(57)【要約】繊毛病関連の疾患の治療方法を開示し、該方法は、それを必要とする対象に対して、少なくとも１つのＧタンパク質共役型受容体を標的とする化合物の有効量を投与することを含む。繊毛病を有する疾患の治療のための治療薬の特定方法を提供し、該方法は、推定治療薬を調べるために繊毛病の動物モデル系を提供すること、該動物に破壊剤を投与すること、該投与された動物を該推定治療薬で処理すること、該処理動物の測定可能な表現型を処理されていない動物のものと比較すること、及び該処理動物の測定可能な表現型が、該処理されていない動物のものと比較して低下した場合に該治療標的を繊毛病の治療として特定することを含む。【選択図】図３２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における少なくとも１つの繊毛病関連の疾患の治療方法であって、前記対象に対して、少なくとも１つのＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）を標的とする、治療有効量の少なくとも１つの薬剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記繊毛病関連の疾患が、ＮＰＨＰ１遺伝子座のホモ接合型欠失に起因する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記繊毛病関連の疾患が、ＮＰＨＰ１遺伝子座のヘテロ接合型欠失及び第二の遺伝子座でのヘテロ接合型またはホモ接合型機能欠損に起因する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記繊毛病関連の疾患が、ＮＰＨＰ１の１つの対立遺伝子におけるヘテロ接合型欠失及びもう１つの対立遺伝子における機能欠損変異に起因する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記繊毛病関連の疾患が、ＮＰＨＰ１の１つの対立遺伝子における機能欠損変異及びもう１つの対立遺伝子における異なる機能欠損変異に起因する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの薬剤が、前記少なくとも１つのＧＰＣＲのアゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つの薬剤が、プロスタグランジンである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つの薬剤が、プロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、１６，１６−ジメチル−ＰＧＥ２（ｄｍＰＧＥ２）、Ｌ９０２，６８８、ＣＰ−５４４３２６、ＡＧＮ−２１  ０６６９、１８ａ、ＡＧＮ−２１  ０９６１、ＥＤ−１  １７、ＣＰ−５３３５３６、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つのＧＰＣＲが、ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３及びＥＰ４からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの疾患が、ネフロン癆（ＮＰＨＰ）、Ｓｅｎｉｏｒ−Ｌｏｋｅｎ症候群（ＳＬＳ）、ジュベール症候群（ＪＢＴＳ）及び関連する障害疾患（ＪＳＲＤ）、バルデ・ビードル症候群（ＢＢＳ）、メッケル・グルーバー症候群（ＭＫＳ）、口顔指症候群（ＯＦＤ）、ＮＰＨＰ１機能欠損が引き起こす末期腎疾患、ならびにＮＰＨＰ１、ＮＰＨＰ４、ＮＰＨＰ６／ＣＥＰ２９０対立遺伝子及び他の病原性または機能欠損バリアントに関連する腎臓及び網膜繊毛病からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの薬剤が、ＣＰ−５４４３２６であり、前記少なくとも１つのＧＰＣＲが、ＥＰ２である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記有効量が、１００ｐＭ〜５μＭである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの疾患がネフロン癆である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１つの繊毛病関連の疾患を治療するための治療薬を特定する方法であって、
（ａ）前記繊毛病関連の疾患の動物または細胞モデルに対して、試験薬を投与することであって、前記動物または細胞モデルは、前記繊毛病関連の疾患の測定可能な表現型を示す、前記投与することと、
（ｂ）前記処理された動物または細胞モデルの前記測定可能な表現型と、未処理の動物または細胞モデルの前記測定可能な表現型を比較することと、
（ｃ）前記処理された動物または細胞モデルの前記測定可能な表現型が、前記未処理の動物または細胞モデルのものと比較して改善された場合、前記試験薬を繊毛病関連の疾患の治療用の治療薬であると特定することとを含む、前記方法。
【請求項１５】
前記動物モデルが、Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ（ゼブラフィッシュ）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記動物モデルが、１つ以上の破壊剤を投与することによって作製される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記１つ以上の破壊剤が、モルホリノを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記モルホリノが、少なくとも１つのネフロシスチン（ＮＰＨＰ）の発現を阻害する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１つのＮＰＨＰが、ＮＰＨＰ４である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記測定可能な表現型が、体表面彎曲、前腎嚢胞、側性心臓欠陥及び排せつ腔拡張からなる群から選択される、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記測定可能な表現型が、前腎嚢胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの繊毛病関連の疾患が、ネフロン癆（ＮＰＨＰ）、Ｓｅｎｉｏｒ−Ｌｏｋｅｎ症候群（ＳＬＳ）、ジュベール症候群（ＪＢＴＳ）及び関連する障害疾患（ＪＳＲＤ）、バルデ・ビードル症候群（ＢＢＳ）、メッケル・グルーバー症候群（ＭＫＳ）、口顔指症候群（ＯＦＤ）、ＮＰＨＰ１の機能欠損が引き起こす末期腎疾患、ならびにＮＰＨＰ１、ＮＰＨＰ４、ＮＰＨＰ６／ＣＥＰ２９０変異に関連する腎臓及び網膜繊毛病からなる群から選択される、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの疾患がネフロン癆である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも１つの繊毛病関連の疾患の治療に使用するためのＧＰＣＲアゴニスト。
【請求項２５】
前記ＧＰＣＲアゴニストが、プロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、１６，１６−ジメチル−ＰＧＥ２（ｄｍＰＧＥ２）、ＣＰ−５４４３２６、Ｌ９０２，６８８、ＡＧＮ−２１  ０６６９、１８ａ、ＡＧＮ−２１  ０９６１、ＥＤ−１  １７、ＣＰ−５３３５３６、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記ＧＰＣＲが、ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３及びＥＰ４からなる群から選択される、請求項２４に記載の使用。
【請求項２７】
前記少なくとも１つの繊毛病関連の疾患が、ネフロン癆（ＮＰＨＰ）、Ｓｅｎｉｏｒ−Ｌｏｋｅｎ症候群（ＳＬＳ）、ジュベール症候群（ＪＢＴＳ）及び関連する障害疾患（ＪＳＲＤ）、バルデ・ビードル症候群（ＢＢＳ）、メッケル・グルーバー症候群（ＭＫＳ）、口顔指症候群（ＯＦＤ）、ＮＰＨＰ１の機能欠損が引き起こす末期腎疾患、ならびにＮＰＨＰ１、ＮＰＨＰ４、ＮＰＨＰ６／ＣＥＰ２９０変異に関連する腎臓及び網膜繊毛病からなる群から選択される、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２８】
前記動物モデルが、ｎｐｈｐ１−／−マウスである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２９】
前記測定可能な表現型が、網膜層の厚さを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも１つの繊毛病関連の疾患が、ネフロン癆（ＮＰＨＰ）、Ｓｅｎｉｏｒ−Ｌｏｋｅｎ症候群（ＳＬＳ）、ジュベール症候群（ＪＢＴＳ）及び関連する障害疾患（ＪＳＲＤ）、バルデ・ビードル症候群（ＢＢＳ）、メッケル・グルーバー症候群（ＭＫＳ）、口顔指症候群（ＯＦＤ）、ＮＰＨＰ１の機能欠損が引き起こす末期腎疾患、ならびにＮＰＨＰ１、ＮＰＨＰ４、ＮＰＨＰ６／ＣＥＰ２９０変異に関連する腎臓及び網膜繊毛病からなる群から選択される、請求項２８または２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本明細書は、特許協力条約に基づく国際出願であり、２０１７年１０月１３日に出願された米国仮出願第６２／５７２，０５１号の利益を主張する。前述の出願の内容は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
繊毛は、基底小体、すなわち、膜に結合した中心小体から生じる微小管に基づく細胞表面の突起である。一次繊毛は、ほとんどの増殖停止または分化した哺乳類細胞の表面に、単一のコピーで存在する非運動性感覚オルガネラである。繊毛は、流れの変化を感知し、発達と組織の恒常性の過程で不可欠なシグナル伝達経路、例えば、ヘッジホッグ、Ｗｎｔ／ＰＣＰ及びｃＡＭＰ／ＰＫＡシグナル伝達を媒介する。繊毛内輸送（ＩＦＴ）は、繊毛の基部で積み荷を選択し、繊毛の構築に必要な軸糸成分、及び繊毛のシグナル伝達に関与するタンパク質を輸送する。繊毛が形成されると、繊毛膜組成の制御は、トランジション・ゾーンと呼ばれる繊毛の基部の特殊な領域での繊毛に進入する膜タンパク質に対するバリア、及びＢＢＳｏｍｅ（バルデ・ビードル症候群（ＢＢＳ）タンパク質、及び基底小体の構成要素であり、一次繊毛への積み荷の輸送に関与する他のタンパク質の複合体）と呼ばれるＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の繊毛への局在を制御する輸送アダプターを含めた、個別の分子機械に依存する。繊毛形成には多くのプロセスの協調が必要である。繊毛を生成するためには、細胞周期調節、小胞輸送、及び繊毛伸長の複雑な調和が正確なタイミングで生じなければならない。胚発生中及び成人の生理機能において適切に分化した繊毛を産生すること及び維持することの重要性は、繊毛病に関連する多くのヒト疾患によって最もよく強調されている。
【０００３】
繊毛病は、繊毛の形成または機能の欠陥によって直接引き起こされる一群のヒトの障害である。一次繊毛不全は、一次繊毛の広範な組織分布及びそれらの広範にわたる機能と一致して、多機能及び非常に多様性のある異常を引き起こす。一次繊毛病の患者は腎臓と網膜の異常、精神遅滞につながり得る中枢神経系の欠陥、肝臓の欠陥（嚢胞を含む）、肥満、ならびに四肢長の異常、指の数の異常（多指症）、左／右軸組織化の異常（内臓逆位）及び頭蓋顔面のパターニングの異常を含めた様々な骨格の欠陥の組み合わせを呈する。光受容体を接続する繊毛に特異的な異常は、網膜変性及び失明にもつながり得る。一次繊毛病の例としては、ネフロン癆（ＮＰＨＰ）、Ｓｅｎｉｏｒ−Ｌｏｋｅｎ症候群（ＳＬＳ）、ジュベール症候群（ＪＢＴＳ）、バルデ・ビードル症候群（ＢＢＳ）、メッケル・グルーバー症候群（ＭＫＳ）、口顔指症候群（ＯＦＤ）及びジューヌ症候群（ＪＡＴＤ）が含まれる。
【０００４】
ネフロン癆（ＮＰＨＰ）は、塊状間質性線維症、尿細管基底膜肥厚及び嚢胞形成を特徴とする常染色体劣勢腎症であり、小児期に末期腎疾患（ＥＳＲＤ）を引き起こす。ＮＰＨＰは、単独の場合もあれば、以後、ネフロン癆関連繊毛病（ＮＰＨＰ−ＲＣ）と呼ぶ症候群型にて、異なる腎外症状（例えば、網膜ジストロフィー、肝線維症、骨格異形成等）と関連する場合もある。
【０００５】
ＮＰＨＰは、これまでのところ、該症例の６０％の主要因であることが知られている２１個のＮＰＨＰ遺伝子によって引き起こされる。ＮＰＨＰの高い遺伝的異質性と多数の機構経路が議論されたことを考えると、ＮＰＨＰにつながる単一の病態は存在しないことは明らかである。ＮＰＨＰの腎組織学は、尿細管障害と線維症の共通のエンドポイントを指摘し、これは複数の誘因を有する可能性がある。各々の新たな遺伝子発見の論文では、分子診断に対してはより明確であるように思われるが、疾患の根本的なシグナル伝達経路に関してはより混乱しているように思われる。
【０００６】
ほとんど解明されていないＮＰＨＰを含めた繊毛病を有する疾患の分子基盤の特性化、ならびにそれら疾患の診断及び治療の改善に対する要求は依然として大きい。
【発明の概要】
【０００７】
１つの実施形態では、本開示は、対象における少なくとも１つの繊毛病関連の疾患の治療方法に関し、該方法は、該対象に対して、少なくとも１つのＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）を標的とする、治療有効量の少なくとも１つの薬剤を投与することを含む。実施形態では、該繊毛病関連の疾患は、ＮＰＨＰ１遺伝子座のホモ接合型欠失に起因する。実施形態では、該繊毛病関連の疾患は、ＮＰＨＰ１遺伝子座のヘテロ接合型欠失及び第二の遺伝子座でのヘテロ接合型またはホモ接合型機能欠損（ＬＯＦ）に起因する。実施形態では、該繊毛病関連の疾患は、ＮＰＨＰ１の１つの対立遺伝子におけるヘテロ接合型欠失及びもう１つの対立遺伝子におけるＬＯＦ変異に起因する。実施形態では、該繊毛病関連の疾患は、ＮＰＨＰ１の１つの対立遺伝子における機能欠損変異及びもう１つの対立遺伝子における異なる機能欠損変異に起因する。
【０００８】
特定の実施形態では、該少なくとも１つの薬剤は、該少なくとも１つのＧＰＣＲのアゴニストである。特定の実施形態では、該少なくとも１つの薬剤は、プロスタグランジンである。特定の実施形態では、該少なくとも１つの薬剤は、プロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、１６，１６−ジメチル−ＰＧＥ２（ｄｍＰＧＥ２）、Ｌ９０２，６８８、ＣＰ−５４４３２６、ＡＧＮ−２１  ０６６９、１８ａ、ＡＧＮ−２１  ０９６１、ＥＤ−１  １７、ＣＰ−５３３５３６、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。特定の実施形態では、該少なくとも１つのＧＰＣＲは、ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３及びＥＰ４からなる群から選択される。特定の実施形態では、該少なくとも１つの疾患は、ネフロン癆（ＮＰＨＰ）、Ｓｅｎｉｏｒ−Ｌｏｋｅｎ症候群（ＳＬＳ）、ジュベール症候群（ＪＢＴＳ）及び関連する障害疾患（ＪＳＲＤ）であって、さらなる特徴を有するＪＢＴＳのバリアント形態のすべて、例えば、多指症、眼欠損症、網膜ジストロフィー、腎嚢胞、口腔小帯、及び肝線維症が含まれ得るもの、バルデ・ビードル症候群（ＢＢＳ）、メッケル・グルーバー症候群（ＭＫＳ）、口顔指症候群（ＯＦＤ）、ＮＰＨＰ１大（ｌａｒｇｅ）ホモ接合型欠失が引き起こす末期腎疾患、ならびにＮＰＨＰ１、ＮＰＨＰ４、ＮＰＨＰ６／ＣＥＰ２９０変異に関連する腎臓及び網膜繊毛病、ならびにＮＰＨＰ遺伝子が引き起こす任意の繊毛病からなる群から選択される。特定の実施形態では、該少なくとも１つの薬剤は、ＣＰ−５４４３２６であり、該少なくとも１つのＧＰＣＲは、ＥＰ２である。特定の実施形態では、該有効量は、１００ｐＭ〜５μＭである。特定の実施形態では、該少なくとも１つの疾患はネフロン癆である。
【０００９】
１つの実施形態では、本開示は、少なくとも１つの繊毛病関連の疾患を治療するための治療薬を特定する方法に関し、該方法は、（ａ）該繊毛病関連の疾患の動物または細胞モデルに対して、試験薬を投与すること、ただし、該動物または細胞モデルは、該繊毛病関連の疾患の測定可能な表現型を示すものであること、（ｂ）処理された動物または細胞モデルの該測定可能な表現型と、未処理の動物または細胞モデルの該測定可能な表現型を比較すること、及び（ｃ）該処理された動物または細胞モデルの該測定可能な表現型が、該未処理の動物または細胞モデルのものと比較して改善された場合、該試験薬を繊毛病関連の疾患の治療用の治療薬であると特定することを含む。特定の実施形態では、該動物モデルは、Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ（ゼブラフィッシュ）またはｎｐｈｐｌノックアウト（ＫＯ）マウスモデル（ｎｐｈｐｌ−／−）であり得る。特定の実施形態では、該動物モデルは、１つ以上の破壊剤を投与することによって作製される。特定の実施形態では、該１つ以上の破壊剤はモルホリノを含む。特定の実施形態では、該モルホリノは、少なくとも１つのネフロシスチン（ＮＰＨＰ）、例えば、ＮＰＨＰ４の発現を阻害する。特定の実施形態では、該測定可能な表現型は、体表面彎曲、前腎嚢胞、側性心臓欠陥及び排せつ腔拡張からなる群から選択される。特定の実施形態では、該少なくとも１つの疾患は、ネフロン癆（ＮＰＨＰ）、Ｓｅｎｉｏｒ−Ｌｏｋｅｎ症候群（ＳＬＳ）、ジュベール症候群（ＪＢＴＳ）及び関連する障害疾患（ＪＳＲＤ）、バルデ・ビードル症候群（ＢＢＳ）、メッケル・グルーバー症候群（ＭＫＳ）、口顔指症候群（ＯＦＤ）、ＮＰＨＰ１大（ｌａｒｇｅ）ホモ接合型欠失が引き起こす末期腎疾患、ならびにＮＰＨＰ１、ＮＰＨＰ４、ＮＰＨＰ６／ＣＥＰ２９０変異に関連する腎臓及び網膜繊毛病からなる群から選択される。
【００１０】
１つの実施形態では、本開示は、少なくとも１つの繊毛病関連の疾患の治療に使用するためのＧＰＣＲアゴニストに関する。特定の実施形態では、該ＧＰＣＲアゴニストは、プロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、１６，１６−ジメチル−ＰＧＥ２（ｄｍＰＧＥ２）、ＣＰ−５４４３２６、Ｌ９０２，６８８、ＡＧＮ−２１  ０６６９、１８ａ、ＡＧＮ−２１  ０９６１、ＥＤ−１  １７、ＣＰ−５３３５３６、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。特定の実施形態では、該ＧＰＣＲは、ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３及びＥＰ４からなる群から選択される。特定の実施形態では、該少なくとも１つの疾患は、ネフロン癆（ＮＰＨＰ）、Ｓｅｎｉｏｒ−Ｌｏｋｅｎ症候群（ＳＬＳ）、ジュベール症候群（ＪＢＴＳ）及び関連する障害疾患（ＪＳＲＤ）、バルデ・ビードル症候群（ＢＢＳ）、メッケル・グルーバー症候群（ＭＫＳ）、口顔指症候群（ＯＦＤ）、ＮＰＨＰ１大（ｌａｒｇｅ）ホモ接合型欠失が引き起こす末期腎疾患、ならびにＮＰＨＰ１、ＮＰＨＰ４、ＮＰＨＰ６／ＣＥＰ２９０変異に関連する腎臓及び網膜繊毛病からなる群から選択される。
【００１１】
特定の実施形態では、該動物モデルは、１つ以上の破壊剤を投与することによって作製される。特定の実施形態では、該１つ以上の破壊剤は、ｓｇＲＮＡが指示する遺伝子欠失を媒介するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを含む。特定の実施形態では、該ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、少なくとも１つのネフロシスチン（ＮＰＨＰ）、例えば、ＮＰＨＰ１の発現を阻害する。特定の実施形態では、該測定可能な表現型は、網膜光受容体層の厚さ、網膜電図及び該光受容体細胞体におけるロドプシンの蓄積からなる群から選択される。特定の実施形態では、該少なくとも１つの疾患は、ネフロン癆（ＮＰＨＰ）、Ｓｅｎｉｏｒ−Ｌｏｋｅｎ症候群（ＳＬＳ）、ジュベール症候群（ＪＢＴＳ）及び関連する障害疾患（ＪＳＲＤ）、バルデ・ビードル症候群（ＢＢＳ）、メッケル・グルーバー症候群（ＭＫＳ）、口顔指症候群（ＯＦＤ）、ＮＰＨＰ１大（ｌａｒｇｅ）ホモ接合型欠失が引き起こす末期腎疾患、ならびにＮＰＨＰ１、ＮＰＨＰ４、ＮＰＨＰ６／ＣＥＰ２９０変異に関連する腎臓及び網膜繊毛病からなる群から選択される。
【００１２】
本開示の本質、目的、及び利点のさらなる理解のため、以下の図面と併せて読まれる以下の詳細な説明を参照されたい。以下の図面において、同様の参照番号は同様の要素を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１Ａ〜１Ｄは、尿由来の腎上皮細胞を示す。１Ａ：正常対照、１Ｂ：ＮＰＨＰ１の欠失があるＮＰＨＰ患者（Ｐｔ１）、１Ｃ：ＲＴ−ＰＣＲの比較、１Ｄ：免疫ブロットの比較。
【図２】目的の細胞における繊毛形成を定量化するための自動インビトロアッセイを示す。
【図３】ＮＰＨＰ患者（ＰＴ１）由来の繊毛細胞の割合が、対照細胞（ＣＴＲＬ）のものより有意に低いことを示す。
【図４】新規な繊毛系アッセイのステップを示す概略図である。
【図５】（Ａ）フルチカゾン、（Ｂ）フェニラミン、（Ｃ）ベラパミル、（Ｄ）ＭＬ−１４１、（Ｅ）ミトキサントロン、（Ｆ）トロピセトロン、（Ｇ）エトプロパジン、（Ｈ）シプロヘプタジン、（Ｉ）パクリタキセル及び（Ｊ）シンバスタチンが繊毛形成に与える影響をＤＭＳＯと比較して示す。
【図６】アルプロスタジルが繊毛形成に与える影響をＤＭＳＯと比較して示す。
【図７Ａ】アルプロスタジルの繊毛形成に対する用量反応をＤＭＳＯと比較して示す。
【図７Ｂ】ＩＣ５０の特定のための対応する片対数表現を示す。
【図８Ａ】アルプロスタジル処理での複数の繊毛形成実験で得られた結果のメタ分析を示す。
【図８Ｂ】アルプロスタジル処理での複数の繊毛形成実験で得られた結果のメタ分析を示す。
【図８Ｃ】アルプロスタジル処理での複数の繊毛形成実験で得られた結果のメタ分析を示す。
【図９】アルプロスタジル処理での複数の繊毛形成実験で得られた結果のメタ分析を、実験ごとのデータを区別して示す（Ａ〜Ｄ）。
【図１０】実験条件下でのＰＧＥ１の安定性を示す。
【図１１Ａ】アルプロスタジル（ＰＧＥ１）、ジノプロストン（ＰＧＥ２）、及び１６，１６−ジメチル−ＰＧＥ２（ｄｍＰＧＥ２）が繊毛形成に与える影響を示す。
【図１１Ｂ】アルプロスタジル（ＰＧＥ１）がＮＰＨＰ１欠失患者由来の細胞株に与える影響を示す。
【図１１Ｃ】繊毛のメタ分析を示す。
【図１２】ＰＧＥ２が繊毛形成に与える影響を示す。
【図１３】ウェスタンブロットによるヒト腎臓組織における、及び免疫組織化学によるヒト網膜におけるＥＰ１〜４の発現プロファイルを示す。
【図１４】図１４Ａは、ＥＰ２及びＥＰ４のｍＲＮＡが、対照及びＰｔ１由来の腎上皮細胞において発現されることを示す。図１４Ｂは、ＥＰ２が、対照及びＰｔ１由来の腎上皮細胞においてタンパク質レベルで発現されることを示す。図１４Ｃは、複数の対照細胞株及び複数のＮＰＨＰ患者由来の腎上皮細胞株におけるＥＰ１〜４受容体をコードする遺伝子のｍＲＮＡ発現を示す。
【図１５】繊毛形成への影響を調べたプロスタグランジン（ＰＧ）モジュレーター（アゴニスト及びアンタゴニスト）を示す。
【図１６Ａ】繊毛のメタ分析を示す。
【図１６Ｂ】ＣＰ−５４４３２６で処理したＮＰＨＰ患者由来の細胞を示す。
【図１６Ｃ】対応する片対数表現を示す。
【図１７Ａ】Ｌ−９０２．６８８が繊毛形成に与える影響を示す。
【図１７Ｂ】ＣＰ−５４４３２６及びアルプロスタジルが繊毛形成に与える影響を示す。
【図１７Ｃ】ＣＰ−５４４３２６が患者由来の細胞に与える影響を示す。
【図１７Ｄ】繊毛のメタ分析を示す。
【図１８】マイクロアレイ分析用にＲＬＴまたはＱｉａｚｏｌ法で抽出されたＲＮＡを示す。
【図１９】階層的クラスタリングによって分析されたサンプルのマイクロアレイデータを示す。
【図２０】階層的クラスタリングによって分析されたサンプルのマイクロアレイデータを示す。
【図１９】階層的クラスタリングによって分析されたサンプルのマイクロアレイデータを示す。
【図２０】階層的クラスタリングによって分析されたサンプルのマイクロアレイデータを示す。
【図２１】階層的クラスタリングによって分析されたサンプルのマイクロアレイデータを示す。
【図２２】ＲＬＴ抽出サンプルから得たマイクロアレイデータを要約する。
【図２３】Ｑｉａｚｏｌ抽出サンプルから得たマイクロアレイデータを要約する。
【図２４Ａ】様々な用量から得たマイクロアレイデータ間に有意差がないことを示す。
【図２４Ｂ】様々な用量から得たマイクロアレイデータ間に有意差がないことを示す。
【図２５】繊毛形成に対する薬効のマルチオミクス解析のプロセスを示す。
【図２６】アルプロスタジルが繊毛形成に与える影響の表現型分析を示す（Ａ〜Ｅ）。
【図２７】ドラッグド（ｄｒｕｇｇｅｄ）及びドラッガブル（ｄｒｕｇｇａｂｌｅ）遺伝子のｉｍＲＮＡ差次的発現を示す。
【図２８Ａ】プロスタグランジンＥ１（アルプロスタジル）の下流相互作用に関するマルチオミクスデータからの経路分析、及び関連する標的機会を示す。
【図２８Ｂ】ＮＰＨＰ１の上流相互作用に関するマルチオミクスデータからの経路分析、及び関連する標的機会を示す。
【図２８Ｃ】ＮＰＨＰ１〜２０遺伝子関連の直接相互作用に関するマルチオミクスデータからの経路分析、及び関連する標的機会を示す。
【図２９】ゼブラフィッシュのＮＰＨＰ４  ＭＯモデルを示す。
【図３０】ゼブラフィッシュのＮＰＨＰ４  ＭＯモデルの薬物処理のプロトコルを示す。
【図３１】モルホリノ注射がゼブラフィッシュに与える影響を要約する（Ａ〜Ｃ）。
【図３２】（Ａ）ゼブラフィッシュの代表的な体軸彎曲、及び（Ｂ、Ｃ）アルプロスタジルがゼブラフィッシュの体軸彎曲に与える影響を示す。
【図３３】（Ａ）ゼブラフィッシュの代表的な前腎嚢胞、及び（Ｂ、Ｃ）アルプロスタジルがゼブラフィッシュの前腎嚢胞に与える影響を示す。
【図３４】（Ａ、Ｂ）ジノプロストンがゼブラフィッシュの体軸彎曲に与える影響、及び（Ｃ）ジノプロストンがゼブラフィッシュの前腎嚢胞に与える影響を示す。
【図３５】ＣＰ−５４４３２６がゼブラフィッシュの前腎嚢胞に与える影響を示す。
【図３６】薬物動態試験デザインを示す。
【図３７Ａ】薬物動態試験結果を示す。
【図３７Ｂ】薬物動態試験結果を示す。
【図３７Ｃ】薬物動態試験結果を示す。
【図３７Ｄ】薬物動態試験結果を示す。
【図３７Ｅ】薬物動態試験結果を示す。
【図３８Ａ】ｗｔ及びＮｐｈｐ１−／−マウスにおける網膜の過ヨウ素酸−シッフ染色を示す。
【図３８Ｂ】網膜層の厚さの半自動定量法を示す。
【図３８Ｃ】ＨｐｈｐＶ’マウスの網膜層の厚さの定量をｗｔマウスと比較して示す。
【図３９Ａ】繊毛マーカーとしてのＣｅｐ２９０ならびにそれぞれ、外節（ＯＳ）、及び内／外節の光受容体マーカーとしてのロドプシン及びＰＮＡ（ピーナッツ凝集素レクチン）のｗｔ及びＮｐｈｐ１−／−マウス網膜での免疫組織染色を示す。
【図３９Ｂ】繊毛マーカーとしてのＣｅｐ２９０ならびにそれぞれ、外節（ＯＳ）、及び内／外節の光受容体マーカーとしてのロドプシン及びＰＮＡ（ピーナッツ凝集素レクチン）のｗｔ及びＮｐｈｐ１−／−マウス網膜での免疫組織染色を示す。
【図４０】Ｎｐｈｐ１−／−マウスの網膜電図をｗｔマウスと比較して示す。
【図４１】ｗｔ及びＮｐｈｐ１−／−マウスにおけるＥＰ２受容体の発現を示す。
【図４２】本開示の１つの実施形態による試験デザインを示す。
【図４３】Ｎｐｈｐ１−／−マウスにおいてＣＰ−５４４３２６がＯＮＬ／ＯＰＬの網膜層の厚さの比に与える影響を示す。
【図４４】ＮｐｈｐＶ’マウスにおいてＣＰ−５４４３２６がＯＮＬの緑色標識ロドプシンの誤局在化に与える影響を示す。
【図４５】ＣＰ−５４４３２６がＮｐｈｐ１−／−マウスの網膜電図に与える影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本開示は、以下に記載する特定の実施形態に限定されず、該特定の実施形態の変形がなされ得るとともに、添付の特許請求の範囲に含まれ得ることを理解されたい。また、使用される用語は、特定の実施形態を記載するためのものであり、限定することを意図しないことも理解されたい。
【００１５】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに他を指示しない限り、複数の参照を含む。特に定義しない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本開示が属する当技術分野における当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。
【００１６】
ＮＰＨＰ患者
ネフロン癆（ＮＰＨＰ）は、腎臓の進行性破壊を特徴とする劣勢尿細管間質性繊毛病であり、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）を引き起こす。ＮＰＨＰが引き起こすＥＳＲＤの発症は、生後数か月（小児ＮＰＨＰ）から＞６０歳まで（成人ＮＰＨＰ）に及び、＞１７％は２０歳以後にＥＳＲＤを有する。疾患を引き起こす突然変異は、２０を超えるＮＰＨＰ関連遺伝子（例えば、ＮＰＨＰ１〜２０、ＩＦＴ１４０、ＴＲＡＦ３ＩＰ１／ＩＦＴ５４）で特定されており、ＮＰＨＰを呈する全症例の約６０％を占める。ＮＰＨＰ１の全遺伝子座欠失（ＮＰＨＰ１（ｄｅｌ））は、ＮＰＨＰの症例の２０％超を占める。従来、希少疾患ポータルＯｒｐｈａｎｅｔは、世界的な頻度約１００，０００分の１（カナダ１／５０，０００、米国１／９００，０００、フィンランド１／１００，０００、フランス１／５０，０００）を報告している。現在、ＮＰＨＰの治療法は存在しない。
【００１７】
繊毛病は、多くの場合、トランジション・ゾーン（ＴＺ）タンパク質をコードする遺伝子または繊毛内輸送（ＩＦＴ）成分の突然変異によって引き起こされる（Ｒｅｉｔｅｒ，Ｊ．＆Ｌｅｒｏｕｘ  Ｍ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１８：５３３−４７，  ２０１７、Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３６４：１５３３−４３，  ２０１１、Ｃｚａｒｎｅｃｋｉ，Ｐ．＆Ｓｈａｈ，Ｊ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２２：２０１−１０，  ２０１２）。機能的には、ＴＺは、軸糸の近位端の一次繊毛の基部にある区画を表し、繊毛タンパク質の出入りを制御する（Ｂｅｔｌｅｊａ，Ｅ．＆Ｃｏｌｅ，Ｄ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，２０：Ｒ９２８−３１，  ２０１０、Ｃｒａｉｇｅ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１９０：９２７−４０，  ２０１０、Ｏｍｒａｎ，Ｈ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１９０：７１５−７，  ２０１０、Ｂｅｎｚｉｎｇ，Ｔ．＆Ｓｃｈｅｒｍｅｒ，Ｂ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，４３：７２３−４，  ２０１１）。分子的には、ＴＺは、異なる多タンパク質複合体、ＮＰＨＰ１−４−８モジュール、ＮＰＨＰ５−６（Ｃｅｐ２９０）モジュール、ＭＫＳ／Ｂ９モジュール及びＩｎｖｅｒｓｉｎ（ＩＮＶＳ、ＮＰＨＰ２）区画からなる（Ｓａｎｇ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１４５：５１３−２８，  ２０１１）。該ＮＰＨＰ１−４−８モジュール、ＮＰＨＰ５−Ｃｅｐ２９０モジュール及びＩｎｖｅｒｓｉｎ区画は、まとめてＮＰＨＰモジュールと呼ばれることがある。
【００１８】
ＮＰＨＰモジュールタンパク質をコードする遺伝子の１つ以上の突然変異及び／または不活性化は、繊毛形成及び／または上皮形成に悪影響を及ぼす場合があり、ＮＰＨＰ患者において線維症及び嚢胞の発生をもたらす。ＩＦＴ装置は、繊毛の基部で積み荷を選択し、繊毛の構築に必要な軸糸成分、及び繊毛のシグナル伝達に関与するタンパク質を輸送する。１６の異なるタンパク質からなるＩＦＴ−Ｂ複合体は、キネシンＩＩと結合することによって順行輸送を媒介する。逆行輸送は、ダイニン２とＩＦＴ−Ａ複合体の６つのサブユニットによって媒介される。ＩＦＴ−Ａサブユニットをコードする６つの遺伝子における突然変異がＮＰＨＰ関連の繊毛病で特定されており、３つのＩＦＴ−Ｂサブユニットのみがネフロン癆と関連している（ＩＦＴ１７２、ＩＦＴ５４）（Ｈａｌｂｒｉｔｔｅｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，９３：９１５−２５，  ２０１３、Ｂｉｚｅｔ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，６：８６６６，  ２０１５）。ＩＦＴ及びＴＺに加えて、付属タンパク質、及びＧＰＣＲもまた繊毛の機能及び維持のために必須の要因である。
【００１９】
ＮＰＨＰモジュールに関しては、Ｎｐｈｐ４変異マウスは、網膜変性を発症したが、腎嚢胞も重度の繊毛形成欠陥も発症せず、雄は不妊であり、運動性が低下した精子を示した（Ｗｏｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，２０：４８２−９６，  ２０１１）。同様に、該マウスでのＮｐｈｐｌの標的破壊（最後のＣ末端エクソン２０の削除）ではネフロン癆が生じなかったが、Ｐ１４〜Ｐ２１で始まる急速な網膜変性を示し（Ｊｉａｎｇ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１７：３３６８−７９，  ２００８）、雄の不妊を引き起こした（Ｊｉａｎｇ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１８：１５６６−７７，  ２００９）。Ｃｅｐ２９０ノックアウトマウスは、光受容体において結合繊毛を欠いており、運動性上衣繊毛を成熟させることができず、これは、それらの網膜変性及び水頭症の表現型と一致する（Ｒａｃｈｅｌ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，２４：３７７５−９１，  ２０１５）。
【００２０】
ＮＰＨＰ１における突然変異は、最も一般的なＮＰＨＰの原因である。成人発症ＥＳＲＤの患者の大きなコホート（病因については任意抽出）において、ＮＰＨＰ１ホモ接合型全遺伝子欠失（ＮＰＨＰ（ｄｅｌ））によるＮＰＨＰは、すべての成人発症ＥＳＲＤで患者２００人に１人（０．５％）の有病率である（Ｓｎｏｅｋ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，２９：７７２−９，２０１８）。ＥＳＲＤの発症が１８歳から５０歳の患者では発生率が明らかに高かった（有病率０．９％）が、ＮＰＨＰは６１歳まで発症する可能性がある。彼らが使用した方法は、原因となる突然変異の総数を低く見積もっているため、ＮＰＨＰが成人発症ＥＳＲＤの比較的頻繁な単一遺伝子要因であり、現在の日常診療では過小診断される可能性があると結論付けている。
【００２１】
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  （ｉＧｅｎＴＲＡｉＮ）協会からの腎移植レシピエント及び（対応するドナー）対照のコホートにおいて、ＥＳＲＤ（１８〜５０歳）の成人の中で、ＮＰＨＰ１欠失に関してホモ接合型の相対度数約０．５％（５６０６人中２６人）の患者が特定された。これらから、１３％（２６人中３人）のみがＮＰＨＰとして正しく診断され、約半数（２６人中１１人）が原因不明のＣＫＤ患者と診断された。これらの結果は、ＥＳＲＤの成人の２００人中１人（０．５％）以下がＮＰＨＰ１ｄｅｌの遺伝子型であり、この数字は、ＥＳＲＤの発症が１８〜５０歳の範囲内にある場合、０．９％に増えることを示した（Ａｂｓｔｒａｃｔ．ＡＳＮ２０１７＆Ｎｅｐｈｒ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓ，Ｖｏｌ  ３２，  ２０１７）。
【００２２】
本明細書では、新規な疾患及び患者関連の洞察を特定し、それにより、科学的発見を可能にし、その患者管理への移行を促進することを目的とした、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｅｎｇｌａｎｄ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、すなわち、承認された研究者が１００，０００ゲノムプロジェクトのデータセットで研究を行うための安全なワークスペースを用いて生成された知見を記載する。該１００，０００ゲノムプロジェクトのデータセットは、希少疾患患者（及びその親族）とがん患者を含む。このデータセット内で、ＮＰＨＰ１（ｄｅｌ）に関してホモ接合型の患者は、相対度数が約６，０００分の１（６１，５５４人中１０人）と特定されたが、このうち以前にＮＰＨＰと診断された者はなかった。特定された１０人の患者のうち、７人が明白なＮＰＨＰの臨床兆候／症状、例えば、腎もしくは繊毛病の兆候／症状を有するか、または、腎・尿路先天異常（ＣＡＫＵＴ）の患者として動員された。残りの３人の患者は、おそらくは複数の希少疾患を有するより複雑な臨床像を示す。ホモ接合体に加え、１９３人のＮＰＨＰｌ（ｄｅｌ）ヘテロ接合型患者が全データセットで特定された（このデータセット内では約２００分の１の頻度）。これらの患者は、ヘテロ接合型キャリアであり得るが、ＮＰＨＰ１複合ヘテロ接合体（ＮＰＨＰ１（ｄｅｌ）とＮＰＨＰ１機能欠損（ＬＯＦ）突然変異）及び／またはエピスタシス（ＮＰＨＰ１（ｄｅｌ）と別の遺伝子座でのＬＯＦ突然変異の組み合わせ）も含み得る。さらに、患者は、スプライスバリアント、フレームシフト及びナンセンス変異のようなさらなるＮＰＨＰ１−ＬＯＦバリアントを有する場合があり、これらもまた、臨床ＮＰＨＰ所見に寄与し得る。
【００２３】
本明細書に記載のＮＰＨＰ（ｄｅｌ）の知見は、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｅｎｇｌａｎｄのデータベースを用いて行われた研究から得た。本研究は、該データへのアクセス及びＧｅｎｏｍｉｃｓ  Ｅｎｇｌａｎｄ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔによって生成された知見を介して、ならびに研究目的での自身のデータの使用に同意した患者ならびに本研究の適用を受けているデータ及び結果に貢献したＮＨＳの臨床医及び医療チームによって可能になった。Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｅｎｇｌａｎｄ’ｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔは、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（保健省の完全所有会社）によって管理され、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  ＮＨＳ  Ｅｎｇｌａｎｄ、Ｔｈｅ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＵＫ及びｔｈｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌが資金提供している。
【００２４】
世界中で何百万人もの患者がＥＳＲＤ及び先天性症状で苦しんでいるが、その唯一の治療法は移植である。米国だけでも、６００，０００件を超える移植が過去５０年間で行われ、今日の需要はかつてないほど高い。残念ながら、ドナー臓器の可用性は、移植需要に追いつくことができていない。本開示の実施形態は、ＮＰＨＰに関してホモ接合型もしくはヘテロ接合型である患者（例えば、ＮＰＨＰが引き起こすＥＳＲＤ）及び／またはＮＰＨＰ関連の繊毛病の患者（例えば、ＮＰＨＰ１）を特定すること及び／または治療することを含む。
【００２５】
ＮＰＨＰ患者由来の細胞
本明細書では、繊毛病関連の疾患もしくは障害、例えば、ＮＰＨＰ、またはＮＰＨＰ１（ｄｅｌ）関連の疾患もしくは障害の治療に有用な治療薬の特定のための材料及び方法を記載する。かかる方法は、患者由来の細胞株の使用を含む場合がある。開発されたかかる細胞株は、例えば、繊毛病関連の疾患もしくは障害またはＮＰＨＰ１（ｄｅｌ）関連の疾患もしくは障害のための所与の治療法の有効性のモニタリングを含めた他の関連する方法にも使用することができる。
【００２６】
繊毛病と関連する疾患、例えば、ＮＰＨＰを治療するための化合物を特定するため、ＮＰＨＰ患者由来の細胞を入手し、細胞株を確立した。簡潔には、ほとんどがＮＰＨＰ１欠損患者の尿から回収された近位尿細管細胞（ｔｂｃ）である剥離腎上皮細胞を、ＳＶ４０  Ｔ抗原のレトロウイルス遺伝子導入によって不死化した。細胞を固定し、免疫蛍光顕微鏡検査法を用いる検出用に、Ｈｏｅｃｈｓｔ（核染色用）、抗ｙ−チューブリン抗体（基底小体染色用）、及び抗ＡＲＬ１３Ｂ抗体（繊毛染色用）で蛍光標識した。各細胞で単一の繊毛を有する（図１Ａ）大部分の正常な尿由来の腎上皮細胞（ＵＲＥＣ）と対照的に、ほとんどのＮＰＨＰ患者由来の細胞は繊毛を有さない（図１Ｂ）。これらのＮＰＨＰ患者由来の細胞でのＮＰＨＰ発現の欠如をさらにＲＴ−ＰＣＲ（図１Ｃ）及び免疫ブロット（図１Ｄ）で確認したが、ＮＰＨＰ患者由来の細胞ではそれぞれ、検出可能なレベルのＮＰＨＰ  ＲＮＡ及びＮＰＨＰタンパク質発現を示していない。
【００２７】
図２は、目的の細胞における繊毛形成を定量するために使用され得る自動インビトロアッセイを示す。簡潔には、ＮＰＨＰ患者由来の細胞及び対照細胞を完全培地で３９Ｃ（ＳＶ４０発現に対して非許容温度）にて培養し、その後、免疫蛍光顕微鏡検査法を用いた自動繊毛分析で、例えば、％繊毛を単位として繊毛形成を測定した。回転盤プラットフォームを薬物のスクリーニング（図５、Ａ〜Ｊ）及びＧ３マルチオミクスデータセットの繊毛形成分析（図２９、Ａ〜Ｅ）に使用してもよい。Ｏｐｅｒａ  Ｐｈｅｎｉｘプラットフォームを他の表現型分析（例えば、アルプロスタジル及びＣＰ−５４４３２６の繊毛形成滴定、繊毛形成に基づく他のＥＰアゴニストのスクリーニング、他のＮＰＨＰ１患者由来の細胞株を用いた繊毛形成、ａ−チューブリンアセチル化分析）に使用してもよい。
【００２８】
図３は、ＮＰＨＰ患者（ＰＴ１）由来の繊毛細胞のパーセンテージが、対照細胞（ＣＴＲＬ）で見られるものより有意に低いことを示す（ｐ＝０．００６５）。
【００２９】
薬物スクリーニング
上記の繊毛系アッセイは、繊毛形成を回復させる化合物を特定するために使用され得る。図４は、繊毛系アッセイのプロセスを示し、ここでは、例えば、細胞を０日目に細胞培養（例えば、９６ウェルプレート）に播種し、３日目に候補薬物とともにインキュベートし、５日目に固定し、Ｈｏｅｃｈｓｔ、抗ｙ−チューブリン抗体、及び抗ＡＲＬ１３Ｂ抗体で蛍光標識してもよい。例えば、ウェル当たり３５枚の画像の自動ランダム収集が行われ得る。各画像は、＜１μｍの間隔で撮影した１０枚の画像のｚ−スタックを有し得る。核（Ｈｏｅｃｈｓｔ、４６１ｎｍ）、基底小体（γ−チューブリン、５５５ｎｍ）及び繊毛（ＡＲＬ１３ｂ、６４７ｎｍ）の連続画像を得てもよい。
【００３０】
図４に示すプロセスを用いて、ＮＰＨＰ患者由来の細胞をいくつかの候補薬物で処理し、繊毛形成を回復させることができる薬物を特定した。図５、パネルＡ〜Ｊは、それぞれ、フルチカゾン、フェニラミン、ベラパミル、ＭＬ−１４１、ミトキサントロン、トロピセトロン、エトプロパジン、シプロヘプタジン、パクリタキセル、及びシンバスタチンが、様々な試験濃度で、ＤＭＳＯと比較して繊毛形成に有意な影響を与えなかったことを示す。驚くべきことに、図６は、アルプロスタジルが、ＤＭＳＯと比較して、ＮＰＨＰ患者由来の細胞において、繊毛形成を有意に回復させたことを繊毛細胞のパーセンテージの増加によって示している。
【００３１】
アルプロスタジル、すなわち、プロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）は、化学構造
【化１】
2020536936.tif 000003
を有し、これは、心臓病及び勃起障害を治療するための血管拡張、血小板凝集の阻害、ならびに腸管及び子宮平滑筋の刺激に対する活性を示す。アルプロスタジルは、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）であるＥ型プロスタグランジン（ＥＰ）受容体に結合することによってアゴニストとして作用する可能性があり、ＩＣ５０値はＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３及びＥＰ４に対して、それぞれ、３６、１０、１．１及び２．１ｎＭである。ＧＰＣＲは、アデニル酸シクラーゼを刺激し、その後細胞内ｃＡＭＰを上昇させる。
【００３２】
本明細書で使用される、「ＧＰＣＲアゴニスト」は、この受容体に特異的な内因性シグナル伝達分子の作用を模倣するようにＧＰＣＲを活性化する組成物を含む。「ＧＰＣＲアンタゴニスト」は、ＧＰＣＲ活性を阻害する組成物を含む。ＧＰＣＲ活性は、Ｇタンパク質等のエフェクターシグナル伝達分子に結合する能力によって測定され得る。「活性化ＧＰＣＲ」は、Ｇタンパク質と相互作用し、これを活性化することが可能であるものである。阻害された受容体は、細胞外リガンドに結合する能力が低下している可能性、及び／またはＧタンパク質と生産的に相互作用し、これを活性化する能力が低下している可能性がある。
【００３３】
例えば、タプレネパグイソプロピルによるＧＰＣＲアゴニスト治療は、例えば、濃度約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１２ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１４ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１６ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、または約１８ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇで、頻度が例えば、毎日、２日ごと、３日ごと、４日ごと、５日ごと、６日ごと、７日ごと、８日ごと、９日ごと、１０日ごと、週１回、２週間ごと、３週間ごと、または月１回で行われ得る。
【００３４】
繊毛形成を回復させるためのアルプロスタジルの有効濃度を特定するため、自動繊毛分析を１ｎＭ〜２μＭ（図７Ａ）及び１００ｐＭ〜２μＭ（図７Ｂ）のアルプロスタジル滴定で行った。ＧＰＣＲアゴニスト、例えば、アルプロスタジルの有効濃度は、約１ｐＭ〜約１０μＭ、約１０ｐＭ〜約５μＭ、約５０ｐＭ〜約５μＭ、約１００ｐＭ〜約５μＭ、約１ｎＭ〜約５μＭ、約１ｎＭ〜約４μＭ、約１ｎＭ〜約３μＭ、約１ｎＭ〜約２．５μＭ、約１ｎＭ〜約２μＭ、約１０ｎＭ〜約２μＭ、約１００ｎＭ〜約２μＭ、約５００ｎＭ〜約２μＭ、または約１μＭ〜約２μＭであり得る。図７Ｃは、ＩＣ５０特定のための対応する片対数表現を示し、アルプロスタジルが、ＮＰＨＰ患者由来の細胞において、用量依存的に繊毛細胞％を有意に増加させることを示している。
【００３５】
図８Ａ〜８Ｃ及び９（パネルＡ〜Ｄ）は、アルプロスタジル処理（２μＭ）が、対照の正常上皮細胞（ＣＴＲＬ）において、対照（ＤＭＳＯ  ０．０４％）と比較して繊毛形成に有意な影響を及ぼさないことを示すメタ分析を示す（図８Ａ）。対照的に、アルプロスタジル処理は、ＮＰＨＰ患者由来の細胞（ＰＴ１）において、対照（ＤＭＳＯ  ０．０４％）と比較して繊毛形成を有意に増加させる（図８Ｂ）。図８Ｃは、アルプロスタジルがＮＰＨＰ患者由来の細胞で繊毛形成に与える影響が、アルプロスタジル処理を受けない対照細胞、すなわち、対照（ＤＭＳＯ  ０．０４％）に対して約２倍増加することを示す。
【００３６】
メタ分析はまた、繊毛形成に対するアルプロスタジル用量のほぼ直線的な効果も示す。図９（パネルＡ及びＢ）は、例えば、アルプロスタジルが対照の正常上皮細胞での繊毛形成に与える影響に関してＲ２値０．９１９４を示す。同様に、図９（パネルＣ及びＤ）は、アルプロスタジルがＮＰＨＰ患者由来の細胞での繊毛形成に与える影響に関してＲ２値０．８４８９を示す。
【００３７】
アルプロスタジル（ＰＧＥ１）の安定性を特定するため、異なる濃度のアルプロスタジルに曝露した尿由来の腎上皮細胞（ＵＲＥＣ）から、曝露の２４時間及び４８時間後に上清を採取した。サンプルを次に抽出し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ及びＰｏｌａｒ  ＬＣプラットフォームでの分析用に等量に分けた。図１０は、ＰＧＥ１が実験条件下で安定なことを示す。
【００３８】
ＰＧＥ１に加えて、他のＥＰアゴニスト、例えば、化学構造
【化２】
2020536936.tif 000004
を有するプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２またはジノプロストン）及びその長時間作用型誘導体である、化学構造
【化３】
2020536936.tif 000005
を有する１６，１６−ジメチル−ＰＧＥ２（ｄｍＰＧＥ２）もまた、繊毛形成を回復させる能力について調べた。図１１Ａは、ＰＧＥ２及びｄｍＰＧＥ２が、ＮＰＨＰ患者由来の細胞においてアルプロスタジルのものと同様の繊毛形成回復効果を有する一方、対照の正常細胞では有意な効果が認められなかったことを示す。ＮＰＨＰ患者由来の細胞において、繊毛形成の回復にわずかな低下が最も高い濃度（４０μＭのジノプロストン及び２０μＭのｄｍＰＧＥ２）で認められたが、これは細胞毒性に起因する可能性がある。
【００３９】
アルプロスタジル（ＰＧＥ１）がＮＰＨＰ１欠失細胞に与える影響を調べるため、ＮＰＨＰｌ（ｄｅｌ）患者由来の細胞株、例えば、ＰＴ１、１−０３−Ｐ、１−０６−Ｐ１、１−０６−Ｐ２、１−０９−Ｐ、１−１０−Ｐ、及び１−１２−Ｐを、アルプロスタジル（２μＭ）またはＤＭＳＯで処理した。図１１Ｂは、アルプロスタジルがＮＰＨＰ１欠失細胞で繊毛形成率を有意に増加させる一方、アルプロスタジルは正常対照細胞では繊毛形成率に有意な影響を与えないことを示しており、アルプロスタジルがＮＰＨＰ１欠失患者において繊毛形成を回復させるのに有効であることを示唆している。
【００４０】
図１１Ｃのメタ分析は、以前のデータの線形回帰分析を示しており、勾配は、アルプロスタジルが対照細胞及び複数のＮＰＨＰ患者由来の細胞株の繊毛形成に与える影響を反映し、各記号は、独立した実験を表し、各色は、患者の細胞株（１−０９−Ｐ  Ｌ４、１−０６−Ｐ１、１−０６−Ｐ２、ＰＴ−１として指定）を表す。対照の正常上皮細胞のデータに関する線形回帰は、０，７６６５〜０，９９７４の勾配値を示し、アルプロスタジルが繊毛形成に与える影響の欠如を示唆している。対照的に、複数のＮＰＨＰ患者由来の細胞に関する線形回帰は、統合勾配値１．４１４または勾配値の範囲１．３３３〜１．５０６を示し、繊毛形成に対するアルプロスタジルの促進効果を示している。
【００４１】
プロスタグランジンは、ほとんどのヒト組織で見出され、必須脂肪酸から合成される。様々なプロスタグランジン間の構造の違いは、生物活性の変化の主要因である。プロスタグランジンを含めたプロスタノイドは、腎臓で豊富に産生される。このプロスタノイドは、ホスホリパーゼＡ２による膜リン脂質からのアラキドン酸（ＡＡ）の放出によって生じる。アラキドン酸は、シクロオキシゲナーゼ（またはプロスタグランジンＧ／Ｈシンターゼ）のビスオキシゲナーゼ及びペルオキシダーゼ活性に供され、プロスタグランジンＧ２（ＰＧＧ２）、次いでプロスタグランジンＨ２（ＰＧＨ２）を形成する。ＰＧＨ２は、ＰＧＥ２シンターゼ、ＰＧＤ２シンターゼ、プロスタサイクリンシンターゼ、ＰＧＦ２αシンターゼ（ＰＧＦ２αはまた、ＰＧＥ２から直接合成され得る）及びトロンボキサンシンターゼを含めたシンターゼの基質であり、ＰＧＥ２を含めた個々のクラスのプロスタノイドを合成する。これらのクラスはすべて、ＥＰ１〜４を含めた異なる受容体サブタイプを有し、そのサブタイプを介してこれらのクラスはその作用を開始する。シクロオキシゲナーゼ１及び２（ＣＯＸ１及びＣＯＸ２）は、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）の第一標的であるが、それらはいずれかのアイソフォームに特異的、すなわち選択的であるか、または非選択的であり得る。ＣＯＸの阻害を介したＰＧＨ２産生の遮断は、すべての下流のプラスタノイドのレベルを低下させ得る。
【００４２】
繊毛形成におけるＰＧＥ
ＰＧＥ２は、腎病態生理学において最もよく特徴づけられているプロスタノイドである。ＰＧＥ２は、ＣＯＸ１及びＣＯＸ２によって合成され、Ｌｋｔ／ＡＢＣＣ４トランスポーターを介して細胞膜に輸送される。放出されたＰＧＥ２は、繊毛のＥＰ４受容体に結合し、ＧＰＣＲ（Ｇｓ）及びアデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）を活性化してｃＡＭＰを増加させ、それにより、順行性ＩＦＴを増加させ、繊毛形成を高める。
【００４３】
繊毛の形成及び伸長には、ＣＯＸ−Ｌｋｔ／ＡＢＣＣ４−ＥＰ４シグナル伝達カスケードが必要である（マウス腎臓集合管細胞ＩＭＣＤ３及びゼブラフィッシュモデルにおいて）。ｃＡＭＰ依存性キナーゼシグナル伝達は、繊毛形成の過程で順行性ＩＦＴを増加させることが知られている。Ｌｋｔ／ＡＢＣＣ４が媒介するＰＧＥ２シグナル伝達は、ｃＡＭＰレベルに影響を及ぼし、ＩＦＴの順行速度の増加を介して繊毛形成を促進する。ＰＧＥ２処理は、ＩＭＣＤ３細胞において繊毛形成の過程で細胞内ｃＡＭＰを増加させるが、Ｃａ２＋は増加させない。ＰＧＥ２は、自己分泌及び／または傍分泌式に作用し、細胞は、それ自体から放出されたＰＧＥ２に応答する場合もあれば、それらの近傍から放出されたＰＧＥ２に応答する場合もある。ヒトがん細胞では、ＰＧＥ２とＥＰ４受容体の相互作用がＷｎｔ／ｐ−カテニンシグナル伝達を誘導し、ＣＯＸ２発現を引き起こし、それにより、さらなるＰＧＥ２合成につながる正のフィードバックループを設定する。
【００４４】
図１２は、外因性ＰＧＥ２の添加が繊毛長及び繊毛細胞のパーセンテージの両方を対照細胞では増加させたが、ＥＰ４枯渇細胞では増加させなかったことを示し、ＥＰ４が繊毛形成の過程でＰＧＥ２シグナル伝達の下流で作用することを示している。
【００４５】
ＰＧＥ２は、ＰＧＥシンターゼ（ＰＧＥＳ）によって産生され、そのＧＰＣＲ、すなわち、ＥＰ１〜４に結合することでシグナル伝達する。ＥＰ１（Ｇｑと共役）の活性化は、ＰＬＣを介して細胞内Ｃａ２＋を増加させる。ＥＰ３（Ｇｉと共役）の活性化は、ＰＬＣを介して細胞内Ｃａ２＋を増加させ、及び／またはアデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）を介してｃＡＭＰ産生を阻害する。ＥＰ２またはＥＰ４（両方ともＧｓと共役）の活性化は、ＡＣを介してｃＡＭＰ産生を促進する。
【００４６】
約８００のヒトＧＰＣＲが存在し、これらは５つの主要な系統発生ファミリー、すなわち、ロドプシン、セクレチン、Ａｄｈｅｓｉｏｎ、グルタミン酸及びＦｒｉｚｚｌｅｄ／Ｔａｓｔｅ２に分けられる。ＧＰＣＲは、組み換えタンパク質、小分子化合物、アロステリックリガンドまたは抗体にとって魅力的な標的である。４６のＧＰＣＲが、高血圧、痛み、潰瘍、アレルギー、アルコール依存症、肥満、緑内障、精神病性障害及びＨＩＶの薬物標的としての機能を果たしている。多くの主要な障害の１つは、推定ＧＰＣＲと正確な生理学的機能または病状との関連に関する全体的な知識不足である。
【００４７】
図１３は、ＥＰ１〜４が、腎臓及び網膜で発現されること、両器官がＮＰＨＰ及びＮＰＨＰ−ＲＣで影響を受けていることを示す。腎臓では、ＥＰ受容体はネフロンに沿って差次的に発現し、腎臓における各ＥＰ受容体サブタイプの活性化がもたらす異なる機能的結果を強調している。ＥＰ受容体は、輸入細動脈の血管緊張を調節し、ここでは、ＥＰ１／ＥＰ３が血管を収縮させるものとして作用し、ＥＰ２／ＥＰ４が血管を拡張するものとして作用する。ＥＰ１／ＥＰ４は近位尿細管輸送を調節する。ＥＰ３及びＥＰ４は、太い上行脚及び遠位尿細管輸送を調節する。ＥＰ４は、緻密斑からのレニン放出を促進する。ＥＰ２／ＥＰ４は、直細血管を拡張する。ＥＰ受容体は、ＥＰ１がＮａ＋の再吸収を阻害し、ＥＰ３がＨ２Ｏの再吸収を阻害し、ＥＰ４がＨ２Ｏの再吸収を促進することにより、集合管輸送を調節する。
【００４８】
ＵＲＥＣにおけるＥＰ受容体を含めたＰＧ経路の成分の発現は、ｑＲＴ−ＰＣＲで測定した。図１４Ａは、ＥＰ２及びＥＰ４がｍＲＮＡレベルで発現されること、及びＥＰ２が主にｉｍＲＮＡレベルで発現されることを示す。図１４Ｂは、ＵＲＥＣにおけるＥＰ２タンパク質発現を示す。
【００４９】
ＰＧＥ２モジュレーター（ＥＰ２）
ＥＰ２受容体の選択的アゴニスト及びアンタゴニストは、例えば、参照することにより組み込まれるＭａｒｋｏｖｉｃ，Ｔ．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｓｕｂｔｙｐｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ＥＰ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ”Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ．２０１７、２２（１）：５７−７１に示されている。第一のクラスのアゴニストは、内因性リガンドＰＧＥ２と構造的に似ているが、ω−親油性鎖に効力及び選択性の向上に寄与する主な修飾を組み込むリガンドを含む。第二のクラスのアゴニストは、非プロスタノイド系のピリジルスルホンアミド誘導体であり、その最も強力なものはタプレネパグイソプロピル（ＰＦ  ０４２１７３２９、ＣＰ５４４３２６のプロドラッグ）である。タプレネパグは、非プロスタノイド構造
【化４】
2020536936.tif 000006
を有する。
【００５０】
第三のクラスのアゴニストとしては、非プロスタノイド系のＮ−フェニル−ｙ−ラクタム誘導体が挙げられ、これには、ＡＧＮ−２１  ０６６９及びＡＧＮ−２１  ０９６１が含まれる。
【００５１】
ＰＦ−０４４１  ８９４８、アゼチジン−３−カルボン酸誘導体は、最初の選択的ＥＰ２アンタゴニストであり、これはＩＣ５０  １６ｎＭ（Ｋｂ＝１．８ｎＭ）を有し、他のプロスタノイド受容体に対して、ＥＰ２受容体の選択性において＞１０，０００倍の増加を示す。
【００５２】
Ｍａｒｋｏｖｉｃの図５（参照することにより組み込まれる）は、ＥＰ４受容体の選択的アゴニスト、すなわち、（ａ）官能化シクロペンタンコアに基づく誘導体、（ｂ）ヒドロキシシクロペンタノンコアのラクタム対応部分を有する誘導体、及び（ｃ）構造的に多様なＥＰ４アゴニストを示す。バイオアベイラビリティの改善を意図して末端カルボン酸官能基の代わりにテトラゾールの特徴をａ鎖に導入し、Ｌ９０２，６８８、すなわち、ＥＰ４受容体のサブナノモルアゴニストの発見につながった（ＥＣ５０＝０．２ｎＭ）。Ｌ９０２，６８８は、プロスタノイド構造
【化５】
2020536936.tif 000007
を有する。
【００５３】
低ナノモルＥＰ４アゴニストであるＫＡＧ−３０８の構造
【化６】
2020536936.tif 000008
は、これが７，７−ジフルオロプロスタサイクリン骨格に基づく唯一のものであることから、ＥＰ４アゴニストの分野ではやや独特である。
【００５４】
Ｍａｒｋｏｖｉｃの図６（参照することにより組み込まれる）は、ＥＰ４受容体の選択的アンタゴニストと、最小限の構造変化の結果としての機能的反応の切り替え、すなわち、（ａ）ＥＰ４受容体の選択的アンタゴニスト、及び（ｂ）ＥＰ４受容体におけるアゴニズムとアンタゴニズムの切り替えを示す。ＰＧ−１  ５３１、すなわち、三置換フラン誘導体は、ナノモルＥＰ４アンタゴニストであり、優れた選択性プロファイル及び向上した水溶性を有する。該分子に若干の修飾を導入することにより、ＥＰ４受容体における後者の固有活性を微調整することが可能である（例を図１７に示す）。例えば、固有活性（アゴニズム対アンタゴニズム）は、図１７（パネルｂ）の化合物のベンジル基のトリフルオロメチル置換基の置換パターンのみに依存することを示した。劇的な機能の変化は、リガンド構造の最小限の変化により達成され得る。
【００５５】
図１５は、繊毛形成に対する影響を調べたＰＧモジュレーター（アゴニスト及びアンタゴニスト）を示す。
【００５６】
図１６Ａは、非プロスタノイドＥＰ２アゴニストであるＣＰ−５４４３２６が、アルプロスタジルと同様のレベルまで繊毛形成を回復させることを示す。図１６Ｂは、ＣＰ−５４４３２６が、繊毛形成を用量依存的に回復させることをＤＭＳＯと比較して示す。図１６Ｃは、図１６Ｂの結果の片対数表現であり、ＣＰ−５４４３２６滴定は、ＥＰ２に対してＥＣ５０＝１１ｎＭを示す。非プロスタノイドであるＣＰ−５４４３２６に関する繊毛形成の回復は、作用機序におけるその特異性を裏付ける。対照的に、図１７Ａは、プロスタノイドＥＰ４アゴニストであるＬ−９０２．６８８が、繊毛形成に有意な影響を及ぼさないことを示す。これらの結果は、ＥＰ２が、繊毛形成においてＥＰ４より重要な役割を果たすことを示す。
【００５７】
図１７Ｃは、アルプロスタジルと同様、ＣＰ−５４４３２６処理が、ＮＰＨＰｌ（ｄｅｌ）患者由来の複数の細胞株、例えば、１−０９−Ｐ、１−０６−Ｐ１及び１−０６−Ｐ２における繊毛形成を増加させることをＤＭＳＯで処理されたものと比較して示す。図１７Ｄのメタ分析は、図１７Ｄの線形回帰分析を示し、勾配は、ＣＰ−５４４３２６が対照細胞及び複数のＮＰＨＰ患者由来の細胞株の繊毛形成に与える影響を反映し、各記号は、独立した実験を表し、各色は、患者の細胞株（１−０９−Ｐ  Ｌ４、１−０６−Ｐ１、１−０６−Ｐ２、ＰＴ−１として指定）を表す。対照の正常上皮細胞のデータに関する線形回帰は、０．６３６９〜１．０３の勾配値を示し、ＣＰ−５４４３２６が繊毛形成に影響を及ぼさないことを示唆している。対照的に、複数のＮＰＨＰ患者由来の細胞に関する線形回帰は、統合勾配値１．３６または勾配値の範囲１．２４５〜１．５３２を示し、繊毛形成に対するアルプロスタジルの促進効果を示している。
【００５８】
差次的発現分析
マイクロアレイ分析を行い、アルプロスタジルが媒介する繊毛形成の回復に関与する発現遺伝子を特定した。ＵＲＥＣを９６ウェルのプレートで培養し、図１８に要約するように、異なる濃度のアルプロスタジルで処理し、その後ＲＬＴまたはＱｉａｚｏｌ法を用いてＲＮＡ抽出を行った。
【００５９】
図１９は、階層的クラスタリングにより分析したサンプルのマイクロアレイデータを示す。最初にデータを抽出のタイプ（Ｑｉａｚｏｌ対ＲＬＴ）によりクラスター化した。Ｑｉａｚｏｌサンプルを次に条件、例えば、対照対アルプロスタジル処理でクラスター化し、ＲＬＴサンプルを次に反復によりクラスター化した。
【００６０】
図２０は、階層的クラスタリングにより分析したサンプルのマイクロアレイデータを示す。Ｑｉａｚｏｌ抽出サンプルから得たデータを、処理内での用量や対照内での培地／ＤＭＳＯによるのではなく、条件により、次に反復によりクラスター化した。
【００６１】
図２１は、階層的クラスタリングにより分析したサンプルのマイクロアレイデータを示す。ＲＬＴ抽出サンプルから得たデータを、処理内での用量や対照内での培地／ＤＭＳＯによるのではなく、反復により、次に条件（対照対アルプロスタジル処理）によりクラスター化した。
【００６２】
ＲＬＴ抽出サンプルから得たマイクロアレイデータに関しては、ＤＭＳＯと培地間で有意な差はなく、例えば、調節されたエクソン／パターンのない４つの差次的に発現された遺伝子のみであった。図２２は、しかしながら、対照（ＤＭＳＯ）とアルプロスタジル処理（０．２μＭ、２μＭ及び１０μＭ）を比較して、３つのアルプロスタジル濃度の比較にわたって、ほぼ同数の発現遺伝子及び調節遺伝子を示している。上位３つの調節遺伝子もまたほぼ同じであり、同じシグナル伝達経路、例えば、細胞接着及び細胞外マトリクスの下方制御を共有する。
【００６３】
Ｑｉａｚｏｌ抽出サンプルから得たマイクロアレイデータに関しては、ＤＭＳＯと培地間で有意な差はなく、例えば、調節されたエクソン／パターンのない３３の差次的に発現された遺伝子であった。しかしながら、図２６に示すように、対照（ＤＭＳＯ）とアルプロスタジル処理（０．２μＭ、２μＭ及び１０μＭ）を比較すると、３つのアルプロスタジル濃度の比較にわたって、ほぼ同数の発現遺伝子及び調節遺伝子が存在する。上位３つの調節遺伝子もまたほぼ同じであり、同じシグナル伝達経路、例えば、細胞接着及び細胞外マトリクスの下方制御、ならびにインターフェロンシグナル伝達の上方制御を共有する。
【００６４】
さらに、図２４Ａ及び２４Ｂは、合計３１０遺伝子、すなわち、「クラスター１」＝１２０の下方制御された遺伝子及び「クラスター２」＝１９０の上方制御された遺伝子をまとめ、２つのクラスターが定義されたことを示す。これは、様々な用量から得られたマイクロアレイデータ間で有意差が検出されなかったことを示す。
【００６５】
さらに、アルプロスタジル処理の有無にかかわらない患者のマイクロアレイデータと、対照対患者のＲＮＡｓｅｑのものを交差させることによる経路分析で、アルプロスタジルが、対照細胞と比較してＮＰＨＰ患者由来の細胞において認められる遺伝子発現の変化を逆転できることが明らかになった。
【００６６】
マルチオミクス解析
図２５は、繊毛形成に対する薬効のマルチオミクス解析のプロセスを示す。図２６Ａ〜２６Ｅは、例えば、５つの独立した実験において、アルプロスタジルが繊毛形成に与える影響、例えば、繊毛細胞％の表現型分析を示す。これらの結果は、ｎ＝１〜５において、用量依存的な反応なしに同様の倍率でアルプロスタジルが部分的に繊毛形成を回復させることを示している。
【００６７】
図２７は、マルチオミクスデータ（ＤＭＳＯ  ０．０４％中のＮＰＨＰ患者由来の細胞とアルプロスタジル２μＭで処理したＮＰＨＰ患者由来の細胞）のタンパク質差次的発現分析から特定されたドラッグド（ｄｒｕｇｇｅｄ）及びドラッガブル（ｄｒｕｇｇａｂｌｅ）遺伝子の要約を示し、そこからドラッグド遺伝子を命名している。
【００６８】
図２８（Ａ〜Ｃ）は、（Ａ）プロスタグランジンＥ１（アルプロスタジル）下流相互作用、（Ｂ）ＮＰＨＰ１上流相互作用及び（Ｃ）ＮＰＨＰ１〜２０遺伝子関連直接相互作用に関するマルチオミクスデータからの経路分析（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓを使用）、ならびに関連する標的機会を示す。
【００６９】
インビボモデル
図２９は、ゼブラフィッシュＮＰＨＰ４モルホリノ（ＭＯ）モデルからの結果を示し、ここでは、単細胞期の野生型のゼブラフィッシュ胚に、ＮＰＨＰ４  ｍＲＮＡの開始部位をリボソーム結合から遮断するモルホリノ（例えば、ＮＰＨＰ４  ＡＴＧ  ＭＯ）を注射した。このモルホリノは、ＮＰＨＰ４  ｍＲＮＡの翻訳を特異的に阻害する。ゼブラフィッシュＮＰＨＰ４  ＭＯは、体表面彎曲、前腎嚢胞、側性（心臓ルーピング）欠損、及び排せつ腔拡張（閉塞）を含めた古典的な繊毛病関連の表現型を示す。
【００７０】
図３０は、ゼブラフィッシュＮＰＨＰ４  ＭＯモデルの薬物処理のプロトコル（アルプロスタジル：０．５μＭ及び５μＭ）を示す概略図である。簡潔には、野生型Ｔｇ（ｗｔ１ｂ：ＧＦＰ）トランスジェニックゼブラフィッシュ胚に、モルホリノ（例えば、ｎｐｈｐ４  ＡＴＧ  ＭＯ）を単細胞期で注射した。受精後時間（ｈｐｆ）８時間で、注射胚をＰＴＵ−卵海水中、薬物または媒体で処理した（１２ウェルプレートに１ｍＬ）。２４ｈｐｆで、薬物処理を更新し、プロナーゼを３６ｈｐｆで加えて絨毛膜を除去した。５４ｈｐｆで、ゼブラフィッシュ胚の表現型、特に体表面彎曲及び糸球体の前腎嚢胞について、適切な手段、例えば、それぞれ、立体鏡及びＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｏｐｅｒａ  Ｐｈｅｎｉｘ  ＨＣＳシステムを用いて調べた（Ｔｇ（ｗｔ１ｂ：ＧＦＰ）導入遺伝子で標識）。
【００７１】
図３１、パネルＡは、ＤＭＳＯ（０．０４％）が野生型ゼブラフィッシュ胚に致死性、体表面彎曲、前腎嚢胞のいずれも誘導しなかったことを示す。さらに、ＮＰＨＰ４発現に影響を及ぼさない対照モルホリノを注射したゼブラフィッシュもまた、体表面彎曲（図３１、パネルＢ）や前腎嚢胞（図３１、パネルＣ）を示さなかった。対照的に、ＮＰＨＰ４  ＭＯを注射したゼブラフィッシュは、例えば、体表面彎曲（図３１、パネルＢ）及び前腎嚢胞（図３１、パネルＣ）を含めた古典的な繊毛病関連の表現型を用量依存的に示す。
【００７２】
図３２、パネルＡは、４つのカテゴリー、すなわち、正常、クラスＩ、クラスＩＩ及びクラスＩＩＩのゼブラフィッシュの代表的な体軸彎曲を示す。図３５、パネルＢは、アルプロスタジル処理（０．５μＭ及び５μＭ）が、ゼブラフィッシュＮＰＨＰ４  ＭＯの体軸彎曲にＤＭＳＯ処理のものと比較して有意に影響を及ぼさなかったことを示す（ｐ＞０．０５、フィッシャーの正確検定）。同様に、自動定量化パラメータとして体表面彎曲を使用して、図３２、パネルＣは、アルプロスタジル処理（０．５μＭ及び５μＭ）が、ゼブラフィッシュＮＰＨＰ４  ＭＯの背部彎曲にＤＭＳＯ処理のものと比較して有意に影響を及ぼさなかったことを示す。
【００７３】
図３３、パネルＡは、ゼブラフィッシュの代表的な前腎嚢胞、すなわち、正常、軽度及び重度を示す。図３３、パネルＢは、アルプロスタジル処理（０．５μＭ）がｎｐｈｐ４  ＭＯ注射胚の重度の前腎嚢胞のパーセンテージをＤＭＳＯ処理のものと比較して有意に低下させたことを示す（ｐ＜０．０５、フィッシャーの正確検定）。同様に、図３３、パネルＣは、アルプロスタジル処理（５μＭ）がｎｐｈｐ４  ＭＯ注射胚の重度の前腎嚢胞のパーセンテージをＤＭＳＯ処理のものと比較して有意に低下させたことを示す。
【００７４】
ジノプロストン（ＰＧＥ２）が繊毛病に与える影響を調べるため、ゼブラフィッシュＮＰＨＰ４  ＭＯをジノプロストン（５０μＭ）またはＤＭＳＯで処理した。図３４、パネルＡは、ジノプロストン処理がゼブラフィッシュＮＰＨＰ４  ＭＯの正常体軸彎曲％をＤＭＳＯ処理のものと比較して有意に増加させることを示す（ｐ＝０．００６６、フィッシャーの正確検定）。図３４、パネルＢは、しかしながら、ジノプロストン処理がゼブラフィッシュＮＰＨＰ４  ＭＯの背部彎曲にＤＭＳＯ処理のものと比較して有意に影響を及ぼさなかったことを示す（ｐ＝０．０５７７、ｔ検定）。図３４、パネルＣは、ジノプロストン処理がＤＭＳＯ処理のものと比較して、ゼブラフィッシュＮＰＨＰ４  ＭＯの重度及び軽度の前腎嚢胞％を有意に低下させ、正常前腎嚢胞％を有意に増加させたことを示す（ｐ＜０．００８、フィッシャーの正確検定）。
【００７５】
選択的ＥＰ２アゴニストであるＣＰ−５４４３２６の影響を調べるため、ゼブラフィッシュＮＰＨＰ４  ＭＯをＣＰ−５４４３２６（１００ｎＭ）またはＤＭＳＯで処理した。図３５は、ＣＰ−５４４３２６処理が、ＤＭＳＯ処理のものと比較して、ゼブラフィッシュＮＰＨＰ４  ＭＯの重度の前腎嚢胞％を有意に低下させ、軽度及び正常前腎嚢胞％を増加させることを示す（ｐ＜０．０１、フィッシャーの正確検定）。
【００７６】
タプレネパグイソプロピル（ＰＦ  ０４２１７３２９、ＣＰ−５４４３２６のプロドラッグ）及びタプレネパグ（ＣＰ−５４４３２６）のインビボでの安定性を調べるため、薬物動態学的（ＰＫ）試験を野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスで行った。図３６は、このＰＫ試験デザインを示す。タプレネパグイソプロピル（１ｍｇ／ｋｇもしくは８ｍｇ／ｋｇ）またはタプレネパグ（８ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射後、これら化合物の様々な器官での濃度を異なる時点で測定した。それらの結果は、一般的に、血漿（図３７Ａ）、腎臓（図３７Ｂ）、精巣（図３７Ｃ）、網膜（図３７Ｄ）、及び硝子体液（図３７Ｅ）では、タプレネパグがタプレネパグイソプロピルよりも安定であることを示す。
【００７７】
ＮＰＨＰ１のホモ接合型欠失は、若年性ネフロン癆１の最も一般的な原因である。ＮＰＨＰ１のホモ接合型または複合ヘテロ接合型変異はまた、例えば、ジュベール症候群４（脳異常）及びＳｅｎｉｏｒ−Ｌｏｋｅｎ症候群１（網膜症）とも関連している。ＮＰＨＰ１  ＫＯ動物を作製し、タプレネパグがこれらの疾患の治療に使用できるかどうかを調べた。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で操作されたＮｐｈｐｌ−／−マウスモデルを確立するため、シングルガイドＲＮＡをＣ５７ＢＬ／６Ｊ胚に注射し、Ｎｐｈｐｌのエクソン１のＡＴＧを含む７６ｂｐの欠失を作製した。Ｎｐｈｐｌ−／−マウスモデルの自然な生長を特徴づけるため、Ｎｐｈｐ１＋／＋及びＮｐｈｐｌ−／−マウスの腎臓及び網膜切片の組織化学染色を行った。Ｎｐｈｐｌ−／−マウスモデルは腎表現型を示さない。対照的に、Ｐ１４齢Ｎｐｈｐｌ−／−マウスは、Ｐ２８でサクリファイスされるまで、光受容体層の厚さの減少を示し始め（例えば、内節（ＩＳ）、外節（ＯＳ）及び外核層（ＯＮＬ））、繊毛病関連の兆候に対応するこのモデルでの急速な網膜変性を示す。
【００７８】
網膜変性を評価するため、半自動ツールを開発し、網膜切片に手動でマークした５つの離れた平面での各網膜層の検出及び定量的厚さ測定を行った（図３８Ｂ）。半自動定量分析は、光受容体層ＯＮＬ、ＩＳ及びＯＳの厚さの明らかな減少を裏付ける（図３８Ｃ）。
【００７９】
Ｎｐｈｐｌ欠失がこのモデルの光受容体の構造機構に与える影響を調べるため、免疫組織化学（ＩＨ）分析をＮｐｈｐ１＋／＋及びＮｐｈｐｌ−／−マウスの網膜切片で行った（図３９Ａ及びＢ）。組織を固定し、ＤＡＰＩ（核染色用）、抗ロドプシン抗体（ＯＳ染色用）、ならびに抗Ｃｅｐ２９０抗体（結合繊毛染色用）またはＰＮＡ（ＯＳ及びＩＳ染色用）で蛍光標識し、免疫蛍光顕微鏡検査法を用いて検出した。図３９Ａは、Ｎｐｈｐ１−／−マウスモデルが、ＯＳに沿ってロドプシンが局在化し、結合繊毛においてＣｅｐ２９０の点状の分布により囲まれたよく組織化された光受容体構造を示すことを示す。これは、結合繊毛が、ＩＳから感光性ＯＳへロドプシンを輸送するのに機能的であることを示す。対照的に、Ｎｐｈｐｌ−／−マウスは、結合繊毛を形成することができず、ＩＳ及びＯＳでの明らかなロドプシンの誤局在化を示し、ロドプシンの輸送が結合繊毛の正確な形成／維持を必要とすることを示唆する。一致して、図３９Ｂは、Ｎｐｈｐ１＋／＋マウスとは対照的に、Ｎｐｈｐｌ−／−マウスが、ＩＳ／ＯＳ、及びＯＮＬでも同様に明らかなロドプシンの誤局在化を示すことを示す。
【００８０】
Ｎｐｈｐｌ欠失が光受容体の機能に与える影響を評価するため、異なる強度の光刺激下、網膜電図（ＥＲＧ）をＮｐｈｐ１＋／＋及びＮｐｈｐ１−／−マウスで行った（図４０Ａ〜Ｃ）。図４０Ａ及びＢは、所与の光強度に関して、Ｐ２１で同じ動物から記録されたＥＲＧのａ波及びｂ波を示す。Ｎｐｈｐ１＋／＋マウスとは対照的に、Ｎｐｈｐ１−／−マウスは、所与の光刺激強度で劇的に低いＥＲＧの振幅を示す。図４０Ｃは、異なる強度の光刺激下のＥＲＧのａ波の拡大図であり、ａ波は光受容体機能を反映している。
【００８１】
ＣＰ−５４４３２６が繊毛病関連の表現型に与える影響を調べる前に、潜在的な標的であるＥＰ２の発現を免疫組織化学により調べた。蛍光顕微鏡検査法により、ＥＰ２が、Ｐ２１齢のＮｐｈｐ７＋／＋及びＮｐｈｐｌ−／−マウスの光受容体層ＩＳ及びＯＮＬにおいてタンパク質レベルでよく発現されることが明らかであるが、ＯＳ／ＩＳ／ＯＮＬの境界は、Ｎｐｈｐｌ−／−マウスでは区別するのが困難であった。
【００８２】
図４２は、ＣＰ−５４４３２６がＮｐｈｐ７−／−マウスモデルで生じる網膜変性に与える影響を評価するための実験デザインを示す。簡潔には、動物に、媒体またはＣＰ−５４４３２６の媒体溶液（１８ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを３日ごとまたは４日ごとに、Ｐ６〜Ｐ２１まで注射した（ｉ．ｐ．）。表現型の計測値は、Ｎｐｈｐｌ−／−マウスモデルの特性評価用に前述した構造的及び機能的パラメータを含む。
【００８３】
図４３は、ＩＨＣ切片の網膜層の半自動定量から計算したＯＮＬ／ＯＰＬ比で表される、ＣＰ−５４４３２６が光受容体層ＯＮＬの厚さに与える影響を示す。ＣＰ−５４４３２６処理（１８ｍｇ／ｋｇ）は、Ｎｐｈｐ７−／−マウスにおけるＯＮＬ／ＯＰＬ比の低下を、媒体処理のものと比較して有意に抑える（ｐ＜０．０５、マン・ホイットニー検定）。同様に、ＣＰ−５４４３２６処理（１８ｍｇ／ｋｇ）は、蛍光顕微鏡検査法により、ＩＨＣ切片で、半自動的に定量化されるパラメータ「ＯＮＬにおける平均緑色強度」として表される、Ｎｐｈｐｌ−／−マウスにおけるロドプシンの誤局在化を有意に抑えた（ｐ＜０．０５、独立ｔ検定）（図４４）。
【００８４】
ＣＰ−５４４３２６が光受容体の反応性に与える影響を評価するため、異なる強度の光刺激下、網膜電図（ＥＲＧ）をＣＰ−５４４３２６（１８ｍｇ／ｋｇ）または媒体で処理したＮｐｈｐ１＋／＋及びＮｐｈｐ１−／−マウスで行った。ＥＲＧのａ波の拡大図（図４５）は、ＣＰ−５４４３２６（１８ｍｇ／ｋｇ）が、媒体処理Ｎｐｈｐｌ＾マウスのものと比較して、光受容体反応の振幅にわずかな改善をもたらすことを示す。
【００８５】
本明細書で引用されたすべての参考文献は、各参考文献が参照することにより組み込まれることが具体的かつ個別に示されたものとして、参照することにより本明細書に組み込まれる。上記の要素の各々、または２つ以上を合わせたものは、上記のタイプとは異なる他のタイプの方法においても有用な用途を見出し得ることが理解されよう。さらなる分析をすることなく、上記は本開示の主旨を十分に明らかにするため、他の者は、現在の知識を適用することによって、先行技術の観点から、一般的なまたは、添付の特許請求の範囲に示される本開示の特定の態様の本質的な特徴を適正に構成する特徴を省略することなく、様々な用途にこれを容易に適合させる。前述の実施形態は、例としてのみ提示されており、本開示の範囲は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１】
2020536936.tif 000009
【図２】
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【図３】
2020536936.tif 000011
【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３３】
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【図３４−１】
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【図３４−２】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３７Ｄ】
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【図３７Ｅ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【国際調査報告】
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