(57)【要約】  以下：  （ａ）配列番号１のアミノ酸２１〜３０９に対して、少なくとも６５％の配列同一性を有するポリペプチド；  （ｂ）中度の緊縮条件下で、配列番号２のポリペプチドコード配列とハイブリーダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；  （ｃ）配列番号２のポリペプチドコード配列に対して、少なくとも６５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；および  （ｄ）脂肪分解酵素活性を有する（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリペプチドの断片からなる群から選択される、脂肪分解酵素活性を有するポリペプチド。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
（ａ）配列番号１のアミノ酸２１〜３０９に対して、少なくとも６５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）中度の緊縮条件下で、配列番号２のポリペプチドコード配列とハイブリーダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
（ｃ）配列番号２のポリペプチドコード配列に対して、少なくとも６５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；および
（ｄ）脂肪分解酵素活性を有する（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリペプチドの断片
からなる群から選択される、脂肪分解酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸２１〜３０９に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記アミノ酸配列Ｇ−Ｈ−Ｓ−Ｌ−Ｇの触媒セグメントを含む、請求項１〜２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、リパーゼおよびホスホリパーゼ活性を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
発現宿主において前記ポリペプチドを生成させる１つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクした、請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む核酸構築物または発現ベクター。
【請求項７】
前記ポリペプチドを生成させる１つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクした、請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチドを生成する方法であって、前記ポリペプチドの生産を促す条件下で、請求項７に記載の宿主細胞を培養するステップを含む方法。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む顆粒または安定化された液体。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の脂肪分解酵素と、以下：アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、α−アミラーゼ、マルトース生成α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、ガラクタナーゼ、グルカン１，４−α−マルトテトラヒドロラーゼ、グルカナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、マンナーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、リン脂質分解酵素、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、およびキシラーゼからなる群から選択される１種または複数の酵素を含む組成物。
【請求項１１】
前記１種または複数の酵素が、マルトース生成α−アミラーゼ、β−アミラーゼおよびグルカン１，４−α−マルトテトラヒドロラーゼからなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
焼成品を調製する方法であって、焼成の前に、請求項１〜４のいずれか１項に記載の脂肪分解酵素、請求項９に記載の顆粒もしくは安定化液体、または請求項１０〜１１のいずれか１項に記載の組成物を前記生地に添加するステップを含む方法。
【請求項１３】
前記脂肪分解酵素の量が、前記生地または前記バッター中の小麦粉ｋｇ当たり０．０１〜１００ｍｇ、好ましくは０．０５〜５０ｍｇ、より好ましくは０．１〜２５ｍｇ、さらに好ましくは０．１〜１５ｍｇの酵素タンパク質である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
製パンおよび／または製菓用途における請求項１〜４のいずれか１項に記載の脂肪分解酵素、請求項９に記載の顆粒もしくは安定化液体、または請求項１０〜１１のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項１５】
パン改良剤および／またはパティスリー・ミックスもしくはプレミックスにおける請求項１４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の参照
本出願は、コンピュータ読み取り可能な形態の配列表を含んでおり、これは本明細書において参照により援用される。
【０００２】
本発明は、新規の脂肪分解酵素；特に、生地に使用するための改善された特性を備える脂肪分解酵素に関し、これらは、例えば、焼成に通常使用される乳化剤の代わりに用いることができる。
【背景技術】
【０００３】
白色のクラム（ｃｒｕｍ）およびきめ細かいクラム構造は、パン；特にトーストパンなどの工場で包装されたパンの消費者選好にとって重要な特徴である。きめ細かいクラム構造は、通常、パン製造中に生地に乳化剤を添加することによって達成される。
【０００４】
近年、消費者は、乳化剤を含むベーカリー製品の消費を避ける傾向がある。
【０００５】
焼成における脂肪分解酵素の使用は、何年も前から知られている。
【０００６】
国際公開第９８／２６０５７号パンフレットは、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）由来のリパーゼ／ホスホリパーゼおよび焼成におけるそれらの使用を開示する。
【０００７】
国際公開第２００４／０９９４００号パンフレットは、さまざまな脂肪分解酵素と、生地粘性低下の目的で焼成におけるそれらの使用を開示する。
【０００８】
国際公開第１９９９／０５３７６９号パンフレットは、焼成後の初期に焼成品の柔らかさ向上の目的でのマルトース生成αアミラーゼおよびホスホリパーゼの使用を開示する。
【０００９】
焼成における脂肪分解酵素の使用は、遊離鎖脂肪酸の形成によって、不要なオフフレーバを生成し得る。
【００１０】
本発明は、オフフレーバを誘導することなく、白色のクラムおよびきめ細かいクラム構造を提供することができる新規の脂肪分解酵素に関する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、驚くことに、白色のクラムおよび非常にきめ細かいクラム構造を提供する新規の脂肪分解酵素を見出し、それと同時に、この脂肪分解酵素は、焼成に使用されるとき、オフフレーバをもたらさない。そこで、本発明者らは、
以下：
（ａ）配列番号１のアミノ酸２１〜３０９に対して、少なくとも６５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）中度の緊縮条件下で、配列番号２のポリペプチドコード配列とハイブリーダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
（ｃ）配列番号２のポリペプチドコード配列に対して、少なくとも６５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；および
（ｄ）脂肪分解酵素活性を有する（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリペプチドの断片
からなる群から選択される、脂肪分解酵素活性を有するポリペプチドを請求する。
【００１２】
一実施形態では、本発明における脂肪分解酵素は、配列番号１のアミノ酸２１〜３０９に対して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。
【００１３】
一実施形態では、本発明の脂肪分解酵素は、アミノ酸配列Ｇ−Ｈ−Ｓ−Ｌ−Ｇの触媒セグメントを含む。
【００１４】
一実施形態では、本発明の脂肪分解酵素は、リパーゼ、ホスホリパーゼおよび／またはガラクトリパーゼ活性を有し；特に、脂肪分解酵素は、リパーゼおよびホスホリパーゼ活性を有する。
【００１５】
一実施形態では、本発明者らは、本発明の脂肪分解酵素をコードする単離されたポリヌクレオチドを請求する。
【００１６】
一実施形態では、本発明者らは、発現宿主においてポリペプチドの生産を指令する１つまたは複数の制御配列と作動可能に連結された本発明の脂肪分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物または発現ベクターを請求する。
【００１７】
一実施形態では、本発明者らは、ポリペプチドの生産を指令する１つまたは複数の制御配列と作動可能に連結された本発明の脂肪分解酵素をコードするポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞を請求する。
【００１８】
一実施形態では、本発明者らは、ポリペプチドの生産を促す条件下で、宿主細胞を培養するステップを含む、本発明の脂肪分解酵素の生成方法を請求する。
【００１９】
一実施形態では、本発明者らは、本発明の脂肪分解酵素を含む顆粒または安定化された液体を請求する。
【００２０】
一実施形態では、本発明者らは、本発明の脂肪分解酵素と、以下：アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、α−アミラーゼ、マルトース生成α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、ガラクタナーゼ、グルカン１，４−α−マルトテトラヒドロラーゼ、グルカナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、マンナーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、およびキシラーゼからなる群から選択される１種または複数の酵素を含む組成物；中でも、本発明の脂肪分解酵素と、以下：マルトース生成α−アミラーゼ、β−アミラーゼおよびグルカン１，４−α−マルトテトラヒドロラーゼからなる群から選択される１種または複数の酵素を含む組成物；特に、本発明の脂肪分解酵素と、マルトース生成α−アミラーゼとを含む組成物を請求する。
【００２１】
一実施形態では、本発明者らは、焼成品を調製する方法であって、焼成の前に、本発明の脂肪分解酵素、本発明の顆粒または安定化液体、または本発明の組成物を生地に添加するステップを含む方法を請求する。
【００２２】
一実施形態では、本発明の脂肪分解酵素の量は、生地またはバッター（ｂａｔｔｅｒ）中の小麦粉ｋｇ当たり０．０１〜１００ｍｇ、好ましくは０．０５〜５０ｍｇ、より好ましくは０．１〜２５ｍｇ、さらに好ましくは０．１〜１５ｍｇの酵素タンパク質である。
【００２３】
一実施形態では、本発明者らは、製パンおよび／または製菓子用途における本発明の脂肪分解酵素の使用を請求する。
【００２４】
一実施形態では、本発明者らは、製パンおよび／または製菓子用途における本発明の脂肪分解酵素を含む顆粒または安定化された液体の使用を請求する。
【００２５】
一実施形態では、本発明者らは、製パンおよび／または製菓子用途における本発明の脂肪分解酵素と１種または複数の別の酵素とを含む組成物の使用を請求する。
【００２６】
一実施形態では、本発明者らは、パン改良剤および／またはパティスリー・ミックスもしくはプレミックスにおける本発明の脂肪分解酵素の使用を請求する。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
定義
脂肪分解酵素：「脂肪分解酵素」という用語は、リパーゼ、ホスホリパーゼおよび／またはガラクトリパーゼ活性を有する酵素（ＥＣ３．１．１）；特に、リパーゼおよびホスホリパーゼ活性を有する酵素を含む。脂肪分解酵素は、さらに他の活性も有し得る。用語「脂肪分解酵素」は、用語「脂肪分解酵素活性を有するポリペプチド」と置き換え可能に使用される。
【００２８】
本発明によれば、リパーゼ活性は、下記の方法によって測定することができる：
リパーゼ活性は、基質としてトリブチリンを用いて決定することができる。この方法は、酵素によるトリブチリンの加水分解に基づくものであり、加水分解中ｐＨを一定に維持するためのアルカリ消費が時間の関数として記録される。
【００２９】
１リパーゼ単位（ＬＵ）は、標準条件（即ち、３０℃；ｐＨ７．０；乳化剤として０．１％ｗ／ｖアラビアゴムおよび基質としての０．１６Ｍトリブチリンを用いて）下で、毎分１マイクロモルの滴定可能な酪酸を遊離する酵素の量として定義される。
【００３０】
リパーゼ活性を同定するための有用なプロトコルは、トリブチリンプレートを用いた次のものである：
【００３１】
トリブチリン基質ミックス：
１５ｍｌのグリセリントリブチレート（トリブチリン）
２ｇのアラビアゴム
２８５ｍｌのＨ２Ｏ
【００３２】
２プレートの使用の場合には：
・５ｍｌのトリブチリンミックス、５０ｍｌの０．０２Ｍユニバーサルバッファー（ｐＨ７．０）を添加
・６０℃に予熱
・６０秒のＵｌｔｒａ  ｔｕｒａｘにより滑らかなエマルジョンを取得
【００３３】
２％アガロース溶液を調製：
・１００ｍｌのＨ２Ｏにつき２ｇ
・溶液を沸騰させた後、６０℃にする（水浴を使用）
【００３４】
５０ｍｌのトリブチリン／５０ｍｌの２％アガロース含有バッファー溶液を混合し、２５０マイクロリットルの４％クリスタルバイオレットを添加する。プレートＯｍｎｉＴｒａｙ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｗｅｌｌカタログ番号２４２８１１およびＮｕｎｃ  ＴＳＰカタログ番号４４５４９７の各々に５０ｍｌずつ注ぐ。１０マイクロリットルのサンプルを適用することができる。プレートを約１時間および３時間３０℃でインキュベートすることができる。活性を写真撮影してもよい。
【００３５】
リパーゼ活性：トリアシルグリセロールリパーゼ活性（ＥＣ３．１．１．３）、即ち、トリグリセリド、例えば、トリブチリンにおけるカルボン酸エステル結合に対する加水分解活性。
【００３６】
ホスホリパーゼ活性：ホスホリパーゼ活性（Ａ１またはＡ２、ＥＣ３．１．１．３２または３．１．１．４）、即ち、レシチンなどのリン脂質における一方または両方の炭酸エステル結合に対する加水分解活性。
【００３７】
ガラクトリパーゼ活性：ガラクトリパーゼ活性（ＥＣ３．１．１．２６）、即ち、ＤＧＤＧ（ジガラクトシルジグリセリド）などのガラクト脂質におけるカルボン酸エステル結合に対する加水分解活性。
【００３８】
コード配列：「コード配列」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列を直接規定するポリヌクレオチドを意味する。コード配列の境界は、一般に、オープンリーディングフレームによって決定されるが、これは、ＡＴＧ、ＧＴＧ、またはＴＴＧなどの開始コドンで開始し、ＴＡＡ、ＴＡＧ、またはＴＧＡなどの終止コドンで終了する。コード配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはこれらの組合せのいずれであってもよい。
【００３９】
断片：「断片」という用語は、成熟型ポリペプチドまたはドメインのアミノおよび／またはカルボキシル末端から欠失された１つまたは複数（数個）のアミノ酸を有するポリペプチドを意味し；ここで、断片は脂肪分解酵素活性を有する。
【００４０】
宿主細胞：「宿主細胞」という用語は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物または発現ベクターによる形質転換、形質移入、形質導入などに対する感受性を有するあらゆる細胞型を意味する。
【００４１】
単離された：「単離された」という用語は、自然界においては生じない形態または環境にある物質を意味する。単離された物質の非限定的な例としては、（１）いずれかの非天然物質、（２）限定するものではないが、自然界において関連している天然構成成分の１種または複数種もしくは全てから少なくとも部分的に取り出されたいずれかの酵素、核酸、タンパク質、ペプチドもしくは補因子を含むいずれかの物質；（３）自然界において見出される物質に対して人為的に修飾されたいずれかの物質；または、（４）自然界で関連する他の成分に対して物質量の増加により修飾されたいずれかの物質（例えば、物質をコードする遺伝子の複数のコピー；物質をコードする遺伝子と自然界で関連するプロモータより強力なプロモータの使用）が挙げられる。単離された物質は、発酵ブロスサンプル中に存在してもよい。
【００４２】
成熟型ポリペプチド：「成熟型ポリペプチド」という用語は、Ｎ末端プロセシング、Ｃ末端切断、グリコシル化、リン酸化などの翻訳およびいずれかの翻訳後修飾後における、その最終形態にあるポリペプチドを意味する。
【００４３】
成熟型ポリペプチドコード配列：「成熟型ポリペプチドコード配列」という用語は、脂肪分解酵素活性を有する成熟型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００４４】
中度の緊縮条件：「中度の緊縮条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、４２℃、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片処理および修飾済みのサケ精子ＤＮＡ、ならびに、３５％ホルムアミドでのプレハイブリーダイゼーションおよびハイブリーダイゼーションを意味する。キャリア材料は、最終的に、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、５５℃で１５分間ずつ３回洗浄される。
【００４５】
中度−高度の緊縮条件：「中−高度の緊縮条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、４２℃、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片処理および修飾済みのサケ精子ＤＮＡ、ならびに、３５％ホルムアミドでのプレハイブリーダイゼーションおよびハイブリーダイゼーションを意味する。キャリア材料は、最終的に、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、６０℃で１５分間ずつ３回洗浄される。
【００４６】
高度の緊縮条件：「極めて高度の緊縮条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、４２℃、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片処理および修飾済みのサケ精子ＤＮＡ、ならびに、５０％ホルムアミドでのプレハイブリーダイゼーションおよびハイブリーダイゼーションを意味する。キャリア材料は、最終的に、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、６５℃で１５分間ずつ３回洗浄される。
【００４７】
極めて高度の緊縮条件：「極めて高度の緊縮条件」という用語は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的なサザンブロッティング法に続く、４２℃、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌ断片処理および修飾済みのサケ精子ＤＮＡ、ならびに、５０％ホルムアミドでのプレハイブリーダイゼーションおよびハイブリーダイゼーションを意味する。キャリア材料は、最終的に、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、７０℃で１５分間ずつ３回洗浄される。
【００４８】
配列同一性：２つのアミノ酸配列間の関連性は、「配列同一性」というパラメータによって表される。本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度は、好ましくはバージョン５．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて判定される。用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティおよびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長の同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性割合として用いられ、以下のように算出される：
（同等の残基×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数）
【００４９】
本発明の脂肪分解酵素活性を有するポリペプチドは、１つまたは複数（例えば、数個）の位置に改変、即ち、置換、挿入、および／または欠失を含んでもよい。置換とは、ある位置を占めるアミノ酸の異なるアミノ酸による置換を意味し；欠失とは、ある位置を占めるアミノ酸の除去を意味し；また、挿入とは、ある位置を占めるアミノ酸に隣接して、この直後に続くアミノ酸を付加することを意味する。
【００５０】
本発明の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、好ましくはバージョン５．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（前述のＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（前述のＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０）を用いて判定される。用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティおよびＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ  ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長の同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性割合として用いられ、以下のように算出される：
（同等のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップの総数）
【００５１】
改善された特性：有効量で生地に配合されると、本発明の脂肪分解酵素は、生地またはそれから得られる焼成品の１つもしくは複数の特性を改善することができる。
【００５２】
「改善された特性」という用語は、本明細書において、本発明の脂肪分解酵素が配合されていない生地、またはその生地から得られる製品と比較して、本発明の脂肪分解酵素の作用により改善された、生地および／またはその生地から得られる製品、特に焼成品の任意の特性と定義される。
【００５３】
改善された特性として、限定はされないが、焼成品のクラムの改善された白色度、焼成品の改善されたクラム構造、焼成品の改善されたクラム柔らかさ、焼成品の改善された風味、および／または焼成品の改善された抗劣化特性が挙げられる。
【００５４】
改善された特性は、本発明の脂肪分解酵素を添加して、または添加せずに調製された生地および／または焼成品の比較により決定することができる。
【００５５】
官能特性は、焼成産業において十分に確立された方法を用いて評価することができ、例えば、官能評価パネルの使用が挙げられる。
【００５６】
焼成品の改善されたクラム構造：「焼成品の改善されたクラム構造」という用語は、本明細書において、よりきめ細かいクラムを有する焼成品と定義される。改善されたクラムきめの細かさは、クラム中のより小さい細胞および／もしくはより薄い細胞壁ならびに／またはクラム中の細胞のより均一／均質な分布に関連し、通常、パン職人／官能評価パネルにより、または当技術分野では公知のデジタル画像解析（例えば、Ｃ−ｃｅｌｌ，Ｃａｌｉｂｒｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ、本発明の実施例２〜３に示すとおり）によって視覚的に評価される。
【００５７】
クラムの改善された白色度：よりきめ細かいクラム構造は、クラムをより白く見せる様式で光を反射するため、クラムのきめ細かさは、往々にしてパンクラムの白色度を測定することにより評価される。クラムの白色度は、例えば、カラースキャナーで測定されるＨｕｎｔｅｒＬａｂ  Ｌ−値を用いることによって、当技術分野で公知のように測定することができる。
【００５８】
焼成品の改善されたクラム柔らかさ：「焼成品の改善されたクラム柔らかさ」という用語は、「硬さ」の反対語であり、本明細書では、容易に圧縮される焼成品の特性として定義され、熟練した試験パン職人／官能評価パネルによって経験的に評価されるか、または当技術分野で公知のように、テクスチャーアナライザー（例えば、Ｓｔａｂｌｅ  Ｍｉｃｒｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｔｄ，Ｓｕｒｒｅｙ，ＵＫ製のＴＡＸＴ２またはＴＡ−ＸＴ  Ｐｌｕｓ）の使用により測定される。
【００５９】
焼成品の改善された風味：「焼成品の改善された風味」という用語は、訓練を受けた試験パネルおよび／または化学分析（例えば、ヘッドスペースＧＣ−ＭＳ分析）により評価する。焼成品の改善された風味は、焼成品のオフフレーバの低減を含む。
【００６０】
焼成品の改善された抗劣化：「焼成品の改善された抗劣化」という用語は、本明細書では、品質パラメータ、例えば、貯蔵中の柔らかさおよび／または弾力性の劣化速度が低下した焼成品の特性として定義される。
【００６１】
焼成品の体積：「焼成品の体積」という用語は、所与のパン１個の体積として測定される。この体積は、菜種置換法により決定することができる。
【００６２】
オフフレーバ：焼成品がオフフレーバを有するか否かという表現は、当技術分野で公知のように、訓練を受けた試験パネルおよび／または化学分析によって評価する。
【００６３】
本発明の脂肪分解酵素
本発明での使用に好適な脂肪分解酵素は、以下：
（ａ）配列番号１のアミノ酸２１〜３０９に対して、少なくとも６５％の配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）中度の緊縮条件下で、配列番号２のポリペプチドコード配列とハイブリーダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；
（ｃ）配列番号２のポリペプチドコード配列に対して、少なくとも６５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド；および
（ｄ）脂肪分解酵素活性を有する（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリペプチドの断片
からなる群から選択される、脂肪分解酵素活性を有するポリペプチドを含む。
【００６４】
本発明の目的のために、配列番号１に開示される成熟型ポリペプチドを用いて、別の脂肪分解酵素中の対応するアミノ酸残基を決定する。
【００６５】
別の脂肪分解酵素のアミノ酸配列を配列番号１に開示される成熟型ポリペプチドとアラインメントし、アラインメントに基づいて、配列番号１に開示される成熟型ポリペプチド中の任意のアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置番号を、好ましくはバージョン５．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて決定する。用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップエクステンションペナルティ、およびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。
【００６６】
一実施形態では、本発明の脂肪分解酵素は、配列番号１のアミノ酸２１〜３０９に対して、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。
【００６７】
一実施形態では、本発明の脂肪分解酵素は、アミノ酸配列Ｇ−Ｈ−Ｓ−Ｌ−Ｇの触媒三残基を含む。
【００６８】
本発明の脂肪分解酵素は、好ましくは、配列番号１のアミノ酸２１〜３０９を含むか、もしくはそれから構成され；またはその対立遺伝子変異体であり；または脂肪分解酵素活性を有するその断片である。
【００６９】
別の実施形態では、本発明は、極めて低度の緊縮条件下、低度の緊縮条件下、中度の緊縮条件下、中−高度の緊縮条件下、高度の緊縮条件下、極めて高度の緊縮条件下で、配列番号２の成熟型ポリペプチドコード配列とハイブリーダイズするポリヌクレオチドによりコードされる脂肪分解酵素活性を有する、単離されたポリペプチドに関する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【００７０】
配列番号２のポリヌクレオチドまたはそのサブ配列、ならびに、配列番号１のポリペプチドまたはその断片は、技術分野において周知である方法に従って、異なる属もしくは種の系統から脂肪分解酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを同定およびクローン化するために核酸プローブの設計に用いられ得る。特に、このようなプローブは、標準的なサザンブロッティング法の後に、含まれる対応する遺伝子を同定および単離するために、対象の細胞のゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡとのハイブリーダイゼーションに用いられることが可能である。このようなプローブは配列全体よりもかなり短いことが可能であるが、例えば、長さが少なくとも２５、少なくとも３５または少なくとも７０ヌクレオチドと少なくとも１５ヌクレオチドであるべきである。好ましくは、核酸プローブは、例えば、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチドまたは少なくとも９００ヌクレオチドの長さといった、少なくとも１００ヌクレオチドの長さである。ＤＮＡおよびＲＮＡプローブの両方が用いられることが可能である。プローブは、典型的には、対応する遺伝子を検出するために標識化される（例えば、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓ、ビオチンまたはアビジンで）。このようなプローブは本発明によって包含される。
【００７１】
このような他の系統から調製したゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリは、上記のプローブとハイブリーダイズし、脂肪分解酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡについてスクリーニングされ得る。このような他の系統由来のゲノムまたは他のＤＮＡは、アガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動、または、他の分離技術によって分離され得る。これらのライブラリからのＤＮＡまたは分離されたＤＮＡが、ニトロセルロースもしくは他の好適なキャリア材料に移され固定化され得る。配列番号１もしくはそのサブ配列とハイブリーダイズするクローンもしくはＤＮＡを同定するために、キャリア材料がサザンブロッティングに用いられ得る。
【００７２】
本発明の目的に関して、ハイブリーダイゼーションとは、極めて低度〜極めて高度の緊縮条件下で、（ｉ）配列番号２；（ｉｉ）配列番号２の成熟型ポリペプチドコード配列；（ｉｉｉ）その完全長相補体；または（ｉｖ）そのサブ配列に対応する標識核酸プローブに、ポリヌクレオチドがハイブリーダイズすることを意味する。核酸プローブがこれらの条件下でハイブリーダイズする分子は、例えば、Ｘ線フィルムまたは当分野では公知の他のいずれかの検出手段によって検出することができる。
【００７３】
別の実施形態では、本発明は、配列番号２の成熟型ポリペプチドコード配列に対して、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる脂肪分解酵素活性を有する、単離されたポリペプチドに関する。
【００７４】
別の実施形態では、本発明は、１つまたは複数（例えば、数個）の位置に置換、欠失および／または挿入を含む、配列番号１の成熟型ポリペプチドの変異体に関する。一実施形態では、配列番号１の成熟型ポリペプチドに導入されるアミノ酸置換、欠失および／または挿入の数は、２０以下、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９である。アミノ酸変異は、副次的な性質のものであってもよく、すなわち、タンパク質の折り畳みおよび／もしくは活性に顕著に影響しない保存的アミノ酸置換もしくは挿入；典型的には１〜３０アミノ酸の小さな欠失；アミノ−端子メチオニン残基などの小さなアミノ−もしくはカルボキシル−末端伸長；２０〜２５個以下の残基の小さなリンカーペプチド；または、ポリヒスチジン配列、抗原性エピトープもしくは結合性ドメインなどの変異もしくは他の機能を変化させることによって精製を促進させる小さな伸長であってもよい。
【００７５】
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシンおよびヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミンおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシンおよびバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン）、および、小さいアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニンおよびメチオニン）の群の範囲内である。特異活性を一般に改変しないアミノ酸置換は技術分野において公知であり、例えば、Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ  ａｎｄ  Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，１９７９，Ｉｎ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。頻繁に生じる置換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／ＧｌｕおよびＡｓｐ／Ｇｌｙである。
【００７６】
あるいは、アミノ酸変異は、ポリペプチドの物理化学的特性が改変されるような性質のものである。例えば、アミノ酸変異は、ポリペプチドの熱安定性を向上させ、基質特異性を改変し、至適ｐＨを変化させることであり得る。
【００７７】
ポリペプチドにおける必須アミノ酸は、部位特異的突然変異誘発またはアラニン走査突然変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５）などの技術分野において公知である手法に従って同定することが可能である。後者の技術においては、単一のアラニン突然変異が分子中のすべての残基に導入され、得られたミュータント分子が、分子の活性に重要であるアミノ酸残基を同定するために脂肪分解酵素活性についてテストされる。また、Ｈｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９−４７０８を参照のこと。
【００７８】
酵素または他の生物学的相互作用の活性部位は、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異が併用される、核磁気共嗚、結晶構造解析、電子回折、または光親和性標識などの技術によって判定される、構造の物理的分析によって判定されることも可能である。例えば、ｄｅ  Ｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６−３１２；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４；Ｗｌｏｄａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０９：５９−６４を参照のこと。必須アミノ酸のアイデンティティーは、関連ポリペプチドとのアラインメントから推測することもできる。
【００７９】
単一もしくは複数のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入は、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５３−５７；Ｂｏｗｉｅ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２１５２−２１５６；国際公開第９５／１７４１３号パンフレット；または、国際公開第９５／２２６２５号パンフレットにより開示されているものなどの公知の突然変異誘発方法、組換え法、および／または、シャッフリング法、これに続く関連するスクリーニング法を用いて行い、テストすることが可能である。用いられることが可能である他の方法としては、エラープローンＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０８３２−１０８３７；米国特許第５，２２３，４０９号明細書；国際公開第９２／０６２０４号パンフレット）、および、領域特異的突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ  ４６：１４５；Ｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，ＤＮＡ  ７：１２７）が挙げられる。
【００８０】
突然変異誘発／シャッフリング法は、宿主細胞によって発現されたクローン化突然変異誘発ポリペプチドの活性を検出するために、高スループット自動スクリーニング法と組み合わせることが可能である（Ｎｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：８９３−８９６）。活性ポリペプチドをコードする突然変異誘発ＤＮＡ分子は、宿主細胞から回収可能であり、技術分野における標準的な方法を用いて直ぐに配列決定されることが可能である。これらの方法では、ポリペプチドにおける個別のアミノ酸残基の重要性を直ぐに判定することが可能である。
【００８１】
ポリペプチドは、一のポリペプチドの一領域が、他のポリペプチドの一領域のＮ−末端またはＣ−末端で融合したハイブリッドポリペプチドであり得る。
【００８２】
ポリペプチドは、他のポリペプチドが本発明のポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端で融合した融合ポリペプチドまたは切断可能な融合ポリペプチドであり得る。融合ポリペプチドは、他のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを本発明のポリヌクレオチドに融合させることにより生成される。融合ポリペプチドを生成する技術は、技術分野において公知であると共に、フレーム中に収まり、融合ポリペプチドの発現が同一のプロモータおよびターミネータによる制御下にあるよう、ポリペプチドをコードするコード配列を連結するステップを含む。融合ポリペプチドはまた、翻訳後に融合ポリペプチドが形成されるインテインテクノロジーを用いて構築されてもよい（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：２５７５−２５８３；Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７７６−７７９）。
【００８３】
融合ポリペプチドは、２つのポリペプチドの間に切断部位をさらに含んでいることが可能である。融合タンパク質が分泌される際に、この部位が切断されて２つのポリペプチドが遊離される。切断部位の例としては、これらに限定されないが、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：５６８−５７６；Ｓｖｅｔｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６：２４５−２５１；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ−Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：３４８８−３４９３；Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：４９８−５０３；および、Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：３７８−３８１；Ｅａｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：５０５−５１２；Ｃｏｌｌｉｎｓ−Ｒａｃｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：９８２−９８７；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：２４０−２４８；および、Ｓｔｅｖｅｎｓ，２００３，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｗｏｒｌｄ  ４：３５−４８に開示されている部位が挙げられる。
【００８４】
脂肪分解酵素活性を有するポリペプチドのソース
本発明の脂肪分解酵素活性を有するポリペプチドは、いずれかの属の微生物から得られ得る。本発明の目的のために、「〜から得られる」という用語は、本明細書において用いられるところ、所与のソースに関連して、ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドがソースによって、または、ソースからのポリヌクレオチドが挿入された系統によって生成されることを意味することとする。一態様において、所与のソースから入手されるポリペプチドは細胞外に分泌される。
【００８５】
一態様において、ポリペプチドは、例えば、限定はされないが、バルサリア・ルブリコサ（Ｖａｌｓａｒｉａ  ｒｕｂｒｉｃｏｓａ）などのバルサリア属（Ｖａｌｓａｒｉａ）から得られる。
【００８６】
これらの種の系統は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ドイツ微生物細胞培養コレクション（ＤＳＭＺ：Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）、オランダ微生物株保存センター（ＣＢＳ：Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  Ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）、および、農業研究局特許培養物コレクション（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、北方リサーチセンター（ＮＲＲＬ：Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）などの多数の微生物保存機関において公共に容易に利用可能である。
【００８７】
ポリペプチドは、前述のプローブを用いて天然（例えば、汚染物、コンポスト、水など）から単離された微生物、または天然物質（例えば、汚染物、コンポスト、水など）から直接得られるＤＮＡサンプルを含む他のソースから同定し、取得することもできる。微生物およびＤＮＡを自然環境から直接単離する技術は、当分野において周知である。次いで、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、他の微生物または混合ＤＮＡサンプルのゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡライブラリを同じようにスクリーニングすることにより得られ得る。一旦、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがプローブで検出されたら、ポリヌクレオチドは、当業者に既知である技術を利用することにより単離またはクローン化されることが可能である。
【００８８】
ポリヌクレオチド
本発明はまた、本明細書に記載されるとおり、本発明の、ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドにも関する。
【００８９】
ポリヌクレオチドを単離またはクローニングするために用いられる技術は、当技術分野では公知であり、ゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡ、またはこれらの組合せからの単離を含む。ゲノムＤＮＡからのポリヌクレオチドのクローニングは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または発現ライブラリの抗体スクリーニングを用いて、共通の構造特徴を有するクローン化ＤＮＡ断片を検出することにより、実施することができる。例えば、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，ＰＣＲ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、連結活性化転写（ＬＡＴ）およびポリヌクレオチドに基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）などの他の核酸増幅方法を使用してもよい。ポリヌクレオチドは、バルサリア属（Ｖａｌｓａｒｉａ）、例えば、バルサリア・ルブリコサ属（Ｖａｌｓａｒｉａ  ｒｕｂｒｉｃｏｓａ）、または関連生物からクローニングすることができる。
【００９０】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾は、ポリペプチドに実質的に類似するポリペプチドを合成するのに必要であり得る。ポリペプチドに「実質的に同様」という用語は、ポリペプチドの非天然形態を指す。これらのポリペプチドは、天然のソースから単離されたポリペプチドとはいくらかの操作法で異なっていてもよく、例えば、特異活性、耐熱性、至適ｐＨなどが異なる変異体である。変異体は、配列番号２の成熟型ポリペプチドコード配列（例えば、そのサブ配列）として表されるポリヌクレオチドに基づいて構築され得、および／または、ポリペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらさないが、酵素の生成のために意図される宿主生体のコドン利用に対応するヌクレオチド置換の導入により、または、異なるアミノ酸配列をもたらし得るヌクレオチド置換の導入により構築され得る。ヌクレオチド置換の概要については、例えば、Ｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ２：９５−１０７を参照のこと。
【００９１】
核酸構築物
本発明はまた、制御配列に適合する条件下で好適な宿主細胞中にコード配列を発現させる１つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクした本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関する。
【００９２】
ポリヌクレオチドは、多様な方法で処置されてポリペプチドの発現がもたらされ得る。ベクターへ挿入される前のポリヌクレオチドの処置が、発現ベクターに応じて、望ましいか、または、必要であり得る。組換えＤＮＡ法を利用するポリヌクレオチドを修飾するための技術は技術分野において周知である。
【００９３】
制御配列は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のための宿主細胞によって認識されるポリヌクレオチドであるプロモータであり得る。プロモータは、ポリペプチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモータは、ミュータント、切断およびハイブリッドプロモータを含む宿主細胞において転写活性を示すいずれかのポリヌクレオチドであり得、ならびに、宿主細胞に対して相同性または非相同性である細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られ得る。
【００９４】
発現ベクター
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド、プロモータ、ならびに、転写および翻訳終止シグナルを含む組換え発現ベクターに関する。種々のヌクレオチドおよび制御配列が一緒になって、このような部位でポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの挿入または置換を可能とするために１つまたは複数の好都合な制限部位を含み得る組換え発現ベクターが生成される。または、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む核酸構築物を発現に適切なベクターに挿入することにより発現され得る。発現ベクターの形成において、コード配列は、コード配列が、発現に適切な制御配列と作動可能にリンクするようベクター中に位置されている。
【００９５】
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ法に簡便に供されることが可能であり、ポリヌクレオチドの発現をもたらすことが可能であるいずれかのベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞に対するベクターの親和性に応じることとなる。ベクターは、直鎖または閉鎖された環状プラスミドであり得る。
【００９６】
ベクターは、例えばプラスミド、染色体外要素、微小染色体または人工染色体といった、自己複製ベクター（すなわち、染色体外のエンティティとして存在し、その複製が染色体複製とは無関係なベクター）であり得る。ベクターは、自己複製を確実とするための何らかの手段を含有し得る。または、ベクターは、宿主細胞に導入された際に、ゲノム中に統合され、および、中に統合された染色体と一緒に複製されるものであり得る。しかも、単一のベクターもしくはプラスミド、または、一緒になって、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを含有する２つ以上のベクターもしくはプラスミド、または、トランスポゾンが用いられてもよい。
【００９７】
ベクターは、形質転換、形質移入、形質導入などされた細胞の選択を容易とする１つまたは複数の選択マーカを含有することが好ましい。選択マーカは、その生成物が、殺生剤またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体に対する原栄養性などをもたらす遺伝子である。
【００９８】
宿主細胞
本発明はまた、本発明のポリペプチドの生成をもたらす１つまたは複数の制御配列に作動可能にリンクした本発明のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞に関する。ポリヌクレオチドを含む構築物もしくはベクターは、構築物もしくはベクターが染色体性組み込み体として、もしくは、既述の自己複製余剰−染色体性ベクターとして維持されるよう宿主細胞に導入される。「宿主細胞」という用語は、複製の最中に生じる突然変異により親細胞と同等ではない親細胞のいずれかの子孫を包含する。宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードする遺伝子およびそのソースに大きく依存することとなる。
【００９９】
宿主細胞は、例えば、原核生物または真核生物といった、本発明のポリペプチドの組換え生成において有用ないずれかの細胞であり得る。
【０１００】
原核宿主細胞は、グラム陽性またはグラム陰性バクテリアのいずれかであり得る。グラム陽性バクテリアとしては、これらに限定されないが、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オセアノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。グラム陰性バクテリアとしては、これらに限定されないが、カムピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター属（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ネイッセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）およびウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）が挙げられる。
【０１０１】
細菌宿主細胞は、特にこれらに限定されないが、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・シルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシラス・フィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、古草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、およびバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）細胞を含むいずれかのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞であり得る。
【０１０２】
細菌宿主細胞はまた、特にこれらに限定されないが、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ）、およびストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ  ｓｕｂｓｐ．Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）細胞のいずれかのストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞を含むいずれかのストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞であり得る。
【０１０３】
細菌宿主細胞はまた、特にこれらに限定されないが、ストレプトマイセス・アウロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、およびストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）細胞を含むいずれかのストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞であり得る。
【０１０４】
宿主細胞はまた、哺乳類、昆虫、植物または真菌細胞などの真核生物であり得る。
【０１０５】
宿主細胞は真菌細胞であってもよい。本明細書において用いられる「真菌」は、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）および接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）、ならびに、卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）およびすべての栄養胞子形成真菌を含む（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｂｉｓｂｙ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｉ，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫに定義されているとおり）。
【０１０６】
真菌宿主細胞はイースト菌細胞であり得る。本明細書において用いられるところ、「イースト菌」は、子嚢菌酵母（エンドミセス目（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ））、担子菌イースト菌を含み、イースト菌は、不完全菌類（不完全酵母菌類（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ））に属する。イースト菌の分類は将来において変更される可能性があるため、本発明の目的について、イースト菌は、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ（Ｓｋｉｎｎｅｒ，，ＰａｓｓｍｏｒｅおよびＤａｖｅｎｐｏｒｔ編，Ｓｏｃ．Ａｐｐ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎｏ．９，１９８０）に記載されているとおりに定義されるものとする。
【０１０７】
イースト菌宿主細胞は、クルイベロマイセスラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、サッカロマイセスカルスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ジアスタチクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセス・ドウグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・オビホルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）またはヤロウイア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞などのカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞であり得る。
【０１０８】
真菌宿主細胞は糸状真菌細胞であり得る。「糸状菌」は、真菌植物門（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）および卵菌門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）亜門（前述のＨａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５で定義されているとおり）のすべてのフィラメント形を含む。糸状菌は、一般に、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナンおよび他の複雑な多糖類から組成される菌糸体壁によって特徴付けられる。栄養成長は菌糸の伸展によるものであり、および、炭素異化は絶対好気性である。対照的に、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのイースト菌による栄養成長は単細胞葉状体の出芽によるものであり、および、炭素異化は発酵性であり得る。
【０１０９】
糸状真菌宿主細胞は、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ブエルカンデラ属（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、セリポリオプシス属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリヌス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、コリオルス属（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスチクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロマイセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロケーテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、フレビア属（Ｐｈｌｅｂｉａ）、ピロマイセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、プレウロツス属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、シゾフィルム属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、テルモアスクス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トラメテス属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）またはトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞であり得る。
【０１１０】
例えば、糸状真菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニズランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ヤケイロタケ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ  ａｄｕｓｔａ）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシス・カレギエア（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｃａｒｅｇｉｅａ）、セリポリオプシス・ギルベスセンス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｇｉｌｖｅｓｃｅｎｓ）、セリポリオプシス・パンノシンタ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｐａｎｎｏｃｉｎｔａ）、セリポリオプシス・リブロサ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｒｉｖｕｌｏｓａ）、セリポリオプシス・スブルファ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｕｂｒｕｆａ）、セリポリオプシス・スブベルミスポラ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）、クリソスポリウム・イノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウム・ケラチノフィルム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウム・ルクノウェンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウム・メルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウム・パンニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム・クイーンスランジクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・トロピクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・ゾナツム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｚｏｎａｔｕｍ）、コプリヌス・シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、クリオルス・ヒルスツス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｈｉｒｓｕｔｕｓ）、フザリウム・バクテリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クロークウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウムグラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レチクランツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サムブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）���フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウムス・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・プルプロゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロケーテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フレビア・ラジアタ（Ｐｈｌｅｂｉａ  ｒａｄｉａｔａ）、プレウロツス・エリンギイ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ）、チエラビア・テルレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トラメテス・ビロサ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｉｌｌｏｓａ）、トラメテス・ベルシコロル（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）またはトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）細胞；特に、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）細胞であり得る。
【０１１１】
真菌細胞は、それ自体公知の様式でのプロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、および、細胞壁の再生を含むプロセスにより形質転換され得る。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主細胞の形質転換に好適な手法は、欧州特許第２３８０２３号明細書、Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１４７０−１４７４、ならびにＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１４１９−１４２２に記載されている。フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種の形質転換に好適な方法は、Ｍａｌａｒｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｅ  ７８：１４７−１５６および国際公開第９６／００７８７号パンフレットに記載されている。イースト菌は、Ｂｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇｕａｒｅｎｔｅ，Ｉｎ  Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．ａｎｄ  Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １９４，ｐｐ  １８２−１８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３；および、Ｈｉｎｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１９２０に記載の手法を用いて形質転換され得る。
【０１１２】
生成方法
本発明はまた：（ａ）ポリペプチドの生成を実施可能な条件下で、野生型形態でポリペプチドを生成する細胞を培養するステップ；および任意選択的に、（ｂ）ポリペプチドを回収するステップを含む本発明のポリペプチドを生成する方法に関する。
【０１１３】
本発明はまた：（ａ）ポリペプチドの生成を実施可能な条件下で本発明の組換え宿主細胞を培養するステップ；および任意選択的に、（ｂ）ポリペプチドを回収するステップを含む本発明のポリペプチドを生成する方法に関する。
【０１１４】
宿主細胞は、技術分野において既知である方法を用いてポリペプチドの生成に好適な栄養培地中で培養される。例えば、細胞は、好適な培地中ならびにポリペプチドの発現および／または単離が許容される条件下の、振盪フラスコ培養により、および、実験用もしくは産業用発酵槽における小規模もしくは大規模発酵（連続式、バッチ式、フェドバッチ式または固体状発酵を含む）により培養され得る。培養は、炭素および窒素源および無機塩を含む好適な栄養培地において、技術分野において公知である手法を用いて行われる。好適な媒体は、商業的な供給者から入手可能であるか、または、公開された組成に従って調製され得る（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ）。ポリペプチドが栄養培地に分泌される場合、ポリペプチドは培地から直接回収可能である。ポリペプチドが分泌されない場合、細胞ライセートから回収可能である。
【０１１５】
ポリペプチドは、脂肪分解酵素に特異的な技術分野において公知である方法を用いて検出され得る。これらの検出方法として、限定するものではないが、特定の抗体の使用、酵素産物の形成、または、酵素基質の消失などが挙げられる。例えば、酵素アッセイを用いてポリペプチドの活性を判定してもよい。
【０１１６】
ポリペプチドは技術分野において公知である方法を用いて回収され得る。例えば、ポリペプチドは、限定されないが、収集、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、または沈殿を含む従来の手法により栄養培地から回収され得る。一態様において、ポリペプチドを含む発酵ブロスを回収する。
【０１１７】
ポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチドを得るために、特にこれらに限定されないが、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシングおよびサイズ排除）、電気泳動的手法（例えば、分取等電点電気泳動）、較差溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または、抽出（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＪａｎｓｏｎおよびＲｙｄｅｎ編，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９を参照のこと）を含む技術分野において公知である多様な手法によって精製され得る。
【０１１８】
代替的な態様においては、ポリペプチドは回収されず、ポリペプチドを発現する本発明の宿主細胞がポリペプチドのソースとして用いられ得る。
【０１１９】
植物
本発明はまた、ポリペプチドまたはドメインを回収可能な量で発現および産生することができるように本発明のポリヌクレオチドを含む、単離された植物、例えば、トランスジェニック植物、植物部分、または植物細胞にも関する。ポリペプチドまたはドメインは、植物または植物部分から回収してもよい。あるいは、食品もしくは飼料の品質の改善、例えば、栄養価、嗜好性、および流動性の改善、または非栄養因子の破壊を目的として、ポリペプチドまたはドメインを含む植物または植物部分をそのまま用いてもよい。
【０１２０】
トラスジェニック植物は、双子葉植物（ｄｉｃｏｔ）または単子葉植物（ｍｏｎｏｃｏｔ）であってよい。単子葉植物の例として、牧草（ナガハグサ、イチゴツナギ（Ｐｏａ））、ウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ）、ライグラス（Ｌｏｌｉｕｍ）などの飼料草、ヌカボ（Ａｇｒｏｓｔｉｓ）などの寒地型牧草などの草、ならびに穀類、例えば、コムギ、オーツムギ、ライムギ、オオムギ、イネ、モロコシおよびトウモロコシ（コーン）が挙げられる。
【０１２１】
本発明はまた、（ａ）ポリペプチドまたはドメインの生成が実施可能な条件下でポリペプチドまたはドメインをコードするポリヌクレオチドを含むトランスジェニック植物または植物細胞を培養するステップ；および（ｂ）ポリペプチドまたはドメインを回収するステップを含む、本発明のポリペプチドまたはドメインを生成する方法にも関する。
【０１２２】
発酵ブロス製剤または細胞組成物
本発明はまた、本発明のポリペプチドを含む発酵ブロス製剤または細胞組成物にも関する。発酵ブロス製剤は、さらに、例えば、細胞（目的のポリペプチドを生成するために用いられる、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を含有する宿主細胞を含む）、細胞残屑、バイオマス、発酵培地および／または発酵産物など、発酵工程で使用される他の栄養素を含む。一部の実施形態では、組成物は、有機酸、死滅細胞および／または細胞屑、ならびに培地を含む、細胞死滅全ブロスである。
【０１２３】
本明細書で使用されるとき、「発酵ブロス」という用語は、回収および／もしくは精製を被らないか、または最小限被る、細胞発酵により生成される調製物を指す。例えば、微生物培養物を飽和まで増殖させ、タンパク質合成（例えば、宿主細胞による酵素の発現）および細胞培地への分泌を可能にする炭素制限条件下でインキュベートすると、発酵ブロスが生成される。発酵ブロスは、発酵の終了時に得られる発酵材料の未分画または分画成分を含有し得る。典型的には、発酵ブロスは、未分画であり、微生物細胞（例えば、糸状真菌細胞）を例えば遠心分離により除去した後に存在する使用済培地および細胞残屑を含む。一部の実施形態では、発酵ブロスは、使用済細胞培地、細胞外酵素、および生存および／または非生存微生物細胞を含有する。
【０１２４】
一実施形態では、発酵ブロス製剤および細胞組成物は、少なくとも１つの炭素数１〜５の有機酸および／またはその塩を含む第１の有機酸成分と、少なくとも１つの炭素数６以上の有機酸および／またはその塩を含む第２の有機酸成分とを含む。具体的な実施形態では、第１の有機酸成分は、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、その塩、またはこれらの２つ以上の混合物であり、第２の有機酸成分は、安息香酸、シクロヘキサンカルボン酸、４−メチル吉草酸、フェニル酢酸、その塩、またはこれらの２つ以上の混合物である。
【０１２５】
一態様において、組成物は、有機酸を含み、さらには、任意選択で死滅細胞および／または細胞残屑も含有する。一実施形態では、死滅細胞および／または細胞残屑を細胞死滅全ブロスから除去して、これらの成分を含まない組成物を提供する。
【０１２６】
発酵ブロス製剤または細胞組成物は、さらに防腐剤および／または抗菌（例えば、静菌）剤を含んでもよく、限定はされないが、ソルビトール、塩化ナトリウム、ソルビン酸カリウム、および当技術分野で公知のその他が挙げられる。
【０１２７】
細胞死滅全ブロスまたは組成物は、発酵の終了時に得られる発酵材料の未分画内容物を含んでもよい。典型的には、細胞死滅全ブロスまたは組成物は、微生物細胞（例えば、糸状真菌細胞）を飽和まで増殖させ、タンパク質合成を可能にする炭素制限条件下でインキュベートした後に存在する使用済培地および細胞残屑を含む。一部の実施形態では、細胞死滅全ブロスまたは組成物は、使用済細胞培地、細胞外酵素、および死滅糸状真菌細胞を含有する。一部の実施形態では、細胞死滅全ブロスまたは組成物中に存在する微生物細胞は、当技術分野で公知の方法を用いて、透過性にし、かつ／または溶解させることができる。
【０１２８】
本明細書に記載されるとおりの全ブロスまたは細胞組成物は、典型的には液体であるが、死滅細胞、細胞残屑、培地成分、および／または不溶性酵素などの不溶性成分を含有し得る。一部の実施形態では、不溶性成分を除去して、清澄化液体組成物を提供してもよい。
【０１２９】
本発明の全ブロスまたは細胞組成物は、国際公開第９０／１５８６１号パンフレットまたは同第２０１０／０９６６７３号パンフレットに記載される方法によって調製してもよい。
【０１３０】
本発明の脂肪分解酵素を含む組成物
本発明は、本発明の脂肪分解酵素を含む組成物に関する。
【０１３１】
本組成物は、さらに、１種もしくは複数の別の酵素、とりわけ、以下：アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、α−アミラーゼ、マルトース生成α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、ガラクタナーゼ、グルカナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、マンナーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、およびキシラーゼからなる群から選択される１種または複数の酵素；特に、マルトース生成α−アミラーゼを含んでもよい。
【０１３２】
組成物は、当技術分野で公知の方法に従って調製することができ、液体、ペーストまたは固体など、任意の物理的外観をしていてよい。例えば、組成物は、酵素、および／または医薬製品を製剤化する当技術分野で公知の方法を用いて、例えば、コーティングが施された、もしくは施されていない顆粒または微粒に製剤化してもよい。
【０１３３】
組成物に含有させようとする本発明の脂肪分解酵素および任意選択でいずれかの別の酵素は、当技術分野で公知の方法に従って、例えば、ポリペプチドの酸化を制限する抗酸化剤もしくは還元剤の添加により、組成物中のポリペプチドを安定化させることによって安定化してもよいし、または固体もしくは液体組成物中のポリペプチドの安定性に有益であることが公知であるＰＶＰ、ＰＶＡ、ＰＥＧもしくはその他の好適なポリマーなどのポリマーを添加することによって安定化させてもよい。
【０１３４】
本発明の脂肪分解酵素を顆粒または凝集粉末として製剤化する場合、粒子は、典型的に、２５〜５００マイクロメートルの範囲の粒子を９５（重量）％超含む狭い粒度分布を有する。
【０１３５】
粒子および凝集粉末は、通常の方法により、例えば、流動層造粒装置でキャリアに脂肪分解酵素を噴霧することによって調製してもよい。キャリアは、好適な粒径を有する粒子コアから構成され得る。キャリアは、可溶性または不溶性、例えば、塩（ＮａＣｌもしくは硫酸ナトリウムなど）、糖（スクロースもしくはラクトースなど）、糖アルコール（ソルビトールなど）、デンプン、コメ、コーングリッツ、もしくはダイズであってよい。組成物は、好ましくは、乾燥粉末または顆粒、特に、非散粉ダスティング顆粒の形態である。
【０１３６】
従って、本発明は、本発明の脂肪分解酵素を含む顆粒または安定化液体も提供する。
【０１３７】
他の酵素
任意選択で、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、α−アミラーゼ、マルトース生成α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、ガラクタナーゼ、グルカン１，４−α−マルトテトラヒドロラーゼ、グルカナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、マンナーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、および／またはキシラーゼなどの１種または複数の別の酵素を本発明の脂肪分解酵素と一緒に使用してもよい。
【０１３８】
本発明で使用するためのグルコアミラーゼは、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）Ｇ１またはＧ２グルコアミラーゼ（Ｂｏｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４），ＥＭＢＯ  Ｊ．３（５），ｐ．１０９７−１１０２）、国際公開第８４／０２９２１号パンフレットに開示されるＡ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ、またはＡ．オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）グルコアミラーゼ（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９１），５５  （４），ｐ．  ９４１−９４９）のアミノ酸配列に対して、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するグルコアミラーゼを含む。
【０１３９】
アミラーゼは、真菌性または細菌性、例えば、Ｂ．ステアロテルモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のマルトース生成α−アミラーゼまたはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、例えば、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）もしくはＢ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のα−アミラーゼ、例えば、植物（例えば、ダイズ）もしくは微生物源（例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ））由来のβ−アミラーゼ、または例えば、Ａ．オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）由来の真菌性α−アミラーゼであってもよい。
【０１４０】
マルトース生成α−アミラーゼはまた、例えば、国際公開第１９９９／０４３７９４号パンフレット；同第２００６／０３２２８１号パンフレット；または同第２００８／１４８８４５号パンフレットに開示されるとおりのマルトース生成α−アミラーゼであってもよい。
【０１４１】
好適な市販のマルトース生成α−アミラーゼとしては、ＮＯＶＡＭＹＬ，ＯＰＴＩＣＡＫＥ  ５０  ＢＧ、およびＯＰＴＩＣＡＫＥ  ３Ｄ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓから入手可能）が挙げられる。好適な市販の真菌性α−アミラーゼ組成物としては、例えば、ＢＡＫＥＺＹＭＥ  Ｐ  ３００（ＤＳＭから入手可能）ならびにＦＵＮＧＡＭＹＬ  ２５００  ＳＧ、ＦＵＮＧＡＭＹＬ  ４０００  ＢＧ、ＦＵＮＧＡＭＹＬ  ８００  Ｌ、ＦＵＮＧＡＭＹＬ  ＵＬＴＲＡ  ＢＧおよびＦＵＮＧＡＭＹＬ  ＵＬＴＲＡ  ＳＧ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓから入手可能）が挙げられる。
【０１４２】
抗劣化アミラーゼはまた、国際公開第１９９９／０５０３９９号パンフレット、同第２００４／１１１２１７号パンフレット、または同第２００５／００３３３９号パンフレットに開示されるアミラーゼのいずれかなど、例えば、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）由来のアミラーゼ（グルカン１，４−α−マルトテトラヒドラーゼ（ＥＣ３．２．１．６０））であってもよい。
【０１４３】
グルコースオキシダーゼは、真菌性グルコースオキシダーゼ、特に、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコースオキシダーゼ（例えば、ＧＬＵＺＹＭＥ（登録商標）、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓから入手可能）であってもよい。
【０１４４】
ヘミセルラーゼは、ペントサナーゼ、例えば、キシラナーゼであってもよく、これは、微生物起源、例えば、細菌、真菌由来、またはアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、特に、Ａ．アキュレアツス（Ａ．ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、Ａ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、もしくはＡ．ツビンゲンシス（Ａ．ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）由来、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、例えば、Ｔ．レエセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の株由来、またはフミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、例えば、Ｈ．インソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）の株由来であり得る。
【０１４５】
本発明で使用するための好適な市販のキシラーゼ調製物は、ＰＡＮＺＥＡ  ＢＧ、ＰＥＮＴＯＰＡＮ  ＭＯＮＯ  ＢＧおよびＰＥＮＴＯＰＡＮ  ５００  ＢＧ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓから入手可能）、ＧＲＩＮＤＡＭＹＬ  ＰＯＷＥＲＢＡＫＥ（ＤｕＰｏｎｔから入手可能）、ならびにＢＡＫＥＺＹＭＥ  ＢＸＰ  ５０００およびＢＡＫＥＺＹＭＥ  ＢＸＰ  ５００１（ＤＳＭから入手可能）が挙げられる。
【０１４６】
プロテアーゼは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、例えば、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来またはテルムス・アクウァーティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来であってもよい。
【０１４７】
生地
一態様において、本発明は、生地、または生地から調製される焼成品の調製方法を開示し、この方法は、本発明の脂肪分解酵素を生地に配合するステップを含む。
【０１４８】
別の態様では、本発明は、小麦粉と、水と、本発明の脂肪分解酵素を含有する有効量の焼成用組成物またはプレミックスとを含む生地を提供する。
【０１４９】
本発明は、さらに、生地または焼成品を調製する方法であって、有効量の本発明の焼成用組成物を生地に配合するステップを含み、これにより、脂肪分解酵素が配合されていない生地または焼成品と比較して、生地または生地から得られる焼成品の１つまたは複数の特性を改善する。
【０１５０】
「生地に配合する」という語句は、本明細書において、生地、生地を作製するための任意の材料、および／または生地を作製するための生地材料の任意の混合物に対する本発明の焼成用組成物の添加として定義される。言い換えれば、本発明の焼成用組成物は、生地の調製の任意のステップで添加してよく、また、１つ、２つもしくはそれを超えるステップで添加してもよい。組成物を生地の材料に添加し、これを混練した後、当技術分野で公知の方法を用いて焼成することにより、焼成品を作製することができる。
【０１５１】
「有効量」という用語は、本明細書において、生地および／または焼成品の少なくとも１つの目的の特性に測定可能な効果をもたらすのに十分な本発明の焼成用組成物の量として定義される。
【０１５２】
「生地」という用語は、本明細書において、混練する、またはローラで伸ばすのに十分な硬さの小麦粉と他の材料との混合物として定義される。本発明に関連して、用語「生地」にはバッターが包含される。
【０１５３】
本発明の生地は、任意の穀物粒または他の供給源から得られる小麦粉を含み、そうしたものとして、コムギ、エンマーコムギ、スペルトコムギ、ヒトツブコムギ、オオムギ、ライムギ、オーツムギ、トウモロコシ、モロコシ、コメ、キビ、アマランス、キヌア、およびキャッサバが挙げられる。
【０１５４】
生地は、さらに、他の一般的な生地材料、例えば、粉乳、グルテン、およびダイズなどのタンパク質；卵（全卵、卵黄、もしくは卵白のいずれか）；アスコルビン酸、臭素酸カリウム、ヨウ化カリウム、アゾジカーボンアミド（ＡＤＡ）または過硫酸アンモニウムなどの酸化剤；Ｌ−システインなどのアミノ酸；糖；塩化ナトリウム、酢酸カルシウム、硫酸ナトリウム、もしくは硫酸カルシウムなどの塩、および／または乳化剤も含み得る。
【０１５５】
生地は、粒状脂肪またはショートニングなどの脂肪（トリグリセリド）を含んでもよい。
【０１５６】
本発明の生地は、新鮮、冷凍または半焼成（プレベイク）であってもよい。
【０１５７】
本発明の生地は、通常にイースト発酵させた生地であるか、またはイースト発酵に付す生地である。
【０１５８】
生地は、化学膨張剤、例えば、ベーキングパウダー、重炭酸ナトリウムの添加、またはイーストの添加（生地の発酵）によるなどの多様な方法でイースト発酵させることができるが、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（パン用イースト）、例えば、市販のサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の株の培養物などの好適な酵母培養物を添加することにより、生地をイースト発酵させるのが好ましい。
【０１５９】
本発明の脂肪分解酵素は、焼成品体積、とりわけパン体積を有意に変化させないと考えられ；典型的には、体積は、０〜５％増減し得る。
【０１６０】
本発明の脂肪分解酵素の量は、生地中の小麦粉ｋｇ当たり０．０１〜１００ｍｇの酵素タンパク質、とりわけ小麦粉ｋｇ当たり０．０５〜５０ｍｇの酵素タンパク質、とりわけ小麦粉ｋｇ当たり０．１〜２５ｍｇの酵素タンパク質、特に生地中の小麦粉ｋｇ当たり０．１〜１５ｍｇの酵素タンパク質であってよい。
【０１６１】
乳化剤
一部の用途では、乳化剤が必要なく；一部の用途では、乳化剤が必要とされ得る。
【０１６２】
本発明での好適な乳化剤は、好ましくは、以下：モノグリセリドのジアセチル酒石酸エステル（ＤＡＴＥＭ）、ステアロイル乳酸ナトリウム（ＳＳＬ）、ステアロイル乳酸カルシウム（ＣＳＬ）、エトキシル化モノ−およびジグリセリド（ＥＭＧ）、蒸留モノグリセリド（ＤＭＧ）、ポリソルベート（ＰＳ）、ならびにモノコハク酸グリセリド（ＳＭＧ）からなる群から選択される乳化剤である。
【０１６３】
一部の用途では、本発明の脂肪分解酵素は、生地レシピに通常存在するすべての乳化剤の代わりに使用される。
【０１６４】
パン改良剤およびパティスリー・ミックスまたはプレミックス
本発明の脂肪分解酵素は、有利には、パン改良剤およびパティスリー・ミックスまたはプレミックスの一部であってもよい。
【０１６５】
「パン改良剤」（「生地コンディショナー」または「生地改良剤」または「改良剤」または「小麦粉処理剤」とも呼ばれる）は、典型的には、焼成品の食感、構造、体積、風味および新鮮さを改善すると共に、生地の機械加工性および安定性を改善する目的で、生地に添加される。
【０１６６】
典型的には、パン改良剤は、以下：１種もしくは複数の酵素（例えば、アミラーゼ（α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、生デンプン分解アミラーゼ）、キシラナーゼ（ヘミセルラーゼ）、セルラーゼ、ペクチナーゼ、プロテアーゼ、ペクチン酸リアーゼ、オキシダーゼ（ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、炭水化物オキシダーゼ、スルフルヒドリルオキシダーゼ）、リポキシゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ、ラッカーゼ、トランスグルタミナーゼ、アシルトランスフェラーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ）、１種もしくは複数の酸化剤または還元剤（例えば、アスコルビン酸、グルタチオン、システインなど）、１種もしくは複数の乳化剤（例えば、モノグリセリド（ＤＡＴＥＭ）のジアセチル酒石酸エステル、ステアロイル乳酸ナトリウム（ＳＳＬ）、ステアロイル乳酸カルシウム（ＣＳＬ）、モノステアリン酸グリセロール（ＧＭＳ）、ラムノリピド、レシチン、スクロエステル、胆汁酸塩など）、１種もしくは複数の脂質材料（例えば、バター、油、ショートニングなど）、１種もしくは複数の糖、１種もしくは複数の小麦粉または小麦粉画分、１種もしくは複数のビタミン（例えば、パントテン酸およびビタミンＥなど）、１種もしくは複数のゴム、ならびに／または１種もしくは複数の繊維供給源（例えば、オーツムギ繊維など）を含むか、またはこれらから構成される。
【０１６７】
ケーキ（パティスリー）ミックスは、典型的に、水、脂肪（油、バター、マーガリン）および卵を除く、ケーキレシピの全材料を含む。卵は、粉末形態でケーキ（パティスリー）ミックスに添加してもよい。ケーキ（パティスリー）プレミックスは、典型的に、小麦粉および砂糖の全部もしくは一部が除外されたケーキミックスである。
【０１６８】
焼成品
本発明の製法は、精白、淡色もしくは濃色のいずれかのタイプの、特に柔らかい特徴の生地から調製されるあらゆる種類の焼成品に使用することができる。例として、典型的には、ローフもしくはロール状のパン（特に、精白パン、全粒もしくはライムギパン）、パン、ピタパン、トルティーヤ、ケーキ、パンケーキ、ビスケット、ウエハース、クッキー、パイクラスト、蒸しパン、ピザなどがある。
【０１６９】
本発明を以下の実施例によりさらに詳しく説明するが、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
【実施例】
【０１７０】
実施例１
本発明の脂肪分解酵素のクローニング、発現および発酵
Ｆａｓｔ  ＤＮＡ  Ｓｐｉｎ  ｆｏｒ  Ｓｏｉｌ  Ｋｉｔ（カタログ番号６５６０−２００、ＭＰ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）を用いて、供給者のプロトコルに従い、バルサリア・ルブリコサ（Ｖａｌｓａｒｉａ  ｒｕｂｒｉｃｏｓａ）株からゲノムＤＮＡを抽出した。バルサリア・ルブリコサ（Ｖａｌｓａｒｉａ  ｒｕｂｒｉｃｏｓａ）株は、２００２年に中国湖南省（Ｈｕｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）の土壌から単離されたものである。当技術分野で公知のように、フォワードおよびリバースプライマー（配列番号３および４）を用いて、ゲノムＤＮＡからＰＣＲにより配列番号１および２を増幅した。
【０１７１】
配列番号１（シグナルペプチド：１〜２０）：
【化１】
2020508698.tif 000002
【０１７２】
配列番号２：
【化２】
2020508698.tif 000003
【０１７３】
配列番号３（プライマー）：
５’ＡＣＡＣＡＡＣＴＧＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＴＣＣＧＣＴＴＣＧＡＴＣＴＴＡＣＴＣＡＧＧ−３’
【０１７４】
配列番号４（プライマー）：
５’ＡＧＡＴＣＴＣＧＡＧＡＡＧＣＴＴＡＡＡＣＣＣＡＣＴＧＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＣＣ−３’
【０１７５】
ＧＦＸ（登録商標）ＰＣＲ  ＤＮＡおよびＧｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｈｉｌｌｅｒｏｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて、製造者の指示に従い、ＰＣＲ産物を精製した。ＩＮ−ＦＵＳＩＯＮ（商標）ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、製造者の指示に従い、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより事前に線状化した発現ベクターｐＤＡｕ１０９（国際公開第２００５／０４２７３５号パンフレット）に、配列番号２に対応する精製済ＰＣＲ産物をクローン化した。
【０１７６】
１μｌ体積の非希釈ライゲーション混合物を用いて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＭｕｌｔｉ  ｓｈｏｔ  ＴＯＰ  １０  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌ品番４４−００９１を形質転換した。ｍｌ当たり１００μｇのアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上で１コロニーを選択し、ｍｌ当たり１００μｇのアンピシリンを補充した２ｍｌのＬＢ培地中で一晩培養した。Ｊｅｔｑｕｉｃｋ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｏｍｅｄ  ＧｍｂＨ，Ｌｏｈｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、製造者の指示に従い、プラスミドＤＮＡを精製した。異種発現の前にサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）シーケンシングにより配列番号２配列を確認した。アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）宿主細胞での異種発現のために、１プラスミド（配列番号２を含む）を選択した。
【０１７７】
Ａ．オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）宿主細胞は、Ａ．オリゼー（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子をｐｙｒＧ遺伝子で破壊することによってｐｙｒＧ栄養要求性が回復されたアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＪａＬ３５５（国際公開第２００２／４０６９４号パンフレット）由来のａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）破壊遺伝子である。アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）のプロトプラストは、国際公開第９５／００２０４３号パンフレットに従って作製した。
【０１７８】
１００μｌのアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）プロトプラストを、クローン化配列番号２遺伝子を含む１〜２μｇのアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）発現ベクターと混合してから、２５０μｌの６０％ＰＥＧ４０００（Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（ポリエチレングリコール、分子量４，０００）、１０ｍＭＣａＣｌ２、および１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を穏やかに混合した。３７℃で３０分のインキュベーション後、４ｍｌの上層寒天（温度４０℃）を添加し、選択のためにＣＯＶＥプレート上にプロトプラストを塗布した。３７℃で４〜７日間のインキュベーション後、４つの形質転換体の胞子を９６ディープウェルプレート内の０．５ｍｌのＤＡＰ−４Ｃ−０１培地に接種した。３０℃で４〜５日間の培養後、培養ブロスをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析して、バルサリア・ルブリコサ（Ｖａｌｓａｒｉａ  ｒｕｂｒｉｃｏｓａ）由来の組換えタンパク質を最大量産生する形質転換体を同定した。
【０１７９】
単一コロニーを単離するために、０．０１％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００を含有するＣＯＶＥプレート上に配列番号２遺伝子を含む最良の形質転換体の胞子を塗布した。クローンの保存の前に塗布をもう１回繰り返した。
【０１８０】
精製のための発酵
前述のように構築したアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）形質転換体を、溝付き振盪フラスコ内の１５０ｍｌのＤＡＰ−４Ｃ−０１培地中で発酵させるが、これは、１５０ＲＰＭで回転する振盪プラットフォームインキュベータにおいて３０℃で３〜５日間インキュベートし、これを後述するアッセイでも使用した。
【０１８１】
使用する培地
ＬＢプレートは、１０ｇのＢａｃｔｏ−トリプトン、５ｇの酵母エキス、１０ｇの塩化ナトリウム、１５ｇのＢａｃｔｏ−寒天、および１リットルまでの脱イオン水から構成された。
【０１８２】
ＬＢ培地は、１０ｇのＢａｃｔｏ−トリプトン、５ｇの酵母エキス、および１０ｇの塩化ナトリウム、ならびに１リットルまでの脱イオン水から構成された。
【０１８３】
ＤＡＰ−４Ｃ−１
１１ｇのＭｇＳＯ４、７Ｈ２Ｏ
１ｇのＫＨ２ＰＯ４
２ｇのＣ６Ｈ８Ｏ７、Ｈ２Ｏ
２０ｇのデキストロース
１０ｇのマルトース
５．２ｇのＫ３ＰＯ４、Ｈ２Ｏ
０．５ｇの酵母エキス
０．５ｍｌのＫＵ６微量金属溶液（ＡＭＧ）（ＭＳＡ−ＳＵＢ−ＦＳ−００４２）
完全に溶解するまで混合する
１ｍｌのＤｏｗｆａｘ  ６３Ｎ１０を添加する
最大１０００ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水で体積を調節する
０．５ｇのＣａＣＯ３錠剤（１錠剤／２００ｍｌを添加）
【０１８４】
注入の前に、１５０ｍｌの各振盪フラスコを３．５ｍｌのリン酸水素ジアンモニウム（ＮＨ４）２ＨＰＯ４  ５０％、および５．０ｍｌの乳酸２０％に添加する。
【０１８５】
ＫＵ６微量金属溶液（ＡＭＧ）（ＭＳＡ−ＳＵＢ−ＦＳ−００４２）
６．８ｇのＺｎＣｌ２
２．５ｇのＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ
０．１３ｇの塩化ニッケル（無水）
１３．９ｇのＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ
８．４５ｇのＭｎＳＯ４．Ｈ２Ｏ
３ｇのＣ６Ｈ８Ｏ７．Ｈ２Ｏ
最大１０００ｍｌのイオン交換水
【０１８６】
ＣＯＶＥスクロースプレートは、３４２ｇのスクロース、２０ｇの寒天粉末、２０ｍｌのＣＯＶＥ塩溶液、および１リットルまでの脱イオン水から構成された。１５ｐｓｉで１５分のオートクレーブ処理により、培地を滅菌した（Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ，８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒｅｖｉｓｉｏｎ  Ａ，１９９８）。培地を６０℃まで冷却してから、１０ｍＭアセトアミド、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（５０μｌ／５００ｍｌ）を添加した。
【０１８７】
ＣＯＶＥ塩溶液は、２６ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２６ｇのＫＣＬ、２６ｇのＫＨ２ＰＯ４、５０ｍｌのＣＯＶＥ微量金属溶液、および１リットルまでの脱イオン水から構成された。
【０１８８】
ＣＯＶＥ微量金属溶液は、０．０４ｇのＮａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ、０．４ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１．２ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．７ｇのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．８ｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、１０ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、および１リットルまでの脱イオン水から構成された。
【０１８９】
配列番号１の特徴：
脂肪分解酵素（配列番号１）は、ペンタペプチド：Ｇ−Ｈ−Ｓ−Ｌ−Ｇに出現する触媒三残基を含む典型的な脂肪分解酵素ボックスを有する。
【０１９０】
本発明の脂肪分解酵素（配列番号１）は、トリブチリン、ＭＧＤＧ（モノガラクトシルジアシルグリセロール）、ＤＧＤＧ（ジガラクトシルジアシルグリセロール）、ＡＰＥ（Ｎ−アシルホスファチジルエタノールアミン）、およびＡＬＰＥ（Ｎ−アシルリソ−ホスファチジルエタノールアミン）に対する活性を示したが、これは、この酵素が、リパーゼ活性（トリブチリン）、ホスホリパーゼ活性（ＡＰＥ／ＡＬＰＥ）、およびガラクトリパーゼ活性（ＭＧＤＧ／ＤＧＤＧ）を有することを明らかにする。
【０１９１】
配列番号１のｐＨ活性プロフィール
精製済配列番号１を、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む０．５、０．１２５、０．０３１および０．００７８ｍｇ酵素タンパク質まで希釈した。
【０１９２】
２０μｌの希釈酵素サンプルを、９６ウェルマイクロタイタープレート内で、４０μｌのｐＨバッファー（０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．１Ｍリン酸ナトリウム、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ＮａＯＨ／ＨＣｌを用いてｐＨ２、３、４、５、６、７、８および９に調節）および４０μｌのオリーブ油基質溶液（１２．５ｍｇ／ｍｌのオリーブ油、０．１％アラビアゴム、１．５ｍＭＣａＣｌ２、Ｕｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘにより均質化）と混合した。
【０１９３】
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒにおいて３７℃で３０分間のインキュベーション後、１０μｌの反応停止試薬（１Ｍリン酸、１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を添加して、混合することにより反応を停止させた。
【０１９４】
次に、オリーブ油基質から放出された遊離脂肪酸の濃度を、ＮＥＦＡキット（Ｗａｋｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて数値化した：１００μｌのＲ１キット試薬（Ｗａｋｏ  ＮＥＦＡ−ＨＲ（２）Ｒ１  ＳＥＴ，４３４−９１７９５）を２５μｌの反応体積と混合した後、５４６ｎｍでの吸光度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓプレートリーダで読み取った。次に、５０μｌのＲ２キット試薬（Ｗａｋｏ  ＮＥＦＡ−ＨＲ（２）Ｒ２  ＳＥＴ，４３６−９１９９５）を添加し、室温で２０分のインキュベーション（振盪しながら）後、５４６ｎｍでの吸光度を再度読み取った。２つの読み取り値の差から、オレイン酸標準曲線（１、０．５、０．２５、０．１２５、０．０６２５、０．０３１２５および０ｍＭオレイン酸）による結果を用いて、遊離脂肪酸の濃度を算出した。線形範囲内の応答をもたらすリパーゼ濃度を用いて、各ｐＨでの活性を計算した。表Ａに、ｐＨ４（至適ｐＨ）での活性と比較した活性を示す。
【０１９５】
【表１】
2020508698.tif 000004
【０１９６】
実施例２
下記の材料を混合することにより、標準的なストレートドウ（ｓｔｒａｉｇｈｔ  ｄｏｕｇｈ）レシピに従って、パンサンプルを調製した（生地の量は、焼成試験の要件を満たすように増加させた）：
小麦粉
（Ｃｒｏｕｓｔｉ  ｆｌｏｕｒ，Ｄｏｓｓｃｈｅ  Ｍｉｌｌｓ，Ｄｅｉｎｚｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）                １０００ｇ
水道水                  ５７０ｇ
スクロース              ６０ｇ
酵母                    ３０ｇ
ナタネ油                ２０ｇ
食塩                    １９ｇ
プロピオン酸カルシウム  ５ｇ
アスコルビン酸          ４０ｐｐｍ
Ｎｏｖａｍｙｌ  １０．０００ＢＧ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）    ４０ｐｐｍ
Ｐａｎｚｅａ  Ｄｕａｌ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）    ２５ｐｐｍ
【０１９７】
下記の生地サンプルを作製し、３つのパンサンプルを各生地から調製した。Ｓｏｆｔ’ｒ  Ｓｉｌｋは、Ｐｕｒａｔｏｓ  ＮＶ（Ｇｒｏｏｔ−Ｂｉｊｇａａｒｄｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）からの市販のＤＭＧ製品であり、これを市販のＤＭＧ製品の効果の基準として用いた。Ｓｏｆｔ’ｒ  Ｓｉｌｋは、小麦粉含量に応じて添加した。
【０１９８】
【表２】
2020508698.tif 000005
【０１９９】
スパイラルミキサー（Ｄｉｏｓｎａ  ＳＰ１２，Ｄｉｅｒｋｓ  ＆  Ｓｏｅｈｎｅ，Ｏｓｎａｂｒｕｅｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で、低速（１７ｒｐｍ）で２分および高速（３５ｒｐｍ）で７分の材料を混合することにより、生地を調製した。混合した後、計量（６００ｇ）の前に生地を評価した。計量した生地をさらに１５分間静置した後、生地をシート状に伸ばした。シート状の生地を、開放型２２００ｍＬスチールパン（最大寸法：２６０ｍｍ（Ｌ）×１２５ｍｍ（Ｗ）×８０ｍｍ（Ｈ））に配置して、３５℃、８６％相対湿度で９０分間発酵させた。
【０２００】
発酵の後、生地を２３０℃のデッキオーブン（Ｗａｃｈｔｅｌ  Ｐｉｃｃｏｌｏ，Ｗａｃｈｔｅｌ  ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で２５分間焼成した。オーブンでは、焼成ステップの開始時に短い蒸気の噴出を使用した。焼成されたパンをスチールパンから取り出し、放置して室温で２時間冷ました。Ｖｏｌｓｃａｎ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  ６００レーザースキャナ（Ｓｔａｂｌｅ  Ｍｉｃｒｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｕｒｒｅｙ，ＵＫ）を用いて、パンサンプルの体積を決定した。続いて、パンサンプルを窒素と共に密封プラスチックバッグ（ＰＡ／ＰＥ、９０μｍ）に包装した。
【０２０１】
室温で２日間の保存後、電気スライサー（Ｇｒａｅｆ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍ１８２  Ｓｌｉｃｅｒ，Ｇｒａｅｆ  ＆  Ｃｏ  ＧｍｂＨ，Ａｒｎｓｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で各々のパンの中央部から２枚のスライスを切断した。Ｃ−Ｃｅｌｌ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０ソフトウェア（Ｃａｌｉｂｒｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＵＫ）を使用するＣ−セル計器を用いて、各スライスを１回測定した。
【０２０２】
Ｃ−セルでは、最適な画像品質を確実にするために、サンプルの高精細画像化および制御照明を使用する。スライス全体を分析して、サンプルの具体的な特徴を示す４８のデータ値および５つの処理画像を取得する。クラムの白色度は、パラメータ「スライス輝度」を用いて評価することができる。輝度測定値は、スライスにおける全画素の平均グレーレベルである。
【０２０３】
よりきめ細かいクラム構造は、より高い「スライス輝度」値をもたらすであろう。
【０２０４】
【表３】
2020508698.tif 000006
【０２０５】
【表４】
2020508698.tif 000007
【０２０６】
表３から、本発明の脂肪分解酵素を使用することによって、スライス輝度が対照より優れ、しかも、小麦粉ｋｇ当たり１ｍｇの脂肪分解酵素を使用したとき、１％Ｓｏｆｔ’ｒ  Ｓｉｌｋよりも高いことが認められる。
【０２０７】
実施例３
Ｃｒｏｕｓｔｉ  ｆｌｏｕｒの代わりにＫｉｎｇ  Ｍｉｄａｓ  Ｓｐｅｃｉａｌ  ｆｌｏｕｒ（Ａｒｄｅｎｔ  Ｍｉｌｌｓ  Ｃｏｒｐ．Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ，ＵＳ）を使用し、実施例２で添加した５７０ｇの水の代わりに６００ｇの水を添加した以外は、実施例２と同様にパンサンプルを調製した。さらに、この試験は、対照を含まず、１％Ｓｏｆｔ’ｒ  Ｓｉｌｋによる基準のみを含んだ。
【０２０８】
【表５】
2020508698.tif 000008
【０２０９】
【表６】
2020508698.tif 000009
【０２１０】
【表７】
2020508698.tif 000010
【０２１１】
表６から、本発明の脂肪分解酵素を使用することによって、スライス輝度が１％Ｓｏｆｔ’ｒ  Ｓｉｌｋよりも高い（小麦粉ｋｇ当たり０．４および１．０ｍｇの脂肪分解酵素の両方で）ことが認められる。
【０２１２】
実施例４
変異体の構築
配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号９を次のように構築した：１００の最も相同的なリガーゼに対して配列番号１とのアラインメントを実施した。アラインメントに基づいて、配列番号１が、他のリパーゼの平均から逸脱したいくつかの位置を選択した。所与の位置を、他のリパーゼに最も一般的に見られるアミノ酸に変異させた。リパーゼ変異体をコードする４つの合成遺伝子を設計し、遺伝子をアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）に発現させた。
【０２１３】
配列番号６（シグナルペプチド：１〜２０、成熟型配列の配列番号１と比較して、１３の変異）：
【化３】
2020508698.tif 000011
【０２１４】
配列番号７（シグナルペプチド：１〜２０、成熟型配列の配列番号１と比較して、２７の変異）：
【化４】
2020508698.tif 000012
【０２１５】
配列番号８（シグナルペプチド：１〜２０、成熟型配列の配列番号１と比較して、４１の変異）：
【化５】
2020508698.tif 000013
【０２１６】
配列番号９（シグナルペプチド：１〜２０、成熟型配列の配列番号１と比較して、５６の変異）：
【化６】
2020508698.tif 000014
【０２１７】
実施例５
様々な脂肪分解酵素を含むアメリカントーストの焼成
実施例２に記載したとおりにパンを作製した。
【０２１８】
配列番号６および配列番号７の脂肪分解酵素を０．４、１、および２ｍｇの酵素タンパク質（ＥＰ）／ｋｇ小麦粉の量で生地に添加した。脂肪分解酵素は、実施例４に記載したとおりに生成した。
【０２１９】
パンの体積およびＣ−セルパラメータ「スライス輝度」を測定した。
【０２２０】
下記の結果が得られた。
【０２２１】
【表８】
2020508698.tif 000015
【０２２２】
表７から、本発明の脂肪分解酵素（配列番号６および配列番号７）を使用することによって、スライス輝度が対照より高く、配列番号７は、１％Ｓｏｆｔ’ｒ  Ｓｉｌｋとほぼ同レベルであることを認めることができる。
【０２２３】
実施例６
様々な脂肪分解酵素を含むアメリカントーストの焼成
実施例２に記載したとおりにパンを作製した。
【０２２４】
脂肪分解酵素配列番号８および配列番号９を０．４、１、および２ｍｇの酵素タンパク質（ＥＰ）／ｋｇ小麦粉（配列番号８）ならびに０．４ｍｇの酵素タンパク質（ＥＰ）／ｋｇ小麦粉（配列番号９）の量で生地に添加した。脂肪分解酵素は、実施例４に記載したとおりに生成した。
【０２２５】
パンの体積、ＨｕｎｔｅｒＬａｂ  Ｌ値、およびＣ−セルパラメータ「スライス輝度」を測定した。ＨｕｎｔｅｒＬａｂは、サンプルを照らすための光源を使用し、異なる波長で光量を測定する比色分析分光測光法である。サンプルにより反射された光が格子に移動し、これが光をそのスペクトル成分に分解する。Ｈｕｎｔｅｒ  Ｌ  ａ  ｂ色空間は、３次元長方形の色空間であり、ここで、Ｌ（明度）軸：０は黒で、１００は白である。数値は、見えるものと相関する。
【０２２６】
各々のパンの２枚のスライスを使用し、ＨｕｎｔｅｒＬａｂを用いて各スライスを一度測定した。
【０２２７】
以下の結果が得られた。
【０２２８】
【表９】
2020508698.tif 000016
【０２２９】
表８から、本発明の脂肪分解酵素（配列番号８および配列番号９）を使用することによって、スライス輝度および／ＨｕｎｔｅｒＬａｂ  Ｌ値が対照より高いことを認めることができる。結論として、配列番号８および配列番号９の両方が、クラム白色度を導入した。
【０２３０】
実施例７
オフフレーバのないクッキー
表９の材料を用いてクッキーを調製した。
【０２３１】
【表１０】
2020508698.tif 000017
【０２３２】
製法：
材料をＨｏｂａｒｔミキサーにおいて速度１で２分間ブレンドした。生地をプラスチックフィルムで包装し、２５℃で一晩寝かせた。
【０２３３】
翌日、２枚のクッキングシートの間で生地を２ｍｍの厚さにローラで伸ばした。直径６．５ｃｍの生地片を切り取った。
【０２３４】
生地片をＭｉｗｅ  Ｃｏｎｄｏオーブンにおいて１８０℃で１１分間焼成した。焼成中、蒸気は加えなかった。
【０２３５】
クッキーの分析：
ＨＳ−ＳＰＭＥ−ＧＣ−ＭＳ技術を用いて、サンプルからの揮発性物質を決定した。揮発性成分の抽出のために、ジビニルベンゼン／カルボキセン／ポリジメチルシロキサン（ＤＶＢ／ＣＡＲ／ＰＤＭＳ）ファイバーを使用した。
【０２３６】
最初に、２５０ｒｐｍの混合速度と共にサンプルを８０℃で１０分間予熱した後、同じ混合速度の下、抽出を８０℃で３０分間実施した。
【０２３７】
Ｔｒｉｐｌｅ−Ａｘｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒおよび自動ＳＰＭＥ分析のために設計されたオートサンプラーＧｅｒｓｔｅｌ  ＭＰＳと共に、質量分析計５９７５Ｃ不活性ＭＳＤを装備したガスクロマトグラフＡｇｉｌｅｎｔ５８９０Ａを用いて、ＧＣ／ＭＳ分析を実施した。分析物の分離は、ＲＥＳＴＥＫ  Ｓｔａｂｉｌｗａｘキャピラリーカラム、３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．５０μｍフィルム厚さで実施した。カラムオーブンは次のようにプログラムした：初期温度８０℃を１０分、２２０℃まで１６℃／分で昇温し、２２０℃で８分間保持した。１ｍＬ／分の定流量で、キャリアガスとしてヘリウムを使用した。ＮＩＳＴ  ＭＳ  Ｓｅａｒｃｈ  ２．０ライブラリの質量スペクトルとの比較により、揮発性化合物を同定した。
【０２３８】
揮発性成分：酪酸、ヘキサン酸、オクタン酸、およびデカン酸は、強度のオフフレーバの原因である。表８は、酪酸、ヘキサン酸、オクタン酸、およびデカン酸の濃度を示す。
【０２３９】
【表１１】
2020508698.tif 000018
【０２４０】
表１０は、市販のリパーゼを用いて作製したクッキーが、本発明の脂肪分解酵素を用いて作製したクッキーと比較して、はるかに高い含量の酪酸、ヘキサン酸、オクタン酸、およびデカン酸を含むことを明らかにする。
【０２４１】
さらに、訓練を受けた焼成スタッフは、本発明の酵素を用いて作製したクッキーにオフフレーバを一切知覚することができなかったが、市販のリパーゼを用いて作製したクッキーには強度のオフフレーバを知覚することができた。
【０２４２】
実施例８
オフフレーバのないブリオッシュ
表１１の材料を用いてブリオッシュを調製した。
【０２４３】
【表１２】
2020508698.tif 000019
【０２４４】
製法：
次の製法を用いた：
Ｄｉｏｓｎａ  ＳＰ２４において、低速で６分、高速で１１分（４分の高速混合の後に初めて脂肪を添加する）様々な材料を混合する。最終生地温度は、約２７℃である。
【０２４５】
バルク発酵を２５℃の周囲温度で１０分間実施する。
【０２４６】
５００ｇまで生地を計量する。
【０２４７】
手でパンを成形する。
【０２４８】
中間発酵を２５℃で２０分間実施する。
【０２４９】
Ｒ４．５およびＬ１６のＪａｃ  Ｕｎｉｃで成形する。
【０２５０】
Ｋｏｍａ発酵室において２８℃および９５％ＲＨで１６５分間発酵させる。
【０２５１】
Ｍｉｗｅ  Ｃｏｎｄｏオーブンにおいて２００℃で３０分間焼成する。
【０２５２】
ブリオッシュを９０分間冷まし、プラスチックバッグでパンを包装する。
【０２５３】
ブリオッシュ分析：
ブリオッシュに対して揮発性物質（実施例４に記載したのと同じ揮発性物質）の分析を実施した。
【０２５４】
表１２は、酪酸、ヘキサン酸、オクタン酸、およびデカン酸の濃度を示す。
【０２５５】
【表１３】
2020508698.tif 000020
【０２５６】
表１２は、市販のリパーゼを用いて作製したブリオッシュが、本発明の脂肪分解酵素を用いて作製したブリオッシュと比較して、高い含量の酪酸、ヘキサン酸、オクタン酸、およびデカン酸を含むことを明らかにする。
【０２５７】
さらに、訓練を受けた焼成スタッフは、本発明の酵素を用いて作製したブリオッシュにオフフレーバを一切知覚することができなかったが、市販のリパーゼを用いて作製したブリオッシュには強度のオフフレーバを知覚することができた。
【０２５８】
酵素（Ｅ＆Ｆ）を用いて作製したブリオッシュは、バターだけを含むブリオッシュよりもきめ細かいクラムをもたらした（訓練を受けた焼成スタッフにより判断された）ことに留意すべきである。
【０２５９】
実施例９
本発明の酵素を用いて調製したパン
表１３の材料を用いてパンを調製した。
【０２６０】
【表１４】
2020508698.tif 000021
【０２６１】
製法：
次の製法を用いた：
Ｄｉｏｓｎａ  ＳＰ２４において、低速で２分、高速で７分かけて様々な材料を混合する。最終生地温度は、約２６℃である。
【０２６２】
バルク発酵を２５℃の周囲温度で５分間実施する。
【０２６３】
６００ｇの生地を計量する。
【０２６４】
手でパンを成形する。
【０２６５】
中間発酵を２５℃で１５分間実施する。
【０２６６】
Ｒ４．５およびＬ１５のＪａｃ  Ｕｎｉｃで成形する。
【０２６７】
Ｋｏｍａ発酵室において３５℃および９５％ＲＨで１１０分間発酵させる。
【０２６８】
Ｍｉｗｅ  Ｃｏｎｄｏオーブンにおいて２２０／２３０℃（超／未満）で２５分間焼成する。
【０２６９】
パンを１２０分間冷まし、プラスチックバッグでパンを包装する。
【０２７０】
パンの食感測定：
硬さ測定のために、Ｓｔａｂｌｅ  Ｍｉｃｒｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製のＴＡ．ＸＴ（ＴＡ．ＸＴ  ｐｌｕｓ）を使用した。２ｍｍ／ｓの速度を用い、直径２５ｍｍのプローブで１０の反復（異なるパン）を測定し、パンクラム中に全高の２５％の力で圧縮した。
【０２７１】
硬さ測定値を表１４に示す。
【０２７２】
【表１５】
2020508698.tif 000022
【０２７３】
これらの結果から、本発明の酵素を用いて作製したパンは、参照よりも有意に柔らかいことがわかる。市販のリパーゼを用いて作製したパンは、柔らかさが参照と同様である。
【配列表】
2020508698000001.app
【国際調査報告】
2020508698.tif 000023
2020508698.tif 000024
2020508698.tif 000025
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