(57)【要約】【課題】  調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を誘導するビフィドバクテリウムビフィダム、ビフィドバクテリウムビフィダムから由来した多糖体、及び多糖体を生産するプロバイオティック菌株を提供する。【解決手段】β−１−６−グルカンを有効成分として含有する多糖体、β−１−６−グルカンを生産するプロバイオティック菌株、前記多糖体又は菌株を有効成分として含有する免疫疾患又は炎症性疾患の改善用食品及び治療剤、前記多糖体又は菌株を処理して誘導調節Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）を製造する方法、及びこれによって製造された誘導調節Ｔ細胞を含む免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療用細胞治療剤に関する。【選択図】  図１５
2020525570.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−１−６−グルカンを有効成分として含有する多糖体。
【請求項２】
β−１−４−ガラクタン、β−１−６−ガラクタン又はβ−ガラクトフラナンをさらに含有することを特徴とする、請求項１に記載の多糖体。
【請求項３】
前記β−１−６−グルカン、β−１−４−ガラクタン、β−１−６−ガラクタン及びβ−ガラクトフラナンの含有量比（モル比）は、５〜５０：２〜１５：２〜１５：１〜５であることを特徴とする、請求項２に記載の多糖体。
【請求項４】
前記多糖体は、分子量が３〜５ｋＤａ又は１００ｋＤａ以下の混合物であることを特徴とする、請求項１に記載の多糖体。
【請求項５】
前記多糖体の電荷は中性であることを特徴とする、請求項１に記載の多糖体。
【請求項６】
前記多糖体は調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を誘導することを特徴とする、請求項１に記載の多糖体。
【請求項７】
前記調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞であることを特徴とする、請求項６に記載の多糖体。
【請求項８】
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ由来であることを特徴とする、請求項１に記載の多糖体。
【請求項９】
β−１−６−グルカンを生産するプロバイオティック菌株。
【請求項１０】
前記プロバイオティック菌株はＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍであることを特徴とする、請求項９に記載の菌株。
【請求項１１】
前記菌株は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＰＲＩ１（ＫＣＴＣ１３２７０ＢＰ）、又は前記Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＰＲＩ１と塩基配列相同性が９９％以上であることを特徴とする、請求項９に記載の菌株。
【請求項１２】
調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を誘導することを特徴とする、請求項９に記載の菌株。
【請求項１３】
前記調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）はＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞であることを特徴とする、請求項１２に記載の菌株。
【請求項１４】
請求項１の多糖体又は請求項９の菌株を有効成分として含有する、免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１の多糖体又は請求項９の菌株を有効成分として含有する、免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は改善用食品。
【請求項１６】
（ａ）樹状細胞（ＤＣ；Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）に請求項１の多糖体又は請求項９の菌株を処理して調節樹状細胞（ｒＤＣ）を得る段階と、
（ｂ）前記ｒＤＣをＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養して調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を誘導する段階と、
を含む、誘導調節Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）の製造方法。
【請求項１７】
前記調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞であることを特徴とする、請求項１６に記載の誘導調節Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）の製造方法。
【請求項１８】
前記（ｂ）段階は、抗−ＣＤ３抗体、ＩＬ−２及びＴＧＦ−βで刺激して調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を誘導することを特徴とする、請求項１６に記載の誘導調節Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）の製造方法。
【請求項１９】
前記樹状細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）由来であることを特徴とする、請求項１６に記載の誘導調節Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）の製造方法。
【請求項２０】
請求項１６の製造方法で製造された誘導調節Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）を有効成分として含有する、免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療用細胞治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を誘導するビフィドバクテリウムビフィダム、ビフィドバクテリウムビフィダムから由来した多糖体、及び多糖体を生産するプロバイオティック菌株に関し、より詳細には、β−１−６−グルカンを有効成分として含有する多糖体、β−１−６−グルカンを生産するプロバイオティック菌株、前記多糖体又は菌株を有効成分として含有する免疫疾患又は炎症性疾患の改善用食品及び治療剤、前記多糖体又は菌株を処理して誘導調節Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）を製造する方法、及びこれによって製造された誘導調節Ｔ細胞を含む免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療用細胞治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類の胃腸管には“マイクロビオタ（ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ）”を構成する多種多様な菌が共生する。マイクロビオタの変化は、アレルギー疾患、自己免疫及び胃腸管炎症障害のような様々な疾患と密接に関連している。無病原菌（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｆｒｅｅ；ＳＰＦ）マウスに比べて無菌（ｇｅｒｍ  ｆｒｅｅ；ＧＦ）マウスはリンパ組織の形成及び免疫反応に異常反応を示し（Ｍａｃｐｈｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４：４７８−４８５，２００４）、このような現象は共生微生物の導入によって解決することができる（Ｍａｚｍａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １２２：１０７−１１８，２００５）。腸内微生物はＴヘルパー１７（Ｔｈ１７）細胞又は調節Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞（Ｉｖａｎｏｖ  ａｎｄ  Ｈｏｎｄａ，Ｃｅｌｌ  ｈｏｓｔ  ＆  ｍｉｃｒｏｂｅ  １２：４９６−５０８，２０１２；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ３：４−１４，２０１２）のようなＣＤ４Ｔ細胞の特定系統の発達と分化を調節する（Ａｔａｒａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３１：３３７−３４１，２０１１；Ｍａｃｐｈｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４：４７８−４８５，２００４；Ｒｏｕｎｄ  ａｎｄ  Ｍａｚｍａｎｉａｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９：３１３−３２３，２００９）。Ｔｒｅｇ細胞は抑制機能を持つＣＤ４＋Ｔ細胞の下位集合であり、転写因子Ｆｏｘｐ３の発現を特徴とする（Ｓ．Ｈｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９：１０５７−１０６１，２００３）。Ｔｒｅｇ細胞は一般的に胸腺（ｎＴｒｅｇ）に形成されるが、正常ＣＤ４＋細胞（ｐＴｒｅｇ）の周辺でも発生することがある。
【０００３】
最近では微生物群集の個別種が宿主の免疫成分を形成することが知られた。すなわち、ＴｒｅｇとＴｈ１７細胞は様々な抗原に対する宿主の免疫反応を調節する相互作用をする。例えば、切片繊維状バクテリア（ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉａ；ＳＦＢ）は、小腸でＴｈ１７細胞を強力に誘導し、これは全身性自己免疫を促進し、腸内病原菌に対する宿主耐性に重要な役割を担う（Ｇａｂｏｒｉａｕ−Ｒｏｕｔｈｉａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３１：６７７−６８９，２００９；Ｉｖａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １３９：４８５−４９８，２００９；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３２：８１５−８２７，２０１０）。これに対し、腸内菌叢を構成する菌株や一部プロバイオティックス菌株の一部は、マウス結腸においてＴｒｅｇ細胞の分化、蓄積及び機能に影響を与えるものと知られている（Ｔａｎｏｕｅ，Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６：２９５−３０９，２０１６）。転写因子Ｆｏｘｐ３（ｆｏｒｋｈｅａｄ  ｂｏｘ  Ｐ３）を発現するＣＤ４＋調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）は、他の臓器に比べて消化器プロプリア層（ｌａｍｉｎａ  ｐｒｏｐｒｉａ；ＬＰ）、特に大腸でより多く観察される（Ａｔａｒａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３１：３３７−３４１，２０１１）。粘膜Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇｓの数と機能は特定の腸内バクテリアの存在に影響を受けるといういくつかの研究がある。ＣｌｏｓｔｒｉｄｉａのＩＶ、ＸＩＶａ、及びＸＶＩＩＩクラスタに属する１７個菌株の混合物はマウス大腸においてＴｒｅｇ細胞の分化、蓄積及び機能を向上させた（Ａｔａｒａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５００：２３２−２３６，２０１３）。ビフィドバクテリア及びラクトバシリのプロバイオティック菌を毎日処理したマウスは、Ｔｒｅｇｓ誘導によってマウスの炎症状態を変形させる（Ｄｉ  Ｇｉａｃｉｎｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７４：３２３７−３２４６，２００５；Ｋａｒｉｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｃａｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １７９：１８６−１９３，２００９；Ｌｙｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ＆  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ４０：８１１−８１９，２０１０）。ヒト共生菌であるバクテロイデスフラジリスでマウスをコロニゼイションすると、Ｔｒｅｇ細胞を生産するＴｈ１及びＩＬ−１０を強化させる（Ｒｏｕｎｄ  ａｎｄ  Ｍａｚｍａｎｉａｎ，ＰＮＡＳ  １０７：１２２０４−１２２０９，２０１０；Ｔｅｌｅｓｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ６：２３４−２４２，２０１５）。以前の研究から、５種のプロバイオティック菌の混合物であるＩＲＴ５がＴｒｅｇ細胞を誘導して様々な免疫疾患を抑制できることを確認した（Ｃｈａｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  ７，ｅ５２１１９，２０１２；Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４６：２１７−２２７，２０１３；Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １０７：２１５９−２１６４，．２０１０）。しかし、Ｔｒｅｇ細胞生成の基本分子メカニズムはまだ不明である。多数の研究によれば、バクテリアが生産した代謝産物又は細胞壁成分がＴｒｅｇ細胞の分化を促進できるとされている。例えば、ブチレートはクロストリジアによって結腸Ｔｒｅｇ細胞を誘導する主要効果分子として報告された（Ｆｕｒｕｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５０４：４４６−４５０，２０１３）。Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓの双性イオン多糖類である多糖類Ａ（ＰＳＡ）はＴｒｅｇを生産するＩＬ−１０誘導に重要な効果免疫調節剤として確認された（Ｍａｚｍａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １２２：１０７−１１８，２００５；Ｏｃｈｏａ−Ｒｅｐａｒａｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １８５：４１０１−４１０８，２０１０）。患者に足りない主要微生物を投与すれば、調節障害微生物の不均衡（ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ）を復元することができる。例えば、健康な寄贈者の糞便微生物（ｆｅｃａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ；ＦＭＴ）を患者に移すことは胃腸病に有益な効果があると報告された。しかし、ＦＭＴは安全性の問題によってまだ一般の治療法として承認されていない。また、プロバイオティックスを含む十分な量の安全性保障バクテリアを服用すれば様々な免疫疾患を改善できると報告されている。しかし、有益な微生物は、患者の免疫状態によって変わり得る。一部の患者は過剰活性化された免疫反応（すなわち、アレルギー又は自己免疫疾患）を抑制しなければならないのに対し、一部の患者は免疫系を強化（すなわち、癌又はウイルス感染）させる必要がある。例えば、Ｔｈ１７−誘導プロバイオティックス菌であるビフィドバクテリウムをリウマチ性関節炎動物モデルに投与したとき、関節炎症状を悪化させた（Ｔｚｅ  Ｇｕａｎ  Ｔａｎ，１１３（５０）：Ｅ８１４１−Ｅ８１５０，２０１６）。したがって、有益な微生物の同定及びその作用因子のメカニズムを解明することは治療学的に非常に重要である。
【０００４】
生体内Ｔｒｅｇ細胞の強化は、自己免疫及びアレルギー疾患のような様々な過免疫疾患を調節することができる。本発明では、安定性の保障された微生物に誘導されたＴｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）細胞を向上させる目的で、プロバイオティック候補菌株を選別してＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＰＲＩ１を最上の候補として選択した。このバクテリアが食餌抗原又は共生反応性誘導調節Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ細胞）の生成を誘導できることを、無菌マウス（Ｇｅｒｍ  Ｆｒｅｅ  ｍｏｕｓｅ；ＧＦ  ｍｏｕｓｅ）システムを用いて証明した。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＰＲＩ１由来作用分子としては、代謝産物であるブチレート（Ｂｕｔｙｒａｔｅ）、アセテート（Ａｃｅｔａｔｅ）を含む。また、本発明は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＰＲＩ１から由来したベータグルカン／ガラクタン多糖体（ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｂｅｔａ  ｇｌｕｃａｎ／ｇａｌａｃｔａｎ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ＣＳＧＧ）が機能的に腸炎症を抑制することに関する。
【０００５】
そこで、本発明者らは、免疫調節及び炎症性免疫疾患に対して治療的潜在力を持つＴｒｅｇ細胞誘導メカニズムを明らかにするために鋭意努力した結果、選別されたプロバイオティックバクテリアのベータグルカン／ガラクタン多糖体（ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｂｅｔａ  ｇｌｕｃａｎ／ｇａｌａｃｔａｎ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ＣＳＧＧ）がｉＴｒｅｇ細胞の生成を誘導できる主要作用分子であることを見出した後、前記ＣＳＧＧによって誘導されたｉＴｒｅｇ細胞が大膓炎を抑制できることを確認し、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を誘導するβ−１−６−グルカンを有効成分として含有する多糖体及び該多糖体を生産するプロバイオティック菌株を提供することにある。
【０００７】
本発明の他の目的は、前記多糖体又は前記菌株を有効成分として含有する免疫調節用組成物を提供することにある。
【０００８】
本発明のさらに他の目的は、前記多糖体又は前記菌株を有効成分として含有する免疫疾患又は炎症性疾患の予防、治療又は改善用医薬組成物及び食品を提供することにある。
【０００９】
本発明のさらに他の目的は、前記多糖体又は前記菌株を有効成分として含有する組成物を投与することを含む免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療方法を提供することにある。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、前記多糖体又は前記菌株を有効成分として含有する組成物を免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療に使用する用途を提供することにある。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、前記多糖体又は前記菌株を有効成分として含有する免疫抑制剤又は免疫治療剤を提供することにある。
【００１２】
本発明のさらに他の目的は、前記多糖体又は前記菌株を用いた誘導調節Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）の製造方法を提供することにある。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、前記方法で製造された誘導調節Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）を有効成分として含有する免疫疾患又は炎症性疾患の予防、治療又は改善用細胞治療剤を提供することにある。
【００１４】
本発明のさらに他の目的は、前記方法で製造された誘導調節Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）を有効成分として含有する細胞治療剤を投与することを含む免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療方法を提供することにある。
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、前記方法で製造された誘導調節Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）を有効成分として含有する細胞治療剤を免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療に使用する用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記の目的を達成するために、本発明は、β−１−６−グルカンを生産する新規のプロバイオティック菌株を提供する。
【００１７】
本発明はまた、β−１−６−グルカンを有効成分として含有する多糖体を提供する。
【００１８】
本発明はまた、前記多糖体又は前記菌株を有効成分として含有する免疫調節用組成物を提供する。
【００１９】
本発明はまた、前記多糖体又は前記菌株を有効成分として含有する免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療用医薬組成物及び治療剤を提供する。
【００２０】
本発明はまた、前記多糖体又は前記菌株を有効成分として含有する免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は改善用食品を提供する。
【００２１】
本発明はまた、前記多糖体又は前記菌株を有効成分として含有する組成物を投与することを含む免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療方法を提供する。
【００２２】
本発明はまた、前記多糖体又は前記菌株を有効成分として含有する組成物を免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療に使用する用途を提供する。
【００２３】
本発明はまた、前記多糖体又は前記菌株を有効成分として含有する免疫抑制剤又は免疫治療剤を提供する。
【００２４】
本発明はまた、樹状細胞（ＤＣ；Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）に前記多糖体又は前記菌株を処理して調節樹状細胞（ｒＤＣ；ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌ）を得る段階；及び前記ｒＤＣをＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養して調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を誘導する段階；を含む誘導調節Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）の製造方法を提供する。
【００２５】
本発明はまた、前記方法で製造された誘導調節Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）を有効成分として含有する免疫疾患又は炎症性疾患の予防、治療又は改善用細胞治療剤を提供する。
【００２６】
本発明はまた、前記方法で製造された誘導調節Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）を有効成分として含有する細胞治療剤を投与することを含む免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療方法を提供する。
【００２７】
本発明はまた、前記方法で製造された誘導調節Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）を有効成分として含有する細胞治療剤を免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療に使用する用途を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍのモノコロニゼイション（ｍｏｎｏｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ）が結腸プロプリア層でＴｒｅｇ個体群（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を増加させることに関するものである。（Ａ）〜（Ｃ）は、ＧＦマウス、又はＬｐａ又はＢｂでコロニゼイションされたマウス大腸（ｃＬＰ）のＴｒｅｇ細胞においてＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋細胞、ＣＴＬＡ４＋及びＩＬ１０＋を流細胞分析法及び百分率分析で示すものである。（Ｄ）〜（Ｆ）は、バクテリアがコロニゼイションされたＧＦマウスの大腸においてＴｒｅｇ細胞の異なる種類の絶対数、代表的な流細胞分析プロット及び信号を示すものである。象限の数字は細胞比率を表し、グラフプロットの円は、各媒介変数に該当する個別マウスを表す。データは３〜５件の独立した実験を代表する（ｎ≧３マウス）。全てのグラフプロットは、平均±ＳＥＭを表す。＊  ｐ＜０．０５、＊＊  ｐ＜０．０１、＊＊＊  ｐ＜０．００１、＊＊＊＊  ｐ＜０．０００１（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ）。
【図２】Ｔｒｅｇ誘導バクテリアへのＢ．ｂｉｆｉｄｕｍ  ＰＲＩ１を確認したものである。（Ａ）〜（Ｂ）は、Ｔｒｅｇ誘導を促進するバクテリア菌株としてＢ．ｂｉｆｉｄｕｍ  ＰＲＩ１（Ｂｂ）を選択したものであり、選別された候補プロバイオティック菌株において代表的なＩＬ−１０／ＩＬ−１２サイトカイン比率（Ａ）及びＦｏｘｐ３発現（Ｂ）である。示されたコロニー形成単位（ｃｆｕ）力価を有するそれぞれのバクテリア菌株を全腸間膜リンパ節（ｍＬＮ）細胞と共に７２時間培養した後、サイトカインレベル又はＦｏｘｐ３発現をＥＬＩＳＡ又は流細胞分析法で分析した。（Ｃ）は、コロニゼイション３週後、ＤＮＡ−Ｃｙ５プローブ（ＥＵＢ３３８、赤色）でＨＩＳＴＯ−ＦＩＳＨ染色をしてＧＦマウスの腸の隙間におけるＢ．ｂｉｆｉｄｕｍ  ＰＲＩ１（Ｂｂ）の局所化を分析したものである。（Ｄ）は、ＧＦ、Ｂｂ−モノコロニゼイション（ｍｏｎｏｃｏｌｏｎｉｚｅｄ）（Ｂｂ）及びＳＰＦマウスの盲腸イメージ（左）及び盲腸重さ（右）を示すものである。（Ｅ）は、ＧＦ又はＢｂ−モノコロニゼイション（Ｂｂ）マウスの盲腸及び大便からブチレートとアセテートのレベルを測定したものである。（Ｆ）は、ＧＦマウス、ＳＦＢ又はＬｐａでモノコロニゼイションされたマウス、ＳＰＦマウスの大腸（ｃＬＰ）プロプリア層においてＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の流細胞分析プロットを示すものである。象限の数字は細胞比率を表し、グラフプロットの円は、各媒介変数に該当する個別マウスを表す。データは、３〜５件の独立した実験を代表する（ｎ≧３マウス）。（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ：Ｂｂ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ：Ｌａｃ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ：Ｌｃａ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ：Ｌｒｅ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ：Ｌｐａ，Ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉａ：ＳＦＢ）。全てのグラフプロットは、平均±ＳＥＭを表す。＊  ｐ＜０．０５、＊＊  ｐ＜０．０１、＊＊＊  ｐ＜０．００１（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ）。
【図３】Ｔｒｅｇ細胞の生成及び表現型に対するＢ．ｂｉｆｉｄｕｍのモノコロニゼイション（ｍｏｎｏｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ）の影響に関する。（Ａ）は、ＳＰＦ、ＧＦ又はＢｂ，ＳＦＢ又はＬｐａでモノコロニゼイションされたマウスの小腸のプロプリア層（ｓｉＬＰ）、ｍＬＮ、ｐＬＮ及び脾臓においてＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の頻度を示すものである。（Ｂ）及び（Ｃ）は、それぞれのバクテリアでモノコロニゼイションされたマウスのｃＬＰ又はｓｉＬＰにおいてＣＤ４＋ＣＤ１０３＋Ｆｏｘｐ３＋（Ｂ）及びＣＤ４＋ＣＤ４４ｈｉＣＤ６２ＬｌｏＦｏｘｐ３＋Ｔ細胞（Ｃ）の流細胞分析プロット及び頻度を百分率で示したものである。象限の数字は細胞比率を表し、グラフプロットの円は、各媒介変数に該当する個別マウスを表す。データは３〜５件の独立した実験を代表する（ｎ≧３マウス）。全てのグラフプロットは、平均±ＳＥＭを表す。＊  ｐ＜０．０５、＊＊  ｐ＜０．０１（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ）。
【図４】Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍのモノコロニゼイションが他のリンパ器官においてＴｒｅｇ個体群（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を増加させることを示す。ＧＦ、Ｂｂ又はＬｐａでモノコロニゼイション３週後のマウスのリンパ器官から細胞を分離した。（Ａ）及び（Ｂ）は、表示されたリンパ組織においてＨｅｌｉｏｓ−及びＮｒｐ１−Ｔｒｅｇ個体群の頻度を示すものである。（Ｃ）〜（Ｄ）は、ＧＦ又はＢｂ又はＬｐａでモノコロニゼイションされたマウスの表示された器官からＨｅｌｉｏｓ−Ｆｏｘｐ３＋（Ｃ）又はＲＯＲγｔ＋Ｈｅｌｉｏｓ−Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞（Ｄ）の流細胞分析プロット及び頻度を百分率で表示したものである。象限の数字は細胞比率を表し、グラフプロットの円は、各媒介変数に該当する個別マウスを表す。データは３〜５件の独立した実験を代表する（ｎ≧３マウス）。全てのグラフプロットは、平均±ＳＥＭを表す。＊  ｐ＜０．０５、＊＊  ｐ＜０．０１（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ）。
【図５】Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍのモノコロニゼイションがｐＴｒｅｇ細胞の新しい生成を促進することを示す。（Ａ）は、Ｂｂのモノコロニゼイション後、ｐＴｒｅｇ細胞の新しい生成分析のための実験的戦略を示すものである。（Ｂ）〜（Ｃ）は、ＣＤ４５．１＋Ｆｏｘｐ３ＧＦＰレポーターマウスから分類されたナイーブＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞をＧＦマウスに移し、Ｂｂで３週間モノコロニゼイションしたものである。Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ個体群は、ｃＬＰ（Ｂ）及びｓｉＬＰ（Ｃ）においてＧＦＰ発現から分析した。（Ｄ）は、表示されたリンパ器官においてＧＦＰ発現によるＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ個体群の頻度を測定したものである。（Ｅ）は、ＣＤ４５．１＋Ｆｏｘｐ３ＧＦＰレポーターマウスから分類されたナイーブＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞をＳＰＦマウスに移し、ｍｏｃｋ（ＰＢＳ）又はＢｂ（５ｘ１０８ｃｆｕ）を３週間一日おきに食餌して、ｃＬＰでＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞を分析したものである。データは３〜５件の独立した実験を代表する（ｎ≧３マウス）。全てのグラフプロットは、平均±ＳＥＭを表す。＊  ｐ＜０．０５、＊＊  ｐ＜０．０１（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ）。
【図６】Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍのコロニゼイションによる食餌抗原−及びマイクロビオタ反応性Ｔｒｅｇ細胞誘導に関する。（Ａ）及び（Ｂ）は、Ｔｈｙ１．１＋Ｆｏｘｐ３ＧＦＰマウスのＣＴＶ−標識されたナイーブＣＤ４＋ＯＴ−ＩＩ＋Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞を、ＧＦマウス又は１４日間プレコロニゼイションしたＧＦマウスに養子移入した後、７日間一日おきにＯＶＡ（２０ｍｇ）を食餌して、供与体（Ｔｈｙ１＋ＯＴ−ＩＩ）細胞のｃＬＰ  ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋個体群を分析したものである。ＦＡＣＳプロット（Ａ）及び生体内で生成されたＴｒｅｇ細胞の頻度（Ｂ）で表示した。（Ｃ）〜（Ｅ）は、ＣＢｉｒＴｇＣＤ４５．１＋Ｆｏｘｐ３ＧＦＰマウスから分類されたナイーブＣＤ４＋ＣＢｉｒ＋Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞をＳＰＦ  Ｒａｇ１−／−授与体に養子移入した後、実験終了時まで毎日Ｂｂ又はＰＢＳを食餌して、体重、大腸長さ及び組織病理の変化（それぞれＣ、Ｄ及びＥ）を測定して分析したものである。（Ｆ）〜（Ｇ）は、ｍｏｃｋ又はＢｂコロニゼイションマウスのｃＬＰ内のＣＢｉｒ＋ＣＤ４５．１＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞（Ｆ）及びＩＦＮ−γ＋細胞（Ｇ）の流細胞分析プロット及び頻度を示すものである。（Ｈ）は、ＧＦ又はＢｂ−ＧＦマウスの大腸ＣＤ４＋細胞を分類してＣＴＶで標識した後、ＧＦ、Ｂｂ又はＬｐａコロニゼイションマウスの排泄物抗原存在下でＴ細胞の除去された脾臓ＡＰＣと共に培養して、３日後、表示された抗原に対する反応するＴｒｅｇ細胞の相対的な増殖をＦＡＣＳで分析したものである。（Ｉ）は、ＧＦマウスと比較して、Ｂｂモノコロニゼイションマウスの大腸、ｍＬＮ及び脾臓のＴｒｅｇでＴＣＲ−ＣＤＲ３領域のα鎖固有の４３個及びβ鎖固有の６１個の頻度分布を示すものである。象限の数字は細胞比率を表し、グラフプロットの円は、各媒介変数に該当する個別マウスを表す。データは、３〜５件の独立した実験を代表する（ｎ≧３マウス）。全てのバーグラフは平均±ＳＥＭを表す。＊  ｐ＜０．０５、＊＊  ｐ＜０．０１、＊＊＊  ｐ＜０．００１（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ）。
【図７】Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍのコロニゼイションによる食餌抗原−及びマイクロビオタ反応性Ｔｒｅｇ細胞誘導に関する。（Ａ）は、ＧＦ又はＢｂコロニゼイションＧＦマウスで食餌抗原（ＯＶＡ特異ＯＴＩＩＴ細胞）に反応して誘導されたＯＶＡ特異ｐＴｒｅｇ細胞を決定するための実験的戦略を示すものである。（Ｂ）は、ＰＢＳ又はＢｂ食餌されたＲａｇ１−／−ＳＰＦマウスから誘導されたマイクロビオタ（フラジェリン−特異ＣＢｉｒＴ細胞）特異ｐＴｒｅｇ細胞を決定する実験的戦略を示すものである。（Ｃ）は、ＰＢＳ又はＢｂ食餌されたＣＢｉｒナイーブＴ細胞が伝達されたＲａｇ１−／−ＳＰＦマウスのｃＬＰにおいてＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−又はＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞のＲＯＲγ、ＧＡＴＡ３、及びＴ−ｂｅｔ個体群分析に関する。（Ｄ）は、Ｂｂ又はＬｐａでモノコロニゼイションされたマウス又はＧＦマウスの排泄物抗原の組合せの存在下にＢｂ誘導されたＴｒｅｇ増殖を決定するための実験的戦略を示すものである。（Ｅ）は、ＧＦ又はＢｂでモノコロニゼイションされたマウスの全大腸ＣＤ４＋細胞を選別してＣＴＶで標識した後、ＧＦ又はＢｂ又はＬｐａでモノコロニゼイションされたマウスの排泄物抗原の組合せの存在下にＴ細胞の除去された脾臓細胞（ＡＰＣ）と共に培養して、３日後、表示された抗原に対する反応するＴｒｅｇ細胞の相対的な増殖をＦＡＣＳで分析したものである。データは、３個の独立した実験を代表する（ｎ≧３マウス）。全てのグラフプロットは、平均±ＳＥＭを表す。＊  ｐ＜０．０５、＊＊  ｐ＜０．０１（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ）。
【図８】Ｔｒｅｇ細胞のＴＣＲレパートリーに対するＢ．ｂｉｆｉｄｕｍモノコロニゼイションの影響に関する。（Ａ）は、ＧＦマウス又はＢｂモノコロニゼイションマウスの個別の臓器（大腸、ＭＬＮ及び脾臓）から得たＴｒｅｇ細胞レパートリーのα鎖とβ鎖においてシャノン（Ｓｈａｎｎｏｎ）多様性を比較したものである。（Ｂ）は、Ｂｂモノコロニゼイション及びＧＦマウスの大腸Ｔｒｅｇ細胞において上位８５個の優位ＴＣＲ−ＣＤＲ３領域の頻度を示すα鎖とβ鎖のヒットマップである。‘ｃｏｍｍｏｎ’表示（２８ペプチド）のＣＤＲ３領域は、各グループにおいて判読カウントの存在を表す。色調は、与えられたＴＣＲが発見された相対的な頻度を表す。（Ｃ）は、両方向バープロットで表示される一般ＴＣＲ−ＣＤＲ３アルファ領域の頻度分布；大腸の８５、ＭＬＮの１４６９及び脾臓の１３８１であり、（Ｄ）は、両方向バープロットで表示される一般ＴＣＲ−ＣＤＲ３ベータ領域の頻度分布；大腸の１１８、ＭＬＮの１７２４及び脾臓の１３８１である。
【図９】Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍの細胞表面ベータ−グルカン／ガラクタンポリサッカライド（ＣＳＧＧ）のＴｒｅｇ細胞誘導媒介に関する。（Ａ）は、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍの細胞表面β−１，６−グルカン（ＣＳβＧ）多糖体の構造である。Ｇｌｃｐ：ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ。（Ｂ）はＣＳＧＧ誘導ｉＴｒｅｇ細胞に対するβ−１，６−グルカン処理効果である。（Ｃ）は、Ｂｂ，Ｌｐａでコロニゼイションし又はＣＳＧＧ（１００μｇ／容量）を３週間一日おきに腹腔内注射したＧＦマウス又はＧＦマウスにおいてＴｒｅｇ細胞の個体群及び表現型を示すものである。（Ｄ）は、健康な供与者のＰＢＭＣのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞と共にＣＳＧＧで前処理されたＤＣを共培養して濃度依存的ヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇｓの誘導を確認したものである。（Ｅ）は、ｍｏｃｋ又はＣＳＧＧで処理したＣＤ１１ｃ＋ＤＣｓのＲＮＡ−Ｓｅｑを分析したものである。（Ｆ）は、ｍｏｃｋ又はＣＳＧＧで前処理したマウスから由来したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ１１ｃ＋ＤＣｓを準最適のｉＴｒｅｇ生成物と共に培養したものである。ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の個体群は流細胞分析で決定された。（Ｇ）は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をｍｏｃｋ又はＣＳＧＧで前処理した野生型又はＴＬＲ２欠乏ＣＤ１１ｃ＋ＤＣｓと共に培養した後、培養上澄液においてＴＧＦβ１レベルを測定したものである。データは、最小３個の独立した実験を代表する。全てのバーグラフは平均±ＳＥＭを表す。＊  ｐ＜０．０５、＊＊  ｐ＜０．０１、＊＊＊  ｐ＜０．００１（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ）。
【図１０】Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍのＤＣ依存メカニズムを通じたＴｒｅｇ細胞誘導促進に関する。（Ａ）は、ＧＦ又はＢｂモノコロニゼイションマウスの全大腸内Ｈｐｒｔに対する標準化されたサイトカインの相対的なｍＲＮＡ発現を定量したものである。（Ｂ）〜（Ｄ）は、ＧＦ又はＢｂモノコロニゼイションマウスのｃＬＰ−ＤＣｓ（ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１０３＋Ｆ４／８０−）の相対的なｍＲＮＡ発現レベルである。（Ｅ）は、ＤＣ：Ｔ細胞共培養システムにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｒｅｇ誘導に対する実験戦略である。（Ｆ）は、脾臓ＣＤ１１ｃ＋ＤＣｓと様々な量のＢｂ（ｃｆｕ）滴定に反応してＦｏｘｐ３＋細胞の濃度依存的誘導及びＴ細胞の生存を示したものである。（Ｇ）は、Ｂｂ又はＬｐａで前処理された脾臓ＣＤ１１ｃ＋ＤＣｓを３日間準最適Ｔｒｅｇ誘導条件（抗−ＣＤ３；０．１μｇ／ｍｌ、ＴＧＦ−β；０．１ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−２；１００ｕｎｉｔ／ｍｌ）でナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養した後、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞をライブ細胞内で分析したものである。ＩＬ−１０分泌は、培養上澄液のＥＬＩＳＡ分析によって決定された。データは、３〜５件の独立した実験を代表する（ｎ≧３マウス）。全てのグラフプロットは、平均±ＳＥＭを表す。＊  ｐ＜０．０５、＊＊  ｐ＜０．０１（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ）。代表的な流細胞分析及びＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の平均頻度を示す。
【図１１】Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍによって誘導されたＴｒｅｇ細胞の中核エフェクター分子としてベータ−グルカン／ガラクタンポリサッカライド（ＣＳＧＧ）を確認したものである。（Ａ）は、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍの分画で前処理された脾臓ＣＤ１１ｃ＋ＤＣｓを準最適Ｔｒｅｇ誘導条件下にナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養し、３日後、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞をＦＡＣＳで分析したものである。（Ｂ）は、表示された量の全細胞表面多糖類（ｔＣＳＰＳ）で前処理した脾臓ＣＤ１１ｃ＋ＤＣｓをナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養し、３日後、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞をＦＡＣＳで分析したものである。（Ｃ）は、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍの全細胞表面多糖類（ｔＣＳＰＳ）から分離した中性（ＣＳＧＧ）又は陰電荷の多糖類（ＰＧβＧ）の構造を示すものである。（Ｇｌｃｐ：ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ、Ｇａｌｐ：ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｅ、Ｇａｌｆ：ｇｌｕｃｏｆｕｒａｎｏｓｅ、Ｇｒｏ：ｇｌｙｃｅｒｏｌであり、ｎ＝反復単位、各多糖類の相対存在量を％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）で表示する。）。（Ｄ）は、ｔＣＳＰＳ（１００μｇ／ｍｌ）と比較して、中性（ＣＳＧＧ；５μｇ／ｍｌ）と陰電荷の多糖類（ＰＧβＧ：１００μｇ／ｍｌ）間のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ誘導活性を示したものである。（Ｅ）は、β−１，６−グルカナーゼ、β−１，４−ガラクタナーゼ及びβ−１，４−グルカナーゼの処理がＣＳＧＧ−誘導されたｉＴｒｅｇ細胞の誘導に及ぼす影響を示すものである（ＣＳＧＧ；５０μｇ／ｍｌ）。（Ｆ）は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を準最適のＴｒｅｇ誘導条件下でＤＣｓのないＣＳＧＧ（５０μｇ／ｍｌ）で処理したものである（抗−ＣＤ３；０．１μｇ／ｍｌ、α−ＣＤ２８；０．１μｇ／ｍｌ、ＴＧＦ−β；０．１ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−２；１００ｕｎｉｔ／ｍｌ）。データは３〜５件の独立した実験を代表する（ｎ≧３マウス）。全てのグラフプロットは、平均±ＳＥＭを表す。＊  ｐ＜０．０５、＊＊  ｐ＜０．０１（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ）。
【図１２】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでＣＳＧＧのＴｒｅｇ細胞誘導向上に関する。（Ａ）は、準最適のＴｒｅｇ誘導条件下でナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞とバクテリア又はＣＳＧＧで前処理されたＣＤ１１ｃ＋ＤＣｓを共培養した後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋個体群の生成を示すものである。（Ｂ）は、ＧＦマウス又はＢｂ、Ｌｐａ又はＣＳＧＧ（１００μｇ／ｄｏｓｅ）をＧＦマウスに３週間一日おきに腹腔内注射してモノコロニゼイションさせたマウスにおいてＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋個体群を示すものである。（Ｃ）及び（Ｄ）は、ＧＦマウスにＣＳＧＧ（１００μｇ／ｄｏｓｅ）又はＰＢＳを３週間一日おきに腹腔内注射し、Ｔｒｅｇ細胞の表示された個体群の頻度をリンパ器官において分析したものである。データは、３〜５件の独立した実験を代表する（ｎ≧３マウス）。全てのグラフプロットは、平均±ＳＥＭを表す。＊  ｐ＜０．０５、＊＊  ｐ＜０．０１、＊＊＊  ｐ＜０．００１（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ）。
【図１３】ＣＳＧＧがＴＬＲ２依存性調節ＤＣｓの生成を通じてｉＴｒｅｇ誘導を促進することを示す。（Ａ）は、ｍｏｃｋ又はＣＳＧＧで前処理されたＣＤ１１ｃ＋ＤＣｓとナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を共培養した後、培養上澄液においてサイトカインレベルを確認したものである。（Ｂ）は、Ｂｂ又はＣＳＧＧ処理後、生体外ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ誘導に対する抗−ＴＧＦβ  Ａｂ処理の効果を示すものである。（Ｃ）は、ＣＳＧＧで前処理したＩＬ−１０−／−ＫＯマウス又は野生型のＣＤ１１ｃ＋ＤＣｓを野生型ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養し、３日後にｉＴｒｅｇ誘導を測定したものである。（Ｄ）は、ＣＳＧＧ処理時にＴＬＲ亜型をコードする遺伝子の発現を調べるためにＲＮＡ−ｓｅｑデータを分析したものである。（Ｅ）は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞及びｍｏｃｋ又はＣＳＧＧで前処理されたマウス由来のＣＤ１１ｃ＋ＤＣｓを準最適のｉＴｒｅｇ生成条件下で３日間共培養した後、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞誘導を流細胞分析で測定したものである。（Ｆ）は、野生型又はｍｏｃｋ又はＣＳＧＧで前処理されたＴＬＲ２−欠乏ＣＤ１１ｃ＋ＤＣｓをナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養した後、培養上澄液でＩＬ−１０及びＩＦＮγサイトカインレベルを測定したものである。（Ｇ）は、Ｃ型レクチンに対するブロッキング抗体の存在下にＣＤ１１ｃ＋ＤＣｓをｍｏｃｋ又はＣＳＧＧで前処理した後、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養してｉＴｒｅｇ誘導を流細胞分析で調べたものである。（Ｈ）は、野生型又はＣＳＧＧで前処理されたＤｅｃｔｉｎ１−／−又はＤｅｃｔｉｎ２−／−ＫＯマウスのＣＤ１１ｃ＋ＤＣｓを野生型ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養し、３日後にｉＴｒｅｇ誘導を測定したものである。データは、少なくとも３回の独立した実験を代表する。全てのバーグラフは平均±ＳＥＭを表す。＊  ｐ＜０．０５（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ）。
【図１４】ＣＳＧＧによって誘導されたｉＴｒｅｇ細胞の腸炎症抑制機能に関する。（Ａ）〜（Ｃ）は、Ｔｈｙ１．１＋Ｆｏｘｐ３ＧＦＰレポーターマウスから分離したナイーブＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞を、ｉＴｒｅｇ細胞の表示された組合せにおいてＲＡＧ１−／−授与体に量子共同移入したものである。体重、大腸長さ及び大腸組織の病理的変化を測定した。（Ｄ）は、実験終了時にｃＬＰから移入されたＴｒｅｇ細胞のＦｏｘｐ３安定性を分析したものである。移入時に分類されたＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３ＧＦＰ＋細胞の純度は９８％以上だった。（Ｅ）〜（Ｇ）は、ＣＤ４５．１＋Ｆｏｘｐ３ＧＦＰレポーターマウスから分離したＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞をＲＡＧ１−／−マウスに養子移入した後、ＰＢＳ又はＣＳＧＧ（１００μｇ／ｍｌ）を腹腔内投与したものである。体重、大腸長さ及び大腸組織の病理的変化を測定した。（Ｈ）は、実験終了時にｃＬＰにおいてエフェクターＴ細胞のＩＦＮγ生成を分析したものである。データは、少なくとも３回の独立した実験を代表する。全てのバーグラフは平均±ＳＥＭを表す。＊  ｐ＜０．０５、＊＊  ｐ＜０．０１、＊＊＊  ｐ＜０．００１、＊＊＊＊  ｐ＜０．０００１（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ）。
【図１５】ＣＳＧＧによって誘導されたｉＴｒｅｇ細胞の腸炎症抑制機能に関する。（Ａ）は、ＣＴＶ標識されたナイーブ応答者Ｔｈｙ１．１＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞を分類して共培養したものである。ＣＤ４５．１＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ｉＴｒｅｇ細胞は、標識されたＣＤ４５．２＋マウスのＴ細胞が除去された脾臓細胞から精製されたｍｏｃｋ又はＣＳＧＧが処理されたＡＰＣｓとして生体外で生成した。応答者Ｔ細胞の増殖は流細胞分析で分析した。（Ｂ）は、ｎＴｒｅｇ及びｍｏｃｋ、Ｂｂ、又はＣＳＧＧによって生体外で誘導されたｉＴｒｅｇ細胞によって抑制された養子移入ＲＡＧ１−／−大膓炎の大腸長さを示すものである。（Ｃ）は、ｍｏｃｋ（ＰＢＳ）又はＣＳＧＧ（１００μｇ／ｄｏｓｅ）を腹腔内投与して養子移入されたナイーブＴ細胞によって誘導されたＲＡＧ１−／−大膓炎の大腸長さを示すものである。（Ｄ）は、ｍｏｃｋ又はＣＳＧＧ処理された養子移入ＲＡＧ１−／−マウスのｍＬＮにおいてＣＤ４＋ＣＤ４５．１＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ個体群を示すものである。データは、少なくとも２回の独立した実験を代表する。全てのバーグラフは平均±ＳＥＭを表す。＊  ｐ＜０．０５（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ）。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
特に定義されない限り、本明細書で使われた全ての技術的及び科学的な用語は、本発明の属する技術分野における熟練した専門家に通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使われた命名法は、この技術分野において周知及び常用されているものである。
【００３０】
本発明では、ヒト共生バクテリアであるＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＰＲＩ１（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）が、ナイーブＣＤ４Ｔ細胞の、炎症性大膓炎を抑制する機能的活性のＦｏｘｐ３＋ｉＴｒｅｇ細胞への分化を向上させ得ることを示す。細胞表面由来ベータ−グルカン／ガラクタン多糖体（ＣＳＧＧ）はｉＴｒｅｇ細胞を誘導する時に全バクテリアの機能を要約する活性分子である。ＣＳＧＧの作用機転は、樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌ，ＤＣ）においてＴＬＲ２／ＩＬ−１０調節経路の誘導によって媒介される。
【００３１】
共生微生物の調節障害は多くの疾病の発病と密接に関連しているため、Ｔｒｅｇ誘導微生物による生体内Ｔｒｅｇ細胞の増進は様々な炎症疾患を調節することができる。腸内微生物は免疫恒常性の維持に重要な役割を担い、このような腸内微生物の調節障害は、免疫抑制性Ｆｏｘｐ３＋Ｔ調節（Ｔｒｅｇ）細胞の損傷された機能に関連した炎症疾患を引き起こすことがある。いくつかの共生微生物がＴｒｅｇ細胞の誘導を向上させると知られているが（Ｔａｎｏｕｅ，Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６：２９５−３０９，２０１６）、この過程を制御する“作用分子”、すなわちバクテリアによって誘導されたＴｒｅｇ細胞の分子機作、抗原特異性及び標的細胞のようなものについてはまだ知られていない。
【００３２】
したがって、本発明では、一般に安全な（ＧＲＡＳ）バクテリアと見なされるプロバイオティック候補菌株を対象に選別し、食餌抗原又は共生菌に対して様々なＴＣＲ特異性を有するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＰＲＩ１（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）をＴｒｅｇ誘導バクテリアの最上の候補として選定した。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＰＲＩ１は、２０１７年５月１９日に韓国生命工学研究院生物資源センターに寄託された（受託番号：ＫＣＴＣ１３２７０ＢＰ）。また、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ及びその細胞表面由来ベータ−グルカン／ガラクタン多糖体（ＣＳＧＧ）がＴｒｅｇを誘導する主要構成要素であることを確認し、特にＣＳＧＧは全バクテリアの活動を効率的に再現し、部分的にＴＬＲ２依存性メカニズムを通じて調節樹状細胞を媒介してマウスとヒトの両方に作用してＴｒｅｇ細胞を誘導することを確認した。Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ又は精製されたＣＳＧＧによって誘導されたＴｒｅｇ細胞は、大膓炎に対する安定的で強力な治療又は抑制能力を示した。
【００３３】
したがって、本発明は、β−１−６−グルカンを生産する新しい菌株に関する。
【００３４】
また、本発明は、一観点において、β−１−６−グルカンを有効成分として含有する多糖体に関する。
【００３５】
本発明において、前記多糖体は、β−１−４−ガラクタン、β−１−６−ガラクタン又はβ−ガラクトフラナンをさらに含有することを特徴とし、このような多糖体は単独で使用されてもよい。特にβ−１−６−グルカンを主成分とする複合物、又は単独物であり得る。
【００３６】
また、前記β−１−６−グルカン、β−１−４−ガラクタン、β−１−６−ガラクタン及びβ−ガラクトフラナンは、全多糖体において５〜５０：２〜１５：２〜１５：１〜５のモル比であることが好ましく、より好ましくは、１０〜２０：３〜１０：３〜１０：２〜４のモル比であり、最も好ましくは１８：５：５：２のモル比であるが、これに限定されない。前記多糖体は、全１００重量％に対してβ−１−６−グルカン５〜５０重量％、β−１−４−ガラクタン２〜１５重量％、β−１−６−ガラクタン２〜１５重量％及びβ−ガラクトフラナン１〜５重量％であることを特徴とし、好ましくは、前記多糖体は全１００重量％に対してβ−１−６−グルカン１０〜２０重量％、β−１−４−ガラクタン３〜１０重量％、β−１−６−ガラクタン３〜１０重量％及びβ−ガラクトフラナン２〜４重量％であり、多糖体はそれぞれ、全１００重量％に対して１８重量％、５重量％、５重量％及び２重量％であることを特徴とする。
【００３７】
本発明において、前記多糖体は、分子量が約３〜５ｋＤａであることが好ましく、より好ましくは４ｋＤａであるが、これに限定されず、１００ｋＤａ以下の様々な分子量を持つ混合物が可能である。
【００３８】
本発明において、前記多糖体の電荷は中性であることを特徴とする。
【００３９】
本発明において、前記多糖体は調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を誘導することを特徴とし、前記調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）はＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞が好ましいが、これに限定されない。
【００４０】
前記調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の誘導は、ＤＣ（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）によって媒介されることを特徴とし、また、前記調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）はＩＬ−１０及びＴＧＦ−β生成誘導を増加させることを特徴とする。
【００４１】
本発明において、前記多糖体はＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ菌株由来のものが好ましく、より好ましくは、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＰＲＩ１と塩基配列相同性が９９％以上である菌株由来のものであり、最も好ましくはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＰＲＩ１（ＫＣＴＣ１３２７９ＢＰ）菌株由来であるが、これに限定されない。
【００４２】
本発明において、前記Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＰＲＩ１と塩基配列相同性が９９％以上である菌株は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  Ａ８又はＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＬＭＧ１１５８２であり得る。
【００４３】
本発明において、前記多糖体は抗炎症又は免疫機能調節活性を有することが好ましく、より好ましくは免疫抑制活性であるが、これに限定されない。腸出血などの腸内に傷がある人の場合、プロバイオティックスを誤って服用すれば副作用が発生し得るが、この場合、多糖体を投与すると治療効果を得ることができる。
【００４４】
本発明は他の観点において、β−１−６−グルカン多糖体を生産する菌株に関する。
【００４５】
本発明において、前記菌株はＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍが好ましいが、ＣＳＧＧ多糖体を生産する菌株であればいずれも可能である。また、本発明において、前記Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍは、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＰＲＩ１と塩基配列相同性が９９％以上であることが好ましく、より好ましくはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＰＲＩ１（ＫＣＴＣ１３２７９ＢＰ）であるが、これに限定されない。
【００４６】
本発明において、前記菌株はβ−１−４−ガラクタン、β−１−６−ガラクタン又はβ−ガラクトフラナンをさらに生産することが好ましいが、これに限定されない。
【００４７】
本発明において、前記菌株は調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を誘導することを特徴とし、前記調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）はＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞が好ましいが、これに限定されない。また、前記菌株はＩＬ−１０及びＴＧＦ−β生成誘導を増加させることを特徴とする。
【００４８】
前記調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の誘導はＤＣによって媒介されることを特徴とする。
【００４９】
本発明において、前記菌株は抗炎症又は免疫機能調節活性を有することが好ましく、より好ましくは、過敏免疫を抑制する活性を有するものであるが、これに限定されない。
【００５０】
特に、前記菌株はＣＳＧＧ多糖体を生成するので、食物、腸内の他の細菌又は菌自体由来物質などの様々な抗原によって抗原特異的Ｔｒｅｇを誘導して、炎症又は免疫疾患治療に適用可能である。
【００５１】
本発明はさらに他の観点において、β−１−６−グルカン多糖体又は該多糖体を生産するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ菌株を有効成分として含有する免疫調節用組成物に関する。
【００５２】
本発明において、前記多糖体はβ−１−４−ガラクタン、β−１−６−ガラクタン又はβ−ガラクトフラナンをさらに含有できるが、これに限定されない。
【００５３】
本発明において、前記多糖体又は菌株は調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を誘導することを特徴とし、前記調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）はＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞が好ましいが、これに限定されない。また、前記多糖体又は菌株はＩＬ−１０及びＴＧＦ−β生成誘導を増加させることを特徴とする。
【００５４】
前記調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の誘導はＤＣによって媒介されることを特徴とする。
【００５５】
本発明で使われる用語“免疫調節”とは、血液内免疫不均衡を解消し、免疫恒常性を維持することを意味する。免疫恒常性維持は、免疫を抑制させるメカニズムである免疫寛容（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）と免疫を増進する免疫反応（ｉｍｍｕｎｉｔｙ）とがバランスした状態を指し、このような状態の維持は免疫疾患治療、特に自己免疫疾患の治療において必須の要素である。
【００５６】
本発明はさらに他の観点において、β−１−６−グルカン多糖体又は該多糖体を生産するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ菌株を有効成分として含有する免疫抑制剤又は免疫治療剤に関する。
【００５７】
本発明の用語“免疫抑制剤”とは、抗原の作用に対して宿主が抗体を作る能力（体液性免疫反応）又は細胞性免疫反応を起こす能力を低下又は遮断するために用いる様々な物質のことを指す。
【００５８】
また、本発明の用語“免疫治療”とは、自分の身体の免疫システムの活性（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）又は抑制（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）反応を誘導して疾病を払う治療法をいう。最も代表的な免疫治療法は、免疫活性を誘導して癌細胞を殺す抗癌免疫治療法（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）であり、異常免疫反応によって誘発される疾患である自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ，ＩＢＤ）、アレルギー（ａｌｌｅｒｇｙ）などの疾患に対しては免疫抑制剤を用いた免疫治療が可能である。
【００５９】
したがって、本発明では“免疫抑制剤”と“免疫治療剤”を同じ意味で使うことができる。
【００６０】
本発明はさらに他の観点において、β−１−６−グルカン多糖体又は該多糖体を生産するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ菌株を有効成分として含有する免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療用医薬組成物に関する。
【００６１】
本発明において、前記多糖体はβ−１−４−ガラクタン、β−１−６−ガラクタン又はβ−ガラクトフラナンをさらに含有することができるが、これに限定されない。
【００６２】
本発明において、前記多糖体又は菌株は調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を誘導することを特徴とし、前記調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）はＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞が好ましいが、これに限定されない。また、前記多糖体又は菌株はＩＬ−１０及びＴＧＦ−β生成誘導を増加させることを特徴とする。
【００６３】
前記調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の誘導はＤＣによって媒介されることを特徴とする。
【００６４】
また、前記免疫調節用組成物は、免疫活性の調節及び免疫疾患の予防、改善又は治療のための目的で医薬組成物又は健康機能食品などに使用することができ、このとき、使用量及び使用形態は目的に応じて適宜調節することができる。
【００６５】
前記免疫調節用組成物は、免疫増進効果及び免疫過剰抑制効果を示すことができる。前記免疫増進効果は大食細胞においてＴＮＦ−αの発現を増加させたり又は脾臓細胞増殖能を向上させて免疫を増進させる効果である。前記免疫過剰抑制効果は、脾臓細胞において非特異的刺激源によるリンパ球過発現を抑制して免疫過剰を抑制する効果である。
【００６６】
本発明の組成物による予防又は治療対象疾病である“免疫疾患”は、皮膚炎、アレルギー、鼻炎、痛風、強直性脊椎炎、リウマチ熱、ループス、線維筋痛（ｆｉｂｒｏｍｙａｌｇｉａ）、腱鞘炎、１型糖尿病、強皮症（ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）、退行性神経疾患、２型糖尿病、珪肺症、粥状動脈硬化症、白斑症、結膜炎及び自己免疫疾患から構成される群から選ばれるいずれか一つに該当し得るが、これに制限されない。
【００６７】
本発明の組成物による予防又は治療対象疾病である“自己免疫疾患”は、リウマチ性関節炎、全身性強皮症（ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）、アトピー皮膚炎、乾癬、喘息、ギランバレー症候群（Ｇｕｉｌｉａｎ−Ｂａｒｒｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、重症筋無力症、皮膚筋炎（ｄｅｒｍａｔｏｍｙｏｓｉｔｉｓ）、多発性筋炎（ｐｏｌｙｍｙｏｓｉｔｉｓ）、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、自己免疫性脳脊髓炎、結節性多発性動脈炎（ｐｏｌｙａｒｔｅｒｉｔｉｓ  ｎｏｄｏｓａ）、側頭動脈炎（ｔｅｍｐｏｒａｌ  ａｒｔｅｒｉｔｉｓ）、小児期糖尿病、円形脱毛症、天疱瘡、アフタ口内炎、クローン病及びベーチェット病から構成される群から選ばれるいずれか一つに該当し得るが、これに制限されない。
【００６８】
本発明の組成物による予防又は治療対象疾病である“炎症性疾患”は、炎症を主病変とする疾病を総称するものであり、むくみ、アレルギー、喘息、結膜炎、歯周炎、鼻炎、中耳炎、咽喉炎、片道炎、肺炎、胃潰瘍、胃炎、クローン病、大膓炎、痔疾、痛風、強直性脊椎炎、リウマチ性熱、ループス、線維筋痛（ｆｉｂｒｏｍｙａｌｇｉａ）、乾癬関節炎、骨関節炎、リウマチ性関節炎、肩関節周囲炎、腱炎、腱鞘炎、筋肉炎、肝炎、膀胱炎、腎臓炎、シェーグレン症候群（ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、重症筋無力症及び多発性硬化症から構成される群から選ばれるいずれか一つに該当し得るが、これに制限されない。
【００６９】
本発明で使われる用語“予防”とは、本発明に係る医薬組成物の投与によって免疫疾患又は炎症性疾患を抑制させたり又は発病を遅延させる全ての行為を意味する。
【００７０】
本発明で使われる用語“治療”とは、本発明に係る医薬組成物の投与によって免疫疾患又は炎症性疾患に対する症状が好転したり又は良くなる全ての行為を意味する。
【００７１】
本発明の医薬組成物は、その有効成分の上述した免疫増進効果、又は免疫過剰抑制効果を通じて様々な免疫疾患に対する予防又は治療及び抗炎症効果を示す。
【００７２】
前記医薬組成物は、β−１−６−グルカン、β−１−４−ガラクタン、β−１−６−ガラクタン及びβ−ガラクトフラナン（ＣＳＧＧ）多糖体又は該多糖体を生産するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ菌株を有効成分として含有する他、医薬組成物に通常使用される適切な担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含むことができる。
【００７３】
前記組成物に含まれ得る担体、賦形剤及び希釈剤は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェ−ト、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、非晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油などがある。前記組成物を製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を用いて調剤することができる。
【００７４】
本発明に係る医薬組成物は、通常の方法によって様々な形態で剤形化して使用することができる。好適な剤形には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、糖衣錠、硬質又は軟質のカプセル剤、溶液剤、懸濁剤又は乳化液剤、注射剤、エアゾールなどの経口型剤形、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液などがあるが、これに限定されない。
【００７５】
本発明に係る医薬組成物は、薬学的に不活性である有機又は無機担体を用いて適合な剤形に製造できる。すなわち、剤形が錠剤、コーティングされた錠剤、糖衣錠及び硬質カプセル剤である場合、ラクトース、スクロース、デンプン又はその誘導体、タルク、カルシウムカーボネート、ゼラチン、ステアリン酸又はその塩を含むことができる。また、剤形が軟質カプセル剤である場合には、植物性オイル、ワックス、脂肪、半固体及び液体のポリオールを含んでもよい。また、剤形が溶液又はシロップ形態である場合、水、ポリオール、グリセロール、及び植物性オイルなどを含んでもよい。
【００７６】
本発明に係る医薬組成物は、前記の担体の他にも、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、溶解剤、甘味剤、着色剤、滲透圧調節剤、酸化防止剤などをさらに含むことができる。
【００７７】
本発明に係る医薬組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明において、“薬学的に有効な量”は、医学的治療に適用可能な合理的な受恵／危険の比率であり、疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効容量レベルは、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、同時使用される薬物を含む要素、及びその他医学分野によく知られた要素によって決定され得る。本発明に係る医薬組成物は、個別治療剤として投与するか、又は他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤とは逐次に又は同時に投与することができ、単一又は多重投与することができる。上述した要素を全て考慮して副作用無しに最小量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、これは当業者にとって容易に決定できる。
【００７８】
本発明の組成物は、免疫、特に自己免疫又はアレルギー関連タンパク質と共に投与することができる。具体的なタンパク質には、自己免疫疾患に関与する自己抗原、例えば、リウマチ関節炎は熱ショックタンパク質（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ；ＨＳＰｓ）、シトルリン化フィラグリン（ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）、グルコース−6−リン酸イソメラーゼ（ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ｐ２０５、コラーゲンなどを含むことができ、１型糖尿病は、インスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）、亜鉛トランスポーター８タンパク質（Ｚｉｎｃ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ８  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＺｎＴ８）、膵臓および十二指腸のホメオボックス１（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｎｄ  ｄｕｏｄｅｎａｌ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  １；ＰＤＸ１）、クロモグラニンＡ（Ｃｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎ  Ａ；ＣＨＧＡ）、膵島アミロイドポリペプチド（Ｉｓｌｅｔ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ；ＩＡＰＰ）を含むことができ、重症筋無力症に関連した自己抗原であるアセチルコリン受容体を含むことができる。また、このような自己免疫疾患に知られたあらゆる種類の自己抗原だけでなく、食品アレルギーを起こすものと知られたいろいろなアレルギー誘導物質であるピーナッツ、牛乳、卵、ナッツ類（Ｔｒｅｅ  ｎｕｔｓ）、豆、海老などの甲殻類、魚由来物質などを含むことができる。
【００７９】
本発明の医薬組成物は、様々な経路で個体に投与することができる。投与の方式は、例えば、皮下、静脈、筋肉又は子宮内硬膜又は脳血管内注射によって投与することができる。本発明の医薬組成物は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別及び体重及び疾患の重症度などの様々な関連因子と共に、活性成分である薬物の種類によって決定される。
【００８０】
本発明に係る医薬組成物の投与方法は、剤形によって容易に選択することができ、経口又は非経口投与することができる。投与量は患者の年齢、性別、体重、病症の程度、投与経路によって変わり得る。
【００８１】
本発明はさらに他の観点において、β−１−６−グルカン多糖体又は該多糖体を生産するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ菌株を有効成分として含有する免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療剤に関する。
【００８２】
本発明はさらに他の観点において、β−１−６−グルカン多糖体又は該多糖体を生産するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ菌株を有効成分として含有する組成物を投与することを含む免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療方法に関する。
【００８３】
本発明において、前記多糖体はβ−１−４−ガラクタン、β−１−６−ガラクタン又はβ−ガラクトフラナンをさらに含有することを特徴とする。
【００８４】
本発明はさらに他の観点において、β−１−６−グルカン多糖体又は該多糖体を生産するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ菌株を有効成分として含有する組成物を免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療に使用する用途に関する。
【００８５】
本発明において、前記多糖体はβ−１−４−ガラクタン、β−１−６−ガラクタン又はβ−ガラクトフラナンをさらに含有することを特徴とする。
【００８６】
本発明に係る医薬組成物は、優れた免疫増強及び免疫過剰抑制効果を提供するだけでなく、薬物による毒性及び副作用もほとんどないため、免疫疾患の治療又は予防の目的で長期間服用時にも安心して使用することができる。
【００８７】
本発明のＢ．ｂｉｆｉｄｕｍ又はＣＳＧＧは生体内で様々な抗原特異Ｔｒｅｇ細胞を誘導できるので、経口耐性の補助剤として使用することができる。
【００８８】
本発明はさらに他の観点において、β−１−６−グルカン多糖体又は該多糖体を生産するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ菌株を有効成分として含有する免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は改善用食品に関する。
【００８９】
本発明において、前記多糖体はβ−１−４−ガラクタン、β−１−６−ガラクタン又はβ−ガラクトフラナンをさらに含有することが好ましいが、これに限定されない。
【００９０】
前記免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は改善用食品は、免疫活性を増強させたり或いは過剰免疫を抑制又は改善して免疫機能の恒常性を維持する活性を有する健康機能食品であることを特徴とする。
【００９１】
本発明において、前記多糖体又は前記菌株は調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を誘導することを特徴とし、前記調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）はＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞であることが好ましいが、これに限定されない。
【００９２】
前記調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の誘導はＤＣによって媒介されることを特徴とし、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−β生成を誘導することを特徴とする。
【００９３】
本発明の用語“食品”とは、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディ類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料水、茶、ドリンク剤、アルコール飲料、ビタミン複合剤、健康機能食品及び健康食品などがあり、通常の意味におけるいかなる食品も含む。
【００９４】
前記健康機能（性）食品（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｆｏｏｄ）とは、特定保健用食品（ｆｏｏｄ  ｆｏｒ  ｓｐｅｃｉａｌ  ｈｅａｌｔｈ  ｕｓｅ；ＦｏＳＨＵ）と同じ意味の用語であり、栄養供給の他にも生体調節機能を効率的に呈するように加工された医学、医療効果が高い食品を意味する。ここで、“機能（性）”とは、人体の構造及び機能に対して営養素を調節したり、又は生理学的作用などのような保健用途に有用な効果を得ることを意味する。本発明の食品は、当業界で通常用いられる方法によって製造可能であり、前記製造時には、当業界で通常添加する原料及び成分を添加して製造することができる。また、前記食品の剤形また食品として認められる剤形であればいずれも製造可能であり、本発明に係る健康機能食品は、粉末、顆粒、錠剤、カプセル又は飲料の形態であり得る。
【００９５】
前記健康食品（ｈｅａｌｔｈ  ｆｏｏｄ）は一般食品に比べて積極的な健康維持や増進効果を有する食品を意味し、健康補助食品（ｈｅａｌｔｈ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｆｏｏｄ）は健康補助目的の食品を意味する。場合によって、健康機能食品、健康食品、健康補助食品の用語は同じ意味で使われる。
【００９６】
前記食品組成物は生理学的に許容可能な担体をさらに含むことができるが、担体の種類は特に制限されず、当該技術分野に通常用いられる担体であればいずれも使用可能である。
【００９７】
また、前記組成物は、食品組成物に通常使用されて臭い、味、視覚などを向上させ得る追加成分を含むことができる。例えば、ビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、ナイアシン（ｎｉａｃｉｎ）、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）、ホレート（ｆｏｌａｔｅ）、パントテン酸（ｐａｎｔｈｏｔｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）などを含むことができる。また、亜鉛（Ｚｎ）、鉄（Ｆｅ）、カルシウム（Ｃａ）、クロム（Ｃｒ）、マグネシウム（Ｍｇ）、マンガン（Ｍｎ）、銅（Ｃｕ）、クロミウム（Ｃｒ）などのミネラルを含むことができる。また、リシン、トリプトファン、システイン、バリンなどのアミノ酸を含むことができる。
【００９８】
また、前記組成物は、防腐剤（ソルビン酸カリウム、ベンゾ酸ナトリウム、サリチル酸、デヒドロ酢酸ナトリウムなど）、殺菌剤（さらし粉と高度さらし粉、次亜塩素酸ナトリウムなど）、酸化防止剤（ブチルヒドロキシアニゾール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）など）、着色剤（タール色素など）、発色剤（亜硝酸ナトリウム、亜酢酸ナトリウムなど）、漂白剤（亜硫酸ナトリウム）、調味料（ＭＳＧなど）、甘味料（ズルチン、シクラメート、サッカリン、ナトリウムなど）、香料（バニリン、ラクトン類など）、膨張剤（ミョウバン、Ｄ−酒石酸水素カリウムなど）、強化剤、乳化剤、増粘剤（糊料）、皮膜剤、ガム基礎剤、気泡抑制剤、溶剤、改良剤などの食品添加物（ｆｏｏｄ  ａｄｄｉｔｉｖｅｓ）を含むことができる。前記添加物は、食品の種類によって選別し、適度の量を使用することができる。
【００９９】
本発明のＣＳＧＧ多糖体又は該多糖体を生産する菌株と共に食品学的に許容可能な食品補助添加剤をさらに含むことができ、他の食品又は食品成分と共に使用することができ、通常の方法によって適切に使用することができる。有効成分の混合量は、その使用目的（予防、健康又は治療的処置）によって適切に決定することができる。
【０１００】
本発明はさらに他の観点において、（ａ）樹状細胞（ＤＣ；Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）にβ−１−６−グルカン多糖体又は該多糖体を生産するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ菌株を処理して調節樹状細胞（ｒＤＣ）を得る段階；、及び（ｂ）前記ｒＤＣをＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養して調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を誘導する段階を含む誘導調節Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）の製造方法に関する。
【０１０１】
本発明において、前記調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞であることを特徴とし、また、前記調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）はＩＬ−１０及びＴＧＦ−β生成を増加させることを特徴とする。
【０１０２】
本発明において、前記（ｂ）段階は、抗−ＣＤ３抗体、ＩＬ−２及びＴＧＦ−βで刺激して調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を誘導することを特徴とする。
【０１０３】
本発明において、前記樹状細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）由来のものが好ましいが、これに限定されない。
【０１０４】
本発明はさらに他の観点において、前記方法で製造された誘導調節Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）を有効成分として含有する免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療用細胞治療剤に関する。
【０１０５】
本発明はさらに他の観点において、前記方法で製造された誘導調節Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）を有効成分として含有する細胞治療剤を投与することを含む免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療方法に関する。
【０１０６】
本発明はさらに他の観点において、前記方法で製造された誘導調節Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）を有効成分として含有する細胞治療剤を免疫疾患又は炎症性疾患の予防又は治療に使用する用途に関する。
【０１０７】
本発明において、前記調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）はＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞であることを特徴とし、また、前記調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）はＩＬ−１０及びＴＧＦ−β生成を増加させることを特徴とする。
【０１０８】
本発明において、前記免疫疾患又は炎症性疾患は炎症性大膓炎であることが好ましいが、これに限定されない。
【０１０９】
Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍは、母乳授乳児の腸内微生物のうち支配的なバクテリア構成員の一部であり、この菌の不足は幼年期アレルギー、喘息及び自己免疫疾患と関連がある。一部の商業用プロバイオティックス製品にはＢ．ｂｉｆｉｄｕｍが含まれているが、効能が不明であり、一部のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種はリウマチ関節炎の進行を悪化させるような有害な影響を及ぼすことがある（ＰＮＡＳ，１１３（５０）：Ｅ８１４１−Ｅ８１５０，２０１６）。したがって、共生菌の特定構成要素が免疫系に有益な影響を及ぼすと考えられる。Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ  ＰＲＩ１から精製されたＣＳＧＧがＴｒｅｇ細胞を刺激するのに非常に効果的であり、大膓炎の進行を抑制できることが本発明から証明され、バクテリア細胞壁多糖体の免疫調節の役割が免疫及びアレルギー疾患治療のためのプロバイオバクテリア選択に特に有用であると考えられる。
【０１１０】
Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍをＳＰＦマウスに接種したり又はＧＦマウスにコロニゼイションさせると、ナイーブＣＤ４＋細胞をＮｒｐ１−Ｆｏｘｐ３＋、Ｈｅｌｉｏｓ−Ｆｏｘｐ３＋又はＮｒｐ１−Ｈｅｌｉｏｓ−Ｆｏｘｐ３＋表現型を有し、高いレベルのＩＬ−１０及びＣＴＬＡ４を発現する末梢由来（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｌｙ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｔｒｅｇ；ｉＴｒｅｇ）細胞に分化させる。
【０１１１】
本発明ではＢ．ｂｉｆｉｄｕｍが生体内でｐＴｒｅｇ生成を誘導できる２つの並列メカニズムを提案した。
【０１１２】
第一に、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍモノコロニゼイションによるブチレートの強化されたレベルは、Ｔ細胞を直接標的にしたり又は調節性ＤＣ表現型を誘導して間接的にＴｒｅｇ生成を促進することができる（Ｙ．Ｆｕｒｕｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５０４：４４６−４５０，２０１３；Ｎ．Ａｒｐａｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５０４：４５１−４５５，２０１３）。すなわち、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍが結腸Ｔｒｅｇ細胞の誘導を刺激する分子機作は少なくとも２類型の作用分子、代謝産物（ブチレート）及び細胞表面多糖体（ＣＳＧＧ）によって媒介され得る。以前の研究は、共生微生物によって生産された発酵産物である短鎖脂肪酸（ｓｈｏｒｔ  ｃｈａｉｎ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ；ＳＣＦＡｓ）のうち、ブチレートがｉＴｒｅｇ誘導物質の共通した作用分子の一つであり得ると提案した。ＳＰＦマウスにブチレート生産バクテリア（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｒａｔｅ；Ａｔａｒａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５００：２３２−２３６，２０１４）又はブチル化デンプンを投与すれば、Ｆｏｘｐ３遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）のエンハンサー及びプロモーター領域でヒストンＨ３アセチル化を増加させて結腸Ｔｒｅｇ細胞を増加させた（Ｙｕｋｉｈｉｒｏ  Ｆｕｒｕｓａｗａ  ｅｔ．ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ５０４：４４６−４５０，２０１３）。しかし、腸内微生物から直接由来した物質がＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞を誘導できるかどうかは確認できなかった。
【０１１３】
本発明の一実施例ではＧＦマウスの盲腸サイズがＢ．ｂｉｆｉｄｕｍコロニゼイションにより正常化され、盲腸及び大便においてブチレートレベルが有意に増加することを発見した。ブチレートの他にも全バクテリアのＴｒｅｇ誘導活性を摸倣する主要作用分子としてＣＳＧＧ（Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｂｅｔａ−Ｇｌｕｃａｎ／Ｇａｌａｃｔａｎ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ）を確認した。細胞表面から分離された他の多糖体である陰電荷を帯びる多糖体ＰＧβＧ（ｐｈｏｓｐｏ  ｇｌｙｃｅｒｏ−β−ｇａｌａｃｔｏｆｕｒａｎ）は、Ｔｒｅｇ誘導活性がなかった。ＰＧβＧはＴｈ１／Ｔｈ１７反応を向上させた。ＰＧβＧの化学構造はＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ亜種であるｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃｕｍ  ＤＳＭ２０２３９のリポタイコ酸（ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ  ａｃｉｄ；ＬＴＡ）と非常に類似している（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｗ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ１６５（３）：６３９−６４６，１９８７）。グラム陽性菌のＬＴＡは一般的にプロ炎症性活性を有しており、これを除去すればプロバイオティック乳酸菌の抗炎症能力が向上する（Ｓａｒａ  Ｌｅｂｅｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１２，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１）。このような結果は、同一バクテリアから由来したバクテリア多糖体の構造が差別的に免疫反応を調節できることを示唆し、共生菌由来多糖体の構造及び機能の連関性を解明することは重要である。
【０１１４】
第二に、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍの細胞表面から由来したＣＳＧＧはＤＣ−依存性メカニズムによってＴｒｅｇ細胞を誘導する（Ｖ．Ｋ．Ｒａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６：５６９，２０１５）。ＤＣｓはＣＳＧＧ及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ誘導されたｉＴｒｅｇ生成において重要な役割を果たす。Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍと作用分子であるＣＳＧＧは、ＴＬＲ／ＩＬ−１０経路を通じてＤＣの表現型を調節ＤＣ（ｒＤＣｓ）に誘導することができる。Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍのコロニゼイション又はＣＳＧＧ処理は、全結腸及びｃＬＰ−ＤＣ（ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１０３＋Ｆ４／８０−ＣＤＦ）においてＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ及び他のＴｒｅｇ誘導因子の発現レベルを増加させる。様々なＴｏｌｌ受容体（ＴＬＲｓ）のうち、ＤＣのＴＬＲ２は、ＣＳＧＧ誘導された耐性信号の感知及び伝達に重要な役割を担当し、ＴＬＲ２ＫＯ（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）ＤＣは、ＣＳＧＧ誘導されたＴｒｅｇ細胞生成において有意の欠陥（ＴＬＲ２ＤＣに比べて約３５％のＴｒｅｇ細胞を生成）を示した。他の研究はまた、ＣＤ４Ｔ細胞（Ｒｏｕｎｄ  ＪＬ，２０１１  Ｓｃｉｅｎｃｅ）又はＤＣｓ（Ｓｕｒｙａｓａｒａｔｈｉ  Ｄａｓｇｕｐｔａ，Ｃｅｌｌ  ｈｏｓｔ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｂｅｓ，２０１４）のＴＬＲ２がＩＬ−１０生産のためのバクテリア由来多糖体の認識に重要な役割を担うと提案した。ＴＬＲ２以外に、ＴＬＲ２ＫＯ  ＤＣが相変らずＴｒｅｇ細胞を誘導するので、他の受容体がＣＳＧＧ誘導ｉＴｒｅｇ生成にも関与することができる。ＣＬＲ（Ｃ−ｔｙｐｅ  ｌｅｃｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）抑制剤は、ＣＳＧＧによって誘導されたＴｒｅｇ生成を減少させなかったため、ＣＬＲは関与しない可能性がある。ＣＳＧＧの認識及びＴ細胞に対する耐性信号の伝達にどの受容体又はそれらの組合せが関連するかを明らかにするためにはより多くの研究が必要である。ＴＧＦ−βとＩＬ−１０はＤＣにおいてＣＳＧＧ−ＴＬＲ２信号を通じたＴｒｅｇ細胞分化の核心作用分子であり得る。ＴＧＦ−β遮断抗体の添加は、ＣＳＧＧ誘導されたＴｒｅｇ細胞を完全に消えるようにした。免疫調節サイトカインＩＬ−１０は、ＣＳＧＧ誘導されたＴｒｅｇ細胞の生成に重要な役割を担う。ＴＬＲ２ＫＯ  ＤＣは、はるかに低いレベルのＩＬ−１０を生産し、Ｔｒｅｇ細胞を誘導する際に減少した活性を示した。このような結果は、様々な免疫反応においてＩＬ−１０が免疫調節の主要調節因子であることを示唆する（Ｌｏｃｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０５：１３８１−１３９３，２００８）。
【０１１５】
また、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍのコロニゼイション又はＣＳＧＧの投与はＲＯＲγｔ＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞だけでなくＣＤ１０３＋も増加させ、ＣＳＧＧ治療が腸Ｔｒｅｇ細胞を誘導できることを示唆する（Ｂ．Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９：４４４−４５７，２０１６；Ｅ．Ｓｅｆｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４９：９９３−９９７，２０１５）。Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍのコロニゼイションは食餌及び食物反応性Ｔｒｅｇ細胞を誘導して、食中毒だけでなく食物による調節障害を抑制することもできる。したがって、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ又はＣＳＧＧによって誘導されたＲＯＲγｔ＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞が高度に抑制された腸特異作用Ｔｒｅｇに属すると見なすことができる（Ｍ．Ｅｓｐｏｓｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １８５：７４６７−７４７３，２０１０；Ｄ．Ｍ．Ｔａｒｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１８４：３３７７−３３８５，２０１０）。
【０１１６】
ＣＳＧＧは共生グラム陰性菌Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓの主要免疫調節分子であるＰＳＡ（ｃａｐｓｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  Ａ）と比較して非常に異なる特徴を有する（Ｎｅｅｒａｊ  Ｋ．Ｓｕｒａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．２４５（１）：１３−２６，２０１２）。ＣＧＧＧとＰＳＡはいずれもＴｒｅｇ細胞を誘導する上でＴＬＲ２／ＩＬ−１０信号を必要とするが、Ｔｒｅｇ細胞の特性はかなり異なる。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓのＰＳＡ又は外膜小胞（ＯＭＶ）は主に、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞ではなくＩＬ−１０ｈｉｇｈ調節Ｔ細胞を誘発するが（Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  ＆  Ｍｉｃｒｏｂｅ１２４：５０９−５２０，２０１２；Ｃｅｌｌ，１２２（１）：１０７−１８，２００５；ＰＮＡＳ．１０７（２７）：１２２０４−９，２０１０）、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞生成に対する直接的な証拠はない。ＰＳＡはまた、高いレベルのＩＦＮ−γｈｉｇｈＴｈ１生産を誘導する（Ｒｏｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３２：９７４−９７７，２０１１；Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ｈｏｓｔ  ＆  ｍｉｃｒｏｂｅ  １２：５０９−５２０，２０１２）。ＰＳＡによって誘導されたＴｒｅｇ細胞は、Ｆｏｘｐ３−ＩＬ−１０ｈｉｇｈＩＦＮγｈｉｇｈのような表現型（Ｊ．Ｌ．Ｒｏｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３２：９７４−９７７，２０１１；Ｙ．Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ｈｏｓｔ  ＆  ｍｉｃｒｏｂｅ  １２：５０９−５２０，２０１２）を示すが、ＣＳＧＧによって誘導されたＴｒｅｇ細胞は大部分Ｆｏｘｐ３＋ＩＬ−１０ｈｉｇｈＩＦＮγｌｏｗを示す。ＰＳＡは抗原提示細胞を活性化させてＩＬ−１２分泌を促進させ、耐性を誘導するよりは樹状細胞の活性化を誘導する（Ｃｅｌｌ，１２２（１）：１０７−１８，２００５）。ＣＳＧＧは、高いレベルのＩＬ−１０及びＣＴＬＡ４を生産するＮｒｐ１−Ｈｅｌｉｏｓ−Ｆｏｘｐ３＋及びＲＯＲγｔ＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞を誘導する。
【０１１７】
本発明の一実施例では、試験管内及び生体内ＧＦマウスにおいてＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓとＢ．ｂｉｆｉｄｕｍ  ＰＲＩ１間のＴｒｅｇ誘導活性を比較した。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓがモノコロニゼイションされたマウスはＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の増加を示さず、ＣＤ４＋細胞においてＩＦＮγ＋ＩＬ−１０ｈｉｇｈを示した。流細胞分析法及びＥＬＩＳＡによるサイトカイン分析は、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ処理群で高いレベルのＩＬ−１０及びＩＦＮ−γを発現することを示した。また、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍはＦｏｘｐ３＋ｉＴｒｅｇ細胞を誘導するのに対し、Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓはＦｏｘｐ３Ｔｒｅｇ細胞ではなくＩＬ−１０ｈｉｇｈＴｒ１細胞を誘導する可能性が高い。また、ＰＳＡ又はＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓの投与がＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞を増進させ得るかに関する直接的な証拠はない。
【０１１８】
さらに、準最適のＴｒｅｇ誘導条件下でＰＳＡ処理されたＤＣは、Ｆｏｘｐ３−ＩＦＮγ＋ＩＬ−１０ｈｉｇｈ細胞を主に誘導するのに対し、ＣＳＧＧ処理されたＤＣはＦｏｘｐ３＋ＩＦＮγ−ＩＬ−１０ｈｉｇｈ細胞を生成した。ＰＳＡはＭＨＣＩＩ分子に結合されたＴ細胞に処理され提示されるため、抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞を誘導することができない（Ｂ．Ａ．Ｃｏｂｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７：１３９８−１４０３，２００５）。対照的に、ＣＳＧＧは、ＭＨＣIIに積載され難いため、食餌抗原又は共生菌に反応する様々な抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞を誘導することができる。このような機能的差異は化学構造及びメカニズムの差異によって媒介され得る。ＰＳＡは陽電荷及び陰性に荷電された当残基を交互に含む独特の陽イオン性（ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ）モチーフを有する。このような電荷及び大きさによって、ＰＳＡはＴ細胞刺激において異なる活性を有する。Ｎａｔｉｖｅ  ＰＳＡは平均〜１３０ｋＤａであり、小さすぎる断片（５０００Ｄａ断片）は活性がないが、１７．１ｋＤａ断片（〜２２反復単位）は大膓炎を抑制する機能をすると報告されている（Ｋａｌｋａ−Ｍｏｌｌ  ＷＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：７１９−７２４，２０００）。ＰＳＡはＴＬＲ−２を通じてＤＣｓに吸収され、適切に切れた後にＭＨＣＩＩ分子に結合して、ＰＳＡを認識するＴ細胞と作用して特定ヘルパーＴ細胞の分化を誘導する（Ｃｏｂｂ  ＢＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７：１３９８−１４０３，２００５）。この場合、ＰＳＡによって誘導されるＴｒｅｇ、Ｔｒ１免疫調節細胞はＰＳＡに特異性を有し、このような現象は将来、抗原特異的なＴｒｅｇ細胞誘導に限界性を持つ。ＣＳＧＧは平均〜４０００Ｄａの中性多糖体であり、ＰＳＡとは違い、主にＴ細胞に直接作用するのではなく、ＤＣ特性調節を通じて作用する。このような作用メカニズムの差異は、ＣＳＧＧ処理によって様々な抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞を誘導できる可能性を提示している。すなわち、処理されたＰＳＡがＭＨＣＩＩ上にローディングされることによってＰＳＡ特異Ｔｒｅｇ細胞だけが生成され得る。一方、ＣＳＧＧはＭＨＣＩＩに内包作用媒介プロセシング及びローディングを行うよりは、ＤＣの表現型変化を誘導してｒＤＣとなるように誘導する。
【０１１９】
本発明の一実施例において、ＣＳＧＧをＧＦマウスに投与すれば、ｃＬＰ及びＭＬＮにおいてＣＤ４＋Ｎｒｐ−Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇｓ細胞が有意に向上した。したがって、全種類の抗原と共に処理されたＢ．ｂｉｆｉｄｕｍ又はＣＳＧＧは、食餌抗原又は共生バクテリア抗原特異Ｔｒｅｇ細胞のような抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞を誘導することができる。興味深い結果の一つは、Ｂｂのコロニゼイション又はＣＳＧＧの投与が大腸においてＲＯＲγｔ＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞のレベルを向上させるということである。また、ｍｏｃｋ  ｉＴｒｅｇと比較して、Ｂｂ又はＣＳＧＧによって誘導されたｉＴｒｅｇ細胞は、腸炎症抑制能力を持つＲＯＲγｔ＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の個体群がより高い。大膓炎モデルのｍｏｃｋ−ｉＴｒｅｇ細胞と比較して、Ｂｂ又はＣＳＧＧによって誘導されたｉＴｒｅｇ細胞は、Ｆｏｘｐ３遺伝子座のＣＮＳ２においてより高い脱メチル化状態（５０〜６０％）を有する持続的なＦｏｘｐ３発現を示した。したがって、Ｂｂ又はＣＳＧＧによって誘導されたＲＯＲγｔ＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞が腸特異作用Ｔｒｅｇに属すると信じる（Ｅｓｐｏｓｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １８５：７４６７−７４７３，２０１０；Ｔａｒｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １８４：３３７７−３３８５，２０１０；Ｂ−Ｈ  Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９：４４４−４５７，２０１６）。このような過程で先天性免疫細胞の役割を研究して、Ｂｂ又はＣＳＧＧ処理がＲＯＲγｔ＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞を強化させる基本メカニズムをさらに調べることができる。
【０１２０】
本発明ではＢ．ｂｉｆｉｄｕｍ  ＰＲＩ１とその作用分子であるＣＳＧＧがｉＴｒｅｇ細胞の生成を促進するということを提示する。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍは放線菌類（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）に属し、ヒトの内臓で特異的に同定され、母乳授乳児の内臓マイクロバイオータ（ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ）の主要バクテリア構成員の一部と表された（Ｔｕｒｒｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７５：１５３４−１５４５，２００９）。自然分娩と比較して、帝王切開分娩は、小児期アレルギー、喘息及び自己免疫疾患と関連があるＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種の欠乏を招いた。ＩＢＤ患者は健康な対照群に比べて糞便においてＢ．ｂｉｆｉｄｕｍの比率がより少ない（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５２：３９８−４０６，２０１４；Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４８：４２７９−４２８，２０１０）。種々の共生菌のうちビフィドバクテリウムは一般的に、宿主反応を調節できる能力においてラクトバチルスに比べて強い抗炎症性的な特徴を有する。しかし、共生菌の免疫調節効果は菌株特異的であり、機能性菌株の同定は相変らず大きな宿題として残っている。例えば、同一Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ菌内で脂質多糖体生産菌株は炎症信号を増加させ、疾病の進行を悪化させる（Ｗａｌｔｅｒ  Ｊ．Ｌｕｋｉｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７：１５４４，２０１６）。これに対し、ＰＳＡ生成菌株は炎症疾患を抑制すると知られている。したがって、同一の種（ｓｐｅｃｉｅｓ)内でも個別の免疫学的特性をどのように有するかを糾明することは非常に重要な宿題である。このような菌株特異的免疫調節特異性を糾明する方法は、菌由来物質とこれらを免疫学的特性を糾明してそれを機能的マーカーとして活用する方法である。例えば、ブチレートはブチル酸が腸間膜Ｔｒｅｇ細胞の分化を促進することによってＴｒｅｇ誘導バクテリアの標識子になり得る（Ｙｕｋｉｈｉｒｏ  Ｆｕｒｕｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５０４：４４６−４５０，２０１３；Ｌｉａｏ  ＨＹ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｒｅｐｏｒｔｓ，６：２０４８１，２０１６）。他の方法は、比較ゲノム分析によって知られた菌株と高い遺伝相同性を有する菌株を同定することである（Ｃ．Ｐｒｅｓｔｏｎ  Ｎｅｆｆ，Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  ＆  Ｍｉｃｒｏｂｅ，２０（４）：５３５−５４７，２０１６）。本発明ではＢ．ｂｉｆｉｄｕｍ菌株の中でＡ８（９９．９７％）とＬＭＧ１１５８２（９９．９８％）が最も高い塩基類似性とＣＳＧＧ合成に関連したオーソロガス（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ）遺伝子を有していることを発見した。ＩＰＬＡ２００１５及びＡ８菌株はヒトＰＢＭＣ培養システムにおいてＴｒｅｇ増進バクテリアとして知られている。試験管内でＴｒｅｇ誘導活性を比較した結果、Ａ８菌株は本発明の菌株と類似の活性を示したが、低い塩基相同性（９８．９％）及びＣＳＧＧ合成に関連したいくつかのオーソロガス遺伝子のないＡＴＣＣ���９５２１は、Ｔｒｅｇ誘導活性がはるかに低かった。
【０１２１】
本発明ではＢ．ｂｉｆｉｄｕｍ又はＣＳＧＧの投与が生体内で様々な抗原特異Ｔｒｅｇ細胞を誘導するための経口耐性の補助剤として使用可能であることを確認した。また、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ又はＣＳＧＧ治療は、ＭＨＣ  ＩＩで抗原提示を妨害しない上にｒＤＣを誘導するので、自己免疫又はアレルギー関連タンパク質と共にＢ．ｂｉｆｉｄｕｍ又はＣＳＧＧを投与すれば抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞が誘導され、疾病進行を抑制できることを確認した。具体的なタンパク質には、自己免疫疾患に関与する自己抗原、例えば、リウマチ関節炎は 熱ショックタンパク質（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ；ＨＳＰｓ）、シトルリン化フィラグリン（ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）、グルコース−6−リン酸イソメラーゼ（ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ｐ２０５、コラーゲンなどを含むことができ、１型糖尿病は、インスリン（ｉｎｓｕｌｉｎ）、亜鉛トランスポーター８タンパク質（Ｚｉｎｃ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ８  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＺｎＴ８）、膵臓および十二指腸のホメオボックス１（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｎｄ  ｄｕｏｄｅｎａｌ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  １；ＰＤＸ１）、クロモグラニンＡ（Ｃｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎ  Ａ；ＣＨＧＡ）、膵島アミロイドポリペプチド（Ｉｓｌｅｔ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ；ＩＡＰＰ）を含むことができ、重症筋無力症に関連した自己抗原であるアセチルコリン受容体を含むことができる。また、このような自己免疫疾患に知られたあらゆる種類の自己抗原だけでなく、食品アレルギーを起こすものと知られたいろいろなアレルギー誘導物質であるピーナッツ、牛乳、卵、ナッツ類（Ｔｒｅｅ  ｎｕｔｓ）、豆、海老などの甲殻類、魚由来物質などを含むことができる。
【０１２２】
本発明は、調節Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞を誘導又は生成して過免疫疾患を治療できるＣＳＧＧ（ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｂｅｔａ−グルカン／ｇａｌａｃｔａｎ）多糖体及びこれを発現するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＰＲＩ１に関し、特に、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＰＲＩ１が発現するＣＳＧＧ（ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｂｅｔａ−グルカン／ｇａｌａｃｔａｎ）多糖体は既存に知られたプロバイオティックス菌株の多糖体と差異があり、前記ＣＳＧＧがプロバイオティックス菌株のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の形成を誘導する主要物質として確認され、ＴＬＲ２−媒介ＤＣを生成するメカニズムを通じて炎症性腸疾患又は過免疫疾患治療効果を示す。本発明では、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＰＲＩ１が発現するＣＳＧＧ（ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｂｅｔａ−ｇｌｕｃａｎ／ｇａｌａｃｔａｎ）多糖体の具体的な構造式を明らかにし、前記ＣＳＧＧが調節Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の誘導に主要作用物質であることを最初に証明した。本発明のＣＳＧＧのβ−Ｄ−グルカンの構造はｂｅｔａ−１−６−グルカンであり、知られたβ−Ｄ−グルカン構造である２−ｓｕｂｓｉｔｕｔｅｄ−（１，３）−ｂｅｔａ−Ｄ−ｇｌｕｃａｎとはその機能が完全に異なる。以前に知られたβ−Ｄ−グルカンはプレバイオティクス機能であるのに対し、本発明のベータ−１−６−グルカンはそれ自体が免疫調節機能を有する。また、ＰＳＡ（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  Ａ）のような多糖体は、ＰＳＡ以外の抗原特異的なＴｒｅｇ誘導能力がないが、これに対し、ＣＳＧＧ生成菌株は種々の抗原、すなわち、飲食物、腸内他の細菌、菌自体由来物質などに対するＴｒｅｇを誘導できるので、ＰＳＡとＣＳＧＧはその構造及び作用機作が全く異なる。細胞表面の多糖体を一つの物質に一般化することは困難であるが、本発明では構造的差異がどのように機能と関連しているかを糾明した。すなわち、本発明の菌から生成された物質であるＣＳＧＧ自体がＴｒｅｇを誘導する菌自体の機能を代弁し得る活性指標物質である。
【０１２３】
ＣＳＧＧはＴｒｅｇ誘導バクテリアの新しい機能的標識子として作用でき、ＣＳＧＧ又はＣＳＧＧ生成Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍは、自己免疫及びアレルギー疾患に対する特異的免疫療法を開発するための耐性誘発補助剤として使用可能である。
【０１２４】
実施例
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないことは、当業界で通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
【０１２５】
材料及び方法
１．  マウス及びバクテリア菌株
１−１：マウス
マウスはＰＯＳＴＥＣＨ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒの動物施設で管理し、全実験手順はＰＯＳＴＥＣＨ実験動物運営委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ，ＩＡＣＵＣ）の承認を受けた。無菌（Ｇｅｒｍ−ｆｒｅｅ）Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスは、Ｄｒｓ．Ａｎｄｒｅｗ  Ｍａｃｐｈｅｒｓｏｎ（Ｂｅｒｎ  Ｕｎｉｖ．，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）及びＤｒ．Ｄａｖｉｄ  Ａｒｔｉｓ（Ｔｈｅｎ  ａｔ  Ｕｎｉｖ．Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ｃｕｒｒｅｎｔｌｙ  ａｔ  Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＵＳＡ）から提供されてＰＯＳＴＥＣＨで確立し、ｓｔｅｒｉｌｅ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｆｉｌｍ  ｉｓｏｌａｔｏｒｓ（Ｃｌａｓｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｌｅａｎ  Ｌｔｄ．，ＵＳＡ）で維持管理した。ＧＦ現況は毎月盲腸内容物によってモニタリングした。Ｆｏｘｐ３−ｅＧＦＰ、Ｔｌｒ２−／−、Ｔｌｒ４−／−、Ｔｌｒ６−／−及びＭｙＤ８８−／−動物はＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。Ｃ５７ＢＬ／６−ＣＤ４５ａ（Ｌｙ５ａ）−Ｒａｇ１−／−ＴＣＲ  ＯＴ−ＩＩ（Ｒａｇ１−／−ＯＴ−ＩＩ  ＴＣＲ形質転換体）及びＲａｇ１−／−マウスはＴａｇｏｎｉｃ交換プログラムによって得た。ＣＢｉｒマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｏ．Ｅｌｓｏｎａ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｌａｂａｍａ  ａｔ  Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ  ３５２９４，ＵＳＡ；Ｙｉｎｇｚｉ  Ｃｏｎｇ，ＰＮＡＳ，１９２５６−１９２６１，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０８１２６８１１０６）から提供された。６〜１２週齢の性別及び年齢に合うマウスを使用した。
【０１２６】
１−２：バクテリア
Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ  ＰＲＩ１と他のＢ．ｂｉｆｉｄｕｍ菌株は、０．１％  Ｌ−システインが添加されたＭＲＳ培地（ＢＤ，Ｄｉｆｃｏ）で嫌気培養し、Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉはＭＲＳ培地で培養した。モノコロニゼイションのために、バクテリア（５ｘ１０８ＣＦＵ／２００μＬ）を無菌（ＧＦ）マウスに経口投与した。
【０１２７】
２．  Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍで細胞表面多糖体の精製
培養したＢ．ｂｉｆｉｄｕｍ  ＰＲＩ１を収穫し、ＰＢＳで２回洗浄した。細胞表面多糖体の精製は、以前の方法（Ｄ．Ｌ．Ｋａｓｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １５３：９９１−９９７，１９８３）をやや修正して行った。６８℃で酸性フェノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）処理を実施して被膜多糖類を抽出し、エーテルを処理して残留フェノールを除去した後、蒸留水に３日間透析した。核酸とタンパク質を除去するために、ＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｒｏｃｈｅ）及びＲＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で３７℃で一晩処理した後、Ｐｒｏｎａｓｅ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で３７℃で一晩処理した。酢酸処理後、沈殿物を除去するために遠心分離をした。冷却されたエタノールを添加して多糖類を沈殿させた後、蒸留水で３日間透析して凍結乾燥させた。精製された多糖類を水に溶解させ、ＨＰＬＣカラム（ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ５０００ＰＷＸＬ，Ｔｏｓｈｏ）でゲル濾過を行った。中性及び陰性電荷多糖類をさらに分離するために陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＰｒｅｐ  Ｑ  ＦＦ１６／１０，ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を行った。多糖類の濃度は、酸性フェノール分析（Ｍ．ＤｕＢｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：３５０−３５６，１９５６）によって決定された。
【０１２８】
３．  １６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子分析によるバクテリアコロニゼイション分析
モノコロニゼイションを確認するためにバクテリアのゲノムＤＮＡをＮｅｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＤＮＡ  Ｓｔｏｏｌ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を用いてマウスの糞便又は内腔内容物から分離した。
【０１２９】
ＰＣＲ分析は、Ｃ１０００タッチサーマルサイクラー（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）を用いて行い、下表１のプライマーを使用した。
【０１３０】
【表１】
2020525570.tif 000003
【０１３１】
４．  ＦＩＳＨ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）によるバクテリアコロニゼイション分析
Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ  ＰＲＩ１によるモノコロニゼイション３週後に、マウスを犠牲して小腸を十二指腸（幽門の末端から１〜３ｃｍ以内）、空腸（Ｔｒｅｉｔｚの靭帯から２〜４ｃｍ以内）及び回腸（回盲部弁から１〜３ｃｍ以内）の３部分に分けた。各小腸切片１ｃｍと結腸を組織学的分析のためにカルノア液固定をした。カルノア固定液（３：１のメタノール：氷酢酸）を落とし、細胞懸濁液を５００ｇで５分間遠心分離した後、ペレットをカルノア固定液で再懸濁した（Ｃｈｏｏｌａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。カルノア溶液で固定したパラフィン埋込（ｅｍｂｅｄｄｅｄ）セクションを脱ワックス処理し、Ｃｙ５で標識されたＢ．ｂｉｆｉｄｕｍ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ蛍光プローブ（配列番号５：Ｂｂｉｆ、５’−ＣＣＡＣＡＡＴＣＡＣＡＴＧＣＧＡＴＣＡＴＧ−３’）と混成化した（Ｄｉｎｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。１００ｎｇのプローブを含有する混成化緩衝液（１００ｎＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．２、０．９Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％  ＳＤＳ）で４５℃加湿チャンバーで１６時間混成化させた。スライドを予熱された（３７℃）混成化緩衝液１００ｍｌで１５分間洗浄し、予熱された（３７℃）洗浄溶液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．２、０．９Ｍ  ＮａＣｌ）１０ｍｌで１５分間洗浄した後（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）でＤＮＡを免疫染色した。スライドを水で洗浄してエアードライした後、蛍光顕微鏡（ＩＸ７０，Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）でイメージを得た。
【０１３２】
５．  大膓炎のＴ細胞伝達モデル
以前に報告された方法（Ａ．Ｉｚｃｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２７：３１３−３３８，２００９；Ｆ．Ｐｏｗｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３：１７１−１７４，１９９５）によってナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の養子移入によって大膓炎を誘導した。Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ  ＰＲＩ１（Ｂｂ）、ＣＳＧＧ又はｍｏｃｋ処理によって誘導されたｉＴｒｅｇ細胞（２ｘ１０５）と共に分類されたナイーブＣＤ４＋ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏＦｏｘｐ３ＧＦＰ−Ｔ細胞（＞９９％  ｐｕｒｅ，１×１０６）をＲａｇ１−／−マウスの静脈内に伝達した。大膓炎の進行は、一週間に２回体重を測定してモニタリングし、マウスの体重が初期体重の約２５％になった時に実験終了を決定した。Ｔｒｅｇ細胞を陽性対照群として、ｅｘ  ｖｉｖｏで分離されたＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３ＧＦＰ＋Ｔｒｅｇ細胞（２×１０５）をナイーブＴ細胞と共にＲａｇ１−／−マウスに共同伝達した。実験終了時に大腸長さと組織学的評価を測定して大膓炎の重症度を決定した。Ｔｒｅｇ細胞とサイトカインのレベルも分析した。
【０１３３】
６．  Ｉｎ  ｖｉｖｏ養子移入
分類されたナイーブポリクロナールＣＤ４＋ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏＦｏｘｐ３ＧＦＰ−Ｔ細胞（＞９９．５％  ｐｕｒｅ）（１×１０６）をＧＦ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスの静脈内に伝達し、単一菌株を経口投与した。養子移入３週後にマウスを犠牲した。食餌抗原に反応するＴｒｅｇ細胞のＴＣＲ特異性を分析するために、ＯＴ−ＩＩ  ＣＤ４＋ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏＦｏｘｐ３ＧＦＰ−Ｔ細胞から分離されたナイーブＴ細胞（１×１０６）を養子移入前の２週間でＢ．ｂｉｆｉｄｕｍ  ＰＲＩ１でモノコロニゼイションさせたＧＦ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスの静脈内に伝達し、７日間一日おきにＯＶＡ（２０ｍｇ／ｄｏｓｅ／ｍｉｃｅ）を植移した。共生バクテリアに反応するＴｒｅｇ細胞のＴＣＲ特異性を分析するために、分類された（＞９９．５％  ｐｕｒｅ）ナイーブＣＢｉｒ  ＣＤ４＋ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏＦｏｘｐ３ＧＦＰ−Ｔ細胞（１×１０６）をＳＰＦ条件で維持されたＣ５７ＢＬ／６マウスの静脈内に伝達し、実験終了時までＢ．ｂｉｆｉｄｕｍ  ＰＲＩ１（５×１０８ｃｆｕ／ｄｏｓｅ）を週３回植移した。マウスは養子移入３週後に犠牲した。
【０１３４】
７．  ＤＣ依存試験管内ｉＴｒｅｇ細胞の誘導
大腸ＬＰ  ＤＣｓ（ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１０３＋Ｆ４／８０−）、脾臓全ＤＣｓ（ｔＤＣ；ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋）、脾臓ＣＤ８α＋（ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ−）及び脾臓ＣＤ８α−（ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋）ＤＣｓを細胞分類又はＣＤ１１ｃ磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）でそれぞれ精製した。分離されたＤＣは１０％  ＦＢＳ、５％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム 、非必須アミノ酸、β−ＭＥを含む完全なＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。脾臓ＤＣｓ（２×１０４）は９６ウェルプレートに接種して２時間培養した後、表示されたバクテリア、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ  ＰＲＩ１の分化細胞分画物又はＢ．ｂｉｆｉｄｕｍ  ＰＲＩ１の精製された多糖体と１０〜１２時間培養した。細胞を洗浄し、準最適Ｔｒｅｇ誘導条件（０．１μｇ／ｍｌ抗−ＣＤ３、１００Ｕ  ＩＬ−２及び０．１ｎｇ  ＴＧＦβ）で３日間ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞（２×１０５）と共培養した。サイトカイン又はＴｒｅｇ細胞のレベルはＥＬＩＳＡ及び流細胞分析法によってそれぞれ決定された。
【０１３５】
８．  ＣＳＧＧ処理によるＤＣ分化及びｉＴｒｅｇ細胞誘導のためのヒトサンプル
亜洲大学校病院臨床研究審議委員会（ＩＲＢ）からこの研究の承認を受け（ＡＪＩＲＢ−ＢＭＲ−ＳＭＰ−１７−１５５）、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ  ｇｒａｄｉｅｎｔを通じて健康な供与者から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を得た（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ，Ｎｙｃｏｍｅｄ，Ｎｏｒｗａｙ）。ＣＤ１４マイクロビーズキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて陽性選別によって単核球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）をＰＢＭＣ（ＣＤ１４＋＞９５％）から分離した。５Ｘ１０５ｍｏｎｏｃｙｔｅ／ｍｌをｒｈＩＬ−４（３５ｎｇ／ｍｌ）及びＧＭ−ＣＳＦ（７０ｎｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＫ）存在下に１０％熱不活性化されたＦＣＳ及び抗生剤が補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地（２ｍＭ  ｌ−グルタミン、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ；ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）で７日間２４−ウェルプレートで培養した。２日目及び５日目に、０．５ｍｌの培地をＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含有する新しい培地に取り替えた。７日目に、未成熟ＤＣを回収してｍｏｃｋ又は個別量のＣＳＧＧで１４時間前処理した。その後、ヒトＰＢＭＣから分離したナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞と準最適Ｔｒｅｇ誘導条件（０．１μｇ／ｍｌ抗−ＣＤ３、１００Ｕ  ＩＬ−２及び０．１ｎｇ  ＴＧＦβ）で３日間培養した。Ｔｒｅｇ細胞のレベルは流細胞分析法によって決定された。
【０１３６】
９．ＲＮＡ−ｓｅｑに対するデータ可用性
全ＲＮＡは、ｍｏｃｋ又はＣＳＧＧ（１００μｇ／ｍｌ）で４時間刺激した脾臓ＣＤ１１ｃ＋ＤＣｓから抽出し、ＲｉｂｏｓｐｉｎＴＭＩＩ（ＧｅｎｅＡｌｌ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で精製した。ＲＮＡ定量及び品質管理はＮａｎｏＤｒｏｐ２０００TM（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で行った。ライブラリー準備は、ＴｒｕＳｅｑ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｍＲＮＡサンプル準備キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で行い、ＲＮＡシーケンシングはＮｅｘｔＳｅｑ５００シーケンシングシステムで行った。ＲＮＡ−ｓｅｑデータは、登録番号ＧＥＯ：ＲＮＡ−ｓｅｑデータ：ＧＳＥ９８９４７としてＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＮＣＢＩ）データ格納所に寄託した。
【０１３７】
１０．  ＲＮＡ分離及び実時間定量ＲＴ−ＰＣＲ
ＴＲＩｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて大腸及びｃＬＰ  ＤＣから分離した全ＲＮＡをＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いて逆転写させてｃＤＮＡを製造した。合成されたｃＤＮＡは、次のプライマーセット（表２）及びＣＨＲＯＭＯ４  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて定量的実時間ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）に適用した。
【０１３８】
【表２】
2020525570.tif 000004
【０１３９】
全てのｑＲＴ−ＰＣＲは、９５℃で５分、９５℃で３０秒、６２℃で３０秒、７２℃で３０秒間４０サイクルで同一条件下で行った。データは、ＨＰＲＴ発現レベルに値を標準化した。結果は、処理群間の各遺伝子に対する相対的な発現レベルとして記述された。
【０１４０】
１１．リンパ球分離及び流細胞分析
ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、細胞分離器を用いてｍＬＮ、ｐＬＮ及び脾臓から精製した（純度９８％以上）。マウスの大腸及び小腸を縦方向にオープンして粘液をＰＢＳで洗浄して除去した。大腸は小さい切片に切ってＣａ２＋及びＭｇ２＋が含まれない１０ｍＭ  ＥＤＴＡ及び２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、３％  ＦＢＳ及びＰＢＳで３７℃で２０分間振盪培養した。組織は、かみそりで小さい切片にして、３％  ＦＢＳ、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム及び０．５ｍｇ／ｍｌのＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  Ｄ（Ｒｏｃｈｅ）及びＤＮａｓｅＩ（Ｓｉｇｍａ）がそれぞれ含まれたＲＰＭＩ  １６４０培地で３７℃で４５分間振盪培養した。酵素処理後、上澄液を１００μｇ細胞濾過器を用いて１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する冷たいＰＢＳで濾過させた。細胞をＰｅｒｃｏｌｌTM（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）勾配（上端４０％パーコール（ｐｅｒｃｏｌｌ）、下端７５％パーコール）上に置いて２０００ｒｐｍで２０分間ブレーキ無しで遠心分離した。４０％及び７５％層の間の細胞を取り、１０％  ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、β−ＭＥ、ピルビン酸ナトリウム、２．０ｍＭ  Ｌ−グルタミンが含まれたＲＰＭＩ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ  ＳＨ３００２７．０１）で２回洗浄し、ＦＡＣＳ染色に使用した。細胞懸濁液は、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  ｆｉｘａｂｌｅ  ｖｉａｂｌｅ  ｄｙｅ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）又はＰＩを用いてＰＢＳでＬｉｖｅ／ｄｅａｄでまず染色した。次の１％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）及びＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する緩衝液で追加染色をした。表面染色は、０．２％牛血清アルブミンを含有するＰＢＳで２０分間行った。細胞内転写因子染色のためには、細胞を固定／透過緩衝液（Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び１倍の透過／洗浄緩衝液（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ／ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した。細胞内サイトカイン分析のためには、精製されたプロプリア層（ｌａｍｉｎａ  ｐｒｏｐｒｉａ）リンパ球をＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、０．５μＬ／ｓａｍｐｌｅ）を用いて５００ｎｇ／ｍｌイオノマイシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）及び１００ｎｇ／ｍｌ  ＰＭＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で３７℃で４〜５時間細胞を再刺激した。細胞をＩＣ固定バッファ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で固定し、透過／洗浄緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で透過性を付与し、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１７Ａ抗体を用いて染色した。
【０１４１】
次の抗体クローンを使用した。ＣＤ４（ＲＭ４−５）、ＣＤ４４（ＩＭ７）、ＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ−１４）、ＣＤ４５．１（Ａ２０）、ＣＤ４５．２（１０４）、ＣＤ９０．１（Ｔｈｙ１．１）（ＯＸ−７）、ＣＤ９０．２（Ｔｈｙ１．２）（３０−Ｈ１２）、ＣＤ１０３（２Ｅ７）、Ｖα２（Ｂ２０．１）、Ｆｏｘｐ３（ＦＪＫ−１６ｓ）、ＣＴＬＡ４（ＵＣ１０−４Ｂ９）、Ｎｒｐ１（３Ｅ１２）、Ｈｅｌｉｏｓ（２２Ｆ６）、Ｔ−ｂｅｔ（４Ｂ１０）、ＲＯＲγｔ（ＡＦＫＪＳ−９）、ＧＡＴＡ−３（１６Ｅ１０Ａ２３）、ＩＬ−１０（ＪＥＳ５−１６Ｅ３）、ＩＬ−１３（ｅＢｉｏ１３Ａ）、ＩＦＮ−γ（ＸＭＧ１．２）、ＩＬ−１７Ａ（１７Ｂ７）、ＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８）、ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、Ｆ４／８０（ＢＭ８）、ＭＨＣＩＩ（Ｍ５／１１４．１５．２）。
【０１４２】
流細胞分析分類のためには、死んだ細胞は排除し、個体群は次をゲートした。ＬＰ  ＤＣｓ（ＣＤ４５＋ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１０３＋Ｆ４／８０−）、ＳＰ  ＤＣｓ（ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ８α＋又はＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ８α−）、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞（（ＣＤ４＋ＣＤ４５．１＋ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏＦｏｘｐ３ＧＦＰ−）、ナイーブＯＴ−ＩＩ  ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ９０．１＋ＯＴ−ＩＩ＋ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏＦｏｘｐ３ＧＦＰ−）、ＣＢｉｒ  ＴＣＲトランスジェニックナイーブＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ４５．１＋ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏＦｏｘｐ３ＧＦＰ−）。
【０１４３】
Ｍｏｆｌｏ−ＸＤＰ及び流細胞分析法を用いて行われた細胞分類は、５個のレーザーが装着されたＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ流細胞分析器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。データは、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析した。
【０１４４】
１２．  ＣＤＲ３高効率シーケンシング（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を用いたＴＣＲレパートリー分析
全ＲＮＡは、ＧＦマウス又はＢ．ｂｉｆｉｄｕｍ  ＰＲＩ１で３週間モノコロニゼイションされたマウスの分類されたＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３ＧＦＰ＋Ｔｒｅｇ細胞から抽出した。死んだ細胞はＩＳＯＧＥＮ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ）によるＦＶＤ染色で除外させた。Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  Ｇｅｎｅｓｉｓ  Ｉｎｃ．の偏向されないＴＣＲレパートリー分析技術を用いて次世代シーケンシングを行った。Ａｄａｐｔｏｒ−ｌｉｇａｔｉｏｎ  ＰＣＲは、以前方法で行った（Ｒ．Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５２：３５−４５，２０００）。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で最初の二本鎖ｃＤＮＡを合成し、５’アダプターオリゴヌクレオチドとライゲーションした後、アダプター及びＴＣＲα不変領域又はＴＣＲβ不変領域に特異的なプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。ＴＣＲα及びＴＣＲβ  ｃＤＮＡの増幅後、Ｎｅｘｔｅｒａ  ＸＴ索引キットｖ２ｓｅｔＡ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて索引（バーコード）配列を追加した。シーケンシングはＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｉｓｅｑ  ｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄプラットホーム（２×３００ｂｐ）で行った。データ処理は、Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  Ｇｅｎｅｓｉｓ社製のＲｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用した。ＴＣＲ配列は、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム（ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）の参照配列の可能なデータセットを用いて割り当てた。点数の低い配列を除去した後、ＴＣＲレパートリー分析は、Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  Ｇｅｎｅｓｉｓ社（Ｉｂａｒａｋｉ，Ｊａｐａｎ）が開発した生物情報学ソフトウェアを使用した。シーケンス読取りは、他のシーケンス読取りと同一性がないので、固有シーケンス読取り（ＵＳＲ）と定義された。同一のＵＳＲのコピー番号はＲＧソフトウェアによって自動で計算される。
【０１４５】
１３．  体外でｉＴｒｅｇ細胞生成に対するＴＧＦ−β中和の効果
脾臓ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋  ＤＣｓ（２×１０４）を２時間丸底９６ウェルプレートに接種した後、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ  ＰＲＩ１又はＣＳＧＧと共に１２時間培養した。細胞を洗浄し、０．１μｇ／ｍｌの抗−ＣＤ３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、１００Ｕ  ＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）及び０．１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β存在又は１５μｇ／ｍｌ抗−ＴＧＦ−β抗体（Ｒ＆Ｄ）の不在下にナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞（２×１０５）と共培養した。培養３日後、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の個体群を流細胞分析した。
【０１４６】
１４．試験管内抑制分析
試験管内生成されたＣＤ４５．１＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３ＧＦＰ  ｉＴｒｅｇ細胞を分類し、３７℃で１０分間パルス処理した反応細胞（Ｔｈｙ１．１＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−）と共に培養した。ＣＴＶで標識された細胞はＰＢＳで２回洗浄し、直ちに使用した。Ｔ細胞の除去された脾臓細胞（１×１０５）とＣＴＶ−パルス処理された反応細胞（５×１０４）及び指示された量のｉＴｒｅｇ細胞を０．５μｇ／ｍｌの抗−ＣＤ３と共に丸底９６ウェルプレートで混合した。細胞を４日間培養し、それらの増殖をＣＴＶ強度の希釈を決定するための流細胞分析で分析した。抑制率（％）は反応細胞の百分率だけを比較して分裂細胞の総百分率で計算した。
【０１４７】
１５．  組織学
実験大膓炎の臨床的状態は、Ｈ＆Ｅ染色を用いた組織学的分析で評価した。大腸を収集し、１０％ホルムアルデヒドで固定させた。固定後、組織をパラフィンブロックに埋め込み、３μｍ厚に切断した後、ヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及びエオシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した。
【０１４８】
１６．  統計分析
統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて行い、対照群と実験群との差異は、Ｕｎｐａｉｒｅｄ−Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを用いて評価した。データは、平均±ＳＥＭで表した。Ｔｒｅｇ細胞及び実験的大膓炎の生体内安定成分析のために、ボンフェローニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）の多重比較検査で両方向分散分析を用いて統計分析を行った。Ｐ＜０．０５は有意のものと見なされた。
【０１４９】
実施例１：Ｔｒｅｇ誘導バクテリアスクリーニング
免疫調節微生物によって生体内Ｔｒｅｇ細胞が強化されると、炎症性障害関連微生物不調和（ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ）を調節することができる。安全性の保障された微生物のうち、Ｔｒｅｇ誘導バクテリアを同定するために、以前に報告されたｅｘ  ｖｉｖｏスクリーニングシステム（Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ１０７：２１５９−２１６４，２０１０，Ｋｉｍ  ＪＥ，Ｊ  Ｆｕｎｃｔ  Ｆｏｏｄｓ．３５０−３６２，２０１５）を用いて２００余種以上のプロバイオティックス菌株をスクリーニングした。
【０１５０】
それぞれのバクテリア菌株は、抗生剤（Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ(R)）の存在下でＦｏｘｐ３レポーターマウスのｍＬＮｓ（ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ）細胞と共培養した。Ｆｏｘｐ３、ＩＬ−１０及びＩＬ−１２のレベルを測定して、ＩＬ−１０／ＩＬ−１２比が＞１００であり、Ｆｏｘｐ３発現を１０％以上増加させる菌株を選別した。
【０１５１】
その結果、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ誘導バクテリアの最適候補としてＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＰＲＩ１（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ；Ｂｂ）を選択し（図２Ａ及び図２Ｂ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ  ｓｕｂ．ｔｏｌｅｒａｎｓ  ４６７（Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ；Ｌｐａ）を、免疫反応を誘導しない対照群菌株として選択した。選択されたＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＰＲＩ１は２０１７年５月１９日に韓国生命工学研究院生物資源センターに寄託された（受託番号：ＫＣＴＣ１３２７０ＢＰ）。
【０１５２】
実施例２：Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍによるＴｒｅｇ細胞誘導
Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍが生体内Ｔｒｅｇ細胞を誘導できるかを調べた。
【０１５３】
ＳＦＢ（Ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉａ）は、Ｔｈ１７−誘導対照群バクテリアを使用した。Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ（Ｂｂ）を無菌（ｇｅｒｍ  ｆｒｅｅ；ＧＦ）マウスに１回投与したとき、大腸に安定してコロニゼイションされ（図２Ｃ）、拡大された盲腸サイズは正常ＳＰＦマウスと類似のサイズに正常化させた（図２Ｄ）。これはＢｂの繊維質消化活性を意味する。また、ブチレート及びアセテートのような短鎖脂肪酸（ｓｈｏｒｔ  ｃｈａｉｎ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ；ＳＣＦＡｓ）は食物繊維発酵の最終産物であるので、Ｂｂがコロニゼイションされたマウスは、盲腸及び大便においてプロピオーネレベルは変わらず、アセテートとブチレートレベルが有意に増加した（図２Ｅ）。
【０１５４】
Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ（Ｌｐａ）又はＳＰＦとは違い、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ（Ｂｂ）で３週コロニゼイションされたＧＦマウスは、結腸プロプリア層（ｃＬＰ）においてＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の頻度を劇的に増加させた（図１Ａ及び図２Ｆ）。のみならず、腸間膜リンパ節（ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅｓ；ＭＬＮ）、脾臓及び小腸のプロプリア層（ｓｉＬＰ）及び末梢リンパ節（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅｓ；ＬＮ）のような他の器官でもＴｒｅｇ細胞がやや増加した（図３Ａ）。Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍがコロニゼイションされたＧＦマウス（Ｂｂ）の結腸プロプリア層（ｃＬＰ）においてＴｒｅｇ細胞はＣＤ１０３＋及びメモリー表現型（ＣＤ６２ＬｌｏＣＤ４４ｈｉ）が非常に高い比率を表し（図３Ｂ及び図３Ｃ）、ＣＴＬＡ４及びＩＬ−１０も高いレベルの発現を示した（図１Ｂ及び図１Ｃ）。
【０１５５】
実施例３：Ｂｂによって新しく生成されたｉＴｒｅｇ
Ｔｒｅｇ細胞は、起源によって胸腺由来Ｔｒｅｇ（ｔＴｒｅｇ）又は末梢誘導されたＴｒｅｇ（ｐＴｒｅｇ又はｉＴｒｅｇ）にさらに分化できるので、Ｔｒｅｇ細胞においてＨｅｌｉｏｓ及びＮｒｐ１発現を分析してＴｒｅｇ起源を追跡した。
【０１５６】
Ｈｅｌｉｏｓ＋Ｎｐｒ１＋胸腺由来Ｔｒｅｇ（ｔＴｒｅｇ）とＨｅｌｉｏｓ−Ｎｐｒ１−末梢由来Ｔｒｅｇ（ｐＴｒｅｇ）細胞（試験管内培養条件で生成された場合“ｉＴｒｅｇ”と呼ばれる。）を区別するためにＩＫＡＲＯＳ系転写因子Ｈｅｌｉｏｓ及びＮｅｕｒｏｐｉｌｉｎ（Ｎｒｐ１）の発現を観察した（Ｊ．Ｍ．Ｗｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０９：１７２３−１７４２，２０１２；Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ２５９：８８−１０２，２０１４；Ｊ．Ｐ．Ｅｄｗａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９３：２８４３−２８４９，２０１４）。
【０１５７】
その結果、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍがコロニゼイションされたｃＬＰではＮｒｐ１＋ｔＴｒｅｇ細胞がやや増加したが、全ての器官においてＮｒｐ１−及びＨｅｌｉｏｓｌｏ  ｐＴｒｅｇ細胞がはるかに増加した（図１Ｄ〜図１Ｆ及び図４Ａ〜図４Ｃ）。また、新しく生成されたｐＴｒｅｇ細胞の相当な部分が転写因子ＲＯＲｇｔを発現し（図１Ｇ及び図４Ｄ）、これは微生物との相互作用によって上向き調節される（Ｂ．Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９：４４４−４５７，２０１６；Ｅ．Ｓｅｆｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３４９：９９３−９９７，２０１５）。
【０１５８】
次に、Ｂｂのコロニゼイションによって誘導されたＴｒｅｇ細胞の増加は、既に存在するＴｒｅｇ細胞の拡張ではなく、末梢組織のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞から新しく生成されたことを確認するために、養子移入実験をした。Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍによって誘導されたＴｒｅｇ細胞の末梢起源を、Ｆｏｘｐ３ＧＦＰマウスから分類されたａｌｌｅｌｉｃａｌｌｙ−ｍａｒｋｅｄナイーブＣＤ４＋ＣＤ４５．１＋Ｆｏｘｐ３−ＣＤ６２ＬｈｉＣＤ４４ｌｏＴ細胞を、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍでモノコロニゼイションされたＧＦマウスに養子移入して確認した（図５Ａ）。
【０１５９】
３週後、供与体細胞分析の結果、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍでコロニゼイションされたＧＦマウスの腸（ｃＬＰ）において供与体細胞のうちＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の相当部分が現れた（図４Ａ〜図４Ｄ）。Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ３週投与ＳＰＦマウスにおいてｐＴｒｅｇ細胞の誘導が類似に増加した（図５Ｅ）。このような結果は、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍの投与が主に結腸のナイーブＣＤ４Ｔ細胞からｉＴｒｅｇを新しく生成できることを表す。
【０１６０】
実施例４：ｐＴｒｅｇ細胞のＴＣＲ特異性を分析
Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍの存在下で生成されたｐＴｒｅｇ細胞のＴＣＲ特異性を分析した。Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍのコロニゼイションが食餌抗原にｐＴｒｅｇ細胞を促進するかどうか、すなわち、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍのコロニゼイションが食餌抗原反応性ｉＴｒｅｇ細胞の生成を増加させ得るかどうかをテストした。ＯＶＡ特異ＴＣＲ−形質転換ＯＴ−ＩＩマウスのＣＴＶ標識されたナイーブＣＤ４＋Ｔｈｙ１．１＋Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞をＧＦマウスに養子移入した後、マウスをＢｂでコロニゼイションするか、コロニゼイションしないで放置した後、経口ＯＶＡタンパク質を供給した。すなわち、ＯＴ−ＩＩ．Ｔｈｙ１．１＋Ｆｏｘｐ３ＧＦＰマウスのＣＴＶ−標識されたＯＶＡ−特異的ナイーブＣＤ４＋細胞を、ＯＶＡタンパク質を投与した正常又はＢ．ｂｉｆｉｄｕｍコロニゼイションＧＦマウスに養子移入した（図７Ａ）。
【０１６１】
その結果、前に観察されたように（Ｋ．Ｓ．Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５１：８５８−８６３，２０１６）、正常ＧＦ宿主において拡張されたＯＴ−ＩＩ細胞の小さな分画は、ｓｉＬＰ及びｃＬＰにおいてＦｏｘｐ３を上向き調節した（図６Ａ及び図６Ｂ）。すなわち、ＧＦ−ＯＶＡ食餌マウスと比較して、Ｂｂコロニゼイションマウスは主にｃＬＰにおいてＴｈｙ１．１＋ＯＴ−ＩＩ特異Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞及び宿主由来Ｔｒｅｇ細胞の有意の増加を示した。特に、ビフィダムコロニゼイションＧＦマウスにおいて供与体ＯＴ−ＩＩ細胞によるＦｏｘｐ３の上向き調節の効率はｃＬＰでは２〜３倍増加したが、ｓｉＬＰとｍＬＮでは変わらなかった（図６Ｂ）。
【０１６２】
実施例５：マイクロビオタに特異的なｐＴｒｅｇ細胞の生成
Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍのコロニゼイションがマイクロビオタに特異的なｐＴｒｅｇ細胞の生成を促進するか否かを決定するために、バクテリアフラジェリン（ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）を認識するＣＢｉｒ  ＴＣＲ遺伝子変形マウスを使用した（Ｙ．Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６５：２１７３−２１８２，２０００）。ナイーブＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞は、ＣＢｉｒ遺伝子変形マウスからＣＤ４５．１＋Ｆｏｘｐ３ＧＦＰ背景で分類してＳＰＦ  Ｒａｇ１−／−授与体に養子移入した後、ｍｏｃｋ（ＰＢＳ）又はＢ．ｂｉｆｉｄｕｍを５週間一日おきに供給した（図７Ｂ）。
【０１６３】
その結果、ＣＢｉｒＴ細胞の対照群ＳＰＦ  Ｒａｇ１−／−受容体マウスだけが漸進的な体重減少を示し（図６Ｃ）、Ｔｒｅｇ細胞はほとんどなく（図６Ｆ）ＣＤ４＋ＩＦＮγ−及びＲＯＲγ−＋Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞の比率は高く（図６Ｇ及び図７Ｃ）、厚い粘膜の（図６Ｅ）大腸は長さが減少する（図６Ｄ）などの大膓炎の顕著な徴候を示した。病理学のこのような様々な徴候は、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ投与と共にＣＢｉｒＴ細胞を注射した宿主ではほとんど現れなかった。（図６Ｃ〜図６Ｇ及び図７Ｃ）。
【０１６４】
実施例６：ｉＴｒｅｇ細胞のＢ．ｂｉｆｉｄｕｍ自体に対する特異性
Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍによって誘導されたｐＴｒｅｇ細胞がＢ．ｂｉｆｉｄｕｍ自体に対する特異性を有するか否かを試験するために、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍがコロニゼイションされたＧＦマウスの全大腸ＣＤ４＋Ｔ細胞を、正常ＧＦマウス、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ又はＬ．ｐａｒａｃａｓｅｉがコロニゼイションされたＧＦマウスの排泄物抗原で前処理した脾臓ＡＰＣと共培養した後、３日後にそれら細胞のＴ細胞増殖（ＣＴＶ希釈）を分析した（図７Ｄ）。
【０１６５】
その結果、大部分のＴｒｅｇ細胞が試験管内培養条件で死んだが、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍがコロニゼイションされたＧＦマウスのＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞は、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ抗原処理されたＡＰＣで刺激すればＦｏｘｐ３発現及び増殖が持続した（図６Ｈ及び図７Ｅ）。
【０１６６】
また、ＧＦとＢ．ｂｉｆｉｄｕｍモノコロニゼイションマウス間のＴＣＲ特異性を、大腸、ｍＬＮ及び脾臓から分類されたＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞のα−及びβ−鎖のシーケンシングで比較した。
【０１６７】
その結果、両Ｔｒｅｇ細胞がα−及びβ−鎖において類似のパターンの多様性を示したが（図８Ａ）、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍコロニゼイションマウスの大腸Ｔｒｅｇ細胞はＧＦ対照群に存在しない別個のＴＣＲパターンを示した（図６Ｉ及び図８Ａ〜図８Ｄ）。総合的に、このような結果は、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍが食餌抗原及び／又は共生微生物及びＢ．ｂｉｆｉｄｕｍ自体に対する広範囲なＴＣＲ特異性を有する機能的に活性のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞を誘導するということを示す。
【０１６８】
実施例７：Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍコロニゼイションによるｒＤＣｓ誘導及び新しいｐＴｒｅｇ分化の増進
Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍによるコロニゼイションが調節樹状細胞（ｒＤＣｓ）の集団を誘導するかどうか調べたが、これは、新しいｐＴｒｅｇ分化を向上させることができる。
【０１６９】
ナイーブＴ細胞をｉＴｒｅｇ細胞に分化させるためには免疫調節サイトカイン環境が必要なので、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍのコロニゼイションが欠腸内免疫寛容環境を誘導するかを試験した。ＧＦマウスと比較して、Ｂｂがコロニゼイションされたマウスから分離されたｃＬＰ−ＤＣｓ（ＭＨＣＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１０３＋Ｆ４／８０−）及び結腸全細胞はｉｌ１０、Ｃｓｆ２、Ｔｇｆβ１、ｉｄｏ、Ｐｔｇｓ２、Ｐｄｃｄ１だけでなく、共同刺激分子であるＣｄ８６及びＣｄ４０のような抑制分子のｍＲＮＡ発現を顕著に増加させた（図１０Ａ〜図１０Ｄ）。これは、ＢｂのコロニゼイションがｉＴｒｅｇ細胞の分化を促進させる調節樹状細胞（ｒＤＣｓ）を誘導できることを示す。
【０１７０】
また、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍと共に分類されたｃＬＰ−ＤＣを１０〜１２時間培養した後洗浄し、準最適のＴｒｅｇ誘導条件で３日間ナイーブＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞と共同培養して生体内摸倣実験を行った。Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍでｃＬＰ−ＤＣを前処理した結果、ｍｏｃｋ又はＬ．ｐａｒａｃａｓｅｉ（Ｌｐａ）処理対照群に比べてｉＴｒｅｇ細胞及びＩＬ−１０生産の誘導及び増殖が濃度依存的に増加した（図１０Ｅ〜図１０Ｇ）。
【０１７１】
実施例８：Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍの作用分子の確認
８−１：Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍの作用分子
試験管内システムを用いて、ｉＴｒｅｇ分化を促進するＢ．ｂｉｆｉｄｕｍ由来の作用分子を確認するために広範囲な実験を行った。Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍは嫌気性であり、ＤＣとの共培養中に殆ど死んだので、Ｂｂの細胞構成要素の一部がｉＴｒｅｇ誘導活性の作用分子であるかどうかをテストした。
【０１７２】
その結果、細胞壁、細胞膜及びサイトゾルの分画物のうち細胞表面抽出物だけが効果的にＴｒｅｇ細胞を誘導した。細胞表面抽出物にＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅ、Ｐｒｏｎａｓｅ又は高温で沸かす処理はＴｒｅｇ誘導活性を減少させておらず、これは、多糖体がエフェクター分子であることを暗示する。実際に、全細胞表面多糖類（ｔｏｔａｌ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ；ｔＣＳＰＳ）はＴｒｅｇ細胞を濃度依存的に誘導した（図１１Ａ〜図１１Ｂ）。
【０１７３】
ｔＣＳＰＳはイオン排除クロマトグラフィーによって分離され、低いイオン強度で溶出された分画をｉｎ−ｄｅｐｔｈ  ＮＭＲで分析した。
【０１７４】
その結果、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍの細胞表面多糖体は少なくとも５種からなっていた（図１１Ｃ）；ベータ−１−６−グルカン（１８％）、ベータ−１−４−ガラクタン（５％）、ベータ−１−６−ガラクタン（５％）、ベータ−ガラクトフラナン（２％）及びｐｈｏｓｐｏ  ｇｌｙｃｅｒｏ−β−ｇａｌａｃｔｏｆｕｒａｎ（ＰＧβＧ）（６４％）がそれぞれ異なる量（ｍｏｌ／ｍｏｌ）で示された。ＰＧβＧ多糖体は全多糖体の中で最も豊富な多糖体（６４％）であり、平均８０００Ｄａであって、陰電荷を帯び、残り４つの中性多糖体（β−１−６−グルカン、β−１−４−ガラクタン、β−１−６−ガラクタン及びβ−ガラクトフラナン）は、類似の分子量（平均〜４０００Ｄａ）であって、これらは個別的にそれ以上分離されない。
【０１７５】
その後、中性の混合多糖体又はＰＧβＧの多糖体のどれが試験管内でＴｒｅｇ細胞を誘導する活性を有するかを試験した。その結果、陰電荷を帯びる多糖体（ＰＧβＧ）以外の中性多糖体だけがＴｒｅｇ細胞を誘導した（図１１Ｄ）。
【０１７６】
このことから、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ由来中性多糖体混合物を“Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ｂｅｔａ−Ｇｌｕｃａｎ／Ｇａｌａｃｔａｎ（ＣＳＧＧ）”と命名した。
【０１７７】
８−２：ＣＳＧＧのＴｒｅｇ誘導の確認
ＣＳＧＧ多糖類のうちβ−１，６−グルカナーゼを処理すれば、濃度依存的にＣＳＧＧ−誘導されたｉＴｒｅｇ細胞レベルが減少するので、細胞表面β−１−６−グルカン（ＣＳβＧ）が核心作用分子であり得る（図９Ａ、図９Ｂ、及び図１１Ｅ）。さらに、ＤＣのない状態でＣＳＧＧとナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の共培養がｉＴｒｅｇ細胞を誘導するのに失敗したため、ＣＳＧＧはＤＣ依存性によってＴｒｅｇ細胞を誘導するものと考えられる（図１１Ｆ）。
【０１７８】
次に、ＣＳＧＧがｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでＴｒｅｇ細胞を誘導する全バクテリアの能力を再現できるか否かをテストした。ＣＳＧＧ処理されたＤＣｓは、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍで処理されたＤＣをＦｏｘｐ３＋  ｉＴｒｅｇ細胞を投与量にしたがって効果的に誘導した（図１２Ａ）。ＣＳＧＧ（１００μｇ／容量）を３週間３回ＧＦマウスに腹腔注射した結果、ｃＬＰ及びｍＬＮにおいてＢ．ｂｉｆｉｄｕｍがコロニゼイションされたマウスと類似のレベルでＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋及びＮｒｐ１−Ｒｏｒγｔ＋  Ｔｒｅｇ細胞が誘導された（図９Ｃ及び図１２Ｂ〜図１２Ｃ）。このＴｒｅｇ細胞は対照群ＧＦマウスのＴｒｅｇ細胞に比べてＣＤ１０３＋及び活性化された表現型ＣＤ４４ｈｉＣＤ６２ＬｌｏＦｏｘｐ３＋の比率がより高かった（図１２Ｄ）。さらに、健康な供与者のＰＢＭＣ由来のヒトＤＣｓ及びナイーブＣＤ４Ｔ細胞とＣＳＧＧの共培養は濃度依存的にＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞を誘導した（図９Ｄ）。
【０１７９】
８−３：ＣＳＧＧ合成遺伝子相同性とＴｒｅｇ誘導活性
乳酸菌の項アレルギー効果は菌株によって異なり、Ｔｈ１／Ｔｈ２サイトカイン発現及び均衡によって影響を受けると知られたように（Ｆｕｊｉｗａｒａ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎ．１３５（３）：２０５−２１５，２００４）、プロバイオティックバクテリアの機能的活性は種特異的ではなく菌株特異的であるため、全てのＢ．ｂｉｆｉｄｕｍの菌株がｉＴｒｅｇ細胞を誘導する機能をするか、或いは本発明のＢ．ｂｉｆｉｄｕｍ  ＰＲＩ１菌株と高い塩基相同性を持つ菌株だけがｉＴｒｅｇ誘導活性を有するかを試験した。本発明のＢ．ｂｉｆｉｄｕｍ  ＰＲＩ１菌株（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ；ＣＰ０１８７５７）の全ゲノムシーケンシングを行い、予想されるＣＳＧＧ合成に関連したオーソロガス遺伝子と他のＢ．ｂｉｆｉｄｕｍのゲノムとの塩基相同性及びＴｒｅｇ誘導活性を比較した。
【０１８０】
その結果、本発明のＢ．ｂｉｆｉｄｕｍ  ＰＲＩ１は、他のＢ．ｂｉｆｉｄｕｍ菌株と高い相同性を示した。特に、Ａ８菌株（Ｌｏｐｅｚ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬＯＳ  ＯＮＥ，６（９）：ｅ２４７７６，２０１１）は、本発明のＢ．ｂｉｆｉｄｕｍ  ＰＲＩ１菌株と類似の活性を有するが、ＣＳＧＧ合成に関連したいくつかのオーソロガス遺伝子が不足しており、Ｔｒｅｇ誘導活性がはるかに少なかった。
【０１８１】
実施例９：ＣＳＧＧによるｒＤＣ生成のメカニズム
ＣＳＧＧ処理が、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍがコロニゼイションされたマウスのｃＬＰ−ＤＣから観察されたとおり、一般ＤＣの表現型を調節ＤＣｓ（ｒＤＣｓ）への変形を誘導するかを試験した。すなわち、ＣＳＧＧによるｒＤＣ生成の根本的なメカニズムを明らかにするために、ＣＳＧＧで４時間処理したＣＤ１１ｃ＋  ＤＣｓのＲＮＡ−ｓｅｑ分析を行った。
【０１８２】
その結果、ｍｏｃｋ対照群処理と比較して、ＣＳＧＧ処理はｍＲＮＡ及びタンパク質においてＩｆｎａ２、Ｐｄｃｄ１、Ｔｇｆβ１、Ｃｓｆ２、Ｐｔｇｓ２、ｉｌ１０及びｉｌ２７のようなｒＤＣ関連マーカーのレベルを有意に向上させた（図９Ｅ及び図１３Ａ）。
【０１８３】
また、ＣＳＧＧ処理はＩＬ−１０及びＴＧＦ−βのタンパク質レベルを顕著に増加させるが、ＩＦＮ−γのレベルは減少させる。ＩＬ−１０と比較して、抗−ＴＧＦβ中和抗体の添加は、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ又はＣＳＧＧ処理によって誘導されたｉＴｒｅｇ生成をほぼ完全に遮断できるので、ＴＧＦ−βが中枢的な役割を担うといえる（図１３Ｂ及び図１３Ｃ）。ＣＳＧＧ処理はＴＬＲ２発現を選択的に増加させ（図１３Ｄ）、ＴＬＲ２−／−又はＭｙｄ８８−／−  ＤＣｓはＣＳＧＧ−媒介ｉＴｒｅｇ誘導において有意の減少を示したので（図９Ｆ、図９Ｇ、及び図１３Ｅ）、ＤＣの様々なパターン認識受容体のうちＴＬＲ２及びＭｙｄ８８は、ＣＳＧＧ認識及び信号伝達に関与する主要分子であり得る。ＴＬＲ２除去ＤＣは培養物においてＴＧＦβ１及びＩＬ−１０の減少を誘導したが（図９Ｇ）、ＩＦＮγレベルは変化がなかった（図１３Ｆ）。Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）はＣＳＧＧ媒介ｉＴｒｅｇ細胞生成に関与しなくて済む（図１３Ｇ及び図１３Ｈ）。
【０１８４】
実施例１０：ＣＧＧＧで誘導されたＴｒｅｇ細胞の機能
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでＣＧＧＧで誘導されたＴｒｅｇ細胞の機能を調べた。
【０１８５】
ｉＴｒｅｇ細胞はしばしば炎症状態で機能的でないか不安定であり、このため、ＣＳＧＧ処理によって誘導されて試験管内で生成されたｉＴｒｅｇ細胞の免疫抑制活性を試験した。ＣＤ４５．１＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−ナイーブＴ細胞は、ｍｏｃｋ又はＣＳＧＧ処理したＤＣｓと２日間培養した後、細胞を分類してＣＤ４５．１＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋  ｉＴｒｅｇｓを精製した。ＣＴＶで標識された反応者ＣＤ４５．２＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞をＣＤ４５．１＋Ｔｒｅｇ細胞と異なる割合で共培養した後、増殖をＦＡＣＳで分析した。
【０１８６】
その結果、試験管内条件において、ＣＳＧＧ処理されたＤＣの存在下に生成されて分類されたｉＴｒｅｇ細胞は、ｍｏｃｋ処理されたＤＣで培養された細胞に比べて顕著に向上した免疫抑制能を示した（図１５Ａ）。
【０１８７】
生体内でＴｒｅｇ細胞の抑制活性を試験するために、大膓炎のＴ細胞伝達モデルを使用した。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、分類されたａｌｌｅｌｉｃａｌｌｙ−表示された（ＣＤ４５．１＋）ｉＴｒｅｇ細胞と共に又は単独でＲａｇ１−／−リンパ球減少症マウスに伝達した（図１４Ａ）。
【０１８８】
その結果、ｍｏｃｋ誘導されたｉＴｒｅｇの共同注入は効果がなく、大膓炎の徴候を抑制できなかった。ナイーブＴ細胞単独投与した授与マウスも３週で大膓炎及び体重減少の深刻な徴候を示した。しかし、対照的に、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ又はＣＳＧＧによって誘導されたｉＴｒｅｇ細胞の伝達は、大膓炎発達及び体重減少を有意に減少させた（図１４Ａ〜図１４Ｄ及び図１５Ｂ）。
【０１８９】
実施例１１：ＣＳＧＧ投与による大膓炎発達の抑制
ＣＳＧＧ自体の投与が大膓炎発達を抑制できるかどうかを調べるために、ＣＤ４５．１＋Ｆｏｘｐ３ＧＦＰマウスから分類されたナイーブＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞をＳＰＦ  Ｒａｇ１−／−宿主マウスに養子移入した後、実験終了時まで１週に３回ＰＢＳ又はＣＳＧＧ（１００μｇ／ｄｏｓｅ）を腹腔内投与した。
【０１９０】
その結果、ナイーブＴ細胞を伝達した後にＰＢＳ処理した授与マウスは深刻な大膓炎が発生したが、ＣＳＧＧ投与マウスは、体重減少及び組織病理学的に分析した大膓炎進行が有意に減少した（図１４Ｅ〜図１４Ｇ及び図１５Ｃ）。ＣＳＧＧ処理の保護効果は、全Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の増加及びＩＦＮ−γ生成作用Ｔ細胞の頻度減少と関連している（図１４Ｈ及び図１５Ｃ）。この結果は、ＣＳＧＧ処理によって誘導されるＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞が炎症性大膓炎の進行を抑制できることを示唆する。
【受託番号】
【０１９１】
寄託機関名：韓国生命工学研究院
受託番号：ＫＣＴＣ１３２７０ＢＰ
受託日：２０１７０５１９
【産業上の利用可能性】
【０１９２】
本発明の多糖体、例えば、ベータグルカン／ガラクタン多糖体（ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｂｅｔａ  ｇｌｕｃａｎ／ｇａｌａｃｔａｎ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ＣＳＧＧ）及びこれを生成するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ  ＰＲＩ１（ＫＣＴＣ１３２７０ＢＰ）が様々な抗原によってＴｒｅｇ細胞を誘導できるので、前記菌株、前記ＣＳＧＧ多糖体又は前記誘導されたＴｒｅｇ細胞は免疫疾患又は炎症性疾患予防又は治療に有用である。
【０１９３】
以上では本発明内容の特定な部分を詳細に述べたが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的技術は単に好ましい実施様態であり、これによって本発明の範囲が制限されることはない点が明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は添付の請求項とそれらの等価物によって定義されるべきである。
【図１Ａ】
2020525570.tif 000005
【図１Ｂ】
2020525570.tif 000006
【図１Ｃ】
2020525570.tif 000007
【図１Ｄ】
2020525570.tif 000008
【図１Ｅ】
2020525570.tif 000009
【図１Ｆ】
2020525570.tif 000010
【図１Ｇ】
2020525570.tif 000011
【図２Ａ】
2020525570.tif 000012
【図２Ｂ】
2020525570.tif 000013
【図２Ｃ】
2020525570.tif 000014
【図２Ｄ】
2020525570.tif 000015
【図２Ｅ】
2020525570.tif 000016
【図２Ｆ】
2020525570.tif 000017
【図３Ａ】
2020525570.tif 000018
【図３Ｂ】
2020525570.tif 000019
【図３Ｃ】
2020525570.tif 000020
【図４Ａ】
2020525570.tif 000021
【図４Ｂ】
2020525570.tif 000022
【図４Ｃ】
2020525570.tif 000023
【図４Ｄ】
2020525570.tif 000024
【図５Ａ】
2020525570.tif 000025
【図５Ｂ】
2020525570.tif 000026
【図５Ｃ】
2020525570.tif 000027
【図５Ｄ】
2020525570.tif 000028
【図５Ｅ】
2020525570.tif 000029
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３Ｈ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１４Ｇ】
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【図１４Ｈ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020525570.tif 000093
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