(57)【要約】  本発明は、細胞ＦＬＩＣＥ［Ｆａｓ関連デスドメイン（ＦＡＤＤ）様ＩＬ−１β−変換酵素］−阻害タンパク質（ＣＦＬＡＲ）の細胞レベルを上昇させるように操作される細胞に関する。操作された細胞は、耐性を誘導する能力を有する。増強された免疫寛容原性は、外部からの移植物の生存期間を延長するため、及び自己免疫疾患の治療のために有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞ＦＬＩＣＥ［Ｆａｓ関連デスドメイン（ＦＡＤＤ）様ＩＬ−１β−変換酵素］−阻害タンパク質（ＣＦＬＡＲ）の細胞レベルを上昇させるように操作される骨髄細胞又はその前駆細胞を含む細胞の集団。
【請求項２】
ＣＦＬＡＲの細胞レベルを上昇させることが、細胞の免疫抑制活性を増大させる、請求項１に記載の細胞の集団。
【請求項３】
骨髄細胞又はその前駆細胞が、ＣＦＬＡＲの細胞発現を増大させるように操作される、請求項１又は２に記載の細胞の集団。
【請求項４】
骨髄細胞又はその前駆細胞が、ＣＦＬＡＲをコードする核酸でトランスフェクトされる、請求項１から３のいずれか一項に記載の細胞の集団。
【請求項５】
前記トランスフェクションが、安定又は一過性トランスフェクションである、請求項４に記載の細胞の集団。
【請求項６】
骨髄細胞又はその前駆細胞が、担体としてレンチウイルスベクターといったウイルス性ベクターを用いてトランスフェクトされる、請求項４又は５に記載の細胞の集団。
【請求項７】
前記核酸がＲＮＡである、請求項４又は５に記載の細胞の集団。
【請求項８】
ＣＦＬＡＲがＣＦＬＡＲＬ及び／又はＣＦＬＡＲＳである、請求項１から７のいずれか一項に記載の細胞の集団。
【請求項９】
骨髄細胞又はその前駆細胞が、単離及び／又は精製された細胞、特に磁気細胞分離により単離及び／又は精製された細胞である、請求項１から８のいずれか一項に記載の細胞の集団。
【請求項１０】
骨髄細胞又はその前駆細胞が単球である、請求項１から９のいずれか一項に記載の細胞の集団。
【請求項１１】
骨髄細胞又はその前駆細胞がＣＤ１４＋単球である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の細胞の集団。
【請求項１２】
骨髄細胞又はその前駆細胞が、バフィーコートから単離されたＣＤ１４＋単球である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の細胞の集団。
【請求項１３】
骨髄細胞又はその前駆細胞が幹細胞である、請求項１から９のいずれか一項に記載の細胞の集団。
【請求項１４】
骨髄細胞又はその前駆細胞が骨髄ＣＤ３４＋細胞である、請求項１から９及び１３のいずれか一項に記載の細胞の集団。
【請求項１５】
骨髄細胞又はその前駆細胞が、骨髄単核細胞（ＭＮＣ）から単離された骨髄ＣＤ３４＋細胞である、請求項１から９、１３及び１４のうちのいずれか一項に記載の細胞の集団。
【請求項１６】
細胞が、免疫抑制活性の獲得を促進するように処置されている、請求項１から１５のいずれか一項に記載の細胞の集団。
【請求項１７】
免疫抑制活性の獲得を促進するための処置が、Ｇ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦの存在下におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の細胞の集団。
【請求項１８】
治療法のための、請求項１から１７のいずれか一項に記載の細胞の集団。
【請求項１９】
治療法が免疫抑制を必要とする、請求項１８に記載の細胞の集団。
【請求項２０】
免疫抑制を必要とする患者を治療するための、請求項１から１７のいずれか一項に記載の細胞の集団。
【請求項２１】
患者にとって自家性である、請求項２０に記載の細胞の集団。
【請求項２２】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の細胞の集団を含む薬学的組成物。
【請求項２３】
治療法のための、請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
治療法が免疫抑制を必要とする、請求項２３に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
免疫抑制を必要とする患者を治療するための、請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
細胞の集団が患者にとって自家性である、請求項２５に記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
治療法のための医薬の製造のための、請求項１から１７のいずれか一項に記載の細胞の集団の使用。
【請求項２８】
治療法が免疫抑制を必要とする、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
免疫抑制を必要とする患者を治療するための医薬の製造のための、請求項１から１７のいずれか一項に記載の細胞の集団の使用。
【請求項３０】
細胞の集団が患者にとって自家性である、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の細胞の集団を投与することを含む、免疫抑制を必要とする患者を治療するための方法。
【請求項３２】
細胞の集団が患者にとって自家性である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
患者の骨髄細胞又はその前駆細胞中のＣＦＬＡＲの細胞レベルを上昇させることを含む、免疫抑制を必要とする患者を治療するための方法。
【請求項３４】
ＣＦＬＡＲの細胞レベルを上昇させることが、細胞の免疫抑制活性を増大させる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
患者の骨髄細胞又はその前駆細胞中のＣＦＬＡＲの細胞レベルを上昇させることが、ＣＦＬＡＲをコードする核酸を投与することを含む、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＣＦＬＡＲをコードする核酸が、骨髄細胞又はその前駆細胞をトランスフェクトする、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記トランスフェクションが、安定又は一過性トランスフェクションである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
骨髄細胞又はその前駆細胞が、担体としてレンチウイルスベクターといったウイルス性ベクターを用いてトランスフェクトされる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記核酸がＲＮＡである、請求項３５から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
ＣＦＬＡＲがＣＦＬＡＲＬ及び／又はＣＦＬＡＲＳである、請求項３３から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
骨髄細胞又はその前駆細胞が単球である、請求項３３から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
骨髄細胞又はその前駆細胞がＣＤ１４＋単球である、請求項３３から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
骨髄細胞又はその前駆細胞が幹細胞である、請求項３３から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
骨髄細胞又はその前駆細胞が骨髄ＣＤ３４＋細胞である、請求項３３から４０、及び４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
治療法のための、ＣＦＬＡＲをコードする核酸。
【請求項４６】
治療法が免疫抑制を必要とする、請求項４５に記載の核酸。
【請求項４７】
免疫抑制を必要とする患者を治療するための、ＣＦＬＡＲをコードする核酸。
【請求項４８】
ＣＦＬＡＲをコードする核酸を含む薬学的組成物。
【請求項４９】
治療法のための、請求項４８に記載の薬学的組成物。
【請求項５０】
治療法が免疫抑制を必要とする、請求項４９に記載の薬学的組成物。
【請求項５１】
免疫抑制を必要とする患者を治療するための、請求項４８に記載の薬学的組成物。
【請求項５２】
治療法のための医薬の製造のための、ＣＦＬＡＲをコードする核酸の使用。
【請求項５３】
治療法が免疫抑制を必要とする、請求項５２に記載の使用。
【請求項５４】
免疫抑制を必要とする患者を治療するための医薬の製造のための、ＣＦＬＡＲをコードする核酸の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞ＦＬＩＣＥ［Ｆａｓ関連デスドメイン（ＦＡＤＤ）様ＩＬ−１β−変換酵素］−阻害タンパク質（ＣＦＬＡＲ）の細胞レベルを上昇させるように操作される細胞に関する。操作された細胞は、耐性を誘導する能力を有する。増強された免疫寛容原性は、外部からの移植物の生存期間を延長するため、及び自己免疫疾患の治療のために有用である。
【背景技術】
【０００２】
免疫系の進化は、二種類の防御、即ち自然免疫と適応免疫に基づく高度に有効なネットワークを脊椎動物にもたらした。病原体に関連付けられる一般的な分子パターンを認識するインバリアントな受容体に依存する進化的に古い自然免疫系とは対照的に、養子免疫は、Ｂ細胞（Ｂリンパ球）及びＴ細胞（Ｔリンパ球）上の高度に特異的な抗原受容体及びクローンクローン選択に基づいている。Ｂ細胞は抗体の分泌により体液性の免疫応答を引き起こし、Ｔ細胞は認識された細胞の破壊につながる細胞免疫応答を媒介し、ヒト及び動物の細胞媒介性免疫において中心的役割を果たす。
【０００３】
成熟Ｔ細胞は、主要組織適合抗原系（ＭＨＣ）分子に結合して標的細胞の表面上に提示される免疫原性ペプチド（エピトープ）と相互作用するその抗原特異的受容体（ＴＣＲ）を通して抗原を認識し、それに応答する。例えば、細胞傷害性Ｔ細胞は、ＭＨＣ−Ｉタンパク質に関連して提示される抗原に応答する。ヘルパーＴ細胞は、ＭＨＣ−ＩＩタンパク質上に提示される抗原を認識する。ＴＣＲ活性化の一番速い結果はシグナル伝達経路の開始であり、これはＴ細胞のクローン拡大、細胞表面上での活性化マーカーの上方制御、エフェクター細胞への分化、細胞傷害性又はサイトカイン分泌の誘導及びアポトーシスの誘導をもたらす。ＴＣＲは複雑なシグナル伝達機構の一部であり、これには、ＴＣＲ  α鎖及びβ鎖のヘテロダイマー複合体、共受容体ＣＤ４又はＣＤ８、及びＣＤ３シグナル変換モジュールが含まれる。ＣＤ３鎖は細胞内部の活性化シグナルを伝達し、ＴＣＲ  α／βヘテロダイマーは抗原認識のみに参画している。
【０００４】
Ｔ細胞が免疫応答に関与する重要な役割に加え、樹状細胞（ＤＣ）は等しく重要である。ＤＣは、自己抗原に対する耐性の維持、及び外来抗原に対する自然及び適応免疫の活性化において重要な調節的役割を有するプロフェッショナル抗原提示細胞である。
【０００５】
サイトカイン、インターロイキン及び代謝物といった可溶型因子を生成することにより、腫瘍は、正常な骨髄細胞分化を変更する代替的造血を誘導し、骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）と呼ばれる免疫抑制機能により細胞の増殖及び拡大を促進する（Ugel S et al., 2015, J Clin Invest. 125:3365-76; Marvel D et al., 2015, J Clin Invest. 125:3356-64）。ＭＤＳＣの特徴は、骨髄起源、異種細胞組成、及び適応及び自然免疫応答を負に調節する能力である。ＭＤＳＣ機能活性は、アルギナーゼ１（ＡＲＧ１）、インドールアミン  ２，３−ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ１）、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ＮＯＸ）及び誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ、ＮＯＳ２とも呼ばれる）といった免疫抑制酵素の上方制御と、Ｔ細胞の活力と適応度を阻害する一酸化窒素（ＮＯ）並びに活性酸素及び窒素種（ＲＯＳ及びＲＮＳ）、例えばフリーラジカルペルオキシナイトライト（ＯＮＯＯ−）の生成増加とに関する（Bronte V et al., 2005, Nat Rev Immunol. 5:641-54）。ＭＤＳＣ組成物は柔軟で、各がんの種類に固有であり、且つ病理の動力学及び発達に従ってしばしば変化する：活性化されたＭＤＳＣは、大部分が原発腫瘍と転移部位に存在するが、循環しているものも見られ、このことは、ＭＤＳＣ特異的活性化マーカーを使用してそれらを他の非抑制骨髄細胞から区別可能であることを示唆している（Gabrilovich DI et al., 2012, Nat Rev Immunol. 12:253-68; De Sanctis F et al, 2016, Biochim Biophys Acta. 1865:35-48）。今日までに、ヒトＭＤＳＣは、三つの主要なサブセット、即ち単球性（ＭＯ）−ＭＤＳＣ、多形核／顆粒球性（ＰＭＮ）−ＭＤＳＣ及び未成熟（ｉ）−ＭＤＳＣに分類されている。しかしながら、試料調製手順及び細胞蛍光定量データの分析における差異は、排他的ＭＤＳＣマーカーが無いことと相まって、研究間に多くの食い違いを生み、臨床ルーチンおけるＭＤＳＣのリスト化を遅らせている。反対に、ここ２０年間に、革新的腫瘍マウスモデルの使用によるＭＤＳＣ関連分子及び生物学的経路の同定と腫瘍微小環境における細胞ネットワークの部分的分類とが、ＭＤＳＣとがんの病理におけるその機能に対する興味を増大させた。最近になって、二つの主サブセット間のマウスＭＤＳＣ不均一性が、細胞死誘導シグナル伝達複合体（ＤＩＳＣ）を調節する分子経路の異なる活性化から生じることが報告された。単球性（ＭＯ）−ＭＤＳＣの発生は、恒常的に、外因性アポトーシス経路及びカスパーゼ８活性化を制御する抗アポトーシス分子細胞ＦＬＩＣＥ［Ｆａｓ関連デスドメイン（ＦＡＤＤ）様ＩＬ−１β−変換酵素］−阻害タンパク質（ＣＦＬＡＲ、ｃ−ＦＬＩＰとしても知られる）］の存在を必要とする。一方、多形核（ＰＭＮ）−ＭＤＳＣの拡大は、固有のミトコンドリア死経路のＭＣＬ−１媒介性制御に依存する（Haverkamp JM et al, 2014, Immunity 41:947-59）。ＣＦＬＡＲは１３の異なるスプライスバリアントを有し、それらのうちの三つ、即ち２６ｋＤａショートフォーム（ｃ−ＦＬＩＰＳ）、２４ｋＤａ  Ｒａｊｉフォーム（ｃ−ＦＬＩＰＲ、いくつかの細胞株及びヒト一次Ｔ細胞のみに特異的に発現する）及び５５ｋＤａロングフォーム（ｃ−ＦＬＩＰＬ）はタンパク質として運ばれる。三つのＣＦＬＡＲバリアントすべてが、アポトーシスアダプタータンパク質Ｆ���ＡＤと相互作用する二つの細胞死エフェクタードメイン（ＤＥＤ）を含む。ＣＦＬＡＲをコードする遺伝子は、進化的に脊椎動物に保存され、ｃ−ＦＬＩＰＳの構造は、ガンマヘルペスウイルスクラス、例えばヒトヘルペスウイルス８、カポジ肉腫関連ウイルスのウイルスの成分であるウイルス性ＦＬＩＣＥ−阻害タンパク質（ｖ−ＦＬＩＰ）に類似している（Safa AR, 2012, Exp Oncol. 34:176-84; Safa AR et al., 2008, Curr Cancer Drug Targets 8:37-46）。
【０００６】
免疫系は、望ましくない影響を生じることもありうる。例えば、自己免疫障害は、自己抗原に対する耐性の欠失、「自己」抗原（自己抗原（ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ））に対して反応性のリンパ球の活性化、及び標的器官における病的損傷を特徴とする。さらに、免疫系は、無関係のドナー由来の細胞、組織及び器官の移植片の拒絶を引き起こしうる。免疫系は、移植組織といった有益な侵入者を、有害なものから区別せず、したがって免疫系は移植組織又は器官を拒絶する。移植器官の拒絶は、通常、ドナーの同種抗原又は異種抗原を認識する宿主中に存在するアロ反応性のＴ細胞により媒介される。一方、同種異系の免疫学的に活性な細胞が宿主に導入、移植又はグラフトされると、移植片対宿主病が発生することがあり、これは、グラフトの免疫担当細胞が宿主を免疫学的に攻撃する宿主とグラフとの間の免疫不適合性に起因して重症の、場合によっては致命的な反応をもたらす。
【０００７】
したがって、免疫寛容原性又は免疫抑制性の作用を有する薬剤に対する需要が存在する。特に、宿主の免疫寛容原性を増強する薬剤に対する需要が存在する。
【発明の概要】
【０００８】
発明の要約
本発明は、抗原に対する免疫応答の抑制により定義される免疫抑制及び耐性を誘導するための、組成物、方法及び使用を包含する。
【０００９】
本発明は、細胞、特に骨髄細胞又はその前駆細胞における細胞ＦＬＩＣＥ［Ｆａｓ関連デスドメイン（ＦＡＤＤ）様ＩＬ−１β−変換酵素］−阻害タンパク質（ＣＦＬＡＲ）の細胞レベルを上昇させることにより、細胞の免疫抑制活性が増大するという概念に基づいている。ＣＦＬＡＲの細胞レベルを上昇させる細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏに存在するもの、即ち単離された細胞でもよく、又はｉｎ  ｖｉｖｏに存在するもの、即ち対象又は個体内に存在する細胞でもよい。したがって、本発明は、細胞、特に骨髄細胞又はその前駆細胞の免疫寛容原性又は免疫抑制能を増強する方法を提供する。
【００１０】
本明細書に記載される免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞は、哺乳動物宿主における外来グラフトの生存期間を延ばすため、及び自己免疫疾患といった炎症関連疾患を改善するために有用である。免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞はまた、所望の遺伝子の遺伝子療法又は外来タンパク質に基づく治療法において免疫応答を抑制するために有用である。したがって、本発明は、移植片の宿主拒絶を低減又は阻害するために、本明細書に記載される免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞を一定量用いてレシピエントを治療することにより、レシピエント中の移植片に対する免疫応答を低減及び／又は排除するための方法及び組成物を包含する。移植片は、宿主に投与されるいずれかの材料を指す。例えば、移植片には、限定されないが、生体適合性格子、組織、器官、細胞、核酸、及びポリペプチドが含まれる。また、レシピエントに対するドナー移植片による有害反応を阻害又は低減するために、本明細書に記載される免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞を用いてドナー移植片及び／又は移植片のレシピエントを処置することにより、宿主に対して異質の移植による宿主の免疫応答、即ち、移植片対宿主病を低減及び／又は排除するための方法及び組成物が包含される。加えて、本発明は、タンパク質の拒絶を低減又は阻害するために、本明細書に記載される免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞を一定量用いてレシピエントを治療することにより、レシピエント中に外因的に送達されたタンパク質に対する免疫応答を低減及び／又は排除するための方法及び組成物を包含する。
【００１１】
本発明の種々の態様は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで、ＣＦＬＡＲを発現する又はＣＦＬＡＲの発現レベルを上昇させる細胞の遺伝子組み換えを想定する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで適用することのできるＲＮＡ、ＤＮＡ又はウイルス性ベクターといった異なるベクターフォーマットを細胞の遺伝子組み換えのために使用することができる。ＣＦＬＡＲの細胞レベルを上昇させる細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏに存在する場合、これら細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで遺伝子的に組み換え、任意選択的にｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞を拡大させた後でレシピエント中に細胞を移すという戦略をとることができる。治療のために使用される細胞は、レシピエントに自家性、同種異系又は同系とすることができる。ＣＦＬＡＲの細胞レベルを上昇させる細胞がｉｎ  ｖｉｖｏに存在する場合、患者において細胞の核酸を用いたトランスフェクションなどによる操作をｉｎ  ｓｉｔｕで行うことができ、任意選択的に適切な担体に含めた適切な核酸をレシピエントに適用することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞を遺伝子的に組み換えることに基づいた戦略をとることができる。
【００１２】
本明細書に記載される免疫抑制及び／又は耐性を誘導するための戦略を使用して、予想される望ましくない免疫応答を抑制し、例えば、例えば哺乳動物宿主にベクター経由で発現されるか又は哺乳動物宿主に外因的に適用される遺伝子療法又は治療タンパク質の反復投与を延長する、宿主中における外来グラフトの生存期間を延ばす、移植片対宿主病を治療又は予防する、自己免疫性関節炎、自己免疫性糖尿病、喘息、敗血症性ショック、肺線維症、糸球体腎炎、及びアテローム性動脈硬化症を含むがこれらに限定されない自己免疫疾患を治療又は予防することができる。
【００１３】
一態様において、本発明は、細胞ＦＬＩＣＥ［Ｆａｓ関連デスドメイン（ＦＡＤＤ）様ＩＬ−１β−変換酵素］−阻害タンパク質（ＣＦＬＡＲ）の細胞レベルを上昇させるように操作される骨髄細胞又はその前駆細胞を含む細胞の集団に関する。例えば、ＣＦＬＡＲの細胞レベルは、細胞中におけるＣＦＬＡＲの発現を増大させることにより上昇させることができる。
【００１４】
一実施態様では、ＣＦＬＡＲの細胞レベルを上昇させることが、細胞の免疫抑制活性を増大させる。
【００１５】
一実施態様では、骨髄細胞又はその前駆細胞が、ＣＦＬＡＲの細胞発現を増大させるように操作される。
【００１６】
一実施態様では、骨髄細胞又はその前駆細胞は、ＣＦＬＡＲをコードする核酸を用いてトランスフェクトされる。一実施態様では、ＣＦＬＡＲの発現は、トランスフェクトされていない細胞と比較して、トランスフェクトされた細胞で増大する。一実施態様では、トランスフェクションは、安定又は一過性トランスフェクションである。一実施態様では、骨髄細胞又はその前駆細胞は、レンチウイルスベクターといった担体としてウイルス性ベクターを用いてトランスフェクトされる。一実施態様では、前記核酸はＲＮＡである。
【００１７】
一実施態様では、ＣＦＬＡＲはＣＦＬＡＲＬ及び／又はＣＦＬＡＲＳである。
【００１８】
一実施態様では、骨髄細胞又はその前駆細胞は、単離及び／又は精製された細胞、特に磁気細胞分離により単離及び／又は精製されたされた細胞である。
【００１９】
一実施態様では、骨髄細胞又はその前駆細胞は単球である。一実施態様では、骨髄細胞又はその前駆細胞は、ＣＤ１４＋単球である。一実施態様では、骨髄細胞又はその前駆細胞は、バフィーコートから単離されたＣＤ１４＋単球である。
【００２０】
一実施態様では、骨髄細胞又はその前駆細胞は幹細胞である。一実施態様では、骨髄細胞又はその前駆細胞は骨髄ＣＤ３４＋細胞である。一実施態様では、骨髄細胞又はその前駆細胞は、骨髄単核細胞（ＭＮＣ）から単離された骨髄ＣＤ３４＋細胞である。
【００２１】
一実施態様では、細胞は、免疫抑制活性の獲得を促進するように処置されている。一実施態様では、免疫抑制活性の獲得を促進するための処置は、Ｇ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦの存在下におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化を含む。
【００２２】
一実施態様では、本発明の細胞の集団は、ＣＦＬＡＲの細胞レベルを上昇させるよう操作されない骨髄細胞又はその前駆細胞も含む。一実施態様では、本発明の細胞の集団は、ＣＦＬＡＲの細胞レベルを上昇させるように操作された骨髄細胞又はその前駆細胞のみを含む。一実施態様では、本発明の細胞の集団は、骨髄細胞又はその前駆細胞以外の細胞を含む。一実施態様では、本発明の細胞の集団は、骨髄細胞又はその前駆細胞のみを含む。
【００２３】
さらなる一態様では、本発明は、治療法のための、本明細書に記載される細胞の集団に関する。一実施態様では、治療法は免疫抑制を必要とする。
【００２４】
さらなる一態様では、本発明は、免疫抑制を必要とする患者を治療するための、本明細書に記載される細胞の集団に関する。一実施態様では、細胞の集団は、患者にとって自家性である。
【００２５】
さらなる一態様では、本発明は、本明細書に記載される細胞の集団を含む薬学的組成物に関する。本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体を含むことができ、また任意選択的に一又は複数のアジュバント、安定剤などを含むことができる。
【００２６】
さらなる一態様では、本発明は、治療法のための、本明細書に記載される薬学的組成物に関する。一実施態様では、治療法は免疫抑制を必要とする。
【００２７】
さらなる一態様では、本発明は、免疫抑制を必要とする患者を治療するための、本明細書に記載される薬学的組成物に関する。一実施態様では、細胞の集団は、患者にとって自家性である。
【００２８】
さらなる一態様では、本発明は、治療法のための医薬の製造のための、本明細書に記載される細胞の集団の使用に関する。一実施態様では、治療法は免疫抑制を必要とする。
【００２９】
さらなる一態様では、本発明は、免疫抑制を必要とする患者を治療するための医薬の製造のための、本明細書に記載される細胞の集団の使用に関する。一実施態様では、細胞の集団は、患者にとって自家性である。
【００３０】
さらなる一態様では、本発明は、本明細書に記載される細胞の集団を投与することを含む、免疫抑制を必要とする患者を治療するための方法に関する。一実施態様では、細胞の集団は、患者にとって自家性である。
【００３１】
さらなる一態様では、本発明は、患者の骨髄細胞又はその前駆細胞中のＣＦＬＡＲの細胞レベルを上昇させることを含む、免疫抑制を必要とする患者を治療するための方法に関する。
【００３２】
一実施態様では、ＣＦＬＡＲの細胞レベルを上昇させることが、細胞の免疫抑制活性を増大させる。
【００３３】
一実施態様では、患者の骨髄細胞又はその前駆細胞中のＣＦＬＡＲの細胞レベルを上昇させることは、ＣＦＬＡＲをコードする核酸を投与することを含む。一実施態様では、ＣＦＬＡＲをコードする核酸は、骨髄細胞又はその前駆細胞をトランスフェクトする。一実施態様では、前記トランスフェクションは、安定又は一過性トランスフェクションである。一実施態様では、骨髄細胞又はその前駆細胞は、レンチウイルスベクターといった担体としてウイルス性ベクターを用いてトランスフェクトされる。一実施態様では、前記核酸はＲＮＡである。
【００３４】
一実施態様では、ＣＦＬＡＲはＣＦＬＡＲＬ及び／又はＣＦＬＡＲＳである。
【００３５】
一実施態様では、骨髄細胞又はその前駆細胞は単球である。一実施態様では、骨髄細胞又はその前駆細胞は、ＣＤ１４＋単球である。
【００３６】
一実施態様では、骨髄細胞又はその前駆細胞は幹細胞である。一実施態様では、骨髄細胞又はその前駆細胞は骨髄ＣＤ３４＋細胞である。
【００３７】
さらなる一態様では、本発明は、治療法のための、ＣＦＬＡＲをコードする核酸に関する。一実施態様では、治療法は免疫抑制を必要とする。
【００３８】
さらなる一態様では、本発明は、免疫抑制を必要とする患者を治療するための、ＣＦＬＡＲをコードする核酸に関する。
【００３９】
さらなる一態様では、本発明は、ＣＦＬＡＲをコードする核酸を含む薬学的組成物に関する。
【００４０】
さらなる一態様では、本発明は、治療法のための、本明明細書に記載される薬学的組成物に関する。一実施態様では、治療法は免疫抑制を必要とする。
【００４１】
さらなる一態様では、本発明は、免疫抑制を必要とする患者を治療するための、本明細書に記載される薬学的組成物に関する。
【００４２】
さらなる一態様では、本発明は、治療法のための医薬の製造のための、ＣＦＬＡＲをコードする核酸の使用に関する。一実施態様では、治療法は免疫抑制を必要とする。
【００４３】
さらなる一態様では、本発明は、免疫抑制を必要とする患者を治療するための医薬の製造のための、ＣＦＬＡＲをコードする核酸の使用に関する。
【００４４】
本明細書に記載されるすべての態様の一実施態様では、免疫抑制を必要とする治療法は移植であり、免疫抑制を必要とする患者は移植片のレシピエントである。したがって、本発明は、レシピエントの移植片に対する免疫応答を低減するため、及び／又はレシピエントによる移植片の拒絶を治療若しくは予防するための、移植レシピエントの治療も包含する。異なる実施態様では、移植片は、組織、器官、細胞、核酸、タンパク質、生体適合性格子、及びこれらのいずれかの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、免疫抑制及び耐性を誘導するための本明細書に記載される治療は、移植に先立ってレシピエントに施される。他の態様では、免疫抑制及び耐性を誘導するための本明細書に記載される治療は、移植と同時にレシピエントに施される。また別の態様では、免疫抑制及び耐性を誘導するための本明細書に記載される治療は、移植の一部としてレシピエントに施される。さらに別の態様では、免疫抑制及び耐性を誘導するための本明細書に記載される治療は、移植の後でレシピエントに施される。
【００４５】
本明細書に記載されるすべての態様の一実施態様では、免疫抑制を必要とする治療法は、移植片対宿主病の治療又は予防であり、免疫抑制を必要とする患者は、移植片対宿主病を有するか又は移植片対宿主病を発症する危険がある患者である。
【００４６】
本明細書に記載されるすべての態様の一実施態様では、免疫抑制を必要とする治療法は、自己免疫疾患の治療又は予防であり、免疫抑制を必要とする患者は、自己免疫疾患を有するか又は自己免疫疾患を発症する危険がある患者である。
【００４７】
一態様において、本発明は、本明細書に記載される治療の方法における使用のための、薬剤及び組成物、例えば本明細書に記載される細胞及び薬学的組成物を提供する。
【００４８】
一態様において、本発明は、ＣＦＬＡＲをコードする核酸を含むウイルス性ベクターを提供する。一実施態様では、ウイルス性ベクターはレンチウイルスベクターである。ウイルス性ベクターは、好ましくは、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで骨髄細胞又はその前駆細胞を操作又はトランスフェクトするために有用である。
【００４９】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】ＣＦＬＡＲＬをコードするレンチウイルスを生成するために使用されるプラスミドを含むＣＦＬＡＲ  ｌｏｎｇ（ＣＦＬＡＲＬと呼ぶ）の遺伝子配列（Ａ）と、ＣＦＬＡＲＳをコードするレンチウイルスを生成するために使用されるプラスミドを含むＣＦＬＡＲ  ｓｈｏｒｔ（ＣＦＬＡＲＳと呼ぶ）の遺伝子配列とを示している。
【図２】陰性コントロールとして用いられたルシフェラーゼ発現ＣＤ３４＋細胞と比較した、ＣＦＬＡＲＬ及びＣＦＬＡＲＳを発現して活性化Ｔ細胞を阻害する感染ヒトＣＤ３４＋細胞の免疫抑制アッセイのプロトコールと結果（Ａ）、及び陰性コントロールとして用いられたルシフェラーゼ発現ＣＤ１４＋細胞と比較した、ＣＦＬＡＲＬ及びＣＦＬＡＲＳを発現して活性化Ｔ細胞を阻害する感染ヒトＣＤ１４＋細胞の免疫抑制アッセイのプロトコールと結果（Ｂ）を示している。
【図３】ルシフェラーゼ感染ＣＤ１４＋細胞と比較した、ＣＤ１４＋細胞上でのＣＦＬＡＲ強制発現の媒介による上方制御及び下方制御された遺伝子のヒートマップを示している。ＣＤ１４＋細胞は、健常ドナー（ＨＤ）の四つの異なるバフィーコートから得られた。
【図４−１】ルシフェラーゼ感染ＣＤ１４＋細胞と比較した、ＣＤ１４＋細胞上でのレンチウイルスによる誘導されたＣＦＬＡＲ発現により有意に上方制御された遺伝子のリストである。
【図４−２】ルシフェラーゼ感染ＣＤ１４＋細胞と比較した、ＣＤ１４＋細胞上でのレンチウイルスによる誘導されたＣＦＬＡＲ発現により有意に上方制御された遺伝子のリストである。
【図４−３】ルシフェラーゼ感染ＣＤ１４＋細胞と比較した、ＣＤ１４＋細胞上でのレンチウイルスによる誘導されたＣＦＬＡＲ発現により有意に上方制御された遺伝子のリストである。
【図４−４】ルシフェラーゼ感染ＣＤ１４＋細胞と比較した、ＣＤ１４＋細胞上でのレンチウイルスによる誘導されたＣＦＬＡＲ発現により有意に上方制御された遺伝子のリストである。
【図４−５】ルシフェラーゼ感染ＣＤ１４＋細胞と比較した、ＣＤ１４＋細胞上でのレンチウイルスによる誘導されたＣＦＬＡＲ発現により有意に上方制御された遺伝子のリストである。
【図５】ＣＤ１４＋細胞における強制ＣＦＬＡＲ発現により調節されたいくつかの遺伝子標的のバリデーションを示す：Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲによるＣＦＬＡＲＳ、ＣＦＬＡＲＬ及びＩＤＯ１遺伝子の上方制御（Ａ）；ＥＬＩＳＡアッセイによるＩＬ−１０の生成（Ｂ）；フローサイトメトリーによる表面マーカーＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ８０、ＣＤ１６３、ＣＤ４４、ＣＤ３８及びＣＤ１２４の発現増強。
【図６Ａ−Ｂ】ヒトＰＢＭＣをグラフトされたＧｖＨＤ罹患マウスを治療するためのプロトコール（Ａ）（免疫調節の手法はＣＦＬＡＲ発現単球の反復投与に基づいていた）と、形質導入されていないか又はルシフェラーゼをコードするベクターを形質導入された単球で処置したマウス（コントロールとして使用）と比較した、治療マウスの生存期間を延長するうえでのこの処置の結果（Ｂ）を示している。
【図６Ｃ】病理組織学的スコアによる病理評価（上部パネル）；及び免疫組織化学による組織浸潤性ヒトリンパ球（ｈＣＤ３＋細胞と定義する）の列挙（下部パネル）を示している。
【図７】プロトコールスキームに報告された、ＣＦＬＡＲ又はルシフェラーゼを発現するヒトＣＤ１４＋細胞で処置したＧｖＨＤ罹患マウスの免疫評価（Ａ）：ＣＦＬＡＲ発現細胞で処置したマウスが血液（Ｂ、パネルｉ）、脾臓（Ｂ、パネルｉｉ）及び骨髄（Ｂ、ｉｉｉ）に低頻度の循環ｈＣＤ３＋  Ｔ細胞を提示すること；さらにはＣＦＬＡＲ発現ＣＤ１４＋細胞で処置したＧｖＨＤ罹患マウスが、ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）＋イオノマイシン（１μｇ／ｍｌ）によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの刺激後に、ルシフェラーゼ発現ＣＤ１４＋で処置したＧｖＨＤ罹患マウスと比較して、低頻度のＩＦＮ−γ放出ｈＣＤ８＋  Ｔ細胞を有すること；最後に、ＣＦＬＡＲを発現するＣＤ１４＋細胞を繰り返し注射することにより処置されたマウスが、ルシフェラーゼを発現するＣＤ１４＋細胞で処置されたマウスと比較して、より高量の調節性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ）を示したことを示している。
【図８】コントロールマウスＲｏｓａ２６．ｖＦＬＩＰから単離されたＣＤ１１Ｂ＋  Ｌｙ６Ｇ−  Ｌｙ６Ｃｈｉｇｈ細胞（白）と比較した、Ｒｏｓａ２６．ｖＦＬＩＰ；ＬｙｓＭｃｒｅから単離された、骨髄及び脾臓由来のＣＤ１１Ｂ＋  Ｌｙ６Ｇ−  Ｌｙ６Ｃｈｉｇｈ単球（パネルＡ）及びＣＤ１１Ｂ＋  Ｌｙ６Ｇ＋  Ｌｙ６Ｃｌｏｗ顆粒球（パネルＢ）両方（黒）の免疫抑制アッセイの結果を示している。
【図９】ｃ−ＦＬＡＲは、その抗アポトーシス機能から独立して免疫抑制プログラムを誘導する。ａ）は、ルシフェラーゼ（コントロール）又はｃ−ＦＬＡＲ発現レンチウイルス（４つの異なるバフィーコートから単離された単球）に感染させたＣＤ１４＋細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生存能力の評価である。ｂ）は、ｃ−ＦＬＡＲ強制発現のみが免疫抑制機能を誘導したことを示している。実際、ＢＣＬ−２又はＢＣＬ発現レンチウイルスに感染させた単球は免疫抑制能を示さなかった。これらデータはすべて、ＣＦＬＡＲがアポトーシス保護から独立して免疫抑制機能を駆動することを実証するものであった。
【図１０ａ】単球における強制ｃ−ＦＬＡＲ発現は、ＭＤＳＣ関連分子プログラムを駆動する。ａ）ｃ−ＦＬＡＲ過剰発現試料における４８６のユニークな上方制御遺伝子のＧＯ  ＢＰ  ｔｅｒｍのエンリッチメント。エンリッチメントは、クラスターＰｒｏｆｉｌｅｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ＧＯ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓカテゴリーにおいて実施されたＧＯ過剰提示（ｏｖｅｒ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）試験を用いて決定された。ｐ値はＢＨ手順を用いて補正された。
【図１０ｂ】単球における強制ｃ−ＦＬＡＲ発現は、ＭＤＳＣ関連分子プログラムを駆動する。ｂ）ｃ−ＦＬＡＲ過剰発現試料（図３、４ａ及び４ｂ）中の上方制御された遺伝子のためのシグナル伝達経路のエンリッチメント。差次的に発現された遺伝子が、ＳＡＭを用いて同定された。ｑ値を＜１％に設定することにより、４８６のユニークな遺伝子がｃ−ＦＬＡＲ過剰発現試料中で上方制御された（ｃ−ＦＬＡＲシグネチャー）。エンリッチメントは、ＧＳＥＡの２６７すべてのシグナル伝達経路上でフィッシャーの検定を用いて決定された。ｐ値はＢＨ手順を用いて補正された。ＦＤＲ  ｑ−ｖａｌ、偽発見率ｑ値。
【図１１】ｃ−ＦＬＡＲは、骨髄細胞の標準のＮＦ−κＢ経路を活性化する。ａ）ｃ−ＦＬＡＲ  ＲＮＡをトランスフェクトされたＴＨＰ１細胞は、コントロール（ＧＦＰコード化ＲＮＡをトランスフェクトされたＴＨＰ１細胞）と比較して、免疫抑制機能を獲得した。抑制的活性を、トランスフェクトされたＴＨＰ１細胞との共培養後に収集したＣＤ３＋  Ｔ細胞の絶対数の列挙により測定した。データは、三つの独立した実験の平均±ｓ．ｅ．ｍとして提示されている。ｂ）トランスフェクトされたＴＨＰ１細胞のｐ６５、ｐ５０及びｐ５２の核転座の免疫蛍光共焦点顕微鏡。核をＤＡＰＩで対比染色し、共焦点顕微鏡を用いてスライドを可視化した。すべてのパネルについて、元の画像×８００。ｃ）ｖ−ＦＬＩＰ発現Ｌｙ６Ｃ＋細胞を精製し、スクランブル、ＩＫＫα  及びＩＫＫβ  ｓｉＲＮＡで少なくとも１８時間トランスフェクトした。その後、骨髄細胞を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ標識ＯＴ−Ｉ細胞と共にインキュベートし、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドの存在下で三日間共培養した。抑制的活性を、共培養後に収集したＣＤ８＋  Ｔ細胞の絶対数の列挙により測定した。データは、四つの独立した実験の平均±ｓ．ｅ．ｍとして提示されている。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本発明を以下に詳細に記載するが、本発明は本明細書に記載される特定の方法、プロトコール及び試薬に限定されず、変更可能であることを理解されたい。また、本明細書で用いられる用語は、特定の実施態様を説明することのみを目的としており、本発明の範囲を限定することを意図しておらず、その範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されることを理解されたい。別途定義しない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語はすべて、当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００５２】
以下、本発明の要素について記載する。これら要素は、特定の実施態様を用いて列挙されるが、さらなる実施態様を生み出すためにあらゆる方式及びあらゆる数で組みあわせることが可能であると理解されたい。様々に記載される実施例及び好ましい実施態様は、本発明を、明示的に記載される実施態様のみに限定するものではない。このような記載は、明示的に記載される実施態様を任意の数の開示される及び／又は好ましい要素と組み合わせる実施態様を支持及び包含するものと理解されたい。さらに、本明細書に記載されるすべての要素の任意の順列及び組み合わせは、内容が矛盾していない限り、本明細書の記載により開示されたと考えられるべきである。
【００５３】
好ましくは、本明細書において使用される用語は、”A multilingual glossary of biotechnological terms: （IUPAC Recommendations）”, H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kolbl, Eds., （1995） Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerlandに記載されている通りに定義される。
【００５４】
本発明の実施は、別途指示がない限り、本分野の文献に説明される生化学、細胞生物学、免疫学、及び組み換えＤＮＡ技術  の一般的方法を用いる（参照、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989）。
【００５５】
本明細書及び特許請求の範囲を通して、内容に矛盾のない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語とその文法的変化形は、記述されるメンバー、整数又は工程、或いはメンバー、整数又は工程の群が含まれることを意味するが、他のいずれかのメンバー、整数又は工程、或いはメンバー、整数又は工程の群が排除されることを意味しない。しかし、いくつかの実施態様においては、そのような他のメンバー、整数又は工程、或いはメンバー、整数又は工程の群は除外されてもよく、即ち、主題は、既述されたメンバー、整数又は工程、或いはメンバー、整数又は工程の群を含むことからなる。本発明を説明する文脈で使用される（特に特許請求の範囲において）「一つの」、「その」及び同様の指示語は、本明細書の記載において別途指示がない限り又は明らかに文脈上矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方を意味するものとする。
【００５６】
本明細書における値の範囲の記載は、範囲内に含まれる各個別の値に個々に言及する省略法として機能するのみである。本明細書において別途指示がない限り、各個別の値は、それが本明細書において個々に記載されたのと同様に、本明細書に組み込まれる。
【００５７】
本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書において別途指示がない限り又は明らかに文脈上矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書に含まれるあらゆる及びすべての例又は例示的文言（例えば、「など」）は、単に本発明をよりよく例示することを目的にしているのであって、別途請求される本発明の範囲を限定するものではない。本明細書の文言はいずれも、特許請求されないいずれかの要素が本発明の実施に必須であることを示すものではない。
【００５８】
複数の文献が本明細書の文を通して引用されている。本明細書に引用される文献の各々（すべての特許、特許出願、科学的出版物、製造者の仕様書、指示書など）は、上掲又は後述を問わず、言及したことによりその全体が本明細書に取り込まれる。本明細書のいずれの部分も、本発明が先行発明によってそのような開示に先行する資格がないことを認めたものと解釈されるべきではない。
【００５９】
本発明の文脈における用語「組み換え」は、「遺伝子工学により作製された」ことを意味する。好ましくは、組み換え細胞又は核酸といった「組み換え物」は、本発明の文脈では、天然に存在しない。
【００６０】
本明細書において使用される用語「天然に存在」は、一つの対象物が自然に見いだされうることを意味する。例えば、生物体（ウイルスを含む）中に存在し、自然界のソースから単離することができ、実験室において人により意図的に修飾されたのでないペプチド又は核酸は、天然に存在している。
【００６１】
本明細書において使用される「単離された」細胞は、他の細胞型を本質的に含まない細胞である。単離された細胞は、天然に存在する状態において通常関連付けられる他の細胞型から分離された細胞も指す。いくつかの場合には、単離された細胞の集団は、均質な細胞の集団を指す。他の場合には、この用語は単純に、自然な状態において自然に関連付けられる細胞から分離された細胞を指す。いくつかの実施態様では、細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養される。他の実施態様では、細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養されない。一実施態様では、本明細書に記載される細胞集団は、細胞集団の５０％以上、好ましくは細胞集団の７５％以上、さらに好ましくは細胞集団の８５％又は９０％以上、最も好ましくは細胞集団の９５％以上の所望の細胞を細胞集団に含む。
【００６２】
本明細書において使用される「精製された」細胞は、細胞が得られた組織源由来の細胞形質成分及び／又は夾雑タンパク質といった望ましくない成分を本質的に含まない細胞である。精製された細胞は、望ましくない成分から分離された細胞も指す。
【００６３】
本発明の一実施態様において、骨髄細胞又はその前駆細胞を含む細胞の集団は、骨髄細胞又はその前駆細胞以外の細胞及び／又は望ましくない成分を実質的に含まない細胞の集団を指す。
【００６４】
本明細書において使用される用語「から分離された」又は「分離する」は、第１の物質の集団が第２の物質の集団の近傍から除去されているという特徴を指し、ここで、第１の物質の集団は必ずしも第２の物質を欠いているわけではなく、第２の物質の集団が必ずしも第１の物質の集団を欠いているわけでもない。しかしながら、第２の物質の集団「から分離された」第１の物質の集団が有する第２の物質の含有量は、分離されていない第１の物質と第２の物質の混合物と比較した場合、測定可能なほど低い。
【００６５】
造血血球は、増殖及び分化により多能性の骨髄幹細胞から誘導される。幹細胞は、その細胞表面受容体のレパートリーを特徴とし（例えばＣＤ３４＋）、未分化である。増殖による自己再生及び拡大の繰り返しと、それに続くサイトカイン及び増殖因子に応答した分化とを通して、これら細胞は、成熟した機能性の血球のすべて（単球／マクロファージ、好酸球、好中球、Ｔリンパ球及びＢリンパ球）を生じさせる。
【００６６】
血球の分化において、二つの系統経路、即ち骨髄（単球／マクロファージ、好酸球及び好中球を含む）とリンパ球（Ｔリンパ球及びＢリンパ球を含む）が明らかである。一般的に、骨髄細胞は病原体（例えば細菌及び寄生体）の迅速な殺傷及び除去に関連付けられる機能的役割を果たし、リンパ系細胞は、病原体の記憶及び抗体媒介性の免疫応答の発生に関連付けられる。骨髄細胞は、さらに一過性の機能を果たし、したがって多数生成されて、数カ月又は数年ではなく数日／数週間生存し、また完全に且つ最終的に分化した機能的に特化した、分割せずに細胞周期のＧＯ／ＧＩフェーズに留まる細胞である。骨髄細胞は、その機能を果たした後に、アポトーシスによって死に、食作用によって除去される。対照的に、またそれらの特殊な記憶の役割により、Ｔ及びＢリンパ球は長く生存することができ、また拡大的な増殖及び細胞周期が可能である。
【００６７】
したがって、用語「骨髄細胞」は、骨髄起源の細胞を意味し、骨髄細胞系統に由来する、最終的に分化した非分割（即ち、非増殖）細胞を包含し、好中球又は多形核好中球（ＰＭＮ）、好酸球及び単核貪食細胞を含む。後者の細胞は、血液中にあるときは単球として、組織中に移動したときにはマクロファージとして知られる。最終的分化は、細胞分化の正常な終点であり、通常可逆的でない。
【００６８】
特に好ましい一実施態様において、用語「骨髄細胞」は単球に関する。本明細書において使用される用語「単球」は、血流中を循環する白血球を指す。単球は、循環する末梢血中に見られ、そこで単核細胞集団全体の１０−２０％を占めている。単球は、そのＣＤ１４の表現型の発現を特徴とし、したがって、一般にＣＤ１４＋単球と呼ばれる。それらは、循環する単球として宿主防御において重要な役割を果たし、強力な抗原提示能で組織マクロファージ及び樹状細胞へと分化することができる。単球は、組織中に移動するとマクロファージへと分化する。したがって、本発明において用いられる用語「単球」はマクロファージも指す。
【００６９】
用語「バフィーコート」は、血液の密度勾配遠心分離法の後で大部分の白血球及び血小板を含む抗凝固剤処置した血液試料の画分に関連する。
【００７０】
骨髄細胞の前駆細胞は、造血幹細胞及び骨髄前駆細胞といった造血細胞を含む。特に、骨髄細胞の前駆細胞は、ＣＤ３４＋を発現する細胞（ＣＤ３４＋細胞）を含む。ＣＤ３４を発現する細胞は、通常造血細胞としての臍帯及び骨髄中に見られる。骨髄ＣＤ３４＋細胞は、造血幹細胞及び前駆細胞を含み、様々な血球型のすべてに分化することが知られている。ＣＤ３４＋細胞は、免疫磁気法又は免疫蛍光法を用いて血液試料から単離することができる。
【００７１】
「低減」、「阻害」又は「減少」といった用語は、そのレベルにおいて好ましくは５％以上、１０％以上、２０％以上の、さらに好ましくは５０％以上の、もっとも好ましくは７５％以上の、全体的な減少を引き起こす能力に関する。これら用語には、完全な又は本質的に完全な阻害、即ち、ゼロ又は本質的にゼロへの低減が含まれる。
【００７２】
「上昇」、「増強」、又は「促進」といった用語は、そのレベルにおいて好ましくは５％以上、１０％以上、２０％以上、５０％以上、７５％以上、１００％以上、２００％以上、又は５００％以上の全体的な増加を引き起こす能力に関する。このような用語は、ゼロ又は測定不能若しくは検出不能なレベルからゼロを上回るか又は測定可能若しくは検出可能なレベルへの上昇、増強、又は促進に関連しうる。或いは、このような用語は、上昇、増強、又は促進の前に特定のレベルが存在したこと、及び上昇、増強、又は促進の後で同レベルが高まったことを意味することもある。
【００７３】
本発明によれば、ＣＦＬＡＲといった特定の物質に関して「細胞レベルを上昇させる」という表現は、人工的に細胞レベルを上昇させない／上昇させていない通常の状況、特に細胞における通常の状況と比較して、より高い物質の度合い又は量をもたらす対策に関連している。
【００７４】
用語「免疫応答」は、抗原に対する統合された身体反応を指し、好ましくは細胞性の免疫応答、体液性の免疫応答、又はそれらの両方を指す。本発明によれば、抗原、細胞又は組織といった薬剤に関する、「〜への免疫応答」又は「〜に対する免疫応答」という表現は、薬剤に対する細胞応答などの免疫応答に関する。
【００７５】
用語「細胞免疫応答」、「細胞応答」、「細胞媒介性免疫」又は同様の用語は、抗原の発現及び／又はクラスＩ又はクラスＩＩ  ＭＨＣによる抗原の提示を特徴とする細胞に対する細胞応答を含むことを意図している。細胞応答は、「ヘルパー」又は「キラー」として作用する、Ｔ細胞又はＴリンパ球と呼ばれる細胞に関する。ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋  Ｔ細胞とも呼ばれる）は、免疫応答を調節することにより中心的な役割を果たし、キラー細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞又はＣＴＬとも呼ばれる）は、減少した細胞などの細胞を殺す。
【００７６】
用語「体液性の免疫応答」は、薬剤及び生物体に応答して抗体が生成され、それら抗体が同薬剤及び生物体を最終的に中和及び／又は排除する生存生物体における過程を指す。抗体応答の特異性は、単一の特異性の抗原に結合する膜結合受容体を通してＴ及び／又はＢ細胞により媒介される。適切な抗原の結合及び他の様々な活性化シグナルの受容に続いて、Ｂリンパ球は分割し、それにより記憶Ｂ細胞と抗体分泌形質細胞のクローンが生成され、それらの各々が、その抗原受容体により認識されたものと同一の抗原エピトープを認識する抗体を生成する。記憶Ｂリンパ球は、その後それらの特異的抗原により活性化されるまで休眠状態にとどまる。これらリンパ球は、細胞に基づく記憶と、特異的抗原に再曝露されたときに、その結果として得られる抗体応答のエスカレーションとを提供する。
【００７７】
本明細書において使用される用語「抗体」は、抗原上のエピトープに特異的に結合することのできる免疫グロブリン分子を指す。特に、用語「抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続する少なくとも二つの重（Ｈ）鎖と二つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質を指す。用語「抗体」は、モノクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体及び前述のいずれかの組み合わせを含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。可変領域及び定常領域は、本明細書では、それぞれ可変ドメイン及び定常ドメインとも呼ぶ。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存度の高い領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超変異性の領域へとさらに小分割することができる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端まで、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に並ぶ、三つのＣＤＲと四つのＦＲとを含む。ＶＨのＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３と呼ばれ  ＶＬのＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３と呼ばれる。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、重鎖定常領域（ＣＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を含み、ＣＨは、定常ドメインＣＨ１、ヒンジ領域、並びに定常ドメインＣＨ２及びＣＨ３（アミノ末端からカルボキシ末端までＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３の順に並ぶ）へとさらに小分割されうる。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）及びクラシカルな補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む、宿主組織又は因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介することができる。抗体は、自然発生源に由来する又は組み換えソースに由来する無傷の免疫グロブリンとすることができ、無傷の免疫グロブリンの免疫活性部分とすることができる。抗体は、典型的には免疫グロブリン分子の四量体である。抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）２、並びに単鎖抗体及びヒト化抗体を含む様々な形態で存在しうる。
【００７８】
用語「免疫グロブリン」は、免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質、好ましくは抗原受容体、例えば抗体又はＢ細胞受容体（ＢＣＲ）に関する。免疫グロブリンは、特徴的な免疫グロブリン（Ｉｇ）の折り畳みを有する構造ドメイン、即ち免疫グロブリンドメインを特徴とする。この用語は、膜結合免疫グロブリンと可溶型免疫グロブリンを包含する。膜結合免疫グロブリンは、通常はＢＣＲの一部である表面免疫グロブリン又は膜免疫グロブリンとも呼ばれる。可溶型免疫グロブリンは、概して抗体と呼ばれる。免疫グロブリンは通常、複数の鎖、典型的にはジスルフィド結合を介して結合する二つの同一の重鎖と二つの同一の軽鎖とを含む。これらの鎖は、免疫グロブリンドメイン、例えばＶＬ（可変軽鎖）ドメイン、ＣＬ（定常軽鎖）ドメイン、ＶＨ（可変重鎖）ドメイン、及びＣＨ（定常重鎖）ドメインであるＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４を主に含む。五種類の哺乳動物免疫グロブリン重鎖、即ちα、δ、ε、γ、及びμが存在し、これらは抗体の異なるクラス、即ち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭを説明する。可溶型免疫グロブリンの重鎖とは反対に、膜又は表面免疫グロブリンの重鎖は、それらのカルボキシ末端に膜貫通ドメイン及び短い細胞質ドメインを含む。哺乳動物には、二種類の軽鎖、即ち、ラムダとカッパが存在する。免疫グロブリン鎖は、可変領域と定常領域を含む。定常領域は本質的に、免疫グロブリンの異なるアイソタイプの内部に保存され、可変部は極めて多様であり、抗原認識を説明する。
【００７９】
本発明による「抗原」は、免疫応答を引き出すであろうあらゆる物質及び／又は免疫応答若しくは細胞応答といった免疫機構の対象となるあらゆる物質を網羅する。これには抗原が抗原ペプチドへ処理される状況も含まれ、免疫応答又は免疫機構は、特にＭＨＣ分子の状態で提示される場合、一又は複数の抗原ペプチドを対象とする。特に、「抗原」は、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）に特異的に反応するあらゆる物質、好ましくはペプチド又はタンパク質に関する。本発明によれば、用語「抗原」は、Ｔ細胞のエピトープなどの少なくとも一つのエピトープを含むあらゆる分子を含む。好ましくは、本発明の文脈における抗原は、任意選択的にプロセシングの後で、免疫反応を誘導する分子であり、これは、好ましくは抗原に対して特異的である（抗原を発現する細胞を含む）。本発明の実施態様の場合、抗原は、好ましくはＭＨＣ分子の状態の細胞により提示され、それにより抗原に対する免疫応が生じる。
【００８０】
本明細書において使用される用語「自己抗原」は、哺乳動物に天然である、自己免疫疾患の病理に関与している可能性のある抗原を指す。
【００８１】
用語「免疫原性」は、免疫反応を誘導する抗原の相対的有効性に関する。
【００８２】
用語「免疫賦活性」は、本明細書では、全体的な免疫応答の増大に言及するために使用される。
【００８３】
用語「免疫抑制」は、本明細書では、全体的な免疫応答の低減に言及するために使用される。いくつかの場合には、抗原特異的免疫抑制効果を誘導することが望ましい。
【００８４】
「免疫耐性」、「免疫学的耐性」、又は単純に「耐性」は、免疫応答を引き出す能力を有する物質又は組織に対する免疫系の不応答性の状態を説明する。これは、従来の免疫媒介型の外来抗原排除とは対照的である。耐性を確立する機序は異なるが、結果として得られる効果は同様である。
【００８５】
本発明による「抗原ペプチド」は、好ましくは、抗原の発現により、好ましくは抗原の提示により特徴付けられる抗原又は細胞に対する免疫応答、好ましくは細胞応答を刺激することのできる抗原の部分又は断片に関する。好ましくは、抗原ペプチドは、クラスＩ  ＭＨＣを有する抗原の提示を特徴とする細胞に対する細胞応答を刺激することができ、好ましくは抗原応答性細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を刺激することができる。好ましくは、抗原ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ及び／又はクラスＩＩに提示されるペプチドである。好ましくは、抗原ペプチドは、抗原の断片のアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列を含む。好ましくは、抗原の前記断片は、ＭＨＣクラスＩ及び／又はクラスＩＩに提示されるペプチドである。
【００８６】
ＭＨＣ分子、特にクラスＩ  ＭＨＣ分子に結合するために適したペプチドは、好ましくは７〜２０個のアミノ酸長、さらに好ましくは７〜１２個のアミノ酸長、さらに好ましくは８〜１１個のアミノ酸長、特に９又は１０個のアミノ酸長である。
【００８７】
一実施態様では、抗原ペプチドは、抗原提示細胞のＭＨＣといったＭＨＣの状態において提示されるとき、Ｔ細胞受容体によって認識される。抗原ペプチドは、Ｔ細胞受容体によって認識される場合、適切な共刺激シグナルの存在下において、抗原ペプチドを特異的に認識するＴ細胞受容体を担持するＴ細胞のクローンの拡大を誘導することができる。好ましくは、抗原ペプチドは、特にＭＨＣ分子の状態において提示される場合、それらが得られた抗原、又は抗原の発現を特徴とする細胞、好ましくは抗原の提示を特徴とする細胞に対する免疫応答、好ましくは細胞応答を刺激することができる。
【００８８】
用語「エピトープ」は、抗原などの分子中の抗原決定基、即ち免疫系によって認識される分子の一部又は断片を指し、例えば、特にＭＨＣ分子の状態で提示されたとき、Ｔ細胞によって認識される分子の一部又は断片を指す。タンパク質のエピトープは、好ましくは、前記タンパク質の連続の又は不連続の部分を含み、好ましくは５から１００個、好ましくは５から５０個、さらに好ましくは８から３０個、最も好ましくは１０から２５個のアミノ酸長であり、例えば、エピトープは、好ましくは９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５個のアミノ酸長である。本発明の文脈では、エピトープはＴ細胞エピトープであることが特に好ましい。
【００８９】
「エピトープ」、「Ｔ細胞エピトープ」、「抗原の断片」、「免疫原性ペプチド」及び「抗原ペプチド」といった用語は、本明細書では交換可能に使用され、好ましくは抗原又は抗原を発現するか若しくは含む、好ましくは提示する細胞に対する免疫応答誘発能を有することが好ましい、抗原の不完全な表現に関する。好ましくは、この用語は、抗原の免疫原性部分に関する。好ましくは、特にＭＨＣ分子の状態で提示される場合にＴ細胞受容体によって認識される（即ち、特異的に結合される）のは、抗原の一部分である。特定の好ましい免疫原性部分は、ＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩの分子に結合する。
【００９０】
用語「標的」は、薬剤、例えば細胞免疫応答といった免疫応答の標的である細胞又は組織を意味するものとする。標的には、抗原又は抗原エピトープ、即ち、抗原に由来するペプチド断片を提示する細胞が含まれる。一実施態様では、標的細胞は、抗原を発現する、好ましくはクラスＩ  ＭＨＣを有する前記抗原を提示する細胞である。
【００９１】
用語「部分」は画分を指す。アミノ酸配列又はタンパク質といった特定の構造に関して、その「部分」という表現は、前記構造の連続の又は不連続の画分を意味しうる。
【００９２】
用語「一部」及び「断片」は、本明細書では交換可能に使用され、連続する要素を指す。例えば、アミノ酸配列又はタンパク質といった構造の一部は、前記構造の連続する要素を指す。
【００９３】
「抗原プロセシング」は、抗原が、前記抗原の断片であるプロセッション産物に分解されること（例えば、タンパク質のペプチドへの分解）、及びこれら断片のうちの一又は複数がＭＨＣ分子と会合し（例えば、結合を介して）、細胞により提示されること、好ましくは抗原提示細胞により特定のＴ細胞へと提示されることを指す。
【００９４】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、その表面上に主要組織適合抗原系（ＭＨＣ）の状態の抗原を表示する細胞である。Ｔ細胞は、そのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を用いてこの系を認識することができる。抗原提示細胞は、抗原を処理してそれらをＴ細胞に提示する。抗原提示細胞には、限定されないが、単球／マクロファージ、Ｂ細胞及び樹状細胞（ＤＣ）が含まれる。
【００９５】
非プロフェッショナル抗原提示細胞は、ナイーブＴ細胞との相互作用に必要なＭＨＣクラスＩＩタンパク質を恒常的には発現しない；これらは非プロフェッショナル抗原提示細胞のＩＦＮγといった特定のサイトカインによる刺激時にのみ発現される。
【００９６】
プロフェッショナル抗原提示細胞は、食作用により又は受容体媒介性のエンドサイトーシスにより抗原を内部移行させ、次いでクラスＩＩ  ＭＨＣ分子に結合した抗原の断片をその膜上に表示するうえで極めて効率的である。Ｔ細胞は、抗原提示細胞の膜上の抗原−クラスＩＩ  ＭＨＣ分子複合体を認識してそれと相互作用する。次いでさらなる共刺激シグナルが抗原提示細胞によって生成され、Ｔ細胞の活性化をもたらす。共刺激分子の発現は、プロフェッショナル抗原提示細胞を決定付ける特徴である。
【００９７】
プロフェッショナル抗原提示細胞の主な種類は、最も広い範囲の抗原提示を有し、おそらくは最も重要な抗原提示細胞である樹状細胞と、マクロファージ、Ｂ細胞、及び特定の活性上皮細胞である。
【００９８】
樹状細胞（ＤＣ）は、ＭＨＣクラスＩＩ及びＩ抗原提示経路の両方を介して、末梢組織に捕獲された抗原をＴ細胞に提示する白血球の集団である。樹状細胞が免疫応答の強力な誘導因子であることは周知であり、これら細胞の活性化は、免疫の誘導に決定的な工程である。
【００９９】
樹状細胞は、簡便には、「未成熟」及び「成熟」細胞に分類され、特徴付けの済んだ二つの表現型を区別する単純な方法として使用することができる。しかしながら、このような分類法は、分化の可能なすべての中間体段階を除外すると解釈されてはならない。
【０１００】
未成熟樹状細胞は、Ｆｃγ受容体及びマンノース受容体の高発現と相関する、高い抗原取り込み及びプロセシング能を有する抗原提示細胞として特徴付けられる。成熟表現型は、典型的には、これらマーカーのより低い発現と、逆に、Ｔ細胞活性化を担う細胞表面分子、例えばクラスＩ及びクラスＩＩ  ＭＨＣ、接着分子（例えばＣＤ５４及びＣＤ１１）並びに共刺激分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６及び４−１  ＢＢ）の高い発現を特徴とする。
【０１０１】
樹状細胞の成熟は、そのような抗原提示樹状細胞によってＴ細胞のプライミングがもたらされる樹状細胞活性化の状態とされ、一方で未成熟樹状細胞による提示は耐性を生じる。樹状細胞の成熟は、主に、生得的受容体（バクテリアＤＮＡ、ウイルス性ＲＮＡ、エンドトキシンなど）、炎症誘発サイトカイン（ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＦＮ）、ＣＤ４０Ｌによる樹状細胞表面上のＣＤ４０のライゲーション、及びストレスの多い細胞死を起こしている細胞から放出される物質によって検出される微生物の特徴を有する生体分子によって引き起こされる。樹状細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び腫瘍壊死因子アルファといったサイトカインを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで骨髄細胞を培養することにより得ることができる。
【０１０２】
用語「免疫反応性細胞」又は「エフェクター細胞」は、本発明の文脈では、免疫反応の間にエフェクター機能を発揮する細胞に関する。「免疫反応性細胞」は、好ましくは、抗原、或いは抗原又は抗原に由来する抗原ペプチドの発現及び／又は提示を特徴とする細胞に結合することができ、且つ免疫応答を媒介することができる。例えば、このような細胞は、サイトカイン及び／又はケモカインを分泌し、微生物を殺し、抗体を分泌し、感染した細胞又はがん性細胞を認識し、任意選択的にこのような細胞を排除する。例えば、免疫反応性細胞は、Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、腫瘍浸潤Ｔ細胞）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、マクロファージ、及び樹状細胞を含む。好ましくは、本発明の文脈では，「免疫反応性細胞」は、Ｔ細胞、好ましくはＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋  Ｔ細胞である。
【０１０３】
好ましくは，「免疫反応性細胞」は、特に抗原提示細胞の表面上といったＭＨＣ分子又は腫瘍細胞などの罹患細胞の状態で提示される場合、ある程度の特異性を有する抗原又は抗原に由来する抗原ペプチドを認識する。好ましくは、前記認識は、抗原又は前記抗原に由来する抗原ペプチドを認識する細胞を、応答性又は反応性にさせることができる。細胞がＭＨＣクラスＩＩ分子の状態の抗原又は抗原に由来する抗原ペプチドを認識する受容体を担持するヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋  Ｔ細胞）である場合、そのような応答性又は反応性には、サイトカインの放出及び／又はＣＤ８＋リンパ球（ＣＴＬ）及び／又はＢ細胞の活性化が含まれうる。細胞がＣＴＬである場合、そのような応答性又は反応性には、ＭＨＣクラスＩ分子の状態で提示される細胞、即ち、クラスＩ  ＭＨＣを有する抗原の提示を特徴とする細胞の、例えばアポトーシス又はパーフォリン媒介性細胞分解を介した排除が含まれうる。本発明によれば、ＣＴＬ応答性には、持続性のカルシウム流、細胞分裂、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αといったサイトカインの生成、ＣＤ４４及びＣＤ６９といった活性化マーカーの上方制御、及び抗原発現標的細胞の特異的細胞溶解性殺傷が含まれうる。ＣＴＬ応答性はまた、ＣＴＬ応答性を正確に示す人工的レポーターを用いて決定することができる。抗原又は抗原に由来する抗原ペプチドを認識し、応答性又は反応性であるこのようなＣＴＬは、本明細書では「抗原応答性ＣＴＬ」とも呼ぶ。細胞がＢ細胞である場合、このような応答性には、免疫グロブリンの放出が含まれうる。
【０１０４】
用語「Ｔ細胞」又は「Ｔリンパ球」は、様々な細胞媒介性免疫反応に参画する胸腺由来の細胞に関し、細胞溶解性Ｔ細胞を含む細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋  Ｔ細胞）及びＴヘルパー細胞（ＣＤ４＋  Ｔ細胞）を含む。
【０１０５】
Ｔ細胞は、リンパ球として知られる白血球のグループに属し、細胞媒介性の免疫に中心的な役割を果たす。それらは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と呼ばれるそれらの細胞表面上における特定の受容体に存在により、Ｂ細胞及びナチュラルキラー細胞といった他のリンパ球の種類から区別することができる。胸腺は、Ｔ細胞の成熟を担う主要な器官である。それぞれ異なる機能を有するＴ細胞の複数の異なるサブセットが発見されている。
【０１０６】
Ｔヘルパー細胞は、他の機能の中でも、Ｂ細胞の形質細胞への成熟及び細胞傷害性Ｔ細胞及びマクロファージの活性化を含む免疫学的プロセスにおいて他の白血球を助ける。これら細胞は、表面上にＣＤ４タンパク質を発現するため、ＣＤ４＋  Ｔ細胞としても知られている。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上に発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子によりペプチド抗原を伴って提示されるとき、活性化する。活性化すると、ヘルパーＴ細胞は、急速に分割し、活性な免疫応答を調節又は補助するサイトカインと呼ばれる小タンパク質を分泌する。
【０１０７】
細胞傷害性Ｔ細胞は、感染細胞及び腫瘍細胞をウイルスにより破壊し、また、移植片拒絶反応に関与する。これら細胞は、表面にＣＤ８糖タンパク質発現するため、ＣＤ８＋  Ｔ細胞としても知られている。これら細胞は、身体のほぼすべての細胞の表面上に存在するＭＨＣクラスＩに関連付けられる抗原に結合することにより、それらの標的を認識する。
【０１０８】
大部分のＴ細胞は、複数のタンパク質の複合体として存在しているＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有する。実際のＴ細胞受容体は、独立したＴ細胞受容体アルファ及びベータ（ＴＣＲα及びＴＣＲβ）遺伝子から生成され、α−及びβ−ＴＣＲ鎖と呼ばれる二つの別個のペプチド鎖を含む。γδＴ細胞（ガンマデルタＴ細胞）は、表面上に異なるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞の小サブセットを表す。しかしながら、γδＴ細胞では、ＴＣＲは、一つのγ鎖と一つのδ鎖から作製される。Ｔ細胞のこのグループは、αβＴ細胞よりずっと少ない（全Ｔ細胞の２％）。
【０１０９】
Ｔ細胞受容体の構造は、抗体アームの軽鎖と重鎖の組み合わせとして定義される領域である、免疫グロブリンＦａｂ断片に極めて類似している。ＴＣＲの各鎖は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、一つのＮ末端免疫グロブリン（Ｉｇ）−可変（Ｖ）ドメイン、一つのＩｇ定常（Ｃ）ドメイン、膜貫通／細胞膜貫通領域、及びＣ末端の短い細胞質尾部を有する。ＴＣＲ  α鎖及びβ鎖両方の可変ドメインは、三つの超可変又は相補性決定領域（ＣＤＲ）を有し、β鎖の可変領域は、通常は抗原と接触せず、したがってＣＤＲとは考慮されない超可変性の追加エリア（ＨＶ４）を有する。ＣＤＲ３は、処理済みの抗原の認識を担う主なＣＤＲであるが、α鎖のＣＤＲ１が抗原性ペプチドのＮ末端部と相互作用することも示されており、β鎖のＣＤＲ１は、ペプチドのＣ末端部分と相互作用する。ＣＤＲ２は、ＭＨＣを認識すると考えられる。β鎖のＣＤＲ４は、抗原認識に参画するとは考えられていないが、スーパー抗原と相互作用することが示されている。ＴＣＲドメインの定常ドメインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成し、二つの鎖の間にリンクを形成する、短い接続配列からなる。
【０１１０】
用語「末梢血単核細胞」又は「ＰＢＭＣ」は、球状の核を有する末梢血細胞に関する。これら細胞は、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）及び単球からなり、一方赤血球及び血小板は核を有さず、顆粒球（好中球、好塩基球、及び好酸球）は分葉核を有する。これら細胞は、血液を、最上層の血漿と、続くＰＢＭＣの層と、最下層の多形核細胞の画分（例えば好中球及び好酸球）及び赤血球に分離するフィコール及び勾配遠心分離を用いて全血から抽出することができる。
【０１１１】
用語「主要組織適合抗原系」及びその略語である「ＭＨＣ」は、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ分子を含み、すべての脊椎動物に生じる遺伝子の複合体に関する。ＭＨＣタンパク質又は分子は、免疫反応におけるリンパ球と抗原提示細胞又は罹患細胞の間のシグナル伝達に重要であり、ＭＨＣタンパク質又は分子はペプチドに結合してＴ細胞受容体による認識のためにそれらを提示する。ＭＨＣによってコードされるタンパク質は、細胞の表面上に発現され、自己抗原（細胞自体に由来するペプチド断片）及び非自己抗原（例えば、侵入微生物の断片）の両方をＴ細胞に対して表示する。
【０１１２】
ＭＨＣ領域は、三つのサブグループ、即ちクラスＩ、クラスＩＩ、及びクラスＩＩＩに分割される。ＭＨＣクラスＩタンパク質は、α鎖及びβ２ミクログロブリン（染色体１５によってコードされるＭＨＣの部分ではない）を含む。このタンパク質は、細胞傷害性Ｔ細胞に抗原断片を提示する。大部分の免疫系細胞、特に抗原提示細胞において、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質はα及びβ鎖を含み、それらは抗原断片を  Ｔヘルパー細胞を提示する。ＭＨＣクラスＩＩＩ領域は、補体成分及びサイトカインをコードするものといった他の免疫成分をコードする。
【０１１３】
ヒトにおいて、細胞表面上で抗原提示タンパク質をコードするＭＨＣ領域内の遺伝子は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子と呼ばれる。しかしながら、略称であるＭＨＣが、しばしばＨＬＡ遺伝子産物を指すために使用される。ＨＬＡ遺伝子には、九つのいわゆる古典的ＭＨＣ遺伝子：ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＡ、及びＨＬＡ−ＤＲＢ１が含まれる。
【０１１４】
本発明のすべての態様の一つの好ましい実施態様では、ＭＨＣ分子はＨＬＡ分子である。
【０１１５】
用語「免疫エフェクター機能」又は「エフェクター機能」は、本発明の文脈では、例えば細胞の殺傷をもたらす、免疫系の成分によって媒介されるあらゆる機能を含む。好ましくは、本発明の文脈における免疫エフェクター機能は、Ｔ細胞媒介性のエフェクター機能である。このような機能は、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋  Ｔ細胞）の場合、ＭＨＣクラスＩＩ分子の状態の抗原又は抗原に由来する抗原ペプチドの、Ｔ細胞受容体による認識、サイトカインの放出及び／又はＣＤ８＋リンパ球（ＣＴＬ）及び／又はＢ細胞の活性化を、ＣＴＬの場合、ＭＨＣクラスＩ分子の状態の抗原又は抗原に由来する抗原ペプチドの、Ｔ細胞受容体による認識、ＭＨＣクラスＩ分子の状態で提示される細胞、即ち、クラスＩ  ＭＨＣを有する抗原の提示を特徴とする細胞の、例えばアポトーシス又はパーフォリン媒介性細胞分解を介した排除、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αといったサイトカインの生成、並びに抗原発現標的細胞の特異的細胞溶解性殺傷を含む。
【０１１６】
「核酸」は、本発明によれば、好ましくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）、さらに好ましくはＲＮＡ、最も好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ  ＲＮＡ）又は合成ＲＮＡである。核酸は、本発明によれば、ゲノムのＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組み換えにより生成された分子及び化学的に合成された分子を含む。本発明によれば、核酸は、一本鎖又は二本鎖で、線形又は共有結合的に円形に閉じた分子として存在しうる。核酸は、本発明により単離することができる。用語「単離された核酸」は、本発明によれば、核酸が、（ｉ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して増幅された，（ｉｉ）クローニングによる組み換えにより生成された，（ｉｉｉ）例えばゲル電気泳動による切断及び分離により生成された、又は（ｉｖ）例えば化学合成により合成されたことを意味する。核は、例えば、ＤＮＡ鋳型からのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写により調製することのできるＲＮＡの形態で、細胞への導入、即ち細胞のトランスフェクションに用いることができる。ＲＮＡは、さらに、配列の安定化、キャップ形成、及びポリアデニル化により適用前に修飾することができる。
【０１１７】
本明細書に記載される核酸は、核酸を細胞の内部へ送達するために使用することのできるベクターに含まれうる。本明細書において使用される用語「ベクター」は、当業者に既知のあらゆるベクターを含み、これには、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、例えばラムダファージ、ウイルス性ベクター、例えばアデノウイルス性又はバキュロウイルス性ベクター、レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクター、トランスポゾン又は人工染色体ベクター、例えばバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、又はＰ１人工染色体（ＰＡＣ）が含まれる。前記ベクターには、発現ベクター並びにクローニングベクターが含まれる。発現ベクターは、プラスミドとウイルス性ベクターを含み、一般的に、特定の宿主生物（例えば、バクテリア、酵母、植物、昆虫、又は哺乳動物）において、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系において、作用可能に連結された  コード配列の発現に必要な所望のコード配列及び適切なＤＮＡ配列を含む。クローニングベクターは、通常特定の所望のＤＮＡ断片を操作及び増幅するために使用され、所望のＤＮＡ断片の発現に必要な機能的配列を欠いていてよい。
【０１１８】
本明細書に記載される免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞は、ＣＦＬＡＲの発現の増加をもたらすベクターを用いて細胞をトランスフェクト又は形質導入することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで発生させることができる。当業者に周知の様々な方法のいずれかを用いて、細胞をトランスフェクト又は形質導入することができる。
【０１１９】
ＣＦＬＡＲをコードする核酸は、複数の種類のベクターへとクローニングすることができる。しかしながら、本発明は、いずれかの特定のベクターに限定されるものではない。むしろ、本発明は、入手が容易で当技術分野で周知の多種多様なベクターを包含するものである。特定の実施態様では、ベクターは、ウイルス性ベクター、細菌性ベクター、及び哺乳動物細胞ベクターからなる群より選択される。多くのこのような系は、商業的に広く入手可能である。
【０１２０】
ベクターは、ウイルス性ベクターの形態で細胞に提供されてもよい。ウイルス性ベクター技術は当技術分野で周知である。ベクターとして有用なウイルスには、限定されないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが含まれる。好ましくは、ウイルスは、ヘルパー依存性アデノウイルス（ＨＤ−Ａｄ）である。一般に、適切なベクターは、少なくとも一つの生物体、プロモーター配列、簡便な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び一又は複数の選択マーカーに機能的な複製開始点をふくむ。
【０１２１】
分子生物学の当業者には、通常、タンパク質発現のための、プロモーター、エンハンサー、及び細胞型の組み合わせの使用法は既知である。用いられるプロモーターは、ＣＦＬＡＲをコードする導入された核酸セグメントの高レベルの発現を導くために適切な条件下において、構成的、組織特異的、誘導性、及び／又は有用なものとすることができる。プロモーターは、異種又は内因性とすることができる。本発明により用いられる構成的プロモーター配列には、限定されないが、即効性早期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）早期プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス即効性早期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、並びにヒト遺伝子プロモーター、例えば、限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及び筋クレアチンプロモーターが含まれる。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されない。誘導性プロモーターはまた、本発明の一部と考慮される。本発明における誘導性プロモーターの使用は、このような発現が望ましいときには作用可能に結合されるか、又は発現が望ましくない時には発現をオフにする、ポリヌクレオチド配列の発現をオンにすることのできる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例には、限定されないが、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリンプロモーターが含まれる。さらに、本発明には、組織特異性のプロモーターの使用が含まれ、このプロモーターは所望の組織においてのみ活性である。組織特異性のプロモーターは当技術分野で周知であり、それには、限定されないが、ＨＥＲ−２プロモーター及びＰＳＡ関連プロモーター配列が含まれる。
【０１２２】
ＣＦＬＡＲの発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターはまた、ウイルス性ベクターを通して感染又はトランスフェクトさせようとする細胞の集団からの発現細胞の同定及び選択を容易にする、選択マーカー遺伝子又はレポーター遺伝子又はこれらの両方を含むことができる。他の実施態様では、選択マーカーをＤＮＡの別個の一片に担持させ、共トランスフェクション手順に使用することができる。選択マーカー及びレポーター遺伝子の両方に、適切な調節配列を隣接させて、宿主細胞における発現を可能にすることができる。有用な選択マーカーが当技術分野で既知であり、それには、例えば抗生物質耐性遺伝子、例えばネオなどが含まれる。レポーター遺伝子は、潜在的トランスフェクト細胞を同定するため、及び調節配列の機能性を評価するために使用される。アッセイが容易なタンパク質をコードするレポーター遺伝子が当技術分野で周知である。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物体又は組織に存在しないかレシピエント生物体又は組織によって発現されず、何らかの容易に検出可能な特性、例えば酵素活性によってその発現が顕在化するタンパク質をコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、核酸がレシピエント細胞中に導入された後の適切な時にアッセイされる。適切なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、又は緑色蛍光性タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を含みうる。
【０１２３】
ベクターは、当技術分野のいずれかの方法により宿主細胞に容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的又は生物学的手段により宿主細胞に移入することができる。核酸を宿主細胞に導入するための物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが含まれる。ベクター及び／又は外来性核酸を含む細胞を生成するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Sambrook et al. （2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York）, and in Ausubel et al. （1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York）参照。
【０１２４】
対象の核酸を宿主細胞に導入するための生物学的方法には、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用が含まれる。ウイルス性ベクター、特にレトロウイルス性ベクターは、遺伝子を哺乳動物、例えばヒト細胞に挿入するために最も広く使用される方法となった。他のウイルス性ベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスなどから誘導することができる。
【０１２５】
核酸を宿主細胞中に導入するための化学的手段には、コロイド分散系、例えば巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、並びに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質に基づく系が含まれる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいて送達ビヒクルとして使用するために好ましいコロイド系はリポソーム（即ち、人工膜小胞）である。このような系の調製及び使用は、当技術分野で周知である。
【０１２６】
宿主細胞中のＣＦＬＡＲ又はそのコード化核酸の存在及び／又は量を確実にするために、外来性核酸を宿主細胞中に導入するため又はそれ以外の方法で細胞中のＣＦＬＡＲの細胞レベルを上昇させるために使用される方法のいかんに関わらず、様々なアッセイを実施することができる。このようなアッセイには、例えば、サザン及びノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ及びＰＣＲ、並びに特定のペプチドの存在又は非存在を検出するためのアッセイ、例えば、免疫学的手段によるもの（ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット）が含まれる。
【０１２７】
本発明の文脈では、用語「ＤＮＡ」は、デオキシリボヌクレオチド残基を含み、好ましくは全体に又は実質的にデオキシリボヌクレオチド残基から構成される分子に関する。「デオキシリボヌクレオチド」は、β−Ｄ−リボフラノシル基の２’位にヒドロキシル基を欠くヌクレオチドに関する。用語「ＤＮＡ」は、単離されたＤＮＡ、例えば部分的に又は完全に精製されたＤＮＡ、本質的に純粋なＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及び組み換えにより生成されたＤＮＡを含み、一又は複数のヌクレオチドの追加、欠失、置換及び／又は変更により天然に存在するＤＮＡとは異なる修飾されたＤＮＡを含む。このような変更には、ＤＮＡの末端（複数可）への又は内部的な、例えばＤＮＡの一又は複数のヌクレオチドへの、非ヌクレオチド物質の追加が含まれうる。ＤＮＡ分子中のヌクレオチドは、非標準的なヌクレオチド、例えば非天然ヌクレオチド又は化学的に合成されたヌクレオチドも含むことができる。これら変更ＤＮＡは、アナログ又は天然に発生するＤＮＡのアナログと呼ぶことができる。
【０１２８】
本発明の文脈では、用語「ＲＮＡ」は、リボヌクレオチド残基を含み、好ましくは全体に又は実質的にリボヌクレオチド残基から構成される分子に関する。「リボヌクレオチド」は、β−Ｄ−リボフラノシル基の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドに関する。この用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離されたＲＮＡ、例えば部分的に又は完全に精製されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組み換えにより生成されたＲＮＡ、並びに一又は複数のヌクレオチドの追加、欠失、置換及び／又は変更により天然に存在するＲＮＡとは異なる修飾されたＲＮＡを含む。このような変更には、ＲＮＡの末端（複数可）への又は内部的な、例えばＲＮＡの一又は複数のヌクレオチドにおける、非ヌクレオチド物質の追加が含まれうる。ＲＮＡ分子中のヌクレオチドは、非標準的なヌクレオチド、例えば非天然ヌクレオチド又は化学的に合成されたヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチドも含むことができる。これら変更ＲＮＡは、アナログ又は天然に発生するＲＮＡのアナログと呼ぶことができる。本発明によれば、用語「ＲＮＡ」は、「メッセンジャーＲＮＡ」を意味する「ｍＲＮＡ」を含み、且つ好ましくはこれに関連し、鋳型としてＤＮＡを用いて生成されうる転写物に関し、且つペプチド又はタンパク質をコードする。ｍＲＮＡは、典型的には  ５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）、タンパク質又はペプチドコード化領域及び３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）を含む。ｍＲＮＡは、細胞中において及びｉｎ  ｖｉｔｒｏで限定された半減期を有する。好ましくは、ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写により生成される。本発明の一実施態様において、ＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写又は化学合成により得られる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写方法は、当業者に既知である。例えば、様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写キットが市販されている。
【０１２９】
本発明によれば、ＲＮＡの安定性及び翻訳効率は、必要に応じて修飾されうる。例えば、安定化効果を有する及び／又はＲＮＡの翻訳効率を上昇させる一又は複数の修飾により、ＲＮＡが安定化し、その翻訳が増大しうる。本発明により用いられるＲＮＡの発現を増大させるために、コード化領域の内部、即ち、発現されるペプチド又はタンパク質をコードする配列内で、好ましくは発現されるペプチド又はタンパク質の配列を変更することなく、ｍＲＮＡの安定性を上昇させ、コドン最適化を実施し、よって細胞内の翻訳を増強するために、ＲＮＡは、ＧＣ含有量が増加するように修飾されてよい。
【０１３０】
本発明に用いられるＲＮＡの文脈において用語「修飾」は、ＲＮＡの、前記ＲＮＡには天然に存在しないあらゆる修飾を含む。
【０１３１】
本発明の一実施態様において、本発明により使用されるＲＮＡは、キャッピングされていない５’−トリホスフェートを有さない。このようなキャッピングされていない５’−トリホスフェートの除去は、ＲＮＡをホスファターゼで処置することにより達成することができる。
【０１３２】
本発明によるＲＮＡは、その安定性を上昇させるため及び／又は細胞傷害性を低下させるために、修飾されたリボヌクレオチドを有することができる。例えば、一実施態様では、本発明により使用されるＲＮＡでは、５−メチルシチジンで、部分的に又は完全に、好ましくは完全に、シチジンを置換される。代替的に又は追加的に、一実施態様では、本発明により使用されるＲＮＡでは、プソイドウリジンで、部分的に又は完全に、好ましくは完全に、ウリジンを置換される。
【０１３３】
一実施態様では、用語「修飾」は、ＲＮＡに５’−ｃａｐ又は５’−ｃａｐアナログを提供することに関する。用語「５’−ｃａｐ」は、ｍＲＮＡ分子の５’末端に見られるキャップ構造を指し、一般に、異常な５’から５’トリホスフェート結合を介してｍＲＮＡに接続するグアノシンヌクレオチドからなる。一実施態様では、このようなグアノシンは７位でメチル化している。用語「一般的な５’−ｃａｐ」は、天然に存在するＲＮＡ５’−ｃａｐ、好ましくは７−メチルグアノシンキャップ（ｍ７Ｇ）を指す。本発明の文脈では、用語「５’−ｃａｐ」は、ＲＮＡキャップ構造に似ており、好ましくはｉｎ  ｖｉｖｏ及び／又は細胞中において、付着するとＲＮＡを安定させ及び／又はＲＮＡの翻訳を増強する能力を有するように修飾される５’−ｃａｐアナログを含む。
【０１３４】
ＲＮＡは、さらなる修飾を含むことができる。例えば、本発明に用いられるＲＮＡのさらなる修飾は、天然に存在するポリ（Ａ）末端の延長若しくはトランケーション、又は５’−若しくは３’−非翻訳領域（ＵＴＲ）の変更、例えば前記ＲＮＡのコード化領域に関連しないＵＴＲの導入、例えば、既存の３’−ＵＴＲの、アルファ２−グロビン、アルファ１−グロビン、ベータ−グロビン、好ましくはベータ−グロビン、さらに好ましくはヒトベータ−グロビンといったグロビン遺伝子から得られた３’−ＵＴＲの一又は複数の、好ましくは二つのコピーによる交換又はそのようなコピーの挿入である。
【０１３５】
マスクされていないポリＡ配列を有するＲＮＡは、マスクされたポリＡ配列を有するＲＮＡより効率的に翻訳される。用語「ポリ（Ａ）末端」又は「ポリＡ配列」は、典型的にはＲＮＡ分子の３’末端に位置するアデニル（Ａ）残基の配列に関し、「マスクされていないポリＡ配列」は、ＲＮＡ分子の３’末端のポリＡ配列がポリＡ配列のＡで終端し、ポリＡ配列の３’末端、即ち下流に位置するＡ以外に、ヌクレオチドが続かないことを意味している。さらに、約１２０塩基対の長いポリＡ配列は、ＲＮＡの最適な転写物安定性及び翻訳効率をもたらす。
【０１３６】
したがって、本発明により用いられるＲＮＡの安定性及び／又は発現を上昇／増大させるために、ＲＮＡは、好ましくは１０から５００個、さらに好ましくは３０から３００個、それよりもさらに好ましくは６５から２００個、特に１００から１５０個のアデノシン残基の長さを有するポリＡ配列と共に存在するように修飾することができる。特に好ましい実施態様では、ポリＡ配列は、約１２０個のアデノシン残基の長さを有する。本発明により使用されるＲＮＡの安定性及び／又は発現をさらに上昇／増大させるために、ポリＡ配列はマスクしないでおくことができる。
【０１３７】
ＲＮＡの「安定性」という用語は、ＲＮＡの「半減期」に関する。「半減期」は、分子の活性、量、又は数の半分を排除するために必要な期間に関する。本発明の文脈では、ＲＮＡの半減期は前記ＲＮＡの安定性を示す。ＲＮＡの半減期は、ＲＮＡの「発現の期間」に影響しうる。長い半減期を有するＲＮＡが長期間にわたって発現されるであろうと予想することができる。
【０１３８】
言うまでもなく、本発明により、ＲＮＡの安定性及び／又は翻訳効率の低下が望ましい場合、ＲＮＡの安定性及び／又は翻訳効率を上昇させる上述の要素の機能を妨害するように、ＲＮＡを修飾することができる。
【０１３９】
「コードする」とは、ヌクレオチドの定義済み配列又はアミノ酸の定義済み配列を有する生物学的過程において他のポリマー及び巨大分子の合成のためのテンプレートとして機能する、核酸中のヌクレオチドの特定の配列に固有の特性に言及する。したがって、核酸は、核酸の発現（翻訳及び任意選択的に転写）が細胞中のタンパク質又は他の生体系を生成する場合、タンパク質をコードする。
【０１４０】
用語「発現」は、本発明によれば、その最も一般的な意味で使用され、ＲＮＡ及び／又はペプチド又はポリペプチドの、例えば転写及び／又は翻訳による生成を含む。ＲＮＡに関して、用語「発現」又は「翻訳」は、特にペプチド又はポリペプチドの生成に関する。この用語は核酸の部分的発現も含む。さらに、発現は、一過性又は安定性でありうる。
【０１４１】
本発明の文脈では、用語「転写」は、ＤＮＡ配列中の遺伝暗号がＲＮＡ中に転写される過程に関する。その後、ＲＮＡはタンパク質中に翻訳されうる。本発明によれば、用語「転写」は「ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写」を含み、用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写」は、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡが、好ましくは適切な細胞抽出物を用いて、無細胞系においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成される過程に関する。好ましくは、クローニングベクターは、転写物の生成に適用される。これらクローニングベクターは、通常転写ベクターと呼ばれ、本発明により用語「ベクター」に包含される。本発明によれば、本発明に用いられるＲＮＡは、好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ−ＲＮＡ）であり、適切なＤＮＡ鋳型のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写により得られる。転写を制御するためのプロモーターは、いずれかのＲＮＡポリメラーゼのための任意のプロモーターとすることができる。ＲＮＡポリメラーゼの特定の例は、Ｔ７、Ｔ３、及びＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼである。好ましくは、本発明によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写は、Ｔ７又はＳＰ６プロモーターにより制御される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特にｃＤＮＡのクローニングと、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写のための適切なベクターへのその導入とにより得られる。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写により得られる。
【０１４２】
本発明による用語「翻訳」は、メッセンジャーＲＮＡの鎖がアミノ酸の配列の集合をペプチド又はポリペプチドの形成へと導く細胞のリボソームにおける過程に関する。
【０１４３】
本発明によれば核酸と機能的に結合する発現制御配列又は調節配列は、核酸に対して同種又は異種とすることができる。コード配列及び調節配列は、コード配列の転写又は翻訳が調節配列の制御下又は影響下にあるように、まとめて共有結合する場合、「機能的に」まとまって結合する。コード配列が機能タンパク質へと翻訳される場合、調節配列のコード配列との機能的結合により、コード配列内で読み枠をシフトさせることなく又はコード配列が所望のタンパク質又はペプチドへと翻訳される能力を失うことなく、調節配列の誘導によりコード配列の転写が起こる。
【０１４４】
用語「発現制御配列」又は「調節配列」は、本発明によれば、核酸の転写又は得られたＲＮＡの翻訳を制御するプロモーター、リボソーム結合配列及びその他制御要素を含む。本発明の特定の実施態様では、調節配列を制御することができる。調節配列の正確な構造は、種又は細胞型に応じて変化しうるが、通常、ＴＡＴＡ−ボックス、キャップ形成−配列、ＣＡＡＴ−配列などといった、転写又は翻訳の開始に関与する５’−非転写並びに５’−及び３’−非翻訳配列を含む。特に、５’−非転写調節配列は、機能的に結合した遺伝子の転写制御のためのプロモータ配列を含むプロモーター領域を含む。調節配列は、エンハンサー配列又は上流アクチベーター配列も含みうる。
【０１４５】
本発明によれば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又は対象中に存在しうる細胞中に取り込まれた又は導入された、即ちトランスフェクト又は形質導入された、ペプチド又はタンパク質をコードするＲＮＡといった核酸により、前記ペプチド又はタンパク質の発現がもたらされることが好ましい。細胞は、細胞内（例えば細胞質及び／又は核の中）で、これらコードされたペプチド又はタンパク質を発現することができるか、コードされたペプチド又はタンパク質を分泌することができるか、又は表面上に発現することができる。
【０１４６】
本発明によれば、「核酸発現」及び「核酸コード化」といった用語又は同様の用語は、本明細書で交換可能に使用され、特定のペプチド又はポリペプチドに関し、核酸が、適切な環境、好ましくは細胞内部に存在する場合、発現されて前記ペプチド又はポリペプチドを生成することができることを意味する。
【０１４７】
本発明によれば、任意の手段を使用して、ＣＦＬＡＲの細胞レベルを上昇させるように細胞を操作することができる。一実施態様において、細胞は、ＣＦＬＡＲポリペプチドをコードする核酸でトランスフェクトすることにより、ＣＦＬＡＲの細胞レベルを上昇させるように操作される。
【０１４８】
「移行する」、「導入する」、「トランスフェクトする」又は「形質導入する」といった用語は、本明細書で交換可能に使用され、核酸、特に外来性又は異種の核酸の導入、例えばＲＮＡの細胞への導入に関する。本発明によれば、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで存在することができ、例えば細胞は、器官、組織及び／又は生物体の一部を形成することができる。本発明によれば、トランスフェクションは、一過性又は安定性でありうる。ランスフェクションのいくつかの用途については、トランスフェクトされた遺伝子材料が一過性に発現されるだけで十分である。トランスフェクションの過程で導入された核酸は通常核ゲノムに統合されないため、外来の核酸は、有糸分裂により希釈されるか又は劣化するであろう。核酸のエピソーム増幅を可能にする細胞株は、希釈率を大きく低下させる。トランスフェクトされた核酸が細胞及びその娘細胞のゲノムに実際に残ることが望ましい場合、安定なトランスフェクションが起こらなければならない。ＲＮＡを細胞中にトランスフェクトして、そのコード化タンパク質を一過性に発現させることができる。
【０１４９】
用語「細胞ＦＬＩＣＥ［Ｆａｓ関連デスドメイン（ＦＡＤＤ）様ＩＬ−１β−変換酵素］−阻害タンパク質」、「細胞ＦＬＩＣＥ−阻害タンパク質」、「ＣＦＬＡＲ」又は「ｃ−ＦＬＩＰ」は、主要な抗アポトーシス調節因子及び腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、Ｆａｓ−Ｌ、及びＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）−誘導アポトーシス、並びに悪性細胞中において化学療法剤によってトリガーされるアポトーシスを抑制する抵抗因子である。ＣＦＬＡＲは、長い（ＣＦＬＡＲＬ）、短い（ＣＦＬＡＲＳ）、及びＣＦＬＡＲＲスプライスバリアントとしてヒト細胞中に発現される。ＣＦＬＡＲは、ＦＡＤＤ及び／又はカスパーゼ−８又は−１０及びＴＲＡＩＬ受容体５（ＤＲ５）に対し、リガンド依存的に及びリガンド非依存的に結合し、アポトーシス抑制複合体（ＡＩＣ）を形成する。このような相互作用は次いで、死誘導シグナル伝達複合体（ＤＩＳＣ）の形成と、その後のカスパーゼカスケードの活性化を防止する。ＣＦＬＡＲＬ及びＣＦＬＡＲＳはまた、様々なシグナル伝達経路、並びにＡｋｔ、ＥＲＫ、及びＮＦ−ｋＢを含む複数の細胞保護的な及び生存促進性のシグナル伝達タンパク質の活性化及び／又は上方制御において、多機能的役割を有することが知られている。本発明によれば、用語「ＣＦＬＡＲ」は、任意の変異体、特に突然変異体、スプライスバリアント、コンホーメーション、アイソフォーム、対立遺伝子変異体、種変異体及び種ホモログ、特に天然に存在するものを含み、且つＣＦＬＡＲＬ、ＣＦＬＡＲＳ、ＣＦＬＡＲＲ及びｖ−ＣＦＬＡＲを含む。
【０１５０】
用語「ＣＦＬＡＲＬ」は、好ましくは、配列表の配列番号１によるアミノ酸配列又は前記アミノ酸配列の変異体を含むタンパク質に関する。一実施態様では、配列表の配列番号１によるアミノ酸配列は、配列表の配列番号２による核酸配列によりコードされる。
【０１５１】
用語「ＣＦＬＡＲＳ」は、好ましくは、配列表の配列番号３によるアミノ酸配列又は前記アミノ酸配列の変異体を含むタンパク質に関する。一実施態様では、配列表の配列番号３によるアミノ酸配列は、配列表の配列番号４による核酸配列によりコードされる。
【０１５２】
用語「ＣＦＬＡＲＲ」は、好ましくは、配列表の配列番号５によるアミノ酸配列又は前記アミノ酸配列の変異体を含むタンパク質に関する。一実施態様では、配列表の配列番号５によるアミノ酸配列は、配列表の配列番号６による核酸配列によりコードされる。
【０１５３】
用語「ｖ−ＣＦＬＡＲ」は、好ましくは、配列表の配列番号７によるアミノ酸配列又は前記アミノ酸配列の変異体を含むタンパク質に関する。一実施態様では、配列表の配列番号７によるアミノ酸配列は、配列表の配列番号８による核酸配列によりコードされる。
【０１５４】
本発明によれば、用語「ペプチド」は、ペプチド結合により共有結合的に接合した二つ以上、好ましくは３以上、好ましくは４以上、好ましくは６以上、好ましくは８以上、好ましくは１０以上、好ましくは１３以上、好ましくは１６以上、好ましくは２１以上、好ましくは８、１０、２０、３０、４０又は５０以下、特に１００のアミノ酸を含む物質を指す。
【０１５５】
用語「タンパク質」は、大きなペプチド、即ちポリペプチド、好ましくは１００を上回るアミノ酸残基を有するペプチドを指すが、一般には、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は同義語であり、本明細書で交換可能に使用される。
【０１５６】
本発明には、本明細書に記載されるペプチド、タンパク質、又はアミノ酸配列の「変異体」も含まれる。
【０１５７】
本発明の目的のために、アミノ酸配列の「変異体」は、アミノ酸挿入変異体、アミノ酸付加変異体、アミノ酸欠失変異体及び／又はアミノ酸置換変異体を含む。
【０１５８】
アミノ酸挿入変異体は、特定のアミノ酸配列内に、単一の又は二つ以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入を有するアミノ酸配列変異体の場合、一又は複数のアミノ酸残基がアミノ酸配列の特定の部位に挿入されるが、結果として得られる産物の適切なスクリーニングによるランダムな挿入も可能である。
【０１５９】
アミノ酸付加変異体は、一又は複数のアミノ酸、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０、又はそれ以上のアミノ酸のアミノ及び／又はカルボキシ末端融合を含む。
【０１６０】
アミノ酸欠失変異体は、配列からの一又は複数のアミノ酸の除去、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０、又はそれ以上のアミノ酸の除去を特徴とする。欠失は、タンパク質のいずれの部分におけるものでもよい。タンパク質のＮ末端及び／又はＣ末端に欠失を含むアミノ酸欠失変異体は、Ｎ末端及び／又はＣ末端トランケーション変異体とも呼ばれる。
【０１６１】
アミノ酸置換変異体は、配列中少なくとも一つの残基が除去されており、且つ別の残基がその場所に挿入されていることを特徴とする。同種のタンパク質又はペプチド間に保存されていないアミノ酸配列内の位置で修飾が行われること及び／又はアミノ酸を類似の特性を有する他のもので置き換えることが好ましい。好ましくは、タンパク質変異体におけるアミノ酸の変化は、保存的なアミノ酸変化、即ち同様の荷電又は非荷電アミノ酸の置換である。保存的なアミノ酸変化には、それらの側鎖に関連するアミノ酸のファミリーの一つの置換が含まれる。天然に存在するアミノ酸は、一般に四つのファミリー、即ち：酸性（アスパルテート、グルタメート）、塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、及び非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）のアミノ酸に分けられる。フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは、時にまとめて芳香族アミノ酸に分類される。
【０１６２】
好ましくは、所与のアミノ酸配列と前記所与のアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列との間の類似性、好ましくは同一性の度合いは、少なくとも約６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％である。類似性又は同一性の度合いは、好ましくは、参照アミノ酸配列の全長の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％又は約１００％であるアミノ酸領域に対して与えられる。例えば、参照アミノ酸配列が２００のアミノ酸からなる場合、類似性又は同一性の度合いは、好ましくは、少なくとも約２０、少なくとも約４０、少なくとも約６０、少なくとも約８０、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０、又は約２００のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸に対して与えられる。類似性又は同一性の度合いは、好ましくは、少なくとも８０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１５０、少なくとも１８０、少なくとも２００又は少なくとも２５０のアミノ酸のセグメントに対して与えられる。好ましい実施態様では、類似性又は同一性の度合いは、参照アミノ酸配列の全長に対して与えられる。配列類似性、好ましくは配列同一性を決定するためのアラインメントを、当技術分野で既知のツールを用いて行うことができ、好ましくは最良の配列アラインメントを用いて、例えば、Ａｌｉｇｎを用いて、標準の設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ，Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２，Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ  １０．０，Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｄ  ０．５を用いて行うことができる。
【０１６３】
「配列類似性」は、同一であるか、又は保存的なアミノ酸置換を表すアミノ酸のパーセンテージを示す。二つのアミノ酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同一のアミノ酸のパーセンテージを示す。
【０１６４】
用語「パーセンテージ同一性」は、最良のアラインメントの後に得られる、比較される二つの配列間で同一であるアミノ酸残基のパーセンテージを表すことを意図し、このパーセンテージは純粋に統計的なものであり、二つの配列間の差異は、ランダムに且つその全長にわたって分布する。二つのアミノ酸配列間の配列比較は、一般的には、これら配列を、最適に整列させた後で比較することにより実行され、前記比較は、配列類似性の局所的領域を同定及び比較するために、セグメント毎に又は「比較のウィンドウ」毎に実行される。比較のための配列の最適なアラインメントは、手動で生成する以外に、Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482の局所的相同性アルゴリズムを用いて、Neddleman and Wunsch,1970,J. Mol. Biol. 48,443の局所的相同性アルゴリズムを用いて、Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444の類似性探索方法を用いて、又はこれらアルゴリズムを使用するコンピュータプログラムを用いて（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ  Ｐ、ＢＬＡＳＴ  Ｎ及びＴＦＡＳＴＡ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）生成することができる。
【０１６５】
パーセンテージ同一性は、比較される二つの配列間で同一の位置の数を決定すること、この数を、比較される位置の数で除すこと、及び得られた結果に１００を乗じてこれら二つの配列間のパーセンテージ同一性を得ることにより計算される。
【０１６６】
同種のアミノ酸配列は、本発明によれば、少なくとも４０％、特に少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９８又は少なくとも９９％のアミノ酸残基同一性を呈する。
【０１６７】
本明細書に記載されるアミノ酸配列変異体は、例えば組み換えＤＮＡ操作により、当業者により容易に調製されうる。置換、付加、挿入又は欠失を有するペプチド又はタンパク質を調製するためのＤＮＡ配列の操作は、例えばSambrook et al.(1989)に詳細に記載されている。さらに、本明細書に記載されるペプチド及びアミノ酸変異体は、例えば、固体相合成及び類似の方法といった既知のペプチド合成技術を援用して容易に調製することができる。
【０１６８】
本発明は、用語「ペプチド」及び「タンパク質」に含まれる、本明細書に記載されるペプチド又はタンパク質の誘導体を含む。本発明によれば、タンパク質及びペプチドの「誘導体」は、タンパク質及びペプチドの修飾型である。このような修飾はあらゆる化学修飾を含み、タンパク質又はペプチド、例えば糖（炭水化物）、脂質及び／又はタンパク質又はペプチドに関連する任意の分子の単一の又は複数の置換、欠失及び／又は付加を含む。一実施態様では、タンパク質又はペプチドの「誘導体」は、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、パルミトイル化、ミリストイル化、イソプレニル化、脂質付加、アルキル化、誘導体化、保護基／ブロッキング基の導入、タンパク質分解切断又は抗体若しくは別の細胞リガンドへの結合から生じる被修飾アナログを含む。用語「誘導体」は、前記タンパク質及びペプチドのすべての機能的化学等価物にもわたる。好ましくは、被修飾ペプチドは、上昇した安定性及び／又は上昇した免疫原性を有する。
【０１６９】
本発明によれば、ペプチド又はタンパク質の変異体又は誘導体は、好ましくは、それが由来するペプチド又はタンパク質の機能特性を有する。好ましくは、ＣＦＬＡＲタンパク質の変異体又は誘導体は、それが由来するＣＦＬＡＲタンパク質と同じ又は類似の特性を有する。
【０１７０】
用語「由来」とは、本発明によれば、特定のエンティティ、特に特定の配列が、それが由来する物体、特に生物体又は分子中に存在することを意味する。アミノ酸配列、特に特定の配列領域の場合，「由来」は特に、関連するアミノ酸配列が、それが存在するアミノ酸配列に由来することを意味する。
【０１７１】
用語「細胞」又は「宿主細胞」は、好ましくは、無傷細胞、即ち酵素、細胞内小器官、又は遺伝子材料といったその正常な細胞内成分を放出していない無傷の膜を有する細胞である。無傷細胞は、好ましくは生細胞、即ちその正常な代謝機能を実行することのできる生存細胞である。好ましくは  前記用語は、本発明によれば、外来性核酸で形質転換又はトランスフェクトすることのできるあらゆる細胞に関する。用語「細胞」は、本発明によれば、原核細胞（例えば大腸菌）又は真核細胞（例えば、樹状細胞、Ｂ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｋ５６２細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＬＡ細胞、酵母細胞、及び昆虫細胞）を含む。外来性核酸は、細胞内で、（ｉ）そのまま自由に分散した，（ｉｉ）組み換えベクター内に組み込まれた、又は（ｉｉｉ）宿主細胞のゲノム又はミトコンドリアのＤＮＡに統合された状態で見られる。ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギ、及び霊長類由来の細胞といった哺乳動物の細胞が特に好ましい。細胞は、多数の組織型に由来し、一次細胞及び細胞株を含む。
【０１７２】
核酸を含む細胞、例えば核酸でトランスフェクトされた細胞は、好ましくは核酸によってコードされるペプチド又はタンパク質を発現する。
【０１７３】
用語「拡大」は、特定のエンティティが倍増する過程を示す。本発明の一実施態様において、この用語は、リンパ球が抗原によって刺激され、増殖し、前記抗原を認識する特定のリンパ球が増幅される免疫学的応答の状況において使用される。好ましくは、クローンの拡大は、リンパ球の分化に繋がる。
【０１７４】
本明細書に記載される免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞（対象への投与のためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成されるか、又は例えば、ＣＦＬＡＲをコードする核酸の投与により、対象においてｉｎ  ｓｉｔｕで生成される）は、自己免疫疾患又は炎症性疾患、或いは器官、組織、細胞、及び／又はタンパク質の移植片を含む移植片拒絶の治療又は予防のための、哺乳動物における免疫応答の抑制方法において有用である。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、患者に投与されるか、又は患者においてｉｎ  ｓｉｔｕで形成される免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞は、患者のＴ細胞の活性化及び増殖を阻害する。
【０１７５】
免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞は、患者に投与されたタンパク質に対して開始される（任意選択的には、患者に投与された核酸の発現を通して）患者の免疫応答の結果生じ、したがってタンパク質の有効性及び安全性を低下させる副作用を回避又は抑制するうえで有用である。タンパク質治療法には、限定されないが、モノクローナル抗体、酵素、サイトカイン、及び毒素が含まれる。
【０１７６】
さらに、免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞は、移植のレシピエントに、宿主の移植片拒絶を低減又は阻害するために有効な免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞の一定量を、投与すること又は生じさせることにより、レシピエントにおける移植片への免疫応答を低減及び／又は排除するために有用である。移植は、生体適合性格子又は移植されるドナーの組織、器官、細胞若しくは分子を含むことができる。移植片の一例には、限定されないが、皮膚の細胞又は組織、骨髄、及び心臓、膵臓、腎臓、肺及び肝臓といった実質臓器が含まれる。いくつかの場合には、移植片は核酸又はタンパク質である。本明細書に提供される開示内容に基づいて、骨髄細胞又はその前駆細胞は、あらゆるソース、例えば移植のドナー、移植のレシピエント又はそれ以外の無関係のソース（完全に異なる個体又は種）から得ることができる。免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞は、好ましくは、宿主の移植片拒絶を低減及び／又は排除するために、移植に先立ち又は移植と同時に、レシピエントに投与するか、又はレシピエント中に生じさせる。また別の実施態様では、免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞は、移植片の投与後に、移植レシピエントに投与するか、又は移植のレシピエント中に生じさせることができる。
【０１７７】
本発明は、移植後の移植片対宿主病を抑制するための治療法としての免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞の使用も含む。この実施態様では、本発明は、移植片のレシピエントへの移植に先立ち、ドナー移植片と免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞とを接触させる方法を包含する。免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞は、レシピエントに対するドナー移植片による有害反応を改善、阻害又は低減するために役立つ。免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞は、移植のレシピエントに対する移植片による望まれない免疫応答を排除又は低減する使用のための、あらゆるソース、例えば、移植ドナー、移植レシピエント又はそれ以外の無関係のソース（完全に異なる個体又は種）から得ることができる。したがって、免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞は、移植ドナー、移植レシピエント又はそれ以外の無関係のソースに対し、自家性、同種異系又は異種とすることができる。本発明の一実施態様において、移植片対宿主病に罹患した移植レシピエント又は移植片対宿主病に罹患する危険のある移植レシピエントは、移植片対宿主病の重症度を低減、阻害又は排除するために、免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞をレシピエントに投与すること又は免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞をレシピエントに生じさせることにより治療される。本発明のこの実施態様では、好ましくは、免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞は、移植に先立ってレシピエントから取得することができ、進行中の移植片対宿主反応を治療するための免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞の予備を十分な量で提供するために、培養物中において拡大及び／又は貯蔵することができる。しかしながら、本明細書の他の部分に記載されるように、免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞は、あらゆるソース、例えば、移植ドナー、移植レシピエント又はそれ以外の無関係なソース（完全に異なる個体又は種）から得ることができる。
【０１７８】
本明細書の開示内容に基づいて、本明細書に記載される免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞を治療の現行モード、例えばドナー組織又は移植片対宿主病に対する宿主の拒絶の治療のための免疫抑制薬療法の使用と併用することができると想定される。移植において免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞と免疫抑制薬とを併用することの利点は、免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞を使用して移植レシピエントにおける免疫応答の重症度を改善することにより、使用される免疫抑制薬療法の量及び／又は免疫抑制薬療法の投与頻度を減らすことができることである。免疫抑制薬療法の使用を低減することの利点は、免疫抑制薬療法に関連付けられる全身的免疫抑制及び不要な副作用の緩和である。
【０１７９】
本明細書に記載される本発明は、特に、本明細書に記載される免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞を、宿主の移植片拒絶及び／又は移植片対宿主病の予防、治療又は改善のための予防的又は治療的有効量で、患者に対して投与すること又は患者において生成することにより、移植片拒絶反応及び／又は移植片対宿主病を予防又は治療する方法を包含する。本開示内容に基づき、免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞の治療的有効量は、活性化Ｔ細胞を阻害するか、又は免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞の投与がない場合の活性化Ｔ細胞の数と比較したとき、活性化Ｔ細胞の数を減少させる量である。宿主の移植片拒絶の状況において、免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞の有効量は、レシピエント中の活性化Ｔ細胞を阻害するか、又は免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞の投与前のレシピエント中の活性化Ｔ細胞の数と比較したとき、レシピエント中の活性化Ｔ細胞の数を減少させる量である。移植片対宿主病の場合、免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞の有効量は、移植片中に存在する活性化Ｔ細胞を阻害する又はそのような活性化Ｔ細胞の数を減少させる量である。
【０１８０】
免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞の有効量は、免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞の投与に先立つレシピエント又は移植片中の活性化Ｔ細胞の数と、免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞の投与後のレシピエント又は移植片中に存在する活性化Ｔ細胞の数とを比較することにより決定することができる。免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞の投与に関連付けられる、移植片のレシピエント又は移植自体における活性化Ｔ細胞の数の減少、又は増加の非存在は、投与された免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞の数が、免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞の治療的有効量であることを示している。
【０１８１】
患者に対して免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞を投与する代わりに、本発明を使用して、哺乳動物中に免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞を生じさせるために、哺乳動物の細胞中にＣＦＬＡＲを発現させることもできる。本発明のこの態様は、治療タンパク質が、それをコードする核酸を哺乳動物の細胞中に導入することにより哺乳動物に投与される、一種の遺伝子療法に関連する。核酸が細胞中にトランスフェクトされるすべての場合において、ＣＦＬＡＲをコードする核酸配列は、細胞内の核酸配列の発現を達成するために必要な調節配列に作用可能に連結される。核酸コンストラクトは、好ましくは、発現ベクターが細胞中にトランスフェクトされたとき、コード配列が細胞によって発現されるように、必須の調節配列に作用可能に連結されたＣＦＬＡＲのコード配列を含む発現ベクターとして提供される。コード配列は、細胞中のその配列の発現に必要な調節要素に作用可能に連結される。ＣＦＬＡＲをコードする核酸は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成されたＤＮＡ若しくはそのハイブリッド、又はｍＲＮＡのようなＲＮＡ分子でありうる。
【０１８２】
核酸コンストラクトは、調節要素に作用可能に連結されたＣＦＬＡＲをコードするヌクレオチド配列を含み、機能的細胞質分子、機能的エピソーム分子として細胞内に存在し続けることができるか、又は細胞の染色体ＤＮＡ中に統合されうる。外来性遺伝子材料は、細胞中に導入することができ、そこでプラスミドの形態の別個の遺伝子材料として残る。代替的に、染色体中に統合しうる直鎖状ＤＮＡが、細胞中に導入されてもよい。ＤＮＡを細胞中に導入するとき、ＤＮＡの染色体への統合を促進する試薬を加えてもよい。統合を促進するために有用なＤＮＡ配列をＤＮＡ分子に含めてもよい。代替的に、ＲＮＡが細胞中に導入されてもよい。
【０１８３】
耐性を誘導するために本発明の免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞を用いる基本的手法は、潜在的に免疫原性の分子を治療目的で利用する治療法の付属物として広い用途を有している。例えば、臨床的障害の治療のための、抗体、又は融合タンパク質などといったタンパク質性分子を利用する治療法の数が増加している。このような分子の治療的使用の限界は、それが治療される対象中の治療的分子に対して免疫応答を引き出しうる（例えば、ヒト対象におけるＶＩＩＩ因子の有効性が、ヒト対象中のＶＩＩＩ因子に対する免疫応答の誘導により妨げられる）ことである。本発明は、投与された分子に対する耐性を誘導するという状況における、一般的なタンパク質療法の改善である。
【０１８４】
Ｔ細胞応答を阻害するための本発明の免疫寛容原性又は免疫抑制性の細胞の投与をこれら治療的状況に適用し、免疫応答を引き出すことなく対象において治療的分子の長期使用を可能にすることができる。
【０１８５】
本発明によれば、用語「疾患」又は「障害」は、あらゆる病理的状態を指す。
【０１８６】
用語「炎症性疾患」は、組織、特に結合組織、又はこのような組織の変性における高レベルの炎症を特徴とするか、又はそのような炎症に関連付けられるあらゆる疾患を指す。慢性の炎症性疾患は、持続性の炎症を特徴とする医学的状態である。（慢性）炎症性疾患の例には、セリアック病、脈管炎、狼瘡、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、過敏性腸疾患、アテローム性動脈硬化症、関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、大腸炎、慢性活動性肝炎、皮膚炎及び乾癬が含まれる。
【０１８７】
用語「自己免疫疾患」又は「自己免疫障害」は、身体がそれ自体の組織の何らかの構成成分に対する免疫原性（即ち免疫系）の応答を生成するあらゆる疾患／障害を指す。換言すれば、免疫系は、身体内部のなんらかの組織又は系を自己として認識するその能力を失い、それをあたかも外来であるかのように標的化して攻撃する。自己免疫疾患は、主に一つの器官が影響を受けるもの（例えば溶血性貧血及び抗免疫甲状腺炎）、及び自己免疫疾患の過程が多くの組織にわたるもの（例えば全身性紅斑性狼瘡）に分類することができる。例えば、多発性硬化症は、Ｔ細胞が脳及び脊髄の神経線維を取り巻く鞘を攻撃することにより生じると考えられている。これは、調節の欠如、虚弱、及びかすみ目を引き起こす。自己免疫疾患の例には、限定されないが、特にアジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、クローン病、糖尿病（Ｉ型）、ジストロフィー型表皮水泡症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、脈管炎、白斑、粘液水腫、悪性貧血、潰瘍性大腸炎、及びＩ型糖尿病が含まれる。
【０１８８】
「移植片」は、移植される生体適合性格子、又はドナーの組織、器官若しくは細胞を指す。移植片の一例には、限定されないが、皮膚の細胞又は組織、骨髄、及び心臓、膵臓、腎臓、肺及び肝臓といった実質臓器が含まれる。移植片は、宿主に投与されるあらゆる物質を指すこともある。例えば、移植片は核酸又はタンパク質を指すことがある。
【０１８９】
用語「移植片拒絶」は、最終的には移植片を破壊しうる、移植された組織又は器官といった移植片の、レシピエントの免疫系による拒絶を指す。
【０１９０】
本明細書において使用される用語「移植片対宿主病」又は「ＧｖＨＤ」は、宿主に骨髄又は脾臓内にあるものといった同種異系の、免疫学的に活性の細胞が導入、移植又はグラフトされたときに生じ、移植片の免疫担当細胞が宿主を免疫学的に攻撃する宿主と移植片との免疫不適合性に起因して、重大な、場合によっては致命的な反応をもたらす、ヒトを含む哺乳動物の状態と定義される。
【０１９１】
「治療／処置（ｔｒｅａｔ）」とは、対象において、疾患を停止させる又は進行を遅らせることを含め、疾患を予防又は排除するために；対象において、新規の疾患の発生を阻害する又は遅らせるために；疾患に現在罹患している又は過去に罹患していた対象において、症候及び／又は再発の頻度又は重症度を低下させるために；及び／又は対象の生存期間を延ばす、即ち増加させるために、本明細書に記載される薬剤又は組成物を対象に投与することを意味する。特に、用語「疾患の治療」は、疾患又はその症候の、治癒、期間の短縮、改善、予防、進行若しくは悪化の遅延若しくは阻害、又は発症の予防若しくは遅延を含む。
【０１９２】
「危険がある」とは、一般集団と比較して、通常より高い疾患発症の可能性を有すると同定される対象、即ち患者を意味する。加えて、過去又は現在疾患を有する対象は、疾患を発症し続ける可能性があるため、疾患を発症する危険が高い対象である。さらに、移植を受けた又は受けることになる対象は、ＧｖＨＤを発症する危険が高い対象である。
【０１９３】
本発明の文脈では，「保護する」、「予防する」、「予防的」、「予防性」、又は「保護的」といった用語は、対象における疾患の発生及び／又は伝播の予防又は治療又はそれらの両方に関し、特に、対象が疾患を発症する可能性を最小化すること又は疾患の発症を遅らせることに関する。例えば、疾患の危険があるヒトは、疾患を予防するための治療法の候補である。
【０１９４】
本明細書に記載される薬剤又は組成物の予防的投与は、好ましくはレシピエントを疾患の発症から保護する。本明細書に記載される薬剤又は組成物の治療的投与は、疾患の進行／成長の阻害をもたらすことができる。これは、疾患の進行／成長の減速、特に疾患の進行の途絶を含み、好ましくは疾患の排除につながる。
【０１９５】
本明細書に提供される薬剤及び組成物は、単独で、又は外科手術、放射線照射、化学療法及び／又は骨髄移植（自家性、同系、同種異系又は無関係の）といった一般的な治療レジメンと組み合わせて使用されうる。
【０１９６】
用語「ｉｎ  ｖｉｖｏ」は、対象の状況に関連する。
【０１９７】
用語「対象」、「個体」、「生物体」又は「患者」は交換可能に使用され、脊椎動物、好ましくは哺乳動物に関する。例えば、本発明の文脈において哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、家畜（イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマなど）、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモットなど）、並びに動物園の動物といった飼育動物である。本明細書において使用される用語「動物」はヒトも含む。用語「対象」は、患者、即ち、疾患、好ましくは本明細書に記載される疾患を有する動物、好ましくはヒトも含みうる。
【０１９８】
用語「自家性」は、同じ対象に由来するものを記載するために使用される。例えば、「自家性移植片」は、同じ対象に由来する組織又は器官の移植片を指す。このような手順は、それらが、それ以外の場合に拒絶を生じる免疫性障害を克服するため有利である。
【０１９９】
用語「同種異形」は、同じ種の異なる固体に由来するものを記載するために使用される。二つ以上の個体は、一又は複数の座の遺伝子が同一でないとき、互いに同種異系であるという。
【０２００】
用語「同系」は、同一のジェノタイプを有する個体又は組織、即ち、一卵性双生児若しくは同じ近交系の動物、又はそれらの組織に由来するものを記載するために使用される。
【０２０１】
用語「異種」は、複数の異なる要素からなるものを記載するために使用される。一例として、一の個体の骨髄の、異なる個体への移行は、異種移植を構成する。異種遺伝子は、対象以外のソースに由来する遺伝子である。
【０２０２】
本明細書に記載される薬剤及び組成物は、注射又は点滴を含む任意の一般的経路を介して投与することができる。投与は、例えば、経口で、静脈内に、腹腔内に、筋肉内に、皮下に、又は経皮的に、実行することができる。特に、本明細書に記載される細胞は、全身的に、即ち、非経口的に、静脈内注射により投与することができるか、又は骨髄などの特定の組織又は器官を標的とすることができる。さらに、細胞は、細胞の皮下移植を介して、又は結合組織、例えば筋肉内への細胞の注射により投与することができる。
【０２０３】
本明細書に記載される薬剤及び組成物は、有効量で投与される。「有効量」は、所望の反応又は所望の効果、例えば検出可能なレベルの免疫抑制又は耐性を、単独で又はさらなる用量と合わせて達成する量を指す。特定の疾患又は特定の状態の治療の場合、望ましい反応は、好ましくは、疾患の過程の阻害に関する。これは、疾患の進行を遅らせること、特に疾患の進行を中断すること又は逆転させることを含む。また、疾患又は状態の治療における所望の反応は、前記疾患又は前記状態の発生の遅延又は予防でもよい。
【０２０４】
本明細書に記載される薬剤又は組成物の有効量は、治療対象の状態、疾患の重症度、年齢、生理的条件、サイズ及び体重を含む患者の個人的パラメータ、治療期間、付随的治療法（もしあれば）の種類、特定の投与経路、並びに類似の因子に応じて決まるであろう。したがって、本明細書に記載される薬剤及び組成物の投与用量は、そのような様々なパラメータに依存しうる。患者の反応が初期用量では不十分である場合、より高い用量（又は異なる、もっと局所的な投与経路により達成される効果のより高い用量）が使用されうる。
【０２０５】
本明細書に記載される薬学的組成物は、好ましくは滅菌であり、所望の反応又は所望の効果を生じさせるために有効量の治療的活性物質を含む。
【０２０６】
本明細書に記載される薬学的組成物は、通常、薬学的に適合性の量で、及び薬学的に適合性の調製物中において投与される。用語「薬学的に適合性」は、薬学的組成物の活性成分の作用と相互作用しない非毒性物質に言及する。この種の調製物は、通常、塩、バッファー物質、防腐剤、担体、及び適切であれば他の治療的に活性な化合物を含みうる。医薬において使用されるとき、塩は薬学的に適合性でなければならない。しかしながら、薬学的に適合性でない塩も、薬学的に適合性の塩を調製するために使用することができ、本発明に含まれる。薬理学的に及び薬学的に適合性のこの種の塩は、非限定的に、以下の酸、即ち塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸などを含む。薬学的に適合性の塩は、ナトリウム塩、カリウム塩又はカルシウム塩といったアルカリ土類金属塩又はアルカリ金属塩として調製することもできる。
【０２０７】
本明細書に記載される薬学的組成物は、薬学的に適合性の担体を含みうる。用語「担体」は、適用を容易にするために活性成分が混合されている、天然又は合成の有機又は無機成分を指す。本発明によれば、用語「薬学的に適合性の担体」は、患者への投与に適した一又は複数の適合性の固体又は液体の充填剤、希釈剤又は封入用物質を含む。本明細書に記載される薬学的組成物の成分は、通常、所望の薬学的有効性を実質的に損なう相互作用が起こらないようなものである。
【０２０８】
本明細書に記載される薬学的組成物は、適切なバッファー物質、例えば塩中の酢酸、塩中のクエン酸、塩中のホウ酸、及び塩中のリン酸を含みうる。
【０２０９】
薬学的組成物は、適切であれば、適切な防腐剤、例えばベンザルコニウムクロライド、クロロブタノール、パラベン及びチメロサールも含みうる。
【０２１０】
薬学的組成物は通常、均一な剤形で提供され、既知の方式で調製されうる。本明細書に記載される薬学的組成物は、例えば、カプセル、錠剤、ロゼンジ、溶液、懸濁液、シロップ剤、又はエリキシル剤などの形態、或いは乳剤の形態にすることができる。
【０２１１】
非経口投与に適した組成物は、通常、活性な化合物の、滅菌の水性又は非水性の調製物を含み、これは好ましくはレシピエントの血液に等張性である。適合性の担体及び溶媒の例は、リンゲル液及び等張性の塩化ナトリウム溶液である。加えて、通常、滅菌の不揮発性油が、溶液又は懸濁培地として使用される。
【０２１２】
本発明はさらに、本発明の範囲を限定することを意図しない以下の実施例により示される。
【実施例】
【０２１３】
ここで使用された技術及び方法は、本明細書に記載されるか、又は既知の方式で、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition （1989） Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載されるように実行される。キット及び試薬の使用を含むすべての方法は、特に断らない限り、製造者の情報に従って実行される。
【０２１４】
実施例１：特異的ＣＦＬＡＲＬ及びＣＦＬＡＲＳコード化レンチウイルスによるヒト幹細胞（ＣＤ３４＋細胞）及び単球（ＣＤ１４＋細胞）の形質導入は免疫抑制表現型を促進する
本発明者らは、ＣＦＬＡＲＬ（図１Ａ）又はＣＦＬＡＲＳ（図１Ｂ）の配列を含む二つのプラスミドコンストラクトを作製した。二つのコンストラクトはレポーター遺伝子：追跡及びマーカー機能を有する緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）を含んでいた。レンチウイルス性の組み換えタンパク質の生成のために、塩化カルシウムを用いた沈殿方法を使用した。簡潔には、ウイルス構築のための重要なタンパク質をコードするプラスミドベクターを、Ｔａｋａｒａ社（Ｔａｋａｒａ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）により購入した。塩化カルシウムＣａＣｌ２（２ｍＭ）を、ｐＧｐベクター、ｐＥ−ｅｃｏベクター及びＣＦＬＡＲＬ若しくはＣＦＬＡＲＳをコードするベクター、又はルシフェラーゼ（コントロール）（２５μｇ）を含む溶液に加えた。その後、バッファーＨＢＳ  ２Ｘ（２７４ｍＭ  ＮａＣｌ２、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１２ｍＭ  デキストロース、４２ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．１）を撹拌下で加えた。次いでトランスフェクション混合物を２９３Ｔ細胞の培養プレートに滴下し、ウイルス性粒子を含有する培地を４８時間後に回収し、遠心分離し、０．４５μｍ孔のフィルターでろ過し、細胞及びデブリを除去し、５０，０００ｇで１４０分間室温で超遠心分離することにより濃縮した。感染はスピン接種（ｓｐｉｎ−ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）により行った：細胞（ヒト幹細胞又は単球）をマルチウェルプレートスインギングバケットローターに置き、遠心分離した；プレートを２５００ｒｐｍで４時間３０℃でスピンさせた。この工程の後、本発明者らは、免疫抑制アッセイを設定した。ヒト幹細胞（骨髄ＣＤ３４＋細胞、１００万個、ｃａｔ．２Ｍ−１０１Ｃ、Ｌｏｎｚａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の場合、感染したＣＤ３４＋細胞をＧ−ＣＳＦ（４０ｎｇ／ｍｌ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｓ．ｒ．ｌ．，Ｉｔａｌｙ）及びＧＭ−ＣＳＦ（４０ｎｇ／ｍｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｓ．ｒ．ｌ．，Ｉｔａｌｙ）の存在下でｉｎ  ｖｉｔｒｏで四日間分化させ、ＭＤＳＣ関連免疫抑制活性の獲得を促進した。四日後、細胞を回収し、活性化された細胞追跡標識ＰＢＭＣの存在下で共培養した（図２Ａ、左パネル）。簡潔には、ＰＢＭＣを回収し、ＩＭＤＭ培地（Ｌｏｎｚａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で洗浄し、１０％  ＦＢＳ（ＥｕｒｏＣｌｏｎｅ，Ｉｔａｌｙ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｔａｌｙ）及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｌｏｎｚａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を補充した。ＰＢＭＣを、ＰＢＳ中で１０７細胞／ｍｌの最終濃度に再懸濁し、最終作用濃度２．５μＭのＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ保存溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ，Ｕ．Ｋ．）で染色し、続いて５分間３７℃でインキュベートし、光から保護した。色素は容易に細胞中に拡散し、細胞内エステラーゼにより切断されて高度に蛍光性の化合物を生じさせた。この化合物は共有結合的に細胞内アミンに結合し、その結果安定でよく保持された蛍光染色が得られた。各分裂後に色素は娘細胞に均等に分配されるため、細胞蛍光性は半減する。フローサイトメトリーヒストグラムでは、左側に向かって離散ピークが現れており、各細胞分裂又は生成を表している。次いで細胞を洗浄し、培地中に再懸濁した。標識された「標的」ＰＢＭＣを、コーティングされた１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（クローン、ＯＫＴ−３；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）及び５μｇ／ｍｌの可溶型抗ＣＤ２８（クローン、ＣＤ２８．２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて四日間刺激し、３８４平底ウェルプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）において、異なるエフェクター対標的率で、「エフェクター」ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化ＣＤ３４＋細胞と共に共培養した。細胞培養物を、アルギニン及びグルタミンを含有しないＲＰＭＩ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中５％  ＣＯ２で３７℃でインキュベートし、２ｍＭのＬ−グルタミン、１５０μＭのアルギニン、１０％  ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）、１０Ｕ／ｍｌのペニシリン及びストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、及び０，１ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｌｏｎｚａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を補充した。培養の最後に、細胞をＰＥ−Ｃｙ７コンジュゲート抗ＣＤ３（ＵＣＨＴ１，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）で染色し、すべての試料をＦＡＣＳ−ＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）で獲得し、ゲーティングされたリンパ球の細胞追跡シグナルをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ  Ｉｎｃ．）により分析した。細胞増殖の範囲は、増殖細胞の数を分析して定量化され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化したＣＤ３４＋細胞なしで１００％と想定された。本発明者らは、ＣＦＬＡＲの上方制御により増強されたｉｎ  ｖｉｔｒｏでの免疫抑制能力が、ＭＤＳＣを分化させることを実証した。このことは、このタンパク質の新規の生物学的役割を示唆するものである。実際、ＣＦＬＡＲ発現ＣＤ３４＋細胞は、ルシフェラーゼ発現ＣＤ３４＋細胞（図２Ａ、右パネル）と比較して、有意に増加した抑制活性を示した。これらデータをさらに検証するために、本発明者らは、通常はなんら免疫抑制機能を示さない、使用するバフィーコート由来の精製されたＣＤ１４＋単球を、ＣＦＬＡＲ又はルシフェラーゼ発現レンチウイルスを用いて免疫磁気的に感染させ（ｃａｔ．１３０−０５０−２０１；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｓ．ｒ．ｌ．，Ｉｔａｌｙ）、それらを抗ヒトＣＤ３／ＣＤ２８によって活性化された細胞追跡標識ＰＢＭＣの存在下において共培養した（図２Ｂ、左パネル）。また、この実験の設定において、ＣＦＬＡＲ感染ＣＤ１４＋細胞は、ルシフェラーゼ感染単球（図２Ｂ、右パネル）と比較して、より強力な抑制能を獲得した。７−ＡＡＤを用いるＡＰＣ−ＡｎｎｅｘｉｎＶアポトーシス検出キット（ｃａｔ．６４０９３０，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）によるフローサイトメトリーを用いたとき、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの共培養後のＣＤ１４＋７−ＡＡＤ−アネキシン−Ｖ−細胞のパーセンテージは同等であった（データは示さない）ため、この強力な免疫抑制機能は、コントロールと比較して、ＣＦＬＡＲ発現ＣＤ１４＋細胞のよりよい生存率とは相関していなかった。すべての試料は、ＦＡＣＳ−ＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）により獲得され、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ  Ｉｎｃ．）により分析された。
【０２１５】
実施例２：単球上の強制ＣＦＬＡＲ発現は、免疫抑制機能を制御するＭＤＳＣ様分子プログラムを誘導する
骨髄細胞における免疫抑制機能プログラムの基礎となるＣＦＬＡＲ活性化分子経路の同定を改善するために、本発明者らは、四名の健常ドナーから単離されたＣＦＬＡＲ感染及びルシフェラーゼ感染ＣＤ１４＋細胞のトランスクリプトーム分析を実施した。簡潔には、全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて単離し、ＲＮＡ完全性を、Ａｇｉｌｅｎｔ−２１００−Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて評価した。ＲＮＡをさらに、ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｃｌｅａｎｕｐキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖｅｎｌｏ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて精製し、Ｏｖａｔｉｏｎ  Ｐｉｃｏ  ＷＴＡ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｖ２（ＮｕＧＥＮ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）により全精製ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し増幅した。すべての試料をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３  ＰＬＵＳ  ２．０アレイにハイブリダイズし、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧＣＳ  ３０００  ７Ｇスキャナでスキャンした。試料及び遺伝子は、それぞれ距離メトリック及び結合としてのピアソン相関係数及び平均を用いてクラスター化される。図３に示すように、監視クラスタリング（ｑ値＜０．０５、倍の変化＞２）は、ＣＦＬＡＲ感染単球に、コントロールと比較して、７５０の上方制御された遺伝子（図４）と１，１３０の下方制御された遺伝子（データは示さない）のリストを生成した。特に、この結果、これら差次的に発現される遺伝子は、炎症経路、Ｎｏｔｃｈ関連経路及びＩＬ−１０関連経路に関与するカテゴリーにおいて有意に濃縮された。さらに、ＣＦＬＡＲの強制発現は、ＳＯＣＳ２、ＦＡＳ、ＣＣＲ７、ＣＣＬ５、ＮＦ−ｋＢ、ＳＴＡＴ３、ＣＤ３８、ＣＤ２７４、ＣＤ２７３、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＣＦＳ３、ＰＴＧＳ２及びＩＤＯ１といったＭＤＳＣ関連免疫抑制遺伝子の上方制御を活性化する。推定されるＣＦＬＡＲ関連標的のいくつかを試験し、検証した（図５）。特に、本発明者らは、ＣＦＬＡＲを形質導入された単球がＣＦＬＡＲＬ及びＣＦＬＡＲＳ両方の上方制御、並びにＩＤＯ１の上方制御を示すことをＲｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲにより実証した。この目的のために、本発明者らは、全ＲＮＡを、ＣＦＬＡＲ感染又はルシフェラーゼ感染単球の両方から、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）により単離し、ＲＮＡ完全性を、Ａｇｉｌｅｎｔ−２１００−Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて評価した。ＲＮＡをさらに、ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｃｌｅａｎｕｐキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖｅｎｌｏ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて精製し、Ｏｖａｔｉｏｎ  Ｐｉｃｏ  ＷＴＡ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｖ２（ＮｕＧＥＮ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）により全精製ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し増幅した。すべての試料を使用して、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ社のＡＢＩ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより設計されたカスタムプライマーを用いてＲｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲを設定した。相対的遺伝子発現を定量化する事後ｑＲＴ−ＰＣＲ分析が、比較Ｃｔ法（２−ΔΔＣｔ）により実施された。図５Ａに示すように、ＣＦＬＡＲ形質導入単球は、有意に高いレベルの推定標的遺伝子を発現した。さらに、本発明者らは、ＣＦＬＡＲ形質導入ＣＤ１４＋細胞が、ルシフェラーゼ−形質導入ＣＤ１４＋細胞より有意に高いレベルのＩＬ−１０を分泌することを、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）アッセイ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ，ＭＮ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）により検証した。つまり、このアッセイは、ＩＬ−１０に特異的な精製された抗体と共に事前にインキュベートした特定の９６ウェルプレートに培地を移行することからなる。いくつかのウェルにおいて、試料の代わりに、問題のサイトカインの１：２のスカラー希釈を用いて、較正曲線を作成した。３７℃での２時間のインキュベーション後、プレートを、ビオチン化した抗ＩＬ−１０抗体で１時間マーキングし、次いでペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄｉｓｅ）に結合したストレプトアビジンを用いた３０分間のインキュベーションを室温で行った。ペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄｉｓｅ）とその基質（ＴＭＢ−３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）との反応により、４５０ｎｍにおける読み取りによる対象のサイトカインの定量化が可能である。最後に、本発明者らは、単球上の強制ＣＦＬＡＲ−発現が特異的表面マーカーの上方制御を促進することを、フローサイトメトリーにより実証した。簡潔には、上述のように、感染から２４時間後のＣＤ１４＋細胞が、マウス抗ヒトＣＤ２７３−ＰＥ（ｃａｔ．５５７９２６、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）、マウス抗ヒトＣＤ２７４−ＡＰＣ（ｃａｔ．２２８４８９、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）、マウス抗ヒトＣＤ８０−ＡＰＣ（ｃａｔ．３０５２２０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）、抗ヒトＣＤ１６３−ＰＥ（ｃａｔ．５５６０１８、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）、抗ヒトＣＤ４４−ＰＥ（ｃａｔ．１０３０２４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，ＮＪ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）、抗ヒトＣＤ３８−ＡＰＣ（ｃａｔ．５５４２６２、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）及び抗ヒトＣＤ１２４−ＡＰＣ（ｃａｔ．ＦＡＢ２３ＯＰ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ，ＭＮ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を含む１００μｌのＦＡＣＳバッファー（２％のＢＳＡ及び０．０２％のＮａＮ３（いずれもＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む０．９％のＮａＣｌ溶液）に再懸濁された。すべての試料は、ＦＡＣＳ−ＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）により獲得され、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ  Ｉｎｃ．）により分析された。
【０２１６】
実施例３：ＣＦＬＡＲ発現単球の養子移入は、ヒトＰＢＭＣを移植された免疫不全マウスにおいてＧｖＨＤの進行を制御する
これら観察に基づいて、本発明者らは、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の発生を制御するＣＦＬＡＲ感染ＣＤ１４＋細胞（上述）の免疫抑制機能を、異種マウスモデルを用いてｉｎ  ｖｉｖｏで評価することを決定した。この目的のために、本発明者らは、半致死的に放射線照射した（１３７Ｃｓ線源照射器を用いて）、免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｓｕｇ／ＪｉｃＴａｃ（ＮＯＧ）（Ｔａｃｏｎｉｃ、ＮＹ，Ｕ．Ｓ．Ａ．により購入）マウスに対し、バフィーコートから単離した１０６個のヒトＰＢＭＣを静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。循環するヒトＣＤ３＋リンパ球の頻度が全細胞の〜５％のパーセンテージに到達したとき、１０６個のＣＦＬＡＲ発現又はルシフェラーゼ発現単球のｉ．ｖ．移入によるマウスの治療を開始した。簡潔には後眼窩出血により１００μｌの血液を単離した；赤血球をＡＣＫ（アンモニウム−クロリド−カリウム）リジンバッファーにより排除し、細胞を、ラット抗マウスＣＤ４５−ＡＰＣ（クローンＡ２０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，ＮＪ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）、抗ヒトＣＤ４５−ＰｅｒＰＣ−Ｃｙ５．５（クローン２Ｄ１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，ＮＪ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）及び抗ヒトＣＤ３−ＰＥ−Ｃｙ７（クローンＵＨＣＴ１，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，ＮＪ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて染色した。すべての試料は、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）により獲得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ  Ｉｎｃ．）を用いて分析した。処置を、初回負荷後四回、２１、２８、４２及び４９日目に繰り返し、マウスを、免疫学的、臨床的、及び病理組織学的なＧｖＨＤスコアについて監視した（図６Ａ）。ＣＦＬＡＲ感染ＣＤ１４＋細胞の注射は、ＧｖＨＤの発生を効率的に減少させ、その結果、ルシフェラーゼ発現単球で処置した又は未処置のＧｖＨＤ罹患マウスと比較して、移植マウスの長期生存率を改善した（図６Ｂ）。加えて、組織浸潤ヒトＣＤ３＋  Ｔ細胞の組織学的解析及び定量化により、ＣＦＬＡＲ発現単球で処置したマウスの解析された器官のすべてにおいて、攻撃性の低下したＧｖＨＤ病理学が示された（図６Ｃ）。簡潔には、検死において組織を除去し、１０％の緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに埋設した。病理組織学的評価を、標準のヘマトキシリン及びエオシン切片で実施した。病理学的スコアを、以前に出版された基準線ガイドを用いて二人の病理学者が盲検により評価した（Cooke KR, Kobzik L, Martin TR, Brewer J, Delmonte J, Crawford JM, Ferrara JLM: An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood 8:3230, 199）。最後に、脾臓、肝臓、肺、皮膚、結腸、腎臓及び胃のパラフィン切片を、免疫組織化学に使用した：切片を抗ヒトＣＤ３（クローン  ａｂ５６９０、Ａｂｃａｍ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）抗体で染色してヒト組織浸潤リンパ球を定量化した。
【０２１７】
ＧｖＨＤ罹患マウスにおけるＴ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの拡大を制御するＣＦＬＡＲ発現単球の能力をチェックするため、本発明者らは、ＰＢＭＣ移植から２１、２８、４２及び４９日目の四回にわたって処置したマウスにおけるヒトＣＤ３＋細胞頻度の存在を確認した（図７Ａ）。二回の処置のみで、ＣＦＬＡＲ発現単球で処置したＧｖＨＤ罹患マウスは、ルシフェラーゼ処置したマウスと比較して低いヒトＴ細胞頻度を示した（図７Ｂ）。特に、ＧｖＨＤ罹患マウスをＰＢＭＣ移植後３５日目に屠殺し、ヒトＴ細胞頻度を、血液（図７Ｂｉ）、脾臓（図７Ｂｉｉ）及び骨髄（図７Ｂｉｉｉ）中においてフローサイトメトリーにより評価した。血液分析のために、後眼窩出血により、１００μｌの血液を単離した；赤血球をＡＣＫ（アンモニウム−クロリド−カリウム）リジンバッファーで排除し、細胞を、ＰＥ−Ｃｙ７コンジュゲート抗ＣＤ３（ＵＣＨＴ１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）抗体で染色した。脾臓の分析のために、新しい脾細胞（１０６／試料）を、抗ヒトＦｃγＲブロッキング溶液（ｃａｔ．１３０−０４６−７０２、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｓ．ｒ．ｌ．，Ｉｔａｌｙ）を含む１００μｌのＦＡＣＳバッファー中に、１０分間室温で再懸濁し、非特異的染色を低減した。洗浄後、細胞をＦＡＣＳバッファー中に再懸濁し、抗ヒトＰＥ−Ｃｙ７コンジュゲート抗ＣＤ３（ＵＣＨＴ１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）抗体で標識した。最後に骨髄細胞分析のために、滅菌技術を用いてＧｖＨＤ罹患マウスから脛骨及び大腿骨を除去し、ＢＭを流した。赤血球をＡＣＫ（アンモニウム−クロリド−カリウム）リジンバッファーで排除し、細胞を、抗ヒトＰＥ−Ｃｙ７コンジュゲート抗ＣＤ３（ＵＣＨＴ１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）抗体で染色した。すべての試料は、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）により獲得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ  Ｉｎｃ．）を用いて分析した。さらに、ヒトＴ細胞の活性化状態も評価した。簡潔には、処置したＧｖＨＤ罹患マウスの脾細胞を、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ、５０ｎｇ／ｍｌ）及びイオノマイシン（１μｇ／ｍｌ）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで２４時間刺激したか又はしなかった（休止状態）。脾細胞を、洗浄し、表面抗体（抗ヒトＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅコンジュゲート抗ＣＤ８（ｃａｔ．３４４１７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）抗体）で染色し、固定し、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ  Ｋｉｔ（ｃａｔ．５５４７２３、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いて透過処理し、ＰＥ標識されたｈＩＦＮ−γ抗体（ｃａｔ．５０６５０６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）と共にインキュベートした（図７Ｂ  ｉｉｉｉ）。すべての試料は、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）により獲得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ  Ｉｎｃ．）を用いて分析した。本発明者らは、ＣＦＬＡＲ処置マウスから単離したＴ細胞が、ルシフェラーゼ処置したマウスと比較して、統計的により低い頻度のヒトＣＤ８＋ＩＦＮγ＋細胞を示す��とを実証した。このことは、ＣＦＬＡＲ−単球により、消耗状態又は非活性化状態を媒介することが可能であることを示すものである。最後に、本発明者らは、ＧｖＨＤ罹患マウスにおけるＣＦＬＡＲ発現単球の注射が、ルシフェラーゼ発現単球と比較した場合に、循環Ｔ調節細胞（Ｔｒｅｇ）の拡大を誘導することを評価した（図７Ｃ）。
【０２１８】
実施例４：Ｒｏｓａ２６．ｖＦＬＩＰ；ＬｙｓＭｃｒｅマウスモデル
ＣＦＬＡＲに誘導される分子経路をよりよく理解するために、本発明者らは、ウイルス形態のＣＦＬＡＲを発現するトランスジェニックマウスモデル：Ｒｏｓａ２６．ｖＦＬＩＰノックインマウスを利用した。カポジ肉腫関連のヘルペスウイルスは、そのゲノム中においてＦＡＤＤ様インターフェロン変換酵素又はカスパーゼ８（ＦＬＩＣＥ）阻害タンパク質（ｖＦＬＩＰ）をコードする。Ｒｏｓａ２６．ｖＦＬＩＰノックインマウスを、内因性のＬｙｚ２プロモーター（ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ）の制御下において、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するマウスと交配し、その結果骨髄細胞系譜に制限されたｖＦＬＩＰ発現を有するマウスを得た。骨髄細胞及び脾細胞をＲｏｓａ２６．ｖＦＬＩＰ；ＬｙｓＭｃｒｅ及びＲｏｓａ２６．ｖＦＬＩＰマウスの両方から取得し、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によりＣＤ１１Ｂ＋  Ｌｙ６Ｇ−  Ｌｙ６Ｃｈｉｇｈ及びＣＤ１１Ｂ＋  Ｌｙ６Ｇ＋  Ｌｙ６Ｃｌｏｗサブセットを単離した。次いで、新しく単離した骨髄細胞を９６ウェルプレートに、トランスジェニック３７Ｂ７マウス由来の脾細胞の存在下で、培養物中の全細胞の２４％の最終濃度で蒔き、これら細胞の免疫抑制活性を評価した。（メラノーマ関連抗原ＴＲＰ２に特異的な操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むすべてのＣＤ８＋  Ｔ細胞を提示するマウスモデル。ＣＦＳＥ  １  μＭで標識＋ＴＲＰ−２１８０-１８８ペプチド（１μｇ／ｍｌ）の存在下でＣＤ４５．１＋脾細胞で１：１０に希釈。３日間の共培養の後、本発明者らは、ＦＡＣＳ−Ｃａｎｔｏ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）によるＦＡＣＳ解析を実施し、増殖の抑制を評価するために、プロットをＣＤ８＋  Ｔ細胞にゲーティングし、ＣＦＳＥを希釈した細胞のパーセンテージを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ  Ｉｎｃ．）を用いて評価した。次いで、増殖細胞のパーセンテージを使用し、式：１−（骨髄細胞がある場合の増殖（％）／骨髄細胞がない場合の増殖（％））×１００を用いて増殖の抑制のパーセントを計算した（図８）。
【０２１９】
実施例５：ｃ−ＦＬＡＲは、その抗アポトーシス機能から独立して免疫抑制プログラムを誘導する
健常ドナー（ＨＤ）のバフィーコートから開始して、本発明者らは、ＣＤ１４＋単球を精製し、ｃ−ＦＬＡＲコード化又はルシフェラーゼコード化レンチウイルスで感染させ、ｃ−ＦＬＡＲの免疫調節特性が、単球を単独で培養したとき及びＣＤ３／ＣＤ２８活性化ＰＢＭＣと共に培養したとき両方のコントロールと比較して、ｃ−ＦＬＡＲ発現単球の生存率の改善と相関しないことを実証した。実際、異なる時点における生存（７−ＡＡＤ−アネキシン−Ｖ−）ＣＤ１４＋細胞のパーセンテージは、ｃ−ＦＬＡＲ−単球又はルシフェラーゼ−単球間で有意に異ならず（図９ａ）、このことは、免疫調節活性が、少なくとも成熟単球においては、ｃ−ＦＬＡＲの抗アポトーシス特性から分離している可能性を示している。加えて、生存促進性と免疫抑制機能の誘導とを区別するために、本発明者らは、他の抗アポトーシス遺伝子のレンチウイルス性発現ベクターを生成し（即ち、Ｂｃｌ−２及びＢｃｌ−ｘＬ）、ヒト単球におけるその強制発現後に免疫抑制特性を試験した。図９ｂに示すように、ｃ−ＦＬＡＲの強制発現だけが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴ細胞活性化及び増殖を有意に抑制することができる。
【０２２０】
実施例６：単球における強制ｃ−ＦＬＡＲ発現は、ＭＤＳＣ関連分子プログラムを駆動する。
遺伝子オントロジー（ＧＯ）エンリッチメント分析を用いることにより、差次的に発現される遺伝子を、炎症、サイトカインネットワーク及びインターフェロンタンパク質に応答して上方制御された遺伝子、並びにＩＬ−１０経路、全体としてＮＦ−κＢ関連経路に関連するカテゴリーにおいて有意に濃縮した（図１０ａ，ｂ）。
【０２２１】
実施例７：ｃ−ＦＬＡＲは、骨髄細胞において正準のＮＦ−κＢ経路を活性化する。
ｃ−ＦＬＡＲの強制発現は、正準のＮＦ−κＢ経路をトリガーする。遺伝子発現データは、恐らくはＮＦ−κＢ経路にリンクする、予測外のｃ−ＦＬＡＲの転写活性及びシグナル伝達活性を示唆した。ｃ−ＦＬＡＲの制御下における分子プログラムを明らかにするために、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）ｃ−ＦＬＡＲ−コード化ＲＮＡを用いてＴＨＰ１単球性細胞を一過性にトランスフェクトした。合理的なのは、標的タンパク質の、持続性且つウイルス依存性の生成を誘導することであった；さらに、ＩＶＴ−ＲＮＡは自然免疫受容体及びＩ型インターフェロンの生成を活性化しない。合成ｃ−ＦＬＡＲ  ＲＮＡのＴＨＰ１細胞への強制導入は、これまでレンチウイルス発現ベクターに関して示されたデータと一貫する免疫抑制プログラムをトリガーした（図１１ａ）。ｃ−ＦＬＡＲ  ＲＮＡのトランスフェクションは、正準のＮＦ−κＢ活性化経路のメディエーターである、ＮＦ−κＢサブユニットｐ６５及びｐ５０の核転座を有意に促進し、一方ｐ５２サブユニットの転座には差異は検出されなかった（図１１ｂ）。ＮＦ−κＢシグナル伝達が、ＦＬＡＲの下流の免疫調節プログラムに必要かどうかを試験するために、本発明者らは、共に正準のＮＦ−κＢ活性化に不可欠なキナーゼＩＫＫα（Ｃｈｕｋによってコード化）、及びＩＫＫβ（Ｉｋｂｋｂによってコード化）を発現停止させた。本発明者らは、Ｔｇマウスから単離したｖ−ＦＬＡＲ発現Ｌｙ６Ｃ＋細胞の免疫抑制活性が、ＩＫＫα又はＩＫＫβの発現停止後に有意に低下することを実証した（図１１ｃ）。総括すると、本発明のデータは、ｃ−ＦＬＡＲが、ＮＦ−κＢ活性化により単球における免疫抑制プログラムを制御するシグナル伝達経路を活性化することを示すものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図５】
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【図６Ａ−Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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