(57)【要約】本明細書において、キメラＣ１ｑポリペプチドを発現するタンパク質をコードする核酸、前述の核酸を含む非ヒト動物、および前述の非ヒト動物を作製または使用する方法が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
そのゲノム内に、キメラＣ１ｑポリペプチドをコードする核酸を含む、遺伝子改変齧歯類動物であって、ここにおいて、前記核酸が、齧歯類核酸配列と、ヒト核酸配列とを含み、ここにおいて、前記キメラＣ１ｑポリペプチドが、キメラＣ１ｑａポリペプチド、キメラＣ１ｑｂポリペプチド、およびキメラＣ１ｑｃポリペプチドをからなる群から選択され、かつここにおいて、前記キメラＣ１ｑポリペプチドが、実質的にヒトである球状頭部ドメインと、実質的に齧歯類であるＮ末端葉柄茎領域とを含む、遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項２】
前記齧歯類動物が、キメラＣ１ｑａポリペプチド、キメラＣ１ｑｂポリペプチド、キメラＣ１ｑｃポリペプチド、またはそれらの組み合わせを発現する、請求項１に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項３】
前記齧歯類動物がラット、またはマウスである、請求項１または２に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項４】
前記キメラＣ１ｑポリペプチドがキメラＣ１ｑａポリペプチドである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項５】
前記キメラＣ１ｑａポリペプチドが、実質的にヒトＣ１ｑａポリペプチドの球状頭部ドメインと同一である前記球状頭部ドメイン、および実質的に齧歯類Ｃ１ｑａポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と同一である前記Ｎ末端葉柄茎領域を含む、請求項４に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項６】
前記ヒトＣ１ｑａポリペプチドの球状頭部ドメインが、配列番号４の１０８〜２４５を含む、請求項５に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項７】
前記齧歯類動物がマウスである、請求項４〜６のいずれか１項に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項８】
前記キメラＣ１ｑａポリペプチドが、内因性マウスＣ１ｑａポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と実質的に同一な前記Ｎ末端葉柄茎領域を含み、ここにおいて、前記内因性マウスＣ１ｑａポリペプチドの前記Ｎ末端葉柄茎領域が、配列番号１のアミノ酸２３〜１０７を含む、請求項７に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項９】
前記キメラＣ１ｑａポリペプチドが、配列番号１０のアミノ酸２３〜２４５を含む、請求項７または８に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項１０】
前記齧歯類動物がラットである、請求項４〜６のいずれか１項に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項１１】
前記キメラＣ１ｑａポリペプチドが、内因性ラットＣ１ｑａポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と実質的に同一な前記Ｎ末端葉柄茎領域を含み、ここにおいて、前記内因性ラットＣ１ｑａポリペプチドの前記Ｎ末端葉柄茎領域が、配列番号７のアミノ酸２３〜１０７を含む、請求項１０に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項１２】
前記キメラＣ１ｑａポリペプチドが、配列番号５５のアミノ酸２３〜２４５を含む、請求項１０または１１に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項１３】
前記キメラＣ１ｑポリペプチドがキメラＣ１ｑｂポリペプチドである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項１４】
前記キメラＣ１ｑｂポリペプチドが、実質的にヒトＣ１ｑｂポリペプチドの球状頭部ドメインと同一である前記球状頭部ドメイン、および実質的に齧歯類Ｃ１ｑｂポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と同一である前記Ｎ末端葉柄茎領域を含む、請求項１３に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項１５】
前記ヒトＣ１ｑｂポリペプチドの球状頭部ドメインが、配列番号５のアミノ酸１１５〜２５１を含む、請求項１４に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項１６】
前記齧歯類動物がマウスである、請求項１３〜１５に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項１７】
前記キメラＣ１ｑｂポリペプチドが、内因性マウスＣ１ｑｂポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と実質的に同一な前記Ｎ末端葉柄茎領域を含み、ここにおいて、前記内因性マウスＣ１ｑｂポリペプチドの前記Ｎ末端葉柄茎領域が、配列番号２のアミノ酸２６〜１１４を含む、請求項１６に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項１８】
前記キメラＣ１ｑｂポリペプチドが、配列番号１１のアミノ酸２６〜２５１を含む、請求項１６または１７に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項１９】
前記齧歯類動物がラットである、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項２０】
前記キメラＣ１ｑｂポリペプチドが、内因性ラットＣ１ｑｂポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と実質的に同一な前記Ｎ末端葉柄茎領域を含み、ここにおいて、前記内因性ラットＣ１ｑｂポリペプチドの前記Ｎ末端葉柄茎領域が、配列番号８のアミノ酸２６〜１１４を含む、請求項１９に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項２１】
前記キメラＣ１ｑｂポリペプチドが、配列番号５６のアミノ酸２６〜２５１を含む、請求項１９または２０に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項２２】
前記キメラＣ１ｑポリペプチドがキメラＣ１ｑｃポリペプチドである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項２３】
前記キメラＣ１ｑｃポリペプチドが、実質的にヒトＣ１ｑｃポリペプチドの球状頭部ドメインと同一である前記球状頭部ドメイン、および実質的に齧歯類Ｃ１ｑｃポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と同一である前記Ｎ末端葉柄茎領域を含む、請求項２２に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項２４】
前記ヒトＣ１ｑｃポリペプチドの球状頭部ドメインが、配列番号６のアミノ酸１１３〜２４５を含む、請求項２３に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項２５】
前記齧歯類動物がマウスである、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項２６】
前記キメラＣ１ｑｃポリペプチドが、内因性マウスＣ１ｑｃポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と実質的に同一な前記Ｎ末端葉柄茎領域を含み、ここにおいて、前記内因性マウスＣ１ｑｃポリペプチドの前記Ｎ末端葉柄茎領域が、配列番号３のアミノ酸３０〜１１３を含む、請求項２５に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項２７】
前記キメラＣ１ｑｃポリペプチドが、配列番号１１のアミノ酸３０〜２４６を含む、請求項２５または２６に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項２８】
前記齧歯類動物がラットある、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項２９】
前記キメラＣ１ｑｃポリペプチドが、内因性ラットＣ１ｑｃポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と実質的に同一な前記Ｎ末端葉柄茎領域を含み、ここにおいて、前記内因性ラットＣ１ｑｃポリペプチドの前記Ｎ末端葉柄茎領域が、配列番号９のアミノ酸３２〜１１５を含む、請求項２８に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項３０】
前記キメラＣ１ｑｃポリペプチドが、配列番号５７のアミノ酸３２〜２４８を含む、請求項２８または２９に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項３１】
前記キメラＣ１ｑポリペプチドが、齧歯類Ｃ１ｑシグナルペプチド、任意選択的に内因性齧歯類Ｃ１ｑシグナルペプチドを含む、請求項１〜３０のいずれかに記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項３２】
前記キメラＣ１ｑポリペプチドをコードする前記核酸が、内因性齧歯類Ｃ１ｑ遺伝子座にある、請求項１に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項３３】
前記内因性齧歯類Ｃ１ｑ遺伝子座における内因性ゲノム配列が、前記ヒト核酸配列によって置換されている、請求項３２に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項３４】
前記ヒト核酸配列が、ヒトＣ１ｑポリペプチドの球状頭部ドメインを実質的にコードする、請求項１、２、３２、または３３のいずれか１項に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項３５】
前記ヒト核酸配列が、ヒトＣ１ｑ遺伝子のゲノム断片である、請求項３４に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項３６】
前記ゲノム断片が、前記ヒトＣ１ｑ遺伝子の３’ＵＴＲを含む、請求項３５に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項３７】
前記キメラＣ１ｑポリペプチドがキメラＣ１ｑａポリペプチドであり、前記ヒト核酸配列が前記ヒトＣ１ｑａポリペプチドの球状頭部ドメインを実質的にコードする、請求項３４〜３６のいずれかに記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項３８】
前記ヒトＣ１ｑａポリペプチドの前記球状頭部ドメインが、配列番号４のアミノ酸１０８〜２４５を含む、請求項３７に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項３９】
前記ヒト核酸配列が、配列番号４のアミノ酸１１２〜２４５をコードする、請求項３７または３８に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項４０】
前記キメラＣ１ｑポリペプチドがキメラＣ１ｑｂポリペプチドであり、前記ヒト核酸配列が前記ヒトＣ１ｑｂポリペプチドの球状頭部ドメインを実質的にコードする、請求項３４〜３６のいずれかに記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項４１】
前記ヒトＣ１ｑｂポリペプチドの前記球状頭部ドメインが、配列番号５のアミノ酸１１５〜２５１を含む、請求項４０に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項４２】
前記ヒト核酸配列が、配列番号５のアミノ酸１１８〜２５１をコードする、請求項４０または４１に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項４３】
前記キメラＣ１ｑポリペプチドがキメラＣ１ｑｃポリペプチドであり、前記ヒト核酸配列が前記ヒトＣ１ｑｃポリペプチドの球状頭部ドメインを実質的にコードする、請求項３４〜３６のいずれかに記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項４４】
前記ヒトＣ１ｑｃポリペプチドの前記球状頭部ドメインが、配列番号６のアミノ酸１１３〜２４５を含む、請求項４３に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項４５】
前記ヒト核酸配列が、配列番号６のアミノ酸１１４〜２４５をコードする、請求項４３または４４に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項４６】
前記齧歯類核酸配列が、齧歯類Ｃ１ｑポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域を実質的にコードする、請求項１、２、または３２〜３４のいずれか１項に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項４７】
前記齧歯類動物がマウスであり、マウスＣ１ｑポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域が、それぞれ、配列番号１のアミノ酸２３〜１０７（Ｃ１ｑａの）、配列番号２のアミノ酸２６〜１１４（Ｃ１ｑｂの）、または配列番号３のアミノ酸３０〜１１３（Ｃ１ｑｃの）を含む、請求項４６に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項４８】
前記マウスが、キメラＣ１ｑａポリペプチドをコードする核酸を含み、ここにおいて、前記核酸が、マウス核酸配列およびヒト核酸配列を含み、ここにおいて前記マウス核酸配列が、配列番号１のアミノ酸２３〜１１１をコードする、請求項４７に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項４９】
前記マウスが、キメラＣ１ｑｂポリペプチドをコードする核酸を含み、ここにおいて、前記核酸が、マウス核酸配列およびヒト核酸配列を含み、ここにおいて前記マウス核酸配列が、配列番号２のアミノ酸２６〜１１７をコードする、請求項４７に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項５０】
前記マウスが、キメラＣ１ｑｃポリペプチドをコードする核酸を含み、ここにおいて、前記核酸が、マウス核酸配列およびヒト核酸配列を含み、ここにおいて前記マウス核酸配列が、配列番号３のアミノ酸３０〜１１４をコードする、請求項４７に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項５１】
前記齧歯類動物がラットであり、前記内因性Ｃ１ｑポリペプチドの前記Ｎ末端葉柄茎領域が、それぞれ、配列番号７のアミノ酸２３〜１０７（Ｃ１ｑａの）、配列番号８のアミノ酸２６〜１１４（Ｃ１ｑｂの）、および配列番号９のアミノ酸３２〜１１５（Ｃ１ｑｃの）を含む、請求項４６に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項５２】
前記ラットが、キメラＣ１ｑａポリペプチドをコードする核酸を含み、ここにおいて、前記核酸が、ラット核酸配列およびヒト核酸配列を含み、ここにおいて前記ラット核酸配列が、配列番号７のアミノ酸２３〜１１１をコードする、請求項５１に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項５３】
前記ラットが、キメラＣ１ｑｂポリペプチドをコードする核酸を含み、ここにおいて、前記核酸が、ラット核酸配列およびヒト核酸配列を含み、ここにおいて前記ラット核酸配列が、配列番号８のアミノ酸２６〜１１７をコードする、請求項５１に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項５４】
前記ラットが、キメラＣ１ｑｃポリペプチドをコードする核酸を含み、前記核酸が、ラット核酸配列、およびヒト核酸配列を含み、ここにおいて前記ラット核酸配列が、配列番号９のアミノ酸３２〜１１６をコードする、請求項５１に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項５５】
前記動物が、ラットであり、かつそのゲノム中に、
ａ．  前記内因性Ｃ１ｑａ遺伝子座で、キメララット／ヒトＣ１ｑａポリペプチドをコードする核酸配列であって、ここにおいて、前記核酸配列が、５’−３’、ならびに、動作可能な連結において、配列番号７のラットＣ１ｑａポリペプチドのアミノ酸１〜１１１をコードする第一のヌクレオチド配列、および配列番号４のヒトＣ１ｑａポリペプチドのアミノ酸１１２〜２４５をコードする第二のヌクレオチド配列、を含む、核酸配列と、
ｂ．  前記内因性Ｃ１ｑｂ遺伝子座で、キメララット／ヒトＣ１ｑｂポリペプチドをコードする核酸配列であって、ここにおいて、前記核酸配列が、５’−３’、ならびに、動作可能な連結において、配列番号８のラットＣ１ｑｂポリペプチドのアミノ酸１〜１１７をコードする第三のヌクレオチド配列、および配列番号５のヒトＣ１ｑｂポリペプチドのアミノ酸１１８〜２５１をコードする第４のヌクレオチド配列を、含む、核酸配列と、
ｃ．  前記内因性Ｃ１ｑｃ遺伝子座で、キメララット／ヒトＣ１ｑｃポリペプチドをコードする核酸配列であって、ここにおいて、前記核酸配列が、５’−３’、ならびに、動作可能な連結において、配列番号９のラットＣ１ｑｃポリペプチドのアミノ酸１〜１１６をコードする第五のヌクレオチド配列、および配列番号６のヒトＣ１ｑｃポリペプチドのアミノ酸１１４〜２４５をコードする第六のヌクレオチド配列を、含む、前記核酸配列と、を含む、請求項１に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項５６】
前記動物がマウスであり、かつそのゲノム中に、
ａ．  前記内因性Ｃ１ｑａ遺伝子座で、キメラマウス／ヒトＣ１ｑａポリペプチドをコードする核酸配列であって、ここにおいて、前記核酸配列が、５’−３’、ならびに、動作可能な連結において、配列番号１のマウスＣ１ｑａポリペプチドのアミノ酸１〜１１１をコードする第一のヌクレオチド配列、および配列番号４のヒトＣ１ｑａポリペプチドのアミノ酸１１２〜２４５をコードする第二のヌクレオチド配列を、含む、核酸配列と、
ｂ．  前記内因性Ｃ１ｑｂ遺伝子座で、キメラマウス／ヒトＣ１ｑｂポリペプチドをコードする核酸配列であって、ここにおいて、前記核酸配列が、５’−３’、ならびに、動作可能な連結において、配列番号２のマウスＣ１ｑｂポリペプチドのアミノ酸１〜１１７をコードする第三のヌクレオチド配列、および配列番号５のヒトＣ１ｑｂポリペプチドのアミノ酸１１８〜２５１をコードする第四のヌクレオチド配列を、含む、核酸配列と、
ｃ．  前記内因性Ｃ１ｑｃ遺伝子座で、キメラマウス／ヒトＣ１ｑｃポリペプチドをコードする核酸配列であって、ここにおいて、前記核酸配列が、５’−３’、ならびに、動作可能な連結において、配列番号３のマウスＣ１ｑｃポリペプチドのアミノ酸１〜１１４をコードする第五のヌクレオチド配列、および配列番号６のヒトＣ１ｑｃポリペプチドのアミノ酸１１４〜２４５をコードする第六のヌクレオチド配列を、含む、前記核酸配列と、を含む、請求項１に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項５７】
前記齧歯類動物が、機能的な内因性Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃポリペプチドを発現しない、請求項１〜５６のいずれか１項に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項５８】
遺伝子改変齧歯類動物を作製する方法であって、前記方法が、キメラＣ１ｑポリペプチドをコードする核酸を含む、齧歯類動物のゲノムを改変することを含み、ここにおいて、前記核酸が、齧歯類核酸配列と、ヒト核酸配列とを含み、ここにおいて、前記キメラＣ１ｑポリペプチドが、キメラＣ１ｑａポリペプチド、キメラＣ１ｑｂポリペプチド、キメラＣ１ｑｃポリペプチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され、かつここにおいて、前記キメラＣ１ｑポリペプチドが、実質的にヒトである球状頭部ドメインと、実質的に齧歯類であるＮ末端葉柄茎領域とを含む、方法。
【請求項５９】
前記齧歯類動物の前記ゲノムが改変されて、キメラＣ１ｑａポリペプチドをコードする核酸と、キメラＣ１ｑｂポリペプチドをコードする核酸と、キメラＣ１ｑｃポリペプチドをコードする核酸とを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記キメラＣ１ｑポリペプチドをコードする核酸が、前記内因性齧歯類Ｃ１ｑ遺伝子座に導入される、請求項５８または５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記キメラＣ１ｑポリペプチドをコードする核酸が、前記内因性齧歯類Ｃ１ｑ遺伝子のヌクレオチド配列を前記内因性齧歯類Ｃ１ｑ遺伝子座で置換する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記動物が齧歯類、例えばマウスまたはラットである、請求項５８〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記改変することが、
ａ．  前記ヒト核酸配列を含む核酸分子を、齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞のゲノム内に導入することと、
ｂ．  齧歯類ＥＳ細胞を得ることであって、前記キメラＣ１ｑポリペプチドをコードするように、前記ヒト核酸配列が、内因性齧歯類核酸配列に動作可能な連結で、内因性Ｃ１ｑ遺伝子座内に統合されている、得ることと、
ｃ．  ｂで得られた前記齧歯類ＥＳ細胞から齧歯類動物を生成することと、を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記核酸分子が、キメラＣ１ｑａポリペプチドをコードする核酸、キメラＣ１ｑｂポリペプチドをコードする核酸、およびキメラＣ１ｑｃポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
実質的にヒトである球状頭部ドメインと、実質的に齧歯類であるＮ末端葉柄茎領域とを含むキメラＣ１ｑポリペプチドであって、ここにおいて、前記キメラＣ１ｑポリペプチドが、キメラＣ１ｑａポリペプチド、キメラＣ１ｑｂポリペプチド、およびキメラＣ１ｑｃポリペプチドからなる群から選択される、キメラＣ１ｑポリペプチド。
【請求項６６】
請求項１〜５７のいずれかに記載の齧歯類動物から作製されたキメラＣ１ｑポリペプチド。
【請求項６７】
請求項６５または６６に記載のキメラＣ１ｑポリペプチドのうちの１つ以上を含むキメラＣ１ｑタンパク質。
【請求項６８】
前記タンパク質が、少なくとも１つのキメラＣ１ｑａ、少なくとも１つのキメラＣ１ｑｂ、および少なくとも１つのキメラＣ１ｑｃポリペプチドを含む、請求項６７に記載のキメラＣ１ｑタンパク質。
【請求項６９】
前記タンパク質が、前記キメラＣ１ｑａポリペプチド、キメラＣ１ｑｂポリペプチド、およびキメラＣ１ｑｃポリペプチドの各々の６個ずつを含む、請求項６８に記載のキメラＣ１ｑタンパク質。
【請求項７０】
機能的なキメラＣ１ｑポリペプチドをコードする単離核酸であって、前記単離核酸が、齧歯類核酸配列、およびヒト核酸配列を含み、ここにおいて、前記ヒト核酸配列が、ヒトＣ１ｑポリペプチドの球状頭部ドメインを実質的にコードし、前記齧歯類核酸配列が、同族齧歯類Ｃ１ｑポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域を実質的にコードし、かつここにおいて、前記Ｃ１ｑポリペプチドが、Ｃ１ｑａポリペプチド、Ｃ１ｑｂポリペプチド、またはＣ１ｑｃポリペプチドから選択される、単離核酸。
【請求項７１】
前記第一、第二、または第三のヌクレオチド配列のうちの１つ以上を含む、キメラ齧歯類Ｃ１ｑタンパク質をコードする単離核酸であって、ここにおいて、
ａ．  前記第一のヌクレオチド配列が、キメラＣ１ｑａポリペプチドをコードし、
ｂ．  前記第二のヌクレオチド配列が、キメラＣ１ｑｂポリペプチドをコードし、
ｃ．  前記第三のヌクレオチド配列が、キメラＣ１ｑｃポリペプチドをコードし、
ここにおいて、前記第一、第二、および第三のヌクレオチド配列が、齧歯類核酸配列と、ヒト核酸配列とを含み、ここにおいて、前記ヒト核酸配列が、それぞれ、ヒトＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、およびＣ１ｑｃポリペプチドの球状頭部ドメインを実質的にコードし、および前記齧歯類核酸配列が、それぞれ、同族齧歯類Ｃ１ｑポリペプチド、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、およびＣ１ｑｃポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域を実質的にコードする、単離核酸。
【請求項７２】
請求項７０または７１に記載の単離核酸を含む細胞。
【請求項７３】
前記細胞が胚性幹細胞である、請求項７２に記載の細胞。
【請求項７４】
請求項７３に記載の細胞を含む、遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項７５】
Ｃ１ｑベースの二重特異性抗原結合タンパク質を試験するトランスジェニック齧歯類モデルであって、ここにおいて、前記抗原結合タンパク質が、ヒトＣ１ｑ、および非齧歯類対象抗原の両方を結合し、請求項１〜５７のいずれかに記載の遺伝子改変齧歯類動物を含み、さらに前記非齧歯類対象抗原、または前記非齧歯類対象抗原を発現する細胞を含む、トランスジェニック齧歯類モデル。
【請求項７６】
対象抗原を標的とする薬剤候補のスクリーニング方法であって、前記方法が、
ａ．  請求項１〜５７のいずれかにより定義された遺伝子改変齧歯類動物に前記対象抗原を導入することと、
ｂ．  前記齧歯類動物を対象の薬剤候補と接触させることであって、ここにおいて、前記薬剤候補が、前記ヒトＣ１ｑおよび前記対象抗原に対して向けられている、接触させることと、
ｃ．  前記薬剤候補が、前記対象抗原の存在または発現により特徴付けられる細胞の予防、低減、または除去において有効であるかどうかを分析することと、を含む、方法。
【請求項７７】
前記導入する工程が、前記齧歯類動物に前記対象抗原を発現することを含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記導入する工程が、前記齧歯類動物内に、前記対象抗原を発現する細胞を導入することを含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
前記対象抗原が腫瘍関連抗原である、請求項７６〜７８のいずれかに記載の方法。
【請求項８０】
前記細胞が、ブドウ球菌細胞などの細菌細胞であり、前記抗原がブドウ球菌抗原などの細菌抗原である、請求項７６〜７８のいずれかに記載の方法。
【請求項８１】
前記抗原がウイルス抗原である、請求項７６〜７８のいずれかに記載の方法。
【請求項８２】
前記導入する工程が、前記齧歯類を前記対象抗原で感染させることを含む、請求項８０または８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記齧歯類動物が、免疫応答性のマウス、または免疫応答性のラットである、請求項７６に記載の方法。
【請求項８４】
前記薬剤候補が、抗体、または抗原結合タンパク質である、請求項７６に記載の方法。
【請求項８５】
前記抗体または前記抗原結合タンパク質が、それぞれ、二重特異性抗体、または二重特異性抗原結合タンパク質であり、これがヒトＣ１ｑタンパク質および前記対象抗原の両方を結合する能力を有する、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
候補抗体が補体経路を活性化するかどうかを評価する方法であって、前記方法が、
ａ．  細胞表面上に対象抗原を発現する細胞、ヒトＦｃ領域を含み、前記対象抗原に向けられる候補抗体、および請求項１〜５９のいずれかに記載の遺伝子改変齧歯類動物からの血清サンプル、を提供することと、
ｂ．  前記細胞を前記候補抗体と混合して、前記抗体が、前記細胞表面上に発現される前記対象抗原に結合することを可能にすることと、
ｃ．  前記血清サンプルを前記細胞抗体混合物に加えて、前記細胞上の前記対象抗原に結合した抗体に、前記血清サンプル内の前記ヒト化Ｃ１ｑタンパク質が結合することを可能にすることと、
ｄ．  前記細胞の細胞毒性を測定することと、を含む、方法。
【請求項８７】
対象抗原およびヒトＣ１ｑを標的とする候補二重特異性抗体を評価するための方法であって、前記方法が、
ａ．  前記対象抗原を発現する細胞またはウイルス、前記候補二重特異性抗体、および請求項１〜５９のいずれかに記載の遺伝子改変齧歯類動物から血液サンプルを混合し、インキュベートして、前記抗体が、前記細胞またはウイルスにより発現される前記対象抗原、および前記血液サンプル中のヒト化Ｃ１ｑ分子に結合することを可能にすることと、
ｂ．  前記細胞またはウイルスの生存を測定することと、を含む、方法。
【請求項８８】
前記細胞が、ブドウ球菌細胞などの細菌細胞であり、前記抗原がブドウ球菌抗原などの細菌抗原である、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記ラットが、そのゲノム中に、
ａ．前記内因性Ｃ１ｑａ遺伝子座で、配列番号５５のアミノ酸配列を含むキメララット／ヒトＣ１ｑａポリペプチドをコードする核酸配列と、
ｂ．前記内因性Ｃ１ｑｂ遺伝子座で、配列番号５６のアミノ酸配列を含むキメララット／ヒトＣ１ｑｂポリペプチドをコードする核酸配列と、
ｃ．前記内因性Ｃ１ｑａ遺伝子座で、配列番号５７のアミノ酸配列を含むキメララット／ヒトＣ１ｑｃポリペプチドをコードする核酸配列と、を含む請求項５５に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【請求項９０】
前記マウスが、そのゲノム内に、
ａ．  前記内因性Ｃ１ｑａ遺伝子座で、配列番号１０のアミノ酸配列を含むキメラマウス／ヒトＣ１ｑａポリペプチドをコードする核酸配列と、
ｂ．  前記内因性Ｃ１ｑｂ遺伝子座で、配列番号１１のアミノ酸配列を含むキメラマウス／ヒトＣ１ｑｂポリペプチドをコードする核酸配列と、
ｃ．  前記内因性Ｃ１ｑａ遺伝子座で、配列番号１２のアミノ酸配列を含むキメラマウス／ヒトＣ１ｑｃポリペプチドをコードする核酸配列と、を含む、請求項５６に記載の遺伝子改変齧歯類動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年９月２９日に出願された米国仮出願第６２／５６５，４３８号の優先権の利益を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の参照による組み込み
【０００２】
２０１８年９月２５日に作製され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して米国特許商標庁に提出された３５３４２＿１０３５３ＵＳ０１＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称の５０ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルの配列表が、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
前臨床薬剤開発段階の間、候補薬剤は通常、その有効性、毒性、およびその他の薬物動態的特性、および薬力学的特性に基づいて研究される。抗体などの候補薬剤は、典型的にはヒト抗原を標的とするが、これは研究の最終的なゴールがヒト療法を開発することだからである。補体経路を隔離する能力は、候補治療薬に有意な利点を提供する。補体経路は先天的な免疫応答の一部であり、マルクファージおよび食細胞の抗原性部位への補充における体液性免疫応答を補助する。補体経路の活性化により、サイトカイン放出、および食細胞による抗体結合抗原のオプソニン化が発生する。ヒト疾患に対処するための補体経路および先天的免疫応答の活性化を目的とする治療薬の開発中、薬剤の作用および／または治療能力の機構に対して研究を可能にするモデル非ヒト動物システムは非常に重要であるが、このようなシステムは欠如している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本明細書において、キメラ哺乳類Ｃ１ｑポリペプチド（例えば、キメラ哺乳類Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ及び／又はＣ１ｑｃポリペプチド）、キメラ哺乳類Ｃ１ｑポリペプチドをコードする核酸分子、及び該核酸分子を含み、キメラＣ１ｑポリペプチドを発現する非ヒト動物（例えば、齧歯類などの哺乳動物）が開示される。
【０００５】
一態様では、そのゲノム内にキメラＣ１ｑポリペプチド（例えば、キメラＣ１ｑａポリペプチド、キメラＣ１ｑｂポリペプチド、またはキメラＣ１ｑｃポリペプチド）をコードする核酸を含み、ここにおいて、この核酸が非ヒト核酸配列およびヒト核酸配列を含む、遺伝子改変非ヒト動物が本明細書に開示される。
【０００６】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、キメラＣ１ｑポリペプチドをコードする複数の核酸をそのゲノム内に含み、例えば、この非ヒト動物は、キメラＣ１ｑａポリペプチドをコードする核酸と、キメラＣ１ｑｂポリペプチドをコードする核酸と、キメラＣ１ｑｃポリペプチドをコードする核酸との組み合わせ（例えば、２つまたは３つ全部）をそのゲノムに含む。
【０００７】
一部の実施形態では、非ヒト動物は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、非ヒト動物はラットまたはマウスなどの齧歯類である。
【０００８】
いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑポリペプチドは、実質的にヒトである球状頭部ドメイン（すなわち、ヒトＣ１ｑポリペプチドの球状頭部ドメインと実質的に同一）、および実質的に非ヒトであるＮ末端葉柄茎（ｓｔａｌｋ−ｓｔｅｍ）領域（すなわち、内因性Ｃ１ｑポリペプチドなどの非ヒトＣ１ｑポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と実質的に同一）を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、キメラＣ１ｑａポリペプチドであるキメラＣ１ｑポリペプチドをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑポリペプチドは、実質的にヒトＣ１ｑａポリペプチドの球状頭部ドメインと同一である球状頭部ドメイン、および実質的に、内因性Ｃ１ｑａポリペプチドなどの非ヒトＣ１ｑａポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と同一であるＮ末端葉柄茎領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＣ１ｑａポリペプチドの球状頭部ドメインは、配列番号４のアミノ酸１０８〜２４５を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、実質的にヒトＣ１ｑａポリペプチドの球状頭部ドメインと同一である球状頭部ドメイン、および実質的に、内因性マウスＣ１ｑａポリペプチドなどのマウスＣ１ｑａポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と同一であるＮ末端葉柄茎領域を含む、キメラＣ１ｑａポリペプチドをコードする核酸を含むマウスである。ある実施形態では、内因性マウスＣ１ｑａポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域は、配列番号１のアミノ酸２３〜１０７を含む。特定の実施形態では、キメラＣ１ｑａポリペプチドは、配列番号１０（マウス／ヒト）のアミノ酸２３〜２４５を含む。特定の実施形態では、キメラＣ１ｑａポリペプチドは、配列番号１０（マウス／ヒト）のアミノ酸配列を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、実質的にヒトＣ１ｑａポリペプチドの球状頭部ドメインと同一である球状頭部ドメイン、および実質的に、内因性ラットＣ１ｑａポリペプチドなどのラットＣ１ｑａポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と同一であるＮ末端葉柄茎領域を含む、キメラＣ１ｑａポリペプチドをコードする核酸を含むラットである。ある実施形態では、内因性ラットＣ１ｑａポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域は、配列番号７のアミノ酸２３〜１０７を含む。特定の実施形態では、キメラＣ１ｑａポリペプチドは、配列番号５５（ラット／ヒト）のアミノ酸２３〜２４５を含む。特定の実施形態では、キメラＣ１ｑａポリペプチドは、配列番号：５５（ラット／ヒト）のアミノ酸配列を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、キメラＣ１ｑｂポリペプチドであるキメラＣ１ｑポリペプチドをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑｂポリペプチドは、実質的にヒトＣ１ｑｂポリペプチドの球状頭部ドメインと同一である球状頭部ドメイン、および実質的に、内因性Ｃ１ｑｂポリペプチドなどの非ヒトＣ１ｑｂポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と同一であるＮ末端葉柄茎領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＣ１ｑｂポリペプチドの球状頭部ドメインは、配列番号５のアミノ酸１１５〜２５１を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、内因性マウスＣ１ｑｂポリペプチドなどのマウスＣ１ｑｂポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と実質的に同一なＮ末端葉柄茎領域を含むキメラＣ１ｑｂポリペプチドをコードする核酸を含むマウスである。いくつかの実施形態では、内因性マウスＣ１ｑｂポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域は、配列番号２のアミノ酸２６〜１１４を含む。特定の実施形態では、キメラＣ１ｑｂポリペプチドは、配列番号１１（マウス／ヒト）のアミノ酸２６〜２５１を含む。特定の実施形態では、キメラＣ１ｑｂポリペプチドは、配列番号１１（マウス／ヒト）のアミノ酸配列を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、内因性ラットＣ１ｑｂポリペプチドなどのラットＣ１ｑｂポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と実質的に同一なＮ末端葉柄茎領域を含むキメラＣ１ｑｂポリペプチドをコードする核酸を含むラットである。いくつかの実施形態では、内因性ラットＣ１ｑｂポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域は、配列番号８のアミノ酸２６〜１１４を含む。特定の実施形態では、キメラＣ１ｑｂポリペプチドは、配列番号５６（ラット／ヒト）のアミノ酸２６〜２５１を含む。特定の実施形態では、キメラＣ１ｑｂポリペプチドは、配列番号５６（ラット／ヒト）のアミノ酸配列を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、キメラＣ１ｑｃポリペプチドであるキメラＣ１ｑポリペプチドをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑｃポリペプチドは、実質的にヒトＣ１ｑｃポリペプチドの球状頭部ドメインと同一である球状頭部ドメイン、および実質的に、内因性Ｃ１ｑｃポリペプチドなどの非ヒトＣ１ｑｃポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と同一であるＮ末端葉柄茎領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＣ１ｑｃポリペプチドの球状頭部ドメインは、配列番号６の１１３〜２４５を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、実質的にヒトＣ１ｑｃポリペプチドの球状頭部ドメインと同一である球状頭部ドメイン、および実質的に、内因性マウスＣ１ｑｃポリペプチドなどのマウスＣ１ｑｃポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と同一であるＮ末端葉柄茎領域を含むキメラＣ１ｑｃポリペプチドをコードする核酸を含むマウスである。ある実施形態では、内因性マウスＣ１ｑｃポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域は、配列番号３のアミノ酸３０〜１１３を含む。特定の実施形態では、キメラＣ１ｑｃポリペプチドは、配列番号１２（マウス／ヒト）のアミノ酸３０〜２４６を含む。特定の実施形態では、キメラＣ１ｑｃポリペプチドは、配列番号１２（マウス／ヒト）のアミノ酸配列を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、実質的にヒトＣ１ｑｃポリペプチドの球状頭部ドメインと同一である球状頭部ドメイン、および実質的に、内因性ラットＣ１ｑｃポリペプチドなどのラットＣ１ｑｃポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と同一であるＮ末端葉柄茎領域を含む、キメラＣ１ｑｃポリペプチドをコードする核酸を含むラットである。いくつかの実施形態では、内因性ラットＣ１ｑｃポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域は、配列番号９のアミノ酸３２〜１１５を含む。特定の実施形態では、キメラＣ１ｑｃポリペプチドは、配列番号５７（ラット／ヒト）のアミノ酸３２〜２４８を含む。特定の実施形態では、キメラＣ１ｑｃポリペプチドは配列番号：５７（ラット／ヒト）のアミノ酸配列を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑポリペプチドは、非ヒト動物で翻訳され、内因性非ヒトＣ１ｑシグナルペプチドなどの非ヒトＣ１ｑシグナルペプチドを含有する。別の言い方をすると、キメラＣ１ｑポリペプチドをコードする核酸分子は、内因性Ｃ１ｑシグナルペプチドなどの非ヒトＣ１ｑシグナルペプチドのコード配列も含む。例えば、キメラＣ１ｑａポリペプチドをコードする核酸分子は、内因性Ｃ１ｑａシグナルペプチドなどの非ヒトＣ１ｑａシグナルペプチドのコード配列を含み、キメラＣ１ｑｂポリペプチドをコードする核酸分子もまた、内因性Ｃ１ｑｂシグナルペプチドなどの非ヒトＣ１ｑｂシグナルペプチドのコード配列を含み、およびキメラＣ１ｑｃポリペプチドをコードする核酸分子もまた、内因性Ｃ１ｑｃシグナルペプチドなどの非ヒトＣ１ｑｃシグナルペプチドのコード配列を含む。マウスおよびラットＣ１ｑシグナルペプチドの例は、本明細書で開示されている（例えば、図３Ａ〜３Ｃを参照のこと）。
【００１９】
いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑポリペプチドをコードする核酸は、内因性非ヒトＣ１ｑ遺伝子座以外の遺伝子座にある。他の実施形態では、キメラＣ１ｑポリペプチドをコードする核酸は、内因性非ヒトＣ１ｑ遺伝子座にある。例えば、キメラＣ１ｑａポリペプチドをコードする核酸は、内因性非ヒトＣ１ｑａ遺伝子座にあり、キメラＣ１ｑｂポリペプチドをコードする核酸は、内因性非ヒトＣ１ｑｂ遺伝子座にあり、および／またはキメラＣ１ｑｃポリペプチドをコードする核酸は、内因性非ヒトＣ１ｑｃ遺伝子座にある。
【００２０】
キメラＣ１ｑポリペプチドをコードする核酸が、内因性非ヒトＣ１ｑ遺伝子座にある実施形態では、いくつかのこのような実施形態では、内因性非ヒトＣ１ｑ遺伝子座における内因性ゲノム配列は、ヒト核酸配列によって置換されている。いくつかの実施形態では、ヒトＣ１ｑ遺伝子のゲノム断片などのヒト核酸配列は、ヒトＣ１ｑポリペプチドの球状頭部ドメインを実質的にコードする。いくつかの実施形態では、ヒト核酸配列はまた、（ヒトＣ１ｑ遺伝子のポリアデニル化シグナルおよびポリアデニル化部位を含む）ヒトＣ１ｑ遺伝子の３’ＵＴＲを含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、キメラＣ１ｑａポリペプチドをコードする核酸を含み、ここにおいて、核酸はヒトおよび非ヒト核酸配列を含み、ヒト核酸配列はヒトＣ１ｑａポリペプチドの球状頭部ドメインを実質的にコードする。いくつかの実施形態では、ヒトＣ１ｑａポリペプチドの球状頭部ドメインは、配列番号４のアミノ酸１０８〜２４５を含む。いくつかの実施形態では、ヒト核酸配列は、配列番号４のアミノ酸１１２〜２４５をコードする。
【００２２】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、キメラＣ１ｑｂポリペプチドをコードする核酸を含み、ここにおいて、核酸はヒトおよび非ヒト核酸配列を含み、ヒト核酸配列はヒトＣ１ｑｂポリペプチドの球状頭部ドメインを実質的にコードする。いくつかの実施形態では、ヒトＣ１ｑｂポリペプチドの球状頭部ドメインは、配列番号５のアミノ酸１１５〜２５１を含む。いくつかの実施形態では、ヒト核酸配列は、配列番号５のアミノ酸１１８〜２５１をコードする。
【００２３】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、キメラＣ１ｑｃポリペプチドをコードする核酸を含み、ここにおいて、核酸はヒトおよび非ヒト核酸配列を含み、ヒト核酸配列はヒトＣ１ｑｃポリペプチドの球状頭部ドメインを実質的にコードする。いくつかの実施形態では、ヒトＣ１ｑｃポリペプチドの球状頭部ドメインは、配列番号６のアミノ酸１１３〜２４５を含む。いくつかの実施形態では、ヒト核酸配列は、配列番号６のアミノ酸１１４〜２４５をコードする。
【００２４】
キメラＣ１ｑポリペプチドをコードする核酸を含む遺伝子改変非ヒト動物の実施形態では、核酸は、ヒトおよび非ヒト核酸配列を含み、非ヒト核酸配列は、内因性非ヒトＣ１ｑポリペプチドなどの非ヒトＣ１ｑポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域を実質的にコードする。内因性非ヒトＣ１ｑ遺伝子座における内因性ゲノム配列がヒト核酸配列によって置換された実施形態では、いくつかのこのような実施形態では、Ｃ１ｑ遺伝子座に残っている内因性ゲノム配列は、内因性Ｃ１ｑポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域を実質的にコードする。
【００２５】
いくつかの実施形態では、非ヒト動物はマウスであり、内因性Ｃ１ｑポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域は、配列番号１のアミノ酸２３〜１０７（Ｃ１ｑａの）、配列番号２のアミノ酸２６〜１１４（Ｃ１ｑｂの）、または配列番号３のアミノ酸３０〜１１３（Ｃ１ｑｃの）を含む。いくつかの実施形態では、マウスは、キメラＣ１ｑａポリペプチドをコードする核酸を含み、ここにおいて、核酸はマウス核酸配列およびヒト核酸配列を含み、またマウス核酸配列は配列番号１のアミノ酸２３〜１１１をコードする。いくつかの実施形態では、マウスはキメラＣ１ｑｂポリペプチドをコードする核酸を含み、ここにおいて、核酸はマウス核酸配列およびヒト核酸配列を含み、またマウス核酸配列は配列番号２のアミノ酸２６〜１１７をコードする。いくつかの実施形態では、マウスは、キメラＣ１ｑｃポリペプチドをコードする核酸を含み、ここにおいて、核酸はマウス核酸配列およびヒト核酸配列を含み、マウス核酸配列は配列番号３のアミノ酸３０〜１１４をコードする。
【００２６】
いくつかの実施形態では、非ヒト動物はラットであり、内因性Ｃ１ｑポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域は、配列番号７のアミノ酸２３〜１０７（Ｃ１ｑａの）、配列番号８のアミノ酸２６〜１１４（Ｃ１ｑｂの）、または配列番号９のアミノ酸３２〜１１５（Ｃ１ｑｃの）を含む。いくつかの実施形態では、ラットは、キメラＣ１ｑａポリペプチドをコードする核酸を含み、ここにおいて、核酸はラット核酸配列およびヒト核酸配列を含み、ラット核酸配列は配列番号７のアミノ酸２３〜１１１をコードする。いくつかの実施形態では、ラットはキメラＣ１ｑｂポリペプチドをコードする核酸を含み、ここにおいて、核酸はラット核酸配列およびヒト核酸配列を含み、ラット核酸配列は配列番号８のアミノ酸２６〜１１７をコードする。いくつかの実施形態では、ラットはキメラＣ１ｑｃポリペプチドをコードする核酸を含み、ここにおいて、核酸はラット核酸配列およびヒト核酸配列を含み、ラット核酸配列は配列番号９のアミノ酸３２〜１１６をコードする。
【００２７】
特定の実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、ラットであり、かつそのゲノム内に、（ｉ）内因性Ｃ１ｑａ遺伝子座で、キメララット／ヒトＣ１ｑａポリペプチドをコードする核酸配列を含み、ここにおいて核酸配列が、５’−３’、ならびに動作可能な連結において、配列番号７のラットＣ１ｑａポリペプチドのアミノ酸１〜１１１をコードする第一ヌクレオチド配列、および配列番号４のヒトＣ１ｑａポリペプチドのアミノ酸１１２〜２４５をコードする第二ヌクレオチド配列を含み、（ｉｉ）内因性Ｃ１ｑｂ遺伝子座で、キメララット／ヒトＣ１ｑｂポリペプチドをコードする核酸配列を含み、ここにおいて核酸配列が、５’−３’、ならびに動作可能な連結において、配列番号８のラットＣ１ｑｂポリペプチドのアミノ酸１〜１１７をコードする第三ヌクレオチド配列、および配列番号５のヒトＣ１ｑｂポリペプチドのアミノ酸１１８〜２５１をコードする第四ヌクレオチド配列を含み、（ｉｉｉ）  内因性Ｃ１ｑｃ遺伝子座で、キメララット／ヒトＣ１ｑｃポリペプチドをコードする核酸配列を含み、ここにおいて核酸配列が、５’−３’、ならびに動作可能な連結において、配列番号９のラットＣ１ｑｃポリペプチドのアミノ酸１〜１１６をコードする第五ヌクレオチド配列、および配列番号６のヒトＣ１ｑｃポリペプチドのアミノ酸１１４〜２４５をコードする第六ヌクレオチド配列を含む。詳細な実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、そのゲノム内に、内因性Ｃ１ｑａ遺伝子座で、配列番号５５のアミノ酸配列を含むキメララット／ヒトＣ１ｑａポリペプチドをコードする核酸配列を含み、内因性Ｃ１ｑｂ遺伝子座で、配列番号５６のアミノ酸配列を含むキメララット／ヒトＣ１ｑｂポリペプチドをコードする核酸配列を含み、かつ内因性Ｃ１ｑａ遺伝子座で、配列番号５７のアミノ酸配列を含むキメララット／ヒトＣ１ｑｃポリペプチドをコードする核酸配列を含む、ラットである。
【００２８】
別の特定の実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、マウスであり、かつそのゲノム内に、（ｉ）内因性Ｃ１ｑａ遺伝子座で、キメラマウス／ヒトＣ１ｑａポリペプチドをコードする核酸配列を含み、ここにおいて核酸配列が、５’−３’、ならびに動作可能な連結において、配列番号１のマウスＣ１ｑａポリペプチドのアミノ酸１〜１１１をコードする第一ヌクレオチド配列、および配列番号４のヒトＣ１ｑａポリペプチドのアミノ酸１１２〜２４５をコードする第二ヌクレオチド配列を含み、（ｉｉ）内因性Ｃ１ｑｂ遺伝子座で、キメラマウス／ヒトＣ１ｑｂポリペプチドをコードする核酸配列を含み、ここにおいて核酸配列が、５’−３’、ならびに動作可能な連結において、配列番号２のマウスＣ１ｑｂポリペプチドのアミノ酸１〜１１７をコードする第三ヌクレオチド配列、および配列番号５のヒトＣ１ｑｂポリペプチドのアミノ酸１１８〜２５１をコードする第四ヌクレオチド配列を含み、（ｉｉｉ）内因性Ｃ１ｑｃ遺伝子座で、キメラマウス／ヒトＣ１ｑｃポリペプチドをコードする核酸配列を含み、ここにおいて核酸配列が、５’−３’、ならびに動作可能な連結において、配列番号３のマウスＣ１ｑｃポリペプチドのアミノ酸１〜１１４をコードする第五ヌクレオチド配列、および配列番号６のヒトＣ１ｑｃポリペプチドのアミノ酸１１４〜２４５をコードする第六ヌクレオチド配列を含む。詳細な実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、そのゲノム内に、内因性Ｃ１ｑａ遺伝子座で、配列番号１０のアミノ酸配列を含むキメラマウス／ヒトＣ１ｑａポリペプチドをコードする核酸配列を含み、内因性Ｃ１ｑｂ遺伝子座で、配列番号１１のアミノ酸配列を含むキメラマウス／ヒトＣ１ｑｂポリペプチドをコードする核酸配列を含み、かつ内因性Ｃ１ｑａ遺伝子座で、配列番号１２のアミノ酸配列を含むキメラマウス／ヒトＣ１ｑｃポリペプチドをコードする核酸配列を含む、マウスである。
【００２９】
本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、機能的な内因性Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃポリペプチドを発現しない。
【００３０】
別の態様では、そのゲノム内に、キメラ非ヒト／ヒトＣ１ｑａポリペプチドをコードする遺伝子、キメラ非ヒト／ヒトＣ１ｑｂポリペプチドをコードする遺伝子、および／またはキメラ非ヒト／ヒトＣ１ｑｃポリペプチドをコードする遺伝子を含むキメラＣ１ｑ遺伝子座を含む遺伝子改変非ヒト動物（例えば、限定されないがマウスまたはラットなどを含む齧歯類のような非ヒト哺乳動物など）を作製する方法が、本明細書に提供され、この方法は、非ヒト動物ゲノム内に、ａ）キメラ非ヒト／ヒトＣ１ｑａポリペプチドをコードする遺伝子、ｂ）キメラ非ヒト／ヒトＣ１ｑｂポリペプチドをコードする遺伝子、および／またはｃ）キメラ非ヒト／ヒトＣ１ｑｃポリペプチドをコードする遺伝子を含む核酸配列を導入することを含む。いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑポリペプチドをコードする遺伝子を含む核酸は、内因性遺伝子座の外側のゲノムの位置にある。したがって、いくつかの実施形態では、非ヒト動物は機能的な内因性Ｃ１ｑポリペプチドを発現しない（例えば、機能的な内因性Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃポリペプチドを発現しない）ように、内因性Ｃ１ｑ遺伝子、またはその一部分をサイレンシングおよび／または削除してもよい。他の実施形態では、キメラポリペプチドをコードする遺伝子を含む核酸は、内因性非ヒトＣ１ｑ遺伝子座にあり、一実施形態では、キメラＣ１ｑポリペプチドをコードする遺伝子を含む核酸は、内因性非ヒトＣ１ｑ遺伝子を内因性Ｃ１ｑ遺伝子座で置換する。
【００３１】
したがって、本明細書に記載される遺伝子改変非ヒト動物を作製する方法が本明細書に提供されており、ここにおいて、キメラＣ１ｑポリペプチドをコードする核酸配列は、内因性非ヒト哺乳動物Ｃ１ｑ遺伝子座に導入される。特定の態様では、遺伝子改変非ヒト動物を作製する方法が開示されており、ここにおいてキメラＣ１ｑポリペプチドをコードする核酸配列は、内因性非ヒト哺乳動物Ｃ１ｑポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を置換する。
【００３２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変非ヒト動物、例えば、遺伝子改変ラットまたはマウス、を作製する方法が、キメラＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃポリペプチドをコードする核酸配列を含む標的化ベクター（例えば、大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ））を生成すること、前述の標的化ベクターをＥＳ細胞に導入すること、および前述の非ヒト動物を該ＥＳ細胞から生成することを含む。
【００３３】
別の態様では、実質的にヒトである球状頭部ドメインと、実質的に非ヒトであるＮ末端葉柄茎領域とを含むキメラＣ１ｑポリペプチドが本明細書に開示され、ここにおいて、キメラＣ１ｑポリペプチドは、キメラＣ１ｑａポリペプチド、キメラＣ１ｑｂポリペプチド、およびキメラＣ１ｑｃポリペプチドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、このようなキメラＣ１ｑポリペプチドは、本明細書に開示される遺伝子改変非ヒト動物から作製される。他の実施形態では、キメラＣ１ｑポリペプチドは、適切な宿主細胞から作製される。
【００３４】
さらに別の態様では、本明細書に開示されるキメラＣ１ｑポリペプチドのうちの１つ以上を含むキメラＣ１ｑタンパク質が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑタンパク質は、少なくとも１つのキメラＣ１ｑａ、１つのキメラＣ１ｑｂ、および１つのキメラＣ１ｑｃポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑタンパク質は、各キメラＣ１ｑａポリペプチド、キメラＣ１ｑｂポリペプチド、およびキメラＣ１ｑｃポリペプチドの６個ずつを含む。
【００３５】
別の態様では、キメラＣ１ｑポリペプチド（Ｃ１ｑａポリペプチド、Ｃ１ｑｂポリペプチド、またはＣ１ｑｃポリペプチド）をコードし、かつ非ヒト哺乳動物核酸配列およびヒト核酸配列を含む、単離核酸が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、ヒト核酸配列は、ヒトＣ１ｑポリペプチドの球状頭部ドメインを実質的にコードし、非ヒト核酸配列は、同族非ヒトＣ１ｑポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域を実質的にコードする。いくつかの実施形態では、単離核酸は、キメラＣ１ｑタンパク質をコードし、第一、第二、または第三のヌクレオチド配列の１つ以上を含み、ここにおいて、第一のヌクレオチド配列はキメラＣ１ｑａポリペプチドをコードし、第二のヌクレオチド配列はキメラＣ１ｑｂポリペプチドをコードし、および第三のヌクレオチド配列はキメラＣ１ｑｃポリペプチドをコードする。
【００３６】
さらに別の態様では、本明細書に開示される単離核酸を含む細胞が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞、例えば、齧歯類（マウスまたはラットなど）ＥＳ細胞など、である。
【００３７】
さらなる態様では、Ｃ１ｑベースの二重特異性抗原結合タンパク質を試験する齧歯類モデルであって、ここにおいて、抗原結合タンパク質は、ヒトＣ１ｑと対象抗原との両方を結合させ、本明細書に開示される遺伝子改変齧歯類を含み、さらに対象抗原、または対象抗原を発現する細胞を含む、Ｃ１ｑベースの二重特異性抗原結合タンパク質を試験する齧歯類モデルが本明細書に提供される。
【００３８】
別の態様では、対象抗原を、遺伝子改変非ヒト動物、例えば、本明細書で提供される齧歯類、例えばラット、またはマウス、に導入すること、当該動物を対象の薬剤候補に接触させることであって、ここにおいて、薬剤候補がヒトＣ１ｑ、および対象抗原に対して向けられる、接触させること、および薬剤候補が対象抗原の存在または発現によって特徴付けられる細胞の予防、低減、または除去において有効であるか否かを判定するために分析すること、を含む、対象抗原を標的とする薬剤候補のスクリーニング方法が本明細書に開示される。一実施形態では、導入する工程は、動物において対象抗原を発現させること（例えば、対象抗原を発現する齧歯類を遺伝子改変することなど）、または当該動物中に対象の抗原を発現する細胞またはウイルスを導入することを含む。１つの特定の態様では、細胞は腫瘍細胞または細菌細胞でありうる。さらなる態様において、対象抗原は、腫瘍関連抗原または細菌抗原とすることができる。別の態様では、細胞は細菌細胞であり得る。
【００３９】
別の態様では、対象抗原を標的とする治療薬剤候補中のスクリーニング方法が本明細書に提供されており、方法は、対象抗原を発現する細胞またはウイルスと、（ｉ）対象の薬剤候補であって、ここにおいて薬剤候補がヒトＣ１ｑおよび対象抗原に対して向けられている、薬剤候補とを、および（ｉｉ）本明細書に開示される遺伝子改変齧歯類の血液サンプル（例えば、全血サンプル）とを、混合すること、ならびに、（ｂ）薬剤候補が、対象抗原の存在または発現によって特徴付けられる細胞またはウイルスの低減、または除去において有効であるか否かを判定するために分析すること、を含む。判定は、例えば、対照薬剤と比較して、または薬剤が全くない場合と比較して、薬剤候補が使用される細胞またはウイルスの生存率の測定に基づいて行うことができる。対象抗原は、腫瘍関連抗原または感染性疾患関連抗原、例えば、細菌またはウイルス抗原であってもよい。いくつかの実施形態では、対象抗原は、ブドウ球菌抗原などの細菌抗原である。いくつかの実施形態では、細胞はブドウ球菌細胞などの細菌細胞である。
【００４０】
いくつかの実施形態では、薬剤候補のスクリーニング方法が提供され、ここにおいて、導入する工程が、動物（例えば、ラットまたはマウス）を対象抗原（例えば、ウイルス抗原またはブドウ球菌抗原などの細菌抗原）に感染させることを含む。したがって、一態様では、導入する工程は、ウイルスまたは細菌に動物を感染させることを含む。
【００４１】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される遺伝子改変非ヒト動物（例えば、齧歯類、例えば、ラットまたはマウス）は、免疫応答性の動物（例えば、免疫応答性のラットまたはマウス）である。
【００４２】
別の態様では、ヒトＦｃ領域を含む抗体が、本明細書に開示されるヒト化Ｃ１ｑタンパク質を発現する遺伝子操作された非ヒト動物（例えば、マウスまたはラットなどの齧歯類）を利用して古典的補体経路を活性化できるかどうかを評価する方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）細胞表面上に対象抗原を発現させる細胞と、ヒトＦｃ領域を含み、対象抗原に向けられた候補抗体と、ヒト化Ｃ１ｑタンパク質を発現する遺伝子操作された非ヒト動物からの血清サンプルとを提供すること、（ｂ）細胞と候補抗体を混合して、抗体と細胞表面上に発現した対象抗原とを結合させること、（ｃ）血清サンプルを細胞抗体混合物に加えて、血清サンプル内のヒト化Ｃ１ｑタンパク質の、細胞の対象抗原と結合された抗体との結合を可能にすること、および（ｄ）細胞の細胞毒性を測定することを含む。
【００４３】
本明細書において援用され、かつ本明細書の一部を成す添付の図面は、いくつかの実施形態を例証し、説明と共に、本開示の組成物および方法を例証する。
【００４４】
具体的に示されない限り（例えば、ｌｏｘＰなど）、すべてのヒトエクソン配列は中空の囲みにあり、すべてのヒトイントロン配列は二重線にある。マウスまたはラットの配列はすべて、黒の囲み（エクソン）または単線（イントロン）のいずれかである。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１Ａ】図１Ａは、３つのマウスＣ１ｑ遺伝子すべてを含むマウスＣ１ｑ遺伝子座を欠失する例示的方法の概略表現（正確な縮尺ではない）である（マウス遺伝子は遺伝子標識の前に「ｍ」で示されている）。３つのＣ１ｑ遺伝子のエクソンは、図の下に標識されている（例えば、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３）。マウスＢＡＣは細菌人工染色体を意味し；ＢＨＲは細菌相同組換えの略であり；ＥＰはエレクトロポレーションの略である。ＨＥＴ＝ヘテロ接合性；ＣＭ＝クロラムフェニコール；ｌｏｘ＝ｌｏｘＰ部位；ｐｇｋ−Ｎｅｏ＝ネオマイシン選択カセット。
【００４６】
【図１Ｂ】図１Ｂは、消化／ライゲーションおよび／または細菌相同組換え（ＢＨＲ）によって、マウスＢＡＣ遺伝子内に挿入された、キメラヒト／マウス遺伝子と共に、ヒト化マウスＣ１ｑ標的化ベクターの作成の概略表現（正確な縮尺ではない）を示す（マウス遺伝子は遺伝子標識の前に「ｍ」で示されている）。３つのＣ１ｑ遺伝子のエクソンは、図の下に標識されている（例えば、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３）。いくつかの制限酵素位置が示されている。ＣＭ＝クロラムフェニコール；ｌｏｘ＝ｌｏｘＰ部位；Ｕｂ−Ｈｙｇ＝ハイグロマイシン選択カセット；ｐ＝ポリＡテール；Ｓｐｅｃ＝スペクチノマイシン。
【００４７】
【図１Ｃ】図１Ｃは、マウスＣ１ｑ  ＫＯ  ＨＥＴ  ＥＳ細胞内へ３つのマウス／ヒトキメラのキメラＣ１ｑ遺伝子すべてを含有する大型標的化ベクターのエレクトロポレーション（ＥＰ）の概略表現（正確な縮尺ではない）を示す。３つのＣ１ｑ遺伝子のエクソンは、図の下に標識されている（例えば、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３）。Ｌｏｘ＝ｌｏｘＰ部位；Ｕｂ−Ｈｙｇ＝ハイグロマイシン選択カセット；ｐｇｋ−Ｎｅｏ＝ネオマイシン選択カセット；ｐ＝ポリＡ配列。マウス、ヒト、またはカセット配列の間の配列接合部は、各接合部の下のそれぞれの配列の線および配列番号で示されている。
【００４８】
【図２Ａ】図２Ａは、３つのラットＣ１ｑ遺伝子すべてを含むラットＣ１ｑ遺伝子座を欠失する例示的方法の概略表現（正確な縮尺ではない）である（ラット遺伝子は遺伝子標識の前に「ｒ」で示されている）。３つのＣ１ｑ遺伝子のエクソンは、図の下に標識されている（例えば、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３）。ラットＣ１ｑＢＡＣはラット細菌人工染色体を意味し；ＢＨＲは細菌相同組換えの略であり；ＥＰはエレクトロポレーションの略である。ＨＥＴ＝ヘテロ接合性；ＣＭ＝クロラムフェニコール；ｌｏｘＰ＝ｌｏｘＰ部位；ＳＤＣ−ｌｏｘＰ−Ｈｙｇ＝自己欠失ＬｏｘＰ−ハイグロマイシン選択カセット。
【００４９】
【図２Ｂ】図２Ｂは、消化／Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ、および／またはＣＡＳ９／Ｇｉｂｓｏｎアセンブリによって、ラットＢＡＣ遺伝子内に挿入された、キメラヒト／ラット遺伝子と共に、ヒト化ラットＣ１ｑカセットの作成の概略表現（正確な縮尺ではない）を示す（ラット遺伝子は遺伝子標識の前に「ｒ」で示されている）。３つのＣ１ｑ遺伝子のエクソンは、図の下に標識されている（例えば、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３）。いくつかの制限酵素位置が示されている。ＣＭ＝クロラムフェニコール；ＳＤＣ−ｌｏｘｐ−ｐｕｒｏ＝自己欠失ｌｏｘｐ−ピューロマイシンカセット。
【００５０】
【図２Ｃ】図２Ｃは、ラットＣ１ｑ  ＫＯ  ＨＥＴ  ＥＳ細胞内へ３つのラット／ヒトキメラのキメラＣ１ｑ遺伝子すべてを含有する大型標的化ベクターのエレクトロポレーション（ＥＰ）の概略表現（正確な縮尺ではない）を示す。３つのＣ１ｑ遺伝子のエクソンは、図の下に標識されている（例えば、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３）。ＳＤＣ−ｌｏｘｐ−ｐｕｒｏ＝自己欠失ｌｏｘｐ−ピューロマイシンカセット；ｐ＝ポリＡ配列。ラット、ヒト、またはカセット配列の間の配列接合部は、各接合部の下のそれぞれの配列の線および配列番号で示されている。
【００５１】
【図３Ａ】図３Ａは、ラット（ｒＣ１ｑａ）、ヒト（ｈＣ１ＱＡ）、およびマウス（ｍＣ１ｑａ）ポリペプチドのためのＣ１ｑａアミノ酸アライメントを示し、類似点が概説されミスマッチがより低いケースに示されている。シグナルペプチド配列は囲まれ、標識されている。コラーゲン三重ヘリックスリピート配列は囲まれ、標識されている。Ｃ１ｑａ球状頭部ドメイン配列は破線で囲まれ、キメラポリペプチド内のマウス／ヒトまたはラット／ヒト配列の接合部が破線で示され、矢印で示されている。
【００５２】
【図３Ｂ】図３Ｂは、ラット（ｒＣ１ｑｂ）、ヒト（ｈＣ１ＱＢ）、およびマウス（ｍＣ１ｑｂ）ポリペプチドのためのＣ１ｑｂアミノ酸アライメントを示し、類似点が概説されミスマッチがより低いケースに示されている。シグナルペプチド配列は囲まれ、標識されている。コラーゲン三重ヘリックスリピート配列は囲まれ、標識されている。Ｃ１ｑｂ球状頭部ドメイン配列は破線で囲まれ、キメラポリペプチド内のマウス／ヒトまたはラット／ヒト配列の接合部が破線で示され、矢印で示されている。
【００５３】
【図３Ｃ】図３Ｃは、ラット（ｒＣ１ｑｃ）、ヒト（ｈＣ１ＱＣ）、およびマウス（ｍＣ１ｑｃ）ポリペプチドのためのＣ１ｑｃアミノ酸アライメントを示し、類似点が概説されミスマッチがより低いケースに示されている。シグナルペプチド配列は囲まれ、標識されている。コラーゲン三重ヘリックスリピート配列は囲まれ、標識されている。Ｃ１ｑｃ球状頭部ドメイン配列は破線で囲まれ、キメラポリペプチド内のマウス／ヒトまたはラット／ヒト配列の接合部が破線で示され、矢印で示されている。
【００５４】
【図４】図４の上部パネルは、抗ヒトＣ１ｑ抗体によって検出されたヒト化Ｃ１ｑマウスの血清中のキメラＣ１ｑタンパク質の存在を示す。図４の下部パネルは、野生型同腹仔マウス（ＷＴ）およびキメラＣ１ｑマウス（１６１５  ＨＯ、ＨＯ＝ホモ接合性）およびヒト血清からの血清サンプルを比較する補体活性を測定する溶血アッセイを示す。
【００５５】
【図５】図５は、Ｒａｊｉ細胞上の２ｎＭでのヒト抗ＣＤ２０抗体、および血清サンプル（正常なヒト血清、ヒト化Ｃ１ｑマウス血清、または野生型マウス血清）によって媒介される補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）活性を示す。
【００５６】
【図６】図６は、野生型同腹仔ラット（「ＷＴ」）、ヒト化Ｃ１ｑラット（「Ｃ１ｑ  Ｈｕｍｉｎ」、または１０００１５ＨＯ；ＨＯ＝ホモ接合性）、Ｃ１ｑノックアウトラット（「Ｃ１ｑ  ＫＯ」）、正常ヒト血清（「ＮＨＳ」）、およびＣ１ｑ枯渇されたヒト血清からの血清サンプルを比較する補体活性を測定する溶血アッセイの結果を示す。左のパネル：メスのラット、右のパネル、Ｃ１ｑ  ＫＯラットを除く、オスのラット。
【００５７】
【図７】図７は、Ｒａｊｉ細胞上の２０ｎＭでのヒト抗ＣＤ２０抗体、および血清サンプル（正常なヒト血清、ヒト化Ｃ１ｑラット血清、または野生型ラット血清）によって媒介される補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
本化合物、組成物、物品、装置、および／または方法が開示され、記述される前に、別段の指定がない限り、特定の合成方法にも特定の組み換え型バイオテクノロジー方法にも、別段の指定がない限り特定の試薬にも限定されず、当然ながら変化することが理解されるべきである。本明細書中で使用されている用語は、もっぱら特定の実施形態の説明を目的としたものであって、限定することを意図するものではないこともまた、理解すべきである。
Ａ．  用語の定義
【００５９】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されているように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上に他の意味に解釈されることが明白な場合を除き、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「医薬担体」には、２つ以上のこうした担体等の混合物が含まれる。
【００６０】
本明細書中では、範囲を「約」の或る特定の値から且つ／または「約」の別の特定の値までとして表現することができる。そのような範囲を表現する場合、別の実施形態では、或る特定の値から且つ／または別の特定の値までが包含される。同様に、値が近似値として表現されている場合には、先行する「約」を使用することにより、特定の値が別の実施形態を形成することが理解されるであろう。各範囲の終点は、他の終点と関連して且つ他の終点とは独立に有意であることが、更に理解されるであろう。
【００６１】
以下の本明細書および特許請求の範囲において、以下の意味を有するように定義される多数の用語に対する参照が行われる。
【００６２】
「任意選択的な」または「任意選択的に」は、後述されている事象または状況が起こる場合もあれば起こらない場合もあることを意味すると共に、この記載には、前述の事象または状況が起こる場合の例および起こらない場合の例が包含されることを意味する。
【００６３】
「プライマー」とは、いくつかのタイプの酵素的操作を支持することができ、酵素的操作が起こり得るように標的核酸とハイブリダイズすることができるプローブのサブセットである。プライマーは、当技術分野で利用可能な、酵素的操作を妨げないヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体または類似体の任意の組み合わせから作製することができる。
【００６４】
「プローブ」とは、典型的には、配列特異的な様式で、例えばハイブリダイゼーションを介して、標的核酸と相互作用することができる分子である。核酸のハイブリダイゼーションは、当該技術分野において良好に理解され、本明細書に記載されている。典型的には、プローブは、当技術分野で利用可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体または類似体の任意の組み合わせから作製することができる。
【００６５】
「機能的」とは本明細書で使用される場合、例えば、機能的なタンパク質を参照してなど、天然タンパク質と通常関連する少なくとも１つの生物活性を保持するタンパク質を含む。例えば、いくつかの実施形態では、内因性遺伝子座での置換（例えば、内因性非ヒトＣ１ｑ遺伝子座での置換）は、機能的な内因性タンパク質を発現することができない遺伝子座をもたらす。
【００６６】
「動作可能に連結した」という用語は、そのように記述された構成要素が、それらが意図された方法で機能できるような関係にある並置を含む。したがって、タンパク質をコードする核酸配列は、適切な転写制御を保持するように、調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー配列など）に動作可能に連結されてもよい。例えば、「動作可能に連結される」によって、核酸発現制御配列（プロモーターなど）と第二の核酸配列との間の機能的連結を意味し、ここで発現制御配列は、第二の配列に対応する核酸の転写を指示する。さらに、本開示のヒト化タンパク質のさまざまな部分は、細胞内のタンパク質の適切な折り畳み、加工、標的、発現、およびその他の機能的特性を保持するように動作可能に連結されてもよく、または融合されてもよい。特に明記しない限り、本開示のヒト化タンパク質の様々なドメインは、互いに動作可能に連結される。
【００６７】
語句「ヒト化Ｃ１ｑ対立遺伝子」、「ヒト化Ｃ１ｑａ対立遺伝子」、「ヒト化Ｃ１ｑｂ対立遺伝子」、「ヒト化Ｃ１ｑｃ対立遺伝子」、「ヒト化Ｃ１ｑ遺伝子」、「ヒト化Ｃ１ｑａ遺伝子」、「ヒト化Ｃ１ｑｂ遺伝子」、「ヒト化Ｃ１ｑｃ遺伝子」に使われるように、用語「ヒト化」は、限定されないが、内因性非ヒトＣ１ｑ、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃ遺伝子あるいは対立遺伝子の全てまたは一部が、ヒトＣ１ｑ、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃ遺伝子あるいは対立遺伝子の対応する部分によって置換される実施形態を含む。例えば、いくつかの実施形態では、「ヒト化された」という用語は、内因性非ヒトＣ１ｑ、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃ遺伝子あるいは対立遺伝子のコード領域（例えば、エクソン）を、ヒトＣ１ｑ、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃ遺伝子あるいは対立遺伝子の対応するコード領域と完全に置換することを意味し、一方、非ヒト動物の内因性非コード領域（例えば、限定されないが、プロモーター、５’および／または３’非翻訳領域、エンハンサー要素など）は、置換されない場合がある。いくつかの実施形態では、ヒト化遺伝子または対立遺伝子は、ゲノム中に無作為に配置されるか、またはゲノム内の特定の場所に標的化される。したがって、いくつかの実施形態では、ヒト化遺伝子または対立遺伝子は、対応する内因性遺伝子または対立遺伝子の生来の位置ではないゲノム内の位置に配置され、すなわち、内因性遺伝子座以外の位置に配置される。他の実施形態では、ヒト化遺伝子または対立遺伝子は、内因性遺伝子座に置かれ、例えば、ヒト化遺伝子または対立遺伝子は、内因性遺伝子座において内因性遺伝子または対立遺伝子を置換しうる。いくつかの実施形態では、非ヒト動物はラットまたはマウスなどの齧歯類である。
【００６８】
「ヒト化タンパク質」は、限定されないが、コードされた内因性非ヒトＣ１ｑ、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃタンパク質のすべてまたは一部が、ヒトＣ１ｑ、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃタンパク質の対応する部分によって置換される実施形態を含む。いくつかの実施形態では、「ヒト化タンパク質」は、ヒト化Ｃ１ｑ、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃ遺伝子あるいは対立遺伝子によってコードされることができるが、さらに完全にヒトＣ１ｑ、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃタンパク質である（例えば、限定されないが、内因性非ヒトＣ１ｑ、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃ遺伝子あるいは対立遺伝子のコード領域（例えば、エクソン）の全てが、ヒトＣ１ｑ、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃ遺伝子あるいは対立遺伝子の対応するコード領域で置換されるが、非ヒト動物の内因性非コード領域（例えば、限定されないが、プロモーター、５’および／または３’非翻訳領域、エンハンサー要素など）は置換されない状況）。いくつかの実施形態では、ヒト化タンパク質は、そのゲノム内の生来の位置ではない、例えば、内因性遺伝子座ではない、ヒト化遺伝子または対立遺伝子から発現される。他の実施形態では、ヒト化タンパク質は、内因性遺伝子座にあるヒト化遺伝子または対立遺伝子から発現される。いくつかの実施形態では、ヒト化タンパク質は、内因性遺伝子座にある内因性遺伝子または対立遺伝子を置換するヒト化遺伝子または対立遺伝子から発現される。いくつかの実施形態では、非ヒト動物はラットまたはマウスなどの齧歯類である。
【００６９】
本開示は、同種交換（ｌｉｋｅ−ｆｏｒ−ｌｉｋｅ）のヒト化を目的としている。例えば、内因性非ヒトＣ１ｑ遺伝子のヌクレオチド配列は、キメラヒト化遺伝子を形成するために同族ヒトＣ１ｑ遺伝子のヌクレオチド配列に動作可能に連結される。いくつかの実施形態では、内因性Ｃ１ｑａ遺伝子のヌクレオチド配列は、ヒトＣ１ｑａ遺伝子のヌクレオチド配列に動作可能に連結され、ヒト化Ｃ１ｑａ遺伝子が形成される。他の実施形態では、内因性Ｃ１ｑｂ遺伝子のヌクレオチド配列は、ヒトＣ１ｑｂ遺伝子のヌクレオチド配列に動作可能に連結され、ヒト化Ｃ１ｑｂ遺伝子が形成される。さらに他の実施形態では、内因性Ｃ１ｑｃ遺伝子のヌクレオチド配列は、ヒトＣ１ｑｃ遺伝子のヌクレオチド配列に動作可能に連結され、ヒト化Ｃ１ｑｃ遺伝子が形成される。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「キメラの」という用語は、配列、例えば、核酸またはポリペプチド配列を含み、ここで、配列のある部分は１つの生物から誘導され、配列のある部分は異なる生物から誘導される。例えば、キメラＣ１ｑポリペプチドは、マウスまたはラット由来の配列、およびヒトＣ１ｑタンパク質由来の別の配列を含みうる。一実施形態では、キメラＣ１ｑポリペプチドは、ヒトＣ１ｑポリペプチドの球状頭部ドメインまたはその断片、ならびに同族マウスまたはラットＣ１ｑポリペプチドの葉柄ドメインおよび茎ドメインを含む。
【００７１】
「Ｃ１ｑ遺伝子座」のような「遺伝子座」という用語は、Ｃ１ｑコード領域を含むゲノムＤＮＡの位置を指す。例えば、Ｃ１ｑａ遺伝子座は、Ｃ１ｑａコード領域を含むゲノムＤＮＡの位置を指し、Ｃ１ｑｂ遺伝子座は、Ｃ１ｑｂコード領域を含むゲノムＤＮＡの位置を指し、Ｃ１ｑｃ遺伝子座は、Ｃ１ｑｃコード領域を含むゲノムＤＮＡの位置を指す。「Ｃ１ｑ遺伝子座」への参照は、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂまたはＣ１ｑｃ遺伝子座の任意の１つを意味する。他の配列は、遺伝子操作、例えば、選択カセット、制限部位などの目的のために導入されていたＣ１ｑ遺伝子座に含まれてもよい。
【００７２】
本明細書および請求項の範囲全体を通して使用されるさまざまな用語のその他の定義および意味は、関連するセクションの全体に含まれる。
【００７３】
本出願全体を通して、様々な刊行物が参照される。これらの全体的な出版物の開示は、本出願への参照により本出願に援用される。開示された参照はまた、その中に含まれ、参照が依存する文章中で検討される材料について、それらの全体が本明細書に参照により個別にまたは特に組み込まれる。
Ｂ．  組成物
【００７４】
開示された組成物を調製するために使用される構成要素、ならびに本明細書に開示される方法で使用される組成物自体が開示される。これらおよび他の材料が本明細書に開示されるものであって、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群等が開示されているとき、これらの構成要素の多様な個別および集合的な組み合わせならびに並べ替え（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎｓ）の各々の具体的な言及が、明示的には列挙されていないかもしれないが、それぞれは、本明細書中で具体的に考慮され、且つ説明されているということが理解される。例えば、特定のキメラＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃ核酸もしくはポリペプチドが開示され、検討される場合、および、キメラＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃ核酸もしくはポリペプチドを含む多数の分子を作製しうる、多数の改変が検討される場合、キメラＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃ核酸もしくはポリペプチドの全ての組み合わせ、および並べ替え、そうではないことが明確に示されない限り、可能性のある改変が具体的に予期される。したがって、分子Ａ、Ｂ、およびＣのクラス、ならびに分子Ｄ、Ｅ、およびＦのクラスが開示されている場合、および分子の組み合わせの例、Ａ−Ｄが開示されている場合、それぞれが個別に列挙されていない場合であっても、それぞれが個別にかつ集合的に、Ａ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ、およびＣ−Ｆの組み合わせを意味することが意図される。同様に、任意のサブセットまたはこれらの組み合わせも開示されている。したがって、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、およびＣ−Ｅのサブグループが開示されることになる。本概念は、本出願の組成物を作製する方法および使用方法の工程を含むがこれに限定されない、本出願のすべての態様に適用される。したがって、実施可能である種々の付加的工程が存在する場合には、当然のことながら、これらの付加的工程の各々を、本開示の方法の任意の特定の実施形態または実施形態の組み合わせを用いて実施できる。
Ｃ．  ポリペプチド
【００７５】
本開示は、新規のキメラ哺乳類Ｃ１ｑポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸、および該核酸を含み、キメラＣ１ｑポリペプチドを発現しうる、遺伝子改変非ヒト哺乳動物を提供する。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「Ｃ１ｑ」（例えば、「Ｃ１ｑタンパク質」または「Ｃ１ｑ複合体」のような）は、Ｃ１ｒおよびＣ１ｓと共に、補体経路の活性化を開始するＣ１複合体の一部分である。Ｃ１ｑは、病原体、アポトーシス本体および場合により腫瘍細胞のクリアランスに必要な古典的補体経路の第一の構成要素である（Ｇｈａｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２００７；２１２（４−５）：２５３−６６；  Ｌｕ  ＪＨ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８  Ｆｅｂ；５（１）：９−２１）。補体経路は、先天的な免疫系の一部である。補体経路の活性化は、抗原の直接溶解、食細胞およびマクロファージの抗原部位への補充、食細胞による抗原のオプソニン化、およびサイトカイン分泌をもたらしうる。
【００７７】
ヒト／マウス／ラットのＣ１ｑタンパク質は、Ａ−Ｃ−Ｂの順序で５’−３’に直列に配列された３つの遺伝子、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｃ、およびＣ１ｑｂ遺伝子によってコードされるポリペプチドから成る（Ｐｅｔｒｙ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．１９９６；４３（６）：３７０−６）。これらのポリペプチドは、本明細書ではＣ１ｑａポリペプチド、Ｃ１ｑｂポリペプチド、またはＣ１ｑｃポリペプチドとすることができる「Ｃ１ｑポリペプチド」とも呼称される。Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂおよびＣ１ｑｃポリペプチド鎖の各々は、システイン残基を含有する葉柄（または首）ドメインと次に続くコラーゲン様ドメイン（茎ドメイン）を含むＮ末端領域、およびＣ末端領域（球状頭部ドメイン）を有する。Ｎ末端領域は本明細書では「Ｎ末端葉柄茎領域」とも呼称され、Ｃ末端領域は「球状頭部ドメイン」とも呼ばれる。ヒトＣ１ｑタンパク質（約４１０ｋＤａ）は、それぞれが球状頭部で終わる６つのコラーゲン性の茎から組み立てられたボークエット様構造（ｂｏｕｑｅｔ−ｌｉｋｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）に似ている。各々の茎／球状頭部は、３個のポリペプチド鎖（Ｃ１ｑＡ、Ｃ１ｑＢ、およびＣ１ｑＣ）から構成される合計１８個のポリペプチドである（１個のＣ１ｑ分子を構成する６個のＡ−、６個のＢ−、および６個のＣ鎖（Ｒｅｉｄ  ＫＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ．１９８３  Ｊａｎ；１１（１）：１−１２））。
【００７８】
Ｃ１ｑは、ヒトおよび齧歯類の両方において脾臓のマクロファージおよび樹状細胞によって発現される（Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ．２００４  Ｍａｙ  １５；１０３（１０）：３８１３−２０）。Ｃ１ｑは、分泌され、およそ１００ｕｇ／ｍｌでヒト循環中に、およびマウスに類似レベルで見出される（Ｄｉｌｌｏｎ  ＳＰ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ．２００９  Ａｕｇｕｓｔ；４（８）：  １２１０−１２１４；Ｙｏｎｅｍａｓｕ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｐｐｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８８；８６（１）：９７−１０１）。タンパク質は、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を認識する防御コラーゲンの群に属し、ここでＣ１ｑのＣ末端／球状頭部が、ＩｇＭのＣＨ３ドメイン、ＩｇＧのＣＨ２ドメイン、ベータアミロイド、ＤＮＡを含むポリアニオン、Ｃ反応性タンパク質、血清アミロイドＰ、ならびにＬＰＳ、ウイルス、およびプリオンと関連するＰＡＭＰを認識する（Ｄｕｎｋｅｌｂｅｒｇｅｒ  ＪＲ、Ｓｏｎｇ  ＷＣ、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２０１０  Ｊａｎ；２０（１）：３４−５０；Ｇｈａｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．  ２００７；２１２（４−５）：２５３−６６）。Ｃ１ｑがＣ１ｓ−Ｃ１ｒ−Ｃ１ｒ−Ｃ１ｓ四量体によって自発的に組み立て、Ｃ１マクロ複合体を形成する。Ｃ１マクロ複合体は、１つのＣ１ｑ複合体、ならびにＣ１ｒおよびＣ１ｓを各２個ずつを含む３つのタンパク質の五量体であり、ここでＣ１ｒおよびＣ１ｓはＣ１ｑの葉柄茎ドメインと関連する。Ｃ１ｒおよびＣ１ｓは、セルピンプロテアーゼ阻害剤ファミリーメンバーＣ１阻害剤（Ｃ１ＩＮＨ）により調節される（Ｂｅｉｎｒｏｈｒ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２００８  Ｄｅｃ；１４（１２）：５１１−２１）。Ｃ１ｑはまた、ＣＤ９３、ＤＣ−ＳＩＧＮ、およびＣＲ１／ＣＤ３５を含む受容体に結合する（Ｈｏｓｓｚｕ  ＫＫ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ．２０１２  Ａｕｇ  ９；１２０（６）：１２２８−３６；  Ｂｏｈｌｓｏｎ  ＳＳ  ａｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７  Ｊａｎ；４４（１−３）：３３−４３）。ＰＡＭＰを結合することにより、Ｃ１ｑは、病原体クリアランスをオプソニン化し、かつ促進し、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ、またはＩｇＧで、それぞれＣＲ１、またはＦｃｇＲを介して、準最適にオプソニン化された標的粒子の貪食を強化することができる（Ｂｏｂａｋ  ＤＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８７  Ｆｅｂ  １５；１３８（４）：１１５０−６）。したがって、Ｃ１ｑは、古典的補体経路を活性化し、膜侵襲複合体（標的溶解）の形成と活性化断片Ｃ３ａおよびＣ５ａの生成の両方を生じる（Ｂｏｈｌｓｏｎ  ＳＳ  ａｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７  Ｊａｎ；４４（１−３）：３３−４３）。最後に、Ｃ１ｑは免疫複合体のクリアランス、ならびにアポトーシスおよび細胞小疱（ｃｅｌｌｓ  ｂｌｅｂｓ）を受けている細胞を、アポトーシス細胞関連分子パターンを認識することによって、媒介する。
【００７９】
古典的補体経路を活性化するために、Ｃ１ｑは、その６つの球状頭部を介して、抗体の病原体表面またはＦｃドメインに結合し、このことが、Ｃ１ｒ、およびＣ１ｓセリンプロテアーゼの活性化を生じ、下流補体成分の切断をもたらし、最終的に膜侵襲複合体を介して補体活性化、沈着、および細胞溶解をもたらす（Ｒｅｉｄ  ＫＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ．  １９８３  Ｊａｎ；１１（１）：１−１２を参照）。
【００８０】
ヒト、マウスおよびラットのＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、およびＣ１ｑｃの例示的な配列およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号は、以下の表１、２、および８に示され、図３Ａ（Ｃ１ｑａ）、図３Ｂ（Ｃ１ｑｂ）、および図３Ｃ（Ｃ１ｑｃ）で示されている。
【００８１】
抗体のＦｃドメインまたは抗原のいずれかを直接認識するＣ１ｑであるため、ヒト化補体系を提供するためにＣ１ｑは重要である。本明細書に提供されるある実施形態では、Ｃ１ｑの球状頭部ドメイン（しばしばｇＣ１ｑと省略される）は、ヒト抗体またはヒト病原体を認識するものであるため、Ｃ１ｑの球状頭部ドメインはこれらの分子をより容易に認識するように操作された。ある実施形態では、Ｃ１ｑの球状頭部ドメインはヒトである一方、タンパク質の残りの部分は非ヒトである。このような実施形態では、本明細書に提供される非ヒト動物は、Ｃ１ｒ／Ｃ１ｓおよび補体系の残りの部分（例えば、タンパク質の茎および葉柄部分）と相互作用することが知られているタンパク質の部分を保持する。したがって、本明細書に提供される実施形態では、実質的にヒトである球状頭部ドメインおよび実質的に非ヒトであるＮ末端葉柄茎領域をのＣ１ｑを保有するＣ１ｑを発現する非ヒト動物は、治療用分子（例えば、抗体）の作用のエフェクター機構としての補体系の要件の評価に有用である。提供される実施形態において、前述の非ヒト動物は、補体系に抗体が関わった場合に、治療的処置の効果を試験するのにも有用である。提供される実施形態において、前述の非ヒト動物は、感染症徴候のために設計された完全ヒト治療抗体（例えば、二重特異性抗体）の有効性を試験するインビボモデルとしても有用である。
【００８２】
したがって、一態様では、キメラ哺乳類Ｃ１ｑポリペプチド（例えば、キメラ哺乳類Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂおよび／またはＣ１ｑｃポリペプチドなど）が本明細書に開示される。
【００８３】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるキメラＣ１ｑポリペプチドは、イムノグロブリンＦｃドメインの認識に関与する、または病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）の認識に関与するヒトＣ末端領域を含む。
【００８４】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるキメラＣ１ｑポリペプチドは、ヒト球状頭部ドメインまたはその断片を含む。
【００８５】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるキメラＣ１ｑポリペプチドは、実質的にヒトである球状頭部ドメインを含む。「実質的にヒトである球状頭部ドメイン」によって、キメラ（ヒト化）Ｃ１ｑポリペプチドの球状頭部ドメインは、ヒトＣ１ｑポリペプチドの球状頭部ドメインと実質的に同一であることを意味する。「実質的に同一」によって、（ｉ）いくつかの実施形態では、ヒトＣ１ｑポリペプチドの球状頭部ドメインと配列において少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一である球状頭部ドメインを指し、（ｉｉ）他の実施形態では、ヒトＣ１ｑポリペプチドの球状頭部ドメインと、５個、４個、３個、２個、または１個以下のアミノ酸が異なる球状頭部ドメインを指し、（ｉｉｉ）さらに他の実施形態では、球状頭部ドメインのＮ末端またはＣ末端部分内に（例えば、球状頭部ドメインのＮ末端またはＣ末端部分で５〜１０個のアミノ酸内に）、ドメインのＮ末端またはＣ末端部分のみで、例えば、同じ長さを持つが、１つ以上（例えば、１個、２個、３個、４個、または５個、しかし５個以下）のアミノ酸置換（例えば、保存的置換など）を持つことによって、ヒトＣ１ｑポリペプチドの球状頭部ドメインと異なる球状頭部ドメインを指し、および／または（ｉｖ）他の実施形態では、ドメインのＮ末端またはＣ末端のいずれかで、ヒトＣ１ｑポリペプチドの球状頭部ドメインより、１個、２個、３個、４個、５個、しかし５個以下のアミノ酸だけ短い、または長い球状頭部ドメインを指す。いくつかの実施形態では、ヒトＣ１ｑポリペプチドの球状頭部ドメインと実質的に同一の球状頭部ドメインは、ドメインのＮ末端部分内（例えば、Ｎ末端から５〜１０個のアミノ酸内）の、１個、２個、または３個以下のアミノ酸だけ、ヒト球状頭部ドメインと異なり、およびあるそのような実施形態では、その差異は、同族非ヒト（例えば、マウスまたはラット）球状頭部ドメインからの対応する位置におけるアミノ酸との、ヒト球状頭部ドメインのアミノ酸の置換を含む。例えば、図３Ａにおける本明細書に開示されるのは、実質的にヒトである球状頭部ドメインを有するキメラＣ１ｑａポリペプチドであり、このキメラＣ１ｑａポリペプチドの球状ドメインは、配列番号４のヒトＣ１ｑａの球状頭部ドメインと、球状頭部ドメインのＮ末端から３番目の位置で１個のアミノ酸だけ異なる（ヒトにおける「Ｋ」、およびキメラマウスおよびラットＣ１ｑａポリペプチドにおける「Ｒ」）。
【００８６】
いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑポリペプチドは、補体経路の非ヒト（例えば、内因性齧歯類）Ｃ１ｓおよびＣ１ｒ、ならびに／またはその他の非ヒト（例えば、内因性齧歯類）構成要素を認識することに関与するＮ末端葉柄茎領域を含む。
【００８７】
いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑポリペプチドは、非ヒト葉柄茎領域を含む。いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑポリペプチドは、非ヒト葉柄ドメインを含む。いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑポリペプチドは、非ヒトコラーゲン三重ヘリックスドメインを含む。いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑポリペプチドは、非ヒト茎ドメイン、および非ヒト葉柄ドメインを含む、非ヒトＮ末端領域を含む。
【００８８】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるキメラＣ１ｑポリペプチドは、実質的に非ヒトであるＮ末端葉柄茎領域を含む。「実質的に非ヒトであるＮ末端葉柄茎領域」によって、キメラＣ１ｑポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域は、非ヒト（例えば、齧歯類）Ｃ１ｑポリペプチドの対応するＮ末端葉柄茎領域と実質的に同一であることを意味する。「実質的に同一」とは、（ｉ）いくつかの実施形態では、非ヒトＣ１ｑポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と、配列において、少なくとも９０％、９５％、９５％、９９％または１００％同一であるＮ末端葉柄茎領域を意味し、（ｉｉ）他の実施形態では、非ヒトＣ１ｑポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と、５個、４個、３個、２個、または１個以下のアミノ酸だけ異なる、Ｎ末端葉柄茎領域を意味し、（ｉｉｉ）さらに他の実施形態では、Ｃ末端のみで、例えば、同じ長さを持つが、葉柄茎領域のＣ末端から５〜１０個のアミノ酸のうちの１つ以上のアミノ酸置換を持つことによって、非ヒトＣ１ｑポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と異なる、Ｎ末端葉柄茎領域を意味し、および／または（ｉｖ）他の実施形態では、領域のＮ末端またはＣ末端で、非ヒトＣ１ｑポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域より、１個、２個、３個、４個、または５個、しかし５個以下のアミノ酸だけ短い、または長いＮ末端葉柄茎領域を意味する。特定の実施形態では、キメラＣ１ｑポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域は、非ヒト（例えば、齧歯類）Ｃ１ｑポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と同一である。
【００８９】
一実施形態では、ヒトＣ１ｑａポリペプチドは、配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ヒトＣ１ｑａポリペプチドは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿００１３３４３９４．１に記載されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ヒトＣ１ｑｂポリペプチドは、配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ヒトＣ１ｑｂポリペプチドは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００４８２．３に記載されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ヒトＣ１ｑｃポリペプチドは、配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ヒトＣ１ｑｃポリペプチドは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿００１３３４５４８．１に記載されるアミノ酸配列を含む。
【００９０】
一実施形態では、マウスＣ１ｑａポリペプチドは、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、マウスＣ１ｑａポリペプチドは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿０３１５９８．２に記載されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、マウスＣ１ｑｂポリペプチドは、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、マウスＣ１ｑｂポリペプチドは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿０３３９０７．１に記載されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、マウスＣ１ｑｃポリペプチドは、配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、マウスＣ１ｑｃポリペプチドは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿０３１６００．２に記載されるアミノ酸配列を含む。
【００９１】
一実施形態では、ラットＣ１ｑａポリペプチドは、配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ラットＣ１ｑａポリペプチドは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿００１００８５１５．１に記載されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ラットＣ１ｑｂポリペプチドは、配列番号８に記載されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ラットＣ１ｑｂポリペプチドは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿０６２１３５．１に記載されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ラットＣ１ｑｃポリペプチドは、配列番号９に記載されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ラットＣ１ｑｃポリペプチドは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿００１００８５２４．１に記載されるアミノ酸配列を含む。
【００９２】
したがって、一態様では、キメラ哺乳類Ｃ１ｑポリペプチドはキメラＣ１ｑａポリペプチドである。
【００９３】
いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑａポリペプチドは、ヒト球状頭部ドメインまたはその断片を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４で明記されるヒトＣ１ｑａポリペプチドのアミノ酸１２２〜２２２を含むキメラＣ１ｑａポリペプチドである（例えば、ヒトＣ１ｑａポリペプチドのアミノ酸１２２〜２３５または１１２〜２４５を含むキメラ哺乳類Ｃ１ｑａポリペプチド）。
【００９４】
いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑａポリペプチドは、実質的にヒトである球状頭部ドメイン（すなわち、ヒトＣ１ｑａポリペプチドの球状頭部ドメインと実質的に同一である球状頭部ドメイン）を含む。一実施形態では、ヒトＣ１ｑａポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列と、配列番号４のアミノ酸１０８〜２４５とを含み、配列番号４のヒトＣ１ｑａポリペプチドの球状頭部ドメインを構成する（図３Ａ参照）。したがって、いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑａポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸１０８〜２４５により表されるヒトＣ１ｑａ球状頭部ドメインと実質的に同一である球状頭部ドメインを含む。特定の実施形態では、キメラＣ１ｑａポリペプチドの球状頭部ドメインは、配列番号１０のアミノ酸１０８〜２４５によって表され、このようなドメインは、１つのアミノ酸の配列番号４のアミノ酸１０８〜２４５によって表されるヒトＣ１ｑａ球状頭部ドメインとは異なる（ヒトＣ１ｑａにおける「Ｋ」の代わりに、マウスおよびラットのＣ１ｑａでは「Ｒ」である第三のアミノ酸残基）。別の特定の実施形態では、キメラＣ１ｑａポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸１０８〜２４５により表されるヒトＣ１ｑａ球状頭部ドメインと同一である球状頭部ドメインを含む。
【００９５】
いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑａポリペプチドは、非ヒトＣ１ｑａ葉柄および／または茎ドメインを含む。したがって、いくつかの実施形態では、キメラ哺乳類Ｃ１ｑａポリペプチドは、配列番号１に記載されたマウスＣ１ｑａポリペプチドの少なくともアミノ酸３３〜１０２、３０〜１０２、２５〜１０５、２３〜１０７または２３〜１１１を含むマウス配列である非ヒト配列を含む。他の実施形態では、キメラ哺乳類Ｃ１ｑａポリペプチドは、配列番号７に記載されたラットＣ１ｑａポリペプチドの少なくともアミノ酸３３〜１０２、３０〜１０２、２５〜１０５、２３〜１０７または２３〜１１１を含むラット配列である非ヒト配列を含む。
【００９６】
いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑａポリペプチドは、実質的に非ヒトであるＮ末端葉柄茎領域、すなわち、非ヒトＣ１ｑａポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と実質的に同一であるＮ末端葉柄茎領域を含む。ある実施形態では、キメラＣ１ｑａポリペプチドは、マウスＣ１ｑａポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と実質的に同一であるＮ末端葉柄茎領域を含む。一実施形態では、マウスＣ１ｑａポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含み（図３Ａ）、配列番号１のアミノ酸２３〜１０７は、配列番号１のマウスＣ１ｑａポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域を構成する（図３Ａ）。従って、いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑａポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２３〜１０７によって表されるマウスＣ１ｑａＮ末端葉柄茎領域と実質的に同一であるＮ末端葉柄茎領域を含む。特定の実施形態では、キメラＣ１ｑａポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域は、配列番号１のアミノ酸２３〜１０７によって表される。いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑａポリペプチドは、ラットＣ１ｑａポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と実質的に同一であるＮ末端葉柄茎領域を含む。一実施形態では、ラットＣ１ｑａポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列を含み（図３Ａ）、配列番号７のアミノ酸２３〜１０７は、配列番号７のラットＣ１ｑａポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域を構成する（図３Ａ）。従って、いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑａポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸２３〜１０７によって表されるラットＣ１ｑａＮ末端葉柄茎領域と実質的に同一であるＮ末端葉柄茎領域を含む。特定の実施形態では、キメラＣ１ｑａポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域は、配列番号７のアミノ酸２３〜１０７によって表される。
【００９７】
いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑａポリペプチドは、実質的にヒトである球状頭部ドメインと、実質的に非ヒトであるＮ末端葉柄茎領域とを含む。例えば、キメラ哺乳類Ｃ１ｑａポリペプチドが本明細書に開示され、ここにおいて、キメラ哺乳類Ｃ１ｑａポリペプチドが、配列番号１０に記載されたポリペプチドの少なくともアミノ酸２３〜２４５（マウス／ヒト）、または配列番号５５に記載されたポリペプチドの少なくともアミノ酸２３〜２４５（ラット／ヒト）を含む。１つの態様では、キメラＣ１ｑａポリペプチドは、配列番号１０または配列番号５５であり、あるいは配列番号１０または配列番号５５を含む。
【００９８】
別の態様では、キメラ哺乳類Ｃ１ｑポリペプチドはＣ１ｑｂポリペプチドである。
【００９９】
いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑｂポリペプチドは、ヒトＣ１ｑｂ球状頭部またはその断片を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号５に記載されたヒトＣ１ｑｂポリペプチドのアミノ酸１２５〜２３３（例えば、ヒトＣ１ｑｂポリペプチドのアミノ酸１２０〜２５０または１１８〜２５１など）を含む、キメラＣ１ｑｂポリペプチドである。
【０１００】
いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑｂポリペプチドは、実質的にヒトである球状頭部ドメイン（すなわち、ヒトＣ１ｑｂポリペプチドの球状頭部ドメインと実質的に同一である球状頭部ドメイン）を含む。一実施形態では、ヒトＣ１ｑｂポリペプチドは、配列番号５に記載されるアミノ酸配列を含み（図３Ｂ）、配列番号５のアミノ酸１１５〜２５１は、配列番号５のヒトＣ１ｑｂポリペプチドの球状頭部ドメインを構成する（図３Ｂ）。したがって、いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑｂポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸１１５〜２５１により表されるヒト球状頭部ドメインと実質的に同一である球状頭部ドメインを含む。特定の実施形態では、キメラＣ１ｑｂポリペプチドの球状頭部ドメインは、配列番号１１のアミノ酸１１５〜２５１によって表され、このようなドメインは、１つのアミノ酸の配列番号５のアミノ酸１１５〜２５１によって表されるヒトＣ１ｑｂ球状頭部ドメインとは異なる（ヒトＣ１ｑｂにおける「Ｋ」の代わりに、マウスＣ１ｑｂでは「Ｇ」である第一のアミノ酸残基）。別の特定の実施形態では、キメラＣ１ｑｂポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸１１５〜２５１により表されるヒトＣ１ｑｂ球状頭部ドメインと同一である球状頭部ドメインを含む。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑｂポリペプチドは、非ヒトＣ１ｑｂ葉柄および／または茎ドメインを含む。いくつかの実施形態では、キメラ哺乳類Ｃ１ｑｂポリペプチドは、配列番号２に記載されたマウスＣ１ｑｂポリペプチドの少なくともアミノ酸３２〜１０５、２７〜１０５、２７〜１１０、２６〜１１４または２６〜１１７を含むマウス配列である非ヒト哺乳動物配列を含む。他の実施形態では、キメラ哺乳類Ｃ１ｑｂポリペプチドは、配列番号８に記載されたラットＣ１ｑｂポリペプチドの少なくともアミノ酸３２〜１０５、２７〜１０５、２７〜１１０、２６〜１１４または２６〜１１７を含むラット配列である非ヒト哺乳動物配列を含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑｂポリペプチドは、実質的に非ヒトであるＮ末端葉柄茎領域、すなわち、非ヒトＣ１ｑｂポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と実質的に同一であるＮ末端葉柄茎領域を含む。ある実施形態では、キメラＣ１ｑｂポリペプチドは、マウスＣ１ｑｂポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と実質的に同一であるＮ末端葉柄茎領域を含む。一実施形態では、マウスＣ１ｑｂポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含み（図３Ｂ）、配列番号２のアミノ酸２６〜１１４は、配列番号２のマウスＣ１ｑｂポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域を構成する（図３Ｂ）。従って、いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑｂポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸２６〜１１４によって表されるマウスＣ１ｑｂＮ末端葉柄茎領域と実質的に同一であるＮ末端葉柄茎領域を含む。特定の実施形態では、キメラＣ１ｑｂポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域は、配列番号２のアミノ酸２６〜１１４によって表される。いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑｂポリペプチドは、ラットＣ１ｑｂポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と実質的に同一であるＮ末端葉柄茎領域を含む。一実施形態では、ラットＣ１ｑｂポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列を含み（図３Ｂ）、配列番号８のアミノ酸２６〜１１４は、配列番号８のラットＣ１ｑｂポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域を構成する（図３Ｂ）。従って、いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑｂポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸２６〜１１４によって表されるラットＣ１ｑｂＮ末端葉柄茎領域と実質的に同一であるＮ末端葉柄茎領域を含む。特定の実施形態では、キメラＣ１ｑｂポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域は、配列番号８のアミノ酸２６〜１１４によって表される。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑｂポリペプチドは、実質的にヒトである球状頭部ドメインと、実質的に非ヒトであるＮ末端葉柄茎領域とを含む。例えば、キメラ哺乳類Ｃ１ｑｂポリペプチドが本明細書に開示され、ここにおいて、ポリペプチドが、配列番号１１に記載されたポリペプチドの少なくともアミノ酸２６〜２５１（マウス／ヒト）、または配列番号５６に記載されたポリペプチドの少なくともアミノ酸２６〜２５１（ラット／ヒト）を含む。１つの態様では、キメラＣ１ｑｂポリペプチドは、配列番号１１または配列番号５６であり、あるいは配列番号１１または配列番号５６を含む。
【０１０４】
別の態様では、キメラ哺乳類Ｃ１ｑポリペプチドは、キメラＣ１ｑｃポリペプチドである。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑｃポリペプチドは、ヒトＣ１ｑｃ球状頭部またはその断片を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号６で記載されたヒトＣ１ｑｃポリペプチドのアミノ酸１１８〜２３４を含むキメラＣ１ｑｃポリペプチドである（例えば、配列番号６に記載されたヒトＣ１ｑｃポリペプチドのアミノ酸１１４〜２４５を含むキメラ哺乳類Ｃ１ｑｃポリペプチド）。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑｃポリペプチドは、実質的にヒトである球状頭部ドメイン（すなわち、ヒトＣ１ｑｃポリペプチドの球状頭部ドメインと実質的に同一である球状頭部ドメイン）を含む。一実施形態では、ヒトＣ１ｑｃポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列を含み（図３Ｃ）、配列番号６のアミノ酸１１３〜２４５は、配列番号６のヒトＣ１ｑｃポリペプチドの球状頭部ドメインを構成する（図３Ｃ）。したがって、いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑｃポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸１１３〜２４５により表されるヒトＣ１ｑｃ球状頭部ドメインと実質的に同一である球状頭部ドメインを含む。特定の実施形態では、キメラＣ１ｑｃポリペプチドの球状頭部ドメインは、配列番号６のアミノ酸１１３〜２４５により表されるヒトＣ１ｑｃ球状頭部ドメインと同一である。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑｃポリペプチドは、非ヒトＣ１ｑｃ葉柄および／または茎ドメインを含む。例えば、キメラ哺乳類Ｃ１ｑｃポリペプチドが本明細書に開示され、ここにおいて、非ヒト哺乳動物配列は、配列番号３に記載されたマウスＣ１ｑｃポリペプチドの少なくともアミノ酸３１〜１１１、３０〜１１３、または３０〜１１４を含むマウス配列であり、またはキメラ哺乳類Ｃ１ｑｃポリペプチドが本明細書に開示され、ここにおいて、非ヒト哺乳動物配列は、配列番号９に記載されたラットＣ１ｑｃポリペプチドの少なくともアミノ酸３３〜１１３、３２〜１１５、または３２〜１１６を含むラット配列である。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑｃポリペプチドは、実質的に非ヒトであるＮ末端葉柄茎領域、すなわち、非ヒトＣ１ｑｃポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と実質的に同一であるＮ末端葉柄茎領域を含む。ある実施形態では、キメラＣ１ｑｃポリペプチドは、マウスＣ１ｑｃポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と実質的に同一であるＮ末端葉柄茎領域を含む。一実施形態では、マウスＣ１ｑｃポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を含み（図３Ｃ）、配列番号３のアミノ酸３０〜１１３は、配列番号３のマウスＣ１ｑｃポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域を構成する（図３Ｃ）。従って、いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑｃポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸３０〜１１３によって表されるマウスＣ１ｑｃＮ末端葉柄茎領域と実質的に同一であるＮ末端葉柄茎領域を含む。特定の実施形態では、キメラＣ１ｑｃポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域は、配列番号３のアミノ酸３０〜１１３によって表される。いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑｃポリペプチドは、ラットＣ１ｑｃポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と実質的に同一であるＮ末端葉柄茎領域を含む。一実施形態では、ラットＣ１ｑｃポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列を含み（図３Ｃ）、配列番号９のアミノ酸３２〜１１５は、配列番号９のラットＣ１ｑｃポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域を構成する（図３Ｃ）。従って、いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑｃポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸３２〜１１５によって表されるラットＣ１ｑｃＮ末端葉柄茎領域と実質的に同一であるＮ末端葉柄茎領域を含む。特定の実施形態では、キメラＣ１ｑｃポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域は、配列番号９のアミノ酸３２〜１１５によって表される。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑｃポリペプチドは、実質的にヒトである球状頭部ドメインと、実質的に非ヒトであるＮ末端葉柄茎領域とを含む。例えば、キメラ哺乳類Ｃ１ｑｃポリペプチドが本明細書に開示され、ここにおいて、ポリペプチドが、配列番号１２に記載されたポリペプチドの少なくともアミノ酸３０〜２４６（マウス／ヒト）、または配列番号５７に記載されたポリペプチドの少なくともアミノ酸３２〜２４８（ラット／ヒト）を含む。１つの態様では、キメラＣ１ｑｃポリペプチドは、配列番号１２または配列番号５７であり、あるいは配列番号１２または配列番号５７を含む。
【０１１０】
１つの特定の態様では、本明細書に記載のキメラＣ１ｑポリペプチドのうちの１つ以上を含むキメラＣ１ｑタンパク質が本明細書に開示される。例えば、キメラＣ１ｑタンパク質が本明細書に開示され、ここにおいて、タンパク質は、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、または６個のキメラＣ１ｑａ、１個、２個、３個、４個、５個、または６個のキメラＣ１ｑｂ、および／または１個、２個、３個、４個、５個、または６個のキメラＣ１ｑｃポリペプチドを含む。従って、いくつかの実施形態では、キメラタンパク質は、各キメラＣ１ｑａポリペプチド、キメラＣ１ｑｂポリペプチド、およびキメラＣ１ｑｃポリペプチドを６個ずつ含む。
【０１１１】
開示されたＣ１ｑポリペプチドは、一部ヒトおよび一部非ヒトアミノ酸構造を含むキメラポリペプチドである。当然のことながら、開示されたキメラポリペプチドのヒト部分および非ヒト部分は、Ｃ１ｑポリペプチドの機能性を保持するような様式で、連結される、融合される、または別の方法で化学的に結合されることが、本明細書に意図されている。本明細書において使用される場合、「機能」及び「機能性」は、ネイティブ分子の役割を遂行する能力を指す。Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂおよびＣ１ｑｃについては、機能性は、二量体（Ｃ１ｑａおよびＣ１ｑｂについてはヘテロ二量体、およびＣ１ｑｃについてはホモ二量体）を形成する能力、キメラポリペプチドの各部分の適切なフォールディングを推測する能力、Ｃ１ｑ複合体を形成する二量体を三量体として構築する能力（三量体につき、２つのＣ１ｑａおよびＣ１ｑｂヘテロ二量体、および１つのＣ１ｑｃホモ二量体）、Ｃ１ｒ、およびＣ１ｓで、五量体Ｃ１複合体を形成する能力、抗体、またはＰＡＭＰのＦｃドメインを認識する能力、および古典的補体経路を開始する能力を含む。Ｃ１ｑタンパク質のアセンブリについて記載がある（例えば、Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｅｌｌｕｌａｒ＆Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８，５（１）：９−２１）、特に図１を参照）。Ｃ１ｑａおよびＣ１ｑｂポリペプチド鎖は、Ｎ末端でジスルフィド結合を通して二量体化し、２つのＣ１ｑｃ鎖は、類似のジスルフィド結合を介してホモ二量体を形成する。Ｃ１ｑａ−Ｃ１ｑｂ二量体および単一のＣ１ｑｃ鎖は、三重ヘリックスを形成し、およびＣ１ｑｃ−Ｃ１ｑｃ二量体の他のＣ１ｑｃ鎖は、２つのＣ１ｑｃ鎖間のジスルフィド結合によって連結された２つの三重へリックスを形成する別のＣ１ｑａ−Ｃ１ｑｂ二量体と三量体を形成する。３つのかかる構造は、Ｎ−末端関連を介してＣ１ｑタンパク質分子を形成する。
【０１１２】
特定の態様では、キメラ哺乳類Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃポリペプチドが本明細書に開示され、ここにおいて、本明細書に開示されるポリペプチドはさらに、ヒト、マウス、またはラットＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃシグナル配列をそれぞれ含む。例示的ヒト、マウス、およびラットＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、およびＣ１ｑｃシグナル配列をそれぞれ、図３Ａ、３Ｂ、および３Ｃに示す。
【０１１３】
当然のことながら、任意の開示されたキメラポリペプチドを非ヒト動物で発現することができることが本明細書においては意図されている。したがって、本開示に包含されることは、本明細書に記載されるキメラＣ１ｑタンパク質を発現する遺伝子改変非ヒト動物、例えば、齧歯類、例えばマウスまたはラット、あるいは本明細書に記載されるアミノ酸配列の、例えば保存的アミノ酸置換のような、バリアントを含むキメラＣ１ｑタンパク質である。
【０１１４】
したがって、キメラポリペプチドは、既知であり、本明細書では意図されているキメラＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃポリペプチドの多数のバリアントのうちの１つとすることができる。公知の機能的なＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃ種および系統バリアントに加えて、開示された方法および組成物にも機能するＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃポリペプチドの誘導体がある。タンパク質バリアントおよび誘導体は、当業者によく理解されており、アミノ酸配列改変を伴うことができる。例えば、アミノ酸配列改変は、一般に、置換、挿入、または欠失バリアントの３つクラスの１つ以上に属する。それらを達成するべきこれらのタイプの改変および分子技術は、当業界で周知である。置換、欠失、挿入、またはそれらの任意の組み合わせは、最終構築物に到達するために組み合わせられてもよい。これらの改変は、配列をリーディングフレームの外に配置してはならず、二次ｍＲＮＡ構造を生成できる相補的な領域を作り出すことは好ましくない。「保存的」という用語は、保存的アミノ酸置換を記載するために使用する場合には、類似の化学特性（例えば、電荷または疎水性）を伴う側鎖のＲ基を有する別のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換を含む。保存的アミノ酸置換は、保存的置換をコードするヌクレオチド変化を導入するように、ヌクレオチド配列を改変することによって達成され得る。一般的に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の対象となる機能特性、例えば、イムノグロブリンを結合する、または補体経路を活性化するＣ１ｑ複合体の能力を、実質的に変化させない。類似の化学特性を備えた側鎖を持つアミノ酸群の例には次のものが含まれる：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンなどの脂肪族側鎖、セリンおよびスレオニンなどの脂肪族−ヒドロキシル側鎖、アスパラギンおよびグルタミンなどのアミド含有側鎖、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンなどの芳香族側鎖、リジン、アルギニン、およびヒスチジンなどの塩基性側鎖、アスパラギン酸およびグルタミン酸などの酸性側鎖、ならびにシステインおよびメチオニンなどの硫黄含有側鎖。保存的アミノ酸置換基には、例えば、バリン／ロイシン／イソロイシン、フェニルアラニン／チロシン、リジン／アルギニン、アラニン／バリン、グルタミン酸／アスパラギン酸、およびアスパラギン／グルタミンが含まれる。一部の実施形態では、保存的アミノ酸置換は、例えばアラニンスキャニング変異誘導などで使用される、アラニンを含むタンパク質の任意の未変性残基の置換である可能性がある。一部の実施形態では、参照により本明細書に援用されるＧｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ  Ｍａｔｃｈｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｎｔｉｒｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３−４５に開示されるＰＡＭ２５０対数尤度マトリクスにおいて正の値を有する保存的置換が行われる。一部の実施形態では、置換は中等度に保存的な置換であり、ここで置換はＰＡＭ２５０対数尤度マトリクスで負でない値を持つ。
【０１１５】
機能の実質的な変化は、上に列挙されたものよりも保存的ではない置換を選択する、すなわち、（ａ）置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造、例えば、シートまたはらせん構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷または疎水性、あるいは（ｃ）側鎖のバルク、を維持することに対してより有意に効果を発揮する残基を選択する、ことによって作製される。一般的にタンパク質の特性の最大変化を生成するために期待される置換は、（ａ）親水性残基、例えばセリルまたはスレオニルが、疎水性残基、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、またはアラニルと（または、によって）置換される、（ｂ）システインまたはプロリンが任意の他の残基と（または、によって）置換される、（ｃ）陽性側鎖を有する残基、例えばリシル、アルギニル、またはヒスチジルが、陰性残基、例えばグルタミルまたはアスパルチルと（または、によって）置換される、あるいは、ｄ）バルク側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンが、側鎖を有さない残基、例えばグリシンと（または、によって）置換される、（ｅ）硫酸化および／またはグリコシル化の部位数を増加させることによる、置換である。
【０１１６】
Ｎ−グリコシル化（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）またはＯ−グリコシル化（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）用の部位を挿入するために、置換または欠失突然変異を用いることができる。システインまたはその他の不安定残基の欠失も望ましい場合がある。潜在的なタンパク質分解部位（例えば、Ａｒｇ）の欠失または置換は、例えば、基本残基のうちの１つを欠失することによって、またはグルタミニル残基またはヒスチジル残基によって置換されることによって達成される。
【０１１７】
本明細書に開示されるタンパク質のバリアントおよび誘導体を定義する１つの方法は、特定の既知の配列に対する相同性／同一性の観点から、バリアントおよび誘導体を定義することを通してであると理解される。例えば、配列番号１は、マウスＣ１ｑａポリペプチドの特定配列を示し、配列番号２は、マウスＣ１ｑｂポリペプチドの特定配列を示し、配列番号３は、マウスＣ１ｑｃポリペプチドの特定配列を示し、配列番号４は、ヒトＣ１ｑａポリペプチドの特定配列を示し、配列番号：５は、ヒトＣ１ｑｂポリペプチドの特定配列を示し、配列番号：６は、ヒトＣ１ｑｃポリペプチドの特定配列を示し、配列番号：７は、ラットＣ１ｑａポリペプチドの特定配列を示し、配列番号：８は、ラットＣ１ｑｂポリペプチドの特定配列を示し、配列番号：９は、ラットＣ１ｑｃポリペプチドの特定配列を示している。これらの、および本明細書に開示されるその他のタンパク質のバリアントが具体的に開示されており、記載された配列に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、または９９％の相同性を有する。いくつかの実施形態では、相同配列は、表１、２、及び８に列挙されたＧｅｎＢａｎｋ登録番号で表されるものである。当業者であれば、２つのタンパク質の相同性を決定する方法を容易に理解する。例えば、相同性がその最高レベルにあるように、相同性を二つの配列を並列させた後に計算することができる。
【０１１８】
相同性を計算する別の方法は、発行されたアルゴリズムによって実施され得る。比較のための配列の最適なアライメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）のローカル相同アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同並列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国．８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または精査によって、実施され得る。
【０１１９】
同じ種類の相同性を、例えば、Ｚｕｋｅｒ、Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：４８−５２、１９８９、Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国８６：７７０６−７７１０，１９８９，Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６、１９８９に開示されたアルゴリズムなどによって、核酸について取得することができる。
【０１２０】
また保存的突然変異および相同性の記述は、バリアントが保存的突然変異である、特定配列に少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の相同性を持つ実施形態のような、任意の組み合わせで一緒に組み合わせることができることが理解されよう。
【０１２１】
本明細書は様々なタンパク質およびタンパク質配列について説明するため、これらのタンパク質配列をコードできる核酸もまた開示されていることが理解される。これには、特定のタンパク質配列に関連するすべての縮重配列、すなわち、１つの特定のタンパク質配列をコードする配列を持つすべての核酸、ならびに開示されたバリアントおよびタンパク質配列の誘導体をコードする縮重核酸を含むすべての核酸、が含まれる。したがって、それぞれの特定の核酸配列は本明細書に記述されない場合があるが、どの配列もすべてが、開示されたタンパク質配列を通して本明細書において実際に開示され、記述されていることが理解される。
Ｄ．  核酸
【０１２２】
例えば、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃ遺伝子改変非ヒト動物、ならびに様々な機能性核酸を作製するための、本明細書に開示されるキメラＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、Ｃ１ｑｃ、または任意の核酸をコードする、例えば核酸を含む、核酸ベースである本明細書に開示されるさまざまな分子が存在する。
【０１２３】
非ヒト、およびヒト核酸配列を含む、キメラ哺乳類Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃポリペプチドをコードする単離核酸が本明細書に開示されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される単離核酸配列は、ゲノムの領域全体を含む大型標的化ベクターであり、エクソン、イントロン、及び／または遺伝子間配列を含む。これらは、５’および３’非翻訳領域、エンハンサー、プロモーター、およびその他の調節領域を含みうる。いくつかの実施形態では、これらの調節要素は、非ヒト調節要素、例えば、内因性非ヒトＣ１ｑ遺伝子の調節要素である。他の実施形態では、これらの調節要素は、ヒト調節要素、例えば、ヒトＣ１ｑ遺伝子の調節要素である。他の実施形態では、本明細書に記載される単離核酸配列はｃＤＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、単離核酸、例えば、本明細書に記載される大型標的化ベクターは、１つを超えるＣ１ｑ遺伝子、例えば、２つまたは３つの遺伝子を含みうる（例えば、本明細書に記載される３つのキメラＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、およびＣ１ｑｃ遺伝子すべてをコードしてもよい）。
【０１２４】
一態様では、非ヒト、およびヒト核酸配列を含む単離核酸が本明細書に開示され、ここにおいて、核酸が、上述のキメラ哺乳類Ｃ１ｑポリペプチド（例えば、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、またはＣ１ｑｃポリペプチド）、例えば実質的に非ヒトであるＮ末端葉柄茎領域、および実質的にヒトである球状頭部ドメインを含むキメラＣ１ｑポリペプチドをコードする。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、キメラ哺乳類Ｃ１ｑａポリペプチドをコードする単離核酸が、非ヒト、およびヒト核酸配列を含み、ここにおいて、ヒト核酸配列は、ヒトＣ１ｑポリペプチドの球状頭部ドメインを実質的にコードし、非ヒト核酸配列は、同族非ヒトＣ１ｑポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域を実質的にコードする。
【０１２６】
「ヒトＣ１ｑポリペプチドの球状頭部ドメインを実質的にコードするヒトＣ１ｑ核酸配列」により、ヒトＣ１ｑポリペプチドの球状ドメインよりもわずかに長いまたは短い球状頭部ドメインまたはポリペプチド断片をコードするヒトＣ１ｑ遺伝子の断片を意味する。「わずかに長いまたは短い」とは、５、４、３、２、または１アミノ酸以下の長さの差を意味する。同様に、「非ヒトＣ１ｑポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域を実質的にコードする非ヒトＣ１ｑ核酸配列」により、非ヒトＣ１ｑポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域よりわずかに長いまたは短いＮ末端葉柄茎領域またはポリペプチド断片をコードする非ヒトＣ１ｑ遺伝子の断片を意味する。
【０１２７】
非ヒトＣ１ｑポリペプチドおよび同族ヒトＣ１ｑポリペプチドが、葉柄茎領域と球状頭部ドメインとの間の接合部近くで共通アミノ酸を共有する状況では、ヒトＣ１ｑポリペプチドの球状頭部ドメインを正確にコードするヒトＣ１ｑ核酸配列を利用する必要はない場合がある。キメラＣ１ｑポリペプチドが、ヒトＣ１ｑポリペプチドの球状頭部ドメインと実質的にまたは完全に同一である球状頭部ドメイン、および非ヒトＣ１ｑポリペプチドの葉柄茎領域と実質的に、または完全に同一である葉柄茎領域を含むように、非ヒト動物Ｃ１ｑポリペプチドの葉柄茎領域を実質的にコードする核酸に動作可能に連結して、ヒトＣ１ｑポリペプチドの球状頭部ドメインを実質的にコードするヒトＣ１ｑ遺伝子の核酸配列を使用することができる。同様に、非ヒトＣ１ｑポリペプチドおよびヒトＣ１ｑポリペプチドが、球状頭部ドメインのＣ末端の近くで共通アミノ酸を共有する状況では、ヒトＣ１ｑポリペプチドの球状頭部ドメインを正確にコードするヒトＣ１ｑ核酸を利用する必要はない場合がある。キメラＣ１ｑポリペプチドが、ヒトＣ１ｑポリペプチドの球状頭部ドメインと、さらに実質的にまたは完全に同一である球状頭部ドメインを含むように、球状頭部ドメインのＣ末端で、残りのアミノ酸をコードする非ヒト核酸に動作可能に連結して、ヒトＣ１ｑポリペプチドの球状頭部ドメインよりわずかに短いポリペプチドをコードする、ヒトＣ１ｑ遺伝子のわずかに短い核酸を挿入することができる。
【０１２８】
一態様では、キメラ哺乳類Ｃ１ｑａポリペプチドをコードする単離核酸が本明細書に開示され、ここにおいて、ヒト核酸配列は、ヒトＣ１ｑａポリペプチドの球状頭部ドメインを実質的にコードし、例えば、ヒトＣ１ｑａポリペプチドの球状頭部ドメイン、またはその断片をコードする。例えば、一態様では、キメラ哺乳類Ｃ１ｑａポリペプチドをコードする単離核酸が本明細書に開示され、ここにおいて核酸は、少なくとも、配列番号４に記載されるヒトＣ１ｑａポリペプチドのアミノ酸１２２〜２２２をコードする核酸配列を含む。例えば、核酸は、配列番号４に記載されるヒトＣ１ｑａポリペプチドのアミノ酸１２２〜２３５または１１２〜２４５をコードする核酸配列（例えば、ヒトＣ１ｑａエクソン３の一部）を含むことができる。
【０１２９】
キメラ哺乳類Ｃ１ｑａポリペプチドをコードする開示される核酸は、非ヒト核酸配列（例えば、非ヒトＣ１ｑａポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域を実質的にコードする核酸配列など）をさらに含みうる。したがって、単離核酸もまた本明細書に開示され、ここにおいて、核酸配列が、少なくとも、配列番号１に記載されたマウスＣ１ｑａポリペプチドのアミノ酸３３〜１０２、３０〜１０２、２５〜１０５、２３〜１０７または２３〜１１１をコードするヌクレオチド配列、または、少なくとも、配列番号７に記載されたラットＣ１ｑａポリペプチドのアミノ酸３３〜１０２、３０〜１０２、２５〜１０５、２３〜１０７、または２３〜１１１をコードするヌクレオチド配列を含む。特定の態様では、単離核酸が本明細書に開示され、ここにおいて、単離核酸が、配列番号１０（マウス／ヒト）に記載されたポリペプチドの少なくともアミノ酸２３〜２４５を、または配列番号５５（ラット／ヒト）に記載されたポリペプチドの少なくともアミノ酸２３〜２４５をコードする。１つの態様では、単離核酸は、配列番号１０または配列番号５５である、あるいは配列番号１０または配列番号５５を含む、機能的なキメラ哺乳類Ｃ１ｑａポリペプチドをコードする。
【０１３０】
また、例えば、ヒトＣ１ｑｂポリペプチドまたはその断片の球状頭部ドメインをコードする、ヒトＣ１ｑｂポリペプチドの球状頭部ドメインを実質的にコードする核酸配列を含む、キメラ哺乳類Ｃ１ｑｂポリペプチドをコードする単離核酸が本明細書に開示される。例えば、キメラ哺乳類Ｃ１ｑｂポリペプチドをコードする核酸が、少なくとも、配列番号５に記載されるヒトＣ１ｑｂポリペプチドのアミノ酸１２５〜２３３をコードする核酸配列を含む。例えば、核酸は、配列番号５に記載されるヒトＣ１ｑｂポリペプチドのアミノ酸１１８〜２５１をコードする核酸配列（例えば、ヒトＣ１ｑｂエクソン３の一部）を含むことができる。
【０１３１】
キメラ哺乳類Ｃ１ｑｂポリペプチドをコードする開示される核酸は、非ヒト核酸配列（例えば、非ヒトＣ１ｑｂポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域を実質的にコードする核酸配列など）をさらに含みうる。したがって、単離核酸もまた本明細書に開示され、ここにおいて、核酸配列が、少なくとも、配列番号２に記載されたマウスＣ１ｑｂポリペプチドのアミノ酸３２〜１０５、２７〜１０５、２７〜１１０、２６〜１１４、または２６〜１１７をコードするヌクレオチド配列、または、少なくとも、配列番号８に記載されたラットＣ１ｑｂポリペプチドのアミノ酸３２〜１０５、２７〜１０５、２７〜１１０、２６〜１１４、または２６〜１１７をコードするヌクレオチド配列を含む。特定の態様では、単離核酸が本明細書に開示され、ここにおいて、単離核酸が、配列番号１１（マウス／ヒト）に記載されたポリペプチドの少なくともアミノ酸２６〜２５１を、またはここにおいて、単離核酸が、配列番号５６（ラット／ヒト）に記載されたポリペプチドの少なくともアミノ酸２６〜２５１をコードする。１つの態様では、単離核酸は、配列番号１１または配列番号５６である、あるいは配列番号１１または配列番号５６を含む、機能的なキメラ哺乳類Ｃ１ｑｂポリペプチドをコードする。
【０１３２】
また、例えば、ヒトＣ１ｑｃポリペプチドまたはその断片の球状頭部ドメインをコードする、ヒトＣ１ｑｃポリペプチドの球状頭部ドメインを実質的にコードする核酸配列を含む、キメラ哺乳類Ｃ１ｑｃポリペプチドをコードする単離核酸が本明細書に開示される。１つの態様では、キメラ哺乳類Ｃ１ｑｃポリペプチドをコードする単離核酸、ここにおいて、核酸が、少なくとも、配列番号６に記載されたヒトＣ１ｑｃポリペプチドのアミノ酸１１８〜２３４をコードする核酸配列を含むキメラ哺乳類Ｃ１ｑｃポリペプチドをコードする。例えば、核酸は、配列番号６に記載されるヒトＣ１ｑｃポリペプチドのアミノ酸１１４〜２４５をコードする核酸配列（例えば、ヒトＣ１ｑａエクソン３の一部）を含むことができる。
【０１３３】
キメラ哺乳類Ｃ１ｑｃポリペプチドをコードする核酸は、非ヒト核酸配列（例えば、非ヒトＣ１ｑｃポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域を実質的にコードする核酸配列など）をさらに含みうる。したがって、単離核酸もまた本明細書に開示され、ここにおいて、核酸配列が、少なくとも、配列番号３に記載されたマウスＣ１ｑｃポリペプチドのアミノ酸３１〜１１１、３０〜１１３、または３０〜１１４をコードするヌクレオチド配列、またはここにおいて、核酸配列が、少なくとも、配列番号９に記載されたラットＣ１ｑｃポリペプチドのアミノ酸３３〜１１３、３２〜１１５、または３２〜１１６をコードするヌクレオチド配列を含む。特定の態様では、単離核酸が本明細書に開示され、ここにおいて、単離核酸が、配列番号１２（マウス／ヒト）に記載されたポリペプチドの少なくともアミノ酸３０〜２４６を、またはここにおいて、単離核酸が、配列番号５７（ラット／ヒト）に記載されたポリペプチドの少なくともアミノ酸３２〜２４８をコードする。１つの態様では、単離核酸は、配列番号１２または配列番号５７である、あるいは配列番号１２または配列番号５７を含む、機能的なキメラ哺乳類Ｃ１ｑｃポリペプチドをコードする。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑポリペプチドをコードする単離核酸中の非ヒト核酸配列は、非ヒトシグナルペプチド、例えば、内因性非ヒトＣ１ｑポリペプチドのシグナルペプチドもコードする。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑポリペプチドをコードする単離核酸中の非ヒト核酸配列は、非ヒト５’ＵＴＲ領域、例えば、内因性非ヒトＣ１ｑ遺伝子の５’ＵＴＲ領域も含む。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑポリペプチドをコードする単離核酸中のヒト核酸配列は、ヒト３’ＵＴＲ領域、例えば、ヒトＣ１ｑ遺伝子の３’ＵＴＲ領域も含む。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、非ヒト核酸配列は、エクソン２のコード部分（例えば、非ヒトＣ１ｑポリペプチドの成熟型のアミノ酸をコードする部分）およびエクソン３の部分（例えば、Ｎ末端葉柄茎領域のアミノ酸をコードする部分）を含む非ヒトＣ１ｑ遺伝子のゲノム断片である。いくつかの実施形態では、非ヒト核酸配列は、シグナルペプチドと非ヒトＣ１ｑポリペプチドの成熟型のアミノ酸との両方をコードするエクソン２のコード全部分、およびＮ末端葉柄茎領域のアミノ酸をコードするエクソン３の部分を含む非ヒトＣ１ｑ遺伝子のゲノム断片である。いくつかの実施形態では、非ヒト核酸配列は、エクソン１、エクソン２、およびＮ末端葉柄茎領域のアミノ酸をコードするエクソン３の部分を含む非ヒトＣ１ｑ遺伝子のゲノム断片であり、それによって非ヒトＣ１ｑ遺伝子の５’ＵＴＲを包含する。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、ヒト核酸配列は、ヒトのＣ１ｑポリペプチドの球状頭部ドメインまたはその断片をコードするエクソン３の一部を含むヒトＣ１ｑ遺伝子のゲノム断片である。コードされたキメラＣ１ｑポリペプチドが、実質的に非ヒトであるＮ末端葉柄茎領域と、実質的にヒトであり、かつ機能的なＣ１ｑポリペプチドである球状頭部ドメインとを含むように、ヒト核酸配列が非ヒト核酸配列に動作可能に連結されている。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、ヒト核酸配列は、球状頭部ドメインまたはその断片をコードし、かつヒトＣ１ｑ遺伝子の全３’ＵＴＲを含む、エクソン３の３’部分を含むヒトＣ１ｑ遺伝子のゲノム断片である。
【０１４０】
１つの特定の態様では、キメラ非ヒトＣ１ｑタンパク質をコードする単離核酸が本明細書に開示されており、ここにおいて、核酸はキメラＣ１ｑａ、キメラＣ１ｑｂ、および／またはキメラＣ１ｑｃをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃをコードする配列のうちの１つ以上が、ヒト球状頭部ドメインまたはその断片をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃをコードする配列のうちの１つ以上は、非ヒト（例えば、齧歯類、例えば、ラットまたはマウス）の茎および／または葉柄をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃをコードする配列のうちの１つ以上は、非ヒト（例えば、齧歯類、例えば、ラットまたはマウス）のコラーゲン三重ヘリックスドメインをコードする配列を含む。
【０１４１】
従って、いくつかの実施形態では、単離核酸が本明細書に開示され、ここにおいて、単離核酸が、第一、第二、または第三のヌクレオチド配列の１つ以上を含むキメラ非ヒト哺乳動物Ｃ１ｑタンパク質をコードし、ここにおいて、第一のヌクレオチド配列がキメラ非ヒトＣ１ｑａポリペプチドをコードし、第二のヌクレオチド配列がキメラ非ヒト哺乳類Ｃ１ｑｂポリペプチドをコードし、および第三のヌクレオチド配列がキメラ非ヒト哺乳類Ｃ１ｑｃポリペプチドをコードする。
【０１４２】
一実施形態では、開示された単離核酸は、図３Ａ、３Ｂ、および／または３Ｃに明記されるように、ヒト、マウスまたはラットのＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含むことができる。
【０１４３】
また、キメラ哺乳類Ｃ１ｑポリペプチドをコードする単離核酸が本明細書に開示されており、ここにおいて、非ヒト哺乳動物核酸配列は、非ヒト哺乳動物Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃ遺伝子のエクソン１および２を含む。
【０１４４】
当然のことながら、開示された核酸は、翻訳および発現されるべき細胞に組み込むことができることが本明細書に意図されている。したがって、開示された核酸のいずれも、キメラＣ１ｑポリペプチドの発現のために細胞のゲノム内にクローニングされ得る。したがって、本明細書において、任意の前述の態様の１つ以上の単離核酸を含む遺伝子改変細胞が提供される。
【０１４５】
「細胞」という用語は、組み換え型核酸配列の発現のために好適な任意の細胞を含む。細胞としては、原核生物及び真核生物（単細胞または多細胞）の細胞、細菌細胞（例えば、大腸菌、バチルス属、ストレプトマイセス属などの株）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、出芽酵母、分裂酵母、ピヒア  メタノリカなど）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ−９、ＳＦ−２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、イラクサギンウワバなど）、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、または例えば、ハイブリドーマもしくはクアドローマなどの細胞融合が挙げられる。一部の実施形態では、細胞はヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラット、またはマウス細胞である。一部の実施形態では、細胞は真核細胞であり、以下の細胞から選択される：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ  Ｋ１、ＤＸＢ−１１  ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３  ＥＢＮＡ、ＭＳＲ  ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ  ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ  ８０６５、ＨＬ−６０、（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ  ０６０５６２、セルトリ細胞、ＢＲＬ  ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞、および前述細胞から派生する細胞株。一部の実施形態では、細胞は、一つ以上のウイルス遺伝子、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６ＴＭ細胞）を備えている。一部の実施形態において、細胞は、ＥＳ細胞である。他の実施形態では、細胞は樹状細胞、線維芽細胞、上皮細胞、または一次細胞である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物を生成するために細胞を使用する。一部の前述の細胞は、少なくとも１つ以上のキメラＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃポリペプチドをコードし、前述のポリペプチドを発現することができる本開示の核酸のいずれかを含む遺伝子改変非ヒト動物に組み込まれ、その遺伝子改変非ヒト動物の発生に使用されうることがさらに理解される。いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に提供される遺伝子改変非ヒト動物から取得する。いくつかのこうした実施形態では、細胞は一次細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞はマクロファージまたは樹状細胞であってもよい。
【０１４６】
当業者であれば、本明細書に記載されるヒト化Ｃ１ｑタンパク質をコードする核酸残基に加えて、遺伝子コードの縮重に起因して、他の核酸が本開示のポリペプチドをコードしてもよいことを理解するであろう。したがって、そのゲノム内に、本明細書に記載されるヒト化Ｃ１ｑタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子改変非ヒト動物に加えて、そのゲノム内に、遺伝子コードの縮重に起因する本明細書に記載されるものとは異なるヌクレオチド配列を含む、非ヒト動物もまた提供される。
【０１４７】
タンパク質Ｃ１ｑ、例えば、ポリペプチドＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃ、ならびにキメラＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃ、あるいはキメラＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃポリペプチドを作製するための本明細書に開示される任意の核酸に関連する様々な配列があり、それらのすべては、核酸によってコードされるか、または核酸である。これらの遺伝子のヒト類似体、ならびにこれらの遺伝子の他の類似体、および対立遺伝子、およびスプライスバリアントおよび他のタイプのバリアントの配列は、Ｇｅｎｂａｎｋを含む様々なタンパク質および遺伝子データベースで利用可能である。当業者であれば、配列矛盾および差異を解決し、特定の配列に関連する組成物および方法を他の関連配列に調整する方法を理解する。
Ｅ．  遺伝子改変ヒト化Ｃ１ｑ動物
【０１４８】
さらなる態様では、本明細書で上述されるキメラ型のヒト化Ｃ１ｑポリペプチド（例えば、キメラＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂまたはＣ１ｑｃ）を発現する遺伝子改変非ヒト動物（例えば、マウスまたはラットなどの齧歯類）が本明細書に提供される。かかる非ヒト動物は、ヒト化Ｃ１ｑポリペプチドを含むヒト化Ｃ１ｑ複合体を発現する。
【０１４９】
一態様では、実質的に非ヒト（内因性）であるＮ末端葉柄茎領域と、実質的にヒトである球状頭部ドメインとを含む、例えばキメラＣ１ｑポリペプチド（Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、またはＣ１ｑｃ）などの、本明細書で上述されるキメラＣ１ｑポリペプチドをコードする核酸分子を、そのゲノム内に含む非ヒト動物（例えば、マウスまたはラットなどの齧歯類）が本明細書に開示される。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される動物は、本明細書で上述のキメラＣ１ｑポリペプチド（例えば、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂまたはＣ１ｑｃポリペプチド）をコードする核酸分子を含み、ここにおいて、核酸分子は非ヒト（例えば、内在性）およびヒト核酸配列を含む。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑポリペプチドをコードする核酸分子は、核酸分子が機能的なＣ１ｑポリペプチドをコードするように、互いが動作可能に連結される、非ヒト（例えば、内因性）Ｃ１ｑ核酸配列および同族ヒトＣ１ｑ核酸配列を含む。「同族」という用語は、キメラ分子の文脈で本明細書で使用される場合、異なる起源のキメラ分子の配列が同じ遺伝子に対応することを示すために使用される。例えば、マウスまたはラットのＣ１ｑａ配列がヒトＣ１ｑａ配列に連結され、キメラＣ１ｑａ分子を形成する、マウスまたはラットＣ１ｑｂ配列がヒトＣ１ｑｂ配列に連結され、キメラＣ１ｑｂ配列を形成する、マウスまたはラットＣ１ｑｃ配列がヒトＣ１ｑｃ配列に連結され、キメラＣ１ｑｃ分子を形成する。いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑポリペプチドは、実質的に非ヒトであるＮ末端葉柄茎領域と、実質的にヒトである球状頭部ドメインとを含む。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物のゲノム中のキメラＣ１ｑポリペプチドをコードする核酸分子は、非ヒトＣ１ｑ核酸配列（例えば、内因性非ヒトＣ１ｑ核酸配列）およびヒトＣ１ｑ核酸配列を含み、ここにおいて、ヒトＣ１ｑ核酸配列が、ヒトＣ１ｑポリペプチドの球状頭部ドメインを実質的にコードする。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物のゲノム中のキメラＣ１ｑポリペプチドをコードする核酸分子は、非ヒト（例えば、内因性）Ｃ１ｑ核酸配列、およびヒトＣ１ｑ核酸配列を含み、ここにおいて、非ヒトＣ１ｑ核酸配列が、非ヒト（例えば、内因性）Ｃ１ｑポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域を実質的にコードする。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑポリペプチドをコードする核酸分子は、非ヒト（例えば、内因性）Ｃ１ｑ遺伝子のプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの５’調節要素に動作可能に連結される。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、ゲノム内のキメラＣ１ｑポリペプチドをコードする核酸分子は、内因性Ｃ１ｑ遺伝子座以外の遺伝子座にある。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、ゲノム内のキメラＣ１ｑ核酸分子は、内因性Ｃ１ｑ遺伝子座にある。いくつかのこうした実施形態では、ゲノム中のキメラＣ１ｑ核酸分子は、内因性Ｃ１ｑ遺伝子のヌクレオチド配列をその内因性遺伝子座で、同族ヒトＣ１ｑ遺伝子のヌクレオチド配列と置換することから生じ得る。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、内因性Ｃ１ｑ遺伝子座の非ヒトＣ１ｑ遺伝子の連続ゲノム配列は、同族ヒトＣ１ｑ遺伝子の連続ゲノム配列と置換され、キメラ型のヒト化Ｃ１ｑ遺伝子が形成される。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、内因性非ヒトＣ１ｑ遺伝子に挿入されたヒトＣ１ｑ遺伝子の連続ゲノム配列は、ヒトＣ１ｑ遺伝子のエクソン３の一部分を含み、その結果、結果としてのキメラ型のヒト化Ｃ１ｑ遺伝子が、実質的にヒトである球状頭部ドメインを含むキメラＣ１ｑポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、内因性非ヒトＣ１ｑ遺伝子に挿入されたヒトＣ１ｑ遺伝子の連続ゲノム配列は、実質的に球状頭部ドメインヒトＣ１ｑポリペプチドをコードするヒトＣ１ｑ遺伝子のエクソン３の一部分を含む。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、ヒト化後に内因性遺伝子座に残留し、挿入された連続ヒトＣ１ｑゲノム配列に動作可能に連結された内因性Ｃ１ｑ遺伝子のゲノム配列は、エクソン２の３’部分と、エクソン３の５’部分とを含み、かつ内因性Ｃ１ｑポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域を実質的にコードする。
【０１６０】
非ヒトＣ１ｑポリペプチドおよび同族ヒトＣ１ｑポリペプチドが、葉柄茎領域と球状頭部ドメインとの間の接合部近くで共通アミノ酸を共有する状況では、ヒトＣ１ｑポリペプチドの球状頭部ドメインを正確にコードするヒトＣ１ｑ核酸を挿入する必要はない場合がある。キメラＣ１ｑポリペプチドが、ヒトＣ１ｑポリペプチドの球状頭部ドメインと実質的にまたは完全に同一である球状頭部ドメイン、および非ヒトＣ１ｑポリペプチドの葉柄茎領域と実質的に、または完全に同一である葉柄茎領域を含むように、非ヒト動物Ｃ１ｑポリペプチドの葉柄茎領域を実質的にコードする核酸に動作可能に連結して、ヒトＣ１ｑポリペプチドの球状頭部ドメインを実質的にコードするヒトＣ１ｑ遺伝子の、わずかに長いまたは短い核酸を挿入することができる。同様に、非ヒトＣ１ｑポリペプチドおよびヒトＣ１ｑポリペプチドが、球状頭部ドメインのＣ末端の近くで共通アミノ酸を共有する状況では、ヒトＣ１ｑポリペプチドの球状頭部ドメインを正確にコードするヒトＣ１ｑ核酸を利用する必要はない場合がある。キメラＣ１ｑポリペプチドが、ヒトＣ１ｑポリペプチドの球状頭部ドメインと、さらに実質的にまたは完全に同一である球状頭部ドメインを含むように、球状頭部ドメインのＣ末端で、残りのアミノ酸をコードする非ヒト核酸に動作可能に連結して、ヒトＣ１ｑポリペプチドの球状頭部ドメインを実質的にコードする（すなわち当該球状頭部ドメインよりわずかに短い）、ヒトＣ１ｑ遺伝子のわずかに短い核酸を挿入することができる。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、ヒト化キメラＣ１ｑ遺伝子に含まれるヒトＣ１ｑヌクレオチド配列はまた、ヒトＣ１ｑ遺伝子の３’非翻訳領域（「ＵＴＲ」）も含み、これはすべてのＣ１ｑ遺伝子（すなわち、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂおよびＣ１ｑｃ遺伝子）におけるエクソン３の最後の部分である。ある実施形態では、ヒトＣ１ｑ遺伝子の３’ＵＴＲに加えて、ヒトＣ１ｑ遺伝子遺伝子座由来の追加のヒトゲノム配列もまた含有され得る。当該追加のヒトゲノム配列は、ヒトＣ１ｑ遺伝子の３’ＵＴＲのすぐ下流のヒトＣ１ｑ遺伝子遺伝子座中に存在する少なくとも１０〜２００ｂｐ、たとえば５０ｂｐ、７５ｂｐ、１００ｂｐ、１２５ｂｐ、１５０ｂｐ、１７５ｂｐ、２００ｂｐまたはそれ以上からなる場合もある。他の実施形態では、ヒト化Ｃ１ｑ遺伝子中に含まれるヒトＣ１ｑヌクレオチド配列は、ヒトＣ１ｑ遺伝子の３’ＵＴＲを含有しない。そのかわりに、内因性Ｃ１ｑ遺伝子の３’ＵＴＲが含有され、これがヒト化Ｃ１ｑ遺伝子の終止コドンのすぐ後に続く。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、ヒト化キメラＣ１ｑ遺伝子（例えば、ヒト化後の内因性遺伝子座に残留する内因性ゲノムＣ１ｑ配列）に含まれる内因性非ヒトＣ１ｑ核酸配列が、内因性Ｃ１ｑ遺伝子の５’ＵＴＲを含む（エクソン１およびほとんどの場合はエクソン２の５’部分を含みうる）。いくつかの実施形態では、ヒト化キメラＣ１ｑ遺伝子に含まれる内因性非ヒトＣ１ｑヌクレオチド配列は、内因性Ｃ１ｑポリペプチドのシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、エクソン２の５’部分）を含む。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される非ヒト動物は、そのゲノムにおいて、ヒト化Ｃ１ｑ遺伝子に対しヘテロ接合性である。他の実施形態では、本明細書に提供される非ヒト動物は、そのゲノムにおいて、ヒト化Ｃ１ｑ遺伝子に対しホモ接合性である。
【０１６４】
特定の実施形態では、非ヒト動物は、複数の、すなわち２つ以上の、キメラＣ１ｑ遺伝子を、そのゲノム中のそれぞれ内因性Ｃ１ｑ遺伝子座または異なる遺伝子座に含む。いくつかの実施形態では、複数のキメラＣ１ｑ遺伝子は、非内因性Ｃ１ｑ遺伝子座で連続する核酸断片上にある。いくつかの実施形態では、複数のキメラＣ１ｑ遺伝子はそれぞれ、その内因性Ｃ１ｑ遺伝子座にある。例えば、非ヒト動物における２つまたは３つすべての内因性Ｃ１ｑ遺伝子（Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂおよびＣ１ｑｃ）は、同族ヒトＣ１ｑ遺伝子のヌクレオチド配列を使用してヒト化されている。
【０１６５】
提供されるさまざまな実施形態で、遺伝子改変非ヒト動物は、キメラ非ヒト／ヒトＣ１ｑ核酸分子によってコードされるポリペプチドを発現する。したがって、遺伝子改変非ヒト動物が本明細書に開示され、ここにおいて、非ヒト動物が、１つ以上のキメラ非ヒト／ヒトＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃポリペプチドを発現する。このような態様では、遺伝子改変非ヒト動物は、１個、２個、３個、４個、５個、または６個のキメラ非ヒト／ヒトＣ１ｑａポリペプチド、１個、２個、３個、４個、５個、または６個のキメラ非ヒト／ヒトＣ１ｑｂポリペプチド、および／または１個、２個、３個、４個、５個、または６個のキメラ非ヒト／ヒトＣ１ｑｃポリペプチドを発現することができる。様々な実施形態では、発現されたキメラＣ１ｑポリペプチドは機能的なＣ１ｑポリペプチドである。様々な実施形態では、本明細書に提供されるＣ１ｑポリペプチドは、典型的なＣ１ｑブーケ構造に配列し、１８個のポリペプチド鎖を含む機能的なＣ１ｑタンパク質を形成する。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、機能的な内因性Ｃ１ｑポリペプチド（例えば、内因性Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、またはＣ１ｑｃポリペプチド）を発現しない。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、機能的な内因性Ｃ１ｑａポリペプチド、機能的な内因性Ｃ１ｑｂポリペプチド、または機能的な内因性Ｃ１ｑｃポリペプチドを発現しない。機能的な内因性Ｃ１ｑポリペプチドの発現の欠如は、内因性Ｃ１ｑ遺伝子の不活性化、欠失、および／またはヒト化の結果とすることができる。
【０１６７】
いくつかの態様では、非ヒト動物は、ヒトＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃポリペプチドの球状頭部ドメインを含む１つ以上のキメラＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃポリペプチドを発現する。いくつかの態様では、非ヒト動物は、配列番号４に記載されたヒトＣ１ｑａの球状頭部ドメイン、またはその断片（例えば、配列番号４に記載されるアミノ酸１１２〜２４５、１２２〜２３５、または１２２〜２２２など）を含む、キメラＣ１ｑａポリペプチドを発現する。いくつかの態様では、非ヒト動物は、配列番号５に記載されたヒトＣ１ｑｂの球状頭部ドメイン、またはその断片（例えば、配列番号５に記載されるアミノ酸１１８〜２５１、１２０〜２５１、または１２５〜２３３など）を含む、キメラＣ１ｑｂポリペプチドを発現する。いくつかの態様では、非ヒト動物は、配列番号６に記載されたヒトＣ１ｑｃの球状頭部ドメイン、またはその断片（例えば、配列番号６で表されるアミノ酸１１８〜２３４またはアミノ酸１１４〜２４５など）を含む、キメラＣ１ｑｃポリペプチドを発現する。いくつかの態様では、非ヒト動物は、配列番号１０、または５５に記述されるキメラＣ１ｑａ、配列番号１１または５６に記述されるＣ１ｑｂ、および／または配列番号１２または５７に記述されるＣ１ｑｃポリペプチドを発現する。
【０１６８】
一態様では、開示された遺伝子改変非ヒト動物が、非ヒトアミノ酸配列およびヒトアミノ酸配列を含むＣ１ｑポリペプチドをコードする核酸を含むことが理解され、本明細書では意図されている。キメラＣ１ｑの球状頭部ドメインの全てまたは一部は、ヒトアミノ酸配列から成ることがさらに理解される。一態様では、遺伝子改変非ヒト動物（例えば、マウスまたはラットなどの齧歯類など）が本明細書に開示され、ここにおいて、ヒトＣ１ｑａポリペプチドの球状頭部またはその断片をコードする核酸配列は、少なくとも、配列番号４に記載されるヒトＣ１ｑａポリペプチドのアミノ酸１２２〜２２２をコードする（例えば、配列番号４に記載されるヒトＣ１ｑａポリペプチドのアミノ酸１２２〜２３５、または１１２〜２４５をコードする核酸配列）。一態様では、遺伝子改変非ヒト動物はラットであり、ヒトＣ１ｑａポリペプチドの球状頭部ドメイン、またはその断片をコードする核酸配列に動作可能に連結して、少なくとも、配列番号７に記載されたラットＣ１ｑａポリペプチドのアミノ酸３３〜１０２、３０〜１０２、２５〜１０５、２３〜１０７、または２３〜１１１をコードするヌクレオチド配列を、さらに含み、あるいは遺伝子改変非ヒト動物はマウスであり、ヒトＣ１ｑａポリペプチドの球状頭部ドメイン、またはその断片をコードする核酸配列に動作可能に連結して、少なくとも、配列番号１に記載されたマウスＣ１ｑａポリペプチドのアミノ酸３３〜１０２、３０〜１０２、２５〜１０５、２３〜１０７、または２３〜１１１をコードするヌクレオチド配列を、さらに含む。一態様では、遺伝子改変非ヒト動物は、少なくとも、配列番号１０または配列番号５５に記載されるＣ１ｑａポリペプチドのアミノ酸２３〜２４５をコードする１つ以上の核酸配列を含む。  特定の態様では、遺伝子改変非ヒト動物（例えば、マウスまたはラットなどの齧歯類）が本明細書に開示され、ここにおいて、非ヒト動物は、配列番号１０または配列番号５５に記載されるＣ１ｑａポリペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、配列番号１０に記載されるＣ１ｑａポリペプチドをコードする核酸を含むマウスである。いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、配列番号５５に記載されるＣ１ｑａポリペプチドをコードする核酸を含むラットである。
【０１６９】
別の態様では、遺伝子改変非ヒト動物（例えば、マウスまたはラットなどの齧歯類など）が本明細書に開示され、ここにおいて、ヒトＣ１ｑｂポリペプチドの球状頭部またはその断片をコードする核酸配列は、少なくとも、配列番号５に記載されるヒトＣ１ｑｂポリペプチドのアミノ酸１２５〜２３３をコードする（例えば、ヒトＣ１ｑｂポリペプチドのアミノ酸１２０〜２５０、または１１８〜２５１をコードする核酸配列）。
【０１７０】
また、遺伝子改変非ヒト動物（例えば、マウスまたはラットなどの齧歯類など）が本明細書に開示され、ここにおいて、遺伝子改変非ヒト動物はラットであり、ヒトＣ１ｑｂポリペプチドの球状頭部ドメイン、またはその断片をコードする核酸配列に動作可能に連結して、少なくとも、配列番号８に記載されたラットＣ１ｑｂポリペプチドのアミノ酸３２〜１０５、２７〜１０５、２７〜１１０、２６〜１１４、または２６〜１１７をコードするヌクレオチド配列を含み、あるいは遺伝子改変非ヒト動物はマウスであり、ヒトＣ１ｑｂポリペプチドの球状頭部ドメイン、またはその断片をコードする核酸配列に動作可能に連結して、少なくとも、配列番号２に記載されたマウスＣ１ｑｂポリペプチドのアミノ酸３２〜１０５、２７〜１０５、２７〜１１０、２６〜１１４、または２６〜１１７をコードするヌクレオチド配列を、さらに含む。
【０１７１】
一態様では、遺伝子改変非ヒト動物は、少なくとも、配列番号１１または配列番号５６に記載されるＣ１ｑｂポリペプチドのアミノ酸２６〜２５１をコードする１つ以上の核酸配列を含む。特定の態様では、遺伝子改変非ヒト動物（例えば、マウスまたはラットなどの齧歯類）が本明細書に開示され、ここにおいて、非ヒト動物は、配列番号１１または配列番号５６に記載されるＣ１ｑｂポリペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、配列番号１１に記載されるＣ１ｑｂポリペプチドをコードする核酸を含むマウスである。いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、配列番号５６に記載されるＣ１ｑｂポリペプチドをコードする核酸を含むラットである。
【０１７２】
一態様では、遺伝子改変非ヒト動物（例えば、マウスまたはラットなどの齧歯類など）が核酸を含み、ここにおいて、ヒトＣ１ｑｃポリペプチドの球状頭部またはその断片をコードする核酸配列は、少なくとも、配列番号６に記載されるヒトＣ１ｑｃポリペプチドのアミノ酸１１８〜２３４をコードする（例えば、ヒトＣ１ｑｃポリペプチドのアミノ酸１１４〜２４５をコードする核酸配列）。
【０１７３】
また、遺伝子改変非ヒト動物（例えば、マウスまたはラットなどの齧歯類など）が本明細書に開示され、ここにおいて、非ヒト動物はラットであり、ヒトＣ１ｑｃポリペプチドの球状頭部ドメイン、またはその断片をコードする核酸配列に動作可能に連結して、少なくとも、配列番号９に記載されたラットＣ１ｑｃポリペプチドのアミノ酸３３〜１１３、３２〜１１５、または３２〜１１６をコードするヌクレオチド配列をさらに含み、あるいはここにおいて、非ヒト動物はマウスであり、ヒトＣ１ｑｃポリペプチドの球状頭部ドメイン、またはその断片をコードする核酸配列に動作可能に連結して、少なくとも、配列番号３に記載されたマウスＣ１ｑｃポリペプチドのアミノ酸３１〜１１１、３０〜１１３、または３０〜１１４をコードするヌクレオチド配列を、さらに含む。
【０１７４】
一態様では、遺伝子改変非ヒト動物は、少なくとも、配列番号１２に記載されるＣ１ｑｃポリペプチドのアミノ酸３０〜２４６をコードする１つ以上の核酸配列、または配列番号５７に記載されるＣ１ｑｃポリペプチドのアミノ酸３２〜２４８をコードする１つ以上の核酸配列を含む。特定の態様では、遺伝子改変非ヒト動物（例えば、マウスまたはラットなどの齧歯類）が本明細書に開示され、ここにおいて、非ヒト動物は、配列番号１２または配列番号５７に記載されるＣ１ｑｃポリペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、配列番号１２に記載されるＣ１ｑｃポリペプチドをコードする核酸を含むマウスである。いくつかの実施形態では、遺伝子改変非ヒト動物は、配列番号５７に記載されるＣ１ｑｂポリペプチドをコードする核酸を含むラットである。
【０１７５】
いくつかの態様では、存在するべきシグナル配列のためのポリペプチドの発現が有益である。開示されたポリペプチド、および前述のポリペプチドをコードする開示された核酸は、シグナル配列を含むことも、またはシグナル配列を含まないこともできる。したがって、一態様では、遺伝子改変非ヒト動物（例えば、マウスまたはラットなどの齧歯類など）が本明細書に開示され、ここにおいて、非ヒト動物は、動作可能な連結で、ラット、マウスあるいはヒトＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を、さらに含む。ラット、マウス、ならびにヒトＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、およびＣ１ｑｃポリペプチドからのシグナルペプチドの例を図３Ａ〜３Ｃに示す。例えば、シグナルペプチドがコードする、ラットまたはマウスＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃ遺伝子の部分と、少なくとも、それぞれヒトＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃポリペプチドの球状頭部ドメインまたはその断片をコードする核酸配列とを含む、核酸配列を、動作可能な連結で含む非ヒト動物が、本明細書に開示される。
【０１７６】
一態様では、遺伝子改変非ヒト動物（例えば、マウスまたはラットなどの齧歯類など）が本明細書に開示され、当該遺伝子改変非ヒト動物は、そのゲノム内に、ａ）内因性Ｃ１ｑａ遺伝子座で、キメララット／ヒトＣ１ｑａポリペプチドをコードする核酸配列を含み、ここにおいて核酸配列が、５’−３’、ならびに動作可能な連結において、配列番号７のラットＣ１ｑａポリペプチドのアミノ酸１〜１１１をコードする第一ヌクレオチド配列、および配列番号４のヒトＣ１ｑａポリペプチドのアミノ酸１１２〜２４５をコードする第二ヌクレオチド配列を含み、ｂ）内因性Ｃ１ｑｂ遺伝子座で、キメララット／ヒトＣ１ｑｂポリペプチドをコードする核酸配列を含み、ここにおいて核酸配列が、５’−３’、ならびに動作可能な連結において、配列番号８のラットＣ１ｑｂポリペプチドのアミノ酸１〜１１７をコードする第三ヌクレオチド配列、および配列番号５のヒトＣ１ｑｂポリペプチドのアミノ酸１１８〜２５１をコードする第４ヌクレオチド配列を含み、ｃ）内因性Ｃ１ｑｃ遺伝子座で、キメララット／ヒトＣ１ｑｃポリペプチドをコードする核酸配列を含み、ここにおいて核酸配列が、５’−３’、ならびに動作可能な連結において、配列番号９のラットＣ１ｑｃポリペプチドのアミノ酸１〜１１６をコードする第五ヌクレオチド配列、および配列番号６のヒトＣ１ｑｃポリペプチドのアミノ酸１１４〜２４５をコードする第六ヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、かかる遺伝子改変非ヒト動物はラットである。
【０１７７】
また、遺伝子改変非ヒト動物（例えば、マウスまたはラットなどの齧歯類など）が本明細書に開示され、当該遺伝子改変非ヒト動物は、そのゲノム内に、ａ）内因性Ｃ１ｑａ遺伝子座で、キメラマウス／ヒトＣ１ｑａポリペプチドをコードする核酸配列を含み、ここにおいて核酸配列が、５’−３’、ならびに動作可能な連結において、配列番号１のマウスＣ１ｑａポリペプチドのアミノ酸１〜１１１をコードする第一ヌクレオチド配列、および配列番号４のヒトＣ１ｑａポリペプチドのアミノ酸１１２〜２４５をコードする第二ヌクレオチド配列を含み、ｂ）内因性Ｃ１ｑｂ遺伝子座で、キメラマウス／ヒトＣ１ｑｂポリペプチドをコードする核酸配列を含み、ここにおいて核酸配列が、５’−３’、ならびに動作可能な連結において、配列番号２のマウスＣ１ｑｂポリペプチドのアミノ酸１〜１１７をコードする第三ヌクレオチド配列、および配列番号５のヒトＣ１ｑｂポリペプチドのアミノ酸１１８〜２５１をコードする第４ヌクレオチド配列を含み、ｃ）内因性Ｃ１ｑｃ遺伝子座で、キメラマウス／ヒトＣ１ｑｃポリペプチドをコードする核酸配列を含み、ここにおいて核酸配列が、５’−３’、ならびに動作可能な連結において、配列番号３のマウスＣ１ｑｃポリペプチドのアミノ酸１〜１１４をコードする第五ヌクレオチド配列、および配列番号６のヒトＣ１ｑｃポリペプチドのアミノ酸１１４〜２４５をコードする第六ヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、かかる遺伝子改変非ヒト動物はマウスである。
【０１７８】
一態様では、遺伝子改変非ヒト動物が本明細書に開示され、ここにおいて、非ヒト動物、例えばラットまたはマウスであって、機能的な内因性Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃポリペプチドを発現しない。
【０１７９】
一部の実施形態では、非ヒト動物は哺乳動物である。一態様では、非ヒト動物は、例えばトビネズミ上科またはネズミ上科の小さな哺乳動物である。一実施形態では、遺伝子改変動物は齧歯類である。一実施形態では、齧歯類は、マウス、ラット、およびハムスターから選択される。一実施形態では、齧歯類はネズミ上科から選択される。一実施形態では、遺伝子改変動物は、ヨルマウス科（例えば、マウス様のハムスター）、キヌゲネズミ科（例えば、ハムスター、Ｎｅｗ  Ｗｏｒｌｄラット及びマウス、ハタネズミ）、ネズミ科（純種のマウス及びラット、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ）、アシナガマウス科（キノボリマウス、ロックマウス、オジロラット、マダガスカルラット及びマウス）、トゲヤマネ科（例えば、トゲヤマネ）、及びメクラネズミ科（例えば、メクラネズミ、タケネズミ、及び高原モグラネズミ）から選択された科からのものである。特定の実施形態では、遺伝子改変齧歯類は、純種のマウスまたはラット（ネズミ科）、アレチネズミ、トゲマウス、およびタテガミネズミから選択される。一実施形態では、遺伝子改変マウスはネズミ科のメンバー由来のものである。一実施形態では、動物は齧歯類である。特定の実施形態では、齧歯類は、マウス、およびラットから選択される。一実施形態では、非ヒト動物はマウスである。
【０１８０】
一実施形態では、非ヒト動物は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、及びＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系のマウスである齧歯類である。別の実施形態では、マウスは１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９５１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２の系統からなる群から選択される１２９系統である（参照、例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｒｅｖｉｓｅｄ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｓｔｒａｉｎ  １２９  ｍｉｃｅ、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  １０：８３６、Ａｕｅｒｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  １２９／ＳｖＥｖ−ａｎｄ  Ｃ５７ＢＬ／６−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓも参照のこと）。特定の実施形態では、遺伝子改変マウスは、前述の１２９系統と前述のＣ５７ＢＬ／６系統との混合である。別の特定の実施形態では、マウスは前述の１２９系統の混合、または前述のＢＬ／６系統の混合である。特定の実施形態では、上記混合の１２９系統は１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。別の実施形態では、マウスはＢＡＬＢ系統、例えばＢＡＬＢ／ｃ系統、である。さらに別の実施形態では、マウスはＢＡＬＢ系統と別の前述の系統との混合である。
【０１８１】
一実施形態では、非ヒト動物はラットである。一実施形態では、ラットは、Ｗｉｓｔａｒラット、ＬＥＡ系統、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ系統、Ｆｉｓｃｈｅｒ系統、Ｆ３４４、Ｆ６、及びＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉから選択される。一実施形態では、ラット系統は、Ｗｉｓｔａｒ、ＬＥＡ、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｆ３４４、Ｆ６、及びＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉからなる群から選択される２つ以上の系統のミックスである。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される遺伝子操作された動物は、その血清中で１つ以上のキメラＣ１ｑポリペプチドを含むヒト化Ｃ１ｑタンパク質を発現する。特定の実施形態では、動物はその血清中で、それぞれが実質的にヒトである球状頭部ドメインを含む、キメラＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂおよびＣ１ｑｃポリペプチドから構成されるＣ１ｑタンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された動物の血清中のヒト化Ｃ１ｑタンパク質のレベルは、ヒト化を伴わない対照動物におけるＣ１ｑタンパク質のレベルに匹敵し、これはウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡなどの従来的アッセイのいずれかによって検出される。「匹敵する」によって、例えば１０％、２０％、３０％、または４０％の変動内のレベルおよび値を表すことを意味する。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、その血清中にヒト化Ｃ１ｑタンパク質を発現する遺伝子操作された動物は、補体活性を表示する。いくつかの実施形態では、下の実施例においてさらに図示されるように、補体活性は、古典的溶血アッセイによって検出可能である。特定の実施形態では、遺伝子操作された動物は、ヒト化を伴わない対照動物のレベルに匹敵するレベルでの、その血清中の古典的溶血活性を表示する。他の実施形態では、補体活性は、  インビトロ補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイにおいて検出可能である。特定の実施形態では、ヒト化Ｃ１ｑタンパク質を含む遺伝子操作された動物の血清は、通常のヒト血清のレベルに匹敵するレベルでＣＤＣ活性を表示する。
【０１８４】
さらなる態様では、本明細書に記載される遺伝子改変非ヒト動物を作製する方法が本明細書に提供される。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、方法は、改変ゲノムがヒト化Ｃ１ｑポリペプチド（すなわち、ヒト化Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃポリペプチド）をコードする核酸分子を含むように、非ヒト動物のゲノムを改変することを含む。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、改変ゲノムは、キメラＣ１ｑポリペプチドをコードする核酸を含み、ここにおいて、核酸は内因性Ｃ１ｑ遺伝子座とは異なる遺伝子座に位置する。特定の実施形態では、異なるヒト化Ｃ１ｑポリペプチドをコードする複数の核酸分子を含む連続核酸断片は、内因性Ｃ１ｑ遺伝子座とは異なる遺伝子座に位置する。例えば、ヒト化Ｃ１ｑａポリペプチドをコードする核酸配列と、ヒト化Ｃ１ｑｂポリペプチドをコードする核酸配列と、ヒト化Ｃ１ｑｃポリペプチドをコードする核酸配列とを含む連続核酸断片が、内因性Ｃ１ｑ遺伝子座とは異なる遺伝子座に位置する。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、改変ゲノムは、キメラＣ１ｑポリペプチドをコードする核酸を含み、ここにおいて、核酸は内因性Ｃ１ｑ遺伝子座に位置する。特定の実施形態では、ヒト化Ｃ１ｑａポリペプチドをコードする核酸配列と、ヒト化Ｃ１ｑｂポリペプチドをコードする核酸配列と、ヒト化Ｃ１ｑｃポリペプチドをコードする核酸配列とを含む連続核酸断片が、内因性Ｃ１ｑ遺伝子座に位置する。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、キメラＣ１ｑポリペプチドをコードする核酸を内因性Ｃ１ｑ遺伝子座に導入する改変は、内因性Ｃ１ｑヌクレオチド配列の、ヒトＣ１ｑヌクレオチド配列との置換をもたらす。一実施形態では、置換は、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、およびＣ１ｑｃの配列の置換を含む。
【０１８９】
ヒト化は、遺伝子改変、例えば、１つ、２つ、または３つすべてのＣ１ｑ遺伝子座における遺伝子改変、を組み込む大型標的化ベクターを作成することによって、および次に、非ヒト（例えば、マウス、またはラットなどの齧歯類）ＥＳ細胞内に、大型標的化ベクターを導入し、マウスなど、例えば実施例１に記載されるように、またはラットなど、例えば実施例２に記載されるように、の非ヒト動物を作製することによって、達成されうる。
【０１９０】
したがって、一実施形態では、本開示の遺伝子改変動物を作製するための大型標的化ベクターが、本明細書に提供される。例示的な実施形態では、大型標的化ベクターは、５’および３’マウス相同アーム、マウスＣ１ｑａコードエクソン３の部分配列を、ヒトＣ１ｑａコードエクソン３の部分配列と置換することを備えたＣ１ｑａ遺伝子を含むＤＮＡ断片、マウスＣ１ｑｂコードエクソン３の部分配列を、ヒトＣ１ｑｂコードエクソン３の部分配列と置換することを備えたＣ１ｑｂ遺伝子を含むＤＮＡ断片、マウスＣ１ｑｃコードエクソン３の部分配列を、ヒトＣ１ｑｃコードエクソン３の部分配列と置換することを備えたＣ１ｑｃ遺伝子を含むＤＮＡ断片、および選択カセットを含む。別の例示的な実施形態では、大型標的化ベクターは、５’および３’ラット相同アーム、ラットＣ１ｑａコードエクソン３の部分配列を、ヒトＣ１ｑａコードエクソン３の部分配列と置換することを備えたＣ１ｑａ遺伝子を含むＤＮＡ断片、ラットＣ１ｑｂコードエクソン３の部分配列を、ヒトＣ１ｑｂコードエクソン３の部分配列と置換することを備えたＣ１ｑｂ遺伝子を含むＤＮＡ断片、ラットＣ１ｑｃコードエクソン３の部分配列を、ヒトＣ１ｑｃコードエクソン３の部分配列と置換することを備えたＣ１ｑｃ遺伝子を含むＤＮＡ断片、および選択カセットを含む。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、大型標的化ベクターは、遺伝子改変細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンである。非ヒト（例えば、齧歯類）Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、およびＣ１ｑｃ遺伝子の１つ以上を担持するＢＡＣのクローンは、細菌相同組換えならびにＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）の技術を使用して改変、およびヒト化されることができる（たとえば、米国特許第６，５８６，２５１号およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３），Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（６）：６５２−６５９を参照のこと）。ＢＡＣのクローンが、複数の非ヒトＣ１ｑ遺伝子（例えば、非ヒトＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、およびＣ１ｑｃ遺伝子の組み合わせ）を含む実施形態では、複数の非ヒトＣ１ｑ遺伝子は、連続細菌相同組換えを介して順次改変されうる。結果として、非ヒトＣ１ｑヌクレオチド配列を、元のＢＡＣクローンから削除し、ヒトＣ１ｑヌクレオチド配列を挿入することで、５’および３’非ヒト相同アームに隣接された１つ以上のヒト化Ｃ１ｑ遺伝子を担持する改変ＢＡＣクローンが得られる。
【０１９２】
選択カセットは、対象の構築物を統合した細胞（例えば、細菌細胞、ＥＳ細胞）の選択を促進するために、標的化構築物に挿入されたヌクレオチド配列である。多数の適切な選択カセットは、当技術分野で公知である（Ｎｅｏ、Ｈｙｇ、Ｐｕｒ、ＣＭ、ＳＰＥＣ、など）。さらに、選択カセットは、組換え部位に隣接してもよく、これはリコンビナーゼ酵素で処理されると選択カセットの欠失を可能にする。一般的に使用される組換え部位は、それぞれＣｒｅおよびＦｌｐ酵素によって認識されるｌｏｘＰおよびＦｒｔであるが、他も当技術分野で知られている。選択カセットは、コード領域の外側の構築物のどこにでも位置してもよい。一実施形態では、選択カセットは、挿入されたヒトＣ１ｑａ配列の上流に挿入される。
【０１９３】
改変ＢＡＣクローンなどの大型標的化ベクターを、公知の技術、例えば、エレクトロポレーションにより、非ヒト（例えば、齧歯類）胚性幹（ＥＳ）細胞に導入することができる。マウスＥＳ細胞及びラットＥＳ細胞は共に当技術分野で説明されている。例えば、ＵＳ７，５７６，２５９、ＵＳ７，６５９，４４２、ＵＳ７，２９４，７５４、及びＵＳ２００８−００７８０００  Ａ１（これらの全てが参照により本明細書に組み込まれる）は、マウスＥＳ細胞及び遺伝子改変マウスを作製するＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法について記載しており、ＵＳ２０１４／０２３５９３３Ａ１及びＵＳ２０１４／０３１０８２８Ａ１、Ｔｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ  ４６７：２１１−２１５、およびＴｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．６（６）：ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１１．３３８（その全てが参照により本明細書に組み込まれる）は、ラットＥＳ細胞および遺伝子改変ラットを作製する方法を記載しているので参照のこと。いくつかの実施形態では、改変ＢＡＣクローンが導入される受容ＥＳ細胞は、内因性Ｃ１ｑ遺伝子座におけるヌクレオチド配列の欠失を含む。いくつかの実施形態では、欠失は、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂおよびＣ１ｑｃ遺伝子のうちの１つ以上のコード領域を含む。特定の実施形態では、欠失は、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂおよびＣ１ｑｃ遺伝子のすべてのコード領域を含み、例えば、Ｃ１ｑｂの終止コドンを通したＣ１ｑａの開始コドンを含む欠失を含む。いくつかの実施形態では、受容ＥＳ細胞は、内因性Ｃ１ｑ遺伝子座での欠失に対してヘテロ接合性である。他の実施形態では、受容ＥＳ細胞は、内因性Ｃ１ｑ遺伝子座での欠失に対してホモ接合性である。
【０１９４】
遺伝子標的化が完了したら、ＥＳ細胞または遺伝子改変非ヒト動物は、対象の外因性ヌクレオチド配列の組み込み、または外因性ポリペプチドの発現が成功したかを確認するためにスクリーニングされる。多数の技術が、当業者には公知であり、（限定されないが、）サザンブロッティング、ロングＰＣＲ、定量的  ＰＣＲ（例えば、ＴＡＱＭＡＮＴＭを使用するリアルタイムＰＣＲなど）、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング、フローサイトメトリー、ウェスタン分析、免疫細胞化学、免疫組織化学などが挙げられる。一例では、対象の遺伝子改変を持つ非ヒト動物（例えば、マウス）は、Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（６）：６５２−６５９に記載された対立遺伝子アッセイの改変を使用して、マウス対立遺伝子の喪失および／またはヒト対立遺伝子の獲得に対するスクリーニングによって特定されうる。遺伝子改変動物内の特定ヌクレオチドまたはアミノ酸配列を特定する他のアッセイは、当業者に公知である。次いで選択されたＥＳ細胞を、ドナーＥＳ細胞として、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法（例えば、ＵＳ７，５７６，２５９、ＵＳ７，６５９，４４２、ＵＳ７，２９４，７５４、及びＵＳ２００８−００７８０００Ａ１を参照）、またはＵＳ２０１４／０２３５９３３Ａ１及びＵＳ２０１４／０３１０８２８Ａ１に記載の方法を使用することにより、桑実期以前の胚（例えば、８細胞期胚）への注入に使用する。ドナーＥＳ細胞を含む胚は胚盤胞期までインキュベートし、次に代理母に移植して、Ｆ０齧歯類を産生する。ヒト化Ｃ１ｑ遺伝子を保有する仔は、非ヒト対立遺伝子の喪失および／またはヒト対立遺伝子の獲得のアッセイを使用した、尾部断片から単離されたＤＮＡの遺伝子型決定により特定することができる。ヒト化Ｃ１ｑ遺伝子に対してヘテロ接合性の非ヒト動物を交配させて、ホモ接合性のオファースプリング（ｏｆｆｅｒｓｐｒｉｎｇｓ）を生成することができる。
【０１９５】
一態様では、本明細書に記載される、単一細胞において、ヌクレオチド構築物からキメラＣ１ｑタンパク質を発現することを含む、キメラヒト／非ヒトＣ１ｑ分子を作製する方法が提供される。一実施形態では、ヌクレオチド構築物はウイルスベクターであり、特定の実施形態では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。一実施形態では、細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、ＨｅＬａ、およびウイルス核酸配列を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲＣ．６ＴＭ細胞）から選択される。
【０１９６】
一態様では、キメラヒト／非ヒトＣ１ｑタンパク質を発現する細胞が提供される。一実施形態では、細胞は、本明細書に記載されるキメラＣ１ｑ配列を含む発現ベクターを含む。一実施形態では、細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、ＨｅＬａ、およびウイルス核酸配列を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲＣ．６ＴＭ細胞）から選択される。
【０１９７】
本明細書に記載される非ヒト動物によって作製されるキメラＣ１ｑ分子も提供されており、ここにおいて、一実施形態では、キメラＣ１ｑ分子が、ヒトＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃポリペプチドの球状頭部ドメインの全て、あるいは実質的に全てのアミノ酸配列と、少なくとも、非ヒトＣ１ｑタンパク質、例えばマウスＣ１ｑタンパク質からの茎および／または葉柄ドメインとを含む。
【０１９８】
遺伝子操作された非ヒト動物に加えて、非ヒト胚（例えば、齧歯類、例えば、マウスまたはラット胚）も提供されており、ここにおいて、胚が、本明細書で上述のように作製されるか、または本明細書に記載されるように、非ヒト動物（例えば、齧歯類、例えばマウスまたはラット）に由来する、ドナーＥＳ細胞を含む。一態様では、胚はキメラＣ１ｑ遺伝子を含むＥＳドナー細胞および宿主胚細胞を含む。
【０１９９】
組織もまた提供され、ここにおいて、組織は、本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、齧歯類、例えば、マウスまたはラット）に由来し、キメラＣ１ｑタンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、組織が血液、血漿、血清、骨髄、脾臓、リンパ節、脳およびそれらの組み合わせから選択される。
【０２００】
さらに、本明細書に記載される非ヒト動物から単離された非ヒト細胞が提供される。一実施形態では、細胞はＥＳ細胞である。一実施形態では、細胞は樹状細胞である。
Ｆ．ヒト療法試験のための齧歯類モデル
【０２０１】
Ｃ１ｑ分子は、一方のヒトＣ１ｑを結合するアームと、他方の対象抗原を結合するアームとを伴う、二重特異性薬剤、例えば、二特異性抗体の標的として研究される。
【０２０２】
前臨床薬剤開発段階の間、候補薬剤は通常、その有効性、毒性、およびその他の薬物動態的特性、および薬力学的特性に基づいて研究される。抗体などの候補薬剤は、典型的にはヒト抗原を標的とするが、これは研究の最終的なゴールがヒト療法を開発することだからである。多くの前臨床研究は、生理学的および薬物代謝がヒトに酷似しているため、霊長類などの大きな動物で行われる。薬剤候補の有効性、毒性、およびその他のパラメータに関連する効果的な前臨床調査を実施するために、薬剤候補はまず、霊長類Ｃ１ｑ分子を認識するために決定されなければならない。
【０２０３】
しかしながら、抗Ｃ１ｑ療法の開発を複雑にする別個の因子は、チンパンジーなどの大きな霊長類が危険にさらされており、また多くの国々ではチンパンジーにおける研究は禁止され、一方、その他の霊長類、例えば、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）での研究は倫理的懸念を提起しうるということである。したがって、齧歯類、例えば、マウスなどの、より小さな動物モデルで得られる特定の治療候補に対する任意の予備的データは、大きな霊長類における前臨床調査のさらなる進行の決定に役立ち得る。
【０２０４】
予備的研究を行うための最も有用な小さな動物モデルは、ヒトまたはヒト化Ｃ１ｑタンパク質を発現し、例えば腫瘍抗原、ウイルス抗原、または細菌抗原（例えば、ブドウ球菌抗原など）もまた標的とする抗Ｃ１ｑ薬剤候補の試験を可能にする、非ヒト動物、例えば齧歯類である。
【０２０５】
したがって、いくつかの態様では、Ｃ１ｑ標的（「抗Ｃ１ｑ」）治療薬を試験するための齧歯類モデル（例えば、マウスまたはラットモデルなど）が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、抗Ｃ１ｑ抗原結合タンパク質を試験するための齧歯類モデル（例えば、マウスまたはラットモデルなど）が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、抗Ｃ１ｑ抗原を試験するための齧歯類モデル（例えば、マウスまたはラットモデルなど）が本明細書に提供される。いくつかのこうした実施形態では、抗Ｃ１ｑ多特異性、例えば、二重特異性、抗原結合タンパク質または抗Ｃ１ｑ二重特異性抗体を試験するための齧歯類モデルが提供される。そのため、抗Ｃ１ｑ多特異性抗原結合タンパク質、例えば、抗Ｃ１ｑ二重特異性抗原結合タンパク質は、前述のヒト化Ｃ１ｑポリペプチド、またはヒト化Ｃ１ｑ複合体、および少なくとも１つの他の対象抗原を、標的化するか、または特異的に結合する。様々な態様では、抗Ｃ１ｑ二重特異性抗原結合タンパク質を試験するための齧歯類モデルであって、ここにおいて、抗原結合タンパク質が、（ヒト化されている複合体の、１つ以上のＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｂポリペプチドを有する）ヒト化Ｃ１ｑ複合体と、対象抗原との両方を結合することができる、抗Ｃ１ｑ二重特異性抗原結合タンパク質を試験するための齧歯類モデルが、ヒト化Ｃ１ｑ複合体をコードする核酸配列であって、ここにおいて、ヒト化Ｃ１ｑポリペプチドが、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、Ｃ１ｑｃ、および／またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、ヒト化Ｃ１ｑ複合体をコードする核酸配列と、対象抗原を発現するまたは含む細胞と、を含む。一実施形態では、齧歯類は前述のヒト化Ｃ１ｑタンパク質を発現する樹状細胞を含む。
【０２０６】
用語「生殖細胞系」は、イムノグロブリン核酸配列に関連し、子孫に引き継ぐことができる核酸配列を含む。
【０２０７】
「イムノグロブリン分子」という語句は、２つのイムノグロブリン重鎖および２つのイムノグロブリン軽鎖を含む。重鎖は同一であっても異なってもよく、軽鎖は同一であっても異なっていてもよい。
【０２０８】
「抗原結合タンパク質」という用語は本明細書において使用される場合、対象抗原を結合することができる抗体および様々な天然生成された分子および操作された分子を含む。これは例えば、ドメイン特異抗体、単一ドメイン抗体（例えば、ラクダ科の動物、及び魚類など由来の）、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ融合抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小モジュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、サメ可変ＩｇＮＡＲドメイン、Ｔ細胞受容体分子、およびＴ細胞受容体可変ドメインを含む分子、ならびにその断片などを含む。抗体結合タンパク質としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）Ｆｄ断片、（ｉｖ）Ｆｖ断片、（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂ断片、および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位、などの抗原結合断片もまた挙げられ得る。
【０２０９】
用語「抗体」には、本明細書で使用される場合、四つのポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合によって相互接続した二つの重（Ｈ）鎖と二つの軽（Ｌ）鎖とを含む、イムノグロブリン分子を含む。各重鎖は、重鎖可変ドメインおよび重鎖定常領域（ＣＨ）．）を含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の３つのドメインを含む。各軽鎖は、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常領域（ＣＬ）．）を含む。重鎖および軽鎖可変ドメインはさらに、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存的な領域に差し込まれている、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分化することができる。各重鎖および軽鎖可変ドメインは、三つのＣＤＲおよび四つのＦＲを含み、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、以下の順序で配列される。ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４（重鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３として省略されてもよく、軽鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３として省略されてもよい）。
【０２１０】
本明細書において使用される場合、「Ｃ１ｑを結合する抗体」または「抗Ｃ１ｑ抗体」は、２つのＣ１ｑサブユニット（例えば、Ｃ１ｑａ／Ｃ１ｑｂ、およびＣ１ｑｃ／Ｃ１ｑｃ二量体）の二量体複合体、ならびに二量体の三量体を特異的に認識する、単一のＣ１ｑサブユニット（例えば、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃ）、ならびに抗体およびその抗原結合断片を特異的に認識する、抗体およびその抗原結合断片を含む。抗体および抗原結合断片はまた、可溶性Ｃ１ｑおよび／またはＩｇＭまたはＩｇＧ結合型Ｃ１ｑに結合することができる。
【０２１１】
「高親和性」抗体、または抗原結合タンパク質という用語は、その標的エピトープに対して約１０−９Ｍ以下（例えば、約１ｘ１０−９Ｍ、１ｘ１０−１０Ｍ、１ｘ１０−１１Ｍ、または約１ｘ１０−１２Ｍ）のＫＤを有する抗体を指す。
【０２１２】
「二重特異性抗体」または「二重特異性抗原結合タンパク質」という語句には、２つのエピトープを選択的に結合することができる抗体または抗原結合タンパク質が含まれる。二重特異性抗体は一般的に、２つの異なる分子（例えば２つの異なる免疫原上の異なるエピトープ）上、または同一分子（例えば、同じ免疫原上の異なるエピトープ）上のいずれかで、各々が異なるエピトープ（例えば、異なる特異性を有する２つの重鎖）に結合する、２つのアーム含む。二重特異性抗体、または抗原結合タンパク質が２つの異なるエピトープ（第一のエピトープおよび第二のエピトープ）を選択的に結合することができる場合、第一のエピトープに対する第一の抗体の親和性は、一般的に、第二のエピトープに対する第一の抗体アームの親和性よりも少なくとも１桁から２桁、または３桁もしくは４桁、またはそれ以上低く、その逆もまた同様である。二重特異性抗体により特異的に結合されるエピトープは、同一の標的の上にも異なる標的の上にも（例えば、同一のタンパク質の上にも異なるタンパク質の上にも）あり得る。例示的な二重特異性抗体としては、Ｃ１ｑに特異的な第一の抗体アーム、及び対象抗原に特異的な第二の抗体アーム（例えば、感染因子の抗原）を有する二重特異性抗体が挙げられる。二重特異性抗体は、例えば、同一の免疫原の異なるエピトープを認識する重鎖を組み合わせることによって作製することができる。例えば、同一の免疫原の異なるエピトープを認識する重鎖可変配列をコードする核酸配列は、同一の、または異なる重鎖定常領域をコードする核酸配列に融合可能であり、こうした配列は、イムノグロブリン軽鎖を発現する細胞内で発現することができる。典型的な二特異性抗体は、２つの重鎖を有しており、その重鎖は各々、３つの重鎖ＣＤＲを有し、それに続けて（Ｎ末端からＣ末端方向に）ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを有している。また典型的な二特異性抗体は、イムノグロブリン軽鎖を有しており、そのイムノグロブリン軽鎖は、エピトープ結合特異性を付与しないが、各重鎖と会合可能であるか、または各重鎖と会合可能でありかつ重鎖エピトープ結合領域に結合するエピトープの１つ以上を結合させることができるか、または各重鎖と会合可能でありかつ重鎖の一方もしくは両方をエピトープの一方もしくは両方に結合させることができる。同様に、「多選択性抗体」という語句には、複数のエピトープ（例えば、２つ、３つ、４つのエピトープ）を選択的に結合することができる抗体が含まれる。
【０２１３】
「相補性決定領域」という文言または「ＣＤＲ」という用語には、生物体のイムノグロブリン遺伝子の核酸配列にコードされるアミノ酸配列が含まれ、該アミノ酸配列は通常（すなわち、野生型動物では）、イムノグロブリン分子の軽鎖または重鎖の可変領域中の２つのフレームワーク領域の間に存在する。ＣＤＲは、例えば生殖系列配列または再構成もしくは非再構成の配列によってコードされ、例えば、ナイーヴＢ細胞もしくは成熟Ｂ細胞によってコードされ得る。ＣＤＲは、体細胞変異され（例えば動物生殖細胞系でコードされた配列と異なり）、ヒト化され、および／または、アミノ酸置換、付加または欠失で改変され得る。一部の状況（例えばＣＤＲ３について）では、ＣＤＲは、二つ以上の配列（例えば生殖系列配列）によってコードでき、それらの配列は（例えば、再構成されていない核酸配列では）連続していないが、Ｂ細胞の核酸配列では、例えば、配列のスプライシングまたは接続（例えば、重鎖ＣＤＲ３を形成するためのＶ−Ｄ−Ｊ再構成）の結果として、連続している。
【０２１４】
「機能的断片」という語句には、発現されることができる、分泌されることができる、およびマイクロモル、ナノモル、またはピコモル単位でＫＤを有するエピトープに特異的に結合することができる抗体のような、抗原結合タンパク質の断片を含む。特定の認識には、少なくともマイクロモル単位、ナノモル単位、またはピコモル単位で、ＫＤを有することを含む。
【０２１５】
「イムノグロブリン重鎖」におけるような、語句「重鎖」には、任意の生物体由来のイムノグロブリン重鎖配列（イムノグロブリン重鎖定常領域配列など）が含まれる。別段の指定のない限り、重鎖可変ドメインは、三つの重鎖ＣＤＲと四つのＦＲ領域とを含む。重鎖の断片としては、ＣＤＲ、ＣＤＲおよびＦＲ、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。典型的な重鎖は、可変ドメインに続いて（Ｎ末端からＣ末端へ）、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを有する。重鎖の機能性断片には、エピトープを特異的に認識する（例えば、エピトープをマイクロモル濃度、ナノモル濃度、またはピコモル濃度範囲のＫＤで認識する）ことができ、発現できかつ細胞から分泌可能であり、少なくとも一つのＣＤＲを含む断片が含まれる。重鎖可変ドメインは、可変領域遺伝子配列によってコードされ、該遺伝子配列は、生殖細胞系に存在するＶＨセグメント、ＤＨセグメント、およびＪＨセグメントのレパートリー由来の、ＶＨセグメント、ＤＨセグメント、およびＪＨセグメントを含むのが一般的である。種々の生物体に関わるＶ重鎖セグメント、Ｄ重鎖セグメント、およびＪ重鎖セグメントの配列、位置、および学名は、ＩＭＧＴ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）（ＩＭＧＴデータベース）のウェブサイトで見つけることができる。
【０２１６】
「イムノグロブリン軽鎖」におけるような、語句「軽鎖」には、任意の生物体由来のイムノグロブリン軽鎖配列が含まれ、特別の規定がない限り、代替軽鎖のみならず、ヒトカッパ軽鎖およびヒトラムダ軽鎖、ならびにＶｐｒｅＢが含まれる。軽鎖可変ドメインは、典型的には、別段の規定がない限り、三つの軽鎖ＣＤＲおよび四つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。一般に、完全長軽鎖には、アミノ末端からカルボキシル末端の方向に、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含む可変ドメインと、軽鎖定常領域とが含まれる。軽鎖可変ドメインは、軽鎖可変領域遺伝子配列によってコードされ、概して、生殖細胞系に存在するＶセグメントおよびＪセグメントのレパートリーに由来するＶＬセグメントおよびＪＬセグメントを含む。種々の生物体に関わるＶ重鎖セグメント、Ｖ軽鎖セグメント、およびＪ軽鎖セグメントの配列、位置、および学名は、ＩＭＧＴ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）（ＩＭＧＴデータベース）のウェブサイトで見つけることができる。軽鎖としては、例えば、該軽鎖が含まれる抗原結合タンパク質（例えば、抗体）によって認識されるいずれのエピトープも選択的に結合しない軽鎖が挙げられる。軽鎖にはまた、該軽鎖が含まれる抗原結合タンパク質（例えば、抗体）に選択的に結合する一つ以上のエピトープを結合かつ認識しながら、重鎖を結合かつ認識、または補佐する軽鎖が含まれる。
【０２１７】
様々な実施形態では、抗原結合タンパク質はＣ１ｑと対象抗原との両方に結合する。
【０２１８】
別の実施形態では、齧歯類モデルは、候補二重特異性抗原結合タンパク質が、感染性疾患関連抗原である対象抗原を遮断する、またはそれに影響を与える能力があるかどうかを判定するために使用される。一実施形態では、齧歯類は感染因子に感染する。一実施形態では、感染性疾患関連抗原はウイルス抗原である。
【０２１９】
別の実施形態では、対象抗原は感染性疾患関連抗原であり、対象抗原は細菌抗原である。いくつかの態様では、細菌抗原はブドウ球菌抗原である。
【０２２０】
いくつかの態様では、Ｃ１ｑベースの二重特異性抗原結合タンパク質は、ヒトＣ１ｑベースの抗原結合タンパク質である。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、抗体、例えばヒト抗体、またはその抗原結合断片である。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、ヒトＣ１ｑを標的とする１つのアームと、感染性疾患関連抗原（例えば黄色ブドウ球菌）を標的とする別のアームとを用いた二重特異性抗体の試験が、そのＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂおよびＣ１ｑｃポリペプチド鎖の各々に、ヒトまたは実質的にヒト球状頭部ドメインを持つヒト化Ｃ１ｑを発現する、本明細書に開示される遺伝子操作された動物を使用して、インビボで行われる。動物は、感染性疾患関連抗原（例えば、  黄色ブドウ球菌）に感染することができ、および二重特異性抗体は、例えば、細菌の負荷量を減少させ、および／または生存を改善する能力において、そのような動物で評価することができる。
Ｇ．遺伝子改変非ヒト動物の使用
【０２２２】
さらに、本明細書に記載される遺伝子改変非ヒト動物を使用する様々な方法が開示されている。
【０２２３】
一実施形態では、（ａ）キメラ、ヒト化Ｃ１ｑａポリペプチド、Ｃ１ｑｂポリペプチド、および／またはＣ１ｑｃポリペプチド、および／または任意のそれらの組み合わせをコードする核酸配列を、その内因性齧歯類Ｃ１ｑ遺伝子座で含む、遺伝子改変齧歯類（例えばマウスまたはラット）を提供すること、あるいは受容すること、（ｂ）前述の遺伝子改変齧歯類の中に対象抗原を導入すること、（ｃ）前述の齧歯類を対象の薬剤候補と接触させることであって、ここにおいて、薬剤候補がヒトＣ１ｑ、および対象抗原に対して向けられる、接触させること、ならびに（ｄ）薬剤候補が、対象抗原の存在、または発現によって特徴づけられる細胞またはウイルスを予防する、低減する、あるいは除去するのに有効であるかどうかを分析すること、を含む、対象抗原を標的とする治療薬剤候補をスクリーニングする方法を、本明細書に提供する。さまざまな実施形態では、齧歯類は機能的なヒト化Ｃ１ｑ複合体を発現する。方法の一実施形態では、遺伝子改変齧歯類は、実質的にヒトである球状頭部ドメインを含むキメラＣ１ｑａポリペプチドと、実質的にヒトである球状頭部ドメインを含むキメラＣ１ｑｂポリペプチドと、実質的にヒトである球状頭部ドメインを含むキメラＣ１ｑｃポリペプチドと、をコードする核酸配列を、内因性齧歯類Ｃ１ｑ遺伝子座において含む。本明細書に記載される方法の一実施形態では、齧歯類は、対応する齧歯類タンパク質の機能的な球状頭部ドメインをコードする核酸配列を含まない。
【０２２４】
本明細書に記載される方法の様々な実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変齧歯類への対象抗原の導入は、当業者にとって公知の任意の方法によって達成されてもよく、これは、限定されないが、遺伝子導入、注射、感染、組織または細胞移植を含み得る。したがって、導入は、対象抗原を齧歯類に発現させることによって達成されうるが、これは、対象抗原を発現するために前述の齧歯類を遺伝子改変することを含むことができる。別の方法として、導入は、例えば、細胞または組織移植においてのように、前述の齧歯類に、対象抗原を発現する細胞を導入することを含みうる。導入は、例えば、細菌感染またはウイルス感染におけるように、対象抗原との前述の齧歯類の感染も含みうる。一実施形態では、対象抗原は、対象ヒト抗原であってもよい。別の実施形態では、それは対象の細菌またはウイルス抗原であってもよい。対象抗原は、詳細に上述されるように、腫瘍関連抗原または感染性疾患関連抗原、例えば、細菌またはウイルス抗原であってもよい。
【０２２５】
別の実施形態では、対象抗原を標的とする治療薬剤候補の評価する、またはスクリーニングする方法であって、対象抗原を発現する細胞またはウイルスと、（ｉ）対象の薬剤候補であって、ここにおいて薬剤候補がヒトＣ１ｑおよび対象抗原に対して向けられている、薬剤候補とを、および（ｉｉ）本明細書に記載される遺伝子改変齧歯類の血液サンプル（例えば、全血サンプル）とを、混合すること、ならびに、（ｂ）薬剤候補が、対象抗原の存在または発現によって特徴付けられる細胞またはウイルスの低減、または除去において有効であるか否かを判定するために分析すること、を含む、対象抗原を標的とする治療薬剤候補の評価する、またはスクリーニングする方法が、本明細書に提供される。判定は、例えば、対照薬剤と比較して、または薬剤が全くない場合と比較して、薬剤候補が使用される細胞またはウイルスの生存率の測定に基づいて行うことができる。対象抗原は、詳細に上述されるように、腫瘍関連抗原または感染性疾患関連抗原、例えば、細菌またはウイルス抗原であってもよい。いくつかの実施形態では、対象抗原は、ブドウ球菌抗原などの細菌抗原である。いくつかの実施形態では、細胞はブドウ球菌細胞などの細菌細胞である。
【０２２６】
治療薬剤候補をスクリーニングする方法の様々な実施形態では、薬剤候補は、抗原結合タンパク質、例えば、抗体、例えば、二重特異性抗体であってもよい。様々な態様では、かかる薬剤候補は、ヒトＣ１ｑと対象抗原との両方を結合する能力を有する。対象抗原はヒト抗原であってもよい。対象抗原はまた、霊長類、例えば、サル、抗原であってもよい。したがって、スクリーニングに使用される薬剤候補は、ヒトＣ１ｑを結合することに加えて、ヒト抗原および対応する霊長類抗原の両方を結合する能力を有してもよい。薬剤候補はまた、霊長類、例えばサル、Ｃ１ｑを結合する能力を有してもよい。したがって、薬剤候補は、ヒトおよび霊長類、例えばサル、Ｃ１ｑの両方を結合する能力を有し、およびまた、一実施形態では、対象ヒト抗原を結合する能力がある。別の実施形態では、対象抗原は細菌またはウイルス抗原であってもよく、薬剤候補は、ヒトおよび霊長類、例えばサル、Ｃ１ｑ、ならびに対象抗原（例えば、ウイルスまたは細菌抗原）の両方を結合する能力を有してもよい。
【０２２７】
本明細書に記載される方法の様々な実施形態では、治療候補は、疾患を低減、除去、または予防する能力を有する。一実施形態では、疾患は腫瘍であり、治療候補は、対象抗原を標的としない薬剤と比較して、腫瘍増殖を減少、除去、または予防する能力を有する。方法のこのような実施形態では、対象抗原の存在または発現によって特徴付けられる細胞の予防、低減、または除去において、薬剤候補が有効であるかどうかの判定は、腫瘍体積アッセイ、殺腫瘍細胞アッセイ、腫瘍へのアポトーシスマーカーの導入、腫瘍内の血管成長の減少、腫瘍への免疫細胞の浸潤などを使用して実施することができる。別の実施形態では、疾患は感染性疾患であり、治療候補は、対象抗原を標的としない薬剤と比較して、細菌またはウイルス感染を低減、除去、あるいは予防する能力を有する。方法のこのような実施形態では、対象抗原の存在または発現によって特徴付けられる細胞またはウイルスの予防、低減、または除去において、薬剤候補が有効であるかどうかの判定は、細菌またはウイルス力価の測定、感染された細胞へのアポトーシスマーカーの導入などを使用して、あるいは、血液サンプル（例えば、全血サンプル）を使用した細菌細胞またはウイルスの生存を測定することによって、実施されうる。
【０２２８】
ヒト化Ｃ１ｑタンパク質を標的とする１つのアームと、対象抗原を標的とするもう１つのアームとを用いた二重特異性抗体を評価することに加えて、本明細書に開示されるヒト化Ｃ１ｑタンパク質を発現する遺伝子操作された非ヒト動物が、ほかの抗体、例えば、ヒトＦｃ領域（ヒト抗体など）を有する一特異性抗体の効果を評価するために有用である。抗体のヒトＦｃ領域へのヒト化Ｃ１ｑの結合は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を引き起こす古典的補体経路を活性化することができる。抗体が受容体の補体系に対して効果を有するかどうか、または治療抗体の有効性が補体系の作用に起因するのかどうか、または治療抗体の有効性のうちどのくらいが補体系の作用に起因するのかの評価において困難があった。本明細書に開示されるヒト化Ｃ１ｑを発現する遺伝子操作された非ヒト動物は、ヒトＦｃ領域（例えば、ヒト抗体）を有する抗体が、古典的補体経路を活性化する能力があるかどうかを評価することを可能にし、このような評価の結果は、このような抗体がヒト患者に与えられた時に、古典的補体経路を活性化するかどうかをより正確に反映するであろう。
【０２２９】
従って、さらなる態様では、ヒトＦｃ領域を含む抗体が、本明細書に開示されるヒト化Ｃ１ｑタンパク質を発現する遺伝子操作された非ヒト動物（例えば、マウスまたはラットなどの齧歯類）を利用して古典的補体経路を活性化できるかどうかを評価する方法が本明細書に開示される。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、方法は、細胞表面上に対象抗原を発現する細胞と、ヒトＦｃ領域を含み、対象抗原に向けられた候補抗体と、ヒト化Ｃ１ｑタンパク質を発現する遺伝子操作された非ヒト動物からの血清サンプルとを利用し、かつ対象抗原を発現する細胞のインビトロでの補体依存性細胞傷害を評価するように設計される。特定の実施形態では、細胞は最初に候補抗体と混合され、抗体が、細胞表面上に発現される対象抗原に結合することを可能にし、次いで血清サンプルが細胞抗体混合物に追加され、細胞上の対象抗原に結合した抗体に、血清サンプル中のＣ１ｑタンパク質が結合されるようになる。細胞毒性（すなわち、前述の殺細胞）は次に、市販の供給源（例えば、ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｐｒｏｍｅｇａからの試薬）からのものを含む、容易に利用可能な試薬を使用して、フローサイトメトリー法、または標的細胞からの予め担持された放射性同位体の放出を使用して、測定できる。ヒト化Ｃ１ｑタンパク質を発現するヒト化非ヒト動物からの血清サンプルを使用する細胞毒性は、ヒト化（陰性対照）なしの対照非ヒト動物からの血清サンプル、およびヒト血清サンプル（陽性対照）を有する対照非ヒト動物からの血清サンプルと比較され得る。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、この方法での使用に適した細胞には、Ｒａｊｉ細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、およびＡ４３１細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、Ｒａｊｉ細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、またはＤａｕｄｉ細胞は、本方法で使用される。細胞は、細胞表面上に対象抗原を自然に発現することができ、または細胞表面上に対象抗原を組み換え発現するように改変することができる。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、候補抗体は、腫瘍抗原、細菌またはウイルス抗原などに対するヒト抗体である。候補抗体の例としては、例えば、抗ＣＤ２０などが挙げられる。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、ヒトＦｃ領域を含む抗体が古典的補体経路を活性化できるかどうかを評価する方法を、Ｃ１ｑヒト化動物における候補抗体の効果を、Ｃ１ｑノックアウト動物を用いて比較することによって、ｉｎ  ｖｉｖｏで実施することができる。効果がＡＤＣＣによるものであることを除外するために（ＣＤＣとは対照的に）、ＮＫ細胞、好中球、および動物のマクロファージが枯渇する可能性があり、補体系はインタクトである。
【実施例】
【０２３４】
以下の実施例は、本明細書に請求される化合物、組成物、物品、デバイス、および／または方法がどのようになされて評価されるのかに関して、当業者に完全な開示および説明を提供するように示されており、単に例示的であることを意図しており、本開示を限定することを意図していない。数字（例えば量、温度など）に関する正確性を確保するために取り組みがなされているが、いくらかの誤差および偏差が考慮されるべきである。特に明示がない限り、部分は重量部であり、温度は℃単位であるか、または周囲温度であり、圧力は大気圧またはその近傍である。
実施例１．ヒト化Ｃ１ｑマウスの生成
【０２３５】
Ｃ１ｑ遺伝子のマウスゲノム配列は、ＮＣＢＩ登録番号ＮＣ＿００００７０．６で見出すことができる、およびＣ１ｑ遺伝子座は、マウス染色体４Ｄ３に位置する（参照ＧＲＣｍ３８．ｐ４  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）。Ｃ１ｑ遺伝子のヒトゲノム配列は、ＮＣＢＩ登録番号ＮＧ＿００７２８１．１、ＮＧ＿００７２８３．１、およびＮＧ＿００７５６５．１で見出すことができる、およびＣ１ｑ遺伝子座は、ヒト染色体１ｐ３６．１に位置する。ヒトおよびマウスＣ１ｑのゲノムおよびアミノ酸配列のいくつかの例を、以下の表１および表２に列挙する。列挙された配列番号境界における予測されるシグナルペプチドが示されている。シグナルペプチド境界も図３Ａ〜３Ｃで囲まれている。
表１：マウスＣ１ｑ配列のＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号
【表１】
2020535815.tif 000002
表２：ヒトＣ１ｑ配列のＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号
【表２】
2020535815.tif 000003
【０２３６】
簡潔に述べると、キメラＣ１ｑマウスを生成するために、マウスＢＡＣライブラリーマウスＢＡＣ  ＥＳリリース２（Ｉｎｃｙｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１２９／ＳｖＪ  ｉｎ  ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１）を使用する、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）の技術を使用して（例えば、米国特許第６，５８６，２５１、およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｕｐｌｅ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（６）：６５２−６５９を参照、両方とも参照により本明細書に援用される）、マウスＣ１ｑ遺伝子座を、ヒトおよびマウス細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡからの一意の標的化ベクターの構築によりヒト化した。マウスＢＡＣクローン３０２ｐ２１からのＤＮＡは改変され、マウスＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、およびＣ１ｑｃ（マウスＣ１ｑ遺伝子は、マウスの染色体４の逆鎖上に互いに近接して位置する）の部分をコードするゲノムＤＮＡを、ヒトＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、およびＣ１ｑｃのそれぞれ対応する部分と置換した（ヒトＣ１ｑ遺伝子は、ヒト染色体１の前方鎖上で互いに近接して位置する）。
【０２３７】
マウスＣ１ｑ  ＢＡＣは、ヒトＣ１ｑ配列の導入によって改変され、ヒト化Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、およびＣ１ｑｃ遺伝子を含むＢＡＣを生成した。実質的にマウスＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、およびＣ１ｑｃ球状ドメインをコードする配列は、それぞれ、実質的にヒトＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、およびＣ１ｑｃ球状ドメインをコードする対応する配列と置換された。ヒトおよびマウスのＣ１ｑ（およびラット）タンパク質配列のアライメントは、図３Ａ、Ｂ、およびＣに示されており、ここで球状頭部の境界は示されており、マウス／ヒト遺伝子の境界は矢印で示されている。ヒト化マウスＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、およびＣ１ｑｃタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１０、１１、および１２で示されており、以下の表３に列挙され、マウス配列は斜体化されている。
表３：キメラマウス／ヒトＣ１ｑタンパク質のアミノ酸配列
【表３】
2020535815.tif 000004
実施例１．１  Ｃ１ｑノックアウトマウスの生成
【０２３８】
詳細には、第一に、３つのＣ１ｑ遺伝子すべてを含むマウスＣ１ｑ遺伝子座を改変し、マウスＣ１ｑをコードする遺伝子を含む１７．６ｋＢヌクレオチド配列を削除した（図１Ａ参照）。Ｃ１ｑａ  ＡＴＧからＣ１ｑｂ終止コドンまでの３つすべてのマウスＣ１ｑ遺伝子を含む１７．６Ｋｂのヌクレオチド配列が削除されるように、細菌性相同組換えにより、ＬａｃＺネオカセット、２０Ｋｂ  ５’相同アーム、および５５ｋｂの３’相同アームを含む標的化ベクターを、マウスＢＡＣ  ３０２ｐ２１に導入した。削除は、開始ＡＴＧ直後のＣ１ｑａエクソン２からＣ１ｑｂエクソン３を通り、１９  ｂｐを含む終止コドンを通過してＣ１ｑｂ  ３’ＵＴＲ内へと及んだ。カセットは、ＬａｃＺコード配列がＣ１ｑａ  ＡＴＧコドンとフレーム内にあるように挿入された。ＬａｃＺコード配列に続いてＳＶ４０ポリアデニル化部位が続き、次いで、Ｐｇｋ１ポリアデニル化シグナルを伴う、マウスホスホグリセレートキナーゼ１（Ｐｇｋ１）プロモーターの制御下のフロックス化（ｆｌｏｘｅｄ）されたネオマイシン抵抗性カセット。結果として生じたベクターを使用して、マウスＥＳ細胞をエレクトロポレーションし、内因性Ｃ１ｑ遺伝子座を欠くマウスを生成するために改変ＥＳ細胞を作製した。欠失された遺伝子座内のさまざまな接合部の配列は、図１Ｃの第二の概略図で標識され、対応する核酸配列は以下の表４に列挙されている。本実施例の表に示す接合部は、短いヌクレオチド配列のみを列挙するが、配列がマウスゲノムに挿入された場所に、当業者を向ける。
表４：マウスＣ１ｑノックアウト遺伝子座の接合部配列
【表４】
2020535815.tif 000005
【０２３９】
マウスＣ１ｑ配列の削除を含有するＥＳ細胞は、定量的ＴＡＱＭＡＮ（商標）アッセイ（例えば、Ｌｉｅ  ａｎｄ  Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ、１９９８．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：４３−４８を参照、参照により本明細書に組み込まれる）、対立遺伝子アッセイ（ＭＯＡ）の改変により特定された。特定のプライマーセットおよびプローブは、カセット配列の挿入（対立遺伝子の獲得、ＧＯＡ）、およびマウス配列の削除（対立遺伝子の喪失、ＬＯＡ）を検出するために設計された。表５は、定量的  ＰＣＲアッセイで使用されるプライマー／プローブセットのそれぞれの名称および場所を特定する。
表５：マウスＣ１ｑ遺伝子座の欠失を確認するためにＭＯＡアッセイで使用されるプライマーおよびプローブ
【表５−１】
2020535815.tif 000006
【表５−２】
2020535815.tif 000007
【０２４０】
上記の標的化ＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法により８つの細胞期のマウス胚に導入した（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号、およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｆ０  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｍｉｃｅ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｆｕｌｌｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｄｏｎｏｒ  ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ  ａｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｓ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１）：９１−９９を参照）。ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）（ドナーＥＳ細胞から完全に由来するＦ０マウス）が、マウスＣ１ｑ欠失を独立して有することが、マウスＣ１ｑ遺伝子配列が無いことを検出する対立遺伝子アッセイの改変（上記参照）を使用した遺伝子型判定によって識別された。欠失されたマウスＣ１ｑ遺伝子座（マウスＣ１ｑ  ＫＯ  ＨＥＴ  ＥＳ細胞）を含む改変マウスＥＳ細胞を、以下に記載されるヒト化Ｃ１ｑ構築に使用した。
【０２４１】
この方法で使用される選択カセットは、当業者によって公知の方法によって取り除かれてもよい。例えば、Ｃ１ｑノックアウト遺伝子座を有するＥＳ細胞は、フロックス化（ｆｌｏｘｅｄ）されたカセットを除去するためにＣｒｅを発現する構築物でトランスフェクトされてもよい。選択カセットは、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するマウスに交配させることによって任意選択的に除去されうる。任意選択的に、選択カセットをマウス内に保持する。
実施例１．２  ヒト化Ｃ１ｑマウスの生成
【０２４２】
ヒト化マウスＣ１ｑを生成するために、Ｃ１ｑ球状頭部ドメイン（以下の実施例においてヒト化Ｃ１ｑラットに使用される同じ配列）の配列、および重複マウス配列を使用して、Ｉｎ−ＦｕｓｉｏｎＨＤクローニングキット（商標）（クロンテック）によってドナープラスミドを生成した。Ｃ１ｑｂヒト化構築物については、ヒトＣ１ｑｂ  ｐｏｌｙＡ配列の下流に制限消化により、ｌｏｘＰ−Ｕｂ−Ｈｙｇ選択カセットを挿入した。Ｃ１ｑａおよびＣ１ｑｃ構築物の両方について、スペクチノマイシン（Ｓｐｅｃ）選択カセットを、各Ｃ１ｑａおよびＣ１ｑｃポリＡ配列の下流に制限消化により挿入した。得られた構築物を、細菌相同組換えによってマウスＣ１ｑ  ＢＡＣ（３０２ｐ２１）に逐次的に導入し、その後選択および／または消化工程が続き、図１Ｂに示す通り、選択カセットを除去した。この詳細な実施形態では、Ｃ１ｑｂのキメラ核酸配列を最初に導入し（図中の１）、次いで、キメラＣ１ｑｃ  ＤＮＡ（図中の２）を導入し、次いでキメラＣ１ｑａ  ＤＮＡ（図中の３）を導入した。
【０２４３】
３つのキメラＣ１ｑ遺伝子すべてを含有する大型標的化ベクターを、図１Ｃに示すマウスＣ１ｑ  ＫＯ  ＨＥＴ  ＥＳ細胞にエレクトロポレーションし、上述の対立遺伝子（ＭＯＡ）アッセイのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）リアルタイムＰＣＴに基づく改変によって統合が成功したことを確認した。ＭＯＡアッセイに使用されるプライマーおよびプローブ、ならびにそれらの位置を表６に記載する。
表６：キメラマウス／ヒトＣ１ｑ遺伝子の存在を確認するためにＭＯＡアッセイで使用されるプライマーおよびプローブ
【表６−１】
2020535815.tif 000008
【表６−２】
2020535815.tif 000009
【０２４４】
キメラ遺伝子座における様々な遺伝子操作された構成要素間の接合部配列を以下の表７に示し、図１Ｃの底部概略図上に示す。本実施例の表に示す接合部は、短いヌクレオチド配列のみを列挙するが、配列がマウスゲノムに挿入された場所に、当業者を向ける。
表７：キメラヒト／マウスＣ１ｑ遺伝子座の接合部配列
【表７−１】
2020535815.tif 000010
【表７−２】
2020535815.tif 000011
【０２４５】
上述の標的化されたＥＳ細胞は、ドナーＥＳ細胞として使用され、上述のＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法によって、８細胞期マウス胚に導入される。ＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）がヒト化Ｃ１ｑ遺伝子を独立して有することが、一意のヒトＣ１ｑ遺伝子配列の存在を検出する対立遺伝子アッセイの改変（上記参照）を用いた遺伝子型判定によって識別される。Ｃ１ｑ遺伝子のヘテロ接合性改変を含むマウスは、ホモ接合性に対して交配される。
【０２４６】
ハイグロマイシン耐性カセットを含まないＥＳ細胞を生成するために、ｃｒｅリコンビナーゼコード配列を含むプラスミドをマウスＣ１ｑ  ＫＯ  ＨＥＴ  ＥＳ細胞にエレクトロポレーションし、表６に図示したプライマーおよびプローブを使用してＴａｑＭａｎアッセイによりハイグロマイシン耐性カセットの喪失をスクリーニングした。次いで、選択されたクローンを上述のように８細胞期のマウス胚に顕微注入し、結果として生じたマウスをホモ接合性に対して交配させた。得られた発現されたキメラタンパク質を、上記表３および配列表に示す。
実施例２．  ヒト化Ｃ１ｑラットの生成
【０２４７】
Ｃ１ｑ遺伝子のラットゲノム配列は、ＮＣＢＩ登録番号ＮＣ＿００５１０４．４で見出すことができる、およびＣ１ｑ遺伝子座は、ラット染色体５に位置する（参照Ｒｎｏｒ＿６．０  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ）。Ｃ１ｑ遺伝子のヒトゲノム配列は、ＮＣＢＩ登録番号ＮＧ＿００７２８３．１、ＮＧ＿００７２８２．１、およびＮＧ＿００７５６５．１で見出すことができる、およびＣ１ｑ遺伝子座は、ヒト染色体１ｐ３６．１に位置する。ラットおよびヒトＣ１ｑのゲノムおよびアミノ酸配列のいくつかの例を、それぞれ、以下の表８および表２に列挙する。列挙された配列番号における予測されるシグナルペプチド境界が示されている。シグナルペプチド境界も図３Ａ〜３Ｃで囲まれている。
表８：ラットＣ１ｑ配列のＧｅｎｅＢａｎｋ登録番号
【表８】
2020535815.tif 000012
【０２４８】
キメラＣ１ｑラットを作製するために、簡潔に述べると、ラットＤａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉ  ＥＳ細胞から、ＬＵＣＩＧＥＮ（登録商標）によってリジェネロン社（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）のために生成されたラットＢＡＣライブラリーと、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／０３１０８２８に記載されるラット標的化技術とを使用して、ラットＣ１ｑ遺伝子座を、合成ヒト配列およびラット細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡからの一意の標的化ベクターの構築によりヒト化した。ＢＡＣ配列は、次世代シークエンシングのデータに基づいて確認および更新された。ラットＢＡＣ（ラットＣ１ｑ  ＢＡＣ、ＬＵＣＩＧＥＮ（登録商標））からのＤＮＡは改変され、ラットＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、およびＣ１ｑｃ（ラットＣ１ｑ遺伝子は、ラット染色体５の逆鎖上に互いに近接して位置する）の部分をコードするゲノムＤＮＡを、ヒトＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、およびＣ１ｑｃのそれぞれ対応する部分と置換した（ヒトＣ１ｑ遺伝子は、ヒト染色体１の前方鎖上で互いに近接して位置する）。
【０２４９】
インハウスで生成された、および上述のラットＣ１ｑ  ＢＡＣは、ヒトＣ１ｑ配列の導入によって改変され、ヒト化Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、およびＣ１ｑｃ遺伝子を含むベクターを生成した。ラットＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、およびＣ１ｑｃ球状ドメインの大部分をコードする配列は、それぞれ、ヒトＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、およびＣ１ｑｃの対応する配列と置換された。ヒトおよびラットのＣ１ｑ（およびマウス）タンパク質配列のアライメントは、図３Ａ、Ｂ、およびＣに示されており、ここで球状頭部の境界は示されており、ラット／ヒト遺伝子の境界は矢印で示されている。ヒト化ラットＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、およびＣ１ｑｃタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号５５、５６、および５７で示されており、以下の表９に列挙され、ラット配列は斜体化されている。
表９：キメララット／ヒトＣ１ｑタンパク質のアミノ酸配列
【表９−１】
2020535815.tif 000013
【表９−２】
2020535815.tif 000014
実施例２．１  Ｃ１ｑノックアウトラットの生成
【０２５０】
詳細には、第一に、３つのＣ１ｑ遺伝子すべてを含むラットＣ１ｑ遺伝子座を改変し、ラットＣ１ｑをコードする遺伝子を含む１７．６Ｋｂヌクレオチド配列を削除した（図２Ａ参照）。標的化ベクターが合成されてＬａｃＺ遺伝子、および自己欠失ハイグロマイシン選択カセットを含み、ベクターは、Ｃ１ｑａ  ＡＴＧ  からＣ１ｑｂ終止コドンまで、３つのラットＣ１ｑ遺伝子のすべての欠失を可能にする５’および３’相同アームを含有した。Ｃ１ｑ配列欠失を含むベクターを、細菌相同組換え（ＢＨＲ）を介してラットＣ１ｑ  ＢＡＣに導入し、その結果生じたＢＡＣ  ＤＮＡを使用して、ラットＥＳ細胞をエレクトロポレーションして、内因性Ｃ１ｑ遺伝子座を欠失したラットを生成するための改変ＥＳ細胞を作製した。欠失された遺伝子座内のさまざまな接合部の配列は、図２Ｃの第二の概略図で標識され、対応する核酸配列は以下の表１０に列挙されている。本実施例の表に示す接合部は、短いヌクレオチド配列のみを列挙するが、配列がラットゲノムに挿入された場所に、当業者を向ける。
表１０：ラットＣ１ｑ遺伝子座の欠失の接合部配列
【表１０】
2020535815.tif 000015
【０２５１】
ラットＣ１ｑ配列の削除を含有するＥＳ細胞は、上述の対立遺伝子アッセイ（ＭＯＡ）の定量的ＴＡＱＭＡＮ（商標）アッセイ改変により特定された。表１１は、定量的ＰＣＲアッセイで使用されたプライマー／プローブセットのそれぞれの名称および場所を特定する。同じＥＳ細胞を使用してヒトＣ１ｑ配列を導入し、以下に記載されるキメララットを生成する。
表１１：ラットＣ１ｑ遺伝子座の欠失を確認するためにＭＯＡアッセイで使用されるプライマーおよびプローブ
【表１１】
2020535815.tif 000016
【０２５２】
標的化されたキメラＣ１ｑ  Ｄａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉ  ＥＳ細胞を、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット胚に移植して、Ｃ１ｑ遺伝子座の欠失を有するＦ０仔を生成する。Ｆ０キメラ仔は野生型ラットに対して交配され、遺伝的操作に関してヘテロ接合性のＦ１仔を作製し、改変対立遺伝子の存在は上述のようにＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイによって確認される。Ｆ１仔は続いて、ホモ接合性に交配される。
実施例２．２  ヒト化Ｃ１ｑラットの生成
【０２５３】
ヒト化Ｃ１ｑラットを生成するために、ヒトＣ１ｑ球状頭部ドメインの配列（上記実施例１のヒト化Ｃ１ｑマウスに使用されるのと同じ配列）、および重複ラット配列を使用してブルーヘロンによってプラスミドを合成した。Ｃ１ｑｂヒト化構築物については、ヒトＣ１ｑｂ  ｐｏｌｙＡ配列の下流に制限消化により、自己欠失ｌｏｘＰ−ピューロマイシン（ＳＤＣ−ｌｏｘｐ−Ｐｕｒｏ）選択カセットを挿入した。Ｃ１ｑａおよびＣ１ｑｃ構築物の両方について、スペクチノマイシン（Ｓｐｅｃ）選択カセットを、各Ｃ１ｑａおよびＣ１ｑｃポリＡ配列の下流に制限消化により挿入した。結果として得られる構築物を、組み合わせＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９技術およびＧｉｂｓｏｎ  アセンブリ、または細菌相同組換え（ＢＨＲ）のいずれかを介して、ＬＵＣＩＧＥＮ（登録商標）からラットＣ１ｑ  ＢＡＣに逐次的に導入し、選択および／または消化工程が続き、図２Ｂに示したように選択カセットを除去する。この詳細な実施形態では、Ｃ１ｑｂのキメラ核酸配列をＢＨＲによって、最初に導入し（図中の１）、次いで、キメラＣ１ｑｃ  ＤＮＡのＢＨＲが続き（図中の２）、次いでキメラＣ１ｑａ  ＤＮＡを、ＢＨＲによって導入した（図中の３）。
【０２５４】
３つのキメラＣ１ｑ遺伝子すべてを含有する大型標的化ベクターを、図２Ｃに示すラットＣ１ｑ  ＫＯ  ＨＥＴ  ＥＳ細胞にエレクトロポレーションし、対立遺伝子（ＭＯＡ）アッセイのＴＡＱＭＡＮ（登録商標）リアルタイムＰＣＴに基づく改変によって統合が成功したことを確認した。ＭＯＡアッセイに使用されるプライマーおよびプローブを、表１２に記載する。
表１２：キメラヒト／ラットのＣ１ｑ遺伝子の存在を確認するためにＭＯＡアッセイで使用されるプライマーおよびプローブ
【表１２−１】
2020535815.tif 000017
【表１２−２】
2020535815.tif 000018
【０２５５】
キメラ遺伝子座における様々な遺伝子操作された構成要素間の接合部配列を以下の表１３に示し、図２Ｃの底部概略図上に示す。本実施例の表に示す接合部は、短いヌクレオチド配列のみを列挙するが、配列がラットゲノムに挿入された場所に、当業者を向ける。
表１３：  キメラヒト／ラットＣ１ｑ遺伝子座の接合部配列
【表１３−１】
2020535815.tif 000019
【表１３−２】
2020535815.tif 000020
【０２５６】
標的化されたキメラＣ１ｑ  Ｄａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉ  ＥＳ細胞を、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット胚に移植して、キメラヒト／ラットＣ１ｑ遺伝子座を有するＦ０仔を生成する。Ｆ０キメラ仔は野生型ラットに対して交配され、遺伝的操作に関してヘテロ接合性のＦ１仔を作製し、改変対立遺伝子の存在は上述のようにＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイによって確認される。Ｆ１仔は続いて、ホモ接合性に交配される。
実施例３：ヒト化Ｃ１ｑマウスの特徴付け
実施例３．１：  キメラＣ１ｑが存在し、マウス血清中の機能性
【０２５７】
キメラＣ１ｑがマウス血清中で発現および機能しているかどうかを判定するために、ヒト化Ｃ１ｑマウスは、ウェスタンブロットおよび古典的補体溶血アッセイによって表現決定した。すべてのマウスは、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓの特定の病原体のない施設に収容および交配された。すべての動物実験は、ＩＡＣＵＣ及びＲｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって承認された。
（１）  ウェスタンブロット：
【０２５８】
下記のように、ウェスタンブロットを使用して、血清Ｃ１ｑ濃度を１６１５  ＨＯマウス（上述のヒト化Ｃ１ｑに対してホモ接合性マウス）で分析した：マウスまたは正常ヒト血清（ＮＨＳ）をＰＢＳ中で希釈した。正常なヒト血清（Ｑｕｉｄｅｌ）を陽性対照として使用した。血清を、メルカプトエタノールおよびＳＤＳを含む電気泳動サンプルロード緩衝液に加え、還元／変性条件下でポリアクリルアミドゲル上で処理し、次いでニトロセルロース膜上に移した。ブロットをブロックし、ヤギ抗ヒトＣ１ｑ一次抗体（Ｑｕｉｄｅｌ）でプローブし、その後、ロバ抗ヤギＩｇＧ  ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を検出した。ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｔｒａｔｅを使用してブロットを展開した。イメージングには、ＧＥ  Ｉｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ  ＬＡＳ４０００  を使用した。
（２）  古典的経路溶血アッセイ：
【０２５９】
望ましい数のＳＲＢＣ（ヒツジ赤血球）をＧＶＢ＋＋緩衝液中で洗浄し、１ｘ１０９細胞／ｍＬで再懸濁し、ウサギ抗ヒツジヘモリシンでオプソニン化された。感受性を高められたＳＲＢＣを、溶血アッセイで使用する前に、ＧＶＢ＋＋緩衝液中で２ｘ１０８細胞／ｍＬに希釈した。ＷＴ同腹仔（ｎ＝５）および１６１５ＨＯ（ｎ＝４）マウスからの血清は、７〜９週齢で収集された。マウス血清を、６ポイント、１／５〜１／１６０の２倍希釈系列で、ＧＶＢ＋＋緩衝液（１００ｕｌ希釈血清／ウェル）で連続希釈した。直ちに、１００ｕＬの感受性を高められたＳＲＢＣ（２ｘ１０８細胞／ｍＬで）を、２００ｕＬの合計体積になるよう加え、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション時間の後、細胞を４℃で１２５０  ｘｇで遠心分離することにより遠心沈殿させた。合計１００ｕＬの上清を、新鮮な９６ウェルの平坦な底部プレートに移し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ５マイクロプレートリーダーおよびＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏソフトウェアで５４１ｎｍで読み取った。溶血活性を計算した：すべての実験サンプルのＯＤ５４１を、最大細胞溶解（１００ｕＬ水で処理された細胞）でＯＤ５４１で割った後、１００を掛けた。表示されるデータはシングルポイント（重複は実行されない）である。
【０２６０】
図４、上部パネル、に示されるように、ヒト血清中よりもヒト化Ｃ１ｑマウス血清中で、より少ないＣ１ｑタンパク質が検出されたにもかかわらず、抗ヒトＣ１ｑ抗体によって検出されたキメラＣ１ｑタンパク質は、ヒト化Ｃ１ｑマウスの血清中で検出された。溶血アッセイによって測定されるように、ヒト化マウスから得られたキメラＣ１ｑタンパク質は、野生型マウスＣ１ｑを含むマウスで観察された古典的補体活性と、類似した古典的補体活性を示した（図４、下部パネル）。
【０２６１】
マウス血清中のキメラヒト／マウスＣ１ｑの濃度も、Ｃ１ｑのヒト頭部に特異的な抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ形式を用いて決定された。標準曲線はヒトＣ１ｑタンパク質の既知濃度を使用して生成され、マウス血清中のキメラＣ１ｑの濃度は約１０〜３０μｇ／ｍＬの範囲であると決定された。
実施例４：ヒト治療薬の試験のためのモデルとしてのヒト化Ｃ１ｑマウス
【０２６２】
ヒト化Ｃ１ｑマウスがヒト治療薬を試験するためのモデルとして機能しうるかどうかを確認するために、我々はまず、ヒト抗ＣＤ２０抗体への結合によって、Ｒａｊｉ細胞（細胞表面抗原ＣＤ２０を発現するＢ細胞）の補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を活性化するためにヒト化Ｃ１ｑの能力を評価するインビトロアッセイを開発した。Ｂ細胞特異的細胞表面抗原ＣＤ２０に対する治療的抗ＣＤ２０抗体は、Ｂ細胞のＣＤＣへと導くために表され（Ｇｌｅｎｎｉｅ  ｅｔ  ａｌ．２００７、抗−ＣＤ２０モノクローナル抗体による死滅のメカニズム、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、Ｖｏｌ．４４（１６）ｐｐ．３８２３−３７）、及びＣＤ２０を発現する細胞株を使用するＣＤＣ  アッセイは以前記述されている（Ｆｌｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０００、ＣＤ２０発現リンパ腫株におけるキメラマウスヒトモノクローナル抗体ＩＤＥＣ−Ｃ２ＢＢによって誘発された細胞毒性のメカニズム、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、Ｖｏｌ．２０４（１）ｐｐ．５５−６３）。
【０２６３】
ＣＤＣバイオアッセイについては、Ｒａｊｉ細胞を、ＲＰＭＩ１６４０含有の１％のＢＳＡ中、１０，０００細胞／ウェルで、９６ウェルアッセイプレートの上に播種した。ヒトまたはマウス血清（ヒト化Ｃ１ｑまたはＷＴマウスのいずれかから）を用いてＣＤＣを測定するために、ヒト抗ＣＤ２０抗体は、２ｎＭ〜０．００７ｎＭの１：４で希釈され、２５°Ｃで１０分間細胞とともにインキュベートした。抗ＣＤ２０抗体とのインキュベーションの結果では、血清を１％の最終濃度で細胞に加えた。５％ＣＯ２で３７℃で１時間インキュベーションした後で、細胞毒性を測定し、次いで２５℃で３０分間インキュベートし、ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏ（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社、カタログ番号Ｇ９２９１）を添加した。ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏ（商標）は、細胞毒性の増加に伴い発光の増加が観察されるような、細胞殺傷を測定する発光ベースの試薬である（相対光単位で測定、ＲＬＵ）。対照ウェル中の未処理細胞を、ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏ（商標）試薬を添加する前に、１０分間ジギトニンでの処理により溶解し、細胞の最大殺傷を判定した。プレートは、ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏ（商標）の添加後に、Ｖｉｃｔｏｒ  Ｘ機器（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）によって、１０〜１５分間発光について読み取られた。計算される場合、以下の方程式を使用して、細胞毒性の割合をＲＬＵ値で計算した：
【数１】
2020535815.tif 000021
【０２６４】
この式では、「バックグラウンド細胞溶解」は、培地および、抗ＣＤ２０抗体なしで血清単独で処理された細胞からの発光であり、「最大細胞溶解」は、ジギトニンで処理された細胞からの発光である。結果を、％細胞毒性またはＲＬＵとして表され、Ｐｒｉｓｍ  ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて非線形回帰（４パラメータロジスティック）を使用して解析した。
【０２６５】
２ｎＭヒト抗ＣＤ２０抗体および正常ヒト血清によって媒介された補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）活性は、８３％の最大溶解をもたらしたが、２ｎＭヒトＣＤ２０抗体およびヒト化Ｃ１ｑマウス由来の血清によって媒介されたＣＤＣは、５５〜５８％の最大溶解であった（図５）。野生型マウス血清を使用して細胞溶解は検出されなかった。したがって、ヒト化Ｃ１ｑ球状頭部を含有する血清は、野生型マウスＣ１ｑタンパク質を含有する血清と比較して、ヒト抗ＣＤ２０抗体によって媒介されるＲａｊｉ細胞のより効率的な補体依存性溶解をもたらした。
【０２６６】
インビボテストのために、黄色ブドウ球菌感染モデルを選択した。黄色ブドウ球菌は、患者における細菌血症の主要な原因であり、これらの感染症は多くの場合、致死的である。様々な、研究所で適合された臨床的黄色ブドウ球菌  分離株を使用して、および様々なマウスバックグラウンドにおいて、感染症の動態および潜在的な治療薬の効果を試験するために、多くの研究所によって細菌血症のマウスモデルが開発されてきた（Ｏ’Ｋｅｅｆｆｅ  ＫＭ，ｅｔ  ａｌ、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２０１５  Ｓｅｐ；８３（９）：３４４５−５７．Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｉｎ  Ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ  Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｂｌｏｏｄｓｔｒｅａｍ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．；Ｒａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２０１２  Ｏｃｔ；８０（１０）：３７２１−３２．Ａｂｓｃｅｓｓ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｌｐｈａ−ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）。二重特異性抗体（ｂｉｓＡｂ）の活性を評価するために細菌血症モデルが確立され、１つのアームがＣ１ｑを標的化し、別のアームが黄色ブドウ球菌に発現する抗原を標的化し、の両方で、細菌の負荷量を減少させ、生存を改善した。
【０２６７】
ヒト化Ｃ１ｑマウスおよび対照野生型マウスを、ＴＳＢ中３７℃でログフェーズＯＤ６００≦１まで増殖させた黄色ブドウ球菌Ｎｅｗｍａｎの２００ｕｌ体積において、マウス当たり１．７ｘ１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）に腹腔内感染させ、ＰＢＳで３回洗浄した。感染の直後に、マウスに１００μｇの各ｂｉｓＡｂを投与し、１００ｕｌ体積で、腹腔内にアイソタイプ一致の抗体を投与した。３日目にマウスを安楽死させ、腎臓を集めて臓器負荷量を判定した。簡潔に述べると、腎臓を、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ  Ｏｃｔｏ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて５．０ｍＬのＰＢＳ中で均質化した。組織ホモジネートをＰＢＳ中で希釈し、１０倍の連続希釈の倍数をＬＢ寒天プレート上に蒔き、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、個別コロニーをカウントして、感染後の時点の細菌負荷量を判定し、結果をＣＦＵｓ／グラム組織として報告した。
【０２６８】
メスヒト化Ｃ１ｑマウスおよびＷＴ対照マウスにおける細菌腎臓負荷量の減少における有効性のためのアイソタイプ対照抗体と共にＢｉｓＡｂを試験した。アイソタイプ対照Ａｂで処置されたマウスと比較して、治療後３日目に、細菌ＣＦＵの２〜４ログ減少が、ｂｉｓＡｂで処理されたヒト化Ｃ１ｑマウスの腎臓で検出された。しかしながら、アイソタイプ対照抗体で得られた結果と同様、ＢｉｓＡｂで処理した内因性マウスＣ１ｑを発現するＷＴマウスでは、細菌負荷量に減少が観察されなかった（データ非表示）。
【０２６９】
生存に対するｂｉｓＡｂの効果を調べるために、ヒト化Ｃ１ｑマウスを、黄色ブドウ球菌Ｎｅｗｍａｎのマウス当たり１．５ｘ１０８  ＣＦＵに感染させ、上述の試験抗体で処理した。３日目にマウスを犠牲にする代わりに、それらは１８日目までモニタリングされた。開始体重の２０％を失ったマウスは犠牲となり、死亡したと記録した。生存している動物の割合は、試験終了時に報告された。
【０２７０】
ヒト化Ｃ１ｑメスマウスにおける生存試験における有効性のため、アイソタイプ対照抗体と共にＢｉｓＡｂを試験した（ｎ＝９）。表１４に示されるように、試験の終了時に、感染後１８日目に、アイソタイプ対照処理したマウスの７８％と比較して、ＢｉｓＡｂで処置したマウスの１００％が生存した。
表１４：細菌血症モデルにおけるヒト化Ｃ１ｑマウスの生存
【表１４−１】
2020535815.tif 000022
【表１４−２】
2020535815.tif 000023
【０２７１】
結論として、この試験は、ヒト化Ｃ１ｑマウスが、抗体（例えば、二重特異性抗体）などの治療薬剤の試験のために貴重なモデルであることを実証しており、このことはヒトＣ１ｑタンパク質に対して向けられる。
実施例５：ヒト化Ｃ１ｑラットの特徴付け
【０２７２】
キメラＣ１ｑがラット血清中で機能しているかどうかを判定するために、実施例２のヒト化Ｃ１ｑラットは、古典的補体溶血アッセイによって表現決定した。結果をＣ１ｑノックアウト（ＫＯ）ラット、および正常なヒト血清と比較した。すべてのラットは、５０％Ｄａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉ、５０％Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙバックグラウンドであった。すべてのラットは、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓの特定の病原体のない施設に収容および交配された。すべての動物実験は、ＩＡＣＵＣ及びＲｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって承認された。
（１）古典的経路溶血アッセイ
【０２７３】
望ましい数のＳＲＢＣ（ヒツジ赤血球）をＧＶＢ＋＋緩衝液中で洗浄し、１ｘ１０９細胞／ｍＬで再懸濁し、ウサギ抗ヒツジヘモリシンでオプソニン化された。感受性を高められたＳＲＢＣを、溶血アッセイで使用する前に、ＧＶＢ＋＋緩衝液中で２ｘ１０８細胞／ｍＬに希釈した。ＷＴ（ｎ＝３メスおよびｎ＝４オス）、１０００１５  ＨＯ（ホモ接合性ヒト化Ｃ１ｑラット）（ｎ＝５メスおよびｎ＝６オス）、およびホモ接合性Ｃ１ｑノックアウトラット（ｎ＝２女性）由来の血清が、１０〜１７週齢で集められた。正常なヒト血清（Ｑｕｉｄｅｌ）を陽性対照として使用し、一方でＣ１ｑ枯渇されたヒト血清（Ｑｕｉｄｅｌ）を陰性対照として使用した。ラットおよびヒト血清を、１２ポイント、１／５〜１／１０２４０の２倍希釈系列で、ＧＶＢ＋＋緩衝液（１００ｕｌ希釈血清／ウェル）で連続希釈した。直ちに、１００ｕＬの感受性を高められたＳＲＢＣ（２ｘ１０８細胞／ｍＬで）を、２００ｕＬの合計体積になるよう加え、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション時間の後、細胞を４℃で１２５０ｘｇで遠心分離することにより遠心沈殿させた。合計１００ｕＬの上清を、新鮮な９６ウェルの平坦な底部プレートに移し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ５マイクロプレートリーダーおよびＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏソフトウェアで４１２ｎｍで読み取った。溶血活性を計算した：すべての実験サンプルのＯＤ５４１を、最大細胞溶解（１００ｕＬ水で処理された細胞）でＯＤ５４１で割った後、１００を掛けた。表示されるデータはシングルポイント（重複は実行されない）である。
【０２７４】
図６に示されるように、ヒト化ラットから得られたキメラＣ１ｑタンパク質は、野生型ラットＣ１ｑを含むラットで観察されたラットで観察された古典的補体活性、および正常なヒト血清で観察された古典的補体活性と、同様の溶血アッセイで測定した古典的補体活性を提示した。オスおよびメスのラット間で差異は観察されなかった。
実施例６：ヒト治療薬の試験のためのモデルとしてのヒト化Ｃ１ｑラット
【０２７５】
ヒト化Ｃ１ｑラットがヒト治療薬を試験するモデルとして機能できるかどうかを確認するため、インビトロ補体依存性細胞障害アッセイおよび全血細菌生存アッセイを実施した。
（１）補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）アッセイ
【０２７６】
ＣＤＣ  バイオアッセイについては、Ｒａｊｉ細胞（ＣＤ２０を発現するヒトＢ細胞株）と、血清サンプル（補体保存ヒト血清、ＷＴラット血清、または実施例２に記載されたホモ接合性Ｃ１ｑヒト化ラットからの血清）、および抗ＣＤ２０抗体が使用された。
【０２７７】
Ｒａｊｉ細胞を、ＲＰＭＩ１６４０含有の１％のＢＳＡ中、１０，０００細胞／ウェルで、９６ウェルアッセイプレートの上に播種した。ヒトまたはラット血清を用いてＣＤＣ  を測定するために、抗ＣＤ２０抗体は、２０ｎＭ〜０．０１９ｎＭ（抗体を含まない対照サンプルを含む）の１：４で希釈され、２５℃で１０分間細胞と共にインキュベートされ、その後、０．５％の血清を添加した。５％ＣＯ２で３７℃で１時間インキュベートした後で、細胞毒性を測定し、次いで２５℃で３０分間インキュベートし、ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏ（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社、カタログ番号Ｇ９２９１）を添加した。ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏ（商標）は、細胞毒性の増加に伴い発光の増加が観察されるような、細胞殺傷を測定する発光ベースの試薬である（相対光単位で測定、ＲＬＵ）。対照ウェル中の未処理細胞を、ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏ（商標）試薬を添加した直後に、ジギトニンでの処理により溶解し、細胞の最大殺傷を判定した。プレートは、ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏ（商標）の添加後に、Ｖｉｃｔｏｒ  Ｘ機器（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）によって、１０〜１５分間発光について読み取られた。計算される場合、以下の方程式を使用して、細胞毒性の割合をＲＬＵ値で計算した：
【数２】
2020535815.tif 000024
【０２７８】
この式では、「バックグラウンド細胞溶解」は、培地および、抗ＣＤ２０抗体なしで血清単独で処理された細胞からの発光であり、「最大細胞溶解」は、ジギトニンで処理された細胞からの発光である。結果を、％細胞毒性またはＲＬＵとして表され、Ｐｒｉｓｍ  ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて非線形回帰（４パラメータロジスティック）を使用して解析した。
【０２７９】
図７に示されるように、２０ｎＭＣＤ２０抗体およびヒト化Ｃ１ｑラット（ＭＡＩＤ１００１５）血清によって媒介される補体依存性細胞障害活性は、野生型ラット血清（９３〜１１２％溶解）および正常なヒト血清（８３％溶解）を使用した溶解と類似した８５〜９０％のＲａｊｉ細胞の最大溶解をもたらした。Ｃ１ｑ分子のヒト化は、ラットＣ１ｑと比較して、ＣＤ２０抗体によって媒介されるＲａｊｉ細胞の補体依存性溶解を変化させなかった。
（２）Ｃ１ｑヒト化ラット血液中の黄色ブドウ球菌の生存、および二重特異性抗体の効果  
【０２８０】
黄色ブドウ球菌のヒト全血液中での生存率は、細菌増殖を調節するための補体および免疫エフェクター細胞の役割を探索するためのエクスビボアッセイで評価され得る（Ｔｈａｍｍａｖｏｎｇｓａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２００９  Ｏｃｔ２６；２０６（１１）：２４１７−２７）。このアッセイでは、Ｃ１ｑを標的とする二重特異性抗体、および黄色ブドウ球菌生存率の調節における黄色ブドウ球菌抗原の活性が測定され、ここで、全血中に二重特異性抗体が追加され、生存が２４時間後に評価される。このアッセイは、本実施例では、Ｃ１ｑヒト化ラット血液を使用するため、および黄色ブドウ球菌  抗原およびヒトまたはヒト化Ｃ１ｑタンパク質を特異的に認識するが、ラットＣ１ｑタンパク質は特異的に認識しない二重特異性抗体の効果を媒介することにおける、ヒト化キメラＣ１ｑタンパク質の機能性を調べるために適合されてきた。同一の黄色ブドウ球菌抗原に対する二価単一特異性抗体を、対照として使用した。
【０２８１】
簡潔に述べると、黄色ブドウ球菌Ｎｅｗｍａｎの培養物をＲＰＭＩで一晩増殖し、ＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳ中１．２５ｘ１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬの濃度に再懸濁し、１０５  ＣＦＵ／ｍＬの濃度まで連続希釈した。二通りで、１０４  ＣＦＵの黄色ブドウ球菌  懸濁液を、１００ｕｇ／ｍＬの二重特異性抗体、対照抗体、または抗体なし、および１００ｕＬのヒト化Ｃ１ｑまたは野生型（ＷＴ）ラット血液と混合した（血塊形成を防止するために追加的に５００ｎＭダビガトランを添加した抗凝固剤としてのクエン酸ナトリウム中）。サンプルを９６ウェルプレート中で、３７ｏＣで２４時間振動（１００ｒｐｍ）しながらインキュベートした。インキュベーション後、１００ｕｌの凝集溶解緩衝液（２００Ｕストレプトキナーゼを用いて補充されたＰＢＳ、２μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅ、１０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅ、０．５％サポニン、１ｍｌのＰＢＳ当たり１００μｇトリプシン）をサンプルに加え、ペレットが消滅するまで強力に渦動した。各サンプルから合計５０ｕＬをＰＢＳ中で連続希釈し、ＣＦＵの列挙のために，ＬＢ寒天プレート上に蒔いた。
【０２８２】
このアッセイでは、１１個のヒト化Ｃ１ｑおよび１０個のＷＴラットから新たに採取された血液サンプルを試験した。二重特異性抗体または対照抗体を用いた処理後の黄色ブドウ球菌の生存率（％）が判定された。試験抗体が存在しないラット血液中の全体的な増殖は、１００％に正規化される。二重特異性抗体処理を用いたＷＴラット血液中の黄色ブドウ球菌の生存は、５８〜１３１％の範囲であり、一方でＣ１ｑヒト化ラット血液中の二重特異性抗体処理は７〜４９％の生存をもたらした。対照抗体処理を用いたＷＴラット血液中の黄色ブドウ球菌の生存は、４０〜１３９％の範囲であり、Ｃ１ｑヒト化ラット血液中の対照抗体処理は６１〜１１４％の生存をもたらした。
【０２８３】
本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
そのゲノム内に、キメラＣ１ｑポリペプチドをコードする核酸を含む、遺伝子改変非ヒト動物であって、ここにおいて、前記核酸が、非ヒト核酸配列と、ヒト核酸配列とを含み、ここにおいて、前記キメラＣ１ｑポリペプチドが、キメラＣ１ｑａポリペプチド、キメラＣ１ｑｂポリペプチド、およびキメラＣ１ｑｃポリペプチドをからなる群から選択され、かつここにおいて、前記キメラＣ１ｑポリペプチドが、実質的にヒトである球状頭部ドメインと、実質的に非ヒトであるＮ末端葉柄茎領域とを含む、遺伝子改変非ヒト動物。
（項目２）
前記非ヒト動物が、キメラＣ１ｑａポリペプチド、キメラＣ１ｑｂポリペプチド、キメラＣ１ｑｃポリペプチド、またはそれらの組み合わせを発現する、項目１に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目３）
前記非ヒト動物が哺乳動物である、項目１または２に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目４）
前記非ヒト動物が齧歯類である、項目１または２に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目５）
前記非ヒト動物がラット、またはマウスである、項目１または２に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目６）
前記キメラＣ１ｑポリペプチドがキメラＣ１ｑａポリペプチドである、項目１〜５のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目７）
前記キメラＣ１ｑａポリペプチドが、実質的にヒトＣ１ｑａポリペプチドの球状頭部ドメインと同一である前記球状頭部ドメイン、および実質的に非ヒトＣ１ｑａポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と同一である前記Ｎ末端葉柄茎領域を含む、項目６に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目８）
前記ヒトＣ１ｑａポリペプチドの球状頭部ドメインが、配列番号４の１０８〜２４５を含む、項目７に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目９）
前記非ヒト動物がマウスである、項目６〜８のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目１０）
前記キメラＣ１ｑａポリペプチドが、内因性マウスＣ１ｑａポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と実質的に同一な前記Ｎ末端葉柄茎領域を含み、ここにおいて、前記内因性マウスＣ１ｑａポリペプチドの前記Ｎ末端葉柄茎領域が、配列番号１のアミノ酸２３〜１０７を含む、項目９に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目１１）
前記キメラＣ１ｑａポリペプチドが、配列番号１０のアミノ酸２３〜２４５を含む、項目９または１０に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目１２）
前記非ヒト動物がラットである、項目６〜８のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目１３）
前記キメラＣ１ｑａポリペプチドが、内因性ラットＣ１ｑａポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と実質的に同一な前記Ｎ末端葉柄茎領域を含み、ここにおいて、前記内因性ラットＣ１ｑａポリペプチドの前記Ｎ末端葉柄茎領域が、配列番号７のアミノ酸２３〜１０７を含む、項目１２に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目１４）
前記キメラＣ１ｑａポリペプチドが、配列番号５５のアミノ酸２３〜２４５を含む、項目１２または１３に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目１５）
前記キメラＣ１ｑポリペプチドがキメラＣ１ｑｂポリペプチドである、項目１〜５のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目１６）
前記キメラＣ１ｑｂポリペプチドが、実質的にヒトＣ１ｑｂポリペプチドの球状頭部ドメインと同一である前記球状頭部ドメイン、および実質的に非ヒトＣ１ｑｂポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と同一である前記Ｎ末端葉柄茎領域を含む、項目１５に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目１７）
前記ヒトＣ１ｑｂポリペプチドの球状頭部ドメインが、配列番号５のアミノ酸１１５〜２５１を含む、項目１６に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目１８）
前記非ヒト動物がマウスである、項目１５〜１７に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目１９）
前記キメラＣ１ｑｂポリペプチドが、内因性マウスＣ１ｑｂポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と実質的に同一な前記Ｎ末端葉柄茎領域を含み、ここにおいて、前記内因性マウスＣ１ｑｂポリペプチドの前記Ｎ末端葉柄茎領域が、配列番号２のアミノ酸２６〜１１４を含む、項目１８に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目２０）
前記キメラＣ１ｑｂポリペプチドが、配列番号１１のアミノ酸２６〜２５１を含む、項目１８または１９に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目２１）
前記非ヒト動物がラットである、項目１５〜１７のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目２２）
前記キメラＣ１ｑｂポリペプチドが、内因性ラットＣ１ｑｂポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と実質的に同一な前記Ｎ末端葉柄茎領域を含み、ここにおいて、前記内因性ラットＣ１ｑｂポリペプチドの前記Ｎ末端葉柄茎領域が、配列番号８のアミノ酸２６〜１１４を含む、項目２１に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目２３）
前記キメラＣ１ｑｂポリペプチドが、配列番号５６のアミノ酸２６〜２５１を含む、項目２１または２２に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目２４）
前記キメラＣ１ｑポリペプチドがキメラＣ１ｑｃポリペプチドである、項目１〜５のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目２５）
前記キメラＣ１ｑｃポリペプチドが、実質的にヒトＣ１ｑｃポリペプチドの球状頭部ドメインと同一である前記球状頭部ドメイン、および実質的に非ヒトＣ１ｑｃポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と同一である前記Ｎ末端葉柄茎領域を含む、項目２４に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目２６）
前記ヒトＣ１ｑｃポリペプチドの球状頭部ドメインが、配列番号６のアミノ酸１１３〜２４５を含む、項目２５に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目２７）
前記非ヒト動物がマウスである、項目２４〜２６のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目２８）
前記キメラＣ１ｑｃポリペプチドが、内因性マウスＣ１ｑｃポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と実質的に同一な前記Ｎ末端葉柄茎領域を含み、ここにおいて、前記内因性マウスＣ１ｑｃポリペプチドの前記Ｎ末端葉柄茎領域が、配列番号３のアミノ酸３０〜１１３を含む、項目２７に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目２９）
前記キメラＣ１ｑｃポリペプチドが、配列番号１１のアミノ酸３０〜２４６を含む、項目２７または２８に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目３０）
前記非ヒト動物がラットある、項目２４〜２６のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目３１）
前記キメラＣ１ｑｃポリペプチドが、内因性ラットＣ１ｑｃポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域と実質的に同一な前記Ｎ末端葉柄茎領域を含み、ここにおいて、前記内因性ラットＣ１ｑｃポリペプチドの前記Ｎ末端葉柄茎領域が、配列番号９のアミノ酸３２〜１１５を含む、項目３０に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目３２）
前記キメラＣ１ｑｃポリペプチドが、配列番号５７のアミノ酸３２〜２４８を含む、項目３０または３１に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目３３）
前記キメラＣ１ｑポリペプチドが、非ヒトＣ１ｑシグナルペプチド、任意選択的に内因性非ヒトＣ１ｑシグナルペプチドを含む、項目１〜３２のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目３４）
前記キメラＣ１ｑポリペプチドをコードする前記核酸が、内因性非ヒトＣ１ｑ遺伝子座にある、項目１に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目３５）
前記内因性非ヒトＣ１ｑ遺伝子座における内因性ゲノム配列が、前記ヒト核酸配列によって置換されている、項目３４に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目３６）
前記ヒト核酸配列が、ヒトＣ１ｑポリペプチドの球状頭部ドメインを実質的にコードする、項目１、２、３４、または３５のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目３７）
前記ヒト核酸配列が、ヒトＣ１ｑ遺伝子のゲノム断片である、項目３６に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目３８）
前記ゲノム断片が、前記ヒトＣ１ｑ遺伝子の３’ＵＴＲを含む、項目３７に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目３９）
前記キメラＣ１ｑポリペプチドがキメラＣ１ｑａポリペプチドであり、前記ヒト核酸配列が前記ヒトＣ１ｑａポリペプチドの球状頭部ドメインを実質的にコードする、項目３６〜３８のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目４０）
前記ヒトＣ１ｑａポリペプチドの前記球状頭部ドメインが、配列番号４のアミノ酸１０８〜２４５を含む、項目３９に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目４１）
前記ヒト核酸配列が、配列番号４のアミノ酸１１２〜２４５をコードする、項目３９または４０に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目４２）
前記キメラＣ１ｑポリペプチドがキメラＣ１ｑｂポリペプチドであり、前記ヒト核酸配列が前記ヒトＣ１ｑｂポリペプチドの球状頭部ドメインを実質的にコードする、項目３６〜３８のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目４３）
前記ヒトＣ１ｑｂポリペプチドの前記球状頭部ドメインが、配列番号５のアミノ酸１１５〜２５１を含む、項目４２に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目４４）
前記ヒト核酸配列が、配列番号５のアミノ酸１１８〜２５１をコードする、項目４２または４３に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目４５）
前記キメラＣ１ｑポリペプチドがキメラＣ１ｑｃポリペプチドであり、前記ヒト核酸配列が前記ヒトＣ１ｑｃポリペプチドの球状頭部ドメインを実質的にコードする、項目３６〜３８のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目４６）
前記ヒトＣ１ｑｃポリペプチドの前記球状頭部ドメインが、配列番号６のアミノ酸１１３〜２４５を含む、項目４５に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目４７）
前記ヒト核酸配列が、配列番号６のアミノ酸１１４〜２４５をコードする、項目４５または４６に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目４８）
前記非ヒト核酸配列が、非ヒトＣ１ｑポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域を実質的にコードする、項目１、２、または３４〜３６のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目４９）
前記非ヒト動物がマウスであり、マウスＣ１ｑポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域が、それぞれ、配列番号１のアミノ酸２３〜１０７（Ｃ１ｑａの）、配列番号２のアミノ酸２６〜１１４（Ｃ１ｑｂの）、または配列番号３のアミノ酸３０〜１１３（Ｃ１ｑｃの）を含む、項目４８に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目５０）
前記マウスが、キメラＣ１ｑａポリペプチドをコードする核酸を含み、ここにおいて、前記核酸が、マウス核酸配列およびヒト核酸配列を含み、ここにおいて前記マウス核酸配列が、配列番号１のアミノ酸２３〜１１１をコードする、項目４９に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目５１）
前記マウスが、キメラＣ１ｑｂポリペプチドをコードする核酸を含み、ここにおいて、前記核酸が、マウス核酸配列およびヒト核酸配列を含み、ここにおいて前記マウス核酸配列が、配列番号２のアミノ酸２６〜１１７をコードする、項目４９に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目５２）
前記マウスが、キメラＣ１ｑｃポリペプチドをコードする核酸を含み、ここにおいて、前記核酸が、マウス核酸配列およびヒト核酸配列を含み、ここにおいて前記マウス核酸配列が、配列番号３のアミノ酸３０〜１１４をコードする、項目４９に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目５３）
前記非ヒト動物がラットであり、前記内因性Ｃ１ｑポリペプチドの前記Ｎ末端葉柄茎領域が、それぞれ、配列番号７のアミノ酸２３〜１０７（Ｃ１ｑａの）、配列番号８のアミノ酸２６〜１１４（Ｃ１ｑｂの）、および配列番号９のアミノ酸３２〜１１５（Ｃ１ｑｃの）を含む、項目４８に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目５４）
前記ラットが、キメラＣ１ｑａポリペプチドをコードする核酸を含み、ここにおいて、前記核酸が、ラット核酸配列およびヒト核酸配列を含み、ここにおいて前記ラット核酸配列が、配列番号７のアミノ酸２３〜１１１をコードする、項目５３に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目５５）
前記ラットが、キメラＣ１ｑｂポリペプチドをコードする核酸を含み、ここにおいて、前記核酸が、ラット核酸配列およびヒト核酸配列を含み、ここにおいて前記ラット核酸配列が、配列番号８のアミノ酸２６〜１１７をコードする、項目５３に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目５６）
前記ラットが、キメラＣ１ｑｃポリペプチドをコードする核酸を含み、前記核酸が、ラット核酸配列、およびヒト核酸配列を含み、ここにおいて前記ラット核酸配列が、配列番号９のアミノ酸３２〜１１６をコードする、項目５３に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目５７）
前記動物が、ラットであり、かつそのゲノム中に、
ａ．  前記内因性Ｃ１ｑａ遺伝子座で、キメララット／ヒトＣ１ｑａポリペプチドをコードする核酸配列であって、ここにおいて、前記核酸配列が、５’−３’、ならびに、動作可能な連結において、配列番号７のラットＣ１ｑａポリペプチドのアミノ酸１〜１１１をコードする第一のヌクレオチド配列、および配列番号４のヒトＣ１ｑａポリペプチドのアミノ酸１１２〜２４５をコードする第二のヌクレオチド配列、を含む、核酸配列と、
ｂ．  前記内因性Ｃ１ｑｂ遺伝子座で、キメララット／ヒトＣ１ｑｂポリペプチドをコードする核酸配列であって、ここにおいて、前記核酸配列が、５’−３’、ならびに、動作可能な連結において、配列番号８のラットＣ１ｑｂポリペプチドのアミノ酸１〜１１７をコードする第三のヌクレオチド配列、および配列番号５のヒトＣ１ｑｂポリペプチドのアミノ酸１１８〜２５１をコードする第４のヌクレオチド配列を、含む、核酸配列と、
ｃ．  前記内因性Ｃ１ｑｃ遺伝子座で、キメララット／ヒトＣ１ｑｃポリペプチドをコードする核酸配列であって、ここにおいて、前記核酸配列が、５’−３’、ならびに、動作可能な連結において、配列番号９のラットＣ１ｑｃポリペプチドのアミノ酸１〜１１６をコードする第五のヌクレオチド配列、および配列番号６のヒトＣ１ｑｃポリペプチドのアミノ酸１１４〜２４５をコードする第六のヌクレオチド配列を、含む、前記核酸配列と、を含む、項目１に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目５８）
前記動物がマウスであり、かつそのゲノム中に、
ａ．  前記内因性Ｃ１ｑａ遺伝子座で、キメラマウス／ヒトＣ１ｑａポリペプチドをコードする核酸配列であって、ここにおいて、前記核酸配列が、５’−３’、ならびに、動作可能な連結において、配列番号１のマウスＣ１ｑａポリペプチドのアミノ酸１〜１１１をコードする第一のヌクレオチド配列、および配列番号４のヒトＣ１ｑａポリペプチドのアミノ酸１１２〜２４５をコードする第二のヌクレオチド配列を、含む、核酸配列と、
ｂ．  前記内因性Ｃ１ｑｂ遺伝子座で、キメラマウス／ヒトＣ１ｑｂポリペプチドをコードする核酸配列であって、ここにおいて、前記核酸配列が、５’−３’、ならびに、動作可能な連結において、配列番号２のマウスＣ１ｑｂポリペプチドのアミノ酸１〜１１７をコードする第三のヌクレオチド配列、および配列番号５のヒトＣ１ｑｂポリペプチドのアミノ酸１１８〜２５１をコードする第四のヌクレオチド配列を、含む、核酸配列と、
ｃ．  前記内因性Ｃ１ｑｃ遺伝子座で、キメラマウス／ヒトＣ１ｑｃポリペプチドをコードする核酸配列であって、ここにおいて、前記核酸配列が、５’−３’、ならびに、動作可能な連結において、配列番号３のマウスＣ１ｑｃポリペプチドのアミノ酸１〜１１４をコードする第五のヌクレオチド配列、および配列番号６のヒトＣ１ｑｃポリペプチドのアミノ酸１１４〜２４５をコードする第六のヌクレオチド配列を、含む、前記核酸配列と、を含む、項目１に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目５９）
前記非ヒト動物が、機能的な内因性Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、および／またはＣ１ｑｃポリペプチドを発現しない、項目１〜５８のいずれか１項に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目６０）
遺伝子改変非ヒト動物を作製する方法であって、前記方法が、キメラＣ１ｑポリペプチドをコードする核酸を含む、非ヒト動物のゲノムを改変することを含み、ここにおいて、前記核酸が、非ヒト核酸配列と、ヒト核酸配列とを含み、ここにおいて、前記キメラＣ１ｑポリペプチドが、キメラＣ１ｑａポリペプチド、キメラＣ１ｑｂポリペプチド、キメラＣ１ｑｃポリペプチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され、かつここにおいて、前記キメラＣ１ｑポリペプチドが、実質的にヒトである球状頭部ドメインと、実質的に非ヒトであるＮ末端葉柄茎領域とを含む、方法。
（項目６１）
前記非ヒト動物の前記ゲノムが改変されて、キメラＣ１ｑａポリペプチドをコードする核酸と、キメラＣ１ｑｂポリペプチドをコードする核酸と、キメラＣ１ｑｃポリペプチドをコードする核酸とを含む、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記キメラＣ１ｑポリペプチドをコードする核酸が、前記内因性非ヒトＣ１ｑ遺伝子座に導入される、項目６０または６１に記載の方法。
（項目６３）
前記キメラＣ１ｑポリペプチドをコードする核酸が、前記内因性非ヒトＣ１ｑ遺伝子のヌクレオチド配列を前記内因性非ヒトＣ１ｑ遺伝子座で置換する、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
前記動物が齧歯類、例えばマウスまたはラットである、項目６０〜６３のいずれか１項に記載の方法。
（項目６５）
前記改変することが、
ａ．  前記ヒト核酸配列を含む核酸分子を、齧歯類胚性幹（ＥＳ）細胞のゲノム内に導入することと、
ｂ．  齧歯類ＥＳ細胞を得ることであって、前記キメラＣ１ｑポリペプチドをコードするように、前記ヒト核酸配列が、内因性非ヒト核酸配列に動作可能な連結で、内因性Ｃ１ｑ遺伝子座内に統合されている、得ることと、
ｃ．  ｂで得られた前記齧歯類ＥＳ細胞から齧歯類動物を生成することと、を含む、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
前記核酸分子が、キメラＣ１ｑａポリペプチドをコードする核酸、キメラＣ１ｑｂポリペプチドをコードする核酸、およびキメラＣ１ｑｃポリペプチドをコードする核酸を含む、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
実質的にヒトである球状頭部ドメインと、実質的に非ヒトであるＮ末端葉柄茎領域とを含むキメラＣ１ｑポリペプチドであって、ここにおいて、前記キメラＣ１ｑポリペプチドが、キメラＣ１ｑａポリペプチド、キメラＣ１ｑｂポリペプチド、およびキメラＣ１ｑｃポリペプチドからなる群から選択される、キメラＣ１ｑポリペプチド。
（項目６８）
項目１〜５９のいずれかに記載の非ヒト動物から作製されたキメラＣ１ｑポリペプチド。
（項目６９）
項目６７または６８に記載のキメラＣ１ｑポリペプチドのうちの１つ以上を含むキメラＣ１ｑタンパク質。
（項目７０）
前記タンパク質が、少なくとも１つのキメラＣ１ｑａ、少なくとも１つのキメラＣ１ｑｂ、および少なくとも１つのキメラＣ１ｑｃポリペプチドを含む、項目６９に記載のキメラＣ１ｑタンパク質。
（項目７１）
前記タンパク質が、前記キメラＣ１ｑａポリペプチド、キメラＣ１ｑｂポリペプチド、およびキメラＣ１ｑｃポリペプチドの各々の６個ずつを含む、項目７０に記載のキメラＣ１ｑタンパク質。
（項目７２）
機能的なキメラＣ１ｑポリペプチドをコードする単離核酸であって、前記単離核酸が、非ヒト哺乳動物核酸配列、およびヒト核酸配列を含み、ここにおいて、前記ヒト核酸配列が、ヒトＣ１ｑポリペプチドの球状頭部ドメインを実質的にコードし、前記非ヒト核酸配列が、同族非ヒトＣ１ｑポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域を実質的にコードし、かつここにおいて、前記Ｃ１ｑポリペプチドが、Ｃ１ｑａポリペプチド、Ｃ１ｑｂポリペプチド、またはＣ１ｑｃポリペプチドから選択される、単離核酸。
（項目７３）
前記第一、第二、または第三のヌクレオチド配列のうちの１つ以上を含む、キメラ非ヒト哺乳動物Ｃ１ｑタンパク質をコードする単離核酸であって、ここにおいて、
ａ．  前記第一のヌクレオチド配列が、キメラＣ１ｑａポリペプチドをコードし、
ｂ．  前記第二のヌクレオチド配列が、キメラＣ１ｑｂポリペプチドをコードし、
ｃ．  前記第三のヌクレオチド配列が、キメラＣ１ｑｃポリペプチドをコードし、
ここにおいて、前記第一、第二、および第三のヌクレオチド配列が、非ヒト哺乳動物核酸配列と、ヒト核酸配列とを含み、ここにおいて、前記ヒト核酸配列が、それぞれ、ヒトＣ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、およびＣ１ｑｃポリペプチドの球状頭部ドメインを実質的にコードし、および前記非ヒト核酸配列が、それぞれ、同族非ヒトＣ１ｑポリペプチド、Ｃ１ｑａ、Ｃ１ｑｂ、およびＣ１ｑｃポリペプチドのＮ末端葉柄茎領域を実質的にコードする、単離核酸。
（項目７４）
項目７３または７４に記載の単離核酸を含む細胞。
（項目７５）
前記細胞が胚性幹細胞である、項目７４に記載の細胞。
（項目７６）
項目７５に記載の細胞を含む、遺伝子改変非ヒト動物。
（項目７７）
Ｃ１ｑベースの二重特異性抗原結合タンパク質を試験するトランスジェニック齧歯類モデルであって、ここにおいて、前記抗原結合タンパク質が、ヒトＣ１ｑ、および非齧歯類対象抗原の両方を結合し、項目１〜５９のいずれかに記載の遺伝子改変齧歯類を含み、さらに前記非齧歯類対象抗原、または前記非齧歯類対象抗原を発現する細胞を含む、トランスジェニック齧歯類モデル。
（項目７８）
対象抗原を標的とする薬剤候補のスクリーニング方法であって、前記方法が、
ａ．  項目１〜５９のいずれかにより定義された遺伝子改変齧歯類に前記対象抗原を導入することと、
ｂ．  前記齧歯類を対象の薬剤候補と接触させることであって、ここにおいて、前記薬剤候補が、前記ヒトＣ１ｑおよび前記対象抗原に対して向けられている、接触させることと、
ｃ．  前記薬剤候補が、前記対象抗原の存在または発現により特徴付けられる細胞の予防、低減、または除去において有効であるかどうかを分析することと、を含む、方法。
（項目７９）
前記導入する工程が、前記齧歯類に前記対象抗原を発現することを含む、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
前記導入する工程が、前記齧歯類内に、前記対象抗原を発現する細胞を導入することを含む、項目７８に記載の方法。
（項目８１）
前記対象抗原が腫瘍関連抗原である、項目７８〜８０のいずれかに記載の方法。
（項目８２）
前記細胞が、ブドウ球菌細胞などの細菌細胞であり、前記抗原がブドウ球菌抗原などの細菌抗原である、項目７８〜８０のいずれかに記載の方法。
（項目８３）
前記抗原がウイルス抗原である、項目７８〜８０のいずれかに記載の方法。
（項目８４）
前記導入する工程が、前記齧歯類を前記対象抗原で感染させることを含む、項目８２または８３に記載の方法。
（項目８５）
前記齧歯類が、免疫応答性のマウス、または免疫応答性のラットである、項目７８に記載の方法。
（項目８６）
前記薬剤候補が、抗体、または抗原結合タンパク質である、項目７８に記載の方法。
（項目８７）
前記抗体または前記抗原結合タンパク質が、それぞれ、二重特異性抗体、または二重特異性抗原結合タンパク質であり、これがヒトＣ１ｑタンパク質および前記対象抗原の両方を結合する能力を有する、項目８６に記載の方法。
（項目８８）
候補抗体が補体経路を活性化するかどうかを評価する方法であって、前記方法が、
ａ．  細胞表面上に対象抗原を発現する細胞、ヒトＦｃ領域を含み、前記対象抗原に向けられる候補抗体、および項目１〜５９のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物からの血清サンプル、を提供することと、
ｂ．  前記細胞を前記候補抗体と混合して、前記抗体が、前記細胞表面上に発現される前記対象抗原に結合することを可能にすることと、
ｃ．  前記血清サンプルを前記細胞抗体混合物に加えて、前記細胞上の前記対象抗原に結合した抗体に、前記血清サンプル内の前記ヒト化Ｃ１ｑタンパク質が結合することを可能にすることと、
ｄ．  前記細胞の細胞毒性を測定することと、を含む、方法。
（項目８９）
対象抗原およびヒトＣ１ｑを標的とする候補二重特異性抗体を評価するための方法であって、前記方法が、
ａ．  前記対象抗原を発現する細胞またはウイルス、前記候補二重特異性抗体、および項目１〜５９のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト動物から血液サンプルを混合し、インキュベートして、前記抗体が、前記細胞またはウイルスにより発現される前記対象抗原、および前記血液サンプル中のヒト化Ｃ１ｑ分子に結合することを可能にすることと、
ｂ．  前記細胞またはウイルスの生存を測定することと、を含む、方法。
（項目９０）
前記細胞が、ブドウ球菌細胞などの細菌細胞であり、前記抗原がブドウ球菌抗原などの細菌抗原である、項目８９に記載の方法。
（項目９１）
前記ラットが、そのゲノム中に、
ａ．前記内因性Ｃ１ｑａ遺伝子座で、配列番号５５のアミノ酸配列を含むキメララット／ヒトＣ１ｑａポリペプチドをコードする核酸配列と、
ｂ．前記内因性Ｃ１ｑｂ遺伝子座で、配列番号５６のアミノ酸配列を含むキメララット／ヒトＣ１ｑｂポリペプチドをコードする核酸配列と、
ｃ．前記内因性Ｃ１ｑａ遺伝子座で、配列番号５７のアミノ酸配列を含むキメララット／ヒトＣ１ｑｃポリペプチドをコードする核酸配列と、を含む項目５７に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
（項目９２）
前記マウスが、そのゲノム内に、
ａ．  前記内因性Ｃ１ｑａ遺伝子座で、配列番号１０のアミノ酸配列を含むキメラマウス／ヒトＣ１ｑａポリペプチドをコードする核酸配列と、
ｂ．  前記内因性Ｃ１ｑｂ遺伝子座で、配列番号１１のアミノ酸配列を含むキメラマウス／ヒトＣ１ｑｂポリペプチドをコードする核酸配列と、
ｃ．  前記内因性Ｃ１ｑａ遺伝子座で、配列番号１２のアミノ酸配列を含むキメラマウス／ヒトＣ１ｑｃポリペプチドをコードする核酸配列と、を含む、項目５８に記載の遺伝子改変非ヒト動物。
【図１Ａ】
2020535815.tif 000025
【図１Ｂ】
2020535815.tif 000026
【図１Ｃ】
2020535815.tif 000027
【図２Ａ】
2020535815.tif 000028
【図２Ｂ】
2020535815.tif 000029
【図２Ｃ】
2020535815.tif 000030
【図３Ａ】
2020535815.tif 000031
【図３Ｂ】
2020535815.tif 000032
【図３Ｃ】
2020535815.tif 000033
【図４】
2020535815.tif 000034
【図５】
2020535815.tif 000035
【図６】
2020535815.tif 000036
【図７】
2020535815.tif 000037
【配列表】
2020535815000001.app
【国際調査報告】
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2020535815.tif 000039
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