(57)【要約】  本開示は、一般に、遺伝子発現の調節に使用するための核酸分子に関する。本明細書に開示されるのは、目的遺伝子のコード配列に作動可能に連結されているウイルスキャプシドエンハンサーの１つ以上の構造エレメントを含む核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスキャプシドエンハンサーは、ウイルスキャプシドタンパク質由来の下流ループ（ＤＬＰ）、またはＤＬＰの多様体を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスキャプシドエンハンサーまたはその多様体のうちの１つ以上のＲＮＡステムループをコードしている第１の核酸配列と、
前記第１の核酸配列に作動可能に連結されている第２の核酸配列と、を含み、前記第２の核酸配列が、目的遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列を含む、核酸分子。
【請求項２】
前記第１の核酸配列が、前記ＧＯＩの前記コード配列の上流に作動可能に連結されている、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記第１の核酸配列の上流に作動可能に連結されているプロモーターをさらに含む、請求項１または２に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記第１の核酸配列の上流に作動可能に連結されている５’ＵＴＲ配列をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記５’ＵＴＲ配列が、前記プロモーターの下流および前記第１の核酸配列の上流に作動可能に連結されている、請求項４に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記第２の核酸配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記自己プロテアーゼペプチドの前記コード配列が、前記第１の核酸配列の下流および前記第２の核酸配列の上流に作動可能に連結されている、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項８】
前記自己プロテアーゼペプチドが、ブタテッショウウイルス−１  ２Ａ（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、細胞質多角体病ウイルス２Ａ（ＢｍＣＰＶ２Ａ）、軟化病ウイルス２Ａ（ＢｍＩＦＶ２Ａ）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチド配列を含む、請求項６〜７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項９】
前記第２の配列核酸配列の下流に作動可能に連結されている３’ＵＴＲ配列をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１０】
前記ウイルスキャプシドエンハンサーが、トガウイルス科に属するウイルス種のキャプシド遺伝子に由来する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１１】
前記ウイルス種が、前記トガウイルス科のアルファウイルス属に属している、請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項１２】
前記アルファウイルス種は、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、エバーグレーズウイルス（ＥＶＥＶ）、ムカンボウイルス（ＭＵＣＶ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ピクスナウイルス（ＰＩＸＶ）、ミドレブルクウイルス（ＭＩＤＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、オニョンニョンウイルス（ＯＮＮＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、バーマフォレストウイルス（ＢＦ）、ゲタウイルス（ＧＥＴ）、サギヤマウイルス（ＳＡＧＶ）、ベバルウイルス（ＢＥＢＶ）、マヤロウイルス（ＭＡＹＶ）、ウナウイルス（ＵＮＡＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）、アウラウイルス（ＡＵＲＡＶ）、ワタロアウイルス（ＷＨＡＶ）、ババンキウイルス（ＢＡＢＶ）、キジラガウイルス（ＫＹＺＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、ハイランドＪウイルス（ＨＪＶ）、フォートモーガンウィルス（ＦＭＶ）、Ｎｄｕｍｕ（ＮＤＵＶ）、サケ科アルファウイルス（Ｓａｌｍｏｎｉｄ  ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）（ＳＡＶ）、およびＢｕｇｇｙ  Ｃｒｅｅｋウイルスからなる群から選択される、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１３】
前記ウイルスキャプシドエンハンサーが、前記ウイルス種の下流ループ（ＤＬＰ）モチーフを含み、前記ＤＬＰモチーフが、前記１つ以上のＲＮＡステムループのうちの少なくとも１つを含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１４】
前記ウイルスキャプシドエンハンサーが、配列番号１および４６〜５２のうちの少なくとも１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を呈する核酸配列を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１５】
前記核酸配列が、配列番号１および４６〜５２のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を呈する、請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項１６】
前記ＧＯＩの前記コード配列が、ポリペプチドをコードする、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドが、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助食品用ポリペプチド、工業用酵素、レポーターポリペプチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、抗体、抗原、免疫調節剤、サイトカイン、酵素、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１９】
第２のウイルスキャプシドエンハンサーまたはその多様体の１つ以上のＲＮＡステムループをコードしている第３の核酸配列と、
前記第３の核酸配列に作動可能に連結されている第４の核酸配列と、をさらに含み、前記第４の核酸配列は、第２の目的遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２０】
前記第３の核酸配列の下流および前記第４の核酸配列の上流に作動可能に連結されている第２の自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む、請求項１９に記載の核酸分子。
【請求項２１】
前記核酸分子が、ｍＲＮＡ分子またはＲＮＡレプリコンである、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２２】
発現ベクターまたは転写ベクターである、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２３】
１つ以上の追加の転写調節配列をさらに含む、請求項２２に記載の核酸分子。
【請求項２４】
１つ以上の追加の翻訳調節配列をさらに含む、請求項２２または２３に記載の核酸分子。
【請求項２５】
プラスミド、バクテリオファージベクター、コスミド、フォスミド、ウイルスレプリコン、シャトルベクター、またはそれらの組み合わせである、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２６】
原核生物ベクターまたは真核生物ベクターである、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２７】
ｄｅ  ｎｏｖｏ合成によって産生される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項２８】
請求項１６〜２７のいずれか一項に記載の核酸分子を細胞内に導入することを含み、それによって前記細胞内において前記ＧＯＩによってコードされているポリペプチドを産生する、細胞内で目的のポリペプチドを産生するための方法。
【請求項２９】
細胞内において目的のポリペプチドを産生するための方法であって、前記細胞内にＲＮＡ分子を導入することを含み、前記ＲＮＡ分子は、ウイルスキャプシドエンハンサーまたはその多様体の１つ以上のＲＮＡステムループ、および目的の前記ポリペプチドのコード配列を含み、それによって、前記細胞内に目的の前記ポリペプチドが産生される、方法。
【請求項３０】
前記ＲＮＡ分子がメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子またはレプリコンＲＮＡ分子である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＲＮＡ分子が、前記細胞に導入される前に、ｄｅ  ｎｏｖｏ合成および／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって産生される、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＲＮＡ分子がウイルス種の下流ループ（ＤＬＰ）モチーフを含み、前記ＤＬＰモチーフが前記ウイルスキャプシドエンハンサーの前記１つ以上のＲＮＡステムループのうちの少なくとも１つを含む、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＲＮＡ分子が、前記１つ以上のＲＮＡステムループのうちの少なくとも１つの下流、および目的の前記ポリペプチドの前記コード配列の上流に自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記自己プロテアーゼペプチドが、ブタテッショウウイルス−１  ２Ａ（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、細胞質多角体病ウイルス２Ａ（ＢｍＣＰＶ２Ａ）、軟化病ウイルス２Ａ（ＢｍＩＦＶ２Ａ）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチド配列を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ポリヌクレオチドが、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助食品用ポリペプチド、工業用酵素、レポーターポリペプチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ポリペプチドが、抗体、抗原、免疫調節剤、サイトカイン、酵素、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞が、組織、器官、または対象に存在する、請求項２９〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記対象がヒト、ウマ、ブタ、霊長類、マウス、フェレット、ラット、コットンラット、ウシ、イノシシ、ヒツジ、ウサギ、ネコ、イヌ、鳥、魚、ヤギ、ロバ、ハムスター、およびバッファローからなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
細胞内でメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を産生するための方法であって、ウイルスキャプシドエンハンサーまたはその多様体のうちの１つ以上のＲＮＡステムループをコードしている第１の核酸配列と、前記第１の核酸配列に作動可能に連結されている第２の核酸配列であって、目的遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列を含む前記第２の核酸配列と、を含む核酸分子を前記細胞に投与することを含み、それによって前記ＧＯＩのｍＲＮＡを産生する、を含む方法。
【請求項４０】
前記第１の核酸配列が、前記ＧＯＩの前記コード配列の上流に作動可能に連結されている、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
前記第１の核酸配列の上流に作動可能に連結されているプロモーターをさらに含む、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記第１の核酸配列の上流に作動可能に連結されている５’ＵＴＲ配列をさらに含む、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記５’ＵＴＲ配列が、前記プロモーターの下流および前記第１の核酸配列の上流に作動可能に連結されている、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記第２の核酸配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む、請求項３９〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記自己プロテアーゼペプチドの前記コード配列が、前記第１の核酸配列の下流および前記第２の核酸配列の上流に作動可能に連結されている、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記自己プロテアーゼペプチドが、ブタテッショウウイルス−１  ２Ａ（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、細胞質多角体病ウイルス２Ａ（ＢｍＣＰＶ２Ａ）、軟化病ウイルス２Ａ（ＢｍＩＦＶ２Ａ）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチド配列を含む、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記第２の配列核酸配列の下流に作動可能に連結されている３’ＵＴＲ配列をさらに含む、請求項３９〜４６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項４８】
前記ウイルスキャプシドエンハンサーが、トガウイルス科に属するウイルス種のキャプシド遺伝子に由来する、請求項３９〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記ウイルス種が、前記トガウイルス科のアルファウイルス属に属している、請求項３９〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記アルファウイルス種は、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、エバーグレーズウイルス（ＥＶＥＶ）、ムカンボウイルス（ＭＵＣＶ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ピクスナウイルス（ＰＩＸＶ）、ミドレブルクウイルス（ＭＩＤＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、オニョンニョンウイルス（ＯＮＮＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、バーマフォレストウイルス（ＢＦ）、ゲタウイルス（ＧＥＴ）、サギヤマウイルス（ＳＡＧＶ）、ベバルウイルス（ＢＥＢＶ）、マヤロウイルス（ＭＡＹＶ）、ウナウイルス（ＵＮＡＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）、アウラウイルス（ＡＵＲＡＶ）、ワタロアウイルス（ＷＨＡＶ）、ババンキウイルス（ＢＡＢＶ）、キジラガウイルス（ＫＹＺＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、ハイランドＪウイルス（ＨＪＶ）、フォートモーガンウィルス（ＦＭＶ）、Ｎｄｕｍｕ（ＮＤＵＶ）、サケ科アルファウイルス（Ｓａｌｍｏｎｉｄ  ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）（ＳＡＶ）、およびＢｕｇｇｙ  Ｃｒｅｅｋウイルスからなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ウイルスキャプシドエンハンサーが、前記ウイルス種の下流ループ（ＤＬＰ）モチーフを含み、前記ＤＬＰモチーフが、前記１つ以上のＲＮＡステムループのうちの少なくとも１つを含む、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記ウイルスキャプシドエンハンサーが、配列番号１および４６〜５２のうちの少なくとも１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を呈する核酸配列を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記核酸配列が、配列番号１および４６〜５２のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を呈する、請求項５２に記載の核酸分子。
【請求項５４】
前記ＧＯＩの前記コード配列が、ポリペプチドをコードする、請求項３９〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記ポリペプチドが、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助食品用ポリペプチド、工業用酵素、レポーターポリペプチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ポリペプチドが、抗体、抗原、免疫調節剤、サイトカイン、酵素、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
第２のウイルスキャプシドエンハンサーまたはその多様体の１つ以上のＲＮＡステムループをコードしている第３の核酸配列と、
前記第３の核酸配列に作動可能に連結されている第４の核酸配列と、をさらに含み、前記第４の核酸配列は、第２の目的遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列を含む、請求項３９〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記第３の核酸配列の下流および前記第４の核酸配列の上流に作動可能に連結されている第２の自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記核酸分子が、ＲＮＡレプリコンである、請求項３９〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記核酸分子が、発現ベクターまたは転写ベクターである、請求項３９〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記核酸分子が、１つ以上の追加の転写調節配列をさらに含む、請求項５９または６０に記載の方法。
【請求項６２】
１つ以上の追加の翻訳調節配列をさらに含む、請求項６０または６１に記載の核酸分子。
【請求項６３】
前記核酸分子が、プラスミド、バクテリオファージベクター、コスミド、フォスミド、ウイルスレプリコン、シャトルベクター、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される発現ベクターである、請求項６０〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記核酸分子が、原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターである、請求項６０〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記細胞が、組織、器官、または対象に存在する、請求項３９〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記対象がヒト、ウマ、ブタ、霊長類、マウス、フェレット、ラット、コットンラット、ウシ、イノシシ、ヒツジ、ウサギ、ネコ、イヌ、鳥、魚、ヤギ、ロバ、ハムスター、およびバッファローからなる群から選択される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記細胞内で前記ＧＯＩの前記ｍＲＮＡによってコードされているポリペプチドを産生することをさらに含む、請求項３９〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記ＧＯＩの前記産生されたｍＲＮＡを得ることと、
前記得られたｍＲＮＡを第２の細胞に導入して、前記第２の細胞における前記ＧＯＩの前記ｍＲＮＡによってコードされているポリペプチドを発現させることと、を含む、請求項３９〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
改変型ウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている核酸配列を含む核酸分子であって、前記改変型ウイルスＲＮＡレプリコンは、
ウイルスキャプシドエンハンサーまたはその多様体のうちの１つ以上の構造エレメントをコードしている第１の核酸配列であって、前記ウイルスキャプシドエンハンサーが、前記ウイルスＲＮＡレプリコンに対して異種である、第１の核酸配列と、
少なくとも１つの非構造ウイルスタンパク質またはその一部分をコードしている第２の核酸配列と、を含み、
前記第１の核酸配列が、前記第２の核酸配列の上流に作動可能に連結されている、核酸分子。
【請求項７０】
前記ウイルスキャプシドエンハンサーの前記１つ以上の構造エレメントのうちの少なくとも１つが、１つ以上のＲＮＡステムループを含む、請求項６９に記載の核酸分子。
【請求項７１】
前記ウイルスキャプシドエンハンサーが、トガウイルス科に属するウイルス種のキャプシド遺伝子に由来する、請求項６９または７０に記載の核酸分子。
【請求項７２】
前記ウイルス種が、前記トガウイルス科のアルファウイルス属に属している、請求項７１に記載の核酸分子。
【請求項７３】
前記アルファウイルス種は、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、エバーグレーズウイルス（ＥＶＥＶ）、ムカンボウイルス（ＭＵＣＶ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ピクスナウイルス（ＰＩＸＶ）、ミドレブルクウイルス（ＭＩＤＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、オニョンニョンウイルス（ＯＮＮＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、バーマフォレストウイルス（ＢＦ）、ゲタウイルス（ＧＥＴ）、サギヤマウイルス（ＳＡＧＶ）、ベバルウイルス（ＢＥＢＶ）、マヤロウイルス（ＭＡＹＶ）、ウナウイルス（ＵＮＡＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）、アウラウイルス（ＡＵＲＡＶ）、ワタロアウイルス（ＷＨＡＶ）、ババンキウイルス（ＢＡＢＶ）、キジラガウイルス（ＫＹＺＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、ハイランドＪウイルス（ＨＪＶ）、フォートモーガンウィルス（ＦＭＶ）、Ｎｄｕｍｕ（ＮＤＵＶ）、およびＢｕｇｇｙ  Ｃｒｅｅｋウイルスからなる群から選択される、請求項７２に記載の核酸分子。
【請求項７４】
前記ウイルスキャプシドエンハンサーが、前記ウイルス種の下流ループ（ＤＬＰ）モチーフを含み、前記ＤＬＰモチーフが、前記１つ以上のＲＮＡステムループのうちの少なくとも１つを含む、請求項７１〜７３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項７５】
前記ウイルスキャプシドエンハンサーが、配列番号１および４６〜５２のうちの少なくとも１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を呈する核酸配列を含む、請求項６９または７０に記載の核酸分子。
【請求項７６】
前記核酸配列が、配列番号１および４６〜５２のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を呈する、請求項７５に記載の核酸分子。
【請求項７７】
前記改変型ウイルスＲＮＡレプリコンをコードする前記核酸配列が、前記第１の核酸配列の下流および前記第２の核酸配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む、請求項６９〜７６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項７８】
前記自己プロテアーゼペプチドが、ブタテッショウウイルス−１  ２Ａ（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、細胞質多角体病ウイルス２Ａ（ＢｍＣＰＶ２Ａ）、軟化病ウイルス２Ａ（ＢｍＩＦＶ２Ａ）、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチド配列を含む、請求項７７に記載の核酸分子。
【請求項７９】
前記第１の核酸配列が、前記改変型ウイルスＲＮＡレプリコンの前記５’末端の下流の約１〜１０００ヌクレオチドの領域内に作動可能に位置付けられている、請求項６９〜７８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項８０】
前記第２の核酸配列が、対応する未改変型ウイルスＲＮＡレプリコンの天然ウイルス非構造タンパク質の前記コード配列を実質的にすべて含む、請求項６９〜７９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項８１】
前記改変型ウイルスＲＮＡレプリコンが、トガウイルス科のアルファウイルス属またはアルテリウイルス科のアルテリウイルス属に属するウイルス種に由来の改変型ＲＮＡレプリコンである、請求項６９〜８０のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項８２】
前記アルテリウイルス種が、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、ブタ呼吸器生殖器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、乳酸脱水素酵素上昇ウイルス（ＬＤＶ）、およびサル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）からなる群から選択される、請求項８１に記載の核酸分子。
【請求項８３】
前記第１の核酸配列が、前記改変型アルテリウイルスＲＮＡレプリコンのｐｐ１ａｂ非構造タンパク質の一部分または全体をコードしている第２の核酸配列の上流に作動可能に位置付けられている、請求項８２に記載の核酸分子。
【請求項８４】
前記改変型アルテリウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている前記核酸配列が、１つ以上の発現カセットをさらに含み、前記１つ以上の発現カセットのうちの少なくとも１つは、目的遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列に作動可能に連結されているプロモーターを含む、請求項８２または８３に記載の核酸分子。
【請求項８５】
前記改変型アルテリウイルスＲＮＡレプリコンが、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの発現カセットを含む、請求項８４に記載の核酸分子。
【請求項８６】
前記１つ以上の発現カセットのうちの少なくとも１つが、前記改変型アルテリウイルスＲＮＡレプリコンの一部分または全部のｐｐ１ａｂ非構造タンパク質をコードしている前記第２の核酸配列の下流に作動可能に連結されている、請求項８４または８５に記載の核酸分子。
【請求項８７】
前記１つ以上の発現カセットのうちの少なくとも１つが、前記改変型アルテリウイルスＲＮＡレプリコンの転写調節配列（ＴＲＳ）の下流に作動可能に位置付けられ、前記ＴＲＳが、ＴＲＳ１、ＴＲＳ２、ＴＲＳ３、ＴＲＳ４、ＴＲＳ５、ＴＲＳ６、およびＴＲＳ７からなる群から選択される、請求項８４〜８６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項８８】
前記１つ以上の発現カセットのうちの少なくとも１つが、ウイルスキャプシドエンハンサーの１つ以上の構造エレメントをコードしている第３の核酸配列をさらに含み、前記第３の核酸配列が、前記ＧＯＩの前記コード配列の上流に作動可能に連結されている、請求項８４〜８７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項８９】
前記改変型アルテリウイルスＲＮＡレプリコンをコードする前記核酸配列が、前記第３の核酸配列の下流および前記ＧＯＩの前記コード配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む、請求項８８に記載の核酸分子。
【請求項９０】
前記ＧＯＩの前記コード配列が、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助食品用ポリペプチド、工業用酵素、レポーターポリペプチド、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される前記ポリペプチドをコードする、請求項８４〜８９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項９１】
前記ＧＯＩの前記コード配列が、抗体、抗原、免疫調節剤、サイトカイン、酵素、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項８４〜８９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項９２】
前記改変型ウイルスＲＮＡレプリコンは、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、エバーグレーズウイルス（ＥＶＥＶ）、ムカンボウイルス（ＭＵＣＶ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ピクスナウイルス（ＰＩＸＶ）、ミドレブルクウイルス（ＭＩＤＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、オニョンニョンウイルス（ＯＮＮＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、バーマフォレストウイルス（ＢＦ）、ゲタウイルス（ＧＥＴ）、サギヤマウイルス（ＳＡＧＶ）、ベバルウイルス（ＢＥＢＶ）、マヤロウイルス（ＭＡＹＶ）、ウナウイルス（ＵＮＡＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）、アウラウイルス（ＡＵＲＡＶ）、ワタロアウイルス（ＷＨＡＶ）、ババンキウイルス（ＢＡＢＶ）、キジラガウイルス（ＫＹＺＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、ハイランドＪウイルス（ＨＪＶ）、フォートモーガンウィルス（ＦＭＶ）、Ｎｄｕｍｕ（ＮＤＵＶ）、サケ科アルファウイルス（Ｓａｌｍｏｎｉｄ  ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）（ＳＡＶ）、およびＢｕｇｇｙ  Ｃｒｅｅｋウイルスからなる群から選択されるアルファウイルス種由来の改変型ＲＮＡレプリコンを含む、請求項６９〜９１のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項９３】
前記第１の核酸配列が、前記改変型アルファウイルスＲＮＡレプリコンの１つ以上の非構造タンパク質ｎｓｐ１〜４またはその一部分をコードしている第２の核酸配列の上流に作動可能に位置付けられている、請求項９２に記載の核酸分子。
【請求項９４】
前記改変型アルファウイルスＲＮＡレプリコンをコードする前記核酸配列は、１つ以上の発現カセットをさらに含み、前記発現カセットの各々は、目的遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列に作動可能に連結されているプロモーターを含む、請求項９２または９３に記載の核酸分子。
【請求項９５】
前記改変型アルファウイルスＲＮＡレプリコンが、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの発現カセットを含む、請求項９４に記載の核酸分子。
【請求項９６】
前記１つ以上の発現カセットのうちの少なくとも１つは、前記改変型アルファウイルスＲＮＡレプリコンの１つ以上の非構造タンパク質ｎｓｐ１〜４またはその一部分をコードしている核酸配列の下流に作動可能に連結されている、請求項９４または９５に記載の核酸分子。
【請求項９７】
前記１つ以上の発現カセットのうちの少なくとも１つが、ウイルスキャプシドエンハンサーの１つ以上の構造エレメントをコードしている第３の核酸配列をさらに含み、前記第３の核酸配列が、前記ＧＯＩの前記コード配列の上流に作動可能に連結されている、請求項９４〜９６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項９８】
前記改変型アルファウイルスＲＮＡレプリコンをコードする前記核酸配列が、前記第３の核酸配列の下流および前記ＧＯＩの前記コード配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む、請求項９７に記載の核酸分子。
【請求項９９】
前記ＧＯＩの前記コード配列が、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助食品用ポリペプチド、工業用酵素、およびレポーターポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項９４〜９８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１００】
前記ＧＯＩの前記コード配列が、抗体、抗原、免疫調節剤、酵素、およびサイトカインからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項９４〜９８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１０１】
改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている核酸配列を含む核酸分子であって、前記改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンが、ウイルスキャプシドエンハンサーまたはその多様体のうちの１つ以上の構造エレメントをコードしている第１の核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項１０２】
前記改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンをコードする前記核酸配列が、少なくとも１つの非構造ウイルスタンパク質またはその一部分をコードしている第２の核酸配列をさらに含み、前記第１の核酸配列が、前記第２の核酸配列の上流に作動可能に連結されている、請求項１０１に記載の核酸分子。
【請求項１０３】
前記改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンをコードする前記核酸配列が、前記第１の核酸配列の下流および前記第２の核酸配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む、請求項１０１または１０２に記載の核酸分子。
【請求項１０４】
前記自己プロテアーゼペプチドが、ブタテッショウウイルス−１  ２Ａ（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、細胞質多角体病ウイルス２Ａ（ＢｍＣＰＶ２Ａ）、軟化病ウイルス２Ａ（ＢｍＩＦＶ２Ａ）、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチド配列を含む、請求項１０３に記載の核酸分子。
【請求項１０５】
前記改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンをコードする前記核酸配列が、プラス鎖ＲＮＡウイルスに由来する改変型ＲＮＡレプリコンを含む、請求項１０１〜１０４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１０６】
前記プラス鎖ＲＮＡウイルスは、トガウイルス科、フラビウイルス科、オルソミクソウイルス科、ラブドウイルス科、およびパラミクソウイルス科からなる群から選択される科に属するウイルス種である、請求項１０５に記載の核酸分子。
【請求項１０７】
前記ウイルス種が、アルテリウイルス科のアルテリウイルス属に属する、請求項１０６に記載の核酸分子。
【請求項１０８】
前記改変型アルファウイルスＲＮＡレプリコンをコードする前記核酸配列が、１つ以上の発現カセットをさらに含み、前記発現カセットの各々は、目的遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列に作動可能に連結されているプロモーターを含む、請求項１０１〜１０７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１０９】
前記改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンをコードする前記核酸配列が、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの発現カセットを含む、請求項１０１〜１０８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１１０】
前記１つ以上の発現カセットの少なくとも１つが、前記少なくとも１つの非構造ウイルスタンパク質またはその一部分をコードしている前記第２の核酸配列の下流に作動可能に連結されている、請求項１０１〜１０９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１１１】
前記１つ以上の発現カセットのうちの少なくとも１つが、ウイルスキャプシドエンハンサーの１つ以上の構造エレメントをコードしている第３の核酸配列をさらに含み、前記第３の核酸配列が、前記ＧＯＩの前記コード配列の上流に作動可能に連結されている、請求項１０１〜１１０のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１１２】
前記改変型アルファウイルスＲＮＡレプリコンをコードする前記核酸配列が、前記第３の核酸配列の下流および前記ＧＯＩの前記コード配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む、請求項１１１に記載の核酸分子。
【請求項１１３】
ｄｅ  ｎｏｖｏ合成によって産生される、請求項１〜２６、および６９〜１１２のいずれか一項記載の核酸分子。
【請求項１１４】
請求項１〜２７および６９〜１１３のいずれか一項に記載の核酸分子を含む組換え細胞。
【請求項１１５】
前記組換え細胞が、原核細胞または真核細胞である、請求項１１４に記載の組換え細胞。
【請求項１１６】
前記組換え細胞が、動物細胞である、請求項１１４に記載の組換え細胞。
【請求項１１７】
前記核酸分子が、改変型ＲＮＡレプリコンをコードしている核酸配列を含み、前記改変型レプリコンＲＮＡの発現により、前記組換え細胞において先天性免疫応答に対する耐性が付与される、請求項１１４〜１１６のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項１１８】
請求項１１４〜１１７のいずれか一項に記載の組換え細胞を含む細胞培養物。
【請求項１１９】
対象に前記先天性免疫系に対する耐性を付与するための方法であって、前記方法は、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている核酸配列を含む核酸分子を前記対象に投与することを含み、前記改変型ウイルスＲＮＡレプリコンは、
ウイルスキャプシドエンハンサーまたはその多様体のうちの１つ以上の構造エレメントをコードしている第１の核酸配列であって、前記ウイルスキャプシドエンハンサーが、前記ウイルスＲＮＡレプリコンに対して異種である、第１の核酸配列と、
少なくとも１つの非構造タンパク質またはその一部分をコードしている第２の核酸配列と、を含み、
前記第１の核酸配列が、前記第２の核酸配列の上流に作動可能に連結され、前記核酸分子によってコードされている前記改変型レプリコンＲＮＡの発現により、前記対象において先天性免疫応答に対する耐性が付与される、方法。
【請求項１２０】
対象において目的のポリペプチドを産生するための方法であって、前記方法は、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている核酸配列を含む核酸分子を前記対象に投与することを含み、前記改変型ウイルスＲＮＡレプリコンは、
ウイルスキャプシドエンハンサーまたはその多様体のうちの１つ以上の構造エレメントをコードしている第１の核酸配列であって、前記ウイルスキャプシドエンハンサーが、前記ウイルスＲＮＡレプリコンに対して異種である、第１の核酸配列と、
少なくとも１つの非構造タンパク質またはその一部分をコードしている第２の核酸配列と、を含み、
前記第１の核酸配列が、前記第２の核酸配列の上流に作動可能に連結されている、方法。
【請求項１２１】
目的のポリペプチドを産生するための方法であって、前記方法は、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている核酸配列を含む核酸分子を含む宿主細胞を培養することを含み、前記改変型ウイルスＲＮＡレプリコンは、
ウイルスキャプシドエンハンサーまたはその多様体のうちの１つ以上の構造エレメントをコードしている第１の核酸配列であって、前記ウイルスキャプシドエンハンサーが、前記ウイルスＲＮＡレプリコンに対して異種である、第１の核酸配列と、
少なくとも１つの非構造タンパク質またはその一部分をコードしている第２の核酸配列と、を含み、
前記第１の核酸配列が、前記第２の核酸配列の上流に作動可能に連結されている、方法。
【請求項１２２】
前記対象がヒト、ウマ、ブタ、霊長類、マウス、フェレット、ラット、コットンラット、ウシ、イノシシ、ヒツジ、ウサギ、ネコ、イヌ、鳥、魚、ヤギ、ロバ、ハムスター、およびバッファローからなる群から選択される、請求項１１９または１２０に記載の方法。
【請求項１２３】
前記ウイルスキャプシドエンハンサーの前記１つ以上の構造エレメントのうちの少なくとも１つが、１つ以上のＲＮＡステムループを含む、請求項１１９〜１２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２４】
前記ウイルスキャプシドエンハンサーが、トガウイルス科に属するウイルス種のキャプシド遺伝子に由来する、請求項１１９〜１２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記ウイルス種が、トガウイルス科のアルファウイルス属に属している、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記アルファウイルス種は、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、エバーグレーズウイルス（ＥＶＥＶ）、ムカンボウイルス（ＭＵＣＶ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ピクスナウイルス（ＰＩＸＶ）、ミドレブルクウイルス（ＭＩＤＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、オニョンニョンウイルス（ＯＮＮＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、バーマフォレストウイルス（ＢＦ）、ゲタウイルス（ＧＥＴ）、サギヤマウイルス（ＳＡＧＶ）、ベバルウイルス（ＢＥＢＶ）、マヤロウイルス（ＭＡＹＶ）、ウナウイルス（ＵＮＡＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）、アウラウイルス（ＡＵＲＡＶ）、ワタロアウイルス（ＷＨＡＶ）、ババンキウイルス（ＢＡＢＶ）、キジラガウイルス（ＫＹＺＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、ハイランドＪウイルス（ＨＪＶ）、フォートモーガンウィルス（ＦＭＶ）、Ｎｄｕｍｕ（ＮＤＵＶ）、およびＢｕｇｇｙ  Ｃｒｅｅｋウイルスからなる群から選択される、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記ウイルスキャプシドエンハンサーが、前記ウイルス種の下流ループ（ＤＬＰ）モチーフを含み、前記ＤＬＰモチーフが、前記１つ以上のＲＮＡステムループのうちの少なくとも１つを含む、請求項１２４〜１２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２８】
前記ウイルスキャプシドエンハンサーが、配列番号１および４６〜５２のうちの少なくとも１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を呈する核酸配列を含む、請求項１１９〜１２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２９】
前記核酸配列が、配列番号１および４６〜５２のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を呈する、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
前記改変型ウイルスＲＮＡレプリコンをコードする前記核酸配列が、前記第１の核酸配列の下流および前記第２の核酸配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む、請求項１１９〜１２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３１】
前記自己プロテアーゼペプチドが、ブタテッショウウイルス−１  ２Ａ（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、細胞質多角体病ウイルス２Ａ（ＢｍＣＰＶ２Ａ）、軟化病ウイルス２Ａ（ＢｍＩＦＶ２Ａ）、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチド配列を含む、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
前記第１の核酸配列が、前記改変型ウイルスＲＮＡレプリコンの前記５’末端の下流の約１〜１０００ヌクレオチドの領域内に作動可能に位置付けられている、請求項１１９〜１３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３３】
前記第２の核酸配列が、対応する未改変型ウイルスＲＮＡレプリコンの天然ウイルス非構造タンパク質の前記コード配列を実質的にすべて含む、請求項１１９〜１３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３４】
前記改変型ウイルスＲＮＡレプリコンが、トガウイルス科のアルファウイルス属またはアルテリウイルス科のアルテリウイルス属に属するウイルス種に由来の改変型ＲＮＡレプリコンである、請求項１１９〜１３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３５】
前記アルテリウイルスウイルス種が、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、ブタ呼吸器生殖器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、乳酸脱水素酵素上昇ウイルス（ＬＤＶ）、およびサル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）からなる群から選択される、請求項１１９〜１３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３６】
前記ウイルス種は、アルテリウイルスであり、前記第１の核酸配列は、前記改変型アルテリウイルスＲＮＡレプリコンの一部分または全部のｐｐ１ａｂ非構造タンパク質をコードしている核酸配列の上流に作動可能に位置付けられている、請求項１３４または１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
前記改変型アルテリウイルスＲＮＡレプリコンをコードする前記核酸配列は、１つ以上の発現カセットをさらに含み、前記発現カセットのうちの少なくとも１つは、目的遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列に作動可能に連結されているプロモーターを含む、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
前記改変型アルテリウイルスＲＮＡレプリコンが、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの発現カセットをさらに含む、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
前記１つ以上の発現カセットのうちの少なくとも１つが、前記改変型アルテリウイルスＲＮＡレプリコンの一部分または全部のｐｐ１ａｂ非構造タンパク質をコードしている前記第２の核酸配列の下流に作動可能に連結されている、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４０】
前記１つ以上の発現カセットのうちの少なくとも１つが、改変型アルテリウイルスＲＮＡレプリコンの転写調節配列（ＴＲＳ）の下流に作動可能に位置付けられ、前記ＴＲＳが、ＴＲＳ１、ＴＲＳ２、ＴＲＳ３、ＴＲＳ４、ＴＲＳ５、ＴＲＳ６、およびＴＲＳ７からなる群から選択される、請求項１３７〜１３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４１】
前記１つ以上の発現カセットのうちの少なくとも１つが、ウイルスキャプシドエンハンサーの１つ以上の構造エレメントをコードしている第３の核酸配列をさらに含み、前記第３の核酸配列が、前記ＧＯＩの前記コード配列の上流に作動可能に連結されている、請求項１３７〜１４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４２】
前記改変型アルテリウイルスＲＮＡレプリコンをコードする前記核酸配列が、前記第３の核酸配列の下流および前記ＧＯＩの前記コード配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
前記ＧＯＩの前記コード配列が、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助食品用ポリペプチド、工業用酵素、レポーターポリペプチド、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項１３７〜１４２のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１４４】
前記ＧＯＩの前記コード配列が、抗体、抗原、免疫調節剤、サイトカイン、酵素、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項１３７〜１４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４５】
前記改変型ウイルスＲＮＡレプリコンは、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、エバーグレーズウイルス（ＥＶＥＶ）、ムカンボウイルス（ＭＵＣＶ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ピクスナウイルス（ＰＩＸＶ）、ミドレブルクウイルス（ＭＩＤＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、オニョンニョンウイルス（ＯＮＮＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、バーマフォレストウイルス（ＢＦ）、ゲタウイルス（ＧＥＴ）、サギヤマウイルス（ＳＡＧＶ）、ベバルウイルス（ＢＥＢＶ）、マヤロウイルス（ＭＡＹＶ）、ウナウイルス（ＵＮＡＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）、アウラウイルス（ＡＵＲＡＶ）、ワタロアウイルス（ＷＨＡＶ）、ババンキウイルス（ＢＡＢＶ）、キジラガウイルス（ＫＹＺＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、ハイランドＪウイルス（ＨＪＶ）、フォートモーガンウィルス（ＦＭＶ）、Ｎｄｕｍｕ（ＮＤＵＶ）、およびＢｕｇｇｙ  Ｃｒｅｅｋウイルスからなる群から選択されるアルファウイルス種由来の改変型ＲＮＡレプリコンを含む、請求項１１９〜１３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４６】
前記第１の核酸配列は、前記改変型アルファウイルスＲＮＡレプリコンの１つ以上の非構造タンパク質ｎｓｐ１〜４またはその一部分をコードしている核酸配列の上流に作動可能に位置付けられている、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
前記改変型アルファウイルスＲＮＡレプリコンをコードする前記核酸配列は、１つ以上の発現カセットをさらに含み、前記発現カセットの各々は、目的遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列に作動可能に連結されているプロモーターを含む、請求項１４５または１４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４８】
前記改変型アルファウイルスＲＮＡレプリコンが、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの発現カセットをさらに含む、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
前記１つ以上の発現カセットのうちの少なくとも１つは、前記改変型アルファウイルスＲＮＡレプリコンの１つ以上の非構造タンパク質ｎｓｐ１〜４またはその一部分をコードしている核酸配列の下流に作動可能に連結されている、請求項１４７または１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
前記１つ以上の発現カセットのうちの少なくとも１つが、ウイルスキャプシドエンハンサーの１つ以上の構造エレメントをコードしている第３の核酸配列をさらに含み、前記第３の核酸配列が、前記ＧＯＩの前記コード配列の上流に作動可能に連結されている、請求項１４７〜１４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５１】
前記改変型アルファウイルスＲＮＡレプリコンが、前記第３の核酸配列の下流および前記ＧＯＩの前記コード配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
前記ＧＯＩの前記コード配列が、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助食品用ポリペプチド、工業用酵素、レポーターポリペプチド、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項１４７〜１５１のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１５３】
前記ＧＯＩの前記コード配列が、抗体、抗原、免疫調節剤、サイトカイン、酵素、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項１４７〜１５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５４】
対象に先天性免疫系に対する耐性を付与するための方法であって、前記方法は、改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている核酸配列を含む核酸分子を前記対象に投与することを含み、前記改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンが、アルファウイルスキャプシドエンハンサーの１つ以上の構造エレメントをコードしている第１の核酸配列を含み、前記核酸分子によってコードされている前記改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンの発現により、前記対象において先天性免疫応答に対する耐性が付与される、方法。
【請求項１５５】
対象において、目的のポリペプチドを産生するための方法であって、前記方法が、改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている核酸配列を含む核酸分子を前記対象に投与することを含み、前記改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンは、アルファウイルスキャプシドエンハンサーの１つ以上の構造エレメントをコードしている第１の核酸配列を含む、方法。
【請求項１５６】
改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている核酸配列を含む核酸分子を含む宿主細胞を培養することを含み、前記改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンは、アルファウイルスキャプシドエンハンサーの１つ以上の構造エレメントをコードしている第１の核酸配列を含む、目的のポリペプチドを産生するための方法。
【請求項１５７】
前記対象がヒト、ウマ、ブタ、霊長類、マウス、フェレット、ラット、コットンラット、ウシ、イノシシ、ヒツジ、ウサギ、ネコ、イヌ、鳥、魚、ヤギ、ロバ、ハムスター、およびバッファローからなる群から選択される、請求項１５４または１５５に記載の方法。
【請求項１５８】
前記改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンが、少なくとも１つの非構造ウイルスタンパク質またはその一部分をコードしている第２の核酸配列をさらに含み、前記第１の核酸配列が、前記第２の核酸配列の上流に作動可能に連結されている、請求項１５４〜１５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５９】
前記改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンが、前記第１の核酸配列の下流および前記第２の核酸配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む、請求項１５４〜１５８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６０】
前記自己プロテアーゼペプチドが、ブタテッショウウイルス−１  ２Ａ（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、細胞質多角体病ウイルス２Ａ（ＢｍＣＰＶ２Ａ）、軟化病ウイルス２Ａ（ＢｍＩＦＶ２Ａ）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチド配列を含む、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６１】
前記改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンは、プラス鎖ＲＮＡウイルスに由来する改変型ＲＮＡレプリコンを含む、請求項１５４〜１６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６２】
前記プラス鎖ＲＮＡウイルスは、トガウイルス科、フラビウイルス科、オルソミクソウイルス科、ラブドウイルス科、およびパラミクソウイルス科からなる群から選択される科に属するウイルス種である、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６３】
前記プラス鎖ＲＮＡウイルスが、アルテリウイルス科のアルテリウイルス属に属するウイルス種である、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６４】
前記改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンをコードする前記配列は、１つ以上の発現カセットをさらに含み、前記発現カセットの各々は、目的遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列に作動可能に連結されているプロモーターを含む、請求項１５４〜１６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６５】
前記改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンが、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの発現カセットをさらに含む、請求項１５４〜１６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６６】
前記１つ以上の発現カセットのうちの少なくとも１つが、前記改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンの前記少なくとも１つの非構造ウイルスタンパク質またはその一部分をコードしている前記第２の核酸配列の下流に作動可能に連結されている、請求項１５４〜１６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６７】
前記１つ以上の発現カセットのうちの少なくとも１つが、アルファウイルスキャプシドエンハンサーの１つ以上の構造エレメントをコードしている第３の核酸配列をさらに含み、前記第３の核酸配列が、前記ＧＯＩの前記コード配列の上流に作動可能に連結されている、請求項１５４〜１６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６８】
前記改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンが、前記第３の核酸配列の下流および前記ＧＯＩの前記コード配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１６９】
請求項１２１〜１５３および１５５〜１６８のいずれか一項に記載の方法によって産生された組換えポリペプチド。
【請求項１７０】
請求項１６９に記載の組換えポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項１７１】
請求項１〜２７および６９〜１１３のいずれか一項に記載の核酸分子と薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項１７２】
請求項１１４〜１１７のいずれか一項に記載の組換え細胞と薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項１７３】
前記組成物が医薬用配合物に配合されている、請求項１７０〜１７２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７４】
前記組成物が、共有結合化合物、非共有結合化合物、物理的組成物、または薬学的に許容される緩衝液を用いて医薬用配合物に配合される、請求項１７０〜１７３のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１６年１２月５日に出願された米国仮特許出願第６２／４３０，２５０号、２０１７年４月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／４８６，３６１号、２０１７年１１月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／５８７，９５４号に対する優先権を主張する。上記参照された出願の内容は、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【０００２】
配列表
添付の配列表の材料は、参照により本出願に組み込まれる。添付の配列表テキストファイル（ファイル名ＳＧＩ０１２ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ）は、２０１７年１２月４日に作成されたもの（１６９ＫＢ）である。
【０００３】
本開示は、遺伝子発現の調節に有用な核酸分子など、分子生物学および遺伝子工学の分野、ならびに、例えば、細胞培養中または対象において、好適な宿主細胞中での所望の産物の産生のため、および宿主細胞または対象に有益な特徴を付与するための核酸分子の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
バイオテクノロジーおよび分子生物学における進歩は、商業的に望ましい特徴または形質を有する組換え細胞および生物を開発するための多くの機会をもたらしてきた。特に、現代の遺伝子工学技術により、遺伝子の導入、従って組換え細胞および生物への新たな形質の導入が大いに加速した。例えば、宿主細胞またはトランスジェニック生物における望ましい遺伝子の適切な発現レベルは、この目的を達成するのに役立つ。
【０００５】
しかしながら、多くの分子ツールが利用可能であるにもかかわらず、宿主細胞および生物の遺伝子改変は、目的遺伝子の発現レベルが不十分であること、または発現が制御されないことによって、多くの場合、制約されている。したがって、宿主細胞および生物における導入遺伝子の発現を増強することができる調節エレメントが依然として必要とされている。調節エレメント、発現ベクター、および様々な種類の生物において機能する発現系などの新規分子ツールを同定することは、遺伝的に増強された細胞および生物の開発に有用であり得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この項は、本出願の概要を提供するものであり、その全範囲またはその特徴のすべてを網羅するものではない。
【０００７】
本開示は、一般に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子発現を調節する、例えば、増加させるために有用である方法および組成物に関する。遺伝子発現は、例えば、動物細胞および他の真核細胞中であり得る。遺伝子は、例えば、目的のタンパク質をコードしている異種遺伝子であり得る。
【０００８】
一態様では、本明細書に開示のいくつかの実施形態は、（ｉ）ウイルスキャプシドエンハンサーまたはその多様体のうちの１つ以上のＲＮＡステムループをコードしている第１の核酸配列と、（ｉｉ）第１の核酸配列に作動可能に連結されている第２の核酸配列と、を含み、第２の核酸配列が、目的遺伝子のコード配列（ＧＯＩ）を含む核酸分子に関する。
【０００９】
本開示による核酸分子の実施形態の実施は、以下の特徴のうちの１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、ＧＯＩのコード配列の上流に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、核酸分子は、第１の核酸配列の上流に作動可能に連結されているプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、第１の核酸配列の上流に作動可能に連結されている５’ＵＴＲ配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ配列は、プロモーターの下流および第１の核酸配列の上流に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、核酸分子は、第２の核酸配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、自己プロテアーゼペプチドのコード配列は、第１の核酸配列の下流および第２の核酸配列の上流に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、自己プロテアーゼペプチドは、ブタテッショウウイルス−１  ２Ａ（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、細胞質多角体病ウイルス２Ａ（ＢｍＣＰＶ２Ａ）、軟化病ウイルス２Ａ（ＢｍＩＦＶ２Ａ）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、第２の配列の核酸配列の下流に作動可能に連結されている３’ＵＴＲ配列をさらに含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、ウイルスキャプシドエンハンサーは、トガウイルス科に属するウイルス種のキャプシド遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、ウイルス種は、トガウイルス科のアルファウイルス属に属する。いくつかの実施形態では、アルファウイルス種は、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、エバーグレーズウイルス（ＥＶＥＶ）、ムカンボウイルス（ＭＵＣＶ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ピクスナウイルス（ＰＩＸＶ）、ミドレブルクウイルス（ＭＩＤＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、オニョンニョンウイルス（ＯＮＮＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、バーマフォレストウイルス（ＢＦ）、ゲタウイルス（ＧＥＴ）、サギヤマウイルス（ＳＡＧＶ）、ベバルウイルス（ＢＥＢＶ）、マヤロウイルス（ＭＡＹＶ）、ウナウイルス（ＵＮＡＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）、アウラウイルス（ＡＵＲＡＶ）、ワタロアウイルス（ＷＨＡＶ）、ババンキウイルス（ＢＡＢＶ）、キジラガウイルス（ＫＹＺＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、ハイランドＪウイルス（ＨＪＶ）、フォートモーガンウィルス（ＦＭＶ）、Ｎｄｕｍｕ（ＮＤＵＶ）、サケ科アルファウイルス（Ｓａｌｍｏｎｉｄ  ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）（ＳＡＶ）、またはＢｕｇｇｙ  Ｃｒｅｅｋウイルスである。いくつかの実施形態では、ウイルスキャプシドエンハンサーは、ウイルス種の下流ループ（ＤＬＰ）モチーフを含み、ＤＬＰモチーフは、１つ以上のＲＮＡステムループのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスキャプシドエンハンサーは、配列番号１および４６〜５２のうちの少なくとも１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を呈する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、配列番号１および４６〜５２のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を呈する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ＧＯＩのコード配列は、ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助食品用ポリペプチド、工業用酵素、レポーターポリペプチド、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体、抗原、免疫調節剤、サイトカイン、酵素、またはそれらの組み合わせである。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子は、第２のウイルスキャプシドエンハンサーまたはその多様体の１つ以上のＲＮＡステムループをコードしている第３の核酸配列、および第３の核酸配列に作動可能に連結した第４の核酸配列をさらに含み、第４の核酸配列は、第２の目的遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、第３の核酸配列の下流および第４の核酸配列の上流に作動可能に連結されている第２の自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子は、ｍＲＮＡ分子またはＲＮＡレプリコンである。いくつかの実施形態では、核酸分子は、発現ベクターまたは転写ベクターである。いくつかの実施形態では、発現ベクターまたは転写ベクターは、１つ以上の追加の転写調節配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターまたは転写ベクターは、１つ以上の追加の転写調節配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターまたは転写ベクターは、１つ以上の追加の翻訳調節配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、プラスミド、バクテリオファージベクター、コスミド、フォスミド、ウイルスレプリコン、シャトルベクター、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、核酸分子は、原核生物ベクターまたは真核生物ベクターである。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ｄｅ  ｎｏｖｏ合成によって産生される。
【００１４】
また、いくつかの実施形態において開示されるのは、細胞内において目的のポリペプチドを産生するための方法であって、この方法には、本開示による核酸分子を細胞内に導入し、それによって細胞内でＧＯＩによってコードされているポリペプチドを産生することを含む。さらに別の関連する態様において、本明細書に開示のいくつかの実施形態は、細胞内において目的のポリペプチドを産生するための方法に関連し、この方法には、ＲＮＡ分子を細胞内に導入することを含み、ＲＮＡ分子が、ウイルスキャプシドエンハンサーまたはその多様体の１つ以上のＲＮＡステムループ、および目的のポリペプチドのコード配列を含み、それによって細胞内において目的のポリペプチドを産生する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子またはレプリコンＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、細胞に導入される前に、ｄｅ  ｎｏｖｏ合成および／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって産生される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、ウイルス種の下流ループ（ＤＬＰ）モチーフを含み、ＤＬＰモチーフは、ウイルスキャプシドエンハンサーの１つ以上のＲＮＡステムループのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、１つ以上のＲＮＡステムループの少なくとも１つの下流であり、かつ目的のポリペプチドのコード配列の上流に自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、自己プロテアーゼペプチドは、ブタテッショウウイルス−１  ２Ａ（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、細胞質多角体病ウイルス２Ａ（ＢｍＣＰＶ２Ａ）、軟化病ウイルス２Ａ（ＢｍＩＦＶ２Ａ）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助食品用ポリペプチド、工業用酵素、レポーターポリペプチド、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体、抗原、免疫調節剤、サイトカイン、酵素、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、細胞は、組織、器官、または対象に存在する。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト、ウマ、ブタ、霊長類、マウス、フェレット、ラット、コットンラット、ウシ、イノシシ、ヒツジ、ウサギ、ネコ、イヌ、鳥、魚、ヤギ、ロバ、ハムスター、またはバッファローである。
【００１６】
いくつかの実施形態は、細胞内においてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を産生するための方法を開示する。いくつかの実施形態では、この方法は、ウイルスキャプシドエンハンサーまたはその多様体のうちの１つ以上のＲＮＡステムループをコードしている第１の核酸配列と、第１の核酸配列に作動可能に連結している第２の核酸配列とを含む核酸分子を細胞に投与することを含み、第２の核酸配列が目的遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列を含み、それによってＧＯＩのｍＲＮＡを産生する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、ＧＯＩのコード配列の上流に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、核酸分子は、第１の核酸配列の上流に作動可能に連結されているプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、第１の核酸配列の上流に作動可能に連結されている５’ＵＴＲ配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ配列は、プロモーターの下流および第１の核酸配列の上流に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、核酸分子は、第２の核酸配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、自己プロテアーゼペプチドのコード配列は、第１の核酸配列の下流および第２の核酸配列の上流に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、自己プロテアーゼペプチドは、ブタテッショウウイルス−１  ２Ａ（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、細胞質多角体病ウイルス２Ａ（ＢｍＣＰＶ２Ａ）、軟化病ウイルス２Ａ（ＢｍＩＦＶ２Ａ）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、第２の配列の核酸配列の下流に作動可能に連結されている３’ＵＴＲ配列をさらに含む。
【００１８】
本明細書に開示のいくつかの実施形態では、ウイルスキャプシドエンハンサーは、トガウイルス科に属するウイルス種のキャプシド遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、ウイルス種は、トガウイルス科のアルファウイルス属に属する。いくつかの実施形態では、アルファウイルス種は、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、エバーグレーズウイルス（ＥＶＥＶ）、ムカンボウイルス（ＭＵＣＶ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ピクスナウイルス（ＰＩＸＶ）、ミドレブルクウイルス（ＭＩＤＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、オニョンニョンウイルス（ＯＮＮＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、バーマフォレストウイルス（ＢＦ）、ゲタウイルス（ＧＥＴ）、サギヤマウイルス（ＳＡＧＶ）、ベバルウイルス（ＢＥＢＶ）、マヤロウイルス（ＭＡＹＶ）、ウナウイルス（ＵＮＡＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）、アウラウイルス（ＡＵＲＡＶ）、ワタロアウイルス（ＷＨＡＶ）、ババンキウイルス（ＢＡＢＶ）、キジラガウイルス（ＫＹＺＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、ハイランドＪウイルス（ＨＪＶ）、フォートモーガンウィルス（ＦＭＶ）、Ｎｄｕｍｕ（ＮＤＵＶ）、サケ科アルファウイルス（Ｓａｌｍｏｎｉｄ  ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）（ＳＡＶ）、またはＢｕｇｇｙ  Ｃｒｅｅｋウイルスである。いくつかの実施形態では、ウイルスキャプシドエンハンサーは、ウイルス種の下流ループ（ＤＬＰ）モチーフを含み、ＤＬＰモチーフは、１つ以上のＲＮＡステムループのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスキャプシドエンハンサーは、配列番号１および４６〜５２のうちの少なくとも１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を呈する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、配列番号１および４６〜５２のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を呈する。
【００１９】
本明細書に開示のいくつかの実施形態では、ＧＯＩのコード配列は、ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助食品用ポリペプチド、工業用酵素、レポーターポリペプチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体、抗原、免疫調節剤、サイトカイン、酵素、またはそれらの組み合わせである。本開示によるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を産生するための方法のいくつかの実施形態では、核酸分子は、第２のウイルスキャプシドエンハンサーまたはその多様体の１つ以上のＲＮＡステムループをコードしている第３の核酸配列、および第３の核酸配列に作動可能に連結した第４の核酸配列をさらに含み、第４の核酸配列は、第２の目的遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、第３の核酸配列の下流および第４の核酸配列の上流に作動可能に連結されている第２の自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子は、ＲＮＡレプリコンであり得る。いくつかの実施形態では、核酸分子は、発現ベクターまたは転写ベクターである。いくつかの実施形態では、核酸分子は、１つ以上の追加の転写調節配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、さらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の翻訳調節配列。いくつかの実施形態では、核酸分子は、プラスミド、バクテリオファージベクター、コスミド、フォスミド、ウイルスレプリコン、シャトルベクター、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される発現ベクターである。いくつかの実施形態では、核酸分子は、原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターである。いくつかの実施形態では、細胞は、組織、器官、または対象に存在する。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト、ウマ、ブタ、霊長類、マウス、フェレット、ラット、コットンラット、ウシ、イノシシ、ヒツジ、ウサギ、ネコ、イヌ、鳥、魚、ヤギ、ロバ、ハムスター、またはバッファローである。本開示によるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を産生するための方法のいくつかの実施形態では、細胞内において、ＧＯＩのｍＲＮＡによってコードされているポリペプチドを産生することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、産生されたＧＯＩのｍＲＮＡを得ること、および得られたｍＲＮＡを第２の細胞に導入して、第２の細胞においてＧＯＩのｍＲＮＡによってコードされたポリペプチドを発現させることを含む。
【００２１】
一態様では、本開示のいくつかの実施形態は、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている核酸配列を含む核酸分子に関し、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンは、（ｉ）ウイルスキャプシドエンハンサーまたはその多様体のうちの１つ以上の構造エレメントをコードしている第１の核酸配列であって、ウイルスキャプシドエンハンサーが、ウイルスＲＮＡレプリコンに対して異種である第１の核酸配列と、（ｉｉ）少なくとも１つの非構造ウイルスタンパク質またはその一部分をコードしている第２の核酸配列と、を含み、第１の核酸配列が、第２の核酸配列の上流に作動可能に連結されている。
【００２２】
いくつかの実施形態では、ウイルスキャプシドエンハンサーの１つ以上の構造エレメントのうちの少なくとも１つは、１つ以上のＲＮＡステムループを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスキャプシドエンハンサーは、トガウイルス科に属するウイルス種のキャプシド遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、ウイルス種は、トガウイルス科のアルファウイルス属に属する。いくつかの実施形態では、アルファウイルス種は、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、エバーグレーズウイルス（ＥＶＥＶ）、ムカンボウイルス（ＭＵＣＶ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ピクスナウイルス（ＰＩＸＶ）、ミドレブルクウイルス（ＭＩＤＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、オニョンニョンウイルス（ＯＮＮＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、バーマフォレストウイルス（ＢＦ）、ゲタウイルス（ＧＥＴ）、サギヤマウイルス（ＳＡＧＶ）、ベバルウイルス（ＢＥＢＶ）、マヤロウイルス（ＭＡＹＶ）、ウナウイルス（ＵＮＡＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）、アウラウイルス（ＡＵＲＡＶ）、ワタロアウイルス（ＷＨＡＶ）、ババンキウイルス（ＢＡＢＶ）、キジラガウイルス（ＫＹＺＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、ハイランドＪウイルス（ＨＪＶ）、フォートモーガンウィルス（ＦＭＶ）、Ｎｄｕｍｕ（ＮＤＵＶ）、またはＢｕｇｇｙ  Ｃｒｅｅｋウイルスである。いくつかの実施形態では、ウイルスキャプシドエンハンサーは、ウイルス種の下流ループ（ＤＬＰ）モチーフを含み、ＤＬＰモチーフは、１つ以上のＲＮＡステムループのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスキャプシドエンハンサーは、配列番号１および４６〜５２のうちの少なくとも１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を呈する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、配列番号１および４６〜５２のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を呈する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている核酸配列は、第１の核酸配列の下流および第２の核酸配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、自己プロテアーゼペプチドは、ブタテッショウウイルス−１  ２Ａ（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、細胞質多角体病ウイルス２Ａ（ＢｍＣＰＶ２Ａ）、軟化病ウイルス２Ａ（ＢｍＩＦＶ２Ａ）、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンの５’末端の下流の約１〜１０００ヌクレオチドの領域内に作動可能に位置付けられている。第２の核酸配列は、対応する未改変型ウイルスＲＮＡレプリコンの天然ウイルス非構造タンパク質のコード配列を実質的にすべて含む。
【００２４】
本明細書に開示のいくつかの実施形態では、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンは、トガウイルス科のアルファウイルス属にまたはアルテリウイルス科のアルテリウイルス属に属するウイルス種に由来する改変型ＲＮＡレプリコンを含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、アルテリウイルス種は、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、ブタ呼吸器生殖器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、乳酸脱水素酵素上昇ウイルス（ＬＤＶ）、またはサル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）である。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、改変型アルテリウイルスＲＮＡレプリコンのｐｐ１ａｂ非構造タンパク質の一部分または全体をコードしている第２の核酸配列の上流に作動可能に位置付けられている。いくつかの実施形態では、改変型アルテリウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている核酸配列は、１つ以上の発現カセットをさらに含み、１つ以上の発現カセットのうちの少なくとも１つは、目的遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列に作動可能に連結されているプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、改変型アルテリウイルスＲＮＡレプリコンは、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の発現カセットのうちの少なくとも１つは、改変型アルテリウイルスＲＮＡレプリコンの一部分または全部のｐｐ１ａｂ非構造タンパク質をコードしている第２の核酸配列の下流に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の発現カセットのうちの少なくとも１つは、改変型アルテリウイルスＲＮＡレプリコンの転写調節配列（ＴＲＳ）の下流に作動可能に位置付けられ、ＴＲＳは、ＴＲＳ１、ＴＲＳ２、ＴＲＳ３、ＴＲＳ４、ＴＲＳ５、ＴＲＳ６、またはＴＲＳ７である。いくつかの実施形態では、１つ以上の発現カセットのうちの少なくとも１つは、ウイルスキャプシドエンハンサーの１つ以上の構造エレメントをコードしている第３の核酸配列をさらに含み、第３の核酸配列は、ＧＯＩのコード配列の上流に作動可能に連結されている。
【００２６】
いくつかの実施形態では、改変型アルテリウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている核酸配列は、第３の核酸配列の下流およびＧＯＩのコード配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＧＯＩのコード配列は、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助食品用ポリペプチド、工業用酵素、レポーターポリペプチド、またはそれらの任意の組み合わせをコードする。いくつかの実施形態では、ＧＯＩのコード配列は、抗体、抗原、免疫調節剤、サイトカイン、酵素、またはそれらの任意の組み合わせをコードする。
【００２７】
いくつかの実施形態では、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンは、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、エバーグレーズウイルス（ＥＶＥＶ）、ムカンボウイルス（ＭＵＣＶ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ピクスナウイルス（ＰＩＸＶ）、ミドレブルクウイルス（ＭＩＤＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、オニョンニョンウイルス（ＯＮＮＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、バーマフォレストウイルス（ＢＦ）、ゲタウイルス（ＧＥＴ）、サギヤマウイルス（ＳＡＧＶ）、ベバルウイルス（ＢＥＢＶ）、マヤロウイルス（ＭＡＹＶ）、ウナウイルス（ＵＮＡＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）、アウラウイルス（ＡＵＲＡＶ）、ワタロアウイルス（ＷＨＡＶ）、ババンキウイルス（ＢＡＢＶ）、キジラガウイルス（ＫＹＺＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、ハイランドＪウイルス（ＨＪＶ）、フォートモーガンウィルス（ＦＭＶ）、Ｎｄｕｍｕ（ＮＤＵＶ）、サケ科アルファウイルス（Ｓａｌｍｏｎｉｄ  ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）（ＳＡＶ）、およびＢｕｇｇｙ  Ｃｒｅｅｋウイルスからなる群から選択されるアルファウイルス種由来の改変型ＲＮＡレプリコンを含む。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、改変型アルファウイルスＲＮＡレプリコンの１つ以上の非構造タンパク質ｎｓｐ１〜４またはその一部分をコードしている第２の核酸配列の上流に作動可能に位置付けられている。いくつかの実施形態では、改変型アルファウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている核酸配列は、１つ以上の発現カセットをさらに含み、発現カセットの各々は、目的遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列に作動可能に連結されているプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、改変型アルファウイルスＲＮＡレプリコンは、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の発現カセットのうちの少なくとも１つは、改変型アルファウイルスＲＮＡレプリコンの１つ以上の非構造タンパク質ｎｓｐ１〜４またはその一部分をコードしている核酸配列の下流に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の発現カセットのうちの少なくとも１つは、ウイルスキャプシドエンハンサーの１つ以上の構造エレメントをコードしている第３の核酸配列をさらに含み、第３の核酸配列は、ＧＯＩのコード配列の上流に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、改変型アルファウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている核酸配列は、第３の核酸配列の下流およびＧＯＩのコード配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＧＯＩのコード配列は、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助食品用ポリペプチド、工業用酵素、レポーターポリペプチド、またはそれらの組み合わせをコードする。いくつかの実施形態では、ＧＯＩのコード配列は、抗体、抗原、免疫調節剤、酵素、サイトカイン、またはそれらの組み合わせをコードする。
【００２８】
一態様では、本開示のいくつかの実施形態は、改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている核酸配列を含む核酸分子に関し、改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンは、ウイルスキャプシドエンハンサーまたはその多様体のうちの１つ以上の構造エレメントをコードしている第１の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている核酸配列は、少なくとも１つの非構造ウイルスタンパク質またはその一部分をコードしている第２の核酸配列をさらに含み、第１の核酸配列が、第２の核酸配列の上流に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている核酸配列は、第１の核酸配列の下流および第２の核酸配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、自己プロテアーゼペプチドは、ブタテッショウウイルス−１  ２Ａ（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、細胞質多角体病ウイルス２Ａ（ＢｍＣＰＶ２Ａ）、軟化病ウイルス２Ａ（ＢｍＩＦＶ２Ａ）、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている核酸配列は、プラス鎖ＲＮＡウイルスに由来する改変型ＲＮＡレプリコンを含む。いくつかの実施形態では、プラス鎖ＲＮＡウイルスは、トガウイルス科、フラビウイルス科、オルソミクソウイルス科、ラブドウイルス科、およびパラミクソウイルス科からなる群から選択される科に属するウイルス種である。いくつかの実施形態では、プラス鎖ＲＮＡウイルスは、アルテリウイルス科のアルテリウイルス属に属するウイルス種である。
【００２９】
本明細書に開示のいくつかの実施形態では、改変型アルファウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている核酸配列は、１つ以上の発現カセットをさらに含み、発現カセットの各々は、目的遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列に作動可能に連結されているプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンは、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の発現カセットのうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの非構造ウイルスタンパク質またはその一部分をコードしている第２の核酸配列の下流に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の発現カセットのうちの少なくとも１つは、ウイルスキャプシドエンハンサーの１つ以上の構造エレメントをコードしている第３の核酸配列をさらに含み、第３の核酸配列は、ＧＯＩのコード配列の上流に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている核酸配列は、第３の核酸配列の下流およびＧＯＩのコード配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、ｄｅ  ｎｏｖｏ合成によって産生される。
【００３０】
一態様において、本明細書に開示のいくつかの実施形態は、本明細書に開示の核酸分子などの組換え細胞に関する。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、原核細胞または真核細胞である。いくつかの実施形態では、組換え細胞は、動物細胞である。いくつかの実施形態では、核酸分子は、改変型ＲＮＡレプリコンをコードしている核酸配列を含み、改変型レプリコンＲＮＡの発現により、組換え細胞において先天性免疫応答に対する耐性が付与される。関連する態様において、本明細書に開示のいくつかの実施形態は、本明細書に開示の少なくとも１つの組換え細胞を含む細胞培養物に関する。
【００３１】
いくつかの態様では、本明細書に開示のいくつかの実施形態は、対象に先天性免疫系に対する耐性を付与するための方法であって、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている核酸配列を含む核酸分子を対象に投与することを含む方法に関する。この方法では、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンは、（ｉ）ウイルスキャプシドエンハンサーまたはその多様体のうちの１つ以上の構造エレメントをコードしている第１の核酸配列であって、ウイルスキャプシドエンハンサーが、ウイルスＲＮＡレプリコンに対して異種である第１の核酸配列と、（ｉｉ）少なくとも１つの非構造タンパク質またはその一部分をコードしている第２の核酸配列と、を含み、第１の核酸配列が、第２の核酸配列の上流に作動可能に連結され、核酸分子によってコードされている改変型レプリコンＲＮＡの発現により、対象において先天性免疫応答に対する耐性が付与される。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト、ウマ、ブタ、霊長類、マウス、フェレット、ラット、コットンラット、ウシ、イノシシ、ヒツジ、ウサギ、ネコ、イヌ、鳥、魚、ヤギ、ロバ、ハムスター、およびバッファローからなる群から選択される。
【００３２】
いくつかの態様では、本明細書に開示のいくつかの実施形態は、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている核酸配列を含む核酸分子を対象に投与することを含む、対象における目的のポリペプチドを産生するための方法に関する。本方法では、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンは、（ｉ）ウイルスキャプシドエンハンサーまたはその多様体のうちの１つ以上の構造エレメントをコードしている第１の核酸配列であって、ウイルスキャプシドエンハンサーが、ウイルスＲＮＡレプリコンに対して異種である第１の核酸配列と、（ｉｉ）少なくとも１つの非構造タンパク質またはその一部分をコードしている第２の核酸配列とを含み、第１の核酸配列が、第２の核酸配列の上流に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト、ウマ、ブタ、霊長類、マウス、フェレット、ラット、コットンラット、ウシ、イノシシ、ヒツジ、ウサギ、ネコ、イヌ、鳥、魚、ヤギ、ロバ、ハムスター、またはバッファローである。
【００３３】
いくつかの態様では、本明細書に開示のいくつかの実施形態は、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている核酸配列を含む核酸分子を含む宿主細胞を培養することを含む、目的のポリペプチドを産生するための方法に関する。この方法では、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンは、（ｉ）ウイルスキャプシドエンハンサーまたはその多様体のうちの１つ以上の構造エレメントをコードしている第１の核酸配列であって、ウイルスキャプシドエンハンサーが、ウイルスＲＮＡレプリコンに対して異種である第１の核酸配列と、（ｉｉ）少なくとも１つの非構造タンパク質またはその一部分をコードしている第２の核酸配列とを含み、第１の核酸配列が、第２の核酸配列の上流に作動可能に連結されている。
【００３４】
本開示による目的のポリペプチドを産生するための方法のいくつかの実施形態では、対象は、ヒト、ウマ、ブタ、霊長類、マウス、フェレット、ラット、コットンラット、ウシ、イノシシ、ヒツジ、ウサギ、ネコ、イヌ、鳥、魚、ヤギ、ロバ、ハムスター、およびバッファローからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ウイルスキャプシドエンハンサーの１つ以上の構造エレメントのうちの少なくとも１つは、１つ以上のＲＮＡステムループを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスキャプシドエンハンサーは、トガウイルス科に属するウイルス種のキャプシド遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、ウイルス種は、トガウイルス科のアルファウイルス属に属する。いくつかの実施形態では、アルファウイルス種は、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、エバーグレーズウイルス（ＥＶＥＶ）、ムカンボウイルス（ＭＵＣＶ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ピクスナウイルス（ＰＩＸＶ）、ミドレブルクウイルス（ＭＩＤＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、オニョンニョンウイルス（ＯＮＮＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、バーマフォレストウイルス（ＢＦ）、ゲタウイルス（ＧＥＴ）、サギヤマウイルス（ＳＡＧＶ）、ベバルウイルス（ＢＥＢＶ）、マヤロウイルス（ＭＡＹＶ）、ウナウイルス（ＵＮＡＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）、アウラウイルス（ＡＵＲＡＶ）、ワタロアウイルス（ＷＨＡＶ）、ババンキウイルス（ＢＡＢＶ）、キジラガウイルス（ＫＹＺＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、ハイランドＪウイルス（ＨＪＶ）、フォートモーガンウィルス（ＦＭＶ）、Ｎｄｕｍｕ（ＮＤＵＶ）、またはＢｕｇｇｙ  Ｃｒｅｅｋウイルスである。いくつかの実施形態では、ウイルスキャプシドエンハンサーは、ウイルス種の下流ループ（ＤＬＰ）モチーフを含み、ＤＬＰモチーフは、１つ以上のＲＮＡステムループのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスキャプシドエンハンサーは、配列番号１および４６〜５２のうちの少なくとも１つに対して少なくとも８０％の配列同一性を呈する核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、配列番号１および４６〜５２のうちの少なくとも１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を呈する。
【００３５】
本明細書に開示のいくつかの実施形態では、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている核酸配列は、第１の核酸配列の下流および第２の核酸配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、自己プロテアーゼペプチドは、ブタテッショウウイルス−１  ２Ａ（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、細胞質多角体病ウイルス２Ａ（ＢｍＣＰＶ２Ａ）、軟化病ウイルス２Ａ（ＢｍＩＦＶ２Ａ）、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンの５’末端の下流の約１〜１０００ヌクレオチドの領域内に作動可能に位置付けられている。第２の核酸配列は、対応する未改変型ウイルスＲＮＡレプリコンの天然ウイルス非構造タンパク質のコード配列を実質的にすべて含む。
【００３６】
いくつかの実施形態では、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンは、トガウイルス科のアルファウイルス属にまたはアルテリウイルス科のアルテリウイルス属に属するウイルス種に由来する改変型ＲＮＡレプリコンを含む。いくつかの実施形態では、アルテリウイルスウイルス種は、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、ブタ呼吸器生殖器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、乳酸脱水素酵素上昇ウイルス（ＬＤＶ）、またはサル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）である。
【００３７】
本明細書に開示のいくつかの実施形態では、改変型アルテリウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている核酸配列は、１つ以上の発現カセットをさらに含み、発現カセットのうちの少なくとも１つは、目的遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列に作動可能に連結されているプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ウイルス種はアルテリウイルスであり、第１の核酸配列は、改変型アルテリウイルスＲＮＡレプリコンの一部分または全部のｐｐ１ａｂ非構造タンパク質をコードしている核酸配列の上流に作動可能に位置付けられている。いくつかの実施形態では、改変型アルテリウイルスＲＮＡレプリコンは、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの発現カセットをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の発現カセットのうちの少なくとも１つは、改変型アルテリウイルスＲＮＡレプリコンの一部分または全部のｐｐ１ａｂ非構造タンパク質をコードしている第２の核酸配列の下流に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の発現カセットのうちの少なくとも１つは、改変型アルテリウイルスＲＮＡレプリコンの転写調節配列（ＴＲＳ）の下流に位置付けられ、ＴＲＳは、ＴＲＳ１、ＴＲＳ２、ＴＲＳ３、ＴＲＳ４、ＴＲＳ５、ＴＲＳ６、またはＴＲＳ７である。いくつかの実施形態では、１つ以上の発現カセットのうちの少なくとも１つは、ウイルスキャプシドエンハンサーの１つ以上の構造エレメントをコードしている第３の核酸配列をさらに含み、第３の核酸配列は、ＧＯＩのコード配列の上流に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、改変型アルテリウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている核酸配列は、第３の核酸配列の下流およびＧＯＩのコード配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＧＯＩのコード配列は、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助食品用ポリペプチド、工業用酵素、レポーターポリペプチド、またはそれらの任意の組み合わせをコードする。いくつかの実施形態では、ＧＯＩのコード配列は、抗体、抗原、免疫調節剤、サイトカイン、酵素、またはそれらの任意の組み合わせをコードする。
【００３８】
いくつかの実施形態では、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンは、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、エバーグレーズウイルス（ＥＶＥＶ）、ムカンボウイルス（ＭＵＣＶ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ピクスナウイルス（ＰＩＸＶ）、ミドレブルクウイルス（ＭＩＤＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、オニョンニョンウイルス（ＯＮＮＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、バーマフォレストウイルス（ＢＦ）、ゲタウイルス（ＧＥＴ）、サギヤマウイルス（ＳＡＧＶ）、ベバルウイルス（ＢＥＢＶ）、マヤロウイルス（ＭＡＹＶ）、ウナウイルス（ＵＮＡＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）、アウラウイルス（ＡＵＲＡＶ）、ワタロアウイルス（ＷＨＡＶ）、ババンキウイルス（ＢＡＢＶ）、キジラガウイルス（ＫＹＺＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、ハイランドＪウイルス（ＨＪＶ）、フォートモーガンウィルス（ＦＭＶ）、Ｎｄｕｍｕ（ＮＤＵＶ）、サケ科アルファウイルス（Ｓａｌｍｏｎｉｄ  ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）（ＳＡＶ）、およびＢｕｇｇｙ  Ｃｒｅｅｋウイルスからなる群から選択されるアルファウイルス種由来の改変型ＲＮＡレプリコンを含む。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、改変型アルファウイルスＲＮＡレプリコンの１つ以上の非構造タンパク質ｎｓｐ１〜４またはその一部分をコードしている核酸配列の上流に作動可能に位置付けられている。
【００３９】
いくつかの実施形態では、改変型アルファウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている核酸配列は、１つ以上の発現カセットをさらに含み、発現カセットの各々は、目的遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列に作動可能に連結されているプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、改変型アルファウイルスＲＮＡレプリコンは、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の発現カセットのうちの少なくとも１つは、改変型アルファウイルスＲＮＡレプリコンの１つ以上の非構造タンパク質ｎｓｐ１〜４またはその一部分をコードしている核酸配列の下流に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の発現カセットのうちの少なくとも１つは、ウイルスキャプシドエンハンサーの１つ以上の構造エレメントをコードしている第３の核酸配列をさらに含み、第３の核酸配列は、ＧＯＩのコード配列の上流に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、改変型アルファウイルスＲＮＡレプリコンは、第３の核酸配列の下流およびＧＯＩのコード配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＧＯＩのコード配列は、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助食品用ポリペプチド、工業用酵素、レポーターポリペプチド、またはそれらの任意の組み合わせをコードする。いくつかの実施形態では、ＧＯＩのコード配列は、抗体、抗原、免疫調節剤、サイトカイン、酵素、またはそれらの任意の組み合わせをコードする。
【００４０】
別の態様では、本明細書に開示のいくつかの実施形態は、対象に先天性免疫系に対する耐性を付与するための方法であって、改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている核酸配列を含む核酸分子を対象に投与することを含む方法に関する。本方法では、改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンは、アルファウイルスキャプシドエンハンサーの１つ以上の構造エレメントをコードしている第１の核酸配列を含み、この核酸分子によってコードされている改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンの発現により、対象において先天性免疫応答に対する耐性が付与される。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト、ウマ、ブタ、霊長類、マウス、フェレット、ラット、コットンラット、ウシ、イノシシ、ヒツジ、ウサギ、ネコ、イヌ、鳥、魚、ヤギ、ロバ、ハムスター、およびバッファローからなる群から選択される。
【００４１】
本明細書に開示されるのはまた、対象において目的のポリペプチドを産生するための方法を含み、この方法は、改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている核酸配列を含む核酸分子を対象に投与することを含み、改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンは、アルファウイルスキャプシドエンハンサーの１つ以上の構造エレメントをコードしている第１の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト、ウマ、ブタ、霊長類、マウス、フェレット、ラット、コットンラット、ウシ、イノシシ、ヒツジ、ウサギ、ネコ、イヌ、鳥、魚、ヤギ、ロバ、ハムスター、またはバッファローである。
【００４２】
本明細書に開示のいくつかの実施形態は、目的のポリペプチドを産生するための方法に関し、この方法は、改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている核酸配列を含む核酸分子を含む宿主細胞を培養することを含み、改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンは、アルファウイルスキャプシドエンハンサーの１つ以上の構造エレメントをコードしている第１の核酸配列を含む。
【００４３】
本開示の上記態様によるいくつかの実施形態では、改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンが、少なくとも１つの非構造ウイルスタンパク質またはその一部分をコードしている第２の核酸配列をさらに含み、第１の核酸配列が、第２の核酸配列の上流に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンは、第１の核酸配列の下流および第２の核酸配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、自己プロテアーゼペプチドは、ブタテッショウウイルス−１  ２Ａ（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、細胞質多角体病ウイルス２Ａ（ＢｍＣＰＶ２Ａ）、軟化病ウイルス２Ａ（ＢｍＩＦＶ２Ａ）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンは、プラス鎖ＲＮＡウイルスに由来する改変型ＲＮＡレプリコンを含む。いくつかの実施形態では、改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンは、トガウイルス科、フラビウイルス科、オルトミクソウイルス科、ラブドウイルス科、またはパラミクソウイルス科に属するウイルス種に由来する改変型ＲＮＡレプリコンを含む。いくつかの実施形態では、改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンは、アルテリウイルス科のアルテリウイルス属に属するウイルス種に由来する改変型ＲＮＡレプリコンを含む。いくつかの実施形態では、非アルファウイルス改変型ＲＮＡレプリコンをコードしている配列は、１つ以上の発現カセットをさらに含み、発現カセットの各々は、目的遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列に作動可能に連結されているプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンは、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の発現カセットのうちの少なくとも１つは、改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンの少なくとも１つの非構造ウイルスタンパク質またはその一部分をコードしている第２の核酸配列の下流に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の発現カセットのうちの少なくとも１つは、アルファウイルスキャプシドエンハンサーの１つ以上の構造エレメントをコードしている第３の核酸配列をさらに含み、第３の核酸配列は、ＧＯＩのコード配列の上流に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンは、第３の核酸配列の下流およびＧＯＩのコード配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む。
【００４４】
いくつかの態様では、本明細書に開示のいくつかの実施形態は、本明細書に記載の１つ以上の実施形態による方法によって産生された組換えポリペプチドに関する。
【００４５】
本明細書に開示のいくつかの実施形態は、本明細書に記載の組換えポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む組成物に関する。
【００４６】
本明細書に開示のいくつかの実施形態は、本明細書に開示の核酸分子および薬学的に許容される担体を含む組成物に関する。
【００４７】
いくつかの実施形態では、本出願の組成物および／または分子、例えば、核酸分子、ＲＮＡレプリコン、およびポリペプチドのうちの１つ以上は、医薬用配合物にさらに配合される。いくつかの実施形態では、本出願の組成物および／または分子のうちの１つ以上は、共有結合化合物、非共有結合化合物、物理的組成物、または薬学的に許容される緩衝液と共に医薬用配合物に配合される。
【００４８】
本明細書に開示のいくつかの実施形態では、本願の組成物および／または分子、例えば、核酸分子、ＲＮＡレプリコン、およびポリペプチドのうちの１つ以上は、保護組成物（例えば、ワクチン）または治療用組成物としての使用のためにさらに配合される。特に、本開示に従って作製された保護組成物は、これらに限定されないが、ワクチンおよび他の治療薬としての使用、診断薬としての使用、ならびにポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の産生における抗原としての使用など、様々な用途を有する。
【００４９】
前述の概要は例示的なものにすぎず、決して限定的であることを意図するものではない。本明細書に記載の例示的な実施形態および特徴に加えて、本出願のさらなる態様、実施形態、目的および特徴は、図面および詳細な説明ならびに特許請求の範囲から完全に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】アルファウイルスキャプシドエンハンサーの非限定的な例示的ステムループＲＮＡ構造を示すグラフ図である。
【図２Ａ】本開示の４つの非限定的な例示的核酸分子のグラフ表示を示す図である。核酸分子の各々は、アルファウイルスキャプシドエンハンサー（例えば、ＤＬＰモチーフ）のコード配列、および目的遺伝子（ＧＯＩ）、例えば、赤色発光ホタル（ｒＦＦ）レポーター遺伝子のコード配列を含む。図２Ａ：ｒＥｘ−ＤＬＰ−ｒＦＦ；図２Ｂ：ｒＥｘ−ＤＬＰ−ｐｐ１ａｂ−ｒＦＦ；図２Ｃ：ｒＥｘ−ＤＬＰ−２Ａ−ｐｐ１ａｂ−ｒＦＦ；および図２Ｄ：ｒＥｘ−ＤＬＰ−２Ａ−ｐｐ１ａｂ−ＤＬＰ−ｒＦＦ。ＤＬＰ：下流ループ配列；２Ａ：自己プロテアーゼペプチド；ｐｐ１ａｂ：非構造ポリペプチド配列；およびｒＦＦ：赤色発光ホタルレポーター遺伝子のコード配列。
【図２Ｂ】同上。
【図２Ｃ】同上。
【図２Ｄ】同上。
【図３Ａ】本開示の４つの非限定的な例示的核酸分子のグラフ表示を示す図である。核酸分子の各々は、アルファウイルスキャプシドエンハンサー（例えば、ＤＬＰモチーフ）のコード配列、および目的遺伝子（ＧＯＩ）、例えば、赤色発光ホタル（ｒＦＦ）レポーター遺伝子のコード配列を含む。図３Ａ：アルファ−Ｒ−ｒＦＦ；図３Ｂ：アルファ−Ｒ−ＤＬＰ−ｒＦＦ；図３Ｃ：アルファ−Ｒ−ＤＬＰ−２Ａ−ｎｓｐ−ｒＦＦ；および図３Ｄ：アルファ−Ｒ−ＤＬＰ−２Ａ−ｎｓｐ−ＤＬＰ−ｒＦＦ。ＤＬＰ：下流ループ配列；２Ａ：自己プロテアーゼペプチド；ｎｓｐ１〜４：非構造ポリペプチド配列；およびｒＦＦ：赤色発光ホタルレポーター遺伝子のコード配列。
【図３Ｂ】同上。
【図３Ｃ】同上。
【図３Ｄ】同上。
【図４Ａ】本開示の２つの他の非限定的な例示的核酸分子のグラフ表示を示す図である。核酸分子の各々は、アルファウイルスキャプシドエンハンサー（例えば、ＤＬＰモチーフ）のコード配列、および目的遺伝子（ＧＯＩ）、例えば、赤色発光ホタル（ｒＦＦ）レポーター遺伝子のコード配列をコードすることを含む。図４Ａ：アルファ−Ｒ−ＤＬＰ−２Ａ−ｒＦＦ；および図４Ｂ：アルファ−Ｒ−ＤＬＰ−２Ａ−ｎｓｐ−ＤＬＰ−２Ａ−ｒＦＦ。ＤＬＰ：下流ループ配列；２Ａ：自己プロテアーゼペプチド；ｎｓｐ１〜４：非構造ポリペプチド配列；およびｒＦＦ：赤色発光ホタルレポーター遺伝子のコード配列。
【図４Ｂ】同上。
【図５Ａ】実施したフローサイトメトリー分析およびバルクルシフェラーゼ分析の結果をグラフで要約したものであり、ＥＡＶ非構造タンパク質遺伝子またはサブゲノムＲＮＡ、すなわちｒＦＦレポーター遺伝子に位置付けられている目的遺伝子のいずれかをコードしている核酸配列の上流にＤＬＰモチーフを組み込むことを実証したものであり、ゲノムＲＮＡの複製に悪影響を及ぼすことはなかった。これらの実験において、ＦＡＣＳ分析（図５Ａ）およびバルク細胞ルシフェラーゼアッセイ（図５Ｂ）を、エレクトロポレートされた細胞に対して実施した。
【図５Ｂ】同上。
【図６Ａ】非構造タンパク質遺伝子をコードしている配列の上流に組み込まれたＤＬＰモチーフを有する改変型アルテレプリコンＲＮＡが、細胞の先天性免疫系を誘導するためにＩＦＮで処理された宿主細胞において複製し、効率的に発現し得ることを実証するために行った別の例示的フローサイトメトリー分析およびバルクルシフェラーゼ分析の結果をグラフにまとめた図である。これらの実験において、ＦＡＣＳ分析（図６Ａ）およびバルク細胞ルシフェラーゼアッセイ（図６Ｂ）を、エレクトロポレートされた細胞に対して実施した。ＩＦＮは、エレクトロポレーションの５時間後に細胞培養培地に添加した。サンプルは、分析のために、エレクトロポレーションの１８時間後に、３回回収した。
【図６Ｂ】同上。
【図７Ａ】非構造タンパク質遺伝子をコードしている配列の上流に組み込まれたＤＬＰモチーフを有する改変型アルファウイルスレプリコンＲＮＡが、細胞の先天性免疫系を誘導するためにＩＦＮにより処理された宿主細胞において、複製し、かつ効率的に発現し得ること実証するために行った別の例示的なバルクルシフェラーゼ分析の結果をグラフにまとめた図である。これらの実験では、バルク細胞ルシフェラーゼアッセイをエレクトロポレートされた細胞で実施した。エレクトロポレーションの直後またはエレクトロポレーションの３時間後に、ＩＦＮを細胞培養培地に添加した。サンプルは、分析のために、エレクトロポレーションの１８時間後に、３回回収した。図７Ａ：α−ｒＦＦ対アルファ−Ｒ−ｒＦＦ構築物；図７Ｂ：α−ｒＦＦ対α−ＤＬＰ−２Ａ−ｎｓｐ−ｒＦＦ；および図７Ｃ：α−ｒＦＦ対アルファ−Ｒ−ＤＬＰ−２Ａ−ｎｓｐ−ｒＦＦ構築物。
【図７Ｂ】同上。
【図７Ｃ】同上。
【図８】非構造タンパク質遺伝子をコードしている配列の上流に組み込まれたＤＬＰモチーフを有する改変型アルファウイルスレプリコンＲＮＡが、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて複製し、かつ効率的に発現し得ることを実証するために行われた例示的なｉｎ  ｖｉｖｏ実験の結果をグラフにまとめた図である。これらの実験では、改変型アルファウイルスレプリコンＲＮＡを注射した動物の全身画像化を実施した。各動物は、７．５μｇのレプリコンＲＮＡの筋肉内注射を受けた。個々の動物を、１日目、３日目、および７日目に画像化した。オリジナル：アルファ−Ｒ−ｒＦＦ構築物を注射したマウス；ＤＬＰ：アルファ−Ｒ−ＤＬＰ−２Ａ−ｎｓｐ−ｒＦＦ構築物を注射したマウス。
【図９】非限定的な例示的アルファウイルスゲノム構造およびゲノム発現（Ｓｔｒａｕｓら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、４９１〜５６２頁、１９９４年９月から適合）を概略的に示す図である。シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）のゲノム構成を示す。非構造遺伝子および構造タンパク質遺伝子の名称が付与されている。遺伝子およびタンパク質の命名法への言及は、Ｓｔｒａｕｓｓら（上記、１９９４年）に見出すことができる。４９ＳゲノムＲＮＡが、中央に概略的に示されており、翻訳されたＯＲＦは、白抜きの四角で示す。小さな黒い四角は、保存配列エレメントである。白い菱形は、漏出性オパール終止コドンを表す。非構造ポリタンパク質およびそれらのプロセシングを受けた産物を、上記に示す。オパールコドンで終結することにより、Ｐ１２３が産生され、その主要な複製機能は、トランスで作用して活性ＲＮＡレプリカーゼ中のポリタンパク質をプロセシングするプロテイナーゼとしてであると考えられている。このプロテイナーゼドメインは、ｎｓＰ２領域内に見られる。オパール終止コドンの読み過ごしにより、Ｐ１２３４が産生され、これにより、活性レプリカーゼを形成することができる。２６ＳサブゲノムｍＲＮＡは、構造的ＯＲＦおよびその翻訳産物を示すために下部に拡大されている。ビリオン中に存在するポリペプチドには、網掛けしている。ｖｃＲＮＡは、ゲノムＲＮＡのマイナス鎖相補体である。
【図１０】ＥＡＶのゲノム構造とゲノム発現戦略を概略的に表したものである。レプリカーゼ遺伝子および構造タンパク質遺伝子の名称が付与されている（遺伝子およびタンパク質の命名法への言及は、Ｓｎｉｊｄｅｒら、２００５年に見出すことができる）。ゲノム構成の下に、ゲノムとｓｇ  ｍＲＮＡとの構造的関係が描かれている。ＥＡＶ  ｍＲＮＡの５’末端に見いだされるリーダー配列およびＴＲＳは、それぞれ青およびオレンジ色の四角で示す。ゲノム長ｍＲＮＡ１に見出されるリボソームフレームシフトエレメント（ＲＦＳ）を示し、各ｍＲＮＡの翻訳領域は、緑色の線で強調し、翻訳においてサイレントな領域は、赤色の線で示す。各ｍＲＮＡについては、翻訳されたオープンリーディングフレームのみが示されている。右側のパネルは、感染細胞から単離されたＥＡＶ  ｍＲＮＡの典型的なパターンを示し、ゲノムの３’末端に相補的なプローブとハイブリダイズすることによって可視化し、このため、すべてのウイルスｍＲＮＡ種が認識される。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜図１１Ｂは、谷ピークトポロジーを有するアルファウイルスｍＲＮＡ２６Ｓの５’ＣＤＳ領域の予測されるステムループＲＮＡ構造を概略的に示す図である。７つの代表的なアルファウイルスのｍＲＮＡ（ＳＩＮＶ、ＳＦＶ、ＲＲＶ、ＳＡＧＶ、ＧＥＴＶ、ＭＩＤＶ、ＵＮＡＶ、ＢＥＢＶ、ＭＡＹＶおよびＡＵＲＡＶ）のＣＤＳの最初の７０〜１４０ヌクレオチドについて基となるＲＮＡ構造の二次元（２Ｄ）モデルである。配列は、開始コドン（ＡＵＧｉ）から番号付けし、Ａは＋１位である。予測構造は、ＳＨＡＰＥ（選択的２’−ヒドロキシルアシル化およびプライマー伸長）データ（Ｔｏｒｉｂｉｏら、２０１６年）に基づいて構築されている。
【図１１Ｂ】同上。
【図１２Ａ】改変型アルファウイルスレプリコンＲＮＡが、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて、免疫原性に対するＤＬＰモチーフ効果を有することを実証するために行われた例示的なｉｎ  ｖｉｖｏ実験における結果をグラフによりまとめた図である。この実験では、６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ動物を、０日目および４２日目に種々の用量のレプリコンＲＮＡを用いて初回免疫した。５６日目に脾臓および血清を収集し、（ａ）検出するためにデキストランを使用した、ＨＡ特異的Ｔ細胞メモリー（ＣＤ８＋ＣＤ４４＋ＣＤ６２ＬＬｏＫＬＲＧ−１ＬｏＩＬ−７ＲａＨｉＣＸＣＲ３Ｈｉ）のフローサイトメトリー（Ｈ−２Ｋｄ）ＩＹＳＴＶＡＳＳＬ；配列番号４４］）、および（ｂ、ｃ）ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞エフェクター応答を定量化したＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔを示す。統計は、通常の一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて、一致した用量間の多重比較を用いたものである。図１２Ａ：各々の同程度の用量の未改変レプリコンと比較して、ＤＬＰモチーフ含有構築物においてメモリー前駆体エフェクター細胞（ＭＰＥＣ）の有意な増加が観察された。図１２Ｂ：エフェクターＴ細胞応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞ペプチドによる刺激後にＩＦＮ−γを分泌していた抗原特異的ＨＡ細胞の数によって測定した。図１２Ｃ：エフェクターＴ細胞応答は、ＣＤ４＋Ｔ細胞ペプチドによる刺激後にＩＦＮ−γを分泌していた抗原特異的ＨＡ細胞の数によって測定した。
【図１２Ｂ】同上。
【図１２Ｃ】同上。
【図１３】非構造タンパク質遺伝子をコードしている配列の上流に組み込まれたＤＬＰモチーフを有する改変型アルファウイルスレプリコンＲＮＡが、Ｂａｌｂ／ｃ  ｍｉｃにおけるウイルス感染をシミュレートする剤による前処理時に、免疫応答の抑制を効果的に妨げることを実証するために行われた、例示的なｉｎ  ｖｉｖｏ実験の結果をグラフにまとめた図である。進行中のウイルス感染をシミュレートするために、ワクチン接種の２４時間前に、６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ動物に流体力学的尾静脈注射により、２０μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）または生理食塩水を投与して、前処理した。次にマウスに対して、１．５μｇ用量のＨＡコードＲＮＡレプリコンを用いて、０日目に初回免疫し、２８日目に追加免疫した。４２日目に血清を収集し、血清中におけるＨＡ特異的抗体を測定した。血清抗体濃度は、４パラメータロジスティック回帰での希釈対光学密度の内挿により、標準として８Ｄ２  ＨＡ特異的モノクローナル抗体を用いて算出した。個々の群間の統計は、マン−ホイットニー（ノンパラメトリック）検定を用いて行った。
【図１４Ａ】本開示によるＤＬＰ含有レプリコンは、ＬＮＰ（カチオン性脂質ナノ粒子）配合物と互換性があることを実証するために実施したｉｎ  ｖｉｖｏ実験の結果をグラフによりまとめた図である。この実験では、様々な用量のＨＡコードＲＮＡレプリコンを用いて、６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ動物に０日目に初回免疫し、２８日目に追加免疫した。脾臓および血清は、４２日目に採取した。図１４Ａ：血清中のＨＡ特異的抗体を測定した。血清抗体力価は、ＥＣ２０％の逆数であり、４パラメータロジスティック回帰における希釈度対光学密度の内挿により算出した。図１４Ｂ：ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔを用いて、ＣＤ８＋細胞エフェクター応答を定量化したものである。抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を検出するために、脾細胞をＨ−２  Ｋｄ（ＩＹＳＴＶＡＳＳＬ；配列番号４４）ペプチドと共にインキュベートした。図１４Ｃ：ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔを用いて、ＣＤ４＋Ｔ細胞エフェクター応答を定量化したものである。抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を検出するために、脾細胞をＨ２−Ｄ拘束性ＣＤ４Ｔ細胞エピトープＫＳＳＦＦＲＮＶＶＷＬＩＫＫＮ（配列番号４５）と共にインキュベートした。個々の群間の統計は、マン−ホイットニー（ノンパラメトリック）検定を用いて行った。
【図１４Ｂ】同上。
【図１４Ｃ】同上。
【図１５】シンドビスウイルスＤＬＰエレメントが目的遺伝子（ＧＯＩ；ｄｓＧＦＰ）のコード配列の上流に配置され、５’ＵＴＲ配列が、Ｔ７プロモーターのすぐ下流およびシンドビスウイルスＤＬＰ配列の上流に配置されているＤＬＰ含有ｍＲＮＡの非限定的な例示的立体配置を示す図である。ｄｓＧＦＰのコード配列は、ブタテッショウウイルス−１に由来する自己触媒性自己切断ペプチド（例えば、自己プロテアーゼペプチド）であるＰ２Ａシグナルを介してＤＬＰエレメントに連結されている。図の下部には、ＧＯＩとして使用される不安定化形態のＥＧＦＰレポーター遺伝子（ｄｓＧＦＰ）のコード配列が、マウスオルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子（ＭＯＤＣ）由来のタンパク質分解性ＰＥＳＴ分解シグナルに作動可能に連結されているＤＬＰ含有ｍＲＮＡの別の非限定的な例示的構成も示す。
【図１６Ａ】ＤＬＰ含有改変型ｍＲＮＡが、インターフェロン耐性を付与できることを実証するために行った実験の結果を、グラフによりまとめた図である。図１６Ａ：ｍＲＮＡ中にＤＬＰを含めることにより、ＩＦＮの存在下において、ＧＦＰ陽性細胞の頻度が統計的に有意に増加する。Ｋｒｕｓｋａｉ−Ｗａｌｌｉｓｔ検定（ノンパラメトリック）において、９５％信頼区間での平均値。図１６Ｂ：未改変ｍＲＮＡは、ＩＦＮ処理に対して感受性がある（二元配置分散分析において、９５％信頼区間を有する平均値）。相互作用：ｐ＝０．００８３。行：ｐ＝＜０．０００１。列：ｐ＝０．０２７３。＊ｐ＝０．０２１７および＃ｐ＝＜０．０２４１でのＳｉｄａｋの多重比較検定。図１６Ｃ：ＤＬＰ改変ｍＲＮＡは、ＩＦＮの存在下において、未改変ｍＲＮＡと比較して、１細胞当たりのタンパク質産生において統計的に有意な３０％の増加をもたらす（二元配置ＡＮＯＶＡにおいて、９５％信頼区間での平均値：ｐ＝＜０．０００１、＊＊＊ｐ＝＜０．０００２および＊＊＊＊ｐ＝＜０．０００１でのＳｉｄａｋの多重比較検定。図１６Ｄ：ＩＦＮの存在下におけるＤＬＰ改変ｍＲＮＡは、ＩＦＮ処理の非存在下での未改変ｍＲＮＡと比較して、等量のタンパク質を産生する（二元配置分散分析において、９５％信頼区間での平均値。相互作用：ｐ＝＜０．０００１、行：ｐ＝＜０．０００１、列：ｐ＝０．００２３＊＊＊＊。ｐ＝＜０．０００１および＊＊ｐ＝＜０．００２３でのＳｉｄａｋの多重比較検定）。
【図１６Ｂ】同上。
【図１６Ｃ】同上。
【図１６Ｄ】同上。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本開示の上記および他の特徴は、添付の図面と併せて、以下の説明および添付の特許請求の範囲からより完全に明らかになるであろう。これらの図面は本開示によるいくつかの実施形態のみを示すものであり、その範囲を限定するものと見なされるべきではないことを理解されたい。本開示は、添付の図面の使用により、さらなる具体性および詳細と共に説明される。
【００５２】
本開示は、一般に、細胞内の遺伝子発現を調節するのに使用するための組成物および方法に関する。本開示のいくつかの実施形態は、組換え細胞において、例えばワクチンおよび治療用ポリペプチドなどの異種分子を発現させるのに好適である優れた発現能力を有するウイルスをベースとした発現系などの発現系に関する。例えば、本開示のいくつかの実施形態は、ウイルスキャプシドエンハンサーまたはその多様体のうちの１つ以上の構造エレメントを含む核酸分子に関する。いくつかの実施形態では、１つ以上の構造エレメントのうちの少なくとも１つは、ＲＮＡステムループを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の構造エレメントのうちの少なくとも１つは、目的遺伝子のコード配列に作動可能に連結されている。本開示のいくつかの実施形態では、ウイルスキャプシドエンハンサーの１つ以上の構造エレメントをコードしている核酸配列を含む、転写および／または発現構築物およびベクターなどの核酸分子に関する。また、いくつかの実施形態において本明細書に開示されているのは、目的遺伝子のコード配列を含む、転写ベクター、およびウイルスベースベクターなどの発現ベクターである。いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子、例えば、メッセンジャー（ｍＲＮＡ）およびＲＮＡレプリコンは、ｄｅ  ｎｏｖｏ合成および／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって生成される。本明細書に開示の核酸分子のうちの１つ以上を含むように遺伝子改変された組変え細胞、ならびにそのような細胞由来の生体材料および組換え産物は、本出願の範囲内である。本明細書にさらに提供されるのは、本明細書に開示の核酸分子および／または組換え細胞のうちの１つ以上を含む組成物およびキット、ならびに宿主細胞において先天性免疫系に対する耐性を付与するための方法である。
【００５３】
以下の詳細な説明では、本明細書の一部分をなす添付の図面を参照する。図面では、文脈上別段の指示がない限り、類似の記号は、通常、類似の構成成分を特定する。詳細な説明、図面、および特許請求の範囲に記載されている例示的代替は、限定的であることを意味するものではない。本明細書に提示されている主題の趣旨または範囲から逸脱することなく、他の代替物が使用され得、また他の変更がなされ得る。本明細書に一般的に説明され、図に示される態様は、様々な異なる構成で配置、置換、結合、および設計することができ、それらのすべては明示的に企図されたものであり、本出願の一部をなすものであることは容易に理解されよう。
【００５４】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語、表記法および他の科学用語または専門用語は、本出願が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有することを意図する。場合によっては、一般に理解されている意味を有する用語は、明確にするため、かつ／または容易に参照するために本明細書に定義されている。本明細書におけるそのような定義の包含は、当該技術分野において一般的に理解されているものに対する実質的な相違を表すと必ずしも解釈されるべきではない。本明細書に記載の、または本明細書において参照される技術および手順の多くは、当業者によって従来の方法論を用いて十分に理解され、かつ一般的に用いられる。
【００５５】
定義
単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の言及を含む。例えば、用語「細胞」は、それらの混合物など、１つ以上の細胞を含む。
【００５６】
本明細書で使用される用語「約」は、おおよそというその通常の意味を有する。近似の程度が文脈から別の方法により明らかでない場合、「約」は、提供された値の±１０％以内であること、または提供された値を含むすべての場合において、最も近い有効数字に丸められることのいずれかを意味する。範囲が提供されている場合には、その範囲は、境界値を含む。
【００５７】
本明細書で使用される「細胞」、「細胞培養物」、「細胞株」、「組換え宿主細胞」、「レシピエント細胞」および「宿主細胞」という用語は、移入の数に関係なく、初代の対象細胞およびその任意の子孫を含む。場合によっては、子孫は親細胞と完全に同一ではない（故意のまたは不注意による突然変異または環境の違いによる）。しかし、こうして改変された子孫は、その子孫が初めに形質転換された細胞と同じであるか、または実質的に類似の機能性を保持する限り、これらの用語に含まれる。
【００５８】
本明細書で使用される場合、用語「構築物」は、発現カセット、プラスミド、コスミド、フォスミド、ウイルスレプリコン、シャトルベクター、自律複製ポリヌクレオチド分子、バクテリオファージ、または直鎖状もしくは環状の一本鎖、または二本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡポリヌクレオチド分子などの任意の組換え核酸分子を意味することを意図したものであり、これらは、任意の供給源に由来し、かつ、ゲノム統合または自律複製が可能であり、かつ核酸配列が、機能的に作動する様式で連結されている、例えば、作動可能に連結されている核酸分子を含む。
【００５９】
本明細書で使用される「に由来する」という用語は、起源または供給源を指し、天然に存在するか、組換えであるか、精製されていないか、または精製されている分子を含み得る。本開示の分子は、ウイルス分子または非ウイルス分子に由来し得る。元のタンパク質またはポリペプチドに由来するタンパク質またはポリペプチドは、元のタンパク質またはポリペプチドを部分的にまたは全体的に含み得、また、元のタンパク質またはポリペプチドの断片または多様体であり得る。
【００６０】
用語「遺伝子」は、タンパク質をコードするか、または機能的ＲＮＡに転写され得る、核酸分子の任意のセグメントを指すために広く用いられる。遺伝子は、転写されているが、最終ＲＮＡ転写産物、成熟ＲＮＡ転写産物、および／または機能的ＲＮＡ転写産物の一部分ではない配列を含み得、タンパク質をコードする遺伝子は、転写されるが、翻訳されない配列、例えば５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、イントロンなどをさらに含み得る。さらに、遺伝子は、それらの発現に必要な調節配列を任意によりさらに含んでもよく、このような配列は、例えば、転写または翻訳されていない配列であり得る。遺伝子は、目的の供給源からのクローニング、または既知のもしくは予測される配列情報から合成されたものなど、様々な供給源から得ることができ、所望のパラメータを有するように設計された配列を含み得る。
【００６１】
用語「天然の」は、本明細書では、それらが宿主中に天然に存在する核酸配列またはアミノ酸配列を指すために使用される。「非天然」という用語は、本明細書では、宿主に天然には存在しないか、または宿主に天然に配置されているために配置されていない核酸配列またはアミノ酸配列を指すのに使用される。宿主細胞から除去され、実験室操作に供され、かつ宿主細胞に導入または再導入された核酸配列またはアミノ酸配列は、「非天然」と見なされる。宿主細胞または生物に導入された合成遺伝子または部分的合成遺伝子は、「非天然」である。非天然遺伝子としては、さらに、宿主ゲノムに組換えられた１つ以上の異種調節配列に作動可能に連結されている宿主細胞に対して内因性である遺伝子、または天然に存在する場所以外のゲノムの遺伝子座にある宿主細胞または生物に対して内因性の遺伝子が挙げられる。
【００６２】
本明細書で使用される「天然に存在する」および「野生型」という用語は、天然に見出される形態を指す。例えば、天然に存在するか、または野生型である核酸分子、核酸配列、またはタンパク質は、天然供給源中に存在し、またそれらから単離されてもよく、また、ヒトの操作によって意図的に改変されないものである。以下に詳細に記載されるように、本開示のいくつかの実施形態による核酸分子は、天然に存在しない核酸分子である。
【００６３】
ポリヌクレオチド、遺伝子、または核酸分子に関して使用される場合の「異種」という用語は、宿主種に由来しないポリヌクレオチド、遺伝子、または核酸分子を指す。例えば、本明細書で使用される「異種遺伝子」または「異種核酸配列」は、それらが導入される宿主生物の種とは異なる種由来の遺伝子または核酸配列を指す。例えばエンハンサー配列などの遺伝子調節配列、または遺伝子配列の発現を操作するために使用される補助核酸配列（例えば、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、ポリＡ付加配列など）、またはタンパク質ドメインをコードしている核酸配列、またはタンパク質局在化配列を指す場合、「異種」は、調節配列もしくは補助配列、またはタンパク質ドメインをコードしている配列、または局在化配列が、遺伝子とは異なる供給源由来であり、調節核酸配列もしくは補助核酸配列、またはタンパク質ドメインをコードしている核酸配列、または局在化配列が、ゲノム内で並置されていることを意味する。したがって、その天然状態において（例えば、遺伝子操作されていない生物のゲノムにおいて）作動可能に連結されていない遺伝子に作動可能に連結されているプロモーターは、プロモーターが、連結している遺伝子と同じ種（または、場合によっては同じ生物）に由来している場合であっても、本明細書においては、「異種プロモーター」と呼ばれる。例えば、本明細書に開示のいくつかの実施形態では、目的の異種遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列は、その天然状態では、組換えＲＮＡレプリコン配列に連結されていない。いくつかの実施形態では、コードＧＯＩ配列は、別のウイルス、細菌、真菌、ヒト細胞（腫瘍Ａｇ）、寄生虫（マラリア）など）など、別の生物に由来する。
【００６４】
用語「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書では同義的に使用され、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、および核酸類似体を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含む核酸分子など、ＲＮＡおよびＤＮＡ分子の両方を指す。核酸分子は、任意の三次元構造を有することができる。核酸分子は、二本鎖または一本鎖（例えば、センス鎖またはアンチセンス鎖）であり得る。核酸分子の非限定的な例としては、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、核酸プローブおよび核酸プライマーが挙げられる。核酸分子は、非従来型または改変型ヌクレオチドを含み得る。本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド配列」および「核酸配列」は、同義的にポリヌクレオチド分子の配列を指す。３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に記載のヌクレオチド塩基の命名法が本明細書において使用される。本開示の核酸分子は、例えば、１つ以上の化学的もしくは酵素的技術を用いて（例えば、化学的核酸合成を使用することによって、もしくは核酸分子の複製、重合、エキソヌクレアーゼ消化、エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、逆転写、転写、塩基修飾（例えば、メチル化など）、もしくは組換え（相同および部位特異的組換えなど）などのための酵素を使用することによって）、当技術分野で公知の任意の手段によって、ｅｘ  ｖｉｔｒｏで合成できる。いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子は、ｄｅ  ｎｏｖｏ合成から生成されたものである。いくつかの実施形態では、核酸分子は、既知の化学的方法、既知の酵素技術、またはそれらの任意の組み合わせを使用して、全体または一部分をｄｅ  ｎｏｖｏで合成できる。例えば、構成成分核酸配列は、固相技術により合成し、樹脂から取り出し、調製用高速液体クロマトグラフィーにより精製して、その後化学結合および／または酵素的ライゲーションにより、キメラ核酸分子を形成することができる。合成核酸分子の組成は、核酸分析またはシーケンシングによって確認され得る。いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子は、当該分野で公知の技術を使用して化学合成オリゴヌクレオチドから酵素的に会合され得る。
【００６５】
本開示の核酸分子は、任意の長さ、例えば、約０．５Ｋｂ〜約１０００Ｋｂ、約０．５Ｋｂ〜約５００Ｋｂ、約１Ｋｂ〜約１００Ｋｂ、約２Ｋｂ〜約５０Ｋｂ、または約５Ｋｂ〜約２０Ｋｂの核酸分子であり得る。いくつかの実施形態では、核酸分子は、０．５Ｋｂ、１Ｋｂ、２Ｋｂ、３Ｋｂ、４Ｋｂ、５Ｋｂ、６Ｋｂ、７Ｋｂ、８Ｋｂ、９Ｋｂ、１０Ｋｂ、１５Ｋｂ、２０Ｋｂ、２５Ｋｂ、３０Ｋｂ、４０Ｋｂ、５０Ｋｂ、１００Ｋｂ、２００Ｋｂ、５００Ｋｂ、１Ｍｂであるか、または約０．５Ｋｂ、約１Ｋｂ、約２Ｋｂ、約３Ｋｂ、約４Ｋｂ、約５Ｋｂ、約６Ｋｂ、約７Ｋｂ、約８Ｋｂ、約９Ｋｂ、約１０Ｋｂ、約１５Ｋｂ、約２０Ｋｂ、約２５Ｋｂ、約３０Ｋｂ、約４０Ｋｂ、約５０Ｋｂ、約１００Ｋｂ、約２００Ｋｂ、約５００Ｋｂ、約１Ｍｂであるか、またはそれ以上、またはこれらの値のうちの任意の２つの間の範囲である。
【００６６】
本開示のポリヌクレオチドは、核酸が別の核酸とハイブリダイズする能力、またはポリヌクレオチド配列が転写因子、リボソーム、および核酸ポリメラーゼのうちの１つ以上によって認識され、結合される能力などの構造的属性のいずれかに関して「生物学的に活性」であり得る。
【００６７】
本明細書で使用される「組換え」または「操作された」核酸分子という用語は、ヒトの介入を介して改変されている核酸分子を指す。非限定的な例として、ｃＤＮＡは、ｅｘ  ｖｉｔｒｏポリメラーゼ反応（複数可）によって生成された、またはリンカーが付着した、またはベクター（クローニングベクターもしくは発現ベクターなど）に組み込まれた任意の核酸分子と同様に、組換えＤＮＡ分子である。非限定的な例として、組換え核酸分子は：１）例えば、化学的または酵素的技術を用いて（例えば化学的核酸合成の使用により、または核酸分子の複製、重合、エキソヌクレアーゼ消化、エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、逆転写、転写、塩基修飾（例えば、メチル化など）、または組換え（相同および部位特異的組換えなど）のための酵素の使用により）、ｅｘ  ｖｉｔｒｏで合成または改変されている、２）本質的に結合していない結合ヌクレオチド配列を含む、３）天然に存在する核酸分子配列について、１つ以上のヌクレオチドを欠失しているように分子クローニング技術を用いて操作されている、かつ／または４）天然に存在する核酸配列について、１つ以上の配列変化または再配列を有するように、分子クローニング技術を用いて操作されている。非限定的な例として、ｃＤＮＡは、ｅｘ  ｖｉｔｒｏポリメラーゼ反応（複数可）によって生成された、またはリンカーが付着した、またはクローニングベクターもしくは発現ベクターなどのベクターに組み込まれた任意の核酸分子と同様に、組換えＤＮＡ分子である。本明細書に開示のいくつかの実施形態では、本出願の組換え核酸分子は、ｄｅ  ｎｏｖｏ合成から生成される。
【００６８】
本明細書で使用されるタンパク質の「多様体」という用語は、少なくとも１つのアミノ酸が改変されている、例えば、それぞれ、欠失している、挿入されている、または置換されていることを除いて、参照タンパク質と同一であるか、または本質的に同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。アミノ酸置換は、好ましくはタンパク質中の非必須アミノ酸残基での保存的アミノ酸置換であり得る。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において公知である。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。タンパク質の多様体は、タンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、９０％、９５％、または９９％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を有し得る。好ましくは、多様体は、タンパク質と同じ機能を保持するタンパク質の機能的多様体である。用語「多様体」は、核酸配列に関して使用される場合、別のものとは１つ以上のヌクレオチドが異なる核酸配列、通常は、関連するヌクレオチド配列を指す。したがって、用語「多様体」は、１つ以上の新しいヌクレオチドの挿入、１つ以上のヌクレオチドの欠失、および１つ以上の既存のヌクレオチドの置換など、参照核酸の１つ以上のヌクレオチドが変化しているものを指すことができる。「変異」とは、２つの異なるヌクレオチド配列間の違いであり、典型的には、１つの配列は参照配列である。概して、本明細書で使用される用語「ヌクレオチド変異」としては、点突然変異、多重突然変異、一塩基多型（ＳＮＰ）、欠失、挿入、および転座が挙げられる。用語「参照核酸」は、目的の既知の参照配列を有するヌクレオチド配列を記載するために本明細書で使用されている。
【００６９】
本明細書で使用される場合、用語「同一」またはパーセント「同一性」は、２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、比較ウィンドウにおいて最大限一致させるために比較され、整列された場合に同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドが、同一であるかまたは特定の割合（パーセント）を有する２つ以上の配列またはサブ配列を指す。別段の指定がない限り、選択された配列（例えば、「配列番号Ｘ」）の比較ウィンドウは、配列番号Ｘの全長であり、例えば、「１００ｂｐの配列番号Ｘ」の比較ウィンドウは、記載されている１００ｂｐである。アミノ酸または核酸配列同一性の程度は、指定されたプログラムパラメータに基づいて比較される配列を整列させるための様々なコンピュータープログラムによって決定され得る。例えば、配列は、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−８９、１９８１年の局所相同性アルゴリズムを用いて、  Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−５３、１９７０年の相同性整列アルゴリズムを用いて、またはＰｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ‘ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４−４８、１９８８の類似方法の検索を用いて、整列させ比較することができ、目視検査に基づいて整列させ比較することができるか、または分析のためにコンピュータープログラム（例えば、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用することができる。
【００７０】
パーセント配列同一性を算出することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析を実行する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ‘ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−８７、１９９３を参照されたい）。最小合計確率（Ｐ（Ｎ））は、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間の一致が偶然に生じ得る確率の指標を提供するものである。例えば、試験核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が約０．１未満、好ましくは約０．０１未満、より好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は、参照配列と類似していると見なされる。
【００７１】
本明細書で使用される場合、用語「ベクター」とは、宿主細胞への、または宿主細胞間の移入のために設計され、形質転換、例えば、異種ＤＮＡを宿主細胞へ導入するために使用され得る組換えポリヌクレオチド構築物を指す。ベクターは、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、またはコスミドなどのレプリコンであり得、挿入されたセグメントの複製を引き起こすように内部に別のＤＮＡセグメントが挿入され得る。一般に、ベクターは、適切な制御エレメントと結合したときに複製することができる。用語「ベクター」としては、クローニングベクターおよび発現ベクター、ならびにウイルスベクターおよび組み込みベクターが挙げられる。「発現ベクター」は、調節領域を含むベクターであり、それによって、例えば、ｅｘ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、およびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＤＮＡ配列及びその断片を発現させることができる。いくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミド、バクテリオファージベクター、コスミド、フォスミド、ウイルスレプリコン、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、ベクターは、真核生物ベクター、原核生物ベクター（例えば、細菌プラスミド）、またはシャトルベクターである。発現系は、例えば、発現ベクターまたは発現カセットであり得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、転写ベクターである。用語「転写ベクター」は、転写され得るが、翻訳はされ得ないベクターを指す。例えば、転写ベクターを使用して、それらの挿入物を増幅することができる。
【００７２】
ウイルスベースの「レプリコン」発現ベクターは、例えばワクチンおよび治療用組成物として使用することができる。レプリコンベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および組換えウイルス粒子など、いくつかの型式で利用され得る。現在では、ワクチンなどの用途において、ウイルスレプリコンベクターの有効性が様々な文献で論証されている。さらに、これらの用語は、まとめてベクター、ベクター構築物または遺伝子送達ベクターと称されるものもある。
【００７３】
当業者には理解されるように、書面による説明を提供することに関することなど、ありとあらゆる目的のために、本明細書に開示されているすべての範囲は、ありとあらゆる可能な部分範囲およびそれらの部分範囲の組み合わせも包含する。列挙された範囲はいずれも、同じ範囲を少なくとも半分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などに細分して十分に記述し、可能にするものとして、容易に認識され得る。非限定的な例として、本明細書で論じられている各範囲は、下３分の１、中３分の１および上３分の１などに容易に細分することができる。また、当業者には理解されるように、「〜まで」、「少なくとも」、「より大きい」、「未満」などの言語はすべて、引用された数字を含み、その後、上記のように部分範囲に細分化され得る範囲を指す。最後に、当業者には理解されるように、範囲は、各個々の要素を含む。したがって、例えば、１〜３個の物を有する群は、１、２、または３個の物を有する群を指す。同様に、１〜５個の物を有する群は、１、２、３、４または５個の物を有する群を指す。
【００７４】
ウイルスキャプシドエンハンサー
いくつかのウイルスは、キャプシド遺伝子発現を調節する（例えば、増大する）、１つ以上のステムループ構造を形成することができる配列を有する。用語「ウイルスキャプシドエンハンサー」は、本明細書では、そのようなステムループ構造を形成することができる配列を含む調節エレメントを指すために使用される。いくつかの例では、ステムループ構造は、キャプシドタンパク質のコード配列内の配列によって形成され、下流ループ（ＤＬＰ）配列と呼ばれる。本明細書に開示されているように、これらのステムループ構造またはその多様体は、目的遺伝子の発現レベルを調節するため、例えば増大するために使用することができる。例えば、これらのステムループ構造またはその多様体は、その下流に作動可能に連結されているコード配列の転写および／または翻訳を増強するために、組換えベクター（例えば、異種ウイルスゲノム）において使用することができる。一例として、アルファウイルス属のメンバーは、ウイルス２６Ｓ転写物中に存在する顕著なＲＮＡ構造によって、抗ウイルスＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）の活性化に抵抗することができ、これにより、これらのｍＲＮＡのｅＩＦ２非依存性翻訳の開始が可能になる。下流ループ（ＤＬＰ）と呼ばれるこの構造は、ＳＩＮＶ２６Ｓ  ｍＲＮＡ中およびアルファウイルス属の他のメンバー中のＡＵＧから下流に配置される。シンドビスウイルスの場合、ＤＬＰモチーフは、シンドビスサブゲノムＲＮＡの最初の約１５０ｎｔに見られる。ヘアピンは、シンドビスキャプシドＡＵＧ開始コドンの下流に配置される（ＡＵＧは、シンドビスサブゲノムＲＮＡのｎｔ５０で照合される）。これまでの配列比較および構造的ＲＮＡ分析の研究により、ＳＩＮＶにおけるＤＬＰの進化的保存を明らかにし、アルファウイルス属の多くのメンバーにおける同等のＤＬＰ構造の存在を予測した（例えば、Ｖｅｎｔｏｓｏ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．９４８４−９４９４、第８６巻、２０１２年９月を参照されたい）。
【００７５】
ＰＫＲは、真核生物翻訳開始因子２α（ｅＩＦ２α）をリン酸化する。ｅＩＦ２αのリン酸化は、ｍＲＮＡの翻訳開始を遮断し、その際にウイルスが生産的な複製サイクルを完了するのを妨げる。ＰＫＲは、インターフェロンおよび二本鎖ＲＮＡによって活性化される。宿主細胞におけるアルファウイルスの複製は、二本鎖ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）を誘導することが知られている。例えば、細胞のシンドビスウイルス感染は、ｅＩＦ２αのリン酸化をもたらすＰＫＲを誘導するが、ウイルスサブゲノムｍＲＮＡが効率的に翻訳される一方で、他のすべての細胞ｍＲＮＡの翻訳は制限される。シンドビスウイルスのサブゲノムｍＲＮＡは、ウイルスキャプシドタンパク質（例えば、キャプシドエンハンサー）の野生型ＡＵＧイニシエーターコドンの下流に配置された安定なＲＮＡヘアピンループを有する。ステムループとも呼ばれるこのヘアピンループのＲＮＡ構造は、多くの場合、下流ループ構造（またはＤＬＰモチーフ）と称される。ＤＬＰ構造は、野生型ＡＵＧのリボソームを失速させることがあり、これは、機能的ｅＩＦ２αを必要とせずにサブゲノムｍＲＮＡの翻訳を助けることが報告されている。したがって、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）ならびに他のアルファウイルスのサブゲノムｍＲＮＡは、高度に活性なＰＫＲを有する細胞においてさえも効率的に翻訳され、その結果ｅＩＦ２αの完全なリン酸化がもたらされる。
【００７６】
アルファウイルスＤＬＰの構造
ＤＬＰ構造は、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）２６Ｓ  ｍＲＮＡにおいて最初に特徴が明らかになり、またセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）においても検出された。同様のＤＬＰ構造が、新世界（例えば、ＭＡＹＶ、ＵＮＡＶ、ＥＥＥＶ（ＮＡ）、ＥＥＥＶ（ＳＡ）、ＡＵＲＡＶ）および旧世界（ＳＶ、ＳＦＶ、ＢＥＢＶ、ＲＲＶ、ＳＡＧ、ＧＥＴＶ、ＭＩＤＶ、ＣＨＩＫＶ、およびＯＮＮＶ）メンバーなど、アルファウイルス属の他の少なくとも１４種中に存在していることが報告されている。これらのアルファウイルス２６Ｓ  ｍＲＮＡの予測される構造は、ＳＨＡＰＥ（選択的２‘−ヒドロキシルアシル化およびプライマー伸長）データに基づいて構築された（Ｔｏｒｉｂｉｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．５月１９日；４４（９）：４３６８−８０、２０１６年、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。ＣＨＩＫＶおよびＯＮＮＶを除くすべてのウイルスにおいて安定したステムループ構造が検出されたが、ＭＡＹＶおよびＥＥＥＶは、より低い安定性のＤＬＰを示した（図１１Ａ〜Ｂ、およびＴｏｒｉｂｉｏら、２０１６年（上記）を参照されたい）。最も高いＤＬＰ活性は、最も安定したＤＬＰ構造を含むアルファウイルスにおいて報告された。場合によっては、ＤＬＰ活性は、ＤＬＰモチーフと開始コドンＡＵＧ（ＡＵＧｉ）との間の距離に依存する。アルファウイルス２６Ｓ  ｍＲＮＡにおけるＡＵＧ−ＤＬＰ間隔は、ＤＬＰによって失速された４０ＳサブユニットのＰ部位にＡＵＧｉを配置できるようにする様式で、リボソーム１８Ｓ  ｒＲＮＡのＥＳ６Ｓ領域のトポロジーに調整され、これにより、ｅＩＦ２が関与することなく、Ｍｅｔ−ｔＲＮＡを組み込むことができるようになる。２つの主なトポロジー（ＳＦＶクレードにおいてコンパクトで安定した構造、およびＳＩＮＶ群においてより伸長された構造）が検出された。両方の場合において、ＤＬＰ構造では、強いＳＨＡＰＥ反応性の領域が先行していることが観察されており、これはＡＵＧ−ＤＬＰ伸長の一本鎖構成であることが示唆されている。したがって、この領域は、全マウスｍＲＮＡトランスクリプトームまたはＤＬＰを欠くアルファウイルスｍＲＮＡにおいて、同等の位置で比較した場合、高含有量のＡおよび低含有量のＧでは、二次構造を形成する傾向が低いことが示されている。これらの結果は、Ｔｏｒｉｂｉｏらによって報告されており（２０１６年、上記）、アルファウイルスにおけるＤＬＰの発生が、おそらく、先行する領域の平坦化に関連しており、その結果、このｍＲＮＡ領域の谷ピークトポロジーがもたらされていることが示唆されている。
【００７７】
シンドビスウイルスの場合、ＤＬＰモチーフは、シンドビスサブゲノムＲＮＡの最初の約１５０ｎｔに見られる。ヘアピンは、シンドビスキャプシドＡＵＧ開始コドン（シンドビスサブゲノムＲＮＡのｎｔ５０のＡＵＧ）の下流に配置され、正しいキャプシド遺伝子ＡＵＧが翻訳を開始するために使用されるように、リボソームを失速させる。これは、ヘアピンにより、リボソームが休止し、翻訳開始を助けるにあたって、ｅＩＦ２αが必要とされないためである。いかなる特定の理論にも縛られるものではないが、あらゆるＧＯＩのコード配列の上流にＤＬＰモチーフを配置することは、典型的には、ＧＯＩコードタンパク質に対するヘアピン領域においてコードされるＮ末端キャプシドアミノ酸の融合タンパク質をもたらすと考えられる。これは、開始がＧＯＩ  ＡＵＧではなく、キャプシドＡＵＧにおいて生じるためである。本明細書に開示のいくつかの実施形態では、ブタテッショウウイルス−１  ２Ａ（Ｐ２Ａ）ペプチド配列は、ＤＬＰ配列の直後にインフレームで、およびすべてのＧＯＩのすぐ上流でインフレームで操作された。本開示の改変型ウイルスＲＮＡレプリコンへＰ２Ａペプチドを組み込むことにより、キャプシド−ＧＯＩ融合物からの、ほぼ元の状態であるＧＯＩタンパク質の放出が可能になり、単一のプロリン残基が、すべてのＧＯＩタンパク質に付加されている。
【００７８】
いかなる特定の理論に縛られるものではないが、ＤＬＰにより、ｅＩＦ２αに依存しない様式で、翻訳を起こさせることができると考えられており、それを用いて非構造タンパク質の翻訳を開始するように操作された核酸分子および発現ベクター（例えば、ＲＮＡレプリコンベクター）は、先天性免疫系が活性化されている細胞において、機能性が増すことになる。したがって、ＤＬＰ操作核酸分子および発現ベクター（例えば、ＲＮＡレプリコンベクター）もまた、異なる細胞、個体または個体の集団において、より均一性をもって機能することが企図されている。これは、当然のことながら、各々における先天性免疫活性化レベルの差が、変動を引き起こすためである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡレプリコンベクターの翻訳および複製（ならびにＧＯＩの発現）では、既存の先天性免疫応答による影響が少ない可能性があるため、ＤＬＰが、その変動を取り除くのに役立ち得る。本明細書に開示されている組成物および方法の重要な価値のうちの１つは、慢性または急性の免疫活性化状態にある個体においてワクチンの有効性を高め得ることである。慢性または急性の免疫活性化の原因は、無症状であるか、または臨床感染症に罹患している個体、または癌もしくは他の疾患（例えば、糖尿病、栄養失調、高血圧、心臓病、クローン病、筋硬化症など）の医学的治療を受けている個体に見られる。
【００７９】
本明細書に記載されるように、本明細書に開示のＤＬＰ含有核酸分子（例えば、転写ベクターおよび発現ベクター（例えば、ＲＮＡウイルスレプリコン））は、対象において先天性免疫系に対する耐性を付与するのに有用であり得る。非改変型ＲＮＡレプリコンは、それらが内部に導入された細胞の初期の先天的免疫系の状態に対して感受性がある。細胞／個体が非常に活発な先天性免疫系状態にある場合、ＲＮＡレプリコン性能（例えば、ＧＯＩの複製および発現）は、悪影響を受ける可能性がある。タンパク質、特に非構造タンパク質の翻訳の開始を制御するようにＤＬＰを操作することによって、効率的なＲＮＡレプリコン複製に影響を及ぼすための先天性免疫系の既存の活性化状態の影響が取り除かれるか、または少なくなる。結果としては、ワクチンの有効性または治療の治療的影響に影響を及ぼし得るＧＯＩの発現が、より一定であるか、かつ／または増強される。
【００８０】
アルテリウイルス
アルテリウイルス（アルテリウイルス科アルテリウイルス属）は、家畜および野生動物に感染する、エンベロープのある、一本鎖のプラスセンスＲＮＡウイルスの重要な群を包含する。アルテリウイルスは、コロナウイルス科（コロナウイルスおよびトロウイルス属）のメンバーと同様のゲノム構成および複製戦略を共有しているが、それらの遺伝的複雑性、ゲノムの長さ、生物物理学的性質、サイズ、構造、およびウイルス粒子（例えば、ビリオン）の構造タンパク質組成においてはかなり異なる。現在、アルテリウイルス属には、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、マウスの乳酸脱水素酵素上昇ウイルス（ＬＤＶ）、サル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）、およびｗｏｂｂｌｙ  ｐｏｓｓｕｍ  ｄｉｓｅａｓｅウイルス（ＷＰＤＶ）が含まれると考えられている。
【００８１】
典型的なアルテリウイルスゲノムは長さが１２．７〜１５．７ｋｂで変化するが、それらのゲノム構成は、いくつかの小さな変化と比較的一致している。アルテリウイルスの例示的なゲノム構成およびビリオン構造を、図１０に示す。アルテリウイルスゲノムは、１０〜１５個の既知のＯＲＦのアレイの側面にある５’および３’の非翻訳領域（ＮＴＲ）を有するポリシストロニック＋ＲＮＡである。大きいレプリカーゼＯＲＦ１ａおよび１ｂは、ゲノムの５’の近位４分の３を占有し、ＯＲＦ１ａのサイズは、ＯＲＦ１ｂのサイズよりはるかに可変性である。ＯＲＦ１ａの翻訳によって、レプリカーゼポリタンパク質（ｐｐ）１ａが産生されるが、ＯＲＦ１ｂは、−１プログラムリボソームフレームシフト（ＰＲＦ）によって発現し、Ｃ末端においてｐｐ１ａがｐｐ１ａｂまで伸長する。さらに、短いトランスフレームＯＲＦは、＋１フレームにおいて、ＯＲＦ１ａのｎｓｐ２コード領域と重なり、−２ＰＲＦによって発現されることが報告されている。３’近位ゲノム部分は、コンパクトな構成を有しており、８〜１２個の比較的小さい遺伝子を含み、そのほとんどが隣接遺伝子と重なる。これらのＯＲＦは、構造タンパク質をコードし、３’共末端のネスト状のｓｇ  ｍＲＮＡのセットから発現される。これらのＯＲＦの構成は保存されているが、ＯＲＦ１ｂ、ＳＨＦＶおよび近年同定されたすべてのＳＨＦＶ様ウイルスの下流には、古代のＯＲＦ２〜４の重複に由来すると考えられる３〜４個のＯＲＦ（約１．６ｋｂ）が含まれる。ＯＲＦ１ａのサイズの変動と共に、こうして推定された重複は、アルテリウイルス間のゲノムサイズの違いを説明するものである。
【００８２】
ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）に関して、野生型ＥＡＶゲノムは、サイズが約１２．７Ｋｂである。ゲノムの５’の４分の３は、２つの大きいレプリカーゼタンパク質１ａおよび１ａｂをコードし、２つのタンパク質のアミノ酸配列は、Ｎ末端において同一であるが、リボソームフレームシフトにより、１ａｂのＣ末端領域のアミノ酸配列は、固有のものである。ＥＡＶゲノムの３’の４分の１は、ウイルスの構造タンパク質遺伝子をコードしており、これらはすべて、サブゲノムＲＮＡから発現される。サブゲノムＲＮＡは、不連続な転写機構を介して生成されるネスト状の３’共末端ＲＮＡのセットを形成する。サブゲノムＲＮＡは、ゲノムＲＮＡと隣接していない配列で構成されている。すべてのＥＡＶサブゲノムＲＮＡは、ゲノム５’配列と同一である共通の５’リーダー配列（長さ１５６〜２２１ｎｔ）を共有する。サブゲノムＲＮＡのリーダー部分とボディ部分は、転写調節配列（ＴＲＳ）と呼ばれる保存配列によって接続されている。ＴＲＳは、リーダーの３’末端（リーダーＴＲＳ）および各構造タンパク質遺伝子の上流に配置されているサブゲノムプロモーター領域（ボディＴＲＳ）において見出される。サブゲノムＲＮＡは、マイナス鎖複製中間体ＲＮＡが転写されるたびに生成される。転写が起こると、複製複合体は、それが各ボディＴＲＳになると一時停止し、次いで新生のマイナス鎖ＲＮＡが、マイナス鎖ＲＮＡ転写が続く相補的プラス鎖リーダーＴＲＳと会合するようになる。この不連続な転写機構により、５‘および３‘の両方のＥＡＶ保存配列を有するサブゲノムＲＮＡがもたらされる。次いで、マイナス鎖サブゲノムＲＮＡは、サブゲノムプラスセンスｍＲＮＡを産生するための鋳型となる。
【００８３】
ＥＡＶの全ゲノムを代表する感染性ｃＤＮＡクローンが報告されており、これらのクローンは、ほぼ２０年間、ＥＡＶ  ＲＮＡの複製および転写を研究するために使用されている。さらに、ＯＲＦ２およびＯＲＦ７の代わりに挿入されたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を含む感染性クローンが生成され、ＣＡＴタンパク質は、それらのＲＮＡでエレクトロポレートされた細胞において発現することが示された。部位特異的突然変異誘発および構造タンパク質遺伝子領域の欠失による感染性クローンの修飾は、ＲＮＡ複製を補助する各構造遺伝子が必要であるかを決定するために使用されている（Ｍｏｌｅｎｋａｍｐ  ２０００）。Ｍｏｌｅｎｋａｍｐ  ２０００によって報告された研究では、構造遺伝子は、ＲＮＡ複製を助けるのに必要としないとの結論となった。サブゲノムＲＮＡの産生におけるＴＲＳ活性のための配列相同性要件の分析を行い、またこの分析を使用して、不連続転写が機構的にどのように起こるかをよりよく定義し（ｖａｎ  Ｍａｒｌｅ  １９９９、Ｐａｓｔｅｒｎａｋ  ２０００、Ｐａｓｔｅｒｎａｋ  ２００１、Ｐａｓｔｅｒｎａｋ  ２００３、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｒｎ  ２００５）、かつ不完全干渉ＲＮＡを使用して、ＲＮＡの複製およびウイルス粒子へのパッケージングに必要な最小限のゲノム配列を理解した（Ｍｏｌｅｎｋａｍｐ  ２０００ａ）。
【００８４】
アルファウイルス
アルファウイルスは、少なくとも３０のメンバーを含む、ＩＶ群のトガウイルス科の遺伝的、構造的、および血清学的に関連するウイルスの属である。これらのメンバーは、各々が、ウイルススパイクタンパク質を含むエンベロープに取り囲まれたヌクレオキャプシドに囲まれた正の極性の一本鎖ＲＮＡゲノムを有する。現在、アルファウイルス属は、特にシンドビスウイルス（ＳＩＮ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、および東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）を含む。これらは、すべて密接に関連しており、哺乳類、げっ歯類、魚類、鳥類などの様々な脊椎動物、およびヒトまたはウマなどの大型哺乳類、ならびに昆虫などの無脊椎動物に感染することができる。種と個体間の伝染は主に蚊を介して起こり、アルファウイルスをアルボウイルス、または節足動物媒介ウイルスの収集の一因としている。特に、シンドビスおよびセムリキ森林ウイルスは広く研究されており、したがって、これらのウイルスのライフサイクル、複製様式などは十分に特徴が明らかになっている。特に、アルファウイルスは、動物細胞中で非常に効率的に複製することが示されており、このため、こうした細胞中でタンパク質および核酸を産生するためのベクターとして、価値のあるものとなる。
【００８５】
アルファウイルス粒子は、包み込まれており、７０ｎｍの直径を有し、球形である傾向があり（わずかに多形性であるが）、かつ約４０ｎｍの等尺性ヌクレオキャプシドを有する。図９に、典型的なアルファウイルスゲノム構造およびゲノム発現を示す。アルファウイルスゲノムは、長さ約１１〜１２ｋｂの正極性の一本鎖ＲＮＡであり、５’キャップ、３’ポリＡテール、および２つのオープンリーディングフレームを含む。オープンリーディングフレームは、酵素機能を有する非構造タンパク質をコードしている第１のフレーム、およびウイルス構造タンパク質（例えば、キャプシドタンパク質Ｃ、Ｅ１糖タンパク質、Ｅ２糖タンパク質、Ｅ３タンパク質および６Ｋタンパク質）をコードしている第２のフレームを有する。
【００８６】
アルファウイルスゲノムの５’の３分の２は、ウイルスＲＮＡの転写および複製に必要な多数の非構造タンパク質をコードする。これらのタンパク質は、ＲＮＡから直接翻訳され、細胞タンパク質と共にウイルスゲノムの複製およびサブゲノムＲＮＡの転写に必須であるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを形成する。４つの非構造タンパク質（ｎｓＰ１〜４）は、ウイルスの複製機構を構成する単一のポリタンパク質として産生される。ポリタンパク質のプロセシングは、高度に調節された様式で起こり、Ｐ２／３接合部で切断されると、ゲノム複製中のＲＮＡ鋳型の使用に影響を与える。この部位は、狭い割れ目の基部に配置されており、容易にアクセスされない。一旦切断されると、ｎｓＰ３は、ｎｓＰ２を囲む環構造を作製する。これら２つのタンパク質は、広範囲の界面を有する。非細胞変性ウイルスまたは温度感受性表現型を産生するｎｓＰ２における突然変異は、Ｐ２／Ｐ３界面領域に集まる。ｎｓＰ２非細胞変性変異の場所の反対側にあるＰ３突然変異により、Ｐ２／３の効率的な切断が妨げられる。次いで、ＲＮＡ感染力に影響を及ぼし、ウイルスＲＮＡ産生レベルを変動させ得る。
【００８７】
ゲノムの３’の３分の１は、ウイルス粒子の形成に必要とされる、すべての構造タンパク質（コアヌクレオキャプシドタンパク質Ｃ、ならびにヘテロ二量体として会合するエンベロープタンパク質Ｐ６２およびＥ１）の翻訳の鋳型として働くサブゲノムＲＮＡを含む。ウイルス膜固定表面糖タンパク質は、受容体認識および膜融合による標的細胞への侵入に関与している。サブゲノムＲＮＡは、ｎｓｐ４タンパク質をコードしているＲＮＡ配列の３’末端に存在するｐ２６Ｓサブゲノムプロモーターから転写される。タンパク質分解によりＰ６２がＥ２およびＥ３に成熟することで、ウイルス表面の変化を引き起こす。Ｅ１、Ｅ２、および時にはＥ３、糖タンパク質の「スパイク」が、一緒になって、Ｅ１／Ｅ２二量体またはＥ１／Ｅ２／Ｅ３三量体を形成する。Ｅ２は、中心から頂点まで伸長し、Ｅ１は頂点間のスペースを埋め、存在する場合には、Ｅ３は、スパイクの先端にある。ウイルスを酸性のエンドソームにさらすと、Ｅ１は、Ｅ２から解離して、Ｅ１ホモ三量体を形成する。これは、融合ステップにおいて、細胞膜とウイルス膜とを一緒に駆動させるのに必要である。アルファウイルス糖タンパク質Ｅ１は、クラスＩＩウイルス融合タンパク質であり、これはインフルエンザウイルスおよびＨＩＶに見られるクラスＩ融合タンパク質とは構造的に異なる。Ｅ２糖タンパク質は、その細胞質ドメインを介してヌクレオキャプシドと相互作用するように機能し、そのエクトドメインは、細胞受容体の結合に関与している。ほとんどのアルファウイルスでは、末梢タンパク質Ｅ３が失われているが、Ｓｅｍｌｉｋｉウイルスにおいては、依然として、ウイルス表面と関連している。
【００８８】
アルファウイルスの複製は、宿主細胞内の膜表面で起こることが報告されている。感染サイクルの第１のステップでは、ゲノムＲＮＡの５’末端が、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有するポリタンパク質（ｎｓＰ１〜４）に翻訳され、これにより、ゲノムＲＮＡに相補的であるマイナス鎖が産生される。第２のステップでは、マイナス鎖は、それぞれ２つのＲＮＡ：（１）翻訳によって他のｎｓｐタンパク質を産生し、ウイルスのゲノムとして作用する二次ウイルスのゲノムに対応するプラスゲノムＲＮＡ、および（２）感染性粒子を形成するウイルスの構造タンパク質をコードするサブゲノムＲＮＡ、を産生するための鋳型として使用する。プラスゲノムＲＮＡ／サブゲノムＲＮＡ比は、タンパク質分解による、ｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３、およびｎｓｐ４へのポリタンパク質の自己切断によって調節される。実際には、ウイルス遺伝子の発現は、２段階で起こる。第１の段階には、プラスゲノム鎖およびマイナス鎖の主な合成が存在する。第２の段階の間、サブゲノムＲＮＡの合成は、実質的に排他的であることから、大量の構造タンパク質の産生をもたらす。
【００８９】
先天性免疫
先天性免疫活性化は、多くの異なる刺激により起こり得るので、抗原または治療用ＧＯＩを発現させるために自己増幅ＲＮＡレプリコンに頼るワクチンアプローチは、ｅＩＦ２αのＰＫＲリン酸化に関連して、包括的な宿主タンパク質がシャットダウンされることにより、悪影響を受ける可能性がある。宿主タンパク質の翻訳が抑制されている細胞環境で機能するようにＲＮＡレプリコンを操作することにより、標準的ＲＮＡレプリコン系を上回る有意な利点がそれらの系に提供される。
【００９０】
したがって、アルファウイルスおよびアルテリウイルスに由来する系などの先天性免疫応答によって悪影響を受けるＲＮＡレプリコン系は、ＤＬＰモチーフを含むように操作された場合、それらのコードされたＧＯＩを発現することにおいてより有効であり得る。ＤＬＰモチーフにより、細胞ｍＲＮＡ翻訳が阻害される細胞環境において、効率的なｍＲＮＡ翻訳が行われる。ＤＬＰが、レプリコンベクターの非構造タンパク質遺伝子の翻訳と関連する場合、レプリカーゼおよび転写酵素タンパク質は、ＰＫＲ活性化細胞環境において機能的複製を開始することができる。ＤＬＰがサブゲノムｍＲＮＡの翻訳と関連している場合、細胞性ｍＲＮＡが先天性免疫活性化により制限されている場合でも、堅牢なＧＯＩの発現が可能である。したがって、非構造タンパク質遺伝子およびサブゲノムｍＲＮＡの両方の翻訳を促進するのを助けるためにＤＬＰ構造を含む操作レプリコンは、先天性免疫活性化を克服するためのさらに別の強力な方法を提供する。
【００９１】
本開示のいくつかの実施形態は、２つの異なるウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）およびウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）に由来するレプリコンベクターのウイルス非構造遺伝子の翻訳を支持するように操作されたＤＬＰ構造に関し、このようにして、先天性免疫応答の回避を系に伝える。以下により詳細に記載されるように、ＤＬＰ構造がレプリコンベクターに組み込まれることにより、それらをインターフェロン（ＩＦＮ）処理に対して耐性があるようにし、また、予想外にも、結果的に、ＧＯＩ発現能が全体的に増大した。ＤＬＰを操作して、ＲＮＡレプリコン系に組み入れることによって付与されるＩＦＮ耐性と優れたタンパク質発現能とを組み合わせることで、先天性免疫活性化が急性または慢性的に存在する個体または集団における使用に適したものにする。
【００９２】
開示の核酸分子
本開示のいくつかの態様は、１つ以上のＤＬＰモチーフ、１つ以上のＤＬＰモチーフのコード配列、またはそれらの組み合わせを含む、合成または組換え核酸分子などの核酸分子に関する。いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子は、ＤＬＰモチーフ（複数可）に作動可能に連結されている目的遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列および／またはＤＬＰモチーフのコード配列を含み得る。
【００９３】
一態様では、本明細書に開示される核酸分子は、（ｉ）ウイルスキャプシドエンハンサーまたはその多様体のうちの１つ以上の構造エレメントをコードしている第１の核酸配列と、（ｉｉ）第１の核酸配列に作動可能に連結されている第２の核酸配列と、を含み、第２の核酸配列は、目的遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスキャプシドエンハンサーの１つ以上の構造エレメントのうちの少なくとも１つは、１つ以上のＲＮＡステムループを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＲＮＡステムループのうちの少なくとも１つは、第１の核酸配列中に存在するＤＬＰモチーフによって構成されている。いくつかの実施形態では、ウイルスキャプシドエンハンサーの１つ以上の構造エレメントのうちの少なくとも１つは、いかなるＲＮＡステムループも含まない。
【００９４】
上記のように、ウイルスキャプシドエンハンサーは、作動可能に連結されている配列の発現（例えば、転写および／または翻訳）を増強する５’非コードおよび／または５’コード配列（好ましくは５’コード配列）内の配列を含む。本開示のいくつかの実施形態では、ウイルスキャプシドエンハンサーの１つ以上の構造エレメントは、ウイルスキャプシドエンハンサーの１つまたは２つのＲＮＡステムループを含む。いくつかの実施形態では、本開示のウイルスキャプシドエンハンサーは、２６Ｓサブゲノムプロモーターを含む配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のウイルスキャプシドエンハンサーは、ウイルス２６Ｓ  ＲＮＡの約ヌクレオチド２０〜２５０、約ヌクレオチド２０〜２００、約ヌクレオチド２０〜１５０、約ヌクレオチド２０〜１００、または約ヌクレオチド５０〜２５０、約ヌクレオチド１００〜２５０、約ヌクレオチド５０〜２００、約ヌクレオチド７５〜２５０、約ヌクレオチド７５〜２００、約ヌクレオチド７５〜１５０、約ヌクレオチド７７〜１３９、または約ヌクレオチド１００〜２５０、約ヌクレオチド１５０〜２５０、約ヌクレオチド１００〜１５０、約ヌクレオチド１００〜２００に５’コード配列を含み、これにより、ヘアピン構造を形成することができる。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、作動可能に連結されている異種配列の発現を増強するために重要であるウイルスキャプシドエンハンサーの１つ以上の構造エレメントをコードする。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、ウイルスキャプシドエンハンサーの１つ以上のＲＮＡステムループのコード配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、作動可能に連結されている異種配列の翻訳を増強するために重要であるウイルスキャプシドエンハンサーの１つ以上の構造エレメントをコードする。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、作動可能に連結されている異種配列の転写を増強するために重要であるウイルスキャプシドエンハンサーの１つ以上の構造エレメントをコードする。
【００９５】
いくつかの実施形態では、核酸分子の第１の核酸配列は、ウイルスキャプシドタンパク質の５’コード配列から少なくとも約５０、約７５、約１００、約１５０、約２００、約３００、またはそれ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、核酸分子の第１の核酸配列は、ウイルスキャプシドタンパク質の５’コード配列から約５０、約７５、約１００、約１５０、約２００、約３００、もしくはそれ以上、またはこれらの値のうちの任意の２つの間の範囲のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスキャプシドエンハンサーは、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、エバーグレーズウイルス（ＥＶＥＶ）、ムカンボウイルス（ＭＵＣＶ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ピクスナウイルス（ＰＩＸＶ）、ミドレブルクウイルス（ＭＩＤＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、オニョンニョンウイルス（ＯＮＮＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、バーマフォレストウイルス（ＢＦ）、ゲタウイルス（ＧＥＴ）、サギヤマウイルス（ＳＡＧＶ）、ベバルウイルス（ＢＥＢＶ）、マヤロウイルス（ＭＡＹＶ）、ウナウイルス（ＵＮＡＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）、アウラウイルス（ＡＵＲＡＶ）、ワタロアウイルス（ＷＨＡＶ）、ババンキウイルス（ＢＡＢＶ）、キジラガウイルス（ＫＹＺＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、ハイランドＪウイルス（ＨＪＶ）、フォートモーガンウィルス（ＦＭＶ）、Ｎｄｕｍｕ（ＮＤＵＶ）、およびＢｕｇｇｙ  Ｃｒｅｅｋウイルスからなる群から選択されるアルファウイルス種のキャプシド遺伝子由来のものである。いくつかの実施形態では、ウイルスキャプシドエンハンサーは、シンドビスウイルス種またはセムリキ森林ウイルス種のキャプシド遺伝子に由来する。いくつかの特定の実施形態では、ウイルスキャプシドエンハンサーは、シンドビスウイルス種のキャプシド遺伝子に由来する。さらに、当業者であれば、その増強活性を実質的に低下させることなく、ウイルスキャプシドタンパク質由来の５’コード配列に改変を加えてもよいことを理解するであろう。これに関するさらなる情報は、例えば、Ｆｒｏｌｏｖら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７０：１１８２、１９９４年；Ｆｒｏｌｏｖら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６８：８１１１、１９９４年に見出すことができる。いくつかの実施形態では、こうした変異にとっては、５’キャプシドコード配列によって形成されたＲＮＡヘアピン構造を実質的に保存することが有利であり得る。
【００９６】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示のウイルスキャプシドエンハンサーは、ヘアピン構造の上流にあるキャプシドタンパク質の５’コード配列のうちの１つ以上、またはすべてを含まない。いくつかの実施形態では、本明細書に開示のウイルスキャプシドエンハンサーは、ヘアピン構造の上流にあるウイルスキャプシドタンパク質の５’コード配列のすべてを含まない。いくつかの実施形態では、ウイルスキャプシドエンハンサー配列は、キャプシドタンパク質のすべてまたは一部分をコードし得る。したがって、本明細書に開示のいくつかの実施形態では、キャプシドエンハンサー領域が、ウイルスキャプシドタンパク質全体をコードすることはない。いくつかの実施形態では、ウイルスキャプシドエンハンサー配列は、ウイルスキャプシドタンパク質由来のアミノ末端断片をコードする。他の点では機能的なキャプシドタンパク質がキャプシドエンハンサー配列によってコードされている実施形態では、キャプシド自己プロテアーゼ活性を除去することが望ましい場合もある。キャプシドタンパク質の自己プロテアーゼ活性を低下させるまたは除去するキャプシド突然変異は、当技術分野において公知である（例えば、国際公開第１９９６／３７６１６号を参照されたい）。それに加えてまたはその代わりに、キャプシドタンパク質中のアミノ酸残基の１つ以上を改変して、キャプシドプロテアーゼ活性を低下させ得る。
【００９７】
上記のように、配列比較および構造的ＲＮＡ分析に関する以前の研究では、アルファウイルス属の多くのメンバーにおけるＤＬＰモチーフの進化的保存を明らかにした（例えば、Ｖｅｎｔｏｓｏ、２０１２年、上記を参照されたい）。したがって、いくつかのさらなる実施形態では、本開示のウイルスキャプシドエンハンサー配列は、例えば合成配列または異種配列などの他の任意の変異型配列であり得、ウイルスキャプシドエンハンサーについて予測されるＲＮＡステムループのうちの１つ以上と機能的または構造的に等価であるＲＮＡヘアピンを形成することができ、また、その下流に作動可能に連結されているＲＮＡ配列（例えば、目的遺伝子のためのコード配列）の翻訳を増強するように作用することができる。転写および／または翻訳エンハンサーとして作用できるＲＮＡステムループの非限定的な例としては、図１１Ａおよび図１１Ｂに示されるものが挙げられる。いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子としては、Ｔｏｒｉｂｉｏら（２０１６年、上記）に記載されている（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ；ＮＣ  ００１５４７．１）、アウラウイルス（ＡＵＲＡＶ；ＡＦ１２６２８４）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ；ＮＣ  ００４１６２）、オニョンニョンウイルス（ＯＮＮＶ；ＮＣ  ００１５１２）、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ（ＳＡ）；ＡＦ１５９５５９およびＥＥＥＶ（ＮＡ）；Ｕ０１５５８）、マヤロウイルス（ＭＡＹＶ；ＤＱ００１０６９）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ；ＮＣ  ００３２１５）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ；ＤＱ２２６９９３およびサギヤマウイルス（ＳＡＧＶ；ＡＢ０３２５５３）、ゲタウイルス（ＧＥＴＶ；ＮＣ  ００６５５８）、ミドレブルクウイルス（ＭＩＤＶ；ＥＦ５３６３２３）、ウナウイルス（ＵＮＡＶ；ＡＦ３３９４８）、またはベバルウイルス（ＢＥＢＶ；ＡＦ３３９４８０）、またはそれらの多様体由来のアルファウイルスキャプシドエンハンサーが挙げられる。
【００９８】
本開示のウイルスキャプシドエンハンサーのコード配列に対して、高い配列同一性（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性）を有する核酸分子は、本明細書に記載の配列を用いて（例えば、配列番号１）、またはそれらが当該技術分野において公知である他のいずれかのアルファウイルスキャプシドタンパク質、例えば、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ；ＮＣ  ００１５４７．１）、アウラウイルス（ＡＵＲＡＶ；ＡＦ１２６２８４）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ；ＮＣ  ００４１６２）、オニョンニョンウイルス（ＯＮＮＶ；ＮＣ  ００１５１２）、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ（ＳＡ）；ＡＦ１５９５５９およびＥＥＥＶ（ＮＡ）；Ｕ０１５５８）、マヤロウイルス（ＭＡＹＶ；ＤＱ００１０６９）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ；ＮＣ  ００３２１５）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ；ＤＱ２２６９９３およびサギヤマウイルス（ＳＡＧＶ；ＡＢ０３２５５３）、ゲタウイルス（ＧＥＴＶ；ＮＣ  ００６５５８）、ミドレブルクウイルス（ＭＩＤＶ；ＥＦ５３６３２３）、ウナウイルス（ＵＮＡＶ；ＡＦ３３９４８）、およびベバルウイルス（ＢＥＢＶ；ＡＦ３３９４８０）の配列を用いることによって、それぞれのアルファウイルスゲノムにおいて同定された配列からの縮重プライマーまたは遺伝子特異的プライマーを用いたゲノム配列分析、ハイブリダイゼーション、および／またはＰＣＲによって、同定および／または単離することができる。例えば、ウイルスキャプシドエンハンサーは、トガウイルス科に属するウイルス種、例えばアルファウイルス種またはルビウイルス種に由来するＤＬＰモチーフを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子は、アルファウイルスキャプシドタンパク質の５’ＣＤＳ部分に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を呈する核酸配列を有するウイルスキャプシドエンハンサーを含む。いくつかの実施形態では、アルファウイルスキャプシドタンパク質の５’ＣＤＳ部分は、アルファウイルスキャプシドタンパク質のコード配列の少なくとも最初の２５、５０、７５、８０、１００、１５０、または２００ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子は、配列番号１および４６〜５２のいずれか１つの核酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を呈する核酸配列を有するウイルスキャプシドエンハンサーを含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号１および４６〜５２のいずれか１つの核酸配列に対して、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、またはこれらの値のうちの任意の２つの間の範囲の配列同一性を呈する核酸配列を有するウイルスキャプシドエン��ンサーを含む。いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子は、本開示の配列番号１の核酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を呈する核酸配列を有するウイルスキャプシドエンハンサーを含む。いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子は、図１１Ａ〜１１Ｂ、および／またはＴｏｒｉｂｉｏら（２０１６年、上記）による刊行物中の図１Ａ（これらは、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる）に記載の配列のいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を呈する核酸配列を有するウイルスキャプシドエンハンサーを含む。
【００９９】
したがって、いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子は、本明細書に開示の配列番号４６〜５２のいずれか１つの核酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を呈する核酸配列を有するウイルスキャプシドエンハンサーを含む。いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子は、本開示の配列番号４６に記載の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を呈する核酸配列を有するウイルスキャプシドエンハンサーを含む。いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子は、本開示の配列番号４７に記載の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を呈する核酸配列を有するウイルスキャプシドエンハンサーを含む。いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子は、本開示の配列番号４８に記載の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を呈する核酸配列を有するウイルスキャプシドエンハンサーを含む。いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子は、本開示の配列番号４９に記載の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を呈する核酸配列を有するウイルスキャプシドエンハンサーを含む。いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子は、本開示の配列番号５０に記載の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を呈する核酸配列を有するウイルスキャプシドエンハンサーを含む。いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子は、本開示の配列番号５１に記載の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を呈する核酸配列を有するウイルスキャプシドエンハンサーを含む。いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子は、本開示の配列番号５２に記載の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を呈する核酸配列を有するウイルスキャプシドエンハンサーを含む。
【０１００】
本開示のいくつかの実施形態による核酸分子では、１つ以上のＲＮＡステムループは、第２の核酸配列のＧＯＩのコード配列の上流に作動可能に位置付けられている。いくつかの実施形態では、１つ以上のＲＮＡステムループは、ＧＯＩのコード配列の上流の約１〜約５０ヌクレオチド、約１０〜約７５ヌクレオチド、約３０〜約１００ヌクレオチド、約４０〜約１５０ヌクレオチド、約５０〜約２００ヌクレオチド、約６０〜約２５０ヌクレオチド、約１００〜約３００ヌクレオチド、または約１５０〜約５００ヌクレオチドに作動可能に位置付けられている。いくつかの実施形態では、１つ以上のＲＮＡステムループは、ＧＯＩのコード配列の上流において、約１、約２、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、またはこれらの値のうちの任意の２つの間の範囲のヌクレオチドに作動可能に位置付けられている。いくつかの実施形態では、１つ以上のＲＮＡステムループは、ＧＯＩのコード配列のすぐ上流に作動可能に位置付けられている。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、第１の核酸配列の上流に作動可能に位置付けられた５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、５’−ＵＴＲ配列は、第１の核酸配列の上流の約１〜約５０、約１０〜約７５、約３０〜約１００、約４０〜約１５０、約５０〜約２００、約６０〜約２５０、約１００〜約３００、または約１５０〜約５００ヌクレオチドに作動可能に位置付けられている。いくつかの実施形態では、５’−ＵＴＲ配列は、第１の核酸配列の上流の約１、約２、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、または１００ヌクレオチドに位置付けられている。いくつかの実施形態では、５’−ＵＴＲ配列は、第１の核酸配列のすぐ上流に作動可能に位置付けられている。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ配列は、プロモーターの下流に作動可能に位置付けられている。いくつかの実施形態では、５’−ＵＴＲ配列は、プロモータ−配列の下流の約１〜約５０、約１０〜約７５、約３０〜約１００、約４０〜約１５０、約５０〜約２００、約６０〜約２５０、約１００〜約３００、または約１５０〜約５００ヌクレオチドに作動可能に位置付けられている。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ配列は、プロモーター配列の下流の約１、約２、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、または１００ヌクレオチドに作動可能に位置付けられている。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ配列は、プロモーター配列のすぐ下流に作動可能に位置付けられている。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ配列は、プロモーターの下流および第１の核酸配列の上流に作動可能に位置付けられている。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、第２の核酸配列の下流に作動可能に位置付けられた３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）配列を含む。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲ配列は、第２の配列核酸配列の下流の約１〜約５０ヌクレオチド、約１０〜約７５ヌクレオチド、約３０〜約１００ヌクレオチド、約４０〜約１５０ヌクレオチド、約５０〜約２００ヌクレオチド、約６０〜約２５０ヌクレオチド、約１００〜約３００ヌクレオチド、または約１５０〜約５００ヌクレオチドに作動可能に位置付けられている。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲ配列は、第２の核酸配列の下流の約１、約２、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、またはこれらの値のうちの任意の２つの間の範囲のヌクレオチドに作動可能に位置付けられている。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲ配列は、第２の核酸配列のすぐ下流に作動可能に位置付けられている。
【０１０４】
本明細書に開示のいくつかの実施形態では、ＧＯＩのコード配列は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはｍＲＮＡの一部に転写される。本明細書で使用される場合、用語「ｍＲＮＡ」または「メッセンジャーＲＮＡ」とは、転写中に合成され、二本鎖ＤＮＡの鎖の一方に相補的であり、かつタンパク質の合成のために、ＤＮＡに含まれる遺伝情報をリボソームに伝達する役割を担う一本鎖ＲＮＡ分子を指す。ｍＲＮＡは、スプライスされても、部分的にスプライスされても、またはスプライスされなくてもよく、真核生物または原核生物のｍＲＮＡであり得る。上記のように、本開示のいくつかの実施形態によるｍＲＮＡ分子は、ｄｅ  ｎｏｖｏ合成によって産生できる。本明細書に開示のいくつかの実施形態では、ＧＯＩのコード配列は、ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助食品用ポリペプチド、工業用酵素、レポーターポリペプチド、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体、抗原、免疫調節剤、サイトカイン、酵素、またはそれらの任意の組み合わせである。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子は、自己プロテアーゼペプチド（例えば、自己触媒性自己切断ペプチド）のコード配列をさらに含む。自己プロテアーゼのコード配列は、任意により、第２の核酸配列の上流に作動可能に連結されている。一般に、当技術分野において公知の任意のタンパク質分解性切断部位は、本開示の核酸分子に組み込まれ得、また、例えば、プロテアーゼによる産生後に切断されるタンパク質分解性切断配列であり得る。さらなる好適なタンパク質分解性切断部位には、外部プロテアーゼの添加後に切断可能なタンパク質分解性切断配列も含まれる。本明細書で使用される場合、用語「自己プロテアーゼ」とは、自己タンパク質分解活性を有し、かつより大きなポリペプチド部分からそれ自体を切断することができる「自己切断」ペプチドを指す。ピコルナウイルス群のメンバーである口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）において最初に同定された、いくつかの自己プロテアーゼ（例えば、ウマ鼻炎Ａウイルス（Ｅ２Ａ）、ブタテッショウウイルス−１（Ｐ２Ａ）、およびＴｈｅｓａ  ａｓｉｇｎａウイルス（Ｔ２Ａ）由来「２Ａ様」ペプチド、など）がその後同定され、タンパク質分解性切断におけるそれらの活性は、様々なｅｘ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ真核生物系において示されている。このように、自己プロテアーゼの概念は、当業者が利用可能であり、多くの天然に存在する自己プロテアーゼ系が同定されている。十分に研究されている自己プロテアーゼ系は、例えば、ウイルスプロテアーゼ、発生タンパク質（例えば、ＨｅｔＲ、Ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質）、ＲｕｍＡ自己プロテアーゼドメイン、ＵｍｕＤなど）である。本開示の組成物および方法に好適である自己プロテアーゼペプチドの非限定的な例としては、ブタテッショウウイルス−１  ２Ａ（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、細胞質多角体病ウイルス２Ａ（ＢｍＣＰＶ２Ａ）、軟化病ウイルス２Ａ（ＢｍＩＦＶ２Ａ）、またはそれらの組み合わせ由来のペプチド配列が挙げられる。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、自己プロテアーゼペプチドのコード配列は、第１の核酸配列の下流および第２の核酸配列の上流に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、自己プロテアーゼペプチドは、ブタテッショウウイルス−１  ２Ａ（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、細胞質多角体病ウイルス２Ａ（ＢｍＣＰＶ２Ａ）、軟化病ウイルス２Ａ（ＢｍＩＦＶ２Ａ）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチド配列を含むか、またはこれらからなる。いくつかの実施形態では、自己プロテアーゼペプチドは、ブタテッショウウイルス−１  ２Ａ（Ｐ２Ａ）のペプチド配列を含む。
【０１０７】
当業者は、キャプシドエンハンサー配列の非存在下で見られるレベルと比較して、キャプシドエンハンサー配列が異種核酸配列（複数可）の発現を増大する限り（例えば、ＧＯＩのコード配列）、ウイルスキャプシドエンハンサー配列、自己プロテアーゼペプチドをコードしている配列、および目的遺伝子をコードしている配列の異なる構成が使用され得ることを理解するであろう。これらの配列は、典型的には、目的遺伝子によってコードされているポリペプチドが、自己プロテアーゼによる切断後にプロテアーゼおよび任意のキャプシドタンパク質配列から放出され得るように構成される。
【０１０８】
本明細書に記載の自己プロテアーゼペプチド（Ｐ２Ａ、Ｆ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｔ２Ａ、ＢｍＣＰＶ２Ａ、およびＢｍＩＦＶ２Ａなど）と本明細書に記載の１つ以上のウイルスキャプシドエンハンサー配列との例示的な組み合わせの非限定的なリストを表１および２に提供する。表１には、各ウイルスキャプシドエンハンサーの短縮名（例えば、「ＣＥ０１」）および各自己プロテアーゼペプチドの短縮名（例えば、「ＡＰ０１」）を提供する。表２中のそれぞれ番号の付いた「Ｘ」ペプチドは、表１に提供されている対応する自己プロテアーゼペプチドを有する。同様に、表２中のそれぞれ番号の付いた「Ｙ」エンハンサーは、表１に提供される対応するウイルスキャプシドエンハンサーを有する。したがって、表２の各「Ｘ：Ｙ」の記載は、本開示の分子、組成物、および方法において使用可能なウイルスキャプシドエンハンサーと自己プロテアーゼペプチドとの組み合わせの例を提供する。例えば、表２において「ＡＰ０１：ＣＥ１６」として示される組み合わせは、シンドビスウイルス由来のウイルスキャプシドエンハンサー（ＳＩＮＶ）とブタテッショウウイルス−１  ２Ａ由来の自己プロテアーゼペプチド（Ｐ２Ａ）との組み合わせを提供する。
【表１】
2020500536.tif 000003
【表２】
2020500536.tif 000004
【０１０９】
一態様では、本明細書に開示されるのは、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている核酸配列を含む新規核酸分子であり、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンは、ウイルスキャプシドエンハンサー（例えば、ＤＬＰモチーフ）またはその多様体の１つ以上の構造エレメントをコードしている第１の核酸配列であって、ウイルスキャプシドエンハンサーが、ウイルスＲＮＡレプリコンに対して異種である第１の核酸配列と、少なくとも１つの非構造ウイルスタンパク質またはその一部分をコードしている第２の核酸配列とを含み、第１の核酸配列は、第２の核酸配列の上流に作動可能に連結されている。
【０１１０】
本明細書で同義的に使用される「レプリコンＲＮＡ」および「ＲＮＡレプリコン」という用語は、許容細胞内でそれ自体の増幅または自己複製を指示するために必要な遺伝情報のすべてを含むＲＮＡを指す。それ自体の複製を指示するために、ＲＮＡ分子は、１）ポリメラーゼ、レプリカーゼ、またはウイルスもしくは宿主細胞由来のタンパク質、核酸またはリボ核タンパク質と相互作用して、ＲＮＡ増幅プロセスを触媒し得る他のタンパク質をコードする、および２）サブゲノムレプリコンコードＲＮＡの複製および転写に必要なシス作用性ＲＮＡ配列を含む。これらの配列は、複製の過程の間に、その自己コード化タンパク質、または非自己コード化細胞由来タンパク質、核酸もしくはリボ核タンパク質、またはこれらの構成成分のいずれかの間の複合体に結合し得る。本開示のいくつかの実施形態では、改変型ウイルスレプリコンＲＮＡ分子は、典型的には、複製のためにシスに必要な５’ウイルスまたは欠失干渉ＲＮＡ配列（複数可）、生物学的に活性な非構造タンパク質をコードしている配列、サブゲノムＲＮＡのプロモーター、複製のためにシス内で必要な３’ウイルス配列、およびポリアデニル酸トラクトの規則正しいエレメントを含む。さらに、レプリコンＲＮＡという用語は一般に、正の極性、または「メッセージ」センスの分子を指し、レプリコンＲＮＡは、任意の公知の天然に存在するＲＮＡウイルスのものとは長さが異なり得る。本開示のいくつかの実施形態では、レプリコンＲＮＡは、構造ウイルスタンパク質のうちの少なくとも１つのコード配列を含まない。これらの例では、構造遺伝子をコードしている配列は、例えば、目的遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列などの１つ以上の異種配列で置換することができる。レプリコンＲＮＡが、組換えアルファウイルス粒子中にパッケージングされるこれらの例において、これは、粒子の形成をもたらすアルファウイルス構造タンパク質との相互作用を開始するのに役立つ１つの以上の配列、いわゆるパッケージングシグナルを含む必要がある。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、「サブゲノムＲＮＡ」とは、それが由来するゲノムＲＮＡよりも短い長さまたは小さいサイズのＲＮＡ分子を指す。ウイルスサブゲノムＲＮＡは、その配列がゲノムＲＮＡまたはその相補鎖内に存在する内部プロモーターから転写されればよい。サブゲノムＲＮＡの転写は、宿主細胞にコードされたタンパク質、リボ核タンパク質（複数可）、またはそれらの組み合わせに関連したウイルスにコードされたポリメラーゼ（複数可）によって媒介されてもよい。本開示のいくつかの実施形態では、サブゲノムＲＮＡは、本明細書中に開示される改変型レプリコンＲＮＡから生成され、１つ以上の目的遺伝子（ＧＯＩ）をコードするかまたは発現させる。天然のサブゲノムプロモーターの代わりに、サブゲノムＲＮＡは、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、ポリオウイルス、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤ）、エンテロウイルス７１、またはＣ型肝炎ウイルスに由来する内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の制御下に置くことができる。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンの第２の核酸配列は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つの非構造ウイルスタンパク質のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンの第２の核酸配列は、少なくとも１つの非構造ウイルスタンパク質の一部分のコード配列を含む。例えば、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンの第２の核酸配列は、少なくとも１つの非構造ウイルスタンパク質のコード配列の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％、またはこれらの値のうちの任意の２つの間の範囲を含み得る。いくつかの実施形態では、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンの第２の核酸配列は、少なくとも１つの非構造ウイルスタンパク質の実質的な一部分のコード配列を含むことができる。本明細書で使用されるとき、非構造ウイルスタンパク質をコードしている核酸配列の「実質的な一部分」は、非構造ウイルスタンパク質をコードしている核酸配列を十分に含み、当業者による配列の手動評価によるか、または、ＢＬＡＳＴなどのアルゴリズムを使用するコンピューター自動化配列比較および同定（例えば、「Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ」；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、１９９３年）による、そのタンパク質の推定上の同定を可能にする。いくつかの実施形態では、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンの第２の核酸配列は、少なくとも１つの非構造タンパク質の全コード配列を含み得る。いくつかの実施形態では、第２の核酸配列は、天然のウイルス非構造タンパク質のコード配列を実質的にすべて含む。
【０１１３】
これらの新しい核酸分子が構築され、特徴を明らかにした分子技術および方法は、本出願の明細書の実施例にさらに十分に記載されている。非限定的な例として、実施例の項において、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）およびウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）が、本明細書に開示の組成物および方法を説明するために使用されている。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の核酸分子は、組換え核酸分子である。本明細書で使用される場合、用語「組換え」は、ヒトによりポリヌクレオチドを操作することによって、間接的であるか、または間接的に生じる任意の分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）を意味する。非限定的な例として、ｃＤＮＡは、ｅｘ  ｖｉｔｒｏポリメラーゼ反応（複数可）によって生成された、またはリンカーが付着した、またはクローニングベクターもしくは発現ベクターなどのベクターに組み込まれた任意の核酸分子と同様に、組換えＤＮＡ分子である。非限定的な例として、組換え核酸分子は：１）例えば、化学的または酵素的技術を用いて（例えば化学的核酸合成の使用により、または核酸分子の複製、重合、エキソヌクレアーゼ消化、エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、逆転写、転写、塩基修飾（例えば、メチル化など）、または組換え（相同および部位特異的組換えなど）のための酵素の使用により）、ｅｘ  ｖｉｔｒｏで合成または改変されている、２）本質的に結合していない結合ヌクレオチド配列を含む、３）天然に存在する核酸配列について、１つ以上のヌクレオチドを欠失しているように分子クローニング技術を用いて操作されている、かつ／または４）天然に存在する核酸配列について、１つ以上の配列変化または再配列を有するように、分子クローニング技術を用いて操作されている。
【０１１５】
天然に存在する核酸配列の多様体を含む核酸分子は、当業者に公知であるいくつかの方法を用いて産生できる。古典的突然変異誘発技術および組換えＤＮＡ技術、例えば、これらに限定されないが、部位特異的変異誘発、突然変異を誘発するための核酸分子の化学的処理、核酸断片の制限酵素切断、核酸断片のライゲーション、核酸配列の選択された領域のＰＣＲ増幅および／または突然変異誘発、組換えクローニング、および化学合成（オリゴヌクレオチド混合物の化学合成、および核酸分子の混合物を「構築する」ための混合物群のライゲーションなど）、およびこれらの組み合わせなど種々の技術を用いて、それが由来する天然に存在する配列に関して核酸分子の配列を改変することができる。核酸分子相同体は、その核酸分子によってコードされているタンパク質またはレプリコンの機能についてスクリーニングすることによって、および／または野生型遺伝子もしくはその断片とのハイブリダイゼーションによって、または標的または野生型核酸分子もしくは配列に対して相同性を有するプライマーを使用するＰＣＲによって、改変核酸分子の混合物から選択され得る。
【０１１６】
本明細書に開示の様々な実施形態において、本明細書に開示の核酸分子は、以下の特徴のうちの１つ以上を含み得る。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンは、トガウイルス科のアルファウイルス属にまたはアルテリウイルス科のアルテリウイルス属に属するウイルス種に由来する改変型ＲＮＡレプリコンを含む。好適な動脈ウイルス種としては、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、ブタ呼吸器生殖器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、乳酸脱水素酵素上昇ウイルス（ＬＤＶ）、サル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）、およびｗｏｂｂｌｙ  ｐｏｓｓｕｍ  ｄｉｓｅａｓｅウイルス（ＷＰＤＶ）が挙げられる。病原性および非病原性アルテリウイルス株は、両方とも好適である。好ましいアルテリウイルス株の非限定的な例としては、これらに限定されないが、ＥＡＶ病原性Ｂｕｃｙｒｕｓ株（ＶＢＳ）、ＬＤＶ−Ｐｌａｇｅｍａｎｎ、ＬＤＶ−Ｃ、ＰＲＲＳＶ−１型、およびＰＲＲＳＶ−２型が挙げられる。例示的な好ましいＥＡＶ株としては、これらに限定されないが、ＥＡＶ  ＶＢ５３、ＥＡＶ  ＡＴＣＣ  ＶＲ−７９６、ＥＡＶ  ＨＫ２５、ＥＡＶ  ＨＫ１１６、ＥＡＶ  ＡＲＶＡＣ  ＭＬＶ、ＥＡＶ  Ｂｕｃｙｒｕｓ株（Ｏｈｉｏ）、改変型ＥＡＶ  Ｂｕｃｙｒｕｓ、非病原性株ＣＡ９５、Ｒｅｄ  Ｍｉｌｅ（Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）、８４ＫＹ−Ａ１（Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）、ヴロツワフ−２（Ｐｏｌａｎｄ）、ビブナ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、およびウィーン（Ａｕｓｔｒａｌｉａ）が挙げられる。ＰＲＲＳＶ株の非限定的な好ましい例としては、ＰＲＲＳＶ  ＬＶ４．２．１、ＰＲＲＳＶ  １６２４４Ｂ、ＰＲＲＳＶ  ＨＢ−１（ｓｈ）／２００２、ＰＲＲＳＶ  ＨＢ−２（ｓｈ）／２００２、ＰＲＲＳＶ  ＨＮ１、ＰＲＲＳＶ  ＳＤ０１−０８、ＰＲＲＳＶ  ＳＤ０８０２、ＰＲＲＳＶ  ＳＤ０８０３、ＰＲＲＳＶ、およびＶＲ２３３２が挙げられる。ＳＨＦＶ株および多様体の非限定的な好ましい例としては、ＳＨＦＶ多様体ＳＨＦＶ−ｋｒｔｇ１ａおよび−ｋｒｔｇ１ｂ（ＳＨＦＶ−ｋｒｔｇ１ａ／ｂ）、ＳＨＦＶｋｒｔｇ２ａ／ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＸ４７３８４７〜ＪＸ４７３８５０）、ＳＨＦＶ−ＬＶＲ、ＳＨＦＶプロトタイプ多様体ＬＶＲ−４２―０／Ｍ６９４１（ＮＣ＿００３０９２）、ＳＨＦＶ−ｋｒｃ１およびＳＨＦＶｋｒｃ２（それぞれＨＱ８４５７３７およびＨＱ８４５７３８）（Ｋｉｂａｌｅ  ｒｅｄ  ｃｏｌｏｂｕｓ）が挙げられる。好ましいアルテリウイルスの他の非限定的な例としては、ＰＲＲＳＶ−Ｌｅｌｙｓｔａｄ、ヨーロッパ（１型）型株（Ｍ９６２６２）；ＰＲＲＳＶＶＲ２３３２、北米（２型）型株（Ｕ８７３９２）、ＥＡＶ−Ｂｕｃｙｒｕｓ（ＮＣ＿００２５３２）、ＥＡＶ−ｓ３６８５（ＧＱ９０３７９４）、ＬＤＶ−Ｐ、Ｐｌａｇｅｍａｎｎ株（Ｕ１５１４６）、およびＬＤＶ−Ｃ、神経毒性Ｃ型株（Ｌ１３２９８）が挙げられる。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、改変型アルテリウイルスＲＮＡレプリコンのｐｐ１ａｂ非構造タンパク質の一部分または全体をコードしている核酸配列の上流に位置付けられている。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンの５’末端の下流の約１〜１０００ヌクレオチドの領域内に作動可能に位置付けられている。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンの５’末端の下流に、約１〜２５、約１〜４０、約１０〜２５、１０〜５０、約１０〜１００、約２０〜５０、約２０〜７５、約２５〜１００、約２５〜１００ヌクレオチドの領域内に作動可能に位置付けられている。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンの５’末端の下流の約１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、またはそれ以上、またはこれらの値のうちの任意の２つの間の範囲のヌクレオチドの領域に作動可能に位置付けられている。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンの５’末端の下流の約１〜１００、約１〜５００、約２５〜８００、約５０〜９００、約５０〜３００、約２５〜２００、約２５〜１００、約５０〜４００、約１００〜５００、約１００〜３００、約１００〜２００、約２００〜５００、約２００〜６００、約２００〜４００、約１５０〜７００、約１５０〜４００、または約５００〜１０００ヌクレオチドの領域に作動可能に位置付けられている。
【０１１９】
特定の理論に束縛されるものではないが、ウイルスＤＬＰモチーフの翻訳増強活性は、いくつかの実施形態では、ウイルスＤＬＰモチーフと開始ＡＵＧｉコドンとの距離に依存し得ると考えられる（Ｔｏｒｉｂｉｏら、２０１６年、上記）。したがって、いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンの開始コドンＡＵＧｉの下流の約１０〜１００ヌクレオチドの領域に作動可能に位置付けられている。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンの開始コドンＡＵＧｉの下流の約１０〜７５、約１０〜５０、約１０〜２５、１５〜７５、約１５〜５０、約１５〜２５、約２５〜７５、約２５〜５０、約２５〜１００ヌクレオチドの領域内に作動可能に位置付けられている。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンの開始コドンＡＵＧｉの下流の約２５、２８、３１、３４、３７、３７、４０、４３、４６、４９、５０、またはこれらの値のうちの任意の２つの間の範囲のヌクレオチドの領域に作動可能に位置付けられている。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている配列は、１つ以上の発現カセットをさらに含み、発現カセットの各々は、目的遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列に作動可能に連結されているプロモーターを含む。本明細書で使用するとき、用語「発現カセット」は、コード配列、ならびにレシピエント細胞、ｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｅｘ  ｖｉｖｏにおけるコード配列の適切な転写および／または翻訳を指示するのに十分な規制情報を含む遺伝物質の構築物を指す。発現カセットは、所望の宿主細胞を標的とするためのベクターおよび／または対象へ挿入され得る。さらに、発現カセットという用語は、「発現構築物」という用語と同義的に使用され得る。本明細書で使用される用語「発現カセット」は、プロモーターなどの発現制御エレメントに作動可能に連結されているタンパク質または機能的ＲＮＡ、および任意により遺伝子の転写または翻訳に影響を及ぼす任意の他の核酸配列、または他の核酸配列の組み合わせをコードする核酸構築物を指す。
【０１２１】
本明細書で使用される用語「作動可能に連結されている」は、２つ以上の配列間の機能的連結を意味する。例えば、目的のポリヌクレオチドと調節配列（例えば、プロモーター）との間の作動可能な連結は、目的のポリヌクレオチドの発現を可能にする機能的連結である。この意味で、用語「作動可能に連結されている」は、調節領域が目的のコード配列の転写または翻訳を調節するのに有効であるように調節領域および転写されるコード配列が位置付けられていることを指す。本明細書に開示のいくつかの実施形態では、「作動可能に連結されている」という用語は、制御配列が、ポリペプチドをコードしているｍＲＮＡ、ポリペプチド、および／または機能的ＲＮＡの発現または細胞局在化を指示するかまたは調節するように、ポリペプチドまたは機能的ＲＮＡをコードしている配列に対して適切な位置に調節配列が位置付けられている構成を指す。したがって、プロモーターが核酸配列の転写を媒介できる場合、プロモーターは、核酸配列と作動可能に連結されている。作動可能に連結されているエレメントは、連続的または非連続的であり得る。
【０１２２】
ＤＮＡの２つ以上の配列を一緒に作動可能に連結するための基本的な技術は、当業者には周知であり、こうした方法は、標準的な分子生物学的操作に関する多くの書籍に記載されている（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第２版  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．；およびＧｉｂｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６：３４３−４５、２００９年を参照されたい）。
【０１２３】
本明細書に開示のいくつかの実施形態では、本明細書に開示の核酸分子は、２つ以上の発現カセットを含み得る。原則として、本明細書に開示の核酸分子は一般に、任意の数の発現カセットを含み得る。いくつかの特定の実施形態では、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンは、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の発現カセットのうちの少なくとも１つは、改変型アルテリウイルスＲＮＡレプリコンの転写調節配列（ＴＲＳ）の下流に作動可能に位置付けられ、ＴＲＳは、ＴＲＳ１、ＴＲＳ２、ＴＲＳ３、ＴＲＳ４、ＴＲＳ５、ＴＲＳ６、ＴＲＳ７、またはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの特定の実施形態では、１つ以上の発現カセットのうちの少なくとも１つは、改変型アルテリウイルスＲＮＡレプリコンのＴＲＳ７の下流に作動可能に位置付けられている。
【０１２４】
本明細書において提供される核酸分子は、例えば、目的遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列などの異種核酸配列に作動可能に連結されている場合に、例えば、発現ベクターまたは転写ベクターとしての使用を見出すことができ、かつＧＯＩの表現に影響を与え得る。いくつかの実施形態では、ＧＯＩのコード配列は、参照コード配列の発現レベルより高いレベルでの発現に最適化されている。いくつかの実施形態では、参照コード配列は、コドン最適化されていない。いくつかの実施形態では、ＧＯＩコード配列は、コドン最適化を含む。核酸配列のコドン最適化に関して、遺伝暗号を縮重することで、遺伝子から産生されるポリペプチドのアミノ酸配列の変動を引き起こすことなく、ある遺伝子のタンパク質コード配列の少なくとも１つの塩基を異なる塩基で置換する可能性がもたらされる。このため、本開示の核酸分子はまた、遺伝暗号の縮重に従って１つ以上のヌクレオチド置換を有し得る。コドン使用法を記載している参考文献は、容易に公的に利用可能である。本開示のいくつかのさらなる実施形態において、ポリヌクレオチド配列の多様体は、様々な理由で、例えば、特定の宿主のコドン発現を最適化する（例えば、アルテリウイルスｍＲＮＡ中のコドンをヒト、ハムスター、マウス、またはサルなどの他の生物によって好ましいものに変化させる）ために産生することができる。
【０１２５】
本明細書に開示のいくつかの実施形態では、ＧＯＩの配列は、ポリペプチドをコードする。ポリペプチドの種類は、特定の用途に応じて変わり得る。例えば、ポリペプチドは、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助食品用ポリペプチド、工業用酵素、レポーターポリペプチド、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、抗体、抗原、免疫調節剤、サイトカイン、酵素、またはそれらの組み合わせである。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の核酸分子は、第２のウイルスキャプシドエンハンサー（例えば、ＤＬＰモチーフ）の１つ以上の構造エレメントをコードしている第３の核酸配列をさらに含むことができ、第３の核酸配列は、ＧＯＩのコード配列の上流に作動可能に連結されている。第２のＤＬＰモチーフは、非構造タンパク質のコード配列の上流に位置付けられている第１のＤＬＰモチーフと同一であっても異なっていてもよい。したがって、いくつかの実施形態では、第２のＤＬＰモチーフは、非構造タンパク質のコード配列の上流に位置付けられている第１のＤＬＰモチーフと同一である。いくつかの実施形態では、第２のＤＬＰモチーフは、非構造タンパク質のコード配列の上流に位置付けられている第１のＤＬＰモチーフとは異なる。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている配列は、第３の核酸配列の下流およびＧＯＩのコード配列の上流に作動可能に連結されているタンパク質分解性切断部位のコード配列をさらに含む。一般に、当技術分野において公知の任意のタンパク質分解性切断部位は、本開示の核酸分子に組み込まれ得、また、例えば、プロテアーゼにより、産生後に切断されるタンパク質分解性切断配列であり得る。さらなる好適なタンパク質分解性切断部位には、外部プロテアーゼの添加後に切断可能なタンパク質分解性切断配列も含まれる。いくつかの実施形態では、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている配列は、第３の核酸配列の下流およびＧＯＩのコード配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、自己プロテアーゼペプチドとしては、ブタテッショウウイルス−１  ２Ａ（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、細胞質多角体病ウイルス２Ａ（ＢｍＣＰＶ２Ａ）、軟化病ウイルス２Ａ（ＢｍＩＦＶ２Ａ）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるペプチド配列が挙げられる。いくつかの実施形態では、自己プロテアーゼペプチドは、ブタテッショウウイルス−１  ２Ａ（Ｐ２Ａ）由来のペプチド配列を含む。
【０１２８】
当業者は、ウイルスキャプシドエンハンサー配列、非構造タンパク質のコード配列、自己プロテアーゼペプチドをコードしている配列、および目的遺伝子をコードしている配列の異なる構成は、キャプシドエンハンサー配列が、キャプシドエンハンサー配列の非存在下で見られるレベルと比較して、異種核酸配列（複数可）の発現を増大する限り使用できることを理解するであろう。これらの配列は、典型的には、目的遺伝子によってコードされているポリペプチドが、自己プロテアーゼによる切断後にプロテアーゼおよび任意のキャプシドタンパク質配列から放出され得るように構成される。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の核酸分子の配列は、アルファウイルスウイルス種の改変型ＲＮＡレプリコンを含む。いくつかの実施形態では、改変型アルファウイルスＲＮＡレプリコンは、ＶＥＥＶ／ＥＥＥＶ群、またはＳＦ群、またはＳＩＮ群に属するアルファウイルスのものである。ＳＦ群アルファウイルスの非限定的な例としては、セムリキ森林ウイルス、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、ミドレブルクウイルス、チクングニアウイルス、バーマフォレストウイルス、ゲタウイルス、マヤロウイルス、サギヤマウイルス、ベバルウイルス、およびウナウイルスが挙げられる。ＳＩＮ群アルファウイルスの非限定的な例としては、シンドビスウイルス、Ｇｉｒｄｗｏｏｄ  ＳＡウイルス、南アフリカアルボウイルスＮｏ．８６、オッケルボウイルス、アウラウイルス、ババンキウイルス、ワタロアウイルス、およびキジラガチウイル（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ  ｖｉｒｕｓ）が挙げられる。ＶＥＥＶ／ＥＥＥＶ群アルファウイルスの非限定的な例としては、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、エバーグレーズウイルス（ＥＶＥＶ）、ムカンボウイルス（ＭＵＣＶ）、ピクスナウイルス（ＰＩＸＶ）、ミドレブルクウイルス（ＭＩＤＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、オニョンニョンウイルス（ＯＮＮＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、バーマフォレストウイルス（ＢＦ）、ゲタウイルス（ＧＥＴ）、サギヤマウイルス（ＳＡＧＶ）、ベバルウイルス（ＢＥＢＶ）、マヤロウイルス（ＭＡＹＶ）、およびウナウイルス（ＵＮＡＶ）が挙げられる。
【０１３０】
アルファウイルス種の非限定的例としては、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、エバーグレーズウイルス（ＥＶＥＶ）、ムカンボウイルス（ＭＵＣＶ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ピクスナウイルス（ＰＩＸＶ）、ミドレブルクウイルス（ＭＩＤＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、オニョンニョンウイルス（ＯＮＮＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、バーマフォレストウイルス（ＢＦ）、ゲタウイルス（ＧＥＴ）、サギヤマウイルス（ＳＡＧＶ）、ベバルウイルス（ＢＥＢＶ）、マヤロウイルス（ＭＡＹＶ）、ウナウイルス（ＵＮＡＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）、アウラウイルス（ＡＵＲＡＶ）、ワタロアウイルス（ＷＨＡＶ）、ババンキウイルス（ＢＡＢＶ）、キジラガウイルス（ＫＹＺＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、ハイランドＪウイルス（ＨＪＶ）、フォートモーガンウィルス（ＦＭＶ）、Ｎｄｕｍｕ（ＮＤＵＶ）、およびＢｕｇｇｙ  Ｃｒｅｅｋウイルスが挙げられる。病原性および非病原性アルファウイルス株は、両方とも好適である。いくつかの実施形態では、改変型アルファウイルスＲＮＡレプリコンは、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、または東部ウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）のものである。いくつかの実施形態では、改変型アルファウイルスＲＮＡレプリコンは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）のものである。
【０１３１】
本明細書に開示の核酸分子がアルファウイルスウイルス種の改変型ＲＮＡレプリコンを含むいくつかの例では、第１の核酸配列は、改変型アルファウイルスＲＮＡレプリコンの１つ以上の非構造タンパク質ｎｓｐ１〜４またはその一部分をコードしている核酸配列の上流に位置付けられる。したがって、いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、改変型アルファウイルスＲＮＡレプリコンの非構造タンパク質ｎｓｐ１、ｎｓｐ１−２、ｎｓｐ１−３、ｎｓｐ１−４、ｎｓｐ２−４、ｎｓｐ３−４、ｎｓｐ２−３、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３、ｎｓｐ４、またはそれらの一部分をコードしている核酸配列の上流に位置付けられる。いくつかの実施形態では、改変型アルファウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている配列は、１つ以上の発現カセットをさらに含み、発現カセットの各々は、目的遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列に作動可能に連結されているプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、改変型アルファウイルスＲＮＡレプリコンは、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の発現カセットのうちの少なくとも１つは、改変型アルファウイルスＲＮＡレプリコンの１つ以上の非構造タンパク質ｎｓｐ１〜４またはその一部分をコードしている核酸配列の下流に作動可能に連結されている。したがって、いくつかの実施形態では、１つ以上の発現カセットのうちの少なくとも１つは、改変型アルファウイルスＲＮＡレプリコンの非構造タンパク質ｎｓｐ１、ｎｓｐ１−２、ｎｓｐ１−３、ｎｓｐ１−４、ｎｓｐ２−４、ｎｓｐ３−４、ｎｓｐ２−３、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３、ｎｓｐ４、またはそれらの一部分をコードしている核酸配列の下流に作動可能に連結されている。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、１つ以上の発現カセットのうちの少なくとも１つは、第２のウイルスキャプシドエンハンサーの１つ以上の構造エレメント（例えば、ＤＬＰモチーフ）をコードしている第３の核酸配列をさらに含み、第３の核酸配列は、ＧＯＩのコード配列の上流に作動可能に連結されている。第２のＤＬＰモチーフは、少なくとも非構造タンパク質ｎｓｐ１〜４またはその一部分のコード配列の上流に位置付けられている第１のＤＬＰモチーフと同一であっても異なっていてもよい。したがって、いくつかの実施形態では、第２のＤＬＰモチーフは、非構造タンパク質のコード配列の上流に位置付けられている第１のＤＬＰモチーフと同一である。いくつかの実施形態では、第２のＤＬＰモチーフは、非構造タンパク質のコード配列の上流に位置付けられている第１のＤＬＰモチーフとは異なる。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、本開示の核酸配列は、第３の核酸配列の下流およびＧＯＩのコード配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む。自己プロテアーゼペプチドは、一般的に当該分野で公知の任意の自己プロテアーゼペプチドであり得る。自己プロテアーゼペプチドの非限定的な例としては、ブタテッショウウイルス−１  ２Ａ（Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、細胞質多角体病ウイルス２Ａ（ＢｍＣＰＶ２Ａ）、軟化病ウイルス２Ａ（ＢｍＩＦＶ２Ａ）、およびそれらの任意の組み合わせ由来のペプチド配列を含む。
【０１３４】
さらなる態様において、本明細書に開示のいくつかの実施形態は、改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている核酸配列を含む核酸分子に関し、改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンは、ウイルスキャプシドエンハンサー（例えば、ＤＬＰモチーフ）をコードしている第１の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンは、少なくとも１つの非構造ウイルスタンパク質またはその一部分をコードしている第２の核酸配列をさらに含み、第１の核酸配列が、第２の核酸配列の上流に作動可能に連結されている。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンは、第１の核酸配列の下流および第２の核酸配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンは、プラス鎖ＲＮＡウイルスの改変型ＲＮＡレプリコンを含む。いくつかの実施形態では、改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンは、マイナス鎖ＲＮＡウイルスの改変型ＲＮＡレプリコンを含む。
【０１３６】
改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンの非限定的な例としては、トガウイルス科、フラビウイルス科、オルトミクソウイルス科、ラブドウイルス科、またはパラミクソウイルス科に属するウイルス種の改変型ＲＮＡレプリコンが挙げられる。したがって、いくつかの実施形態では、改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンとしては、マイナス鎖ＲＮＡウイルスの改変型ＲＮＡレプリコンが挙げられる。好適なマイナス鎖ＲＮＡウイルス種としては、オルトミクソウイルス科、ラブドウイルス科、およびパラミクソウイルス科のウイルス種が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンとしては、トガウイルス科またはフラビウイルス科に属するプラス鎖ウイルス種の改変型ＲＮＡレプリコンが挙げられる。いくつかの実施形態では、改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンとしては、アルテリウイルス科のアルテリウイルス属に属するプラス鎖ウイルス種の改変型ＲＮＡレプリコンが挙げられる。好適なアルテリウイルス種としては、これらに限定されないが、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、ブタ呼吸器生殖器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、乳酸脱水素酵素上昇ウイルス（ＬＤＶ）、サル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）、およびｗｏｂｂｌｙ  ｐｏｓｓｕｍ  ｄｉｓｅａｓｅウイルス（ＷＰＤＶ）の種が挙げられる。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、非アルファウイルス改変型ＲＮＡレプリコンをコードしている配列は、１つ以上の発現カセットをさらに含み、発現カセットの各々は、目的遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列に作動可能に連結されているプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンは、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の発現カセットのうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの非構造ウイルスタンパク質またはその一部分をコードしている第２の核酸配列の下流に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の発現カセットのうちの少なくとも１つは、ウイルスキャプシドエンハンサーの１つ以上の構造エレメントをコードしている第３の核酸配列をさらに含み、第３の核酸配列は、ＧＯＩのコード配列の上流に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、改変型非アルファウイルスＲＮＡレプリコンは、第３の核酸配列の下流およびＧＯＩのコード配列の上流に作動可能に連結されている自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む。
【０１３８】
本開示のいくつかの実施形態は、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている核酸配列を含む核酸分子に関し、核酸分子は、５’→３’方向にシンドビスウイルス由来のキャプシドエンハンサーをコードしている第１の核酸配列、自己プロテアーゼペプチドをコードしている第２の核酸配列、およびウイルス非構造タンパク質のすべてをコードしている第３の核酸配列を含む。本開示のいくつかの実施形態は、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている核酸配列を含む核酸分子に関し、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンは、ウイルスキャプシドエンハンサーを含み、また、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンの配列は、配列番号１５〜１８および２７〜２９のうちの少なくとも１つの配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性を呈する。
【０１３９】
本開示の範囲内で企図されるのは、本明細書に提供されるポリヌクレオチドの多様体である。こうした多様体は、同じであるか、または異なる種からの相同ポリヌクレオチドなど、天然のものでもよく、または非天然の多様体、例えば化学合成法を用いて合成されたポリヌクレオチド、または組換えＤＮＡ技術を用いて生成されたポリヌクレオチドであってもよい。核酸配列に関して、遺伝暗号を縮重することで、遺伝子から産生されるポリペプチドのアミノ酸配列の変動を引き起こすことなく、遺伝子のタンパク質コード配列の少なくとも１つの塩基を異なる塩基で置換する可能性がもたらされる。したがって、本開示の核酸分子はまた、遺伝暗号の縮重に従って置換することにより本明細書に開示の任意のポリヌクレオチド配列から変更された、任意の塩基配列を有し得る。コドン使用法を記載する参考文献は、容易に公的に利用可能である。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチド配列の多様体は、様々な理由で、例えば、特定の宿主のコドン発現を最適化する（例えば、ウイルスｍＲＮＡ中のコドンを、哺乳動物または魚種などの他の生物に好ましいものに変化させる）ために産生することができる。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子は、５’―＞３’方向に、シンドビスウイルス由来のキャプシドエンハンサーをコードしている核酸配列、自己プロテアーゼペプチドをコードしている核酸配列、および改変型ウイルスＲＮＡレプリコンのウイルス非構造タンパク質のすべてをコードしている核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、５’―＞３’方向に５−ＵＴＲ配列、シンドビスウイルス由来の第１のキャプシドエンハンサー、自己プロテアーゼペプチド、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンのウイルス非構造タンパク質のすべてをコードしている配列、１つ以上の発現カセット、および３’ＵＴＲ配列を含み、１つ以上の発現カセットのうちの少なくとも１つは、目的遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列の上流に作動可能に連結されているシンドビスウイルス由来の第２のキャプシドエンハンサーを含む。
【０１４１】
したがって、いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子は、改変型ウイルスＲＮＡレプリコンをコードしている核酸配列を含み、本配列は、配列番号１５〜１８および２７〜２９のうちの少なくとも１つの配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を呈する。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子は、発現ベクターである。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、転写調節エレメントまたは翻訳調節エレメントであり得る１つ以上の追加の調節配列をさらに含む。本開示において同義的に使用される「調節エレメント」および「調節領域」という用語は、転写または翻訳の開始および速度、ならびに転写または翻訳産物の安定性および／または移動性に影響を与える核酸配列を指す。こうした調節エレメントは、天然配列のものである必要はない。調節配列としては、これらに限定されないが、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答エレメント、タンパク質認識部位、誘導エレメント、タンパク質結合配列、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、転写開始部位、終止配列、ポリアデニル化配列、イントロン、およびそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、本開示の発現ベクターは、複製起点、発現カセットの宿主ゲノムへの組み込みを促進するための１つ以上の配列、ターミネーター配列のうちの１つ以上をさらに含む。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、細胞内で複製するための少なくとも１つの複製起点（「ＯＲＩ」）配列を含む。ベクターは、１つ以上の真核生物プロモーターの制御下の１つ以上の選択マーカー、１つ以上の原核生物プロモーターの制御下の１つ以上の選択マーカー、および／または標的細胞のゲノムへ外因性核酸配列の組換えを媒介する１つ以上の配列を任意によりさらに含み得る。
【０１４４】
ＯＲＩは、複製が開始するＤＮＡ分子中の配列である。ＯＲＩは、複製前複合体のための会合の基礎として機能する。ＯＲＩに応じて、こうした複製は、一方向または双方向に進行することができる。本明細書において提供される発現ベクターは、大腸菌または酵母菌などのクローニング宿主において発現ベクターを複製するためのＯＲＩを含むことができ、かつ／または標的細胞（例えば、哺乳動物細胞であってもよい）において発現ベクターを複製するためのＯＲＩを含むことができる。ＯＲＩの構造生物学は、原核生物、真核生物、ウイルスの間で広く保存されている。ほとんどのＯＲＩは、単純なトリ、テトラ、またはそれ以上のヌクレオチド反復パターンを有する。そのほとんどが、ＡＴが豊富であり、逆方向反復を含む。当業者は、Ｐ１５ＡおよびｐＵＣのＯＲＩなど、より一般的なＯＲＩに精通しているだろう。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、発現ベクターはまた、選択マーカーを担持し得る。一例として、発現カセットを含むベクターは、選択マーカーとして、抗生物質、除草剤などの有毒物質、または他の何らかの毒素に対する耐性を付与する遺伝子を含むことができ、これにより、形質転換体は、細胞を毒に曝露し、この毒との遭遇に生き残った細胞を選択することによって、選択することができる。いくつかの実施形態では、選択マーカーは、プロモーターの制御下にあり得る。いくつかの実施形態では、選択マーカーの発現を調節するプロモーターは、条件付きまたは誘導性であり得る。いくつかの実施形態では、選択マーカーの発現を調節するプロモーターは、好ましくは構成的であり得、また、例えば、本明細書に記載の任意のプロモーターまたは別のプロモーターであり得る。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、プラスミド、バクテリオファージベクター、コスミド、フォスミド、ウイルスレプリコン、シャトルベクター、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ＲＮＡレプリコンである。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、原核生物発現ベクターである。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、真核生物発現ベクターである。いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子は、ｄｅ  ｎｏｖｏ合成によって産生される。本開示のいくつかの実施形態では、ｄｅ  ｎｏｖｏ合成を用いて、合成ｍＲＮＡ分子を生成することができる。
【０１４７】
組換え細胞
一態様では、本明細書に開示のいくつかの実施形態は、動物細胞などの宿主細胞、本明細書に提供される核酸分子に導入すること、および形質転換細胞を選択またはスクリーニングすることを含む細胞の形質転換方法に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書では同義的に使用される。こうした用語は、特定の対象の細胞のみでなく、こうした細胞の子孫または潜在的な子孫も指すことが理解される。突然変異または環境の影響のいずれかにより、後続の世代においてある種の改変が起こり得るので、こうした子孫は、実際に、親細胞と同一ではない可能性もあるが、それでも本明細書で用いる用語の範囲内に含まれる。いくつかの実施形態では、核酸分子は、エレクトロポレーション手順またはバイオリスティック手順によって宿主細胞に導入される。
【０１４８】
関連する態様では、いくつかの実施形態は、組換え宿主細胞、例えば本明細書に記載の核酸分子を含む組換え動物細胞に関する。核酸分子は、宿主ゲノムに安定に組み込まれ得るか、またはエピソームにより複製し得るか、または安定な発現もしくは一過性の発現のためのミニサークル発現ベクター（ｍｉｎｉ−ｃｉｒｃｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）として、組換え宿主細胞中に存在し得る。したがって、本明細書に開示のいくつかの実施形態では、核酸分子は、エピソーム単位として組換え宿主細胞中に維持され、かつ複製される。いくつかの実施形態では、核酸分子は、組換え細胞のゲノムに安定に組み込まれている。安定した組込みは、古典的なランダムゲノム組換え技術を使用するか、またはガイドＲＮＡ指向ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、またはＤＮＡガイドエンドヌクレアーゼゲノム編集ＮｇＡｇｏ（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒｅｇｏｒｙｉアルゴノート）、またはＴＡＬＥＮゲノム編集（転写活性化剤様エフェクターヌクレアーゼ）など、より精密なゲノム編集技術を用いて、完遂させ得る。いくつかの実施形態では、核酸分子は、安定な発現または一過性の発現のためのミニサークル発現ベクターとして、組換え宿主細胞に存在する。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、例えば、本出願のベクター構築物を用いて、遺伝子操作（例えば、形質導入、または形質転換、またはトランスフェクト）することができ、これは、例えば、宿主細胞のゲノムの一部分に相同である核酸配列を含む相同組換え用のベクターであり得るか、または、目的遺伝子のいずれかまたはそれらの組み合わせの発現のための発現ベクターであり得る。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドの発現のためのベクターはまた、例えば、相同組換えによる宿主への組み込みのために設計され得る。本明細書に記載のポリヌクレオチド配列を含む核酸分子、例えば、改変型アルファウイルスゲノムまたはレプリコンＲＮＡ、ならびに任意により選択マーカーまたはレポーター遺伝子を含むベクターを用いて、適切な宿主細胞を形質転換することができる。
【０１５０】
本明細書に開示される方法および組成物は、これらに限定されないが、原核生物および真核生物の種など、任意の種の遺伝子操作のために展開され得る。本開示による組成物および方法を使用して改変される好適な宿主細胞としては、これらに限定されないが、藻類細胞、細菌細胞、ヘテロコント、真菌細胞、ツボカビ細胞、マイクロ真菌、微細藻類、および動物細胞が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、動物細胞は、無脊椎動物細胞である。いくつかの実施形態では、脊椎動物細胞は、哺乳動物細胞である。宿主細胞は、非形質転換細胞、または少なくとも１つの核酸分子で既にトランスフェクトされている細胞のいずれかであり得る。
【０１５１】
本明細書に開示される方法および組成物は、例えば、水産養殖、農業、畜産業、および／またはワクチン、医薬品、工業製品、化学薬品などの製造に使用されるポリペプチドの産生を含む治療および医学的用途にとって重要であるか、または興味深い対象および／もしくは宿主細胞と共に使用できる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、げっ歯類、マウス、魚、鳥などのアルファウイルスの天然宿主である種、およびヒト、ウマ、ブタ、サル、および類人猿などの大型哺乳動物由来の宿主細胞、ならびに無脊椎動物の宿主細胞と共に使用できる。本出願のいくつかの実施形態では、特に好ましい種は、脊椎動物種および無脊椎動物種である。原則として、任意の動物種が一般的に使用され得、例えば、ヒト、イヌ、鳥、魚、ウマ、ブタ、霊長類、マウス、コットンラット、フェレット、ウシ、イノシシ、ヒツジ、ウサギ、ネコ、ヤギ、ロバ、ハムスター、またはバッファローであり得る。好適な鳥種の非限定的な例としては、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、ダチョウ、エミュー、白鳥、クジャク、キジ、ヤマウズラ、およびホロホロチョウが挙げられる。いくつかの特定の実施形態では、魚は、サケ科の任意の種である。一次哺乳動物細胞および連続／不死化細胞型もまた好適である。好適な動物宿主細胞の非限定的な例としては、これらに限定されないが、肺ウマ動脈内皮細胞、ウマ真皮細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ウサギ腎臓細胞、マウス筋肉細胞、マウス結合組織細胞、ヒト子宮頸部細胞、ヒト類表皮喉頭細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ヒトＨＥＫ−２９３細胞、マウス３Ｔ３細胞、ベロ細胞、メイディン・ダービー・イヌ腎臓上皮細胞（ＭＤＣＫ）、初代ニワトリ線維芽細胞、ＨｕＴ７８細胞、Ａ５４９肺細胞、ＨｅＬａ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、ＷＩ−３８細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＦＲｈＬ−２、およびＣＥＭ  Ｔ細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ベビーハムスター腎臓細胞である。いくつかの実施形態では、ベビーハムスター腎臓細胞は、ＢＨＫ−２１細胞である。
【０１５２】
上記の様々な宿主細胞および種を形質転換するための技術は、当技術分野において公知であり、技術的および科学的文献に記載されている。したがって、本明細書に開示される少なくとも１つの組換え細胞を含む細胞培養物もまた、本出願の範囲内である。細胞培養物を生成し、維持するのに好適である方法およびシステムは、当技術分野において公知である。  
【０１５３】
異種核酸配列
本開示のいくつかの実施形態によれば、様々な核酸配列は、本開示の核酸分子によって担持され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸分子は、いかなる追加の異種核酸配列も含まない。いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子は、１つ以上の追加の異種核酸配列または外来核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の異種核酸配列または外来核酸配列は、目的遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列を含む。本明細書に開示のいくつかの実施形態では、ＧＯＩのコード配列は、ポリペプチドまたは機能的ＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、ＧＯＩのコード配列は、リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボザイム、ＣＲＩＳＰＲ系のトランス活性型（ｔｒ）ＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ系のｃｒｉｓｐｒ（ｃｒ）ＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ系のキメラガイドＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子、低分子ヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ、またはアンチセンスＲＮＡ分子から選択される機能的ＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、ＧＯＩのコード配列は、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助食品用ポリペプチド、工業用酵素、レポーターポリペプチド、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ＧＯＩのコード配列は、抗体、抗原、免疫調節剤、およびサイトカインからなる群から選択されるポリペプチドをコードする。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、異種核酸配列は、少なくとも約１００塩基、２ｋｂ、３．５ｋｂ、５ｋｂ、７ｋｂ、または８ｋｂの異種核酸配列である。異種ＲＮＡまたは異種核酸配列は、ウイルス、原核生物または真核生物に由来する様々な配列から選択することができる。異種配列のカテゴリーの例としては、これらに限定されないが、免疫原（天然、修飾または合成抗原タンパク質、ペプチド、エピトープまたは免疫原性断片など）、サイトカイン、毒素、治療用タンパク質、酵素、アンチセンス配列、および免疫応答モジュレーターが挙げられる。
【０１５５】
これらに限定されないが、サイトカイン、毒素、プロドラッグ、免疫応答を刺激する抗原、リボザイム、および免疫応答を補助するか、または阻害するタンパク質、ならびにアンチセンス配列（または「アンチセンス用途」のためのセンス配列）など、様々なＧＯＩを、ＧＯＩのポリペプチドを発現させるために、本開示の核酸分子に含めることができる。上記のように、本開示の様々な実施形態内で、本明細書において提供される改変型ＲＮＡレプリコンは、２つ以上の目的のポリペプチドのコード領域を含み得る（およびいくつかの実施形態では２つ以上の目的のポリペプチドが発現する）。
【０１５６】
１）サイトカイン
本明細書に開示のいくつかの実施形態では、ＧＯＩは、サイトカインをコードする。一般に、サイトカインは、免疫エフェクター細胞を増殖、活性化、および／または分化させるように作用する。サイトカインの例としては、これらに限定されないが、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、内皮細胞、線維芽細胞、γインターフェロンなどのリンホカイン、腫瘍壊死因子、インターロイキン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１およびＧ−ＣＳＦが挙げられる。
【０１５７】
いくつかの関連実施形態では、ＧＯＩは、免疫調節補因子をコードする。本開示の文脈内で利用される場合、「免疫調節補因子」は、免疫応答に関与する細胞のうちの１つ以上によって産生される場合、または細胞に外因的に添加された場合、免疫応答が、補因子が存在しない場合に生じたであろうものの質または効力とは異なるようになる因子を指す。応答の質または効力は、例えば、細胞増殖を測定するｅｘ  ｖｉｔｒｏアッセイ（例えば、３Ｈチミジンの取り込み）およびｅｘ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイ（例えば、５１  Ｃｒの放出を測定する）など、当業者に公知の様々なアッセイによって測定することができる（Ｗａｒｎｅｒら、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．およびＨｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ７：６４５−６５５、１９９１年を参照されたい）。
【０１５８】
免疫調節補因子の例としては、これらに限定されないが、アルファインターフェロン、ガンマインターフェロン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、２−マイクログロブリン、シャペロン、ＣＤ３、Ｂ７／ＢＢ  １、ＭＨＣ結合トランスポータータンパク質、およびこれらの類似体が挙げられる。
【０１５９】
いずれの免疫調節補因子を本開示の核酸分子内に含めるかの選択は、その補因子の既知の治療効果に基づくか、または実験により決定され得る。例えば、慢性Ｂ型肝炎感染症では、アルファインターフェロンが患者の免疫学的欠損を補うのに有効であり、それによって疾患からの回復を助けるのに有効であることが判明している。いくつかの状況において、好適な免疫調節補因子は、実験により決定され得る。簡単に説明すると、最初に、血液サンプルが、肝疾患患者から採取される。末梢血リンパ球（ＰＢＬ）は、自己またはＨＬＡ適合細胞（例えば、ＥＢＶ形質転換細胞）によりｅｘ  ｖｉｔｒｏで再刺激され、および改変型アルテリウイルスゲノム、または肝炎抗原の免疫原性部分および免疫調節補因子の発現を指示する本開示のレプリコンＲＮＡにより形質導入される。刺激されたＰＢＬは、標的としてＢＬＡ適合形質導入細胞を用いたＣＴＬアッセイにおいて、エフェクターとして使用される。ＨＬＡ適合刺激剤、および抗原のみをコードするベクターで形質導入された標的細胞を用いて行われた同じアッセイにおいて見られるものを上回るＣＴＬ応答の増加は、有用な免疫調節補因子であることを示す。いくつかの実施形態では、免疫調節補因子ガンマインターフェロンが特に好ましい。
【０１６０】
免疫調節補因子の別の非限定的な例は、Ｂ７／ＢＢ１共刺激因子である。Ｔ細胞の機能活性を完全に活性化するには、２つのシグナルを必要とする。１つのシグナルは、抗原特異的Ｔ細胞受容体と、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合しているペプチドとの相互作用によって提供され、共刺激と称される第２のシグナルは、抗原提示細胞によってＴ細胞に送達される。第２のシグナルは、Ｔ細胞によるインターロイキン−２（ＩＬ−２）の産生に必要であり、抗原提示細胞上のＢ７／ＢＢ１分子と、Ｔリンパ球上のＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４受容体との相互作用を伴うと考えられている。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞が増殖して十分に活性化されるのに十分なＩＬ−２を産生するように、ＣＤ８＋Ｔ細胞の共刺激を引き起こすために、Ｂ７／ＢＢ１を腫瘍細胞に導入してもよい。これらのＣＤ８＋Ｔ細胞は、共刺激がさらなるＣＴＬ機能に必要とされることがないことから、Ｂ７を発現していない腫瘍細胞を死滅させることができる。共刺激性Ｂ７／ＢＢ１因子、および例えば免疫原性ＨＢＶコアタンパク質の両方を発現させるベクターは、本明細書に記載の方法を利用して構築することができる。これらのベクターで形質導入された細胞は、より効果的な抗原提示細胞になる。ＨＢＶコア特異的ＣＴＬ応答は、共刺激リガンドＢ７／ＢＢ１により完全に活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞から増強される。
【０１６１】
２）毒素
本明細書に開示のいくつかの実施形態では、ＧＯＩは、毒素をコードする。いくつかの実施形態では、毒素は、細胞の成長を直接阻害するように作用する。毒素の例としては、これらに限定されるものではないが、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン、ヤマゴボウ、抗ウイルスタンパク質、トリチン、赤痢菌毒素、シュードモナス外毒素Ａ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶＴＫ）、および大腸菌グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼが挙げられる。
【０１６２】
３）プロドラッグ
本明細書に開示のいくつかの実施形態では、ＧＯＩは、「プロドラッグ」をコードする。本開示の文脈内で利用される「プロドラッグ」とは、毒性生成物にほとんどまたは全く細胞毒性を有さない化合物を活性化させる遺伝子産物を指す。このような遺伝子産物の代表例としては、ある種のプリンアラビノシドおよび置換ピリミジン化合物を選択的にモノリン酸化し、それらを細胞傷害性または細胞増殖抑制性代謝産物に変換する、ＨＳＶＴＫおよびＶＺＶＴＫ（ならびにその類似体および誘導体）が挙げられる。より具体的には、薬物ガンシクロビル、アシクロビル、またはそれらの類似体（例えば、ＦＩＡＵ、およびＤＨＰＧ）のいずれかがＨＳＶＴＫに曝露することで、薬物が、リン酸化して、対応する活性ヌクレオチド三リン酸形態になる。
【０１６３】
本開示の文脈内で利用され得るプロドラッグの非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：チオキサンチンを毒性チオキサンチンモノホスフェートに変換する大腸菌グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ；マイトマイシンホスフェートおよびドキソルビシンホスフェートなどの不活性リン酸化化合物を有毒な脱リン酸化化合物に変換するアルカリホスファターゼ；５−フルオロシトシンを毒性化合物５−フルオロウラシルに変換することができる真菌（例えば、フザリウムオキシスポラム）および細菌性シトシンデアミナーゼ；パラ−Ｎ−ビス（２−クロロエチル）アミノベンゾイルグルタミン酸からグルタミン酸を切断し、それにより有毒な安息香酸マスタードを生成するカルボキシペプチダーゼＧ２；ならびにドキソルビシンおよびメルファランのフェノキシアセタビド誘導体を有毒化合物に変換するペニシリンＶアミダーゼ。
【０１６４】
４）アンチセンス配列
本明細書に開示されているいくつかの実施形態では、ＧＯＩのコード配列は、アンチセンス配列である。アンチセンス配列は、ＲＮＡ転写物に結合し、それによって特定のタンパク質の細胞合成を妨げるか、または細胞によるそのＲＮＡ配列の使用を妨げるように設計されている。そのような配列の非限定的な例としては、アンチセンスチミジンキナーゼ、アンチセンスジヒドロ葉酸還元酵素、アンチセンスＨＥＲ２、アンチセンスＡＢＬ、アンチセンスＭｙｃ、アンチセンスｒａｓ、ならびにヌクレオチド生合成経路中のあらゆる酵素を遮断するアンチセンス配列が挙げられる。さらに、本明細書に開示のいくつかの実施形態によれば、免疫応答を減少させるために、インターフェロンおよび２ミクログロブリンに対するアンチセンス配列が利用され得る。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、アンチセンスＲＮＡは、強力なクラスＩ制限応答を誘導するために抗腫瘍剤として利用され得る。ＲＮＡに結合し、それによって特定のｍＲＮＡの翻訳を妨げることに加えて、特異的なアンチセンス配列が高レベルであることにより、二本鎖ＲＮＡが大量に形成されることによる、インターフェロン（ガンマ−インターフェロンなど）の発現の増大を誘導すると考えられている。ガンマインターフェロンの発現が増加することで、ＭＨＣクラスＩ抗原の発現が促進される。これに関して使用するための好ましいアンチセンス配列としては、アクチンＲＮＡ、ミオシンＲＮＡ、およびヒストンＲＮＡが挙げられる。アクチンＲＮＡとミスマッチを形成するアンチセンスＲＮＡが特に好ましい。
【０１６６】
５）リボザイム
本明細書に開示のいくつかの実施形態では、宿主細胞の感染時にリボザイムを産生する、１つ以上のＲＮＡステムループ構造を含む核酸分子が提供される。リボザイムは、特定のＲＮＡを切断するために使用され、これにより、１つの特定のＲＮＡ配列に影響を与え得るように設計される。一般的に、リボザイムの基質結合配列は、１０〜２０ヌクレオチド長である。この配列の長さは、標的ＲＮＡとのハイブリダイゼーションおよび切断されたＲＮＡからのリボザイムの解離を可能にするのに十分である。リボザイムを作製するための代表的な例としては、米国特許第５，１１６，７４２号、同第５，２２５，３３７号、および同第５，２４６，９２１号に記載されているものが挙げられる。
【０１６７】
６）タンパク質および他の細胞構成成分
本明細書に開示のいくつかの実施形態では、様々なタンパク質または他の細胞構成成分が、本開示の核酸分子によって担持され得る。こうしたタンパク質の非限定的な例としては、天然のまたは改変された細胞構成成分、ならびに例えばウイルス、細菌、寄生虫、真菌または哺乳動物などの動物に見られる外来タンパク質または細胞構成成分が挙げられる。
【０１６８】
ポリペプチドの産生方法
原核生物または真核生物宿主細胞など、本開示の宿主細胞を使用して、本明細書に開示の目的遺伝子（ＧＯＩ）のオープンリーディングフレームにコードされている、例えば、ポリペプチドなどの目的の分子を産生（例えば、発現）させることができる。したがって、本出願は、本開示の宿主細胞および／または核酸分子を使用して、例えば、ポリペプチドなどの目的の分子を産生するための方法をさらに提供する。宿主細胞は、例えば、単離された細胞、細胞培養中の細胞、生体内の細胞、またはそれらの組み合わせであり得る。
【０１６９】
本明細書に開示のいくつかの実施形態は、目的のポリペプチドを産生するための方法を提供する。この方法は、本開示の態様および実施形態のうちのいずれか１つによる核酸分子を宿主細胞に導入し、それによって、その宿主細胞においてＧＯＩによってコードされているポリペプチドを産生することを含み得る。いくつかの実施形態では、導入された核酸分子が、ＲＮＡ分子、例えばｍＲＮＡ分子またはＲＮＡレプリコンである。ＲＮＡ分子は、当技術分野において公知の任意の方法によって、例えば、全体的または部分的にｄｅ  ｎｏｖｏ合成によって生成することができる。例えば、これらに限定されないが、ｍＲＮＡ分子およびＲＮＡレプリコンなどのＲＮＡ分子は、化学的方法、酵素的技術、またはそれらの任意の組み合わせを用いて、例えば  ｄｅ  ｎｏｖｏ会合による化学合成（オリゴヌクレオチドを用いるなど）、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応（適切な酵素、緩衝液、ヌクレオチドなどを用いる）により産生され得る。導入された核酸分子がｍＲＮＡであるいくつかの例では、細胞内で目的のポリペプチド（例えば、薬物、抗原など）を産生するために、ｍＲＮＡをｉｎ  ｖｉｖｏで細胞に直接送達することができる。細胞は、単離された細胞、細胞培養中の細胞、組織、器管、および／または対象内の細胞、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、細胞内に新しいｍＲＮＡコピーが作成されることはない。本明細書に開示されるように、ウイルスキャプシドエンハンサー（例えば、ＤＬＰモチーフ）の１つ以上のＲＮＡステムループを化学合成されたＲＮＡに組み込むことにより、ＤＬＰ含有ｍＲＮＡが一旦細胞に導入されると、意図される遺伝子の発現の増強が付与され得る。
【０１７０】
導入された核酸分子が、例えばＲＮＡレプリコンなどのベクターであるいくつかの実施形態では、１つ以上のＤＬＰモチーフに作動可能に連結されている目的遺伝子のコード配列を含む、新しいｍＲＮＡコピーが生成され得る。１つ以上のＤＬＰモチーフをベクター、例えば、ＲＮＡレプリコンに組み込むことにより、一旦ＤＬＰ含有ベクターまたはレプリコンが細胞に導入されると、意図された遺伝子の発現の増強が付与され得る。
【０１７１】
本明細書に開示のいくつかの実施形態では、宿主細胞において、目的のポリペプチドを産生するための方法が提供される。このような方法としては、本開示の態様および実施形態のうちのいずれか１つによる核酸分子など、組換え宿主細胞の培養が挙げられる。いくつかの実施形態では、方法は、目的の分子が産生されるように、本開示の宿主細胞（内部には目的の分子をコードする組換え発現ベクターが導入されている）を好適な培地中で培養することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、培地または宿主細胞から目的の分子を単離することをさらに含む。
【０１７２】
態様および実施形態のいずれか１つに記載の核酸分子を対象に投与することを含む、対象において目的のポリペプチドを産生するための方法もまた開示される。
【０１７３】
本明細書に開示される方法および組成物における使用のための好適な宿主細胞および／または対象としては、原核生物種および真核生物種が挙げられるが、これらに限定されない。本開示による組成物および方法を使用して改変される好適な宿主細胞としては、これらに限定されないが、藻類細胞、細菌細胞、ヘテロコント、真菌細胞、ツボカビ細胞、マイクロ真菌、微細藻類、および動物細胞が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、動物細胞は、無脊椎動物細胞である。いくつかの実施形態では、脊椎動物細胞は、哺乳動物細胞である。宿主細胞は、非形質転換細胞または少なくとも１つの核酸分子で既にトランスフェクトされている細胞のいずれかであり得る。したがって、態様および実施形態のうちのいずれか１つによる生物学的サンプル、バイオマス、および組換え細胞の子孫もまた、本願の範囲内である。したがって、以下により詳細に論じるように、本出願のこの態様による方法によって産生されたポリペプチドもまた本出願の範囲内である。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、組換え細胞は、動物細胞である。動物細胞において産生されるタンパク質は、一般に、適切なプロセシング、翻訳後修飾を有し、このため、生理学的状態の治療に十分な活性を有すると考えられているため、小規模および大規模での治療用タンパク質の産生は、製薬産業において重要な開発分野である。原則として、任意の動物種が一般的に使用され得、例えば、ヒト、イヌ、鳥、魚、ウマ、ブタ、霊長類、マウス、コットンラット、フェレット、ウシ、イノシシ、ヒツジ、ウサギ、ネコ、ヤギ、ロバ、ハムスター、またはバッファローであり得る。好適な鳥種の非限定的な例としては、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、ダチョウ、エミュー、白鳥、クジャク、キジ、ヤマウズラ、およびホロホロチョウが挙げられる。いくつかの特定の実施形態では、魚は、サケ科の任意の種である。一次哺乳動物細胞および連続／不死化細胞型もまた好適である。好適な動物宿主細胞の非限定的な例としては、これらに限定されないが、肺ウマ動脈内皮細胞、ウマ真皮細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ウサギ腎臓細胞、マウス筋肉細胞、マウス結合組織細胞、ヒト子宮頸部細胞、ヒト類表皮喉頭細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ヒトＨＥＫ−２９３細胞、マウス３Ｔ３細胞、ベロ細胞、メイディン・ダービー・イヌ腎臓上皮細胞（ＭＤＣＫ）、初代ニワトリ線維芽細胞、ＨｕＴ７８細胞、Ａ５４９肺細胞、ＨｅＬａ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、ＷＩ−３８細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＦＲｈＬ−２、およびＣＥＭ  Ｔ細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ベビーハムスター腎臓細胞である。いくつかの実施形態では、ベビーハムスター腎臓細胞は、ＢＨＫ−２１細胞である。
【０１７５】
組換えポリペプチド
本明細書に開示のいくつかの実施形態は、本明細書に記載の１つ以上の実施形態による方法によって産生された組換えポリペプチドに関する。本出願の組換えポリペプチドは、一般に、任意の組換えポリペプチドであり得、例えば、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助食品用ポリペプチド、工業用酵素、およびレポーターポリペプチドのうちの１つ以上であり得る。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、抗体、抗原、免疫調節剤、およびサイトカインのうちの１つ以上であり得る。いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドは、治療的または予防的活性を有し得る。
【０１７６】
組成物および配合物
本明細書に開示のいくつかの実施形態は、本明細書に記載されている組換えポリペプチドのいずれかを含む組成物に関する。組成物は、例えば、栄養補給組成物、予防組成物、薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物、またはこれらの混合物であり得る。いくつかの実施形態では、本願の組成物は、ワクチンとして使用することができる。
【０１７７】
本明細書に開示のいくつかの実施形態は、本明細書に記載の核酸分子（例えば、発現ベクター）のうちのいずれかなどの組成物に関する。組成物は、例えば、栄養補給組成物、予防組成物、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物、またはこれらの混合物であり得る。いくつかの実施形態では、本願の組成物は、ワクチンとして使用することができる。
【０１７８】
本明細書に開示のいくつかの実施形態は、本明細書に記載の組換え細胞のうちのいずれかなどの組成物に関する。組成物は、例えば、栄養補給組成物、予防組成物、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物、またはこれらの混合物であり得る。いくつかの実施形態では、本願の組成物は、ワクチンとして使用することができる。
【０１７９】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」は、一般に安全、無毒であり、生物学的にもその他の点でも望ましくないものではない、医薬組成物または配合物を調製するのに有用な担体を意味し、獣医学的用途およびヒトの医薬用途に許容される担体を含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は、水と同じくらい単純であるが、例えば生理的塩濃度の溶液も含み得る。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は、安定化剤、希釈剤および緩衝剤であり得るか、またはそれらを含み得る。好適な安定化剤は、例えばＳＰＧＡ、炭水化物（例えば、粉ミルク、血清アルブミン、もしくはカゼイン）またはそれらの分解生成物である。好適な緩衝剤は、例えば、アルカリ金属リン酸塩である。希釈剤としては、水、水性緩衝液（例えば緩衝食塩水）、アルコールおよびポリオール（例えば、グリセロール）が挙げられる。動物またはヒトへの投与のために、本願による組成物は、とりわけ、鼻腔内、噴霧、皮内、皮下、経口、エアロゾル、筋肉内、またはそれらの任意の組み合わせなど、任意の経腸または非経口経路によって投与することができる。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子（例えば、ｍＲＮＡおよび／または発現ベクター）、タンパク質分子、および／または組成物は、好適な配合物、例えば医薬用配合物中にある。本明細書に提供されるものとしては、薬学的に許容されるビヒクル中に本明細書に開示の分子および／または組成物のうちの１つ以上を含む医薬用配合物が挙げられる。本開示のいくつかの実施形態は、本明細書に開示されている発現ベクターのうちの１つ以上を含む医薬用配合物に関する。本開示のいくつかの実施形態は、本明細書に開示の核酸分子のうちの１つ以上を含有する医薬用配合物に関する。本開示のいくつかの実施形態は、本明細書に開示のポリペプチドのうちの１つ以上を含有する医薬用配合物に関する。本開示のいくつかの実施形態は、本明細書に開示の組換え細胞のうちの１つ以上を含有する医薬用配合物に関する。
【０１８１】
本明細書に開示の分子（例えば、タンパク質および核酸分子）ならびに組成物は、種々の配合物、例えば医薬用配合物中にあり得る。例えば、本開示の核酸分子（例えば、レプリコン、ｍＲＮＡおよび発現ベクター）、タンパク質分子、および／または組成物は、１つ以上の共有結合化合物（例えば、直接連結方法により）、非共有化合物（例えば、ＬＮＰまたはカチオン性ナノエマルジョンからの荷電ベースの会合による）、物理的組成物（例えば、ヴォールトタンパク質、非荷電脂質カプセル化）、薬学的に許容される緩衝液（例えば、生理食塩水、乳酸加リンガー液）、およびそれらの任意の組み合わせと共に、例えば、医薬用配合物に配合され得る。前述の医薬用配合物を生成するのに好適である多くの方法、試薬、および系が、当技術分野において公知である。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の分子および／または組成物は、生理食塩水または脂質配合物中に配合されている。脂質配合物は、リポソーム、リポプレックス、ＰＬＧＡなどのコポリマー、および脂質ナノ粒子から選択することができるが、これらに限定されない。
【０１８３】
粒子およびナノ粒子
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の核酸分子、ポリペプチド分子、および／または組成物のうちの１つ以上は、粒子またはナノ粒子に組み込まれ得る。本明細書に開示の分子および組成物のうちの１つ以上を含む粒子は、ポリマー粒子、脂質粒子、固体脂質粒子、自己会合粒子、コンジュゲートリン脂質の複合ナノ粒子、界面活性剤、タンパク質、ポリアミノ酸、無機粒子、またはそれらの組み合わせ（例えば、脂質安定化ポリマー粒子）であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の分子および／または組成物は、粒子内に実質的にカプセル化されているかまたは部分的にカプセル化されている。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の分子および／または組成物は、粒子の表面に堆積および／または吸着される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の分子および／または組成物は、粒子に組み込まれている。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の分子および／または組成物は、粒子の一部分または構成成分である。いくつかの実施形態では、本開示の分子および／または組成物は、共有結合または非共有相互作用により粒子の表面に付着することができる。いくつかの実施形態では、本開示の分子および／または組成物は、自己会合して粒子になる。
【０１８４】
本明細書で使用されるとき、用語「カプセル化する」は、囲む、取り囲む、または包むことを意味する。カプセル化は、本開示の分子および／または組成物の配合に関するため、実質的、完全または部分的であり得る。「実質的にカプセル化された」という用語は、本開示の分子および／または組成物の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、または９９．９９９％超が、粒子内に封入されるか、取り囲まれるか、または包み込まれていてもよいことを意味する。「部分的カプセル化」は、本開示の分子および／または組成物の１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％未満が粒子内に封入されるか、取り囲まれるか、または包み込まれてもよいことを意味する。例えば、本開示の分子および／または組成物の少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、または９９．９９９％が粒子内にカプセル化されている。カプセル化は、任意の既知の方法によって決定することができる。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、粒子は、ポリマー粒子であるか、またはポリマーマトリックスを含む。粒子は、一般に、当技術分野で公知のポリマーのいずれかを含有することができる。粒子は、一般に、１種以上の生体適合性ポリマーを含有する。ポリマーは、生分解性ポリマーであり得る。ポリマーは、疎水性ポリマー、親水性ポリマー、または両親媒性ポリマーであり得る。いくつかの実施形態では、粒子は、付着させた追加のターゲティング部分を有する１つ以上のポリマーを含む。いくつかの実施形態では、粒子は、これらに限定されないが、金ナノ粒子および酸化鉄ナノ粒子などの無機粒子である。
【０１８６】
粒子のサイズは、意図する用途に合わせて調整することができる。粒子は、ナノ粒子またはマイクロ粒子であり得る。粒子は、約１０ｎｍ〜約１０ミクロン、約１０ｎｍ〜約１ミクロン、約１０ｎｍ〜約５００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約５００ｎｍ、または約２５ｎｍ〜約２５０ｎｍの直径を有することができる。いくつかの実施形態では、粒子は、約２５ｎｍ〜約２５０ｎｍの直径を有するナノ粒子である。いくつかの実施形態では、粒子は、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍの直径を有するナノ粒子である。いくつかの実施形態では、粒子は、約７０ｎｍ〜約１３０ｎｍの直径を有するナノ粒子である。いくつかの実施形態では、粒子は、約１００ｎｍの直径を有するナノ粒子である。当業者には理解されるように、複数の粒子はある範囲のサイズを有し、直径は、粒子サイズ分布のメジアン直径であると理解される。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される分子および／または組成物は、温度、ｐＨ、およびイオン条件に反応する粒子に組み込まれてもよい。例えば、粒子は、共有結合架橋ホモポリマーイオン化モノマーのイオン化ネットワークを含み得、イオン化ネットワークは、両親媒性コポリマーの単一末端領域に共有結合により付着して、複数の「ダングリング鎖」を形成し、両親媒性コポリマーの「ダングリング鎖」は、米国特許第７，２０４，９９７号に開示のとおり、水溶液中において固定されているネットワーク内凝集体を形成する。
【０１８８】
リポソーム、リポプレックス、および脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）
本開示の分子および／または組成物は、１つ以上のリポソーム、リポプレックス、および／または脂質ナノ粒子を使用して配合され得る。一実施形態では、本開示の分子および／または組成物の医薬用配合物としては、リポソームが挙げられる。リポソームは、人工的に調製された小胞であり、主に脂質二重層から構成され得、栄養素および医薬用配合物を投与するための送達ビヒクルとして使用され得る。リポソームは、これらに限定されないが、直径が数百ナノメートルになり得、狭い水性区画によって分離された一連の同心二重層を含み得る多層小胞（ＭＬＶ）、直径５０ｎｍ以下であり得る小さい単細胞小胞（ＳＵＶ）、および直径５０〜５００ｎｍであり得る大きい単層小胞（ＬＵＶ）など、異なるサイズのものであり得る。リポソーム設計は、これらに限定されないが、リポソームの健康でない組織への付着を改善するため、またはこれに限定されないがエンドサイトーシスなどの事象を活性化するために、オプソニンまたはリガンドを含み得る。リポソームは、医薬用配合物の送達を改善するために低または高ｐＨを含み得る。
【０１８９】
リポソームの形成は、これらに限定されないが、捕捉された医薬用配合物およびリポソーム成分、脂質小胞が分散している媒体の性質、捕捉された物質の有効濃度およびその潜在的毒性、小胞の適用および／または送達の間に伴う任意の追加のプロセス、企図される用途に対する小胞の最適化サイズ、多分散性および有効保存期間、ならびに安全で効率的なリポソーム産物のバッチ間再現性および大規模産生の可能性などの物理化学的特性に依存し得る。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、本開示の分子および／または組成物は、官能化脂質二重層の間に架橋を有し得る脂質小胞中に配合され得る。いくつかの実施形態では、本開示の分子および／または組成物は、脂質−ポリカチオン複合体に配合されてもよい。脂質−ポリカチオン複合体の形成は、当該分野において公知の方法によって達成され得る。非限定的な例として、ポリカチオンは、これらに限定されないが、カチオン性ペプチド、またはポリリジン、ポリオルニチンおよび／もしくはポリアルギニンなどのポリペプチド、ならびにカチオン性ペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示の核酸分子および／または組成物は、これらに限定されないが、コレステロールまたはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）などの中性脂質をさらに含み得る脂質−ポリカチオン複合体中で配合され得る。リポソーム配合物は、これらに限定されないが、カチオン性脂質構成成分の選択、カチオン性脂質飽和度、ＰＥＧ化の性質、全成分の比率、およびサイズなどの生物物理学的パラメータの影響を受ける可能性がある。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）配合物中のＰＥＧの比率を増減することができ、かつ／またはＰＥＧ脂質の炭素鎖長をＣ１４からＣ１８に変更して、ＬＮＰ配合物の薬物動態および／または体内分布を変えることができる。非限定的例として、ＬＮＰ配合物は、カチオン性脂質、ＤＳＰＣおよびコレステロールと比較して、１〜５％の脂質モル比のＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧを含み得る。別の実施形態では、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧは、これらに限定されないが、ＰＥＧ−ＤＳＧ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）またはＰＥＧ−ＤＰＧ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）などのＰＥＧ脂質で置き換えてもよい。カチオン性脂質は、これらに限定されないが、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、Ｃ１２−２００、およびＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡなどの当技術分野において公知の任意の脂質から選択することができる。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰ配合物は、ポリカチオン性組成物を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリカチオン性組成物を含むＬＮＰ配合物は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｅｘ  ｖｉｔｒｏにおいて、本明細書に記載の改変型ＲＮＡを送達するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＬＮＰ配合物は、透過性エンハンサー分子を追加で含み得る。ナノ粒子配合物は、炭水化物担体および改変型核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）を含む炭水化物ナノ粒子であり得る。非限定的な例として、炭水化物担体としては、これらに限定されないが、無水物修飾フィトグリコーゲンまたはグリコーゲン型材料、フィトグリコーゲンオクテニルスクシネート、フィトグリコーゲンベータデキストリン、および無水物修飾フィトグリコーゲンベータデキストリンを挙げることができる。
【０１９３】
脂質ナノ粒子配合物は、カチオン性脂質を、急速排除脂質ナノ粒子（ｒａｐｉｄｌｙ  ｅｌｉｍｉｎａｔｅｄ  ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ、ｒｅＬＮＰ）として公知である生分解性カチオン性脂質で置き換えることによって改善され得る。これらに限定されないが、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、およびＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡなどのイオン化可能なカチオン性脂質は、時間の経過と共に、血漿および組織に蓄積することが示されており、潜在的な毒性源となり得る。急速排除脂質が急速に代謝されることにより、脂質ナノ粒子の耐容性および治療指数が、ラットにおいて、１ｍｇ／ｋｇ用量から１０ｍｇ／ｋｇ用量へ、一桁改善することができる。酵素により分解されたエステル連結を含むことにより、カチオン性構成成分の分解および代謝プロファイルを改善しながらも、ｒｅＬＮＰ配合物の活性を維持することができる。エステル連結は、脂質鎖内の内部に配置されてもよく、または脂質鎖の終結部において、末端に配置されてもよい。内部エステル連結は、脂質鎖中の任意の炭素を置換し得る。
【０１９４】
ＬＮＰ配合物に好適であるカチオン性脂質に関するさらなる情報は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１７／０１５１３３９号に見出すことができる。
【０１９５】
本開示の分子および／または組成物はまた、ポリマー、脂質、および／またはこれらに限定されないが、リン酸カルシウムなどの他の生分解性剤の組み合わせを使用して、ナノ粒子として配合され得る。ナノ粒子の微調整を可能にして、これにより、本開示の分子および／または組成物の送達を増大させ得るように、構成成分をコア−シェル、ハイブリッド、および／または層間のアーキテクチャで組み合わせることができる。
【０１９６】
本開示の医薬用配合物は、本明細書で使用するとき、所望の特定の剤形に適するように、任意のおよびすべての溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散助剤または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤および乳化剤、保存剤、固体結合剤、潤滑剤など、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。この点に関するさらなる情報は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２１版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ、２００６年）に見出すことができ、医薬組成物の配合に使用される種々の賦形剤およびその調製のための公知の技術が開示されている。任意の従来の賦形剤媒体が物質またはその誘導体と相溶性でない場合を除いて、例えば、任意の望ましくない生物学的効果を生じさせることによる、またはそうでなければ医薬組成物の任意の他の構成成分（複数可）と有害な様式で相互作用させることによるなど、その使用は、本開示の範囲内であることが意図される。
【実施例】
【０１９７】
実施例
以下の実施例において、さらなる代替物がさらに詳細に開示される。これらは、決して、特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。
【０１９８】
実施例１
一般的な実験手順
ＤＮＡ鋳型の調製
プラスミドＤＮＡ鋳型を、５０ｎｇ／ｍｌカルバミシリン（Ｔｅｋｎｏｖａカタログ番号ＮＣ９７３０１１６）を補充したＬＢブロス培地（Ｔｅｋｎｏｖａカタログ番号Ｌ８０００  ０６）で増殖させた３００ｍＬの飽和大腸菌ＴｒａｎｓｆｏｒＭａｘ  Ｅｐｉ３００（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅカタログ番号３００１０５）培養物から精製した（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号１２１６３）。プラスミドＤＮＡを、３７℃で１時間、ＮｏｔＩ消化（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ＮＥＢカタログ番号Ｒ３１８９Ｓ）により直線状した。直鎖鋳型ＤＮＡを再精製し（Ｚｙｍｏカタログ番号Ｄ４００３）、市販の２−ｌｏｇ  ＤＮＡラダー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＮＥＢカタログ番号Ｎ３２００Ｓ）に対して、０．８％アガロースゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｇ５０１８−０８）により分析した。単一のバンドの存在が各サンプルにおいて確認され、これは、ｅｘ  ｖｉｔｒｏ転写を進める前に、直鎖ＤＮＡ鋳型の予想される断片サイズに対応するものであった。
【０１９９】
Ｅｘ  ｖｉｔｒｏ転写
Ｅｘ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）反応は、２０μｌの反応物中で上記のように調製した１μｇのＤＮＡ鋳型を用いて、３７°Ｃで、１時間にわたってインキュベーションして行った（ＮＥＢカタログ番号Ｅ２０６５Ｓ）。そして、供給元によって提供された１単位のＤＮａｓｅ  ＩをＩＶＴ反応物に直接添加し、３７℃でさらに１５分間インキュベートした。次に反応物を氷上に置き、製造者が示唆した方法を用いて精製した（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号７４１０４）。次いで、精製したＲＮＡをＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００ｃ  ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計を用いて定量した。エレクトロポレーションを進める前に、ＲＮＡを、０．８％アガロースゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｇ５０１８−０８）を用いて、電気泳動により可視化し、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  ＲＮＡ  Ｍａｒｋｅｒ（Ａｍｂｉｏｎカタログ番号ＡＭ７１５０）と比較した。
【０２００】
トランスフェクションおよび分析
典型的な細胞トランスフェクション実験において、４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｏｎｚａ）用のＳＦ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）キットを用いて、エレクトロポレーションによりレプリコンＲＮＡをＢＨＫ−２１細胞に導入した。０．２５％トリプシンを用いてＢＨＫ−２１細胞を採取し、冷ＰＢＳで１回洗浄した。細胞を、２０μＬのエレクトロポレーション反応物あたり細胞密度１×１０６細胞でＳＦ緩衝液に再懸濁した。３マイクログラムのＲＮＡを、１６ウェルキュベットストリップ中で、三連で細胞にエレクトロポレートし、室温で１０分間インキュベートした。エレクトロポレートされた細胞を、１０％ウシ胎児血清含有ダルベッコ改変イーグル培地を含有するプレートに回収し、続いて標準的な細胞培養条件で１６〜１８時間インキュベートした。
【０２０１】
レプリコントランスフェクション効率およびタンパク質産生の細胞内分析は、フローサイトメトリーにより行った。これらのアッセイでは、トランスフェクトしたＢＨＫ−２１細胞を、固定／パーマ濃縮液および透過処理緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて固定し、透過処理した。次いで、細胞を、Ｒ−フィコエリスリン（Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とコンジュゲートした二本鎖ＲＮＡ産生用抗体（Ｊ２抗ｄｓＲＮＡ  ＩｇＧ２Ａモノクローナル抗体、Ｅｎｇｌｉｓｈ＆Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ）とインキュベートした。抗原産生は、ＰＥ−Ｃｙ５（Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とコンジュゲートした抗原特異的抗体（例えば、赤色発光ホタル、緑色ウミシイタケ、ＨＡ、またはＲＳＶ−Ｆ０（Ａｂｃａｍ））の抗体）とさらにインキュベーションすることにより査定した。次に細胞を１回洗浄し、ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）Ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）ＩＩ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。補償対照のために単色で染色したトランスフェクトＢＨＫ−２１細胞は、サンプル収集前に泳動させた。データは、ＦＡＣＳＤｉｖａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いてさらに分析した。前方および側方散布図を用いて、死滅細胞および破片を排除するために初期ゲーティングを行った。ｄｓＲＮＡ（Ｒ−ＰＥ陽性）およびタンパク質発現（ＧＦＰ発現についてＰＥ−Ｃｙ５陽性またはＦＩＴＣ陽性）の両方について陽性である細胞集団を同定するために、さらにゲーティングを行った。頻度および平均蛍光強度を収集し、構築物の比較および最適化に利用した。
【０２０２】
実施例２
ＤＬＰ含有ＥＡＶレプリコンデザインの構築
この実施例は、ポリタンパク質遺伝子／非構造タンパク質遺伝子および／またはレポーター遺伝子の上流に、作動可能に位置付けられたＤＬＰモチーフを有する複数のアルテリウイルスＲＮＡレプリコンベースの発現ベクターの生成について記載する。これらのアルテリウイルスＲＮＡレプリコンベースの発現ベクターは、その後、実施例４に記載のフローサイトメトリー分析およびバルクルシフェラーゼ分析においてその特徴を明らかにし、かつ分析した。
【０２０３】
Ａ．デザイン
４つのＥＡＶベースのＤＬＰレプリコン構築物のそれぞれの設計上の特徴を、以下に記載する。
【０２０４】
（１）ｒＥＸ−ＤＬＰ−ｒＦＦ
この構築物では、ｒＦＦのすぐ上流およびＴＲＳ７の下流に配置されたＤＬＰモチーフがｒＦＦの転写を駆動する。
【０２０５】
（２）ｒＥＸ−ＤＬＰ−ｐｐ１ａｂ−ｒＦＦ
この構築物では、複製およびサブゲノムｍＲＮＡの転写に必須であることが公知であるレプリコンの５’ＵＴＲにおいて、ステムループ構造を維持するために、以下に記載するいくつかの慎重な設計変更を加えて、ＤＬＰモチーフをｐｐ１ａｂ遺伝子のすぐ上流に配置した。
（ｉ）非構造ウイルス遺伝子１ａの最初の７９ヌクレオチドは、ＡＴＧからＴＡＧに変異したその開始コドンと重複しており、「ＡＴＧシフト領域」として示されている（以下の配列番号２の配列において太字である）。
（ｉｉ）１ａ遺伝子の上流に位置し、その開始コドンＡＴＧと塩基対を形成し、ステムを形成する対応するヌクレオチドもまた、ＣＡＴからＣＴＡに変更された（以下の配列番号２の配列において下線が引いてある）。
（ｉｉｉ）ＤＬＰ（以下の配列でイタリック体で示す）を「ＡＴＧシフト領域」のすぐ下流、かつポリタンパク質１ａｂ遺伝子の上流（以下の配列番号２の配列に示す開始コドンＡＴＧ）に配置した。
【化１】
2020500536.tif 000005
【０２０６】
この構築物は、第２の構築物と本質的に同一であり、２Ａプロテアーゼ配列（配列番号３）がＤＬＰの３’末端にすぐに付加されたことを除いて、ＤＬＰは、同じ３つの設計変更に従って配置され、これにより、翻訳時に、ポリタンパク質が、プロテアーゼによる選択的切断によってＤＬＰ由来ペプチドから放出され得る。レプリコン構築物２（上記）および構築物３による性能の比較分析は、２Ａプロテアーゼが機能的レプリコンに必要であるかについての情報を提供する（以下の実施例４を参照されたい）。
配列番号３
ＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＣＴＡＣＴＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴ
【０２０７】
（４）ｒＥＸ−ＤＬＰ−２Ａ−ｐｐ１ａｂ−ＤＬＰ−ｒＦＦ
この構築物は、別のＤＬＰが、レポーターｒＦＦ遺伝子のすぐ上流に配置されたことを除いて（ＤＬＰモチーフが構築物１に配置されたのと同じ様式で）、上記の第３の構築物と本質的に同一であった。レプリコン構築物３（上記）および構築物４による性能の比較分析は、レポーター遺伝子の上流に配置された追加のＤＬＰが、レポーター遺伝子の発現に付加価値を有するかに関する情報を提供する。
【０２０８】
Ｂ．構築
ｒＥｘ−ＤＬＰ−ｒＦＦは、ベクターとしてのＳｐｈＩおよびＥｃｏＲＩおよびインサートとしてのＤＬＰ含有ｇブロックで消化させたｒＥｘ−ｒＦＦ（ｃ４；配列番号３４）を用いて、Ｇｉｂｓｏｎら（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｕｐ  ｔｏ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｈｕｎｄｒｅｄ  ｋｉｌｏｂａｓｅｓ．Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６、３４３−３４５、２００９年）に記載の３−ｐｉｅｃｅ  Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）手順により構築した。ｒＥｘ−ＤＬＰ−ｒＦＦの構築に使用されたｇブロックの核酸配列は、配列表の配列番号４に記載されている。
【０２０９】
以下のプライマーは、上記の３つの新しいＥＡＶベースのＤＬＰレプリコン構築物を構築するために必要とされる、対応する断片を増幅するように設計された。
【表３】
2020500536.tif 000006
【０２１０】
ｒＥｘ−ＤＬＰ−ｐｐ１ａｂ−ｒＦＦの構築
ｒＥｘ−ＤＬＰ−ｐｐ１ａｂ−ｒＦＦベクターの構築のために、３つの核酸断片を、以下のように、３−ｐｉｅｃｅ  Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）手順を使用することによって生成した。
【０２１１】
断片１は、プライマーＲＰ１１４およびＲＰ１１５、ならびに鋳型骨格ｒＥｘ−ｒＦＦを用いて生成した。
【０２１２】
断片２は、プライマーＲＰ１１６およびＲＰ１１７、ならびに鋳型骨格ｒＥｘ−ｒＦＦを用いて生成した。
【０２１３】
断片３は、配列表の配列番号１０に記載の核酸配列を有するｒＥｘ−ＤＬＰ−ｐｐ１ａｂ−ｒＦＦのｇブロックであった。
【０２１４】
ｒＥｘ−ＤＬＰ−２Ａ−ｐｐ１ａｂ−ｒＦＦの構築
ｒＥｘ−ＤＬＰ−２Ａ−ｐｐ１ａｂ−ｒＦＦベクターの構築のために、３つの核酸断片を、以下のように、３−ｐｉｅｃｅ  Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）手順を使用することによって生成した。
【０２１５】
断片４は、プライマーＲＰ１１８およびＲＰ１１５、ならびに鋳型骨格ｒＥｘ−ｒＦＦを用いて生成した。
【０２１６】
断片５は、プライマーＲＰ１１６およびＲＰ１１７、ならびに鋳型骨格ｒＥｘ−ｒＦＦを用いて生成した。
【０２１７】
断片６は、配列表の配列番号１１に記載の核酸配列を有するｒＥｘ−ＤＬＰ−２Ａ−ｐｐ１ａｂ−ｒＦＦのｇブロックであった。
【０２１８】
ｒＥｘ−ＤＬＰ−２Ａ−ｐｐ１ａｂ−ＤＬＰ−ｒＦＦの構築
ｒＥｘ−ＤＬＰ−２Ａ−ｐｐ１ａｂ−ＤＬＰ−ｒＦＦベクターの構築のために、３つの核酸断片を、以下のように、３−ｐｉｅｃｅ  Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）手順を使用することによって生成した。
【０２１９】
断片７は、プライマーＲＰ１１８およびＲＰ１１５、ならびに鋳型骨格ｒＥｘ−ＤＬＰ−ｒＦＦを用いて生成した。
【０２２０】
断片８は、プライマーＲＰ１１６およびＲＰ１１７、ならびに鋳型骨格ｒＥｘ−ＤＬＰ−ｒＦＦを用いて生成した。
【０２２１】
断片９は、配列表の配列番号１２に記載の核酸配列を有するｒＥｘ−ＤＬＰ−２Ａ−ｐｐ１ａｂ−ＤＬＰ−ｒＦＦのｇブロックであった。
【０２２２】
構築物の会合は、Ｇｉｂｓｏｎら（２００９年、上記）に記載の３−ｐｉｅｃｅ  Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）手順によって実施した。特に、ｒＥｘ−ＤＬＰ−ｐｐ１ａｂ−ｒＦＦ構築物は、断片１、２、および３を使用して構築した。ｒＥｘ−ＤＬＰ−２Ａ−ｐｐ１ａｂ−ｒＦＦ構築物は、断片４、５、および６を用いて構築した。また、ｒＥｘ−ＤＬＰ−２Ａ−ｐｐ１ａｂ−ＤＬＰ−ｒＦＦ構築物は、断片７、８および９を用いて構築した。会合された生成物は、続いてＥＰＩ３００細胞（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ）に形質転換した。各形質転換について、プライマーＲＰ１２６（配列番号１３）およびＲＰ１２７（配列番号１４）を用いて、合計１４４個のコロニーをスクリーニングし、ｒＥｘ−ＤＬＰ−ｐｐ１ａｂ−ｒＦＦについて４個のＰＣＲ陽性クローンを得た。ｒＥｘ−ＤＬＰ−２Ａ−ｐｐ１ａｂ−ｒＦＦでは、３個のＰＣＲ陽性クローンを得て、ｒＥｘ−ＤＬＰ−２Ａ−ｐｐ１ａｂ−ＤＬＰ−ｒＦＦでは、２つのＰＣＲ陽性クローンを得た。その後のＭｉＳｅｑの結果から、クローン４、クローン３および１５、ならびにクローン１８および２０は、それぞれ、ｒＥｘ−ＤＬＰ−ｐｐ１ａｂ−ｒＦＦ、ｒＥｘ−ＤＬＰ−２Ａ−ｐｐ１ａｂ−ｒＦＦ、およびｒＥｘ−ＤＬＰ−２Ａ−ｐｐ１ａｂ−ＤＬＰ−ｒＦＦについて、完全に配列が正しいことが明らかになった。
【表４】
2020500536.tif 000007
【０２２３】
ｒＥｘ−ＤＬＰ−ｒＦＦ、ｒＥｘ−ＤＬＰ−ｐｐ１ａｂ−ｒＦＦ、ｒＥｘ−ＤＬＰ−２Ａ−ｐｐ１ａｂ−ｒＦＦ、およびｒＥｘ−ＤＬＰ−２Ａ−ｐｐ１ａｂ−ＤＬＰ−ｒＦＦのマップも図２Ａ〜２Ｄに示す。
【０２２４】
得られたレプリコンの配列は、以下のように、Ｔ７プロモーターおよび６５AのポリＡテールと共に配列表に開示されている：ｒＥｘ−ＤＬＰ−ｒＦＦ（配列番号１５）、ｒＥｘ−ＤＬＰ−ｐｐ１ａｂ−ｒＦＦ（配列番号１６）、ｒＥｘ−ＤＬＰ−２Ａ−ｐｐ１ａｂ−ｒＦＦ（配列番号１７）、およびｒＥｘ−ＤＬＰ−２Ａ−ｐｐ１ａｂ−ＤＬＰ−ｒＦＦ（配列番号１８）。
【０２２５】
実施例３
ＤＬＰ含有アルファウイルスレプリコンの構築デザイン
この実施例は、ポリタンパク質遺伝子／非構造タンパク質遺伝子および／またはレポーター遺伝子の上流に位置付けられたＤＬＰモチーフを有する複数のアルファウイルスＲＮＡレプリコンベースの発現ベクターの生成について記載する。これらのアルファウイルスＲＮＡレプリコンベースの発現ベクターは、その後、実施例５に記載のフローサイトメトリー分析およびバルクルシフェラーゼ分析において特徴を明らかにし、かつ分析した。
Ａ．デザイン
【０２２６】
３つのアルファウイルスベースのＤＬＰレプリコン構築物のそれぞれの設計上の特徴を以下に記載する。
【０２２７】
（１）アルファ−Ｒ−ＤＬＰ−ｒＦＦ
この構築物では、ＤＬＰをレポーター遺伝子ｒＦＦの開始コドンのすぐ上流に配置した。
【０２２８】
（２）アルファ−Ｒ−ＤＬＰ−２Ａ−ｎｓｐ−ｒＦＦ
この構築物において、ＤＬＰモチーフおよび２Ａペプチド配列（これは、上記実施例２に記載のｒＥｘ−ＤＬＰ−２Ａ−ｐｐ１ａｂ−ｒＦＦレプリコンにおいて使用されたのと同じ配列であった）をコードしている配列は、レプリコンの５’末端内に配置され、複製およびサブゲノムｍＲＮＡ転写のための配列構造要件を潜在的に維持するために、以下に記載のいくつかの慎重な設計変更を行う。
（ｉ）ｎｓｐ１遺伝子の最初の１９５ヌクレオチドは、ＡＴＧからＴＡＧに変異した開始コドンと重複している（以下の配列番号１９の配列において太字で示す）。
（ｉｉ）この１９５のヌクレオチドの重複配列を野生型アルファウイルスの５’ＵＴＲの直後（下記の配列番号１９の配列に下線付きで示す）、続いてＤＬＰ−２Ａ配列（配列中のイタリック体で示す）に配置した。
（ｉｉｉ）ＤＬＰ−２Ａ配列後のｎｓｐ１遺伝子の開始コドンを除去した（以下の配列番号１９の配列中において取り消し線で示す）。
【化２】
2020500536.tif 000008
【０２２９】
(３）アルファ−Ｒ−ＤＬＰ−２Ａ−ｎｓｐ−ＤＬＰ−ｒＦＦ
この構築物は、別のＤＬＰモチーフがレポーターｒＦＦ遺伝子のすぐ上流に配置された以外は、同じ３つの設計変更後、構築物２と本質的に同一である（ＤＬＰモチーフが構築物１に配置されたのと同じ様式）。レプリコン構築物２および３による性能の比較分析は、レポーター遺伝子の上流に配置された追加のＤＬＰがレポーター遺伝子の発現に付加価値を有するかに関する情報を提供する（下記の実施例５を参照されたい）。
【０２３０】
Ｂ．構築
アルファ−Ｒ−ＤＬＰ−ｒＦＦの構築
アルファ−Ｒ−ＤＬＰ−ｒＦＦは、ベクターとしてＥｃｏＲＩ／ＳａｐＩ、インサートとして、ＰＣＲにより鋳型ｒＥｘ−ＤＬＰ−ｒＦＦ（ｃ２、配列番号１５）から増幅させたＤＬＰ−ｒＦＦにより消化させたアルファ−Ｒ−ｅＧＦＰ（ｃ６；配列番号３５）を用いて、プライマーｒＰ１１２（配列番号２０）およびＲＰ１１３（配列番号２１）を用いて、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）手順によって構築し、ｅＧＦＰをＤＬＰ−ｒＦＦに置換させた。クローン２および３は、ＭｉＳｅｑシーケンシングにより、完全に正しい配列であることが確認された。
【表５】
2020500536.tif 000009
【０２３１】
アルファ−Ｒ−ＤＬＰ−２Ａ−ｎｓｐ−ｒＦＦおよびアルファ−Ｒ−ＤＬＰ−２Ａ−ｎｓｐ−ＤＬＰ−ｒＦＦの構築
アルファ−Ｒ−ＤＬＰ−２Ａ−ｎｓｐ−ｒＦＦ（構築物２）およびアルファ−Ｒ−ＤＬＰ−２Ａ−ｎｓｐ−ＤＬＰ−ｒＦＦ（構築物３）は、それぞれのｇブロックをインサート、プライマーＲＰ１２４およびＲＰ１２５（配列番号２３）を用いて、それぞれの鋳型であるアルファ−Ｒ−ｒＦＦ（ｃ６；配列番号３５）およびアルファ−Ｒ−ＤＬＰ−ｒＦＦ（ｃ２；配列番号２６）からＰＣＲ増幅されたベクターとして使用して、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）手順によって構築した。アルファ−Ｒ−ＤＬＰ−２Ａ−ｎｓｐ−ｒＦＦのクローン１および３、ならびにアルファ−Ｒ−ＤＬＰ−２Ａ−ｎｓｐ−ＤＬＰ−ｒＦＦのクローン８および３２は、ＭｉＳｅｑによって完全に正しいことが配列確認された。
【表６】
2020500536.tif 000010
【０２３２】
アルファ−Ｒ−ＤＬＰ−２Ａ−ｎｓｐ−ｒＦＦの構築に使用されたｇブロックの配列は、配列表に配列番号２４として提供されている。アルファ−Ｒ−ＤＬＰ−２Ａ−ｎｓｐ−ＤＬＰ−ｒＦＦの構築に使用されたｇブロックの配列は、配列表に配列番号２５として提供されている。
【０２３３】
アルファ−Ｒ−ｒＦＦ、アルファ−Ｒ−ＤＬＰ−ｒＦＦ、アルファ−Ｒ−ＤＬＰ−２Ａ−ｎｓｐ−ｒＦＦ、およびアルファ−Ｒ−ＤＬＰ−２Ａ−ｎｓｐ−ＤＬＰ−ｒＦＦのマップを、図３Ａ〜図３Ｄに示す。
【０２３４】
得られたレプリコンの配列もまた、以下のように、Ｔ７プロモーターおよび４０AのポリＡテールと共に配列表に提供されている。アルファ−Ｒ−ｒＦＦ（配列番号２６）、アルファ−Ｒ−ＤＬＰ−ｒＦＦ（配列番号２７）、アルファ−Ｒ−ＤＬＰ−２Ａ−ｎｓｐ−ｒＦＦ（ＳＥＱ番号２８）、およびアルファ−Ｒ−ＤＬＰ−２Ａ−ｎｓｐ−ＤＬＰ−ｒＦＦ（配列番号２９）。
【０２３５】
アルファ−Ｒ−ＤＬＰ−２Ａ−ｒＦＦおよびアルファ−Ｒ−ＤＬＰ−２Ａ−ｎｓｐ−ＤＬＰ−２Ａ−ｒＦＦの構築
いかなる特定の理論にも拘束されないが、間に２Ａプロテアーゼを含まずに、ＤＬＰモチーフをレポーター遺伝子ｒＦＦのすぐ上流に配置することは、ＧＯＩのタンパク質発現に悪影響を及ぼし得ると考えられる。この悪影響は、ｒＦＦの５’末端に、ペプチドに翻訳されたＤＬＰ配列が存在することにより、ｒＦＦがここで「融合」タンパク質になったという事実に起因し得る。したがって、２つのアルファウイルス−レプリコン構築物についてのＤＬＰモチーフとｒＦＦ遺伝子との間の２Ａプロテアーゼ配列、アルファ−Ｒ−ＤＬＰ−ｒＦＦおよびアルファ−Ｒ−ＤＬＰ−２Ａ−ｎｓｐ−ＤＬＰなど、２つの新しい構築物を設計および構築し、アルファ−Ｒ−ＤＬＰ−２Ａ−ｒＦＦおよびアルファ−Ｒ−ＤＬＰ−２Ａ−ｎｓｐ−ＤＬＰ−２Ａ−ｒＦＦを、それぞれ生成した。２Ａプロテアーゼペプチド配列を含むことにより、ｒＦＦから、ＤＬＰ配列によってコードされているペプチドの切断が可能になる（以下の実施例５を参照されたい）。
【０２３６】
この目的のために、２つのｇ−ブロック断片を合成し（配列番号３０および３１）、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙを介してＥｃｏＲＶ／ＳｂｆＩで消化したそれぞれのベクターにクローニングした。アルファ−Ｒ−ＤＬＰ−２Ａ−ｒＦＦのクローン１ならびにアルファ−Ｒ−ＤＬＰ−２Ａ−ｎｓｐ−ＤＬＰ−２Ａ−ｒＦＦのクローン８および９は、ＲＰ１２３（配列番号３２）、およびＲＰ９６（Ｐ８９；配列番号９６）を用いたＳａｎｇｅｒシーケンシングにより、完全に正しい配列であることが確認された。
【表７】
2020500536.tif 000011
【０２３７】
アルファ−Ｒ−ＤＬＰ−２Ａ−ｒＦＦおよびアルファ−Ｒ−ＤＬＰ−２Ａ−ｎｓｐ−ＤＬＰ−２Ａ−ｒＦＦの概略マップを図４Ａおよび４Ｂに提供する。
【０２３８】
実施例４
レプリコンを含むＥＡＶベースのＤＬＰの発現解析
上記の実施例２および３に示されるように、サブゲノムｍＲＮＡ上で、レプリコン非構造タンパク質遺伝子またはＧＯＩ遺伝子のいずれかの上流に位置付けたＤＬＰモチーフの操作の影響を決定するために、複数のＥＡＶベースＤＬＰ含有レプリコンを構築した（表８）。
【表８】
2020500536.tif 000012
【０２３９】
ＤＬＰレプリコン構築物の初期特性は、ｅｘ  ｖｉｔｒｏにより明らかにした。ＲＮＡは、上記の実施例１に記載されるように産生し、ＢＨＫ細胞をエレクトロポレーションするために使用した。エレクトロポレーションの後、タンパク質発現について、ＦＡＣ分析、ウエスタンブロットまたはバルクルシフェラーゼアッセイによって、細胞を分析した。
【０２４０】
ＥＡＶベースＤＬＰレプリコン由来の例示的な目的遺伝子（ＧＯＩ）、ｒＦＦルシフェラーゼレポーターの発現レベルを測定するために行われた実験結果の要約を、グラフにより、図５に示す。ＦＡＣ分析およびバルクルシフェラーゼデータの両方を提示する。これらの実験では、４つの異なるＥＡＶ  ＤＬＰレプリコンを以下のように分析した：
１）ｒＥｘ−ＤＬＰ−ｒＦＦ：ＤＬＰモチーフをサブゲノムｍＲＮＡ  ｒＦＦ転写産物の上流に位置付けたＥＡＶベースレプリコン；
２）ｒＥｘ−ＤＬＰ−ｐｐ１ａｂ−ｒＦＦ：ＤＬＰを非構造的ｐｐ１ａｂ遺伝子の上流に位置付けたＥＡＶベースレプリコン；
３）ｒＥｘ−ＤＬＰ−２Ａ−ｐｐ１ａｂ−ｒＦＦ：ＤＬＰモチーフを非構造タンパク質の上流に位置付け、２ＡプロテアーゼペプチドをＤＬＰとｐｐ１ａｂ領域との間に位置付けたＥＡＶベースレプリコン；および
４）ｒＥｘ−ＤＬＰ−２Ａ−ｐｐ１ａｂ−ＤＬＰ−ｒＦＦ：第１のＤＬＰモチーフを非構造タンパク質の上流に位置付け、２ＡプロテアーゼペプチドをＤＬＰとｐｐ１ａｂ領域との間に位置付け、第２のＤＬＰモチーフをｒＦＦサブゲノムｍＲＮＡ転写産物の上流に位置付けたＥＡＶベースレプリコン。
【０２４１】
図５Ａ〜５Ｂに示す結果は、ＥＡＶ非構造タンパク質遺伝子（例えば、ｒＥｘ−ＤＬＰ−ｐｐ１ａｂ−ｒＦＦ、ｒＥｘ−ＤＬＰ−２Ａ−ｐｐ１ａｂ−ｒＦＦ、もしくはｒＥｘ−ＤＬＰ−２Ａ−ｐｐ１ａｂ−ＤＬＰ−ｒＦＦ）、またはｒＦＦレポーター遺伝子サブゲノムＲＮＡ（例えば、ｒＥｘ−ＤＬＰ−ｒＦＦおよびｒＥｘ−ＤＬＰ−２Ａ−ｐｐ１ａｂ−ＤＬＰ−ｒＦＦ）のいずれかの上流にＤＬＰモチーフを操作することにより、４つすべての構築物がほぼ同じエレクトロポレーション効率を示したために、ゲノムＲＮＡ複製に悪影響を及ぼさなかったことを実証している（図５Ａ）。興味深いことに、バルクルシフェラーゼ活性分析は、ｒＥｘ−ＤＬＰ−ｐｐ１ａｂ−ｒＦＦレプリコンが他の３つのレプリコン設計物よりも有意に少ないルシフェラーゼを発現することを実証した（図５Ｂ）。上述のように、任意のＧＯＩの上流にＤＬＰモチーフを組み込むことにより、ＤＬＰ配列に見られるインフレームコドンにコードされているシンドビスキャプシドアミノ酸のＮ末端融合が生じる。ＤＬＰをコードするアミノ酸およびＥＡＶ  ｎｓＰ１タンパク質を用いて生成された融合タンパク質は、サブゲノムＲＮＡを効率的に産生することからＥＡＶ複製複合体に影響を及ぼし、その結果、注目されているｒＦＦ  ＧＯＩ発現レベルの低下をもたらすと考えられる。この研究からの最も注目すべき結果のうちの１つは、非構造タンパク質遺伝子の翻訳を制御するＤＬＰを有するＥＡＶレプリコン構築物（ｒＥｘ−ＤＬＰ−ｐｐ１ａｂ−ｒＦＦ、ｒＥｘ−ＤＬＰ−２Ａ−ｐｐ１ａｂ−ｒＦＦ、およびｒＥｘ−ＤＬＰ−２Ａ−ｐｐ１ａｂ−ＤＬＰ−ｒＦＦ）は、この位置にＤＬＰを有さないレプリコンＲＮＡ（ｒＥｘ−ＤＬＰ−ｒＦＦ）と同程度の効率で翻訳された。他の研究者によって行われた研究からは、この結果は、予測されないものであった。５’シンドビスウイルスサブゲノムＲＮＡ配列（ＤＬＰ領域を含む）を組み込むと、ウイルスに感染した細胞内でのみ効率的に翻訳されることが以前に報告されている。言い換えれば、レポーター遺伝子に関連しているＤＬＰモチーフを含むｍＲＮＡは、シンドビスウイルスに感染していない細胞において、翻訳が不十分であることが報告された。これらの細胞において、先天性免疫活性化の欠如により、ＤＬＰ改変を有さないｍＲＮＡ（すべての細胞ｍＲＮＡ）の翻訳と比較して、ＤＬＰ改変ｍＲＮＡを明確な翻訳上の不利益なものであるとした。ＤＬＰ含有レプリコンベクターが導入された時点では、これらの細胞において先天性免疫系は活性化されていなかったので、これらのＤＬＰ含有ｍＲＮＡ（自己増幅が可能である）は、非常に非効率的な翻訳となるはずである。意外にも、このことは、本明細書に提示された実験では裏付けられなかった。
【０２４２】
続いて、細胞性先天性免疫系を誘導するためにＩＦＮで処理した細胞において、ｒＥｘ−ＤＬＰ−２Ａ−ｐｐ１ａｂ−ｒＦＦ  ＥＡＶレプリコンを調べた。ＢＨＫ細胞のＩＦＮ処理は、ＰＫＲの活性化およびｅＩＦ２αのリン酸化を誘導し、次に、全体的な細胞ｍＲＮＡ翻訳の停止をもたらす。アルテリウイルスは、ＩＦＮ処理に対して感受性が高いことがこれまでに報告されており（Ｌｕｏら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．Ａｕｇ；９１（２）：９９−１０１、２０１１年）、このため、ＩＦＮの曝露に対して応答可能であり、先天性免疫系を誘導するＢＨＫ細胞のＩＦＮ処理が、アルテリウイルスの複製を停止させることになる。先天性免疫系活性化の存在下でのＤＬＰ改変ＥＡＶレプリコンの発現能力の代表例を図６に示す。ｒＥｘ−ＤＬＰ−２Ａ−ｐｐ１ａｂ−ｒＦＦレプリコンは、ＤＬＰモチーフを含むようにされていないＥＡＶレプリコン、すなわちｒＥｘ−ｒＦＦと比較した場合、先天性免疫系の活性化に対して、有意な耐性を示した。対照ｒＥｘ−ｒＦＦレプリコンと比較した場合、ｒＥｘ−ＤＬＰ−２Ａ−ｐｐ１ａｂ−ｒＦＦの複製（図６Ａ）および発現（図６Ｂ）は両方とも、ＩＦＮ処理細胞において有意に高かった。これらのデータは、ＤＬＰ改変ＥＡＶレプリコンは、先天性免疫系の停止を克服することができること、およびこのレプリコンベクターが、自己増幅ＲＮＡ技術における著しい進歩を表していることを実証している。
【０２４３】
実施例５
ＤＬＰ含有ＶＥＥＶレプリコンの発現解析
上記の実施例２および３に示されるように、サブゲノムｍＲＮＡ上で、レプリコン非構造タンパク質遺伝子またはＧＯＩ遺伝子のいずれかの上流に位置付けたＤＬＰモチーフの操作の影響を決定するために、複数のＶＥＥＶベースＤＬＰ含有レプリコンを構築した。
【０２４４】
ＶＥＥＶアルファウイルスレプリコンベクターは、ＥＡＶベースレプリコンベクターの構築と同様の戦略を用いることによって、１つ以上のＤＬＰモチーフを含むように操作した。重要なことに、アルファウイルス属の他のメンバー（ほとんどが、旧世界ウイルスのメンバー）とは異なり、ＶＥＥＶのゲノムは、そのサブゲノムｍＲＮＡの翻訳に関連するＤＬＰモチーフを含まない。ＶＥＥＶ  ＤＬＰレプリコンの最初の分析は、上記の実施例１に記載されているＢＨＫ−２１細胞において行われた。ＢＨＫ−２１細胞は、ＲＮＡ複製に応答してＩＦＮを分泌しないが、これらの細胞は、外因性ＩＦＮに応答して、先天性免疫活性化を誘導することができる。この実験では、４つの異なるアルファウイルスレプリコン構築物の試験を行った。図７に示した実験データは、エレクトロポレーション（０時間）または外因性ＩＦＮ１０００Ｕ／ｍｌによるエレクトロポレーションの３時間後のいずれかにおいて、処理したＢＨＫ細胞における、ＤＬＰ含有アルファウイルスレプリコンの複製、ｒＦＦルシフェラーゼ遺伝子の発現を示す。試験を行ったレプリコンＲＮＡは：
１）アルファ−Ｒ−ｒＦＦ：ＤＬＰが存在していない対照ＶＥＥＶベースレプリコン；
２）アルファ−Ｒ−ＤＬＰ−ｒＦＦ：ＤＬＰモチーフがサブゲノムｍＲＮＡ  ｒＦＦ転写産物の上流に位置付けられているＶＥＥＶベースレプリコン；
３）アルファ−Ｒ−ＤＬＰ−２Ａ−ｎｓｐ−ｒＦＦ：ＤＬＰモチーフが非構造タンパク質の上流に位置付けられ、２ＡプロテアーゼがＤＬＰとｎｓｐ領域との間にあるＶＥＥＶベースレプリコン；および
４）アルファ−Ｒ−ＤＬＰ−２Ａ−ｎｓｐ−ＤＬＰ−ｒＦＦ：第１のＤＬＰモチーフが非構造タンパク質の上流に位置付けられ、２ＡプロテアーゼがＤＬＰとｎｓｐ領域との間にあり、第２のＤＬＰモチーフがｒＦＦサブゲノムｍＲＮＡ転写産物の上流に位置付けられたＶＥＥＶベースレプリコンである。
【０２４５】
ＦＡＣ分析によって検出された陽性細胞の数に対して正規化させたルシフェラーゼ発現の結果を図７に示す。ＶＥＥＶ非構造タンパク質遺伝子の翻訳を制御するＤＬＰモチーフが存在することで、エレクトロポレーション後のＩＦＮ処理の非存在下および存在下の両方において、より高いレポーター遺伝子の発現をもたらすことが観察された（図７Ａ〜７Ｃ）。ｒＦＦ発現の増加は、統計的に有意ではないと考えられ得るが、すべての条件における傾向は、タンパク質の発現が増加したためであった。ＤＬＰ含有ＥＡＶレプリコンに関して実施例４において上述したように、ＤＬＰモチーフは、先天性免疫応答活性化状態にない細胞において、ｍＲＮＡ翻訳に悪影響を有することが予想され得る。その予想に直接的に反して、これらの実験では、ＩＦＮ（図７Ａ）で処理していないＢＨＫ細胞は、ＤＬＰモチーフの取り込みに最大の利益を有するサンプルを表している。
【０２４６】
続いて、２つのＲＮＡレプリコンアルファ−Ｒ−ｒＦＦおよびアルファ−ＤＬＰ−２Ａ−ｎｓｐ−ｒＦＦをＢａｌｂ／ｃマウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで試験を行った。この実験では、マウスを１０匹／動物群で試験した。これらの実験では、等用量のＲＮＡをマウスに筋肉内注射し、全身ＩＶＩＳ（ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングシステム）分析を１週間にわたって行った。全身イメージングは、注射後１日目、３日目および７日目に行った。注射部位で測定された総フラックスを、図８に示す。タンパク質発現のわずかな増加は、ＤＬＰ改変ＶＥＥＶレプリコンよりｅｘ  ｖｉｔｒｏ（図８）で明らかになったが、統計的に有意に高いタンパク質発現が、いずれの測定時点においても、ＤＬＰ改変ＶＥＥＶレプリコンＲＮＡにおいて検出された（図８）。未改変のＶＥＥＶレプリコンベクターは、全細胞タンパク質の最大２０％に達し得る非常に高いタンパク質発現が可能であるため（Ｐｕｓｓｋｏら、１９９７年）、この観察は、重要な利点を表している。ＤＬＰ改変型ＶＥＥＶレプリコンは、この発現能力さえも超え、優れたタンパク質発現を示した。この理由のために、ＤＬＰ改変型アルファウイルスレプリコンベクターは、既存のアルファウイルスレプリコンＲＮＡ技術を超える有意な進歩を表す。
【０２４７】
上記の実施例に示した実験データから引き出すことができる少なくとも３つの予想外の結果が存在する。第一に、細胞が先天性免疫系の活性化状態にない場合、ＤＬＰモチーフは、ｍＲＮＡの翻訳に悪影響を与えることが示されている。本明細書に開示のＤＬＰ含有レプリコンＲＮＡでは、生来の活性化の基底状態の細胞において悪影響を受けていないことが見出された。第二に、特にＤＬＰ含有ＶＥＥＶレプリコンの発現レベルは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、未改変レプリコンよりもさらに高いことが見出された。この観察は、アルファウイルスレプリコンからでさえも、発現レベルが以前の高い歴史的発現レベルより増加し得ることを実証したものである。第三に、すべてのプラス鎖ＲＮＡウイルスは、それらのゲノムの５’および３’末端の両方においてかなりの配列保存性を有する。ＶＥＥＶレプリコンおよびＥＡＶレプリコンの両方が、それらのＲＮＡの５’末端にステムループ構造（ＤＬＰ）の組み込みを受け入れるのに十分に柔軟であるという事実は予想外である。  
【０２４８】
実施例６
ＤＬＰレプリコン発現系を用いた  ｉｎ  ｖｉｖｏ免疫原性反応
アルファウイルスレプリコンベクターは、上記のように、１つ以上のＤＬＰモチーフを含むように操作された。ＤＬＰ配列を含むＲＮＡレプリコンであるアルファ−Ｒ−ｇＤＬＰ−ＨＡを、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏでさらに分析した。この実験では、インフルエンザＡ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）由来のヘマグルチニンをコードする１５μｇ、１．５μｇ、または０．１５μｇのＲＮＡを６週間間隔でマウスに注射した。最後の追加免疫の１４日後、脾臓および血清を採取してＨＡに対する免疫応答を分析した。これらの実験の結果のまとめを図１２Ａ〜図１２Ｃに示す。図１２Ａでは、同程度の用量の未改変レプリコンと比較して、ＤＬＰモチーフ含有構築物においてメモリー前駆体エフェクター細胞（ＭＰＥＣ）の有意な増加が観察された。ＨＡ特異的ＭＰＥＣを、デキストラマー（Ｈ−２  Ｋｄ（ＩＹＳＴＶＡＳＳＬ；配列番号４４））を用いて、他の集団特異的マーカー（ＣＤ８＋ＣＤ４４＋ＣＤ６２ＬＬｏＫＬＲＧ−１ＬｏＩＬ−７ＲａＨｉＣＸＣＲ３Ｈｉ）と共に検出した。注目すべきことに、この利点は、低用量でも観察可能であることであった。図１２Ｂおよび図１２Ｃにおいて、エフェクターＴ細胞応答は、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞ペプチドによる刺激後に、ＩＦＮ−γを分泌していた抗原特異的ＨＡ細胞の数によって測定した。ＤＬＰモチーフを含むレプリコンで免疫した動物は、用量１５μｇおよび１．５μｇでは、有意に高い頻度のサイトカイン発現ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を有する。これらのデータをまとめると、非改変型と比較して、ＤＬＰモチーフを含むレプリコンによって発現した抗原による免疫化に応答したエフェクターおよびメモリーＴ細胞応答の両方において、有意な増加が示されている。
【０２４９】
ＬＮＰ配合物との適合性について、上記のＤＬＰ含有レプリコンを、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏでさらに分析した。この実験では、インフルエンザＡ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）由来のヘマグルチニンをコードする２μｇ、または０．２μｇのＲＮＡを４週間間隔でマウスに注射した。最後の追加免疫の１４日後、脾臓および血清を採取してＨＡに対する免疫応答を分析した。これらの実験のまとめを、図１４Ａ〜図１４Ｃに提示する。図１４Ａ〜１４Ｃでは、Ｔ細胞答およびＢ細胞応答の増加は、ＬＮＰ（カチオン性脂質ナノ粒子）配合物と組み合わせた場合、ＤＬＰモチーフを含有する構築物を用いて観察した。図１４Ａでは、ＨＡ特異的総ＩｇＧ力価は、生理食塩水にレプリコンを投与した群と比較して、ＬＮＰ配合物を用いたすべての用量群において有意に高かった。さらに、図１４Ｂおよび１４Ｃでは、ＨＡ特異的ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞もまた、生理食塩水にレプリコンを投与した群と比較して、ＬＮＰ配合物を用いたすべての用量群において有意に高いことが観察された。このデータをまとめると、ＤＬＰモチーフを含むレプリコン構築物が、代表的な配合物と相溶性であることを実証している。  
【０２５０】
実施例７
ＤＬＰ含有レプリコンを用いた免疫反応の抑制の防止
Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける免疫応答の抑制を妨げる能力について、上記のように構築されたＤＬＰ含有レプリコンをｉｎ  ｖｉｖｏでさらに評価した。これらの実験では、ＤＬＰモチーフの有無にかかわらず、インフルエンザＡ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）由来のヘマグルチニンのコード配列を保持する１．５μｇのｍＲＮＡを４週間間隔でマウスに注射する。注射の約２４時間前に、６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、ウイルス感染をシミュレートするために、水力学的尾静脈注射によって２０μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）または生理食塩水で前処理する。最後の追加免疫から１４日後、これらのマウスの血清を収集して、ヘマグルチニン（ＨＡ）に対する免疫応答を分析する。これらの実験のまとめを、図１３に示す。図１３では、ポリ（Ｉ：Ｃ）で前処理し、未改変レプリコンの用量を受けたマウスにおいて、ＨＡ特異的抗体の血清濃度の有意な減少が観察される。ポリ（Ｉ：Ｃ）群のレベルは、バックグラウンドを有意に上回ることはなかった。対照的に、ポリ（Ｉ：Ｃ）で前処理し、ＤＬＰモチーフを含有する構築物を投与した動物では、血清抗原特異的総ＩｇＧ濃度の有意な減少を示すことはなかった。これらのデータをまとめると、未改変型と比較して、疑似ウイルス感染後のワクチン接種に応答して、ＤＬＰモチーフが、血清抗体レベルの抑制に対して保護することを示している。  
【０２５１】
実施例８
ＤＬＰ含有発現カセットの構築
この実施例は、本開示のいくつかの実施形態による、目的遺伝子、例えば、レポーター遺伝子の上流にシンドビスウイルスＤＬＰエレメントを含むｍＲＮＡをｅｘ  ｖｉｔｒｏ転写するためのプラスミドベクターの作製について記載している。これらの実験で使用した５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）（それぞれ、配列番号３６および配列番号４１）は、ヒトベータグロビン遺伝子由来のものであった。５’ＵＴＲ配列は、Ｔ７プロモーター（配列番号３７）のすぐ下流およびシンドビスウイルスＤＬＰ配列（配列番号３８）の上流に配置した。いくつかの実験では、目的遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列を、ブタテッショウウイルス−１由来の自己触媒性自己切断ペプチド（例えば、自己プロテアーゼペプチド）であるＰ２Ａシグナルを介してＤＬＰに連結した。いくつかの実験では、この場合ＧＯＩとして使用される、不安定化形態のＥＧＦＰレポーター遺伝子（ｄｓＧＦＰ）のコード配列は、マウスオルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子（ＭＯＤＣ）由来のタンパク質分解性ＰＥＳＴ分解シグナルに作動可能に連結されていた。いくつかの他の実験では、赤色発光ホタルルシフェラーゼにより報告された遺伝子のコード配列を目的遺伝子として使用した（以下の実施例９も参照）。しかしながら、任意の目的遺伝子のコード配列が、この構成で配置され得ることが企図される。また、図１５に示すように、ヒトベータグロビン由来の３’ＵＴＲ配列、１２０個のアデニン残基から構成されるポリＡテール、およびＴ７ターミネーターを、ｄｓＧＦＰの終止コドンの下流に隣接して挿入した。上記の構成成分の各々の核酸配列は、以下のとおりである：
【表９−１】
2020500536.tif 000013
【表９−２】
2020500536.tif 000014
【０２５２】
上記の実験では、シンドビスウイルス由来のＤＬＰ配列を使用した。追加的実験は、本開示の核酸分子に、ＳＶ、ＳＦＶ、ＢＥＢＶ、ＲＲＶ、ＳＡＧ、ＧＥＴＶ、ＭＩＤＶ、ＣＨＩＫＶ、およびＯＮＮＶなどの他の旧世界アルファウイルスメンバーからＤＬＰ配列を組み込むために行う。目的遺伝子へのＤＬＰの連結は、Ｐ２Ａなどの自己切断ペプチドの有無にかかわらず、構成することができる。いかなる特定の理論に束縛されるものでもないが、２Ａ配列または他の自己切断ペプチドを必要とするか否かは、遺伝子カセットに挿入される個々の遺伝子に依存するか、またはＤＬＰを包含することによって付加された追加のアミノ酸が、翻訳されたタンパク質の機能に影響を与えるかどうかに依存すると考えられている。本明細書で使用される５’および３’ＵＴＲ配列は、起源にかかわらず、機能的ＵＴＲの任意の他のセットについても変更され得ることがさらに企図される。
【０２５３】
実施例９
ＤＬＰ含有発現カセットにおける遺伝子発現のｅｘ  ｖｉｖｏ評価
ＢＨＫ−２１細胞において、目的遺伝子の発現を増強する能力について、上記のように、１つ以上のＤＬＰモチーフを含むように操作したＤＬＰ含有発現カセット由来のｍＲＮＡをｅｘ  ｖｉｖｏで評価した。対照として、ＤＬＰ配列を欠くがそれ以外は上記のＤＬＰ含有ｍＲＮＡと同一であるｍＲＮＡサンプルを、同じ条件下で並行してアッセイした。これらの実験では、ＢＨＫ−２１細胞を汎発性  Ｉ型インターフェロンまたはビヒクル対照３００、６００または１０００Ｕ／ｍＬで２時間前処理した。前処理後、細胞に、ＤＬＰモチーフを含むかまたは含まないｍＲＮＡ２．５μｇと共に、三連でエレクトロポレートした。細胞は、前処理中に使用したものと同じ濃度のインターフェロンを含有する培地に戻した。ＧＦＰ陽性細胞の頻度および平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、フローサイトメトリーによって、エレクトロポレーションの２時間後、４時間後および２４時間後にアッセイした。ＤＬＰ非含有ｍＲＮＡと比較して、ＤＬＰ含有ｍＲＮＡでは、インターフェロンの存在下で、有意に高い頻度のＧＦＰ陽性細胞を生成することが観察された（図１６Ａ）。
【０２５４】
さらに、ＧＦＰのＭＦＩをＧＦＰ陽性細胞の頻度に対して正規化し、時間に対してプロットした場合、未改変ｍＲＮＡは、２４時間の経過中に産生された全タンパク質の３０％である、統計的に有意な減少によって示されるように、インターフェロン処理に対して感受性が高いことが観察された（図１６Ｂ）。対照的に、ＤＬＰ含有改変ｍＲＮＡは、同じ２４時間の時間中に、対照の未改変ｍＲＮＡを上回る、産生された全タンパク質の３０％である、統計的に有意な増加によって示されるように、インターフェロン処理に対する耐性を示した（図１６Ｃ）。ＤＬＰモチーフの存在によって付与された、インターフェロン処理に対する耐性は、インターフェロンにより処理され、ＤＬＰ含有ｍＲＮＡをエレクトロポレートされた細胞により、未改変ｍＲＮＡをエレクトロポレートされた未処理細胞と同量のタンパク質を産生したという知見によってさらに強化された（図１６Ｃ）。
【０２５５】
実施例１０
ＤＬＰ含有発現カセットにおける遺伝子発現のｉｎ  ｖｉｖｏ評価
Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける目的遺伝子の発現を増強する能力について、上記のように、１つ以上のＤＬＰモチーフを含むように操作されたＤＬＰ含有発現カセット由来のｍＲＮＡをｉｎ  ｖｉｖｏでさらに評価する。この実験では、赤色発光ホタルルシフェラーゼをコードする３０μｇ、１５μｇ、または１．５μｇのＤＬＰ含有ｍＲＮＡを６週間間隔でマウスに注射する。続いて、赤色発光ルシフェラーゼ発現を、注射後１、３、７、１０、１４、２１および２８日目にＩＶＩＳ（ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングシステム）分析によってモニターする。ＤＬＰモチーフを含まないｍＲＮＡを受けた対照動物と比較したとき、ルシフェラーゼ発現の有意な増加が、ＤＬＰ含有ｍＲＮＡを受けたマウスにおいて観察される。
【０２５６】
実施例１１
ＤＬＰ含有ｍＲＮＡを用いた免疫応答の抑制の防止
Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて、目的遺伝子の発現を増強する能力について、上記のようなＤＬＰ含有ｍＲＮＡをｉｎ  ｖｉｖｏでさらに評価する。この実験では、ＤＬＰモチーフの有無にかかわらず、インフルエンザＡ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）由来のヘマグルチ二ンのコード配列を保有する、３０μｇ、１５μｇ、または１．５μｇのｍＲＮＡを４週間間隔でマウスに注射する。注射の約２４時間前に、マウスを２０μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）または生理食塩水で流体力学的尾静脈注射により前処理して、ウイルス感染をシミュレートする。最後の追加免疫から１４日後、これらのマウスの血清を収集して、ヘマグルチニン（ＨＡ）に対する免疫応答を分析する。ＨＡ特異的抗体の血清濃度の有意な減少は、ポリ（Ｉ：Ｃ）で前処理され、ＤＬＰ配列を有さない用量のｍＲＮＡを受けたマウスで観察されると予想される。対照的に、ポリ（Ｉ：Ｃ）で前処理し、ＤＬＰモチーフを含有するｍＲＮＡを投与した動物は、血清抗原特異的総ＩｇＧ濃度の有意な減少を示さないと予想される。
【０２５７】
本開示の特定の代替形態が開示されているが、様々な修正形態および組み合わせが可能であり、かつ添付の特許請求の範囲の真の趣旨および範囲内で企図されることを理解されたい。したがって、本明細書に提示されている正確な要約および開示に対する制限を意図するものではない。
【０２５８】
雑誌記事、テキストブック、刊行物、特許および特許出願を含むがこれらに限定されない、本明細書に開示された参考文献のすべては、それぞれの参考文献が具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されるのと同じ程度まで、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２５９】
本明細書に引用されたいずれの参考文献も、先行技術を構成することを承認するものではない。参考文献の議論は、それらの著者が主張することを述べており、また、発明者らは、引用された文書の正確さおよび適切さに異議を申し立てる権利を留保する。科学雑誌論文、特許文書、およびテキストブックなど、複数の情報源が本明細書において言及されているが、特定の情報源での議論およびコメントはいずれも、決して、こうしたコメントがその分野の一般的な意見として広く受け入れられていることを認めたものと見なすべきではないことは明らかに理解されるであろう。
【０２６０】
本明細書に示されている一般的な組成物および方法の考察は、例示目的のみを意図している。これは、網羅的であること、またはその開示を制限することを意図するものではない。特定の実施形態の個々の態様または特徴は、一般的に、その特定の実施形態に限定されるものではないが、適用可能であれば、交換可能であり、具体的に示されなくても、または説明されていなくても、選択された実施形態において使用され得る。本開示の任意の態様または特徴は、本明細書に開示されている任意の他の態様、特徴、または態様と特徴の組み合わせと組み合わせることができることが明確に企図される。他の代替の組成物、方法、および実施形態は、本開示の検討時に当業者にとって明らかであり、本出願の趣旨および範囲内に含まれるものとする。
【図１】
2020500536.tif 000015
【図２Ａ】
2020500536.tif 000016
【図２Ｂ】
2020500536.tif 000017
【図２Ｃ】
2020500536.tif 000018
【図２Ｄ】
2020500536.tif 000019
【図３Ａ】
2020500536.tif 000020
【図３Ｂ】
2020500536.tif 000021
【図３Ｃ】
2020500536.tif 000022
【図３Ｄ】
2020500536.tif 000023
【図４Ａ】
2020500536.tif 000024
【図４Ｂ】
2020500536.tif 000025
【図５Ａ】
2020500536.tif 000026
【図５Ｂ】
2020500536.tif 000027
【図６Ａ】
2020500536.tif 000028
【図６Ｂ】
2020500536.tif 000029
【図７Ａ】
2020500536.tif 000030
【図７Ｂ】
2020500536.tif 000031
【図７Ｃ】
2020500536.tif 000032
【図８】
2020500536.tif 000033
【図９】
2020500536.tif 000034
【図１０】
2020500536.tif 000035
【図１１Ａ】
2020500536.tif 000036
【図１１Ｂ】
2020500536.tif 000037
【図１２Ａ】
2020500536.tif 000038
【図１２Ｂ】
2020500536.tif 000039
【図１２Ｃ】
2020500536.tif 000040
【図１３】
2020500536.tif 000041
【図１４Ａ】
2020500536.tif 000042
【図１４Ｂ】
2020500536.tif 000043
【図１４Ｃ】
2020500536.tif 000044
【図１５】
2020500536.tif 000045
【図１６Ａ】
2020500536.tif 000046
【図１６Ｂ】
2020500536.tif 000047
【図１６Ｃ】
2020500536.tif 000048
【図１６Ｄ】
2020500536.tif 000049
【配列表】
2020500536000001.app
【国際調査報告】
2020500536.tif 000050
2020500536.tif 000051
2020500536.tif 000052
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