(57)【要約】本発明は、溶解パラセタモールを含む含水アルコール溶液からなる、頬側／歯肉経路によりパラセタモールを投与するための医薬製剤であって、＃パラセタモールの質量が９５ｍｇ〜１９０ｍｇであり、＃該含水アルコール溶液の体積が１.０ｍＬ〜２.０ｍＬであり、＃該含水アルコール溶液のアルコール度が４８.５°〜５２.５°であり、＃該含水アルコール溶液中のパラセタモールの濃度が８５ｍｇ／ｍｌ〜１１０ｍｇ／ｍｌであることを特徴とする医薬製剤である。本発明はまた、パラセタモールが血液脳関門を通過する速度を加速するための使用のための上記医薬製剤、および特に疼痛または発熱の対症療法のための薬物としてのその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶解パラセタモールを含む含水アルコール溶液からなる、パラセタモールの頬側／歯肉投与用医薬製剤であって、
パラセタモールの質量が９５ｍｇ〜１９０ｍｇであり、
該含水アルコール溶液の体積が１.０ｍＬ〜２.０ｍＬであり、
該含水アルコール溶液のアルコール度が４８.５°〜５２.５°であり、
該含水アルコール溶液中のパラセタモールの濃度が８５ｍｇ／ｍＬ〜１１０ｍｇ／ｍＬである、
医薬製剤。
【請求項２】
含水アルコール溶液が水／エタノール混合物からなり、ここで、エタノールの体積が該含水アルコール溶液の総体積の５０％である、請求項１記載の医薬製剤。
【請求項３】
含水アルコール溶液の粘度が１.５・１０-3Ｐａ・ｓよりも大きい、請求項１および２のいずれか１項記載の医薬製剤。
【請求項４】
４０℃におけるパラセタモールの流体力学的半径が２.１Åよりも小さい、請求項１〜３いずれか１項記載の医薬製剤。
【請求項５】
含水アルコール溶液が香味剤および／または甘味剤を含む、請求項１〜４いずれか１項記載の医薬製剤。
【請求項６】
パラセタモールによる血液脳関門の通過を促進するために用いるための、請求項１〜５いずれか１項記載の医薬製剤。
【請求項７】
疼痛および／または発熱の処置のための薬物として用いるための、請求項１〜５いずれか１項記載の医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パラセタモールの頬側／歯肉投与のための医薬製剤、ならびに、パラセタモールによる血液脳関門
2020509045.tif 000002
の通過を促進するためのその使用、および、特に疼痛および／または発熱の処置のための、薬物としてのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
技術水準
パラセタモールは、軽度〜中等度の疼痛および／または発熱を緩和するために長年使用されてきた有効成分である。
【０００３】
その作用機序は、まだ詳細に知られていないが、この生成物は、その非常に好ましいリスク・ベネフィット比により、世界で最も広く使用されている医薬品の１つである。
【０００４】
しかしながら、その好ましいリスク・ベネフィット比により、その使用が一般的になりすぎて、特にこの化合物が消費者向け製剤に体系的に加えられている米国では、多くの偶発的過量投与を引き起こしている。いくつかの医薬品を摂取している消費者は、最終的に過量投与および致死性中毒を引き起こす可能性がある。
【０００５】
米国食品医薬局（ＦＤＡ）は、実際、製薬会社に対し、併用製品においてパラセタモールの用量を減らすよう警告している。
【０００６】
２０１４年に、ＦＤＡは、中毒および致死性事故のリスクを制限するために、３２５ｍｇを超えるパラセタモールを含有する他の有効成分と組み合わせた全ての製品の販売を禁止した。
【０００７】
したがって、効果的な鎮痛効果を得るのに必要な用量を減らすために、最適化された製剤がパラセタモールの有効性を改善する医薬品を開発する必要がある。
【０００８】
特許文献１の特許出願には、製品の有効性を維持しながら、パラセタモールの用量を減らすことを目的とするパラセタモールの製剤が非常に具体的に開示されている。
【０００９】
この特許出願には、体積が０.５ｍＬ〜２.５ｍＬの含水アルコール溶液中にパラセタモール２５ｍｇ〜２５０ｍｇを含むパラセタモール経粘膜投与用投与剤形が記載されている。
【００１０】
かくして、該投与剤形中のパラセタモールの濃度は、１０ｍｇ／ｍＬ〜５００ｍｇ／ｍＬの間で変化する。
【００１１】
しかしながら、本出願人は、一方で、パラセタモールの濃度が８５ｍｇ／ｍＬよりも低い場合には、嚥下反射を引き起こすという点で頬側／歯肉投与と不適合である過剰な体積の溶液を投与する必要があることを発見した。これは、結局、有効成分を経口投与することを意味し、これにより、有効成分は消化器系および肝臓を通過して血流に到達しなければならず、肝臓初回通過代謝として知られている代謝（化学的または生物学的）を受ける。
【００１２】
他方、本出願人は、安定性試験において、パラセタモールの濃度が高過ぎる場合、典型的には１２５ｍｇ／ｍＬ以上である場合、パラセタモールが経時的に再結晶することを見出した。加えて、４０℃で６か月間の予備安定性試験は濃度が１１５ｍｇ／ｍＬよりも高い場合にはピンク色の外観を示し、これは電気酸化による含水アルコール溶液中のパラセタモールの重合に関連している。
【００１３】
加えて、従来技術の投与剤形においては、含水アルコール溶液のアルコール度は、１０°〜７０°の間で変化し得る。
【００１４】
しかしながら、本出願人は、エタノールの体積が総体積の６０％以上である含水アルコール溶液は粘膜の生理学的不耐性の問題を引き起こす可能性が高いということを発見した。さらにまた、他方、水／エタノール混合物の総体積に対するエタノールの体積百分率が低すぎる場合、典型的には４５％未満である場合、パラセタモールが水よりもエタノールの方に容易に溶解する限り、パラセタモールの溶解は損なわれる。
【００１５】
結果的に、本出願人は、先に挙げた種々の落とし穴を避けるパラセタモールの頬側／歯肉投与用新規医薬製剤を開発した。
【００１６】
驚くべきことに、本出願人によって最適化された該医薬製剤は、高い治療効果につながる非常に特異的な物理化学的特性を有している。実際、本発明の製剤におけるパラセタモール分子の収縮が実証されており、頬側粘膜を通過するのに役立っている。加えて、本出願人が開発した該製剤は、従来の製剤、特にペルファルガン（Perfalgan）のような既存の注射用水溶液と比べて非常に高い通過能で血液脳関門を通過するパラセタモール分子の能動輸送を可能にする。これは、中枢神経系へのパラセタモールの送達を標的とすることによりパラセタモールの治療効果を改善するのに役立つ。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】国際公開第２００８／０８７３２３号
【発明の概要】
【００１８】
したがって、本発明の第１の対象は、溶解パラセタモールを含む含水アルコール溶液からなるパラセタモールの頬側／歯肉投与用医薬製剤であって、
・パラセタモールの質量が９５ｍｇ〜１９０ｍｇであり、
・該含水アルコール溶液の体積が１.０ｍＬ〜２.０ｍＬであり、
・該含水アルコール溶液のアルコール度が４８.５°〜５２.５°であり、
・該含水アルコール溶液中のパラセタモールの濃度が８５ｍｇ／ｍＬ〜１１０ｍｇ／ｍＬである、
医薬製剤に関する。
【００１９】
本発明の第２の対象は、パラセタモールによる血液脳関門の通過を促進するために使用するための該医薬製剤に関する。
【００２０】
本発明の第３の対象は、特に疼痛または発熱の対症療法のための、薬物として使用するための該医薬製剤に関する。
【００２１】
定義
本発明の目的のために、「頬側／歯肉」とは、有効成分を口内に投与する薬物投与経路を意味する。それは、頬側粘膜を通って拡散し、血流に直接進入する。吸収のタイプに応じて、舌下（sublinguale）または経舌（perlingual）経路を区別することができる。
【００２２】
本発明の目的のために、「溶解パラセタモール」とは、経時的に完全かつ安定な溶解状態にある、溶媒中で分子状態であって弱くイオン化されており、パラセタモールを意味する。
【００２３】
本発明の目的のために、「血液脳関門」
2020509045.tif 000003
とは、全ての陸生脊椎動物における脳内で循環血液と中枢神経系（ＣＮＳ）との間に存在する生理学的関門をいい、血液からＣＮＳを分離することにより脳の恒常性を維持することを可能にする。それは、血液脳関門
2020509045.tif 000004
または血液髄膜関門とも称される。この関門の必須構成要素は、血流側の毛細血管の内側を覆っており、密着結合により互いに接続しあっている、内皮細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、試料ＥＵ−９５に対して行ったＤＯＳＹ実験の結果を再現する。  図１Ａは、磁場勾配強度の関数としてのシグナル強度のプロット（パラセタモールのＣＨ3）をより正確に示す。  図１Ｂは、２５℃にて４００ＭＨｚで記録したＤＯＳＹ  1Ｈ−ＮＭＲスペクトルに相当する（１６勾配増分について８スキャン、ｄｌ＝２ｓ、ＬＢ＝５Ｈｚ）。水平方向は混合物中の化合物のプロトンの化学シフトを表し、垂直方向はラプラス変換後の拡散係数を表す。
【図２】図２Ａおよび図２Ｂは、それぞれ２５℃および４０℃での水中エタノール希釈実験中の水およびエタノールの流体力学的半径、ならびに粘度を表す。ＲH（±０.１Å）は、ＤＯＳＹ  1Ｈ−ＮＭＲ拡散係数測定値から算出される。粘度の値は文献から取られている［Khattab et al. (2012) Korean J. Chem. Eng. 29, 812-817］。網掛け部分は、パラセタモールの存在下で実験したモル分率に対応する。
【図３】図３Ａおよび図３Ｂは、それぞれ２５℃および４０℃での、試料ＥＵ−９５、ＥＵ−９５−３０、ＥＵ−９５−５０およびＥＵ−９５−８０についての、水、エタノールおよびパラセタモールの流体力学的半径、ならびに粘度を表す。ＲH（±０.１Å）は、ＤＯＳＹ  1Ｈ−ＮＭＲ拡散係数測定値から算出される。粘度の値は文献［Khattab et al. (2012) Korean J. Chem. Eng. 29, 812-817］から取得されている。
【図４】図４は、血液脳関門を模倣した細胞モデルに使用されるデバイスの概略図である。それはトランスウェル系である。
【図５】図５は、以下の４つの状況でのインビトロ血液脳関門モデルを通過するパラセタモールのフローを時間の関数として示す：ＵＳ：  パラセタモールは溶液Ｕ９５に由来し、        培養培地は５％の血清を含有する；Ｕ：    パラセタモールは溶液Ｕ９５に由来し、        培養培地は血清を含有しない；ＰＳ：  パラセタモールはパーファルガンに由来し、        培養培地は５％の血清を含有する；Ｐ：    パラセタモールはパーファルガンに由来し、        培養培地は血清を含有しない。
【図６】図６は、培養培地中血清含有量０％、５％、２０％および５０％について、パラセタモール「Ｕ９５」の反管腔側濃度（すなわち、トランスウェルの下部コンパートメントにおける）の経時的変化を示す。
【図７】図７は、血清が培養培地中に存在する（５％、曲線ＰＳ）か存在しない（曲線Ｐ）かに依存する、パラセタモール「パーファルガン」の反管腔側濃度（すなわち、トランスウェルの下部コンパートメントにおける）の経時的変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明は、第一に、溶解パラセタモールを含む含水アルコール溶液からなるパラセタモールの頬側／歯肉投与用医薬製剤であって、
・パラセタモールの質量が９５ｍｇ〜１９０ｍｇであり、
・該含水アルコール溶液の体積が１.０ｍＬ〜２.０ｍＬであり、
・該含水アルコール溶液のアルコール度が４８.５°〜５２.５°であり、
・該含水アルコール溶液中のパラセタモールの濃度が８５ｍｇ／ｍＬ〜１１０ｍｇ／ｍＬである、
医薬製剤に関する。
【００２６】
有利には、パラセタモールの質量は、１２０ｍｇ〜１７０ｍｇであり、典型的には１２５ｍｇ〜１６５ｍｇであり、特に１２５ｍｇまたは１６５ｍｇに等しい。
【００２７】
好ましくは、含水アルコール溶液の体積は、１.２ｍＬ〜１.７ｍＬであり、典型的には１.２５ｍＬ〜１.６５ｍＬであり、特に１.２５ｍＬまたは１.６５ｍＬに等しい。
【００２８】
有利には、該含水アルコール溶液中のパラセタモールの濃度は、９０ｍｇ／ｍＬ〜１０５ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは、９５ｍｇ／ｍＬ〜１０５ｍｇ／ｍＬであり、特に１００ｍｇ／ｍＬに等しい。
【００２９】
好ましくは、含水アルコール溶液は、エタノールの体積が該含水アルコール溶液の総体積の４５％〜６０％であり、有利には４８.５％〜５２.５％であり、典型的には５０％である、水／エタノール混合物からなる。
【００３０】
本発明の文脈において、「エタノール」とは、水およびエタノールからなり、９６体積％〜９９.８体積％のエタノール、有利には９６体積％のエタノールを含有する、市販の二成分溶液をいう。
【００３１】
有利には：
・パラセタモールの質量は、１２０ｍｇ〜１７０ｍｇであり、典型的には１２５ｍｇ〜１６５ｍｇであり、
・含水アルコール溶液の体積は、１.２ｍＬ〜１.７ｍＬであり、典型的には１.２５ｍＬ〜１.６５ｍＬであり、
・含水アルコール溶液は、エタノールの体積が該含水アルコール溶液の総体積の５０％の間である水／エタノール混合物からなる。
【００３２】
第一の特定の実施態様において、
・パラセタモールの質量は、１２５ｍｇに等しく、
・含水アルコール溶液の体積は、１.２５ｍＬに等しく、
・含水アルコール溶液は、エタノールの体積が該含水アルコール溶液の総体積の５０％である水／エタノール混合物からなる。
【００３３】
第二の特定の実施態様において、
・パラセタモールの質量は、１６５ｍｇであり、
・含水アルコール溶液の体積は、１.６５ｍＬであり、
・含水アルコール溶液は、エタノールの体積が該含水アルコール溶液の総体積の５０％ である水／エタノール混合物からなる。
【００３４】
好ましくは、含水アルコール溶液の粘度は、１.５・１０-3Ｐａ・ｓよりも大きい。
【００３５】
有利には、上記定義の含水アルコール溶液に溶解したパラセタモールの４０℃での流体力学的半径は、２.１Å未満である。
【００３６】
本発明の目的のために、「流体力学的半径」またはＲHとは、溶質が下記のストークス−アインシュタイン（Stokes-Einstein）関係式によって定義されるように球状であると仮定して、溶液中の溶質の半径を意味する［Edward, J. T. (1970) J. Chem. Educ. 47, 261；Einstein, A. (1905) Annalen Der Physik 17, 549-560；Einstein, A. (1906) Annalen Der Physik 19, 371-381］：
【数１】
2020509045.tif 000005
式中、
・Ｄは、溶媒中の溶質の拡散係数であり（ｍ2・ｓ-1で表される）、
・ｋBは、ボルツマン定数であり、ｋB＝１.３８０６・１０-23  Ｊ・Ｋ-1であり、
・Ｔは、培地の温度であり（Ｋで表される）、
・ρは、培地の粘度であり（Ｐａ・ｓで表されるか、またはｋｇ・ｓ-1・ｍ-1と等価である）、
・ＲHはｍで表される。
【００３７】
かくして、球状とみなされる分子の溶液における拡散係数の測定により、該分子のサイズ、より正確にはその流体力学的半径を決定することが可能となる。
【００３８】
特定の実施態様において、含水アルコール溶液は、香味剤および／または甘味剤を含む。
【００３９】
本発明の目的のために、「香味剤および／または甘味剤」とは、医薬製剤の投与を受ける患者によって知覚される味をより快適にする薬学的に許容される物質であると定義される。
【００４０】
「薬学的に許容される」とは、一般的に安全であり、非毒性であり、生物学的にもその他の点でも望ましくなくはなく、獣医およびヒトのどちらの薬学的使用にも許容されるものを意味する。
【００４１】
特定の実施態様において、含水アルコール溶液は、パラセタモール以外の有効成分を少なくとも１種類含有する。
【００４２】
特に、含水アルコール溶液への溶解に適合する、気道、副鼻腔、鼻（rhino）および中咽頭経路のための鎮痛剤、鬱血除去剤、鎮静剤であるアジュバントを提供することができる親油性物質を、パラセタモールと組み合わせることができる。特に、パラセタモールは、プソイドエフェドリン、トリプロリジン、プロメタジン、フェニラミン、メクリジン、ジフェンヒドラミン、ジメンヒドリナート、シプロヘプタジン、デキストロプロポキシフェン
2020509045.tif 000006
および／またはコデインと組み合わせることができる。
【００４３】
加えて、本発明は、また、パラセタモールによる血液脳関門の通過を促進するのに使用するための上記で定義された医薬製剤にも関する。
【００４４】
最後に、本発明は、また、特に疼痛（典型的には軽度から中等度）および／または発熱の処置のための薬物として使用するための上記で定義された医薬製剤にも関する。
【００４５】
本発明の医薬製剤は、０.５〜３ｍＬの単回投与パッケージにパッケージ化されてもよく、該パッケージは、その表面でのパラセタモールの吸着を制限しなければならず、含水アルコール溶液に対して不浸透でなければならず、溶液の安定性を保証しなければならず、一方では、医薬製剤の下顎前庭への完全な送達を可能にする。
【実施例】
【００４６】
下記の略語が使用されている：
2020509045.tif 000007
【００４７】
１．パラセタモールの流体力学的半径に対する含水アルコール溶液の希釈の影響
【００４８】
・材料および方法
【００４９】
・材料
Ａ．パラセタモール溶液
−  Ｕ９５：  水／エタノール混合物（５０／５０ ｖ／ｖ）中９５ｍｇ／ｍｌパラセタモール溶液（Ｃ＝６２８ｍＭ）、および
−  パーファルガン：  幼児および小児用の市販の１０ｍｇ／ｍＬパラセタモール溶液＋賦形剤（Ｃ＝６６ｍＭ）。
【００５０】
Ｂ．参照
−  エタノール（ロットＭＰＡ１００３５８３）：  １０ｍＬバイアル、
−  パラセタモール粉末（ロットＭＰＡ１００３１４６５）：  １ｇ（Ｍ＝１５１.１６ｇ／ｍｏｌ）、
−  重水（Ｄ2Ｏ）：  Eurisotop（Groupe CEA, Saclay）から購入、
−  生理食塩水（Gilbert Laboratoires）：  ５ｍＬ投与単位中０.９ｇ／１００ｍＬ（Ｃ＝１５４ｍＭ）の塩化ナトリウムを含有する水溶液、および
−  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水、Millipore（Molsheim, France）からの濾過および逆浸透システムを用いて生成。
【００５１】
・試料の調製
液体のＮＭＲ分析のために、下記の試料を調製し、５ｍｍ径のＮＭＲガラス管または４ｍｍ径のジルコニアローター（Cortecnet, France）に入れた。少量の重水（Ｄ2Ｏ）を加えて、収集中の空間的および時間的な均一性を確保する。
−  ＥＵ−９５：  Ｕ９５  ４５０μＬ＋Ｄ2Ｏ  ５０μＬ（Ｃ＝５６５ｍＭ、ｘE＝０.２３６）、
−  ＥＵ−９５−３０：  Ｕ９５  ５００μＬ＋生理食塩水２１５μＬ＋Ｄ2Ｏ  ７０μＬ（Ｃ＝４００ｍＭ、ｘE＝０.１４１）、
−  ＥＵ−９５−５０：  Ｕ９５  ２５０μＬ＋生理食塩水２５０μＬ＋Ｄ2Ｏ  ５０μＬ（Ｃ＝２８５ｍＭ、ｘE＝０.０９２）、
−  ＥＵ−９５−８０：  Ｕ９５  ２５０μＬ＋生理食塩水１２５０μＬ＋Ｄ2Ｏ  １５０μＬ（Ｃ＝９５ｍＭ、ｘE＝０.０３３）、
−  ＲＥＦ−生理食塩水：  生理食塩水４５０μＬ＋Ｄ2Ｏ  ５０μＬ（ＣNaCl＝１３８ｍＭ、ｘE＝０.０）、
−  ＲＥＦ：  ＥｔＯＨ  ２５０μＬ＋Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水２５０μＬ＋Ｄ2Ｏ  ５０μＬ（Ｃ＝６.９Ｍ、ｘE＝０.２３６）、
−  ＲＥＦ−３０：  ＥｔＯＨ  ２５０μＬ＋Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水２５０μＬ＋生理食塩水２１５μＬ＋Ｄ2Ｏ  ７０μＬ（Ｃ＝４.８Ｍ、ｘE＝０.１４１）、
−  ＲＥＦ−５０：  ＥｔＯＨ  １２５μＬ＋Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水１２５μＬ＋生理食塩水２１５μＬ＋Ｄ2Ｏ  ５０μＬ（Ｃ＝３.７Ｍ、ｘE＝０.０９２）、
−  ＲＥＦ−８０：  ＥｔＯＨ  １２５μｌ＋Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水１２５μＬ＋生理食塩水１２５０μＬ＋Ｄ2Ｏ  １５０μＬ（Ｃ＝１.１４Ｍ、ｘE＝０.０３３）、
−  ＲＥＦ−ＥｔＯＨ：  ＥｔＯＨ  ４５０μＬ（Ｃ＝１３.６Ｍ、ｘE＝０.９９９）、
−  ＰＥＲＦ：  パーファルガン４５０μＬ＋Ｄ2Ｏ  ５０μＬ（Ｃ＝５９ｍＭ、ｘE＝０.０）、および
−  ＰＡＲＡ−１２５：  パラセタモール粉末５６ｍｇ＋ＥｔＯＨ  ５００μＬ＋Ｄ2Ｏ  ５０μＬ（Ｃ＝６７３ｍＭ、ｘE＝０.７３５)。
【００５２】
・方法
静的モードで操作するＱＮＰ  ＳＢ  1Ｈ／19Ｆ−13Ｃ−31Ｐプローブを装備したＢｒｕｋｅｒ  ＳＢ  ４００ＭＨｚ  ＮＭＲ分光計（Wissembourg, France）を使用して、液体プロトンＮＭＲ分析を行った。
【００５３】
２Ｄ 1Ｈ−ＮＭＲにおいて、使用したシーケンスは、＋０.５℃の温度調整を有するＤＯＳＹパルスシーケンス ［Morris, K. F., and Johnson, C. S. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115, 4291-4299］（Ｚ勾配のスピンエコーシーケンス）である。９０°パルスは１５μ秒であり、リサイクリング時間は５秒であり、収集の数は、１時間の合計収集時間で、勾配について１６増分で、４８である。信号は、Ｆ２次元のフーリエ変換（1Ｈ化学シフト）の前に、定数２Ｈｚの減少指数関数でフィルタリングされる。逆ラプラス変換は、Ｆ１次元で実行され、拡散係数を直接与える。
【００５４】
ＮＭＲスペクトル処理に使用されるソフトウェアは、Brukerが開発したＴｏｐｓｐｉｎ  ２.０である。
【００５５】
・結果
【００５６】
・前置き
溶液中の分子のサイズは、溶液中の種の拡散係数を測定するためにいわゆる拡散実験を使用する液体ＮＭＲによって推定することができる。該実験は、粒子の拡散が測定される方向である所定の方向に磁場勾配を適用することにより行われる。
【００５７】
このタイプの実験に続いて２つの処理が可能である。ピークごとの分析は、ＮＭＲピークの強度の変動を該磁場勾配の関数として非常に正確に設定することにより行われ得る（図１Ａ）。唯一の調整変数が拡散係数である場合、すでに記載されているストークス−アインシュタインの式を使用して溶液中の種のサイズを得ることは容易である。２次元マップ（２Ｄ−ＮＭＲ）で拡散／化学シフトを得るためにラプラス変換を適用することもでき、該拡散係数はｙ軸に沿って直接測定可能である（図１Ｂ）。
【００５８】
・参照試料の拡散係数の測定
水、エタノール、パーファルガン、およびエタノールに溶解したパラセタモールについてＤＯＳＹ実験を行った。
【００５９】
拡散係数の測定には、ＮＭＲ共鳴、通常、単離されたＣＨ3が選択され、これはより高い精度を提供するためである。この場合、精度は±０.１・１０-9ｍ2・ｓ-1と推定される。
【００６０】
決定された種々の化合物の拡散係数の値を下記の表１に示す。この表は、文献［Khattab, I. S., Bandarkar, F., Fakhree, M. A. A., and Jouyban, A. (2012) Korean J. Chem. Eng. 29, 812-817］から得られる粘度値、エタノールのモル分率、およびストークス−アインシュタイン式から算出された流体力学的半径も包含する。このようにして算出された値の精度は±０.１Åと推定される。
【００６１】
【表１】
2020509045.tif 000008
【００６２】
・水（生理食塩水）による希釈中の水−ＥｔＯＨ溶液の拡散係数の測定
参照試料についての実験から、分子のサイズは、溶媒に非常に強く依存して、試料ごとに異なると考えられる：例えば、パラセタモールは、パーファルガン試料中ではＲHが２.８Åであり、エタノール中ではＲHが４.２Åである。
【００６３】
ここでは該試料の粘度および複雑な水和現象が関係している。研究において、特に希釈研究中に、種々の溶媒中の分子サイズをモニターすることが重要である。
【００６４】
したがって、水による希釈の効果を評価するために、参照溶液（ＲＥＦ−生理食塩水、ＲＥＦ、ＲＥＦ−３０、ＲＥＦ−５０、ＲＥＦ−８０およびＲＥＦ−ＥｔＯＨ）をＤＯＳＹ実験に供した。
【００６５】
２５℃および４０℃で得られた結果をそれぞれ図２Ａおよび図２Ｂに示す。
【００６６】
かかる結果からいくつかの結論を引き出すことができる。
【００６７】
粘度は、ＥｔＯＨ／水のモル分率が２５℃では０.３（６０／４０ ｖ／ｖ）に近くて４０℃では０.２（５０／５０ ｖ／ｖ）に近い場合に最大である。これは、注目に値し、最大粘度が純粋な水または純粋なエタノールよりも２〜３倍高いことを示している。
【００６８】
水およびエタノールについて算出した流体力学的半径はまた、特定の挙動を有する。エタノールは、２５℃において半径が１.５Åであるが、純粋な形態および高度に希釈された形態のどちらにおいても０.０５〜０.１のｘEに対して最小（０.８Å）である。水は、同様に挙動する。この現象は、すでに文献［Price, W. S., Ide, H., and Arata, Y. (2003) The Journal of Physical Chemistry A 107, 4784-4789；Codling, D. J., Zheng, G., Stait-Gardner, T., Yang, S., Nilsson, M., and Price, W. S. (2013) The Journal of Physical Chemistry B 117, 2734-2741］に見られており、水またはエタノールの純粋な溶液について見られる水−水会合またはエタノール−エタノール会合が混合物において破壊されることによって説明される。
【００６９】
４０℃における粘度およびＲHは２５℃の場合よりも低く、これは温度の影響を反映している：  ブラウン運動は水素結合を破壊する傾向があり、これは水およびエタノールが一緒に形成することができる全ての双極子−双極子会合を破壊する効果を有する。
【００７０】
興味深いことに、試料ＥＵ−９５はエタノールのモル分率が０.２３６であり、すなわち、その領域では粘度が最大である。
【００７１】
・水（生理食塩水）で希釈した場合または同じ含水アルコール媒体中のパラセタモールの濃度が低下した場合の水−ＥｔＯＨ−パラセタモール溶液の拡散係数の測定
種々の希釈条件下でパラセタモールを含有する溶液（ＥＵ−９５、ＥＵ−９５−３０、ＥＵ−９５−５０およびＥＵ−９５−８０）もまたＤＯＳＹ実験に供した。これらの溶液は、それぞれ、０.２３６、０.１４１、０.０９２および０.０３３のｘE値に対応し、図２Ａおよび図２Ｂにおける網掛け部分を定義する。２５℃および４０℃で得られた結果を下記の表２にまとめ、それぞれ、図３Ａおよび図３Ｂに報告する。
【００７２】
ヒトの体温に最も近い温度である４０℃において、Ｕ９５の非希釈試料（ＥＵ−９５）の場合にパラセタモールの最小の流体力学的半径（１.９Å）が得られる。温度の上昇による影響をほとんど受けないパーファルガン中のパラセタモールの値（２.５Å）とは異なる。
【００７３】
【表２】
2020509045.tif 000009
【００７４】
・結論
【００７５】
含水アルコール溶液は特定の巨視的および分子的側面によって区別され、該溶液に溶解したパラセタモール分子は顕著な特性を有する。
【００７６】
水は純粋な水素結合のネットワークを形成し、エタノールは純粋なアルコール−アルコール会合を形成する。水中のアルコール含有量が非常に低いと、水／エタノール会合が生じる。エタノール含有量がより高い場合には、会合の破壊が起こり、分子は混合物中で互いに単離されて個々に行動する。
【００７７】
同時に、溶液の粘度は、上昇して、ＥｔＯＨ／水のモル分率が２５℃では０.３（６０／４０ ｖ／ｖ）に近くて４０℃では０.２（５０／５０ ｖ／ｖ）に近い場合に最大に達し、これは、純粋な水または純粋なエタノールよりも２〜３倍高い粘度に相当する。
【００７８】
サブナノメートルスケールサイズの測定（ＤＯＳＹ ＮＭＲ拡散実験）により、パラセタモール分子の変動が明らかになる。
【００７９】
５０／５０（ｖ／ｖ）の範囲の水−エタノール混合物の特定の組成により、特にヒトの体温に最も近い４０℃で、パラセタモールが最小サイズとなる。これは、分子をよりステルシーにし、該分子の疎水特性を高め、疎水性でもある膜バリアを該分子が通過するのを助ける、分子の濡れが弱いことにより解釈できる。
【００８０】
パラセタモール分子の収縮、そのステルス性は、調製物の高粘度および既知であるがほとんど特徴付けられていない現象であるエタノールによる生体膜の流動化効果と合わせて、頬側／歯肉投与における発明に従って医薬製剤の有効性に寄与する。
【００８１】
２．血液脳関門を通過するパラセタモールの輸送
【００８２】
・材料および方法
【００８３】
・材料
Ａ．パラセタモール溶液
−  Ｕ９５：  水／エタノール混合物（５０／５０ ｖ／ｖ）中９５ｍｇ／ｍｌパラセタモール溶液（Ｃ＝６２８ｍＭ）、および
−  パーファルガン：  幼児および小児用の市販の１０ｍｇ／ｍＬパラセタモール溶液＋賦形剤（Ｃ＝６６ｍＭ）。
【００８４】
Ｂ．血液脳関門の細胞モデル
文献において、ｈＣＭＥＣ／Ｄ３細胞株が、血液脳関門の構成要素を模倣している、血液脳関門の関連するインビトロモデルを構成し得ることが従前に確立されている［Weksler et al., FASEB J. 2005 Nov;19(13):1872'4. Epub 2005 Sep 1；Weksler et al., Fluids Barriers CNS. 2013 Mar 26;10(1):16. doi: 10.1186/2045'8118'10'1］。
【００８５】
該細胞をまず細胞培養バイアル中にて培養し（保存培養物からの凍結細胞を解凍した後、３継代培養）、次いで、図４に記載のトランスウェルシステムに播種した。
【００８６】
それらが、トランスウェルシステムにおいて１４日間培養した後に得られるコンフルエンスに達すると、該細胞は、血液脳関門形成に特徴的なタンパク質、すなわち、ＺＯ１、オクルディン、ファロイジンおよびＣＤ３１を発現する。
【００８７】
次いで、このように模倣された該関門の透過性を、ルシファーイエローを使用して決定する。この場合、ルシファーイエローは、該関門を通過することができない。
【００８８】
Ｃ．培養培地
培養培地の組成を下記の表３に示す：
【００８９】
【表３】
2020509045.tif 000010
＊  以下に詳述するいくつかの実験は、血清の非存在下で、またはより高い血清濃度（２０％および５０％）を用いて、行われた。
【００９０】
Ｄ．ＨＰＬＣ
培養培地およびサンプリングプロトコルを考慮して、上記のインビトロ血液脳関門モデルを通過するパラセタモールの定量化を可能にする特定のＨＰＬＣ法を開発した。
【００９１】
使用した装置は、Thermo Fisher（Courtaboeuf, France）からの、Ｐ４０００ポンプ、５０ｍｍ光路を備えた６０００ＬＰ  ＵＶ検出器、１００μＬループを備えたＡＳ  ３０００オートサンプラー、およびＳＮ  ４０００  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒで構成されている。使用した収集ソフトウェアはＣｈｒｏｍＱｕｅｓｔ  ５.０である。
【００９２】
開発した方法は、以下の特徴に基づいている：
カラム：  ＸＴｅｒｒａ  ＲＰ１８  ２０＊４.６ｍｍ＊３.５μｍ、
ＵＶ検出器：  ２４２ｎｍ、
流速：  １ｍＬ／分、
カラム温度：  ３５℃、
注入体積：  １０μＬ、および
移動相：  ０.０２ＭおよびｐＨ４のギ酸アンモニウム緩衝液。
【００９３】
・方法
様々なステップを含む以下のサンプリングプロトコルを確立した：
ａ）図４に記載のトランスウェルシステムの上部コンパートメントにＵ９５  １０μＬを堆積すること、
ｂ）下部コンパートメントから１０００μＬを取り出すこと、
ｃ）１０％トリクロロ酢酸溶液２００μＬを添加することによりタンパク質を沈殿させること、
ｄ）３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離すること、
ｅ）移動相を使用して１／１０に希釈すること、
ｆ）０.２２μｍ  ＰＴＦＥフィルターを使用して濾過すること、
ｇ）ＨＰＬＣに１０μＬを注入すること、
ｈ）パラセタモールを定量化すること。
【００９４】
・結果
【００９５】
・パラセタモール「Ｕ９５」対パラセタモール「パーファルガン」による血液脳関門通過の比較
「Ｕ９５」溶液に含まれるパラセタモールとパーファルガンに含まれるパラセタモールの両方について、血液脳関門膜のインビトロモデルを通るパラセタモールのフローを測定した。
【００９６】
同一濃度のパラセタモールを得るために、第１のケースでは、トランスウェルシステムの管腔コンパートメントにＵ９５溶液１０μＬおよび培養培地８５μＬを加え、第２のケースでは、パーファルガン９５μＬを使用した。
【００９７】
培養培地中の血清の存在下（５％）および血清の非存在下において３７℃で各化合物の通過を研究した。
【００９８】
細胞を、３７℃で２０〜２２時間培養した後、測定を行った。
【００９９】
このようにして測定したフローを図５に報告している。
【０１００】
血清の存在下または非存在下でのパラセタモール「Ｕ９５」のフロー（それぞれ、曲線ＵＳおよびＵ）は経時的にほぼ一定であり、非常に急速に減少するパラセタモール「パーファルガン」のフローよりも有意に高いことが分かる。
【０１０１】
図５において、血液脳関門膜のインビトロモデルを通過するパラセタモール「Ｕ９５」の輸送は、最初の３０分間、血清の存在下でより高くなることにも注目する。
【０１０２】
したがって、パラセタモール「Ｕ９５」の輸送に対する血清の影響を決定するために、さらなる実験を行った。
【０１０３】
・血清の存在下でのパラセタモール「Ｕ９５」の輸送
細胞培地中の血清含有量が０％、５％、２０％および５０％の場合のパラセタモール「Ｕ９５」の反管腔側濃度の経時的変化を測定した。
【０１０４】
得られた結果を図６に報告している。
【０１０５】
図６に示されているパラセタモールの反管腔側濃度の値が、ＨＰＬＣ定量化によって得られる生の値に対応していることに注目すべきである。ＨＰＬＣでは希釈が行われるため、それらは、実際の値と一致させるためには１２倍すべきである。
【０１０６】
血液脳関門膜のインビトロモデルを通過するパラセタモール「Ｕ９５」の輸送が培養培地中の血清の存在によって増強されることが分かる。存在する血清の量とバリアを通過するパラセタモールの量との間には比例関係があるようにさえ考えられる。
【０１０７】
他方、このような血清の有無の影響は、パラセタモール「パーファルガン」の場合には見られない。
【０１０８】
実際、細胞培地中の血清含有量が０％、５％、２０％および５０％の場合のパラセタモール「パーファルガン」の反管腔側濃度の経時的変化を測定した。
【０１０９】
得られた結果は図７に報告されている。
【０１１０】
血液脳関門膜のインビトロモデルを通過するパラセタモール「パーファルガン」の輸送が、３０分以降、血清の存在下であまり好ましくないことが分かる。
【０１１１】
・結論
上記の結果は、血清溶液の少なくとも１つの成分が関与している、本発明の医薬製剤に含まれるパラセタモールの能動輸送を示している。
【図１】
2020509045.tif 000011
【図２】
2020509045.tif 000012
【図３】
2020509045.tif 000013
【図４】
2020509045.tif 000014
【図５】
2020509045.tif 000015
【図６】
2020509045.tif 000016
【図７】
2020509045.tif 000017
【国際調査報告】
2020509045.tif 000018
2020509045.tif 000019
2020509045.tif 000020
2020509045.tif 000021
2020509045.tif 000022
2020509045.tif 000023