(57)【要約】本発明は、カプシドタンパク質VP1およびカプシドタンパク質VP3を任意の組み合わせで含むポリプロイド性アデノ随伴ウイルス（AAV）カプシドであって、カプシドタンパク質VP1が、1つまたは1つよりも多い第1のAAV血清型由来であり、カプシドタンパク質VP2が、1つまたは1つよりも多い第1のAAV血清型由来であり、カプシドタンパク質VP3が、1つまたは1つよりも多い第2のAAV血清型由来であり、第1のAAV血清型のうちの少なくとも1つが、第2のAAV血清型のうちの少なくとも1つと異なり、かつ第3のAAV血清型のうちの少なくとも1つと異なる、ポリプロイド性AAVカプシドを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カプシドタンパク質VP1およびカプシドタンパク質VP3を任意の組み合わせで含むアデノ随伴ウイルス（AAV）カプシドであって、カプシドタンパク質VP1が、1つまたは1つよりも多い第1のAAV血清型由来であり、カプシドタンパク質VP3が、1つまたは1つよりも多い第2のAAV血清型由来であり、第1のAAV血清型のうちの少なくとも1つが、第2のAAV血清型のうちの少なくとも1つと異なる、前記AAVカプシド。
【請求項２】
1つまたは1つよりも多い第3のAAV血清型由来であるカプシドタンパク質VP2を任意の組み合わせで含み、1つまたは1つよりも多い第3のAAV血清型のうちの少なくとも1つが、第1のAAV血清型および／または第2のAAV血清型と異なる、請求項1に記載のAAVカプシド。
【請求項３】
カプシドタンパク質VP1.5を含む、請求項2に記載のAAVカプシド。
【請求項４】
1つまたは1つよりも多い第4のAAV血清型由来であるカプシドタンパク質VP1.5を任意の組み合わせで含み、1つまたは1つよりも多い第4のAAV血清型のうちの少なくとも1つが、第1のAAV血清型および／または第2のAAV血清型と異なる、請求項1に記載のAAVカプシド。
【請求項５】
カプシドタンパク質VP2を含む、請求項4に記載のAAVカプシド。
【請求項６】
カプシドタンパク質VP1およびカプシドタンパク質VP2を任意の組み合わせで含むアデノ随伴ウイルス（AAV）カプシドであって、カプシドタンパク質VP1が、1つまたは1つよりも多い第1のAAV血清型由来であり、カプシドタンパク質VP2が、1つまたは1つよりも多い第2のAAV血清型由来であり、第1のAAV血清型のうちの少なくとも1つが、第2のAAV血清型のうちの少なくとも1つと異なる、前記AAVカプシド。
【請求項７】
1つまたは1つよりも多い第3のAAV血清型由来であるカプシドタンパク質VP3を任意の組み合わせで含み、1つまたは1つよりも多い第3のAAV血清型のうちの少なくとも1つが、第1のAAV血清型および／または第2のAAV血清型と異なる、請求項6に記載のAAVカプシド。
【請求項８】
カプシドタンパク質VP1.5を含む、請求項7に記載のAAVカプシド。
【請求項９】
カプシドタンパク質VP1およびカプシドタンパク質VP1.5を任意の組み合わせで含むアデノ随伴ウイルス（AAV）カプシドであって、カプシドタンパク質VP1が、1つまたは1つよりも多い第1のAAV血清型由来であり、カプシドタンパク質VP1.5が、1つまたは1つよりも多い第2のAAV血清型由来であり、第1のAAV血清型のうちの少なくとも1つが、第2のAAV血清型のうちの少なくとも1つと異なる、前記AAVカプシド。
【請求項１０】
1つまたは1つよりも多い第3のAAV血清型由来であるカプシドタンパク質VP3を任意の組み合わせで含み、1つまたは1つよりも多い第3のAAV血清型のうちの少なくとも1つが、第1のAAV血清型および／または第2のAAV血清型と異なる、請求項9に記載のAAVカプシド。
【請求項１１】
カプシドタンパク質VP2を含む、請求項10に記載のAAVカプシド。
【請求項１２】
1つまたは1つよりも多い第1のAAV血清型、1つまたは1つよりも多い第2のAAV血清型、1つまたは1つよりも多い第3のAAV血清型、および1つまたは1つよりも多い第4のAAV血清型が、表3に記載されるAAV血清型からなる群より任意の組み合わせで選択される、前記請求項のいずれか一項に記載のAAVカプシド。
【請求項１３】
キメラカプシドVP1タンパク質、キメラカプシドVP2タンパク質、キメラカプシドVP3タンパク質、および／またはキメラカプシドVP1.5タンパク質を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のAAVカプシド。
【請求項１４】
カプシドタンパク質VP2を欠く、請求項1、3、4、9、または10のいずれか一項に記載のAAVカプシド。
【請求項１５】
AAV2/8/9である、請求項1に記載のAAVカプシド。
【請求項１６】
H-AAV82である、請求項1に記載のAAVカプシド。
【請求項１７】
H-AAV92である、請求項1に記載のAAVカプシド。
【請求項１８】
H-AAV82G9である、請求項1に記載のAAVカプシド。
【請求項１９】
AAV2/8 3：1である、請求項1に記載のAAVカプシド。
【請求項２０】
AAV2/8 1：1である、請求項1に記載のAAVカプシド。
【請求項２１】
AAV2/8 1：3である、請求項1に記載のAAVカプシド。
【請求項２２】
AAV8/9である、請求項1に記載のAAVカプシド。
【請求項２３】
LK3、LK0l-19、AAV-DJ、Olig001、rAAV2-レトロ、AAV-LiC、AAV0Keral、AAV-Kera2、AAV-Kera3、AAV 7m8、AAVl,9、AAVr3.45、AAVクローン32、AAVクローン83、AAV-U87R7-C5、AAV ShH13、AAV ShH19、AAV Ll-12、AAV HAE-1、AAV HAE-2、AAVバリアントShH10、AAV2.5T、AAV LSl-4、AAV Lsm、AAV1289、AAVHSC 1-17、AAV2 Rec 1-4、AAV8BP2、AAV-Bl、AAV-PHP.B、AAV9.45、AAV9.61、AAV9.47、AAVM41、AAV2ディスプレイ型ペプチド、AAV2-GMN、AAV9-ペプチドディスプレイ型、AAV8およびAAV9ペプチドディスプレイ型、AAVpo2.1、AAVpo4、AAVpo5、AAVpo6、AAV rh、AAV Hu、AAV-Go.1、AAV-1110.l、DAAV、AAAV、AAV8 K137R、AAV Anc80L65、AAV2G9、AAV2 265挿入型-AAV2/265D、AAV2.5、AAV3 SASTG、AAV2i8、AAV8G9、AAV2チロシン変異体AAV2 Y-F、AAV8 Y-F、AAV9 Y-F、AAV6 Y-F、AAV6.2、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるAAVカプシドタンパク質を含む、請求項1に記載のAAVカプシド。
【請求項２４】
（a）前記請求項のいずれか一項に記載のAAVカプシド；および
（b）少なくとも1つの末端反復配列を含む核酸であって、該AAVカプシドにより包まれている核酸
を含む、ウイルスベクター。
【請求項２５】
（a）AAV粒子を組み立てるために必要な全ての機能および遺伝子を一緒に提供する1種もしくは複数種のプラスミドを宿主細胞にトランスフェクトする工程；
（b）1種もしくは複数種の核酸構築物をパッケージング細胞株もしくはプロデューサー細胞株に導入して、AAV粒子を組み立てるために必要な全ての機能および遺伝子を一緒に提供する工程；
（c）AAV粒子を組み立てるために必要な全ての機能および遺伝子を一緒に提供する1種もしくは複数種の組み換えバキュロウイルスベクターを宿主細胞に導入する工程；ならびに／または
（d）AAV粒子を組み立てるために必要な全ての機能および遺伝子を一緒に提供する1種もしくは複数種の組み換えヘルペスウイルスベクターを宿主細胞に導入する工程
を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のAAVカプシドを含むAAV粒子を作製する方法。
【請求項２６】
カプシドタンパク質VP1およびカプシドタンパク質VP2を任意の組み合わせで含むアデノ随伴ウイルス（AAV）カプシドであって、カプシドタンパク質VP1が、1つまたは1つよりも多い第1のAAV血清型由来であり、カプシドタンパク質VP2が、1つまたは1つよりも多い第2のAAV血清型由来であり、カプシドタンパク質VP3が、1つまたは1つよりも多い第1のAAV血清型由来であり、第1のAAV血清型のうちの少なくとも1つが、第2のAAV血清型のうちの少なくとも1つおよび第3のAAV血清型のうちの1つと異なる、前記AAVカプシド。
【請求項２７】
Repタンパク質が、第1のアデノ随伴ウイルス（AAV）血清型由来であり、カプシドタンパク質VP1、VP2、およびVP3が、Repタンパク質と異なる第2のAAV血清型由来である、AAV。
【請求項２８】
Repタンパク質が、第1のアデノ随伴ウイルス（AAV）血清型由来であり、カプシドタンパク質VP1、VP2、およびVP3が、2つ以上の異なるAAV血清型由来であり、該カプシドタンパク質が、Repタンパク質のAAV血清型と異なる2つ以上の異なるAAV血清型由来である、AAV。
【請求項２９】
Repタンパク質が、第1のアデノ随伴ウイルス（AAV）血清型由来であり、カプシドタンパク質VP1、VP2、およびVP3が、2つ以上の異なるAAV血清型由来であり、Repタンパク質のAAV血清型が、カプシドタンパク質のAAV血清型のうちの1つと同じである、AAV。
【請求項３０】
Repタンパク質が、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、または各AAVの任意のキメラのうちの1つより選択される、請求項28に記載のAAV。
【請求項３１】
Repタンパク質が、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、または各AAVの任意のキメラのうちの1つより選択される、請求項29に記載のAAV。
【請求項３２】
VP1、VP2、およびVP3カプシドタンパク質が、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、または各AAVの任意のキメラのうちの2つ以上より選択される、請求項28に記載のAAV。
【請求項３３】
VP1、VP2、およびVP3カプシドタンパク質が、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、または各AAVの任意のキメラのうちの2つ以上より選択される、請求項29に記載のAAV。
【請求項３４】
Repタンパク質が、第1のアデノ随伴ウイルス（AAV）血清型由来であり、AAV中のカプシドタンパク質VP1が、2つ以上の異なるAAV血清型由来であり、該カプシドタンパク質が、Repタンパク質のAAV血清型と異なる2つ以上の異なるAAV血清型由来である、AAV。
【請求項３５】
AAV中の1つのAAV血清型のVP1カプシドと第2のAAV血清型のVP1カプシドとの比が、1：1である、請求項34に記載のAAV。
【請求項３６】
AAV中の1つのAAV血清型のVP1カプシドと第2のAAV血清型のVP1カプシドとの比が、1：1ではない、請求項34に記載のAAV。
【請求項３７】
AAV中の1つのAAV血清型のVP1カプシドと第2のAAV血清型のVP1カプシドとの比が、事前に決定されている、請求項34に記載のAAV。
【請求項３８】
VP1カプシドの3つ以上のAAV血清型が、事前に決定された比でAAV中に存在する、請求項34に記載のAAVカプシド。
【請求項３９】
Repタンパク質が、第1のアデノ随伴ウイルス（AAV）血清型由来であり、AAV中のカプシドタンパク質VP2が、2つ以上の異なるAAV血清型由来であり、該カプシドタンパク質が、Repタンパク質のAAV血清型と異なる2つ以上の異なるAAV血清型由来である、AAV。
【請求項４０】
AAV中の1つのAAV血清型のVP2カプシドと第2のAAV血清型のVP2カプシドとの比が、1：1である、請求項34に記載のAAV。
【請求項４１】
AAV中の1つのAAV血清型のVP2カプシドと第2のAAV血清型のVP2カプシドとの比が、1：1ではない、請求項34に記載のAAV。
【請求項４２】
AAV中の1つのAAV血清型のVP2カプシドと第2のAAV血清型のVP2カプシドとの比が、事前に決定されている、請求項34に記載のAAV。
【請求項４３】
VP2カプシドの3つ以上のAAV血清型が、事前に決定された比でAAV中に存在する、請求項34に記載のAAVカプシド。
【請求項４４】
Repタンパク質が、第1のアデノ随伴ウイルス（AAV）血清型由来であり、AAV中のカプシドタンパク質VP3が、2つ以上の異なるAAV血清型由来であり、該カプシドタンパク質が、Repタンパク質のAAV血清型と異なる2つ以上の異なるAAV血清型由来である、AAV。
【請求項４５】
AAV中の1つのAAV血清型のVP3カプシドと第2のAAV血清型のVP3カプシドとの比が、1：1である、請求項34に記載のAAV。
【請求項４６】
AAV中の1つのAAV血清型のVP3カプシドと第2のAAV血清型のVP3カプシドとの比が、1：1ではない、請求項34に記載のAAV。
【請求項４７】
AAV中の1つのAAV血清型のVP3カプシドと第2のAAV血清型のVP3カプシドとの比が、事前に決定されている、請求項34に記載のAAV。
【請求項４８】
VP3カプシドの3つ以上のAAV血清型が、事前に決定された比でAAV中に存在する、請求項34に記載のAAVカプシド。
【請求項４９】
AAVが、第1のAAV血清型由来のRepタンパク質ならびにRepタンパク質とは異なる第2のAAV血清型由来のカプシドタンパク質VP1、VP2、およびVP3を含有する第1のヘルパープラスミドと、疾患の処置のための遺伝子のコード領域を含有する第2のヘルパープラスミドとを使用して製造される、AAVの製造方法。
【請求項５０】
疾患が、ムコ多糖障害（例えば、スライ症候群［-グルクロニダーゼ］、ハーラー症候群［a-L-イズロニダーゼ］、シャイエ症候群［a-L-イズロニダーゼ］、ハーラー-シャイエ症候群［a-L-イズロニダーゼ］、ハンター症候群［イズロン酸スルファターゼ］、サンフィリッポ症候群A［ヘパランスルファミダーゼ］、B［N-アセチルグルコサミニダーゼ］、C［アセチル-CoA：a-グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ］、D［N-アセチルグルコサミン6-スルファターゼ］、モルキオ症候群A［ガラクトース-6-硫酸スルファターゼ］、B［-ガラクトシダーゼ］、マロトー-ラミー症候群［N-アセチルガラクトサミン-4-スルファターゼ］、その他）、ファブリー病（a-ガラクトシダーゼ）、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、またはグリコーゲン貯蔵障害（例えば、ポンペ病；リソソーム酸性a-グルコシダーゼ）などのリソソーム貯蔵障害より選択される、請求項49に記載の方法。
【請求項５１】
AAVが、第1のAAV血清型由来のRepタンパク質を含有する第1のヘルパープラスミド、Repタンパク質と異なる第2のAAV血清型由来のカプシドタンパク質VP1、VP2、およびVP3を含有する第2のヘルパープラスミド、ならびに疾患の処置のための遺伝子のコード領域を含有する第3のヘルパープラスミドを使用して製造される、AAVの製造方法。
【請求項５２】
疾患が、ムコ多糖障害（例えば、スライ症候群［-グルクロニダーゼ］、ハーラー症候群［a-L-イズロニダーゼ］、シャイエ症候群［a-L-イズロニダーゼ］、ハーラー-シャイエ症候群［a-L-イズロニダーゼ］、ハンター症候群［イズロン酸スルファターゼ］、サンフィリッポ症候群A［ヘパランスルファミダーゼ］、B［N-アセチルグルコサミニダーゼ］、C［アセチル-CoA：a-グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ］、D［N-アセチルグルコサミン6-スルファターゼ］、モルキオ症候群A［ガラクトース-6-硫酸スルファターゼ］、B［-ガラクトシダーゼ］、マロトー-ラミー症候群［N-アセチルガラクトサミン-4-スルファターゼ］、その他）、ファブリー病（a-ガラクトシダーゼ）、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、またはグリコーゲン貯蔵障害（例えば、ポンペ病；リソソーム酸性a-グルコシダーゼ）などのリソソーム貯蔵障害より選択される、請求項52に記載の方法。
【請求項５３】
AAVが、第1のAAV血清型由来のRepタンパク質を含有する第1のヘルパープラスミド、Repタンパク質のAAV血清型とは異なる2つ以上の異なるAAV血清型由来のカプシドタンパク質VP1、VP2、およびVP3を含有する第2のヘルパープラスミド、ならびに疾患の処置のための遺伝子のコード領域を含有する第3のヘルパープラスミドを使用して製造される、AAVの製造方法。
【請求項５４】
疾患が、ムコ多糖障害（例えば、スライ症候群［-グルクロニダーゼ］、ハーラー症候群［a-L-イズロニダーゼ］、シャイエ症候群［a-L-イズロニダーゼ］、ハーラー-シャイエ症候群［a-L-イズロニダーゼ］、ハンター症候群［イズロン酸スルファターゼ］、サンフィリッポ症候群A［ヘパランスルファミダーゼ］、B［N-アセチルグルコサミニダーゼ］、C［アセチル-CoA：a-グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ］、D［N-アセチルグルコサミン6-スルファターゼ］、モルキオ症候群A［ガラクトース-6-硫酸スルファターゼ］、B［-ガラクトシダーゼ］、マロトー-ラミー症候群［N-アセチルガラクトサミン-4-スルファターゼ］、その他）、ファブリー病（a-ガラクトシダーゼ）、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、またはグリコーゲン貯蔵障害（例えば、ポンペ病；リソソーム酸性a-グルコシダーゼ）などのリソソーム貯蔵障害より選択される、請求項51に記載の方法。
【請求項５５】
AAVが、第1のAAV血清型由来のRepタンパク質と、2つ以上の異なるAAV血清型由来であるカプシドタンパク質VP1、VP2、およびVP3とを含有する第1のヘルパープラスミド、ならびに疾患の処置のための遺伝子のコード領域を含有する第2のプラスミドを使用して製造され、さらに、Repタンパク質のAAV血清型が、カプシドタンパク質のAAV血清型のうちの1つと同じである、AAVの製造方法。
【請求項５６】
疾患が、ムコ多糖障害（例えば、スライ症候群［-グルクロニダーゼ］、ハーラー症候群［a-L-イズロニダーゼ］、シャイエ症候群［a-L-イズロニダーゼ］、ハーラー-シャイエ症候群［a-L-イズロニダーゼ］、ハンター症候群［イズロン酸スルファターゼ］、サンフィリッポ症候群A［ヘパランスルファミダーゼ］、B［N-アセチルグルコサミニダーゼ］、C［アセチル-CoA：a-グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ］、D［N-アセチルグルコサミン6-スルファターゼ］、モルキオ症候群A［ガラクトース-6-硫酸スルファターゼ］、B［-ガラクトシダーゼ］、マロトー-ラミー症候群［N-アセチルガラクトサミン-4-スルファターゼ］、その他）、ファブリー病（a-ガラクトシダーゼ）、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、またはグリコーゲン貯蔵障害（例えば、ポンペ病；リソソーム酸性a-グルコシダーゼ）などのリソソーム貯蔵障害より選択される、請求項51に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、35 U.S.C.第119（e）条の下、2017年3月15日に出願された米国仮出願第62/471,762号、2017年6月16日に出願された米国仮出願第62/520,901号、および2018年2月14日に出願された米国仮出願第62/630,558号の恩典を主張し、これらの各出願の全内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
配列表の電子的提出に関する記載
2018年3月15日に作成され、EFS-Webを介して提出された、名称が5470-786WO_ST25.txtでサイズが102,196バイトの、37 C.F.R.第1.821条に従って提出されたASCIIテキスト形式の配列表が、紙の写しの代わりに提供される。これにより、この配列表は、本明細書への参照により本明細書にその開示のために組み入れられる。
【０００３】
発明の分野
本発明は、アデノ随伴ウイルス（AAV）粒子、ビリオン、およびウイルスカプシド由来の修飾カプシドタンパク質、ならびにそれを含む増強のための表面タンパク質と結合したウイルスベクターに関する。特に、本発明は、ウイルスベクター中に組み入れて、形質導入と、低下した抗原性、向性、および／または他の望ましい表現型特徴とを、ウイルスベクターにおいて組み合わせることができる、修飾AAVカプシドタンパク質およびそれを含むカプシドに関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターは100を超える臨床試験で使用され、特に盲および血友病Bの処置に有望な結果を出している。AAVは、非病原性であり、広い組織向性を有し、分裂細胞または非分裂細胞に感染することができる。より重要なことに、AAVベクター形質導入は、前臨床試験および臨床試験で長期の治療的導入遺伝子発現を誘導した。今のところ、遺伝子送達のために単離された12種類の血清型のAAVがある。それらの中で、AAV8は、マウス肝臓のターゲティングのために最良であることが示されている。FIX欠損を有する前臨床動物における幅広い研究により、血友病Bを有する患者においてAAV2およびAAV8を使用する第I/II相臨床試験が実施された。これらの試験からの結果は、非常に有望ではあるが、AAV/FIXの投与を受けた患者からのFIXの発現は、同じベクター投与量／kgを使用しても、動物モデルで達成された発現と比例しなかった。FIXをコードするAAV8粒子1×1011個を使用してFIXノックアウトマウスに全身投与すると、血中で正常レベルの160％のFIXが検出された。しかし、AAV8/FIX粒子2×1011個が投与された場合、霊長類においてはFIXの40％しか達成されず、ヒトにおいてはFIXの1％未満しか見出されなかった。これらの種の間でのAAVベクター形質導入後の一貫しないFIX発現は、異なる種における肝実質細胞の向性の変更が原因であり得る。AAV FIX臨床試験からの別の興味深い知見は、AAV形質導入肝実質細胞を全滅させ、治療の失敗を招くカプシド特異的細胞傷害性Tリンパ球（CTL）応答である。この現象は、AAV送達後の動物モデルにおいては実証されておらず、このことは、前臨床試験と臨床試験との間にまた別の変化があることを示している。はるかに高い用量のAAV/FIXベクターを使用した場合には、AAV2またはAAV8のいずれかを使用した臨床試験の両方においてFIX発現が検出された。しかし、血中FIXレベルは、それぞれ注射の4週間後または9週間後に減少した。さらなる研究により、AAVベクター感染がカプシド特異的CTL応答を誘発し、この応答がAAV形質導入肝実質細胞を除去したようであることが示唆された。したがって、これらの臨床試験からの結果は、ベクターカプシドの負荷を増すことなくAAV形質導入を増強するための効果的なアプローチを探求する必要性を強調している。AAVカプシド抗原を減少させるどのようなベクター改善も、厄介なベクター生産という懸念材料に影響を与え、実現可能な遺伝子治療薬の開発にとって歓迎すべき追加となるであろう。
【０００５】
効率的な複製のためにヘルパーウイルスを必要とする非病原性依存性パルボウイルスであるアデノ随伴ウイルス（AAV）は、その安全性および簡単さのため、遺伝子療法用のウイルスベクターとして利用される。AAVは、広範囲の宿主を有し、分裂細胞および非分裂細胞の両方を形質転換することが可能な細胞型向性を有する。現在までのところ、12種類のAAV血清型および100種類を超えるバリアントが同定されている。異なる血清型カプシドは、組織または培養細胞において異なる感染性を有し、それは、細胞表面の主受容体および共受容体または細胞内輸送経路自体に依存する。AAV2およびAAV3についてのヘパリン硫酸プロテオグリカン（HSPG）、ならびにAAV5についてのN-結合型シアル酸のように、AAVのいくつかの血清型の主受容体は決定されているが、AAV7およびAAV8の主受容体は同定されていない。興味深いことに、培養細胞におけるAAVベクターの形質導入効率が、常に動物での形質導入効率に転換されるわけではない。例えば、AAV8は、マウス肝臓において他の血清型よりもずっと高い導入遺伝子の発現を誘導するが、培養細胞株では誘導しない。
【０００６】
12種類の血清型のうち、いくつかのAAV血清型およびバリアントが臨床試験に使用されている。最初に特徴付けられたカプシドとして、AAV2は、レーバー先天黒内障についてのRPE 65および血友病Bについての第IX因子（FIX）などの遺伝子送達に最も広く使用されている。AAVベクターの適用は安全であることが証明されており、これらの臨床試験で治療効果が達成されているものの、AAVベクターの主な難題のうちの1つは、比較的膨大な数のウイルスゲノムを必要とする、その低感染性である。AAV8ベクターは、血友病Bの患者におけるいくつかの臨床試験で使用されている別のベクターである。AAV8/FIX肝臓標的指向型送達からの結果により、マウス、非ヒト霊長類およびヒトの間で導入遺伝子の発現にはっきりした種差があることが実証された。FIX遺伝子を有するAAV8 1010vgは、FIXノックアウトマウスにおいて生理レベルを上回るFIX発現（＞100％）に達することができたが、高用量（2×1012vg/kg体重）だけがヒトにおいて検出可能なFIX発現を誘導することができた。上記のこれらの結果に基づき、AAVの形質導入を増強するための効果的な戦略の開発が、依然として必要である。
【０００７】
大部分の人々はAAVに自然に曝露されている。結果として、集団の大部分は、血液および他の体液中にAAVに対する中和抗体（Nab）を生じている。Nabの存在は、将来的な臨床試験におけるAAVのより広い適用にとって別の大きな難題を提起する。AAVの形質導入を増強するまたはNab活性を回避するために、多くのアプローチ、特に合理的設計および定向進化に基づくAAVカプシドの遺伝子修飾が探究されている。いくつかのAAV変異体が、インビトロまたは動物モデルにおいてNabを回避する能力と共に高い形質導入を実証しているものの、カプシド組成の修飾は、親AAVの細胞向性を変更する能力を提供する。
【０００８】
本発明は、組み合わされた望ましい特徴を有するAAVベクターの、当技術分野における必要性に取り組むものである。
【発明の概要】
【０００９】
一局面では、本発明は、アデノ随伴ウイルス（AAV）粒子の表面に結合したタンパク質が、（a）フィブリノーゲンアルファ鎖；（b）フィブリノーゲンベータ鎖；（c）フィブリノーゲンガンマ鎖；（d）フィブロネクチン；（e）プラスミノーゲン；（f）フォンウィルブランド因子；（g）アルファ-1-酸性糖タンパク質；（h）血小板第4因子；（i）クリオプレシピテート；（j）第VIII因子；（k）第XIII因子；（l）アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン、またはイヌ、ウマ、ウシ、ブタなどの任意の他の種由来のアルブミン）；（m）アポリポタンパク質B（ApoB）、（n）アポリポタンパク質E（ApoE）；（o）トランスフェリン；（p）低密度リポタンパク質；（q）免疫グロブリン；（r）細胞表面のAAVの結合を増加および／またはAAV細胞内輸送を増強する任意の他の血清タンパク質および融合血清タンパク質；ならびに（s）上記（a）〜（r）の任意の組み合わせからなる群より選択される表面結合タンパク質を含む、AAV粒子を提供する。
【００１０】
本発明者らの以前の研究は、異なるAAV血清型（AAV1〜AAV5）由来のカプシドが、ハプロイドAAVカプシドを組み立てるために適合し、単離された大部分のAAVモノクローナル抗体が、異なるAAVサブユニットに位置するいくつかの部位を認識したことを示した。追加的に、キメラAAVカプシドからの研究により、主受容体についてのドメインまたは他の血清型由来の組織特異的ドメインの導入で、より高い形質導入を達成できることが実証された。AAV2カプシド中へのAAV9グリカン受容体の導入は、AAV2の形質導入を増強する。AAV6からの100アミノ酸（aa）ドメインをAAV2カプシド中に置換することは、筋肉向性を増加させる。本発明者らは、2つ以上のAAV血清型由来のカプシドから構成されるポリプロイド性AAVベクターが、親由来の向性を排除せずに、より高い形質導入のために個別の血清型を利用できる場合があろうと推定した。そのうえ、大部分のNabは立体構造エピトープを認識し、ポリプロイド性ビリオンはその表面構造を変えている場合があるので、これらのポリプロイド性ウイルスは、Nabによる中和を回避する能力を有し得る。
【００１１】
AAV2およびAAV8が臨床応用に使用されている。本研究において、本発明者らはまず、インビトロおよびインビボ形質導入効率ならびにNab回避能について、AAV2およびAAV8由来のハプロイドAAVウイルスを特徴付けた。本発明者らは、ハプロイドベクターのウイルス収量は損なわれず、ヘパリン結合プロファイルがAAV2カプシドサブユニットタンパク質の組み入れに関係したことを見出した。ハプロイドベクターAAV2/8は、マウス筋肉および肝臓においてより高い形質導入を開始した。FIX欠損マウスモデルに適用した場合、AAV8群と比較してハプロイドベクター処置マウスにおいて高いFIX発現および改善した出血表現型補正が観察された。重要なことに、ハプロイドウイルスAAV2/8は、A20に対して低い結合親和性を有し、抗AAV2血清からの中和を回避することができた。次のハプロイドウイルスAAV2/8/9は、3つの血清型（AAV2、8および9）のカプシドからできていた。親血清型で免疫処置された血清に対するハプロイドAAV2/8/9の中和抗体回避能は、顕著に改善したことが実証された。
【００１２】
したがって、一態様では、本発明は、アデノ随伴ウイルス（AAV）カプシドが、カプシドタンパク質VP1およびカプシドタンパク質VP3を任意の組み合わせで含み、カプシドタンパク質VP1が、1つまたは1つよりも多い第1のAAV血清型由来であり、カプシドタンパク質VP3が、1つまたは1つよりも多い第2のAAV血清型由来であり、第1のAAV血清型のうちの少なくとも1つが、第2のAAV血清型のうちの少なくとも1つと異なる、AAVカプシドを提供する。
【００１３】
いくつかの態様では、本発明のカプシドは、カプシドタンパク質VP2を任意の組み合わせで含み、カプシドタンパク質VP2は、1つまたは1つよりも多い第3のAAV血清型由来であり、1つまたは1つよりも多い第3のAAV血清型のうちの少なくとも1つが、第1のAAV血清型および／または第2のAAV血清型と異なる。
【００１４】
いくつかの態様では、本発明のカプシドは、カプシドタンパク質VP1.5を任意の組み合わせで含み、カプシドタンパク質VP1.5は、1つまたは1つよりも多い第4のAAV血清型由来であり、1つまたは1つよりも多い第4のAAV血清型のうちの少なくとも1つは、第1のAAV血清型および／または第2のAAV血清型と異なる。いくつかの態様では、本明細書に記載のAAVカプシドタンパク質は、カプシドタンパク質VP2を含むことができる。
【００１５】
本発明は、また、AAVカプシドが、カプシドタンパク質VP1およびカプシドタンパク質VP2を任意の組み合わせで含み、カプシドタンパク質VP1が、1つまたは1つよりも多い第1のAAV血清型由来であり、カプシドタンパク質VP2が、1つまたは1つよりも多い第2のAAV血清型由来であり、第1のAAV血清型のうちの少なくとも1つが、第2のAAV血清型のうちの少なくとも1つと異なる、AAVカプシドを提供する。
【００１６】
いくつかの態様では、カプシドは、カプシドタンパク質VP3を任意の組み合わせで含み、カプシドタンパク質VP3は、1つまたは1つよりも多い第3のAAV血清型由来であり、1つまたは1つよりも多い第3のAAV血清型のうちの少なくとも1つが、第1のAAV血清型および／または第2のAAV血清型と異なる。いくつかの態様では、本明細書に記載のAAVカプシドは、カプシドタンパク質VP1.5を含むことができる。
【００１７】
本発明は、アデノ随伴ウイルス（AAV）カプシドが、カプシドタンパク質VP1およびカプシドタンパク質VP1.5を任意の組み合わせで含み、カプシドタンパク質VP1が、1つまたは1つよりも多い第1のAAV血清型由来であり、カプシドタンパク質VP1.5が、1つまたは1つよりも多い第2のAAV血清型由来であり、第1のAAV血清型のうちの少なくとも1つが、第2のAAV血清型のうちの少なくとも1つと異なる、AAVカプシドをさらに提供する。
【００１８】
追加的な態様では、本発明は、（a）本発明のAAVカプシドと（b）少なくとも1つの末端反復配列を含み、AAVカプシドにより包まれた核酸とを含むウイルスベクターを提供する。ウイルスベクターは、AAV粒子であることができ、本発明のカプシドタンパク質、カプシド、ウイルスベクター、および／またはAAV粒子は、薬学的に許容される担体をさらに含む組成物中に存在することができる。
【００１９】
任意の前記請求項記載のAAVカプシドを含むAAV粒子を作製する方法であって、（a）AAV粒子を組み立てるために必要な全ての機能および遺伝子を一緒に提供する1種もしくは複数種のプラスミドを宿主細胞にトランスフェクトする工程；（b）1種もしくは複数種の核酸構築物をパッケージング細胞株もしくはプロデューサー細胞株に導入して、AAV粒子を組み立てるために必要な全ての機能および遺伝子を一緒に提供する工程；（c）AAV粒子を組み立てるために必要な全ての機能および遺伝子を一緒に提供する1種もしくは複数種の組み換えバキュロウイルスベクターを宿主細胞に導入する工程；ならびに／または（d）AAV粒子を組み立てるために必要な全ての機能および遺伝子を一緒に提供する1種または複数種の組み換えヘルペスウイルスベクターを宿主細胞に導入する工程
を含む方法が、本明細書にさらに提供される。
【００２０】
さらなる態様では、本発明は、核酸を細胞に投与する方法であって、細胞を本発明のウイルスベクターおよび／または本発明の組成物と接触させる工程を含む方法を提供する。
【００２１】
核酸を対象に送達する方法であって、対象に本発明のウイルスベクターおよび／または組成物を投与する工程を含む方法もまた、本明細書に提供される。
【００２２】
追加的に、障害または疾患の有益な処置における医薬として使用するための、本発明のカプシドタンパク質、カプシド、ウイルスベクター、AAV粒子、および／または組成物が、本明細書に提供される。
【００２３】
本発明のこれらおよび他の局面は、後述の本発明の説明に、より詳細に扱われる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】AAV形質導入に対する血清の増強効果。（a）ヒト血清は、異なる血清型由来のAAVの形質導入を増強する。AAV/lucベクターの粒子1×108個を1：500希釈血清またはPBSと共に4℃で2時間インキュベートした。AAVベクターと血清との混合物を使用して、MOIが5のアデノウイルスdl309の存在下で48ウェルプレート中のHuh7細胞1×105個に形質導入した。24時間後、細胞溶解物からのルシフェラーゼ活性を分析した。血清のインキュベーションからの導入遺伝子の発現の増加倍率をPBSとの比較により計算した。
【図１Ｂ】AAV形質導入に対する血清の増強効果。（b）ヒト血清とのAAVのインキュベーション時間が形質導入増強に及ぼす効果。AAV8/luc粒子1×108個をad dl309の存在下で1：100希釈ヒト血清またはPBSと共に4℃で異なる時間インキュベートした。24時間後に、細胞溶解物からルシフェラーゼの発現を測定した。
【図１Ｃ】AAV形質導入に対する血清の増強効果。（c）全身投与後のAAV形質導入増強。AAV8/luc粒子1×1010個を異なる希釈のヒト血清と共に4℃で2時間インキュベートした。この混合物を後眼窩注射により成雌性C57BLマウスに投与した。AAV注射後3日目に5分間イメージングを行った。上欄：ルシフェラーゼ導入遺伝子の発現プロファイルの代表的な生きた動物の生物発光イメージ。下欄：全身投与後のマウス6匹からのAAV形質導入増強についてのルシフェラーゼの導入遺伝子の発現の定量。
【図１Ｄ】AAV形質導入に対する血清の増強効果。（d）筋肉注射後のAAV形質導入増強。（c）からのAAV8/lucとヒト血清との混合物を、PBS 200ul中に粒子1×109個となるように希釈し、マウス後肢筋肉内に注射した。注射の2週間後に、イメージングを5分間取得した。仰臥：左後肢-AAV8＋ヒト血清、右後肢-AAV8＋PBS。上欄：代表的なイメージング。下：筋肉注射後のマウス6匹からのAAV形質導入増強のデータ。PBS処理AAVからの形質導入に対する、HSAとインキュベートしたAAVからの形質導入により、形質導入の増加倍率を計算した。
【図２Ａ】AAV8形質導入に対するヒトアルブミンの効果。（a）形質導入の増強は、AAVと血清との直接相互作用に関係する。AAV8/lucウイルスを1：100希釈のヒト血清またはPBSと共に4℃で2時間インキュベートし、次に、PBSと予備インキュベートしたAAV8の添加の直前に、この混合物を使用して、FBSを有する培地、無血清培地、または無血清培地＋ヒト血清のいずれかの中でHuh7細胞に形質導入した。24時間後、導入遺伝子発現の増加倍率を計算した。
【図２Ｂ】AAV8形質導入に対するヒトアルブミンの効果。（b）AAV8とヒトアルブミンとの相互作用。AAV8/luc粒子1×1010個をヒト血清またはPBSと共に4℃で2時間インキュベートし、次に、ウイルスとヒト血清またはPBSとの混合物をプレ-Ig結合カラムに適用した。洗浄後、カラム結合性タンパク質をAAV8ゲノムのコピー数の分析のために溶離した。
【図２Ｃ】AAV8形質導入に対するヒトアルブミンの効果。（c）アルブミン枯渇血清を用いたAAV8の形質導入。AAV8/luc粒子1×108個を異なる希釈のヒト血清もしくはアルブミン枯渇血清またはPBSと共に4℃で2時間インキュベートした。次に、この混合物を使用して、無血清培地中のHuh7細胞に感染させた。2日後、細胞溶解物からルシフェラーゼを検出し、導入遺伝子の発現の増加倍率をPBSと比較しながら計算した。
【図２Ｄ】AAV8形質導入に対するヒトアルブミンの効果。（d）組み換えヒトアルブミンはAAV8の形質導入を増強する。AAV8/lucを異なる希釈の組み換えヒトアルブミン（50mg/ml）もしくはヒト血清またはPBSと共にインキュベートした。48時間後に導入遺伝子の発現を検出し、導入遺伝子の発現の増加倍率をPBSと比較して計算した。
【図３】AAV8の形質導入に対する臨床等級ヒトアルブミンの効果。（a）Huh7細胞における臨床等級HSAからのAAV8の形質導入増強。AAV8/luc粒子1×108個を5％ HSAまたは異なる希釈のヒト血清またはPBSと共に4℃で2時間インキュベートした。次に、この混合物を使用してHuh7細胞に形質導入し、48時間後、ルシフェラーゼの発現をアッセイした。（b）全身投与後の臨床等級HSAからのAAV8の形質導入増強。AAV8/luc粒子1×1010個を異なる希釈の25％ HSAと共にインキュベートし、次に、後眼窩を介して成雌性C57BLマウスに注射した。7日目にイメージングを取得した。上欄：代表的な動物イメージ。下欄：全身投与後のマウス6匹からのAAVの形質導入増強のデータ。（c）筋肉注射後の臨床等級HSAからのAAVの形質導入増強。AAV8/luc粒子1×109個を異なる希釈の25％ HSAと共にインキュベートし、次に、C57BLマウスにおける筋肉に注射した。1週間後に、イメージングを行った。上欄：代表的な動物イメージ。下：筋肉注射後のマウス6または7匹からのAAVの形質導入増強のデータ。
【図４】ウイルスの凍結前または解凍後のHSAと一緒のAAVベクターのインキュベーションは、類似した増強効果を有する。（a）Huh7細胞における形質導入増強。ウイルスの凍結前、またはウイルスの解凍後に、AAV/luc粒子1×108個を異なる希釈の臨床等級HSAと共に4℃で2時間インキュベートし、次にHuh7細胞に添加した。48時間後、細胞溶解物中のルシフェラーゼ活性を測定した。（b）および（c）筋肉の形質導入増強。AAV8/luc粒子1×109個をマウスの筋肉内に直接注射した。注射の7日後に、マウスのイメージング（b）を実施し（左欄）、導入遺伝子の発現の増加倍率（c）を計算した（右欄、n=6）。仰臥：左後肢-HSA、右後肢-PBS。
【図５】透析前にウイルス調製物にHSAを添加しても、形質導入の増強は損なわれない。CsClまたはカラムのいずれかから精製したAAV8/lucウイルスを、25％ HASのうちの1％と混合し、次に、PBSに対する透析のために適用した。透析後、AAVウイルスを凍結し；2日後にインビボ形質導入アッセイを行った。肝臓の形質導入のために、AAV/luc粒子1×1010個を、後眼窩注射を介して投与し；マウス5匹についてAAV注射後3日目にイメージングを取得した（a）。筋肉の形質導入のために、AAV/luc粒子1×109個を使用し；マウス4匹について注射後7日目にイメージングを行った（a）。仰臥：左後肢-HSA、右後肢-PBS。イメージングの定量（b）も行った。
【図６Ａ】ヒトアルブミンは、AAV結合能を増加させる。（a）HSAは、Huh7細胞とのAAVウイルスの結合を増加させる。AAVウイルスをHSAと共に4℃で2時間インキュベートし、次にHuh7細胞1×106個に4℃で5または15分間添加した。5回洗浄後、q-PCRによるAAVゲノムのコピー数分析のために全DNAを抽出した。（b）肝臓形質導入のイメージング。AAV8/luc粒子1×1011個を後眼窩静脈を介してマウス内に投与した。24時間後、イメージングを実施し、イメージングの定量を計算した（c）。48時間後、マウスを安楽死させ、肝臓組織を回収し；肝臓組織溶解物中のルシフェラーゼ活性を測定し（d）、AAVゲノムのコピー数を分析した（e）。最初の24時間の間、AAV注射後15分、2時間、および24時間目に血液から血漿を収集し、AAVゲノムのコピー数を分析した（f）。データは、マウス4匹の平均および標準偏差を表した。（*）は、HSA処置を受けた肝臓におけるAAVゲノムのコピー数を、PBS処置を受けた肝臓と比較したときに、p＜0.05で統計的に有意差があることを示す。
【図６Ｂ】図6Aの説明を参照のこと。
【図６Ｃ】図6Aの説明を参照のこと。
【図６Ｄ】図6Aの説明を参照のこと。
【図６Ｅ】図6Aの説明を参照のこと。
【図６Ｆ】図6Aの説明を参照のこと。
【図７】ヒトアルブミンとAAVとの相互作用は、Nab活性をブロックしない。AAV8/lucベクターを最初にヒトアルブミンと共に4℃で2時間インキュベートし、次に異なる希釈のヒトIVIGを4℃でさらに2時間添加した。この混合物をHuh7細胞に添加した。48時間目に、細胞溶解物からの導入遺伝子の発現を測定し、Nabの力価を計算した。（a）Nab活性に対するヒトアルブミンとAAVビリオンとの相互作用の効果。（b）AAV形質導入のヒトアルブミン増強に対するIVIGの効果。
【図８】ヒトアルブミンとインキュベートされたAAVベクターを使用した血友病Bの表現型補正の改善。AAV8/FIX-optベクター粒子2×109個をヒトHSAまたはPBSと共に4℃で2時間インキュベートし、次に、尾静脈注射によりAAVベクターを成雄性FIX欠損マウスに投与した。AAVの注射後、FIX発現（a）および機能アッセイ（b）のために表示の時点で血液を収集した。AAV注射後6週目に、インビボ出血アッセイ（c）のためにマウスを適用した。（*）は、HSA処置マウスとPBSマウスとの間の失血にp＜0.05で統計的な有意差があることを示す。データは、マウス6〜8匹の平均および標準偏差に基づく。
【図９Ａ】マウス血清はAAV8のインビボ形質導入を増強する。（a）全身投与後のAAVの形質導入増強。AAV8/luc粒子1×1010個を異なる希釈のマウス血清と共に4℃で2時間インキュベートした。後眼窩注射を介してこの混合物をC57BLマウスに投与した。AAV注射後3日目にイメージングを5分間実施した。（b）筋肉注射後のAAVの形質導入増強。マウス血清と共にインキュベートされたAAV8粒子1×109個をマウス後肢筋肉内に注射した。注射後2週目に、イメージングを5分間取得した。仰臥：左後肢-AAV8＋ヒト血清、右後肢-AAV8＋PBS。PBS処置したAAVからの形質導入に対する、HSAとインキュベートしたAAVからの形質導入により、形質導入の増加倍率を計算した。上欄：代表的なイメージング。下：マウス3または4匹からのAAVの形質導入増強のデータ。
【図９Ｂ】図9Aの説明を参照のこと。
【図１０】イヌおよび霊長類からの血清は、Huh7細胞におけるAAVの形質導入を増強する。AAV/lucベクター粒子1×108個をイヌ6匹（a）、もしくは霊長類23匹（b）、もしくはウシ胎児（c）からの1：500希釈血清、またはPBSと共に4℃で2時間インキュベートした。AAVベクターと血清との混合物を適用して、アデノウイルスdl309の存在下でHuh7細胞に形質導入した。24時間後、細胞溶解物からのルシフェラーゼ活性を分析した。血清インキュベーションからの導入遺伝子の発現の増加倍率をPBSとの比較により計算した。
【図１１】アルブミン枯渇血清中のヒトアルブミン濃度。
【図１２Ａ】rHSAはAAV8のインビボ形質導入を増強する。（a）全身投与後のrHSAからのAAV8の形質導入増強。rHSAと共に予備インキュベートしたAAV8粒子1×1010個を、後眼窩注射を介してC57BLマウスに投与した。注射後3日目にイメージを取得した。（b）筋肉注射後のrHSAからのAAVの形質導入増強。rHSAと共にインキュベートしたAAV8/luc粒子1×109個を後肢筋肉内に注射した。注射後2週間目にイメージングを実施した。上欄：代表的なイメージング。下：マウス3または4匹からのAAV形質導入増強のデータ。
【図１２Ｂ】図12Aの説明を参照のこと。
【図１３】臨床等級HSAを用いたAAV形質導入の長期増強。AAV8の筋肉投与後、表示の時点でイメージングを行った。左欄：代表的なイメージング。右欄：筋肉注射後のマウス3または4匹からのAAVの形質導入増強のデータ。
【図１４Ａ】他の血清型由来のAAVの形質導入に及ぼす臨床等級のヒトアルブミンの効果。（a）HSAは、Huh7細胞におけるAAV2の形質導入を増強する。AAV2/luc粒子1×108個を異なる希釈のヒト血清または5％臨床等級HSAと共に4℃で2時間インキュベートし、次にHuh7に添加した。48時間後、細胞溶解物中のルシフェラーゼ活性を検出した。
【図１４Ｂ】他の血清型由来のAAVの形質導入に及ぼす臨床等級のヒトアルブミンの効果。（b）HSAは、Huh7細胞におけるAAV9の形質導入を増強する。
【図１４Ｃ】他の血清型由来のAAVの形質導入に及ぼす臨床等級のヒトアルブミンの効果。（c）および（d）HSAは、C57BLマウスにおけるAAV2およびAAV9からの肝臓または筋肉形質導入を増強する。AAVの形質導入からのイメージング（c）およびイメージングの定量（d）。肝臓の形質導入について、1倍のHSAと共にインキュベートしたAAV/luc粒子1×1010個を、後眼窩注射を介して投与し（n=4）、AAV注射後の7日目（AAV2）または3日目（AAV9）にイメージングを取得した。筋肉形質導入のために、1倍のHSAと共にインキュベートしたAAV/luc粒子1×109個を使用し（n=3）；注射後7日目にイメージングを行った。
【図１４Ｄ】図14Cの説明を参照のこと。
【図１５】AAVのインビトロ形質導入に対するLDLおよびトランスフェリンの効果。細胞1個あたりAAV8/lucベクター粒子10000個を正常生理的血漿濃度の異なる希釈でLDLまたはトランスフェリンと共に4℃で2時間インキュベートし、次に48ウェルプレート中のHuh7細胞（A）または293T細胞（B）に添加した。48時間後、細胞を溶解させ、上清をルシフェラーゼ活性分析のために回収した。データは、3つの独立した実験からの平均および標準偏差を表す。
【図１６】LDLおよびトランスフェリンに対する受容体をブロックすることは、マウスにおけるAAV8の形質導入に影響する。後眼窩静脈を介してマウスにLDL 0.5mgまたはラクトフェリン1mgを注射し、5分後に、AAV8/lucベクター粒子1×1010個を全身投与した。AAV注射後1週間目に、マウスのイメージングを取得し（A）、肝臓における導入遺伝子の発現を計算した（B）。データは、マウス5匹の平均および標準偏差を表したものである。
【図１７Ａ】AAV8の肝臓形質導入に対する異なる用量のLDLまたはトランスフェリンの効果。AAV8/luc粒子1×1010個を正常生理的血漿濃度の異なる希釈でLDLまたはトランスフェリンと共に4℃で2時間インキュベートし、次に後眼窩注射を介してC57BLマウスに投与した。AAV注射後3日目にマウスをイメージングし（AおよびC）、肝臓における導入遺伝子ルシフェラーゼの発現を定量した（BおよびD）。データは、マウス5匹からの平均および標準偏差を表したものである。
【図１７Ｂ】図17Aの説明を参照のこと。
【図１７Ｃ】図17Aの説明を参照のこと。
【図１７Ｄ】図17Aの説明を参照のこと。
【図１８】LDLおよびトランスフェリンはAAVの結合能を増加させる。AAVウイルスを血清タンパク質と共に4℃で1時間インキュベートし、次にHuh7細胞または293T細胞1×106個に4℃で2時間添加した。5回洗浄後、q-PCRによるAAVゲノムのコピー数分析のために全DNAを抽出した。
【図１９】LDLまたはトランスフェリンと共にインキュベートしたAAV8の全身投与後の血中AAVベクターのクリアランス動態。AAV8/luc粒子1×1011個をLDL 500ugまたはトランスフェリン1mgと共に4℃で1時間インキュベートし、次に後眼窩注射を介してC57BLマウスに投与した。AAVの注射後2日目に、マウスをイメージングし（A）、肝臓における導入遺伝子ルシフェラーゼの発現の定量を行った（B）。表示の時点で、マウス血漿を回収し、AAVゲノムのコピー数を定量PCRにより検出した（C）。データはマウス5匹の平均および標準偏差を表したものである。
【図２０】AAV8ベクターの体内分布に対するLDLまたはトランスフェリンの効果。図5からのマウスをAAV投与後5日目に屠殺し、インビトロのルシフェラーゼ活性アッセイ（A）およびゲノムのコピー数分析（B）のために組織を回収した。
【図２１】AAVのインビトロ形質導入に対する血清タンパク質の組み合わせの効果。細胞1個あたりAAV8/lucベクター粒子10000個を、2種のタンパク質または3種のタンパク質のいずれかを有するLDLまたはトランスフェリンまたはアルブミンの組み合わせと共に4℃で2時間インキュベートし、次に293T細胞またはHuh7細胞に適用した。48時間後、細胞溶解物からの上清をルシフェラーゼ活性のために分析した。データは、3つの独立した実験の平均および標準偏差を表したものである。
【図２２】マウスにおけるAAVの肝臓形質導入に対する血清タンパク質の組み合わせの効果。AAV8/luc粒子1×1010個を、生理的濃度の100倍希釈の個別の血清タンパク質と共に、または3種のタンパク質全て（LDL、トランスフェリンおよびアルブミン）と一緒に、4℃で2時間インキュベートし、次にマウスに注射した。AAV注射後3日目および7日目に、イメージングを実施し（A）、肝臓の導入遺伝子発現を分析した（B）。結果は、マウス5匹からの平均および標準偏差を表したものである。
【図２３】AAV8ビリオンに対する血清タンパク質の競合結合分析。アルブミンの競合アッセイ（A）のために、AAV8/lucベクター粒子1×1010個を異なる希釈のアルブミンおよび100倍希釈のLDL、トランスフェリン、またはApoBと共に4℃で1時間インキュベートした。次に、免疫沈降のためにApoBおよびトランスフェリンに対する特異的抗体を対応するチューブに添加した。プルダウン後、定量PCRによりウイルス力価を決定した。ブロッキングアッセイ（B）のために、AAV8/lucベクターを異なる希釈のアルブミンと共に4℃で30分間インキュベートし、次に100倍希釈のLDL、またはトランスフェリン、またはApoBをさらに1時間添加した。プルダウン後、ウイルス力価を決定した。結果は、3つの個別の実験の平均および標準偏差を表したものである。
【図２４】フィブリノーゲンはAAV9の形質導入を増加させる。AAV9/luc粒子1×1010個をフィブリノーゲン3mgと共に4℃で2時間インキュベートし、次に後眼窩静脈を介してC57BLマウスに注射した。AAV注射後7日目に、マウスをイメージングし（A）、肝臓における導入遺伝子ルシフェラーゼの発現を定量した（B）。データは、マウス4匹の平均および標準偏差を表したものである。
【図２５】フィブリノーゲンと共にインキュベートしたAAV9の全身投与後のAAVベクターの体内分布。図1からのマウスをAAV投与後10日目に屠殺し、インビトロのルシフェラーゼ活性アッセイ（A）およびゲノムのコピー数分析（B）のために組織を回収した。
【図２６】AAV9の形質導入に対するフィブリノーゲン用量の効果。AAV9/luc粒子1×1010個を異なる希釈のフィブリノーゲンと共に4℃で2時間インキュベートし、次に後眼窩注射を介してC57BLマウスに投与した。AAVの注射後5日目に、マウスをイメージングし（A）、肝臓における導入遺伝子ルシフェラーゼの発現を定量した（B）。データはマウス4匹の平均および標準偏差を表したものである。
【図２７Ａ】フィブリノーゲンと共にインキュベートしたAAV9の全身投与後のAAVベクターの血中クリアランス動態。AAV9/luc粒子2×1011個をフィブリノーゲン1mgと共に4℃で2時間インキュベートし、次に後眼窩注射を介してC57BLマウスに投与した。AAV注射後2日目に、マウスのイメージングを行い（A）、肝臓における導入遺伝子ルシフェラーゼの発現の定量を実施した（B）。表示の時点で、マウスの血漿を回収し、定量PCRによりAAVゲノムのコピー数を検出した（C）。データはマウス4匹の平均および標準偏差を表したものである。
【図２７Ｂ】図27Aの説明を参照のこと。
【図２７Ｃ】図27Aの説明を参照のこと。
【図２８】他の血清タンパク質は、AAV9の肝臓形質導入を増強する。AAV9/luc粒子1×1010個を生理的濃度の用量の異なるタンパク質と共に4℃で2時間インキュベートし、次に後眼窩静脈を介してC57BLマウスに注射した。AAV注射後の3日目に、マウスのイメージングを行い（A）、肝臓における導入遺伝子ルシフェラーゼの発現を定量した（B）。データはマウス5匹の平均および標準偏差を表したものである。
【図２９Ａ】他の血清タンパク質は、AAV9の脳形質導入を増強する。図28からのマウスをAAV投与後7日目にイメージングし（A）、肝臓（B）および脳（C）における導入遺伝子ルシフェラーゼの発現を定量した。イメージング後、マウスを屠殺した。AAVゲノムのコピー数を肝臓（D）および脳（E）において検出した。
【図２９Ｂ】図29Aの説明を参照のこと。
【図２９Ｃ】図29Aの説明を参照のこと。
【図３０】AAV9の形質導入に対する生理的血中濃度の異なる希釈の他の血清タンパク質の効果。AAV9/luc粒子1×1010個を異なる希釈の他の血清タンパク質と共に4℃で2時間インキュベートし、次に後眼窩注射を介してC57BLマウスに投与した。AAV注射後3日目に、マウスをイメージングし（A）、肝臓における導入遺伝子ルシフェラーゼの発現を定量した（B）。データは、マウス5匹からの平均および標準偏差を表したものである。
【図３１】クリオプレシピテートとの相互作用によるAAV9の形質導入の増強。AAV9/luc粒子1×1010個を異なる希釈のクリオプレシピテートと共に4℃で2時間インキュベートし、次にC57BLマウスに全身投与した。AAV注射後3日目に、マウスをイメージングし（A）、肝臓における導入遺伝子ルシフェラーゼの発現を定量した（B）。データは、マウス5匹の平均および標準偏差を表したものである。
【図３２】中和抗体A20の阻害活性に対するアルブミンとAAVビリオンとの相互作用の効果。
【図３３】HSA/AAV複合体の安定性。（A）異なる濃度のNaCl中の複合体の安定性。（B）異なるpHにおける複合体の安定性。
【図３４】AAV2の形質導入に対するAs2O3およびプロテアソーム阻害剤の効果。Balb/CマウスにAAV2/luc粒子1×1011個およびAs2O3 5mg/kgを5日間（A）、またはボルテゾミブ0.5mg/kg、カルフィルゾミブ1mg/kgを同時に（B）施した。AAV注射後7日目にライブイメージングにより形質導入をアッセイした。
【図３５Ａ】HSAはAAVの形質導入を増強する。（A）質量分析の結果。
【図３５Ｂ】HSAはAAVの形質導入を増強する。（B）AAV2とヒトアルブミンとの相互作用。
【図３５Ｃ】HSAはAAVの形質導入を増強する。（C）アルブミン枯渇血清により減少したAAVの形質導入。
【図３５Ｄ】HSAはAAVの形質導入を増強する。（D）組み換えヒトアルブミンはHuh7細胞におけるAAV2の形質導入を増強する。
【図３５Ｅ】HSAはAAVの形質導入を増強する。（E）Huh7細胞におけるrHSAからのAAV8の形質導入増強。
【図３５Ｆ】HSAはAAVの形質導入を増強する。（F）全身投与後のrHSAからの肝臓AAV8形質導入増強。上欄：イメージング。下欄：全身注射後のAAVの形質導入増強のデータ。
【図３５Ｇ】HSAはAAVの形質導入を増強する。（G）筋肉注射後のrHSAからのAAV8の形質導入増強。上欄：イメージング。仰臥：左後肢-rHSA、右後肢-PBS。下欄：筋肉注射後のAAV形質導入増強のデータ。
【図３６Ａ】AAVOVAの形質導入後のカプシド抗原提示はインビボで用量応答性である。様々な用量のAAV2OVA/AATベクターをC57BL/6マウスに静脈内注射し、3日後、CFSE標識OT-1 T細胞を移植した。移植後10日目に、脾臓におけるOT-1 T細胞の増殖をフローサイトメトリーにより判断した。（A）代表的なフローサイトメトリーのヒストグラム。（B）マウス4匹の平均T細胞増殖および標準偏差。（C）平均増殖指数（PI）および標準偏差。AAV処置を受けていない対照マウスと比較して**p＜0.01、*p＜0.05。
【図３６Ｂ】図36Aの説明を参照のこと。
【図３６Ｃ】図36Aの説明を参照のこと。
【図３７】マウスにおけるAAV8OVA形質導入後のカプシド抗原提示の動態。AAVOVA/AATウイルス粒子（1×1011個）をC57BL/6マウスに静脈内注射し、表示の時点で、CFSE標識OT-1 T細胞5×106個を移植した。移植後10日目に、CD8+ OT-1 T細胞の増殖をフローサイトメトリーにより測定した。（A）マウス4匹についての平均T細胞増殖および標準偏差。（B）平均増殖指数（PI）および標準偏差。AAV処置を受けていない対照マウスと比較して**p＜0.01、*p＜0.05。
【図３８】VIPRによるOVAエピトープの提示の阻害。
【図３９】IVIG存在下でマウス肝臓から単離された変異体。
【図４０】Nab活性に及ぼすペプチドの阻害。予め決定された希釈のA20、およびAAV2で免疫処置されたC57/BLまたはBalb/Cマウスからの血漿をペプチドとインキュベーションすることによりNAbアッセイを行い、次にAAV2/GFPベクターと共にインキュベートした。RC32細胞に形質導入後、細胞を回収し、フローサイトメトリー分析のために適用した。
【図４１】AAV8の肝臓形質導入に対するヒトIVIGの効果。AAV8/lucベクター粒子1×1010個を異なる濃度のIVIGまたはPBSと共にインキュベートし、次に後眼窩注射を介してC57BL/6マウスに投与した。1週間後に、イメージングを行い、肝臓領域におけるルシフェラーゼ発現について分析した。（a）マウス（n=4）からのルシフェラーゼ発現のイメージング。（b）ヒトIVIGを使用するAAV8の全身形質導入の阻害。データは、マウス4匹からの平均および標準偏差を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明は、本発明の代表的な態様が示される添付の図面を参照して、ここに記載される。しかし、本発明は、異なる形態で具体化される場合があり、本明細書に示される態様に限定されると見なされるべきではない。これらの態様はむしろ、本開示が十分かつ完全であり、本発明の範囲を当業者に完全に伝達するように、提供される。
【００２６】
特に定義しないかぎり、本明細書に使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書における発明の説明に使用される専門用語は、特定の態様だけを記載することを目的としており、本発明を限定することを意図しない。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、アクセッション番号、および他の参照は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００２７】
本発明の明細書および添付の特許請求の範囲におけるAAVカプシドタンパク質の全てのアミノ酸の位置の呼称は、VP1カプシドサブユニットの付番（ネイティブなAAV2 VP1カプシドタンパク質：GenBankアクセッション番号AAC03780またはYP680426）に関するものである。本明細書に記載される修飾が、AAV cap遺伝子内に挿入されたならば、VP1、VP2、および／またはVP3カプシドサブユニットに修飾を生じ得ることが当業者により理解されるであろう。あるいは、カプシドサブユニットを独立して発現させて、カプシドサブユニット（VP1、VP2、VP3、VP1+VP2、VP1+VP3、またはVP2+VP3）のうちの1または2つだけに修飾を達成することができる。
【００２８】
定義
本明細書および添付の特許請求の範囲に以下の用語が使用される。
【００２９】
文脈が明らかに他のことを指し示さないかぎり、単数形（a, an, the）は、複数形も含むことが意図される。
【００３０】
さらに、本明細書に使用される「約」という用語は、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の長さの量、用量、時間、温度、およびその他などの測定可能な値を指す場合、特定の量の±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％、またはさらには±0.1％の変動を包含することが意味される。
【００３１】
また、本明細書において使用される「および／または」は、関連する記載事項のうちの1つまたは複数のうちの任意および全ての可能な組み合わせに加えて、択一（「または」）で解釈された場合は、組み合わせの欠如を指し、かつこれらを包含する。
【００３２】
本明細書において使用される「から本質的になる」という移行句は、特許請求の範囲が、その請求項で引用された特定の材料または工程ならびに請求された発明の「基本的かつ新規な特徴に実質的に影響しないもの」を包含すると解釈するべきであることを意味する。In re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 USPQ 461,463（CCPA 1976）（原文で強調）を参照されたく、MPEP §2111.03も参照されたい。したがって、本発明の請求項において使用される場合、「から本質的になる」という用語は、「含む」と同等であると解釈されることが意図されない。文脈が他のことを指し示さないかぎり、本明細書に記載される本発明の様々な特徴を任意の組み合わせで使用できることが具体的に意図される。
【００３３】
そのうえ、本発明はまた、本発明のいくつかの態様において本明細書に示される任意の特徴または特徴の組み合わせを排除または省略できることも想定する。
【００３４】
さらに例証すると、例えば本明細書が特定のアミノ酸をA、G、I、L、および／またはVから選択できると示す場合、この言葉はまた、これらのアミノ酸の任意の各サブセット、例えばA、G、I、またはL；A、G、I、またはV；AまたはG；Lのみなどが本明細書において明確に示されたかのように、このような下位組み合わせよりアミノ酸を選択できることも示している。そのうえ、このような言葉はまた、特定のアミノ酸のうちの1種または複数種を（例えば否定的条件により）放棄できることも示す。例えば、特定の態様では、このような可能な各放棄が本明細書において明白に示されるかのように、アミノ酸は、A、G、またはIではなく；Aではなく；GまたはVではないなどである。
【００３５】
本明細書において使用される「低減する（reduce）」、「低減する（reduces）」、「低減」という用語および類似の用語は、少なくとも約25％、35％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、97％またはそれよりも大きい減少を意味する。
【００３６】
本明細書において使用される「増強する（enhance）」、「増強する（enhances）」、「増強」という用語および類似の用語は、少なくとも約25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％、500％またはそれよりも大きい増加を示す。
【００３７】
本明細書において使用される「パルボウイルス」という用語は、自律複製パルボウイルスおよびデペンドウイルスを含む、パルボウイルス科（Parvoviridae）を包含する。自律的パルボウイルスには、パルボウイルス属、エリスロウイルス属、デンソウイルス属、イテラウイルス属、およびコントラウイルス属のメンバーが含まれる。例示的な自律的パルボウイルスには、非限定的に、マウス微小ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ニワトリパルボウイルス、ネコ汎白血球減少ウイルス、ネコパルボウイルス、ガチョウパルボウイルス、H1パルボウイルス、バリケンパルボウイルス、B19ウイルス、および現在公知またはのちに発見される任意の他の自律的パルボウイルスが含まれる。他の自律的パルボウイルスは、当業者に公知である。例えば、BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69（4th ed., Lippincott-Raven Publishers）を参照されたい。
【００３８】
本明細書において使用される「アデノ随伴ウイルス」（AAV）という用語には、非限定的に、AAV1型、AAV2型、AAV3型（3A型および3B型を含む）、AAV4型、AAV5型、AAV6型、AAV7型、AAV8型、AAV9型、AAV10型、AAV11型、トリAAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAV、ヒツジAAV、および現在公知またはのちに発見される任意の他のAAVが含まれる。例えば、BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers）を参照されたい。いくつかの比較的新しいAAV血清型およびクレードが同定されている（例えば、Gao et al., (2004) J. Virology 78:6381-6388；Moris et al., (2004) Virology 33-:375- 383；および表3を参照されたい）。
【００３９】
AAVおよび自律的パルボウイルスの様々な血清型のゲノム配列、ならびにネイティブな末端反復（TR）、Repタンパク質、およびカプシドサブユニット配列は、当技術分野において公知である。このような配列は、文献またはGenBankなどの公的データベース中に見出すことができる。例えば、GenBankアクセッション番号NC_002077、NC_001401、NC_001729、NC_001863、NC_001829、NC_001862、NC_000883、NC_001701、NC_001510、NC_006152、NC_006261、AF063497、U89790、AF043303、AF028705、AF028704、J02275、J01901、J02275、X01457、AF288061、AH009962、AY028226、AY028223、NC_001358、NC_001540、AF513851、AF513852、AY530579を参照されたく；これらの開示は、パルボウイルスおよびAAVの核酸配列およびアミノ酸配列を教示するために参照により本明細書に組み入れられる。例えば、また、Srivistava et al., (1983) J. Virology 45:555；Chiarini et al., (1998) J. Virology 71:6823；Chiarini et al., (1999) J. Virology 73:1309；Bantel-Schaal et al., (1999) J. Virology 73:939；Xiao et al., (1999) J. Virology 73:3994；Muramatsu et al., (1996) Virology 221:208；Shade et al., (1986) J. Virol. 58:921；Gao et al., (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:11854；Moris et al., (2004) Virology 33-:375- 383；国際公開公報第00/28061号、国際公開公報第99/61601号、国際公開公報第98/11244号；および米国特許第6,156,303号も参照されたく；これらの開示は、パルボウイルスおよびAAVの核酸配列およびアミノ酸配列を教示するために参照により本明細書に組み入れられる。表1も参照されたい。
【００４０】
自律的パルボウイルスおよびAAVのカプシド構造は、BERNARD N. FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapters 69 & 70（4th ed., Lippincott-Raven Publishers）に、より詳細に記載されている。AAV2（Xie et al., (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. 99:10405-10）、AAV4（Padron et al., (2005) J. Virol. 79: 5047-58）、AAV5（Walters et al., (2004) J. Virol. 78: 3361-71）ならびにCPV（Xie et al., (1996) J. Mol. Biol. 6:497-520およびTsao et al., (1991) Science 251: 1456-64）の結晶構造の記載も参照されたい。
【００４１】
本明細書において使用される「向性」という用語は、ある特定の細胞または組織中へのウイルスの優先的侵入を指し、その後に任意で、ウイルスゲノムにより運搬される配列の細胞中での発現（例えば転写および任意で翻訳）、例えば組み換えウイルスについては関心対象の異種核酸の発現が続く。
【００４２】
本明細書において使用される「全身向性」および「全身形質導入」（および同等の用語）は、本発明のウイルスカプシドまたはウイルスベクターが、体全体の組織（例えば、脳、肺、骨格筋、心臓、肝臓、腎臓および／または膵臓）に対して向性を示し、かつ／またはそれに形質導入することを示す。本発明の複数の態様では、中枢神経系（例えば、脳、神経細胞、その他）の全身形質導入が観察される。他の態様では、心筋組織の全身形質導入が達成される。
【００４３】
本明細書において使用される「選択的向性」または「特異的向性」は、ある特定の標的細胞および／またはある特定の組織へのウイルスベクターの送達および／または特異的形質導入を意味する。
【００４４】
特に示さないかぎり、「効率的な形質導入」もしくは「効率的な向性」、または類似の用語は、適切な対照を基準として決定することができる（例えば、それぞれ対照の形質導入または向性の少なくとも約50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、500％またはそれよりも大きい）。特定の態様では、ウイルスベクターは、神経細胞および心筋細胞に効率的に形質導入するまたは効率的な向性を有する。適切な対照は、所望の向性および／または形質導入プロファイルを含む多様な要因に依存するであろう。
【００４５】
同様に、ウイルスが標的組織に「効率的に形質導入しない」もしくは「効率的な向性を有しない」かどうか、または類似の用語を、適切な対照を基準として決定することができる。特定の態様では、ウイルスベクターは、肝臓、腎臓、性腺および／または生殖細胞に対して効率的に形質導入しない（すなわち、効率的な向性を有しない）。特定の態様では、組織（例えば肝臓）の形質導入（例えば、望ましくない形質導入）は、所望の標的組織（例えば、骨格筋、横隔膜筋、心筋および／または中枢神経系の細胞）の形質導入レベルの20％以下、10％以下、5％以下、1％以下、0.1％以下である。
【００４６】
本発明のいくつかの態様では、本発明のカプシドを含むAAV粒子は、ある特定の組織／細胞の効率的な形質導入、および形質導入が望ましくないある特定の組織／細胞に対して非常に低レベルの形質導入（例えば、低減した形質導入）という複数の表現型を示すことができる。
【００４７】
本明細書において使用される「ポリペプチド」という用語は、特に示さないかぎり、ペプチドおよびタンパク質の両方を包含する。
【００４８】
「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド塩基の配列であり、RNA、DNAまたはDNA-RNAハイブリッド配列（天然および非天然ヌクレオチドの両方を含む）であり得るが、代表的な態様では、一本鎖または二本鎖DNA配列のいずれかである。
【００４９】
本明細書において使用される、「単離された」ポリヌクレオチド（例えば、「単離されたDNA」または「単離されたRNA」）は、天然に存在する生物またはウイルスのその他の成分のうちの少なくともいくつか、例えば、ポリヌクレオチドと関連して一般に見出される細胞もしくはウイルスの構造成分または他のポリペプチドもしくは核酸から少なくとも部分的に分離された、ポリヌクレオチドを意味する。代表的な態様では、「単離された」ヌクレオチドは、出発材料と比較して、少なくとも約10倍、100倍、1000倍、10,000倍またはそれよりも大きく濃縮されている。
【００５０】
同様に、「単離された」ポリペプチドは、天然に存在する生物またはウイルスのその他の成分のうちの少なくともいくつか、例えば、細胞もしくはウイルスの構造成分またはポリペプチドと関連して一般に見出される他のポリペプチドもしくは核酸から少なくとも部分的に分離されているポリペプチドを意味する。代表的な態様では、「単離された」ポリペプチドは、出発物質と比較して少なくとも約10倍、100倍、1000倍、10,000倍またはそれよりも大きく濃縮されている。
【００５１】
「単離された細胞」は、通常その自然状態で関連している他の成分から分離された細胞を指す。例えば、単離された細胞は、培地中の細胞および／または本発明の薬学的に許容される担体中の細胞であることができる。したがって、単離された細胞は、対象内に送達および／または導入することができる。いくつかの態様では、単離された細胞は、対象から取り出され、本明細書に記載のようにエクスビボ操作され、次に対象に戻された細胞であることができる。
【００５２】
本明細書において使用されるように、ウイルスベクターまたはウイルス粒子またはウイルス粒子の集団を「単離」または「精製」すること（または文法的同等語）により、ウイルスベクターまたはウイルス粒子またはウイルス粒子の集団が、出発物質中の他の成分の少なくともいくつかから少なくとも部分的に分離されることが意味される。代表的な態様では、「単離された」または「精製された」ウイルスベクターまたはウイルス粒子またはウイルス粒子の集団は、出発物質と比較して少なくとも約10倍、100倍、1000倍、10,000倍またはそれよりも大きく濃縮されている。
【００５３】
「治療用ポリペプチド」は、細胞もしくは対象中のタンパク質における不在もしくは欠損に起因する症状を緩和、低減、予防、遅延および／もしくは安定化することができるポリペプチド、ならびに／または他のやり方で対象に利益、例えば、抗がん作用もしくは移植片生存可能性の改善もしくは免疫応答の誘導を付与するポリペプチドである。
【００５４】
「処置する」、「処置すること」、または「の処置」という用語（およびその文法的変形）により、対象の状態の重症度が低減される、少なくとも部分的に改善もしくは安定化されること、および／または少なくとも1つの臨床症候においていくらかの緩和、軽減、減少もしくは安定化が達成され、かつ／もしくは疾患もしくは障害の進行に遅延があることが意味される。
【００５５】
「予防する」、「予防すること」および「予防」という用語（およびその文法的変形）は、対象における疾患、障害および／もしくは臨床症候の発症の予防および／もしくは遅延、ならびに／または本発明の方法の不在下で起こるであろう重症度と比較した疾患、障害および／もしくは臨床症候の発症の重症度の低減を指す。予防は、完全、例えば、疾患、障害および／または臨床症候の全くの不在であることができる。予防は、また、対象における疾患、障害および／もしくは臨床症候の出現ならびに／または発症の重症度が本発明の不在下で起こるであろう重症度よりも実質的に小さいような、部分的であることもできる。
【００５６】
本明細書において使用される「処置有効」量は、対象にいくらかの改善または利益を提供するために十分な量である。別様に述べると、「処置有効」量は、対象における少なくとも1つの臨床症候にいくらかの緩和、軽減、減少または安定化を提供する量である。当業者は、いくらかの利益が対象に提供されるかぎり、治療効果は完全または治癒的である必要がないことを認識するであろう。
【００５７】
本明細書において使用される「予防有効」量は、本発明の方法の不在下で起こるであろうことと比較して、対象における疾患、障害および／もしくは臨床症候の発症を予防および／もしくは遅延させるため、ならびに／または対象における疾患、障害および／もしくは臨床症候の発症の重症度を低減および／もしくは遅延させるために十分な量である。当業者は、いくらかの予防的利益が対象に提供されるかぎり、予防レベルが完全である必要がないと認識するであろう。
【００５８】
「異種ヌクレオチド配列」および「異種核酸分子」という用語は、本明細書において互換的に使用され、ウイルス中に天然に存在しない核酸配列を指す。一般的に、異種核酸分子または異種ヌクレオチド配列は、関心対象のポリペプチドおよび／または非翻訳RNAをコードするオープンリーディングフレームを含む（例えば、細胞および／または対象への送達のため）。
【００５９】
本明細書において使用される、「ウイルスベクター」、「ベクター」または「遺伝子送達ベクター」という用語は、核酸送達ビヒクルとして機能し、ビリオン内にパッケージングされたベクターゲノム（例えば、ウイルスDNA［vDNA］）を含むウイルス（例えばAAV）粒子を指す。あるいは、いくつかの状況では、「ベクター」という用語は、ベクターゲノム／vDNA単独を指すために使用され得る。
【００６０】
「rAAVベクターゲノム」または「rAAVゲノム」は、1種または複数種の異種核酸配列を含むAAVゲノム（すなわち、vDNA）である。rAAVベクターは、ウイルスを生成するために、一般的にシスの末端反復（TR）だけを必要とする。全ての他のウイルス配列は必要ではなく、トランスで供給され得る（Muzyczka, (1992) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 158:97）。典型的には、rAAVベクターゲノムは、ベクターによって効率的にパッケージングされることができる導入遺伝子のサイズを最大限にするように、1つまたは複数のTR配列だけを保持する。構造タンパク質および非構造タンパク質のコード配列は、トランスで提供され得る（例えば、プラスミドなどのベクターから、または配列をパッケージング細胞中に安定的に組み入れることによる）。本発明の態様では、rAAVベクターゲノムは、典型的にはベクターゲノムの5'および3'末端にあり、異種核酸と近接するが、それと連続する必要がない、少なくとも1つのTR配列（例えば、AAV TR配列）、任意で2つのTR（例えば、2つのAAV TR）を含む。TRは、相互に同じまたは異なることができる。
【００６１】
「末端反復」または「TR」という用語には、ヘアピン構造を形成し、末端逆位反復として機能する（すなわち、複製、ウイルスパッケージング、組み入れおよび／またはプロウイルス救出、その他などの所望の機能を媒介する）任意のウイルス末端反復または合成配列が含まれる。TRは、AAV TRまたは非AAV TRであることができる。例えば、他のパルボウイルス（例えば、イヌパルボウイルス（CPV）、マウスパルボウイルス（MVM）、ヒトパルボウイルスB-19）のTR配列などの非AAV TR配列または任意の他の適切なウイルス配列（例えば、SV40複製起点として役立つSV40ヘアピン）をTRとして使用することができ、このTRを短縮化、置換、欠失、挿入および／または付加によりさらに修飾することができる。さらに、TRは、Samulskiらの米国特許第5,478,745号に記載されているような「ダブルD配列」などの部分合成または完全合成であることができる。
【００６２】
「AAV末端反復」または「AAV TR」は、非限定的に血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11もしくは12または現在公知もしくはのちに発見される任意の他のAAVを含む任意のAAV由来であり得る（例えば、表1参照）。AAV末端反復は、それが所望の機能、例えば、複製、ウイルスのパッケージング、組み入れ、および／またはプロウイルス救済、その他を媒介するかぎり、ネイティブな末端反復配列を有する必要がない（例えば、ネイティブなAAV TR配列が、挿入、欠失、短縮化および／またはミスセンス変異により変更され得る）。
【００６３】
AAVタンパク質VP1、VP2およびVP3は、一緒に相互作用して正二十面体の対称性のAAVカプシドを形成するカプシドタンパク質である。VP1.5は、米国特許出願公開第2014/0037585号に記載されているAAVカプシドタンパク質である。
【００６４】
本発明のウイルスベクターは、さらに、国際公開公報第00/28004号およびChao et al., (2000) Molecular Therapy 2:619に記載されているように、「標的指向型（targeted）」ウイルスベクター（例えば、定方向の向性を有する）および／または「ハイブリッド」パルボウイルス（すなわち、ウイルスTRおよびウイルスカプシドが、異なるパルボウイルス由来である）であることができる。
【００６５】
本発明のウイルスベクターは、さらに、国際公開公報第01/92551号（その開示は、その全体で参照により本明細書に組み入れられる）に記載されているような二重鎖パルボウイルス粒子であることができる。したがって、いくつかの態様では、二本鎖（二重鎖）ゲノムを本発明のウイルスカプシド中にパッケージングすることができる。
【００６６】
さらに、ウイルスカプシドまたはゲノムエレメントは、挿入、欠失および／または置換を含む他の修飾を含有することができる。
【００６７】
本明細書において使用される「キメラ」カプシドタンパク質は、野生型と比べたカプシドタンパク質のアミノ酸配列中の1つまたは複数（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、その他）のアミノ酸残基における置換、ならびに野生型と比べたアミノ酸配列中の1つまたは複数（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、その他）のアミノ酸残基の挿入および／または欠失により修飾されているAAVカプシドタンパク質を意味する。いくつかの態様では、1つのAAV血清型からの完全または部分ドメイン、機能性領域、エピトープ、その他は、異なるAAV血清型の対応する野生型ドメイン、機能性領域、エピトープ、その他と、任意の組み合わせで置き換わって、本発明のキメラカプシドタンパク質を生成することができる。キメラカプシドタンパク質の生成は、当技術分野において周知のプロトコルにより実施することができ、本発明のカプシド中に含まれることができる多種のキメラカプシドタンパク質が、文献および本明細書に記載されている。
【００６８】
本明細書において使用される、「アミノ酸」という用語は、任意の天然に存在するアミノ酸、その修飾形態、および合成アミノ酸を包含する。
【００６９】
天然に存在する左旋性（L-）アミノ酸を表2に示す。
【００７０】
あるいは、アミノ酸は、修飾アミノ酸残基（非限定的な例を表4に示す）であることができ、かつ／または翻訳後修飾（例えば、アセチル化、アミド化、ホルミル化、ヒドロキシル化、メチル化、リン酸化または硫酸化）により修飾されたアミノ酸であることができる。
【００７１】
さらに、天然に存在しないアミノ酸は、Wang et al., Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35:225-49 (2006)により記載されているような「非天然」アミノ酸であることができる。これらの非天然アミノ酸は、関心対象の分子をAAVカプシドタンパク質と化学的に連結するために有利に使用することができる。
【００７２】
本明細書において使用される「相同組み換え」という用語は、2つの類似または同等のDNA分子の間でヌクレオチド配列が交換される遺伝子組み換えの1種を意味する。相同組み換えは、また、DNA配列の新しい組み合わせも生成する。これらのDNAの新しい組み合わせは遺伝的変異に相当する。相同組み換えは、また、ウイルスの異なる株および種の間で遺伝物質を交換するために遺伝子の水平移動にも使用される。
【００７３】
本明細書において使用される、「遺伝子編集」、「ゲノム編集」、または「ゲノム操作」という用語は、操作ヌクレアーゼまたは「分子ハサミ」を使用して生きた生物のゲノム中でDNAが挿入、欠失または置換される、遺伝子操作の1種を意味する。これらのヌクレアーゼは、ゲノム中の所望の位置で部位特異的二本鎖切断（DSB）を生み出す。
【００７４】
本明細書において使用される「遺伝子送達」という用語は、遺伝子療法の適用のために外来DNAが宿主細胞に移入されるプロセスを意味する。
【００７５】
本明細書において使用される「CRISPR」という用語は、CRISPR-Cas9ゲノム編集技法の基礎を形成する細菌防御システムの特徴である、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートを表す。
【００７６】
本明細書において使用される「ジンクフィンガー」という用語は、折り畳みを安定化するための1つまたは複数の亜鉛イオンの配位によって特徴付けられる小型タンパク質構造モチーフを意味する。
【００７７】
形質導入増強および抗原性低減のための表面結合タンパク質を有する修飾AAVカプシドタンパク質およびウイルスカプシドおよびウイルスベクター
本発明は、タンパク質が表面に結合したAAVビリオンが、増強した形質導入特性および／または低減した抗原性を有するという予想外の発見に基づく。したがって、一態様では、本発明は、表面結合タンパク質を含むアデノ随伴ウイルス（AAV）粒子であって、AAV粒子の表面に結合したタンパク質が、（a）フィブリノーゲンアルファ鎖；（b）フィブリノーゲンベータ鎖；（c）フィブリノーゲンガンマ鎖；（d）フィブロネクチン；（e）プラスミノーゲン；（f）フォンウィルブランド因子；（g）アルファ-1-酸性糖タンパク質；（h）血小板第4因子；（i）クリオプレシピテート；（j）第VIII因子；（k）第XIII因子；（l）アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン、および／またはイヌ、ウマ、ウシ、ブタ、その他などの任意の他の種由来のアルブミン）；（m）アポリポタンパク質B（ApoB）；（n）アポリポタンパク質E（ApoE）；（o）トランスフェリン；（p）低密度リポタンパク質；（q）細胞表面へのAAVの結合を増加させる、またはAAVの細胞内輸送を増強する任意の融合血清タンパク質；および（r）上記（a）〜（q）の任意の組み合わせからなる群より選択される、AAV粒子を提供する。
【００７８】
AAV粒子への血清タンパク質の結合は、本明細書に提供される実施例の部に例示されるように、塩濃度の濃度およびpHに依存する。
【００７９】
本発明のAAV粒子は、表10に記載された血清型または血清型の任意の組み合わせのAAVであることができる。
【００８０】
いくつかの態様では、本発明のAAV粒子は、単一でまたは任意の組み合わせで、AAV8、AAV9、AAV2、AAV2i8、AAV9.45、または本明細書において記載された、現在公知である、もしくはのちに同定される任意のAAV変異体もしくはバリアントであることができる。
【００８１】
本発明のAAV粒子のいくつかの態様では、AAV粒子の表面に結合したタンパク質は、AAV粒子1つあたりタンパク質分子約2000〜AAV粒子1つあたりタンパク質分子約4×107個（例えば、本明細書において明白に示されない2000から4×107個の間の任意の数を含む、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000、25,000、26,000、27,000、28,000、29,000、30,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000、25,000、26,000、27,000、28,000、29,000、30,000、31,000、32,000、33,000、34,000、35,000、36,000、37,000、38,000、39,000、40,000、41,000、42,000、43,000、44,000、45,000、46,000、47,000、48,000、49,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、または4×107個）の範囲の量でAAV粒子表面に存在することができる。AAV粒子1つあたりのタンパク質分子の数は、当技術分野において公知のプロトコルに従って、および本明細書の実施例の部に例示されるように決定することができる。
【００８２】
いくつかの態様では、表面結合タンパク質を含むAAV粒子は、表面結合タンパク質を欠如するAAV粒子と比べて、増強した形質導入活性および／または低減した抗原性を有する。したがって、AAV粒子と結び付いたタンパク質分子の数は、表面結合タンパク質を欠如するAAV粒子と比べて形質導入活性を増強する、またはAAV粒子の抗原性を低減する量であることができる。
【００８３】
いくつかの態様では、本発明のAAV粒子は、異種核酸分子を含むことができる。
【００８４】
いくつかの態様では、本発明のAAV粒子は、異なるインビトロおよびインビボ適用に適した一連の望ましい表現型を呈するように設計された合成ウイルスベクターであることができる。したがって、一態様では、本発明は、アデノ随伴ウイルス（AAV）を含むAAV粒子を提供する。
【００８５】
本発明は、異なるインビトロおよびインビボ適用に適した一連の望ましい表現型を呈する合成ウイルスベクターのアレイを提供する。特に、本発明は、個別のカプシド中に異なるAAV血清型由来のカプシドタンパク質を組み合わせることが、各個別のカプシドにおいて複数の望ましい表現型を有する改良されたAAVカプシドの開発を可能にするという予想外の発見に基づく。例えば、血清型2、8および9由来のAAVヘルパープラスミドの共トランスフェクションにより生成される本明細書に記載のトリプロイド性AAV2/8/9ベクターは、AAV2よりもずっと高く、AAV8と類似のマウス肝臓の形質導入を有する。重要なことに、トリプロイド性AAV2/8/9ベクターは、親血清型で免疫処置された血清からの中和抗体を回避する能力が改善されている。AAV3は、全身投与後にマウス全身にあまり効率的に形質導入されないものの、VP3がAAV3由来であり、VP1/VP2がAAV8、9またはrh10由来である本明細書に記載のハプロイド性ベクターH-AAV83またはH-AAV93またはH-rh10-3は、全身の形質導入を誘導するだけでなく、AAV3と比較して肝臓および他の組織においてずっと高い形質導入を誘導する。
【００８６】
したがって、一態様では、本発明は、カプシドタンパク質VP1およびカプシドタンパク質VP3を任意の組み合わせで含むアデノ随伴ウイルス（AAV）カプシドであって、カプシドタンパク質VP1が、1つまたは1つよりも多い第1のAAV血清型由来であり、カプシドタンパク質VP3が1つまたは1つよりも多い第2のAAV血清型由来であり、第1のAAV血清型のうちの少なくとも1つが、第2のAAV血清型のうちの少なくとも1つと異なる、AAVカプシドを提供する。
【００８７】
いくつかの態様では、本発明のカプシドは、カプシドタンパク質VP2を任意の組み合わせで含み、その際、カプシドタンパク質VP2は、1つまたは1つよりも多い第3のAAV血清型由来であり、1つまたは1つよりも多い第3のAAV血清型のうちの少なくとも1つは、第1のAAV血清型および／または第2のAAV血清型と異なる。いくつかの態様では、本明細書に記載のAAVカプシドは、カプシドタンパク質VP1.5を含むことができる。VP1.5は、米国特許出願公開第2014/0037585号に記載されており、VP1.5のアミノ酸配列は、本明細書に提供される。
【００８８】
いくつかの態様では、本発明のカプシドは、カプシドタンパク質VP1.5を任意の組み合わせで含み、その際、カプシドタンパク質VP1.5は、1つまたは1つよりも多い第4のAAV血清型由来であり、1つまたは1つよりも多い第4のAAV血清型のうちの少なくとも1つは、第1のAAV血清型および／または第2のAAV血清型と異なる。いくつかの態様では、本明細書に記載のAAVカプシドタンパク質は、カプシドタンパク質VP2を含むことができる。
【００８９】
本発明は、また、カプシドタンパク質VP1およびカプシドタンパク質VP2を任意の組み合わせで含むAAVカプシドであって、カプシドタンパク質VP1が、1つまたは1つよりも多い第1のAAV血清型由来であり、カプシドタンパク質VP2が、1つまたは1つよりも多い第2のAAV血清型由来であり、第1のAAV血清型のうちの少なくとも1つが、第2のAAV血清型のうちの少なくとも1つと異なる、AAVカプシドも提供する。
【００９０】
いくつかの態様では、本発明のAAV粒子は、カプシドタンパク質VP3を任意の組み合わせで含むカプシドを含むことができ、その際、カプシドタンパク質VP3は、1つまたは1つよりも多い第3のAAV血清型由来であり、1つまたは1つよりも多い第3のAAV血清型のうちの少なくとも1つは、第1のAAV血清型および／または第2のAAV血清型と異なる。いくつかの態様では、本明細書に記載のAAVカプシドは、カプシドタンパク質VP1.5を含むことができる。
【００９１】
本発明は、アデノ随伴ウイルス（AAV）カプシドを含むAAV粒子であって、カプシドが、カプシドタンパク質VP1およびカプシドタンパク質VP1.5を任意の組み合わせで含み、カプシドタンパク質VP1が、1つまたは1つよりも多い第1のAAV血清型由来であり、カプシドタンパク質VP1.5が、1つまたは1つよりも多い第2のAAV血清型由来であり、第1のAAV血清型のうちの少なくとも1つが、第2のAAV血清型のうちの少なくとも1つと異なる、AAV粒子をさらに提供する。
【００９２】
いくつかの態様では、カプシドは、カプシドタンパク質VP3を任意の組み合わせで含み、その際、カプシドタンパク質VP3は、1つまたは1つよりも多い第3のAAV血清型由来であり、1つまたは1つよりも多い第3のAAV血清型のうちの少なくとも1つは、第1のAAV血清型および／または第2のAAV血清型と異なる。いくつかの態様では、本明細書に記載のAAVカプシドは、カプシドタンパク質VP1.5を含むことができる。
【００９３】
本発明は、カプシドタンパク質VP1およびカプシドタンパク質VP1.5を任意の組み合わせで含むアデノ随伴ウイルス（AAV）カプシドであって、カプシドタンパク質VP1が、1つまたは1つよりも多い第1のAAV血清型由来であり、カプシドタンパク質VP1.5が、1つまたは1つよりも多い第2のAAV血清型由来であり、第1のAAV血清型のうちの少なくとも1つが、第2のAAV血清型のうちの少なくとも1つと異なる、AAVカプシドをさらに提供する。
【００９４】
いくつかの態様では、本発明のAAVカプシドは、カプシドタンパク質VP3を任意の組み合わせで含み、その際、カプシドタンパク質VP3は、1つまたは1つよりも多い第3のAAV血清型由来であり、1つまたは1つよりも多い第3のAAV血清型のうちの少なくとも1つは、第1のAAV血清型および／または第2のAAV血清型と異なる。いくつかの態様では、本明細書に記載のAAVカプシドタンパク質は、カプシドタンパク質VP2を含むことができる。
【００９５】
本発明のカプシドのいくつかの態様では、1つまたは1つよりも多い第1のAAV血清型、1つまたは1つよりも多い第2のAAV血清型、1つまたは1つよりも多い第3のAAV血清型および1つまたは1つよりも多い第4のAAV血清型は、表5に記載するAAV血清型からなる群より任意の組み合わせで選択される。
【００９６】
本発明のいくつかの態様では、本明細書に記載のAAVカプシドは、カプシドタンパク質VP2を欠く。
【００９７】
本発明のカプシドのいくつかの態様では、キメラカプシドVP1タンパク質、キメラカプシドVP2タンパク質、キメラカプシドVP3タンパク質および／またはキメラカプシドVP1.5タンパク質を含む。
【００９８】
いくつかの態様では、本発明のAAVカプシドは、AAV AAV2/8/9、H-AAV82、H-AAV92、H-AAV82G9、AAV2/8 3：1、AAV2/8 1：1、AAV2/8 1：3、またはAAV8/9であることができ、その全ては、本明細書に提供される実施例の部に記載されている。
【００９９】
本明細書に記載の他のカプシドタンパク質および／または現在公知もしくはのちに開発される他のカプシドタンパク質との任意の組み合わせで本発明のカプシド中に含まれることができるAAVカプシドタンパク質の非限定的な例には、LK3、LK01-19、AAV-DJ、Olig001、rAAV2-レトロ、AAV-LiC、AAV0Kera1、AAV-Kera2、AAV-Kera3、AAV 7m8、AAV1,9、AAVr3.45、AAVクローン32、AAVクローン83、AAV-U87R7-C5、AAV ShH13、AAV ShH19、AAV L1-12、AAV HAE-1、AAV HAE-2、AAVバリアントShH10、AAV2.5T、AAV LS1-4、AAV Lsm、AAV1289、AAVHSC 1-17、AAV2 Rec 1-4、AAV8BP2、AAV-B1、AAV-PHP.B、AAV9.45、AAV9.61、AAV9.47、AAVM41、AAV2ディスプレイ型ペプチド、AAV2-GMN、AAV9-ペプチドディスプレイ型、AAV8およびAAV9ペプチドディスプレイ型、AAVpo2.1、AAVpo4、AAVpo5、AAVpo6、AAV rh、AAV Hu、AAV-Go.1、AAV-mo.1、BAAV、AAAV、AAV8 K137R、AAV Anc80L65、AAV2G9、AAV2 265挿入型-AAV2/265D、AAV2.5、AAV3 SASTG、AAV2i8、AAV8G9、AAV2チロシン変異体AAV2 Y-F、AAV8 Y-F、AAV9 Y-F、AAV6 Y-F、AAV6.2およびそれらの任意の組み合わせが含まれる。
【０１００】
非限定的な例として、本発明のAAVカプシドタンパク質およびウイルスカプシドは、例えば、国際公開公報第00/28004号に記載されているように、別のウイルス、任意で別のパルボウイルスまたはAAV由来のカプシドサブユニットの全部または一部分を含むことができる点で、キメラであることができる。
【０１０１】
以下の刊行物は、野生型カプシドタンパク質および／または現在公知もしくはのちに同定される他のキメラもしくはバリアントカプシドタンパク質との任意の組み合わせで本発明のAAVカプシドに組み入れることができる、キメラまたはバリアントカプシドタンパク質を記載している。
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【０１５６】
PCT公報WO2013158879A1（リジン変異体）。
【０１５７】
米国特許商標庁の発行済みの特許および公開済みの出願の包袋に記載されている以下の生物学的配列ファイルは、野生型カプシドタンパク質および／または現在公知もしくはのちに同定される他のキメラもしくはバリアントカプシドタンパク質との任意の組み合わせで本発明のAAVカプシドに組み入れることができるキメラまたはバリアントカプシドタンパク質を記載するものである（例証目的、米国特許出願第11/486,254号は米国特許出願第11/486,254号に対応する)：11486254.raw、11932017.raw、12172121.raw、12302206.raw、12308959.raw、12679144.raw、13036343.raw、13121532.raw、13172915.raw、13583920.raw、13668120.raw、13673351.raw、13679684.raw、14006954.raw、14149953.raw、14192101.raw、14194538.raw、14225821.raw、14468108.raw、14516544.raw、14603469.raw、14680836.raw、14695644.raw、14878703.raw、14956934.raw、15191357.raw、15284164.raw、15368570.raw、15371188.raw、15493744.raw、15503120.raw、15660906.raw、および15675677.raw。
【０１５８】
AAV血清型の任意の組み合わせから、VP1およびVP3、ならびに存在する場合はVP1.5およびVP2の任意の組み合わせを採用して、本発明のAAVカプシドを生成することができると理解される。例えば、AAV血清型の任意の組み合わせ由来のVP1タンパク質は、AAV血清型の任意の組み合わせ由来のVP3タンパク質と組み合わせることができ、それぞれのVP1タンパク質は、異なる血清型の任意の比で存在することができ、それぞれのVP3タンパク質は、異なる血清型の任意の比で存在することができ、VP1およびVP3タンパク質は、異なる血清型の任意の比で存在することができる。存在する場合、AAV血清型の任意の組み合わせ由来のVP1.5および／またはVP2タンパク質は、AAV血清型の任意の組み合わせ由来のVP1およびVP3タンパク質と組み合わせることができ、それぞれのVP1.5タンパク質は、異なる血清型の任意の比で存在することができ、それぞれのVP2タンパク質は、異なる血清型の任意の比で存在することができ、それぞれのVP1タンパク質は、異なる血清型の任意の比で存在することができ、それぞれのVP3タンパク質は、異なる血清型の任意の比で存在することができ、VP1.5および／またはVP2タンパク質は、異なる血清型の任意の比でVP1およびVP3タンパク質と組み合わせて存在することができることが、さらに理解される。
【０１５９】
例えば、それぞれのウイルスタンパク質および／またはそれぞれのAAV血清型は、A：B、A：B：C、A：B：C：D、A：B：C：D：E、A：B：C：D：E：F、A：B：C：D：E：F：G、A：B：C：D：E：F：G：H、A：B：C：D：E：F：G：H：IまたはA：B：C：D：E：F：G：H：I：Jの比であることができる、任意の比で組み合わせることができ、その際、Aは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、その他であることができ；Bは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、その他であることができ；Cは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、その他であることができ；Dは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、その他であることができ；Eは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、その他であることができ；Fは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、その他であることができ；Gは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、その他であることができ；Hは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、その他であることができ；Iは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、その他であることができ；Jは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、その他であることができる。
【０１６０】
VP1、VP1.5、VP2および／またはVP3カプシドタンパク質のうちのいずれかは、同じタンパク質型と比べて、かつ／または異なるカプシドタンパク質と比べて、キメラカプシドタンパク質として本発明のカプシド中に、任意の組み合わせおよび比で存在できることも、理解される。
【０１６１】
さらなる態様では、本発明は、（a）本発明のAAVカプシド；および（b）少なくとも1つ末端反復配列を含む核酸分子を含む、それから本質的になる、および／またはそれからなるウイルスベクターであって、核酸分子がAAVカプシドにより包まれている、ウイルスベクターをさらに提供する。いくつかの態様では、ウイルスベクターは、AAV粒子であることができる。
【０１６２】
いくつかの態様では、本発明のウイルスベクターは、骨格筋、心筋および／または横隔膜筋に対して全身的または選択的向性を有することができる。いくつかの態様では、本発明のウイルスベクターは、肝臓に対して低減した向性を有することができる。
【０１６３】
本発明は、本発明のカプシドタンパク質、カプシド、ウイルスベクター、AAV粒子組成物および／または薬学的製剤と薬学的に許容される担体とを含む薬学的製剤であることができる組成物をさらに提供する。
【０１６４】
いくつかの非限定的な例では、本発明は、3回軸ループ4におけるアミノ酸配列中に修飾を含む（Opie et al., J. Viral. 77: 6995-7006 (2003)）、AAVカプシドタンパク質（VP1、VP1.5、VP2および／またはVP3）ならびに修飾AAVカプシドタンパク質を含むウイルスカプシドおよびウイルスベクターを提供する。本発明者らは、このループ中の修飾が、修飾AAVカプシドタンパク質を含むウイルスベクターに、（i）肝臓の低減した形質導入、（ii）内皮細胞を通過する増強した移動、（iii）全身形質導入；（iv）筋肉組織（例えば、骨格筋、心筋および／もしくは横隔膜筋）の増強した形質導入、ならびに／または（v）脳組織（例えば、ニューロン）の低減した形質導入を非限定的に含む1つまたは複数の望ましい特性を付与できることを発見した。したがって、本発明は、従来のAAVベクターと関連する制限のいくつかに取り組むものである。例えば、AAV8およびrAAV9ベクターをベースとするベクターは、内皮細胞関門を容易に通過するので、全身核酸送達にとって魅力的であるが、rAAV8またはrAAV9の全身投与は、大部分のベクターが肝臓に送達され、それにより、骨格筋などの他の重要な標的組織の形質導入を低減することを招く。
【０１６５】
本発明の複数の態様では、心筋および／または骨格筋の形質導入（個別の骨格筋、複数の骨格筋、またはあらゆる種類の骨格筋をベースに決定される）は、肝臓における形質導入レベルと比べて少なくとも約5倍、10倍、50倍、100倍、1000倍またはそれよりも高い。
【０１６６】
特定の態様では、本発明の修飾AAVカプシドタンパク質は、3回軸ループ4（例えば、ネイティブなAAV2 VP1カプシドタンパク質のアミノ酸位置575〜600［両端を含む］または別のAAV由来のカプシドタンパク質の対応する領域）のアミノ酸配列中に1つまたは複数の修飾を含む。本明細書において使用されるアミノ酸配列中の「修飾」には、それぞれが1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれよりも多いアミノ酸を含むことができる置換、挿入および／または欠失が含まれる。特定の態様では、修飾は置換である。例えば、特定の態様では、1つのAAV由来の3回軸ループ4からの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25個またはそれよりも多いアミノ酸を、ネイティブなAAV2カプシドタンパク質のアミノ酸位置575〜600または別のAAV由来のカプシドタンパク質の対応する位置の中に置換することができる。しかし、本発明の修飾ウイルスカプシドは、1つのAAVカプシド由来のアミノ酸が別のAAVカプシド中に置換されているAAVカプシドに限定されず、置換および／または挿入されたアミノ酸は、任意の起源由来であることができ、さらに、天然に存在するまたは部分的もしくは完全に合成であることができる。
【０１６７】
本明細書に記載される、いくつかのAAV由来のカプシドタンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列は、当技術分野において公知である。したがって、ネイティブなAAV2カプシドタンパク質のアミノ酸位置575〜600（両端を含む）またはアミノ酸位置585〜590（両端を含む）に「対応する」アミノ酸は、任意の他のAAVについて（例えば、配列アライメントを使用することにより）容易に決定することができる。
【０１６８】
いくつかの態様では、本発明は、本発明の修飾カプシドタンパク質を、現在公知またはのちに発見される任意のAAVのカプシドタンパク質を修飾することにより生成できることを想定する。さらに、修飾すべきAAVカプシドタンパク質は、天然に存在するAAVカプシドタンパク質（例えば、AAV2、AAV3aもしくは3b、AAV4、AAV5、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、またはAAV12カプシドタンパク質あるいは表3に示されるAAVのいずれか）であることができるが、それに限定されるわけではない。当業者は、AAVカプシドタンパク質への多様な操作が当技術分野において公知であり、本発明が、天然に存在するAAVカプシドタンパク質の修飾に限定されないと理解するであろう。例えば、修飾すべきカプシドタンパク質は、天然に存在するAAVと比較してすでに変更を有し得る（例えば、天然に存在するAAVカプシドタンパク質、例えば、AAV2、AAV3a、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11および／もしくはAAV12または現在公知もしくはのちに発見される任意の他のAAVから得られる）。このようなAAVカプシドタンパク質も、本発明の範囲内である。
【０１６９】
例えば、いくつかの態様では、修飾すべきAAVカプシドタンパク質は、ネイティブなAAV2カプシドタンパク質配列（例えば、PCT公報WO2006/066066）のアミノ酸264のすぐ後にアミノ酸挿入を含むことができ、かつ／またはPCT公報WO2009/108274に記載されているように変更されたHIループを有するAAVであることができ、かつ／または精製を容易にするためにポリ-His配列を含有するように修飾されたAAVであることができる。別の例証的な例として、AAVカプシドタンパク質は、挿入または置換としてその中に組み入れられたペプチドターゲティング配列を有することができる。さらに、AAVカプシドタンパク質は、カプシドタンパク質中に置換および／または挿入された別のAAV由来の大きなドメインを含むことができる。
【０１７０】
したがって、特定の態様では、修飾すべきAAVカプシドタンパク質は、天然に存在するAAVから得ることができるが、カプシドタンパク質中に挿入および／もしくは置換された1つもしくは複数の外来配列（例えば、ネイティブなウイルスに対して外因性）をさらに含み、かつ／または1つもしくは複数のアミノ酸の欠失により変更されている。
【０１７１】
それゆえに、本明細書において特定のAAVカプシドタンパク質（例えば、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11もしくはAAV12カプシドタンパク質または表1、その他に示されるAAVのいずれか由来のカプシドタンパク質）を参照する場合、ネイティブなカプシドタンパク質および本発明の修飾以外の変更を有するカプシドタンパク質を包含することが意図される。このような変更には、置換、挿入および／または欠失が含まれる。特定の態様では、カプシドタンパク質は、ネイティブなAAVカプシドタンパク質配列と比較してその中に挿入された1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19もしくは20個、20個未満、30個未満、40個未満、50個未満、60個未満、または70個未満のアミノ酸を（本発明の挿入以外に）含む。本発明の態様では、カプシドタンパク質は、ネイティブなAAVカプシドタンパク質配列と比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19もしくは20個、20個未満、30個未満、40個未満、50個未満、60個未満、または70個未満のアミノ酸置換を（本発明によるアミノ酸置換以外に）含む。本発明の態様では、カプシドタンパク質は、ネイティブなAAVカプシドタンパク質配列と比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19もしくは20個、20個よりも多い、30個よりも多い、40個よりも多い、50個よりも多い、60個よりも多い、または70個よりも多いアミノ酸の欠失を（本発明のアミノ酸欠失以外に）含む。
【０１７２】
したがって、例えば、「AAV2カプシドタンパク質」という用語には、ネイティブなAAV2カプシドタンパク質配列（GenBankアクセッション番号AAC03780参照）を有するAAVカプシドタンパク質ならびにネイティブなAAV2カプシドタンパク質配列中に置換、挿入および／または欠失（前述の段落に記載）を含むAAVカプシドタンパク質が含まれる。
【０１７３】
特定の態様では、AAVカプシドタンパク質は、ネイティブなAAVカプシドタンパク質配列を有する、またはネイティブなAAVカプシドタンパク質配列と少なくとも約70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％もしくは99％類似もしくは同一なアミノ酸配列を有する。例えば、特定の態様では、「AAV2」カプシドタンパク質は、ネイティブなAAV2カプシドタンパク質配列およびネイティブなAAV2カプシドタンパク質配列と少なくとも約75％、80％＜85％、90％、95％、97％、98％または99％類似または同一な配列を包含する。
【０１７４】
2つ以上のアミノ酸配列の間の配列類似性または同一性を決定する方法は、当技術分野において公知である。配列類似性または同一性は、非限定的に、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math.  2,482 (1981)の局所配列同一性アルゴリズム、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48,443 (1970)の配列同一性アライメントアルゴリズム、Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444 (1988)の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピューター実装（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WIの中のGAP、BESTFIT、FASTA,およびTFASTA）、Devereux et al., Nucl. Acid Res. 12, 387-395 (1984)により記載されたBest Fit配列プログラム、または検査を含む、当技術分野において公知の標準的な技法を使用して決定され得る。
【０１７５】
別の適切なアルゴリズムは、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410, (1990)およびKarlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873-5787 (1993)に記載されているBLASTアルゴリズムである。特に有用なBLASTプログラムは、Altschul et al., Methods in Enzymology, 266, 460-480 (1996)；http://blast.wustl/edu/blast/README.htmlから得られたWU-BLAST-2プログラムである。WU-BLAST-2は、任意でデフォルトの値に設定されたいくつかの検索パラメータを使用する。パラメータは、動的値であり、特定の配列の組成および関心対象の配列が検索されている特定のデータベースの組成に応じてプログラム自体により確立される。しかし、これらの値は、感度を上げるために調整され得る。
【０１７６】
さらに、追加的に有用なアルゴリズムは、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402により報告されたようなギャップドBLASTである。
【０１７７】
本発明のいくつかの態様では、修飾は、ネイティブなAAV2カプシドタンパク質（VP1番号付けを使用）のアミノ酸位置585〜590（両端を含む）の領域中に、または他のAAV（ネイティブなAAV2 VP1カプシドタンパク質：GenBankアクセッション番号AAC03780もしくはYP680426）の対応する位置に、すなわち、ネイティブなAAV2カプシドタンパク質のアミノ酸位置585〜590（VP1番号付け）に対応するアミノ酸に行うことができる。ネイティブなAAV2カプシドタンパク質の位置585〜590に「対応する」、他のAAV血清型または修飾AAVカプシド中のアミノ酸位置は、当業者に明らかであり、配列アライメント技法（例えば、国際公開公報第2006/066066号の図7参照）および／または結晶構造解析（Padron et al., (2005) J. Virol. 79: 5047-58）を使用して容易に決定することができる。
【０１７８】
例証すると、修飾は、全ての下流配列の位置が移動されるように、挿入および／または欠失をすでに含有するAAVカプシドタンパク質中に導入することができる。この状況で、AAV2カプシドタンパク質中のアミノ酸位置585〜590に対応するアミノ酸位置は、依然として当業者に容易に同定可能である。例証すると、カプシドタンパク質は、アミノ酸位置264の後に挿入を含有するAAV2カプシドタンパク質であることができる（例えば、国際公開公報第2006/066066号を参照されたい）。585位から590位にわたり見出されるアミノ酸（例えば、ネイティブなAAV2カプシドタンパク質中のRGNRQA（SEQ ID NO：1））は、今度は586位から591位であるが、依然として当業者に同定可能である。
【０１７９】
本発明は、また、本発明の修飾AAVカプシドタンパク質を含む、それから本質的になる、またはそれからなるウイルスカプシドも提供する。特定の態様では、ウイルスカプシドは、さらに自律的パルボウイルスカプシドまたはディペンドウイルスカプシドであり得るパルボウイルスカプシドである。任意で、ウイルスカプシドは、AAVカプシドである。特定の態様では、AAVカプシドは、AAV1、AAV2、AAV3a、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、または表1に示される、もしくは他の方法で公知もしくはのちに発見される任意の他のAAVであり、かつ／あるいは1つまたは複数の挿入、置換および／または欠失により前述のいずれかから得られるものである。
【０１８０】
修飾ウイルスカプシドは、例えば、米国特許第5,863,541号に記載されたように、「カプシド媒体」として使用することができる。修飾ウイルスカプシドによりパッケージングされ、細胞内に移入することができる分子には、異種DNA、RNA、ポリペプチド、有機小分子、金属、またはその組み合わせが含まれる。
【０１８１】
異種分子は、AAV感染で自然に見られない分子、例えば、野生型AAVゲノムによりコードされない分子として定義される。さらに、治療的に有用な分子は、宿主標的細胞への分子の移入のためにウイルスカプシドの外側と関連することができる。このような関連した分子は、DNA、RNA、有機小分子、金属、糖質、脂質および／またはポリペプチドを含むことができる。本発明の一態様では、治療的に有用な分子は、カプシドタンパク質と共有結合的に連結している（すなわち、コンジュゲートまたは化学的に結合している）。分子を共有結合的に連結する方法は、当業者に公知である。
【０１８２】
本発明の修飾ウイルスカプシドはまた、新規なカプシド構造に対する抗体を産出することにも役立つ。さらなる代替として、外因性アミノ酸配列は、例えば、対象に投与して外因性アミノ酸配列に対する免疫応答を生成するために、細胞への抗原提示のために修飾ウイルスカプシド中に挿入され得る。
【０１８３】
他の態様では、ウイルスカプシドは、関心対象のポリペプチドをコードする核酸または機能性RNAを送達するウイルスベクターの投与の前および／または投与と同時に（例えば相互に数分または数時間以内で）、ある特定の細胞部位をブロックするために投与することができる。例えば、本発明のカプシドは、肝臓細胞上の細胞受容体をブロックするために送達することができ、送達ベクターは、続いてまたは同時に投与することができ、このことは、肝臓細胞の形質導入を低減し、他の標的（例えば、骨格筋、心筋および／または横隔膜筋）の形質導入を増強する場合がある。
【０１８４】
代表的な態様によると、修飾ウイルスカプシドは、本発明による修飾ウイルスベクターの前および／またはそれと同時に対象に投与することができる。さらに、本発明は、本発明の修飾ウイルスカプシドを含む組成物および薬学的製剤を提供し；任意で組成物は、本発明の修飾ウイルスベクターも含む。
【０１８５】
本発明はまた、本発明の修飾ウイルスカプシドおよびカプシドタンパク質をコードする核酸分子（任意で、単離された核酸分子）も提供する。さらに、核酸分子を含むベクターならびに本発明の核酸分子および／またはベクターを含む細胞（インビボまたは培養）が提供される。適切なベクターには、非限定的に、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、AAV、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、ワクシニア、ポックスウイルス、バキュロウイルス、およびその他）、プラスミド、ファージ、YAC、BAC、およびその他が含まれる。このような核酸分子、ベクターおよび細胞は、例えば、本明細書に記載の修飾ウイルスカプシドまたはウイルスベクターの生成のための試薬（例えば、ヘルパーパッケージング構築物またはパッケージング細胞）として使用することができる。
【０１８６】
本発明によるウイルスカプシドは、当技術分野において公知の任意の方法を使用して、例えばバキュロウイルスからの発現により生成することができる（Brown et al., (1994) Virology 198:477-488）。
【０１８７】
いくつかの態様では、本発明のAAVカプシドタンパク質への修飾は、「選択的」修飾である。このアプローチは、サブユニット全体またはAAV血清型の間の大きなドメイン交換を用いる以前の研究（例えば、国際公開公報第00/28004号およびHauck et al., (2003) J. Virology 77:2768-2774を参照されたい）と対照的である。特定の態様では、「選択的」修飾は、約20、18、15、12、10、9、8、7、6、5、4、3または2個未満の連続アミノ酸の挿入および／または置換および／または欠失を招く。
【０１８８】
本発明の修飾カプシドタンパク質およびカプシドは、現在公知もしくはのちに同定される任意の他の修飾をさらに含むことができる。
【０１８９】
ウイルスカプシドは、所望の標的組織に存在する細胞表面分子と相互作用するようにウイルスカプシドに指令するターゲティング配列（例えば、ウイルスカプシド中に置換または挿入されたもの）を含む標的指向型ウイルスカプシドであることができる（例えば、国際公開公報第00/28004号およびHauck et al., (2003) J. Virology 77:2768-2774）；Shi et al., Human Gene Therapy 17:353-361 (2006)［AAVカプシドサブユニットの520位および／または584位でのインテグリン受容体結合モチーフRGDの挿入を記載している］；ならびに米国特許第7,314,912号［AAV2カプシドサブユニットのアミノ酸447位、534位、573位および587位に続いてRGDモチーフを含有するP1ペプチドの挿入を記載している］を参照されたい）。挿入を許容するAAVカプシドサブユニット内の他の位置は、当技術分野において公知である（例えば、Grifman et al., Molecular Therapy 3:964-975 (2001)により記載されている449位および588位）。
【０１９０】
例えば、本発明のウイルスカプシドのいくつかは、関心対象の大部分の標的組織（例えば、肝臓、骨格筋、心臓、横隔膜筋、腎臓、脳、胃、腸、皮膚、内皮細胞、および／または肺）に対して相対的に非効率的な向性を有する。ターゲティング配列は、これらの低形質導入ベクターに有利に組み入れられて、それにより、ウイルスカプシドに所望の向性および任意で特定の組織に対する選択的向性を付与することができる。ターゲティング配列を含むAAVカプシドタンパク質、カプシドおよびベクターは、例えば、国際公開公報第00/28004号に記載されている。別の可能性として、低形質導入ベクターを所望の標的組織に再方向付けする手段として、Wang et al., Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35:225-49 (2006)）により記載されるように1つまたは複数の天然に存在しないアミノ酸をAAVカプシドサブユニット中の直行性部位（orthogonal site）に組み入れることができる。これらの非天然アミノ酸を有利に使用して、非限定的に、グリカン（マンノース-樹状細胞ターゲティング）；特定のがん細胞型を標的とした送達のためのRGD、ボンベシンまたは神経ペプチド；増殖因子受容体、インテグリン、およびその他などの特定の細胞表面受容体を標的としたファージディスプレイより選択されるRNAアプタマーまたはペプチドを含む、関心対象の分子をAAVカプシドタンパク質に化学的に連結することができる。アミノ酸を化学的に修飾する方法は、当技術分野において公知である（例えば、Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, 1st edition, Academic Press, 1996を参照されたい）。
【０１９１】
代表的な態様では、ターゲティング配列は、特定の細胞型に感染を方向付けるウイルスカプシド配列（例えば、自律的パルボウイルスカプシド配列、AAVカプシド配列、または任意の他のウイルスカプシド配列）であり得る。
【０１９２】
別の非限定的な例として、ヘパリン結合ドメイン（例えば、呼吸器合胞体ウイルスのヘパリン結合ドメイン）が、結果として生じる変異体にヘパリン結合性を付与するために典型的にはHS受容体と結合しない（例えば、AAV4、AAV5）カプシドサブユニット中に挿入または置換される場合がある。
【０１９３】
B19は、初代赤血球前駆細胞に、グロボシドをその受容体として感染する（Brown et al., (1993) Science 262:114）。B19の構造は、解像度8Åで決定されている（Agbandje-McKenna et al., (1994) Virology 203:106）。グロボシドと結合するB19カプシドの領域は、β-バレル構造EとFとの間のループアウト領域であるアミノ酸399〜406の間（Chapman et al., (1993) Virology 194:419）にマッピングされている（Chipman et al., (1996) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93:7502）。したがって、B19カプシドのグロボシド受容体結合ドメインは、それを含むウイルスカプシドまたはウイルスベクターを赤血球細胞にターゲティングさせるために、AAVカプシドタンパク質中に置換される場合がある。
【０１９４】
代表的な態様では、外因性ターゲティング配列は、ウイルスカプシドまたは修飾AAVカプシドタンパク質を含むウイルスベクターの向性を変更するペプチドをコードする任意のアミノ酸配列であり得る。特定の態様では、ターゲティングペプチドまたはタンパク質は、天然に存在する、またはその代わりに完全もしくは部分的に合成であり得る。例示的なターゲティング配列には、細胞表面受容体および糖タンパク質と結合するリガンドおよび他のペプチド、例えばRGDペプチド配列、ブラジキニン、ホルモン、ペプチド増殖因子（例えば、上皮増殖因子、神経増殖因子、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、インスリン様増殖因子IおよびII、その他）、サイトカイン、メラニン細胞刺激ホルモン（例えば、α、βまたはγ）、神経ペプチドおよびエンドルフィン、およびその他、ならびに標的細胞のそれらの同族受容体に対する能力を保持するその断片が含まれる。他の例示的なペプチドおよびタンパク質には、サブスタンスP、ケラチノサイト増殖因子、神経ペプチドY、ガストリン放出ペプチド、インターロイキン2、ニワトリ卵白リゾチーム、エリスロポエチン、ゴナドリベリン、コルチコスタチン、β-エンドルフィン、リュー-エンケファリン、リモルフィン、α-ネオ-エンケファリン、アンジオテンシン、ニューマジン（pneumadin）、血管作動性腸管ペプチド、ニューロテンシン、モチリン、および上記のその断片が含まれる。なおさらなる代替として、毒素（例えば、破傷風毒素またはヘビ毒素、例えばα-ブンガロトキシン、およびその他）由来の結合ドメインを、ターゲティング配列としてカプシドタンパク質中に置換することができる。なおさらなる代表的な態様では、AAVカプシドタンパク質は、Cleves（Current Biology 7:R318 (1997)）により記載されるように「非古典的」搬入／搬出シグナルペプチド（例えば、線維芽細胞増殖因子-1および-2、インターロイキン1、HIV-1 Tatタンパク質、ヘルペスウイルスVP22タンパク質、およびその他）のAAVカプシドタンパク質中への置換により修飾することができる。特定の細胞による取り込みを指令するペプチドモチーフも包含され、例えば、FVFLPペプチドモチーフは、肝臓細胞による取り込みをトリガーする。
【０１９５】
関心対象の任意の細胞型を認識するペプチドを同定するために、ファージディスプレイ技法および当技術分野において公知の他の技法が使用され得る。
【０１９６】
ターゲティング配列は、受容体（例えば、タンパク質、糖質、糖タンパク質またはプロテオグリカン）を含む、細胞表面結合部位を標的とする任意のペプチドをコードし得る。細胞表面結合部位の例には、非限定的に、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、および他のグリコサミノグリカン、ムチン上に見られるシアル酸部分、糖タンパク質、およびガングリオシド、MHC I糖タンパク質、膜糖タンパク質上に見られる、マンノース、N-アセチル-ガラクトサミン、N-アセチル-グルコサミン、フコース、ガラクトース、およびその他を含む糖質構成成分が含まれる。
【０１９７】
特定の態様では、ヘパラン硫酸（HS）またはヘパリン結合ドメインは、ウイルスカプシド中に（例えば、そうでなければHSまたはヘパリンに結合しないAAVにおいて）置換される。HS／ヘパリン結合は、アルギニンおよび／またはリジンが豊富な「塩基性パッチ」により媒介されることは、当技術分野において公知である。例示的な態様では、モチーフBXXB［配列中、「B」は、塩基性残基であり、Xは、中性および／または疎水性である］に続く配列。1つの非限定的な例として、BXXBはRGNRである。特定の態様では、BXXBは、ネイティブなAAV2カプシドタンパク質中のアミノ酸位置262〜265にかけて、または別のAAVのカプシドタンパク質における対応する位置で置換されている。
【０１９８】
適切なターゲティング配列の他の非限定的な例には、Mueller et al., Nature Biotechnology 21:1040-1046 (2003)により同定された冠動脈内皮細胞をターゲティングするペプチド（コンセンサス配列NSVRDLG/S（SEQ ID NO：2）、PRSVTVP（SEQ ID NO：3）、NSVSSXS/A（SEQ ID NO：4)）；Grifman et al., Molecular Therapy 3:964-975 (2001)により記載されているような腫瘍ターゲティングペプチド（例えば、NGR、NGRAHA（SEQ ID NO：5)）；Work et al., Molecular Therapy 13:683-693 (2006)により記載されているような肺または脳ターゲティング配列
2020511127.tif 000002
；Hajitou et al., TCM 16:80-88 (2006)により記載された血管ターゲティング配列
2020511127.tif 000003
；Koivunen et al., J. Nucl. Med. 40:883-888 (1999)により記載されているようなターゲティングペプチド
2020511127.tif 000004
；ならびにNewton & Deutscher, Phage Peptide Display in Handbook of Experimental Pharmacology, pages 145-163, Springer-Verlag, Berlin (2008)により記載されているような腫瘍ターゲティングペプチド
2020511127.tif 000005
2020511127.tif 000006
が含まれる。
【０１９９】
なおさらなる代替として、ターゲティング配列は、細胞内への侵入をターゲティングする別の分子との化学結合のために使用できる（例えば、そのR基を経由して化学結合することができるアルギニンおよび／またはリジン残基を含むことができる）ペプチドであり得る。
【０２００】
別の選択肢として、本発明のAAVカプシドタンパク質またはウイルスカプシドは、国際公開公報第2006/066066号に記載されているような変異を含むことができる。例えば、カプシドタンパク質は、ネイティブなAAV2カプシドタンパク質のアミノ酸位置263、705、708および／もしくは716に選択的アミノ酸置換または別のAAV由来のカプシドタンパク質中に対応する変化を含むことができる。追加的または代替的に、代表的な態様では、カプシドタンパク質、ウイルスカプシドまたはベクターは、AAV2カプシドタンパク質のアミノ酸位置264のすぐ後の選択的アミノ酸挿入または他のAAV由来のカプシドタンパク質中に対応する変化を含む。「アミノ酸位置Xのすぐ後」により、挿入が、表示されたアミノ酸位置の直後であることが意図される（例えば、「アミノ酸位置264の後」は、位置265での点挿入またはより大きな挿入、例えば位置265〜268などを示す）。本発明の前述の態様は、本明細書に記載のように細胞または対象に異種核酸を送達するために使用することができる。例えば、修飾ベクターを使用して、本明細書に記載のムコ多糖障害（例えば、スライ症候群［β-グルクロニダーゼ］、ハーラー症候群［α-L-イズロニダーゼ］、シャイエ症候群［α-L-イズロニダーゼ］、ハーラー-シャイエ症候群［α-L-イズロニダーゼ］、ハンター症候群［イズロン酸スルファターゼ］、サンフィリッポ症候群A［ヘパランスルファミダーゼ］、B［N-アセチルグルコサミニダーゼ］、C［アセチル-CoA：α-グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ］、D［N-アセチルグルコサミン6-スルファターゼ］、モルキオ症候群A［ガラクトース-6-硫酸スルファターゼ］、B［β-ガラクトシダーゼ］、マロトー-ラミー症候群［N-アセチルガラクトサミン-4-スルファターゼ］、その他）、ファブリー病（α-ガラクトシダーゼ）、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、またはグリコーゲン貯蔵障害（例えば、ポンペ病；リソソーム酸性α-グルコシダーゼ）などのリソソーム貯蔵障害を処置することができる。
【０２０１】
当業者は、いくつかのAAVカプシドタンパク質について、対応するアミノ酸位置がウイルス中に部分的もしくは完全に存在するか、またはその代わりに完全に不在かどうかに応じて、対応する修飾が、挿入および／または置換であることを認識するであろう。同様に、AAV2以外のAAVを修飾する場合、特定のアミノ酸位置は、AAV2における位置と異なる場合がある（例えば、表3を参照されたい）。本明細書の他のどこかに記述するように、対応するアミノ酸位置は、周知の技法を使用して当業者に容易に明らかになるであろう。
【０２０２】
代表的な態様では、カプシドタンパク質中の挿入および／または置換および／または欠失の結果として、（i）その領域における親水性ループ構造を維持するアミノ酸；（ii）ループ構造の立体配置を変更するアミノ酸；（iii）荷電アミノ酸；および／あるいは（iv）AAV2カプシドタンパク質中の264の後でリン酸化もしくは硫酸化されることができるアミノ酸、または翻訳後修飾（例えばグリコシル化）により他の方法で電荷もしくは別のAAVのカプシドタンパク質中に対応する変化を獲得することができるアミノ酸の挿入、置換および／または再配置が生じる。挿入／置換に適したアミノ酸には、アスパラギン酸、グルタミン酸、バリン、ロイシン、リジン、アルギニン、トレオニン、セリン、チロシン、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、フェニルアラニン、チロシンまたはグルタミンが含まれる。特定の態様では、トレオニンは、カプシドサブユニット内に挿入または置換される。いくつかの他のAAVにおける対応する位置の非限定的な例を表3（位置2）に示す。特定の態様では、アミノ酸の挿入または置換は、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはフェニルアラニンである（この位置にそれぞれトレオニン、グルタミン酸またはフェニルアラニンを有するAAVを除く）。
【０２０３】
本発明のこの局面により、いくつかの態様では、AAVカプシドタンパク質は、AAV2、AAV3aまたはAAV3bカプシドタンパク質におけるアミノ酸位置264の後に、あるいはそれぞれ非AAV2、AAV3aもしくはAAV3b配列を含むように修飾された、および／または1つもしくは複数のアミノ酸の欠失により修飾された（すなわち、AAV2、AAV3aもしくはAAV3bから得られた）AAV2、AAV3aまたはAAV3bカプシドタンパク質における対応する位置に、アミノ酸挿入を含む。AAV2（またはAAV3aもしくはAAV3b）のカプシドサブユニットにおける位置264に対応するアミノ酸は、AAV2（またはAAV3aもしくはAAV3b）から得られた出発ウイルスから容易に同定可能であり、次にこのサブユニットを本発明によりさらに修飾することができる。挿入に適したアミノ酸には、アスパラギン酸、グルタミン酸、バリン、ロイシン、リジン、アルギニン、トレオニン、セリン、チロシン、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、フェニルアラニン、チロシンまたはグルタミンが含まれる。
【０２０４】
他の態様では、AAVカプシドタンパク質は、AAV1カプシドタンパク質のアミノ酸位置265、AAV8カプシドタンパク質のアミノ酸位置266、もしくはAAV9カプシドタンパク質のアミノ酸位置265に、またはそれぞれ非AAV1、非AAV8もしくは非AAV9配列を含むように修飾され、かつ／もしくは1つもしくは複数のアミノ酸の欠失（すなわち、AAV1、AAV8もしくはAAV9から得られる欠失）により修飾された、AAV1、AAV8もしくはAAV9カプシドタンパク質の対応する位置に、アミノ酸置換を含む。AAV1およびAAV9カプシドサブユニットの265位およびAAV8カプシドサブユニットの266位に対応するアミノ酸は、AAV1、AAV8またはAAV9から得られた出発ウイルスから容易に同定可能であり、次にこのアミノ酸を本発明によりさらに修飾することができる。挿入に適したアミノ酸には、アスパラギン酸、グルタミン酸、バリン、ロイシン、リジン、アルギニン、トレオニン、セリン、チロシン、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、フェニルアラニン、チロシンまたはグルタミンが含まれる。
【０２０５】
本発明の代表的な態様では、カプシドタンパク質は、AAV2カプシドタンパク質のアミノ酸位置264または別のカプシドタンパク質の対応する位置の後にトレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはフェニルアラニンを含む（すなわち、挿入）。
【０２０６】
他の代表的な態様では、本発明の修飾カプシドタンパク質またはウイルスカプシドは、国際公開公報第2007/089632号に記載されているような1つまたは複数の変異をさらに含む（例えば、AAV2カプシドタンパク質のアミノ酸位置531または別のAAV由来のカプシドタンパク質の対応する位置でのE7K変異）。
【０２０７】
さらなる態様では、修飾カプシドタンパク質またはカプシドは、国際公開公報第2009/108274号に記載されているような変異を含むことができる。
【０２０８】
別の可能性として、AAVカプシドタンパク質は、Zhongら（Virology 381: 194-202 (2008)；Proc. Nat. Acad. Sci. 105: 7827-32 (2008)）により記載されているような変異を含むことができる。例えば、AAVカプシドタンパク質は、アミノ酸位置730にYF変異を含むことができる。
【０２０９】
上記修飾は、相互に組み合わせて、および／または現在公知もしくはのちに発見される任意の他の修飾と共に、本発明のカプシドタンパク質またはカプシド中に組み入れることができる。
【０２１０】
本発明は、また、本発明の修飾カプシドタンパク質およびカプシドを含むウイルスベクターも包含する。特定の態様では、ウイルスベクターは、パルボウイルスベクター（例えば、パルボウイルスカプシドおよび／またはベクターゲノムを含む）、例えば、AAVベクター（例えば、AAVカプシドおよび／またはベクターゲノムを含む）である。代表的な態様では、ウイルスベクターは、本発明の修飾カプシドタンパク質サブユニットおよびベクターゲノムを含む修飾AAVカプシドを含む。
【０２１１】
例えば、代表的な態様では、ウイルスベクターは、（a）本発明の修飾カプシドタンパク質を含む修飾ウイルスカプシド（例えば、修飾AAVカプシド）；および（b）末端反復配列（例えば、AAV TR）を含む核酸であって、末端反復配列を含む核酸が、修飾ウイルスカプシドにより包まれている核酸を含む。核酸は、任意で、2つの末端反復（例えば、2つのAAV TR）を含むことができる。
【０２１２】
代表的な態様では、ウイルスベクターは、関心対象のポリペプチドまたは機能性RNAをコードする異種核酸を含む組み換えウイルスベクターである。組み換えウイルスベクターは、下により詳細に説明される。
【０２１３】
いくつかの態様では、本発明のウイルスベクターは、（i）本発明の修飾カプシドタンパク質を有しないウイルスベクターによる形質導入のレベルと比較して、低減した肝臓の形質導入を有し；（ii）本発明の修飾カプシドタンパク質を有しないウイルスベクターにより観察されたレベルと比較して、動物対象においてウイルスベクターによる増強した全身形質導入を示し；（iii）本発明の修飾カプシドタンパク質を有しないウイルスベクターによる移動のレベルと比較して、内皮細胞を通過する増強した移動を実証し、かつ／あるいは（iv）本発明の修飾カプシドタンパク質を有しないウイルスベクターによる形質導入のレベルと比較して、筋肉組織（例えば、骨格筋、心筋および／もしくは横隔膜筋）の形質導入における選択的増強、ならびに／または（v）脳組織（例えば、ニューロン）の低減した形質導入を示す。いくつかの態様では、ウイルスベクターは、筋肉に向けた全身形質導入を有し、例えば、ウイルスベクターは、全身にわたる複数の骨格筋群に形質導入し、任意で、心筋および／または横隔膜筋に形質導入する。
【０２１４】
さらに、本発明のいくつかの態様では、修飾ウイルスベクターは標的組織の効率的な形質導入を示す。
【０２１５】
本発明の修飾カプシドタンパク質、ウイルスカプシド、ウイルスベクターおよびAAV粒子は、ネイティブな状態で存在するまたは見出されるようなカプシドタンパク質、カプシド、ウイルスベクターおよびAAV粒子を除くことが当業者により理解されるであろう。
【０２１６】
ウイルスベクターを生成する方法
本発明は、本発明の創意に富むウイルスベクターをAAV粒子として生成する方法をさらに提供する。したがって、本発明は、本発明のAAVカプシドを含むAAV粒子を作製する方法であって、（a）AAV粒子を組み立てるために必要な全ての機能および遺伝子を一緒に提供する1種または複数種のプラスミドを宿主細胞にトランスフェクトすること；（b）1種もしくは複数種の核酸構築物をパッケージング細胞株もしくはプロデューサー細胞株に導入して、AAV粒子を組み立てるために必要な全ての機能および遺伝子を一緒に提供する工程；（c）AAV粒子を組み立てるために必要な全ての機能および遺伝子を一緒に提供する1種もしくは複数種の組み換えバキュロウイルスベクターを宿主細胞に導入する工程；ならびに／または（d）AAV粒子を組み立てるために必要な全ての機能および遺伝子を一緒に提供する1種もしくは複数種の組み換えヘルペスウイルスベクターを宿主細胞に導入する工程を含む、方法を提供する。本発明のウイルスベクターを作製する様々な方法の非限定的な例は、ClementおよびGrieger（"Manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors for clinical trials" Mol. Ther. Methods Clin Dev. 3:16002 (2016)）およびGriegerら（"Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector" Mol Ther 24(2):287-297 (2016)）に記載されており、これらの全内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０２１７】
代表的な一態様では、本発明は、ウイルスベクターを生成する方法であって、細胞に、（a）少なくとも1つのTR配列（例えば、AAV TR配列）を含む核酸鋳型、ならびに（b）核酸鋳型の複製およびAAVカプシド内への包み込みに十分なAAV配列（例えば、AAV rep配列および本発明のAAVカプシドをコードするAAV cap配列）を提供することを含む方法を提供する。任意で、核酸鋳型は、少なくとも1つの異種核酸配列をさらに含む。特定の態様では、核酸鋳型は、異種核酸配列（存在する場合）に対して5'および3'に位置する2つのAAV ITR配列を含むが、それらは、異種核酸配列と直接連続する必要はない。
【０２１８】
核酸鋳型ならびにAAV repおよびcap配列は、AAVカプシド内にパッケージングされた核酸鋳型を含むウイルスベクターが細胞中で生成されるような条件で提供される。方法は、細胞からウイルスベクターを収集する工程をさらに含むことができる。ウイルスベクターは、培地からおよび／または細胞を溶解することにより収集することができる。
【０２１９】
細胞は、AAVウイルス複製に許容性の細胞であることができる。当技術分野において公知の任意の適切な細胞が採用され得る。特定の態様では、細胞は哺乳動物細胞である。別の選択肢として、細胞は、複製欠損ヘルパーウイルスから欠失された機能を提供するトランス相補パッケージング細胞株、例えば、293細胞または他のElaトランス相補細胞であることができる。
【０２２０】
AAVのreplication配列およびcapsid配列は、当技術分野においての公知の任意の方法により提供され得る。現行のプロトコルは、典型的には、単一のプラスミド上にAAV rep/cap遺伝子を発現する。AAVのreplication配列およびパッケージング配列は、一緒に提供される必要はないが、そうすることが好都合であり得る。AAV repおよび／またはcap配列は、任意のウイルスまたは非ウイルスベクターにより提供される場合がある。例えば、rep/cap配列は、ハイブリッドアデノウイルスまたはヘルペスウイルスベクターにより提供される場合がある（例えば、欠失アデノウイルスベクターのElaまたはE3領域に挿入される）。EBVベクターは、また、AAV capおよびrep遺伝子を発現するために採用される場合がある。この方法の1つの利点は、EBVベクターがエピソーム性であるものの、継続的な細胞分裂を通して高いコピー数を維持することである（すなわち「EBVベースの核エピソーム」と称される染色体外エレメントとして細胞に安定的に組み入れられる、Margolski, (1992) Curr. Top. Microbiol. Immun. 158:67を参照されたい）。
【０２２１】
さらなる代替として、rep/cap配列が細胞に安定的に組み入れられる場合がある。典型的には、AAV rep/cap配列は、これらの配列の救済および／またはパッケージングを防止するために、TRと近接しない。
【０２２２】
核酸鋳型は、当技術分野において公知の任意の方法を使用して細胞に提供することができる。例えば、鋳型は、非ウイルス（例えば、プラスミド）またはウイルスベクターにより供給することができる。特定の態様では、核酸鋳型は、ヘルペスウイルスまたはアデノウイルスベクターにより供給される（例えば、欠失アデノウイルスのElaまたはE3領域に挿入される）。別の例証として、Palombo et al., (1998) J. Virology 72:5025は、AAV TRと近接するレポーター遺伝子を有するバキュロウイルスベクターを記載している。EBVベクターは、また、rep/cap遺伝子に関して上に記載されたように、鋳型を送達するために採用される場合がある。
【０２２３】
別の代表的な態様では、核酸鋳型は、複製rAAVウイルスにより提供される。なお他の態様では、核酸鋳型を含むAAVプロウイルスは、細胞の染色体に安定的に組み入れられる。
【０２２４】
ウイルス力価を高めるために、増殖性AAV感染を促進するヘルパーウイルスの機能（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）を細胞に提供することができる。AAVの複製に必要なヘルパーウイルス配列は、当技術分野において公知である。典型的には、これらの配列は、ヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスベクターにより提供される。あるいは、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス配列は、別の非ウイルスまたはウイルスベクターにより例えば、Ferrari et al., (1997) Nature Med. 3:1295、ならびに米国特許第6,040,183号および同第6,093,570号により記載されたように、効率的なAAV生成を促進する全てのヘルパー遺伝子を有する非感染性アデノウイルスミニプラスミドとして提供することができる。
【０２２５】
さらに、ヘルパーウイルスの機能は、ヘルパー配列が染色体中に包埋された、または安定な染色体外エレメントとして維持された、パッケージング細胞により提供され得る。一般的に、ヘルパーウイルスの配列は、AAVビリオン中にパッケージングすることができず、例えば、TRと近接しない。
【０２２６】
当業者は、単一のヘルパー構築物上にAAVのreplicationおよびcapsid配列ならびにヘルパーウイルス配列（例えば、アデノウイルス配列）を提供することが有利な場合があることを認識している。このヘルパー構築物は、非ウイルス構築物またはウイルス構築物であり得る。非限定的な一例として、ヘルパー構築物は、AAV rep/cap遺伝子を含むハイブリッドアデノウイルスまたはハイブリッドヘルペスウイルスであることができる。
【０２２７】
特定の一態様では、AAV rep/cap配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターにより供給される。このベクターは、さらに核酸鋳型をさらに含むことができる。AAV rep/cap配列および／またはrAAV鋳型は、アデノウイルスの欠失領域（例えば、E1aまたはE3領域）に組み入れることができる。
【０２２８】
さらなる態様では、AAV rep/cap配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターにより供給される。この態様によると、rAAV鋳型は、プラスミド鋳型として提供することができる。
【０２２９】
別の例証的な態様では、AAV rep/cap配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターにより提供され、rAAV鋳型は、プロウイルスとして細胞に組み入れられる。あるいは、rAAV鋳型は、細胞内に染色体外エレメントとして（例えば、EBVベースの核エピソームとして）維持されるEBVベクターにより提供される。
【０２３０】
さらに例示的な態様では、AAV rep/cap配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーにより提供される。rAAV鋳型は、別々の複製ウイルスベクターとして提供することができる。例えば、rAAV鋳型は、rAAV粒子または第2の組み換えアデノウイルス粒子により提供することができる。
【０２３１】
前述の方法により、ハイブリッドアデノウイルスベクターは、典型的には、アデノウイルスの複製およびパッケージングに十分なアデノウイルス5'および3'シス配列（すなわち、アデノウイルス末端反復およびPAC配列）を含む。AAV rep/cap配列および存在する場合に、rAAV鋳型は、アデノウイルス骨格中に包埋され、5'および3'シス配列と近接し、それにより、これらの配列は、アデノウイルスカプシド中にパッケージングされる場合がある。上記のように、アデノウイルスヘルパー配列およびAAV rep/cap配列は、これらの配列がAAVビリオン中にパッケージングされないように、一般的に、TRと近接しない。
【０２３２】
Zhangら（(2001) Gene Ther. 18:704-12）は、アデノウイルスとAAV repおよびcap遺伝子との両方を含むキメラヘルパーについて記載している。
【０２３３】
ヘルペスウイルスはまた、AAVパッケージング法におけるヘルパーウイルスとしても使用される場合がある。
【０２３４】
AAV Repタンパク質をコードするハイブリッドヘルペスウイルスは、拡大縮小できるAAVベクター生成スキームを有利に促進し得る。AAV-2 repおよびcap遺伝子を発現するハイブリッド単純ヘルペスウイルスI型（HSV-1）ベクターが記述されている（Conway et al., (1999) Gene Therapy 6:986および国際公開公報第00/17377号）。
【０２３５】
さらなる代替として、バキュロウイルスベクターを使用して昆虫細胞において本発明のウイルスベクターを生成して、例えば、Urabe et al., (2002) Human Gene Therapy 13:1935-43に記載されているようにrep/cap遺伝子およびrAAV鋳型を送達することができる。
【０２３６】
混入ヘルパーウイルスを含まないAAVベクターストックは、当技術分野において公知の任意の方法によって取得可能である。例えば、AAVおよびヘルパーウイルスは、サイズに基づき容易に区別され得る。AAVはまた、ヘパリン基質に対する親和性に基づきヘルパーウイルスから分離除去され得る（Zolotukhin et al. (1999) Gene Therapy 6:973）。いかなる混入ヘルパーウイルスも複製不適格であるように、欠失型複製欠損ヘルパーウイルスを使用することができる。さらなる代替として、後期遺伝子発現を欠如するアデノウイルスヘルパーが採用される場合がある。それは、アデノウイルス初期遺伝子の発現だけが、AAVウイルスのパッケージングを媒介するために必要とされるからである。後期遺伝子の発現を欠損するアデノウイルス変異体は、当技術分野において公知である（例えば、ts100Kおよびts149アデノウイルス変異体）。
【０２３７】
組み換えウイルスベクター
本発明は、細胞に核酸分子を投与する方法であって、細胞を本発明のウイルスベクター、AAV粒子および／または組成物もしくは薬学的製剤と接触させることを含む方法を提供する。
【０２３８】
本発明は、核酸を対象に送達する方法であって、対象に本発明のウイルスベクター、AAV粒子および／または組成物もしくは薬学的製剤を投与することを含む方法をさらに提供する。
【０２３９】
特定の態様では、対象は、ヒトであり、いくつかの態様では、対象は、遺伝子療法プロトコルにより処置できる障害を有する、またはその危険がある。このような障害の非限定的な例には、デュシェンヌまたはベッカー型筋ジストロフィーを含む筋ジストロフィー、血友病A、血友病B、多発性硬化症、糖尿病、ゴーシェ病、ファブリー病、ポンペ病、がん、関節炎、筋消耗、うっ血性心不全または末梢動脈疾患を含む心疾患、内膜肥厚、てんかん、ハンチントン病、パーキンソン病またはアルツハイマー病を含む神経障害、自己免疫疾患、嚢胞性線維症、サラセミア、ハーラー症候群、スライ症候群、シャイエ症候群、ハーラー-シャイエ症候群、ハンター症候群、サンフィリッポ症候群A、B、C、D、モルキオ症候群、マロトー-ラミー症候群、クラッベ病、フェニルケトン尿症、バッテン病、脊髄性脳性運動失調、LDL受容体欠損、高アンモニア血症、貧血、関節炎、黄斑変性を含む網膜変性障害、アデノシンデアミナーゼ欠損、代謝障害、および腫瘍形成性のがんを含むがんが含まれる。
【０２４０】
本発明の方法のいくつかの態様では、本発明のウイルスベクター、AAV粒子および／または組成物もしくは薬学的製剤は、骨格筋、心筋および／または横隔膜筋に投与することができる。
【０２４１】
本明細書に記載の方法では、本発明のウイルスベクター、AAV粒子および／または組成物もしくは薬学的製剤は、全身経路を介して（例えば、静脈内、動脈内、腹腔内など）本発明の対象に投与／送達することができる。いくつかの態様では、ウイルスベクターおよび／または組成物は、脳室内、大槽内、実質内、頭蓋内および／またはくも膜下腔内経路を介して対象に投与することができる。特定の態様では、本発明のウイルスベクターおよび／または薬学的製剤は、静脈内投与される。
【０２４２】
本発明のウイルスベクターは、細胞への核酸分子のインビトロ、エクスビボ、およびインビボ送達に有用である。特に、ウイルスベクターは、哺乳動物細胞を含む動物細胞に核酸分子を送達または移入するために有利に採用することができる。
【０２４３】
任意の関心対象の異種核酸配列を、本発明のウイルスベクターで送達し得る。関心対象の核酸分子には、治療用ポリペプチド（例えば、医学的もしくは獣医学的使用のため）および／または免疫原性ポリペプチド（例えば、ワクチン用）を含むポリペプチドをコードする核酸分子が含まれる。
【０２４４】
治療用ポリペプチドには、非限定的に、嚢胞性線維症膜貫通型調節タンパク質（CFTR）、ジストロフィン（ミニ-およびマイクロ-ジストロフィンを含む、例えば、Vincent et al., (1993) Nature Genetics 5:130；米国特許出願公開第2003/017131号；国際公開公報第2008/088895号、Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13714-13719 (2000)；およびGregorevic et al., Mol. Ther. 16:657-64 (2008)を参照されたい）、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンII型可溶性受容体、IGF-1、IカッパBドミナント変異体などの抗炎症ポリペプチド、サルコスパン（sarcospan）、ユートロフィン（Tinsley et al., (1996) Nature 384:349）、ミニ-ユートロフィン、凝固因子（例えば、第VIII因子、第IX因子、第X因子、その他）、エリスロポエチン、アンジオスタチン、エンドスタチン、カタラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、LDL受容体、リポタンパク質リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、β-グロビン、α-グロビン、スペクトリン、α1-アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼA、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ、RP65タンパク質、サイトカイン（例えば、α-インターフェロン、β-インターフェロン、インターフェロン-γ、インターロイキン-2、インターロイキン-4、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシン、およびその他）、ペプチド増殖因子、神経栄養因子およびホルモン（例えば、ソマトトロピン、インスリン、インスリン様増殖因子1および2、血小板由来増殖因子、上皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子、神経成長因子、神経栄養因子-3および-4、脳由来神経栄養因子、骨形成タンパク質［RANKLおよびVEGFを含む］、グリア由来増殖因子、形質転換増殖因子-αおよび-β、およびその他）、リソソーム酸性α-グルコシダーゼ、α-ガラクトシダーゼA、受容体（例えば、腫瘍壊死増殖因子-α可溶性受容体）、S100A1、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ6型、カルシウムハンドリングをモジュレートする分子（例えば、SERCA2A、PP1阻害剤1およびその断片［例えば、国際公開公報第2006/029319号および同第2007/100465号］）、Gタンパク質共役受容体キナーゼ2型ノックダウンに影響する分子、例えば切断型構成的活性bARKct、IRAPなどの抗炎症因子、抗ミオスタチンタンパク質、アスパルトアシラーゼ、モノクローナル抗体（単鎖モノクローナル抗体を含む；例示的なMabは、Herceptin（登録商標）Mabである）、神経ペプチドおよびその断片（例えば、ガラニン、ニューロペプチドY（米国特許第7,071,172号参照）、バソヒビンおよび他のVEGF阻害剤などの血管新生阻害剤（例えば、バソヒビン2［WOJP2006/073052参照］）が含まれる。他の例証的な異種核酸配列は、自殺遺伝子生成物（例えば、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、および腫瘍壊死因子）、がん治療に使用される薬物に対する耐性を付与するタンパク質、腫瘍抑制遺伝子生成物（例えば、p53、Rb、Wt-1）、TRAIL、FAS-リガンド、ならびにそれを必要とする対象において治療効果を有する任意の他のポリペプチドをコードする。AAVベクターは、また、モノクローナル抗体および抗体断片、例えば、ミオスタチンに対す���抗体または抗体断片を送達するために使用することもできる（例えば、Fang et al., Nature Biotechnology 23:584-590 (2005)を参照されたい）。
【０２４５】
ポリペプチドをコードする異種核酸配列には、レポーターポリペプチド（例えば、酵素）をコードするものが含まれる。レポーターポリペプチドは、当技術分野において公知であり、それらには、非限定的に、緑色蛍光タンパク質（GFP）、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれる。
【０２４６】
任意で、異種核酸分子は、分泌型ポリペプチド（例えば、そのネイティブな状態で分泌型ポリペプチドである、または、例えば当技術分野において公知のように分泌シグナル配列との機能的関連により、分泌されるように操作されたポリペプチド）をコードする。
【０２４７】
あるいは、本発明の特定の態様では、異種核酸分子は、アンチセンス核酸分子、リボザイム（例えば、米国特許第5,877,022号に記載）、スプライセオソーム媒介トランススプライシングに影響するRNA（Puttaraju et al., (1999) Nature Biotech. 17:246；米国特許第6,013,487号；米国特許第6,083,702号参照）、遺伝子サイレンシングを媒介するsiRNA、shRNAまたはmiRNAを含む干渉性RNA（RNAi）（Sharp et al., (2000) Science 287:2431参照）、および「ガイド」RNAなどの他の非翻訳RNA（Gorman et al., (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:4929；Yuanらの米国特許第5,869,248号）、およびその他をコードする場合がある。例示的な非翻訳RNAには、多剤耐性（MDR）遺伝子生成物に対するRNAi（例えば、腫瘍を処置および／もしくは予防するためならびに／または化学療法による損傷を予防するために心臓に投与するため）、ミオスタチンに対するRNAi（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのため）、VEGFに対するRNAi（例えば、腫瘍を処置および／または予防するため）、ホスホランバンに対するRNAi（例えば、心血管疾患を処置するため、例えば、Andino et al., J. Gene Med. 10:132-142 (2008)およびLi et al., Acta Pharmacol Sin. 26:51-55 (2005)を参照されたい）；ホスホランバン阻害またはドミナントネガティブ分子、例えばホスホランバンS16E（例えば、心血管疾患を処置するため、例えば、Hoshijima et al. Nat. Med. 8:864-871 (2002)参照）、アデノシンキナーゼに対するRNAi（例えば、てんかんのため）、ならびに病原生物およびウイルスに対するRNAi（例えば、Bおよび／またはC型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、CMV、単純ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルス、その他）が含まれる。
【０２４８】
さらに、選択的スプライシングを指令する核酸配列を送達することができる。例証すると、ジストロフィンのエクソン51の5'および／または3'スプライス部位に相補的なアンチセンス配列（または他の阻害配列）をU1またはU7核内低分子（sn）RNAプロモータと併せて送達して、このエクソンのスキッピングを誘導することができる。例えば、アンチセンス／阻害配列の5'に位置するU1またはU7 snRNAプロモータを含むDNA配列をパッケージングし、本発明の修飾カプシド中に送達することができる。
【０２４９】
ウイルスベクターは、また、宿主細胞染色体の座位と相同性を共有し、それと組み換えする異種核酸分子を含む場合もある。このアプローチを利用して、例えば、宿主細胞における遺伝的欠陥を修正することができる。
【０２５０】
本発明はまた、例えば、ワクチン接種用の、免疫原性ポリペプチド、ペプチドおよび／またはエピトープを発現するウイルスベクターも提供する。核酸分子は、非限定的に、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、サル免疫不全ウイルス（SIV）、インフルエンザウイルス、HIVまたはSIV gagタンパク質、腫瘍抗原、がん抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、およびその他由来の免疫原を含む、当技術分野において公知の関心対象の任意の免疫原をコードし得る。
【０２５１】
ワクチンベクターとしてのパルボウイルスの使用は当技術分野において公知である（例えば、Miyamura et al., (1994) Proc. Nat. Acad. Sci USA 91:8507；Youngらの米国特許第5,916,563号、Mazzaraらの米国特許第5,905,040号、Samulskiらの米国特許第5,882,652号、および同第5,863,541号を参照されたい）。抗原は、パルボウイルスカプシド中にもたらされる場合がある。あるいは、免疫原または抗原は、組み換えベクターゲノム中に導入された異種核酸分子から発現される場合がある。本明細書において記載および／または当技術分野において公知の、関心対象の任意の免疫原または抗原を、本発明のウイルスベクターにより提供することができる。
【０２５２】
免疫原性ポリペプチドは、免疫応答を誘発するため、ならびに／または非限定的に、微生物、細菌、原虫、寄生虫、真菌および／もしくはウイルス感染および疾患を含む、感染および／もしくは疾患から対象を防御するために適した、任意のポリペプチド、ペプチド、および／またはエピトープであることができる。例えば、免疫原性ポリペプチドは、オルトミクソウイルス免疫原（例えば、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（HA）表面タンパク質もしくはインフルエンザウイルス核タンパク質、もしくはウマインフルエンザウイルス免疫原などのインフルエンザウイルス免疫原）またはレンチウイルス免疫原（例えば、ウマ伝染性貧血ウイルス免疫原、サル免疫不全ウイルス（SIV）免疫原、もしくはヒト免疫不全ウイルス（HIV）免疫原、例えばHIVもしくはSIVエンベロープGP160タンパク質、HIVもしくはSIVマトリックス／カプシドタンパク質、およびHIVもしくはSIV gag、polおよびenv遺伝子生成物）であることができる。免疫原性ポリペプチドは、また、アレナウイルス免疫原（例えば、ラッサ熱ウイルスヌクレオカプシドタンパク質およびラッサ熱エンベロープ糖タンパク質などのラッサ熱ウイルス免疫原）、ポックスウイルス免疫原（例えば、ワクシニアL1またはL8遺伝子生成物などのワクシニアウイルス免疫原）、フラビウイルス免疫原（例えば、黄熱病ウイルス免疫原または日本脳炎ウイルス免疫原）、フィロウイルス免疫原（例えば、エボラウイルス免疫原、またはマールブルグウイルス免疫原、例えばNPおよびGP遺伝子生成物）、ブニヤウイルス免疫原（例えば、RVFV、CCHF、および／またはSFSウイルス免疫原）、またはコロナウイルス免疫原（例えば、感染性ヒトコロナウイルス免疫原、例えばヒトコロナウイルスエンベロープ糖タンパク質、またはブタ伝染性胃腸炎ウイルス免疫原、またはトリ伝染性気管支炎ウイルス免疫原）であることもできる。免疫原性ポリペプチドは、さらに、ポリオ免疫原、ヘルペス免疫原（例えば、CMV、EBV、HSV免疫原）、ムンプス免疫原、麻疹免疫原、風疹免疫原、ジフテリア毒素もしくは他のジフテリア免疫原、百日咳抗原、肝炎（例えば、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、その他）免疫原、および／または免疫原として当技術分野において現在公知もしくはのちに同定される任意の他のワクチン免疫原であることができる。
【０２５３】
あるいは、免疫原性ポリペプチドは、任意の腫瘍細胞抗原またはがん細胞抗原であることができる。任意で、腫瘍抗原またはがん抗原は、がん細胞の表面に発現される。例示的ながん細胞抗原および腫瘍細胞抗原は、S.A. Rosenberg（Immunity 10:281 (1991)）に記載されている。他の例証となるがん抗原および腫瘍抗原には、非限定的に：BRCA1遺伝子生成物、BRCA2遺伝子生成物、gp100、チロシナーゼ、GAGE-1/2、BAGE、RAGE、LAGE、NY-ESO-1、CDK-4、β-カテニン、MUM-1、カスパーゼ-8、KIAA0205、HPVE、SART-1、PRAME、p15、メラノーマ腫瘍抗原（Kawakami et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3515；Kawakami et al., (1994) J. Exp. Med., 180:347；Kawakami et al., (1994) Cancer Res. 54:3124）、MART-1、gp100 MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、CEA、TRP-1、TRP-2、P-15、チロシナーゼ（Brichard et al., (1993) J. Exp . Med. 178:489）；HER-2/neu遺伝子生成物（米国特許第4,968,603号）、CA 125、LK26、FB5（エンドシアリン（endosialin））、TAG 72、AFP、CA19-9、NSE、DU-PAN-2、CA50、SPan-1、CA72-4、HCG、STN（シアリルTn抗原）、c-erbB-2タンパク質、PSA、L-CanAg、エストロゲン受容体、乳脂肪グロブリン、p53腫瘍抑制タンパク質（Levine, (1993) Ann. Rev. Biochem. 62:623）；ムチン抗原（国際公開公報第90/05142号）；テロメラーゼ；核マトリックスタンパク質；前立腺酸性ホスファターゼ；パピローマウイルス抗原；および／または以下のがんと関連することが現在公知もしくはのちに発見される抗原：メラノーマ、腺がん、胸腺腫、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫）、肉腫、肺がん、肝臓がん、結腸がん、白血病、子宮がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、膀胱がん、腎臓がん、膵臓がん、脳がんおよび現在公知またはのちに同定される任意の他のがんまたは悪性状態が含まれる（例えば、Rosenberg, (1996) Ann. Rev. Med. 47:481-91を参照されたい）。
【０２５４】
さらなる代替として、異種核酸分子は、望ましくは細胞中でインビトロ、エクスビボ、またはインビボ生成される任意のポリペプチド、ペプチドおよび／またはエピトープをコードすることができる。例えば、ウイルスベクターを培養細胞に導入して、発現された遺伝子生成物をそこから単離し得る。
【０２５５】
関心対象の異種核酸分子は適切な制御配列と機能的に関連できることが、当業者により理解されるであろう。例えば、異種核酸分子は、転写／翻訳制御シグナル、複製起点、ポリアデニル化シグナル、配列内リボソーム進入部位（IRES）、プロモータ、および／またはエンハンサ、およびその他などの発現制御エレメントと機能的に関連することができる。
【０２５６】
さらに、関心対象の異種核酸分子の調節発現は、転写後レベルで、例えば、オリゴヌクレオチド、小分子および／またはスプライシング活性を特定の部位で選択的にブロックする他の化合物の存在または不在により異なるイントロンの選択的スプライシングを（例えば、WO2006/119137に記載されているように）調節することにより、達成することができる。
【０２５７】
当業者は、所望のレベルおよび組織特異的発現に応じて、多様なプロモータ／エンハンサエレメントを使用できることを認識している。プロモータ／エンハンサは、所望の発現パターンに応じて構成的または誘導性であることができる。プロモータ／エンハンサは、ネイティブまたは外来であることができ、天然または合成配列であることができる。外来とは、転写開始領域が、転写開始領域の導入される野生型宿主に見られないことを意図する。
【０２５８】
特定の態様では、プロモータ／エンハンサエレメントは、処置すべき標的細胞または対象に対してネイティブであることができる。代表的な態様では、プロモータ／エンハンサエレメントは、異種核酸配列に対してネイティブであることができる。
【０２５９】
プロモータ／エンハンサエレメントは一般的に、それが関心対象の標的細胞において機能するように選択される。さらに、特定の態様では、プロモータ／エンハンサエレメントは、哺乳動物プロモータ／エンハンサエレメントである。プロモータ／エンハンサエレメントは、構成的または誘導性であり得る。
【０２６０】
誘導性発現制御エレメントは、典型的には、異種核酸配列の発現に調節をもたらすことが理想的な適用において有利である。遺伝子送達用の誘導性プロモータ／エンハンサエレメントは、組織特異的または選好的プロモータ／エンハンサエレメントであることができ、それらには、筋肉特異的または選好的（心筋、骨格筋および／または平滑筋特異的または選好的を含む）、神経組織特異的または選好的（脳特異的または選好的を含む）、眼特異的または選好的（網膜特異的および角膜特異的を含む）、肝臓特異的または選好的、骨髄特異的または選好的、膵臓特異的または選好的、脾臓特異的または選好的、および肺特異的または選好的プロモータ／エンハンサエレメントが含まれる。他の誘導性プロモータ／エンハンサエレメントには、ホルモン誘導性および金属誘導性エレメントが含まれる。例示的な誘導性プロモータ／エンハンサエレメントには、非限定的に、Tet on/offエレメント、RU486誘導性プロモータ、エクジソン誘導性プロモータ、ラパマイシン誘導性プロモータ、およびメタロチオネインプロモータが含まれる。
【０２６１】
異種核酸配列が転写され、次に標的細胞において翻訳される態様では、挿入されたタンパク質コード配列の効率的な翻訳のために、特異的開始シグナルが一般的に含められる。ATG開始コドンおよび隣接配列を含む場合があるこれらの外因性翻訳制御配列は、天然および合成の両方の多様な起源であることができる。
【０２６２】
本発明によるウイルスベクターは、分裂細胞および非分裂細胞を含む広範囲の細胞内に異種核酸分子を送達するための手段を提供する。例えば、ポリペプチドをインビトロで生成するためまたはエクスビボもしくはインビボ遺伝子療法のためにウイルスベクターを採用して、関心対象の核酸分子を細胞にインビトロで送達することができる。ウイルスベクターは、それを必要とする対象に核酸を送達して、例えば、免疫原性もしくは治療用ポリペプチドまたは機能性RNAを発現させる方法に追加的に有用である。このようにして、ポリペプチドまたは機能性RNAを対象においてインビボで生成することができる。対象は、ポリペプチドの欠損を有するせいで、ポリペプチドを必要とする対象であり得る。
【０２６３】
さらに、対象におけるポリペプチドまたは機能性RNAの生成が何らかの有益効果を与える可能性を理由として、この方法を実施することができる。
【０２６４】
また、ウイルスベクターを使用して、関心対象のポリペプチドまたは機能性RNAを培養細胞または対象において（例えば、ポリペプチドを生成するためまたは例えばスクリーニング方法に関連して対象に及ぼす機能性RNAの効果を観察するためのバイオリアクターとして対象を使用して）生成することもできる。
【０２６５】
一般に、本発明のウイルスベクターを採用して、ポリペプチドまたは機能性RNAをコードする異種核酸分子を送達して、治療用ポリペプチドまたは機能性RNAを送達することが有益な任意の障害または疾患状態を処置および／または予防することができる。例証となる疾患状態には、非限定的に：嚢胞性線維症（嚢胞性線維症膜貫通型調節タンパク質）および他の肺疾患、血友病A（第VIII因子）、血友病B（第IX因子）、サラセミア（β-グロビン）、貧血（エリスロポエチン）および他の血液障害、アルツハイマー病（GDF；ネプリライシン）、多発性硬化症（β-インターフェロン）、パーキンソン病（グリア細胞株由来神経栄養因子［GDNF］）、ハンチントン病（反復を除去するためのRNAi）、筋萎縮性側索硬化症、てんかん（ガラニン、神経栄養因子）、および他の神経障害、がん（エンドスタチン、アンジオスタチン、TRAIL、FAS-リガンド、インターフェロンを含むサイトカイン；VEGFまたは多剤耐性遺伝子生成物に対するRNAiを含むRNAi、mir-26a［例えば、肝細胞がんについて］）、糖尿病（インスリン）、デュシェンヌ型を含む筋ジストロフィー（ジストロフィン、ミニ-ジストロフィン、インスリン様増殖因子I、サルコグリカン［例えば、α、β、γ］、ミオスタチンに対するRNAi、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンII型可溶性受容体、抗炎症ポリペプチド、例えば、IカッパBドミナント変異体、サルコスパン、ユートロフィン、ミニ-ユートロフィン、エクソンスキッピングを誘導するためのジストロフィン遺伝子中のスプライスジャンクションに対するアンチセンスまたはRNAi［例えば、WO2003/095647参照］、エクソンスキッピングを誘導するためのU7 snRNAに対するアンチセンス［例えば、WO2006/021724参照］、およびミオスタチンまたはミオスタチンプロペプチドに対する抗体または抗体断片）およびベッカー病、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、ハーラー病（α-L-イズロニダーゼ）、アデノシンデアミナーゼ欠損（アデノシンデアミナーゼ）、グリコーゲン貯蔵疾患（例えば、ファブリー病［α-ガラクトシダーゼ］およびポンペ病［リソソーム酸性α-グルコシダーゼ］）および他の代謝障害、先天性肺気腫（α1-アンチトリプシン）、レッシュ-ナイハン症候群（ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）、ニーマン-ピック病（スフィンゴミエリナーゼ）、テイ-サックス病（リソソームヘキソサミニダーゼA）、メープルシロップ尿症（分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ）、網膜変性疾患（および眼および網膜の他の疾患；例えば、黄斑変性についてのPDGFおよび／または例えば、I型糖尿病における網膜障害を処置／予防するためのバソヒビンもしくはVEGFの他の阻害剤もしくは他の血管新生阻害剤）、脳などの実質臓器の疾患（パーキンソン病［GDNF］、星状細胞腫［エンドスタチン、アンジオスタチンおよび／またはVEGFに対するRNAi］、神経膠芽腫［エンドスタチン、アンジオスタチンおよび／またはVEGFに対するRNAi］を含む）、肝臓、腎臓、うっ血性心不全または末梢動脈疾患（PAD）を含む心臓（例えば、プロテインホスファターゼ阻害剤I（I-1）およびその断片（例えば、I1C）を送達することによる、serca2a、ホスホランバン遺伝子を調節するジンクフィンガータンパク質、Barkct、β2-アドレナリン受容体、β2-アドレナリン受容体キナーゼ（BARK）、ホスホイノシチド-3キナーゼ（PI3キナーゼ）、S100A1S100Al、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ6型、切断型構成的活性bARKctなどのGタンパク質共役受容体キナーゼ2型ノックダウンを引き起こす分子；カルサルシン（calsarcin）、ホスホランバンに対するRNAi；ホスホランバンS16E、その他などのホスホランバン阻害分子またはドミナントネガティブ分子）、関節炎（インスリン様増殖因子）、関節障害（インスリン様増殖因子1および／または2）、内膜肥厚（例えば、enos、inosを送達することによる）、移植心の生存を改善する（スーパーオキシドジスムターゼ）、AIDS（可溶性CD4）、筋消耗（インスリン様増殖因子I）、腎臓欠損（エリスロポエチン）、貧血（エリスロポエチン）、関節炎（IRAPおよびTNFα可溶性受容体などの抗炎症因子）、肝炎（α-インターフェロン）、LDL受容体欠損（LDL受容体）、高アンモニア血症（オルニチントランスカルバミラーゼ）、クラッベ病（ガラクトセレブロシダーゼ）、バッテン病、SCA1、SCA2およびSCA3を含む脊髄性脳性運動失調、フェニルケトン尿症（フェニルアラニンヒドロキシラーゼ）、自己免疫疾患、ならびにその他が含まれる。本発明は、臓器移植の後に移植の成功を増加するためおよび／または臓器移植もしくは補助的療法の（例えば、サイトカイン生成をブロックするために免疫抑制剤もしくは阻害性核酸を投与することによる）負の副作用を低減するためにさらに使用することができる。別の例として、例えば、骨折またはがん患者における外科的除去の後に、骨形成タンパク質（BNP2、7、その他、RANKLおよび／またはVEGFを含む）を骨同種移植片と共に投与することができる。
【０２６６】
また、本発明を使用して、人工多能性幹細胞（iPS）を生成することもできる。例えば、本発明のウイルスベクターを使用して、成体線維芽細胞、皮膚細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、脂肪細胞、心臓細胞、神経系細胞、上皮細胞、内皮細胞、およびその他などの非多能性細胞中に幹細胞関連核酸を送達することができる。幹細胞に関連する因子をコードする核酸は、当技術分野において公知である。幹細胞および多能性に関連するこのような因子の非限定的な例には、Oct-3/4、SOXファミリー（例えば、SOX1、SOX2、SOX3および／もしくはSOX15）、Klfファミリー（例えば、Klf1、Klf2、Klf4および／もしくはKlf5）、Mycファミリー（例えば、C-myc、L-mycおよび／もしくはN-myc）、NANOGならびに／またはLIN28が含まれる。
【０２６７】
また、本発明を実施して、糖尿病（例えば、インスリン）などの代謝障害、血友病（例えば、第IX因子または第VIII因子）、ムコ多糖障害（例えば、スライ症候群［β-グルクロニダーゼ］、ハーラー症候群［α-L-イズロニダーゼ］、シャイエ症候群［α-L-イズロニダーゼ］、ハーラー-シャイエ症候群［α-L-イズロニダーゼ］、ハンター症候群［イズロン酸スルファターゼ］、サンフィリッポ症候群A［ヘパランスルファミダーゼ］、B［N-アセチルグルコサミニダーゼ］、C［アセチル-CoA：α-グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ］、D［N-アセチルグルコサミン6-スルファターゼ］、モルキオ症候群A［ガラクトース-6-硫酸スルファターゼ］、B［β-ガラクトシダーゼ］、マロトー-ラミー症候群［N-アセチルガラクトサミン-4-スルファターゼ］、その他）、ファブリー病（α-ガラクトシダーゼ）、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、またはグリコーゲン貯蔵障害（例えば、ポンペ病；リソソーム酸性α-グルコシダーゼ）などのリソソーム貯蔵障害を処置および／または予防することができる。
【０２６８】
遺伝子移入は、疾患状態のための治療法を理解および提供するために実質的な潜在的有用性を有する。欠陥遺伝子が公知であり、クローニングされている、いくつかの遺伝性疾患がある。一般に、上記疾患状態は、一般的に劣性遺伝する、通常は酵素の欠損状態、および典型的には優性遺伝する、調節タンパク質または構造タンパク質を伴い得る不平衡状態の2つのクラスに分かれる。欠損状態の疾患について、遺伝子移入を使用して、代償療法のために、およびアンチセンス変異を使用して疾患に関する動物モデルを生み出すために罹患組織中に正常遺伝子を入れることができる。不平衡疾患状態について、遺伝子移入を使用してモデル系で疾患状態を生み出すことができ、次に、この疾患状態と対抗することを図ってこのモデルを使用することができる。したがって、本発明によるウイルスベクターは、遺伝性疾患の処置および／または予防を可能にする。
【０２６９】
また、細胞にインビトロまたはインビボで機能性RNAを提供するために、本発明によるウイルスベクターを採用し得る。細胞における機能性RNAの発現は、例えば、細胞による特定の標的タンパク質の発現を低下させることができる。したがって、機能性RNAを投与して、それを必要とする対象における特定のタンパク質の発現を減少させることができる。また、機能性RNAを細胞にインビトロ投与して、遺伝子発現および／または細胞生理を調節して、例えば、細胞もしくは組織培養系またはスクリーニング方法を最適化することもできる。
【０２７０】
加えて、本発明によるウイルスベクターは、関心対象の核酸が、細胞培養系またはその代わりにトランスジェニック動物モデルで一過性または安定的に発現される診断およびスクリーニング方法に用途を見つける。
【０２７１】
また、本発明のウイルスベクターは、当業者に明らかなように、遺伝子ターゲティング、クリアランス、転写、翻訳、その他を判断するためのプロトコルにおける使用を非限定的に含む、様々な非治療目的で使用することもできる。ウイルスベクターは、また、安全性（拡散、毒性、免疫原性、その他）を評価するためにも使用することができる。このようなデータは、例えば、臨床有効性の評価前の規制承認プロセスの一部として米国食品医薬品局により考慮される。
【０２７２】
さらなる局面として、本発明のウイルスベクターは、対象における免疫応答を生成するために使用される場合がある。この態様により、免疫原性ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含むウイルスベクターを対象に投与することができ、対象により免疫原性ポリペプチドに対する能動免疫応答が開始される。免疫原性ポリペプチドは、本明細書上記の通りである。いくつかの態様では、防御免疫応答が誘発される。
【０２７３】
あるいは、ウイルスベクターは、細胞にエクスビボで投与される場合があり、変更された細胞が対象に投与される。異種核酸を含むウイルスベクターは、細胞に導入され、細胞が対象に投与され、そこで免疫原をコードする異種核酸が発現され、対象において免疫原に対する免疫応答を誘導することができる。特定の態様では、細胞は、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）である。
【０２７４】
「能動免疫応答」または「能動免疫」は、「リンパ細網組織内の免疫担当細胞の分化および増殖を伴い、抗体の合成もしくは細胞媒介反応性の発生、またはその両方に繋がる、免疫原と遭遇後の宿主組織および細胞の関与」により特徴付けられる。Herbert B. Herscowitz, Immunophysiology: Cell Function and Cellular Interactions in Antibody Formation、in IMMUNOLOGY: BASIC PROCESSES 117（Joseph A. Bellanti ed., 1985）。別様に述べると、能動免疫応答は、感染またはワクチン接種による免疫原への曝露後の宿主により開始される。能動免疫は、「能動免疫処置された宿主から非免疫宿主への、事前に形成された物質（抗体、伝達因子、胸腺移植片、およびインターロイキン2）の移入」（同上）を経由して獲得される受動免疫と対照的であることができる。
【０２７５】
本明細書において使用される「防御」免疫応答または「防御」免疫は、それが疾患の発生を予防または低減する点で、免疫応答が対象にいくらかの利益を付与することを示す。あるいは、防御免疫応答または防御免疫は、（例えば、がんもしくは腫瘍の形成を予防することにより、がんもしくは腫瘍の退縮を引き起こすことにより、および／または転移を予防することにより、および／または転移結節の成長を予防することにより）疾患、特にがんまたは腫瘍の処置および／または予防に有用であり得る。防御効果は、処置の利益がその任意の欠点を上回るかぎり、完全または部分的であり得る。
【０２７６】
特定の態様では、異種核酸分子を含むウイルスベクターまたは細胞は、下記のように免疫原的有効量で投与することができる。
【０２７７】
本発明のウイルスベクターはまた、1種または複数種のがん細胞抗原（もしくは免疫学的に類似の分子）またはがん細胞に対する免疫応答を生成する任意の他の免疫原を発現するウイルスベクターの投与によりがん免疫療法のために投与することができる。例証すると、免疫応答は、例えば、がんを有する患者を処置するため、および／または対象においてがんが発生することを予防するために、がん細胞抗原をコードする異種核酸を含むウイルスベクターを投与することにより、対象においてがん細胞抗原に対して生成することができる。ウイルスベクターは、本明細書に記載のように、対象にインビボで、またはエクスビボ方法を使用することにより投与される場合がある。あるいは、がん抗原は、ウイルスカプシドの一部として発現される、またはその他の方法でウイルスカプシドと（例えば、上記のように）関連することができる。
【０２７８】
別の代替として、当技術分野において公知の任意の他の治療用核酸（例えば、RNAi）またはポリペプチド（例えば、サイトカイン）は、がんを処置および／または予防するために投与することができる。
【０２７９】
本明細書において使用される、「がん」という用語は、腫瘍形成性のがんを包含する。
【０２８０】
同様に、「がん性組織」という用語は、腫瘍を包含する。「がん細胞抗原」は、腫瘍抗原を包含する。
【０２８１】
「がん」という用語は、それが当技術分野において理解される意味、例えば、身体の遠位部位に拡散する（すなわち、転移する）潜在性を有する、制御されない組織成長を有する。例示的ながんには、非限定的に、メラノーマ、腺がん、胸腺腫、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫）、肉腫、肺がん、肝臓がん、結腸がん、白血病、子宮がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、膀胱がん、腎臓がん、膵臓がん、脳がんおよび現在公知またはのちに同定される任意の他のがんまたは悪性状態が含まれる。代表的な態様では、本発明は、腫瘍形成性がんを処置および／または予防する方法を提供する。
【０２８２】
「腫瘍」という用語は、当技術分野において、例えば、多細胞生物内の未分化細胞の異常な塊としても理解される。腫瘍は、悪性または良性であることができる。代表的な態様では、本明細書開示の方法は、悪性腫瘍を予防および処置するために使用される。
【０２８３】
「がんを処置する」、「がんの処置」という用語および同等の用語により、がんの重症度が低減されるもしくは少なくとも部分的に除去される、ならびに／または疾患の進行が減速および／もしくは制御される、ならびに／または疾患が安定化することが意図される。特定の態様では、これらの用語は、がんの転移が予防されるもしくは低減されるもしくは少なくとも部分的に除去されるおよび／または転移結節の成長が予防されるもしくは低減されるもしくは少なくとも部分的に除去されることを示す。
【０２８４】
「がんの予防」または「がんを予防する」という用語および同等の用語により、この方法が、がんの発生率および／または発生の重症度を少なくとも部分的に除去もしくは低減する、および／または遅延することが意図される。別様に述べると、対象におけるがんの発生は、可能性もしくは確率が低減および／または遅延し得る。
【０２８５】
特定の態様では、がんを有する対象から細胞を取り出し、本発明によるがん細胞抗原を発現するウイルスベクターに接触させる場合がある。次に、改変細胞を対象に投与し、それにより、がん細胞抗原に対する免疫応答が誘発される。この方法は、インビボで十分な免疫応答を開始することができない（すなわち、促進抗体を十分な量で生成することができない）免疫無防備状態の対象に有利に採用することができる。
【０２８６】
免疫応答は、免疫調節サイトカイン（例えば、α-インターフェロン、β-インターフェロン、γ-インターフェロン、ω-インターフェロン、τ-インターフェロン、インターロイキン-1α、インターロイキン-1β、インターロイキン-2、インターロイキン-3、インターロイキン-4、インターロイキン-5、インターロイキン-6、インターロイキン-7、インターロイキン-8、インターロイキン-9、インターロイキン-10、インターロイキン-11、インターロイキン-12、インターロイキン-13、インターロイキン-14、インターロイキン-18、B細胞増殖因子、CD40リガンド、腫瘍壊死因子-α、腫瘍壊死因子-β、単球走化性タンパク質-1、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、およびリンホトキシン）により増強され得ることが、当技術分野において公知である。それゆえに、免疫調節サイトカイン（好ましくは、CTL誘導サイトカイン）が、ウイルスベクターと併せて対象に投与される場合がある。
【０２８７】
サイトカインは、当技術分野において公知の任意の方法により投与し得る。外因性サイトカインが対象に投与される場合があり、またはその代わりに、サイトカインをコードする核酸が、適切なベクターを使用して対象に送達され、サイトカインがインビボで生成される場合がある。
【０２８８】
対象、薬学的製剤、および投与様式
本発明によるウイルスベクター、AAV粒子およびカプシドは、獣医学的および医学的適用の両方に用途が見出される。適切な対象には、トリおよび哺乳動物の両方が含まれる。本明細書において使用される「トリ」という用語には、非限定的に、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、シチメンチョウ、キジ、オウム、インコ、およびその他が含まれる。本明細書において使用される「哺乳動物」という用語には、非限定的に、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ、その他が含まれる。
【０２８９】
ヒト対象には、新生児、乳児、若年、成人および老人対象が含まれる。
【０２９０】
代表的な態様では、対象は、本発明の方法を「必要とする」。
【０２９１】
特定の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体中の本発明のウイルスベクターおよび／またはカプシドおよび／またはAAV粒子ならびに任意で他の薬剤、医薬品、安定化剤、緩衝剤、担体、佐剤、希釈剤、その他を含む薬学的組成物を提供する。注射について、担体は、典型的には液体であろう。他の投与方法について、担体は、固体または液体のいずれかであり得る。吸入投与について、担体は、呼吸用であり、任意で固体または液体粒子状形態であることができる。対象への投与または他の薬学的使用のために、担体は、無菌および／または生理的に適合性である。
【０２９２】
「薬学的に許容される」により、有毒またはその他不要でない物質、すなわち、いかなる望ましくない生物学的作用も引き起こさずに対象に投与され得る物質が意味される。
【０２９３】
本発明の一局面は、細胞に核酸分子をインビトロで移入する方法である。ウイルスベクターは、特定の標的細胞に適した標準的な形質導入方法により、細胞に適切な感染多重度で導入され得る。投与すべきウイルスベクターの力価は、標的細胞の種類および数ならびに特定のウイルスベクターに応じて可変であり、過度の実験なしに当業者により決定されることができる。代表的な態様では、少なくとも約103感染単位、任意で少なくとも約105感染単位が、細胞に導入される。
【０２９４】
ウイルスベクターが導入される細胞は、非限定的に、神経系細胞（末梢および中枢神経系の細胞、特に、脳細胞、例えばニューロンおよび乏突起膠細胞を含む）、肺細胞、眼細胞（網膜細胞、網膜色素上皮、および角膜細胞を含む）、上皮細胞（例えば、腸および呼吸上皮細胞）、筋肉細胞（例えば、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞および／または横隔膜筋細胞を含む）、樹状細胞、膵臓細胞（島細胞を含む）、肝細胞、心筋細胞、骨細胞（例えば、骨髄幹細胞）、造血幹細胞、脾臓細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、生殖細胞、およびその他を含む、任意の種類であることができる。代表的な態様では、細胞は、任意の前駆細胞であることができる。さらなる可能性として、細胞は、幹細胞（例えば、神経幹細胞、肝臓幹細胞）であることができる。なおさらなる代替として、細胞は、がんまたは腫瘍細胞であることができる。そのうえ、細胞は、前述のように、任意の起源種由来であることができる。
【０２９５】
改変細胞を対象に投与するために、ウイルスベクターを細胞にインビトロで導入することができる。特定の態様では、細胞は対象から取り出されたものであり、ウイルスベクターがその中に導入され、次に細胞が対象に戻される。エクスビボ操作のために対象から細胞を取り出し、その後対象に導入し戻す方法は、当技術分野において公知である（例えば、米国特許第5,399,346号を参照されたい）。あるいは、組み換えウイルスベクターをドナー対象由来の細胞に、培養細胞に、または任意の他の適切な起源の細胞に導入することができ、細胞がそれを必要とする対象（すなわち、「レシピエント」対象）に投与される。
【０２９６】
エクスビボ核酸送達に適した細胞は、上記の通りである。対象に投与すべき細胞の投与量は、対象の年齢、状態および種、細胞の種類、細胞により発現される核酸、投与様式、ならびにその他に応じて変動する。典型的には、少なくとも細胞約102〜約108個または少なくとも細胞約103〜約106個が、薬学的に許容される担体中の1用量あたりで投与される。特定の態様では、ウイルスベクターが形質導入された細胞が、薬学的担体と一緒に対象に処置有効量または予防有効量で投与される。
【０２９７】
いくつかの態様では、ウイルスベクターは、細胞に導入され、この細胞を対象に投与して、送達されたポリペプチド（例えば、導入遺伝子としてまたはカプシド中に発現されたもの）に対する免疫原性応答を誘発することができる。典型的には、免疫原的有効量のポリペプチドを発現している細胞の量が、薬学的に許容される担体と一緒に投与される。「免疫原的有効量」は、薬学的製剤が投与される対象においてポリペプチドに対する能動免疫応答を誘起するために十分な、発現されたポリペプチドの量である。特定の態様では、投与量は、防御免疫応答（上に定義）を生成するために十分である。
【０２９８】
免疫原性ポリペプチドを投与する利益がその任意の欠点より勝るかぎり、付与される防御の程度は完全または永続性である必要はない。
【０２９９】
本発明のさらなる局面は、ウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドを対象に投与する方法である。本発明によるウイルスベクターおよび／またはカプシドをそれを必要とするヒト対象または動物に投与することは、当技術分野において公知の任意の手段によることができる。任意で、ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、薬学的に許容される担体中に処置有効用量または予防有効用量で送達される。
【０３００】
本発明のウイルスベクターおよび／またはカプシドをさらに投与して、免疫原性応答を（例えば、ワクチンとして）誘発することができる。典型的には、本発明の免疫原性組成物は、ウイルスベクターおよび／またはカプシドの免疫原性有効量を薬学的に許容される担体と一緒に含む。任意で、投与量は、防御免疫応答（上に定義）を生成するために十分である。免疫原性ポリペプチドを投与する利益がその任意の欠点より勝るかぎり、付与される防御の程度は完全または永続性である必要はない。対象および免疫原は、上記の通りである。
【０３０１】
対象に投与されるべきウイルスベクターおよび／またはカプシドの投与量は、投与様式、処置および／または予防すべき疾患または状態、個別の対象の状態、特定のウイルスベクターまたはカプシド、および送達すべき核酸、およびその他に依存し、日常的な方法で決定することができる。治療効果を達成するための例示的な用量は、少なくとも約105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015形質導入単位、任意で約108〜約1013形質導入単位の力価である。
【０３０２】
特定の態様では、所望のレベルの遺伝子発現を様々な間隔の期間、例えば、毎時、毎日、毎週、毎月、毎年、その他にわたり達成するために、1回よりも多い投与（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、その他、またはより多い投与）が採用され得る。投薬は単一投与量または累積（一続きの投薬）であることができ、当業者により容易に決定されることができる。例えば、疾患または障害の処置は、本明細書開示の薬学的組成物のウイルスベクターの有効用量の1回投与を含む場合がある。あるいは、疾患または障害の処置は、例えば、1日1回、1日2回、1日3回、数日に1回、または1週間に1回などの一連の期間にわたり実施される、ウイルスベクターの有効用量の複数回投与を含む場合がある。投与のタイミングは、個別の症状の重症度などの要因に応じて、個体毎に異なることができる。例えば、本明細書開示のウイルスベクターの有効用量を6ヶ月に1回不定期間または個体がもはや治療を必要としなくなるまで、個体に投与することができる。当業者は、処置の経過全体を通して個体の状態を監視できること、および投与される本明細書開示のウイルスベクターの有効量を適宜調整できることを認識しているであろう。
【０３０３】
一態様では、ウイルスベクターの投与期間は、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、9週間、10週間、11週間、12週間、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、12ヶ月、またはそれよりも長い。さらなる態様では、投与が停止される期間は、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、9週間、10週間、11週間、12週間、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、7ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、10ヶ月、11ヶ月、12ヶ月、またはそれよりも長い。
【０３０４】
例示的な投与様式には、経口、直腸、経粘膜、鼻腔内、吸入（例えば、エアロゾルを介する）、口腔（例えば、舌下）、膣、くも膜下腔内、眼内、経皮、子宮内（または卵内）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、筋肉内［骨格筋、横隔膜筋および／または心筋への投与を含む］、皮内、胸膜内、脳内、および関節内）、局所（例えば、皮膚および気道表面を含む粘膜表面の両方に、ならびに経皮投与）、リンパ内、およびその他、ならびに直接組織または器官注射（例えば、肝臓、骨格筋、心筋、横隔膜筋または脳への）が含まれる。投与は、また、腫瘍へのものであることもできる（例えば、腫瘍またはリンパ節の内部または近く）。任意の所与の場合における最も適切な経路は、処置および／もしくは予防される状態の性質および重症度ならびに使用される特定のベクターの性質に依存するであろう。
【０３０５】
本発明による骨格筋への投与には、非限定的に、四肢（例えば、上腕、前腕、大腿、および／または下腿）、背部、頸部、頭部（例えば、舌）、胸部、腹部、骨盤／会陰、および／または指における骨格筋への投与が含まれる。適切な骨格筋には、非限定的に、小指外転筋（手の）、小指外転筋（足の）、足の母指外転筋、第5中足骨外転筋（abductor ossis metatarsi quinti）、手の短母指外転筋、手の長母指外転筋、短内転筋、足の母指内転筋、長内転筋、大内転筋、手の母指内転筋、肘筋、前斜角筋、膝関節筋、上腕二頭筋、大腿二頭筋、上腕筋、腕橈骨筋、頬筋、烏口腕筋、皺眉筋、三角筋、口角下制筋、下唇下制筋、顎二腹筋、背側骨間筋（手の）、背側骨間筋（足の）、短橈側手根伸筋、長橈側手根伸筋、尺側手根伸筋、小指伸筋、指伸筋、足の短指伸筋、足の長指伸筋、足の短母指伸筋、足の長母指伸筋、示指伸筋、手の短母指伸筋、手の長母指伸筋、橈側手根屈筋、尺側手根屈筋、短小指屈筋（手の）、短小趾屈筋（足の）、足の短指屈筋、足の長指屈筋、深指屈筋、浅指屈筋、足の短母指屈筋、足の長母指屈筋、手の短母指屈筋、手の長母指屈筋、前頭筋、腓腹筋、オトガイ舌骨筋、大殿筋、中殿筋、小殿筋、薄筋、頸腸肋筋、腰腸肋筋、胸腸肋筋、腸骨筋（illiacus）、下双子筋、下斜筋、下直筋、棘下筋、棘間筋、横突間筋（intertransversi）、外側翼突筋、外側直筋、広背筋、口角挙筋、上唇挙筋、上唇鼻翼挙筋、上眼瞼挙筋、肩甲挙筋、長回旋筋（long rotators）、頭最長筋、頸最長筋、胸最長筋、頭長筋、頸長筋、虫様筋（手の）、虫様筋（足の）、咬筋、内側翼突筋、内側直筋、中斜角筋、多裂筋、顎舌骨筋、下頭斜筋、上頭斜筋、外閉鎖筋、内閉鎖筋、後頭筋、肩甲舌骨筋、小指対立筋、母指対立筋、眼輪筋、口輪筋、掌側骨間筋、短掌筋、長掌筋、恥骨筋、大胸筋、小胸筋、短腓骨筋、長腓骨筋、第三腓骨筋、梨状筋、底側骨間筋、足底筋、広頸筋、膝窩筋、後斜角筋、方形回内筋、円回内筋、大腰筋、大腿方形筋、足底方形筋、前頭直筋、外側頭直筋、大後頭直筋、小後頭直筋、大腿直筋、大菱形筋、小菱形筋、笑筋、縫工筋、最小斜角筋、半膜様筋、頭半棘筋、頸半棘筋、胸半棘筋、半腱様筋、前鋸筋、短回旋筋（short rotators）、ヒラメ筋、頭棘筋、頸棘筋、胸棘筋、頭板状筋、頸板状筋、胸鎖乳突筋、胸骨舌骨筋、胸骨甲状筋、茎突舌骨筋、鎖骨下筋、肩甲下筋、上双子筋、上斜筋、上直筋、回外筋、棘上筋、側頭筋、大腿筋膜張筋、大円筋、小円筋、胸部の筋、甲状舌骨筋、前脛骨筋、後脛骨筋、僧帽筋、上腕三頭筋、中間広筋、外側広筋、内側広筋、大頬骨筋および小頬骨筋、ならびに当技術分野において公知の任意の他の適切な骨格筋が含まれる。
【０３０６】
ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、四肢灌流、（任意で、脚および／もしくは腕の四肢分離灌流；例えば Arruda et al., (2005) Blood 105: 3458-3464を参照されたい）、ならびに／または直接筋肉内注射により骨格筋に送達することができる。特定の態様では、ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、対象（例えば、DMDなどの筋ジストロフィーを有する対象）の肢（腕および／または脚）に四肢灌流、任意で四肢分離灌流（例えば、静脈内または関節内投与により）投与される。本発明の態様では、本発明のウイルスベクターおよび／またはカプシドは、「水力学的」技法を採用せずに有利に投与することができる。先行技術のベクターの組織送達（例えば、筋肉へ）は、しばしば、水力学的技法（例えば、大量の静脈内／静脈内投与）により増強され、それは、脈管構造中の圧力を増加させ、ベクターが内皮細胞関門を通過する能力を促進する。特定の態様では、本発明のウイルスベクターおよび／またはカプシドは、大量注入および／または上昇した脈管内圧力（例えば、通常の収縮期圧よりも大きい、例えば、通常の収縮期圧から5％、10％、15％、20％、25％以下の血管内圧の増加）などの、水力学的技法の不在下で投与することができる。このような方法は、浮腫、神経損傷および／またはコンパートメント症候群などの、水力学的技法と関連する副作用を低減または回避し得る。
【０３０７】
心筋への投与には、左房、右房、左室、右室および／または中隔への投与が含まれる。ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、静脈内投与、大動脈内投与などの動脈内投与、直接的心臓注射（例えば、左房、右房、左室、右室内に）、および／または冠状動脈灌流により心筋に送達することができる。
【０３０８】
横隔膜筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、および／または腹腔内投与を含む、任意の適切な方法によることができる。
【０３０９】
標的組織への送達はまた、ウイルスベクターおよび／またはカプシドを含むデポーを送達することにより達成することもできる。代表的な態様では、ウイルスベクターおよび／もしくはカプシドを含むデポーは、骨格筋、心筋および／もしくは横隔膜筋組織内に植え込まれる、または組織を、ウイルスベクターおよび／もしくはカプシドを含むフィルムもしくは他のマトリックスと接触させることができる。このような植え込み可能なマトリックスまたは基材は、米国特許第7,201,898号に記載されている。
【０３１０】
特定の態様では、本発明によるウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドは、骨格筋、横隔膜筋および／または心筋に（例えば、筋ジストロフィー、心疾患［例えば、PADまたはうっ血性心不全］を処置および／または予防するために）投与される。
【０３１１】
代表的な態様では、本発明は、骨格筋、心筋および／または横隔膜筋の障害を処置および／または予防するために使用される。
【０３１２】
代表的な態様では、本発明は、それを必要とする対象における筋ジストロフィーを処置および／または予防する方法であって、本発明のウイルスベクターの処置または予防有効量を哺乳動物対象に投与することを含む方法を提供し、その際、ウイルスベクターは、ジストロフィン、ミニ-ジストロフィン、マイクロ-ジストロフィン、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンII型可溶性受容体、IGF-1、抗炎症ポリペプチド、例えば、IカッパBドミナント変異体、サルコスパン、ユートロフィン、マイクロ-ジストロフィン、ラミニン-α2、α-サルコグリカン、β-サルコグリカン、γ-サルコグリカン、δ-サルコグリカン、IGF-1、ミオスタチンもしくはミオスタチンプロペプチドに対する抗体もしくは抗体断片、および／またはミオスタチンに対するRNAiをコードする異種核酸を含む。特定の態様では、ウイルスベクターは、本明細書の他の箇所に記載するように骨格筋、横隔膜筋および／または心筋に投与することができる。
【０３１３】
あるいは、本発明は、骨格筋、心筋または横隔膜筋に核酸を送達するために実施することができ、それは、障害（例えば、糖尿病［例えば、インスリン］などの代謝障害、血友病［例えば、第IX因子もしくは第VIII因子］、ムコ多糖障害［例えば、スライ症候群、ハーラー症候群、シャイエ症候群、ハーラー-シャイエ症候群、ハンター症候群、サンフィリッポ症候群A、B、C、D、モルキオ症候群、マロトー-ラミー症候群、その他］またはゴーシェ病［グルコセレブロシダーゼ］もしくはファブリー病［α-ガラクトシダーゼA］またはポンペ病［リソソーム酸性αグルコシダーゼ］などのグリコーゲン貯蔵障害などのリソソーム貯蔵障害）を処置および／または予防するために、通常は血中を循環するポリペプチド（例えば、酵素）もしくは機能性RNA（例えば、RNAi、マイクロRNA、アンチセンスRNA）の生成のためのプラットフォームとしてまたは他の組織への全身送達のために使用される。代謝障害を処置および／または予防するための他の適切なタンパク質は、本明細書に記載されている。関心対象の核酸を発現させるためのプラットフォームとしての筋肉の使用は、米国特許出願公開第2002/0192189号に記載されている。
【０３１４】
したがって、一局面として、本発明は、さらに、それを必要とする対象における代謝障害を処置および／または予防する方法であって、本発明のウイルスベクターの処置または予防有効量を対象の骨格筋に投与することを含む方法を包含し、その際、ウイルスベクターは、ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、代謝障害は、ポリペプチドにおける欠損および／または欠陥の結果である。例証となるポリペプチドをコードする代謝障害および異種核酸は、本明細書に記載されている。任意で、ポリペプチドは、分泌される（例えば、そのネイティブな状態で分泌型ポリペプチドである、または例えば、当技術分野において公知の分泌型シグナル配列との機能的関連により分泌されるように操作されている、ポリペプチド）。本発明の任意の特定の理論により限定されることなく、本態様により、骨格筋への投与は、全身循環中へのポリペプチドの分泌および標的組織への送達を招くことができる。骨格筋にウイルスベクターを送達する方法は、本明細書により詳細に記載される。
【０３１５】
本発明はまた、全身送達のためにアンチセンスRNA、RNAiまたは他の機能性RNA（例えば、リボザイム）を生成するため実施することもできる。
【０３１６】
本発明はまた、それを必要とする対象において先天性心不全またはPADを処置および／または予防する方法であって、本発明のウイルスベクターの処置または予防有効量を哺乳動物対象に投与することを含む方法も提供し、その際、ウイルスベクターは、例えば、筋小胞体（sarcoplasmic endoreticulum）Ca2+-ATPアーゼ（SERCA2a）、血管新生因子、ホスファターゼ阻害剤I（I-1）およびその断片（例えば、I1C）、ホスホランバンに対するRNAi；ホスホランバンS16Eなどのホスホランバン阻害またはドミナントネガティブ分子、ホスホランバン遺伝子を調節するジンクフィンガータンパク質、β2-アドレナリン受容体、β2-アドレナリン受容体キナーゼ（BARK）、PI3キナーゼ、カルサルカン（calsarcan）、β-アドレナリン受容体キナーゼ阻害剤（βARKct）、プロテインホスファターゼ1阻害剤1およびその断片（例えば、I1C）、S100A1、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ6型、切断型構成的活性bARKctなどのGタンパク質共役受容体キナーゼ2型ノックダウンを引き起こす分子、Pim-1、PGC-1α、SOD-1、SOD-2、EC-SOD、カリクレイン、HIF、チモシン-β4、mir-1、mir-133、mir-206、mir-208および／またはmir-26aをコードする異種核酸を含む。
【０３１７】
注射剤は、従来の形態で、液剤もしくは懸濁剤、注射前に液体中で溶解もしくは懸濁するのに適した固体形態、またはエマルションのいずれかとして、調製することができる。あるいは、本発明のウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドは、全身的よりもむしろ局所的に、例えばデポー製剤または徐放製剤の状態で投与され得る。さらに、ウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドは、外科的に植え込み可能なマトリックスに接着させて（例えば、米国特許出願公開第2004/0013645号に記載されているように送達することができる。本明細書開示のウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドは、任意の適切な手段により、任意で、ウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドから構成される呼吸可能な粒子のエアロゾル懸濁物を投与することにより、対象の肺に投与することができ、それを対象が吸入する。呼吸可能な粒子は、液体または固体であることができる。ウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドを含む液体粒子のエアロゾルは、当業者に公知であるように、圧力駆動エアロゾルネブライザーまたは超音波ネブライザーなどの任意の適切な手段により生成される場合がある。例えば、米国特許第4,501,729号を参照されたい。ウイルスベクターおよび／またはカプシドを含む固体粒子のエアロゾルは、同様に、薬学分野において公知の技法により、任意の固体粒子状医薬エアロゾル発生装置を用いて生成される場合がある。
【０３１８】
ウイルスベクターおよびウイルスカプシドは、CNS（例えば、脳、眼）の組織に投与することができ、本発明の不在下で観察されるよりも広い分布のウイルスベクターまたはカプシドを有利に与え得る。
【０３１９】
特定の態様では、本発明の送達ベクターは、遺伝障害、神経変性障害、精神障害および腫瘍を含む、CNSの疾患を処置するために投与され得る。CNSの例証となる疾患には、非限定的に、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、カナバン病、リー病、レフサム病、トゥレット症候群、原発性側索硬化症、筋萎縮性側索硬化症、進行性筋萎縮症、ピック病、筋ジストロフィー、多発性硬化症、重症筋無力症、ビンスワンガー病、脊髄または頭部損傷による外傷、テイ-サックス病、レッシュ-ナイハン病、てんかん、脳梗塞、気分障害を含む精神障害（例えば、うつ病、双極性感情障害、持続性感情障害、二次気分障害）、統合失調症、薬物依存（例えば、アルコール依存症および他の物質依存症）、神経症（例えば、不安、強迫障害、身体表現性障害、解離症、悲嘆、産後うつ病）、精神病（例えば、幻覚および妄想）、認知症、パラノイア、注意欠陥障害、精神性的障害、睡眠障害、疼痛性障害、摂食または体重障害（例えば、肥満、悪液質、神経性食欲不振症、および過食症）ならびにCNSのがんおよび腫瘍（例えば、下垂体腫瘍）が含まれる。
【０３２０】
CNSの障害には、網膜、後索（posterior tract）、および視神経に及ぶ眼の障害（例えば、網膜色素変性、糖尿病性網膜症および他の網膜変性疾患、ぶどう膜炎、加齢性黄斑変性、緑内障）が含まれる。
【０３２１】
全てではないにしろ大部分の眼の疾患および障害は、3種類の徴候：（1）血管新生、（2）炎症、および（3）変性のうちの1つまたは複数と関連する。本発明の送達ベクターを採用して、抗血管新生因子；抗炎症因子；細胞変性を遅らせる、細胞の節約を促進する、または細胞の成長を促進する因子、および前記の組み合わせを送達することができる。
【０３２２】
例えば、糖尿病性網膜症は、血管新生により特徴付けられる。糖尿病性網膜症は、眼内（例えば、硝子体中）または眼周囲（例えば、テノン下領域中）のいずれかに1種または複数種の抗血管新生因子を送達することにより処置することができる。また、1種または複数種の神経栄養因子が、眼内（例えば、硝子体内）または眼周囲のいずれかに共送達される場合もある。
【０３２３】
ぶどう膜炎は、炎症を伴う。1種または複数種の抗炎症因子を、本発明の送達ベクターの眼内（例えば、硝子体または前房）投与により投与することができる。
【０３２４】
網膜色素変性は、比較すると、網膜変性により特徴付けられる。代表的な態様では、網膜色素変性は、1種または複数種の神経栄養因子をコードする送達ベクターの眼内（例えば、硝子体）投与により処置することができる。
【０３２５】
加齢性黄斑変性は、血管新生および網膜変性の両方を伴う。この障害は、1種もしくは複数種の神経栄養因子をコードする本発明の送達ベクターを眼内（例えば、硝子体）に、および／または1種もしくは複数種の抗血管新生因子をコードする本発明の送達ベクターを眼内もしくは眼周囲（例えば、テノン下領域中）に投与することにより処置することができる。
【０３２６】
緑内障は、増加した眼圧および網膜の神経節細胞の喪失により特徴付けられる。緑内障のための処置は、本発明の送達ベクターを使用して興奮毒性損傷から細胞を保護する1種または複数種の神経保護剤を投与することを含む。このような薬剤には、眼内に、任意で硝子体内に送達されたN-メチル-D-アスパラギン酸塩（NMDA）アンタゴニスト、サイトカイン、および神経栄養因子が含まれる。
【０３２７】
他の態様では、本発明は、発作を処置するため、例えば、発作の発生、発生率または重症度を低減するために使用される場合がある。発作のための治療的処置の効力は、行動（例えば、震え、眼もしくは口のチック）および／または電気記録手段（大部分の発作は、電気記録的異常のシグネチャーを有する）により判断することができる。したがって、また、本発明を使用して、てんかんを処置することもでき、てんかんは、経時的な複数の発作により特色付けられる。
【０３２８】
代表的な一態様では、ソマトスタチン（またはその活性断片）を、本発明の送達ベクターを使用して脳に投与し、下垂体腫瘍を処置する。この態様によると、ソマトスタチン（またはその活性断片）をコードする送達ベクターが、下垂体へのマイクロ注入により投与される。同様に、このような処置を使用して、先端巨大症（下垂体からの成長ホルモンの異常分泌）を処置することができる。ソマトスタチンの核酸（例えば、GenBankアクセッション番号J00306）およびアミノ酸（例えば、GenBankアクセッション番号P01166；プロセシングされた活性ペプチドソマトスタチン-28およびソマトスタチン-14を含有）の配列は、当技術分野において公知である。
【０３２９】
特定の態様では、ベクターは、米国特許第7,071,172号に記載されたような分泌シグナルを含むことができる。
【０３３０】
本発明の代表的な態様では、ウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドは、CNS（例えば、脳または眼）に投与される。ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、脊髄、脳幹（延髄、脳橋）、中脳（視床下部、視床、視床上部、下垂体、黒質、松果体）、小脳、終脳（線条体、後頭葉、側頭葉、頭頂葉および前頭葉を含む大脳。皮質、基底核、海馬および扁桃体（portaamygdala））、辺縁系、新皮質、線条体、大脳、および下丘に導入される場合がある。ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、また、網膜、角膜および／または視神経などの眼の異なる領域にも投与される場合がある。
【０３３１】
ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、送達ベクターのより分散した投与のために、脳脊髄液中に（例えば、腰椎穿刺により）送達される場合がある。
【０３３２】
ウイルスベクターおよび／またはカプシドはさらに、血液脳関門が撹乱された状況（例えば、脳腫瘍または脳梗塞）では、CNSに血管内投与される場合がある。
【０３３３】
ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、非限定的に、くも膜下腔内、眼内、脳内、脳室内、静脈内（例えば、マンニトールなどの糖の存在下で）、鼻腔内、耳内、眼内（例えば、硝子体内、網膜下、前房）および眼周囲（例えば、テノン下領域）送達、ならびに運動ニューロンへの逆行性送達を伴う筋内送達を含む、当技術分野において公知の任意の経路によりCNSの所望の領域に投与することができる。
【０３３４】
特定の態様では、ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、CNS中の所望の領域または区画への直接的注射（例えば、定位注射）により、液体製剤として投与される。他の実施形態では、ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、所望の領域への局所適用により、またはエアロゾル製剤の鼻腔内投与により提供され得る。眼への投与は、液滴の局所適用によるものであり得る。さらなる代替として、ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、固体の徐放製剤として投与され得る（例えば、米国特許第7,201,898号を参照されたい）。
【０３３５】
なお追加的な態様では、ウイルスベクターは、運動ニューロンに関与する疾患および障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、脊髄性筋萎縮症（SMA）、その他）を処置および／または予防するための逆行性輸送のために使用することができる。例えば、ウイルスベクターを筋肉組織に送達することができ、そこからベクターは、ニューロン中に移行することができる。
【０３３６】
この態様の他の局面では、ウイルスベクターは、疾患または障害の重症度を例えば、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％または少なくとも95％低減する。この態様のなお他の局面では、ウイルスベクターは、疾患または障害の重症度を、例えば、約5％〜約100％、約10％〜約100％、約20％〜約100％、約30％〜約100％、約40％〜約100％、約50％〜約100％、約60％〜約100％、約70％〜約100％、約80％〜約100％、約10％〜約90％、約20％〜約90％、約30％〜約90％、約40％〜約90％、約50％〜約90％、約60％〜約90％、約70％〜約90％、約10％〜約80％、約20％〜約80％、約30％〜約80％、約40％〜約80％、約50％〜約80％、または約60％〜約80％、約10％〜約70％、約20％〜約70％、約30％〜約70％、約40％〜約70％、または約50％〜約70％低減する。
【０３３７】
本明細書開示のウイルスベクターは、本明細書開示のウイルスベクターを溶解するために十分な量で溶媒、エマルションまたは他の希釈剤を含み得る。この態様の他の局面では、本明細書開示のウイルスベクターは、溶媒、エマルションまたは希釈剤を、例えば、約90％（v/v）未満、約80％（v/v）未満、約70％（v/v）未満、約65％（v/v）未満、約60％（v/v）未満、約55％（v/v）未満、約50％（v/v）未満、約45％（v/v）未満、約40％（v/v）未満、約35％（v/v）未満、約30％（v/v）未満、約25％（v/v）未満、約20％（v/v）未満、約15％（v/v）未満、約10％（v/v）未満、約5％（v/v）未満、または約1％（v/v）未満の量で含み得る。この態様の他の局面では、本明細書開示のウイルスベクターは、溶媒、エマルションまたは他の希釈剤を、例えば、約1％（v/v）〜90％（v/v）、約1％（v/v）〜70％（v/v）、約1％（v/v）〜60％（v/v）、約1％（v/v）〜50％（v/v）、約1％（v/v）〜40％（v/v）、約1％（v/v）〜30％（v/v）、約1％（v/v）〜20％（v/v）、約1％（v/v）〜10％（v/v）、約2％（v/v）〜50％（v/v）、約2％（v/v）〜40％（v/v）、約2％（v/v）〜30％（v/v）、約2％（v/v）〜20％（v/v）、約2％（v/v）〜10％（v/v）、約4％（v/v）〜50％（v/v）、約4％（v/v）〜40％（v/v）、約4％（v/v）〜30％（v/v）、約4％（v/v）〜20％（v/v）、約4％（v/v）〜10％（v/v）、約6％（v/v）〜50％（v/v）、約6％（v/v）〜40％（v/v）、約6％（v/v）〜30％（v/v）、約6％（v/v）〜20％（v/v）、約6％（v/v）〜10％（v/v）、約8％（v/v）〜50％（v/v）、約8％（v/v）〜40％（v/v）、約8％（v/v）〜30％（v/v）、約8％（v/v）〜20％（v/v）、約8％（v/v）〜15％（v/v）、または約8％（v/v）〜12％（v/v）の範囲の量で含み得る。
【０３３８】
本明細書の局面は、疾患または障害を患う個体を部分的に処置することを開示する。本明細書において使用される、「処置する」という用語は、個体における疾患もしくは障害の臨床症候を低減もしくは除去すること；または個体における疾患もしくは障害の臨床症候の発症を遅延もしくは予防することを指す。例えば、「処置する」という用語は、疾患または障害により特徴付けられる状態の症候を、例えば、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも100％低減することを意味することができる。特定の疾患または障害と関連する実際の症候は、周知であり、非限定的に、疾患もしくは障害の位置、疾患もしくは障害の原因、疾患もしくは障害の重症度、および／または疾患もしくは障害により冒された組織もしくは器官を含む要因を考慮することにより、当業者によって決定されることができる。当業者は、特定の種類の疾患または障害と関連する適切な症候または指標を知っており、個体が本明細書開示の処置のための候補であるかどうかをどのように判定するかを知っている。
【０３３９】
この態様の局面では、本明細書開示のウイルスベクターの治療有効量は、疾患または障害と関連する症候を、例えば、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または少なくとも100％低減する。この態様の他の局面では、本明細書開示のウイルスベクターの治療有効量は、疾患または障害と関連する症候を、例えば、最大で10％、最大で15％、最大で20％、最大で25％、最大で30％、最大で35％、最大で40％、最大で45％、最大で50％、最大で55％、最大で60％、最大で65％、最大で70％、最大で75％、最大で80％、最大で85％、最大で90％、最大で95％または最大で100％低減する。この態様のなお他の局面では、本明細書開示のウイルスベクターの治療有効量は、疾患または障害と関連する症候を、例えば、約10％〜約100％、約10％〜約90％、約10％〜約80％、約10％〜約70％、約10％〜約60％、約10％〜約50％、約10％〜約40％、約20％〜約100％、約20％〜約90％、約20％〜約80％、約20％〜約20％、約20％〜約60％、約20％〜約50％、約20％〜約40％、約30％〜約100％、約30％〜約90％、約30％〜約80％、約30％〜約70％、約30％〜約60％、または約30％〜約50％低減する。
【０３４０】
一態様では、本明細書開示のウイルスベクターは、患者に投与されるウイルスベクター中にコードされるタンパク質のレベルおよび／または量を、同じ処置を受けていない患者と比較して、例えば、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％または少なくとも95％増加させることが可能である。この態様の他の局面では、ウイルスベクターは、疾患または障害を患う個体における疾患または障害の重症度を、同じ処置を受けていない患者と比較して、例えば、約10％〜約100％、約20％〜約100％、約30％〜約100％、約40％〜約100％、約50％〜約100％、約60％〜約100％、約70％〜約100％、約80％〜約100％、約10％〜約90％、約20％〜約90％、約30％〜約90％、約40％〜約90％、約50％〜約90％、約60％〜約90％、約70％〜約90％、約10％〜約80％、約20％〜約80％、約30％〜約80％、約40％〜約80％、約50％〜約80％、約60％〜約80％、約10％〜約70％、約20％〜約70％、約30％〜約70％、約40％〜約70％、または約50％〜約70％低減することが可能である。
【０３４１】
この態様の局面では、本明細書開示のウイルスベクターの治療有効量は、個体におけるウイルスベクター内にコードされるタンパク質の量を、同じ処置を受けていない個体と比較して、例えば、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％または少なくとも100％増加させる。この態様の他の局面では、本明細書開示のウイルスベクターの治療有効量は、個体における疾患もしくは障害の重症度を、例えば、最大で10％、最大で15％、最大で20％、最大で25％、最大で30％、最大で35％、最大で40％、最大で45％、最大で50％、最大で55％、最大で60％、最大で65％、最大で70％、最大で75％、最大で80％、最大で85％、最大で90％、最大で95％もしくは最大で100％低減する、または個体における疾患もしくは障害の重症度を維持する。この態様のなお他の局面では、本明細書開示のウイルスベクターの治療有効量は、個体における疾患または障害の重症度を、例えば、約10％〜約100％、約10％〜約90％、約10％〜約80％、約10％〜約70％、約10％〜約60％、約10％〜約50％、約10％〜約40％、約20％〜約100％、約20％〜約90％、約20％〜約80％、約20％〜約20％、約20％〜約60％、約20％〜約50％、約20％〜約40％、約30％〜約100％、約30％〜約90％、約30％〜約80％、約30％〜約70％、約30％〜約60％、または約30％〜約50％低減または維持する。
【０３４２】
ウイルスベクターは、個体または患者に投与される。個体または患者は、典型的にはヒトであるが、非限定的に、家畜化されているか否かに関わらずイヌ、ネコ、トリ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、爬虫類および他の動物を含む動物であることができる。
【０３４３】
一態様では、本発明のウイルスベクターを使用して、非限定的に、中枢神経系、網膜、心臓、肺、骨格筋および肝臓を含む特定の組織を標的とするAAVを生み出すことができる。これらの標的指向型ウイルスベクターを使用して、組織特異的な疾患を、または第IX因子（FIX）、第VIII因子、FVIIIおよび当技術分野において公知の他のタンパク質などの特定の正常組織に内因性生成されるタンパク質の生成のために処置することができる。
【０３４４】
中枢神経系の疾患
一態様では、中枢神経系の疾患を、AAVを使用して処置することができ、その際、AAVは、任意のAAV血清型であることができるレシピエントAAVならびにAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9またはAAV10のうちの1つまたは複数より選択されるドナーカプシドを含む。一態様では、レシピエントAAVは、AAV2であり、ドナーカプシドは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9またはAAV10のうちの1つまたは複数より選択される。別の態様では、レシピエントAAVは、AAV3であり、ドナーカプシドは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9またはAAV10のうちの1つまたは複数より選択される。
【０３４５】
網膜疾患
一態様では、網膜疾患を、AAVを使用して処置することができ、その際、AAVは、任意のAAV血清型であることができるレシピエントAAVおよびAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9またはAAV10のうちの1つまたは複数より選択されるドナーカプシドを含む。一態様では、レシピエントAAVは、AAV2であり、ドナーカプシドは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9またはAAV10のうちの1つまたは複数より選択される。別の態様では、レシピエントAAVは、AAV3であり、ドナーカプシドは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7、AAV8、AAV9またはAAV10より選択される。
【０３４６】
心臓疾患
さらなる態様では、心臓の疾患を、AAVを使用して処置することができ、その際、AAVは、任意のAAV血清型であることができるレシピエントAAVおよびAAV1、AAV3、AAV4、AAV6またはAAV9のうちの1つまたは複数より選択されるドナーカプシドを含む。追加的な態様では、レシピエントAAVは、AAV2であり、ドナーカプシドは、AAV1、AAV3、AAV4、AAV6またはAAV9のうちの1つまたは複数より選択される。別の態様では、レシピエントAAVは、AAV3であり、ドナーカプシドは、AAV1、AAV3、AAV4、AAV6またはAAV9のうちの1つまたは複数より選択される。
【０３４７】
肺疾患
一態様では、肺疾患を、AAVを使用して処置することができ、その際、AAV血清型は、任意のAAV血清型であることができるレシピエントAAVおよびAAV1、AAV5、AAV6、AAV9またはAAV10のうちの1つまたは複数より選択されるドナーカプシドを含む。別の態様では、レシピエントAAVは、AAV2であり、ドナーカプシドは、AAV1、AAV5、AAV6、AAV9またはAAV10のうちの1つまたは複数より選択される。さらなる態様では、レシピエントAAVは、AAV3であり、ドナーカプシドは、AAV1、AAV5、AAV6、AAV9またはAAV10のうちの1つまたは複数より選択される。
【０３４８】
骨格筋疾患
さらなる態様では、骨格筋の疾患を、AAVを使用して処置することができ、その際、AAV血清型は、任意のAAV血清型であることができるレシピエントAAVおよびAAV1、AAV2、AAV6、AAV7、AAV8、またはAAV9のうちの1つまたは複数より選択されるドナーカプシドを含む。別の態様では、レシピエントAAVは、AAV2であり、ドナーカプシドは、AAV1、AAV2、AAV6、AAV7、AAV8、またはAAV9のうちの1つまたは複数より選択される。態様では、レシピエントAAVは、AAV3であり、ドナーカプシドは、AAV1、AAV2、AAV6、AAV7、AAV8、またはAAV9のうちの1つまたは複数より選択される。
【０３４９】
肝臓疾患
一態様では、肝臓の疾患を、AAVを使用して処置することができ、その際、AAV血清型は、任意のAAVであることができるレシピエントAAVおよびAAV2、AAV3、AAV6、AAV7、AAV8、またはAAV9のうちの1つまたは複数より選択されるドナーカプシドを含む。追加的な態様では、レシピエントAAVは、AAV2であり、ドナーカプシドは、AAV2、AAV3、AAV6、AAV7、AAV8、またはAAV9のうちの1つまたは複数より選択される。さらなる態様では、レシピエントAAVは、AAV3であり、ドナーカプシドは、AAV2、AAV3、AAV6、AAV7、AAV8、またはAAV9のうちの1つまたは複数より選択される。
【実施例】
【０３５０】
実施例1
アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターは100を超える臨床試験で使用され、特に盲および血友病Bの処置に有望な結果を出している。AAVは、非病原性であり、広い組織向性を有し、分裂細胞または非分裂細胞に感染することができる。より重要なことに、AAVベクター形質導入は、前臨床試験および臨床試験で長期の治療的導入遺伝子発現を誘導した。現時点で、遺伝子送達のために単離された12種類の血清型のAAVがある。それらの中で、AAV8は、マウス肝臓のターゲティングのために最良の血清型であることが示されている。FIX欠損を有する前臨床動物における幅広い研究により、血友病Bを有する患者においてAAV2およびAAV8を使用する第I/II相臨床試験が実施された。これらの試験からの結果は、非常に有望ではあるが、AAV/FIXの投与を受けた患者からのFIXの発現は、同じベクター投与量／kgを使用しても、動物モデルで達成された発現と比例しなかった。FIXをコードするAAV8粒子1×1011個を使用してFIXノックアウトマウスに全身投与すると、血中で正常レベルの160％のFIXが検出された。しかし、AAV8/FIX粒子2×1011個が投与された場合、霊長類においてはFIXの40％しか達成されず、ヒトにおいてはFIXの1％未満しか見出されなかった。これらの種の間でのAAVベクター形質導入後の一貫しないFIX発現は、異なる種における肝実質細胞の向性の変更が原因であり得る。AAV FIX臨床試験からの別の興味深い知見は、AAV形質導入肝実質細胞を全滅させ、ひいては結果として治療の失敗を招くカプシド特異的細胞傷害性Tリンパ球（CTL）応答である。この現象は、AAV送達後の動物モデルにおいては実証されておらず、このことは、前臨床試験と臨床試験との間にまた別の変化があることを示している。はるかに高い用量のAAV/FIXベクターを使用した場合には、AAV2またはAAV8のいずれかを使用した臨床試験の両方においてFIX発現が検出された。しかし、血中FIXレベルは、それぞれ注射の4週間後または9週間後に減少した。さらなる研究により、AAVベクター感染がカプシド特異的CTL応答を誘発し、この応答がAAV形質導入肝実質細胞を除去したようであることが示唆された。したがって、これらの臨床試験からの結果は、ベクターカプシドの負荷を増すことなくAAV形質導入を増強するための効果的なアプローチを探求する必要性を強調している。AAVカプシド抗原を減少させるどのようなベクター改善も、厄介なベクター生産という懸念材料に影響を与え、実現可能な遺伝子治療薬の開発にとって歓迎すべき追加となるであろう。
【０３５１】
AAVベクター形質導入を増大させるために多くの戦略が探求されてきた。1つの戦略は、強いプロモータおよび／またはエンハンサの利用、トランスジェニックcDNAのコドン最適化、効果的なポリアデニル化配列および可能ならば自己相補的ベクターゲノムの使用により、AAVベクターカセットを最適化することである。AAVカプシドのレベルでは、様々な向性を示す天然の血清型、合理的に設計されたカプシドまたは変異体カプシドライブラリから選択もしくはスクリーニングされたカプシドを用いることに多大な注目が集められた。しかし、この手法の欠点は、関連する実験をヒトにおいて実施することができず、ヒトデータを継続して収集するならば、AAVカプシド向性の種間変化が認められ続けることである。AAVベクター形質導入を増強するための第三の方法は、薬理学的物質による細胞生理の変化に依存する。様々な感染レベルでAAV形質導入を増強するために数多くの薬理学的物質が使用されてきた。しかし、これらの薬物の大部分はがん治療薬として使用され、重篤な副作用を有する。
【０３５２】
本発明者らの以前の中和抗体研究において、ヒト血清がAAV形質導入に対して増強された効果を有することが見出された。この研究において、本発明者らは、ヒト血清から、AAVビリオンと直接的に相互作用し、AAV形質導入に影響する能力を有するいくつかのタンパク質を同定した。これらのタンパク質のうち、もっとも興味深いものは、血液中でもっとも豊富なタンパク質であり、臨床診療において広く利用されてきた治療物質、ヒト血清アルブミン（HSA）である。HSAとAAVビリオンとの相互作用がAAV形質導入を増強するならば、この手法をただちにAAV臨床試験に適用することができる。本明細書において、本発明者らは、HSAとAAVベクターとの相互作用がAAV形質導入を増強すること、およびこの増強がインビトロの特定の細胞またはインビボの特定の組織に限定されないことを実証した。AAVベクターとのHSAのインキュベーションがベクター凍結前かベクター解凍後かにかかわらず、匹敵しうる増強が達成された。透析前のベクター調製物へのHSAの添加は、AAV形質導入に対するHSA増強効果に影響しなかった。機序研究は、HSAが、インビトロで標的細胞表面へのAAV結合を増大させ、全身投与後、血液中の急速なクリアランスを生じさせたということを示唆する。中和抗体（Nab）分析は、アルブミンとAAVとの相互作用が、Nabの存在下でもなおAAV形質導入を増強し、かつNab活性に影響しないということを実証した。本発明者らは、この手法を、FIX欠乏マウスにおける血友病の処置に応用した。ヒトアルブミンとともにインキュベートされたAAV/FIXの全身投与後、導入遺伝子FIX発現の増大および表現型補正の改善が達成された。
【０３５３】
ヒト血清はAAV形質導入を増強する
本発明者らの以前の結果は、ヒト血清の存在のみよるAAV形質導入の増強を実証した。本発明者らは、この知見を展開して、10のヒト血清試料を使用してAAV形質導入増強を試験し、ヒト血清とAAVとの相互作用がインビトロでAAVカプシド非依存的に導入遺伝子活性の約4倍の増加を誘導することを見出した（図1a）。AAV8が血友病患者におけるいくつかの臨床試験に使用されていたため、以下の実験にはAAV8カプシドを選択した。導入遺伝子活性の増強は短めの期間で認められたが、最大の効果は、≧2時間のAAVビリオンとの血清インキュベーション後に達成された（図1b）。Huh7細胞中のAAV形質導入に対するヒト血清の増強効果がインビボでも当てはまるかどうかを決定するために、AAV8/lucベクターを、連続希釈血清とともにインキュベートしたのち、眼窩後注射または筋肉注射によって投与した（対側の筋肉には血清なしのベクターを注射した）。図1cおよび1dに示すように、＞3000倍の血清希釈度さえ、肝臓および筋肉中のAAV形質導入をそれぞれ2〜5倍および4〜16倍増強した。また、マウス、イヌ、霊長類およびウシ胎児をはじめとする他の種からの血清とのAAVベクターのインキュベーション後にも、AAV形質導入の増強が実証された（図9および10）。
【０３５４】
ヒト血清アルブミンはAAV形質導入に対して増強効果を及ぼす
上記実験からのデータは、血清の何らかの成分がAAV形質導入をインビトロおよびインビボで増強するということを強く示唆する。形質導入の増強がAAVビリオンと血清タンパク質との直接的な相互作用を要するかどうかを試験するために、本発明者らは5つのコホートを設計した：1. 完全培地中のHuh7細胞と、PBSとともにインキュベートされたAAV、2. 完全培地中のHuh7細胞と、ヒト血清とともにインキュベートされたAAV、3. 無血清培地中のHuh7細胞と、PBSとともにインキュベートされたAAV、4. 無血清培地中のHuh7細胞と、PBSとともにインキュベートされたAAV（その後、ウイルスを細胞に適用する直前に同じ量の血清を培地に加えた）、5. 無血清培地中のHuh7細胞と、ヒト血清とともにインキュベートされたAAV。上記方法と同様に、コホート1と比べ、コホート2において増強された形質導入が達成された。興味深いことに、群3と比べて血清の希釈度が高いコホート4においてAAV形質導入の増大は認められなかったが、コホート5においては形質導入の増大が得られた（図2a）。これらの結果は、AAV形質導入のヒト血清媒介増強がヒト血清タンパク質とAAVビリオンとの直接的な相互作用を要するということを示唆する。4〜16倍希釈のヒト血清で、増加倍率が明らかに「無血清」群中で「完全培地」群中よりもはるかに高いということは興味深い。理由は、完全培地が、AAV形質導入を増強するウシ胎児血清（FBS）を含有するからである。PBSとともにインキュベートされたAAVベクターが、完全培地中に維持される細胞に加えられると、AAVベクターはFBSタンパク質と相互作用し、それが、AAVベクターが無血清培地中の細胞に加えられるときよりもより高い形質導入を誘導する（データは示さず）。どの血清タンパク質がAAV形質導入を増強するのかを同定するために、ヒト血清をAAV8ベクターとともにインキュベートしたのち、無傷のAAV8ビリオンを認識する抗体を使用して、質量分析のためにAAV8結合タンパク質を沈降させた。同定したタンパク質のうち、もっとも興味深いものはヒト血清アルブミンである（表5）。血清アルブミンは、循環中でもっとも豊富なタンパク質であり、多くの臨床現場で広く使用されており、したがって、この研究の主な目的は、AAV形質導入に対するHSAの効果を調べることである。
【０３５５】
AAV8へのHSA結合の質量分析データをさらに確認するために、本発明者らは、AAV8粒子をHSAとともにインキュベートしたのち、ヒトアルブミン抗体を使用してアルブミン結合AAV粒子を沈降させた。次いで、Q-PCRによってAAVゲノムコピー数を定量した。図2bに示すように、アルブミン特異抗体（A80-129A, Bethyl Lab, INC）による免疫沈降は、対照（アイソタイプIgGまたはPBS）と比べて2倍の数のゲノムを沈降させる結果となった。ヒトアルブミンとAAVビリオンとの相互作用がAAV形質導入に影響するかどうかを試験するために、本発明者らは、AAV8粒子をHSA枯渇血清（枯渇度＞99％、図11）または組換えHSAとともにインキュベートした。ヒトアルブミン枯渇血清からの形質導入は完全血清処理ベクターよりも低いということが実証された（図2c）。組換えHSA（rHSA）とともにインキュベートされたAAVベクターもまた、高めの形質導入を生じさせたが、ヒト完全血清と比べると低い程度であった（図2d）。HSAがインビボでAAV形質導入を増強するかどうかを調べるために、AAV8/lucベクターを様々な濃度のrHSAとともにインキュベートしたのち、後眼窩注射または筋肉注射によってマウスに投与した。全身投与後、HSAで前処理されたベクターは肝臓形質導入の増大（1.5〜8倍（図12a））を実証した。筋肉中のヒト血清によるAAV形質導入の刺激と一致するように、rHSAとのAAV8ベクターのインキュベーション後、筋肉中のより高い形質導入（2.1〜11.5倍）が認められた（図12b）。これらの結果は、ヒト血清アルブミンがインビトロおよびインビボでAAV形質導入を増大させることを意味する。
【０３５６】
AAV形質導入に対する臨床等級HSAの増強効果
HSAは臨床的に広く応用されてきたため、次に、本発明者らは、臨床等級HSAがAAV形質導入を増強する能力をも有するかどうかを試験した。正常対象の血液中の血清アルブミン濃度と同一である5％の臨床等級HSAを様々な希釈度のAAVベクターとともにインキュベートしたとき、20,000倍の希釈度でさえ、増大したAAV形質導入がインビトロで認められた（図3a）。次に、本発明者らは、AAV8/lucを様々な希釈倍率で25％HSAとともにインキュベートしたのち、後眼窩注射または筋肉注射を実施した。1倍希釈は、1ml溶液中、25％HSA10ulとともにインキュベートされるAAV粒子1×1012個と定義する。図3bおよび3cに示すように、臨床等級HSAは、AAV8形質導入を有意に、肝臓および筋肉中でそれぞれ約3倍または5倍、増大させた。次に、筋肉注射から1、2、4および7週後に、AAV形質導入に対するHSAの長期的効果を記録した（図13）。これらの結果は、臨床等級HSAが持続的な導入遺伝子発現のために筋肉中のAAV形質導入を増強することを示す。また、本発明者らは、AAV2またはAAV9とのHSAのインキュベーションがインビトロおよびインビボではるかに高い形質導入を誘導することを認めた（図14）。
【０３５７】
HSAによるAAV形質導入の増強は凍結／解凍によって変化しない
上記実験において、AAV調製物は、解凍し、HSAとともにインキュベートしたのち、細胞またはマウスに投与した。臨床現場においては、注射の直前に医療スタッフがこのインキュベーションを実施することは実践的ではない可能性がある。したがって、−80℃での貯蔵の前のAAVベクターとのHSAのインキュベーションが、HSA増強AAVベクター形質導入の移行を簡単にするであろう。これを調べるために、本発明者らはまず、AAVベクターを臨床等級HSAとともに4℃で2時間インキュベートした。溶液の半分を−80℃で3日間貯蔵し、他方のアリコートのAAVウイルスをただちに使用して、粒子1×103個／細胞の用量でHuh7細胞に感染させた。凍結したHSA-AAV調製物を解凍したのち、同じやり方でHuh7中のベクター形質導入を分析した。図4aに示すように、HSAベクター凍結保存にかかわらず、ルシフェラーゼ活性の同様な増大が認められた。また、インキュベーションおよび凍結保存後のAAV形質導入のHSA増強が筋肉注射後に認められた（図4bおよび4c）。
【０３５８】
透析前のAAV調製物へのHSA付加後のAAV形質導入
ベクター産生中、精製に使用される方法（CsClまたはカラムクロマトグラフィー）にかかわらず、高濃度の塩を除去するためにベクター透析を実施する必要がある。透析中、HSA中のAAVベクターのインキュベーションがAAV形質導入に影響するかどうかを決定するために、透析の直前に、CsCl密度勾配超遠心法またはアニオン交換カラムによって精製されたAAV8/lucベクターを、粒子1012個の1mlとして、25％ HSAまたはPBS 10ulと混合した。次いで、これらの調合物をPBSに対して透析し、マウスにおいて後眼窩注射または直接筋肉注射によるAAV形質導入を分析した。図5に示すように、透析中のHSAインキュベーションは、肝臓および筋肉中のベクター形質導入を、PBSインキュベーション対照と比べ、それぞれ2倍または4倍、さらに増大させた。増強効果は異なる精製法の場合でも類似していた。この観察結果は、様々なやり方で精製されたベクターの透析の前にヒトアルブミンをAAV調製物に加えて遺伝子送達を増強することができることを意味する。
【０３５９】
アルブミンは標的細胞へのAAV結合能力を高める
効果的なAAV形質導入のための最初の段階は、主受容体および副次受容体を介する標的細胞へのAAVビリオン結合である。AAVベクターとのアルブミンのインキュベーションが細胞結合を高めるかどうかを試験するために、AAV8/lucベクターをHSAまたはPBSとともにインキュベートした。次いで、本発明者らの以前の研究に示されているように、ベクター内在化を防ぐためにHuh7細胞を4℃で加えた。徹底的な洗浄後、全DNAを回収し、Q-PCRによってAAVゲノムコピー数を決定した。図6aに示すように、HSAとのインキュベーションは、Huh7細胞へのAAVベクター結合を有意に3倍高めた。HSAがベクター結合および肝臓による取り込みを増大させるかどうかを決定するために、HSAまたはPBS中でプレインキュベートしたAAV8/lucの粒子1×1011個を後眼窩注射によって投与し、24時間後、ルシフェラーゼ活性を測定した。Huh7細胞で観察された結果と一致するように、肝臓中でより高い形質導入が達成された（図6bおよび6c）。注射から48時間後、マウスを屠殺し、ルシフェラーゼ活性およびAAVゲノムコピー数の定量のために肝臓を採取した。生体の画像分析と同様に、PBSのみの中でインキュベートされたAAVベクターを与えられたマウスの肝臓と比べて、HSAで前処理されたAAVベクターを投与されたマウスの肝臓中でより高いルシフェラーゼ活性およびAAVゲノムコピー数が見出された（図6dおよび6e）。HSAプレインキュベーションを実施した肝臓による、より多くのAAVベクター取り込みの結果は、血液からのベクタークリアランスに相関していた。AAVベクターの投与後、注射から15分および24時間後で、対照マウスと比べて、HSA処理AAVベクターを与えられたマウスの血漿1マイクロリットルあたりのAAVゲノムコピー数のわずかな増加があった（p＞0.05）。しかし、AAV投与から2時間後、HSAコホートにおいてAAVゲノムコピー数の有意な減少が認められた（p＜0.05）。これらの結果は、HSAによるAAVベクター形質導入の増強が標的細胞への粒子結合の増大から生じるということを示唆する。
【０３６０】
アルブミンとAAVとの相互作用は中和抗体活性に干渉しない
ヒトアルブミンとAAVビリオンとの相互作用がAAV中和抗体（Nab）活性をブロックするかどうかを調べるために、本発明者らはNabアッセイをインビトロで実施した。IVIGは、1000を超える対象からプールされた血清であり、様々な血清型に対するAAV Nabを含有する。本発明者らは、まず、AAV8/Lucビリオンを100倍希釈のHSAまたはPBSとともにインキュベートし、次いで、様々な濃度のIVIGを加えた。Huh7細胞への形質導入後、Nab力価を計算した。図7aに示すように、HSAとともにプレインキュベートされたAAVベクターにかかわらず、同じNab力価（IVIGの1：200）が得られた。本発明者らはまた、HSAがAAV Nabの存在下でもなおAAV形質導入を増強することができるかどうかを研究し、AAVとのHSAのインキュベーションが、様々な量のIVIGの存在下、同様な効率でAAV形質導入を増大させることを見出した（図7b）。これらの結果は、HSAとAAVとの相互作用がAAVウイルス感染機序に影響しないということを示唆する。
【０３６１】
ヒトアルブミンを使用してAAVベクター形質導入を増強する血友病Bの表現型補正の改善
HSAとともにインキュベートされたAAVベクターを使用する表現型補正を研究するために、本発明者らは、疾患モデルとしての血友病Bマウスと、血友病B患者における第I相臨床試験で使用されてきたAAV8/FIX-OPTとを使用した。注射後、様々な時点でFIX濃度および機能を測定し、6週目に表現型補正を評価した。図8aに示すように、インキュベートされたAAV8/FIX-OPTを与えられたマウスにおいて、PBSで処理された同じベクターを与えられたマウスよりも5倍の高さのFIXレベルが検出された。同様に、血漿FIX活性は、HSAで処理されたベクターを与えられたマウスにおいてはるかに高かった（図8b）。AAV注射から6週後、ベクター発現ヒト第IX因子のインビボ機能を評価するために、すべてのマウスに尾静脈離断出血負荷試験を実施した。負荷試験後、非処理血友病Bマウスは、WT対照と比べ、深刻な出血（血液30mg／マウス体重1g）を示した。HSA中でインキュベートされたAAVベクターを与えられた血友病Bマウスは、PBS中でインキュベートされたAAVベクターと比べ、失血量の有意な減少を実証した（p＜0.05、図8c）。事実、HSA中でインキュベートされたベクターで処理された血友病マウスは、WT対照の失血と同程度の失血を実証した。これらの結果は、HSAとでプレインキュベートされたAAVベクターを使用する血友病Bの改善された補正を実証し、また、血友病および他の疾患の処置の場合に低めのベクター用量での効力を高めるためのこの調合物の利用可能性を示唆する。
【０３６２】
ヒトAAV FIX試験における低めのFIX発現および高用量のAAVカプシドに対するカプシド特異的CTL応答の観察結果により、低めの用量で効率的な遺伝子送達を維持する、より効率的な戦略の必要性が強調された。本発明者らの以前の報告は、AAV形質導入がヒト血清によって増強されることを記したが、正確な成分は同定されていなかった。したがって、より効率的なAAVベクターの探求のために、本研究の目的は、AAVビリオンと相互作用してより高い形質導入を誘導する、ヒト血清由来の特定のタンパク質を同定することであった。質量分析から同定されたAAV8カプシド相互作用性タンパク質の中で（表5）、HSAとでさらなる実験を遂行した。これらの調査は、組換えまたは臨床等級のHSAとのAAV8のインキュベーションがAAV形質導入を増大させるが、ヒトアルブミン枯渇血清は形質導入を減少させるということを実証した。臨床等級HSAは、マウスの肝臓および骨格筋においてAAV形質導入を有意に増強した。AAVベクター産生および臨床試験におけるHSAの適用を容易にするために、本発明者らの研究は、ヒトアルブミンとのインキュベーション後のAAVベクターの凍結または透析前のAAV調製物へのHSAの添加がさらに形質導入の増強を生じさせるということを実証した。機序研究は、ヒトアルブミンが標的細胞表面へのAAVベクター結合を高め、全身投与後、より高速の血液クリアランスを生じさせたが、AAV感染経路に影響しないということを示唆した。最後に、血友病Bの前臨床マウスモデルにおいて、アルブミンとインキュベートされたAAVベクターは、ヒトFIX発現を増大させ、出血表現型をWTレベルまで改善した。
【０３６３】
血清タンパク質はウイルスと相互作用し、ウイルス感染に影響することができる。たとえば、アデノウイルスは、凝固因子および肝臓ターゲティングのための補体をはじめとする血清タンパク質とのその相互作用に関して広く研究されてきた。本発明者らの以前のNab研究が、Nab活性なしの希釈度の血清が、血清型にかかわらず、実際にAAV形質導入を増強するということを実証した。他の研究が、いくつかの血清タンパク質がAAVビリオンとの相互作用を介してAAV形質導入に対して影響を及ぼすことを見出した。Denardらは、AAVと相互作用するガレクチン3結合タンパク質（G3BP）およびC反応性タンパク質（CRP）を同定した。Denardらは、G3BPとAAVビリオンとの相互作用が、AAV形質導入をブロックするAAV凝集物の形成を招くこと、およびCRPとAAVとの相互作用がより高い形質導入を生じさせることを示した。AAV形質導入のCRP増強は種特異的かつAAV表現型特異的である。別の研究において、Saisらは、AAV2カプシドがC3補体タンパク質に結合してAAVのマクロファージ取り込みを増強し、マクロファージ活性化を誘導するということを実証した。この研究においては、AAVおよび臨床等級HSAのインキュベーションがインビトロおよびインビボで形質導入を増強する。概して、AAV形質導入に対するヒトアルブミンの増強は全血清よりも低い。この知見は、血清中の他のタンパク質もまた、AAV形質導入を増強する役割を演じ得ることを意味する。これらのタンパク質の相互作用がどのようにAAV形質導入に影響するのかを研究することは価値あることであろう。
【０３６４】
ヒトアルブミン処理ウイルスによるAAV形質導入の増強は概して肝臓中よりも筋肉中で高いことが注目される。この現象の説明は、血液が非常に高濃度のアルブミンを含有し、それが、全身注射後、形質導入をある程度増強するということであることができる。対照的に、筋肉組織中に存在するアルブミンはより少なく、したがって、筋肉注射後、アルブミンによる形質導入増大の程度は、IV注射後に認められる形質導入増大の程度よりも大きい。AAVベクターの全身投与後、AAVビリオンはただちにアルブミンと相互作用する。しかし、本発明者らの研究は、AAVビリオンとのHSAのより長いインキュベーションがより高い形質導入の増強を誘導するということを実証した。この結果は、全身投与後、AAVビリオンとのHSAのプレインキュベーションによって形質導入のさらなる増強が達成されるはずであることを示す。この研究においては、ヒト血清アルブミンとともにインキュベートされたAAVビリオンからの形質導入増強が、全身投与および直接注射後、それぞれ肝臓および筋肉中で達成された。肝臓は、全身投与後、循環からより多くのAAVビリオンを取り込むため、血液から逃れるAAVベクターはより少なくなり、心臓および骨格筋のような他の組織を形質導入するということがあり得る。他方、アルブミンで処理されたAAVベクターは筋肉形質導入を増大させる。アルブミンとともにインキュベートされたAAVベクターの全身投与後、心臓または骨格筋中の形質導入の増強を達成することができるかどうかは不明である。全身投与後、心臓および骨格筋中のAAV形質導入を増大させるために、いくつかの肝臓脱標的指向型AAV変異体（AAV2i8およびAAV9.45）が開発され、アルブミンとともにインキュベートされたそのような肝臓脱標的指向型AAVベクターの全身投与後、筋肉中の形質導入増強が達成されるかどうかの試験が進行中である。
【０３６５】
アルブミンは、薬物ターゲティングおよびペプチドまたはタンパク質ベースの薬物の薬物動態プロファイルの改善のための多機能性タンパク質担体として台頭している。エンドサイトーシスを誘導するいくつかのアルブミン受容体が記述されている。アルブミンエンドサイトーシスのための経路は細胞型依存性であり、クラスリンまたはカベオリン媒介エンドサイトーシスを含む。AAVベクターがアルブミンと相互作用する方法は未知であるが、この研究は、AAVとアルブミンとの相互作用が標的細胞のAAV結合能力を高めるということを実証した。これは、アルブミンが、AAVとの相互作用ののち、アルブミン受容体によるAAV結合のための別の層を細胞表面上に提供するという事実によって説明づけることができる。
【０３６６】
アルブミンは血中で長い半減期を有する。アルブミンのホメオスタシス調節が胎児性Fc受容体（FcRn）によって制御されるということが今や明らかになっている。FcRnは、細胞内エンドソーム区画内のアルブミンに結合し、その結果、三元複合体を細胞膜へ輸送してリガンドを循環中に放出して戻すことにより、細胞中の分解からアルブミンを救う。アルブミンのこれらの性質のせいで、形質導入に対するアルブミンとAAVベクターとの相互作用の効果に関するいくつかの問いが生じる。アルブミン取り込みはクラスリンまたはカベオリン媒介エンドサイトーシスを介するものであり、AAV細胞移行はクラスリン媒介エンドサイトーシスによるものであるため、アルブミンとAAVとがエンドサイトーシス経路中で競合するかどうかは不明である。別の問いは、エンドソーム中で、または核の中への輸送中にアルブミンがAAVから解離するかどうかである。第三の問いは、アルブミンエンドサイトーシスまたはトランスサイトーシスがAAV形質導入に影響するかどうかである。第四の問いは、AAVカプシド特異的CTL応答に対する、アルブミンおよびAAVとの相互作用からの形質導入増強の効果である。アルブミンとAAVビリオンとの相互作用は標的細胞表面へのAAV結合を高めるが、その相互作用が細胞内でAAV輸送に影響するということがあり得る。これらの問題のさらなる解明は、AAV遺伝子治療におけるアルブミンの使用のためのより効果的な手法を設計するのに役立つであろう。
【０３６７】
まとめると、本発明者らの研究は、AAVカプシドがヒト血清アルブミンと相互作用し、それがインビトロおよびインビボで形質導入を増大させることを実証した。臨床等級ヒトアルブミンからの形質導入効率増強はまた、他の点では最適以下用量のAAVベクターの全身投与後、血友病Bマウスモデルにおいて表現型補正を可能にした。臨床目的に関し、透析前のAAVウイルス調製物へのヒトアルブミンの添加またはアルブミンとのインキュベーション後のAAVウイルスの凍結もまた、形質導入増強を生じさせる。ヒトアルブミンとのAAVビリオン相互作用の正確な機序は不明であるが、本発明者らの知見は、許容ベクター用量では形質導入が基準に満たない多様な臨床用途にHSAを直ちに含めることに関して重要である。したがって、これらの研究からの本発明者らの結果は、将来の臨床試験においてAAV形質導入効率を高めるためには、透析中にAAVベクターとの臨床等級ヒトアルブミンのインキュベーションを実施すべきであることを強く示す。
【０３６８】
細胞株
HEK293およびHuh7細胞（ATCCから）を、10％ウシ胎児血清およびペニシリン−ストレプトマイシンで補足されたダルベッコ改変イーグル培地中、5％ C02中、37℃で維持した。
【０３６９】
AAVウイルス産生
HEK293細胞中への3プラスミドトランスフェクションを用いる標準的手法を使用してAAVベクターを産生した。簡潔にいうと、AAV導入遺伝子プラスミドpTR/CBA-lucまたはpTTR/FIX-optをAAVヘルパープラスミドおよびアデノウイルスヘルパープラスミドpXX6-80とともにHEK293細胞中に同時トランスフェクトした。60時間後、細胞を採取し、溶解させ、細胞溶解物をCsCl密度勾配超遠心法またはカラム精製に適用した。AAVビリオンを採取し、ドットブロットによって力価測定した。
【０３７０】
個々のヒト血清は、Valley Biomedical（Minchester, VA）から購入し、分取し、将来の使用に備えて−80℃で貯蔵しておいたものであった。
【０３７１】
インビトロAAV形質導入アッセイ
Huh7細胞1×105個を、10％ FBSを含有する300uL DMEMまたは無血清培地中、48ウェルプレートに播種した。AAV/lucを血清またはrHSA（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）もしくは臨床等級HSA（Albuminar, CSL Behring LLC, Kankakee, IL）とともにインキュベートした。次いで、混合物を標記の細胞に加えた。48時間後、受動溶解バッファ（passive lysis buffer）（Promega）によって細胞を溶解させ、Wallacl420 Victor 2自動プレートリーダによってルシフェラーゼ活性を計測した。PBSからの導入遺伝子発現に対する血清またはアルブミン処理群からの導入遺伝子発現の比として導入遺伝子発現の増加倍率を計算した。
【０３７２】
動物実験
University of North Carolina at Chapel Hillの動物委員会によって制定されたガイドラインにしたがって、すべてのマウスを特定病原体除去施設中に維持した。すべての動物実験は、University of North Carolina Institutional Animal Care and Usage Committeeによって審査され、承認されたものであった。動物実験は、血友病B（FIX-/-）マウスまたは正常C57BL/6マウス（Jackson Laboratories, Bar Harbor, MEから購入）において実施した。全身投与の場合、AAV/lucベクターの粒子1×1010個を血清またはヒトアルブミンとともに4℃で2時間インキュベートしたのち、成体雌C57BLマウスに後眼窩投与した。標記の時点で、120mg/kgのD-ルシフェリン基質（Nanolight, Pinetop, AZ）の腹腔内注射ののち、Xenogen IVIS Lumina画像診断システム（Caliper Lifesciences, Hopkinton, MA）を使用して画像診断を実施した。Living Imageソフトウェアを使用して生物発光画像を分析した。筋肉注射の場合、AAV/lucベクターの粒子1×109個を血清またはヒトアルブミンとともに4℃で2時間インキュベートした。次いで、混合物を6〜8週齢のC57BLマウスの後肢筋肉に直接注射した。標記の時点で、画像診断を実施し、生物発光画像を分析した。
【０３７３】
血友病B研究の場合、成体雄血友病Bマウスに対し、AAV8/FIXベクターの粒子2×109個を尾静脈から注射した。標記の時点で、イソフルランを使用した麻酔下、後眼窩静脈叢から血液を採取した。AAV8/FIX注射から6週後、インビボ出血分析を実施した。
【０３７４】
ヒトアルブミン枯渇
Pierce（商標）アルブミン枯渇キット（Cat# 85160, Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA）を、同社の取り扱い指示にしたがって（わずかな変更を加えて）使用した。簡潔にいうと、樹脂をカラムに移し、12,000rpmで1分間遠心処理したのち、カラムを洗浄し、予試験したAAV Nab陰性血清50uLを負荷した。遠心処理後、通過液を新たな樹脂処理カラムに適用し、上記工程を繰り返した。最大限のアルブミン枯渇を達成するために、通過液をさらに2回適用し、全部で4つのカラムを1つの試料に使用した。結合／洗浄バッファ50uLをカラムに加えて非結合タンパク質を放出させ、遠心処理した。最終的な通過液を、ELISAキットを使用するアルブミンの検出に適用した。
【０３７５】
共免疫沈降
Pierce Co-Immunoprecipitation（Co-IP）Kit（Cat# 26149, Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA）を用いて血清タンパク質の共免疫沈降を実施した。まず、抗体固定化を実施した。樹脂スラリーをスピンカラムに加え、遠心処理したのち、カラムを洗浄し、ボトムプラグを挿入した。次いで、希釈抗体およびシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液を順次にスピンカラム中の樹脂に直接加え、室温で2時間インキュベートした。遠心処理および洗浄後、消光バッファをカラムに加え、遠心処理した。消光バッファを樹脂に適用したのち、シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液を15分間添加した。遠心処理および洗浄ののち、AAVウイルスとヒト血清またはPBSとの混合物を樹脂に移し、4℃で2時間インキュベートした。遠心処理および洗浄ののち、溶出バッファを加え、5分間インキュベートし、遠心処理した。通過溶液を質量分析またはQ-PCRによるAAVゲノム数定量のために採取した。
【０３７６】
質量分析
FASPプロトコルを使用してタンパク質を還元し、アルキル化し、トリプシンで消化した。ペプチドを2％アセトニトリル／98％（0.1％ギ酸）中に再懸濁させたのち、LC-MS/MSによって分析した。簡潔にいうと、ペプチドを、Magic 5μm C18AQ樹脂（Michrom Biosciences, Inc.）を詰めた長さ2cm×外径360μm×内径100μmのマイクロ毛管溶融シリカプレカラムに負荷した。試料の負荷後、プレカラムを、2uL/minの流量の95％溶媒A（水中0.1％ギ酸）／5％溶媒B（アセトニトリル中0.1％ギ酸）で20分間洗浄した。次いで、プレカラムを、5μm C18樹脂22cmを詰めた外径360μm×内径75μmの分析カラムに接続した。Nano-Acquity HPLC溶媒送達システム（Waters Corp.）を用いて溶媒Bの割合を40％に増すことにより、ペプチドを250nL/minの流量で溶出させた。LCシステムを、LTQ Orbitrap Velosイオントラップ質量分析計（Thermo Fisher Scientific）にインタフェースさせたエレクトロスプレーイオン化ソースを介して直結させた。質量分析計をXcaliburソフトウェアによって制御し、データ依存モードで作動させて、その間、初期MSスキャンがイオンの質量電荷（m/z）比を400〜2000の範囲で記録した。もっとも豊富な10のイオンを後続の衝突活性化解離のために自動的に選択した。すべてのファイルを、Uniprotからダウンロードされたヒトタンパク質を含むデータベースに対し、MASCOT（Matrix Science, Ver. 2.3.02）を使用して、Proteome Discoverer（Thermo., Ver. 1.3.0.339）を介して検索した。検索パラメータは、10ppmのペプチド質量許容差および0.6質量単位のフラグメントイオン許容差を含んだ。検索は、Metの酸化およびCysのカルバミドメチル化の可変性修飾を考慮した。各試料を2回（R1およびR2）試験した。AAV試料とPBSとの間の2倍の差を陽性とみなした。
【０３７７】
組織中のルシフェラーゼ発現の定量
画像診断研究に利用した動物をAAV注射から2週後に屠殺し、以下の器官：肝臓、脾臓、腎臓、心臓、肺、骨格筋（ひ腹筋）および脳を採取した。組織を切り刻み、受動溶解バッファ（Promega, Madison, WI）中にホモジナイズした。組織溶解物を10,000rpmで5分間遠心処理して細胞残渣を除去した。上記のようなルシフェラーゼ活性分析のために上清を96ウェルプレートに移した。Bradfordアッセイ（BioRad, Hercules, CA）を使用して組織溶解物中の総タンパク質濃度を計測した。
【０３７８】
AAVゲノムコピー数分析
様々なrAAVベクターの血液クリアランス率を測定するために、rAAVベクターの静脈内投与から2、6、24および48時間後にマウスから血漿を得た。DNeasy Blood & Tissue kit（QIAGEN, CA）を製造者の取り扱い指示にしたがって使用して、血漿からのウイルスDNA単離を実施した。フォワードプライマー：
2020511127.tif 000007
およびリバースプライマー：
2020511127.tif 000008
を用いるリアルタイムPCRによってウイルスゲノムを定量した。リアルタイムPCRはLightCycler 480（Roche Diagnostics Cooperation, Indianapolis, IN）機器で実施した。0.2uMプライマーを補ったSYBR Green（Roche Diagnostics Cooperation, Indianapolis, IN）ミックスを使用して10uL最終量の絶対定量化反応を実施した。プライマー−プローブセットごとの汚染の可能性を排除するため、鋳型対照は各試験に含めなかった。反応を95℃で10分間増幅したのち、95℃で10秒間、60℃で10秒間および72℃で10秒間を45サイクル行って増幅し、次いで融解サイクルを実施した。各遺伝子を二重反復でアクセスした。プラスミドDNA（ルシフェラーゼ）の標準曲線への二次導関数最大比較に基づいて絶対定量化を実施した。
【０３７９】
様々な組織中のAAVゲノムコピー数を検出するために、rAAVの静脈内注射から2週後にマウスを屠殺し、選択した器官を採取した。DNeasy Blood & Tissue kit（QIAGEN, CA）を使用するDNA単離ののち、各試料に対し、ルシフェラーゼ遺伝子およびマウス（Mus musculus）ラミンB2遺伝子の両方に関してリアルタイムPCRを実施した。マウス（Mus musculus）ラミンB2遺伝子に使用されたプライマーは：
2020511127.tif 000009
であった。Lightcycler software v.4.5（Roche Diagnostics Cooperation, Indianapolis, IN）により、初期形質導入に使用されたpTR-CBA-ルシフェラーゼプラスミドおよび内在性遺伝子のそれらに基づき、ゲノムのコピーを分析した。
【０３８０】
AAV結合アッセイ
AAV/lucベクターの粒子5×1010個を臨床等級ヒト血清アルブミンとともに4℃で様々な期間インキュベートした。次いで、予冷したHuh細胞5×105個をAAVベクターに4℃で30分間加えた。細胞を冷PBSで4回洗浄し、新たなチューブに移した。細胞からDNAを抽出し、Q-PCRを適用して、luc特異的プライマーを使用して1細胞あたりのAAVゲノムコピー数を決定した。
【０３８１】
中和抗体分析
本発明者らの以前の研究に記載されているようにして（わずかな変更を加えて）、Nabアッセイを実施した。簡潔にいうと、AAV8/Lucベクターの粒子1×108個を100倍希釈の25％HSAとともに4℃で2時間インキュベートしたのち、様々な希釈度のIVIGをさらに2時間加えた。混合物を適用してHuh7細胞に感染させた。48時間後、細胞溶解物からルシフェラーゼ活性を分析し、中和抗体力価を計算した。
【０３８２】
ヒト第IX因子抗原および活性アッセイ
以前に記述されているようにして、ヒト第IX因子抗原1ステージヒト第IX因子活性アッセイを実施した。第IX因子活性（U/ml）を第IX因子タンパク質（第IX因子抗原）の濃度（mg/ml）で割ることにより、タンパク質1ミリグラムあたりの第IX因子活性の単位（U/mg）として表される第IX因子の比活性を計算した。
【０３８３】
インビボ出血モデル
Meeksらによって以前に記述されているようにして（わずかな変更を加えて）、インビボ出血を分析した。麻酔後、尾の遠位部3mmを離断し、尾の近位部を、予め加温し、秤量しておいたチューブに入れた。尾の切り取りから40分後または失血死の前に、体重1グラムあたりの失血量を計算した。
【０３８４】
統計的解析
定量データを平均値±SDとして提示した。スチューデントt検定を使用してすべての統計的解析を実施した。0.05未満のP値を統計的に有意な差とみなした。
【０３８５】
実施例2
アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターの全身投与後、血友病患者において治療用導入遺伝子発現が上首尾に達成されている。数多くの前臨床研究が、AAV媒介送達導入遺伝子によって長期的導入遺伝子発現が誘導されるということを実証している。具体的には、AAVベクターによる血友病処置の場合、血友病動物モデルにおいてはAAVベクターの筋内注射によって有望なデータが生成され、IM後に血友病B患者の筋肉中に長期的導入遺伝子発現が見出されたが、治療用導入遺伝子FIXは血液中に検出されなかった。肝臓は、血友病因子（FIXおよびFVIII）合成する天然の器官である。臨床試験において、血友病B患者において肝臓ターゲティング用にFIXを送達するためにAAV2およびAAV8の両方が使用された。血中へのAAVベクターの投与後、ウイルスはまず、血清タンパク質と遭遇する。ウイルスと血清タンパク質との相互作用は、肝臓へのAAV形質導入に影響し得る。本発明者らの以前の研究は、質量分析によっていくつかのタンパク質を同定し、ヒト血清アルブミンがAAVビリオンとの直接的な相互作用によってAAV形質導入を増強するということを実証している。しかし、答える必要のある問いがいくつかある。他のAAV結合血清タンパク質もすべてAAV形質導入に影響するのか？血清タンパク質の組み合わせがAAV形質導入をさらに増強するか？質量分析によって同定されたAAV8結合タンパク質のうち、アルブミンは別として、トランスフェリンおよびアポリポタンパク質B（ApoB）が、肝臓における受容体を有することから、より興味深い。トランスフェリンは、血液および他の組織流体中の遊離鉄のレベルを制御する鉄結合性の血漿糖タンパク質である。鉄を添加されたトランスフェリンタンパク質はトランスフェリン受容体に結合し、受容体媒介エンドサイトーシスによって細胞の中に運ばれる。ApoBは、カイロミクロン、VLDL、IDLおよびLDL粒子の主要なアポリポタンパク質であり、ApoBはLDL粒子の形成にとって不可欠である。LDL粒子上のApoBはLDL受容体のリガンドとして作用して、脂肪を細胞の中に送達する。以下の研究において、本発明者らは、肝臓中のAAV形質導入に対するLDLおよびトランスフェリンの効果ならびにAAV肝臓形質導入に対する血清タンパク質の組み合わせの効果を研究した。本発明者らの研究は、LDLまたはトランスフェリンとAAV8ビリオンとの相互作用がAAV肝臓形質導入を増強することを示した。しかし、AAV形質導入のさらなる増強に対する3つのタンパク質（HSA、LDL、トランスフェリン）の組み合わせの効果は見られなかった。
【０３８６】
LDLまたはトランスフェリンとのAAV8のインキュベーションはHuh細胞中の形質導入を増大させる
トランスフェリンおよびapoBは肝実質細胞上のトランスフェリン受容体およびLDL受容体に特異的に結合することができるため、本発明者らは、トランスフェリンまたはapoBとAAVビリオンとの相互作用が形質導入を増強することができると推定した。ホタルルシフェラーゼ遺伝子をコードするAAV8/lucベクターを様々な希釈度の正常血中濃度のLDLまたはトランスフェリンとともに4℃で1時間インキュベートしたのち、Huh7または293細胞に形質導入した。48時間後、ルシフェラーゼ分析のために細胞溶解物を採取した。本発明者らが以前に報告したように、AAV8とヒトアルブミンとの相互作用は、1：10000の希釈度でさえ、Huh7細胞中のAAV8形質導入を増大させた（図15）。本発明者らはまた、トランスフェリンおよびLDLが、それぞれ1：1000および1：100の希釈度で、Huh7細胞中でAAV8形質導入の増強をもたらすことを見出した。血清タンパク質の違いまたは希釈度にかかわらず、293細胞中で導入遺伝子発現の顕著な増大は見られなかった（図15）。この結果は、LDLまたはトランスフェリンとAAV8との相互作用が肝実質細胞中の形質導入を増強することを意味する。
【０３８７】
AAV8は肝臓形質導入のためにLDLまたはトランスフェリン受容体を利用しない
一部のウイルスの効果的な肝臓感染のためにLDLまたはトランスフェリン受容体が使用されることが示されている。LDLまたはラクトフェリンの高用量注射によるこれらの受容体のブロッキングがマウスの肝臓におけるこれらのウイルス感染性を低下させる。他の血清型についての主受容体は同定されているが、効果的な形質導入のためにどの主受容体がAAV8によって使用されるのかは不明である。AAV8は、マウス肝臓を形質導入するための最良の血清型であることが示されている。AAV8が標的細胞形質導入のためにLDLまたはトランスフェリン受容体に結合するかどうかを研究するために、本発明者らは、ヒトLDL（LDL受容体を飽和させる）0.5mgまたはラクトフェリン（LRPおよびHSPGを飽和させる）1mgをマウスに投与し、5分後、AAV8/lucの粒子1×1010個を注射した。AAV注射から3日後、画像を撮影した。LDLまたはラクトフェリンの前注射が実際に肝臓中のAAV8形質導入を増大させるということは驚くべきことであった（図16）。この結果は、AAV8は、効果的なマウス肝臓形質導入のためにLDLおよびトランスフェリン受容体を用いなくてもよいことを示唆する。
【０３８８】
AAV8とLDLまたはトランスフェリンとの相互作用はマウス肝臓形質導入を増強する
LDLまたはトランスフェリンとのAAV8のインキュベーションは、ヒト肝実質細胞株Huh7中では形質導入を増大させたが、非肝実質細胞株293T中では形質導入を増大させなかった。上記のように、マウスにおけるAAV肝臓形質導入に対するLDLおよびトランスフェリンの効果を研究するために、AAV8/luc粒子1×1010個を様々な希釈度のLDLまたはトランスフェリンとともにインキュベートしたのち、後眼窩静脈からマウスに注射した。AAV注射から3、10および14日後、マウス画像診断を実施した。図17に示すように、実験全体を通して、LDLの場合には10000倍、トランスフェリンの場合には1000倍の希釈度でさえ、肝臓形質導入の増強が認められた。
【０３８９】
LDLまたはトランスフェリンとのAAV8のインキュベーションは標的細胞へのウイルスビリオン結合を増大させる
HSAからの増強された形質導入は標的細胞へのAAVビリオン結合の増大によるということが示された。同じ機序が肝実質細胞中のAAV8形質導入に対するLDLおよびトランスフェリンの効果にも当てはまるかどうかを試験するために、本発明者らは、まず、Huh7細胞においてウイルス細胞結合分析を実施した。AAV8ウイルスを様々な希釈度の正常血中濃度のLDLまたはTRFとともに4℃で1時間インキュベートしたのち、Huh7細胞を加え、4℃でさらに2時間インキュベートした。PBSで徹底的に洗浄したのち、Huh7細胞からDNAを抽出し、適用して、定量的PCRを使用してAAVゲノムコピー数を計測した。導入遺伝子発現からの結果と一致するように、AAV8ビリオンとのLDLまたはApoBまたはトランスフェリンのインキュベーションは、Huh7細胞へのAAV8結合を増大させた（図18）。10〜1000倍希釈のHSAはHuh7細胞への同様なウイルス結合を示した。対照的に、LDLおよびトランスフェリンの場合のHuh7細胞へのAAV8の結合能力は用量依存性であった。したがって、AAVベクターとともにインキュベートされたより多くのタンパク質がHuh7細胞へのより高いウイルス結合を誘導した。
【０３９０】
マウス肝臓におけるAAV結合能力に対するLDLおよびトランスフェリンの効果を研究するために、本発明者らは、まず、AAV投与後の血液中のウイルスクリアランスの速度を調べた。100倍希釈のLDLまたはトランスフェリンとともにプレインキュベートされたAAV8/lucベクターの粒子1×1011個を後眼窩静脈からマウスに注射した。AAV8注射から48時間後、マウス画像診断を実施した（図19Aおよび19B）。上記結果と一致するように、LDLまたはトランスフェリンで前処理されたAAV8はマウス肝臓形質導入を増大させた。また、AAV注射から5分、2時間、24時間および48時間後、血液を抜き取り、血液試料の短時間の遠心処理ののち、血漿を採取した。定量的PCRによって血漿中のAAVゲノムコピー数を計測した（図19C）。HSAとともにインキュベートされたAAV8の場合のウイルスクリアランスの速度とは対照的に、LDLおよびトランスフェリンで前処理されたAAV8を与えられたマウスにおいては、AAV注射から5分後、より高い血中ウイルス力価が見出された。AAV投与から2時間後、差は見られなくなった。
【０３９１】
AAV8の生体分布に対する血清タンパク質LDLおよびトランスフェリンの効果を研究するために、AAV投与から7日後、マウスを屠殺し、導入遺伝子発現分析およびAAVゲノムコピー数検出のために様々な組織を採取した。図20に示すように、PBSとともにインキュベートされたAAV8ベクターを与えられた対照マウスと比べて、LDLまたはトランスフェリンとともにプレインキュベートされたAAV8ベクターで処理されたマウスの肝臓でのみ、増大した導入遺伝子発現が示された。導入遺伝子発現と並んで、LDLまたはトランスフェリンとともにAAV8を与えられたマウスの肝臓中、より高いAAVゲノムコピー数が認められた。これらの結果は、LDLまたはトランスフェリンとのAAV8のインキュベーションがAAV8組織向性を変化させず、むしろ、肝臓中のAAV取り込みを増大させるということを示唆する。
【０３９２】
血清タンパク質の組み合わせとともにインキュベートされたAAV8からは導入遺伝子発現のさらなる増大はない
本発明者らの以前の研究および上記結果は、個々の血清タンパク質（HSA、LDLおよびトランスフェリン）が肝細胞中のAAV8形質導入を増強することを実証した。次に、本発明者らは、これらのタンパク質の組み合わせが、AAV8形質導入を増大させるさらなる能力を有するかどうかと考える。AAV8ベクターを、2または3つのタンパク質の組み合わせとともにインキュベートし、Huh7細胞中に形質導入した。アルブミンで処理されたAAV8と比べて、個々のタンパク質の組み合わせまたは希釈度にかかわらず、導入遺伝子発現のさらなる増大は達成されなかった（図21）。
【０３９３】
本発明者らはまた、AAV8/lucの粒子1×1010個を100倍希釈の3つのタンパク質と個別に、または組み合わせてインキュベートし、後眼窩静脈からマウスに注射した。AAV注射から3および7日後、マウスを画像診断した。Huh7細胞における結果と同様に、個々のタンパク質と比べて、HSA、LDLおよびトランスフェリンの組み合わせはAAV8肝臓導入遺伝子発現を増大させなかった（図22）。
【０３９４】
血清タンパク質はAAV8ビリオンの同じ位置に競合的に結合する
インビトロおよびインビボ実験からの上記結果は、血清タンパク質の組み合わせが、個々のタンパク質と比べ、より優れた肝臓形質導入を有しないということを実証した。肝臓形質導入の同様な増強が、HSAまたはLDLまたはトランスフェリンとともにインキュベートされたAAV8からも認められた。本発明者らは、これらのタンパク質がAAVビリオン表面の同じ位置に結合し得ると推定する。この仮説を裏付けるために、本発明者らは競合アッセイを実施した。まず、本発明者らは、AAV8ウイルスを、様々な希釈度のアルブミンと希釈度1：100のLDLまたはトランスフェリンとの混合物とともにインキュベートした。次いで、ApoBまたはトランスフェリンに特異的な抗体によってAAVビリオンを沈降させ、定量的PCRによって測定した（図23A）。高濃度のHSAを含有する組み合わせとのAAV8のインキュベーションは、LDLまたはトランスフェリンへのウイルス結合を完全にブロックした。HSA濃度の低下は他のタンパク質へのAAV8ビリオン結合を増大させた。希釈度10000倍のHSAを使用したとき、LDLまたはトランスフェリンへのAAV8結合の阻害は見られなかった。次に、本発明者らはAAV8タンパク質結合ブロッキング分析を実施した。AAV8/lucを様々な希釈度のHSAとともに30分間インキュベートしたのち、100倍希釈のLDLまたはトランスフェリンを1時間加えた。LDLまたはトランスフェリン特異抗体で沈降させたのち、競合分析と同様に、高濃度のHSAは、LDLまたはトランスフェリンへのその後のAAVビリオン結合をブロックした（図23B）。
【０３９５】
要約すると、血清タンパク質（LDL-ApoB、トランスフェリン、アルブミン）は、標的細胞へのAAVビリオン結合を増大する機序を介してAAV8肝臓形質導入を増強することができる。これらのタンパク質はAAV8ビリオン表面上の同じ位置と相互作用する。
【０３９６】
実施例3
12のAAV血清型のうち、AAV9の全身投与が動物モデルにおいて全体的な形質導入を誘導するということは周知であった。したがって、臨床試験において、治療用導入遺伝子を送達するためにAAV9ベクターの末梢注入によって脳および筋肉をターゲティングすることが提案されている。インビトロおよびインビボ研究の結果は、AAV9ベクターが効率的なトランスサイトーシスによって血管内皮バリアを透過することができ、それが、全身的な遺伝子送達後、筋肉、心臓および他の組織または器官におけるその優れた形質導入に貢献するということを示唆した。AAV9ベクターは、全身投与後、まず血清タンパク質と相互作用し、次いで標的細胞に結合する。いくつかの血清タンパク質がAAV9と相互作用し、その形質導入を増強することができるかどうかを解明するために、本発明者らは、AAV9結合血清タンパク質の質量分析を実施し、AAV9の全体的な形質導入に対するこれらの結合血清タンパク質の潜在的効果を研究した。
【０３９７】
血管透過性を変調させる血清タンパク質がAAV9に結合する
どの血清タンパク質がAAV9ビリオン表面に結合することができるのかを同定するために、本発明者らは、質量分析アッセイのための免疫沈降を実施した。AAV9ビリオンをヒト血清とともに4℃で2時間インキュベートした。無傷のAAV9カプシドのみを認識するモノクローナル抗体ADK9を加えた。次いで、AAV9結合血清タンパク質を沈降させ、質量分析によって分析した。同定されたタンパク質のうち（表6）、フィブリノーゲン（Fib）、フィブロネクチン（FN）、プラスミノーゲン（PMG）、フォン・ヴィレブランド因子（vWF）、α1酸性糖タンパク質（AGP）および血小板第4因子（PF4）をはじめとするいくつかのタンパク質が血管透過性に影響し得る（表7）。
【０３９８】
フィブリノーゲンとAAV9との直接的な相互作用が体全体の形質導入を増強する
Fibは、血栓形成を支援する糖タンパク質である。Fibは、ジスルフィド結合によって互いにリンクしている3つの異なる鎖（α、βおよびγ）2組を含むヘキサマーである。フィブリノーゲンは肝実質細胞によって合成され、血漿中の濃度は2〜4mg/mlである。フィブリノーゲンは分子量340kDaの可溶性物質である。質量分析は、Fibの3つの鎖すべてがAAV9に結合すると同定されたことを示した（表7）。マウスにおけるAAV9形質導入に対するFibの効果を研究するために、本発明者らは、AAV9の粒子1×1010個をFib3mgとともに4℃で2時間インキュベートしたのち、マウスに注射した（Fib-PBSコホート）。3日後、画像診断を実施した。AAV9のみを与えられたマウス（PBSコホート）またはAAV9の注射の直前にFibで処理されたマウス（PBS-Fibコホート）と比べて、Fib-PBSコホート内のマウスにおいて約3倍の高さの肝臓形質導入が達成された（図24）。また、画像診断プロファイルに基づくと、FibとともにプレインキュベートされたAAV9を与えられたマウスにおいては、肝臓の他に頭部、心臓および他の部位にも強い形質導入が認められた。PBSコホートとPBS-Fibコホートとの間で肝臓または体全体における導入遺伝子発現の差は見られなかった。この結果は、AAV9ベクターとのFibのインキュベーションがAAV9血管透過性を増大させ、体全体のAAV9形質導入を増強することができること、および形質導入の増強がFibとAAVビリオンとの直接的な相互作用を必要とすることを示唆する。肝臓以外の他の組織における高い形質導入を試験するために、本発明者らは、FibとともにプレインキュベートされたAAV9ベクターの全身投与を実施し、AAV注射から1週後、マウスを屠殺し、ルシフェラーゼ分析およびゲノムコピー数検出のために組織を採取した（図25）。画像診断と一致するように、Fib-PBSコホート中のマウスは、肝臓、心臓、肺、筋肉および脳において、PBSおよびPBS-Fibコホート中のマウスよりも高い導入遺伝子発現を示した（図25A）。また、Fib-PBSコホートからのマウスの組織中に、他2つのコホートからのマウスの組織中よりも高いAAVゲノムコピー数が見出された（図25B）。AAV9をより低い用量のFibとともにインキュベートしたとき、増強された形質導入は1mgおよび10OugのFib濃度でのみ見られた。より低い用量のFibはAAV9形質導入に対して効果を有しなかった（図26）。
【０３９９】
より高いAAVビリオンが、フィブリノーゲンとともにインキュベートされたAAV9の全身投与後に持続する
AAV9ベクターの血液クリアランスは他の血清型の血液クリアランスよりも遅く、それが、高い全身形質導入のための血管透過性の増大に貢献し得ることが実証されている。Fibのインキュベーションが血中のAAV9クリアランスの速度に影響するかどうかを研究するために、本発明者らは、AAV9の粒子2×1011個をマウスに注射し、2日目に、マウスの画像を撮影した（図27A）。上記観察結果と同様に、FibとともにプレインキュベートされたAAV9で処理されたマウスにおいて、PBSコホートまたはPBS-Fibコホートのマウスにおけるもより高い導入遺伝子発現が肝臓において示された（図27B）。異なる時点で血液を抜き取り、定量的PCRによって血漿中のAAVゲノムコピー数を検出した。AAV注射から20分、2時間および24時間後、FibとともにインキュベートされたAAV9を与えられたマウスにおいて、他2つのコホート内のマウスよりも有意に高いゲノムコピー数が循環中に見出された。AAV投与から48時間後、3つのコホートの間で差は見られなくなった（図27C）。結果は、フィブリノーゲンとともにプレインキュベートされたAAV9ベクターの全身投与後、循環中のより高いAAVビリオンから全身形質導入の増強が生じ得ることを説明づけ得る。
【０４００】
他の血清タンパク質とAAV9との相互作用が形質導入を増強する
この研究の主な焦点は、どの血清タンパク質がAAV9の全身的形質導入を増強するのかを試験することであった。このために、質量分析からの結果と組み合わせると、同じくAAV9に結合する、α1酸性糖タンパク質2（AGP）、フィブロネクチン（FN）、フォン・ヴィレブランド因子（vWF）、血小板第4因子（PF4）およびプラスミノーゲン（PMG）をはじめとする他のいくつかのタンパク質が血管透過性を変調させてAAV9の全身的形質導入に影響し得る。本発明者らは、生理学的血中濃度のこれらのタンパク質とともにAAV9ベクターをインキュベートし、マウスに注射した。AAV投与から3日後、マウス画像診断を実施した。これらのタンパク質すべてが、AAV9で処理されたマウスにおいてより高い肝臓形質導入を誘導した（図28）。また、本発明者らは、いくつかの群において、AAV注射から1週後、AGPまたはFNまたはPF4またはvWFとともにプレインキュベートされたAAV9を与えられたマウスの脳において高い導入遺伝子発現を見出した（図29Aおよび29B）。AAV投与から1週後、マウスを屠殺し、肝臓および脳中のAAVゲノムコピー数を検出した。画像プロファイルと一致するように、FibまたはPF4またはvWFとともにプレインキュベートされたAAV9を与えられたマウスの肝臓において3〜4倍の高さのゲノムコピー数が得られた。肝臓とは対照的に、PF4を除く血清タンパク質とともにプレインキュベートされたAAV9を与えられたマウスの脳中には、ごくわずかに高いゲノムコピー数しか認めらなかった（図29C）。
【０４０１】
次に、本発明者らは、増強されたAAV9形質導入に対する様々な用量の血清タンパク質の効果を試験した。AAV9を、様々な希釈度の血清タンパク質とともにインキュベートしたのち、後眼窩静脈からマウスに投与した。図30に示すように、1000倍希釈のAGPおよび100倍希釈のフィブロネクチンの場合、増強された形質導入がなおも見られたが、PF4およびvWFの場合、10倍希釈でこれらのタンパク質を使用しても形質導入増大は見られなかった（図30）。
【０４０２】
AAV9とのクリオプレシピテートのインキュベーションがAAV9形質導入を増強する
上記研究の結果に基づいて、いくつかの血清タンパク質がAAV9の全身的形質導入を増強した。次の問いは、これらのタンパク質をただちに臨床試験に使用することができるかどうかである。臨床診療に利用可能な個々のタンパク質は存在しないが、クリオプレシピテートが臨床診療において長らく使用されている。クリオプレシピテートとは、新鮮な凍結された血漿の遠心処理および沈降によって血漿から調製される凍結血液産物である。クリオプレシピテートは主にフィブリノーゲン、第VIII因子、vWF、第XIII因子およびフィブロネクチンを含有する。クリオプレシピテートは、血友病、vWF病、低フィブリノーゲン血症、無フィブリノーゲン血症などの患者を処置するために使用されてきた。フィブリノーゲン、vWFおよびフィブロネクチンは上記のようにAAV9形質導入を増強することが実証されているため、次に、本発明者らは、クリオプレシピテートがAAV9形質導入に対して効果を有するかどうかを試験した。AAV9を様々な用量のクリオプレシピテートとともにインキュベートし、マウスに全身注射した。肝臓中のAAV9形質導入の増強は100〜1000倍希釈のクリオプレシピテートとで用量依存性であった。100000倍希釈のクリオプレシピテート用量で増強は見られなかった（図31）。この結果は、将来の臨床試験において全身投与のためにAAV9ベクターが求められるとき、クリオプレシピテートをただちに使用することができることを示す。
【０４０３】
フィブリノーゲン、vWFおよびフィブロネクチンで構成されるクリオプレシピテートは、AAV9の全身投与後、血管透過性を高め、脳および筋肉をターゲティングするために、臨床試験にただちに適用することができる。
【０４０４】
実施例4
本発明者らは、中和抗体A20阻害活性に対するアルブミンとAAVビリオンとの相互作用の影響に関してもう1つの実験を実施した。表8および図32に示すように、アルブミンの希釈度（希釈なし、5倍、50倍、500倍）にかかわらず、AAV2とのヒトアルブミンのインキュベーションはA20阻害機能をブロックしなかった。A20中和抗体力価（最初の希釈度はAAV形質導入を50％より大きく阻害する）は一貫して同じであった（1：640希釈）。この結果により、アルブミンとAAVビリオンとの相互作用は、中和抗体A20がAAVカプシドに結合してAAV形質導入をブロックすることに干渉することができないことが、示される。
【０４０５】
これらの結果に基づくと、12.5ul中20000倍希釈の5％HSAは、インビトロでAAV形質導入（AAV粒子1×10e8個）を増強する効果を有する。一態様においては、形質導入を増強するために約3000個（2830個）のヒトアルブミン分子を1つのAAVビリオンとともにインキュベートすることができる。以下の計算を参照されたい：
ヒト血清アルブミン分子量（kDa）：66.5kDa
1ng＝15.04fmol＝分子905570676個
5％ HSA12.5ul（50ug/ul）＝625ug＝625000ng
12.5ul中20000倍希釈の5％ HSAは、なおもAAV形質導入（AAV粒子1×108個）を増強する効果を有する。したがって、HSA分子の合計数は、625000／20000×905570676＝282990836466HSA分子／AAVビリオン＝282990836466／100000000＝2830個分子／AAVビリオンとなる。
【０４０６】
実施例5：アルブミン融合タンパク質／AAV複合体の安定性
方法
AAV8/lucベクターの粒子1×1010個をマニホルド装置中のニトロセルロース膜に負荷したのち、1％ゼラチンによって膜を塞ぎ、その後、希釈度1：1000の25％ヒト血清アルブミン（HSA）とともに30分間インキュベートして、AAVをアルブミンと直接相互作用させた。PBSで洗浄したのち、様々な塩濃度またはpHのバッファをマニホルド装置の個々のウェルに加えた。様々なバッファを除去したのち、膜を洗浄し、HRP標識ヤギ抗ヒトアルブミンとハイブリダイズさせ、その後、Immun-Star（商標）Chemiluminescence Kits（Bio-Rad）を使用して発色させた。
【０４０７】
結果
図33に示すように、様々な濃度のNaClを加えたとき、ヒトアルブミンはAAV/HSA複合体から解離し、AAV/HAS複合体の解離はNaClの濃度に依存した（図33A）。より高濃度のNaClはAAV8ビリオンとHSAとの相互作用を完全にブロックした。本発明者らはまた、HSA/AAV複合体がpH＞6では安定であるが、pH≦5で解離することを見出した（図33B）。
【０４０８】
実施例6
アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターは、血液疾患および視覚障害の患者の臨床試験に適用されて成功を収めている。2つの懸念がより広いAAVベクター適用を制限する：AAVカプシド特異的細胞傷害性Tリンパ球（CTL）応答によって媒介されるAAV形質導入標的細胞の排除および中和抗体（Nab）によって媒介されるAAV形質導入のブロッキング。カプシド抗原提示は用量依存性であることが実証されており、それは、低用量のAAVベクターによるAAV形質導入の増強が潜在的にカプシド抗原負荷を減らし、望むらくは、導入遺伝子発現を損なうことなく、カプシドCTLによって媒介されるAAV形質導入標的細胞のクリアランスを除去することを示す。このために、導入遺伝子カセットの最適化、AAVカプシドの修飾および薬理学的物質によるAAV輸送の干渉をはじめとするいくかの手法が調べられている。特に、ヒト組織中のAAV形質導入効率は不明であるため、AAVカプシドの修飾はAAV向性を変化させるおそれがある。
【０４０９】
AAV形質導入を増強するための薬理学的試薬は普通、望まれない副作用を伴う。AAV形質導入を増強するための理想的な戦略を開発することは必須であるが、カプシドの修飾による向性の変化または薬理学的処理による負の副作用があってはならない。本発明者らは、先駆的研究を実施し、ヒト血清アルブミン（HSA）が、AAVビリオンとアルブミンとの直接的な相互作用により、AAV形質導入に対して増強された効果を及ぼすことを見出した。アルブミンは天然に存在し、循環中でもっとも回復される（rebounded）タンパク質であることから、これらの観察結果は、臨床試験にとって決定的に重要な意義を有する。
【０４１０】
効果的なAAV形質導入は、以下の工程：受容体および共受容体を介する標的細胞表面への結合、エンドソーム中へのエンドサイトーシス、エンドソームからの脱出、核移行およびAAVビリオン脱殻、次いで導入遺伝子発現を含む。AAV形質導入を増強するために、細胞結合、エンドソーム脱出および核移行をはじめとするいくつかの工程は変更されることができる。本発明者らの予備的研究が、HSAがAAVビリオンと直接的に相互作用し、おそらくはHSA受容体を介する細胞表面へのAAVウイルス結合の増大によってその形質導入を増強することができることを示している。
【０４１１】
効果的な薬物またはバイオカーゴ送達の場合、いくつかの研究が、数多くのペプチド（細胞膜透過ペプチド―CPPを含む）が標的肝実質細胞に特異的に結合し、エンドソーム脱出（エンドソーム溶解）を支援し、核移行を増大させると同定されたことを実証している。前記研究は、これらのペプチドとHSAとの融合がAAV肝臓形質導入をさらに増強するかどうかを試験する。増強された形質導入のためのAAVビリオン輸送の干渉もまた、カプシド抗原提示に影響し得る。以前の研究が、カプシド抗原提示がAAVカプシドのプロテアソーム媒介分解に依存するということを実証している。多くのウイルス（たとえばCMV、ヘルペス）は、抗原提示をブロックするためにVIPRペプチド（抗原提示に干渉するウイルスタンパク質、たとえばUS6、ICP47）を利用する。これらの実験において、本発明者らは、カプシド抗原提示に対する、HSAによるAAV形質導入増強の効果を研究し、VIPRとHSAとの融合がAAVカプシド抗原提示に干渉するかどうかを調べる。HSAによるAAV形質導入増強は、アルブミンとの相互作用ののち、より多くのビリオンが標的細面に結合することによる。この結果は、AAV中和抗体（Nab）活性を防ぐために、アルブミン融合ペプチドをAAV形質導入のための代替受容体リガンドとして使用し得るということを示唆する。中和抗体認識のためのエピトープはビリオン表面の9つの可変領域（VR）に位置することが示唆されている。以前の研究が、AAVのVRからのペプチドがNab機能をブロックすることを示している。AAVのVRに由来する様々なペプチドの組み合わせは、Nab活性をブロックする、より強い能力を有し得る。本発明者らは、AAVビリオンの表面可変領域に由来するペプチドとのアルブミン融合タンパク質が中和抗体活性に干渉するかどうかを調べる。
【０４１２】
アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターは、血友病B患者の第I相臨床試験において肝実質細胞を形質導入するために使用されて成功を収めている。しかし、臨床結果は、カプシド特異的細胞傷害性Tリンパ球（CTL）がAAV形質導入肝実質細胞を排除して、それにより治療の失敗を招くことを示唆している。AAV形質導入標的細胞におけるカプシド抗原提示は用量依存性である。AAV形質導入肝細胞のカプシド特異的CTL媒介クリアランスを防ぐために、より低い用量のAAVベクターがAAV形質導入細胞中のカプシド抗原負荷を減らすことが提案されている。低いベクター用量で同様な形質導入効率を得るために、導入遺伝子最適化、カプシド変性および形質導入を増強するための薬物処理をはじめとするいくつかの手法が調べられている。プロテアソーム阻害薬、DNA合成阻害薬およびトポイソメラーゼ阻害薬をはじめとするいくつかの薬理学的物質がこの目的に使用されている。しかし、これらの薬物は重篤な副作用を有する。また、AAVカプシドの修飾が肝臓形質導入を増強できることが実証されている。本発明者らの最近の研究は、AAV2ビリオンへのAAV9ガラクトース受容体結合残基の移植（デュアル受容体）がより強い肝臓導入遺伝子発現を誘導するということを実証した。しかし、AAV2i8（AAV8からのヘパリン結合部位スワップを有するAAV2）などの他の変異体は、それらの親の肝臓向性を向筋肉性に変える。アルブミンはもっとも豊富な血漿タンパク質であり、肝臓で合成される。アルブミンは非常に可溶性かつ安定なタンパク質である。ヒトアルブミンのX線結晶構造は、それが、αヘリックス67％からなりβシートを含まないハート形の分子であり、3つの相同ドメイン（それぞれがAおよびBサブドメインに分割される）に折り畳まれることを明らかにした。ドメインどうしは長い柔軟性のあるループによって接続されている。3つのドメインそれぞれは、物質を運ぶことを可能にする疎水性結合ポケットを有する。したがって、アルブミンは、必須物質および廃棄物を血流中で最適な分布のためにそれらの標的部位へ運ぶ分子タクシーとして行動する。いくつかのアルブミン受容体が記述されている：細胞表面糖タンパク質（gp）18、gp30、gp60（albondin）、メガリン（magalin）／キュビリン複合体、SPARC（secreted protein acidic and rich in cysteine、オステオネクチンとも呼ばれる）およびFcRn。アルブミンが受容体に結合したのち、アルブミンはエンドサイトーシスによって取り込まれる。アルブミンエンドサイトーシスの経路は細胞型依存性であり、クラスリンまたはカベオリン媒介エンドサイトーシスを含む。ヒト血清アルブミン（HSA）は、非常に多様な薬物に結合してそれらの送達および効力に影響し、最終的には薬の薬物動態学的および薬力学的性質を変えることができるため、医薬品産業において多大な関心を集めている。
【０４１３】
AAV感染は、細胞表面へのウイルス結合から始まり、ウイルス取り込み、細胞内輸送、核移行、脱殻および第2鎖DNA合成へと続く多段階プロセスである。AAV2は、その主受容体（ヘパラン硫酸プロテオグリカン―HSPG）および共受容体（インテグリンおよび線維芽細胞増殖因子受容体1）に結合することによって感染を開始する。AAVがそのライフサイクルを継続するためには、エンドサイトーシスののちエンドソームから放出されなければならない。エンドソームからの脱出後、AAVは、エンドサイトーシスの発生後30分以内に速やかに細胞核へと移動し、核周囲腔中に蓄積する。2時間以内にウイルス粒子は細胞核中に検出でき、脱殻前にAAV粒子が細胞核に入ることを示唆する。興味深いことに、細胞内ウイルスの大多数は安定な核周囲区画の中に留まる。受容体結合、内部移行および核移行ののち、AAVビリオンは脱殻し、一本鎖DNA鋳型を放出し、この一本鎖DNA鋳型は、転写が起こることができる前に二本鎖中間体に転換されなければならない。標的細胞へのウイルス結合能、エンドソーム脱出の効率、および核移行を含むいくつかの段階は、効果的なAAV形質導入にとっての速度制限因子である。
【０４１４】
タンパク質形質導入ドメイン（PTD）としても知られる細胞膜透過ペプチド（CPP）は、ペプチド、タンパク質、核酸およびナノ粒子を細胞膜に通して細胞の中へ運び、完全なカーゴの内部移行を生じさせることができる小さなペプチドである。CPPは、カーゴ結合能力を高める、エンドソームからのカーゴ脱出および核移行を増強するなど、様々な機能を果たすことができる。肝実質細胞に特異的に結合するいくつかのペプチドが同定されている。あるペプチドは、保存領域Iアミノ酸（KLKQP、SEQ ID NO: 131）および領域Iよりも上流にある塩基性アミノ酸ドメイン
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を含有するスポロゾイト周囲タンパク質に由来する。別のペプチドpreS1ドメインはB型肝炎ウイルス表面抗原に由来する
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。第三のペプチドはT7ファージテールファイバタンパク質に由来する
2020511127.tif 000012
。いくつかのペプチドは、様々な機序：エンドソーム膜中の孔形成、pH緩衝効果（プロトンスポンジ効果）、エンドソーム膜への融合およびエンドソーム膜の光化学破壊によってエンドソーム膜破壊を促進する性質を有する。これらのペプチドは、合成されるだけでなく、ウイルス、細菌およびヒト／動物タンパク質に由来する。高位生物学的系中、高分子カーゴを核へターゲティングさせるためには核移行シグナル（NLS）が不可欠である。核輸入効率を改善するために、核移行配列（NLS）を有するCPPをDNAまたは遺伝子キャリヤに直接的または間接的に取り付けることが多大な研究の興味を集めている。NLSは、核輸送タンパク質のインポーチンスーパーファミリーのメンバーによって認識されることができる、リジン、アルギニンまたはプロリンに富むモチーフに基づく短いペプチドである。インポーチンαはNLSシグナルに直接結合し、複合体は、インポーチンβとヌクレオポリン（Nup）との連続的なドッキングによって核膜孔複合体（NPC）を介して核中に移行する。したがって、NLSは核膜バリアに打ち勝ち、核移行を容易にする。遺伝子治療の分野においてもっとも周知かつ広く研究されたNLSは、シミアンウイルス40（SV40）のラージ腫瘍抗原に由来するNLSである。
【０４１５】
アルブミン媒介薬物送達の場合、エンドサイトーシスされるカーゴは多くの場合、エンドソーム中に捕らえられ、そこで、加水分解酵素によって分解され得る。AAV感染の場合、取り込み後、AAVは、アデノウイルスと比べてはるかに長い期間、エンドソーム中に留まる。エンドソーム／リソソームからの脱出後、ベクターの小さな部分だけが脱殻のために核に入る。したがって、エンドソーム脱出および核移行は、アルブミン媒介AAVベクター送達において制限要素となる。CPPとアルブミンとの融合はアルブミンの取り込みおよび肝実質細胞中の核への移動を高める。AAVベクターがこれらのアルブミン融合タンパク質とともにプレインキュベートされるとき、肝実質細胞に結合するより多くのウイルスおよびエンドソームからのAAV脱出の増加ならびに核移行のせいで、肝実質細胞中で増強されたAAV形質導入が生じる。したがって、標的細胞中の高用量関連の抗原提示が回避され、AAVを作製するために必要な労力は減る。
【０４１６】
アルブミンは、AAVビリオンと直接的に相互作用することができ、したがって、AAV形質導入を増強するが、アルブミンとAAVとの相互作用がカプシド抗原提示に影響するかどうかは不明である。特にアルブミンがCPPと融合しているとき、アルブミンはAAV輸送経路を変化させ、さらに、カプシド抗原提示効率および速度に影響し得る。カプシドベースの抗原提示に対するアルブミンおよびその融合タンパク質の影響の調査は、増強された肝臓形質導入および長期的臨床効力を有するより安全なAAVベクターを設計するのに効果的なパラメータを当業者が理解することを可能にする。AAVカプシド交差提示は、典型的なMHCクラスI抗原提示機序を使用するカプシドのプロテアソーム媒介分解によって媒介される。いくつかのウイルスは、VIPRと呼ばれるタンパク質群をコードしてMHCクラスI提示経路に影響することにより、生物の寿命の間、宿主内で存続することができる。AAVベクター送達のためのアルブミンとの融合によるこれらVIPRの潜在的な使用がこれらの研究の焦点である。
【０４１７】
全人口のうち、95％を超える個人がAAV血清型2（AAV2）に感染しており、感染者の平均50％がNAbを有する。AAV NAbに打ち勝ちために、いくつかの手法が研究室で開発されている。1つの手法は、ポリマーコートを使用してAAV表面を隠蔽し、NAb認識をブロックすることを含む（たとえばポリエチレングリコール）。有望ではあるが、この手法は、AAV形質導入プロファイルを変化させるおそれがある。第二の手法は、エラープローンPCRを使用してAAVカプシドバリアントのライブラリを生成し、NAbの存在下、インビトロでNAb回避変異体を選択する。この手法は新規なカプシドを生み出したが、インビボで未知の形質導入効率を有するカプシドを生成する潜在的な限界を抱えている。第三の手法は、低いNAb交差反応性を示す、またはNAb交差反応性を示さないAAVの代替血清型を使用する手法（いくつかの動物モデルにおいて実証された手法）である。最終的な研究室手法は、AAVカプシド表面上のNAb結合ドメインを合理的に変異させてNAb結合部位を除くことである。この戦略は、モノクローナル抗体エピトープおよびAAVビリオンの構造に関する情報を必要とし、また、ヒト血清からのNAbがポリクロナールであり、生成されるすべてのNAbを表すmAbをヒトから得ることが不可能であるという事実のせいで、本質的に限界がある。また、いくつかの臨床現場手法が用いられている。一例は、ベクター送達の前に血漿アフェレーシスを実施することである。しかし、アフェレーシスの各回の相対的に低い効率およびNAbの低い力価（＜1：5）でさえAAV形質導入を無効化することができるという事実のせいで、この戦略は、AAV NAbの開始力価が低めである患者にしか適さず、複数のアフェレーシス期間を必要とする。同様に、抗CD20抗体（リツキシマブ）の使用は、6〜9ヶ月間はB細胞枯渇を達成することができるが、血漿細胞（抗体産生性）には向けられず、1：1000未満の力価を有する対象の少数者集団においてAAV NAbを減らすのに有効である。
【０４１８】
AAV VRに由来するペプチドは、AAV形質導入に対するNAB活性をブロックすることができる。HSAにリンクしたAAV VRからのペプチドだけでなく肝実質細胞特異的ペプチドとCPPとの組み合わせは2つの機能：AAV中和抗体をブロックするためのデコイ（AAVからのVR）としての機能および効果的なAAV結合／細胞内輸送のための別の層（CPP）としての機能を有する。戦略は、AAVベクターの全身投与または任意の反復投与を要する任意の状態に対する全体的用途を有する。
【０４１９】
数多くの研究が以下を実証する：（1）ヒト血清アルブミンはAAVビリオンと直接的に相互作用し、AAV形質導入を増強する；（2）AAVカプシド抗原提示はインビトロでプロテアソーム媒介カプシド分解に依存する；（3）AAVカプシド抗原交差提示はインビボで用量依存性である；（4）AAVビリオンの修飾は肝臓形質導入を増大させる；（5）薬理学的物質はインビボでAAV肝臓形質導入を増強する；（6）VIPRは抗原提示に干渉する；および（7）AAV VRからのペプチドはAAV形質導入に対する中和抗体活性をブロックする。これらの予備的結果すべてが、AAV形質導入の増強、カプシド抗原提示の干渉およびNabの回避をはじめとする、AAV臨床応用におけるHSAの役割を利用するための基礎を築く。
【０４２０】
AAV全身投与のための臨床試験において直面する2つの重大な問題は、カプシド特異的CTL応答およびAAV中和抗体である。AAV形質導入の増強は、治療効果を達成するために必要なAAVベクターの用量を減らしつつ、カプシド抗原負荷を減らしてカプシド特異的CTL認識を回避し得る。カプシド修飾および薬理学的物質の適用がAAV形質導入を増強することが提案されているが、AAVカプシドの変異はその向性を変化させ得、AAV形質導入を増強する薬物は常に副作用を伴う。特定の組織中でAAV形質導入を増強するための、CPPと融合した血清タンパク質アルブミンの利用は新規であり、望まれない副作用を伴わない。
【０４２１】
AAV変異体による増強された肝臓形質導入
AAVウイルスは、ヘパラン硫酸（HS）、ガラクトース（Gal）またはシアル酸（Sia）を、細胞表面結合のための主受容体として利用する。種々のAAV系統はまた、その後、細胞取り込みのために共受容体との相互作用を必要とする。AAV9カプシドによるGal認識に関与する鍵となるアミノ酸残基が同定されている。AAVカプシド上の受容体結合部位の修飾は、導入遺伝子プロファイルまたは形質導入効率のいずれかを変化させることができる。本発明者らは、AAVカプシドの合理的設計研究を開拓してきた；例えば、本発明者らは、異なる血清型間で主受容体結合部位にとって重要な残基を変異させ、AAV2/AAV8キメラAAV2i8が変更された形質導入プロファイルを呈したことを実証した。AAV2i8は、心筋および全身骨格筋を高効率で選択的に形質導入し、肝臓向性を喪失する。AAV9主受容体Gal結合残基をAAV2カプシドに組み込む（AAV2G9）さらなる研究は、AAV2G9が、二重受容体機能を有し、感染にGalおよびヘパラン硫酸受容体を利用することを示した。特に興味深いのは、AAV2G9は、AAV2と類似の向性を保持しているが、より急速な発症およびより高い肝臓導入遺伝子発現をマウスにおいて付与する。同様に、AAV2i8上へのGalフットプリントの移植（AAV2i8G9）もまた、AAV9と同程度に、筋肉および肝臓においてより高い形質導入を誘導した。
【０４２２】
加えて、本発明者らは、AAV2カプシドの残基265における修飾が、AAV2組織向性および免疫プロファイルを変化させることを実証している。AAV2カプシドの残基265におけるアスパラギン酸の挿入（AAV2D）は、AAV2よりもはるかに高い筋肉形質導入を誘導した。同様に、AAV2Dの全身投与もまた、AAV2よりも高い肝臓形質導入を誘導した。残基585Argは、AAV2ヘパリン結合能に寄与し、そして、AAV2ヘパリン結合部位の変異（AAV2/585E）は、AAV2肝臓向性を取り除く。しかしながら、AAV2/585Eカプシドの残基265におけるAspの挿入は、AAV8を使用して観察されたものと類似の形質導入効率まで肝臓向性を戻した。これらの研究は、変異によるより高い肝臓形質導入が達成されたことを実証したが、組織向性もまた変化した。
【０４２３】
化学療法剤による増強された肝臓形質導入
MG-132およびボルテゾミブなどのプロテアソーム阻害剤、ヒドロキシウレア（HU）およびアフィジコリンなどのDNA合成阻害剤、ならびにエトポシドおよびカンプトテシンなどのトポイソメラーゼ阻害剤を含め多数の化学物質がAAV形質導入を増強させるために使用されてきた。これまでのところ、インビボでのrAAV形質導入を増強させるための最有力候補は、プロテアソーム阻害剤のボルテゾミブであり、これは、大型動物研究において導入遺伝子発現を3〜6倍増加させることが実証されている。本発明者らは、AAV肝臓形質導入も増大させる、新規作用物質の三酸化二ヒ素、ならびに、代替プロテアソーム阻害剤のカルフィルゾミブをさらに同定している（図34）。
【０４２４】
ヒト血清アルブミンによる増強された肝臓形質導入
本発明者らがヒト血清に対してAAV中和抗体分析を実施したときに、非常に高い血清希釈物を使用したにもかかわらず増強されたAAV形質導入が観察された。AAVに結合して形質導入を増強させることができるタンパク質を単離するために、本発明者らは、AAV2をヒト血清とインキュベートし、免疫沈降用のA20抗体を使用してAAV2結合タンパク質を沈降させた。質量分析による分析後、ヒト血清アルブミン（HSA）を同定した（図35A）。本発明者らは、Cy5標識AAV2およびCy3標識アルブミンとの共局在化を研究することによって、血清アルブミンとAAVビリオンとの直接的相互作用をさらに確認した（図35B）。AAV形質導入に対するHSAの効果を解明するために、本発明者らは、Huh7細胞においてHSA枯渇血清および組換えヒトアルブミンを用いた形質導入アッセイを実施した。完全血清よりもHSA枯渇血清を用いて、AAV2形質導入のより低い増強が見出された（図35C）。rHSA由来の増強されたAAV形質導入は、完全血清由来のものと類似していた（図35D）。また、本発明者らは、rHSAがAAV8形質導入を増強したことを実証した（図35E）。増強されたAAV形質導入に対するHSAの効果が特定の組織に限定されるかどうかを調べるために、本発明者らは、rHSAとプレインキュベートしたAAV8ベクターを異なる組織に注射し、肝臓および筋肉において増強された形質導入を見出した（図35Fおよび3G）。
【０４２５】
AAVトラフィッキング
感染後のウイルスを追跡する蛍光標識AAVビリオンを使用して、本発明者らは、クラスリン被覆ピットを通じたAAV内在化、およびサイトゾルへの侵入を可能にする初期エンドソームからの脱出（t1/2<10分）を観察した。次いで、AAVは、細胞核へと急速にトラフィッキングし、エンドサイトーシスの発生後30分以内に核周囲腔に蓄積した。2時間以内に、ウイルス粒子を細胞核内で検出することができた。蛍光の結果を裏付けるために、本発明者らは、モノクローナル抗体A20を使用した免疫分析を行って、受容体侵入後の無傷のビリオンを検出した。類似の結果が観察された。感染の間の無傷のビリオンの細胞内位置をさらに決定するために、本発明者らは、γチューブリンモノクローナル抗体を使用して微小管形成中心（MTOC）の位置を特定し、AAVウイルスがMTOCを通って核に移動することを見出した。ウイルス移動をリアルタイムでモニタリングする一粒子追跡法を使用して、本発明者らは、AAV2が、核に向かって、微小管（MT）上で一方向移動のみを呈したことを見出した。さらに、電子顕微鏡分析は、AAV2粒子が膜区画内のMT上に輸送されたこと、および、MTの崩壊によってAAV2含有エンドソームの酸性化が遅延したことを実証した。
【０４２６】
AAVカプシド抗原提示は、用量依存的であり、初期に起きる
インビボでのカプシド抗原提示の用量反応を調査するために、様々な粒子数のAAV2-OVAベクターをマウスに注射し、OT-1 T細胞刺激を調べた。未処置対照と比較したとき、5×1010の用量のAAV2-OVA粒子は、OT-1 T細胞の増殖を誘導した（図36A〜C）。重要なことに、1×1010以下の用量のAAV2-OVA粒子を用いた群では、脾臓細胞の増殖はなかった。
【０４２７】
導入遺伝子発現は、AAV2投与後のマウスにおいて徐々に増加し、6週目にピークを付け、その後、長期にわたって安定した状態を保つことが示されている。カプシドエピトープのインビボ抗原提示の動態が導入遺伝子発現のダイナミクスと一致するかどうかに取り組むために、本発明者らは、1×1011のAAV2-OVA/AAT粒子を静脈内注射した。注射後の様々な時点で、CFSE色素で標識した脾臓のOT-1 T細胞を処置マウスに投与した。移入の10日後、フローサイトメトリーによってOT-1 T細胞分裂を測定した。図37に示す通り、3〜12日目および21〜30日目間、AAV2-OVA/AATベクターで処置した動物では、対照レシピエントに対してOT-1 T細胞分裂が大幅に増加した。しかしながら、41〜50日目および61〜70日目間では、OT-1細胞増殖に関して、AAV2-OVAと対照群との間で差は観察されなかった（p>0.05）。この結果は、AAV2カプシドからの交差抗原提示が、AAV2全身投与後、早期に起きることを示している。抗原提示の類似の動態および効率がまた、全身適用後のAAV8-OVAベクターから観察された。この研究では、本発明者らは、AAV2/OVAベクターおよびAAV8/OVAベクターを使用して、全身適用後のマウスモデルにおけるAAV（2および8）カプシド交差抗原提示の動態および用量反応に対するヒトアルブミン融合タンパク質の効果を調査する。
【０４２８】
AAVカプシド抗原提示に対するプロテアソーム阻害剤の二重機能
ボルテゾミブは、AAV形質導入を増強させるので、本発明者らはまた、AAVカプシド抗原提示に対するこのプロテアソーム阻害剤の効果を研究し、高濃度のボルテゾミブが、カプシド抗原提示を阻害すると共に、導入遺伝子発現を増強させたことを見出した。その一方、より低濃度のボルテゾミブ（10nM）は、導入遺伝子発現を増加させることなく、AAV2-OVA形質導入HepG2/kb細胞からの抗原提示を増加させ、中間用量（100nM）は、形質導入と抗原提示の両方を増強させた。
【０４２９】
VIPRは、抗原提示を阻害する
ウイルスペプチド由来のVIPRが抗原提示を阻害する能力を発揮し得るかどうかを判定するために、本発明者らは、CMV VIPR US6またはHSV VIPR ICP47をOVAおよびH-2kb発現構築物と293細胞に共トランスフェクトし、次いで、抗原提示アッセイのために、293細胞をOT-1脾臓細胞と共インキュベートした。CD8サブセット全体におけるCD8/CD69（T細胞の初期活性化に関する）またはCD8/IFN-γ二重陽性細胞の百分率を分析することによって、バックグラウンドを減算した後に、ICP47またはUS6処置群におけるCD8/CD69またはCD8/IFN-γ発現の二重陽性細胞は、VIPR処置なしの群よりもはるかに少なく、95％を超えるOVAエピトープ提示の阻害がUS6およびICP47を用いて実証された（図38）。インビボ抗原提示に対するVIPRの阻害を検討するために、OVA、H-2kbおよびICP47またはGFP構築物を293細胞にトランスフェクトし、次いで、0.2mlマトリゲル中の1×107の293細胞をマウスの左脇腹に皮下注射した。同時に、インビトロで活性化されたOT-1脾臓細胞を、尾静脈を介して輸注し、そして、2〜3日毎に腫瘍サイズを測定した。20日後、GFPをトランスフェクトした293細胞を移植＋OT-1脾臓細胞を注入したマウスにおいて、腫瘍は見出されなかった。他のマウスは全て、OT-1脾臓細胞の注入なしにGFPをトランスフェクトした293細胞を異種移植した後、またはOT-1脾臓細胞の適用に関係なくICP-47をトランスフェクトした293細胞を異種移植した後、類似のサイズの腫瘍を発症した（表9）。
【０４３０】
AAV2カプシドの残基265における挿入によるA20活性の回避
本発明者らの研究は、A20抗体（無傷のAAV2ビリオンのみを認識する）がAAV2.5形質導入（AAV1からの5aa置換を有するAAV2変異体）をブロックすることができないことを実証している。残基265における挿入がまた、A20結合部位を取り除いて筋肉形質導入を増強させるかどうかを評価するために、本発明者らは、抗体結合をまず評価した。ウェスタンドットブロッティングによるA20結合親和性の分析は、AAV2.5に関する結果と類似して、変異体がA20によって認識されなかったことを示し、このことは、抗体−カプシド認識フットプリントにおける265部位の重要性を強調している。残基265に20の異なる単一アミノ酸が挿入されたAAV2変異体の中和抗体プロファイルを研究するために、本発明者らは、異なる変異体で免疫した血清からのNAb活性をマウスにおいて分析した。変異体由来の筋肉形質導入と挿入されたアミノ酸特性との間にもNAb力価と交差反応性との間にも、明らかな関連性は見出されなかった。
【０４３１】
定向進化法を使用したマウス肝臓由来のIVIG Nab回避変異体の開発
本発明者らは、AAVシャッフリングライブラリのマウス筋肉への直接注射によって、ヒト血清の存在下でNab回避の能力および筋向性を有するいくつかの変異体を単離することに成功している。Nab回避性を有する肝臓標的AAV変異体を単離することにこの研究を拡張するために、本発明者らはまず、IVIGをマウスに注射し、3時間後、後眼窩静脈を介してAAVライブラリを投与した。AAV注射後の3日目に、マウスに、Ad dl309を2日間与えた。マウス肝臓を採取し、Hirt DNAを抽出した。Hirt DNAからのPCR産物をpSSV9にクローニングして、第二のライブラリを作製した。上の工程をさらに2サイクル繰り返した後、PCR産物をpXRにクローニングして配列決定した。4つのAAV変異体がマウス肝臓から回収された（図39）。これらの変異体を使用して、ルシフェラーゼをパッケージングし、そして、これらの変異体およびAAV8をマウスに後眼窩注射を介して投与した後、撮像した。AAV8（優れたマウス肝臓形質導入を有する）と比較して、全ての変異体は、より低い肝臓形質導入を誘導した（図39）。この知見は、AAV6よりも低い筋肉形質導入を有する筋肉から単離された変異体と類似している。
【０４３２】
Nab活性に対するAAVペプチドの阻害
本発明者らは、AAV2免疫化C57BL/6およびBalb/Cマウス由来の血清ならびにモノクローナル抗体A20に対するエピトープスキャニングを実行した。血清またはA20 Abとペプチドライブラリとをインキュベーションした後、AAV2ベクターを血清とペプチドの混合物に加え、次いで、AAV2形質導入を対照ペプチドと比較した。このアプローチを使用して、AAV2/GFPベクターによるAAV2形質導入を増加させるいくつかのペプチドが同定されている（図40）。構造分析は、ペプチド全体またはそれらの一部がAAV2ビリオン表面上に露出していることを実証した。ペプチドp28は、aa 265領域を含有するベータシートの下に部分的に埋没しており、3回軸を構成する突起の外側であるがその間に位置している。p29、p32およびp68の露出部分は、5回細孔（five-fold pore）を取り囲むように位置している。ペプチドp67は、5回細孔の外側のくぼみに限局している。P28もまた、2回対称くぼみのすぐ外側に位置している（図10）。A20抗体は、C57BL/6マウスから最初に生成された。A20干渉に関してスクリーニングされた2つのペプチド（p28およびp67）が、C57BL/6マウス由来のペプチド（p28、p32およびp67）のプールにおいて同定されたが、このことは、このアプローチの妥当性を裏付けている。これらの予備段階の結果は、デコイとしてのNab活性を阻害するAAV VR由来のペプチドの能力を実証している。
【０４３３】
AAV肝臓形質導入をさらに増強させるアルブミン融合タンパク質の検討
本発明者らの予備データおよび臨床結果は、AAVカプシド抗原提示が用量依存的であること、および、より低い用量のAAVベクターが抗原提示全体を低減することを示している。それ故、より低いベクター用量を使用しながら必要な治療レベルを達成する効果的な戦略を検討することが理にかなっている。この目的を達成するために、化学物質の適用だけでなく、異なる血清型の利用、AAVカプシドの遺伝的修飾およびAAVベクターカセットの最適化を含め、いくつかのアプローチがAAV肝臓形質導入を増強させるのに利用されてきた。しかしながら、これらのアプローチは、AAV向性を変化させる（AAVカプシド修飾）かまたは不要な副作用をもたらす（薬理学的物質）かのいずれかである。本発明者らの予備研究は、ヒト血清アルブミン（HSA）が、AAVビリオンとの直接的相互作用を介してAAV形質導入を増強させることができることを実証している。
【０４３４】
アルブミンは、薬物ターゲティングのための重要なタンパク質担体として台頭している。アルブミンは、血液循環において最も豊富な血漿タンパク質（35〜50g/Lヒト血清）である。治療上意義のあるポリペプチドの効力、バイオアベイラビリティおよび安全性を改善するために、HSA融合技術が十分に確立されている。その技術は、アルブミン融合タンパク質を異なる種で生成しており、サイトカインおよび生物活性ペプチドに適用されている。肝実質細胞特異的ターゲティングのために、いくつかのペプチドが同定されている。追加的に、細胞透過性ペプチド（CPP）が、効率的な薬物送達のために積極的に研究されている。CPPは、典型的には5〜30アミノ酸を有する多様なペプチドの一クラスであり、大部分のペプチドとは異なって、これらは細胞膜を通過することができる。CPPは、siRNA、核酸、低分子治療用物質、タンパク質、量子ドットおよびMRI造影剤などのカーゴを、インビトロおよびインビボの両方でうまく輸送できる。この系は、他の送達法と比較して細胞傷害性が低い。CPPは、それらの高い内在化能のためだけでなく、それらの様々な修飾設計潜在性にも起因して、医学的応用に魅力的である。一般に、CPPは、大きく3つのタイプに分類することができる：（1）主にアルギニン、リジンおよび／またはオルニチン残基から構成される6〜12アミノ酸長のカチオン性ペプチド；（2）分泌成長因子またはサイトカインのリーダー配列などの疎水性ペプチド；ならびに（3）疎水性ペプチドをNLSに連結することによって得られる両親媒性ペプチド。
【０４３５】
エンドソーム隔離および不十分な核移行は、効果的なAAV形質導入に対する2つの制限段階であり、アルブミンとAAVビリオンとの間の直接的相互作用が形質導入を増強させるために必要であるという証拠に基づき、本発明者らは、肝実質細胞特異的ペプチドおよびCPPを有するアルブミン融合タンパク質が、肝臓特異的結合、エンドソーム分解（endosomolysis）および核移行を増加させることによって、AAV肝実質細胞形質導入を増強させると推測する。
【０４３６】
AAV肝臓形質導入に対するアルブミン融合タンパク質の効果
T7ファージ尾部繊維タンパク質（p17）コイルドコイルロッドドメイン内の33アミノ酸配列
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、スポロゾイト周囲タンパク質（CSP）由来のペプチドCSPIプラス
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およびB型肝炎ウイルス由来のプレSペプチド
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を含め、肝実質細胞に特異的に結合するいくつかのペプチドが同定されている。エンドサイトーシス経路は、AAVおよびアルブミンの主要な取り込み機序である。アルブミンは、取り込み後にエンドソーム中に封入され、リソソーム中の特異的酵素によって分解される。エンドソーム中の酸性pHは、脱出のためのホスホリピダーゼ（phospholipidase）のAAV曝露を助ける。したがって、効果的なAAV形質導入の達成における律速段階の1つは、エンドソーム脱出を容易にし、AAVベクターのサイトゾル送達を確保することである。ウイルス/細菌/植物に由来する多数のペプチドまたは合成界面活性剤がこの目的のために同定されている。エンドソーム脱出（エンドソーム分解）に関して、HAタンパク質のHA2由来のペプチド
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が広く研究されている。生体系では、高分子カーゴを核に送達するために核局在化シグナル（NLS）が必要とされる。SV40由来のよく知られているNLS
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がこの研究で使用される。細胞表面上の結合から核への生物活性カーゴのトラフィッキングは、受容体媒介性エンドサイトーシス、エンドソーム脱出および核移行を含む多くの段階を伴う。
【０４３７】
ペプチド（単一または組み合わせで、肝実質細胞結合、エンドソーム分解および核移行において役割を果たす）をHSAとコンジュゲートさせ、肝実質細胞におけるAAV形質導入に対するHSA融合タンパク質の効果を判定する。HSA融合タンパク質カセットは、CMVプロモータによって駆動され、融合タンパク質を293細胞において発現する。精製した融合タンパク質をインビトロおよびインビボ形質導入分析に使用する。インビトロ分析は、融合タンパク質とインキュベーションした後のヒト肝実質細胞の細胞株（Huh7およびHepG2）ならびに肝実質細胞以外の細胞株（293、Hela、CHO、C2C12、MG87など）における形質導入を含む。インビボ実験は、肝臓および他の組織における全身投与を介した形質導入分析ならびに直接筋肉注射による筋肉形質導入からなる。AAV血清型2および8は、肝実質細胞を標的とする臨床試験において使用されているので、これらを試験する。
【０４３８】
アルブミン融合タンパク質のクローニング
PCRアプローチを使用して、リンカー
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を有するHSA融合構築物（His6タグを有する）を作製する。正確なカセットを保証するために、クローンの配列決定を実施する。
【０４３９】
HSA-プレS融合タンパク質の精製
発現構築物pCMV-HSAまたはpCMV-HSA融合タンパク質をHEK293細胞にトランスフェクトする。トランスフェクション後、細胞を、Opti-MEM（登録商標）I（Invitrogen）中、3日毎に合計3〜4回交換しながら培養する。上清をプールし、タンパク質を硫酸アンモニウム沈殿（60％飽和）によって濃縮し、50mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.5）、500mM NaCl、20mMイミダゾールで平衡化したニッケル−ニトリロ三酢酸カラム（Qiagen, Hilden, Germany）に負荷する。洗浄工程（50mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.5）、500mM NaCl、35mMイミダゾール）後、50mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.5）、500mM NaCl、100mMイミダゾールでHisタグ化HSAタンパク質を溶離させる。タンパク質画分をプールし、PBSに対して透析する。タンパク質濃度を分光測定で決定する。
【０４４０】
AAVベクターの生産
XX6-80アデノウイルスヘルパープラスミドをパッケージングプラスミド（AAV血清型および変異体）およびITRプラスミド（ルシフェラーゼ）と共に使用した標準的な三重トランスフェクション法を使用して、全ての組換えAAV（rAAV）ウイルスを生成する。セシウム勾配を使用してrAAVベクターを精製し、ドットブロットハイブリダイゼーションおよび定量PCRを使用してベクターの物理的力価を評価する。
【０４４１】
異なる細胞株におけるAAV形質導入
1×108のAAV/lucベクター粒子をHSAまたはHSA融合タンパク質と4℃で2時間インキュベートする。次いで、混合物を、無血清培養培地中の1×105の細胞に2日間加え、細胞溶解物中のルシフェラーゼ発現を検出する。
【０４４２】
マウスにおける全身投与後のAAV形質導入
ルシフェラーゼ導入遺伝子をコードするAAVベクターを、HSAまたはHSA融合タンパク質（単一または組み合わせで）またはPBSと4℃で2時間インキュベートし、次いで、混合物を、C57BL/6マウスに1×1010粒子（5×1012/kg）の用量で後眼窩注射を介して投与する。AAV注射後の指定の時点に、マウスの撮像を実施し、そして、肝臓域における生物発光画像を分析する。注射後2週目に、異なる組織における導入遺伝子発現およびAAVゲノムコピーの検出のためにマウスを屠殺する。
【０４４３】
マウスにおける筋肉注射後のAAV形質導入
HSAとインキュベートした1×109のAAV/luc粒子を、マウスの後肢の筋肉に注射する。注射後の異なる時点で撮像する。血清型毎に、6匹の群を設計する：PBS、HSAおよびHSA融合タンパク質（HSA-プレS（perS）、HSA-HA、HSA-NLSおよびHSA−組み合わせ）。
【０４４４】
インビトロ組織におけるルシフェラーゼ発現の定量
ルシフェラーゼ発現に関して、肝臓、脾臓、腎臓、心臓、肺、骨格筋（腓腹筋）および脳を含むいくつかの器官を収集する。組織を細かく切り刻み、受動溶解バッファ中でホモジナイズする。組織溶解物を10,000rpmで5分間手短に遠心分離し、細胞残屑を除去する。Wallac1420 Victor 2自動プレートリーダによるルシフェラーゼ活性分析のために、上清を96ウェルプレートに移す。組織溶解物中の総タンパク質濃度を、Bradfordアッセイを使用して測定する。
【０４４５】
AAVベクターの組織分布
異なる組織におけるAAVゲノムコピー数を検出するために、Qiagen DNeasy Blood & Tissue kitを使用して組織からDNAを単離する。ルシフェラーゼ遺伝子およびマウス（Mus musculus）ラミンB2遺伝子の両方に対してサンプル毎にリアルタイムPCRを実施する。ラミンB2遺伝子に対して使用するプライマーは、
2020511127.tif 000019
であり；ルシフェラーゼに対して使用するプライマーは、フォワードプライマー
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およびリバースプライマー
2020511127.tif 000021
である。LightCycler 480装置でのリアルタイムPCRによってウイルスゲノムを定量する。Lightcyclerソフトウェアv.4.5によって、ゲノムのコピーを、初期形質導入に使用するpTR-CBA-ルシフェラーゼプラスミドおよび内在性遺伝子のコピーに基づいて分析する。
【０４４６】
統計分析
全てのデータを平均±SEMとして提示する。本発明者らは、両側スチューデントのt検定または一元配置分散分析によって異なる実験群から平均値を比較する。P値<0.05を有意と見なす。
【０４４７】
HSA融合タンパク質を使用したAAV肝臓形質導入の機序
AAV形質導入に対するHSA効果の機序を研究するために、本発明者らは、以下の実験を実施する：AAV結合分析、蛍光標識ウイルスおよび共焦点顕微鏡を使用した細胞内トラフィッキング分析、ならびに全身投与後の血中AAVクリアランス。
【０４４８】
AAV結合分析
1×106の細胞を、HSAまたはHSA融合タンパク質とプレインキュベートしたAAVベクターと、103〜105の粒子/細胞にて4℃で1時間インキュベートし、冷培地で洗浄して、未結合ウイルスを除去する。洗浄後、AAVゲノムDNAを単離し、ホタルルシフェラーゼに対する特異的プライマーを用いたqPCRによってAAVベクターゲノムのコピー/細胞を定量する。
【０４４９】
ウイルス粒子およびアルブミン融合タンパク質の蛍光色素標識
先に記載の通り、精製したAAVビリオンまたはHSA融合タンパク質を、カプシドタンパク質またはアルブミン単位で10倍モル過剰のCy5またはCy3モノN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）エステル（GE Healthcare, Piscataway, NJ）とPBS中4℃で1時間インキュベートする。標識ウイルスまたはタンパク質を、5％ソルビトールを含有するPBSに対して透析し、遊離色素を除去する。
【０４５０】
免疫細胞化学
Huh7細胞を、HSA融合タンパク質とプレインキュベートした蛍光標識AAV2ベクターと、10000の粒子/細胞の用量にて異なる時間（30分間、2時間、4時間、8時間、16時間および24時間）インキュベートする。これらの細胞を、2％パラホルムアルデヒドを用いてRTで15分間固定する。洗浄後、L-リジンで事前にコートしたLabTek 4-チャンバースライドに細胞をプレーティングする。2時間後、PBS中0.1％ Triton X-100を用いて、細胞を室温で5分間透過処理する。細胞を洗浄し、LAMP（エンドソームに関する）またはγ-チューブリン（MTOCに関する）に対する一次抗体と37℃で1時間インキュベートする。洗浄後、細胞をCy3コンジュゲート二次抗体とインキュベートする。最終洗浄後、細胞をVectashield（Vector Laboratories; Burlingame, CA）に封入し、共焦点レーザー走査顕微鏡（Leica SP2）で分析する。
【０４５１】
AAVの血中クリアランス
C57BL/6マウスにおける1×1011のAAV/luc粒子の尾静脈注射後、2、6、24および48時間にマウスから血漿を得る。DNeasy Blood & Tissue kitを使用して、血漿からのウイルスDNA単離を実施する。リアルタイムPCRによってウイルスゲノムを定量する。
【０４５２】
CPPは、ある研究ではAAVベクターと直接混合したときにAAV形質導入を増強させることが実証されている。肝実質細胞における増強されたAAV形質導入は、AAVとのインビトロおよびインビボインキュベーションに単一ペプチドまたは3つのペプチドの組み合わせ由来のHSA融合タンパク質を使用して達成され得る。3つのペプチドの組み合わせとコンジュゲートされたHSA融合タンパク質は、AAV形質導入に対して、あらゆる単一ペプチドよりもはるかに高い増強効果を有する。エンドソーム分解性ペプチドもしくはNLSペプチドまたは組み合わせペプチドとコンジュゲートされたHSA融合タンパク質はまた、肝実質細胞以外の細胞株または組織においてもAAV形質導入に対して増強効果を発揮する。エンドソーム分解性ペプチドとコンジュゲートされたHSA融合タンパク質（単一または組み合わせ）は、エンドソームからのAAVベクター回避を増加させ、AAV核周囲蓄積を減少させることができ、これは、蛍光色素標識ウイルスおよび共焦点顕微鏡を使用して可視化される。AAVベクターをNLSとコンジュゲートされたHSA融合タンパク質とインキュベートしたときに、より多くのウイルスが核で可視化される。HSA融合タンパク質をHBVプレSペプチドとコンジュゲートしたとき、より多くのAAVゲノムのコピーが肝臓で検出される；また、この融合タンパク質は、全身投与後により速いAAVベクターの血中クリアランスを誘導する。
【０４５３】
AAVカプシド抗原提示に対するアルブミン融合タンパク質の効果の調査
データは、AAVカプシド抗原提示が用量依存的であること、および、より低い用量のAAVベクターが抗原提示全体を低減し得ることを示している。さらなる研究は、より低いベクター用量を使用しながら必要な治療レベルを達成する異なる戦略を検討する。これらは、化学試薬の適用だけでなく、異なる血清型の利用、AAVカプシドの遺伝的修飾およびAAVベクターカセットの最適化を含め、AAV肝臓形質導入の増強を利用するアプローチを含む。
【０４５４】
多くのウイルスは、様々な機序を使用して抗原−MHC I提示と干渉する特定のペプチド（VIPR）を産生することによってヒト免疫応答を回避する。2つのVIPR（US6およびICP47）が十分に特徴付けられており、この特定の目的に使用することができる。TAPに結合する23 kDaの小胞体（ER）局在性I型膜内在性タンパク質である、ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）のUS6遺伝子産物は、ペプチド移行を阻害し、MHCクラス-Iアセンブルを防止する。内腔ドメインのC末端の20残基は、TAPの阻害に必須であることが実証されている。単純ヘルペスウイルス（HSV）-1タンパク質ICP47は、TAPに特異的に結合し、それによって、ペプチド結合、TAPによる移行、および後続のER中のMHCクラスI分子上へのペプチドのローディングをブロックする。32アミノ酸残基の短い断片であるICP47（aa3-34）は、TAPへのペプチド結合を阻害する能力を持つ最小領域であると分かった。その結果は、ICP47およびUS6の補充で抗原提示がインビトロ阻害されたことを実証している。
【０４５５】
インビボのAAVカプシド抗原提示に対するアルブミン処置の効果
カプシド抗原提示を研究するために、本発明者らは、OVAペプチドSIINFEKLがHIループに組み込まれた本発明者らの改変ウイルス（AAV2/OVAおよびAAV8/OVA）を使用して、肝実質細胞HepG2/K2b細胞株でおよび全身投与後にマウスで用量反応および動態を含めこれらの研究を実施する。
【０４５６】
HepG2/H2kb細胞における抗原提示分析
1×109のAAV/OVAベクター粒子をHSAと4℃で2時間インキュベートし、次いで、これを使用して1×105のHepG2/H2kb細胞に感染させる。24時間後、OT-1マウス由来の1×106の脾臓細胞をHepG2細胞に一晩加える。細胞を採取し、早期T細胞活性化の検出のためにCD8およびCD69で染色する。
【０４５７】
AAV空カプシドからの抗原提示の動態に関する動物実験
7つの実験群を設計する：HSA、HSA/プレS、HSA/HA2、HSA/NSL、HSA/組み合わせ、陰性対照としてのビヒクル処置−PBSおよびAAVなし。AAVベクター（1×1011の粒子）を、HSAまたは融合タンパク質とインキュベートし、次いで、C57BLマウスに尾静脈注射を介して投与する。異なる時点（AAV投与後、3日目、21日目、41日目および61日目）で、5×106のCFSE標識OT-1脾臓細胞をこれらの処置マウスにIV投与を介して輸注する。OT-1細胞注入の10日後、マウスを屠殺して、OT-1 CD8細胞の増殖を分析する。
【０４５８】
AAV空カプシドからのAAVカプシド抗原提示の用量反応に関する動物実験
HSAまたは融合タンパク質とインキュベートした漸増用量のAAV粒子（108、109、1010、1011および1012）を、C57BLマウスに尾静脈を介して注射する。3日後、OT-1 CD8増殖アッセイのためにCFSE標識OT-1細胞を注入する。6つのマウス群（0、108、109、1010、1011および1012のAAV粒子）に割り当てる。
【０４５９】
カプシド抗原提示に対するVIPRと融合されたアルブミン
本発明者らは、US6を使用して、HSAとの融合タンパク質（HSA-US6）およびHSA組み合わせとの融合タンパク質（HSA-組み合わせ−US6）を作製する。導入遺伝子発現およびカプシド抗原提示に対するUS6融合タンパク質の効果を、本明細書に記載の通りインビトロおよびインビボで研究する。
【０４６０】
マウス実験
導入遺伝子発現のために、4つの群（HSA、HSA-US6、HSA−組み合わせ、HSA−組み合わせ−US6）を設計する。抗原提示の動態に関して、6つの群（対照、PBS、HSA、HSA-US6、HSA−組み合わせ、HSA−組み合わせ−US6）に割り当てる。抗原提示の用量反応に関して、6用量（0、108、109、1010、1011、1012の粒子/マウス）を研究する。
【０４６１】
高用量のプロテアソーム阻害剤ボルテゾミブは、二重機能を有する：増加されたAAV形質導入および減少された抗原提示。しかしながら、比較的低い用量を使用するとき、AAV形質導入は増加するかまたは変化しないが、抗原提示は増加する。本発明者らの過去の研究は、効果的なAAVカプシド抗原提示が、ユビキチン化およびプロテアソームによる分解にエンドソームからサイトゾルへのウイルスの脱出を必要とすることを実証している。このことによって、HSAまたは融合タンパク質とインキュベートしたとき、より多くのウイルスが、エンドソームを回避して核へ急速に移動できるようになるので、HSAまたはその融合タンパク質は、インビトロでかつマウスのAAV全身投与後早期にカプシド抗原提示を増加させるだろう。エンドソーム分解性ペプチドおよびNLSペプチドを有するHSA融合タンパク質に結合したウイルスは、核へより速く移動し得るので、カプシド抗原提示の効率は、インビボのより遅い時点でのHSA結合ウイルス形質導入に由来してより低いかまたは検出不能であるはずである。
【０４６２】
AAV Nab回避に対するアルブミン融合タンパク質の効果の研究
一般的なヒト集団では、95％を超える対象がAAVウイルスに自然に感染し、その半分が中和抗体を生成するので、これらの対象は有益なAAV遺伝子療法から除外され得る。これは、肝臓を標的とするためにAAVベクターの全身投与を必要とする、肝臓障害を有する患者に特に影響を及ぼす。主に求められることは、ヒトNabを回避してヒト肝臓向性を付与する能力を有するAAVベクターである。AAV Nabを克服するために、AAV表面をコートポリマーでマスクすること、Nabの存在下AAVシャッフリングライブラリを有するAAV変異体を開発することの他に、AAVの代替血清型、AAVカプシド表面上のNab結合ドメインの合理的変異から生成されたAAV変異体、血漿−アフェレーシス、B細胞を枯渇させる抗CD20抗体（リツキシマブ）、およびNabに対するデコイとして過度の空AAVカプシドを使用することを含め、いくつかのアプローチが利用されている。これらのアプローチは、AAV向性を変化させるか、長い時間を要するか、または低い効率もしくは他の負の副作用（Ig欠損、増加されたカプシド抗原負荷）を有するかのいずれかである。理想的なアプローチは、肝臓向性変化および重度の副作用なしにNabを回避する能力を有することだろう。HSAとAAVとの直接的相互作用は、AAV形質導入を増強させるが、AAVビリオン上のHSAの結合部位の場所は依然として不明である。AAVビリオン表面上のHSA結合部位は、AAVが効果的な結合および効果的な形質導入に使用する部位である可能性がある。言い換えれば、HSA結合部位はまた、Nabによってターゲティングされる。Nab機能のブロッキングにおけるアルブミンおよびその融合タンパク質の役割を検討するために、本発明者らは、HSAがNabの存在下でAAV形質導入を助けるかどうかを研究する。AAV表面は、AAV形質導入およびNab結合に役割を果たす9つの可変領域（VR）を有する。9つのVR由来のペプチドがデコイとして使用されれば、AAVベクターは、Nab結合を回避することができると想定される。これは、空ビリオンの適用と類似している。HASまたはその融合タンパク質がNabの存在下で肝実質細胞におけるAAV形質導入に影響を及ぼすかどうかを判定するために、実験を実行した。HSAおよび融合タンパク質の効果を、A20モノクローナル抗体中和活性に対して試験する。次に、AAV形質導入に対するHSAおよびその融合タンパク質の効果を、AAVで免疫されたマウスおよびIVIGを含むNabに陽性のヒト由来の血清の存在下で調べる。
【０４６３】
Nab回避に対するアルブミンおよびその融合タンパク質の効果
アルブミンまたはアルブミン融合タンパク質がNab活性に干渉するかどうかを研究するために、AAV2/lucウイルスを、HSAまたはHSA融合タンパク質とインキュベートし、次いで、中和活性アッセイのためにNab（A20、AAV免疫化マウス血清およびヒト血清またはIVIG）を加える。
【０４６４】
Huh7細胞における中和抗体アッセイ
10ulの1×108のAAV2/lucベクター粒子を、10ulのHSAまたはHSA−プレSまたはPBSと4℃で2時間インキュベートし、次いで、段階希釈した20ulのA20またはマウスもしくはヒト由来の血清を、4℃でさらに2時間加える。AAV、HSAおよびNabの混合物を1×105のHuh細胞と無血清培地中で48時間共培養する。細胞溶解物を使用して、ルシフェラーゼ活性を測定する。Nab力価は、ルシフェラーゼ活性が対照より50％低い最大希釈として定義される。
【０４６５】
マウスにおける免疫化
1×1010のAAV2/ルシフェラーゼ（AAV/luc）粒子をC57BL/Cマウスに腹腔内注射し、そして、14日目に同じウイルスでマウスを追加免疫する。NAbアッセイのために、指定の時点で後眼窩叢を介して血清を収集する。
【０４６６】
ヒトIVIGおよび血漿
10％ヒトIVIG（Gamunex-c）をGrifols Therapeutics Inc.（Research Triangle Park, NC）から購入する。個々のヒト血清をValley Biomedical（Minchester, VA）から購入する。ヒトIVIGおよび血清を分割し、将来使用するために−80℃で保存する。
【０４６７】
Nab回避に対するAAV VRと融合されたアルブミンの効果
AAVビリオン表面には9つのVRがある。単一VRペプチドの各々および9つ全てのVR由来のペプチドの組み合わせを用いてHSA融合タンパク質を構築する。HSA融合タンパク質の精製後、Huh7細胞およびマウス肝臓におけるAAV形質導入に対する効果を試験して、HSA融合タンパク質とAAV VRペプチドとのインキュベーションがAAV形質導入に影響を及ぼすかどうかを検証する。次に、これらのHSA融合タンパク質の効果を研究して、マウスおよびヒト由来のNabの存在下でのHuh 7細胞におけるAAV形質導入に対するそれらの効果を判定する。
【０４６８】
マウス実験
AAV形質導入に対するAAV2 VRを有するHSA融合タンパク質の効果を研究するために、1×1010のAAV2/luc粒子を、HSAまたはHSA-VR融合タンパク質と4℃で2時間インキュベートし、次いで、マウスに後眼窩注射を介して投与する。異なる時点で、撮像および分析する。12の群を設計する：PBS、HSA、9つのHSA-VR（単一由来）およびHSA-VR（9つのVRの組み合わせ由来）。
【０４６９】
Nab回避に対するCPPおよびVRを有するアルブミン融合タンパク質の効果
本明細書に記載の研究に基づき、肝実質細胞特異的リガンドおよび両親媒性CPPとのアルブミン融合タンパク質HSA−組み合わせが、単一CPPを有するあらゆる融合タンパク質よりも高いAAV肝実質細胞形質導入を誘導すること、そして、HSA-VR（9つのVRを含有する）が、Nab活性に対してあらゆる単一HSA-VRよりも強い阻害を持つことが示される。次いで、アルブミン融合タンパク質HSA−組み合わせ−VR（HASとCPPおよび9つのAAV2 VR由来のペプチドからなる）の効果を、本明細書に記載の通り肝実質細胞形質導入およびNab回避能に対して試験した。
【０４７０】
マウス実験
導入遺伝子発現のために、4つの群（PBS、HSA−組み合わせ、HSA-VRおよびHSA−組み合わせ−VR）に割り当てる。AAV2/lucベクターを、HSA−組み合わせ−VRと4℃で2時間インキュベートし、次いでマウスに投与する。マウスの撮像を行い、分析する。
【０４７１】
AAV NabがAAVビリオン表面上の共通領域に結合すること、および、異なるNabが異なるエピトープを認識することが実証されている。これに基づき、HSAが、いくつかの結合部位をいくつかの血清試料由来のNabと共有し得るので、HSAとAAV2とのインキュベーションがNab活性をブロックすることを示唆されるという理解の下、試験を実行する。AAV結合、細胞内トラフィッキングなどを伴う効果的なAAV形質導入にVRが主要な役割を果たすこと、そして、ペプチドスキャニング研究によってAAV VRに由来するペプチドがNab活性をブロックできることが示されているので、本発明者らは、デコイとしてAAV VR由来のペプチドを有するBSA融合タンパク質が、AAV形質導入に対するNab活性を阻害すると予測する。
【０４７２】
これらの研究の全体目標は、増強されたAAV形質導入、AAVカプシド抗原提示の抑制およびAAV中和抗体認識のブロッキングを含むAAV遺伝子送達における、ヒトアルブミンの適用を検討することであり、これは、肝臓タンパク質合成に欠陥のあるより広い用途にとって重要である。これらの予備研究およびAAVベクター開発への継続的な貢献は、実験設計全体を支援する。
【０４７３】
本発明を、その特定の態様の具体的な詳細に関して記載したが、そのような詳細は、添付の特許請求の範囲に含まれる場合を除きかつその程度まで、本発明の範囲を限定するものとして見なされるべきではない。
【０４７４】
実施例7：AAV形質導入に対するIVIGの効果
AAV免疫化血清由来の免疫グロビンが、AAV形質導入に対して中和活性を有することがよく知られている。本発明者らの研究では、ヒトIVIGをAAV中和抗体分析のための供給源として使用したとき、実際に、本発明者らは、高濃度のIVIGを使用したときに中和効果が検出されたが、より低い用量のIVIGを適用したときには、全身投与後の肝臓で増強された導入遺伝子発現が観察されたことを実証した（図41）。結果は、非中和免疫グロビンがAAV形質導入を増加させることを示している。
【０４７５】
実施例8：形質導入増強および中和抗体回避のためのポリプロイド性アデノ随伴ウイルスベクターの適用
アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターは、血友病患者および盲患者の臨床試験において使用され成功を収めている。AAV形質導入を増強して中和抗体活性を回避する効果的な戦略の検討は、依然として不可欠である。過去の研究は、AAV血清型由来のカプシドの適合性および1つのビリオンの異なるカプシドサブユニット上に位置するAAV Nabの認識部位を示している。この研究では、本発明者らは、AAV2およびAAV8ヘルパープラスミドを異なる比（3：1、1：1および1：3）で共トランスフェクトして、ハプロイドカプシドをアセンブルし、それらの形質導入およびNab回避活性を研究した。ハプロイドウイルス収量は、親の場合と類似しており、そして、ヘパリン硫酸結合能は、AAV2カプシドインプットと正に相関していた。筋肉注射後、ハプロイドウイルスは全て、親のAAVベクターよりも高い形質導入（AAV2より2〜9倍）を誘導し、ハプロイドベクターAAV2/8 1：3で最高であった。全身投与後、AAV8単独の場合よりも、4倍高い形質導入がハプロイドAAV2/8 1：3を用いて肝臓で観察された。重要なことに、本発明者らは、治療用IX因子カセットをハプロイドAAV2/8 1：3カプシドにパッケージングし、それらをFIXノックアウトマウスに尾静脈を介して注射した。AAV8のウイルスベクターと比較して、より高いFIX発現および改善された表現型補正が、ハプロイドAAV2/8 1：3ウイルスベクターを用いて達成された。追加的に、ハプロイドウイルスAAV2/8 1：3は、AAV2中和を回避することができ、AAV2との非常に低いNab交差反応性を有していた。
【０４７６】
ポリプロイド性ウイルスのNab回避能を改善するために、本発明者らは、AAV2、AAV8およびAAV9ヘルパープラスミドを1：1：1の比で共トランスフェクトすることによって、トリプロイドベクターAAV2/8/9ベクターを生産した。全身投与後、AAV8を用いた場合よりも2倍高い形質導入が、トリプロイドベクターAAV2/8/9を用いて肝臓で観察された。中和抗体分析は、AAV2/8/9ベクターが、親の血清型で免疫化されたマウス血清由来の中和抗体活性を回避することができたことを実証した。これらの結果は、ポリプロイド性ウイルスが、形質導入の増強およびNab認識の回避に対して親の血清型から潜在的に有意性を獲得し得ることを示している。この戦略を、中和抗体陽性患者の将来の臨床試験において検討すべきである。
【０４７７】
異なるcap遺伝子を有するヘルパープラスミドの数は、限定されることなく、特定の処置レジメンの具体的な要件に基づいて混合および適合させることができる。
【０４７８】
細胞株
HEK293細胞、Huh7細胞およびC2C12細胞を、10％ウシ胎児血清および10％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地中、5％ CO2、37℃で維持した。
【０４７９】
組換えAAVウイルス生産
組換えAAVを三重プラスミドトランスフェクション系によって生産した。15cmのディッシュのHEK293細胞に、9μgのAAV導入遺伝子プラスミドpTR/CBA-Luc、12μgのAAVヘルパープラスミドおよび15μgのAdヘルパープラスミドXX680をトランスフェクトした。トリプロイドAAV2/8ビリオンを生成するために、トランスフェクトされるAAV2またはAAV8に対する各ヘルパープラスミドの量を、1：1、1：3および3：1の3種の異なる比で共トランスフェクトした。ハプロイドAAV2/8/9ベクターを作製するために、各血清型に対するヘルパープラスミドの比は、1：1：1であった。トランスフェクションの60時間後、HEK293細胞を収集して溶解した。上清をCsCl勾配超遠心分離に供した。ウイルス力価を定量PCRによって決定した。
【０４８０】
ウェスタンおよび免疫ブロット
ウイルス力価に従って、同じ量のビリオンを各レーンに負荷し、続いて、NuPage 4〜10％ポリアクリルアミドビス−トリスゲル（Invitrogen, Carlsbad, CA）上で電気泳動し、次いで、iBlot（登録商標）2ドライブロッティングシステム（Invitrogen, Carlsbad, CA）を介してPVDFメンブレンに転写した。メンブレンを、AAVカプシドタンパク質に特異的なB1抗体とインキュベートした。
【０４８１】
ネイティブ免疫ブロットアッセイを以前に記載の通りに行った。簡潔に述べると、精製したカプシドを、バキュームドットブロッターを使用することによってHybond-ECLメンブレン（Amersham, Piscataway, NJ）に転写した。メンブレンを10％ミルクPBS中で1時間ブロッキングし、次いで、モノクローナル抗体A20またはADK8とインキュベートした。メンブレンをペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体とl時間インキュベートした。Amersham Imager 600（GE Healthcare Biosciences, Pittsburg, PA）によってタンパク質を可視化した。
【０４８２】
インビトロ形質導入アッセイ
組換えウイルスによって平底24ウェルプレート中1×104vg/細胞で、Huh7細胞およびC2C12細胞を形質導入した。48時間後、細胞を採取し、ルシフェラーゼアッセイ系（Promega, Madison, WI）によって評価した。
【０４８３】
ヘパリン阻害アッセイ
Huh7細胞またはC2C12細胞への組換えウイルスの結合を阻害する可溶性ヘパリンの能力をアッセイした。簡潔に述べると、AAV2、AAV8、ハプロイドウイルスAAV2/8 1：1、AAV2/8 1：3およびAAV2/8 3：1を、DMEM中、可溶性HSの存在下または非存在下、37℃で1時間インキュベートした。プレインキュベーション後、組換えウイルスの混合物と可溶性HSをHuh7細胞またはC2C12細胞に加えた。形質導入の48時間後、細胞を採取し、ルシフェラーゼアッセイによって評価した。
【０４８４】
動物研究
この研究において実施された動物実験は、C57BL/6マウスおよびFIX-/-マウスで実行した。UNC動物実験委員会（IACUC）によって承認されている通りのNIHガイドラインに従ってマウスを維持した。6週齢の雌C57BL/6マウスに、後眼窩注射を介して3×1010vgの組換えウイルスを注射した。D-ルシフェリン基質（Nanolight Pinetop, AZ）の腹腔内（i.p.）注射後、Xenogen IVIS Lumina（Caliper Lifesciences, Waltham, MA）を使用して注射の1週間後にルシフェラーゼ発現を撮像した。Living Image（PerkinElmer, Waltham, MA）を使用して、生物発光画像を分析した。筋肉形質導入のために、1×1010のAAV/Luc粒子を6週齢の雌C57BL/6の腓腹筋に注射した。マウスを指定の時点に撮像した。
【０４８５】
FIXノックアウト雄マウス（FIX KOマウス）に、尾静脈注射を介して1×1010vgを与えた。注射後の様々な時点に、後眼窩叢から採血した。6週目に、マウス出血分析を実施した。
【０４８６】
肝臓におけるルシフェラーゼ発現の定量
撮像研究に利用した動物を、組換えウイルス注射後4週目に屠殺し、肝臓を収集した。肝臓を細かく切り刻み、受動溶解バッファ中でホモジナイズした。肝臓溶解物を遠心分離した後、上清中のルシフェラーゼ活性を検出した。組織溶解物中の総タンパク質濃度を、Bradfordアッセイ（BioRad, Hercules, CA）を使用して測定した。
【０４８７】
肝臓におけるAAVゲノムコピー数の検出
細かく切り刻んだ肝臓をプロテアーゼKによって処理した。PureLink Genomic DNA mini Kit（Invitrogen, Carlsbad, CA）によって全ゲノムDNAを単離した。ルシフェラーゼ遺伝子をqPCRアッセイによって検出した。マウスラミン遺伝子を内部対照とした。
【０４８８】
ヒトFIX発現、機能および尾出血時間アッセイ
ヒトFIX発現、一段階hFIX活性アッセイおよび尾出血時間アッセイを以前に記載の通り実施した。中和アッセイのために、Huh7細胞を、48ウェルプレート中に各ウェル当たり105細胞の密度で播種した。マウス抗体の2倍希釈物をAAV-Luc（1×108vg）と37℃で1時間インキュベートした。混合物を細胞に加え、37℃で48時間インキュベートした。細胞を受動溶解バッファ（Promega, Madison, WI）で溶解し、ルシフェラーゼ活性を測定した。Nab力価は、ルシフェラーゼ活性が無血清対照より50％低い最大希釈として定義した。
【０４８９】
統計分析
データを平均±SDとして提示した。スチューデントのt検定を使用して、全ての統計分析を行った。P値<0.05を統計的に有意な差と見なした。
【０４９０】
ハプロイドウイルスのインビトロ特徴付け
本発明者らの過去の研究は、AAV1、2、3および5カプシド間のカプシド適合性を実証している。AAV導入遺伝子およびアデノウイルスヘルパーpXX6-80を用いた、2つの血清型由来のAAVヘルパープラスミドの異なる比でのトランスフェクションによってハプロイドウイルスを生産した。親ベクターと比較して、いくつかの細胞株においてハプロイドウイルスからの増強された形質導入が観察された。AAV2は、その生物学に関してかつ遺伝子送達ビヒクルとして十分に特徴付けられており、そして、AAV8は、マウス肝臓における高い形質導入の理由で多くの注目を集めている。両血清型は、血友病患者のいくつかの臨床試験で利用されている。AAV血清型2および8カプシドがハプロイドウイルスを形成する可能性およびそれらの形質導入プロファイルを調査するために、本発明者らは、AAV2およびAAV8のヘルパープラスミドを3：1、1：1および1：3の比でトランスフェクトしてハプロイドベクターを作製した。ハプロイドウイルスの全てを、セシウム勾配を使用して精製し、Q-PCRによって力価測定した。ハプロイドウイルスと親のAAV2またはAAV8との間でウイルス収量に有意差はなかった。ハプロイドウイルスのカプシドタンパク質が発現されたかどうかを判定するために、AAV2およびAAV8のカプシドタンパク質を認識するモノクローナル抗体B1を使用して、精製したハプロイドウイルス由来の等価なウイルスゲノムに対してウェスタンブロット分析を実施した。全てのハプロイドウイルスにおいて、AAV2およびAAV8由来のVP2カプシドの混合物が観察され、ハプロイドウイルス中のAAV2またはAAV8由来のVP2カプシドの強度は、2つのヘルパープラスミドの比に関連していた。これらの結果は、AAV2およびAAV8由来のカプシドが適合性であり、AAVビリオンへ集合可能であったことを示唆した。
【０４９１】
カプシドタンパク質を混合することによってハプロイドウイルスの向性が変化したかどうかを判定するために、ヒトHuh7細胞株およびマウスC2Cl2細胞株を形質導入することによってハプロイドウイルスの形質導入有効性を分析した。AAV8の形質導入効率は、該細胞株の両方においてAAV2よりもはるかに低かった。全てのハプロイドベクターからの形質導入は、AAV8の場合よりも高く、その効率は、両細胞株においてAAV2カプシドの添加と正に相関した。ハプロイドベクター形質導入は、Huh7細胞においてAAV2よりも低かったが、ハプロイドベクターAAV2/8 3：1は、C2C12細胞においてAAV2よりも3倍高い形質導入を誘導した。
【０４９２】
このインビトロ形質導入データは、ウイルス調製物が個々の血清型ベクターの混合物ではなくハプロイドベクターからなることを裏付けており、ハプロイドベクターがAAV形質導入を増強し得ることを示している。ヘパリン硫酸プロテオグリカンがAAV2の主受容体として同定されている。次に、本発明者らは、ヘパリン結合能の阻害がハプロイドウイルスの形質導入を変化させたかどうかを調査した。AAVベクターと可溶性ヘパリンとのプレインキュベーションは、AAV2形質導入をHuh7細胞とC2C12細胞の両方においてほぼ100％ブロックし、AAV8形質導入をHuh7細胞およびC2C12細胞においてそれぞれ37％および56％ブロックした。可溶性ヘパリンによるハプロイドベクター形質導入の阻害は、両細胞株においてAAV2カプシドのインプットに依存していた。より多いAAV2カプシドインプットで、形質導入のより高い阻害が観察された。この結果は、ハプロイドウイルスが、効果的な形質導入に親ベクター由来の両主受容体を使用し得ることを示唆している。
【０４９３】
ハプロイドウイルスの筋肉形質導入の増加
上記の通り、ハプロイドウイルスAAV2/8 3：1の形質導入効率は、筋肉細胞株C2C12において、AAV2およびAAV8の場合よりも高い。次に、本発明者らは、インビトロでの高い形質導入がマウス筋肉組織に転換されたかどうかを研究した。AAV2/8ハプロイドおよび親ベクターを、C57BL/6マウスの後肢の筋肉に直接注射した。対照として、3：1、1：1および1：3の比のAAV2およびAAV8ウイルスの混合物も調査した。簡易比較のために、片脚にAAV2を注射し、他方の脚に試験ベクターを注射した。ウイルス毎に合計1×1010vgのベクターを投与した。AAV2と比較して、類似の筋肉形質導入がAAV8について達成された。C2C12細胞での結果に反して、ハプロイドウイルスの全てから増強された筋肉形質導入が観察された。
【０４９４】
ハプロイドベクターAAV2/8 1：1およびAAV2/8 1：3は、AAV2よりも4倍および2倍高い形質導入をそれぞれ達成した。注目すべきことに、ハプロイドベクターAAV2/8 3：1の筋肉形質導入は、AAV2の場合よりも6倍超高かった。しかしながら、混合ウイルスは全て、AAV2と類似の形質導入効率を有していた。これらの結果は、ハプロイドウイルスが筋肉形質導入を増加できることを示唆しており、2つのカプシドプラスミドの共トランスフェクションから生産されたウイルスがハプロイドであることをさらに裏付けている。
【０４９５】
ハプロイドウイルスの増強された肝臓形質導入
AAV2およびAAV8は、血友病B患者のいくつかの臨床試験において肝臓ターゲティングに使用されている。本発明者らはまた、マウス肝臓におけるハプロイドウイルスの形質導入効率を評価した。AAV2およびAAV8と混合したウイルスも対照として注射した。3×1010vgの用量のAAV/lucベクターをC57BLマウスに後眼窩静脈を介して投与した；AAV注射後3日目に撮像を行った。ハプロイドウイルスAAV2/8 1：3は、他のハプロイド、混合ウイルスおよびさらには親のAAV8と比べ、マウス肝臓において最も高い形質導入効率を誘導した。ハプロイドベクターAAV2/8 1：3の形質導入効率は、AAV8の場合より約4倍高かった。他のハプロイドウイルスからの肝臓形質導入は、親ベクターAAV8からの場合よりも低かったが、AAV2よりは高かった。注射後7日目に、マウスを屠殺し、肝臓を採取し、ゲノムDNAを単離した。肝臓におけるルシフェラーゼ遺伝子コピー数をqPCRによって決定した。肝臓形質導入効率の結果とは異なり、ハプロイドウイルスにもAAV血清型2および8にも関係なく類似のAAVベクターゲノムコピー数が肝臓において見出された。導入遺伝子発現を遺伝子コピー数に対して正規化したとき、肝臓における導入遺伝子発現と一致して、ハプロイドベクターAAV2/8 1：3は、他のあらゆるハプロイドベクターおよび血清型と比べ、最も高い相対導入遺伝子発現を誘導した。肝臓におけるハプロイドウイルスの形質導入プロファイルは、筋肉形質導入におけるものとは異なっており、全てのハプロイドウイルスが親の血清型の場合よりも高い導入遺伝子発現を誘導し、AAV2/8 3：1からのものが最良であった。
【０４９６】
血友病Bマウスモデルにおけるハプロイドベクターによる増大された治療的FIX発現および改善された出血表現型補正
上の結果に基づき、ハプロイドベクターAAV2/8 1：3は、AAV8よりもはるかに高い肝臓形質導入を誘導した。次に、本発明者らは、ハプロイドベクターAAV2/8 1：3が、動物疾患モデルにおいて治療的導入遺伝子発現を増加できるかどうかをさらに試験した。本発明者らは、ヒトFIX（hFIX）を治療用物質として使用し、そして、ヒト最適化FIX導入遺伝子をコードしておりかつ肝臓特異的プロモータTTRによって駆動されるハプロイドベクターAAV2/8 1：3/hFIXを、FIXノックアウト（KO）マウスに1×1010vg/マウスの用量で尾静脈を介して注射した。注射後1、2および4週目に、血液循環におけるhFIX発現および活性を、それぞれ、ELISAおよび一段階因子活性によって分析した。6週目に、インビボhFIX機能に関する失血を、テールクリッピングアッセイを使用して評価した。野生型C57BL/6マウスにおけるハプロイドAAVベクターを用いた高い肝臓形質導入の観察と一致して、ハプロイドベクターAAV2/8 1：3肝臓ターゲティングは、注射の2週間後、AAV8ベクターよりもはるかに多いhFIXを生産した。AAV2/8 1：3のより高いhFIXタンパク質発現は、高いFIX活性に密接に関連していた。AAV2/8 1：3/hFIX注射を受けたマウスの失血は、野生型C57BL/6マウスの場合と類似しており、KOマウスの場合よりも低かった。しかしながら、AAV8処置マウスは、野生型マウスの場合よりも失血が多かった。これらのデータは、ハプロイドベクターAAV2/8 1：3が、肝臓からの治療的導入遺伝子発現を増加させ、疾患表現型補正を改善することを示している。
【０４９７】
ハプロイドウイルスAAV2/8の中和抗体を回避する能力
個々のハプロイドウイルスビリオンは各々、異なるAAV血清型カプシド由来の60個のサブユニットからなる。1つの血清型由来のいくつかのカプシドサブユニットの異なる血清型由来の他のカプシドサブユニットへの挿入は、ビリオン表面構造を変化させ得る。ほとんどのAAVモノクローナル抗体が、1つの単一ビリオンの異なるサブユニット上の残基を認識することがよく知られている。ハプロイドウイルスが親ベクターから生成されたNabを回避することができるかどうかを研究するために、まず本発明者らは、免疫ブロットアッセイによるモノクローナル抗体を使用したNab結合アッセイを実施した。ウイルスゲノム含有粒子の3つの希釈物をニトロセルロースメンブレンに吸着させ、無傷のAAV2またはAAV8をそれぞれ認識するNab A20またはADK8をプローブとした。全てのハプロイドウイルスおよびAAV2とAAV8の混合物とのウイルスは、モノクローナル抗体ADK8またはA20によって認識された。ハプロイドウイルスのA20との反応性は、より多くのAAV2カプシドをハプロイドウイルスビリオンに組み込むことによって増加した。しかしながら、カプシド比に関係なく、ハプロイドウイルス間で抗AAV8 Nab ADK8の認識について明らかな変化はなかった。とりわけ、A20へのハプロイドAAV2/8 1：3の結合は、親のAAV2およびAAV2とAAV8と（1：3比）の混合物のウイルスの場合よりもはるかに弱く、このことは、ハプロイドAAV2/8 1：3ビリオン表面にA20結合部位が枯渇していることを示している。
【０４９８】
次に、本発明者らは、AAV免疫化マウス由来の血清に対するハプロイドウイルスの免疫学的プロファイルを分析した。Nab力価を使用して、ベクター形質導入を阻害する血清の能力を評価した。注射後4週目に、親ウイルスで処置したマウスから血清を収集した。表10に示す通り、A20またはADK8に対するハプロイドウイルスの中和プロファイルは、ネイティブ免疫ブロット由来のデータと類似していた。AAV8とAAV2との間でNab交差反応性はなかった。興味深いことに、AAV8免疫化マウス血清が、AAV8カプシドの組み込み量に関係なく、AAV8ウイルスおよびハプロイドウイルスの全てに対して類似の中和活性を有していたが、AAV2およびAAV8と混合したウイルスに対しては有していなかった。混合ウイルスに対するAAV8血清の阻害がないことは、試験細胞株におけるAAV2からAAV8までの優れた形質導入によって説明され得る。しかしながら、ハプロイドウイルスは、AAV2血清からの中和を部分的に回避した。ハプロイドAAV2/8 1：1の形質導入は、ウイルスと抗AAV2血清のインキュベーション後、親のAAV2よりも16倍減少した。ハプロイドウイルスについてのAAV2血清Nabを回避する能力は、AAV2およびAAV8と混合したウイルスの場合よりもはるかに高かった。際だったことに、ハプロイドAAV2/8 1：3は、AAV2血清およびA20中和をほぼ完全に回避したが、このことは、ハプロイドウイルスが、抗AAV2 Nabを有する個体に使用できる潜在性を有することを示唆している（表10）。
【０４９９】
3つの血清型から作製されたトリプロイドベクターを用いた改善された中和抗体回避能
上記の本発明者らのデータは、ハプロイドAAV2/8ウイルスが、AAV8中和抗体活性を回避できなかったが、AAV8からのカプシド統合の量に依存するAAV2中和抗体を回避する能力を有していたことを実証した。より多くの血清型カプシドから作製されたポリプロイド性ウイルスがNab回避能を改善したかどうかを研究するために、本発明者らは、トリプロイドウイルスAAV2/8/9（1：1：1比）を作製した。トリプロイドベクターAAV2/8/9をマウスに注射した後、AAV2と比較して、トリプロイドウイルスAAV2/8/9は、AAV8よりも2倍高い形質導入を肝臓において誘導した。AAV8ならびにハプロイドベクターAAV2/9およびAAV8/9（トリプロイドベクターが2つのAAVヘルパープラスミドから1：1の比で作製された）の中で肝臓形質導入の差は観察されなかった。AAV9全身投与は、AAV8よりも高い肝臓形質導入を誘導したことが示された。中和抗体アッセイを実施したとき、ハプロイドAAV2/8/9ベクターは、そのNab回避能を、AAV2、8および9と比較してそれぞれ約20倍、32倍および8倍改善した（表11）。
【０５００】
この研究では、ポリプロイド性AAVビリオンを2つの血清型または3つの血清型のカプシドからアセンブルした。AAV2主受容体ヘパリンへのハプロイドウイルスの結合能は、AAV2カプシドインプットの量に依存していた。ハプロイドウイルスは全て、親のAAV2ベクターよりも高い形質導入有効性をマウスの筋肉および肝臓において達成した一方で、ハプロイドウイルスAAV2/8 1：3は、親のAAV8ベクターよりも顕著な肝臓形質導入の増強を有していた。AAV8と比較して、ヒトFIXを送達するためのハプロイドウイルスAAV2/8 1：3の全身投与は、はるかに高いFIX発現および改善された血友病表現型補正をFIX-/-マウスにおいて誘導した。重要なことに、ハプロイドウイルスAAV2/8 1：3は、抗AAV2血清の中和を回避することができた。ハプロイドAAV2/8ビリオンへのAAV9カプシドの統合は、中和抗体回避能をさらに改善した。
【０５０１】
AAV2の主受容体はHSPGであるが、AAV8の主受容体は依然として不明である。ハプロイドウイルスがAAV2およびAAV8の両方由来の受容体を使用できるかどうかを研究するために、本発明者らは、ヘパリン阻害アッセイを実施して、ヘパリン受容体モチーフに結合するハプロイドウイルスの能力を試験した。Huh7細胞株およびC2C12細胞株におけるヘパリン阻害結果は、ハプロイドウイルスが、効果的な形質導入にAAV2カプシドのヘパリン受容体モチーフを使用することを裏付けている。ある程度まで、AAV8もまた、ヘパリンの存在下で減少した形質導入効率を示したが、形質導入効率は、AAV2の場合よりも依然として高い。
【０５０２】
臨床試験における効率的な形質導入の最も困難な局面の1つは、AAVベクターに対する中和抗体の広範な出現率である。AAVベクターのNab媒介性クリアランスは、AAV遺伝子導入の繰り返し投与の制限因子となっている。いくつかの研究は、中和抗体認識部位の合理的変異または定向進化法アプローチによって、Nab回避のためにAAVカプシドを遺伝子修飾することを検討している。カプシド変異は、AAV向性および形質導入効率を変化させ得る。追加的に、AAVビリオン上のNab結合部位の同定は、臨床試験におけるベクター適用に後れを取っており、そして、ポリ血清（poly sera）から全てのNab結合部位を見つけ出すことは不可能である。過去の研究は、いくつかのAAVモノクローナル抗体の認識部位が1つのビリオンの異なるサブユニット上に広がっていることを実証している。AAV8カプシドがAAV2ビリオンに導入されると、AAV2免疫化血清からのA20結合能および中和活性は、ハプロイドウイルスに対して劇的に減少した。AAV8ビリオンへのAAV2カプシドの統合は、無傷のAAV8モノクローナル抗体ADK8に結合する能力を減少させず、抗AAV8血清の中和活性を回避しなかった（表10）。このことは、ポリ血清からの全てのNab認識部位が、AAV8ビリオンの同じサブユニット上に位置し得ることを示唆している。また、結果は、AAV2ビリオンに統合されたAAV8カプシドが、ウイルスの細胞内トラフィッキングにおいて主要な役割を果たし得ることを示唆している。
【０５０３】
トリプロイドウイルスを3つの血清型AAV2、8および9のカプシドから作製したとき、トリプロイドベクターAAV2/8とは異なり、ハプロイドAAV2/8/9ウイルスは、AAV2、8または9免疫化マウス由来の血清の中和抗体活性を回避する能力を有し、このことは、AAV8およびAAV9が類似の形質導入経路を共有していることを示唆している。
【０５０４】
この研究からの数種類の証拠は、2または3つのAAVヘルパープラスミドのトランスフェクションからのポリプロイド性ビリオンアセンブルを裏付けている。（1）ウェスタンブロット分析を使用して、ハプロイドウイルスから異なるサイズの2つのVP2バンドが表示された。これらのVP2は、異なる血清型からのサイズと一致する。（2）形質導入プロファイルはC2C12細胞対Huh7細胞で異なっていた。ハプロイドAAV2/8 3：1ベクターは、特に、AAV2を用いた場合よりも低い形質導入をHuh7細胞において実証したが、C2C12細胞ではより高かった。（3）親ベクターAAV2およびAAV8、ならびにAAV2およびAAV8の混合物とのウイルスと比較して、全てのハプロイドAAV2/8ウイルスでより高い筋肉形質導入が実証された。（4）トリプロイドウイルスAAV2/8 1：3は、AAV8と比較して増強された肝臓向性を有していた。（5）A20およびADK8へのハプロイドウイルスの結合パターンは、AAV2およびAAV8の混合物とのウイルスとは異なる。（6）AAV2血清中和活性のプロファイルは、ハプロイドウイルスと混合ウイルスとの間で異なる。（7）トリプロイドAAV2/8/9ウイルスは、あらゆる親の血清型で免疫化されたマウス由来の血清の中和抗体活性を回避する。
【０５０５】
これらのポリプロイド性ウイルスは、インビトロおよびインビボでの形質導入効率を増強し、親ベクター免疫化血清からの中和さえ回避する。治療用導入遺伝子FIXを送達するためのポリプロイド性ウイルスの適用は、FIX欠損マウスにおいて、FIX発現を増加させ、血友病表現型補正を改善できた。これらの結果は、ハプロイドAAVベクターが、形質導入を増強してNabを回避する能力を有することを示している。
【０５０６】
実施例9：AAVビリオンと1つのAAVベクター由来のVP1/VP2および代替物由来のVP3とのアセンブルによるハプロイドAAVベクターからの増強されたAAV形質導入
上記研究において、本発明者らは、増加したAAV形質導入が、2つのAAVヘルパープラスミド（AAV2およびAAV8またはAAV9）または3つのプラスミド（AAV2、AAV8およびAAV9）のトランスフェクションによって生産されるポリプロイド性ベクターを使用して達成されることを実証している。これらの個々のポリプロイド性ベクタービリオンは、異なる血清型由来の異なるカプシドサブユニットからなり得る。例えば、AAV2ヘルパーおよびAAV8ヘルパープラスミドのトランスフェクションによって生成されるハプロイドAAV2/8は、効果的な形質導入のため1つのビリオンに異なる組み合わせのカプシドサブユニットを有し得る：AAV8由来のVP1およびAAV2由来のVP2/VP3、またはAAV8由来のVP1/VP2およびAAV2由来のVP3、またはAAV2由来のVP1およびAAV8由来のVP2/VP3、またはAAV2由来のVP1/VP2およびAAV8由来のVP3、またはAAV8由来のVP1およびAAV2由来のVP3、またはAAV2由来のVP1およびAAV8由来のVP3、またはAAV2由来のVP1/VP2/VP3、またはAAV8由来のVP1/VP2/VP3。以下の研究において、本発明者らは、増強された形質導入が、1つのAAVベクターカプシド由来のVP1/VP2および代替物由来のVP3を有するハプロイドベクターから達成できることを見出した。
【０５０７】
異なるAAV血清型によるVP1、VP2およびVP3の生成は、これらの異なるタンパク質を生産するために2つの異なる戦略を提供する。興味深いことに、VPタンパク質は、VP1、VP2およびVP3に対する重複配列を有する単一CAPヌクレオチド配列から翻訳される。
2020511127.tif 000022
【０５０８】
Cap遺伝子は、3つのタンパク質VP1、VP2およびVP3をコードする。上図に示す通り、VP1は、VP2およびVP3タンパク質を含有し、VP2は、VP3タンパク質を含有する。したがって、Cap遺伝子は、3つのセグメント、VP1の開始点−VP2の開始点−VP3の開始点−3つ全てのVPタンパク質の末端を有する。
【０５０９】
VPタンパク質に対するヌクレオチド配列の重複は、異なるAAV血清型から異なるVPタンパク質を生成する機会を与える。例えば、ヌクレオチド配列が、第一のセグメント中の「A」（Aは、第一の血清型である）、第二のセグメント中の「B」（Bは、Aとは別個で異なる第二の血清型である）および第三のセグメント中の「B」由来のヌクレオチドを含有した場合；得られるVP1タンパク質は、ABBセグメントを含有し、VP2タンパク質は、BBセグメントを含有し、そして、VP3は、Bセグメントを含有するだろう。それ故、どのセグメントがどのヌクレオチド配列を含有したかに応じて、得られるカプシドは、異なる量の各Capタンパク質を有する。
【０５１０】
2つの異なるAAV血清型（AおよびBとする）由来のCap遺伝子を供給源とする場合、3つのCapタンパク質の6つの可能な組み合わせがある。
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【０５１１】
3つの異なるAAV血清型（A、BおよびCとする）由来のCap遺伝子を供給源とする場合、3つのCapタンパク質の6つの可能な組み合わせがある。
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【０５１２】
加えて、ヘルパープラスミド中のCap遺伝子を、2つのAAV血清型由来の特定のVPタンパク質に対するヌクレオチド配列の完全コピーを用いて生成することができる。個々のCap遺伝子は、その特定のAAV血清型（AおよびBとする）に関連するVPタンパク質を生成する。
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【０５１３】
3つの異なるCap遺伝子の場合、ヘルパープラスミドを、3つのAAV血清型由来の特定のVPタンパク質に対するヌクレオチド配列の完全コピーを用いて生成することができる。個々のCap遺伝子は、その特定のAAV血清型（A、BおよびCとする）に関連するVPタンパク質を生成する。
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【０５１４】
AAV8由来のVP1/VP2およびAAV2由来のVP3のC末端を有するハプロイドベクターは、AAV形質導入を増強させる
AAV2カプシドとAAV8カプシドの比が任意のハプロイドベクターAAV2/8は、AAV2または同じ比のAAV2ベクターおよびAAV8ベクターの混合物とのウイルスよりも高い肝臓形質導入を誘導したことが実証されている。個々のハプロイドAAV2/8ベクター中のどのAAVサブユニットが、AAV2よりも高い形質導入に寄与しているかを解明するために、本発明者らは、AAV8 VP1/VP2のみ、AAV2 VP3のみ、AAV2由来のN末端およびAAV8由来のC末端を有するキメラVP1/VP2（28m-2VP3）、またはVP3開始コドンの変異を有さずAAV8由来のN末端およびAAV2由来のC末端を有するキメラAAV8/2を発現する異なる構築物を作製した。これらのプラスミドを使用して、異なる組み合わせのハプロイドAAVベクターを生産した。1×1010のこれらのハプロイドベクター粒子をマウスに後眼窩静脈を介して注射した後、肝臓形質導入効率を評価した。キメラAAV82ベクター（AAV82）は、AAV2よりも少し高い肝臓形質導入を誘導した。しかしながら、ハプロイドAAV82（H-AAV82）は、AAV2よりもはるかに高い肝臓形質導入を有していた。ハプロイドベクター28m-2vp3を用いて肝臓形質導入のさらなる増加が観察された。本発明者らはまた、これらのハプロイドベクターをマウスの筋肉に投与した。比較を容易にするため、マウスが仰向けになった状態で、右脚にAAV2ベクターを注射し、左脚にハプロイドベクターを注射した。AAV注射後3週目に撮像した。肝臓における観察と一致して、全てのハプロイドベクターおよびキメラベクターがより高い筋肉形質導入を有しており、ハプロイドベクター28m-2vp3からのものが最良であった。この結果は、AAV2由来のN末端およびAAV8由来のC末端を有するキメラVP1/VP2が、ハプロイドAAV82ベクターの高い肝臓形質導入の原因であることを示している。
【０５１５】
他の血清型由来のVP1/VP2およびAAV2由来のVP3を有するハプロイドベクターからの増強されたAAV肝臓形質導入
本発明者らは、AAV8由来のVP1/VP2およびAAV2由来のVP3を有するハプロイドベクターAAV82が上記の通り肝臓形質導入を増加させることを示している。次に、本発明者らは、VP1/VP2が異なる血清型に由来する他のハプロイドビリオンも形質導入を増加させるかどうかを調べようと考える。前臨床研究において、AAV9は、異なる組織を効率的に形質導入すると示されている。本発明者らは、VP1/VP2がAAV9に由来しかつVP3がAAV2に由来するハプロイドAAV92ベクター（H-AAV92）を作製した。全身投与後、1週目に撮像を実施した。AAV2を用いた場合より約4倍高い肝臓形質導入がH-AAV92を用いて達成された。このデータは、他の血清型由来のVP1/VP2もまた、AAV2形質導入を増加させることができることを示している。
【０５１６】
AAV2変異体または他の血清型由来のVP3を有するハプロイドベクターからの増強されたAAV肝臓形質導入
AAV9は、効果的な形質導入のために主受容体としてグリカンを使用する。本発明者らの過去の研究において、本発明者らは、AAV9グリカン受容体結合部位をAAV2に移植してAAV2G9を作製し、AAV2G9がAAV2よりも高い肝臓向性を有することを見出した。本明細書において、本発明者らは、VP1/VP2がAAV8に由来しかつVP3がAAV2G9に由来するハプロイドベクター（H-AAV82G9）を作製した。マウスへの全身注射後、AAV2G9と比較して、H-AAV82G9適用後1週目および2週目の両方で10倍超のより高い肝臓形質導入が観察された。VP3が他の血清型に由来しかつVP1/VP2が異なる血清型またはバリアントに由来するハプロイドベクターを研究するために、本発明者らは、他の構築物：AAV3 VP3のみ、AAV rh10 VP1/VP2のみをクローニングし、そして、様々な組み合わせの異なるハプロイドベクター（H-AAV83、H-AAV93およびH-AAVrh10-3）を作製した。マウスへの全身注射後、1週目に撮像を行った。他のハプロイドベクターから得られた結果と一致して、AAV3を用いた場合よりも高い肝臓形質導入がハプロイドベクター（H-AAV83、H-AAV93およびH-AAVrh10-3）を用いて達成された。興味深いことに、これらのハプロイドベクターはまた、撮像プロファイルに基づき全身形質導入を誘導したが、これは、唯一肝臓を効率的に形質導入したAAV2由来のVP3を有するハプロイドベクター5の結果とは異なる。まとめると、1つの血清型由来のVP1/VP2および代替物由来のVP3を有するハプロイドベクターは、形質導入を増強させることができ、おそらく向性を変化させることができる。
【０５１７】
実施例10：ポリプロイド性アデノ随伴ウイルスベクターは、形質導入を増強させ、中和抗体を回避する
アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターは、血友病患者および盲患者の臨床試験において使用され成功を収めている。AAVベクターの適用は、安全であると証明されており、これらの臨床試験において治療効果を示しているが、主要な課題の1つは、比較的大量のウイルスゲノムを必要とするその低い感染力である。加えて、その集団の大部分は、血中および他の体液中にAAVに対する中和抗体（Nab）を有する。Nabの存在は、将来の臨床試験におけるより広いAAV適用に対する別の主要な課題をもたらす。AAV形質導入を増強させ、中和抗体活性を回避する効果的な戦略が強く求められている。過去の研究は、AAV血清型由来のカプシドの適合性および1つのビリオンの異なるカプシドサブユニット上に位置するAAV Nabの認識部位を示している。この研究では、本発明者らは、異なるAAVヘルパープラスミドの共トランスフェクションから生産されたポリプロイド性AAVウイルスが、増強されたAAV形質導入およびNabの回避のための能力を有するかどうかを研究することを提案する。本発明者らは、AAV2およびAAV8ヘルパープラスミドを異なる比（3：1、1：1および1：3）で共トランスフェクトして、ハプロイドカプシドをアセンブルした。ハプロイドウイルス収量は、親の場合と類似しており、このことは、これらの2つのAAVカプシドが適合性であったことを示唆している。Huh7細胞株およびC2Cl2細胞株では、AAV8の形質導入効率は、AAV2からのものよりもはるかに低かった；しかしながら、全てのハプロイドベクターからの形質導入は、AAV8からのものよりも高かった。ハプロイドベクターの形質導入効率およびヘパリン硫酸結合能は、統合されるAAV2カプシドの量と正に相関していた。これらの結果は、ハプロイドウイルスベクターが、それらの親のウイルス特性を保持し、増強された形質導入に親ベクターを活用することを示している。筋肉注射後、ハプロイドウイルスは全て、親のAAVベクターよりも高い形質導入（AAV2より2〜9倍）を誘導し、ハプロイドベクターAAV2/8 3：1で最高であった。
【０５１８】
全身投与後、AAVS単独を用いた場合よりも4倍高い形質導入がハプロイドベクターAAV2/8 1：3を用いて肝臓において観察された。重要なことに、本発明者らは、治療用IX因子カセットをハプロイドベクターAAV2/8 1：3カプシドにパッケージングし、それらをFIXノックアウトマウスに尾静脈を介して注射した。AAVSの場合と比較して、より高いFIX発現および改善された表現型補正が、ハプロイドベクターAAV2/8 1：3ウイルスベクターを用いて達成された。際だったことに、ハプロイドウイルスAAV2/8 1：3は、AAV2中和を回避することができ、AAV2との非常に低いNab交差反応性を有していた。しかし、AAVS中和抗体は、ハプロイドベクターAAV2/8形質導入をAAV8と同じ効率で阻害することができる。次に、本発明者らは、AAV2、AAV8およびAAV9ヘルパープラスミドを1：1：1の比で共トランスフェクトすることによって、トリプロイドベクターAAV2/8/9ベクターを生産した。全身投与後、AAV8を用いた場合よりも2倍高い形質導入がトリプロイドベクターAAV2/8/9を用いて肝臓で観察された。中和抗体分析は、AAV2/8/9ベクターが、AAV2/8トリプロイドベクターとは異なり、親の血清型で免疫化されたマウス血清由来の中和抗体活性を回避することができたことを実証した。結果は、ポリプロイド性ウイルスが、形質導入の増強に対して親の血清型から潜在的に有意性を獲得し得、かつ、Nab認識の回避のための能力を有することを示している。この戦略を、中和抗体陽性患者の将来の臨床試験において検討すべきである。
【０５１９】
実施例11：AAVカプシドサブユニットの置換は、形質導入を増強させ、中和抗体を回避する
血液疾患および盲障害を有する患者の臨床試験において、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを使用して治療効果が達成された。しかしながら、AAVカプシド特異的細胞傷害性Tリンパ球（CTL）および中和抗体（Nab）という2つの懸念事項がAAVベクター適用の拡大を制限している。低用量のAAVベクターを用いたAAV形質導入の増強は、カプシド抗原負荷を潜在的に減少させ、かつ、願わくは、導入遺伝子発現を損なうことなく、カプシドCTL媒介性のAAV形質導入標的細胞のクリアランスを除去する。現在、12の血清型および100を超えるバリアントまたは変異体が、それらの異なる組織向性および形質導入効率に起因して遺伝子送達に検討されている。AAV血清型間でカプシドの適合性があり、1つの血清型由来の特定のアミノ酸の別のAAVカプシドへの統合がAAV形質導入を増強させることが実証されている。異なる血清型からの効果的なAAV形質導入に異なる機序を活用することによって、AAVカプシドサブユニットが異なる血清型に由来するモザイクウイルスをインビトロおよびインビボで使用して増強されたAAV形質導入が達成された。AAVベクターとモノクローナル中和抗体との相互作用に関する最近の構造研究は、Nabが、1つのビリオン表面のいくつかの異なるサブユニット上の残基に結合することを実証しており、このことは、AAVビリオンのサブユニットアセンブルの変化が、AAV Nab結合部位を取り除き、次いでNab活性を回避し得ることを示唆している。本発明者らは、モザイクAAVベクターがNab活性を回避することができることを実証している。これらの結果は、AAVカプシドサブユニットの置換が、AAV形質導入および中和抗体回避の能力を増強する潜在性を有することを示している。
【０５２０】
アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターは、血液疾患および盲障害を有する患者の臨床試験において適用され成功を収めている。2つの懸念事項が広範なAAVベクター適用を制限している：AAVカプシド特異的細胞傷害性Tリンパ球（CTL）応答媒介性のAAV形質導入標的細胞の排除および中和抗体（Nab）媒介性のAAV形質導入のブロッキング。カプシド抗原提示が用量依存的であることが実証されており、このことは、低用量のAAVベクターを用いたAAV形質導入の増強が、カプシド抗原負荷を潜在的に減少させ、かつ、願わくは、導入遺伝子発現を損なうことなく、カプシドCTL媒介性のAAV形質導入標的細胞のクリアランスを除去することを示している。導入遺伝子カセットの最適化、AAVカプシドの修飾および薬理学的物質によるAAVトラフィッキングの干渉を含むいくつかのアプローチがこの目的に検討されている。AAVカプシドの修飾は、AAV向性を変化させ得る；とりわけ、AAV形質導入効率はヒト組織において知られていない。いくつかの臨床試験が進行中であるが、動物モデルからの観察に基づきAAVベクターが経験的に選択された。AAV形質導入を増強させるための薬理学的試薬は、通常、不要な副作用を有する。カプシドの修飾からその向性を変化させることなくかつ薬理学的処置から副作用なしに、AAV形質導入を増強させる理想的な戦略を開発することが必須である。現在、遺伝子送達に検討されている12の血清型および100を超えるバリアントまたは変異体がある。効果的なAAV形質導入は、標的細胞表面上への受容体および共受容体を介した結合、エンドソームへのエンドサイトーシス、エンドソームからの脱出、核侵入、AAVビリオンの脱殻とそれに続く導入遺伝子発現を含む工程を伴う。増強された形質導入のための新規AAVベクターを合理的に設計するために、本発明者らは、キメラウイルスAAV2.5（AAV1から5aa置換されたAAV2変異体）およびAAV2G9（AAV9由来のガラクトース受容体がAAV2カプシドに移植された）を開発した。両方のキメラ変異体はそれぞれ、AAV2よりもはるかに高い形質導入をマウスの筋肉および肝臓において誘導する。これらの観察は、これらのキメラウイルスが、両方のAAV血清型由来の特性を増強された形質導入に使用し得ることを示している（例えば、AAV2G9は、2つの主受容体であるヘパリンおよびガラクトースを効果的な細胞表面結合に使用する）。ウイルスアセンブルに対する異なるAAV血清型由来のカプシドサブユニット間の適合性と、AAV血清型2への他の血清型（1または9）由来の特定のアミノ酸の統合が、AAV2形質導入を筋肉および肝臓において増強させたことを実証した本発明者らの予備段階の結果に基づき、本発明者らは、他の血清型由来のいくつかのカプシドサブユニットの置換が、異なる血清型からの効果的なAAV形質導入に異なる機序を活用することによって、AAV形質導入を増強させることができると推論する。加えて、天然に存在するAAVに対する既存の抗体は、血友病Bおよび他のAAV遺伝子導入研究の成功に影響を及ぼした。一般的なヒト集団では、50％前後が中和抗体を保有する。Nab回避AAVベクターを設計するために、化学修飾、異なる血清型のAAVベクター、カプシドのインサイチュー合理的設計およびコンビナトリアル変異誘発ならびにNab力価の生物学的枯渇（空カプシド利用、B細胞枯渇および血漿アフェレーシス）を含むいくつかのアプローチが考慮されている。これらのアプローチは、低い効率もしくは副作用またはAAV向性の変化を有する。AAVベクターとモノクローナル中和抗体との相互作用に関する最近の構造研究は、Nabが、1つのビリオン表面のいくつかの異なるサブユニット上の残基に結合することを実証しており、このことは、AAVビリオンのサブユニットアセンブルの変化が、AAV Nab結合部位を取り除き、次いでNab活性を回避し得ることを示唆している。本発明者らは、新規モザイクAAVベクターが、様々な組織において形質導入を増強させる潜在性を有し、中和抗体活性を回避することができるという概念を強く裏付けている結果を有する。
【０５２１】
実施例12：2以上の異なるAAV血清型由来のVP1/VP2/VP3を用いた中枢神経系の疾患の処置
第一の実験では、2つのヘルパープラスミドを使用する。第一のヘルパープラスミドは、AAV2由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有し、そして、第二のヘルパープラスミドは、AAV2由来のRep遺伝子およびAAV4由来のCap遺伝子を有する。第三のプラスミドは、グルタミン酸デカルボキシラーゼ65（GAD65）および／またはグルタミン酸デカルボキシラーゼ67（GAD67）に対するヌクレオチド配列をコードし、そのヌクレオチド配列は、2つのITR間に挿入される。3つのプラスミドから生成されたハプロイドAAVは、本発明の方法に従ってVP1、VP2およびVP3をコードするタンパク質を供給する複数のAAV血清型を利用してパーキンソン病に関連する中枢神経系組織に対する特異性を部分的に増加させることによって、パーキンソン病を処置するためのGAD65および／またはGAD67タンパク質に対するヌクレオチド配列を含有する。実際に、パーキンソン病を処置するためにこの方法によって作製されたハプロイドウイルスは、AAV2またはAAV4のみからなるウイルスベクターよりも関連組織に対して高い特異性を有する。
【０５２２】
さらなる実験では、この場合も同様に2つのヘルパープラスミドを使用するが、Rep遺伝子およびCap遺伝子の供給源としてのAAV血清型が異なる。第一のヘルパープラスミドは、AAV3由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有し、そして、第二のヘルパープラスミドは、AAV3由来のRep遺伝子およびAAV5由来のCap遺伝子を有する。第三のプラスミドは、第三のプラスミドに含有されかつ2つのITR間に挿入された、バッテン病を処置するためのCLN2に対するヌクレオチド配列をコードする。3つのプラスミドから生成されたハプロイドAAVは、本発明の方法に従ってVP1、VP2およびVP3をコードするタンパク質を供給する複数のAAV血清型を利用してパーキンソン病に関連する中枢神経系組織に対する特異性を部分的に増加させることによって、バッテン病を処置するためのヌクレオチド配列を含有する。実際に、バッテン病を処置するためにこの方法によって作製されたハプロイドウイルスは、AAV3またはAAV5のみからなるウイルスベクターよりも関連する中枢神経系組織に対して高い特異性を有する。
【０５２３】
別の実験では、3つのヘルパープラスミドを使用するが、Rep遺伝子およびCap遺伝子の供給源としてのAAV血清型が異なる。第一のヘルパープラスミドは、AAV3由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有し、そして、第二のヘルパープラスミドは、AAV3由来のRep遺伝子およびAAV4由来のCap遺伝子を有する。第三のヘルパープラスミドは、AAV3由来のRep遺伝子およびAAV5由来のCap遺伝子を有する。第四のプラスミドは、第三のプラスミドに含有されかつ2つのITR間に挿入された、アルツハイマー病を処置するための神経成長因子（NGF）に対するヌクレオチド配列をコードする。4つのプラスミドから生成されたトリプロイドAAVは、本発明の方法に従ってVP1、VP2およびVP3をコードするタンパク質を供給する複数のAAV血清型（例えば、AAV3、AAV4およびAAV5）を利用してアルツハイマー病に関連する中枢神経系組織に対する特異性を部分的に増加させることによって、アルツハイマー病を処置するためのヌクレオチド配列を含有する。実際に、アルツハイマー病を処置するためにこの方法によって作製されたトリプロイドウイルスは、AAV3、AAV4またはAAV5のみからなるウイルスベクターよりも関連する中枢神経系組織に対して高い特異性を有する。
【０５２４】
別の実験では、1つのヘルパープラスミドを使用するが、Rep遺伝子およびCap遺伝子の供給源としてのAAV血清型が異なる。ヘルパープラスミドは、AAV2由来のRepおよびAAV2由来のVP1、AAV4由来のVP2およびAAV5由来のVP3を有する。第二のプラスミドは、カナバン病を処置するための2つのITR間に挿入されたAACに対するヌクレオチド配列をコードする。2つのプラスミドから生成されたトリプロイドAAVは、本発明の方法に従ってVP1、VP2およびVP3をコードするタンパク質を供給する複数のAAV血清型（例えば、AAV2、AAV4およびAAV5）を利用してカナバン病に関連する中枢神経系組織に対する特異性を部分的に増加させることによって、カナバン病を処置するためのヌクレオチド配列を含有する。実際に、カナバン病を処置するためにこの方法によって作製されたトリプロイドウイルスは、AAV2、AAV4またはAAV5のみからなるウイルスベクターよりも関連する中枢神経系組織に対して高い特異性を有する。
【０５２５】
2以上の異なるAAV血清型由来のVP1/VP2/VP3を用いた心臓の疾患の処置
一実験において、2つのヘルパープラスミドを使用するが、Rep遺伝子およびCap遺伝子の供給源としてのAAV血清型が異なる。第一のヘルパープラスミドは、AAV2由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有し、そして、第二のヘルパープラスミドは、AAV2由来のRep遺伝子およびAAV6由来のCap遺伝子を有する。第三のプラスミドは、第三のプラスミドに含有されかつ2つのITR間に挿入された、心疾患を処置するためのタンパク質に対するヌクレオチド配列をコードする。3つのプラスミドから生成されたハプロイドAAVは、本発明の方法に従ってVP1、VP2およびVP3をコードするタンパク質を供給する複数のAAV血清型を利用して心臓の疾患に関連する心臓組織に対する特異性を部分的に増加させることによって、心疾患を処置するためのヌクレオチド配列を含有する。実際に、心疾患を処置するためにこの方法によって作製されたハプロイドウイルスは、AAV2またはAAV6のみからなるウイルスベクターよりも関連する心臓組織に対して高い特異性を有する。
【０５２６】
さらなる実験では、2つのヘルパープラスミドを使用するが、Rep遺伝子およびCap遺伝子の供給源としてのAAV血清型が異なる。第一のヘルパープラスミドは、AAV3由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有し、そして、第二のヘルパープラスミドは、AAV3由来のRep遺伝子およびAAV9由来のCap遺伝子を有する。第三のプラスミドは、第三のプラスミドに含有されかつ2つのITR間に挿入された、心疾患を処置するためのタンパク質に対するヌクレオチド配列をコードする。3つのプラスミドから生成されたハプロイドAAVは、本発明の方法に従ってVP1、VP2およびVP3をコードするタンパク質を供給する複数のAAV血清型を利用して心臓の疾患に関連する心臓組織に対する特異性を部分的に増加させることによって、心疾患を処置するためのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する。実際に、心疾患を処置するためにこの方法によって作製されたハプロイドウイルスは、AAV3またはAAV9のみからなるウイルスベクターよりも関連する心臓組織に対して高い特異性を有する。
【０５２７】
一実験において、3つのヘルパープラスミドを使用するが、Rep遺伝子およびCap遺伝子の供給源としてのAAV血清型が異なる。第一のヘルパープラスミドは、AAV3由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有し、そして、第二のヘルパープラスミドは、AAV3由来のRep遺伝子およびAAV6由来のCap遺伝子を有する。第三のヘルパープラスミドは、AAV3由来のRep遺伝子およびAAV9由来のCap遺伝子を有する。第四のプラスミドは、第三のプラスミドに含有されかつ2つのITR間に挿入された、心疾患を処置するためのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する。4つのプラスミドから生成されたトリプロイドAAVは、本発明の方法に従ってVP1、VP2およびVP3をコードするタンパク質を供給する複数のAAV血清型（例えば、AAV3、AAV6およびAAV9）を利用して心疾患に関連する心臓組織に対する特異性を部分的に増加させることによって、心疾患を処置するためのヌクレオチド配列を含有する。実際に、心疾患を処置するためにこの方法によって作製されたトリプロイドウイルスは、AAV3、AAV6またはAAV9のみからなるウイルスベクターよりも関連する心臓組織に対して高い特異性を有する。
【０５２８】
別の実験では、1つのヘルパープラスミドを使用するが、Rep遺伝子およびCap遺伝子の供給源としてのAAV血清型が異なる。ヘルパープラスミドは、AAV2由来のRepおよびAAV2由来のVP1、AAV3由来のVP2およびAAV9由来のVP3を有する。第二のプラスミドは、2つのITR間に挿入された心疾患を処置するためのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する。2つのプラスミドから生成されたトリプロイドAAVは、本発明の方法に従ってVP1、VP2およびVP3をコードするタンパク質を供給する複数のAAV血清型（例えば、AAV2、AAV3およびAAV9）を利用して心疾患に関連する心臓組織に対する特異性を部分的に増加させることによって、心疾患を処置するためのヌクレオチド配列をコードする。実際に、心疾患を処置するためにこの方法によって作製されたトリプロイドウイルスは、AAV2、AAV3またはAAV9のみからなるウイルスベクターよりも関連する心臓組織に対して高い特異性を有する。
【０５２９】
別の実験では、1つのヘルパープラスミドを使用するが、Rep遺伝子およびCap遺伝子の供給源としてのAAV血清型が異なる。ヘルパープラスミドは、AAV3由来のRepおよびAAV3由来のVP1、AAV6由来のVP2およびAAV6由来のVP3を有する。第二のプラスミドは、2つのITR間に挿入された心疾患を処置するためのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する。2つのプラスミドから生成されたハプロイドAAVは、本発明の方法に従ってVP1、VP2およびVP3をコードするタンパク質を供給する複数のAAV血清型（例えば、AAV3およびAAV6）を利用して心疾患に関連する心臓組織に対する特異性を部分的に増加させることによって、心疾患を処置するためのヌクレオチド配列をコードする。実際に、心疾患を処置するためにこの方法によって作製されたハプロイドウイルスは、AAV2またはAAV6のみからなるウイルスベクターよりも関連する心臓組織に対して高い特異性を有する。
【０５３０】
別の実験では、1つのヘルパープラスミドを使用するが、Rep遺伝子およびCap遺伝子の供給源としてのAAV血清型が異なる。ヘルパープラスミドは、AAV3由来のRepおよびAAV3由来のVP1、AAV6由来のVP2およびAAV9由来のVP3を有する。第二のプラスミドは、2つのITR間に挿入された心疾患を処置するためのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する。2つのプラスミドから生成されたトリプロイドAAVは、本発明の方法に従ってVP1、VP2およびVP3をコードするタンパク質を供給する複数のAAV血清型（例えば、AAV3、AAV6およびAAV9）を利用して心疾患に関連する心臓組織に対する特異性を部分的に増加させることによって、心疾患を処置するためのヌクレオチド配列をコードする。実際に、心疾患を処置するためにこの方法によって作製されたトリプロイドウイルスは、AAV3、AAV6またはAAV9のみからなるウイルスベクターよりも関連する心臓組織に対して高い特異性を有する。
【０５３１】
2以上の異なるAAV血清型由来のVP1/VP2/VP3を用いた肺の疾患の処置
一実験において、この場合も同様に2つのヘルパープラスミドを使用するが、Rep遺伝子およびCap遺伝子の供給源としてのAAV血清型が異なる。第一のヘルパープラスミドは、AAV2由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有し、そして、第二のヘルパープラスミドは、AAV9由来のCap遺伝子を有する。第三のプラスミドは、2つのITR間に挿入された嚢胞性線維症を処置するためのCFTRに対するヌクレオチド配列をコードする。3つのプラスミドから生成されたハプロイドAAVは、本発明の方法に従ってVP1、VP2およびVP3をコードするタンパク質を供給する複数のAAV血清型を利用して嚢胞性線維症に関連する肺組織に対する特異性を部分的に増加させることによって、嚢胞性線維症を処置するためのCFTRに対するヌクレオチド配列を含有する。実際に、嚢胞性線維症を処置するためにこの方法によって作製されたハプロイドウイルスは、AAV2またはAAV9のみからなるウイルスベクターよりも関連組織に対して高い特異性を有する。
【０５３２】
一実験において、この場合も同様に2つのヘルパープラスミドを使用するが、Rep遺伝子およびCap遺伝子の供給源としてのAAV血清型が異なる。第一のヘルパープラスミドは、AAV3由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有し、そして、第二のヘルパープラスミドは、AAV3由来のRepおよびAAV10由来のCap遺伝子を有する。第三のプラスミドは、2つのITR間に挿入された嚢胞性線維症を処置するためのCFTRに対するヌクレオチド配列をコードする。3つのプラスミドから生成されたハプロイドAAVは、本発明の方法に従ってVP1、VP2およびVP3をコードするタンパク質を供給する複数のAAV血清型を利用して嚢胞性線維症に関連する肺組織に対する特異性を部分的に増加させることによって、嚢胞性線維症を処置するためのCFTRに対するヌクレオチド配列を含有する。実際に、嚢胞性線維症を処置するためにこの方法によって作製されたハプロイドウイルスは、AAV3またはAAV10のみからなるウイルスベクターよりも関連組織に対して高い特異性を有する。
【０５３３】
一実験において、3つのヘルパープラスミドを使用するが、Rep遺伝子およびCap遺伝子の供給源としてのAAV血清型が異なる。第一のヘルパープラスミドは、AAV3由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有し、そして、第二のヘルパープラスミドは、AAV3由来のRep遺伝子およびAAV9由来のCap遺伝子を有する。第三のヘルパープラスミドは、AAV3由来のRep遺伝子およびAAV10由来のCap遺伝子を有する。第四のプラスミドは、第三のプラスミドに含有されかつ2つのITR間に挿入された、嚢胞性線維症を処置するためのCFTRに対するヌクレオチド配列をコードする。4つのプラスミドから生成されたトリプロイドAAVは、本発明の方法に従ってVP1、VP2およびVP3をコードするタンパク質を供給する複数のAAV血清型（例えば、AAV3、AAV9およびAAV10）を利用して嚢胞性線維症に関連する肺組織に対する特異性を部分的に増加させることによって、嚢胞性線維症を処置するためのCFTRに対するヌクレオチド配列を含有する。実際に、嚢胞性線維症を処置するためにこの方法によって作製されたトリプロイドウイルスは、AAV3、AAV9またはAAV10のみからなるウイルスベクターよりも関連組織に対して高い特異性を有する。
【０５３４】
別の実験では、1つのヘルパープラスミドを使用するが、Rep遺伝子およびCap遺伝子の供給源としてのAAV血清型が異なる。ヘルパープラスミドは、AAV2由来のRepおよびAAV2由来のVP1、AAV9由来のVP2およびAAV9由来のVP3を有する。第二のプラスミドは、嚢胞性線維症を処置するための2つのITR間に挿入されたCFTRに対するヌクレオチド配列をコードする。2つのプラスミドから生成されたハプロイドAAVは、本発明の方法に従ってVP1、VP2およびVP3をコードするタンパク質を供給する複数のAAV血清型（例えば、AAV2およびAAV9）を利用して嚢胞性線維症に関連する中枢神経系組織に対する特異性を部分的に増加させることによって、嚢胞性線維症を処置するためのヌクレオチド配列を含有する。実際に、嚢胞性線維症を処置するためにこの方法によって作製されたハプロイドウイルスは、AAV2またはAAV9のみからなるウイルスベクターよりも関連組織に対して高い特異性を有する。
【０５３５】
さらなる実験では、1つのヘルパープラスミドを使用するが、Rep遺伝子およびCap遺伝子の供給源としてのAAV血清型が異なる。ヘルパープラスミドは、AAV3由来のRepおよびAAV2由来のVP1、AAV10由来のVP2およびAAV10由来のVP3を有する。第二のプラスミドは、嚢胞性線維症を処置するための2つのITR間に挿入されたCFTRに対するヌクレオチド配列をコードする。2つのプラスミドから生成されたハプロイドAAVは、本発明の方法に従ってVP1、VP2およびVP3をコードするタンパク質を供給する複数のAAV血清型（例えば、AAV3およびAAV10）を利用して嚢胞性線維症に関連する中枢神経系組織に対する特異性を部分的に増加させることによって、嚢胞性線維症を処置するためのヌクレオチド配列を含有する。実際に、嚢胞性線維症を処置するためにこの方法によって作製されたハプロイドウイルスは、AAV3またはAAV10のみからなるウイルスベクターよりも関連組織に対して高い特異性を有する。
【０５３６】
別の実験では、1つのヘルパープラスミドを使用するが、Rep遺伝子およびCap遺伝子の供給源としてのAAV血清型が異なる。ヘルパープラスミドは、AAV2由来のRepおよびAAV2由来のVP1、AAV9由来のVP2およびAAV10由来のVP3を有する。第二のプラスミドは、嚢胞性線維症を処置するための2つのITR間に挿入されたCFTRに対するヌクレオチド配列をコードする。2つのプラスミドから生成されたトリプロイドAAVは、本発明の方法に従ってVP1、VP2およびVP3をコードするタンパク質を供給する複数のAAV血清型（例えば、AAV2、AAV9およびAAV10）を利用してカナバン病に関連する中枢神経系組織に対する特異性を部分的に増加させることによって、嚢胞性線維症を処置するためのヌクレオチド配列を含有する。実際に、嚢胞性線維症を処置するためにこの方法によって作製されたトリプロイドウイルスは、AAV2、AAV9またはAAV10のみからなるウイルスベクターよりも関連組織に対して高い特異性を有する。
【０５３７】
2以上の異なるAAV血清型由来のVP1/VP2/VP3を用いた骨格筋の疾患の処置
以下の実験について、骨格筋疾患は、限定されないが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、脳性麻痺、重症筋無力症および筋萎縮性側索硬化症（ALS）であることができる。
【０５３８】
一実験において、この場合も同様に2つのヘルパープラスミドを使用するが、Rep遺伝子およびCap遺伝子の供給源としてのAAV血清型が異なる。第一のヘルパープラスミドは、AAV2由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有し、そして、第二のヘルパープラスミドは、AAV2由来のRepおよびAAV8由来のCap遺伝子を有する。第三のプラスミドは、2つのITR間に挿入された骨格筋の疾患を処置するためのタンパク質に対するヌクレオチド配列をコードする。3つのプラスミドから生成されたハプロイドAAVは、本発明の方法に従ってVP1、VP2およびVP3をコードするタンパク質を供給する複数のAAV血清型を利用して骨格筋の疾患に関連する骨格筋に対する特異性を部分的に増加させることによって、骨格筋の疾患を処置するためのタンパク質に対するヌクレオチド配列を含有する。実際に、骨格筋疾患を処置するためにこの方法によって作製されたハプロイドウイルスは、AAV2またはAAV8のみからなるウイルスベクターよりも関連する骨格筋組織に対して高い特異性を有する。
【０５３９】
一実験において、この場合も同様に2つのヘルパープラスミドを使用するが、Rep遺伝子およびCap遺伝子の供給源としてのAAV血清型が異なる。第一のヘルパープラスミドは、AAV3由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有し、そして、第二のヘルパープラスミドは、AAV3由来のRepおよびAAV9由来のCap遺伝子を有する。第三のプラスミドは、2つのITR間に挿入された骨格筋の疾患を処置するためのタンパク質に対するヌクレオチド配列をコードする。3つのプラスミドから生成されたハプロイドAAVは、本発明の方法に従ってVP1、VP2およびVP3をコードするタンパク質を供給する複数のAAV血清型を利用して骨格筋の疾患に関連する骨格筋に対する特異性を部分的に増加させることによって、骨格筋の疾患を処置するためのタンパク質に対するヌクレオチド配列を含有する。実際に、骨格筋疾患を処置するためにこの方法によって作製されたハプロイドウイルスは、AAV3またはAAV9のみからなるウイルスベクターよりも関連する骨格筋組織に対して高い特異性を有する。
【０５４０】
一実験において、3つのヘルパープラスミドを使用するが、Rep遺伝子およびCap遺伝子の供給源としてのAAV血清型が異なる。第一のヘルパープラスミドは、AAV3由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有し、そして、第二のヘルパープラスミドは、AAV3由来のRep遺伝子およびAAV8由来のCap遺伝子を有する。第三のヘルパープラスミドは、AAV3由来のRep遺伝子およびAAV9由来のCap遺伝子を有する。第四のプラスミドは、2つのITR間に挿入された骨格筋の疾患を処置するためのタンパク質に対するヌクレオチド配列をコードする。4つのプラスミドから生成されたトリプロイドAAVは、本発明の方法に従ってVP1、VP2およびVP3をコードするタンパク質を供給する複数のAAV血清型（例えば、AAV3、AAV8およびAAV9）を利用して骨格筋の疾患に関連する骨格筋に対する特異性を部分的に増加させることによって、骨格筋疾患を処置するためのタンパク質に対するヌクレオチド配列を含有する。実際に、骨格筋疾患を処置するためにこの方法によって作製されたトリプロイドウイルスは、AAV3、AAV8またはAAV9のみからなるウイルスベクターよりも関連組織に対して高い特異性を有する。
【０５４１】
別の実験では、1つのヘルパープラスミドを使用するが、Rep遺伝子およびCap遺伝子の供給源としてのAAV血清型が異なる。ヘルパープラスミドは、AAV3由来のRepおよびAAV3由来のVP1、AAV9由来のVP2およびAAV9由来のVP3を有する。第二のプラスミドは、2つのITR間に挿入された骨格筋の疾患を処置するためのタンパク質に対するヌクレオチド配列をコードする。2つのプラスミドから生成されたハプロイドAAVは、本発明の方法に従ってVP1、VP2およびVP3をコードするタンパク質を供給する複数のAAV血清型（例えば、AAV3およびAAV9）を利用して骨格筋疾患に関連する骨格筋組織に対する特異性を部分的に増加させることによって、骨格筋の疾患を処置するためのヌクレオチド配列を含有する。実際に、骨格筋疾患を処置するためにこの方法によって作製されたハプロイドウイルスは、AAV3またはAAV9のみからなるウイルスベクターよりも関連する骨格筋組織に対して高い特異性を有する。
【０５４２】
別の実験では、1つのヘルパープラスミドを使用するが、Rep遺伝子およびCap遺伝子の供給源としてのAAV血清型が異なる。ヘルパープラスミドは、AAV3由来のRepおよびAAV3由来のVP1、AAV8由来のVP2およびAAV8由来のVP3を有する。第二のプラスミドは、2つのITR間に挿入された骨格筋の疾患を処置するためのタンパク質に対するヌクレオチド配列をコードする。2つのプラスミドから生成されたハプロイドAAVは、本発明の方法に従ってVP1、VP2およびVP3をコードするタンパク質を供給する複数のAAV血清型（例えば、AAV3およびAAV8）を利用して骨格筋疾患に関連する骨格筋組織に対する特異性を部分的に増加させることによって、骨格筋の疾患を処置するためのヌクレオチド配列を含有する。実際に、骨格筋疾患を処置するためにこの方法によって作製されたハプロイドウイルスは、AAV3またはAAV8のみからなるウイルスベクターよりも関連する骨格筋組織に対して高い特異性を有する。
【０５４３】
別の実験では、1つのヘルパープラスミドを使用するが、Rep遺伝子およびCap遺伝子の供給源としてのAAV血清型が異なる。ヘルパープラスミドは、AAV3由来のRepおよびAAV3由来のVP1、AAV8由来のVP2およびAAV9由来のVP3を有する。第二のプラスミドは、2つのITR間に挿入された骨格筋の疾患を処置するためのタンパク質に対するヌクレオチド配列をコードする。2つのプラスミドから生成されたトリプロイドAAVは、本発明の方法に従ってVP1、VP2およびVP3をコードするタンパク質を供給する複数のAAV血清型（例えば、AAV3、AAV8およびAAV9）を利用して骨格筋疾患に関連する骨格筋組織に対する特異性を部分的に増加させることによって、骨格筋の疾患を処置するためのヌクレオチド配列を含有する。実際に、骨格筋疾患を処置するためにこの方法によって作製されたトリプロイドウイルスは、AAV3、AAV8またはAAV9のみからなるウイルスベクターよりも関連する骨格筋組織に対して高い特異性を有する。
【０５４４】
2以上の異なるAAV血清型由来のVP1/VP2/VP3を用いた肝臓の疾患の処置
一実験において、この場合も同様に2つのヘルパープラスミドを使用するが、Rep遺伝子およびCap遺伝子の供給源としてのAAV血清型が異なる。第一のヘルパープラスミドは、AAV2由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有し、そして、第二のヘルパープラスミドは、AAV2由来のRepおよびAAV6由来のCap遺伝子を有する。第三のプラスミドは、2つのITR間に挿入された血友病Bを処置するためのIX因子（FIX）に対するヌクレオチド配列をコードする。3つのプラスミドから生成されたハプロイドAAVは、本発明の方法に従ってVP1、VP2およびVP3をコードするタンパク質を供給する複数のAAV血清型を利用して血友病Bに関連するFIXに対する特異性を部分的に増加させることによって、骨格筋の疾患を処置するためのタンパク質に対するヌクレオチド配列を含有する。実際に、血友病Bを患っている患者の肝臓組織を処置するためにこの方法によって作製されたハプロイドウイルスは、AAV2またはAAV6のみからなるウイルスベクターよりも関連組織に対して高い特異性を有する。
【０５４５】
一実験において、この場合も同様に2つのヘルパープラスミドを使用するが、Rep遺伝子およびCap遺伝子の供給源としてのAAV血清型が異なる。第一のヘルパープラスミドは、AAV2由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有し、そして、第二のヘルパープラスミドは、AAV3由来のRepおよびAAV7由来のCap遺伝子を有する。第三のプラスミドは、2つのITR間に挿入された血友病Bを処置するためのIX因子（FIX）に対するヌクレオチド配列をコードする。3つのプラスミドから生成されたハプロイドAAVは、本発明の方法に従ってVP1、VP2およびVP3をコードするタンパク質を供給する複数のAAV血清型を利用して血友病Bに関連するFIXに対する特異性を部分的に増加させることによって、骨格筋の疾患を処置するためのタンパク質に対するヌクレオチド配列を含有する。実際に、血友病Bを患っている患者の肝臓組織を処置するためにこの方法によって作製されたハプロイドウイルスは、AAV3またはAAV7のみからなるウイルスベクターよりも関連組織に対して高い特異性を有する。
【０５４６】
一実験において、3つのヘルパープラスミドを使用するが、Rep遺伝子およびCap遺伝子の供給源としてのAAV血清型が異なる。第一のヘルパープラスミドは、AAV3由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有し、そして、第二のヘルパープラスミドは、AAV3由来のRep遺伝子およびAAV6由来のCap遺伝子を有する。第三のヘルパープラスミドは、AAV3由来のRep遺伝子およびAAV7由来のCap遺伝子を有する。第四のプラスミドは、2つのITR間に挿入された血友病Bを処置するためのIX因子（FIX）に対するヌクレオチド配列をコードする。4つのプラスミドから生成されたトリプロイドAAVは、本発明の方法に従ってVP1、VP2およびVP3をコードするタンパク質を供給する複数のAAV血清型（例えば、AAV3、AAV6およびAAV7）を利用して血友病Bに関連する肝臓組織に対する特異性を部分的に増加させることによって、血友病Bを処置するためのタンパク質に対するヌクレオチド配列を含有する。実際に、血友病Bを患っている患者の肝臓組織を処置するためにこの方法によって作製されたトリプロイドウイルスは、AAV3、AAV6またはAAV7のみからなるウイルスベクターよりも関連組織に対して高い特異性を有する。
【０５４７】
別の実験では、1つのヘルパープラスミドを使用するが、Rep遺伝子およびCap遺伝子の供給源としてのAAV血清型が異なる。ヘルパープラスミドは、AAV2由来のRepおよびAAV2由来のVP1、AAV6由来のVP2およびAAV6由来のVP3を有する。第二のプラスミドは、2つのITR間に挿入された血友病Bを処置するためのFIXに対するヌクレオチド配列をコードする。2つのプラスミドから生成されたハプロイドAAVは、本発明の方法に従ってVP1、VP2およびVP3をコードするタンパク質を供給する複数のAAV血清型（例えば、AAV2およびAAV6）を利用して血友病Bに関連する肝臓組織に対する特異性を部分的に増加させることによって、血友病Bを処置するためのヌクレオチド配列を含有する。実際に、血友病Bを患っている患者の肝臓組織を処置するためにこの方法によって作製されたハプロイドウイルスは、AAV2またはAAV6のみからなるウイルスベクターよりも関連組織に対して高い特異性を有する。
【０５４８】
別の実験では、1つのヘルパープラスミドを使用するが、Rep遺伝子およびCap遺伝子の供給源としてのAAV血清型が異なる。ヘルパープラスミドは、AAV2由来のRepおよびAAV3由来のVP1、AAV7由来のVP2およびAAV7由来のVP3を有する。第二のプラスミドは、2つのITR間に挿入された血友病Bを処置するためのFIXに対するヌクレオチド配列をコードする。2つのプラスミドから生成されたハプロイドAAVは、本発明の方法に従ってVP1、VP2およびVP3をコードするタンパク質を供給する複数のAAV血清型（例えば、AAV3およびAAV7）を利用して血友病Bに関連する肝臓組織に対する特異性を部分的に増加させることによって、血友病Bを処置するためのヌクレオチド配列を含有する。実際に、血友病Bを患っている患者の肝臓組織を処置するためにこの方法によって作製されたハプロイドウイルスは、AAV3またはAAV7のみからなるウイルスベクターよりも関連組織に対して高い特異性を有する。
【０５４９】
別の実験では、1つのヘルパープラスミドを使用するが、Rep遺伝子およびCap遺伝子の供給源としてのAAV血清型が異なる。ヘルパープラスミドは、AAV2由来のRepおよびAAV3由来のVP1、AAV6由来のVP2およびAAV7由来のVP3を有する。第二のプラスミドは、2つのITR間に挿入された血友病Bを処置するためのFIXに対するヌクレオチド配列をコードする。2つのプラスミドから生成されたトリプロイドAAVは、本発明の方法に従ってVP1、VP2およびVP3をコードするタンパク質を供給する複数のAAV血清型（例えば、AAV3、AAV6およびAAV7）を利用して血友病Bに関連する肝臓組織に対する特異性を部分的に増加させることによって、血友病Bを処置するためのヌクレオチド配列を含有する。実際に、血友病Bを患っている患者の肝臓組織を処置するためにこの方法によって作製されたトリプロイドウイルスは、AAV3、AAV6またはAAV7のみからなるウイルスベクターよりも関連組織に対して高い特異性を有する。
【０５５０】
一実験において、この場合も同様に2つのヘルパープラスミドを使用するが、Rep遺伝子およびCap遺伝子の供給源としてのAAV血清型が異なる。第一のヘルパープラスミドは、AAV2由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有し、そして、第二のヘルパープラスミドは、AAV2由来のRepおよびAAV6由来のCap遺伝子を有する。第三のプラスミドは、2つのITR間に挿入された血友病Aを処置するためのVIII因子（FVIII）に対するヌクレオチド配列をコードする。3つのプラスミドから生成されたハプロイドAAVは、本発明の方法に従ってVP1、VP2およびVP3をコードするタンパク質を供給する複数のAAV血清型を利用して血友病Aに関連するFVIIIに対する特異性を部分的に増加させることによって、骨格筋の疾患を処置するためのタンパク質に対するヌクレオチド配列を含有する。実際に、血友病Aを患っている患者の肝臓組織を処置するためにこの方法によって作製されたハプロイドウイルスは、AAV2またはAAV6のみからなるウイルスベクターよりも関連組織に対して高い特異性を有する。
【０５５１】
一実験において、この場合も同様に2つのヘルパープラスミドを使用するが、Rep遺伝子およびCap遺伝子の供給源としてのAAV血清型が異なる。第一のヘルパープラスミドは、AAV2由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有し、そして、第二のヘルパープラスミドは、AAV3由来のRepおよびAAV7由来のCap遺伝子を有する。第三のプラスミドは、2つのITR間に挿入された血友病Aを処置するためのFVIIIに対するヌクレオチド配列をコードする。3つのプラスミドから生成されたハプロイドAAVは、本発明の方法に従ってVP1、VP2およびVP3をコードするタンパク質を供給する複数のAAV血清型を利用して血友病Aに関連するFVIIIに対する特異性を部分的に増加させることによって、骨格筋の疾患を処置するためのタンパク質に対するヌクレオチド配列を含有する。実際に、血友病Aを患っている患者の肝臓組織を処置するためにこの方法によって作製されたハプロイドウイルスは、AAV3またはAAV7のみからなるウイルスベクターよりも関連組織に対して高い特異性を有する。
【０５５２】
一実験において、3つのヘルパープラスミドを使用するが、Rep遺伝子およびCap遺伝子の供給源としてのAAV血清型が異なる。第一のヘルパープラスミドは、AAV3由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有し、そして、第二のヘルパープラスミドは、AAV3由来のRep遺伝子およびAAV6由来のCap遺伝子を有する。第三のヘルパープラスミドは、AAV3由来のRep遺伝子およびAAV7由来のCap遺伝子を有する。第四のプラスミドは、2つのITR間に挿入された血友病Aを処置するためのFVIIIに対するヌクレオチド配列をコードする。4つのプラスミドから生成されたトリプロイドAAVは、本発明の方法に従ってVP1、VP2およびVP3をコードするタンパク質を供給する複数のAAV血清型（例えば、AAV3、AAV6およびAAV7）を利用して血友病Bに関連する肝臓組織に対する特異性を部分的に増加させることによって、血友病Aを処置するためのFVIIIタンパク質に対するヌクレオチド配列を含有する。実際に、血友病Aを患っている患者の肝臓組織を処置するためにこの方法によって作製されたトリプロイドウイルスは、AAV3、AAV6またはAAV7のみからなるウイルスベクターよりも関連組織に対して高い特異性を有する。
【０５５３】
別の実験では、1つのヘルパープラスミドを使用するが、Rep遺伝子およびCap遺伝子の供給源としてのAAV血清型が異なる。ヘルパープラスミドは、AAV2由来のRepおよびAAV2由来のVP1、AAV6由来のVP2およびAAV6由来のVP3を有する。第二のプラスミドは、2つのITR間に挿入された血友病Bを処置するためのFVIIIに対するヌクレオチド配列をコードする。2つのプラスミドから生成されたハプロイドAAVは、本発明の方法に従ってVP1、VP2およびVP3をコードするタンパク質を供給する複数のAAV血清型（例えば、AAV2およびAAV6）を利用して血友病Aに関連する肝臓組織に対する特異性を部分的に増加させることによって、血友病Aを処置するためのFVIIIに対するヌクレオチド配列を含有する。実際に、血友病Aを患っている患者の肝臓組織を処置するためにこの方法によって作製されたハプロイドウイルスは、AAV2またはAAV6のみからなるウイルスベクターよりも関連組織に対して高い特異性を有する。
【０５５４】
別の実験では、1つのヘルパープラスミドを使用するが、Rep遺伝子およびCap遺伝子の供給源としてのAAV血清型が異なる。ヘルパープラスミドは、AAV2由来のRepおよびAAV3由来のVP1、AAV7由来のVP2およびAAV7由来のVP3を有する。第二のプラスミドは、2つのITR間に挿入された血友病Aを処置するためのFVIIIに対するヌクレオチド配列をコードする。2つのプラスミドから生成されたハプロイドAAVは、本発明の方法に従ってVP1、VP2およびVP3をコードするタンパク質を供給する複数のAAV血清型（例えば、AAV3およびAAV7）を利用して血友病Bに関連する肝臓組織に対する特異性を部分的に増加させることによって、血友病Aを処置するためのFVIIIに対するヌクレオチド配列を含有する。実際に、血友病Aを患っている患者の肝臓組織を処置するためにこの方法によって作製されたハプロイドウイルスは、AAV3またはAAV7のみからなるウイルスベクターよりも関連組織に対して高い特異性を有する。
【０５５５】
別の実験では、1つのヘルパープラスミドを使用するが、Rep遺伝子およびCap遺伝子の供給源としてのAAV血清型が異なる。ヘルパープラスミドは、AAV2由来のRepおよびAAV3由来のVP1、AAV6由来のVP2およびAAV7由来のVP3を有する。第二のプラスミドは、2つのITR間に挿入された血友病Aを処置するためのFVIIIに対するヌクレオチド配列をコードする。2つのプラスミドから生成されたトリプロイドAAVは、本発明の方法に従ってVP1、VP2およびVP3をコードするタンパク質を供給する複数のAAV血清型（例えば、AAV3、AAV6およびAAV7）を利用して血友病Aに関連する肝臓組織に対する特異性を部分的に増加させることによって、血友病Bを処置するためのFVIIIに対するヌクレオチド配列を含有する。実際に、血友病Aを患っている患者の肝臓組織を処置するためにこの方法によって作製されたトリプロイドウイルスは、AAV3、AAV6またはAAV7のみからなるウイルスベクターよりも関連組織に対して高い特異性を有する。
【０５５６】
実施例13：パーキンソン病の疾患処置を処置するための本発明のAAVの使用
パーキンソン病を患っている45歳の男性患者を、AAV2由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有する第一のヘルパープラスミド、ならびに、AAV2由来のRep遺伝子およびAAV4由来のCap遺伝子を有する第二のヘルパープラスミド、ならびに、グルタミン酸デカルボキシラーゼ65（GAD65）および／またはグルタミン酸デカルボキシラーゼ67（GAD67）に対するヌクレオチド配列をコードし、そのヌクレオチド配列が2つのITR間に挿入された第三のプラスミドを含有する、細胞株、例えば、ATCC No. PTA 13274のHEK293単離細胞株（例えば、米国特許第9,441,206号を参照のこと）から生成されたAAVで処置する。3つのプラスミドから生成されたハプロイドAAVは、パーキンソン病を処置するためのGAD65および／またはGAD67タンパク質に対するヌクレオチド配列を含有する。AAVが患者に投与され、投与の直後に患者は、振戦の頻度の低減および患者の平衡の改善を示す。時間と共に患者はまた、患者がAAVの投与前に患っていた幻覚および妄想の数および重症度の低減を経験する。
【０５５７】
バッテン病の処置
バッテン病を患っている8歳の男性患者を、AAV3由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有する第一のヘルパープラスミド、ならびに、AAV3由来のRep遺伝子およびAAV5由来のCap遺伝子を有する第二のヘルパープラスミドを含有する、細胞株、例えば、ATCC No. PTA 13274のHEK293単離細胞株（例えば、米国特許第9,441,206号を参照のこと）から生成されたAAVで処置する。第三のプラスミドは、バッテン病を処置するためのCLN2に対するヌクレオチド配列をコードし、ここで、CLN2遺伝子は、2つのITR間に挿入されている。3つのプラスミドから生成されたハプロイドAAVは、バッテン病を処置するためのヌクレオチド配列を含有する。AAVが患者に投与され、投与の直後に患者は、精神の鋭敏さの増加を示す。追加的に、患者は、患者がAAVの投与前に患っていた発作の低減ならびに徴候および運動技能の改善を経験する。
【０５５８】
アルツハイマー病の処置
アルツハイマー病を患っている73歳の女性患者を、AAV3由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有する第一のヘルパープラスミド；AAV3由来のRep遺伝子およびAAV4由来のCap遺伝子を有する第二のヘルパープラスミド；ならびに、AAV3由来のRep遺伝子およびAAV5由来のCap遺伝子を有する第三のヘルパープラスミドを含有する、細胞株、例えば、ATCC No. PTA 13274のHEK293単離細胞株（例えば、米国特許第9,441,206号を参照のこと）から生成されたAAVで処置する。第四のプラスミドは、アルツハイマー病を処置するための神経成長因子（NGF）に対するヌクレオチド配列をコードし、ここで、NGFは、2つのITR間に挿入されている。トリプロイドAAVが患者に投与され、投与の直後に患者は、精神の鋭敏さおよび短期記憶の増加を示す。患者はまた、AAVの投与前よりも、他者とより良好に意思疎通することができ、より独力で動作し始める。
【０５５９】
心疾患の処置
心疾患を患っている63歳の男性患者を、以下のいずれかを含有する、細胞株、例えば、ATCC No. PTA 13274のHEK293単離細胞株（例えば、米国特許第9,441,206号を参照のこと）から生成されたAAVで処置する：
（1）AAV2由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有する第一のヘルパープラスミド；AAV2由来のRep遺伝子およびAAV6由来のCap遺伝子を有する第二のヘルパープラスミド；ならびに、第三のプラスミドに含有されかつ2つのITR間に挿入された、心疾患を処置するためのタンパク質に対するヌクレオチド配列をコードする第三のプラスミド；
（2）AAV3由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有する第一のヘルパープラスミド；AAV3由来のRep遺伝子およびAAV9由来のCap遺伝子を有する第二のヘルパープラスミド；ならびに、第三のプラスミドに含有されかつ2つのITR間に挿入された、心疾患を処置するためのタンパク質に対するヌクレオチド配列をコードする第三のプラスミド；
（3）AAV3由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有する第一のヘルパープラスミド；AAV3由来のRep遺伝子およびAAV6由来のCap遺伝子を有する第二のヘルパープラスミド；AAV3由来のRep遺伝子およびAAV9由来のCap遺伝子を有する第三のヘルパープラスミド；ならびに、第三のプラスミドに含有されかつ2つのITR間に挿入された、心疾患を処置するためのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する第四のプラスミド；
（4）AAV2由来のRepおよびAAV2由来のVP1、AAV3由来のVP2およびAAV9由来のVP3を有するヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入された心疾患を処置するためのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する第二のプラスミド；
（5）AAV3由来のRepおよびAAV3由来のVP1、AAV6由来のVP2およびAAV6由来のVP3を有するヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入された心疾患を処置するためのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する第二のプラスミド；または
（6）AAV3由来のRepおよびAAV3由来のVP1、AAV6由来のVP2およびAAV9由来のVP3を有するヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入された心疾患を処置するためのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有する第二のプラスミド。
ここで、ポリプロイド性AAVが患者に投与され、投与の直後に患者は、心疾患に関連する症状の低減を示し、患者の心臓健康の同等の改善を示す。
【０５６０】
嚢胞性線維症の処置
嚢胞性線維症を患っている19歳の女性を、以下のいずれかを含有する、細胞株、例えば、ATCC No. PTA 13274のHEK293単離細胞株（例えば、米国特許第9,441,206号を参照のこと）から生成されたAAVで処置する：
（1）AAV3由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有する第一のヘルパープラスミド；AAV3由来のRepおよびAAV10由来のCap遺伝子を有する第二のヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入されたCFTRに対するヌクレオチド配列をコードする第三のプラスミド；
（2）AAV3由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有する第一のヘルパープラスミド；AAV3由来のRep遺伝子およびAAV9由来のCap遺伝子を有する第二のヘルパープラスミド；AAV3由来のRep遺伝子およびAAV10由来のCap遺伝子を有する第三のヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入されたCFTRに対するヌクレオチド配列をコードする第四のプラスミド；
（3）AAV2由来のRepおよびAAV2由来のVP1、AAV9由来のVP2およびAAV9由来のVP3を有するヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入されたCFTRに対するヌクレオチド配列をコードする第二のプラスミド；
（4）AAV3由来のRepおよびAAV2由来のVP1、AAV10由来のVP2およびAAV10由来のVP3を有するヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入されたCFTRに対するヌクレオチド配列をコードする第二のプラスミド；または
（7）AAV2由来のRepおよびAAV2由来のVP1、AAV9由来のVP2およびAAV10由来のVP3を有するヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入されたCFTRに対するヌクレオチド配列をコードする第二のプラスミド。
ここで、AAVが患者に投与され、投与の直後に患者は、患者の肺への損傷の増加の遅延；肺機能の喪失の増加の低減ならびに肝臓が損傷する速度の低減および肝硬変の重症度の増加の減速を示す。同じ患者はまた、患者が苦しみ始めていた嚢胞性線維症関連糖尿病の重症度の低減を経験する。
【０５６１】
骨格筋疾患−筋萎縮性側索硬化症（ALS）の処置
筋萎縮性側索硬化症（ALS）を患っている33歳の男性を、以下のいずれかを含有する、細胞株、例えば、ATCC No. PTA 13274のHEK293単離細胞株（例えば、米国特許第9,441,206号を参照のこと）から生成されたAAVで処置する：
（1）AAV2由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有する第一のヘルパープラスミド；AAV2由来のRepおよびAAV8由来のCap遺伝子を有する第二のヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入されたスーパーオキシドジスムターゼ1（SOD1）に対するヌクレオチド配列をコードする第三のプラスミド；
（2）AAV3由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有する第一のヘルパープラスミド；AAV3由来のRepおよびAAV9由来のCap遺伝子を有する第二のヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入されたSOD1に対するヌクレオチド配列をコードする第三のプラスミド；
（3）AAV3由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有する第一のヘルパープラスミド；AAV3由来のRep遺伝子およびAAV8由来のCap遺伝子を有する第二のヘルパープラスミド；AAV3由来のRep遺伝子およびAAV9由来のCap遺伝子を有する第三のヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入されたSOD1に対するヌクレオチド配列をコードする第四のプラスミド；
（4）AAV3由来のRepおよびAAV3由来のVP1、AAV9由来のVP2およびAAV9由来のVP3を有するヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入されたSOD1に対するヌクレオチド配列をコードする第二のプラスミド；
（5）AAV3由来のRepおよびAAV3由来のVP1、AAV8由来のVP2およびAAV8由来のVP3を有するヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入されたSOD1に対するヌクレオチド配列をコードする第二のプラスミド；または
（6）AAV3由来のRepおよびAAV3由来のVP1、AAV8由来のVP2およびAAV由来のVP3を有するヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入されたSOD1に対するヌクレオチド配列をコードする第二のプラスミド。
ここで、AAVが患者に投与され、投与の直後に患者は、脳および脊髄における運動ニューロンへの損傷の進行の減速または停止ならびに患者の脳と筋肉との間の伝達の維持を含む、ALSに関連する症状の低減を示す。
【０５６２】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）を患っている5歳の男性を、以下のいずれかを含有する、細胞株、例えば、ATCC No. PTA 13274のHEK293単離細胞株から生成されたAAVで処置する：
（1）AAV2由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有する第一のヘルパープラスミド；AAV2由来のRepおよびAAV8由来のCap遺伝子を有する第二のヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入されたジストロフィンに対するヌクレオチド配列をコードする第三のプラスミド；
（2）AAV3由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有する第一のヘルパープラスミド；AAV3由来のRepおよびAAV9由来のCap遺伝子を有する第二のヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入されたジストロフィンに対するヌクレオチド配列をコードする第三のプラスミド；
（3）AAV3由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有する第一のヘルパープラスミド；AAV3由来のRep遺伝子およびAAV8由来のCap遺伝子を有する第二のヘルパープラスミド；AAV3由来のRep遺伝子およびAAV9由来のCap遺伝子を有する第三のヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入されたジストロフィンに対するヌクレオチド配列をコードする第四のプラスミド；
（4）AAV3由来のRepおよびAAV3由来のVP1、AAV9由来のVP2およびAAV9由来のVP3を有するヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入されたジストロフィンに対するヌクレオチド配列をコードする第二のプラスミド；
（5）AAV3由来のRepおよびAAV3由来のVP1、AAV8由来のVP2およびAAV8由来のVP3を有するヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入されたジストロフィンに対するヌクレオチド配列をコードする第二のプラスミド；または
（6）AAV3由来のRepおよびAAV3由来のVP1、AAV8由来のVP2およびAAV由来のVP3を有するヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入されたジストロフィンに対するヌクレオチド配列をコードする第二のプラスミド。
ここで、AAVが患者に投与され、投与の直後に患者は、患者の骨格筋への損傷および消耗の増加の遅延、ならびにデュシェンヌ型筋ジストロフィーの結果としての心臓および肺が受ける損傷の遅延または停止を示す。
【０５６３】
重症筋無力症
重症筋無力症（MG）を患っている33歳の女性を、以下のいずれかを含有する、細胞株、例えば、ATCC No. PTA 13274のHEK293単離細胞株から生成されたAAVで処置する：
（1）AAV2由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有する第一のヘルパープラスミド；AAV2由来のRepおよびAAV8由来のCap遺伝子を有する第二のヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入された、患者がもはやMGを患わないような遺伝子に対するヌクレオチド配列をコードする第三のプラスミド；
（2）AAV3由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有する第一のヘルパープラスミド；AAV3由来のRepおよびAAV9由来のCap遺伝子を有する第二のヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入された、患者がもはやMGを患わないような遺伝子をコードする第三のプラスミド；
（3）AAV3由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有する第一のヘルパープラスミド；AAV3由来のRep遺伝子およびAAV8由来のCap遺伝子を有する第二のヘルパープラスミド；AAV3由来のRep遺伝子およびAAV9由来のCap遺伝子を有する第三のヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入された、患者がもはやMGを患わないような遺伝子をコードする第四のプラスミド；
（4）AAV3由来のRepおよびAAV3由来のVP1、AAV9由来のVP2およびAAV9由来のVP3を有するヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入された、患者がもはやMGを患わないような遺伝子をコードする第二のプラスミド；
（5）AAV3由来のRepおよびAAV3由来のVP1、AAV8由来のVP2およびAAV8由来のVP3を有するヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入された、患者がもはやMGを患わないような遺伝子をコードする第二のプラスミド；または
（6）AAV3由来のRepおよびAAV3由来のVP1、AAV8由来のVP2およびAAV由来のVP3を有するヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入された、患者がもはやMGを患わないような遺伝子をコードする第二のプラスミド。
ここで、AAVが患者に投与され、投与の直後に患者は、患者の身体の筋肉と神経との間の伝達の断絶の増加の減速を示し、その結果、筋肉制御の喪失の重症度の減速または停止をもたらす。AAVの投与後、患者の運動機能は安定し、もはや悪化することなく、また患者の呼吸もAAVの投与後悪化しない。
【０５６４】
肢帯型筋ジストロフィー
肢帯型筋ジストロフィー（LGMD）を患っている13歳の男性を、以下のいずれかを含有する、細胞株、例えば、ATCC No. PTA 13274のHEK293単離細胞株から生成されたAAVで処置する：
（1）AAV2由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有する第一のヘルパープラスミド；AAV2由来のRepおよびAAV8由来のCap遺伝子を有する第二のヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入された、ミオチリン、テレトニン、カルパイン-3、アルファ−サルコグリカンおよびベータ−サルコグリカンを非限定的に含むLGMDに関連する変異を有する15の遺伝子の1つに対するヌクレオチド配列をコードする第三のプラスミド；
（2）AAV3由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有する第一のヘルパープラスミド；AAV3由来のRepおよびAAV9由来のCap遺伝子を有する第二のヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入された、ミオチリン、テレトニン、カルパイン-3、アルファ−サルコグリカンおよびベータ−サルコグリカンを非限定的に含むLGMDに関連する変異を有する15の遺伝子の1つに対するヌクレオチド配列をコードする第三のプラスミド；
（3）AAV3由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有する第一のヘルパープラスミド；AAV3由来のRep遺伝子およびAAV8由来のCap遺伝子を有する第二のヘルパープラスミド；AAV3由来のRep遺伝子およびAAV9由来のCap遺伝子を有する第三のヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入された、ミオチリン、テレトニン、カルパイン-3、アルファ−サルコグリカンおよびベータ−サルコグリカンを非限定的に含むLGMDに関連する変異を有する15の遺伝子の1つに対するヌクレオチド配列をコードする第四のプラスミド；
（4）AAV3由来のRepおよびAAV3由来のVP1、AAV9由来のVP2およびAAV9由来のVP3を有するヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入された、ミオチリン、テレトニン、カルパイン-3、アルファ−サルコグリカンおよびベータ−サルコグリカンを非限定的に含むLGMDに関連する変異を有する15の遺伝子の1つに対するヌクレオチド配列をコードする第二のプラスミド；
（5）AAV3由来のRepおよびAAV3由来のVP1、AAV8由来のVP2およびAAV8由来のVP3を有するヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入された、ミオチリン、テレトニン、カルパイン-3、アルファ−サルコグリカンおよびベータ−サルコグリカンを非限定的に含むLGMDに関連する変異を有する15の遺伝子の1つに対するヌクレオチド配列をコードする第二のプラスミド；または
（6）AAV3由来のRepおよびAAV3由来のVP1、AAV8由来のVP2およびAAV由来のVP3を有するヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入された、ミオチリン、テレトニン、カルパイン-3、アルファ−サルコグリカンおよびベータ−サルコグリカンを非限定的に含むLGMDに関連する変異を有する15の遺伝子の1つに対するヌクレオチド配列をコードする第二のプラスミド。
ここで、LGMDに関連する15の異なる遺伝子の1つを各々コードする1以上のAAVが患者に投与され、投与の直後に患者は、追加の筋肉の消耗および萎縮の遅延または停止を示す。
【０５６５】
肝臓の疾患−血友病Bの処置
IX因子（FIX）の欠損から生じる血友病Bを患っている9歳の男性を、以下のいずれかを含有する、細胞株、例えば、ATCC No. PTA 13274のHEK293単離細胞株から生成されたAAVで処置する：
（1）AAV2由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有する第一のヘルパープラスミド；AAV2由来のRepおよびAAV6由来のCap遺伝子を有する第二のヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入された血友病Bを処置するためのFIXに対するヌクレオチド配列をコードする第三のプラスミド；
（2）AAV2由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有する第一のヘルパープラスミド；AAV3由来のRepおよびAAV7由来のCap遺伝子を有する第二のヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入された血友病Bを処置するためのFIXに対するヌクレオチド配列をコードする第三のプラスミド；
（3）AAV3由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有する第一のヘルパープラスミド；AAV3由来のRep遺伝子およびAAV6由来のCap遺伝子を有する第二のヘルパープラスミド；AAV3由来のRep遺伝子およびAAV7由来のCap遺伝子を有する第三のヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入されたFIXに対するヌクレオチド配列をコードする第四のプラスミド；
（4）AAV2由来のRepおよびAAV2由来のVP1、AAV6由来のVP2およびAAV6由来のVP3を有するヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入されたFIXに対するヌクレオチド配列をコードする第二のプラスミド；
（5）AAV2由来のRepおよびAAV3由来のVP1、AAV7由来のVP2およびAAV7由来のVP3を有するヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入されたFIXに対するヌクレオチド配列をコードする第二のプラスミド；または
（6）AAV2由来のRepおよびAAV3由来のVP1、AAV6由来のVP2およびAAV7'由来のVP3を有するヘルパープラスミド、ならびに2つのITR間に挿入されたFIXに対するヌクレオチド配列をコードする第二のプラスミド。
ここで、AAVが患者に投与され、投与の直後に患者は、出血エピソードの低減を含む血友病Bの重症度の低減を示す。
【０５６６】
血友病A
VIII因子（FVIII）の欠損から生じる血友病Aを患っている8歳の男性を、以下のいずれかを含有する、細胞株、例えば、ATCC No. PTA 13274のHEK293単離細胞株から生成されたAAVで処置する：
（1）AAV2由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有する第一のヘルパープラスミド；AAV2由来のRepおよびAAV6由来のCap遺伝子を有する第二のヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入されたFVIIIに対するヌクレオチド配列をコードする第三のプラスミド；
（2）AAV2由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有する第一のヘルパープラスミド；AAV3由来のRepおよびAAV7由来のCap遺伝子を有する第二のヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入されたFVIIIに対するヌクレオチド配列をコードする第三のプラスミド；
（3）AAV3由来のRep遺伝子およびCap遺伝子を有する第一のヘルパープラスミド；AAV3由来のRep遺伝子およびAAV6由来のCap遺伝子を有する第二のヘルパープラスミド；AAV3由来のRep遺伝子およびAAV7由来のCap遺伝子を有する第三のヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入されたFVIIIに対するヌクレオチド配列をコードする第四のプラスミド；
（4）AAV2由来のRepおよびAAV2由来のVP1、AAV6由来のVP2およびAAV6由来のVP3を有するヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入されたFVIIIに対するヌクレオチド配列をコードする第二のプラスミド；
（5）AAV2由来のRepおよびAAV3由来のVP1、AAV7由来のVP2およびAAV7由来のVP3を有するヘルパープラスミド；ならびに、2つのITR間に挿入されたFVIIIに対するヌクレオチド配列をコードする第二のプラスミド；または
（6）AAV2由来のRepおよびAAV3由来のVP1、AAV6由来のVP2およびAAV7'由来のVP3を有するヘルパープラスミド、ならびに2つのITR間に挿入されたFVIIIに対するヌクレオチド配列をコードする第二のプラスミド。
ここで、AAVが患者に投与され、投与の直後に患者は、出血エピソードの低減を含む血友病Aの重症度の低減を示す。
【０５６７】
最後に、本明細書の局面は、具体的な態様を参照することによって明らかにされるが、当業者であれば、これらの開示された態様が本明細書に開示される主題の原理を単に例証したものにすぎないことを容易に認識することを理解すべきである。それ故、開示される主題は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコルおよび／または試薬などに決して限定されるものではないことを理解すべきである。そういう意味で、本明細書の精神から逸脱することなく、本明細書の教示に従って、開示される主題に対する様々な修正もしくは変更またはその代替構成を施すことができる。最後に、本明細書において使用される専門用語は、特定の態様を説明することを目的としているにすぎず、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定することを意図したものではない。したがって、本発明は、まさに示されかつ説明された通りのものに、限定されるものではない。
【０５６８】
本発明を実施する上で本発明者らの知る最良の形態を含めた本発明の特定の態様が本明細書に記載される。当然のことながら、当業者には、前述の説明を読めば、これらの記載されている態様に対する変形が明らかになるであろう。本発明者は、当業者が必要に応じてそのような変形を用いることを予想しており、そして、本発明者は、本発明が本明細書に具体的に記載されるもの以外の方法で実施されることを意図している。したがって、本発明は、準拠法によって認められる通りの、本明細書に添付される特許請求の範囲に列記される主題の全ての修正および等価物を含む。さらに、本明細書に別途指示されるかまたは文脈に矛盾することが明らかである場合を除き、上記の態様の全ての可能な変形の任意の組み合わせが本発明に包含される。
【０５６９】
本発明の代替的な態様、要素または工程の群分けは、限定的なものとして解釈されるべきではない。群のメンバーは各々、個別にまたは本明細書に開示される他の群のメンバーとの任意の組み合わせで、言及および特許請求され得る。利便性および／または特許性を理由に、ある群の1以上のメンバーが群に包含されても群から削除されてもよいことが予想される。このような包含または削除がある場合、本明細書は、その群を、修正されたものとして、したがって、添付の特許請求の範囲において使用されるあらゆるマーカッシュ群の記載を満たすものとして含有すると見なされる。
【０５７０】
別途指示のない限り、本明細書および特許請求の範囲において使用される、特徴、項目、量、パラメータ、特性、期間などを表す数値はいずれも、全ての場合において「約」という用語によって修飾されるものと理解されるべきである。本明細書において使用される場合、「約」という用語は、そのように条件付けされた特徴、項目、量、パラメータ、特性または期間が、記載される特徴、項目、量、パラメータ、特性または期間の値の上下±10パーセントの範囲を包含することを意味する。したがって、反対の指示のない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、変動し得る近似値である。少なくとも、かつ、請求項の範囲への等価論の適用を限定することを試みるものではないが、各数値表示は少なくとも、報告される有効桁数を考慮に入れ、通常の丸め技法を適用することによって解釈されるべきである。本発明の広い範囲を記載する数値範囲および値は近似値であるが、具体例に記載される数値範囲および値は、可能な限り正確に報告したものである。しかしながら、いかなる数値範囲も値も、本来、それぞれの試験測定にみられる標準偏差から必然的に生じるある種の誤差を含有する。本明細書における値の数値範囲の列記は、その範囲内に収まる別個の各数値に個別に言及するのを省略する方法としての役割を果たしているにすぎない。本明細書に別途指示のない限り、数値範囲の個々の各値は、それが個別に本明細書に列記された場合と同様に本明細書に組み入れられる。
【０５７１】
本明細書に記載の全ての方法は、本明細書に別途指示されるかまたは文脈に矛盾することが明らかである場合を除き、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書に提供されるいずれかおよび全ての例、または例示的な言語（例えば、「など（such as）」）の使用は、本発明をより良好に例証することを意図しているにすぎず、他に特許請求される本発明の範囲の限定を提起するものではない。本明細書における言語は、本発明の実施に必須のあらゆる特許請求されていない要素を示すものと解釈されるべきではない。
【０５７２】
本明細書に開示される具体的な態様は、特許請求の範囲において、言語「からなる」または言語「から本質的になる」を使用してさらに限定され得る。特許請求の範囲において使用されるとき、出願されたものであるか補正により追加されたものであるかにかかわらず、移行用語「からなる」は、特許請求の範囲において特定されていない任意の要素、段階または成分を排除する。移行用語「から本質的になる」は、特許請求の範囲を、特定されている材料または段階ならびに基本的なおよび新規な特徴に実質的に影響を与えないものに限定する。このように特許請求される本発明の態様は、本明細書にて本質的にまたは明示的に記載され、本明細書にて可能となる。
【０５７３】
本明細書において参照および特定される特許、特許公開および他の刊行物は全て、例えば、本発明と関連して使用され得るそのような刊行物に記載される組成物および方法論を記載および開示する目的で、個別にかつ明示的にその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。これらの刊行物は、単に本出願の出願日よりも前に開示されたという理由で提供されるものである。これに関して、いかなる点においても、先行発明またはその他の理由によって本発明者らがそのような開示に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。これらの文献の日付に関する陳述または内容に関する説明は全て、本出願者等に入手可能な情報に基づくものであり、これらの文献の日付または内容の正確さに関する承認となるものではない。
【０５７４】
（表１）
2020511127.tif 000027
2020511127.tif 000028
【０５７５】
（表２）アミノ酸残基および略号
2020511127.tif 000029
【０５７６】
（表３）
2020511127.tif 000030
表中、（X）→任意のアミノ酸への変異
（-）→任意のアミノ酸の挿入
注記：位置2の挿入は、挿入の部位によって示される
【０５７７】
（表４）
2020511127.tif 000031
【０５７８】
（表５）AAV8結合血清タンパク質についてのMS結果
2020511127.tif 000032
2020511127.tif 000033
* NDは、対照群におけるタンパク質の検出がないことを示す
【０５７９】
（表６）AAV9結合血清タンパク質についてのMS結果
2020511127.tif 000034
2020511127.tif 000035
2020511127.tif 000036
* NDは、対照群におけるタンパク質の検出がないことを示す
【０５８０】
（表７）血管透過性を高めるAAV9に結合する潜在的な血清タンパク質
2020511127.tif 000037
* NDは、対照群におけるタンパク質の検出がないことを示す
【０５８１】
（表８）
2020511127.tif 000038
【０５８２】
（表９）インビボでの抗原提示に対するVIPRの効果
2020511127.tif 000039
【０５８３】
（表１０）トリプロイドウイルスAAV2/8に対する中和抗体力価および交差反応性
2020511127.tif 000040
【０５８４】
（表１１）ハプロイドウイルスAAV2/8/9に対する中和抗体力価および交差反応性
2020511127.tif 000041
【０５８５】
配列
AAV1（SEQ ID NO:138）
2020511127.tif 000042
2020511127.tif 000043
【０５８６】
AAV2（SEQ ID NO:139）
2020511127.tif 000044
2020511127.tif 000045
【０５８７】
AAV3（SEQ ID NO:140）
2020511127.tif 000046
2020511127.tif 000047
【０５８８】
AAV4（SEQ ID NO:141）
2020511127.tif 000048
2020511127.tif 000049
【０５８９】
AAV5（SEQ ID NO:142）
2020511127.tif 000050
2020511127.tif 000051
【０５９０】
AAV6（SEQ ID NO:143）
2020511127.tif 000052
2020511127.tif 000053
【０５９１】
AAV7（SEQ ID NO:144）
2020511127.tif 000054
2020511127.tif 000055
【０５９２】
AAV8（SEQ ID NO:145）
2020511127.tif 000056
2020511127.tif 000057
【０５９３】
AAV9（SEQ ID NO:146）
2020511127.tif 000058
2020511127.tif 000059
2020511127.tif 000060
【０５９４】
AAV10（SEQ ID NO:147）
2020511127.tif 000061
2020511127.tif 000062
【０５９５】
AAV11（SEQ ID NO:148）
2020511127.tif 000063
2020511127.tif 000064
【０５９６】
AAV12（SEQ ID NO:149）
2020511127.tif 000065
2020511127.tif 000066
【図１Ａ】
2020511127.tif 000067
【図１Ｂ】
2020511127.tif 000068
【図１Ｃ】
2020511127.tif 000069
【図１Ｄ】
2020511127.tif 000070
【図２Ａ】
2020511127.tif 000071
【図２Ｂ】
2020511127.tif 000072
【図２Ｃ】
2020511127.tif 000073
【図２Ｄ】
2020511127.tif 000074
【図３】
2020511127.tif 000075
【図４】
2020511127.tif 000076
【図５】
2020511127.tif 000077
【図６Ａ】
2020511127.tif 000078
【図６Ｂ】
2020511127.tif 000079
【図６Ｃ】
2020511127.tif 000080
【図６Ｄ】
2020511127.tif 000081
【図６Ｅ】
2020511127.tif 000082
【図６Ｆ】
2020511127.tif 000083
【図７】
2020511127.tif 000084
【図８】
2020511127.tif 000085
【図９Ａ】
2020511127.tif 000086
【図９Ｂ】
2020511127.tif 000087
【図１０】
2020511127.tif 000088
【図１１】
2020511127.tif 000089
【図１２Ａ】
2020511127.tif 000090
【図１２Ｂ】
2020511127.tif 000091
【図１３】
2020511127.tif 000092
【図１４Ａ】
2020511127.tif 000093
【図１４Ｂ】
2020511127.tif 000094
【図１４Ｃ】
2020511127.tif 000095
【図１４Ｄ】
2020511127.tif 000096
【図１５】
2020511127.tif 000097
【図１６】
2020511127.tif 000098
【図１７Ａ】
2020511127.tif 000099
【図１７Ｂ】
2020511127.tif 000100
【図１７Ｃ】
2020511127.tif 000101
【図１７Ｄ】
2020511127.tif 000102
【図１８】
2020511127.tif 000103
【図１９】
2020511127.tif 000104
【図２０】
2020511127.tif 000105
【図２１】
2020511127.tif 000106
【図２２】
2020511127.tif 000107
【図２３】
2020511127.tif 000108
【図２４】
2020511127.tif 000109
【図２５】
2020511127.tif 000110
【図２６】
2020511127.tif 000111
【図２７Ａ】
2020511127.tif 000112
【図２７Ｂ】
2020511127.tif 000113
【図２７Ｃ】
2020511127.tif 000114
【図２８】
2020511127.tif 000115
【図２９Ａ】
2020511127.tif 000116
【図２９Ｂ】
2020511127.tif 000117
【図２９Ｃ】
2020511127.tif 000118
【図３０】
2020511127.tif 000119
【図３１】
2020511127.tif 000120
【図３２】
2020511127.tif 000121
【図３３】
2020511127.tif 000122
【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３５Ｄ】
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【図３５Ｅ】
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【図３５Ｆ】
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【図３５Ｇ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３６Ｃ】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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