(57)【要約】  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによる除草剤耐性植物を創出するための方法が提供される。植物において除草剤耐性を付与することができる内在性遺伝子突然変異部位をスクリーニングするための方法および作物交雑における特定された内在性遺伝子突然変異部位の使用も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
除草剤耐性植物、好ましくは導入遺伝子非含有除草剤耐性植物を作出するための方法であって、前記植物内に除草剤耐性関連遺伝子を塩基編集するためのシステムを導入し、それによりガイドＲＮＡが前記植物内の除草剤耐性関連遺伝子の標的配列との塩基編集融合タンパク質を標的とし、結果的に前記標的配列内の１つ以上のヌクレオチド置換を生じることを含み、前記システムが、次の（ｉ）〜（ｖ）；
ｉ）塩基編集融合タンパク質およびガイドＲＮＡ、
ｉｉ）塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列とガイドＲＮＡとを含む発現コンストラクト、
ｉｉｉ）塩基編集融合タンパク質、およびガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、
ｉｖ）塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、およびガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、
ｖ）塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列とガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列とを含む発現コンストラクト
のうちの少なくとも１つを含み、前記塩基編集融合タンパク質がヌクレアーゼ不活性型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９など）ドメインおよびデアミナーゼドメインを含有し、前記ガイドＲＮＡが前記植物ゲノム内での前記除草剤耐性関連遺伝子における標的配列との前記塩基編集融合タンパク質を標的とすることができ、
前記１つ以上のヌクレオチド置換が、前記植物に除草剤耐性を付与し、
場合により、前記方法が、除草剤耐性について前記植物をスクリーニングする工程をさらに含む、方法。
【請求項２】
前記除草剤耐性関連遺伝子が、ＰｓｂＡ、ＡＬＳ、ＥＰＳＰＳ、ＡＣＣアーゼ、ＰＰＯ、ＨＰＰＤ、ＰＤＳ、ＧＳ、ＤＯＸＰＳ、Ｐ４５０から選択される除草剤耐性関連タンパク質についてコードする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記塩基編集融合タンパク質が、配列番号１０または配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記ガイドＲＮＡが、配列番号１９〜配列番号７８のうちの１つ以上を標的とする、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記除草剤耐性関連遺伝子がＡＣＣアーゼについてコードし、前記１つ以上のヌクレオチド置換がＷ２０２７およびＷ２０２７＋Ｒ２０２８から選択されるＡＣＣアーゼ内アミノ酸置換を結果的に生じ、ここで、前記アミノ酸の位置は配列番号１に示されている、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記除草剤耐性関連遺伝子がＡＬＳについてコードし、前記１つ以上のヌクレオチド置換がＰ１９７Ａ、Ｐ１９７Ｆ、Ｐ１９７Ｓ、Ｐ１９７Ｙ、Ｐ１９７Ｆ＋Ｒ１９８Ｃ、Ｇ６５４Ｅ＋Ｇ６５５Ｓ、Ｇ６５４Ｋ＋Ｇ６５５Ｓ、Ｇ６５４Ｅ＋Ｇ６５９Ｎ、Ｐ１９７Ｆ＋Ｇ６５４Ｅ＋Ｇ６５５Ｓ、またはこれらのいずれかの組み合わせから選択されるＡＬＳ内アミノ酸置換を結果的に生じ、ここで、前記アミノ酸の位置は配列番号２に示されている、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記除草剤耐性関連遺伝子がＡＬＳについてコードし、前記ガイドＲＮＡがＡ１２２、Ｐ１９７、Ｒ１９８、Ｄ２０４、Ａ２０５、Ｇ６５４、Ｇ６５５、Ｇ６５９、またはこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸（複数可）をコードする配列を含む標的配列を標的とし、ここで、前記アミノ酸の位置は配列番号２に示されている、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記除草剤耐性関連遺伝子がＡＣＣアーゼについてコードし、前記ガイドＲＮＡがＳ１７６８、Ｒ１７９３、Ａ１７９４、Ｒ１８２５、Ｄ１８２７、Ｌ１８１５、Ａ１８１６、Ｒ１８１７、Ａ１８３７、Ｇ１８５４、Ｇ１８５５、Ｄ１９７１、Ｄ１９７２、Ｇ１９８３、Ｐ１９９３、Ｒ１９９４、Ｓ２００３、Ａ２００４、Ｔ２００５、Ｔ２００７、Ａ２００８、Ｒ２０２８、Ｇ２０２９、Ｔ２０４７、Ｒ２０７０、Ｇ２０７１、Ａ２０９０、Ｅ２０９１、Ｅ２１０６、Ｓ２１１９、Ｒ２２２０、Ａ１８１３、Ｅ１７９６、Ｅ１７９７、Ｔ１８００、Ｌ１８０１、Ｓ１８４９、Ｈ１８５０、Ｄ１８７４、Ｄ１８７５、Ｌ２０２４、Ｅ１９８９、Ｒ１９９０、Ｌ２０９９、またはこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、１つまたはそれ以上のアミノ酸をコードする配列を含む標的配列を標的とし、ここで、前記アミノ酸の位置は配列番号１に示されている、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記除草剤耐性関連遺伝子がＥＰＳＰＳについてコードし、前記ガイドＲＮＡがＴ１０２および／またはＡ１０３からなる群から選択される、１つまたはそれ以上のアミノ酸をコードする配列を含む標的配列を標的とし、ここで、前記アミノ酸の位置は配列番号４に示されている、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記除草剤耐性関連遺伝子がＨＰＰＤについてコードし、前記ガイドＲＮＡがＰ２７７、Ｖ３６４、Ｃ４１３、Ｇ４１４、Ｇ４１５、Ｖ３６６、またはこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、１つまたはそれ以上のアミノ酸をコードする配列を含む標的配列を標的とし、ここで、前記アミノ酸の位置は配列番号３に示されている、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
除草剤耐性関連タンパク質の変異体を同定する方法であって、前記変異体は、除草剤耐性を植物に付与することができるものであり、
ｉ）除草剤耐性植物を請求項１記載の方法によって作出することと、
ｉｉ）結果として生じる除草剤耐性植物における前記除草剤耐性関連遺伝子の配列および／またはコードされた除草剤耐性関連タンパク質の配列を決定し、それにより、前記変異体の配列を同定すること
とを含む、方法。
【請求項１２】
前記除草剤耐性関連除草剤耐性関連タンパク質が、ＰｓｂＡ、ＡＬＳ、ＥＰＳＰＳ、ＡＣＣアーゼ、ＰＰＯ、ＨＰＰＤ、ＰＤＳ、ＧＳ、ＤＯＸＰＳ、Ｐ４５０から選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
請求項１１または請求項１２記載の方法によって同定される除草剤耐性関連タンパク質の変異体であって、除草剤耐性を植物に付与することができる、変異体。
【請求項１４】
野生型ＡＣＣアーゼと比較して、ＡＣＣアーゼ変異体が、１７６８、１７９３、１７９６、１７９７、１７９４、１８００、１８０１、１８１３、１８１３、１８１５、１８２５、１８２７、１８１５、１８１６、１８１７、１８３７、１８３８、１８４９、１８５０、１８５４、１８５５、１８７４、１８７５、１９７１、１８７２、１９８３、１９８９、１９９０、１９９３、１９９４、２００３、２００４、２００５、２００７、２００８、２０２４、２０２７、２０２８、２０２９、２０４７、２０７０、２０７１、２０９０、２０９１、２０９０、２１０６、２０９９、２１０６、２１１９、２２２０から選択される、１つまたはそれ以上の位置でのアミノ酸の突然変異を含む、ＡＣＣアーゼ変異体であって、前記アミノ酸の位置は配列番号１に示されており、前記変異体が除草剤耐性を植物に付与する、ＡＣＣアーゼ変異体。
【請求項１５】
野生型ＡＬＳと比較して、ＡＬＳ変異体が、１２２、１９７、２０４、２０５、６５３、６５４、６５５、６５９から選択される、１つまたはそれ以上の位置でのアミノ酸の突然変異を含む、ＡＬＳ変異体であって、前記アミノ酸の位置は配列番号２に示されており、前記変異体が除草剤耐性を植物に付与する、ＡＬＳ変異体。
【請求項１６】
野生型ＨＰＰＤと比較して、前記ＨＰＰＤが２７７、３６４、３６６、４１３、４１４、４１５から選択される、１つまたはそれ以上の位置でのアミノ酸の突然変異を含む、ＨＰＰＤ変異体であって、前記アミノ酸の位置は配列番号３に示されており、前記変異体が除草剤耐性を植物に付与する、ＨＰＰＤ変異体。
【請求項１７】
野生型ＥＰＳＰＳと比較して、前記ＥＰＳＰＳが１０２および１０３から選択される、１つまたはそれ以上の位置でのアミノ酸の突然変異を含む、ＥＰＳＰＳ変異体であって、前記アミノ酸の位置は配列番号４に示されており、前記変異体が除草剤耐性を植物に付与する、ＥＰＳＰＳ変異体。
【請求項１８】
請求項１３から請求項１７までのいずれか１項記載の変異体をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項１９】
調節配列へ操作可能に連結された請求項１３から請求項１７までのいずれか１項記載の変異体をコードするヌクレオチド配列を含む、発現カセット。
【請求項２０】
請求項１３から請求項１７までのいずれか１項記載の変異体をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクトであって、前記ヌクレオチド配列が調節配列へ操作可能に連結されている、発現コンストラクト。
【請求項２１】
除草剤耐性植物の作出における請求項１３から請求項１７までのいずれか１項記載の変異体、請求項１８記載の単離された核酸、請求項１９記載の発現カセット、および請求項２０記載の発現コンストラクトの、使用。
【請求項２２】
請求項１８記載の単離された核酸、請求項１９記載の発現カセット、および／または請求項２０記載の発現コンストラクトを植物内へ導入することを含む、除草剤耐性植物を作出する方法。
【請求項２３】
請求項１もしくは請求項２２記載の方法によって得られたか、請求項１９記載の発現カセットを含むか、あるいは請求項１８記載の単離された核酸もしくは請求項２０記載の発現コンストラクトを用いて形質転換された、除草剤耐性植物。
【請求項２４】
前記植物が、単子葉植物および双子葉植物から選択され、例えば、前記植物が、コムギ、コメ、トウモロコシ、ダイズ、ヒマワリ、ソルガム、カノーラ、アルファルファ、ワタ、オオムギ、ミレー、トウキビ、トマト、タバコ、タピオカ、ジャガイモ、キャベツ、ケール、キュウリ、トマト、カーネーション、ペオニア、バラ、スイカ、メロン、イチゴ、ブルーベリー、ブドウ、リンゴ、カンキツ、モモ、板藍根（Ｒａｄｉｘ  ｉｓａｔｉｄｉｓ）、リコリス、チョウセンニンジン、トウスケボウフウ（Ｓａｐｏｓｈｎｉｋｏｖｉａ  ｄｉｖａｒｉｃａｔａ）、およびシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）から選択される、請求項１から請求項１０までのいずれか１項記載の方法、請求項１３から請求項１７までのいずれか１項記載の変異体、請求項２１記載の使用、請求項２２記載の方法、および請求項２３記載の除草剤耐性植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物遺伝子工学の分野に属する。具体的には、本発明は、塩基編集技術によって新規の除草剤耐性植物を創出するための方法、および植物において除草剤耐性を付与することができる内在性遺伝子突然変異をスクリーニングするための方法に関する。本発明は、作物交雑における特定された内在性遺伝子突然変異の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
雑草は、作物に対する主な脅威であり、作物の収量および品質に影響するだけでなく、農業上の有害生物および疾患も移す。それゆえ、有効な雑草防除は、農業における高い収量を達成することにとって必須である。伝統的な手作業の除草は、非効率的であり、高いコストをもたらし、したがって、作物の成長中に除草性化学物質を噴霧することに徐々に置き換えられてきた。現在、中国の農業生産において、適用される除草剤の面積および量は、殺虫剤および真菌剤をすでに超過している。
【０００３】
除草剤の作用機序は、３つの区分へと分けることができる。第１は、植物光合成系に関与する酵素を抑制することであり、第２は、アミノ酸または脂肪酸の合成の阻害など、細胞代謝を抑制することであり、第３は、微小管重合の抑制または植物ホルモン系への干渉を含む、細胞成長／分裂を抑制することである。除草剤が抑制する酵素はまた、多くの作物において感受性があり、それゆえ多くの除草剤は、雑草を防除しながら、作物に対する重大な損傷を発生させる可能性がある。それゆえ、除草剤に対する作物の耐性を改善することは大いに意義がある。
【０００４】
除草剤に対する作物耐性を上昇させるための２つの主要な戦略がある。１つは、標的耐性であり、これは、除草剤が酵素の生理活性を有効に抑制することができないように、除草剤によって抑制された酵素が突然変異していることを意味する。この戦略は概して、イミダゾリノン、グリホサート、スルホニル尿素、アトラジンおよびこれらに類するものに対する耐性を包含する。第２は、解毒であり、すなわち、除草剤の迅速な分解を通じて標的酵素の生理学的機能を保護することである。この戦略は概して、植物の内在性Ｐ４５０酵素系ならびに導入遺伝子によるグルホシナート、２，４−Ｄ、ジカムバおよびこれらに類するものに対する耐性を包含する。
【０００５】
植物内で除草剤耐性を達成することに対して、現在２つの異なる技術的アプローチ、すなわち、ｉ）化学的突然変異誘発、放射線突然変異誘発などを含む伝統的な作物交雑、およびｉｉ）導入遺伝子、すなわち、関心対象の植物内への除草剤耐性遺伝子の組込みがある。しかしながら、伝統的な交雑農産物によって除草剤耐性突然変異（特に、同じ情報における複数の突然変異）を取得する確率は非常に低く、連関した望ましくない突然変異を生じることが可能である。導入遺伝子技術は、公知の除草剤耐性遺伝子を関心対象の植物内へ導入して、期待される除草剤耐性を付与することしかできない。
【０００６】
除草剤耐性植物および新たな除草剤耐性遺伝子を取得するためのより単純な、かつより効率的な方法について、当技術分野において必要性がなおもある。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、コメＡＬＳにおける耐性突然変異のスクリーニングを示す。
【図２】図３は、コメＡＣＣアーゼにおける耐性突然変異のスクリーニングを示す。
【図３】図３は、コムギＡＬＳにおける耐性突然変異のスクリーニングを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
Ｉ．定義
本発明において、特に示されていない限り、本明細書で使用される科学用語および技術用語は、当業者によって通常理解される意味を指す。また、タンパク質およびヌクレオチドの化学、分子生物学、細胞および組織の培養、微生物学、免疫学に関する本明細書で使用する用語および実験手順はすべて、当技術分野で概して使用される用語および従来方法に属する。例えば、本明細書で使用される標準的なＤＮＡ組換えおよび分子クローン化技術は、当業者に周知であり、次の参考文献において詳細に説明されている：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９（以後、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ」と称する）。その一方で、本発明をより良好に理解するために、関連用語についての定義および説明を以下に提供する。
【０００９】
「Ｃａｓ９ヌクレアーゼ」および「Ｃａｓ９」は、本明細書で相互交換可能に使用されることができ、ＲＮＡ特異的ヌクレアーゼ（ＲＮＡ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）と称し、Ｃａｓ９タンパク質またはその断片（Ｃａｓ９の活性のあるＤＮＡ開裂ドメインおよび／またはＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインを含むタンパク質など）を含む。Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（クラスター化され規則正しく間の空いた短いパリンドロームリピートおよびその関係する系）ゲノム編集システムの構成要素であり、ＤＮＡ標的配列を標的としかつ開裂させ、ガイドＲＮＡの誘導下でＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を形成する。
【００１０】
「ガイドＲＮＡ」および「ｇＲＮＡ」は、本明細書で相互交換可能に使用されることができ、典型的には、部分的な相補体を通じて複合体を形成するｃｒＲＮＡ分子およびｔｒａｃｒＲＮＡ分子から構成され、ｃｒＲＮＡは、ハイブリッド形成のための標的配列と十分相補的であり、かつＣＲＩＳＰＲ複合体（Ｃａｓ９＋ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ）に向かい、標的配列へ特異的に結合する配列を含む。しかしながら、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方の特徴を含む一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が設計されることができることは当技術分野において公知である。
【００１１】
「デアミナーゼ」は、脱アミノ反応を触媒する酵素を称する。本発明のいくつかの実施形態において、デアミナーゼは、シチジンまたはデオキシシチジンからそれぞれウラシルまたはデオキシウリジンへの脱アミノを触媒するシチジンデアミナーゼを称する。
【００１２】
植物細胞へ適用される場合の「ゲノム」は、核内で認められる染色体ＤＮＡだけでなく、細胞の細胞内構成要素（例えば、ミトコンドリア、色素体）内で認められる細胞小器官ＤＮＡも包含する。
【００１３】
本明細書で使用する場合、「植物」という用語には、植物全体および何らかの後代、植物の細胞、組織、または部分が含まれる。「植物部分」という用語には、例えば、種子（成熟種子および未成熟種子を含む）、植物挿木、植物細胞、植物細胞培養物、植物器官（例えば、花粉、胚、花、果実、芽、葉、根、茎および外植片）を含むがこれに限定されない植物の何らかの部分（複数可）が含まれる。植物組織または植物器官は、種子、プロトプラスト、カルス、または構造単位もしくは機能単位へと組織化された植物細胞の何らかの他の群であってもよい。植物の細胞または組織培養物は、細胞または組織が取得された植物の生理学的特徴および形態学的特徴を有する植物を再生することができることがあり、かつ該植物と実質的に同じ遺伝子型を有する植物を再生することができることがある。対照的に、いくつかの植物細胞は、植物を作出するよう再生することができない。植物の細胞または組織培養物における再生可能な細胞は、胚、プロトプラスト、分裂組織的細胞、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、シルク、花、仁、穂、穂軸、殻、または柄であってもよい。
【００１４】
植物部分には、収穫可能な部分、および後代植物の増殖に有用な部分が含まれる。増殖に有用な植物部分には、例えば、種子、果実、挿木、芽、塊茎、および根茎が含まれるが、これらに限定されない。植物の収穫可能な部分は、例えば、花、花粉、芽、塊茎、葉、茎、果実、種子、および根を含むがこれらに限定されない植物の何らかの有用な部分であってもよい。
【００１５】
植物細胞とは、植物の構造的かつ生理学的な単位であり、細胞壁を有さないプロトプラスト細胞と細胞壁を有する植物細胞とを含む。植物細胞は、単離された単一の細胞、または細胞の凝集体の形態であってもよく（例えば、脆いカルスおよび培養された細胞）、より高度の組織化された単位（例えば、植物組織、植物器官、および植物）の部分であってもよい。したがって、植物細胞は、プロトプラスト、配偶子産生細胞、または植物全体へと再生することができる細胞もしくは細胞の収集物であってもよい。このように、複数の植物細胞を含み、かつ植物全体へと再生することができる種子は、本明細書では実施形態において、「植物細胞」とみなされる。
【００１６】
「プロトプラスト」という用語は、本明細書で使用される場合、その細胞壁が完全にまたは部分的に除去され、その脂質二重膜がむき出しになった植物細胞を称し、したがって、細胞壁が完全に除去されたプロトプラストと、細胞壁が部分的にしか除去されていないスフェロプラストとを含むが、これらに限定されない。典型的には、プロトプラストとは、細胞培養物または植物全体への再生のための能力を有する、細胞壁を有さない単離された植物細胞である。
【００１７】
植物の「後代」は、植物の何らかのその後の世代を含む。
【００１８】
「遺伝子改変された植物」には、そのゲノム内に外来性ポリヌクレオチドを含む植物が含まれる。例えば、外来性ポリヌクレオチドは、ゲノム内に安定して組み込まれており、それにより該ポリヌクレオチドは連続的な世代へと伝えられる。外来性ポリヌクレオチドは、単独でまたは組換えＤＮＡコンストラクトの一部としてゲノム内へと組み込まれることができる。改変された遺伝子または発現調節配列は、植物ゲノム内に、該配列が１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、または付加を含むことを意味する。例えば、本発明によって取得された遺伝子改変された植物は、野生型植物（遺伝子改変されていない対応する植物）に対して、１つ以上のＣからＴへの置換を含有することができる。
【００１９】
配列に関する「外来性の」という用語は、外来種から生じる配列、または同じ種からの場合、人為的なヒト介在による組成および／またはゲノムの遺伝子座におけるその本来の形態から実質的に改変されている配列を意味する。
【００２０】
「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、または「核酸フラグメント」は、合成の非天然ヌクレオチド塩基または変化したヌクレオチド塩基を場合により含有する一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを称するよう相互交換可能に使用される。ヌクレオチド（その５’−一リン酸形態で通常認められる）は、次のように一文字表記によって称される：「Ａ」は、アデニル酸またはデオキシアデニル酸（それぞれ、ＲＮＡまたはＤＮＡについて）、「Ｃ」は、シチジル酸またはデオキシシチジル酸、「Ｇ」は、グアニル酸またはデオキシグアニル酸、「Ｕ」は、ウリジル酸、「Ｔ」は、デオキシチミジル酸、「Ｒ」は、プリン（ＡまたはＧ）、「Ｙ」は、ピリミジン（ＣまたはＴ）、「Ｋ」は、ＧまたはＴ、「Ｈ」は、ＡまたはＣまたはＴ、「Ｉ」はイノシン、および「Ｎ」は何らかのヌクレオチドを表す。
【００２１】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、「アミノ酸配列」および「タンパク質」は、本明細書では相互交換可能に使用されて、アミノ酸残基のポリマーを称する。該用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然のアミノ酸の人工的な化学的類似体であるアミノ酸ポリマーに、および天然のアミノ酸ポリマーに適用される。「ポリペプチド」、「ペプチド」、「アミノ酸配列」および「タンパク質」という用語は、グルタミン酸残基のグリコシル化、脂質付着、硫酸化、ガンマ−カルボキシル化と、ヒドロキシル化と、ＡＤＰ−リボシル化とを含むがこれらに限定されない修飾も含む。
【００２２】
本明細書で使用する場合、「発現コンストラクト」は、組換えベクターなど、植物における関心対象のヌクレオチド配列の発現に適したベクターを称する。「発現」は、機能的生成物の生成を称する。例えば、ヌクレオチド配列の発現は、ヌクレオチド配列の転写（ｍＲＮＡまたは機能的ＲＮＡを生成するよう転写するなど）および／またはＲＮＡからタンパク質前駆体もしくは成熟タンパク質への翻訳を称することができる。
【００２３】
本発明の「発現コンストラクト」は、線状核酸フラグメント、環状プラスミド、ウイルスベクター、またはいくつかの実施形態においては、翻訳されることができるＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）であることができる。
【００２４】
本発明の「発現コンストラクト」は、異なる源に由来する関心対象の調節配列およびヌクレオチド配列、または同じ源に由来するが、自然界で通常認められるのとは異なる様式で配置された関心対象の調節配列およびヌクレオチド配列を含むことができる。
【００２５】
「調節配列」または「調節因子」は、相互交換可能に使用されており、コード配列内の上流（５’非コード配列）、またはコード配列の下流（３’非コード配列）に位置し、かつ転写、ＲＮＡのプロセシングもしくは安定性、または関係するコード配列の翻訳に影響するヌクレオチド配列を称する。植物発現調節因子は、植物における転写、ＲＮＡのプロセシングもしくは安定性、または関心対象のヌクレオチド配列の翻訳を制御することができるヌクレオチド配列を称する。
【００２６】
調節配列には、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列が含まれることができるが、これらに限定されない。
【００２７】
「プロモーター」は、別の核酸フラグメントの転写を制御することができる核酸フラグメントを称する。本発明のいくつかの実施形態において、該プロモーターは、その起源が植物細胞由来であろうとなかろうと、植物細胞における遺伝子転写を制御することができるプロモーターである。プロモーターは、構成プロモーターまたは組織特異的プロモーターまたは発生上調節されるプロモーターまたは誘導性プロモーターであることができる。
【００２８】
「構成プロモーター」は、たいていの状況におけるたいていの細胞型における遺伝子発現を概して生じるプロモーターを称する。「組織特異的プロモーター」および「組織に好ましいプロモーター」は、相互交換可能に使用され、１つの組織内または器官内で主としてだが必ずしも排他的ではなく発現するが、１つの特異的な細胞内または細胞型内で発現することもできるプロモーターを称する。「発生上調節されるプロモーター」は、発生事象によって活性が決定されるプロモーターを称する。「誘導性プロモーター」は、内在性または外来性の刺激（環境、ホルモン、または化学シグナルなど）に応じて、該プロモーターへ操作可能に連結されたＤＮＡ配列を選択的に発現する。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「操作可能に連結された」という用語は、調節因子（例えば、プロモーター配列、転写終結配列などだがこれらに限定されない）が核酸配列（コード配列またはオープンリーディングフレーム）と会合し、それによりヌクレオチド配列の転写が転写調節因子によって制御および調節されることを意味する。調節因子領域を核酸分子へ操作可能に連結するための技術は、当技術分野において公知である。
【００３０】
植物内への核酸分子（プラスミド、線状核酸フラグメント、ＲＮＡなど）またはタンパク質の「導入」は、植物細胞を核酸またはタンパク質で形質転換し、それにより核酸またはタンパク質が植物細胞において機能することができることを意味する。本明細書で使用される場合の「形質転換」には、安定した形質転換および一過性の形質転換が含まれる。
【００３１】
「安定した形質転換」は、外来性のヌクレオチド配列を植物ゲノム内へと導入して、結果的に遺伝上安定した遺伝を生じることを称する。いったん安定して形質転換されると、外来性核酸配列は、植物およびその何らかの連続した世代のゲノム内へと安定して組み込まれる。
【００３２】
「一過性の形質転換」は、植物細胞内へ核酸分子またはタンパク質を導入して、安定した遺伝なしでその機能を実行することを称する。一過性の形質転換において、外来性核酸配列は、植物ゲノム内へ組み込まれることはない。
【００３３】
ＩＩ．除草剤耐性植物を作出するための塩基編集システム
本発明は、次の（ｉ）〜（ｖ）、すなわち
ｉ）塩基編集融合タンパク質、およびガイドＲＮＡ、
ｉｉ）塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、ガイドＲＮＡとを含む発現コンストラクト、
ｉｉｉ）塩基編集融合タンパク質、およびガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、
ｉｖ）塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、およびガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、
ｖ）塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列とガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列とを含む発現コンストラクト
のうちの少なくとも１つを含む、植物のゲノム内の除草剤耐性関連遺伝子の塩基編集のためのシステムを提供し、ここで、該塩基編集融合タンパク質は、ヌクレアーゼ不活性型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼドメイン（ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインなど）およびデアミナーゼドメインを含有し、該ガイドＲＮＡは、植物ゲノム内の除草剤耐性関連遺伝子における標的配列へ該塩基編集融合タンパク質を向かわせることができる。
【００３４】
除草剤耐性関連遺伝子は、除草剤によって抑制されることができる、植物における重要な生理学的活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。このような除草剤耐性関連遺伝子における突然変異は、除草剤の抑制を逆転させることができ、その生理学的活性を保有することができる。あるいは、除草剤耐性関連遺伝子は、除草剤を分解することができるタンパク質をコードすることができる。このような除草剤と関係する遺伝子の発現を上昇させること、またはその分解活性を増強させることは、除草剤に対する耐性の上昇を結果的に生じることができる。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態において、除草剤耐性関連遺伝子には、ＰｓｂＡ遺伝子（アトラジンなどに対して耐性）、ＡＬＳ（アセトラクタートシンターゼ）遺伝子（スルホニル尿素、イミダゾリジノンなどに対して耐性）、ＥＰＳＰＳ（５−エノールピルビン酸オキサラート−３−リン酸シンターゼ）遺伝子（グリホサートに対して耐性）、ＡＣＣアーゼ（アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ）遺伝子（セトキシジムなどに対して耐性）、ＰＰＯ（プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ）遺伝子（カルフェントラゾン−エチルなどに対して耐性）およびＨＰＰＤ（ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ）遺伝子（メソトリオンなどに対して耐性）、ＰＤＳ（フィトエンデヒドロゲナーゼ）（ジフルフェニカンなどに対して耐性）、ＧＳ（グルタミンシンテターゼ）（グルホシナートなどの除草剤の標的）、ＤＯＸＰＳ（クロマゾンなどの除草剤の標的）、Ｐ４５０（除草剤の分解に関与）が含まれるが、これらに限定されない。
【００３６】
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、配列番号１９〜配列番号７８のうちの１つ以上を標的とする。
【００３７】
本発明において使用されることができるヌクレアーゼ不活性型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに特に限定することはないが、ただし、ｇＲＮＡの誘導下での特定のＤＮＡを標的とする性能を保有することを条件とし、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１およびこれらに類するものに由来するヌクレアーゼ不活性型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを使用することができる。ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ヌクレアーゼが好ましい。
【００３８】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＤＮＡ開裂ドメインは、２つのサブドメイン、すなわちＨＮＨヌクレアーゼサブドメインおよびＲｕｖＣサブドメインを含有することが公知である。ＨＮＨサブドメインは、ｇＲＮＡに相補的である鎖を開裂するのに対し、ＲｕｖＣサブドメインは、非相補鎖を開裂する。これらのサブドメインにおける突然変異は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを不活性化させて、「ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９」を形成することができる。ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９は、ｇＲＮＡによって命令されるＤＮＡ結合性能を保有する。したがって、原則として、追加のタンパク質と融合したとき、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９は、該追加のタンパク質をほぼいかなるＤＮＡ配列に対しても、適切なガイドＲＮＡとの共発現を通じて単純に標的とすることができる。
【００３９】
シチジンデアミナーゼは、ＤＮＡにおけるシチジン（Ｃ）の脱アミノを触媒して、ウラシル（Ｕ）を形成することができる。ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９がシチジンデアミナーゼと融合する場合、この融合タンパク質は、ガイドＲＮＡの命令を通じて植物のゲノムにおける標的配列を標的とすることができる。ＤＮＡ二本鎖は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性の喪失によって開裂されることがないのに対し、融合タンパク質におけるデアミナーゼドメインは、Ｃａｓ９−ガイドＲＮＡ−ＤＮＡ複合体の形成の間に生じる一本鎖ＤＮＡのシチジンからＵへと転換することができ、次いで、ＣからＴへの置換は塩基ミスマッチ修復によって達成されることがある。
【００４０】
それゆえ、本発明のいくつかの実施形態において、このデアミナーゼとは、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーデアミナーゼなどのシチジンデアミナーゼである。特に、本明細書で説明するデアミナーゼとは、一本鎖ＤＮＡを基質として受け入れることができるデアミナーゼである。
【００４１】
本発明において使用することができるシチジンデアミナーゼの例としては、ＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼ、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ），ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、またはＣＤＡ１が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
本発明のいくつかの具体的な実施形態において、シチジンデアミナーゼは、配列番号１０または配列番号１１の位置９〜位置２３５において示されるアミノ酸配列を含む。
【００４３】
本発明のヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９は、異なる種のＣａｓ９に由来することができ、例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９、アミノ酸配列は配列番号５に示されている）に由来することができる。ＳｐＣａｓ９のＨＮＨヌクレアーゼサブドメインおよびＲｕｖＣサブドメインの両方における突然変異（例えば、Ｄ１０Ａ突然変異およびＨ８４０Ａ突然変異を含む）は、ヌクレアーゼ死滅Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）において結果的に生じるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９ヌクレアーゼを不活性化する。突然変異によるサブドメインのうちの１つの不活性化によって、Ｃａｓ９がニッカーゼ活性を獲得することができ、すなわち、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）、例えば、Ｄ１０Ａ突然変異のみを有するｎＣａｓ９を結果的に生じる。
【００４４】
それゆえ、本発明のいくつかの実施形態において、本発明のヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９は、野生型Ｃａｓ９と比較して、アミノ酸置換Ｄ１０Ａおよび／またはＨ８４０Ａを含む。
【００４５】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、本発明のヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９は、ニッカーゼ活性を有する。いかなる理論によっても縛られることなく、真核生物のミスマッチ修復は、ＤＮＡ鎖におけるミスマッチした塩基の除去および修復のために、該ＤＮＡ鎖上のニックを使用する。シチジンデアミナーゼによって形成されるＵ：Ｇミスマッチは、Ｃ：Ｇへと修復されることができる。編集されていないＧを含有する鎖の上のニックの導入を通じて、Ｕ；Ｇミスマッチを所望のＵ：ＡまたはＴ：Ａに優先的に修復することは可能であることになる。それゆえ、好ましくは、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９のＨＮＨサブドメインの開裂活性を保有するのに対し、ＲｕｖＣサブドメインの開裂活性が不活性化されるＣａｓ９ニッカーゼである。例えば、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９は、野生型Ｃａｓ９と比較してアミノ酸置換Ｄ１０Ａを含有する。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態において、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９は、配列番号６のアミノ酸配列を含む。いくつかの好ましい実施形態において、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９は、配列番号７のアミノ酸配列を含む。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態において、デアミナーゼドメインは、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインのＮ末端へ融合する。いくつかの実施形態において、デアミナーゼドメインは、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインのＣ末端へ融合する。
本発明のいくつかの実施形態において、デアミナーゼドメインおよびヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９ドメインは、リンカーを通じて融合する。リンカーは、長さ１〜５０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２０〜２５、２５〜５０）またはそれより多数のアミノ酸である二次以上の構造を有さない非機能的アミノ酸配列であることができる。例えば、リンカーは、ＧＧＧＧＳ、ＧＳ、ＧＡＰ、（ＧＧＧＧＳ）×３、ＧＧＳ、（ＧＧＳ）×７、およびこれらに類するものなどの可撓性リンカーであってもよい。いくつかの好ましい実施形態において、リンカーは、配列番号８において示されるＸＴＥＮリンカーである。
【００４８】
細胞内で、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼは、ＤＮＡからのＵの除去を触媒し、塩基切除修復（ＢＥＲ）を開始し、このことは結果的にＵ：ＧからＣ：Ｇへの修復を生じる。それゆえ、いかなる理論的な制限もなく、本発明の塩基編集融合タンパク質または本発明のシステムにおいてウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤を含むことは、塩基編集の効率性を高めることができることになる。
【００４９】
したがって、本発明のいくつかの実施形態において、塩基編集融合タンパク質は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）をさらに含む。いくつかの実施形態において、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤は、配列番号９において明らかにされるアミノ酸配列を含む。
【００５０】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明の塩基編集融合タンパク質は、核局在配列（ＮＬＳ）をさらに含む。概して、塩基編集融合タンパク質における１つ以上のＮＬＳは、塩基編集機能に十分な量で、植物細胞の核内での塩基編集融合タンパク質の蓄積を駆動するのに十分な強度を有するべきである。概して、核局在活性の強度は、ＮＬＳの数および位置、ならびに塩基編集融合タンパク質において使用される１つ以上の具体的なＮＬＳ、またはこれらの組み合わせによって決定される。
【００５１】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明の塩基編集融合タンパク質のＮＬＳは、Ｎ末端および／またはＣ末端に局在することができる。いくつかの実施形態において、塩基編集融合タンパク質は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多数のＮＬＳを含む。いくつかの実施形態において、塩基編集融合タンパク質は、Ｎ末端にまたはＮ末端の近くに約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多数のＮＬＳを含む。いくつかの実施形態において、塩基編集融合タンパク質は、Ｃ末端にまたはＣ末端の近くに約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多数のＮＬＳを含む。いくつかの実施形態において、塩基編集融合タンパク質は、Ｎ末端における１つ以上のＮＬＳおよびＣ末端における１つ以上のＮＬＳなど、これらの組み合わせを含む。１つよりも多くのＮＬＳがある場合、各ＮＬＳは、他のＮＬＳとは独立しているものとして選択されることができる。本発明のいくつかの好ましい実施形態において、塩基編集融合タンパク質は、２つのＮＬＳを含み、例えば、２つのＮＬＳは、それぞれＮ末端およびＣ末端に位置する。
【００５２】
概して、ＮＬＳは、タンパク質の表面上に曝露された正に帯電したリジンまたはアルギニンの１つ以上の短い配列からなるが、他の種類のＮＬＳも当技術分野で公知である。ＮＬＳの非限定例としては、ＫＫＲＫＶ（ヌクレオチド配列５’−ＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＧＴＣ−３’）、ＰＫＫＫＲＫＶ（ヌクレオチド配列５’−ＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧ−３’またはＣＣＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＧＴＴ）、またはＳＧＧＳＰＫＫＫＲＫＶ（ヌクレオチド配列５’−ＴＣＧＧＧＧＧＧＧＡＧＣＣＣＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＧＴＧ−３’）が挙げられる。
【００５３】
本発明のいくつかの実施形態において、塩基編集融合タンパク質のＮ末端は、ＰＫＫＫＲＫＶによって示されるアミノ酸配列を有するＮＬＳを含む。本発明のいくつかの実施形態において、塩基編集融合タンパク質のＣ末端は、ＳＧＧＳＰＫＫＫＲＫＶによって示されるアミノ酸配列を有するＮＬＳを含む。
【００５４】
加えて、本発明の塩基編集融合タンパク質には、編集されることになっているＤＮＡの位置に応じて、細胞質局在配列、葉緑体局在配列、ミトコンドリア局在配列、およびこれらに類するものなど、他の局在配列も含むことができる。
【００５５】
本発明のいくつかの実施形態において、塩基編集融合タンパク質は、配列番号１０または配列番号１１において明らかにされるアミノ酸配列を含む。
【００５６】
植物内に効率的な発現を取得するために、本発明のいくつかの実施形態において、塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、塩基編集されることになっている植物についてコドンが最適化されている。
【００５７】
コドンの最適化は、天然のアミノ酸配列を維持しながら、天然の配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、もしくは約１超、２超、３超、４超、５超、１０超、１５超、２０超、２５超、５０超、またはそれより多数のコドン）を該宿主細胞の遺伝子においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンと置き換えることによる、関心対象の宿主細胞内での発現増強のために核酸配列を修飾する方法を称する。種々の種は、特定のアミノ酸のある特定のコドンについて特定のバイアスを呈する。コドンバイアス（生体間でのコドンの使用における差）はしばしば、伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と相関しており、このことは順に、とりわけ、翻訳されるコドンの特性および特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の有用性によると考えられている。細胞内での選択されたｔＲＮＡの優先性とは概して、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンの反映である。したがって、遺伝子は、コドンの最適化に基づく所与の生体内での最適な遺伝子発現について適合することができる。コドンの使用の表は、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／において入手可能な「Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ」において容易に入手可能であり、これらの表は、多くの方法において応用することができる。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．“Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｔａｂｕｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ：  ｓｔａｔｕｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｙｅａｒ  ２０００”  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照されたい。
【００５８】
本発明のいくつかの実施形態において、塩基編集融合タンパク質をコードするコドンの最適化されたヌクレオチド配列は、配列番号１２または配列番号１３に記載されている。
【００５９】
本発明のいくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。所与の標的配列による適切なｓｇＲＮＡを構築する方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｗａｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｈｏｍｏｅｏａｌｌｅｌｅｓ  ｉｎ  ｈｅｘａｐｌｏｉｄ  ｂｒｅａｄ  ｗｈｅａｔ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｈｅｒｉｔａｂｌｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｐｏｗｄｅｒｙ  ｍｉｌｄｅｗ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２，９４７−９５１（２０１４）、Ｓｈａｎ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｒｏｐ  ｐｌａｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１，６８６−６８８（２０１３）、Ｌｉａｎｇ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｚｅａ  ｍａｙｓ  ｕｓｉｎｇ  ＴＡＬＥＮｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｊ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．４１，６３−６８（２０１４）を参照されたい。
【００６０】
本発明のいくつかの実施形態において、塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列および／またはガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、プロモーターなど植物発現調節因子へ操作可能に連結される。
【００６１】
本発明において使用されることができるプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：  ８１０−８１２）、トウモロコシＵｂｉ−１プロモーター、コムギＵ６プロモーター、コメＵ３プロモーター、トウモロコシＵ３プロモーター、コメアクチンプロモーター、ＴｒｐＰｒｏ５プロモーター（２００５年３月１６日出願の米国特許出願公開第１０／３７７，３１８号明細書）、ｐＥＭＵプロモーター（Ｌａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１：５８１−５８８）、ＭＡＳプロモーター（Ｖｅｌｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：２７２３−２７３０）、トウモロコシＨ３ヒストンプロモーター（Ｌｅｐｅｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３１：２７６−２８５およびＡｔａｎａｓｓｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２（３）：２９１−３００）、およびＢｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ  ＡＬＳ３（ＰＣＴ出願国際公開第９７／４１２２８号）プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。本発明において使用されることのできるプロモーターには、Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．４５（４）：６５１−６８３において総説されているような共通して使用される組織特異的プロモーターも含まれる。
【００６２】
ＩＩＩ．塩基編集によって除草剤耐性植物を作出するための方法
別の態様において、本発明は、除草剤耐性植物へ、該植物のゲノム内で除草剤耐性関連遺伝子を塩基編集するための本発明のシステムを導入し、それによりガイドＲＮＡが該植物内で除草剤耐性関連遺伝子の標的配列への塩基編集融合タンパク質を標的とし、結果的に、標的配列において１つ以上のヌクレオチド置換を生じることを含む、該植物を作出するための方法を提供する。
【００６３】
いくつかの実施形態において、該方法は、除草剤耐性について植物をスクリーニングする工程をさらに含む。
【００６４】
いくつかの実施形態において、除草剤耐性関連遺伝子は、除草剤耐性関連タンパク質をコードする。本発明のいくつかの実施形態において、除草剤耐性関連タンパク質には、ＰｓｂＡ（アトラジンなどに対して耐性）、ＡＬＳ（スルホニル尿素、イミダゾリジノンなどに対して耐性）、ＥＰＳＰＳ（グリホサートに対して耐性）、ＡＣＣアーゼ（セトキシジムなどに対して耐性）、ＰＰＯ（カルフェントラゾン−エチルなどに対して耐性）およびＨＰＰＤ（メソトリオンなどに対して耐性）、ＰＤＳ（ジフルフェニカンなどに対して耐性）、ＧＳ（グルホシナートなどの除草剤の標的）、ＤＯＸＰＳ（クロマゾンなどの除草剤の標的）、Ｐ４５０（除草剤の分解に関与）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６５】
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド置換とは、ＣからＴへの置換である。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド置換とは、ＣからＡへの置換またはＣからＧへの置換である。いくつかの実施形態において、発現調節領域など、除草剤耐性遺伝子における非コード領域内に位置するヌクレオチド置換である。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド置換は、遺伝子によってコードされる除草剤耐性タンパク質におけるアミノ酸置換を結果的に生じる。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド置換および／またはアミノ酸置換は、除草剤耐性を植物に付与する。
【００６６】
本発明のいくつかの実施形態において、除草剤耐性を植物に付与するヌクレオチド置換および／またはアミノ酸置換は、除草剤耐性関連遺伝子において除草剤耐性を植物に付与する何らかの公知の置換であってもよい。本発明の方法によって、除草剤耐性を付与することのできる単一の突然変異、二重突然変異または多重突然変異は、導入遺伝子の必要性なく、生体内原位置で植物において創出されることができる。突然変異は、当技術分野で公知であってもよく、または本発明の方法によって新たに特定されていてもよい。
【００６７】
本発明は、本発明の塩基編集方法によって植物においてＡＬＳ遺伝子を修飾し、その結果として、除草剤耐性を植物に付与するＡＬＳにおける１つ以上のアミノ酸の突然変異を生じることを含む、除草剤耐性植物を作出するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、アミノ酸の突然変異は、Ａ１２２Ｔ、Ｐ１９７Ｓ、Ｐ１９７Ｌ、Ｐ１９７Ｆ、Ｒ１９８Ｃ、Ｄ２０４Ｎ、Ａ２０５Ｔ、Ｄ２０４Ｎ＋Ａ２０５Ｔ、Ｇ６５４Ｋ、Ｇ６５５Ｄ、Ｇ６５５Ｓ、Ｇ６５５Ｎ、Ｇ６５４Ｋ＋Ｇ６５５Ｄ、Ｇ６５４Ｋ＋Ｇ６５５Ｓ、Ｇ６５４Ｋ＋Ｇ６５５Ｎ、Ｇ６５９Ｎ、Ｐ１９７Ｓ、Ｐ１９７Ｌ、Ｐ１９７Ｆ、Ｄ２０４Ｎ、Ａ２０５Ｔ、Ｄ２０４Ｎ＋Ａ２０５Ｔ、Ｇ６５４Ｄ、Ｇ６５４Ｓ、Ｇ６５４Ｎ、Ｇ６５５Ｄ、Ｇ６５５Ｓ、Ｇ６５５Ｎ、Ｇ６５４Ｄ＋Ｇ６５５Ｄ、Ｇ６５４Ｄ＋Ｇ６５５Ｓ、Ｇ６５４Ｄ＋Ｇ６５５Ｎ、Ｇ６５４Ｓ＋Ｇ６５５Ｄ、Ｇ６５４Ｓ＋Ｇ６５５Ｓ、Ｇ６５４Ｓ＋Ｇ６５５Ｎ、Ｇ６５４Ｎ＋Ｇ６５５Ｄ、Ｇ６５４Ｎ＋Ｇ６５５Ｓ、Ｇ６５４Ｎ＋Ｇ６５５Ｎ、Ａ１２２Ｔ、またはこれらの何らかの組み合わせから選択され、ここで、アミノ酸の位置は、配列番号２（シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿１９０４２５）におけるＡＬＳのアミノ酸配列）を参照する。いくつかの具体的な実施形態において、アミノ酸の突然変異は、Ｐ１９７Ａ、Ｐ１９７Ｆ、Ｐ１９７Ｓ、Ｐ１９７Ｙ、Ｐ１９７Ｆ＋Ｒ１９８Ｃ、Ｇ６５４Ｅ＋Ｇ６５５Ｓ、Ｇ６５４Ｋ＋Ｇ６５５Ｓ、Ｇ６５４Ｅ＋Ｇ６５９Ｎ、Ｐ１９７Ｆ＋Ｇ６５４Ｅ＋Ｇ６５５Ｓ、またはこれらの何らかの組み合わせから選択され、ここで、アミノ酸の位置は、配列番号２（シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿１９０４２５）におけるＡＬＳのアミノ酸配列）を参照する。
【００６８】
したがって、いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、Ａ１２２、Ｐ１９７、Ｒ１９８、Ｄ２０４、Ａ２０５、Ｇ６５４、Ｇ６５５、Ｇ６５９、またはこれらの何らかの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸（複数可）をコードする配列を含む標的配列を標的とし、ここで、アミノ酸の位置は、配列番号２（シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿１９０４２５）におけるＡＬＳのアミノ酸配列）を参照する。
【００６９】
いくつかの実施形態において、ＡＬＳとは、コメＡＬＳであり、かつその野生型配列は、配列番号１６に示されている。いくつかの実施形態において、ＡＬＳとは、コムギＡＬＳであり、かつその野生型配列は、配列番号１７に示されている（部分的配列）（ｇｅｎｂａｎｋ  ＩＤ：ＡＡＯ５３５４８．１）。
【００７０】
本発明は、本発明の塩基編集方法によって植物においてＰｓｂＡ遺伝子を修飾し、その結果として除草剤耐性を植物に付与するＰｓｂＡにおける１つ以上のアミノ酸の突然変異を生じることを含む、除草剤耐性植物を作出するための方法を提供する。
【００７１】
本発明は、本発明の塩基編集方法によって植物においてＥＰＳＰＳ遺伝子を修飾し、その結果として除草剤耐性を植物に付与するＥＰＳＰＳにおける１つ以上のアミノ酸の突然変異を生じることを含む、除草剤耐性植物を作出するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、アミノ酸の突然変異は、Ｔ１０２Ｉ、Ａ１０３Ｖ、Ｔ１０２Ｉ＋Ａ１０３Ｖからなる群から選択され、ここで、アミノ酸の位置は、配列番号４を参照する（コムギＡゲノムＥＰＳＰＳアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＬＫ２７１６３））。
【００７２】
それゆえ、いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、Ｔ１０２および／またはＡ１０３からなる群から選択されるアミノ酸（複数可）をコードする配列を含む標的配列を標的とし、ここで、アミノ酸の位置は、配列番号４を参照する。
【００７３】
本発明は、本発明の塩基編集方法によって植物においてＡＣＣアーゼ遺伝子を修飾し、その結果として除草剤耐性を植物に付与するＡＣＣアーゼにおける１つ以上のアミノ酸の突然変異を生じることを含む、除草剤耐性植物を作出するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、アミノ酸の突然変異は、Ｓ１７６８Ｆ、Ｒ１７９３Ｋ、Ａ１７９４Ｔ、Ｒ１７９３Ｋ＋Ａ１７９４Ｔ、Ｒ１８２５Ｈ、Ｄ１８２７Ｎ、Ｒ１８２５Ｈ＋Ｄ１８２７Ｎ、Ｌ１８１５Ｆ、Ａ１８１６Ｖ、Ｒ１８１７終止、Ｌ１８１５Ｆ＋Ｒ１８１７終止、Ａ１８１６Ｖ＋Ｒ１８１７終止、Ｌ１８１５Ｆ＋Ａ１８１６Ｖ、Ｌ１８１５Ｆ、Ａ１８１６Ｖ、＋Ｒ１８１７終止、Ａ１８３７Ｖ、Ｇ１８５４Ｄ、Ｇ１８５５Ｄ、Ｇ１８５５Ｓ、Ｇ１８５４Ｎ、Ｇ１８５４Ｄ＋Ｇ１８５５Ｄ、Ｇ１８５４Ｄ＋Ｇ１８５５Ｓ、Ｇ１８５４Ｄ＋Ｇ１８５５Ｎ、Ｄ１９７１Ｎ、Ｄ１９７２Ｎ、Ｄ１９７１Ｎ＋Ｄ１９７２Ｎ、Ｇ１９８３Ｄ、Ｐ１９９３Ｓ、Ｐ１９９３Ｌ、Ｐ１９９３Ｆ、Ｒ１９９４Ｃ、Ｐ１９９３Ｓ＋Ｒ１９９４Ｃ、Ｐ１９９３Ｌ＋Ｒ１９９４Ｃ、Ｐ１９９３Ｆ＋Ｒ１９９４Ｃ、Ｓ２００３Ｆ、Ａ２００４Ｖ、Ｔ２００５Ｉ、Ｓ２００３Ｆ＋Ａ２００４Ｖ、Ｓ２００３Ｆ＋Ｔ２００５Ｉ、Ａ２００４Ｖ＋Ｔ２００５Ｉ、Ｔ２００７Ｉ、Ａ２００８Ｖ、Ｔ２００７Ｉ＋Ａ２００８Ｖ、Ｒ２０２８Ｋ、Ｗ２０２７Ｃ、Ｇ２０２９Ｄ、Ｇ２０２９Ｓ、Ｇ２０２９Ｎ、Ｒ２０２８Ｋ＋Ｇ２０２９Ｄ、Ｒ２０２８Ｋ＋Ｇ２０２９Ｓ、Ｒ２０２８Ｋ＋Ｇ２０２９Ｎ、Ｔ２０４７Ｉ、Ｒ２０７０Ｑ、Ｇ２０７１Ｒ、Ｒ２０７０Ｑ＋Ｇ２０７１Ｒ、Ａ２０９０Ｔ、Ｅ２０９１Ｋ、Ａ２０９０Ｔ＋Ｅ２０９１Ｋ、Ａ２０９０Ｖ、Ｅ２１０６Ｋ、Ｓ２１１９Ｎ、Ｒ２２２０Ｑ、Ｓ２１１９Ｎ＋Ｒ２２２０Ｑ、Ａ１８１３Ｖ、Ｒ１７９３Ｋ、Ａ１７９４Ｔ、Ｒ１７９３Ｋ＋Ａ１７９４Ｔ、Ｅ１７９６Ｋ、Ｅ１７９７Ｋ、Ｅ１７９６Ｋ＋Ｅ１７９７Ｋ、Ｔ１８００Ｍ、Ｌ１８０１Ｆ、Ｔ１８００Ｍ＋Ｌ１８０１Ｆ、Ａ１８１３Ｖ、Ｇ１８５４Ｄ、Ｇ１８５４Ｓ、Ｇ１８５４Ｎ、Ｇ１８５５Ｄ、Ｇ１８５５Ｓ、Ｇ１８５５Ｎ、Ｇ１８５４Ｄ＋Ｇ１８５５Ｄ、Ｇ１８５４Ｄ＋Ｇ１８５５Ｓ、Ｇ１８５４Ｄ＋Ｇ１８５５Ｎ、Ｇ１８５４Ｓ＋Ｇ１８５５Ｄ、Ｇ１８５４Ｓ＋Ｇ１８５５Ｓ、Ｇ１８５４Ｓ＋Ｇ１８５５Ｎ、Ｇ１８５４Ｎ＋Ｇ１８５５Ｄ、Ｇ１８５４Ｎ＋Ｇ１８５５Ｓ、Ｇ１８５４Ｎ＋Ｇ１８５５Ｎ、Ｓ１８４９Ｆ、Ｈ１８５０Ｙ、Ｓ１８４９Ｆ＋Ｈ１８５０Ｙ、Ｄ１８７４Ｎ、Ｄ１８７５Ｎ、Ｄ１８７４Ｎ＋Ｄ１８７５Ｎ、Ｒ２０２８Ｋ、Ｇ２０２９Ｄ、Ｇ２０２９Ｓ、Ｇ２０２９Ｎ、Ｒ２０２８Ｋ＋Ｇ２０２９Ｄ、Ｒ２０２８Ｋ＋Ｇ２０２９Ｓ、Ｒ２０２８Ｋ＋Ｇ２０２９Ｎ、Ｌ２０２４Ｆ、Ｔ２０４７Ｉ、Ｒ２０７０Ｃ、Ａ２０９０Ｖ、Ｇ１９８３Ｄ、Ｅ１９８９Ｋ、Ｒ１９９０Ｑ、Ｅ１９８９Ｋ＋Ｒ１９９０Ｑ、Ｐ１９９３Ｓ、Ｐ１９９３Ｌ、Ｐ１９９３Ｆ、Ｒ１９９４Ｃ、Ｐ１９９３Ｓ＋Ｒ１９９４Ｃ、Ｐ１９９３Ｌ＋Ｒ１９９４Ｃ、Ｐ１９９３Ｆ＋Ｒ１９９４Ｃ、Ｔ２００７Ｉ、Ａ２００８Ｖ、Ｔ２００７Ｉ＋Ａ２００８Ｖ、Ｓ２００３Ｌ、Ａ２００４Ｖ、Ｔ２００５Ｉ、Ｓ２００３Ｌ＋Ａ２００４Ｖ、Ｓ２００３Ｌ＋Ｔ２００５Ｉ、Ａ２００４Ｖ＋Ｔ２００５Ｉ、Ｓ２００３Ｌ、Ａ２００４Ｖ＋Ｔ２００５Ｉ、Ｌ２０９９Ｆ、Ｅ２１０６Ｋ、Ｒ２２２０Ｋ、Ｇ２１１９Ｄ、Ｒ２２２０Ｋ＋Ｇ２１１９Ｄ、またはこれらの何らかの組み合わせから選択され、ここで、アミノ酸の位置は、配列番号１を参照する（ノスズメノテッポウ（Ａｌｏｐｅｃｕｒｕｓ  ｍｙｏｓｕｒｏｉｄｅｓ）ＡＣＣアーゼアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＣ８４１６１．１））。いくつかの実施形態において、アミノ酸の突然変異は、Ｗ２０２７Ｃ、Ｗ２０２７Ｃ＋Ｒ２０２８Ｋから選択され、ここで、アミノ酸の位置は、配列番号１を参照する（ノスズメノテッポウ（Ａｌｏｐｅｃｕｒｕｓ  ｍｙｏｓｕｒｏｉｄｅｓ）ＡＣＣアーゼアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＣ８４１６１．１））。
【００７４】
それゆえ、いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、Ｓ１７６８、Ｒ１７９３、Ａ１７９４、Ｒ１８２５、Ｄ１８２７、Ｌ１８１５、Ａ１８１６、Ｒ１８１７、Ａ１８３７、Ｇ１８５４、Ｇ１８５５、Ｄ１９７１、Ｄ１９７２、Ｇ１９８３、Ｐ１９９３、Ｒ１９９４、Ｓ２００３、Ａ２００４、Ｔ２００５、Ｔ２００７、Ａ２００８、Ｒ２０２８、Ｇ２０２９、Ｔ２０４７、Ｒ２０７０、Ｇ２０７１、Ａ２０９０、Ｅ２０９１、Ｅ２１０６、Ｓ２１１９、Ｒ２２２０、Ａ１８１３、Ｅ１７９６、Ｅ１７９７、Ｔ１８００、Ｌ１８０１、Ｓ１８４９、Ｈ１８５０、Ｄ１８７４、Ｄ１８７５、Ｌ２０２４、Ｅ１９８９、Ｒ１９９０、Ｌ２０９９、またはこれらの何らかの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸（複数可）をコードする配列を含む標的配列を標的とし、ここで、アミノ酸の位置は、配列番号１を参照する。
【００７５】
いくつかの実施形態において、ＡＣＣアーゼとは、コメＡＣＣアーゼであり、かつその野生型配列は、配列番号１４に示されている（ｇｅｎｂａｎｋ  ＩＤ：Ｂ９ＦＫ３６）。いくつかの実施形態において、ＡＣＣアーゼとは、コムギＡＣＣアーゼであり、その野生型配列は、配列番号１５に示されている（ｇｅｎｂａｎｋ  ＩＤ：ＡＣＤ４６６８４．１）。
【００７６】
本発明は、本発明の塩基編集方法によって植物においてＰＰＯ遺伝子を修飾し、その結果として除草剤耐性を植物に付与するＰＰＯにおいて１つ以上のアミノ酸の突然変異を生じることを含む、除草剤耐性植物を作出するための方法を提供する。
【００７７】
本発明は、本発明の塩基編集方法によって植物においてＨＰＰＤ遺伝子を修飾し、その結果として除草剤耐性を植物に付与するＨＰＰＤにおいて１つ以上のアミノ酸の突然変異を生じることを含む、除草剤耐性植物を作出するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、アミノ酸の突然変異は、Ｐ２７７Ｓ、Ｐ２７７Ｌ、Ｖ３６４Ｍ、Ｃ４１３Ｙ、Ｇ４１４Ｄ、Ｇ４１４Ｓ、Ｇ４１４Ｎ、Ｇ４１５Ｅ、Ｇ４１５Ｒ、Ｇ４１５Ｋ、Ｇ４１４Ｄ＋Ｇ４１５Ｅ、Ｇ４１４Ｄ＋Ｇ４１５Ｒ、Ｇ４１４Ｄ＋Ｇ４１５Ｋ、Ｇ４１４Ｓ＋Ｇ４１５Ｅ、Ｇ４１４Ｓ＋Ｇ４１５Ｒ、Ｇ４１４Ｓ＋Ｇ４１５Ｋ、Ｇ４１４Ｎ＋Ｇ４１５Ｅ、Ｇ４１４Ｎ＋Ｇ４１５Ｒ、Ｇ４１４Ｎ＋Ｇ４１５Ｋ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１５Ｅ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１５Ｒ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１５Ｋ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｄ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｓ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｎ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｄ＋Ｇ４１５Ｅ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｄ＋Ｇ４１５Ｒ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｄ＋Ｇ４１５Ｋ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｓ＋Ｇ４１５Ｅ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｓ＋Ｇ４１５Ｒ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｓ＋Ｇ４１５Ｋ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｎ＋Ｇ４１５Ｅ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｎ＋Ｇ４１５Ｒ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｎ＋Ｇ４１５Ｋ、Ｐ２７７Ｓ、Ｐ２７７Ｌ、Ｖ３６６Ｉ、Ｃ４１３Ｙ、Ｇ４１４Ｄ、Ｇ４１４Ｓ、Ｇ４１４Ｎ、Ｇ４１５Ｅ、Ｇ４１５Ｒ、Ｇ４１５Ｋ、Ｇ４１４Ｄ＋Ｇ４１５Ｅ、Ｇ４１４Ｄ＋Ｇ４１５Ｒ、Ｇ４１４Ｄ＋Ｇ４１５Ｋ、Ｇ４１４Ｓ＋Ｇ４１５Ｅ、Ｇ４１４Ｓ＋Ｇ４１５Ｒ、Ｇ４１４Ｓ＋Ｇ４１５Ｋ、Ｇ４１４Ｎ＋Ｇ４１５Ｅ、Ｇ４１４Ｎ＋Ｇ４１５Ｒ、Ｇ４１４Ｎ＋Ｇ４１５Ｋ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１５Ｅ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１５Ｒ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１５Ｋ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｄ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｓ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｎ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｄ＋Ｇ４１５Ｅ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｄ＋Ｇ４１５Ｒ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｄ＋Ｇ４１５Ｋ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｓ＋Ｇ４１５Ｅ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｓ＋Ｇ４１５Ｒ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｓ＋Ｇ４１５Ｋ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｎ＋Ｇ４１５Ｅ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｎ＋Ｇ４１５Ｒ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｎ＋Ｇ４１５Ｋ、またはこれらの何らかの組み合わせから選択され、ここで、アミノ酸の位置は、配列番号３を参照する（コメＨＰＰＤアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＸＰ＿０１５６２６１６３））。
【００７８】
したがって、いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、Ｐ２７７、Ｖ３６４、Ｃ４１３、Ｇ４１４、Ｇ４１５、Ｖ３６６、またはこれらの何らかの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸（複数可）をコードする配列を含む標的配列を標的とし、ここで、アミノ酸の位置は、配列番号３を参照する。
【００７９】
Ｃａｓ９とガイドＲＮＡとの複合体によって認識されかつ標的とされ得る標的配列の設計は、当業者の工業的な技能のうちである。概して、標的配列とは、ガイドＲＮＡにおいて含まれる約２０個のヌクレオチドのリーダー配列に相補的である配列であり、その３’末端は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）であるＮＧＧのすぐ隣にある。
【００８０】
例えば、本発明のいくつかの実施形態において、標的配列は、構造５’−ＮＸ−ＮＧＧ−３’を有し、式中、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴから独立して選択され、Ｘは、１４≦Ｘ≦３０の整数であり、ＮＸは、Ｘ個の連続したヌクレオチドを表し、かつＮＧＧは、ＰＡＭ配列である。本発明のいくつかの具体的な実施形態において、Ｘは２０である。
【００８１】
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、配列番号１９〜配列番号７８のうちの１つ以上を標的とする。
【００８２】
本発明の塩基編集システムは、植物における広範な脱アミノウィンドウ、例えば、長さ７ヌクレオチドの脱アミノウィンドウを有する。本発明の方法のいくつかの実施形態において、標的配列の位置３〜位置９内の１個以上のＣ塩基は、Ｔと置換される。例えば、存在する場合、標的配列における位置３〜位置９内のいずれか１個、２個、３個、４個、５個、６個、または７個のＣは、Ｔと置き換えられることができる。例えば、標的配列の位置３〜位置９内に４個のＣがある場合、いずれか１個、２個、３個、４個のＣがＴによって置き換えられることができる。Ｃ塩基は、連続していてもよく、または他のヌクレオチドによって分離されていてもよい。それゆえ、標的配列において複数のＣがある場合、種々の突然変異の組み合わせは、本発明の方法によって取得されることができる。
【００８３】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、所望のヌクレオチド置換を有する植物をスクリーニングすることをさらに含む。植物におけるヌクレオチド置換は、Ｔ７ＥＩ、ＰＣＲ／ＲＥまたは配列決定方法によって検出されることができ、例えば、Ｓｈａｎ，Ｑ．，Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｌｉ，Ｊ．＆  Ｇａｏ，Ｃ．Ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｒｉｃｅ  ａｎｄ  ｗｈｅａｔ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．９，２３９５−２４１０（２０１４）を参照されたい。
【００８４】
本発明の方法において、塩基編集システムは、当業者に周知の種々の方法によって植物内へと導入されることができる。本発明の塩基編集システムを植物内へと導入するために使用されることのできる方法には、粒子衝撃、ＰＥＧ仲介性プロトプラスト形質転換、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性形質転換、植物ウイルス媒介性形質転換、花粉管アプローチ、および子房注入アプローチが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、塩基編集システムは、一過性形質転換によって植物内へと導入される。
【００８５】
本発明の方法において、標的配列の修飾は、単に植物細胞内で塩基編集融合タンパク質およびガイドＲＮＡを導入または生成することによって達成されることができ、修飾は、塩基編集システムを用いた植物の安定した形質転換の必要性なく安定して遺伝することができる。このことは、安定した塩基編集システムの潜在的なオフターゲット効果を回避し、かつ植物ゲノム内への外来性ヌクレオチド配列の組込みも回避し、それにより結果的により高い生物安全性を生じる。
【００８６】
いくつかの好ましい実施形態において、この導入は、選択的圧力の非存在下で実施され、それにより、植物ゲノム内での外来性ヌクレオチド配列の組込みを回避する。
【００８７】
いくつかの実施形態において、この導入は、本発明の塩基編集システムを、単離された植物細胞または単離された組織内へと形質転換すること、次いで形質転換された植物細胞または組織を未処置の植物へと再生することを含む。好ましくは、この再生は、選択的圧力の非存在下で実施され、すなわち、発現ベクター上に担持される選択的遺伝子に対する選択的薬剤は、組織培養中に何ら使用されない。選択的薬剤の使用なしで、植物の再生効率は、外来性ヌクレオチド配列を含有しない改変された植物を取得するために上昇させることができる。
【００８８】
他の実施形態において、本発明の塩基編集システムは、葉、茎頂、花粉管、若穂（ｙｏｕｎｇ  ｅａｒ）、または胚軸など、未処置の植物の特定部位へと形質転換されることができる。このことは、組織培養によって再生することが困難である植物の形質転換に特に適している。
【００８９】
本発明のいくつかの実施形態において、試験管内で発現するタンパク質および／または試験管内で転写されるＲＮＡ分子は、植物内へと直接形質転換される。該タンパク質および／またはＲＮＡ分子は、植物細胞内での塩基編集を達成することができ、かつ細胞によってその後分解されて、植物ゲノム内への外来性ヌクレオチド配列の組込みを回避することができる。
【００９０】
したがって、いくつかの実施形態において、除草剤耐性植物は、導入遺伝子非含有である。
【００９１】
本発明の方法において使用されることのできる植物には、単子葉類および双子葉類が含まれる。例えば、該植物は、コムギ、コメ、トウモロコシ、ダイズ、ヒマワリ、ソルガム、カノーラ、アルファルファ、ワタ、オオムギ、ミレー、トウキビ、トマト、タバコ、タピオカ、またはジャガイモなどの作物植物であってもよい。該植物はまた、キャベツ、ケール、キュウリ、トマトを含むがそれらに限定されない野菜作物であってもよい。該植物はまた、カーネーション、ペオニア、バラ、およびこれらに類するものを含むがそれらに限定されない花作物であってもよい。該植物はまた、スイカ、メロン、イチゴ、ブルーベリー、ブドウ、リンゴ、カンキツ、モモを含むがこれらに限定されない果実作物であってもよい。該植物はまた、板藍根（Ｒａｄｉｘ  ｉｓａｔｉｄｉｓ）、リコリス、チョウセンニンジン、およびトウスケボウフウ（Ｓａｐｏｓｈｎｉｋｏｖｉａ  ｄｉｖａｒｉｃａｔａ）を含むがこれらに限定されない中国産生薬であってもよい。該植物はまた、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）であることができる。
【００９２】
本発明のいくつかの実施形態において、該方法は、除草剤耐性植物の後代を取得することをさらに含む。
【００９３】
別の態様において、本発明は、除草剤耐性植物またはその後代もしくは部分も提供し、ここで、該植物は、本発明の上述の方法によって取得される。いくつかの実施形態において、除草剤耐性植物は、導入遺伝子非含有である。
【００９４】
別の態様において、本発明は、本発明の上述の方法によって取得された第一の除草剤耐性植物を、除草剤耐性をまったく有さない第二の植物と交雑させることと、それにより除草剤耐性を第二の植物内へ導入することとを含む、植物交雑方法も提供する。
【００９５】
本発明は、本発明の方法によって取得された除草剤耐性植物またはその後代も包含する。
【００９６】
ＩＶ．除草剤耐性関連タンパク質の変異体を特定すること
本発明の方法によって、除草剤耐性関連遺伝子の多数の突然変異体は、除草剤耐性関連遺伝子の標的とされた塩基修飾によって容易に取得されることができ、次いで、新規の除草剤耐性突然変異は、耐性スクリーニングを通じて特定されることができる。
【００９７】
したがって、本発明は、以下、すなわち
ｉ）先の第ＩＩＩ節の方法によって除草剤耐性植物を作出することと、
ｉｉ）結果として生じる除草剤耐性植物における除草剤耐性関連遺伝子および／またはコードされた除草剤耐性関連タンパク質の配列を決定し、それにより変異体の配列を特定すること
とを含む、除草剤耐性を植物へ付与することのできる除草剤耐性関連タンパク質の変異体を特定する方法も提供する。
【００９８】
Ｖ．除草剤耐性関連タンパク質変異体、その核酸、発現コンストラクトおよび使用
本発明は、本発明の先の第ＩＶ節による方法によって特定される除草剤耐性関連タンパク質の変異体も提供する。
【００９９】
本発明は、野生型ＡＣＣアーゼと比較して、植物ＡＣＣアーゼ変異体も提供し、該ＡＣＣアーゼ変異体は、１７６８、１７９３、１７９６、１７９７、１７９４、１８００、１８０１、１８１３、１８１３、１８１５、１８２５、１８２７、１８１５、１８１６、１８１７、１８３７、１８３８、１８４９、１８５０、１８５４、１８５５、１８７４、１８７５、１９７１、１８７２、１９８３、１９８９、１９９０、１９９３、１９９４、２００３、２００４、２００５、２００７、２００８、２０２４、２０２７、２０２８、２０２９、２０４７、２０７０、２０７１、２０９０、２０９１、２０９０、２１０６、２０９９、２１０６、２１１９、２２２０から選択される、１つまたは複数の位置でのアミノ酸の突然変異を含み、ここで、アミノ酸の位置は配列番号１を参照し、該変異体は、除草剤耐性を植物に付与する。いくつかの実施形態において、アミノ酸の突然変異は、Ｓ１７６８Ｆ、Ｒ１７９３Ｋ、Ａ１７９４Ｔ、Ｒ１７９３Ｋ＋Ａ１７９４Ｔ、Ｒ１８２５Ｈ、Ｄ１８２７Ｎ、Ｒ１８２５Ｈ＋Ｄ１８２７Ｎ、Ｌ１８１５Ｆ、Ａ１８１６Ｖ、Ｒ１８１７終止、Ｌ１８１５Ｆ＋Ｒ１８１７終止、Ａ１８１６Ｖ＋Ｒ１８１７終止、Ｌ１８１５Ｆ＋Ａ１８１６Ｖ、Ｌ１８１５Ｆ、Ａ１８１６Ｖ、＋Ｒ１８１７終止、Ａ１８３７Ｖ、Ｇ１８５４Ｄ、Ｇ１８５５Ｄ、Ｇ１８５５Ｓ、Ｇ１８５４Ｎ、Ｇ１８５４Ｄ＋Ｇ１８５５Ｄ、Ｇ１８５４Ｄ＋Ｇ１８５５Ｓ、Ｇ１８５４Ｄ＋Ｇ１８５５Ｎ、Ｄ１９７１Ｎ、Ｄ１９７２Ｎ、Ｄ１９７１Ｎ＋Ｄ１９７２Ｎ、Ｇ１９８３Ｄ、Ｐ１９９３Ｓ、Ｐ１９９３Ｌ、Ｐ１９９３Ｆ、Ｒ１９９４Ｃ、Ｐ１９９３Ｓ＋Ｒ１９９４Ｃ、Ｐ１９９３Ｌ＋Ｒ１９９４Ｃ、Ｐ１９９３Ｆ＋Ｒ１９９４Ｃ、Ｓ２００３Ｆ、Ａ２００４Ｖ、Ｔ２００５Ｉ、Ｓ２００３Ｆ＋Ａ２００４Ｖ、Ｓ２００３Ｆ＋Ｔ２００５Ｉ、Ａ２００４Ｖ＋Ｔ２００５Ｉ、Ｔ２００７Ｉ、Ａ２００８Ｖ、Ｔ２００７Ｉ＋Ａ２００８Ｖ、Ｒ２０２８Ｋ、Ｇ２０２９Ｄ、Ｇ２０２９Ｓ、Ｇ２０２９Ｎ、Ｒ２０２８Ｋ＋Ｇ２０２９Ｄ、Ｒ２０２８Ｋ＋Ｇ２０２９Ｓ、Ｒ２０２８Ｋ＋Ｇ２０２９Ｎ、Ｔ２０４７Ｉ、Ｒ２０７０Ｑ、Ｇ２０７１Ｒ、Ｒ２０７０Ｑ＋Ｇ２０７１Ｒ、Ａ２０９０Ｔ、Ｅ２０９１Ｋ、Ａ２０９０Ｔ＋Ｅ２０９１Ｋ、Ａ２０９０Ｖ、Ｅ２１０６Ｋ、Ｓ２１１９Ｎ、Ｒ２２２０Ｑ、Ｓ２１１９Ｎ＋Ｒ２２２０Ｑ、Ａ１８１３Ｖ、Ｒ１７９３Ｋ、Ａ１７９４Ｔ、Ｒ１７９３Ｋ＋Ａ１７９４Ｔ、Ｅ１７９６Ｋ、Ｅ１７９７Ｋ、Ｅ１７９６Ｋ＋Ｅ１７９７Ｋ、Ｔ１８００Ｍ、Ｌ１８０１Ｆ、Ｔ１８００Ｍ＋Ｌ１８０１Ｆ、Ａ１８１３Ｖ、Ｇ１８５４Ｄ、Ｇ１８５４Ｓ、Ｇ１８５４Ｎ、Ｇ１８５５Ｄ、Ｇ１８５５Ｓ、Ｇ１８５５Ｎ、Ｇ１８５４Ｄ＋Ｇ１８５５Ｄ、Ｇ１８５４Ｄ＋Ｇ１８５５Ｓ、Ｇ１８５４Ｄ＋Ｇ１８５５Ｎ、Ｇ１８５４Ｓ＋Ｇ１８５５Ｄ、Ｇ１８５４Ｓ＋Ｇ１８５５Ｓ、Ｇ１８５４Ｓ＋Ｇ１８５５Ｎ、Ｇ１８５４Ｎ＋Ｇ１８５５Ｄ、Ｇ１８５４Ｎ＋Ｇ１８５５Ｓ、Ｇ１８５４Ｎ＋Ｇ１８５５Ｎ、Ｓ１８４９Ｆ、Ｈ１８５０Ｙ、Ｓ１８４９Ｆ＋Ｈ１８５０Ｙ、Ｄ１８７４Ｎ、Ｄ１８７５Ｎ、Ｄ１８７４Ｎ＋Ｄ１８７５Ｎ、Ｗ２０２７Ｃ、Ｒ２０２８Ｋ、Ｗ２０２７Ｃ＋Ｒ２０２８Ｋ、Ｇ２０２９Ｄ、Ｇ２０２９Ｓ、Ｇ２０２９Ｎ、Ｒ２０２８Ｋ＋Ｇ２０２９Ｄ、Ｒ２０２８Ｋ＋Ｇ２０２９Ｓ、Ｒ２０２８Ｋ＋Ｇ２０２９Ｎ、Ｌ２０２４Ｆ、Ｔ２０４７Ｉ、Ｒ２０７０Ｃ、Ａ２０９０Ｖ、Ｇ１９８３Ｄ、Ｅ１９８９Ｋ、Ｒ１９９０Ｑ、Ｅ１９８９Ｋ＋Ｒ１９９０Ｑ、Ｐ１９９３Ｓ、Ｐ１９９３Ｌ、Ｐ１９９３Ｆ、Ｒ１９９４Ｃ、Ｐ１９９３Ｓ＋Ｒ１９９４Ｃ、Ｐ１９９３Ｌ＋Ｒ１９９４Ｃ、Ｐ１９９３Ｆ＋Ｒ１９９４Ｃ、Ｔ２００７Ｉ、Ａ２００８Ｖ、Ｔ２００７Ｉ＋Ａ２００８Ｖ、Ｓ２００３Ｌ、Ａ２００４Ｖ、Ｔ２００５Ｉ、Ｓ２００３Ｌ＋Ａ２００４Ｖ、Ｓ２００３Ｌ＋Ｔ２００５Ｉ、Ａ２００４Ｖ＋Ｔ２００５Ｉ、Ｓ２００３Ｌ、Ａ２００４Ｖ＋Ｔ２００５Ｉ、Ｌ２０９９Ｆ、Ｅ２１０６Ｋ、Ｒ２２２０Ｋ、Ｇ２１１９Ｄ、Ｒ２２２０Ｋ＋Ｇ２１１９Ｄ、またはこのいずれかの組み合わせから選択され、ここで、アミノ酸の位置は配列番号１を参照する。いくつかの具体的な実施形態において、アミノ酸の突然変異は、Ｗ２０２７Ｃ、Ｗ２０２７Ｃ＋Ｒ２０２８Ｋから選択され、ここで、アミノ酸の位置は配列番号１を参照する。
【０１００】
いくつかの実施形態において、ＡＣＣアーゼとは、コメＡＣＣアーゼであり、その野生型配列は、配列番号１４に示される（ｇｅｎｂａｎｋ  ＩＤ：Ｂ９ＦＫ３６）。いくつかの実施形態において、ＡＣＣアーゼとは、コムギＡＣＣアーゼであり、その野生型配列は、配列番号１５に示される（ｇｅｎｂａｎｋ  ＩＤ：ＡＣＤ４６６８４．１）。
【０１０１】
このような変異体の発現によって、植物（コメ、トウモロコシ、コムギおよび他の単子葉植物）は、シクロへキセノン除草剤（クレトジムなど）、アリールオキシフェノキシプロピオン酸除草剤（ハロキシホップ−Ｐ−メチルなど）、フェニルピラゾリン除草剤（オキサゾリンなど）および他のＡＣＣアーゼ阻害剤除草剤に対する、単一の耐性（１つの除草剤に対する耐性）または交差耐性（２つ以上の除草剤に対して耐性がある）を取得することができる。ＡＣＣアーゼは、植物の脂肪酸合成経路における鍵となる酵素であり、その活性の阻害は究極的には、脂肪酸欠乏による植物の死滅をもたらす。
【０１０２】
本発明は、野生型ＡＬＳと比較して、植物ＡＬＳ変異体も提供し、該ＡＬＳ変異体は、１２２、１９７、２０４、２０５、６５３、６５４、６５５、６５９から選択される、１つまたは複数の位置でのアミノ酸の突然変異を含み、ここで、アミノ酸の位置は配列番号２を参照し、該変異体は除草剤耐性を植物に付与する。いくつかの具体的な実施形態において、アミノ酸の突然変異は、Ａ１２２Ｔ、Ｐ１９７Ａ、Ｐ１９７Ｙ、Ｐ１９７Ｓ、Ｐ１９７Ｌ、Ｐ１９７Ｆ、Ｄ２０４Ｎ、Ａ２０５Ｔ、Ｄ２０４Ｎ＋Ａ２０５Ｔ、Ｅ６５４Ｋ、Ｇ６５５Ｄ、Ｇ６５５Ｓ、Ｇ６５５Ｎ、Ｅ６５４Ｋ＋Ｇ６５５Ｄ、Ｅ６５４Ｋ＋Ｇ６５５Ｓ、Ｅ６５４Ｋ＋Ｇ６５５Ｎ、Ｇ６５９Ｎ、Ｐ１９７Ｓ、Ｐ１９７Ｌ、Ｐ１９７Ｆ、Ｄ２０４Ｎ、Ａ２０５Ｔ、Ｄ２０４Ｎ＋Ａ２０５Ｔ、Ｇ６５４Ｄ、Ｇ６５４Ｓ、Ｇ６５４Ｎ、Ｇ６５５Ｄ、Ｇ６５５Ｓ、Ｇ６５５Ｎ、Ｇ６５４Ｄ＋Ｇ６５５Ｄ、Ｇ６５４Ｄ＋Ｇ６５５Ｓ、Ｇ６５４Ｄ＋Ｇ６５５Ｎ、Ｇ６５４Ｓ＋Ｇ６５５Ｄ、Ｇ６５４Ｓ＋Ｇ６５５Ｓ、Ｇ６５４Ｓ＋Ｇ６５５Ｎ、Ｇ６５４Ｎ＋Ｇ６５５Ｄ、Ｇ６５４Ｎ＋Ｇ６５５Ｓ、Ｇ６５４Ｎ＋Ｇ６５５Ｎ、Ａ１２２Ｔ、またはこれらの何らかの組み合わせから選択され、ここで、アミノ酸の位置は配列番号２を参照する。いくつかの具体的な実施形態において、アミノ酸の突然変異は、Ｐ１９７Ａ、Ｐ１９７Ｆ、Ｐ１９７Ｓ、Ｐ１９７Ｙ、Ｐ１９７Ｆ＋Ｒ１９８Ｃ、Ｇ６５４Ｅ＋Ｇ６５５Ｓ、Ｇ６５４Ｋ＋Ｇ６５５Ｓ、Ｇ６５４Ｅ＋Ｇ６５９Ｎ、Ｐ１９７Ｆ＋Ｇ６５４Ｅ＋Ｇ６５５Ｓ、またはこれらの何らかの組み合わせから選択され、ここで、アミノ酸の位置は配列番号２を参照する。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、ＡＬＳとはコメＡＬＳであり、その野生型配列は配列番号１６に示されている。いくつかの実施形態において、ＡＬＳとはコムギＡＬＳであり、その野生型配列は配列番号１７に示されている（部分的な配列）（ｇｅｎｂａｎｋ  ＩＤ：ＡＡＯ５３５４８．１）。
【０１０４】
このような変異体の発現によって、植物（例えば、コメ、トウモロコシ、コムギなどの単子葉植物、ならびにダイズ、ワタ、カノーラ、およびヒマワリなどの双子葉植物）は次の除草剤、すなわち、イミダゾリノン除草剤（イマザメスなど）、スルホニル尿素除草剤（ニコスルフロンなど）、トリアゾリノン除草剤（フルカルバゾンナトリウムなど）、トリアゾロピリミジン除草剤（例えば、ペノキスラム）、ピリミジンサリチラート除草剤（例えば、ビスピリバック−ナトリウム）のうちの１つ以上に対してより高レベルの除草剤耐性を有することができる可能性がある。ＡＬＳは、植物における分枝鎖アミノ酸の合成における鍵となる酵素であり、その活性の阻害は究極的には、分枝鎖アミノ酸の欠如による植物の死滅を結果的に生じる。
【０１０５】
本発明は、植物ＨＰＰＤ変異体も提供し、野生型ＨＰＰＤと比較して、該ＨＰＰＤは、２７７、３６４、３６６、４１３、４１４、４１５から選択される、１つまたは複数の位置でのアミノ酸の突然変異を含み、ここで、アミノ酸の位置は配列番号３を参照し、該変異体は、除草剤耐性を植物に付与する。いくつかの具体的な実施形態において、アミノ酸の突然変異は、Ｐ２７７Ｓ、Ｐ２７７Ｌ、Ｖ３６４Ｍ、Ｃ４１３Ｙ、Ｇ４１４Ｄ、Ｇ４１４Ｓ、Ｇ４１４Ｎ、Ｇ４１５Ｅ、Ｇ４１５Ｒ、Ｇ４１５Ｋ、Ｇ４１４Ｄ＋Ｇ４１５Ｅ、Ｇ４１４Ｄ＋Ｇ４１５Ｒ、Ｇ４１４Ｄ＋Ｇ４１５Ｋ、Ｇ４１４Ｓ＋Ｇ４１５Ｅ、Ｇ４１４Ｓ＋Ｇ４１５Ｒ、Ｇ４１４Ｓ＋Ｇ４１５Ｋ、Ｇ４１４Ｎ＋Ｇ４１５Ｅ、Ｇ４１４Ｎ＋Ｇ４１５Ｒ、Ｇ４１４Ｎ＋Ｇ４１５Ｋ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１５Ｅ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１５Ｒ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１５Ｋ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｄ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｓ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｎ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｄ＋Ｇ４１５Ｅ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｄ＋Ｇ４１５Ｒ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｄ＋Ｇ４１５Ｋ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｓ＋Ｇ４１５Ｅ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｓ＋Ｇ４１５Ｒ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｓ＋Ｇ４１５Ｋ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｎ＋Ｇ４１５Ｅ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｎ＋Ｇ４１５Ｒ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｎ＋Ｇ４１５Ｋ、Ｐ２７７Ｓ、Ｐ２７７Ｌ、Ｖ３６６Ｉ、Ｃ４１３Ｙ、Ｇ４１４Ｄ、Ｇ４１４Ｓ、Ｇ４１４Ｎ、Ｇ４１５Ｅ、Ｇ４１５Ｒ、Ｇ４１５Ｋ、Ｇ４１４Ｄ＋Ｇ４１５Ｅ、Ｇ４１４Ｄ＋Ｇ４１５Ｒ、Ｇ４１４Ｄ＋Ｇ４１５Ｋ、Ｇ４１４Ｓ＋Ｇ４１５Ｅ、Ｇ４１４Ｓ＋Ｇ４１５Ｒ、Ｇ４１４Ｓ＋Ｇ４１５Ｋ、Ｇ４１４Ｎ＋Ｇ４１５Ｅ、Ｇ４１４Ｎ＋Ｇ４１５Ｒ、Ｇ４１４Ｎ＋Ｇ４１５Ｋ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１５Ｅ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１５Ｒ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１５Ｋ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｄ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｓ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｎ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｄ＋Ｇ４１５Ｅ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｄ＋Ｇ４１５Ｒ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｄ＋Ｇ４１５Ｋ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｓ＋Ｇ４１５Ｅ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｓ＋Ｇ４１５Ｒ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｓ＋Ｇ４１５Ｋ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｎ＋Ｇ４１５Ｅ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｎ＋Ｇ４１５Ｒ、Ｃ４１３Ｙ＋Ｇ４１４Ｎ＋Ｇ４１５Ｋ、またはこれらの何らかの組み合わせから選択される。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、ＨＰＰＤとはコメＨＰＰＤであり、その野生型配列は配列番号３において示される。いくつかの実施形態において、ＨＰＰＤとはコムギＨＰＰＤであり、その野生型配列は配列番号１８において示される。
【０１０７】
このような変異体の発現によって、植物（例えば、コメ、トウモロコシ、コムギなどの単子葉植物、ならびにダイズ、ワタ、ナタネ、およびヒマワリなどの双子葉植物）は１つ以上のＨＰＰＤ阻害剤除草剤（例えば、メソトリオン、トプラメゾン）に対するより高レベルの耐性を取得することができる可能性がある。ＨＰＰＤは、植物におけるクロロフィル合成経路の鍵となる酵素である。ＨＰＰＤの活性の阻害は究極的には、植物の白化および死滅をもたらす。
【０１０８】
本発明は、野生型ＥＰＳＰＳと比較した、植物ＥＰＳＰＳ変異体も提供し、該ＥＰＳＰＳは、１０２および１０３から選択される、１つまたは複数の位置でのアミノ酸の突然変異を含み、ここで、アミノ酸の位置は配列番号４を参照し、該変異体は、除草剤耐性を植物に付与する。いくつかの実施形態において、アミノ酸の突然変異は、Ｔ１０２Ｉ、Ａ１０３Ｖ、Ｔ１０２Ｉ＋Ａ１０３Ｖからなる群から選択される。ＥＰＳＰＳ酵素は、植物における芳香属アミノ酸の合成における鍵となる酵素であり、その活性の阻害は究極的には、芳香族アミノ酸の欠如による植物の死滅をもたらす。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、ＥＰＳＰＳとはコムギＥＰＳＰＳであり、その野生型配列は配列番号４に示されている。
【０１１０】
このような変異体の発現は、植物（例えば、コメ、トウモロコシ、コムギなどの単子葉類、ならびにダイズ、ワタ、ナタネ、およびヒマワリなどの双子葉類）におけるグリホサートに対する耐性を有意に上昇させることができる。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、本発明の変異体は、除草剤耐性を植物に付与することのできる、当技術分野で公知の他のアミノ酸の突然変異も含む。
【０１１２】
本発明は、本発明の変異体をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸も提供する。
【０１１３】
本発明は、調節配列へ操作可能に連結された本発明の変異体をコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットも提供する。
【０１１４】
本発明は、本発明の変異体をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクトも提供し、該ヌクレオチド配列は、調節配列へ操作可能に連結される。
【０１１５】
本発明は、除草剤耐性植物の作出における本発明の変異体、単離された核酸、発現カセットおよび発現コンストラクトの使用も提供する。
【０１１６】
本発明は、本発明の単離された核酸、本発明の発現カセット、および／または本発明の発現コンストラクトを植物内へ導入することを含む、除草剤耐性植物を作出する方法も提供する。
【０１１７】
本発明は、本発明の発現カセットを含むまたは該発現カセットによって形質転換する除草剤耐性植物も提供する。本発明は、除草剤耐性植物の後代も網羅する。
【０１１８】
該植物には、単子葉類および双子葉類が含まれる。例えば、該植物は、コムギ、コメ、トウモロコシ、ダイズ、ヒマワリ、ソルガム、カノーラ、アルファルファ、ワタ、オオムギ、ミレー、トウキビ、トマト、タバコ、タピオカ、またはジャガイモなどの作物植物であってもよい。該植物はまた、キャベツ、ケール、キュウリ、トマトを含むがこれらに限定されない野菜作物であってもよい。該植物はまた、カーネーション、ペオニア、バラ、およびこれらに類するものを含むがそれらに限定されない花作物であってもよい。該植物はまた、スイカ、メロン、イチゴ、ブルーベリー、ブドウ、リンゴ、カンキツ、モモを含むがこれらに限定されない果実作物であってもよい。該植物はまた、板藍根（Ｒａｄｉｘ  ｉｓａｔｉｄｉｓ）、リコリス、チョウセンニンジン、およびトウスケボウフウ（Ｓａｐｏｓｈｎｉｋｏｖｉａ  ｄｉｖａｒｉｃａｔａ）を含むがこれらに限定されない中国産生薬であってもよい。該植物はまた、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）であることができる。
【実施例】
【０１１９】
実施例１．塩基編集ベクターの構築
本実施例において、異なる作物のためのＡＬＳ、ＡＣＣアーゼ、ＥＰＳＰＳ、およびＨＰＰＤなどの除草剤耐性関連遺伝子のための塩基編集ベクターを構築した。
【０１２０】
コメ：
Ｙｕａｎ  Ｚｏｎｇ（Ｚｏｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｅｃｉｓｅ  ｂａｓｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｒｉｃｅ，ｗｈｅａｔ  ａｎｄ  ｍａｉｚｅ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｃａｓ９−  ｃｙｔｉｄｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ  ｆｕｓｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３８１１）に従って、ＯｓＡＬＳ遺伝子、ＯｓＡＣＣアーゼ遺伝子、およびＯｓＨＰＰＤ遺伝子を標的とする塩基編集ベクターを、ｐＨ−ｎＣａｓ９−  ＰＢＥコンストラクトを用いて構築した。とりわけ、ＯｓＡＬＳにおける４個の標的単一部位（Ｒ１〜Ｒ４）、ＯｓＡＬＳ遺伝子の３個の標的二重部位（Ｒ２５〜Ｒ２７）、およびＯｓＡＣＣアーゼ遺伝子の２０個の標的単一部位（Ｒ５〜Ｒ２４）、ＯｓＨＰＰＤの４個の標的単一部位（Ｒ２８〜Ｒ３０）とした。本実験におけるｓｇＲＮＡ標的配列を表１に示す。潜在的な耐性突然変異を表３に示す。
【０１２１】
【表１】
2020519310.tif 000002
【０１２２】
コムギ：
Ｙｕａｎ  Ｚｏｎｇ（Ｚｏｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｅｃｉｓｅ  ｂａｓｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｒｉｃｅ，ｗｈｅａｔ  ａｎｄ  ｍａｉｚｅ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｃａｓ９−  ｃｙｔｉｄｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ  ｆｕｓｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３８１１）に従って、ＴａＡＬＳ、ＴａＡＣＣアーゼ、ＴａＥＰＳＰＳおよびＴａＨＰＰＤ遺伝子を標的とする塩基編集ベクターを、ｐＴａＵ６を用いて構築した。とりわけ、ＴａＡＬＳ遺伝子における４個の標的単一部位（Ｗ１〜Ｗ３、Ｗ１６）、ＴａＡＬＳ遺伝子における３個の標的二重部位（Ｗ３１〜Ｗ３３）、ＴａＡＣＣアーゼ遺伝子の２０個の標的単一部位（Ｗ４〜Ｗ１５、Ｗ１７〜Ｗ２４）、ＴａＥＰＳＰＳ遺伝子の３個の標的単一部位（Ｗ２５〜Ｗ２７）およびＴａＨＰＰＤ遺伝子の３個の標的単一部位（Ｗ２８〜Ｗ３０）、ならびにＴａＡＬＳ遺伝子およびＴａＡＣＣアーゼの１個の同時の標的二重部位（Ｗ３４）とした。本実験におけるｓｇＲＮＡ標的配列を表２に示す。潜在的な耐性突然変異を表４に示す。
【０１２３】
【表２】
2020519310.tif 000003
【０１２４】
【表３−１】
2020519310.tif 000004
【表３−２】
2020519310.tif 000005
【表３−３】
2020519310.tif 000006
【０１２５】
【表４−１】
2020519310.tif 000007
【表４−２】
2020519310.tif 000008
【表４−３】
2020519310.tif 000009
【表４−４】
2020519310.tif 000010
【０１２６】
実施例２．コメおよびコムギの形質転換
コメ（アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）系形質転換）：
ｐＨ−ｎＣａｓ９−ＰＢＥベクターをアグロバクテリウム株ＡＧＬ１内へと電気穿孔法によって形質転換した。Ｚｈｏｎｇｈｕａ  １１のアグロバクテリウム媒介性形質転換、組織培養および再生をＳｈａｎら（Ｓｈａｎ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｒｏｐ  ｐｌａｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１，６８６−６８８（２０１３））に従って実施した。ヒグロマイシン選択（５０μｇ／ｍｌ）をその後の組織培養すべての間に使用した。
【０１２７】
コムギ（粒子衝撃形質転換）：
すでに説明されているとおり（Ｚｈａｎｇ，Ｋ．，Ｌｉｕ，Ｊ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｙａｎｇ，Ｚ．＆  Ｇａｏ，Ｃ．Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｗｉｄｅ  ｒａｎｇｅ  ｏｆ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｅｌｉｔｅ  ｗｈｅａｔ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．）ｖａｒｉｅｔｉｅｓ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．４２，３９−４２（２０１５））、プラスミドＤＮＡ（ｐｎＣａｓ９−ＰＢＥベクターおよびｐＴａＵ６ベクターをそれぞれ等しく混合した）を用いて、Ｋｅｎｏｎｇ  １９９の胚に粒子を当てた。衝撃後、胚をＺｈａｎｇ，Ｋらに従って加工したが、組織培養中に選択剤を全く使用しなかった。
【０１２８】
実施例３．形質転換した植物についての耐性スクリーニング条件を確立すること
表５に列挙された除草剤を選択して、異なる濃度の除草剤を含有する１／２ＭＳ培地を、野生型コメおよび野生型コムギの組織培養の芽ばえをスクリーニングするために調製した。７日後、植物の成長を抑制する最小除草剤濃度を、形質転換した植物のその後のスクリーニングのために選択した。
【０１２９】
【表５】
2020519310.tif 000011
【０１３０】
実施例４．耐性植物のスクリーニングおよび特定
実施例３において取得された形質転換植物を、対応する除草剤スクリーニング培地（表５）上で成長させ、表現型を観察し、かつ耐性植物を選択した（図１〜図３）。
【０１３１】
耐性植物のＤＮＡを抽出した後、Ｔ７ＥＩおよびＰＣＲ／ＲＥを実施した。最後に、標的遺伝子の突然変異をＳａｎｇｅｒの配列決定によって確認した。
【０１３２】
結果として、植物内在性タンパク質ＡＬＳおよびＡＣＣアーゼにおける次の突然変異を除草剤耐性突然変異として特定した。ＣからＴへの突然変異に加えて、本発明の塩基編集システムは、ＣからＧ／Ａへの突然変異も生じることができ、そのため、予期せぬ耐性突然変異をスクリーニングした。
【０１３３】
【表６】
2020519310.tif 000012
【０１３４】
【表７】
2020519310.tif 000013
【０１３５】
【表８】
2020519310.tif 000014
【図１】
2020519310.tif 000015
【図２】
2020519310.tif 000016
【図３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年1月17日(2020.1.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
除草剤耐性植物、好ましくは導入遺伝子非含有除草剤耐性植物を作出するための方法であって、前記植物内に除草剤耐性関連遺伝子を植物ゲノム内で塩基編集するためのシステムを導入し、それによりガイドＲＮＡが前記植物内の除草剤耐性関連遺伝子の標的配列との塩基編集融合タンパク質を標的とし、結果的に前記標的配列内の１つ以上のヌクレオチド置換を生じることを含み、前記システムが、次の（ｉ）〜（ｖ）；
ｉ）塩基編集融合タンパク質およびガイドＲＮＡ、
ｉｉ）塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列とガイドＲＮＡとを含む発現コンストラクト、
ｉｉｉ）塩基編集融合タンパク質、およびガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、
ｉｖ）塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、およびガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、
ｖ）塩基編集融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列とガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列とを含む発現コンストラクト
のうちの少なくとも１つを含み、前記塩基編集融合タンパク質がヌクレアーゼ不活性型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９など）ドメインおよびデアミナーゼドメインを含有し、前記ガイドＲＮＡが前記植物ゲノム内での前記除草剤耐性関連遺伝子における標的配列との前記塩基編集融合タンパク質を標的とすることができ、
前記１つ以上のヌクレオチド置換が、前記植物に除草剤耐性を付与し、
場合により、前記方法が、除草剤耐性について前記植物をスクリーニングする工程をさらに含む、方法。
【請求項２】
前記除草剤耐性関連遺伝子が、ＰｓｂＡ、ＡＬＳ、ＥＰＳＰＳ、ＡＣＣアーゼ、ＰＰＯ、ＨＰＰＤ、ＰＤＳ、ＧＳ、ＤＯＸＰＳ、Ｐ４５０から選択される除草剤耐性関連タンパク質についてコードするか、
前記塩基編集融合タンパク質が、配列番号１０または配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含むか、あるいは
前記ガイドＲＮＡが、配列番号１９〜配列番号７８のうちの１つ以上を標的とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記除草剤耐性関連遺伝子がＡＣＣアーゼについてコードし、前記１つ以上のヌクレオチド置換がＷ２０２７およびＷ２０２７＋Ｒ２０２８から選択されるＡＣＣアーゼ内アミノ酸置換を結果的に生じ、ここで、前記アミノ酸の位置は配列番号１に示されているか、
前記除草剤耐性関連遺伝子がＡＬＳについてコードし、前記１つ以上のヌクレオチド置換がＰ１９７Ａ、Ｐ１９７Ｆ、Ｐ１９７Ｓ、Ｐ１９７Ｙ、Ｐ１９７Ｆ＋Ｒ１９８Ｃ、Ｇ６５４Ｅ＋Ｇ６５５Ｓ、Ｇ６５４Ｋ＋Ｇ６５５Ｓ、Ｇ６５４Ｅ＋Ｇ６５９Ｎ、Ｐ１９７Ｆ＋Ｇ６５４Ｅ＋Ｇ６５５Ｓ、またはこれらのいずれかの組み合わせから選択されるＡＬＳ内アミノ酸置換を結果的に生じ、ここで、前記アミノ酸の位置は配列番号２に示されているか、
前記除草剤耐性関連遺伝子がＡＬＳについてコードし、前記ガイドＲＮＡがＡ１２２、Ｐ１９７、Ｒ１９８、Ｄ２０４、Ａ２０５、Ｇ６５４、Ｇ６５５、Ｇ６５９、またはこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、１つまたはそれ以上のアミノ酸をコードする配列を含む標的配列を標的とし、ここで、前記アミノ酸の位置は配列番号２に示されているか、
前記除草剤耐性関連遺伝子がＡＣＣアーゼについてコードし、前記ガイドＲＮＡがＳ１７６８、Ｒ１７９３、Ａ１７９４、Ｒ１８２５、Ｄ１８２７、Ｌ１８１５、Ａ１８１６、Ｒ１８１７、Ａ１８３７、Ｇ１８５４、Ｇ１８５５、Ｄ１９７１、Ｄ１９７２、Ｇ１９８３、Ｐ１９９３、Ｒ１９９４、Ｓ２００３、Ａ２００４、Ｔ２００５、Ｔ２００７、Ａ２００８、Ｒ２０２８、Ｇ２０２９、Ｔ２０４７、Ｒ２０７０、Ｇ２０７１、Ａ２０９０、Ｅ２０９１、Ｅ２１０６、Ｓ２１１９、Ｒ２２２０、Ａ１８１３、Ｅ１７９６、Ｅ１７９７、Ｔ１８００、Ｌ１８０１、Ｓ１８４９、Ｈ１８５０、Ｄ１８７４、Ｄ１８７５、Ｌ２０２４、Ｅ１９８９、Ｒ１９９０、Ｌ２０９９、またはこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、１つまたはそれ以上のアミノ酸をコードする配列を含む標的配列を標的とし、ここで、前記アミノ酸の位置は配列番号１に示されているか、
前記除草剤耐性関連遺伝子がＥＰＳＰＳについてコードし、前記ガイドＲＮＡがＴ１０２および／またはＡ１０３からなる群から選択される、１つまたはそれ以上のアミノ酸をコードする配列を含む標的配列を標的とし、ここで、前記アミノ酸の位置は配列番号４に示されているか、あるいは
前記除草剤耐性関連遺伝子がＨＰＰＤについてコードし、前記ガイドＲＮＡがＰ２７７、Ｖ３６４、Ｃ４１３、Ｇ４１４、Ｇ４１５、Ｖ３６６、またはこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される、１つまたはそれ以上のアミノ酸をコードする配列を含む標的配列を標的とし、ここで、前記アミノ酸の位置は配列番号３に示されている、請求項１記載の方法。
【請求項４】
除草剤耐性関連タンパク質の変異体を同定する方法であって、前記変異体は、除草剤耐性を植物に付与することができるものであり、
ｉ）除草剤耐性植物を請求項１から３までのいずれか１項記載の方法によって作出することと、
ｉｉ）結果として生じる除草剤耐性植物における前記除草剤耐性関連遺伝子の配列および／またはコードされた除草剤耐性関連タンパク質の配列を決定し、それにより、前記変異体の配列を同定すること
とを含む、方法。
【請求項５】
前記除草剤耐性関連除草剤耐性関連タンパク質が、ＰｓｂＡ、ＡＬＳ、ＥＰＳＰＳ、ＡＣＣアーゼ、ＰＰＯ、ＨＰＰＤ、ＰＤＳ、ＧＳ、ＤＯＸＰＳ、Ｐ４５０から選択される、請求項４記載の方法。
【請求項６】
請求項４または請求項５記載の方法によって同定される除草剤耐性関連タンパク質の変異体であって、除草剤耐性を植物に付与することができる、変異体。
【請求項７】
野生型ＡＣＣアーゼと比較して、ＡＣＣアーゼ変異体が、１７６８、１７９３、１７９６、１７９７、１７９４、１８００、１８０１、１８１３、１８１３、１８１５、１８２５、１８２７、１８１５、１８１６、１８１７、１８３７、１８３８、１８４９、１８５０、１８５４、１８５５、１８７４、１８７５、１９７１、１８７２、１９８３、１９８９、１９９０、１９９３、１９９４、２００３、２００４、２００５、２００７、２００８、２０２４、２０２７、２０２８、２０２９、２０４７、２０７０、２０７１、２０９０、２０９１、２０９０、２１０６、２０９９、２１０６、２１１９、２２２０から選択される、１つまたはそれ以上の位置でのアミノ酸の突然変異を含む、ＡＣＣアーゼ変異体であって、前記アミノ酸の位置は配列番号１に示されており、前記変異体が除草剤耐性を植物に付与する、ＡＣＣアーゼ変異体。
【請求項８】
野生型ＡＬＳと比較して、ＡＬＳ変異体が、１２２、１９７、２０４、２０５、６５３、６５４、６５５、６５９から選択される、１つまたはそれ以上の位置でのアミノ酸の突然変異を含む、ＡＬＳ変異体であって、前記アミノ酸の位置は配列番号２に示されており、前記変異体が除草剤耐性を植物に付与する、ＡＬＳ変異体。
【請求項９】
野生型ＨＰＰＤと比較して、前記ＨＰＰＤが２７７、３６４、３６６、４１３、４１４、４１５から選択される、１つまたはそれ以上の位置でのアミノ酸の突然変異を含む、ＨＰＰＤ変異体であって、前記アミノ酸の位置は配列番号３に示されており、前記変異体が除草剤耐性を植物に付与する、ＨＰＰＤ変異体。
【請求項１０】
野生型ＥＰＳＰＳと比較して、前記ＥＰＳＰＳが１０２および１０３から選択される、１つまたはそれ以上の位置でのアミノ酸の突然変異を含む、ＥＰＳＰＳ変異体であって、前記アミノ酸の位置は配列番号４に示されており、前記変異体が除草剤耐性を植物に付与する、ＥＰＳＰＳ変異体。
【請求項１１】
請求項６から請求項１０までのいずれか１項記載の変異体をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項１２】
調節配列へ操作可能に連結された請求項６から請求項１０までのいずれか１項記載の変異体をコードするヌクレオチド配列を含む、発現カセット。
【請求項１３】
請求項６から請求項１０までのいずれか１項記載の変異体をコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクトであって、前記ヌクレオチド配列が調節配列へ操作可能に連結されている、発現コンストラクト。
【請求項１４】
請求項６から請求項１０までのいずれか１項記載の変異体、請求項１１記載の単離された核酸、請求項１２記載の発現カセット、および請求項１３記載の発現コンストラクトの、除草剤耐性植物の作出における使用。
【請求項１５】
請求項１１記載の単離された核酸、請求項１２記載の発現カセット、および／または請求項１３記載の発現コンストラクトを植物内へ導入することを含む、除草剤耐性植物を作出する方法。
【請求項１６】
請求項１もしくは請求項１５記載の方法によって得られたか、請求項１２記載の発現カセットを含むか、あるいは請求項１１記載の単離された核酸もしくは請求項１３記載の発現コンストラクトを用いて形質転換された、除草剤耐性植物。
【請求項１７】
前記植物が、単子葉植物および双子葉植物から選択され、例えば、前記植物が、コムギ、コメ、トウモロコシ、ダイズ、ヒマワリ、ソルガム、カノーラ、アルファルファ、ワタ、オオムギ、ミレー、トウキビ、トマト、タバコ、タピオカ、ジャガイモ、キャベツ、ケール、キュウリ、トマト、カーネーション、ペオニア、バラ、スイカ、メロン、イチゴ、ブルーベリー、ブドウ、リンゴ、カンキツ、モモ、板藍根（Ｒａｄｉｘ  ｉｓａｔｉｄｉｓ）、リコリス、チョウセンニンジン、トウスケボウフウ（Ｓａｐｏｓｈｎｉｋｏｖｉａ  ｄｉｖａｒｉｃａｔａ）、およびシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）から選択される、請求項１から請求項５までのいずれか１項記載の方法、請求項６から請求項１０までのいずれか１項記載の変異体、請求項１４記載の使用、請求項１５記載の方法、および請求項１６記載の除草剤耐性植物。
【国際調査報告】
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