが抗原の関与によって活性化され得る。任意の既知のヘテロ二量化成分は、スプリットＣＡＲシステムに組み込まれ得る。ジベレリン誘導性二量化システム（ＧＩＤ１−ＧＡＩ）、トリメトプリム−ＳＬＦ誘導性ｅｃＤＨＦＲ及びＦＫＢＰ二量化（Ｃｚｌａｐｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．，２００８，１３０（４０）：１３１８６−１３１８７）、ならびにＰＰ２Ｃ及びＰＹＬドメインのＡＢＡ（アブシジン酸）誘導性二量化（Ｃｕｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．２０１０，６１：６５１−６７９）を含むが、これらに限定されない、他の小分子依存性のヘテロ二量化ドメインもまた、使用してもよい。スプリットＣＡＲシステムの誘導性アセンブリ（例えば、リガンド依存性二量化）及び分解（例えば、不安定化ドメイン誘導性ＣＡＲ分解）を使用した二重調節は、ＣＡＲ修飾Ｔ細胞の活性を制御するようにさらに可撓性を提供し得る。
【０２８８】
切替可能なＣＡＲ
いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲは、切替可能なＣＡＲであり得る。Ｊｕｉｌｅｒａｔら（Ｊｕｉｌｅｒａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２０１６，６：１８９５０、当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、近年、刺激物質（例えば、小分子）に応答して一次的に切り替えられ得る制御可能なＣＡＲを報告した。このＣＡＲ設計において、システムは、ＣＡＲにおいてｓｃＦｖドメインを細胞膜ドメインから分離するヒンジドメインに直接一体化する。このようなシステムは、受容体複合体の異なる鎖内での活性化及び共刺激などのＣＡＲの異なる重要な機能を分割するまたは組み合わせることが可能であり、これは、ＴＣＲ天然構造の複雑性を模倣する。この一体化システムは、刺激物質の不在／存在によって制御されるオン／オフ状態の間のｓｃＦｖ及び抗原相互作用を切り替えることができる。
【０２８９】
可逆的ＣＡＲ
他の実施形態において、本発明のＣＡＲは、可逆的ＣＡＲシステムであってもよい。このＣＡＲ構造において、ＬＩＤドメイン（リガンド誘導性分解）は、ＣＡＲシステムに組み込まれる。ＣＡＲは、ＬＩＤドメインのリガンドを加えることによって一時的に下方調節することができる。ＬＩＤ及びＤＤに媒介された調節の組み合わせは、持続的に活性化したＣＡＲ  Ｔ細胞の調節可能な制御を提供し、それによって、ＣＡＲによって媒介された組織毒性を軽減する。
【０２９０】
阻害性ＣＡＲ（ｉＣＡＲ）
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、阻害性ＣＡＲであり得る。阻害性ＣＡＲ（ｉＣＡＲ）は、陰性シグナルは、腫瘍特異性を増強し、正常組織毒性を制限するために使用される、二重特異性ＣＡＲ設計を指す。この設計は、阻害性シグナルドメインと組み合わせられた表面抗原認識ドメインを有する第２のＣＡＲを組み込んで、活性化した受容体の同時に関与するとしてもＴ細胞応答性を制限する。この抗原認識ドメインは、Ｔ細胞が、第１の標的タンパク質の存在下で活性化され得るが、ｉＣＡＲに結合する第２のタンパク質が存在する場合、Ｔ細胞の活性化が阻害されるように正常組織特異性抗原に行われる。
【０２９１】
非限定的な例として、ＣＴＬＡ４及びＰＤ１阻害性ドメインに基づいて前立腺特異的な膜抗原（ＰＭＳＡ）に対するｉＣＡＲは、Ｔ細胞の活性化によって誘導されるサイトカイン分泌、細胞毒性、及び増殖を選択的に制限する能力を示した（Ｆｅｄｏｒｏｖ  Ｖ．Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，１１；５（２１５）：２１５ｒａ１７２、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２９２】
キメラスイッチ受容体
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、陰性シグナルを陽性シグナルに切り替えることができるキメラスイッチ受容体であってもよい。本明細書で使用される場合、「キメラスイッチ受容体」という用語は、第１の細胞外ドメインならびに第２の膜貫通及び細胞内ドメインを含む融合タンパク質を指し、第１のドメインは、陰性シグナル領域を含み、第２のドメインは、陽性細胞内シグナル伝達領域を含む。いくつかの態様において、融合タンパク質は、共刺激受容体の膜貫通及び細胞質ドメインに融合したＴ細胞上の抑制性受容体の細胞外ドメインを含むキメラスイッチ受容体である。このキメラスイッチ受容体は、Ｔ細胞阻害性シグナルをＴ細胞刺激性シグナルに変換し得る。
【０２９３】
非限定的な例として、キメラスイッチ受容体は、Ｌｉｕらによって教示される、ＣＤ２８の膜貫通及び細胞質ドメインに融合したＰＤ−１の細胞外ドメインを含み得る（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２０１６，７６（６）：１５７８−１５９０、その内容は、参照によりその全体が組み込まれる）。いくつかの態様において、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＫＩＲ、及びＢＴＬＡなどの他の阻害性受容体の細胞外ドメインはまた、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＧＴＩＲ、及びＩＣＯＳなどの共刺激受容体に由来する膜貫通及び細胞質ドメインに融合し得る。本発明との関係においては、ＳＲＥドメイン（例えば、ＤＤ）は、キメラスイッチ受容体のＮまたはＣ末端で挿入され得る。
【０２９４】
いくつかの実施形態において、本発明のキメラスイッチ受容体は、ＩＬ２Ｒ（ＩＬ２Ｒα、ＩＬ２Ｒβ、及びＩＬ２Ｒガンマ）及びＩＬ７Ｒαなどの刺激性サイトカイン受容体の細胞内シグナル伝達ドメインに融合した阻害性サイトカイン受容体（例えば、ＩＬ１３受容体α（ＩＬ１３Ｒα１）、ＩＬ１０Ｒ、及びＩＬ４Ｒα）の細胞外サイトカイン結合ドメインを含む組換え受容体を含み得る。このようなキメラサイトカイン受容体の一例は、ＩＬ７Ｒαの細胞内シグナル伝達ドメインに連結したＩＬ４Ｒαのサイトカイン結合細胞外ドメインを含む組換え受容体である（米国特許出願第２０１４／００５０７０９号を参照されたく、当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２９５】
一実施形態において、本発明のキメラスイッチ受容体は、キメラＴＧＦβ受容体であってもよい。キメラＴＧＦβ受容体は、ＴＧＦβ受容体１、ＴＧＦβ受容体２、ＴＧＦβ受容体３、または任意の他のＴＧＦβ受容体またはそれらのバリアント、及び非ＴＧＦβ受容体細胞内ドメインなどのＴＧＦβ受容体に由来する細胞外ドメインを含み得る。非ＴＧＦβ受容体細胞内ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ４０、ＣＤ２７、またはこれらの組み合わせに由来する細胞内ドメインまたはその断片であってもよい。このようなキメラＴＧＦβ受容体は、米国特許出願第ＵＳ２０１６／００７５７５５号（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）において論じされる。
【０２９６】
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、二部融合受容体であってもよい。一態様において、二部融合受容体は、腫瘍抗原に結合する抗原結合ドメイン及び１つ以上の細胞表面分子に結合する活性化ドメインを含み得る。いくつかの態様において、二部受容体の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ抗体である。他の態様において、Ｔ細胞表面刺激性分子に結合する活性化ドメインは、ＣＤ３、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）から選択され得るか、またはＮＫ細胞表面刺激性分子は、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、及びＮＫｐ３０から選択され得る。活性化ドメインはまた、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞及びＮＫ細胞）の表面上の刺激性分子に特異的なｓｃＦｖであってもよい。免疫細胞は、少なくとも１つの抗原結合ドメイン及び活性化ドメインを含む二部分子を発現するように遺伝子操作され得る。抗原結合ドメインは、がん細胞などの標的細胞上に存在する１つ以上の分子に結合する。活性化ドメインによって認識される分子を発現する免疫細胞は、認識したがん細胞を活性化するまたは攻撃するであろう。非限定的な例として、二部分子は、米国特許出願第ＵＳ２０１６／００１５７４９号（当該出願の内容は、参照によりその全体が組み込まれる）に記載されるように、ＣＤ１９またはＥｐｈＡ２に特異的な抗原認識ｓｃＦｖを含むエンゲージャー分子であってもよい。
【０２９７】
活性化条件付きＣＡＲ
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、活性化免疫細胞においてのみ発現する活性化条件付きキメラ抗原受容体であってもよい。ＣＡＲの発現は、その制御下で、配列、例えば、ＣＡＲの転写及び／または発現を誘導する１つ以上の核酸配列を指す活性化条件付き制御領域に結合され得る。このような活性化条件付き制御領域は、免疫エフェクター細胞、例えば、ＩＬ２プロモーターまたはＮＦＡＴ結合部位の活性化中上方調節する遺伝子のプロモーターであってもよい。いくつかの実施形態において、免疫細胞の活性化は、構造的に発現したＣＡＲによって達成され得る（国際特許公開第ＷＯ２０１６１２６６０８号、当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２９８】
特定のプロテオグリカンマーカーを有する腫瘍細胞に対して標的化するＣＡＲ
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、特定のタイプのがん細胞を標的にするＣＡＲであってもよい。ヒトがん細胞及び転移は、固有の及びそうでなければ異常プロテオグリカン、例えば、多糖鎖（例えば、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、デルマタン硫酸（ＤＳまたはＣＳＢ）、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、及びヘパリン）を発現し得る。したがって、ＣＡＲは、がん関連プロテオグリカンを認識する結合部分で融合され得る。一例において、ＣＡＲは、プロテオグリカンに結合した特定のタイプのコンドロイチン硫酸Ａ（ＣＳＡ）に対して高親和性で結合するＶＡＲ２ＣＳＡポリペプチド（ＶＡＲ２−ＣＡＲ）で融合され得る。ＣＡＲの細胞外ＳｃＦｖ部分は、少なくとも最小のＣＳＡ結合ドメインを含むＶＡＲ２ＣＳＡバリアントで置換され、コンドロイチン硫酸Ａ（ＣＳＡ）修飾に特異的なＣＡＲを生成し得る。あるいは、ＣＡＲは、ｓｐｙ−ＣＡＲを生成するためにスプリット−タンパク質結合システムで融合され得、ＣＡＲのｓｃＦｖ部分が、Ｓｐｙタグ及びＳｐｙキャッチャーなどのスプリットタンパク質結合システムの１つの部分で置換され、がん認識分子（例えば、ｓｃＦｖ及びまたはＶＡＲ２−ＣＳＡ）は、スプリット−タンパク質結合システムを通してＣＡＲに結合される（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／１３５２９１号を参照されたく、当該出願の内容は、参照によりその全体が組み込まれる）。
【０２９９】
ＳＵＰＲＡ  ＣＡＲ
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、スプリットユニバーサルプログラム可能な（ＳＵＰＲＡ）ＣＡＲであってもよい。ＳＵＰＲＡ  ＣＡＲは、Ｔ細胞上に発現したユニバーサル受容体（ジップＣＡＲ）及び腫瘍標的化ｓｃＦｖアダプターからなる二成分受容体システムであってもよい。ジップＣＡＲユニバーサル受容体は、細胞内シグナル伝達ドメイン、及び細胞外ドメインとしてロイシンジッパーの融合によって生成され得る。腫瘍標的化ｓｃＦｖアダプター分子またはジップＦｖは、同族のロイシンジッパー及びｓｃＦｖの融合によって生成され得る。ジップＦｖのｓｃＦｖは、腫瘍抗原に結合し得、ロイシンジッパーは、Ｔ細胞上のジップＣＡＲを結合し、活性化し得る。従来の固定したＣＡＲ設計とは異なって、ＳＵＰＲＡ  ＣＡＲモジュール設計は、免疫細胞のさらなる遺伝子操作を伴わずに多重抗原の標的化を可能にする。Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８，Ｃｅｌｌ  １７３，１−１３によって開示されるＣＡＲ設計のうちのいずれかは、本発明において有用であり得る（その内容は、参照によりその全体が組み込まれる）。
【０３００】
６．サイトカイン、ケモカイン、及び他の可溶性因子
本発明に従って、本発明のペイロードは、免疫細胞、がん細胞、及び他の細胞型によって産生されるサイトカイン、ケモカイン、成長因子、及び可溶性タンパク質であってもよく、これらは、体内で細胞と組織の間の化学的コミュニケーターとしての役割を果たす。これらのタンパク質は、細胞の成長、分化、移動、及び生存への効果から多くのエフェクター活性に広範囲の生理学的機能を媒介する。例えば、活性化したＴ細胞は、細胞毒性機能に対して様々なサイトカインを生成して、腫瘍細胞を排除する。
【０３０１】
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、インターロイキン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＴＧＦベータ、及びケモカインを含むが、これらに限定されない、サイトカイン、ならびにそれらの断片、バリアント、類似体、及び誘導体であり得る。いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、免疫応答を刺激するサイトカインであり得る。他の実施形態において、本発明のペイロードは、抗がん免疫応答に悪影響を及ぼすサイトカインのアンタゴニストであり得る。
【０３０２】
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、サイトカイン受容体、組換え受容体、それらのバリアント、類似体、及び誘導体、またはサイトカインのシグナル成分であり得る。
【０３０３】
いくつかの実施形態において、本発明のサイトカインは、免疫療法のために使用される、免疫細胞、例えば、ＣＤ８＋ＴＥＭ、ナチュラルキラー細胞、及び腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）細胞の拡張、生存、持続性、及び効力を改善させるために使用され得る。他の実施形態において、２つ以上のＤＤによって調節されたサイトカインで操作したＴ細胞は、Ｔ細胞の活性化及び腫瘍微環境のリモデリングの動的制御を提供するために使用される。一態様において、本発明は、サイトカイン療法に関連する毒性を最小限に抑えるためにバイオサーキット及び組成物を提供する。腫瘍負荷を軽減する際の成功にもかかわらず、全身サイトカイン療法は、しばしば、重度の用量を制限する副作用の発生をもたらす。２つの因子は、観察された毒性の一因となり、（ａ）多面発現、サイトカインが異なる細胞型に影響を及ぼし、文脈に応じて同じ細胞への拮抗作用を生じる場合がある、（ｂ）サイトカインは、短い血中半減期を有し、それ故に、治療効果を達するように高い用量で投与される必要があり、これは多面発現効果を悪化させる。一態様において、本発明のサイトカインは、副作用の事象においてサイトカイン発現を調節するために使用され得る。いくつかの実施形態において、本発明のサイトカインは、寿命を延長させるか、または毒性を最小限に抑えるために特異性を増強するように設計され得る。
【０３０４】
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、インターロイキン（ＩＬ）サイトカインであり得る。インターロイキン（ＩＬ）は、免疫応答を調節するための白血球によって生成される一群の糖タンパク質である。本明細書で使用される場合、「インターロイキン（ＩＬ）」という用語は、任意の種または供給源からのインターロイキンポリペプチドを指し、完全長タンパク質、ならびにタンパク質の断片または部分を含む。いくつかの態様において、インターロイキンペイロードは、ＩＬ１、ＩＬ１アルファ（赤血球生成促進因子−１とも呼ばれる）、ＩＬ１ベータ（カタボリン）、ＩＬ１デルタ、ＩＬ１エプシロン、ＩＬ１エータ、ＩＬ１ゼータ、インターロイキン−１ファミリーメンバー１〜１１（ＩＬ１Ｆ１〜ＩＬ１Ｆ１１）、インターロイキン−１ホモログ１〜４（ＩＬ１Ｈ１〜ＩＬ１Ｈ４）、ＩＬ１関連タンパク質１〜３（ＩＬ１ＲＰ１〜ＩＬ１ＲＰ３）、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１０Ｃ、ＩＬ１０Ｄ、ＩＬ１１、ＩＬ１１ａ、ＩＬ１１ｂ、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ａ、Ｉｌ１７Ｂ、ＩＬ１７Ｃ、ＩＬ１７Ｅ、ＩＬ１７Ｆ、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２０  様（ＩＬ２０Ｌ）、Ｉｌ２１、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ２３−ｐ１９、ＩＬ２３−ｐ４０、ＩＬ２４、Ｉｌ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＩＬ３１、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＩＬ３４、ＩＬ３５、ＩＬ３６  アルファ、ＩＬ３６ベータ、ＩＬ３６ガンマ、ＩＬ３６ＲＮ、ＩＬ３７、ＩＬ３７ａ、ＩＬ３７ｂ、ＩＬ３７ｃ、ＩＬ３７ｄ、ＩＬ３７ｅ、及びＩＬ３８から選択される。他の態様において、本発明のペイロードは、ＣＤ１２１ａ、ＣＤｗ１２１ｂ、ＩＬ２Ｒα／ＣＤ２５、ＩＬ２Ｒβ／ＣＤ１２２、ＩＬ２Ｒγ／ＣＤ１３２、ＣＤｗ１３１、ＣＤ１２４、ＣＤ１３１、ＣＤｗ１２５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３０、ＣＤ１２７、ＣＤｗ２１０、ＩＬ８ＲＡ、ＩＬ１１Ｒα、ＣＤ２１２、ＣＤ２１３α１、ＣＤ２１３α２、ＩＬ１４Ｒ、ＩＬ１５Ｒα、ＣＤｗ２１７、ＩＬ１８Ｒα、ＩＬ１８Ｒβ、ＩＬ２０Ｒα、及びＩＬ２０Ｒβから選択されるインターロイキンであり得る。
【０３０５】
ある特定の実施形態において、サイトカインは、ＩＦＮアルファサブタイプ（ＩＦＮα１、ＩＦＮα１ｂ、ＩＦＮα１ｃ）、ＩＦＮ  ベータ、ＩＦＮデルタサブタイプ（ＩＦＮデルタ１、ＩＦＮデルタ２、ＩＦＮデルタ８）、ＩＦＮガンマ、ＩＦＮカッパ、及びＩＦＮエプシロン、ＩＦＮラムダ、ＩＦＮオメガ、ＩＦＮタウ、及びＩＦＮゼータを含む、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）であり得る。ある特定の実施形態において、サイトカインは、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−ベータ（リンホトキシン−アルファ（ＬＴ−α）としても知られている）、リンホトキシン−ベータ（ＬＴ−β）、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、ＣＤ２７Ｌ（ＣＤ７０）、ＣＤ３０Ｌ（ＣＤ１５３）、ＦＡＳＬ（ＣＤ１７８）、４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ＯＸ４０Ｌ、ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド）、ＡＰＲＩＬ（増殖誘導リガンド）、ＴＷＥＡＫ、ＴＲＡＮＣＥ、ＴＡＬＬ−１、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、及びＴＮＦＳＦ１〜ＴＮＦＳＦ２０（ＴＮＦリガンドスーパーファミリーメンバー１〜２０）を含む、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーのメンバーであり得る。
【０３０６】
一実施形態において、本発明のペイロードは、ＩＬ２（配列番号８３００及び８３０１によってコードされる、配列番号８２９９）を含み得る。一態様において、本発明のエフェクターモジュールは、ＤＤ−ＩＬ２融合ポリペプチドであり得る。
【０３０７】
本発明のいくつかの態様において、ＩＬ２変異タンパク質は、ペイロードとして使用され得る。本明細書で使用される場合、「変異タンパク質」という用語は、タンパク質の変異、変更、または変化の構築物、分子、または配列であり、それ故に、変異体、例えば、タンパク質変異体、変異タンパク質としても知られている。続いて、「ＩＬ２変異タンパク質」は、ＩＬ２変異体である。いくつかの実施形態において、ＩＬ２変異タンパク質は、野生型ＩＬ２タンパク質のバリアントであり、野生型ＩＬ２は、配列番号８２９９のアミノ酸配列からなる。いくつかの態様において、それは、ＩＬ２Ｒαβγを発現する細胞のみに結合し、活性化するが、ＩＬ２Ｒβγのみを発現する細胞に著しく結合するか、または活性化しない、ＩＬ２バリアントを指す。いくつかの例において、ＩＬ２変異タンパク質は、ＩＬ２ＲβまたはＩＬ２Ｒγのいずれかへの結合に関与するＩＬ２の残基が、置換され、それらの相互作用を破壊する、ＩＬ２タンパク質であり得る。他の例において、ＩＬ２変異タンパク質は、ＩＬ２Ｒαに対して高い親和性を得る変異を含むＩＬ２タンパク質であり得る。ＩＬ２変異タンパク質は、ＮＫ細胞に対してＴ細胞を選択的に活性化することが必要である高親和性ＩＬ２受容体（すなわち、ＩＬ２Ｒαβγ）を優先的に活性化することができるＩＬ２選択的アゴニスト（ＩＬ２ＳＡ）であり得る。いくつかの実施形態において、ＩＬ２変異タンパク質は、より低い親和性のＩＬ２Ｒβγに優先的に結合するが、ＣＤ２５に対する低下した親和性を有する、ＩＬ２タンパク質であり得る。
【０３０８】
いくつかの実施形態において、ＩＬ２変異タンパク質は、Ｔｒｅｇ細胞を優先的に拡張または刺激するために使用され得る。本明細書で使用される場合、「Ｔｒｅｇ細胞を優先的に拡張または刺激する」は、Ｔ調節細胞の増殖、生存、活性化、及び／または機能を促進するＩＬ２変異タンパク質を意味する。
【０３０９】
例示的なＩＬ２変異タンパク質は、Ｎ８８Ｒ置換（Ｓｈａｎａｆｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２０００，１８：１１９７−１２０２）、Ｖ９１Ｋ置換を有するＩＬ２（例えば、米国特許出願第ＵＳ２０１４０２８６８９８号）；３つの変異：Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ｑ７４Ｐを有する、Ｖ９１Ｋ置換、Ｃ１２５Ａ置換；ＩＬ２Ｒα（Ｎ２９Ｓ、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ａ、Ｋ４８Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ｑ７４Ｐ）に対して高い親和性を有するＩＬ２変異タンパク質；ＩＬ２Ｒα及び低下したシグナル伝達活性に対して高い親和性を有するＩＬ２変異タンパク質（Ｎ２９Ｓ、Ｙ３１Ｈ、Ｋ３５Ｒ、Ｔ３７Ａ、Ｋ４８Ｅ、Ｖ６９Ａ、Ｎ７１Ｒ、Ｑ７４Ｐ、Ｎ８８Ｄ）、及びＰＣＴ公開第１９９９０６０１２８号に記載される、Ｄ２０Ｈ、Ｄ２０Ｉ、Ｎ８８Ｇ、Ｎ８８Ｉ、Ｎ８８Ｒ、及びＱ１２６Ｌ置換を含み得るが、これらに限定されず、当該出願の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。他の態様において、ＩＬ２変異タンパク質は、米国特許第４，５１８，５８４号、同第５，１１６，９４３号、同第５，２０６，３４４号、同第６，９５５，８０７号、同第７，１０５，６５３号、同第７，３７１，３７１号、同第７，８０３，３６１号、同第８，１２４，０６６号、同第８，３４９，３１１号、同第８，７５９，４８６号、及び同第９，２０６，２４３号、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ２００５０８６７５１号及び同第ＷＯ２０１２０８８４４６号、ＥＰ特許第ＥＰ０２３４５９９号及び同第ＥＰ０２００２８０号、ならびにＳｉｍ，Ｇ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ；４（１１）：９８３−９９４に記載されるものを含み得、それらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０３１０】
いくつかの態様において、ＩＬ２変異タンパク質は、ＩｇＧ  Ｆｃ断片などのＩＬ２変異タンパク質の血中半減期を拡張するポリペプチドに融合し得る。好ましいＦｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む、ヒトＩｇＧに由来する。他の態様において、本発明のペイロードは、第２の機能的ポリペプチドと比較するＩＬ２融合タンパク質であり得る。非限定的な例において、ＩＬ２融合タンパク質は、プロアポトーシスＢｃｌ−２ファミリーポリペプチド（Ｂａｄ、Ｂｉｋ／Ｎｂｋ、Ｂｉｄ、Ｂｉｍ／Ｂｏｄ、Ｈｒｋ、Ｂａｋ、またはＢａｘなど）で融合したＩＬ２またはＩＬ２変異タンパク質ポリペプチドを含み得、このような融合タンパク質は、細胞の生存を阻害し、細胞の増殖を阻害するか、またはＩＬ２受容体を発現する標的細胞の細胞死もしくはアポトーシスを増強させることが可能であり得る。あるいは、ＩＬ２またはＩＬ２変異タンパク質ポリペプチドは、抗アポトーシスＢｃｌ−２ファミリーポリペプチド（Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｗ、またはＢｃｌ−２など）で融合され得る。融合タンパク質は、細胞の生存を増強し、細胞の増殖を増強するか、またはＩＬ２受容体を発現する標的細胞の細胞死もしくはアポトーシスを阻害することが可能であり得る。例えば、米国特許出願第ＵＳ２０１６／０２２９９０１号を参照のこと。
【０３１１】
加えて、ＩＬ２融合タンパク質は、細胞間の相互作用を促進することができ、したがって、抗がん免疫応答を増強する、ＩＬ２−ＧＭＣＳＦ融合タンパク質であり得る（Ｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄ．，２０１６，１４：４１）。
【０３１２】
一実施形態において、本発明のペイロードは、ＩＬ１２を含み得る。ＩＬ１２は、マクロファージ及び樹状細胞などの抗原提示細胞によって分泌される２つのサブユニット（ｐ３５、ｐ４０）のヘテロ二量化タンパク質である。ＩＬ１２は、これらのエフェクター免疫細胞においてＩＦＮγ産生を誘導するためのＳＴＡＴ４経路を通してナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、ＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞、及びＣＤ４＋  Ｔヘルパー細胞に作用する１型サイトカインである（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ  Ｇ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；  ３（２）：１３３−１４６による概説）。ＩＬ１２は、ＮＫ細胞及びＣＤ８＋  Ｔ細胞の細胞毒性活性を促進することができ、したがって、抗腫瘍機能を有する。組換えＩＬ１２の静脈内注射は、進行性黒色腫及び腎細胞癌に罹患している少数の患者において適度の臨床的有効性を示した（Ｇｏｌｌｏｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０００；６（５）：１６７８−１６９２）。ＩＬ１２は、メラノーマ抗原ワクチンを用いて、またはペプチドパルスされた末梢血単核細胞を用いて細胞毒性の免疫力を増強し、トラスツズマブ治療で乳癌のＮＫ細胞活性を促進するためのアジュバントとして使用されている。腫瘍微環境へのＩＬ１２の局所送達は、いくつかの腫瘍モデルにおける腫瘍退縮を促進する。これらの研究はすべて、局所的に増加したＩＬ１２レベルが、抗腫瘍の免疫力を促進することができることを示す。組換えＩＬ１２タンパク質の全身もしくは局所投与、または腫瘍崩壊ウイルスベクターによるある大きな障害は、ＩＬ１２が高レベルで示されるときの重度の副作用である。ＩＬ１２レベルを厳しく制御するシステムの開発は、がん治療におけるＩＬ１２の安全な使用を提供し得る。
【０３１３】
一態様において、本発明のエフェクターモジュールは、ＤＤ−ＩＬ１２融合ポリペプチドであり得る。この調節可能なＤＤ−ＩＬ１２融合ポリペプチドは、養子細胞移入のためにインビボでのより大きな拡張及び生存能力を有する修飾したＴ細胞を生成するために、免疫治療剤として直接使用され得るか、または免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞及びＴＩＬ細胞）に形質導入され得る。現行の養子細胞療法における厳しい条件付けレジメンの必要性は、調節したＩＬ１２を使用して最小限に抑え得、ＤＤ−ＩＬ１２は、腫瘍微環境を修飾し、現行の腫瘍抗原標的療法では効果がない固形腫瘍に対する持続性を増大させるために使用され得る。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞を発現するＣＡＲは、全身毒性を伴わずに免疫抑制を軽減するために、ＤＤによって調節されたＩＬ１２で装甲され得る。
【０３１４】
いくつかの実施形態において、ＩＬ１２は、Ｆｌｅｘｉ  ＩＬ１２であり得、ｐ３５及びｐ４０サブユニットの両方は、単一鎖ポリペプチドを生成する単一のｃＤＮＡによってコードされる。一実施形態において、ＩＬ１２は、野生型ＩＬ１２Ｂのアミノ酸２３〜３２８を含むｐ４０サブユニットを含み得、野生型ＩＬ１２Ａのアミノ酸５７〜２５３を含む（配列番号８３０３−８３１２によってコードされる）配列番号８３０２のアミノ酸配列及びｐ３５サブユニットを含み、（配列番号８３１４〜８３２３によってコードされる）配列番号８３１３のアミノ酸配列を含む。完全長または成熟ＩＬ１２の１つ以上の機能を保持するＩＬ１２の任意の部分は、本発明において有用であり得る。
【０３１５】
いくつかの実施形態において、本発明のＤＤによって調節されたＩＬ１２組成物は、ＩＬ１２の全身投与と関連する細胞毒性を最小限に抑えるために使用され得る。ＩＬ１２による治療は、全身インフルエンザに似た症状（発熱、悪寒、疲労、関節痛、頭痛）、骨髄及び肝臓への毒性作用に関連している。最も一般的に観察された血液学的毒性は、好中球減少症及び血小板減少症、トランスアミナーゼ、高ビリルビン血症、及び低アルブミン血症の一時的（用量依存的）増加で表される肝機能異常を含んだ。場合によっては、毒性はまた、粘膜の炎症（経口粘膜炎、口内炎、または大腸炎）にも関連する。ＩＬ１２のこれらの毒性作用は、ＩＦＮγ、ＴＮＦアルファ、及びケモカイン、例えば、ＩＰ１０、及びＭＩＧの二次産生に関連した。本発明のある特定の態様において、ＤＤによって調節されたＩＬ１２は、二次メッセンジャーの生成の上昇と関連する毒性作用を防ぐように使用され得る。いくつかの実施形態において、ＤＤによって調節されたＦｌｅｘｉ−ＩＬ１２構築物は、腫瘍微環境リモデリング及びエピトープ拡散に対して制御された局所シグナルを提供することによって、特に、固体腫瘍設定において、ＣＡＲの有効性を改善するために使用され得る。ＤＤ調節はまた、Ｆｌｅｘｉ  ＩＬ１２の迅速な用量依存的及び局所産生も提供する。
【０３１６】
本発明のペイロードとして使用されたＩＬ１２構築物の形式は、最適化され得る。一実施形態において、本発明のペイロードは、Ｐ２Ａまたはフリンなどの内部リボソーム侵入部位または切断部位によって分離されるｐ４０及びｐ３５サブユニットを含むバイシストロニック（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）ＩＬ１２であり得、単一のベクターからの両方のサブユニットの独立した発現を可能にする。これは、ｆｌｅｘｉ  ＩＬ１２構築物よりも天然に生じるＩＬ１２とより同種である分泌されたＩＬ１２の構造をもたらし、本発明のペイロードは、ＩＬ１２のｐ４０サブユニットであり得る。ＤＤによって調節されたｐ４０は、「調節可能なＩＬ１２」発現を生成するために、構造的ｐ３５構築物と共発現され得る。あるいは、ＤＤによって調節されたｐ４０は、内因性ｐ３５とヘテロ二量化され得る。ｐ４０は、ｐ３５発現を安定化し、ｐ３５の輸出を刺激することが示されている（Ｊａｌａｈ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８８，６７６３−６７７６（その内容は、参照によりその全体が組み込まれる）。
【０３１７】
いくつかの実施形態において、修飾型のＩＬ１２は、ペイロードとして使用され得る。これらの修飾型のＩＬ１２は、特に、本明細書に記載の同調可能なシステムと組み合わせて使用されるときの非修飾型と比較して、インビボで短縮される半減期を有するように操作され得る。
【０３１８】
ヒトｆｌｅｘｉ  ＩＬ１２は、治療化合物として投与されるとき、全身細胞毒性をもたらし得る、５〜１９時間の報告された半減期を有する（Ｃａｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｔｈｅ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ  ”  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃ  Ｐａｔｈ．２７  Ａ，５８−６３、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）”  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １２  Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｂｙ  Ｂｏｌｕｓ  Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｃａｎｃｅｒ”  Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５：９−１６、Ａｔｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）”Ｐｈａｓｅ  Ｉ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １２  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ａｄｖａｎｃｅ  Ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ”  Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３：４０９−４１７）。ＩＬ１２のリガンド誘導制御は、用量依存的様式で生成を調節することができ、リガンド投与の停止からタンパク質合成及びＩＬ１２のクリアランスの  停止までの時間は、血漿中のＩＬ１２の毒性蓄積を防ぐには不十分であり得る。
【０３１９】
一実施形態において、ペイロードとして使用された修飾型のＩＬ１２は、Ｎ末端からＣ末端まで、（ｉ）第１のＩＬ１２  ｐ４０ドメイン（ｐ４０Ｎ）、（ｉｉ）任意の第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）ＩＬ１２  ｐ３５ドメイン、（ｉｖ）任意の第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第２のＩＬ１２  ｐ４０ドメイン（ｐ４０Ｃ）のような構造を有する、Ｔｏｐｏ−ｓｃ  ＩＬ１２であり得る。一実施形態において、修飾されたｔｏｐｏ  ｓｃ  ＩＬ１２ポリペプチドは、タンパク質分解に対する感受性の増加を示す。Ｔｏｐｏ−ｓｃ  ＩＬ１２は、国際特許公開第ＷＯ２０１６０４８９０３号（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０３２０】
ＩＬ１２ポリペプチドはまた、修飾されて（例えば、遺伝子的に、合成的に、または組換え操作されて）、対応するＩＬ１２を欠いているプロテイナーゼ感受性と比較して、ＩＬ１２複合体の生物学的に活性な半減期を低減するように、プロテイナーゼに対する感受性を増加し得る。プロテイナーゼ感受性型のＩＬ１２は、国際特許公開第ＷＯ２０１７０６２９５３号（当該出願の内容は、参照によりその全体が組み込まれる）に記載されている。
【０３２１】
ＩＬ１２の全身毒性はまた、腫瘍部位に対するその治療効果を制限するために細胞表面にＩＬ１２を結合することを含む機構を介して制限されるかまたは厳しく制御され得る。膜結合型ＩＬ１２は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）シグナルペプチドを使用することまたはＣＤ８０膜貫通ドメインを使用することがこれまでに記載されている（Ｎａｇａｒａｊａｎ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  Ａ．９９（３）：４１０−７、Ｂｏｚｅｍａｎ  ＥＮ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｖａｃｃｉｎｅ．７；３１（２０）：２４４９−５６、Ｗｅｎ−Ｙｕ  Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２），Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０：５，９２７−９３７；それらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が組み込まれる）。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、表１３、表１４、及び表１５のうちのいずれかから選択され得る。
【０３２２】
いくつかの実施形態において、本発明の免疫細胞によって分泌されるＩＬ１２レベルは、ＴＬＲアゴニストで活性化したときに、ヒト骨髄性樹状細胞（ｍＤＣ１）によって分泌されるＩＬ１２レベルほぼ相当し得る。一実施形態において、ＴＬＲアゴニストは、投与したリポ多糖とＲ８４８との組み合わせであり得る。
【０３２３】
いくつかの実施形態において、免疫細胞のＩＬ１２によって誘導した活性化によって分泌されるＩＦＮガンマは、リガンドの不在下でのレベルと比較して、リガンドの存在下で少なくとも５倍多い。
【０３２４】
いくつかの実施形態において、ＩＬ１２の調節は、必要な安全スイッチを提供する。いくつかの実施形態において、ＩＬ−１２分泌は、腫瘍微環境におけるエフェクター細胞を動員する、及び／または活性化する。いくつかの実施形態において、ＩＬ１２の調節は、毒性を生じることなく、ＣＡＲ  Ｔ機能への利益を提供する。
【０３２５】
一実施形態において、本発明のペイロードは、ＩＬ１５を含み得る。インターロイキン１５は、Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞に対して強力な免疫刺激サイトカイン及び必須の生存因子である。ＩＬ２及びＩＬ１５を比較する前臨床研究は、ＩＬ１５がＩＬ２よりも低い毒性と関連することを示している。いくつかの実施形態において、本発明のエフェクターモジュールは、ＤＤ−ＩＬ１５融合ポリペプチドであり得る。ＩＬ１５ポリペプチドはまた、ＩＬ１５受容体に対するその結合親和性を増大させるために修飾され得る。例えば、アスパラギンは、ＩＬ１５（米国特許出願第ＵＳ２０１４０１３４１２８Ａ１号（当該出願の内容は、参照によりその全体が組み込まれる）の配列番号２）の７２位でアスパラギン酸によって置き換えられ得る。いくつかの態様において、ＩＬ１５は、野生型ＩＬ１５のアミノ酸４９〜１６２を含む、（配列番号８２３６によってコードされる）配列番号８２３４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ１５配列は、終止コドンを含み得、配列番号８２３５及び８２３７〜８２３８のヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【０３２６】
ＩＬ１５によって媒介された活性化の固有の特性は、トランス提示の機構であり、ＩＬ１５は、同じ細胞または異なる細胞において、膜結合型ＩＬ１５ベータ／ガンマ受容体に結合し、活性化するＩＬ１５受容体（ＩＬ１５Ｒａ）のアルファサブユニットとの複合体として提示される、ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ複合体は、ＩＬ１５それ自体よりもＩＬ１５シグナル伝達を活性化するのにさらに有効である。それゆえに、いくつかの実施形態において、本発明のエフェクターモジュールは、ＤＤ−ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ融合ポリペプチドを含み得る。一実施形態において、ペイロードは、米国特許出願第ＵＳ２０１６０１５８２８５Ａ１号（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ融合ポリペプチドであり得る。ＩＬ１５受容体アルファは、ＩＬ１５への結合に必要な構造エレメントの大部分を含むスシドメインと呼ばれる細胞外ドメインを含む。それ故に、いくつかの実施形態において、ペイロードは、米国特許出願第ＵＳ２００９０２３８７９１Ａ１号（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａスシドメイン融合ポリペプチドであり得る。
【０３２７】
調節されるＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａは、制御性Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及びＴＩＬ細胞に影響を及ぼすことなく、ＣＤ８ＴＥＭ細胞集団の拡張、生存、及び効力を促進するために使用され得る。一実施形態において、ＤＤ−ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａは、Ｂ細胞白血病及びリンパ腫におけるＣＤ１９指向性Ｔ細胞療法を増強するために使用され得る。一態様において、ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａは、現行のＣＡＲ−Ｔ治療パラダイムにおいて条件付きレジメンの必要性を軽減するための本発明のペイロードとして使用され得る。
【０３２８】
ＤＤ−ＩＬ１５、ＤＤ−ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ及び／またはＤＤ−ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａスシドメインを含むエフェクターモジュールは、分泌する（例えば、ＩＬ２シグナル配列を使用して）または膜結合する（例えば、ＩｇＥまたはＣＤ８ａシグナル配列を使用して）ように設計され得る。
【０３２９】
いくつかの実施形態において、免疫細胞のＩＬ１５によって誘導した活性化によって分泌されるＩＦＮガンマは、リガンドの不在下でのレベルと比較して、リガンドの存在下で少なくとも１０倍多い。
【０３３０】
いくつかの実施形態において、ＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａ融合タンパク質の調節は、構造的に発現したＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａと比較して安全スイッチを提供する。いくつかの実施形態において、ＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａは、ＣＡＲ  Ｔ細胞のより良好な拡張及び／または持続性をもたらす。
【０３３１】
いくつかの態様において、ＤＤ−ＩＬ１１５／ＩＬ１５Ｒａは、表１８に提供されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、表１８中に使用されるリンカーは、ＳＧリンカーであり得る。表１８において、アスタリスクは、終止コドンの翻訳を示す。いくつかの実施形態において、表１８に記載のＤＤは、さらなる終止コドンを含み得る。本明細書で使用される場合、ＩＬ１５の野生型（ＷＴ）は、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号：Ｐ４０９３３を指し、ＩＬ１５Ｒａの野生型（ＷＴ）は、ＵｎｉＰｒｏｔ番号：Ｑ１３２６１を指す。表１８はまた、所与の構築物番号の代替のエイリアスも提供する。これらのエイリアスは、接頭辞ＯＴによって特定される。
【表１８−１】
2020525536.tif 000373
【表１８−２】
2020525536.tif 000374
【表１８−３】
2020525536.tif 000375
【表１８−４】
2020525536.tif 000376
【表１８−５】
2020525536.tif 000377
【表１８−６】
2020525536.tif 000378
【表１８−７】
2020525536.tif 000379
【表１８−８】
2020525536.tif 000380
【表１８−９】
2020525536.tif 000381
【表１８−１０】
2020525536.tif 000382
【表１８−１１】
2020525536.tif 000383
【表１８−１２】
2020525536.tif 000384
【表１８−１３】
2020525536.tif 000385
【０３３２】
いくつかの実施形態において、表１８に記載の配列は、さらなる終止コドンを含み得る。例えば、構築物「ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｌ）、終止」は、配列番号８３６２のヌクレオチド配列によってコードされ得、構築物「ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｌ、Ｆ７３６Ａ）、終止」は、配列番号８３６３のヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【０３３３】
一実施形態において、本発明のペイロードは、ＩＬ１８を含み得る。ＩＬ１８は、Ｔ及びＮＫ細胞によって生成されるＩＦＮγを促進する炎症性及び免疫調節サイトカインである。ＩＬ１８は、ＩＬ１ファミリーに属する。分泌されたＩＬ１８は、ＩＬ１８Ｒα及びβ鎖からなるヘテロ二量体受容体複合体に結合し、シグナル変換を開始する。ＩＬ１８は、病原体生成物に応答してＩＦＮγの生成、Ｔｈ１の応答、及びＮＫ細胞の活性化を含む、免疫システム機能を調節するために、他のサイトカインに合わせて作用する。ＩＬ１８は、いくつかの腫瘍において抗がん効果を示した。組換えＩＬ１８タンパク質またはＩＬ１８トランス遺伝子の投与は、ＣＤ４＋Ｔ及び／またはＮＫ細胞媒介性応答の活性化を通して黒色腫または肉腫退縮を誘導する（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０１０，１７：３３５３−３３５７による概説）。ＩＬ１８と、他のサイトカイン、例えば、ＩＬ１２または共刺激分子（例えば、ＣＤ８０）との組み合わせは、ＩＬ１８の抗がん効果を増加させる。例えば、ＩＬ１８及びＩＬ１２Ａ／ＢまたはＣＤ８０遺伝子は、Ｔ細胞媒介性抗腫瘍免疫応答を相乗的に引き起こすことを目的として腫瘍崩壊ウイルスのゲノムに首尾よく一体化されている（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，２０１１，１８：８９８−９０９）。ＩＬ２／ＩＬ１８融合タンパク質はまた、前臨床モデルにおけるサイトカイン単独で及び低毒性と比較して増強した抗腫瘍特性を示す（Ａｃｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００５，６５：９５３６−９５４６）。
【０３３４】
単独でまたはＩＬ１２及びＩＬ１５と組み合わせてＩＬ１８は、ＮＫ細胞を活性化する。前臨床研究は、養子移入のＩＬ１２、ＩＬ１５、及びＩＬ１８の予め活性化したＮＫ細胞は、インビボで構築された腫瘍に対して増強したエフェクター機能を示す（Ｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０１２，２０９：２３５１−２３６５、及びＲｏｍｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１２，１２０：４７５１−４７６０）。ヒトＩＬ１２／ＩＬ１５／ＩＬ１８を活性化したＮＫ細胞はまた、メモリ様特性を示し、サイトカイン（例えば、ＩＬ２の低濃度）に応答してさらにＩＦＮγを分泌する。一実施形態において、本発明のエフェクターモジュールは、ＤＤ−ＩＬ１８融合ポリペプチドであり得る。
【０３３５】
一実施形態において、本発明のペイロードは、ＩＬ２１を含み得る。ＩＬ２１は、Ｔ細胞及びナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞によって主に生成される別の多面Ｉ型サイトカインである。ＩＬ２１は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、単球、及び樹状細胞（ＤＣ）を含むが、これらに限定されない、様々な細胞型への各種の効果を有する。ＩＬ２１に対する機能的受容体は、ＩＬ２１受容体（ＩＬ２１Ｒ）及び一般のサイトカイン受容体ガンマ鎖からなり、これはまた、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、及びＩＬ１５に対する受容体のサブユニットである。研究は、ＩＬ２１ががん免疫療法のための有望な免疫治療剤である有力な証拠を提供する。ＩＬ２１は、成熟を促進し、細胞毒性を増強し、ＮＫ細胞によってＩＦＮγ及びパーフォリンの生成を誘導する。これらのエフェクター機能は、Ｂ１６黒色腫の成長を阻害する（Ｋａｓａｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２００２，１６（４）：５５９−５６９及びＢｒａｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４，１７２（４）：２０４８−２０５８）。ＩＬ１５と一緒にＩＬ２１は、抗原特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞メンバー及びそれらのエフェクター機能を拡張し、腫瘍退縮をもたらす（Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２００５，２０１（１）：１３９−１４８）。ＩＬ２１はまた、腫瘍微環境における複数の免疫エフェクター細胞を活性化させるために使用され得る。ＩＬ２１はまた、ＳＴＡＴ３またはＳＴＡＴ１シグナル経路を介して、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、及び慢性リンパ球性白血病細胞などのある特定の型のリンパ腫においてアポトーシスを直接誘導し得る。単独でまたは抗ＣＤ２０  ｍＡｂ（リツキシマブ）と組み合わせてＩＬ２１は、ＮＫ細胞依存性細胞毒性効果を活性化し得る。興味深いことには、ＩＬ２１の免疫抑制作用の発見は、このサイトカインが、免疫応答の誘導または抑制をもたらし得る「両刃の剣」−ＩＬ２１刺激であることを示唆している。ＩＬ２１の刺激効果及び抑制効果の両方は、ＩＬ２１関連の免疫治療剤を使用するときに、見なされなければならない。ＩＬ２１のレベルは、調節エレメントによって厳しく制御される必要がある。一態様において、本発明のエフェクターモジュールは、ＤＤ−ＩＬ２１融合ポリペプチドであり得る。
【０３３６】
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、Ｉ型インターフェロンを含み得る。Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ−Ｉ）は、ヒトにおけるウイルス感染を攻撃するために重要な可溶性タンパク質である。ＩＦＮ−Ｉは、ＩＦＮアルファサブタイプ（ＩＦＮα１、ＩＦＮα１ｂ、ＩＦＮα１ｃ）、ＩＦＮベータ、ＩＦＮデルタサブタイプ（ＩＦＮデルタ１、ＩＦＮデルタ２、ＩＦＮデルタ８）、ＩＦＮガンマ、ＩＦＮカッパ、及びＩＦＮエプシロン、ＩＦＮラムダ、ＩＦＮオメガ、ＩＦＮタウ、及びＩＦＮゼータを含む。ＩＦＮα及びＩＦＮβは、免疫応答において主なＩＦＮ  Ｉサブタイプである。免疫療法のための固有のヘテロ二量化受容体であるインターフェロンアルファ受容体（ＩＦＮＡＲ）を通したＩＦＮ  Ｉシグナルのすべてのサブタイプは、２つのサブユニットであるＩＦＮＡＲ１及びＩＦＮＡＲ２からなった。ＩＦＮＲの活性化は、ウイルス感染への宿主応答及び適応免疫において調節する。いくつかのシグナル伝達カスケードは、Ｊａｎｕｓ活性化キナーゼ−シグナルトランスジューサー及び転写活性化（ＪＡＫ−ＳＴＡＴ）経路、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）経路、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）経路、ｖ−ｃｒｋ肉腫ウイルス性ＣＴ１０癌遺伝子ホモログ（鳥類）様（ＣＲＫＬ）経路、及びＮＦ−κＢカスケードを含む、ＩＦＮＲによって活性化され得る。Ｉ型ＩＦＮが、腫瘍細胞及びウイルス感染細胞の増殖を直接阻害し、ＭＨＣクラスＩ発現を増加させ、抗原認識を増強することが長年構築されていた。ＩＦＮ−Ｉはまた、免疫システム調節に関与することが証明されている。ＩＦＮは、インターフェロン受容体（ＩＦＮＲ）を通して直接的に、またはケモカイン及びサイトカインの誘導によって間接的に、免疫システムを調節することができる。Ｉ型ＩＦＮは、ＮＫ細胞機能を増強し、ＮＫ細胞の生存を促進する。Ｉ型ＩＦＮはまた、抗原提示に対する高い能力を有するＤＣに単球の分化を支持する単球に影響を及ぼし、マクロファージ機能及び分化を刺激する。いくつかの研究はまた、ＩＦＮ−ＩがＣＤ８＋Ｔ細胞の生存及び機能を促進することも示す。場合によっては、本発明のバイオサーキットを使用してＩ型ＩＦＮの発現を同調して、ＩＦＮによる長期治療によって生じる免疫抑制を避けることが望ましくあり得る。
【０３３７】
組換えＩ型ＩＦＮタンパク質、Ｉ型ＩＦＮトランス遺伝子、Ｉ型ＩＦＮをコードするベクター、及びＩ型ＩＦＮを発現する細胞を使用する、新規の抗がん免疫療法が、開発されている。例えば、ＩＦＮαは、黒色腫、ＲＣＣ、及び多発性骨髄腫などのいくつかの腫瘍性疾患の治療への承認を得ている。Ｉ型ＩＦＮが免疫システムの機能を直接的及び間接的に調節するための強力なツールであるが、全身長期治療の副作用及び十分に高い有効性の欠如は、腫瘍学における臨床用途ＩＦＮαの影響力を抑える。ＩＦＮレベルが悪性組織で厳しく調節される場合、Ｉ型ＩＦＮはより有効である可能性が高いと見られている。間欠的送達のためのアプローチは、観察に従って、最適化ペースでの間欠性が、応答する免疫細胞において、ＩＦＮ−Ｉによって誘導される（すなわち、ＳＯＣＳ１誘導のため）シグナル伝達脱感作機構（ネガティブフィードバック機構）を回避するのに役立ち得ることが提案されている。本発明に従って、エフェクターモジュールは、ＤＤ−ＩＦＮ融合ポリペプチドを含み得る。ＤＤ及びそのリガンドは、ＩＦＮの配列を制御して、抗ウイルス及び抗腫瘍免疫応答を誘導し、その間に、ＩＦＮの長期曝露によって引き起こされる副作用を最適化する。
【０３３８】
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーのメンバーを含み得る。「ＴＮＦスーパーファミリー」という用語は、本明細書で使用する場合、アポトーシスを誘導し得る一連のサイトカインを指す。ＴＮＦファミリーのメンバーは、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−ベータ（リンホトキシン−アルファ（ＬＴ−α）としても知られている）、リンホトキシン−ベータ（ＬＴ−β）、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、ＣＤ２７Ｌ（ＣＤ７０）、ＣＤ３０Ｌ（ＣＤ１５３）、ＦＡＳＬ（ＣＤ１７８）、４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ）、ＯＸ４０Ｌ、ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド）、ＡＰＲＩＬ（増殖誘導リガンド）、ＴＷＥＡＫ、ＴＲＡＮＣＥ、ＴＡＬＬ−１、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、及びＴＮＦＳＦ１〜ＴＮＦＳＦ２０（ＴＮＦリガンドスーパーファミリーメンバー１〜２０）を含む。一実施形態において、本発明のペイロードは、ＴＮＦ−アルファであり得る。ＴＮＦ−アルファは、腫瘍細胞の細胞溶解を生じ、細胞増殖の分化を誘導し得る。一態様において、本発明のエフェクターモジュールは、ＤＤ−ＴＮＦアルファ融合ポリペプチドを含み得る。
【０３３９】
一実施形態において、本発明のペイロードは、ＴＮＦアルファ細胞外ドメインに融合したサイトカインであり得る。このようなペイロードは、ＴＮＦ細胞外ドメインに融合した膜関連サイトカインとして生成される。一実施形態において、サイトカインは、膜結合プロテアーゼ及び／または細胞外空間内のプロテアーゼ、例えば、ＭＭＰ９の作用によって細胞表面から放出され得る。本明細書に記載のサイトカインのうちのいずれかは、本発明において有用であり得る。このようなサイトカイン−ＴＮＦ骨格構築物は、調節を保ちつつ、処理されたサイトカインの天然配列を保存するために使用され得る。
【０３４０】
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、阻害性サイトカインを遮断する阻害性分子を含み得る。阻害剤は、阻害性サイトカインに特異的な遮断抗体、及び阻害性サイトカインに対してアンタゴニストなどであり得る。
【０３４１】
いくつかの態様において、本発明のペイロードは、二次サイトカインＩＬ３５の阻害剤を含み得る。ＩＬ３５は、インターロイキン−１２（ＩＬ１２）サイトカインファミリーに属し、ＩＬ２７β鎖Ｅｂｉ３及びＩＬ１２α鎖ｐ３５からなるヘテロ二量体である。生物活性ＩＬ３５の分泌は、フォークヘッドボックスタンパク質３（Ｆｏｘｐ３）＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）（静止している及び活性化Ｔｒｅｇ）においてのみ記載されている。ファミリーにおける他の膜とは違って、ＩＬ３５は、エフェクターＴ細胞の増殖を阻害すること及び恐らく他のパラメータによって抗炎症性様式においてのみ機能するように思われる（Ｃｏｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００７，４５０（７１６９）：５６６−５６９）。
【０３４２】
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）サブタイプ（ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、及びＴＧＦ−β３）を遮断する阻害剤を含み得る。ＴＧＦ−βは、マクロファージを含む多くの細胞型によって分泌され、しばしば、２つのタンパク質ＬＴＢＰ及びＬＡＰと複合体形成される。プラスミンなどの血清プロテイナーゼは、活性化マクロファージからの複合体からの活性ＴＧＦ−βの放出を触媒する。ＴＧＦ−βの発現の増加が、多くのがんの悪性腫瘍と相関することが示されている。腫瘍微環境におけるＴＧＦ−βの免疫抑制活性は、腫瘍形成に寄与する。
【０３４３】
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、ＩＤＯ酵素の阻害剤を含み得る。いくつかの実施形態において、本発明のＤＤに融合したペイロードは、ＴＧＦ−ベータ及びＩＤＯなどの免疫抑制分子の阻害剤であり得る。
【０３４４】
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、ケモカイン及びケモカイン受容体を含み得る。ケモカインは、近隣の応答細胞の有向走化性を誘導することができる、分泌型低分子サイトカインまたはシグナル伝達タンパク質のファミリーである。ケモカインは、ＳＣＹＡ１−２８（ＣＣＬ１−２８）、ＳＣＹＢ１−１６（ＣＸＣＬ１−１６）、ＳＣＹＣ１−２（ＸＣＬ１−２）、ＳＣＹＤ−１、及びＳＣＹＥ−１からなる群から選択されるＳＣＹ（低分子サイトカイン）；またはＸＣＬ１及びＸＣＬ２からなる群から選択されるＣケモカイン；またはＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、及びＣＣＬ２８からなる群から選択されるＣＣケモカイン；またはＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、及びＣＸＣＬ１７からなる群から選択されるＣＸＣケモカイン；またはＣＸ３ＣケモカインＣＸ３ＣＬ１であり得る。いくつかの態様において、ケモカイン受容体は、ＸＣＲ１を含むＣケモカインに対する受容体、またはＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、及びＣＣＲ１０を含むＣＣケモカインに対する受容体、またはＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、及びＣＸＣＲ５を含むＣＸＣケモカインに対する受容体、またはＣＸ３Ｃケモカイン受容体ＣＸ３ＣＲ１であり得る。
【０３４５】
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＭＩＰ３ａ、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）−１、細胞内接着分子（ＩＣＡＭ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、インターロイキン−１受容体活性化キナーゼ（ｉＲＡＫ−１）、ラクトトランスフェリン、及び顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）などの免疫療法において重要な役割を担う他の免疫調節剤を含み得る。
【０３４６】
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、アンフィレグリンを含み得る。アンフィレグリン（ＡＲＥＧ）は、ＥＧＦＲ受容体に結合し、ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の機能を増強するＥＧＦ様成長因子である。ＡＲＥＧは、腫瘍環境内に免疫抑制を促進する。したがって、いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、免疫療法中に免疫応答を抑制するためのアンフィレグリン（Ａｍｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）を含み得る。
【０３４７】
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、融合タンパク質を含み得、サイトカイン、ケモカイン、及び／または他の可溶性因子は、抗体などの他の生体分子、及びまたは受容体のためのリガンドに融合し得る。このような融合分子は、サイトカインの半減期を増加させ、全身毒性を軽減させ、腫瘍部位でサイトカインの局所濃度を増加させ得る。２つ以上のサイトカイン、ケモカイン、及び他の可溶性因子を含む融合タンパク質は、相乗的治療的有用性を得るために使用され得る。一実施形態において、ペイロードは、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ２融合タンパク質であり得る。
【０３４８】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のヒンジドメイン及び膜貫通ドメインのうちのいずれかが、可溶性サイトカイン提示のための骨格として使用され得る。サイトカインは、プロテアーゼ切断部位によってＣＤ８のヒンジ及び膜貫通ドメインに作動可能に連結され得る。切断部位での切断は、細胞表面膜からサイトカインを放出する。いくつかの態様において、サイトカインは、前駆体型であり得る。前駆体型からのサイトカインの活性型の生成は、切断部位での切断を介して生じる。本明細書に記載のサイトカインのうちのいずれかは、骨格として本明細書に記載のヒンジ及び膜貫通ドメインのうちのいずれかを使用して操作され得る。
【０３４９】
７．免疫調節因子
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲＡ、ＣＤ１６０、２Ｂ４、及びＴＧＦＲを含むが、これらに限定されない、共抑制性分子（例えば、免疫チェックポイント）の阻害剤（アンタゴニスト）を含み得る。いくつかの態様において、阻害剤は、これまでに論じられるように、遮断／アンタゴニスト抗体またはそれらの断片、あるいは共抑制性受容体のリガンドであり得る。
【０３５０】
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３を含むが、これらに限定されない、共刺激分子のアゴニストを含み得る。非限定的な例として、共刺激分子ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）のアゴニストは、国際特許公開第ＷＯ２０１６１２０７８９号（当該出願の内容は、参照によりその全体が組み込まれる）に開示されている、配列番号１、２、３、４、５、及び６のアミノ酸配列を含むＩＣＯＳ結合タンパク質であり得る。
【０３５１】
いくつかの態様において、共刺激分子のアゴニストは、これまでに論じられるように、アゴニスト抗体またはその断片、あるいはその標的の生物学的活性を増強することができる任意の結合分子であり得る。例えば、ＯＸ４０のアゴニストリガンドは、ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２）であり得る。本明細書で使用される、ＯＸ４０リガンドは、無傷ＯＸ４０リガンド、可溶性ＯＸ４０リガンドを含み、第２の部分に共有結合されるＯＸ４０リガンドの機能的に活性な部分を含む融合タンパク質、例えば、タンパク質ドメイン、及びバリアントは、天然に生じるＯＸ４Ｌからのアミノ酸配列によって異なるが、ＯＸ４０受容体に特異的に結合するまたはＯＸ４０Ｌの生物学的活性さえも増強する能力を保持し得る。
【０３５２】
全般に、共刺激分子のアゴニストは、Ｔ細胞の活性化などのその標的分子の生物学的活性を実質的に増強する。望ましくは、生物学的活性は、１０、２０、３０、５０、７０、８０、９０、９５、または１００によって増強される。
【０３５３】
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、先天性応答及び適応免疫応答の両方を統合し得るストレスタンパク質及び熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）を含む免疫調節剤を含み得る。それらはまた、免疫応答を刺激する他のシャペロン及びアダプターであり得る。非限定的な例として、本発明のペイロードは、ＡＴＰ結合ドメイン切断型グルコース調節タンパク質１７０（Ｇｒｐ１７０）で融合したフラジェリンのＮＦ−ＫＢ−活性化ドメインを含む融合タンパク質であり得る（米国特許出願第ＵＳ２０１５／０３１５２５５号（当該出願の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。融合構築物は、抗がん免疫応答を刺激するために使用することができる分泌可能なＧｒｐ１７０−フラジェリンハイブリッドシャペロン（Ｆｌａｇｒｐ１７０）を形成する。
【０３５４】
他の実施形態において、本発明のペイロードは、ＳＴＩＮＧ（インターフェロン遺伝子の刺激因子）タンパク質、宿主細胞質の監視経路の要素としてＴＡＮＫ結合キナーゼ（ＴＢＫ１）−ＩＲＦ３シグナル伝達軸を活性化する細胞質におけるアダプター分子を含み得、先天的免疫力を強力に活性化するＩＦＮβ及び他のＩＲＦ−３依存性遺伝子産物の誘導を生じ、抗原特異性ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞、ならびに病原体特異性抗体の両方からなる適応免疫応答の発生をもたらす。
【０３５５】
Ｄｅｍａｒｉａらは、ＳＴＩＮＧのアゴニストである環状ジヌクレオチドＧＭＰ−ＡＭＰ（ｃＧＡＭＰ）の腫瘍内注射によるＳＴＩＮＧタンパク質の強制的な活性化が、黒色腫及び結腸癌のマウスモデルにおける注射された対側の腫瘍の成長制御をもたらす抗腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を増強することができることを報告した。ＳＴＩＮＧ依存性抗腫瘍免疫力は、腫瘍微環境における内皮細胞によって生成されたＩ型ＩＦＮに応じて異なる（Ｄｅｍａｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０１５，１１２（５）：１５４０８−１５４１３）。これらの研究は、ＳＴＩＮＧが、腫瘍微環境におけるＩ型ＩＦＮシグナル伝達の増強を介して抗腫瘍免疫応答に寄与することを示す。バイオサーキット、ＳＴＩＮＧを含むエフェクターモジュールは、単独でまたは本発明の他の免疫治療剤と組み合わせて抗腫瘍応答を増強するために、腫瘍微環境に適用され得る。
【０３５６】
ＳＴＩＮＧタンパク質に加えて、本発明のペイロードは、先天性免疫炎症応答を活性化するために、ウイルス及び微生物によって細胞の感染を感知することに関与するＰＲＲ（パターン認識受容体）を含み得る。このようなＰＲＲは、トール様受容体（ＴＬＲ）、ＲＩＧ−Ｉ様受容体（ＲＬＲ）、ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）、及びＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）を含む。ＲＬＲファミリーは、レチノイン酸誘導性遺伝子様Ｉ（ＲＩＧ−１）、黒色腫分化関連遺伝子５（ＭＤＡ５）、ならびに遺伝学及び生理学研究室２（ＬＧＰ２）からなる、ＲＮＡ感知システムである。ＲＩＧ−１は、比較的短いｄｓＲＮＡ（最大１ｋｂ）を認識するが、一方、ＭＤＡ５は、ＩＦＮα及びＩＦＮβを含むＩ型ＩＦＮの合成を活性化するために、長いｄｓＲＮＡ（２ｋｂを超える）を検出する（Ｗｉｌｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１０，２２：４１−４７）。ＲＬＲは、Ｉ型ＩＦＮの生成を引き起こす下方調節シグナル伝達タンパク質を活性化する。ＴＬＲは、多くの場合、「ＰＡＭＰ」（病原体関連分子パターンと称される）、微生物における異なる構造を認識する。ＴＬＲに結合するリガンドは、炎症性サイトカイン及びケモカインなどの炎症及び免疫、ならびにＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化に関与する因子の産生を誘導する細胞内シグナル伝達経路のカスケードを起動させる。ヒトにおいて特定されている１０のＴＬＲのうちで、ＴＬＲ−１、２、４、５、及び６は、細胞表面に発現するが、一方、ＴＬＲ−３、−７／８、及び−９は、ＥＲ区画に発現する。いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、ＰＲＲのうちの１つ、またはＰＲＲのアゴニストであり得る。
【０３５７】
８．代謝因子／代謝チェックポイント
いくつかの実施形態において、免疫療法で使用されるＴ細胞などの免疫細胞は、抗腫瘍Ｔ細胞応答を増強させるように代謝的に再プログラミングされ得る。代謝活性は、Ｔ細胞受容体またはＣＡＲ及び共刺激シグナルを通して活性化する際に、免疫細胞、具体的には、Ｔ細胞の成長、拡張、分化、及びエフェクター機能を支持することを必要とする。がん細胞と浸潤免疫エフェクター細胞との間の代謝競合は、Ｔ細胞のエネルギー及び機能不全をもたらす。
【０３５８】
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、解糖の調節物質であり得る。がん細胞におけるＷａｒｂｕｒｇ効果は、Ｔ細胞毒性及びエフェクター機能を抑制し得る乳酸の大量の生成をもたらす。非限定的な例として、養子移入のための免疫細胞は、Ｔ細胞におけるＰＥＰの産生を増加させるホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ１（ＰＣＫ１）を過剰発現するように修飾され得る。解糖代謝産物ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）の産生の増加は、ｓａｒｃｏ／ＥＲ  Ｃａ（２＋）−ＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ）活性を抑制することができ、それ故に、Ｔ細胞受容体媒介性Ｃａ（２＋）−ＮＦＡＴシグナル伝達及びエフェクター機能を持続することができる（Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，２０１５，１６２（６）：１２１７−１２２８）。
【０３５９】
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、ＯＸＰＨＯＳ経路に関与するタンパク質からなり得る。例えば、ＬＥＭ（リンパ球拡張分子）は、細胞毒性のＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖及びエフェクター機能、ならびにリンパ性脈絡髄膜炎（ＣＭＶ）による感染に応答するメモリＴ細胞の生成を促進し得るタンパク質である。ＬＥＭは、ＯＸＰＨＯＳ（酸性リン酸化）タンパク質の翻訳及びミトコンドリア内膜への挿入を媒介し、それによって、ＯＸＰＨＯＳ活性を調節する、ＣＲＩＦ１（ＣＲ６相互作用因子１）の複合体である。したがって、ＬＥＭは、Ｔ細胞の代謝（ミトコンドリア呼吸レベル）及び拡張の陽性調節物質である（Ｏｋｏｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１５，３４８（６２３８）：９９５−１００１）。
【０３６０】
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、アミノ酸調節に関与する代謝酵素の阻害剤であり得る。免疫細胞と腫瘍細胞との間の代謝競合は、Ｔ細胞のエネルギーによる免疫抑制性腫瘍微環境の構築及び維持をもたらし得る。非限定的な例は、細胞外アルギニンを分解することができる一酸化窒素シンターゼ及びアルギナーゼＩ、またはトリプトファンを分解するインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の阻害剤を含む。腫瘍細胞及び免疫抑制細胞によって分泌されるこれらの酵素の廃棄は、抗腫瘍免疫を促進し得る。
【０３６１】
他の実施形態において、本発明のペイロードは、デノボ脂肪酸及びコレステロール生合成に重要であるタンパク質を含み得る。これは、ＳＲＥＢＰ１（ＳＲＥＢＦ１としても知られている）、ＳＲＥＢＰ２（ＳＲＥＢＦ２）、ＨＭＧＣＲ、ＨＭＧＣＳ、ＦＡＳＮ、ＡＣＡＣＡ、及びＳＱＬＥなどのタンパク質、ならびにＬＤＬＲなどの輸送経路を含み得る。細胞毒性のＣＤ８＋Ｔ細胞のコレステロール代謝の調節は、それらの抗腫瘍エフェクター機能及び増殖を増強し得る。コレステロールは、膜脂質の重要な要素であり、ＣＤ８＋Ｔ細胞の原形質膜のコレステロールレベルの増加が、Ｔ細胞受容体のクラスタリング及びシグナル伝達、ならびに免疫学的シナプスのより効率的な形成を増強することが示されている（Ｍｏｌｎａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  ＢｉｏｌＣｈｅｍ．２０１２，２８７：４２６６４−４２６７４）。養子移入のために使用されるＴ細胞（例えば、抗腫瘍ＣＡＲ  Ｔ細胞）は、コレステロール生合成及び／または輸送を増強するタンパク質を発現するようにさらに操作され得る。
【０３６２】
９．安全スイッチ
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、強い毒性の場合に養子移入細胞を排除し、それによって、Ｔ細胞療法の副作用を緩和することができる、ＳＲＥによって調節される安全スイッチを含み得る。免疫療法における養子移入Ｔ細胞は、ＴＡＡの正常な組織発現に応答して、正常な細胞を攻撃し得る。さらに、養子移入Ｔ細胞のオン腫瘍標的活性は、腫瘍溶解症候群、サイトカイン放出症候群、及び関連マクロファージ活性化症候群などの毒性をもたらし得る。
【０３６３】
一実施形態において、本発明のペイロードは、当該技術分野で開発されているアポトーシスの誘導によってまたは免疫監視によって不適切に活性化した細胞を排除し得る。
【０３６４】
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、安全スイッチとしての役割を果たす誘導性キラー／自殺遺伝子を含み得る。養子移入免疫細胞に導入されると、キラー／自殺遺伝子は、それらの同種反応性を制御し得る。キラー／自殺遺伝子は、ＳＲＥ（例えば、ＤＤ）の非治療リガンドの投与によって形質導入した細胞の条件付きアポトーシスを可能にするアポトーシス遺伝子（例えば、カスパーゼ）であり得る。
【０３６５】
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、カスパーゼ９を含み得る。場合によっては、カスパーゼ９は、低い基本的発現を有するように修飾され、カスパーゼ動員ドメイン（ＣＡＲＤ）を欠いていてもよい（米国特許第ＵＳ９４３４９３５Ｂ２号、当該出願の内容は、参照によりその全体が組み込まれる）の配列番号２６及び配列番号２８）。
【０３６６】
一実施形態において、本発明のペイロードは、ヒトＦＫ５０６タンパク質に由来する薬物結合ドメインに融合したカスパーゼ９遺伝子に由来するポリペプチドからなる、自殺遺伝子システム、ｉＣａｓｐ９／化学的に誘導した二量化（ＣＩＤ）システムである。生体不活性の小分子ＡＰ１９０３（リミヅシド（ｒｉｍｉｄｕｃｉｄ））の投与は、薬物結合ドメインの架橋結合及び融合タンパク質の二量化、次いで、カスパーゼ９の二量化を誘導する。これは、下方調節エフェクターカスパーゼ３の活性化、続いて細胞アポトーシスの誘導をもたらす（Ｓｔｒａａｔｈｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００５，１０５：４２４７−４２５４、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ｉＣａｓｐ９遺伝子を含むＣＡＲＴを使用した前臨床研究は、マウスモデルにおけるインビボでのＣＡＲ  Ｔ細胞の有効な排除を示し、このアプローチの潜在的有効性を示す。（Ｂｕｄｄｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ，２０１３，８：ｅ８２７４２．１０．１３７１、Ｈｏｙｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２０１０；２４（６）：１１６０−１１７０）。一実施形態において、本発明のペイロードは、カスパーゼ９を含み得る。一態様において、本発明のエフェクターモジュールは、ＤＤ−カスパーゼ９融合ポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、完全長カスパーゼ９（配列番号８３６５、８３６６によってコードされる、配列番号８３６４）またはカスパーゼ９デルタＣＤ（配列番号８３６８によってコードされる、配列番号８３６７）であり得る。本明細書に記載のカスパーゼ９配列は、任意に、配列のＣ末端で終止コドンを含み得る。
【０３６７】
場合によっては、ｉＣａｓｐ９／ＣＩＤシステムは、リミヅシドの不在下でさえ、二量化の基本比率を有し、意図的でない細胞死をもたらすことが示されている。ｉＣａｓｐ９／ＣＩＤの発現レベルの調節は、ｉＣａｓｐ９／ＣＩＤシステムの有効性を最大限にするのに重要である。本発明のバイオサーキット及び／またはそれらの要素のうちのいずれかは、その有用性を最適化するために、ｉＣａｓｐ９／ＣＩＤシステムを調節または同調するのに使用され得る。二量化によって誘導されたアポトーシスパラダイムに使用されるタンパク質の他の例は、Ｆａｓ受容体、Ｆａｓ関連タンパク質の死エフェクター機能、ＦＡＤＤ、カスパーゼ１、カスパーゼ３、カスパーゼ７、及びカスパーゼ８を含み得るが、これらに限定されない（Ｂｅｌｓｈａｗ  Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．，９９６，３：７３１−７３８、ＭａｃＣｏｒｋｌｅ  Ｒ．Ａ．ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，１９９８，９５：３６５５−３６６０、Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．１９９６；６：８３９−８４７、それらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。
【０３６８】
いくつかの実施形態において、本発明の安全スイッチは、代謝酵素、例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）及びシトシンデアミナーゼ（ＣＤ）を含み得る。ＨＳＶ−ＴＫは、三リン酸型ヌクレオシドを生成するために、アシクロビル及びガンシクロビル（ＧＣＶ）を含む、ヌクレオシド類似体をリン酸化する。ＤＮＡに組み込まれると、ＨＳＶ−ＴＫは、連鎖停止及び細胞死をもたらす。哺乳動物チミジンキナーゼとは違って、ＨＳＶ−ＴＫは、哺乳動物細胞における自殺遺伝子として使用するのに好適である、ＧＣＶなどのヌクレオシド類似体に対して１０００倍高い親和性を特徴とする。シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）は、５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）を細胞毒性５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に変換することができる（Ｔｉｒａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９８，１６７：４１−４９）。
【０３６９】
いくつかの実施形態において、本発明の安全スイッチは、ＣＡＲ操作Ｔ細胞において共発現され得る、ＣＹＰ４Ｂ１変異体（自殺遺伝子として）を含み得る（Ｒｏｅｌｌｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎ  Ｔｈｅｒ．，２０１６，Ｍａｙ  １９，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｇｔ．２０１６．３８）。
【０３７０】
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、細胞死を誘導し得る融合構築物、例えば、Ｓｔ−Ｒ１−Ｓ１−Ｑ−Ｓ２−Ｒ２（式中、Ｓｔは、軸配列（ｓｔａｌｋ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）であり、Ｒ１／２及びＱは、異なるエピトープであり、Ｓ１／２は、任意のスペーサー配列である）の式を有するポリペプチドを含み得る（国際特許公開第ＷＯ２０１３／１５３３９１号、当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０３７１】
いくつかの実施形態において、安全スイッチは、養子移入細胞の原形質膜に発現される抗原に特異的に結合する治療抗体によって媒介され得る。抗原−抗体の相互作用は、抗原に対して特定のモノクローナル抗体の投与後に、細胞除去を可能にする。非限定的な例として、本発明のペイロードは、ＣＤ２０及び抗ＣＤ２０抗体（Ｇｒｉｆｆｉｏｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ，２００９，９４：１３１６−１３２０）、タンパク質タグ及び抗タグ抗体（Ｋｉｅｂａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２００８，１０５：６２３−６２８）、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の投与後に、ＣＤ３４選択、細胞追跡、ならびに細胞消失を可能にする、ＣＤ３４（マーカー部分として）及びＣＤ２０（自殺部分として）からのエピトープを組み合わせる小型自殺遺伝子（ＲＱＲ８）（Ｐｈｉｌｉｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２０１４，１２４：１２７７−１２８７）、切断型ヒトＥＧＦＲポリペプチド及び抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２０１１，１１８：１２５５−１２６３）、ならびに米国特許出願公開第２０１５／００９３４０１号、当該出願の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）において論じられる構造式を有する小型ポリペプチド安全スイッチなどの安全スイッチを媒介するために使用される抗原及び抗体対を含み得る。
【０３７２】
１０．調節スイッチ
養子細胞療法（ＡＣＴ）の有用性は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の高発生率によって制限されている。ＧＶＨＤは、養子移入Ｔ細胞が宿主組織損傷をもたらす免疫応答を引き出すときに生じる。移植細胞による宿主抗原の認識は、急性ＧＶＨＤを示す炎症性サイトカインストームカスケードを引き起こす。ＧＶＨＤは、免疫システムのエフェクターと調節アームとの間の不均衡と特徴付けられる。いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、調節スイッチとして使用され得る。本明細書で使用される場合、「調節スイッチ」は、免疫システムの調節アームを増強することによって移植片への耐性を増加させるときのタンパク質を指す。
【０３７３】
一実施形態において、調節スイッチは、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ細胞）の拡張を優先的に促進するペイロードを含み得る。Ｔｒｅｇは、胸腺における高親和性リガンドにおいて陽性に選択され、自己抗原への耐性に重要な役割を果たす、異なる細胞集団である。さらに、Ｔｒｅｇはまた、外来抗原への末梢耐性に重要な役割を果たすことも示されている。Ｔｒｅｇは、免疫耐性を促進するため、本発明の組成物によるＴｒｅｇの拡張は、ＧＶＨＤを制限するのに望ましくあり得る。
【０３７４】
いくつかの実施形態において、調節スイッチは、ＮＦκＢ、ＦＯＸＯ、核内受容体Ｎｒ４ａ、レチノイン酸受容体アルファ、ＮＦＡＴ、ＡＰ−１、及びＳＭＡＤなどのＴｒｅｇ活性化因子を含み得るが、これらに限定されない。このような因子は、制御性Ｔ細胞プログラムの活性化及びＴ細胞の拡張をもたらすＴ細胞のフォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）の発現をもたらし得る。
【０３７５】
一実施形態において、調節スイッチは、ＦＯＸＰ３、Ｔ細胞における転写調節因子であり得る。ＦＯＸＰ３の機能は、ＩＬ２及びエフェクターＴ細胞サイトカインを含む多くの遺伝子の発現の抑制をもたらす、ＮＦＡＴの機能を抑制することである。ＦＯＸＰ３はまた、ＣＤ２Ｓ、細胞毒性Ｔ−リンパ球抗原細胞毒性Ｔ−リンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体ファミリー遺伝子（ＧＩＴＲ）及び葉酸受容体４などの遺伝子に対する転写活性化因子としての役割を果たす。ＦＯＸＰ３はまた、ＲＯＲＣ（ＲＡＲ関連オーファン受容体Ｃ）に拮抗することによってＩＬ１７産生ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１７）の分化も阻害する。エクソン２（ＦＯＸＰ３デルタ２）またはエクソン７（ＦＯＸＰ３デルタ７）を欠いているＦＯＸＰ３のアイソフォームはまた、調節スイッチとして使用され得る。一態様において、本発明のエフェクターモジュールは、ＤＤ−ＦＯＸＰ３融合ポリペプチドであり得る。ＦＯＸＰ３は、完全長ＦＯＸＰ３（配列番号８３７０によってコードされる配列番号８３６９）、またはＦＯＸＰ３（ＷＴのアミノ酸２〜４３１）（配列番号８３７２によってコードされる配列番号８３７１）、デルタ２ＦＯＸＰ３（配列番号８３７４によってコードされる配列番号８３７３）、またはＦＯＸＰ３デルタ（ＷＴのアミノ酸２〜３９６）（配列番号８３７６によってコードされる配列番号８３７５）であり得る。
【０３７６】
１１．ホーミング受容体
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、指定された腫瘍部位などの異なる解剖学的区画に免疫療法細胞を誘導するホーミング受容体を含み得る。例えば、キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞は、Ｔ細胞によって通常は発現されないホーミング受容体を発現するようにさらに修飾され得る。本明細書で使用される場合、「ホーミング受容体」という用語は、指示された臓器、特定の組織、または特定の細胞型に対して受容体を発現する細胞を誘導する受容体である。このようなトラフィッキング受容体は、ある特定の標的臓器におけるＴ細胞の蓄積を好む。いくつかの実施形態において、本発明のホーミング受容体は、接着分子であり得る。他の実施形態において、本発明のホーミング受容体は、ケモカインへの走化性を媒介するケモカイン受容体であり得る。非限定的な例として、ホーミング受容体は、ＣＸＣＲ５などのＢ細胞ゾーンホーミング受容体、ＣＸＣＲ７などのＴ細胞ゾーンホーミング受容体、ＣＣＲ９及びインテグリンα４β７（リンパ球パイアー斑接着分子としても知られている）などの胃腸ホーミング受容体、ＣＬＡ（皮膚リンパ球関連抗原受容体）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ８、及びＣＣＲ１０などの皮膚ホーミング受容体（例えば、国際特許公開第ＷＯ２０１６０２５４５４号、当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）であり得る。他のホーミング受容体には、黒色腫腫瘍に対してケモカイン受容体修飾された腫瘍浸潤リンパ球を再指向するＣＸＣＲ２及びＣＸＣＲ１（Ｉｄｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０１６，１４２８：２６１−２７６及びＳａｐｏｚｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２０１２，６１（１０）：１８３３−１８４７）、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって発現されると、ＣＣＬ２（ＣＣＲ２リガンド）発現が増加される前立腺癌の部位に修飾されたＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導することができるＣＣＲ２（Ｇａｒｅｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，２０１６，Ｍａｙ  １０．ｄｏｉ：１０．１８６３２／ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．９２８０）、ならびに腸管ホーミング受容体としてＣＤ１０３が含まれるが、これらに限定されない。
【０３７７】
１２．免疫シグナル伝達
免疫治療剤による治療は、免疫細胞シグナル伝達を誘導し、細胞型特異的な免疫活性の活性化をもたらし、最終的には、免疫応答をもたらし得る。いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、シグナル伝達経路の外因性制御を達成するために使用される免疫シグナル伝達生体分子であり得る。例示的な免疫シグナル伝達生体分子は、活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）（例えば、ＮＦＡＴ、ＮＦＡＴ２、ＮＦＡＴ３、及びＮＦＡＴ  ４）、核因子カッパＢ（ＮＦκＢ）、シグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ）、アクチベータータンパク質−１（ＡＰ−１）、Ｒｅｌ、Ｆｏｓ、及びＪｕｎ；ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）、哺乳動物のラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）、ホスホイノシチド依存性キナーゼ（ＰＤＫ）、タンパク質キナーゼＢ（ＰＫＢ）、ＩｋＢキナーゼ（ＩＫＫ）、カルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼ（ＣａＭＫ）などのキナーゼ；ならびにＲａｓ、Ｃｂｌ、カルモジュリン（ＣａＭ）、カルパイン、及びＩｋｋＢキナーゼなどの他のシグナル伝達分子などの転写因子を含む。
【０３７８】
一実施形態において、本発明のペイロードは、ＳＨＰ−１及び／またはＳＨＰ−２の阻害と組み合わせて投与され得る。チロシン−タンパク質ホスファターゼＳＨＰ１（ＰＴＰＮ６とも知られている）及びＳＨＰ２（ＰＴＰＮ１１とも知られている）は、プログラム細胞死（ＰＤ１）阻害性シグナル伝達経路に関与する。ＰＤ１の細胞内ドメインは、免疫受容体チロシンに基づいた阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）及び免疫受容体チロシンに基づいたスイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を含む。ＩＴＳＭは、ＳＨＰ−１及び２を動員することが示されている。これは、近隣のＴＣＲシグナル伝達分子の脱リン酸化を誘導し、それによって、Ｔ細胞の活性化の抑制をもたらし、Ｔ細胞枯渇をもたらすことができる、陰性の共刺激マイクロクラスターを生成する。一実施形態において、ＳＨＰ−１及び２の阻害剤は、Ｔ細胞、ＴＩＬ、または枯渇を緩和するための他の細胞型において、タンパク質の優性ネガティブ形を発現することを含み得る。このような変異体は、内因性の触媒的に活性なタンパク質に結合し、それらの機能を阻害することができる。一実施形態において、ＳＨＰ−１及び／またはＳＨＰ−２の優性ネガティブ変異体は、触媒活性に必要とされるホスファターゼドメインを欠いている。いくつかの実施形態において、Ｂｅｒｇｅｒｏｎ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．２０１１  Ｄｅｃ；１５２（１２）：４５８１−８．、Ｄｕｓｔｉｎ  ＪＢ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍａｒ  １；１６２（５）：２７１７−２４．、Ｂｅｒｃｈｔｏｌｄ  Ｓ（１９９８）Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ａｐｒ；１２（４）：５５６−６７、及びＳｃｈｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１；３０２（１）：Ｈ２３１−４３に教示される優性ネガティブＳＨＰ−１変異体のうちのいずれかは、本発明において有用であり得る（それらの内容は、参照によりそれらの全体が組み込まれる）。
【０３７９】
１３．腫瘍崩壊ウイルス
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、腫瘍崩壊ウイルスまたは腫瘍崩壊ウイルスの任意の要素を含み得る。いくつかの実施形態において、ペイロードは、腫瘍崩壊ウイルス療法での使用のために遺伝的に修飾された腫瘍崩壊ウイルスまたは要素であり得る。本明細書で使用される場合、「ウイルス療法」という用語は、がん細胞を攻撃または破壊するための腫瘍崩壊ウイルス（複製可能なウイルス）を指す。腫瘍崩壊ウイルスは、正常組織に害を生じることなく、腫瘍内のがん細胞の直接標的及び殺傷することによって悪性腫瘍を排除することができるようなウイルスを指す。例示的な腫瘍崩壊ウイルス及びがん特異的親和性を有する遺伝的に操作した腫瘍崩壊ウイルスは、アルボウイルス、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、麻疹、ムンプスイウルス、モロニー白血病ウイルス、ミクソウイルス、ニューカッスル病ウイルス、レオウイルス、ラプドウイルス、水疱性口腔ウイルス（Ｖｅｓｔｉｃｕｌａｒ  Ｓｔｏｍａｔｉｃ  Ｖｉｒｕｓ）、及びワクシニアウイルス（ＶＶ）を含み得る。それはまた、米国特許第９，４４１，２４６号におけるアデノ−パルボウイルスキメラなどの腫瘍崩壊の可能性が増加するキメラウイルスであり得る。腫瘍崩壊ウイルスは、より具体的には、特定のクラスのがん細胞を標的化しつつ、免疫抑制に左右されないように修飾され得るか、またはがんを抑制するトランス遺伝子を挿入し、発現するように修飾され得る。腫瘍崩壊ウイルスへの修飾はまた、ウイルスの複製の可能性を改善し、ウイルス力価を増加させ、及び／またはウイルスによって感染され得る範囲のがん細胞を増強させるように行われ得る。ペイロードとして使用され得る修飾された腫瘍崩壊ウイルスの例には、米国特許第ＵＳ８２８２９１７Ｂ２号、国際特許公開第ＷＯ２０１１０７０４４０号、同第ＷＯ２００４０７８２０６Ａ１号、同第ＷＯ２０１６１４４５６４号、同第ＷＯ２０１６１１９０５２号、同第ＷＯ２００９１１１８９２号が含まれ、当該出願各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０３８０】
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、ウイルスの１つ以上のコートタンパク質、挿入されたトランス遺伝子、腫瘍内ウイルスの複製及び組み合わせを増加させ得る他の因子であり得る。
【０３８１】
場合によっては、２つ以上の腫瘍崩壊ウイルスはまた、国際特許公開第ＷＯ２０１００２００５６号（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される、標的がん細胞の相乗的殺傷を達成するために、同じＳＲＥ内のまたは２つ以上のＳＲＥにおけるペイロードとして使用され得る。
【０３８２】
１４．ゲノム編集システム
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された、規則的に間隔が空いた、短い回文型の反復）、ＣＲＩＳＰＲ酵素（Ｃａｓ９）、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲシステム及びＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９複合体を含む遺伝子編集システムの要素であってもよい。それはまた、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ）、及びメガヌクレアーゼなどの他のゲノム編集システムであってもよい。
【０３８３】
さらなる特性
本発明のエフェクターモジュールは、ペイロードの分布を調節するシグナル配列、エフェクターモジュール構築物からのペイロードの切断を促進する切断及び／または処理特性、エフェクターモジュールの細胞局在を調節することができる標的化及び／または貫通シグナル、及び／またはエフェクターモジュールの異なる要素（例えば、ＤＤ及びペイロード）に連結する１つ以上のリンカー配列をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、エフェクターモジュールは、リンカー配列（特定の配列及び長さを有する）、切断部位、調節エレメント（マイクロＲＮＡ標的化部位などの対象となるタンパク質の発現を調節する）、特定の細胞もしくは細胞内部位にエフェクターモジュールを導くシグナル配列、貫通配列、またはエフェクターモジュールを追跡するためのタグ及びバイオマーカーなどの１つ以上のさらなる特性を含み得る。
【０３８４】
１．シグナル配列
ＳＲＥ（例えば、ＤＤ）及びペイロード領域に加えて、本発明のエフェクターモジュールは、１つ以上のシグナル配列をさらに含み得る。シグナル配列（シグナルペプチド、標的化シグナル、標的ペプチド、局在配列、輸送ペプチド、リーダー配列、またはリーダーペプチドと称される場合がある）は、タンパク質（例えば、本発明のエフェクターモジュール）をそれらの指定された細胞及び／または細胞外部位に配向する。タンパク質シグナル配列は、ほぼすべての分泌されたタンパク質及び多くの内在性膜タンパク質の標的化及び転座において中心的役割を果たす。
【０３８５】
シグナル配列は、特定の部位に向かうように運命づけられた、新たに合成されたタンパク質の大部分のＮ末端に存在する短い（５〜３０アミノ酸長の）ペプチドである。シグナル配列は、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）によって認識され、Ｉ型及びＩＩ型シグナルペプチドペプチダーゼを使用して切断され得る。ヒトタンパク質に由来するシグナル配列は、エフェクターモジュールを特定の細胞及び／または細胞外部位に配向するためのエフェクターモジュールの調節モジュールとして組み込まれ得る。これらのシグナル配列は、実験的に実証され、切断され得る（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２００４，１３：２８１９−２８２４）。
【０３８６】
いくつかの実施形態において、シグナル配列は、必ずではないが、エフェクターモジュールのＮ末端またはＣ末端に位置することができ、必ずではないが、所望のエフェクターモジュールを切断して、「成熟」ペイロード、すなわち、本明細書に論じられる、免疫治療剤を得ることができる。
【０３８７】
いくつかの例において、シグナル配列は、天然に分泌されたタンパク質及びそのバリアントに由来する分泌されたシグナル配列であってもよい。場合によっては、分泌されたシグナル配列は、配列番号２６１（配列番号２６２〜２６５のヌクレオチド配列によってコードされる）のアミノ酸を含むＩＬ２シグナル配列、及び／または配列番号２６６（配列番号２６７〜２７５のヌクレオチド配列によってコードされる）のアミノ酸配列を含むｐ４０シグナル配列などであるが、これらに限定されない、サイトカインシグナル配列であってもよい。
【０３８８】
場合によっては、ペイロードを標的細胞の表面膜に配向するシグナル配列が、使用され得る。標的細胞の表面上のペイロードの発現は、非標的インビボ環境においてペイロードの拡散を制限し、それによって、ペイロードの安全性プロファイルを潜在的に改善するために有用であり得る。さらに、ペイロードの膜提示は、ペイロードの生理学的及び定性的シグナル伝達ならびに安定化及びリサイクリングをより長い半減期可能にし得る。膜配列は、ペイロードのＮ末端要素の内因性シグナル配列であってもよい。任意に、異なるシグナル配列のためにこの配列を交換することが望ましくあり得る。シグナル配列は、ペイロードがＴ細胞の表面上に提示されるように、対象となる細胞型の分泌経路とのそれらの相溶性に基づいて選択され得る。いくつかの実施形態において、シグナル配列は、配列番号２７６（配列番号２７７のヌクレオチド配列によってコードされる）のアミノ酸を含むＩｇＥシグナル配列、または配列番号２７８（配列番号２７９〜２８３のヌクレオチド配列によってコードされる）のアミノ酸を含むＣＤ８ａシグナル配列であってもよい。
【０３８９】
シグナル配列の他の例は、以下を含み、バリアントは、米国特許第８，１４８，４９４号、同第８，２５８，１０２号、同第９，１３３，２６５号、同第９，２７９，００７号、及び米国特許出願公開第２００７／０１４１６６６号、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ１９９３／０１８１８１号（当該出願の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に論じられる修飾シグナル配列であってもよい。他の例において、シグナル配列は、エフェクターモジュールを核などの特定の細胞部位に配向し得るウイルス、酵母菌、及び細菌などの他の生物からの異種シグナル配列であってもよい（例えば、ＥＰ  １２０９４５０）。他の例は、酵素などの融合タンパク質の分泌を増加させ得るトリコデルマからのアスパラギン酸プロテアーゼ（ＮＳＰ２４）シグナル配列（例えば、Ｃｅｒｖｉｎ  ａｎｄ  Ｋｉｍの米国特許第８，０９３，０１６号）、細菌性リポタンパク質シグナル配列（例えば、Ｌａｕ  ａｎｄ  ＲｉｏｕｘのＰＣＴ出願公開第１９９１／０９９５２号）、大腸菌エンテロトキシンＩＩシグナルペプチド（例えば、Ｋｗｏｎらの米国特許第６，６０５，６９７号）、大腸菌分泌シグナル配列（例えば、Ｍａｌｌｅｙらの米国特許公開第２０１６／０９０４０４号）、メチロトローフ酵母からのリパーゼシグナル配列（例えば、米国特許第８，９７５，０４１号）、及びコリネフォルム細菌に由来するＤＮａｓｅのためのシグナルペプチド（例えば、米国特許第４，９６５，１９７号）を含み得、当該出願の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０３９０】
シグナル配列はまた、核局在シグナル（ＮＬＳ）、核輸出シグナル（ＮＥＳ）、極性細胞管状腺房構造局在シグナル（例えば、米国特許第８，９９３，７４２号、Ｃｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００３，３１（１）：３９３−３９６を参照されたく、それらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）、細胞内部位への細胞外局在シグナル（例えば、リソソーム、小胞体、ゴルジ、ミトコンドリア、原形質膜、及びペルオキシソームなど）（例えば、米国特許第７，３９６，８１１号及びＮｅｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄａｔａｂａｓｅ，２０１５，１−７を参照されたく、それらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）も含み得る。
【０３９１】
２．切断部位
いくつかの実施形態において、エフェクターモジュールは、切断及び／または処理特性を含む。本発明のエフェクターモジュールは、少なくとも１つのタンパク質切断シグナル／ｌ部位を含み得る。タンパク質切断シグナル／部位は、Ｎ末端、Ｃ末端、Ｎ末端とＣ末端の間の中間、Ｎ末端と中間点の間、中間点とＣ末端の間、及びこれらの組み合わせなどが、これらに限定されない、Ｎ末端とＣ末端の間の任意の空間に位置し得る。
【０３９２】
エフェクターモジュールは、任意のプロテイナーゼの１つ以上の切断シグナル（複数可）／部位（複数可）を含み得る。プロテイナーゼは、セリンプロテイナーゼ、システインプロテイナーゼ、エンドペプチダーゼ、ジペプチダーゼ、メタロプロテイナーゼ、グルタミン酸プロテイナーゼ、スレオニンプロテイナーゼ、及びアスパラギン酸プロテイナーゼであってもよい。いくつかの態様において、切断部位は、フリン、アクチニダイン、カルパイン−１、カルボキシペプチダーゼＡ、カルボキシペプチダーゼＰ、カルボキシペプチダーゼＹ、カスパーゼ−１、カスパーゼ−２、カスパーゼ−３、カスパーゼ−４、カスパーゼ−５、カスパーゼ−６、カスパーゼ−７、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９、カスパーゼ−１０、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＧ、カテプシンＨ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＳ、カテプシンＶ、クロストリパイン、キマーゼ、キモトリプシン、エラスターゼ、細胞内タンパク質分解、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、ギ酸、グランザイムＢ、マトリックスメタロプロテアーゼ−２、マトリックスメタロプロテアーゼ−３、ペプシン、プロテイナーゼＫ、ＳＵＭＯプロテアーゼ、スブチリシン、ＴＥＶプロテアーゼ、サーモリシン、トロンビン、トリプシン、及びＴＡＧＺｙｍｅのシグナル配列であってもよい。
【０３９３】
一実施形態において、切断部位は、アミノ酸配列ＳＡＲＮＲＱＫＲＳを含むフリン切断部位（配列番号２８５のヌクレオチド配列によってコードされる配列番号２８４）、またはアミノ酸配列ＡＲＮＲＱＫＲＳを含む改正フリン切断部位（配列番号２８７のヌクレオチド配列によってコードされる配列番号２８６）、またはアミノ酸配列ＥＳＲＲＶＲＲＮＫＲＳＫを含む修飾フリン部位（配列番号２８９〜２９１のヌクレオチド配列によってコードされる配列番号２８８）である。
【０３９４】
３．タンパク質タグ
いくつかの実施形態において、本発明のエフェクターモジュールは、タンパク質タグを含み得る。タンパク質タグは、エフェクターモジュールを検出する及びそのプロセスをモニタリングするために使用され得る。エフェクターモジュールは、エピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧまたは血球凝集素（ＨＡ）タグ）などの１つ以上のタグを含み得る。多数のタンパク質タグは、本発明のエフェクターモジュールのために使用され得る。それらには、自己標識ポリペプチドタグ（例えば、ハロアルカンデハロゲナーゼ（ハロタグ２またはハロタグ７）、ＡＣＰタグ、クリップタグ、ＭＣＰタグ、スナップタグ）、エピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧ、ＨＡ、Ｈｉｓ、及びＭｙｃ）、蛍光タグ（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、及びそれらのバリアント）、生物発光タグ（例えば、ルシフェラーゼ及びそのバリアント）、親和性タグ（例えば、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ）、免疫原性親和性タグ（例えば、タンパク質Ａ／Ｇ、ＩＲＳ、ＡＵ１、ＡＵ５、ｇｌｕ−ｇｌｕ、ＫＴ３、Ｓ−ｔａｇ、ＨＳＶ、ＶＳＶ−Ｇ、Ｘｐｒｅｓｓ、及びＶ５）、ならびに他のタグ（例えば、ビオチン（小分子）、Ｓｔｒｅｐタグ（ＳｔｒｅｐＩＩ）、ＳＢＰ、ビオチンカルボキシル担体タンパク質（ＢＣＣＰ）、ｅＸａｃｔ、ＣＢＰ、ＣＹＤ、ＨＰＣ、ＣＢＤインテイン−キチン結合ドメイン、Ｔｒｘ、ＮｏｒｐＡ、及びＮｕｓＡが含まれるが、これらに限定されない。
【０３９５】
他の実施形態において、タグはまた、米国特許第８，９９９，８９７号、同第８，３５７，５１１号、同第７，０９４，５６８号、同第５，０１１，９１２号、同第４，８５１，３４１号、及び同第４，７０３，００４号、米国特許出願公開第２０１３／１１５６３５号及び同第２０１３／０１２６８７号、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ２０１３／０９１６６１号（当該出願の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に開示されているものから選択され得る。
【０３９６】
いくつかの態様において、多数のタンパク質タグ、同じまたは異なるタグのいずれかが使用され得、タグの各々は、同じＮ末端またはＣ末端に位置し得るが、一方、他の場合において、これらのタグは、各末端に位置し得る。
【０３９７】
４．標的化ペプチド
いくつかの実施形態において、本発明のエフェクターモジュールは、標的化及び／または貫通ペプチドをさらに含み得る。細胞表面マーカーを選択的に認識する低分子標的化及び／または貫通ペプチド（例えば、受容体、トランス膜タンパク質、及び細胞外マトリックス分子）は、エフェクターモジュールを所望の臓器、組織、または細胞に標的にするために使用され得る。インビトロで合成された短ペプチド（５〜５０アミノ酸残基）及び天然に生じるペプチド、またはそれらの類似体、バリアント、誘導体は、エフェクターモジュールを所望の臓器、組織、もしくは細胞及び／または細胞の内側の細胞内部位にホーミングするためのエフェクターモジュールに組み込まれ得る。
【０３９８】
いくつかの実施形態において、標的化配列及び／または貫通ペプチドは、エフェクターモジュールを標的臓器、または組織、または細胞（例えば、がん組織）に起こすためのエフェクターモジュールに含まれ得る。他の実施形態において、標的化及び／または貫通ペプチドは、エフェクターモジュールを、細胞の内側に特定の細胞内部位を配向し得る。
【０３９９】
標的化ペプチドは、約６〜約３０を含んだ任意の数のアミノ酸を有する。ペプチドは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸を有し得る。概して、標的化ペプチドは、２５個以下のアミノ酸、例えば、２０個以下、例えば、１５個以下を有し得る。
【０４００】
例示的な標的化ペプチドは、当該技術分野に開示されているもの、例えば、米国特許第９，２０６，２３１号、同第９，１１０，０５９号、同第８，７０６，２１９号、及び同第８，７７２，４４９号、ならびに米国特許出願公開第２０１６／０８９４４７号、同第２０１６／０６０２９６号、同第２０１６／０６０３１４号、同第２０１６／０６０３１２号、同第２０１６／０６０３１１号、同第２０１６／００９７７２号、同第２０１６／００２６１３号、同第２０１５／３１４０１１号、及び同第２０１５／１６６６２１号、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ２０１５／１７９６９１号及び同第ＷＯ２０１５／１８３０４４号（当該出願の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）を含み得るが、これらに限定されない。
【０４０１】
５．リンカー
いくつかの実施形態において、本発明のエフェクターモジュールは、リンカー配列をさらに含み得る。リンカー領域は、主に、エフェクターモジュール内の２つ以上のポリペプチド間のスペーサーとしての役割を果たす。「リンカー」または「スペーサー」は、本明細書で使用される場合、２つの分子、または組換えタンパク質の２つのドメインなどの２つの部分に接続する、分子または分子の群を指す。
【０４０２】
いくつかの実施形態において、「リンカー」（Ｌ）または「リンカードメイン」または「リンカー領域」または「リンカー分子」または「ペプチドリンカー」は、本明細書で使用される場合、エフェクターモジュールのドメイン／領域のうちのいずれかに連結する、約１〜１００アミノ酸長のオリゴまたはポリペプチド領域（ペプチドリンカーとも呼ばれる）を指す。ペプチドリンカーは、１〜４０アミノ酸長、または２〜３０アミノ酸長、または２０〜８０アミノ酸長、または５０〜１００アミノ酸長であってもよい。リンカー長はまた、使用されたペイロードの型に応じて、及びペイロードの結晶構造に基づいて最適化され得る。場合によっては、より短いリンカー長は、好ましくは選択され得る。いくつかの態様において、ペプチドリンカーは、ペプチド結合によって一緒に連結されるアミノ酸、好ましくは、ペプチド結合によって連結される１〜２０アミノ酸から構成され、アミノ酸は、２０個の天然に生じるアミノ酸：グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、セリン（Ｓ）、システイン（Ｃ）、スレオニン（Ｔ）、メチオニン（Ｍ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、及びグルタミン（Ｑ）から選択される。これらのアミノ酸のうちの１つ以上は、当業者によって理解されるように、グリコシル化され得る。いくつかの態様において、ペプチドリンカーのアミノ酸は、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、プロリン（Ｐ）、アスパラギン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）、及びリジン（Ｋ）から選択され得る。
【０４０３】
一例において、人工的に設計されたペプチドリンカーは、好ましくは、隣接したタンパク質ドメインは、互いに対して自由に移動できるように、グリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）のような可撓性残基のポリマーからなり得る。より長いリンカーは、２つの隣接したドメインが互いに干渉しないことを確実にすることが望ましいときに使用され得る。特定のリンカー配列の選択は、融合構築物の生物学的活性、安定性、折り畳み、標的化、及び／または薬物動態特性に影響を及ぼす場合に懸念し得る。ペプチドリンカーの例には、ＳＧ、ＭＨ、配列番号２９３のヌクレオチド配列によってコードされるＧＧＳＧ（配列番号２９２、配列番号２９５〜２９９のヌクレオチド配列によってコードされるＧＧＳＧＧ（配列番号２９４）、配列番号９３及び３００のヌクレオチド配列によってコードされるＧＧＳＧＧＧ（配列番号７８）、配列番号３０２〜３０３のヌクレオチド配列によってコードされるＳＧＧＧＳ（配列番号３０１）、配列番号９２のヌクレオチド配列によってコードされるＧＧＳＧＧＧＳＧＧ（配列番号７７）、ＧＧＧＧＧ（配列番号３０４）、ＧＧＧＧＳ（配列番号３０５）、または（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ｎ＝２（配列番号３０６）、３（配列番号３０８〜３１３によってコードされる配列番号３０７）、４（配列番号３１４）、５（配列番号３１５）、または６（配列番号３１６））、ＳＳＳＳＧ（配列番号３１７）、または（ＳＳＳＳＧ）ｎ（ｎ＝２（配列番号３１８）、３（配列番号３１９）、４（配列番号３２０）、５（配列番号３２１）、または６（配列番号３２２））、配列番号３２４のヌクレオチド配列によってコードされるＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＬＱ（配列番号３２３）、配列番号３２６〜３２７のヌクレオチド配列によってコードされるＥＦＳＴＥＦ（配列番号３２５）、ＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳ（配列番号３２８）、ＧＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ（配列番号３２９）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＳＥＧＳＧＳＴＫＧ（配列番号３３０）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号３３１）、配列番号３３３のヌクレオチド配列によってコードされるＶＤＹＰＹＤＶＰＤＹＡＬＤ（配列番号３３２）、またはＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＥＦ（配列番号３３４）、または配列番号８３４７のヌクレオチド配列によってコードされるＧＳＧＳＧＳ（配列番号８３３０）、または配列番号８３４８のヌクレオチド配列によってコードされるＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号８３３１）、また配列番号８３４９のヌクレオチド配列によってコードされるＧＳＧＳＧＧＧＳＧＳ（配列番号８３３２）、ＳＧＳＧＳＧＳリンカー（配列番号８３８２）、またはＡＧＴＧＧＴによってコードされるＳＧリンカー、またはＣＴＡＧＡＴによってコードされるリジンアスパラギン酸を含むＬＤリンカーが含まれるが、これらに限定されない。リンカーはまた、ＤＮＡ制限酵素認識部位またはそれらの修飾物、例えば、可撓性ＧＳまたはＧ／Ｓリッチリンカー；ＧＧＡＴＣＣによってコードされるＢａｍＨ１部位；可撓性Ｇ／ＳリッチリンカーまたはＢａｍＨ１部位；ＴＣＴＡＧＡによってコードされるＳＲ／Ｘｂａ  Ｉ部位；またはＧＧＡＴＣＣＧＧＡによってコードされるＧＳＧリン���ー（ＢａｍＨ１−Ｇｌｙ）リンカーであり得る。
【０４０４】
他の例において、ペプチドリンカーは、グリシン（Ｇ）及びアラニン（Ａ）などの立体障害のないアミノ酸の大部分で構成され得る。例示的なリンカーは、ポリグリシン（例えば、（Ｇ）４（配列番号８３７８）、（Ｇ）５（配列番号８３７９）、（Ｇ）８（配列番号８３８０））、ポリ（ＧＡ）、及びポリアラニンである。本明細書に記載のリンカーは、例示的であり、より長く、他の残基を含むリンカーは、本発明によって企図される。
【０４０５】
リンカー配列は、マルチドメインタンパク質に由来する天然リンカーであり得る。天然リンカーは、タンパク質内の２つの異なるドメインまたはモチーフを分離する短ペプチド配列である。
【０４０６】
いくつかの態様において、リンカーは、可撓性または剛性であり得る。他の態様において、リンカーは、切断可能であっても、切断できなくてもよい。本明細書で使用される場合、「切断可能なリンカードメインまたは領域」または「切断可能なペプチドリンカー」という用語は、同義に使用される。いくつかの実施形態において、リンカー配列は、酵素的に及び／または化学的に切断され得る。ペプチドリンカーを切断するために有用な酵素（例えば、プロテイナーゼ／ペプチダーゼ）の例には、Ａｒｇ−Ｃプロテイナーゼ、Ａｓｐ−Ｎエンドペプチダーゼ、キモトリプシン、クロストリパイン、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、グルタミルエンドペプチダーゼ、グランザイムＢ、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）プロテイナーゼＩ、ペプシン、プロリンエンドペプチダーゼ、プロテイナーゼＫ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌペプチダーゼＩ、サーモリシン、トロンビン、トリプシン、及びタンパク質分解酵素のカスパーゼファミリーのメンバー（例えば、カスパーゼ１〜１０）が含まれるが、これらに限定されない。化学的に感知する切断部位はまた、リンカー配列に含まれ得る。化学的切断試薬の例には、メチオニン残基を切断する臭化シアン；トリプトファン残基を切断する、Ｎ−クロロスクシンイミド、ヨード安息香酸、またはＢＮＰＳ−スカトール［２−（２−ニトロフェニルスルフェニル）−３−メチルインドール］；アスパルチル−プロリル結合を切断する希酸；及びｅアスパラギン酸−プロリン酸切断可能な認識部位（すなわち、１つ以上のＤ−Ｐジペプチド部分を含む切断可能なペプチドリンカー）が含まれるが、これらに限定されない。融合モジュールは、１つ以上の切断可能なペプチドリンカーによって分離される対象となるペプチドをコードする複数の領域を含み得る。
【０４０７】
他の実施形態において、切断可能なリンカーは、「自己切断性」リンカーペプチド、例えば、２Ａリンカー（例えば、Ｔ２Ａ）、２Ａ様リンカー、またはその機能的等価物及びこれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態において、リンカーは、ピコルナウイルス２Ａ様リンカー、ブタテシオウイルス（Ｐ２Ａ）のＣＨＹＳＥＬ配列、ゾセアアシグナ（Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ）ウイルス（Ｔ２Ａ）、またはそれらの組み合わせ、バリアント、及び機能的等価物を含む。いくつかの実施形態において、本発明のバイオサーキットは、２Ａペプチドを含み得る。２Ａペプチドは、細胞に内因性であるプロテアーゼ（２Ａペプチダーゼ）によって認識されるウイルスからの約２０個のアミノ酸残基の配列である。２Ａペプチドは、ピコルナウイルスの中で特定され、この典型的な例は、口蹄疫ウイルスである（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ＢＨ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９８５，５４：６５１−６６０）。２Ａ様配列はまた、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ様ウマ鼻炎Ａウイルス、ならびにブタテシオウイルス−１及び無傷ゾセアアシグナウイルス（ＴａＶ）などの非関連ウイルスにおいて見出されている。このようなウイルスにおいて、多種タンパク質は、オープンリーディングフレームによってコードされる大きなポリタンパク質に由来する。２Ａペプチドは、ウイルスカプシドと複製ポリタンパク質ドメインの間の接合を形成する単一部位でこのポリタンパク質の共翻訳切断を媒介する。２Ａ配列は、コンセンサスモチーフＤ−Ｖ／Ｉ−Ｅ−Ｘ−Ｎ−Ｐ−Ｇ−Ｐ（配列番号８３８１）を含む。これらの配列は、共翻訳に作用し、グリシンと最後のプロリンとの間の正常なペプチド結合の形成を防ぎ、次のコドンのリボソームスキッピングをもたらすと考えられる（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ＭＬ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ，８２：１０１３−１０２５）。切断後、短ペプチドは、切断部位のタンパク質上流のＣ末端に融合したままであるが、プロリンを、切断部位のタンパク質下流のＮ末端に付加する。特定された２Ａペプチドのうちで、４つは、すなわち、ＦＭＤＶ２Ａ（Ｆ２Ａとして本明細書で短縮される）；ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）；ブタテシオウイルス−１  ２Ａ（Ｐ２Ａ）及びゾセアアシグナウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）と幅広く使用されている。いくつかの実施形態において、本発明において有用な２Ａペプチド配列は、国際特許出願第ＷＯ２０１００４２４９０号（当該出願の内容は、参照によりその全体が組み込まれる）の配列番号８〜１１から選択される。いくつかの実施形態において、切断部位は、配列番号８２６９のヌクレオチド配列によってコードされるＰ２Ａに切断可能なペプチド（配列番号８２３９）であり得る。
【０４０８】
他のリンカーは、当業者には明らかであり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。
【０４０９】
本発明のリンカーはまた、非ペプチドリカーであり得る。例えば、−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｃ（Ｏ）−（式中、ａ＝２−２０）などのアルキルリンカーは、使用され得る。これらのアルキルリンカーは、任意の非立体障害基、例えば、低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ６）低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニルなどによってさらに置換され得る。
【０４１０】
いくつかの態様において、リンカーは、米国特許第４，９４６，７７８号、同第５，５２５，４９１号、同第５，８５６，４５６号、及び国際特許出願第ＷＯ２０１２／０８３４２４号（当該出願の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）からの人工リンカーであり得る。
【０４１１】
６．埋め込み刺激物質、シグナル、及び他の調節特性
マイクロＲＮＡ（またはｍｉＲＮＡ）は、核酸分子の安定性を軽減することによってまたは翻訳を阻害することによって、核酸分子の３’ＵＴＲに結合し、遺伝子発現を下方調節する１９〜２５ヌクレオチド長の非コードＲＮＡである。本発明のポリヌクレオチドは、１つ以上のマイクロＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ配列、またはマイクロＲＮＡ播種を含み得る。このような配列は、米国特許公開第ＵＳ２００５／０２６１２１８号及び米国特許公開第ＵＳ２００５／００５９００５号（当該出願の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に教示されるものなどの任意の既知のマイクロＲＮＡに対応し得る。非限定的な実施形態として、ヒトゲノムにおける既知のマイクロＲＮＡ、それらの配列、及びそれらの結合部位配列を、２０１６年４月１１日に出願された共同する米国特許出願公開第６２／３２０，８６４号及び２０１７年３月３日に出願された同第６２／４６６，５９６号の表１４、及び国際特許公開第ＷＯ２０１７／１８０５８７号（当該出願の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に示される。
【０４１２】
マイクロＲＮＡ配列は、「播種」領域、すなわち、成熟マイクロＲＮＡの２〜８位の領域内に配列を含み、この配列は、ｍｉＲＮＡ標的配列に対する完全なワトソンクリック相補性を有する。マイクロＲＮＡ播種は、成熟マイクロＲＮＡの２〜８位または２〜７位を含み得る。いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ播種は、７ヌクレオチド（例えば、成熟マイクロＲＮＡのヌクレオチド２〜８）を含み得、対応するｍｉＲＮＡ標的における播種相補性部位は、マイクロＲＮＡ１位に反対して、アデニン（Ａ）によって配置されている。いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ播種は、６ヌクレオチド（例えば、成熟マイクロＲＮＡのヌクレオチド２〜７）を含み得、対応するｍｉＲＮＡ標的における播種相補性部位は、マイクロＲＮＡ１位に反対して、アデニン（Ａ）によって配置されている。例えば、Ｇｒｉｍｓｏｎ  Ａ，Ｆａｒｈ  ＫＫ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＷＫ，Ｇａｒｒｅｔｔ−Ｅｎｇｅｌｅ  Ｐ，Ｌｉｍ  ＬＰ，Ｂａｒｔｅｌ  ＤＰ；Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２００７  Ｊｕｌ  ６；２７（１）：９１−１０５を参照のこと。マイクロＲＮＡ播種の塩基は、標的配列を有する完全な相補性を有する。マイクロＲＮＡ標的配列を、バイオサーキット成分をコードするポリヌクレオチド、エフェクターモジュール、ＳＲＥ、または本発明のペイロードに操作することによって、問題になっているマイクロＲＮＡが利用可能である場合、分解または軽減した翻訳のための分子を標的化することができる。このプロセスは、核酸分裂配達の際にオフターゲット効果の危険性を軽減するであろう。
【０４１３】
生物学におけるマイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡ標的領域、ならびにそれらの発現パターン及び役割は、報告されている（Ｂｏｎａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ２０１０  １１：９４３−９４９、Ａｎａｎｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０１１  １８：１７１−１７６、Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ａｎｄ  Ｒａｏ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２０１２  ２６：４０４−４１３（２０１１  Ｄｅｃ  ２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌｅｕ．２０１１．３５６）、Ｂａｒｔｅｌ  Ｃｅｌｌ  ２００９  １３６：２１５−２３３、Ｌａｎｄｇｒａｆ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，２００７  １２９：１４０１−１４１４、Ｇｅｎｔｎｅｒ  ａｎｄ  Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ．２０１２  ８０：３９３−４０３、及びそのなかのすべての参照文献（それらの各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。
【０４１４】
例えば、ポリヌクレオチドが肝臓に送達されることを意図されないが、そこに落ち着く場合、肝臓中に豊富なマイクロＲＮＡであるｍｉＲ−１２２は、ｍｉＲ−１２２の１つまたは複数の標的部位がポリヌクレオチドに操作される場合、ポリヌクレオチドの発現を阻害し得る。異なるマイクロＲＮＡの１つまたは複数の結合部位の導入を操作して、ポリヌクレオチドの長寿命、安定性、及びタンパク質翻訳をさらに減少させることができ、それ故に、刺激物質の選択、ＳＲＥ設計、及びペイロードの変化より勝った持続可能性のあるさらなる層を提供する。
【０４１５】
本明細書で使用される場合、「マイクロＲＮＡ部位」という用語は、マイクロＲＮＡ標的部位もしくはマイクロＲＮＡ認識部位、またはマイクロＲＮＡが結合または会合する任意のヌクレオチド配列を指す。「結合」が、伝統的なワトソン−クリックのハイブリダイゼーション法則に従ってもよいし、またはマイクロＲＮＡとマイクロＲＮＡ部位またはその近傍の標的配列との任意の安定な会合を反映してもよいことを理解されたい。
【０４１６】
逆に、本発明のポリヌクレオチドの目的のために、特定の組織中のタンパク質発現を増加させるために天然に生じるマイクロＲＮＡ結合部位を操作して、配列から出す（すなわち、配列から除去する）ことができる。例えば、ｍｉＲ−１２２結合部位が除去されて、肝臓中でのタンパク質発現を改善することができる。
【０４１７】
複数の組織中の発現の調節は、導入または除去または１つもしくはいくつかのマイクロＲＮＡ結合部位を通して達成することができる。
【０４１８】
具体的には、マイクロＲＮＡは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞及びマクロファージ）、マクロファージ、単球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、顆粒球、ナチュラルキラー細胞などの免疫細胞（造血細胞とも呼ばれる）において、差次的に発現されることが知られている。免疫細胞特異的なマイクロＲＮＡは、免疫原性、自己免疫、感染に対する免疫応答、炎症、ならびに遺伝子治療及び組織／臓器移植後の望ましくない免疫応答に関与している。免疫細胞特異的なマイクロＲＮＡはまた、造血細胞（免疫細胞）の発生、増殖、分化、及びアポトーシスの多くの態様を調節する。例えば、ｍｉＲ−１４２及びｍｉＲ−１４６は、免疫細胞において排他的に発現され、特に、骨髄性樹状細胞において豊富に発現される。本発明のポリペプチドの３’−ＵＴＲへのｍｉＲ−１４２結合部位の導入は、ｍｉＲ−１４２媒介ｍＲＮＡ分析を介して抗原提示細胞における遺伝子発現を選択的に抑制し得、専門ＡＰＣ（例えば、樹状細胞）における抗原提示を制限し、それによって、遺伝子送達後の抗原媒介性免疫応答を妨げる（Ａｎｎｏｎｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，ｂｌｏｏｄ，２００９，１１４，５１５２−５１６１を参照されたく、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０４１９】
一実施形態において、免疫細胞、特に、抗原提示細胞において発現されることが知られているマイクロＲＮＡ結合部位は、マイクロＲＮＡ媒介性のＲＮＡ分解を介して、ＡＰＣにおけるポリヌクレオチドの発現を抑制するために、ポリヌクレオチドに操作され、抗原媒介性免疫応答を抑制し得、一方、ポリヌクレオチドの発現は、免疫細胞特異的なマイクロＲＮＡが発現されない非免疫細胞において維持される。
【０４２０】
様々ながん細胞／組織及び他の疾患におけるマイクロＲＮＡの差次的発現を概説するために、多くのマイクロＲＮＡ発現の研究が行われており、当該技術分野において説明されている。いくつかのマイクロＲＮＡは、ある特定のがん細胞において異常に過剰発現され、他のものは低発現される。例えば、マイクロＲＮＡは、がん細胞（ＷＯ２００８／１５４０９８、ＵＳ２０１３／００５９０１５、ＵＳ２０１３／００４２３３３、ＷＯ２０１１／１５７２９４）；がん幹細胞（ＵＳ２０１２／００５３２２４）；膵臓癌及び疾患（ＵＳ２００９／０１３１３４８、ＵＳ２０１１／０１７１６４６、ＵＳ２０１０／０２８６２３２、ＵＳ８３８９２１０）；喘息及び炎症（ＵＳ８４１５０９６）；前立腺癌（ＵＳ２０１３／００５３２６４）；肝細胞癌（ＷＯ２０１２／１５１２１２、ＵＳ２０１２／０３２９６７２、ＷＯ２００８／０５４８２８、ＵＳ８２５２５３８）；肺癌細胞（ＷＯ２０１１／０７６１４３、ＷＯ２０１３／０３３６４０、ＷＯ２００９／０７０６５３、ＵＳ２０１０／０３２３３５７）；皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＷＯ２０１３／０１１３７８）；結腸直腸癌細胞（ＷＯ２０１１／０２８１７５６、ＷＯ２０１１／０７６１４２）；がん陽性リンパ節（ＷＯ２００９／１００４３０、ＵＳ２００９／０２６３８０３）；鼻咽頭癌（ＥＰ２１１２２３５）；慢性閉塞性肺疾患（ＵＳ２０１２／０２６４６２６、ＵＳ２０１３／００５３２６３）；甲状腺癌（ＷＯ２０１３／０６６６７８）；卵巣癌細胞（ＵＳ２０１２／０３０９６４５、ＷＯ２０１１／０９５６２３）；乳癌細胞（ＷＯ２００８／１５４０９８、ＷＯ２００７／０８１７４０、ＵＳ２０１２／０２１４６９９）、白血病及びリンパ腫（ＷＯ２００８／０７３９１５、ＵＳ２００９／００９２９７４、ＵＳ２０１２／０３１６０８１、ＵＳ２０１２／０２８３３１０、ＷＯ２０１０／０１８５６３、当該出願の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）において、差次的に発現される。
【０４２１】
一実施形態において、マイクロＲＮＡは、同調可能なバイオサーキットの形成を支持して本明細書に記載されるように使用され得る。
【０４２２】
いくつかの実施形態において、エフェクターモジュールは、マイクロＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ結合部位などの１つ以上のペイロード、ＳＲＥ、及び／または調節配列を（ＤＮＡまたはＲＮＡまたはｍＲＮＡとして）コードするように設計され得る。いくつかの実施形態において、コードしたペイロードまたＳＲＥのうちのいずれかは、変異によって安定化または不安定化され、次いで、１つ以上の調節配列と組み合わせて、二重またはマルチ同調したエフェクターモジュールまたはバイオサーキットシステムを生成し得る。
【０４２３】
各態様または同調したモダリティは、エフェクターモジュールまたはバイオサーキットを特異的に同調した特性にし得る。例えば、ＳＲＥは、不安定化ドメインを表し得るが、一方、タンパク質ペイロードにおける変異体は、その切断部位または二量化特性または半減期を変化させ得、１つ以上のマイクロＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ結合部位の封入体は、細胞の脱標的化またはトラフィッキング特性に影響を及ぼし得る。その結果、本発明は、それらの持続可能性において多因子であるバイオサーキットを包含する。
【０４２４】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、任意のプロテアソームアダプターを含み得る。本明細書で使用される場合、「プロテアソームアダプター」という用語は、分解のために添付のペイロードを標的とする任意のヌクレオチド／アミノ酸配列を指す。いくつかの態様において、このアダプターは、分解のためにペイロードを直接標的とし、それによってユビキチン化反応のために必要を回避する。プロテアソームアダプターは、ペイロードの基本的発現を軽減するために、不安定化ドメインと共に使用され得る。例示的なプロテアソームアダプターは、Ｒａｄ２３またはｈＨＲ２３ｂのＵｂＬドメイン、ユビキチン化機構を回避する、直接プロテアソーム標的化を可能にする、高親和性を有するプロテアソームの標的タンパク質Ｒｂ及びＳ４サブユニットの両方に結合するＨＰＶ  Ｅ７、Ｒｂ及びプロテアソームサブユニットＳ６に結合するタンパク質のガンクリンを含む。
【０４２５】
このようなバイオサーキットは、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の同調特性を含むように操作され得る。
【０４２６】
ポリヌクレオチド
本発明は、新規のｈＰＤＥ５  ＤＤをコードするポリヌクレオチド、ペイロード及び関連ＤＤを含むエフェクターモジュール、ＤＤ及びエフェクターモジュールを含むバイオサーキットシステム、ならびに本発明の他の要素を提供する。
【０４２７】
本発明は、単離されたバイオサーキットポリペプチド、エフェクターモジュール、刺激応答エレメント（ＳＲＥ）、及びペイロード、ならびに前述のうちのいずれかをコードするポリヌクレオチド、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、ならびに本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、及びベクターを発現する細胞を提供する。ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ウイルスベクター、及び細胞は、対象における抗腫瘍免疫応答を誘導するために有用である。
【０４２８】
「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」という用語は、その最も広い意味において、ヌクレオチドのポリマー、例えば、結合ヌクレオシドを含む任意の化合物及び／または物質を含む。これらのポリマーは、しばしば、ポリヌクレオチドと称される。本発明の例示的な核酸またはポリヌクレオチドには、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックされた核酸（β−Ｄ−リボ立体配置を有するＬＮＡ、α−Ｌ−リボ立体配置を有するα−ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）を含むＬＮＡ、２’−アミノ官能化を有する２’−アミノ−ＬＮＡ、及び２’−アミノ官能化を有する２’−アミノ−α−ＬＮＡ）またはそれらのハイブリッドが含まれるが、これらに限定されない。
【０４２９】
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）または任意の核酸分子であり得、化学的に修飾されても、修飾されなくともよい。一態様において、核酸分子は、ｍＲＮＡである。本明細書で使用される場合、「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」という用語は、対象となるポリペプチドをコードし、かつインビトロ、インビボ、原位置、またはエクスビボで対象となるコードされたポリペプチドを生成するために翻訳することができる、任意のポリヌクレオチドを指す。
【０４３０】
伝統的に、ｍＲＮＡ分子の主要成分は、少なくともコーディング領域、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、５’キャップ、及びポリＡ尾部を含む。この野生型モジュール構造を構築して、本発明は、モジュール組織を維持するが、ポリヌクレオチドへの有用な特性、例えば、機能の持続可能性を付与する１つ以上の構造及び／または化学修飾または改変を含むペイロード構築物を提供することによって従来のｍＲＮＡ分子の機能の範囲を拡大する。本明細書で使用される場合、「構造的」特性または修飾は、２つ以上の結合ヌクレオシドが、ヌクレオシド自体への著しい化学修飾なく、ポリヌクレオチドにおいて挿入、欠失、複製、反転、またはランダム化される特性または修飾である。化学結合が必然的に破壊及び再形成されて構造的修飾をもたらすため、構造的修飾は、化学的性質のものであり、したがって、化学修飾である。しかしながら、構造的修飾は、異なるヌクレオチド配列をもたらす。例えば、ポリヌクレオチド「ＡＴＣＧ」は、「ＡＴ−５ｍｅＣ−Ｇ」に化学修飾され得る。同じポリヌクレオチドは、「ＡＴＣＧ」から「ＡＴＣＣＣＧ」に構造的修飾され得る。ここで、ジヌクレオチド「ＣＣ」が挿入されており、ポリヌクレオチドへの構造修飾をもたらす。
【０４３１】
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、翻訳開始の役割を果たす５’ＵＴＲ配列を提供し得る。５’ＵＴＲ配列は、リボソームが遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することが一般的に知られているコザック配列などの特性を含み得、コザック配列は、コンセンサスＸＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧを有し、式中、Ｒは、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（アデニンまたはグアニン）であり、Ｘは、任意のヌクレオチドである。一実施形態において、コザック配列は、ＡＣＣＧＣＣである。標的細胞または組織の豊富に発現される遺伝子において典型的に見出される特性を操作することによって、本発明のポリヌクレオチドの安定性及びタンパク質産生を増強することができる。
【０４３２】
ポリヌクレオチドにおける５’キャップ構造の不在下でタンパク質合成を開始する際に重要な役割を果たす内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含み得る、ポリヌクレオチドがさらに提供される。ＩＲＥＳは、唯一のリボソーム結合部位として働き得るか、または複数の結合部位のうちの１つの役割を果たし得る。１つを超える機能的リボソーム結合部位を含む本発明のポリヌクレオチドは、二シストロン性及び／または多シストロン性核酸分子を生じさせるリボソームによって独立して翻訳されるいくつかのペプチドまたはポリペプチドをコードし得る。
【０４３３】
いくつかの実施形態において、バイオサーキット、エフェクターモジュール、ＤＤ、及びペイロードをコードするポリヌクレオチドは、約３０〜約１００，０００個のヌクレオチド（例えば、３０〜５０、３０〜１００、３０〜２５０、３０〜５００、３０〜１，０００、３０〜１，５００、３０〜３，０００、３０〜５，０００、３０〜７，０００、３０〜１０，０００、３０〜２５，０００、３０〜５０，０００、３０〜７０，０００、１００〜２５０、１００〜５００、１００〜１，０００、１００〜１，５００、１００〜３，０００、１００〜５，０００、１００〜７，０００、１００〜１０，０００、１００〜２５，０００、１００〜５０，０００、１００〜７０，０００、１００〜１００，０００、５００〜１，０００、５００〜１，５００、５００〜２，０００、５００〜３，０００、５００〜５，０００、５００〜７，０００、５００〜１０，０００、５００〜２５，０００、５００〜５０，０００、５００〜７０，０００、５００〜１００，０００、１，０００〜１，５００、１，０００〜２，０００、１，０００〜３，０００、１，０００〜５，０００、１，０００〜７，０００、１，０００〜１０，０００、１，０００〜２５，０００、１，０００〜５０，０００、１，０００〜７０，０００、１，０００〜１００，０００、１，５００〜３，０００、１，５００〜５，０００、１，５００〜７，０００、１，５００〜１０，０００、１，５００〜２５，０００、１，５００〜５０，０００、１，５００〜７０，０００、１，５００〜１００，０００、２，０００〜３，０００、２，０００〜５，０００、２，０００〜７，０００、２，０００〜１０，０００、２，０００〜２５，０００、２，０００〜５０，０００、２，０００〜７０，０００、及び２，０００〜１００，０００個のヌクレオチド）を含み得る。いくつかの態様において、本発明のポリヌクレオチドは、１０，０００個を超えるヌクレオチドを含み得る。
【０４３４】
切断部位、リンカー、トラッフィングシグナル、タグなどのある特定の特性、または他の特性をコードするポリヌクレオチドの領域は、独立して、１０〜１，０００ヌクレオチド長（例えば、２０超、３０、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、及び９００個のヌクレオチド、または少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、及び１，０００個のヌクレオチド）の範囲に及び得る。
【０４３５】
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、マイクロＲＮＡ分子に結合するとき、核酸分子の安定性を軽減することによってまたは翻訳を阻害することによって遺伝子発現を下方調節する核酸分子の３’ＵＴＲ内のマイクロＲＮＡ結合部位などの埋め込み調節部分をさらに含み得る。逆に、本発明のポリヌクレオチドの目的のために、特定の組織中のタンパク質発現を増加させるために天然に生じるマイクロＲＮＡ結合部位を操作して、配列から出す（すなわち、配列から除去する）ことができる。例えば、ｍｉＲ−１４２及びｍｉＲ−１４６結合部位が除去されて、免疫細胞でのタンパク質発現を改善することができる。いくつかの実施形態において、コードされたペイロードのうちのいずれかは、ＳＲＥによって調節され、１つ以上の調節配列と組み合わせて、二重またはマルチ同調したエフェクターモジュールまたはバイオサーキットシステムを生成し得る。
【０４３６】
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの断片、バリアント、誘導体をコードし得る。いくつかの態様において、バリアント配列は、同じまたは同様の活性を維持し得る。あるいは、バリアントは、開始配列と比較して、活性の変化（例えば、増加または減少）を有し得る。概して、本発明の特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドのバリアントは、本明細書に記載の及び当業者に周知の配列アラインメントプログラム及びパラメータによって決定される、その特定の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であるが、１００％未満の配列同一性を有するであろう。アラインメントのためのそのようなツールには、ＢＬＡＳＴスイートのそれらが含まれる（Ｓｔｅｐｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９７，２５：３３８９−３４０２）。
【０４３７】
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、修飾され得る。本明細書で使用される場合、「修飾された」または必要に応じて、「修飾」という用語は、Ａ、Ｇ、Ｕ（ＤＮＡではＴ）、またはＣヌクレオチドに対する化学修飾を指す。修飾は、ポリヌクレオチドを含むヌクレオシドのヌクレオシド塩基及び／または糖部分上であり得る。いくつかの実施形態において、複数の修飾は、修飾核酸または１つ以上の個々のヌクレオシドまたはヌクレオチドに含まれる。例えば、ヌクレオシドへの修飾は、核酸塩基及び糖への１つ以上の修飾を含み得る。本発明のポリヌクレオチドへの修飾は、例えば、国際特許出願第ＷＯ２０１３／０５２５２３号（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に教示されるもののうちのいずれかを含み得る。
【０４３８】
本明細書に記載の「ヌクレオシド」は、有機塩基（例えば、プリンもしくはピリミジン）またはその誘導体（本明細書中では「核酸塩基」とも称される）との組み合わせで糖分子（例えば、ペントースもしくはリボース）またはその誘導体を含有する化合物として定義される。本明細書に記載の「ヌクレオチド」は、リン酸基を含むヌクレオシドとして定義される。
【０４３９】
いくつかの実施形態において、修飾は、ヌクレオシド間連結（例えば、リン酸骨格）上であり得る。本明細書において、ポリヌクレオチド骨格との関連で、「リン酸塩」及び「ホスホジエステル」という語句は、同義に使用される。骨格リン酸基は、酸素原子のうちの１個以上を異なる置換基で置換することによって修飾され得る。さらに、修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドは、未修飾リン酸塩部分の別のヌクレオシド間連結との大規模な置換を含み得る。修飾リン酸基の例には、ホスホロチオエート、ホスホロセレナート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、水素ホスホネート、ホスホロラミデート、ホスホロジアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、及びホスホトリエステルが含まれるが、これらに限定されない。ホスホロジチオエートは、硫黄で置換された両方の非結合酸素を有する。リン酸リンカーは、結合酸素の窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、及び炭素（架橋メチレンホスホネート）での置換によっても修飾され得る。使用され得る他の修飾は、例えば、国際特許出願第ＷＯ２０１３／０５２５２３号（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている。
【０４４０】
本発明において有用である本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチドまたは核酸塩基の化学修飾及び／または置換は、当該技術分野で周知の任意の修飾置換、例えば、（±）１−（２−ヒドロキシプロピル）プソイドウリジンＴＰ、（２Ｒ）−１−（２−ヒドロキシプロピル）プソイドウリジンＴＰ、１−（４−メトキシ−フェニル）プソイド−ＵＴＰ、２’−Ｏ−ジメチルアデノシン、１，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン、１，２’−Ｏ−ジメチルイノシン、１−ヘキシル−プソイド−ＵＴＰ、１−ホモアリルプソイドウリジンＴＰ、１−ヒドロキシメチルプソイドウリジンＴＰ、１−イソ−プロピル−プソイド−ＵＴＰ、１−Ｍｅ−２−チオ−プソイド−ＵＴＰ、１−Ｍｅ−４−チオ−プソイド−ＵＴＰ，１−Ｍｅ−アルファ−チオ−プソイド−ＵＴＰ、１−Ｍｅ−ＧＴＰ、２’−アミノ−２’−デオキシ−ＡＴＰ、２’−アミノ−２’−デオキシ−ＣＴＰ、２’−アミノ−２’−デオキシ−ＧＴＰ、２’−アミノ−２’−デオキシ−ＵＴＰ、２’−アジド−２’−デオキシ−ＡＴＰ、ツベルシジン、低修飾ヒドロキシワイブトシン、ウリジン５−オキシ酢酸、ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル、ワイブトシン、ワイオシン、キサンチン、キサントシン−５’−ＴＰ、キシロ−アデノシン、ゼブラリン、α−チオ−アデノシン、α−チオ−シチジン、α−チオ−グアノシン、及び／またはα−チオ−ウリジンを含む。
【０４４１】
本発明のポリヌクレオチドは、本明細書で教示される修飾のうちの１つ以上を含み得る。異なる糖修飾、塩基修飾、ヌクレオチド修飾、及び／またはヌクレオシド間連結（例えば、骨格構造）は、本発明のポリヌクレオチドにおける様々な位置で存在し得る。当業者は、ポリヌクレオチドの機能が実質的に低下されないように、ヌクレオチド類似体または他の修飾（複数可）が、ポリヌクレオチドの任意の位置（複数可）に位置し得ることが、当業者に理解されよう。修飾はまた、５’または３’末端修飾であり得る。ポリヌクレオチドは、約１％〜約１００％の修飾ヌクレオチド（全ヌクレオチド含量に対して、または１つ以上のタイプのヌクレオチド、すなわち、Ａ、Ｇ、Ｕ、またはＣのいずれか１つ以上に対して）またはその間の任意のパーセンテージ（例えば、１％〜２０％、１％〜２５％、１％〜５０％、１％〜６０％、１％〜７０％、１％〜８０％、１％〜９０％、１％〜９５％、１０％〜２０％、１０％〜２５％、１０％〜５０％、１０％〜６０％、１０％〜７０％、１０％〜８０％、１０％〜９０％、１０％〜９５％、１０％〜１００％、２０％〜２５％、２０％〜５０％、２０％〜６０％、２０％〜７０％、２０％〜８０％、２０％〜９０％、２０％〜９５％、２０％〜１００％、５０％〜６０％、５０％〜７０％、５０％〜８０％、５０％〜９０％、５０％〜９５％、５０％〜１００％、７０％〜８０％、７０％〜９０％、７０％〜９５％、７０％〜１００％、８０％〜９０％、８０％〜９５％、８０％〜１００％、９０％〜９５％、９０％〜１００％、及び９５％〜１００％）を含有し得る。
【０４４２】
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドのうちの１つ以上のコドンは、コドン選択と称されるプロセスを通して、ＳＲＥの発現を同調するために、天然アミノ酸配列をコードする他のコドンで置き換えられ得る。ｍＲＮＡコドン及びｔＲＮＡ抗コドンプールが生物、細胞型、細胞内位置、及び経時において異なる傾向があるため、本明細書に記載のコドン選択は、時空間（ＳＴ）のコドン選択である。
【０４４３】
本発明のいくつかの実施形態において、ある特定のポリヌクレオチド特性は、コドン最適化され得る。コドン最適化は、天然配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０、１５、２０、２５、５０またはそれ以上のコドンを、その宿主細胞の遺伝子に最も頻繁に使用されるが、天然アミノ酸配列を維持するコドンと置換することによって宿主細胞における発現の増強のために核酸配列を修飾するプロセスを指す。コドン使用は、参照遺伝子セットからのコードポリヌクレオチド配列の偏差を測定するコドン適合指数（ＣＡＩ）を使用して測定され得る。コドン使用表は、コドン使用データベース（ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）で入手可能であり、ＣＡＩは、ＥＭＢＯＳＳ  ＣＡＩプログラム（ｅｍｂｏｓｓ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／）によって計算することができる。コドン最適化法は、当該技術分野で周知であり、いくつかの目的を達成するために有用であり得る。これらの目的には、標的及び宿主生物におけるコドン頻度を一致させて適切な折り畳みを確実にすること、ヌクレオチド含量を付勢させて安定性を変化させるか、または二次構造を減少させること、遺伝子構築または発現を障害し得る縦列反復コドンまたは塩基泳動を最小限に抑えること、転写及び翻訳制御領域をカスタマイズすること、タンパク質シグナル伝達配列を挿入または除去すること、コードされたタンパク質における翻訳後修飾部位（例えば、グリコシル化部位）を除去／付加すること、タンパク質ドメインを付加、除去、または組み替えること、制限部位を挿入するかまたは欠失させること、リボソーム結合部位及び分解部位を修飾すること、翻訳速度を調節してタンパク質の様々なドメインの適切な折り畳みを可能にすること、あるいはポリヌクレオチド内の問題の二次構造を減少させるか、または排除することが含まれる。コドン最適化ツール、アルゴリズム、及びサービスは、当該技術分野で周知であり、非限定的な例には、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ  ＣＡ）、ＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）からのサービス、ＤＮＡＷｏｒｋｓ  ｖ３．２．３などであるが、これらに限定されない、アルゴリズム、及び／または所有権を有する方法が含まれる。一実施形態において、ポリヌクレオチド配列またはその部分は、最適化アルゴリズムを使用してコドン最適化される。各アミノ酸のためのコドン選択肢は、その特定の種において発現を最適化するための様々な種の表にあるように当該技術分野で公知である。
【０４４４】
本発明のいくつかの実施形態において、ある特定のポリヌクレオチド特性は、コドン最適化され得る。例えば、コドン最適化のために好ましい領域は、ポリペプチドをコードする領域に対して上流（５’）または下流（３’）であり得る。これらの領域は、ペイロードをコードする領域またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のコドン最適化前及び／または後にポリヌクレオチドに組み込まれ得る。
【０４４５】
最適化後（必要に応じて）、ポリヌクレオチド成分は、プラスミド、ウイルス、コスミド、及び人工染色体などであるが、これらに限定されない、ベクターに再構築及び変換され得る。
【０４４６】
時空間コドン選択は、コドン組成物がｍＲＮＡ空間の翻訳速度及びその安定性を決定するため、本発明のポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼし得る。例えば、最適化コドンに対するｔＲＮＡ抗コドンは、豊富であり、それ故に、翻訳は、増強され得る。対照的に、あまり一般的でないコドンに対するｔＲＮＡ抗コドンは、より少なく、それ故に、翻訳は、より低速度で継続され得る。Ｐｒｅｓｎｙａｋらは、ｍＲＮＡ種の安定性が、コドン含量及びより高い安定性に応じて異なり、それ故に、より高いタンパク質発現は、最適化コドンを使用することによって達成され得ることを示している（Ｐｒｅｓｎｙａｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ  １６０，１１１１−１１２４、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。したがって、いくつかの実施形態において、ＳＴコドンの選択は、本発明のＳＲＥＳの発現、エフェクターモジュール、及びバイオサーキットを増強させるために、最適化コドンの選択を含み得る。他の実施形態において、時空間コドンの選択は、本発明の組成物の発現を軽減するために、宿主細胞の遺伝子においてあまり一般的に使用されないコドンの選択を含み得る。最適化コドン対宿主細胞の遺伝子においてあまり一般的に使用されないコドンの比率はまた、発現を同調するために異なり得る。
【０４４７】
いくつかの実施形態において、ある特定の領域のポリヌクレオチドは、コドン選択方法を使用して修飾され得る。例えば、コドン選択のために好ましい領域は、ポリペプチドをコードする領域に対して上流（５’）または下流（３’）であり得る。これらの領域は、ペイロードをコードする領域またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のコドン選択前及び／または後にポリヌクレオチドに組み込まれ得る。
【０４４８】
本発明のポリヌクレオチドの終止コドンは、本発明のＳＲＥの発現レベル、ペイロード、及びエフェクターモジュールを変化させるための配列及びモチーフを含むように修飾され得る。このような配列は、終止コドンの読み合わせを誘導するために組み込むことができ、終止コドンは、アミノ酸、例えば、セレノシステインまたはピロリシンを特定し得る。他の例では、終止コドンは、代替のオープンリーディングフレームを通して翻訳を再開するために完全に飛ばしてもよい。終止コドン読み合わせは、特定の比率でエフェクターモジュールの成分の発現を同調するために使用され得る（例えば、終止コドンの文脈によって記されるように）。好ましい終止コドンモチーフの例は、ＵＧＡＮ、ＵＡＡＮ、及びＵＡＧＮを含み、式中、Ｎは、ＣまたはＵのいずれかである。
【０４４９】
ポリヌクレオチド修飾及び操作は、部位特異的突然変異誘発及び組換え技術などであるが、これらに限定されない、当該技術分野で周知の方法によって達成され得る。次いで、得られた修飾分子は、本明細書に記載のものまたは当該技術分野で周知の任意の他の好適なスクリーニングアッセイなどのインビトロまたはインビボアッセイを使用した活性について試験され得る。
【０４５０】
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、２つ以上のエフェクターモジュール配列、または２つ以上のペイロード配列を含み得、これらは、ＡＢＡＢＡＢまたはＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢまたはＡＢＣＡＢＣＡＢＣ、または１回、２回、もしくは３回より多く繰り返されたそれらのバリアントのようなパターンの配列である。これらのパターンでは、各文字Ａ、Ｂ、またはＣは、異なるエフェクターモジュール成分を表す。
【０４５１】
さらに別の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、各成分が１つ以上のＳＲＥ配列（ＤＤ配列）、または２つ以上のペイロード配列を有する、２つ以上のエフェクターモジュール成分配列を含み得る。非限定的な例として、配列は、ＡＢＡＢＡＢまたはＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢまたはＡＢＣＡＢＣＡＢＣ、または領域の各々において、１回、２回、もしくは３回より多く繰り返されたそれらのバリアントのようなパターンの配列であり得る。別の非限定的な例として、配列は、ＡＢＡＢＡＢまたはＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢまたはＡＢＣＡＢＣＡＢＣ、またはポリヌクレオチド全体にわたって１回、２回、もしくは３回より多く繰り返されたそれらのバリアントのようなパターンの配列であり得る。これらのパターンでは、各文字Ａ、Ｂ、またはＣは、異なる配列または成分を表す。
【０４５２】
本発明によれば、異なるバイオサーキット、エフェクターモジュール、ＳＲＥ、及びペイロード構築物をコードするポリヌクレオチドは、３’−末端で修飾されているヌクレオチドを使用して、３’−末端を通して一緒に連結され得る。化学的コンジュゲーションは、細胞への送達の化学量論を制御するために使用され得る。ポリヌクレオチドは、他のポリヌクレオチド、色素、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソライン（ｐｓｏｒａｌｅｎｅ）、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えばＥＤＴＡ）、アルキル化剤、リン酸塩、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えばビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ、タンパク質、例えば、糖タンパク質類、またはペプチド、例えば、コリガンドに対して特異親和性を有する分子、または抗体、例えば、がん細胞、内皮細胞、もしくは骨細胞などの特定の細胞型に結合する抗体、ホルモン及びホルモン受容体、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、または薬物にコンジュゲートするように設計することができる。非限定的な例として、それらは、他の免疫コンジュゲートとコンジュゲートされ得る。
【０４５３】
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドの組成物は、ギブソンアセンブリ方法を使用して、エフェクターモジュールの様々な成分を混合することによって生成され得る。ギブソンアセンブリ反応は、３つの等温反応からなり、それぞれ、長い突出部を生成する５’エキソヌクレアーゼ、アニーリングされた一本鎖領域のギャップを埋めるポリメラーゼ、及びアニーリングされ埋められたギャップのニックを閉じるＤＮＡリガーゼを含む異なる酵素活性に応じて異なる。ポリメラーゼ連鎖反応は、重複配列を有するＰＣＲ産物を生成するために使用され得るギブソンアセンブリの前に行われる。これらの方法は、連続して繰り返して、ますます大きな分子をアセンブルすることができる。例えば、この方法は、上記の方法を繰り返して、対象となる２つ以上のＤＮＡ分子の第２のセットを互いに連結させること、次いで、この方法を再度繰り返して、対象となる第１及び第２のセットのＤＮＡ分子を連結することなどを含むことができる。これらの複数ラウンドのアセンブリの間の任意の段階で、アセンブリされたＤＮＡを、好適な微生物に形質転換することによってそれを増幅させることができ、またはインビトロで（例えば、ＰＣＲによって）それを増幅させることもできる。
【０４５４】
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に教示される不安定化ドメイン（ＤＤ）及び少なくとも１つのペイロードを含むエフェクターモジュールをコードし得る。ＤＤドメインは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の変異を含むｈＰＤＥ５変異体であり得る。
【０４５５】
いくつかの実施形態において、エフェクターモジュールは、配列番号９５〜１０６、２０５〜２２２、２３４〜２３６、２５６〜２６０、３７８〜３７９、４６９〜５０３、及び５２６〜５３３によってコードされるＰＤＥ５−ＧＦＰ融合物であり得る。いくつかの実施形態において、エフェクターモジュールは、配列番号８２８５〜８２９８によってコードされるｈＰＤＥ５−ＣＡＲ構築物、または配列番号８３５２〜８３６１によってコードされるｈＰＤＥ５−ＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａ構築物であり得る。
【０４５６】
細胞
本発明に従って、本発明の少なくとも１つのバイオサーキット、ＳＲＥ（例えば、ＤＤ）、エフェクターモジュール、及び免疫治療剤を発現するように遺伝子操作される細胞が、提供される。本発明の細胞は、免疫細胞、幹細胞、及び腫瘍細胞を含み得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞（例えば、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｆｏｘｐ３＋細胞）、メモリＴ細胞、例えば、Ｔメモリ幹細胞、中央Ｔメモリ細胞、及びエフェクターメモリＴ細胞、最終分化したエフェクターＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫ  Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、及び樹状細胞（ＤＣ）、エフェクター機能を引き出すことができる他の免疫細胞、またはこれらの混合物を含むが、これらに限定されない、免疫エフェクター細胞である。Ｔ細胞は、Ｔαβ細胞及びＴγδ細胞であり得る。いくつかの実施形態において、幹細胞は、ヒト胚幹細胞、間葉幹細胞、及び神経幹細胞からのものであり得る。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、枯渇した内因性Ｔ細胞受容体であり得る（米国特許第９，２７３，２８３号、同第９，１８１，５２７号、及び同第９，０２８，８１２号を参照されたく、当該出願の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。
【０４５７】
いくつかの実施形態において、本発明の細胞は、特定の個々の対象に関して自家、同種異系、同系、または異種であり得る。
【０４５８】
いくつかの実施形態において、本発明の細胞は、哺乳動物細胞、特に、ヒト細胞であり得る。本発明の細胞は、初代細胞または不死化細胞株であり得る。
【０４５９】
いくつかの実施形態において、本発明の細胞は、細胞の増殖及び拡張を引き起こすためのペイロードとして拡張因子を含み得る。例示的なペイロードには、ＲＡＳ、例えば、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＲＲＡＳ、ＲＲＡＳ２、ＭＲＡＳ、ＥＲＡＳ、及びＨＲＡＳ、ＤＩＲＡＳ、例えば、ＤＩＲＡＳ１、ＤＩＲＡＳ２、及びＤＩＲＡＳ３、ＮＫＩＲＡＳ、例えば、ＮＫＩＲＡＳ１及びＮＫＩＲＡＳ２、ＲＡＬ、例えば、ＲＡＬＡ及びＲＡＬＢ、ＲＡＰ、例えば、ＲＡＰ１Ａ、ＲＡＰ１Ｂ、ＲＡＰ２Ａ、ＲＡＰ２Ｂ、及びＲＡＰ２Ｃ、ＲＡＳＤ、例えば、ＲＡＳＤ１及びＲＡＳＤ２、ＲＡＳＬ、例えば、ＲＡＳＬ１０Ａ、ＲＡＳＬ１０Ｂ、ＲＡＳＬ１１Ａ、ＲＡＳＬ１１Ｂ、及びＲＡＳＬ１２、ＲＥＭ、例えば、ＲＥＭ１及びＲＥＭ２、ＧＥＭ、ＲＥＲＧ、ＲＥＲＧＬ、ならびにＲＲＡＤが含まれる。
【０４６０】
操作された免疫細胞は、細胞組成物を、バイオサーキット、エフェクターモジュール、ＳＲＥ、及び／または対象となるペイロード（すなわち、免疫治療剤）のポリペプチド、または当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または当該ポリヌクレオチドを含むベクターに形質導入することによって達成され得る。ベクターは、レンチウイルスベクター、ガンマ−レトロウイルスベクター、組換えＡＡＶ、アデノウイルスベクター、及び腫瘍崩壊ウイルスベクターなどのウイルスベクターであり得る。他の態様において、非ウイルスベクター、例えば、ナノ粒子及びリポソームもまた、使用され得る。いくつかの実施形態において、本発明の免疫細胞は、刺激物質を使用して同調可能である、少なくとも１つの本発明の免疫治療剤を発現するように遺伝子操作されている。いくつかの例において、同じバイオサーキット及びエフェクターモジュールにおいて構築される３つ以上の免疫治療剤は、細胞に導入される。他の例において、２つ、３つまたはそれ以上のバイオサーキット、エフェクターモジュールは、これらの各々が免疫治療剤を含み、細胞に導入され得る。
【０４６１】
いくつかの実施形態において、本発明の免疫細胞は、本明細書に教示される（ＣＡＲ  Ｔ細胞として知られている）、抗原特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、または抗原特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように修飾されるＴ細胞であり得る。したがって、本明細書に記載のＣＡＲシステム（またはＴＣＲ）をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドをコードするベクターは、Ｔ細胞に導入される。ＣＡＲまたはＴＣＲを発現するＴ細胞は、ＣＡＲまたはＴＣＲの細胞外標的化部分を介して特定の抗原に結合し、それによって、細胞内シグナル伝達ドメイン（複数可）を介してシグナルは、Ｔ細胞に伝播され、結果として、Ｔ細胞が活性化される。活性化したＣＡＲ  Ｔ細胞は、細胞毒性サイトカイン（例えば、腫瘍壊死因子及びリンホトキシンなど）の放出、細胞増殖率の改善、細胞表面分子の変化などを含むその挙動を変化させる。このような変化は、ＣＡＲまたはＴＣＲによって認識される抗原を発現する標的細胞の破壊を引き起こす。加えて、サイトカインの放出または細胞表面分子の変化は、他の免疫細胞、例えば、Ｂ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、及びマクロファージを刺激する。
【０４６２】
Ｔ細胞に導入されたＣＡＲは、ＴＣＲ  ＣＤ３ゼータからの細胞内シグナル伝達ドメインのみを含む第一世代ＣＡＲ、またはＴＣＲ  ＣＤ３ゼータからの細胞内シグナル伝達ドメイン及び共刺激シグナル伝達ドメインを含む第二世代ＣＡＲ、またはＴＣＲ  ＣＤ３ゼータからの細胞内シグナル伝達ドメイン及び２つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む第三世代ＣＡＲ、またはスプリットＣＡＲシステム、またはオン／オフスイッチＣＡＲシステムであり得る。一例において、ＣＡＲまたはＴＣＲの発現は、本発明のエフェクターモジュールにおいて、ｈＤＨＦＲ変異体などの不安定化ドメイン（ＤＤ）によって制御される。ＴＭＰなどのｈＤＨＦＲ結合リガンドの存在または不在は、形質導入したＴ細胞またはＮＫ細胞においてＣＡＲまたはＴＣＲの発現を同調するために使用される。
【０４６３】
いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞は、別の１つ、２つ、３つまたはそれ以上の免疫治療剤を発現するようにさらに修飾され得る。免疫治療剤は、異なる標的分子に特異的な別のＣＡＲまたはＴＣＲ；サイトカイン、例えば、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１５、及びＩＬ１８、またはサイトカイン受容体、例えば、ＩＬ１５Ｒａ；阻害シグナルを刺激シグナルに変換するキメラスイッチ受容体；養子導入細胞を腫瘍組織などの標的部位に導くホーミング受容体；免疫細胞の代謝を最適化する薬剤；あるいは重度の事象が養子細胞移入後に観察されるとき、または移入した免疫細胞をもはや必要としないときに、活性化したＴ細胞を殺傷する安全スイッチ遺伝子（例えば、自殺遺伝子）であり得る。これらの分子は、同じエフェクターモジュールまたは別々のエフェクターモジュールに含まれ得る。
【０４６４】
一実施形態において、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞（ＴＣＲ  Ｔ細胞を含む）は、ＣＡＲを含むエフェクターモジュール及びサイトカインを含むエフェクターモジュールで形質転換される「武装化した（ａｒｍｅｄ）」ＣＡＲ  Ｔ細胞であり得る。誘導性または構造的に分泌が活性なサイトカインは、ＣＡＲ  Ｔ細胞をさらに装甲して、有効性及び持続性を改善する。この文脈において、このようなＣＡＲ  Ｔ細胞はまた、「装甲した（ａｒｍｏｒｅｄ）ＣＡＲ  Ｔ細胞」とも称される。「装甲した」分子は、腫瘍微環境ならびに先天性及び適応性免疫システムの他のエレメントに基づいて選択され得る。いくつかの実施形態において、分子は、刺激因子、例えば、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、Ｉ型ＩＦＮ、ＣＤ４０Ｌ、及び４−１ＢＢＬであり得、これらは、異なる機構を介して敵対する腫瘍微環境に直面してＣＡＲ  Ｔ細胞の有効性及び持続性をさらに増強することが示されている（Ｙｅｋｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ．，２０１６，４４（２）：４１２−４１８）。
【０４６５】
いくつかの態様において、本発明の武装化したＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ１９  ＣＡＲ及びＩＬ１２を発現するように修飾される。このようなＴ細胞は、腫瘍においてＣＡＲによって媒介された活性化後に、Ｔ細胞の活性化を増大し、先天性免疫細胞を引き付け、活性化して、ＣＤ１９−陰性がん細胞を排除する、誘導性ＩＬ１２を放出する。
【０４６６】
一実施形態において、本発明のＴ細胞は、ＣＡＲを含むエフェクターモジュール及び自殺遺伝子を含むエフェクターモジュールを発現するように修飾され得る。
【０４６７】
一実施形態において、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞（ＴＣＲ  Ｔ細胞を含む）は、サイトカイン及び安全スイッチ遺伝子（例えば、自殺遺伝子）を含むエフェクターモジュールで形質転換され得る。自殺遺伝子は、バイオサーキットシステムの細胞外刺激物質によって活性化されるときに、アポトーシスを誘導するカスパーゼ９などの誘導性カスパーゼであり得る。このような誘導性アポトーシスは、直接毒性及び制御されない細胞の増殖のリスクを減少させるために必要とされるため、形質移入細胞を排除する。
【０４６８】
いくつかの実施形態において、本発明の免疫細胞は、本明細書に教示される抗原特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、または抗原特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように修飾されるＮＫ細胞であり得る。
【０４６９】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、先天性リンパ系細胞ファミリーのメンバーであり、ＣＤ３（Ｔ細胞共受容体）の不在下で、表現型マーカーＣＤ５６（神経系細胞接着分子）の発現によってヒトにおいて特徴付けられる。ＮＫ細胞は、事前抗原プライミングを必要としないで細胞毒性の攻撃を媒介し、がん悪性腫瘍及びウイルス感染を含む疾患に対して第一選択の防御を形成する、先天性免疫システムの強力なエフェクター細胞である。
【０４７０】
いくつかの前臨床及び臨床試験は、ＮＫ細胞の養子移入が急性骨髄性白血病などのがんに対して有望な治療アプローチであることを実証している（Ｒｕｇｇｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ；２００２，２９５：２０９７−２１００、及びＧｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１１，３：１４４５−１４５９）。ＤＡＰ１２ベースの活性化するＣＡＲなどのＣＡＲを発現するＮＫ細胞の養子移入は、腫瘍細胞の改善された根絶を示した（Ｔｏｐｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５；１９４：３２０１−３２１２）。ＣＳ−１特異性ＣＡＲを発現するように操作されたＮＫ細胞はまた、多発性骨髄腫における増強した細胞溶解及びインターフェロン−γ（ＩＦＮγ）の産生も示した（Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２０１４，２８（４）：９１７−９２７）。
【０４７１】
ＮＫ細胞は、活性化及び阻害性機能を有する一連の受容体によって特徴付けられる。ＮＫ細胞における重要な活性化受容体は、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ及びＮＫＧ２Ｄ（Ｃ型レクチン様受容体）、ならびに天然細胞毒性受容体（ＮＣＲ）ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、及びＮＫｐ４６を含み、これらは、腫瘍細胞またはウイルス感染した細胞においてリガンドを認識する。ＮＫ細胞の阻害は、本質的には、多型阻害性キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）と、ＨＬＡ分子のアルファ−１らせんを介したそれらの同種ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）リガンドとの相互作用によって媒介される。活性化受容体及び阻害性受容体から生成されるシグナルの平衡は、主に、急速な細胞毒性の活性化を決定する。
【０４７２】
ＮＫ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されても、ヒト胚幹（ＥＳ）細胞及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来してもよい。ＰＢＭＣから単離された一次ＮＫ細胞は、養子免疫療法においてさらに拡張され得る。ＮＫ細胞の拡張に有用な戦略及びプロトコルは、インターロイキン２（ＩＬ２）の刺激及び自家フィーダー細胞の使用、または遺伝子操作した同種異系フィーダー細胞の使用を含み得る。いくつかの態様において、ＮＫ細胞は、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＩＬ２、４１ＢＢＬ、ＩＬ１２、ＩＬ１８、ＭＩＣＡ、２Ｂ４、ＬＦＡ−１、及びＢＣＭ１／ＳＬＡＭＦ２を含む、刺激性リガンドの組み合わせで選択的に拡張され得る（例えば、米国特許出願第ＵＳ２０１５０１９０４７１号）。
【０４７３】
ＣＡＲ及び／または他の免疫治療剤を含むエフェクターモジュールを発現する免疫細胞は、がん免疫療法として使用することができる。免疫療法は、ＣＡＲ及び／または活性成分として他の免疫治療剤を発現する細胞を含み、好適な賦形剤をさらに含み得る。賦形剤の例には、様々な細胞培養培地及び等張塩化ナトリウムを含む、薬学的に許容される賦形剤が含まれ得る。
【０４７４】
いくつかの実施形態において、本発明の細胞は、本発明の組成物を発現するように遺伝子操作されている樹状細胞であり得る。このような細胞は、がんワクチンとして使用され得る。
【０４７５】
ＩＩＩ．薬学的組成物及び製剤
本発明は、１つ以上のバイオサーキット、エフェクターモジュール、ＳＲＥ（例えば、ＤＤ）、対象となる刺激物質及びペイロード（すなわち、免疫治療剤）、ベクター、本発明の細胞及び他の成分、ならびに任意に少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤または不活性成分を含む、薬学的組成物をさらに提供する。
【０４７６】
本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」という用語は、バイオサーキット、ＳＲＥ、対象となる刺激物質及びペイロード（すなわち、免疫治療剤）、他の成分、ベクター、細胞及び本明細書に記載のもの、またはその薬学的に許容される塩、任意に、生理学的に好適な担体及び賦形剤などの他の化学的成分を有する調製物を指す。本発明の薬学的組成物は、有効量の本発明の１つ以上の活性組成物を含む。本発明の少なくとも１つの組成物、及び／またはさらなる活性成分を含有する薬学的組成物の調製物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０（参照により本明細書に組み込まれる）によって例示される、本開示を考慮する当業者に周知であろう。
【０４７７】
「賦形剤」または「不活性成分」という用語は、活性成分の投与をさらに促進するために薬学的組成物及び製剤に添加された不活性物質を指す。本開示の目的のために、「活性成分」という語句は、概して、任意の１つ以上のバイオサーキット、エフェクターモジュール、ＳＲＥ、対象となる刺激物質及びペイロード（すなわち、免疫治療剤）、他の成分、ベクター、ならびに本明細書に記載のように送達される細胞を指す。「薬学的に許容される」という語句は、必要に応じて、動物、例えば、ヒトなどに投与されるときに、有害なアレルギー反応または他の不都合な反応を引き起こさない分子的実体及び組成物を指す。
【０４７８】
いくつかの実施形態において、薬学的組成物及び製剤は、ヒト、ヒト患者、または対象に投与される。本明細書に提供される薬学的組成物の説明は、原則的に、ヒトへの投与に適している薬学的組成物を対象とするが、このような組成物は、概して、任意の他の動物、例えば、非ヒト動物、例えば、非ヒト哺乳動物への投与に適していることが当業者によって理解されるであろう。薬学的組成物の投与が企図される対象には、ウシ、ウマ、ニワトリ、及びブタなどの農業動物、ネコ、イヌなどの家庭用動物、またはマウス、ラット、ウサギ、イヌ、及び非ヒト霊長類などの研究動物を含む、非ヒト哺乳動物が含まれるが、これらに限定されない。ヒトへの投与のために、調製物がＦＤＡの生物学製剤基準により要求される滅菌、発熱性、一般的安全性及び純度の基準を満たさなければならないことが理解されよう。
【０４７９】
本発明に従って、薬学的組成物及び製剤は、単一単位用量として、及び／または複数の単一単位用量として、調剤し、パッケージし、及び／又は大量販売され得る。本明細書で使用される場合、「単位用量」は、有効成分の所定量を含む薬学的組成物の個別の量である。有効成分の量は、概して、対象に投与され得る及び／又は、例えば、そのような投与量の２分の１または３分の１などのような、投与量の便利な画分であり得る、有効成分の投与量と等しい。
【０４８０】
本発明の組成物は、送達に適している任意の様式で製剤化され得る。製剤は、ナノ粒子、ポリ（乳酸−グリコール酸共重合体）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア、リピドイド（ｌｉｐｉｄｏｉｄ）、リポプレックス、リポソーム、ポリマー、炭水化物（単糖を含む）、カチオン性脂質、及びこれらの組み合わせであり得るが、これらに限定されない。
【０４８１】
一実施形態において、製剤は、少なくとも１つの脂質を含み得るナノ粒子である。脂質は、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、及びＰＥＧ化脂質から選択され得るが、これらに限定されない。別の態様において、脂質は、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｄ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、及びＤＯＤＭＡなどであるが、これらに限定されない、カチオン性脂質であり得る。
【０４８２】
本発明のポリヌクレオチドのために、製剤は、例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６９６１０号（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）において教示されるもののうちのいずれかから選択され得る。
【０４８３】
本発明に従って薬学的組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤または不活性成分、及び／または任意のさらなる成分の相対量は、治療される対象のアイデンティティ、大きさ、及び／または状態に応じて、ならびに組成物が投与される経路にさらに応じて変化するであろう。一例として、組成物は、０．１〜１００、例えば、０．５〜５０、１〜３０、５〜８０、少なくとも８０（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
【０４８４】
治療の有効性または疾患の改善は、例えば、疾患の進行、疾患の寛解、症状の重症度、疼痛の低減、生活の質、治療効果を持続するのに必要とされる医薬の用量、疾患マーカーのレベル、または治療もしくは予防対象の所与の疾患に適した任意の他の測定可能なパラメータを測定することによって評価され得る。このようなパラメータのうちのいずれか１つまたはパラメータの任意の組み合わせを測定することによって治療または予防の有効性をモニターすることは、十分に当業者の能力の範囲内にある。本発明の組成物の投与との関連では、例えば、がん「に対して有効」とは、臨床的に適切な方法での投与が、患者の少なくとも統計学的に有意な割合に対して、症状の改善、治癒、疾患負荷の低減、腫瘍塊もしくは腫瘍細胞数の低減、寿命の延長、生活の質の向上、または特定の型のがんの治療を熟知している医師により好ましいものとして一般に認められる他の効果などの有益な効果を生じることを示す。
【０４８５】
疾患状態の１つ以上のパラメータに統計学的に有意な改善がある場合、またはそうでなければ予想される症状の悪化や発症が見られない場合、治療効果または予防効果は明らかである。例として、疾患の測定可能なパラメータの少なくとも１０、好ましくは少なくとも２０、３０、４０、５０またはそれ以上の好ましい変化が、有効な治療を示し得る。本発明の所与の組成物または製剤の有効性はまた、当該技術分野で公知のように所与の疾患の実験動物モデルを用いて判断可能である。実験動物モデルを使用するときの、治療の有効性は、統計的に有意な変化が観察されるときに実証される。
【０４８６】
ＩＶ．送達モダリティ及び／またはベクター
ベクター
本発明はまた、バイオサーキット、エフェクターモジュール、ＳＲＥ（ＤＤ）、及びペイロード構築物、ならびにこれらの組み合わせをコードする本発明のポリヌクレオチドをパッケージングするベクターも提供する。いくつかの実施形態において、不安定化ドメイン、エフェクターモジュール、及びバイオサーキットシステムをコードするポリヌクレオチドが、提供される。本発明のポリヌクレオチドを含むベクターが、提供される。いくつかの態様において、ベクターは、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターであり得る。いくつかの実施形態において、本発明のベクターは、ウイルスベクターである。ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス、またはレンチウイルスベクターを含み得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明のベクターは、ナノ粒子及びリポソームなどの非ウイルスベクターであり得る。
【０４８７】
本発明のベクターはまた、細胞、局所組織部位、または対象にパッケージングしたポリヌクレオチドを送達するために使用され得る。これらのベクターは、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミド、ウイルスベクター、及び粒子を含む、いずれかの種類のものであり得る。ウイルスベクター技術は、公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）において説明されている。ベクターとして有用であるウイルスには、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、腫瘍崩壊ウイルスなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０４８８】
全般に、ベクターは、少なくとも１つの生物中で機能する複製起点、プロモーター配列、及び便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、ならびに１つ以上の選択可能なマーカー、例えば、薬物耐性遺伝子を含有する。
【０４８９】
本明細書で使用される場合、プロモーターは、本発明のポリヌクレオチド配列の特定の転写を開始するのに必要とされる、細胞の転写機構によって認識されるＤＮＡ配列として定義される。ベクターは、本発明のポリヌクレオチドに作動可能に連結された天然または非天然プロモーターを含み得る。選択されたプロモーターは、強い、弱い、構造的、誘導性、組織特異的、発育段階特異的な、及び／または生物特異的であり得る。好適なプロモーターの一例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに機能的に連結されているポリヌクレオチド配列の高いレベルの発現を駆動することができる、強い構成的プロモーター配列である。好ましいプロモーターの別の例は、伸長成長因子−１アルファ（ＥＦ−１．アルファ）である。シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、長い末端反復（ＬＴＲ）、プロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン−バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、ユビキチンＣ（Ｕｂｃ）プロモーター、ヒトＵ６核内低分子タンパク質プロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーターが含まれるが、これらに限定されない、ヒト遺伝子プロモーターを含むが、これらに限定されない、他の構成的プロモーターもまた、使用され得る。場合によっては、メタロチオニン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター及びテトラサイクリンプロモーターなどであるが、これらに限定されない、誘導性プロモーターが、使用され得る。いくつかの実施形態において、このプロモーターは、配列番号３３５のヌクレオチド配列を含むＣＭＶプロモーター、配列番号３３６〜３３７のヌクレオチド配列を含むＥＦ１ａプロモーター、及び配列番号３３８のヌクレオチド配列を含むＰＧＫプロモーターから選択され得る。
【０４９０】
いくつかの実施形態において、最適プロモーターは、リガンドの不在下で本発明のＳＲＥ及びペイロードの最小限の発現及びリガンドの存在下で検出可能な発現を達成する能力に基づいて選択され得る。
【０４９１】
さらなるプロモーターエレメント、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を調節するために使用され得る。このような領域は、開始部位の１０〜１００の塩基対の上流または下流に位置し得る。場合によっては、２つ以上のプロモーターエレメントは、転写を協調的にまたは独立して活性化するために使用され得る。
【０４９２】
いくつかの実施形態において、組換え発現ベクターは、転写及び翻訳開始ならびに終止コドンなどの調節配列を含み得、これらは、ベクターが導入される宿主細胞の型に特異的である。
【０４９３】
１．レンチウイルスベクター
いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクター／粒子は、ビヒクル及び送達モダリティとして使用され得る。レンチウイルスは、ＤＮＡへのウイルスＲＮＡゲノムの逆転写が、宿主ゲノムへの組み込み前に必要とされるため、レトロウイルス科ファミリーのウイルスのサブグループとされる。したがって、レンチウイルスビヒクル／粒子の最も重要な特性は、標的／宿主細胞のゲノムにそれらの遺伝物質の組み込みである。レンチウイルスのいくつかの例は、ヒト免疫不全ウイルス：ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ジェンブラナ病ウイルス（ＪＤＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス、ビスナ−マエディ及びヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）を含む。
【０４９４】
典型的には、遺伝子送達ビヒクルからなるレンチウイルス粒子は、それら自体複製欠損である（「自己不活性化」とも称される）。レンチウイルスは、無傷宿主核エンベロープを通して侵入機構によって分裂細胞及び非分裂細胞の両方を感染させ得る（Ｎａｌｄｉｎｉ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９８，９：４５７−４６３）。組換えレンチウイルスビヒクル／粒子は、ＨＩＶ病原性遺伝子を多重弱毒させることにより作製されており、例えば、遺伝子Ｅｎｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｎｅｆ、及びＴａｔを欠失させ、ベクターを生物学的に安全にする。対応して、例えば、ＨＩＶ−１／ＨＩＶ−２に由来するレンチウイルスビヒクルは、非分裂細胞へのトランス遺伝子の効率的な送達、組み込み、及び長期の発現を媒介し得る。本明細書で使用される場合、「組換え」という用語は、レンチウイルス配列及び非レンチウイルスレトロウイルス配列の両方を含む、ベクターまたは他の核酸を指す。
【０４９５】
レンチウイルス粒子は、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞などの産生細胞においてウイルスパッケージングエレメント及びベクターゲノム自体を共発現することによって生成され得る。これらのエレメントは、通常、３つの別々のプラスミド（第二世代レンチウイルスシステムにおいて）または４つの別々のプラスミド（第三世代レンチウイルスシステムにおいて）において提供される。産生細胞は、コア（すなわち、構造タンパク質）を含むレンチウイルス成分及びウイルスの酵素成分を含むレンチウイルス成分をコードするプラスミド、及びエンベロープタンパク質（複数可）（パッケージングシステムと称される）、及び標的細胞に移入される外来トランス遺伝子を含むゲノムをコードするプラスミド、ビヒクル自体（移入ベクターとも称される）である。全般に、プラスミドまたはベクターは、産生細胞株に含まれる。プラスミド／ベクターは、トランスフェクション、形質導入、または感染を介して、産生細胞株に導入される。トランスフェクション、形質導入、または感染のための方法は、当業者には公知である。非限定的な例として、パッケージング及び移入構築物は、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションによって、一般的に、ｎｅｏ、ＤＨＦＲ、Ｇｌｎシンテターゼ、またはＡＤＡなどの優性の選択可能なマーカーと共に産生細胞株に導入することができ、続いて、適切な薬物の存在下での選択及びクローンの単離を行う。
【０４９６】
産生細胞は、外来遺伝子、例えば、本発明のエフェクターモジュールを含む、組換えウイルス粒子を産生する。組換えウイルス粒子は、当業者によって使用される標準的な方法によって、培養培地から回収され、滴定される。組換えレンチウイルスビヒクルは、標的細胞に感染させるために使用することができる。
【０４９７】
高感染価のレンチウイルス粒子を生成するために使用され得る細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、２９３Ｇ細胞、ＳＴＡＲ細胞（Ｒｅｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２００５，１１：４５２−４５９）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、及び他のＨＥＫ２９３Ｔベースの産生細胞株（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１１，２２（３）：３５７−３６９、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，２０１２，１０９９６）：１５５１−１５６０、Ｔｈｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００９，１１３（２１）：５１０４−５１１０、それらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０４９８】
いくつかの態様において、エンベロープタンパク質は、水疱性口内炎ウイルスのＧタンパク質（ＶＳＶ  Ｇ）またはバキュロウイルスｇｐ６４エンベロープタンパク質などの他のウイルスからの異種エンベロープタンパク質であり得る。ＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質は、特に、ベシクロウイルス属において分類される種の中から選んでよい：カラジャス（Ｃａｒａｊａｓ）ウイルス（ＣＪＳＶ）、チャンディプラ（Ｃｈａｎｄｉｐｕｒａ）ウイルス（ＣＨＰＶ）、Ｃｏｃａｌウイルス（ＣＯＣＶ）、イスファハン（Ｉｓｆａｈａｎ）ウイルス（ＩＳＦＶ）、マラバ（Ｍａｒａｂａ）ウイルス（ＭＡＲＡＶ）、Ｐｉｒｙウイルス（ＰＩＲＹＶ）、水疱性口内炎アラゴアスウイルス（ＶＳＡＶ）、水疱性口内炎インディアナウイルス（ＶＳＩＶ）、及び水疱性口内炎ニュージャージーウイルス（ＶＳＮＪＶ）及び／またはソウギョラブドウイルス（Ｇｒａｓｓ  ｃａｒｐ  ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）としてベシクロウイルス属において暫定的に分類される株、ＢｅＡｎ  １５７５７５ウイルス（ＢｅＡｎ  １５７５７５）、ボテケ（Ｂｏｔｅｋｅ）ウイルス（ＢＴＫＶ）、カルチャキ（Ｃａｌｃｈａｑｕｉ）ウイルス（ＣＱＩＶ）、Ｅｅｌ  ｖｉｒｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａｎ（ＥＶＡ）、グレイロッジ（Ｇｒａｙ  Ｌｏｄｇｅ）ウイルス（ＧＬＯＶ）、ユロナ（Ｊｕｒｏｎａ）ウイルス（ＪＵＲＹ）、クラマス（Ｋｌａｍａｔｈ）ウイルス（ＫＬＡＶ）、クワッタ（Ｋｗａｔｔａ）ウイルス（ＫＷＡＶ）、ラホージャ（Ｌａ  Ｊｏｙａ）ウイルス（ＬＪＶ）、マルパイススプリング（Ｍａｌｐａｉｓ  Ｓｐｒｉｎｇ）ウイルス（ＭＳＰＶ）、エルゴン山（Ｍｏｕｎｔ  Ｅｌｇｏｎ）コウモリウイルス（ＭＥＢＶ）、ペリネ（Ｐｅｒｉｎｅｔ）ウイルス（ＰＥＲＶ）、パイク（Ｐｉｋｅ）ハエラブドウイルス（ＰＦＲＶ）、ポートン（Ｐｏｒｔｏｎ）ウイルス（ＰＯＲＶ）、ラジ（Ｒａｄｉ）ウイルス（ＲＡＤＩＶ）、コイ春ウイルス血症（Ｓｐｒｉｎｇ  ｖｉｒｅｍｉａ  ｏｆ  ｃａｒｐ）ウイルス（ＳＶＣＶ）、ツバイ（Ｔｕｐａｉａ）ウイルス（ＴＵＰＶ）、潰瘍性疾患ラブドウイルス（Ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）（ＵＤＲＶ）、及びユグボグダノヴァツ（Ｙｕｇ  Ｂｏｇｄａｎｏｖａｃ）ウイルス（ＹＢＶ）。ｇｐ６４または他のバキュロウイルスｅｎｖタンパク質は、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）、Ａｎａｇｒａｐｈａ  ｆａｌｃｉｆｅｒａ核多角体病ウイルス、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ核多角体病ウイルス、Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ核多角体病ウイルス、Ｏｒｇｙｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ単一カプシド核多角体病ウイルス、Ｅｐｉｐｈｙａｓ  ｐｏｓｔｖｉｔｔａｎａ核多角体病ウイルス、Ｈｙｐｈａｎｔｒｉａ  ｃｕｎｅａ核多角体病ウイルス、Ｇａｌｌｅｒｉａ  ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ核多角体病ウイルス、Ｄｈｏｒｉウイルス、Ｔｈｏｇｏｔｏウイルス、Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｐｅｍｙｉ核多角体病ウイルス、またはＢａｔｋｅｎウイルスに由来し得る。
【０４９９】
レンチウイルス粒子に提供されるさらなるエレメントは、５’または３’末端のいずれかでレトロウイルスＬＴＲ（長い末端反復）、レトロウイルス輸送エレメント、任意に、レトロウイルス逆応答エレメント（ＲＲＥ）、プロモーターまたはその活性部分、及び遺伝子座調節領域（ＬＣＲ）またはその活性部分を含み得る。他のエレメントは、非分裂細胞中の導入効率を改善するための中央ポリプリン管（ｃＰＰＴ）配列、トランス遺伝子の発現を増強し、力価を増加させるウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む。エフェクターモジュールは、ベクターに連結される。
【０５００】
組換えレンチウイルス粒子を作製するための方法は、例えば、米国特許第８，８４６，３８５号、同第７，７４５，１７９号、同第７，６２９，１５３；７，５７５，９２４号、同第７，１７９，９０３号、及び同第６，８０８，９０５号（当該出願の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）などの当該技術分野で論じられている。
【０５０１】
使用されたレンチウイルスベクターは、ｐＬＶＸ、ｐＬｅｎｔｉ、ｐＬｅｎｔｉ６、ｐＬＪＭ１、ＦＵＧＷ、ｐＷＰＸＬ、ｐＷＰＩ、ｐＬｅｎｔｉ  ＣＭＶ  ｐｕｒｏ  ＤＥＳＴ、ｐＬＪＭ１−ＥＧＦＰ、ｐＵＬＴＲＡ、ｐＩｎｄｕｃｅｒ２０、ｐＨＩＶ−ＥＧＦＰ、ｐＣＷ５７．１、ｐＴＲＰＥ、ｐＥＬＰＳ、ｐＲＲＬ、及びｐＬｉｏｎＩＩから選択され得るが、これらに限定されない。
【０５０２】
当該技術分野で周知のレンチウイルスビヒクルもまた、使用され得る（米国特許第９，２６０，７２５号、同第９，０６８，１９９号、同第９，０２３，６４６号、同第８，９００，８５８号、同第８，７４８，１６９号、同第８，７０９，７９９号、同第８，４２０，１０４号、同第８，３２９，４６２号、同第８，０７６，１０６号、同第６，０１３，５１６号、及び同第５，９９４，１３６号、国際特許公開第ＷＯ２０１２０７９０００号を参照されたく、当該出願の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。
【０５０３】
２．レトロウイルスベクター（γ−レトロウイルスベクター）
いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターは、本発明のバイオサーキット、バイオサーキット成分、エフェクターモジュール、ＳＲＥ、またはペイロード構築物をパッケージングし、送達するために使用され得る。レトロウイルスベクター（ＲＶ）は、標的細胞中のトランス遺伝子の永続的な統合を可能にする。複合体ＨＩＶ−１／２に基づいたレンチウイルスベクターに加えて、単純なガンマ−レンチウイルスベクターに基づいたレンチウイルスベクターは、治療遺伝子を送達するために広範に使用されており、広範囲の細胞型を形質導入することができる、最も効率が良く、強力な遺伝子送達システムのうちの１つとして臨床的に示されている。ガンマレトロウイルスの例示的な種は、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）及びネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）を含む。
【０５０４】
いくつかの実施形態において、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）などの哺乳動物ガンマ−レトロウイルスに由来するガンマ−レトロウイルスベクターは、組換えである。ガンマレトロウイルスのＭＬＶファミリーは、エコトロピックな、両種性の、異種指向性の、及びポリトロピックなサブファミリーを含む。エコトロピックウイルスは、ｍＣＡＴ−１受容体を使用してマウス細胞のみに感染することができる。エコトロピックウイルスの例は、Ｍｏｌｏｎｅｙ  ＭＬＶ及びＡＫＶである。両種性ウイルスは、Ｐｉｔ−２受容体を通してマウス、ヒト、及び他の種に感染する。両種性ウイルスの一例は、４０７０Ａウイルスである。異種指向性及びポリトロピックウイルスは、同じ（Ｘｐｒ１）受容体を使用するが、それらの種指向性とは異なる。ＮＺＢ−９−１などの異種指向性ウイルスは、ヒト及び他の種に感染するが、マウス種には感染せず、一方、フォーカス形成ウイルス（ＭＣＦ）などのポリトロピックウイルスは、マウス、ヒト、及び他の種に感染する。
【０５０５】
ガンマ−レトロウイルスベクターは、レトロウイルス構造及び酵素（ｇａｇ−ｐｏｌ）ポリタンパク質をコードするもの、エンベロープ（ｅｎｖ）タンパク質をコードするもの、及び新たに形成されたウイルス粒子中にパッケージングされている本発明の組成物をコードするポリヌクレオチドを含むベクターｍＲＮＡをコードするものを含む、細胞をいくつかのプラスミドと共トランスフェクションすることによって、パッケージング細胞において産生され得る。
【０５０６】
いくつかの態様において、組換えガンマ−レトロウイルスベクターは、他のウイルスからのエンベロープタンパク質で偽型される。エンベロープ糖タンパク質は、細胞指向性を増加する／変化させることができるウイルス粒子の外側脂質層に組み込まれる。例示的なエンベロープタンパク質は、テナガザル白血病ウイルスエンベロープタンパク質（ＧＡＬＶ）または水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）、またはサル内因性レトロウイルスエンベロープタンパク質、または麻疹ウイルスＨ及びＦタンパク質、またはヒト免疫不全ウイルスｇｐ１２０エンベロープタンパク質、またはｃｏｃａｌビシクロウイルスエンベロープタンパク質を含む（例えば、米国特許出願公開第２０１２／１６４１１８号を参照されたく、当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。他の態様において、エンベロープ糖タンパク質は、ペプチドリガンド、単一鎖抗体、及び成長因子を含むが、これらに限定されない、ガンマ−レトロウイルスベクター、結合リガンドに標的化／結合リガンドを組み込むように遺伝子操作され得る（Ｗａｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２００７，８（８）：５７３−５８７、その内容は、参照によりその全体が組み込まれる）。これらの操作された糖タンパク質は、それらの対応する標的部分を発現する細胞にベクターを再標的することができる。他の態様において、「分子ブリッジ」は、特定の細胞にベクターを配向するように導入され得る。分子ブリッジは、一方の末端は、ウイルス糖タンパク質を認識することができ、他方の末端は、標的細胞上の分子決定基に結合することができる、二重特異性を有する。このような分子ブリッジ、例えば、リガンド−受容体、アビジン−ビオチン、及び化学的結合、モノクローナル抗体、及び操作した融合タンパク質は、形質導入のために標的細胞にウイルスベクターの接着を配向することができる（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２００８，１０１（２）：３５７−３６８及びＭａｅｔｚｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｕｓｅｓ，２０１１，３，６７７−７１３、それらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。
【０５０７】
いくつかの実施形態において、組換えガンマ−レトロウイルスベクターは、自己不活性化（ＳＩＮ）ガンマレトロウイルスベクターである。ベクターは、複製能力がない。ＳＩＮベクターは、初めに、エンハンサー／プロモーター活性を含む、３’Ｕ３領域内に欠失を有し得る。さらに、５’Ｕ３領域は、サイトメガロウイルスもしくはＲＳＶに由来する強いプロモーター（パッケージング細胞株中で必要とされる）、または最適な内部プロモーター、及び／またはエンハンサーエレメントで置き換えられ得る。内部プロモーターの選択は、本発明の特定の目的のために必要とされる遺伝子発現の特定の必要条件に従って行われ得る。
【０５０８】
いくつかの実施形態において、バイオサーキット、バイオサーキット成分、エフェクターモジュール、ＳＲＥをコードするポリヌクレオチドは、組換えウイルスゲノム内に挿入される。組換えガンマ−レトロウイルスベクターのウイルスｍＲＮＡの他の成分は、天然に生じる配列の挿入または除去（例えば、ＩＲＥＳの挿入、対象となるポリペプチドもしくは阻害性核酸をコードする異種ポリヌクレオチドの挿入、野生型プロモーターの代わりに異なるレトロウイルスもしくはウイルスからのより有効なプロモーターのシャッフリングなど）によって修飾され得る。いくつかの例において、組換えガンマ−レトロウイルスベクターは、修飾されたパッケージングシグナル、及び／またはプライマー結合部位（ＰＢＳ）、及び／または５’−長い末端反復（ＬＴＲ）のＵ３−領域における５’−エンハンサー／プロモーターエレメント、及び／または３’−ＬＴＲのＵ３−領域において修飾された３’−ＳＩＮエレメントを含み得る。これらの修飾は、感染の力価及び能力を増加し得る。
【０５０９】
本発明のバイオサーキット成分、エフェクターモジュール、ＳＲＥ、またはペイロード構築物を送達するのに適しているガンマレトロウイルスベクターは、米国特許第８，８２８，７１８号、同第７，５８５，６７６号、同第７，３５１，５８５号、米国特許出願公開第２００７／０４８２８５号、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１０／１１３０３７号、同第ＷＯ２０１４／１２１００５号、同第ＷＯ２０１５／０５６０１４、ならびに欧州特許第ＥＰ１７５７７０２号、同第ＥＰ１７５７７０３号（当該出願の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）において開示されているものから選択され得る。
【０５１０】
３．アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターにパッケージングされ得る。このようなベクターまたはウイルス粒子は、既知の血清型カプシドまたは血清型カプシドの組み合わせのうちのいずれかを使用するために設計され得る。血清型カプシドは、任意の特定されたＡＡＶ血清型及びそれらのバリアント、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ４−４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、及びＡＡＶｒｈ１０からのカプシドを含み得る。
【０５１１】
一実施形態において、ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１（ＵＳ２００３０１３８７７２の配列番号６及び６４）、ＡＡＶ２（ＵＳ２００３０１３８７７２の配列番号７及び７０）、ＡＡＶ３（ＵＳ２００３０１３８７７２の配列番号８及び７１）、ＡＡＶ４（ＵＳ２００３０１３８７７２の配列番号６３）、ＡＡＶ５（ＵＳ２００３０１３８７７２の配列番号１１４）、ＡＡＶ６（ＵＳ２００３０１３８７７２の配列番号６５）、ＡＡＶ７（ＵＳ２００３０１３８７７２の配列番号１−３）、ＡＡＶ８（ＵＳ２００３０１３８７７２の配列番号４及び９５）、ＡＡＶ９（ＵＳ２００３０１３８７７２の配列番号５及び１００）、ＡＡＶ１０（ＵＳ２００３０１３８７７２の配列番号１１７）、ＡＡＶ１１（ＵＳ２００３０１３８７７２の配列番号１１８）、ＡＡＶ１２（ＵＳ２００３０１３８７７２の配列番号１１９）、ＡＡＶｒｈ１０（ＵＳ２００３０１３８７７２の配列番号８１のアミノ酸１〜７３８）またはそれらのバリアントなどであるが、これらに限定されない、米国特許出願公開第ＵＳ２００３０１３８７７２号（参照によりその全体が組み込まれる）に記載される配列であり得るか、またはそれらを有し得る。バリアントの非限定的な例は、ＵＳ２００３０１３８７７２（当該出願の内容は、参照によりその全体が組み込まれる）の配列番号９、２７〜４５、４７〜６２、６６−６９、７３〜８１、８４〜９４、９６、９７、９９、１０１〜１１３を含む。
【０５１２】
一実施形態において、ＡＡＶ血清型は、Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１１，１９（６）：１０７０−１０７８）、米国特許第６，１５６，３０３号、同第７，１９８，９５１号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１５／０１５９１７３号及び同第ＵＳ２０１４／０３５９７９９号、ならびに国際特許公開第ＷＯ１９９８／０１１２４４号、同第ＷＯ２００５／０３３３２１号、及び同第ＷＯ２０１４／１４４２２号（それらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載される配列を有し得る。
【０５１３】
ＡＡＶベクターは、一本鎖ベクターだけでなく、自己相補的なＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶ）も含む。ｓｃＡＡＶベクターは、二本鎖ベクターゲノムを形成するために一緒にアニーリングするＤＮＡを含有する。第２の鎖合成をスキップすることによって、ｓｃＡＡＶは、細胞内での迅速な発現を可能にする。
【０５１４】
ｒＡＡＶベクターは、ｓｆ９昆虫細胞中、またはＨＥＫ２９３細胞などのヒト細胞の懸濁細胞培養中の三重トランスフェクションによるような当該技術分野で標準的な方法によって製造され得る。
【０５１５】
バイオサーキット、バイオサーキット成分、エフェクターモジュール、ＳＲＥ、またはペイロード構築物は、本明細書で教示されるＡＡＶカプシドにおいてパッケージングされるように１つ以上のウイルスゲノムにコードされ得る。
【０５１６】
このようなベクターはまた、少なくとも１つまたは２つのＩＴＲ（逆方向末端反復）に加えて、ベクターまたはウイルスゲノムからの発現に必要なある特定の調節エレメントも含み得る。このような調節エレメントは、当該技術分野で公知であり、例えば、プロモーター、イントロン、スペーサー、スタッファー配列などを含む。
【０５１７】
いくつかの実施形態において、１つを超えるエフェクターモジュールまたはＳＲＥ（例えば、ＤＤ）は、ウイルスゲノムにコードされ得る。
【０５１８】
４．腫瘍崩壊ウイルスベクター
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ワクチンウイルスなどの腫瘍崩壊ウイルスにパッケージングされ得る。腫瘍崩壊ワクチンウイルスは、腫瘍における細胞の腫瘍崩壊を誘導するのに十分なチミジンキナーゼ（ＴＫ）欠損性の顆粒球マクロファージ（ＧＭ）−コロニー刺激因子（ＣＳＦ）を発現し、複製可能なワクチンウイルスベクターのウイルス粒子を含み得る（例えば、米国特許第９，２２６，９７７号）。
【０５１９】
いくつかの実施形態において、本発明のウイルスベクターは、本明細書で教示される２種以上の免疫治療剤を含み得、２種以上の免疫治療剤は、同じＤＤの調節下で１つのエフェクターモジュールに含まれ得る。この場合、２種以上の免疫治療剤は、同じ刺激物質によって同時に同調される。他の実施形態において、本発明のウイルスベクターは、２つ以上のエフェクターモジュールを含み得、各エフェクターモジュールは、異なる免疫治療剤を含む。この場合、２つ以上のエフェクターモジュール及び免疫治療剤は、異なる刺激物質によって同調され、２つ以上の成分の別々に独立した調節を提供する。
【０５２０】
５．メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）
いくつかの実施形態において、本発明のエフェクターモジュールは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として設計され得る。本明細書で使用される場合、「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）という用語は、対象となるポリペプチドをコードし、かつインビトロ、インビボ、原位置、またはエクスビボで対象となるコードされたポリペプチドを生成するために翻訳することができる、任意のポリヌクレオチドを指す。このようなｍＲＮＡ分子は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３００６２号（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）において教示されるもののうちのいずれかの構造成分または特性を有し得る。
【０５２１】
本発明のポリヌクレオチドはまた、例えば、Ｒｉｂｏｓｔｅｍ  Ｌｉｍｉｔｅｄの２００３年７月９日に出願され、現在は放棄されている英国特許出願第０３１６０８９．２号、ＷＯ２００５００５６２２として公開されている２００４年７月９日に出願のＰＣＴ出願公開第ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００２９８１号、ＵＳ２００６０２４７１９５として公開され、現在は放棄されている２００６年６月８日に出願の米国特許出願国内段階登録第１０／５６３，８９７号、及びＥＰ１６４６７１４として公開され、現在撤回されている２００４年７月９日に出願の欧州特許出願国内段階登録第ＥＰ２００４７４３３２２号；Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，Ｉｎｃ．のＷＯ２００８１４０６１５として公開された２００７年１２月１９日に出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／８８０６０号、ＵＳ２０１０００２８９４３として公開された２００９年７月２日に出願の米国特許出願国内段階登録第１２／５２０，０７２号、及びＥＰ２１０４７３９として公開された２００９年７月７日に出願の欧州特許出願国内段階登録第ＥＰ２００７８７４３７６号、ロチェスター大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ）のＷＯ２００７０６４９５２として公開された２００６年１２月４日に出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／４６１２０号、及びＵＳ２００７０１４１０３０として公開された２００６年１２月１日に出願の米国特許出願第１１／６０６，９９５号；ＢｉｏＮＴｅｃｈ  ＡＧの２００７年１２月１４日に出願され、現在は放棄されている欧州特許出願第ＥＰ２００７０２４３１２号、ＷＯ２００９０７７１３４として公開された２００８年１２月１２日に出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０１０５９号、ＥＰ２２４０５７２として公開された２０１０年６月２日に出願の欧州特許出願国内段階登録第ＥＰ２００８８６１４２３号、ＵＳ２０１１００６５１０３として公開された２０１０年１１月２４日に出願の米国特許出願国内段階第１２／，７３５，０６０号、２００５年９月２８日に出願の独国特許出願第ＤＥ  １０  ２００５  ０４６  ４９０号、ＷＯ２００７０３６３６６として公開された２００６年９月２８日に出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０４４８号、２０１２年３月２１日に出願の国内段階欧州特許第ＥＰ１９３４３４５号、及び２０１００１２９８７７として公開された２００９年８月１４日に出願の国内段階米国特許出願第１１／９９２，６３８号；Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．のＵＳ２０１２００４６３４６として公開された２０１１年４月１５日に出願の米国特許出願第１３／０８８，００９号、及びＷＯ２０１１０１３０６２４として公開された２０１１年４月１５日に出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／３２６７９号；Ｓｈｉｒｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓのＵＳ２０１１０２４４０２６として公開された２０１０年１１月２０日に出願の米国特許出願第１２／９５７，３４０号；Ｓｅｑｕｉｔｕｒ  Ｉｎｃ．のＷＯ１９９９０１４３４６として公開された１９９８年９月１８日に出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９８／０１９４９２号；Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃ��  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＷＯ２０１００９８８６１として公開された２０１０年２月２４日に出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／００５６７号、及びＵＳ２０１２００５３３３３として公開された２０１１年１１月３日に出願の米国特許出願国内段階登録第１３／２０３，２２９号；ルートヴィヒマクシミリアン大学（Ｌｕｄｗｉｇ−Ｍａｘｉｍｉｌｌｉａｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）のＷＯ２０１１０１２３１６として公開された２０１０年７月３０日に出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／００４６８１号；Ｃｅｌｌｓｃｒｉｐｔ  Ｉｎｃ．の２００８年６月３０日に出願され、２０１１年１０月１８日に許可された米国特許第８，０３９，２１４号、ＵＳ２０１１０１４３４３６として公開された２０１０年１２月７日に出願の米国特許出願第１２／９６２，４９８号、ＵＳ２０１１０１４３３９７として公開された２０１０年１２月７日に出願の同第１２／９６２，４６８号、ＵＳ２０１２０００９６４９として公開された２０１１年９月２０日に出願の同第１３／２３７，４５１号、及びＷＯ２０１１０７１９３１として公開された２０１０年１２月７日に出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／５９３０５号、及びＷＯ２０１１０７１９３６として公開された２０１０年１２月７日に出願の同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／５９３１７号；ペンシルベニア大学理事会（Ｔｈｅ  Ｔｒｕｓｔｅｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）のＷＯ２００７０２４７０８として公開された２００６年８月２１日に出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／３２３７２号、及びＵＳ２００９０２８６８５２として公開された２００９年３月２７日に出願の米国特許出願国内段階第１１／９９０，６４６号；Ｃｕｒｅｖａｃ  ＧＭＢＨの２００１年６月５日に出願の独国特許出願第ＤＥ１０  ２００１  ０２７  ２８３．９号、２００１年１２月１９日に出願の同第ＤＥ１０  ２００１  ０６２  ４８０．８号、及び２００６年１０月３１日に出願の同第ＤＥ  ２０  ２００６  ０５１  ５１６号（これらすべて放棄されている）、２００５年３月３０日に許可された欧州特許第ＥＰ１３９２３４１号、及び２００８年１月２日に許可された同第ＥＰ１４５８４１０号、ＷＯ２００２０９８４４３として公開された２００２年６月５日に出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００２／０６１８０号、ＷＯ２００３０５１４０１として公開された２００２年１２月１９日に出願の同第ＰＣＴ／ＥＰ２００２／１４５７７号、ＷＯ２００８０５２７７０として公開された２００７年１２月３１日に出願の同第ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０９４６９号、２００８年４月１６日に出願の同第ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０３０３３号、ＷＯ２００６１２２８２８として公開された２００５年５月１９日に出願の同第ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００４７８４号、ＷＯ２００８０８３９４９として公開された２００７年１月９日に出願の同第ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０００８１号、ならびにＵＳ２００５００３２７３０として公開された２００３年１２月５日に出願の米国特許出願第１０／７２９，８３０号、ＵＳ２００５００５９６２４として公開された２００４年６月１８日に出願の同第１０／８７０，１１���号、ＵＳ２００８０２６７８７３として公開された２００８年７月７日に出願の同第１１／９１４，９４５号、ＵＳ２０１００４７２６１として公開され、現在は放棄されている２００９年１０月２７日に出願の同第１２／４４６，９１２号、ＵＳ２０１００１８９７２９として公開された２０１０年１月４日に出願の同第１２／５２２，２１４号、ＵＳ２０１１００７７２８７として公開された２０１０年５月２６日に出願の同第１２／７８７，５６６号、ＵＳ２０１００２３９６０８として公開された２０１０年５月２６日に出願の同第１２／７８７，７５５号、ＵＳ２０１１０２６９９５０として公開された２０１１年７月１８日に出願の同第１３／１８５，１１９号、及びＵＳ２０１１０３１１４７２として公開された２０１１年５月１２日に出願の同第１３／１０６，５４８号（当該出願のすべては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）において教示されるように設計され得る。
【０５２２】
いくつかの実施形態において、エフェクターモジュールは、自己増幅ＲＮＡとして設計され得る。「自己増幅ＲＮＡ」は、本明細書で使用される場合、ＲＮＡ及びＲＮＡによってコードされるタンパク質の量の増加をもたらす宿主において複製することができるＲＮＡ分子を指す。このような自己増幅ＲＮＡは、国際特許出願第ＷＯ２０１１００５７９９号（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）において教示されるもののうちのいずれかの構造成分または特性を有し得る。
【０５２３】
Ｖ．投薬、送達、及び投与
本発明の組成物は、１つ以上の経路及びモダリティを通して細胞または対象に送達され得る。１つ以上のエフェクターモジュール、ＳＲＥ、免疫治療剤、及び本明細書に記載の他の成分を含むウイルスベクターは、細胞及び／または対象にそれらを送達するために使用され得る。他のモダリティはまた、ｍＲＮＡ、プラスミド、及び組換えタンパク質として使用され得る。
【０５２４】
１．細胞への送達
本発明の別の態様において、本発明のバイオサーキット、エフェクターモジュール、ＳＲＥ（例えば、ＤＤ）、対象となるペイロード（免疫治療剤）、及び組成物をコードするポリヌクレオチド、ならびに当該ポリヌクレオチドを含むベクターは、免疫エフェクター細胞などの細胞に導入され得る。
【０５２５】
本発明の一態様において、本発明のバイオサーキット、エフェクターモジュール、ＳＲＥ（例えば、ＤＤ）、対象となるペイロード（免疫治療剤）、及び組成物をコードするポリヌクレオチドは、ウイルスベクターにパッケージングされるか、またはウイルスゲノムに組み込まれて、ポリヌクレオチドの一時的または安定した発現を可能にし得る。好ましいウイルスベクターは、レンチウイルスベクターを含むレトロウイルスベクターである。レトロウイルスベクター、バイオサーキット、エフェクターモジュール、ＤＤ、または対象となるペイロード（すなわち、免疫治療剤）をコードするポリヌクレオチド分子は、ある特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入されて、複製欠損のウイルスを生成する。次いで、組換えウイルスベクターは、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子を含むが、ＬＴＲ及びパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株に導入される。組換えレトロウイルス粒子は、培養培地に分泌され、次いで、回収され、任意に濃縮され、遺伝子導入のために使用される。レンチウイルスベクターは、分裂細胞及び非分裂細胞の両方を感染させることができる場合に、特に好ましい。
【０５２６】
ベクターはまた、針、エレクトロポレーション、ソノポレーション、水分補給などの物理的方法；無機粒子（例えば、リン酸カルシウム、シリカ、金）などの化学的担体、及び／または化学的方法による非ウイルス法によって細胞に移入され得る。いくつかの実施形態において、カチオン性脂質、脂質ナノ乳剤、ナノ粒子、ペプチドベースのベクター、またはポリマーベースのベクターなどの合成または天然生分解性剤が、送達のために使用され得る。
【０５２７】
いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、細胞に直接送達され得る。一実施形態において、本発明のポリペプチドは、細胞透過ドメイン（ＣＬＤ）に融合したエンドソーム漏出ドメイン（ＥＬＤ）を含む合成ペプチドを使用して送達され得る。本発明のポリペプチドは、ＥＬＤ−ＣＬＤ−合成ペプチドを有する細胞に同時導入される。ＥＬＤは、サイトゾルへの、エンドソーム中に捕らえられているタンパク質の脱出を促す。このようなドメインは、微生物及びウイルス起源の誘導タンパク質であり、当該技術分野で説明されている。ＣＰＤは、原形質膜を横切るタンパク質の輸送を可能にし、これも、当該技術分野で説明されている。ＥＬＤ−ＣＬＤ融合タンパク質は、いずれかのドメインのみによる共形質導入と比較したときに、形質導入効率を相乗的に増加する。いくつかの実施形態において、ヒスチジンリッチなドメインは、任意に、エンドソームからサイトゾルへのカーゴの脱出を可能にするさらなる方法としてシャトル構築物に加えられ得る。シャトルはまた、融合ペプチドの多量体を生成するために、ＮまたはＣ末端にシステイン残基も含み得る。ペプチドの末端にシステイン残基を加えることによって生成したＥＬＤ−ＣＬＤ融合ペプチドの多量体は、単一の融合ペプチド構築物と比較したときに、より大きな形質導入効率を示す。本発明のポリペプチドはまた、カーゴを適切な細胞内位置、例えば、核を配向するために、適切な局在化シグナルに付加され得る。いくつかの実施形態において、国際特許公開第ＷＯ２０１６１６１５１６号及び同第ＷＯ２０１７１７５０７２号において教示される、ＥＬＤ、ＣＬＤ、または融合ＥＬＤ−ＣＬＤ合成ペプチドのうちのいずれかは、本発明において有用であり得る（当該出願の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。
【０５２８】
２．投薬
本発明は、免疫療法のための任意の１つ以上の組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。これらは、がん、炎症疾患、及び他の免疫不全疾患などの臨床症状を予防または治療するために有効な投与の任意の量及び任意の経路を使用して、対象に投与され得る。
【０５２９】
本発明に従って組成物は、典型的には、投与の容易さ及び投薬の均一性のために、投薬単位形態で製剤化され得る。しかしながら、本発明の組成物の１日合計の用法は、健全な医療判断の範囲内で医師によって決定され得ることが理解されよう。任意の特定の対象に対する特定の治療上有効なまたは予防上有効な用量レベルは、治療される障害及び障害の重症度；使用される特定の化合物の活性；使用される特定の組成物；患者の年齢、体重、一般健康、性別、及び食事；使用される特定の化合物の投与時間、投与経路、事前または同時治療的介入、及び排泄速度；治療の持続時間；使用される特定の化合物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物；ならびに医学分野で公知の同様の因子を含む様々な因子に応じて異なるであろう。
【０５３０】
本発明の組成物は、Ｔ細胞のアネルギーを回避し、サイトカイン放出症候群を予防し、免疫療法と関連する毒性を最小限に抑えるために用量を変化させる際に使用され得る。例えば、本発明の組成物の低用量は、高い腫瘍負荷を有する患者を初めに治療するために使用され得るが、一方、低い腫瘍負荷を有する患者は、高く、反復した用量の本発明の組成物で治療して、最小限の腫瘍抗原負荷の認識を確実にし得る。別の例では、本発明の組成物は、緊張性Ｔ細胞シグナル伝達を軽減し、持続性をインビボで増強するために脈動性様式で送達され得る。いくつかの態様において、毒性は、高用量を投与する前に、低用量の本発明の組成物を初めに使用することによって最小限に抑え得る。投薬は、フェリチン、血清Ｃ反応性タンパク質、ＩＬ６、ＩＦＮγ、及びＴＮＦ−αなどの血清マーカーが上昇する場合、修飾され得る。
【０５３１】
一実施形態において、本明細書に記載の組成物を発現するポリペプチド及び／またはポリヌクレオチド、例えば、エフェクターモジュールは、がんの治療を必要とする対象に投与される。一実施形態において、本明細書に記載のバイオサーキット、エフェクターモジュール及び／またはＳＲＥを含む細胞の集団は、がんの治療を必要とする対象に投与される。
【０５３２】
一実施形態において、本明細書に記載の組成物を発現する細胞は、本明細書に記載の用量及び／または投与スケジュールで投与される。
【０５３３】
一実施形態において、組成物は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）に導入される。組成物は、ウイルス形質転換、トランスフェクション、及び／またはインビトロ転写を含むが、これらに限定されない、方法によって免疫細胞に導入され得る。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、レトロウイルスで形質導入される。一態様において、レトロウイルスは、レンチウイルスであってもよい。いくつかの態様において、レトロウイルスの力価は、ペイロードの発現を同調するために使用され得る。いくつかの実施形態において、レトロウイルスの力価は、０．００１〜０．０１、０．０１〜０．１、０．１〜１、または１〜１０の範囲の感染多重度（ＭＯＩ）を有し得る。いくつかの実施形態において、ＭＯＩは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり得る。
【０５３４】
いくつかの実施形態において、対象（例えば、ヒト）は、本明細書に記載の組成物、例えば、ＳＲＥを含む免疫細胞の初回投与、及び細胞の１回以上のその後の投与を受ける。いくつかの実施形態において、治療上有効量の、本明細書に記載の組成物及び／または細胞は、対象に投与され得る。いくつかの実施形態において、治療上有効量は、腫瘍阻害、腫瘍有病率、及び／または腫瘍負荷に必要とされる正確な量を示し得る。治療上有効量は、対象の年齢、体重、腫瘍の大きさ、性別、感染または転移の程度を考慮して決定され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物を発現する細胞は、１０４〜１０９細胞／ｋｇ（対象の体重）の用量で投与され得る。細胞は、免疫療法において一般的に知られている注入技術を使用することによって投与され得る（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８を参照されたく、当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０５３５】
いくつかの態様において、対象は、白血球除去輸血を行ってよく、白血球を回収して、エクスビボで濃縮するか、または枯渇させて、対象となる細胞、例えば、Ｔ細胞を選択及び／または単離する。これらのＴ細胞の単離物は、当該技術分野で周知の方法によって増殖させ、本発明の組成物が細胞に導入され得るように処理してもよい。それらを必要とする対象は、高用量の化学療法による標準的な処理を行った後、末梢血幹細胞の移植を行ってよい。ある特定の態様において、移植の後または移植と同時に、対象は、本発明の免疫細胞の注入を受ける。さらなる態様において、増殖させた細胞は、外科手術の前または後で投与される。
【０５３６】
上記の処置の患者に投与する用量は、処置される症状及び処置のレシピエントの正確な性質により変化するであろう。ヒト投与用の用量の調整は、当該技術分野で受容される方法に従って行ってよい。
【０５３７】
一実施形態において、組成物は、例えば、インビトロ転写を使用して、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）に導入され、対象（例えば、ヒト）は、本発明の免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の初回投与、及び本発明の免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の１回以上のその後の投与を受け、１回以上のその後の投与は、１５日未満、例えば、前回の投与から１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日、または２日後に投与される。一実施形態において、本発明の免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の１回を超える投与は、１週間毎に対象（例えば、ヒト）に投与され、例えば、本発明の免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の２回、３回、または４回の投与が、１週間毎に投与される。一実施形態において、対象（例えば、ヒト対象）は、１週間毎に免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の１回を超える投与（例えば、１週間毎に２回、３回、または４回の投与）（本明細書において、サイクルとも称される）を受け、続いて、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の投与を１週間行わず、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の１回以上のさらなる投与（例えば、１週間毎に免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の１回を超える投与）が、対象に投与される。別の実施形態において、対象（例えば、ヒト対象）は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の１回を超えるサイクルを受け、各サイクル間の時間は、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、または３日未満である。一実施形態において、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、１週間毎の３回の投与については隔日で投与される。一実施形態において、本発明の免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、またはそれ以上投与される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の本発明の組成物を発現する免疫細胞の用量は、約１×１０６、１．１×１０６、２×１０６、３．６×１０６、５×１０６、１×１０７、１．８×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、または５×１０８個の細胞／ｋｇを含む。いくつかの実施形態において、免疫細胞の用量は、少なくとも約１×１０６、１．１×１０６、２×１０６、３．６×１０６、５×１０６、１×１０７、１．８×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、または５×１０８個の細胞／ｋｇを含む。いくつかの実施形態において、免疫細胞の用量は、最大約１×１０６、１．１×１０６、２×１０６、３．６×１０６、５×１０６、１×１０７、１．８×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、または５×１０８個の細胞／ｋｇを含む。いくつかの実施形態において、免疫細胞の用量は、約１．１×１０６〜１．８×１０７個の細胞／ｋｇを含む。いくつかの実施形態において、免疫細胞の用量は、約１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９、または５×１０９個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、免疫細胞の用量は、少なくとも約１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０��、３×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９、または５×１０９個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、免疫細胞の用量は、最大約１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９、または５×１０９個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、免疫細胞の用量は、最大約１×１０７、１．５×１０７、２×１０７、２．５×１０７、３×１０７、３．５×１０７、４×１０７、５×１０７、１×１０８、１．５×１０８、２×１０８、２．５×１０８、３×１０８、３．５×１０８、４×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９、または５×１０９個の細胞を含む。いくつかの実施形態において、免疫細胞の用量は、最大約１〜３×１０７〜１〜３×１０８個の細胞を含む。
【０５３８】
一実施形態において、本明細書に記載の組成物を発現する細胞は、疾患、例えば、がん、例えば、本明細書に記載のがんの第一選択の治療として投与される。別の実施形態において、本明細書に記載の組成物を発現する細胞は、疾患、例えば、がん、例えば、本明細書に記載のがんの第二選択、第三選択、第四選択の治療として投与される。いくつかの実施形態において、対象は、細胞の投与前に、条件付けを行い得る。
【０５３９】
本発明に従ってリガンドをそれを必要とする対象に投与する方法も、本明細書に提供される。リガンドは、本発明のバイオサーキットを同調するために有効な投与の任意の量及び任意の経路を使用して、対象または細胞に投与され得る。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、及び全身状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与方法、その活性方法などに応じて、対象ごとに変化するであろう。対象は、ヒト、哺乳動物、または動物であり得る。本発明に従って組成物は、典型的には、投与の容易さ及び投薬の均一性のために、単位剤形で製剤化され得る。しかしながら、本発明の組成物の１日合計の用法は、健全な医療判断の範囲内で医師によって決定され得ることが理解されよう。ある特定の実施形態において、本発明に従ってリガンドは、１日毎に、１日１回以上、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約０．００５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇ（対象の体重）を送達するのに十分な投与量レベルで投与し、所望の効果を得ることができる。いくつかの実施形態において、投与量レベルは、１日毎に、１日１回以上、１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１１０ｍｇ／ｋｇ、１２０ｍｇ／ｋｇ、１３０ｍｇ／ｋｇ、１４０ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、１６０ｍｇ／ｋｇ、１７０ｍｇ／ｋｇ、１８０ｍｇ／ｋｇ、１９０ｍｇ／ｋｇまたはｍｇ／ｋｇ（対象の体重）であり、所望の効果を得ることができる。
【０５４０】
本開示は、細胞または組織を当該リガンドと接触させることを含む、本明細書に記載のリガンドのうちのいずれかを細胞または組織に送達するための方法を提供し、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで達成され得る。ある特定の実施形態において、本発明に従ってリガンドは、約１ｎＭ〜約１０ｎＭ、約５ｎＭ〜約５０ｎＭ、約１０ｎＭ〜約１００ｎＭ、約５０ｎＭ〜約５００ｎＭ、約１００ｎＭ〜約１０００ｎＭ、約１μＭ〜約１０μＭ、約５μＭ〜約５０μＭ、約１０μＭ〜約１００μＭ、約２５μＭ〜約２５０μＭ、約５０μＭ〜約５００μＭ送達するのに十分な投与量レベルで投与され得る。いくつかの実施形態において、リガンドは、０．００６４μＭ、０．００３２μＭ、０．０１６μＭ、０．０８μＭ、０．４μＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭ、２５μＭ、５０μＭ、７５μＭ、１００μＭ、１５０μＭ、２００μＭ、２５０μＭから選択されるが、これらに限定されない、用量で細胞に投与され得る。
【０５４１】
本発明のリガンドの所望の投与量は、１回のみ、１日３回、１日２回、１日１回、隔日、３日毎に、毎週、２週間毎に、３週間毎に、または４週間毎に送達され得る。ある特定の実施形態において、所望の投与量は、複数回投与（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回またはそれ以上の投与）を使用して送達され得る。複数回投与が使用されるとき、本明細書に記載のものなどの分割投薬レジメンが、使用され得る。本明細書で使用される場合、「分割用量」は、「単一単位用量」または総１日用量を２回以上の用量、例えば、「単一単位用量」の２回以上の投与の分裂である。本明細書で使用される場合、「単一単位用量」は、１回用量／一度に／単一経路／単一接触点、すなわち単一投与事象で投与される任意の治療薬の用量である。本発明のリガンドの所望の投薬量は、「パルス用量」または「連続流」として投与され得る。本明細書で使用される場合、「パルス用量」は、一定期間にわたって一定の頻度で投与される任意の治療薬の一連の単一単位用量である。本明細書で使用される場合、「連続流」は、単一経路／単一接触点で一定期間連続的に投与される治療薬の用量、すなわち連続投与事象である。総１日用量、２４時間で与えられるかまたは処方される量は、これらの方法のうちのいずれかによって、またはこれらの方法の組み合わせとして、または薬学的投与に適した任意の他の方法によって投与され得る。
【０５４２】
３．投与
いくつかの実施形態において、免疫療法のための組成物は、細胞をエクスビボで投与され、続いて、対象に投与され得る。免疫細胞は、当該技術分野で周知の様々な方法を使用して、単離され、エクスビボで増殖され得る。例えば、細胞毒性Ｔ細胞を単離する方法は、米国特許第６，８０５，８６１号及び同第６，５３１，４５１号（当該出願の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）において説明されている。ＮＫ細胞の単離は、米国特許第７，４３５，５９６号（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）において説明されている。
【０５４３】
いくつかの実施形態において、細胞の性質に応じて、細胞は、注入、輸血、注入、局所点滴、または移植を含む多種多様の方法において、宿主生物、例えば、哺乳動物に導入され得る。いくつかの態様において、本発明の細胞は、腫瘍の部位で導入され得る。使用される細胞の数は、多くの状況、導入の目的、細胞の生存期間、使用されるプロトコール、例えば、投与の数、細胞の増殖能などに応じて異なるであろう。細胞は、生理学的に許容される媒体であり得る。
【０５４４】
いくつかの実施形態において、本発明の細胞は、複数の用量で疾患または状態を有する対象に投与され得る。投与は、概して、がんもしくは臨床状態の１つ以上の症状の改善に影響を及ぼす、及び／またはがんもしくは臨床状態もしくはその症状を治療もしくは予防する。
【０５４５】
いくつかの実施形態において、免疫療法のための組成物は、インビボで投与され得る。いくつかの実施形態において、本発明のバイオサーキット、エフェクターモジュール、ＳＲＥ、対象となるペイロード（免疫治療剤）、及び組成物を含む本発明のポリペプチドは、対象にインビボで送達され得る。免疫治療剤のインビボでの送達は、当該技術分野で十分に説明されている。例えば、サイトカインの送達の方法は、欧州特許第ＥＰ０９３０８９２Ａ１号（当該出願の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）において説明されている。
【０５４６】
送達の経路
本発明の、薬学的組成物、バイオサーキット、バイオサーキット成分、エフェクターモジュール（それらのＳＲＥ（例えば、ＤＤ）、ペイロード（すなわち、免疫治療剤）を含む）、ベクター、及び細胞は、治療上有効な結果を達成するために任意の経路によって投与され得る。
【０５４７】
これらには、腸内（小腸に）、胃腸内、硬膜外（硬膜に）、経口（口腔によって）、経皮、硬膜上、脳内（大脳に）、脳室内（脳室に）、皮膚上（皮膚に塗布）、皮内（皮膚自体に）、皮下（皮膚下に）、経鼻投与（鼻を通じて）、静脈内（静脈に）、静脈内ボーラス、静脈内点滴、動脈内（動脈に）、筋肉内（筋肉に）、心臓内（心臓に）、骨内注入（骨髄に）、髄腔内（脊柱管に）、腹腔内（腹膜への注入または注射）、膀胱内注入、硝子体中（眼を通じて）、空洞内注射（病的空洞に）、腔内（陰茎の基部（ｂａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｅｎｉｓ）に）、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（全身分布のための無傷の皮膚を通じて拡散）、経粘膜（粘膜を通じて拡散）、経膣、吹送（経鼻吸引（ｓｎｏｒｔｉｎｇ））、舌下、唇下、浣腸、点眼（結膜上に）、点耳、耳（耳道内、またはそれによって）、頬側（頬側に対して）、結膜、皮膚、歯科的（歯（複数可）に）、電気浸透、頸管内、静脈洞内、気管内、体外、血液透析、浸潤、間質性、腹腔内、羊膜内、関節内、胆管内、気管支内、滑液包内、軟骨内（軟骨の内部に）、馬尾内（馬尾の内部に）、槽内（小脳延髄大槽（ｃｉｓｔｅｒｎａ  ｍａｇｎａ  ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｍｅｄｕｌａｒｉｓ）の内部に）、角膜内（角膜の内部に）、歯冠内（ｄｅｎｔａｌ  ｉｎｔｒａｃｏｒｎａｌ）、冠内（冠動脈の内部に）、陰核海綿体内（陰茎の海綿体の膨張性空間の内部に）、椎間板内（椎間板の内部に）、管内（腺管の内部に）、十二指腸内（十二指腸の内部に）、硬膜内（硬膜の内部に、またはその下に）、表皮内（表皮に対して）、食道内（食道に対して）、胃内（胃の内部に）、歯肉内（歯肉の内部に）、回腸内（小腸遠位部の内部に）、病変内（局所病変の内部に、またはそれに直接導入される）、管腔内（管腔の内部に）、リンパ内（リンパの内部に）、髄内（骨髄腔の内部に）、髄膜内（髄膜の内部に）、心膜内（心膜の内部に）、眼内（眼の内部に）、卵巣内（卵巣の内部に）、心膜内（心膜の内部に）、胸膜内（胸膜の内部に）、前立腺内（前立腺の内部に）、肺内（肺またはその気管支の内部に）、洞内（鼻洞または眼窩周囲洞の内部に）、髄腔内（脊柱の内部に）、滑液包内（関節の滑膜腔の内部に）、腱内（腱の内部に）、精巣内（精巣の内部に）、くも膜下腔内（任意の脳脊髄軸レベルの脳脊髄液の内部に）、胸腔内（胸部の内部に）、管内（臓器細管の内部に）、腫瘍内（腫瘍の内部に）、鼓室内（中耳（ａｕｒｕｓ  ｍｅｄｉａ）の内部に）、血管内（血管（複数可）の内部に）、脳室内（脳室の内部に）、イオントフォレーシス（電流を用いて、ここでは可溶性塩のイオンが体の組織中に移動する）、潅注（開放創または体腔を浴洗し、またはフラッシュするため）、喉頭（喉頭上に直接）、経鼻胃（鼻から胃の中に）、密封包帯療法（局所経路投与、次いで包帯で被覆して範囲を閉塞する）、眼（外眼部に対して）、口腔咽頭（口及び咽頭に直接）、非経口、経皮、関節周囲、硬膜外、神経周囲、歯周、直腸、呼吸器（局所作用または全身作用のため経口的または経鼻的に吸入することによって気道の内部に）、球後（橋の後方または眼球の後方）、心筋内（心筋層の内部に）、軟部組織、クモ膜下、結膜下、粘膜下、局所、経胎盤（胎盤を���じて、またはそれにわたって）、経皮気管内（気管壁を通じて）、経鼓室（鼓室にわたって、またはそれを通じて）、尿管（尿管に対して）、尿道（尿道に対して）、腟内、仙骨ブロック、診断、神経ブロック、胆管潅流、心潅流、フォトフェレーシス、または脊髄が含まれるが、これらに限定されない。
【０５４８】
キット
それはまた、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたは発現のうちのいずれかを含むキットも提供する。
【０５４９】
本発明は、本発明の方法を都合よく及び／または効果的に実行する様々なキットを含む。典型的には、キットは、対象（複数可）の１つもしくは複数の治療を実施する、及び／または１つもしくは複数の実験を実施することを可能にするのに十分な量及び／または数の成分を含むであろう。
【０５５０】
一実施形態において、本発明は、本発明のバイオサーキットまたは本発明のバイオサーキットの組み合わせを含む、任意に、任意の他の好適な活性剤と組み合わせて含む、インビトロまたはインビボで遺伝子を阻害するためのキットを提供する。
【０５５１】
キットは、パッケージング及び使用説明書及び／または製剤組成物を形成するための送達剤をさらに含み得る。送達剤は、例えば、生理食塩水、緩衝液を含み得る。
【０５５２】
さらなる実施形態において、アッセイスクリーニングキットが提供される。キットは、スクリーニングアッセイのための容器を含む。アッセイの使用のための使用説明書及びスクリーニング法についての情報は、キットに含まれる。
【０５５３】
いくつかの実施形態において、本発明のＤＤ、エフェクターモジュール、及びバイオサーキットシステム、及び組成物は、このような細胞及び対象におけるバイオサーキットシステムにおけるタンパク質の活性を調査するための研究ツールとして使用され得る。他の実施形態において、本発明のＤＤ、エフェクターモジュール、及びバイオサーキットシステム、及び組成物は、がん及び遺伝性障害などの疾患を治療するために使用され得る。
【０５５４】
ＶＩ．適用
本発明の一態様において、腫瘍体積または負荷を軽減するための方法は、提供される。本方法は、薬物学的に有効な量の、少なくとも１つのバイオサーキット、エフェクターモジュール、ＤＤ、及び／または対象となるペイロード（すなわち、免疫治療剤）、少なくとも１つのベクター、または細胞を含む薬学的組成物を、腫瘍を有する対象に投与することを含む。本明細書に記載の任意の免疫治療剤を有するバイオサーキットシステム及びエフェクターモジュールは、ポリペプチド、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを含むウイルスベクター、またはバイオサーキット、エフェクターモジュール、ＤＤ、及び対象となるペイロード（すなわち、免疫治療剤）を発現するように修飾される細胞の形態であり得る。
【０５５５】
本発明の別の態様において、対象における抗腫瘍免疫応答を誘導するための方法は、提供される。本方法は、薬物学的に有効な量の、少なくとも１つのバイオサーキット、エフェクターモジュール、ＤＤ、及び／または対象となるペイロード（すなわち、免疫治療剤）、少なくとも１つのベクター、または細胞を含む薬学的組成物を、腫瘍を有する対象に投与することを含む。本明細書に記載の任意の免疫治療剤を有するバイオサーキット及びエフェクターモジュールは、ポリペプチド、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを含むウイルスベクター、またはバイオサーキット、エフェクターモジュール、ＤＤ、及び対象となるペイロード（すなわち、免疫治療剤）を発現するように修飾される細胞の形態であり得る。
【０５５６】
本発明によって、方法は、本発明の免疫エフェクター細胞、本発明のバイオサーキットシステム、エフェクターモジュール、ＤＤ、対象となるペイロード（すなわち、免疫治療剤）、または腫瘍免疫抑制性微環境もしくはそれらの組み合わせを操作する組成物を含むがんワクチンなどの遺伝子操作されている細胞を使用した養子細胞移入（ＡＣＴ）であり得る。これらの治療は、化学療法及び放射線療法などの他のがん治療と共にさらに使用され得る。
【０５５７】
１．養子細胞移入（養子免疫療法）
がん免疫学の分野において最近の進歩は、免疫システムががんを寄せ付けないことに役立つようにいくつかのアプローチの開発を可能にする。このような免疫療法アプローチは、（例えば、キメラ抗原受容体または操作されたＴ細胞受容体を含む）モノクローナル抗体を通してまたはエクスビボで操作されたＴ細胞を通してがん抗原の標的化を含む。本発明はまた、本発明の組成物を使用して対象における免疫応答を誘導するための方法も提供する。本発明の組成物を使用して対象における腫瘍負荷を軽減するための方法も提供する。本発明はまた、本発明の１つ以上のポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはベクターを含むように操作された免疫細胞も提供する。細胞は、Ｔ細胞、例えば、細胞毒性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫ  Ｔ細胞、サイトカイン誘導性キラー（ＣＩＫ）細胞、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、及び腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、免疫エフェクター細胞であり得る。操作された細胞は、疾患（例えば、がん）を治療するために養子細胞移入のために使用され得る。
【０５５８】
いくつかの実施形態において、本発明の、薬学的組成物、バイオサーキット、バイオサーキット成分、エフェクターモジュール（それらのＳＲＥまたはペイロードを含む）は、１つ以上のがんを標的にするための免疫システムの変調または変更または開発において使用され得る。このアプローチはまた、他のこのような生物学的アプローチ、例えば、免疫応答を修飾する療法、例えば、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、他のモノクローナル抗体、ワクチン、遺伝子療法の投与を伴うとみなされ得、非特異的免疫調節剤はまた、本発明の、薬学的組成物、バイオサーキット、バイオサーキット成分、エフェクターモジュール（それらのＳＲＥまたはペイロードを含む）と組み合わせられる抗がん療法と想定される。
【０５５９】
がん免疫療法は、がんと闘う患者自身の免疫システムを誘導するように設計されている、多様なセットの治療的戦略を指す。いくつかの実施形態において、本発明の、薬学的組成物、バイオサーキット、バイオサーキット成分、エフェクターモジュール（それらのＳＲＥまたはペイロードを含む）は、免疫腫瘍学治療剤として設計される。
【０５６０】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのバイオサーキットシステム、エフェクターモジュール、ＤＤ、及び／または対象となるペイロード（免疫治療剤）を発現するように遺伝子操作されている細胞は、養子細胞療法（ＡＣＴ）のために使用され得る。本明細書で使用される場合、養子細胞移入は、直接的な抗がん活性を有する（自家、同種、または遺伝子操作されている宿主からの）免疫細胞の投与を指す。ＡＣＴは、悪性及び感染性疾患に対する臨床的応用に有望である。例えば、ＣＤ１９を認識するように遺伝子操作されているＴ細胞は、濾胞性Ｂ細胞リンパ腫を治療するために使用されており（Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２０１０，１１６：４０９９−４１０２；及びＫｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，２０１３，１０（５）：２６７−２７６）、抗腫瘍Ｔ細胞受容体を発現するように遺伝子操作されている自家リンパ球を使用するＡＣＴは、転移性黒色腫を治療するために使用されている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｄｕｄｌｅｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９，２１：２３３−２４０）。
【０５６１】
養子細胞療法のための免疫細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、メモリＴ細胞、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、サイトカイン誘導性キラー（ＣＩＫ）細胞、樹状細胞、ヒト胚幹細胞、間葉幹細胞、造血幹細胞、またはこれらの混合物から選択され得るが、選択されたものに限定されない。
【０５６２】
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）療法、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を持つ遺伝子操作されているＴ細胞、及び組換えＴＣＲ技術を含む、いくつかのタイプの細胞免疫療法がある。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、対象におけるＴＩＬ（腫瘍浸潤リンパ球）集団を変化させるように使用され得る。一実施形態において、本明細書に記載のペイロードのうちのいずれかは、ＣＤ４陽性細胞対ＣＤ８陽性細胞の比を変化させるように使用され得る。いくつかの実施形態において、ＴＩＬは、エクスビボで分類され、本明細書に記載のサイトカインのうちのいずれかを発現するように操作され得る。本発明のペイロードは、ＴＩＬのＣＤ４及び／またはＣＤ８集団を拡張して、ＴＩＬ媒介性免疫応答を増強させるために使用され得る。
【０５６３】
一実施形態において、本発明のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、条件付きで活性なＣＡＲであってもよい。本明細書に記載されるもののような、野生型タンパク質またはそのドメインは、野生型の正常な生理学的条件で、ならびにこのような条件付きで活性な生物学的タンパク質及びドメインに可逆的または不可逆的に不活性化される、条件付きで活性な生物学的タンパク質を作製するために使用され得、このような条件付きで活性な生物学的タンパク質及びドメインの使用が提供される。このような方法及び条件付きで活性なタンパク質は、例えば、国際特許出願第ＷＯ２０１６０３３３３１号（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）において教示される。非限定的な例として、ＣＡＲは、野生型タンパク質またはそのドメインから発生する少なくとも１つの抗原特異的な標的化領域、ならびに野生型タンパク質またはそのドメインの抗原特異的な標的化領域と比較して正常な生理学的条件でアッセイにおける活性の減少、及び野生型タンパク質またはそのドメインの抗原特異的な標的化領域と比較して異常な条件下でアッセイにおける活性の増加のうちの１つ以上を含む。
【０５６４】
本発明によれば、バイオサーキット及びシステムは、養子細胞療法などの細胞療法の開発及び実施において使用され得る。細胞療法において有用なある特定のエフェクターモジュールを、図７〜１２に示す。バイオサーキット、それらの成分、エフェクターモジュール、ならびにそれらのＳＲＥ及びペイロードは、ＴＣＲ除去−ＴＣＲ遺伝子破壊、ＴＣＲ操作に影響を及ぼすために、エピトープタグ受容体を調節するために、Ｔ細胞を刺激するためのＡＰＣプラットフォームにおいて、エクスビボでのＡＰＣ刺激を増強させるためのツールとして、Ｔ細胞の増殖の方法を改善させるために、抗原によるエクスビボでの刺激において、ＴＣＲ／ＣＡＲの組み合わせにおいて、ＴＩＬの操作または調節において、同種異系細胞療法において、Ｔ細胞療法を他の治療株（例えば、放射線、サイトカイン）と組み合わせて、操作されたＴＣＲもしくは修飾されたＴＣＲをコードするために、または（例えば、サイトカイン遺伝子、チェックポイント阻害剤ＰＤ１、ＣＴＬＡ４のための遺伝子を導入することによって）Ｔ細胞を増強させるために、細胞療法において使用され得る。
【０５６５】
いくつかの実施形態において、改善された応答速度は、細胞療法を支持して得られる。
【０５６６】
細胞集団の増殖及び持続性は、ペイロードの調節または微調整、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または他の免疫関連細胞において受容体または経路成分を通して達成され得る。いくつかの実施形態において、バイオサーキット、それらの成分、ＳＲＥ、エフェクターモジュールは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞応答を増強させるタンパク質の発現を空間的及び／または時間的に制御するように設計されている。いくつかの実施形態において、バイオサーキット、それらの成分、ＳＲＥ、エフェクターモジュールは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞応答を阻害するタンパク質の発現を空間的及び／または時間的に制御するように設計されている。
【０５６７】
養子細胞療法で用いるための方法が、本明細書に提供される。本方法は、それを必要とする対象を条件付けすること、本発明のＳＲＥ、バイオサーキット、及び組成物を用いて免疫細胞を調節すること、対象に、本発明の組成物を発現する操作された免疫細胞を投与すること、ならびに対象内の操作された細胞の成功した生着を含む。
【０５６８】
いくつかの実施形態において、本発明のＳＲＥ、バイオサーキット、及び組成物は、養子細胞療法と関連する条件付けレジメンを最小限に抑えるために使用され得る。本明細書で使用される場合、「条件付け」は、養子細胞療法の結果を改善するために、対象に投与された任意の治療レジメンを指す。条件付け戦略には、全身照射法及び／またはリンパ除去化学療法が含まれるが、これらに限定されない。条件付けすることなく、養子療法臨床試験は、いかなる臨床的利点も示すこともできず、ＡＣＴにおけるその重要性を示す。さらに、条件付けは、著しい毒性と関連し、ＡＣＴに好適な対象コホートを制限する。場合によっては、ＡＣＴのための免疫細胞は、条件付けのための必要性を軽減するために本発明のＳＲＥを使用するペイロードとしてＩＬ１２及びＩＬ１５などのサイトカインを発現するように操作され得る（Ｐｅｎｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｂｌｏｏｄ  １１９（１８）：４１３３−４１；当該出願の内容は、参照によりその全体が組み込まれる）。
【０５６９】
いくつかの実施形態において、神経毒性は、ＣＡＲまたはＴＩＬ療法と関連し得る。このような神経毒性は、関連したＣＤ１９−ＣＡＲであり得る。毒性は、脳への過剰なＴ細胞の浸透によるものであり得る。いくつかの実施形態において、神経毒性は、血液脳関門を通してＴ細胞の継代を防ぐことによって軽減され得る。神経毒性は、タイサブリ／ナタリズマブなどの内因性アルファ−４インテグリン阻害剤の標的化遺伝子欠失によって達成され得、これは、本発明において有用であり得る。
【０５７０】
いくつかの実施形態において、エフェクターモジュールは、１つ以上のサイトカインをコードし得る。いくつかの実施形態において、サイトカインは、ＩＬ１５である。ＩＬ１５をコードするエフェクターモジュールは、細胞毒性集団における増殖を誘導し、Ｔ  ｒｅｇの刺激を避けるように設計され得る。他の場合では、細胞毒性集団における増殖を誘導するエフェクターモジュールはまた、ＮＫ及びＮＫＴ細胞を刺激し得る。
【０５７１】
いくつかの実施形態において、エフェクターモジュールは、本発明のバイオサーキットにおける細胞の増殖のために１つ以上のサイトカインをコードし得るか、またはそれらを生成するように同調されもしくは誘導され得る。このような場合では、細胞は、実際の増殖について試験され得る。増殖は、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上であり得る。
【０５７２】
いくつかの実施形態において、腫瘍微環境は、ＩＬ１７をコードするエフェクターモジュールを含むバイオサーキットを使用して再構築され得る。
【０５７３】
いくつかの実施形態において、バイオサーキット、それらの成分、ＳＲＥ、エフェクターモジュールは、自己免疫障害を減衰するためにＴｒｅｇを調節するように設計されている。このような場合では、ＩＬ２は、単一同調したモジュール、または本明細書に記載のマルチ同調した特性を有するものを使用して調節され得る。
【０５７４】
いくつかの実施形態において、ＡＣＴのための免疫細胞は、樹状細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞などのＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫ  Ｔ細胞、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、メモリＴ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ヘルパーＴ細胞、サイトカイン誘導性キラー（ＣＩＫ）細胞、及びこれらの任意の組み合わせであり得る。他の実施形態において、ＡＣＴのための免疫刺激細胞は、胚幹細胞（ＥＳＣ）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から生成され得る。いくつかの実施形態において、自家または同種異系免疫細胞は、ＡＣＴのために使用される。
【０５７５】
いくつかの実施形態において、ＡＣＴのために使用された細胞は、対象となる腫瘍細胞における抗原に特異的な抗原−結合ドメインを含む、新たな特異性またはＣＡＲを有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように操作されているＴ細胞であり得る。他の実施形態において、ＡＣＴのために使用された細胞は、対象となる腫瘍細胞における抗原に特異的な抗原−結合ドメインを含む、ＣＡＲを発現するように操作されているＮＫ細胞であり得る。免疫療法のために遺伝子操作されているＴ細胞（例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞）の養子移入に加えて、代替のタイプのＣＡＲを発現する白血球は、単独でまたはＣＡＲ  Ｔ細胞と組み合わせて、養子免疫療法のために使用され得る。一例において、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の混合物は、ＡＣＴのために使用され得る。本発明に従って、Ｔ細胞及びＮＫ細胞におけるＣＡＲの発現レベルは、エフェクターモジュールにおいてＣＡＲに作動可能に連結されたＤＤ（複数可）に結合する小分子によって同調され、制御される。
【０５７６】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物を発現するように操作されているＮＫ細胞は、ＡＣＴのために使用され得る。ＮＫ細胞の活性化は、標的細胞におけるパーフォリン／グランザイム依存性アポトーシスを誘導する。ＮＫ細胞の活性化はまた、ＩＦＮγ、ＴＮＦ−α、及びＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカイン分泌も誘導する。これらのサイトカインは、マクロファージ及びそれらの抗菌活性の食細胞機能を増強させ、樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞によって抗原提示の上方調節を介して、養子免疫応答を増加させる（Ｖｉｖｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００８，９（５）：５０３−５１０によって概説）。
【０５７７】
遺伝的修飾の他の例は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の導入、及びＮＫＧ２Ａなどの阻害性ＮＫ細胞受容体の下方調節を含み得る。ＣＡＲの例には、Ｂ細胞悪性腫瘍に対してＣＤ１９及びＣＤ２０に特異的なＣＡＲ、白血病細胞におけるＣＤ３３を標的化するＣＡＲ、骨髄腫細胞におけるＣＳ１  ＣＡＲ及びＣＤ１３８  ＣＡＲ、神経芽細胞腫細胞におけるＧＤ２  ＣＡＲ、乳癌細胞におけるＨｅｒ２／Ｎｅｕ及びｅｒｂＢ２、結腸癌における癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮腫瘍におけるＥｐＣＡＭ、黒色腫におけるＧＰＡ７、白血病及び固形腫瘍におけるＮＫＧ２Ｄリガンド、ならびに様々な腫瘍標的におけるＴＲＡＩＬ  Ｒ１が含まれるが、これらに限定されない。ＣＡＲは、エフェクターモジュールのＰＯＩであり、その対応するリガンドによるＤＤの結合によって調節され得る。
【０５７８】
別例において、ＡＣＴのためのＮＫ細胞は、腫瘍に対するＮＫ細胞媒介性抗体依存性細胞の細胞毒性（ＡＤＣＣ）を増加する高親和性ＣＤ１６−１５８Ｖ多型性（ＨＡ−ＣＤ１６）を含むエフェクターモジュールを発現するように修飾され得る。ＨＡ−ＣＤ１６を発現するように遺伝子操作されているＮＫ細胞の注入は、がん患者のための抗体ベースの療法の有効性を改善するための戦略として使用され得る。
【０５７９】
ＮＫ細胞はまた、腫瘍細胞との相互作用におけるＮＫ細胞阻害性シグナルを回避するように遺伝的に再プログラミングされ得る。例えば、ＮＫ細胞を遺伝子操作して、それらの阻害性受容体を静めるようなＣＲＩＳＰＲ、ＺＦＮ、またはＴＡＬＥＮの使用は、ＮＫ細胞の抗腫瘍効果を増強させ得る。
【０５８０】
免疫細胞は、当該技術分野で周知の様々な方法を使用して、単離され、エクスビボで増殖され得る。例えば、細胞毒性Ｔ細胞を単離し、増殖させる方法は、米国特許第６，８０５，８６１号及び同第６，５３１，４５１号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１６０３４８０７２Ａ１号及び際特許公開第ＷＯ２０１６１６８５９５Ａ１号（当該出願の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）において説明されている。ＮＫ細胞の単離及び増殖は、米国特許出願公開第ＵＳ２０１５０１５２３８７Ａ１号、米国特許第７，４３５，５９６号、及びＯｙｅｒ，Ｊ．Ｌ．（２０１６）．Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ．１８（５）：６５３−６３（それらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）において説明されている。具体的には、ヒト一次ＮＫ細胞は、フィーダー細胞、例えば、膜結合型ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＩＬ１２、及び４−１ＢＢＬを発現するように操作されている骨髄性細胞の存在下で増殖され得る。
【０５８１】
場合によっては、免疫細胞のサブ集団は、ＡＣＴに対して濃縮され得る。免疫細胞の濃縮のための方法は、国際特許出願公開第ＷＯ２０１５０３９１００Ａ１号に教示される。別例において、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーターマーカーＢＴＬＡ）に陽性であるＴ細胞は、米国特許第９，５１２，４０１号（当該出願の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載の抗がん応答を示すＴ細胞に対して濃縮するために使用され得る。
【０５８２】
いくつかの実施形態において、ＡＣＴのための免疫細胞は、Ｔ細胞の増殖を増強させるために、サブ集団を選択するように枯渇され得る。例えば、免疫細胞は、米国特許出願公開第ＵＳ  ２０１６０２９８０８１Ａ１号（当該出願の内容は、参照によりその全体が組み込まれる）に教示される方法を使用して抗腫瘍免疫応答を最小限に抑えるようにＦｏｘｐ３＋Ｔリンパ球が枯渇され得る。
【０５８３】
いくつかの実施形態において、ＡＣＴのためのＴ細胞の活性化及び増殖は、細胞表面上に一時的に発現したキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の抗原刺激が達成された。このような活性化方法は、国際特許出願公開第ＷＯ２０１７０１５４２７号（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）において教示される。
【０５８４】
いくつかの実施形態において、免疫細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）と関連する抗原によって活性化され得る。いくつかの実施形態において、ＡＰＣは、抗原特異的または非特異的である、樹状細胞、マクロファージ、またはＢ細胞であり得る。ＡＰＣは、それらの臓器において自家または同種であり得る。いくつかの実施形態において、ＡＰＣは、細胞ベースのａＡＰＣまたは無細胞ａＡＰＣなどの人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であり得る。細胞ベースのａＡＰＣは、ヒト赤白血病細胞などの遺伝子操作されている細胞、またはマウス線維芽細胞及びショウジョウバエ細胞などの異種細胞のいずれかから選択され得る。あるいは、ＡＰＣは、抗原または共刺激ドメインが、ラテックスビーズ、ポリスチレンビーズ、脂質小胞、またはエキソソームなどの合成表面上に提示される、無細胞であり得る。
【０５８５】
いくつかの実施形態において、養子細胞療法は、自家移入によって行われ、細胞は、治療を必要とする対象に由来し、単離及び処理後の細胞は、同じ対象に投与される。他の例では、ＡＣＴは、細胞が最終的に細胞療法を受けているレシピエント対象以外のドナー対象から単離及び／または調製される、同種移入を含み得る。ドナー及びレシピエント対象は、遺伝学的に同一であっても類似であってもよく、または同じＨＬＡクラスまたはサブタイプを発現し得る。
【０５８６】
いくつかの実施形態において、ＡＣＴのための免疫細胞（例えば、Ｔ細胞及びＮＫ細胞）に導入される複数の免疫治療剤は、同じバイオサーキットシステムによって制御され得る。一例において、ＩＬ１２などのサイトカイン及びＣＤ１９  ＣＡＲなどのＣＡＲ構築物は、同じｈＤＨＦＲ不安定化ドメインに連結されている。ＩＬ１２及びＣＤ１９  ＣＡＲの発現は、ＴＭＰを使用して同時に同調される。他の実施形態において、ＡＣＴのための免疫細胞（例えば、Ｔ細胞及びＮＫ細胞）に導入される複数の免疫治療剤は、異なるバイオサーキットシステムによって制御され得る。一例において、ＩＬ１２などのサイトカイン及びＣＤ１９  ＣＡＲなどのＣＡＲ構築物は、２つの別々のエフェクターモジュールにおいて異なるＤＤに連結され、それによって異なる刺激物質を別々に使用して同調され得る。別例において、自殺遺伝子及びＣＡＲ構築物は、２つの別々のエフェクターモジュールに連結され得る。
【０５８７】
本発明のＳＲＥ、バイオサーキット、及び組成物を使用して遺伝的修飾後に、細胞は、それを必要とする対象に投与される。養子細胞療法のために細胞の投与のための方法は、周知であり、提供された方法及び組成物に関連して使用され得る。例えば、養子Ｔ細胞療法は、例えば、Ｇｒｕｅｎｂｅｒｇらの米国特許出願公開第２００３／０１７０２３８号、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇの米国特許第４，６９０，９１５、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（２０１１）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．８（１０）：５７７−８５）において説明されている。例えば、Ｔｈｅｍｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（１０）：９２８−９３３、Ｔｓｕｋａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ４３８（１）：８４−９、Ｄａｖｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８（４）：ｅ６１３３８を参照されたく、それらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０５８８】
いくつかの実施形態において、ＡＣＴのための免疫細胞は、免疫細胞の活性化、浸透、増殖、生存、及び抗腫瘍機能を促進する、１つ以上の免疫治療剤を発現するように操作され得る。免疫治療剤は、異なる標的分子に特異的な第２のＣＡＲまたはＴＣＲ；サイトカインまたはサイトカイン受容体；阻害シグナルを刺激シグナルに変換するキメラスイッチ受容体；養子導入細胞を腫瘍組織などの標的部位に導くホーミング受容体；免疫細胞の代謝を最適化する薬剤；あるいは重度の事象が養子細胞移入後に観察されるとき、または移入した免疫細胞をもはや必要としないときに、活性化したＴ細胞を殺傷する安全スイッチ遺伝子（例えば、自殺遺伝子）であり得る。
【０５８９】
いくつかの実施形態において、養子細胞移入のために使用される免疫細胞は、がん患者における腫瘍を殺傷するそれらの能力をさらに改善する全体的な目的として、それらの持続性、細胞毒性、腫瘍標的化能、及びインビボで疾患部位が存在する能力を改善するように遺伝子的に操作され得る。一例は、ガンマ−サイトカイン（ＩＬ２及びＩＬ１５）などのサイトカインを含む本発明のエフェクターモジュールを免疫細胞に導入して、免疫細胞の増殖及び生存を促進することである。細胞へのサイトカイン遺伝子（例えば、ガンマ−サイトカインＩＬ２及びＩＬ１５）の形質導入は、外因性サイトカインを加えることなく、免疫細胞を増殖させることができ、ＮＫ細胞を発現するサイトカインは、腫瘍の細胞毒性を増強させている。
【０５９０】
別例は、適切な腫瘍組織に、注入したＮＫ細胞を配向するための遺伝的修飾の使用を含む。ＮＫ細胞は、そのリガンドＣＣＬ１９のうちの１つに向けてそれらの移動を改善するために、ＣＣＲ７受容体をコードするエフェクターモジュールで遺伝子操作され得る。他の戦略は、転移性腫瘍で浸潤されている組織などの炎症を起こした組織へのＮＫ細胞の移動を改善するためにＣＸＣＲ３などのケモカイン受容体を使用することを含み得る。
【０５９１】
ＮＫ細胞は、ＴＧＦ−βなどの抑制性サイトカインに感受性がないように修飾され、それによって、それらの細胞毒性を防ぐことができる。例えば、ＮＫ細胞は、ＴＧＦ−βの抑制効果に耐性があるＮＫ細胞を示すそれらの表面上にＴＧＦ−β  ＩＩ型受容体（ＤＮＴβＲＩＩ）の優性阻害変異型を発現するように遺伝子操作され得る。
【０５９２】
いくつかの実施形態において、バイオサーキット、それらの成分、ＳＲＥ、エフェクターモジュールは、当該技術分野で他のバイオサーキットまたはスイッチよりも著しく免疫原性が少なくなるように設計される。
【０５９３】
本明細書で使用される場合、「著しく免疫原性が少なくなる」とは、免疫原性の検出可能な減少を指す。別の実施形態において、この用語は、免疫原性の減少を指す。別の実施形態において、この用語は、有効量の、バイオサーキット、それらの成分、ＳＲＥ、エフェクターモジュールが、検出可能な免疫応答を引き起こすことなく投与され得るような減少を指す。別の実施形態において、この用語は、バイオサーキット、それらの成分、ＳＲＥ、エフェクターモジュールが、免疫応答を引き起こすことなく繰り返し投与され得るような減少を指す。別の実施形態において、この減少は、バイオサーキット、それらの成分、ＳＲＥ、エフェクターモジュールが、免疫応答を引き起こすことなく繰り返し投与され得るような減少である。
【０５９４】
別の実施形態において、バイオサーキット、それらの成分、ＳＲＥ、エフェクターモジュールは、免疫原性がその未修飾対照物または参照化合物よりも２分の１に減少する。別の実施形態において、免疫原性が、３分の１に減少する。別の実施形態において、免疫原性は、５分の１に減少する。別の実施形態において、免疫原性は、７分の１に減少する。別の実施形態において、免疫原性は、１０分の１に減少する。別の実施形態において、免疫原性は、１５分の１に減少する。別の実施形態において、免疫原性は、２分の１に減少する。別の実施形態において、免疫原性は、５０分の１に減少する。別の実施形態において、免疫原性は、１００分の１に減少する。別の実施形態において、免疫原性は、２００分の１に減少する。別の実施形態において、免疫原性は、５００分の１に減少する。別の実施形態において、免疫原性は、１０００分の１に減少する。別の実施形態において、免疫原性は、２０００分の１に減少する。別の実施形態において、免疫原性は、さらに倍差で減少する。
【０５９５】
免疫原性を決定する方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、サイトカイン（例えば、ＩＬ１２、ＩＦＮアルファ、ＴＮＦ−アルファ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１アルファもしくはベータ、ＩＬ６、ＩＦＮベータ、またはＩＬ８）の分泌物を測定すること、ＤＣ活性化マーカー（例えば、ＣＤ８３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０、及びＣＤ８６）の発現を測定すること、または適応免疫応答のためのアジュバントの役割を果たす能力を測定することを含む。
【０５９６】
本発明は、細胞における免疫応答誘導する方法を提供する。本明細書で使用される場合、「免疫応答」という用語は、刺激物質または抗原に応答した免疫システムの細胞の活性を指す。いくつかの実施形態において、抗原は、がん抗原であり得る。いくつかの態様において、免疫応答を誘導する方法は、細胞に、治療上有効量の本明細書に記載の組成物のうちのいずれかを投与することを含み得る。一態様において、本方法は、本明細書に記載の薬学的組成物を投与することを含み得る。一態様において、本方法は、ポリヌクレオチド、ベクターを投与することを含み得る。いくつかの実施形態において、免疫応答の誘導は、本明細書に記載の免疫治療剤の発現及びまたは機能により生じる。免疫応答を誘導する方法は、細胞に、有効量の刺激物質を投与して、免疫治療剤の発現を同調することを含み得る。いくつかの実施形態において、免疫治療剤は、刺激物質に応答して、免疫応答を誘導可能である。免疫応答の誘導は、対象内の細胞、すなわち、インビボ、エクスビボ、またはインビトロで生じ得る。免疫応答の誘導は、細胞からのＩＬ２及びＩＦＮγなどのサイトカインの放出を測定することによって評価され得る。いくつかの実施形態において、免疫応答の誘導は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ  １４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ４５、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ  ６９、ＣＤ２８、ＣＤ４４、ＩＦＮガンマなどであるが、これらに限定されない、細胞表面マーカーを評価することによって測定され得る。抗原提示細胞に対する細胞表面マーカーの例には、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ４５、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮγ受容体、及びＩＬ２受容体、ＩＣＡＭ−１、及び／またはＦｃγ受容体が含まれるが、これらに限定されない。樹状細胞のための細胞表面マーカーの例には、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、Ｂ７−２、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ、及び／またはデクトン−１などが含まれるが、これらに限定されず、場合によっては、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ  １９、ＣＤ２０、ＣＤ５６、及び／またはＣＤ５７の不在を有する。ＮＫ細胞のための細胞表面マーカーの例には、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、グラニュリシン、グランザイムＢ、グランザイムＫ、ＩＬ１０、ＩＬ２２、ＩＦＮｇ、ＬＡＰ、パーフォリン、及びＴＮＦａが含まれるが、これらに限定されない。
【０５９７】
２．がんワクチン
いくつかの実施形態において、本発明のバイオサーキット、エフェクターモジュール、対象となるペイロード（免疫治療剤）、ベクター、細胞、及び組成物は、がんワクチンのために使用され得る。一態様において、樹状細胞は、本発明の組成物を発現するように修飾され、がんワクチンとして使用される。
【０５９８】
いくつかの実施形態において、がんワクチンは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に由来するペプチド及び／またはタンパク質を含み得る。このような戦略は、対象における免疫応答を引き起こすために使用され得、場合によっては、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答であり得る。がんワクチンのために使用されるペプチドはまた、対象の変異プロファイルに一致するように修飾され得る。例えば、治療法を必要とする対象に見出される変異に一致した変異を有するＥＧＦＲ由来のペプチドは、肺癌に罹患している患者にうまく使用されている（Ｌｉ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｏｃｔ  ７；５（１２）：ｅ１２３８５３９、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０５９９】
一実施形態において、本発明のがんワクチンは、ＴＡＡに由来するスーパーアゴニスト改変型ペプチドリガンド（ＡＰＬ）であり得る。これらは、天然エピトープよりもさらに有効に特定のＣＴＬクローンを活性化する１つ以上のアミノ酸によって天然ペプチド配列に由来する変異体ペプチドリガンドである。これらの変化は、ペプチドが制限するクラスＩ  ＭＨＣ分子により良好に結合するか、または所与の腫瘍特異的なＣＴＬのサブセットのＴＣＲとより好ましく相互作用することを可能にし得る。ＡＰＬは、米国特許出願公開第ＵＳ２０１６０３１７６３３Ａ１号（当該出願の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に教示される方法を使用して選択され得る。
【０６００】
３．腫瘍微環境（ＴＭＥ）
いくつかの実施形態において、バイオサーキット、それらの成分、ＳＲＥ、エフェクターモジュールは、直接細胞死滅を超越して、バイオサーキットまたは薬学的組成物の有用性を拡張するために、腫瘍微環境を再形成するように設計されている。
【０６０１】
いくつかの実施形態において、バイオサーキット、それらの成分、ＳＲＥ、エフェクターモジュールは、ＣＡＲサイトカインストームを軽減する、緩和する、または排除するように設計されている。いくつかの実施形態において、このような軽減、緩和、及び／または排除は、固形腫瘍または腫瘍微環境を生じる。
【０６０２】
いくつかの実施形態において、本発明のバイオサーキット、エフェクターモジュール、対象となるペイロード（免疫治療剤）、ベクター、細胞、及び薬学的組成物は、免疫抑制性微環境を変えて、免疫応答を増加させるように使用され得る。
【０６０３】
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の組成物を使用して、がん細胞または周囲の腫瘍間質によって分泌された免疫抑制性サイトカインからの阻害性免疫調節シグナルを、刺激性シグナルに変換させるための方法を提供する。免疫抑制性サイトカインには、ＩＬ１３、ＩＬ４、ＴＧＦ−ベータ、ＩＬ６、ＩＬ８、及びＩＬ１０が含まれるが、これらに限定されない。一態様において、遺伝子操作されている腫瘍特異的なＴ細胞（例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞）、または天然腫瘍特異性を有するＴ細胞は、阻害性／抑制性サイトカインに結合し、かつそれらの細胞内の結果を免疫刺激性／活性化シグナルに変換するキメラスイッチ受容体を含むエフェクターモジュールを発現するようにさらに操作して、腫瘍特異的なＴ細胞の有効性を改善することができる。キメラスイッチ受容体は、ＩＬ２Ｒ（すなわち、ＩＬ２Ｒα／ＣＤ２５、ＩＬ２Ｒβ／ＣＤ１２２、ならびに様々なサイトカイン受容体によって共有される共通γ鎖受容体／ＣＤ１３２）、及び／またはＩＬ７Ｒ（ＩＬ７Ｒα／ＣＤ１２７、共通γ鎖受容体／ＣＤ１３２）などの刺激性サイトカイン受容体に由来する細胞内シグナル形質導入で融合した、阻害性サイトカイン受容体（例えば、ＩＬ１３Ｒ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ１０Ｒ、ＴＧＦβＲ１／ＡＬＫ５、ＴＧＦβＲ２、及びＴＧＦβＲ３／β−グリカン）の細胞外ドメインからなる。これらの操作は、抑制性腫瘍微環境に耐性を示す腫瘍特異的なＴ細胞またはＣＡＲ  Ｔ細胞を表す。
【０６０４】
いくつかの実施形態において、本発明は、骨髄性由来の抑制性細胞（ＭＤＳＣ）によって生成された免疫抑制効果を無効にするための方法を提供する。腫瘍細胞は、ＭＤＳＣの動員を通して免疫抑制を促進するインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）を分泌する。免疫抑制性環境は、細胞外アルギニンを分解することができる酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）及びアルギナーゼ１（ＡＲＧ１）を通してＭＤＳＣによってさらに促進される。腫瘍微環境内のアミノ酸枯渇は、Ｔ細胞抗腫瘍活性を抑制する。いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、ＮＯＳ、ＡＲＧ１の阻害剤、及びトリプトファン代謝経路、例えば、ＩＤＯを含み得る。一実施形態において、ペイロードは、ＭＤＳＣの増殖及び機能に必要とされる、コロニー刺激因子受容体１（ＣＳＦＲ１）の阻害剤を含み得る。
【０６０５】
いくつかの実施形態において、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＫＩＲ、またはＢＴＬＡなどの阻害性共受容体の優性阻害変異体は、腫瘍微環境内の阻害性シグナルを克服するための本発明のペイロードとして使用され得る。
【０６０６】
４．併用療法
いくつかの実施形態において、対象への投与のために、本発明の組成物、ベクター、及び細胞を組み合わせることが望ましい。異なる免疫治療剤を含む本発明の組成物は、免疫療法の増強のための組み合わせに使用され得る。
【０６０７】
免疫治療剤
いくつかの実施形態において、本発明の組成物を、抗原特異的な免疫応答の有効性及び寿命を増強することができるアジュバントと組み合わせることが望ましい。併用療法における免疫刺激剤として使用されるアジュバントは、生体分子、及び抗原を送達する送達担体を含む。非限定的な例として、本発明の組成物は、サイトカイン、トール様受容体、細菌毒素、及び／またはサポニンなどの生物学的アジュバントと組み合わせられ得る。他の実施形態において、本発明の組成物は、送達担体と組み合わせられ得る。例示的な送達担体には、ポリマーミクロスフェア、免疫刺激複合体、乳剤（水中油型または油中水型）、アルミニウム塩、リポソーム、またはビロソームが含まれる。
【０６０８】
いくつかの実施形態において、本発明のバイオサーキット、エフェクターモジュール、ＤＤ、及びペイロードを発現するように修飾された免疫エフェクター細胞は、本明細書に記載の生物学的アジュバントと組み合わせられ得る。内因性細胞Ｔ細胞の増殖から標的媒介性活性化の動的制御を偏析するためのＣＡＲ及びサイトカイン及びリガンドの二重調節。このような二重調節はまた、患者における条件付けレジメンの必要性を最小限に抑える。非限定的な例として、ＤＤを調節したＣＡＲ、例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲは、サイトカイン、例えば、ＣＡＲの抗腫瘍有効性を増強するために、サイトカイン、例えば、ＩＬ１２と組み合わせられ得る（Ｐｅｇｒａｍ  Ｈ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｕｍｏｒ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｔｏ  ｓｅｃｒｅｔｅ  ＩＬ１２  ｅｒａｄｉｃａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｔｕｍｏｒｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｎｅｅｄ  ｆｏｒ  ｐｒｉｏｒ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ．Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１１９：４１３３−４１、それらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。別の非限定的な例として、Ｍｅｒｃｈａｎｔらは、樹状細胞ベースのワクチン接種を、組換えヒトＩＬ７と組み合わせて、高リスクの小児肉腫患者の転帰を改善した（Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ．ａｌ．Ａｄｊｕｖａｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｔｏ  Ｉｍｐｒｏｖｅ  Ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｎ  Ｈｉｇｈ−Ｒｉｓｋ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｓａｒｃｏｍａｓ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１６．２２（１３）：３１８２−９１、それらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。
【０６０９】
いくつかの実施形態において、１つ以上の抗原特異的なＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように修飾されている免疫エフェクター細胞は、免疫抑制性腫瘍微環境を変える免疫治療剤を含む本発明の組成物と組み合わせられ得る。
【０６１０】
一態様において、同じ細胞上の異なる標的分子に特異的なＣＡＲを発現するように修飾されているエフェクター免疫細胞は、組み合わせられ得る。別の態様において、ＮＫ細胞及びＴ細胞などの同じＣＡＲ構築物を発現するように修飾されている異なる免疫細胞は、腫瘍治療のための組み合わせで使用され得、例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲを発現するように修飾されているＴ細胞は、Ｂ細胞悪性腫瘍を治療するために、同じＣＤ１９  ＣＡＲを発現するように修飾されているＮＫ細胞と組み合わせられ得る。
【０６１１】
他の実施形態において、ＣＡＲを発現するように修飾されている免疫細胞は、チェックポイント阻止剤と組み合わせられ得る。
【０６１２】
いくつかの実施形態において、本発明のバイオサーキット、エフェクターモジュール、ＤＤ、及びペイロードを発現するように修飾された免疫エフェクター細胞は、本発明のがんワクチンと組み合わせられ得る。
【０６１３】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲを含むエフェクターモジュールは、サイトカインを含むエフェクターモジュール、または安全スイッチを含むエフェクターモジュール、または代謝因子を含むエフェクターモジュール、またはホーミング受容体を含むエフェクターモジュールと組み合わせて使用され得る。
【０６１４】
一実施形態において、ＣＤ１９  ＣＡＲを含むエフェクターモジュールは、国際特許出願公開第ＷＯ２０１６１６４５８０号（当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に教示された方法を使用して、バーキットチロシン受容体キナーゼ（ＢＴＫ）阻害剤などのアミノピリミジン誘導体と組み合わせて使用され得る。
【０６１５】
がん
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、本発明の組成物と、がん、炎症疾患、及び他の免疫不全障害の治療に有効な他の薬剤、例えば、抗がん剤の組み合わせを含み得る。本明細書で使用される場合、「抗がん剤」という用語は、例えば、がん細胞を死滅させること、がん細胞のアポトーシスを誘導すること、がん細胞の増殖速度を遅くすること、転移の発生率または数を少なくすること、腫瘍サイズを小さくすること、腫瘍成長を阻害すること、腫瘍もしくはがん細胞への血液供給を減らすこと、がん細胞もしくは腫瘍に対する免疫応答を促進すること、がんの進行を阻止もしくは阻害すること、またはがんに罹患している対象の寿命を延ばすことによって、対象におけるがんに負の影響を及ぼすことができる任意の薬剤を指す。
【０６１６】
いくつかの実施形態において、抗がん剤または治療剤は、本発明と組み合わせて、治療の有効性を改善する、化学療法剤、または放射線療法剤、免疫治療剤、外科手術、または任意の他の治療剤であり得る。
【０６１７】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、腫瘍細胞の表面上にいくつかの標的分子に特異的な抗体などの本明細書に記載の本発明の治療剤以外の免疫療法剤と組み合わせて使用され得る。
【０６１８】
例示的な化学療法剤には、アシビシン；アクラルビシン；アコダゾール塩酸塩；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン；アメタントロンアセテート；アムサクリン；アナストロゾール；アンスラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン、スリンダク、クルクミン、アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード、例えば、メクロル−エタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、及びクロラムブシル；ニトロウレア、例えば、カルムスチン（ＢＣ  Ｕ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、及びセムスチン（メチル−ＣＣ  Ｕ）；エチレンイミン（ｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）／メチルメラミン、例えば、トリエチレンメラミン（ｔｈｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｍｅｌａｍｉｎｅ）（ＴＥＭ）、トリエチレン、チオホスホルアミド（チオテパ）、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ、アルトレタミン）；ブスルファンなどのスルホン酸アルキル；ダカルバジン（ＤＴＩＣ）などのトリアジン；抗代謝剤、例えば、葉酸類似体、例えば、メトトレキサート及びトリメトレキサート、ピロリジン類似体、例えば、５−フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、シタラビン）、５−アザシチジン、２，２’−ジフルオロデオキシシチジン、プリン類似体、例えば、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アザチオプリン、２’−デオキシコホルマイシン（ペントスタチン）、エリトロヒドロキシノニルアデニン（ＥＨＮＡ）、リン酸フルダラビン、及び２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン、２−ＣｄＡ）；天然産物、例えば、抗有糸分裂剤、例えば、パクリタキセル、ビンカアルカロイド、例えば、ビンブラスチン（ＶＬＢ）、ビンクリスチン、及びビノレルビン、タキソテール、エストラムスチン、及びエストラムスチンホスフェート；エピポドフィロトキシン、例えば、エトポシド及びテニポシド；抗生物質、例えば、アクチノマイシンＤ、ダウノマイシン（ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、マイトマイシンＣ、及びアクチノマイシン；酵素、例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ、サイトカイン、例えば、インターフェロン（ＩＦＮ）−ガンマ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−アルファ、ＴＮＦ−ベータ、及びＧＭ−ＣＳＦ、抗血管新生因子、例えば、アンギオスタチン及びエンドスタチン、ＦＧＦまたはＶＥＧＦの阻害剤、例えば、可溶性ＶＧＦ／ＶＥＧＦ受容体を含めた血管新生因子の受容体の可溶性の形態、白金配位錯体、例えば、シスプラチン及びカルボプラチン、アントラセンジオン、例えば、ミトキサントロン、置換尿素、例えば、ヒドロキシウレア、Ｎ−メチルヒドラジン（ＭＩＦｆ）及びプロカルバジンを含むメチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制薬、例えば、ミトタン（ο，ρ’−ＤＤＤ）及びアミノグルテチミド；ホルモン及びアンタゴニスト、例えば、プレドニゾン及び等価物、デキサメタゾンならびにアミノグルテチミド；プロゲスチン、例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン及び酢酸メゲストロール；エストロゲン、例えば、ジエチルスチルベストロー���及びエチニルエストラジオール等価物；抗エストロゲン薬、例えば、タモキシフェン；アンドロゲン、例えば、プロピオン酸テストステロン及びフルオキシメステロン／等価物；抗アンドロゲン薬、例えば、フルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体、及びロイプロリド；非ステロイド性抗アンドロゲン薬、例えば、フルタミド；キナーゼ阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、メチル化阻害剤、プロテアソーム阻害剤、モノクローナル抗体、酸化剤、抗酸化剤、テロメラーゼ阻害剤、ＢＨ３模倣物、ユビキチンリガーゼ阻害剤、ｓｔａｔ阻害剤及び受容体チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、メシル酸イマチニブ（ＧｌｅｅｖａｃまたはＧｌｉｖａｃとして販売されている）及び現在Ｔａｒｖｅｃａとして販売されているエルロチニブ（ＥＧＦ受容体阻害剤）；抗ウイルス剤、例えば、リン酸オセルタミビル、アンフォテリシンＢ、及びパリビズマブ；Ｓｄｉ  １模倣剤；セムスチン；老化誘導阻害剤１；スパルフォス酸；スピカマイシンＤ；スピロムスチン；スプレノペンチン；スポンギスタチン１；スクワラミン；スチピアミド；ストメライシン阻害剤；スルフィノシン；超活性血管作用性腸ペプチドアンタゴニスト；ベラレソール；ベラミン；ベルジン；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンキサルチン；ビタキシン；ボロゾール；ザノテロン；ゼニプラチン；ジラスコルブ；及びジノスタチンスチマラマル；ＰＩ３Ｋβ小分子阻害剤、ＧＳＫ２６３６７７１；汎−ＰＩ３Ｋ阻害剤（ＢＫＭ１２０）；ＢＲＡＦ阻害剤、ベムラフェニブ（Ｚｅｌｂｏｒａｆ）及びダブラフェニブ（Ｔａｆｉｎｌａｒ）；あるいは前述の任意の類似体または誘導体及びバリアントが含まれるが、これらに限定されない。
【０６１９】
一実施形態において、本発明は、さらに、他の薬剤、及び／または他の治療方法、例えば、既知の薬剤及び／または既知の治療方法、例えば、これらの障害を治療するために現在用いられているものと組み合わせて、１つ以上の形態のがんを治療するための、本発明の、薬学的組成物、バイオサーキット、バイオサーキット成分、エフェクターモジュール（それらのＳＲＥまたはペイロードを含む）の使用に関する。例えば、本発明の、薬学的組成物、バイオサーキット、バイオサーキット成分、エフェクターモジュール（それらのＳＲＥまたはペイロードを含む）はまた、生物製剤、化学療法、及び放射線療法などの１つ以上のさらなる抗がん治療と組み合わせても投与され得る。したがって、治療は、例えば、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖａｃ）、オールトランス型レチノイン酸、モノクローナル抗体治療（ゲムツズマブ、オゾガマイシン）、化学療法（例えば、クロラムブチル、プレドニゾン、プレドニゾロン、ビンクリスチン、シタラビン、クロファラビン、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、デシタビン、ＭＤＲ１の阻害剤）、リツキシマブ、インターフェロン−α、アントラサイクリン薬物（ダウノルビシンまたはイダルビシンなど）、Ｌ−アスパラギナーゼ、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ブレオマイシン、フルダラビン、エトポシド、ペントスタチン、もしくはクラドリビン）、骨髄移植、幹細胞移植、放射線照射療法、代謝拮抗薬物（メトトレキサート及び６−メルカプトプリン）、または２０１６年４月１１日に出願された共同所有の米国仮特許出願第６２／３２０，８６４号、２０１７年３月３日に出願された同第６２／４６６，５９６号、及び国際特許出願公開第ＷＯ２０１７／１８０５８７号（当該出願の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）の表６中のものなどの本明細書で教示された抗体のうちのいずれか、またはこれらの組み合わせを含み得る。
【０６２０】
放射線照射療法薬剤及び因子は、例えば、γ−照射、Ｘ線、ＵＶ−照射、マイクロ波、電子放出、放射性同位体などのＤＮＡ損傷を誘導する放射線及び電波を含む。治療法は、上記の形態の放射線を用いて局在化した腫瘍部位を照射することによって達成され得る。これらの因子のすべてが、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製及び修復、ならびに染色体の組み立て及び維持に対して広範囲の損傷ＤＮＡをもたらす可能性が最も高い。Ｘ線の投薬量範囲は、長期間（３〜４週間）にわたる５０〜２００レントゲンの１日用量から２０００〜６０００レントゲンの単一用量までの範囲である。放射性同位体の投薬量範囲は、広く変動し、同位体の半減期、放射される放射線の強度及び型、ならびに新生物細胞による取り込みに応じて異なる。
【０６２１】
放射線療法（放射線療法、Ｘ線療法、または照射とも呼ばれる）は、がん細胞を死滅させ、腫瘍を退縮させるためのイオン化放射の使用である。放射線療法は、外照射療法（ＥＢＲＴ）を介して外部にまたは小線源療法を介して内部に投与され得る。放射線療法の効果は、局在化され、治療される領域に限定される。放射線療法は、脳、胸部、頸部、喉頭、肺、膵臓、前立腺、皮膚、胃、子宮、または軟部組織肉腫のがんを含む、ほぼすべてのタイプの固形腫瘍を治療するために使用され得る。放射線はまた、白血病及びリンパ腫を治療するためにも使用される。
【０６２２】
いくつかの実施形態において、化学療法剤は、レナリドマイド（ＬＥＮ）などの免疫調節剤であり得る。最近の研究は、レナリドマイドがＣＡＲ修飾されたＴ細胞の抗腫瘍機能を増強することができることを示している（Ｏｔａｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１５，５（４）：ｅ１１１５９４０）。抗腫瘍抗体のいくつかの例は、トシリズマブ、シルツキシマブを含む。
【０６２３】
化学療法は、がん細胞を破壊することができる薬物によるがんの治療である。現行の使用法では、「化学療法」という用語は、通常、標的療法とは対照的に、一般に急速に分裂する細胞に影響する細胞毒性薬を指す。化学療法薬は、様々な可能な様式で細胞分裂に干渉し、例えば、ＤＮＡの複製または新たに形成された染色体の分離に干渉する。化学療法のほとんどの形態は、急速に分裂する細胞のすべてを標的とし、がん細胞に特異的ではないが、正常細胞はＤＮＡ損傷を修復することができるものの多くのがん細胞はＤＮＡ損傷を修復することができないことから、ある程度の特異性がもたらされ得る。
【０６２４】
ほとんどの化学療法レジメンは、組み合わせて与えられる。例示的な化学療法剤には、５−ＦＵエンハンサー、９−ＡＣ、ＡＧ２０３７、ＡＧ３３４０、アグリカナーゼ阻害剤、アミノグルテチミド、アムサクリン（ｍ−ＡＭＳＡ）、アスパラギナーゼ、アザシチジン、バチマスタット（ＢＢ９４）、ＢＡＹ  １２−９５６６、ＢＣＨ−４５５６、ビス−ナフタルイミド、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン＋ポリフェプロザン（Ｐｏｌｉｆｅｐｒ  Ｏｓａｎ）、ｃｄｋ４／ｃｄｋ２阻害剤、クロロムブシル、ＣＩ−９９４、シスプラチン、クラドリビン、ＣＳ−６８２、シタラビンＨＣｌ、Ｄ２１６３、ダクチノマイシン、ダウノルビシンＨＣｌ、デポサイト（ＤｅｐｏＣｙｔ）、デキシフォスアミド（Ｄｅｘｉｆｏｓａｍｉｄｅ）、ドセタキセル、ドラスタイン、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、ＤＸ８９５１ｆ、Ｅ  ７０７０、ＥＧＦＲ、エピルビシン、エリスロポエチン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エトポシド（ＶＰ１６−２１３）、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ＦＫ  ３１７、フラボピリドール、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルタミド、フラジリン（Ｆｒａｇｙｌｉｎｅ）、ゲムシタビン、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、ヒドロキシウレア（ヒドロキシカルバミド）、イホスファミド、インターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターロイキン−２、イリノテカン、ＩＳＩ  ６４１、クレスチン（Ｋｒｅｓｔｉｎ）、レモナール（Ｌｅｍｏｎａｌ）ＤＰ  ２２０２、酢酸ロイプロリド（ＬＨＲＨ−放出因子類似体）、レバミゾール、ＬｉＧＬＡ（ガンマ−リノレン酸リチウム）、ロジンシード（Ｌｏｄｉｎｅ  Ｓｅｅｄ）、ロメテクソール、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、マリミスタット（Ｍａｒｉｍｉｓｔａｔ）、メクロレタミンＨＣｌ（ナイトロジェンマスタード）、酢酸メゲステロール、メグラミンＧＬＡ、メルカプトプリン、メスナ、ミトグアゾン（メチル−ＧＡＧ；メチルグリオキサールビス−グアニルヒドラゾン；ＭＧＢＧ）、ミトタン（ｏ．ｐ’−ＤＤＤ）、ミトキサントロン、ミトキサントロンＨＣｌ、ＭＭＩ２７０、ＭＭＰ、ＭＴＡ／ＬＹ  ２３１５１４、オクトレオチド、ＯＤＮ  ６９８、ＯＫ−４３２、経口白金剤、経口トキソイド、パクリタキセル（タキソール（ＴＡＸＯＬ）ＲＴＭ．）、ＰＡＲＰ阻害剤、ＰＤ  １８３８０５、ペントスタチン（２’デオキシコホルマイシン）、ＰＫＣ  ４１２、プリカマイシン、プロカルバジンＨＣｌ、ＰＳＣ  ８３３、ラリトレキセド、ＲＡＳファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ＲＡＳがん遺伝子阻害剤、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、ストレプトゾシン、スラミン、クエン酸タモキシフェン、タキサン類似体、テモゾロミド、テニポシド（ＶＭ−２６）、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、チロシンキナーゼ、ＵＦＴ（テガフル／ウラシル）、バルルビシン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンデシン、ＶＸ−７１０、ＶＸ−８５３、ＹＭ  １１６、ＺＤ  ０１０１、ＺＤ  ０４７３／アノーメッド（Ａｎｏｒｍｅｄ）、ＺＤ  １８３９、ＺＤ  ９３３１が含まれるが、これらに限定されない。
【０６２５】
本発明の組成物と組み合わせて使用され得る他の薬剤はまた、細胞表面受容体及びそれらのリガンド、例えば、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド、ＤＲ４またはＤＲ５／ＴＲＡＩＬの上方調節に影響を及ぼす薬剤、ならびにＧＡＰの接合部、細胞増殖抑制剤及び分化剤、焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤及びロバスタチンなどの細胞接着阻害剤、または抗体Ｃ２２５などのアポトーシス誘導物質への超増殖細胞の感受性を増大させる薬剤を含み得るが、これらに限定されない。
【０６２６】
組み合わせは、本発明の組成物及び他の薬剤を同時にまたは別々に投与することを含み得る。あるいは、本発明の免疫療法は、数分間、数日間、数週間から数か月間の間隔によって他の薬剤／療法に先行し得るか、またはその後に続き得る。
【０６２７】
５．治療上の使用
腫瘍体積または腫瘍負荷を軽減する方法が、本発明に提供され、本方法は、対象に、本発明の組成物を導入することを含む。
【０６２８】
本発明はまた、対象に、有効量の、本発明の少なくとも１つのエフェクターモジュールを発現するように遺伝子操作されている免疫エフェクター細胞を投与することを含む、対象におけるがんを治療するための方法も提供する。
【０６２９】
がん
様々ながんは、本発明の薬学的組成物、バイオサーキット、バイオサーキット成分、エフェクターモジュール（それらのＳＲＥまたはペイロードを含む）で治療され得る。本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、周囲の組織に浸潤して、新しい身体部位に転移する傾向がある未分化細胞の増殖によって特徴付けられる様々な悪性新生物のうちのいずれかを指し、このような悪性新生物の成長によって特徴付けられる病理学的状態を指す。がんは、腫瘍または血液学的悪性腫瘍であり得、すべてのタイプのリンパ腫／白血病、がん腫、及び肉腫、例えば、肛門、膀胱、胆管、骨、脳、乳房、頚部、結腸／直腸、子宮内膜、食道、眼、胆嚢、頭頸部、肝臓、腎臓、喉頭、肺、縦隔（胸部）、口腔、卵巣、膵臓、陰茎、前立腺、皮膚、小腸、胃、脊髄、尾骨、精巣、甲状腺、及び子宮に見出されるがん及び腫瘍などを含むが、これらに限定されない。
【０６３０】
本発明の組成物で治療され得るがん腫の型には、乳頭腫／がん腫、絨毛癌、内胚葉洞腫瘍、奇形腫、腺腫／腺癌、黒色腫、線維腫、脂肪腫、平滑筋腫、横紋筋腫、中皮腫、血管腫、骨腫、軟骨腫、神経膠腫、リンパ腫／白血病、扁平上皮細胞癌、小細胞癌、大細胞未分化癌、基底細胞癌、及び副鼻腔未分化癌が含まれるが、これらに限定されない。
【０６３１】
本発明の組成物で治療され得るがん腫の型には、胞状軟部肉種のような軟部組織肉腫、血管肉腫、血管肉腫、皮膚線維肉腫、類線維腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、骨外性軟骨肉腫、骨外性骨肉腫、線維肉腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、リンパ肉腫、悪性線維性組織球腫、神経線維肉腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫、及びアスキン腫瘍、ユーイング肉腫（原始神経外胚葉性腫瘍）、悪性血管内皮腫、悪性シュワン腫、骨肉腫、及び軟骨肉腫が含まれるが、これらに限定されない。
【０６３２】
非限定的な例として、治療され得るがん腫は、急性顆粒球性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、腺癌、腺肉腫、副腎癌、副腎皮質癌、肛門癌、未分化星状細胞腫、血管肉腫、虫垂癌、星状細胞腫、基底細胞癌、基底細胞様癌、Ｂ細胞性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、胆管癌、膀胱癌、骨癌、腸癌、脳癌、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、カルチノイド腫瘍、子宮頸癌、胆管癌、軟骨肉腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚リンパ腫、皮膚黒色腫、非浸潤性乳管癌、子宮内膜癌、上衣腫、類上皮肉腫、食道癌、ユーイング肉腫、肝外胆管癌、眼癌、卵管癌、胆嚢癌、胃癌（Ｇａｓｔｒｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ）、消化管癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、消化管間質腫瘍、一般的な胚細胞腫瘍、多形性膠芽腫、神経膠腫、有毛細胞性白血病、有毛細胞性白血病、頭頸部癌、血管内皮腫、ホジキンリンパ腫、ホジキン病、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、浸潤性腺管癌、浸潤性小葉癌、炎症性乳癌、腸内癌、肝内胆管癌、侵襲性／浸潤性乳癌、島細胞癌、顎部癌、島細胞腫、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、平滑筋肉腫、軟髄膜転移、白血病、口唇癌、脂肪肉腫、肝臓癌、上皮内小葉癌（Ｌｏｂｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｓｉｔｕ）、低悪性度星細胞腫、肺癌、リンパ節癌、リンパ腫、男性乳癌、髄様癌、髄芽細胞腫、黒色腫、髄膜腫、メルケル細胞癌、間葉性軟骨肉腫、間葉腫、中皮腫、転移性乳癌、転移性黒色腫、転移性扁平上皮性頸部癌、混合型神経膠腫、口腔癌、粘液性癌、粘膜黒色腫、多発性骨髄腫、鼻腔癌、上咽頭癌、頸癌、神経芽細胞腫、神経内分泌腫瘍、非ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、燕麦細胞癌、眼癌、眼黒色腫、乏突起膠腫、口腔（Ｏｒａｌ）癌、口腔（Ｏｒａｌ  ｃａｖｉｔｙ）癌、中咽頭癌、骨肉腫、骨肉腫、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣原発腹膜癌、卵巣性索間質腫瘍、パジェット病、膵臓癌、乳頭癌、副鼻腔癌、副甲状腺癌、骨盤癌、陰茎癌、末梢神経癌、腹膜癌、咽頭癌、褐色細胞腫、毛様細胞性星細胞腫、松果体領域腫瘍、松果体芽腫、下垂体腺癌、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫、肉腫、骨、肉腫、軟部組織、肉腫、子宮、副鼻腔癌、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、脊髄癌、脊柱癌、脊髄癌、脊髄腫瘍、扁平上皮癌、胃癌、滑膜肉腫、Ｔ細胞リンパ腫）、精巣癌、咽頭癌、胸腺（Ｔｈｙｍｏｍａ）／胸腺（ｔｈｙｍｉｃ）癌、甲状腺癌、舌癌、扁桃腺癌、移行上皮癌、移行上皮癌、移行上皮癌、トリプルネガティブ乳癌、卵管癌、管状腺癌、尿管癌、尿管癌、尿道癌、子宮腺癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、及び外陰癌であり得る。
【０６３３】
いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲは、ＣＳ１  ＣＡＲ、ＣＤ３８  ＣＡＲ、ＣＤ１３８  ＣＡＲ、及びＢＣＭＡ  ＣＡＲなどの多発性骨髄腫の治療において有用なＣＡＲであり得る。いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲは、ＣＤ３３  ＣＡＲ、ＣＤ１２３  ＣＡＲ、及びＣＬＬ１  ＣＡＲなどの急性骨髄性白血病の治療において有用なＣＡＲであり得る。いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲは、ＣＤ５  ＣＡＲ及びＣＤ７  ＣＡＲなどのＴ細胞白血病の治療において有用なＣＡＲであり得る。いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲは、メソテリンＣＡＲ、ＧＤ２  ＣＡＲ、ＧＰＣ３  ＣＡＲ、Ｈｅｒ２  ＣＡＲ、ＥＧＦＲ  ＣＡＲ、Ｍｕｃ１  ＣＡＲ、ＥｐＣＡＭ  ＣＡＲ、ＰＤ−Ｌ１  ＣＡＲ、ＣＥＡ  ＣＡＲ、Ｍｕｃ１６  ＣＡＲ、ＣＤ１３３  ＣＡＲ、ＣＤ１７１  ＣＡＲ、ＣＤ７０  ＣＡＲ、ＣＬＤ１８  ＣＡＲ、ｃＭＥＴ  ＣＡＲ、ＥｐｈＡ２  ＣＡＲ、ＦＡＰ  ＣＡＲ、葉酸受容体ＣＡＲ、ＩＬ１３Ｒａ２  ＣＡＲ、ＭＧ７  ＣＡＲ、ＰＳＭＡ  ＣＡＲ、ＲＯＲ１  ＣＡＲ、及びＶＥＧＦＲ２  ＣＡＲなどの固形腫瘍の治療において有用なＣＡＲであり得る。
【０６３４】
本発明はまた、対象における腫瘍負荷を軽減する方法も提供する。いくつかの実施形態において。本明細書で使用される場合、「腫瘍負荷」は、対象におけるがん細胞の数またはがんの量を指す。いくつかの態様において、腫瘍負荷はまた、腫瘍細胞量も指す。いくつかの実施形態において、腫瘍は、対象の体内全体に散在性であり得る。一態様において、腫瘍は、白血病またはリンパ腫などの液性腫瘍であり得る。腫瘍負荷を減少させる方法は、対象に、治療上有効量の免疫細胞を投与することを含み得る。免疫細胞は、本明細書に記載の組成物を発現するように操作され得る。いくつかの実施形態において、本発明の組成物を発現する免疫細胞は、本明細書に記載の送達の経路のうちのいずれかを介して対象に投与され得る。免疫細胞を投与するための投薬レジメンもまた、本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、対象はまた、治療上有効量の刺激物質を投与され、免疫治療剤の発現を同調し得る。いくつかの態様において、免疫治療剤は、腫瘍負荷を軽減することが可能であり得る。リガンド／刺激物質投薬のためのレジメンもまた、提供される。腫瘍負荷の減少は、腫瘍画像化を含む当該技術分野で既知の方法のうちのいずれか、及びマーカータンパク質の測定によって測定され得る。いくつかの態様において、生物発光画像化は、腫瘍負荷を測定するために使用され得る。生物発光画像化は、ルシフェラーゼなどの生物発光タンパク質からの天然の発光を利用する。このような生物発光タンパク質は、好適な基質の添加によって光子を放出する化学反応に関与し得る。光子の放出は、高感度検出法によって捕捉され、定量化され得る。腫瘍細胞は、ルシフェラーゼを発現するように操作され得、腫瘍負荷を軽減するための本明細書に記載の組成物の有効性は、画像化によって定量化され得る。いくつかの態様において、腫瘍負荷は、光子フラックス（光子／秒）によって測定され得る。いくつかの実施形態において、光子フラックスは、腫瘍負荷と正に相関する。
【０６３５】
疾患及び毒素
様々な感染性疾患は、本発明の、薬学的組成物、バイオサーキット、バイオサーキット成分、エフェクターモジュール（それらのＳＲＥまたはペイロードを含む）で治療され得る。本明細書で使用される場合、「感染性疾患」という用語は、細菌、ウイルス、真菌、または寄生虫などの生物によってもたらされる任意の障害を指す。非限定的な例として、感染性疾患は、急性細菌性鼻副鼻腔炎、１４日間のはしか、にきび、慢性萎縮性皮膚炎（ＡＣＡ）−（潜在性ライム病の晩期皮膚症状）、急性出血性結膜炎、急性出血性膀胱炎、急性鼻副鼻腔炎、成人Ｔ細胞白血病−リンパ腫（ＡＴＬＬ）、アフリカ睡眠病、エイズ（後天性免疫不全症候群）、肺胞包虫症、アメーバ症、アメーバ性髄膜脳炎、アナプラズマ症、炭疽病、アルボウイルスまたはパラ感染症、回虫症−（回虫感染症）、無菌性髄膜炎、水虫（足白癬）、オーストラリアダニチフス、鳥インフルエンザ、バベシア症、細菌性血管腫症、細菌性髄膜炎、細菌性膣炎、バラニチス、バランティディア症、バング病、バルマ森林ウイルス感染症、バルトネラ症（ペルー疣症；キャリオン病；オロヤ熱）、コウモリＬｙｓｓａｖｉｒｕｓ感染症、ベイソア（チクレロ潰瘍）、Ｂａｙｌｉｓａｓｃａｒｉｓ感染症（アライグマ回虫感染症）、ビーバー熱、無鉤条虫、ベジェル（風土病性梅毒）、二相性髄膜脳炎、Ｂｌａｃｋ  Ｂａｎｅ、黒死病、黒色砂毛症、黒水熱、ブラストミセス症、新生児の膿漏、眼瞼炎、ボイルズ、ボルンホルム病（胸膜痛）、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｍｉｙａｍｏｔｏｉ病、ボツリヌス中毒症、ボタン熱、ブラジル紫斑熱、骨折熱、ブリル、細気管支炎、気管支炎、気管支炎、ブルセラ症（バング病）、腺ペスト、水疱性膿痂疹、鼻疽菌（鼻疽）、類鼻疽菌（類鼻疽症）、ブルーリ潰瘍（またマイコブルリ潰瘍）、ブッセ、ブッセブシュケ病（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ）、カリフォルニア脳炎、カンピロバクター感染症、カンジダ症、Ｃａｎｅｆｉｅｌｄ熱（カニコラ熱；７日間の発熱；ワイル病；レプトスピラ症；ｃａｎｅｆｉｅｌｄ熱）、カニコラ熱、毛頭虫症、カラート、カルバペネム耐性腸内細菌科（ＣＲＥ）、カーバンクル、キャリオン病、猫ひっかき病、洞窟病、中央アジア出血熱、中央ヨーロッパダニ、子宮頸癌、シャーガス病、軟性下疳（Ｃｈａｎｃｒｏｉｄ）（軟性下疳）、シカゴ病、水痘（水疱（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ））、チクレロ潰瘍、チクングニア熱、クラミジア感染症、コレラ、Ｃｈｒｏｍｏｂｌａｓｔｏｍｙｃｏｓｉｓ、シガテラ、クラップ、肝吸虫症（肝蛭感染症）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  Ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症、ウェルシュ菌（イプシロン毒素）、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｏｍｙｃｏｓｉｓ真菌感染（渓谷熱；砂漠リウマチ）、共尾虫症、コロラドダニ熱、Ｃｏｎｄｙｌｏｍａ  ａｃｃｕｍｉｎａｔａ、Ｃｏｎｄｙｌｏｍａ  ａｃｃｕｍｉｎａｔａ（いぼ）、扁平コンジローム、コンゴ熱、コンゴ出血熱ウイルス、結膜炎、牛痘、毛ジラミ、クリミア、クループ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｏｓｉｓ（Ｃｒｙｐｔｏ）、皮膚幼虫移行症、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉａｓｉｓ、Ｃｙｓｔｉｃ  ｈｙｄａｔｉｄ、嚢尾虫症、膀胱炎、Ｃｚｅｃｈｏｓｌｏｖａｋダニ、Ｄ６８（ＥＶ−Ｄ６８）、涙嚢炎（Ｄａｃｒｙｏｃｙｔｉｔｉｓ）、ダンディ熱、ダーリング病、シカバエ熱、デング熱（１、２、３、及び４）、砂漠リウマチ、悪魔のしぶり腹、二相性乳熱、ジフテリア、播種性血管内凝固、イヌ条虫、ドノヴァン症、ドノヴァン症（鼠径部肉芽腫）、ドラコンチア症、Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｏｓｉｓ、デューク病、ダムダム病、デュランニコラスファーブル病、小型条虫、Ｅ．Ｃｏｌｉ感染症（Ｅ．Ｃｏｌｉ）、東部ウマ脳炎、エボラ出血熱（エボラウイルス病ＥＶＤ）、エクトリックス、エールリヒア症（千年熱）、脳炎、ダニ再帰熱、地方病性梅毒、眼内炎、Ｅｎｄｏｔｈｒｉｘ、蟯虫症（蟯虫感染症）、エンテロトキシン−Ｂ中毒（Ｓｔａｐｈ  Ｆｏｏｄ中毒）、エンテロウイルス感染症、流行性角結膜炎、流行性回帰熱、流行性発疹チフス、喉頭蓋炎、エリシペリス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｉｓ）、類丹毒（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｃｏｓｉｓ）、慢性遊走性紅斑、伝染性紅斑、有縁性紅斑、多形性紅斑、結節性紅斑、癩性結節性紅斑、紅皮症、エスプンジア、真菌性菌腫、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｂｌａｓｔｏｍｙｃｏｓｉｓ、突発性発疹（第六病）、眼虫、Ｆａｒ  Ｅａｓｔｅｒｎダニ、肝蛭症、Ｆｉｅｖｒｅ  ｂｏｕｔｏｎｎｅｕｓｅ（ダニチフス）、第五病（伝染性紅斑）、Ｆｉｌａｔｏｗ−Ｄｕｋｅｓ病（熱傷様皮膚症候群；リッター病）、魚類条虫、フィッツヒューカーティス症候群−肝周囲炎、フリンダース島紅斑熱、インフルエンザ（インフルエンザ）、毛嚢炎、四隅疾患、四隅疾患（ヒト肺症候群（ＨＰＳ））、フランベシア、Ｆｕｒｕｎｃｕｌｏｓｉｓ、ガス壊疽、胃腸炎、性器ヘルペス、生殖器疣、ドイツはしか、ゲルストマンストロイスラーシャインカー（ＧＳＳ）、ジアルジア症、ギルクリスト病、歯肉炎、歯肉口内炎、鼻疽、腺熱（感染性単核球症）、顎口虫症、淋菌感染症（淋病）淋病、鼠径部肉芽腫肉芽腫（ドノヴァン症）、ギニア虫、ヘモフィルスインフルエンザ病、ハンバーガー病、ハンセン病−ハンセン病、ハンタン病、ハンタン−韓国出血熱、ハンタウイルス肺症候群、ハンタウイルス肺症候群（ＨＰＳ）、硬性下疳、硬性はしか、ヘーヴァヒル熱−ネズミ咬熱、アタマジラミ（Ｈｅａｄ  ａｎｄ  Ｂｏｄｙ  Ｌｉｃｅ）、ハートランド熱、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｏｓｉｓ、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎、ヘルパンギーナ、性器ヘルペス、口唇ヘルペス、ヘルペス新生児、汗腺炎、ヒストプラズマ症、ヒストプラスマ感染症ヒストプラス）、Ｈｉｓ−Ｗｅｒｎｅｒ疾患、ＨＩＶ感染症、鉤虫感染症、麦粒腫、麦粒腫（Ｓｔｙｅ）、ＨＴＬＶ、ＨＴＬＶ−関連脊髄症（ＨＡＭ）、ヒト顆粒球性エールリヒア症、ヒト単球性エールリヒア症、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒト肺症候群、包虫嚢胞、恐水病、膿痂疹、先天性（ドイツはしか）を含む、封入体結膜炎、封入体結膜炎−プール結膜炎−パンヌス、乳児下痢症、感染性単核球症、感染性心筋炎、感染性心膜炎、インフルエンザ、イソスポリア症、イスラエル斑点熱、日本脳炎、股部白癬、Ｊｏｒｇｅ  Ｌｏｂｏ病−ロボ真菌症、ジャングル黄熱病、フニンアルゼンチン出血熱、カラアザール、カポジ肉腫、ケロイド性芽球菌症、角結膜炎、クールー、キ��サヌール森林病、ラクロス脳炎、ラッサ出血熱、在郷軍人病（レジオネラ症敗血症）、レジオネラ肺炎、レミエール症候群（Ｐｏｓｔａｎｇｉｎａｌ  ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、レミング熱、ハンセン病、レプトスピラ症（七日熱；ワイル）、リステリア症（リステリア）、肝蛭感染症、ロボ真菌症、開口障害（Ｌｏｃｋｊａｗ）、ロア糸状虫症、跳躍病、ルートヴィヒ狭心症、肺蛭感染症、肺蛭感染症（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｉａｓｉｓ）、ライム病、性病性リンパ肉芽腫（ＬＧＶ）、Ｍａｃｈｕｐｏ  Ｂｏｌｉｖｉａｎ出血熱、マズラ足、マルデルピント（Ｍａｌ  ｄｅｌ  ｐｉｎｔｏ）、マラリア、悪性膿疱、マルタ熱、マールブルグ出血熱、マスター病、母体敗血症（産褥熱）、はしか、地中海斑点熱、類鼻疽（ホイットモア病）、髄膜炎、髄膜炎菌性疾患、ＭＥＲＳ、ミルカー結節、伝染性軟属腫、モニリア症、サル痘、単核球症、単核球症様症候群、旅行者にダメージを与える下痢（Ｍｏｎｔｅｚｕｍａ’ｓ  Ｒｅｖｅｎｇｅ）、麻疹（Ｍｏｒｂｉｌｌｉ）、ＭＲＳＡ（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）感染症、ムコール菌症−接合菌症、多臓器不全症候群またはＭＯＤＳ、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、おたふく風邪、ネズミチフス、マレーバレー脳炎（ＭＶＥ）、マイコブルリ潰瘍、マイコブルリ潰瘍−ブルーリ潰瘍、真菌性膣炎、筋炎、七日熱、壊死性筋膜炎、壊死性筋膜炎−１型、壊死性筋膜炎−２型、Ｎｅｇｉｓｈｉ、新世界紅斑熱、ノカルジア症、非淋菌性尿道炎、非ポリオ（非ポリオエンテロウイルス）、ノロウイルス感染症、北米ブラストミセス症、北アジアダニチフス、ノーウォークウイルス感染症、ノルウェー疥癬（Ｎｏｒｗｅｇｉａｎ  ｉｔｃｈ）、オハラ病、オムスク出血熱、オンコセリア症、爪甲真菌症、オピストルキス症、新生児眼炎（Ｏｐｔｈａｌｍｉａ  ｎｅｏｎａｔｏｒｉｕｍ）、口腔毛状白板症、Ｏｒｆ、東洋瘤腫、東洋紅斑熱、オルニトーシス（オウム熱；乾癬）、オロヤ熱、外耳炎、中耳炎、パンヌス、パラコクシジオイデス症（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｏｍｙｃｏｓｉｓ）、パラゴニミアシス、麻痺性貝中毒（麻痺性貝中毒）、爪周囲炎（ひょう疽）、耳下腺炎、ＰＣＰ肺炎、シラミ寄生症、肝臓紫斑病、骨盤内炎症性疾患、百日咳（Ｗｈｏｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｇｈとも呼ばれる）、フェオヒフォ真菌症、咽頭結膜熱、砂毛（白色砂毛）、砂毛（黒色砂毛）、ピッグベル、ピンクアイ結膜炎、ピンタ、蟯虫感染症、陥凹性角質溶解（Ｐｉｔｔｅｄ  Ｋｅｒａｔｏｌｙｓｉｓ）、癜風（Ｔｉｎｅａ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、ペスト；腺、胸膜痛、ニューモシスチス症、ニューモシスチス症（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｏｓｉｓ）、肺炎、肺（ペスト）、ポリオまたはポリオウイルス感染症、多嚢胞性包虫、ポンティアック熱、ブタ条虫、Ｐｏｓａｄａ−Ｗｅｒｎｉｃｋｅ病、狭心症敗血症、ポワッサン、進行性多巣性白質脳症、進行性風疹全脳炎、前立腺炎、偽膜性大腸炎、オウム病、産褥熱、膿疱性発疹（天然痘）、腎盂腎炎、門脈炎、Ｑ熱、化膿性扁桃腺炎、キンタナ熱（５日熱）、ウサギ熱、狂犬病、アライグマ回虫感染症、ネズミ咬熱、ラット条虫、ライター症候群、回帰熱、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染症、リウマチ熱、ロドトルーシス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌｏｓｉｓ）、リシン中毒、リケッチア痘瘡、リケッチア症、リフトバレー熱、白癬、リッター病、リバーブラインドネス、ロッキー山発疹熱、Ｒｏｓｅ  Ｈａｎｄｌｅｒ病（スポロトリクム症）、乳児のバラ発疹、バラ疹、ロス川熱、ロタウイルス感染症、回虫感染症、風疹、麻疹（Ｒｕｂｅｏｌａ）、ロシア春、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌｏｓｉｓ胃腸炎、サンジョアキンバレー熱、サンパウロ脳炎、サンパウロ熱、ＳＡＲＳ、疥癬感染症（Ｓｃａｂｉｅｓ）（ノルウェー疥癬）、熱傷様皮膚症候群、猩紅熱（Ｓｃａｒｌａｔｉｎａ）、住血吸虫症、スコンボイド、草原熱（Ｓｃｒｕｂ  ｔｙｐｈｕｓ）、千年熱、敗血症（敗血性ショック）、重症急性呼吸器症候群、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、志賀毒素Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＳＴＥＣ／ＶＴＥＣ）、Ｓｈｉｇｅｌｌｏｓｉｓ胃腸炎（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、新骨熱、帯状疱疹、輸送熱、シベリアダニチフス、副鼻腔炎、第六病、引っぱたかれた頬病（Ｓｌａｐｐｅｄ  ｃｈｅｅｋ  ｄｉｓｅａｓｅ）、睡眠病、天然痘（Ｖａｒｉｏｌａ）、カタツムリ熱、軟性下疳、南ダニ関連発疹病、スパルガノシス、スペランカー病、散発性チフス、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｏｓｉｓ、紅斑熱、春、セントルイス脳炎、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｆｏｏｄ中毒、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ感染症、Ｓｔｒｅｐ．咽喉、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ疾患、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ中毒性ショック症候群、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｃｉａｓｉｓ、麦粒腫、亜急性硬化性全脳炎、亜急性硬化性全脳炎（ＳＳＰＥ）、突発性急性呼吸器症候群、突発性発疹、外耳炎（Ｓｗｉｍｍｅｒ’ｓ  ｅａｒ）、水泳者かゆみ症、プール結膜炎、森林黄熱病、梅毒、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、脊髄癆（三期梅毒）、条虫症、Ｔａｉｇａ脳炎、タナー病、条虫感染症、側頭葉てんかん、側頭葉てんかん、テタニー（Ｌｏｃｋ  Ｊａｗ）、破傷風感染症、線虫感染症、ツグミ、ダニ、ダニチフス、白癬性毛瘡、頭部白癬、体部白癬、頑癬、手白癬、黒癬、足白癬、爪白癬、癜風、トルロプシス症、トルローシス、毒素性ショック症候群、トキソプラズマ症、伝染性海綿状（ＣＪＤ）、旅行者下痢、塹壕熱５、旋毛虫症、トリコモナス症、黄菌毛症、鞭虫症、熱帯性痙性不全対麻痺（ＴＳＰ）、トリパノソーマ症、結核（ＴＢ）、結核、野兎病、腸チフス、発疹チフス、軟性下疳、波状熱、都市黄熱、尿道炎、膣炎
、膣症、バンコマイシン中間（ＶＩＳＡ）、バンコマイシン耐性（ＶＲＳＡ）、水痘、ベネズエラウマ脳炎、ペルー疣症、コレラ菌（コレラ）、ビブリオ症（ビブリオ）、ビンセント病または塹壕口腔炎、ウイルス性結膜炎、ウイルス性髄膜炎、ウイルス性髄膜脳炎、ウイルス性発疹、内臓幼虫移行症、ボミト黒人病、外陰膣炎、いぼ、ウォーターハウス、ワイル病、西ナイル熱、西部ウマ脳炎、ホイップル病、鞭虫感染症、白色砂毛、ひょう疽、ホイットモア病、冬季下痢症、Ｗｏｌｈｙｎｉａ熱、ウールソーター病、イチゴ腫、黄熱病、エルシニア症、エルシニア症（エルシニア）、ザホルスキー病、ジカウイルス病、帯状疱疹、接合菌症、ジョンカニンガムウイルス（ＪＣＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、単純ヘルペスウイルス１及び２、ヒトサイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、コロナウイルス、ポックスウイルス、エンテロウイルス７１、風疹ウイルス、ヒトパピローマウイルス、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ肺炎、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｉｒｉｄａｎｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン中間Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＶＩＳＡ）、バンコマイシン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＶＲＳＡ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  Ｔｅｔａｎｉ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｔｕｓｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、カンジダ（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ及びＣ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、及び／または任意の他の感染性疾患、障害、もしくは症状であり得る。
【０６３６】
様々な毒素は、本発明の、薬学的組成物、バイオサーキット、バイオサーキット成分、エフェクターモジュール（それらのＳＲＥまたはペイロードを含む）で治療され得る。毒素の非限定的な例には、リシン、炭疽菌、志賀毒素、及び志賀様毒素、ボツリヌス毒素が含まれる。
【０６３７】
様々な熱帯病は、本発明の、薬学的組成物、バイオサーキット、バイオサーキット成分、エフェクターモジュール（それらのＳＲＥまたはペイロードを含む）で治療され得る。熱帯病の非限定的な例には、チクングンヤ熱、デング熱、シャーガス病、狂犬病、マラリア、エボラウイルス、マールブルグウイルス、ウエストナイルウイルス、黄熱病、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルスが含まれる。
【０６３８】
様々な食中毒及び胃腸炎は、本発明の、薬学的組成物、バイオサーキット、バイオサーキット成分、エフェクターモジュール（それらのＳＲＥまたはペイロードを含む）で治療され得る。食中毒及び胃腸炎の非限定的な例は、ロタウイルス、ノーウォークウイルス（ノロウイルス）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、赤痢アメーバ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのエンテロトキシンＢ、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｅ型肝炎、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａが含まれる。
【０６３９】
様々な感染性因子は、本発明の、薬学的組成物、バイオサーキット、バイオサーキット成分、エフェクターモジュール（それらのＳＲＥまたはペイロードを含む）で治療され得る。感染性因子の非限定的な例には、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｉｕｍ、Ａｓｃａｒｉｓ  ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ  ｓｐ、Ｂａｒｍａｈ  Ｆｏｒｅｓｔウイルス、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｈｅｎｓｅｌａｅ、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｑｕｉｎｔａｎａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのベータ毒素、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｍｉｙａｍｏｔｏｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐ．、Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ毒素、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓウイルス、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａウイルス、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ細菌、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｃｏｌｏｒａｄｏダニ熱ウイルス、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍｕｍ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ、ｃｏｘｓａｃｋｉｅ  Ａ、ｃｏｘｓａｃｋｉｅ  Ｂ、Ｃｒｉｍｅａｎ−Ｃｏｎｇｏ出血熱ウイルス、ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、ｄｅｎｇｕｅウイルス、Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｅｑｕｉｎｅ脳炎ウイルス、Ｅｂｏｌａウイルス、ｅｃｈｏｖｉｒｕｓ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｅｑｕｉ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｓｐ．、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ  ７１、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ａｅｇｙｐｔｉｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、ｈａｎｔａｖｉｒｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎、単純ヘルペスウイルス１及び２、ヒトヘルペスウイルス６、ヒトヘルペスウイルス８、ヒト免疫不全ウイルス１及び２、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ及びＩＩ、インフルエンザウイルス（Ａ、Ｂ、Ｃ）、Ｊａｍｅｓｔｏｗｎ  Ｃａ���ｙｏｎウイルス、日本脳炎抗原性、日本脳炎ウイルス、Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｈａｍウイルス、ｊｕｎｉｎｖｉｒｕｓ、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｋｙａｓａｎｕｒ  Ｆｏｒｅｓｔ  Ｄｉｓｅａｓｅウイルス、Ｌａ  Ｃｒｏｓｓｅウイルス、Ｌａｓｓａｖｉｒｕｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｃｈｏｒｉｏｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓウイルス、ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ、Ｍａｃｈｕｐｏウイルス、Ｍａｒｂｕｒｇウイルス、はしかウイルス、ＭＥＲＳコロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｅｄｅｎｔａｒｉｕｓ、Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ  ｓｐ．、Ｍｏｌｌｕｓｃｉｐｏｘｖｉｒｕｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｍｏｒｂｉｌｌｉ−Ｒｕｂｅｏｌａウイルス、Ｍｕｍｐｓウイルス、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｃｅｒａｎｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐ、Ｎａｉｒｏｖｉｒｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｎｏｒｗａｌｋウイルス、ノロウイルス、Ｏｍｓｋ出血熱ウイルス、ｐａｐｉｌｌｏｍａウイルス、ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａウイルス１〜３、ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓ、ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ  Ｂ１９、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐ．、ポリオウイルスＩ、ＩＩ、及びＩＩＩ型、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、狂犬病ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、リシン毒素、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｃｏｎｏｒｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｈｏｎｅｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ、Ｒｏｓｓ  Ｒｉｖｅｒウイルス、ロタウイルス、ｒｕｂｅｌｌａウイルス、セントルイス脳炎、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓａｒｃｏｐｔｅｓ  ｓｃａｂｉｅｉ、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ．、志賀毒素及び志賀様毒素、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐ．、Ｓｉｎ  Ｎｏｍｂｒｅウイルス、Ｓｎｏｗｓｈｏｅ  ｈａｒｅウイルス、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ａ〜Ｈ群、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ  ｓｕｂｓｐ．Ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｔｒｅｐｏ��ｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ  ｖａｒ．ｃａｒａｔｅｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ  ｖａｒ．ｅｎｄｅｍｉｃｕｍ、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ  ｗｈｉｐｐｅｌｉｉ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、Ｖａｒｉｃｅｌｌａ−Ｚｏｓｔｅｒウイルス、ｖａｒｉｏｌａ  ウイルス、コレラ菌、ウエストナイルウイルス、黄熱病ウイルス、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ、及びジカウイルスが含まれる。
【０６４０】
様々な奇病は、本発明の、薬学的組成物、バイオサーキット、バイオサーキット成分、エフェクターモジュール（それらのＳＲＥまたはペイロードを含む）で治療され得る。本明細書で使用される場合、「奇病」という用語は、わずかな比率の集団に影響を及ぼす任意の疾患を指す。非限定的な例として、奇病は、尖頭合指症、先端皮膚炎、アジソン病、アディ症候群、アラジール症候群、アミロース、筋萎縮性側索硬化症、エンジェルマン症候群、好酸球増加を伴う血管リンパ過形成、アーノルド・キアリ奇形、関節炎、若年性リウマチ、アスペルガー症候群、バルデー・ビードル症候群、バレット食道、ベックウィズヴィーデマン症候群、ベーチェット症候群、ブルーム症候群、ボーエン病、腕神経叢神経障害、ブラウン・シーカー症候群、バッドキアリ症候群、バーキットリンパ腫、癌２５６、ウォーカー、カロリ病、シャルコー・マリー・トゥース病、チェディアック・東症候群、キアリ・フロメル症候群、点状軟骨異形成症、結腸偽性閉塞症、結腸直腸新生物、遺伝性非ポリポーシス、頭蓋顔面ジストーシス、クロイツフェルト・ヤコブ症候群、クローン病、クッシング症候群、嚢胞性線維症、ダンディ・ウォーカー症候群、デランジェ症候群、認知症、血管、疱疹状皮膚炎、ディジョージ症候群、シルダー汎発性脳硬化症、デュアン退縮症候群、デュプイトラン攣縮、エプスタイン奇形、アイゼンメンゲルコンプレックス、エリス・ヴァン・クレベルト症候群、脳炎、内軟骨腫症、中毒性表皮壊死症、顔面片側萎縮、第ＸＩＩ因子欠乏症、ファンコニ貧血、フェルティ症候群、線維性異形成症、多骨性、フォックス−フォーダイス病、フリードライヒ失調症、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ガードナー症候群、ゴーシェ病、ゲルストマン症候群、巨大リンパ節過形成、グリコーゲン蓄積症Ｉ型、グリコーゲン蓄積症ＩＩ型、グリコーゲン蓄積症ＩＶ型、グリコーゲン蓄積症Ｖ型、グリコーゲン蓄積症ＶＩＩ型、ゴールデンハル症候群、ギラン・バレー症候群、ハラーマン症候群、過誤腫症候群、多発性、ハートナップ病、肝レンズ核変性症、肝レンズ核変性症、遺伝性感覚及び運動神経障害、ヒルシュスプルング病、組織球性壊死性リンパ節炎、組織球増殖症、ランゲルハンス細胞、ホジキン病、ホーナー症候群、ハンチントン病、高アルドステロン症、多汗症、骨化過剰症、広汎性特発性骨増殖症、下垂体機能低下症、不適切なＡＤＨ症候群、腸ポリープ、アイザック症候群、カールタジュナー症候群、キーンズ・セイアー症候群、クリペル・ファイル症候群、クリッペル−トレノネイ−ウェーバ症候群、クリューバー・ビューシー症候群、コルサコフ症候群、ラフォーラ病、Ｌａｍｂｅｒｔ−Ｅａｔｏｎ筋無力症候群、ランドウ・クレフナー症候群、ランガー・ギーディオン症候群、リー病、レッシュ・ナイハン症候群、大脳白質萎縮症、球様細胞、リー・フラウメニ症候群、ロングＱＴ症候群、マチャドジョセフ病、マロリーワイス症候群、マレック病、マルファン症候群、メッケル憩室、メイジ症候群、メルカーソン・ローゼンタール症候群、メニエール病、ミクリチ病、ミラー・フィッシャー症候群、メビウス症候群、もやもや病、粘膜皮膚リンパ節症候群、ムコ多糖症Ｉ型、ムコ多糖症ＩＩ型、ムコ多糖症ＩＩＩ型、ムコ多糖症ＩＶ型、ムコ多糖症ＶＩ型、多発性内分泌腺腫１型、ムコポリサッカリド症プロキシ、筋萎縮、脊髄、ナルコレプシー、神経軸索ジストロフィー、視神経脊髄炎、神経セロイドリポフスチン症、ニーマン−ピック病、ヌーナン症候群、視神経萎縮症、遺伝性、変形性骨炎、骨軟骨炎、骨軟骨異形成症、骨溶解、必須、パジェット病乳房外、パジェット病、乳房、脂肪織炎、結節性非化膿性、パピヨン・ルフェーブル病、麻痺、ペリツェウス・メルツバッハー病、天疱瘡、良性家族性、陰茎硬化、心膜炎、収縮性、ペルオキシソーム病、プーツ・ジェガーズ症候群、脳のピック病、ピエール・ロビン症候群、色素沈着症、苔癬状粃糠疹、多嚢胞性卵巣症候群、多発性嚢胞症候群、自己免疫、ウィリー症候群、瞳孔障害、レット症候群、ライ症候群、ルービンシュタイン・タイビー症候群、サンドホフ病、肉腫、ユーイング、シュニッツラー症候群、シェーグレン症候群、シェーグレン・ラーソン症候群、スミス・レムリ・オピッツ症候群、脊髄性筋萎縮症、脊髄性筋萎縮症ウェーバー症候群、発汗、味覚、高安動脈炎、タンジール病、テイサックス病、血栓血管炎閉塞症、甲状腺炎、自己免疫、プラダー・ウィリ症候群、眼孔障害、レット症候群、ライ症候群、ルビンシュタイン・テイビ症候群、サンドホフ病、肉腫、ユーイングの、シュニッツラー症候群、シェーグレン症候群、シェーグレン・ラルソン症候群、スミス・レムリ・オピッツ症候群、小児脊髄性筋萎縮症、スタージ・ウェーバー症候群、発汗、味覚、高安動脈炎、タンジアー病、テイ・サックス病、閉塞性血栓血管炎、甲状腺炎、自己免疫、ティーツェ症候群、トガウイルス科感染症、トローザ・ハント症候群、トゥレット症候群、ぶどう膜髄膜脳炎（Ｕｖｅｏｍｅｎｉｎｇｏｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｃ）症候群、ワールデンブルグ症候群、ウェゲナー肉芽腫症、ワイル病、ウェルナー症候群、ウィリアムズ症候群、ウィルムス腫瘍、ウォルフ・パーキンソン・ホワイト症候群、ウォルフラム症候群、ウォルマン病、ツェルヴェーガー症候群、ゾリンジャー・エリソン症候群、及びフォン・ヴィレブランド病であり得る。
【０６４１】
様々な自己免疫疾患及び自己免疫関連疾患は、本発明の、薬学的組成物、バイオサーキット、バイオサーキット成分、エフェクターモジュール（それらのＳＲＥまたはペイロードを含む）で治療され得る。本明細書で使用される場合、「自己免疫疾患」という用語は、身体がそれ自体の組織を攻撃する抗体を生成する疾患を指す。非限定的な例として、自己免疫疾患は、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、自己免疫血管性浮腫、自己免疫無形成性貧血、自己免疫自律神経障害、自己免疫肝炎、自己免疫脂質異常症、自己免疫性免疫不全、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性じんましん、軸索及び神経ニューロパシー、バロ病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性疲労症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ−ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、クロ−ン病、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ疾患、本態性混合型クリオグロブリン血症、脱髄性ニューロパシー、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エバンス症候群、線維筋痛症＊＊、線維化性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）（旧称：Ｗｅｇｅｎｅｒ肉芽腫症）、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホシェーンライン紫斑病、妊娠性ヘルペス、低ガンマグロブリン血症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫調節疾患筋炎、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性糖尿病（１型糖尿病）、若年性筋炎、川崎症候群、ランバートイートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、苔癬硬化症、木質結膜炎、線形ＩｇＡ疾患（ＬＡＤ）、ループス（ＳＬＥ）、ライム病、慢性、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ミュシャハーバーマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（デビック）、好中球減少症、眼性瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓに関連する小児自己免疫性神経精神障害）、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パリーロンバーグ症候群、パーソンナージターナー症候群、扁平部炎（周辺性ブドウ膜炎）、天疱瘡、末梢性ニューロパシー、静脈周囲性脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発性動脈炎、多腺性自己免疫症候群Ｉ型、ＩＩ、及びＩＩＩ型、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開術後症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、特発性肺線維症、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、むずむず脚症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子及び精巣自己免疫、スティッフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、Ｓｕｓａｃ症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、血管炎、水疱症、水疱症皮膚病、白斑、ウェゲナー肉芽腫症（現在、多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）と呼ばれる）であり得る。
【０６４２】
様々な腎臓疾患は、本発明の、薬学的組成物、バイオサーキット、バイオサーキット成分、エフェクターモジュール（それらのＳＲＥまたはペイロードを含む）で治療され得る。非限定的な例として、腎臓疾患、アブデルハルデン・カウフマン・リグナック症候群（腎シスチン症）、腹部コンパートメント症候群、急性腎不全／急性腎傷害、急性大葉性ネフロニア（Ａｃｕｔｅ  Ｌｏｂａｒ  Ｎｅｐｈｒｏｎｉａ）、急性リン酸腎症、急性尿細管壊死、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損症、アデノウイルス腎炎、アルポート症候群、アミロイドーシス、心内膜炎及び他の感染症に関係するＡＮＣＡ脈管炎、血管筋脂肪腫、鎮痛薬性腎症、神経性食欲不振症及び腎臓疾患、アンジオテンシン抗体及び巣状分節状糸球体硬化症、抗リン脂質抗体症候群、抗ＴＮＦ−α療法関連糸球体腎炎、ＡＰＯＬ１突然変異、偽性ミネラルコルチコイド過剰症候群、アリストロキン酸腎症、漢方腎症、バルカン風土性腎症、バーター症候群、ビート尿、β−サラセミア腎臓疾患、胆汁円柱腎症、自然腎におけるＢＫポリオーマウイルス腎症、膀胱破裂、膀胱括約筋協調不全、膀胱タンポナーデ、越境者腎症（Ｂｏｒｄｅｒ−Ｃｒｏｓｓｅｒｓ’Ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）、バーボンウイルス（Ｂｏｕｒｂｏｎ  Ｖｉｒｕｓ）及び急性腎臓傷害、焼き畑サトウキビ収穫及び急性腎機能障害、バイエッタ及び腎不全、Ｃ１ｑ腎症、カンナビノイド妊娠悪阻急性腎不全、心腎症候群、カルフィルゾミブ誘発性腎臓傷害、ＣＦＨＲ５腎症、糸球体症を伴うシャルコー・マリー・トゥース病、サクランボ濃縮物（Ｃｈｅｒｒｙ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）及び急性腎臓傷害、コレステロール塞栓、チャーグ・ストラウス症候群、乳糜尿、コリスチン腎毒性、膠原線維性糸球体症、糸球体虚脱症、ＣＭＶに関係する糸球体虚脱症、先天性ネフローゼ症候群、腎錐体症候群（Ｃｏｎｏｒｅｎａｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（メインザー−サルディノ症候群またはサルディノ−メインザー症候群）、造影剤腎症、硫酸銅中毒、皮質壊死、クリゾチニブ関連急性腎臓傷害、クリオグロブリン血症、結晶性グロブリン誘発性腎症、結晶誘発性急性腎臓傷害、嚢胞性腎疾患、後天性シスチン尿、ダサチニブ誘発性ネフローゼ域タンパク尿、高密度沈着物疾患（２型ＭＰＧＮ）、デント病（Ｘ連鎖劣性疾患腎結石症）、透析不均衡症候群、糖尿病及び糖尿病性腎臓疾患、尿崩症、栄養補助食品及び腎不全、乱用薬物及び腎臓疾患、重複尿管、ＥＡＳＴ症候群、エボラ及び腎臓、異所性腎、異所性尿管、浮腫、膨潤、エルトハイム・チェスター病、ファブリー病、家族性低カルシウム尿性高カルシウム血症、ファンコーニ症候群、フレーザー症候群、フィブロネクチン糸球体症、線維性糸球体腎炎及びイムノタクトイド糸球体症、フレーリー症候群、巣状分節性糸球体硬化症、巣状硬化症、巣状糸球体硬化症、ギャロウェイ−モワト症候群、腎臓の関与を伴う巨細胞性側頭動脈炎、妊娠高血圧症、ギテルマン症候群、糸球体疾患、糸球体尿細管逆流、糖尿、グッドパスチャー症候群、染毛剤摂取及び急性腎臓傷害、ハンタウイルス感染ポドサイトパシー、血尿症（尿中の血液）、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、血球貪食症候群、出血���膀胱炎、腎症候性出血熱（ＨＦＲＳ、ハンタウイルス腎臓疾患、朝鮮出血熱、流行性出血熱、流行性腎症）、発作性夜間ヘモグロビン尿症及び溶血性貧血に関係するヘモジデリン沈着症、肝臓糸球体症、肝静脈閉塞性疾患、類洞閉塞症候群、Ｃ型肝炎関連腎臓疾患、肝腎症候群、ハーブ系サプリメント及び腎臓疾患、高血圧及び腎臓疾患、ＨＩＶ関連腎症（ＨＩＶＡＮ）、馬蹄腎（腎融合）、ハンナー潰瘍、高アルドステロン症、高カルシウム血症、高カリウム血症、高マグネシウム血症、高ナトリウム血症、高シュウ酸尿症、高リン血症、低カルシウム血症、低カリウム血症、低カリウム血症誘導性腎機能障害、低カリウム血性周期性四肢麻痺、低マグネシウム血症、低ナトリウム血症、低リン血症、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４腎症、間質性膀胱炎、疼痛性膀胱症候群（質問票）、間質性腎炎、アイブマーク症候群、ケタミン関連膀胱機能不全、腎臓結石、腎結石症、紅茶キノコ毒性、鉛腎症及び腎臓毒性、レプトスピラ症腎臓疾患、軽鎖沈着症、モノクローナル免疫グロブリン沈着症、リドル症候群、ライトウッド・オルブライト症候群、リポタンパク質糸球体症、リチウム腎毒性、ＬＭＸ１Ｂ突然変異が原因の遺伝性ＦＳＧＳ、腰痛血尿症、ループス、全身性エリテマトーデス、ループス腎臓疾患、ループス腎炎、抗好中球細胞質抗体血清反応陽性のループス腎炎、ライム病関連糸球体腎炎、マラリア腎症、悪性腫瘍関連腎臓疾患、悪性高血圧症、マラコプラキア、外尿道口狭窄症、髄質嚢胞性腎臓疾患、海綿腎、巨大尿管症、メラミン毒性及び腎臓、膜性増殖性糸球体腎炎、膜性腎症、メソアメリカ腎症、代謝性アシドーシス、代謝性アルカローシス、メトトレキサート関連腎不全、顕微鏡的多発血管炎、ミルク・アルカライ（Ｍｉｌｋ−ａｌｋａｌａｉ）症候群、微小変化型疾患、ＭＤＭＡ（モリー、エクスタシー、３，４−メチレンジオキシメタンフェタミン）及び腎不全、多嚢胞性異形成腎、多発性骨髄腫、骨髄増殖性新生物及び糸球体症、爪膝蓋骨症候群、腎石灰沈着症、腎性全身性線維症、腎下垂症（遊走腎、腎下垂（Ｒｅｎａｌ  Ｐｔｏｓｉｓ））、ネフローゼ症候群、神経因性膀胱、結節性糸球体硬化症、非淋菌性尿道炎、ナットクラッカー症候群、口腔顔面指趾症候群、オロト酸尿症、起立性低血圧症、起立性タンパク尿、浸透圧利尿、卵巣過剰刺激症候群、ページ腎、乳頭壊死、腎乳頭症候群（腎欠損症候群、分離腎形成不全）、パルボウイルスＢ１９及び腎臓、腹膜腎症候群、後部尿道弁、感染後糸球体腎炎、連鎖球菌感染後糸球体腎炎、結節性多発動脈炎、多発性嚢胞腎、後部尿道弁、妊娠高血圧腎症、プロポフォール注入症候群、モノクローナルＩｇＧ沈着を伴う増殖性糸球体腎炎（ナスル病）、プロポリス（ハチヤニ）関連腎不全、タンパク尿（尿中のタンパク質）、偽性高アルドステロン症、偽性高重炭酸血症（Ｐｓｅｕｄｏｈｙｐｏｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅｍｉａ）、偽性副甲状腺機能低下症、肺腎症候群、腎盂腎炎（腎臓感染）、膿腎症、放射線腎症、ラノラジン及び腎臓、リフィーディング症候群、逆流性腎症、急速進行性糸球体腎炎、腎膿瘍、腎周囲膿瘍、腎無形成、腎弓状静脈微小血栓関連急性腎臓傷害、腎動脈瘤、腎動脈狭窄、腎細胞癌、腎嚢胞、運動誘発性急性腎不全を伴う腎性低��酸血症、腎梗塞、腎性骨ジストロフィー、尿細管性アシドーシス、レニン分泌腫瘍（傍糸球体細胞腫）、オスモスタットがリセットされた状態（Ｒｅｓｅｔ  Ｏｓｍｏｓｔａｔ）、下大静脈後尿管、後腹膜線維化症、横紋筋融解症、肥満手術に関係する横紋筋融解症、リウマチ性関節炎関連腎臓疾患、サルコイドーシス腎臓疾患、塩喪失、腎及び脳住血吸虫症及び糸球体疾患、シムケ免疫性骨形成不全、強皮症腎クリーゼ、蛇行性腓骨多発性嚢胞腎症候群（Ｓｅｒｐｅｎｔｉｎｅ  Ｆｉｂｕｌａ−Ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、エクスナー症候群（Ｅｘｎｅｒ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、鎌状赤血球腎症，シリカ暴露及び慢性腎臓疾患、スリランカファーマーズ腎臓疾患（Ｓｒｉ  Ｌａｎｋａｎ  Ｆａｒｍｅｒｓ’Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ）、シェーグレン症候群及び腎臓疾患、合成カンナビノイドの使用及び急性腎傷害、造血細胞移植後の腎臓疾患、幹細胞移植に関係する腎臓疾患、菲薄基底膜病、良性家族性血尿、三角部炎、結核、尿生殖器、結節硬化症、尿細管形成異常、近位尿細管刷子縁への自己抗体に起因する免疫複合体性尿細管間質性腎炎、腫瘍崩壊症候群、尿毒症、尿毒性視神経障害、嚢胞性尿管炎、尿管瘤、尿道カルンクル、尿道狭窄、尿失禁、尿路感染症、尿路閉塞症、膀胱小腸瘻、膀胱尿管逆流、揮発性麻酔薬及び急性腎傷害、フォン・ヒッペル・リンドウ病、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症性糸球体腎炎、ワルファリン関連腎症、ハチ刺傷及び急性腎傷害、ウェゲナー肉芽腫症、多発血管性肉芽腫症、西ナイルウイルス及び慢性腎臓疾患、ならびにワンダーリッヒ症候群。
【０６４３】
様々な心臓血管疾患は、本発明の、薬学的組成物、バイオサーキット、バイオサーキット成分、エフェクターモジュール（それらのＳＲＥまたはペイロードを含む）で治療され得る。非限定的な例として、心臓血管疾患は、冠動脈疾患、脳血管疾患（卒中）、末梢血管疾患、心不全、リウマチ性心疾患、及び先天性心疾患としても知られている虚血性心疾患であり得る。
【０６４４】
様々な抗体欠乏は、本発明の、薬学的組成物、バイオサーキット、バイオサーキット成分、エフェクターモジュール（それらのＳＲＥまたはペイロードを含む）で治療され得る。非限定的な例として、抗体欠乏は、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）、常染色体劣性無ガンマグロブリン血症（ＡＲＡ）、一般的な可変免疫不全（ＣＶＩＤ）、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）サブクラス欠損、選択的ＩｇＡ欠損、特異的抗体欠損（ＳＡＤ）、乳児期の一過性低ガンマグロブリン血症、正常または上昇した免疫グロブリンを伴う抗体欠乏症、選択的ＩｇＭ欠乏症、胸腺腫を伴う免疫不全症（グッド症候群）、トランスコバラミンＩＩ欠乏症、いぼ、低ガンマグロブリン血症、感染症、ミエロカトヘキシス（ＷＨＩＭ）症候群、薬物誘導性抗体欠乏症、カッパ鎖欠乏症、重鎖欠乏症、減数分裂後の分離（ＰＭＳ２）障害、及び詳細不明の低ガンマグロブリン血症であり得る。
【０６４５】
様々な眼疾患は、本発明の、薬学的組成物、バイオサーキット、バイオサーキット成分、エフェクターモジュール（それらのＳＲＥまたはペイロードを含む）で治療され得る。非限定的な例として、眼疾患は、甲状腺眼疾患（ＴＥＤ）、グレーブス病（ＧＤ）、及び眼窩疾患、網膜変性症、白内障、眼球萎縮、黄斑変性症、レーベル遺伝性視神経症、網膜変性症（ｒｅｔｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、錐体杆体ジストロフィー、アッシャー症候群、レパード症候群、光恐怖症、及び羞明（ｐｈｏｔｏａｖｅｒｓｉｏｎ）であり得る。
【０６４６】
様々な神経学的疾患は、本発明の、薬学的組成物、バイオサーキット、バイオサーキット成分、エフェクターモジュール（それらのＳＲＥまたはペイロードを含む）で治療され得る。非限定的な例として、神経学的疾患は、透明中隔の欠如、酸性リパーゼ病、酸性マルタ症欠乏症、後天性てんかん様失語症、急性播種性脳脊髄炎、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、アディ瞳孔、アディ症候群、副腎白質ジストロフィー、脳梁欠損症、失認症、アイカルディ症候群、アイカルディ・グティエール症候群障害、ＡＩＤＳ−神経学的合併症、アレクサンダー病、アルパース病、交互性片麻痺、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、無脳症、動脈瘤、アンジェルマン症候群、血管腫症、無酸素症、抗リン脂質症候群、失語症、失行症、くも膜嚢胞、くも膜炎、アーノルド・キアリ奇形、動静脈奇形、アスペルガー症候群、運動失調、運動失調、毛細血管拡張症、運動失調及び小脳または脊髄小脳変性、心房細動及び脳卒中、注意欠陥多動性障害、自閉症スペクトラム障害、自律神経機能障害、背痛、バース症候群、バッテン病、ベッカーミオトニー、ベーチェット病、ベル麻痺、良性本態性眼瞼痙攣、良性局在性筋委縮症、良性頭蓋内圧亢進症、ベルンハルトロート症候群、ビンスワンガー病、眼瞼痙攣、ブロッホサルツバーガー症候群、腕神経叢分娩外傷、腕神経叢損傷、Ｂｒａｄｂｕｒｙ−Ｅｇｇｌｅｓｔｏｎ症候群、脳及び脊髄腫瘍、脳動脈瘤、脳外傷、ブラウンセカール症候群、球脊髄性筋萎縮症、皮質下梗塞及び白質脳症を伴う脳常染色体優性動脈症（ＣＡＤＡＳＩＬ）、カナバン病、手根管症候群、カウザルギー、海綿腫、海綿状血管腫、海綿状奇形、中心性頚髄症候群、中心性脊髄症候群、中心性疼痛症候群、橋中央ミエリン溶解、頭部障害、セラミダーゼ欠損症、小脳変性症、小脳形成不全、脳動脈瘤、脳動脈硬化症、脳萎縮症、脳性脚気、脳性海綿状奇形、脳性巨人症、脳低酸素、脳性麻痺、脳−目−顔−骨格症候群（ＣＯＦＳ）、シャルコーマリートゥース病、キアリ奇形、コレステロールエステル貯蔵病、舞踏病、有棘赤血球舞踏病、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（ＣＩＤＰ）、慢性起立性調節障害、慢性疼痛、コケイン症候群ＩＩ型、コフィンローリー症候群、コルポセファリー、昏睡、複合性局所疼痛症候群、先天性両側顔面神経麻痺、先天性筋無力症、先天性ミオパチー、先天性海綿状血管奇形、大脳皮質基底核変性症、頭部動脈炎、頭蓋骨癒合症、クリー脳炎、クロイツフェルト・ヤコブ病、蓄積外傷疾患、クッシング症候群、巨大細胞性封入体症、サイトメガロウイルス感染、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群、ダンシングアイズ−ダンス足症候群、ダンディ−ウォーカー症候群、ドーソン病、ドモルシア症候群、デジェリン−クルンプケ麻痺、認知症、認知症−パーキンソン病に対する脳深部刺激療法、腕神経叢ニューロパチー、認知症、多発梗塞性認知症、意味認知症、皮質下認知症、レビー小体型認知症、歯状核小脳性運動失調症、歯状核赤核萎縮症、皮膚筋炎、発達性失行（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｄｙｓｐｒａｘｉａ）、デビック症候群、糖尿病性ニューロパチー、びまん性硬化症、ドラベ症候群、自律神経障害、書字障害、失読症、嚥下障害、統合運動障害、���オクローヌス性小脳性共同運動障害、進行性小脳性共同運動障害、ジストニア、早期乳児てんかん性脳症、エンプティセラ症候群、脳炎、嗜眠性脳炎、脳ヘルニア、脳症、脳症（家族性乳児）、脳三叉神経領域血管腫症、てんかん、てんかん片麻痺、エルブ麻痺、エルブ−デュシェンヌ及びデジェリン−クルンプケ麻痺、本態性振戦、橋外髄鞘崩壊症、ファブリー病、ファール病、失神、家族性自律神経障害、家族性血管腫、家族性基底核石灰化症、家族性周期性麻痺、家族性痙性麻痺、ファーバー病、熱性けいれん、線維筋性形成異常、フィッシャー症候群、フロッピーインファント症候群、下垂足、フリードライヒ運動失調症、前頭側頭型認知症、ゴーシェ病、全身性ガングリオシド沈着症、ゲルストマン症候群、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、巨大軸索ニューロパチー、巨細胞性動脈炎、巨細胞性封入体病、球様細胞白質萎縮症、舌咽神経痛、グリコーゲン貯蔵症、ギランバレー症候群、ハラーフォルデン−シュパッツ病、頭部損傷、頭痛、持続性片側頭痛、片側顔面けいれん、交代性片麻痺、遺伝性ニューロパチー、遺伝性痙性対麻痺、多発神経炎型遺伝性失調症、帯状疱疹、耳性帯状疱疹、ヒラヤマ症候群、ホームズアディー症候群、全前脳症、ＨＴＬＶ−１関連脊髄症、ヒューズ症候群、ハンチントン病、水頭無脳症、水頭症、正常圧水頭症、水脊髄症、副腎皮質機能高進症、過眠症、筋緊張亢進、低血圧、低酸素症、免疫介在性脳脊髄炎、封入体筋炎、色素失調症、乳児低血圧症、小児神経軸索ジストロフィー、小児フィタン酸蓄積症、小児レフサム病、小児けいれん、炎症性ミオパチー、不脳症、腸性リポジストロフィー、頭蓋内嚢腫、頭蓋内圧高進、アイザック症候群、ジュベール症候群、キーンズ−セイア−症候群、ケネディ病、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群（Ｋｉｎｓｂｏｕｒｎｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、クライネ−レヴィン症候群、クリペル−ファイル症候群、クリッペル・トレノネー症候群（ＫＴＳ）、クリューバー−ビューシー症候群、コルサコフ健忘症候群、クラッベ病、クーゲルバーグ−ウェランダー病、クール−、Ｌａｍｂｅｒｔ−Ｅａｔｏｎ筋無力症候群、ランドウ−クレフナー症候群、外側大腿皮神経絞扼、外側髄症候群、学習障害、リー病、レノックス−ガストー症候群、レッシュ−ナイハン症候群、大脳白質萎縮症、Ｌｅｖｉｎｅ−Ｃｒｉｔｃｈｌｅｙ症候群、レビー小体型認知症、脂質蓄積症、リポイドタンパク症、滑脳症（Ｌｉｓｓｅｎｃｅｐｈａｌｙ）、閉じ込め症候群、ルー・ゲーリック病、ループス神経学的後遺症、ライム病−神経学的合併症、マチャド−ジョセフ病、大頭症、巨大頭蓋症、メルカーソン−ローゼンタール症候群、髄膜炎、髄膜炎及び脳炎、メンケス病、知覚異常性神経痛、異染性白質ジストロフィー、小頭症、偏頭痛、ミラー・フィッシャー症候群、軽度の卒中、ミトコンドリアミオパチー、メービウス症候群、モノマー性筋萎縮症、運動ニューロン疾患、もやもや病、ムコリピドーシス、ムコ多糖症、多発脳梗塞性認知症、多巣性運動ニューロパチー、多発性硬化症、多系統萎縮症、起立性低血圧を伴う多系統萎縮症、筋ジストロフィー、先天的筋無力症、重症筋無力症、アルパーズ症候群（Ｍｙｅｌｉｎｏｃｌａｓｔ��ｃ  Ｄｉｆｆｕｓｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、幼児のミオクロニー脳症、ミオクローヌス、ミオパシー、先天的ミオパシー、ナルコレプシー、甲状腺中毒性ミオパシー、ミオトニー、先天性筋緊張症、ナルコレプシー、神経有棘赤血球症（Ｎｅｕｒｏａｃａｎｔｈｏｃｙｔｏｓｉｓ）、脳への鉄の蓄積を伴う神経変性、神経線維腫症、神経弛緩薬性悪性症候群、ＡＩＤＳの神経性合併症、ライム病の神経性合併症、サイトメガロウィルス感染の神経性の後遺症（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）、ポンペ病の神経学的兆候、ループスの神経性後遺症、視神経脊髄炎、神経ミオトニー、神経セロイドリポフスチン症、神経細胞移動障害、遺伝的ニューロパチー、神経サルコイドーシス、神経梅毒、神経毒性、海綿状母斑、ニーマン−ピック病、オサリバン・マクラウド症候群、後頭神経痛、大田原症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、眼球クローヌス・ミオクローヌス、起立性低血圧症、使い過ぎ症候群、慢性疼痛、パントテン酸キナーゼ関連神経変性症、腫瘍随伴症候群、錯感覚、パーキンソン病、発作性舞踏病、発作性片側頭痛、ペイリー−ロンベルグ病、ペリツェウス−メルツバッハー病、ペナ−ショッカーＩＩ症候群、神経周囲嚢胞（Ｐｅｒｉｎｅｕｒａｌ  Ｃｙｓｔｓ）、周期性四肢麻痺、末梢ニューロパチー、脳室周囲白質軟化症、脳室周囲白質軟化症、遷延性植物状態、広汎性発達障害、フィタン酸蓄積症、ピック病、圧迫神経、梨状筋症候群、下垂体腫瘍、多発性筋炎、ポンペ病、孔脳症、ポリオ後症候群、帯状疱疹後神経痛、感染後脳脊髄炎、起立性低血圧症、体位性起立性頻拍症候群、体位性頻拍症候群、原発性歯状核萎縮症、原発性側索硬化症（Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｄｅｎｔａｔｕｍ  Ａｔｒｏｐｈｙ）、原発性側索硬化症、原発性進行性失語症、プリオン病、進行性顔面片側萎縮症、進行性歩行性運動失調症、進行性多巣性白質脳症、進行性硬化性ポリオジストロフィー、進行性核上性麻痺、相貌失認、偽トーチ症候群、偽性トキソプラズマ症候群、偽脳腫瘍、心因性運動、ラムゼー−ハント症候群Ｉ、ラムゼー−ハント症候群ＩＩ、ラスムッセン脳炎、反射性交感神経性ジストロフィー症候群、レフサム病、乳児レフサム病、反復動作障害、反復動作による傷害、下肢静止不能症候群、レトロウイルス関連脊髄症、レット症候群、ライ症候群、リウマチ性脳炎、ライリー・デイ症候群、仙骨神経根嚢胞、舞踏病、唾液腺疾患、サンドホフ病、シルダー病、裂脳症、ザイテルバーガー病、発作性障害、意味認知症、痴呆、中隔視神経異形成異常症、小児乳児難治性癲癇（ＳＭＥＩ）、揺さぶられっ子症候群、帯状疱疹、シャイ−ドレーガー症候群、シェーグレン症候群、睡眠時無呼吸、睡眠病、ソトス症候群、痙縮、脊椎破裂、脊髄梗塞、脊髄損傷、脊髄腫瘍、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳萎縮症、脊椎小脳変性症、スティール−リチャードソン−オルゼウスキー症候群、スティッフパーソン症候群、線条体黒質変性症、卒中、スタージ−ウェーバー症候群、亜急性硬化性全脳炎、皮質下動脈硬化性脳症、短時間持続性片側神経痛様（ＳＵＮＣＴ）頭痛、嚥下障害、シデナム舞踏病、失神、梅毒性脊髄麻痺硬化症、脊髄空洞症（Ｓｙｒｉｎｇｏｈｙｄｒｏｍｙｅｌｉａ）、脊髄空洞症（Ｓｙｒｉｎ��ｏｍｙｅｌｉａ）、全身性エリテマトーデス、脊髄癆、脊髄係留症候群、遅発性ジスキネジー、ターロブ嚢胞、テイ・サックス病、側頭動脈炎、脊髄係留症候群、トムゼン病（Ｔｈｏｍｓｅｎ’ｓ  Ｍｙｏｔｏｎｉａ）、胸郭出口症候群、甲状腺中毒性ミオパチー、三叉神経痛、トッド麻痺、トゥレット症候群、一過性虚血発作、伝達性海綿状脳症、横断性脊髄炎、外傷性脳損傷、振戦、三叉神経痛、熱帯性痙性不全対麻痺症、トロイヤー症候群、結節性硬化症、血管勃起腫瘍（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｌｅｃｔｉｌｅ  Ｔｕｍｏｒ）、中枢神経系及び末梢神経系の血管炎症候群、フォン−エコーノモ病、フォンヒッペル−リンダウ病（ＶＨＬ）、フォンレックリングハウゼン病、ワレンベルク症候群、ウェルドニッヒ・ホフマン病、ウェルニッケ−コルサコフ症候群、ウェスト症候群、むちうち、ウィップル病、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、ウォルマン病、Ｘ連鎖球延髄性筋萎縮であり得る。
【０６４７】
様々な心理学的障害は、本発明の、薬学的組成物、バイオサーキット、バイオサーキット成分、エフェクターモジュール（それらのＳＲＥまたはペイロードを含む）で治療され得る。非限定的な例として、精神障害は、無為、欠神発作、急性ストレス障害、適応障害、薬物ＮＯＳの有害作用、加齢関連認知低下、広場恐怖症、アルコール依存症、アルツハイマー病、記憶喪失（健忘障害としても知られている）、アンフェタミン依存症、神経性無食欲症、前向性健忘症、反社会性パーソナリティ障害（反社会病質としても知られている）、不安障害（全般性不安障害としても知られている）、抗不安薬関連障害、アスペルガー症候群（現在は自閉症スペクトラム障害の一部）、注意欠陥障害（ＡＤＤとしても知られている）、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤとしても知られている）、自閉症スペクトラム障害（自閉症としても知られている）、自食症、回避性パーソナリティ障害、バルビツレート関連障害、ベンゾジアゼピン関連障害、死別、蔵書癖、むちゃ食い障害、双極性障害（躁鬱病としても知られ、双極性Ｉ型及び双極性ＩＩ型を含む）、身体醜形障害、境界性知能機能、境界性パーソナリティ障害、呼吸関連睡眠障害、短期精神病性障害、歯ぎしり、神経性大食症、カフェイン依存症、大麻依存症、緊張病性障害、緊張型統合失調症、小児期健忘、小児期崩壊性障害（現在は自閉症スペクトラム障害の一部）、小児期発症流暢障害（以前は吃音として知られていた）、概日リズム障害、閉所恐怖症、コカイン関連障害、コミュニケーション障害、行為障害、転換性障害、コタール妄想、循環気質（気分循環性障害としても知られている）、デレリウム（Ｄｅｌｅｒｉｕｍ）、妄想性障害、認知症、依存性パーソナリティ障害（無力性パーソナリティ障害としても知られている）、離人性障害（離人症／現実感喪失障害としても知られている）、鬱病（大鬱病性障害としても知られている）、抑鬱性パーソナリティ障害、現実感喪失障害（現在は離人症／現実感喪失障害としても知られている）、自傷性皮膚症、非同期症候群、発達性協調障害、ディオゲネス症候群、書字表出障害、ディスパルーニア（Ｄｉｓｐａｒｅｕｎｉａ）、反社会性パーソナリティー障害、解離性健忘症、解離性遁走、解離性同一性障害（以前は多重パーソナリティー障害としても知られている）、ダウン症候群、失読症、性交疼痛、気分変調（現在は持続性抑鬱障害としても知られている）、摂食障害ＮＯＳ、エクボム症候群症候群（寄生虫妄想症）、情緒不安定パーソナリティ障害、遺糞症、遺尿症（夜尿症）、エロトマニア、露出障害、表出性言語障害、虚偽性障害、女性の性的障害、フェティシズム障害、二人組精神病、フレゴリの錯覚、窃触障害、遁走状態、ガンザー症候群、賭博依存症、性別違和（以前は性同一性障害としても知られている）、全般性不安障害、汎適応症候群、誇大妄想、幻覚剤依存症、Ｈａｌｔｌｏｓｅパーソナリティ障害、演技性パーソナリティ障害、原発性過眠症、ハンチントン病、性的欲求低下障害、心気症、軽躁病、多動症候群、過眠症、ヒステリー、衝動制御障害、衝動制御障害ＮＯＳ、吸入依存症、不眠症、知的発達障害、間欠性爆発性障害、ジュベール症候群、窃盗癖、コルサコフ症候群、まだら健忘症、言語障害、学習障害、大鬱病（大鬱病性障害としても知られている）、大鬱病性障害、男性の性的障害、詐病、数学障害、薬物関連障害、鬱病（Ｍｅｌａｎｃｈｏｌｉａ）、精神遅滞（現在は知的発達障害として知られる）、音嫌悪症候群、病的嫉妬、多重パーソナリティー障害（現在は解離性同一性障害として知られる）、ミュンヒハウゼン症候群、代理ミュンヒハウゼン、自己愛性パーソナリティ障害、ナルコレプシー、子供のネグレクト、神経認知障害（以前は認知症としても知られている）、神経弛緩薬関連障害、悪夢障害、ノンレム眼球運動、強迫性障害、強迫性パーソナリティ障害（強迫性パーソナリティ障害（Ａｎａｎｋａｓｔｉｃ  Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｔｙ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒ）としても知られている）、夢幻精神病、咬爪癖、オピオイド依存症、反抗的行為障害、オルトレキシア（ＯＮ）、疼痛障害、パニック発作、パニック障害、妄想性パーソナリティ障害、パーキンソン病、パートナー関係の問題、受動的攻撃的パーソナリティー障害、病的賭博、小児性愛障害、完璧主義、被害妄想、持続性抑鬱障害（気分変調としても知られている）、一般的健康状態に起因する人格変化、パーソナリティ障害、広汎性発達障害（ＰＤＤ）、フェンシクリジン関連障害、恐怖性障害、音韻障害、身体的虐待、異食症、多剤関連障害、産後鬱、心的外傷後憤慨障害（ＰＴＥＤ）、心的外傷後ストレス障害、早漏、月経前不快気分障害、心因性健忘症、健康状態に影響を及ぼす心理的要因、精神神経パーソナリティ障害、特定不能の精神病性障害、火炎性愛、反応性愛着障害、読字障害、再発性短期鬱病、関係障害、レム睡眠行動障害、下肢静止不能症候群、逆行性健忘症、レット症候群（現在は自閉症スペクトラム障害の一部）、反芻障害、サディスティックパーソナリティ障害、統合失調性感情障害、統合失調質パーソナリティ障害、統合失調症、統合失調症様障害、統合失調症性パーソナリティー障害、季節性情動障害、鎮静剤、催眠剤、または抗不安薬依存症、場面緘黙症、自滅性パーソナリティ障害、分離不安障害、性的障害（女性）、性的障害（男性）、セックス依存症、被虐性愛障害、加虐性愛障害、共有精神病性障害、睡眠覚醒障害、睡眠麻痺、夜驚症（現在は悪夢障害の一部）、社会不安障害、身体化障害、特定恐怖症、スタンダール症候群、常同運動障害、覚醒剤依存症、吃音（現在は小児期発症流暢症として知られる）、物質関連障害、遅発性ジスキネジア、タバコ依存症、トゥレット症候群、一過性チック障害、一過性全健忘症、服装倒錯性障害、抜毛癖、非定型身体表現性障害、膣痙、及び窃視障害であり得る。
【０６４８】
様々な肺疾患は、本発明の、薬学的組成物、バイオサーキット、バイオサーキット成分、エフェクターモジュール（それらのＳＲＥまたはペイロードを含む）で治療され得る。非限定的な例として、肺疾患は、石綿肺症、喘息、気管支拡張症、気管支炎、慢性咳、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、クループ、嚢胞性線維症、ハンタウイルス、特発性肺線維症、百日咳、胸膜炎、肺炎、肺塞栓症、肺高血圧症、肺高血圧症、サルコイドーシス、睡眠時無呼吸、肺活量測定、乳幼児突然死症候群（ＳＩＤＳ）、結核、アラジール症候群、自己免疫性肝炎、胆道閉鎖症、肝硬変、ＥＲＣＰ（内視鏡的逆行性胆道膵管造影）、及び血色素症であり得る。非アルコール性脂肪性肝炎、ポルフィリン症、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎。
【０６４９】
様々な骨疾患は、本発明の、薬学的組成物、バイオサーキット、バイオサーキット成分、エフェクターモジュール（それらのＳＲＥまたはペイロードを含む）で治療され得る。非限定的な例として、骨疾患は、骨粗鬆症、神経線維腫症、骨形成不全症（ＯＩ）、くる病、骨肉腫、軟骨形成不全、骨折、骨髄炎、骨のユーイング腫瘍、骨軟化症、股関節異形成、骨のパジェット病、大理石骨病、骨軟骨腫、骨癌、骨疾患、骨軟骨症、骨腫、線維性骨異形成、鎖骨頭蓋骨形成不全、骨巨細胞腫、骨嚢胞、代謝性骨疾患、メロレオストーシス、カルス、キャフィー症候群、及び下顎顔面骨形成不全症であり得る。
【０６５０】
様々な血液疾患は、本発明の、薬学的組成物、バイオサーキット、バイオサーキット成分、エフェクターモジュール（それらのＳＲＥまたはペイロードを含む）で治療され得る。非限定的な例として、血液疾患は、貧血及びＣＫＤ（ヘルスケア専門家に対する）、再生不良性貧血及び骨髄異形成症候群、深部静脈血栓症、ヘモクロマトーシス、血友病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、特発性血小板減少性紫斑病、鉄欠乏性貧血、悪性貧血、肺塞栓症、鎌状赤血球貧血、鎌状赤血球形質及び他の異常ヘモグロビン症、サラセミア、血栓性血小板減少性紫斑病、及びフォン・ヴィレブランド病であり得る。
【０６５１】
いくつかの実施形態において、本発明のバイオサーキットは、感染性疾患の治療のために使用され得る。本発明のバイオサーキットは、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、及びまたはＴ細胞などの養子細胞移入のために好適な細胞中に導入され得る。本発明のバイオサーキットによって治療された感染性疾患は、ウイルス、細菌、真菌、及び／または寄生虫によって引き起こされる疾患であり得る。本発明のＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａのペイロードは、感染性疾患を治療するのに有用である免疫細胞の増殖及び／または免疫細胞の耐性を増加させるために使用され得る。
【０６５２】
６．微生物叢
微生物叢の組成物の変化は、抗がん療法の作用に影響を及ぼし得る。共生的、片利共生的、及び病原性の微生物の様々な群は、身体のすべての環境に曝露した部位に存在し、本明細書において、「微生物叢」と称される。微生物叢が生息する可能性のある身体の環境に曝露した部位には、皮膚、鼻咽頭、口腔、気道、胃腸管、及び生殖器官が含まれる。
【０６５３】
いくつかの実施形態において、本発明のバイオサーキットで操作された微生物叢は、抗がん免疫療法の有効性を改善するために使用され得る。Ｓｉｖａｎらは、それらの腸内の微生物叢中のビフィズス菌を有するマウスが、免疫チェックポイントの阻害、例えば、皮下黒色腫腫瘍モデルにおける抗ＰＤ−Ｌ免疫療法に対してさらに応答することを見出した（Ｓｉｖａｎ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｍｅｎｓａｌ  Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ  ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１  ｅｆｆｉｃａｃｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１５；３５０：１０８４−９、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。一実施形態において、微生物叢に由来する、タンパク質、ＲＮＡ、及び／または他の生体分子は、抗がん免疫療法の有効性に影響を及ぼすためにペイロードとして使用され得る。他の実施形態において、微生物は、免疫療法の有効性を改善するために、本発明の免疫療法の組成物と共に送達され得る。
【０６５４】
７．治療剤を作製するためのツール及び薬剤
腫瘍体積または負荷の軽減を必要とする対象における腫瘍体積または負荷を軽減するための免疫療法剤を生成するために使用され得るツール及び薬剤が、本発明に提供される。対象におけるペイロードの構造、細胞のタイプ、遺伝子導入の方法、エクスビボでの拡張の方法及び時間、条件付け、ならびに腫瘍負荷の量及びタイプなどの相当数の変数は、治療剤の製造に関与する。このようなパラメータは、本明細書に記載のツール及び薬剤を使用して最適化され得る。
【０６５５】
細胞株
本開示は、本発明の組成物で遺伝子操作されている哺乳動物細胞を提供する。好適な哺乳動物細胞は、初代細胞及び不死化細胞株を含む。好適な哺乳動物細胞株には、ヒト胎児腎臓細胞株２９３、線維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３、ヒト結腸直腸癌細胞株ＨＣＴ１１６、卵巣癌腫細胞株ＳＫＯＶ−３、不死化Ｔ細胞株ジャーカット細胞、リンパ腫細胞株ラージ細胞、ＮＡＬＭ−６細胞、Ｋ５６２細胞、ＨｅＬａ細胞、ＰＣ１２細胞、ＨＬ−６０細胞、ＮＫ細胞株（例えば、ＮＫＬ、ＮＫ９６２、及びＹＴＳ）などが含まれるが、これらに限定されない。場合によっては、細胞は、不死化細胞株ではないが、その代わりに、個体から得られた細胞であり、本明細書において、初代細胞と称される。例えば、細胞は、個体から得られたＴリンパ球である。他の例には、個体から得られた、細胞毒性細胞、幹細胞、末梢血単核細胞、または前駆細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【０６５６】
ＳＲＥ、バイオサーキット、及び細胞株の追跡
いくつかの実施形態において、本発明の組成物または本発明の組成物によって修飾された細胞を追跡することが望ましくあり得る。追跡は、レポーター部分などのペイロードを使用することによって達成され得、これは、本明細書で使用される場合、入力に応答して、検出可能なシグナルを生成することができる任意のタンパク質を指す。例には、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、ペルオキシダーゼ、β−ラクタマーゼ、触媒抗体、生物発光タンパク質、例えば、ルシフェラーゼ、及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光タンパク質が含まれる。
【０６５７】
レポーター部分は、ＤＤに対応するリガンドの添加時にＤＤの応答をモニタリングするために使用され得る。他の例では、レポーター部分は、インビトロ、インビボ、またはエクスビボで細胞生存、持続性、細胞増殖、及び／または局在化を追跡するために使用され得る。
【０６５８】
いくつかの実施形態において、好ましいレポーター部分は、ルシフェラーゼタンパク質であり得る。一実施形態において、レポーター部分は、ウミシイタケルシフェラーゼまたは蛍ルシフェラーゼである。
【０６５９】
動物モデル
本発明の組成物の有用性及び有効性は、インビボでの動物モデル、好ましくはマウスモデルで試験され得る。使用されたマウスモデルは、マウス細胞が本発明の組成物で修飾され、同じ遺伝的背景のマウスで試験されている同系マウスモデルであり得る。例には、ｐＭＥＬ−１及び４Ｔ１マウスモデルが含まれる。あるいは、腫瘍細胞及び免疫細胞などのヒト細胞が、免疫不全マウスに導入される異種移植片モデルはまた、このような研究において使用さ得る。使用された免疫不全マウスは、ＣＢｙＪ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ／Ｊ、Ｂ６；１２９Ｓ７−Ｒａｇ１ｔｍ１Ｍｏｍ／Ｊ、Ｂ６．１２９Ｓ７−Ｒａｇ１ｔｍ１Ｍｏｍ／Ｊ、Ｂ６．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／ＳｚＪ、ＮＯＤ．１２９Ｓ７（Ｂ６）−Ｒａｇ１ｔｍ１Ｍｏｍ／Ｊ、ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｒａｇ１ｔｍ１ＭｏｍＰｒｆ１ｔｍ１Ｓｄｚ／Ｓｚ、ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／ＳｚＪ、ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＢ２ｍｔｍ１Ｕｎｃ／Ｊ、ＮＯＤ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２Ｒｇヌル、ヌード（ｎｕ）マウス、ＳＣＩＤマウス、ＮＯＤマウス、ＲＡＧ１／ＲＡＧ２マウス、ＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウス、ＩＬ２ｒｇヌルマウス、ｂ２ｍヌルマウス、ＮＯＤ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２ｒγヌルマウス、ＮＯＤ−ｓｃｉｄ−Ｂ２ｍヌルマウス、及びＨＬＡトランスジェニックマウスであり得る。
【０６６０】
細胞アッセイ
いくつかの実施形態において、免疫治療剤として本発明の組成物の有効性は、細胞アッセイを使用して評価され得る。本発明の組成物の発現のレベル、及び／または同一性は、タンパク質を特定する、及び／またはタンパク質レベルを定量化するための当該技術分野で周知の任意の方法に従って決定され得る。いくつかの実施形態において、このような方法は、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、及び免疫沈降を含み得る。
【０６６１】
本発明のＳＲＥを発現する細胞、バイオサーキット、及び組成物を機能的に特徴付けるための方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、機能的な特徴付けは、一次免疫細胞または不死化免疫細胞株中で行われ、細胞表面マーカーの発現によって決定されてもよい。Ｔ細胞に対する細胞表面マーカーの例には、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ  １４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ４５、及びＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ６９、ＣＤ２８、ＣＤ４４、ＩＦＮガンマが含まれるが、これらに限定されない。抗原提示細胞に対する細胞表面マーカーの例には、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ４５、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＦＮγ受容体、及びＩＬ２受容体、ＩＣＡＭ−１、及び／またはＦｃγ受容体が含まれるが、これらに限定されない。樹状細胞に対する細胞表面マーカーの例には、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、Ｂ７−２、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＭＲＦ−４４、ＣＭＲＦ−５６、ＤＣＩＲ、及び／またはデクチン−１などが含まれるが、これらに限定されず、一方で場合によっては、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６、及び／またはＣＤ５７が存在しない。ＮＫ細胞に対する細胞表面マーカーの例には、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、グラニュライシン、グランザイムＢ、グランザイムＫ、ＩＬ１０、ＩＬ２２、ＩＦＮｇ、ＬＡＰ、パーフォリン、及びＴＮＦａが含まれるが、これらに限定されない。
【０６６２】
８．遺伝子編集
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系は、急速に開発され、数多くのモデル生物及び細胞型に実施されている、ＴＡＬＥＮ及びＺＦＮなどの他のゲノム編集技術に取って代わる新規のゲノム編集系である。ＣＲＩＳＰＲは、配列モチーフであり、細菌及び古細菌ゲノム中に存在し、類似したサイズの固有のスペーサーによって分離した短い（ヌクレオチド約２４〜４８個）直接反復で構成される（Ｇｒｉｓｓａ  ｅｔ  ａｌ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ８，１７２（２００７）。これらには、一般に、ＣＲＩＳＰＲの管理及び機能に必要とされるＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質コード遺伝子のセットが隣接している（Ｂａｒｒａｎｇｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１５，１７０９（２００７）、Ｂｒｏｕｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２１，９６０（２００８）、Ｈａｆｔ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ  １，ｅ６０（２００５））。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、侵襲的な遺伝因子（例えば、ウイルス、ファージ、及びプラスミド）に対する適応免疫を提供する（Ｈｏｒｖａｔｈ  ａｎｄ  Ｂａｒｒａｎｇｏｕ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１０，３２７：１６７−１７０、Ｂｈａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，２０１１，４５：２７３−２９７、及びＢｒｒａｎｇｏｕ  Ｒ，ＲＮＡ，２０１３，４：２６７−２７８）。３つの異なる種類のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が細菌において分類されており、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が最も研究されている。細菌のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系では、トランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）／Ｃａｓ９の存在下で前駆体反復スペーサー転写産物（ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ）からプロセシングされた小型のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）がｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体と二本鎖を形成することができる。成熟した複合体は、ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ二本鎖中のスペーサー配列に相補的である標的二本鎖ＤＮＡ配列に補充されて、標的ＤＮＡをＣａｓ９エンドヌクレアーゼによって切断する（Ｇａｒｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１０，４６８：６７−７１、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１２，３３７：８１６−８２１、Ｇａｓｉｕｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１０９：Ｅ２５７９−２５８６、及びＨａｕｒｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１０，３２９：１３５５−１３５８）。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ系におけるｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体による標的認識及び切断は、標的配列に相補的であるｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ二本鎖中の配列（「プロトスペーサー」配列とも呼ばれる）だけでなく、標的ポリヌクレオチドのプロトスペーサー配列の３’末端に位置するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列も必要とする。ＰＡＭモチーフは、異なるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の間で様々であり得る。ＰＡＭモチーフは、異なるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の間で様々であり得る。
【０６６３】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系は、遺伝子編集に使用するために開発及び改変されており、真核細胞中であっても核酸配列の編集に極めて効果的かつ特異的な技術であることが証明されている。多くの研究者が、細菌ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に対する様々な改変を開示しており、、哺乳動物細胞及び植物細胞などの細胞中で核酸を操作するためにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を使用できることを示した。代表的な参考文献には、米国特許第８，９９３，２３３号、同第８，９９９，６４１号、同第８，９４５，８３９号、同第８，９３２，８１４号、同第８，９０６，６１６号、同第８，８９５，３０８号、同第８，８８９，４１８号、同第８，８８９，３５６号、同第８，８７１，４４５号、同第８，８６５，４０６号、同第８，７７１，９４５号、及び同第８，６９７，３５９号、米国特許公開第２０１５００３１１３４号、同第２０１５０２０３８７２号、同第２０１５０２１８２５３号、同第２０１５０１７６０１３号、同第２０１５０１９１７４４号、同第２０１５００７１８８９号、同第２０１５００６７９２２号、及び同第２０１５０１６７０００号が含まれ、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０６６４】
しかしながら、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系（例えば、ガイドＲＮＡ及びヌクレアーゼ）の効果及び活性を制御することは困難であり、問題となり得ることが多い。
【０６６５】
本発明のバイオサーキット、及び／またはそれらの成分のうちのいずれかは、その有用性を最適化するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを調節または同調するのに使用され得る。
【０６６６】
いくつかの実施形態において、本発明のエフェクターモジュールのペイロードは、Ｃａｓ９酵素の代替的アイソフォームまたはオルソログを含んでもよい。
【０６６７】
最も一般的に使用されるＣａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来し、ＲｕｖＣドメインはＤ１０Ａ  変異によって不活性化され得、ＨＮＨドメインはＨ８４０Ａ  変異によって不活性化され得る。
【０６６８】
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９の加えて、他のＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）もプログラム可能なゲノム編集に使用され得る。Ｃａｓ９配列は、６００個超の細菌株において特定されている。Ｃａｓ９ファミリーは、アミノ酸配列及びタンパク質サイズの高度な多様性を示すが、すべてのＣａｓ９タンパク質が、中心ＨＮＨヌクレアーゼドメイン及び分割ＲｕｖＣ／ＲＨａｓｅ  Ｈドメインを有する共通の構造を共有する。他の細菌株からのＣａｓ９オルソログの例には、Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｍａｒｉｎａ  ＭＢＩＣ１１０１７、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ａｒａｂａｔｉｃｕｍ  ＤＳＭ  ５５０１、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ  ＡＴＣＣ２３２７０、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＬＡＡ１、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ  ＤＳＭ  ４４６、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍ  ＤＳＭ１８０、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ  ｄｅｇｅｎｓｉｉ  ＫＣ４、Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ２９４１３、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｍａｘｉｍａ  ＣＳ−３２８、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ  ｓｔｒ．Ｐａｒａｃａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．ＰＣＣ  ８００５、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ  ＤＳＭ１２４４２、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ  ＭＬＳ１０、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  １＿１＿４７、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｂｅｃｓｃｉｉ  ＤＳＭ６７２５、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ  ａｕｄａｘｖｉａｔｏｒ  ＭＰ１０４Ｃ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ＿１０８、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｈａｇｅ  ｃ−ｓｔ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ａ３  ｓｔｒ．Ｌｏｃｈ  Ｍａｒｅｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｂａ４  ｓｔｒ．６５７、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ＱＣＤ−６３ｑ４２、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ  ｗａｔｓｏｎｉｉ  ＷＨ８５０１、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．ＡＴＣＣ５１１４２、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．ＣＣＹ０１１０、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．ＰＣＣ７４２４、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ  ｓｐ．ＰＣＣ  ７８２２、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ２５５−１５、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｍａｇｎａ  ＡＴＣＣ２９３２８、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｒａｃｅｍｉｆｅｒ  ＤＳＭ４４９６３、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ  ＰＢ２００３／０４４−Ｔ３−４、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ  ＡＴＣＣ１１７４１、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌｙｎｇｂｙａ  ｓｐ．．ＰＣＣ８１０６、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．ＥＬＢ１７、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ  ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ  Ｚ−７３０３、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ｐｈａｇｅ  Ｍａ−ＬＭＭ０１、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＮＩＥＳ−８４３、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ  ｍａｒｉｎａ  ＡＴＣＣ２３１３４、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ  ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ  ＰＣＣ７４２０、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ  Ｎｃ４、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ  ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ  ｓｕｂｓｐ．ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ  ＤＳＭ４３１１１、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ  ｓｐｕｍｉｇｅｎａ  ＣＣＹ９４１４、Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．ＰＣＣ７１２０、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ  ｓｐ．ＰＣＣ６５０６、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ  ＳＩ、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ  ｍｏｂｉｌｉｓ  ＳＪ９５、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ  ＣＪ２、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＪＳ６６６、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ  ＴＡＣ１２５、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ２５４８６、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ  ＡＴＣＣ２５４８６、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ  ＤＳＭ４０７３６、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ  ＤＳＭ４３０２１、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ７３３５、及びＴｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ  ＴＣＦ５２Ｂ（Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  Ｂｉｏｌ．，２０１３；１０（５）：７２６−７３７）中で特定されたＣａｓタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
【０６６９】
Ｃａｓ９オルソログに加えて、他のＣａｓ９バリアント、例えば、不活性なｄＣａｓ９の融合タンパク質及び異なる機能を有するエフェクタードメインが、ゲノム調節のためのプラットフォームとして働き得る。前述の酵素のうちのいずれも、本発明において有用であり得る。
【０６７０】
９．幹細胞用途
本発明のバイオサーキット及び／またはそれらの構成要素のうちのいずれも、細胞の調節された再プログラム化、幹細胞生着、またはそのような再プログラム化因子の制御されたもしくは調整可能な発現が有用である他の用途において利用され得る。
【０６７１】
本発明のバイオサーキットは、幹細胞または誘導された幹細胞含む細胞の再プログラム化に使用されてもよい。人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の誘導は、Ｔａｋａｈａｓｈｉ及びＹａｍａｎａｋａによって最初に達成され（Ｃｅｌｌ，２００６．１２６（４）：６６３−７６、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、彼らは、ウイルスベクターを使用して、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、ＯＣＴ４、及びＳＯＸ２（あるいはまとめてＫＭＯＳとして知られる）を発現させた。
【０６７２】
摘出可能なレンチウイルス及びトランスポゾンベクター、一時的プラスミドの繰り返しの適用、エピソーム及びアデノウイルスベクターも、ｉＰＳＣを導出する試みに使用されてきた（Ｃｈａｎｇ，Ｃ．−Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２００９．２７（５）：１０４２−１０４９、Ｋａｊｉ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００９．４５８（７２３９）：７７１−５、Ｏｋｉｔａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００８．３２２（５９０３）：９４９−５３、Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００８．３２２（５９０３）：９４５−９、Ｗｏｌｔｊｅｎ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００９、Ｙｕ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９：１１７２４８２、Ｆｕｓａｋｉ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｊｐｎ  Ａｃａｄ  Ｓｅｒ  Ｂ  Ｐｈｙｓ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ，２００９．８５（８）：３４８−６２；これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０６７３】
ヒトｉＰＳＣを生成するためのＤＮＡを使用しない方法も、細胞透過性ペプチド部分を組み込む組換えタンパク質による連続タンパク質形質導入（Ｋｉｍ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，２００９．４（６）：４７２−４７６、Ｚｈｏｕ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，２００９．４（５）：３８１−４；これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、及びＳｅｎｄａｉウイルスを使用する感染性トランス遺伝子（Ｆｕｓａｋｉ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｊｐｎ  Ａｃａｄ  Ｓｅｒ  Ｂ  Ｐｈｙｓ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ，２００９．８５（８）：ｐ．３４８−６２；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を使用して導出されている。
【０６７４】
本発明のエフェクターモジュールは、再プログラム化細胞を支援するために、ＯＣＴ４などのＯＣＴ、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、ＳＯＸ１５、及びＳＯＸ１８などのＳＯＸ、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、及びＫＬＦ５などのＫＬＦ、ｃ−ＭＹＣ及びｎ−ＭＹＣなどのＭＹＣ、ＲＥＭ２、ＴＥＲＴ、及びＬＩＮ２８、ならびにそれらのバリアントが含まれるがこれらに限定されない遺伝子のうちのいずれかを含むペイロードを含んでもよい。そのような再プログラム化因子の配列は、例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４５６０号で教示されており、当該出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０６７５】
いくつかの実施形態において、本発明のペイロードは、心臓系統仕様因子、例えば、Ｔボックス転写因子であるエオミソデルミン（ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ）（ＥＯＭＥＳ）、ＷＮＴ３及びＷＮＴ３ＡなどのＷＮＴシグナル伝達経路構成要素であってもよい。ＥＯＭＥＳは、心臓の発達に必要不可欠である。ＥＯＭＥＳによる心筋細胞のプログラム化には、正準なＷＮＴシグナル伝達経路の自己分泌活性化が伴い、逆もまた同様である。心臓系統の促進の助けとなる条件下で、ＷＮＴシグナル伝達はＥＯＭＥＳ及びＥＯＭＥＳを活性化し、これにより今後はＷＮＴシグナル伝達が促進されて、心臓系統を促進する自立的ループが創出される。過度に弱いまたは過度に強い活性化ループは、それぞれ、内胚葉及び他の中胚葉の結果など、非心臓系の結果を促進する。本発明のＤＤを使用して、ＥＯＭＥＳ及びＷＮＴペイロードレベルを調整し、原腸形成中に心臓仕様を開始及び／または維持する活性化ループを生成してもよい。
【０６７６】
ＶＩＩ．定義
本明細書の様々な場所で、本開示の組成物の特徴または機能がグループまたは範囲で開示される。本開示は、そのようなグループ及び範囲の構成要素のありとあらゆる個々の小結合を含むことが具体的に意図される。以下は、用語定義の非限定的な一覧である。
【０６７７】
活性：本明細書で使用される場合、「活性」という用語は、物事が起きているまたは行われている状態を指す。本発明の組成物は活性を有してもよく、この活性には、１つ以上の生物学的事象が伴ってもよい。いくつかの実施形態において、生物学的事象には、細胞シグナル伝達事象が含まれてもよい。いくつかの実施形態において、生物学的事象には、タンパク質と、１つ以上の対応するタンパク質、受容体、小分子、または本明細書に記載のバイオサーキット構成要素のうちのいずれかとの相互作用に関連する細胞シグナル伝達事象が含まれてもよい。
【０６７８】
養子細胞療法（ＡＣＴ）：「養子細胞療法」または「養子細胞移入」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞の患者への移入が関与する細胞療法を指し、本療法では、細胞は、患者から生じても別の個体から生じてもよく、患者に移入し戻される前に操作（改変）される。免疫エフェクター細胞であるＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、ならびに切除した腫瘍に由来するＢ細胞及び腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）など、治療用細胞は免疫系に由来してもよい。最も一般的に移入される細胞は、エクスビボでの増殖または操作後の自家抗腫瘍Ｔ細胞である。例えば、自家末梢血リンパ球は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の発現により、特異的な腫瘍抗原を認識するように遺伝子操作することができる。
【０６７９】
薬剤：本明細書で使用される場合、「薬剤」という用語は、生物学的、薬学的、または化学的な化合物を指す。非限定的な例には、単純なまたは複雑な有機または無機分子、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体誘導体、抗体断片、受容体、及び可溶性因子が含まれる。
【０６８０】
アゴニスト：「アゴニスト」という用語は、本明細書で使用される場合、受容体と組み合わさって細胞応答を生成することができる化合物を指す。アゴニストは、受容体に直接結合するリガンドであってもよい。あるいは、アゴニストは、例えば、（ａ）受容体に直接結合する別の分子と複合体を形成することによって、または（ｂ）さもなければ、別の化合物の修飾をもたらして、その結果、その他の化合物が受容体に直接結合するようにさせることによって、間接的に受容体と組み合わさってもよい。アンタゴニストは、特定の受容体または受容体のファミリーのアゴニスト、例えば、共刺激性受容体のアゴニストとして言及されてもよい。
【０６８１】
アンタゴニスト：「アンタゴニスト」という用語は、本明細書で使用される場合、それが結合する標的（複数可）の生物学的活性を阻害または軽減する任意の薬剤を指す。
【０６８２】
抗原：「抗原」という用語は、本明細書で使用される場合、癌増殖自体によって生じる腫瘍抗原など、免疫応答を、それが対象に導入されるか、または対象によってもたらされるときに誘発する分子として定義される。この免疫応答には、抗体産生、もしくは細胞毒性Ｔリンパ球及びＴヘルパー細胞などの特定の免疫適格細胞の活性化のいずれか、またはそれらの両方が関与してもよい。抗原は、生物、タンパク質／抗原のサブユニット、殺滅または不活性化された全細胞または溶解物に由来し得る。本発明との関係においては、「対象となる抗原」または「所望の抗原」という用語は、本発明の抗体、及び／または本明細書に記載のそれらの断片、変異体、バリアント、及び／または変化物と免疫特異的に結合または相互作用する、本明細書で提供されるタンパク質及び／または他の生体分子を指す。いくつかの実施形態において、対象となる抗原は、本明細書に記載のポリペプチドもしくはペイロードもしくはタンパク質、またはそれらの断片もしくは部分のうちのいずれかを含んでもよい。
【０６８３】
約：本明細書で使用される場合、対象となる１つ以上の値に適用される「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、述べられている参照値に類似する値を指す。ある特定の実施形態において、「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約」という用語は、別途記述のない限り、または別途文脈から明らかでない限り、述べられている参照値の両方向（より大きいまたはより小さい）で、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以下の内に入る値の範囲を指す（そのような数が可能値の１００％を超過する場合を除く）。
【０６８４】
アルキル：「アルキル」、「アルコキシ」、「ヒドロキシアルキル」、「アルコキシアルキル」、及び「アルコキシカルボニル」という用語は、本明細書で使用される場合、１〜１２個の炭素原子を含有し、及び／または置換されている場合もされていない場合もある、直鎖と分岐鎖との両方を含む。
【０６８５】
アルケニル：「アルケニル」及び「アルキニル」という用語は、単独でまたはより大きい部分の一部として本明細書で使用される場合、１〜１２個の炭素原子を含有する直鎖と分岐鎖との両方を含む。
【０６８６】
アリール：「アリール」という用語は、単独で、または「アラルキル」、「アラルコキシ」、もしくは「アリールオキシアルキル」など、より大きい部分の一部として本明細書で使用される場合、単環式、二環式、及び三環式の炭素環式環系を指し、これらの環系は、合計で５〜１４環員を有し、少なくとも１つの環が芳香族であり、系における各環が３〜８環員を含む。「アリール」という用語は、「アリール環」という用語と同義に使用され得る。
【０６８７】
芳香族：「芳香族」という用語は、本明細書で使用される場合、非局在化パイ電子を有する不飽和炭化水素環構造を指す。本明細書で使用される場合、「芳香族」は、単環式、二環式、または多環式芳香族化合物を指してもよい。
【０６８８】
脂肪族：「脂肪族」または「脂肪族基」という用語は、本明細書で使用される場合、直鎖もしくは分岐鎖のＣ１〜Ｃ８炭化水素鎖または単環式Ｃ３〜Ｃ８炭化水素または二環式Ｃ８〜Ｃ１２炭化水素を指し、これは、完全に飽和しているかまたは不飽和の１つ以上の単位を含むもの、完全に飽和しているかまたは不飽和の１つ以上の単位を含むが、芳香族ではないもの（本明細書では「炭素環」または「シクロアルキル」とも称される）、及び分子の残部への結合点を１つ有し、該二環式環系中の任意の個々の環が３〜７員を有するものである。
【０６８９】
と会合する：本明細書で使用される場合、「と会合する」、「抱合される」、「連結する」、「結合する」、及び「繋留される」という用語は、２つ以上の部分に関して使用されるとき、部分が、直接的に、または連結剤として働く１つ以上の追加の部分を介して、互いに物理的に会合または接続して、それらの部分が、構造が使用される条件、例えば生理学的条件の下で、物理的に会合したままであるように、十分に安定している構造を形成することを意味する。「会合」は、厳密に直接的共有化学結合による必要はない。これはまた、「会合した」存在が物理的に会合したままであるように十分に安定している、イオンもしくは水素結合またはハイブリダイゼーションに基づく接続を示してもよい。
【０６９０】
自家：「自家」という用語は、本明細書で使用される場合、物質が後に再導入されることになる個体と同じ個体に由来する任意の物質を意味する。
【０６９１】
バーコード：「バーコード」という用語は、本明細書で使用される場合、あるポリヌクレオチドまたはアミノ酸を別のポリヌクレオチドまたはアミノ酸と区別するポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列を指す。
【０６９２】
バイオサーキットシステム：本明細書で使用される場合、「バイオサーキット」または「バイオサーキットシステム」は、刺激物質への応答が、生物学的システム内の、生物学的システムの間の、生物学的システムのインジケータとして、または生物学的システム上に少なくとも１つのシグナルまたは結果をもたらす場合には、刺激物質及び刺激物質に応答する少なくとも１つのエフェクターモジュールを含む生物学的システム内のまたは生物学的システムにおいて有用なサーキットとして定義される。生物学的システムは、概して、任意の細胞、組織、臓器、臓器系、または生物、動物、植物、菌、細菌、またはウイルス性であり得ることが理解される。また、バイオサーキットが、本発明によって教示され、例えば、診断的、レポーターシステム、デバイス、アッセイ、またはキットを用いて、無細胞環境においてシグナルまたは結果に影響を及ぼす、刺激物質またはエフェクターモジュールを使用する人工サーキットであり得ることも理解される。人工サーキットは、１つ以上の電子、磁気性、または放射性成分もしくは部品と連通し得る。本発明との関係においては、バイオサーキットは、不安定化ドメイン（ＤＤ）バイオサーキットシステムを含む。
【０６９３】
チェックポイント因子：本明細書で使用される場合、チェックポイント因子は、機能がプロセスの接合部で作用する任意の部分または分子である。例えば、チェックポイントタンパク質、リガンド、またはレポーターは、細胞周期を失速させるかまたは加速する役割を果たし得る。
【０６９４】
共刺激分子：本明細書で使用される場合、免疫Ｔ細胞の活性化におけるその意味に従って、Ｔ細胞とＡＰＣとの間に関与し、ＡＰＣにおける抗原／ＭＨＣ複合体（ｐＭＨＣ）のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）認識によって生じるＴ細胞における刺激性シグナルを生成する、一群の免疫細胞表面受容体／リガンドを指す。
【０６９５】
サイトカイン：「サイトカイン」という用語は、本明細書で使用される場合、免疫システムの機能に影響を及ぼし、調節し得る多くの細胞型によって生成される多面的機能を有する低分子可溶性因子の一群を指す。
【０６９６】
送達：「送達」という用語は、本明細書で使用される場合、化合物、物質、要素、部分、カーゴ、またはペイロードを送達する行為または方式を指す。「送達剤」は、少なくとも部分的に、細胞、対象、または他の生物学的システム細胞への１つ以上の物質（本発明の化合物及び／または組成物を含むが、これらに限定されない）のインビボ送達を促進する任意の薬剤を指す。
【０６９７】
不安定化された：本明細書で使用される場合、「不安定な」、「不安定化する」、「不安定化領域」、または「不安定化ドメイン」という用語は、同じ領域または分子の出発、参照、野生型、または天然形態よりも不安定である領域または分子を意味する。
【０６９８】
操作された：本明細書で使用される場合、本発明の実施形態は、出発点、野生型、または天然分子から変化した特徴または特性（構造的かもしくは化学的かにかかわらず）を有するように設計される場合、「操作されている」。
【０６９９】
発現：本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」は、以下の事象の１つ以上を指す：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の生成（例えば、転写による）；（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、及び／または３’末端プロセシングによる）；（３）ポリペプチドまたはタンパク質へのＲＮＡの翻訳；（４）ポリペプチドまたはタンパク質の折り畳み；ならびに（５）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。
【０７００】
特性：本明細書で使用される場合、「特性」は、特徴、特性、または独特の要素を指す。
【０７０１】
製剤：本明細書で使用される場合、「製剤」は、本発明の少なくとも化合物、及び／または組成物及び送達剤を含む。
【０７０２】
断片：「断片」は、本明細書で使用される場合、一部分を指す。例えば、タンパク質の断片は、完全長タンパク質を消化することによって得られるポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態において、タンパク質の断片は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、抗体の断片は、抗体の部分を含む。
【０７０３】
機能性：本明細書で使用される場合、「機能性」生体分子は、それが特徴とする特性及び／または活性を示す構造及び形態での生物学的存在である。
【０７０４】
複素環：「複素環」、「ヘテロシクリル」、または「複素環式」という用語は、本明細書で使用される場合、１つ以上の環員がヘテロ原子である３〜１４の環員を有する単環式、二環式、または三環式の環員を指し、システムにおける各環は、３〜７の環員を含み、非芳香族である。
【０７０５】
ホットスポット：本明細書で使用される場合、「ホットスポット」または「変異ホットスポット」は、同じ遺伝子内の他の箇所と比較してより頻繁に（置換によって）変異されているタンパク質コード遺伝子中のアミノ酸位置を指す。
【０７０６】
親水性：本明細書で使用される場合、「親水性」は、水と相互作用するまたは水に対して親和性を有する分子を指す。
【０７０７】
疎水性：本明細書で使用される場合、「疎水性」は、水と相互作用しないまたは水に対して親和性を有しない分子を指す。
【０７０８】
免疫細胞：「免疫細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、２つの主要な系統である骨髄性前駆細胞（単球、マクロファージ、樹状細胞、巨核球、及び顆粒球などの骨髄性細胞を引き起こす）ならびにリンパ前駆細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などのリンパ系細胞を引き起こす）を引き起こす、骨髄中の造血幹細胞が起源である免疫システムの任意の細胞を指す。例示的な免疫システムは、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−ダブルネガティブＴ細胞、Ｔγδ細胞、Ｔαβ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、及び樹状細胞を含む。マクロファージ及び樹状細胞は、ペプチドと複合体形成されたＡＰＣの表面上で主要組織適合複合体（ＭＨＣ）受容体は、Ｔ細胞の表面上でＴＣＲと相互作用するとき、Ｔ細胞を活性化し得る特異性細胞である「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」と称され得る。
【０７０９】
免疫療法：「免疫療法」という用語は、本明細書で使用される場合、モノクローナル抗体、受容体−免疫グロブリン融合タンパク質、ワクチン、及び／または免疫細胞などの免疫学的ツールを使用する疾患の一種の治療を指す。
【０７１０】
インビトロ：本明細書で使用される場合、「インビトロ」という用語は、生物（例えば、動物、植物、または微生物）内ではなく、人工環境、例えば、試験管または反応容器、細胞培養物、ペトリ皿などで起こる事象を指す。
【０７１１】
インビボ：本明細書で使用される場合、「インビボ」という用語は、生物（例えば、動物、植物、または微生物またはそれらの細胞もしくは組織）内で起こる事象を指す。
【０７１２】
リンカー：本明細書で使用される場合、リンカーは、２つ以上のドメイン、部分、または実体を連結する部分を指す。一実施形態において、リンカーは、１０個以上の原子を含み得る。さらなる実施形態において、リンカーは、原子の群、例えば、１０〜１，０００個の原子を含み得、炭素、アミノ、アルキルアミノ、酸素、硫黄、スルホキシド、スルホニル、カルボニル、及びイミンなどであるが、これらに限定されない、原子または基からなり得る。いくつかの実施形態において、リンカーは、１つ以上のヌクレオチドを含む１つ以上の核酸を含み得る。いくつかの実施形態において、リンカーは、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態において、リンカーにより結合される部分には、原子、化学基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸塩基、糖、核酸、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質複合体、ペイロード（例えば、治療剤）、またはマーカー（化学、蛍光、放射性、または生物発光マーカーを含むが、これらに限定されない）が含まれ得るが、これらに限定されない。リンカーは、多量体またはコンジュゲートを形成するために、ならびに本明細書に記載のペイロードを投与するためのような、任意に有用な目的のために使用され得る。リンカーに組み込まれ得る化学基の例には、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、アミノ、エーテル、チオエーテル、エステル、アルキレン、ヘテロアルキレン、アリール、またはヘテロシクリルが含まれるが、これらに限定されず、それらの各々は、本明細書に記載されるように、任意に置換され得る。リンカーの例には、不飽和アルカン、ポリエチレングリコール（例えば、エチレンまたはプロピレングリコール単量体単位、例えば、ジエチレングリコール、ジポリエチレングリコール、トリエチレングリコール、トリプロピレングリコール、テトラエチレングリコール、またはテトラエチレングリコール）、及びデキストランポリマーが含まれるが、これらに限定されない。他の例には、還元剤または光分解を使用して切断され得る、例えば、ジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）またはアゾ結合（−Ｎ＝Ｎ−）などの、リンカー内の切断部位が含まれるが、これらに限定されない。選択的に切断可能な結合の非限定的な例には、例えば、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、または他の還元剤及び／または光分解の使用によって切断され得る、アミド結合、ならびに例えば、酸性または塩基性加水分解によって切断され得る、エステル結合が含まれる。
【０７１３】
親油性：本明細書で使用される場合、「親油性」という用語は、脂質または脂に対する親和性を指す。
【０７１４】
代謝産物：代謝産物は、細胞内に天然に存在する酵素によって触媒される代謝反応の中韓産物である。この用語は、通常、小分子、より大きな生体分子の断片、またはプロセスされた産物を説明するために使用される。
【０７１５】
修飾された：本明細書で使用される場合、「修飾された」という用語は、親または参照分子または実体と比較して、分子または実体の変化した状態または構造を指す。分子は、化学的、構造的、及び機能的を含む、多くの方式で修飾され得る。いくつかの実施形態において、本発明の化合物及び／または組成物は、非天然アミノ酸の導入によって修飾される。
【０７１６】
変異：本明細書で使用される場合、「変異」という用語は、変化及び／または改変を指す。いくつかの実施形態において、変異は、タンパク質（ペプチド及びポリペプチドを含む）及び／または核酸（ポリ核酸を含む）の変化及び／または改変であり得る。いくつかの実施形態において、変異は、タンパク質及び／または核酸配列の変化及び／または改変を含み得る。このような変化及び／または改変は、１つ以上のアミノ酸（タンパク質及び／またはペプチドの場合）及び／またはヌクレオチド（核酸及びポリ核酸の場合）の付加、置換、及びまたは欠失を含み得る。変異がアミノ酸及び／またはヌクレオチドの付加及び／または置換を含む、いくつかの実施形態において、このような付加及び／または置換は、１つ以上のアミノ酸及び／またはヌクレオチド残基を含み得、修飾されたアミノ酸及び／またはヌクレオチドを含み得る。変異、変化、または改変から得られる構築物、分子、または配列は、本明細書において、変異体と称され得る。
【０７１７】
新抗原：「新抗原」という用語は、本明細書で使用される場合、腫瘍細胞に存在するが、正常細胞には存在せず、胸腺におけるそれらの同種抗原特異的なＴ細胞の欠失（すなわち、中央耐性）を誘導しない、腫瘍抗原を指す。これらの腫瘍新抗原は、がん免疫療法のために必要な有効な免疫応答を誘導するために、病原体に類似した「外来」シグナルを提供し得る。新抗原は、特異的腫瘍に対して制限され得る。新抗原は、ミスセンス変異（ミスセンス新抗原）を有するペプチド／タンパク質、または新規のオープンリーディングフレーム（ｎｅｏＯＲＦ）からのアミノ酸の長く、完全に新規のストレッチを有する新しいペプチドであり得る。ｎｅｏＯＲＦは、アウトオブフレームの挿入または欠失（マイクロサテライト不安定を生じるＤＮＡミスマッチ修復の欠陥による）、遺伝子融合、終止コドンのリードスルー変異、または不適切にスプライスされたＲＮＡの翻訳によっていくつかの腫瘍において生成され得る（例えば、Ｓａｅｔｅｒｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２００１，９８：１３２５５−１３２６０）。
【０７１８】
オフターゲット：本明細書で使用される場合、「オフターゲット」は、任意の１つ以上の標的、遺伝子、細胞転写物、細胞、及び／または組織への任意の意図されない効果を指す。
【０７１９】
作動可能に連結される：本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」という語句は、２つ以上の分子、構築物、転写物、実体、部分などの間の機能的結合を指す。
【０７２０】
フェニル：本明細書で使用される場合、「フェニル」は、式Ｃ６Ｈ５を有する原子の環状基を指す。
【０７２１】
ペイロードまたは対象となるペイロード（ＰＯＩ）：「ペイロード」及び「対象となるペイロード（ＰＯＩ）」という用語は、本明細書で使用される場合、交換可能に使用される。対象となるペイロード（ＰＯＩ）は、機能が改変される任意のタンパク質または化合物を指す。本発明との関係においては、ＰＯＩは、先天性及び適応免疫システムの両方を含む、免疫システムの成分である。対象となるペイロードは、タンパク質、融合タンパク質をコードする融合構築物、または非コード遺伝子、またはそれらのバリアント及び断片であり得る。対象となるペイロードは、アミノ酸ベースであるとき、対象となるタンパク質と称され得る。
【０７２２】
薬学的に許容される賦形剤：「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、本明細書で使用される場合、薬学的組成物に存在し、対象において実質的に非毒性及び非炎症性である特性を有する活性剤（例えば、本明細書に記載されるように）以外の任意の成分を指す。いくつかの実施形態において、薬学的に許容される賦形剤は、活性剤を懸濁する及び／または溶解することができるビヒクルである。賦形剤は、例えば、粘着防止剤（ａｎｔｉａｄｈｅｒｅｎｔｓ）、酸化防止剤、結合剤、コーティング剤、圧縮助剤（ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｉｄｓ）、崩壊剤、色素（色）、軟化剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、薄膜形成剤またはコーティング剤、香味剤、着香剤、流動促進剤（流動性促進剤）、滑沢剤、防腐剤、印刷インキ、吸着剤、懸濁化剤または分散化剤、甘味剤、及び水和水を含み得る。例示的な賦形剤には、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋結合ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微小結晶セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、α化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、ショ糖、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、及びキシリトールが含まれるが、これらに限定されない。
【０７２３】
薬学的に許容される塩：本明細書に記載の化合物の薬学的に許容される塩は、酸または塩基部分をその塩形態である（例えば、遊離塩基を好適な有機酸と反応させることによって生成されるような）、開示される化合物の形態である。薬学的に許容される塩の例としては、アミンなどの塩基性残基の鉱酸塩または有機酸塩、カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩などが挙げられるが、これらに限定されない。代表的な酸付加塩には、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリル酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチニン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアネート、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが含まれる。代表的なアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、ならびにアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含むが、これらに限定されない、非毒性アンモニウム、第四級アンモニウム、及びアミンカチオンが含まれる。薬学的に許容される塩には、例えば、非毒性無機酸または有機酸から、従来の非毒性塩が含まれる。いくつかの実施形態において、薬学的に許容される塩は、従来の化学方法によって、塩基性または酸性部分を含有する親化合物から調製される。一般に、そのような塩は、これらの化合物の遊離酸型または遊離塩基型を、化学量論的量の適切な塩基または酸と、水中もしくは有機溶媒中で、またはその２つの混合物中で反応させることによって調製することができ、一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルなどの非水性媒体が好ましい。好適な塩の一覧は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．１４１８，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｕｓｅ，Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ  ａｎｄ  Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００８、及びＢｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，１−１９（１９７７）（これらの各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込��れる）において見出される。薬学的に許容される溶媒和物：「薬学的に許容される溶媒和物」という用語は、本明細書で使用される場合、好適な溶媒の分子が結晶格子に組み込まれる、化合物の結晶形態を指す。例えば、溶媒和物は、有機溶媒、水、またはそれらの混合物を含む溶液から結晶化、再結晶化、または沈殿によって調製され得る。好適な溶媒の例は、エタノール、水（例えば、一、二、及び三水和物）、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２−（１Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、２−ピロリドン、ベンジル安息香酸塩である。水が溶媒であるとき、その溶媒和物は、「水和物」と称される。いくつかの実施形態において、溶媒和物に組み込まれる溶媒は、溶媒和物が投与される（例えば、薬学的組成物の単位投与形態で）生物にとって生理学的に許容されるタイプであるか、またはそのようなレベルである。
【０７２４】
ピペラジン：本明細書で使用される場合、「ピペラジン」は、環内の適切な位置で２個の窒素原子を含有する６員環を指す。
【０７２５】
対象となるタンパク質：本明細書で使用される場合、「対象となるタンパク質」または「所望のタンパク質」という用語は、本明細書に提供されるもの、ならびにそれらの断片、変異体、バリアント、及び改変を含む。
【０７２６】
プリン：本明細書で使用される場合、「プリン」は、芳香族複素環構造を指し、複素環のうちの１つは、イミダゾール環であり、複素環のうちの１つは、ピリミジン環である。
【０７２７】
ピリミジン：本明細書で使用される場合、「ピリミジン」は、ベンゼンと同様の芳香族複素環構造を指し、炭素原子のうちの２つは、窒素原子によって置き換えられる。
【０７２８】
ピリドピリミジン：本明細書で使用される場合、「ピリドピリミジン」は、芳香族複素環構造を指し、複素環のうちの１つは、プリン環であり、複素環のうちの１つは、ピリミジン環である。
【０７２９】
キナゾリン：本明細書で使用される場合、「キナゾリン」は、芳香族複素環構造を指し、複素環のうちの１つは、ベンゼン環であり、複素環のうちの１つは、ピリミジン環である。
【０７３０】
安定した：本明細書で使用される場合、「安定した」は、反応混合物から有用な純度で単離後に残存するのに十分に強固であり、好ましくは効果的な治療剤へと製剤可能である、化合物または実体を指す。
【０７３１】
安定化される：本明細書で使用される場合、「安定化」、「安定化される」、「安定化領域」という用語は、安定させるまたは安定となることを意味する。いくつかの実施形態において、安定性は、絶対値に対して測定される。いくつかの実施形態において、安定性は、二次状態（ｓｔａｔｕｓ）もしくは状態（ｓｔａｔｅ）または参照化合物もしくは実態に対して測定される。
【０７３２】
標準ＣＡＲ：本明細書で使用される場合、「標準ＣＡＲ」という用語は、キメラ抗原受容体の標準設計を指す。細胞外ｓｃＦｖ断片、膜貫通ドメイン、及び１つ以上の細胞内ドメインを含むＣＡＲ融合タンパク質の成分は、単一の融合タンパク質として直線的に構成される。
【０７３３】
刺激応答エレメント（ＳＲＥ）：「刺激応答エレメント（ＳＲＥ）」という用語は、本明細書で使用される場合、エフェクターモジュールの１つ以上のペイロードに接合、結合、連結、または連通するエフェクターモジュールの成分であり、場合によっては、１つ以上の刺激物質へのエフェクターモジュールの応答性に関与する。本明細書で使用される場合、刺激へのＳＲＥの「応答性」の性質は、共有結合性相互作用または非共有結合性相互作用、直接もしくは間接連通、または刺激への構造的もしくは化学反応に特徴付けられ得る。さらに、刺激物質への任意のＳＲＥの応答は、程度または種類の問題であり得る。応答は、部分応答であり得る。応答は、可逆的応答であり得る。応答は、最終的に、調節シグナルまたは出力をもたらし得る。このような出力シグナルは、刺激物質への相対的な性質、例えば、１〜１００の調節効果、または例えば、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍またはそれ以上の要因の増加または減少をもたらし得る。ＳＲＥのある非限定的な例は、不安定化ドメイン（ＤＤ）である。
【０７３４】
対象：本明細書で使用される場合、「対象」または「患者」という用語は、本発明に従う組成物が、例えば、実験、診断、予防、及び／または治療目的のために投与され得る、任意の生物を指す。典型的な対象には、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、及びヒトなどの哺乳動物）及び／または植物が含まれる。
【０７３５】
Ｔ細胞：Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を生成する免疫細胞である。Ｔ細胞は、天然（抗原に曝露されない；ＴＣＭと比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ１２７、及びＣＤ４５ＲＡの発現の増加、及びＣＤ４５ＲＯの発現の減少）、メモリＴ細胞（ＴＭ）（抗原を経験した及び長寿命）、ならびにエフェクター細胞（抗原を経験した、細胞毒性）であり得る。ＴＭは、天然Ｔ細胞と比較して、中央メモリＴ細胞（ＴＣＭ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ、及びＣＤ９５の発現の増加、及びＣＤ５４ＲＡの発現の減少、ならびにエフェクターメモリＴ細胞（ＴＥＭ、天然Ｔ細胞もしくはＴＣＭと比較して、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡの発現の減少、及びＣＤ１２７の発現の増加）のサブセットにさらに分類され得る。エフェクターＴ細胞（ＴＥ）は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８の発現の減少を有する抗原を経験したＣＤ８＋細胞毒性Ｔリンパ球を指し、ＴＣＭと比較してグランザイム及びパーフォリンに対して陽性である。他の例示的なＴ細胞は、制御性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋（Ｆｏｘｐ３＋）制御性Ｔ細胞及びＴｒｅｇ１７細胞、ならびにＴｒ１、Ｔｈ３、ＣＤ８＋ＣＤ２８−、及びＱａ−１制限されたＴ細胞を含む。
【０７３６】
Ｔ細胞受容体：Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、ＭＨＣ受容体に結合する抗原ペプチドに特異的に結合することができる、可変抗原結合ドメイン、定常ドメイン、膜貫通領域、及び短い細胞質尾部を有する、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーを指す。ＴＣＲは、細胞の表面上または可溶形態で見出され得、一般に、α及びβ鎖（それぞれ、ＴＣＲα及びＴＣＲβとしても知られている）、またはγ及びδ鎖（それぞれ、ＴＣＲγ及びＴＣＲδとしても知られている）を有するヘテロ二量体からなる。ＴＣＲ鎖（例えば、α鎖、β鎖）の細胞外部分は、２つの免疫グロブリンドメイン、Ｎ末端にある可変ドメイン（例えば、α鎖可変ドメインまたはＶα、β鎖可変ドメインまたはＶβ）と、細胞膜に隣接する１つの定常ドメイン（例えば、α鎖定常ドメインまたはＣα及びβ鎖定常ドメインまたはＣβ）と、を含有する。免疫グロブリンと同様に、可変ドメインは、フレームワーク領域（ＦＲ）によって分離される相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する。ＴＣＲは、通常、ＴＣＲ複合体を形成するために、ＣＤ３複合体と関連する。本明細書で使用される場合、「ＴＣＲ複合体」という用語は、ＴＣＲとのＣＤ３の関連によって形成される複合体を指す。例えば、ＴＣＲ複合体は、１本のＣＤ３γ鎖、１本のＣＤ３δ鎖、２本のＣＤ３ε鎖、ＣＤ３ζ鎖のホモ二量体、１本のＴＣＲα鎖、及び１本のＴＣＲβ鎖からなり得る。あるいは、ＴＣＲ複合体は、１本のＣＤ３γ鎖、１本のＣＤ３δ鎖、２本のＣＤ３ε鎖、ＣＤ３ζ鎖のホモ二量体、１本のＴＣＲγ鎖、及び１本のＴＣＲδ鎖からなり得る。「ＴＣＲ複合体の成分」は、本明細書で使用される場合、ＴＣＲ鎖（すなわち、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、もしくはＴＣＲδ）、ＣＤ３鎖（すなわち、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、もしくはＣＤ３ζ）、または２つ以上ＴＣＲ鎖もしくはＣＤ３鎖の複合体（例えば、ＴＣＲα及びＴＣＲβの複合体、ＴＣＲγ及びＴＣＲδの複合体、ＣＤ３ε及びＣＤ３δの複合体、ＣＤ３γ及びＣＤ３εの複合体、またはＴＣＲα、ＴＣＲβのサブＴＣＲ複合体、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ならびに２本のＣＤ３ε鎖を指す。
【０７３７】
治療剤：「治療剤」という用語は、対象に投与されるとき、治療、診断、及び／または予防効果を有し、所望の生物学的及び／または薬理学的効果を誘発する、任意の薬剤を指す。本発明の治療剤は、単独でまたは他の治療剤と組み合わせて本明細書に教示されるバイオサーキット成分のうちのいずれかを含む。
【０７３８】
治療上有効量：本明細書で使用される場合、「治療上有効量」という用語は、感染、疾患、障害、及び／または状態を患うか、またはそれらに罹患しやすい対象に投与されたときに、感染、疾患、障害、及び／または状態を治療する、その症状を改善する、診断する、予防する、及び／またはその発症を遅延させるのに十分である、送達される薬剤（例えば、核酸、薬物、治療剤、診断剤、予防剤など）の量を意味する。いくつかの実施形態において、治療上有効量は、単一用量で提供される。いくつかの実施形態において、治療上有効量は、複数の用量を含む投薬レジメンにおいて投与される。当業者は、いくつかの実施形態において、単位剤形が、そのような投薬レジメンの一環として投与されるときに有効である量を含む場合、治療上有効量の特定の薬剤または実体を含むように考慮され得ることが理解されよう。
【０７３９】
トリアジン：本明細書で使用される場合、「トリアジン」は、ベンゼンと同様の構造を有する複素環を含有する一連の窒素であるが、３個の炭素原子が、窒素原子によって置き換えられる。
【０７４０】
治療または治療する：本明細書で使用される場合、「治療」または「治療する」という用語は、好ましくは、有益なまたは所望の結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを示す。そのような有益なまたは所望の臨床結果は、以下のうちの１つ以上を含むが、これらに限定されない：がん細胞または他の罹患の増殖を軽減すること（または破壊すること）、がんに見出されたがん細胞の転移を軽減すること、腫瘍のサイズを縮小すること、疾患から生じる症状を和らげること、疾患に患っている者の生活の質を増大させること、疾患を治療するのに必要とされる他の薬剤の用量を減少させること、疾患の進歩を遅延させること、及び／または個体の生存を延長すること。
【０７４１】
同調する：本明細書で使用される場合、「同調する」という用語は、刺激物質に応答したものまたは特定の結果に対するものを調節する、平衡を保つ、または適応することを意味する。ある非限定的な例において、本発明のＳＲＥ及び／またはＤＤは、組成物の機能または構造を調節する、平衡を保つ、または適応し、それらは、特定の刺激物質及び／または環境に付加される、結合して、またはそれに応答して関連する。
【０７４２】
バリアント：本明細書で使用される場合、「バリアント」という用語は、第２の組成物（例えば、第２のＤＤまたはペイロードはまた、「親」と称される）に関連する、第１の組成物（例えば、第１のＤＤまたはペイロード）を指す。バリアント分子は、親分子に由来し、それから単離され、それに基づいているか、または一致し得る。バリアントという用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを説明するために使用され得る。
【０７４３】
ＶＩＩＩ．等価物及び範囲
当業者は、日常の実験だけを使用して、本明細書に記載の本発明に従って特定の実施形態に対して多くの等価物を認識し、または確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の説明に限定されるようには意図されておらず、添付の特許請求の範囲に示される。
【０７４４】
特許請求の範囲において、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」などの冠詞は、それとは反対のことが明らかに示されない限り、またはそうでなければ文脈から明らかでない限り、１つまたは１つを超えるものを意味し得る。群メンバーのうちの１つ、１つを超える、またはすべてが、所与の生成物またはプロセスに存在するか、それらの中に使用されているか、またはそうでなければそれらに関係している場合、それとは反対のことが示されていないかまたはそうでなければ文脈から明らかでない限り、群のうちの１つ以上のメンバーの間に「または」を含む特許請求の範囲または説明は、満たされると見なされる。本発明は、その群のうちの正確に１つのメンバーが、所与の生成物またはプロセスに存在するか、それらの中に使用されているか、またはそうでなければそれらに関係している実施形態を含む。本発明は、１つを超えるまたはすべての群メンバーが、所与の生成物またはプロセスに存在するか、それらの中に使用されているか、またはそうでなければそれらに関係している実施形態を含む。
【０７４５】
また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語が、排他的でないことが意図されること、及びさらなるエレメントまたはステップの包含を許可することにも留意されたい。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語が、本明細書で使用されるとき、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語もまた、包含され、開示されている。
【０７４６】
範囲が与えられる場合、エンドポイントは含まれる。さらに、別途記載されていないか、またはそうでなければ文脈及び当業者の理解から明らかでない限り、範囲として示される値は、本発明の様々な実施形態において、記載される範囲内の任意の特定の値または部分領域を、文脈が明らかに別のことを示していない限り、その範囲の下限の単位の１０分の１まで想定し得ると理解されるべきである。
【０７４７】
さらに、従来技術に包含される本発明の任意の特定の実施形態は、特許請求の範囲のうちの任意の１つまたは複数から明確に除外され得ると理解されるべきである。このような実施形態は、当業者に公知であると見なされるので、それらは、その除外が本明細書中で明確に示されていない場合も除外され得る。本発明の組成物の任意の特定の実施形態（例えば、任意の抗生物質、治療剤または活性成分、任意の使用方法など）は、従来技術の存在に関係があるか否かに関わらず、いかなる理由があっても任意の１つまたは複数の特許請求の範囲から除外され得る。
【０７４８】
使用されている用語は、制限ではなく、説明の用語であり、かつ本発明の真の範囲及び精神から逸脱することなく、そのより広い態様で、添付の特許請求の範囲内で、変更を行われ得ると理解されるべきである。
【０７４９】
本発明が、いくつかの記載の実施形態に関してかなり詳細にかなり具体的に記載してきたが、いかなるそのような特定事項もしくは実施形態またはいかなる特定の実施形態にも限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲を参照しながら、従来技術を考慮して、そのような特許請求の範囲の可能なかぎり最広義の解釈を提供するように、したがって、本発明の意図された範囲を効果的に包含するように、解釈されるものとする。本発明はさらに、以下の実施例によってさらに例示される。
【実施例】
【０７５０】
実施例１．変異誘発スクリーニングによる新規のリガンド応答性ＤＤの生成
研究設計
リガンドに依存した安定性を示す構築物を操作するために、候補リガンドドメイン（ＬＢＤ）が選択され、タンパク質安定性のためのレポーターとして黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）を使用した細胞ベースのスクリーンが、不安定化ドメインの所望の特徴：ＬＢＤのリガンドの不在下で低いタンパク質レベル（すなわち、低い基本的安定性）、広範なダイナミックレンジ、ロバストかつ予測可能な用量反応挙動、及び分解の迅速な動態を有する候補ＬＢＤの変異体を特定するように設計される（Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｃｅｌｌ；１２６（５）：９９５−１００４）。候補ＬＢＤは、所望のリガンドに結合するが、内因性シグナル伝達分子に結合しない。
【０７５１】
候補ＬＢＤ配列（鋳型として）は、まず、ヌクレオチド類似体変異誘発及び変異性ＰＣＲの組み合わせを使用して、鋳型候補ドメイン配列に基づいて変異体のライブラリーを生成するように変異される。生成されたライブラリーは、ＹＦＰ遺伝子の５’末端または３’末端のいずれかでインフレームでクローン化され、レトロウイルス発現システムは、ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞にＹＦＰ融合物のライブラリーを安定に形質導入するために使用される。
【０７５２】
形質導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞は、候補ＤＤのライブラリーをスクリーニングするために、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を使用して、３〜４ラウンドの分類に供する。形質導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞は、リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）の高親和性リガンドの不在下で培養され、低レベルのＹＦＰ発現を示す細胞は、ＦＡＣＳを通して選択される。
【０７５３】
スクリーニング戦略Ｉ
選択された細胞集団は、リガンド結合ドメインの高親和性リガンドの存在下で、ある一定期間中（例えば、２４時間）培養され、その時点で、細胞は、ＦＡＣＳによって再分類される。高レベルのＹＦＰ発現を示す細胞は、ＦＡＣＳを通して選択され、選択された細胞集団は、２つの群に分けられ、異なる濃度でリガンド結合ドメインの高親和性リガンドでさらに処理され、ある一定期間中（例えば、２４時間）、一方の群は、より低濃度のリガンドで処理され、もう一方の群は、高濃度のリガンドで処理され、その時点で、細胞は、ＦＡＣＳによって再分類される。より低濃度のリガンドに応答する変異体を発現する細胞が、単離される。
【０７５４】
より低濃度のリガンドに応答して単離された細胞は、リガンドで再度処理され、低蛍光レベルを示す細胞は、培地からリガンドを除去してから４時間後に回収される。この４番目の分類は、分解の迅速な動態を示す細胞を濃縮するように設計される（Ｉｗａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０１０  Ｓｅｐ  ２４；１７（９）：９８１−９８８）。
【０７５５】
スクリーニング戦略ＩＩ
選択された細胞集団は、ＬＢＤの高親和性リガンドの不在下でＦＡＣＳによってさらなる１つ以上の分類に供され、低レベルのＹＦＰ発現を示す細胞は、さらなる分析のために選択される。細胞は、ある一定期間中（例えば、２４時間）、リガンド結合ドメインの高親和性リガンドで処理され、ＦＡＣＳによって再分類される。高レベルのＹＦＰを発現する細胞は、ＦＡＣＳを通して選択される。高発現のＹＦＰを有する細胞は、リガンドで再度処理され、低蛍光レベルを示す細胞は、分解の迅速な動態を示す細胞を濃縮するために、培地からリガンドを除去してから４時間後に回収される。分類ステップのうちのいずれかは、リガンドに依存した安定性を有するＤＤを特定するために繰り返され得る。
【０７５６】
細胞は、分類後に回収される。特定された候補細胞が収穫され、ゲノムＤＮＡが抽出される。候補ＤＤは、ＰＣＲによって増幅され、単離される。候補ＤＤは、配列決定され、ＬＢＤ鋳型と比較して、候補ＤＤにおいて変異を特定する。
【０７５７】
実施例２．部位特異的突然変異誘発によるヒトＰＤＥ５に由来する新規のＤＤ
新規の不安定化ドメイン変異を特定するために、変異原性ＰＣＲは、非天然ヌクレオチドを使用して、ヒトＰＤＥ５触媒ドメイン（配列番号３）のオープンリーディングフレームに行われた。変異体ライブラリーは、Ｃ末端でＡｃＧＦＰレポーターでインフレームでライゲーションし、ｐＬＶＸ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏベクターにクローン化した。次いで、レンチウイルスライブラリーは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を感染させるために使用された。細胞は、ピューロマイシンで選択され、ライブラリーは、実施例１に記載のスクリーニング戦略を使用してスクリーニングされた。ＤＮＡは、細胞プールから抽出され、ベクターにクローン化され、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換された。個々のクローンは、配列決定され、Ｃ末端でリンカーＧＧＳＧＧＧＳＧＧ（配列番号７７）及びＡｃＧＦＰでｐＬＶＸ．ＩＲＥＳ  ｐｕｒｏにインフレームでクローン化された。野生型ｈＰＤＥ５の触媒ドメインはまた、ｐＬＶＸ．ＩＲＥＳ．Ｐｕｒｏにクローン化され、対照として使用された。ＨＥＫ２９３細胞は、個々のクローンで形質導入され、ピューロマイシンで選択された。
【０７５８】
ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ構築物を発現するＨＥＫ２９３細胞は、１０μＭのシルデナフィルまたはビヒクル対照、ＤＭＳＯで４８時間インキュベートされ、ｈＰＤＥ５変異体の安定性は、タンパク質レベルで評価された。ｈＰＤＥ５Ｎ構築物を発現する細胞から得られた細胞溶解物は、ＡｃＧＦＰ抗体（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用して免疫ブロットされた。試料はまた、均一のタンパク質負荷を確実にするために、ＧＡＰＤＨ抗体で免疫ブロットされた。免疫ブロットは、ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−００２、ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−００３、ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−００６、ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−００８、ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−００９、ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０１０が、ＤＭＳＯ処理と比較したときに、シルデナフィル処理によるＰＤＥ５−ＧＦＰタンパク質レベルの増加を示し、構築物のシルデナフィルに依存した安定化を示唆していることを示した。さらに、ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−００２、ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−００３、及びＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−００６におけるＤＭＳＯ処理によるｈＰＤＥ５−ＧＦＰレベルは、野生型ｈＰＤＥ５構築物、ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−００１においてより低く、これらの構築物がリガンドの不在下で不安定化されることを示す。
【０７５９】
ｈＰＤＥ５構築物を発現する細胞のＧＦＰ発現は、ＦＡＣＳによって測定された。ＯＴ−ｈＰＤＥ１Ｎ−０２〜ＯＴ−ｈＰＤＥ９３Ｎ−５００１を発現するＨＥＫ５０細胞は、１０μＭのシルデナフィルまたはビヒクル対照、ＤＭＳＯで４８時間インキュベートされ、平均蛍光強度（ＭＦＩ）が計算された。安定化比率は、同じ構築物を有するＤＭＳＯ（すなわち、リガンドの不在下で）による処理と比較して、シルデナフィルで処理した試料中のＧＦＰ強度の倍率変化として計算された。不安定化変異係数は、リガンドの不在下でｈＰＤＥ５野生型構築物（ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−００１）と比較して、ｈＰＤＥ５変異体構築物（ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−００２〜ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０１０）におけるＧＦＰ強度の倍率変化として計算された。１未満の不安定化変異係数及び１を超える安定化比率が、ＤＤにおいて望ましい。これらの結果及び比率を、表１９に表す。
【表１９】
2020525536.tif 000386
【０７６０】
表１９に示すように、すべての構築物は、１を超える安定化比率を示し、すべての構築物がリガンド（シルデナフィル）に依存した安定化を示すことを示した。ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−００６、ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−００８、及びＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−００９の安定化比率は、１０を超え、強力なリガンドに依存した安定化を示した。構築物ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−００２、ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−００３、ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−００５、及びＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０１０は、２〜１０の範囲内で安定化比率を示し、軽度のリガンドに依存した安定化を示した。すべての構築物で観察された不安定化変異係数は、１未満であり、すべてのｈＰＤＥ５変異体が野生型ｈＰＤＥ５と比較して不安定化されることを示した。とりわけ、構築物ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−００２、ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−００３、ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−００４、０Ｔ−ｈＰＤＥ５Ｎ−００６、ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−００８、及びＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−００９は、０．２未満の不安定化変異係数を示し、リガンドの不在下で強力な不安定化を示した。ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−００６、ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−００８、及びＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−００９は、ＤＤの所望の特徴、すなわち、リガンドの不在下で低い基本的発現及びリガンドの存在下で高い発現を有する変異体として特定された。
【０７６１】
実施例３．ｈＰＤＥ５変異体のシルデナフィルに依存した安定化
ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−００６、ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−００８、またはＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−００９構築物を発現するＨＥＫ２９３細胞は、０．００５μＭ〜１０μＭの範囲の様々な濃度のシルデナフィル、またはビヒクル（ＤＭＳＯ）で、４８時間インキュベートされた。ｈＰＤＥ５変異体の安定性は、ＦＡＣＳを使用して測定され、ＧＦＰの平均蛍光強度（ＭＦＩ）が計算された。安定化比率は、同じ構築物を有するＤＭＳＯ（すなわち、リガンドの不在）による処理と比較して、シルデナフィルで処理した試料中のＧＦＰ強度の倍率変化として計算された。１を超える安定化比率が、ＤＤにおいて望ましい。ＭＦＩ及び安定化比率を、表２０に示す。
【表２０−１】
2020525536.tif 000387
【表２０−２】
2020525536.tif 000388
【０７６２】
表２０に示すように、３つすべての構築物が、シルデナフィルの用量の増加と共に安定化比率の増加を示し、ｈＰＤＥ５変異体のリガンドの用量依存的な安定化を示した。５０％効果濃度またはＥＣ５０は、約１μＭであった。
【０７６３】
ｈＰＤＥ５変異体のシルデナフィルに依存した安定化はまた、ある一定期間にわたって測定された。ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−００６、ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−００８、及びＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−００９を発現するＨＥＫ２９３細胞は、１０μＭのシルデナフィルで２、４、６、１６、２４、及び４８時間処理した。ｈＰＤＥ５変異体の安定性は、ＦＡＣＳを使用して測定され、ＧＦＰの平均蛍光強度（ＭＦＩ）が計算された。安定化比率は、同じ構築物を有するＤＭＳＯ（すなわち、リガンドの不在）による処理と比較して、シルデナフィルで処理した試料中のＧＦＰ強度の倍率変化として計算された。１を超える安定化比率が、ＤＤにおいて望ましい。ＭＦＩ及び安定化比率を、表２１に示す。
【表２１】
2020525536.tif 000389
【０７６４】
表２１に示すように、３つすべての構築物が、シルデナフィルによる処理の持続時間の増加と共に安定化比率の増加を示し、ｈＰＤＥ５変異体の安定化の時間に依存しした増加を示した。
【０７６５】
実施例４．ｈＰＤＥ５  ＤＤのバルデナフィルに依存した安定化
バルデナフィルは、０．７ｎＭのＩＣ５０を有し、３．９ｎＭのＩＣ５０を有するシルデナフィルよりもｈＰＤＥ５のより強力な阻害剤である（Ｄｏｇｇｒｅｌｌ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｉｍｐｏｔ．Ｒｅｓ  １９（３）：２８１−９５）。バルデナフィルが、ｈＰＤＥ５  ＤＤを安定化することができるかどうかを試験するために、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−００６、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−００８、及びＯＴ−ｈＰＤＥ５−００９を発現するＨＥＫ２９３細胞は、０．０００５μＭ〜１０μＭの範囲である濃度でバルデナフィルで４８時間処理した。ｈＰＤＥ５変異体の安定性は、ＦＡＣＳを使用して測定され、ＧＦＰの平均蛍光強度（ＭＦＩ）が計算された。安定化比率は、同じ構築物を有するＤＭＳＯ（すなわち、リガンドの不在）による処理と比較して、バルデナフィルで処理した試料中のＧＦＰ強度の倍率変化として計算された。１を超える安定化比率が、ＤＤにおいて望ましい。ＭＦＩ及び安定化比率を、表２２に示す。
【表２２−１】
2020525536.tif 000390
【表２２−２】
2020525536.tif 000391
【０７６６】
表２２に示すように、３つすべての構築物が、バルデナフィルの用量の増加と共に安定化比率の増加を示し、ｈＰＤＥ５  ＤＤのバルデナフィルの用量依存的な安定化を示した。５０％効果濃度またはＥＣ５０は、約０．１−０．３μＭであり、シルデナフィル（約１μＭ）で観察されたＥＣ５０よりも少なく、バルデナフィルが、シルデナフィルよりもさらに強力にｈＰＤＥ５  ＤＤを安定化し得ることを示した。
【０７６７】
ｈＰＤＥ５由来のＤＤを安定化するためのバルデナフィルの能力は、ｈＰＤＥ５  ＤＤで安定に形質導入した細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＣＴ−１１６細胞、及びＳＫＯＶ−３細胞において測定された。細胞は、ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−００６、００８、及び００９構築物で形質導入され、１μＭまたは１０μＭのバルデナフィルまたはＤＭＳＯで４８時間インキュベートされた。ｈＰＤＥ５変異体の安定性は、ＦＡＣＳを使用して測定され、ＧＦＰの平均蛍光強度（ＭＦＩ）が計算された。安定化比率は、同じ構築物を有するＤＭＳＯ（すなわち、リガンドの不在）による処理と比較して、バルデナフィルで処理した試料中のＧＦＰ強度の倍率変化として計算された。１を超える安定化比率が、ＤＤにおいて望ましい。ＭＦＩ及び安定化比率を、表２３に示す。
【表２３】
2020525536.tif 000392
【０７６８】
表２３に示すように、３つすべての構築物が、バルデナフィルの用量の増加と共に安定化比率の増加を示し、ｈＰＤＥ５  ＤＤのリガンドの用量依存的な安定化を示した。これらのデータは、表２２において観察されたバルデナフィルの用量応答で観察された結果と一致する。
【０７６９】
実施例５．ｈＰＤＥ５  Ｃ末端融合タンパク質
ＤＤは、ＳＲＥ内のペイロードの上流または下流で配置され得る。実施例２で論じられるように、部位変異誘発によって生成されたｈＰＤＥ５変異体は、ＧＦＰのＣ末端に融合し、ｈＰＤＥ５変異体が、対象となるタンパク質のＣ末端に誘導されるときに、対象となるタンパク質を不安定化し得るかどうかを試験する。リンカーは、ＧＦＰとｈＰＤＥ５との間に置かれ、ｐＬＶＸ．ＩＲＥＳ．Ｐｕｒｏにクローン化される。ＧＦＰ−ｈＰＤＥ５（野生型及び変異体）構築物を安定に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１０μＭのシルデナフィルまたは１０μＭのバルデナフィルまたはＤＭＳＯ（対照）で４８時間インキュベートされる。インキュベーション後、平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、ＦＡＣＳを使用して測定される。すべてのｈＰＤＥ５（変異体）−ＧＦＰ構築物は、リガンドの存在下でＧＦＰを安定化することが予想されるが、それらは、Ｃ末端に融合するとき、リガンドの不在下でＧＦＰを不安定化することが予想される。
【０７７０】
実施例６．部位特異的突然変異誘発によるヒトｈＰＤＥに由来する新規のＤＤ
タンパク質安定性に影響を及ぼすホスホジエステラーゼにおける既知の変異体は、新規のｈＰＤＥ由来のＤＤを特定するために特定され、利用される。これまでに特定された変異には、ｈＰＤＥ５（Ｉ７７８Ｔ）、またはｈＰＤＥ６Ｃ（Ｈ６０２Ｌ）、ｈＰＤＥ６Ｃ（Ｅ７９０Ｋ）、ｈＰＤＥ６Ｃ（Ｒ１０４Ｗ）、ｈＰＤＥ６Ｃ（Ｙ３２３Ｎ）、及びｈＰＤＥ６Ｃ（Ｐ３９１Ｌ）またはｈＰＤＥ４Ｄ（Ｓ７５２Ａ）、ｈＰＤＥ４Ｄ（Ｓ７５４Ａ）、ｈＰＤＥ４Ｄ（Ｓ７５２Ａ、Ｓ７５４Ａ）、及びｈＰＤＥ４Ｄ（Ｅ７５７Ａ、Ｅ７５８Ａ、Ｄ７５９Ａ）が含まれるが、これらに限定されない（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４３７９−４３９０、Ａｌｅｘａｎｄｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｌａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  ２２（４）：５１９−３０、Ｃｈｅｇｕｒｕ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ；６４：１−８、それらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。ヒトＰＤＥ変異体は、リンカー、及びレポーター遺伝子、例えば、ＧＦＰに融合する。レポーター構築物は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞及び２９３Ｔ細胞などの細胞にトランスフェクトされる。トランスフェクトされた細胞は、適切なリガンド、例えば、ｈＰＤＥ５のためのシルデナフィル及びバルデナフィルまたはｈＰＤＥ４のためのアプレミラスト及びロフルミラストでインキュベートされる。蛍光シグナルは、ＦＡＣＳによって測定され、平均蛍光強度が計算される。
【０７７１】
実施例７．熱シフトアッセイを使用してｈＰＤＥ５変異体の特徴付け
熱シフトアッセイは、ｐＨ、イオン、塩、添加剤、薬物、及び／または変異体などの異なる状態に応答してその安定性の指標としてタンパク質の熱変性温度を測定するために使用することができる。さらに、熱シフトアッセイは、リガンド結合、酵素活性、及び安定化効力の間に相互関係を理解するために使用することができる。ヒトＰＤＥ５変異体を、熱アッセイ色素、熱アッセイ緩衝液、及びリガンド（またはＤＭＳＯ対照）と混合する。試料はまた、薬物、塩、イオン、または他のパラメータなどの様々な濃度の因子で処理される。試料は、リアルタイムＰＣＲ装置などの装置に充填し、温度ランプ速度は、毎分摂氏約０．１〜１０度の範囲内で設定される。各条件下で蛍光発光は、摂氏２５〜９５度の典型的なタンパク質アンフォールディング温度にわたる温度範囲にわたって規則的な間隔で測定される。
【０７７２】
実施例８．ｈＰＤＥ５切断変異体の特徴付け
上記の実施例に示されるデータは、ｈＰＤＥ５の触媒ドメインが、不安定化ドメインの特定に好適な鋳型であった。完全長ｈＰＤＥ５のいくつかの切断変異体は、ＤＤを特定するための鋳型として機能し得る触媒ドメイン内の触媒を超える領域を特定するために生成された。試験した切断変異体は、ｈＰＤＥ５ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０（Ｅ５３５〜Ｑ８６０）、ｈＰＤＥ５ＷＴのアミノ酸５３５〜８３６（Ｅ５３５〜Ｓ８３６）、ｈＰＤＥ５ＷＴのアミノ酸５９０〜８６０（Ｍ５９０〜Ｑ８６０）、ｈＰＤＥ５ＷＴのアミノ酸５９０〜８３６（Ｍ５９０〜Ｓ８３６）を含み、アミノ酸位置は、配列番号１に関する。ＤＤ変異Ｒ７３２Ｌは、すべての切断変異体に組み込まれ、変異体をＳＧリンカー及びレポーター、ＡｃＧＦＰに融合することによってＥ５３５〜Ｑ８６０野生型に比較された。ＨＣＴ−１１６細胞は、上記の構築物で安定に形質導入され、１０μＭの安定化リガンド、シルデナフィル、またはバルデナフィルまたはＤＭＳＯで４８時間処理された。対照として、親の非形質導入細胞、及びＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−００１またはＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２８を発現する細胞はまた、分析において含まれた。ＧＦＰの平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、ＦＡＣＳによって分析された。安定化比率は、同じ構築物を有するＤＭＳＯ（すなわち、リガンドの不在下で）による処理と比較して、シルデナフィルで処理した試料中のＧＦＰ強度の倍率変化として計算された。不安定化変異係数は、リガンドの不在下で、ｈＰＤＥ５野生型構築物（ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０１９）と比較して、ｈＰＤＥ５変異体構築物におけるＧＦＰ強度の倍率変化として計算された。１未満の不安定化変異係数が、望ましい。１を超える安定化比率が、ＤＤにおいて望ましい。これらの結果及び比率を、表２４に示す。
【表２４−１】
2020525536.tif 000393
【表２４−２】
2020525536.tif 000394
【０７７３】
表２４に示すように、Ｒ７３２Ｌ変異体内のｈＰＤＥ５のＥ５３５〜Ｑ８６０アミノ酸からなるＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２０構築物は、最高の安定化比率を有する両方のリガンドで最強のリガンドに依存した安定化を示した。不安定化変異係数はまた、構築物０２０〜０２４のために計算され、この分析は、構築物がペイロードを不安定化するのにすべて有効であったことを示した。これは、触媒ドメインからの残基の除去が、ｈＰＤＥ５のリガンドに依存した安定化の可能性を増強するように思われないことを示唆している
【０７７４】
切断変異体のタンパク質発現分析は、ウェスタンブロットを介して同時に行われた。ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０１９〜ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２４を発現するＨＣＴ１１６細胞は、１０μＭのバルデナフィルで２４時間処理され、抗ＡｃＧＦＰ抗体を使用してＡｃＧＦＰのために免疫ブロットされた（カタログ番号６３２７７，Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。ＧＡＰＤＨレベルはまた、さらにタンパク質負荷を確実にするように分析された。Ｅ５３５〜Ｑ８６０からなるＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２０構築物、すなわち、Ｒ７３２Ｌ変異体を有するｈＰＤＥ５ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０（配列番号１）は、バルデナフィルに依存した安定化を示した。この結果は、ＦＡＣＳ分析と一致する。安定化は、ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２１で観察されなかったが、構築物ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２２、ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２３、及びＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２４は、バルデナフィルの存在及び不在下で、ＡｃＧＦＰ発現を示さず、これらの変異体の構築物の発現が、ウェスタンブロット方法の検出レベルを下回る。
【０７７５】
実施例９．ｈＰＤＥ５の組み合わせ変異体の特徴付け
特定された単一の不安定化変異体は、２つ以上の変異体の組み合わせが、付加してまたは相乗的により大きい不活性化の可能性を有するドメインを生成するかどうかを試験するために組み合わせられた。ＤＤの望ましい品質は、リガンドの不在下でＳＲＥの低い発現、及びＳＲＥのリガンドに依存した安定化を含む。構築物は、ＳＧリンカーを使用してＧＦＰに連結されたＤＤを使用して生成された。ＨＣＴ−１１６細胞は、上記の構築物で安定に形質導入され、１０μＭの安定化リガンド、シルデナフィルまたはバルデナフィルまたはＤＭＳＯで４８時間処理された。対照として、親の非形質導入細胞、及びＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−００１またはＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２８を発現する細胞はまた、分析において含まれた。ＧＦＰの平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、ＦＡＣＳによって分析された。安定化比率は、同じ構築物を有するＤＭＳＯ（すなわち、リガンドの不在下で）による処理と比較して、シルデナフィルで処理した試料中のＧＦＰ強度の倍率変化として計算された。不安定化変異係数は、リガンドの不在下で、ｈＰＤＥ５野生型構築物（ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０１９）と比較して、ｈＰＤＥ５変異体構築物におけるＧＦＰ強度の倍率変化として計算された。１未満の不安定化変異係数が、望ましい。１を超える安定化比率が、ＤＤにおいて望ましい。これらの結果及び比率を、表２５に示す。
【表２５−１】
2020525536.tif 000395
【表２５−２】
2020525536.tif 000396
【０７７６】
表２５に示すように、Ｒ７３２Ｌ及びＤ７６４Ｎ変異体によるＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２６構築物のみが、５．６３の比を有するシルデナフィルに依存した安定化を示した。同様の結果は、バルデナフィルによる処理時にＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２６で得られた。しかしながら、ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２５のみが、４．２６の比を有するバルデナフィルに依存した安定化を示した。両方の構築物は、リガンドの不在下で不安定化された。予想通りに、ｈＰＤＥ５野生型構築物は、いかなる著しいリガンドに依存した安定化も示さなかった。これらのデータは、変異体を組み合わせる戦略が、改善されたＤＤならびに特定のリガンドによって安定化されるＤＤを特定するために使用され得る。
【０７７７】
組み合わせ変異体のタンパク質発現分析は、ウェスタンブロットを介して並行して行われた。ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２５及び２６を発現するＨＣＴ１１６細胞を、１０μＭのバルデナフィルで２４時間処理し、抗ＡｃＧＦＰ抗体（カタログ番号６３２７７，Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用してＡｃＧＦＰにおいて免疫ブロットされた。ＧＡＰＤＨレベルはまた、さらにタンパク質負荷を確実にするように分析された。ｈＰＤＥ５（Ｆ７３６Ａ、Ｄ７６４Ｎ）によるＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２５、及びｈＰＤＥ５（Ｒ７３２Ｌ、Ｄ７６４Ｎ）構築物によるＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２６は、ウェスタンブロットを介して測定されるように、ＡｃＧＦＰタンパク質レベルのバルデナフィルに依存した安定化を示した。この結果は、ＦＡＣＳ分析と一致する。
【０７７８】
シルデナフィルの用量の増加へのｈＰＤＥ５組み合わせ変異体の応答が、試験された。ｈＰＤＥ５構築物で形質導入したＨＣＴ１１６細胞は、０．０４μＭ〜３０μＭの範囲である用量のシルデナフィルで２４時間処理された。平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、ＦＡＣＳによって測定された。親のＨＣＴ１１６、及びＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０１９野生型構築物を発現する細胞もまた、対照として含まれた。シルデナフィルへの組み合わせ変異体の応答は、単一の変異体構築物ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２０の応答と比較された。表２６中のＳＲとして示された安定化比率は、同じ構築物を有するＤＭＳＯ（すなわち、リガンドの不在下で）による処理と比較して、シルデナフィルで処理した試料中のＧＦＰ強度の倍率変化として計算された。不安定化変異係数比率は、リガンドの不在下で、ｈＰＤＥ５野生型構築物（ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０１９）と比較して、ｈＰＤＥ５変異体構築物におけるＧＦＰ強度の倍率変化として計算された。１未満の不安定化変異係数比率が、望ましい。１を超える安定化比率が、ＤＤにおいて望ましい。これらの結果及び比率を、表２６に示す。
【表２６】
2020525536.tif 000397
【０７７９】
表２６に示すように、複数の用量のシルデナフィルにおいて得られたＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２６構築物における安定化比率は、単一の変異体ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２０構築物よりも高かった。組み合わせ変異体０２５は、任意の所与のリガンド用量における０２６構築物よりもはるかに低い安定化比率を達成した。ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２０（比率＝０．１）、ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２５（比率＝０．１７）、及びＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２６（比率＝０．１）において得られた不安定化変異係数比率は、すべての構築物が、リガンドの不在下で不安定化されることを示す。これらのデータは、組み合わせ変異体ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２６が、安定化リガンドがシルデナフィルであるときに、強力なＤＤ候補であることを示す。
【０７８０】
バルデナフィルの用量の増加へのｈＰＤＥ５組み合わせ変異体の応答が、試験された。ｈＰＤＥ５構築物で形質導入したＨＣＴ１１６細胞は、０．０４μＭ〜３０μＭの範囲である用量のバルデナフィルで２４時間処理された。平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、ＦＡＣＳによって測定された。親のＨＣＴ１１６、及びｈＰＤＥ５野生型構築物を含むＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０１９を発現する細胞もまた、対照として含まれた。バルデナフィルへの組み合わせ変異体の応答は、単一の変異体構築物ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２０の応答と比較された。安定化比率（ＳＲ）は、同じ構築物を有するＤＭＳＯ（すなわち、リガンドの不在下で）による処理と比較して、バルデナフィルで処理した試料中のＧＦＰ強度の倍率変化として計算された。不安定化変異係数比率は、リガンドの不在下で、ｈＰＤＥ５野生型構築物（ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０１９）と比較して、ｈＰＤＥ５変異体構築物におけるＧＦＰ強度の倍率変化として計算された。１未満の不安定化変異係数比率が、望ましい。１を超える安定化比率が、ＤＤにおいて望ましい。これらの結果及び比率を、表２７に示す。
【表２７】
2020525536.tif 000398
【０７８１】
表２７に示すように、複数の用量のバルデナフィルにおいて得られたＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２６構築物における安定化比率は、単一の変異体ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２０構築物よりも高かった。組み合わせ変異体０２５は、任意の所与のリガンド用量における０２６構築物よりもはるかに低い安定化比率を達成した。ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２０（比率＝０．１３）、ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２５（比率＝０．１２）、及びＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２６（比率＝０．０８）において得られた不安定化変異係数比率は、すべての構築物が、リガンドの不在下で不安定化されることを示す。これらのデータは、組み合わせ変異体ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２６が、安定化リガンドがバルデナフィルであるときに、強力なＤＤ候補であることを示す。
【０７８２】
タダラフィルの用量の増加へのｈＰＤＥ５組み合わせ変異体の応答が、試験された。ｈＰＤＥ５構築物で形質導入したＨＣＴ１１６細胞は、０．１４〜１００μＭの範囲である用量のタダラフィルで２４時間処理された。平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、ＦＡＣＳによって測定された。親のＨＣＴ１１６、及びＰＤＥ５野生型構築物を含むＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０１９を発現する細胞もまた、対照として含まれた。タダラフィルへの組み合わせ変異体の応答は、単一の変異体構築物ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２０の応答と比較された。安定化比率（ＳＲ）は、同じ構築物を有するＤＭＳＯ（すなわち、リガンドの不在下で）による処理と比較して、タダラフィルで処理した試料中のＧＦＰ強度の倍率変化として計算された。不安定化変異係数は、リガンドの不在下で、ｈＰＤＥ５野生型構築物（ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−００１９）と比較して、ｈＰＤＥ５変異体構築物におけるＧＦＰ強度の倍率変化として計算された。１未満の不安定化変異係数が、望ましい。１を超える安定化比率が、ＤＤにおいて望ましい。これらの結果及び比率を、表２８に示す。
【表２８−１】
2020525536.tif 000399
【表２８−２】
2020525536.tif 000400
【０７８３】
表２８に示すように、複数の用量のタダラフィルにおいて得られたＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２６構築物における安定化比率は、１００μＭの濃度の薬物を除いて、単一の変異体ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２０構築物よりも高かった。組み合わせ変異体ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０２５は、任意の所与のリガンド用量におけるｈＰＤＥ５−０２６構築物よりもはるかに低い安定化比率を達成した。ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２０（比率＝０．１）、ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２５（比率＝０．１７）、及びＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２６（比率＝０．１）において得られた不安定化変異係数は、すべての構築物が、リガンドの不在下で不安定化されることを示す。これらのデータは、組み合わせ変異体ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２６が、安定化リガンドがタダラフィルであるときに、強力なＤＤ候補であることを示す。
【０７８４】
構築物の各々において３つすべてのリガンド、シルデナフィル、バルデナフィル、及びタダラフィルの最高濃度において得られた安定化比率が、比較され、これらを、表２９に示す。
【表２９−１】
2020525536.tif 000401
【表２９−２】
2020525536.tif 000402
【０７８５】
表２９に示すように、安定化比率に基づいて、ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２６が、単一の変異体構築物、ならびに他の組み合わせ変異体構築物（ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２５）の両方と比較して、３つすべてのリガンドによって効果的に安定化されることは、明らかであった。組み合わせ変異体の両方が、ｈＰＤＥ５の最も強力な阻害剤である、バルデナフィルによって最も有効に安定化された。構築物ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２５は、小幅によってのみであるが、シルデナフィルよりもタダラフィルによってさらに有効に安定化され、この観察は、タダラフィルよりもｈＰＤＥ５のはるかに強力な阻害剤であるため、注目すべきである。
【０７８６】
シルデナフィルによる持続的な処理の増加へのｈＰＤＥ５組み合わせ変異体の応答が、試験された。ｈＰＤＥ５構築物で形質導入したＨＣＴ１１６細胞は、０．５または５μＭのシルデナフィルで０〜７２時間処理した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、ＦＡＣＳによって測定された。シルデナフィルへの組み合わせ変異体の応答は、単一の変異体構築物ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０２０の応答と比較された。安定化比率は、同じ構築物を有するＤＭＳＯ（すなわち、リガンドの不在下で）による処理と比較して、シルデナフィルで処理した試料中のＧＦＰ強度の倍率変化として計算された。不安定化変異係数は、リガンドの不在下で、ｈＰＤＥ５野生型構築物（ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０１９）と比較して、ｈＰＤＥ５変異体構築物におけるＧＦＰ強度の倍率変化として計算された。１未満の不安定化変異係数が、望ましい。１を超える安定化比率が、ＤＤにおいて望ましい。５または０．５μＭを用いた経時変化実験における結果及び安定化比率を、それぞれ、表３０及び表３１に示す。
【表３０−１】
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【表３０−２】
2020525536.tif 000404
【表３１】
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【０７８７】
表３０及び表３１に示すように、５μＭの用量のシルデナフィルで経時的に得られたＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２６構築物における安定化比率は、単一の変異体ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２０構築物よりも高かった。しかしながら、このパターンは、単一の変異体構築物がより大きな安定化を示した場合、０．５μＭのより低い用量で覆された。組み合わせ変異体ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０２５は、任意の所与の時間で両方のリガンド用量の両方におけるＯＴ−ｈＰＤＥ５−０２６構築物よりもはるかに低い安定化比率を達成した。これらのデータは、適したＤＤの選択が、時には、所望のリガンド処理の持続時間、ならびにシステムで用いるために利用可能であるリガンドの濃度に応じて異なり得る。
【０７８８】
実施例１０．ＤＤホットスポットの変異誘発
部位特異的突然変異誘発によって特定された変異体の分析が、変異がｈＰＤＥ５への不安定化及びリガンドに依存した安定化特性を与える、アミノ酸ホットスポットを特定した。これらの構築物のＤＤの特徴付けを改善するために、ホットスポット位置のアミノ酸は、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、メチオニン、トリプトファン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、バリン、プロリン、及びグリシンを含むが、これらに限定されない、既知のアミノ酸のいずれかに変異された。ホットスポット変異体のライブラリーは、部位特異的突然変異誘発によって生成され、ライブラリー中の変異体の各々は、リンカーを介してレポータータンパク質、例えば、ＡｃＧＦＰに融合する。ＤＤの特性は、上述のように、ウェスタンブロット及びＦＡＣＳを介してリガンドの存在及び不在下で分析される。評価されたリガンドには、シルデナフィル、バルデナフィル、及びタダラフィルが含まれるが、これらに限定されない。
【０７８９】
実施例１１．バイオサーキット挙動の最適化
本発明のバイオサーキットは、最適化され得る複数のモジュールを含む。成分の各々のライブラリーは、所望の挙動を有する新しい構築物の迅速な生成を可能にするように生成される。リガンド薬物動態は、変調因子に応じて左または右にエフェクターモジュールのリガンド応答曲線をシフトするために使用することができる、ペイロード特異的な同調のためのインビボで強力なツールである。リガンドの用量、濃度、大きさ、持続時間、及び投与経路を含むが、これらに限定されない、いくつかの変調因子が、試験される。不安定化ドメインはまた、バイオサーキット挙動を改善するために修飾され得る。不安定化ドメインは、バイオサーキットのダイナミックレンジのコア決定基である。選択されるＤＤに応じて、エフェクターモジュールのリガンド応答曲線は、上または下にシフトされ得る。エフェクターモジュール内のＤＤの自然の位置ならびにエフェクターモジュール内のＤＤの数が、修飾される。ＤＤ選択はまた、所望の分解動態に応じても改変される。ＳＲＥの発現を転写に制御するプロモーターが、最適化される。プロモーターの選択は、基礎オフ状態に影響を及ぼし、安定化のダイナミックレンジに影響を及ぼす。さらに、プロモーターの選択は、生成された安定化したペイロードの範囲に寄与する。バイオサーキットの他の最適化エレメントは、ベクター、翻訳エレメント、リーダー配列、ＳＲＥ内の成分の設置、コドン選択、プロテアーゼ部位、リンカー、及びｍＲＮＡの安定性を含む。
【０７９０】
実施例１２．ｈＰＤＥ５変異体におけるバルデナフィルの用量応答曲線
組み合わせ変異体は、実施例９に記載されるように生成した。バルデナフィルの用量の増加に伴うｈＰＤＥ５組み合わせ変異体の応答は、ｈＰＤＥ５構築物で形質導入したＨＣＴ１１６細胞において試験され、０．１〜１０μＭの範囲である用量のバルデナフィルまたはビヒクル対照（ＤＭＳＯ）で４８時間処理した。ＧＦＰの平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、ＦＡＣＳによって測定された。バルデナフィルへの組み合わせ変異体の応答は、単一の変異体構築物ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２０の応答と比較された。ＤＭＳＯを上回るＭＦＩの倍数変化を、表３２に示す。
【表３２】
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【０７９１】
表３２に示すように、ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２０構築物において得られたリガンドに依存した安定化は、他の２つの構築物と比較して、より低い用量で、すなわち、０．１及び０．３マイクロモルの濃度のバルデナフィルで観察され、非常に低い用量のリガンドが、このｈＰＤＥ５変異体を安定化するのに十分であることを示した。ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２６構築物は、同様の用量でリガンドに依存した安定化を示さなかった。しかしながら、最高の用量のバルデナフィルで、得られたＧＦＰ発現は、ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２０よりもはるかに高かった。対照的に、ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２５は、より低い用量でＧＦＰの発現がほとんどなく、より高い用量で他の２つの構築物と比較して、穏やかなＧＦＰ発現のみを示した。これらの実験は、単一のｈＰＤＥ５  ＤＤ変異体の組み合わせが、単一の変異体の特性によって予測されなかった相乗効果をもたらすことを示す。したがって、対象となるペイロードの特性及び所望の発現レベルに基づいて、好適なｈＰＤＥ５  ＤＤが、選択され得る。
【０７９２】
実施例１３．インビトロでＤＤで調節した免疫治療剤の発現
サイトカイン（例えば、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａ）、キメラ抗原受容体（ＣＤ１９  ＣＡＲ）、調節タンパク質（例えば、ＦＯＸＰ３）、安全スイッチ（例えば、カスパーゼ９）などの本発明の免疫調節剤ペイロードは、本明細書に記載のＤＤのうちのいずれかに融合し、発現ベクターにクローン化する。任意のリンカー及び切断部位を付加して、エフェクターモジュールの確認を最適化する。
【０７９３】
リガンドに依存した免疫調節剤ペイロード産生を試験するために、細胞を、１０％ＦＢＳで増殖培地、例えば、ＤＭＥＭに播種し、３７℃で、５％ＣＯ２で一晩インキュベートする。細胞を、一過性にトランスフェクトするか、またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して構築物で形質導入し、４８時間インキュベートする。インキュベーション後、増殖培地を、リガンド（例えば、シルデナフィル、バルデナフィル、及びタダラフィル）を含有する培地のために交換する。リガンドによる２４時間のインキュベーション後、細胞を溶解し、ペイロードに特異的な抗体を使用して免疫ブロットする。サイトカインなどの分泌したペイロードにおいては、増殖培地を、本発明のエフェクターモジュールを発現する培養物から収穫する。免疫ブロットと同様に、培地は、ＥＬＩＳＡ及びＭＳＤアッセイなどの当該技術分野で既知の方法を使用してペイロードの発現においてアッセイされる。細胞表面に発現したペイロードにおいては、ペイロードの配列はまた、フローサイトメトリーなどの当該技術分野で既知である細胞表面発現分析の方法を使用してアッセイされる。リガンドの存在下で得られたペイロードの発現は、リガンドの不在下で発現と比較される。リガンド濃度及び／または処理の持続時間の増加に伴うペイロードのレベルの増加は、ペイロードのＤＤに媒介された調節を示す。発現はまた、親の非形質導入細胞、ならびにＤＤに付加しない（すなわち、構造的に発現した）免疫調節剤ペイロードを発現する細胞と比較される。
【０７９４】
実施例１４．インビトロでＤＤで調節した免疫治療剤の機能
ＤＤで調節したＩＬ１２の発現がＩＬ１２シグナル伝達を活性化することができるかどうかを試験すること。ヒトＴ細胞を、ＰＢＭＣから単離し、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ、２μｇ／ｍｌ）で３日間活性化し、続いて、５０ＩＵ／ｍｌのインターロイキン−２（ＩＬ２）で２４時間処理する。細胞を、洗浄し、新鮮な培地中で再懸濁し、４時間休息させる。Ｔ細胞を、ＤＤで調節したＩＬ１２構築物で形質導入し、使用したＤＤまたはビヒクル対照に基づいて、リガンド（例えば、シルデナフィル、バルデナフィル、及びタダラフィル）で処理する。ＩＬ１２を介した活性化は、ＳＴＡＴ４のリン酸化をもたらす。さらに、ＩＬ１２は、Ｔ細胞からＩＦＮガンマの分泌をもたらす、Ｔｈ１細胞へのナイーブＴ細胞の分化を促進する。細胞を収穫し、ＳＴＡＴ４のリン酸化は、ＳＴＡＴ４抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）を使用して測定される。細胞上清及び細胞溶解物を、ＩＦＮガンマのために分解する。リガンドの存在下で、ＤＤで調節したＩＬ１２を発現する細胞は、ＳＴＡＴ４のリン酸化の増加及びＩＦＮガンマの発現の増加を有することが見込まれる。
【０７９５】
ＩＬ１５及びＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ融合分子は、Ｔ細胞におけるメモリ表現型を与え、ＮＫ細胞の増殖を増加することができる（Ｈｕｒｔｏｎ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６），ＰＮＡＳ，１１３：Ｅ７７８８−７７９７）。サイトカインにおけるＮＫ細胞の増殖のこの依存性は、ＤＤで調節したまたは構造的に発現したサイトカイン及びサイトカイン融合タンパク質の機能性を試験するために使用することができる。リガンド処理に応答してＮＫ−９２細胞の活性化は、発現の増加がＮＫの活性化と関連するマーカーのパネルを使用してＦＡＣＳによって評価される。これらは、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ７１、ＣＤ６９；ケモカイン受容体、例えば、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、及びＣＸＣＲ３、パーフォリン、グランザイムＢ、及びインターフェロンガンマ（ＩＦＮｇ）を含む。ＤＤで調節したＩＬ１５またはＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａ融合分子の発現は、ＮＫ細胞の活性化を増加させることが見込まれる。初代Ｔ細胞におけるＩＬ１５及びＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａのリガンドに依存した安定化による効果を評価するために、Ｔ細胞を、ＤＤ−ＩＬ１５Ｒａ構築物で形質導入する。Ｔ細胞の増殖及びメモリ表現型マーカー（例えば、ＣＤ６２Ｌ）は、フローサイトメトリーを使用することによってリガンドの存在または不在下で測定される。
【０７９６】
インビトロで標的細胞を死滅させるためのＤＤで調節したＣＤ１９  ＣＡＲ細胞の能力を試験するために、初代Ｔ細胞集団を、ＤＤで調節したＣＤ１９  ＣＡＲ構築物で形質導入し、それらを、ＤＤに特異的なリガンドの存在または不在下でＣＤ１９（標的細胞）を発現するＫ５６２細胞で共培養する。Ｔ細胞及び標的細胞の複数の組み合わせを設定する。これらは、Ｋ５６２細胞（リガンドの存在または不在下で）で共培養したＤＤで調節したＣＡＲを発現するＴ細胞、Ｔ細胞を共培養することなく、ＣＤ１９を発現するＫ５６２細胞及びＣＤ１９を発現するＫ５６２細胞で培養するＴ細胞を含む。さらなる対照は、標的細胞のみ；非形質導入Ｔ細胞；空のベクターで形質導入したＴ細胞を含む。標的細胞を、それらの増殖を防ぐために、マイトマイシンＣで処理する。Ｋ５６２細胞を、ＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄで蛍光に標識し、Ｔ細胞で３００時間共培養する。細胞死は、アネキシンＶで細胞を標識することによってモニタリングし、Ｋ５６２細胞における細胞死は、標的ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）生細胞分析システム（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を使用して、アネキシンＶ及びＮｕｃＬｉｇｈｔ  Ｒｅｄの両方に対して陽性である細胞を評価することによってモニタリングする。標的細胞の死滅が、リガンドの存在下で、及びＣＤ１９を異所的に発現するＫ５６２標的細胞が使用されるときにのみ、ＤＤで調節したＣＡＲ構築物で期待される。細胞の死滅は、同じ共培養の設定の未処理対照で、及びＴ細胞が、リガンドの存在または不在下で、ＣＤ１９を発現しない親のＫ５６２細胞で共発現されるときに期待される。構造的構築物は、リガンドの存在下で共に細胞の死滅を示すことが期待される。
【０７９７】
実施例１５．インビボでＤＤで調節した免疫治療剤の機能
ＤＤで調節した免疫調節剤ペイロードのリガンドに依存したインビボの機能は、本発明のリガンドによる処理時に、構築された腫瘍の増殖を阻害するために、ＤＤで調節した構築物を発現するＴ細胞の能力を評価することによって特定付けられる。ＨＣＴ１１６細胞などの腫瘍細胞を、マウスに皮下に異種移植する。本明細書に記載のＤＤで調節した構築物で安全に形質導入したＴ細胞を、マウスに静脈内注射する。腫瘍が約３００立法ｍｍの大きさに達するときに、注射から約２週間後、マウスに、リガンド（例えば、シルデナフィル、バルデナフィル、及びタダラフィル）またはビヒクル対照で、様々な濃度で２日毎に投与される。腫瘍体積及び体重は、週回モニタリングされる。血漿及び腫瘍試料はまた、リガンドの最終投与後に回収され、ペイロードレベル及びリガンドレベルが測定される。腫瘍体積は、ビヒクルで処置した動物と比較してリガンドで処置したマウスにおいて著しく小さいことが期待される。腫瘍ペイロードレベルは、腫瘍体積と正に相関することが期待される。
【０７９８】
本発明の組成物が免疫細胞の耐性を促進するかどうかを測定するために、ＤＤ−ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ構築物で形質導入したＴ細胞を、マウスに注射する。マウスを、リガンド（例えば、シルデナフィル、バルデナフィル、及びタダラフィル）で処置し、４０〜５０日の期間にわたってモニタリングされる。構造的ＯＴ−ＩＬ１５−００８構築物で形質導入したＴ細胞及び非形質導入した親Ｔ細胞を、対照として別々のマウスに注射する。血液を、マウスから定期的に採血し、Ｔ細胞の存在について試験する。リガンドで処置したマウスは、ｈＰＤＥ５  ＤＤ−ＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａを発現するＴ細胞を保有することが期待されるが、ビヒクル処置したマウスにおけるＴ細胞が、持続することが期待されない。
【０７９９】
実施例１６．ＤＤで調節したペイロードの共発現
インターロイキンの全身投与に関連した毒性は、標的組織にインターロイキンを送達するために、ＣＡＲ−Ｔ細胞を使用することによって回避され得る。この組み合わせアプローチはまた、インターロイキン及びＣＡＲ療法のみでよりも大きな抗腫瘍活性を有する。細胞を、ＣＤ１９  ＣＡＲ（構造的またはＤＤで調節した）及びＤＤ−インターロイキン、例えば、ＤＤ−ＩＬ２、ＤＤ−ＩＬ１２、ＤＤ−ＩＬ１５、及びＤＤ−ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ構築物で共トランスフェクトする。トランスフェクト細胞を、使用したＤＤに応じて安定化リガンドで処理する。ＣＤ１９  ＣＡＲ発現は、ＣＤ３ゼータに対して免疫ブロットすることによって評価される。培地中のＤＤ−ＩＬ２、ＤＤ−ＩＬ１２、ＤＤ−ＩＬ１５、及びＤＤ−ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａの発現は、ＥＬＩＳＡによって測定される。
【０８００】
ＤＤで調節したカスパーゼ９は、安定性を改善し、ＣＤ１９  ＣＡＲ療法と関連する毒性を最小限に抑える可能性を有する。細胞を、ＣＤ１９  ＣＡＲ（構造的またはＤＤで調節した）及びＤＤ−カスパーゼ９構築物で共トランスフェクトする。トランスフェクト細胞を、使用したＤＤに応じて安定化リガンドで処理する。ＣＤ１９  ＣＡＲ及びカスパーゼ９の発現は、それぞれ、ＣＤ３ゼータ及びカスパーゼ９に対して免疫ブロットすることによって評価される。
【０８０１】
実施例１７．ｈＰＤＥ５変異体におけるシルデナフィル及びタダラフィルの用量応答曲線
組み合わせ変異体は、実施例９において上述されるように生成した。０．１μＭ〜１００μＭの範囲であるタダラフィル及びシルデナフィルの用量の増加へのｈＰＤＥ５組み合わせ変異体を４８時間発現するＨＣＴ１１６細胞またはビヒクル対照（ＤＭＳＯ）の応答が、試験された。平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、ＦＡＣＳによって測定された。リガンド処理への組み合わせ変異体の応答は、単一の変異体構築物ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｎ−０２０と比較された。リガンド処理によるＭＦＩを、表３３及び表３４に示す。
【表３３】
2020525536.tif 000407
【表３４】
2020525536.tif 000408
【０８０２】
表３３及び表３４に示すように、リガンド用量依存の安定化は、３つのすべての構築物で得られた。より低い用量（例えば、最大１１μＭのシルデナフィル及びタダラフィル）で用量依存の安定化は、他の２つの構築物と比較して、単一の変異体構築物ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０２０においてさらに明らかである。より高い濃度のリガンドで、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０２５及びＯＴ−ｈＰＤＥ５−０２６は共に、リガンドに依存した安定化を示した。実際には、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０２６構築物は、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０２０及びＯＴ−ｈＰＤＥ５−０２５の両方と比較して、３３及び１００μＭでさらに高いＭＦＩ値を示した。これらの実験は、単一のｈＰＤＥ５  ＤＤ変異体の組み合わせが、単一の変異体の特性によって予測されなかった相乗効果をもたらすことを示す。したがって、好適なｈＰＤＥ対象となるペイロード及び所望の発現５  ＤＤは、対象となるペイロードの特性及び所望の発現レベルに基づいて選択され得る。
【０８０３】
実施例１８．ｈＰＤＥ５変異体の動態
ｈＰＤＥ５変異体、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０２０及びＯＴ−ｈＰＤＥ５−０２６のオフ動態は、これらの構築物または野生型構築物ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０１９を発現するＨＣＴ１１６細胞を処理すること試験された。細胞を、リガンドで４８時間処理した。リガンドを含有する培地を除去し、リガンドを含有しない新たな培地を加えた。ＭＦＩは、０時間（すなわち、実験を開始する前）、リガンド処理から４８時間後、ならびにリガンド洗い出しからいくつかの時点で、最大９６時間でＦＡＣＳによって分析された。安定化比率は、同じ構築物を有するリガンドの不在下で、ＧＦＰ強度と比較して、リガンドで処理した試料中のＧＦＰ強度の倍率変化として計算された。これらの結果を、表３５に示す。
【表３５】
2020525536.tif 000409
【０８０４】
表３５に示すように、ｈＰＤＥ５変異体の安定化比率は、リガンドの除去後に減少した。安定化比率の値は、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０２０構築物と比較して、組み合わせ変異体ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０２６においてより迅速に減少し、これは、ＤＤの不安定化が、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０２６構築物においてより迅速に達成することを示唆している。安定化比率によって示されるように、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０２６構築物で達成されたリガンドに依存した安定化は、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０２０構築物よりも低く、これはまた、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０２６構築物で見られる優れたオフ動態にも寄与し得る。
【０８０５】
実施例１９．ｈＰＤＥ５  Ｃ末端の変異体の挙動
ペイロードのＣ末端に付加されるとき、ペイロードの発現を同調するｈＰＤＥ５変異体の能力が、試験された。ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｃ−０３０は、ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｃ−０３６と比較された。ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞は、様々な用量のシルデナフィルまたはバルデナフィルで４８時間インキュベートされ、ＭＦＩは、ＦＡＣＳによって分析された。安定化比率（ＳＲ）は、同じ構築物を有するリガンドの不在下で、ＧＦＰ強度と比較して、リガンドで処理した試料中のＧＦＰ強度の倍率変化として計算された。これらの結果を、表３６に示す。
【表３６】
2020525536.tif 000410
【０８０６】
表３６に示すように、ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｃ−０３０構築物は、１を超える安定化比率を示し、バルデナフィル及びタダラフィルリガンドの両方がＧＦＰ発現を安定化し得ることを示した。予想通りに、野生型構築物、ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｃ−０３６は、１をはるかに超えて安定化せず、仮想的に、不安定化が、野生型構築物で達成したことを示した。
【０８０７】
ＧＦＰ発現はまた、リガンド曝露の持続時間におけるｈＰＤＥ５−ＤＤ  ＧＦＰ構築物の依存性をモニタリングするために、２４及び４８時間で測定した。これらの結果を、表３７及び表３８Ａを示し、ＳＲは、安定化比率を示す。
【表３７】
2020525536.tif 000411
【表３８Ａ】
2020525536.tif 000412
【０８０８】
４８時間で測定された応答と一致して、２４時間は、ｈＰＤＥ５変異体構築物が、１を超える安定化比率によって証明されるように、ＧＦＰ発現を安定化させることを示したが、ＯＴ−ｈＰＤＥ５Ｃ−０３６は、約１の安定化比率を示し、リガンドに依存した安定化を示さなかった。これらの結果は、シルデナフィル処理とバルデナフィル処理で一致した。４８時間で得られた安定化比率が、２４時間で得られた値をはるかに超え、ＧＦＰ発現の時間に依存した安定化を示唆している。同様の結果が、ＧＦＰ抗体を用いたウェスタンブロット分析によって得られた。０．１μＭのシルデナフィルで、ＧＦＰタンパク質レベルの穏やかな安定化が、ウェスタンブロットを介して観察された。ＧＦＰの安定化は、細胞が１μＭのシルデナフィルで処理されたときに増加した。０．１μＭ及び１μＭの用量のバルデナフィルは共に、ＧＦＰレベルの安定化を示した。これらの傾向は、２４時間及び４８時間の両方で観察された。いずれのリガンドでも処理されなかった細胞に対して、すべての比較を行った。
【０８０９】
より低用量のバルデナフィルへのｈＰＤＥ５Ｃ末端の変異体の応答もまた、試験され、表３８Ｂに示す。
【表３８Ｂ】
2020525536.tif 000413
【０８１０】
表３８Ｂに示すように、ｈＰＤＥ５Ｃ末端の変異体は、安定化比率の増加によって示されるように、より低用量のバルデナフィルでさえ、用量に依存した安定化を示した。したがって、低いナノモル用量のバルデナフィルであっても、ｈＰＤＥ５  ＤＤのリガンドに依存した安定化を誘導するのに十分である。
【０８１１】
実施例２０．ｈＰＤＥ５ルシフェラーゼ構築物の挙動
ＰＤＥ５由来のＤＤは、ルシフェラーゼなどのレポーターペイロードに付加して、構築物ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０３１、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０３２、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０３３、及びＯＴ−ｈＰＤＥ５−０３５構築物を生成した。このような構築物は、インビボでＤＤの不安定化及び安定化の動態において試験するために有用であり得る。これらの構築物は、ＨＣＴ１１６細胞に形質導入された。細胞は、１ウェル当たり２０００個の細胞で９６ウェルプレートに播種され、１μＭのＤＭＳＯまたはバルデナフィルで４８時間インキュベートした。次いで、ルシフェラーゼ活性は、プレートリーダーアッセイを使用して測定された。親の非形質導入細胞は、バックグラウンド蛍光レベルを測定するために対照として使用された。これらの結果を、表３９に示す。表３９において、安定化比率は、同じ構築物を有するＤＭＳＯ（すなわち、リガンドの不在下で）による処理と比較して、バルデナフィルで処理した試料中のルシフェラーゼシグナルの倍率変化として計算された。不安定化変異係数は、リガンドの不在下で、ｈＰＤＥ５野生型構築物（ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０３１）と比較して、ｈＰＤＥ５変異体構築物におけるＧＦＰ強度の倍率変化として計算された。１未満の不安定化変異係数が、望ましい。１を超える安定化比率が、ＤＤにおいて望ましい。
【表３９】
2020525536.tif 000414
【０８１２】
構築物を発現しなかった親細胞において観察されたルシフェラーゼシグナル強度は、シグナルのいくつかがバックグラウンドノイズを可能にしたことを示した。構築物ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０３３は、構築物が不安定化することを示す、最小の不安定化変異係数を示した。安定化比率の増加は、野生型ｈＰＤＥ５構築物ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０３１を含む、すべての構築物で観察された。構築物ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０３５は、最強のリガンドに依存した安定化を示す最高の安定化比率を示した。試験した構築物の中で、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０３３は、リガンドの不在下で不安定化を示し、リガンドの安定下で安定化を示した。
【０８１３】
実施例２１．ｈＰＤＥ５のアミノ酸７３２の変異誘発
部位特異的突然変異誘発によって特定された変異体の分析が、変異がｈＰＤＥ５への不安定化及びリガンドに依存した安定化特性を与える、アミノ酸ホットスポットを特定した。７３５位のアミノ酸は、ｈＰＤＥ５（Ｒ７３２Ｌ）変異が上記の特性を有したため、さらなる分析のために選択された。このＤＤのＤＤの特徴付けを改善するために、７３２位のアミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、メチオニン、トリプトファン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、バリン、プロリン、及びグリシンを含むが、これらに限定されない、既知のアミノ酸のいずれかに変異された。変異体のライブラリーは、部位特異的突然変異誘発によって生成され、ライブラリー中の変異体の各々は、リンカーを介して、レポータータンパク質、例えば、ＡｃＧＦＰに融合し、ＨＣＴ１１６細胞に形質導入された。ＤＤの特性は、上述のように、ＦＡＣＳを介してリガンドの存在及び不在下で分析された。評価されたリガンドには、シルデナフィル及びバルデナフィルが含まれるが、これらに限定されない。これらの結果を、表４０Ａ及び表４０Ｂに示す。
【表４０Ａ−１】
2020525536.tif 000415
【表４０Ａ−２】
2020525536.tif 000416
【表４０Ｂ−１】
2020525536.tif 000417
【表４０Ｂ−２】
2020525536.tif 000418
【０８１４】
示されたリガンドを有する各構築物において得られた不安定化変異係数及び安定化比率は、最低の不安定化変異係数比率を有した構築物を特定するために分析され、次いで、データの第２の分類は、最高の安定化比率を有する構築物を特定するために行われた。この分析は、最高の安定化比率も有した最低の不安定化変異係数比率の両方を有する構築物の特定を可能にした。この分析に基づいて、仮想的に、試験したすべての変異体が、シルデナフィル処理のＤＭＳＯ対照において１未満の不安定化変異係数を示し、すべての構築物がシルデナフィルの不在下で不安定化することを示した。シルデナフィルの存在下で、アルギニンからリシンへの置換を有するＯＴ−ｈＰＤＥ５−０８１構築物は、高いシルデナフィルに依存した安定化比率を示した。バルデナフィルによる構築物の同様の分析は、低い不安定化変異係数及び高リガンドに依存した安定化比率を有する、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０８１、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０６６、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０６７、及びＯＴ−ｈＰＤＥ５−０６５を特定した。低い不安定化変異係数及び高い安定化比率を有する他の構築物は、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０６７、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０６５、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０６９、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０７４、及びＯＴ−ｈＰＤＥ５−０７５を含む。
【０８１５】
シルデナフィル、バルデナフィル、及びタダラフィルの用量の増加への選択変異体の応答はまた、リガンドで４８時間処理したＨＣＴ１１６細胞において試験された。各リガンド処理で得られたＭＦＩ値を、表４１Ａ、表４１Ｂ、及び表４１Ｃに示す。
【表４１Ａ−１】
2020525536.tif 000419
【表４１Ａ−２】
2020525536.tif 000420
【表４１Ｂ】
2020525536.tif 000421
【表４１Ｃ−１】
2020525536.tif 000422
【表４１Ｃ−２】
2020525536.tif 000423
【０８１６】
アルギニンからスレオニンへの置換を有するＯＴ−ｈＰＤＥ５−０７４は、ＧＦＰ発現の最強の増加を示し、最高の用量で３つすべてのリガンドが試験された。１μＭよりも低い用量のバルデナフィルで、すべての構築物は、リガンドに依存した安定化を示した。１μＭよりも低い用量のシルデナフィルで、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０６９、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０７４、及びＯＴ−ｈＰＤＥ５−０７５は、リガンドに依存した安定化を示した。１μＭよりも低い用量のタダラフィルで、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０６５、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０６９、及びＯＴ−ｈＰＤＥ５−０７４は、リガンドに依存した安定化を示した。Ｒ７３２遺伝子座の変異誘発により、様々な特性を有するＤＤが、得られた。特定のＤＤの選択は、使用されたペイロード及びペイロードで所望の発現の範囲に基づいて行われ得る。リガンドの各々で構築物の各々に対するＥＣ５０値を、表４１Ｄに示す。
【表４１Ｄ】
2020525536.tif 000424
【０８１７】
これらの結果は、これらの変異体で安定に形質導入したＨＣＴ１１６細胞におけるＧＦＰタンパク質レベルのウェスタンブロット分析と一致する。以下の構築物は、バルデナフィルの存在下で、及びＤＭＳＯ対照と比較したときに、ＧＦＰレベルの強力な安定化を示した：ＯＴ−ｈＰＤＥ５−００９、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０６４、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０６５、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０６８、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０７０、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０７１、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０７２、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０７３、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０７４、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０７５、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０７６、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０７７、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０７８、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０７９、及びＯＴ−ｈＰＤＥ５−０８０。ＧＦＰレベルの穏やかなリガンドに依存した安定化は、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０６６、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０６７、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０６９、及びＯＴ−ｈＰＤＥ５−０８１で観察された。すべての試料は、ＧＡＰＤＨタンパク質レベルによって測定されるように、同等のタンパク質負荷を示した。
【０８１８】
実施例２２：ｈＰＤＥ５調節のダイナミックレンジ
ＨＣＴ１１６細胞は、ｈＰＤＥ５−ＧＦＰ構築物、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０８３、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０８４、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０８５、及びＯＴ−ｈＰＤＥ５−０９４で形質導入され、リガンドの指示された濃度で４８時間インキュベートされた。ＧＦＰ蛍光は、ＦＡＣＳによって測定された。未処理ＤＭＳＯ対照にわたるＧＦＰ発現の倍数変化を、それぞれ、バルデナフィル、シルデナフィル、及びタダラフィルに対して、表４２Ａ、表４２Ｂ、及び表４２Ｃに示す。
【表４２Ａ】
2020525536.tif 000425
【表４２Ｂ−１】
2020525536.tif 000426
【表４２Ｂ−２】
2020525536.tif 000427
【表４２Ｃ】
2020525536.tif 000428
【０８１９】
表４２Ａ、表４２Ｂ、及び表４２Ｃに示すように、ｈＰＤＥ５  ＤＤの動的調節は、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０８３、ＯＴ−ｈＰＤＥ５−０８４、及びＯＴ−ｈＰＤＥ５−０８５で観察された。ｈＰＤＥ５野生型構築物は、３つすべてのリガンドでリガンドに依存した安定化をほとんど示さなかった。５０％の安定化を達成するのに必要とされるリガンドの濃度である、安定化濃度５０または（ＳＣ５０）はまた、リガンドの各々で４つすべての構築物のために計算され、これらの結果を、表４２Ｄに示す。
【表４２Ｄ−１】
2020525536.tif 000429
【表４２Ｄ−２】
2020525536.tif 000430
【０８２０】
総合すれば、これらの結果は、ＰＤＥ５中のリガンド結合部位の構造に指南された変異誘発が、２３ｎＭのリガンド−ＤＤの相互作用を生成することを示す。Ｙ６１２Ｆ、Ｒ７３２ＬによるＯＴ−ｈＰＤＥ５−０８３は、２３ｎＭのＳＣ５０でバルデナフィルと結合することができ、強力なＤＤ−リガンドの相互作用を示唆している。
【０８２１】
実施例２３．インビトロでＤＤで調節したＩＬ１５−ＩＬ１５−Ｒａの発現
ＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａ融合タンパク質などの本発明の免疫治療剤ペイロードは、本明細書に記載のＤＤのうちのいずれかに融合し、ｐＬＶＸ及びｐＥＬＮＳベクターなどの発現ベクターにクローン化した。リガンドに依存したＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａの産生を試験するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、構築物で一過性にトランスフェクトした。次いで、細胞を、１０％ＦＢＳでＤＭＥＭに播種し、３７℃で５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。増殖培地を、リガンド、例えば、１０μＭのバルデナフィルを含有する培地のために交換した。リガンドによる４８時間のインキュベーション後、細胞を溶解し、ＩＬ１５Ｒａに特異的な抗体を使用して免疫ブロットした。ｈＰＤＥ５−ＤＤは、バルデナフィルの存在下で、試験した３つすべての構築物、ＯＴ−ＩＬ１５−０４３、ＯＴ−ＩＬ１５−０４４、及びＯＴ−ＩＬ１５−０４５で、ＩＬ１５Ｒａレベルを調節することができた。対照的に、ＩＬ１５Ｒａレベルは、リガンドの存在及び不在下で、構造的構築物、ＯＴ−ＩＬ１５−００８で変化がなかった。リガンドに依存した安定化が、バルデナフィルの存在下で、ＩＬ１５Ｒａのみの移動性において上方移行を伴うことが顕著であり、安定化が翻訳後のタンパク質修飾を伴う可能性が高いことを示した。試料の均一の負荷は、負荷対照としてアクチンを使用して示した。
【０８２２】
ペイロードの発現におけるベクター骨格の効果は、ＯＴ−ＩＬ１５−０３１構築物をｐＥＬＰＳベクター骨格にクローン化することによって試験して、ＯＴ−ＩＬ１５−０７９構築物を生成した。構築物を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質導入し、ＩＬ１５Ｒａの発現は、上記のようにアッセイした。ＯＴ−ＩＬ１５−０３１のみが、ＩＬ１５Ｒａのタンパク質レベルのバルデナフィルに依存した安定化を示した。穏やかなリガンドに依存した安定化のみが、バルデナフィルの存在下でＯＴ−ＩＬ１５−０７９構築物で観察された。
【０８２３】
ＩＬ１５レベルはまた、ＭＳＤアッセイを使用して試験した。増殖培地を、ＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａを発現し、かつ１０μＭのバルデナフィルまたはビヒクル対照に４８時間曝露された細胞から収穫した。これらの結果を、表４３に示し、安定化比率は、刺激物質（すなわち、ＤＭＳＯ対照）の不在下で、ＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａの配列への、刺激物質（すなわち、バルデナフィル）と応答して、対象となるタンパク質（すなわち、ＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａ）の発現の比率、機能またはレベルとして定義された。不安定化比率は、構造的に発現している対象となるタンパク質（ＯＴ−ＩＬ１５−００８）の発現、機能、またはレベルへの、エフェクターモジュールに特異的な刺激物質（すなわち、バルデナフィル）の不在下で、ならびにＳＲＥに特異的な刺激物質の不在下で、ＩＬ１５Ｒａの発現の比率として計算された。１を超える安定化比率及び１未満の不安定化比率が、望ましい。
【表４３】
2020525536.tif 000431
【０８２４】
表４３に示すように、３つすべてのｈＰＤＥ５で調節した構築物は、１未満の不安定化比率を示し、リガンドの不在下で不安定化を示した。ＯＴ−ＩＬ１５−０４３は、最も不安定化した構築物であると思われた。それはまた、最高の安定化比率を有する、最もリガンドで安定化した構築物であった。
【０８２５】
ＯＴ−ＩＬ１５−０３１構築物の発現はまた、ウェスタンブロットを介してＨＣＴ−１１６細胞においても分析した。細胞を、１０μＭのバルデナフィルに４８時間曝露し、ＩＬ１５及びＩＬ１５Ｒａレベルは、ウェスタンブロットによって分析された。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞と同様に、ＨＣＴ１１６細胞はまた、タンパク質修飾を示すＩＬ１５Ｒａタンパク質の移動性の同時に起こる上方シフトを伴ってバルデナフィルに依存した安定化も示した。
【０８２６】
実施例２４．ＩＬ１５−ＩＬ１５ＲａのＤＤ調節におけるリンカーの効果
使用したリンカーのタイプの効果及びペイロードの発現の調節におけるリンカーの長さが、試験された。ＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａ融合構築物は、リンカーとして（ＯＴ−ＩＬ１５−１１１などの場合）ＧＳＧＳＧＳ（配列番号８３３０）、またはリンカーとして（ＯＴ−ＩＬ１５−１１２などの場合）ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号８３３１）を使用して、またはリンカーとして（ＯＴ−ＩＬ１５−１１３などの場合）ＧＳＧＳＧＧＧＳＧＳ（配列番号８３３２）を使用して、ｈＰＤＥ５（Ｒ７３２Ｌ）ＤＤに連結された。構築物のＩＬ１５部分を、Ｆｌａｇタグでタグ化したが、ＩＬ１５Ｒａ部分を、ＨＡタグでタグ化した。これらのタグは、構築物の成分の両方が実験では個々に追跡されることを可能にする。構築物を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に一過性にトランスフェクトし、次いで、１μＭのバルデナフィルで２４時間インキュベートした。ＤＤで調節したＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａペイロードの特性は、上述のように、ＨＡ抗体を使用して、リガンドの存在及び不在下で、ＦＡＣＳを介して分析された。これらの結果を、表４４に示し、安定化比率が、刺激物質（すなわち、ＤＭＳＯ対照で処理した試料）の不在下で、ＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａの発現と応答して、発現の比率、対象となるタンパク質への、刺激物質（すなわち、バルデナフィル）と応答して、対象となるタンパク質（すなわち、ＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａ）の発現の比率、機能またはレベルとして定義された。
【表４４】
2020525536.tif 000432
【０８２７】
表４４に示すように、異なるリンカーを有する、３つすべての構築物は、それぞれ、いくぶん類似している安定化比率をもたらし、リンカーの長さ及び同一性が、ＤＤによるペイロードの調節に３つ構築物はすべて影響を及ぼさなかったことを示した。３つすべての構築物もまた、１を超える安定化比率を有し、ペイロード発現がリガンドの存在下で安定化されたことを示唆している。試験した３つの構築物の中で、ＯＴ−ＩＬ１５−１１２は、他の２つの構築物よりもわずかに高い安定化比率を示し、ＧＳＧＳＧＳＧＳリンカーの使用がわずかに改善されたリガンドに依存した安定化をもたらし得ることを示した。
【０８２８】
実施例２５．ＤＤで調節したＣＤ１９  ＣＡＲの発現及び機能
ＣＤ１９  ＣＡＲなどの本発明の免疫治療剤ペイロードは、本明細書に記載のＤＤのうちのいずれかに融合し、発現ベクターｐＬＶＸ及びｐＥＬＮＳベクターにクローン化した。このようにして、ＯＴ−ＣＤ１９−０５２（ｈＰＤＥ５（ＷＴ））及びＯＴ−ＣＤ１９−０５３（ｈＰＤＥ５（Ｒ７３２Ｌ））。ＨＡタグは、キメラタンパク質の容易な検出を可能にするために付加された。
【０８２９】
リガンドに依存したＣＤ１９  ＣＡＲ産生を試験するために、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、構築物で一過性にトランスフェクトした。次いで、細胞を、増殖培地、例えば、１０％ＦＢＳでＤＭＥＭに播種し、３７℃で、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。増殖培地を、３０ｎＭ〜１０，０００ｎＭの範囲である様々な濃度のバルデナフィルで、リガンドを含有する培地のために交換した。リガンドでの４８時間のインキュベーション後、細胞を、ＨＡ抗体を使用してＦＡＣＳによって分析し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を計算した。これらの結果を、表４５Ａに示し、安定化比率は、刺激物質（すなわち、ＤＭＳＯ対照）の不在下で、ＣＤ１９  ＣＡＲの発現への、激物質（すなわち、バルデナフィル）と応答して、対象となるタンパク質（すなわち、ＣＤ１９  ＣＡＲ）の発現の比率、機能またはレベルとして定義された。１を超える安定化比率が、望ましい。
【表４５Ａ】
2020525536.tif 000433
【０８３０】
表４５Ａに示すように、１を超える安定化比率が、すべての用量のバルデナフィルで、最低濃度のバルデナフィル（３０ｎＭ）でさえ観察され、低用量のリガンドがリガンドに依存した安定化を達成するのに十分であり得ることを示唆している。最高濃度のリガンド、すなわち、１０，０００ｎＭで得られた安定化比率が１０００ｎＭのリガンドで得られた比率よりも低く、安定化の二峰性パターンを示唆している。
【０８３１】
ＯＴ−ＣＤ１９−０５２及びＯＴ−ＣＤ１９−０５３の用量に依存した調節は、２ｕｇのＤＮＡでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞において測定され、２ｕｇ／ｍｌのピューロマイシンを使用して安定に選択された。ＣＡＲ表面発現は、指示された濃度でリガンド処理から２４時間後、タンパク質Ｌ染色を使用して検出された。タンパク質Ｌの蛍光中央値を、表４５Ｂに示す。
【表４５Ｂ−１】
2020525536.tif 000434
【表４５Ｂ−２】
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【０８３２】
表４５Ｂに示すように、ＷＴ構築物ＯＴ−ＣＤ１９−０５２ではなく、表面ＣＡＲ発現の増加と共にＯＴ−ＣＤ１９−０５３のみが、増加する用量のリガンドに応答した。これは、３つすべてのリガンドで観察された。しかしながら、最高レベルのＣＡＲ発現は、増加する用量のバルデナフィルで観察された。バルデナフィル、タダラフィル、及びシルデナフィルにおけるＥＣ５０は、それぞれ、２５ｎＭ、３８０ｎＭ、及び１５００ｎＭに決定された。
【０８３３】
細胞はまた、表４５Ｃに示すリガンド濃度で様々な持続時間に対するリガンドで処理し、タンパク質Ｌの発現を、ＦＡＣＳを使用して測定した。これらの結果を、表４５Ｃ及び表４５Ｄに示す。安定化比率を、表４５Ｅに示す。
【表４５Ｃ】
2020525536.tif 000436
【表４５Ｄ−１】
2020525536.tif 000437
【表４５Ｄ−２】
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【表４５Ｅ】
2020525536.tif 000439
【０８３４】
安定化比率の分析は、ＯＴ−ＣＤ１９−０５３がリガンドによるインキュベーション時間の持続時間の増加に伴って３つすべてのリガンドによって安定化されることを示した。予想通りに、１０μＭの用量のリガンドは、１μＭの用量よりもはるかに大きいＣＡＲの発現を示した。より低い用量でさえ調節は、明らかであった。
【０８３５】
構築物ＯＴ−ＣＤ１９−１３０、ＯＴ−ＣＤ１９−１３１、及びＯＴ−ＣＤ１９−１３２は、ｐＥＬＮＳベクターにクローン化し、Ｔ細胞に形質導入した。３つの異なる体積のレンチウイルス上清は、細胞において、すなわち、１μｌ、１０μｌ、及び２０μｌで試験した。形質導入後、細胞を、１０μＭのバルデナフィルで処理したまたは４日目に開始して、２４時間未処理のままであった。非形質導入細胞はまた、陰性対照として含まれた。５日目に、ＣＡＲ陽性細胞の割合は、１μｇ／ｍｌのＣＤ１９  Ｆｃを使用してＦＡＣＳによって測定された。これらの結果を、図１９Ａに示す。
【０８３６】
図１９Ａに示すように、３つすべてのリガンドは、バルデナフィルの存在下で、ＣＡＲ陽性細胞の割合でウイルス用量に依存した増加を示した。同様の傾向が未処理対照で観察されたが、バルデナフィルで処理することなく観察されたＣＡＲ陽性細胞の割合は、バルデナフィルで処理した対照よりも実質的には少なかった。３つの構築物の中で、ＯＴ−ＣＤ１９−１３２は、リガンドの不在下でＣＡＲの最低の基本的発現、及びバルデナフィルの存在下でＣＡＲ陽性細胞の最高の割合を示した。図１９Ｂに示すように、２０μｌのウイルスを使用して異なる構築物で得られたＣＡＲ陽性の割合と比較するときに、同様の観察が行われ、ＣＡＲ陽性である細胞の数のシフトが、非形質導入及び未処理細胞と比較して、バルデナフィルで処理した細胞（標識処理）において観察された。
【０８３７】
１０日間にわたって培地中に維持されたＴ細胞は、休眠に達し、したがって、ＯＴ−ＣＤ１９−１３１で形質導入したＴ細胞は、１１日目にバルデナフィルに依存したＣＡＲ発現を示さなかった。しかしながら、１１日目において、同じＴ細胞とＣＤ３／ＣＤ２８ビーズとの再刺激（３：１のビーズ：細胞の比で、リガンド処理と同時で２４時間）は、２０μｌのウイルスで形質導入したＴ細胞におけるバルデナフィルに依存したＣＡＲ発現を復元した（図１９Ｃ）。ＣＡＲの発現における再刺激の効果は、図１９Ｄで試験したすべての濃度のウイルスで明らかであった。総合すれば、これらのデータは、ｈＰＤＥ５  ＤＤに作動可能に連結されたＣＤ１９  ＣＡＲがリガンドに依存したＣＡＲ発現を示すことを示す。さらに、リガンドの反応性及びその後のＣＡＲ発現は、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズによる再刺激によって休眠Ｔ細胞中に復元され得る。
【０８３８】
ｈＰＤＥ５−ＣＡＲ構築物における異なるリガンドへの効果を試験するために、構築物は、プラスミドにパッケージ化し、１０μｌのウイルスを使用してＴ細胞に形質導入した。９日目に、ＯＴ−ＣＤ１９−１１１、ＯＴ−ＣＤ１９−１３０、ＯＴ−ＣＤ１９−１３１、またはＯＴ−ＣＤ１９−１３２のいずれかを発現するＴ細胞は、０．１ｎＭ〜１０μＭの範囲である様々な用量のリガンドで２４時間処理した。構造的構築物ＯＴ−ＣＤ１９−０６３は、陽性対照として含まれ、空のベクター（ｐＥＬＮＳ）で形質導入した細胞は、陰性対照としての役割を果たした。シルデナフィル、タダラフィル、及びバルデナフィルを含む、ｈＰＤＥ５のための３つの異なるリガンドが、試験された。細胞は、ＦＡＣＳによって分析され、一重項／生のＣＡＲ陽性細胞に対して分類された。これらの結果を、図１９Ｅに示す。試験した３つのリガンドの中で、すべての構築物は、バルデナフィルに対して最も応答性があり、続いて、タダラフィル及びシルデナフィルに対して応答性があった。上記に見られるように、ＯＴ−ＣＤ１９−１３１及びＯＴ−ＣＤ１９−１３２は、他の構築物よりも低い基本的発現を示し、それよりも高いＥＣ５０値を有した。実験は、１０μＬ、２μＬ、０．４μＬ、または０．０８μＬのウイルスを使用してＴ細胞に形質導入した異なる体積のウイルスでＴ細胞を形質導入することによってＯＴ−ＣＤ１９−１３１構築物で繰り返され、ＣＡＲ発現は、３つすべてのリガンドの存在下及びリガンドの不在下で、ＦＡＣＳによって測定された。これらの結果を、表４５Ｆに示し、「ＣＡＲ＋の基礎の割合（％）」は、リガンドの不在下で、ＣＡＲ陽性細胞の割合を示し、「ＣＡＲ＋の最大（％）」は、リガンドの存在下で、ＣＡＲの最大発現を示す。ＥＣ５０は、最大半量応答を得る薬物／リガンドの濃度として定義される。本明細書において応答は、キメラ抗原受容体の発現を指す。
【表４５Ｆ】
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【０８３９】
試験した３つのリガンドの中で、より高い形質導入体積が増加し、最大のＣＡＲ発現レベルを達成したが、リガンドＥＣ５０値を改変しなかった。
【０８４０】
いかに迅速にｈＰＤＥ５−ＣＡＲがリガンドで安定化され得るかを試験するために、指示された構築物が、Ｔ細胞において試験された。ドナーからのＴ細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８のＤｙｎａｂｅａｄｓの存在下で、３：１のビーズ：細胞の比で、一晩解凍し、活性化した。翌日、細胞を、ＯＴ−ＣＤ１９−０６３、ＯＴ−ＣＤ１９−１１１、ＯＴ−ＣＤ１９−１３０、ＯＴ−ＣＤ１９−１３１、及びＯＴ−ＣＤ１９−１３２構築物から調製した１０μＬのレンチウイルスで形質導入した。細胞を、１０日間にわたって新たな培地の付加によって増殖し、約０．５×１０＾６個の細胞／ｍＬの細胞を維持し、次いで、解凍した。増殖したＴ細胞を、解凍し、ＣＤ３／ＣＤ２８のビーズで４８時間再刺激した。すべての状態が、０、２、４、６、２４、または４８時間のリガンド処理による４８時間のビーズ刺激を受容するように、細胞を、１０μＭのタダラフィルまたはバルデナフィルで様々な時間で処理した。ＣＡＲ表面発現を、１μｇ／ｍＬのＣＤ１９−Ｆｃで測定した。これらの結果を、図１９Ｆに示す。活性化したＴ細胞では、ＣＡＲ表面発現は、リガンド付加から２時間後にほぼ最大レベルで生じた。
【０８４１】
調節発現を示すＣＤ１９−ＣＡＲもまた、調節細胞毒性を示すかどうかを試験するために、形質導入したＴ細胞は、ＣＤ１９を発現するＮａｌｍ６腫瘍細胞株に対する細胞毒性アッセイにおいて試験され、ヒトドナーからのＴ細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８のＤｙｎａｂｅａｄｓの存在下で、３：１のビーズ：細胞の比で、一晩解凍し、活性化した。翌日、細胞を、ＯＴ−ＣＤ１９−０６３、ＯＴ−ＣＤ１９−１１１、ＯＴ−ＣＤ１９−１３０、ＯＴ−ＣＤ１９−１３１、及びＯＴ−ＣＤ１９−１３２からの１０μＬのレンチウイルスで形質導入した。細胞を、１０日間にわたって新たな培地の付加によって増殖し、約０．５×１０＾６個の細胞／ｍＬの細胞を維持し、次いで、解凍した。増殖したＴ細胞を、解凍し、タダラフィルの不在または存在下で、ＣＤ１９を発現する標的細胞、Ｎａｌｍ６−Ｋａｔｕｓｈｋａと、１０：１のエフェクター：標的細胞比で６日間共培養した。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ  Ｚｏｏｍ上に取り込まれた画像は、経時的に赤色蛍光（全ＮｕｃＲｅｄ領域）を測定することによって標的細胞の増殖のために分析された。リガンド、すなわち、ＤＭＳＯの不在下で、ＯＴ−ＣＤ１９−１３１、及びＯＴ−ＣＤ１９−１３２は、全ＮｕｃＲｅｄ領域（赤色蛍光）の増加によって測定されるように、標的細胞の増殖を示した。構築物、ＯＴ−ＣＤ１９−１３０、ＯＴ−ＣＤ１９−１１１は、構造的に発現したＣＡＲ構築物ＯＴ−ＣＤ１９−０６３に相当する基礎活性を示す、非常に低いレベルの赤色蛍光を示した。試験したすべての構築物は、構造的に発現したＣＡＲで観察された赤色蛍光レベルに相当する、３μＭのタダラフィルまたは１０μＭのタダラフィルのいずれかで処理したときに、赤色蛍光の低下を示した。予想通りに、非形質導入細胞は、リガンドの存在及び不在下で、高いレベルの赤色蛍光を示した。
【０８４２】
Ｔ細胞におけるより高い基礎ＣＡＲ発現を示す構築物、ＯＴ−ＣＤ１９−１１１及びＯＴ−ＣＤ１９−１３０は、タダラフィルの不在下で標的細胞の増殖を阻害した。ＣＡＲ発現に関して、最高のＥＣ５０のタダラフィルを有した、ＯＴ−ＣＤ１９−１３２で形質導入したＴ細胞は、インビトロで機能的応答を生成するために、より高い濃度のリガンドを必要とした。
【０８４３】
Ｔ細胞におけるサイトカインレベルを測定するために、上記の共培養アッセイからの上清は、４８時間収穫し、ＭＳＤアッセイ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  ＤｉｓｃｏｖｅｒｙのＥＬＩＳＡ）によってＩＦＮγ及びＩＬ２レベルについて分析された。これらの結果を、図１９Ｇに示す。以下のエフェクター対標的細胞の比でのサイトカインレベル：１０：１、３：１、１：１、０．３：１、及び０．１：１。高レベルのＩＦＮγ及びＩＬ２は、３μＭのタダラフィルの存在下で、Ｎａｌｍ６標的物のみで共培養されるとき、ＯＴ−ＣＤ１９−１３１で形質導入したＴ細胞によって生成され、観察された細胞毒性と相関する。
【０８４４】
細胞毒性及びサイトカイン分泌がＣＡＲ発現と直接関連することを確認するために、ＯＴ−ＣＤ１９−１３１で形質導入したＴ細胞を、１０μＭ〜１０ｎＭの用量漸増のタダラフィルの存在下で、１０：１のエフェクター：標的細胞の比で、Ｎａｌｍ６−Ｋａｔｕｓｈｋａ標的細胞と６日間共培養した。Ｎａｌｍ６細胞の蛍光を、０．０１μＭ、０．０４μＭ、０．１２μＭ、０．３７μＭ、１．１１μＭ、３．３３μＭ、１０μＭの用量のタダラフィルに応答して、６日間にわたって測定した。０．３７μＭ、１．１１μＭ、３．３３μＭ、１０μＭのタダラフィル用量は、６日間にわたってＮａｌｍ６の増殖の低下を示した。より低い濃度（＜０．３７μＭ）のタダラフィルは、Ｎａｌｍ６蛍光の低下を生じず、実際には、Ｎａｌｍ６細胞は、６日間にわたって増殖し続ける。著しいＣＡＲ発現は、３００ｎＭ以上のタダラフィル濃度のＣＤ１９−Ｆｃを使用してＦＡＣＳによって検出された。このＣＡＲ発現は、タダラフィルの用量に依存した細胞毒性（図１９Ｈ）ならびにＩＦＮγ及びＩＬ２のサイトカイン分泌（図１９Ｉ）に応答した。
【０８４５】
ＣＡＲで形質導入したＴ細胞の機能性はまた、インビトロで試験された。Ｔ細胞を、ＯＴ−ＣＤ１９−１３１または構造的構築物ＯＴ−ＣＤ１９−０６３で形質導入した。次いで、細胞を解凍した。実験前に、Ｔ細胞を、一晩解凍し、Ｋａｔｕｓｈｋａ  ＲＦＰを安定に発現するＮａｌｍ６標的細胞と共培養した。Ｎａｌｍ６細胞は、高レベルのＣＤ１９抗原を発現し、したがって、ＣＤ１９  ＣＡＲ構築物を試験する細胞死滅アッセイにおいて理想的な標的細胞である。Ｔ細胞を、１０μＭのバルデナフィルまたはＤＭＳＯの存在下で、５：１のエフェクター細胞対標的細胞（Ｅ：Ｔ）の比でＮａｌｍ６細胞と１２時間混合した。標的細胞アポトーシスを、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ装置を使用して経時的にアネキシンＶ蛍光を測定することによって決定した。細胞死滅が、すべての死滅した標的領域及びＮＡＬＭ６−Ｋａｔｕｓｈｋａ領域（μＭ２）の比率として測定される。図１９Ｊに示すように、バルデナフィルの存在下で、Ｎａｌｍ６細胞を、ＯＴ−ＣＤ１９−１３１を発現するＴ細胞と共刺激したときに、すべての死滅した標的細胞領域が、増加した。同様の傾向は、Ｎａｌｍ６細胞の増殖において観察された（図１９Ｋ）。同じ細胞は、ＤＭＳＯの存在下で著しい細胞死滅をもたらさなかったが、Ｔ細胞による標的死滅が具体的にはリガンドの存在に応じることを示した。予想通りに、構造的構築物、ＯＴ−ＣＤ１９−０６３は、リガンドの存在及び不在下で、リガンドの存在下でのさらなる死滅に対する傾向を有するすべての死滅した標的細胞領域の増加を示した。Ｎａｌｍ６細胞は、非形質導入Ｔ細胞と共刺激し、Ｔ細胞と共刺激しなかったＮａｌｍ６細胞は、すべての死滅した標的領域の増加を示さなかった。総合すれば、これらのデータは、調節したＣＡＲ構築物、ＯＴ−ＣＤ１９−１３１がリガンドに応答して抗原陽性細胞のみに活性であることを示す。
【０８４６】
細胞上清はまた、Ｔ細胞／Ｎａｌｍ６細胞毒性共培養アッセイから６６時間回収し、インターフェロンガンマレベルが、ＭＳＤアッセイによって測定された。これらの結果を、表４５Ｇに示す。
【表４５Ｇ】
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【０８４７】
表４５Ｇに示すように、インターフェロンガンマレベルは、バルデナフィルの付加により、ＯＴ−ＣＤ１９−１３１で形質導入したＴ細胞の５倍の誘導を示した。バルデナフィル処理は、ＯＴ−ＣＤ１９−０６３で形質導入したＴ細胞または非形質導入Ｔ細胞のインターフェロンガンマ産生を誘導せず、インターフェロンガンマのリガンド特異的な誘導が、ＣＡＲ発現の増加及び同様の条件下で観察された細胞死滅に関連することを示した。ＤＭＳＯで処理したＯＴ−ＣＤ１９−１３１のインターフェロンガンマレベルは、構造的構築物で観察されたレベルよりも低、ＯＴ−ＣＤ１９−１３１細胞がＣＤ１９  ＣＡＲの低い基本的発現を有することを示した。
【０８４８】
実施例２６．ｈＰＤＥ５で調節したＣＤ１９  ＣＡＲのインビボ評価
腫瘍拒絶モデルにおけるリガンドで調節したＣＡＲの有効性の有効性を試験するために、５００万個のＣＡＲ陽性Ｔ細胞（２５００万個の全Ｔ細胞）を、Ｎａｌｍ６腫瘍を持つ雌ＮＳＧマウスにおいて注射した。Ｎａｌｍ６−Ｌｕｃは、血液腫瘍を研究するために、静脈内播種性腫瘍モデルを生成するために使用されるＢ細胞前駆体白血病細胞株である。マウスを、ｍｇ／ｋｇ（体重）またはｍｐｋ：１０ｍｐｋ、３０ｍｐｋ、または１００ｍｐｋで、ビヒクルまたはタダラフィルで毎日処理した。構造的ＯＴ−ＣＤ１９−０６３で形質導入したＴ細胞は、陽性対照としての役割を果たし、陰性対照として非形質導入Ｔ細胞の役割を果たした。Ｔ細胞を、Ｎａｌｍ６細胞を移植してから７日後に注射した。タダラフィル群の動物は、Ｔ細胞を注射する前に、２回の用量のリガンドを受容した。研究の目的は、ｈＰＤＥ５  ＤＤのＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔのリガンド用量応答調節及び有効性におけるその影響を試験することであった。さらに、研究はまた、抗原の存在がＣＡＲの検出及び発現のために必要である場合に対処するために使用された。用量群は、（ａ）非形質導入Ｔ細胞、（ｂ）非形質導入のビヒクルで処理した細胞、（ｃ）１００ｍｇ／ｋｇのタダラフィルで投与した非形質導入細胞、（ｄ）５００万個のＣＤ１９＋ＯＴ−ＣＤ１９−０６３  ＣＡＲ  Ｔ細胞、（ｅ）ＯＴ−ＣＤ１９−０６３  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ビヒクル）を有する５００万個のＣＤ１９陽性Ｎａｌｍ６細胞、（ｆ）ＯＴ−ＣＤ１９−０６３  ＣＡＲ  Ｔ細胞（タダラフィル１００ｍｇ）を有する５００万個のＣＤ１９陽性Ｎａｌｍ６細胞、（ｇ）ＯＴ−ＣＤ１９−１３１  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ビヒクル）を有する５００万個のＣＤ１９陽性Ｎａｌｍ６細胞、（ｈ）ＯＴ−ＣＤ１９−１３１（１０ｍｇ／ｋｇのタダラフィル）を有する５００万個のＣＤ１９陽性Ｎａｌｍ６細胞、（ｉ）ＯＴ−ＣＤ１９−１３１  ＣＡＲ  Ｔ細胞（３０ｍｇ／ｋｇのタダラフィルを有する５００万個のＣＤ１９陽性Ｎａｌｍ６細胞、（ｊ）ＯＴ−ＣＤ１９−１３１  ＣＡＲ  Ｔ細胞（１００ｍｇ／ｋｇのタダラフィル）を有する５００万個のＣＤ１９陽性Ｎａｌｍ６細胞を含んだ。すべての動物は、１日１回、２５日間経口投与した。腫瘍負荷評価は、生物発光画像を使用して隔週で行われ、Ｎａｌｍ６  Ｌｕｃ細胞の蛍光強度は、経時的に観察された。２つの最終的な回収は、骨髄、血液、及び脾臓細胞集団を評価するために行われた。腫瘍負荷／有病率の低下は、Ｎａｌｍ６−ルシフェラーゼ細胞からの発光の減少によって測定され、タダラフィルで処置したＣＤ１９−１３１動物において観察された（図２０Ａ）。図２０Ａにおいて、「ｃｏｎｓｔ」とは、ＯＴ−ＣＤ１９−０６３を指し、「調節した」とは、ＯＴ−ＣＤ１９−１３１を指す。総合すれば、これらのデータは、タダラフィルの毎日の経口投与が腫瘍増殖の用量に依存した抑制及び／または腫瘍負荷の低下をもたらしたことを示す。最大腫瘍抑制は、薬物の不在下で非常に低い活性を有する構造的ＣＡＲに相当した。血漿ＰＫはまた、指示された用量レベルで単回投与後に、ｈＰＤＥ５阻害剤タダラフィル及びバルデナフィルの非腫瘍担持マウスにおいて構築され、これを、図２０Ｂ及び図２０Ｃに示す。
（項目１）
エフェクターモジュールを含む細胞または対象における免疫応答を誘導する組成物であって、前記エフェクターモジュールが、
（ａ）刺激応答エレメント（ＳＲＥ）と、
（ｂ）前記ＳＲＥに結合する、付加される、またはそれと関連する、少なくとも１つのペイロードと、を含み、
前記ＳＲＥが、不安定化ドメイン（ＤＤ）を含み、前記ＤＤが、全体的または部分的に、ｃＧＭＰ特異的３’，５’−環式ホスホジエステラーゼ（ｈＰＤＥ５；配列番号１）を含む、前記組成物。
（項目２）
前記ペイロードが、前記ＳＲＥに付加される、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記ＤＤが、ｈＰＤＥ５の触媒ドメイン（配列番号３）を含み、前記触媒ドメインが、ｈＰＤＥ５（配列番号１）のアミノ酸５３５〜８６０を含む、項目１に記載の組成物。
（項目４）
前記ＤＤが、配列番号１の７３２位（Ｒ７３２）のアミノ酸の変異を含む、項目３に記載の組成物。
（項目５）
前記７３２位（Ｒ７３２）のアミノ酸の変異が、Ｒ７３２Ｌ、Ｒ７３２Ａ、Ｒ７３２Ｇ、Ｒ７３２Ｖ、Ｒ７３２Ｉ、Ｒ７３２Ｐ、Ｒ７３２Ｆ、Ｒ７３２Ｗ、Ｒ７３２Ｙ、Ｒ７３２Ｈ、Ｒ７３２Ｓ、Ｒ７３２Ｔ、Ｒ７３２Ｄ、Ｒ７３２Ｅ、Ｒ７３２Ｑ、Ｒ７３２Ｎ、Ｒ７３２Ｍ、Ｒ７３２Ｃ、及びＲ７３２Ｋからなる群から選択される、項目４に記載の組成物。
（項目６）
前記ＤＤが、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｌ）（配列番号１２）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ａ）（配列番号３８４）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｇ）（配列番号３８３）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｖ）（配列番号３８５）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｉ）（配列番号３８６）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｐ）（配列番号３８７）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｆ）（配列番号３８８）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｗ）（配列番号３８９）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｙ）（配列番号３９０）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｈ）（配列番号３９１）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｓ）（配列番号３９２）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｔ）（配列番号３９３）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｄ）（配列番号３９４）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｅ）（配列番号３９５）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｑ）（配列番号３９６）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｎ）（配列番号３９７）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｍ）（配列番号３９８）、ｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｃ）（配列番号３９９）、及びｈＰＤＥ５（ＷＴのアミノ酸５３５〜８６０、Ｒ７３２Ｋ）（配列番号４００）からなる群から選択される、項目４または項目５に記載の組成物。
（項目７）
前記Ｒ７３２位のアミノ酸の変異が、Ｒ７３２Ｌであり、前記ＤＤが、配列番号１２のアミノ酸配列を含む、項目４に記載の組成物。
（項目８）
前記Ｒ７３２位のアミノ酸の変異が、Ｒ７３２Ａであり、前記ＤＤが、配列番号３８４のアミノ酸配列を含む、項目４に記載の組成物。
（項目９）
前記Ｒ７３２位のアミノ酸の変異が、Ｒ７３２Ｇであり、前記ＤＤが、配列番号３８３を含む、項目４に記載の組成物。
（項目１０）
前記ＤＤが、Ｈ６５３Ａ、Ｆ７３６Ａ、Ｄ７６４Ａ、Ｄ７６４Ｎ、Ｙ６１２Ｆ、Ｙ６１２Ｗ、Ｙ６１２Ａ、Ｗ８５３Ｆ、Ｉ８２１Ａ、Ｙ８２９Ａ、Ｆ７８７Ａ、Ｄ６５６Ｌ、Ｙ７２８Ｌ、Ｍ６２５Ｉ、Ｅ５３５Ｄ、Ｅ５３６Ｇ、Ｑ５４１Ｒ、Ｋ５５５Ｒ、Ｆ５５９Ｌ、Ｆ５６１Ｌ、Ｆ５６４Ｌ、Ｆ５６４Ｓ、Ｋ５９１Ｅ、Ｎ５８７Ｓ、Ｋ６０４Ｅ、Ｋ６０８Ｅ、Ｎ６０９Ｈ、Ｋ６３０Ｒ、Ｋ６３３Ｅ、Ｎ６３６Ｓ、Ｎ６６１Ｓ、Ｙ６７６Ｄ、Ｙ６７６Ｎ、Ｃ６７７Ｒ、Ｈ６７８Ｒ、Ｄ６８７Ａ、Ｔ７１２Ｓ、Ｄ７２４Ｎ、Ｄ７２４Ｇ、Ｌ７３８Ｈ、Ｎ７４２Ｓ、Ａ７６２Ｓ、Ｄ７６４Ｇ、Ｄ７６４Ｖ、Ｓ７６６Ｆ、Ｋ７９５Ｅ、Ｌ７９７Ｆ、Ｉ７９９Ｔ、Ｔ８０２Ｐ、Ｓ８１５Ｃ、Ｍ８１６Ａ、Ｉ８２４Ｔ、Ｃ８３９Ｓ、Ｋ８５２Ｅ、Ｓ５６０Ｇ、Ｖ５８５Ａ、Ｉ５９９Ｖ、Ｉ６４８Ｖ、Ｓ６６３Ｐ、Ｌ６７５Ｐ、Ｔ７１１Ａ、Ｆ７４４Ｌ、Ｌ７４６Ｓ、Ｆ７５５Ｌ、Ｌ８０４Ｐ、Ｍ８１６Ｔ、及びＦ８４０Ｓからなる群から独立して選択される、１つ以上の変異をさらに含む、項目５に記載の組成物。
（項目１１）
前記ＤＤが、前記変異Ｈ６５３Ａを含み、かつ前記ＤＤが、配列番号５０９のアミノ酸配列を含む、項目１０に記載の組成物。
（項目１２）
前記ＤＤが、前記変異Ｆ７３６Ａを含み、かつ前記ＤＤが、配列番号２２７のアミノ酸配列を含む、項目１０に記載の組成物。
（項目１３）
前記ＤＤが、前記変異Ｄ７６４Ａを含み、かつ前記ＤＤが、配列番号５１０のアミノ酸配列を含む、項目１０に記載の組成物。
（項目１４）
前記ＤＤが、前記変異Ｙ６１２Ｆを含み、かつ前記ＤＤが、配列番号５０６のアミノ酸配列を含む、項目１０に記載の組成物。
（項目１５）
前記ＤＤが、前記変異Ｙ６１２Ｗを含み、かつ前記ＤＤが、配列番号５０７のアミノ酸配列を含む、項目１０に記載の組成物。
（項目１６）
前記ＤＤが、前記変異Ｙ６１２Ａを含み、かつ前記ＤＤが、配列番号５０８のアミノ酸配列を含む、項目１０に記載の組成物。
（項目１７）
前記ＤＤが、前記変異Ｄ７６４Ｎを含み、かつ前記ＤＤが、配列番号５０５のアミノ酸配列を含む、項目１０に記載の組成物。
（項目１８）
前記ペイロードが、免疫治療剤である、項目２に記載の組成物。
（項目１９）
前記免疫治療剤が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びサイトカイン−サイトカイン受容体融合ポリペプチドから選択される、項目１８に記載の組成物。
（項目２０）
前記免疫治療剤が、キメラ抗原受容体であり、
前記キメラ抗原受容体が、
（ａ）細胞外標的部分と、
（ｂ）ヒンジ及び膜貫通ドメインと、
（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、
（ｄ）任意に、１つ以上の共刺激ドメインと、を含む、項目１９に記載の組成物。
（項目２１）
前記ＣＡＲが、標準ＣＡＲ、スプリットＣＡＲ、オフスイッチＣＡＲ、オンスイッチＣＡＲ、第一世代ＣＡＲ、第二世代ＣＡＲ、第三世代ＣＡＲ、または第四世代ＣＡＲである、項目２０に記載の組成物。
（項目２２）
前記ＣＡＲ部分の細胞外標的が、がん細胞の表面上の標的分子に対する親和性を有するか、または前記標的分子に結合する、項目２０に記載の組成物。
（項目２３）
前記ＣＡＲの前記細胞外標的部分が、ｓｃＦｖである、項目２２に記載の組成物。
（項目２４）
前記標的分子が、ＣＤ１９である、項目２２に記載の組成物。
（項目２５）
前記ＣＡＲの前記細胞外標的部分が、ＣＤ１９  ｓｃＦｖ（配列番号８２３３）である、項目２３または項目２４に記載の組成物。
（項目２６）
前記ＣＡＲの前記ヒンジ及び前記膜貫通ドメインが、対合され、
前記対合されたヒンジ及び膜貫通ドメインが、
（ａ）ＣＤ８ａ、ＣＤ５、ＣＤ４、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１４８、ＤＡＰ１０、ＥｐｏＲＩ、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＩＣＯＳ、Ｈｅｒ２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＰＤ−１、またはＣＴＬＡ−４から選択される分子と、
（ｂ）Ｔ細胞受容体のＣＤ３イプシロン鎖と、
（ｃ）Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、またはゼータ鎖の膜貫通領域と、
（ｄ）ＩｇＧ１、ＩｇＤ、ＩｇＧ４、及びＩｇＧ４  Ｆｃ領域から選択される免疫グロブリンと、からなる群のメンバーのうちのいずれかに由来する、項目２０に記載の組成物。
（項目２７）
前記ＣＡＲの前記対合されたヒンジ及び膜貫通ドメインが、ＣＤ８ａに由来し、前記対合されたヒンジ及び膜貫通ドメインが、配列番号８２３５のアミノ酸配列を含む、項目２６に記載の組成物。
（項目２８）
（ａ）前記ＣＡＲの前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ、またはＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄからなる群から選択される細胞表面分子に由来するシグナル伝達ドメインであり、
（ｂ）前記共刺激ドメインが、存在し、かつ４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）２Ｂ４、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、及びＢ７−Ｈ３からなる群に由来する、項目２０に記載の組成物。
（項目２９）
前記ＣＡＲの前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータに由来し、前記細胞内シグナル伝達ドメインが、配列番号８２３６のアミノ酸配列を含む、項目２８に記載の組成物。
（項目３０）
前記ＣＡＲの前記共刺激ドメインが、存在し、前記共刺激ドメインが、４−１ＢＢに由来し、前記共刺激ドメインが、配列番号８２３７のアミノ酸配列を含む、項目２８に記載の組成物。
（項目３１）
前記キメラ抗原受容体が、シグナル配列をさらに含む、項目２０に記載の組成物。
（項目３２）
前記シグナル配列が、ＣＤ８αに由来し、前記シグナル配列が、配列番号２７８のアミノ酸配列を含む、項目３１に記載の組成物。
（項目３３）
前記免疫治療剤が、サイトカイン−サイトカイン受容体融合ポリペプチドである、項目１９に記載の組成物。
（項目３４）
前記サイトカイン−サイトカイン受容体融合ポリペプチドが、ＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａ融合ポリペプチドを生成するために、ＩＬ１５Ｒａの全体またはその一部に融合したＩＬ１５の全体またはその一部を含む、項目３３に記載の組成物。
（項目３５）
前記サイトカイン−サイトカイン受容体融合ポリペプチドが、融合ポリペプチドを生成するために、配列番号８３２４のアミノ酸配列に融合した配列番号８３２４のアミノ酸配列を含む、項目３４に記載の組成物。
（項目３６）
前記エフェクターモジュールが、配列番号８２８３、配列番号８２７１〜８２８２、及び配列番号８２８４からなる群から選択されるＤＤ−ＣＤ１９  ＣＡＲ融合ポリペプチドである、項目１〜３２のいずれか１項に記載の組成物。
（項目３７）
前記エフェクターモジュールが、配列番号８３３８、配列番号８３３４〜８３３７、及び配列番号８３３９〜８３４３からなる群から選択されるＤＤ−ＩＬ１５−ＩＬ１５Ｒａ融合ポリペプチドである、項目１〜１９及び項目３３〜３５に記載の組成物。
（項目３８）
前記ＳＲＥが、１つ以上の刺激物質に応答する、項目１〜３７に記載の組成物。
（項目３９）
前記刺激物質が、小分子であり、前記小分子が、タダラフィル、バルデナフィル、シルデナフィル、アバナフィル、ロデナフィル、ミロデナフィル、ウデナフィル、ベンザミデナフィル、ダサンタフィル、及びベミナフィルから選択される、項目３８に記載の組成物。
（項目４０）
前記小分子が、タダラフィルである、項目３９に記載の組成物。
（項目４１）
項目１〜４０のいずれか１項に記載の組成物と、薬学的に許容される賦形剤と、を含む、薬学的組成物。
（項目４２）
項目１〜４０に記載の組成物のいずれか、または項目４１に記載の薬学的組成物をコードする、ポリヌクレオチド。
（項目４３）
項目４２に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
（項目４４）
項目１〜４０のいずれかに記載の組成物、項目４１に記載の薬学的組成物、項目４２に記載のポリヌクレオチドを発現する、及び／または項目４３に記載のベクターで形質導入もしくはトランスフェクトされる、養子細胞移入（ＡＣＴ）のための免疫細胞。
（項目４５）
細胞における免疫応答を誘導する方法であって、
（ａ）前記細胞に、治療上有効量の項目４１に記載の薬学的組成物のいずれかを投与することと、
（ｂ）前記免疫治療剤の発現を調節するために、前記細胞に、治療上有効量の刺激物質を投与することであって、前記刺激物質がリガンドであり、前記免疫治療剤が、前記刺激物質に応答して、前記細胞における免疫応答を誘導することができる、前記刺激物質を投与することと
を含む、前記方法。
（項目４６）
対象における腫瘍負荷を軽減する方法であって、
（ａ）前記対象に、治療上有効量の項目４４に記載の免疫細胞を投与することと、
（ｂ）前記免疫治療剤の発現を調節し、前記腫瘍負荷を軽減するように、前記対象に、治療上有効量のリガンドである刺激物質を投与することと、を含む、前記方法。
（項目４７）
前記リガンドが、タダラフィルである、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
タダラフィルが、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ（前記対象の体重）の範囲の用量で、前記対象に投与される、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記タダラフィルが、１０ｍｇ／ｋｇ（前記対象の体重）の用量で、前記対象に投与される、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記タダラフィルが、３０ｍｇ／ｋｇ（前記対象の体重）の用量で、前記対象に投与される、項目４８に記載の方法。
（項目５１）
前記タダラフィルが、１００ｍｇ／ｋｇ（前記対象の体重）の用量で、前記対象に投与される、項目４８に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図１９Ｇ】
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【図１９Ｈ】
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【図１９Ｉ】
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【図１９Ｊ】
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【図１９Ｋ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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