(57)【要約】  本開示は、神経変性疾患病理を誘発するための化合物、組成物、および方法に関する。一態様では、光誘発オリゴマー形成ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列および神経変性疾患標的タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が本明細書で開示される。細胞に神経変性疾患病理を誘発する方法であって、光誘発オリゴマー形成ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列および神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードする発現ベクターであって、第１のヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、発現ベクターを細胞中に導入するステップ；キメラポリペプチドを発現するステップ；ならびに青色光を用いた刺激によりキメラポリペプチドのオリゴマー形成を誘発するステップを含む方法が本明細書で開示される。
2020509748.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光誘発オリゴマー形成ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列および神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項２】
前記光誘発オリゴマー形成ドメインが、ＣＲＹＰＨＲ、ＣＲＹ２ＯＬＩＧ、ＮｃＶＶＤ、ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ、ＮｃＬＯＶ、ＶｆＡＵ１、ＹｔｖＡ、ＥＬ２２２、ＲｓＬＯＶ、およびＡｓＬＯＶ２からなる群から選択される、請求項１に記載のヌクレオチド配列。
【請求項３】
前記光誘発オリゴマー形成ドメインがＮｃＶＶＤである、請求項２に記載のヌクレオチド配列。
【請求項４】
前記光誘発オリゴマー形成ドメインがＣＲＹ２ＯＬＩＧである、請求項２に記載のヌクレオチド配列。
【請求項５】
前記光誘発オリゴマー形成ドメインがＣＲＹＰＨＲである、請求項２に記載のヌクレオチド配列。
【請求項６】
前記光誘発オリゴマー形成ドメインがＬＯＶドメインを含む、請求項１に記載のヌクレオチド配列。
【請求項７】
前記光誘発オリゴマー形成ドメインがＰＨＲドメインを含む、請求項１に記載のヌクレオチド配列。
【請求項８】
神経変性疾患標的タンパク質由来の前記低複雑度ドメインが、ＴＤＰ−４３、アルファシヌクレイン、Ｔａｕ、ＴＩＡ１、ＳＯＤ１、ハンチンチン、アタキシン２、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１、ＥＷＳ  ＲＮＡ結合タンパク質１、およびＴＡＴＡボックス結合タンパク質因子１５からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項９】
神経変性疾患標的タンパク質由来の前記低複雑度ドメインがＴＤＰ−４３である、請求項８に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１０】
神経変性疾患標的タンパク質由来の前記低複雑度ドメインがアルファシヌクレインである、請求項８に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１１】
神経変性疾患標的タンパク質由来の前記低複雑度ドメインがＴａｕである、請求項８に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１２】
光誘発オリゴマー形成ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列および神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードする発現ベクターであって、前記第１のヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、発現ベクター。
【請求項１３】
光誘発オリゴマー形成ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列および神経変性疾患標的タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む細胞。
【請求項１４】
光誘発オリゴマー形成ドメイン；および
神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメイン
を含むキメラポリペプチド。
【請求項１５】
細胞に神経変性疾患病理を誘発する方法であって、
光誘発オリゴマー形成ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列および神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードする発現ベクターであって、前記第１のヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、発現ベクターを前記細胞中に導入するステップ；
前記キメラポリペプチドを発現するステップ；ならびに
青色光を用いた刺激により前記キメラポリペプチドのオリゴマー形成を誘発するステップ
を含む方法。
【請求項１６】
前記光誘発オリゴマー形成ドメインが、ＣＲＹＰＨＲ、ＣＲＹ２ＯＬＩＧ、ＮｃＶＶＤ、ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ、ＮｃＬＯＶ、ＶｆＡＵ１、ＹｔｖＡ、ＥＬ２２２、ＲｓＬＯＶ、およびＡｓＬＯＶ２からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記光誘発オリゴマー形成ドメインがＮｃＶＶＤである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記光誘発オリゴマー形成ドメインがＣＲＹ２ＯＬＩＧである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記光誘発オリゴマー形成ドメインがＣＲＹＰＨＲである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記光誘発オリゴマー形成ドメインがＬＯＶドメインを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記光誘発オリゴマー形成ドメインがＰＨＲドメインを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
神経変性疾患標的タンパク質由来の前記低複雑度ドメインが、ＴＤＰ−４３、アルファシヌクレイン、Ｔａｕ、ＴＩＡ１、ＳＯＤ１、ハンチンチン、アタキシン２、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１、ＥＷＳ  ＲＮＡ結合タンパク質１、およびＴＡＴＡボックス結合タンパク質因子１５からなる群から選択される、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
神経変性疾患標的タンパク質由来の前記低複雑度ドメインがＴＤＰ−４３である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
神経変性疾患標的タンパク質由来の前記低複雑度ドメインがアルファシヌクレインである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
神経変性疾患標的タンパク質由来の前記低複雑度ドメインがＴａｕである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１５〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞がヒト細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記青色光が４０５ｎｍ〜４９９ｎｍの波長を有する、請求項１５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
タンパク質凝集を調節する作用物質を求めてスクリーニングする方法であって、
光誘発オリゴマー形成ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列および神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードする発現ベクターであって、前記第１のヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、発現ベクターを細胞中に導入するステップ；
前記キメラポリペプチドを発現するステップ；
前記細胞を含む培養培地中に前記作用物質を導入するステップ；
青色光を用いた刺激により前記キメラポリペプチドのオリゴマー形成を誘発するステップ；ならびに
前記作用物質によるタンパク質凝集の調節を判定するステップ
を含む方法。
【請求項３０】
前記光誘発オリゴマー形成ドメインが、ＣＲＹＰＨＲ、ＣＲＹ２ＯＬＩＧ、ＮｃＶＶＤ、ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ、ＮｃＬＯＶ、ＶｆＡＵ１、ＹｔｖＡ、ＥＬ２２２、ＲｓＬＯＶ、およびＡｓＬＯＶ２からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記光誘発オリゴマー形成ドメインがＮｃＶＶＤである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記光誘発オリゴマー形成ドメインがＣＲＹ２ＯＬＩＧである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記光誘発オリゴマー形成ドメインがＣＲＹＰＨＲである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記光誘発オリゴマー形成ドメインがＬＯＶドメインを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記光誘発オリゴマー形成ドメインがＰＨＲドメインを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
神経変性疾患標的タンパク質由来の前記低複雑度ドメインが、ＴＤＰ−４３、アルファシヌクレイン、Ｔａｕ、ＴＩＡ１、ＳＯＤ１、ハンチンチン、アタキシン２、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１、ＥＷＳ  ＲＮＡ結合タンパク質１、およびＴＡＴＡボックス結合タンパク質因子１５からなる群から選択される、請求項２９〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
神経変性疾患標的タンパク質由来の前記低複雑度ドメインがＴＤＰ−４３である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
神経変性疾患標的タンパク質由来の前記低複雑度ドメインがアルファシヌクレインである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
神経変性疾患標的タンパク質由来の前記低複雑度ドメインがＴａｕである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項２９〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞がヒト細胞である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記青色光が４０５ｎｍ〜４９９ｎｍの波長を有する、請求項２９〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年３月７日に提出の米国特許仮出願第６２／４６８，０６５号の利益を主張するものであり、前記特許文献の開示は参照により本明細書に明白に組み込む。
【０００２】
本開示は、神経変性疾患病理を誘発するための化合物、組成物、および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
世界は高齢化に向かっている。２０５０年までには、６０歳を超えた個人の割合は２０００年の６億５００万から２０億に倍増している。不運なことに、高齢化は致命的な神経変性疾患を発症する唯一最大の危険因子である。次に、アルツハイマー病（ＡＤ）、レビー小体病（ＬＢＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）などの認知症、ならびにパーキンソン病（ＰＤ）および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの運動障害を抱えた個人の数は著しく増加することになる。合衆国内部でほぼ６５０万の個人が現在こうした疾患の１つを抱えて生活しており、関連するコストは持続不可能なほどである。
【０００４】
合衆国では、ＡＤ、ＰＤ、およびＡＬＳの現在の経済的負担は年間推定２４１０億ドルである。ＡＤおよびＡＬＳ／ＦＴＤ患者は、年間１００，０００ドル〜２５０，０００ドル以上の個人医療費を負担することがある。ＡＤでは、２０１０年の４７０万人から増えて、２０５０年までには合衆国の１３８０万人の個人がそう診断されており、ＡＬＳ患者の世界規模の数は２０４０年までに約３１％増加すると推定されているが、こうした障害に対して効果的な処置は現在存在しない。種々の遺伝子突然変異がこれら神経変性障害の一因となっているが、既知の単一の原因は存在しない。しかし、このような多様性にもかかわらず、それぞれの疾患内のほぼすべての患者が、細胞内タンパク質凝集塊の形態で一般的神経病理学的特質を示している。これらの神経病理を再現する動物モデルでは、現在、遺伝子突然変異または著しく過剰発現するタンパク質を使用する必要があり、これらは患者の病理を模倣しないことが多い。必要とされているのは、細胞株および動物モデルにおいて神経変性疾患病理を誘発するための新しい改良された方法である。
【０００５】
本明細書で開示される化合物、組成物、および方法はこうしたおよび他の必要に取り組む。
【発明の概要】
【０００６】
細胞または動物に神経変性疾患病理を誘発するための化合物、組成物、および方法が本明細書で開示される。発明者らは、遺伝子突然変異または著しく過剰発現している神経変性疾患タンパク質を必要とせずに、細胞および動物に神経変性疾患病理を誘発するための新しい方法を開発した。
【０００７】
一態様では、光誘発オリゴマー形成ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列および神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が本明細書で開示される。
【０００８】
一態様では、光誘発オリゴマー形成ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列および神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードする発現ベクターであって、第１のヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、発現ベクターが本明細書で開示される。
【０００９】
一態様では、光誘発オリゴマー形成ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列および神経変性疾患標的タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む細胞が本明細書で開示される。
【００１０】
一態様では、光誘発オリゴマー形成ドメインおよび神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインを含むキメラポリペプチドが本明細書で開示される。
【００１１】
一態様では、細胞に神経変性疾患病理を誘発する方法であって、
光誘発オリゴマー形成ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列および神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードする発現ベクターであって、第１のヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、発現ベクターを細胞中に導入するステップ；
キメラポリペプチドを発現するステップ；ならびに
青色光を用いた刺激によりキメラポリペプチドのオリゴマー形成を誘発するステップ
を含む方法が本明細書で開示される。
【００１２】
別の態様では、タンパク質凝集を調節する作用物質を求めてスクリーニングする方法であって、
光誘発オリゴマー形成ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列および神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードする発現ベクターであって、第１のヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、発現ベクターを細胞中に導入するステップ；
キメラポリペプチドを発現するステップ；
細胞を含む培養培地中に作用物質を導入するステップ；
青色光を用いた刺激によりキメラポリペプチドのオリゴマー形成を誘発するステップ；ならびに
作用物質によるタンパク質凝集の調節を判定するステップ
を含む方法が本明細書で開示される。
【００１３】
一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、ＣＲＹＰＨＲ、ＣＲＹ２ＯＬＩＧ、ＮｃＶＶＤ、ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ、ＮｃＬＯＶ、ＶｆＡＵ１、ＹｔｖＡ、ＥＬ２２２、ＲｓＬＯＶ、およびＡｓＬＯＶ２からなる群から選択される。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、表２のドメインの一覧から選択される。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはＮｃＶＶＤＹ５０Ｗである。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはＣＲＹ２ＯＬＩＧである。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはＣＲＹＰＨＲである。
【００１４】
一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、ＣＲＹ２ＰＨＲドメイン（例えば、ＣＲＹ２ＰＨＲ、ＣＲＹ２ＯＬＩＧ）または光−酸素−電圧−感知（ＬＯＶ）ドメイン（例えば、ＮｃＶＶＤ、ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ、ＶｆＡＵ１、ＹｔｖＡ、ＥＬ２２２、ＲｓＬＯＶ、ＡｓＬＯＶ２）からなる群から選択される。
【００１５】
一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは、ＴＤＰ−４３、アルファシヌクレイン、Ｔａｕ、Ｆｕｓ、ＴＩＡ１、ＳＯＤ１、ハンチンチン、アタキシン２、ｈｎＲＮＰＡ１、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１、ＥＷＳ  ＲＮＡ結合タンパク質１、およびＴＡＴＡボックス結合タンパク質因子１５からなる群から選択される。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは表３から選択される。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはＴＤＰ−４３である。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはアルファシヌクレインである。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはＴａｕである。
【００１６】
一実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。一実施形態では、細胞はヒト細胞である。
【００１７】
一実施形態では、青色光は４０５ｎｍ〜４９９ｎｍの波長を有する。一実施形態では、青色光は約４６５ｎｍの波長を有する。
【００１８】
添付図は、本明細書に組み込まれその一部を構成するが、下に記載されるいくつかの態様を図解する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１はＡＬＳの遺伝的原因の例および一般的な神経病理を示している。左パネルはＹ軸にＡＬＳを引き起こす遺伝子の数のグラフを示しており、Ｘ軸はそれぞれの突然変異が発見された年を示している。図１、パネルＡは、特にこれらの突然変異がＡＬＳ患者の約１０％でしか見つかっていないので、ＡＬＳが極端な遺伝的多様性を表すことを示している。表１に記載されるように、ＡＬＳのこれら遺伝的原因にもかかわらず、ほぼすべての患者が運動皮質および脊髄において同じ神経病理を示している。右パネルは、ＡＬＳ患者運動皮質由来のパラフィン組織切片のＨおよびＥ染色によるＡＬＳ神経病理の例を示している。ＴＤＰ−４３の細胞質凝集塊が示されている。ＴＤＰ−４３は、＊により表される正常細胞においては主に核にある。ＡＬＳでは、ＴＤＰ−４３は核には存在せず、矢印で示されるように細胞質において凝集している。ＡＬＳは例として使用されているが、細胞質凝集神経病理は多くの神経変性疾患の一般的な特色である。表１を参照されたい。
【図２】図２Ａ〜２Ｂは、例としてＴＤＰ−４３およびＣＲＹ２ＯＬＩＧを使用して、ＬＣＤ／ＩＤＲ／プリオン様ドメインを含有する神経病理凝集タンパク質を光を用いて生成する方法を記載している。種々のタンパク質配置および青色光曝露パラダイムを開発して、ＬＣＤ／ＩＤＲ／プリオン様ドメインを含有するタンパク質およびタンパク質断片のタンパク質凝集を誘発し、核タンパク質の誤局在化を促進し、神経変性疾患の神経病理を再現した。ＴＤＰ−４３はＩＤＲ／ＩＤＤ／プリオン様ドメインを含有する主に核にあるタンパク質であり、例えば、ＡＬＳ、ＦＴＤ、および一部のＡＤ患者では誤局在化し凝集している。ＤＮＡ配列を操作して、青色光に曝露されるとクラスター化するＣＲＹ２ＯＬＩＧタンパク質をコードするアミノ酸配列を生成し、全ＴＤＰ−４３タンパク質（ｃｒｙ２−ＴＤＰ４３−ｍＣｈ）または低複雑度ドメインのみ（ＬＣＤ／ＩＤＤ／プリオン様ドメイン）である融合タンパク質を生成したが、これによりＴＤＰ−４３は凝集易発性になる（Ｃｒｙ２−２７４−ｍＣｈ）。対照として、ＣＲＹ２ＯＬＩＧ単独を使用した。すべての構築物をｍＣｈｅｒｒｙ（ｍＣｈ）と呼ばれる蛍光タンパク質に融合させ、生細胞中でタンパク質を可視化した。ＣＲＹ２ＯＬＩＧ−ｍＣｈは青色光刺激で可逆的にクラスター化するが、ＣＲＹ２ＯＬＩＧ−ＴＤＰ−４３−ｍＣｈまたは切り詰め型ＣＲＹ２ＯＬＩＧ−２７４−ｍＣｈは、特定の青色光刺激パラダイムを用いると非可逆的凝集塊を形成する。図２Ａは、本研究で使用したＣＲＹ２ＯＬＩＧ−ＴＤＰ−４３配置および切り詰め型ＣＲＹ２ＯＬＩＧ−２７４配置の例を示している。図２Ｂは、記載されている技術のモデルを示している。
【図３】図３は、ＮｃＶＶＤ、ＮｃＶＶＤＹ５０ＷまたはＮｃＬＯＶ光受容体を用いたタンパク質の青色光誘発されたオリゴマー形成および凝集を説明する模式図を示している。ＮｃＶＶＤまたはＬＯＶドメインは青色光刺激でホモ二量体化することだけが示されている。オリゴマー形成および凝集を誘発するための光曝露パラダイムを開発した。上のパネルは、青色光（４０５〜４９９ｎｍ）での単回の急性刺激が、目的のタンパク質に融合された場合にＬＯＶタンパク質のホモ二量体化をどのようにして誘発するのかの模式図を示している。下のパネルは、青色光での長時間刺激がプリオン様ドメイン／ＬＣＤ／ＩＤＤを含有するＮｃＶＶＤまたはＬＯＶ融合タンパク質のホモオリゴマー形成を促進することを示している。
【図４−１】図４Ａ〜４Ｅは、低複雑度ドメインタンパク質の光誘発凝集を示している。低複雑度ドメイン（ＬＣＤ）を含有するオプトジェネティクＴＤＰ−４３断片は光刺激で漸進性凝集を起こす。（図４Ａ〜４Ｂ）ＴＤＰ−４３のＣ終端断片（ｏｐｔｏＲＲＭ２＋ＬＣＤ／ｏｐｔｏＬＣＤ）は、ライブ共焦点顕微鏡によりモニターした場合、青色光の短時間パルス（８秒、１０％レーザー出力光、４８８ｎｍ）後急速にオリゴマー形成する。これらのオリゴマーは、Ｃｒｙ２光受容体単独（約１０分で分解）よりもはるかに長く持続する。（図４Ｃ〜４Ｄ）オプトジェネティクＬＣＤ断片も短時間の光パルスに続いて凝集し続け、経時的にサイズが増えていく。（図４Ｅ）ＴＤＰ−４３ＬＣＤの持続的な青色光刺激により細胞において細胞内凝集塊が形成される。光退色後蛍光回復（ＦＲＡＰ）実験は、持続的光ＬＣＤ封入体はＦＲＡＰから回復せず、これらが不溶性であることを示している。
【図４−２】図４−１と同様である。
【図４−３】図４−１と同様である。
【図４−４】図４−１と同様である。
【図５−１】図５Ａ〜５Ｋは、長時間青色光刺激がｏｐｔｏＴＤＰ４３誤局在化および患者ＣＮＳ組織で見られる病理学的特質を再現する凝集を誘発することを示している。ｏｐｔｏＴＤＰ４３−ｍＣｈを発現しているＨＥＫ２９３細胞は、最長３６時間４８８ｎｍ  ＬＥＤ刺激または暗闇に曝露された。（図５Ａ〜５Ｃ）（図５Ｂ）最初に漸進的な細胞質誤局在化を経験するｏｐｔｏＴＤＰ４３を示す代表的画像であり、（図５Ｃ）この誤局在化は、核／細胞質に分画することによって確認された。（図５Ｄ）同時長時間青色光曝露およびハイスループット自動共焦点顕微鏡によって測定した場合、誤局在化に続いてｏｐｔｏＴＤＰ４３が凝集し、凝集の傾向は光曝露が増加するにしたがって増加する。（図５Ｅ）光退色後蛍光回復（ＦＲＡＰ）撮像を実施してｏｐｔｏＴＤＰ４３構造物の動的性質（dynamicity）を評価した。蛍光回復の欠如は、光誘発ｏｐｔｏＴＤＰ４３凝集塊が凝集構造物を暗示する非動的、不動の顆粒であることを示している。（図５Ｆ）ｏｐｔｏＴＤＰ４３構造物の界面活性剤可溶性を細胞下分画することによって評価して、光誘発ｏｐｔｏＴＤＰ４３顆粒の凝集状態を確認した。（左レーン）非オプトジェネティクＴＤＰ−４３（ＴＤＰ４３−ｍＣｈ）は光処理があってもなくても可溶性に変化はなく、ｏｐｔｏＴＤＰ４３（右レーン）は長時間青色光刺激により不溶性画分への徹底的な移行を呈している。外来性完全長ｏｐｔｏＴＤＰ４３の不溶性の増加に加えて（上バンド）、長時間青色光曝露により、異常なｏｐｔｏＴＤＰ４３切断産物（中バンド）、ならびに内在性完全長ＴＤＰ−４３および疾患関連切断産物（下バンド）も、患者組織において観察される細胞可溶化物の界面活性剤不溶性尿素可溶性画分に動員する。（図５Ｇ）外来性光誘発ｏｐｔｏＴＤＰ４３封入体への非オプトジェネティクＴＤＰ−４３種の直接の動員を確かめるため、ＥＧＦＰタグ付けＴＤＰ−４３を、ｏｐｔｏＴＤＰ４３、またはＣｒｙ２光受容体のみの対照と同時発現させた。長時間青色光刺激に曝露された細胞では、ｏｐｔｏＴＤＰ４３封入体とＥＧＦＰ−ＴＤＰ４３の間で強力な共局在が観察され、ｏｐｔｏＴＤＰ４３封入体が他のＴＤＰ−４３種を直接動員する能力が確認される。この動員はＴＤＰ４３：ＴＤＰ４３相互作用に依存していると思われる。なぜならば、青色光曝露に続くＣｒｙ２−ｍＣｈ斑点との共局在は観察されないからである。（図５Ｈ〜５Ｊ）光誘発ｏｐｔｏＴＤＰ４３凝集塊で免疫蛍光分析を実施して、患者組織において見られる病理学的特質を確認した。ｏｐｔｏＴＤＰ４３封入体は（図５Ｈ）ユビキチン化されている、（図５Ｉ）高リン酸化されている、および（図５Ｊ）ｐ６２陽性であると思われ、それらすべてが患者ＣＮＳにおいてＴＤＰ−４３封入体と一緒に観察されている。（図５Ｋ）自動ハイスループット共焦点顕微鏡検査を実施して、光誘発ｏｐｔｏＴＤＰ４３封入体の神経細胞毒性を評価した。ＴＤＰ４３−ｍＣｈまたはｏｐｔｏＴＤＰ４３を発現しているヒトＲｅＮ神経細胞を長時間青色光刺激に曝露し、生存能を縦方向撮像（longitudinal imaging）により同時にモニターした。非オプトジェネティクＴＤＰ４３−ｍＣｈを発現している神経細胞は、青色光曝露があって���なくても生存に有意な減少を示さなかった。しかし、ｏｐｔｏＴＤＰ４３を発現しており青色光刺激に曝露された神経細胞は経時的に生存能の有意な減少を呈しており、ｏｐｔｏＴＤＰ４３封入体には神経毒性があることが示唆される。＊＝ｐ＜．０５、＊＊＝ｐ＜．０１。
【図５−２】図５−１と同様である。
【図５−３】図５−１と同様である。
【図５−４】図５−１と同様である。
【図５−５】図５−１と同様である。
【図５−６】図５−１と同様である。
【図６−１】図６Ａ〜６Ｂは、ＣＲＹ２ＯＬＩＧα−シヌクレインまたはα−シヌクレインＬＯＶの長時間刺激によりクラスター化および凝集が誘発されることを示している。ＣＲＹ２−ａｓｙｎ−ｍＣｈの長時間刺激を試験して、α−シヌクレインタンパク質のクラスター化を誘発した。図６Ａは長時間刺激パラダイムを示し、図６Ｂは光を用いた経時的なα−シヌクレインクラスター化の代表的画像を、図６Ｃでのクラスター化の定量化と共に示している。これらのデータは、このオプトジェネティク方式を用いれば、凝集の傾向がある、すなわち、プリオン様ドメイン／ＬＣＤ／ＩＤＤを含有する複数の神経変性疾患タンパク質のクラスター化および凝集を誘発することが可能であることを示している。図６Ｄは、ＬＯＶ（二量体化光受容体）に融合しているα−シヌクレインがアルファシヌクレイン細胞内クラスターを形成することを示している。図６Ｅは、光誘発α−シヌクレインＬＯＶ凝集塊がセリン１２９でのリン酸化およびｐ６２陽性を含む、シヌクレイン病の病理学的特質を見せることを示している。
【図６−２】図６−１と同様である。
【図６−３】図６−１と同様である。
【図７−１】図７Ａ〜７Ｄは、Ｃｒｙ２−Ｔａｕ融合タンパク質が種々のタウオパチーの病理学的マーカーを見せることを示している。（図７Ａ〜７Ｃ）Ｃｒｙ２光受容体単独またはＣｒｙ２−Ｔａｕ融合タンパク質を発現しているＨＥＫ２９３細胞を長時間青色光刺激（１６時間、４８８ｎｍ、１０ｍＷ）に曝露した。Ｃｒｙ２−Ｔａｕ発現細胞は、ホスホ−Ｔａｕ抗体ＡＴ８（図７Ａ）およびＰＨＦ１（図７Ｂ）、ならびに病理学的形態依存性Ｔａｕ抗体ＭＣ１（図７Ｃ）と共染色する原線維様凝集塊を示している。（図７Ｄ）まとめは、神経原線維濃縮体形成の光誘発後病理学的Ｔａｕ抗体と一緒に共局在化する種々のオプトジェネティクＴａｕ構築物を示している。
【図７−２】図７−１と同様である。
【図８−１】図８Ａ〜８Ｅは、ＬＯＶ−Ｔａｕ融合タンパク質も種々のタウオパチーの病理学的マーカーを見せ、不溶性であることを示している。（図８Ａ〜図８Ｂ）ＶＶＤ−ＴａｕまたはＶｆＡＵ−Ｔａｕ融合タンパク質を発現しているＨＥＫ２９３細胞を長時間青色光刺激（１６時間、４８８ｎｍ、１０ｍＷ）に曝露した。両方の融合タンパク質は、ホスホ−Ｔａｕ抗体ＡＴ８およびＰＨＦ１、ならびに病理学的形態依存性Ｔａｕ抗体ＭＣ１と共染色する。（図８Ｃ）ＶＶＤ−Ｔａｕを発現している分化ＭＡＰ２＋ヒトＲｅＮ神経細胞も、長時間光処理に続き、ＡＴ８と共局在している神経原線維濃縮体形成を示す。（図８Ｄ）光退色後蛍光回復分析を光誘発濃縮体で実施したが蛍光回復の欠如を示しており、非動的不動構造を示している。（図８Ｅ）次に尿素抽出を実施して、ＶＶＤ−Ｔａｕを発現しているＨＥＫ２９３細胞において光処理を用いて不溶性ｔａｕ種を確認した。長時間光に曝露される細胞は、アルツハイマー病および前頭側頭型認知症患者組織に存在する可溶性および不溶性１５０ｋＤａ  ｔａｕ種のレベルの増加を示している。
【図８−２】図８−１と同様である。
【図８−３】図８−１と同様である。
【図９−１】図９Ａ〜９Ｂは、タンパク質配置および光刺激パラダイム組合せに基づくＣＲＹ２またはＶＶＤ融合タンパク質の凝集可能性を示している。研究によれば、Ｃｒｙ２またはＶＶＤ光受容体がクラスター化および活性化を刺激する能力はタンパク質配置ならびに光刺激パラダイムに依存していることが示されている。図９Ａは、ＴＤＰ−４３−ＣＲＹ２ＯＬＩＧ−ｍＣｈタンパク質は誤局在化するが、ＣＲＹ２ＯＬＩＧ−ＴＤＰ−４３−ｍＣｈ配置が見せるような凝集能力を見せないことを示している。同様に、図９Ｂは、ｍＣｈ−ａＳｙｎ−ＮｖＶＶＤＹ５０Ｗが凝集能力をもたないことを示している。このデータは、タンパク質配置および光刺激パラダイムが、神経変性疾患を抱えた患者のＣＮＳ組織において観察される神経病理タンパク質凝集塊を誘発するのに重要であることを示している。
【図９−２】図９−１と同様である。
【図１０−１】図１０Ａ〜１０Ｂは、青色光誘発ＴＤＰ−４３凝集塊または切り詰め型ＬＣＤ／ＩＤＲ／プリオン様ドメイン凝集塊が細胞に毒性であることを示している。図１０Ａは、ＣＲＹ２ＯＬＩＧ−ＴＤＰ２７４−ｍＣｈを発現しているＨＥＫ細胞の急性刺激が１時間以内の病理凝集塊の形成を誘発可能であることを示している。これらの凝集塊は経時的にサイズが増え毒性になることが可能である。図１０Ｂは、神経変性疾患病理の誘発を使用して、毒性を救出し誘発神経変性疾患病理の形成を予防するまたは取り除く治療化合物を同定するためのスクリーニングパイプラインの模式図である。
【図１０−２】図１０−１と同様である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
細胞または動物に神経変性疾患病理を誘発するための化合物、組成物、および方法が本明細書で開示される。発明者らは、遺伝子突然変異または著しく過剰発現している神経変性疾患タンパク質を必要とせずに、細胞および動物に神経変性疾患病理を誘発するための新しい方法を開発した。
【００２１】
今や本発明の実施形態に詳細に言及することとし、その例は図および実施例において説明される。しかし、本発明は多くの異なる形態で具体化してもよく、本明細書で表明される実施形態に限定されると解釈するべきではない。
【００２２】
他に定義されなければ、本明細書で使用されるすべての専門および科学用語は、本開示が属する分野の当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書で使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」およびその変形は、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」およびその変形と同義に使用され、開かれた非限定的用語である。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は種々の実施形態を記載するのに本明細書では使用されたが、用語「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の代わりに使用してより具体的な実施形態を提供することが可能であり、開示もされる。
【００２３】
以下の定義は、本明細書で使用される用語の完全な理解のために提供される。
【００２４】
用語法
本明細書で使用されるように、冠詞「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、冠詞が使用されている文脈が他にはっきりと指示していなければ、「少なくとも１つ」を意味する。
【００２５】
本明細書で使用される用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、量、パーセント、および同類のものなどの測定可能な値に言及する場合、測定可能な値から±２０％、±１０％、±５％、または±１％の変動を包含することを意図している。
【００２６】
本明細書で使用されるように、用語「でもよい（ｍａｙ）」、「任意選択で（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」、および「任意選択ででもよい（ｍａｙ  ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」は互換的に使用され、状態が起こる場合ならびに状態が起こらない場合を含むことが意図されている。
【００２７】
本明細書で使用される用語「核酸」は、ヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドで構成されたポリマーのことである。
【００２８】
本明細書で使用される用語「リボ核酸」および「ＲＮＡ」はリボヌクレオチドで構成されたポリマーのことである。
【００２９】
本明細書で使用される用語「デオキシリボ核酸」および「ＤＮＡ」はデオキシリボヌクレオチドで構成されたポリマーのことである。
【００３０】
用語「オリゴヌクレオチド」は、約２から最長約１００ヌクレオチド長の一本または二本鎖ヌクレオチド多量体を表す。適切なオリゴヌクレオチドは、Beaucage and Carruthers, Tetrahedron Lett., 22:1859-1862 (1981)により記載されるホスホラミダイト法により、またはMatteucci, et al., J. Am. Chem. Soc., 103:3185 (1981)によるトリエステル法により、または市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置もしくはＶＬＳＩＰＳ（商標）技術を使用する他の化学的方法により調製してもよく、前記両文献は参照により本明細書に組み込む。オリゴヌクレオチドが「二本鎖」と呼ばれる場合、オリゴヌクレオチドの対が、水素結合した、典型的には会合しているらせん状アレイ、例えば、ＤＮＡで存在すると、当業者により理解されている。１００％相補性形態の二本鎖オリゴヌクレオチドに加えて、本明細書で使用される用語「二本鎖」は、バルジおよびループなどの構造特色を含む形態も指すことが意図されており、Stryer, Biochemistry, Third Ed., (1988)などの生化学テキストにさらに完全に記載され、この文献はあらゆる目的のために参照により本明細書に組み込む。
【００３１】
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、および「核酸配列」は本明細書では互換的に使用され、ヌクレオチド単量体で構成された一本または二本鎖ポリマーのことである。
【００３２】
用語「ポリペプチド」とは、ペプチド結合で結合された一本鎖のＤ−もしくはＬ−アミノ酸またはＤ−とＬ−アミノ酸の混合物で作られている化合物のことである。
【００３３】
用語「相補的な」とは、プローブ分子とその標的の相互作用する表面の形態的適合性または互いにぴったり合うことである。したがって、標的とそのプローブは相補的であると言うことが可能であり、さらに、接触表面の特徴は互いに相補的である。
【００３４】
用語「ハイブリダイゼーション」とは、核酸の２つまたはそれよりも多い相補鎖の間の非共有結合性の配列特異的相互作用を確立して単一のハイブリッドにする過程のことであり、このハイブリッドは２つの鎖の場合には二重鎖と呼ばれる。
【００３５】
用語「アニールする」とは、熱により分離された（熱的に変性された）相補鎖の再形成（再生）を含む、一本鎖核酸配列が水素結合によって相補的配列に対合し、二本鎖核酸配列を形成する過程のことである。
【００３６】
用語「融解する」とは、高温により二本鎖核酸配列が変性し、鎖間の水素結合を切断することにより二本鎖が分離して２つの一本鎖になることである。
【００３７】
用語「プロモーター」または「調節エレメント」とは、転写開始から上流または下流に位置し、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写を開始させる他のタンパク質の認識および結合に関与している領域または配列決定因子のことである。本明細書に記載される組成物、方式、または方法においては、プロモーターは細菌起源である必要はなく、例えば、ウイルスまたは他の生物由来のプロモーターを使用可能である。用語「調節エレメント」は、プロモーター、エンハンサー、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、および他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナルおよびポリＵ配列などの転写終結シグナル）を含むことが意図されている。そのような調節エレメントは、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載されている。調節エレメントは、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指示するエレメントおよびある特定の宿主細胞だけにおいてヌクレオチド配列の発現を指示するエレメント（例えば、組織特異的調節配列）を含む。組織特異的プロモーターは、筋肉、神経細胞、骨、皮膚、血液、特定の器官（例えば、肝臓、膵臓）、または特定の細胞型（例えば、リンパ球）などの主に目的の所望の組織において発現を指示してもよい。調節エレメントは、細胞周期依存性または発生段階依存性の様式でなどの時間依存性様式で発現を指示してもよく、その様式は組織または細胞型特異的であってもそうでなくてもよい。一部の実施形態では、ベクターは、１つもしくは複数のｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５、またはそれよりも多いｐｏｌ  Ｉプロモーター）、１つもしくは複数のｐｏｌ  ＩＩプロモーター（例えば、１、２、３、４、５、またはそれよりも多いｐｏｌ  ＩＩプロモーター）、１つもしくは複数のｐｏｌ  Ｉプロモーター（例えば、１、２、３、４、５、またはそれよりも多いｐｏｌ  Ｉプロモーター）、またはその組合せを含む。ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの例は、Ｕ６およびＨ１プロモーターを含むがこれらに限定されない。ｐｏｌ  ＩＩプロモーターの例は、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択でＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意選択でＣＭＶエンハンサーを有する）［例えば、Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)参照］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、βアクチンプロモーター、リン酸グリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーターを含むがこれらに限定されない。用語「調節エレメント」により、ＷＰＲＥなどのエンハンサーエレメント；ＣＭＶエンハンサー；ＨＴＬＶ−ＩのＬＴＲにおけるＲ−Ｕ５’セグメント（Mol. Cell. Biol., Vol. 8(1), p. 466-472, 1988）；ＳＶ４０エンハンサー；およびウサギβグロブリンのエキソン２と３の間のイントロン配列（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 78(3), p. 1527-31, 1981）も包含される。発現ベクターの設計は形質転換される宿主細胞の選択、所望の発現レベルなどの要因に依存することが可能であることは当業者であれば認識する。
【００３８】
用語「組換え」とは、ヒト操作された核酸（例えば、ポリヌクレオチド）またはヒト操作された核酸（例えば、ポリヌクレオチド）のコピーもしくは相補体、あるいは、タンパク質（すなわち、「組換えタンパク質」）に関する場合は、組換え核酸（例えば、ポリヌクレオチド）によりコードされるタンパク質のことである。実施形態では、第２の核酸（例えば、ポリヌクレオチド）に作動可能に連結されたプロモーターを含む組換え発現カセットは、ヒト操作の結果として（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989) or Current Protocols in Molecular Biology Volumes 1-3, John Wiley & Sons, Inc. (1994-1998)に記載される方法により）第２の核酸（例えば、ポリヌクレオチド）にとり異種であるプロモーターを含んでいてもよい。別の例では、組換え発現カセットは、核酸（例えば、ポリヌクレオチド）が天然に見出されることが極めてなさそうな方法で組み合わされた核酸（例えば、ポリヌクレオチド）を含んでいてもよい。例えば、ヒト操作制限部位またはプラスミドベクター配列は、第２の核酸（例えば、ポリヌクレオチド）に隣接しているまたはそれからプロモーターを分離していてもよい。当業者であれば、核酸（例えば、ポリヌクレオチド）は多くのやり方で操作可能であり上の例に限定されないことを認識している。
【００３９】
用語「発現カセット」とは、核酸構築物のことであり、これは宿主細胞中に導入されると、それぞれＲＡＮの転写および／またはポリペプチドの翻訳をもたらす。実施形態では、第２の核酸（例えば、ポリヌクレオチド）に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットは、ヒト操作の結果として（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989) or Current Protocols in Molecular Biology Volumes 1-3, John Wiley & Sons, Inc. (1994-1998)に記載される方法により）第２の核酸（例えば、ポリヌクレオチド）にとり異種であるプロモーターを含んでいてもよい。一部の実施形態では、第２の核酸（例えば、ポリヌクレオチド）に作動可能に連結されたターミネーター（または終結配列）を含む発現カセットは、ヒト操作の結果として第２の核酸（例えば、ポリヌクレオチド）にとり異種であるターミネーターを含んでいてもよい。一部の実施形態では、発現カセットは、ヒト操作の結果として第２の核酸（例えば、ポリヌクレオチド）に作動可能に連結されたプロモーターおよび第２の核酸（例えば、ポリヌクレオチド）に作動可能に連結されたターミネーターを含む。一部の実施形態では、発現カセットは内在性プロモーターを含む。一部の実施形態では、発現カセットは内在性ターミネーターを含む。一部の実施形態では、発現カセットは合成（または非天然）プロモーターを含む。一部の実施形態では、発現カセットは合成（または非天然）ターミネーターを含む。
【００４０】
用語「同一の」またはパーセント「同一性」とは、２つまたはそれよりも多い核酸またはポリペプチド配列という文脈では、下記のデフォルトパラメータを用いてＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを使用して、または手動アラインメントおよび目視検査により測定した場合（例えば、ＮＣＢＩウェブサイトまたは同類のもの参照）、同じであるまたは同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの特定のパーセント（すなわち、比較窓または指示領域にわたり最大一致を求めて比較し整列させた場合特定の領域にわたって、約６０％同一性、好ましくは６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性）を有する２つまたはそれよりも多い配列または部分配列のことである。次に、そのような配列は「実質的に同一である」と言われる。この定義は、試験配列の相補体も指し、またはこれに適用してもよい。定義は、欠失および／または付加を有する配列、ならびに置換を有する配列も含む。下記の通り、好ましいアルゴリズムはギャップおよび同類のものを説明することが可能である。好ましくは、同一性は、少なくとも約１０アミノ酸もしくは２０ヌクレオチド長である領域にわたって、またはさらに好ましくは１０〜５０アミノ酸もしくは２０〜５０ヌクレオチド長である領域にわたって存在する。本明細書で使用されるように、パーセント（％）アミノ酸配列同一性は、最大パーセント配列同一性を達成するために、配列を整列させ必要な場合にはギャップを導入した後の、候補配列において参照配列中のアミノ酸に同一であるアミノ酸のパーセントと定義される。パーセント配列同一性を決定するためのアラインメントは、当分野の技術内にある種々のやり方で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公表されているコンピュータソフトウェアを使用して達成することが可能である。比較されている配列の完全長にわたり最大アラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータは、公知の方法により決定することが可能である。
【００４１】
配列比較では、典型的には１つの配列が参照配列として働き、この配列と試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列をコンピュータに入れ、必要な場合には、部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。好ましくは、デフォルトプログラムパラメータを使用可能である、または代替のパラメータを指定することが可能である。次に、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列と比べて試験配列についてパーセント配列同一性を計算する。
【００４２】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらのアルゴリズムはそれぞれAltschul et al. (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, and Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を通して公開されている。このアルゴリズムは、クエリー配列中の長さＷの短いワードを確認することにより先ず高スコアリング配列対（ＨＳＰ）を確認し、このワードはデータベース配列中の同じ長さのワードと整列させた場合、一部の陽性値を持つ閾値スコアーＴと適合するまたは満たす。Ｔは近隣ワードスコアー閾値と呼ばれる（Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410）。これら最初の近隣ワードヒットは、それを含有するもっと長いＨＳＰを見つける探索を開始するためのシードとして働く。ワードヒットは、累積アラインメントスコアーを増やすことが可能である限りそれぞれの配列に沿って両方向に延ばされる。累積スコアーは、ヌクレオチド配列では、パラメータＭ（適合残基の対についてのリワードスコアー；常に＞０）およびＮ（不適合残基についてのペナルティースコアー；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列では、スコアリングマトリックスを使用して累積スコアーを計算する。それぞれの方向でのワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアーがその最大到達値から量Ｘ低下する；１つまたは複数のマイナススコアリング残基アラインメントの蓄積のせいで、累計スコアーがゼロもしくはそれよりも下に下がる；またはどちらかの配列の末端に到達すると停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸはアラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列では）は、デフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列では、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとしてワード長３、および期待値（Ｅ）１０を使用し、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915参照）はアラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。
【００４３】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２つの配列の類似性の統計解析も実施する（例えば、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの尺度は最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の適合が偶然起きると考えられる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸と参照核酸の比較での最小合計確率が約０．２未満、さらに好ましくは約０．０１未満である場合、核酸は参照配列に類似していると見なされる。
【００４４】
語句「コドン最適化された」とは、それが種々の宿主の形質転換のための遺伝子または核酸分子のコード領域に言及する場合、ＤＮＡによりコードされるポリペプチドを変更することなく選択された生物の典型的なコドン使用を反映するための遺伝子またはポリ核酸分子のコード領域におけるコドンの変更のことである。そのような最適化は、少なくとも１つ、または１つよりも多い、または著しい数のコドンの代わりに、その選択された生物の遺伝子において比較的頻繁に使用される１つまたは複数のコドンを使用することを含む。
【００４５】
核酸は、それが別の核酸配列と機能的な関係に置かれると、「作動可能に連結される」。例えば、シグナルペプチドもしくは分泌リーダーのためのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するタンパク質前駆体として発現される場合、ポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結されており、プロモーターもしくはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されており、またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように位置する場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般的に、「作動可能に連結された」とは、連結されているＤＮＡ配列が互いに近くにあり、分泌リーダーの場合は、近接していてリーディング相にあることを意味する。しかし、作動可能に連結された核酸（例えば、エンハンサーおよびコード配列）は近接している必要はない。連結は、都合の良い制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが従来の慣行に従って使用される。実施形態では、プロモーターは、それがそのコード配列からのタンパク質の発現に影響を及ぼす（例えば、プロモーターの非存在と比べて調節する）ことができる（すなわち、コード配列はプロモーターの転写制御下にある）場合は、コード配列に作動可能に連結されている。
【００４６】
本明細書で使用される用語「変異体」または「誘導体」とは、１つまたは複数のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を有する親タンパク質のアミノ酸配列由来のアミノ酸配列のことである。
【００４７】
キメラ構築物
一態様では、光誘発オリゴマー形成ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列および神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が本明細書で開示される。
【００４８】
一態様では、光誘発オリゴマー形成ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列および神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードする発現ベクターであって、第１のヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、キメラポリペプチドをコードする発現ベクターが本明細書で開示される。
【００４９】
一部の実施形態では、キメラポリペプチドをコードする発現ベクターは、プラスミドにまたはウイルスもしくはウイルスベクターに含まれる。プラスミドまたはウイルスベクターは染色体外複製が可能であり、任意選択で、宿主ゲノムに組み込まれることが可能である。本明細書で使用されるように、発現ベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター）に関連して使用される用語「組み込まれる」とは、発現ベクターまたはその部分が宿主細胞の染色体ＤＮＡ中に組み込まれる（物理的に挿入されるまたはライゲートされる）ことを意味する。本明細書で使用されるように、「ウイルスベクター」とは、真核細胞に実質的な病原性効果を引き起こさずに真核細胞中に導入することが可能な遺伝物質を含有するウイルス様粒子のことである。広範囲なウイルスまたはウイルスベクターが、形質導入に使用することが可能であるが、ウイルスまたはウイルスベクターが形質導入される細胞型に適合するべきである（例えば、低毒性、細胞に進入する能力）。適切なウイルスおよびウイルスベクターは、とりわけ、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルスを含む。一部の実施形態では、キメラポリペプチドをコードする発現ベクターは、ネイキッドＤＮＡであるまたはナノ粒子（例えば、リポソーム小胞、多孔性シリコンナノ粒子、金−ＤＮＡコンジュゲート粒子、ポリエチレンイミンポリマー粒子、カチオン性ペプチド、等）に含まれる。
【００５０】
本明細書に開示される発現ベクターは、一部の実施形態では、神経変性疾患病理に関与しているタンパク質の発現レベルを実質的に変更せずに細胞に神経変性疾患病理を誘発する（例えば、タンパク質の凝集を誘発する）ことができる。例えば、および限定せずに、発現ベクターは、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインを有するタンパク質の凝集を、同じ低複雑度ドメインを含む内在性標的タンパク質の発現レベルを実質的に増加するまたは減少することなく、誘発することが可能である。したがって、キメラポリペプチドをコードする本明細書に開示されるヌクレオチド配列を含む細胞は、キメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含まない同じ細胞型の細胞と比べた場合、低複雑度ドメインを含む内在性神経変性疾患標的タンパク質の実質的に変化していない発現レベルを有することが可能である。本明細書で使用される用語「実質的に変化していない発現レベル」とは、たとえあるにしても、細胞に神経変性疾患病理を引き起こすまたはこれを誘発することに関連することが分からないまたは疑われない程度の発現レベルの変化のことである。
【００５１】
本明細書に開示される発現ベクターは、一部の実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインの野生型形態を使用して細胞に神経変性疾患病理を誘発する（例えば、タンパク質の凝集を誘発する）ことができる。したがって、一部の実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは、野生型配列とは異なっており、細胞に神経変性疾患病理を引き起こすまたはこれを誘発することに関連することが分かっているまたは疑われる突然変異を含まない。例えば、および限定せずに、発現ベクターは、ＡＬＳを引き起こすまたは関連することが分かっているＱ３３１Ｋなどの突然変異を含有しない野生型ＴＤＰ−４３タンパク質由来の低複雑度ドメインを含むことが可能である。
【００５２】
一態様では、光誘発オリゴマー形成ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列および神経変性疾患標的タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む細胞が本明細書で開示される。
【００５３】
一部の実施形態では、細胞は、神経変性疾患により影響を受けることが可能な細胞である。例えば、細胞はグリア細胞または神経細胞が可能である。
【００５４】
一態様では、光誘発オリゴマー形成ドメインおよび神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインを含むキメラポリペプチドが本明細書で開示される。
【００５５】
一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、ＣＲＹＰＨＲ、ＣＲＹ２ＯＬＩＧ、ＮｃＶＶＤ、ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ、およびＮｃＬＯＶからなる群から選択される。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、ＣＲＹＰＨＲ、ＣＲＹ２ＯＬＩＧ、ＮｃＶＶＤ、ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ、ＮｃＬＯＶ、ＶｆＡＵ１、ＹｔｖＡ、ＥＬ２２２、ＲｓＬＯＶ、およびＡｓＬＯＶ２からなる群から選択される。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、表２のドメインの一覧から選択される。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、ＣＲＹＰＨＲ、ＣＲＹ２ＯＬＩＧ、ＮｃＶＶＤ、ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ、ＮｃＬＯＶ、ＶｆＡＵ１、ＹｔｖＡ、ＥＬ２２２、ＲｓＬＯＶ、またはＡｓＬＯＶ２の変異体から選択される。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、ＣＲＹＰＨＲ、ＣＲＹ２ＯＬＩＧ、ＮｃＶＶＤ、ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ、ＮｃＬＯＶ、ＶｆＡＵ１、ＹｔｖＡ、ＥＬ２２２、ＲｓＬＯＶ、またはＡｓＬＯＶ２の断片から選択される。
【００５６】
一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはＮｃＶＶＤＹ５０Ｗである。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはＣＲＹ２ＯＬＩＧである。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはＣＲＹＰＨＲである。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、ＶＶＤタンパク質由来のＬＯＶドメインを含む。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、ＬＯＶタンパク質由来のＬＯＶドメインを含む。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはＰＨＲドメインを含む。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、ＣＲＹ２タンパク質由来のＰＨＲドメインを含む。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはＶｆＡＵ１である。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはＹｔｖＡである。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはＥＬ２２２である。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはＲｓＬＯＶである。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはＡｓＬＯＶ２である。
【００５７】
一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはＣＲＹＰＨＲに少なくとも９０％同一である。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはＮｃＶＶＤに少なくとも９０％同一である。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはＮｃＶＶＤＹ５０Ｗに少なくとも９０％同一である。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはＮｃＬＯＶに少なくとも９０％同一である。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはＣＲＹ２ＯＬＩＧに少なくとも９０％同一である。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはＶｆＡＵ１に少なくとも９０％同一である。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはＹｔｖＡに少なくとも９０％同一である。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはＥＬ２２２に少なくとも９０％同一である。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはＲｓＬＯＶに少なくとも９０％同一である。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはＡｓＬＯＶ２に少なくとも９０％同一である。
【００５８】
一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ＣＲＹＰＨＲ、ＣＲＹ２ＯＬＩＧ、ＮｃＶＶＤ、ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ、ＮｃＬＯＶ、およびＶｆＡＵ１ＬＯＶからなる群から選択される光誘発オリゴマー形成ドメインをコードするヌクレオチド配列を含むことが可能である。
【００５９】
一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号９２；配列番号９３；配列番号９９；配列番号１００；配列番号１０１；または配列番号１０２に少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むことが可能である。一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号９２；配列番号９３；配列番号９９；配列番号１００；配列番号１０１；または配列番号１０２に少なくとも７５％同一である、少なくとも８０％同一である、少なくとも８５％同一である、少なくとも９０％同一である、少なくとも９５％同一である、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列をコードすることが可能である。一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、配列番号１；配列番号２；配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号９２；配列番号９３；配列番号９９；配列番号１００；配列番号１０１；または配列番号１０２を含むことが可能である。一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、配列番号９４を含むことが可能である。ヌクレオチド配列は、本明細書に開示されるアミノ酸配列をコードする野生型核酸配列のヌクレオチド配列が可能である。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は野生型配列から改変されるが、遺伝コードの縮重のせいで、それでも同じアミノ酸配列をコードすることが可能である。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、本明細書に開示される配列のうちの１つの変異体である（または変異タンパク質配列をコードする）。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、本明細書の核酸のうちの１つの断片である、または本明細書に開示されるアミノ酸のうちの１つの断片をコードする。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コドン最適化されている（例えば、発現を改良するために）。
【００６０】
一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、ＣＲＹ２ＰＨＲドメイン（例えば、ＣＲＹ２ＰＨＲ、ＣＲＹ２ＯＬＩＧ）または光−酸素−電圧−感知（ＬＯＶ）ドメイン（例えば、ＮｃＶＶＤ、ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ、ＶｆＡＵ１、ＹｔｖＡ、ＥＬ２２２、ＲｓＬＯＶ、ＡｓＬＯＶ２）からなる群から選択される。
【００６１】
一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは、ＴＤＰ−４３、アルファシヌクレイン、Ｔａｕ、Ｆｕｓ、ＴＩＡ１、ＳＯＤ１、ハンチンチン、アタキシン２、およびｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１からなる群から選択される。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは、ＴＤＰ−４３、アルファシヌクレイン、Ｔａｕ、Ｆｕｓ、ＴＩＡ１、ＳＯＤ１、ハンチンチン、アタキシン２、ｈｎＲＮＰＡ１、およびｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１からなる群から選択される。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは、ＴＤＰ−４３、アルファシヌクレイン、Ｔａｕ、Ｆｕｓ、ＴＩＡ１、ＳＯＤ１、ハンチンチン、アタキシン２、ｈｎＲＮＰＡ１、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１、ＥＷＳ  ＲＮＡ結合タンパク質１、およびＴＡＴＡボックス結合タンパク質因子１５からなる群から選択される。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは、ＴＤＰ−４３、アルファシヌクレイン、Ｔａｕ、ＴＩＡ１、ＳＯＤ１、ハンチンチン、アタキシン２、ｈｎＲＮＰＡ１、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１、ＥＷＳ  ＲＮＡ結合タンパク質１、またはＴＡＴＡボックス結合タンパク質因子１５の変異体から選択される。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは、ＴＤＰ−４３、アルファシヌクレイン、Ｔａｕ、ＴＩＡ１、ＳＯＤ１、ハンチンチン、アタキシン２、ｈｎＲＮＰＡ１、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１、ＥＷＳ  ＲＮＡ結合タンパク質１、またはＴＡＴＡボックス結合タンパク質因子１５の断片から選択される。一実施形態では、ＴＤＰ−４３、アルファシヌクレイン、Ｔａｕ、ＴＩＡ１、ＳＯＤ１、ハンチンチン、アタキシン２、ｈｎＲＮＰＡ１、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１、ＥＷＳ  ＲＮＡ結合タンパク質１、またはＴＡＴＡボックス結合タンパク質因子１５の断片は、それぞれの神経変性疾患標的タンパク質内に低複雑度ドメイン（またはその断片）を含む。
【００６２】
一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは表３から選択される。一実施形態では、低複雑度ドメインは、神経変性疾患において凝集する任意の神経変性疾患標的タンパク質由来である。
【００６３】
一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは、ＴＤＰ−４３、アルファシヌクレイン、Ｔａｕ、Ｆｕｓ、ＴＩＡ１、ＳＯＤ１、ハンチンチン、アタキシン２、ｈｎＲＮＰＡ１、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１、ＥＷＳ  ＲＮＡ結合タンパク質１、およびＴＡＴＡボックス結合タンパク質因子１５に少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択される。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは、表３から選択される神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインに少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択される。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは、ＴＤＰ−４３、アルファシヌクレイン、Ｔａｕ、Ｆｕｓ、ＴＩＡ１、ＳＯＤ１、ハンチンチン、アタキシン２、ｈｎＲＮＰＡ１、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１、ＥＷＳ  ＲＮＡ結合タンパク質１、およびＴＡＴＡボックス結合タンパク質因子１５からなる群のオルソログから選択される。
【００６４】
一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは、ＴＤＰ−４３、アルファシヌクレイン、Ｔａｕ、Ｆｕｓ、ＴＩＡ１、ＳＯＤ１、ハンチンチン、アタキシン２、ｈｎＲＮＰＡ１、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１、ＥＷＳ  ＲＮＡ結合タンパク質１、およびＴＡＴＡボックス結合タンパク質因子１５（またはその断片）に少なくとも６０％（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択される。
【００６５】
一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはＴＤＰ−４３である。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはアルファシヌクレインである。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはＴａｕである。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはＦｕｓである。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはＴＩＡ１である。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはＳＯＤ１である。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはハンチンチンである。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはアタキシン２である。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはｈｎＲＮＰＡ１である。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１である。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはＥＷＳ  ＲＮＡ結合タンパク質１である。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはＴＡＴＡボックス結合タンパク質因子１５である。
【００６６】
一実施形態では、ＶＶＤ光誘発オリゴマー形成ドメインはＴＤＰ−４３の低複雑度ドメインに融合される。一実施形態では、ＶＶＤ光誘発オリゴマー形成は完全長ＴＤＰ−４３（低複雑度ドメインを含む）に融合される。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、神経変性疾患において凝集する任意の神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインに融合される。
【００６７】
一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはＴＤＰ−４３の低複雑度ドメインに融合され、ＴＤＰ−４３の低複雑度ドメインの配列は、配列番号９５；配列番号９６；配列番号９７；または配列番号９８（またはその断片）を含む。
【００６８】
一実施形態では、キメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、蛍光タンパク質（蛍光によりタンパク質凝集塊の視覚化を可能にする）などのレポータータンパク質をコードする第３のヌクレオチド配列をさらに含んでもよい。一実施形態では、蛍光タンパク質はｍＣｈｅｒｒｙ（ｍＣｈ）である。一部の実施形態では、蛍光タンパク質はＧＦＰまたはＹＦＰである。一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、シロイヌナズナ（Arabidopsis）クリプトクロム２タンパク質のＰＨＲドメイン（例えば、ＣＲＹＰＨＲ）を含む光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能である。一部の実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、例えば、配列番号１に開示されている野生型ＣＲＹＰＨＲアミノ酸配列を含むことが可能であり、または任意選択により、例えば、配列番号２に開示されている変異ＣＲＹＰＨＲアミノ酸配列を含むことが可能である。一部の実施形態では、変異ＣＲＹＰＨＲアミノ酸配列はＥ４９０Ｇ突然変異を含むことが可能であり、この突然変異は、野生型ＣＲＹＰＨＲアミノ酸配列と比べて青色光刺激によりクラスター化する効率を高めることが可能である。一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能であり、光誘発オリゴマー形成ドメインは、配列番号１または配列番号２に少なくとも７０％同一であるポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能であり、光誘発オリゴマー形成ドメインは、配列番号１または配列番号２に少なくとも７５％同一である、少なくとも８０％同一である、少なくとも８５％同一である、少なくとも９０％同一である、少なくとも９５％同一である、または少なくとも９９％同一であるポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、配列番号１または配列番号２のポリペプチド配列を含む光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能である。
【００６９】
一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ニューロスポラビビド（Neurospora Vivid）タンパク質由来の光−酸素−電圧−感知ドメイン（ＬＯＶ）（例えば、ＬＯＶ、ＮｃＶＶＤ、ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ、ＮｃＬＯＶ、ＶｆＡＵ１、ＹｔｖＡ、ＥＬ２２２、ＲｓＬＯＶ、および／またはＡｓＬＯＶ２）を含む光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能である。一部の実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、例えば、配列番号３；配列番号４；配列番号９２；配列番号９３；配列番号９９；配列番号１００；配列番号１０１；または配列番号１０２に開示される野生型ＬＯＶアミノ酸配列を含むことが可能であり、または任意選択で、例えば、配列番号５に開示される変異ＬＯＶアミノ酸配列を含むことが可能である。一部の実施形態では、変異ＬＯＶアミノ酸配列はＹ５０Ｗ突然変異を含むことが可能であり、この突然変異は野生型ＬＯＶアミノ酸配列と比べた場合、二量体化状態からの放散速度を低減することが可能である。一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能であり、光誘発オリゴマー形成ドメインは、配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号９２；配列番号９３；配列番号９９；配列番号１００；配列番号１０１；または配列番号１０２に少なくとも７０％同一であるポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能であり、光誘発オリゴマー形成ドメインは、配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号９２；配列番号９３；配列番号９９；配列番号１００；配列番号１０１；または配列番号１０２に少なくとも７５％同一である、少なくとも８０％同一である、少なくとも８５％同一である、少なくとも９０％同一である、少なくとも９５％同一である、または少なくとも９９％同一であるポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、配列番号３；配列番号４；配列番号５；配列番号９２；配列番号９３；配列番号９９；配列番号１００；配列番号１０１；または配列番号１０２のポリペプチド配列を含む光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能である。
【００７０】
一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、シロイヌナズナ（Arabidopsis）クリプトクロム２タンパク質のＰＨＲドメイン（例えば、ＣＲＹＰＨＲ）を含む光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能であり、第２のヌクレオチド配列は、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードすることが可能である。一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、シロイヌナズナ（Arabidopsis）クリプトクロム２タンパク質のＰＨＲドメイン（例えば、ＣＲＹＰＨＲ）を含む光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能であり、第２のヌクレオチド配列は、ＴＤＰ−４３を含む神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードすることが可能である。一部の実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、完全長ＴＤＰ−４３（例えば、配列番号６または配列番号７）を含む神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードすることが可能である。一部の実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、切り詰め型ＴＤＰ−４３（例えば、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、または配列番号１３）を含む神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードすることが可能である。一部の実施形態では、切り詰め型ＴＤＰ−４３は、完全長ＴＤＰ−４３アミノ酸配列のアミノ酸１０５〜４１４、１９１〜４１４、または２７４〜４１４を含むまたはからなる。したがって、一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ＣＲＹＰＨＲを含む光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能であり、第２のヌクレオチド配列は、完全長または切り詰め型ＴＤＰ−４３を含む神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードすることが可能であり、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、または配列番号１３に少なくとも７５％同一である、少なくとも８０％同一である、少なくとも８５％同一である、少なくとも９０％同一である、少なくとも９５％同一である、または少なくとも９９％同一であるキメラポリペプチド配列をコードする。一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、または配列番号１３に従ったキメラポリペプチド配列をコードする。一部の実施形態では、配列番号６が選択される。一部の実施形態では、配列番号１１が選択される。
【００７１】
一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列を含むキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、レポータータンパク質またはその断片（例えば、ｍＣＨとも呼ばれるｍＣｈｅｒｒｙなどの蛍光タンパク質）をコードする第３のヌクレオチド配列をさらに含有することが可能である。したがって、一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ＣＲＹＰＨＲを含む光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能であり、第２のヌクレオチド配列は、完全長または切り詰め型ＴＤＰ−４３を含む神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードすることが可能であり、第３のヌクレオチド配列はｍＣｈｅｒｒｙタンパク質をコードすることが可能であり、第１、第２、および第３のヌクレオチド配列は、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、または配列番号２５に少なくとも７５％同一である、少なくとも８０％同一である、少なくとも８５％同一である、少なくとも９０％同一である、少なくとも９５％同一である、または少なくとも９９％同一であるキメラポリペプチド配列をコードする。一部の実施形態では、第１、第２、および第３のヌクレオチド配列は、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、または配列番号２５に従ったキメラポリペプチド配列をコードする。一部の実施形態では、配列番号１４が選択される。一部の実施形態では、配列番号２３が選択される。
【００７２】
一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ＬＯＶ光受容体ドメイン（例えば、ＮｃＶＶＤ、ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ、ＮｃＬＯＶ、ＶｆＡＵ１、ＹｔｖＡ、ＥＬ２２２、ＲｓＬＯＶ、およびＡｓＬＯＶ２）を含む光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能であり、第２のヌクレオチド配列は、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードすることが可能である。一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ＬＯＶ光受容体ドメイン（例えば、ＮｃＶＶＤ、ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ、ＮｃＬＯＶ、ＶｆＡＵ１、ＹｔｖＡ、ＥＬ２２２、ＲｓＬＯＶ、およびＡｓＬＯＶ２）を含む光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能であり、第２のヌクレオチド配列は、ＴＤＰ−４３を含む神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードすることが可能である。一部の実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、完全長ＴＤＰ−４３（例えば、配列番号２６または配列番号２７）を含む神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードすることが可能である。一部の実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、切り詰め型ＴＤＰ−４３（例えば、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、または配列番号３３）を含む神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードすることが可能である。一部の実施形態では、切り詰め型ＴＤＰ−４３は、完全長ＴＤＰ−４３アミノ酸配列のアミノ酸１０５〜４１４、１９１〜４１４、または２７４〜４１４からなる。したがって、一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗを含む光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能であり、第２のヌクレオチド配列は、完全長または切り詰め型ＴＤＰ−４３を含む神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードすることが可能であり、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列は、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、または配列番号３３に少なくとも７５％同一である、少なくとも８０％同一である、少なくとも８５％同一である、少なくとも９０％同一である、少なくとも９５％同一である、または少なくとも９９％同一であるキメラポリペプチド配列をコードする。一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列は、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、または配列番号３３に従ったキメラポリペプチド配列をコードする。
【００７３】
一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列を含むキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、レポータータンパク質またはその断片（例えば、ｍＣｈｅｒｒｙなどの蛍光タンパク質）をコードする第３のヌクレオチド配列をさらに含有することが可能である。したがって、一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗを含む光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能であり、第２のヌクレオチド配列は、完全長または切り詰め型ＴＤＰ−４３を含む神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードすることが可能であり、第３のヌクレオチド配列はｍＣｈｅｒｒｙタンパク質をコードすることが可能であり、第１、第２、および第３のヌクレオチド配列は、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、または配列番号４１に少なくとも７５％同一である、少なくとも８０％同一である、少なくとも８５％同一である、少なくとも９０％同一である、少なくとも９５％同一である、または少なくとも９９％同一であるキメラポリペプチド配列をコードする。一部の実施形態では、第１、第２、および第３のヌクレオチド配列は、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、または配列番号４１に従ったキメラポリペプチド配列をコードする。一部の実施形態では、配列番号３４が選択される。一部の実施形態では、配列番号４１が選択される。
【００７４】
一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、シロイヌナズナ（Arabidopsis）クリプトクロム２タンパク質のＰＨＲドメイン（例えば、ＣＲＹ２ＯＬＩＧ）を含む光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能であり、第２のヌクレオチド配列は、α−シヌクレインを含む神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードすることが可能である。したがって、一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ＣＲＹ２ＯＬＩＧを含む光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能であり、第２のヌクレオチド配列は、α−シヌクレインを含む神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードすることが可能であり、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列は、配列番号４２または配列番号４３に少なくとも７５％同一である、少なくとも８０％同一である、少なくとも８５％同一である、少なくとも９０％同一である、少なくとも９５％同一である、または少なくとも９９％同一であるキメラポリペプチド配列をコードする。一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列は、配列番号４２または配列番号４３に従ったキメラポリペプチド配列をコードする。
【００７５】
一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列を含むキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、レポータータンパク質またはその断片（例えば、ｍＣｈｅｒｒｙなどの蛍光タンパク質）をコードする第３のヌクレオチド配列をさらに含有することが可能である。したがって、一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ＣＲＹ２ＯＬＩＧを含む光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能であり、第２のヌクレオチド配列は、α−シヌクレインを含む神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードすることが可能であり、第３のヌクレオチド配列はｍＣｈｅｒｒｙタンパク質をコードすることが可能であり、第１、第２、および第３のヌクレオチド配列は、配列番号４４、配列番号４５、または配列番号４６に少なくとも７５％同一である、少なくとも８０％同一である、少なくとも８５％同一である、少なくとも９０％同一である、少なくとも９５％同一である、または少なくとも９９％同一であるキメラポリペプチド配列をコードする。一部の実施形態では、第１、第２、および第３のヌクレオチド配列は、配列番号４４、配列番号４５、または配列番号４６に従ったキメラポリペプチド配列をコードする。一部の実施形態では、配列番号４４が選択される。
【００７６】
一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ＬＯＶ光受容体ドメイン（例えば、ＮｃＶＶＤ、ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ、ＮｃＬＯＶ、ＶｆＡＵ１、ＹｔｖＡ、ＥＬ２２２、ＲｓＬＯＶ、およびＡｓＬＯＶ２）を含む光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能であり、第２のヌクレオチド配列は、α−シヌクレインを含む神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードすることが可能である。したがって、一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗを含む光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能であり、第２のヌクレオチド配列は、α−シヌクレインを含む神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードすることが可能であり、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列は、配列番号４７または配列番号４８に少なくとも７５％同一である、少なくとも８０％同一である、少なくとも８５％同一である、少なくとも９０％同一である、少なくとも９５％同一である、または少なくとも９９％同一であるキメラポリペプチド配列をコードする。一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列は、配列番号４７または配列番号４８に従ったキメラポリペプチド配列をコードする。
【００７７】
一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列を含むキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、レポータータンパク質またはその断片（例えば、ｍＣｈｅｒｒｙなどの蛍光タンパク質）をコードする第３のヌクレオチド配列をさらに含有することが可能である。したがって、一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗを含む光誘発オリゴマー形成ドメインをコードすることが可能であり、第２のヌクレオチド配列は、α−シヌクレインを含む神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードすることが可能であり、第３のヌクレオチド配列はｍＣｈｅｒｒｙタンパク質をコードすることが可能であり、第１、第２、および第３のヌクレオチド配列は、配列番号４９、配列番号５０、または配列番号５１に少なくとも７５％同一である、少なくとも８０％同一である、少なくとも８５％同一である、少なくとも９０％同一である、少なくとも９５％同一である、または少なくとも９９％同一であるキメラポリペプチド配列をコードする。一部の実施形態では、第１、第２、および第３のヌクレオチド配列は、配列番号４９、配列番号５０、または配列番号５１に従ったキメラポリペプチド配列をコードする。一部の実施形態では、配列番号５１が選択される。
【００７８】
一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は第２のヌクレオチド配列の上流に位置している。一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は第２のヌクレオチド配列の下流に位置している。
【００７９】
一部の実施形態では、本明細書に開示される配列がタンパク質の開始点にメチオニンを含有する場合、メチオニンのないタンパク質も開示される。一部の実施形態では、本明細書に開示される配列がタンパク質の開始点にメチオニンを含有しない場合、タンパク質の開始点にメチオニンのあるタンパク質も開示される。
【００８０】
一部の実施形態では、キメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、または配列番号９１から選択される配列を含む。
【００８１】
方法
一態様では、細胞に神経変性疾患病理を誘発する方法であって、
光誘発オリゴマー形成ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列および神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードする発現ベクターであって、第１のヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、発現ベクターを細胞中に導入するステップ；
キメラポリペプチドを発現するステップ；ならびに
青色光を用いた刺激によりキメラポリペプチドのオリゴマー形成を誘発するステップ
を含む方法が本明細書で開示される。
【００８２】
別の態様では、タンパク質凝集を調節する作用物質を求めてスクリーニングする方法であって、
光誘発オリゴマー形成ドメインをコードする第１のヌクレオチド配列および神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインをコードする第２のヌクレオチド配列を含む、キメラポリペプチドをコードする発現ベクターであって、第１のヌクレオチド配列がプロモーターに作動可能に連結されている、発現ベクターを細胞中に導入するステップ；
キメラポリペプチドを発現するステップ；
細胞を含む培養培地中に作用物質を導入するステップ；
青色光を用いた刺激によりキメラポリペプチドのオリゴマー形成を誘発するステップ；ならびに
作用物質によるタンパク質凝集の調節を判定するステップ
を含む方法が本明細書で開示される。
【００８３】
一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、ＣＲＹ２ＰＨＲドメイン（例えば、ＣＲＹ２ＰＨＲ、ＣＲＹ２ＯＬＩＧ）または光−酸素−電圧−感知（ＬＯＶ）ドメイン（例えば、ＮｃＶＶＤ、ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ、ＶｆＡＵ１、ＹｔｖＡ、ＥＬ２２２、ＲｓＬＯＶ、ＡｓＬＯＶ２）からなる群から選択される。
【００８４】
一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、ＣＲＹＰＨＲ、ＣＲＹ２ＯＬＩＧ、ＮｃＶＶＤ、ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ、およびＮｃＬＯＶからなる群から選択される。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、ＣＲＹＰＨＲ、ＣＲＹ２ＯＬＩＧ、ＮｃＶＶＤ、ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ、ＮｃＬＯＶ、ＶｆＡＵ１、ＹｔｖＡ、ＥＬ２２２、ＲｓＬＯＶ、およびＡｓＬＯＶ２からなる群から選択される。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、表２のドメインの一覧から選択される。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、ＣＲＹＰＨＲ、ＣＲＹ２ＯＬＩＧ、ＮｃＶＶＤ、ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ、ＮｃＬＯＶ、ＶｆＡＵ１、ＹｔｖＡ、ＥＬ２２２、ＲｓＬＯＶ、およびＡｓＬＯＶ２の変異体から選択される。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、ＣＲＹＰＨＲ、ＣＲＹ２ＯＬＩＧ、ＮｃＶＶＤ、ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ、ＮｃＬＯＶ、ＶｆＡＵ１、ＹｔｖＡ、ＥＬ２２２、ＲｓＬＯＶ、およびＡｓＬＯＶ２の断片から選択される。
【００８５】
一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはＮｃＶＶＤＹ５０Ｗである。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはＣＲＹ２ＯＬＩＧである。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはＣＲＹＰＨＲである。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、ＶＶＤタンパク質由来のＬＯＶドメインを含む。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、ＬＯＶタンパク質由来のＬＯＶドメインを含む。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはＰＨＲドメインを含む。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインは、ＣＲＹ２タンパク質由来のＰＨＲドメインを含む。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはＶｆＡＵ１である。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはＹｔｖＡである。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはＥＬ２２２である。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはＲｓＬＯＶである。一実施形態では、光誘発オリゴマー形成ドメインはＡｓＬＯＶ２である。
【００８６】
一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは、ＴＤＰ−４３、アルファシヌクレイン、Ｔａｕ、Ｆｕｓ、ＴＩＡ１、ＳＯＤ１、ハンチンチン、アタキシン２、ｈｎＲＮＰＡ１、およびｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１からなる群から選択される。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは、ＴＤＰ−４３、アルファシヌクレイン、Ｔａｕ、Ｆｕｓ、ＴＩＡ１、ＳＯＤ１、ハンチンチン、アタキシン２、ｈｎＲＮＰＡ１、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１、ＥＷＳ  ＲＮＡ結合タンパク質１、およびＴＡＴＡボックス結合タンパク質因子１５からなる群から選択される。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは、ＴＤＰ−４３、アルファシヌクレイン、Ｔａｕ、ＴＩＡ１、ＳＯＤ１、ハンチンチン、アタキシン２、ｈｎＲＮＰＡ１、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１、ＥＷＳ  ＲＮＡ結合タンパク質１、またはＴＡＴＡボックス結合タンパク質因子１５の変異体から選択される。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは、ＴＤＰ−４３、アルファシヌクレイン、Ｔａｕ、ＴＩＡ１、ＳＯＤ１、ハンチンチン、アタキシン２、ｈｎＲＮＰＡ１、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１、ＥＷＳ  ＲＮＡ結合タンパク質１、またはＴＡＴＡボックス結合タンパク質因子１５の断片から選択される。一実施形態では、ＴＤＰ−４３、アルファシヌクレイン、Ｔａｕ、ＴＩＡ１、ＳＯＤ１、ハンチンチン、アタキシン２、ｈｎＲＮＰＡ１、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１、ＥＷＳ  ＲＮＡ結合タンパク質１、またはＴＡＴＡボックス結合タンパク質因子１５の断片は、それぞれの神経変性疾患標的タンパク質内に低複雑度ドメインを含む。
【００８７】
一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは表３から選択される。一実施形態では、低複雑度ドメインは、神経変性疾患において凝集する任意の神経変性疾患標的タンパク質由来である。
【００８８】
一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは、ＴＤＰ−４３、アルファシヌクレイン、Ｔａｕ、Ｆｕｓ、ＴＩＡ１、ＳＯＤ１、ハンチンチン、アタキシン２、ｈｎＲＮＰＡ１、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１、ＥＷＳ  ＲＮＡ結合タンパク質１、およびＴＡＴＡボックス結合タンパク質因子１５に少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択される。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは表３から選択される神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインに少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択される。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは、ＴＤＰ−４３、アルファシヌクレイン、Ｔａｕ、Ｆｕｓ、ＴＩＡ１、ＳＯＤ１、ハンチンチン、アタキシン２、ｈｎＲＮＰＡ１、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１、ＥＷＳ  ＲＮＡ結合タンパク質１、およびＴＡＴＡボックス結合タンパク質因子１５からなる群のオルソログから選択される。
【００８９】
一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは、ＴＤＰ−４３、アルファシヌクレイン、Ｔａｕ、Ｆｕｓ、ＴＩＡ１、ＳＯＤ１、ハンチンチン、アタキシン２、ｈｎＲＮＰＡ１、ｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１、ＥＷＳ  ＲＮＡ結合タンパク質１、およびＴＡＴＡボックス結合タンパク質因子１５（またはその断片）に少なくとも６０％（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）の同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択される。
【００９０】
一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはＴＤＰ−４３である。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはアルファシヌクレインである。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはＴａｕである。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはＦｕｓである。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはＴＩＡ１である。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはＳＯＤ１である。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはハンチンチンである。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはアタキシン２である。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはｈｎＲＮＰＡ１である。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはｈｎＲＮＰＡ２Ｂ１である。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはＥＷＳ  ＲＮＡ結合タンパク質１である。一実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインはＴＡＴＡボックス結合タンパク質因子１５である。
【００９１】
一実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。一実施形態では、細胞はヒト細胞である。一実施形態では、細胞は、酵母、昆虫、トリ、魚、虫、両生類、ツメガエル、細菌、藻類および哺乳動物細胞からなる群から選択される。一実施形態では、非ヒトトランスジェニック生物が本明細書で開示され、生物は昆虫、魚、鳥、虫、両生類、ツメガエル、または非ヒト哺乳動物である。
【００９２】
神経変性疾患病理を誘発することとは、神経変性疾患病理を引き起こす行為、または選択された行為の実施を控えることと比べた場合、神経変性疾患病理の表現型、症状、もしくは重症度を増すことである。
【００９３】
神経変性疾患病理は、いずれか１つまたは複数の神経変性疾患に関連していることが分かっているまたは疑われる一連の病理を含むことが可能である。そのような病理の例は、細胞の細胞質におけるタンパク質凝集、例えば、細胞質への核タンパク質の誤局在化、ユビキチンの発現の増加、細胞変性および／もしくは細胞死、細胞外アミロイドベータ（Ａβ）凝集、ならびに／またはＴａｕタンパク質の細胞内および／もしくは細胞質凝集を含むがこれらに限定されない。タンパク質凝集塊は、一部の実施形態では、ｐ６２タンパク質と共局在化することが可能であり、高リン酸化されることが可能であり、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインを含む内在性タンパク質（例えば、内在性ＴＤＰ−４３）を含む、またはその組合せが可能である。
【００９４】
ユビキチン化の増加またはユビキチン発現の増加は、神経変性疾患の表現型特色でありうる。ユビキチンは、プロテアソームでの分解のための「タグ付け」タンパク質（例えば、共有結合により）を含む、多数の細胞役割を有する。細胞でのユビキチン発現の増加は典型的には対照と比較される。一部の実施形態では、ユビキチンが増加している細胞は、対照と比べて少なくとも５０％ユビキチン発現が増加している。一部の実施形態では、ユビキチンが増加している細胞は、対照と比べて少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％ユビキチン発現が増加している。
【００９５】
細胞中のユビキチン発現は、転写レベル、翻訳レベル、またはその組合せで判定することが可能であり、遺伝子またはポリペプチド発現レベルを測定するのに使用される幅広い方法によって測定可能である。一部の実施形態では、ユビキチン発現は、遺伝子転写レベルで測定可能である。例えば、および限定せずに、ユビキチンｍＲＮＡ転写物のレベルは、放射線吸収度（例えば、２６０、２８０、または２３０ｎｍでの紫外線吸収）、蛍光色素またはタグ放出の定量化（例えば、臭化エチジウムインターカレーション）、ｍＲＮＡ転写物から生成されるｃＤＮＡの定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、サザンブロット分析、遺伝子発現マイクロアレイ、または他の適切な方法により決定することが可能である。ｍＲＮＡ転写物レベルの増加を使用すれば、ポリペプチド発現レベルの増加を推測するまたは見積もることが可能である。一部の実施形態では、ユビキチン発現は翻訳後レベルで測定可能である。例えば、および限定せずに、ユビキチンポリペプチドのレベルは、放射線吸収度（例えば、紫外線）、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ、ブラッドフォードアッセイ、ビュレット試験、ローリー法、クマーシーブルー染色、機能的もしくは酵素的アッセイ、免疫検出法および／もしくはウェスタンブロット分析、または他の適切な方法により決定することが可能である。
【００９６】
本明細書で使用されるように、用語「導入する（ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ）」、「導入する（ｉｎｔｒｏｄｕｃｅ）」、およびその文法的変形とは、発現ベクターを細胞中に導入することに関する場合、発現ベクターを細胞中に移入するのに適した任意の方法のことである。用語は、例として、コンジュゲーション、形質転換／トランスフェクション（例えば、二価カチオン曝露、熱ショック、エレクトロポレーション）、核マイクロインジェクション、リン酸カルシウムポリヌクレオチド沈殿物とのインキュベーション、ポリヌクレオチド被覆マイクロプロジェクタイルを用いた高速銃（例えば、遺伝子銃により）、リポフェクション、カチオンポリマー複合体形成（例えば、ＤＥＡＥデキストラン、ポリエチレンイミン）、デンドリマー複合体形成、細胞膜の機械的変形（例えば、細胞圧搾（cell-squeezing））、ソノポレーション、光学的トランスフェクション、インペールフェクション（impalefection）、流体力学ポリヌクレオチド送達、アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換、形質導入（例えば、ウイルスまたはウイルスベクターを用いた形質導入）、天然もしくは人工の形質転換受容性、プロトプラスト融合、マグネトフェクション、ヌクレオフェクション（nucleofection）、またはその組合せを含むがこれらに限定されない。導入された発現ベクター、またはそれ由来のポリヌクレオチドは遺伝子に組み込まれるまたは染色体外に存在することが可能である。
【００９７】
青色光波長の範囲は開示された方法において使用することが可能である。一実施形態では、青色光は約４００ｎｍ〜約５００ｎｍの波長を有する。一実施形態では、青色光は約４０５ｎｍ〜約４９９ｎｍの波長を有する。一実施形態では、青色光は約４２０ｎｍ〜約４９０ｎｍの波長を有する。一実施形態では、青色光は約４５０ｎｍ〜約４９０ｎｍの波長を有する。一実施形態では、青色光は約４６０ｎｍ〜約４９５ｎｍの波長を有する。一実施形態では、青色光は約４８８ｎｍの波長を有する。一実施形態では、青色光は約４７５ｎｍの波長を有する。一実施形態では、青色光は約４６５ｎｍの波長を有する。
【００９８】
一実施形態では、青色光は約４０５ｎｍ、約４１０ｎｍ、約４１５ｎｍ、約４２０ｎｍ、約４２５ｎｍ、約４３０ｎｍ、約４３５ｎｍ、約４４０ｎｍ、約４４５ｎｍ、約４５０ｎｍ、約４５５ｎｍ、約４６０ｎｍ、約４６５ｎｍ、約４７０ｎｍ、約４７５ｎｍ、約４８０ｎｍ、約４８５ｎｍ、約４９０ｎｍ、約４９５ｎｍ、または約５００ｎｍの波長を有する。
【００９９】
方法は様々な程度の青色光刺激を含むことが可能である。一部の実施形態では、刺激は急性、または任意選択で長時間である。急性刺激は、約０．２〜約６０秒の青色光パルスを用いた刺激のことであり、青色光の波長は、本明細書に開示される任意の青色光波長が可能である。一部の実施形態では、急性刺激は、約０．５〜約３０秒、約１秒〜約２０秒、または約５秒の青色光パルスを含む。青色光は、青色光源または開示された波長についてフィルターをかけた広域分光光源により提供することが可能である。
【０１００】
一部の実施形態では、急性刺激により光誘発オリゴマー形成ドメイン（例えば、細胞質プリオン様ドメイン／ＬＣＤ／ＩＤＤタンパク質断片）が一時的に凝集することがある。一時的凝集は、一部の実施形態では、約２０分間未満または、任意選択で、約１５分間未満、約１０分間未満、もしくは約５分間以下の間本明細書に開示される方法により観察可能なタンパク質凝集を含む。一部の実施形態では、急性刺激によっても２０分間またはそれよりも長い間、細胞質プリオン様ドメイン／ＬＣＤ／ＩＤＤタンパク質断片は凝集しない。
【０１０１】
一部の実施形態では、急性刺激により、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインと融合された光誘発オリゴマー形成ドメインの凝集よりも持続時間が短い光誘発オリゴマー形成ドメインの凝集が生じることが可能である。一部の実施形態では、急性刺激により、神経変性疾患を引き起こすまたは関連することが分かっているアミノ酸突然変異（例えば、ＴＤＰ−４３  Ｑ３３１Ｋ）を有する同じタンパク質の凝集よりも持続時間が短い神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインと融合された光誘発オリゴマー形成ドメインの凝集が生じることが可能である。
【０１０２】
長時間刺激は、約０．１ｍＷ／ｃｍ２〜８ｍＷ／ｃｍ２（４００ｎｍ〜５００ｎｍ波長内で）で約１分またはそれよりも長い（例えば、少なくとも１分、少なくとも５分、少なくとも１０分、少なくとも３０分、少なくとも６０分、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、またはそれよりも長い）持続時間、約４００ｎｍ〜約５００ｎｍの波長を有する青色光への曝露により定義される。
【０１０３】
本明細書に開示される方法は、一部の実施形態では、神経変性疾患病理に関与するタンパク質の発現レベルを実質的に変更せずに、細胞で神経変性疾患病理（例えば、タンパク質の凝集）を誘発することが可能である。例えば、および限定せずに、方法は内在性ＴＤＰ−４３の発現レベルを実質的に増加させるまたは減少させることなく、ＴＤＰ−４３を含むキメラポリペプチドの凝集（内在性ＴＤＰ−４３の凝集を含むことが可能である）を誘発することが可能である。一部のまたはさらなる実施形態では、方法は、神経変性疾患標的タンパク質由来の野生型形態の低複雑度ドメインを使用して細胞で神経変性疾患病理を誘発することが可能である。したがって、一部の実施形態では、神経変性疾患標的タンパク質由来の低複雑度ドメインは、野生型配列とは異なり、細胞で神経変性疾患病理を引き起こすまたはこれを誘発することに関連することが分かっているまたはそれが疑われる突然変異を含まない。例えば、および限定せずに、方法は、野生型ＴＤＰ−４３タンパク質またはその断片を含むキメラポリペプチドの凝集を誘発することが可能であり、このタンパク質はＡＬＳを引き起こすまたは関連することが分かっているＱ３３１Ｋなどの突然変異を含有しない。
【実施例】
【０１０４】
以下の実施例は、開示された主題に従って化合物、組成物、方法、および結果を説明するために下に明記される。これらの実施例は、本明細書に開示される主題のすべての態様を含めることを意図しておらず、むしろ代表的な方法および結果を説明することを意図している。これらの実施例は、当業者に明らかである本発明の均等物および変形形態を排除することを意図していない。
【０１０５】
[実施例１]
神経変性疾患病理のオプトジェネティク誘発
世界は高齢化に向かっている。２０５０年までには、６０歳を超えた個人の割合は２０００年の６億５００万から２０億に倍増している。不運なことに、高齢化は致命的な神経変性疾患を発症する唯一最大の危険因子である。次に、アルツハイマー病（ＡＤ）、レビー小体病（ＬＢＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）などの認知症、ならびにパーキンソン病（ＰＤ）および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの運動障害を抱えた個人の数は著しく増加することになる。合衆国内部でほぼ６５０万の個人が現在こうした疾患の１つを抱えて生活しており、関連するコストは持続不可能なほどである。合衆国では、ＡＤ、ＰＤ、およびＡＬＳの現在の経済的負担は年間推定２４１０億ドルである。ＡＤおよびＡＬＳ／ＦＴＤ患者は、年間１００，０００ドル〜２５０，０００ドル以上の個人医療費を負担することがある。ＡＤでは、２０１０年の４７０万人から増えて、２０５０年までには合衆国の１３８０万人の個人がそう診断されており、ＡＬＳ患者の世界規模の数は２０４０年までに約３１％増加すると推定されている。そのうえ、こうした障害に対して効果的な処置は現在存在しない。
【０１０６】
２０年の遺伝子分析により、多くの神経変性疾患関連突然変異が明らかにされてきた。しかし、これらの突然変異は、ＡＤ、ＬＢＤ、ＦＴＤ、ＰＤ、およびＡＬＳ患者のうちのわずかでしか見つかっていない（表１）。
【０１０７】
【表１】
2020509748.tif 000003
【０１０８】
表１は、神経変性疾患の選択、主症状、中枢神経系（ＣＮＳ）の罹患領域、患者ＣＮＳにおいて観察される凝集神経病理、この病理を示している患者のパーセントおよび疾患のある遺伝成分（ファミリー内の既知のまたは未知の突然変異）を抱える患者のパーセントを記載している。アルツハイマー病（ＡＤ）は、海馬および嗅内皮質の変性に起因する記憶消失および錯乱を特徴とする。原因となる遺伝子突然変異を抱えているのは患者のわずか１〜３％であるが、すべての患者が罹患組織において一般的な凝集病理を示している。これは、細胞外アミロイドベータ（Ａβ）凝集塊ならびにＴａｕタンパク質の細胞内および細胞質凝集を特徴とする。前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）は、前頭葉および側頭葉の漸進性の変性を特徴とし、患者の２０〜２５％は疾患の遺伝的原因を抱えることがあるが、患者の８０〜７５％は家族歴がない。しかし、すべての患者が、ＴＤＰ−４３（症例の４５％）、Ｔａｕ（症例の４５％）、またはＦＵＳ（症例の５％）タンパク質のいずれかを含むある形態の細胞質タンパク質凝集を示す。パーキンソン病（ＰＤ）は、黒質においてドーパミン作動性神経細胞の漸進性の変性を特徴とし、既知の遺伝的原因を有するのは患者の１０％だけであるが、ほぼすべての患者（９９％）がα−シヌクレインタンパク質の細胞質凝集を示す。筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、患者の麻痺および死亡をもたらす脊髄での運動皮質における運動神経細胞の急速な変性を特徴とする。疾患の家族歴を有するのはＡＬＳ患者の１０％だけであるが、症例のほぼ９０％が散発的に発生する。現在まで、ほぼ３５の原因となる遺伝子突然変異が種々の遺伝子で同定されている（図１参照）が、このような遺伝的多様性にもかかわらず、ほぼすべてのＡＬＳ患者が同じ神経病理を示している。ＡＬＳ患者のほぼ９７％が、罹患領域において、主に核にあるＴＤＰ−４３タンパク質の細胞質誤局在化を示している。ＳＯＤ１またはＦＵＳ遺伝子に突然変異のある患者はこれらのタンパク質の細胞質凝集も示すが、これはすべてのＡＬＳ症例の、それぞれ２％および１％でしか発生しない。
【０１０９】
まとめると、この表から、多くの神経変性疾患の主な統一要因が神経病理学的特質であることが際立つ。これらの神経病理は主に細胞内タンパク質凝集塊の形態で発生し、大多数の症例では、これらの細胞内タンパク質凝集はいかなる既知の遺伝的原因とも無関係に形成される。さらに、これらの神経病理は、それぞれの疾患において最も罹患した領域および細胞型において主に形成される。
【０１１０】
興味深いことに、一般的な既知の遺伝的または環境上の原因がないにもかかわらず、これらは、疾患ごとの患者の間で普遍的な神経病理学的特色である。したがって、大多数の患者（疾患に応じてすべての患者の９０〜１００％）は、既知の遺伝的原因がないにもかかわらず中枢神経系において同じ病理を示している。これらの病理学的特質は中枢神経系において不溶性タンパク質塊または凝集塊の形態で現れる（表１、図１）。
【０１１１】
現在まで、ヒト神経病理を模倣する神経変性疾患凝集を正確にモデル化することは可能ではない。神経変性疾患ごとに、高い局所濃度の場合これらのタンパク質凝集を易発性にするタンパク質ドメイン（プリオン様ドメイン、低複雑度ドメイン、本質的に変性しているドメイン、本質的に変性している領域としても知られる）を抱えた細胞内タンパク質凝集塊の主成分が存在する。したがって、これらの神経変性疾患凝集塊をモデル化する現在の方法は、神経変性疾患凝集塊を含むこれらの凝集易発性タンパク質をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで過剰発現することに頼っている。なぜならば、細胞内での濃度が細胞濃度いと、一部のモデルでは、凝集塊を形成することが可能だからである。さらに、または代わりに、これらの疾患をモデル化するもう１つの方法は、神経変性疾患凝集塊を含むタンパク質の変異型を発現させることである。これらの突然変異は患者のごくわずかな一部で見出され、典型的にはタンパク質の凝集する能力を増強する。不運なことに、これらの方法のどれも患者の細胞環境を再現しない。なぜならば、大多数の患者がいかなる病原突然変異も抱えておらず、凝集塊の成分を著しく過剰発現してもいないからである。実際、これらのタンパク質の著しい過剰発現にもかかわらず、多くのモデルがそれでもヒト神経病理を示していない。患者生物学とモデル系の間がこのように断絶していることは、現在の神経変性疾患モデルから示唆を得ることができない、大きな一因となっていた。
【０１１２】
本実施例に記載されているのは、凝集易発性遺伝子を単に過剰発現させるまたはこれらの遺伝子の変異型を発現させることなく、タンパク質凝集塊を空間的におよび時間的に誘発する新規の方法である。したがって、この方法のほうがヒト疾患状態をよく再現する。ここでは、オプトジェネティクスの力を利用する（光を用いてタンパク質機能を制御する）ことによりこのやっかいな生物学的難問に取り組むための革新的なアプローチに着手した。細胞が特定の光刺激に曝露された時だけ患者で観察される神経変性疾患病理を誘発することが可能である一連の新規のＤＮＡ配置を構築した。この方法を使用して、細胞が特定の光波長に曝露された後だけ患者で観察される神経病理を模倣しこの病理を誘発するモデル系をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで創り出す。この新規のアプローチは、神経変性疾患モデル化を変形することが可能であり、変異トランス遺伝子の発現と違って、大多数の患者に適用可能であり時間的におよび空間的に誘発可能である種々の疾患モデルを生成するのに使用可能である。
【０１１３】
青色光曝露（表２）に応答して、それぞれクラスター化するまたはホモ二量体化するＰＨＲドメイン（ＣＲＹ２ＯＬＩＧまたはＣＲＹ２ＰＨＲ）または光−酸素−電圧−感知（ＬＯＶ）ドメイン（ＮｃＶＶＤ、ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ、Ｖｆａｕ１、ＹｔｖＡ、ＥＬ２２２、ＲｓＬＯＶ、ＡｓＬＯＶ２）および低複雑度ドメイン（ＬＣＤ）を含有し神経変性疾患タンパク質凝集塊を含むタンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ配列（表３）を含む一連のＤＮＡ配置を開発した。
【０１１４】
【表２】
2020509748.tif 000004
【０１１５】
表２は、青色光曝露による細胞に神経変性病理をオプトジェネティクに誘発するために用いる光受容体の一覧を示している。シロイヌナズナ（Arabidopsis）植物に見出されるクリプトクロム２タンパク質のＰＨＲドメインの変種は、用いられる光受容体の１ファミリーとなる（本文書ではＣＲＹ２ＰＨＲおよびＣＲＹ２ＯＬＩＧと名付けられる）。ＣＲＹ２タンパク質のＰＨＲドメインおよびその変種は、青色光の単一パルス（４０５〜４９９ｎｍレンジ内）に曝露されると約５分間クラスター化する／ホモオリゴマー形成する能力を有する。ＣＲＹ２ＰＨＲはシロイヌナズナ（Arabidopsis）に見出される内在性タンパク質配列である。一方、ＣＲＹ２ＯＬＩＧは内在性アミノ酸配列であるが、Ｅ４９０Ｇ突然変異を有し、青色光刺激によりクラスター化する効率のわずかな増加を示すことが明らかにされている。ＣＲＹ２ＰＨＲおよびＣＲＹ２ＯＬＩＧの自己結合は同じ機構を通じて作用し細胞内ＦＡＤ＋を必要とする。ＣＲＹ２ＯＬＩＧと神経病理タンパク質凝集塊を含む標的タンパク質の種々の配置を生成して、主に細胞質にあるタンパク質と主に核にあるタンパク質の両方の神経変性疾患病理を誘発するＣＲＹ２ＯＬＩＧの光誘発クラスター化特性の調節を明らかにした。これは、患者神経病理で観察される核タンパク質の細胞質誤局在化を誘発することを含む。さらに、これらのタンパク質ドメインを使用して、これら神経変性タンパク質の切り詰め型の本質的に変性しているドメイン／プリオン様ドメイン／低複雑度ドメインの凝集を誘発させた。
【０１１６】
ビビド（ＶＶＤ）はパンカビ（Neurospora）生物で産生されるタンパク質であり、青色光（４０５〜４９９ｎｍレンジ内）に応答してホモ二量体化する光受容体である。光−酸素−電圧−感知（ＬＯＶ）ドメインは多くの生物を通して共通であるがこのドメインはこの生物では非常に小さい。ＮｃＬＯＶはＶＶＤタンパク質のＬＯＶドメインにすぎないが、他の種全体を通じて保存されている。ＮｃＶＶＤは、Ｎ−ｔｅｒｍ  ＶＶＤタンパク質の小断片およびＶＶＤ  ＬＯＶドメインを含む。しかし、ＮｃＶＶＤタンパク質配列由来のＮｃＶＶＤＹ５０Ｗは、二量体化状態から放散するもっと時間がかかる能力を促進するＹ５０Ｗ変化により変更される。ＬＯＶドメインの持続性二量体化は、長時間の光を用いて、ＬＣＤ含有タンパク質に融合されるとオリゴマー形成を誘発することがここで明らかにされた（図６、８）。ＬＯＶドメインはオリゴマーを形成するとは報告されていないが、これらの光受容体と特定の標的神経変性疾患タンパク質の特定のタンパク質配置のタンパク質クラスター化を誘発する光刺激パラダイムが本明細書で開発された。本明細書で使用される追加のＬＯＶドメインもＶｆＡＵ１、ＹｔｖＡ、ＥＬ２２２、ＲｓＬＯＶ、およびＡｓＬＯＶ２を含む。
【０１１７】
【表３】
2020509748.tif 000005
【０１１８】
表３は、神経変性疾患病理を再現するタンパク質配置を生成するための標的神経変性疾患タンパク質の一覧を記載している。表３に収載され、これら種々の青色光曝露パラダイムに応答して神経変性疾患病理を再現するタンパク質などの神経変性疾患タンパク質に融合されている表２の光受容体の新規の配置は本明細書に開示されている。この技術は、患者における神経病理凝集塊を含む切り詰め型のこれらの成分のプリオン様ドメイン／ＬＣＤ／ＩＤＤを凝集するのにも使用される。本実施例では、ＴＤＰ−４３、α−シヌクレイン、およびＴａｕタンパク質に融合されたＣＲＹ２ＯＬＩＧおよびＬＯＶを用いて研究を実施した。別の実施例では、標的神経変性疾患タンパク質はハンチンチン遺伝子／タンパク質（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｒｅｆ．ＮＭ＿００２１１１；ＮＰ＿００２１０２．４）が可能である。しかし、創り出された光処理パラダイムのおかげで二量体化またはオリゴマー形成能力のある任意の光受容体に適用可能な方法を開発した。この方法の主目的は、ＬＣＤを含有し神経変性疾患で凝集するタンパク質の分子内密集を強制しつつ神経変性疾患タンパク質の局所濃度を特定の期間制御することである。それぞれの神経変性疾患タンパク質と光受容体配置は、タンパク質の性質に起因して特定の光刺激パラメータを必要とすることがある。例えば、細胞質タンパク質または切り詰め型の核タンパク質が細胞質に局在するには典型的には（いつもとは限らないが）短い刺激パラダイムを必要とし、一方、主に核にあるタンパク質は長時間刺激を必要とする。なぜならば、タンパク質は翻訳の間に細胞質にトラップされる必要があるからである（例えば、ＴＤＰ−４３、ＦＵＳ）。刺激パラダイムの詳細は下で考察される。
【０１１９】
次に、光曝露はこれらの独特な融合タンパク質配置を強制的に接近させ、長時間または反復光刺激を用いると、完全長タンパク質またはＬＣＤ単独の神経変性疾患凝集病理を得ることが可能である。神経変性疾患凝集塊のこのような時間的空間的制御は新規である。なぜならば、この制御は疾患ごとに患者の極一部にしか関連しない過剰発現または突然変異を必要としないからである（表１）。細胞をこれらの凝集易発性タンパク質で満たすのではなく、これらのタンパク質を強制的に相互作用させヒト患者で発生する疾患病理を形成させる。
【０１２０】
タンパク質凝集を超えて、この方式は、患者で見出される重要な病理学的特色を模倣する光誘発病理を創り出し、そのためこの方式は過剰発現方式と比べて独特なものになっている。ＴＤＰ−４３タンパク質は、ＬＣＤを含有するが、青色光に曝露するとクラスター化し不溶性になって持続性の光処理により凝集するＣＲＹ２ＯＬＯＧ光受容体ドメインと組み合わせた。完全長および部分的ＬＣＤ配列の融合タンパク質を生成して、ＡＬＳおよびＦＴＤを抱えた患者で発生する核タンパク質の細胞質誤局在化を含むヒト神経変性疾患病理を再現した。この方式は、種々の青色光刺激パラダイムに細胞を曝露することによって生ＨＥＫ細胞で神経変性疾患タンパク質凝集塊を誘発することができた（図４〜５）。さらに、ＡＬＳ、ＦＴＤ、およびＡＤの生化学的特質（図７）が生成され、細胞が、これらのタグを付加しているにもかかわらず、患者ＣＮＳで観察される光誘発凝集塊に応答していることを示している。とりわけ、ＴＤＰ−４３神経病理は模倣するにはさらに複雑な神経病理の１つである。なぜならば、これは、主に核にあるタンパク質であるのに、患者の細胞質に誤局在しているのが見出されるからである。このＤＮＡ配置および光刺激方式を例として用いて、ＡＬＳ、ＦＴＤ、およびＡＤ患者で観察されるユビキチン化され、切断され、高リン酸化もされている細胞質ＴＤＰ−４３凝集塊が得られた。ＴＤＰ−４３病理はＡＤならびに慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）でも見出され、したがってこの研究の潜在的な疾患関連性を浮き彫りにしている。さらに、α−シヌクレインの凝集（図６）を誘発するタンパク質配置および光刺激パラダイムを開発した。このα−シヌクレインはパーキンソン病およびレビー小体病と診断された患者のＣＮＳで見出される。Ｃｒｙ−ＰＨＲおよびＬＯＶ光受容体（図７）と持続性青色光刺激の両方を使用してＴａｕタンパク質の細胞内凝集を誘発する方法も開発した。このｔａｕ濃縮体は、ＨＥＫ細胞におけるＡＤ、ＦＴＤおよびＣＴＥの病理学的特質である。これらは、病理学的ｔａｕ封入体に対して開発された特定の抗体を使用して患者で観察される、高リン酸化を含む、タウオパチーの病理学的特質を示している（図７〜８）。最後に、この方法を使用して形成されるＴＤＰ−４３の凝集塊が内在性ＴＤＰ−４３を動員して病原性神経病理の種を蒔く（図５Ｆ、５Ｇ）ので、この方法を利用すれば、凝集の種を蒔くことが可能であることが示された。
【０１２１】
ＬＣＤを含有するタンパク質に融合されたＬＯＶドメインタンパク質を強制的にオリゴマー形成および凝集させる新規の方法も開発した。ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗを含むＬＯＶドメインは、青色光刺激だけで二量体化することが明らかにされている。長時間青色光刺激パラダイム（図３および６〜８に記載されている）を使用すれば、ＬＯＶ配列に融合されたＬＣＤ含有タンパク質のオリゴマー形成および最終的な凝集が誘発される。このアミノ酸配列はＣＲＹ２のＰＨＲドメインよりも著しく小さく、ＣＲＹ２ＰＨＲの代替物として作用する場合がある。なぜならば、このアミノ酸配列は内在性標的タンパク質機能を妨害する可能性はもっと低いからである。
【０１２２】
一部の実施形態では、ＬＣＤ断片または表３に収載される完全長神経変性疾患タンパク質（または９０％類似性）に融合されたＰＨＲドメイン（ＣＲＹ２ＰＨＲまたはＣＲＹ２ＯＬＩＧ）またはＬＯＶ光受容体タンパク質（ＮｃＶＶＤ、ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ、Ｖｆａｕ１、ＹｔｖＡ、ＥＬ２２２、ＲｓＬＯＶ、ＡｓＬＯＶ２）（または９０％類似性）をコードするＤＮＡ配置を構築する。一部の実施形態では、青色光曝露処理パラダイムを用いてこれらの神経変性疾患病理を誘発する方法が本明細書で開示される。他の実施形態では、得られたタンパク質凝集塊および細胞生存能は、神経変性疾患薬スクリーニングのための読み出し情報として利用される（図１０）。この方式は、神経変性疾患病理形成を薬理学的にまたは遺伝的に軽減することにより使用される、または滞留時間は特定の神経変性疾患の処置のための新規の化合物を同定することが可能である。以下の実施形態も開示される：
１．新規モデル方式の生成：これらの光受容体配列は、神経変性疾患を研究するための新しいモデルとして働くことが可能な種々のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ方式のゲノムに挿入される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用のいくつかの例は、ヒトおよび齧歯類細胞株、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、または酵母を含む。ｉｎ  ｖｉｖｏ使用のいくつかの例は、無脊椎動物：キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）（ミバエ）、線虫（Caenorhabditis elegans）（カイチュウ）、またはゼブラフィッシュ（Danio rerio）を含む。ｉｎ  ｖｉｖｏ使用の他の例は、脊椎動物：マウス、ラット、または非ヒト霊長類を含む。
２．これらの化合物、方法、および編集されたゲノムを有する方式（ｉＰＳＣなどの）は高スループット薬物スクリーニングシステムで使用される。これを達成するため、細胞を光で刺激することにより神経変性疾患病理が誘発される。次に、化合物ライブラリーの存在下で細胞生存能ならびにタンパク質凝集塊／病理の形成および滞留時間が調べられる。さらに、アッセイは、光を用いた誘発に続くｉｎ  ｖｉｖｏモデルの生存および神経病理を用いることも含む。
【０１２３】
配列
光受容体ツールのアミノ酸配列
シロイヌナズナ（Arabidopsis）クリプトクロム２タンパク質の光回復酵素相同領域（ＰＨＲ）ドメインのアミノ酸配列：
配列番号１  クリプトクロム２ＰＨＲドメイン；Ｃｒｙ２ＰＨＲ
【０１２４】
【化１】
2020509748.tif 000006
配列番号２  Ｅ４９０Ｇ置換を有するクリプトクロム２ＰＨＲドメイン；Ｃｒｙ２Ｏｌｉｇ：［Ｅ４９０Ｇは太字］
【０１２５】
【化２】
2020509748.tif 000007
パンカビ（Neurospora）ビビドタンパク質由来の光−酸素−電圧−感知ドメイン（ＬＯＶ）を含有するアミノ酸配列
配列番号３  ＶＶＤ  ＬＯＶドメインのみ：
【０１２６】
【化３】
2020509748.tif 000008
配列番号４  ＮｃＶｉｖｉｄ（ＮｃＶＶＤ）：
【０１２７】
【化４】
2020509748.tif 000009
配列番号５  ＮｃＶｉｖｉｄ  Ｙ５０Ｗ置換；ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ：（Ｙ５０Ｗは太字）
【０１２８】
【化５】
2020509748.tif 000010
生成されたＴＤＰ−４３タンパク質配置：
１．Ｃｒｙ２ｏｌｉｇ融合タンパク質アミノ酸配列：
Ａ）完全長ＴＤＰ−４３タンパク質レポーターなし
配列番号６  Ｃｒｙ２ｏｌｉｇ−ＴＤＰ−４３：
【０１２９】
【化６】
2020509748.tif 000011
配列番号７  ＴＤＰ−４３−Ｃｒｙ２ｏｌｉｇ：
【０１３０】
【化７】
2020509748.tif 000012
Ｂ）切り詰め型ＴＤＰ−４３タンパク質レポーターなし
配列番号８  ＴＤＰ−４３（ＡＡ２７４〜４１４）−Ｃｒｙ２ｏｌｉｇ：
【０１３１】
【化８】
2020509748.tif 000013
配列番号９  ＴＤＰ−４３（ＡＡ１９１〜４１４）−Ｃｒｙ２ｏｌｉｇ：
【０１３２】
【化９】
2020509748.tif 000014
配列番号１０  ＴＤＰ−４３（ＡＡ１０５〜４１４）−Ｃｒｙ２ｏｌｉｇ：
【０１３３】
【化１０】
2020509748.tif 000015
配列番号１１  Ｃｒｙ２ｏｌｉｇ−ＴＤＰ−４３（ＡＡ２７４〜４１４）：
【０１３４】
【化１１】
2020509748.tif 000016
配列番号１２  Ｃｒｙ２ｏｌｉｇ−ＴＤＰ−４３（ＡＡ１９１〜４１４）：
【０１３５】
【化１２】
2020509748.tif 000017
配列番号１３  Ｃｒｙ２ｏｌｉｇ−ＴＤＰ−４３（ＡＡ１０５〜４１４）：
【０１３６】
【化１３】
2020509748.tif 000018
Ｃ）完全長ＴＤＰ−４３タンパク質＋ｍＣｈｅｒｒｙレポーター
配列番号１４  Ｃｒｙ２ｏｌｉｇ−ＴＤＰ−４３−ｍＣｈｅｒｒｙ：
【０１３７】
【化１４】
2020509748.tif 000019
配列番号１５  ＴＤＰ−４３−Ｃｒｙ２ｏｌｉｇ−ｍＣｈｅｒｒｙ：
【０１３８】
【化１５】
2020509748.tif 000020
配列番号１６  ｍＣｈｅｒｒｙ−ＴＤＰ−４３−Ｃｒｙ２ｏｌｉｇ：
【０１３９】
【化１６】
2020509748.tif 000021
Ｄ）切り詰め型ＴＤＰ−４３タンパク質＋ｍＣｈｅｒｒｙレポーター
配列番号１７  ＴＤＰ−４３（ＡＡ２７４〜４１４）−Ｃｒｙ２ｏｌｉｇ−ｍＣｈｅｒｒｙ：
【０１４０】
【化１７】
2020509748.tif 000022
配列番号１８  ＴＤＰ−４３（ＡＡ１９１〜４１４）−Ｃｒｙ２ｏｌｉｇ−ｍＣｈｅｒｒｙ：
【０１４１】
【化１８】
2020509748.tif 000023
配列番号１９  ＴＤＰ−４３（ＡＡ１０５〜４１４）−Ｃｒｙ２ｏｌｉｇ−ｍＣｈｅｒｒｙ：
【０１４２】
【化１９】
2020509748.tif 000024
配列番号２０  ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃｒｙ２ｏｌｉｇ−ＴＤＰ−４３（ＡＡ２７４〜４１４）：
【０１４３】
【化２０】
2020509748.tif 000025
配列番号２１  ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃｒｙ２ｏｌｉｇ−ＴＤＰ−４３（ＡＡ１９１〜４１４）：
【０１４４】
【化２１】
2020509748.tif 000026
配列番号２２  ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃｒｙ２ｏｌｉｇ−ＴＤＰ−４３（ＡＡ１０５〜４１４）：
【０１４５】
【化２２】
2020509748.tif 000027
配列番号２３  Ｃｒｙ２ｏｌｉｇ−ＴＤＰ−４３（ＡＡ２７４〜４１４）−ｍＣｈｅｒｒｙ：
【０１４６】
【化２３】
2020509748.tif 000028
配列番号２４  Ｃｒｙ２ｏｌｉｇ−ＴＤＰ−４３（ＡＡ１９１〜４１４）−ｍＣｈｅｒｒｙ：
【０１４７】
【化２４】
2020509748.tif 000029
配列番号２５  Ｃｒｙ２ｏｌｉｇ−ＴＤＰ−４３（ＡＡ１０５〜４１４）−ｍＣｈｅｒｒｙ：
【０１４８】
【化２５】
2020509748.tif 000030
２．ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ融合タンパク質アミノ酸配列：
Ａ）完全長ＴＤＰ−４３タンパク質レポーターなし
配列番号２６  ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ−ＴＤＰ−４３
【０１４９】
【化２６】
2020509748.tif 000031
配列番号２７  ＴＤＰ−４３−ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ
【０１５０】
【化２７】
2020509748.tif 000032
Ｂ）切り詰め型ＴＤＰ−４３タンパク質レポーターなし
配列番号２８  ＴＤＰ−４３（ＡＡ１０５〜４１４）−ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ
【０１５１】
【化２８】
2020509748.tif 000033
配列番号２９  ＴＤＰ−４３（ＡＡ１９１〜４１４）−ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ
【０１５２】
【化２９】
2020509748.tif 000034
配列番号３０  ＴＤＰ−４３（ＡＡ２７４〜４１４）−ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ
【０１５３】
【化３０】
2020509748.tif 000035
配列番号３１  ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ−ＴＤＰ−４３（ＡＡ１０５〜４１４）
【０１５４】
【化３１】
2020509748.tif 000036
配列番号３２  ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ−ＴＤＰ−４３（ＡＡ１９１〜４１４）
【０１５５】
【化３２】
2020509748.tif 000037
配列番号３３  ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ−ＴＤＰ−４３（ＡＡ２７４〜４１４）
【０１５６】
【化３３】
2020509748.tif 000038
Ｃ）完全長ＴＤＰ−４３タンパク質＋ｍＣｈｅｒｒｙレポーター
配列番号３４  ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ−ＴＤＰ−４３−ｍＣｈｅｒｒｙ
【０１５７】
【化３４】
2020509748.tif 000039
配列番号３５  ｍＣｈｅｒｒｙ−ＴＤＰ−４３−ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ
【０１５８】
【化３５】
2020509748.tif 000040
Ｄ）切り詰め型ＴＤＰ−４３タンパク質＋ｍＣｈｅｒｒｙレポーター
配列番号３６  ｍＣｈｅｒｒｙ−ＴＤＰ−４３（ＡＡ１０５〜４１４）−ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ
【０１５９】
【化３６】
2020509748.tif 000041
配列番号３７  ｍＣｈｅｒｒｙ−ＴＤＰ−４３（ＡＡ１９１〜４１４）−ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ
【０１６０】
【化３７】
2020509748.tif 000042
配列番号３８  ｍＣｈｅｒｒｙ−ＴＤＰ−４３（ＡＡ２７４〜４１４）−ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ
【０１６１】
【化３８】
2020509748.tif 000043
配列番号３９  ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ−ＴＤＰ−４３（ＡＡ１０５〜４１４）−ｍＣｈｅｒｒｙ
【０１６２】
【化３９】
2020509748.tif 000044
配列番号４０  ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ−ＴＤＰ−４３（ＡＡ１９１〜４１４）−ｍＣｈｅｒｒｙ
【０１６３】
【化４０】
2020509748.tif 000045
配列番号４１  ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ−ＴＤＰ−４３（ＡＡ２７４〜４１４）−ｍＣｈｅｒｒｙ
【０１６４】
【化４１】
2020509748.tif 000046
生成されたアルファシヌクレインタンパク質配置
１．Ｃｒｙ２ｏｌｉｇ融合タンパク質アミノ酸配列：
Ａ）完全長アルファシヌクレイン（ａｓｙｎ）タンパク質レポーターなし
配列番号４２  Ｃｒｙ２ｏｌｉｇ−ａｓｙｎ
【０１６５】
【化４２】
2020509748.tif 000047
配列番号４３  Ａｓｙｎ−Ｃｒｙ２
【０１６６】
【化４３】
2020509748.tif 000048
Ｂ）完全長アルファシヌクレイン（ａｓｙｎ）タンパク質＋ｍＣｈｅｒｒｙレポーター
配列番号４４  Ｃｒｙ２ｏｌｉｇ−ａｓｙｎ−ｍＣｈｅｒｒｙ
【０１６７】
【化４４】
2020509748.tif 000049
配列番号４５  Ｃｒｙ２ｏｌｉｇ−ｍＣｈｅｒｒｙ−Ａｓｙｎ
【０１６８】
【化４５】
2020509748.tif 000050
配列番号４６  Ａｓｙｎ−Ｃｒｙ２−ｍＣｈｅｒｒｙ
【０１６９】
【化４６】
2020509748.tif 000051
１．ＮｃＶＶＤ融合タンパク質アミノ酸配列：
Ａ）完全長アルファシヌクレイン（ａｓｙｎ）タンパク質レポーターなし
配列番号４７  Ａｓｙｎ−ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ
【０１７０】
【化４７】
2020509748.tif 000052
配列番号４８  ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ−Ａｓｙｎ
【０１７１】
【化４８】
2020509748.tif 000053
Ｂ）完全長アルファシヌクレイン（ａｓｙｎ）タンパク質＋ｍＣｈｅｒｒｙレポーター
配列番号４９  ｍＣｈｅｒｒｙ−Ａｓｙｎ−ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ
【０１７２】
【化４９】
2020509748.tif 000054
配列番号５０  ｍＣｈｅｒｒｙ−ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ−Ａｓｙｎ
【０１７３】
【化５０】
2020509748.tif 000055
配列番号５１  ＮｃＶＶＤＹ５０Ｗ−Ａｓｙｎ−ｍＣｈｅｒｒｙ
【０１７４】
【化５１】
2020509748.tif 000056
配列番号５２  アルファシヌクレイン−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＮｃＶＶＤ（野生型）
【０１７５】
【化５２】
2020509748.tif 000057
配列番号５３  ｍＣｈｅｒｒｙ−アルファシヌクレイン−ＮｃＶＶＤ（野生型）
【０１７６】
【化５３】
2020509748.tif 000058
配列番号５４  ｍＣｈｅｒｒｙ−ＮｃＶＶＤ（野生型）−アルファシヌクレイン
【０１７７】
【化５４】
2020509748.tif 000059
Ｔａｕ
配列番号５５  ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｔａｕ
【０１７８】
【化５５】
2020509748.tif 000060
配列番号５６  ｍＣｈｅｒｒｙ−ＶｆＡＵ−Ｔａｕ
【０１７９】
【化５６】
2020509748.tif 000061
配列番号５７  ｍＣｈｅｒｒｙ−（ｙ５０ｗ）−Ｔａｕ
【０１８０】
【化５７】
2020509748.tif 000062
配列番号５８  ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｔａｕ−ＮｃＶＶＤ（ｙ５０ｗ）
【０１８１】
【化５８】
2020509748.tif 000063
配列番号５９  ｍＣｈｅｒｒｙ−ＮｃＶＶＤ（ｙ５０ｗ）−Ｔａｕ
【０１８２】
【化５９】
2020509748.tif 000064
配列番号６０  Ｔａｕ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＮｃＶＶＤ（ｙ５０ｗ）
【０１８３】
【化６０】
2020509748.tif 000065
配列番号６１  Ｃｒｙ−ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｔａｕ
【０１８４】
【化６１】
2020509748.tif 000066
配列番号６２  Ｔａｕ−ｍＣｈｅｒｒｙ
【０１８５】
【化６２】
2020509748.tif 000067
配列番号６３  Ｔａｕ−Ｃｒｙ２ｏｌｉｇ−ｍＣｈｅｒｒｙ
【０１８６】
【化６３】
2020509748.tif 000068
配列番号６４  Ｃｒｙ２ｏｌｉｇ−Ｔａｕ−ｍＣｈｅｒｒｙ
【０１８７】
【化６４】
2020509748.tif 000069
配列番号６５  Ｃｒｙ−ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｔａｕ
【０１８８】
【化６５】
2020509748.tif 000070
配列番号６６  ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｔａｕ−ＮｃＶＶＤ（ｙ５０ｗ）
【０１８９】
【化６６】
2020509748.tif 000071
配列番号６７  ｍＣｈｅｒｒｙ−ＮｃＶＶＤ（ｙ５０ｗ）−Ｔａｕ
【０１９０】
【化６７】
2020509748.tif 000072
配列番号６８  Ｃｒｙ−Ｔａｕ
【０１９１】
【化６８】
2020509748.tif 000073
配列番号６９  ＮｃＶＶＤ（ｙ５０ｗ）−Ｔａｕ
【０１９２】
【化６９】
2020509748.tif 000074
配列番号７０  Ｔａｕ−Ｃｒｙ
【０１９３】
【化７０】
2020509748.tif 000075
配列番号７１  Ｔａｕ−ＶｆＡＵ
【０１９４】
【化７１】
2020509748.tif 000076
配列番号７２  Ｔａｕ−ＮｃＶＶＤ（ｙ５０ｗ）
【０１９５】
【化７２】
2020509748.tif 000077
配列番号７３  Ｔａｕ−ＮｃＶＶＤ（野生型）
【０１９６】
【化７３】
2020509748.tif 000078
配列番号７４  ＶｆＡＵ−Ｔａｕ
【０１９７】
【化７４】
2020509748.tif 000079
配列番号７５  Ｃｒｙ−ＴＤＰ（Ｆ１４７Ｌ）−ｍＣｈｅｒｒｙ
【０１９８】
【化７５】
2020509748.tif 000080
配列番号７６  Ｃｒｙ−ＴＤＰ（Ｆ２２９Ｌ）−ｍＣｈｅｒｒｙ
【０１９９】
【化７６】
2020509748.tif 000081
配列番号７７  Ｃｒｙ−ＴＤＰ（Ｓ４０９、４１０Ａ）−ｍＣｈｅｒｒｙ
【０２００】
【化７７】
2020509748.tif 000082
配列番号７８  Ｃｒｙ−ＴＤＰ（Ｓ４０９、４１０Ｄ）−ｍＣｈｅｒｒｙ
【０２０１】
【化７８】
2020509748.tif 000083
配列番号７９  Ｃｒｙ−ＴＤＰ（Ａ３２１Ｖ）−ｍＣｈｅｒｒｙ
【０２０２】
【化７９】
2020509748.tif 000084
配列番号８０  Ｃｒｙ−ＴＤＰ（ｍ３３７Ｖ）−ｍＣｈｅｒｒｙ
【０２０３】
【化８０】
2020509748.tif 000085
配列番号８１  Ｃｒｙ−ＴＤＰ（ＬＣＤ、Ａ３２１Ｖ）−ｍＣｈｅｒｒｙ
【０２０４】
【化８１】
2020509748.tif 000086
配列番号８２  Ｃｒｙ−ＴＤＰ（ＬＣＤ、Ｍ３３７Ｖ）−ｍＣｈｅｒｒｙ
【０２０５】
【化８２】
2020509748.tif 000087
配列番号８３  Ｃｒｙ−ＴＤＰ（ＬＣＤ、Ｓ４０９、４１０Ａ）−ｍＣｈｅｒｒｙ
【０２０６】
【化８３】
2020509748.tif 000088
配列番号８４  Ｃｒｙ−ＴＤＰ（ＬＣＤ、Ｓ４０９、４１０Ｄ）−ｍＣｈｅｒｒｙ
【０２０７】
【化８４】
2020509748.tif 000089
配列番号８５  Ｃｒｙ−ＴＤＰ（５ＦＬ）−ｍＣｈｅｒｒｙ
【０２０８】
【化８５】
2020509748.tif 000090
配列番号８６  Ｃｒｙ−ＴＤＰ（ＲＲＭ１）−ｍＣｈｅｒｒｙ
【０２０９】
【化８６】
2020509748.tif 000091
配列番号８７  Ｃｒｙ−ＴＤＰ（ＲＲＭ２）−ｍＣｈｅｒｒｙ
【０２１０】
【化８７】
2020509748.tif 000092
配列番号８８  Ｃｒｙ−ＴＤＰ（ＲＲＭ１＋２）−ｍＣｈｅｒｒｙ
【０２１１】
【化８８】
2020509748.tif 000093
配列番号８９  Ｃｒｙ−ＴＤＰ（ｄＬＣＤ）−ｍＣｈｅｒｒｙ
【０２１２】
【化８９】
2020509748.tif 000094
生成されたＦＵＳタンパク質配置：
１．Ｃｒｙ２ｏｌｉｇ融合タンパク質アミノ酸配列：
Ａ）完全長ＦＵＳタンパク質レポーターなし
配列番号９０  Ｃｒｙ２Ｏｌｉｇ−ＦＵＳ
【０２１３】
【化９０】
2020509748.tif 000095
Ｂ）完全長ＦＵＳタンパク質＋ｍＣｈｅｒｒｙレポーター
配列番号９１  Ｃｒｙ２Ｏｌｉｇ−ＦＵＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ
【０２１４】
【化９１】
2020509748.tif 000096
バウチェリア・フリジダ（Vaucheria frigida）（黄緑藻（Yellow-green alga））（コンフェルバ・フリジダ（Conferva frigida））オーレオクロム（Aureochrome）１タンパク質のアミノ酸配列（遺伝子はＡＵＲＥＯ１である）：
配列番号９２  ＶｆＡＵ１（Ａ８ＱＷ５５）：
【０２１５】
【化９２】
2020509748.tif 000097
配列番号９３  ＶｆＡＵ１−ＬＯＶドメイン：
【０２１６】
【化９３】
2020509748.tif 000098
配列番号９４  ＶｆＡＵ１−ＤＮＡ配列−ＶｆＡＵ１−ＬＯＶドメイン（開始コドンなし）：
【０２１７】
【化９４】
2020509748.tif 000099
配列番号９５  ＴＤＰ−４３（ＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質−４３）
【０２１８】
【化９５】
2020509748.tif 000100
配列番号９６  ＴＤＰ−４３（アミノ酸１０５〜４１４）
【０２１９】
【化９６】
2020509748.tif 000101
配列番号９７  ＴＤＰ−４３（アミノ酸１９１〜４１４）
【０２２０】
【化９７】
2020509748.tif 000102
配列番号９８  ＴＤＰ−４３（アミノ酸２７４〜４１４）
【０２２１】
【化９８】
2020509748.tif 000103
配列番号９９  ＡｓＬＯＶ２
【０２２２】
【化９９】
2020509748.tif 000104
配列番号１００  ＥＬ２２２
【０２２３】
【化１００】
2020509748.tif 000105
配列番号１０１  Ｙｔｖａ
【０２２４】
【化１０１】
2020509748.tif 000106
配列番号１０２  ＲｓＬＯＶ
【０２２５】
【化１０２】
2020509748.tif 000107
【０２２６】
他に定義されなければ、本明細書で使用されるすべての専門および科学用語は、開示されている本発明が属する分野の当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に引用される刊行物および刊行物が引用されている対象の題材は参照により明確に取り込まれている。
【０２２７】
当業者であれば、本発明の好ましい実施形態に多数の変更および改変を加えることが可能であること、本発明の精神から逸脱することなくそのような変更および改変を行うことが可能であることを認識する。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の精神および範囲内に入るようなすべての等価な変形形態に及ぶことが意図されている。
【図１】
2020509748.tif 000108
【図２】
2020509748.tif 000109
【図３】
2020509748.tif 000110
【図４−１】
2020509748.tif 000111
【図４−２】
2020509748.tif 000112
【図４−３】
2020509748.tif 000113
【図４−４】
2020509748.tif 000114
【図５−１】
2020509748.tif 000115
【図５−２】
2020509748.tif 000116
【図５−３】
2020509748.tif 000117
【図５−４】
2020509748.tif 000118
【図５−５】
2020509748.tif 000119
【図５−６】
2020509748.tif 000120
【図６−１】
2020509748.tif 000121
【図６−２】
2020509748.tif 000122
【図６−３】
2020509748.tif 000123
【図７−１】
2020509748.tif 000124
【図７−２】
2020509748.tif 000125
【図８−１】
2020509748.tif 000126
【図８−２】
2020509748.tif 000127
【図８−３】
2020509748.tif 000128
【図９−１】
2020509748.tif 000129
【図９−２】
2020509748.tif 000130
【図１０−１】
2020509748.tif 000131
【図１０−２】
2020509748.tif 000132
【配列表】
2020509748000001.app
【国際調査報告】
2020509748.tif 000133
2020509748.tif 000134