(57)【要約】  ムコ多糖症I型(MPS I)と診断されたヒト対象の中枢神経系(CNS)の脳脊髄液に、完全ヒトグリコシル化(HuGly)α-L-イズロニダーゼ(IDUA)を送達するための組成物及び方法を記載する。【選択図】図１
2020508289.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ムコ多糖症I型(MPS I)と診断されたヒト対象の治療方法であって、該ヒト対象の脳の脳脊髄液にヒト神経細胞によって生産された治療有効量の組換えヒトα-L-イズロニダーゼ(IDUA)を送達することを含む、前記方法。
【請求項２】
MPS Iと診断されたヒト対象の治療方法であって、該ヒト対象の脳の脳脊髄液にヒトグリア細胞によって生産された治療有効量の組換えヒトIDUAを送達することを含む、前記方法。
【請求項３】
ヒトIDUAによる治療の前に、又はそれと同時に、前記対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続することをさらに含む、請求項1又は2記載の方法。
【請求項４】
MPS Iと診断されたヒト対象の治療方法であって：
該ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のα2,6-シアル酸付加ヒトIDUAを送達すること；及び
該ヒトIDUAによる治療の前又はそれと同時に、該対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続すること、を含む、前記方法。
【請求項５】
ムコ多糖症I型(MPS I)と診断されたヒト対象の治療方法であって：
該ヒト対象の脳の脳脊髄液に検出可能なNeuGcを含まない治療有効量のグリコシル化ヒトIDUAを送達すること；及び
該ヒトIDUAによる治療の前又はそれと同時に、該対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続すること、を含む、前記方法。
【請求項６】
ムコ多糖症I型(MPS I)と診断されたヒト対象の治療方法であって：
該ヒト対象の脳の脳脊髄液に検出可能なNeuGc及び/又はα-Gal抗原を含まない治療有効量のグリコシル化ヒトIDUAを送達すること；並びに
該ヒトIDUAによる治療の前又はそれと同時に、該対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続すること、を含む、前記方法。
【請求項７】
ムコ多糖症I型(MPS I)と診断されたヒト対象の治療方法であって：
該ヒト対象の脳の脳脊髄液にチロシン硫酸化を含む治療有効量のヒトIDUAを送達すること；並びに
該ヒトIDUAによる治療の前又はそれと同時に、該対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続すること、を含む、前記方法。
【請求項８】
ムコ多糖症I型(MPS I)と診断されたヒト対象の治療方法であって：
該ヒト対象の脳にヒトIDUAをコードする発現ベクターを投与することであって、該IDUAがヒト不死化神経細胞において該発現ベクターから発現される際にα2,6-シアル酸付加される、前記投与すること；及び
該発現ベクターの投与の前又はそれと同時に、該対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続すること、を含む、前記方法。
【請求項９】
ムコ多糖症I型(MPS I)と診断されたヒト対象の治療方法であって：
該ヒト対象の脳にヒトIDUAをコードする発現ベクターを投与することであって、該IDUAがヒト不死化神経細胞において該発現ベクターから発現される際にグリコシル化されるが検出可能なNeuGcを含まない、前記投与すること；及び
該発現ベクターの投与の前又はそれと同時に、該対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続すること、を含む、前記方法。
【請求項１０】
ムコ多糖症I型(MPS I)と診断されたヒト対象の治療方法であって：
該ヒト対象の脳にヒトIDUAをコードする発現ベクターを投与することであって、該IDUAがヒト不死化神経細胞において該発現ベクターから発現される際にグリコシル化されるが検出可能なNeuGc及び/又はα-Gal抗原を含まない、前記投与すること；並びに
該発現ベクターの投与の前又はそれと同時に、該対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続すること、を含む、前記方法。
【請求項１１】
ムコ多糖症I型(MPS I)と診断されたヒト対象の治療方法であって：
該ヒト対象の脳にヒトIDUAをコードする発現ベクターを投与することであって、該IDUAがヒト不死化神経細胞において該発現ベクターから発現される際にチロシン硫酸化される、前記投与すること；並びに
該発現ベクターの投与の前又はそれと同時に、該対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続すること、を含む、前記方法。
【請求項１２】
ムコ多糖症I型(MPS I)と診断されたヒト対象の治療方法であって：
該ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトIDUAをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果α2,6-シアル酸付加グリカンを含む該IDUAを放出するデポーが形成される、前記投与すること；及び
該発現ベクターの投与の前又はそれと同時に、該対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続すること、を含む、前記方法。
【請求項１３】
ムコ多糖症I型(MPS I)と診断されたヒト対象の治療方法であって：
該ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトIDUAをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果検出可能なNeuGcを含まないグリコシル化ヒトIDUAを放出するデポーが形成される、前記投与すること；及び
該発現ベクターの投与の前又はそれと同時に、該対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続すること、を含む、前記方法。
【請求項１４】
ムコ多糖症I型(MPS I)と診断されたヒト対象の治療方法であって：
該ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトIDUAをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果検出可能なNeuGc及び/又はα-Gal抗原を含まないグリコシル化ヒトIDUAを放出するデポーが形成される、前記投与すること；並びに
該発現ベクターの投与の前又はそれと同時に、該対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続すること、を含む、前記方法。
【請求項１５】
ムコ多糖症I型(MPS I)と診断されたヒト対象の治療方法であって：
該ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトIDUAをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果チロシン硫酸化を含む該IDUAを放出するデポーが形成される、前記投与すること；並びに
該発現ベクターの投与の前又はそれと同時に、該対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続すること、を含む、前記方法。
【請求項１６】
前記免疫抑制治療が、前記ヒトIDUAによる治療の前に、又はそれと同時に(a) タクロリムス及びミコフェノール酸、(b) ラパマイシン及びミコフェノール酸、又は(c) タクロリムス、ラパマイシン、及びコルチコステロイド、例えばプレドニゾロン及び/若しくはメチルプレドニゾロンの組合わせを前記対象に投与し、かつその後継続することを含む、請求項3〜15のいずれか1項記載の方法。
【請求項１７】
前記免疫抑制治療を180日後に中止する、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
前記ヒトIDUAが配列番号:1のアミノ酸配列を含む、請求項1〜17のいずれか1項記載の方法。
【請求項１９】
前記免疫抑制治療が前記ヒトIDUAによる治療の前に、又はそれと同時に(a) タクロリムス及びミコフェノール酸、(b) ラパマイシン及びミコフェノール酸、又は(c) タクロリムス、ラパマイシン、及びコルチコステロイド、例えばプレドニゾロン及び/若しくはメチルプレドニゾロンの組合わせを前記対象に投与することを含む、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
前記免疫抑制治療を180日後に中止する、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
α2,6-シアル酸付加グリカンを含む前記IDUAの生産を、細胞培養中でヒト神経細胞株を前記組換えヌクレオチド発現ベクターを用いて形質導入することにより確認する、請求項12記載の方法。
【請求項２２】
検出可能なNeuGcを含まない前記グリコシル化IDUAの生産を、細胞培養中でヒト神経細胞株を前記組換えヌクレオチド発現ベクターを用いて形質導入することにより確認する、請求項13記載の方法。
【請求項２３】
検出可能なNeuGc及び/又はα-Gal抗原を含まない前記グリコシル化IDUAの生産を、細胞培養中でヒト神経細胞株を前記組換えヌクレオチド発現ベクターを用いて形質導入することにより確認する、請求項14記載の方法。
【請求項２４】
チロシン硫酸化を含む前記IDUAの生産を、細胞培養中でヒト神経細胞株を前記組換えヌクレオチド発現ベクターを用いて形質導入することにより確認する、請求項15記載の方法。
【請求項２５】
生産をマンノース-6-リン酸の存在下及び非存在下で確認する、請求項21〜24のいずれか1項記載の方法。
【請求項２６】
前記発現ベクター又は組換えヌクレオチド発現ベクターが、シグナルペプチドをコードする、請求項8〜15及び21〜25のいずれか1項記載の方法、又は請求項8〜15のいずれか1項に直接的若しくは間接的に従属する場合の請求項16〜17のいずれか1項記載の方法。
【請求項２７】
ムコ多糖症I型(MPS I)と診断されたヒト対象の治療方法であって：
該ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトIDUAをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果α2,6-シアル酸付加グリカンを含む該IDUAを放出するデポーが形成される、前記投与すること；及び
該発現ベクターの投与の前又はそれと同時に、該対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続すること、を含み、
ここで該組換えベクターは、培養中でヒト神経細胞への形質導入に使用する場合、該細胞培養中で該α2,6-シアル酸付加グリカンを含む該IDUAを生産する、前記方法。
【請求項２８】
ムコ多糖症I型(MPS I)と診断されたヒト対象の治療方法であって：
該ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトIDUAをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果検出可能なNeuGcを含まないグリコシル化IDUAを放出するデポーが形成される、前記投与すること；及び
該発現ベクターの投与の前又はそれと同時に、該対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続すること、を含み、
ここで該組換えベクターは、培養中でヒト神経細胞への形質導入に使用する場合、該細胞培養中でグリコシル化されるが検出可能なNeuGcを含まない該IDUAを生産する、前記方法。
【請求項２９】
ムコ多糖症I型(MPS I)と診断されたヒト対象の治療方法であって：
該ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトIDUAをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果検出可能なNeuGc及び/又はα-Gal抗原を含まないグリコシル化IDUAを放出するデポーが形成される、前記投与すること；及び
該発現ベクターの投与の前又はそれと同時に、該対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続すること、を含み、
ここで該組換えベクターは、培養中でヒト神経細胞への形質導入に使用する場合、該細胞培養中でグリコシル化されるが検出可能なNeuGc及び/又はα-Gal抗原を含まない該IDUAを生産する、前記方法。
【請求項３０】
ムコ多糖症I型(MPS I)と診断されたヒト対象の治療方法であって：
該ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトIDUAをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果チロシン硫酸化を含む該IDUAを放出するデポーが形成される、前記投与すること；及び
該発現ベクターの投与の前又はそれと同時に、該対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続すること、を含み、
ここで該組換えベクターは、培養中でヒト神経細胞への形質導入に使用する場合、該細胞培養中でチロシン硫酸化された該IDUAを生産する、前記方法。
【請求項３１】
前記ヒトIDUAによる治療の前に、又はそれと同時に(a) タクロリムス及びミコフェノール酸、(b) ラパマイシン及びミコフェノール酸、又は(c) タクロリムス、ラパマイシン、及びコルチコステロイド、例えばプレドニゾロン及び/若しくはメチルプレドニゾロンの組合わせを前記対象に投与し、かつその後継続することを含む、請求項27〜30のいずれか1項記載の方法。
【請求項３２】
前記免疫抑制治療を180日後に中止する、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
前記ヒト対象が3歳未満である、請求項1〜32のいずれか1項記載の方法。
【請求項３４】
前記ヒト対象が3歳未満であり、前記発現ベクター又は前記組換えヌクレオチド発現ベクターが1×1010 GC/g脳質量又は5×1010 GC/g脳質量の用量で投与される、請求項8〜15及び21〜33のいずれか1項記載の方法、又は請求項8〜15のいずれか1項に直接的若しくは間接的に従属する場合の請求項16〜20のいずれか1項記載の方法。
【請求項３５】
前記ヒト対象が3歳未満であり、前記発現ベクター又は前記組換えヌクレオチド発現ベクターが1×1010 GC/g脳質量〜5×1010 GC/g脳質量の範囲の用量で投与される、請求項8〜15及び21〜33のいずれか1項記載の方法、又は請求項8〜15のいずれか1項に直接的若しくは間接的に従属する場合の請求項16〜20のいずれか1項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(関連出願の相互参照)
本願は、2017年1月31日に出願された米国仮特許出願番号第62/452,769号、2017年4月14日に出願された第62/485,655号、2017年7月6日に出願された第62/529,366号、2017年10月31日に出願された第62/579,690号、2018年1月11日に出願された第62/616,234号の恩典を主張し、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
(電子的に提出された配列表の参照)
本願は、2018年1月16日に作成されて、80,541バイトのサイズを有する「Sequence_Listing_12656-106-228.txt」という名のテキストファイルとして本願とともに提出された配列表を参照により組み込む。
【０００２】
(1. 導入)
ムコ多糖症I型(MPS I)と診断されたヒト対象の中枢神経系(CNS)の脳脊髄液に、完全ヒトグリコシル化(HuGly)α-L-イズロニダーゼ(IDUA)を送達するための組成物及び方法を記載する。
【背景技術】
【０００３】
(2. 発明の背景)
ムコ多糖症I型(MPS I)は、発生率が100,000件の出生のうち1件と推定されている稀な劣性遺伝疾患である(Moore Dらの文献、2008、Orphanet Journal of Rare Diseases 3)。MPS Iは遍在する複合多糖類、ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸のリソソーム異化に必要な酵素である、α-l-イズロニダーゼ(IDUA)の欠損によって生じる。これらの多糖類はグリコサミノグリカン(GAG)と呼ばれ、MPS I患者の組織に蓄積されて、特徴的な貯蔵病変及び多様な疾患後遺症をもたらす。患者は、低身長、骨及び関節の変形、顔の特徴の粗雑化、肝脾腫、心臓弁膜疾患、閉塞性睡眠無呼吸、再発性上気道感染症、聴覚障害、手根管症候群及び角膜混濁による視覚障害を示し得る(Beck Mらの文献、2014、「MPS Iの自然史: MPS Iの記録からの全体的な展望(The natural history of MPS I: global perspectives from the MPS I Registry)」、Genetics in medicine: official journal of the American College of Medical Genetics 16(10):759-765)。さらに、多くの患者は水頭症、脊髄圧迫症、及び一部の患者では認知障害を含み得る中枢神経系におおけるGAGの貯蔵に関連した症状を発症する。
【０００４】
MPS I患者は、広い範囲の疾患重症度及びCNS病変の程度に及ぶ。この重症度の多様性は、残存するIDUAの発現と相関する;活性を有する酵素の発現を喪失させる2つの突然変異―ナンセンス変異、欠失、及び何らかのミスセンス変異を含む―を有する患者は、典型的に2歳になる前に症状を示し、正常な発達初期の後に例外なく重度の認知機能低下を示す(Terlato NJ及びCox GFの文献、2003、Genetics in Medicine: official journal of the American College of Medical Genetics 5(4):286-294)。この重度の形態のMPS Iは、ハーラー(H)症候群とも呼ばれる。少量の活性あるIDUAの生産をもたらす少なくとも1つの突然変異を有する患者は、ハーラー-シャイエ(HS)症候群又はシャイエ症候群と呼ばれる減弱型表現形を示す。これらの患者は、幼小期の初期に症状を示し得るか、又は人生の最初の10年を経た後まで識別し得ない。概して発症が遅れ、重症度が低下し得るものの、減弱型形態のMPS Iを有する患者は、ハーラー症候群を有する患者と同じあらゆる身体特徴を経験し得る(Vijay S及びWraith JEの文献、2005、Acta Paediatrica 94(7):872-877)。また、減弱型MPS Iを有する患者は、高い割合で脊髄圧迫症及び水頭症を含む神経学的合併症を経験する。減弱型MPS Iを有すると分類された患者のおよそ30%において、認知障害が報告されている(Beck Mらの文献、2014、Genetics in medicine: official journal of the American College of Medical Genetics 16(10):759-765)。
【０００５】
酵素補充療法(ERT)[Aldurazyme(登録商標) (ラロニダーゼ)]は、MPS Iの全身症状の標準治療として認められているが、CNS徴候を治療しない(de Ru MHらの文献、2011、Orphanet Journal of Rare Diseases 6:9; Wraith JEらの文献、2007, Pediatrics 120(1): E37-E46)。造血幹細胞移植(HSCT)は実際MPS Iの神経認知症状に影響を与えるが、手順に重大な制約がある。MPS IのためのHSCTは相当な病的状態及び最大20%の死亡率に関連付けられ、IDUA発現が安定してもなお患者はHSCTの最長1年後に神経認知機能の低下に直面するため、治療は不完全である(de Ru MHらの文献、2011、Orphanet Journal of Rare Diseases 6:9; Fleming DRらの文献、1998、Pediatric transplantation 2(4):299-304; Boelens JJらの文献、2007、Bone Marrow Transplantation 40(3):225-233; Souillet Gらの文献、2003、Bone Marrow Transplantation 31(12):1105-1117; Whitley CBらの文献、1993、American Journal of Medical Genetics 46(2):209-218)。移植に成功した患者において、知性は典型的に正常より顕著に下回ったままである。
【発明の概要】
【０００６】
(3. 発明の概要)
本発明はハーラー、ハーラー-シャイエ又はシャイエ症候群と診断された患者を含むが、これらに限定されないムコ多糖症I型(MPS I)と診断されたヒト対象の中枢神経系の脳脊髄液(CSF)に完全ヒトグリコシル化(HuGly)α-L-イズロニダーゼ(HuGlyIDUA)を送達することを含む。好ましい実施態様において、治療は遺伝子治療を介して―例えば、ヒトIDUA(hIDUA)又はhIDUAの誘導体をコードするウイルスベクター又は他のDNA発現コンストラクトをMPS Iと診断された患者(ヒト対象)のCSFに投与して、絶えず完全ヒトグリコシル化導入遺伝子産物をCNSに供給する形質導入細胞の永続的なデポーを生成することにより―達成される。デポーからCSFに分泌されるHuGlyIDUAは、CNS中の細胞によってエンドサイトーシスされて、レシピエント細胞における酵素欠陥を「横断修正(cross-correction)」する。代替の実施態様において、HuGlyIDUAを細胞培養で生産して、酵素補充療法(「ERT」)として、例えば酵素を注入することにより投与することができる。しかしながら、遺伝子治療アプローチはERTを上回るいくつかの利点を提供する―酵素は血液脳関門を通過することができないため、酵素の全身送達によってはCNSは治療されず;かつ本発明の遺伝子治療アプローチとは異なり、CNSへの酵素の直接の送達には、大きな負担となるだけでなく感染のリスクを生む反復注入が必要となるであろう。
【０００７】
導入遺伝子によってコードされるHuGlyIDUAは、これらに限定はされないが、配列番号:1のアミノ酸配列を有するヒトIDUA(hIDUA)(図1に示す)、及びアミノ酸の置換、欠失、又は付加を有する、例えばこれらに限定はされないが、図2に示すIDUAのオーソログ中に対応する非保存的残基から選択されるアミノ酸置換を含む(ただし、そのような突然変異が図3に示す(その全体が参照により本明細書に組み込まれているSaitoらの文献、2014、Mol Genet Metab 111:107-112、57個のMPS I突然変異を列記する表1より)；又はその各々の全体が参照により本明細書に組み込まれているVenturiらの文献、2002、Human Mutation #522 Online(「Venturi 2002」)、若しくはBertolaらの文献、2011、Human Mutation 32:E2189-E2210(「Bertola 2011」)によって報告された重度の、中程度に重度の、中程度の、又は減弱型MPS I表現形において同定されたいずれの突然変異も含まないことを条件とする)hIDUAの誘導体を含み得る。
【０００８】
例えば、hIDUAの特定位置でのアミノ酸置換は図2(その全体が参照により本明細書に組み込まれているMaitaらの文献、2013、PNAS 110:14628、図S8に報告されたオーソログのアラインメントを示す)に表されるIDUAオーソログにおけるその位置に見出される対応する非保存的アミノ酸残基から選択することができる(ただし、そのような置換は図3に示されるか、又は上記Venturi 2002若しくはBertola 2011において報告される有害な突然変異のいずれも含まないことを条件とする)。結果として得られる導入遺伝子産物は、細胞培養又は試験動物で、突然変異がIDUA機能を損なわないことを保証するためのインビトロでの従来のアッセイを使用して試験することができる。選択される好ましいアミノ酸置換、欠失又は付加は、細胞培養又は動物モデルにおけるMPS Iのためのインビトロでの従来のアッセイによって試験されるIDUAの酵素活性、安定性、又は半減期を維持するか、又は増加させるものとするべきである。例えば、導入遺伝子産物の酵素活性は基質として4-メチルウンベリフェリルα-L-イズロニドを用いる従来の酵素アッセイを使用して評価することができる(使用可能な例示的なIDUA酵素アッセイについては、例えばその各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている、Hopwoodらの文献、1979、Clin Chim Acta 92: 257-265; Clementsらの文献、1985、Eur J Biochem 152: 21-28;及びKakkisらの文献、1994、Prot Exp Purif 5:225-232を参照されたい)。導入遺伝子産物がMPS I表現形を修正する能力は;例えば、培養中でMPS I細胞にhIDUA又は誘導体をコードするウイルスベクター又は他のDNA発現コンストラクトを形質導入することにより; 培養中のMPS I細胞にrHuGlyIDUA又は誘導体を加えることにより;あるいはMPS I細胞を rHuGlyIDUA又は誘導体を発現及び分泌するように操作したヒト宿主細胞と共培養して、MPS I培養細胞の欠陥の修正を決定することにより、例えば培養中のMPS I細胞におけるIDUA酵素活性及び/又はGAG貯蔵量の低下を検出することにより、細胞培養中で評価することができる(例えば、その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれているMyerowitz及びNeufeldの文献、1981、J Biol Chem 256: 3044-3048;並びにAnsonらの文献1992、Hum Gene Ther 3: 371-379を参照されたい)。
【０００９】
MPS Iのための動物モデルは、マウス(例えば、Clarkeらの文献、1997、Hum Mol Genet 6(4):503-511を参照されたい)、雑種のイエネコ(例えば、Haskinsらの文献、1979、Pediatr Res 13(11):1294-97を参照されたい)、及びいくつかの品種のイヌ(例えば、Menonらの文献、1992、Genomics 14(3):763-768; Shullらの文献、1982、Am J Pathol 109(2):244-248を参照されたい)について記載されている。イヌのMPS Iモデルは、IDUA突然変異により検出可能なタンパク質が喪失するため、MPS Iの最も重度の形態であるハーラー症候群に類似している。IDUAタンパク質間の遺伝子相同性が高いこと(図2のアラインメントを参照されたい)は、hIDUAが動物において機能的であることを意味し、hIDUAを包含する治療はこれらの動物モデルで試験することができる。
【００１０】
好ましくは、rHuGlyIDUA導入遺伝子は、神経細胞及び/又はグリア細胞において機能する発現制御エレメント、例えば、CB7プロモーター(ニワトリβ-アクチンプロモーター及びCMVエンハンサー)によって制御されるべきであり、かつベクターによって駆動される導入遺伝子の発現を増強する他の発現制御エレメント(例えば、ニワトリβ-アクチンイントロン及びウサギβ-グロビンポリAシグナル)を含むことができる。hIDUA導入遺伝子のためのcDNAコンストラクトには、形質導入されたCNS細胞による適切な翻訳中(co-translational)及び翻訳後プロセシング(グリコシル化及びタンパク質硫酸化)を保証するシグナルペプチドのためのコード配列を含めるべきである。CNS細胞によって使用されるそのようなシグナルペプチドには：
・オリゴデンドロサイト-ミエリン糖タンパク質(hOMG)シグナルペプチド:
【化１】
2020508289.tif 000003
・E1A刺激を受けた遺伝子の細胞リプレッサー2(hCREG2)シグナルペプチド:
【化２】
2020508289.tif 000004
・V-セット及び膜貫通ドメイン含有2B(hVSTM2B)シグナルペプチド:
【化３】
2020508289.tif 000005
・プロトカドヘリンα-1(hPCADHA1)シグナルペプチド:
【化４】
2020508289.tif 000006
・FAM19A1(TAFA1)シグナルペプチド:
【化５】
2020508289.tif 000007
・インターロイキン-2シグナルペプチド:
【化６】
2020508289.tif 000008
があり得るが、これらに限定されない。
シグナルペプチドは本明細書において、リーダー配列又はリーダーペプチドとも呼ぶことができる。
【００１１】
導入遺伝子を送達するために使用される組換えベクターは、神経細胞及び/又はグリア細胞を含むがこれらに限定される、CNSの細胞への向性を有するべきである。そのようなベクターは非複製組換えアデノ随伴ウイルスベクター(「rAAV」)を含むことができ、特にAAV9又はAAVrh10キャプシドを有するウイルスベクターが好ましい。その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第7,906,111号においてWilsonによって記載された、特に好ましくはAAV/hu.31、及びAAV/hu.32を有するキャプシドを含むが、これらに限定されないAAVバリアントキャプシド;並びにその各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第8,628,966号、米国特許第8,927,514号及びSmithらの文献、2014、Mol Ther 22:1625-1634においてChatterjeeによって記載されたAAVバリアントキャプシドを使用することができる。しかしながら、「ネイキッドDNA」コンストラクト(5.2節を参照されたい)と呼ばれるレンチウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又は非ウイルス性発現ベクターを含むがこれらに限定されない、他のウイルスベクターを使用することができる。
【００１２】
CSFへの投与に好適な医薬組成物は、生理的に適合性の水性緩衝剤、界面活性剤、及び任意の賦形剤を含む製剤化緩衝液中のrHuGlyIDUAベクターの懸濁液を含む。ある実施態様において、医薬組成物は、くも膜下腔内投与に好適である。ある実施態様において、医薬組成物は、大槽内投与(大槽への注入)に好適である。ある実施態様において、医薬組成物は、C1-2穿刺を介するくも膜下空間への注入に好適である。ある実施態様において、医薬組成物は、脳室内投与に好適である。ある実施態様において、医薬組成物は、腰椎穿刺を介する投与に好適である。
【００１３】
組換えベクターの治療有効用量は、くも膜下腔内投与を介して(すなわち、くも膜下空間に注入して、組換えベクターがCSFを通じて散布され、CNSの細胞が形質導入されるようにする)、CSFに投与すべきである。このことは、いくつかの方法で―例えば、頭蓋内(大槽又は脳室)注入、又は腰椎槽への注入によって―達成することができる。例えば、(大槽への)大槽内(IC)注入は、CTによって導かれる後頭下穿刺によって実施することができ;又は、患者に実行できそうな場合は、C1-2穿刺を介したくも膜下空間への注入を実施することができ;又は、腰椎穿刺(典型的にCSFの試料を収集するために実施される診断手順)を、CSFにアクセスするために使用することができる。あるいは、脳室内(ICV)投与(血液脳関門を透過しない、抗感染性又は抗癌性の薬物の導入に使用されるより侵襲的な技術)を使用して、組換えベクターを直接脳室内に点滴することができる。あるいは、鼻腔内投与を使用して、CNSに組換えベクターを送達するために用いてもよい。rHuGlyIDUAのCSF濃度を少なくとも9.25 μg/mLのCminに維持する用量又は9.25〜277 μg/mLの範囲内の濃度を使用すべきである。
【００１４】
CSF濃度は後頭部又は腰椎穿刺から得られるCSF流体中のrHuGlyIDUAの濃度を直接測定することによってモニタリングし、又は患者の血清において検出されたrHuGlyIDUAの濃度から外挿によって推定することができる。ある実施態様において、血清中のrHuGlyIDUAが10 ng/mL〜100 ng/mLであることは、CSF中のrHuGlyIDUAが1〜30 mgであることを示す。ある実施態様において、組換えベクターは、血清中のrHuGlyIDUAを10 ng/mL〜100 ng/mLに維持する用量で、CSFに投与する。
【００１５】
背景として、ヒトIDUAは、653アミノ酸のポリペプチドとして翻訳され、図1において表される6つの可能性のある部位(N110、N190、N336、N372、N415、及びN451)でN-グリコシル化される。シグナル配列が除去され、ポリペプチドはリソソーム内で成熟形態にプロセシングされる: 75 kDaの細胞内前駆体は数時間で72 kDaまでトリミングされ、最終的に、4〜5日かけて66 kDaの細胞内形態にプロセシングされる。IDUAの分泌形態(使用するアッセイに応じて76 kDa又は82 kDa)はマンノース-6-リン酸受容体を介して細胞に容易にエンドサイトーシスされ、より小さい細胞内形態と同様にプロセシングされる。(その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている、Myerowitz及びNeufeldの文献、1981、J Biol Chem 256: 3044-3048; Clementsらの文献、1989、Biochem J. 259: 199-208; Taylorらの文献、1991、Biochem J. 274: 263-268;及びZhaoらの文献、1997、J Biol Chem 272:22758-22765を参照されたい)。
【００１６】
hIDUAの全体の構造は、3つのドメインからなる:残基42-396は、古典的な(β/α)トリオースリン酸イソメラーゼ(TIM)バレルドメインを形成し;残基27-42及び397-545は、短いへリックス-ループ-へリックス(482-508)を有するβ-サンドイッチドメインを形成し;かつ残基546-642は、Ig様ドメインを形成する。最後に挙げた2つのドメインは、C541及びC577の間のジスルフィド架橋によって連結される。β-サンドイッチ及びIg様ドメインは、TIMバレルの1番目、7番目、及び8番目のα-へリックスに結合される。β-ヘアピン(β12-β13)はTIMバレルの8番目のβ-ストランド及び8番目のα-へリックスの間に挿入され、これは基質結合及び酵素活性に要求されるN-グリコシル化N372を含む。(図1及びその各々の全体が参照により本明細書に組み込まれているMaitaらの文献、2013、PNAS 110: 14628-14633及びSaitoらの文献、2014 Mol Genet Metab 111:107-112に記載の結晶構造を参照されたい)。
【００１７】
本発明は部分的に、以下の原理に基づく:
(i) CNSの神経細胞及びグリア細胞はCNSにおける活発なプロセスであるグリコシル化及びチロシン-O-硫酸化を含む分泌タンパク質の翻訳後プロセシングのための細胞機構を有する分泌細胞である。ヒトCNS細胞が行う翻訳後修飾についての、その各々の全体が参照により組み込まれている、例えばヒト脳マンノース-6-リン酸(M6P)グリコプロテオームについて記載され、脳が他の組織に見出されるよりはるかに多くの個々のアイソフォームを有するより多くのタンパク質及びマンノース-6-リン酸化タンパク質を含むことを注記した、Sleatらの文献、2005、Proteomics 5: 1520-1532及びSleatの文献、1996、J Biol Chem 271:19191-98;並びに神経細胞によって分泌されたチロシン硫酸化糖タンパク質の生産を報告しているKananらの文献、2009、Exp. Eye Res. 89: 559-567並びにKanan及びAl-Ubaidiの文献、2015 Exp. Eye Res. 133: 126-131を参照されたい。
(ii) hIDUAは、図1と特定される6つのアスパラギン(「N」)のグリコシル化部位を有する(N110FT; N190VS; N336TT; N372NT; N415HT; N451RS)。N372のN-グリコシル化は基質との結合及び酵素活性に要求され、かつマンノース-6-リン酸化は分泌された酵素の細胞取り込み及びMPS I細胞の横断修正に要求される。N-結合型グリコシル化部位は複雑なハイマンノース、リン酸化マンノース糖質部分を含むが(図4)、分泌形態のみが細胞によって取り込まれる(上記Myerowitz及びNeufeldの文献、1981)。本明細書に記載の遺伝子治療アプローチは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって測定して(使用するアッセイに応じて)76〜82 kDaの2,6-シアル酸付加され、かつマンノース-6リン酸化されたIDUA糖タンパク質が絶えず分泌されるべきである。分泌されたグリコシル化/リン酸化IDUAは、CNSの形質導入されていない神経細胞及びグリア細胞によって取り込まれ、かつ正しくプロセシングされるべきである。
(iii) リソソームタンパク質の細胞性及び細胞内輸送/取り込みは、M6Pを介する。Danieleの文献、2002、Biochimica et Biophysica Acta 1588(3):203-9においてイズロネート-2-スルファターゼ酵素について行われたように、分泌タンパク質のM6P含有量を測定することは、可能である。(例えば、5mMの)抑制性M6Pの存在下では、非神経細胞又は非グリア細胞、例えばDaniele の文献、2002の遺伝子操作された腎細胞によって生成された酵素前駆体の取り込みは、Danieleの文献、2002に示されたように、対照細胞のレベルに近いレベルまで減少すると予測される。抑制性M6Pの存在下であっても、脳細胞、例えば神経細胞及びグリア細胞によって生成される酵素前駆体の取り込みは、取り込み量が対照細胞より4倍高く、抑制性M6Pの非存在下で遺伝子操作された腎細胞によって生成された酵素前駆体の酵素活性(すなわち、取り込み)のレベルと同等であったDanieleの文献、2002に示されたように高レベルを維持すると予測される。このアッセイを用いると、脳細胞によって生成される酵素前駆体のM6P含有量を予測し、特に異なる種類の細胞によって生成される酵素前駆体中のM6P含有量を比較することが可能となる。本明細書に記載の遺伝子治療アプローチは、そのようなアッセイにおいて抑制性M6Pの存在下、高レベルで神経細胞及びグリア細胞に取り込まれ得る、hIDUAの継続的分泌をもたらすべきである。
(iv) N-結合型グリコシル化部位に加えて、hIDUAは、結合及び活性のために要求されるN372を含むドメインの近くに、チロシン(「Y」)硫酸化部位
【化７】
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を含む。(例えば、その全体が参照により組み込まれている、タンパク質チロシン硫酸化を受けるチロシン残基を取り巻くアミノ酸の解析についてのYangらの文献、2015、Molecules 20:2138-2164、特にp. 2154を参照されたい。「規則」は、以下の通りに要約することができる: Y残基がYから+5〜-5位の範囲内にE又はDを有し、かつYの-1位が中性又は酸性荷電アミノ酸であるが―硫酸化を無効化する塩基性アミノ酸、例えばR、K、又はHではない)。いかなる理論に束縛されることも意図するものではないが、チロシン硫酸化領域内の突然変異(例えば、W306L)が酵素活性の減少及び疾患と関連することは公知であるため、hIDUAのこの部位の硫酸化は活性にきわめて重要となり得る。(Maitaらの文献、2013、PNAS 110:14628、pp. 14632-14633を参照されたい)。
(v) CNSのヒト細胞によるhIDUAのグリコシル化により、安定性、半減期を向上させ、かつ導入遺伝子産物の望まない凝集を減らすことができるグリカンが付加される。大事なことに、本発明のHuGlyIDUAに付加されるグリカンは2,6-シアル酸を含み、Neu5Ac(「NANA」)を組み込むが、そのヒドロキシル化誘導体NeuGc(N-グリコリルノイラミン酸、すなわち「NGNA」又は「Neu5Gc」)を組み込まない高度にプロセシングされた複合型二分岐N-グリカンである。そのようなグリカンはこの翻訳後修飾を行うのに要求される2,6-シアリルトランスフェラーゼを有さず、バイセクティングGlcNAcも生産しないが、Neu5Ac(NANA)の代わりにヒトにとって典型的でない(かつ潜在的に免疫原性の)シアル酸であるNeu5Gc(NGNA)を付加するCHO細胞において生産されるラロニダーゼには存在しない。例えば、Dumontらの文献、2016、Critical Rev in Biotech 36(6):1110-1122(早期オンラインpp. 1-13、p. 5);及びHagueらの文献、1998、Electrophor 19:2612-2630(「CHO細胞株は、α2,6-シアリルトランスフェラーゼの欠如のため、グリコシル化に関して『表現形上制限されている』と考えられている」)。さらに、CHO細胞は大部分の個体に存在する抗α-Gal抗体と反応して、高濃度でアナフィラキシーを誘発し得る免疫原性グリカン、α-Gal抗原も生産し得る。例えば、Bosquesの文献、2010、Nat Biotech 28: 1153-1156を参照されたい。本発明のHuGlyIDUAのヒトグリコシル化パターンは、導入遺伝子産物の免疫原性を低下させ、かつ効力を向上させるべきである。
(vi) hIDUA のチロシン硫酸化―ヒトCNS細胞の活発な翻訳後プロセス―は、導入遺伝子産物のプロセシング及び活性を向上させるべきである。リソソームタンパク質のチロシン硫酸化の意義は、明らかにされていない;しかし、他のタンパク質では、チロシン硫酸化により、タンパク質-タンパク質相互作用(抗体及び受容体)の親和性が増加し、タンパク質分解プロセシング(ペプチドホルモン)が促進されることが示されている。(Mooreの文献、2003、J Biol. Chem. 278:24243-46;及びBundegaardらの文献、1995、EMBO J 14: 3073-79を参照されたい)。チロシン硫酸化(IDUAのプロセシングの最終ステップとして起こる場合がある)を担うチロシンタンパク質スルホトランスフェラーゼ(TPST1)は、明らかに脳(TPST1のための遺伝子発現データは、例えば、http://www.ebi.ac.uk/gxa/homeにてアクセス可能なEMBL-EBI Expression Atlasに見出すことができる)でより高いレベル(mRNAに基づいて)で発現する。そのような翻訳後修飾は、最高でもCHO細胞の生産物であるラロニダーゼにおいて過少に示される。ヒトCNS細胞とは異なり、CHO細胞は、分泌細胞ではなく、翻訳後のチロシン-硫酸化能が限られている。(例えばMikkelsen及びEzbanの文献、1991、Biochemistry 30: 1533-1537、特に1537ページの考察を参照されたい)。
(vii) 導入遺伝子産物の免疫原性は、患者の免疫状態、注入されたタンパク質薬物の構造及び特徴、投与経路、及び治療の持続時間を含む様々な因子によって誘導され得る。プロセス関連不純物、例えば宿主細胞タンパク質(HCP)は宿主細胞DNA、及び化学的残留物、並びに生産物関連不純物、例えばタンパク質分解物及び構造特徴、例えばグリコシル化、酸化及び凝集(肉眼不可視粒子)は免疫反応を増強するアジュバントとしての機能を果たすことによって免疫原性を増加させる場合がある。プロセス関連及び生産物関連不純物の量は、製造プロセス:商業的に製造されるIDUA産物に影響を及ぼし得る細胞培養、精製、製剤化、保存、及び取扱いの影響を受け得る。遺伝子治療では、タンパク質はインビボで生産され、その結果プロセス関連不純物は存在せず、タンパク質産物は組換え技術によって生産されるタンパク質と関連した生産物関連不純物/分解物、例えばタンパク質凝集物及びタンパク質酸化物を含む可能性は低い。凝集は、例えばタンパク質生産及び保存と関連づけられ、高いタンパク質濃度、製造装置及び容器との表面相互作用、並びに特定の緩衝液システムを用いた精製プロセスに起因する。しかし、導入遺伝子をインビボで発現させる場合、凝集を促進するこれらの条件は存在しない。また、酸化、例えばメチオニン、トリプトファン、及びヒスチジンの酸化は、タンパク質生産及び保存と関連付けられ、例えばストレス負荷された細胞培養条件、金属及び空気との接触、並びに緩衝液及び賦形剤中の不純物によって引き起こされる。インビボで発現されるタンパク質は、ストレス負荷された条件下で酸化され得るが、ヒトは多くの生物と同様に、抗酸化防衛システムを備えており、それにより酸化ストレスが低下するだけでなく、酸化を修復し、かつ/又は逆行させもする。従って、インビボで生産されるタンパク質が、酸化形態にある可能性は低い。凝集及び酸化は両方とも、効力、PK(クリアランス)に影響を及ぼし得、免疫原となる懸念を大きくし得る。本明細書に記載の遺伝子治療アプローチは、商業的に製造された産物と比較して免疫原性の低下したhIDUAを絶えず分泌するべきである。
【００１８】
前述の理由のために、HuGlyIDUAの生産は―例えば、MPS I疾患(ハーラー、ハーラー-シャイエ又はシャイエを含むが、これらに限定はされない)と診断される患者(ヒト対象)のCSFにHuGlyIDUAをコードするウイルスベクター又は他のDNA発現コンストラクトを投与して、形質導入されたCNS細胞によって分泌される完全ヒトグリコシル化、マンノース-6-リン酸化、硫酸化導入遺伝子産物を絶えず供給するCNS中の永続的なデポーを作製することによる―遺伝子治療によって達成されるMPS Iの治療のための「バイオベター(biobetter)」分子をもたらすべきである。デポーからCSF中に分泌されるHuGlyIDUA導入遺伝子産物は、CNS中の細胞によりエンドサイトーシスされ、MPS Iレシピエント細胞における酵素欠陥の「横断修正」をもたらす。
【００１９】
遺伝子治療又はタンパク質治療アプローチにおいて生産されるすべてのhIDUA分子が完全にグリコシル化され、硫酸化されることは、必須ではない。むしろ、生じる糖タンパク質の集団は、有効性を実証するのに十分なグリコシル化(2,6-シアル酸付加及びマンノース-6-リン酸化を含む)及び硫酸化を受けるべきである。本発明の遺伝子治療処置の目的は、疾患の進行を減速させ、又は停止させることである。有効性は、認知機能(例えば、神経認知機能の低下の防止若しくは減少);CSF及び/若しくは血清中の疾患バイオマーカー(例えばGAG)の低下;及び/又は、CSF及び/若しくは血清のIDUA酵素活性の増加を測定することによってモニタリングすることができる。炎症の徴候及び他の安全事象をモニタリングすることもできる。
【００２０】
遺伝子治療に対する代替又は追加治療として、rHuGlyIDUA糖タンパク質は組換えDNA技術によってヒト細胞株で生産することができ、糖タンパク質は全身的に及び/又はERTのためのCSFにMPS Iと診断された患者に投与することができる。そのような組換え糖タンパク質生産のために使用することができるヒト細胞株は、これらに限定されないが、少し例を挙げればHT-22、SK-N-MC、HCN-1A、HCN-2、NT2、SH-SY5y、hNSC11、ReNcell VM、ヒト胎児腎293細胞(HEK293)、線維肉腫HT-1080、HKB-11、CAP、HuH-7、網膜細胞株、PER.C6、又はRPEを含む(例えば、その全体が参照により組み込まれている、rHuGlyIDUA糖タンパク質の組換え生産のために使用することができるヒト細胞株の総説についてのDumontらの文献、2016、Critical Rev in Biotech 36(6):1110-1122の「生物医薬製造のためのヒト細胞株:歴史、現状、及び将来の展望(Human cell lines for biopharmaceutical manufacturing: history, status, and future perspectives)」)。完全なグリコシル化、特にシアル酸付加及びチロシン硫酸化を保証するために、生産に使用する細胞株をチロシン-O-硫酸化を担うα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ(又はα-2,3-及びα-2,6-シアリルトランスフェラーゼの両方)並びに/又はTPST-1及びTPST-2酵素を共発現するように宿主細胞を操作することによって強化することができる。
【００２１】
rHuGlyIDUAの送達が免疫反応を最小化すべきである一方、CNS関連遺伝子治療に関する毒性の最も明白な潜在的源は遺伝的にIDUAを欠損しており、従ってタンパク質及び/又は導入遺伝子を送達するために用いるベクターを潜在的に寛容しないヒト対象において発現されたhIDUAタンパク質に対する免疫が発生することである。
【００２２】
従って、好ましい実施態様において、患者を免疫抑制治療で共治療することは―特にIDUAのレベルが0に近い重度の疾患(例えば、ハーラー)を有する患者を治療する場合に―適切である。タクロリムス又はラパマイシン(シロリムス)を、例えばミコフェノール酸と組合わせた、若しくはプレドニゾロン及び/若しくはメチルプレドニゾロンなどのコルチコステロイドと組合わせたレジメン、又は組織移植手順において使用される他の免疫抑制レジメンを伴う免疫抑制治療を、利用することができる。そのような免疫抑制治療は遺伝子治療クール中に投与することができ、ある実施態様において、免疫抑制治療による前処理が好ましい場合がある。免疫抑制治療は治療医師の判断に基づいて、遺伝子治療処置の後も継続することができ、その後免疫寛容が誘発された場合：例えば、180日後に、中止することができる。
【００２３】
他の利用可能な治療の送達を伴うCSFへのHuGlyIDUAの送達の組合せは、本発明の方法に包含される。追加治療は、遺伝子治療処置の前に、それと同時に、又はその後に投与することができる。本発明の遺伝子治療と併用することができるMPS Iのための利用可能な治療には、これらに限定はされないが、全身的に、若しくはCSFに投与されるラロニダーゼを使用する酵素補充療法及び/又はHSCT療法がある。
(例示的実施態様)
1. ムコ多糖症I型(MPS I)と診断されたヒト対象の治療方法であって、該ヒト対象の脳の脳脊髄液にヒト神経細胞によって生産された治療有効量の組換えヒトα-L-イズロニダーゼ(IDUA)を送達することを含む、前記方法。
2．MPS Iと診断されたヒト対象の治療方法であって、該ヒト対象の脳の脳脊髄液にヒトグリア細胞によって生産された治療有効量の組換えヒトIDUAを送達することを含む、前記方法。
3. ヒトIDUAによる治療の前に、又はそれと同時に、前記対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続することをさらに含む、段落1又は2記載の方法。
4. MPS Iと診断されたヒト対象の治療方法であって：
該ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のα2,6-シアル酸付加ヒトIDUAを送達することを含む、前記方法。
5. ムコ多糖症I型(MPS I)と診断されたヒト対象の治療方法であって：
該ヒト対象の脳の脳脊髄液に検出可能なNeuGcを含まない治療有効量のグリコシル化ヒトIDUAを送達することを含む、前記方法。
6. ムコ多糖症I型(MPS I)と診断されたヒト対象の治療方法であって：
該ヒト対象の脳の脳脊髄液に検出可能なNeuGc及び/又はα-Gal抗原を含まない治療有効量のグリコシル化ヒトIDUAを送達すること；並びに
該ヒトIDUAによる治療の前又はそれと同時に、該対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続すること、を含む、前記方法。
7. ムコ多糖症I型(MPS I)と診断されたヒト対象の治療方法であって：
該ヒト対象の脳の脳脊髄液にチロシン硫酸化を含む治療有効量のヒトIDUAを送達することを含む、前記方法。
8. ムコ多糖症I型(MPS I)と診断されたヒト対象の治療方法であって：
該ヒト対象の脳にヒトIDUAをコードする発現ベクターを投与することであって、該IDUAがヒト不死化神経細胞において該発現ベクターから発現される際にα2,6-シアル酸付加される、前記投与することを含む、前記方法。
9. ムコ多糖症I型(MPS I)と診断されたヒト対象の治療方法であって：
該ヒト対象の脳にヒトIDUAをコードする発現ベクターを投与することであって、該IDUAがヒト不死化神経細胞において該発現ベクターから発現される際にグリコシル化されるが検出可能なNeuGcを含まない、前記投与することを含む、前記方法。
10. ムコ多糖症I型(MPS I)と診断されたヒト対象の治療方法であって：
該ヒト対象の脳にヒトIDUAをコードする発現ベクターを投与することであって、該IDUAがヒト不死化神経細胞において該発現ベクターから発現される際にグリコシル化されるが検出可能なNeuGc及び/又はα-Gal抗原を含まない、前記投与することを含む、前記方法。
11. ムコ多糖症I型(MPS I)と診断されたヒト対象の治療方法であって：
該ヒト対象の脳にヒトIDUAをコードする発現ベクターを投与することであって、該IDUAがヒト不死化神経細胞において該発現ベクターから発現される際にチロシン硫酸化される、前記投与することを含む、前記方法。
12. ムコ多糖症I型(MPS I)と診断されたヒト対象の治療方法であって：
該ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトIDUAをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果α2,6-シアル酸付加グリカンを含む該IDUAを放出するデポーが形成される、前記投与することを含む、前記方法。
13. ムコ多糖症I型(MPS I)と診断されたヒト対象の治療方法であって：
該ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトIDUAをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果検出可能なNeuGcを含まないグリコシル化ヒトIDUAを放出するデポーが形成される、前記投与することを含む、前記方法。
14. ムコ多糖症I型(MPS I)と診断されたヒト対象の治療方法であって：
該ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトIDUAをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果検出可能なNeuGc及び/又はα-Gal抗原を含まないグリコシル化ヒトIDUAを放出するデポーが形成される、前記投与することを含む、前記方法。
15. ムコ多糖症I型(MPS I)と診断されたヒト対象の治療方法であって：
該ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトIDUAをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果チロシン硫酸化を含む該IDUAを放出するデポーが形成される、前記投与することを含む、前記方法。
16. 前記ヒトIDUAによる治療の前に、又はそれと同時に(a) タクロリムス及びミコフェノール酸、(b) ラパマイシン及びミコフェノール酸、又は(c) タクロリムス、ラパマイシン、及びコルチコステロイド、例えばプレドニゾロン及び/若しくはメチルプレドニゾロンの組合わせを前記対象に投与し、かつその後継続することを含む、該対象に免疫抑制治療を施すことをさらに含む、段落3〜15のいずれか1つ記載の方法。
17. 前記免疫抑制治療を180日後に中止する、段落16記載の方法。
18. 前記ヒトIDUAが配列番号:1のアミノ酸配列を含む、段落1〜17のいずれか1つ記載の方法。
19.前記ヒトIDUAによる治療の前に、又はそれと同時に(a) タクロリムス及びミコフェノール酸、(b) ラパマイシン及びミコフェノール酸、又は(c) タクロリムス、ラパマイシン、及びコルチコステロイド、例えばプレドニゾロン及び/若しくはメチルプレドニゾロンの組合わせを前記対象に投与することを含む、該対象に免疫抑制治療を施すことをさらに含む、段落18記載の方法。
20. 前記免疫抑制治療を180日後に中止する、段落19記載の方法。
21. α2,6-シアル酸付加グリカンを含む前記IDUAの生産を、細胞培養中でヒト神経細胞株を前記組換えヌクレオチド発現ベクターを用いて形質導入することにより確認する、段落12記載の方法。
22. 検出可能なNeuGcを含まない前記グリコシル化IDUAの生産を、細胞培養中でヒト神経細胞株を前記組換えヌクレオチド発現ベクターを用いて形質導入することにより確認する、段落13記載の方法。
23. 検出可能なNeuGc及び/又はα-Gal抗原を含まない前記グリコシル化IDUAの生産を、細胞培養中でヒト神経細胞株を前記組換えヌクレオチド発現ベクターを用いて形質導入することにより確認する、段落14記載の方法。
24. チロシン硫酸化を含む前記IDUAの生産を、細胞培養中でヒト神経細胞株を前記組換えヌクレオチド発現ベクターを用いて形質導入することにより確認する、段落15記載の方法。
25. 生産をマンノース-6-リン酸の存在下及び非存在下で確認する、段落21〜24のいずれか1つ記載の方法。
26.   前記発現ベクター又は組換えヌクレオチド発現ベクターが、シグナルペプチドをコードする、段落8〜15及び21〜25のいずれか1つ記載の方法、又は請求項8〜15のいずれか1つに直接的若しくは間接的に従属する場合の段落16〜17のいずれか1項記載の方法。
27. ムコ多糖症I型(MPS I)と診断されたヒト対象の治療方法であって：
該ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトIDUAをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果α2,6-シアル酸付加グリカンを含む該IDUAを放出するデポーが形成される、前記投与することを含み、
ここで該組換えベクターは、培養中でヒト神経細胞への形質導入に使用する場合、該細胞培養中で該α2,6-シアル酸付加グリカンを含む該IDUAを生産する、前記方法。
28. ムコ多糖症I型(MPS I)と診断されたヒト対象の治療方法であって：
該ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトIDUAをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果検出可能なNeuGcを含まないグリコシル化IDUAを放出するデポーが形成される、前記投与することを含み、ここで該組換えベクターは、培養中でヒト神経細胞への形質導入に使用する場合、該細胞培養中でグリコシル化されるが検出可能なNeuGcを含まない該IDUAを生産する、前記方法。
29. ムコ多糖症I型(MPS I)と診断されたヒト対象の治療方法であって：
該ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトIDUAをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果検出可能なNeuGc及び/又はα-Gal抗原を含まないグリコシル化IDUAを放出するデポーが形成される、前記投与することを含み、ここで該組換えベクターは、培養中でヒト神経細胞への形質導入に使用する場合、該細胞培養中でグリコシル化されるが検出可能なNeuGc及び/又はα-Gal抗原を含まない該IDUAを生産する、前記方法。
30. ムコ多糖症I型(MPS I)と診断されたヒト対象の治療方法であって：
該ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトIDUAをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果チロシン硫酸化を含む該IDUAを放出するデポーが形成される、前記投与することを含み、
ここで該組換えベクターは、培養中でヒト神経細胞への形質導入に使用する場合、該細胞培養中でチロシン硫酸化された該IDUAを生産する、前記方法。
31. 前記ヒトIDUAによる治療の前に、又はそれと同時に(a) タクロリムス及びミコフェノール酸、(b) ラパマイシン及びミコフェノール酸、又は(c) タクロリムス、ラパマイシン、及びコルチコステロイド、例えばプレドニゾロン及び/若しくはメチルプレドニゾロンの組合わせを前記対象に投与し、かつその後継続することを含む、該対象に免疫抑制治療を施すことをさらに含む、段落27〜30のいずれか1つ記載の方法。
32. 前記免疫抑制治療を180日後に中止する、段落31記載の方法。
33. 前記ヒト対象が3歳未満である、段落1〜32のいずれか1つ記載の方法。
34. 前記ヒト対象が3歳未満であり、前記発現ベクター又は前記組換えヌクレオチド発現ベクターが1×1010 GC/g脳質量又は5×1010 GC/g脳質量の用量(例えば、単一の一定用量として)で投与される(例えば、IC投与(例えば、後頭下注入により))、段落8〜15及び21〜33のいずれか1つ記載の方法、又は請求項8〜15のいずれか1つに直接的若しくは間接的に従属する場合の段落16〜20のいずれか1つ記載の方法。
35. 前記ヒト対象が3歳未満であり、前記発現ベクター又は前記組換えヌクレオチド発現ベクターが1×1010 GC/g脳質量〜5×1010 GC/g脳質量の範囲の用量(例えば、単一の一定用量として)で投与される(例えば、IC投与(例えば、後頭下注入により))、段落8〜15及び21〜33のいずれか1つ記載の方法、又は請求項8〜15のいずれか1つに直接的若しくは間接的に従属する場合の段落16〜20のいずれか1つ記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
(4. 図面の簡単な説明)
【図１】ヒトIDUAのアミノ酸配列。6つのN-結合型グリコシル化部位(N)は、太字にして下線を引いてある;1つのチロシン-O-硫酸化部位(Y)は太字にして下線を引き、完全な硫酸化部位配列
【化８】
2020508289.tif 000010
は陰影をつけてある;かつジスルフィド結合(2つのシステイン残基;C)は、太字にして、下線を引いてある。CHO細胞中で作製される分泌型組換え産物のN末端はA26であるが、ヒト肝臓のネイティブ細胞内酵素のN末端はE27である(Kakkisらの文献、1994、Prot Exp Purif 5: 225-232のp. 230ページを参照されたい)。
【００２５】
【図２】hIDUAの公知のオーソログとのマルチプル配列アラインメント。配列は、Clustal X ver.2を使用してアラインした(Larkin MAらの文献、2007、「Clustal W及びClustal X version 2.0(Clustal W and Clustal X version 2.0)」、Bioinformatics 23(21):2947-2948)。種の名前及びタンパク質IDは、以下の通りである:ヒト(ホモ・サピエンス(Homo sapiens);NP_000194.2)、イヌ(カニス・ファミリアリス(Canis familiaris);M81893.1)、ウシ(ボス・タウルス(Bos taurus);XP_002688492.1)、マウス(ムス・ムスクルス(Mus musculus);NP_032351.2)、ラット(ラトゥス・ノルベギクス(Rattus norvegicus);NP_001165555.1)、カモノハシ(オルニソリンクス・アナチヌス(Ornithorhynchus anatinus);XP_001514102.2)、ニワトリ(ガルス・ガルス(Gallus gallus);NP_001026604.1)、アフリカツメガエル(ゼノパス・ラエビス(Xenopus laevis);NP_001087031.1)、ゼブラフィッシュ(ダニオ・レリオ(Danio rerio);XP_001923689.3)、ウニ(ストロンギロセントロゥス・プルプラトゥス(Strongylocentrotus purpuratus);XP_796813.3) ユウレイボヤ(シオナ・インテスチナリス(Ciona intestinalis);XP_002120937.1)、そして、ショウジョウバエ(ドロソフィラ・メラノガスター(Drosophila melanogaster);NP_609489.1)。ヒトタンパク質(N110、N190、N336、N372、T374、N415、N451)のN-グリコシル化部位;基質結合に関与する残基(R89、H91、N181、E182、H262、K264、E299、D349、及びR363)及びN372でのN-グリカンとの相互作用に関与する残基(P54、H58、W306、S307、Y355、R368及びQ370)は、濃淡によって示す。(Maitaらの文献、2013、PNAS 110: 14628-14633;補助資料、図S8から改変)。
【００２６】
【図３】MPS I突然変異、IDUAの構造変化及び表現形。(Saitoらの文献、Mol Genet Metab 111:107-112, 表1から)。
【００２７】
【図４】CHO細胞によって分泌された組換えヒトO-L-イズロニダーゼの6つのグリコシル化部位のオリゴ糖。C (複合) ;M、ハイマンノース;Pは、リン酸化されたハイマンノース。大文字はよく識別された、主要なオリゴ糖を意味するが、小文字は軽微な又は不完全に特徴づけられた構成要素を意味する。(Zhaoらの文献、1997、J Biol Chem 272:22758-22765から)。
【００２８】
【図５】AAVキャプシド1〜9のClustalマルチプル配列アラインメント(配列番号: 16〜26)。アミノ酸置換(一番下の列に太字で示す)は、他のアラインされたAAVキャプシドの対応する位置からアミノ酸残基を「動員する」ことによって、AAV9及びAAV8キャプシドに加えることができる。「HVR」=超可変領域と呼ばれる配列領域。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
(5. 発明の詳細な説明)
本発明はハーラー、ハーラー-シャイエ又はシャイエ症候群と診断された患者を含むが、これらに限定されないムコ多糖症I型(MPS I)と診断されたヒト対象の中枢神経系の脳脊髄液(CSF)に完全ヒトグリコシル化(HuGly)α-L-イズロニダーゼ(HuGlyIDUA)を送達することを含む。好ましい実施態様において、治療は遺伝子治療を介して―例えば、ヒトIDUA(hIDUA)又はhIDUAの誘導体をコードしているウイルスベクター又は他のDNA発現コンストラクトをMPS Iと診断された患者(ヒト対象)のCSFに投与して、その結果絶えず完全ヒトグリコシル化導入遺伝子産物をCNSに供給する形質導入細胞の永続的なデポーを生成することにより―達成される。デポーからCSFに分泌されるHuGlyIDUAは、CNS中の細胞によってエンドサイトーシスされて、レシピエント細胞における酵素欠陥を「横断修正」する。代替の実施態様において、HuGlyIDUAを細胞培養で生産して、酵素補充療法(「ERT」)として、例えば酵素を注入することにより投与することができる。しかしながら、遺伝子治療アプローチはERTを上回るいくつかの利点を提供する―酵素は血液脳関門を通過することができないため、酵素の全身送達によってはCNSは治療されず;かつ本発明の遺伝子治療アプローチとは異なり、CNSへの酵素の直接の送達には、大きな負担となるだけでなく感染のリスクを生む反復注入が必要となるであろう。
【００３０】
導入遺伝子によってコードされるHuGlyIDUAは、これらに限定はされないが、配列番号:1のアミノ酸配列を有するヒトIDUA(hIDUA)(図1に示す)、及びアミノ酸の置換、欠失、又は付加を有する、例えばこれらに限定はされないが、図2に示すIDUAのオーソログ中に対応する非保存的残基から選択されるアミノ酸置換を含むhIDUAの誘導体を含み得る(ただし、そのような突然変異が図3に示す(その全体が参照により本明細書に組み込まれているSaitoらの文献、2014、Mol Genet Metab 111:107-112、57個のMPS I突然変異を列記する表1より)；又はその各々の全体が参照により本明細書に組み込まれているVenturiらの文献、2002、Human Mutation #522 Online(「Venturi 2002」)、若しくはBertolaらの文献、2011、Human Mutation 32:E2189-E2210(「Bertola 2011」)によって報告された重度の、中程度に重度の、中程度の、又は減弱型MPS I表現形において同定されたいずれの突然変異も含まないことを条件とする)。
【００３１】
例えば、hIDUAの特定位置でのアミノ酸置換は図2(その全体が参照により本明細書に組み込まれているMaitaらの文献、2013、PNAS 110:14628、図S8に報告されたオーソログのアラインメントを示す)に表されるIDUAオーソログにおけるその位置に見出される対応する非保存的アミノ酸から選択することができる(ただし、そのような置換は図3に示されるか、又は上記Venturi 2002若しくはBertola 2011において報告される有害な突然変異のいずれも含まないことを条件とする)。結果として得られる導入遺伝子産物は、細胞培養又は試験動物で、突然変異がIDUA機能を損なわないことを保証するためのインビトロでの従来のアッセイを使用して試験することができる。選択される好ましいアミノ酸置換、欠失又は付加は、細胞培養又は動物モデルにおけるMPS Iのためのインビトロでの従来のアッセイによって試験されるIDUAの酵素活性、安定性、又は半減期を維持するか、又は増加させるものとするべきである。例えば、導入遺伝子産物の酵素活性は基質として4-メチルウンベリフェリルα-L-イズロニドを用いる従来の酵素アッセイを使用して評価することができる(使用可能な例示的なIDUA酵素アッセイについては、例えばその各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている、Hopwoodらの文献、1979、Clin Chim Acta 92: 257-265; Clementsらの文献、1985、Eur J Biochem 152: 21-28;及びKakkisらの文献、1994、Prot Exp Purif 5:225-232を参照されたい)。導入遺伝子産物がMPS I表現形を修正する能力は;例えば、培養中でMPS I細胞にhIDUA又は誘導体をコードするウイルスベクター又は他のDNA発現コンストラクトを形質導入することにより;培養中のMPS I細胞にrHuGlyIDUA又は誘導体を加えることにより;あるいはMPS I細胞を rHuGlyIDUA又は誘導体を発現及び分泌するように操作したヒト宿主細胞と共培養して、MPS I培養細胞の欠陥の修正を決定することにより、例えば培養中のMPS I細胞におけるIDUA酵素活性及び/又はGAG貯蔵量の低下を検出することにより、細胞培養中で評価することができる(例えば、その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれているMyerowitz及びNeufeldの文献、1981、J Biol Chem 256: 3044-3048;並びにAnsonらの文献、1992、Hum Gene Ther 3: 371-379を参照されたい)。
【００３２】
MPS Iのための動物モデルは、マウス(例えば、Clarkeらの文献、1997、Hum Mol Genet 6(4):503-511を参照されたい)、雑種のイエネコ(例えば、Haskinsらの文献、1979、Pediatr Res 13(11):1294-97を参照されたい)、及びいくつかの品種のイヌ(例えば、Menonらの文献、1992、Genomics 14(3):763-768; Shullらの文献、1982、Am J Pathol 109(2):244-248を参照されたい)について記載されている。イヌのMPS Iモデルは、IDUA突然変異により検出可能なタンパク質が喪失するため、MPS Iの最も重度の形態であるハーラー症候群に類似している。IDUAタンパク質間の遺伝子相同性が高いこと(図2のアラインメントを参照されたい)は、hIDUAが動物において機能的であることを意味し、hIDUAを包含する治療はこれらの動物モデルで試験することができる。
【００３３】
好ましくは、rHuGlyIDUA導入遺伝子は、神経細胞及び/又はグリア細胞において機能する発現制御エレメント、例えば、CB7プロモーター(ニワトリβ-アクチンプロモーター及びCMVエンハンサー)によって制御されるべきであり、かつベクターによって駆動される導入遺伝子の発現を増強する他の発現制御エレメント(例えば、ニワトリβ-アクチンイントロン及びウサギβ-グロビンポリAシグナル)を含むことができる。huIDUA導入遺伝子のためのcDNAコンストラクトには、形質導入されたCNS細胞による適切な翻訳中及び翻訳後プロセシング(グリコシル化及びタンパク質硫酸化)を保証するシグナルペプチドのためのコード配列を含めるべきである。CNS細胞によって使用されるそのようなシグナルペプチドには：
・オリゴデンドロサイト-ミエリン糖タンパク質(hOMG)シグナルペプチド:
【化９】
2020508289.tif 000011
・E1A刺激を受けた遺伝子の細胞リプレッサー2(hCREG2)シグナルペプチド:
【化１０】
2020508289.tif 000012
・V-セット及び膜貫通ドメイン含有2B(hVSTM2B)シグナルペプチド:
【化１１】
2020508289.tif 000013
・プロトカドヘリンα-1(hPCADHA1)シグナルペプチド:
【化１２】
2020508289.tif 000014
・FAM19A1(TAFA1)シグナルペプチド:
【化１３】
2020508289.tif 000015
・インターロイキン-2シグナルペプチド:
【化１４】
2020508289.tif 000016
があり得るが、これらに限定されない。
シグナルペプチドは本明細書において、リーダー配列又はリーダーペプチドとも呼ぶことができる。
【００３４】
導入遺伝子を送達するために使用される組換えベクターは、神経細胞及び/又はグリア細胞を含むがこれらに限定されない、CNSの細胞への向性を有するべきである。そのようなベクターは非複製組換えアデノ随伴ウイルスベクター(「rAAV」)を含むことができ、特にAAV9又はAAVrh10キャプシドを有するウイルスベクターが好ましい。その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第7,906,111号においてWilsonによって記載された、特に好ましくはAAV/hu.31、AAV/hu.32を有するキャプシドを含むが、これらに限定されないAAVバリアントキャプシド;並びにその各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第8,628,966号、米国特許第8,927,514号及びSmithらの文献、2014、Mol Ther 22:1625-1634においてChatterjeeによって記載されたAAVバリアントキャプシドを使用することができる。しかしながら、「ネイキッドDNA」コンストラクト(5.2節を参照されたい)と呼ばれるレンチウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又は非ウイルス性発現ベクターを含むがこれらに限定されない、他のウイルスベクターを使用することができる。
【００３５】
CSFへの投与に好適な医薬組成物は、生理的に適合性の水性緩衝剤、界面活性剤、及び任意の賦形剤を含む製剤化緩衝液中のrHuGlyIDUAベクターの懸濁液を含む。ある実施態様において、医薬組成物は、大槽内投与(大槽の注入)に好適である。ある実施態様において、医薬組成物は、C1-2穿刺を介するくも膜下空間への注入に好適である。ある実施態様において、医薬組成物は、くも膜下腔内投与に好適である。ある実施態様において、医薬組成物は、脳室内投与に好適である。ある実施態様において、医薬組成物は、腰椎穿刺を介する投与に好適である。
【００３６】
組換えベクターの治療有効用量は、くも膜下腔内投与を介して(すなわち、くも膜下空間に注入して、組換えベクターがCSFを通じて散布され、CNSの細胞が形質導入されるようにする)、CSFに投与すべきである。このことは、いくつかの方法で―例えば、頭蓋内(大槽又は脳室)注入、又は腰椎槽への注入によって―達成することができる。例えば、(大槽への)大槽内(IC)注入は、CTによって導かれる後頭下穿刺によって実施することができ;又は、患者に実行できそうな場合は、C1-2穿刺を介したくも膜下空間への注入を実施することができ;又は、腰椎穿刺(典型的にCSFの試料を収集するために実施される診断手順)を、CSFにアクセスするために使用することができる。あるいは、脳室内(ICV)投与(血液脳関門を透過しない、抗感染性又は抗癌性の薬物の導入に使用されるより侵襲的な技術)を使用して、組換えベクターを直接脳室内に点滴することができる。あるいは、鼻腔内投与を使用して、CNSに組換えベクターを送達するために用いてもよい。rHuGlyIDUAのCSF濃度を少なくとも9.25 μg/mLのCminに維持する用量又は9.25〜277 μg/mLの範囲内の濃度を使用すべきである。
【００３７】
CSF濃度は後頭部又は腰椎穿刺から得られるCSF流体中のrHuGlyIDUAの濃度を直接測定することによってモニタリングし、又は患者の血清において検出されたrHuGlyIDUAの濃度から外挿によって推定することができる。ある実施態様において、血清中のrHuGlyIDUAが10 ng/mL〜100 ng/mLであることは、CSF中のrHuGlyIDUAが1〜30 mgであることを示す。ある実施態様において、組換えベクターは、血清中のrHuGlyIDUAを10 ng/mL〜100 ng/mLに維持する用量で、CSFに投与する。
【００３８】
背景として、ヒトIDUAは、653アミノ酸のポリペプチドとして翻訳され、図1に表される6つの可能性のある部位(N110、N190、N336、N372、N415、及びN451)でN-グリコシル化される。シグナル配列が除去され、ポリペプチドはリソソーム内で成熟形態にプロセシングされる: 75 kDaの細胞内前駆体は数時間で72 kDaまでトリミングされ、最終的に、4〜5日かけて66 kDaの細胞内形態にプロセシングされる。IDUAの分泌形態(使用するアッセイに応じて76 kDa又は82 kDa)はマンノース-6-リン酸受容体を介して細胞に容易にエンドサイトーシスされ、より小さい細胞内形態と同様にプロセシングされる。(その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている、Myerowitz及びNeufeldの文献、1981、J Biol Chem 256: 3044-3048; Clementsらの文献、1989、Biochem J. 259: 199-208; Taylorらの文献、1991、Biochem J. 274: 263-268;及びZhaoらの文献、1997、J Biol Chem 272:22758-22765を参照されたい)。
【００３９】
hIDUAの全体の構造は、3つのドメインからなる:残基42-396は、古典的な(β/α)トリオースリン酸イソメラーゼ(TIM)バレルドメインを形成し;残基27-42及び397-545は、短いへリックス-ループ-へリックス(482-508)を有するβ-サンドイッチドメインを形成し;かつ残基546-642は、Ig様ドメインを形成する。最後に挙げた2つのドメインは、C541及びC577の間のジスルフィド架橋によって連結される。β-サンドイッチ及びIg様ドメインは、TIMバレルの1番目、7番目、及び8番目のα-へリックスに結合される。β-ヘアピン(β12-β13)はTIMバレルの8番目のβ-ストランド及び8番目のα-へリックスの間に挿入され、これは基質結合及び酵素活性に要求されるN-グリコシル化N372を含む。(図1及びその各々の全体が参照により本明細書に組み込まれているMaitaらの文献、2013、PNAS 110: 14628-14633及びSaitoらの文献、2014 Mol Genet Metab 111:107-112に記載の結晶構造を参照されたい)。
【００４０】
本発明は部分的に、以下の原理に基づく:
(i) CNSの神経細胞及びグリア細胞はCNSにおける活発なプロセスであるグリコシル化及びチロシン-O-硫酸化を含む分泌タンパク質の翻訳後プロセシングのための細胞機構を有する分泌細胞である。ヒトCNS細胞が行う翻訳後修飾についての、その各々の全体が参照により組み込まれている、例えばヒト脳マンノース-6-リン酸(M6P)グリコプロテオームについて記載され、脳が他の組織に見出されるよりはるかに多くの個々のアイソフォームを有するより多くのタンパク質及びマンノース-6-リン酸化タンパク質を含むことを注記した、Sleatらの文献、2005、Proteomics 5: 1520-1532及びSleatの文献、1996、J Biol Chem 271:19191-98;並びに神経細胞によって分泌されたチロシン硫酸化糖タンパク質の生産を報告しているKananらの文献、2009、Exp. Eye Res. 89: 559-567並びにKanan及びAl-Ubaidiの文献、2015 Exp. Eye Res. 133: 126-131を参照されたい。
(ii) hIDUAは、図1と特定される6つのアスパラギン(「N」)のグリコシル化部位を有する(N110FT; N190VS; N336TT; N372NT; N415HT; N451RS)。N372のN-グリコシル化は基質との結合及び酵素活性に要求され、かつマンノース-6-リン酸化は分泌された酵素の細胞取り込み及びMPS I細胞の横断修正に要求される。N-結合型グリコシル化部位は複雑なハイマンノース、リン酸化マンノース糖質部分を含むが(図4)、分泌形態のみが細胞によって取り込まれる(上記Myerowitz及びNeufeldの文献、1981)。本明細書に記載の遺伝子治療アプローチは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって測定して(使用するアッセイに応じて)76〜82 kDaの2,6-シアル酸付加され、かつマンノース-6リン酸化されたIDUA糖タンパク質が絶えず分泌されるべきである。分泌されたグリコシル化/リン酸化IDUAは、CNSの形質導入されていない神経細胞及びグリア細胞によって取り込まれ、かつ正しくプロセシングされるべきである。
(iii) リソソームタンパク質の細胞性及び細胞内輸送/取り込みは、M6Pを介する。Danieleの文献、2002においてイズロネート-2-スルファターゼ酵素について行われたように、分泌タンパク質のM6P含有量を測定することは、可能である。(例えば、5mMの)抑制性M6Pの存在下では、非神経細胞又は非グリア細胞、例えばDaniele の文献、2002の遺伝子操作された腎細胞によって生成された酵素前駆体の取り込みは、Danieleの文献、2002に示されたように、対照細胞のレベルに近いレベルまで減少すると予測される。抑制性M6Pの存在下であっても、脳細胞、例えば神経細胞及びグリア細胞によって生成される酵素前駆体の取り込みは、取り込み量が対照細胞より4倍高く、抑制性M6Pの非存在下で遺伝子操作された腎細胞によって生成された酵素前駆体の酵素活性(すなわち、取り込み)のレベルと同等であったDanieleの文献、2002に示されたように高レベルを維持すると予測される。このアッセイを用いると、脳細胞によって生成される酵素前駆体のM6P含有量を予測し、特に異なる種類の細胞によって生成される酵素前駆体中のM6P含有量を比較することが可能となる。本明細書に記載の遺伝子治療アプローチは、そのようなアッセイにおいて抑制性M6Pの存在下、高レベルで神経細胞及びグリア細胞に取り込まれ得る、hIDUAの継続的分泌をもたらすべきである。
(iv) N-結合型グリコシル化部位に加えて、hIDUAは、結合及び活性のために要求されるN372を含むドメインの近くに、チロシン(「Y」)硫酸化部位
【化１５】
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を含む。(例えば、その全体が参照により組み込まれている、タンパク質チロシン硫酸化を受けるチロシン残基を取り巻くアミノ酸の解析についてのYangらの文献、2015、Molecules 20:2138-2164、特にp. 2154を参照されたい。「規則」は、以下の通りに要約することができる: Y残基がYから+5〜-5位の範囲内にE又はDを有し、かつYの-1位が中性又は酸性荷電アミノ酸であるが―硫酸化を無効化する塩基性アミノ酸、例えばR、K、又はHではない)。いかなる理論に束縛されることも意図するものではないが、チロシン硫酸化領域内の突然変異(例えば、W306L)が酵素活性の減少及び疾患と関連することは公知であるため、hIDUAのこの部位の硫酸化は活性にきわめて重要となり得る。(Maitaらの文献、2013、PNAS 110:14628、pp. 14632-14633を参照されたい)。
(v) CNSのヒト細胞によるhIDUAのグリコシル化により、安定性、半減期を向上させ、かつ導入遺伝子産物の望まない凝集を減らすことができるグリカンが付加される。大事なことに、本発明のHuGlyIDUAに付加されるグリカンは2,6-シアル酸を含み、Neu5Ac(「NANA」)を組み込むが、そのヒドロキシル化誘導体NeuGc(N-グリコリルノイラミン酸、すなわち「NGNA」又は「Neu5Gc」)を組み込まない高度にプロセシングされた複合型二分岐N-グリカンである。そのようなグリカンはこの翻訳後修飾を行うのに要求される2,6-シアリルトランスフェラーゼを有さず、バイセクティングGlcNAcも生産しないが、Neu5Ac(NANA)の代わりにヒトにとって典型的でない(かつ潜在的に免疫原性の)シアル酸であるNeu5Gc(NGNA)を付加するCHO細胞において生産されるラロニダーゼには存在しない。例えば、Dumontらの文献、2016、Critical Rev in Biotech 36(6):1110-1122(早期オンラインpp. 1-13、p. 5);及びHagueらの文献、1998、Electrophor 19:2612-2630(「CHO細胞株は、α2,6-シアリルトランスフェラーゼの欠如のため、グリコシル化に関して『表現形上制限されている』と考えられている」)。さらに、CHO細胞は大部分の個体に存在する抗α-Gal抗体と反応して、高濃度でアナフィラキシーを誘発し得る免疫原性グリカン、α-Gal抗原も生産し得る。例えば、Bosquesの文献、2010、Nat Biotech 28: 1153-1156を参照されたい。本発明のHuGlyIDUAのヒトグリコシル化パターンは、導入遺伝子産物の免疫原性を低下させ、かつ効力を向上させるべきである。
(vi) hIDUA のチロシン硫酸化―ヒトCNS細胞の活発な翻訳後プロセス―は、導入遺伝子産物のプロセシング及び活性を向上させるべきである。リソソームタンパク質のチロシン硫酸化の意義は、明らかにされていない;しかし、他のタンパク質では、チロシン硫酸化により、タンパク質-タンパク質相互作用(抗体及び受容体)の親和性が増加し、タンパク質分解プロセシング(ペプチドホルモン)が促進されることが示されている。(Mooreの文献、2003、J Biol. Chem. 278:24243-46;及びBundegaardらの文献、1995、EMBO J 14: 3073-79を参照されたい)。チロシン硫酸化(IDUAのプロセシングの最終ステップとして起こる場合がある)を担うチロシンタンパク質スルホトランスフェラーゼ(TPST1)は、明らかに脳(TPST1のための遺伝子発現データは、例えば、http://www.ebi.ac.uk/gxa/homeにてアクセス可能なEMBL-EBI Expression Atlasに見出すことができる)でより高いレベル(mRNAに基づいて)で発現する。そのような翻訳後修飾は、最高でもCHO細胞の生産物であるラロニダーゼにおいて過少に示される。ヒトCNS細胞とは異なり、CHO細胞は、分泌細胞ではなく、翻訳後のチロシン-硫酸化能が限られている。(例えばMikkelsen及びEzbanの文献、1991、Biochemistry 30: 1533-1537、特に1537ページの考察を参照されたい)。
(vii) 導入遺伝子産物の免疫原性は、患者の免疫状態、注入されたタンパク質薬物の構造及び特徴、投与経路、及び治療の持続時間を含む様々な因子によって誘導され得る。プロセス関連不純物、例えば宿主細胞タンパク質(HCP)は宿主細胞DNA、及び化学的残留物、並びに生産物関連不純物、例えばタンパク質分解物及び構造特徴、例えばグリコシル化、酸化及び凝集(肉眼不可視粒子)は免疫反応を増強するアジュバントとしての機能を果たすことによって免疫原性を増加させる場合がある。プロセス関連及び生産物関連不純物の量は、製造プロセス:商業的に製造されるIDUA産物に影響を及ぼし得る細胞培養、精製、製剤化、保存、及び取扱いの影響を受け得る。遺伝子治療では、タンパク質はインビボで生産され、その結果プロセス関連不純物は存在せず、タンパク質産物は組換え技術によって生産されるタンパク質と関連した生産物関連不純物/分解物、例えばタンパク質凝集物及びタンパク質酸化物を含む可能性は低い。凝集は、例えばタンパク質生産及び保存と関連づけられ、高いタンパク質濃度、製造装置及び容器との表面相互作用、並びに特定の緩衝液システムを用いた精製プロセスに起因する。しかし、導入遺伝子をインビボで発現させる場合、凝集を促進するこれらの条件は存在しない。また、酸化、例えばメチオニン、トリプトファン、及びヒスチジンの酸化は、タンパク質生産及び保存と関連付けられ、例えばストレス負荷された細胞培養条件、金属及び空気との接触、並びに緩衝液及び賦形剤中の不純物によって引き起こされる。インビボで発現されるタンパク質は、ストレス負荷された条件下で酸化され得るが、ヒトは多くの生物と同様に、抗酸化防衛システムを備えており、それにより酸化ストレスが低下するだけでなく、酸化を修復し、かつ/又は逆行させもする。従って、インビボで生産されるタンパク質が、酸化形態にある可能性は低い。凝集及び酸化は両方とも、効力、PK(クリアランス)に影響を及ぼし得、免疫原となる懸念を大きくし得る。本明細書に記載の遺伝子治療アプローチは、商業的に製造された産物と比較して免疫原性の低下したhIDUAを絶えず分泌するべきである。
【００４１】
前述の理由のために、HuGlyIDUAの生産は―例えば、MPS I疾患(ハーラー、ハーラー-シャイエ又はシャイエを含むが、これらに限定はされない)と診断される患者(ヒト対象)のCSFにHuGlyIDUAをコードするウイルスベクター又は他のDNA発現コンストラクトを投与して、形質導入されたCNS細胞によって分泌される完全ヒトグリコシル化、マンノース-6-リン酸化、硫酸化導入遺伝子産物を絶えず供給するCNS中の永続的なデポーを作製することによる―遺伝子治療によって達成されるMPS Iの治療のための「バイオベター」分子をもたらすべきである。デポーからCSF中に分泌されるHuGlyIDUA導入遺伝子産物は、CNS中の細胞によりエンドサイトーシスされ、MPS Iレシピエント細胞における酵素欠陥の「横断修正」をもたらす。
【００４２】
遺伝子治療又はタンパク質治療アプローチにおいて生産されるすべてのhIDUA分子が完全にグリコシル化され、硫酸化されることは、必須ではない。むしろ、生じる糖タンパク質の集団は、有効性を実証するのに十分なグリコシル化(2,6-シアル酸付加及びマンノース-6-リン酸化を含む)及び硫酸化を受けるべきである。本発明の遺伝子治療処置の目的は、疾患の進行を減速させ、又は停止させることである。有効性は、認知機能(例えば、神経認知機能の低下の防止若しくは減少);CSF及び/若しくは血清中の疾患バイオマーカー(例えばGAG)の低下;及び/又は、CSF及び/若しくは血清のIDUA酵素活性の増加を測定することによってモニタリングすることができる。炎症の徴候及び他の安全事象をモニタリングすることもできる。
【００４３】
遺伝子治療に対する代替又は追加治療として、rHuGlyIDUA糖タンパク質は組換えDNA技術によってヒト細胞株で生産することができ、糖タンパク質は全身的に及び/又はERTのためのCSFにMPS Iと診断された患者に投与することができる。そのような組換え糖タンパク質生産のために使用することができるヒト細胞株は、これらに限定されないが、少し例を挙げればHT-22、SK-N-MC、HCN-1A、HCN-2、NT2、SH-SY5y、hNSC11、ReNcell VM、ヒト胎児腎293細胞(HEK293)、線維肉腫HT-1080、HKB-11、CAP、HuH-7、網膜細胞株、PER.C6、又はRPEを含む(例えば、その全体が参照により組み込まれている、rHuGlyIDUA糖タンパク質の組換え生産のために使用することができるヒト細胞株の総説についてのDumontらの文献、2016、Critical Rev in Biotech 36(6):1110-1122「生物医薬製造のためのヒト細胞株:歴史、現状、及び将来の展望(Human cell lines for biopharmaceutical manufacturing: history, status, and future perspectives)」)。完全なグリコシル化、特にシアル酸付加及びチロシン硫酸化を保証するために、生産に使用する細胞株をチロシン-O-硫酸化を担うα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ(又はα-2,3-及びα-2,6-シアリルトランスフェラーゼの両方)並びに/又はTPST-1及びTPST-2酵素を共発現するように宿主細胞を操作することによって強化することができる。
【００４４】
rHuGlyIDUAの送達が免疫反応を最小化すべきである一方、CNS関連遺伝子治療に関する毒性の最も明白な潜在的源は遺伝的にIDUAを欠損しており、従ってタンパク質及び/又は導入遺伝子を送達するために用いるベクターを潜在的に寛容しないヒト対象において発現されたhIDUAタンパク質に対する免疫が発生することである。
【００４５】
従って、好ましい実施態様において、患者を免疫抑制治療で共治療することは―特にIDUAのレベルが0に近い重度の疾患(例えば、ハーラー)を有する患者を治療する場合に―適切である。タクロリムス又はラパマイシン(シロリムス)を、例えばミコフェノール酸と組合わせた、及び/若しくはプレドニゾロン及び/若しくはメチルプレドニゾロンなどのコルチコステロイドと組合わせたレジメン、あるいは組織移植手順において使用される他の免疫抑制レジメンを伴う免疫抑制治療を、利用することができる。そのような免疫抑制治療は遺伝子治療クール中に施すことができ、ある実施態様において、免疫抑制治療による前処理が好ましい場合がある。免疫抑制治療は治療医師の判断に基づいて、遺伝子治療処置の後も継続することができ、その後免疫寛容が誘発された場合：例えば、180日後に、中止することができる。
【００４６】
一実施態様において、免疫抑制はコルチコステロイド、例えばプレドニゾロン及び/又はメチルプレドニゾロンの投与並びに任意にMMFとともに投与されるタクロリムス及び/又はシロリムスのレジメンを含む。例えば、1回のコルチコステロイド、例えばメチルプレドニゾロンを注入し、その後経口コルチコステロイドを投与し、12週の経過にわたり段階的に漸減し、続いて中断する。同時に、タクロリムス及びシロリムスを組合わせで低用量(例えば、4〜8 ng/mLの血清濃度を維持する)で、又はラベル用量で単独で24〜48週にわたって経口投与することができる。タクロリムス又はシロリムスは、MMFと組合わせてラベル用量で投与されることもできる。従って、患者は直ちに利用可能なステロイドの初期の注入を受けこのステロイドは続いて経口投与によって維持されて、12週までに漸減される。さらなる免疫抑制は、任意にMMFと組合わせて、タクロリムス及び/又はシロリムスによって48週を通じて維持される。
【００４７】
他の利用可能な治療薬の送達を伴うCSFへのHuGlyIDUAの送達の併用は、本発明の方法に包含される。追加治療薬は、遺伝子治療処置の前に、それと同時に、又はその後に投与することができる。本発明の遺伝子治療と組合わせることができるMPS Iの利用可能な治療には、これらに限定はされないが、全身に、若しくはCSFに投与するラロニダーゼを使用する酵素補充療法；及び/又はHSCT療法がある。
【００４８】
ある実施態様において、MPS I と診断されたヒト対象を治療する方法であって、前記ヒト対象の脳の脳脊髄液にヒト神経細胞によって生産された治療有効量の組換えヒトIDUAを送達することを含む、前記方法を本明細書に記載する。ある実施態様において、MPS Iと診断されたヒト対象を治療する方法であって、前記ヒト対象の脳の脳脊髄液にヒトグリア細胞によって生産された治療有効量の組換えヒトIDUAを送達することを含む、前記方法を本明細書に記載する。
【００４９】
ある実施態様において、ムコ多糖症I型(MPS I)と診断されたヒト対象を治療する方法は：前記ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のα2,6シアル酸付加ヒトα-L-イズロニダーゼ(IDUA)を送達すること;及びヒトIDUAによる治療の前に、又はそれと同時に前記対象に免疫抑制治療を施して、その後も免疫抑制治療を継続することを含む、前記方法を本明細書において提供する。
【００５０】
ある実施態様において、MPS Iと診断されたヒト対象を治療する方法であって：前記ヒト対象の脳の脳脊髄液に検出可能なNeuGcを含まない治療有効量のグリコシル化ヒトIDUAを送達すること;及びヒトIDUAによる治療の前に、又はそれと同時に前記対象に免疫抑制治療を施し、その後も免疫抑制治療を継続することを含む、前記方法を本明細書において提供する。
【００５１】
ある実施態様において、MPS Iと診断されたヒト対象を治療する方法であって：前記ヒト対象の脳の脳脊髄液に検出可能なNeuGc及び/又はα-Gal抗原を含まない治療有効量のグリコシル化ヒトIDUAを送達すること;及びヒトIDUAによる治療の前に、又はそれと同時に前記対象に免疫抑制治療を施し、その後も免疫抑制治療を継続することを含む、前記方法を本明細書において提供する。
【００５２】
ある実施態様において、MPS Iと診断されたヒト対象を治療する方法であって：前記ヒト対象の脳の脳脊髄液にチロシン-硫酸化を含む治療有効量のヒトIDUAを送達すること;及びヒトIDUAによる治療の前に、又はそれと同時に前記対象に免疫抑制治療を施し、その後も免疫抑制治療を継続することを含む、前記方法を本明細書において提供する。
【００５３】
ある実施態様において、MPS Iと診断されたヒト対象を治療する方法であって：前記ヒト対象の脳にヒトIDUAをコードする発現ベクターを投与することであって、前記IDUAがヒト不死化神経細胞において前記発現ベクターから発現される際にα2,6シアル酸付加される、前記投与すること；及び
【００５４】
発現ベクターの投与の前に、又はそれと同時に、前記対象に免疫抑制治療を施し、その後も免疫抑制治療を継続することを含む、前記方法を本明細書において提供する。
【００５５】
ある実施態様において、MPS Iと診断されたヒト対象を治療する方法であって：前記ヒト対象の脳にヒトIDUAをコードする発現ベクターを投与することであって、前記IDUAがヒト不死化神経細胞において前記発現ベクターから発現される際にグリコシル化されるが検出可能なNeuGcを含まない、前記投与すること;及び発現ベクターの投与の前に、又はそれと同時に、前記対象に免疫抑制治療を施し、その後も免疫抑制治療を継続することを含む、前記方法を本明細書において提供する。
【００５６】
ある実施態様において、MPS Iと診断されたヒト対象を治療する方法は：工程a) 前記ヒト対象の脳にヒトIDUAをコードしている発現ベクターを投与することであって、前記ヒトIDUAは、ヒト又は不死化神経細胞において前記発現ベクターから発現される際にグリコシル化されるが、検出可能なNeuGc及び/又はα-Gal抗原を含まない、前記投与すること;並びに工程b) 発現ベクターの投与の前に及び/又はそれと同時に、及び/又はその後に前記対象に免疫抑制治療を施し、その後も免疫抑制治療を継続することを含む、前記方法を本明細書において提供する。
【００５７】
ある実施態様において、MPS Iと診断されたヒト対象を治療する方法は：前記ヒト対象の脳にヒトIDUAをコードする発現ベクターを投与することであって、前記IDUAがヒト不死化神経細胞において前記発現ベクターから発現される際にチロシン硫酸化される、前記投与すること；及び発現ベクターの投与の前に、又はそれと同時に前記対象に免疫抑制治療を施し、その後も免疫抑制治療を継続することを含む、前記方法を本明細書において提供する。
【００５８】
ある実施態様において、MPS Iと診断されたヒト対象を治療する方法は：前記ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトIDUAをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果α2,6シアル酸付加グリカンを含む前記IDUAを放出するデポーが形成される、前記投与すること;及び発現ベクターの投与の前に、又はそれと同時に、前記対象に免疫抑制治療を施し、その後も免疫抑制治療を継続することを含む、前記方法を本明細書において提供する。
【００５９】
ある実施態様において、MPS Iと診断されたヒト対象を治療する方法であって：前記ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトIDUAをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果検出可能なNeuGcを含まないグリコシル化ヒトIDUAを放出するデポーが形成される、前記投与すること;及び発現ベクターの投与の前に、又はそれと同時に、前記対象に免疫抑制治療を施し、その後も免疫抑制治療を継続することを含む、前記方法を本明細書において提供する。
【００６０】
ある実施態様において、MPS Iと診断されたヒト対象を治療する方法であって：前記ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトIDUAをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果検出可能なNeuGc及び/又はα-Gal抗原を含まないグリコシル化ヒトIDUAを放出するデポーが形成される、前記投与すること;及び発現ベクターの投与の前に、又はそれと同時に、前記対象に免疫抑制治療を施し、その後も免疫抑制治療を継続することを含む、前記方法を本明細書において提供する。
【００６１】
ある実施態様において、MPS Iと診断されたヒト対象を治療する方法であって：前記ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトIDUAをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果チロシン硫酸化を含む前記IDUAを放出するデポーが形成される、前記投与すること;及び発現ベクターの投与の前に、又はそれと同時に、前記対象に免疫抑制治療を施し、その後も免疫抑制治療を継続することを含む、前記方法を本明細書において提供する。
【００６２】
ある実施態様において、α2,6シアル酸付加グリカンを含む前記IDUAの生産は、細胞培養中で前記組換えヌクレオチド発現ベクターを用いてヒト神経細胞株を形質導入することによって確認する。ある実施態様において、検出可能なNeuGcを含まない前記グリコシル化IDUAの生産は、細胞培養中で前記組換えヌクレオチド発現ベクターを用いてヒト神経細胞株を形質導入することによって確認する。ある実施態様において、検出可能なNeuGc及び/又はα-Gal抗原を含まない前記グリコシル化IDUAの生産は、細胞培養中で前記組換えヌクレオチド発現ベクターを用いてヒト神経細胞株を形質導入することによって確認する。ある実施態様において、チロシン硫酸化を含む前記IDUAの生産は、細胞培養中で前記組換えヌクレオチド発現ベクターを用いてヒト神経細胞株を形質導入することによって確認する。具体的な実施態様において、IDUA導入遺伝子は、シグナルペプチドをコードする。ある実施態様において、ヒト神経細胞株は、HT-22、SK-N-MC、HCN-1A、HCN-2、NT2、SH-SY5y、hNSC11又はReNcell VMである。
【００６３】
ある実施態様において、MPS Iと診断されたヒト対象を治療する方法であって：前記ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトIDUAをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果α2,6シアル酸付加グリカンを含む前記IDUAを放出するデポーが形成される、前記投与すること;及び発現ベクターの投与の前に、又はそれと同時に前記対象に免疫抑制治療を施し、その後も免疫抑制治療を継続することを含み、ここで前記組換えベクターが、培養中でヒト神経細胞に形質導入するために使用される場合、前記細胞培養中の前記α2,6シアル酸付加グリカンを含む前記IDUAの生産をもたらす、前記方法を本明細書において提供する。ある実施態様において、ヒト神経細胞は、HT-22、SK-N-MC、HCN-1A、HCN-2、NT2、SH-SY5y、hNSC11又はReNcell VM細胞である。
【００６４】
ある実施態様において、MPS Iと診断されたヒト対象を治療する方法であって：前記ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトIDUAをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果検出可能なNeuGcを含まないグリコシル化IDUAを放出するデポーが形成される、前記投与すること;及び発現ベクターの投与の前に、又はそれと同時に、前記対象に免疫抑制治療を施し、その後も免疫抑制治療を継続することを含み;ここで前記組換えベクターが、培養中でヒト神経細胞に形質導入するために使用される場合、前記細胞培養中の検出可能なNeuGcを含まないグリコシル化された前記IDUAの生産をもたらす、前記方法を本明細書において提供する。ある実施態様において、ヒト神経細胞は、HT-22、SK-N-MC、HCN-1A、HCN-2、NT2、SH-SY5y、hNSC11又はReNcell VM細胞である。
【００６５】
ある実施態様において、MPS Iと診断されたヒト対象を治療する方法であって：前記ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトIDUAをコードしている組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果検出可能なNeuGc及び/又はα-Gal抗原を含まないグリコシル化IDUAを放出するデポーが形成される、前記投与すること;及び発現ベクターの投与の前に、又はそれと同時に、前記対象に免疫抑制治療を施し、その後も免疫抑制治療を継続することを含み;ここで前記組換えベクターが、培養中でヒト神経細胞に形質導入するために使用される場合、前記細胞培養中のグリコシル化されるが、検出可能なNeuGc及び/又はα-Gal抗原を含まない前記IDUAの生産をもたらす、前記方法を本明細書において提供する。ある実施態様において、ヒト神経細胞は、HT-22、SK-N-MC、HCN-1A、HCN-2、NT2、SH-SY5y、hNSC11又はReNcell VM細胞である。
【００６６】
ある実施態様において、MPS Iと診断されたヒト対象を治療する方法であって：前記ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトIDUAをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果チロシン硫酸化を含む前記IDUAを放出するデポーが形成される、前記投与すること;及び発現ベクターの投与の前に、又はそれと同時に前記対象に免疫抑制治療を施し、その後も免疫抑制治療を継続することを含み;ここで前記組換えベクターが、培養中でヒト神経細胞に形質導入するために使用される場合、前記細胞培養中のチロシン硫酸化された前記IDUAの生産をもたらす前記方法を、本明細書において提供する。ある実施態様において、ヒト神経細胞は、HT-22、SK-N-MC、HCN-1A、HCN-2、NT2、SH-SY5y、hNSC11又はReNcell VM細胞である。
【００６７】
ある実施態様において、ヒトIDUAは、配列番号:1のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、免疫抑制治療は、ヒトIDUAによる治療の前に、又はそれと同時に前記対象に(a)タクロリムス及びミコフェノール酸、又は(b)ラパマイシン及びミコフェノール酸の組合せを投与すること、並びにその後も継続することを含む。ある実施態様において、免疫抑制治療は、180日後に中止する。
【００６８】
好ましい実施態様において、グリコシル化IDUAは、検出可能なNeuGc及び/又はα-Galを含まない。本明細書で使用するフレーズ「検出可能なNeuGc及び/又はα-Gal」は、NeuGc及び/又はα-Gal成分が当技術分野において公知の標準アッセイ方法によって検出可能であることを意味する。例えば、NeuGcは、NeuGcを検出する方法について参照により本明細書に組み込まれているHaraらの文献、1989、「蛍光検出を伴う逆相液体クロマトグラフィーによる、ヒト血清及び尿、並びにラット血清中のN-アセチル及びN-グリコリルノイラミン酸の高感度測定(Highly Sensitive Determination of N-Acetyl-and N-Glycolylneuraminic Acids in Human Serum and Urine and Rat Serum by Reversed-Phase Liquid Chromatography with Fluorescence Detection.)」J. Chromatogr., B: Biomed. 377: 111-119に従ったHPLCによって検出することができる。あるいは、NeuGcは、質量分析によって検出することができる。α-Galは、ELISAを使用して(例えば、Galiliらの文献、1998、「モノクローナル抗Gal抗体によって細胞表面のα-Galエピトープ発現を測定するための高感度アッセイ(A sensitive assay for measuring alpha-Gal epitope expression on cells by a monoclonal anti-Gal antibody.)」、Transplantation. 65(8):1129-32を参照されたい)、又は質量分析により(例えば、Ayoubらの文献、2013、「インタクトな、ミドル-アップ、ミドル-ダウン、及びボトム-アップESI及びMALDI質量分析技術の組合せによる、セツキシマブの修正された一次構造評価及び広範囲のグリコプロファイリング(Correct primary structure assessment and extensive glyco-profiling of cetuximab by a combination of intact, middle-up, middle-down and bottom-up ESI and MALDI mass spectrometry techniques.)」、Landes Bioscience. 5(5): 699-710を参照されたい)を検出することができる。また、Platts-Millsらの文献、2015、「糖側鎖α-galに対するアナフィラキシー(Anaphylaxis to the Carbohydrate Side-Chain Alpha-gal)」Immunol Allergy Clin North Am. 35(2): 247-260において引用されている参考文献も参照されたい。
【００６９】
(5.1 N-グリコシル化及びチロシン硫酸化)
(5.1.1. N-グリコシル化)
CNSの神経細胞及びグリア細胞はグリコシル化及びチロシン-O-硫酸化を含む分泌タンパク質の翻訳後プロセシングのための細胞機構を備える分泌細胞である。hIDUAは、図1において特定される6つのアスパラギン(「N」)グリコシル化部位(N110FT; N190VS; N336TT; N372NT; N415HT; N451RS)を有する。N372のN-グリコシル化は基質との結合及び酵素活性に要求され、マンノース-6-リン酸化は分泌された酵素の細胞取り込み及びMPS I細胞の横断修正に要求される。N-結合型グリコシル化部位は複雑な、ハイマンノース及びリン酸化されたマンノース糖質成分を含むが(図4)、分泌形態のみが細胞によって取り込まれる。本明細書に記載の遺伝子治療アプローチでは、2,6シアル酸付加され、かつマンノース-6リン酸化されたIDUA糖タンパク質が絶えず分泌されるべきである。分泌されたグリコシル化/リン酸化IDUAは、CNSの形質導入されていない神経細胞及びグリア細胞によって取り込まれ、かつ正しくプロセシングされるべきである。
【００７０】
CNSのヒト細胞によるhIDUAのグリコシル化により、安定性、半減期を向上させ、かつ導入遺伝子産物の望まない凝集を減らすことができるグリカンが付加される。大事なことに、本発明のHuGlyIDUAに付加されるグリカンは2,6-シアル酸を含み、Neu5Ac(「NANA」)を組み込むが、そのヒドロキシル化誘導体NeuGc(N-グリコリルノイラミン酸、すなわち「NGNA」又は「Neu5Gc」)を組み込まない高度にプロセシングされた複合型二分岐N-グリカンである。そのようなグリカンはこの翻訳後修飾を行うのに要求される2,6-シアリルトランスフェラーゼを有さず、バイセクティングGlcNAcも生産しないが、Neu5Ac(NANA)の代わりにヒトにとって典型的でない(かつ潜在的に免疫原性の)シアル酸であるNeu5Gc(NGNA)を付加するCHO細胞において生産されるラロニダーゼには存在しない。さらに、CHO細胞はまた、大部分の個体に存在する抗α-Gal抗体と反応して、高濃度でアナフィラキシーを誘発し得る免疫原性グリカン、α-Gal抗原を生産し得る。例えば、Bosquesの文献、2010、Nat Biotech 28: 1153-1156を参照されたい。本発明のHuGlyIDUAのヒトグリコシル化パターンは、導入遺伝子産物の免疫原性を低下させ、かつ効力を向上させるべきである。
【００７１】
遺伝子治療又はタンパク質治療アプローチにおいて生産されるすべての分子が完全にグリコシル化され、硫酸化されることは、必須ではない。むしろ、生じる糖タンパク質の集団は、有効性を実証するのに十分なグリコシル化及び硫酸化を受けるべきである。
【００７２】
特定の実施態様において、本明細書に記載の方法に従って使用されるHuGlyIDUAは、神経細胞又はグリア細胞においてインビボ又はインビトロで発現させた場合、そのN-グリコシル化部位の100%でグリコシル化され得る。しかしながら、当業者であれば、グリコシル化の利益が達成されるためには、必ずしもすべてのHuGlyIDUAのN-グリコシル化部位がN-グリコシル化される必要はないことを認識されよう。むしろ、グリコシル化の利益はN-グリコシル化部位の一定の割合のみがグリコシル化され、かつ/又は発現されたIDUA分子の一定の割合のみがグリコシル化される場合に実現され得る。したがって、ある実施態様において、本明細書に記載の方法に従って使用されるHuGlyIDUAは、神経細胞又はグリア細胞においてインビボ又はインビトロで発現させた場合、その利用可能なN-グリコシル化部位の10%〜20%、20%〜30%、30%〜40%、40%〜50%、50%〜60%、60%〜70%、70%〜80%、80%〜90%、又は90%〜100%でグリコシル化される。ある実施態様において、神経細胞又はグリア細胞においてインビボ又はインビトロで発現させた場合、本明細書に記載の方法に従って使用されるHuGlyIDUA分子の10%〜20%、20%〜30%、30%〜40%、40%〜50%、50%〜60%、60%〜70%、70%〜80%、80%〜90%又は90%〜100%は、それらの利用可能なN-グリコシル化部位の少なくとも1つでグリコシル化される。
【００７３】
具体的な実施態様において、HuGlyIDUAを神経細胞又はグリア細胞においてインビボ又はインビトロで発現させた場合、本明細書に記載の方法に従って使用されるHuGlyIDUAに存在するN-グリコシル化部位の少なくとも10%、20% 30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%又は99%はN-グリコシル化部位に存在するAsn残基(又は他の関連した残基)でグリコシル化される。すなわち、結果として生じるHuGlyIDUAのN-グリコシル化部位の少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%又は99%は、グリコシル化される。
【００７４】
別の具体的な実施態様において、HuGlyIDUAが神経細胞又はグリア細胞においてインビボ又はインビトロで発現された場合、本明細書に記載の方法に従って使用されるHuGlyIDUA分子に存在するN-グリコシル化部位の少なくとも10%、20% 30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、又は99%は、N-グリコシル化部位に存在するAsn残基(又は他の関連した残基)に結合される同一の結合されたグリカンによりグリコシル化される。すなわち、結果として生じるHuGlyIDUAのN-グリコシル化部位の少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、又は99%は、同一の結合されたグリカンを有する。
【００７５】
重要なことに、本明細書に記載の方法に従って使用されるIDUAタンパク質が神経細胞又はグリア細胞において発現される場合、原核生物宿主細胞(例えば、大腸菌(E. coli))又は真核生物宿主細胞(例えば、CHO細胞)におけるインビトロ生産の必要は回避される。その代わりに、本明細書に記載の方法の結果(例えば、IDUAを発現させるための神経細胞又はグリア細胞の使用)、IDUAタンパク質のN-グリコシル化部位は、有利なことにヒトの治療に関連及び有益なグリカンで修飾される(decorated)。CHO細胞又は大腸菌がタンパク質生産に利用される場合、そのような利点には到達できない；それは、例えばCHO細胞は、(1)は2,6シアリルトランスフェラーゼを発現せず、従ってN-グリコシル化の間、2,6シアル酸を付加することができず、かつ(2)シアル酸としてNeu5Acの代わりにNeu5Gcを付加することができるためであり;並びに大腸菌は天然にはN-グリコシル化に必要な構成要素を含まないためである。したがって、一実施態様において、神経細胞又はグリア細胞において発現され、本明細書に記載の治療方法において使用されるHuGlyIDUAを生じるIDUAタンパク質は、ヒト神経細胞又はグリア細胞においてタンパク質がN-グリコシル化される様式でグリコシル化されるが、CHO細胞においてタンパク質がグリコシル化される様式でグリコシル化されるのではない。別の実施態様において、神経細胞又はグリア細胞において発現されて本明細書に記載の治療方法で使用されるHuGlyIDUAを生じるIDUAタンパク質は、神経細胞又はグリア細胞においてタンパク質がN-グリコシル化される様式でグリコシル化され、そのようなグリコシル化は、原核生物宿主細胞を使用して、例えば大腸菌を使用した場合は手を加えずには不可能である。
【００７６】
タンパク質のグリコシル化パターンを決定するためのアッセイは、当技術分野において公知である。例えば、ヒドラジン分解は、グリカンを分析するために使用することができる。第一に、多糖を、ヒドラジンとのインキュベーションによって、その会合するタンパク質から放出させる(Ludger解放ヒドラジン分解グリカン放出キット、Oxfordshire, UKを使用することができる)。求核剤であるヒドラジンは、多糖及びキャリアタンパク質間のグリコシド結合を攻撃して、結合したグリカンを放出させる。N-アセチル基は、この処理の間、失われて、再N-アセチル化によって再構成されなければならない。遊離グリカンは、炭素カラム上で精製し、続いて蛍光色素分子である2-アミノベンズアミドを用いて還元末端を標識することができる。標識多糖は、Royleらの文献、Anal Biochem 2002, 304(1):70-90.のHPLCプロトコルに従ってGlycoSep-Nカラム(GL Sciences)上で分離することができる。結果として生じる蛍光クロマトグラムは、多糖の長さ及び繰り返し単位の数を示す。構造情報は、個々のピークを収集し、引き続きMS/MS分析を実施することによって集めることができる。それにより、繰り返し単位の単糖の組成及び配列を確認することができ、さらに多糖の組成の均一性を特定することができる。低分子量の特異的ピークは、MALDI-MS/MS及びグリカン配列を確認するために使用される結果によって分析することができる。各ピークは、特定の数の繰り返し単位及びその断片からなるポリマーに対応する。従って、クロマトグラムを用いれば、ポリマー長の分布の測定が可能となる。
溶出時間はポリマー長の指標である一方、蛍光強度はそれぞれのポリマーのためのモル存在量と相関する。
【００７７】
タンパク質と会合するグリカンパターンの均一性は、グリカン長及びグリコシル化部位全体に存在するグリカンの数と関係しているため、この均一性は当技術分野で公知の方法、例えばグリカン長及び流体力学半径を測定する方法を使用して評価することができる。サイズ排除HPLCは、流体力学半径の測定を可能にする。タンパク質中のグリコシル化部位の数が多いほど、グリコシル化部位がより少ないキャリアと比較して、流体力学半径の多様性がより大きくなる。しかしながら、単一のグリカン鎖が分析される場合、それらは長さがより高度に制御されているために、より均一になり得る。グリカン長は、ヒドラジン分解、SDS PAGE、及びキャピラリーゲル電気泳動によって測定することができる。さらに、また、均一であることは、特定のグリコシル化部位の使用パターンがより広い/より狭い範囲に変化することを意味し得る。これらの因子は、糖ペプチドLC-MS/MSで測定することができる。
【００７８】
N-グリコシル化は、本明細書に記載の方法で使用されるHuGlyIDUAに多くの利益を付与する。そのような利益は大腸菌におけるタンパク質生産によっては到達不能である。それは、大腸菌は、N-グリコシル化に必要とされる構成要素を天然には有しないためである。さらに、いくつかの利益は例えば、CHO細胞におけるタンパク質生産によっては到達不能である。それは、CHO細胞が特定のグリカン(例えば、2,6シアル酸)の付加に必要な構成要素を欠いており、かつヒトにとって典型的でないグリカン、例えばNeu5Gc及び大部分の個体において免疫原性であり、かつ高濃度ではアナフィラキシーを誘発し得るα-Gal抗原を付加し得るためである。従って、ヒト神経細胞又はグリア細胞におけるIDUAの発現により、そうせずにCHO細胞又は、大腸菌において生産された場合はタンパク質と会合していないであろう有益なグリカンを含むHuGlyIDUAが生産される。
【００７９】
(5.1.2. チロシン硫酸化)  
N-結合型グリコシル化部位に加えて、hIDUAは、結合及び活性に要求されるN372を含むドメインの近くにチロシン(「Y」)硫酸化部位
【化１６】
2020508289.tif 000018
を含む。(例えば、その全体が参照により組み込まれている、タンパク質チロシン硫酸化を受けるチロシン残基を取り巻くアミノ酸の解析についてのYangらの文献、2015、Molecules 20:2138-2164、特にp. 2154を参照されたい。「規則」は、以下の通りに要約することができる: Y残基がYから+5〜-5位の範囲内にE又はDを有し、かつYの-1位が中性又は酸性荷電アミノ酸であるが―硫酸化を無効化する塩基性アミノ酸、例えばR、K、又はHではない。任意の理論に束縛されることを意図するものではないが、チロシン-硫酸化領域内の突然変異(例えば、W306L)が酵素活性の減少及び疾患と関係することは公知であるため、hIDUAのこの部位の硫酸化は活性に非常に重要となり得る。(Maitaらの文献、2013、PNAS 110:14628、pp. 14632-14633を参照されたい)。
【００８０】
重要なことに、チロシン硫酸化タンパク質は、チロシン硫酸化に要求される酵素を天然には有しない大腸菌では、生産することができない。さらに、CHO細胞は、チロシン硫酸化について欠陥がある―この細胞は、分泌細胞ではなく、翻訳後のチロシン硫酸化を行う能力が限定されている。例えば、Mikkelsen及びEzbanの文献、1991、Biochemistry 30: 1533-1537.を参照されたい。有利なことに、本明細書で提供する方法は分泌型であり、かつ実にチロシン硫酸化のための能力を備える神経細胞又はグリア細胞におけるIDUA、例えばHuGlyIDUAの発現を必要とする。チロシン硫酸化を検出するためのアッセイは、当技術分野において公知である。例えば、Yangらの文献、2015, Molecules 20:2138-2164.を参照されたい。
【００８１】
hIDUA のチロシン硫酸化―ヒトCNS細胞の活発な翻訳後プロセス―は、導入遺伝子産物のプロセシング及び活性を向上させるべきである。リソソームタンパク質のチロシン硫酸化の意義は、明らかにされていない;しかし、他のタンパク質では、チロシン硫酸化により、タンパク質-タンパク質相互作用(抗体及び受容体)の親和性を増加させ、タンパク質分解プロセシング(ペプチドホルモン)を促進することが示されている。(Mooreの文献、2003、J Biol. Chem. 278:24243-46;及びBundegaardらの文献、1995、EMBO J 14: 3073-79を参照されたい)。チロシン硫酸化(IDUAのプロセシングの最終ステップとして起こる場合がある)を担うチロシンタンパク質スルホトランスフェラーゼ(TPST1)は、明らかに脳(TPST1のための遺伝子発現データは、例えば、http://www.ebi.ac.uk/gxa/homeにてアクセス可能なEMBL-EBI Expression Atlasに見出すことができる)でより高いレベル(mRNAに基づいて)で発現する。そのような翻訳後修飾は、最高でもCHO細胞の生産物であるラロニダーゼにおいて過少に示される。
【００８２】
(5.2 コンストラクト及び製剤化)
α-L-イズロニダーゼ(IDUA)、例えばヒトIDUA(hIDUA)をコードするウイルスベクター又は他のDNA発現コンストラクトは、本明細書において提供する方法における使用のためのものである。本明細書において提供するウイルスベクター及び他のDNA発現コンストラクトは、脳脊髄液(CSF)に、導入遺伝子を送達するための任意の好適な方法を含む。導入遺伝子の送達の手段には、ウイルスベクター、リポソーム、他の脂質を含む複合体、他の高分子複合体、合成修飾mRNA、非修飾mRNA、小分子、非生物活性分子(例えば、金粒子)、重合分子(例えば、デンドリマー)、ネイキッドDNA、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド又はエピソームがある。いくつかの実施態様において、ベクターは、標的化ベクター(例えば、神経細胞を標的とするベクター) である。
【００８３】
いくつかの態様において、本開示はIDUA、例えばhIDUAをコードする使用のための核酸を提供し、該核酸はサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、MMTプロモーター、EF-1αプロモーター、UB6プロモーターニワトリβアクチンプロモーター、CAGプロモーター、RPE65プロモーター、及びオプシンプロモーターからなる群から選択されるプロモーターと作用可能に連結されている。
【００８４】
ある実施態様において、１以上の核酸(例えばポリヌクレオチド)を含む組換えベクターを、本明細書において提供する。核酸は、DNA、RNA又はDNA及びRNAの組合せを含むことができる。ある実施態様において、DNAは、プロモーター配列、関心対象の遺伝子配列(導入遺伝子、例えば、IDUA)、非翻訳領域及び終結配列からなる群から選択される1以上の配列を含む。ある実施態様において、本明細書において提供するウイルスベクターは、関心対象の遺伝子と作用可能に連結されたプロモーターを含む。
【００８５】
ある実施態様において、本明細書において開示する核酸(例えば、ポリヌクレオチド)及び核酸配列は、例えば、当業者に公知の任意のコドン-最適化技術を介して、コドン最適化することができる(例えば、Quaxらによる総説、2015, Mol Cell 59:149-161を参照されたい)。
【００８６】
(5.2.1. mRNA)
ある実施態様において、本明細書において提供するベクターは、関心対象の遺伝子(例えば、導入遺伝子、例えば、IDUA)をコードしている修飾mRNAである。CSFへの導入遺伝子の送達のための修飾及び非修飾mRNAの合成は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれているHocquemillerらの文献、2016、Human Gene Therapy 27(7):478-496 において教示される 。ある実施態様において、IDUA、例えば、hIDUAをコードしている修飾mRNAを、本明細書において提供する。
【００８７】
(5.2.2. ウイルスベクター) 
ウイルスベクターには、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV、例えば、AAV9)、レンチウイルス、ヘルパー依存的アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、センダイウイルス(hemagglutinin virus of Japan)(HVJ)、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、及びレトロウイルスベクターがある。レトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス(MLV)及びヒト免疫不全ウイルス(HIV)ベースのベクターがある。アルファウイルスベクターには、セムリキ森林ウイルス(SFV)及びシンドビスウイルス(SIN)がある。ある実施態様において、本明細書において提供されるウイルスベクターは、組換えウイルスベクターである。ある実施態様において、本明細書において提供するウイルスベクターは、ヒトにおいて複製欠損型となるように、改変される。ある実施態様において、ウイルスベクターは、ハイブリッドベクター、例えば、「ヘルプレス」アデノウイルスベクターに配置されるAAVベクターである。ある実施態様において、第1のウイルスからのウイルスキャプシド及び第2のウイルスからのウイルスエンベロープタンパク質を含むウイルスベクターを、本明細書において提供する。具体的な実施態様において、第2のウイルスは、水疱性口内炎ウイルス(VSV)である。より具体的な実施態様において、エンベロープタンパク質は、VSV-Gタンパク質である。
【００８８】
ある実施態様において、本明細書において提供するウイルスベクターは、HIVベースのウイルスベクターである。ある実施態様において、本明細書において提供するHIVベースのベクターは少なくとも2つのポリヌクレオチドを含み、ここでgag及びpol遺伝子はHIVゲノム由来のものとし、env遺伝子は別のウイルス由来のものとする。
【００８９】
ある実施態様において、本明細書において提供するウイルスベクターは、単純ヘルペスウイルスベースのウイルスベクターである。ある実施態様において、本明細書において提供する単純ヘルペスウイルスベースのベクターは、１以上の前初期(IE)遺伝子を含まず、そのために細胞傷害性がなくなるように改変する。
【００９０】
ある実施態様において、本明細書において提供するウイルスベクターは、MLVベースのウイルスベクターである。ある実施態様において、本明細書において提供するMLVベースのベクターは、ウイルス遺伝子の代わりに最高8kbの異種DNAを含む。
【００９１】
ある実施態様において、本明細書において提供するウイルスベクターは、レンチウイルスベースのウイルスベクターである。ある実施態様において、本明細書において提供するレンチウイルスベクターは、ヒトレンチウイルスに由来する。ある実施態様において、本明細書において提供するレンチウイルスベクターは、非ヒトレンチウイルスに由来する。ある実施態様において、本明細書において提供するレンチウイルスベクターは、レンチウイルスキャプシドにパッケージングされる。ある実施態様において、本明細書において提供するレンチウイルスベクターは、以下のエレメント:長鎖末端反復配列、プライマー結合部位、ポリプリントラクト、att部位、及びキャプシド化部位の1以上を含む。
【００９２】
ある実施態様において、本明細書において提供するウイルスベクターは、アルファウイルスベースのウイルスベクターである。ある実施態様において、本明細書において提供するアルファウイルスベクターは、組換え、複製欠損アルファウイルスである。ある実施態様において、本明細書において提供するアルファウイルスベクターのアルファウイルスレプリコンは、それらのビリオン表面に機能的な異種リガンドを提示することによって、特定の細胞種に標的化される。
【００９３】
ある実施態様において、本明細書において提供するウイルスベクターは、AAVベースのウイルスベクターである。好ましい実施態様において、本明細書において提供するウイルスベクターはAAV9又はAAVrh10ベースのウイルスベクターである。ある実施態様において、本明細書において提供するAAV9又はAAVrh10ベースのウイルスベクターは、CNS細胞への向性を保持する。複数のAAV血清型が特定されている。ある実施態様において、本明細書において提供するAAVベースのベクターは、AAVの１以上の血清型に由来する成分を含む。ある実施態様において、本明細書において提供するAAVベースのベクターは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、又はAAV11の1以上に由来する成分を含む。好ましい実施態様において、本明細書において提供するAAVベースのベクターは、AAV8、AAV9、AAV10又はAAV11血清型の1以上に由来する成分を含む。AAV9ベースのウイルスベクターは、本明細書に記載の方法で使用する。AAVベースのウイルスベクターの核酸配列並びに組換えAAV及びAAVキャプシドの作製方法は、例えばその各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第7,282,199 B2号、米国特許第7,790,449 B2号、米国特許第8,318,480 B2号、米国特許第8,962,332 B2号及び国際特許出願第PCT/EP2014/076466号において教示される。一態様において、ただし、導入遺伝子(例えば、IDUA)をコードするAAV(例えば、AAV9又はAAVrh10)-ベースのウイルスベクターを本明細書において提供する。具体的な実施態様において、IDUAをコードするAAV9ベースのウイルスベクターを、本明細書において提供する。より具体的な実施態様において、hIDUAをコードしているAAV9ベースのウイルスベクターを、本明細書において提供する。
【００９４】
(i) 調節エレメントの制御下にあり、ITRと隣接している導入遺伝子を含む発現カセット；及び(ii) AAV9キャプシドタンパク質のアミノ酸配列を有し、又はAAV9キャプシドタンパク質(配列番号:26)のアミノ酸配列と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、又は99.9%同一であり、同時にAAV9キャプシドの生物学的機能を保持するウイルスキャプシドを含む人工ゲノムを含むAAV9ベクターを、特定の実施態様において提供する。ある実施態様において、コードされたAAV9キャプシドは、配列番号:26の配列に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、又は30個のアミノ酸置換を有し、かつAAV9キャプシドの生物学的機能を保持する。図5は、置換と表示された列における比較に基づくアラインされた配列の特定の位置で置換され得る潜在的アミノ酸を有する異なるAAV血清型のキャプシドタンパク質のアミノ酸配列の比較アラインメントを提供する。従って、具体的な実施態様で、AAV9ベクターは、ネイティブAAV9配列中のその位置に存在しない図5の置換列において特定される1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、又は30個のアミノ酸置換を有するAAV9キャプシドバリアントを含む。
【００９５】
ある実施態様において、本明細書に記載の方法で使用するAAVは、その全体が参照により組み込まれているZinnらの文献、2015, Cell Rep. 12(6): 1056-1068に記載の通り、Anc80又はAnc80L65である。ある実施態様において、本明細書に記載の方法で使用されるAAVは、その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第9,193,956号、第9458517号;及び第9,587,282号、並びに米国特許出願公開第2016/0376323号に記載の通り、以下のアミノ酸挿入:LGETTRP又はLALGETTRPのうちの1つを含む。ある実施態様において、その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第9,193,956号;第9,458,517号;及び第9,587,282号、並びに米国特許出願公開第2016/0376323号にて説明したように、本明細書に記載の方法で使用するAAVは、AAV.7m8である。ある実施態様において、本明細書に記載の方法で使用されるAAVは、米国特許第9,585,971号において開示される任意のAAV(例えばAAV-PHP.B)である。ある実施態様において、本明細書に記載の方法で使用されるAAVは、その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている以下の特許及び特許出願：米国特許第7,906,111号; 第8,524,446号; 第8,999,678号; 第8,628,966号; 第8,927,514号; 第8,734,809号; 米国第9,284,357号; 第9,409,953号; 第9,169,299号; 第9,193,956号; 第9458517号;及び第9,587,282号、米国特許出願公開第2015/0374803号; 第2015/0126588号; 第2017/0067908号; 第2013/0224836号; 第2016/0215024号; 第2017/0051257号;及び国際特許出願番号PCT/US2015/034799; PCT/EP2015/053335のいずれかにおいて開示されるAAVである。
【００９６】
ある実施態様において、一本鎖AAV(ssAAV)は、上記の通り使用することができる。ある実施態様において、自己相補的ベクター、例えば、scAAVを使用することができる(例えば、その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれているWuの文献、2007、Human Gene Therapy、18(2):171-82、McCartyらの文献、2001、Gene Therapy、Vol 8、Number 16、1248-1254ページ;及び米国特許第6,596,535号; 第7,125,717号;及び第7,456,683号を参照されたい)。
【００９７】
ある実施態様において、本明細書に記載の方法で使用するウイルスベクターは、アデノウイルスベースのウイルスベクターである。組換えアデノウイルスベクターは、IDUAの導入に使用することができる。組換えアデノウイルスは、E1欠失を有し、E3欠失を有していてもいなくてもよく、かつ発現カセットがいずれかの欠失した領域に挿入されている第一世代のベクターとし得る。組換えアデノウイルスはE2及びE4領域の完全又は部分的欠失を含む第二世代のベクターとし得る。ヘルパー依存的アデノウイルスは、アデノウイルス逆向き末端反復配列及びパッケージングシグナル(φ)のみを保持する。導入遺伝子は、パッケージングシグナル及び3'ITRの間に挿入され、およそ36 kbの野生型のサイズの近くに人工ゲノムを維持するかさ増し配列(stuffer sequences)があってもなくてもよい。アデノウイルスベクターの生産のための例示的なプロトコルは、その全体が参照により本明細書に組み込まれているAlbaらの文献、2005、「弱体化アデノウイルス:遺伝子治療のための最新世代アデノウイルス(Gutless adenovirus: last generation adenovirus for gene therapy)」、Gene Therapy 12:S18-S27に見出すことができる。
【００９８】
ある実施態様において、本明細書に記載の方法で使用するウイルスベクターは、レンチウイルスベースのウイルスベクターである。組換えレンチウイルスベクターは、IDUAの導入に使用することができる。4つのプラスミドを、コンストラクト：gag/pol配列を含むプラスミド、Rev配列を含むプラスミド、エンベロープタンパク質を含むプラスミド(すなわちVSV-G)、並びにパッケージングエレメント及びIDUA遺伝子を有するCisプラスミドを作製するために使用する。
【００９９】
レンチウイルスベクター作製のため、とりわけポリエチレンイミン又はリン酸カルシウムをトランスフェクション薬剤として使用し得ることにより4つのプラスミドを細胞(すなわち、HEK293ベースの細胞)に共トランスフェクションする。続いて上清中のレンチウイルスを採取する(レンチウイルスは、活性を示すために細胞から出芽する必要があるため、細胞からの採取は行う必要がないし、するべきではない)。上清を濾過し(0.45 μm)、続いて塩化マグネシウム及びベンゾナーゼを加える。さらに下流のプロセスは、非常に様々なものがあり得、TFF及びカラムクロマトグラフィーの使用が最もGMPに適合するプロセスである。他のプロセスでは、超遠心分離が使用され、カラムクロマトグラフィーを伴ってもよいし、伴わなくてもよい。レンチウイルスベクターの作製のための例示的なプロトコルは、その両方とも全体が参照により本明細書に組み込まれている、Leschらの文献、2011、「バキュロウイルスベクターを用いて293T懸濁細胞中に生成されたレンチウイルスベクターの生産及び精製(Production and purification of lentiviral vector generated in 293T suspension cells with baculoviral vectors)」、Gene Therapy 18:531-538及びAusubelらの文献、2012、「CGMP-等級のレンチウイルスベクターの生産(Production of CGMP-Grade Lentiviral Vectors)」、Bioprocess Int. 10(2):32-43に見出すことができる。
【０１００】
具体的な実施態様において、本明細書に記載の方法に用いられるベクターはIDUA(例えば、hIDUA)をコードするベクターであり、CNSの細胞又は関連した細胞(例えば、インビボ又はインビトロの神経細胞)に形質導入した際に、IDUAのグリコシル化バリアントが形質導入された細胞によって発現されるようになっている。具体的な実施態様において、本明細書に記載の方法に用いられるベクターはIDUA(例えば、hIDUA)をコードするベクターであり、CNSの細胞又は関連した細胞(例えば、インビボ又はインビトロの神経細胞)に形質導入した際に、IDUAの硫酸化バリアントが細胞によって発現されるようになっている。
【０１０１】
(5.2.3. 遺伝子発現のプロモーター及び調節配列(modifiers)) 
ある実施態様において、本明細書において提供するベクターは、遺伝子送達又は遺伝子発現(例えば、「発現制御エレメント」)を調節する構成要素を含む。ある実施態様において、本明細書において提供するベクターは、遺伝子発現を調節する構成要素を含む。ある実施態様において、本明細書において提供するベクターは、細胞との結合に影響を及ぼすか又は細胞を標的とする構成要素を含む。ある実施態様において、本明細書において提供するベクターは、取り込みの後細胞内でのポリヌクレオチド(例えば、導入遺伝子)の局在化に影響を及ぼす構成要素を含む。ある実施態様において、本明細書において提供するベクターは、例えば、ポリヌクレオチドを取り込んだ細胞を検出するか、又は選択するための検出可能な、又は選択可能なマーカーとして使用することができる構成要素を含む。
【０１０２】
ある実施態様において、本明細書において提供するウイルスベクターは、１以上のプロモーターを含む。ある実施態様において、プロモーターは、構成的プロモーターである。代替の実施例において、プロモーターは、誘導性プロモーターである。ネイティブのIDUA遺伝子は、大部分のハウスキーピング遺伝子と同様に、主にGCリッチプロモーターを使用する。好ましい実施態様において、hIDUAの持続的な発現を提供する強力な構成的プロモーターを使用する。そのようなプロモーターには：「C」―サイトメガロウイルス(CMV)初期エンハンサーエレメント;「A」―ニワトリβアクチン遺伝子のプロモーター並びに第一エキソン及びイントロン;並びに「G」 ― ウサギβ-グロビン遺伝子のスプライスアクセプターを含む「CAG」合成プロモーターがある(Miyazakiらの文献、1989、Gene 79: 269-277;及びNiwaらの文献、Gene 108: 193-199を参照されたい)。
【０１０３】
ある実施態様において、プロモーターはCB7プロモーターである(その全体が参照により本明細書に組み込まれているDinculescuらの文献、2005、Hum Gene Ther 16:649-663を参照されたい。いくつかの実施態様において、CB7プロモーターは、ベクターによって駆動される導入遺伝子の発現を増強する他の発現制御エレメントを含む。ある実施態様において、他の発現制御エレメントには、ニワトリβ-アクチンイントロン及び/又はウサギβ-グロビンpolAシグナルがある。ある実施態様において、プロモーターは、TATAボックスを含む。ある実施態様において、プロモーターは、１以上のエレメントを含む。ある実施態様において、１以上のプロモーターエレメントは、互いに対して逆向きにしても、位置を変えてもよい。ある実施態様において、プロモーターのエレメントは、協働的に機能するように配置する。ある実施態様において、プロモーターのエレメントは、独立して機能するように配置する。ある実施態様において、本明細書において提供するウイルスベクターはヒトCMV前初期遺伝子プロモーター、SV40初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RS)長鎖末端反復配列、及びラットインスリンプロモーターからなる群から選択される１以上のプロモーターを含む。ある実施態様において、本明細書において提供するベクターは、AAV、MLV、MMTV、SV40、RSV、HIV-１、及びHIV-２ LTRからなる群から選択される１以上の長鎖末端反復配列(LTR)プロモーターを含む。ある実施態様において、本明細書において提供するベクターは、１以上の組織特異的プロモーター(例えば、神経細胞特異的なプロモーター)を含む。
【０１０４】
ある実施態様において、本明細書において提供するウイルスベクターは、１以上のプロモーター以外の調節エレメントを含む。ある実施態様において、本明細書において提供するウイルスベクターは、エンハンサーを含む。ある実施態様において、本明細書において提供するウイルスベクターは、リプレッサーを含む。ある実施態様において、本明細書において提供するウイルスベクターは、イントロン又はキメライントロンを含む。ある実施態様において、本明細書において提供するウイルスベクターは、ポリアデニル化配列を含む。
【０１０５】
(5.2.4. シグナルペプチド)
ある実施態様において、本明細書において提供するベクターは、タンパク質送達を調節する構成要素を含む。ある実施態様において、本明細書において提供するウイルスベクターは、１以上のシグナルペプチドを含む。ある実施態様において、シグナルペプチドは、導入遺伝子産物(例えば、IDUA)の細胞内での適切なパッケージング(例えばグリコシル化)を達成することを可能にする。ある実施態様において、シグナルペプチドは、導入遺伝子産物(例えば、IDUA)が細胞内で適切な局在化を達成することを可能にする。ある実施態様において、シグナルペプチドは、導入遺伝子産物(例えば、IDUA)が細胞からの分泌を達成することを可能にする。ベクターに関連して使用されるシグナルペプチドの例及び本明細書において提供する導入遺伝子は、表1に見出すことができる。シグナルペプチドは、本明細書において、リーダー配列又はリーダーペプチドと呼んでもよい。
表1. 本明細書において提供するベクターとともに使用するためのシグナルペプチド。
【表１】
2020508289.tif 000019
【０１０６】
(5.2.5. 非翻訳領域)
ある実施態様において、本明細書において提供するウイルスベクターは、１以上の非翻訳領域(UTR) (例えば、3'及び/又は5’ UTR)を含む。ある実施態様において、UTRは、タンパク質発現の所望のレベルのために最適化される。ある実施態様において、UTRは、導入遺伝子のmRNA半減期の間最適化される。ある実施態様において、UTRは、導入遺伝子のmRNAの安定性のために最適化される。ある実施態様において、UTRは、導入遺伝子のmRNAの二次構造のために最適化される。
【０１０７】
(5.2.6. 逆向き末端反復配列)
ある実施態様において、本明細書において提供するウイルスベクターは、１以上の逆向き末端反復(ITR)配列を含む。ITR配列は、ウイルスベクターのビリオンに組換え遺伝子発現カセットをパッケージングするために使用することができる。ある実施態様において、ITRは、AAV(例えば、AAV9)に由来するものである(その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている、例えばYanらの文献、2005, J. Virol., 79(1):364-379;米国特許第7,282,199 B2号、米国特許第7,790,449 B2号、米国特許第8,318,480 B2号、米国特許第8,962,332 B2号及び国際特許出願番号PCT/EP2014/076466を参照されたい)。
【０１０８】
(5.2.7. 導入遺伝子)
ある実施態様において、本明細書において提供するベクターは、IDUA導入遺伝子をコードする。具体的な実施態様において、IDUAは、神経細胞における発現に適当な発現制御エレメントによって制御される:ある実施態様において、IDUA(例えば、hIDUA)導入遺伝子は、配列番号:1のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、IDUA(例えば、hIDUA)導入遺伝子は、配列番号:1に記載の配列と少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%同一のアミノ酸配列を含む。
【０１０９】
導入遺伝子によってコードされるHuGlyIDUAは、これらに限定はされないが、配列番号:1のアミノ酸配列を有するヒトIDUA(hIDUA)(図1に示す)、及びアミノ酸の置換、欠失、又は付加を有する、例えばこれらに限定はされないが、図2に示すIDUAのオーソログ中に対応する非保存的残基から選択されるアミノ酸置換を含むhIDUAの誘導体を含み得る(ただし、そのような突然変異が図3に示す(その全体が参照により本明細書に組み込まれているSaitoらの文献、2014、Mol Genet Metab 111:107-112、57個のMPS I突然変異を列記する表1より)；又はその各々の全体が参照により本明細書に組み込まれているVenturiらの文献、2002、Human Mutation #522 Online(「Venturi 2002」)、若しくはBertolaらの文献、2011、Human Mutation 32:E2189-E2210(「Bertola 2011」)によって報告された重度の、中程度に重度の、中程度の、又は減弱型MPS I表現形において同定されたいずれの突然変異も含まないことを条件とする)。
【０１１０】
例えば、hIDUAの特定位置でのアミノ酸置換は図2(その全体が参照により本明細書に組み込まれているMaitaらの文献、2013、PNAS 110:14628、図S8に報告されたオーソログのアラインメントを示す)に表されるIDUAオーソログにおけるその位置に見出される対応する非保存的アミノ酸残基から選択することができる(ただし、そのような置換は図3に示されるか、又は上記Venturi 2002若しくはBertola 2011において報告される有害な突然変異のいずれも含まないことを条件とする)。結果として得られる導入遺伝子産物は、細胞培養又は試験動物で、突然変異がIDUA機能を損なわないことを保証するためのインビトロでの従来のアッセイを使用して試験することができる。選択される好ましいアミノ酸置換、欠失又は付加は、細胞培養又は動物モデルにおけるMPS Iのためのインビトロでの従来のアッセイによって試験されるIDUAの酵素活性、安定性、又は半減期を維持するか、又は増加させるものとするべきである。例えば、導入遺伝子産物の酵素活性は基質として4-メチルウンベリフェリルα-L-イズロニドを用いる従来の酵素アッセイを使用して評価することができる(使用可能な例示的なIDUA酵素アッセイについては、例えばその各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている、Hopwoodらの文献、1979、Clin Chim Acta 92: 257-265; Clementsらの文献、1985、Eur J Biochem 152: 21-28;及びKakkisらの文献、1994、Prot Exp Purif 5:225-232を参照されたい)。導入遺伝子産物がMPS I表現形を修正する能力は;例えば、培養中でMPS I細胞にhIDUA又は誘導体をコードするウイルスベクター又は他のDNA発現コンストラクトを形質導入することにより; 培養中のMPS I細胞にrHuGlyIDUA又は誘導体を加えることにより;あるいはMPS I細胞を rHuGlyIDUA又は誘導体を発現及び分泌するように操作したヒト宿主細胞と共培養して、MPS I培養細胞の欠陥の修正を決定することにより、例えば培養中のMPS I細胞におけるIDUA酵素活性及び/又はGAG貯蔵量の低下を検出することにより、細胞培養中で評価することができる(例えば、その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれているMyerowitz及びNeufeldの文献、1981、J Biol Chem 256: 3044-3048;並びにAnsonらの文献、1992、Hum Gene Ther 3: 371-379を参照されたい)。
【０１１１】
(5.2.8. コンストラクト)
ある実施態様において、本明細書において提供されるウイルスベクターは、以下の順序で以下のエレメント: a) 第1のITR配列、b) 第1のリンカー配列、c) プロモーター配列、d) 第2のリンカー配列、e) イントロン配列、f) 第3のリンカー配列、g) 導入遺伝子(例えば、IDUA)をコードする配列、h) 第4のリンカー配列、i) ポリA配列、j) 第5のリンカー配列、及びk) 第2のITR配列を含む。
【０１１２】
ある実施態様において、本明細書において提供するウイルスベクターは、以下の順序で以下のエレメント: a) プロモーター配列、及びb) 導入遺伝子(例えば、IDUA)をコードする配列を含む。ある実施態様において、本明細書において提供するウイルスベクターは、以下の順序で以下のエレメント: a) プロモーター配列、及びb) 導入遺伝子(例えば、IDUA)をコードする配列を含み、ここで導入遺伝子はシグナルペプチドを含む。
【０１１３】
ある実施態様において、本明細書において提供するウイルスベクターは、以下の順序で以下のエレメント: a)最初のITR配列、b) 第1のリンカー配列、c) プロモーター配列、d) 第2のリンカー配列、e) イントロン配列、f) 第3のリンカー配列、g) 第1のUTR配列、h) 導入遺伝子(例えば、IDUA)をコードする配列、i) 第2のUTR配列、j) 第4のリンカー配列、k) ポリA配列、l) 第5のリンカー配列、及びm) 第2のITR配列を含む。
【０１１４】
ある実施態様において、本明細書において提供されるウイルスベクターは、以下の順序で以下のエレメント: a) 第1のITR配列、b) 第1のリンカー配列、c) プロモーター配列、d) 第2のリンカー配列、e) イントロン配列、f) 第3のリンカー配列、g) 第1のUTR配列、h) 導入遺伝子(例えば、IDUA)をコードする配列、i) 第2のUTR配列、j) 第4のリンカー配列、k) ポリA配列、l) 第5のリンカー配列、及びm) 第2のITR配列を含み、ここで導入遺伝子はシグナルペプチドを含み、かつhIDUAをコードする。
【０１１５】
(5.2.9. ベクターの製造及び試験)
本明細書において提供するウイルスベクターは、宿主細胞を使用して製造することができる。本明細書において提供するウイルスベクターは、哺乳動物の宿主細胞、例えば、A549、WEHI、10T1/2、BHK、MDCK、COS1、COS7、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO、W138、HeLa、293、Saos、C2C12、L、HT1080、HepG2、初代線維芽細胞、肝細胞及び筋芽細胞) を使用して製造することができる。本明細書において提供するウイルスベクターは、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、又はハムスターから宿主細胞を使用して製造することができる。
【０１１６】
宿主細胞は、導入遺伝子及び関連するエレメント(すなわち、ベクターゲノム)、及びウイルスを宿主細胞で生産する手段、例えば複製及びキャプシド遺伝子(例えば、AAVのrep及びcap遺伝子)をコードする配列を用いて安定的に形質転換する。AAV8キャプシドを有する組換えAAVベクターを生産する方法については、その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第7,282,199 B2号の詳細な説明の第IV節を参照されたい。前記ベクターのゲノムコピー力価は、例えばTAQMAN(登録商標)分析によって決定することができる。ビリオンは、例えばCsCl2沈降によって回収することができる。
【０１１７】
インビトロアッセイ、例えば細胞培養アッセイは本明細書に記載のベクターからの導入遺伝子発現を測定するために使用することができ、従って例えば、ベクターの効力を示すことができる。例えば、HT-22、SK-N-MC、HCN-1A、HCN-2、NT2、SH-SY5y、hNSC11、又はReNcell VM細胞株、あるいは神経細胞若しくはグリア細胞、又は神経細胞若しくはグリア細胞の前駆細胞に由来する他の細胞株を、導入遺伝子発現を評価するために使用することができる。いったん発現されると、HuGlyIDUAと関連したグリコシル化及びチロシン硫酸化のパターンの決定を含め、発現された産物(すなわち、HuGlyIDUA)の特徴を決定することができる。
【０１１８】
(5.2.10. 組成物)
本明細書に記載の導入遺伝子をコードしているベクター及び好適な担体を含む組成物を記載する。好適な担体(例えば、CSF、及び例えば神経細胞への投与のために)は、当業者によって容易に選択される。
【０１１９】
(5.3 遺伝子治療) 
MPS Iを有するヒト対象に、治療有効量の導入遺伝子コンストラクトの投与のための方法を記載する。より詳細には、MPS Iを有する患者に、治療有効量の導入遺伝子コンストラクトを、投与するため、特にCSFに投与のための方法を記載する。特定の実施態様において、そのような治療有効量の導入遺伝子コンストラクトのCSFに投与するための方法は、ハーラー症候群又はハーラー-シャイエ症候群を有する患者を治療するために使用することができる。
【０１２０】
(5.3.1. 標的患者集団)
ある実施態様において、治療有効用量の組換えベクターをMPS Iと診断された患者に投与する。具体的な実施態様において、患者は、ハーラー-シャイエ症候群と診断された。具体的な実施態様において、患者は、シャイエ症候群と診断された。具体的な実施態様において、患者は、ハーラー症候群と診断された。
【０１２１】
ある実施態様において、治療有効用量の組換えベクターを、重度のMPS Iと診断された患者に投与する。ある実施態様において、治療有効用量の組換えベクターを、減弱型MPS Iと診断された患者に投与する。
【０１２２】
ある実施態様において、治療有効用量の組換えベクターを、MPS Iと診断され、IDUA (例えば、hIDUA)を用いた治療に反応すると特定された患者に投与する。
【０１２３】
ある実施態様において、治療有効用量の組換えベクターを、小児患者に投与する。ある実施態様において、治療有効用量の組換えベクターを、3歳未満である患者に投与する。ある実施態様において、治療有効用量の組換えベクターを、2〜4歳である患者に投与する。ある実施態様において、治療有効用量の組換えベクターを、3〜8歳である患者に投与する。ある実施態様において、治療有効用量の組換えベクターを、8〜16歳である患者に投与する。ある実施態様において、治療有効用量の組換えベクターを、6〜18歳である患者に投与する。ある実施態様において、治療有効用量の組換えベクターを、6歳以上である患者に投与する。ある実施態様において、治療有効用量の組換えベクターを、3歳未満の患者に投与する。ある実施態様において、治療有効用量の組換えベクターを、4ヵ月齢以上であるが９ヵ月齢未満である患者に投与する。ある実施態様において、治療有効用量の組換えベクターを、9ヵ月齢以上であるが18ヵ月齢未満である患者に投与する。ある実施態様において、治療有効用量の組換えベクターを、18ヵ月以上であるが3歳未満である患者に投与する。ある実施態様において、治療有効用量の組換えベクターを、10歳を超える患者に投与する。ある実施態様において、治療有効用量の組換えベクターを、青年期の患者に投与する。ある実施態様において、治療有効用量の組換えベクターを、成人の患者に投与する。
【０１２４】
ある実施態様において、治療有効用量の組換えベクターは、MPS Iと診断され、遺伝子治療処置の前にCSFに注入されたIDUA (例えば、hIDUA )による治療に反応すると特定された患者に投与する。
【０１２５】
(5.3.2. 投薬量及び投与様式)
ある実施態様において、治療有効用量の組換えベクターは、くも膜下腔内投与(すなわち、くも膜下空間に注入して、組換えベクターがCSFを通じて散布され、CNSの細胞が形質導入されるようにする)を介して、CSFに投与する。このことは、いくつかの方法で―例えば、頭蓋内(大槽又は脳室)注入、又は腰椎槽への注入によって―達成することができる。ある実施態様において、くも膜下腔内投与は、大槽内(IC)注入(例えば、大槽に)により実施する。具体的な実施態様において、大槽内注入は、CTによって導かれる後頭下穿刺によって実施する。具体的な実施態様において、くも膜下腔内注入は、腰椎穿刺によって実施する。具体的な実施態様において、患者に実行できそうな場合は、くも膜下空間への注入はC1-2穿刺によって実施する。ある実施態様において、治療有効用量の組換えベクターは、鼻腔内投与を介してCNSに投与する。ある実施態様において、治療有効用量の組換えベクターは、実質内注入によりCNSに投与する。ある実施態様において、実質内注入は、線条体を標的とする。ある実施態様において、実質内注入は、白質を標的とする。ある実施態様において、治療有効用量の組換えベクターは、当技術において公知の任意の手段、例えばその全体が参照により本明細書に組み込まれているHocquemillerらの文献、2016、Human Gene Therapy 27(7):478-496において開示された任意の手段によって、CSFに投与する。
【０１２６】
組換えベクターは、rHuGlyIDUAのCSF濃度を少なくとも9.25〜277 μg/mLのCminに維持する用量で、CSFに投与するべきである。ある実施態様において、組換えベクターは、rHuGlyIDUAのCSF濃度を少なくとも9.25、16、46、92、185、又は277 μg/mL) のCminに維持する用量で、CSFに投与する。ある実施態様において、組換えベクターは、rHuGlyIDUAのCSF濃度を少なくとも9.25、16、46、92、185、又は277 μg/mL) のCminに維持する用量で、CSFに投与する。ある実施態様において、組換えベクターは、rHuGlyIDUAのCSF濃度を少なくとも9.25 μg/mLのCminに維持する用量で、CSFに投与する。ある実施態様において、組換えベクターは、rHuGlyIDUAのCSF濃度を少なくとも16 μg/mLのCminに維持する用量で、CSFに投与する。ある実施態様において、組換えベクターは、rHuGlyIDUAのCSF濃度を少なくとも46 μg/mLのCminに維持する用量で、CSFに投与する。ある実施態様において、組換えベクターは、rHuGlyIDUAのCSF濃度を少なくとも92 μg/mLのCminに維持する用量で、CSFに投与する。ある実施態様において、組換えベクターは、rHuGlyIDUAのCSF濃度を少なくとも185 μg/mLのCminに維持する用量で、CSFに投与する。ある実施態様において、組換えベクターは、rHuGlyIDUAのCSF濃度を少なくとも277 μg/mLのCminに維持する用量で、CSFに投与する。
【０１２７】
ある実施態様において、小児患者のために、組換えベクターは、CSF中で総rHuGlyIDUAを1.00〜30.00 mgに維持する用量で、CSFに投与する。ある実施態様において、小児患者のために、組換えベクターは、CSF中で総rHuGlyIDUAを1.00、1.74、5.00、10.00、20.00又は30.00 mgに維持する用量で、CSFに投与する。ある実施態様において、小児患者のために、組換えベクターは、CSF中で総rHuGlyIDUAを1.00 mgに維持する用量で、CSFに投与する。ある実施態様において、小児患者のために、組換えベクターは、CSF中で総rHuGlyIDUAを1.74 mgに維持する用量で、CSFに投与する。ある実施態様において、小児患者のために、組換えベクターは、CSF中で総rHuGlyIDUAを5.00 mgに維持する用量で、CSFに投与する。ある実施態様において、小児患者のために、組換えベクターは、CSF中で総rHuGlyIDUAを10.00 mgに維持する用量で、CSFに投与する。ある実施態様において、小児患者のために、組換えベクターは、CSF中で総rHuGlyIDUAを20.00 mgに維持する用量で、CSFに投与する。ある実施態様において、小児患者のために、組換えベクターは、CSF中で総rHuGlyIDUAを30.00 mgに維持する用量で、CSFに投与する。
【０１２８】
ある実施態様において、成人患者のために、組換えベクターは、CSF中の総rHuGlyIDUAを1.29〜38.88 mgに維持する用量で、CSFに投与する。ある実施態様において、成人患者のために、組換えベクターは、CSF中の総rHuGlyIDUAを1.29、2.25、8.40、12.96、25.93又は38.88 mgに維持する用量で、CSFに投与する。ある実施態様において、成人患者のために、組換えベクターは、CSF中の総rHuGlyIDUAを1.29 mgに維持する用量で、CSFに投与する。ある実施態様において、成人患者のために、組換えベクターは、CSF中の総rHuGlyIDUAを2.25 mgに維持する用量で、CSFに投与する。ある実施態様において、成人患者のために、組換えベクターは、CSF中の総rHuGlyIDUAを8.40 mgに維持する用量で、CSFに投与する。ある実施態様において、成人患者のために、組換えベクターは、CSF中の総rHuGlyIDUAを12.96 mgに維持する用量で、CSFに投与する。ある実施態様において、成人患者のために、組換えベクターは、CSF中の総rHuGlyIDUAを25.93 mgに維持する用量で、CSFに投与する。ある実施態様において、成人の患者のために、組換えベクターは、CSF中の総rHuGlyIDUAを38.88 mgに維持する用量で、CSFに投与する。
【０１２９】
くも膜下腔内投与について、治療有効用量の組換えベクターは、注入容量を好ましくは最高約20mLとしてCSFに投与するべきである。くも膜下腔内注入に好適な担体、例えばElliotts B溶液は、組換えベクターのためのビヒクルとして使用するべきである。Elliots B溶液(一般名:塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、無水ブドウ糖、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、及びリン酸ナトリウム)は、静菌保存剤を含んでいない無菌の、非発熱性の、等張溶液であり、化学療法薬のくも膜下腔内投与のための希釈剤として使用する。
【０１３０】
CSF濃度は後頭部又は腰椎穿刺から得られるCSF流体中のrHuGlyIDUAの濃度を直接測定することによってモニタリングし、又は患者の血清において検出されたrHuGlyIDUAの濃度から外挿によって推定することができる。ある実施態様において、血清中のrHuGlyIDUAが10 ng/mL〜100 ng/mLであることは、CSF中のrHuGlyIDUAが1〜30 mgであることを示す。ある実施態様において、組換えベクターは、血清中のrHuGlyIDUAを10 ng/mL〜100 ng/mLに維持する用量で、CSFに投与する。
【０１３１】
ある実施態様において、投薬量は、患者(例えば、後頭下穿刺又は腰椎穿刺を介して注入された)のCSFに投与されるゲノムコピーの数により測定する。ある実施態様において、1×1012〜2×1014ゲノムコピーを投与する。ある実施態様において、5×1012〜2×1014ゲノムコピーを投与する。具体的な実施態様において、1×1013〜1×1014ゲノムコピーを投与する。具体的な実施態様において、1×1013〜2×1013ゲノムコピーを投与する。具体的な実施態様において、6×1013〜8×1013ゲノムコピーを投与する。
【０１３２】
ある実施態様において、1×1013ゲノムコピーの一定用量を、小児患者に投与する。ある実施態様において、5.6×1013ゲノムコピーの一定用量を、小児患者に投与する。ある実施態様において、1×1012〜5.6×1013ゲノムコピーの一定用量を、小児患者に投与する。ある実施態様において、1×1013〜5.6×1013ゲノムコピーの一定用量を、小児患者に投与する。ある実施態様において、2.6×1012ゲノムコピーの一定用量を、成人患者に投与する。ある実施態様において、1.3×1013ゲノムコピーの一定用量を、成人患者に投与する。ある実施態様において、1.4×1013ゲノムコピーの一定用量を、成人患者に投与する。ある実施態様において、7.0×1013ゲノムコピーの一定用量を、成人患者に投与する。ある実施態様において、1.4×1013〜7.0×1013ゲノムコピーの一定用量を、成人患者に投与する。ある実施態様において、1×1012〜5.6×1013ゲノムコピーの一定用量を、成人患者に投与する。
【０１３３】
ある実施態様において、投薬量は、患者のCSFに脳質量のグラム当たりに投与する(例えば、後頭下穿刺又は腰椎穿刺を介して注入する)ゲノムコピーの数によって測定する。ある実施態様において、脳質量のグラム当たり1×109〜2×1010ゲノムコピーを投与する。ある実施態様において、脳質量のグラム当たり5×109〜2×1010ゲノムコピーを投与する。ある実施態様において、脳質量のグラム当たり2×109ゲノムコピーを投与する。ある実施態様において、脳質量のグラム当たり1×1010ゲノムコピーを投与する。具体的な実施態様において、脳質量のグラム当たり9×109〜1×1010ゲノムコピーを投与する。具体的な実施態様において、脳質量のグラム当たり1×1010〜1.5×1010ゲノムコピーを投与する。具体的な実施態様において、脳質量のグラム当たり5×1010〜6×1010ゲノムコピーを投与する。
【０１３４】
一実施態様において、hIDUA発現カセットを含む血清型9キャプシドの非複製組換えAAV(rAAV9.hIDUA)を、治療用に使用する。AAV9血清型を用いると、IC投与の後、CNS中でhIDUAタンパク質の効率的発現が可能となる。ベクターゲノムは、AAV2の逆向き末端反復配列(ITR)と隣接したhIDUA発現カセットを含む。カセットからの発現は、強力な構成的プロモーターによって駆動される。
【０１３５】
rAAV9.hIDUAは、約5〜20mlの容量、又は約5ml以下の容量中、1.4×1013 GC(1.1×1010 GC/g脳質量)〜7.0×1013 GC(5.6×1010 GC/g脳質量)の範囲にわたる単一の一定用量としてのICで(後頭下注入によって)投与することができる。患者がAAVに対する中和抗体を有する場合、高い範囲の用量を使用することができる。rAAV9.hIDUAは、約5〜20mlの容量、又は約5ml以下の容量中、2.6×1012 GC(2×109 GC/g脳質量)〜1.3×1013 GC(1×1010 GC/g脳質量)の範囲にわたる単一の一定用量としてのICで(後頭下注入によって)投与することができる。患者が4ヵ月齢以上であるが9ヵ月齢未満の場合、rAAV9.hIDUAは約5〜20mlの容量、又は約5ml以下の容量中、6.0×1012 GC(1.0×1010 GC/g脳質量)〜3.0×1013 GC(5×1010 GC/g脳質量)の範囲にわたる単一の一定用量としてのICで(後頭下注入によって)投与することができる。患者が9ヵ月齢以上であるが18ヵ月齢未満の場合、rAAV9.hIDUAは約5〜20mlの容量、又は約5ml以下の容量中、1.0×1013 GC(1.0×1010 GC/g脳質量)〜5.0×1013 GC(5×1010 GC/g脳質量)の範囲にわたる単一の一定用量としてのICで(後頭下注入によって)投与することができる。患者が18ヵ月齢以上であるが3歳未満の場合、rAAV9.hIDUAは約5〜20mlの容量、又は約5ml以下の容量中、1.1×1013 GC(1.0×1010 GC/g脳質量)〜5.5×1013 GC(5×1010 GC/g脳質量)の範囲にわたる単一の一定用量としてのICで(後頭下注入によって)投与することができる。
【０１３６】
(5.4 併用療法)
(5.4.1. 免疫抑制による共治療)
rHuGlyIDUAの送達が免疫反応を最小化すべきである一方、CNSを対象とする遺伝子治療に関する毒性の最も明白な潜在的源は遺伝的にIDUAを欠損しており、従ってタンパク質及び/又は導入遺伝子を送達するために用いるベクターを潜在的に寛容しないヒト対象において発現されたhIDUAタンパク質に対する免疫が発生することである。従って、好ましい実施態様において、患者を免疫抑制治療で共治療することは―特にIDUAのレベルが0に近い重度の疾患を有する患者(例えば、ハーラー症候群を有する患者)を治療する場合に―適切である。タクロリムス又はラパマイシン(シロリムス)を、ミコフェノール酸と組合わせたレジメン、又は組織移植手順において使用される他の免疫抑制レジメンを伴う免疫抑制治療を、利用することができる。そのような免疫抑制治療は遺伝子治療クール中に投与することができ、ある実施態様において、免疫抑制治療による前処理が好ましい場合がある。免疫抑制治療は治療医師の判断に基づいて、遺伝子治療処置の後も継続することができ、その後免疫寛容が誘発された場合：例えば、180日後に、中止することができる。
【０１３７】
ある実施態様において、本明細書において提供する治療方法は、プレドニゾロン、ミコフェノール酸、及びタクロリムスを含む免疫抑制レジメンとともに施す。ある実施態様において、本明細書において提供する治療方法は、プレドニゾロン、ミコフェノール酸、及びラパマイシン(シロリムス)を含む免疫抑制レジメンとともに施す。ある実施態様において、本明細書において提供する治療方法は、タクロリムスを含まない免疫抑制レジメンとともに施す。ある実施態様において、本明細書において提供する治療方法は、１以上のコルチコステロイド、例えばメチルプレドニゾロン及び/又はプレドニゾロン並びにタクロリムス及び/又はシロリムスを含む免疫抑制レジメンとともに施す。ある実施態様において、免疫抑制治療は、ヒトIDUA治療の前に、又はそれと同時に前記対象に(a) タクロリムス及びミコフェノール酸、又は(b) ラパマイシン及びミコフェノール酸の組合わせを投与して、その後も継続することを含む。ある実施態様において、免疫抑制治療は、180日後に中止する。ある実施態様において、免疫抑制治療は、30、60、90、120、150、又は180日後に中止する。
【０１３８】
ある実施態様において、タクロリムスは、血清濃度を5〜10 ng/mLとする用量で投与する。ある実施態様において、タクロリムスは、血清濃度を4〜8 ng/mLとする用量で投与する。ある実施態様において特に、患者が3歳未満である場合、タクロリムスは、血清濃度を2〜4 ng/mLとする用量で投与する。ある実施態様において、MMFは、血清濃度を2〜3.5 μg/mLとする用量で投与する。ある実施態様において、タクロリムスは、血清濃度を5〜10 ng/mLとする用量で投与し、かつMMFは、血清濃度を2〜3.5 μg/mLとする用量で投与する。ある実施態様において、血清濃度は、タクロリムス及び/又はMMFのトラフレベルの測定後、タクロリムス及び/又はMMFの漸増によって達成する。
【０１３９】
ある実施態様において、メチルプレドニゾロンは、10 mg/kgの用量で1回静脈内投与する。ある実施態様において、プレドニゾロンは、0.5 mg/kgの用量で１日１回経口投与する。ある実施態様において、プレドニゾロンは、段階的に漸減し、その後中断する。ある実施態様において、タクロリムスは、4〜8 ng/mlの目標血中レベルを維持するために、1日2回1 mgを経口投与する。ある実施態様において特に、患者が3歳未満である場合、タクロリムスは2〜4 ng/mlの目標血中レベルを維持するために1日2回0.05 mg/kgを経口投与する。ある実施態様において、シロリムスも投与する。患者にシロリムスを事前投与し、続いてレジメンの間、標的血中レベルを4〜8 ng/mlに維持することができる。しかしながら、ある実施態様において、患者が3歳未満である場合、好ましくは患者にシロリムスを事前投与し、続いてレジメンの間、標的血中レベルを1〜3 ng/mlに維持する。ある実施態様において、メチルプレドニゾロンを10 mg/kgの用量で1回静脈内投与し、プレドニゾロンを0.5 mg/kgの用量で１日１回経口投与し、タクロリムスを１日１回0.2 mg/kgを経口投与し、かつシロリムスを投与する。
【０１４０】
ある実施態様において、ラパマイシンを2又は4 mg/kgの用量で１日１回経口投与する。ある実施態様において、MMFを25 mg/kgの用量で1日2回経口投与する。ある実施態様において、ラパマイシンを2又は4 mg/kgの用量で１日１回経口投与し、かつMMFを25 mg/kgの用量で1日2回経口投与する。ある実施態様において、ラパマイシンは、血清濃度を5〜15 ng/mLとする用量で投与する。ある実施態様において、MMFは、血清濃度を2〜3.5 μg/mLとする用量で投与する。ある実施態様において、ラパマイシンは血清濃度を5〜15 ng/mLとする用量で投与し、かつMMFは血清濃度を2〜3.5 μg/mLとする用量で投与する。ある実施態様において、血清濃度は、ラパマイシン及び/又はMMFのトラフレベルの測定後、ラパマイシン及び/又はMMFの滴定によって達成する。
【０１４１】
(5,4,2. 標準治療を含む他の治療との共治療)
CSFへのHuGlyIDUAの投与及びこれに伴う他の利用可能な治療を施すことの組合わせは、本発明の方法に包含される。追加治療を、遺伝子治療処置の前に、それと同時に、その後に施すことができる。本発明の遺伝子治療と併用することができる利用可能なMPS Iの治療には、これらに限定はされないが、全身に、又はCSFに投与されるラロニダーゼを用いた酵素補充療法(ERT)；及び/又はHSCT療法がある。別の実施態様において、ERTは、組み換えDNA技術によってヒト細胞株で生産されるrHuGlyIDUA糖タンパク質を使用して投与することができる。そのような組換え糖タンパク質生産のために使用することができるヒト細胞株は、これらに限定されないが、少し例を挙げればHT-22、SK-N-MC、HCN-1A、HCN-2、NT2、SH-SY5y、hNSC11、ReNcell VM、ヒト胎児腎293細胞(HEK293)、線維肉腫HT-1080、HKB-11、CAP、HuH-7、網膜細胞株、PER.C6、又はRPEを含む(例えば、その全体が参照により組み込まれている、rHuGlyIDUA糖タンパク質の組換え生産のために使用することができるヒト細胞株の総説についてのDumontらの文献、2016、Critical Rev in Biotech 36(6):1110-1122「生物医薬製造のためのヒト細胞株:歴史、現状、及び将来の展望(Human cell lines for biopharmaceutical manufacturing: history, status, and future perspectives)」)。完全なグリコシル化、特にシアル酸付加及びチロシン硫酸化を保証するために、生産に使用する細胞株をチロシン-O-硫酸化を担うα-2,6-シアリルトランスフェラーゼ(又はα-2,3-及びα-2,6-シアリルトランスフェラーゼの両方)並びに/又はTPST-1及びTPST-2酵素を共発現するように宿主細胞を操作することによって強化することができる。
【０１４２】
(5.5. バイオマーカー/採取/モニタリング効率)
有効性は、認知機能(例えば、神経認知機能低下の防止若しくは減少);CSF及び/若しくは血清中の疾患バイオマーカー(例えばGAG)の低下;並びに/又はCSF及び/若しくは血清中のIDUA酵素活性の増加を測定することによってモニタリングすることができる。炎症の徴候及び他の安全事象をモニタリングすることもできる。
【０１４３】
(5.5.1. 疾患マーカー)
ある実施態様において、組換えベクターによる治療の有効性は、患者における疾患バイオマーカーのレベルを測定することによってモニタリングする。ある実施態様において、疾患バイオマーカーのレベルは、患者のCSFにおいて測定する。ある実施態様において、疾患バイオマーカーのレベルは、患者の血清において測定する。ある実施態様において、疾患バイオマーカーのレベルは、患者の尿において測定する。ある実施態様において、疾患バイオマーカーは、GAGである。ある実施態様において、疾患バイオマーカーは、IDUA酵素活性である。ある実施態様において、疾患バイオマーカーは、炎症である。ある実施態様において、疾患バイオマーカーは、安全事象である。
【０１４４】
(5.5.2. 神経認知機能の試験)
ある実施態様において、組換えベクターによる治療の有効性は、患者の認知機能のレベルを測定することによってモニタリングする。認知機能は、当業者に知られている任意の方法で測定することができる。ある実施態様において、認知機能は、知能指数(IQ)を測定するための認証された装置を介して測定する。具体的な実施態様において、IQは、「ベクスラー略式知能スケール(Wechsler Abbreviated Scale of Intelligence)」第2版(WASI-II)によって測定する。ある実施態様において、認知機能は、記憶力を測定するための認証された装置を介して測定する。具体的な実施態様において、記憶力は、ホプキンス言語学習試験(HVLT)によって測定する。ある実施態様において、認知機能は、注意力を測定するための認証された装置を介して測定する。具体的な実施態様において、注意力は、注意変数試験(TOVA)によって測定する。ある実施態様において、認知機能は、IQ、記憶力、及び注意力の1以上を測定するための認証された装置を介して測定する。
【０１４５】
(5.5.3. 身体的変化)
ある実施態様において、組換えベクターによる治療の有効性は、患者のリソソームの貯蔵欠陥に関連する身体的な特徴を測定することによってモニタリングする。ある実施態様において、身体的な特徴は、貯蔵部の病変である。ある実施態様において、身体的な特徴は、低身長である。ある実施態様において、身体的な特徴は、顔の特徴の粗雑化である。ある実施態様において、身体的な特徴は、閉塞性睡眠無呼吸である。ある実施態様において、身体的な特徴は、聴覚障害である。ある実施態様において、身体的な特徴は、視覚障害である。具体的な実施態様において、視覚障害は、角膜混濁に起因する。ある実施態様において、身体的な特徴は、水頭症である。ある実施態様において、身体的な特徴は、脊髄圧迫症である。ある実施態様において、身体的な特徴は、肝脾腫である。ある実施態様において、身体的な特徴は、骨及び関節の変形である。ある実施態様において、身体的な特徴は、心臓弁膜疾患である。ある実施態様において、身体的な特徴は、再発性上気道感染症である。ある実施態様において、身体的な特徴は、手根管症候群である。ある実施態様において、身体的な特徴は、巨舌症(舌の肥大)である。ある実施態様において、身体的な特徴は、声帯肥大及び/又は変声である。そのような身体的な特徴は、当業者に公知の任意の方法によって測定することができる。
(配列表)
【表２】
2020508289.tif 000020
2020508289.tif 000021
2020508289.tif 000022
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【０１４６】
(6. 実施例)
(6.1 実施例1: hIDUA cDNA)
hIDUA cDNAベースのベクターは、hIDUA(配列番号:1)を含む導入遺伝子を含むように構築する。また、導入遺伝子は、表1に列記される群から選択されるシグナルペプチドを含む核酸を含む。任意に、ベクターは、さらにプロモーターを含む。
【０１４７】
(6.2 実施例2：置換hIDUA cDNA)
配列番号:1のhIDUA配列と比較してアミノ酸置換、欠失、又は付加を有する、例えばこれに限定はされないが、図2に示すIDUAのオーソログ中の対応する非保存的残基から選択されるアミノ酸置換を含むhIDUAを含む、導入遺伝子を含むhIDUA cDNAベースのベクターを構築する(ただし、そのような突然変異が図3に示す(その全体が参照により本明細書に組み込まれているSaitoらの文献、2014、Mol Genet Metab 111:107-112、57個のMPS I突然変異を列記する表1より)；又はその各々の全体が参照により本明細書に組み込まれているVenturiらの文献、2002、Human Mutation #522 Online(「Venturi 2002」)、若しくはBertolaらの文献、2011、Human Mutation 32:E2189-E2210(「Bertola 2011」)によって報告された重度の、中程度に重度の、中程度の、又は減弱型MPS I表現形において同定されたいずれの突然変異も含まないことを条件とする)。また、導入遺伝子は、表1に列記される群から選択されるシグナルペプチドを含む核酸を含む。任意には、ベクターは、さらにプロモーターを含む。
【０１４８】
(6.3 実施例3：hIDUA又は置換hIDUAを用いた動物モデルにおけるMPS Iの治療)
導入遺伝子として発現される場合、hIDUA cDNAベースのベクターはMPS Iの治療に有用であると考えられる。MPS Iのための動物モデル、例えばClarkeらの文献、1997、Hum Mol Genet 6(4):503-511(マウス)、Haskinsらの文献、1979、Pediatr Res 13(11):1294-97(雑種のイエネコ)、Menonらの文献、1992、Genomics 14(3):763-768(イヌ)、又はShullらの文献、1982、Am J Pathol 109(2):244-248(イヌ)に記載される動物モデルに、導入遺伝子産物を送達し、動物のCSF中でCminを少なくとも9.25 μg/mLの濃度に維持するのに十分な用量でくも膜下腔内にhIDUAをコードする組換えベクターを投与する。治療の後、動物を、特定の動物モデルの疾患と一致した症状の改善について評価する。
【０１４９】
(6.4 実施例4：hIDUA又は置換hIDUAを用いたMPS Iの治療)
導入遺伝子として発現される場合、hIDUA cDNAベースのベクターはMPS Iの治療に有用であると考えられる。MPS Iを呈する対象に導入遺伝子産物を送達し、CSF中でCminを少なくとも9.25 μg/mLの濃度に維持するのに十分な用量でくも膜下腔内にhIDUAをコードするcDNAベースのベクターを投与する。治療の後、対象を、MPS Iの症状の改善について評価する。hIDUAをコードするcDNAベースのベクターの投与の前に、それと同時に、又はその後に、患者に、ラパマイシン、MMF、及びプレドニゾロンを含む免疫抑制治療薬を投与する。
【０１５０】
(6.5 実施例5：MPS I治療の臨床プロトコル)
以下の実施例は、MPS Iを治療するためにヒト対象をrAAV9.hIDUAベクターで治療するために使用することができるプロトコルを記載する。
【０１５１】
患者集団。治療されることとなる患者は:
・血漿、線維芽細胞又は白血球において測定された酵素活性によって確認されるMPS Iの診断、
・任意の他の神経学的又は精神医学的な因子によって説明可能でない場合、以下のいずれかとして定義されるMPS Iに起因する初期段階の神経認知機能低下：
○IQ試験での、又は1ドメインの神経心理的機能(言語理解、記憶力、注意力、又は知覚推理)における平均を下回る標準偏差≧1のスコア、
○逐次試験での＞1の標準偏差の低下の文書化された履歴的証拠(医療記録)、を有する男性又は女性を含み得る。
【０１５２】
患者には、ERT(例えば、ALDURAZYME[ラロニダーゼ] IV)の安定レジメンを受けている患者を含み得る。出産可能性のある女性は、治療の日に血清妊娠試験陰性であるべきである。性的に活発な対象(女性及び男性の両方とも)は、ベクター投与の24週間後まで医学的に認められた障害的避妊法(例えば、コンドーム、隔膜又は節制)を使用するべきである。大槽内(IC)治療から除外され得る患者には、IC注入又は腰椎穿刺についての禁忌を有する対象が含まれ得る。IC注入のための禁忌には、以下のいずれかを含むことができる:
・過去の頭部/頸部手術の履歴の結果IC注入が禁忌となっている、
・CT(若しくは造影)又は全身麻酔に任意の禁忌を有する、
・MRI(又はガドリニウム)に対する任意の禁忌を有する、
・糸球体濾過速度(eGFR) ＜30mL/分/1.73m2の推定値を有する。
【０１５３】
いずれかの時にIT治療を受けて、IT投与に関係すると考えられる重大な有害反応を経験した患者は、ICで治療されるべきではない。
【０１５４】
治療医師が免疫抑制治療に適当でないと考える任意の状態を有する患者は、治療を受けるべきではない(例えば、絶対好中球数＜1.3×103/μL、血小板数＜100×103/μL、及びヘモグロビン＜12 g/dL[男性]又は＜10 g/dL[女性])。代替免疫抑制レジメンは、シロリムス、MMF、又はプレドニゾロンに対する過敏性反応の任意の履歴を有する任意の患者に対し使用すべきである。
【０１５５】
リンパ腫又は皮膚の扁平上皮細胞又は基底細胞癌以外の別の癌の病歴を有する患者は、治療前少なくとも3ヵ月にわたって完全寛解にない限り、治療するべきではない。
【０１５６】
アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)若しくはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)が＞3×正常上限値(ULN)であるか、又は総ビリルビンが＞1.5×ULNである患者は、対象が過去ギルバート症候群及び総ビリルビンの＜35%の抱合ビリルビンを示す分画ビリルビンの履歴を有することが分かっている場合を除いては、治療するべきではない。
【０１５７】
感染症又は物質乱用の履歴を有する患者は、治療の候補とすることはできない。例えば、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)試験陽性の履歴、活動性若しくは再発性のB型肝炎若しくはC型肝炎、又はB型肝炎、C型肝炎、若しくはHIVスクリーニング試験陽性の履歴;治療前1年以内のアルコール又は物質乱用の履歴である。
【０１５８】
一実施態様において、患者は、成人の患者である。別の実施態様において、患者は、小児患者である。
【０１５９】
(施される治療―免疫抑制治療による前治療)
遺伝子治療の前に、患者は、導入遺伝子及び/又はAAVキャプシドへの免疫反応を防止するために、免疫抑制治療で治療すべきである。そのような免疫抑制治療は、プレドニゾロン(第-2〜8日に60 mgを1日1回、経口)、MMF(第-2〜60日に1gを1日2回、経口)及びシロリムス(第-2日に6 mgを経口で 、その後第-1日から第48週まで2 mgを1日1回)を含む。シロリムスの用量は、全血トラフ濃度を16〜24 ng/mL以内に維持するように調整する。大部分の対象において、用量調整は、式:新規用量＝現在の用量×(目標濃度/現在の濃度)に基づくことができる。対象は、さらに投薬量を調整する前に、濃度をモニタリングしながら少なくとも7〜14日間にわたり新しい維持用量を継続するべきである。好中球減少症を発症する場合(絶対好中球数＜1.3×103/μL)、MMFの投薬は中断するか、又は用量を低下させるべきである。
【０１６０】
遺伝子治療。hIDUA発現カセット(rAAV9.hIDUA)を含む血清型9キャプシドの非複製組換えAAVを、治療に使用する。AAV9血清型は、IC投与の後、CNSにおけるhIDUAタンパク質の効率的な発現を可能にする。ベクターゲノムは、AAV2逆向き末端反復配列(ITR)に隣接するhIDUA発現カセットを含む。カセットからの発現は、強力な構成的CAGプロモーターによって駆動する。rAAV9.hIDUAベクターは、くも膜下腔内注入のためのElliotts B溶液中に懸濁させる。
【０１６１】
rAAV9.hIDUAは、IC投与による単一の一定用量として投与する:1.4×1013 GC(1.1×1010 GC/g脳質量)の低用量、又は7.0×1013 GC(5.6×1010 GC/g脳質量)の高用量を、約5〜20mlの容量中で使用することができる。患者がAAVに対する中和抗体を有する場合、高用量は使用することができる。
【０１６２】
rAAV9.IDUAの投与のために、対象を全身麻酔下におく。腰椎穿刺を実施し、まず5 ccのCSFを除去し、その後大槽の可視化を補助するために造影ITを注入する。CT(造影を伴う)を利用して針挿入及び後頭下空間への選択された用量のrAAV9.IDUAの投与を導く。
【０１６３】
(6.6 実施例6：MPS I治療の臨床プロトコル)
以下の実施例では、MPS Iを治療するためにヒト対象をrAAV9.hIDUAベクターで治療するために使用することができるプロトコルを記載する。
【０１６４】
患者集団。治療されることとなる患者は:
・血漿、線維芽細胞又は白血球において測定された酵素活性によって確認されるMPS Iの診断(これには、過去にHSCTを受けたことがあり、又は過去若しくは現在ラロニダーゼ治療を受けている患者を含む)、
・任意の他の神経学的又は精神医学的な因子によって説明可能でない場合、以下のいずれかとして定義されるMPS Iに起因する初期段階の神経認知機能低下：
○IQ試験での、又は1ドメインの神経心理的機能(言語理解、注意力、又は知覚推理)における平均を下回る標準偏差≧1のスコア、
○逐次試験での＞1の標準偏差の低下、を有する6歳以上の男性又は女性を含み得る。
【０１６５】
患者は、補助具の有無にかかわらず、要求されるプロトコル試験を完了するのに十分な聴覚的及び視覚的能力を有し、適用できる場合、試験日に進んで補助具を着用することに従うべきである。
【０１６６】
出産可能性のある女性は、治療の日に血清妊娠試験陰性であるべきである。全ての性的に活発な対象は、スクリーニング受診からベクター投与の24週間後まで医学的に認められた障害的避妊法を進んで使用しなくてはならない。性的に活発な女性は、スクリーニング受診からシロリムスの最後の投薬の12週間後まで(どちらか遅い方)有効な受胎調節法を進んで使用しなければならない。大槽内(IC)治療から除外され得る患者には、IC注入又は腰椎穿刺についての禁忌を有する対象が含まれ得る。IC注入のための禁忌には、以下のいずれかを含むことができる: 
・過去の頭部/頸部手術の履歴の結果IC注入が禁忌となっている、 
・CT(若しくは造影)又は全身麻酔に任意の禁忌を有する、 
・MRI(又はガドリニウム)に対する任意の禁忌を有する、 
・糸球体濾過速度(eGFR) ＜30mL/分/1.73m2の推定値を有する。
【０１６７】
いずれかの時にIT治療を受けて、IT投与に関し関係すると考えられる重大な有害反応を経験した患者は、ICで治療されるべきではない。治療医師が免疫抑制治療に適当でないと考える任意の状態を有する患者は、治療を受けるべきではない(例えば、絶対好中球数＜1.3×103/μL、血小板数＜100×103/μL、及びヘモグロビン＜12 g/dL[男性]又は＜10 g/dL[女性])。代替免疫抑制レジメンは、シロリムス、MMF、又はプレドニゾロンに対する過敏性反応の任意の履歴を有する任意の患者に対し使用すべきである。
【０１６８】
リンパ腫又は皮膚の扁平上皮細胞又は基底細胞癌以外の別の癌の病歴を有する患者は、治療前少なくとも3ヵ月にわたって完全寛解にない限り、治療するべきではない。
【０１６９】
最大限の医学的治療にもかかわらず抑制されない高血圧(収縮期BP ＞180 mmHg、拡張期BP ＞100 mmHg)を有する患者は、治療するべきではない。
【０１７０】
アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)若しくはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)が＞3×正常上限値(ULN)であるか、又は総ビリルビンが＞1.5×ULNである患者は、対象が過去ギルバート症候群及び総ビリルビンの＜35%の抱合ビリルビンを示す分画ビリルビンの履歴を有することが分かっている場合を除いては、治療するべきではない。
【０１７１】
感染症又は物質乱用の履歴を有する患者は、治療の候補とすることはできない。例えば、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)又はB型肝炎若しくはC型肝炎ウイルス感染の履歴、あるいはB型肝炎表面抗原若しくはB型肝炎核抗体、又はC型肝炎若しくはHIV抗体のスクリーニング陽性の試験結果；スクリーニング前1年以内のアルコール又は物質乱用の履歴である。
【０１７２】
30日以内又は半減期の5倍の期間だけ前に任意の治験薬を与えられた患者はどちらの期間が長かったとしても、任意の時間先立って投与することができるITラロニダーゼを投与された患者を除き、治療するべきではない。
【０１７３】
妊娠している、分娩後6週未満の、スクリーニング時に授乳中の、又は52週を通じて任意の時に妊娠する予定である患者は、治療するべきではない。
【０１７４】
対象の安全を脅かす臨床的に重要なECG異常を有する患者は、治療するべきではない。対象の安全を脅かす、深刻又は不安定な医学又は心理状態を有する患者は、治療するべきではない。
【０１７５】
(施される治療―免疫抑制治療による前治療)
遺伝子治療の前に、患者は、導入遺伝子及び/又はAAVキャプシドへの免疫反応を防止するために、免疫抑制治療で治療すべきである。そのような免疫抑制治療は、プレドニゾロン(第-2〜8日に60 mgを1日1回、経口)、MMF(第-2〜60日に1gを1日2回、経口)及びシロリムス(第-2日に6 mgを経口で 、その後第-1日から第48週まで2 mgを1日1回)を含む。シロリムスの用量は、全血トラフ濃度を16〜24 ng/mL以内に維持するように調整する。大部分の対象において、用量調整は、式:新規用量＝現在の用量×(目標濃度/現在の濃度)に基づくことができる。対象は、さらに投薬量を調整する前に、濃度をモニタリングしながら少なくとも7〜14日間にわたり新しい維持用量を継続するべきである。
【０１７６】
免疫抑制レジメンの土台となる原理は完全に免疫を抑制するためにコルチコステロイドを投与すること―用量を負荷するためにIVメチルプレドニゾロンから開始し、続いて経口プレドニゾロンを段階的に漸減させて、患者が12週までにステロイドを中止するようにする。コルチコステロイド治療は、タクロリムス(24週間)及び/又はシロリムス(12週間)によって補充し、MMFでさらに補充することができる。タクロリムス及びシロリムスの両方を使用する場合、各々の用量は4〜8 ng/mlの血液トラフレベルを維持するように調整された低用量とすべきである。一方の薬剤のみを使用する場合、ラベル用量(高用量)を利用するべきである;例えば、12時間ごとの2分割された用量として与えられる0.15〜0.20 mg/kg/日のタクロリムス;及び1 mg/m2/日のシロリムス;負荷投与量は、3 mg/m2とするべきである。MMFをレジメンに加える場合、作用機序が異なるため、タクロリムス及び/又はシロリムスの用量は維持することができる。
【０１７７】
遺伝子治療。hIDUA発現カセット(rAAV9.hIDUA)を含む血清型9キャプシドの非複製組換えAAVを、治療に使用する。AAV9血清型は、IC投与の後、CNSにおけるhIDUAタンパク質の効率的な発現を可能にする。ベクターゲノムは、AAV2逆向き末端反復配列(ITR)に隣接するhIDUA発現カセットを含む。カセットからの発現は、強力な構成的CAGプロモーターによって駆動する。rAAV9.hIDUAベクターは、くも膜下腔内注入のためのElliotts B溶液中に懸濁させる。
【０１７８】
rAAV9.hIDUAは、IC投与による単一の一定用量として投与する: 2×109 GC/g脳質量(2.6×1012 GC)の用量、又は1×1010 GC/g脳質量(1.3×1013 GC)の用量。用量は、約5〜20mlの容量とすることができる。
【０１７９】
rAAV9.IDUAの投与のために、対象を全身麻酔下におく。
【０１８０】
(6.7 実施例7：MPS I治療の臨床プロトコル)
以下の実施例は、MPS Iを治療するためにヒト対象をrAAV9.hIDUAベクターで治療するために使用することができるプロトコルを記載する。
【０１８１】
患者集団。治療されることとなる患者は:
・血漿、線維芽細胞又は白血球において測定された酵素活性によって確認されるMPS Iの診断(これには、過去又は現在HSCT又はラロニダーゼ治療を受け得る患者を含む)、
・任意の他の神経学的又は精神医学的な因子によって説明可能でない場合、以下のいずれかとして定義されるMPS Iに起因する初期段階の神経認知機能低下：
○IQ試験での、又は1ドメインの神経心理的機能(言語理解、注意力、又は知覚推理)における平均を下回る標準偏差≧1のスコア、
○逐次試験での＞1の標準偏差の低下、を有する男性又は女性を含み得る。
【０１８２】
患者は、補助具の有無にかかわらず、要求されるプロトコル試験を完了するのに十分な聴覚的及び視覚的能力を有し、適用できる場合、試験日に進んで補助具を着用することに従うべきである。
【０１８３】
出産可能性のある女性は、治療の日に血清妊娠試験陰性であるべきである。全ての性的に活発な対象は、スクリーニング受診からベクター投与の24週間後まで医学的に認められた障害的避妊法を進んで使用しなくてはならない。性的に活発な女性は、スクリーニング受診からシロリムスの最後の投薬の12週間後まで(どちらか遅い方)有効な受胎調節法を進んで使用しなければならない。大槽内(IC)治療から除外され得る患者には、IC注入又は腰椎穿刺についての禁忌を有する対象が含まれ得る。IC注入のための禁忌には、以下のいずれかを含むことができる: 
・過去の頭部/頸部手術の履歴の結果IC注入が禁忌となっている、 
・CT(若しくは造影)又は全身麻酔に任意の禁忌を有する、 
・MRI(又はガドリニウム)に対する任意の禁忌を有する、 
・糸球体濾過速度(eGFR) ＜30mL/分/1.73m2の推定値を有する。
【０１８４】
いずれかの時にIT治療を受けて、IT投与に関係すると考えられる重大な有害反応を経験した患者は、ICで治療されるべきではない。治療医師が免疫抑制治療に適当でないと考える任意の状態を有する患者は、治療を受けるべきではない(例えば、絶対好中球数＜1.3×103/μL、血小板数＜100×103/μL、及びヘモグロビン＜12 g/dL[男性]又は＜10 g/dL[女性])。
【０１８５】
代替免疫抑制レジメンは、シロリムス、又はプレドニゾロンに対する過敏性反応の任意の履歴を有する任意の患者に対し使用すべきである。原発性免疫不全症、脾臓摘出又は感染にかかりやすくする任意の基礎的状態の履歴を有する患者は、免疫抑制治療で治療するべきではない。スクリーニングの少なくとも12週間前に完全には消散していない帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス又はエプスタイン・バー・ウイルス(EBV)に感染している患者は、免疫抑制治療で治療するべきではない。(1) 2回目の受診の少なくとも8週間前に消散しておらず、入院又は親世代抗感染症薬による治療を必要とする任意の感染症を有する患者、又は(2) 2回目の受診前10日以内に経口抗感染症薬(抗ウイルス薬を含む)を必要とする任意の活発な感染症、若しくは活発な結核の病歴を有する患者、又は(3) スクリーニングの間のQuantiferon_TB Gold試験で陽性となった患者、又は(4) インフォームドコンセント用紙に署名をする前8週間以内に任意の生ワクチンを受けた患者、又は(5) インフォームドコンセントに署名をする前8週間以内に大手術を行った患者、又は(6) 試験期間中に大手術を予定している患者は、免疫抑制治療で治療するべきではない。絶対好中球数＜1.3×103/μLである患者は、免疫抑制治療で治療するべきではない。
【０１８６】
治療前少なくとも3ヵ月にわたり完全寛解にない限り、リンパ腫又は皮膚の扁平上皮細胞又は基底細胞癌以外の別の癌の病歴を有する患者は、治療するべきではない。
【０１８７】
最大限の医学的治療にもかかわらず抑制されない高血圧(収縮期BP ＞180 mmHg、拡張期BP ＞100 mmHg)を有する患者は、治療するべきではない。
【０１８８】
アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)若しくはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)が＞3×正常上限値(ULN)であるか、又は総ビリルビンが＞1.5×ULNである患者は、対象が過去ギルバート症候群及び総ビリルビンの＜35%の抱合ビリルビンを示す分画ビリルビンの履歴を有することが分かっている場合を除いては、治療するべきではない。
【０１８９】
感染症又は物質乱用の履歴を有する患者は、治療の候補とすることはできない。例えば、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)又はB型肝炎若しくはC型肝炎ウイルス感染の履歴、あるいはB型肝炎表面抗原若しくはB型肝炎核抗体、又はC型肝炎若しくはHIV抗体のスクリーニング陽性の試験結果；治療前1年以内のアルコール又は物質乱用の履歴である。
【０１９０】
一実施態様において、患者は成人患者である。別の実施態様において、患者は小児患者である。
【０１９１】
(施される治療―免疫抑制治療による前治療)
遺伝子治療に先立ち、導入遺伝子及び/又はAAVキャプシドに対する免疫反応を予防するために、患者を免疫抑制治療で治療するべきである。そのような免疫抑制治療はコルチコステロイド(第1日にメチルプレドニゾロン10 mg/kgを1回静脈内[IV]に前投与し、第2日に経口プレドニゾンを0.5 mg/kg/日から開始し、段階的に漸減させて、第12週までに中断する)、タクロリムス(第2日から第24週まで1日2回[BID]1 mgを経口的に[PO]、目標血中レベルを4〜8 ng/mLとし、第24週から第32週にかけての8週間にわたり漸減する)、及びシロリムス(第-2日に4時間ごとに1 mg/m2×3用量の負荷用量、続いて第-1日からシロリムス0.5 mg/m2/日をBIDに分けて、第48週まで目標血中レベルを4〜8 ng/mLとして投薬する)を含む。神経学的評価及びタクロリムス/シロリムス血中レベルのモニタリングを実施する。シロリムス及びタクロリムスの用量は、目標範囲の血中レベルを維持するように調整する。48週の経過後は、免疫抑制治療は予定されない。大部分の対象において、用量調整は、式:新規用量＝現在の用量×(目標濃度/現在の濃度)に基づくことができる。対象は、さらに投薬量を調整する前に、濃度をモニタリングしながら少なくとも7〜14日間にわたり新しい維持用量を継続するべきである。
【０１９２】
遺伝子治療。hIDUA発現カセット(rAAV9.hIDUA)を含む血清型9キャプシドの非複製組換えAAVを、治療に使用する。AAV9血清型は、IC投与の後、CNSにおけるhIDUAタンパク質の効率的な発現を可能にする。ベクターゲノムは、AAV2逆向き末端反復配列(ITR)に隣接するhIDUA発現カセットを含む。カセットからの発現は、強力な構成的CAGプロモーターによって駆動する。rAAV9.hIDUAベクターは、くも膜下腔内注入のためのElliotts B溶液中に懸濁させる。
【０１９３】
rAAV9.hIDUAは、IC投与による単一の一定用量として投与する: 2×109 GC/g脳質量(2.6×1012 GC)の用量、又は1×1010 GC/g脳質量(1.3×1013 GC)の用量。用量は、約5〜20mlの容量とすることができる。
【０１９４】
rAAV9.IDUAの投与のために、対象を全身麻酔下におく。
【０１９５】
(6.8 実施例8：MPS I治療の臨床プロトコル)
以下の実施例は、MPS Iを治療するためにヒト対象をrAAV9.hIDUAベクターで治療するために使用することができるプロトコルを記載する。
【０１９６】
患者集団。治療されることとなる患者は:
・血漿、線維芽細胞又は白血球において測定された酵素活性によって確認されるMPS Iの診断(これには、過去又は現在HSCT又はラロニダーゼ治療を受け得る患者を含む)、
・任意の他の神経学的又は精神医学的な因子によって説明可能でない場合、以下のいずれかとして定義されるMPS Iに起因する初期段階の神経認知機能欠陥：
○IQ試験での、又は1ドメインの神経心理的機能(言語理解、注意力、又は知覚推理)における平均を下回る標準偏差≧1のスコア、
○逐次試験での＞1の標準偏差の低下、を有する6歳以上の男性又は女性を含み得る。
【０１９７】
患者は、補助具の有無にかかわらず、要求されるプロトコル試験を完了するのに十分な聴覚的及び視覚的能力を有し、適用できる場合、試験日に進んで補助具を着用することに従うべきである。
【０１９８】
出産可能性のある女性は、治療の日に血清妊娠試験陰性であるべきである。全ての性的に活発な対象は、スクリーニング受診からベクター投与の24週間後まで医学的に認められた障害的避妊法を進んで使用しなくてはならない。性的に活発な女性は、スクリーニング受診からシロリムスの最後の投薬の12週間後まで(どちらか遅い方)有効な受胎調節法を進んで使用しなければならない。大槽内(IC)治療から除外され得る患者には、IC注入又は腰椎穿刺についての禁忌を有する対象が含まれ得る。IC注入のための禁忌には、以下のいずれかを含むことができる: 
・過去の頭部/頸部手術の履歴の結果IC注入が禁忌となっている、 
・CT(若しくは造影)又は全身麻酔に任意の禁忌を有する、 
・MRI(又はガドリニウム)に対する任意の禁忌を有する、 
・糸球体濾過速度(eGFR) ＜30mL/分/1.73m2の推定値を有する。
【０１９９】
いずれかの時にIT治療を受けて、IT投与に関係すると考えられる重大な有害反応を経験した患者は、ICで治療されるべきではない。治療医師が免疫抑制治療に適当でないと考える任意の状態を有する患者は、治療を受けるべきではない(例えば、絶対好中球数＜1.3×103/μL、血小板数＜100×103/μL、及びヘモグロビン＜12 g/dL[男性]又は＜10 g/dL[女性])。
【０２００】
代替免疫抑制レジメンは、タクロリムス、シロリムス、又はプレドニゾロンに対する過敏性反応の任意の履歴を有する任意の患者に対し使用すべきである。原発性免疫不全症、脾臓摘出又は感染にかかりやすくする任意の基礎的状態の履歴を有する患者は、免疫抑制治療で治療するべきではない。スクリーニングの少なくとも12週間前に完全には消散していない帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス又はエプスタイン・バー・ウイルス(EBV)に感染している患者は、免疫抑制治療で治療するべきではない。(1) 2回目の受診の少なくとも8週間前に消散しておらず、入院又は親世代抗感染症薬による治療を必要とする任意の感染症を有する患者、又は(2) 2回目の受診前10日以内に経口抗感染症薬(抗ウイルス薬を含む)を必要とする任意の活発な感染症、若しくは活発な結核の病歴を有する患者、又は(3) スクリーニングの間のQuantiferon_TB Gold試験で陽性となった患者、又は(4) インフォームドコンセント用紙に署名をする前8週間以内に任意の生ワクチンを受けた患者、又は(5) インフォームドコンセントに署名をする前8週間以内に大手術を行った患者、又は(6) 試験期間中に大手術を予定している患者は、免疫抑制治療で治療するべきではない。絶対好中球数＜1.3×103/μLである患者は、免疫抑制治療で治療するべきではない。
【０２０１】
リンパ腫又は皮膚の扁平上皮細胞又は基底細胞癌以外の別の癌の病歴を有する患者は、治療前少なくとも3ヵ月にわたって完全寛解にない限り、治療するべきではない。
【０２０２】
最大限の医学的治療にもかかわらず抑制されない高血圧(収縮期BP ＞180 mmHg、拡張期BP ＞100 mmHg)を有する患者は、治療するべきではない。
【０２０３】
アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)若しくはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)が＞3×正常上限値(ULN)であるか、又は総ビリルビンが＞1.5×ULNである患者は、対象が過去ギルバート症候群及び総ビリルビンの＜35%の抱合ビリルビンを示す分画ビリルビンの履歴を有することが分かっている場合を除いては、治療するべきではない。
【０２０４】
感染症又は物質乱用の履歴を有する患者は、治療の候補とすることはできない。例えば、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)又はB型肝炎若しくはC型肝炎ウイルス感染の履歴、あるいはB型肝炎表面抗原若しくはB型肝炎核抗体、又はC型肝炎若しくはHIV抗体のスクリーニング陽性の試験結果；治療前1年以内のアルコール又は物質乱用の履歴である。
【０２０５】
(施される治療―免疫抑制治療による前治療)
遺伝子治療に先立ち、導入遺伝子及び/又はAAVキャプシドに対する免疫反応を予防するために、患者を免疫抑制治療で治療するべきである。そのような免疫抑制治療はコルチコステロイド(第1日にメチルプレドニゾロン10 mg/kgを1回静脈内[IV]に前投与し、第2日に経口プレドニゾンを0.5 mg/kg/日から開始し、段階的に漸減させて、第12週までに中断する)、タクロリムス(第2日から第24週まで1日2回[BID]1 mgを経口的に[PO]、目標血中レベルを4〜8 ng/mLとし、第24週から第32週にかけての8週間にわたり漸減する)、及びシロリムス(第-2日に4時間ごとに1 mg/m2×3用量の負荷用量、続いて第-1日からシロリムス0.5 mg/m2/日をBIDに分けて、第48週まで目標血中レベルを4〜8 ng/mlとして投薬する)を含む。神経学的評価及びタクロリムス/シロリムス血中レベルのモニタリングを実施する。シロリムス及びタクロリムスの用量は、目標範囲の血中レベルを維持するように調整する。48週の経過後は、免疫抑制治療は予定されない。大部分の対象において、用量調整は、式:新規用量＝現在の用量×(目標濃度/現在の濃度)に基づくことができる。対象は、さらに投薬量を調整する前に、濃度をモニタリングしながら少なくとも7〜14日間にわたり新しい維持用量を継続するべきである。
【０２０６】
遺伝子治療。hIDUA発現カセット(rAAV9.hIDUA)を含む血清型9キャプシドの非複製組換えAAVを、治療に使用する。AAV9血清型は、IC投与の後、CNSにおけるhIDUAタンパク質の効率的な発現を可能にする。ベクターゲノムは、AAV2逆向き末端反復配列(ITR)に隣接するhIDUA発現カセットを含む。カセットからの発現は、強力な構成的CAGプロモーターによって駆動する。rAAV9.hIDUAベクターは、くも膜下腔内注入のためのElliotts B溶液中に懸濁させる。
【０２０７】
rAAV9.hIDUAは、IC投与による単一の一定用量として投与する: 2×109 GC/g脳質量(2.6×1012 GC)の用量、又は1×1010 GC/g脳質量(1.3×1013 GC)の用量。用量は、約5〜20mlの容量とすることができる。
【０２０８】
rAAV9.IDUAの投与のために、対象を全身麻酔下におく。
【０２０９】
(6.9 実施例9：MPS I治療の臨床プロトコル)
以下の実施例は、MPS Iを治療するためにヒト対象をrAAV9.hIDUAベクターで治療するために使用することができるプロトコルを記載する。
【０２１０】
患者集団。治療されることとなる患者は:
・血漿、線維芽細胞又は白血球において測定された酵素活性によって確認されるMPS Iの診断(これには、過去又は現在HSCT又はラロニダーゼ治療を受け得る患者を含む)、
・任意の他の神経学的又は精神医学的な因子によって説明可能でない場合、以下のいずれかとして定義されるMPS Iに起因する初期段階の神経認知機能欠陥：
○IQ試験での、又は1ドメインの神経心理的機能(言語理解、注意力、又は知覚推理)における平均を下回る標準偏差≧1のスコア、
○逐次試験での＞1の標準偏差の低下、を有し、
・3歳未満の患者が神経認知機能低下を伴うハーラー症候群をもたらすことが知られる突然変異(複数可)によって確認される、重度形態のMPS I(ハーラー症候群)を有する、6歳以上の男性又は女性及び3歳未満の男性又は女性を含み得る。
【０２１１】
患者は、補助具の有無にかかわらず、要求されるプロトコル試験を完了するのに十分な聴覚的及び視覚的能力を有し、適用できる場合、試験日に進んで補助具を着用することに従うべきである。
【０２１２】
出産可能性のある女性は、治療の日に血清妊娠試験陰性であるべきである。全ての性的に活発な対象は、スクリーニング受診からベクター投与の24週間後まで医学的に認められた障害的避妊法を進んで使用しなくてはならない。性的に活発な女性は、スクリーニング受診からシロリムスの最後の投薬の12週間後まで(どちらか遅い方)有効な受胎調節法を進んで使用しなければならない。大槽内(IC)治療から除外され得る患者には、IC注入又は腰椎穿刺についての禁忌を有する対象が含まれ得る。IC注入のための禁忌には、以下のいずれかを含むことができる: 
・過去の頭部/頸部手術の履歴の結果IC注入が禁忌となっている、 
・CT(若しくは造影)又は全身麻酔に任意の禁忌を有する、 
・MRI(又はガドリニウム)に対する任意の禁忌を有する、 
・糸球体濾過速度(eGFR) ＜30mL/分/1.73m2の推定値を有する。
【０２１３】
いずれかの時にIT治療を受けて、IT投与に関係すると考えられる重大な有害反応を経験した患者は、ICで治療されるべきではない。治療医師が免疫抑制治療に適当でないと考える任意の状態を有する患者は、治療を受けるべきではない(例えば、絶対好中球数＜1.3×103/μL、血小板数＜100×103/μL、及びヘモグロビン＜12 g/dL[男性]又は＜10 g/dL[女性])。
【０２１４】
代替免疫抑制レジメンは、タクロリムス、シロリムス、又はプレドニゾロンに対する過敏性反応の任意の履歴を有する任意の患者に対し使用すべきであるか、又は該患者は除外するべきである。原発性免疫不全症、脾臓摘出又は感染にかかりやすくする任意の基礎的状態の履歴を有する患者は、免疫抑制治療で治療するべきではない。スクリーニングの少なくとも12週間前に完全には消散していない帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス又はエプスタイン・バー・ウイルス(EBV)に感染している患者は、免疫抑制治療で治療するべきではない。(1) 2回目の受診の少なくとも8週間前に消散しておらず、入院又は親世代抗感染症薬による治療を必要とする任意の感染症を有する患者、又は(2) 2回目の受診前10日以内に経口抗感染症薬(抗ウイルス薬を含む)を必要とする任意の活発な感染症、若しくは活発な結核の病歴を有する患者、又は(3) スクリーニングの間のQuantiferon_TB Gold試験で陽性となった患者、又は(4) インフォームドコンセント用紙に署名をする前8週間以内に任意の生ワクチンを受けた患者、又は(5) インフォームドコンセントに署名をする前8週間以内に大手術を行った患者、又は(6) 試験期間中に大手術を予定している患者は、免疫抑制治療で治療するべきではない。絶対好中球数＜1.3×103/μLである患者は、免疫抑制治療で治療するべきではない。
【０２１５】
リンパ腫又は皮膚の扁平上皮細胞又は基底細胞癌以外の別の癌の病歴を有する患者は、治療前少なくとも3ヵ月にわたって完全寛解にない限り、治療するべきではない。
【０２１６】
最大限の医学的治療にもかかわらず抑制されない高血圧(収縮期BP ＞180 mmHg、拡張期BP ＞100 mmHg)を有する患者は、治療するべきではない。
【０２１７】
アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)若しくはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)が＞3×正常上限値(ULN)であるか、又は総ビリルビンが＞1.5×ULNである患者は、対象が過去ギルバート症候群及び総ビリルビンの＜35%の抱合ビリルビンを示す分画ビリルビンの履歴を有することが分かっている場合を除いては、治療するべきではない。
【０２１８】
感染症又は物質乱用の履歴を有する患者は、治療の候補とすることはできない。例えば、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)又はB型肝炎若しくはC型肝炎ウイルス感染の履歴、あるいはB型肝炎表面抗原若しくはB型肝炎核抗体、又はC型肝炎若しくはHIV抗体のスクリーニング陽性の試験結果；治療前1年以内のアルコール又は物質乱用の履歴である。
【０２１９】
(施される治療―免疫抑制治療による前治療)
遺伝子治療に先立ち、導入遺伝子及び/又はAAVキャプシドに対する免疫反応を予防するために、患者を免疫抑制治療で治療するべきである。6歳以上の患者のためのそのような免疫抑制治療はコルチコステロイド(第1日にメチルプレドニゾロン10 mg/kgを1回静脈内[IV]に前投与し、第2日に経口プレドニゾンを0.5 mg/kg/日から開始し、段階的に漸減させて、第12週までに中断する)、タクロリムス(第2日から第24週まで1日2回[BID]1 mgを経口的に[PO]、目標血中レベルを4〜8 ng/mLとし、第24週から第32週にかけての8週間にわたり漸減する)、及びシロリムス(第-2日に4時間ごとに1 mg/m2×3用量の負荷用量、続いて第-1日からシロリムス0.5 mg/m2/日をBIDに分けて、第48週まで目標血中レベルを4〜8 ng/mlとして投薬する)を含む。3歳未満の患者のためのそのような免疫抑制治療はコルチコステロイド(第1日にメチルプレドニゾロン10 mg/kgを1回静脈内[IV]に前投与し、第2日に経口プレドニゾンを0.5 mg/kg/日から開始し、段階的に漸減させて、第12週までに中断する)、タクロリムス(第2日から第24週まで1日2回[BID]0.05 mg/kgを経口的に[PO]、目標血中レベルを2〜4 ng/mLとし、第24週から第32週にかけての8週間にわたり漸減する)、及びシロリムス(第-2日に4時間ごとに1 mg/m2×3用量の負荷用量、続いて第-1日からシロリムス0.5 mg/m2/日をBIDに分けて、第48週まで目標血中レベルを1〜3 ng/mlとして投薬する)を含む。神経学的評価及びタクロリムス/シロリムス血中レベルのモニタリングを実施する。シロリムス及びタクロリムスの用量は、目標範囲の血中レベルを維持するように調整する。48週の経過後は、免疫抑制治療は予定されない。大部分の対象において、用量調整は、式:新規用量＝現在の用量×(目標濃度/現在の濃度)に基づくことができる。対象は、さらに投薬量を調整する前に、濃度をモニタリングしながら少なくとも7〜14日間にわたり新しい維持用量を継続するべきである。
【０２２０】
遺伝子治療。hIDUA発現カセット(rAAV9.hIDUA)を含む血清型9キャプシドの非複製組換えAAVを、治療に使用する。AAV9血清型は、IC投与の後、CNSにおけるhIDUAタンパク質の効率的な発現を可能にする。ベクターゲノムは、AAV2逆向き末端反復配列(ITR)に隣接するhIDUA発現カセットを含む。カセットからの発現は、強力な構成的CAGプロモーターによって駆動する。rAAV9.hIDUAベクターは、くも膜下腔内注入のためのElliotts B溶液中に懸濁させる。
【０２２１】
6歳以上の患者には、rAAV9.hIDUAは、IC投与による単一の一定用量として投与する: 2×109 GC/g脳質量(2.6×1012 GC)の用量、又は1×1010 GC/g脳質量(1.3×1013 GC)の用量。用量は、約5 ml以下の容量とすることができる。
【０２２２】
3歳未満の患者には、rAAV9.hIDUAをIC投与により、1×1010 GC/g脳質量の用量で(4ヵ月齢以上であるが9ヵ月齢未満の患者については6.0×1012 GC；9ヵ月齢以上であるが18ヵ月齢未満の患者については1.0×1013 GC；18ヵ月以上であるが3歳未満の患者については1.1×1013 GC)、又は5×1010 GC/g脳質量の用量で(4ヵ月齢以上であるが9ヵ月齢未満の患者については3.0×1013 GC；9ヵ月齢以上であるが18ヵ月齢未満の患者については5.0×1013 GC；18ヵ月以上であるが3歳未満の患者については5.5×1013 GC)、単一の一定用量として投与する。用量は、約5 ml以下の容量とし得る。
【０２２３】
rAAV9.IDUAの投与のために、対象を全身麻酔下におく。
【０２２４】
(6.10 実施例10：MPS I治療の臨床プロトコル)
以下の実施例は、MPS Iを治療するためにヒト対象をrAAV9.hIDUAベクターで治療するために使用することができるプロトコルを記載する。
【０２２５】
患者集団。治療されることとなる患者は:
・臨床徴候及びMPS I-Hに合致する症状、及び/又は重症表現形のみに関連付けられる突然変異についてのホモ接合性若しくは複合的ヘテロ接合性の存在によって確認される重度のMPS I-ハーラーとの診断、
・知能指数(IQ)スコア≧55、を有する3歳未満の男性又は女性を含み得る。
【０２２６】
患者は、補助具の有無にかかわらず、要求されるプロトコル試験を完了するのに十分な聴覚的及び視覚的能力を有し、適用できる場合、試験日に進んで補助具を着用することに従うべきである。
【０２２７】
大槽内(IC)治療から除外され得る患者には、IC注入又は腰椎穿刺についての禁忌を有する対象が含まれ得る。IC注入のための禁忌には、以下のいずれかを含むことができる: 
・過去の頭部/頸部手術の履歴の結果IC注入が禁忌となっている、 
・CT(若しくは造影)又は全身麻酔に任意の禁忌を有する、 
・MRI(又はガドリニウム)に対する任意の禁忌を有する、 
・糸球体濾過速度(eGFR) ＜30mL/分/1.73m2の推定値を有する。
【０２２８】
いずれかの時にIT治療を受けて、IT投与に関係すると考えられる重大な有害反応を経験した患者は、ICで治療されるべきではない。治療医師が免疫抑制治療に適当でないと考える任意の状態を有する患者は、治療を受けるべきではなく(例えば、絶対好中球数＜1.3×103/μL、血小板数＜100×103/μL)、かつヘモグロビンを評価する。
【０２２９】
代替免疫抑制レジメンは、タクロリムス、シロリムス、又はプレドニゾロンに対する過敏性反応の任意の履歴を有する任意の患者に対し使用すべきであるか、又は該患者は除外するべきである。原発性免疫不全症、脾臓摘出又は感染にかかりやすくする任意の基礎的状態の履歴を有する患者は、免疫抑制治療で治療するべきではない。スクリーニングの少なくとも12週間前に完全には消散していない帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス又はエプスタイン・バー・ウイルス(EBV)に感染している患者は、免疫抑制治療で治療するべきではない。(1) 2回目の受診の少なくとも8週間前に消散しておらず、入院又は親世代抗感染症薬による治療を必要とする任意の感染症を有する患者、又は(2) 2回目の受診前10日以内に経口抗感染症薬(抗ウイルス薬を含む)を必要とする任意の活発な感染症、若しくは活発な結核の病歴を有する患者、又は(3) スクリーニングの間のQuantiferon_TB Gold試験で陽性となった患者、又は(4) インフォームドコンセント用紙に署名をする前8週間以内に任意の生ワクチンを受けた患者、又は(5) インフォームドコンセントに署名をする前8週間以内に大手術を行った患者、又は(6) 試験期間中に大手術を予定している患者は、免疫抑制治療で治療するべきではない。絶対好中球数＜1.3×103/μLである患者は、免疫抑制治療で治療するべきではない。
【０２３０】
リンパ腫又は皮膚の扁平上皮細胞又は基底細胞癌以外の別の癌の病歴を有する患者は、治療前少なくとも3ヵ月にわたって完全寛解にない限り、治療するべきではない。
【０２３１】
最大限の医学的治療にもかかわらず抑制されない高血圧(収縮期BP ＞180 mmHg、拡張期BP ＞100 mmHg)を有する患者は、治療するべきではない。
【０２３２】
アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)若しくはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)が＞3×正常上限値(ULN)であるか、又は総ビリルビンが＞1.5×ULNである患者は、対象が過去ギルバート症候群の履歴を有することが分かっている場合を除いては、治療するべきではない。
【０２３３】
感染症又は物質乱用の履歴を有する患者は、治療の候補とすることはできない。例えば、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)又はB型肝炎若しくはC型肝炎ウイルス感染の履歴、あるいはB型肝炎表面抗原若しくはB型肝炎核抗体、又はC型肝炎若しくはHIV抗体のスクリーニング陽性の試験結果；治療前1年以内のアルコール又は物質乱用の履歴である。
【０２３４】
(施される治療―免疫抑制治療による前治療)
遺伝子治療に先立ち、導入遺伝子及び/又はAAVキャプシドに対する免疫反応を予防するために、患者を免疫抑制治療で治療するべきである。プレドニゾンの投薬は、0.5 mg/kg/日から開始し、第12週の受診まで段階的に漸減させる。タクロリムスの用量は、最初の24週にわたり全血中トラフ濃度を2〜4 ng/mL以内に維持するように調整する。第24週に、用量をおよそ50%まで減少させる。第28週に、用量をおよそ50%までさらに減少させる。
タクロリムスは、第32週に中断する。シロリムスの用量は、全血中トラフ濃度を1〜3 ng/mL以内に維持するように調整する。大部分の対象において、用量調整は、式:新規用量＝現在の用量×(目標濃度/現在の濃度)に基づくことができる。対象は、さらに投薬量を調整する前に、濃度をモニタリングしながら少なくとも7〜14日間にわたり新しい維持用量を継続するべきである。さらなる詳細については以下を参照されたい。
【０２３５】
(コルチコステロイド)
【０２３６】
ベクター投与(第1日、前投与)の朝において、患者に、少なくとも30分間にわたるメチルプレドニゾロン10 mg/kg(最大500 mg)をIVで与える。メチルプレドニゾロンは、IPの腰椎穿刺及びIC注入の前に投与するべきである。アセトアミノフェン及び抗ヒスタミン剤による前投薬は、治験責任医師の裁量で任意に行う。
【０２３７】
第12週までにプレドニゾンを中断することを目標として、第2日に経口プレドニゾンを開始する。プレドニゾンの用量は、以下の通りである:
第2日から第2週の終わりまで:0.5 mg/kg/日
第3週及び4週:0.35 mg/kg/日
第5週〜8週:0.2 mg/kg/日
第9週〜12週:0.1 mg/kg。
プレドニゾンは、第12週の後に中断する。プレドニゾンの正確な用量は、一段階高めた臨床上実用的な用量に調整することができる。
【０２３８】
(シロリムス)
【０２３９】
ベクター投与の2日前(第-2日):4時間ごとに1 mg/m2×3用量のシロリムスの負荷用量を投与する。
【０２４０】
第-1日から：目標血中レベルを1〜3 ng/mlとする、1日2回の投薬に分割した0.5 mg/m2/日のシロリムス。
【０２４１】
シロリムスを、第48週の受診後に中断する。
【０２４２】
(タクロリムス)
【０２４３】
第2日(IP投与の次の日)にタクロリムスを1日2回0.05 mg/kgの用量で開始し、24週間にわたり2〜4 ng/mLの血中レベルを達成するように調整した。
【０２４４】
タクロリムスは第24週の受診から開始し、8週にわたって漸減する。第24週に、用量をおよそ50%減少させる。第28週に、用量をさらにおよそ50%減少させる。タクロリムスは、第32週で中断する。
【０２４５】
遺伝子治療。hIDUA発現カセット(rAAV9.hIDUA)を含む血清型9キャプシドの非複製組換えAAVを、治療に使用する。AAV9血清型は、IC投与の後、CNSにおけるhIDUAタンパク質の効率的な発現を可能にする。ベクターゲノムは、AAV2逆向き末端反復配列(ITR)に隣接するhIDUA発現カセットを含む。カセットからの発現は、強力な構成的CAGプロモーターによって駆動する。rAAV9.hIDUAベクターは、くも膜下腔内注入のためのElliotts B溶液中に懸濁させる。
【０２４６】
rAAV9.hIDUAをIC投与により、1×1010 GC/g脳質量の用量で(4ヵ月齢以上であるが9ヵ月齢未満の患者については6.0×1012 GC；9ヵ月齢以上であるが18ヵ月齢未満の患者については1.0×1013 GC；18ヵ月以上であるが3歳未満の患者については1.1×1013 GC)、又は5×1010 GC/g脳質量の用量で(4ヵ月齢以上であるが9ヵ月齢未満の患者については3.0×1013 GC；9ヵ月齢以上であるが18ヵ月齢未満の患者については5.0×1013 GC；18ヵ月以上であるが3歳未満の患者については5.5×1013 GC)、単一の一定用量として投与する。用量は、約5〜20 mlの容量とし得る。
【０２４７】
rAAV9.IDUAの投与のために、対象を全身麻酔下におく。
【０２４８】
(等価物)
本発明がその具体的な実施態様に関して詳細に記載されるにもかかわらず、機能的に等価である変形が本発明の範囲内にあることが理解されよう。実際、本明細書において示され、説明される発明に加え、本発明の様々な修正が、上記明細書及び添付される図面から当業者にとって明らかとなるであろう。そのような修正は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあることを意図する。当業者であれば、本明細書に記載の発明の具体的な実施態様との多くの等価物を認識するか又は定型的な実験の範囲の域でこれを使用し、確認することが可能である。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されることを意図する。
【０２４９】
この明細書に言及のある全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各々の個別の刊行物、特許、又は特許出願の全体が参照により本明細書に組み込まれていることが具体的かつ個別的に示されているかのように、同程度明細書中に参照により本明細書中に組み込まれている。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年12月12日(2019.12.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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