(57)【要約】次の酵素的反応に特に適している回復培地であり、酵素的反応において蛍光産物は３２０ｎｍ〜３７０ｎｍの波長で励起され、４２０ｎｍ〜４６０ｎｍの波長での放出が提供される。回復培地は、色が透明であり、メイラード反応に関与する化合物の組み合わせを含まない。回復培地は、自己充足型の生物学的指標システムに適している。
2020508678.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物の存在を検出するための回復培地であって、
少なくとも一つの無機塩；および
少なくとも一つの蛍光発生基質
を含み、
ここで、前記回復培地は、色が透明であり、実質的に還元糖を含まない、
回復培地。
【請求項２】
前記少なくとも一つの蛍光発生基質は、４−メチルウンベリフェリル誘導体を含む、請求項１に記載の回復培地。
【請求項３】
前記４−メチルウンベリフェリル誘導体は、４−メチルウンベリフェリルα−Ｄ−グルコピラノシドを含む、請求項２に記載の回復培地。
【請求項４】
前記蛍光発生基質は、３２０ｎｍ〜３７０ｎｍの範囲での励起波長のために４２０ｎｍ〜４６０ｎｍの範囲で蛍光発光を有する切断可能な蛍光色素分子基を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の回復培地。
【請求項５】
前記蛍光色素分子は、４−メチルウンベリフェロンを含む、請求項４に記載の回復培地。
【請求項６】
前記培地は、４２０ｎｍ〜４６０ｎｍの範囲の光エネルギーを吸収しない、請求項１〜５のいずれか一項に記載の回復培地。
【請求項７】
少なくとも一つのアミノ酸をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の回復培地。
【請求項８】
少なくとも一つのビタミンをさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の回復培地。
【請求項９】
非還元糖をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の回復培地。
【請求項１０】
前記非還元糖は、スクロース、トレハロース、ラフィノース、およびメレジトースの中から選択される、請求項９に記載の回復培地。
【請求項１１】
前記微生物は胞子を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の回復培地。
【請求項１２】
前記胞子は、ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｕｓ）属、またはクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）属の胞子を含む、請求項１１に記載の回復培地。
【請求項１３】
滅菌工程の有効性を決定する方法であって、前記方法は、次のステップ：
少なくとも一つの活性酵素を含む生物学的指標を、滅菌チャンバーに置くこと；
前記チャンバー内で前記滅菌工程を行うこと、ここで、前記生物学的指標は、滅菌培地に曝され；
前記生物学的指標を、少なくとも一つの無機塩と切断可能な蛍光色素分子基を含む少なくとも一つの蛍光発生基質とを含む回復培地と接触させること、ここで、前記回復培地は、色が透明であり、実質的に還元糖は含まない；
前記生物学的指標を、ある期間インキュベートすること；および
前記蛍光色素分子基によって放出される蛍光シグナルの存在または非存在を検出すること、
を含む、方法。
【請求項１４】
前記滅菌培地は、蒸気、乾熱、放射線、プラズマ、一つ以上のガス状滅菌剤および／または一つ以上の液体滅菌剤を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも一つの蛍光発生基質は、４−メチルウンベリフェリル誘導体を含む、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記４−メチルウンベリフェリル誘導体は、４−メチルウンベリフェリルα−Ｄ−グルコピラノシドを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記切断可能な蛍光色素分子基は、３２０ｎｍ〜３７０ｎｍの範囲での励起波長のために４２０ｎｍ〜４６０ｎｍの範囲で蛍光発光を有する、請求項１３〜請求項１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記回復培地は、４２０ｎｍ〜４５０ｎｍの範囲の光エネルギーを吸収しない、請求項１３〜請求項１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記回復培地は、少なくとも一つのアミノ酸を含む、請求項１３〜請求項１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記回復培地は、少なくとも一つのビタミンをさらに含む、請求項１３〜請求項１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記回復培地は、非還元糖をさらに含む、請求項１３〜請求項２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記非還元糖は、スクロース、トレハロース、ラフィノース、およびメレジトースの中から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記活性酵素は、細菌胞子と関連している、請求項１３〜請求項２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記細菌胞子は、ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｕｓ）属、またはクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）属の胞子を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
滅菌監視装置であって、
生物学的指標を含む第一の部分を含み、前記生物学的指標は少なくとも一つの活性酵素を含み、前記第一の部分は、前記生物学的指標を滅菌工程の間、滅菌培地と接触させることを可能とするように構成されており；並びに
回復培地を含む第二の部分を含み、前記第二の部分は、前記滅菌工程の間、前記回復培地が前記生物学的指標から分離することを維持するように、および、前記生物学的指標が前記滅菌培地に曝された後に、前記回復培地に前記生物学的指標を接触させることを可能とするように構成されており、ここで、前記回復培地は、請求項１〜請求項１０のいずれか一項に記載の回復培地からなる、
滅菌監視装置。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１７年２月２８日に提出された米国仮出願Ｎｏ．６２／４６４，６０７に基づく利益を主張する。米国仮出願Ｎｏ．６２／４６４，６０７は、その全体が本明細書に参照によって組み込まれる。
［技術分野］
本出願は、蛍光によって生存する微生物を検出する方法、および装置に関し、特に、滅菌工程の有効性を評価するための方法、および装置に関する。より具体的に、本発明は、生物学的指標のための回復培地に関する。
［背景］
生物学的指標は、一般的に試験微生物（例えば、胞子など）を含み、滅菌工程の有効性を評価するために使用される。生物学的指標は、滅菌チャンバーに置かれ、滅菌用の装備（例えば、医療装置）と共に滅菌工程にさらされる。滅菌工程を完了すると、生物学的指標は、任意の生存試験生物細胞の成長を促進することになる条件下、液体成長支持培地に曝される。成功した滅菌工程は、試験微生物の完全な不活性化（成長しないこと）によって示される。成功しない滅菌工程は、試験微生物の不完全な不活性化（検出される成長）によって示される。回復培地は、蛍光発生基質を含んでもよく、蛍光発生基質は、微生物によって合成される酵素に触れると、切断され、蛍光性になる。生物学的活性の検出を、例えば、蛍光光度計によって行ってもよい。
【発明の概要】
【０００２】
滅菌保証において使用される生物学的指標は、生存試験生物の培養のために提供する回復培地を含んでもよい。好気性細菌のための一般的な回復培地は、トリプチックソイブロス（Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ）（ＴＳＢ）であり、ＴＳＢは複合体であり、微生物実験において通常使用される汎用培養液である。ＴＳＢは、蒸気、気相過酸化水素、エチレンオキシドなどを含む種々の滅菌方法のための、多数の商業用生物学的指標用の培地の出発点とされている。これらの培養液製剤は、ｐＨに応答する染料を含んでもよく、そのことによって、生物の成長の物的証拠を提供し、または酵素活性に応答する染料を含んでもよく、蛍光光度計によって読まれる蛍光部分を生成する。
【０００３】
生物学的指標は、滅菌工程にさらされる物が、良好なサイクルの終わりに滅菌状態にされていることの保証を提供するために使用される。滅菌工程のための生物学的指標は、工程において「多耐性細菌（Ｍｏｓｔ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｏｒｇａｎｉｓｍ）」（ＭＲＯ）を使用する。多耐性細菌は、胞子が生物の生存状態を殺すことを非常に困難にするので、一般的に胞子形成生物である。蒸気および気相過酸化水素滅菌の場合において、生物は、一般的に細菌ゲオバチルス  ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）であり、欠乏状態にされされると胞子を形成する。
【０００４】
改良のための継続的な努力が見られている生物学的指標の一態様は、負の反応を決定するために必要とされる時間である。負の反応は、成功した滅菌サイクルを示す。食品医薬品局に承認用の新しい生物学的指標を提出する目的のために、負の成長応答を決定するための標準インキュベーション時間は、７日であると考えられる。７日未満の任意の時間は、培養時間短縮（ＲＩＴ）と考えられる。
【０００５】
より複雑な医療装置および手順の出現と共に、ならびに運営費の減少を達成するために在庫を低レベルで維持する必要性と共に、診療所および病院は、医療機器の装置が滅菌であるかどうか決定するために７日間待つことは望まない。したがって、より短いＲＩＴを有する生物学的指標（ＢＩ）が試験されており、ＦＤＡによって使用が承認されている。視覚的色変化ＢＩのための一般的なＲＩＴは、数時間から１〜２日である。視覚的色変化ＢＩは、所望の温度でのＢＩを保持するためのユニット以外の特別な装置を必要としない。
【０００６】
蛍光分子の測定は、比色法より高感度であるので、進展は最初の蛍光ＢＩから作られた。ここでＲＩＴは、３０分〜４時間である。蛍光ＢＩは、温度を維持する、特定の波長の光を供給する、および他の波長で生成された光の検出を可能にするユニットを必要とする。ＦＤＡによって承認されるリーダー／インキュベーターは、正の応答（非滅菌）と負の応答（成功した滅菌）との間の違いを決定するいくつかの方法も含む。正の応答は、負の応答よりリーダー／インキュベーターによってより早く発現されることができる。したがって、非滅菌結果は、滅菌結果が保証されるよりも早く知ることができる。
【０００７】
ＴＳＢは、定義される特性が少ない２つの主成分を含む複合培地である。第一は、トリプトンであり、トリプトンはプロテアーゼによるカゼインの分解物であり、結果的にペプチドの混合物を生じる。第二は、フィトン（ｐｈｙｔｏｎｅ）であり、大豆ミールの酵素的分解物である。ＴＳＢは、塩化ナトリウム（浸透圧調節剤）、リン酸二カリウム（緩衝剤）、およびグルコース（還元糖および食物源）も含む。
【０００８】
第一の二つの成分は、天然産物であり、工程は制御されるが、天然産物の構成要素は、供給原料に基づいて変化してもよい。カゼインおよび／または大豆の源は、生育の最高潮な状態、動物または植物の生育、栄養などに変化をもたらしてもよい。したがって、最終産物はよく定義されることはできず、一般的な目的培地にふさわしいが、蛍光を使用する高感度な検出方法において変化を与えるだろう。
【０００９】
ＴＳＢが特に重要であるのは、培地成分が黄褐色であり、還元糖と混合されると、メイラード反応を受けるという事実である。メイラード反応は、アミノ酸と還元糖との混合物を加熱すると起こる非酵素的褐色化を包含する。この褐色化反応は、例えば、焼いた食品、および料理された肉の焼き焦げた印における褐色から認識できる。メイラード反応は、大気温度で起こることも明らかにされている。
【００１０】
したがって、ＴＳＢ培地は、最初に黄褐色になり、続く蒸気滅菌曝露および／または経年劣化（ａｇｉｎｇ）で色の増加（濃化）が続くだろう。このことは、４２０ｎｍの波長での溶液の吸光度の測定によって証明される。加えて、メイラード反応は、４２０ｎｍ〜４４０ｎｍの波長範囲の放出スペクトルでいくつか報告される蛍光化合物の混合物も生産する。このバックグラウンド蛍光は、生物学的指標の酵素活性を検出する正確さ、およびスピードに悪影響を与えることができる。
【００１１】
一般的な蛍光指標ファミリー、メチルウンベリフェリルピラノシド（ヒドロキシメチルクマリンとしても知られている）は、４４５ｎｍ範囲の蛍光シグナルを放出する。メチルウンベリフェリルグルコ−またはガラクト−ピラノシドは、グルコシダーゼまたはガラクトシダーゼ（酵素）の決定において使用される。適切な酵素が蛍光前駆体に作用する場合、分子は切断され、グルコースまたはガラクトースのどちらか、および蛍光化合物、４−メチルウンベリフェロン（４ＭＵ）を放出する。４ＭＵはグリシンバッファーにおいて３６５ｎｍで励起され、４４５ｎｍで放出する。
【００１２】
ＴＳＢ培地の着色成分およびメイラード反応によって生成される蛍光化合物の両方の存在は、対象の、例えば約４４５ｎｍでの放出光の出力シグナルの変化を妨げ、または増加させるだろう。
【００１３】
本発明の一態様において、色が透明でありメイラード反応に参加する化合物の組み合わせを含まない定義された回復培地を提供する。本願に記述される回復培地は、続く酵素的反応に特に適しており、ここで蛍光産物は、３２０ｎｍ〜３７０ｎｍの波長で励起され、４２０ｎｍ〜４６０ｎｍの波長で放出する。
【００１４】
回復培地の使用が自己充足型の生物学的指標システムのための回復培地と同じくらい特に適していると本願に記述されるが、本願に記述される回復培地は、酵素濃度を決定するために、または蛍光部分の使用を介した酵素的反応を続いて行うために使用されてもよい。回復培地は、上述のリーダー／インキュベーターの較正基準を生成するために使用されてもよい。
【００１５】
本発明の態様において、微生物の存在を検出するための回復培地は、少なくとも一つの無機塩、および少なくとも一つの蛍光発生基質を含み、ここで回復培地は、色が透明であり、実質的に還元糖を含まない。回復培地は、少なくとも一つのアミノ酸および／または少なくとも一つのビタミンをさらに含んでもよい。
【００１６】
回復培地における蛍光発生基質は、４−メチルウンベリフェリル誘導体を含んでもよい。４−メチルウンベリフェリル誘導体は、４−メチルウンベリフェリルα−Ｄ−グルコピラノシドを含んでもよい。
【００１７】
一つの実施形態において、回復培地における蛍光発生基質は、３２０ｎｍ〜３７０ｎｍの範囲での励起波長のために４２０ｎｍ〜４６０ｎｍの範囲で蛍光放出を有する切断可能な蛍光色素分子基を含む。切断可能な蛍光色素分子は、４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）を含んでもよい。
【００１８】
一つの実施形態において、回復培地は、４２０ｎｍ〜４５０ｎｍの範囲の波長の光エネルギーを吸収しない。
本発明の一つの態様において、滅菌工程における有効性を決定する方法を提供し、当該方法は、次のステップ：（ｉ）少なくとも一つの活性酵素を含む生物学的指標を、滅菌チャンバーに置くこと；（ｉｉ）前記チャンバー内で滅菌工程を行うこと、ここで、前記生物学的指標は、滅菌培地に曝され；（ｉｉｉ）前記生物学的指標を、少なくとも一つの無機塩、および切断可能な蛍光色素分子基を含む少なくとも一つの蛍光発生基質を含む回復培地と接触させること、ここで、前記回復培地は、色が透明であり、実質的に還元糖を含まない；（ｉｖ）前記生物学的指標を、ある期間インキュベートすること；および（ｖ）蛍光色素分子基によって放出される蛍光シグナルの存在または消失を検出すること、を含む。
【００１９】
滅菌工程における滅菌培地は、蒸気、乾熱、放射線、プラズマ、一つ以上のガス状滅菌剤および／または一つ以上の液体滅菌剤を含んでもよい。
本発明の他の態様において、滅菌監視装置を提供し、滅菌監視装置は、生物学的指標を含む第一の部分を含み、前記生物学的指標は少なくとも一つの活性酵素を含み、前記第一の部分は、前記生物学的指標に、滅菌工程の間、滅菌培地と接触させることを可能とするように構成されており；並びに回復培地を含む第二の部分を含み、前記第二の部分は、前記滅菌工程の間、前記回復培地が前記生物学的指標から分離することを維持するように、および、前記生物学的指標が滅菌培地に曝された後に、前記回復培地に前記生物学的指標を接触させることを可能とするように構成されており、ここで、前記回復培地は、少なくとも一つの無機塩；および少なくとも一つの蛍光発生基質を含み；ここで、前記回復培地は、色が透明であり、実質的に還元糖を含まない。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、本発明で使用のために適切な滅菌監視装置、活性化前構造で示される前記滅菌監視装置の略図である。
【図２】図２は、活性化構造における図１の滅菌監視装置の略図である。
【図３】図３は、本発明で使用のために適切な滅菌監視装置、活性化前構造で示される前記滅菌監視装置の略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
［詳細な説明］
用語「微生物」は、微細な生体に関する。微生物は、単細胞、多細胞、または細胞集団であってもよい。微生物は、細菌、古細菌、原虫、菌類、藻、ウイルス、多細胞動物寄生生物（寄生蠕虫）、またはそれらの２つ以上の組み合わせを含んでもよい。微生物は、胞子を含んでもよい。微生物は、細菌胞子を含んでもよい。
【００２２】
用語「細菌」は、原核微生物の領域に関する。細菌は単細胞微生物であってもよい。細菌は核を欠いているので、細菌細胞は、原核と記述されてもよい。細菌細胞は、４つの主な形：バチルス（Ｂａｃｉｌｕｓ）（棒状の）、コッカス（ｃｏｃｃｕｓ）（球状）、スピリラ（ｓｐｉｒｉｌｌａ）（らせん形）、またはビブリオ（ｖｉｂｒｉｏ）（曲がった形）のうちの一つを有してもよい。細菌はペプチドグリカン壁を有してもよい。細菌は、細菌核分裂によって分割してもよい。細菌は、運動性のために鞭毛を保有してもよい。細菌は、グラム染色を使用する場合、グラム−陽性、またはグラムー陰性のどちらかに分類されてもよい。細菌は、気体酸素に対する細菌の応答に基づいて、次の群：好気性（酸素の存在で生存する）、嫌気性（酸素無しで生存する）、および通性嫌気性（両方の環境で生きることができる）、に分類されてもよい。細菌は、従属栄養生物または独立栄養生物として分類されてもよい。独立栄養生物は、化学独立栄養生物と呼ばれる場合に、太陽光または化学反応のエネルギーを用いることによって生物自身で食物を作る。従属栄養生物は、他の生物を摂取することによってエネルギーを得る。エネルギー源として生命体を腐らせることを用いる細菌は、腐生菌と呼ばれてもよい。
【００２３】
用語「胞子」は、好まない条件下、長時間、分散および生存するために適し得る無性生殖の単位に関する。胞子は、高い抵抗性、休眠細胞型である。内性胞子（または単に胞子）は、無性生殖母細胞内で、環境の不利の変化、最も一般的には栄養枯渇に応答して、形成する。母細胞は、非対称細胞分裂を受け、非対称細胞分裂において、当該遺伝物質を複製し、母細胞は、その後、複数の同心性および胞子特異的層によって取り囲まれる。母細胞は、その後、分解し、生存のための栄養、水、または空気を必要としない成熟休眠胞子を放出し、極度の温度、放射線、および化学的攻撃を含む、様々な外傷に対して保護される。
【００２４】
用語「細菌胞子」は、細菌によって生産される胞子に関する。
用語「試験微生物」は、滅菌工程における有効性を試験するために使用され得る微生物に関する。試験微生物は、滅菌工程の間、破壊用の生物より滅菌工程に対して、より抵抗性があってもよい。理論的には、試験微生物が滅菌工程の間に死ぬことになる場合、試験微生物よりも滅菌に対する抵抗性が低い滅菌工程中の破壊用の全ての生物も死ぬだろう。試験微生物は、細菌を含んでもよい。試験微生物は、胞子を含んでもよい。試験微生物は、細菌胞子を含んでもよい。試験微生物は、バチルス（Ｂａｃｉｌｕｓ）属、またはクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）属の胞子を含んでもよい。試験微生物は、ゲオバチルス  ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス  アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）、バチルス  スファエリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、バチルス  アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、バチルス  プミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス  コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、クロストリジウム  スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）、クロストリジウム  ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、クロストリジウム  ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、バチルス  スブチルス  グロビギ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｇｌｏｂｉｇｉｉ）、バチルス  セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス  サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、またはそれらの２つ以上の混合物を含んでもよい。試験微生物は、ゲオバチルス  ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）胞子、バチルス  アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）胞子、またはそれらの混合物を含んでもよい。
【００２５】
用語「生物学的指標」は、滅菌工程における有効性を決定するために使用されることができる物または材料に関する。生物学的指標は、試験微生物（例えば、細菌、胞子、または細菌胞子）を含んでもよい。生物学的指標は、担体上の試験微生物を含んでもよい。生物学的指標は、細菌を含んでもよく、細菌は、定義された空間内に存在してもよく、または担体上に沈着されてもよい。生物学的指標は、胞子（例えば、細菌胞子）を含んでもよく、胞子は、定義された空間内または担体上に存在してもよい。生物学的指標は、胞子ストリップ（ｓｔｒｉｐ）を含んでもよい。
【００２６】
用語「滅菌」は、複製、代謝、および／または成長をする能力がない物質の状態に関する。これは、生物の全体的な欠如をしばしば意味することになるが、用語「滅菌」は、以前に同意した許容できる程度に生物を含まない物質に関して本願において使用されてもよい。別段の指示がない限り、用語滅菌は、例えば、殺菌、浄化、および同様のもの等、滅菌より厳密性が低い方法および手順に関しても本願で使用される。本願に記述される生物学的指標、並びに工程および装置は、医療分野、科学分野などに使用されてもよい。これらは、商業的および工業的応用において使用されてもよく、商業的および工業的応用において滅菌、殺菌、浄化、除染、洗浄などが所望されてもよい。商業的および工業的応用は、食品加工、低温殺菌、土壌改善、水改善などのような工程を含んでもよい。
【００２７】
本発明の一つの態様において、生物学的指標のための回復培地は、液体栄養支持体を含み、液体栄養支持体において、少なくとも一つの蛍光発生基質が可溶化される。培地は色が透明であることによって、測定される蛍光の効率、並びにメチルウンベリフェリルピラノシド前駆体に基づく蛍光分析および４００ｎｍ〜４５０ｎｍの範囲の放出波長を有する蛍光分子を生成する任意の他の分析の測定感度を増加させる。
【００２８】
前述の用語「色が透明」とは、培地が約３９０ｎｍ〜７００ｎｍの可視光範囲において実質的に色がないことを意味する。
回復培地は、アミノ酸、ビタミン、金属イオン、無機塩および緩衝液の混合物を含む。アミノ酸成分は、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、およびＬ−バリン、並びにアミノ酸のナトリウム塩および／または塩酸塩の２つ以上の混合物を含んでもよい。例となるビタミンは、Ｄ−ビオチン、チアミン、およびニコチン酸から選択されてもよい。培地は、塩基として、塩化鉄、塩化カルシウム、硫酸亜鉛、塩化マグネシウム、塩化アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、並びにリン酸カリウムおよびリン酸二カリウムの一つ以上を含んでもよい。
【００２９】
回復培地は、酵素基質を含み、指標酵素の作用を受けると、酵素基質は酵素修飾産物に変換される。酵素基質は、蛍光発生基質を含んでもよく、材料として本願に定義され、蛍光化合物を生成するために酵素の作用を受ける。
【００３０】
特異的な指標酵素の検出のために使用され得る蛍光発生基質の２つの基礎的な型がある。蛍光発生基質の第一の型は、ＡＢのような化学式を与えられてもよい。指標酵素の作用を受けると、ＡＢは、Ａ＋Ｂに分解されてもよく、Ｂは、例えば、蛍光であってもよい。一つの実施形態において、２つのＢ成分が、蛍光シグナルを生成するために共に反応してもよい。この型の蛍光発生基質の特異的な例は、リン酸４−メチルウンベリフェリルであってもよい。指標酵素のホスファターゼの存在において、基質は、４−メチルウンベリフェリルおよびリン酸塩に分解されてもよい。この型の他の蛍光発生基質は、４−メチルウンベリフェリル、７−アミド−４−メチルクマリン、インドキシル、およびフルオレセインの誘導体を含んでもよい。
【００３１】
蛍光発生基質の第二の型は、化学式ＣＤによって与えられてもよく、例えば、化学式ＣＤは、特異的酵素によってＣ＋Ｄに変換されてもよい。しかしながら、ＣまたはＤのどちらも蛍光性でなくてもよいが、Ｄは、蛍光化合物を与えるために化合物Ｚとさらに反応することが可能であってもよく、したがって酵素活性を示す。この型における特異的な蛍光発生基質の例は、アミノ酸リシンであってもよい。酵素リシンデカルボキシラーゼの存在において、リシンはＣＯ２分子を失ってもよい。リシンの残存する部分は、その後、カダベリンと呼ばれ、カダベリンは強い塩基性である。４−メチルウンベリフェロンのような塩基性指標は、強い塩基の存在下で組み込まれてもよく、蛍光性であってもよい。
【００３２】
多様な起源の指標酵素のために多くの酵素基質が使用されてもよい。これらは、蛍光性４−メチルウンベリフェリル誘導体（４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）に加水分解される）；７−アミド−４−メチル−クマリンの誘導体；ジアセチルフルオレセイン誘導体；およびフルオレセインを含んでもよい。
【００３３】
酵素基質として使用され得る４−メチルウンベリフェリルの誘導体は、４−メチルウンベリフェリル−２−アセトアミド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−ベータ−Ｄ−ルコピラノシド；酢酸４−メチルウンベリフェリル；４−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−ベータ−Ｄ−ガラクトサミニド；４−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−アルファ−Ｄ−グルコサミニド；４−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−ベータ−Ｄ−グルコサミニド；２’−（４−メチルウンベリフェリル）−アルファ−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸；４−メチルウンベリフェリル−アルファ−Ｌ−アラビノフラノシド；４−メチルウンベリフェリル−アルファ−Ｌ−アラビノフラノシド；酪酸４−メチルウンベリフェリル；４−メチルウンベリフェリル−ベータ−Ｄ−セロビオシド；メチルウンベリフェリル−ベータ−Ｄ−Ｎ，Ｎ’−ジアセチルキトビオシド；４−メチルウンベリフェリル−エラジエート；４−メチルウンベリフェリル−ベータ−Ｄ−フコシド；４−メチルウンベリフェリル−アルファ−Ｌ−フコシド；４−メチルウンベリフェリル−ベータ−Ｌ−フコシド；４−メチルウンベリフェリル−アルファ−Ｄ−ガラクトシド；４−メチルウンベリフェリル−ベータ−Ｄ−ガラクトシド；４−トリフルオロメチルウンベリフェリルベータ−Ｄ−ガラクトシド；６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリル−ベータ−Ｄ−ガラクトシド；４−メチルウンベリフェリル−アルファ−Ｄ−グルコシド；４−メチルウンベリフェリル−ベータ−Ｄ−グルコシド；４−メチルウンベリフェリル−７，６−スルホ−２−アセトアミド−２−デオキシ−ベータ−Ｄ−グルコシド；４−メチルウンベリフェリル−ベータ−Ｄ−グルクロニド；６，８−ジフルオ（ｄｉｆｌｕｏｒ）−４−メチルウンベリフェリル−ベータ−Ｄ−グルクロニド；４−メチルウンベリフェリルｐ−グアニジノベンゾエート；４−メチルウンベリフェリルヘプタノエート；４−メチルウンベリフェリル−アルファ−Ｄ−マンノピラノシド；４−メチルウンベリフェリル−ベータ−Ｄ−マンノピラノシド；オレイン酸４−メチルウンベリフェリル；オレイン酸４−トリフルオロメチルウンベリフェリル；パルミチン酸４−メチルウンベリフェリル；リン酸４−メチルウンベリフェリル；プロピオン酸４−メチルウンベリフェリル；ステアリン酸４−メチルウンベリフェリル；硫酸４−メチルウンベリフェリル；４−メチルウンベリフェリル−ベータ−Ｄ−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−トリアセチルキトトリオ―ス；４’−メチルウンベリフェリル２，３，５−トリ−ベータ−ベンゾイル−アルファ−Ｌ−アラビノフラノシド；４−メチルウンベリフェリル−ベータ−トリメチルアンモニウムシンナマートクロリド；４−メチルウンベリフェリル４−グアニジノベンゾエート；および４−メチルウンベリフェリル−ベータ−Ｄ−キシロシド、を含んでもよい。
【００３４】
酵素基質として使用され得る７−アミド−４−メチルクマリンの誘導体は、Ｌ−アラニン−７−アミド−４−メチルクマリン；Ｌ−プロリン−７−アミド−４−メチルクマリン；Ｌ−チロシン−７−アミド−４−メチルクマリン；Ｌ−アルギニン−７−アミド−４−メチルクマリン；Ｌ−シトルリン−７−アミド−４−メチルクマリン；Ｌ−ロイシン−７−アミド−４−メチルクマリン；Ｌ−メチオニン−７−アミド−４−メチルクマリン；Ｌ−ピログルタミン酸−７−アミド−４−メチルクマリン；Ｌ−アスパラギン酸−ベータ−（７−アミド−４−メチルクマリン）；Ｌ−グルタミン酸１−（７−アミド−４−メチルクマリン）；Ｌ−フェニルアラニン−７−アミド−４−メチルクマリン；および７−グルタリル−フェニルアラニン−７−アミド−４−メチルクマリン、を含んでもよい。
【００３５】
酵素基質として使用され得る７−アミド−４−メチルクマリンのペプチド誘導体は、Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ７−アミド−４−メチルクマリン；Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ７−アミド−４−メチルクマリン；Ｎ−ＣＢＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ７−アミド−４−メチルクマリン；Ｎ−スクシニル−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−７−アミド−４−メチルクマリン；Ｇｌｙ−Ｐｒｏ７−アミド−４−メチルクマリン；Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ７−アミド−４−メチルクマリン；Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ７−アミド−４−メチルクマリン；およびＮ−グルタリル−Ｇｌｙ−Ａｒｇ７−アミド−４−メチルクマリン、を含んでもよい。
【００３６】
酵素基質として使用され得るジアセチルフルオレセインの誘導体は、フルオレセイン二酢酸、フルオレセイン二酪酸、２’，７’−ジクロロフルオレセイン二酢酸、フルオレセインジ−（ベータ−Ｄ−Ｎ−アセチルガラクトサミン）、フルオレセインジ−（ベータ−Ｄ−ガラクトシド）、フルオレセインモノ−（ベータ−Ｄ−ガラクトシド）、およびフルオレセイン二ラウリン酸、を含んでもよい。
【００３７】
使用される酵素基質は、指標酵素の独自性に依存してもよく、指標酵素の活性は研究中である。ここで、活性を検出することが可能である指標酵素は、アルファ−Ｄ−グルコシダーゼ、キモトリプシン、または脂肪酸エステラーゼであり、使用され得る蛍光発生酵素基質は、４−メチルウンベリフェリル−アルファ−Ｄ−グルコシド、７−グルタリルフェニルアラニン−７−アミド−４−メチルクマリン、または４−メチルウンベリフェリル−ヘプタノエート、それぞれ、であってもよい。ここで、活性を検出することが可能である指標酵素は、アルファ−Ｌ−アラビノフラノシダーゼであり、使用され得る蛍光発生酵素基質は、４−メチルウンベリフェリル−アルファ−Ｌ−アラビノフラノシドであってもよい。ここで、活性を検出することが可能である指標酵素は、ベータ−Ｄ−ガラクトシドダーゼであり、使用され得る蛍光発生酵素基質は、４−メチルウンベリフェリル−ベータ−Ｄ−グルコシドであってもよい。
【００３８】
一つの実施形態において、蛍光前駆体分子は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコピラノシド（ＭＵＤ）である。酵素切断は４−ＭＵを放出して、結果的に３６５ｎｍの励起波長で４４５ｎｍの放出波長を有する４−ＭＵアニオンと関連する蛍光をもたらす。他の溶媒に溶解される他の蛍光前駆体分子を使用してもよい。
【００３９】
回復培地の付加的な成分は、非還元糖であってもよい。非還元糖は、塩基性水溶液中で弱い酸化剤（アルデヒドを酸化するがアルコールは酸化しない酸化剤）によって酸化されない。非還元糖の特有の性質は、塩基性含水培地中でアルデヒド基を含む任意の化合物を生成しないということである。非還元糖の例は、スクロース、トレハロース、ラフィノースおよびメレジトースを含む。非還元糖は、メイラード反応に参加せず、アミノ酸との相互作用で培地に黄褐色を与えない。加えて、非還元糖は、細菌のエネルギー／食物源を提供する。
【００４０】
回復培地のｐＨは、微生物代謝のための状態を与えるために好ましくは約７．２〜７．５である。ｐＨは、酸レベルから最大約ｐＨ１１まで変化することも可能である。培地は色が透明であり、ＴＳＢ培地が吸収する程度である４２０ｎｍ〜４５０ｎｍの範囲の光を吸収しないことによって、測定される蛍光効率および測定感度を上昇させる。
【００４１】
培地は、還元糖を含まないので、メイラード反応を受けない。還元糖はマルトース、ラクトース、メリビオース、セロビオース、ゲンチオビオース、フルクトース、ガラクトース、グルコース、グリセルアルデヒド、リボース、およびキシロースを含む。還元糖の非存在は、正バイアスとして、対象の酵素の正確な決定と干渉することが可能になる生成される無関係な蛍光分子の可能性も減少させる。上述されるように、培地は色が黄褐色ではないので、酵素検出感度の上昇を可能にする。
【００４２】
還元糖の非存在でさえ、回復培地は、振とうフラスコでの微生物の生育を可能にすることが明らかになっている。
本発明の態様において、回復培地は、下記の表１に示される濃度範囲内で次の成分を含む。
【００４３】
【表１】
2020508678.tif 000003
【００４４】
回復培地において酵素基質の濃度は、酵素基質および指標酵素の特性、検出可能に生成されなければならない酵素修飾産物の量、並びに指標酵素が存在するかどうか決定するために必要とされる時間量、に依存してもよい。十分であり得る酵素基質の量は、滅菌が完了された後に存在し得る指標酵素と反応するために必要とされる量、例えば少なくとも約１０−１５モル濃度のモル濃度での酵素修飾産物が最大約４時間の期間内で生産され得る、または少なくとも約１０−８モル濃度のモル濃度での酵素修飾産物が最大約２時間の期間内で生産され得るような量、であってもよい。
【００４５】
回復培地は、生物学的指標が滅菌サイクルに曝された後に生物学的指標と混合されてもよい。生物学的指標を含む回復培地は、その後、インキュベートされることができる。インキュベーションは、いくつかの生物学的指標が機能的な状態であると仮定して、検出可能な量の指標酵素を遊離させるのに十分な期間および条件下で続けられてもよい。一般的に、検出可能であり得る指標酵素の量は、約１×１０−１５モル濃度ほど低くてもよい。インキュベーション条件は、少なくとも約１×１０−８モル濃度の指標酵素を、または約１×１０−６〜約１×１０−５モル濃度の指標酵素を生成するために十分であってもよい。検出可能な量の指標酵素を生産するために必要とされるインキュベーション時間および温度は、回復培地における指標酵素の特性、および指標酵素の濃度に依存してもよい。インキュベーション温度は、約２０℃〜約７０℃の範囲であってもよい。インキュベーション時間は、最大約４時間の範囲内で、または約０．０１〜約４時間の範囲内で、または約０．０１〜約３時間の範囲内で、または約０．０１〜約２時間の範囲内で、または約０．０１〜約１時間の範囲内であってもよい。指標酵素は、検出可能な酵素−修飾産物を形成するために酵素基質に作用する。検出は、最大約４時間、または約０．０１〜約４時間、または約０．０１〜約３時間、または約０．０１〜約２時間、または約０．０１〜約１時間、または約０．０１〜約０．７時間、または約０．０１〜約０．５時間の期間内で達成されることができる。
【００４６】
生物学的指標は、本願において単一の指標酵素に関して主に記述されるけれども、多数の指標酵素を提供してもよい。例えば、生物学的指標は、３つの型の指標酵素を提供してもよく、第一の酵素は熱に対して抵抗があり、第二の酵素は気体滅菌に対して抵抗があり、第三の酵素は放射線、例えばガンマ放射、またはベータ放射などに対して抵抗がある。
【００４７】
一実施形態において、回復培地の組成は、下記の表２に示される通りである。
【００４８】
【表２】
2020508678.tif 000004
【００４９】
本願に記述される回復培地は、滅菌監視装置において使用されてもよい。一実施形態において、滅菌監視装置は、２つの分離した部分を有する容器を含む自己−充足型の滅菌監視装置である。一つの部分は、生物学的指標を含んでもよい。もう一方の部分は、回復培地を含んでもよい。使用において、滅菌監視装置および滅菌されるための物は、滅菌培地に曝される。続く滅菌後に、滅菌監視装置を、滅菌工程が有効であるかどうか決定するために、生物学的指標が回復培地と十分に接触するように起動する。滅菌監視装置は、いくつかの滅菌工程と共に使用されてもよく、ここで、生物学的指標は、滅菌培地、例えば、気体滅菌剤を用いる滅菌工程にさらされる。
【００５０】
図１、および図２に関して、滅菌監視装置１０を開示する。滅菌監視装置１０は、容器３０に取り付けられるキャップ２０を含む。容器３０は、閉じた底部末端３１、開いた上部末端、および内部空間３４を含む。キャップ２０は、外壁２２、開いた下部末端、および閉じた上部末端２３を有する。キャップ２０は、内壁２４および内部チャンバー２６も含む。内部チャンバー２６は、壁２４の底部末端に隣接した穴２５を含む。内部チャンバー２６は、回復培地５０を含む。キャップ２０は、穴２５を覆い、およびチャンバー２６内の回復培地５０を包含する壊れやすい障壁４０を含む。滅菌監視装置１０は、キャップ２０がスナップ−フィット（ｓｎａｐ−ｆｉｔ）連結で容器３０に取り付けられるように構成される。他の実施形態において、示されてはいないが、滅菌監視装置１０は、キャップ２０がネジ式連結で容器３０に取り付けられるように構成されてもよく、ねじ式連結において、キャップ２０は、ねじによって容器３０と連結され、このシステムは、容器３０に対してキャップ２０を回転すること、すなわち、容器３０にキャップ２０をさらにねじ込むことによって達成される。
【００５１】
容器３０は、容器３０の上部末端に隣接して、または近くに頂上部（ｒｉｄｇｅ）または縁（ｌｉｐ）を形成する環状突起３２を含む。キャップ２０は、キャップ２０の底部に隣接する頂上部または縁を形成する環状突起２９を含む。キャップ２０は、容器の縁部３２を覆うキャップの縁２９をスライドさせることによって容器３０に取り付けられてもよい。容器３０の頂上部３２は、キャップ２０および容器３０が脱連結することを防ぐために、キャップ２０の頂上部２９をはめ込む。キャップ２０および容器３０は、キャップ２０に外部の下向きの力を供給することなくキャップ２０が下向きにスライドすることを防ぐために、頂上部３２が、キャップ２０に対して十分な量の圧を与えるように形成されてもよい。
【００５２】
容器３０は、キャップ２０が下向きに移動されると壊れやすい障壁４０を壊すまたは穿刺するように構成される一つ以上の穿刺部材３６を含み、障壁４０は、穿刺部材３６の先端３８と接触する。穿刺部材３６は、容器３０の底壁３７から上方へ伸ばすように示される。他の実施形態において、示されていないが、穿刺部材３６は、側壁３５から、または側壁３５と底壁３７の両方から上方へ延びてもよい。
【００５３】
滅菌工程を評価するために、較正濃度の生物学的指標を容器３０の内部３４に置く。生物学的指標は、容器の壁３５に直接的に置かれても、または容器３０内に置かれる支持メンバー（例えば、支持メンバー７０）に提供されてもよい。内部チャンバー２６は、回復培地５０で満たされている。滅菌監視装置１０は、その後、容器３０にキャップ２０を取り付けることによって組み立てられる。キャップ２０は、上述のように容器３０にキャップ２０をスナップ−フィットすることによって、または例えば、ねじ込んで取り付けられてもよい。図３に関して、キャップ２０は、最初に容器３０に、壊れやすい障壁４０が無傷の状態で穿刺部材３６によって穿刺されないような非活性化（または開いた）位置に、取り付けられる。
【００５４】
図１に示されるように組み立てられた滅菌監視装置１０を用いて、滅菌監視装置１０は、その後、滅菌工程に晒されることができる。キャップ２０は、滅菌監視装置１０に入る滅菌剤蒸気が通る開口部２８を有する。滅菌剤は、開口部２８を通ってキャップに（壁２２と壁２４との間の空間に）入り、キャプ２０の内壁２４における外側表面と、壁３５の内側表面との間に定義される空間６０を通って容器３０に流れ込む。滅菌剤蒸気は、容器３０に流れ込み、生物学的指標と接触する。
【００５５】
滅菌工程が完了した後、滅菌監視装置１０は、第二の（または閉じた、もしくは活性化された）位置に、容器３０に向かってキャップ２０を下方に移動することによって活性化されてもよく、そのことは図４に示される。キャップ２０は、十分な下方に向かう力を適用することによって、またはキャップ２０の圧力によって下方に移動される。キャップ２０は、下方に移動されるので、壊れやすい障壁４０は、穿刺部材３６の先端３８と接触して、先端３８が壊れやすい障壁４０を穿刺するような位置に最終的に移動される。壊れやすい障壁４０が穿刺されると、回復培地５０は、容器３０の内部空間３４に流れ出し、生物学的指標と接触する。容器への誘導流体の完全な流れ込みを確実にするために、壊れやすい障壁４０のよりよい、または最大の開口をもたらすようなねじる動きを用いてキャップ２０を下方に移動することが望まれてもよい。
【００５６】
キャップ２０の内部表面は、第二の環状突起２７を含む。キャップ２０は、キャップ２０を保持するために、突起２７の上部が容器３０における縁３２の底にはめ込むような位置へ、閉じた／活性化された位置へ下方に移動されてもよい。閉じた／活性化された位置はキャップ２０を容器３０と密封された関係で保持する。滅菌監視装置１０は、その後、微生物の生存能力が決定されるのに十分な期間インキュベートされる。インキュベーション中、生物学的指標からの任意の生存微生物は、代謝し成長するだろう。この代謝は、回復培地５０に副生成物を放出する。副生成物は、例えば、ｐＨ変化、色の変化、不透明性、蛍光、などを含む任意の選択された特性によって検出されてもよい。
【００５７】
他の実施形態において、キャップ２０は、閉じた位置で容器を維持するために、第二の突起２７を含まない。容器３０は、他の環状突起、または容器３０の外側で縁３２の下方にある一連の戻り止め（示されていない）を含んでもよく、突起または戻り止めは、閉じた位置で容器３０を保持するためにキャップの縁２９をはめ込むように構成されてもよい。米国特許第５，７７０，３９３号は、当該形状を示し、この特許は、キャップおよび容器の形状に関する当該教示のために本明細書に参照によって組み込まれる。
【００５８】
他の実施形態において、キャップ２０の内部表面および容器３０の外部表面は、ねじ込まれてもよく、キャップ２０は、容器３０にキャップ２０をねじ込むことによって閉じた位置に移動され保持されてもよく、そのことにおいて、キャップ２０は、例えば米国特許第８，１７３，３８８Ｂ２号などに示されるようにねじ込まれてもよい。米国特許第８，１７３，３８８Ｂ２号は本明細書に参照によって組み込まれる。
【００５９】
キャップ２０は、図１、および図２に示される実施態様において、滅菌監視装置１０に滅菌剤の進入を可能にする開口部２８を有するように示される。しかしながら、キャップ２０は、当該特徴を備わっている必要がないことは理解されるだろう。開口部の数、サイズ、形、および／または位置は、滅菌剤指標を使用することになるので特定の滅菌剤を考慮して、所望される通りに選択されてもよい。例えば、キャップ２０および／または容器３０における開口部の位置、形、およびサイズは、生物学的指標と周囲環境との間に滅菌培地の出入りのための曲がりくねった通路を提供するために選択されてもよい。他の実施形態において、キャップ２２の側壁と瓶（ｖｉａｌ）３０の外壁との間の空間は、キャップまたは瓶のどちらかにおいて開口部を提供しなくても曲がりくねった通路を提供するために十分であってもよい。曲がりくねった通路は、外部物質からの汚染を阻害する、または予防するために、および十分な量の滅菌剤が利用可能であることを確実にするために機能してもよい。曲がりくねった通路を含むことによって、装備全体が滅菌剤にさらされることになるので、滅菌監視装置１０において試験生物が殺される前に任意の現存している微生物を殺すことになるとより好ましい。
【００６０】
開口部は、さらに容器３０に提供されてもよく、または別の方法としてキャップ２０に提供されてもよい。さらに、開口部が容器３０に提供される場合、開口部は、滅菌監視装置１０が活性化され障壁４０が壊れると回復培地５０が当該開口部を通って漏れる、またはこぼれることがないように置かれてもよい。
【００６１】
図３は、滅菌監視装置１０を描写し、滅菌監視装置１０において、開口部８０は、適切な位置で容器３０の側壁３５に形成され、さらにキャップ２０の開口部２８も形成される。図５に示される開口部８０は、活性化後に漏れ、またはこぼれることを防ぐために、容器３０の頂上部近くで容器３０の側壁３５に、穿刺部材３６の先端３８の近辺にある。図５から見られることができるように、活性化後、この場所での開口部８０は、活性化位置でキャップ２０によって覆われるだろう。図５に示される滅菌監視装置１０は、キャップ２０において開口部２８を含むが、開口部２８は必須でなくてもよいということを注意する。一実施形態において（示されていない）、容器３０は開口部８０を含み、キャップ２０と同様にキャップと共に使用されるが、キャップ２０は開口部２８を含まない。したがって、開口部はキャップ２０または容器３０のどちらか、またはキャップ２０および容器３０の両方に設けられることができる。代替的に、経路が不活性化状態のうちにキャップ２０と容器３０との間に設けられる限り、開口部は、必要とされなくてもよい。
【００６２】
滅菌工程が完結された後、キャップ２０は、滅菌工程で生存し得る生物学的指標の任意の微生物と混合しインキュベーションするために、穿刺部材３６の先端３８が壊れやすい障壁４０を貫通し壊し、空間２６に回復培地５０を放出するように、下方向に圧縮され、またはねじ込まれる。
【００６３】
開示される本発明は、さまざまな詳細な実施態様に関して説明されている一方、本発明におけるさまざまな修飾は、明細書を読んだ当業者に対して明らかになり得ることは理解されるべきである。したがって、本願において特定される発明は、別記の請求項の範囲内に含まれ得るように当該修飾を含むことを目的とすることは理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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