(57)【要約】本発明は、免疫チェックポイント介入による治療に適する、癌を有する対象を同定する方法に関し、前記方法は、前記対象から単離された試料において、発現フレームシフトインデル変異量を分析することを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫療法による治療に適する、癌を有する対象を同定する方法であって、前記対象から単離された試料中の、発現フレームシフトインデル変異量を分析する工程を含む、方法。
【請求項２】
免疫療法による治療に適する、癌を有する対象を同定する方法であって、前記対象由来の試料中の、発現フレームシフトインデル変異量を決定する工程を含み、参照試料と比較して高い発現フレームシフトインデル変異量は、免疫療法への応答を示す、方法。
【請求項３】
癌を有する対象が免疫療法による治療に応答するかを予測または決定する方法であって、前記対象由来の試料中の発現フレームシフトインデル変異量を決定する工程を含み、より高い発現フレームシフトインデル変異量が、該治療への応答を示す、方法。
【請求項４】
癌の種類が免疫療法による応答するかを予測または決定する方法であって、前記癌由来の試料中の発現フレームシフトインデル変異量を決定する工程を含み、より高い発現フレームシフトインデル変異量が、前記治療への応答を示す、方法。
【請求項５】
以下の工程を含む、対象における癌を治療または予防する方法：
（i）請求項１または２に記載の方法によって、免疫療法による治療に適する、癌を有する対象を同定する工程、
（ii）前記対象を免疫療法で治療する工程。
【請求項６】
対象における癌を治療または予防する方法であって、癌を有する対象を免疫療法で治療する工程を含み、対象は、参照試料と比較して、高い発現フレームシフトインデル変異量を有すると決定されている、方法。
【請求項７】
対象における癌を治療または予防する方法であって、癌を有する対象を免疫療法で治療する工程を含み、対象は、請求項１または２に記載の方法で免疫療法による治療に適すると同定されている、方法。
【請求項８】
以下の工程を含む、対象における癌の治療または予防の方法における使用のための免疫療法：
（i）請求項１または２のいずれかに記載の方法によって、免疫療法による治療に適する、癌を有する対象を同定する工程、
（ii）前記対象を免疫療法で治療する工程。
【請求項９】
対象における癌の治療または予防における使用のための免疫療法であって、対象は、参照試料と比較して、より高い発現フレームシフトインデル変異量を有することが決定されている、免疫療法。
【請求項１０】
請求項１または２に記載の方法によって、免疫療法による治療に適すると同定された対象における癌の治療または予防における使用のための免疫療法。
【請求項１１】
発現フレームシフトインデル変異が、腫瘍抑制遺伝子の発現フレームシフトインデル変異である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法または使用のための免疫療法。
【請求項１２】
発現されたフレームシフトインデル変異が、クローン性ネオアンチゲンをコードする、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法または使用のための免疫療法。
【請求項１３】
インデル変異が、エクソーム配列決定、RNA配列決定、全ゲノム配列決定および／または標的遺伝子パネル配列決定によって同定される、請求項１〜１２のいずれかに記載の使用または使用のための免疫療法。
【請求項１４】
試料が、対象由来の腫瘍、血液または組織試料である、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法または使用のための免疫療法。
【請求項１５】
免疫療法が、免疫チェックポイント介入または細胞療法である、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法または使用のための免疫療法。
【請求項１６】
免疫チェックポイント介入が、CTLA4、PD-1、PD-L1、Lag-3、Tim-3、TIGITまたはBTLAと相互作用する、請求項１５に基づく方法または使用のための免疫チェックポイント介入。
【請求項１７】
免疫チェックポイント介入が、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブまたはイピリムマブである、請求項１６または１７に記載の方法または使用のための免疫チェックポイント介入。
【請求項１８】
前記細胞療法がT細胞療法である、請求項１５に記載の方法または使用のための免疫療法。
【請求項１９】
癌が、膀胱癌、胃癌、食道癌、乳癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、腎臓癌（腎細胞）、肺癌（小細胞、非小細胞および中皮腫）、脳癌（神経膠腫、星状細胞腫、神経膠芽腫）、黒色腫、メルケル細胞癌、淡明細胞型腎細胞癌（ccRCC）、リンパ腫、小腸癌（十二指腸および空腸）、白血病、膵臓癌、肝胆道腫瘍、胚細胞癌、前立腺癌、頭頸部癌、甲状腺癌および肉腫から選択される、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法または使用のための免疫療法。
【請求項２０】
癌が、黒色腫、メルケル細胞癌、腎癌、非小細胞肺癌（NSCLC）、膀胱尿路上皮癌（BLAC）、頭頸部扁平上皮癌（HNSC）、およびMSI-high癌から選択される、請求項１９に記載の方法または使用のための免疫療法。
【請求項２１】
癌が黒色腫である、請求項１９に記載の方法または使用のための免疫療法。
【請求項２２】
癌が腎臓癌（腎細胞）である、請求項１９に記載の方法または使用のための免疫療法。
【請求項２３】
対象が哺乳動物、好ましくはヒト、ネコ、イヌ、ウマ、ロバ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット、ウサギまたはモルモットである、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法または使用のための免疫療法。
【請求項２４】
対象がヒトである、請求項２２に記載の方法または使用のための免疫療法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫チェックポイント介入による治療に適する、癌を有する対象を同定する方法に関する。本発明はさらに、癌を有する対象が免疫チェックポイント介入による治療に応答するかを予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍遺伝子変異量（TMB）は、複数種にわたる腫瘍の免疫療法への応答、並びに、チェックポイント阻害剤（CPI）および細胞ベースの治療を含む治療手段に関連する。しかしながら、TMBは、臨床的に関連するバイオマーカーであるが、免疫療法への応答に関連する分子的特徴の詳細を明らかにする余地が明確に存在する。
【０００３】
特に、TMBを免疫療法バイオマーカーとする基本的な仮説は、体細胞変異体が腫瘍特異的ネオアンチゲンを生成できるという事象に関連する。しかしながら、変異の大部分は、免疫原性効果を有さないようである。例えば、通常の腫瘍試料では数百の高親和性ネオアンチゲンが予測されるが、ペプチドスクリーニングでは、通常ではT細胞反応性は、腫瘍あたり少数のネオアンチゲンにしか検出されない。
【発明の概要】
【０００４】
従って、当技術分野では、免疫療法に応答する対象を同定する代替的かつ改良された方法、および代替的な免疫療法バイオマーカーが必要とされている。本発明は、この課題に取り組むものである。
【０００５】
本発明は、フレームシフト挿入／欠失（fsインデル）は頻繁ではないが（汎癌中央値=腫瘍あたり4）、体細胞変異体の高度に免疫原性のサブセットであることを見出した。fsインデルは、より高い変異体結合特異性を有する、腫瘍特異的なネオアンチゲンをより多数産生することができる。しかしながら、fsインデルは、未成熟終止コドン（PTC）を引き起こし、ナンセンス媒介性崩壊（NMD）の過程を経たメッセンジャーRNAレベルでの分解に感受性を有する。NMDは通常、切断されたタンパク質の毒性の蓄積から真核細胞を保護するための監視経路として機能する。本発明者らは、fsインデルのサブセットがNMD分解を回避し、これが翻訳されると、抗腫瘍免疫への指向に実質的に関与すること、従って、fsインデルのサブセットが免疫療法に対する応答のバイオマーカーであることを見出した。
【０００６】
第１の態様によれば、本発明は、免疫療法による治療に適する、癌を有する対象を同定する方法であって、前記対象から単離された試料中の、発現されたフレームシフトインデル変異量を分析する工程を含む、方法を提供する。
【０００７】
本明細書中で使用される「インデル変異」は、生物のヌクレオチド配列（例えば、DNAまたはRNA）における塩基の挿入および/または欠失をいう。通常は、インデル変異は、生物のDNA、好ましくはゲノムDNAにおいて生じる。適切には、インデル変異は、対象における腫瘍細胞のゲノムDNAにおいて生じる。適切には、インデルは、挿入変異であってもよい。適切には、インデルは欠失変異であってもよい。
【０００８】
適切には、インデルは、1~100塩基、例えば、1~90、1~50、1~23または1~10塩基であってもよい。
【０００９】
本発明の別の態様によれば、免疫療法による治療に適する、癌を有する対象を同定する方法であって、前記対象由来の試料中の、発現フレームシフトインデル変異量を決定する工程を含み、参照試料と比較して高い発現フレームシフトインデル変異量は、免疫療法への応答を示す、方法が提供される。
【００１０】
さらなる態様において、本発明は、癌を有する対象の予後を予測または決定する方法、または癌を有する対象の生存を予測する方法であって、この方法は前記対象由来の試料中の発現フレームシフトインデル変異量を決定する工程を含み、より高い発現フレームシフトインデル変異量は、改善された予後または改善された生存を示す、方法を提供する。
【００１１】
本発明はさらに、癌の種類が免疫療法による治療に応答するかを予測または決定する方法であって、前記癌由来の試料における発現フレームシフトインデル変異量を決定することを含み、より高い発現フレームシフトインデル変異量は、前記治療への応答を示す、方法を提供する。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は、以下の工程を含む、対象における癌を治療または予防する方法を提供する；
（i）本発明の方法によって、免疫療法による治療に適する、癌を有する対象を同定する工程、
（ii）前記対象を免疫療法で治療する工程。
【００１３】
別の態様において、本発明は、対象における癌を治療または予防する方法であって、免疫療法を対象に投与する工程を含み、対象は、本発明の方法を使用する免疫療法による治療に適すると同定されている（同定されたものである）、方法を提供する。
【００１４】
本発明はさらに、以下の工程を含む、対象における癌の治療または予防の方法における使用のための免疫療法を提供する：
（i）本発明の方法を用いた免疫療法による治療に適する、癌を有する対象を同定する工程、
（ii）前記対象を免疫療法で治療する工程。
【００１５】
本発明はさらに、対象における癌の治療または予防への使用のための免疫療法であって、対象は、本発明の方法を使用する免疫療法による治療に適すると同定されている、免疫療法を提供する。
【００１６】
従って、本発明は、癌の治療および予防の、新規の、代替の、および/またはより効果的な方法に関する、当技術分野の課題に取り組むものである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図1（a）腎臓癌は、最も高い汎癌インデル率を有する。プロットされるのは、TCGAからの19の固形腫瘍種にわたるインデル（すなわち、#インデル/（#インデル+#SNV））である、変異の増殖である。最後の2つのボックスプロットは、追加の独立した腎細胞癌複製データセットである。統計学的な関連性は、全ての他の非腎臓TCGA試料と比較したKIRCコホートに基づいて計算される。（b）腎臓癌の汎癌インデル数が最も高い。TCGAからの19の固形腫瘍種にわたるインデル変異の絶対数をプロットする。最後の2つのボックスプロットは、追加の独立した腎細胞癌複製データセットである。統計学的な関連性は、全ての他の非腎臓TCGA試料と比較したKIRCコホートに基づいて計算される。
【図２】図2:TCGA汎癌コホートの全患者にわたる、フレームシフトインデルネオアンチゲンを有する再発遺伝子。X軸にはフレームシフトインデルネオアンチゲンを含む固有の試料の数がプロットされ、Y軸には固有のネオアンチゲンの数がプロットされる（すなわち、各変異は複数のネオアンチゲンを生成し得る）。30個を超える試料または80個を超えるネオアンチゲンのいずれかで、変異した遺伝子がマークされる。
【図３−１】図3：癌種による腫瘍特異的ネオアンチゲン数。第1のパネルは、snv由来のネオアンチゲンの数のプロットである。第2のパネルは、フレームシフトインデル由来のネオアンチゲンの数である。第3は変異体のみのネオアンチゲンバインダーの数である。第4はsnv/インデル由来のネオアンチゲンの割合である。第5は、変異体アレルのみが結合するネオアンチゲンの割合である。最後は、5つより多い変異体、または5つより少ない変異体のみのネオアンチゲンバインダーを有する試料の割合を示す円グラフである。最初の3つのパネルは、中央値によって、最小（左）から最高（右）に順序付けられる。パネル4および5は、パネル3と同じように順序付けられる。
【図３−２】図3：癌種による腫瘍特異的ネオアンチゲン数。第1のパネルは、snv由来のネオアンチゲンの数のプロットである。第2のパネルは、フレームシフトインデル由来のネオアンチゲンの数である。第3は変異体のみのネオアンチゲンバインダーの数である。第4はsnv/インデル由来のネオアンチゲンの割合である。第5は、変異体アレルのみが結合するネオアンチゲンの割合である。最後は、5つより多い変異体、または5つより少ない変異体のみのネオアンチゲンバインダーを有する試料の割合を示す円グラフである。最初の3つのパネルは、中央値によって、最小（左）から最高（右）に順序付けられる。パネル4および5は、パネル3と同じように順序付けられる。
【図３−３】図3：癌種による腫瘍特異的ネオアンチゲン数。第1のパネルは、snv由来のネオアンチゲンの数のプロットである。第2のパネルは、フレームシフトインデル由来のネオアンチゲンの数である。第3は変異体のみのネオアンチゲンバインダーの数である。第4はsnv/インデル由来のネオアンチゲンの割合である。第5は、変異体アレルのみが結合するネオアンチゲンの割合である。最後は、5つより多い変異体、または5つより少ない変異体のみのネオアンチゲンバインダーを有する試料の割合を示す円グラフである。最初の3つのパネルは、中央値によって、最小（左）から最高（右）に順序付けられる。パネル4および5は、パネル3と同じように順序付けられる。
【図４−１】図4:（a）非同義置換SNV変異量（第1）、インフレームインデル量（第2）およびフレームシフトインデル量（第3）はHugoら、Snyderら、およびVan Allenらの黒色腫コホートにわたる、チェックポイント阻害剤療法に対する応答によって分ける。（b）非同義置換SNV変異量（上）、インフレームインデル量（中）およびフレームシフトインデル量（下）に基づく、チェックポイント阻害剤患者応答率。患者を、各指標について、高（上四分位）および低（下3四分位）群に分ける。分析はHugoら、Snyderら、およびVan Allenらの黒色腫コホートについて提示した。
【図４−２】図4:（a）非同義置換SNV変異量（第1）、インフレームインデル量（第2）およびフレームシフトインデル量（第3）はHugoら、Snyderら、およびVan Allenらの黒色腫コホートにわたる、チェックポイント阻害剤療法に対する応答によって分ける。（b）非同義置換SNV変異量（上）、インフレームインデル量（中）およびフレームシフトインデル量（下）に基づく、チェックポイント阻害剤患者応答率。患者を、各指標について、高（上四分位）および低（下3四分位）群に分ける。分析はHugoら、Snyderら、およびVan Allenらの黒色腫コホートについて提示した。
【図５】図5:ccRCC患者において、i）フレームシフトインデルネオアンチゲン数（fsインデル-NeoAtgs）、ii）フレーム内インデル変異数（ifインデル変異）およびiii）非同義置換snvネオアンチゲン数（ns-snv-NeoAtg）に基づいて、免疫遺伝子シグネチャーを比較した。左:i）、ii）およびiii）について、高群と低群との間でのシグネチャー発現中央値（FPKM正規化された上四分位）の変化率を示す。いくつかの経路が、高fsインデル-NeoAtg群において排他的にアップレギュレートされることが見出された。右:高fsインデルNeoAtg群内の相関分析は、CD8+ T細胞シグネチャーがMHCクラスI抗原提示遺伝子および細胞溶解活性の両方と強く相関していることを示した。
【図６】図6:非同義置換SNV変異量（第1）、インフレームインデル量（第2）、フレームシフトインデル量（第3）およびクローン性フレームシフトインデル量（第4）を、Snyderらの黒色腫コホートにおけるチェックポイント阻害剤療法に対する応答によって分ける。
【図７−１】図7:パネルAは、試験設定および方法論的アプローチの概要を示す。パネルの左手側はfsインデル誘発早期終止コドンを示し、これは、効率的なナンセンス媒介性崩壊（NMD）に関連する位置で、遺伝子の中央エクソンに入る。パネルの右側はfsインデル誘発早期終止コドンを示し、これは、遺伝子の最後のエクソン（NMDを回避することに関連した位置）に入る。パネルBは、最初、中間、最後から2番目、または最後のエクソン位置のいずれかに入る場合の、発現fsインデルと非発現fsインデルとの間のオッズ比（OR）を示す。オッズ比および関連するp値は、Fisher's Exact Testを用いて計算した。着色は、グループを区別するために任意に使用される。エラーバーは、OR推定値の95%信頼区間を示す。パネルCは、エクソン群位置による、発現fsインデルの変異アレル頻度を示す。Kruskal-Wallis検定を用いて群間の分布の違いを検定した。パネルDは、発現fsインデル変異に対する、非発現fsインデル変異のタンパク質発現レベルを示す。両側Mann Whitney U検定を用いて群間の差を評価した。
【図７−２】図7:パネルAは、試験設定および方法論的アプローチの概要を示す。パネルの左手側はfsインデル誘発早期終止コドンを示し、これは、効率的なナンセンス媒介性崩壊（NMD）に関連する位置で、遺伝子の中央エクソンに入る。パネルの右側はfsインデル誘発早期終止コドンを示し、これは、遺伝子の最後のエクソン（NMDを回避することに関連した位置）に入る。パネルBは、最初、中間、最後から2番目、または最後のエクソン位置のいずれかに入る場合の、発現fsインデルと非発現fsインデルとの間のオッズ比（OR）を示す。オッズ比および関連するp値は、Fisher's Exact Testを用いて計算した。着色は、グループを区別するために任意に使用される。エラーバーは、OR推定値の95%信頼区間を示す。パネルCは、エクソン群位置による、発現fsインデルの変異アレル頻度を示す。Kruskal-Wallis検定を用いて群間の分布の違いを検定した。パネルDは、発現fsインデル変異に対する、非発現fsインデル変異のタンパク質発現レベルを示す。両側Mann Whitney U検定を用いて群間の差を評価した。
【図８−１】図8:パネルAは、治療に対する「臨床的効果なし」または「臨床的効果あり」に基づいて群に分けた、3つの黒色腫チェックポイント阻害剤（CPI）治療コホートを示す。コホートあたり3つの指標を表示する:（一番上の行）TMB非同義置換SNV数、（中央の行）フレームシフトインデル数および（一番下の行）NMD回避性変異数。最初の列は、Van Allenらの抗CTLA4コホートであり、中央の列はSnyderらの抗CTLA4コホートであり、最後の列はHugoらの抗PD1コホートである。右端は、3つのコホートにわたる各指標についてのメタ分析p値であり、CPI治療からの臨床的効果との関連を示している。両側Mann Whitney U検定を用いて群間の差を評価した。独立した各検定からのP値を組み合わせるFisher法を用いて、コホート間の結果のメタ分析を行った。パネルBは、1以上のNMD回避性変異を有する患者およびNMD回避性変異がゼロの患者について、CPI療法の臨床的効果を示す患者の%を示す。パネルCは、養子細胞療法治療コホートにおいて比較された、同じ3つの測定指標を示す。
【図８−２】図8:パネルAは、治療に対する「臨床的効果なし」または「臨床的効果あり」に基づいて群に分けた、3つの黒色腫チェックポイント阻害剤（CPI）治療コホートを示す。コホートあたり3つの指標を表示する:（一番上の行）TMB非同義置換SNV数、（中央の行）フレームシフトインデル数および（一番下の行）NMD回避性変異数。最初の列は、Van Allenらの抗CTLA4コホートであり、中央の列はSnyderらの抗CTLA4コホートであり、最後の列はHugoらの抗PD1コホートである。右端は、3つのコホートにわたる各指標についてのメタ分析p値であり、CPI治療からの臨床的効果との関連を示している。両側Mann Whitney U検定を用いて群間の差を評価した。独立した各検定からのP値を組み合わせるFisher法を用いて、コホート間の結果のメタ分析を行った。パネルBは、1以上のNMD回避性変異を有する患者およびNMD回避性変異がゼロの患者について、CPI療法の臨床的効果を示す患者の%を示す。パネルCは、養子細胞療法治療コホートにおいて比較された、同じ3つの測定指標を示す。
【図９−１】図9：は、a）T細胞反応性（左側の列）またはb）T細胞非反応性（右側の列）のいずれかであることが見出された、個人向けワクチンおよびCPI研究におけるT細胞反応性について実験的に試験されたfsインデルのエクソン位置を示す。fsインデル変異がNMD回避性に関連したエクソン位置（最初、最後から2番目、または最後）に入った場合、転写産物を暗青色とし、fsインデルがNMD適格性に関連したエクソン位置（中間）に入った場合、転写産物は淡青色とした。灰色の線は、T細胞反応性およびT細胞非反応性に基づいて、NMD回避性エクソン位置に入るfsインデルの全体的な割合が示されている。P値は、Fisher’s Exact Testを用いて計算される。
【図９−２】図9：は、a）T細胞反応性（左側の列）またはb）T細胞非反応性（右側の列）のいずれかであることが見出された、個人向けワクチンおよびCPI研究におけるT細胞反応性について実験的に試験されたfsインデルのエクソン位置を示す。fsインデル変異がNMD回避性に関連したエクソン位置（最初、最後から2番目、または最後）に入った場合、転写産物を暗青色とし、fsインデルがNMD適格性に関連したエクソン位置（中間）に入った場合、転写産物は淡青色とした。灰色の線は、T細胞反応性およびT細胞非反応性に基づいて、NMD回避性エクソン位置に入るfsインデルの全体的な割合が示されている。P値は、Fisher’s Exact Testを用いて計算される。
【図１０】図10:パネルAは、機能的に等価なSNVストップゲイン変異に対して標準化されたfsインデルの選択性分析を示す。（SNVストップゲインと比較した）fsインデルが、各エクソン位置群に入るオッズ比を示す。オッズ比および関連するp値は、Fisher’s Exact Testを用いて計算した。着色は、グループを区別するために任意に使用される。エラーバーは、OR推定値の95%信頼区間を示す。パネルBは、TCGA SKCM（左）およびMSI（右）のコホートについて、全体的な生存Kaplan-Meirプロットを示した。Cox比例ハザードモデルを用いて、全生存率の分析を行った。
【図１１】図11:データは3つの黒色腫チェックポイント阻害剤（CPI）治療コホートを示し、治療に対する「臨床的効果なし」（淡青色）または「臨床的効果あり」（暗青色）に基づいて群に分け、発現nsSNV変異数（アレル特異的RNA配列を用いて検出）の関連性について試験した。最初の列はVan Allenらの抗CTLA4コホートであり、中央の列はSnyderらの抗CTLA4コホートであり、最後の列はHugoらの抗PD1コホートである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、癌の発現フレームシフトインデル変異量が、特に、免疫チェックポイント介入または細胞療法などの免疫療法に対する対象の応答に関連する、という驚くべき知見に基づくものである。特に、本発明は、癌のインデル変異量（特に、発現フレームシフトインデル変異量）が、他の種類の変異（例えば、単一ヌクレオチド変異体）と比較して、免疫チェックポイント介入または細胞療法に対する対象の応答に関連する、という驚くべき発見に基づくものである。
【００１９】
理論に縛られることを意図するものではないが、本発明者らは、他の種類の変異（例えば、SNV）と比較して、インデル変異、特に発現フレームシフトインデル変異によって、MHCクラスI分子による、高度に異なり、かつ区別される「非自己」ペプチドの提示が生じることで、免疫療法に対して、この応答性の向上を提供し得ると考察する。さらに、インデル変異（特にフレームシフト変異）は、SNV変異と比較して、１つの変異あたりのネオアンチゲンの数を増加させる。これらの高度に異なる非自己ペプチドは、胸腺における選択および除去を経た後も対象に存在する高親和性TCRを有するT細胞によって認識される、変異体特異的MHC結合を提供する。従って、対象へのチェックポイント介入の投与は、これらの高親和性T細胞を開放して、腫瘍に対する有効なT細胞媒介免疫応答を標的とする。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「インデル変異量」は、「インデル変異の数」および/または「インデル変異の割合」をいい得る。
【００２１】
「変異」とは、同じ個体由来の健康な細胞と比較した、腫瘍細胞におけるヌクレオチド配列（例えば、DNAまたはRNA）の差異をいう。ヌクレオチド配列における差異は、同じ個体由来の健康な細胞（例えば、非癌細胞）では発現しないタンパク質の発現、および/または腫瘍細胞で発現するMHCクラスI分子の「非自己」ペプチドの提示を生じ得る。
【００２２】
インデル変異は、エクソーム配列決定、RNA配列決定、全ゲノム配列決定および/または標的遺伝子パネル配列決定および/または単一遺伝子の通常のサンガー配列決定によって同定することができる。適切な方法は、当技術分野において公知である。
【００２３】
エクソーム配列決定およびRNA配列決定の説明は、それぞれ、Boaら（Cancer Informatics.2014;13（Suppl 2）:67-82）およびAresら（Cold Spring Harb Protoc.2014 Nov 3;2014（11）:1139-48）によって開示されている。標的遺伝子パネル配列決定は、例えば、Kammermeierら（J Med Genet.2014 Nov; 51（11）:748-55）およびYap KLら（Clin Cancer Res.2014.20:6605）を参照できる。MeyersonらのNat. Rev. Genetics, 2010 and Mardis, Annu Rev Anal Chem, 2013の記載も参照できる。標的遺伝子配列決定パネルは、市販されてもいる（例えば、Biocompare （http://www.biocompare.com/Editorial-Articles/161194-Build-Your-Own-Gene-Panels-with-These-Custom-NGS-Targeting-Tools/）に集約されている）。
【００２４】
適切な配列決定方法としては、次世代配列決定（Illumina, Roche Sequencer, Life Technologies SOLID（商標））、単分子リアルタイム配列決定（Pacific Biosciences）、真の単一分子配列決定（Helicos）などのハイスループット配列決定の技術、または発光技術を使用せずに配列決定反応または配列決定産物の検出をするための他の物理的方法（Ion Torrent（Life Technologies）など）を使用する配列決定方法が挙げられるが、これらに限定するものではない。
【００２５】
非腫瘍試料由来のDNAおよび/またはRNAと比較して、腫瘍試料由来のDNAおよび/またはRNAにおけるインデルを同定するための配列アラインメントは、当技術分野において公知の方法を使用して実施してもよい。例えば、参照試料と比較したヌクレオチドの差異は、本実施例と、Koboldt DC, Zhang Q, Larson DE, Shen D, McLellan MD, Lin L ら, VarScan 2: somatic mutation and copy number alteration discovery in cancer by exome sequencing. Genome research. 2012;22(3):568-76に記載の方法を使用して実施してもよい。
【００２６】
参照試料と比較したヌクレオチドの差異検出は、本実施例に記載の方法を使用して実施してもよい。適切には、参照試料は、生殖細胞系列のDNAおよび/またはRNA配列であり得る。
【００２７】
好ましい実施形態において、インデル変異はフレームシフトインデル変異である。このようなフレームシフトインデル変異は、通常は、対象における対応する健康な細胞中の非変異DNA/RNAによってコードされるポリペプチドとは、高度に異なる新規なオープンリーディングフレームを生成する。
【００２８】
フレームシフト変異は、通常は未成熟終止コドン（PTC）をオープンリーディングフレームに導入し、得られたmRNAは、ナンセンス媒介性崩壊（NMD）の標的となる。本発明者らは、フレームシフトインデル変異によって生成される異なるオープンリーディングフレームが、NMDを逃れて生産的な翻訳を受け、ポリペプチド配列が生成され得ることを検知した。理論に縛られることを意図するものではないが、通常のようにNMDの標的とはならず、腫瘍細胞中のMHCクラスI分子によって提示され得るペプチドを生成し得るインデルフレームシフト変異は、T細胞媒介免疫応答のための有効な標的を提供し、特に、チェックポイント介入に対する応答性をいい得る。
【００２９】
適切には、本方法が、NMDの標的となるか、または標的とならない、インデルフレームシフト変異を同定することを含み得る。
【００３０】
本明細書で使用する場合、用語「発現インデル」はNMDを逃れた（それによって発現した）インデルと同義でる。同様に、「発現フレームシフトインデル」はNMDを逃れたフレームシフトインデルと同義である。
【００３１】
高いインデル変異量は、本明細書で定義される。
【００３２】
試料
腫瘍からの生検および試料の単離は、当技術分野において一般的に実施されており、任意の適切な方法に従って実施できる。そのような方法は、当技術分野において公知である。
【００３３】
試料は、腫瘍試料、血液試料または組織試料であり得る。
【００３４】
一部の実施形態において、試料は腫瘍に関連する体液または組織である。
【００３５】
試料は血液試料であってもよい。試料は、血液画分（例えば、血清試料または血漿試料）を含んでいてもよく、または全血であってもよい。対象から試料を採取する技術は、当技術分野において周知である。
【００３６】
適切には、試料は、循環する腫瘍DNA、循環する腫瘍細胞、または腫瘍DNAを含むエクソソームであり得る。循環する腫瘍DNA、循環する腫瘍細胞、または腫瘍DNAを含むエクソソームは、当技術分野において公知の方法を使用して、対象から得られた血液試料から単離され得る。
【００３７】
腫瘍試料および非癌性組織試料は、当技術分野において公知の任意の方法で取得できる。例えば、腫瘍および非癌性試料は、切除を受けた癌患者から取得でき、あるいは、皮下注射針を用いた抽出、マイクロダイセクションまたはレーザーキャプチャーによって取得できる。対照（非癌性）試料は、例えば、死体のドナーまたは健康なドナーから取得できる。
【００３８】
ctDNAおよび循環する腫瘍細胞は、例えば、Nature. 2017 Apr 26; 545 （7655）: 446-451または、Nat Med. 2017 Jan;23（1）:114-119の記載に従って、血液試料から単離してもよい。
【００３９】
下流配列決定に適するDNAおよび/またはRNAは、当技術分野において公知の方法を用いて試料から単離することができる。例えば、DNAおよび/またはRNAの単離は、フェノールベースの抽出を用いて実施してもよい。フェノールベースの試薬は、細胞および組織を破壊して、その後、不純物からDNAまたはRNAを分離するため、変性剤およびRNase阻害剤の組み合わせを含む。たとえば、DNAzol（商標）、TRIZOL（商標）、TRI REAGENT（商標）等を使用した抽出手順を使用してもよい。PureLink（商標）ゲノムDNAミニキットまたはQIAGEN RNeasy（商標）などの固相抽出法（例えば、スピンカラム）を使用して、DNAおよび/またはRNAをさらに単離してもよい。単離されたRNAは、当技術分野において公知の方法（RT-PCR）を用いて、下流配列決定のためにcDNAに変換してもよい。
【００４０】
治療に適する対象
ある態様において、本発明は、免疫療法による治療に適する、癌を有する対象を同定する方法であって、前記対象から単離された試料における、発現フレームシフトインデル変異量を分析することを含む、方法を提供する。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、用語「治療に適する」は、免疫療法による治療に応答する可能性がより高い対象、または免疫療法による治療の候補となる対象をいい得る。治療に適する対象は、本発明を用いて適切でないと決定された対象よりも、前記治療に応答する可能性が高い。本発明による治療に適すると決定された対象は、免疫療法による治療への応答において、少なくとも6ヶ月間、部分的に応答するか、または、安定的に疾患を維持することで定義され得るものであり、持続的臨床効果（DCB）を実証し得る。
【００４２】
対象から得られた癌細胞において、同定または予測された発現フレームシフトインデル変異の数を、1つ以上の所定の閾値と比較してもよい。このような閾値を使用して、治療に対する応答の程度を示すカテゴリーに、対象を層別化してもよい。
【００４３】
閾値は、癌患者の参照のコホートに関連づけて決定してもよい。コホートは、少なくとも10、25、50、75、100、150、200、250、500またはそれ以上の癌患者を含んでいてもよい。コホートは、任意の癌のコホートであり得る。あるいは、患者が全て、試験される対象と関連する癌種または特異的な癌種を有していてもよい。
【００４４】
本発明はさらに、免疫療法による治療に適する、癌を有する対象を同定するための方法であって、前記対象由来の試料における発現フレームシフトインデル変異量を決定する工程を含み、参照試料と比較して高い発現フレームシフトインデル変異量が、免疫療法に対する応答を示す、方法を提供する。
【００４５】
本明細書で定義されるように、発現フレームシフトインデル変異量は、発現フレームシフトインデル変異の数および/または変異の総数に対するインデル変異の割合をいい得る。
【００４６】
適切には、発現フレームシフインデル変異量は、発現フレームシフトインデル変異の数をいい得る。発現フレームシフトインデル変異が「高い」または「より高い」数であるということは、癌患者の参照のコホートにおいて予測される発現フレームシフトインデル変異の中央値の数よりも多いことを意味し得る。例えば、発現フレームシフトインデル変異の最小数が、参照のコホートの上四分位にあると予測されることを意味し得る。
【００４７】
他の実施形態において、「高い」または「より高い」数の発現フレームシフトインデル変異は、少なくとも5、6、7、8、9、10、12、15、または20の発現フレームシフトインデル変異として定義してもよい。
【００４８】
適切には、発現フレームシフトインデル変異量が「高い」または「より高い」数であるということは、全変異数の割合としての、発現フレームシフトインデル変異の寄与（発現フレームシフトインデルの割合）として定義され得る。適切には、発現フレームシフトインデルの割合は、発現フレームシフトインデル変異の数を、変異の総数の分数として計算することによって得ることができる。
【００４９】
適切には、変異の総数は、発現フレームシフトインデル変異の数+SNV変異の数として定義してもよい。このように、一部の実施形態において、発現フレームシフトインデルの割合は、発現フレームシフトインデル変異+SNV変異の総数のうちの分数として、発現フレームシフトインデル変異の数を計算することで、提供され得る（すなわち、発現フレームシフトインデル変異の数／発現フレームシフトインデル変異の数＋SNV変異の数）。
【００５０】
適切には、発現フレームシフトインデル変異の「高い」または「より高い」割合は、癌患者の参照のコホートにおいて、決定または予測される発現フレームシフトインデル変異の割合の中央値よりも高いことを意味する。例えば、決定または予測される発現フレームシフトインデル変異の割合の最小値が、参照のコホートの上四分位内にあることを意味する。
【００５１】
他の実施形態において、発現フレームシフトインデル変異の「高い」または「より高い」割合は、変異の総数の少なくとも約0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.12、0.15、0.20、0.25または0.30であることとして定義され得る。
【００５２】
当業者は、「高い」または「より高い」数の発現フレームシフトインデル変異の意義が、文脈によるものであり得ること、それに応じて適切な分析を実行し得ることを理解するであろう。
【００５３】
上記のように、発現フレームシフトインデル変異量は、任意の癌または関連する癌/特異的な癌のいずれかを有する、対象の文章中のコホートで決定され得る。従って、発現フレームシフトインデル変異量は、参照のコホートに、上記で論じた方法を適用することによって決定し得る。従って、発現フレームシフトインデル変異の「高い」または「より高い」数は、癌患者の参照コホートにおいて、予測される発現フレームシフトインデル変異の中央値数よりも多い数に対応し、例えば、予測される発現フレームシフトインデル変異の最小数が参照コホートの上四分位にあることをいい得る。発現フレームシフトインデル変異の「高い」または「より高い」比率は、癌患者の参照コホートにおいて予測される発現フレームシフトインデル変異の中央値比率よりも大きい比率に対応し、例えば、予測される発現フレームシフトインデル変異の最小比率が参照コホートの上四分位にあることをいい得る。
【００５４】
適切には、本方法は、発現フレームシフトインデル変異の数および発現フレームシフトインデル変異の割合の両方を決定することを含み得る。発現フレームシフトインデル変異の数および/または割合は、当技術分野で公知の方法、例えば、本実施例に記載の方法によって分析してもよい。
【００５５】
免疫療法
「免疫療法」は、癌と戦うために、被験体自身の免疫系を使用する治療をいう。それは、免疫系が、癌細胞を認識し攻撃するのを補助することで作用する。
【００５６】
本明細書中に記載される本発明の1つの態様において、免疫療法は、免疫チェックポイント介入である。
【００５７】
免疫チェックポイントは、付随的な組織損傷を最小限にするために、自己寛容を維持し、末梢組織における生理学的免疫応答の持続時間および強さを調節するのに重要な、免疫系に強固に結びついた多量の阻害経路を示す。しかし、健康な組織における免疫応答を調節するためには、免疫チェックポイントは重要であるが、癌性組織においては、免疫チェックポイントは、腫瘍が、本来は腫瘍を根絶するために働く宿主免疫応答を回避することを補助し得る。
【００５８】
従って、腫瘍は、特定の免疫チェックポイント経路を、特に、腫瘍抗原に特異的なT細胞に対する免疫抵抗性の主要なメカニズムとして共に選択し得る。しかしながら、多くの免疫チェックポイントは、リガンド-レセプター相互作用によって開始されるため、抗体によって容易にブロックされるか、またはリガンドもしくはレセプターの組み換え体によって調節され得る。このような介入は、癌に対する治療的攻撃の新しい路線の基礎を形成している。細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4（CTLA4）抗体は、米国食品医薬品局（FDA）の承認を得た、この分野の免疫療法剤で最初のものであり、その後、多くの他の治療剤が承認を得ている。
【００５９】
免疫チェックポイント阻害剤は、進行中の癌との戦いにおいて有用なツールであることが証明されているが、全ての患者がこの治療に応答するわけではない。本発明は、免疫チェックポイント介入に応答する患者の同定の改良を円滑にする。
【００６０】
本明細書に記載の本発明の方法は、免疫チェックポイント介入での治療に適すると同定された対象に、免疫チェックポイント介入を投与する工程をさらに含み得る。
【００６１】
従って、本発明は、対象における癌を治療または予防する方法も提供する:
（a）前記方法はを下記を含む:
（i）本発明の方法によって、免疫チェックポイント介入による治療に適する、癌を有する対象を同定する工程;
（ii）前記対象を免疫チェックポイント介入で治療する工程;
（b）対象は、参照試料と比較して、より高い発現フレームシフトインデル変異量を有すると決定されている；または
（c）対象は、本発明の方法によって、免疫チェックポイント介入による治療に適すると同定されている。
【００６２】
本明細書で定義されるように、「治療」は、治療前の症状と比較して、治療された疾患、障害または感染の１つ以上の症状を減少させる、軽減する、または無くすことを示す。
【００６３】
「予防（prevention）」（または予防（prophylaxis））とは、疾患、障害または感染の症状の発症を遅延または妨げることをいう。予防は絶対的であってもよく（すなわち、疾患をまったく生じない）、一部の個体においてのみ、または限られた期間のみ有効であってもよい。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、「免疫チェックポイント介入」は、免疫細胞活性（特に、T細胞活性）を増加/増強するために、シグナル伝達相互作用またはシグナル伝達カスケードと相互作用するか（細胞外レベルまたは細胞内レベルのいずれかで）、またはそれを調節する任意の治療をいい得る。例えば、免疫チェックポイント介入は、免疫細胞活性（特に、T細胞活性）の阻害を、予防、減少、または最小化し得る。免疫チェックポイント介入は、共刺激シグナル伝達を増加させることによって免疫細胞活性（特にT細胞活性）を増加させることができる。
【００６５】
適切には「免疫チェックポイント介入」は、免疫チェックポイント阻害分子と相互作用するか、または免疫チェックポイント阻害分子を調節する療法であってもよい。本明細書では、このような実施形態における免疫チェックポイント介入を、「チェックポイント遮断療法」、「チェックポイント調節剤」または「チェックポイント阻害剤」とも称する。
【００６６】
免疫チェックポイント阻害分子は当技術分野において公知であり、例えばCTLA-4、PD-1、PD-L1、Lag-3、Tim-3、TIGITおよびBTLAの経路によるものが含まれる。「阻害剤」とは、例えば、これらの経路によるT細胞活性の阻害を防ぐ任意の手段を意味する。これは、レセプターリガンド相互作用をブロックする抗体または分子、細胞内シグナル伝達経路の阻害剤、およびT細胞表面上の免疫チェックポイント分子の発現を妨げる化合物によって達成され得る。
【００６７】
チェックポイント阻害剤には、例えば、CTLA-4阻害剤、PD-1阻害剤、PD-L1阻害剤、Lag-3阻害剤、Tim-3阻害剤、TIGIT阻害剤およびBTLA阻害剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。免疫細胞活性を増加させ得る介入の例としては、ICOS、CD137、CD27 OX-40およびGITRを含む（ただし、これらに限定されない）免疫調節レセプターを介して陽性シグナルを送達する共刺激抗体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６８】
免疫細胞活性の阻害を予防、減少または最小限に抑える適切な免疫チェックポイント介入の例としては、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルムマブ、アベルマブ、トレメリムマブおよびイピリムマブが挙げられる。
【００６９】
本明細書中に記載される本発明の１つの態様において、免疫療法は、細胞療法であり、例えば、養子細胞療法である。１つの態様において、細胞療法は、T細胞療法である。
【００７０】
養子細胞療法は、細胞と共に免疫機能および他の特徴を移植する目的のための、患者への細胞の移植である。細胞は、最も一般的には、免疫由来（例えば、T細胞）であり、自己由来であっても同種異系由来であってもよい。同種異系である場合、それらは、通常はHLA適合する同種異系である。一般に、癌免疫療法において、T細胞は、患者から抽出され、必要に応じて遺伝子改変され、インビトロで培養され、同じ患者に戻される。自己細胞の移植は、同種細胞よりも移植片対宿主疾患の問題を最小限にする。養子細胞療法を実施するための方法は、当技術分野において公知である。
【００７１】
ACTで移植されるT細胞は、CARTであってもよい。キメラ抗原レセプター（CAR）改変T細胞（CART）は、特異的細胞種を選択的に標的として、免疫系監視能力および腫瘍細胞に対する強力な自己増殖性細胞毒性メカニズム（高い特異性を有する）を利用することにおいて、大きな可能性を有する。この技術はモノクローナル抗体可変領域断片の特異性で腫瘍細胞を標的として、エフェクターT細胞機能の細胞傷害性で細胞死に影響を及ぼす方法を提供する。例えば、抗原レセプターは、scFvであっても、他の任意のモノクローナル抗体ドメインであってもよい。一部の実施形態において、抗原レセプターは、標的細胞に結合する任意のリガンド、例えば、細胞膜タンパク質と天然で会合するタンパク質の結合ドメインであり得る。
【００７２】
本発明の方法は、免疫療法による治療に適すると同定された対象に、細胞療法を施す工程をさらに含み得る。
【００７３】
従って、本発明は、対象における癌を治療または予防する方法を提供する：
（a）前記方法は、以下の工程を含む：
（i）本発明の方法によって、免疫療法による治療に適する、癌を有する対象を同定する工程;
（ii）細胞療法によって前記対象を治療する工程；
（b）対象は、参照試料と比較して、より高い発現フレームシフトインデル変異量を有すると決定されたか、または
（c）対象は、本発明の方法によって、免疫療法による治療に適すると同定された対象である。
【００７４】
本明細書中に記載される本発明の１つの態様において、対象は、手術前の疾患を有するか、または、原疾患の切除を受けた対象であって、補助療法を必要とし得る、若しくは、補助療法の効果を受け得る対象である。
【００７５】
本発明の方法を使用する治療は、循環腫瘍細胞および/または腫瘍に由来する転移を標的とすることを含んでもよい。
【００７６】
本発明の癌を治療するための方法および使用は、追加の癌治療と組み合わせて実施してもよい。特に、本発明の免疫チェックポイント介入は、共刺激抗体、化学療法および/または放射線療法、標的療法若しくはモノクローナル抗体療法と組み合わせて投与されてもよい。
【００７７】
免疫療法による治療結果を予測する方法
さらなる態様において、本発明は、癌を有する対象が免疫療法による治療に応答するかを予測または決定する方法であって、前記対象から単離された試料中の発現フレームシフトインデル変異量を決定する工程を含む、方法を提供する。
【００７８】
本実施例において提示される驚くべき発見により、当業者は、本発明において、例えば、対象のコホート内で、または多数の異なる対象またはコホートを使用して同定される範囲内で、高い、またはより高い発現フレームシフトインデル変異量を有する対象が、低い発現フレームシフトインデル変異量を有する対象と比較して、生存性が改善し得ることを理解するであろう。
【００７９】
発現フレームシフトインデル変異量の参照値は、本明細書中に提供される方法を使用して決定され得る。
【００８０】
発現フレームシフトインデル変異量は、本明細書で定義されるように、発現フレームシフトインデル変異の数または発現フレームシフトインデル変異量の割合であり得る。
【００８１】
前記方法は、癌対象のコホートにおいて予測される、発現フレームシフトインデル変異量を決定する工程と、下記のいずれかを含んでもよい；
（i）そのコホートにおいて予測される発現フレームシフトインデル変異の中央値の数および/または割合を決定する工程であって、その中央値数を参照値とする、工程；または
（ii）そのコホートの上四分位にあると予測される、発現フレームシフトインデル変異の最小の数および/または割合を決定する工程であって、その最小の数および/または割合を参照値とする、工程。
【００８２】
そのような「中央値数」または「上四分位にあるべき最小数」は、任意の癌コホート自体において、または代替の関連する/特異的な癌種において、決定できる。
【００８３】
適切には、発現フレームシフトインデル変異の「高い」または「より高い」数は、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、または20個のインデル変異として定義してもよい。
【００８４】
適切には、発現されたフレームシフトインデル変異の「高い」または「より高い」割合は、全変異の少なくとも約0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.12、0.15、0.20、0.25または0.30として定義してもよい。
【００８５】
当業者は、「高い」または「より高い」発現フレームシフトインデル変異量への言及が、文脈によるものであり得ること、それに応じた適切な分析が実行可能であることを理解するであろう。
【００８６】
このように、本発明は、癌を有する対象が免疫療法による治療に応答するかを予測または決定するための方法であって、対象由来の1つ以上の癌細胞における発現フレームシフトインデル変異量を決定する工程を含み、例えば、上記のコホートと比較して、より高い発現フレームシフトインデル変異量は治療に対する応答または生存性の向上を示す、方法も提供する。好適な実施形態において、癌は、腎臓癌（腎細胞）または黒色腫である。
【００８７】
腫瘍抑制因子
1つの態様において、発現フレームシフトインデル変異は、腫瘍抑制遺伝子中に存在し得る。
【００８８】
腫瘍抑制遺伝子は、腫瘍/癌細胞への進行から細胞を保護する遺伝子として定義され得る。従って、腫瘍抑制遺伝子によってコードされるタンパク質の機能の喪失または減少を引き起こす変異は、通常、他の遺伝的変化と組み合わせて、細胞の癌への進行に関与し得る。腫瘍抑制遺伝子は、ケアテイカー遺伝子、ゲートキーパー遺伝子、およびランドスケーパー遺伝子を含むカテゴリーに分類され得る。
【００８９】
腫瘍抑制遺伝子によってコードされるタンパク質は、通常は、細胞周期の調節に減衰または抑制効果を有する、および/または、アポトーシスを促進する。
【００９０】
腫瘍抑制遺伝子の例としては、網膜芽細胞腫（RB）、TP53、ARID1A、PTEN、MLL2/MLL3、APC、VHL、CD95、ST5、YPEL3、ST7、ST14、およびSWI/SNFクロマチンリモデリング複合体の成分をコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９１】
従って、本方法は、腫瘍抑制遺伝子における発現フレームシフトインデル変異量を決定する工程を含み得る。
【００９２】
ネオアンチゲン
適切には、インデル変異は、ネオアンチゲンを生成する。本明細書に記載の本発明のインデル変異は、発現フレームシフトネオアンチゲンを生成し得る。
【００９３】
ネオアンチゲンは、癌細胞内の変異の結果として生じる腫瘍特異的抗原である。従って、ネオアンチゲンは健康な細胞（すなわち、非腫瘍細胞）によっては発現しない。本明細書中に記載されるように、ネオアンチゲンは、プロセシングを受けて別個のペプチドを生成することができ、それらのペプチドはMHC分子の文脈で提示されたときにはT細胞によって認識され得る。
【００９４】
適切には、発現フレームシフトインデル変異は、クローンのネオアンチゲンを生成する。
【００９５】
「クローン性」ネオアンチゲンは、腫瘍全体にわたって効果的に発現し、本質的に全ての腫瘍細胞内にコードされるネオアンチゲンである。「分枝性」または「サブクローン性」ネオアンチゲンは、腫瘍内の、１つのサブセットまたはある割合の細胞で、または領域で発現するネオアンチゲンである。
【００９６】
「腫瘍全体にわたって存在する」、「腫瘍全体にわたって効果的に発現する」、および「本質的に全ての腫瘍細胞内でコードされる」は、クローン性ネオアンチゲンが、分析対象となる試料由来の腫瘍の全ての領域において発現することを意味し得る。
【００９７】
変異が「本質的に全ての腫瘍細胞内でコードされる」ことの決定は、統計的計算をいい、従って、統計的分析および閾値に従うことが理解されるであろう。
【００９８】
同様に、クローン性ネオアンチゲンが「腫瘍全体にわたって効果的に発現される」ことの決定は、統計学的計算をいい、従って、統計学的分析および閾値に従う。
【００９９】
本質的に各腫瘍細胞において、または、本質的に全ての腫瘍細胞において効果的に発現する、ということは、試料中の分析される全ての腫瘍細胞中に変異が存在すること、それが適切な統計的方法を使用して決定されること、を意味する。
【０１００】
例として、変異を有する癌細胞の割合を示す癌細胞画分（CCF）は、変異がクローン性であるかサブクローン性であるかを決定するために使用され得る。例えば、癌細胞画分は、Landauら（Cell.2013 Feb 14;152（4）:714-26）に記載されるように、変異型アレルの頻度を、コピー数および純度推定値によって統合することで決定され得る。
【０１０１】
適切には、CCF値は、分析される各腫瘍領域内および全ての腫瘍領域内で同定される、全ての変異について計算され得る。１つの領域のみ（すなわち、単一の試料のみ）が使用される場合、１セットのCCF値のみが得られる。これは、どの変異がその腫瘍領域内の全ての腫瘍細胞に存在するかに関する情報を提供し、それによって、変異が切断型か分岐型かを示す指標を提供する。腫瘍領域における全てのサブクローン性変異（すなわち、CCF<1）は、分岐型と決定し、一方、CCF=1を有するクローン性変異は切断型と決定する。
【０１０２】
上記のように、クローン性変異の決定は、統計的分析および閾値に従う。従って、>=0.75、例えば、0.80、0.85、0.90、0.95、1.00または>1.00のCCF95%信頼区間を有すると決定される場合、変異は切断型として同定され得る。逆に、分析した任意の試料において、<=0.75、例えば、0.70、0.65、0.60、0.55、0.50、0.45、0.40、0.35、0.30、0.25、0.20、0.15、0.10、0.05、0.01のCCF95%信頼区間を有すると決定される場合、変異は分岐型として同定され得る。
【０１０３】
切断型変異を同定するための方法の精度は、腫瘍から単離された2つ以上の試料についてクローン性変異を同定することによって、増加することが理解されるであろう。
【０１０４】
従って、本発明の方法は、クローン性ネオアンチゲンの発現フレームシフトインデル変異量を決定する工程を含み得る。
【０１０５】
一部の実施形態において、本発明の方法は、腫瘍抑制遺伝子からクローン性ネオアンチゲンを生成する、発現フレームシフトインデル変異量を決定することを含み得る。
【０１０６】
対象
本発明の好ましい実施形態において、対象は、哺乳動物、好ましくはネコ、イヌ、ウマ、ロバ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、マウス、ラット、ウサギまたはモルモットであるが、最も好ましくは、対象はヒトである。
【０１０７】
癌
適切には、癌は卵巣癌、乳癌、子宮内膜癌、腎臓癌（腎細胞）、肺癌（小細胞、非小細胞および中皮腫）、脳癌（神経膠腫、星状細胞腫、神経膠芽腫）、黒色腫、メルケル細胞癌、淡明細胞型腎細胞癌（ccRCC）、リンパ腫、小腸癌（十二指腸および空腸）、白血病、膵臓癌、肝胆道腫瘍、胚細胞癌、前立腺癌、頭頸部癌、甲状腺癌および肉腫であり得る。
【０１０８】
ある実施形態において、癌はDNA修復経路に変異を有してもよい。
【０１０９】
ある実施形態において、癌は黒色腫である。ある実施形態において、癌は腎臓癌（腎細胞癌）である。
【０１１０】
ある実施形態において、癌は黒色腫、メルケル細胞癌、腎臓癌、非小細胞肺癌（NSCLC）、膀胱尿路上皮癌（BLAC）、頭頸部扁平上皮癌（HNSC）、および高頻度マイクロサテライト不安定性（MSI-high）癌から選択され得る。
【０１１１】
ある実施形態において、癌はMSI-high癌であり得る。
【０１１２】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York （1994）, and Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY （1991）は、本開示で使用される多くの用語の一般的な辞書を当業者に提供する。
【０１１３】
本開示は、本明細書に記載される例示的な方法および材料に限定されるものではなく、本開示の実施形態の実施または試験において、本明細書に記載される方法および材料と、類似または同等のものを使用することができる。数値範囲には、範囲を定義する数値自体も含まれる。別段の指示がない限り、それぞれ、任意の核酸配列は、5'から3'の方向で左から右に書かれ、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの方向で左から右に書かれる。
【０１１４】
本明細書で提供される見出しは、本明細書全体を参照することによって得ることができる、本開示の様々な態様または実施形態を限定するものではない。従って、下記で定義される用語は、本明細書全体を参照することによって、より完全に定義される。
【０１１５】
アミノ酸は、本明細書では、アミノ酸の名称、3文字の略号、または1文字の略号を用いて示される。
【０１１６】
用語「タンパク質」は、本明細書中で使用される場合、タンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを含む。
【０１１７】
用語の他の定義は、本明細書全体を通して表され得る。例示的な実施形態をより詳細に説明する前に、本開示は説明された特定の実施形態に限定されず、当然ながら多様であり得ることを理解されるべきである。本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図しないことも理解されるべきである。
【０１１８】
特に明確に指示しない限り、ある範囲の値が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の、下限の単位の10分の1までの中間値もまた、具体的に開示されることが理解される。設定範囲内の任意の設定値または中間値と、その設定範囲内の任意の他の設定値または中間値との間の各小範囲は、本開示内に包含される。これらの小範囲の上限および下限は独立して、その範囲に含まれてもよいし、除外されてもよい。また、いずれかの、または両方の限界が小範囲に含まれない各範囲も、設定範囲における任意の特別に除外された限界として、本開示内に包含される。設定範囲が限界の一方または両方を含む場合、これらの限界の一方または両方を除外する範囲もまた、本開示に含まれる。
【０１１９】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、明らかに不適切な場合を除き、単数形「a」「an」「the」には複数の意味も含まれる。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、「含む（comprising）」、「含む（comprises）」、および「含まれる（comprised）」という用語は「含む（including）」、「含む（includes）」、または「含む（containing）」、「含む（containing）」、および「含む（contains）」と同義であり、包含的であるか、限定されないものであり、追加の非列挙のメンバー、要素、または方法工程を除外するものではない。用語「含む（comprising）」、「含む（comprises）」、および「含まれる（comprised）」は、「からなる（consisting of）」という用語も含む。
【０１２１】
本明細書で述べる引例は、全て本発明の出願日前に開示され提供される。本明細書のいかなるものも、そのような刊行物が本明細書に添付された特許請求の範囲の先行技術を構成することを容認するものと解釈されるべきではない。
【０１２２】
本発明は、以下の実施例を参照して、単なる例示として記載される。
【０１２３】
実施例
実施例1
汎癌に基づくインデル変異のパターン、ならびに、それらとチェックポイント阻害後の抗腫瘍免疫応答および結果との関連を決定した。
【０１２４】
結果
インデル頻度を、癌ゲノムアトラス（TCGA）からの5,777の試料を利用して、19の固形腫瘍種にわたって、汎癌に基づいて比較した。インデルの関与は、１試料あたりの総変異数の比率（インデル率）および１試料あたりのインデルの絶対数（インデル数）として分析され、観察された中央値はコホート全体でそれぞれ0.05および4であった。全ての腫瘍種にわたって、ccRCCは、0.12（P=2.2×10-16、図2）と、最も高い割合のコーディングインデルを有することが見出され、汎癌の平均と比較して2.4倍高かった。この結果は、他の2つ独立した試験で再現され、観察されたインデル比率の中央値が、それぞれ0.10および0.12あった（1、2）（図1）。乳頭腎細胞癌（pRCC）と色素芽球腎細胞癌（chrRCC）は、それぞれ2番目、3番目に高い割合を示し、腎癌内の、インデルの獲得に関与し得る、組織特異的な変異過程が示唆された。pRCC、chrRCCおよびccRCCはまた、全ての腫瘍種にわたって、最も高いインデル絶対数を有し、インデル数の中央値はそれぞれ10、8および7であった。ccRCCは1つ以上の腫瘍抑制遺伝子: VHL、PBRM1、SETD2、BAP1およびKDM5C（これらはnsSNVまたはインデル変異によって不活性化できる）における機能喪失（LoF）変異を特徴とする（11）。これらの顕著な変異による結果を歪みの可能性を排除するため、ccRCCのインデル比率を、VHL、PBRM1、SETD2、BAP1およびKDM5Cを除いて再計算したが、再計算後のインデル比率は0.12のままであった。以前に公表された、ccRCCの10症例から多領域全エクソーム配列決定データ（2）を利用して、インデル変異のクローン性を評価したところ、フレームシフトインデルの48%がクローン性のものである（全ての腫瘍領域に存在する）ことが明らかになった。
【０１２５】
フレームシフトネオアンチゲンが抗腫瘍免疫に関与するためには、変異ペプチドを発現させなければならない。フレームシフトは、早期終止コドン（PTC）を引き起こし、得られたmRNAは、ナンセンス媒介性崩壊（NMD）の標的となる。生殖系列試料についての先行技術での分析結果は、PTCがしばしば変異体アレルの発現の喪失を導くが、一部の変異体転写物は、遺伝子内のフレームシフトの確定した位置に基づいて、NMDを逃れることを示す（16）。１万を超える癌試料からの変異データおよび発現データの組み合わせ分析によって、NMDが様々な効力で誘発され、それが効果的な場合であっても、mRNA半減期が短い、などの要因により発現レベルを変化させない可能性があることを示した（17）。TCGA ccRCCデータを使用して、所定の遺伝子に変異を有する試料の遺伝子発現レベルを、非変異試料のものと比較した。インデルおよびSNV変異の両方についてこの分析を実施し、後者は標準比較として組み込んだ。インデル変異遺伝子の発現レベルに対するNMDの全体的な影響は14%であると推定され、完全に操作可能なNMDの下で得られるものより著しく低い。これはNMD回避PTCの存在を示す。
【０１２６】
nsSNVおよびインデル変異の潜在的免疫原性を、汎癌TCGAコホートにおけるMHCクラスI関連腫瘍特異的ネオアンチゲンの結合予測の分析を通して決定した。全ての試料にわたって、HLA特異的ネオアンチゲン予測を335,594のnsSNV変異に対して実施し、合計214,882の高親和性バインダー（IC50<50 nMと予測されるエピトープとして定義される）を得た。これはnsSNV変異あたり0.64 ネオアンチゲン（snv-ネオアンチゲン）の割合に相当する。同様の方法で、19,849のフレームシフトインデル変異について予測を行い、39,768の高親和性バインダーを得た。これは、フレームシフト変異あたり2.00のネオアンチゲン（フレームシフトネオアンチゲン）の割合に相当する。従って、変異ごとに、フレームシフトインデルは、結腸直腸癌コホートの最近の分析における予測と一致して（18）、約3倍以上の高親和性ネオアンチゲンバインダーを生成することができた（表1）。野生型および変異ペプチドの両方が中枢性免疫寛容に結合すると予測される場合、機構は、反応性T細胞受容体を有する細胞を欠失させ得る。従って、汎癌分析を繰り返し、ネオアンチゲンが変異体特異的バインダーに制限される場合（すなわち、野生型ペプチドが結合すると予測されない場合）、フレームシフトインデルが、変異体-アレルのみのバインダーについて9倍富化されたことを実証した（表1）。
【０１２７】
【表１】
2020525030.tif 000002
【０１２８】
特に興味深いのは、フレームシフト変異を介して頻繁に改変され、高いMHC結合傾向を有する遺伝子であった。汎癌分析において、それらは、TP53、ARID1A、PTEN、MLL2/MLL3、APCおよびVHLを含む、古典的な腫瘍抑制遺伝子について富化された（図2）。全体として、フレームシフト変異の数が最も多い上位15遺伝子は、>2,400の高親和性ネオアンチゲンが予測される、>500の試料（コホートの約10%）中で変異した。腫瘍抑制遺伝子は、以前は扱いにくい変異の標的であったが、それらは潜在的なネオアンチゲンとして標的対象となり得る。さらに、発明者らによって、腫瘍抑制遺伝子における多くの変化が、クローン性であり、全ての癌細胞に存在すること、それらが免疫系の強制的な標的となることが見いだされた。
【０１２９】
インデル変異の臨床的な影響を、ネオアンチゲン富化と治療的効果との間の関係を評価することによって考察した。今日まで、CPIは、6つの固形腫瘍型:黒色腫（抗PD1/CTLA-4）、マーケル細胞癌（抗PD1）、ccRCC（抗PD1）、NSCLC（抗PD1）、BLAC（抗PD-L1）およびHNSC（抗PD1）の治療用に承認されている。全SNV/インデル変異量（すなわちccRCC）における劇的な差異にもかかわらず、ネオアンチゲンの生成におけるフレームシフトの潜在的な役割と一致して、CPIが承認された腫瘍種は全て、平均を超える数のフレームシフトネオアンチゲンを有することが見出された（図3）。全体として、フレームシフトネオアンチゲンの数は、CPIが承認された腫瘍種において、現在まで承認されたCPIのない腫瘍種よりも非常に高かった（P=2.2×10-16）。CPIの効力に対するフレームシフトネオアンチゲンの影響を、黒色腫（n=38人の患者）における最近の抗PD-1研究からのエクソーム配列決定結果を用いて評価した（3）。変異の3つの分類を定義した:（i）非同義置換SNV、（ii）インフレーム（3n）インデルおよび（iii）フレームシフト（非3n）インデル、それぞれを治療への応答に関して試験した。分類（i）および（ii）の変異では、有意差がない傾向を示したが（P=0.26、P=0.22）、分類（iii）のフレームシフトインデル変異は抗PD-1応答と有意に相関し、P=0.02であった（図4a）。分類（iii）のフレームシフトインデル量が最も高い患者の上四分位は、抗PD-1療法に対する応答率（RR）が88%であったのに対し、下3四分位では43%であった（図4b）。この関連付けの再現性を確認するために、CPI応答結果を、ゲノムプロファイリングを伴う2つの追加の黒色腫コホート: Snyderら（n=62、抗CTLA-4処理）（4）およびVan Allenら（n=100、抗CTLA-4処理）（5）から得た。同じ分析を各コホートで実施したところ、フレームシフトインデル量は、両方の追加のデータセットにおいてCPI応答と有意に相関し、それぞれP=0.0074およびP=0.024であった（図4a）。3つのコホートにわたる全体的なメタ分析により、フレームシフトインデル数がCPI応答と有意に相関し（P=3.8×10-4）、nsSNV数（P=3.5×10-3）よりも強い相関があることが確認された。さらに、分類（iii）のフレームシフトインデル群において、全体的な生存率の改善がみられた（補足図3）。最後に、別の腫瘍種におけるフレームシフトインデル量とCPI応答との間の関係を評価するために、抗PD1療法で治療された31人の非小細胞肺癌患者の小コホートをRizviらから得た（6）。有意差はなかったが、CPI応答者においてフレームシフトインデル量がより高い傾向が見られた（P=0.2）。
【０１３０】
最後に、ccRCCにおいて、ゲノムデータは、CPI応答と相関させるために利用できないが、フレームシフト-ネオアンチゲン負荷と腫瘍内の免疫応答との間の関係を、RNA配列遺伝子発現データを用いて分析した。患者を、フレームシフト-ネオアンチゲン量（>10フレームシフト/症例を「高い」と定義する）対snv-ネオアンチゲン量（>17nsSNV/症例を「高い」と定義する；この閾値は、マッチングされた患者の試料サイズを確保するように設定された）に基づいて群に分けた。高負荷のフレームシフトネオアンチゲンは、MHCクラスI抗原提示、CD8+ T細胞活性化、および細胞溶解活性の増加を含む、免疫活性化に古典的に関連づけられる免疫的シグネチャーのアップレギュレーションと相関しており、このパターンは、高snvネオアンチゲン群では見られなかった（図5）。さらに、高フレームシフトネオアンチゲン群内の相関分析は、CD8+ T細胞のシグネチャーが、MHCクラスI抗原提示遺伝子および細胞溶解活性（それぞれρ=0.78およびρ=0.83）の両方と強く相関することを実証した（図5）。
【０１３１】
方法
試験設定と患者
19の異なる固形腫瘍種、すなわち：膀胱尿路上皮癌（BLCA）、乳癌（BRCA）、子宮頸癌および子宮頸癌（CESC）、結腸直腸腺癌（COADREAD）、神経膠腫（GMBLGG）、頭頸部扁平上皮癌（HNSC）、色素嫌性腎癌（KICH）、腎臓腎明細胞癌（KIRC）、腎乳頭細胞癌（KIRP）、肝細胞癌（LIHC）、肺腺癌（LUAD）、肺扁平上皮癌（LUSC）、卵巣漿液性嚢胞腺癌（OV）、膵臓腺癌（PAAD）、前立腺癌（PRAD）、 皮膚黒色腫（SKCM）、胃腺癌（STAD）、甲状腺癌（THCA）および子宮癌肉腫（UCS）にわたる、全エクソーム配列決定を受けた5,777人の患者について、癌ゲノムアトラス（TCGA）から汎癌の体細胞変異データを得た。患者レベルの変異アノテーションファイルは、厳密な品質管理を確保するためにTCGA分析ワーキンググループの専門家によって、以前に収集されたBroad Institute TCGA GDAC Firehoseリポジトリ（https://gdac.broadinstitute.org/）から抽出された。2つの追加のccRCC患者コホートにおいて、複製解析を行った:i）Satoらによって報告された106個のccRCCの全エクソーム配列決定研究（1）、ii）Gerlingerらによって報告された10個のccRCCの全エクソーム配列決定研究（2）。最終的な品質管理（QC）後の患者レベルの変異アノテーションファイルを、各研究について取得した。
【０１３２】
非同義置換SNV/インデルの負荷とチェックポイント阻害剤（CPI）治療に対する患者の応答との間の関連性を試験するために、さらに4つの患者コホートを使用した。第1のデータセットはHugoら（3）によって報告されているように、抗PD-1療法で治療された38人の黒色腫患者で構成された。最終的なQC後の変異アノテーションファイルおよび臨床結果データを入手し、患者由来の細胞株からDNAを抽出した症例およびCPI療法後に組織試料を入手した患者を除外して、32人の患者を分析のために組み入れた。後者の除外は、CPI療法自体が免疫原性腫瘍クローンの可能な排除を通して、変異頻度を変化させる可能性があるという事実から、特に重要であった。第2のCPIコホートはSnyderら（4）によって報告されているように、抗CTLA-4療法で治療された62人の黒色腫患者を含んだ。全ての患者試料は、CPI治療前の新鮮な急速凍結腫瘍組織から採取され、従って、62症例の全てを分析のために組み入れた。第3のCPIコホートはVan Allenら（5）によって報告されているように、抗CTLA-4療法で治療された100人の黒色腫患者を含み、同様に、全ての患者は、上記と同じ基準を使用して組み入れるのに適格であった。最後のCPIコホートはRizviら（6）によって報告されたように、抗PD1療法で治療された31人の非小細胞肺癌患者を含み、同様に、全ての患者は、組み入れに適格であった。Snyderら、Van Allenら、およびRizviらのコホートについては、インデル変異を含む最終的な変異アノテーションファイルを入手できなかったので、生のBAMファイルを入手し、以下に記載するように、標準化バイオインフォマティクスパイプラインを用いて変異体のコール（variant calling）を行った。
【０１３３】
全エクソーム配列変異体のコール
Snyderら、Van Allenら、およびRizviらのコホートからの生殖系列領域および腫瘍領域の両方を表すBAMファイルを得て、picardツール（1.107）SamToFastqを使用してFASTQフォーマットに変換した。FastQフォーマットにおける末端対読み込み生データ（100bp）を、bwa mem（bwa-0.7.7）（8）を使用して、GATKバンドル2.8（7）から得られた完全なhg19ゲノムアセンブリ（未知のコンティグを含む）に整列させた。Picardツールv1.107を使用して、同じ患者の領域からファイルを整理し、並べ替え、統合して、重複する読み込みを削除した（http://broadinstitute.github.io/Picard）。Picardツール（1.107）、GATK（2.8.1）およびFastQC （0.10.1）（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/FastQC/）を用いて、品質管理の指標を作成した。SAMtools compileup（0.1.19）（9）を用いて、腫瘍および生殖細胞系列試料中の非参照位置を決定した。phredスコアが20未満の塩基またはマッピング品質が20未満の読み込みは省略した。BAQ計算を無効にし、マッピング性能をダウングレードさせる係数を50に設定した。VarScan2 somatic （v2.3.6）（58）は、腫瘍試料と一致した生殖系列試料との間の体細胞変異を同定するために、SAMtools compileupからの出力を利用した。デフォルトのパラメータは、10に設定された生殖系列試料の最小範囲を除いて使用され、最小変異頻度は0.01に変更された。VarScan2 processSomaticを用いて体細胞変異を抽出した。Varscan2に関連づけられたfpfilter.plスクリプトを用いて、最初はデフォルト設定で、min-var-frac = 0.02で再度繰り返し、最初のデータは、bam-readcount （0.5.1） （https://github.com/genome/bam-readcount）を通して、得られた単一ヌクレオチド変異体（SNV）コールを偽陽性としてフィルタリングした。VarScan2 processSomaticによって「高信頼度」と分類されたINDELコールのみを、somatic_p_valueスコア<5x10-4で、さらなる分析のために保存した。MuTect （1.1.4） （10）はまた、GATKバンドル2.8に含まれるアノテーションファイルを利用してSNVを検出するために使用された。完了後、MuTectによってコールされる変異体を、フィルターパラメーター「PASS」に従ってフィルタリングした。
【０１３４】
汎癌挿入／欠失分析
汎癌コホートにおいて、SNVおよび挿入/欠失（インデル）変異数を、全ての変異型を考慮して、症例ごとに計算した。全5,777試料にわたって、合計1,227,075のSNVおよび54,207のインデルが観察された。ジヌクレオチドおよびトリヌクレオチド置換は考慮しなかった。「インデル量」の指標は、単に、症例あたりの絶対的なインデル数として定義し、「インデル比例」は、#インデル/（#インデル+#SNV）として定義した。同じ分析を2つのccRCC複製コホートで繰り返した。
【０１３５】
ナンセンス媒介性崩壊分析
ナンセンス媒介性崩壊（NMD）効率を、TCGA GDAC Firehoseレポジトリーhttps://GDAC.broadinstitute.org/から得られたRNA配列発現データ（TPMで測定）を用いて推定した。変異を有する試料におけるmRNA発現レベルを、変異が存在しなかった他の全ての腫瘍試料にわたる同転写物のmRNA発現レベル中央値と比較することによって、全てのインデルおよびSNV変異について、NMDの程度を推定した。具体的には、全ての変異保有転写物のmRNA発現レベルを、非変異試料中の同転写物のmRNA発現レベル中央値で割って、NMD指数を得た。観察された全体的なNMD指数値は、0.93（インデル）および1.00（SNV）であり、インデル変異転写物において、全体的に0.07の発現の減少が示唆された。KIRCコホートにおける腫瘍純度は0.54であると報告されており（11）、残りの0.46正常細胞含量における一定の発現レベルを仮定すると、癌細胞を有するインデル変異における発現は、0.136低下するよう調整されたこととなる。腫瘍変異がクローン性であり、ヘテロ接合体遺伝子型であると仮定すると、二倍体ゲノム領域において、変異癌細胞における野生型アレル発現は一定のままであり、純度を調整した後の低下は、NMDが完全に有効な条件下で0.5と予測される。従って、このデータはKIRCコホートにおいてNMDが効率を低下させて動作することを示唆しているが、我々は上記の仮定がいくらかの影響を有することを認める。これらのデータは、以前の刊行物（12）と同様の方法を利用して、NMD効率の全体的な近似として提示される。
【０１３６】
腫瘍特異的ネオアンチゲン分析
TCGAコホート由来の患者のサブセット（n=4,592）については、腫瘍特異的ネオアンチゲン結合親和性予測データも入手可能であり、Rooneyら（60）から入手した。簡潔に述べると、POLYSOLVER（POLYmorphic loci reSOLVER）を用いて、クラスI HLA遺伝子における変異と共に、各試料の4桁のHLA型を決定した。体細胞変異は、Mutect（14）およびStrelkaツールを用いて決定した。コホート全体で検出された体細胞snvおよびインデル変異に基づいて、可能性のある全ての9および10 merの変異ペプチドを計算した。NetMHCpan （v2.4）を用いて、対応するPOLYSOLVER推測HLAアレルに関連する変異体および対応する野生型ペプチドの結合親和性を予測した。強い親和性バインダーをIC50<50 nMと定義し、野生型アレル非結合をIC50>500nMと定義した。子宮頸部（>80%のHPV組み込み率）、肝細胞癌（>50%のHepB組み込み率）を含むが、HNCC（<15%のHPV組み込み率）を含まない、高レベルのウイルスゲノム組み込みに関連する癌を（汎癌ネオアンチゲン分析から）除外した。メルケル細胞癌に利用可能なTCGAデータセットはなかった。
【０１３７】
免疫シグネチャーRNA配列分析
免疫遺伝子シグネチャーデータは、表Ｓ１に従って定義される遺伝子セットを用いてRooneyら（15）から得た。試料あたりのRNA配列の100万個の１キロベース転写物（Transcripts Per Kilobase Million, TPM）発現レベルに基づいて、セット内の遺伝子の幾何平均として免疫シグネチャースコアを計算した。RNA配列およびネオアンチゲンデータの両方を適用して、ccRCC TCGA（KIRC）患者に対して分析を実施した（n=392）。高フレームシフトインデル強親和性ネオアチゲン量を症例あたり>10（n=32）と定義し、各免疫シグネチャーにわたって、高インデルネオアチゲン群と他の全ての患者との間で、発現のパーセンテージの差を比較した。全ての群において、発現が最小の（<0.5 TPM）免疫シグネチャーを除外した。変異型全体にわたる高値群（同数の患者、全ての高値群にわたってn=32）とサイズが一致するように選択された、>17 snv ネオアンチゲンの閾値を用いて、同じ分析を、snv由来の強親和性ネオアンチゲンについて繰り返した。発現の差のパーセンテージをヒートマップ形式でプロットした。高フレームシフトインデルネオアンチゲン群（n=32 ccRCC患者）内の相関解析を行った。
【０１３８】
チェックポイント阻害剤（CPI）応答分析
4つのCPI治療患者コホートにわたって、 （i）非同義置換SNV、（ii）全てのコードインデルおよび（iii）フレームシフトインデル変異体数の、治療に対する患者の応答との相関性について試験した。各測定基準（i）、（ii）および（iii）について、高群および低群を、上位四分位（高）および下位三分位（低）で定義した。4つのデータセット全てにわたって同じ基準を使用し、高群および低群における治療に応答する患者の割合（応答率）を比較した。各試験において、患者の応答の測定基準を以下のように定義した:
Snyderら（4）：
・長期臨床的効果（LB）：６か月以上の （i） X線写真上に疾患が見られないという根拠；または （ii） 疾患安定性の根拠；または（iii） 疾患体積の縮小。
・長期臨床的効果の欠如（NB）： （i） 治療開始後のCTスキャン毎の腫瘍増大（効果なし）、または （ii） 臨床的効果の持続が6ヶ月以下（効果が最小限）。
Hugoら（3）：
・応答腫瘍：完全奏効（CR）、部分奏効（PR）および安定病変（SD）。
・不応答腫瘍:病状進行（PD）
VanAllenら（5）：
・臨床的効果：CR/PR/SD
・臨床的効果なし：PDまたはOSが1年未満のSD
Rizviら（6）：
・持続的有効性：6ヵ月以上持続するPRまたはSD
・非持続性有益性（NDB）:治療開始から6ヵ月未満のPD
【０１３９】
統計解析
両側Mann Whitney検定を用いて、ccRCCと他の全ての非腎癌との間で、インデル量および割合測定を比較した。CPI応答分析では、非同義置換SNV、エクソンインデルおよびフレームシフトインデル数を、両側Mann Whitney検定を用いて、各患者の応答結果と比較した。４つのCPIデータセットにわたる結果のメタ分析は、独立した各試験からのP値を組み合わせて、Fisher法を用いて実施した。免疫シグネチャー相関性分析は、スペアマンのランク相関係数を用いて行った。統計解析は、R3.0.2（http://www.r-project.org/）を用いて行った。P値0.05（両側）を統計的に有意であるとみなした。
【０１４０】
クローン性
クローン性の影響をさらに評価し、クローン性フレームシフトインデルは、全てのフレームシフトインデル（クローン性およびサブクローン性）を超えて、さらなる予測可能な効果を有することが見出された。これに関しては図6を参照されたい。
【０１４１】
参考文献
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【０１４２】
実施例２
実施例１では、fsインデルがチェックポイント阻害剤療法に対する応答性改善と関連していることが決定された。次いで、ノンセンス媒介性崩壊の効果を調査した。
【０１４３】
材料および方法
研究コホート
適合するDNA/RNA配列の分析を、全て免疫療法で治療した以下のコホートにおいて行った： 
・Van Allenら（8）、 進行性黒色腫のチェックポイント阻害剤（CPI）（抗CTLA-4）治療コホート。RNA配列および全エクソーム（DNA）配列データの両方を有する症例を使用した（n=33）。
・Snyderら（7）、進行性黒色腫のCPI（抗CTLA-4）治療コホート。RNA配列および全エクソーム（DNA）配列データの両方を有する症例を使用した（n=21）。
・Hugoら（4）、進行性黒色腫のCPI（抗PD-1）治療コホート。RNA配列および全エクソーム（DNA）配列データの両方を有する症例を使用した（n=24）。
・Laussら（10）、進行した黒色腫の養子細胞療法治療コホート。RNA配列および全エクソーム（DNA）配列データの両方を有する症例を使用した（n=22）。
・Snyderら（18）、転移性尿路上皮癌のCPI（抗PD-L1）治療コホート。RNA配列および全エクソーム（DNA）配列データの両方を有する症例を使用した（n=23）。
適合するDNA/RNA配列の分析を、以下のコホート（免疫療法で特異的に治療されていない）において行った：
・癌ゲノムアトラスから得られた皮膚黒色腫（SKCM）。RNA配列の末端対データおよびTCGA GDAC Firehose（2016_01_28リリース）から収集した変異体コールを有する症例を使用した（n=368）。
・マイクロサテライト不安定（MSI）腫瘍は、TCGAからの全ての組織学的サブタイプにわたる。MSI症例のIDは、Cortes-Cirianoらの分類に基づいて特定した（19）。末端対RNA配列データとTCGA GDAC Firehose（2016_01_28リリース）から収集した変異体コールを有する症例を使用した（n = 96）。
NMD回避の特徴予測（適合するDNA/RNA配列分析よりもむしろDNAエクソン変異位置のみに基づく）を、以下の免疫療法治療コホートにおいて行った:
・Ottら（22）、進行性黒色腫の個人向けワクチン治療コホート（n=6症例）。
・Rahmaら、転移性腎細胞癌の個人向けワクチン治療コホート（n=6症例）。
・Leら（24）、進行性ミスマッチ修復機構欠損コホートであり、12の異なる腫瘍種の癌にわたり、抗PD-1阻害で治療された（n=86症例、機能的ネオアンチゲン反応性T細胞試験はn=1症例でのみ行われた）。
【０１４４】
全エクソーム配列（DNA）変異体コール
Van Allenら（8）、Snyderら（7）およびSnyder ら（18）のコホートについて、本発明者らは、著者らから生殖細胞系列/腫瘍BAMファイルを入手し、Picardツール（バージョン1.107）SamToFastqを使用して、これらをFASTQフォーマットに戻した。bwa mem （bwa-0.7.7）を用いて、FastQフォーマットの末端対の読み込みの生データを、GATKバンドル（バージョン2.8）から得られた完全なhg19ゲノムアセンブリ（未知のコンティグを含む）上に整列させた。Picardツールを使用して、整理し、並べ替え、重複した読み込みを削除した。GATK （バージョン2.8）を局所インデル再整列に使用した。Picardツール（1.107）、GATK（2.8.1）およびFastQC （0.10.1）を用いて、品質管理の指標を作成した。SAMtools compileup（0.1.19）（9）を用いて、腫瘍および生殖細胞系列試料中の非参照位置を決定した。phredスコアが20未満の塩基またはマッピング品質が20未満の読み込みは省略した。VarScan2 somatic （v2.3.6）は、腫瘍試料と一致した生殖系列試料との間の体細胞変異を同定するために、SAMtools compileupからの出力を利用した。デフォルトのパラメータは、10に設定された生殖系列試料の最小範囲を除いて使用され、最小変異頻度は0.01に変更された。VarScan2 processSomaticを用いて体細胞変異を抽出した。Varscan2に関連づけられたfpfilter.plスクリプトを用いて、最初はデフォルト設定で、min-var-frac = 0.02で再度繰り返し、最初のデータは、bam-readcount （0.5.1） （https://github.com/genome/bam-readcount）を通して、単一ヌクレオチド変異体（SNV）コールを偽陽性としてフィルタリングした。MuTect（バージョン1.1.4）は、SNVの検出にも使用し、フィルターパラメーター「PASS」に従って結果をフィルタリングした。最終的なQCフィルタリングにおいて、変異アレル頻度（VAF）が2%を超え、変異がVarScan2（体細胞p値<=0.01で）とMuTectの両方でコールされた場合、SNVは真陽性とみなされた。あるいは、VarScan2（これも体細胞p値<=0.01）でのみコールされた場合は、5%の頻度を必須とした。小規模挿入/削除（INDEL）について、VarScan2 processSomaticによって、体細胞ｐ値スコアは5×10-4未満であった、高信頼度として分類されたコールのみをさらなる解析のために残した。Annovar（バージョン2016Feb01）を使用して、変異体アノテーションを行った。Annovarによって最初（デフォルト）にアノテーションされた関連転写物の、１番目、最後から2番目、または最後のエクソンのいずれかの変異体は、NMD回避に関連するエクソン位置における変異であると考えられた。中間のエクソン変異は、１番目、最後から2番目、または最後のエクソン位置にない全ての変異であると考えられた。Hugoら（4）のコホートについて、我々は、先に記載されたように生成された、最終的な品質管理後の変異アノテーションファイルを得た（4）。簡潔に述べると、MuTect、VarScan2およびGATK Unified Genotyperを用いてSNVを検出し、VarScan2、IndelLocatorおよびGATK-UGFを用いてINDELを検出した。3人のSNV/INDELコールのうちの少なくとも2人によってコールされた変異は、高信頼性のコールとして残した。Laussら（10）のコホートについては、SNVおよびINDELが、以前に記載されたようにコールされた（10）。簡潔に述べると、MuTectとVarScan2変異体の交差を用いてSNVを検出し、一方、VarScan2のみを用いてINDELを検出した。VarScan2については、10%を超えるVAFでの高信頼性コールを残した。
【０１４５】
全転写物配列（RNA）変異体コール
RNA配列データは全ての試験でBAM形式として入手し、bam2fastq（v1.1.0）を使用してFASTQ形式に戻した。挿入/欠失変異は、mapsplice（v2.2.0）を用いて、未加工の末端対FASTQファイルからコールして、配列読み込みをhg19ゲノムアセンブリに整列させた（ボウタイ型作成済みインデックスを用いて）。最小QC閾値は、=>5の選択的読み込み、=>0.05の変異体アレル頻度を有する変異体を残すように設定した。RNAおよびDNA配列決定アッセイの両方において、コールされる挿入および欠失を交差させ、発現インデルとして指定し、+/-10bpのパディングインターバルを含めて、わずかなアラインメントミスマッチを可能にした。RNA配列決定データ中のSNVはRsamtoolsを使用して、hg19再整列BAMファイルから直接コールし、SNVがDNA配列分析において、既にコールした各ゲノム位置についてのアレルあたりの読み込み数を抽出した。同様に、=>5の選択的読み込み、および=>0.05の変異体アレル頻度の最小QC閾値を利用して、これらの閾値を通過する変異体を、発現SNVとした。
【０１４６】
タンパク質発現解析
本発明者らは、癌プロテオームアトラス（http://tcpaportal.org/tcpa/index.html））から、n=453のTCGA黒色腫/MSI腫瘍（DNA/RNA配列決定を介しても分析されたTCGAコホートと重複する）にわたる、223のタンパク質について、レベル4（L4）補正タンパク質発現データを検索した。本発明者らは、DNA配列決定によりコールされる、fs-インデル変異（n=136）も含む試料/タンパク質の組み合わせへと、データをフィルタリングした。次いで、データセットを、発現しているか否かに基づいて2つの群に分けた（上記に詳述した方法を使用して、RNA配列によって測定した）。両側Mann Whitney検定を用いて2群を比較した。
【０１４７】
出力分析
全ての免疫療法で治療されたコホートにわたって、患者の臨床的効果あり/臨床的効果なしの基準は、著者らの基準/定義と一致させた。TCGA出力分析のために、TCGA GDACFirehoseレポジトリーから得られた臨床アノテーションデータに基づいて、全生存者（OS）データを利用した。
【０１４８】
選択分析
選択の根拠を試験するために、fsインデル変異を、SKCM TCGAコホート（n=368症例）において、ストップゲインSNV変異と比較した。ストップゲインSNV変異は、その可能性のある同等の機能的影響（すなわち、機能の喪失）、NMD経路による同等の処理（すなわち、最後のエクソンストップゲインSNVは依然としてNMDを逃れ、切断されたタンパク質の蓄積を引き起こす）、しかし、潜在的な免疫原性の欠如（すなわち、変異ペプチドは生成されない）という特性から、標準（ベンチマーク）比較として利用した。全てのSKCM症例にわたって、n=1,594のfsインデルおよびn=9,833のストップゲインSNVについて考察した。各グループにおける全ての変更は、エクソン位置（上で定義したように、最初、中間、最後から2番目、または最後のエクソン）について注記された。最初、中、再度から2番目、最後のエクソン位置にfsインデルを持つオッズ比は、ストップゲインSNVの同等の予測値に対して標準化された。
【０１４９】
統計的方法
オッズ比はFisher's Exact Test for Count Dataを用いて計算し、各エクソン位置群を他の全てと比較した。Kruskal-Wallis検定を用いて、3つ以上の独立した群間の分布の差異を検定した。両側Mann Whitney U検定を用いて、2つの集団群間の分布の差を評価した。独立した複数の検定からのP値を組み合わせるFisher法を用いて、コホート間の結果のメタ分析を行った。ロジスティック回帰を用いて、２元の出力との独立した関連性について、複数の変数を共同で評価した。SKCM TCGAコホートにおいて、ステージ、性別および年齢を共変量として含めたCox比例ハザードモデルを用いて、全生存率分析を実施した。Cox比例ハザードモデルを用いて、原発性疾患部位を共変量として含め、MSI TCGAコホートにおける全生存率分析を行った。統計解析は、R3.4.4（http://www.r-project.org/）を用いて行った。本発明者らは、0.05（両側）のP値を統計的に有意であるとみなした。
【０１５０】
結果
NMD回避性変異の検出
発現フレームシフトインデル（fsインデル）を、対のDNAおよびRNA配列を用いて、データをアレル特異的バイオインフォマティクスパイプラインを通して処理することで検出した（図7A）。全ての処理済みTCGA試料（n=453、コホートの詳細については、方法を参照のこと）にわたって、腫瘍あたりに検出されたfsインデルの中央値は4（範囲0~470）、変異アレル発現は、腫瘍あたりに検出された変異アレル発現の中央値は1（範囲0~94）であった。従って、発現fsインデル変異の頻度および存在量は、比較的低かった。事実、プロファイリングされた試料の49.6%は、発現が検出されたfsインデル変異がゼロであった。発現fsインデル（n=1,840）について、エクソン位置にアノテーションを付け、非発現fsインデル（すなわち、DNA中に存在するがRNA中には存在しない変異アレル）（n=8,691）と比較した。発現fsインデルは、最後から2番目（非発現fsインデルに対するオッズ比 = 1.80、95%信頼区間[1.53-2.11]、p=3.2x10-12）および最後のエクソン位置（OR=1.80[1.60-2.04]、p<2.2x10-16）の変異で多かったが、中央のエクソン位置では少なかった（OR=0.56[0.51-0.62]、p<2.2x10-16）（図7B）。これらのエクソン位置は、すでに確立された、NMD回避の既知のパターン（14）と整合する。最初のエクソン位置の変異は予想外に少なかった（OR=0.71[0.55-0.91、p=0.006]）が、この群で観察された変異の絶対数が少なく（発現fsインデルはn=80のみ）、それらの割合（n=21）は、遺伝子開始から>200ntであった。次に、発現fsインデルに対するRNA変異体アレル頻度（VAF）推定値を考察し、それらが最後（中央値=0.33）、最後から2番目（0.28）、次いで最初（0.26）のエクソン位置の順で最も高く、中央のエクソン変化で最も低い値（0.19）を有することを見出した（図7C、p<2.2x10-16）。最後に、本発明者らは癌プロテオームアトラス（17）から、DNA/RNA配列処理コホートと重複する453個の腫瘍にわたる223個のタンパク質について、タンパク質発現データを取得した。fsインデル遺伝子変異および適合したタンパク質発現データの両方を有する試料を交差させて、発現fsインデル（n=40）対非発現fsインデルの（n=96）のタンパク質レベルを比較した。タンパク質存在量は、発現fsインデルについて有意に高いことが見出された（p=0.018、図7D）。まとめると、これらの結果は、発現したfsインデルが（少なくとも部分的に）NMDを逃れ、タンパク質レベルに翻訳されることを示唆する。以下、発現fsインデルをNMD回避性と呼び、非発現fsインデルをNMD適格性と称呼する。
【０１５１】
NMD回避性変異量は、免疫チェックポイント阻害に対する臨床的効果に関連する
NMD回避性変異が、抗腫瘍免疫応答に及ぼす影響を評価するために、適合したDNAおよびRNA配列データを用いた、3つの独立した黒色腫コホートにおけるNMD回避性変異数とCPI臨床効果との間の関連を評価した: Van Allenら（n=33、抗CTLA-4で治療）、Snyderら（n=21、抗CTLA-4で治療）およびHugoら（n=24、抗PD-1で治療）。各試料について、変異量を、以下の分類に基づいて定量した: i）TMB:全ての非同義置換SNV（nsSNV）、ii）fsインデル、およびiii）NMD回避性fsインデル。各変異分類の、臨床的効果との関連について試験した（図8a）。WESおよびRNA配列の両方を有する3つの黒色腫コホート（合計n=78）のプールメタ分析では、nsSNV（全コホートにわたるメタ分析、Pmeta=0.12）およびfsインデル（Pmeta=0.048）について、有意的な傾向がみられたが、臨床的効果（Pmeta=0.0087）との総合的な関連は、NMD回避性変異数が最も強かった（図8a）。明確にするために、本発明者らは、ここで使用した試料が以前に報告された試料よりも少ないことを特記する。それは、症例のサブセットのみが、適合したDNAおよびRNA配列決定データの両方を利用可能であり、nsSNVおよびfsインデル測定値は、完全なデータセットにおいて有意であるためである。1つ以上のNMD回避性変異を有する患者は、NMD回避性変異を有さない患者と比較して、免疫チェックポイント阻害に対する臨床的効果を有する割合が高かった:56%対12%（Van Allenら）、57%対14%（Snyderら）、および71%対35%（Hugoら）（図8b）。NMD回避性群が、単に通常のネオアンチゲン発現の重要性を反映するものではないことを明らかにするために、本発明者らは、アレル特異的RNA配列分析を使用し、検出された発現nsSNVを試験し、臨床的効果との関連が有意的でないことを見出した（Pmeta=0.24、図11）。さらに、TMBとNMD回避性の指標間の相関データを評価し、2つの変数間には弱い相関しかないことを見出した（r=0.21、P=0.06、n=78）。また、多変量ロジスティック回帰分析において、両変数を共に統合モデルで検証し、独立的有意性を評価した（n=78、研究IDもコホート特異的因子を制御するためのモデル用語として含めた）。そして、NMD回避性変異数がCPIの臨床的効果と独立的に関連することが見いだされたが（P=0.032）、TMBは独立的な有意性に達しなかった（P=0.25）。最後に、他の腫瘍種における潜在的な関連性を調査するために、NMD回避性分析を、CPIで治療した転移性尿路上皮癌コホート（n=23症例）において行った（18）。この研究における以前の分析は、TMB、予測されたネオアンチゲン量または発現したネオアンチゲン量のいずれも、CPI臨床的効果と関連しないことを見出した（18）。同様に、本明細書では、NMD回避性の数と臨床的効果との間に、関連性の根拠が認められなった（P=1.0）。これは、おそらく、試料が少ないこと、このコホートでは変異量が低いこと（TMB＝約0~5ミスセンスSNV/メガベース、最近発表された大規模コホート（9）での~10.0に比べて）、または転移性尿路上皮癌では一般に反応率が低いことによるものと考えられる。より完全にするために、上記膀胱データを含めて、3つの黒色腫コホートと共にNMD回避性CPIメタ分析を繰り返したが、関連性は有意のままであった（Pmeta=0.028）。
【０１５２】
養子細胞療法（ACT）の臨床的効果は、NMD回避性変異量と関連する
抗腫瘍免疫応答への指向におけるNMD回避性変異の重要性をさらに調べるために、養子細胞療法で治療された黒色腫患者（n=22）からの適合するDNAおよびRNA配列データを分析した（10）。TMB ns-SNV （P=0.027）、fsインデル（P=0.025）およびNMD回避性数（P=0.021）は全て、治療の臨床的効果と関連していた（図8c）。NMD回避性数≧1の患者は全て、NMD回避性変異を有さなかった患者の33%（6/18）と比較して、臨床的効果（n=4、100%）を経験し、単一のNMD回避性変異のみからの潜在的に強力な免疫原性効果をさらに強調した。以前に報告されたように（10）、高nsSNV負荷（患者の上三分位と定義される）を有する患者は、中（中三分位）または低（下三分位）nsSNV数を有する患者と比較して、無増悪生存率が改善された（P=0.0008）。NMD回避性数が1以上の患者のうち、大多数（4人のうち3人）は、中三分位nsSNV群（高ではない）にあり、TMB単独を予測バイオマーカーとして使用した場合、高い可能性を有する潜在的な応答者として見逃されたおそれがあることに留意すべきである。単一NMD回避性変異あたりのハザード比（HR）は、0.28（95%信頼区間0.07〜1.09）であり、約845 nsSNV変異（HR = 0.28 （0.08〜0.92））と同等であった（表S1）。
【０１５３】
【表２】
2020525030.tif 000003
【０１５４】
表S1
Laussらのコホートについて、Cox比例ハザードモデルを用いて、多変量無増悪生存解析の結果を示す。nsSNVおよびNMD回避性変異の数は、両方とも連続変数としてモデルに含まれる。第1の表は各基準についての単一変異あたりの補正されたハザード比を示し、第2の表は、１つのNMD回避性変異とリスク低減度合いを等しくするために必要なTMB（nsSNV）変異の数について、匹敵するハザード比を示す。
【０１５５】
T細胞再活性化ネオアンチゲンは、NMD回避性と予測されるゲノム位置で富化される
バイオマーカーの関連性は、翻訳的関連性および臨床的有用性があるが、抗腫瘍免疫応答を駆動する特異的なネオアンチゲンを直接特定しない。従って、本発明者らは、2つの抗腫瘍個人向けワクチンの研究および1つのCPIの研究からデータを取得した。これらにおいては、特定のネオペプチドに対するT細胞反応性が、患者のT細胞の機能的アッセイによって確認されていた。これらの3つの研究にわたって、6つのfsインデル由来ネオアンチゲンが、T細胞反応性を誘発するものとして機能的に確認された: DHX40 p.S754fs、RALGAPB p.I1404fs、BTBD7 p.Y324fs、SLC16A4 p.F475fs、DEPDC1 p.K418fsおよびVHL p.L116fs （図9）。従って、概念証明のレベルにおいて、抗腫瘍免疫応答を誘発するfsインデルの能力は、以前に確立されている。これらの同研究にわたって、fsインデル由来の12のネオアンチゲンも機能的スクリーニングを受けたが、T細胞非反応性であることが見出された（図9）。発現を決定するための、対のDNAおよびRNA配列データは、これらのコホートの全てに利用可能であったわけではない。そのため、エクソン位置のアノテーションを使用して、NMD回避性の可能性を推定した。T細胞反応性を示すfsインデル群では6個中5個が、NMD効率が低下したエクソン位置（すなわち、最初、最後から2番目、および最後のエクソン）であることが分かった。一方で、fsインデルペプチドスクリーニングでは12個中3個のみであり、T細胞非反応性であった（図9）。例外も観察されるが（すなわち、T細胞応答を誘発する中間エクソン位置の変異、および逆にT細胞反応性を生成しない最後のエクソン位置変異）、NMD回避性エクソン位置において、より生じやすいT細胞反応性fsインデルで、富化が観察される（OR=12.5[0.9-780.7]、P=0.043）（図9）。
【０１５６】
NMD回避性変異は、ネガティブ選択の根拠を示す
次に、本発明者らは、自然に抗腫瘍免疫原性を生成する可能性を反映し得るNMD回避性変異に対する、選択圧の根拠について評価した。潜在的な免疫原性の選択圧に加えて、fsインデルは、タンパク質機能効果の損失のために、機能的選択下にあることも以前に報告されている（15）。これを説明するために、我々はストップゲインSNV変異を標準比較として使用したが、ストップゲインSNV変異体は同等の機能的影響を有するが、免疫原性の可能性はない（すなわち、機能の喪失はあるが、新抗原は生成されない）からである。さらに、ストップゲインSNVおよびfsインデルは両方とも早期終止コドンを誘発するので、NMDの規則は、ストップゲインSNVおよびfsインデルの両方に等しく適用される。皮膚皮膚黒色腫（SKCM）TCGAコホートを用いて、エクソン位置についてfsインデル（n=1,594）およびストップゲイン（n=9,883）の変異の全てにアノテーションを付けた。最後から2番目および最後のエクソンは、fsインデルにおいて、ストップゲイン発生と比較して、有意に少ないことが見出された（それぞれ、OR=0.58[0.46-0.71]、P=1.5x10-5およびOR=0.65[0.55-0.75]、P=1.5x10-7）（図10A）。対照的に、fsインデル変異は、中間エクソン位置で、より生じやすかった（OR=1.51[1.33-1.68]、P=1.2x10-11）。最初のエクソン変異は、おそらく絶対数が小さい（最初のエクソンには、n=69のfsインデルしかなかった）のために、いずれの方法でも富化されなかった。このデータは、NMDを回避しやすいエクソン位置（例えば、最後から2番目と最後）におけるfsインデル変異に対して負の選択的免疫圧が作用し、中間のエクソンfsインデルを有する癌細胞が、免疫編集に対してより生き残る可能性をもたらすことを示唆している。
【０１５７】
NMD回避性変異量は全生存率の改善と関連する
最後に、黒色腫におけるNMD回避性変異の自然の抗腫瘍免疫原性の根拠を評価するために、発明者らはTCGA SKCMコホートの368人の患者からの、適合したDNAおよびRNA配列データを調べた。少なくとも1つのNMD回避性変異を有する患者は、NMD回避性変異がゼロである患者と比較して、そのOSが有意に改善された（HR = 0.69 [0.50-0.96]、P=0.03）（図10B）。さらに、Cortes-Cirianoら（19）（n=96）によって同定されたMSI癌（fsインデル発生が多い）からの適合したDNAおよびRNA配列データを用いて、高NMD回避性変異量（インデル発生が高レベルであるため、=>1ではなく>コホート中央値として定義する）を示す患者において、有意性はないが、同様にOSが改善される傾向が観察された（HR=0.67[0.31-1.45]、P=0.313）。
【０１５８】
本明細書中に提示される結果は、発現fsインデルが、NMDを回避すると予測されるゲノム位置において高度に富化され、そしてより高いタンパク質レベルの発現（非発現fsインデルと比較して）を有することを示す。発現fsインデル（別名NMD回避性変異）もまた、免疫療法の臨床的効果と有意に関連していた。
【０１５９】
NMD回避性変異数は、CPIおよびACT方式の両方にわたって、免疫療法からの臨床的効果と有意に関連し、nsSNVまたはfsインデルのいずれよりも強い関連を有することが見出された。1つ以上のNMD回避性変異を有する患者におけるCPIの臨床的効果は、このような変異がゼロの患者（0.12~0.35の範囲）と比較して高かった（分析したコホートにわたる範囲=0.56~0.71）。さらに、抗腫瘍ワクチンおよびCPI研究から分析された実験的な根拠は、ヒト患者において発現したフレームシフトネオエピトープに対するT細胞反応性を直接的に実証するものである。T細胞反応性fsインデルネオアンチゲンは、実験的にスクリーニングされたがT細胞非反応性のfsインデルと比較して、NMD回避性エクソン位置で富化された（OR=12.5[0.9-780.7]、P=0.043）。
【０１６０】
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【０１６１】
上記明細書に記載された全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記載された方法およびシステムの様々な修正および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して説明されてきたが、特許請求される本発明はそのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことは理解されるであろう。実際に、生化学およびバイオテクノロジーまたは関連分野の当業者に明らかな、本発明を実施するための記載された様式の種々の改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【図１】
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【図２】
2020525030.tif 000005
【図３−１】
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【図３−２】
2020525030.tif 000007
【図３−３】
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【図４−１】
2020525030.tif 000009
【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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