(57)【要約】  本発明は、敗血症原因菌特異的ゲノムの一部と相補的に結合するターゲット捕捉オリゴヌクレオチドが結合された第１コア金ナノ粒子と、それと重なることなく連続的であり、敗血症原因菌特異的ゲノムの一部と相補的な配列を含み、一末端にラマン活性分子が結合されたターゲット捕捉オリゴヌクレオチドが他の末端を介して結合された第２コア金ナノ粒子とを含む敗血症診断用キット及びそれを用いた敗血症診断方法に関する。
2020525038.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
敗血症第１原因菌特異的ゲノムの一部と相補的に結合する第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドが一末端を介して結合された第１コア金ナノ粒子と、
敗血症第１原因菌特異的ゲノムの他の一部と相補的に結合する第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドが一末端を介して結合された第２コア金ナノ粒子と、
安定化剤、還元剤及び銀又は金イオンを含む溶液とを含む敗血症診断用キットであって、
前記第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと前記第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドのいずれかは、金ナノ粒子に結合していない他末端に第１ラマン活性分子が結合されたものである敗血症診断用キット。
【請求項２】
前記敗血症第１原因菌とは異なる敗血症第２原因菌特異的ゲノムの一部と相補的に結合する第３ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドが一末端を介して結合された第３コア金ナノ粒子と、敗血症第２原因菌特異的ゲノムの他の一部と相補的に結合する第４ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドが一末端を介して結合された第４コア金ナノ粒子を少なくとも１対さらに含むことにより、複数の敗血症原因菌を同時に診断することができ、前記第３ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと前記第４ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドのいずれかは、金ナノ粒子に結合していない他末端に第２ラマン活性分子が結合されたものである、請求項１に記載の敗血症診断用キット。
【請求項３】
前記第３コア金ナノ粒子及び前記第４コア金ナノ粒子は、それぞれ第１コア金ナノ粒子と第２コア金ナノ粒子のいずれか一方及び他方とサイズが同一であるか、又は全て独立したものである、請求項２に記載の敗血症診断用キット。
【請求項４】
前記第１コア金ナノ粒子及び前記第３コア金ナノ粒子は、それぞれ独立して１０〜５０ｎｍの平均直径を有し、前記第２コア金ナノ粒子及び前記第４コア金ナノ粒子は、それぞれ第１コア金ナノ粒子及び第３コア金ナノ粒子の１〜２倍の平均直径を有する、請求項１又は２に記載の敗血症診断用キット。
【請求項５】
前記第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと前記第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド、及び第３ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと第４ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドは、それらに含まれる塩基数が同一であるか、±５個以内の差であり、第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの塩基数の合計、並びに第３ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第４ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの塩基数の合計は、それぞれ独立して１５〜１００である、請求項１又は２に記載の敗血症診断用キット。
【請求項６】
前記第１コア金ナノ粒子及び前記第３コア金ナノ粒子のサイズが２０ｎｍであれば、それぞれ第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの塩基数の合計、並びに第３ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第４ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの塩基数の合計が３０であることを基準に、第１コア金ナノ粒子のサイズと第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの塩基数の合計、並びに第３コア金ナノ粒子のサイズと第３ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第４ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの塩基数の合計は、互いに比例する、請求項１又は２に記載の敗血症診断用キット。
【請求項７】
前記第１コア金ナノ粒子〜前記第４コア金ナノ粒子は、標準偏差±０．０５以下の真円度（circularity）０．９〜１．０を有する球形である、請求項１又は２に記載の敗血症診断用キット。
【請求項８】
前記敗血症第１原因菌及び前記敗血症第２原因菌は、それぞれ独立して大腸菌（Escherichia coli）、肺炎桿菌（Klepsiella pneumoniae）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）、エンテロコッカス・フェカリス菌（Enterococcus faecalis）及び緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の敗血症診断用キット。
【請求項９】
第１コア金ナノ粒子、第２コア金ナノ粒子、第３コア金ナノ粒子及び第４コア金ナノ粒子は、それぞれ独立して２０〜１００ｎｍの直径を有する完全球形粒子である、請求項１又は２に記載の敗血症診断用キット。
【請求項１０】
前記第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと前記第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドのいずれか一方は５’末端を介して、他方は３’末端を介して、それぞれ第１コア金ナノ粒子及び第２コア金ナノ粒子に結合され、第３ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと第４ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドのいずれか一方は５’末端を介して、他方は３’末端を介して、それぞれ第３コア金ナノ粒子及び第４コア金ナノ粒子に結合されたものである、請求項１又は２に記載の敗血症診断用キット。
【請求項１１】
前記第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び前記第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドは、どちらも敗血症第１原因菌特異的ゲノムの一部と相補的な５〜２０個のヌクレオチド配列を含み、第３ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第４ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドは、どちらも敗血症第２原因菌特異的ゲノムの一部と相補的な５〜２０個のヌクレオチド配列を含み、これら配列は、互いに重ならず、第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド、並びに第３ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第４ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドは、それぞれ０〜３個のヌクレオチド間隔で隣接して位置する、請求項１又は２に記載の敗血症診断用キット。
【請求項１２】
前記第１ラマン活性分子又は前記第２ラマン活性分子は、互いに異なる波長でラマン信号を示す有機蛍光分子である、請求項１又は２に記載の敗血症診断用キット。
【請求項１３】
前記第１ラマン活性分子及び前記第２ラマン活性分子は、低い蛍光信号を示す、請求項１又は２に記載の敗血症診断用キット。
【請求項１４】
敗血症発症の疑いのある個体から採取した検体から分離したゲノムを含む試料を準備する第１ステップと、
前記第１ステップで準備した試料を、敗血症原因菌特異的ゲノムの一部と相補的に結合する第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドが一末端を介して結合された第１コア金ナノ粒子、及び敗血症原因菌特異的ゲノムの他の一部と相補的に結合する第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドが一末端を介して結合された第２コア金ナノ粒子と反応させる第２ステップ（ここで、前記第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと前記第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドのいずれかは、金ナノ粒子に結合していない他末端にラマン活性分子が結合されたものである）と、
前記第２ステップの生成物を、安定化剤、還元剤及び銀又は金イオンを含む溶液と反応させ、第１コア金ナノ粒子及び第２コア金ナノ粒子上に同時に銀又は金からなる第１シェル及び第２シェルをそれぞれ形成する第３ステップと、
前記第３ステップで得られた生成物のラマン活性分子のラマン信号を測定する第４ステップとを含む、敗血症診断のための情報提供方法。
【請求項１５】
前記敗血症原因菌は、大腸菌（Escherichia coli）、肺炎桿菌（Klepsiella pneumoniae）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）、エンテロコッカス・フェカリス菌（Enterococcus faecalis）及び緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）からなる群から選択される、請求項１４に記載の情報提供方法。
【請求項１６】
第４ステップで測定したラマン活性分子のラマン信号が、同じサイズの金コア−銀又は金シェルナノ粒子に標識された同じラマン活性分子から測定したラマン信号に比べて、大幅に増加した場合、第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと相補的な配列をゲノムに含む敗血症原因菌に感染したと判断する、請求項１４に記載の情報提供方法。
【請求項１７】
前記第３ステップは、第１シェルと第２シェル間の最も短い距離が０．５〜１０ｎｍになるまで行う、請求項１４に記載の情報提供方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、敗血症原因菌特異的ゲノムの一部と相補的に結合するオリゴヌクレオチドが結合された第１コア金ナノ粒子と、それと重なることなく連続的であり、敗血症原因菌特異的ゲノムの一部と相補的な配列を含み、一末端にラマン活性分子が結合されたオリゴヌクレオチドが他の末端を介して結合された第２コア金ナノ粒子とを含む敗血症診断用キット及びそれを用いた敗血症診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
敗血症は、バクテリア、ウイルス、カビなどの敗血症原因菌に患者が感染して発症し、発症すると高熱が出て死亡に至ることもある急性重症疾患である。ここで、死亡に至る原因は大きく２つに分けられ、１つは、いわゆる「サイトカインストーム（cytokine storm）」により免疫機能が過度に働き、その過度な自己免疫機能が自らの体の中の臓器を破壊すること（hyper-inflammation，免疫過剰）であり、もう１つは、原因菌の繁殖が抑制されずに血液や臓器に入り込み、臓器の機能が全て麻痺すること（hypo-inflammation，免疫麻痺；immune paralysis）である。
【０００３】
敗血症によるショックは、様々な微生物による全身性炎症反応が主な発症機序として知られており、それにより細動脈血管拡張や血圧上昇剤に反応しない血圧低下が引き起こされる。敗血症性ショック患者の死亡率は診断、モニター、治療の発展にもかかわらず、依然として高く、高齢化社会になるにつれて高齢患者における敗血症性ショックの有病率は増加しており、これは病院内での死亡の大部分を占める。
【０００４】
韓国における敗血症発症率は１０万人当たり３４７人に相当し、これは心筋梗塞の３倍、脳卒中の１．５倍であり、死亡率は３１％（心筋梗塞及び脳卒中の死亡率は９％）に達する致命的な疾患である。特に、全世界の５歳未満幼児死亡原因の６０％を占め、韓国内の「集中治療室（intensive care unit; ICU）」における死亡原因の１位であり、北米、オーストラリア、ヨーロッパなどの敗血症死亡率が２０％程度であるのに対して、韓国の敗血症死亡率は３１％と多少高い。
【０００５】
これに関して、敗血症患者の生存率を高めるための最も重要な治療は、適切な抗生剤を迅速に投与することである。２０１２年に発表された敗血症治療の診療指針においては、３時間以内の適切な広範囲抗生剤の投与及び抗生剤投与前の原因菌同定のための血液培養検査を勧告している（非特許文献１）。
【０００６】
しかし、臨床における血液培養検査結果は血液採取後一般に５日以上、少なくとも２４時間以上経過しなければ得られないので、正確な原因菌の確認が行われないまま、ほとんどの敗血症患者に経験的抗生剤が投与される。よって、多剤耐性菌などの経験的抗生剤に耐性のある菌が敗血症の原因菌である場合は、血液培養検査結果の報告により多剤耐性菌感染が確認されたときには既に患者の治療に失敗している可能性があり、これは死亡率の増加につながる。
【０００７】
よって、より迅速な診断のために、ＰＣＲにより遺伝子を増幅して検出する方法も考えられるが、微量の遺伝子であっても増幅するＰＣＲの特性上、検出対象である敗血症の原因菌でない他の菌が検出されることもあり、複数の菌が検出されることもあるので、抗生剤の誤用及び／又は乱用を招くことがある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】大韓医師協会紙, 2012
【非特許文献２】Chem. Comm. 2008, J. Phys. Chem. B 2004, 108, 5882-5888
【非特許文献３】ACS Nano, 2013, 7(12): 11064-11070
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、ＰＣＲにより遺伝子を増幅することなく、迅速かつ正確に敗血症を診断できるだけでなく、原因菌の種類を判明できるキットと方法を見出すべく鋭意研究を重ねた結果、敗血症原因菌特異的ゲノムに相補的な配列のオリゴヌクレオチドが結合された２つのコア金ナノ粒子二量体を形成し、それに銀又は金シェルを調節された厚さで形成し、粒子間の距離を数ｎｍ以内に調節することにより、表面増強ラマン散乱効果を最大化してラマン散乱信号を確認すると、迅速かつ敏感に敗血症感染の有無だけでなく、原因菌の種類まで判明できることを確認し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第１態様は、敗血症第１原因菌特異的ゲノムの一部と相補的に結合する第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド（target-capturing oligonucleotide）が一末端を介して結合された第１コア金ナノ粒子と、敗血症第１原因菌特異的ゲノムの他の一部と相補的に結合する第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドが一末端を介して結合された第２コア金ナノ粒子と、安定化剤、還元剤及び銀又は金イオンを含む溶液とを含む敗血症診断用キットであって、前記第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと前記第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドのいずれかは、金ナノ粒子に結合していない他末端に第１ラマン活性分子が結合されたものである敗血症診断用キットを提供する。
【００１１】
本発明の第２様態は、敗血症発症の疑いのある個体から採取した検体から分離したゲノムを含む試料を準備する第１ステップと、前記第１ステップで準備した試料を、敗血症原因菌特異的ゲノムの一部と相補的に結合する第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドが一末端を介して結合された第１コア金ナノ粒子、及び敗血症原因菌特異的ゲノムの他の一部と相補的に結合する第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドが一末端を介して結合された第２コア金ナノ粒子と反応させる第２ステップ（ここで、前記第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと前記第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドのいずれかは、金ナノ粒子に結合していない他末端にラマン活性分子が結合されたものである）と、前記第２ステップの生成物を、安定化剤、還元剤及び銀又は金イオンを含む溶液と反応させ、第１コア金ナノ粒子及び第２コア金ナノ粒子上に同時に銀又は金からなる第１シェル及び第２シェルをそれぞれ形成する第３ステップと、前記第３ステップで得られた生成物のラマン活性分子のラマン信号を測定する第４ステップとを含む、敗血症診断のための情報提供方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のキットは、敗血症原因菌特異的ゲノムと反応するとラマン散乱信号が大幅に増加する構造物を形成することができるので、微量の試料であっても数時間以内に迅速かつ正確な診断を行うことができ、適切な抗生剤投与につながり、敗血症の迅速な診断により致死率を低下させるのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の敗血症診断用キットによるコア−シェルナノ粒子二量体形成を用いた敗血症原因菌分析方法の概略を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の第１態様は、敗血症第１原因菌特異的ゲノムの一部と相補的に結合する第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド（target-capturing oligonucleotide）が一末端を介して結合された第１コア金ナノ粒子と、敗血症第１原因菌特異的ゲノムの他の一部と相補的に結合する第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドが一末端を介して結合された第２コア金ナノ粒子と、安定化剤、還元剤及び銀又は金イオンを含む溶液とを含む敗血症診断用キットであって、前記第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと前記第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドのいずれかは、金ナノ粒子に結合していない他末端に第１ラマン活性分子が結合されたものであるキットを提供する。
【００１５】
本発明の第２様態は、敗血症発症の疑いのある個体から採取した検体から分離したゲノムを含む試料を準備する第１ステップと、前記第１ステップで準備した試料を、敗血症原因菌特異的ゲノムの一部と相補的に結合する第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドが一末端を介して結合された第１コア金ナノ粒子、及び敗血症原因菌特異的ゲノムの他の一部と相補的に結合する第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドが一末端を介して結合された第２コア金ナノ粒子と反応させる第２ステップ（ここで、前記第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと前記第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドのいずれかは、金ナノ粒子に結合していない他末端にラマン活性分子が結合されたものである）と、前記第２ステップの生成物を、安定化剤、還元剤及び銀又は金イオンを含む溶液と反応させ、第１コア金ナノ粒子及び第２コア金ナノ粒子上に同時に銀又は金からなる第１シェル及び第２シェルをそれぞれ形成する第３ステップと、前記第３ステップで得られた生成物のラマン活性分子のラマン信号を測定する第４ステップとを含む、敗血症診断のための情報提供方法を提供する。
【００１６】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００１７】
本発明は、迅速、正確かつ精密な敗血症診断方法を提供すべく考案されたものであり、表面増強ラマン散乱（surface enhanced raman scattering; SERS）を用いた超高感度のラマン分光法に基づくものである。ラマン分光法は、分子の誘導偏極率に変化がある非極性分子においても信号が得られ、ほとんど全ての有機分子が固有のラマンシフト（Raman Shift, cm-1）を有する。また、水分子による干渉の影響を受けないので、タンパク質、遺伝子などの生体分子（biomolecules）の検出にさらに適している。もっとも、信号の強度が低いので市販化されていないが、様々なナノ構造に表面増強ラマン散乱を行うことができるので、単分子レベルの信号検出を行うことができる。前記ＳＥＲＳは、ラマン活性分子が金属表面に吸着又は近接して位置する場合に発生し、ラマン測定のために入射したレーザにより金属表面で発生するプラズモンがラマン活性分子から放出される信号を増加させる現象であり、密集したナノ粒子間に形成される強い電磁場であるホットスポット（hot spot）によりＳＥＲＳ信号を増強させることができる。ここで、前記ＳＥＲＳ信号は、ナノ粒子のサイズ、形態及び／又は前記ナノ粒子とラマン活性物質の距離に敏感に反応する。しかし、ナノ粒子間の任意の凝集により形成されるホットスポットはこれらの因子の調節ができないので、むしろ信号検出の再現性を阻害することがある。
【００１８】
よって、本発明者らは、敏感かつ信頼できる測定結果が得られるようにＳＥＲＳ効果を最大化すると共に、再現性ある結果が得られる調節可能なナノ構造体を形成するキットを提供する。具体的には、ＤＮＡハイブリダイゼーションにより２つのコアナノ粒子が所定の間隔で離隔して連結され、それらの間にラマン活性分子を含む二量体を形成し、その後前述した各コアナノ粒子に金又は銀シェルを調節された厚さで形成することにより、２つのコア−シェル粒子の間隔をサブナノメートルレベルで調節してＳＥＲＳ増強を誘導することができる。コアナノ粒子の表面にＤＮＡを導入し、そのハイブリダイゼーションにより二量体を形成するのは、ナノ粒子間の距離を一定に保つための好ましい手段である。相補的な結合により形成される二本鎖ＤＮＡは、一定の構造を有し、１塩基対当たり０．３４ｎｍの一定の長さを有するので、それを構成するヌクレオチドの数を調節することにより、粒子間の間隔を調節することができる。さらに、コアナノ粒子上に二量体形成のために考案された配列以外に、非特異的結合を防止するための任意の配列のＤＮＡをさらに導入すると、多量体の形成を抑制して高い純度で二量体を作製できるという利点がある。
【００１９】
本発明のキットにおける「敗血症第１原因菌特異的ゲノム」とは、前記ゲノムの存在により第１原因菌を特定できる所定の配列を含むオリゴヌクレオチドを意味する。前記ゲノムは、敗血症原因菌株から分離したゲノムの全体であってもよく、反応の単純化のために制限酵素で切断したＤＮＡ断片であってもよいが、これらに限定されるものではない。ここで、前記制限酵素としては、ＨｐａＩＩ（ＭｓｐＩ）、ＨａｅＩＩＩ、ＨｇａＩ又はＴａｑ（ａｌｐｈａ）Ｉを用いてもよいが、これらに限定されるものではない。例えば、４ｂｐ以下の認識配列を用いてできるだけ多くの断片を確保できる制限酵素を選定して用いてもよい。具体的には、前述した条件及び経済的な効率性を考慮して、ＨｐａＩＩ又はＴａｑＩを用いてもよい。本発明のターゲットオリゴヌクレオチド及びそれに対応するターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの考案の際も、前記制限酵素、特にＨｐａＩＩ及びＴａｑＩの切断位置を適用した。
【００２０】
例えば、前記敗血症原因菌特異的ゲノムの一部と相補的に結合するオリゴヌクレオチドとは、敗血症原因菌特異的ゲノムとハイブリダイズできるように、その一部と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドを意味する。
【００２１】
本発明における「ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド」とは、検出対象である遺伝子、すなわちターゲットオリゴヌクレオチドの一部と相補的な配列を有するため、それらのハイブリダイゼーションによりターゲットオリゴヌクレオチドを捕捉できるオリゴヌクレオチドを意味する。本発明において、前記第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと第２ターゲット捕捉ヌクレオチドは、敗血症原因菌特異的ゲノムの重なることなく連続的であるか又は数個のオリゴヌクレオチドのギャップ内に位置する互いに異なる一部とそれぞれ相補的な配列を有してもよい。逆に、本発明において、ターゲットヌクレオチドは、第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第２ターゲット捕捉ヌクレオチドと相補的な配列、及び存在する場合はそれらの間で発生する数個のオリゴヌクレオチドのギャップを有する全配列を含んでもよい。
【００２２】
本発明は、従来の敗血症診断及び原因菌判明のための血液培養検査が少なくとも２４時間、長い場合は数日かかり、適切な抗生剤処置が遅延して致死率が高くなるのを防止するために考案されたものであり、敗血症原因菌の特異的ゲノムを確認し、それに相補的な配列を用いることにより、著しく増強されたラマン信号を供給する構造物を提供することができるので、試料の前処理に数時間かかることを除けば、１時間以内にラマン分光法で高い感度及び正確性を有し、かつ迅速に測定及び診断することができ、複数の原因菌を１度の測定で同時に同定することができることを見出したことに基づくものである。さらに、このような診断キットを提供する上で、信号の感度及び／又は正確性を確保できる最適化された条件を見出すことを目的とする。
【００２３】
一方、ラマン分光信号は、蛍光信号とは異なり、振動分光学に基づく特性上、分光分解能が高いためラマン信号のピークは非常にシャープであり、スペクトルの重複が少ないので、互いに異なる波長でラマン信号を示す複数のラマン活性分子を用いて数種の原因菌を同時に診断することができる。
【００２４】
具体的には、本発明のキットは、前記敗血症第１原因菌とは異なる敗血症第２原因菌特異的ゲノムの一部と相補的に結合する第３ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドが一末端を介して結合された第３コア金ナノ粒子と、敗血症第３原因菌特異的ゲノムの他の一部と相補的に結合する第４ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドが一末端を介して結合された第４コア金ナノ粒子を少なくとも１対さらに含むことにより、複数の敗血症原因菌を同時に診断することができ、前記第３ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと前記第４ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドのいずれかは、金ナノ粒子に結合していない他末端に第２ラマン活性分子が結合されたものであってもよい。前記第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと前記第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド、及び前記第３ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと前記第４ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドは、互いに競争的な関係ではなく、それぞれの標的との相互作用やそれぞれからの信号に干渉しないので、前記敗血症第１原因菌特異的ゲノムの一部と相補的に結合する第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドが一末端を介して結合された第１コア金ナノ粒子、及び敗血症第１原因菌特異的ゲノムの他の一部と相補的に結合する第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドが一末端を介して結合された第２コア金ナノ粒子からなる対と、敗血症第２原因菌特異的ゲノムの一部と相補的に結合する第３ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドが一末端を介して結合された第３コア金ナノ粒子、及び敗血症第２原因菌特異的ゲノムの他の一部と相補的に結合する第４ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドが一末端を介して結合された第４コア金ナノ粒子からなる対は、混合物の形態又はそれぞれ独立して提供することができる。
【００２５】
ここで、前記第３コア金ナノ粒子及び前記第４コア金ナノ粒子は、それぞれ第１コア金ナノ粒子と第２コア金ナノ粒子のいずれか一方及び他方とサイズが同一であってもよく、全て独立したものであってもよい。例えば、１つのコア金ナノ粒子に１種の配列を有する核酸のみ結合された２つ以上の対のコア金ナノ粒子を用いてもよく、１つのコア金ナノ粒子に少なくとも２種の敗血症原因菌特異的ゲノムと結合可能なオリゴヌクレオチドを全て含むが、互いに異なる波長でラマン信号を示すラマン活性分子を含むように考案されたコア金ナノ粒子を用いてもよい。これらの粒子を用いて、少なくとも２種の敗血症原因菌を同時に検出することができる。
【００２６】
本発明のキットに備えられる前記第１コア金ナノ粒子及び前記第３コア金ナノ粒子は、それぞれ独立して１０〜５０ｎｍの平均直径を有し、前記第２コア金ナノ粒子及び前記第４コア金ナノ粒子は、それぞれ第１コア金ナノ粒子及び第３コア金ナノ粒子の１〜２倍の平均直径を有するように、組み合わせて選択することができる。本発明のキットを用いて敗血症を診断する上で、最終的に測定されるラマン信号の増強の程度は、前記コア金ナノ粒子上に形成された金又は銀シェル間の距離に依存する。しかし、測定されるラマン信号は、前記最終形成されたコア−シェルナノ粒子二量体間の距離だけでなく、それぞれを構成するコアのサイズ及びそれらの距離、すなわちターゲットオリゴヌクレオチドの距離と無関係ではなく、それらは相互有機的な関係を有する。
【００２７】
前述したように、１つのコア金ナノ粒子は、１０〜５０ｎｍの範囲から選択されるサイズを有するが、それと二量体を形成する他方のコア金ナノ粒子は、前記選択されたサイズの１〜２倍、好ましくは１．３〜１．７倍のサイズを有する粒子を選択することができる。より好ましくは１．４〜１．６倍のサイズを有する粒子を選択することできるが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
さらに、前記第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと前記第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド、及び前記第３ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと前記第４ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドは、それらに含まれる塩基数が同一であるか、±５個以内の差であり、第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの塩基数の合計、並びに第３ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第４ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの塩基数の合計は、それぞれ独立して１５〜１００、好ましくは２５〜７０、より好ましくは３５〜６０であるが、これらに限定されるものではない。
【００２９】
例えば、最も効率的に増強されたラマン信号を供給するためには、前述したコア金ナノ粒子のサイズを考慮して、検出対象であるターゲットオリゴヌクレオチドと相補的に結合できるように、それぞれのコア金ナノ粒子に結合されたターゲット捕捉オリゴヌクレオチド、すなわち第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド、及び第３ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと第４ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの長さを選択することが好ましい。具体的には、前記第１コア金ナノ粒子及び前記第３コア金ナノ粒子のサイズが２０ｎｍであれば、それぞれ第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの塩基数の合計、並びに第３ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第４ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの塩基数の合計が３０であることを基準に、第１コア金ナノ粒子のサイズと第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの塩基数の合計、並びに第３コア金ナノ粒子のサイズと第３ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第４ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの塩基数の合計は、互いに比例するように考案してもよい。例えば、第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの塩基数の合計、並びに第３ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第４ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの塩基数の合計は、前記範囲から選択するが、用いる第１又は第３コア金ナノ粒子のサイズが２０ｎｍであれば、塩基数３０を基準に、そのサイズの増減に応じて２０％の偏差内で比例的に増減させることが好ましい。
【００３０】
また、第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドのいずれかのオリゴヌクレオチドのコア金ナノ粒子と結合していない他末端にラマン活性分子を導入し、ターゲットオリゴヌクレオチドと結合することにより形成される複合体において、前記ラマン活性分子は第１コア金ナノ粒子と第２コア金ナノ粒子間に位置し、各コア金ナノ粒子において金又は銀シェルは同じ速度で形成されるので、最終形成されたコア−シェルナノ粒子二量体において前記ラマン活性分子がそのシェル間に形成されたナノギャップに位置し、最大化されたＳＥＲＳ効果を発揮するためには、その粒子間の距離の中央近くに位置することが好ましく、よって、各コアに結合される第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドは、同程度の長さを有するようにすることが好ましい。例えば、第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの長さの差が大きい場合、数ｎｍのナノギャップを有するようにシェルを形成すると、ラマン活性分子がいずれか一方のシェルに包埋されてラマン信号を示さないことがある。
【００３１】
また、用いる粒子のサイズが前記範囲より小さい場合、それ自体のラマン信号のサイズが小さいため、ＳＥＲＳ効果により増幅しても所望のレベルの感度が得られないことがある。一方、前記範囲より大きい場合、二量体単位が不要に大きくなることがあり、それ自体のサイズによる立体効果が働いてターゲットオリゴヌクレオチドとの結合が妨害されることがある。また、前述したように、効率的にラマン信号を得るためのコア金ナノ粒子のサイズの増加によるターゲットオリゴヌクレオチド塩基数の増加により、コア粒子間の距離が増加するので、シェル粒子を不要に厚く形成しなければならず、それによる反応時間及び／又は試薬の浪費を伴うことがある。
【００３２】
本発明の具体的な実施例においては、第１コア金ナノ粒子及び第２コア金ナノ粒子のサイズをそれぞれ４０ｎｍと６０ｎｍに選択し、それに応じてターゲットオリゴヌクレオチドの４０個の塩基と相補的に結合させるために、それぞれその連続的な２０個の配列と相補的な配列を含むように第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドを構成した。
【００３３】
本発明のキットを用いて診断することのできる前記敗血症第１原因菌及び前記敗血症第２原因菌は、それぞれ独立して大腸菌（Escherichia coli）、肺炎桿菌（Klepsiella pneumoniae）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）、エンテロコッカス・フェカリス菌（Enterococcus faecalis）及び緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）からなる群から選択されてもよい。ここに挙げた菌株は当該技術分野で周知の敗血症原因菌であり、本発明はこれらの菌株に限定されるものではなく、敗血症を引き起こす菌株であればいかなる菌株にも適用されてもよい。
【００３４】
本発明のキットは、微量の敗血症原因菌でも検出できるように増強された信号を示すようにすると共に、敗血症の特性上、誤った診断は薬物の誤用乱用を引き起こす可能性があるため、より正確な診断が行えるように各要素を最適化したことを特徴とする。
【００３５】
本発明のキットにおいて、第１コア金ナノ粒子、第２コア金ナノ粒子、第３コア金ナノ粒子及び第４コア金ナノ粒子は、それぞれ独立して２０〜１００ｎｍの直径を有する球形粒子であるが、これらに限定されるものではない。具体的には、前記第１コア金ナノ粒子〜前記第４コア金ナノ粒子は、標準偏差±０．０５以下の真円度（circularity）０．９〜１．０を有する球形である。通常、市販の金ナノ粒子は、球形ではなく、多面体の形態であるので、銀又は金シェルを導入する際にコア金ナノ粒子の基本形態を維持することにより均一な厚さで銀又は金シェルを導入すると、オリゴヌクレオチドが連結された部分の微細構造に応じて形成された二量体における両コア−シェルナノ粒子間の間隔に微差が生じることがある。よって、より均一なサイズのナノギャップを形成するためには、可能な限り完全球形のコア金粒子を用いることが好ましく、そうすることにより均一かつ予測可能に調節されて増強されたラマン信号が得られる。具体的には、完全な球の組み合わせで形成された二量体は点対点（point-to-point）の相互作用を示すので、その間に位置するラマン活性分子からの信号の増幅効果は多少低くなるが、他の干渉などを排除してより正確に所望の方向及び／又は予測可能な方向に調節された信号が得られるという利点がある。それに対して、不均一な形態、すなわち円に近い多面体の粒子の組み合わせで形成された二量体は、それらが接する部位における点対点、点対線、点対面、線対線、線対面又は面対面の選択、及び調節不可能な任意の形態の相互作用が発生することがあり、これは接触面の増加により高い信号増強効果を得ることはできるが、これらの不均一な混在による信号の不明瞭化、すなわちスペクトルのバンド拡大（band broadening）は避けられない。よって、より正確な診断のためには、完全球形のコア金ナノ粒子を用いることが好ましい。
【００３６】
また、測定される信号を不明瞭にする他の要素としては、二量体でないクラスターを形成するケース、すなわち１つの第１コア金ナノ粒子に複数の第２コア金ナノ粒子が結合するケースも考えられる。クラスターの形成は、測定されるラマン信号のバンド拡大及び／又はピーク位置移動を引き起こすことがある。よって、第１コア金ナノ粒子と第２コア金ナノ粒子が１：１で結合するように、それぞれのコア金ナノ粒子の表面に第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド以外に、保護オリゴヌクレオチドをさらに導入してもよい。前記保護オリゴヌクレオチドは、ターゲットオリゴヌクレオチドや検出対象である菌株内に存在するゲノムと非特異的に結合しない任意の配列で構成されてもよい。ここで、保護オリゴヌクレオチドの使用量は、適用するコア金ナノ粒子のサイズに応じて決定される。例えば、１５ｎｍのサイズの粒子において、ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド（第１〜第４ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド）と保護オリゴヌクレオチドを１：９０〜１１０の割合で用いることができ、粒子サイズの増減に応じて比例的に増加又は減少させて用いることができる。本発明の具体的な実施例においては、直径１５ｎｍのサイズの粒子に１：９９の割合で用いて、直径３０ｎｍのサイズの粒子に１：１９９の割合で用いた。
【００３７】
本発明のキットに含まれるオリゴヌクレオチドは、敗血症原因菌特異的ゲノムの一部と相補的に結合することを特徴とする。前記オリゴヌクレオチドは、次の過程で選択することができる。例えば、公知のデータベースから敗血症原因菌のゲノム情報を得て、そのうち細胞内代謝経路に関与し、各菌株間の交差反応の可能性が小さい配列を分析して選択し、それに基づいて適切な長さ及び配列のオリゴヌクレオチド対を考案することができる。前記オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよいが、ＲＮＡの場合は安定性が保障されないので、ＤＮＡを用いることが好ましい。以上の方法で１０〜１５個の候補群を選択し、それを基に本発明のキットを用いたラマン複合体を形成し、その信号を測定して分子診断的有効性の高いオリゴヌクレオチド配列を選択してキットに含ませてもよい。
【００３８】
本発明のキットにおいて、前記第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと前記第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドのいずれか一方は５’末端を介して、他方は３’末端を介して、それぞれ第１コア金ナノ粒子及び第２コア金ナノ粒子に結合され、第３ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと第４ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドのいずれか一方は５’末端を介して、他方は３’末端を介して、それぞれ第３コア金ナノ粒子及び第４コア金ナノ粒子に結合されたものであってもよい。
【００３９】
具体的には、前記第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び前記第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドは、どちらも敗血症第１原因菌特異的ゲノムの一部と相補的な５〜２０個のヌクレオチド配列を含み、第３ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第４ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドは、どちらも敗血症第２原因菌特異的ゲノムの一部と相補的な５〜２０個のヌクレオチド配列を含んでもよい。ここで、これらの配列は、互いに重ならないことが好ましく、互いに数個以内の配列が離隔して隣接する配列に相補的であることが好ましい。例えば、第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド、並びに第３ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第４ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドは、互いに連結されているか、それぞれ３個以内のヌクレオチド間隔で隣接して位置するものであってもよい。
【００４０】
例えば、敗血症第１原因菌特異的ゲノムが３０個のアミノ酸配列からなる場合、第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドは、前記敗血症第１原因菌特異的ゲノムの３’末端から５’末端の方向に１５個の配列にハイブリダイズするように、それと相補的な配列を含むように構成してもよい。さらに、第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドは、３’末端から５’末端の方向に１６番目の配列から１５個の配列、すなわち５’末端から３’末端の方向に１５個の配列にハイブリダイズするように、それと相補的な配列を含むように構成してもよい。ここで、第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの５’末端にチオール基を有するので、それにより直接又はリンカーを介して第１コア金ナノ粒子に結合することができる。一方、第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドは、３’末端にチオール基を有するので、それにより直接又はリンカーを介して第２コア金ナノ粒子に結合することができる。よって、ラマン活性分子は、第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの３’末端、又は第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの５’末端に結合されてもよく、直接又は１〜３個以内の配列からなるリンカーを介して連結されてもよいが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
以上のように構成し、第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドがＡ10−ＰＥＧ18をリンカーとして含む場合、金ナノ粒子が約１５ｎｍの間隔で離隔して結合された二量体が得られ、それに反応時間及び／又は条件を調節して銀又は金シェルを５ｎｍの厚さで形成すると、５ｎｍのナノギャップを有し、前記ナノギャップにラマン活性分子が位置する金コア−銀又は金シェル二量体が得られる。前記リンカーは、ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドがコア金ナノ粒子の表面で横にならず、直立した形態で位置するように導入されたものであり、これらのリンカーは表面に付着しているので、コア金ナノ粒子間の距離にほとんど影響を及ぼさない。
【００４２】
例えば、前記第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び前記第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドは、どちらも敗血症第１原因菌特異的ゲノムの一部と相補的な５〜２０個のヌクレオチド配列を含み、第３ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第４ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドは、どちらも敗血症第２原因菌特異的ゲノムの一部と相補的な５〜２０個のヌクレオチド配列を含み、これらの配列は互いに重ならず、第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド、並びに第３ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第４ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドは、敗血症原因菌ゲノムに結合する際に、互いに直接隣接、すなわち連続的に結合するか、１〜３個のヌクレオチド間隔で離隔して位置するが、これらに限定されるものではない。
【００４３】
前記第１ラマン活性分子又は前記第２ラマン活性分子は、有機蛍光分子であってもよい。例えば、ＦＡＭ（6-carboxyfluorescein; 6-FAM）、Ｄａｂｃｙｌ（４−（（４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ）ａｚｏ）ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ又は４−（（４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ）ａｚｏ）ｂｅｎｚｏａｔｅ）、ＴＲＩＴ（テトラメチルローダミンイソチオール）、ＮＢＤ（７−ニトロベンゾ−２−１，３−ジアゾール）、テキサスレッド（Texas Red）染料、フタル酸、テレフタル酸、イソフタル酸、クレシルファーストバイオレット、クレシルブルーバイオレット、ブリリアント（brilliant）クレシルブルー、パラ−アミノ安息香酸、エリスロシン、ビオチン、ジゴキシゲニン（digoxigenin）、５−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、５−カルボキシ−２’，４’，５’，７’−テトラクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン、６−カルボキシローダミン、６−カルボキシテトラメチルアミノフタロシアニン、アゾメチン、シアニン、キサンチン、スクシニルフルオレセイン、アミノアクリジン、量子ドット、カーボンナノチューブ、炭素同素体、シアン化物、チオール、クロリン、臭素、メチル、リン、硫黄、シアニン染料（Ｃｙ３，Ｃｙ３．５，Ｃｙ５）及びローダミン（Rhodamine）からなる群から選択されてもよい。ここで、多重原因菌の同時検出を容易にするために、第１又は第２ラマン活性分子として互いに異なるもの、例えばラマンスペクトルの重複がないものを組み合わせて選択してもよい。一方、前記有機蛍光分子は、ラマン信号だけでなく、蛍光信号を発生するので、蛍光信号による遮蔽を最小限に抑えるために、蛍光収率の低い物質を選択してもよいが、これに限定されるものではない。
【００４４】
本発明の敗血症診断のための情報提供方法において、前記第４ステップで測定したラマン活性分子のラマン信号が、同じサイズの金コア−銀又は金シェルナノ粒子に標識された同じラマン活性分子から測定したラマン信号に比べて、大幅に増加した場合、第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと相補的な配列をゲノムに含む敗血症原因菌に感染したと判断することができる。
【００４５】
個体から採取した試料から分離した試料中に含まれる敗血症原因菌特異的ゲノムが前記第１コア金ナノ粒子及び前記第２コア金ナノ粒子に結合されたオリゴヌクレオチドと相補的な配列を含んでハイブリダイズ可能であれば、第１コア金ナノ粒子及び第２コア金ナノ粒子は、それに結合されたオリゴヌクレオチド及びそれにハイブリダイズされた敗血症原因菌特異的ゲノムを介して連結されてダンベル状の二量体を形成するが、ここで、前記第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと前記第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドのいずれかは金ナノ粒子に結合していない他末端に位置し、第１ラマン活性分子は第１コア金ナノ粒子と第２コア金ナノ粒子の中間に位置する。よって、前記形成された二量体に銀又は金シェルを形成すると、両側のナノ粒子間の間隔は徐々に狭くなり、前記シェルの厚さを調節することにより、ナノ粒子間の間隔が０．５〜１０ｎｍ、具体的には０．５〜５ｎｍ、より具体的には０．５〜３ｎｍの狭いナノギャップを有するように調節することができる。このように形成された最終構造物は、数ｎｍのナノギャップを有し、前記ナノギャップにラマン活性分子が位置するオリゴヌクレオチドの相補的な結合により連結された金コア−銀又は金シェル構造の粒子が形成されるので、金コア−銀又は金シェル構造の粒子間のナノギャップに位置するラマン活性分子は、適切な波長の光を照射するとラマン信号を発生するが、ここで、発生するラマン信号は〜１０10倍以上増強された信号を示すため、ラマン分光法で微量のゲノムも検出することができ、何よりも血液培養検査に比べて非常に短時間で原因菌の種類まで区分することができるので、敗血症の迅速な診断及びそれによる適切な抗生剤の初期処方が可能になる。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明の理解を容易にするために好ましい実施例を提示する。しかし、これらの実施例は本発明の理解を容易にするために提供するものにすぎず、本発明がこれらにより限定されるものではない。
【実施例１】
【００４７】
ラマン活性分子（Ｃｙ３）が２つのナノ粒子の接合部に位置する金コア−銀シェルナノ粒子の作製
ラマン活性金コア−銀シェル二量体の合成は、ターゲットオリゴヌクレオチドが結合された金ナノ粒子と、それに追加して銀前駆体の量により調節される銀シェルを形成するＤＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｂｒｉｄｇｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄにより行った。
【００４８】
まず、保護（protecting）及びターゲット捕捉（target capturing）オリゴヌクレオチド配列のモル比の正確な調節及び効果的な精製ステップにより、ターゲット（target）オリゴヌクレオチドを有して高度に精製された金ナノ粒子二量体構造を得た。具体的には、大腸菌（Escherichia coli）のゲノムの一部である配列番号１で表される４０個の塩基（５’−ＧＣＣＧＣＣＴＴＧＣＣＡＧＧＣＡＴＴＧＡＣＴＴＣＧＡＣＡＴＣＡＴＣＧＴＡＡＴＡＴ−３’；Ｔm＝６７．６℃）を含むターゲットオリゴヌクレオチドを選択し、それを検出できるように、ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドがそれぞれ配列番号２及び３で表される塩基配列を含むように考案した（配列番号２；プローブＡ；５’−ＴＣＡＡＴＧＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＣＧＧＣ／ｉＳｐ９／Ａ３０／ＳＨ−３’；Ｔm＝６４．２℃，配列番号３；プローブＢ；５’−ＨＳ／Ａ３０／ｉＳｐ９／ＡＴＡＴＴＡＣＧＡＴＧＡＴＧＴＣＧＡＡＧＡＡＡ／ラマン活性分子／−３’；Ｔm＝５４．２℃）。保護オリゴヌクレオチドは、前記ターゲットオリゴヌクレオチドとの結合を遮断するように任意の配列で構成した（配列番号４；保護Ａ；５’−ＧＡＣＣＴＧＡＡＴＡＡＣＣＣＴ／ｉＳｐ９／Ａ１０／ＳＨ−３’；Ｔm＝５０．４℃，配列番号５；保護Ｂ；５’−ＨＳ／Ａ１０／ｉＳｐ９／ＧＡＴＣＧＴＣＧＴＣＴＡＣＣＧ−３’；Ｔm＝６１．０℃）。
【００４９】
依然として金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）表面とラマン活性分子間の最大間隔距離（d; gap distance）が７ｎｍに達するので、増幅された電磁気的増強を得るために間隔を小さくする必要があった。一方、ＳＥＲＳ検出において銀は金に比べて数倍の効果があるので、銀ナノシェルを導入してシェル表面とラマン活性分子との距離を調節した。ここで、ラマン活性分子としてＣｙ３、Ｄａｂｃｙｌ、ＦＡＭなどの蛍光波長及び／又は強度が異なる様々な有機蛍光分子を交換してテストした。その結果、蛍光強度が高いＣｙ３に比べて多少蛍光が弱いＤａｂｃｙｌを導入すると、蛍光によるラマン信号の遮蔽が低減するので、ラマン信号検出に有利であることが確認された。
【００５０】
具体的には、増幅されたＳＥＲＳ信号を作製すべく、ナノ粒子間の間隔距離を減らすために、銀ナノシェルの厚さを従来の公知の改質方法（非特許文献２）によりナノメートルレベルで調節し、金ナノ粒子二量体の表面をコーティングした。０．３Ｍ ＰＢＳ溶液内にて、安定化剤としての１００μＬのポリ（ビニル）ピロリドン、及び還元剤としての５０μＬのＬ−アスコルビン酸ナトリウム（１０-1Ｍ）の存在下で、金ナノ粒子二量体溶液２５０μＭを様々な量のＡｇＮＯ3（１０-3Ｍ）と常温で３時間反応させた。〜３ｎｍ、〜５ｎｍ、〜１０ｎｍの銀シェル厚さを有する金コア−銀シェルヘテロ二量体ナノ粒子は、それぞれ３０μＬ、４０μＬ、７０μＬのＡｇＮＯ3溶液（１０-3Ｍ）を用いて合成した。前記方法により、銀シェル厚さを〜３ｎｍ、〜５ｎｍ、〜１０ｎｍなどのナノ単位に好適に調節すると、ターゲットオリゴヌクレオチドと結合された金コア−銀シェルヘテロ二量体構造が得られた。
【００５１】
典型的な合成方法により、１つのターゲット捕捉オリゴヌクレオチド配列が金ナノ粒子の表面に改質されるように調節するために、プローブＡにおける金ナノ粒子（２０ｎｍ）を２種類の、プローブＡ及び保護Ａの３’末端がチオール改質されたオリゴヌクレオチド配列で官能化（functionalize）した。プローブＢにおける金ナノ粒子（４０ｎｍ）も２種類の、プローブＢ及び保護Ｂの５’末端がチオール改質されたオリゴヌクレオチド配列で官能化した。２種類の配列のモル比は、金ナノ粒子の表面のオリゴヌクレオチドのナノ粒子サイズ依存的ローディング（loading）能力に基づいて、保護オリゴヌクレオチド：ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの比がプローブＡにおいて１３２：１、プローブＢにおいて２６６：１になるように調節した。具体的には、プローブＡの金ナノ粒子とプローブＢのナノ粒子がクラスターでない１：１で結合された二量体を形成するように、保護オリゴヌクレオチドの使用量を調節して実験し、直径１５ｎｍのサイズの粒子における保護オリゴヌクレオチド：ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの比を９９：１に設定し、粒子のサイズに応じて比例的に調節することにより、多量体形成を遮断し、二量体を作製できることが確認された。重要なことには、プローブＢにおけるターゲット捕捉オリゴヌクレオチド配列は、ラマンタグとして機能するラマン活性分子Ｃｙ３を末端に結合した。また、オリゴヌクレオチド改質されたプローブＡ及びＢは、ターゲット捕捉分子配列（target capturing sequence）が結合されていないモノマー粒子を除去するために、磁気（magnetic）分離技術により精製した。マグネチックビーズ（直径１μｍ，インビトロゲン）のトシル（tosyl）基は、アミン改質されたオリゴヌクレオチド相補的配列により、それぞれプローブＡ又はＢのターゲット捕捉配列に置換して結合された。ターゲット捕捉配列に結合されている金ナノ粒子のみマグネチックビーズにより分離することができた。次に、精製したプローブＡ及びＢ溶液は、０．３Ｍ ＰＢＳ内の十分な量のターゲットオリゴヌクレオチド配列にハイブリダイズした。
【実施例２】
【００５２】
コア粒子の形態による正確度の向上
測定の正確度を向上させるために、サイズが調節された２種の完全な球形の金ナノ粒子をコアとして選択した。合成には、成均館大学校のイ・ギラ教授研究チームにより提示された方法を用いた（非特許文献３）。具体的には、作製する球形粒子より大きいサイズの８面体を初期粒子として合成し、それをエッチングして真円度（circularity）０．９４以上を有する完全な球形の金ナノ粒子を準備した。合成に用いられるＣＴＡＢ（cetyl trimethylammonium bromide）により、粒子が凝集したり、粒子表面でのチオール基によるＤＮＡの導入に不利であるため、ツイーン２０などの界面活性剤などで処理して負のゼータ電位を有するように表面を改質した。
【実施例３】
【００５３】
敗血症診断のためのターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの選択
敗血症診断のためのターゲットオリゴヌクレオチドは、敗血症を引き起こすことが知られている代表的な菌株である大腸菌、肺炎桿菌（Klepsiella pneumoniae）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、エンテロコッカス・フェカリス菌（Enterococcus faecalis）及び緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）のゲノムから選択した。
【００５４】
前述した５種の菌株のゲノムから選択した少なくとも２種のそれぞれ４０〜１１５個の塩基を含むターゲットオリゴヌクレオチドと特異的に結合するように、２〜１２個のターゲット捕捉オリゴヌクレオチド対を選択した。具体的には、大腸菌に対して実施例１に用いた配列番号２及び３で表されるオリゴヌクレオチド以外に、配列番号６及び７（配列番号６；５’−ＴＴＴＴＧＧＣＡＡＣＡＧＧＧＣＴＡＧＧＴ−３’，配列番号７；５’−ＴＡＡＴＡＴＣＣＴＧＴＣＧＡＡＡＡＴＣＣＴ−３’）で表される配列対をさらにテストした。
【００５５】
さらに、肺炎桿菌（ＫＰ）、黄色ブドウ球菌（ＳＡ）、エンテロコッカス・フェカリス菌（ＥＦ）及び緑膿菌（ＰＡ）のゲノム検出のために考案したそれぞれ配列番号８〜１９（全６対）、２０〜２７（全４対）、２８〜５１（全１２対）及び５２〜５９（全４対）で表される一連のターゲット捕捉オリゴヌクレオチド対を用いてテストした。それぞれの配列は次の通りである。
配列番号８；５’−ＧＧＧＡＴＡＴＣＴＧＡＣＣＡＧＴＣＧＧＧ−３’
配列番号９；５’−ＧＡＡＴＴＡＡＡＡＡＡＣＡＧＧＡＡＡＴＣ−３’
配列番号１０；５’−ＡＧＧＴＣＡＡＣＡＡＴＧＣＴＧＣＧＧＡＴ−３’
配列番号１１；５’−ＣＴＧＣＡＧＡＡＡＣＡＣＴＧＴＡＣＧＴＣ−３’
配列番号１２；５’−ＧＴＡＣＴＴＣＧＣＡＡＡＴＣＴＣＡＡＣＧ−３’
配列番号１３；５’−ＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＴＣＡＡＡＧＣＧＡＡ−３’
配列番号１４；５’−ＴＴＡＡＣＴＧＣＣＣＴＡＣＡＣＴＧＧＴＧ−３’
配列番号１５；５’−ＧＡＣＡＡＴＧＴＣＧＧＴＡＡＡＧＴＴＡＡ−３’
配列番号１６；５’−ＧＴＴＡＡＣＴＧＣＣＣＴＡＣＡＣＴＧＧＴＧ−３’
配列番号１７；５’−ＣＡＡＧＧＴＣＴＴＴＴＧＧＧＧＴＴＡＴＣＧ−３’
配列番号１８；５’−ＧＧＴＡＣＣＡＧＡＧＧＴＣＴＣＧＴＡＡＡ−３’
配列番号１９；５’−ＣＡＧＡＧＧＴＣＴＣＧＴＡＡＡＡＣＴＧＡ−３’
配列番号２０；５’−ＴＣＡＣＡＡＡＣＡＧＡＴＡＡＴＧＧＣＧＴ−３’
配列番号２１；５’−ＡＡＡＴＡＧＡＡＧＴＧＧＴＴＣＴＧＡＡＧ−３’
配列番号２２；５’−ＣＴＡＴＧＡＴＴＧＴＧＧＴＡＧＣＣＡＴＣ−３’
配列番号２３；５’−ＡＴＴＡＴＴＧＴＡＧＧＴＧＴＡＴＴＡＧＣ−３’
配列番号２４；５’−ＣＧＡＡＣＴＡＡＡＧＣＴＴＣＧＴＴＴＡＣＣ−３’
配列番号２５；５’−ＣＣＡＣＧＴＣＣＡＴＡＴＴＴＡＴＣＡＧＴ−３’
配列番号２６；５’−ＣＡＡＴＧＴＴＣＴＡＣＣＡＴＡＧＣＧＡＴ−３’
配列番号２７；５’−ＣＡＴＡＣＧＡＴＣＴＴＴＡＣＴＴＡＴＣＣ−３’
配列番号２８；５’−ＧＣＴＴＣＴＴＴＣＣＴＣＣＣＧＡＧＴＧＣ−３’
配列番号２９；５’−ＴＴＧＣＡＣＴＣＡＡＴＴＧＧＡＡＡＧＡＧ−３’
配列番号３０；５’−ＧＡＡＧＡＡＣＡＡＧＧＡＣＧＴＴＡＧＴＡ−３’
配列番号３１；５’−ＡＣＴＧＡＡＣＧＴＣＣＣＣＴＧＡＣＧＧＴ−３’
配列番号３２；５’−ＴＧＧＴＴＡＡＡＣＴＴＴＴＴＧＣＣＴＴＡ−３’
配列番号３３；５’−ＣＧＡＧＣＧＡＡＧＡＴＣＡＴＴＧＧＣＡＣ−３’
配列番号３４；５’−ＴＴＴＴＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＧＧＴＧＡＣ−３’
配列番号３５；５’−ＣＡＴＡＴＡＧＴＣＴＡＡＧＡＡＧＧＣＴＴ−３’
配列番号３６；５’−ＡＡＴＧＴＡＡＴＡＡＴＴＧＧＴＴＣＡＴＡ−３’
配列番号３７；５’−ＣＣＣＴＧＧＧＴＡＡＡＴＡＧＧＴＧＣＴＧ−３’
配列番号３８；５’−ＧＧＡＡＴＴＴＣＧＴＴＣＣＣＧＴＴＡＣＴ−３’
配列番号３９；５’−ＡＴＡＣＣＡＧＴＴＣＧＣＡＡＡＡＡＧＣＡ−３’
配列番号４０；５’−ＡＣＧＡＴＣＣＧＡＡＡＡＣＣＴＴＣＴＴＣ−３’
配列番号４１；５’−ＧＴＣＣＡＴＴＧＣＣＧＡＡＧＡＴＴＣＣＣ−３’
配列番号４２；５’−ＣＴＴＴＣＧＡＧＣＣＴＣＡＧＣＧＴＣＡＧ−３’
配列番号４３；５’−ＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣＴＧＴＴＴ−３’
配列番号４４；５’−ＧＴＧＴＡＴＴＡＧＧｔＧＡＡＧＧＴＧＴＴ−３’
配列番号４５；５’−ＴＧＡＴＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＧＧＴＧ−３’
配列番号４６；５’−ＧＡＡＡＴＣＧＴＣＧＴＡＡＴＡＡＡＣＣＧ−３’
配列番号４７；５’−ＣＡＡＧＡＡＡＴＣＧＴＣＧＴＡＡＴＡＡＡ−３’
配列番号４８；５’−ＧＧＡＡＴＴＧＡＡＧＧＴＡＴＴＴＴＡＡＡ−３’
配列番号４９；５’−ＡＴＴＡＡＣＧＣＴＡＧＧＡＧＡＧＣＣＧＧ−３’
配列番号５０；５’−ＣＧＡＣＴＡＴＴＴＡＣＡＡＧＴＴＣＧＣＣＣ−３’
配列番号５１；５’−ＡＴＴＴＡＣＡＡＧＴＴＣＧＣＣＣＡＧＡＧ−３’
配列番号５２；５’−ＣＡＧＣＧＧＴＡＣＧＴＣＣＴＴＧＡＣＣＡ−３’
配列番号５３；５’−ＧＣＣＡＧＡＣＡＴＧＴＡＣＧＴＣＧＧＣＣ−３’
配列番号５４；５’−ＧＴＴＴＣＣＡＧＴＧＣＧＴＧＧＴＡＣＴＧ−３’
配列番号５５；５’−ＧＡＣＧＡＡＧＡＣＧＴＡＣＡＧＣＧＧＣＣ−３’
配列番号５６；５’−ＧＣＧＣＴＣＡＧＴＣＡＧＧＡＡＡＧＣＡＴ−３’
配列番号５７；５’−ＣＧＡＣＡＡＧＡＡＧＧＣＧＣＴＣＡＧＴＣ−３’
配列番号５８；５’−ＧＡＣＣＴＧＧＣＡＧＴＧＣＡＴＴＣＴＴＣ−３’
配列番号５９；５’−ＧＴＣＡＴＴＣＧＣＡＧＴＧＧＴＣＣＣＴＧ−３’
【００５６】
各菌株を培養し、その後ｇＤＮＡ（genomic DNA）を分離してＰＣＲで増幅する一連の過程を経て、前述したように考案したターゲット捕捉オリゴヌクレオチド対を用いた各菌株の検出により敗血症診断における適合性を確認した。
【００５７】
さらに、それらを代表して、大腸菌による敗血症患者においてｇＤＮＡ確認のためのターゲットオリゴヌクレオチドの適合性を再度確認した。まず、血液培養検査で大腸菌が検出された検体によりターゲットオリゴヌクレオチドの感度を確認した。また、血液培養検査では大腸菌が確認されなかったが、組織検査で大腸菌感染が確認された敗血症患者の検体によりターゲットオリゴヌクレオチドの感度を確認した。
【図１】
2020525038.tif 000003
【配列表】
2020525038000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年3月6日(2020.3.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
敗血症第１原因菌特異的ゲノムの一部と相補的に結合する第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドが一末端を介して結合された第１コア金ナノ粒子と、
敗血症第１原因菌特異的ゲノムの他の一部と相補的に結合する第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドが一末端を介して結合された第２コア金ナノ粒子と、
安定化剤、還元剤及び銀又は金イオンを含む溶液とを含む敗血症診断用キットであって、
前記第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと前記第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドのいずれかは、金ナノ粒子に結合していない他末端に第１ラマン活性分子が結合されたものである敗血症診断用キット。
【請求項２】
前記敗血症第１原因菌とは異なる敗血症第２原因菌特異的ゲノムの一部と相補的に結合する第３ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドが一末端を介して結合された第３コア金ナノ粒子と、敗血症第２原因菌特異的ゲノムの他の一部と相補的に結合する第４ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドが一末端を介して結合された第４コア金ナノ粒子を少なくとも１対さらに含むことにより、複数の敗血症原因菌を同時に診断することができ、前記第３ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと前記第４ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドのいずれかは、金ナノ粒子に結合していない他末端に第２ラマン活性分子が結合されたものである、請求項１に記載の敗血症診断用キット。
【請求項３】
前記第３コア金ナノ粒子及び前記第４コア金ナノ粒子は、それぞれ第１コア金ナノ粒子と第２コア金ナノ粒子のいずれか一方及び他方とサイズが同一であるか、又は全て独立したものである、請求項２に記載の敗血症診断用キット。
【請求項４】
前記第１コア金ナノ粒子及び／又は前記第３コア金ナノ粒子は、それぞれ独立して１０〜５０ｎｍの平均直径を有し、前記第２コア金ナノ粒子及び／又は前記第４コア金ナノ粒子は、それぞれ第１コア金ナノ粒子及び第３コア金ナノ粒子の１〜２倍の平均直径を有する、請求項１又は２に記載の敗血症診断用キット。
【請求項５】
前記第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと前記第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド、及び／又は第３ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと第４ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドは、それらに含まれる塩基数が同一であるか、±５個以内の差であり、第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの塩基数の合計、並びに／又は第３ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第４ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの塩基数の合計は、それぞれ独立して１５〜１００である、請求項１又は２に記載の敗血症診断用キット。
【請求項６】
前記第１コア金ナノ粒子及び／又は前記第３コア金ナノ粒子のサイズが２０ｎｍであれば、それぞれ第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの塩基数の合計、並びに／又は第３ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第４ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの塩基数の合計が３０であることを基準に、第１コア金ナノ粒子のサイズと第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの塩基数の合計、並びに／又は第３コア金ナノ粒子のサイズと第３ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第４ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドの塩基数の合計は、互いに比例する、請求項１又は２に記載の敗血症診断用キット。
【請求項７】
前記第１コア金ナノ粒子〜前記第４コア金ナノ粒子は、標準偏差±０．０５以下の真円度（circularity）０．９〜１．０を有する球形である、請求項１又は２に記載の敗血症診断用キット。
【請求項８】
前記敗血症第１原因菌及び／又は前記敗血症第２原因菌は、それぞれ独立して大腸菌（Escherichia coli）、肺炎桿菌（Klepsiella pneumoniae）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）、エンテロコッカス・フェカリス菌（Enterococcus faecalis）及び緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の敗血症診断用キット。
【請求項９】
第１コア金ナノ粒子、第２コア金ナノ粒子、第３コア金ナノ粒子及び／又は第４コア金ナノ粒子は、それぞれ独立して２０〜１００ｎｍの直径を有する完全球形粒子である、請求項１又は２に記載の敗血症診断用キット。
【請求項１０】
前記第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと前記第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドのいずれか一方は５’末端を介して、他方は３’末端を介して、それぞれ第１コア金ナノ粒子及び第２コア金ナノ粒子に結合されたものである、及び／又は第３ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと第４ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドのいずれか一方は５’末端を介して、他方は３’末端を介して、それぞれ第３コア金ナノ粒子及び第４コア金ナノ粒子に結合されたものである、請求項１又は２に記載の敗血症診断用キット。
【請求項１１】
前記第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び前記第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドは、どちらも敗血症第１原因菌特異的ゲノムの一部と相補的な５〜２０個のヌクレオチド配列を含み、及び／又は、第３ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第４ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドは、どちらも敗血症第２原因菌特異的ゲノムの一部と相補的な５〜２０個のヌクレオチド配列を含み、これら配列は、互いに重ならず、第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド、並びに／又は第３ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第４ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドは、それぞれ０〜３個のヌクレオチド間隔で隣接して位置する、請求項１又は２に記載の敗血症診断用キット。
【請求項１２】
前記第１ラマン活性分子又は前記第２ラマン活性分子は、互いに異なる波長でラマン信号を示す有機蛍光分子である、請求項１又は２に記載の敗血症診断用キット。
【請求項１３】
前記第１ラマン活性分子及び／又は前記第２ラマン活性分子は、低い蛍光信号を示す、請求項１又は２に記載の敗血症診断用キット。
【請求項１４】
敗血症発症の疑いのある個体から採取した検体から分離したゲノムを含む試料を準備する第１ステップと、
前記第１ステップで準備した試料を、敗血症原因菌特異的ゲノムの一部と相補的に結合する第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドが一末端を介して結合された第１コア金ナノ粒子、及び敗血症原因菌特異的ゲノムの他の一部と相補的に結合する第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドが一末端を介して結合された第２コア金ナノ粒子と反応させる第２ステップ（ここで、前記第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと前記第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドのいずれかは、金ナノ粒子に結合していない他末端にラマン活性分子が結合されたものである）と、
前記第２ステップの生成物を、安定化剤、還元剤及び銀又は金イオンを含む溶液と反応させ、第１コア金ナノ粒子及び第２コア金ナノ粒子上に同時に銀又は金からなる第１シェル及び第２シェルをそれぞれ形成する第３ステップと、
前記第３ステップで得られた生成物のラマン活性分子のラマン信号を測定する第４ステップとを含む、敗血症診断のための情報提供方法。
【請求項１５】
前記敗血症原因菌は、大腸菌（Escherichia coli）、肺炎桿菌（Klepsiella pneumoniae）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）、エンテロコッカス・フェカリス菌（Enterococcus faecalis）及び緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）からなる群から選択される、請求項１４に記載の情報提供方法。
【請求項１６】
第４ステップで測定したラマン活性分子のラマン信号が、同じサイズの金コア−銀又は金シェルナノ粒子に標識された同じラマン活性分子から測定したラマン信号に比べて、大幅に増加した場合、第１ターゲット捕捉オリゴヌクレオチド及び第２ターゲット捕捉オリゴヌクレオチドと相補的な配列をゲノムに含む敗血症原因菌に感染したと判断する、請求項１４に記載の情報提供方法。
【請求項１７】
前記第３ステップは、第１シェルと第２シェル間の最も短い距離が０．５〜１０ｎｍになるまで行う、請求項１４に記載の情報提供方法。
【国際調査報告】
2020525038.tif 000004
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