(57)【要約】本発明は、（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合できる少なくとも１つの部分と（ｂ）テネイシンＣ（ＴｎＣ）に特異的に結合できる少なくとも１つの部分とを含む新規の二重特異性抗原結合分子、並びにこのような分子の製造方法及び使用方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
二重特異性抗原結合分子であって、
（ａ）抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、ＯＸ４０に特異的に結合できる少なくとも１つの部分、並びに
（ｂ）抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、テネイシンＣ（ＴｎＣ）に特異的に結合できる少なくとも１つの部分
を含む二重特異性抗原結合分子。
【請求項２】
（ｃ）安定な結合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃ領域
を更に含む、請求項１に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項３】
Ｆｃ領域が、抗体のＦｃ受容体への結合アフィニティー及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１又は２に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項４】
（ｉ）配列番号２及び配列番号３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号４及び配列番号５から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、並びに
（ｉｉｉ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨと、
（ｉｖ）配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、並びに
（ｖｉ）配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２４から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬと
を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項５】
ＯＸ４０に特異的に結合できる部分が、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５及び配列番号３７から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６及び配列番号３８から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項６】
ＯＸ４０に特異的に結合できる部分が、
（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｉｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号３０のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｖ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｖｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｖｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項７】
ＴｎＣに特異的に結合できる部分が、
（ｉ）配列番号４０及び配列番号４１から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号４２及び配列番号４３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、並びに
（ｉｉｉ）配列番号４４及び配列番号４５から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨと、
（ｉｖ）配列番号４６及び配列番号４７から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｖ）  配列番号４８及び配列番号４９から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、並びに
（ｖｉ）配列番号５０及び配列番号５１から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬと
を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項８】
ＴｎＣに特異的に結合できる部分が、配列番号５２及び配列番号５４から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号５３及び配列番号５５から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む、請求項１にから７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項９】
（ｉ）配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５又は配列番号３７から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６又は配列番号３８から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＯＸ４０に特異的に結合できる少なくとも１つの部分と、
（ｉｉ）配列番号５２又は配列番号５４から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５３又は配列番号５５から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＴｎＣに特異的に結合できる少なくとも１つの部分と
を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１０】
（ａ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＯＸ４０に特異的に結合できる少なくとも１つの部分、並びに
（ｂ）
（ｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｉｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む、ＴｎＣに特異的に結合できる少なくとも１つの部分
を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１１】
Ｆｃ領域がＩｇＧ、特にＩｇＧ１  Ｆｃ領域又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域である、請求項２から１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１２】
Ｆｃ領域がＦｃ領域の第１及び第２のサブユニットの結合を促進する改変を含む、請求項２から１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１３】
（ａ）Ｆｃ領域に連結しており、ＯＸ４０に特異的に結合できる少なくとも２つのＦａｂ断片と、
（ｂ）Ｆｃ領域のＣ末端に連結しており、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、ＴｎＣに特異的に結合できる少なくとも１つの部分と
を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１４】
（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合できるＦａｂ断片のＶＨ及びＣＨ１ドメインと、Ｆｃ領域サブユニットとをそれぞれが含む２つの重鎖、
（ｂ）ＯＸ４０に特異的に結合できるＦａｂ断片のＶＬ及びＣＬドメインをそれぞれが含む２つの軽鎖、
（ｃ）ＴｎＣに特異的に結合できる２つのＦａｂ断片であって、そのＦａｂ断片の一方が（ａ）の２つの重鎖のうちの一方のＣ末端に連結し、Ｆａｂ断片のうちのもう一方が（ａ）の２つの重鎖のうちのもう一方のＣ末端に連結しているＦａｂ断片
を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１５】
ＯＸ４０に特異的に結合できる４つのＦａｂ断片を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１６】
（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合できるＦａｂ断片の２つのＶＨドメイン及び２つのＣＨ１ドメインと、Ｆｃ領域サブユニットとをそれぞれが含む２つの重鎖、
（ｂ）ＯＸ４０に特異的に結合できるＦａｂ断片のＶＬ及びＣＬドメインをそれぞれが含む４つの軽鎖、並びに
（ｃ）ＴｎＣに特異的に結合できる部分のＶＨ及びＶＬであって、ＶＨが（ａ）の２つの重鎖のうちの一方のＣ末端に連結し、ＶＬが（ａ）の２つの重鎖のうちのもう一方のＣ末端に連結しているＶＨ及びＶＬ
を含む、請求項１から１３のいずれか一項又は１５に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１７】
（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合できるＦａｂ断片の２つのＶＨドメイン及び２つのＣＨ１ドメインと、Ｆｃ領域サブユニットとをそれぞれが含む２つの重鎖、
（ｂ）ＯＸ４０に特異的に結合できるＦａｂ断片のＶＬ及びＣＬドメインをそれぞれが含む４つの軽鎖、並びに
（ｃ）ＴｎＣに特異的に結合できる２つのＦａｂ断片であって、そのＦａｂ断片の一方が（ａ）の２つの重鎖のうちの一方のＣ末端に連結し、Ｆａｂ断片のうちのもう一方が（ａ）の２つの重鎖のうちのもう一方のＣ末端に連結しているＦａｂ断片
を含む、請求項１から１３のいずれか一項又は１５に記載の二重特異性抗原結合分子。
【請求項１８】
二重特異性抗原結合分子であって、
（ｉ）それぞれが配列番号２１３のアミノ酸配列を含む２つの重鎖と、それぞれが配列番号２１２のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖と、それぞれが配列番号２１４のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖とを含む二重特異性抗原結合分子、
（ｉｉ）それぞれが配列番号２１５のアミノ酸配列を含む２つの重鎖と、それぞれが配列番号２１２のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖と、それぞれが配列番号２１６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖とを含む二重特異性抗原結合分子、
（ｉｉｉ）配列番号２２２のアミノ酸配列を含む第１の重鎖と、配列番号２２３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖と、それぞれが配列番号２１２のアミノ酸配列を含む４つの軽鎖とを含む二重特異性抗原結合分子、及び
（ｉｖ）それぞれが配列番号２２５のアミノ酸配列を含む２つの重鎖と、それぞれが配列番号２２４のアミノ酸配列を含む４つの軽鎖と、それぞれが配列番号２２６のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖とを含む二重特異性抗原結合分子
から成る群(the group consisting of comprising)より選択される二重特異性抗原結合分子。
【請求項１９】
請求項１から１８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１９のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２１】
請求項１９に記載のポリヌクレオチド又は請求項２０に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２２】
二重特異性抗原結合分子を製造する方法であって、二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で請求項２１に記載の宿主細胞を培養することと、二重特異性抗原結合分子を単離することとを含む、方法。
【請求項２３】
請求項１から１８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子と薬学的に許容される少なくとも１種の添加剤とを含む薬学的組成物。
【請求項２４】
医薬としての使用のための、請求項１から１８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子、又は請求項２３に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
（ｉ）Ｔ細胞応答を刺激すること、
（ｉｉ）活性化Ｔ細胞の生存を維持すること、
（ｉｉｉ）感染症の治療、
（ｉｖ）がんの治療、
（ｖ）がんの進行を遅らせること、又は
（ｖｉ）がんに罹患している患者の生存を延長させること
における使用のための、請求項１から１８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は請求項２３に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
がんの治療における使用のための、請求項１から１８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は請求項２３に記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
がんの治療のための医薬の製造における、請求項１から１８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は請求項２３に記載の薬学的組成物の使用。
【請求項２８】
がんを有する個体の治療方法であって、請求項１から１８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は請求項２３に記載の薬学的組成物の有効量を該個体に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合可能な少なくとも１つの部分と（ｂ）テネイシンＣ（ＴｎＣ）に特異的に結合可能な少なくとも１つの部分とを含む新規の二重特異性抗原結合分子に関する。本発明は更に、このような分子を生成する方法及びそれを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーのいくつかのメンバーは、初期Ｔ細胞活性化後にＴ細胞応答を維持する働きをすることから、免疫系の組織及び機能に極めて重要な役割を果たす。ＣＤ２７、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＨＶＥＭ、ＣＤ３０及びＧＩＴＲは、Ｔ細胞に共刺激作用を及ぼし得る。すなわち、初期Ｔ細胞活性化後にＴ細胞応答を維持する（Watts T.H. (2005) Annu. Rev. Immunol. 23, 23-68）。これらの共刺激ＴＮＦＲファミリーメンバーの作用は、多くの場合、機能的、時間的又は空間的に、ＣＤ２８の作用から、及び互いから分離され得る。異なる共刺激分子によるＴ細胞活性化／生存シグナルの連続的及び一時的な調節は、Ｔ細胞生存の厳密な制御を維持しながら応答に持続性をもたせる働きをすることができる。疾患の状態によって、共刺激性ＴＮＦファミリーのメンバーを介した刺激は、疾患を悪化させることも改善することもある。このような複雑さにもかかわらず、ＴＮＦＲファミリー共刺激分子の刺激又は遮断は、がん、感染症、移植及び自己免疫を含むいくつか用途に有望である。
【０００３】
いくつかの共刺激分子の中でも、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリーメンバーＯＸ４０（ＣＤ１３４）は、エフェクター及びメモリーＴ細胞の生存と恒常性において重要な役割を果たす（Croft M. et al. (2009), Immunological Reviews 229, 173-191）。ＯＸ４０（ＣＤ１３４）は複数の細胞型において発現し、感染、腫瘍及び自己抗原に対する免疫応答を調節し、その発現はＴ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、好中球の表面で実証されていて（Baumann R. et al. (2004), Eur. J. Immunol. 34, 2268-2275）、様々な刺激シグナルに応答して厳密に誘導可能又は強く上方制御されることを示している。該分子の機能活性は、全てのＯＸ４０発現細胞型で実証されており、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＯＸ４０媒介活性の複雑な調節を示唆している。Ｔ細胞受容体誘発と組み合わさった、ＯＸ４０のその天然リガンド又はアゴニスト抗体によるＴ細胞への関与は、ＰＩ３Ｋ及びＮＦκＢシグナル伝達経路の相乗的活性化をもたらす（Song J. et al. (2008) J. Immunology 180(11), 7240-7248）。ひいては、これにより増殖が促進され、サイトカイン受容体及びサイトカイン産生が増加し、活性化Ｔ細胞の生存が向上した。エフェクターＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＯＸ４０の共刺激活性に加えて、ＯＸ４０誘発がＴ調節細胞の発達と免疫抑制機能を阻害することが最近示された。この作用は、少なくとも部分的に、抗腫瘍又は抗微生物免疫応答に対するＯＸ４０の活性を増強する役割を果たしている可能性がある。ＯＸ４０の関与がＴ細胞集団を拡大し、サイトカイン分泌を促進し、Ｔ細胞メモリーを維持し得ることから、抗体及びＯＸ４０Ｌリガンドの可溶型を含むアゴニストが様々な前臨床腫瘍モデルにおいて成功裡に使用されている（Weinberg et al. (2000), J. Immunol. 164 (2160-2169）。
【０００４】
入手可能な前臨床及び臨床データは、がんに対する効果的な内因性免疫応答を誘導及び増強できる、共刺激ＴＮＦＲファミリーメンバー（ＯＸ４０及び４−１ＢＢなど）の効果的なアゴニストに対するニーズが存在することを明確に実証している。但し、作用が単一の細胞型に限定されたり、又は単一の機構を介して働いたりすることはほとんどなく、細胞間及び細胞内シグナル伝達機構を解明するために設計された研究により、複雑さが増していることが明らかになった。したがって、好ましくは単一の細胞型に作用する「標的」アゴニストの必要性が存在する。本発明の抗原結合分子は、腫瘍特異的又は腫瘍関連標的への優先的結合が可能な部分を、共刺激性ＴＮＦ受容体へのアゴニスト結合が可能な部分と組み合わせる。本発明の抗原結合分子は、効果的にだけでなく、所望の部位で非常に選択的にＴＮＦ受容体を作動させることができ、そのため望ましくない副作用を減らすことができる。
【０００５】
テネイシン類は、脊椎動物に見られる、高度に保存された大きな多量体細胞外マトリックス（ＥＣＭ）糖タンパク質のファミリーである。４つのテネイシンパラログは、哺乳類において同定されており、テネイシンＣ（ＴｎＣ）、テネイシンＲ、テネイシンＸテネイシンＷと呼ばれている。テネイシンファミリータンパク質は、Ｎ末端の７アミノ酸繰り返し、上皮成長因子（ＥＧＦ）様繰り返し、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン繰り返しと、Ｃ末端のフィブリノーゲン様球状ドメインとを含む共通の一次構造を有する。Ｎ末端オリゴマー化ドメインを介して、個々のサブユニットが集合して、テネイシンＣの場合は三量体だが、六量体の構造さえも形成する。
【０００６】
哺乳類のＴｎＣモノマーは通常、１４．５ＥＧＦ様繰り返しと、全てのＴｎＣアイソフォームで共有される８つのフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを有する。但し、最大９つの追加のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン繰り返し（ドメインＡ１からＤ）を選択的スプライシングによって独立に包含又は除外できるため、多数のＴｎＣアイソフォームが生じる（例えば、Hsia and Schwarzbauer, J Biol Chem 280, 26641-26644 (2005)参照）。
【０００７】
ＴｎＣは、発生中の胚内に一時的に発現するが、成体組織には事実上存在しない。しかし、創傷治癒、炎症、がん等の特定の病的状態を含むリモデリングプロセス中の組織では、ＴｎＣが再出現する（Chiquet-Ehrismann & Chiquet, J Pathol 200, 488-499 (2003)に総説あり）。
【０００８】
重要なこととして、ＴｎＣは、脳、乳房、結腸、肺、皮膚及び他の臓器の腫瘍を含む悪性固形腫瘍の大部分で高度に発現しており（Orend and Chiquet-Ehrismann, Cancer Letters 244, 143-163 (2006)に総説あり）、ＴｎＣは形質転換上皮細胞と腫瘍微小環境内の間質細胞によって発現し得る（Yoshida et al., J Pathol 182, 421-428 (1997), Hanamura et al., Int J Cancer 73, 10-15 (1997)）。特に、選択的にスプライシングされたドメインＡ１からＤを含むＴｎＣの「大きなアイソフォーム」は、浸潤性癌腫において発現するが、健康な成人組織ではほとんど検出不可能である（Borsi et al., Int J Cancer 52, 688-692 (1992), Carnemolla et al., Eur J Biochem 205, 561-567 (1992)）。
【０００９】
その発現パターンにより、ＴｎＣ、特にその選択的スプライシングドメインは、腫瘍ターゲティング用途のための有望な抗原となり、したがって、タンパク質のいくつかのドメインに対する多くの抗体が開発されている（例えば、以下を参照のこと：Ｂｒａｃｋら，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １２，３２００−３２０８（２００６）又はＥＰ第１８１７３４５号、ＴｎＣのＡ１ドメインに対する抗体を記載；Ｓｉｌａｃｃｉら，Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  １９，４７１−４７８（２００６）又はＥＰ第１１７３７６６号、ＴｎＣのＣドメインに対する抗体を記載；Ｗａｎｇら，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ２９，１３−１６（２０１０）、ＴｎＣのＤドメインに対する抗体を記載；又はＢａｌｚａら，ＦＥＢＳ  ３３２，３９−４３（１９９３）、ヒトテネイシンの様々なドメインに対するいくつかの抗体を記載）。近年、ヒトＴｎＣのＡ２ドメイン内の特定のエピトープを認識する抗体も記載されている（国際公開第２００９／０８９９９８号及び同第２０１２／０２００３８号）。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、
（ａ）抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、ＯＸ４０に特異的に結合できる少なくとも１つの部分、並びに
（ｂ）抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、テネイシンＣ（ＴｎＣ）に特異的に結合できる少なくとも１つの部分
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００１１】
本発明の新規な二重特異性抗原結合分子は、ＴｎＣに対する結合能力により、ＴｎＣが発現する部位で非常に選択的にＯＸ４０を作動させることができる。それゆえ、副作用が劇的に減少する可能性がある。
【００１２】
いくつかの実施態様において、該二重特異性抗原結合分子は、
（ｃ）安定な結合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃ領域
を更に含む。
【００１３】
いくつかの実施態様において、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号１のアミノ酸配列を含むか又はそれから成るポリペプチドに結合する。
【００１４】
いくつかの実施態様において、ＴｎＣに特異的に結合することができる部分は、配列番号３９のアミノ酸配列を含むか又はそれから成るポリペプチドに結合する。
【００１５】
いくつかの実施態様において、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、
（ｉ）配列番号２及び配列番号３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号４及び配列番号５から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、並びに
（ｉｉｉ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、
（ｉｖ）配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、並びに
（ｖｉ）配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２４から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と
を含む。
【００１６】
いくつかの実施態様では、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５及び配列番号３７から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６及び配列番号３８から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【００１７】
いくつかの実施態様において、ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分は、
（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｉｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号３０のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｖ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｖｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｖｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む。
【００１８】
いくつかの実施態様において、ＴｎＣに特異的に結合することができる部分は、
（ｉ）配列番号４０及び配列番号４１から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号４２及び配列番号４３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、並びに
（ｉｉｉ）配列番号４４及び配列番号４５から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨと、
（ｉｖ）配列番号４６及び配列番号４７から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号４８及び配列番号４９から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、並びに
（ｖｉ）配列番号５０及び配列番号５１から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬと
を含む。
【００１９】
いくつかの実施態様では、ＴｎＣに特異的に結合することができる部分は、配列番号５２及び配列番号５４から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号５３及び配列番号５５から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。
【００２０】
いくつかの実施態様において、ＴｎＣに特異的に結合することができる部分は、
（ｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｉｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む。
【００２１】
いくつかの実施態様において、二重特異性抗原結合分子は、
（ｉ）配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５又は配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６又は配列番号３８から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＯＸ４０に特異的に結合できる少なくとも１つの部分と、
（ｉｉ）配列番号５２又は配列番号５４から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５３又は配列番号５５から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＴｎＣに特異的に結合できる少なくとも１つの部分と
を含む。
【００２２】
いくつかの実施態様において、二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＯＸ４０に特異的に結合できる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）
（ｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｉｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む、ＴｎＣに特異的に結合できる少なくとも１つの部分と
を含む。
【００２３】
いくつかの実施態様において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ、特にＩｇＧ１  Ｆｃ領域又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。
【００２４】
いくつかの実施態様では、Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体及び／又はエフェクター機能に対する抗体の結合アフィニティーを低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。
【００２５】
いくつかの実施態様では、Ｆｃ領域は、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を有するヒトＩｇＧ１ｈサブクラスのものである。
【００２６】
いくつかの実施態様では、Ｆｃ領域は、Ｆｃ領域の第１と第２のサブユニットの結合を促進する改変を含む。
【００２７】
いくつかの実施態様では、Ｆｃ領域の第１のサブユニットはノブ・イントゥ・ホール法によるノブを含み、Ｆｃ領域の第２のサブユニットはホールを含む。
【００２８】
いくつかの実施態様では、Ｆｃ領域の第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含み、Ｆｃ領域の第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【００２９】
いくつかの実施態様において、二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）Ｆｃ領域に連結しており、ＯＸ４０に特異的に結合できる少なくとも２つのＦａｂ断片と、
（ｂ）Ｆｃ領域のＣ末端に連結している抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、ＴｎＣに特異的に結合できる少なくとも１つの部分と
を含む。
【００３０】
いくつかの実施態様において、二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）抗体の２つの軽鎖及び、ＯＸ４０に特異的に結合できる２つのＦａｂ断片とＦｃ領域とを含む２つの重鎖、並びに
（ｂ）ＴｎＣに特異的に結合できる部分のＶＨ及びＶＬであって、ＶＨが（ａ）の２つの重鎖のうちの一方の重鎖のＣ末端に連結しており、ＶＬが（ａ）の２つの重鎖のうちのもう一方のＣ末端に連結しているＶＨ及びＶＬ
を含む。
【００３１】
いくつかの実施態様において、二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）抗体の２つの軽鎖及び、ＯＸ４０に特異的に結合できる２つのＦａｂ断片とＦｃ領域とを含む２つの重鎖、並びに
（ｂ）ＴｎＣに特異的に結合できる２つのＦａｂ断片であって、そのＦａｂ断片のうちの一方が（ａ）の２つの重鎖のうちの一方のＣ末端に連結しており、Ｆａｂ断片のうちのもう一方が（ａ）の２つの重鎖のうちのもう一方のＣ末端に連結しているＦａｂ断片
を含む。
【００３２】
いくつかの実施態様において、二重特異性抗原結合分子は、
（ａ１）ＯＸ４０に特異的に結合できるＦａｂ断片のＶＨ及びＣＨ１ドメインと、Ｆｃ領域サブユニットとをそれぞれが含む２つの重鎖、
（ａ２）ＯＸ４０に特異的に結合できるＦａｂ断片のＶＬ及びＣＬドメインをそれぞれが含む２つの軽鎖、並びに
（ｂ）ＴｎＣに特異的に結合できる部分のＶＨ及びＶＬであって、ＶＨが（ａ１）の２つの重鎖のうちの一方のＣ末端に連結し、ＶＬが（ａ１）の２つの重鎖のうちのもう一方のＣ末端に連結しているＶＨ及びＶＬ
を含む。
【００３３】
いくつかの実施態様において、二重特異性抗原結合分子は、
（ａ１）ＯＸ４０に特異的に結合できるＦａｂ断片のＶＨ及びＣＨ１ドメインと、Ｆｃ領域サブユニットとをそれぞれが含む２つの重鎖、
（ａ２）ＯＸ４０に特異的に結合できるＦａｂ断片のＶＬ及びＣＬドメインをそれぞれが含む２つの軽鎖、
（ｂ）ＴｎＣに特異的に結合できる２つのＦａｂ断片であって、そのＦａｂ断片のうちの一方が（ａ１）の２つの重鎖のうちの一方のＣ末端に連結し、Ｆａｂ断片のうちのもう一方が（ａ１）の２つの重鎖のうちのもう一方のＣ末端に連結しているＦａｂ断片
を含む。
【００３４】
いくつかの実施態様において、ＴｎＣに特異的に結合できる２つのＦａｂ断片は、ＶＬ−ＣＨ１鎖とＶＨ−ＣＬ鎖とをそれぞれが含むクロスオーバー（crossover）Ｆａｂ断片であって、ＶＬ−ＣＨ１鎖の一方が（ａ１）の２つの重鎖のうちの一方のＣ末端に連結しており、ＶＬ−ＣＨ１鎖のもう一方が（ａ１）の２つの重鎖のうちのもう一方のＣ末端に連結している。
【００３５】
いくつかの実施態様において、二重特異性抗原結合分子は、ＯＸ４０に特異的に結合できる４つのＦａｂ断片を含む。
【００３６】
いくつかの実施態様において、（ａ）の２つの重鎖のそれぞれは、ＯＸ４０に特異的に結合できるＦａｂ断片の２つのＶＨドメインと２つのＣＨ１ドメインとを含む。
【００３７】
いくつかの実施態様において、ＯＸ４０に特異的に結合できる、１つ又は複数のＦａｂ断片は、
１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸においてアルギニン（Ｒ）を、及び１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸においてリジン（Ｋ）を含むＣＬドメイン、並びに
１４７位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸においてグルタミン酸（Ｅ）を、及び２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸においてグルタミン酸（Ｅ）を含むＣＨ１ドメイン
を含む。
【００３８】
本発明はまた、
配列番号２１３のアミノ酸配列をそれぞれが含む２つの重鎖、  
配列番号２１２のアミノ酸配列をそれぞれが含む２つの軽鎖、及び  
配列番号２１４のアミノ酸配列をそれぞれが含む２つの軽鎖
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００３９】
本発明はまた、
配列番号２１５のアミノ酸配列をそれぞれが含む２つの重鎖、
配列番号２１２のアミノ酸配列をそれぞれが含む２つの軽鎖、及び
配列番号２１６のアミノ酸配列をそれぞれが含む２つの軽鎖
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００４０】
本発明はまた、
配列番号２２２のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、
配列番号２２３のアミノ酸配列をが含む第２の重鎖、及び
配列番号２１２のアミノ酸配列をそれぞれが含む４つの軽鎖
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００４１】
本発明はまた、
配列番号２２５のアミノ酸配列をそれぞれが含む２つの重鎖、
配列番号２２４のアミノ酸配列をそれぞれが含む４つの軽鎖、及び
配列番号２２６のアミノ酸配列をそれぞれが含む２つの軽鎖
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【００４２】
本発明はまた、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００４３】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【００４４】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド又は発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。
【００４５】
本発明はまた、二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で本発明の宿主細胞を培養することと、その二重特異性抗原結合分子を単離することとを含む、二重特異性抗原結合分子の製造方法も提供する。
【００４６】
本発明はまた、本発明の二重特異性抗原結合分子と、少なくとも１種の薬学的に許容される添加剤とを含む薬学的組成物を提供する。
【００４７】
本発明はまた、医薬としての使用のための、本発明の二重特異性抗原結合分子又は本発明の薬学的組成物を提供する。
【００４８】
本発明はまた、
（ｉ）Ｔ細胞応答を刺激すること、
（ｉｉ）活性化Ｔ細胞の生存を維持すること、
（ｉｉｉ）感染症の治療、
（ｉｖ）がんの治療、
（ｖ）がんの進行を遅らせること、又は
（ｖｉ）がんに罹患している患者の生存を延長させること
における使用のための、本発明の二重特異性抗原結合分子又は本発明の薬学的組成物を提供する。
【００４９】
本発明はまた、がんの治療における使用のための、本発明の二重特異性抗原結合分子又は本発明の薬学的組成物を提供する。
【００５０】
本発明はまた、がんの治療のための医薬の製造における、本発明の二重特異性抗原結合分子又は本発明の薬学的組成物の使用を提供する。
【００５１】
本発明はまた、がんを有する個体を治療する方法であって、本発明の二重特異性抗原結合分子又は本発明の薬学的組成物の有効量を該個体に投与することを含む方法を提供する。
【００５２】
本発明はまた、細胞傷害性Ｔ細胞活性の上方制御又は延長における使用のための、本発明の二重特異性抗原結合分子又は本発明の薬学的組成物を提供する。
【００５３】
本発明はまた、細胞傷害性Ｔ細胞活性の上方制御又は延長のため医薬の製造における、本発明の二重特異性抗原結合分子又は本発明の薬学的組成物の使用を提供する。
【００５４】
本発明はまた、がんを有する個体における細胞傷害性Ｔ細胞を上方制御するか又は延長させる方法であって、本発明の二重特異性抗原結合分子又は本発明の薬学的組成物の有効量を該個体に投与することを含む方法を提供する。
【００５５】
本発明の様々な態様によるいくつかの実施態様では、個体は哺乳動物、特にヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】抗ＯＸ４０抗体の調製に使用されたＦｃ結合ヒトＯＸ４０抗原ＥＣＤの単量体型を示す。
【図２】二重特異性二価抗ＯＸ４０／二価抗ＴｎＣ  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ２＋２コンストラクトの模式図を示す。
【図３】図３Ａは二重特異性四価抗ＯＸ４０／一価抗ＴｎＣ  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ｋｉｈ  ４＋１コンストラクトの模式図を示し、図３Ｂは二重特異性四価抗ＯＸ４０／二価抗ＴｎＣ  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ４＋２コンストラクトの模式図を示す。荷電残基は星印で示す。
【図４Ａ】二重特異性抗ＯＸ４０／抗ＴｎＣ抗原結合分子によるヒトＯＸ４０とヒトＴｎＣの同時結合のための表面プラズモン共鳴アッセイの仕組みを簡単に示す。
【図４Ｂ−Ｅ】図４Ｂから４Ｅは、表面プラズモン共鳴により評価される、二重特異性抗ＯＸ４０／抗ＴｎＣ抗原結合分子の組換えＯＸ４０  Ｆｃ（ｋｉｈ）受容体及びヒトＴｎＣタンパク質への結合を示す。図４Ｂは抗ＯＸ４０クローン４９Ｂ４とＴｎＣクローン１１Ｃ７とを含む「２＋２」分子の結合を示し、図４Ｃは抗ＯＸ４０クローン４９Ｂ４と抗ＴｎＣクローン１８Ｄ４とを含む「２＋２」分子の結合を示し、図４Ｄは抗ＯＸ４０クローン４９Ｂ４と抗ＴｎＣクローン１８Ｄ４とを含む「４＋１」分子の結合を示し、図４Ｅは抗ＯＸ４０クローン４９Ｂ４と抗ＴｎＣクローン１８Ｄ４とを含む「４＋２」分子の結合を示す。
【図５】二重特異性抗ＯＸ４０／抗ＴｎＣ抗原結合分子によるヒトＴｎＣ、マウスＴｎＣ及びカニクイザルＴｎＣの結合の分析のための表面プラズモン共鳴アッセイの仕組みを簡単に示す。
【図６】図６Ａから６Ｄは、二重特異性二価抗ＯＸ４０／二価抗ＴｎＣ抗原結合分子（すなわち２＋２型）の休止及び活性化ヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞への結合を示す。図６Ａは活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞への結合を示し、図６Ｂは休止ＣＤ４＋Ｔ細胞への結合を示し、図６Ｃは活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞への結合を示し、図６Ｄは休止ＣＤ８＋Ｔ細胞への結合を示す。結合は、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ｀）２断片（二次検出抗体として使用される）の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）として示される。ＭＦＩはフローサイトメトリーで測定し、ブランクコントロールのＭＦＩを差し引くことによりベースラインを補正した。ｘ軸は抗原結合分子の濃度を示す。ＯＸ４０結合ドメインを含む全ての抗原結合分子は、活性化ＯＸ４０発現ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に結合し、より低い程度で活性化ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞に結合する。ＯＸ４０は、休止ヒトＰＢＭＣでは発現しない（図６Ｂ及び６Ｄ）。活性化後、ＯＸ４０はＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞で上方制御される（図６Ａ及び６Ｃ）。ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞でのＯＸ４０発現は、ＣＤ４＋Ｔ細胞での発現よりも少ない。
【図７】図７Ａから７Ｄは、二重特異性四価抗ＯＸ４０／一価又は二価抗ＴｎＣ抗原結合分子（すなわち４＋２又は４＋１型）の休止及び活性化ヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞への結合を示す。図７Ａは活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞への結合を示し、図７Ｂは休止ＣＤ４＋Ｔ細胞への結合を示し、図７Ｃは活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞への結合を示し、図７Ｄは休止ＣＤ８＋Ｔ細胞への結合を示す。結合は、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ｀）２断片（二次検出抗体として使用される）の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）として示される。ＭＦＩはフローサイトメトリーで測定し、ブランクコントロールのＭＦＩを差し引くことによりベースラインを補正した。ｘ軸は抗原結合分子の濃度を示す。ＯＸ４０結合ドメインを含む全ての抗原結合分子は、活性化ＯＸ４０発現ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に結合する。ＯＸ４０は、休止ヒトＰＢＭＣでは発現しない（図７Ｂ及び７Ｄ）。活性化後、ＯＸ４０はＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞で上方制御される（図７Ａ及び７Ｃ）。ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞でのＯＸ４０発現は、ＣＤ４＋Ｔ細胞での発現よりも少ない。
【図８】フローサイトメトリーによって測定された、ＷＭ２２６−４、Ｕ８７−ＭＧ及びＣＴ２６ｈｕＴｎＣ細胞でのヒトＦＡＰ及びヒトＴｎＣの発現を示す。ＷＭ２６６−４細胞は、ＦＡＰを発現するがＴｎＣは発現しないことが示されている。Ｕ８７−ＭＧ細胞はＦＡＰとＴｎＣを発現することが示されている。ＣＴ２６ｈｕＴｎＣ細胞はＴｎＣを発現することが示されている。
【図９】図９Ａから９Ｃは、二重特異性二価抗ＯＸ４０／二価抗ＴｎＣ抗原結合分子（すなわち２＋２型）のＷＭ２６６−４、Ｕ８７−ＭＧ及びＣＴ２６ｈｕＴｎＣ細胞への結合を示す。図９Ａは、ＴｎＣを発現しないＷＭ２６６−４細胞への結合を示す。図９Ｂは、ＴｎＣを発現するＵ８７−ＭＧ細胞への結合を示す。図９Ｃは、ＴｎＣを発現するＣＴ２６ｈｕＴｎＣ細胞への結合を示す。結合は、フローサイトメトリーで測定された、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ヒトＩｇＧ抗体又はフィコエリトリン（ＰＥ）標識抗ヒトＩｇＧ抗体二次検出抗体の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）として示す。ｘ軸は抗原結合分子の濃度を示す。
【図１０】図１０Ａから１０Ｃは、二重特異性四価抗ＯＸ４０／一価又は二価抗ＴｎＣ抗原結合分子（すなわち４＋２又は４＋１型）のＷＭ２６６−４、Ｕ８７−ＭＧ及びＣＴ２６ｈｕＴｎＣ細胞への結合を示す。図１０Ａは、ＴｎＣを発現しないＷＭ２６６−４細胞への結合を示す。図１０Ｂは、ＴｎＣを発現するＵ８７−ＭＧ細胞への結合を示す。図１０Ｃは、ＴｎＣを発現するＣＴ２６ｈｕＴｎＣ細胞への結合を示す。結合は、フローサイトメトリーで測定された、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ヒトＩｇＧ抗体又はフィコエリトリン（ＰＥ）標識抗ヒトＩｇＧ抗体二次検出抗体の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）として示す。ｘ軸は抗原結合分子の濃度を示す。
【図１１Ａ−１１Ｃ】図１１Ａから１１Ｃは、架橋の有無に関わらず、二重特異性二価抗ＯＸ４０／二価抗ＴｎＣ抗原結合分子（すなわち２＋２型）によるＮＦκＢの活性化を示す。図１１Ａは、架橋の非存在下での、抗原結合分子によるＯＸ４０＋  ＨｅＬａレポーター細胞内のＮＦκＢ活性化を示す。図１１Ｂは、抗ヒトＦｃ特異的二次抗体による架橋の存在下での、抗原結合分子によるＯＸ４０＋  ＨｅＬａレポーター細胞内のＮＦκＢ活性化を示す。図１１Ｃは、Ｕ８７−ＭＧ細胞による架橋の存在下での、抗原結合分子によるＯＸ４０＋  ＨｅＬａレポーター細胞内のＮＦκＢ活性化を示す。ＮＦ−κＢ媒介ルシフェラーゼ活性は、抗原結合分子の濃度（ｎＭ）に対して、０．５秒間に測定された放出光の単位（ＵＲＬ）をプロットすることによって特徴付けられた。ＵＲＬは、ルシフェリンのオキシルシフェリンへのルシフェラーゼ媒介酸化により放出される。値は、「ブランクコントロール」条件のＵＲＬを差し引くことによりベースライン修正された。
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、架橋の有無に関わらず、二重特異性二価抗ＯＸ４０／二価抗ＴｎＣ抗原結合分子（すなわち２＋２型）によるＮＦκＢの活性化を示す。図１１Ｄは、曲線下面積（ＡＵＣ）として表された、図１１Ａから１１Ｃのデータを示す。
【図１２】図１２Ａから１２Ｃは、Ｕ８７−ＭＧ細胞による架橋の有無に関わらず、二重特異性四価抗ＯＸ４０／一価又は二価抗ＴｎＣ抗原結合分子（すなわち４＋２又は４＋１型）及び二重特異性二価抗ＯＸ４０／二価抗ＴｎＣ（すなわち２＋２型）によるＮＦκＢの活性化を示す。図１１Ａは、架橋の非存在下での、抗原結合分子によるＯＸ４０＋  ＨｅＬａレポーター細胞内のＮＦκＢ活性化を示す。図１１Ｂは、Ｕ８７−ＭＧ細胞による架橋の存在下での、抗原結合分子によるＯＸ４０＋  ＨｅＬａレポーター細胞内のＮＦκＢ活性化を示す。ＮＦ−κＢ媒介ルシフェラーゼ活性は、抗原結合分子の濃度（ｎＭ）に対して、０．５秒間に測定された放出光の単位（ＵＲＬ）をプロットすることによって特徴付けられた。ＵＲＬは、ルシフェリンのオキシルシフェリンへのルシフェラーゼ媒介酸化により放出される。値は、「ブランクコントロール」条件のＵＲＬを差し引くことによりベースライン修正された。図１２Ｃは、曲線下面積（ＡＵＣ）として表された、図１２Ａ及び図１２Ｂのデータを示す。
【図１３】図１３Ａから１３Ｃは、ＣＴ２６ｈｕＴｎＣ細胞による架橋の有無に関わらず、二重特異性四価抗ＯＸ４０／一価又は二価抗ＴｎＣ抗原結合分子（すなわち４＋２又は４＋１型）及び二重特異性二価抗ＯＸ４０／二価抗ＴｎＣ（すなわち２＋２型）によるＮＦκＢの活性化を示す。図１３Ａは、架橋の非存在下での、抗原結合分子によるＯＸ４０＋  ＨｅＬａレポーター細胞内のＮＦκＢ活性化を示す。図１３Ｂは、ＣＴ２６ｈｕＴｎＣ細胞による架橋の存在下での、抗原結合分子によるＯＸ４０＋  ＨｅＬａレポーター細胞内のＮＦκＢ活性化を示す。ＮＦ−κＢ媒介ルシフェラーゼ活性は、抗原結合分子の濃度（ｎＭ）に対して、０．５秒間に測定された放出光の単位（ＵＲＬ）をプロットすることによって特徴付けられた。ＵＲＬは、ルシフェリンのオキシルシフェリンへのルシフェラーゼ媒介酸化により放出される。値は、「ブランクコントロール」条件のＵＲＬを差し引くことによりベースライン修正された。図１３Ｃは、曲線下面積（ＡＵＣ）として表された、図１３Ａ及び１３Ｂのデータを示す。
【図１４】図１４Ａから１４Ｄは、Ｕ８７−ＭＧ細胞による架橋の存在下での、プレートに固定化された二重特異性四価抗ＯＸ４０／一価又は二価抗ＴｎＣ抗原結合分子（すなわち４＋２又は４＋１型）及び二重特異性二価抗ＯＸ４０／二価抗ＴｎＣ（すなわち２＋２型）による、事前活性化ＣＤ４  Ｔ細胞の最適以下のＴＣＲ再刺激のレスキューを示す。図１４ＡはＣＤ４＋イベント数を示し、図１４ＢはＣＤ８＋イベント数を示し、図１４ＣはＣＤ４＋Ｔ細胞で発現したＣＤ１２７の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示し、図１４ＤはＣＤ８＋Ｔ細胞で発現したＣＤ１２７のＭＦＩを示す。値は、抗ヒトＣＤ３のみを含む試料の値に対してベースライン補正された。
【図１５】図１５Ａから１５Ｄは、Ｕ８７−ＭＧ細胞による架橋の存在下での、プレートに固定化された二重特異性四価抗ＯＸ４０／一価又は二価抗ＴｎＣ抗原結合分子（すなわち４＋２又は４＋１型）及び二重特異性二価抗ＯＸ４０／二価抗ＴｎＣ（すなわち２＋２型）による、事前活性化ＣＤ４  Ｔ細胞の最適以下のＴＣＲ再刺激のレスキューを示す。図１５ＡはＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞のパーセンテージを示し、図１５ＢはＣＤ８＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞のパーセンテージを示し、図１５ＣはＣＤ４＋Ｔ細胞で発現したＣＤ２５の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示し、図１５ＤはＣＤ８＋Ｔ細胞で発現したＣＤ２５のＭＦＩを示す。値は、抗ヒトＣＤ３のみを含む試料の値に対してベースライン補正された。
【図１６】図１６Ａから１６Ｄは、ＣＴ２６ｈｕＴｎＣ細胞による架橋の存在下での、プレートに固定化された二重特異性四価抗ＯＸ４０／一価又は二価抗ＴｎＣ抗原結合分子（すなわち４＋２又は４＋１型）及び二重特異性二価抗ＯＸ４０／二価抗ＴｎＣ（すなわち２＋２型）による、事前活性化ＣＤ４  Ｔ細胞の最適以下のＴＣＲ再刺激のレスキューを示す。図１６Ａは、重要な（vital）、ＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋  Ｔ細胞のパーセンテージを示し、図１６Ｂは、重要なＣＦＳＥ標識ＣＤ８＋  Ｔ細胞のパーセンテージを示し、図１６ＣはＣＤ４＋  Ｔ細胞で発現したＣＤ１２７の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示し、図１６ＤはＣＤ８＋  Ｔ細胞で発現したＣＤ１２７のＭＦＩを示す。値は、抗ヒトＣＤ３のみを含む試料の値に対してベースライン補正された。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
定義
特に定義しない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野において一般的に使用されるのと同じ意味を有する。本明細書の説明のために、以下の定義を適用し、単数形で用いられる用語は、適切な場合はいつでも複数形も含み、その逆も同じである。
【００５８】
本明細書で使用される場合、用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、抗体、抗体断片、及び足場抗原結合タンパク質である。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「テネイシンＣ（ＴｎＣ）に特異的に結合できる部分」又は「テネイシンＣ（ＴｎＣ）に特異的に結合できる抗原結合ドメイン」という用語は、ＴｎＣに特異的に結合するポリペプチド分子を指す。特定の態様において、抗原結合部分は、それが結合している実体を標的部位、例えばＴｎＣを有する特定のタイプの腫瘍細胞又は腫瘍間質へ方向付けることができる。ＴｎＣに特異的に結合できる部分には、本明細書で更に定義される抗体及びその断片が含まれる。加えて、ＴｎＣに特異的に結合できる部分には、本明細書で更に定義される足場抗原結合タンパク質、例えば、設計反復タンパク質又は設計反復ドメインに基づく結合ドメインが含まれる（例えば国際公開第２００２／０２０５６５号参照）。
【００６０】
抗体又はその断片に関して、「テネイシンＣ（ＴｎＣ）に特異的に結合できる部分」又は「テネイシンＣ（ＴｎＣ）に特異的に結合できる抗原結合ドメイン」という用語は、ＴｎＣの一部又は全部に対し、特異的に結合し且つ相補的である領域を含む分子の部分を指す。ＴｎＣに特異的に結合できる部分は、例えば一又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）により提供され得る。ＴｎＣに特異的に結合できる部分は特に、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの実施態様において、「テネイシンＣ（ＴｎＣ）に特異的に結合できる部分」は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ断片又はクロス（cross）Ｆａｂ断片、特にＦａｂ断片又はクロスＦａｂ断片であり得る。
【００６１】
「ＯＸ４０に特異的に結合できる部分」又は「テネイシンＯＸ４０に特異的に結合できる抗原結合ドメイン」という用語は、ＯＸ４０に特異的に結合できるポリペプチド分子を指す。ある態様では、抗原結合部分は、ＯＸ４０を介したシグナル伝達を活性化することができる。ＯＸ４０に特異的に結合できる部分には、本明細書で更に定義される抗体及びその断片が含まれる。加えて、ＯＸ４０に特異的に結合できる部分には、本明細書で更に定義される足場抗原結合タンパク質、例えば、設計反復タンパク質又は設計反復ドメインに基づく結合ドメインが含まれる（例えば国際公開第２００２／０２０５６５号参照）。ＯＸ４０に特異的に結合できる部分は特に、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。特定の態様では、「ＯＸ４０に特異的に結合できる部分」は、Ｆａｂ断片、クロスＦａｂ断片又はｓｃＦｖ、特にＦａｂ断片又はクロスＦａｂ断片であり得る。
【００６２】
本明細書における用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、種々の抗体構造を包含し、限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性及び多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、並びに、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【００６３】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体集団、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、一般に少量で存在し得るバリアント抗体（例えば自然発生の突然変異を含むか、又はモノクローナル抗体調製物の製造時に発生するもの）を除いて、同一であり、且つ／又は同じエピトープに結合する集団から得られる抗体を意味する。様々な決定基（エピトープ）に対する様々な抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。
【００６４】
本明細書で使用される用語「単一特異性」抗体は、それぞれが同一の抗原の同一のエピトープに結合する一又は複数の結合部位を有する抗体を意味する。用語「二重特異性」とは、抗原結合分子が少なくとも２つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。二重特異性抗原結合分子は、各々が異なる抗原決定基に特異的な少なくとも２つの抗原結合部位を含む。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原決定基、特に２つの別個の細胞上に発現した２つの抗原決定基に同時に結合することができる。例えば、本発明の抗原結合分子は二重特異性であり、ＯＸ４０に特異的に結合できる，部分とＴｎＣに特異的に結合できる，部分とを含む。
【００６５】
本願内で使用される「価」という用語は、抗原結合分子中に特定の数の結合部位が存在することを示す。このように、用語「二価」、「四価」及び「六価」は、抗原結合分子中、それぞれ２つの結合部位、４つの結合部位及び６つの結合部位の存在を意味する。抗原結合分子の原子価は、所定の抗原決定基の結合部位の数に関連して表される場合もある。例えば、いくつかの実施態様では、本発明の抗原結合分子は、ＯＸ４０に関して四価であり、ＴｎＣに関して二価である（すなわち４＋２）。
【００６６】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然抗体構造と実質的に類似の構造を有する抗体を指す。「天然抗体」は、様々な構造を有する天然に生じる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧクラスの抗体は、ジスルフィド結合している２つの軽鎖と２つの重鎖とから構成される約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端にかけて各重鎖は、可変領域（ＶＨ）（可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる）、続いて３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）（重鎖定常領域とも呼ばれる）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端にかけて各軽鎖は、可変領域（ＶＬ）（可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる）、続いて軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）（軽鎖定常領域とも呼ばれる）を有する。抗体の重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つのタイプのうちの１つに割り当てられ、それらのいくつかはサブタイプ、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）に更に分けられる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる２つの型のうちのいずれかに割り当てることができる。
【００６７】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合し、インタクトな抗体の一部分を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、クロスＦａｂ断片；直鎖状抗体、一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び単一ドメイン抗体が含まれる。特定の抗体断片の総説については、Ｈｕｄｓｏｎら，  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えばＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。また、国際公開第９３／１６１８５号、並びに米国特許第５５７１８９４号及び同第５５８７４５８号も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、且つ増加したｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有するＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。ダイアボディは、二価又は二重特異性でありう得る２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えばＥＰ第４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎら，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９，１２９−１３４（２００３）；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０，６４４４−６４４８（１９９３）を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディもＨｕｄｓｏｎら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部又は一部、或いは軽鎖可変ドメインの全部又は一部を含む抗体断片である。特定の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（マサチューセッツ州ウォルサム、Ｄｏｍａｎｔｉｓ社；例えば米国特許第６２４８５１６号参照）。抗体断片は、本明細書に記載のように、組換え宿主細胞（例えば大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）又はファージ）による産生の他、インタクトな抗体のタンパク質消化を含むがこれらに限定されない種々の技術で作製することができる。
【００６８】
インタクトな抗体のパパイン消化は、各々が重鎖及び軽鎖可変ドメインと、更には軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片を生成する。したがって、本明細書で使用される場合、用語「Ｆａｂ断片」は、軽鎖のＶＬ及び定常ドメイン（ＣＬ）と、重鎖のＶＨ及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む軽鎖断片を含む抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加されている点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を持つＦａｂ’断片である。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂ断片）とＦｃ領域の一部とを有するＦ（ａｂ’）２断片を生成する。本発明によれば、「Ｆａｂ断片」という用語は、以下に定義する「クロスＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」も含む。
【００６９】
用語「クロスＦａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」はＦａｂ断片であって、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されているものを指す。クロスＦａｂ分子の２つの異なる鎖構成（chain composition）が可能であり、本発明の二重特異性抗体に含まれる。一方では、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されており、すなわちクロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域（ＣＨ１）から構成されているペプチド鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成されているペプチド鎖とを含む。このクロスオーバーＦａｂ分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも称される。他方では、軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域（ＣＨ１）から構成されているペプチド鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成されているペプチド鎖このクロスオーバー分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも呼ばれる。
【００７０】
「一本鎖Ｆａｂ断片」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーから成るポリペプチドであり、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に次の順序：ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１、又はｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬのうちの１つを有し；前記リンカーは、少なくとも３０のアミノ酸、好ましくは３２から５０の間のアミノ酸のポリペプチドである。前記一本鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合によって安定化されている。加えて、これらの一本鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基（例えばＫａｂａｔ番号付けによる可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）の挿入による鎖間ジスルフィド結合の生成により、更に安定化する可能性もある。
【００７１】
「クロスオーバー一本鎖Ｆａｂ断片」又は「ｘ−ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーから成るポリペプチドであり、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に、ａ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１及びｂ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬのうちの一つを有し、ＶＨとＶＬは一緒に、特に抗原に結合する抗原結合部位を形成し、前記リンカーは少なくとも３０個のアミノ酸のポリペプチドである。加えて、これらｘ−ｓｃＦａｂ分子は、システイン残基（例えばＫａｂａｔ番号付けによる可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）の挿入による鎖間ジスルフィド結合の生成により、更に安定化されることがある。
【００７２】
「一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は、抗体の、１０から約２５個のアミノ酸から成る短いリンカーペプチドと連結している重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）可変領域の融合タンパク質である。リンカーは通常、柔軟性のためにグリシンに、溶解度のためにセリン又はスレオニンに富み、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に接続することができ、又はその逆も可能である。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にも関わらず、元の抗体の特異性を保持している。ｓｃＦｖ抗体は、例えばＨｏｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３（１９９１）４６−９６に記載されている。加えて、抗体断片は、ＶＨの特徴、つまりＶＬと共に集合して機能的抗原結合部位を形成することができる特徴、又はＶＬの特徴、つまりＶＨと共に集合して機能的抗原結合部位を形成することができる特徴を有し、よって完全長抗体の抗原結合特性を提供する一本鎖ポリペプチドを含む。
【００７３】
「足場抗原結合タンパク質」は当技術分野で既知であり、例えば、フィブロネクチン及び設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）が抗原結合ドメインの代替的な足場として使用されている。例えば、Ｇｅｂａｕｅｒ及びＳｋｅｒｒａ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ａｓ  ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  １３：２４５−２５５（２００９）及びＳｔｕｍｐｐら，Ｄａｒｐｉｎｓ：  Ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  １３：６９５−７０１（２００８）を参照されたい。本発明の一態様において、足場抗原結合タンパク質は、ＣＴＬＡ−４（エビボディ（Evibody））、リポカリン（アンチカリン）、プロテインＡ由来の分子、例えばプロテインＡのＺドメイン（アフィボディ）、Ａドメイン（アビマー（Avimer）／マキシボディ）、血清トランスフェリン（トランスボディ（trans-body））；設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、抗体軽鎖又は重鎖の可変ドメイン（単一ドメイン抗体、ｓｄＡｂ）、抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ、ａＶＨ）、ＶＮＡＲ断片、フィブロネクチン（アドネクチン）、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン）；新規抗原受容体ベータラクタマーゼの可変ドメイン（ＶＮＡＲ断片）、ヒトガンマクリスタリン又はユビキチン（アフィリン分子）；ヒトプロテアーゼ阻害剤のクーニッツ型ドメイン、ミクロボディ、例えばノッチンファミリー由来のタンパク質、ペプチドアプタマー及びフィブロネクチン（アドネクチン）から成る群より選択される。ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４）は、主にＣＤ４＋  Ｔ細胞に発現するＣＤ２８ファミリーの受容体である。その細胞外ドメインは、可変ドメイン様Ｉｇフォールドを有する。抗体のＣＤＲに対応するループを異種配列で置換して、異なる結合特性を付与することができる。異なる結合特異性を持つように工学操作されたＣＴＬＡ−４分子は、エビボディとしても知られている（例：米国特許第７１６６６９７号）。エビボディは、抗体の分離された可変領域（例：ドメイン抗体）とほほ同じ大きさである。更なる詳細は、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８（１−２），３１−４５（２００１）を参照のこと。リポカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質等の疎水性の小分子を運搬する細胞外タンパク質のファミリーである。これは、様々な標的抗原に結合するように工学操作することのできる円錐構造の開放端に複数のループを備えた強固なベータシート二次構造を有する。アンチカリンは、大きさが１６０〜１８０アミノ酸であり、リポカリンに由来する。更なる詳細については、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １４８２：３３７−３５０（２０００）、米国特許第７２５０２９７号及び同第２００７０２２４６３３号を参照されたい。アフィボディは、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のプロテインＡ由来の足場であり、抗原に結合するように工学操作できる。このドメインは、約５８アミノ酸で構成される３ヘリックス���ンドルから成る。ライブラリーは、表面残基のランダム化によって生成されている。更なる詳細については、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２００４，１７，４５５−４６２及びＥＰ第１６４１８１８号を参照のこと。アビマーは、Ａドメイン足場ファミリー由来のマルチドメインタンパク質である。約３５アミノ酸の天然ドメインは、明確なジスルフィド結合構造をとっている。多様性は、Ａドメインのファミリーが表す天然変異のシャッフルによって生じる。更なる詳細については、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３（１２），１５５６−１５６１（２００５）及びＥｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｕｇｓ  １６（６），９０９−９１７（２００７年６月）を参照されたい。トランスフェリンは、単量体の血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは、ペプチド配列を許容表面ループに挿入することにより、様々な標的抗原に結合するように工学操作することができる。工学操作されたトランスフェリン足場の例には、トランスボディが含まれる。更なる詳細は、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７４，２４０６６−２４０７３（１９９９）を参照のこと。設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）は、細胞骨格に対する内在性膜タンパク質の付着を媒介するタンパク質のファミリーであるアンキリンに由来する。単一のアンキリン反復は、２つのアルファヘリックスと１つのベータターンから成る３３残基のモチーフである。これらは、各反復の第１のアルファヘリックスとベータターンの残基をランダム化することにより、様々な標的抗原に結合するように工学操作することができる。これらの結合面は、モジュールの数を増加せることにより増大させることができる（アフィニティー成熟の方法）。更なる詳細については、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２，４８９−５０３（２００３），ＰＮＡＳ  １００（４），１７００−１７０５（２００３）及びＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６９，１０１５−１０２８（２００７）及び米国特許出願公開第２００４０１３２０２８号を参照のこと。単一ドメイン抗体は、単一の単量体可変抗体ドメインから成る抗体断片である。第１の単一ドメインは、ラクダ科の抗体重鎖の可変ドメインに由来するものであった（ナノボディ又はＶＨＨ断片）。更に、単一ドメイン抗体という用語は、自律性ヒト重鎖可変ドメイン（ａＶＨ）又はサメ由来のＶＮＡＲ断片を含む。フィブロネクチンは、抗原に結合するように工学操作可能な足場である。アドネクチンは、ヒトフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）の１５反復単位の１０番目のドメインの天然アミノ酸配列の主鎖から成る。ベータサンドイッチの一端にある３つのループを工学操作して、アドネクチンが目的の治療標的を特異的に認識できるようにすることができる。更なる詳細については、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１８，４３５−４４４（２００５）、米国特許出願公開第２００８０１３９７９１号、国際公開第２００５０５６７６４号及び米国特許第６８１８４１８号を参照されたい。ペプチドアプタマーは、定常足場タンパク質、典型的には活性部位に挿入された拘束可変ペプチドループを含むチオレドキシン（ＴｒｘＡ）から成るコンビナトリアル認識分子である。更なる詳細については、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．５，７８３−７９７（２００５）を参照されたい。ミクロボディは、３〜４個のシステインブリッジを含有する、長さ２５〜５０アミノ酸の天然に存在する微小タンパク質に由来する。微小タンパク質の例には、ＫａｌａｔａＢＩ、コノトキシン及びノッチンが含まれる。微小タンパク質は、その全体的フォールドに影響を与えることなく、最大２５個のアミノ酸を含むように工学操作できるループを有する。工学操作されたノッチンドメインの更なる詳細については、国際公開第２００８０９８７９６号を参照されたい。
【００７４】
参照分子と「同じエピトープに結合する抗原結合分子」とは、競合アッセイにおいてその抗原に対する参照分子の結合を５０％以上ブロックする抗原結合分子を指し、逆に、参照分子は競合アッセノッチンドメイイにおいてその抗原に対する抗原結合分子の結合を５０％以上ブロックする。
【００７５】
用語「抗原結合ドメイン」又は「抗原結合部位」は、抗原の一部又は全部に対し、特異的に結合し且つ相補的な領域を含む抗体結合分子の部分を指す。抗原が大きい場合、抗原結合分子は、エピトープと呼ばれる抗原の特定部分にのみ結合する。抗原結合ドメインは、例えば、一又は複数の可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）により提供され得る。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００７６】
本明細書において使用される用語「抗原決定基」は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合し、抗原結合部分−抗原複合体を形成するポリペプチド巨大分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続的広がり又は非連続的アミノ酸の異なる領域から形成される立体配座構造）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面に、ウイルス感染細胞の表面に、他の疾患細胞の表面に、免疫細胞の表面に、血清中に遊離した状態で、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に見出すことができる。特に断らない限り、本明細書において抗原として有用なタンパク質は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然タンパク質を指す。特定の実施態様では、抗原はヒトタンパク質である。本明細書において特定のタンパク質が言及される場合、その用語は、「完全長」、未処理のタンパク質だけではなく、細胞内でのプロセシングから生じる任意の型のタンパク質を包含する。その用語はまた、天然に存在するタンパク質バリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントを包含する。
【００７７】
「特異的結合」とは、結合が抗原について選択的であり、望ましくない又は非特異的な相互作用とは区別可能であることを意味する。特定の抗原への抗原結合分子の結合能は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られているその他の技術（例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ装置での解析）（Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)）及び古典的結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)）のいずれかにより測定することができる。一実施態様では、抗原結合分子の無関係なタンパク質への結合の程度は、例えばＳＰＲによって測定した場合、抗原結合分子の抗原への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、抗原に結合する分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。
【００７８】
「アフィニティー」又は「結合アフィニティー」は、分子（例えば抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合アフィニティー」は、結合対（例えば抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合アフィニティーを指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対するアフィニティーは通常、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができるが、これは、解離速度定数と結合速度定数（それぞれｋｏｆｆ、ｋｏｎ）の比である。したがって、速度定数の比率が同じである限り、同等のアフィニティーは異なる速度定数を含み得る。アフィニティーは、本明細書に記載したものを含め、当技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。アフィニティーを測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
【００７９】
「アフィニティー成熟」抗体とは、変化を有しない親抗体と比較して、一又は複数の超可変領域（ＨＶＲ）に一又は複数の変化があり、かかる変化が抗原に対する抗体のアフィニティーの改善をもたらす抗体を指す。
【００８０】
特に断らない限り、用語「テネイシンＣ（ＴｎＣ）」は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＴｎＣを指す。この用語は、「完全長」、未処理のＴｎＣだけではなく、細胞内でのプロセシングから生じる任意の型のＴｎＣを包含する。この用語はまた、天然に存在するＴｎＣのバリアント、例えばスプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、ヒト、マウス及び／又はカニクイザルＴｎＣに特異的に結合することができる。ヒトＴｎＣのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）のアクセッション番号Ｐ２４８２１（バージョン１９６、配列番号３９）又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿００２１５１．２に示されている。Ｃ末端Ａｖｉタグ付き及びＨｉｓタグ付きヒトＴｎＣのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１６７、１７０に示されている。マウスＴｎＣのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）のアクセッション番号Ｑ８０ＹＸ１（バージョン１２５、配列番号６３）又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿０３５７３７．２に示されている。Ｃ末端Ａｖｉタグ付き及びＨｉｓタグ付きマウスＴｎＣのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１６８、１７１に示されている。Ｃ末端Ａｖｉタグ付き及びＨｉｓタグ付きカニクイザルＴｎＣのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列はそれぞれ、配列番号１６９、１７２に示されている。
【００８１】
特定の実施態様では、本発明の抗原結合分子は、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ｂ、ＡＤ１、ＡＤ２、Ｃ及びＤから成る群より選択される、少なくとも１つのＴｎＣのドメインに特異的に結合することができる部分を含む。いくつかの実施態様において、ＴｎＣに特異的に結合することができる部分は、ＴｎＣのＡ１及びＡ４ドメインに結合する。いくつかの実施態様において、ＴｎＣに特異的に結合することができる部分は、ＴｎＣのＣドメインに結合する。
【００８２】
特に断らない限り、「線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）」（プロリルエンドペプチダーゼＦＡＰ又はセプラーゼ（ＥＣ  ３．４．２１としても知られている）という用語は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＦＡＰを指す。ヒトＦＡＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）のアクセッション番号Ｑ１２８８４（バージョン１４９、配列番号８１）又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿００４４５１．２に示されている。
【００８３】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗原結合分子の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ、ＶＬ）は一般に、各ドメインが４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含んでいる、類似の構造を有する。例えば、Ｋｉｎｄｔら，Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第６版，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ｐ．９１（２００７）を参照されたい。単一のＶＨ又はＶＬは、抗原結合特異性を付与するのに十分である。
【００８４】
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であり、且つ／又は構造的に定まったループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般に、天然の４鎖抗体は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）、計６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは通常、超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は最も高い配列可変性を有し、且つ／又は抗原認識に関与している。例示的な超可変ループは、アミノ酸残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、及び９６〜１０１（Ｈ３）に生じる。（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）例示的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５及びＨ３の９５−１０２に生じる。（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).）超可変領域（ＨＶＲ）は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれ、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に関して本明細書では互換的に使用される。このような特定の領域は、Ｋａｂａｔら，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）及びＣｈｏｔｈｉａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）に記載されており、その定義には、互いに対して比較されたときのアミノ酸残基の重複又はサブセットが含まれる。とは言え、抗体又はそのバリアントのＣＤＲを指すいずれかの定義の適用は、本明細書で定義及び使用される用語の範囲にあることが意図されている。上記引用文献の各々により定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基を、比較として以下の表Ａに明記する。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列及び大きさに応じて変化するであろう。当業者であれば、抗体の可変領域アミノ酸配列があれば、どの残基が特定のＣＤＲを含むかを慣用的に決定することができる。
表Ａ：ＣＤＲの定義１
2020515541.tif 000002
１表ＡのＣＤＲ定義の番号付けは全て、Ｋａｂａｔらが定めた番号付け規則に従っている（以下参照）。
２表Ａで使用されている、「ｂ」が小文字の「ＡｂＭ」は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒの「ＡｂＭ」抗体モデリングソフトウエアによって定義されているＣＤＲを指す。
【００８５】
Ｋａｂａｔらは、あらゆる抗体に適用可能な可変領域配列の番号付けシステムも定義した。当業者であれば、配列自体を超える実験データに頼らなくとも、この「Ｋａｂａｔ番号付け」のシステムを任意の可変領域配列に明確に割り当てることができる。「Ｋａｂａｔ番号付け」は、本明細書で使用される場合、Ｋａｂａｔら，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）によって定められた番号付けシステムを指す。特に断らない限り、抗体可変領域における特定のアミノ酸残基の位置の番号付けへの言及は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従っている。
【００８６】
ＶＨのＣＤＲ１を除き、ＣＤＲは一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲはまた、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」すなわち「ＳＤＲ」も含む。ＳＤＲは、短縮型（ａｂｂｒｅｖｉａｔｅｄ−）ＣＤＲ又はａ−ＣＤＲと称されるＣＤＲの領域内に含まれている。例示的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８及びＨ３の９５−１０２に生じる。（Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)参照。）特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えばＦＲ残基）は、本明細書では上掲のＫａｂａｔらに従って番号が付けられる。
【００８７】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４で構成される。したがって、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は一般に、ＶＨ（又はＶＬ）の次の配列：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４に現れる。
【００８８】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種に由来し、残りの重鎖及び／又は軽鎖が異なる起源又は種に由来する抗体を指す。
【００８９】
抗体の「クラス」は、その重鎖が有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体には５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００９０】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基とヒトＦＲ由来のアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＨＶＲ（例えばＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、場合によって、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば非ヒト抗体は、ヒト化を遂げた抗体を指す。本発明により包含される「ヒト化抗体」の他の型は、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して、本発明による特性が生じるように定常領域が追加的に改変されているか、又は元の抗体ものから変更されているものである。
【００９１】
「ヒト」抗体は、ヒト若しくはヒト細胞により産生された抗体の、又はヒト抗体レパートリーを利用する非ヒト源に由来する抗体のアミノ酸配列、或いは他のヒト抗体をコードする配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。
【００９２】
本明細書の用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、抗体重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域とバリアントＦｃ領域を含む。ＩｇＧ  Ｆｃ領域は、ＩｇＧ  ＣＨ２及びＩｇＧ  ＣＨ３ドメインを含む。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は通常、およそ２３１位のアミノ酸残基からおよそ３４０位のアミノ酸残基まで延びる。一実施態様では、ＣＨ２ドメインに糖鎖が結合している。本明細書のＣＨ２ドメインは、天然配列ＣＨ２ドメインでもバリアントＣＨ２ドメインでもよい。「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域のＣ末端からＣＨ２ドメインまでひと続きの残基を含む（すなわちＩｇＧのおよそ３４１位のアミノ酸残基からおよそ４４７位のアミノ酸残基まで）。本明細書におけるＣＨ３領域は、天然配列ＣＨ３ドメインでもバリアントＣＨ３ドメイン（例えばその一方の鎖に導入された「隆起」（「ノブ」）と、その他方の鎖に導入された対応する「空洞」（「ホール」）とを有するＣＨ３ドメイン；米国特許第５８２１３３３号（出典明示により本明細書において明示的に援用される）参照）でもよい。このようなバリアントＣＨ３ドメインは、本明細書に記載の２つの非同一抗体重鎖のヘテロ二量体化を促進するために使用することができる。一実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、重鎖のＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０からカルボキシル末端にまで及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在してもしなくてもよい。本明細書において別段の定めがない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載のＥＵ番号付けシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。
【００９３】
「ノブ・イントゥ・ホール」技術は、例えば米国特許第５７３１１６８号；同第７６９５９３６号；Ｒｉｄｇｗａｙら，Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ９，６１７−６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ２４８，７−１５（２００１）に記載されている。通常、この方法は、隆起（「ノブ」）が対応する空洞（「ホール」）内に配置されて、ヘテロ二量体形成を促進し、且つ、ホモ二量体形成を妨げることができるように、第１のポリペプチドの境界面に隆起を、対応する空洞を第２のポリペプチドの境界面に導入することを伴う。「隆起」は、第１のポリペプチド境界面の小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより構築される。大きなアミノ酸側鎖をそれよりも小さなもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置き換えることにより、隆起と同じか又は同様のサイズの、埋め合わせとなる空洞が第２のポリペプチドの境界面に作られる。隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的突然変異誘発又はペプチド合成によって、改変することにより作られる。特定の実施態様では、ノブ改変は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ホール改変は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのもう一方にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む。更なる特定の実施態様では、Ｆｃドメインのノブ改変を含むサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃを更に含み、Ｆｃドメインのホール改変を含むサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃを更に含む。これら２つのシステイン残基の導入により、Ｆｃ領域の２つのサブユニット間にジスルフィド架橋が形成され、したがって二量体を更に安定させる（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
【００９４】
「免疫グロブリンのＦｃ領域に相当する領域」には、免疫グロブリンのＦｃ領域の天然に存在する対立遺伝子バリアントと、置換、付加又は欠失を生じるが免疫グロブリンのエフェクター機能（例えば抗体依存性細胞傷害）を媒介する能力を実質的に低下させない変更を有するバリアントとが含まれることが意図される。例えば、１又は複数のアミノ酸は、生物学的機能を実質的に損なうことなく、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端から欠失させることができる。このようなバリアントは、活性に対する影響が最小となるように、当技術分野で知られている一般的な規則に従って選択することができる（例えばBowie, J. U. et al., Science 247:1306-10 (1990)参照）。
【００９５】
用語「エフェクター機能」は、抗体のアイソタイプによって異なる、抗体のＦｃ領域に起因する生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み、細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）の下方制御、及びＢ細胞の活性化が含まれる。
【００９６】
Ｆｃ受容体結合依存性エフェクター機能は、抗体のＦｃ領域と、造血細胞の特定の細胞表面上の受容体であるＦｃ受容体（ＦｃＲ）との相互作用により媒介され得る。Ｆｃ受容体は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、抗体依存性細胞介在性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を介した免疫複合体の食作用による、抗体でコーティングされた病原体の除去と、対応する抗体でコーティングされた赤血球及び種々の他の細胞標的（例えば腫瘍細胞）の溶解の両方を媒介することが示されている（例えばVan de Winkel, J.G. anderson, C.L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524を参照のこと）。ＦｃＲは、免疫グロブリンアイソタイプに対するその特異性によって定義され、ＩｇＧ抗体に対するＦｃ受容体はＦｃγＲという。Ｆｃ受容体結合は、例えば、Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．及びＫｉｎｅｔ，Ｊ．Ｐ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９（１９９１）４５７−４９２；Ｃａｐｅｌ，Ｐ．Ｊ．ら，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４（１９９４）２５−３４；ｄｅ  Ｈａａｓ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６（１９９５）３３０−３４１；及びＧｅｓｓｎｅｒ，Ｊ．Ｅ．ら，Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．７６（１９９８）２３１−２４８に記載されている。
【００９７】
ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に対する受容体（ＦｃγＲ）の架橋は、免疫複合体の除去及び抗体産生の制御のみならず、食作用、抗体依存性細胞傷害性、及び炎症メディエーターの放出を含む広範なエフェクター機能を誘発する。ヒトにおいては、以下の、ＦｃγＲの３つのクラスの特徴が明らかにされている。
【００９８】
−  ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）は、高いアフィニティーでモノマーＩｇＧに結合し、マクロファージ、単球、好中球及び好酸球に発現する。アミノ酸残基Ｅ２３３〜Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７及びＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）の少なくとも１つにおけるＦｃ領域ＩｇＧの改変が、ＦｃγＲＩへの結合を減少させる。ＩｇＧ１及びＩｇＧ４に置換された２３３〜２３６位のＩｇＧ２残基が、ＦｃγＲＩへの結合を１０3分の１減少させ、抗体感作赤血球に対するヒト単球応答を排除した（Armour, K.L., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624）。
【００９９】
−  ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）は、中程度から低いアフィニティーで複合体化ＩｇＧ（complexed IgG）に結合し、広く発現している。この受容体は、２つのサブタイプ、ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＢに分けることができる。ＦｃγＲＩＩＡは、殺傷に関与する多くの細胞（例えば、マクロファージ、単球、好中球）に見られ、殺傷プロセスを活性化することができるようである。ＦｃγＲＩＩＢは、阻害プロセスにおいて役割を果たすようであり、Ｂ細胞、マクロファージ、並びにマスト細胞及び好酸球に見られる。Ｂ細胞上では、ＦｃγＲＩＩＢは、更なる免疫グロブリン産生及びアイソタイプスイッチ（例えばＩｇＥクラスへの）を抑制するように機能するようである。マクロファージ上では、ＦｃγＲＩＩＢは、ＦｃγＲＩＩＡによって媒介される食作用を阻害するように作用する。好酸球及びマスト細胞上では、該Ｂフォームが、ＩｇＥの分離した受容体へのＩｇＥ結合を通じたこれらの細胞の活性化を抑制するのに資する。ＦｃγＲＩＩＡに対する結合の減少は、例えば、アミノ酸残基Ｅ２３３〜Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｒ２９２及びＫ４１４（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）のうちの少なくとも１つにおいて変異を有するＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む抗体に関して見られる。
【０１００】
−  ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は、中程度から低いアフィニティーでＩｇＧに結合し、２種類存在する。ＦｃγＲＩＩＩＡは、ＮＫ細胞、マクロファージ、好酸球、並びにいくつかの単球及びＴ細胞上で見られ、ＡＤＣＣを媒介する。ＦｃγＲＩＩＩＢは、好中球に多く発現する。ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合の減少は、例えば、アミノ酸残基Ｅ２３３〜Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｓ２３９、Ｅ２６９、Ｅ２９３、Ｙ２９６、Ｖ３０３、Ａ３２７、Ｋ３３８及びＤ３７６（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）のうちの少なくとも１つにおける変異を有するＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む抗体に関して見られる。
【０１０１】
Ｆｃ受容体に対するヒトＩｇＧ１上の結合部位、すなわち上述の変異部位のマッピング、並びにＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＡへの結合を測定するための方法は、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）６５９１−６６０４に記載されている。
【０１０２】
用語「ＡＤＣＣ」又は「抗体依存性細胞傷害性」とは、Ｆｃ受容体結合により媒介される機能であり、エフェクター細胞の存在下での、本明細書で報告されているような抗体による標的細胞の溶解を指す。ＡＤＣＣを媒介する初期段階を誘導する抗体の能力は、Ｆｃγ受容体発現細胞（ＦｃγＲＩ及び／若しくはＦｃγＲＩＩＡ、又はＮＫ細胞（本質的にＦｃγＲＩＩＩＡを発現する）を組換え発現する細胞など）への結合を測定することによって調べられる。特に、ＮＫ細胞上でのＦｃγＲへの結合が測定される。
【０１０３】
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃ領域のによる関与に続いて、受容体保有細胞を刺激してエフェクター機能を実行するシグナル伝達事象を誘発するＦｃ受容体である。活性化Ｆｃ受容体には、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が含まれる。活性化Ｆｃ受容体は特に、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０８６３７，バージョン１４１参照）。
【０１０４】
「腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー」又は「ＴＮＦ受容体スーパーファミリー」は、現在２７の受容体で構成されている。ＴＮＦ受容体スーパーファミリーは、細胞外のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）を介して腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に結合する能力によって特徴付けられるサイトカイン受容体のグループである。この偽反復は、受容体鎖内の高度に保存されたシステイン残基によって生成される鎖内ジスルフィドによって画定される。神経成長因子（ＮＧＦ）を除き、ＴＮＦは全て、原型的なＴＮＦアルファと相同である。ＴＮＦの活性型では、ＴＮＦ受容体の大部分が原形質膜中で三量体複合体を形成する。したがって、ほとんどのＴＮＦ受容体は膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）を含有している。これらの受容体のいくつかは、リガンド結合後にカスパーゼ相互作用タンパク質を動員して、カスパーゼ活性化の外因性経路を開始する細胞内デスドメイン（ＤＤ）も含有する。デスドメインを欠く他のＴＮＦスーパーファミリー受容体は、ＴＮＦ受容体関連因子に結合し、増殖又は分化を引き起こす可能性のある細胞内シグナル伝達経路を活性化する。このような受容体はアポトーシスも開始することができるが、それは間接的なメカニズムを介して行われるものである。アポトーシスの調節に加えて、ＴＮＦスーパーファミリー受容体のいくつかは、Ｂ細胞の恒常性と活性化、ナチュラルキラー細胞の活性化、及びＴ細胞の共刺激等の免疫細胞機能の調節に関与している。他のいくつかは、毛嚢の発達及び破骨細胞の発達なｔど、細胞型特異的応答を調節する。ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーには以下のものが含まれる：腫瘍壊死因子受容体１（１Ａ）（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ，ＣＤ１２０ａ）、腫瘍壊死因子受容体２（１Ｂ）（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ，ＣＤ１２０ｂ）、リンホトキシンベータ受容体（ＬＴＢＲ，ＣＤ１８）、ＯＸ４０（ＴＮＦＲＳＦ４，ＣＤ１３４）、ＣＤ４０（Ｂｐ５０）、Ｆａｓ受容体（Ａｐｏ−１，ＣＤ９５，ＦＡＳ）、デコイ受容体３（ＴＲ６，Ｍ６８，ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ）、ＣＤ２７（Ｓ１５２，Ｔｐ５５）、ＣＤ３０（Ｋｉ−１，ＴＮＦＲＳＦ８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７，ＴＮＦＲＳＦ９）、ＤＲ４（ＴＲＡＩＬＲ１，Ａｐｏ−２，ＣＤ２６１，ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ）、ＤＲ５（ＴＲＡＩＬＲ２，ＣＤ２６２，ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ）、デコイ受容体１（ＴＲＡＩＬＲ３，ＣＤ２６３，ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ）、デコイ受容体２（ＴＲＡＩＬＲ４，ＣＤ２６４，ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ）、ＲＡＮＫ（ＣＤ２６５，ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ）、破骨細胞形成抑制因子（ＯＣＩＦ，ＴＲ１，ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）、ＴＷＥＡＫ受容体（Ｆｎ１４，ＣＤ２６６，ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ）、ＴＡＣＩ（ＣＤ２６７，ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ）、ＢＡＦＦ受容体（ＣＤ２６８，ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ）、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ，ＴＲ２，ＣＤ２７０，ＴＮＦＲＳＦ１４）、神経成長因子受容体（ｐ７５ＮＴＲ，ＣＤ２７１，ＮＧＦＲ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＣＤ２６９，ＴＮＦＲＳＦ１７）、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連（ＧＩＴＲ，ＡＩＴＲ，ＣＤ３５７，ＴＮＦＲＳＦ１８）、ＴＲＯＹ（ＴＮＦＲＳＦ１９）、ＤＲ６（ＣＤ３５８，ＴＮＦＲＳＦ２１）、ＤＲ３（Ａｐｏ−３，ＴＲＡＭＰ，ＷＳ−１，ＴＮＦＲＳＦ２５）、及びエクトジスプラシンＡ２受容体（ＸＥＤＡＲ，ＥＤＡ２Ｒ）。
【０１０５】
腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーのいくつかのメンバーは、初期Ｔ細胞活性化後に機能して、Ｔ細胞応答を維持する。「共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバー」又は「共刺激ＴＮＦファミリー受容体」という用語は、ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーのサブグループを指し、これはＴ細胞の増殖及びサイトカイン産生を共刺激することができる。特に断らない限り、この用語は、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）等の哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の天然ＴＮＦファミリー受容体を指す。本発明の特定の実施態様では、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーは、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ（ＣＤ２７０）、ＣＤ３０及びＧＩＴＲから成る群から選択され、これらは全てＴ細胞への共刺激作用を与え得る。より詳細には、本発明の抗原結合分子は、共刺激ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＯＸ４０に特異的に結合することができる部分を少なくとも含む。
【０１０６】
ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーの、特定の配列における更なる情報が、Ｕｎｉｐｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）などの一般にアクセス可能なデータベースから取得できる。例えば、ヒト共刺激性ＴＮＦ受容体は、以下のアミノ酸配列：ヒトＯＸ４０（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ４３４８９，配列番号５６）、ヒト４−１ＢＢ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ０７０１１，配列番号５７）、ヒトＣＤ２７（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２６８４２，配列番号５８）、ヒトＨＶＥＭ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９２９５６，配列番号５９）、ヒトＣＤ３０（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２８９０８，配列番号６０）、及びヒトＧＩＴＲ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９Ｙ５Ｕ５，配列番号６１）を有する。
【０１０７】
特に断らない限り、本明細書で使用される用語「ＯＸ４０」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳動物を含む脊椎動物源由来の任意の天然ＯＸ４０を指す。この用語は、「完全長」、未処理（unprocessed）のＯＸ４０たけではなく、細胞内でのプロセシングから生じる任意の型のＯＸ４０を包含する。この用語は、天然に存在するＯＸ４０のバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトＯＸ４０のアミノ酸配列は配列番号５６（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ４３４８９，バージョン１１２）に示され、例示的なマウスＯＸ４０のアミノ酸配列は配列番号６２（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ４７７４１，バージョン１０１）に示されている。
【０１０８】
用語「抗ＯＸ４０抗体」、「抗ＯＸ４０」、「ＯＸ４０抗体」及び「ＯＸ４０に結合する抗体」は、ＯＸ４０を標的とするのに診断薬及び／又は治療剤として有用であるほどに十分なアフィニティーでＯＸ４０に結合することができる抗体を指す。一実施態様において、無関係な非４−１ＢＢタンパク質への抗ＯＸ４０抗体の結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で測定した場合、該抗体の４−１ＢＢへの結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、ＯＸ４０に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−６Ｍ以下、例えば１０−６８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−８Ｍから１０−１０Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
【０１０９】
用語「抗ＴｎＣ抗体」及び「ＴｎＣに結合する抗体」は、ＴｎＣを標的とするのに診断薬及び／又は治療剤として有用であるほどに十分なアフィニティーでテネイシンＣ（ＴｎＣ）に結合することができる抗体を指す。一実施態様において、無関係な非ＣＤ２０タンパク質への抗ＴｎＣ抗体の結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で測定した場合、該抗体のＴｎＣへの結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、ＴｎＣに結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦５ｎＭ、≦２ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０ｎＭから０．１ｎＭ、例えば５ｎＭから０．１ｎＭ、例えば２ｎＭから０．１ｎＭ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。特定の実施態様では、抗ＴｎＣ抗体は、異なる種由来のＴｎＣ間で保存されているＴｎＣのエピトープに結合する。特定の実施態様では、ＴｎＣのエピトープに結合する抗体は、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ｂ、ＡＤ１、ＡＤ２、Ｃ及びＤ．から成る群より選択される少なくとも１つのドメインに特異的である。特定の実施態様では、ＴｎＣ  Ａ１ドメイン及びＴｎＣ  Ａ４ドメインに特異的な抗体が提供される。特定の実施態様では、ＴｎＣ  Ｃドメインに特異的な抗体が提供される。
【０１１０】
用語「ペプチドリンカー」は、１以上のアミノ酸、典型的には約２から２０のアミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは当技術分野において既知であるか、又は本願明細書に記載される。適切な非免疫原性リンカーペプチドは、例えば（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーであり、ここで「ｎ」は通常１から１０、典型的には２から４の数字、特に２であり、すなわちＧＧＧＧＳ（配列番号６４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６５）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号６６）及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号６８）から成る群より選択されるペプチドであるが、配列ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号７０）、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号６７）、（Ｇ４Ｓ）４（配列番号６９）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号７１）、ＧＳＧＳＧＮＧＳ（配列番号７２）、ＧＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号７３）、ＧＧＳＧＳＧ（配列番号７４）、ＧＧＳＧ（配列番号７５）、ＧＧＳＧＮＧＳＧ（配列番号７６）、ＧＧＮＧＳＧＳＧ（配列番号７７）及びＧＧＮＧＳＧ（配列番号７８）も含む。特に目的とするペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）（配列番号：６４）、（Ｇ４Ｓ）２又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６５）、及びＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号７０）である。
【０１１１】
本願内で使用される場合、用語「アミノ酸」は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に存在するカルボキシαアミノ酸の群を意味する。
【０１１２】
「融合した」又は「連結した」とは、構成要素（例えば、抗体の重鎖及びＦａｂ断片）が、直接又は１若しくは複数のペプチドリンカーを介して、ペプチド結合によって結合していることを意味する。
【０１１３】
参照ポリペプチド（タンパク質）配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、これらの配列を整列させ、最大の配列同一性パーセントを得るために必要に応じてギャップを導入し、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮しない場合の、該参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の割合と定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメントは、当分野の技術の範囲内にある様々な方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＳＡＷＩ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して得ることができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを得るのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、配列を整列させるための適切なパラメーターを決定することができる。しかしながら、本明細書において、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作成されたもので、そのソースコードは、ユーザー文書と共に米国著作権庁（ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９）に提出されており、ここで米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ジェネンテック社（カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）から公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされていなければならない。すべての配列比較パラメーターは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂとの（又はこれに対する）アミノ酸配列同一性％（或いは、所与のアミノ酸配列Ａは、所与のアミノ酸配列Ｂと（又はこれに対して）特定のアミノ酸配列同一性％を有するか又は含む所与のアミノ酸配列Ａ、ということもできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは、プログラムのアライメントＡ及びＢにおいて、配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により完全一致としてスコアされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性％は、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性％とは異なると認識されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性％値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して、直前の段落に記載のようにして得られる。
【０１１４】
特定の実施態様では、本明細書で提供される抗原結合分子のアミノ酸配列バリアントが企図される。例えば、抗原結合分子の結合アフィニティー及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗原結合分子のアミノ酸配列バリアントは、分子をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、又はペプチド合成により調製することができる。このような改変には、例えば抗体のアミノ酸配列内の残基からの削除及び／又はそれへの挿入及び／又はそれの置換が含まれる。最終コンストラクトに到達するために、削除、挿入及び置換の任意の組み合わせが作られてもよい。但し、これは最終コンストラクトが所望の特性、例えば抗原結合を有する場合に限る。置換突然変異の対象となる部位には、ＨＶＲとフレームワーク（ＦＲ）が含まれる。表Ｂの「好ましい置換」という項目で保存的置換が示されており、その後にアミノ酸側鎖に基づいた分類（１）から（６）が更に記載されている。アミノ酸置換を目的の分子に導入することができ、その生成物を、所望の活性、例えば抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下又はＡＤＣＣ若しくはＣＤＣの改善についてスクリーニングすることができる。
表Ｂ
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アミノ酸は以下の共通の側鎖特性に従ってグループ化することができる。
（１）疎水性：ノルロイシン，Ｍｅｔ，Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ａｓｎ，Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ，Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ，Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｐｈｅ
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つの要素を別のクラスの要素と交換することを必然的に伴うものである。
【０１１５】
用語「アミノ酸配列バリアント」は、親抗原結合分子（例えばヒト化又はヒト抗体）の１又は複数の超可変領域残基中にアミノ酸置換が存在する実質的なバリアントを含む。一般に、更なる研究のために選択された結果として得られるバリアントは、親抗原結合分子と比較して、特定の生物学的特性の改変（例えば改善）（例えばアフィニティーの向上、免疫原性の低下）を有し、且つ／又は親抗原結合分子の特定の生物学的特性を実質的に保持しているものである。例示的な置換型バリアントは、アフィニティー成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるようなファージディスプレイに基づくアフィニティー成熟技術を用いて、簡便に生成することができる。簡潔に言えば、１又は複数のＨＶＲ残基を突然変異させ、バリアント抗原結合分子をファージ上に提示させ、特定の生物活性（例えば結合アフィニティー）についてスクリーニングする。特定の実施態様では、置換、挿入又は削除は、 これらの変更が抗原結合分子の抗原に結合する能力を実質的に低下させない限り、１又は複数のＨＶＲ内で起こってもよい。例えば、実質的に結合アフィニティーを低下させない保存的変更（例えば本明細書において提供される保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５により記載されるように「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、複数の標的残基のうちの１つ残基又は群（例えばＡｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕ等の荷電残基）を同定し、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えばアラニン又はポリアラニン）で置き換えて、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを判定する。最初の置換に対する機能感受性を示すアミノ酸位置に、更なる置換を導入することができる。別法として又はそれに加えて、抗体と抗原との接触点を特定するための抗原−抗原結合分子複合体の結晶構造。このような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的にしても排除してもよい。バリアントをスクリーニングして、それらが所望の特性を含むかどうか判定することができる。
【０１１６】
アミノ酸配列挿入には、長さが１残基から１００又はそれ以上の残基を有するポリペプチドまでの範囲のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する、本発明の二重特異性抗原結合分子が含まれる。該分子のその他の挿入バリアントには、該二重特異性抗原結合分子の血清半減期を延ばす、ポリペプチドに対するＮ末端又はＣ末端への融合体が含まれる。
【０１１７】
特定の実施態様では、本明細書に提供される二重特異性抗原結合分子は、抗体がグリコシル化される程度を上昇又は低下させるように変更される。該分子のグリコシル化バリアントは、簡便には、１又は複数のグリコシル化部位が生成又は除去されるようにアミノ酸配列を変更することにより得ることができる。該二重特異性抗原結合分子がＦｃ領域を含む場合、それに結合する炭水化物が変更され得る。哺乳動物細胞によって産生される天然抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ結合によって通常結合される分枝状の二分岐オリゴ糖を含む。例えばＷｒｉｇｈｔら，ＴＩＢＴＥＣＨ  １５：２６−３２（１９９７）を参照。オリゴ糖には、様々な糖、例えばマンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース及びシアル酸、並びに二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれ得る。いくつかの実施態様では、特定の改善された特性を有するバリアントを作製するために、抗原結合分子中のオリゴ糖の修飾が行われ得る。一態様において、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）結合したフコースを欠く糖鎖構造を有する、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体のバリアントが提供される。このようなフコシル化バリアントは、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Presta, L.）又は同第２００４／００９３６２１号（協和発酵株式会社）を参照のこと。別の態様において、本発明の二重特異性抗原結合分子又は抗体のバリアントは、例えばＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分されている二分岐オリゴ糖を伴う。このような変バリアントは、減少したフコシル化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能有し得る。例えば国際公開第２００３／０１１８７８号（Jean-Mairet et al.）；米国特許第６６０２６８４号（Umana et al.）；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Umana et al.）を参照のこと。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１のガラクトース残基を持つバリアントも提供される。このような抗体バリアントは、改善されたＣＤＣ機能を有し、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Patel et al.）；国際公開第１９９８／５８９６４号（Raju, S.）；及び国際公開第１９９９／２２７６４（Raju, S.）に記載されている。
【０１１８】
特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のシステイン操作バリアント、例えば、分子の１又は複数の残基がシステイン残基で置換されている「チオＭａｂ」を作製することが望ましい。特定の態様において、置換残基は、分子のアクセス可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基が抗体のアクセス可能な部位に配置され、その反応性チオール基を用いて抗体を他の部分、例えば薬物部分又はリンカー−薬物部分にコンジュゲートさせて、イムノコンジュゲートを作製することができる。ある態様において、次の残基：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）のいずれか１つ又はそれ以上がシステインと置換され得る。システイン操作抗原結合分子は、例えば米国特許第７５２１５４１号に記載されているように生成され得る。
【０１１９】
用語「ポリヌクレオチド」は、単離された核酸分子又はコンストラクト、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、一般的なホスホジエステル結合又は非一般的結合（例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含み得る。用語「核酸分子」は、ポリヌクレオチド中に存在する、任意の１又は複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。
【０１２０】
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドとは、天然環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡを意図する。例えばベクターに含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されたとみなされる。単離されたポリヌクレオチドの更なる例には、異種宿主細胞内に維持されている組換えポリヌクレオチド、又は溶液中の（部分的に又は実質的に）精製されたポリヌクレオチドが含まれる。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外に、又は天然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。単離されたＲＮＡ分子には、本発明のｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡ転写物、並びにプラス鎖及びマイナス鎖型及び二本鎖型が含まれる。更に、本発明の単離されたポリヌクレオチド又は核酸には、合成により生成されたこのような分子が含まれる。また、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位又は転写ターミネーター等の調節エレメントを含んでも含まなくてもよい。
【０１２１】
本発明の参照ヌクレオチド配列と、例えば、少なくとも９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５つまでの点突然変異を含み得ること以外は、参照配列と同一であることを意味する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中最大５％のヌクレオチドが削除されるか又は別のヌクレオチドで置換されてもよく、或いは参照配列中の全ヌクレオチドの最大５％の数のヌクレオチドが参照配列に挿入されてよい。参照配列のこのような変更は、参照ヌクレオチド配列の５’若しくは３’末端位置で、又はこれら末端位置の間のどの位置で起こってもよく、参照配列中の残基間に個々に散在してもよいし、又は参照配列内に１つ若しくは複数の連続した群として散在してもよい。実際問題として、特定のポリヌクレオチド配列が本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、ポリペプチドについて上述したもの（例えばＡＬＩＧＮ−２）などの既知のコンピュータプログラムを用いて慣例的に判定することができる。
【０１２２】
用語「発現カセット」とは、標的細胞内の特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸要素を用いて、組換え又は合成により生成されたポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス又は核酸断片に組み込むことができる。発現ベクターの組換え発現カセット部分には、数ある配列の中でも特に、転写される核酸配列及びプロモーターが典型的に含まれる。特定の実施態様では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
【０１２３】
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、「発現コンストラクト」と同義であり、ＤＮＡ分子であって、それが標的細胞内において作動可能に結合する特定の遺伝子の発現を導入し、指示するために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造物としてのベクター、及び導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、大量の安定なｍＲＮＡの転写を可能にする。発現ベクターが標的細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞転写及び／又は翻訳機構によって生成される。一実施態様では、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
【０１２４】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は、互換的に使用され、外因性の核酸が導入されている細胞を指し、そのような細胞の子孫も含む。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞及び、継代の数に関係なく、それに由来する子孫が含まれる。子孫は、核酸含量が親細胞と完全に同じでなくてもよく、突然変異を含んでもよい。本明細書には、最初に形質転換された細胞でスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する突然変異子孫が含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するのに使用できる任意の種類の細胞系である。宿主細胞には、培養細胞、例えばいくつか例を挙げると、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞等の哺乳動物の培養細胞、又はハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞が含まれるだけでなく、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、又は培養された植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞も含まれる。
【０１２５】
「有効量の」薬剤は、それが投与される細胞又は組織の生理的変化をもたらすために必要な量を指す。
【０１２６】
薬剤、例えば薬学的組成物の「治療的有効量」とは、所望の治療的又は予防的結果を得るのに必要な用量及び期間での有効な量を指す。薬剤の治療的有効量は、疾患の有害作用を、例えば排除し、低下させ、遅延させ、最小化し、又は防止する。
【０１２７】
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれる。特に、個体又は対象はヒトである。
【０１２８】
用語「薬学的組成物」とは、中に含まれる活性成分の生物活性が有効になるような形態の調製物であり、且つ、製剤が投与される対象にとって許容できないほど毒性である追加の成分を含まない調製物を指す。
【０１２９】
「薬学的に許容される添加剤」は、薬学的組成物中の活性成分以外の成分で、対象に対して非毒性である成分を指す。薬学的に許容される添加剤には、限定されないが、バッファー、安定剤又は保存剤が含まれる。
【０１３０】
「添付文書」という用語は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに用いられ、適応症、用法、用量、投与、併用療法、当該治療製品の使用に関する禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。
【０１３１】
本明細書で用いられる場合、「治療（treatment）」（及び「治療する（treat）」又は「治療すること（treating）」など、その文法的変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために行うことも、臨床病理の過程において行うこともできる。治療の望ましい効果には、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患の状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。いくつかの実施態様において、本発明の分子は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。
【０１３２】
本明細書で使用される用語「がん」は、増殖性疾患、例えばリンパ腫、リンパ性白血病、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、細気管支肺胞細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚黒色腫又は眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（stomach cancer）、胃がん（gastric cancer）、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫、及びユーイング肉腫（任意の上記がんの難治性型、又は１つ以上の上記がんの組合せを含む）を指す。
【０１３３】
本発明の二重特異性抗原結合分子
本発明は、生産可能性、安定性、結合アフィニティー、生物活性、標的化効率、及び低い毒性等の特に有利な特性を有する新規の二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１３４】
本発明は、
（ａ）抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、ＯＸ４０に特異的に結合できる少なくとも１つの部分、並びに
（ｂ）抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、テネイシンＣ（ＴｎＣ）に特異的に結合できる少なくとも１つの部分
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１３５】
いくつかの実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、（ｃ）安定な結合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃ領域を更に含む。
【０１３６】
特定の態様では、このような二重特異性抗原結合分子は、ＯＸ４０へのアゴニスト結合により特徴付けられる。
【０１３７】
ＯＸ４０に結合する二重特異性抗原結合分子
ある態様では、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、そのＯＸ４０に特異的に結合できる部分が、配列番号１のアミノ酸配列を含むか又はそれから成るポリペプチドに結合する二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１３８】
ある態様では、提供されているのは、ＯＸ４０に特異的に結合できる少なくとも１つの部分を含む二重特異性抗原結合分子であって、前記部分が、
（ｉ）配列番号２及び配列番号３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号４及び配列番号５から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、並びに
（ｉｉｉ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨと、
（ｉｖ）配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、並びに
（ｖｉ）配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２４から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬと
を二重特異性抗原結合分子である。
【０１３９】
提供されているのは、特に、ＯＸ４０に特異的に結合できる少なくとも１つの部分を含む二重特異性抗原結合分子であって、前記部分が、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ；並びに配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬを含むか、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、並びに配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬを含むか、
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、並びに配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１を含むＶＬ、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬを含むか、
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、並びに配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬを含むか、
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３含むＶＨ、並びに配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬを含むか、
（ｆ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、並びに配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬを含むか、又は
（ｇ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、並びに配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬを含む
二重特異性抗原結合分子である。
【０１４０】
一態様において、本発明は、ＯＸ４０に特異的に結合できる少なくとも１つの部分を含む二重特異性抗原結合分子を提供し、前記部分は、配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、並びに配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬを含む。
【０１４１】
別の態様では、本発明は、ＯＸ４０に特異的に結合できる部分が、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号：３３、配列番号３５、及び配列番号：３７から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、及び配列番号３８から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１４２】
提供されているのは、特に、ＯＸ４０に特異的に結合できる部分が、
（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｉｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号３０のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｖ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｖｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｖｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む二重特異性抗原結合分子である。
【０１４３】
特定の態様において、提供されているのは、ＯＸ４０に特異的に結合できる部分が、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む二重特異性抗原結合分子である。
【０１４４】
ＴｎＣに結合する二重特異性抗原結合分子
ある態様では、本発明は、二重特異性抗原結合分子であって、そのテネイシンＣ（ＴｎＣ）に特異的に結合できる部分が、配列番号３９のアミノ酸配列を含むか又はそれから成るポリペプチドに結合する二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１４５】
ある態様において、提供されているのは、ＴｎＣに特異的に結合できる少なくとも１つの部分を含む二重特異性抗原結合分子であって、前記部分は、
（ｉ）配列番号４０及び配列番号４１から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号４２及び配列番号４３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、並びに
（ｉｉｉ）配列番号４４及び配列番号４５から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨと、
（ｉｖ）配列番号４６及び配列番号４７から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号４８及び配列番号４９から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、並びに
（ｖｉ）配列番号５０及び配列番号５１から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬと
を含む。
【０１４６】
提供されているのは、特に、ＴｎＣに特異的に結合できる少なくとも１つの部分を含む二重特異性抗原結合分子であり、前記部分は
（ａ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、並びに配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ、又は
（ｂ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、並びに配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬを含む。
【０１４７】
提供されているのは、特に、ＴｎＣに特異的に結合できる少なくとも１つの部分を含む二重特異性抗原結合分子であり、前記部分は、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、並びに配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬを含む。
【０１４８】
別の態様において、本発明は二重特異性抗原結合分子を提供し、そのＴｎＣに特異的に結合できる部分は、配列番号５２及び配列番号５４から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号５３及び配列番号５５から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。
【０１４９】
提供されているのは、特に、二重特異性抗原結合分子であり、そのＴｎＣに特異的に結合できる部分は、
（ｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｉｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む。
【０１５０】
特定の態様において、提供されているのは、ＯＸ４０に特異的に結合できる部分が、配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む二重特異性抗原結合分子である。
【０１５１】
ＯＸ４０及びＴｎＣに結合する二重特異性抗原結合分子
更なる態様において、提供されるのは、
（ｉ）配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５又は配列番号３７から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６又は配列番号３８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＯＸ４０に特異的に結合できる部分と、
（ｉｉ）配列番号５２又は配列番号５４から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５３又は配列番号５５から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む部分とを含む
二重特異性抗原結合分子である。
【０１５２】
特定の態様において、提供されるのは、
（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合できる部分が、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬとを含み、ＴｎＣに特異的に結合できる部分が、配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬとを含むか、
（ｂ）ＯＸ４０に特異的に結合できる部分が、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬとを含み、ＴｎＣに特異的に結合できる部分が、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＬとを含むか、
（ｃ）ＯＸ４０に特異的に結合できる部分が、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＬとを含み、ＴｎＣに特異的に結合できる部分が、配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬとを含むか、
（ｄ）ＯＸ４０に特異的に結合できる部分が、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＬとを含み、ＴｎＣに特異的に結合できる部分が、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＬとを含むか、
（ｅ）ＯＸ４０に特異的に結合できる部分が、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号３０のアミノ酸配列を含むＶＬとを含み、ＴｎＣに特異的に結合できる部分が、配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬとを含むか、
（ｆ）ＯＸ４０に特異的に結合できる部分が、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号３０のアミノ酸配列を含むＶＬとを含み、ＴｎＣに特異的に結合できる部分が、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＬとを含むか、
（ｇ）ＯＸ４０に特異的に結合できる部分が、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬとを含み、ＴｎＣに特異的に結合できる部分が、配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬとを含むか、
（ｈ）ＯＸ４０に特異的に結合できる部分が、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬとを含み、ＴｎＣに特異的に結合できる部分が、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＬとを含むか、
（ｉ）ＯＸ４０に特異的に結合できる部分が、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含み、ＴｎＣに特異的に結合できる部分が、配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬとを含むか、
（ｊ）ＯＸ４０に特異的に結合できる部分が、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＬとを含み、ＴｎＣに特異的に結合できる部分が、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＬとを含むか、
（ｋ）ＯＸ４０に特異的に結合できる部分が、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬとを含み、ＴｎＣに特異的に結合できる部分が、配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬとを含むか、
（ｌ）ＯＸ４０に特異的に結合できる部分が、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬとを含み、ＴｎＣに特異的に結合できる部分が、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＬとを含むか、
（ｍ）ＯＸ４０に特異的に結合できる部分が、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＬとを含み、ＴｎＣに特異的に結合できる部分が、配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬとを含むか、又は
（ｎ）ＯＸ４０に特異的に結合できる部分が、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＬとを含み、ＴｎＣに特異的に結合できる部分が、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む
二重特異性抗原結合分子である。
【０１５３】
特定の態様において、本発明は、
ＯＸ４０に特異的に結合することができる部分が、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＬとを含み、ＴｎＣに特異的に結合することができる部分が、配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬとを含むか、又は
ＯＸ４０に特異的に結合できる部分が、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＬとを含み、ＴｎＣに特異的に結合できる部分が、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む
二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１５４】
二重特異性、二価の抗原結合分子（２＋２型）
ある態様では、本発明は、
（ａ）抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と抗体重鎖可変領域（ＶＨ）とを含む、ＯＸ４０に特異的に結合できる２つの部分、
（ｂ）抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と抗体重鎖可変領域（ＶＨ）とを含む、ＴｎＣに特異的に結合できる２つの部分、並びに
（ｃ）安定な結合が可能な第１及び第２サブユニットから構成されるＦｃ領域
を含む
二重特異性抗原結合分子に関する。
【０１５５】
ある態様では、二重特異性抗原結合分子は、ＯＸ４０とＴｎＣの双方に対して二価である。
【０１５６】
一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）抗体の２つの軽鎖及び、ＯＸ４０に特異的に結合できる２つのＦａｂ断片とＦｃ領域とを含む２つの重鎖、並びに
（ｂ）ＴｎＣに特異的に結合できる２つのＦａｂ断片であって、そのＦａｂ断片のうちの一方が（ａ）の２つの重鎖のうちの一方のＣ末端に連結し、Ｆａｂ断片のうちのもう一方が（ａ）の２つの重鎖のうちのもう一方のＣ末端に連結しているＦａｂ断片
を含む。
【０１５７】
一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合できるＦａｂ断片のＶＨ及びＣＨ１ドメインと、Ｆｃ領域サブユニットとをそれぞれが含む２つの重鎖、
（ｂ）ＯＸ４０に特異的に結合できるＦａｂ断片のＶＬ及びＣＬドメインをそれぞれが含む２つの軽鎖、
（ｃ）ＴｎＣに特異的に結合できる２つのＦａｂ断片であって、そのＦａｂ断片の一方が（ａ）の２つの重鎖のうちの一方のＣ末端に連結し、Ｆａｂ断片のうちのもう一方が（ａ）の２つの重鎖のうちのもう一方のＣ末端に連結しているＦａｂ断片
を含む。
【０１５８】
いくつかの実施態様において、ＴｎＣに特異的に結合できる２つのＦａｂ断片は、ＶＬ−ＣＨ１鎖とＶＨ−ＣＬ鎖とをそれぞれが含むクロスオーバーＦａｂ断片であって、ＶＬ−ＣＨ１鎖の一方が（ａ）の２つの重鎖のうちの一方のＣ末端に連結し、ＶＬ−ＣＨ１鎖のもう一方が（ａ）の２つの重鎖のうちのもう一方のＣ末端に連結している。
【０１５９】
本発明の様々な態様によるいくつかの実施態様では、ＴｎＣに特異的に結合できるＦａｂ断片は、ペプチドリンカーを介して（ａ）の重鎖のＣ末端に連結している。本発明の様々な態様によるいくつかの実施態様では、ＴｎＣに特異的に結合できるＦａｂ断片は、ペプチドリンカーを介して（ａ）の２つ重鎖のうちの一方のＣ末端に連結している。特定の態様において、ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）４（配列番号６９）である。
【０１６０】
特定の態様において、本発明は、
（ａ）配列番号２１３のアミノ酸配列をそれぞれが含む２つの重鎖、配列番号２１２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、及び配列番号２１４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖、又は
（ｂ）配列番号２１５のアミノ酸配列をそれぞれが含む２つの重鎖、配列番号２１２のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、及び配列番号２１６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１６１】
特定の態様において、本発明は、配列番号２１３のアミノ酸配列をそれぞれが含む２つの重鎖、配列番号２１２のアミノ酸配列をそれぞれが含む２つの軽鎖、及び配列番号２１４のアミノ酸配列をそれぞれが含む２つの軽鎖を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１６２】
特定の態様において、本発明は、配列番号２１５のアミノ酸配列をそれぞれが含む２つの重鎖、配列番号２１２のアミノ酸配列をそれぞれが含む２つの軽鎖、及び配列番号２１６のアミノ酸配列をそれぞれが含む２つの軽鎖を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１６３】
ＯＸ４０への二価又は四価，結合及びＴｎＣへの一価結合を有する二重特異性抗原結合分子（２＋１及び４＋１型）
ある態様では、二重特異性抗原結合分子は、ＯＸ４０に対して二価で、ＴｎＣに対して一価である。
【０１６４】
ある態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）Ｆｃ領域に連結している、ＯＸ４０に特異的に結合できる２つのＦａｂ断片、及び
（ｂ）抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と、Ｆｃ領域のＣ末端に連結している抗体重鎖可変領域（ＶＨ）とを含む、ＴｎＣに特異的に結合できる部分
を含む。
【０１６５】
一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）抗体の２つの軽鎖及び、ＯＸ４０に特異的に結合できる２つのＦａｂ断片とＦｃ領域とを含む２つの重鎖、並びに
（ｂ）ＴｎＣに特異的に結合できる部分のＶＨ及びＶＬであって、ＶＨが（ａ）の２つの重鎖のうちの一方のＣ末端に連結し、ＶＬが（ａ）の２つの重鎖のうちのもう一方のＣ末端に連結しているＶＨ及びＶＬ
を含む。
【０１６６】
一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合できるＦａｂ断片のＶＨ及びＣＨ１ドメインと、Ｆｃ領域サブユニットとをそれぞれが含む２つの重鎖、
（ｂ）ＯＸ４０に特異的に結合できるＦａｂ断片のＶＬ及びＣＬドメインをそれぞれが含む２つの軽鎖、並びに
（ｃ）ＴｎＣに特異的に結合できる部分のＶＨ及びＶＬであって、ＶＨが（ａ）の２つの重鎖のうちの一方のＣ末端に連結し、ＶＬが（ａ）の２つの重鎖のうちのもう一方のＣ末端に連結しているＶＨ及びＶＬ
を含む。
【０１６７】
別の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合できるＦａｂ断片のＶＨ及びＣＨ１ドメインと、Ｆｃ領域サブユニットとをそれぞれが含む２つの重鎖、
（ｂ）ＯＸ４０に特異的に結合できるＦａｂ断片のＶＬ及びＣＬドメインをそれぞれが含む２つの軽鎖、並びに
（ｃ）ＴｎＣに特異的に結合できるＦａｂ断片であって、そのＦａｂ断片のＶＨＣＨ１鎖又はＶＬＣＬ鎖が（ａ）の２つの重鎖のうちの一方のＣ末端に連結しているＦａｂ断片
を含む。
【０１６８】
ＯＸ４０への四価結合及びＴｎＣへの一価結合を有する二重特異性抗原結合分子（４＋１型）
ある態様では、二重特異性抗原結合分子は、ＯＸ４０に対して四価で、ＴｎＣに対して一価である。
【０１６９】
ある態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）Ｆｃ領域に連結している、ＯＸ４０に特異的に結合できる４つのＦａｂ断片及び、
（ｂ）抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と、Ｆｃ領域のＣ末端に連結している抗体重鎖可変領域（ＶＨ）とを含む、ＴｎＣに特異的に結合できる部分
を含む。
【０１７０】
一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）抗体の２つの軽鎖と、Ｆｃ領域及びＯＸ４０に特異的に結合できる４つのＦａｂ断片を含む２つの重鎖、並びに
（ｂ）ＴｎＣに特異的に結合できる部分のＶＨ及びＶＬであって、ＶＨが（ａ）の２つの重鎖のうちの一方のＣ末端に連結し、ＶＬが（ａ）の２つの重鎖のうちのもう一方のＣ末端に連結しているＶＨ及びＶＬ
を含む。
【０１７１】
一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合できるＦａｂ断片の２つのＶＨドメイン及び２つのＣＨ１ドメインと、Ｆｃ領域サブユニットとをそれぞれが含む２つの重鎖、
（ｂ）ＯＸ４０に特異的に結合できるＦａｂ断片のＶＬ及びＣＬドメインをそれぞれが含む４つの軽鎖、並びに
（ｃ）ＴｎＣに特異的に結合できる部分のＶＨ及びＶＬであって、ＶＨが（ａ）の２つの重鎖のうちの一方のＣ末端に連結し、ＶＬが（ａ）の２つの重鎖のうちのもう一方のＣ末端に連結しているＶＨ及びＶＬ
を含む。
【０１７２】
本発明の様々な態様によるいくつかの実施態様では、ＴｎＣに特異的に結合できる部分のＶＨは、ペプチドリンカーを介して（ａ）の２つ重鎖のうちの一方のＣ末端に連結している。本発明の様々な態様によるいくつかの実施態様では、ＴｎＣに特異的に結合できる部分のＶＬは、ペプチドリンカーを介して（ａ）の２つ重鎖のうちの一方のＣ末端に連結している。特定の態様において、ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）４（配列番号６９）である。
【０１７３】
特定の態様において、本発明は、配列番号２２２のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２２３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２１２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１７４】
特定の態様において、本発明は、配列番号２２２のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２２３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２１２のアミノ酸配列をそれぞれが含む４つの軽鎖を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１７５】
ある態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、第１、第２、第３、第４、及び第５の抗原結合部分を形成する第１及び第２の重鎖並びに４つの軽鎖を含み、第１、第２、第３、及び第４の抗原結合部分はそれぞれＯＸ４０に特異的に結合でき、第５の抗原結合部分はＴｎＣに特異的に結合することができ、この場合、
（ｉ）第１のポリペプチド鎖は、アミノ（Ｎ）末端からカルボキシル（Ｃ）末端の方向に、ＶＨ（ＯＸ４０）、ＣＨ１、ＶＨ（ＯＸ４０）、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３（Ｆｃノブ）、及びＶＨ（ＴｎＣ）を含み、
（ｉｉ）第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＶＨ（ＯＸ４０）、ＣＨ１、ＶＨ（ＯＸ４０）、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３（Ｆｃホール）、及びＶＬ（ＴｎＣ）を含み、且つ
（ｉｉｉ）４つの軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＶＬ（Ｏｘ４０）及びＣＬを含む。
【０１７６】
別の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、第１、第２、第３、第４、及び第５の抗原結合部分を形成する第１及び第２の重鎖並びに４つの軽鎖を含み、第１、第２、第３、及び第４の抗原結合部分はそれぞれＯＸ４０に特異的に結合でき、第５の抗原結合部分はＴｎＣに特異的に結合することができ、この場合、
（ｉ）第１のポリペプチド鎖は、アミノ（Ｎ）末端からカルボキシル（Ｃ）末端の方向に、ＶＨ（ＯＸ４０）、ＣＨ１、ＶＨ（ＯＸ４０）、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３（Ｆｃノブ）、及びＶＬ（ＴｎＣ）を含み、
（ｉｉ）第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＶＨ（ＯＸ４０）、ＣＨ１、ＶＨ（ＯＸ４０）、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３（Ｆｃホール）、及びＶＨ（ＴｎＣ）を含み、且つ
（ｉｉｉ）４つの軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＶＬ（Ｏｘ４０）及びＣＬを含む。
【０１７７】
ＯＸ４０への四価結合及びＴｎＣへの二価結合を有する二重特異性抗原結合分子（４＋２型）
ある態様では、二重特異性抗原結合分子は、ＯＸ４０に対して四価で、ＴｎＣに対して二価である。
【０１７８】
ある態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）Ｆｃ領域に連結している、ＯＸ４０に特異的に結合できる４つのＦａｂ断片、及び
（ｂ）抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と、Ｆｃ領域のＣ末端に連結している抗体重鎖可変領域（ＶＨ）とを含む、ＴｎＣに特異的に結合できる２つの部分
を含む。
【０１７９】
一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）抗体の４つの軽鎖と、Ｆｃ領域及びＯＸ４０に特異的に結合できる４つのＦａｂ断片を含む２つの重鎖、並びに、
（ｂ）ＴｎＣに特異的に結合できる２つのＦａｂ断片であって、そのＦａｂ断片のうちの一方が（ａ）の２つの重鎖のうちの一方のＣ末端に連結し、Ｆａｂ断片のうちのもう一方が（ａ）の２つの重鎖のうちのもう一方のＣ末端に連結しているＦａｂ断片
を含む。
【０１８０】
一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、
（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合できるＦａｂ断片の２つのＶＨドメイン及び２つのＣＨ１ドメインと、Ｆｃ領域サブユニットとをそれぞれが含む２つの重鎖、
（ｂ）ＯＸ４０に特異的に結合できるＦａｂ断片のＶＬ及びＣＬドメインをそれぞれが含む４つの軽鎖、並びに
（ｃ）ＴｎＣに特異的に結合できる２つのＦａｂ断片であって、そのＦａｂ断片の一方が（ａ）の２つの重鎖のうちの一方のＣ末端に連結し、Ｆａｂ断片のうちのもう一方が（ａ）の２つの重鎖のうちのもう一方のＣ末端に連結しているＦａｂ断片
を含む。
【０１８１】
いくつかの実施態様において、ＴｎＣに特異的に結合できる２つのＦａｂ断片は、ＶＬ−ＣＨ１鎖とＶＨ−ＣＬ鎖とをそれぞれが含むクロスオーバーＦａｂ断片であって、ＶＬ−ＣＨ１鎖の一方が（ａ）の２つの重鎖のうちの一方のＣ末端に連結し、ＶＬ−ＣＨ１鎖のもう一方が（ａ）の２つの重鎖のうちのもう一方のＣ末端に連結している。
【０１８２】
本発明の様々な態様によるいくつかの実施態様では、ＴｎＣに特異的に結合できるＦａｂ断片は、ペプチドリンカーを介して（ａ）の重鎖のＣ末端に連結している。本発明の様々な態様によるいくつかの実施態様では、ＴｎＣに特異的に結合できるＦａｂ断片は、ペプチドリンカーを介して（ａ）の２つ重鎖のうちの一方のＣ末端に連結している。特定の態様において、ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）４（配列番号６９）である。
【０１８３】
特定の態様において、本発明は、配列番号２２５のアミノ酸配列をそれぞれが含む２つの重鎖、配列番号２２４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、及び配列番号２２６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１８４】
特定の態様において、本発明は、配列番号２２５のアミノ酸配列をそれぞれが含む２つの重鎖、配列番号２２４のアミノ酸配列をそれぞれが含む４つの軽鎖、及び配列番号２２６のアミノ酸配列をそれぞれが含む２つの軽鎖を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０１８５】
ある態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、第１、第２、第３、第４、第５、及び第６の抗原結合部分を形成する第１及び第２の重鎖並びに６つの軽鎖を含み、第１、第２、第３、及び第４の抗原結合部分はそれぞれＯＸ４０に特異的に結合でき、第５及び第６の抗原結合部分はそれぞれＴｎＣに特異的に結合することができ、この場合、
（ｉ）第１及び第２のポリペプチド鎖は、アミノ（Ｎ）末端からカルボキシル（Ｃ）末端の方向に、ＶＨ（ＯＸ４０）、ＣＨ１＊、ＶＨ（ＯＸ４０）、ＣＨ１＊、ＣＨ２、ＣＨ３、ＶＬ（ＴｎＣ）、及びＣＨ１を含み、
（ｉｉ）４つの軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＶＬ（ＯＸ４０）及びＣＬ＊を含み、且つ
（ｉｉｉ）２つの軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、ＶＨ（ＴｎＣ）及びＣＬを含み、ここでＣＨ１＊及びＣＬ＊は、より良いペアリングを可能にするアミノ酸変異を含む。
【０１８６】
Ｆｃ受容体の結合及び／又はエフェクター機能を低下させるＦｃ領域改変
本発明の様々な態様による実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、安定に結合することのできる第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃ領域を更に含む。
【０１８７】
特定の態様において、１又は複数のアミノ酸改変を、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域に導入し、それによりＦｃ領域バリアントを生成することができる。Ｆｃ領域バリアントは、１つ又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸改変（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含み得る。
【０１８８】
Ｆｃ領域は、本発明の二重特異性抗体に、好ましい薬物動態特性、例えば標的組織内への良好な蓄積に貢献する長い血清半減期、及び好ましい組織−血液分布比などを付与する。しかし同時に、Ｆｃ領域は、好ましい抗原保有細胞ではなくＦｃ受容体を発現する細胞に対する、本発明の二重特性抗体の望ましくない標的化の原因となることがある。したがって、特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗体のＦｃ領域は、天然ＩｇＧ  Ｆｃ領域、特にＩｇＧ１  Ｆｃ領域又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域と比較して、低下したＦｃ受容体に対する結合アフィニティー及び／又は低下したエフェクター機能を示す。より具体的には、Ｆｃ領域はＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。
【０１８９】
このような一態様では、Ｆｃ領域（又は前記Ｆｃ領域を含む本発明の二重特異性抗原結合分子）は、天然ＩｇＧ１  Ｆｃ領域（又は天然ＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む本発明の二重特異性抗原結合分子）と比較して５０％未満、好ましくは２０％未満、更に好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満の、Ｆｃ受容体への結合アフィニティー及び／又は、天然ＩｇＧ１  Ｆｃ領域（又は天然ＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む本発明の二重特異性抗原結合分子）と比較して５０％未満、好ましくは２０％未満、更に好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満のエフェクター機能を示す。一態様では、Ｆｃ領域（又は前記Ｆｃ領域を含む本発明の二重特異性抗原結合分子）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合せず、且つ／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は活性化Ｆｃ受容体である。特定の態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、更に具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一態様では、Ｆｃ受容体は、抑制性Ｆｃ受容体である。特定の態様では、Ｆｃ受容体は、抑制性ヒトＦｃγ受容体であり、更に具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩＢである。一態様では、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びサイトカイン分泌のうちの１つ又は複数である。特定の態様では、エフェクター機能はＡＤＣＣである。一態様では、Ｆｃ領域領域は、天然ＩｇＧ１  Ｆｃ領域と比較して実質的に同様の、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合アフィニティーを示す。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合アフィニティーは、Ｆｃ領域（又は前記Ｆｃ領域を含む本発明の二重特異性抗原結合分子）が、天然ＩｇＧ１  Ｆｃ領域（又は天然ＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む本発明の二重特異性抗原結合分子）の約７０％超、特に約８０％超、更には特に約９０％超の、ＦｃＲｎに対する結合アフィニティーを示した場合に達成される。
【０１９０】
特定の態様では、Ｆｃ領域は、非操作型Ｆｃ領域と比較して低い、Ｆｃ受容体に対する結合アフィニティー及び／又はエフェクター機能を有するように工学操作される。特定の態様において、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃ領域は、Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の結合アフィニティー及び／又はエフェクター機能を低下させる、１つ又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、１つ又は複数の同じアミノ酸変異がＦｃ領域の２つのサブユニットの各々に存在する。一態様では、アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の結合アフィニティーを低下させる。別の態様では、アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の結合アフィニティーを、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１、又は少なくとも１０分の１に低下させる。一態様では、操作されたＦｃ領域を含む本発明の二重特異性抗原結合分子は、非操作型型Ｆｃ領域を含む本発明の二重特異性抗体と比較して２０％未満、特に１０％未満、更に特に５％未満の、Ｆｃ受容体に対する結合アフィニティーを示す。特定の態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。他の態様では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は、抑制性Ｆｃ受容体である。特定の態様では、Ｆｃ受容体は、抑制性ヒトＦｃγ受容体であり、更に具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩＢである。いくつかの態様では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。特定の態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、更に具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これらの各受容体への結合は、減少する。いくつかの態様では、補体成分に対する結合アフィニティー、特にＣ１ｑに対する結合アフィニティーも低下する。一態様では、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合アフィニティーは、低下しない。ＦｃＲｎに対する実質的に同様の結合、すなわち、前記受容体に対するＦｃ領域の結合アフィニティーの保存は、Ｆｃ領域（又は前記Ｆｃ領域を含む本発明の二重特異性抗原結合分子）が、非操作型Ｆｃ領域（又はＦｃ領域の前記非操作型を含む本発明の二重特異性抗原結合分子）のＦｃＲｎに対する結合アフィニティーの約７０％を上回る結合アフィニティーを示した場合に達成される。Ｆｃ領域、又は前記Ｆｃ領域を含む本発明の二重特異性抗原結合分子は、このようなアフィニティーの約８０％超、更には約９０％超のアフィニティーを示すこともある。特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃ領域は、非操作型Ｆｃ領域と比較して低下したエフェクター機能を有するように工学操作されている。低下したエフェクター機能には、低下した補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、低下した抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、低下した抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、低下したサイトカイン分泌、抗原提示細胞による低下した免疫複合体媒介性抗原取り込み、ＮＫ細胞への低下した結合、マクロファージへの低下した結合、単球への低下した結合、多形核細胞への低下した結合、アポトーシスを誘導する、低下した直接シグナル伝達、低下した樹状細胞成熟、又は低下したＴ細胞プライミングのうちの１つ以上が含まれるが��これらに限定されない。
【０１９１】
エフェクター機能が低下した抗体は、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９のうちの１つ又は複数の置換を伴うものを含む（米国特許第６７３７０５６号）。このようなＦｃ変異体には、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、所謂「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体（米国特許第７３３２５８１号）など、アミノ酸位２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７のうちの２つ以上に置換を有するＦｃ変異が含まれる。ＦｃＲへの結合が改善又は減少した、特定の抗体バリアントが記載されている。（例えば、米国特許第６７３７０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604を参照）。
【０１９２】
本発明の一態様では、Ｆｃ領域は、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の位置にアミノ酸置換を含む。いくつかの態様では、Ｆｃ領域は、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（「ＬＡＬＡ」）を含む。このような一実施態様では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、特にヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。一態様では、Ｆｃ領域は、Ｐ３２９位にアミノ酸置換を含む。より具体的な態様では、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである。一実施態様では、Ｆｃ領域は、Ｐ３２９位でのアミノ酸置換と、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓから成る群より選択される更なるアミノ酸置換とを含む。より具体的な実施態様では、Ｆｃ領域は、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」）を含む。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」の組み合わせは、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載のように、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域のＦｃγ受容体結合をほぼ完全に無効にする。前記参考文献はまた、このような変異Ｆｃ領域の調製方法と、Ｆｃ受容体結合又はエフェクター機能などのその特性を決定するための方法も記載している。このような抗体は、変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ、又は変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔらのＥＵインデックスによる番号付け；Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991）を有するＩｇＧ１である。
【０１９３】
一態様では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。より具体的な実施態様では、Ｆｃ領域は、Ｓ２２８位（Ｋａｂａｔ番号付け）のアミノ酸置換を、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。より具体的な実施態様では、Ｆｃ領域は、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。このアミノ酸置換は、ＩｇＧ４抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでのＦａｂアーム交換を減少させる（Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)参照）。
【０１９４】
半減期が延長され、且つ、母体ＩｇＧの胎児への輸送を担う新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）（Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593, and Kim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434）に対する結合が改善された抗体は、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号に記載されている。そのような抗体は、ＦｃＲｎに対するＦｃ領域の結合を改善する１又は複数の置換を伴うＦｃ領域を含む。このようなＦｃバリアントには、Ｆｃ領域残基２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４のうちの１又は複数における置換、例えばＦｃ領域残基４３４の置換を有するものが含まれる（米国特許第７３７１８２６号）。また、Ｆｃ領域バリアントの他の例に関するＤｕｎｃａｎ，Ａ．Ｒ．及びＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２（１９８８）７３８−７４０；米国特許第５６４８２６０号；同第５６２４８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。
【０１９５】
Ｆｃ受容体に対する結合は、例えばＥＬＩＳＡにより、又はＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥヘルスケア）などの標準的な装置を用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により容易に測定することができ、このようなＦｃ受容体は組換え発現により得ることができる。適切なこのような結合アッセイが本明細書に記載されている。代替的に、Ｆｃ領域又はＦｃ領域を含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃ受容体に対する結合アフィニティーは、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えば、ＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞を用いて評価することもできる。Ｆｃ領域の、又はＦｃ領域を含む本発明の抗体のエフェクター機能は、当技術分野で既知の方法により測定することができる。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは、本明細書に記載されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの他の例が、米国特許第５５００３６２号；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３，７０５９−７０６３  （１９８６）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２，１４９９−１５０２（１９８５）；米国特許第５８２１３３７号; Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６６，１３５１−１３６１（１９８７）に記載されている。代替的に、非放射性アッセイ法を用いてもよい（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（カリフォルニア州マウンテンビューのＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．；及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ウィスコンシン州マディソンのＰｒｏｍｅｇａ）参照）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。代替的又は追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５，６５２−６５６（１９９８）に開示されているような動物モデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏで評価することができる。
【０１９６】
以下のセクションでは、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低下させるＦｃ領域改変を含む本発明の二重特異性抗原結合分子の好ましい態様を記載する。一態様では、本発明は、二重特異性抗原結合分子（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合できる少なくとも１つの部分、（ｂ）ＴｎＣに特異的に結合できる少なくとも１つの部分、並びに（ｃ）安定した結合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃ領域に関し、Ｆｃ領域は、Ｆｃ受容体への、特にＦｃγ受容体に対する該抗体の結合アフィニティーを低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。別の態様では、本発明は、（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合できる少なくとも１つの部分、（ｂ）ＴｎＣに特異的に結合できる少なくとも１つの部分、並びに（ｃ）安定した結合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃ領域を含む二重特異性抗原結合分子に関し、Ｆｃ領域は、エフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。特定の態様では、Ｆｃ領域は、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＫａｂａｔのＥＵインエックスによる番号付け）を有する、ヒトＩｇＧ１サブクラスのものである。
【０１９７】
ヘテロ二量体化を促進するＦｃ領域改変
本発明の二重特異性抗原結合分子は、Ｆｃ領域の２つのサブユニットの一方又は他方に融合した異なる抗原結合部位を含み、したがってＦｃ領域の２つのサブユニットは、２つの非同一ポリペプチド鎖に含まれていることがある。これらポリペプチドの組換え共発現とそれに続く二量体化は、２つのポリペプチドの複数の可能な組み合わせをもたらす。したがって、組換え産生における本発明の二重特異性抗体の収率及び純度を高めるために、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦ領域に、所望のポリペプチドの結合を促進する改変を導入することが有利であろう。
【０１９８】
よって、特定の態様では、本発明は、（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合できる少なくとも１つの部分、（ｂ）ＴｎＣに特異的に結合できる少なくとも１つの部分、並びに（ｃ）安定した結合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃ領域を含む二重特異性抗原結合分子に関し、Ｆｃ領域は、Ｆｃ領域の第１及び第２のサブユニットの結合を促進する改変を含む。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域の２つのサブユニット間のタンパク質−タンパク質相互作用が最大である部位は、Ｆｃ領域のＣＨ３ドメイン内に存在する。したがって一態様では、前記改変は、Ｆｃ領域のＣＨ３ドメイン内に存在する。
【０１９９】
特定の態様において、前記改変は、Ｆｃ領域の２つのサブユニットの一方に「ノブ」改変を、Ｆｃ領域の２つのサブユニットの他方に「ホール」改変を含む、所謂「ノブ・イントゥ・ホール」改変である。したがって、本発明は、（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合できる少なくとも１つの部分、（ｂ）ＴｎＣに特異的に結合できる少なくとも１つの部分、並びに（ｃ）安定した結合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃ領域を含む二重特異性抗原結合分子に関し、Ｆｃ領域の第１のサブユニットは、ノブ・イントゥ・ホールにによるノブを含み、Ｆｃ領域の第２のサブユニットはホールを含む。特定の態様では、Ｆｃ領域の第１のサブユニットはアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）を含み、Ｆｃ領域の第２のサブユニットはアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０２００】
ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば米国特許第５７３１１６８号；同第７６９５９３６号；Ｒｉｄｇｗａｙら．，Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ  ９，６１７−６２１（１９９６）、及びＣａｒｔｅｒ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  ２４８，７−１５（２００１）に記載されている。通常、この方法は、隆起（「ノブ」）が対応する空洞（「ホール」）内に配置されて、ヘテロ二量体形成を促進し、且つ、ホモ二量体形成を妨げることができるように、第１のポリペプチドの境界面に隆起を、対応する空洞を第２のポリペプチドの境界面に導入することを伴う。隆起は、第１のポリペプチド境界面の小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより構築される。大きなアミノ酸側鎖をそれよりも小さなもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置き換えることにより、隆起と同じか又は同様のサイズの、埋め合わせとなる空洞が第２のポリペプチドの境界面に作られる。
【０２０１】
このように、一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子のＦｃ領域の第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起が生成され、Ｆｃ領域の第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の隆起を配置可能な空洞が生成される。隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的突然変異誘発により、又はペプチド合成により変化させることによって作り出すことができる。特定の態様では、Ｆｃ領域の第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基で置き換えられ（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃ領域の第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置き換えられる（Ｙ４０７Ｖ）。一態様では、Ｆｃ領域の第２のサブユニットにおいて更に、３６６位のスレオニン残基がセリン残基で置き換えられ（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられる（Ｌ３６８Ａ）。
【０２０２】
また更なる態様では、Ｆｃ領域の第１のサブユニットにおいて更に、３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられ（Ｓ３５４Ｃ）、Ｆｃ領域の第２のサブユニットにおいて更に、３４９位のチロシン残基がシステイン残基で置き換えられる（Ｙ３４９Ｃ）。これら２つのシステイン残基の導入により、Ｆｃ領域の２つのサブユニット間にジスルフィド架橋が形成され、二量体を更に安定させる（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。特定の態様では、Ｆｃ領域の第１のサブユニットはアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（ＥＵ番号付け）を含み、Ｆｃ領域の第２のサブユニットはアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０２０３】
代替的な態様では、Ｆｃ領域の第１のサブユニットと第２のサブユニットの結合を促進する改変は、例えば、国際公開第２００９／０８９００４号に記載されているような静電気操作効果（electrostatic steering effect）を媒介する改変を含む。通常、この方法は、ホモ二量体形成が静電的に好ましくなくなり、ヘテロ二量体化が静電的に好ましくなるように、Ｆｃ領域の２つのサブユニットの境界面の１又は複数のアミノ酸残基を荷電アミノ酸残基で置き換えることを伴う。
【０２０４】
本明細書に記載の二重特異性抗体の重鎖のＣ末端は、アミノ酸残基ＰＧＫで終端する完全なＣ末端であり得る。重鎖のＣ末端は、Ｃ末端のアミノ酸残基のうちの１つ又は２つが除去されている、短縮されたＣ末端であり得る。好ましい一態様では、重鎖のＣ末端は、ＰＧで終端する短縮されたＣ末端である。本明細書に記載の全態様のうちの一態様において、本明細書で規定される、Ｃ末端ＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む二重特異性抗体は、Ｃ末端グリシン−リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７，Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本明細書に記載の全態様のうちの一態様において、Ｃ末端ＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む二重特異性抗体は、本明細書で規定されるように、Ｃ末端グリシン残基（Ｇ４４６，Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【０２０５】
Ｆａｂドメインの改変
ある態様において、本発明は、（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合できる第１のＦａｂ断片、（ｂ）ＴｎＣに特異的に結合できる第２のＦａｂ断片、並びに（ｃ）安定した結合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃ領域を含む二重特異性抗原結合分子に関し、一方のＦａｂ断片において、可変ドメインＶＨとＶＬが交換されるか、又は定常ドメインＣＨ１とＣＬ交換されるかのいずれかである。二重特異性抗体は、Ｃｒｏｓｓｍａｂ技術に従って調製される。
【０２０６】
１つの結合アームにドメインの置換／交換を有する多重特異性抗体（ＣｒｏｓｓＭａｂＶＨ−ＶＬ又はＣｒｏｓｓＭａｂＣＨ−ＣＬ）は、国際公開第２００９／０８０２５２号及びＳｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．ら，ＰＮＡＳ，１０８（２０１１）１１１８７−１１９１に詳細に記載されている。多重特異性抗体は、（このようなドメイン交換なしの手法と比較して）、第２の抗原に対する間違った重鎖を有する、第１の抗原に対する軽鎖のミスマッチにより生じる副次的結果を明らかに低減する。
【０２０７】
ある態様において、本発明は、（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合できる第１のＦａｂ断片、（ｂ）ＴｎＣに特異的に結合できる第２のＦａｂ断片、並びに（ｃ）安定した結合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃ領域を含む二重特異性抗原結合分子に関し、一方のＦａｂ断片において、定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いに置き換えられて、ＣＨ１ドメインは軽鎖の一部になり、ＣＬドメインは重鎖の一部になる。より詳細には、ＴｎＣに特異的に結合できる第２Ｆａｂ断片において、定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いに置き換えられて、ＣＨ１ドメインは軽鎖の一部になり、ＣＬドメインは重鎖の一部になる。
【０２０８】
特定の態様において、本発明は、（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合できる第１のＦａｂ断片、（ｂ）ＴｎＣに特異的に結合できる第２のＦａｂ断片を含む二重特異性抗原結合分子に関し、定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いに置き換えられて、ＣＨ１ドメインは軽鎖の一部になり、ＣＬドメインは重鎖の一部になる。このような分子は、一価の二重特異性抗原結合分子と呼ばれる。
【０２０９】
別の態様では、本発明は、（ａ）抗体の２つの軽鎖及び、ＯＸ４０に特異的に結合できる２つのＦａｂ断片とＦｃ領域とを含む２つの重鎖、並びに（ｂ）ＴｎＣに特異的に結合できる２つの追加のＦａｂ断片を含む二重特異性抗原結合分子に関し、前記追加のＦａｂ断片は各々、（ａ）の重鎖のＣ末端にペプチドリンカーを介して連結している。特定の態様では、追加のＦａｂ断片は、可変ドメインＶＬとＶＨが互いに置き換えられて、ＶＨは軽鎖の一部になり、ＶＬは重鎖の一部になるようなＦａｂ断片である。
【０２１０】
したがって、特定の態様では、本発明は、（ａ）抗体の２つの軽鎖及び、ＯＸ４０に特異的に結合できる２つのＦａｂ断片とＦｃ領域とを含む２つの重鎖、並びに（ｂ）ＴｎＣに特異的に結合できる２つの追加のＦａｂ断片を含む二重特異性抗原結合分子を含み、ＴｎＣに特異的に結合できる前記２つの追加のＦａｂ断片は、可変ドメインＶＬとＶＨが互いに置き換えられ、ＶＬ−ＣＨ鎖が各々、（ａ）の重鎖のＣ末端にペプチドリンカーを介して連結しているクロスオーバーＦａｂ断片である。
【０２１１】
別の態様では、正しいペアリングを更に改善するために、（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合できる第１のＦａｂ断片、（ｂ）ＴｎＣに特異的に結合できる第２のＦａｂ断片、並びに（ｃ）安定した結合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃ領域を含む二重特異性抗原結合分子は、異なる荷電アミノ酸置換（所謂「荷電残基」）を含むことができる。このような改変は、交差（crossed）又は非交差（non-crossed）ＣＨ１及びＣＬドメインに導入される。特定の態様では、本発明は、１つのＣＬドメインにおいて、１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）で置き換えられており、１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）で置換されており、且つ、１つのＣＨ１ドメインにおいて、１４７位（ＥＵ番号付け）及び２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）で置換されている二重特異性抗原結合分子に関する。
【０２１２】
より詳細には、本発明は、ＣＬドメインにおいて、１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）で置き換えられており、１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）で置換されており、且つ、ＣＨ１ドメインにおいて、１４７位（ＥＵ番号付け）及び２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）で置換されている、Ｆａｂを含む二重特異性抗原結合分子に関する。
【０２１３】
したがって、いくつかの実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子の１つ以上のＦａｂ断片（例えば、ＯＸ４０に特異的に結合できるＦａｂ断片）は、１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸においてアルギニン（Ｒ）を、及び１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸においてリジン（Ｋ）を含むＣＬドメイン、並びに１４７位及び２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸においてグルタミン酸（Ｅ）を含むＣＨ１ドメインを含む。
【０２１４】
ポリヌクレオチド
本発明は、本明細書に記載の、本発明の二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを更に提供する。
【０２１５】
本発明の二重特異性抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドは、抗原結合分子全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は共発現される複数の（例えば２以上の）ポリヌクレオチとして発現され得る。共発現されるポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドは、例えばジスルフィド結合又は他の手段を介して結合し、機能的抗原結合分子を形成することができる。例えば、ＴｎＣに特異的に結合できる部分の軽鎖部分は、ＴｎＣに特異的に結合できる部分の重鎖部分とは別個のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。共発現されるとき、重鎖ポリペプチドは、軽鎖ポリペプチドと結合して、ＴｎＣに特異的に結合できる部分を形成する。同様に、ＯＸ４０に特異的に結合できる部分の軽鎖部分は、ＯＸ４０に特異的に結合できる部分の重鎖部分とは別のポリヌクレオチドによってコードされてよい。共発現されるとき、重鎖ポリペプチドは、軽鎖ポリペプチドと結合して、ＯＸ４０に特異的に結合できる部分を形成する。
【０２１６】
特定の実施態様では、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡ、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは、一本鎖でも二本鎖でもよい。
【０２１７】
本発明の別の態様によれば、本明細書で前述した二重特異性抗原結合分子又は本明細書で前述した融合ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。本発明は更に、ベクター、特に本発明の単離されたポリヌクレオチド含む発現ベクター及び本発明の単離されたポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施態様では、宿主細胞は真核細胞、特に哺乳動物の細胞である。
【０２１８】
別の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子を製造するための方法が提供され、この方法は、（ｉ）前記抗原結合分子の発現に適した条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程と、（ｉｉ）前記二重特異性抗原結合分子を単離する工程とを含む。本発明はまた、本発明の方法によって製造される二重特異性抗原結合分子も包含する。
【０２１９】
組換え法
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、例えば、固相ペプチド合成（例えばメリフィールド固体相合成）又は組換え生成によって得ることができる。組換え生成のために、例えば上述したように、抗体又はそのポリペプチド断片をコードする一又は複数のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために一又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離され、シーケンシングされ得る。本発明の一態様において、本発明のポリヌクレオチドの一又は複数を含むベクター、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者によく知られている方法を使用して、適切な転写／翻訳制御シグナルと共に、二重特異性抗原結合分子（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。このような方法には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの組換えＤＮＡ技術、合成技術及びｉｎ  ｖｉｖｏでの組換え／遺伝子組換えが含まれる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；及びＡｕｓｕｂｅｌら，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載の技術を参照。発現ベクターはプラスミド、ウイルスの一部であっても、又は核酸断片であってもよい。発現ベクターには、二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド又はそのポリペプチド断片（すなわちコード領域）が、プロモーター及び／又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントと作動可能に結合してクローニングされる発現カセットが含まれる。本発明で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンから成る核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、（存在する場合には）コード領域の一部と考えられる。但し、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域等の任意の隣接配列はコード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト中（例えば単一のベクター上）に、又は別々のポリヌクレオチドコンストラクト中（例えば別々の（異なる）ベクター上）に存在することができる。更に、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよいし、２つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断によって翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質に分離される１又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド又は核酸は、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド若しくはそのポリペプチド断片又はそのバリアント若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合しているか、又は融合していない異種コード領域をコードすることができる。異種コード領域には、限定されないが、例えば分泌シグナルペプチド又は異種性機能ド��インなどの特殊なエレメント又はモチーフが含まれる。作動可能な結合とは、ポリペプチドなどの遺伝子産物のコード領域が、遺伝子産物の発現を制御配列の影響下又は制御下に置くように、１又は複数の制御配列と結合している場合である。２つのＤＮＡ断片（ポリペプチドコード領域とそれに結合するプロモーターなど）は、プロモーター機能の誘導が、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、及び２つのＤＮＡ断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を指示する発現制御配列の能力を妨げないか又は転写されるＤＮＡテンプレートの能力を妨げない場合、「作動可能に結合している」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合に、ポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合されているといえる。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を指示する、細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーター以外に、他の転写調節エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を指示するポリヌクレオチドと作動可能に結合することができる。
【０２２０】
適切なプロモーター及び他の転写調節領域は本明細書に開示されている。様々な転写調節領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写調節領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えば、最初期プロモーターとイントロンＡ）、シミアンウイルス４０（例えば最初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルスなど）が含まれる。他の転写調節領域には、脊椎動物遺伝子、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギαグロビンに由来するもの、並びに、真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列が含まれる。更なる適切な転写調節領域には、組織特異的プロモーター及びエンハンサー、並びに誘導性プロモーター（例えば、テトラサイクリンを誘導可能なプロモーター）が含まれる。同様に、様々な翻訳調節エレメントが当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、並びにウイルス系由来のエレメント（特に、配列内リボソーム進入部位、又はＣＩＴＥ配列とも呼ばれるＩＲＥＳ）が含まれる。また、発現カセットは、例えば複製起点及び／又はレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）若しくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の逆位末端配列（ＩＴＲ）などの染色体組み込みエレメントといった他の特徴を含んでいてもよい。
【０２２１】
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌又はシグナルペプチドをコードする更なるコード領域と結合させることができる。例えば、二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片の分泌が望まれる場合、シグナル配列をコードするＤＮＡが、本発明の二重特異性抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードする核酸の上流に配置され得る。シグナル仮説によると、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質は、成長中のタンパク質鎖の粗面小胞体を横切る排出輸送が開始されると成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが一般に、ポリペプチドのＮ末端に融合したシグナルペプチドを有し、それが翻訳されたポリペプチドから切断されて分泌又は「成熟」型のポリペプチドを産生することを知っている。特定の実施態様では、天然のシグナルペプチド（例えば免疫グロブリン重鎖若しくは軽鎖シグナルペプチド）、又はその配列と作動可能に結合している、ポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。或いは、異種哺乳動物シグナルペプチド又はその機能的誘導体が使用され得る。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。
【０２２２】
（例えばヒスチジンタグなど）後の精製を容易にするため又は融合タンパク質の標識化の補助のために使用され得る短いタンパク質配列をコードするＤＮＡは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド又はそのポリペプチド断片の中又は両末端に含まれ得る。
【０２２３】
本発明の更なる態様では、本発明の１又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。特定の実施態様では、本発明の１又は複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、ポリヌクレオチド及びベクターそれぞれに関連して本明細書に記載される特徴のいずれかを単独で又は組み合わせて組み込むことができる。一態様では、宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えばそのようなベクターで形質転換又はトランスフェクトされている）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本発明の融合タンパク質又はその断片を生成するように工学操作可能な任意の種類の細胞系を指す。抗原結合分子の複製及び発現の補助に適切な宿主細胞は当分野でよく知られている。このような細胞は、特定の発現ベクターを適切にトランスフェクト又は形質導入することができ、臨床応用に十分な量の抗原結合分子を得るために大規模発酵槽に播種するために大量のベクター含有細胞を増殖させることができる。適切な宿主細胞には、原核生物微生物、例えば大腸菌、又は種々の真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ヒト胎児性腎臓（ＨＥＫ）細胞、昆虫細胞等が含まれる。例えば、グリコシル化が必要でない場合、ポリペプチドは、特に細菌中で産生され得る。発現の後、ポリペプチドは可溶性画分にとして細菌細胞のペーストから単離することができ、更に精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌などの真核微生物は、そのグリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトグリコシル化パターンを有するポリペプチドの産生を結果として生じる菌類及び酵母菌株を含む、ポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２２，１４０９−１４１４（２００４），及びＬｉら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２４，２１０−２１５（２００６）を参照。
【０２２４】
（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）からも得られる。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。特にヨウトガ（Spodoptera frugiperda）細胞のトランスフェクションのために昆虫細胞と併せて使用することができる、多数のバキュロウイルス株が特定されている。植物細胞培養を宿主として利用することもできる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生のためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。脊椎動物細胞も宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合された哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（例えばGraham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載の２９３又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（例えばMather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載のＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載）、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及びＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が含まれる。タンパク質生成に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の総説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ及びＷｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，編，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐ．２５５−２６８（２００３）を参照。宿主細胞には、培養細胞、例えばいくつか挙げると、哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞が含まれ、更にはトランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞も含まれる。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。これらの系において外来遺伝子を発現する標準的な技術が当技術分野で知られている。抗原結合ドメインの重鎖又は軽鎖のいずれかを含むポリペプチドを発現する細胞は、発現産物が、重鎖及び軽鎖の両方を有する抗原結合ドメインであるように、免疫グロブリン鎖のもう一方も発現するように工学操作することができる。
【０２２５】
別の態様において、提供されているのは、本発明の二重特異性抗原結合分子を製造するための方法であって、（ｉ）前記抗原結合分子の発現に適した条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程と、（ｉｉ）前記二重特異性抗原結合分子を宿主細胞又は宿主細胞培養培地から単離する工程とを含む方法である。
【０２２６】
二重特異性抗原結合分子の構成要素は、通常互いに融合している。二重特異性抗原結合分子は、その構成要素が互いに直接的に、又はリンカー配列を介して間接的に融合するように設計することができる。リンカーの組成及び長さは、当技術分野で周知の方法に従って決定することができ、有効性について試験することができる。二重特異性抗原結合分子の様々な構成要素間のリンカー配列の例は、本明細書に提供されている配列に見出される。必要に応じて、融合体の個々の構成要素を切り離すための切断部位を取り込むために、追加的配列、例えばエンドペプチダーゼ認識配列も含めることができる。
【０２２７】
特定の実施態様では、抗原結合分子の一部を形成する、ＴｎＣに特異的に結合できる部分（例えばＦａｂ断片又はｓｃＦｖ）は、少なくとも、ＴｎＣに結合することのできる免疫グロブリン可変領域を含む。同様に、特定の実施態様では、抗原結合分子の一部を形成する、ＯＸ４０に特異的に結合できる部分（例えばＦａｂ断片又はｓｃＦｖ）は、少なくとも、ＯＸ４０に結合することのできる免疫グロブリン可変領域を含む。可変領域は、天然又は非天然の抗体及びその断片の一部を形成することができ、且つ、そのような抗体及び断片から得られる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を産生する方法は、当技術分野でよく知られている（例えばHarlow and Lane, 「Antibodies, a laboratory manual」, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988参照）。天然には存在しない抗体は、固体相−ペプチド合成を使用して構築することができ、（例えば米国特許第４１８６５６７号に記載のように）組換え的に産生することも、又は例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙへの米国特許第５９６９１０８号を参照）。
【０２２８】
あらゆる動物種の免疫グロブリンを本発明に使用することができる。本発明において有用な非限定的免疫グロブリンは、マウス、霊長類又はヒト起源のものであり得る。融合タンパク質がヒトでの使用を目的とする場合、免疫グロブリンの定常領域がヒト由来であるキメラｔ型の免疫グロブリンを使用することができる。ヒト化又は完全ヒト型の免疫グロブリンも、当分野でよく知られている方法に従って調製することができる（例えばＷｉｎｔｅｒへの米国特許第５５６５３３２号を参照）。ヒト化は、様々な方法によって達成することができ、それらの方法には、限定されないが、（ａ）非ヒト（例えばドナー抗体）のＣＤＲを、重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合アフィニティー又は抗体機能を維持するために重要であるもの）の保持を伴う又は伴わない、ヒト（例えばレシピエント抗体）のフレームワーク領域及び定常領域の上に移植すること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ−ＣＤＲ；抗体−抗原相互作用に重要な残基）のみをヒトフレームワーク領域及び定常領域上に移植すること、又は（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置き換えによってヒト様切片で「クローキング」することが含まれる。ヒト化抗体及びその製造方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ及びＦｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）に総説され、更に、例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎら．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２，３２３−３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６，１００２９−１００３３（１９８９）；米国特許第５８２１３３７号、同第７５２７７９１号、同第６９８２３２１号、及び同第７０８７４０９号；Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１，５２２−５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８１，６８５１−６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ及びＯｉ，Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４４，６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９，１５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ  Ｉｍｍｕｎ  ３１（３），１６９−２１７  （１９９４）；Ｋａｓｈｍｉｒｉら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６，２５−３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）移植について記載）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２８，４８９−４９８（１９９１）（「リサーフェイシング」について記載）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６，４３−６０（２００５）（「ＦＲシャフリング」について記載）；Ｏｓｂｏｕｒｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６，６１−６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａら，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ８３，２５２−２６０（２０００）（ＦＲシャフリングへの「誘導選択(guided selection)」アプローチについて記載）に記載されている。本発明による特定の免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当技術分野において既知の様々な技術を用いて作製することができる。ヒト抗体は、ｖａｎ  Ｄｉｊｋ及びｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８−７４（２００１）、並びにＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．���ｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０−４５９（２００８）で一般的に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されたヒトモノクローナル抗体の一部を形成することができ、且つそのような抗体から得ることができる（例えば、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987）を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つインタクトな抗体を生成するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することによっても調製することができる（例えば、Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変領域配列を単離することによっても作製することができる（例えば、Hoogenboom et al. Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001);及びMcCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)参照）。ファージは通常、抗体断片を、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片又はＦａｂ断片として表示する。
【０２２９】
特定の態様では、本発明の抗原結合分子に含まれる、関連標的に特異的に結合できる部分（例えばＦａｂ断片又はｓｃＦｖ）は、例えば国際公開第２０１２／０２０００６号（アフィニティー成熟に関する実施例）又は米国特許出願公開第２００４／０１３２０６６号に開示されている方法に従って、向上した結合アフィニティーを有するように工学操作される。特定の抗原決定基に対する本発明の抗原結合分子の結合能は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴技術（Liljeblad,et al.,Glyco.J.17:323-329(2000)）及び古典的な結合アッセイ（Heeley,R.P.,Endocr.Res.28:217-229(2002））によって測定することができる。競合アッセイは、特定の抗原への結合について参照抗体と競合する抗原結合分子を同定するために使用され得る。特定の実施態様では、このような競合抗原結合分子は、参照抗原結合分子によって結合される同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗原結合分子が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的な方法が、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）によるＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第６６巻の「Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ニュージャージー州トトワ）に提供されている。例示的な競合アッセイでは、固定化された抗原は、抗原に結合する第１の標識抗原結合分子と、抗原への結合について第１の抗原結合分子と競合するその能力について試験されている第２の非標識抗原結合分子とを含む溶液中でインキュベートされる。第２の抗原結合分子はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。コントロールとして、固定化抗原が、第１の標識抗原結合分子を含むが第２の非標識抗原結合分子を含まない溶液中でインキュベートされる。第１の抗体の抗原への結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰な未結合抗体が除去され、固定化された抗原に結合した標識の量が測定される。固定化抗原に結合した標識の量が、コントロール試料と比較して試験試料中で実質的に減少している場合、それは、第２の抗原結合分子が、抗原への結合について第１の抗原結合分子と競合していることを示している。Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照。
【０２３０】
本明細書に記載されるように調製された本発明の二重特異性抗原結合分子は、当分野で知られている技術、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等によって精製することができる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には正味荷電、疎水性、親水性などの因子に依存し、当業者に明瞭であろう。アフィニティークロマトグラフィー精製では、二重特異性抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原が使用され得る。例えば、本発明の融合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー精製では、プロテインＡ又はプロテインＧを含むマトリックスが使用され得る。連続的なプロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーが、基本的に実施例に記載されるように、抗原結合分子を単離するために使用され得る。二重特異性抗原結合分子又はその断片の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む任意の様々な周知の分析方法によって決定され得る。例えば、実施例に記載されるように発現された二重特異性抗原結合分子は、還元型及び非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより示されるようにインタクトであり、且つ、適切に集合する（assemble）ことが示された。
【０２３１】
本発明は、本発明の方法によって生成された二重特異性抗原結合分子も包含する。
【０２３２】
アッセイ
本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子は、当技術分野で既知の様々なアッセイによって、その物理的／化学的性質及び／又は生物活性について同定、スクリーニング又は特徴付けすることができる
１．アフィニティーアッセイ
本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子のＯＸ４０又はＴｎＣに対するアフィニティーは、実施例に記載の方法に従って、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥヘルスケア）などの標準的装置と、組換え発現により得られるような受容体又は標的タンパク質とを用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定することができる。結合アフィニティーを測定するための具体的な説明的且つ例示的な実施態様は、実施例４．２に記載されている。一態様によれば、ＫＤは、２５ ℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００装置（ＧＥヘルスケア）を用いる表面プラズモン共鳴により測定される。
【０２３３】
２．結合アッセイ及びその他のアッセイ
本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子の、対応するＯＸ４０及び／又はＴｎＣ発現細胞への結合は、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を使用して評価することができる。一態様では、ＯＸ４０を発現する新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が結合アッセイで使用される。この細胞は、単離後そのまま使用することも（ナイーブＰＭＢＣ）、刺激後に使用することもできる（活性化ＰＭＢＣ）。別の態様では、活性化されたマウス脾細胞（ＯＸ４０を発現している）を使用して、本発明の二重特異性抗原結合分子の、対応するＯＸ４０発現細胞への結合を実証することができる。
【０２３４】
更なる態様では、ＴｎＣを発現するがん細胞株を使用して、該抗原結合分子のＴｎＣへの結合を実証した。
【０２３５】
別の態様では、競合アッセイを使用して、ＴｎＣ、ＯＸ４０それぞれへの結合について特定の抗体又は抗原結合分子と競合する抗原結合分子を同定することができる。特定の実施態様では、このような競合抗原結合分子は、特定の抗ＴｎＣ抗体又は特定の抗ＯＸ４０抗体によって結合される同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的な方法が、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）によるＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第６６巻の「Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ニュージャージー州トトワ）に提供されている。
【０２３６】
３．活性アッセイ
一態様において、ＴｎＣ及びＯＸ４０に結合する、生物活性を有する二重特異性抗原結合分子を同定するためのアッセイが提供される。生物活性には、例えばＯＸ４０を発現する細胞での、ＯＸ４０を介したアゴニストシグナル伝達が含まれる。これらのアッセイによってｉｎ  ｖｉｔｒｏでそのような生物活性を有すると認められた二重特異性抗原結合分子も提供される。特に、ヒトＯＸ４０を発現し、且つ、ＴｎＣ発現腫瘍細胞と共培養されたＨｅｌａ細胞内のＮＦ−κＢ活性化を検出するレポーター細胞アッセイが提供される（例えば実施例５．１参照）。
【０２３７】
特定の態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、このような生物活性について試験される。本発明の該分子の生物活性を検出するためのアッセイは、実施例５に記載されているものである。更に、細胞溶解（例えばＬＤＨ放出の測定による）、誘導性アポトーシスのカイネティクス（例えばカスパーゼ３／７活性の測定による）又はアポトーシス（例えばＴＵＮＥＬアッセイを使用）を検出するためのアッセイは、当技術分野で周知である。更に、このような複合体の生物活性は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞又はγδ  Ｔ細胞などの様々なリンパ球サブセットの生存、増殖及びリンホカイン分泌に対するこれらの複合体の作用を調べるか、或いは樹状細胞、単球／マクロファージ又はＢ細胞等の抗原提示細胞の表現型と機能を調節するこれらの能力を査定することによって、評価され得る。
【０２３８】
薬学的組成物、製剤及び投与経路
更なる態様において、本発明は、例えば下記の治療法のいずれかに使用される、本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。一実施態様において、薬学的組成物は、二重特異性抗原結合分子と、少なくとも１の薬学的に許容される添加剤とを含む。別の他の実施態様において、薬学的組成物は、本明細書で提供される二重特異性抗原結合分子のいずれかと、少なくとも１種の追加的治療剤を、例えば後述するように含む。
【０２３９】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される添加剤に溶解又は分散した１種以上の二重特異性抗体の治療的有効量を含む。「薬学的又は薬理学的に許容される」という語句は、用いられる用量及び濃度でレシピエントに対して一般に無毒である、すなわち、例えばヒトなどの動物に必要に応じて投与されたとき、副作用、アレルギー又は他の有害な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。少なくとも１種の二重特異性抗原結合分子と、任意選択的に追加の活性成分とを含有する薬学的組成物の調製は、（参照により本明細書に援用される）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０によって例示されている通りであり、本開示に照らして当業者には既知であろう。特に、該組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液である。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される添加剤」には、当業者に既知であるように、あらゆる溶媒、バッファー、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば抗細菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、塩、安定剤、及びこれらの組み合わせが含まれる。
【０２４０】
非経口組成物には、注射による投与、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内注射用に設計されたものが含まれる。注射の場合、本発明の二重特異性抗原結合分子は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液又は生理食塩水バッファー等の、生理的に適合性のバッファー中で製剤化され得る。該溶液は、懸濁剤、安定剤、及び／又は分散剤等の調合剤を含有することができる。或いは、該融合タンパク質は、使用前に、適切なビヒクル（例えば発熱性物質除去蒸留水）と構成するために、粉末形態であってもよい。滅菌注射用溶液は、本発明の融合タンパク質又は二重特異性抗原結合分子を、必要に応じて、以下に列挙する他の様々な成分を含む適切な溶媒に必要量で組み込むことによって調製される。滅菌状態は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより、容易に達成される。分散体は通常、塩基性分散媒及び／又は他の成分を含有する滅菌ビヒクルに、様々な滅菌活性成分を取り込むことにより調製される。滅菌注射用溶液、懸濁液又は乳濁液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥又は凍結乾燥技術であり、これは、該活性成分の事前の滅菌濾過液体媒質から該活性成分＋任意の所望の追加的成分の粉末を得るものである。場合によっては、該液体媒質を適切に緩衝し、注射前にまず、その液体希釈剤を十分な生理食塩水又はグルコースで等張にする必要がある。該組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌といった微生物の汚染作用から保護されなければならない。エンドトキシンの汚染は、安全量（例えばタンパク質１ｍｇあたり０．５ｎｇ未満）で、最小限に保たれなければならない。薬学的に許容される適切な添加剤には、限定されないが、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン類、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー類、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。水性注射懸濁液には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストラン等の懸濁液の粘度を上昇させる化合物が含有されていてよい。任意選択的に、該懸濁液は、適切な安定剤、又は化合物の溶解度を上昇させて高濃度溶液の調製を可能にする薬剤も含有することができる。加えて、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒又はビヒクルには、ゴマ油などの脂肪油、又はオレイン酸エチル（ethyl cleat）若しくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、又はリポソームが含まれる。
【０２４１】
活性成分は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合法によって調製されたマイクロカプセル（例えばそれぞれ、ヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル又はゼラチン−マイクロカプセル、ポリ−（メチルメタクリレート）（poly-(methylmethacylate)）マイクロカプセル）に、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに封入することができる。これらの技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版，Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）に開示されている。徐放性調製物が調製されてもよい。徐放性調製物の適切な例には、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが含まれ、そのマトリックスは、成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。特定の実施態様では、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、又はそれらの組合せなど、吸収を遅らせる薬剤を組成物において使用することにより、注射可能な組成物の長期吸収をもたらすことができる。
【０２４２】
本明細書における例示的な薬学的に許容される添加剤には、間質性薬物分散剤（insterstitial drug dispersion agent）、例えば可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒｈｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質が更に含まれる。ｒＨｕＰＨ２０を含む、特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法については、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの、１種以上の更なるグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
【０２４３】
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性抗体製剤には、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
【０２４４】
上記の組成物に加えて、該二重特異性抗原結合分子は、持効性製剤として製剤化することもできる。このような長時間作用型の製剤は、植込（implantation）（例えば、皮下又は筋肉内）により、又は筋肉内注射により投与することができる。したがって、例えば、該二重特異性抗原結合分子は、適切なポリマー性若しくは疎水性物質（例えば、薬学的に許容可能な油中の乳濁液として）又はイオン交換樹脂を用いて、或いは難溶性の誘導体として、例えば難溶性の塩として製剤化することができる。
【０２４５】
本発明の二重特異性抗原結合分子を含む薬学的組成物は、一般的な混合、溶解、乳化、カプセル化、封入又は凍結乾燥プロセスにより製造することができる。薬学的組成物は、１種以上の生理的に許容される担体、希釈剤、添加剤、又はタンパク質の薬学的に使用可能な調製物への加工を容易にする補助剤を使用して、従来の方法で製剤化できる。適した製剤は、選択される投与経路に応じて決まる。
【０２４６】
該二重特異性抗原結合分子は、遊離の酸又は塩基、中性又は塩形態の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、遊離の酸又は塩基の生物活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えばタンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されたもの、又は例えば塩酸若しくはリン酸といった無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸といった有機酸で形成されたものが含まれる。また、遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム若しくは水酸化第二鉄等の無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン若しくはプロカイン等の有機塩基に由来し得る。薬学的塩は、対応する遊離塩基形態より、水性及び他のプロトン性溶媒に溶け易い。
【０２４７】
該薬学的組成物はまた、治療される特定の適応症に必要な、１種より多い活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものも含有し得る。そのような活性成分は、好適には、意図する目的に有効な量で組み合わせて存在する。一態様では、該薬学的組成物は、二重特異性抗原結合分子及び別の活性な抗がん剤を含む。
【０２４８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、一般的に無菌である。滅菌状態は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより、容易に達成される。
【０２４９】
治療方法及び組成物
本明細書において提供される二重特異性抗原結合分子のいずれも、治療方法において使用することができる。治療方法において使用される場合、本発明の二重特異性抗原結合分子は、医療実施基準に一致した様式で製剤化、調薬及び投与され得る。この観点において考慮すべき要素には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程、及び医療従事者が知るその他の要素が含まれる。
【０２５０】
一態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、医薬としての使用のために提供される。更なる態様において、二重特異性抗原結合分子は、疾患の治療における使用のため、特にがんの治療における使用のために提供される。特定の実施態様では、本発明の二重特異性抗原結合分子は、治療法における使用のために提供される。一実施態様では、本発明は、本明細書に記載の二重特異性抗原結合分子であって、それを必要とする個体の疾患の治療における使用のための二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の実施態様において、本発明は、疾患を有する個体に治療的有効量の該二重特異性抗原結合分子を投与することを含む、該個体の治療法における使用のための二重特異性抗原結合分子を提供する。特定の実施態様では、治療される疾患は、がんである。特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性障害、特にがんである。がんの例には、前立腺がん、脳がん、頭頸部がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮癌、骨がん、及び腎臓がんが含まれる。本発明の二重特異性抗原結合分子を用いて治療することができる他の細胞増殖性障害には、限定されないが、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、（中枢及び末梢）神経系、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、及び泌尿生殖器系に位置する腫瘍が含まれる。前がん性の状態又は病変及びがん転移も含まれる。特定の実施態様では、がんは、腎細胞がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳がん、頭頸部がんから成る群より選択される。治療を必要とする対象、患者又は個体は、典型的には哺乳動物であり、具体的にはヒトである。
【０２５１】
細胞傷害性Ｔ細胞活性の上方制御または延長における使用のための、本発明の二重特異性抗原結合分子又は本発明の薬学的組成物も、本発明に包含される。
【０２５２】
更なる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における本発明の二重特異性抗原結合分子の使用を提供する。一態様において、該医薬は、疾患を有する個体に治療的有効量の該医薬を投与することを含む疾患の治療方法における使用のためのものである。特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性障害、特にがんである。がんの例には、前立腺がん、脳がん、頭頸部がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮癌、骨がん、及び腎臓がんが含まれる。本発明の二重特異性抗原結合分子を用いて治療することができる他の細胞増殖性障害には、限定されないが、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、（中枢及び末梢）神経系、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、及び泌尿生殖器系に位置する腫瘍が含まれる。前がん性の状態又は病変及びがん転移も含まれる。特定の実施態様では、がんは、腎細胞がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳がん、頭頸部がんから成る群より選択される。当業者は、該二重特異性抗原結合分子は多くの場合、治癒をもたらすわけではないが部分的恩恵をもたらし得ることを容易に認識する。いくつかの実施態様では、いくつかの恩恵を有する生理的変化も治療的に有益と考えられる。したがって、いくつかの実施態様では、生理的変化をもたらす二重特異性抗原結合分子の量は、「有効量」又は「治療的有効量」と考えられる。上記実施態様のいずれにおいても、個体は好ましくは哺乳動物、特にヒトである。
【０２５３】
更なる態様において、本発明は、個体に治療的有効量の本発明の二重特異性抗原結合分子を投与することを含む、疾患を治療するための方法を提供する。一実施態様では、薬学的に許容される形態の本発明の融合タンパク質を含む組成物が前記個体に投与される。特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性障害である。特定の実施態様では、疾患はがんである。特定の実施態様では、該方法は、該個体に治療的有効量の少なくとも１種の追加の治療剤（例えば、治療される疾患ががんである場合には抗がん剤）を投与することを更に含む。上記実施態様のいずれかによる「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトとすることができる。
【０２５４】
疾患の予防又は治療に関し、本発明の二重特異性抗原結合分子の（単独での使用又は１種以上の他の追加的治療剤との併用の際の）適切な投与量は、治療される疾患の種類、投与経路、患者の体重、融合タンパク質の種類、疾患の重症度及び経過、融合タンパク質が予防又は治療のどちらの目的で投与されるか、従前又は同時の治療的介入、患者の病歴及び融合タンパク質に対する応答、並びに主治医の裁量によって決定されるであろう。いずれにしても、投与を担当する施術者は、組成物中の活性成分の濃度及び個々の対象にとって適切な用量を決定する。本明細書では、単回投与又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含むがこれらに限定されない様々な投与スケジュールが想定される。
【０２５５】
該二重特異性抗原結合分子は、単回、又は一連の治療にわたって患者に適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば単回又は複数回の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）の該抗原結合分子が患者への投与のための初期候補用量となり得る。１つの典型的な１日用量は、上記の要素に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。数日以上にわたる反復投与に関しては、病状に応じて、治療は一般に疾患症状の望まれる抑制が起こるまで継続されるものとする。融合タンパク質の１つの例示的な投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。他の例では、用量は、投与１回につき、体重１ｋｇあたり約１μｇから、体重１ｋｇあたり約５μｇから、体重１ｋｇあたり約１０μｇから、体重１ｋｇあたり約５０μｇから、体重１ｋｇあたり約１００μｇから、体重１ｋｇあたり約２００μｇから、体重１ｋｇあたり約３５０μｇから、体重１ｋｇあたり約５００μｇから、体重１ｋｇあたり約１ｍｇから、体重１ｋｇあたり約５ｍｇから、体重１ｋｇあたり約１０ｍｇから、体重１ｋｇあたり約５０ｍｇから、体重１ｋｇあたり約１００ｍｇから、体重１ｋｇあたり約２００ｍｇから、体重１ｋｇあたり約３５０ｍｇから、体重１ｋｇあたり約５００ｍｇから、体重１ｋｇあたり約１０００ｍｇまで、又はそれ以上の範囲、及びそこから導き出せる範囲を含む。本明細書に挙げた数字から導き出せる範囲の例では、上記の数字に基づいて、体重１ｋｇあたり約５ｍｇ〜体重１ｋｇあたり約１００ｍｇ、体重１ｋｇあたり約５μｇ〜体重１ｋｇあたり約５００ｍｇ等の範囲が投与され得る。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はこれらの任意の組み合わせ）の１又は複数の用量を患者に投与することができる。このような用量は断続的に、例えば毎週又は３週毎（例えば患者が約２〜約２０用量、又は例えば約６用量の該二重特異性抗原結合分子を受けるように）投与してもよい。初回の高負荷用量の後、それより低い用量を１以上投与してもよい。しかしながら、他の用量レジメンも有用である。この療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易にモニターされる。
【０２５６】
一般に、本発明の二重特異性抗原結合分子は、意図された目的を達成するのに有効な量で使用される。疾患の状態を治療又は予防するための使用のために、本発明の二重特異性抗原結合分子又はその薬学的組成物は、治療的有効量で投与又は適用される。治療的有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示内容を踏まえると十分に当業者の能力の範囲内である。
【０２５７】
全身投与の場合、治療的有効用量は、細胞培養アッセイなどのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイから最初に推定することができる。その後、細胞培養で決定したＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて用量を定式化することができる。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量を更に正確に決定するために使用することができる。
【０２５８】
初期投与量は、ｉｎ  ｖｉｖｏデータ、例えば動物モデルから、当技術分野でよく知られている技術を用いて推定することもできる。当業者であれば、動物データに基づくヒトへの投与を容易に最適化することができるであろう。
【０２５９】
投与の量及び間隔は、二重特異性抗原結合分子の、治療効果を維持するのに十分な血漿レベルを提供するために個別に調整される。注射による投与のための患者への通常の投与量は、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５〜１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療的に有効な血漿レベルは、毎日複数回投与を行うことにより達成することができる。血漿中のレベルは、例えばＨＰＬＣにより測定することができる。
【０２６０】
局所投与又は選択的取り込みの場合、二重特異性抗原結合分子の有効な局所濃度は血漿濃度に関連していなくともよい。当業者であれば、過度の実験をしなくとも、治療的に有効な局所投与量を最適化することができるであろう。
【０２６１】
本明細書に記載される二重特異性抗原結合分子の治療的に有効な用量は一般に、実質的な毒性を引き起こすことなく治療的効果を提供する。融合タンパク質の毒性及び治療効果は、細胞培養又は実験動物における標準の薬学的手順により決定することができる。細胞培養アッセイ及び動物の研究を用いて、ＬＤ５０（集団の５０％を死に至らしめる用量）及びＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な用量）を決定することができる。毒性作用と治療効果の用量比が治療指数であり、これはＬＤ５０／ＥＤ５０の比率として表すことができる。大きな治療指数を呈する二重特異性抗原結合分子が好ましい。一実施態様では、本発明による二重特異性抗原結合分子は、高い治療指数を呈する。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータを用いて、ヒトにおける使用に適した投与量の範囲を定式化することができる。投与量は、好ましくは、毒性がほどんど又は全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。投与量は、様々な要素、例えば、使用される剤形、利用される投与経路、対象の病状等に応じて、この範囲内で変動し得る。正確な処方、投与経路及び用量は、患者の病状を考慮して個々の医師により選択され得る（例えば、本明細書に参照にり全文が援用されるFingl et al., 1975, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 第1章, p. 1参照）。
【０２６２】
本発明の二重特異性抗原結合分子を用いて治療される患者の主治医は、毒性、臓器不全などのために投与を終了、中断又は調整する方法及び時期を知っているであろう。逆に、主治医は、臨床応答が十分でなかった場合には、治療レベルを上げるように調整する（毒性は予め排除）ことも知っているであろう。対象となる障害の管理における投与量の大きさは、治療される病状の重症度、投与経路などによって変わる。例えば、病状の重症度は、部分的には標準の予後評価方法により評価される。更に、用量及び恐らくは投薬頻度も、個々の患者の年齢、体重及び応答応じて変化するであろう。
【０２６３】
その他の薬剤及び治療
治療において、本発明の二重特異性抗原結合分子は、１種以上の他の薬剤との併用で投与され得る。例えば、本発明の融合タンパク質は、少なくとも１種の追加の治療剤と共投与され得る。用語「治療剤」は、このような治療を必要とする個体の症状又は疾患を治療するために投与され得る任意の薬剤を包含する。このような追加の治療剤は、治療される特定の適応症に適した活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含んでもよい。特定の実施態様では、追加の治療剤は別の抗がん剤である。
【０２６４】
このような他の薬剤は、好適には、意図した目的に有効な量で組み合わされて存在する。このような他の薬剤の有効量は、使用される融合タンパク質の量、障害又は治療の種類、及び上述の他の要素に応じて決まる。一般に、該二重特異性抗原結合分子は、本明細書に記載されているのと同じ用量及び投与経路で、又は本明細書に記載の投与量の約１％〜９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の投与量及び経路で使用される。
【０２６５】
上記のこうした併用療法は、併用投与（同じ又は別々の組成物に２種以上の治療剤が含まれている）及び単独投与（これは、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与前、投与と同時、及び／又は投与後に本発明の二重特異性抗原結合分子の投与が起こり得る）を包含する。
【０２６６】
製造品
本発明の別の態様では、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器と、容器に貼られているか又は付随しているラベル又は添付文書とを備える。好適な容器には、例えば瓶、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグ等が含まれる。該容器は、例えばガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成され得る。該容器は、該病状の治療、予防及び／又は診断に有効な、単独の又は他の組成物と組み合わされる組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、該容器は皮下注射針で穿孔可能な、ストッパーを有する静脈内溶液のバッグ又はバイアルであってよい）。該組成物中の少なくとも１種の活性剤は、本発明の二重特異性抗原結合分子である。
【０２６７】
ラベル又は添付文書は、最適な病状の治療のために該組成物が使用されることを示している。更に、製造品は、（ａ）本発明の二重特異性抗原結合分子を含む組成物が中に収容されている第１の容器；及び（ｂ）更なる細胞傷害性又はその他の治療剤を含む組成物が中に収容されている第２の容器を備え得る。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の状態を治療するために使用できることを示す添付文書を更に備えてもよい。
【０２６８】
代替的に又は追加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー（例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液）を収容する第２（又は第３）の容器を更に備えてもよい。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む、商業的及びユーザーの観点から望ましい他の材料を更に備えてもよい。
【０２６９】
表Ｃ．配列
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【０２７０】
本発明の態様
以下の番号付き項目は、本発明の態様を説明するものである。
１．二重特異性抗原結合分子であって、
（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合できる少なくとも１つの部分と、
（ｂ）テネイシンＣ（ＴｎＣ）に特異的に結合できる少なくとも１つの部分と
を含む二重特異性抗原結合分子。
２．（ｃ）安定な結合が可能な第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃ領域を更に含む、項目１に記載の二重特異性抗原結合分子。
３．ＯＸ４０に特異的に結合できる部分が、配列番号１のアミノ酸配列を含むか又はそれから成るポリペプチドに結合する、項目１又は２に記載の二重特異性抗原結合分子
４．ＴｎＣに特異的に結合できる部分が、配列番号３９のアミノ酸配列を含むか又はそれから成るポリペプチドに結合する、項目１から３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
５．ＯＸ４０に特異的に結合できる部分が、
（ｉ）配列番号２及び配列番号３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号４及び配列番号５から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、並びに
（ｉｉｉ）配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含むＶＨと、
（ｉｖ）配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｖ）配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、並びに
（ｖｉ）配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２４から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含むＶＬと
を含む、項目１から４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
６．ＯＸ４０に特異的に結合できる部分が、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５及び配列番号３７から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６及び配列番号３８から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む、項目１から５のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
７．ＯＸ４０に特異的に結合できる部分が、
（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号２６のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｉｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号３０のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｉｖ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｖ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｖｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｖｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号３８のアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む、項目１から６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
８．ＴｎＣに特異的に結合できる部分が、
（ｉ）配列番号４０及び配列番号４１から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｉｉ）配列番号４２及び配列番号４３から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、並びに
（ｉｉｉ）配列番号４４及び配列番号４５から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨと、
（ｉｖ）配列番号４６及び配列番号４７から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｖ）  配列番号４８及び配列番号４９から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、並びに
（ｖｉ）  配列番号５０及び配列番号５１から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬと
を含む、項目１から７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
９．ＴｎＣに特異的に結合できる部分が、配列番号５２及び配列番号５４から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号５３及び配列番号５５から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む、項目１から８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１０．ＴｎＣに特異的に結合できる部分が、
（ｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
（ｉｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む、項目１から９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１１．
（ｉ）配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５又は配列番号３７から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６又は配列番号３８から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＯＸ４０に特異的に結合できる少なくとも１つの部分と、
（ｉｉ）配列番号５２又は配列番号５４から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５３又は配列番号５５から成る群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＴｎＣに特異的に結合できる少なくとも１つの部分と
を含む、項目１から１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１２．
（ｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、ＯＸ４０に特異的に結合できる少なくとも１つの部分と、
（ｉｉ）ＴｎＣに特異的に結合できる少なくとも１つの部分であって以下を含むもの：
●配列番号５２のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号５３のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は
●配列番号５４のアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号５５のアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む、項目１から１１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１３．Ｆｃ領域がＩｇＧ、特にＩｇＧ１  Ｆｃ領域又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域である、項目２から１２のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１４．Ｆｃ領域が、抗体のＦｃ受容体への結合アフィニティー及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、項目２から１３のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１５．Ｆｃ領域がアミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を有するヒトＩｇＧ１サブクラスのものである、項目２から１４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１６．Ｆｃ領域がＦｃ領域の第１及び第２のサブユニットの結合を促進する改変を含む、項目２から１５のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１７．Ｆｃ領域の第１のサブユニットがノブ・イントゥ・ホール法によるノブを含み、Ｆｃ領域の第２のサブユニットがホールを含む、項目２から１６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１８．Ｆｃ領域の第１のサブユニットがアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含み、Ｆｃ領域の第２のサブユニットがアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ及びＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む、項目２から１７のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
１９．
（ａ）Ｆｃ領域に連結しており、ＯＸ４０に特異的に結合できる少なくとも２つのＦａｂ断片と、
（ｂ）Ｆｃ領域のＣ末端に連結している、ＴｎＣに特異的に結合できる少なくとも１つの部分と
を含む、項目１から１８のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
２０．
（ａ）抗体の２つの軽鎖及び、ＯＸ４０に特異的に結合できる２つのＦａｂ断片とＦｃ領域とを含む２つの重鎖、並びに
（ｂ）ＴｎＣに特異的に結合できる部分のＶＨ及びＶＬであって、ＶＨが（ａ）の２つの重鎖のうちの一方のＣ末端に連結し、ＶＬが（ａ）の２つの重鎖のうちのもう一方のＣ末端に連結しているＶＨ及びＶＬ
を含む、項目１から１９のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
２１．
（ａ）抗体の２つの軽鎖及び、ＯＸ４０に特異的に結合できる２つのＦａｂ断片とＦｃ領域とを含む２つの重鎖、並びに
（ｂ）ＴｎＣに特異的に結合できる２つのＦａｂ断片であって、そのＦａｂ断片のうちの一方が（ａ）の２つの重鎖のうちの一方のＣ末端に連結し、Ｆａｂ断片のうちのもう一方が（ａ）の２つの重鎖のうちのもう一方のＣ末端に連結しているＦａｂ断片
を含む、項目１から２０のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
２２．
（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合できるＦａｂ断片のＶＨ及びＣＨ１ドメインと、Ｆｃ領域サブユニットとをそれぞれが含む２つの重鎖、
（ｂ）ＯＸ４０に特異的に結合できるＦａｂ断片のＶＬ及びＣＬドメインをそれぞれが含む２つの軽鎖、並びに
（ｃ）ＴｎＣに特異的に結合できる部分のＶＨ及びＶＬであって、ＶＨが（ａ）の２つの重鎖のうちの一方のＣ末端に連結し、ＶＬが（ａ）の２つの重鎖のうちのもう一方のＣ末端に連結しているＶＨ及びＶＬ
を含む、項目１から２１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
２３．
（ａ）ＯＸ４０に特異的に結合できるＦａｂ断片のＶＨ及びＣＨ１ドメインと、Ｆｃ領域サブユニットとをそれぞれが含む２つの重鎖、
（ｂ）ＯＸ４０に特異的に結合できるＦａｂ断片のＶＬ及びＣＬドメインをそれぞれが含む２つの軽鎖、
（ｃ）ＴｎＣに特異的に結合できる２つのＦａｂ断片であって、そのＦａｂ断片の一方が（ａ）の２つの重鎖のうちの一方のＣ末端に連結し、Ｆａｂ断片のうちのもう一方が（ａ）の２つの重鎖のうちのもう一方のＣ末端に連結しているＦａｂ断片
を含む、項目１から１９のいずれか一項又は項目２１の二重特異性抗原結合分子。
２４．ＴｎＣに特異的に結合できる２つのＦａｂ断片が、ＶＬ−ＣＨ１鎖とＶＨ−ＣＬ鎖とをそれぞれ含むクロスオーバーＦａｂ断片であって、ＶＬ−ＣＨ１鎖の一方が（ａ）の２つの重鎖のうちの一方のＣ末端に連結し、ＶＬ−ＣＨ１鎖のもう一方が（ａ）の２つの重鎖のうちのもう一方のＣ末端に連結している、項目２１又は項目２３の二重特異性抗原結合分子。
２５．ＯＸ４０に特異的に結合できる４つのＦａｂ断片を含む、項目１から２４のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
２６．（ａ）の２つの重鎖のそれぞれが、ＯＸ４０に特異的に結合できるＦａｂ断片の２つのＶＨドメインと２つのＣＨ１ドメインとを含む、項目２０から２５のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
２７．ＯＸ４０に特異的に結合できる１つ以上のＦａｂ断片が、
１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸においてアルギニン（Ｒ）を、及び１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸においてリジン（Ｋ）を含むＣＬドメイン、並びに
１４７位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸においてグルタミン酸（Ｅ）を、及び２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸においてグルタミン酸（Ｅ）を含むＣＨ１ドメイン
を含む、項目１９から２６のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
２８．
配列番号２１３のアミノ酸配列をそれぞれが含む２つの重鎖、
配列番号２１２のアミノ酸配列をそれぞれが含む２つの軽鎖、及び
配列番号２１４のアミノ酸配列をそれぞれが含む２つの軽鎖
を含む二重特異性抗原結合分子。
２９．
配列番号２１５のアミノ酸配列をそれぞれが含む２つの重鎖、
配列番号２１２のアミノ酸配列をそれぞれが含む２つの軽鎖、及び
配列番号２１６のアミノ酸配列をそれぞれが含む２つの軽鎖
を含む二重特異性抗原結合分子。
３０．
配列番号２２２のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、
配列番号２２３のアミノ酸配列をが含む第２の重鎖、及び
配列番号２１２のアミノ酸配列をそれぞれが含む４つの軽鎖
を含む二重特異性抗原結合分子。
３１．
配列番号２２５のアミノ酸配列をそれぞれが含む２つの重鎖、
配列番号２２４のアミノ酸配列をそれぞれが含む４つの軽鎖、及び
配列番号２２６のアミノ酸配列をそれぞれが含む２つの軽鎖
を含む二重特異性抗原結合分子。
３２．項目１から３１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド。
３３．項目３２のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
３４．項目３２のポリヌクレオチド又は項目３３の発現ベクターを含む宿主細胞。
３５．二重特異性抗原結合分子の発現に適した条件下で項目３４の宿主細胞を培養することと、二重特異性抗原結合分子を単離することとを含む、二重特異性抗原結合分子を製造する方法。
３６．項目１から３１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子と、薬学的に許容される少なくとも１種の添加剤とを含む、薬学的組成物。
３７．医薬としての使用のための、項目１から３１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は項目３６の薬学的組成物。
３８．以下のいずれかにおける使用のための、項目１から３１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は項目３６の薬学的組成物。
（ｉ）Ｔ細胞応答を刺激すること
（ｉｉ）活性化Ｔ細胞の生存を維持すること
（ｉｉｉ）感染症の治療
（ｉｖ）がんの治療
（ｖ）がんの進行を遅らせること
（ｖｉ）がんに罹患している患者の生存を延長させること
３９．がんの治療における使用のための、項目１から３１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は項目３６の薬学的組成物。
４０．がんの治療のための医薬の製造における、項目１から３１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は項目３６の薬学的組成物の使用。
４１．がんを有する個体の治療方法であって、項目１から３１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は項目３６の薬学的組成物の有効量を該個体に投与することを含む、方法。
４２．細胞傷害性Ｔ細胞活性の上方制御又は延長における使用のための、項目１から３１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は項目３６の薬学的組成物。
４３．細胞傷害性Ｔ細胞活性の上方制御又は延長のための医薬の製造における、項目１から３１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は項目３６の薬学的組成物の使用。
４４．がんを有する個体における細胞傷害性Ｔ細胞活性の上方制御又は延長の方法であって、項目１から３１のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子又は項目３６の薬学的組成物の有効量を該個体に投与することを含む、方法。
【実施例】
【０２７１】
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
組換えＤＮＡ技術
Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９に記載されているように、標準的な方法を使用してＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を製造者の指示書に従って使用した。ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ  ９１−３２４２に示されている。
【０２７２】
ＤＮＡシーケンシング
ＤＮＡ配列は、二本鎖シーケンシングにより決定された。
【０２７３】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、適切なテンプレートを用いるＰＣＲによって生成されたか、又は自動遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ産物からＧｅｎｅａｒｔ社（ドイツ、レーゲンスブルク）によって合成された。正確な遺伝子配列が入手可能でない場合、最も近いホモログの配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、ＲＴ−ＰＣＲによって適切な組織を起源とするＲＮＡから遺伝子を単離した。単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準的なクローニング／シーケンシングベクター中でクローニングした。形質転換した細菌からプラスミドＤＮＡを精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡシーケンシングによって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計された。全てのコンストラクトは、真核細胞における分泌のためのタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする、５’末端ＤＮＡ配列を含むように設計された。
【０２７４】
タンパク質の精製
標準的なプロトコールを参照して、濾過された細胞培養上清からタンパク質を精製した。簡潔には、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥヘルスケア）に抗体を塗布し、ＰＢＳで洗浄した。抗体の溶出はｐＨ２．８で達成され、その直後に試料を中和した。凝集したタンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００，ＧＥヘルスケア）により、ＰＢＳ中又は２０ｍＭのヒスチジン（１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）中の単量体抗体から分離させた。単量体抗体画分をプールし、（必要な場合）例えばＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（３０ＭＷＣＯ）遠心濃縮機を使用して濃縮し、−２０℃又は−８０℃で凍結保存した。これらの試料の一部が、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）又は質量分析によるその後のタンパク質解析及び分析的特徴付けのために提供された。
【０２７５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の指示書に従って使用した。特に、１０％若しくは４〜１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｂｉｓ−ＴＲＩＳ  Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）及びＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）抗酸化剤ランニングバッファー添加剤を含む）又はＭＯＰＳ（非還元ゲル）ランニングバッファーを使用した。
【０２７６】
分析用サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集及びオリゴマー状態の決定のためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって実施した。簡潔には、プロテインＡ精製抗体を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ  １１００システムで３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）中のＴｏｓｏｈ  ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷカラムに、又はＤｉｏｎｅｘ  ＨＰＬＣ−システムで２倍のＰＢＳ中のＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥヘルスケア）に塗布した。ＵＶ吸光度及びピーク面積の積分により、溶出したタンパク質を定量化した。ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  １５１-１９０１が標準として機能した。
【０２７７】
実施例１
ＯＸ４０抗体の生成
１．１  抗原の調製、精製及び特徴付け、並びにファージディスプレイによる新規ＯＸ４０バインダーの生成のためのスクリーニングツール
ヒト、マウス又はカニクイザルＯＸ４０の外部ドメインをコードするＤＮＡ配列（表１）は、ノブ上のヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを用いてインフレームでサブクローニングされた（Merchant et al., Nat Biotechnol (1998) 16, 677-681）。ＡｃＴＥＶプロテアーゼ切断部位は、抗原外部ドメインとヒトＩｇＧ１のＦｃの間に導入された。抗原−ＦｃノブのＣ末端に、定方向（directed）ビオチン化用のＡｖｉタグが導入された。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ変異を含有する抗原−Ｆｃノブ鎖と、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異を含有するＦｃホール鎖との組み合わせにより、ＯＸ４０外部ドメイン含有鎖の単一コピーを含むヘテロダイマーの生成が可能になり、それによってＦｃ結合抗原の単量体型を作製する（図１）。表１に、様々なＯＸ４０外部ドメインのアミノ酸配列を示す。表２は、図１に示した単量体抗原Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列。
表１．抗原外部ドメイン（ＥＣＤ）のアミノ酸番号付けと及び起源
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表２．単量体抗原Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列（１つのＦｃホール鎖と１つの抗原Ｆｃノブ鎖の組み合わせにより生成）
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【０２７８】
ＯＸ４０−Ｆｃ−融合体をコードする配列は全て、ＭＰＳＶプロモーターから挿入物の発現を促進し、且つ、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡシグナル配列を含むプラスミドベクター中でクローニングされた。更に、該ベクターには、プラスミドのエピソーム維持のためのＥＢＶ  ＯｒｉＰ配列が含まれていた。
【０２７９】
ビオチン化モノマー抗原／Ｆｃ融合分子の調製のために、指数関数的に増殖する懸濁液ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞に、融合タンパク質の２つの構成要素（ノブ鎖とホール鎖）をコードする３つのベクターと、ビオチン化反応に必要な酵素ＢｉｒＡとをコトランスフェクトした。対応するベクターは、２：１：０．０５の比率（「抗原ＥＣＤ−ＡｃＴＥＶ−Ｆｃノブ」：「Ｆｃ（ホール）」：「ＢｉｒＡ」）で使用された。
【０２８０】
５００ｍｌの振盪フラスコ内でのタンパク質生成のために、トランスフェクションの２４時間前に４億個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を播種した。トランスフェクションのために、細胞を２１０ｇで５分間遠心分離し、予熱したＣＤ  ＣＨＯ培地で上清を置き換えた。発現ベクターは、２００μｇのベクターＤＮＡを含む２０ｍＬのＣＤ  ＣＨＯ培地に再懸濁した。５４０μｌのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を加えた後、該溶液を１５秒間ボルテックスし、室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌの振盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気でインキュベーター中、３７℃で３時間インキュベートした。インキュベート後、１６０ｍｌのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの翌日、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のＦｅｅｄを培養液に加えた。７日間の培養後、細胞を２１０ｇで１５分間スピンダウンすることによって細胞上清を回収した。溶液を滅菌濾過（０．２２μｍフィルター）し、最終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）になるようにアジ化ナトリウムを添加し、４℃で維持した。
【０２８１】
分泌タンパク質を、プロテインＡを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって、続いてサイズ排除クロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、４０ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＴｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＡ  ＨＰカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥヘルスケア）に上清を充填した。２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム及び０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有する少なくとも１０カラム体積のバッファー（ｐＨ７．５）で洗浄することにより、結合していないタンパク質を除去した。結合したタンパク質は、２０カラム体積の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ３．０）で作成された塩化ナトリウムの直線ｐＨ勾配（０〜５００ｍＭ）を使用して溶出した。その後、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム及び０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ３．０）を含有する、１０カラム体積の溶液でカラムを洗浄した。
【０２８２】
収集された画分のｐＨは、１／４０（ｖ／ｖ）の２Ｍ  トリス（ｐＨ８．０）を加えることにより調整した。このタンパク質を濃縮し、濾過した後、２ｍＭ  ＭＯＰＳ、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥヘルスケア）に充填した。
【０２８３】
１．２  汎用Ｆａｂ及び共通軽鎖のライブラリーからのＯＸ４０特異的８Ｈ９、２０Ｂ７、４９Ｂ４、１Ｇ４、ＣＬＣ−５６３、ＣＬＣ−５６４及び１７Ａ９抗体の選択
抗ＯＸ４０抗体は、３つの異なる汎用ファージディスプレイライブラリー、ＤＰ８８−４（クローン２０Ｂ７、８Ｈ９  １Ｇ４及び４９Ｂ４）、共通軽鎖ライブラリーＶｋ３＿２０／ＶＨ３＿２３（クローンＣＬＣ−５６３及びＣＬＣ−５６４）、及びラムダＤＰ４７（クローン１７Ａ９）から選択された。
【０２８４】
ＤＰ８８−４ライブラリーは、ランダム化した配列空間を軽鎖のＣＤＲ３（Ｌ３、３つの異なる長さ）と重鎖のＣＤＲ３（Ｈ３、３つの異なる長さ）に含むＶドメインベアリングＶｋ１＿５（カッパ軽鎖）及びＶＨ１＿６９（重鎖）を使用して、ヒトの生殖系列遺伝子に基づいて構築された。ライブラリーの生成は、オーバーラップエクステンションによるスプライシング（ＳＯＥ）ＰＣＲを適用する３つのＰＣＲ増幅断片のアセンブリによって実施された。断片１は、ランダム化したＬ３を含む抗体遺伝子の５’末端を含み、断片２は、Ｌ３からＨ３に及ぶ中央の定常断片であり、断片３は、ランダム化したＨ３と抗体遺伝子の３’部分とを含む。それぞれ次のプライマーの組み合わせを使用して、ＤＰ８８−４ライブラリーのためのこれらのライブラリー断片を生成した：断片１（リバースプライマーＶｋ１＿５＿Ｌ３ｒ＿Ｓ又はＶｋ１＿５＿Ｌ３ｒ＿ＳＹ又はＶｋ１＿５＿Ｌ３ｒ＿ＳＰＹと組み合わせたフォワードプライマーＬＭＢ３）、断片２（リバースプライマーＲＪＨ３２と組み合わせたフォワードプライマーＲＪＨ３１）、及び断片３（リバースプライマーｆｄｓｅｑｌｏｎｇと組み合わせたフォワードプライマーＤＰ８８−ｖ４−４又はＤＰ８８−ｖ４−６又はＤｐ８８−ｖ４−８）。ライブラリーの断片生成のためのＰＣＲパラメーターは、９４℃で５分の初期変性、１分９４℃、１分５８℃、１分７２℃の２５サイクル、及び７２℃で１０分間の最終伸長であった。ゲル精製された単一断片の等モル比をテンプレートとして使用するアセンブリＰＣＲの場合、パラメーターは９４℃で３分の初期変性と３０秒９４℃、１分５８℃、２分７２℃の５サイクルであった。この段階で、外部プライマー（ＬＭＢ３とｆｄｓｅｑｌｏｎｇ）を追加し、７２℃で１０分間の最終伸長の前に更なる２０サイクルを実施した。十分な量の完全長ランダム化Ｆａｂコンストラクトをアセンブリした後、それらをＮｃｏＩ／ＮｈｅＩ消化し、同様に処理したアクセプターファージミドベクターにライゲートした。精製されたライゲーションは、エレクトロコンピテント大腸菌ＴＧ１への約６０の形質転換に使用された。Ｆａｂライブラリーを表示するファージミド粒子をレスキューし、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製によって精製し、選択に使用した。こうしたライブラリー構築工程を３回繰り返して、４．４×１０９の最終ライブラリーサイズを取得した。機能的クローンの割合は、ドットブロットでのＣ末端タグの検出により決定して、軽鎖で９２．６％、重鎖で９３．７％であった。
【０２８５】
共通軽鎖ライブラリーｋ３＿２０／ＶＨ３＿２３は、定常非ランダム化共通軽鎖Ｖｋ３＿２０とランダム化配列空間とを重鎖のＣＤＲ３に（Ｈ３、３つの異なる長さ）に含むＶドメインペアリングＶｋ３＿２０（カッパ軽鎖）及びＶＨ３＿２３（重鎖）を使用して、ヒト生殖系列遺伝子に基づいて構築された。ライブラリーの生成は、オーバーラップエクステンションによるスプライシング（ＳＯＥ）ＰＣＲを適用する２つのＰＣＲ増幅断片のアセンブリによって実施された。断片１は、Ｌ３からＨ３に及ぶ定常断片であり、断片２は、ランダム化したＨ３と抗体遺伝子の３’部分とを含む。それぞれ次のプライマーの組み合わせを使用して、Ｖｋ３＿２０／ＶＨ３＿２３共通軽鎖ライブラリーのためのこれらのライブラリー断片を生成した：断片１（リバースプライマーＤＰ４７ＣＤＲ３＿ｂａ（改変）と組み合わせたフォワードプライマーＭＳ６４）及び断片２（リバースプライマーｆｄｓｅｑｌｏｎｇと組み合わせたフォワードプライマーＤＰ４７−ｖ４−４、ＤＰ４７−ｖ４−６、ＤＰ４７−ｖ４−８）。ライブラリーの断片生成のためのＰＣＲパラメーターは、９４℃で５分の初期変性、９４℃１分、５８℃１分、７２℃１分の２５サイクル、及び７２℃で１０分間の最終伸長であった。ゲル精製された単一断片の等モル比をテンプレートとして使用するアセンブリＰＣＲの場合、パラメーターは９４℃で３分の初期変性と９４℃で３０秒、５８℃で１分、７２℃で２分の５サイクルであった。この段階で、外部プライマー（ＭＳ６４とｆｄｓｅｑｌｏｎｇ）を追加し、７２℃で１０分間の最終伸長の前に更なる１８サイクルを実施した。十分な量の完全長ランダム化ＶＨコンストラクトをアセンブリした後、それらをＭｕｎＩ／ＮｏｔＩ消化し、同様に処理したアクセプターファージミドベクターにライゲートした。精製されたライゲーションは、エレクトロコンピテント大腸菌ＴＧ１への約６０の形質転換に使用された。Ｆａｂライブラリーを表示するファージミド粒子をレスキューし、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製によって精製し、選択に使用した。最終的なライブラリーサイズは、３．７５×１０９になった。機能的クローンの割合は、ドットブロットでのＣ末端タグの検出により決定して、軽鎖で９８．９％、重鎖で８９．５％であった。
【０２８６】
ラムダＤＰ４７ライブラリーは、次のＶドメインペアリング：Ｖｌ３＿１９ラムダ軽鎖とＶＨ３＿２３重鎖を使用して、ヒトの生殖系列遺伝子に基づいて構築された。このライブラリーは、軽鎖のＣＤＲ３（Ｌ３）及び重鎖のＣＤＲ３（Ｈ３）においてランダム化され、「オーバーラップエクステンションによるスプライシング」（ＳＯＥ）ＰＣＲによって３つの断片からアセンブリされた。断片１は、ランダム化したＬ３を含む抗体遺伝子の５’末端を含み、断片２は、Ｌ３の末端からのＨ３の始まりにまで及ぶ中央の定常断片であり、断片３は、ランダム化したＨ３とＦａｂ断片の３’部分とを含む。次のプライマーの組み合わせを使用して、ライブラリーのためのライブラリー断片を生成した：断片１（ＬＭＢ３−Ｖｌ＿３＿１９＿Ｌ３ｒ＿Ｖ／Ｖｌ＿３＿１９＿Ｌ３ｒ＿ＨＶ／Ｖｌ＿３＿１９＿Ｌ３ｒ＿ＨＬＶ）、断片２（ＲＪＨ８０−ＤＰ４７ＣＤＲ３＿ｂａ（改変））、及び断片３（ＤＰ４７−ｖ４−４／ＤＰ４７−ｖ４−６／ＤＰ４７−ｖ４−８−ｆｄｓｅｑｌｏｎｇ）。ライブラリーの断片生成のためのＰＣＲパラメーターは、９４℃で５分の初期変性、９４℃６０秒、５５℃６０秒、７２℃６０秒の２５サイクル、及び７２℃で１０分間の最終伸長であった。３つの断片の等モル比をテンプレートとして使用するアセンブリＰＣＲの場合、パラメーターは９４℃で３分の初期変性と９４℃で６０秒、５５℃で６０秒、７２℃で１２０秒の５サイクルであった。この段階で、外部プライマーを追加し、７２℃で１０分間の最終伸長の前に更なる２０サイクルを実施した。十分な量の完全長ランダム化Ｆａｂ断片をアセンブリした後、それらを同様に処理したアクセプターファージミドベクターと共にＮｃｏＩ／ＮｈｅＩで消化した。１５μｇのＦａｂライブラリー挿入物を１３．３μｇのファージミドベクターとライゲートした。精製されたライゲーションを６０回の形質転換に使用し、１．５×１０９個の形質転換体を得た。Ｆａｂライブラリーを表示するファージミド粒子をレスキューし、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製によって精製し、選択に使用した。
【０２８７】
ファージディスプレイ選択のための抗原としてのヒトＯＸ４０（ＣＤ１３４）は、Ｎ末端単量体Ｆｃ融合体としてＨＥＫ  ＥＢＮＡ細胞に一時的に発現し、受容体鎖（Ｆｃノブ鎖）を有するＦｃ部分のＣ末端に位置するａｖｉタグ認識配列におけるＢｉｒＡビオチンリガーゼの共発現によって、ｉｎ  ｖｉｖｏで部位特異的にビオチン化された。
【０２８８】
選択ラウンド（バイオパニング）は、以下のパターンに従って溶液中で実施された。
１．  抗原のＦｃ部分を認識する抗体のライブラリーを枯渇させるための、１０μｇ／ｍｌの無関係なヒトＩｇＧでコーティングされたｍａｘｉｓｏｒｐプレート上のファージミド粒子約１０１２個のプレクリアリング（pre-clearing）、
２．  総量１ｍｌのＦｃバインダーのさらなる枯渇のための、１００ｎＭの無関係な非ビオチン化Ｆｃノブ・イントゥ・ホールコンストラクトの存在下、０．５時間の非結合ファージミド粒子と１００ｎＭビオチン化ヒトＯＸ４０とのインキュべーション、
３．  ニュートラアビジンプレコートマイクロタイタープレートの４つのウェルに１０分間（ラウンド１＆３で）移すことによる、ビオチン化ｈｕ  ＯＸ４０及び付着した特異的結合ファージの捕捉、
４．  ５ｘ  ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０と５ｘ  ＰＢＳを使用する、各ウェルの洗浄、
５．  １ウェルあたり２５０μｌの１００ｍＭ  ＴＥＡ（トリエチルアミン）を１０分間添加することによるファージ粒子の溶出及び５００μｌの１Ｍ  トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を４ウェルからプールした溶出液に添加することによる中和、
６．  Ｆｃバインダーを最終的に除去するための、ニュートラアビジンプレコートマイクロタイタープレート上でのビオチンで捕捉された１００ｎＭのＦｃノブ・イントゥ・ホールコンストラクトとのインキュベーションによる中和溶出液のポストクリアリング（post-clearing）、
７．  溶出したファージ粒子の上清による、対数期大腸菌ＴＧ１細胞の再感染、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３による感染、３０℃で一晩のシェーカーでのインキュベーション、及びそれに続く、次の選択ラウンドにおいて使用するためのファージミド粒子のＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿。
【０２８９】
選択は、１００ｎＭの一定の抗原濃度を使用して、３又は４ラウンドにわたって実施された。カニクイザルＯＸ４０だけでなくマウスＯＸ４０とも交差反応するバインダーの可能性を高めるために、いくつかの選択ラウンドでは、ヒトＯＸ４０の代わりにマウス標的を使用した。ラウンド２と４では、ニュートラアビジンへのバインダーの濃縮を避けるために、５．４×１０７のストレプトアビジンコート磁気ビーズを添加して、抗原：ファージ複合体の捕捉を実施した。次のように、特異的バインダーをＥＬＩＳＡにより同定した：１００μｌの２５ｎＭ  ビオチン化ヒトＯＸ４０及び１０μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧをそれぞれ、ニュートラアビジンプレート及びｍａｘｉｓｏｒｐプレートにコーティングした。Ｆａｂ含有細菌の上清を加え、抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を用い、結合するＦａｂをそれらのＦｌａｇタグにより検出した。更なる分析のために、ヒトＯＸ４０でシグナルを示し、且つ、ヒトＩｇＧで陰性であるクローンが最終候補とされ、カニクイザル及びマウスＯＸ４０に対しても同様の方法で試験された。０．５リットルの培養液でそれらを細菌的に発現させ、アフィニティー精製し、ＢｉｏＲａｄのＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６バイオセンサーを使用するＳＰＲ分析によって更に特徴付けた。
【０２９０】
表３は汎用ファージディスプレイ抗体ライブラリー（ＤＰ８８−４）の配列を示し、表４はライブラリーＤＰ８８−４生殖系列テンプレートのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示し、表５はＤＰ８８−４生殖系列テンプレートの生成のために使用されるプライマー配列を示す。
表３．汎用ファージディスプレイ抗体ライブラリーの配列（ＤＰ８８−４）
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表４．ライブラリーＤＰ８８−４生殖系列テンプレートのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列
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表５．ＤＰ８８−４ライブラリーの生成に使用されるプライマー配列
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【０２９１】
表６は、汎用ファージディスプレイ抗体共通軽鎖ライブラリー（Ｖｋ３＿２０／ＶＨ３＿２３）の配列を示す。表７は共通軽鎖ライブラリー（Ｖｋ３＿２０／ＶＨ３＿２３）生殖系列テンプレートのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示し、表８は共通軽鎖ライブラリー（Ｖｋ３＿２０／ＶＨ３＿２３）の生成に使用されるプライマー配列を示す。
表６．ＰＣＲに使用される汎用ファージディスプレイ抗体共通軽鎖ライブラリー（Ｖｋ３＿２０／ＶＨ３＿２３）テンプレートの配列
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表７．共通軽鎖ライブラリー（Ｖｋ３＿２０／ＶＨ３＿２３）生殖系列テンプレートのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列
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表８．共通軽鎖ライブラリー（Ｖｋ３＿２０／ＶＨ３＿２３）作成のために用いられるプライマー配列
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【０２９２】
表９は、ＰＣＲに使用される汎用のファージディスプレイラムダ−ＤＰ４７ライブラリー  （Ｖｌ３＿１９／ＶＨ３＿２３）テンプレートの配列を示す。表１０はラムダＤＰ４７ライブラリー（Ｖｌ３＿１９／ＶＨ３＿２３）生殖系列テンプレートのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示し、表１１はラムダＤＰ４７ライブラリー（Ｖｌ３＿１９／ＶＨ３＿２３）の作成のために使用されるプライマー配列を示す。
表９：ＰＣＲに使用される汎用ファージディスプレイ抗体共通軽鎖ライブラリー（Ｖｌ３＿１９／ＶＨ３＿２３）テンプレートの配列
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表１０．ラムダＤＰ４７ライブラリー（Ｖｌ３＿１９／ＶＨ３＿２３）生殖系列テンプレートのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列
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表１１．ラムダＤＰ４７ライブラリー（Ｖｌ３＿１９／ＶＨ３＿２３）作成のために用いられるプライマー配列
2020515541.tif 000032
【０２９３】
ラムダＤＰ４７ライブラリー、すなわちＤＰ４７ＣＤＲ３＿ｂａ（改変）、ＤＰ４７−ｖ４−４、ＤＰ４７−ｖ４−６、ＤＰ４７−ｖ４−８及びｆｄｓｅｑｌｏｎｇの構築に使用される追加のプライマーは、共通軽鎖ライブラリー（Ｖｋ３＿２０／ＶＨ３＿２３）の構築に使用されるプライマーと同一であり、すでに表８に列挙されている。
【０２９４】
クローン８Ｈ９、２０Ｂ７、４９Ｂ４、１Ｇ４、ＣＬＣ−５６３、ＣＬＣ−５６４及び１７Ａ９は、上記の手順により、ヒトＯＸ４０特異的バインダーと同定された。これらの可変領域のｃＤＮＡ配列を以下の表１２に示し、対応するアミノ酸配列を表Ｃに示す。
表１２．ファージ由来抗ＯＸ４０抗体の可変領域塩基対配列下線部は相補性決定領域（ＣＤＲ）。
2020515541.tif 000033
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【０２９５】
１．３  抗ＯＸ４０  ＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ抗体の調製、精製及び特徴付け
選択された抗ＯＸ４０バインダーの重及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、ヒトＩｇＧ１の定常重鎖又は定常軽鎖のいずれかとインフレームでサブクローニングした。国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、ノブ及びホール重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を導入した。
【０２９６】
抗ＯＸ４０クローンのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を表１３に示す。抗ＯＸ４０−Ｆｃ−融合体をコードする配列は全て、ＭＰＳＶプロモーターから挿入物の発現を促進し、且つ、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡシグナル配列を含むプラスミドベクター中でクローニングされた。更に、ベクターには、プラスミドのエピソーム維持のためのＥＢＶ  ＯｒｉＰ配列が含まれている。
表１３．Ｐ３２９ＧＬＡＬＡヒトＩｇＧ１型抗ＯＸ４０クローンの配列
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【０２９７】
抗Ｏｘ４０抗体は、ポリエチレンイミンを使用してＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に哺乳動物発現ベクターをコトランスフェクトすることにより産生された。該細胞には、対応する発現ベクターが１：１（「ベクター重鎖」：「ベクター軽鎖」）の比でトランスフェクトされた。
【０２９８】
５００ｍｌの振盪フラスコ内での産生の場合、トランスフェクションの２４時間前に４億個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を播種した。トランスフェクションのために、これらの細胞を２１０×ｇで５分間遠心分離し、予熱したＣＤ  ＣＨＯ培地で上清を置き換えた。発現ベクター（全ＤＮＡの２００μｇ）を２０ｍＬ  ＣＤ  ＣＨＯ培地中で混合した。５４０μｌのＰＥＩを加えた後、溶液を１５秒間ボルテックスし、その後室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌの振盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気でインキュベーター中、３７℃で３時間インキュベートした。インキュベート後、１６０ｍｌのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの翌日、１ｍＭのバルプロ酸と、サプリメントを含む７％のＦｅｅｄとを添加した。７日間培養した後、２１０×ｇで１５分間遠心分離することによって、上清を回収した。溶液を滅菌濾過（０．２２μｍフィルター）し、最終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）になるようにアジ化ナトリウムを添加し、４℃で維持した。
【０２９９】
細胞培養上清からの抗体分子の精製は、抗原Ｆｃ融合体の生成の場合に上に記載したプロテインＡを使用するアフィニティークロマトグラフィーで行った。
【０３００】
該タンパク質を濃縮し、濾過した後、２０ｍＭ  ヒスチジン、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥヘルスケア）に充填した。
【０３０１】
精製された抗体のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおけるＯＤを測定することにより決定した。抗体の純度及び分子量をＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を使用して、還元剤（米国、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の有無に関わらずＣＥ−ＳＤＳ分析により分析した。抗体試料の凝集体含有量を、２５  ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  Ｌ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３（ｐＨ６．７、２５℃のランニングバッファー）中で平衡化されたＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析用サイズ除外カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
【０３０２】
表に、抗ＯＸ４０  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ  ＩｇＧ１抗体の収量と最終含有量をまとめる。
表１４：抗ＯＸ４０  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ  ＩｇＧ１クローンの生化学的分析
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【０３０３】
実施例２
テネイシンＣ（ＴｎＣ）抗体の生成
２．１  ファージディスプレイによる新規ＴｎＣバインダーの生成のための抗原の調製、精製及び特徴付け、並びにスクリーニングツール
表１５及び表１６のコンストラクトをＧＳＴのＣ末端に融合し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に発現させた。部位特異的ビオチン化のために、Ａｖｉタグをテネイシン配列のＣ末端に追加し、ＢｉｒＡビオチンリガーゼを別個のプラスミド（米国コロラド州のＡｖｉｄｉｔｙ）に共発現させた。増殖培地は、１００μｇ／ｍｌアンピシリンと２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールとを含む２ＹＴであった。ビオチンを５０μＭの最終濃度まで添加した。タンパク質発現を、１ｍＭ  ＩＰＴＧで２２℃で一晩誘導した。遠心分離により細胞を収集し、Ｂ−ＰＥＲ試薬（ｐｉｅｒｃｅ  ７８２６０）及び１ｍｇ／ｍｌリゾチーム（シグマ  Ｌ６８７６）の存在下での超音波処理により細胞溶解を実施した。ライセートを遠心分離し、透明なライセートをＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥヘルスケア；製品番号１７−０７５６−０１）に充填した。洗浄後、ＴｎＣ分子を４℃で一晩、Ｔｈｒｏｍｂｉｎ（シグマアルドリッチ；製品番号１０６０２４００００１）でＧＳＴから切断した。溶出は、５０ｍＭ  トリスバッファー（ｐＨ８．０；２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ及び１０％グリセロール）中で実施された。最終精製工程は、ゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １６／６０；ＧＥヘルスケア）で行った。試料は、処理するまで液体窒素で瞬間凍結させた。
表１５：異種間アフィニティー決定に使用されるＴｎＣ抗原の配列
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表１６：アフィニティー決定に使用されるＴｎＣ抗原の配列
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【０３０４】
２．２  汎用ＦａｂライブラリーからのＴｎＣ特異的抗体１８Ｄ４及び１１Ｃ７の選択
抗ＴｎＣ抗体は、ＤＰ８８−４（クローン１８Ｄ４）とラムダＤＰ４７（クローン１１Ｃ７）という２つの異なる汎用ファージディスプレイライブラリーから選択された。
【０３０５】
ライブラリー構築
ＤＰ８８−４ライブラリーは、ランダム化した配列空間を軽鎖のＣＤＲ３（Ｌ３、３つの異なる長さ）と重鎖のＣＤＲ３（Ｈ３、３つの異なる長さ）に含むＶドメインベアリングＶｋ１＿５（カッパ軽鎖）及びＶＨ１＿６９（重鎖）を使用して、ヒトの生殖系列遺伝子に基づいて構築された。ライブラリーの生成は、オーバーラップエクステンションによるスプライシング（ＳＯＥ）ＰＣＲを適用する３つのＰＣＲ増幅断片のアセンブリによって実施された。断片１は、ランダム化したＬ３を含む抗体遺伝子の５’末端を含み、断片２は、Ｌ３からＨ３に及ぶ中央の定常断片であり、断片３は、ランダム化したＨ３と抗体遺伝子の３’部分とを含む。それぞれ次のプライマーの組み合わせを使用して、ＤＰ８８−４ライブラリーのためのこれらのライブラリー断片を生成した：断片１（リバースプライマーＶｋ１＿５＿Ｌ３ｒ＿Ｓ又はＶｋ１＿５＿Ｌ３ｒ＿ＳＹ又はＶｋ１＿５＿Ｌ３ｒ＿ＳＰＹと組み合わせたフォワードプライマーＬＭＢ３）、断片２（リバースプライマーＲＪＨ３２と組み合わせたフォワードプライマーＲＪＨ３１）、及び断片３（リバースプライマーｆｄｓｅｑｌｏｎｇと組み合わせたフォワードプライマーＤＰ８８−ｖ４−４又はＤＰ８８−ｖ４−６又はＤｐ８８−ｖ４−８）。ライブラリーの断片生成のためのＰＣＲパラメーターは、９４℃で５分の初期変性、９４℃１分、５８℃１分、７２℃１分の２５サイクル、及び７２℃で１０分間の最終伸長であった。ゲル精製された単一断片の等モル比をテンプレートとして使用するアセンブリＰＣＲの場合、パラメーターは９４℃で３分の初期変性と３０秒９４℃、１分５８℃、２分７２℃の５サイクルであった。この段階で、外部プライマー（ＬＭＢ３とｆｄｓｅｑｌｏｎｇ）を追加し、７２℃で１０分間の最終伸長の前に更なる２０サイクルを実施した。十分な量の完全長ランダム化Ｆａｂコンストラクトをアセンブリした後、それらをＮｃｏＩ／ＮｈｅＩ消化し、同様に処理したアクセプターファージミドベクターにライゲートした。精製されたライゲーションは、エレクトロコンピテント大腸菌ＴＧ１への約６０回の形質転換に使用された。Ｆａｂライブラリーを表示するファージミド粒子をレスキューし、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製によって精製し、選択に使用した。こうしたライブラリー構築工程を３回繰り返して、４．４×１０９の最終ライブラリーサイズを取得した。機能的クローンの割合は、ドットブロットでのＣ末端タグの検出により決定して、軽鎖で９２．６％、重鎖で９３．７％であった。
【０３０６】
ラムダＤＰ４７ライブラリーは、次のＶドメインペアリング：Ｖｌ３＿１９ラムダ軽鎖とＶＨ３＿２３重鎖を使用して、ヒトの生殖系列遺伝子に基づいて構築された。このライブラリーは、軽鎖のＣＤＲ３（Ｌ３）及び重鎖のＣＤＲ３（Ｈ３）においてランダム化され、「オーバーラップエクステンションによるスプライシング」（ＳＯＥ）ＰＣＲによって３つの断片からアセンブリされた。断片１は、ランダム化したＬ３を含む抗体遺伝子の５’末端を含み、断片２は、Ｌ３の末端からのＨ３の始まりにまで及ぶ中央の定常断片であり、断片３は、ランダム化したＨ３とＦａｂ断片の３’部分とを含む。次のプライマーの組み合わせを使用して、ライブラリーのためのライブラリー断片を生成した：断片１（ＬＭＢ３−Ｖｌ＿３＿１９＿Ｌ３ｒ＿Ｖ／Ｖｌ＿３＿１９＿Ｌ３ｒ＿ＨＶ／Ｖｌ＿３＿１９＿Ｌ３ｒ＿ＨＬＶ）、断片２（ＲＪＨ８０−ＤＰ４７ＣＤＲ３＿ｂａ（改変））、及び断片３（ＤＰ４７−ｖ４−４／ＤＰ４７−ｖ４−６／ＤＰ４７−ｖ４−８−ｆｄｓｅｑｌｏｎｇ）。ライブラリーの断片生成のためのＰＣＲパラメーターは、９４℃で５分の初期変性、９４℃６０秒、５５℃６０秒、７２℃６０秒の２５サイクル、及び７２℃で１０分間の最終伸長であった。３つの断片の等モル比をテンプレートとして使用するアセンブリＰＣＲの場合、パラメーターは９４℃で３分の初期変性と９４℃６０秒、５５℃６０秒、７２℃１２０秒の５サイクルであった。この段階で、外部プライマーを追加し、７２℃で１０分間の最終伸長の前に更なる２０サイクルを実施した。十分な量の完全長ランダム化Ｆａｂ断片をアセンブリした後、それらを同様に処理したアクセプターファージミドベクターと共にＮｃｏＩ／ＮｈｅＩで消化した。１５μｇのＦａｂライブラリー挿入物を１３．３μｇのファージミドベクターとライゲートした。精製されたライゲーションを６０回の形質転換に使用し、１．５×１０９個の形質転換体を得た。Ｆａｂライブラリーを表示するファージミド粒子をレスキューし、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製によって精製し、選択に使用した。
【０３０７】
ファージディスプレイの選択とＥＬＩＳＡスクリーニング
ファージディスプレイ選択の抗原としてのヒトＧＳＴ融合ＴｎＣ  ｆｎ５  Ａ１２３４  ＢＣ  ｆｎ６は、大腸菌内で発現され、融合タンパク質のＣ末端に位置するａｖｉタグ認識配列でのＢｉｒＡビオチンリガーゼの共発現によってｉｎ  ｖｉｖｏで部位特異的にビオチン化された（実施例２．１による抗原の産生、表１４から導かれる配列）。この抗原は、２つのフィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン５と６の間に位置する、ヒトＴｎＣエクストラスプライスドメインＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ｂ及びＣを含む。ファージディスプレイの選択は、これらのエクストラスプライスドメインのいずれかへのバインダーを選択することを目的とし、より少ないエクストラスプライスドメインを含む追加の抗原コンストラクトを使用する表面プラズモン共鳴による後続の工程でドメイン特異性を決定する。
【０３０８】
選択ラウンド（バイオパニング）は、以下のパターンに従って溶液中で実施された。１．３つの異なるタグを認識する抗体のライブラリーを枯渇させるための、ＴｎＣ標的抗原に類似したａｖｉタグ及びＨｉｓ６タグも保持している無関係なＧＳＴ融合タンパク質による、約１０１２個のファージミド粒子のプレクリアリング、２．総量１ｍｌのタグバインダーのさらなる枯渇のための、無関係な非ビオチン化ＧＳＴ融合タンパク質の存在下０．５時間の、上清中のプレクリアリングされたファージミド粒子と１００ｎＭビオチン化ヒトＧＳＴ融合ＴｎＣ  ｆｎ５  Ａ１２３４  ＢＣ  ｆｎ６とのインキュべーション、３．ニュートラアビジンプレコートマイクロタイタープレートの４つのウェルに１０分間（ラウンド１＆３で）移すことによる、ビオチン化ヒトＧＳＴ融合ＴｎＣ  ｆｎ５  Ａ１２３４  ＢＣ  ｆｎ６及び付着した特異的結合ファージの捕捉、４．５ｘＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０と５ｘＰＢＳを使用する、各ウェルの洗浄、５．１ウェルあたり２５０μｌの１００ｍＭ  ＴＥＡ（トリエチルアミン）を１０分間添加することによるファージ粒子の溶出及び５００μｌの１Ｍ  トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を４ウェルからプールした溶出液に添加することによる中和、６．溶出したファージ粒子の上清による、対数期大腸菌ＴＧ１細胞の再感染、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３による感染、３０℃で一晩のシェーカーでのインキュベーション及びそれに続く、次の選択ラウンドにおいて使用するためのファージミド粒子のＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿。選択は、１００ｎＭの一定の抗原濃度を使用して、３ラウンドにわたって実施された。ラウンド２では、ニュートラアビジンへのバインダーの濃縮を避けるために、５．４×１０７のストレプトアビジンコート磁気ビーズを添加して、抗原：ファージ複合体の捕捉を実施した。ラウンド２及び３の後、次のように、ＥＬＩＳＡにより特異的バインダーが同定された：１００μｌの１００ｎＭビオチン化ヒトＧＳＴ融合ＴｎＣ  ｆｎ５  Ａ１２３４  ＢＣ  ｆｎ６をニュートラアビジンプレートにコーティングした。Ｆａｂ含有細菌の上清を加え、抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を用い、結合するＦａｂをそれらのＦｌａｇタグにより検出した。ヒトＧＳＴ融合ＴｎＣ  ｆｎ５  Ａ１２３４  ＢＣ  ｆｎ６にシグナルを示し、且つ、標的と同じタグを有する無関係のＧＳＴ融合タンパク質で陰性であるクローンが、更なる分析のための最終候補とされた。これらを、０．５リットルの培養量で細菌発現させ、アフィニティー精製し、ＢｉｏＲａｄのＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６バイオセンサーを使用するＳＰＲ分析によって更に特徴付けて、マウスＴｎＣとの交差反応性を試験し、抗体が認識するエクストラスプライスドメインを決定した。
【０３０９】
ＢｉｏＲａｄのＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６バイオセンサーを使用するＳＰＲ分析
選択されたクローンのアフィニティー（ＫＤ）は、ニュートラアビジン捕捉によってＮＬＣチップ上に固定化されたビオチン化ヒト及びマウスＴｎＣ抗原と共にＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６機器（Ｂｉｏｒａｄ）を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）で測定される。抗原（リガンド）の固定化：組換え抗原をＰＢＳＴ（１０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．４）、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、その後垂直方向に３０μｌ／分で注入した。分析物の注入：「ワンショットカイネティクス」（‘one-shot kinetics’）測定では、注入方向を水平方向に変更し、精製されたＦａｂの２倍希釈系列を別々のチャネル１−５に沿って同時に注入し、それぞれ結合時間は２００秒、解離時間は２４０秒であった。参照用の「インライン」ブランク（“in-line” blank）を提供するために、バッファー（ＰＢＳＴ）を６番目のチャネルに沿って注入した。結合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）は、ＰｒｏｔｅＯｎ  Ｍａｎａｇｅｒ  ｖ３．１ソフトウェアで単純な１対１のラングミュア結合モデルを使用して、結合センサーグラムと解離センサーグラムを同時にフィットさせることにより計算した。平衡解離定数（ＫＤ）はｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。表１５に、種及びエクストラスプライスドメインの組成が異なるいくつかのＴｎＣ抗原の２つの選択されたクローンである１８Ｄ４及び１１Ｃ７の平衡解離定数（ＫＤ）を示す。
表１７：クローン１８Ｄ４及び１１Ｃ７の平衡解離定数（ＫＤ）  
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表３は汎用ファージディスプレイＤＰ８８−４ライブラリー（Ｖｋ１＿５／ＶＨ１＿６９）の配列を示し、表４はライブラリーＤＰ８８−４生殖系列テンプレートのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示し、表５はＤＰ８８−４生殖系列テンプレートの生成のために使用されるプライマー配列を示す。
【０３１０】
表９は、ＰＣＲに使用される汎用のファージディスプレイラムダ−ＤＰ４７ライブラリー（Ｖｌ３＿１９／ＶＨ３＿２３）テンプレートの配列を示す。表１０はラムダＤＰ４７ライブラリー（Ｖｌ３＿１９／ＶＨ３＿２３）生殖系列テンプレートのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示し、表１１はラムダＤＰ４７ライブラリー（Ｖｌ３＿１９／ＶＨ３＿２３）の作成のために使用されるプライマー配列を示す。
【０３１１】
２．３  可変抗体ドメインの発現ベクターへのクローニング
選択された抗ＴｎＣバインダーの重及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域（表１８〜表２３）を、ヒトＩｇＧ１の定常重鎖又は定常軽鎖のいずれかとインフレームでサブクローニングした。これらの抗体は、野生型ヒトＩｇＧ１骨格として、又はＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異（これらはＦｃガンマ受容体への結合を抑制するために導入されている）を含むバリアントとして、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って調製された。
抗ＴｎＣバインダーのＣＤＲ配列を表２０から表２３に示す。
抗ＴｎＣ  ＩｇＧの塩基対及びアミノ酸配列を表２４と表２５に示す。抗ＴｎＣ  Ｐ３１９ＧＬＡＬＡ  ＩｇＧの塩基対及びアミノ酸配列を表２６と表２７に示す。抗体をコードする配列は全て、キメラＭＰＳＶプロモーターで挿入物の転写を促進し、且つ、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ポリＡシグナル配列を含む発現ベクター中でクローニングされた。更に、該ベクターには、プラスミドのエピソーム維持のためのＥＢＶ  ＯｒｉＰ配列が含まれている。
ファージディスプレイによって選択されたクローン１１Ｃ７のＬＣＤＲ３（ＮＳＩＮＳＴＲＮＥＶ（配列番号５１））は、潜在的なＮグリコシル化部位、つまりＮＳＴを含む。これは、アミノ酸置換によって潜在的に除去することができ、均一な製品の生産を容易にし得る。同時に、標的への結合が保持される必要がある。Ｎ（１位）は、優先的にＱ、Ｓ又はＴによって置換され得る。代わりに、Ｓ（２位）をＰで置き換えることもできる。代わりに、Ｔ（３位）をＧ若しくはＮで、又はＳ若しくはＣを除く任意の他のタンパク質構成アミノ酸で優先的に置換することもできる。最適な置換は、当業者が経験的に決定することができる。
表１８：ファージ由来抗ＴｎＣ抗体の可変領域塩基対配列
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表１９：ファージ由来抗ＴｎＣ抗体の可変領域ポリペプチド配列
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表２０：抗ＴｎＣ抗体軽鎖のＣＤＲ塩基対配列
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表２１：抗ＴｎＣ抗体軽鎖のＣＤＲポリペプチド配列
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表２２：抗ＴｎＣ抗体重鎖のＣＤＲ塩基対配列
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表２３：抗ＴｎＣ抗体重鎖のＣＤＲポリペプチド配列
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表２４：野生型ヒトＩｇＧ１型抗ＴｎＣクローンの塩基対配列
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表２５：野生型ヒトＩｇＧ１型抗ＴｎＣクローンのポリペプチド配列
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表２６：Ｐ３２９ＧＬＡＬＡヒトＩｇＧ１型抗ＴｎＣクローンの塩基対配列
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表２７：Ｐ３２９ＧＬＡＬＡヒトＩｇＧ１型抗ＴｎＣクローンのポリペプチド配列
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【０３１２】
実施例３
ＯＸ４０及びテネイシンＣ（ＴｎＣ）を標的とする二重特異性抗体の生成
３．１  ＯＸ４０及びテネイシンＣ（ＴｎＣ）を標的とする二重特異性抗体の生成
ＯＸ４０に対する二価結合とＴｎＣに対する二価結合とを有する二重特異性アゴニストＯＸ４０コンストラクト（すなわち「２＋２」コンストラクト）を調製した。
本実施例において、該コンストラクトの重鎖（ＨＣ）は次の構成要素で構成されていた：抗ＯＸ４０  ４９Ｂ４  Ｆｃ（Ｐ３２９Ｇ／ＬＡＬＡ）のＶＨＣＨ１、これに続く抗ＴｎＣクローン１８Ｄ４又は１１Ｃ７の（Ｇ４Ｓ）４リンカー及びＶＨＣＨ１。国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を導入した。この重鎖融合体は、抗Ｏｘ４０  ４９Ｂ４の軽鎖（ＶＬＣＬ）及び１８Ｄ４又は１１Ｃ７のクロスＦａｂ  ＬＣ（ＶＬＣＨ１）と共発現された。ＴｎＣ結合部分にクロスマブ（crossmab）技術を使用して、間違ってペアになった軽鎖の形成を減らした（国際公開第２０１０／１４５７９２号参照）。得られた二重特異性二価構コンストラクトを図２に示し、塩基対とアミノ酸の配列をそれぞれ表２８と表２９に示す。
表２８：成熟した二重特異性抗Ｏｘ４０、抗ＴｎＣヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ２＋２型の塩基対配列
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表２９：成熟した二重特異性抗Ｏｘ４０、抗ＴｎＣヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ２＋２型のアミノ酸配列
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【０３１３】
ＣＭＶプロモーターエンハンサー断片と組み合わせたＭＰＳＶコアプロモーターから成るキメラＭＰＳＶプロモーターの制御下で、全ての遺伝子が一時的に発現された。発現ベクターは、宿主細胞を含有するＥＢＮＡ（エプスタイン・バーウイルス核抗原）に、エピソーム複製のためのｏｒｉＰ領域も含んでいる。
【０３１４】
二重特異性抗ＯＸ４０、抗ＴｎＣ  ２＋２コンストラクトは、ポリエチレンイミンを使用してＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に哺乳動物発現ベクターをコトランスフェクトすることにより産生された。該細胞には、対応する発現ベクターが１：１：１の比（「ベクターＬＣ１」：「ベクターＨＣ」：「ベクターＬＣ２」）でトランスフェクトされた。
【０３１５】
５００ｍｌの振盪フラスコ内での２００ｍＬの産生の場合、サプリメントを含むＥｘｃｅｌｌ培地に２億５千万個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのために、これらの細胞を２１０×ｇで５分間遠心分離し、予熱したＣＤ  ＣＨＯ培地で上清を置き換えた。ＤＮＡの最終量が２００μｇになるように、発現ベクターを２０ｍＬ  ＣＤ−ＣＨＯ培地で混合した。５４０μｌのＰＥＩ（１ｍｇ／ｍＬ）を加えた後、溶液を１５秒間ボルテックスし、その後室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌの振盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気でインキュベーター中、３７℃で３時間インキュベートし、１６５ｒｐｍで振盪した。インキュベート後、サプリメントを含む１６０ｍｌのＥｘｃｅｌｌ培地を加え、細胞を２４時間培養した。この時点で、バルプロ酸濃度は１ｍＭである（培地中には、５ｇ／Ｌ  ＰｅｐＳｏｙと６ｍＭ  Ｌ−グルタミンもある）。トランスフェクションの２４時間後、細胞に１２％の最終量のＦｅｅｄ  ７（２４ｍＬ）と３ｇ／Ｌのグルコース（５００ｇ／Ｌのストックからの１２ｍＬ）を補充した。７日間培養した後、２０００〜３０００×ｇで４５分間遠心分離することによって、細胞上清を回収した。溶液を滅菌濾過（０．２２μｍフィルター）し、最終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）になるようにアジ化ナトリウムを添加し、４℃で貯蔵した。
【０３１６】
細胞培養上清からの二重特異性コンストラクトの精製は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅを使用するアフィニティークロマトグラフィーにより実施された。該タンパク質を濃縮し、濾過した後、２０ｍＭ  ヒスチジン、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０溶液（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥヘルスケア）に充填した。
【０３１７】
アフィニティークロマトグラフィーのために、３０ｍｌの２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）で平衡化したＰｒｏｔＡ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅカラム（ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥヘルスケア）に上清を充填した。２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム及び０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有する６〜１０カラム体積のバッファー（ｐＨ７．５）で洗浄することにより、結合していないタンパク質を除去した。結合タンパク質は、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ３．０）から成る１５カラム体積の塩化ナトリウムの段階又は直線ｐＨ勾配（０〜１００％）のいずれかを使用して溶出された。その後、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭグリシン、０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ３．０）を含有する１０カラム体積の溶液でカラムを洗浄し、これに再平衡化工程が続いた。
【０３１８】
収集された画分のｐＨは、１／１０（ｖ／ｖ）の０．５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．０）を加えることにより調整した。該タンパク質を濃縮し、濾過した後、２０ｍＭ  ヒスチジン、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥヘルスケア）に充填した。
【０３１９】
精製された二重特異性コンストラクトのタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおけるＯＤを測定することにより決定した。この二重特異性コンストラクトの純度及び分子量をＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を使用して、還元剤（米国、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の有無に関わらずＣＥ−ＳＤＳ分析により分析した。二重特異性コンストラクトの凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３（ｐＨ６．７、２５℃のランニングバッファー）中で、ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析的サイズ除外カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
表３０．二重特異性抗ＯＸ４０、抗ＴｎＣ  ＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ  ２＋２コンストラクトの生化学分析
2020515541.tif 000079
【０３２０】
３．２  ＯＸ４０及びテネイシンＣ（ＴｎＣ）を標的とする二重特異性抗体の生成（４＋１及び４＋２）
ＯＸ４０に対する四価結合及びＴｎＣに対する一価結合（すなわち「４＋１」）又はＴｎＣに対する二価結合（すなわち「４＋２」）を有する二重特異性アゴニストＯＸ４０コンストラクトを調製した。４＋２型のＴｎＣ結合部分にクロスマブ技術を適用して、間違ってペアになった軽鎖の形成を減らした（国際公開第２０１０／１４５７９２号参照）。
４＋１コンストラクトの場合、コンストラクトのＨＣ１は次の構成要素で構成されていた：抗ＯＸ４０  ４９Ｂ４＿Ｆｃホール（Ｐ３２９Ｇ／ＬＡＬＡ）のＶＨＣＨ１＿ＶＨＣＨ１、これに続く抗ＴｎＣクローン１８Ｄ４の（Ｇ４Ｓ）４リンカー及びＶＬ。ＨＣ２は、抗ＯＸ４０  ４９Ｂ４のＶＨＣＨ１＿ＶＨＣＨ１と、それに続く抗ＴｎＣクローン１８Ｄ４のＶＨに融合したＦｃノブ（Ｐ３２９Ｇ／ＬＡＬＡ）＿（Ｇ４Ｓ）４リンカーで構成されていた。ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば米国特許第５７３１１６８号及び同第７６９５９３６号に記載されており、ＨＣ１とＨＣ２のアセンブリが可能になっている。重鎖融合ポリペプチドは、抗ＯＸ４０クローン４９Ｂ４の軽鎖（ＣＬＶＬ）と共発現された。
４＋２コンストラクトの場合、このコンストラクトのＨＣは、次の構成要素で構成されている：抗ＯＸ４０  ４９Ｂ４＿Ｆｃ（Ｐ３２９Ｇ／ＬＡＬＡ）のＶＨＣＨ１＿ＶＨＣＨ１、これに続く（Ｇ４Ｓ）４リンカーと、これに続く、ＦｃのＣ末端に融合したＴｎＣ結合クローン１８Ｄ４のクロスＦａｂユニット（ＶＬＣＨ１）。重鎖融合ポリペプチドは、抗ＯＸ４０クローン４９Ｂ４の軽鎖（ＬＣ１）（ＣＬＶＬ）と共発現された。抗ＯＸ４０  ＦａｂのＣＨ及びＣＬには、ベンス・ジョーンズタンパク質の生成を防ぎ、ＬＣ１とＨＣの正しいペアリング更に安定させるための荷電残基が含まれていた。
具体的には、置換Ｅ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋ（ＥＵ番号付けによる残基）は、ＯＸ４０（４９Ｂ４）ＶＬＣＬ軽鎖（配列番号２１２）のＣＬドメインでなされ、配列番号２２４の軽鎖配列をもたらし；また、置換Ｋ１４７Ｅ及びＫ２１３Ｅ（ＥＵ番号付けによる残基）は、ＯＸ４０（４９Ｂ４）のＣＨ１ドメインでなされ、配列番号２２０の重鎖配列をもたらした。
この場合、両方のＨＣに同じドメインが含まれているため、ノブ・イントゥ・ホールの導入は必要なかった。重鎖融合ポリペプチド及びＬＣ１ポリペプチドは、抗ＴｎＣ結合クローン１８Ｄ４のＶＶＨ及びＣＬをコードするポリペプチドと共発現された。
国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載の方法に従って、Ｆｃガンマ受容体への結合を無効にするために、４＋１及び４＋２コンストラクトの重鎖の定常領域にＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ変異を導入した。
ＯＸ４０に対する四価結合を有する、得られた二重特異性抗原結合分子を図３に示し、塩基対とアミノ酸の配列をそれぞれ表３１と表３２に示す。
表３１．成熟した二重特異性、四価抗ＯＸ４０、一価及び二価抗ＴｎＣ  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ分子の塩基対配列
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表３２．成熟した二重特異性、四価抗ＯＸ４０、一価及び二価抗ＴｎＣ  ｈｕＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ分子のアミノ酸配列
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【０３２１】
ＣＭＶプロモーターエンハンサー断片と組み合わせたＭＰＳＶコアプロモーターから成るキメラＭＰＳＶプロモーターの制御下で、全ての遺伝子が一時的に発現された。発現ベクターは、宿主細胞を含有するＥＢＮＡ（エプスタイン・バーウイルス核抗原）に、エピソーム複製のためのｏｒｉＰ領域も含んでいる。
【０３２２】
二重特異性抗ＯＸ４０、抗ＴｎＣコンストラクトは、ポリエチレンイミンを使用してＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に哺乳動物発現ベクターをコトランスフェクトすることにより産生された。細胞には、対応する発現ベクターが１：１：４（４＋２の「ベクター重鎖」：「ベクター軽鎖１」：「ベクター軽鎖２」）及び１：１：４（４＋１の「ベクター重鎖１」：「ベクター重鎖２」：「ベクター軽鎖」）の比でトランスフェクトされた。
【０３２３】
５００ｍｌの振盪フラスコ内での２００ｍＬの産生の場合、サプリメントを含むＥｘｃｅｌｌ培地に２億５千万個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのために、これらの細胞を２１０×ｇで５分間遠心分離し、予熱したＣＤ  ＣＨＯ培地で上清を置き換えた。ＤＮＡの最終量が２００μｇになるように、発現ベクターを２０ｍＬ  ＣＤ−ＣＨＯ培地で混合した。５４０μｌのＰＥＩ（１ｍｇ／ｍＬ）を加えた後、溶液を１５秒間ボルテックスし、その後室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌの振盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気でインキュベーター中、３７℃で３時間インキュベートし、１６５ｒｐｍで振盪した。インキュベート後、サプリメントを含む１６０ｍｌのＥｘｃｅｌｌ培地を加え、細胞を２４時間培養した。この時点で、バルプロ酸濃度は１ｍＭである（培地中には、５ｇ／Ｌ  ＰｅｐＳｏｙと６ｍＭ  Ｌ−グルタミンもある）。トランスフェクションの２４時間後、細胞に１２％の最終量のＦｅｅｄ  ７（２４ｍＬ）と３ｇ／Ｌのグルコース（５００ｇ／Ｌのストックからの１２ｍＬ）を補充した。７日間培養した後、２０００〜３０００×ｇで４５分間遠心分離することによって、細胞上清を回収した。溶液を滅菌濾過（０．２２μｍフィルター）し、最終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）になるようにアジ化ナトリウムを添加し、４℃で維持した。
【０３２４】
アフィニティークロマトグラフィーのために、３０ｍｌの２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）で平衡化したＰｒｏｔＡ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅカラム  （ＣＶ＝５ｍＬ、ＧＥヘルスケア）に上清を充填した。２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、２０ｍＭ  クエン酸ナトリウムを含有する６〜１０カラム体積のバッファー（ｐＨ７．５）で洗浄することにより、結合していないタンパク質を除去した。結合したタンパク質は、８カラム体積の２０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、１００ｍＭ  グリシン（ｐＨ３．０）での段階溶出液を使用して溶出した。
【０３２５】
収集された画分のｐＨは、１／１０（ｖ／ｖ）の０．５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．０）を加えることにより調整した。該タンパク質を濃縮し、濾過した後、２０ｍＭ  ヒスチジン、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥヘルスケア）に充填した。
【０３２６】
精製された二重特異性四価４＋１及び４＋２コンストラクトのタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおけるＯＤを測定することにより決定した。この二重特異性コンストラクトの純度及び分子量をＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を使用して、還元剤（米国、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の有無に関わらずＣＥ−ＳＤＳ分析により分析した。二重特異性コンストラクトの凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３（ｐＨ６．７、２５℃のランニングバッファー）中で、ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ分析的サイズ除外カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
表３３．二重特異性四価抗Ｏｘ４０、抗ＴｎＣ  ＩｇＧ１  Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ  ４＋１及び４＋２コンストラクトの生化学分析
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【０３２７】
３．３  抗ＯＸ４０、抗ＴｎＣ  ２＋２、４＋１及び４＋２コンストラクトの凝集温度の決定
全ての型を直接比較するために、熱安定性を、静的光散乱（ＳＬＳ）によって、及び適用した温度ストレスに応答する内在性タンパク質の蛍光発光を測定することによってモニターした。タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌの３０ｍｇの濾過したタンパク質試料をＯｐｔｉｍ  ２装置（Ａｖａｃｔａ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ社）に２回繰り返して適用した。半径及び全散乱強度を収集しながら、０．１℃／分で２５から８５℃まで温度を上昇させた。内在性ダンパ質の蛍光発光を決定するために、試料を２６６ｎｍで励起し、発光を２７５ｎｍから４６０ｎｍまでの間で収集した。
表３４．二重特異性抗ＯＸ４０、抗ＴｎＣ  ２＋２、４＋１及び４＋２コンストラクトの凝集温度
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【０３２８】
実施例４
ＯＸ４０及びテネイシンＣ  （ＴｎＣ）を標的とする二重特異性の結合
４．１  表面プラズモン共鳴分析によるＯＸ４０及びＴｎＣへの同時結合の分析
ヒトＯｘ４０  Ｆｃ（ｋｉｈ）とヒトＴｎＣに同時に結合する能力を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。全てのＳＰＲ実験は、ＨＢＳ−ＥＰ（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０、ドイツ国フライブルグのＢｉａｃｏｒｅ社）をランニングバッファーとして用い、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００で２５℃で実施された。
ビオチン化ヒトＴｎＣは、ストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップのフローセルに直接結合させた。最大１０００共鳴単位（ＲＵ）までの固定化レベルが使用された。
ＯＸ４０及びＴｎＣを標的とする二重特異性抗体を、濃度２５０ｎＭ、流速３０μＬ／分で９０秒間チップ表面を通過させ、解離をゼロ秒に設定した。ヒトＯＸ４０を、濃度２５０ｎＭ、流速３０μＬ／分で９０秒間、第２の分析物として注入し、解離を１２０秒間モニターした。タンパク質が全く固定化されていない基準フローセルで得られた応答差し引くことによって、バルク屈折率の差異を補正した。
全ての二重特異性抗原結合分子は、ヒトＯＸ４０及びヒトＴｎＣに同時に結合することができた（図４Ｂ〜４Ｅ）。
【０３２９】
４．２  表面プラズモン共鳴分析による、ヒト、マウス及びカニクイザルＴｎＣへの結合の分析
二重特異性コンストラクトのヒト、マウス及びカニクイザルＴｎＣに結合する能力を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって分析した。全てのＳＰＲ実験は、ＨＢＳ−ＥＰ（０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０、ドイツ国フライブルグのＢｉａｃｏｒｅ社）をランニングバッファーとして用い、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００で２５ ℃で実施された。
ビオチン化ヒト、マウス又はカニクイザルＴｎＣ分子をＳＡチップに固定化し、１０共鳴単位（ＲＵ）の固定化レベルに達成した。
固定化後、二重特異性分子又はコントロール分子を、０．０５〜５０ｎＭの範囲の濃度、流速３０μＬ／分で１２０秒間、及び１８０秒間の解離相でチップ表面を直ちに通過させた。１０ｍＭ  グリシン（ｐＨ２．１）を使用して、表面を再生した。ＴｎＣが全く固定化されていない基準フローセルで得られた応答差し引くことによって、バルク屈折率の差異を補正した。これらの実験条件下で、ラングミュア１：１曲線フィッティングを使用してアフィニティー／アビディティーを決定した。二価の結合では、見かけのＫＤ値につながる同じ１：１のフィッティングが使用された。コンストラクト４９Ｂ４／１１Ｃ７（２＋２）の場合、カニクイザル及びマウスＴＮＣへの結合は非常に弱かったため、「結合なし」と分類された。
表３５．ヒト、マウス及びカニクイザルＴｎＣのＯＸ４０及びＴｎＣを標的とする示された二重特異性抗体の結合のＫＤ値
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【０３３０】
４．３  ヒトＯｘ４０発現細胞への結合の分析：ナイーブ及び活性化ヒト末梢単核白血球（ＰＢＭＣ）
バフィーコートはチューリッヒ献血センターから入手した。新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離するために、バフィーコートを同量のＤＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＧｉｂｃｏ、カタログ番号１４１９０  ３２６）で希釈した。５０ｍＬポリプロピレン遠心管（ＴＰＰ、カタログ番号９１０５０）に、１５ｍＬのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ１０７７（シグマライフサイエンス社、カタログ番号１０７７１、ポリスクロース及びジアトリゾ酸ナトリウム、１．０７７ｇ／ｍＬの密度に調整）を供給し、バフィーコート溶液をＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ１０７７の上に重ねた。この管を、低加速度、中断なし、室温で、４００×ｇで３０分間、遠心分離にかけた。その後、ＰＢＭＣを相間から収集し、ＤＰＢＳで３回洗浄し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ，ライフテクノロジー製Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号１６０００−０４４，ロット９４１２７３，ガンマ線照射，マイコプラズマ不含，５６℃３５分で熱不活性化）、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｉ（ライフテクノロジー製ＧＩＢＣＯ，カタログ番号３５０５００３８）、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ−Ｐｙｒｕｖａｔ）（シグマ製，カタログ番号Ｓ８６３６）、１％（ｖ／ｖ）ＭＥＭ非必須アミノ酸（シグマ製，カタログ番号Ｍ７１４５）及び５０μＭ  β−メルカプトエタノール（シグマ製，Ｍ３１４８）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（ライフテクノロジー製Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号４２４０１−０４２）から成るＴ細胞培地に再懸濁させた。
ＰＢＭＣは、単離直後に（休止ヒトＰＢＭＣへの結合の分析用）、又はＴ細胞の細胞表面でのヒトＯＸ４０発現の高発現を得るために刺激後に（活性化ヒトＰＢＭＣへの結合の分析用）実験で使用した。刺激のために、ナイーブＰＢＭＣを６ウェル組織培養プレート内で、２００Ｕ／ｍＬプロロイキン（ノバルティス製）及び２μｇ／ｍＬ  ＰＨＡ−Ｌ（シグマアルドリッチ製，Ｌ２７６９−１０）を入れたＴ細胞培地中４日間培養し、その後１日、プレコート６ウェル組織培養プレートで［２μｇ／ｍＬ］抗ヒトＣＤ３（クローンＯＫＴ３，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製，カタログ番号１６−００３７−８５）及び［２μｇ／ｍＬ］抗ヒトＣＤ２８（クローン２８．２，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製，カタログ番号１６−０２８９−８５］を、２００Ｕ／ｍＬプロロイキンを入れたＴ細胞培地中、３７℃及び５％ＣＯ２で培養した。
ＯＸ４０の検出のために、ナイーブヒトＰＢＭＣと活性化ヒトＰＢＭＣを混合した。ナイーブと活性化ヒトＰＢＭＣの区別を可能にするため、ｅＦｌｕｏｒ６７０細胞増殖色素（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製，カタログ番号６５−０８４０−８５）を使用して、結合アッセイの前にナイーブ細胞を標識した。
標識のために細胞を回収し、予熱した（３７℃）ＤＰＢＳで洗浄し、ＤＰＢＳ中１ｘ１０７細胞／ｍＬのｄ細胞密度に調整した。２．５ｍＭの最終濃度及びＤＰＢＳ中０．５ｘ１０７個／ｍＬの最終細胞密度で、ｅＦｌｕｏｒ６７０細胞増殖色素（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製，カタログ番号６５−０８４０−８５）をナイーブヒトＰＢＭＣの懸濁液に添加した。その後、細胞を暗所で室温で１０分間インキュベートした。標識反応を停止させるために、４ｍＬの熱不活性化ＦＢＳを加え、細胞をＴ細胞培地で３回洗浄した。その後、１ｘ１０５の休止ｅＦｌｕｏｒ６７０標識ヒトＰＢＭＣと０．５ｘ１０５の非標識活性化ヒトＰＢＭＣとの２：１混合物を、丸底懸濁細胞９６ウェルプレート（グレイナーバイオワン製，ｃｅｌｌｓｔａｒ，カタログ番号６５０１８５）の各ウェルに添加した。
細胞を、示された抗原結合分子を異なる量含む５０μＬ／ウェル４℃のＦＡＣＳバッファー中、４℃で１２０分間、暗所で染色した。４℃のＦＡＣＳバッファーで３回洗浄した後、細胞を、蛍光標識抗ヒトＣＤ４（クローンＲＰＡ−Ｔ４，マウスＩｇＧ１  ｋ，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ製，カタログ番号３００５３２）、抗ヒトＣＤ８（クローンＲＰａ−Ｔ８，マウスＩｇＧ１ｋ，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ製，カタログ番号３０１０４４１）及びフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ｀）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ製，カタログ番号１０９−０９６−０９８）の混合物を含有する、２５μＬ／ウェル４℃のＦＡＣＳバッファー中、４℃で４５分間、暗所で染色した。
その後細胞を、０．２μｇ／ｍＬ  ＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃ製，カタログ番号Ｓｃ−３５９８）を含有する８５μＬ／ウェルＦＡＣＳバッファーに再懸濁させ、５本レーザー搭載ＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製、ＤＩＶＡソフトウェア付き）を使用して、同日に取得した。
図６Ａ〜６Ｄ及び図７Ａ〜７Ｄに示すように、ＯＸ４０に特異的な抗原結合分子は、細胞表面でＯＸ４０を発現しない休止ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞又はＣＤ８＋  Ｔ細胞に結合しなかった。対照的に、二重特異性抗ＯＸ４０、抗ＴｎＣ分子は全て、ＯＸ４０を発現する活性化ＣＤ８＋又はＣＤ４＋  Ｔ細胞への結合を示した。ＣＤ４＋  Ｔ細胞への結合は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞への結合よりもはるかに強かった。活性化ヒトＣＤ８＋  Ｔ細胞は、活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞による発現レベルよりもはるかに低いレベルでＯＸ４０を発現する。ＯＸ４０の発現レベルは刺激のカイネティクス及び強さに依存し、ここでは、条件はＣＤ４＋  Ｔ細胞でのＯＸ４０発現に最適化されたが、ＣＤ８＋  Ｔ細胞では最適化されなかった。したがって、少量のＯＸ４０発現のみがＣＤ８  ＋  Ｔ細胞で誘導された。
二重特異性抗ＯＸ４０、抗ＴｎＣ分子は、結合強度が異なることがわかった。図７Ａに見られるように、表３６に示すように、ＯＸ４０に４価の結合を持つ４＋２分子は、２価の２＋２分子よりも強く、より高いアビディティーで結合した。
また、これらの結果は、ＴｎＣ結合部分の存在が四価のＯＸ４０バインダーのＯＸ４０への結合に影響を与えなかったことも示唆した（例えば図６Ａ及び図７Ａ参照）。
【０３３１】
４．４  ヒトＴｎＣ発現及びＴｎＣ陰性腫瘍細胞への結合
細胞表面で発現したＴｎＣへの二重特異性抗ＯＸ４０、抗ＴｎＣ分子の結合は、ＴｎＣ発現Ｕ８７−ＭＧ細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１４）と、ヒトＴｎＣを安定して発現するようにトランスフェクトされたＣＴ２６細胞株（「ＣＴ２６ｈｕＴｎＣ」細胞という）とを用いて分析された。ＴｎＣ陰性細胞株ＷＭ−２６６−４（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６７６）を使用して、結合の特異性を分析した。
腫瘍細胞を区別できるようにするために、ＷＭ２６６−４細胞をＰＫＨ−２６  Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｅｌｌリンカーキット（シグマ製，カタログ番号ＰＫＨ２６ＧＬ）で事前に標識した。細胞を回収し、ＲＰＭＩ  １６４０培地で３回洗浄した。その後、これらの細胞を、（最終濃度１ｎＭ，希釈液Ｃ（ＰＫＨ−２６  Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｅｌｌリンカーキットに付属）中で）新しく調製したＰＫＨ２６−Ｒｅｄ染色溶液中で、最終密度０．５ｘ１０７細胞で、室温で５分間染色した。過剰のＦＢＳを添加して標識化反応を停止させ、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉを補充したＲＰＭＩ  １６４０培地で細胞を４回洗浄して、過剰な色素を除去した。
抗原結合分子の様々な細胞型への結合の検出のために、０．５−２ｘ１０５ＰｋＨ２６標識ＷＭ２６６−４及び／又は非標識Ｕ８７−ＭＧ細胞又はＣＴ２６ｈｕＴｎＣ細胞を、丸底懸濁細胞９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ製，ｃｅｌｌｓｔａｒ，カタログ番号６５０１８５）のウェルに添加した。その後細胞を、滴定された抗原結合分子を含有し、ＢＳＡ（０．１％ｖ／ｗ，シグマアルドリッチ，カタログ番号Ａ９４１８）を含む５０μＬ／ウェル４℃のＦＡＣＳバッファー（ＤＰＢＳ（ライフテクノロジー製Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号１４１９０  ３２６）中、４℃で６０〜１２０秒間、暗所で染色した。過剰なＦＡＣＳバッファーで３回洗浄した後、示されているように、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ｀）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ製，カタログ番号１０９−０９６−０９８）又はフィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ｀）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ製，カタログ番号１０９−１１６−０９８）を含有する、２５μＬ／ウェル４℃のＦＡＣＳバッファー中、４℃で３０〜６０分間、暗所で染色した。腫瘍細胞でのＴｎＣ及びＦＡＰ発現は、抗ＦＡＰ抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ製，ｍｏＩｇＧ１，ＯＰ１８８）又は抗ＴｎＣ抗体（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ製，ｍｏＩｇＧ１，Ｔ２５５０−２０Ｄ）を使用して決定され、二次抗体であるＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｄａｋｏ製，Ｃｏｄｅ  Ｋ００７８（Ｑｕｉｆｉｋｉｔ））を使用して検出された。
生細胞と死細胞の識別には、２つの方法が使用された。５本レーザー搭載ＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製，ＤＩＶＡ  スフトウェア付き）を流れる０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃ製，カタログ番号Ｓｃ−３５９８）を含有する８５μＬ／ウェルＦＡＣＳバッファー中で、非固定細胞を同日中に取得した。ただし場合によっては、死細胞は、結合アッセイの前に、Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６６０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ６５−０８６４−１８）で、又はＺｏｍｂｉｅ  ＡｑｕａＴＭ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｋｉｔ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ４２３１０２）で、製造業者の指示書に従って標識したことによって、その後のＭＡＣＳ  Ｑｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０での、又は５本レーザー搭載ＬＳＲ＿Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＤＩＶＡソフトウェア付き）での細胞のホルマリン固定及び一晩取得が可能になった。    簡潔にいうと、細胞をＤＰＢＳ（ライフテクノロジーズ製Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号１４１９０  ３２６）で１回洗浄し、Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６６０［１ｕｇ／ｍＬ］を含有するＤＰＢＳに１ｘ１０６細胞／ｍＬの細胞濃度で、暗所／４℃で３０分間インキュベートした。代替的には、細胞をＤＰＢＳで１回洗浄し、Ｚｏｍｂｉｅ  ＡｑｕａＴＭ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ［１：８００希釈］を含有するＤＰＢＳに１ｘ１０６細胞／ｍＬの細胞濃度で、暗所／４℃で１５分間インキュベートした。その後、細胞をＤＰＢＳで１回洗浄して過剰な色素を除去した後、一次抗原結合分子を細胞に加え、その細胞を上記のようにインキュベートした。その後、その細胞をホルマリン溶液（ＤＰＢＳ中１〜２．５％（ｖ／ｖ），シグマ  ＨＴ５０１３２０）に４℃で１５分間固定した後、測定した。
図８に示すように、ＴｎＣ発現は、Ｕ８７−ＭＧ細胞で（低レベルで）検出され、ＣＴ２６ｈｕＴｎＣ細胞では高レベルで検出されたが、ＷＭ−２６６−４細胞では検出されなかった。ＦＡＰ発現は、ＷＭ−２６６−４及びＵ８７−ＭＧ細胞で検出された。
図９に示すように、二重特異性、二価抗ＯＸ４０（クローン４９Ｂ４）、二価抗ＴｎＣ（クローン１１Ｃ７又はクローン１８Ｄ４）抗原結合分子は、ＷＭ−２６６−４細胞への結合を示さない（図９Ａ）。二価抗ＯＸ４０、二価抗ＴｎＣクローン１８Ｄ４抗原結合分子は、ＴｎＣへのＵ８７−ＭＧ細胞上での結合（図９Ｂ）と、ＣＴ２６ｈｕＴｎＣ細胞への強い結合（図９Ｃ；黒三角）を示した。
図１０に示すように、親の二価抗ＴｎＣ抗体クローン１８Ｄ４（図１０Ｂ；×印付き四角）は、ＴｎＣへのＵ８７−ＭＧ細胞上での強い結合と、ＣＴ２６ｈｕＴｎＣ細胞への強い結合（図１０Ｃ；×印付き四角）とを示した。二価抗ＯＸ４０、二価抗ＴｎＣクローン１８Ｄ４及び四価抗ＯＸ４０、二価抗ＴｎＣクローン１８Ｄ４分子は、親の二価抗ＴｎＣ抗体クローン１８Ｄ４（図１０Ｃ；黒三角及び黒丸対×印付き四角）よりも弱くＣＴ２６ｈｕＴｎＣ細胞に結合することが示されたが、これは、抗原結合分子のＣ末端での該分子の発現がＴｎＣへの結合を減少させることを示唆している。．電荷の導入による安定化により、Ｎ末端に発現した二価抗ＴｎＣによるＴｎＣへの結合をわずかに増加させることができた（図１０Ｃ；黒丸対黒三角）。二価抗ＯＸ４０、二価抗ＴｎＣクローン１８Ｄ４及び四価抗ＯＸ４０、二価抗ＴｎＣクローン１８Ｄ４分子は、四価抗ＯＸ４０、一価抗ＴｎＣクローン１８Ｄ４分子よりも強く、ＣＴ２６ｈｕＴｎＣ細胞に結合することが示された（図１０Ｃ；黒四角対黒三角及び黒丸）。抗ＴｎＣ抗原結合分子は、ＴｎＣ陰性ＷＭ−２２６−４細胞への結合を示さなかった（図１０Ａ）。
表３６は、示された抗原結合分子のＷＭ２６６−４、Ｕ８７−ＭＧ及びＣＴ２６ｈｕＴｎＣ細胞への結合に関するＥＣ５０値を示す。
表３６．様々な二重特異性ヒトＩｇＧ１  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ型のａＯｘ４０バインダー４９Ｂ９の、細胞表面ヒトＴｎＣ及びヒトＯｘ４０への結合に関するＥＣ５０値
2020515541.tif 000093
ｎ．ｃ．＝曲線フィッティングできず、ＥＣ５０  値算出不可能
【０３３２】
実施例５
ＯＸ４０及びＴｎＣを標的とする二重特異性抗原結合分子の生物活性
５．１  ヒトＯＸ４０及びレポーター遺伝子ＮＦ−κＢルシフェラーゼを発現するＨｅＬａ細胞
Ｏｘ４０のそのリガンドに対するアゴニスト結合は、核因子カッパＢ（ＮＦκＢ）の活性化を介して下流のシグナル伝達を誘導する（A. D. Weinberg et al., J. Leukoc. Biol. 2004, 75(6), 962-972）。表面にヒトＯＸ４０を発現する組換えレポーター細胞株ＨｅＬａ＿ｈＯＸ４０＿ＮＦκＢ＿Ｌｕｃ１が生成された。この細胞株は、ＮＦκＢ感受性エンハンサーセグメントの制御下でルシフェラーゼ遺伝子を含有するレポータープラスミドを保有している。ＯＸ４０の結合と活性化は、ＮＦκＢの用量依存的活性化を誘導し、その後ＮＦκＢは核に移行し、そこでレポータープラスミドのＮＦκＢ感受性エンハンサーに結合してルシフェラーゼタンパク質の発現を増加させる。ルシフェラーゼは、ルシフェリン酸化を触媒し、オキシルシフェリンを生成し、それが発光する。これは、ルミノメーターを使用して検出及び定量化可能である。したがって、ＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１レポーター細胞を使用して、抗ＯＸ４０分子が生物活性の尺度としてＮＦκＢ活性化を誘導する能力を分析することができる。
付着したＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１細胞を、細胞解離バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製，カタログ番号１３１５１−０１４）を使用して３７℃で１０分間収集した。細胞をＤＰＢＳで１回洗浄し、ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製，カタログ番号２２５６１−０２１）、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ＦＢＳ、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（ｖ／ｖ）、非必須アミノ酸で構成するアッセイ培地で細胞密度を１．３３×１０５に調整した。細胞を、蓋付きの滅菌白色９６ウェル平底組織培養プレート（ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ，カタログ番号６５５０８３）にウェルあたり０．２×１０５細胞の密度で播種し、インキュベーター（Ｈｅｒａ  Ｃｅｌｌ  １５０）内で５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で一晩インキュベートした。
翌日、ＯＸ４０を標的とする、滴定されたＰ３２９ＧＬＡＬＡ  ｈｕＩｇＧ１型の様々な二重特異性抗原結合分子を含有するアッセイ培地を添加することにより、ＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１細胞を５〜６時間刺激した。生物活性に対する超架橋の効果を分析するために、二次抗体抗ヒトＩｇＧＦｃγ断片特異的ヤギＩｇＧ  Ｆ（ａｂ｀）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１０９−００６−０９８）を含有する２５μＬ／ウェルの培地を１：２の比率（一次抗ＯＸ４０  Ｐ３２９ＧＬＡＬＡ  ｈｕＩｇＧ１抗原結合分子より２倍多い二次抗体）で加えた。細胞表面ＴｎＣ＋細胞によるコンストラクトの超架橋は、ＴｎＣ＋腫瘍細胞（Ｕ８７−ＭＧ又はＣＴ２６ｈｕＴｎＣ細胞）を含有する培地２５μＬ／ウェルを４対１の比率（ウェルあたりレポーター細胞の４倍多いＴｎＣ＋腫瘍細胞）で加えることによって試験された。
インキュベーション後、アッセイ上清を吸引し、プレートをＤＰＢＳで２回洗浄した。ルシフェラーゼ１００アッセイシステムとレポーター溶解バッファー（双方ともＰｒｏｍｅｇａ製、カタログ番号Ｅ４５５０及びＥ３９７１）を製造元の指示書に従って使用して、発光の定量化を実施した。簡潔にいうと、ウェルあたり３０μＬの１×溶解バッファーを加えることによって、−２０℃で１０分間細胞を溶解した。細胞を３７℃で２０分間解凍した後、ウェルごとに９０μＬのルシフェラーゼアッセイ試薬を添加した。全ての波長を収集するフィルターなしで  ５００ｍｓの積分時間を用いるＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５／Ｍ５ｅマイクロプレートリーダー（米国、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）又はＳｐａｒｋ（登録商標）１０Ｍマルチモードマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  ｔｒａｄｉｎｇ社）で発光を直ちに定量した。放射相対光単位（ＲＬＵ）は、ＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１細胞の基底発光によって補正され、Ｐｒｉｓｍ４又は６（米国、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して対数一次抗体濃度に対してプロットされた。組み込みのＳ字形用量反応を使用して、曲線をデータにフィッティングさせた。
図１１に示すように、二価の抗ＯＸ４０抗原結合２＋２分子は全て、限られたＮＦｋＢ活性化を誘発した（図１１Ａ）。抗ヒトＦｃ特異的二次抗体による架橋は、標的化部分とは無関係に生物活性を強力に増強した（図１１Ｂ）。ＴｎＣ発現腫瘍細胞は、ＴｎＣ標的分子を使用した場合、ＮＦｋＢを介したルシフェラーゼ活性の誘導を増加させた（図１１Ｃ及び１１Ｄ；黒四角及び黒三角）。
図１２及び図１３に示すように、抗ＯＸ４０抗原結合２分子は全て、限られたＮＦｋＢ活性化を誘発した（図１２Ａ及び図１３Ａ）。Ｕ８７−ＭＧ細胞による架橋は、ＴｎＣ標的抗原結合分子を使用した場合に生物活性を増強した（図１２Ｂ）。予想した通り、全てのＴｎＣ標的分子はＣＴ２６ｈｕＴｎＣ細胞株と架橋した場合に、Ｕ８７−ＭＧ細胞による架橋と比較してはるかに高いＮＦｋＢの誘導を引き起こした（図１２Ｂを図１３Ｂと比較せよ）。
それぞれのプロットされた用量反応曲線の曲線下面積は、各抗原結合分子のアゴニスト能力の指標として決定された。
図１２Ｃに示す通り、四価抗ＯＸ４０、二価抗ＴｎＣ（クローン１８Ｄ４）４＋２分子は、Ｕ８７−ＭＧ細胞（表面ＴｎＣの中間体レベルを発現する）による架橋の存在下で最もＮＦｋＢの活性化を誘導し、且つ、低レベルのアゴニズムのみが、同等の四価抗ＯＸ４０、一価抗ＴｎＣ（クローン１８Ｄ４）４＋１分子とのＵ８７−ＭＧ細胞による架橋によって検出された。この発見は、４＋２分子が４＋１分子よりもＵ８７−ＭＧ細胞に強く結合するという発見と一致している（図１０Ｃを参照）。
ただし、図１３Ｂ及び１３Ｃに示すように、ＣＴ２６ｈｕＴｎＣ細胞株を使用した場合、四価抗ＯＸ４０、二価抗ＴｎＣ（クローン１８Ｄ４）４＋２分子と４価抗ＯＸ４０、１価抗ＴｎＣ（クローン１８Ｄ４）４＋１分子は双方とも、非常に強く、且つ、同程度のＮＦｋＢ活性化を誘導した。また、図１３Ｂ及び１３Ｃから、二価抗ＯＸ４０、二価抗ＴｎＣ（クローン１８Ｄ４）２＋２分子は、四価抗ＯＸ４０、二価抗ＴｎＣ（クローン１８Ｄ４）４＋２及び四価抗ＯＸ４０、一価抗，ＴｎＣ（クローン１８Ｄ４）４＋１分子と比較して、より低いレベルのＮＦｋＢ活性化を誘導した。
この後者の発見は、ＯＸ４０の高い結合価と同様に、ＴｎＣによる超架橋がＯＸ４０抗原結合分子のアゴニスト機能にとって重要であることを示唆している。
【０３３３】
５．２  ＴＣＲのＯＸ４０を介する共刺激は、準最適に休止ヒトＰＢＭＣと細胞表面ＴｎＣによる超架橋とを引き起こした。
ＯＸ４０のライゲーションは、準最適なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激後のＴ細胞の分裂と生存を促進する相乗的共刺激シグナルを提供する（M. Croft et al., Immunol. Rev. 2009, 229(1), 173-191）。更に、いくつかのサイトカインの産生とＴ細胞活性化マーカーの表面発現は、ＯＸ４０のライゲーション後に増加している（I. Gramaglia et al., J. Immunol. 1998, 161(12), 6510-6517; S. M. Jensen et al., Seminars in Oncology 2010, 37(5), 524-532）。
二重特異性抗ＯＸ４０、抗ＴｎＣ抗原結合分子を、休止ＰＢＭＣ細胞の準最適なＴＣＲ刺激をレスキューする能力について分析した。ヒトＰＢＭＣ調製物には、（１）休止、ＯＸ４０陰性ＣＤ４＋  及びＣＤ８＋  Ｔ細胞、並びに（２）細胞表面に種々のＦｃ受容体分子を有する抗原提示細胞（例えばＢ細胞及び単球）が含まれている。ヒトＩｇＧ１アイソタイプの抗ヒトＣＤ３抗体は、そのＦｃを介してＦｃ−γ受容体分子に結合し、休止ＯＸ４０陰性ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞で長期ＴＣＲ活性化を引き起こす。これらの細胞は、数時間以内にＯＸ４０を発現し始める。ＯＸ４０に対する機能的アゴニスト化合物は、活性化ＣＤ８＋及びＣＤ４＋  Ｔ細胞に存在するＯＸ４０受容体を介してシグナルを伝達し、ＴＣＲを介する刺激をサポートする。
休止ｅＦｌｕｏｒ６７０−又はＣＦＳＥ標識（Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  ＣＦＳＥ増殖キット，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ製，Ｃ３４５５４）ヒトＰＢＭＣは、照射されたＵ８７−ＭＧ又はＣＴ２６ｈｕＴｎＣ細胞及び滴定された抗ＯＸ４０抗原結合分子の存在下で、準最適な濃度の抗ＣＤ３抗体を用いて、４日間刺激された。Ｔ細胞の生存、増殖、分化への影響は、フローサイトメトリーにより生細胞の総細胞数とｅＦｌｕｏｒ６７０／ＣＦＳＥ希釈をモニターすることにより分析した。更に、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ２５及び成熟マーカーＣＤ１２７に対する蛍光標識抗体で細胞を共染色した。
Ｕ８７−ＭＧ又はＣＴ２６ｈｕＴｎＣ細胞を、細胞解離バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製，カタログ番号１３１５１−０１４）を使用して３７℃で１０分間収集した。細胞を、ＤＰＢＳで１回洗浄した。Ｕ８７−ＭＧ又はＣＴ２６ｈｕＴｎＣ細胞を、インキュベーター（Ｈｅｒａ  Ｃｅｌｌ  １５０）内３７℃及び５％ＣＯ２で、滅菌９６ウェル丸底接着組織培養プレート（ＴＰＰ、カタログ番号９２０９７）に入れたＴ細胞培地中１ウェルあたり０．２ｘ１０５細胞の密度で一晩培養した。翌日、４５００ＲＡＤの線量を使用してｘ線照射器で照射し、腫瘍細胞株によるヒトＰＢＭＣの過剰増殖を防いだ。
フィコール密度遠心分離によりヒトＰＢＭＣを単離し、実施例４．３に記載のようにｅＦｌｕｏｒ６７０で標識した。代替的に、ＰＢＭＣをＣＦＳＥで標識し、標識のために細胞を回収し、予熱した（３７℃）ＤＰＢＳで洗浄し、ＤＰＢＳ中１×１０７細胞／ｍＬの細胞密度に調整した。ＣＦＳＥ（Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  ＣＦＳＥ増殖キット、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ、カタログ番号Ｃ３４５５４）をナイーブヒトＰＢＭＣの懸濁液に、最終濃度０．２μＭ、ＤＰＢＳ中の最終細胞密度０．５×１０７細胞／ｍＬで加えました。その後、細胞を暗所で３７℃で１０分間インキュベートした。標識反応を停止させるために、４ｍＬの熱不活性化ＦＢＳを加え、細胞をＴ細胞培地で３回洗浄した。細胞を各ウェルに０．６×１０５細胞／ウェルの密度で加えた。１０ｎＭの最終濃度の抗ヒトＣＤ３抗体（クローンＶ９、ヒトＩｇＧ１）、及び示された抗ＯＸ４０抗原結合分子を示された濃度で加えた。細胞を、インキュベーター（Ｈｅｒａ  Ｃｅｌｌ  １５０）内で３７℃、５％ＣＯ２で４日間活性化させた。続いて、細胞を蛍光色素コンジュゲート抗体抗ヒトＣＤ４（クローンＲＰＡ−Ｔ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００５３２）、ＣＤ８（クローンＲＰａ−Ｔ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０１０４４１）、抗ＣＤ２５（クローンＭ−Ａ２５１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３５６１１２）及び抗ＣＤ１２７（クローンＡ０１９Ｄ５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号３５１３２４）を用い、４℃で２０分間表面染色した。細胞ペレットをＦＡＣＳバッファーで１回洗浄した。最後に細胞を、０．２μｇ／ｍＬ  ＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃ製，カタログ番号Ｓｃ−３５９８）を含有する８５μＬ／ウェルＦＡＣＳバッファーに再懸濁させ、５本レーザー搭載ＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製、ＤＩＶＡソフトウェア付き）を使用して、同日に取得した。
場合によって、細胞をＤＰＢＳで１回洗浄し、Ｚｏｍｂｉｅ  ＡｑｕａＴＭ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ［１：８００希釈］を含有するＤＰＢＳに１×１０６細胞／ｍＬの細胞濃度で、暗所／４℃で１５分間インキュベートした。細胞をＤＰＢＳで１回洗浄して過剰を除去し、上記のように蛍光色素コンジュゲート抗体による表面染色を行った。測定前に、細胞をホルマリン液（ＤＰＢＳ中１％（ｖ／ｖ）、シグマ製ＨＴ５０１３２０）に４℃で３０分間固定した。プレートを最終的に１００μＬ／ウェルＦＡＣＳバッファーに再懸濁させ、５本レーザー搭載ＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＤＩＶＡソフトウェア付きのＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）を使用して同日に取得した。
【０３３４】
これらの実験の結果を図１４から図１６に示す。
Ｕ８７−ＭＧ細胞の存在下での培養によるＴｎＣ標的４＋２（黒丸）抗ＯＸ４０抗原結合分子の超架橋は、ヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞において増殖と成熟を強く促進し（図１４）、活性化（ＣＤ２５＋）表現型を増強した（図１５）。ＣＴ２６ｈｕＴｎＣ細胞の存在下での培養によるＴｎＣ標的４＋２（黒丸）抗ＯＸ４０抗原結合分子の超架橋は、ヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞において増殖と成熟を強く促進した（図１６）。四価抗ＯＸ４０、二価抗ＴｎＣ  ４＋２分子（黒丸）は、二価抗ＯＸ４０、二価抗ＴｎＣ  ２＋２分子（黒三角）及び四価抗ＯＸ４０、一価抗ＴｎＣ  ４＋１分子（黒四角）と比較して、準最適なＴＣＲ刺激をレスキューする能力において明らかに優れていた。
四価抗ＯＸ４０、一価抗ＴｎＣ  ４＋１分子（黒四角）は、二価抗ＯＸ４０、二価抗ＴｎＣ  ２＋２分子（黒三角）と比較して、準最適なＴＣＲ刺激をレスキューする能力が低下していることが示された。これは、二価分子と比較して、ＴｎＣに対する単量体Ｎ末端融合抗ＴｎＣ（１８Ｄ４）分子のアフィニティーの低下によって説明できる。ただし、細胞表面ＴｎＣによるわずかな架橋は、立体障害のためＮ末端融合抗ＴｎＣ（１８Ｄ４）バインダーから予想できる。
これらの結果は、Ｔ細胞における最適なＯＸ４０アゴニズムには、（例えばＯＸ４０の四価による）ＯＸ４０受容体の十分なオリゴマー化が必要であるだけでなく、ＯＸ４０受容体オリゴマーの細胞表面の固定化も必要であることを示唆している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ−Ｅ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ−１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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