(57)【要約】  本発明はＧＡＲＰとＴＧＦ−β１との複合体、特にヒトＧＡＲＰとヒトＴＧＦ−β１との複合体に結合する抗体及びその抗原結合断片に関する。これらの抗体及び抗原結合断片は、高親和性の抗原結合及び制御Ｔ細胞からの活性ＴＧＦ−βの放出を阻害する能力を含む有利な特性の組合せを呈する。本発明の抗体及び抗原結合断片は脱アミド化、異性化及び酸化に比較的抵抗性があり、したがって改善された安定性を示す。
2020519308.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＧＡＲＰとＴＧＦ−β１との複合体に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含み、
ＶＨ  ＣＤＲ３がアミノ酸配列ＹＥＷＥＴＶＶＶＧＤＬＭＹＥＹＥＹ（配列番号１３）を含み、
ＶＨ  ＣＤＲ２がアミノ酸配列ＲＩＤＰＥＤＡＧＴＫＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号１２）を含み、及び
ＶＨ  ＣＤＲ１がアミノ酸配列ＳＹＹＩＤ（配列番号４）を含む、
抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、
ＶＬ  ＣＤＲ３がアミノ酸配列ＱＱＹＡＳＶＰＶＴ（配列番号１１）を含み
ＶＬ  ＣＤＲ２がアミノ酸配列ＧＡＳＲＬＫＴ（配列番号１０）を含み、及び
ＶＬ  ＣＤＲ１がアミノ酸配列ＱＡＳＱＳＩＳＳＹＬＡ（配列番号９）を含む、
請求項１に記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項３】
重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が、高いヒト相同性を呈する、請求項１に記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項４】
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、高いヒト相同性を呈する、請求項２又は３に記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項５】
重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が、ラクダ科由来のＶＨドメインのヒト化、生殖細胞系列化又は親和性バリアントである、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項６】
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、ラクダ科由来のＶＬドメインのヒト化、生殖細胞系列化又は親和性バリアントである、請求項２〜５のいずれかに記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項７】
重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が、配列番号１４のアミノ酸配列又は配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項８】
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、配列番号１５のアミノ酸配列又は配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２〜７のいずれかに記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項９】
重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が配列番号１４のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が配列番号１５のアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項１０】
ヒトＩｇＧのＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインを含む、請求項１〜９のいずれかに記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項１１】
ヒトＩｇＧがＩｇＧ１である、請求項１０に記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項１２】
ヒトＩｇＧがＩｇＧ４である、請求項１１に記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項１３】
ヒトＩｇＧ４がＣＨ３ドメインに置換Ｓ２２８Ｐを有する、請求項１２に記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項１４】
配列番号１６のアミノ酸配列又は配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの重鎖を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項１５】
配列番号１７のアミノ酸配列又は配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの軽鎖を含む、請求項１４に記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項１６】
カニクイザル由来のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β複合体と交差反応する、請求項１〜１５のいずれかに記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項１７】
高い親和性でヒトＧＡＲＰとＴＧＦ−β１との複合体に結合する、請求項１〜１６のいずれかに記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項１８】
ＶＨドメイン及びＶＬドメインが、Ｆａｂとして試験したとき、ＧＡＲＰとＴＧＦ−β１との複合体について５×１０−４ｓ−１未満のオフレート（ｋｏｆｆ）を呈する、請求項１〜１６のいずれかに記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項１９】
ＶＨドメイン及びＶＬドメインが、Ｆａｂとして試験したとき、ＧＡＲＰとＴＧＦ−β１との複合体について１×１０−６ｓ−１〜５×１０−４ｓ−１の範囲のオフレート（Ｋｏｆｆ）を呈する、請求項１〜１６のいずれかに記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項２０】
ＶＨドメイン及びＶＬドメインが、ｍＡｂとして試験したとき、１．７×１０−９未満のＫＤを呈する、請求項１〜１６のいずれかに記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項２１】
制御Ｔ細胞からの活性ＴＧＦ−βの放出をブロックする、請求項１〜２０のいずれかに記載の抗体又は抗原結合断片。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれかに記載の抗体又は抗原結合断片の重鎖可変ドメインをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２３】
配列番号１８の配列を含む、請求項２２の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項１〜２１のいずれかに記載の抗体又は抗原結合断片の軽鎖可変ドメインをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２５】
配列番号１９の配列を含む、請求項２４の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２６】
請求項１〜２１のいずれかに記載の抗体又は抗原結合断片をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２７】
宿主細胞又は無細胞発現システムにおける抗体、抗原結合断片、重鎖可変ドメイン、又は軽鎖可変ドメインの発現を可能にする制御配列に操作可能に連結された、請求項２２〜２６のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２８】
請求項２７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞又は無細胞発現システム。
【請求項２９】
抗体又は抗原結合断片の発現を可能にする条件下で請求項２８に記載の宿主細胞又は無細胞発現システムを培養するステップ及び発現した抗体又は抗原結合断片を回収するステップを含む、組み換え抗体又はその抗原結合断片を産生する方法。
【請求項３０】
請求項１〜２１のいずれかに記載の抗体又は抗原結合断片及び少なくとも１つの薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項３１】
治療有効量の請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片又は請求項３０に記載の医薬組成物を、ＴＧＦ−β関連障害の治療を必要とする対象に投与することを含む、それを必要とする対象におけるＴＧＦ−β関連障害を処置する方法。
【請求項３２】
対象がヒトである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ＴＧＦ−β関連障害が、炎症性疾患、慢性感染症、がん、線維症、心血管系疾患、脳血管系疾患及び神経変性疾患からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ＴＧＦ−β関連障害ががんである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
抗体又はその抗原結合断片が別の治療と組み合わせて投与される、請求項３１〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
抗体又は抗原結合断片が免疫治療剤、任意選択的に免疫刺激性抗体又は腫瘍ワクチンと組み合わせて投与される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
医薬としての使用のための、請求項１〜２１のいずれかに記載の抗体若しくはその抗原結合断片又は請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
請求項１〜２１のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願はその内容全てが参照により本明細書に組み込まれる２０１７年５月１１日出願の英国出願番号１７０７５６１．５の優先権の利益を主張する。
【０００２】
配列表
本出願はＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出した、参照により全体として本明細書に組み込まれる配列表を含む。
【０００３】
本発明はＧＡＲＰとＴＧＦ−β１との複合体、特にヒトＧＡＲＰとヒトＴＧＦ−β１との複合体に結合する抗体及びその抗原結合断片に関する。これらの抗体及び抗原結合断片は、高親和性の抗原結合及び制御Ｔ細胞からの活性ＴＧＦ−βの放出を阻害する能力を含む有利な特性の組合せを呈する。本発明の抗体及び抗原結合断片は、ＧＡＲＰとＴＧＦ−β１との複合体に結合する従来技術の抗体と比較して改善されている。特に、本発明の抗体及び抗原結合断片は脱アミド化、異性化及び酸化に比較的抵抗性があり、したがって従来技術に記載されたＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体と比較して改善された安定性を示す。
【背景技術】
【０００４】
制御Ｔ細胞（別の面では「Ｔｒｅｇ」又はＦｏｘｐ３＋Ｔ制御細胞として知られている）は、免疫系の重要な成分である。特に、Ｔｒｅｇは種々の態様の免疫応答を抑制することによって、免疫恒常性に重要な役割を果たしている。免疫応答を調整するそれらの役割の結果として、Ｔｒｅｇの活性の制御が障害を受けると、種々の疾患及び病態の発生が起こることがある。特にＴｒｅｇ機能が不十分であると自己免疫病理が生じる一方、過剰のＴｒｅｇ活性はがん患者における抗腫瘍応答の阻害に関連付けられてきた。
【０００５】
タンパク質ＧＡＲＰ（反復優位型グリコプロテインＡ）は、Ｔｒｅｇ、特に活性化されたＴｒｅｇの表面上に高度に発現されるマーカーとして同定されてきた。ＧＡＲＰは８０ｋＤａの膜貫通タンパク質であり、２０個の多ロイシンリピートを含む細胞外領域を有する。これはＬＲＲＣ３２としても知られている。ＧＡＲＰはＴＧＦ−β、特にＴＧＦ−βの潜在型の受容体として働き、Ｔｒｅｇ細胞上の潜在型ＴＧＦ−βの発現に必要である（ＥＭ  Ｓｈｅｖａｃｈ、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｔｈｅｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ（２０１６）２１（２）、１９１〜２００頁）。
【０００６】
ＴＧＦ−βは、細胞の増殖及び分化、組織の形態形成、炎症及びアポトーシスを含む多様なプロセスにおいて役割を演じることが知られているサイトカインである。これはがんの発生に関連する重要な増殖因子としても同定されており、むしろ珍しく腫瘍促進及び腫瘍抑制特性を有するサイトカインとして同定されている。
【０００７】
ＴＧＦ−βの産生及び活性化は多ステップのプロセスであり、これは種々のレベルで制御されている。ＴＧＦ−βはプロＴＧＦ−βダイマー前駆体として合成され、それぞれのポリペプチド鎖は潜在性関連ペプチド（ＬＡＰ）及び成熟ＴＧＦ−β領域からなっている。プロＴＧＦ−βは酵素フリンによって開裂を受けて、ＬＡＰがそれぞれのポリペプチド鎖の成熟ＴＧＦ−β領域に非共有結合的に会合して残っている不活性形である「潜在型ＴＧＦ−β」を形成する（図１参照）。膜に局在化したＧＡＲＰは潜在型ＴＧＦ−βを輸送してＴｒｅｇの細胞表面に固定化する働きをし、ＴＧＦ−βの活性型を放出するのはこの膜結合ＧＡＲＰ−潜在型ＴＧＦ−β複合体からである。活性ＴＧＦ−βがどのようにＴｒｅｇの表面上のＧＡＲＰ−潜在型ＴＧＦ−β複合体から放出されるかを説明するために、種々の機構が提案されてきた。しかし、インテグリン、特にαｖβ６及びαｖβ８が、成熟ＴＧＦ−βダイマーの放出に必要な剪断力の促進において重要な役割を演じていると現在では考えられている。
【０００８】
いったん放出されると、活性ＴＧＦ−βダイマーは、下流のシグナル伝達経路のオートクリン又はパラクリンメディエーターとして作用することができる。免疫系に関しては、Ｔｒｅｇ細胞からのＴＧＦ−βの放出は種々のＴエフェクター細胞及びまたＴｒｅｇそれ自体の活性にも影響すると考えられる（図１参照）。Ｔｒｅｇは抑制免疫において重要な役割を演じているので、Ｔｒｅｇから放出されてオートクリン様式で作用するＴＧＦ−βは介在するＴｒｅｇの抑制に関与していると考えられる。特に、Ｔｒｅｇ由来のＴＧＦ−β１は腫瘍免疫におけるＴｒｅｇ介在抑制において重要な役割を演じていると考えられる。
【０００９】
腫瘍の微小環境での免疫応答の抑制におけるＴｒｅｇ由来のＴＧＦ−βの役割を考慮して、がんの免疫療法への代替のアプローチとしてこの経路を標的とすることに、興味が持たれてきた。たとえば、この経路を弱めることができる治療薬は、身体の免疫系の力を利用してがんを処置するために設計されたがんワクチン又はその他のがんの免疫治療戦略の効率を改善する有用なツールとして働き得る。
【００１０】
Ｃｕｅｎｄｅら（Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１５年４月２２日；７（２８４）：２８４ｒａ５６頁）は、Ｔｒｅｇ上のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β複合体に結合してＴＧＦ−βの産生を阻害する２つのモノクローナル抗体（ＭＨＧ−８及びＬＨＧ１０）の産生及び特性解析について記載している。これら２つの抗体は国際特許出願ＷＯ２０１５／０１５００３及びＷＯ２０１６／１２５０１７にも記載され特徴付けられている。これらの抗体は、異種グラフト対宿主疾患のマウスモデルにおいてヒトＴｒｅｇの免疫抑制活性を阻害することができることが示された。この研究は、Ｔｒｅｇの機能を調節し、続いてＴｒｅｇ活性のレベルが重要な役割を演じるがん及び自己免疫疾患のような疾患を処置するための目的の治療標的としてＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β複合体を検証するために役立っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２０１５／０１５００３号
【特許文献２】国際公開第２０１６／１２５０１７号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】ＥＭ  Ｓｈｅｖａｃｈ、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｔｈｅｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ（２０１６）２１（２）、１９１〜２００頁
【非特許文献２】Ｃｕｅｎｄｅら（Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１５年４月２２日；７（２８４）：２８４ｒａ５６頁）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかし、ＴＧＦ−βの放出を阻害し、それによりＴｒｅｇ活性を改変することができる改善されたＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β抗体へのニーズが残っている。本発明は本明細書に記載するようにこの課題に対処する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要旨）
本発明は、ヒトＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１複合体に結合する新規な抗体及びその抗原結合断片を提供することによって、最新技術を改善する。本発明の抗体及び抗原結合断片は、国際特許出願ＷＯ２０１５／０１５００３及びＷＯ２０１６／１２５０１７に記載されたＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体「ＬＨＧ−１０」に由来する。ＬＨＧ−１０の重鎖及び軽鎖可変ドメイン配列はそれぞれ配列番号１及び２で示され、鎖がシャッフルしたバリアントであるＬＨＧ−１０．６（これもＷＯ２０１５／０１５００３及びＷＯ２０１６／１２５０１７に記載されている）の軽鎖可変ドメインは配列番号３で示される。本発明の抗体は、特にＬＨＧ−１０及びＬＨＧ−１０．６と比較して、特定のＣＤＲ配列に関して、具体的には重鎖可変ドメインのＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列に関して、異なっている。ＬＨＧ−１０及びＬＨＧ−１０．６  ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β抗体は重鎖ＣＤＲ２配列：ＲＩＤＰＥＤＧＧＴＫＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号５）及び重鎖ＣＤＲ３配列：ＮＥＷＥＴＶＶＶＧＤＬＭＹＥＹＥＹ（配列番号６）を有する一方、本発明の抗体は重鎖ＣＤＲ２配列：ＲＩＤＰＥＤＡＧＴＫＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号１２）及び重鎖ＣＤＲ３配列：ＹＥＷＥＴＶＶＶＧＤＬＭＹＥＹＥＹ（配列番号１３）を含む。
【００１５】
本明細書に報告する重鎖ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の相違により、その改善された安定性によって、先行技術の抗体と比較して改善された抗体がもたらされる。より具体的には、本発明の抗体は、脱アミド化、異性化及び酸化に比較的抵抗性があり、それにより向上した安定性を呈する。驚くべきことに、安定性の改善をもたらす重鎖ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域におけるこれらの特定の置換は、ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１複合体に対する抗体の結合親和性を有意に低下させない。高い親和性の標的結合と組み合わされた改善された安定性により、本発明の抗体は治療薬として、たとえばがんの治療薬としての臨床開発に特に適している。
【００１６】
第１の態様では、本発明はヒトＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１の複合体に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供し、抗体又はその抗原結合断片は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含み、
ＶＨ  ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＹＥＷＥＴＶＶＶＧＤＬＭＹＥＹＥＹ（配列番号１３）を含み、
ＶＨ  ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＲＩＤＰＥＤＡＧＴＫＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号１２）を含み、
ＶＨ  ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＳＹＹＩＤ（配列番号４）を含む。
【００１７】
ある実施形態では、本発明はヒトＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１の複合体に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供し、抗体又はその抗原結合断片は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含み、
ＶＨ  ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＹＥＷＥＴＶＶＶＧＤＬＭＹＥＹＥＹ（配列番号１３）からなり、
ＶＨ  ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＲＩＤＰＥＤＡＧＴＫＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号１２）からなり、
ＶＨ  ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＳＹＹＩＤ（配列番号４）からなる。
【００１８】
抗体又は抗原結合断片は軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をさらに含んでよく、
ＶＬ  ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＱＱＹＡＳＶＰＶＴ（配列番号１１）を含み
ＶＬ  ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＧＡＳＲＬＫＴ（配列番号１０）を含み、
ＶＬ  ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＱＡＳＱＳＩＳＳＹＬＡ（配列番号９）を含む。
【００１９】
ある実施形態では抗体又は抗原結合断片は軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をさらに含んでよく、
ＶＬ  ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＱＱＹＡＳＶＰＶＴ（配列番号１１）からなり、
ＶＬ  ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＧＡＳＲＬＫＴ（配列番号１０）からなり、
ＶＬ  ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＱＡＳＱＳＩＳＳＹＬＡ（配列番号９）からなる。
【００２０】
ある実施形態では抗体又はその抗原結合断片は、
ＶＨ  ＣＤＲ３がアミノ酸配列ＹＥＷＥＴＶＶＶＧＤＬＭＹＥＹＥＹ（配列番号１３）を含み、
ＶＨ  ＣＤＲ２がアミノ酸配列ＲＩＤＰＥＤＡＧＴＫＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号１２）を含み、
ＶＨ  ＣＤＲ１がアミノ酸配列ＳＹＹＩＤ（配列番号４）を含む、
重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び
ＶＬ  ＣＤＲ３がアミノ酸配列ＱＱＹＡＳＶＰＶＴ（配列番号１１）を含み、
ＶＬ  ＣＤＲ２がアミノ酸配列ＧＡＳＲＬＫＴ（配列番号１０）を含み、
ＶＬ  ＣＤＲ１がアミノ酸配列ＱＡＳＱＳＩＳＳＹＬＡ（配列番号９）を含む、
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
【００２１】
ある実施形態では抗体又はその抗原結合断片は、
ＶＨ  ＣＤＲ３がアミノ酸配列ＹＥＷＥＴＶＶＶＧＤＬＭＹＥＹＥＹ（配列番号１３）からなり、
ＶＨ  ＣＤＲ２がアミノ酸配列ＲＩＤＰＥＤＡＧＴＫＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号１２）からなり、
ＶＨ  ＣＤＲ１がアミノ酸配列ＳＹＹＩＤ（配列番号４）からなる、
重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び
ＶＬ  ＣＤＲ３がアミノ酸配列ＱＱＹＡＳＶＰＶＴ（配列番号１１）からなり、
ＶＬ  ＣＤＲ２がアミノ酸配列ＧＡＳＲＬＫＴ（配列番号１０）からなり、
ＶＬ  ＣＤＲ１がアミノ酸配列ＱＡＳＱＳＩＳＳＹＬＡ（配列番号９）からなる、
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
【００２２】
ある実施形態では抗体又は抗原結合断片は、ラクダ科由来のＶＨ又はＶＬドメインのヒト化、生殖細胞系列化、又は親和性バリアントである、少なくとも１つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び／又は少なくとも１つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
【００２３】
ある実施形態では、ヒトＧＡＲＰとヒトＴＧＦ−β１の複合体に結合する抗体又はその抗原結合断片が本明細書で提供され、抗体又は抗原結合断片は、以下の
（ｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ、又は
（ｉｉ）配列番号１４と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＨ
から選択される重鎖可変ドメインを含む。
【００２４】
あるいは又はさらに、抗体又は抗原結合断片は以下の
（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ、又は
（ｉｉ）配列番号１５と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるＶＬ
から選択される軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含んでよい。
【００２５】
抗体又は抗原結合断片のドメインが参照配列への特定の配列同一性百分率によって定義される実施形態については、ＶＨ及び／又はＶＬドメインは、参照配列に存在する配列と同一のＣＤＲ配列を保持し、したがって変化はフレームワーク領域の中にのみ存在する。
【００２６】
特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片が本明細書で提供され、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）は配列１４のアミノ酸配列を含み又はからなり、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は配列１５のアミノ酸配列を含み又はからなる。
【００２７】
ある実施形態では、本発明の抗体はヒト抗体、特にヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。ある実施形態では、抗体はヒトＩｇＧ４のＣＨ３領域を含み、ＣＨ３ドメインに置換Ｓ２２８Ｐを含む。
【００２８】
ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１複合体に結合する抗体は、少なくとも１つの全長免疫グロブリン重鎖及び／又は少なくとも１つの全長ラムダ又はカッパ軽鎖を含んでよい。ある実施形態では、抗体は配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。ある実施形態では、配列番号１６として示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する重鎖を含むモノクローナル抗体が本明細書で提供される。ある実施形態では、配列番号１７として示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する軽鎖を含むモノクローナル抗体が本明細書で提供される。ある実施形態では、配列番号１６として示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する重鎖及び配列番号１７として示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する軽鎖を含むモノクローナル抗体が本明細書で提供される。
【００２９】
抗体の重鎖及び／又は軽鎖が参照配列への特定の配列同一性百分率によって定義される実施形態については、重鎖及び／又は軽鎖は、参照配列に存在する配列と同一のＣＤＲ配列を保持し、それにより変化はＣＤＲ領域の外にのみ存在する。
【００３０】
本出願で他に述べない限り、２つのアミノ酸配列の間の配列同一性百分率は、最適な様式で整列し、その中で比較すべきアミノ酸配列がこれらの２つの配列の間の最適な整列についての参照配列に関して付加又は欠失を含み得るこれら２つの配列を比較することによって、決定することができる。同一性の百分率は、アミノ酸残基が２つの配列の間で同一である同一位置の数を決定し、この同一位置の数を比較ウィンドウの中の位置の全数で割り、これら２つの配列の間の同一性の百分率を得るために得られた結果を１００倍することによって計算される。たとえば、ＢＬＡＳＴプログラム、即ち「ＢＬＡＳＴ２配列」（Ｔａｔｕｓｏｖａら、「Ｂｌａｓｔ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  −  ａ  ｎｅｗ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．、１７４：２４７〜２５０頁）を用いることができ、用いるパラメーターはデフォルトによって与えられるものであり（特にパラメーター「オープンギャップペナルティ」：５、「エクステンションギャップペナルティ」：２であり、選択するマトリックスはたとえばプログラムによって提案される「ＢＬＯＳＵＭ６２」である）、比較すべき２つの配列の間の同一性の百分率はプログラムによって直接計算される。
【００３１】
本明細書で提供されるＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ以下の特性／特徴の１つ以上を呈し得る。
・抗体又は抗原結合断片は、カニクイザル由来のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β複合体と交差反応し得る。
・抗体又は抗原結合断片は、高い親和性でヒトＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１と結合し得る。
・抗体又は抗原結合断片は、Ｆａｂ断片として試験したときにヒトＧＡＲＰとＴＧＦ−β１の複合体について５×１０−４ｓ−１未満のオフレート（Ｋｏｆｆ）を呈するＶＨドメイン及びＶＬドメインを含み得る。
・抗体又は抗原結合断片は、Ｆａｂ断片として試験したときにヒトＧＡＲＰとＴＧＦ−β１の複合体について１×１０−６ｓ−１〜５×１０−４ｓ−１の範囲のオフレート（Ｋｏｆｆ）を呈するＶＨドメイン及びＶＬドメインを含み得る。
・抗体又は抗原結合断片は、ｍＡｂとして試験したときに１．７×１０−９Ｍ未満のＫＤを呈するＶＨドメイン及びＶＬドメインを含み得る。
・抗体又は抗原結合断片は、制御Ｔ細胞からの活性ＴＧＦ−β１の放出をブロックし又は阻害し得る。
【００３２】
さらなる態様では、本発明は、ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、ベクターを含む宿主細胞及び本明細書に記載した抗体の組み換え発現／産生の方法に加えて、上記の抗体及び抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド分子をも提供する。
【００３３】
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載したＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つ及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００３４】
本発明のさらなる態様は、上記のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体又はその抗原結合断片を用いる、特にＴＧＦ−β関連障害の予防及び／又は処置における医学的処置の方法に関する。ある実施形態では、本発明はＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体又はその抗原結合断片を用いる処置の方法に関し、処置すべき疾患又は病態は、炎症性疾患、慢性感染症、がん、線維症、心血管系疾患、脳血管系疾患及び神経変性疾患からなる群から選択される。ある実施形態では、ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体又はその抗原結合断片は、併用療法の一部として別の処置と組み合わせて投与される。たとえば、ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体又はその抗原結合断片は、免疫療法剤、任意選択的に免疫刺激抗体又は腫瘍ワクチンと組み合わせて投与してよい。
【００３５】
これらの及びその他の本発明の実施形態は、以下の記述及び付随する図面と併用して考慮すればより良く認識され理解される。しかし、以下の記述は、本発明の種々の実施形態及びその多くの具体的な詳細を示しているが、説明のために提供するものであって限定するものではないと理解されたい。本発明の精神から逸脱することなく本発明の範囲内で多くの置換、改変、付加及び／又は再配置をすることができ、本発明はそのような置換、改変、付加及び／又は再配置の全てを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】制御Ｔ細胞の表面上における潜在型ＴＧＦ−βのＧＡＲＰへの結合を示す略図である。ＴＧＦ−βは前駆体「プロＴＧＦ−β」として産生され、開裂を受けて「潜在型ＴＧＦ−β」、即ちその中で成熟ＴＧＦ−βダイマーがそれぞれのポリペプチドの潜在性関連ペプチド（ＬＡＰ）領域と非共有結合的に会合したままである形態を産生する。Ｔｒｅｇ細胞の表面上でＧＡＲＰに結合するのは、この潜在型である。インテグリンαｖβ６及びαｖβ８は、細胞表面からの成熟又は「活性ＴＧＦ−β」の放出の媒介に関与していると考えられる。この活性形はパラクリン様式で多様な標的細胞に効果をもたらすために作用することができ、又はＴｒｅｇ細胞上のＴＧＦ−β受容体に結合することによってオートクリンメディエーターとして作用することができる。
【図２】ＰＢＳ又はＰＢＳＴｗｅｅｎ（ＰＢＳＴｗ）中、−２０℃、５℃及び３７℃で保存した試料について５６日の期間にわたって抗体３９Ｂ６ＩｇＧ１Ｎ２９７Ｑ及び３９Ｂ６ＩｇＧ４Ｓ２２８ＰについてのＢｉａｃｏｒｅ（商標）又は表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した標的結合活性を示す図である。それぞれの時点において参照試料（−２０℃）を結合活性１００％と設定した。
【図３−１】ＴＧＦ−β受容体活性化の下流にあるＳＭＡＤ２リン酸化をモニターするために設計したアッセイにおける３９Ｂ６−Ａ抗体バリアントを試験した結果を示す図である。ＳＭＡＤ２リン酸化はＴＧＦ−βのその受容体への結合に続くＴＧＦ−βシグナル伝達経路の活性化のマーカーとして働く。ＳＭＡＤ２リン酸化が低減すれば、ＴＧＦ−β活性が阻害されている。図３Ａ：種々の濃度のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β抗体、３９Ｂ６−Ａ、３９Ｂ６−ＡＶＥ、３９Ｂ６−ＡＥＥ、３９Ｂ６−ＡＹＥ、３９Ｂ６−ＡＮＲ及び３９Ｂ６−ＡＮＫの存在下におけるＳＭＡＤ２リン酸化の低減を示すウェスタンブロットである。図３Ｂ：種々の抗体濃度におけるＳＭＡＤ２リン酸化の阻害百分率を示す（Ａ）におけるデータのグラフ表現である。
【図３−２】ＴＧＦ−β受容体活性化の下流にあるＳＭＡＤ２リン酸化をモニターするために設計したアッセイにおける３９Ｂ６−Ａ抗体バリアントを試験した結果を示す図である。ＳＭＡＤ２リン酸化はＴＧＦ−βのその受容体への結合に続くＴＧＦ−βシグナル伝達経路の活性化のマーカーとして働く。ＳＭＡＤ２リン酸化が低減すれば、ＴＧＦ−β活性が阻害されている。図３Ａ：種々の濃度のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β抗体、３９Ｂ６−Ａ、３９Ｂ６−ＡＶＥ、３９Ｂ６−ＡＥＥ、３９Ｂ６−ＡＹＥ、３９Ｂ６−ＡＮＲ及び３９Ｂ６−ＡＮＫの存在下におけるＳＭＡＤ２リン酸化の低減を示すウェスタンブロットである。図３Ｂ：種々の抗体濃度におけるＳＭＡＤ２リン酸化の阻害百分率を示す（Ａ）におけるデータのグラフ表現である。
【図４】ＳＭＡＤプロモーターにコンジュゲートしたルシフェラーゼレポーター遺伝子を介してＴＧＦ−βの活性を測定するために設計したアッセイにおいて３９Ｂ６−Ａ抗体バリアントを試験した結果を示す図である。グラフは、種々の濃度のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β抗体、ＬＨＧ−１０、３９Ｂ６−Ａ、３９Ｂ６−ＡＶＥ、３９Ｂ６−ＡＥＥ、３９Ｂ６−ＡＹＥ、３９Ｂ６−ＡＮＲ及び３９Ｂ６−ＡＮＫの存在下における発光シグナルの阻害百分率を示す。
【図５−１】５℃及び３７℃で保存した抗体３９Ｂ６−ＡＶＥ、３９Ｂ６−ＡＹＥ、３９Ｂ６−ＡＮＫ及び３９Ｂ６−ＡＮＲによる５６日の期間にわたる凝集形成百分率を示す図である。凝集形成はサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）によってモニターした。
【図５−２】５℃及び３７℃で保存した抗体３９Ｂ６−ＡＶＥ、３９Ｂ６−ＡＹＥ、３９Ｂ６−ＡＮＫ及び３９Ｂ６−ＡＮＲによる５６日の期間にわたる凝集形成百分率を示す図である。凝集形成はサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）によってモニターした。
【図６】３７℃で保存した抗体３９Ｂ６−ＡＶＥ、３９Ｂ６−ＡＹＥ、３９Ｂ６−ＡＮＫ及び３９Ｂ６−ＡＮＲによる５６日の期間にわたる断片形成百分率を示す図である。断片形成はサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）によってモニターした。
【図７−１】５℃及び３７℃で保存した抗体３９Ｂ６−ＡＶＥ、３９Ｂ６−ＡＹＥ、３９Ｂ６−ＡＮＫ及び３９Ｂ６−ＡＮＲによる５６日の期間にわたるモノマー面積百分率を示す図である。モノマー面積はサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）によってモニターした。
【図７−２】５℃及び３７℃で保存した抗体３９Ｂ６−ＡＶＥ、３９Ｂ６−ＡＹＥ、３９Ｂ６−ＡＮＫ及び３９Ｂ６−ＡＮＲによる５６日の期間にわたるモノマー面積百分率を示す図である。モノマー面積はサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）によってモニターした。
【図８】参照温度（−２０℃）、５℃及び３７℃で５６日間保存した抗体試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す図である。図８Ａ：３９Ｂ６−ＡＶＥ。図８Ｂ：３９Ｂ６−ＡＹＥ。図８Ｃ：３９Ｂ６−ＡＮＫ。図８Ｄ：３９Ｂ６−ＡＮＲ。マーカーはそれぞれのゲルの中心に現われている。マーカーの左の３つの試料は非還元条件下で試験した（ｉ）参照、（ｉｉ）５℃、（ｉｉｉ）３７℃の試料であり、マーカーの右の３つの試料は還元条件下で試験した（ｉ）参照、（ｉｉ）５℃、（ｉｉｉ）３７℃の試料である。
【図９−１】−２０℃、５℃及び３７℃で保存した試料について５６日の期間にわたって抗体３９Ｂ６−ＡＶＥ、３９Ｂ６−ＡＹＥ、３９Ｂ６−ＡＮＫ及び３９Ｂ６−ＡＮＲについてＢｉａｃｏｒｅ（商標）又はＳＰＲによって測定した標的結合活性を示す図である。それぞれの時点において参照試料（−２０℃）を結合活性１００％と設定した。
【図９−２】−２０℃、５℃及び３７℃で保存した試料について５６日の期間にわたって抗体３９Ｂ６−ＡＶＥ、３９Ｂ６−ＡＹＥ、３９Ｂ６−ＡＮＫ及び３９Ｂ６−ＡＮＲについてＢｉａｃｏｒｅ（商標）又はＳＰＲによって測定した標的結合活性を示す図である。それぞれの時点において参照試料（−２０℃）を結合活性１００％と設定した。
【図１０−１】−２０℃（参照）、５℃及び３７℃で保存した試料について５６日の期間にわたって抗体３９Ｂ６−ＡＶＥ、３９Ｂ６−ＡＹＥ、３９Ｂ６−ＡＮＫ及び３９Ｂ６−ＡＮＲの試料のタンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）を示す図である。
【図１０−２】−２０℃（参照）、５℃及び３７℃で保存した試料について５６日の期間にわたって抗体３９Ｂ６−ＡＶＥ、３９Ｂ６−ＡＹＥ、３９Ｂ６−ＡＮＫ及び３９Ｂ６−ＡＮＲの試料のタンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）を示す図である。
【図１１】１０回の凍結解凍サイクルの後の抗体試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す図である。マーカーはゲルの中心に現われている。マーカーの左の４つの試料は非還元条件下で解析した（ｉ）３９Ｂ６−ＡＶＥに対する参照、（ｉｉ）３９Ｂ６−ＡＶＥに対する凍結解凍試料、（ｉｉｉ）３９Ｂ６−ＡＹＥに対する参照及び（ｉｖ）３９Ｂ６−ＡＹＥに対する凍結解凍試料である。マーカーの右の４つの試料は還元条件下で解析した（ｉ）３９Ｂ６−ＡＶＥに対する参照、（ｉｉ）３９Ｂ６−ＡＶＥに対する凍結解凍試料、（ｉｉｉ）３９Ｂ６−ＡＹＥに対する参照及び（ｉｖ）３９Ｂ６−ＡＹＥに対する凍結解凍試料である。
【図１２】抗体３９Ｂ６−ＡＶＥ及び３９Ｂ６−ＡＹＥについて１０回の凍結解凍サイクルの後でＢｉａｃｏｒｅ（商標）又はＳＰＲによって測定した標的結合活性を示す図である。それぞれの時点において参照試料（−２０℃）を結合活性１００％と設定した。
【図１３】１０回の凍結解凍サイクルの後の抗体３９Ｂ６−ＡＶＥ及び３９Ｂ６−ＡＹＥの試料のタンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）を示す図である。
【図１４】抗体３９Ｂ６−ＡＶＥ、３９Ｂ６−ＡＹＥ、３９Ｂ６−ＡＮＫ及び３９Ｂ６−ＡＮＲについて５４．６℃〜７１．４℃の温度範囲で熱安定性試験を行なった後のＢｉａｃｏｒｅ（商標）又はＳＰＲによって測定した標的結合活性を示す図である。参照試料を結合活性１００％と設定した。
【図１５】９６時間の回転の後の抗体試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す図である。マーカーはゲルの中心に現われている。マーカーの左の４つの試料は非還元条件下で解析した（ｉ）３９Ｂ６−ＡＶＥに対する参照、（ｉｉ）３９Ｂ６−ＡＶＥに対する回転した試料、（ｉｉｉ）３９Ｂ６−ＡＹＥに対する参照及び（ｉｖ）３９Ｂ６−ＡＹＥに対する回転した試料である。マーカーの右の４つの試料は還元条件下で解析した（ｉ）３９Ｂ６−ＡＶＥに対する参照、（ｉｉ）３９Ｂ６−ＡＶＥに対する回転した試料、（ｉｉｉ）３９Ｂ６−ＡＹＥに対する参照及び（ｉｖ）３９Ｂ６−ＡＹＥに対する回転した試料である。
【図１６】ｍＡｂ  ３９Ｂ６−ＡＶＥ及び３９Ｂ６−ＡＹＥについての回転安定性試験の後でＢｉａｃｏｒｅ（商標）又はＳＰＲによって測定した標的結合活性を示す図である。参照試料を結合活性１００％と設定した。
【図１７】回転安定性試験の後のｍＡｂ  ３９Ｂ６−ＡＶＥ及び３９Ｂ６−ＡＹＥの試料のタンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）を示す図である。
【図１８】５６日の期間にわたる抗体３９Ｂ６−ＡＮＥ、３９Ｂ６−ＡＮＲ及び３９Ｂ６−ＡＮＫにおける位置Ｎ９５の脱アミド化及び異性化の相対量を示す図である。抗体３９Ｂ６−ＡＶＥ及び３９Ｂ６−ＡＹＥは残基「Ｎ９５」がＣＤＲ３から除去されているので、ここに含まれていない。３７℃で保存した試料についての５６日の時間経過にわたるｍＡｂ  ３９Ｂ６−ＡＮＥ、３９Ｂ６−ＡＶＥ、３９Ｂ６−ＡＹＥ、３９Ｂ６−ＡＮＫ及び３９Ｂ６−ＡＮＲについての相対結合活性も示す。
【図１９】３９Ｂ６−ＡＹＥ（ＡＲＧＸ−１１５）のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β複合体への結合における成熟ＴＧＦ−βの必要性を示す図である。ＧＡＲＰ又は抗ＧＡＲＰ  Ａｂ  ＡＲＧＸ−１１５のいずれかでＥＬＩＳＡプレートをコートした。ＧＡＲＰでコートしたＥＬＩＳＡプレートについては、関連のある組み換えタンパク質を添加することによって、全長の潜在型ＴＧＦ−β（ＬＡＰ及び成熟ＴＧＦ−β領域の両方を含む）との複合体又は組み換えＬＡＰとの複合体を形成させた。ＡＲＧＸ−１１５でコートしたＥＬＩＳＡプレートについては、ＧＡＲＰを添加し、次いで全長の潜在型ＴＧＦ−β又はＬＡＰを添加した。ＡＲＧＸ−１１５は全長ＴＧＦ−βの存在下でＧＡＲＰと結合できるのみであった。ＡＲＧＸ−１１５のＧＡＲＰ−ＬＡＰ複合体への結合は起きなかった。対照的に、抗ＬＡＰ抗体はＧＡＲＰ−ＬＡＰ複合体に結合することができた。これにより、ＡＲＧＸ−１１５のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β複合体への結合に成熟ＴＧＦ−βが必要であることが実証される。
【図２０】ＴＧＦ−βの種々の変異形態とのＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β複合体によるＴＧＦ−βの活性化を中和する抗体の能力を示す図である。ＡＲＧＸ−１１５の中和活性は、ＬＡＰのＲ５８及び成熟ＴＧＦ−βのＫ３３８の変異によって無効となった。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
Ａ．定義
「ＧＡＲＰ」−ＧＡＲＰ（反復優位型グリコプロテインＡ）はタンパク質の多ロイシンリピートファミリーの一員である。これは多ロイシンリピート含有３２（ＬＲＲＣ３２）とも呼ばれる。ＧＡＲＰは主として２０個の多ロイシンリピートからなる細胞外領域を有する８０ｋＤａの膜貫通タンパク質である。ヒトＧＡＲＰタンパク質トランスクリプトバリアント２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００１１２２３９４．１）の完全なアミノ酸配列は、
【００３８】
【化１】
2020519308.tif 000003
である。
【００３９】
「ＴＧＦ−β」−ＴＧＦ−βは成長因子のスーパーファミリーに属するサイトカインである。３つの異なった遺伝子によってコードされるＴＧＦ−βの３つの異なったアイソフォーム（ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２及びＴＧＦ−β３）があるが、ＴＧＦ−βアイソフォームの全体の構造は極めて同様であり、相同性は７０〜８０％のオーダーである。用語ＴＧＦ−βは本明細書において用いる場合、文脈が他を指示しない限り、典型的にはＴＧＦ−βサイトカインの３つ全ての異なったアイソフォームを包含するために用いられる。
【００４０】
３つ全てのＴＧＦ−βアイソフォームは大きなタンパク質前駆体としてコードされている。ＴＧＦ−β１（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００６６０）は３９０個のアミノ酸を含み、ＴＧＦ−β２（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１１３５５９９及びＮＭ＿００３２３８）及びＴＧＦ−β３（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＸＭ＿００５２６８０２８）はそれぞれ４１２個のアミノ酸を含む。これらはそれぞれ、細胞からの分泌に必要な２０〜３０アミノ酸のＮ末端シグナルペプチド、プロ領域（潜在性関連ペプチド又はＬＡＰと命名されている）、及びタンパク分解性開裂によるプロ領域からの放出の後で成熟ＴＧＦ−β分子になる１１２〜１１４アミノ酸のＣ末端領域を含む。タンパク分解性開裂の後、ＬＡＰ及び成熟ＴＧＦ−βは非共有結合的に会合したまま残り、「潜在型ＴＧＦ−β」分子を形成する。この潜在型において、成熟ＴＧＦ−βはＬＡＰによってＴＧＦ−β受容体への結合が防止されている。シグナルを働かせるために、成熟ＴＧＦ−βはＬＡＰから放出されなければならない。ＬＡＰと会合していない成熟ＴＧＦ−βは、ＴＧＦ−β受容体に結合してシグナルを変換することができるので、活性ＴＧＦ−βと呼ばれる。
【００４１】
全長のＴＧＦ−β１は以下のアミノ酸配列を有している。
【００４２】
【化２】
2020519308.tif 000004
【００４３】
ＬＡＰは以下のアミノ酸配列を有している。
【００４４】
【化３】
2020519308.tif 000005
【００４５】
成熟ＴＧＦ−β１は以下のアミノ酸配列を有している。
【００４６】
【化４】
2020519308.tif 000006
【００４７】
「ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β複合体」−本明細書で用いる場合、ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β複合体は、潜在型ＴＧＦ−βがＧＡＲＰ、特にＴｒｅｇ細胞の表面上に位置するＧＡＲＰに結合する際に形成されるネイティブ複合体を意味する。完全に特定してはいないが、「ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β複合体」又は単純に「ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β」は、本明細書で用いる場合、ＧＡＲＰと潜在型ＴＧＦ−βとの間の複合体を意味することを意図している。ＧＡＲＰとＴＧＦ−β、より具体的には潜在型ＴＧＦ−βとの結合は、たとえばＷａｎｇら、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ、２０１２年３月、２３（６）、１１２９〜３９頁に報告されているように、分子レベルで特性解析されている。ＧＡＲＰは潜在型ＴＧＦ−βのＣｙｓ４とジスルフィドリンケージを形成し、非共有結合的相互作用で潜在型ＴＧＦ−βと会合してもいる。ＧＡＲＰの細胞外ドメインには１５個のＣｙｓ残基が存在し、ＧＡＲＰはＣｙｓ−１９２及びＣｙｓ−３３１を用いて潜在型ＴＧＦ−βの２つのＣｙｓ４残基とジスルフィドリンケージを形成している。したがって１つのＧＡＲＰタンパク質が１つの潜在型ＴＧＦ−βダイマーと会合していることになる。
【００４８】
「抗体」又は「免疫グロブリン」−本明細書で用いる場合、用語「免疫グロブリン」は、それがいかなる関連する特定の免疫反応性を有しているか否かには関わらず、２つの重鎖と２つの軽鎖の組合せを有するポリペプチドを含む。「抗体」は、目的の抗原（たとえばＧＡＲＰとＴＧＦ−βの複合体）に対して顕著で既知の特定の免疫反応活性を有するアセンブリーを意味する。本明細書において用語「ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β抗体」は、ＧＡＲＰとＴＧＦ−β１の複合体、特にヒトＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１複合体、及びある場合にはその相同種に対して免疫学的特異性を呈する抗体を意味するために用いられる。抗体及び免疫グロブリンは、軽鎖及び重鎖を、それらの間の鎖間共有リンケージを伴って又は伴わずに、含む。脊椎動物系における基礎的な免疫グロブリンの構造は、比較的よく理解されている。
【００４９】
総称的な用語「免疫グロブリン」は、生化学的に識別できる５つの異なった抗体のクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥ）を含む。５つ全ての抗体のクラスは本発明の範囲内にある。以下の考察は一般に免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスに向けられる。ＩｇＧに関しては、免疫グロブリンは典型的には分子量約２３，０００ドルトンの２つの同一の軽ポリペプチド鎖と、分子量５３，０００〜７０，０００の２つの同一の重鎖を含む。４つの鎖はジスルフィド結合によって「Ｙ」形状で接合されており、軽鎖は「Ｙ」の口のところから始まって重鎖を取り囲み、可変領域を通して連続している。
【００５０】
抗体の軽鎖はカッパ（κ）又はラムダ（λ）と分類される。それぞれの重鎖クラスはカッパ又はラムダ軽鎖と結合し得る。一般に、軽鎖及び重鎖は互いに共有結合しており、２つの重鎖の「尾」の部分は、免疫グロブリンがハイブリドーマ、Ｂ細胞又は遺伝子操作された宿主細胞によって生成する際に共有結合ジスルフィドリンケージ又は非共有結合リンケージによって互いに結合する。重鎖では、アミノ酸配列はＹ形状の分枝した端のＮ末端から、それぞれの鎖の底部のＣ末端まで連なっている。当業者には、重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタ又はイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）に分類され、それらの中にいくつかのサブクラス（たとえばγ１〜γ４）があることが認識される。抗体の「クラス」をそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥとして決定するものはこの鎖の性質である。免疫グロブリンのサブクラス（アイソタイプ）、たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１等はよく特性解析されており、機能の特殊化を生じることが知られている。これらのクラス及びアイソタイプのそれぞれの改変されたバージョンは本開示に鑑みて、したがって本発明の範囲内で、当業者には容易に識別できる。
【００５１】
上記のように、抗体の可変領域によって抗体は抗原のエピトープを選択的に認識し、特異的に結合することができる。即ち、抗体のＶＬドメインとＶＨドメインが組み合わされて三次元の抗原結合部位を画定する可変領域を形成する。この四次抗体構造は、Ｙのそれぞれの腕の端に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位はＶＨ及びＶＬ鎖のそれぞれの上の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって画定される。
【００５２】
「結合部位」−本明細書で用いる場合、用語「結合部位」は、目的の標的抗原への選択的な結合に関与するポリペプチドの領域を含む。結合ドメインは少なくとも１つの結合部位を含む。例示的な結合ドメインには抗体の可変ドメインが含まれる。本発明の抗体分子は単一の結合部位又は複数（たとえば２つ、３つ又は４つ）の結合部位を含んでよい。
【００５３】
「可変領域」又は「可変ドメイン」−用語「可変領域」及び「可変ドメイン」は、本明細書において相互交換可能に用いられ、等価の意味を有することが意図されている。用語「可変」は、ＶＨ及びＶＬの可変ドメインのある部分が抗体の間で配列に大きな相違があり、その標的抗原に対するそれぞれの特定の抗体の結合及び特異性に用いられるという事実を意味している。しかし、可変性は抗体の可変ドメインにわたって均一に分布しているわけではない。それは、抗原結合部位の部分を形成するＶＬドメイン及びＶＨドメインのそれぞれにおける「超可変ループ」と呼ばれる３つのセグメントに集中している。Ｖラムダ軽鎖ドメインの第１、第２及び第３の超可変ループは本明細書でＬ１（λ）、Ｌ２（λ）及びＬ３（λ）と称され、ＶＬドメイン内で残基２４〜３３（Ｌ１（λ）、９、１０又は１１アミノ酸残基からなる）、４９〜５３（Ｌ２（λ）、３つの残基からなる）及び９０〜９６（Ｌ３（λ）、５つの残基からなる）を含むと定義してよい（Ｍｏｒｅａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０：２６７〜２７９頁（２０００））。Ｖカッパ軽鎖ドメインの第１、第２及び第３の超可変ループは本明細書でＬ１（κ）、Ｌ２（κ）及びＬ３（κ）と称され、ＶＬドメイン内で残基２５〜３３（Ｌ１（κ）、６、７、８、１１、１２又は１３残基からなる）、４９〜５３（Ｌ２（κ）、３つの残基からなる）及び９０〜９７（Ｌ３（κ）、６つの残基からなる）を含むと定義してよい（Ｍｏｒｅａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０：２６７〜２７９頁（２０００））。ＶＨドメインの第１、第２及び第３の超可変ループは本明細書でＨ１、Ｈ２及びＨ３と称され、ＶＨドメイン内で残基２５〜３３（Ｈ１、７、８又は９残基からなる）、５２〜５６（Ｈ２、３つ又は４つの残基からなる）及び９１〜１０５（Ｈ３、長さが高度に可変）を含むと定義してよい（Ｍｏｒｅａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０：２６７〜２７９頁（２０００））。
【００５４】
他に指示しない限り、用語Ｌ１、Ｌ２及びＬ３はそれぞれＶＬドメインの第１、第２及び第３の超可変ループを意味し、Ｖカッパ及びＶラムダアイソタイプの両方から得られた超可変ループを包含する。用語Ｈ１、Ｈ２及びＨ３はそれぞれＶＨドメインの第１、第２及び第３の超可変ループを意味し、γ、ε、δ、α又はμを含む既知の重鎖アイソタイプのいずれかから得られた超可変ループを包含する。
【００５５】
超可変ループＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２及びＨ３はそれぞれ、以下に定義する「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」の一部を含む。超可変ループ（ＨＶ）は構造に基づいて定義される一方、相補性決定領域（ＣＤＲ）は配列の可変性に基づいて定義され（Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ．、１９８３）、いくつかのＶＨ及びＶＬドメインにおいてＨＶとＣＤＲの限界は異なることがあるので、用語「超可変ループ」及び「相補性決定領域」は厳密には同義ではない。
【００５６】
ＶＬ及びＶＨドメインのＣＤＲは典型的には以下のアミノ酸、軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）及び８９〜９７（ＬＣＤＲ３）並びに重鎖可変ドメイン中の残基３１〜３５又は３１〜３５ｂ（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）及び９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）を含むと定義することができる（Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ．、（１９９１））。したがって、ＨＶは対応するＣＤＲの中に含まれ、本明細書におけるＶＨ及びＶＬドメインの「超可変ループ」への言及は、他に指示しない限り、対応するＣＤＲをも包含し、逆もそうであると解釈されたい。
【００５７】
可変ドメインのより高度に保存された部分は、以下に定義するようにフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。ネイティブな重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、３つの超可変ループで連結され、主としてβシート構造を取る４つのＦＲ（それぞれＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）を含む。それぞれの鎖の中の超可変ループはＦＲによって互いに接近して保持され、他の鎖の超可変ループとともに抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。抗体の構造解析によって、相補性決定領域によって形成された結合部位の配列と形状の間の関係が明らかになった（Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：７９９〜８１７頁（１９９２））、Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、２１５：１７５〜１８２頁（１９９０））。それらの高い配列可変性に関わらず、６つのループのうち５つは「カノニカル構造」と呼ばれる、主鎖コンフォメーションの小さな範囲のみを取っている。これらのコンフォメーションはまずループの長さによって決定され、二次的にはそれらの充填、水素結合又は通常でない主鎖のコンフォメーションを取り得る能力によってコンフォメーションを決定するループ及びフレームワーク領域内でのある位置における重要な残基の存在によって決定される。
【００５８】
「ＣＤＲ］−本明細書で用いる場合、用語「ＣＤＲ」又は「相補性決定領域」は、重鎖及び軽鎖のポリペプチドの両方の可変領域内で見出される非連続的な抗原結合部位を意味する。これらの特定の領域はＫａｂａｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５２、６６０９〜６６１６頁（１９７７）及びＫａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．（１９９１）によって、またＣｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１〜９１７頁（１９８７）及びＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６２：７３２〜７４５頁（１９９６）によって述べられており、定義は相互に比較した場合のアミノ酸残基の重複又はサブセットを含む。上に引用した参照文献のそれぞれによって定義されるＣＤＲを包含するアミノ酸残基を比較のために説明する。好ましくは、用語「ＣＤＲ」は配列の比較に基づいてＫａｂａｔによって定義されたＣＤＲである。
【００５９】
【表１】
2020519308.tif 000007
【００６０】
「フレームワーク領域」−本明細書で用いる用語「フレームワーク領域」又は「ＦＲ領域」は、可変領域の一部であるがＣＤＲ（たとえばＣＤＲのＫａｂａｔ定義を用いる）の一部ではないアミノ酸残基を含む。したがって、可変領域フレームワークは長さ約１００〜１２０アミノ酸であるが、ＣＤＲの外側のアミノ酸のみを含む。重鎖可変ドメインの特定の例について、及びＫａｂａｔらによって定義されたＣＤＲについて、フレームワーク領域１はアミノ酸１〜３０を包含する可変領域のドメインに対応し、フレームワーク領域２はアミノ酸３６〜４９を包含する可変領域のドメインに対応し、フレームワーク領域３はアミノ酸６６〜９４を包含する可変領域のドメインに対応し、フレームワーク領域４はアミノ酸１０３から可変領域の端までの可変領域のドメインに対応する。軽鎖のフレームワーク領域は軽鎖可変領域ＣＤＲのそれぞれによって同様に分離されている。同様に、Ｃｈｏｔｈｉａら及びＭｃＣａｌｌｕｍらによるＣＤＲの定義を用いて、フレームワーク領域の境界は上記のようにそれぞれのＣＤＲ末端によって分離されている。好ましい実施形態ではＣＤＲはＫａｂａｔによって定義されたものである。
【００６１】
天然生成の抗体においては、それぞれのモノマー抗体の上に存在する６つのＣＤＲは、抗体が水性環境の中でその三次元構造を取る際に特定の位置を占めて抗原結合部位を形成するアミノ酸の短い非連続的な配列である。重鎖及び軽鎖の可変ドメインの残りの部分はアミノ酸配列においてより少ない分子間可変性を示し、フレームワーク領域と名付けられている。フレームワーク領域は主としてβシートコンフォメーションを取り、ＣＤＲはβシート構造を結合し、ある場合にはその部分を形成するループを形成する。したがって、これらのフレームワーク領域は、６つのＣＤＲを鎖間の非共有結合的相互作用によって正しい配向に位置決めするスカフォールドを形成するように作用する。位置決めされたＣＤＲによって形成された抗原結合部位は、免疫反応性抗原のエピトープに相補的な表面を画定する。この相補的表面は抗体と免疫反応性抗原のエピトープとの非共有結合的な結合を促進する。当業者によれば、ＣＤＲの位置は容易に識別できる。
【００６２】
「定常領域」−本明細書で用いる場合、用語「定常領域」は、可変ドメイン又は可変領域の外側の抗体分子の部分を意味する。免疫グロブリンの軽鎖は、典型的には「ＣＬ又はＣＬ１ドメイン」と称される一本鎖ドメイン「定常領域」を有する。このドメインはＶＬドメインのＣ末端に存在する。免疫グロブリンの重鎖は免疫グロブリンのクラス（γ、μ、α、δ、ε）に応じてそれらの定常領域において異なる。重鎖γ、α及びδは、３つの免疫グロブリンドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３と称される）並びにＣＨ１及びＣＨ２ドメインを分離する可撓性のヒンジ領域からなる定常領域を有している。重鎖μ及びεは、４つのドメイン（ＣＨ１〜ＣＨ４）からなる定常領域を有している。重鎖の定常領域はＶＨドメインのＣ末端に位置している。
【００６３】
免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖におけるアミノ酸の番号付けは、Ｙ構造の分枝した端のＮ末端から始まり、それぞれの鎖の底部のＣ末端に至る。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の定常ドメインを定義するために異なった番号付けスキームが用いられる。ＥＵ番号付けスキームによれば、ＩｇＧ分子の重鎖定常ドメインは以下のように識別される。ＣＨ１−アミノ酸残基１１８〜２１５、ＣＨ２−アミノ酸残基２３１〜３４０、ＣＨ３−アミノ酸残基３４１〜４４６。Ｋａｂａｔ番号付けスキームによれば、ＩｇＧ分子の重鎖定常ドメインは以下のように識別される。ＣＨ１−アミノ酸残基１１４〜２２３、ＣＨ２−アミノ酸残基２４４〜３６０、ＣＨ３−アミノ酸残基３６１〜４７７。「ヒンジ領域」は、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインを接合する重鎖分子の部分を含む。ヒンジ領域はほぼ２５残基を含み、可撓性であるので、２つのＮ末端抗原結合領域は独立に動くことができる。ヒンジ領域は３つの異なったドメイン、即ち上部、中部、下部ヒンジドメインに再分割することができる（Ｒｏｕｘ  Ｋ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：４０８３〜９０頁（１９９８））。「完全なヒトの」ヒンジ領域を含む本発明の抗体は、以下の表２に示すヒンジ領域配列の１つを含んでよい。
【００６４】
【表２】
2020519308.tif 000008
【００６５】
「断片」−用語「断片」は、本発明の抗体に関して用いる場合、無傷の又は完全な抗体又は抗体鎖よりも少ないアミノ酸残基を含む抗体又は抗体鎖の一部又は部分を意味する。用語「抗原結合断片」は、抗原に結合し又は抗原結合（即ちＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β複合体への特異的結合）に関して無傷の抗体と（即ち、抗原がそれに由来する無傷の抗体と）競合する免疫グロブリン又は抗体のポリペプチド断片を意味する。本明細書で用いる場合、抗体分子の用語「断片」は、抗体の抗原結合断片、たとえば抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、一本腕（一価）抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ又はそのような抗原結合断片の組合せ、アセンブリー又はコンジュゲーションによって形成された任意の抗原結合分子を含む。用語「抗原結合断片」は、本明細書で用いる場合、ユニボディ、ドメイン抗体及びナノボディからなる群から選択される抗体断片を包含することがさらに意図されている。断片は、たとえば無傷の又は完全な抗体又は抗体鎖の化学的若しくは酵素的処理、又は組み換え手段によって得ることができる。
【００６６】
「保存的アミノ酸置換」−「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる置換である。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、塩基性側鎖（たとえばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（たとえばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（たとえばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（たとえばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（たとえばスレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（たとえばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含めて、当技術で定義されてきた。したがって、免疫グロブリンポリペプチドにおける非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置き換えることができる。別の実施形態では、一続きのアミノ酸は、側鎖のファミリーメンバーの順序及び／又は組成が異なる構造的に同様の一続きによって置き換えることができる。
【００６７】
「キメラ」−「キメラ」タンパク質は、自然界では天然に連結されていない第２のアミノ酸配列に連結された第１のアミノ酸配列を含む。このアミノ酸配列は、通常は別々のタンパク質の中に存在するものが融合ポリペプチドの中で一緒に存在したり、又は通常は同じタンパク質の中に存在するが融合ポリペプチドの中では新たな配置に置かれたりする場合がある。キメラタンパク質は、たとえば化学合成によって、又は所望の関係性でペプチド領域がコードされているポリヌクレオチドを創成し翻訳することによって、創成することができる。本発明の例示的なキメラ抗体には、ヒト抗体、たとえばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４の定常ドメインに融合されたラクダ科由来のＶＨ及びＶＬドメイン、又はそのヒト化バリアントを含む融合タンパク質が含まれる。
【００６８】
「価数」−本明細書で用いる場合、用語「価数」は、ポリペプチド中の可能な標的結合部位の数を意味する。それぞれの標的結合部位は、１つの標的分子又は標的分子上の特定の部位に特異的に結合する。ポリペプチドが２つ以上の標的結合部位を含む場合には、それぞれの標的結合部位は同じ又は異なった分子に特異的に結合し得る（たとえば、異なったリガンド若しくは異なった抗原、又は同じ抗原上の異なったエピトープに結合し得る）。
【００６９】
「特異性」−用語「特異性」は、所与の標的、たとえばＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１の複合体に結合する（たとえば免疫反応する）能力を意味する。ポリペプチドは、単一特異性で標的に特異的に結合する１つ以上の結合部位を含んでよく、又はポリペプチドは多特異性で同じ又は異なった標的に特異的に結合する２つ以上の結合部位を含んでよい。
【００７０】
「合成」−本明細書で用いる場合、ポリペプチドに関する用語「合成」は、天然には生成しないアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。たとえば、天然に生成したポリペプチドの改変された形態（たとえば付加、置換又は欠失のような変異を含む）、又は自然界では天然に連結されていない第２のアミノ酸配列（天然生成であってもなくてもよい）にアミノ酸の一次配列で連結された第１のアミノ酸配列（天然生成であってもなくてもよい）を含む非天然生成のポリペプチド。
【００７１】
「操作された」−本明細書で用いる場合、用語「操作された」は、合成的手段による（たとえば組み換え手法、インビトロペプチド合成による、ペプチドの酵素的若しくは化学的カップリング又はこれらの手法のいくつかの組合せによる）核酸又はポリペプチド分子の操作を含む。好ましくは、本発明の抗体は操作されており、たとえばヒト化及び／又はキメラ抗体、並びに抗原結合、安定性／半減期又はエフェクター機能のような１つ以上の特性を改善するために操作された抗体を含む。
【００７２】
「ヒト化置換」−本明細書で用いる場合、用語「ヒト化置換」は、抗体（たとえばラクダ科由来のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体）のＶＨ又はＶＬドメインの中の特定の位置に存在するアミノ酸残基が、参照のヒトＶＨ又はＶＬドメインの等価の位置に存在するアミノ酸残基で置き換えられるアミノ酸置換を意味する。参照のヒトＶＨ又はＶＬドメインは、ヒト生殖細胞系列によってコードされたＶＨ又はＶＬドメインであってよい。ヒト化置換は本明細書に定義される抗体のフレームワーク領域及び／又はＣＤＲで行なってよい。
【００７３】
「ヒト化バリアント」−本明細書で用いる場合、用語「ヒト化バリアント」は、参照抗体と比較して１つ以上の「ヒト化置換」を含むバリアント抗体を意味し、参照抗体の一部（たとえばＶＨドメイン及び／若しくはＶＬドメイン又は少なくとも１つのＣＤＲを含むその部分）は非ヒト種由来のアミノ酸を有し、「ヒト化置換」は非ヒト種由来のアミノ酸配列の中で起こる。
【００７４】
「生殖細胞系列化バリアント」−用語「生殖細胞系列化バリアント」は、本明細書で具体的には、その中で「ヒト化置換」が抗体（たとえばラクダ科由来のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体）のＶＨ又はＶＬドメインの中の特定の位置に存在する１つ以上のアミノ酸残基の、ヒト生殖細胞系列によってコードされた参照のヒトＶＨ又はＶＬドメインの中の等価の位置で起こるアミノ酸残基による置き換えをもたらす「ヒト化バリアント」を意味するために用いられる。任意の所与の「生殖細胞系列化バリアント」について、生殖細胞系列化バリアントの中に置換された置き換えアミノ酸残基は、単一のヒト生殖細胞系列にコードされたＶＨ又はＶＬドメインからのみ、又は主としてそれから取られるのが通常である。用語「ヒト化バリアント」及び「生殖細胞系列化バリアント」は、本明細書では相互交換可能に用いることが多い。１つ以上の「ヒト化置換」をラクダ科由来（たとえばラマ由来）のＶＨ又はＶＬドメインに導入すると、ラクダ科（ラマ）由来のＶＨ又はＶＬドメインの「ヒト化バリアント」が産生される。置換されるアミノ酸残基が単一のヒト生殖細胞系列にコードされたＶＨ又はＶＬドメイン配列から主として、又はそれのみに由来する場合には、結果はラクダ科（ラマ）由来のＶＨ又はＶＬドメインの「ヒト生殖細胞系列化バリアント」になり得る。
【００７５】
「親和性バリアント」−本明細書で用いる場合、用語「親和性バリアント」は、参照抗体と比較してアミノ酸配列に１つ以上の変化を呈するバリアント抗体を意味し、親和性バリアントは参照抗体と比較して標的抗原に対して変化した親和性を呈する。たとえば、親和性バリアントは参照のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β抗体と比較してＧＡＲＰ−ＴＧＦ−βに対して変化した親和性を呈する。好ましくは、親和性バリアントは標的抗原に対して参照抗体と比較して改善された親和性を呈する。親和性バリアントは典型的には参照抗体と比較してＣＤＲの中のアミノ酸配列に１つ以上の変化を呈する。そのような置換により、ＣＤＲの中の所与の位置に存在する元のアミノ酸は、天然産生のアミノ酸残基又は非天然産生のアミノ酸残基でもよい異なったアミノ酸残基で置き換えられる。アミノ酸の置換は保存的又は非保存的であってよい。
【００７６】
Ｂ．ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体
本発明は、ＧＡＲＰとＴＧＦ−β１の複合体、特にヒトＧＡＲＰとヒトＴＧＦ−β１の複合体に特異的に結合する抗体及びその抗原結合断片に関する。本発明の抗体及び抗原結合断片は、本明細書に記載した構造的及び機能的特徴に関して定義され得る。
【００７７】
重要なことに、本発明のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体は、これらが改善された安定性を示すという理由で、過去に記載されたＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体と比較して改善されている。特に、本明細書に記載したＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体の安定性は、ＷＯ２０１５／０１５００３及びＷＯ２０１６／１２５０１７に記載されたＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１参照抗体ＬＨＧ−１０及びＬＨＧ−１０．６の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列を有する抗体と比較して改善されている。この安定性の改善は、参照のＬＨＧ１０及びＬＨＧ１０．６抗体と比較してＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１複合体に対する抗体の結合親和性を顕著に減少させることなく達成される。
【００７８】
本発明の抗体は、特に重鎖ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の配列に関して、過去に記載されたＬＨＧ−１０及びＬＨＧ−１０．６のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１参照抗体と異なっている。より具体的には、ＬＨＧ−１０及びＬＨＧ−１０．６のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体は重鎖ＣＤＲ２配列：ＲＩＤＰＥＤＧＧＴＫＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号５）及び重鎖ＣＤＲ３配列：ＮＥＷＥＴＶＶＶＧＤＬＭＹＥＹＥＹ（配列番号６）を有する一方、本発明の抗体は重鎖ＣＤＲ２配列：ＲＩＤＰＥＤＡＧＴＫＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号１２）及び重鎖ＣＤＲ３配列：ＹＥＷＥＴＶＶＶＧＤＬＭＹＥＹＥＹ（配列番号１３）を含んでいる。本明細書に記載し例示するように、重鎖ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列それぞれにおけるＧ５５Ａ及びＮ９５Ｙのアミノ酸の置換は、脱アミド化、異性化及び酸化を低減する一方、参照抗体のそれとほぼ等価のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１複合体の結合親和性を達成することによって抗体の安定性を改善することが見出された。
【００７９】
第１の態様では、本発明はＧＡＲＰとＴＧＦ−β１の複合体に結合し、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む抗体又はその抗原結合断片を提供し、
ＶＨ  ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＹＥＷＥＴＶＶＶＧＤＬＭＹＥＹＥＹ（配列番号１３）を含むか又はそれからなり、
ＶＨ  ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＲＩＤＰＥＤＡＧＴＫＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号１２）を含むか又はそれからなり、
ＶＨ  ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＳＹＹＩＤ（配列番号４）を含むか又はそれからなる。
【００８０】
ある実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をさらに含み、
ＶＬ  ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＱＱＹＡＳＶＰＶＴ（配列番号１１）を含むか又はそれからなり、
ＶＬ  ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＧＡＳＲＬＫＴ（配列番号１０）を含むか又はそれからなり、
ＶＬ  ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＱＡＳＱＳＩＳＳＹＬＡ（配列番号９）を含むか又はそれからなる。
【００８１】
ある実施形態では、ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１複合体に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片が本明細書で提供され、抗体又はその抗原結合断片は少なくとも１つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び少なくとも１つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、
ＶＨ  ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＹＥＷＥＴＶＶＶＧＤＬＭＹＥＹＥＹ（配列番号１３）を含むか又はそれからなり、
ＶＨ  ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＲＩＤＰＥＤＡＧＴＫＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号１２）を含むか又はそれからなり、
ＶＨ  ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＳＹＹＩＤ（配列番号４）を含むか又はそれからなり、
ＶＬ  ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＱＱＹＡＳＶＰＶＴ（配列番号１１）を含むか又はそれからなり、
ＶＬ  ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＧＡＳＲＬＫＴ（配列番号１０）を含むか又はそれからなり、
ＶＬ  ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＱＡＳＱＳＩＳＳＹＬＡ（配列番号９）を含むか又はそれからなる。
【００８２】
ある実施形態では、ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１複合体に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片が本明細書で提供され、抗体又はその抗原結合断片は少なくとも１つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び少なくとも１つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、
ＶＨ  ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＹＥＷＥＴＶＶＶＧＤＬＭＹＥＹＥＹ（配列番号１３）からなり、
ＶＨ  ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＲＩＤＰＥＤＡＧＴＫＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号１２）からなり、
ＶＨ  ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＳＹＹＩＤ（配列番号４）からなり、
ＶＬ  ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＱＱＹＡＳＶＰＶＴ（配列番号１１）からなり、
ＶＬ  ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＧＡＳＲＬＫＴ（配列番号１０）からなり、
ＶＬ  ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＱＡＳＱＳＩＳＳＹＬＡ（配列番号９）からなる。
【００８３】
ある実施形態では、抗体又は抗原結合断片は組み換え体である。ある実施形態では、抗体又は抗原結合断片はモノクローナルである。
【００８４】
用語「抗体」は本明細書では最も広い意味で用いられ、ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１複合体に対して適切な免疫学的特異性を示す限り、それだけに限らないが、モノクローナル抗体（全長のモノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体及び多重特異性抗体（たとえば二重特異性抗体）を包含する。用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で用いる場合、実質的に均質の抗体の集団から得られた抗体を意味する。即ち、集団を構成する個別の抗体は、少量で存在してもよい可能な天然産生の変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位を指向している。さらに、典型的には抗原の異なった決定基（エピトープ）を指向する異なった抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基又はエピトープを指向している。
【００８５】
本発明は抗体の「抗原結合断片」をも包含し、そのような断片は本明細書の別の箇所に定義している。抗体断片は典型的には全長の抗体の一部、一般にはその抗原結合又は可変ドメインを含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、二重特異性Ｆａｂ’、及びＦｖ断片、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ、Ｈｕｄｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２３：１１２６〜３６頁（２００５）を参照）。
【００８６】
本発明の抗体及び抗原結合断片は、高いヒト相同性を呈し得る。ヒト配列との相同性のレベルは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）の長さにわたって、及び／又は軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）の長さにわたって評価することができる。本発明の文脈では、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体は、ＶＨドメインとＶＬドメインを一緒にした場合、最も近く一致するヒト生殖細胞系列のＶＨ及びＶＬ配列と少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、又は少なくとも９６％のアミノ酸配列同一性を呈するならば、高いヒト相同性を有すると考えてよい。１つの実施形態では、高いヒト相同性を有する抗体のＶＨドメインは、フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４にわたって１つ以上のヒトＶＨドメインと少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、又は少なくとも９６％のアミノ酸配列同一性又は配列相同性を呈し得る。１つの実施形態では、高いヒト相同性を有する抗体のＶＨドメインは、最も近く一致するヒトＶＨ配列と比較して、フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４にわたって１つ以上（たとえば１〜１０）のアミノ酸配列のミスマッチを含み得る。
【００８７】
別の実施形態では、高いヒト相同性を有する抗体のＶＬドメインは、フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４にわたって１つ以上のヒトＶＬドメインと少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、又は少なくとも９６％の配列同一性又は配列相同性を呈し得る。１つの実施形態では、高いヒト相同性を有する抗体のＶＬドメインは、最も近く一致するヒトＶＬ配列と比較して、フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４にわたって１つ以上（たとえば１〜１０）のアミノ酸配列のミスマッチを含み得る。
【００８８】
高いヒト相同性を有する本発明の抗体及び抗原結合断片は、ヒト生殖細胞系列の配列と十分に高い配列同一性百分率を呈する天然の非ヒト抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含む抗体を含み得る。ある実施形態では、本発明の抗体及び抗原結合断片は、非ヒト抗体のヒト化又は生殖細胞系列化バリアント、たとえば元の抗体のヒト化又は生殖細胞系列化バリアントであるように操作されたラクダ科の従来の抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含む抗体である。
【００８９】
抗体又はその抗原結合断片は、配列１４のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び任意選択的に配列番号１５のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含んでよい。
【００９０】
ある実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含んでよい。ある実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含んでよい。
【００９１】
ある実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１４のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含んでよい。ある実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１５のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含んでよい。
【００９２】
ある実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含んでよい。
【００９３】
ある実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１４のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び配列番号１５のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含んでよい。
【００９４】
ある実施形態では、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含むモノクローナル抗体又はその抗原結合断片が本明細書で提供され、重鎖可変ドメインは配列番号１４として示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨ配列を含み、及び／又は軽鎖可変ドメインは配列番号１５として示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＬを含む。
【００９５】
抗体又は抗原結合断片のドメインが参照配列に対する特定の配列同一性百分率によって定義される実施形態では、ＶＨ及び／又はＶＬドメインは参照配列の中に存在する配列と同一のＣＤＲ配列を保持し、それにより変化はフレームワーク領域の中のみに存在する。ある実施形態では、それぞれ配列番号１４及び１５に対して特定の同一性百分率を有すると定義される重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインを含む抗体又は抗原結合断片は、以下のＣＤＲ配列：
アミノ酸配列ＹＥＷＥＴＶＶＶＧＤＬＭＹＥＹＥＹ（配列番号１３）を含むか又はそれからなるＶＨ  ＣＤＲ３、
アミノ酸配列ＲＩＤＰＥＤＡＧＴＫＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号１２）を含むか又はそれからなるＶＨ  ＣＤＲ２、
アミノ酸配列ＳＹＹＩＤ（配列番号４）を含むか又はそれからなるＶＨ  ＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＱＱＹＡＳＶＰＶＴ（配列番号１１）を含むか又はそれからなるＶＬ  ＣＤＲ３、
アミノ酸配列ＧＡＳＲＬＫＴ（配列番号１０）を含むか又はそれからなるＶＬ  ＣＤＲ２、
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＩＳＳＹＬＡ（配列番号９）を含むか又はそれからなるＶＬ  ＣＤＲ１
を有することになる。
【００９６】
非限定的な実施形態では、本発明の抗体は、そのアミノ酸配列が完全に又は実質的にヒトであるＣＨ１ドメイン及び／又はＣＬドメイン（それぞれ重鎖及び軽鎖からの）を含んでよい。本発明の抗体又は抗原結合断片がヒトの治療用途を意図した抗体である場合には、抗体の定常領域全体又は少なくともその一部は、完全な又は実質的なヒトアミノ酸配列を有することが通常である。したがって、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＬドメイン（及び存在する場合にはＣＨ４ドメイン）の１つ以上又はいずれかの組合せは、そのアミノ酸配列に関して完全に又は実質的にヒトであってよい。
【００９７】
有利には、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＬドメイン（及び存在する場合にはＣＨ４ドメイン）は全て、完全に又は実質的にヒトアミノ酸配列を有してよい。ヒト化若しくはキメラ抗体又は抗体断片の定常領域に関しては、用語「実質的にヒト」は、ヒト定常領域と少なくとも９０％、又は少なくとも９２％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９７％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を意味する。この文脈における用語「ヒトアミノ酸配列」は、生殖細胞系列、再配列された及び体細胞変異した遺伝子を含むヒト免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を意味する。本発明は、「完全なヒト」のヒンジ領域の存在が明示的に必要な実施形態を除いて、ヒト配列に関して１つ以上のアミノ酸の付加、欠失又は置換によって変化した「ヒト」配列の定常ドメインを含むポリペプチドをも意図している。
【００９８】
本発明のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体における「完全なヒト」のヒンジ領域の存在は、免疫原性を最小化するため及び抗体の安定性を最適化するために有益である。
【００９９】
本明細書の他の箇所で考察するように、重鎖及び／又は軽鎖の定常領域の中で、特にＦｃ領域の中で、１つ以上のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を行なってよいことが意図されている。アミノ酸の置換は、置換されるアミノ酸を異なった天然産生のアミノ酸、又は非天然産生の若しくは改変されたアミノ酸による置き換えをもたらし得る。たとえばグリコシル化パターン（たとえばＮ連結若しくはＯ連結のグリコシル化部位の付加又は欠失による）の変化のような他の構造的改変も許される。
【０１００】
ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体を、Ｆｃ領域の中で改変して、新生児受容体ＦｃＲｎへの結合親和性を増大させてよい。増大した結合親和性は、酸性ｐＨ（たとえばｐＨ約５．５〜ｐＨ約６．０）で測定可能である。増大した結合親和性は、中性ｐＨ（たとえばｐＨ約６．９〜ｐＨ約７．４）でも測定可能である。「増大した結合親和性」は、改変していないＦｃ領域と比べてＦｃＲｎへの増大した結合親和性を意味する。典型的には、改変していないＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４の野生型アミノ酸配列を有することになる。そのような実施形態では、改変されたＦｃ領域を有する抗体分子の増大したＦｃＲｎ結合親和性は、ＦｃＲｎについての野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４の結合親和性に比べて測定されることになる。
【０１０１】
ある実施形態では、Ｆｃ領域の中の１つ以上のアミノ酸残基は異なったアミノ酸で置換され、それによりＦｃＲｎへの結合が増大する。ＦｃＲｎ結合を増大させ、それにより抗体の薬物動態を改善するいくつかのＦｃ置換が報告されている。そのような置換は、たとえばＺａｌｅｖｓｋｙら、（２０１０）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２８（２）：１５７〜９頁；Ｈｉｎｔｏｎら、（２００６）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７６：３４６〜３５６頁；Ｙｅｕｎｇら、（２００９）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１８２：７６６３〜７６７１；Ｐｒｅｓｔａ  ＬＧ．、（２００８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０：４６０〜４７０頁；及びＶａｃｃａｒｏら、（２００５）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２３（１０）：１２８３〜８８頁に報告されており、これらの内容は全体として本明細書に組み込まれる。
【０１０２】
ある実施形態では、ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体はアミノ酸の置換Ｈ４３３Ｋ及びＮ４３４Ｆを含むか又はそれからなる改変されたヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインを含み、Ｆｃドメインの番号付けはＥＵの番号付けに従っている。さらなる実施形態では、本明細書に記載したＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体はアミノ酸の置換Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｈ４３３Ｋ及びＮ４３４Ｆを含むか又はそれからなる改変されたヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインを含み、Ｆｃドメインの番号付けはＥＵの番号付けに従っている。
【０１０３】
ある実施形態では、ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体は、対応する野生型ＩｇＧ配列に比べて２個まで、３個まで、４個まで、５個まで、６個まで、７個まで、８個まで、９個まで、１０個まで、１２個まで、１５個まで、２０個までの置換からなる改変されたヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインを含む。
【０１０４】
抗体の意図された用途に応じて、本発明の抗体をそのＦｃ受容体への結合特性に関して、たとえばエフェクター機能を調節するために改変することが望ましいことがある。たとえば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それによりこの領域における鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にしてよい。このようにして生成したホモダイマー抗体は、改善された内在化の能力及び／又は増大した補体介在性細胞殺滅性並びに抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を有し得る。Ｃａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７６：１１９１〜１１９５頁（１９９２）及びＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８：２９１８〜２９２２頁（１９９２）を参照。本発明は、化学療法剤、毒素（たとえば細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素的に活性な毒素又はその断片）、又は放射性同位元素（即ち放射性コンジュゲート）のような細胞毒性薬剤にコンジュゲートした、本明細書に記載した抗体を含む免疫コンジュゲートをも意図している。Ｆｃ領域は、参照により本明細書に組み込まれるＣｈａｎ、Ｃａｒｔｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ：Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１０巻、３０１〜３１６頁、２０１０に記載されているように、半減期の延長のために操作されてもよい。
【０１０５】
さらに別の実施形態では、Ｆｃ領域は抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を増大させるため、及び／又は１つ以上のアミノ酸を改変することによってＦｃγ受容体への抗体の親和性を増大させるために、改変される。
【０１０６】
特定の実施形態では、Ｆｃ領域はエフェクター機能がないように操作してよい。Ｆｃエフェクター機能を有しないＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体は、受容体ブロッキング剤として特に有用である。ある実施形態では、本発明の抗体は低減されたエフェクター機能を有する天然産生のＩｇＧアイソタイプ、たとえばＩｇＧ４由来のＦｃ領域を有してよい。ＩｇＧ４由来のＦｃ領域は、たとえばインビボにおけるＩｇＧ４分子の間の腕の交換を最小にする改変の導入によって、治療用有用性を増大させるようにさらに改変してよい。ＩｇＧ４由来のＦｃ領域は、Ｓ２２８Ｐ置換を含むように改変してよい。
【０１０７】
さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化が改変される。たとえば、非グリコシル化抗体（即ち、グリコシル化がない抗体）を作ることができる。グリコシル化は、たとえば標的抗原に対する抗体の親和性を増大するために変化させることができる。そのような炭水化物改変は、たとえば抗体の配列の中の１つ以上のグリコシル化部位を変化させることによって達成することができる。たとえば、可変領域フレームワークの１つ以上のグリコシル化部位の排除をもたらす１つ以上のアミノ酸の置換を行ない、それによりその部位におけるグリコシル化を排除することができる。そのような非グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増大させ得る。
【０１０８】
フコシル残基の量が低減したか又は完全に若しくは部分的に脱フコシル化された、低フコシル化抗体（Ｎａｔｓｕｍｅら、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、３巻、７〜１６頁、２００９）、又は分岐したＧｌｃＮａｃ構造が多い抗体のような変化した型のグリコシル化を有するバリアントＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体も、想定される。そのような変化したグリコシル化パターンは抗体のＡＤＣＣ活性を増大させ、「ネイティブな」ヒトＦｃドメインを含む等価の抗体と比べて典型的には１０倍のＡＤＣＣの増大を起こすことが実証されてきた。そのような炭水化物改変は、たとえば変化したグリコシル化酵素機構を有する宿主細胞中で抗体を発現させることによって達成することができる（Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ、Ｓａｔｏｈ、ｍＡｂｓ、１：３、２３０〜２３６頁、２００９に記載されているように）。ＡＤＣＣ機能が増大した非フコシル化抗体の例は、ＢｉｏＷａ  Ｉｎｃ．のＰｏｔｅｌｌｉｇｎｅｔ（登録商標）技術を用いて産生された抗体である。
【０１０９】
ヒト治療用途を意図した抗体は、典型的にはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＥ型、しばしばＩｇＧ型のものであり、この場合、これらは４つのサブクラス、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びｂ、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のいずれかに属し得る。これらのサブクラスのそれぞれの中で、Ｆｃ部分の中で１つ以上のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を行なうこと、又はたとえばＦｃ依存性機能を増大し又は低減させるために他の構造改変を行なうことが可能である。
【０１１０】
ある実施形態では、ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１に特異的に結合する抗体は、少なくとも１つの全長の免疫グロブリン重鎖及び／又は少なくとも１つの全長のラムダ若しくはカッパ軽鎖を含み、重鎖は配列番号１６のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、軽鎖は配列番号１７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
【０１１１】
ある実施形態では、ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１に特異的に結合する抗体は、少なくとも１つの全長の免疫グロブリン重鎖及び／又は少なくとも１つの全長のラムダ若しくはカッパ軽鎖を含み、重鎖は配列番号１６のアミノ酸配列を含み、軽鎖は配列番号１７のアミノ酸配列を含む。
【０１１２】
ある実施形態では、ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１に特異的に結合する抗体は、少なくとも１つの全長の免疫グロブリン重鎖及び／又は少なくとも１つの全長のラムダ若しくはカッパ軽鎖を含み、重鎖は配列番号１６のアミノ酸配列からなり、軽鎖は配列番号１７のアミノ酸配列からなる。
【０１１３】
ある実施形態では、配列番号１６として示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する重鎖、及び／又は配列番号１７として示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する軽鎖を含むモノクローナル抗体が本明細書で提供される。
【０１１４】
ある実施形態では、配列番号１６として示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する重鎖を含むモノクローナル抗体が本明細書で提供される。ある実施形態では、配列番号１７として示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する軽鎖を含むモノクローナル抗体が本明細書で提供される。ある実施形態では、配列番号１６として示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する重鎖及び配列番号１７として示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する軽鎖を含むモノクローナル抗体が本明細書で提供される。
【０１１５】
抗体の鎖が参照配列に対する特定の配列同一性百分率によって定義される実施形態では、重鎖及び／又は軽鎖は参照配列の中に存在する配列と同一のＣＤＲ配列を保持し、それにより変化はＣＤＲ領域の外側にのみ存在する。特に、それぞれ配列番号１６及び１７に対して特定の同一性百分率を有すると定義される重鎖及び／又は軽鎖を含む抗体又は抗原結合断片は、以下のＣＤＲ配列：
アミノ酸配列ＹＥＷＥＴＶＶＶＧＤＬＭＹＥＹＥＹ（配列番号１３）を含むか又はそれからなるＶＨ  ＣＤＲ３、
アミノ酸配列ＲＩＤＰＥＤＡＧＴＫＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号１２）を含むか又はそれからなるＶＨ  ＣＤＲ２、
アミノ酸配列ＳＹＹＩＤ（配列番号４）を含むか又はそれからなるＶＨ  ＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＱＱＹＡＳＶＰＶＴ（配列番号１１）を含むか又はそれからなるＶＬ  ＣＤＲ３、
配列番号１０［ＧＡＳＲＬＫＴ］を含むか又はそれからなるＶＬ  ＣＤＲ２、及び
アミノ酸配列ＱＡＳＱＳＩＳＳＹＬＡ（配列番号９）を含むか又はそれからなるＶＬ  ＣＤＲ１
を有し得る。
【０１１６】
ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１への結合
本発明の抗体及び抗原結合断片は、ＧＡＲＰとＴＧＦ−β１の複合体、特にヒトＧＡＲＰとヒトＴＧＦ−β１の複合体に結合する。本明細書の他の箇所で説明したように、ＧＡＲＰは制御Ｔ細胞の表面上に発現する膜貫通タンパク質であり、潜在型ＴＧＦ−βの受容体として作用する。図１は、制御Ｔ細胞の細胞表面でＧＡＲＰと潜在型ＴＧＦ−βとの間に形成される複合体の概略図を含む。
【０１１７】
本発明の抗体及び抗原結合断片が結合するＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１複合体は、細胞表面でＧＡＲＰとＴＧＦ−β１との間に形成されるネイティブのＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１複合体である。
【０１１８】
本発明の抗体及び抗原結合断片は、ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１の複合体に結合するが、ＴＧＦ−β１又は潜在型ＴＧＦ−βの存在がないとＧＡＲＰに結合しないという特徴がある。抗体及び抗原結合断片は、ＴＧＦ−β１の存在下にのみＧＡＲＰに結合する。特に、抗体及び抗原結合断片は、潜在型ＴＧＦ−β１の存在下にのみＧＡＲＰに結合する。抗体及び抗原結合断片は、Ｔｒｅｇ細胞からの活性ＴＧＦ−βの放出をブロックし又は阻害し得る。
【０１１９】
本発明の抗体及びその抗原結合断片の標的抗原は、２つの別個のタンパク質を含む複合体であるので、抗体及び抗原結合断片が結合するエピトープは、一次ではなくコンフォメーショナルなエピトープである。コンフォメーショナルなエピトープはＧＡＲＰからの少なくとも１つの残基と、潜在型ＴＧＦ−β１からの少なくとも１つの残基を含む。好ましい実施形態では、コンフォメーショナルなエピトープはＧＡＲＰからの少なくとも１つの残基、潜在型ＴＧＦ−β１の潜在性関連ペプチド（ＬＡＰ）からの少なくとも１つの残基及び成熟ＴＧＦ−β１からの少なくとも１つの残基を含む。
【０１２０】
本発明の抗体及び抗原結合断片は、ヒトＧＡＲＰとヒトＴＧＦ−β１とによって形成される複合体のエピトープに結合してよく、エピトープはＹ１３７、Ｓ１３８、Ｇ１３９、Ｔ１６２及びＲ１６３から選択されるＧＡＲＰからの少なくとも１つの残基（配列番号３３に関して）、並びにＴＧＦ−β１からの少なくとも１つの残基を含む。好ましい実施形態では、エピトープは少なくともＧＡＲＰの残基Ｙ１３７、Ｓ１３８、Ｇ１３９、Ｔ１６２及びＲ１６３（配列番号３３に関して）を含む。
【０１２１】
エピトープはＴＧＦ−β１ポリペプチド（配列番号３４）からの少なくとも１つの残基を含んでよく、任意選択的に少なくとも１つの残基はＫ３３８である。エピトープはＴＧＦ−β１の潜在性関連ペプチド（ＬＡＰ）からの少なくとも１つの残基及び成熟ＴＧＦ−β１からの少なくとも１つの残基を含んでよい。エピトープはＬＡＰのＲ５８及び成熟ＴＧＦ−β１のＫ３３８を含んでよい（配列番号３４に関して）。
【０１２２】
本発明の抗体及び抗原結合断片は、ＧＡＲＰとＴＧＦ−β１の複合体に結合する。本発明の抗体及び抗原結合断片はさらに、ヒトＧＡＲＰとヒトＴＧＦ−β２の複合体及び／又はヒトＧＡＲＰとヒトＴＧＦ−β３の複合体に結合してよい。
【０１２３】
ある実施形態では、本発明の抗体及び抗原結合断片は、ＧＡＲＰとＴＧＦ−β１の複合体に高い親和性で結合する。本明細書で用いる場合、用語「親和性」又は「結合親和性」は、抗体結合に関する技術における通常の意味に基づいて理解されるべきであり、抗原と、抗体又はその抗原結合断片の結合部位との間の結合の強さ及び／又は安定性を反映している。
【０１２４】
抗体又はその抗原結合断片の、それぞれの抗原に対する結合親和性は、当技術で既知の手法を用いて実験的に決定することができる。たとえば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）のようなＳＰＲ装置は、抗体又は抗体断片が固定化された標的の上を特定の流れ条件下で通過する間の、バイオセンサーチップ上の標的タンパク質又は抗原の固定化に基づいて親和性を測定する。これらの実験によってｋｏｎ及びｋｏｆｆの測定が得られ、これらはＫＤ値に置き換えることができ、ここでＫＤは抗原と抗体又はその断片との解離の平衡定数である。ＫＤ値が小さくなれば、抗体とその標的抗原との間の結合相互作用が強くなる。
【０１２５】
上記のように、抗体の親和性は、たとえば本明細書の他の箇所に記載したプロトコルを用いてＢｉａｃｏｒｅ（商標）又はＳＰＲによって決定することができる。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）又はＳＰＲによって測定されるＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１複合体に対する抗体又は抗原結合断片の親和性は、たとえば実施例２に記載したように、組み換え発現したＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１複合体を用いて決定することができる。
【０１２６】
本発明のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体又はその抗原結合断片は、Ｆａｂとして試験した際に、７×１０−４ｓ−１未満、５×１０−４ｓ−１未満、３×１０−４ｓ−１未満、１．５×１０−４ｓ−１未満の、ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１複合体についてのオフレート（ｋｏｆｆ）を呈し得る。本発明のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β抗体又はその抗原結合断片は、１×１０−６ｓ−１〜５×１０−４ｓ−１の範囲、好ましくは１×１０−６ｓ−１〜３×１０−４ｓ−１の範囲、より好ましくは１×１０−５ｓ−１〜１．５×１０−４ｓ−１の範囲の、ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１の複合体についてのオフレート（ｋｏｆｆ）を呈し得る。
【０１２７】
本発明のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体は、５×１０−９Ｍ未満、２×１０−９Ｍ未満のＫＤ値を呈し得る。好ましい実施形態では、本発明のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体は、１．７×１０−９Ｍ未満のＫＤ値を呈する。
【０１２８】
ある実施形態では、ＧＡＲＰとＴＧＦ−β１の複合体に結合する本明細書に記載した抗体又は抗原結合断片は、ＧＡＲＰ及びＴＧＦ−βの１つ以上の種同族体、たとえば非ヒト霊長類由来のＧＡＲＰ及びＴＧＦ−βの同族体と交差反応し得る。
【０１２９】
ある実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合断片は、マウス由来のＧＡＲＰとＴＧＦ−βの複合体とは交差反応しない。その代わりに又はさらに、抗体又は抗原結合断片は、非ヒト霊長類由来のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β複合体、特にカニクイザル由来のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β複合体に結合し得る。他種同族体との交差反応性は、治療用抗体の開発及び試験において特に有利であり得る。たとえば、治療用抗体の前臨床毒性試験は、それだけに限らないが、カニクイザルを含む霊長類種で行なわれることが多い。したがってこれらの種同族体との交差反応性は、臨床用候補としての抗体の開発のために特に有利であり得る。
【０１３０】
改善された安定性
本発明のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体は、改善された安定性を示すという理由で、過去に記載されたＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体と比較して改善されている。特に、ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体の安定性は、ＷＯ２０１５／０１５００３及びＷＯ２０１６／１２５０１７に記載されたＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１参照抗体ＬＨＧ１０．６の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列を有する抗体と比較して改善されている。
【０１３１】
ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β抗体ＬＨＧ１０．６は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列の以下の組合せ：
ＮＥＷＥＴＶＶＶＧＤＬＭＹＥＹＥＹ（配列番号６）からなる重鎖ＣＤＲ３、
ＲＩＤＰＥＤＧＧＴＫＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号５）からなる重鎖ＣＤＲ２、
ＳＹＹＩＤ（配列番号４）からなる重鎖ＣＤＲ１、
ＱＱＹＡＳＶＰＶＴ（配列番号１１）からなる軽鎖ＣＤＲ３、
ＧＡＳＲＬＫＴ（配列番号１０）からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び
ＱＡＳＱＳＩＳＳＹＬＡ（配列番号９）からなる軽鎖ＣＤＲ１
を有している。
【０１３２】
本明細書の他の箇所に報告したように、ＬＨＧ１０．６の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ配列を有するＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体は安定性を欠くことが見出された。特に、ＬＨＧ１０．６（本明細書の他の箇所ではｍＡｂ  ３９Ｂ６  ＩｇＧ４及び３９Ｂ６  ＩｇＧ１と称する）の生殖細胞系列化されたモノクローナル抗体バリアントは、ＰＢＳとＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎの両方の中で３７℃で保存した場合に低い標的結合活性の傾向を呈することが見出された（たとえば図２参照）。この不安定性は、少なくとも部分的に、ＨＣＤＲ３のＮ９５の位置、即ち重鎖ＣＤＲ３の最初の残基における異性化及び脱アミド化に起因すると考えられた。
【０１３３】
本発明のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体及び抗原結合断片は、そのＣＤＲ配列、特にその重鎖ＣＤＲ配列に関して異なり、それにより安定性が改善されている。特に、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２又はＶＨ  ＣＤＲ２）配列はＧ５５Ａ置換を含むように改変され、それにより本発明の抗体のＨＣＤＲ２配列はＲＩＤＰＥＤＡＧＴＫＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号１２）で表されるＨＣＤＲ２を含む。さらに、重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３又はＶＨ  ＣＤＲ３）はＮ９５Ｙ置換を含むように改変され、それにより本発明の抗体のＨＣＤＲ３配列はＹＥＷＥＴＶＶＶＧＤＬＭＹＥＹＥＹ（配列番号１３）で表されるＨＣＤＲ３を含む。本発明の抗体は脱アミド化又は異性化を受けない。さらに、本発明のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体は酸化に対して比較的抵抗性があることが驚くべきことに見出された。脱アミド化、異性化及び酸化に対するこの抵抗性は、本発明の抗体の改善された安定性、特に温度３７℃で測定された改善された安定性と相関している。
【０１３４】
さらに、本発明の抗体及び抗原結合断片は、重鎖ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の改変が参照抗体ＬＨＧ１０．６と比較して標的結合活性を顕著には低下させないので、驚くほど有利である。本明細書に例示したように、本発明のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体は３７℃で比較的安定であり、参照抗体ＬＨＧ１０．６又はその生殖細胞系列化バリアント（３９Ｂ６）と比較してＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１複合体への結合親和性において顕著な低減を呈しない。他の箇所に記載したように、好ましい実施形態では、本発明のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体は１．７×１０−９Ｍ未満のＫＤ値を呈する。
【０１３５】
本明細書で報告したように、Ａｓｎ（Ｎ）残基を除去するＨＣＤＲ３のＮ９５の位置の全ての置換がＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１複合体との結合親和性をも保持しながら抗体の安定性を改善することができるわけではない。Ｎ９５Ｖの置換を有する生殖細胞系列化モノクローナル抗体バリアント（本明細書で３９Ｂ６−ＡＶＥと称する）は、脱アミド化及び異性化に抵抗することが見出されたが、３７℃で２８時間の保存で顕著な酸化を受けた。このＮ９５Ｖバリアントの結合活性も、３７℃で５６日間の保存で顕著に低下することが見出された。本発明者らは、重鎖の隣接する位置９６（即ちＨＣＤＲ３の第２の残基）における嵩高な置換は、安定性を改善し高い親和性の抗原結合活性を保持することができないことも見出した。本明細書で例示したように、本発明者らはＨＣＤＲ３ドメインにおけるＥ９６Ｋ及びＥ９６Ｒの置換を含む２つの生殖細胞系列化モノクローナル抗体バリアントを試験した。Ｅ９６Ｋバリアント（本明細書で３９Ｂ６−ＡＮＫと称する）は酸化を受けなかったが、３７℃、２８日間では脱アミド化及び異性化の対象となり、５６日間では結合活性の顕著な低下を受けた。Ｅ９６Ｒバリアント（本明細書で３９Ｂ６−ＡＮＲと称する）は３７℃、２８日間で顕著な酸化及び脱アミド化を受け、５６日間で結合活性の低下を受けた。
【０１３６】
本発明の好ましい実施形態では、ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１複合体に特異的に結合し、改善された安定性を呈する抗体は少なくとも１つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び少なくとも１つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、
ＶＨ  ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＹＥＷＥＴＶＶＶＧＤＬＭＹＥＹＥＹ（配列番号１３）を含むか又はそれからなり、
ＶＨ  ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＲＩＤＰＥＤＡＧＴＫＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号１２）を含むか又はそれからなり、
ＶＨ  ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＳＹＹＩＤ（配列番号４）を含むか又はそれからなり、
ＶＬ  ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＱＱＹＡＳＶＰＶＴ（配列番号１１）を含むか又はそれからなり、
ＶＬ  ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＧＡＳＲＬＫＴ（配列番号１０）を含むか又はそれからなり、
ＶＬ  ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＱＡＳＱＳＩＳＳＹＬＡ（配列番号９）を含むか又はそれからなる。
【０１３７】
本発明のある好ましい実施形態では、ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１複合体に特異的に結合し、改善された安定性を呈する抗体は少なくとも１つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び少なくとも１つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、
ＶＨ  ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＹＥＷＥＴＶＶＶＧＤＬＭＹＥＹＥＹ（配列番号１３）を含み、
ＶＨ  ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＲＩＤＰＥＤＡＧＴＫＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号１２）を含み、
ＶＨ  ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＳＹＹＩＤ（配列番号４）を含み、
ＶＬ  ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＱＱＹＡＳＶＰＶＴ（配列番号１１）を含み、
ＶＬ  ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＧＡＳＲＬＫＴ（配列番号１０）を含み、
ＶＬ  ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＱＡＳＱＳＩＳＳＹＬＡ（配列番号９）を含む。
【０１３８】
本発明のある好ましい実施形態では、ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１複合体に特異的に結合し、改善された安定性を呈する抗体は少なくとも１つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び少なくとも１つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み、
ＶＨ  ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＹＥＷＥＴＶＶＶＧＤＬＭＹＥＹＥＹ（配列番号１３）からなり、
ＶＨ  ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＲＩＤＰＥＤＡＧＴＫＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号１２）からなり、
ＶＨ  ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＳＹＹＩＤ（配列番号４）からなり、
ＶＬ  ＣＤＲ３はアミノ酸配列ＱＱＹＡＳＶＰＶＴ（配列番号１１）からなり、
ＶＬ  ＣＤＲ２はアミノ酸配列ＧＡＳＲＬＫＴ（配列番号１０）からなり、
ＶＬ  ＣＤＲ１はアミノ酸配列ＱＡＳＱＳＩＳＳＹＬＡ（配列番号９）からなる。
【０１３９】
これらの抗体は好ましくは１．７×１０−９Ｍ未満のＫＤ値を呈する。
【０１４０】
本発明の特に好ましい実施形態では、ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１複合体に特異的に結合し、改善された安定性を呈する抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び任意選択的に配列番号１５のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
【０１４１】
本発明の特に好ましい実施形態では、ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１複合体に特異的に結合し、改善された安定性を呈する抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
【０１４２】
本発明の特に好ましい実施形態では、ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１複合体に特異的に結合し、改善された安定性を呈する抗体は、配列番号１４のアミノ酸配列からなる重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び配列番号１５のアミノ酸配列からなる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。
【０１４３】
本発明のさらに好ましい実施形態では、ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１複合体に特異的に結合し、改善された安定性を呈する抗体は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖及び任意選択的に配列番号１７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖を含む。
【０１４４】
本発明のさらに好ましい実施形態では、ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１複合体に特異的に結合し、改善された安定性を呈する抗体は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０１４５】
本発明のさらに好ましい実施形態では、ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１複合体に特異的に結合し、改善された安定性を呈する抗体は、配列番号１６のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１７のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む。
【０１４６】
ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β抗体をコードするポリヌクレオチド
本発明は、本発明のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体又は抗原結合断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子、宿主細胞又は無細胞発現システムにおける抗体又はその断片の発現を可能にする制御配列に操作可能に連結された本発明の前記ヌクレオチド配列を含む発現ベクター、及び前記発現ベクターを含む宿主細胞又は無細胞発現システムをも提供する。
【０１４７】
ある実施形態では、本発明によるＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体又は抗原結合断片の重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインは第１及び第２のポリヌクレオチド配列によってコードされ、第１及び第２のポリヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号１８及び１９のアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、本発明のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体をコードするポリヌクレオチドは、ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体の機能性ＶＨ又はＶＬドメインをコードするバリアント配列を含んでよい。ＶＨドメインをコードするバリアント配列は、配列番号１８と最適に整列した際に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％の配列同一性を呈し得る。またＶＬドメインをコードするバリアント配列は、配列番号１９と最適に整列した際に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％の配列同一性を呈し得る。
【０１４８】
ある実施形態では、本発明によるＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体又は抗原結合断片の重鎖及び／又は軽鎖は第１及び第２のポリヌクレオチド配列によってコードされ、第１及び第２のポリヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号２０及び２１のアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、本発明のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体をコードするポリヌクレオチドは、ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体の重鎖又は軽鎖をコードするバリアント配列を含んでよい。重鎖をコードするバリアント配列は、配列番号２０と最適に整列した際に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％の配列同一性を呈し得る。また軽鎖をコードするバリアント配列は、配列番号２１と最適に整列した際に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％の配列同一性を呈し得る。
【０１４９】
この文脈において、２つのポリヌクレオチド配列の間の配列同一性百分率は、最適の様式で整列し、その中で比較すべきポリヌクレオチド配列がこれらの２つの配列の間の最適の整列についての参照配列に関して付加又は欠失を含み得るこれら２つの配列を比較することによって、決定することができる。同一性の百分率は、ヌクレオチド残基が２つの配列の間で同一である同一位置の数を決定し、この同一位置の数を比較ウィンドウの中の位置の全数で割り、これら２つの配列の間の同一性の百分率を得るために得られた結果を１００倍することによって計算される。たとえば、ＢＬＡＳＴプログラム、即ちｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．／ｇｏｒｆ／ｂｌ２で入手可能な「ＢＬＡＳＴ２配列」（Ｔａｔｕｓｏｖａら、「Ｂｌａｓｔ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  −  ａ  ｎｅｗ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．、１７４：２４７〜２５０頁）を用いることができ、用いるパラメーターはデフォルトによって与えられるものであり（特にパラメーター「オープンギャップペナルティ」：５、「エクステンションギャップペナルティ」：２であり、選択するマトリックスはたとえばプログラムによって提案される「ＢＬＯＳＵＭ６２」である）、比較すべき２つの配列の間の同一性の百分率はプログラムによって直接計算される。
【０１５０】
本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド分子は、たとえば組み換えＤＮＡ分子を含む。用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド分子」は、本明細書で交換可能に用いられ、一本鎖又は二本鎖の任意のＤＮＡ又はＲＮＡ分子、一本鎖の場合にはその相補性配列の分子を意味する。核酸分子を考察する場合には、特定の核酸分子の配列又は構造は、本明細書において５’から３’の方向に配列を提供する通常の慣例に従って記載し得る。本発明のいくつかの実施形態では、核酸又はポリヌクレオチドは「単離」される。この用語は、核酸分子に適用する場合には、それが由来する生命体の天然に産生するゲノムにおいて直接隣接している配列から分離された核酸分子を意味する。たとえば、「単離された核酸」は、プラスミド若しくはウイルスベクターのような、ベクターに挿入されたＤＮＡ分子、又は原核細胞若しくは真核細胞又は非ヒト宿主生命体のゲノムＤＮＡに組み込まれたＤＮＡ分子を含んでよい。ＲＮＡ分子に適用する場合には、用語「単離されたポリヌクレオチド」は、一義的には上で定義した単離されたＤＮＡ分子によってコードされたＲＮＡ分子を意味する。あるいは、この用語は、天然の状態で（即ち細胞内又は組織内で）それが会合している他の核酸から精製され／分離されたＲＮＡ分子を意味し得る。単離されたポリヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）は、生物学的又は合成的手段によって直接産生され、その産生の間に存在する他の成分から分離された分子をさらに表し得る。
【０１５１】
本発明による抗体の組み換え産生のため、抗体をコードするポリヌクレオチドを（標準的な分子生物学の手法を用いて）調製し、選択した宿主細胞又は無細胞発現システムにおいて複製可能なベクターに挿入する。好適な宿主細胞は原核細胞、酵母、又はより高級な真核細胞、具体的には哺乳類細胞であってよい。有用な哺乳類宿主細胞株の例としては、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胎児腎臓株（２９３又は懸濁培養中で増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、３６：５９頁（１９７７））；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６頁（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３〜２５１頁（１９８０））；マウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０−ＡＧ１４（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５８１；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ８２８７）又はＮＳ０（ＨＰＡ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｎｏ．８５１１０５０３）；サル腎細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト頚癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、３８３：４４〜６８頁（１９８２））；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株（Ｈｅｐ  Ｇ２）、並びにＤＳＭのＰＥＲＣ−６細胞株がある。これらの宿主細胞のそれぞれにおける使用のために好適な発現ベクターも当技術で一般に知られている。
【０１５２】
用語「宿主細胞」は一般に培養された細胞株を意味することに留意されたい。その中に本発明による抗体又は抗原結合断片をコードする発現ベクターが導入されたヒト全体は、「宿主細胞」の定義から明確に除外される。
【０１５３】
抗体の産生
さらなる態様では、本発明は、抗体の発現を可能にする条件下で抗体をコードする１つ以上のポリヌクレオチド（たとえば発現ベクター）を含む宿主細胞（又は無細胞発現システム）を培養するステップ、及び発現した抗体を回収するステップを含む、本発明の抗体を産生する方法も提供する。この組み換え発現プロセスは、ヒト治療用途を意図したモノクローナル抗体を含む本発明によるＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体を含む抗体の大スケール産生のために用いることができる。インビボ治療用途に適した組み換え抗体の大スケール製造のための好適なベクター、細胞株及び産生プロセスは当技術で一般に入手可能であり、当業者にはよく知られている。
【０１５４】
医薬組成物
本発明の範囲は、１つ以上の薬学的に許容される担体又は賦形剤とともに製剤化された本発明のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体又はその抗原結合断片の１つ以上の組合せを含む医薬組成物を含む。そのような組成物は、（たとえば２つ以上の異なった）ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体の１つ以上の組合せを含んでよい。ヒト治療用途のためのモノクローナル抗体を製剤化する手法は当技術で周知であり、たとえばその内容が全体として本明細書に組み込まれるＷａｎｇら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、９６巻、１〜２６頁（２００７）に概説されている。
【０１５５】
ある実施形態では、医薬組成物は、それだけに限らないが、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、硬膜外、経鼻、経口、直腸、局所、吸入、頬側（たとえば舌下）、及び経皮投与を含む任意の好適な投与経路を介して対象に投与するために製剤化される。
【０１５６】
これらの組成物において用いられる薬学的に許容される賦形剤には、それだけに限らないが、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミンのような血清タンパク質、リン酸塩のような緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩、又は硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩のような電解質、コロイダルシリカ、トリケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質（たとえばカルボキシメチルセルロースナトリウム）、ポリエチレングリコール、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール及び羊毛脂が含まれる。
【０１５７】
ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１の治療有用性
本発明の抗体及び抗原結合断片は処置の方法において用いられ、治療有効量のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体又はその抗原結合断片が処置を必要とする対象に投与される。ある実施形態では、本発明の抗体及び抗原結合断片は処置の方法において用いられ、治療有効量のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体又はその抗原結合断片が処置を必要とするヒト対象に投与される。ヒトＧＡＲＰとＴＧＦ−β１の複合体に結合する抗体又はその抗原結合断片が、医薬としての使用のために本明細書で提供される。
【０１５８】
本発明の抗体及び抗原結合断片は制御Ｔ細胞の上のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β複合体に結合し、活性ＴＧＦ−βの産生又は放出をブロックし又は阻害することができる。したがって、本発明のさらなる態様では、ＴＧＦ−β関連障害を有するか有していると疑われる対象を処置するための方法が本明細書で提供される。そのような方法は、処置を必要とする対象に治療有効量の本発明のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体を投与するステップを含む。
【０１５９】
例示的なＴＧＦ−β関連障害には、炎症性疾患、慢性感染症、がん、線維症、心血管系疾患、脳血管系疾患（たとえば虚血性発作）及び神経変性疾患が含まれるが、それだけに限らない。ある実施形態では、ＴＧＦ−β関連障害は、慢性感染症である。ある実施形態では、ＴＧＦ−β関連障害はがんである。
【０１６０】
対象への投与における使用のため、本発明の抗体及び抗原結合断片は医薬組成物として製剤化される。組成物は経口、非経口、吸入スプレー、局所、直腸、経鼻、経頬、経膣又は埋め込まれたリザーバを介して投与してよい。用語「投与」は、本明細書で用いる場合、限定なしに皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、滑液内、胸骨内、髄腔内、肝内、病巣内、腫瘍内、及び頭蓋内注射又は注入手法を含む。
【０１６１】
組成物の無菌の注入可能な形態は、水性又は油性の懸濁液であってよい。これらの懸濁液は、好適な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて当技術で既知の手法に従って製剤化できる。無菌の注入可能な調製物は、無毒性の非経口に許容できる希釈剤又は溶媒の中の無菌の注入可能な溶液又は懸濁液であってもよい。採用可能な許容できる媒体及び溶媒には、水、リンゲル液及び等張の塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌の固定油が溶媒又は懸濁媒体として便利に採用される。この目的のため、合成のモノ−又はジ−グリセリドを含む任意のブランドの固定油を採用してよい。オレイン酸及びそのグリセリド誘導体のような脂肪酸は、特にそのポリオキシエチル化バージョンにおけるオリーブ油又はヒマシ油のような天然の薬学的に許容される油と同じく、注射液の調製に有用である。これらの油溶液又は懸濁液は、乳濁液及び懸濁液を含む薬学的に許容される剤型の製剤化において一般に用いられるカルボキシメチルセルロース又は同様の分散剤のような長鎖アルコール希釈剤又は分散剤を含んでもよい。薬学的に許容される固体、液体又は他の剤型の製造に一般に用いられるＴｗｅｅｎ、Ｓｐａｎ、及び他の乳化剤又は生体利用性促進剤のような他の一般に用いられる界面活性剤も、製剤の目的のために用いてよい。
【０１６２】
医薬組成物中の抗体又はその抗原結合断片の投与のためのスケジュール及び用量は、これらの型の製品についての既知の方法に従って、たとえばメーカーの指示書を用いて決定することができる。たとえば、本発明の医薬組成物中に存在する抗体は、１００ｍｇ（１０ｍＬ）又は５００ｍｇ（５０ｍＬ）の使い捨てバイアル中、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で供給することができる。製品は９．０ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム、７．３５ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム二水塩、０．７  ｉｎｇ／ｍＬのポリソーベート８０、及び滅菌注射用水の中で静脈内（ＩＶ）投与のために製剤化される。ｐＨは６．５に調節される。
【０１６３】
臨床使用のため、抗体又は抗原結合断片は１つ以上の用量で対象に投与することができる。非経口投与経路のため、抗体又は抗原結合断片の単一用量は、たとえば約０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重とすることができる。１つの実施形態では、抗体又は抗原結合断片の単一用量は、たとえば約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重とすることができる。１つの実施形態では、抗体又は抗原結合断片の単一用量は、たとえば約１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重とすることができる。繰り返し投与のため、個別の用量を同じ又は異なる投与経路によって投与することができる。また繰り返し投与のため、個別の用量は同じでも異なってもよい。たとえば、第１の又は負荷用量は引き続く用量より多くてよい。また繰り返し投与のため、個別の用量を固定されたスケジュールで投与してもよく、たとえば対象の臨床状態又は臨床応答に基づいて調節可能な又は変動するスケジュールで投与してもよい。また繰り返し投与のため、個別の用量は典型的には毎日１回、１日おきに１回、３、４、５、６又は７日おきに１回、週１回、２週に１回、３週又は４週おきに１回、又は１月おきに１回投与することができる。他のスケジュールも本発明によって意図されている。
【０１６４】
これらの用量及びスケジュールは例示的なものであり、最適のスケジュール及び治療計画は投与すべき特定の抗体又は抗原結合断片、処置すべき疾患又は障害、処置すべき対象の大きさ、年齢及び病態、投与の経路、対象に行なわれている他の治療、及び特定の抗体の親和性及び耐性等の要因を考慮して決定することができることが認識される。そのような要因及び用量の考慮は、１回以上の臨床試験において決定することができる。
【０１６５】
本発明はまた、治療有効量の本発明の抗体又は抗原結合断片を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における免疫系を増強するための方法を提供する。本発明はまた、治療有効量の本発明の抗体又は抗原結合断片を対象に投与することを含む、それを必要とする対象におけるヒトＴｒｅｇの免疫抑制機能を阻害するための方法を提供する。
【０１６６】
本発明はまた、本発明のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体及び抗原結合断片を用いるがんの処置のための方法を提供する。そのような方法は、それを必要とする対象の腫瘍環境における免疫抑制を低減することを含み得る。
【０１６７】
ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体又はその抗原結合断片ががんを処置する方法における使用のためである実施形態については、抗体又はその抗原結合断片は、１つ以上の付加的ながんの処置、たとえば１つ以上の免疫治療剤と組み合わせて投与してよい。
【０１６８】
ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体が免疫治療剤と組み合わせて投与される実施形態については、前記免疫治療剤は腫瘍ワクチンであってよい。あるいは、免疫治療剤は免疫刺激性抗体であってよい。理論に縛られることを望むものではないが、本発明の抗体は免疫抑制があればこれを防止し又は軽減することによって免疫治療剤の有効性を改善する可能性がある。ある実施形態では、免疫治療剤との組合せによって相乗効果が呈され得る。
【０１６９】
副腎皮質癌、肛門がん、膀胱がん、脳腫瘍、グリオーマ、乳癌、カルシノイド腫瘍、頚がん、結腸癌、子宮内膜がん、食道がん、肝外胆管がん、エウィング腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、眼がん、胆嚢がん、胃がん、胚細胞腫瘍、妊娠絨毛性腫瘍、頭頚部がん、下咽頭がん、アイレット細胞癌、腎がん、喉頭がん、白血病、唇及び口腔がん、肝がん、肺がん、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、メルケル細胞癌、転移性扁平上皮頭頚部がん、骨髄腫、新生物、鼻咽頭がん、神経芽腫、口腔がん、口腔咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵がん、洞及び鼻がん、副甲状腺がん、陰茎がん、褐色細胞腫、下垂体がん、形質細胞腫、前立腺がん、横紋筋肉腫、直腸がん、腎細胞癌、唾液腺がん、皮膚がん、カポシ肉腫、Ｔ細胞リンパ腫、軟組織肉腫、胃がん、精巣がん、胸腺腫、甲状腺がん、尿道がん、子宮がん、膣がん、外陰がん、又はウィルムス腫瘍を含むがそれだけに限らない種々のがんは、本明細書に記載した方法に従って処置することができる。
【０１７０】
当技術で既知の腫瘍ワクチンとして使用するための好適な腫瘍抗原には、たとえば（ａ）ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＳＸ２、ＳＣＰ１並びにＲＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ及びＭＡＧＥファミリーポリペプチド、たとえばＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、及びＭＡＧＥ−１２（これらはたとえば黒色腫、肺腫瘍、頭頚部腫瘍、ＮＳＣＬＣ、乳腫瘍、胃腸腫瘍、及び膀胱腫瘍に対処するために用いることができる）のようながん−精巣抗原、（ｂ）転移した抗原、たとえばｐ５３（種々の固形腫瘍、たとえば結腸直腸がん、肺がん、頭頚部がんに関連する）、ｐ２１／Ｒａｓ（たとえば黒色腫、膵がん及び結腸直腸がんに関連する）、ＣＤ４（たとえば黒色腫に関連する）、ＭＵＭ１（たとえば黒色腫に関連する）、カスペース−８（たとえば頭頚部がんに関連する）ＣＩＡ０２０５（たとえば膀胱がんに関連する）、ＨＬＡ−Ａ２−Ｒ１７０１、βカテニン（たとえば黒色腫に関連する）、ＴＣＲ（たとえばＴ細胞非ホジキンリンパ腫に関連する）、ＢＣＲ−ａｂｌ（たとえば慢性骨髄性白血病に関連する）、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ＩＡ０２０５、ＣＤＣ−２７及びＬＤＬＲ−ＦＵＴ、（ｃ）過発現した抗原、たとえばガレクチン４（たとえば結腸直腸がんに関連する）、ガレクチン９（たとえばホジキン病に関連する）、プロテイナーゼ３（たとえば慢性骨髄性白血病に関連する）、ＷＴ１（たとえば種々の白血病に関連する）、カーボニックアンヒドラーゼ（たとえば腎がんに関連する）、アルドラーゼＡ（たとえば肺がんに関連する）、ＰＲＡＭＥ（たとえば黒色腫に関連する）、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（たとえば乳がん、結腸がん、肺がん及び卵巣がんに関連する）、α−フェトプロテイン（たとえば肝癌に関連する）、ＳＡ（たとえば結腸直腸がんに関連する）、ガストリン（たとえば膵がん及び胃がんに関連する）、テロメラーゼ触媒タンパク質、ＭＵＣ−１（たとえば乳がん及び卵巣がんに関連する）、Ｇ−２５０（たとえば腎細胞癌に関連する）、及び癌胎児性抗原（たとえば乳がん、肺がん、及び直腸結腸がんのような胃腸管のがんに関連する）、（ｄ）共有された抗原、たとえばＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ  Ａのような黒色腫−メラミン細胞分化抗原、ｇｐ１００、ＭＣ１Ｒ、メラミン細胞刺激ホルモン受容体、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連プロテイン−１／ＴＲＰ１及びチロシナーゼ関連プロテイン−２／ＴＲＰ２（たとえば黒色腫に関連する）、（ｅ）たとえば前立腺がんに関連するＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＨ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ１、ＰＳＭ−Ｐ２のような前立腺関連抗原、（ｆ）免疫グロブリンイディオタイプ（たとえば黒色腫及びＢ細胞リンパ腫に関連する）、及び（ｇ）（ｉ）シアリルＴｎ及びシアリルＬｅ＜ｘ＞のような糖タンパク質（たとえば乳がん及び結腸直腸がんに関連する）、並びに種々のムチン（糖タンパク質はキャリアタンパク質にカップリングしていてもよい（たとえばＭＵＣ−１はＬＨにカップリングしていてもよい）、（ｉｉ）リポポリペプチド（たとえば脂質部分に連結されたＭＵＣ−１）、（ｉｉｉ）多糖（たとえばＧｌｏｂｏ  Ｈ  合成ヘキササッカライド）��これはキャリアタンパク質に（たとえばＫＬＨに）カップリングしていてもよい）、（ｉｖ）ＧＭ２、ＧＭ１２、ＧＤ２、ＧＤ３のようなガングリオシド（たとえば脳、肺のがん、黒色腫に関連する）（これもキャリアタンパク質（たとえばＫＬＨ）にカップリングしていてもよい）を含むポリペプチド及び糖を含む抗原のような、その他の腫瘍抗原が含まれる。その他の腫瘍抗原には、ｐｉ  ５、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ−４０、Ｈ−Ｒａｓ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタインバーウイルス抗原、ＥＢＮＡ、Ｅ６及びＥ７を含むヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、Ｂ型及びＣ型肝炎ウイルス抗原、ヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス抗原、ＴＳＰ−１８０、ｐＩ８５ｅｒｂＢ２、ｐＩ８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｍｎ−２３ＨＩ、ＴＡＧ−７２−４、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、ｐ１６、ＴＡＧＥ、ＰＳＣＡ、ＣＴ７、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１  Ｔｇｐ７２、β−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３（ＣＡ２７．２９／ＢＣＡＡ）、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８／ＫＰ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０（Ｍａｃ−２結合タンパク質／シクロフィリンンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳ、その他が含まれる。好適な免疫刺激抗体には、それだけに限らないが、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ１、抗ＰＤＬ１及び抗ＫＩＲ抗体が含まれる。
【０１７１】
ある実施形態では、本明細書に記載したがんを処置する方法は、化学療法処置のような別の抗がん剤又はがん処置の投与の前に、投与と同時に、及び／又は投与の後に、本発明の抗体又は抗原結合断片を対象に投与することを含む。
【０１７２】
本発明はまた、本発明の抗体又は抗原結合断片を投与してワクチン化戦略の効率を改善することによって感染症を防止する方法を含む。たとえば、本発明の方法は、本明細書に記載した抗体又は抗原結合断片をＨＩＶ、マラリア又はエボラによる疾患に特定されたワクチンとともに組み合わせて投与することによるこれらの感染症の防止を含んでよい。
【０１７３】
キット
さらなる態様では、本発明は少なくとも１つの本発明のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体又は抗原結合断片を含むキットを提供する。
【０１７４】
用語「キット」は、ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１複合体に特異的に結合するための少なくとも１つの試薬、たとえば本発明の抗体又は抗原結合断片を含む任意の製品（たとえばパッケージ又は容器）を意味することを意図している。キットは、本発明の方法を実施するためのユニットとして推進し、流通させ、又は販売してよい。さらに、キット試薬の何れか又は全ては、密封された容器のような、それらを外部環境から保護する容器に入れて提供してよい。キットは、キット及びその使用のための方法を説明する添付文書を含んでもよい。
【実施例】
【０１７５】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することによって、さらに理解される。
【０１７６】
実施例１  生殖細胞系列化抗体ＬＨＧ１０．６
抗体「ＬＨＧ−１０」の産生及び特性解析は、その内容が全体として本明細書に組み込まれる国際特許出願ＷＯ２０１５／０１５００３及びＷＯ２０１６／１２５０１７に記載されている。抗体ＬＨＧ−１０はヒトＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１複合体を過剰発現しているＨＥＫ２９３Ｅ細胞でラマを免疫することによって産生させ、ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１Ｆａｂについて選択しスクリーニングすることによって同定した。モノクローナル抗体ＬＨＧ−１０の親和性を改善するために、軽鎖シャフリングアプローチ（たとえば国際特許出願ＷＯ２０１４／０３３２５２に記載されている）を用い、改善された結合特性を有していることでバリアント「ＬＨＧ−１０．６」（本明細書では１７Ｈ５とも称する）を同定した。ＬＨＧ−１０及びＶｋをシャフルしたバリアントＬＨＧ−１０．６のＶＨ及びＶＬ配列を表３に示す。
【０１７７】
【表３】
2020519308.tif 000009
【０１７８】
１７Ｈ５抗体は、ＶＨドメインにわたって最も近いヒト生殖細胞系列配列（Ｘ９２３４３｜ＩＧＨＶ−４６＊０１）と８８．５％の同一性、及びＶＬドメインにわたって最も近いヒトヒト生殖細胞系列配列（Ｘ５９３１５｜ＩＧＫＶ１−３９＊０１）と８６．２％の同一性を有していることが見出された。抗体を３ステップ法：
１−重複するオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲにより可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）をコードする遺伝子を合成的に生成させることによる遺伝子ライブラリーのアセンブリー、
２−ヒト定常重鎖（ＣＨ１）及び定常軽カッパ鎖（ＣＫ）をコードする遺伝子を含むベクター（ｐＣＢ１３）にこの遺伝子ライブラリーをクローニングすること（ライブラリーの構築）、
３−ファージディスプレイ及び親和性選択を用いる機能性Ｆａｂの選択
による生殖細胞系列化に供した。
【０１７９】
１．ライブラリーの構築
１７Ｈ５のＶＨを最も近いヒト生殖細胞系列配列と比較し、ヒト生殖細胞系列から逸脱したフレームワーク残基を同定した。元の残基をライブラリーの中に維持しつつ、これらのフレームワーク残基をヒトＶ領域内に存在する残基に変異させた。ヒトの同等物に変異させた１２ＶＨ残基を下の表に示す。これらの生殖細胞系列化変異に加えて、ＣＤＲ２の中の異性化部位（Ｄ５４；Ｄ５５）及びＣＤＲ３の中の酸化部位（Ｍ１００ｆ）を変異させた。これらの部位も下の表に示す。
【０１８０】
【表４】
2020519308.tif 000010
【０１８１】
１７Ｈ５のＶｋについて、最も近いヒト生殖細胞系列配列とフレームワーク配列との比較により、標的とすべき１１残基を同定した。これらの部位を下の表に示す。
【０１８２】
【表５】
2020519308.tif 000011
【０１８３】
１７Ｈ５の生殖細胞系列化ライブラリーの理論的サイズを表６に示す。
【０１８４】
【表６】
2020519308.tif 000012
【０１８５】
２．遺伝子ライブラリーの構築
遺伝子アセンブリーによって生殖細胞系列化ライブラリーを創成した。この設計に基づくＶＨ及びＶＬの合成遺伝子（２セット）をＰＣＲに基づくアセンブリーによって生成させた（Ｓｔｅｍｍｅｒら、Ｇｅｎｅ（１９９５）、１６４：４９〜５３０頁）。ある位置における特定の変異を有する重複オリゴヌクレオチドを、ＰＣＲによって組み立てた。ヒト及びラマのアミノ酸をコードさせるために、ヌクレオチドを変性させた。これは、ラマの残基が安定性、折り畳み、又は高親和性結合に重要である場合の結合の完全な喪失を防止するために行なった。
【０１８６】
最初に、１７Ｈ５  Ｖｋ及びＶＨライブラリーの合成遺伝子を、それぞれヒトＣｋ及びＣＨ１ドメインを有するファージミドベクターであるｐＣＢ１３−ＣＫ１にクローニングした。これらのＶｋＣｋ及びＶＨＣＨ１サブライブラリーを構築した後、重鎖インサートを軽鎖ライブラリーにライゲーションすることによって最終ライブラリーを作成した。インサート百分率を決定するためにコロニーＰＣＲを行ない、ライブラリー中に全ての望ましい変異が存在することを確認するためにクローンをシーケンシングに送った。種々のライブラリーの特性を下の表に記載する。
【０１８７】
【表７】
2020519308.tif 000013
【０１８８】
生殖細胞系列化ライブラリーは良好な品質を有し、選択に用い得ることが見出された。
【０１８９】
３．高いヒト同一性を有するＦａｂの選択
その内容が全体として本明細書に組み込まれるＷＯ２０１５／０１５００３に以前記載されたように、ファージディスプレイを用いてヒトＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１複合体に高い親和性を有するＦａｂを選択した。簡単には、マイクロタイタープレートをＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１複合体で４℃、一夜コートし、翌日、Ｆａｂを発現しているファージを、種々の濃度の複合体でコートしたウェル中で２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、特定のファージをトリプシンで溶出させて、ＴＧ１細胞の感染に用いた。選択条件の詳細を表８にまとめる。
【０１９０】
【表８】
2020519308.tif 000014
【０１９１】
第１ラウンドの選択の後、１０μｇ／ｍｌの無関係なタンパク質のコーティングの上にのみ、富化が観察された。第２ラウンドでは、富化は１０倍大きくなる一方、インプットファージの量は１０分の１に少なくなった。第３ラウンドから始めて、洗浄の時間を長くし、溶液中に過剰の標的を加えることによって、厳密性が増大した。解離したファージの再結合を防止するために、溶液中の大過剰の可溶性標的を加えた。第６ラウンドの後でさえも、１週間のオフレート洗浄及び１００倍過剰の可溶性標的によって、富化はまだ観察された。
【０１９２】
４．高いヒト同一性を有するＦａｂのスクリーニング
ラウンド２、３、４、５及び６（各ラウンドについて４８クローン）からマスタープレートを選び出した。ペリプラズム抽出物を調製し、ＳＰＲによって（Ｂｉａｃｏｒｅを用いて）オフレートを決定した。全てのクローンについてＤＮＡシーケンシングを行ない、そのアミノ酸配列を推定した。ヒト生殖細胞系列ＩｇＶ領域と９２％を超える同一性を有するクローンを表９にまとめる。これらのクローンのオフレートをペリプラズム抽出物としてＳＰＲで（Ｂｉａｃｏｒｅを用いて）測定し、Ｆａｂ  １７Ｈ５のオフレートと比較した。
【０１９３】
【表９】
2020519308.tif 000015
【０１９４】
９３％を超える全体のヒト同一性及び親の１７Ｈ５  Ｆａｂと同等のオフレートを示す５つのクローンを、完全なヒトＩｇＧ１抗体として再クローニングした。これらの抗体のＣＤＲ、ＶＨ及びＶＬの配列を表１０、１１及び１２に示す。
【０１９５】
【表１０】
2020519308.tif 000016
【０１９６】
【表１１】
2020519308.tif 000017
【０１９７】
【表１２】
2020519308.tif 000018
【０１９８】
５．高いヒトフレームワーク残基同一性を有するｍＡｂのインビトロ特性解析
ヒトＩｇＧ１に再フォーマットした５つの生殖細胞系列化クローンを、ＨＥＫ  ２９３Ｅ細胞への過渡的トランスフェクションによって産生させた。全ての抗体をＳＰＲによるヒトＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１複合体への結合について試験し、生殖細胞系列化していない親クローンと同様の結合親和性を示した（ＫＤは１７Ｈ５より２〜５倍低い）。ＣＤＲ３における残基Ｍ１００ｆをスレオニンに変更することによって、ＫＤは約５倍減少した。生殖細胞系列化１７Ｈ５  Ａｂの結合特性及び特徴を表１３にまとめる。
【０１９９】
【表１３】
2020519308.tif 000019
【０２００】
６．生殖細胞系列化ｍＡｂ  ３９Ｂ６の安定性
クローン３９Ｂ６をその結合特性に基づいてリード生殖細胞系列化クローンとして選択した。この抗体を、エフェクター機能を欠く２つのフォーマット、ｈＩｇＧ１Ｎ２９７Ｑ及びｈＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐとして産生させ、安定性試験を実施した。安定性試験の前に、エフェクター欠乏３９Ｂ６抗体のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１への親和性を、７５０ＲＵのＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１複合体でコート（表１４）又は１０００ＲＵの抗体でコート（表１５）したＣＭ５チップを用いるＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００によって試験した。
【０２０１】
【表１４】
2020519308.tif 000020
【０２０２】
【表１５】
2020519308.tif 000021
【０２０３】
３９Ｂ６抗体の耐熱性を、以下の設定を用いて試験した。
・ｍＡｂ試料調製：１ｍｌのｍＡｂ（３９Ｂ６−ＩｇＧ１及び３９Ｂ６−ＩｇＧ４）の新たに調製したストック溶液（５ｍｇ／ｍｌ）をガラススクリューキャップ付きの２ｍｌのガラスバイアルに入れて５℃及び３７℃で保存した。バイアルには粒子がないことを直ちに確認した。
・ＰＢＳ陰性対照：ＰＢＳＴ陰性対照として、２ｍｌのガラスバイアル中で１ｍｌの濾過したダルベッコＰＢＳのアリコートを調製した。バイアルには粒子がないことを直ちに確認した。
・ＰＢＳＴｗ陰性対照：ＰＢＳＴｗ陰性対照として、２ｍｌのガラスバイアル中で０．０２％のＴｗｅｅｎ８０（Ｓｉｇｍａ）を含む１ｍｌの濾過したダルベッコＰＢＳのアリコートを調製した。バイアルには粒子がないことを直ちに確認した。
・高凝集対照：大量の目視可能な凝集を含む自家製の抗体の１ｍｌのアリコートを２ｍｌのガラスバイアル中で調製した。
・参照試料：各抗体について、５００μｌの滅菌したＰＣＲチューブ中で６０μｌのｍＡｂのアリコートを調製し、ラベルを付して−２０℃で保存した。
【０２０４】
種々の温度及び種々の条件（ＰＢＳ対ＰＢＳＴｗ）で保存した抗体の安定性を５６日の時間経過でモニターした。ＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標））によって測定した標的結合活性に対する保存の影響を図２に示す。提示した結果から分かるように、３９Ｂ６抗体は（両方のエフェクター欠乏フォーマットで）３７℃で保存した場合にＰＢＳ及びＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎの両方で標的結合活性が低下する傾向を呈した。対照的に、５℃で保存した試料は時間経過にわたって標的結合活性の顕著な損失を示さなかった。
【０２０５】
実施例２  改善された安定性を有するＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体の開発
【０２０６】
２．１  ３９Ｂ６バリアントの産生
抗体３９Ｂ６について上記した標的結合活性の低下は、ＶＨ  ＣＤＲ３の９５位〜９６位で起こる脱アミド化に関連していることが見出された。したがって、３９Ｂ６の安定性を改善するためにさらなる研究を行なった。
【０２０７】
最初にこのクローンをＣＤＲ２領域におけるＶＨ鎖の改変に供して、Ｇ５５Ａの置換を導入した（３９Ｂ６−Ａ）。３９Ｂ６−ＡのＶＨ及びＶＬ領域をヒトＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐ主鎖、即ちエフェクター機能を欠くヒト抗体フォーマットに再クローニングした。
【０２０８】
抗体３９Ｂ６−Ａ  ＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐの安定性を改善する試みにおいて、ＶＨドメインのＣＤＲ３の９５位又は９６位に変異を有する５つのバリアントを生成させた。これらのバリアントを下に示す。全てのバリアントはエフェクター機能を欠くフォーマットＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐで産生させた。
【０２０９】
【表１６】
2020519308.tif 000022
【０２１０】
抗体を濾過して５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、０．０２％のＴｗｅｅｎ８０（Ｓｉｂｍａ）を含むダルベッコＰＢＳ中に保存した。Ｔｗｅｅｎ８０は抗体製剤を安定化させるために必要であった。
【０２１１】
全ての抗体（３９Ｂ６−Ａを含む）のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１に対する親和性を、１５０ＲＵのＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１複合体で（表１７）又は２００ＲＵの抗体で（表１８）コートしたＣＭ５チップを用いるＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００によって試験した。
【０２１２】
【表１７】
2020519308.tif 000023
【０２１３】
【表１８】
2020519308.tif 000024
【０２１４】
全てのバリアントについて、ヒトＴｒｅｇによる活性ＴＧＦ−βの放出をブロックする能力を、ｍＡｂの存在下にＣＤ３／ＣＤ２８で刺激したヒトＴｒｅｇのＳＭＡＤ２リン酸化のレベルを決定することによって解析した。図３に示すように、抗体３９Ｂ６−ＡＹＥ、３９Ｂ６−ＡＮＫ及び３９Ｂ６−ＡＮＲは、ＳＭＡＤ２リン酸化アッセイにおいて元の３９Ｂ６−Ａと比較して同様の能力を有していた。バリアント３９Ｂ６−ＡＥＥ及び３９Ｂ６−ＡＶＥは、能力の明確な損失を示した。
【０２１５】
２９３Ｔ−ｈＧＡＲＰ細胞が、ホタルルシフェラーゼがＳＭＡＤ応答プロモーター（ＧＡＧＡ−ｌｕｃ）の制御下にあるレポータープラスミドによって過渡的にトランスフェクトされた、ＧＡＧＡ−ｌｕｃアッセイを用いても同様の結果が得られた。抗体３９Ｂ６−ＡＹＥ、３９Ｂ６−ＡＮＫ及び３９Ｂ６−ＡＮＲは、ルシフェラーゼアッセイにおいて元の３９Ｂ６−Ａと比較して同様の能力を有していた。バリアント３９Ｂ６−ＡＥＥ及び３９Ｂ６−ＡＶＥは、能力の明確な損失を示した（図４参照）。
【０２１６】
２．２  安定性の検討
３９Ｂ６−ＡＥＥを例外として、以下に記載する種々のアプローチを用いてバリアントの安定性を試験した。
【０２１７】
種々の安定性試験のそれぞれについて、以下の手法の１つ以上を用いて抗体を試験した。
・目視検査
・サイズ排除ＨＰＬＣ
・ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元及び非還元）
・ＳＰＲによる標的結合親和性
・タンパク質濃度
【０２１８】
これらの手法のプロトコルを以下に記載する。
【０２１９】
目視検査のプロトコル
試料名を隠し、３名の分析者によるバイアルの目視検査で目に見える粒子の存在についてスコア付けした。検査の前、試料が室温に達するまで３０分放置した。評価には下記のスコアリングシステムを用いた。
【０２２０】
Ａ：試料は澄明で目視可能な粒子がない
Ｂ：ごく微量の粒子
Ｃ：中程度の粒子の存在
Ｄ：多くの粒子が観察される
ｆ：繊維
【０２２１】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）のプロトコル
システム、カラム及び試料調製
研究を通じて用いたカラムは、通常２０％ＥｔＯＨ中に保存されるＸｂｒｉｄｇｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＢＥＨ  ＳＥＣ  ２００Ａ（３．５μｍ、７．８＊３０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）であった。Ｘｂｒｉｄｇｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＢＥＨ  ２００Ａプレガードカラムを分析カラムに連結した（３．５μｍ、７．８＊３ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）。それぞれの使用の前に、カラムを少なくとも５ＣＶのダルベッコＰＢＳで平衡化し、システムから外す前に５ＣＶのＬＣグレード水で清浄化した。全ての溶媒は使用前に濾過し脱気した。
【０２２２】
用いたクロマトグラフィーシステムは、クォータナリーポンプ、自動注入器、オンライン脱気器及びＤＡＤ検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙであった。カラムは定温コンパートメントに保持されておらず、試料は室温で分析した。検出器は波長２８０及び２１４ｎｍに同時に設定した（参照波長３６０ｎｍ、カットオフ１００ｎｍ）。凝集のモニタリングはチャネル２１４ｎｍで追跡した。Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いてデータを取得した。
【０２２３】
試料分析は無菌条件下で５ｍｇ／ｍｌの濃度から直接全ての元の試料２５μｌを移すことによって行なった。これらを２０００ｒｃｆで１分間遠心分離し、２０μｌを注意深くスクリューキャップ付きのコハク色のガラスバイアルに移した。それぞれの条件についての注入量は５μｌ（２５μｇ）、流量０．７ｍｌＰＢＳ／分、２５分とした。それぞれの注入はＬＣグレードの水で針を洗浄して行ない、各試料の最後にシールの洗浄を行なった。
【０２２４】
各時点のシーケンスは２回のＰＢＳの注入（ブランク、注入量５μｌ）で開始し、続いて２μｌのＢＥＨ２００標準タンパク質混合物注入（Ｗａｔｅｒｓ）及び既知の凝集ｍＡｂ試料を注入した。１２個の試料を分析する毎にブランクの注入を行なった。それぞれの分析シーケンスは開始時と同様であるが逆の順序で終了した（既知の凝集対照ｍＡｂ、ＢＥＨ標準タンパク質混合物及びブランク２回）。
【０２２５】
凝集％及びモノマー面積％の決定に用いた方法
以下のプロトコルを用いた。
・全てのクロマトグラムを方法ＡＲＧＸ−１１５で統合する（基礎的技術パラメーター：タンジェントスキム標準モード、勾配感度２．０、ハイトリジェクト１．７、エリアリジェクト１．０、ピーク幅：０．０２）。
・全てのピークが以前得られた分析と一致する方法で統合されていることを検証する。
・統合結果をＰＤＦ及びエクセルファイルにエクスポートする。
・モノマーピークの前に溶出する全てのピークの面積の合計を注入の全面積で割り、１００倍することによって全凝集％を計算する。
・モノマー面積を全面積で割って１００倍することによってモノマー面積％をも計算する。このモノマー面積％は試料中に不溶性の凝集物があるか否かを反映する。
・分析カラムの性能、効率及び分解能をモニターするために詳細な記録を保持する（即ちピークの対称性、モノマー面積、全面積、保持時間の再現性、その他）。
【０２２６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥのプロトコル
試料調製
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元及び非還元）、ＳＰＲによる結合親和性及びタンパク質濃度の評価のための１ｍｇ／ｍｌの中間濃度を生成するため、２５μｌの全ての元の試料を５ｍｇ／ｍｌで１００μｌのＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ８０（本研究を通してＰＢＳＴｗと略す）中に無菌条件下で移すことによって試料分析を行なった。試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために４〜２０％のトリスグリシン、ミニプロテアン、ステインフリーのプレキャストゲルを用いた（Ｂｉｏｒａｄ）。還元剤ＤＴＴ有り及び無しで４倍濃縮負荷染料のバッチを調製し、−２０℃にアリコートした。通常、１ｍｇ／ｍｌの中間希釈から５μｌを取り、５μｌの４倍濃縮負荷染料（±ＤＴＴ）を１０μｌのｍＱとともに加えた。それぞれの条件についての最終量は５μｇであった。試料を９５℃で１０分煮沸し、プレキャストゲルに負荷した（２０μｌ）。電気泳動は２００Ｖの定電圧、トリスグリシン緩衝系中で３５分間行なった。その後、青色染色（Ｇｅｎｔａｕｒ）を１時間行なった。全てのゲルはｍＱ水で少なくとも１時間脱染した。
【０２２７】
全長Ａｂ％の決定
タンパク質ゲルを以下の設定、即ちフォーカスオフセット０．５ｍｍ及び「高」品質とし、１チャネル検出（７００ｎｍ）でスキャンすることによって、種々のバンドの強度をＯｄｙｓｓｅｙ  ｖ３．０  Ｌｉ−Ｃｏｒシステムで決定した。それぞれの分析についての輝度及びコントラストはリニアーマニュアルパラメーター５として５０％に設定した。
【０２２８】
方法は以下の通りであった。
・ゲルをスキャンし、ゲル上の全てのバンドがしっかりとした長方形で囲まれていることを検証する。
・エクセルフォーマットで全てのバンドの生の強度を得るために設定で「エクスポート」を選択する。
・バンドの生の強度をレーンの全ての生の強度で割り、１００倍することによって、レーン中に存在する各バンドの生の強度の％を計算する。
・非還元条件については、全長Ａｂの％を、約１００ｋＤのバンドに対応するバンドの生の強度の％として定義する。
・還元条件については、全長Ａｂの％を、約２５〜３５ｋＤ及び約５５ｋＤのバンドに対応するバンドの生の強度の％の合計として定義する。
【０２２９】
Ｂｉａｃｏｒｅ３０００における標的結合活性測定のプロトコル
試料調製
上述の１ｍｇ／ｍｌの全ての試料の中間濃度から、ＳＰＲ分析のために追加の２５０倍希釈を行ない、最終濃度４μｇ／ｍｌとした。この２５０倍希釈は、全ての条件について２ステップ；ａ）５μｌ（１ｍｇ／ｍｌ）＋１２０μｌ  ＨＢＳ−ＥＰ（ＳＰＲ緩衝液）及びｂ）追加の１０倍希釈（１５μｌ＋１３５μｌ  ＨＢＳ−ＥＰ）で行なった。各抗体及び各時点で、−８０℃で凍結した試料から始めて個別の標準曲線を準備した。これを安定性の試料とともに分析し、標準をおおまかに近似した後で、各曲線の勾配を決定した。これらの勾配を用いて、参照試料を１００％に設定することにより、安定性試料の活性％を計算した。
【０２３０】
Ｂｉａｃｏｒｅにおける活性％の決定
Ｂｉａｃｏｒｅにおける標的結合活性を決定するため、ＣＭ５チップを約４０００ＲＵのヒトＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β複合体でコートした。流量を「キンジェクト」注入モードで３０μｌ／分に設定し、５分間隔で２回の再生注入を行なった（１ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭグリシン、ｐＨ１．５）。
【０２３１】
方法は以下のようにして行なった。
・ＢＩＡＥＶＡＬプログラムの曲線を開き、値「２−１」を選択する（１：ブランク、２：ｈＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１）。
・プロット重畳のためその時間で１つの曲線を選択する。
・曲線の変性部分を削除する。
・注入直前のベースラインを選択し、Ｙ軸を「選択の中央値におけるゼロ」に変換する。
・「ジェネラルフィット」を選択し、注入の１２０秒後から開始して１５５秒で終了する。
・エクセルで標準をプロットし、各抗体について曲線の勾配を決定する。
・参照（−２０℃で保存した試料）を１００％に設定することによって、これらの値を活性％に換算する。
【０２３２】
タンパク質濃度のプロトコル
各条件のタンパク質含量の決定のため、各試料（２μｌ）の２８０ｎｍにおける吸光度を測定することによって、ＮａｎｏＤｒｏｐシステムを用いた。システムはＰＢＳをブランクとし、各試料（１ｍｇ／ｍｌの中間希釈）の２８０ｎｍにおける吸光度を３回ずつ測定することによって、タンパク質の決定を行なった。２８０ｎｍで得られた全ての値をファクター１．５１で割った。ＰＢＳブランク測定はそれぞれの異なった条件の後で行なった。全てのデータは各条件についての３回の測定の平均値として報告した。
【０２３３】
２．２．１  温度安定性の検討
種々の温度保存条件下における抗体の安定性をモニターするため、以下の設定に従った。
・ｍＡｂ試料調製：１ｍｌのｍＡｂ（３９Ｂ６−ＡＶＥ、３９Ｂ６−ＡＹＥ、３９Ｂ６−ＡＮＫ及び３９Ｂ６−ＡＮＲ）の新たに調製したストック溶液（５ｍｇ／ｍｌ）をガラススクリューキャップ付きの２ｍｌのガラスバイアルに入れて５℃及び３７℃で保存した。バイアルには粒子がないことを直ちに確認した。
・ＰＢＳＴｗ陰性対照：ＰＢＳＴｗ陰性対照として、２ｍｌのガラスバイアル中で０．０２％のＴｗｅｅｎ８０（Ｓｉｇｍａ）を含む１ｍｌの濾過したダルベッコＰＢＳのアリコートを調製した。バイアルには粒子がないことを直ちに確認した。
・高凝集対照：大量の目視可能な凝集を含む自家製の抗体の１ｍｌのアリコートを２ｍｌのガラスバイアル中で調製した。
・参照試料：各抗体について、５００μｌの滅菌したＰＣＲチューブ中で６０μｌのｍＡｂのアリコートを調製し、ラベルを付して−２０℃で保存した。
【０２３４】
保存条件から種々の時点でｍＡｂの試料を取り出し、
・目視検査
・ＳＥ−ＨＰＬＣ
・ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元及び非還元）
・ＳＰＲによる標的結合親和性
・タンパク質濃度
について試験した。
【０２３５】
目視検査
目視検査の結果を下の表１９に示す。全てのｍＡｂはＰＢＳＴｗ中であり、これには安定化効果があると考えられる。
【０２３６】
【表１９】
2020519308.tif 000025
【０２３７】
５℃の条件では、５６日後のｍＡｂの平均スコアは下記の通りであった。
３９Ｂ６−ＡＹＥ：「試料は澄明で目視可能な粒子がない」
３９Ｂ６−ＡＶＥ及び３９Ｂ６−ＡＮＫ：「ごく微量の粒子」
３９Ｂ６−ＡＮＲ：「中程度の粒子の存在」
ＰＢＳＴｗ緩衝液は５℃で「試料は澄明で目視可能な粒子がない」とスコア付けされた。したがってこれは観察された粒子がタンパク質に関連していることを示している。
【０２３８】
３７℃の保存条件では、５６日後のｍＡｂの平均スコアは下記の通りであった。
３９Ｂ６−ＡＹＥ、３９Ｂ６−ＡＮＫ及び３９Ｂ６−ＡＮＲ：「ごく微量の粒子」
３９Ｂ６−ＡＶＥ：「試料は澄明で目視可能な粒子がない」
ＰＢＳＴｗ緩衝液は３７℃で「試料は澄明で目視可能な粒子がない」とスコア付けされた。したがってこれは観察された粒子がタンパク質に関連していることを示している。
【０２３９】
ＳＥ−ＨＰＬＣによる分析
タンパク質の凝集及び断片化をＳＥ−ＨＰＬＣによって測定した。
ｍＡｂ  ３９Ｂ６−ＡＶＥ、３９Ｂ６−ＡＹＥ、３９Ｂ６−ＡＮＫ及び３９Ｂ６−ＡＮＲについてＳＥ−ＨＰＬＣによって測定したタンパク質凝集の結果を下の表２０にまとめ、図５に示す。
【０２４０】
【表２０】
2020519308.tif 000026
【０２４１】
３７℃では、ｍＡｂ  ３９Ｂ６−ＡＹＥ及び３９Ｂ６−ＡＮＫについて凝集レベル％に変化は観察されなかった。３９Ｂ６−ＡＮＲについては、０日の１．１％から５６日の１．５％への僅かな増加が観察された。３９Ｂ６−ＡＶＥについては、０日の１．０％から５６日の４．４％への凝集％の増加が観察された。
【０２４２】
ｍＡｂ  ３９Ｂ６−ＡＶＥ、３９Ｂ６−ＡＹＥ、３９Ｂ６−ＡＮＫ及び３９Ｂ６−ＡＮＲについてＳＥ−ＨＰＬＣによって測定した断片ピークの存在を表２１及び図６に示す。断片化ピークは３７℃で５６日後にのみ観察されたので、これらの結果のみを提示する。
【０２４３】
【表２１】
2020519308.tif 000027
【０２４４】
ｍＡｂ  ３９Ｂ６−ＡＶＥ、３９Ｂ６−ＡＮＫ及び３９Ｂ６−ＡＮＲについては、断片ピークの百分率は５６日後に０．２％〜０．３％である。一方ｍＡｂ  ３９Ｂ６−ＡＹＥについては、断片ピークの百分率は５．７％である。
【０２４５】
全てのｍＡｂについてのモノマーピークの％の結果を表２２に示す。
【０２４６】
【表２２】
2020519308.tif 000028
【０２４７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
全ての抗体の分析についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表２３及び図８に示す。
【０２４８】
【表２３】
2020519308.tif 000029
【０２４９】
還元及び非還元の両方の条件で、温度５℃の条件でｍＡｂのいずれについても分解の傾向は観察されなかった。
【０２５０】
３７℃では、ｍＡｂ  ３９Ｂ６−ＡＹＥを除く全てのｍＡｂは非還元条件で同様の分解速度を示した。３９Ｂ６−ＡＹＥは他のｍＡｂと比較して、２８日までは同様の分解速度を示すが、２８日〜５６日の間により速い分解速度を示す。還元条件では、全てのｍＡｂは同様の分解速度を示す。
【０２５１】
Ｂｉａｃｏｒｅによる標的結合親和性
Ｂｉａｃｏｒｅで各時点での勾配を測定することにより、試料をその標的結合活性について試験した。参照試料を活性１００％と設定した。全てのｍＡｂについての結果を表２４及び図９にまとめる。
【０２５２】
【表２４】
2020519308.tif 000030
【０２５３】
３７℃で保存したｍＡｂ試料について、抗体３９Ｂ６−ＡＹＥのみが５６日の期間全体にわたって標的結合活性を保持していた。他の抗体全ては３７℃で保存すると５６日の期間で標的結合活性の顕著な低下を示した。
【０２５４】
タンパク質濃度
全ての試料のタンパク質濃度を各条件についてＮａｎｏＤｒｏｐで測定した。表２５及び図１０に、全てのｍＡｂについて測定したタンパク質濃度を示す。
【０２５５】
【表２５】
2020519308.tif 000031
【０２５６】
温度安定性検討の概要及び結論
温度安定性の検討により、試験した４つのｍＡｂの間にいくつかの顕著な相違があることが明らかになった。ｍＡｂ  ３９Ｂ６−ＡＶＥについては３７℃、５６日でＳＥ−ＨＰＬＣにより４．４％の凝集が観察され、ｍＡｂ  ３９Ｂ６−ＡＹＥについては５．７％の断片化が観察された。しかし、ｍＡｂ  ３９Ｂ６−ＡＹＥについてのこの断片化はＢｉａｃｏｒｅで３７℃での標的結合活性に影響しなかった。５６日後も、これは参照抗体と同様に良好であった。一方、ｍＡｂ  ３９Ｂ６−ＡＶＥ、３９Ｂ６−ＡＮＫ及び３９Ｂ６−ＡＮＲについては、３７℃、５６日後に、より低い標的結合活性が明らかに見られた。
【０２５７】
２．２．２  凍結解凍安定性の検討
凍結解凍条件下における抗体の安定性をモニターするため、下記のように設定した。ｍＡｂの１ｍｌのアリコート（５ｍｇ／ｍｌで）を−２０℃で少なくとも６時間凍結し、室温で１時間解凍した。このサイクルを９回繰り返した（全体で１０回の凍結解凍サイクル）。試料を目視検査、ＳＥ−ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｂｉａｃｏｒｅによる標的結合活性及びタンパク質濃度によって分析した。−２０℃で保存した参照試料を全ての分析において並行して用いた。ｍＡｂ  ３９Ｂ６−ＡＮＲ及び３９Ｂ６−ＡＮＫは可能な脱アミド化部位を有しているので、これらは目視検査による分析のみに供した。
【０２５８】
目視検査
凍結解凍安定性の検討における目視検査の結果を表２６に示す。全てのｍＡｂはＰＢＳＴｗ中であり、これには安定化効果があると考えられる。
【０２５９】
【表２６】
2020519308.tif 000032
【０２６０】
ＰＢＳＴｗ緩衝液は２人によって「ごく微量の粒子」とスコア付けされた。したがって３９Ｂ６−ＡＶＥ、３９Ｂ６−ＡＹＥ及び３９Ｂ６−ＡＮＫ試料で見られた粒子はタンパク質に関連していないと考えられる。全てのｍＡｂは１０回の凍結解凍サイクルの後で変化しないままであることが結論できる。
【０２６１】
ＳＥ−ＨＰＬＣによる分析
タンパク質の凝集及び断片化をＳＥ−ＨＰＬＣによって測定した。
【０２６２】
ｍＡｂ  ３９Ｂ６−ＡＶＥ及び３９Ｂ６−ＡＹＥの凍結解凍安定性検討についてのタンパク質凝集の結果を表２７にまとめる。
【０２６３】
【表２７】
2020519308.tif 000033
【０２６４】
参照試料と比較して、１０回の凍結解凍サイクルの後でいずれのｍＡｂでも凝集レベル百分率の変化は観察されなかった。
【０２６５】
全ての異なった注入液についてもモノマーピークの面積も検討した。ｍＡｂ  ３９Ｂ６−ＡＶＥ及び３９Ｂ６−ＡＹＥについてのモノマー面積％の結果を表２８にまとめる。
【０２６６】
【表２８】
2020519308.tif 000034
【０２６７】
参照試料と比較して、１０回の凍結解凍サイクルの後で両方のｍＡｂについてモノマー面積％の変化は観察されなかった。
【０２６８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析
非還元条件下及び還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって凍結解凍試料をその一体性について分析した。ｍＡｂ  ３９Ｂ６−ＡＶＥ及び３９Ｂ６−ＡＹＥについての結果を表２９及び図１１に示す。
【０２６９】
【表２９】
2020519308.tif 000035
【０２７０】
１０回の凍結解凍サイクルの後、両方のｍＡｂについて変化は観察されなかった。
【０２７１】
Ｂｉｏｃｏｒｅによる標的結合の解析
１０回の凍結解凍サイクルの後の勾配を測定することによって、Ｂｉａｃｏｒｅにおける試料の標的結合活性を試験した。参照試料を活性１００％と設定した。ｍＡｂ  ３９Ｂ６−ＡＶＥ及び３９Ｂ６−ＡＹＥの両方についての結果を図１２に示す。
【０２７２】
その結果、１０回の凍結解凍サイクルの後、標的結合活性に変化が観察されないことが実証された。
【０２７３】
タンパク質濃度の分析
凍結解凍試料のタンパク質濃度をＮａｎｏＤｒｏｐで測定した。表３０に、１０回の凍結解凍サイクルの後のｍＡｂ  ３９Ｂ６−ＡＶＥ及び３９Ｂ６−ＡＹＥについて測定したタンパク質濃度を示す。また図１３は両方のｍＡｂについてのこれらの結果を示す。
【０２７４】
【表３０】
2020519308.tif 000036
【０２７５】
結論
凍結解凍安定性の検討により、試験したｍＡｂ  ３９Ｂ６−ＡＶＥ及び３９Ｂ６−ＡＹＥについて顕著な相違は何ら認められなかった。
【０２７６】
２，２，３  熱安定性の検討
融解曲線を解析するため、以下のスキームに従ってｍＡｂを加熱した。ＰＣＲデバイス中での熱サイクルが完了した後で、Ｂｉａｃｏｒｅで試料の親和性を試験した。
【０２７７】
用いたプロトコルは下記の通りであった。
１）検討の開始時に、各ｍＡｂについて１ｍｌのアリコートをガラスバイアル中、−２０℃で保存した。
２）保存１週間後に、これらをいったん解凍した。
３）通常のようにｍＡｂを１ｍｇ／ｍｌに希釈し、次いでさらに１００μｇ／ｍｌに希釈した（１０倍希釈：２００μｌ＋１８００μｌ  ＰＢＳＴｗ）。
４）希釈したｍＡｂをＰＣＲプレート中に分注した（５０μｌ／ウェル）。
５）分析すべき十分な試料及び参照としての５℃の試料を並列に保つ。
６）ＰＣＲデバイス中で、以下に示す温度に１時間曝す。
７）ＰＣＲデバイス中、２５℃に２時間。
８）ＰＣＲデバイス中、４℃。
９）分析のため４μｇ／ｍｌで試料及び参照を調製する（２５倍希釈：１６８μｌＢｉａｃｏｒｅ緩衝液＋７μｌ試料）。
【０２７８】
【表３１】
2020519308.tif 000037
【０２７９】
Ｂｉａｃｏｒｅ分析のためのプロトコル：
・約４０００ＲＵのヒトＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β複合体でコートした同じＣＭ５チップを用いた。
・ＢＩＡＥｖａｌｕａｔｉｏｎプログラムの曲線を開き、値「２−１」を選択する（１：ブランク、２：ｈＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β）。
・プロット重畳のためその時間で１つの曲線を選択する。
・曲線の変性部分を削除する。
・注入直前のベースラインを選択し、Ｙ軸を「選択の中央値におけるゼロ」に変換する。
・「ジェネラルフィット」を選択し、注入の１２０秒後から開始して１５５秒で終了する。
・ＩＣ５０の計算のため、５℃の参照の勾配を１００％で水平にする。他の温度（Ｘ軸）の百分率（Ｙ軸）を計算することができる、
４つのｍＡｂの耐熱性を測定し、結果を図１４にまとめる。融解温度は、抗体の５０％がまだ機能を有している温度として計算した。５℃に保った参照試料を活性１００％と設定した。融解温度を表３１に示す。
【０２８０】
【表３２】
2020519308.tif 000038
【０２８１】
ｍＡｂ  ３９Ｂ６−ＡＮＫ及び３９Ｂ６−ＡＮＲは、最高の融解温度、それぞれ６９．１３℃及び６８．５５℃を示した。ｍＡｂ  ３９Ｂ６−ＡＶＥ及び３９Ｂ６−ＡＹＥも良好な融解温度、それぞれ６６．９９℃及び６６．５３℃を示した。全てのｍＡｂの全ての融解温度は高いと考えることができる。
【０２８２】
熱安定性検討の結論
４つのｍＡｂは良好な耐熱性を実証した。融解温度は以前の安定性検討における元の３９Ｂ６−Ａ  ｍＡｂの６６．８℃と同程度であった。
【０２８３】
２．２．４  回転安定性の検討
回転安定性の検討のため、下記のように設定した。検討の開始時に、各ｍＡｂについて１ｍｌのアリコートをガラスバイアル中、−２０℃で保存した。保存１週間後に、アリコートをいったん解凍し、室温、１５ｒｐｍでひっくり返し回転させた。
【０２８４】
指示した時点で、試料を粒子の存在についてスコア付けした。
・時間：０、３、６、２４、３０、４８、５４、７２及び９６
試料は、９６時間後にＳＥ−ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｂｉａｃｏｒｅによる標的結合活性及びタンパク質濃度によっても分析した。−２０℃で保存した参照試料を全ての分析において並行して用いた。ｍＡｂ  ３９Ｂ６−ＡＮＲ及び３９Ｂ６−ＡＮＫは可能な脱アミド化部位をまだ有しているので、これらは目視検査によってのみ評価した。
【０２８５】
目視検査
回転安定性の検討における目視検査の結果を表３２に示す。全てのｍＡｂはＰＢＳＴｗ中であり、これには安定化効果があると考えられる。
【０２８６】
【表３３】
2020519308.tif 000039
【０２８７】
全てのｍＡｂは「ごく微量の粒子」という平均スコアを有することが見出された。したがってこれらは９６時間の回転後も比較的影響を受けていないままである。ＰＢＳＴｗ緩衝液は試験した実験条件では何ら粒子を含んでいなかった。これは、観察された「ごく微量の粒子」が抗体試料中のタンパク質に関連していることを示している。
【０２８８】
ＳＥ−ＨＰＬＣによる分析
タンパク質の凝集及び断片化をＳＥ−ＨＰＬＣによって測定した。ｍＡｂ  ３９Ｂ６−ＡＶＥ及び３９Ｂ６−ＡＹＥの回転安定性の検討についてのタンパク質凝集の結果を表３３に示す。
【０２８９】
【表３４】
2020519308.tif 000040
【０２９０】
回転ストレスの後、参照試料と比較してｍＡｂについては凝集レベルの％に変化は観察されなかった。
【０２９１】
全ての種々の注入についてのモノマーピークの面積も検討した。ｍＡｂ  ３９Ｂ６−ＡＶＥ及び３９Ｂ６−ＡＹＥについてのモノマー面積％の結果を表３４に示す。
【０２９２】
【表３５】
2020519308.tif 000041
【０２９３】
回転９６時間後のいずれのｍＡｂについても、参照試料と比較してモノマー面積％の変化は観察されなかった。
【０２９４】
両方の抗体について、回転９６時間後に参照試料と比較してＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルに変化は観察されなかった。
【０２９５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析
非還元条件下及び還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって回転試料をその一体性について分析した。ｍＡｂ  ３９Ｂ６−ＡＶＥ及び３９Ｂ６−ＡＹＥについての結果を表３５にまとめる。
【０２９６】
【表３６】
2020519308.tif 000042
【０２９７】
回転９６時間後の両方のｍＡｂのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは図１５に見ることができる。回転９６時間後にいずれの抗体についても変化は観察されなかった。
【０２９８】
Ｂｉａｃｏｒｅによる標的結合の解析
Ｂｉａｃｏｒｅで回転９６時間後の勾配を測定することにより、試料をその標的結合活性について試験した。参照試料を活性１００％と設定した。ｍＡｂ  ３９Ｂ６−ＡＶＥ及び３９Ｂ６−ＡＹＥの両方についての結果を図１６に示す。
【０２９９】
タンパク質濃度の分析
回転試料のタンパク質濃度をＮａｎｏＤｒｏｐで測定した。表３６に、回転９６時間後のｍＡｂ  ３９Ｂ６−ＡＶＥ及び３９Ｂ６−ＡＹＥについて測定したタンパク質濃度を示す。また図１７は両方の抗体についてのこれらの結果を示す。
【０３００】
【表３７】
2020519308.tif 000043
【０３０１】
回転９６時間後に、両方のｍＡｂについてタンパク質の損失は観察されなかった。
【０３０２】
回転安定性検討の結論
回転安定性の検討により、試験したｍＡｂ  ３９Ｂ６−ＡＶＥ及び３９Ｂ６−ＡＹＥの間で相違は何ら認められなかった。
【０３０３】
２．２．５  ペプチドマッピングによる一次配列の解析
温度、凍結解凍及び回転安定性の検討からの試料を、タンパク質（ペプチド）レベルでの改変（脱アミド化、異性化及び酸化）を同定するために、トリプシンペプチドマッピングＲＰ−ＨＰＬＣ−ＵＶ−ＭＳ法を用いて解析した。
【０３０４】
ｍＡｂ  ３９Ｂ６−ＡＶＥ及び３９Ｂ６−ＡＹＥにおいて、Ｎ９５位の変異により、重鎖のＣＤＲ３の９５〜９６位（アミノ酸ＮＥ）における脱アミド化を行なった。この脱アミド化部位は、ｍＡｂ  ３９Ｂ６−ＡＮＫ及び３９Ｂ６−ＡＮＲにおいてまだ存在し、温度安定性の検討並びに凍結解凍及び回転安定性の検討において５℃と３７℃の両方で２８日後も、顕著な脱アミド化／異性化が検出された。Ｎ９５の下流に嵩高で正荷電を有する残基を導入しても脱アミド化は防止できないことが結論された。
【０３０５】
重鎖のＣＤＲ３の１００ｆ位に、高い結合親和性に必須なメチオニンが存在する。温度、凍結解凍及び回転安定性の検討により、ｍＡｂ  ３９Ｂ６−ＡＹＥ及び３９Ｂ６−ＡＮＫではＭ１００ｆの酸化は起こらず、一方、ｍＡｂ  ３９Ｂ６−ＡＶＥ及び３９Ｂ６−ＡＮＲでは酸化がまだ観察されることが実証された。これは、９５位及び９６位のアミノ酸が下流のメチオニンの酸化に対する感受性に影響していることを実証するものである。表３７に、トリプシン消化によって生じた、重鎖ＣＤＲ３をカバーするペプチドの酸化及び脱アミド化のレベルの概観を示す。
【０３０６】
【表３８】
2020519308.tif 000044
【０３０７】
Ｎ９５の脱アミド化及び異性化の相対量及び３７℃で保存したバリアントの相対結合活性を図１８に示す。元の３９Ｂ６−Ａも図に示す（３９Ｂ６−ＡＮＥとラベル）。ｍＡｂ  ３９Ｂ６−ＡＶＥ及び３９Ｂ６−ＡＹＥではＮ９５が変異しているので脱アミド化及び異性化のレベルは０であり、したがって含まれていない。Ｎ９５の脱アミド化とｍＡｂ  ３９Ｂ６−ＡＮＫ及び３９Ｂ６−ＡＮＲについて観察された低い標的結合活性との相関により、Ｎ９５の脱アミド化がｍＡｂのその標的への結合を抑制するように影響することが示唆される。
【０３０８】
結論
ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体バリアント３９Ｂ６−ＡＹＥは、臨床開発に向けられるべき特に良好なＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１抗体である。その理由は下記の通りである。
・その標的であるＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β１複合体に対して高い親和性結合を保持している。
・ＳＭＡＤ２リン酸化アッセイにおいて良好な能力を示す。
・ＣＤＲ３において脱アミド化又は異性化を受けない。
・ＣＤＲ３において酸化を受けない。
・ヒトとの高い相同性（９５％）を示す。
・種々の安定性アッセイによって測定して、３９Ｂ６−Ａと比較して改善された安定性を示す。
【０３０９】
３９Ｂ６−ＡＹＥのＣＤＲ及び可変ドメイン配列を下の表３８及び３９に示す。全長の重鎖及び軽鎖の配列を表４０に示す。ＶＨ及びＶＬドメイン並びに全長の重鎖及び軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列を表４１に示す。
【０３１０】
【表３９】
2020519308.tif 000045
【０３１１】
【表４０】
2020519308.tif 000046
【０３１２】
【表４１】
2020519308.tif 000047
【０３１３】
【表４２】
2020519308.tif 000048
2020519308.tif 000049
2020519308.tif 000050
【０３１４】
実施例３  ３９Ｂ６−ＡＹＥ（ＡＲＧＸ−１１５）のバッチ試験
ＡＲＧＸ−１１５のパイロット薬剤物質バッチを３か月の期間にわたって安定性について試験した。パイロット薬剤物質バッチの試料を、−７０℃の意図した保存条件、＋５℃の加速した保存条件、及び＋２５℃のストレスをかけた保存条件で保存した。パイロット薬剤物質は以下の製剤：１０ｍＭのヒスチジン／ヒスチジン塩酸、２００ｍＭのスクロース、４０ｍＭのアルギニン、０．０３％（ｗ／ｖ）のポリソーベート８０、ｐＨ６．０及びタンパク質濃度２０．０±２．０ｍｇ／ｍｌで提示した。
【０３１５】
ＡＲＧＸ−１１５のパイロット薬剤物質バッチは、−７０℃の意図した保存条件で保存すると３か月安定であることが確認された。安定性の尺度としてＳＰＲ結合活性も決定した。結合活性は、−７０℃に保った参照試料の結合活性の百分率として表現した。
結果を下の表４２に示す。
【０３１６】
【表４３】
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【０３１７】
これらの結果から、ＡＲＧＸ−１１５は長期の保存期間にわたって安定であることが確認される。
【０３１８】
実施例４  ＡＲＧＸ−１１５のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β複合体への結合の特性解析
４．１  成熟ＴＧＦ−βはＡＲＧＸ−１１５の結合に必須である
本質的に、ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β複合体（潜在型ＴＧＦ−βと複合したＧＡＲＰ）は、ＧＡＲＰと潜在型ＴＧＦβとの間の共有結合システイン相互作用（ジスルフィド架橋）を有して小胞体の中で形成される。次いでこの複合体は細胞表面に現われる。インビトロでは、ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β複合体は組み換えヒトＧＡＲＰと組み換えヒト潜在型ＴＧＦ−β（Ｃ３３Ｓ）−３ｘｓｔｒｅｐ−ｔａｇから形成することができる。潜在型ＴＧＦ−βのＣ３３Ｓミュータント形は、ネイティブな複合体中に存在するようにはＧＡＲＰと（又は潜在型ＴＧＦ−β結合タンパク質（ＬＴＢＰ）のいずれとも）共有結合型相互作用を形成しない。
【０３１９】
組み換えＧＡＲＰと組み換え潜在型ＴＧＦβ（Ｃ３３Ｓ）とのインビトロで形成された複合体へのＡＲＧＸ−１１５の結合を実証するため、組み換えＧＡＲＰをＥＬＩＳＡプレートにコートし（１μｇ／ｍＬのヒトＧＡＲＰ、４℃、一夜）、ブロッキング剤（カゼイン−ＰＢＳ）でブロックし、コートしたＧＡＲＰによって潜在型ＴＧＦ−β（５μｇ／ｍＬ、室温、１時間）を捕捉させた。ＡＲＧＸ−１１５及びアイソタイプ対照抗体（１μｇ／ｍＬ、室温、１時間）を複合体に結合させ、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧで検出した。図１９に示すように、ＡＲＧＸ−１１５はＧＡＲＰ−潜在型ＴＧＦ−β（Ｃ３３Ｓ）複合体に結合したが、アイソタイプ対照は結合しなかった。
【０３２０】
アッセイは順番を逆にしても機能することが見出された。ＥＬＩＳＡプレートをＡＲＧＸ−１１５又はアイソタイプ対照抗体でコートし（１μｇ／ｍＬ、４℃、一夜）、ブロッキング剤（カゼイン−ＰＢＳ）でブロックした。コートしたＡＲＧＸ−１１５抗体によって組み換えＧＡＲＰ（５μｇ／ｍＬ）を捕捉させ、プレートを洗浄し、組み換え潜在型ＴＧＦ−β（Ｃ３３Ｓ）−３ｘｓｔｒｅｐ−ｔａｇ（５μｇ／ｍＬ）を捕捉させてストレプトアビジン−ＨＲＰで検出した。ＨＲＰ活性はＡＲＧＸ−１１５の存在下でのみ検出され、アイソタイプ対照でコートしたプレートのウェル中では検出されなかった。
【０３２１】
ＧＡＲＰとＴＧＦ−βの潜在性関連ペプチド（ＬＡＰ）との複合体に対するＡＲＧＸ−１１５の結合を試験するため、組み換えＧＡＲＰと組み換えＬＡＰとの複合体を形成させた。ＥＬＩＳＡプレートを組み換えＧＡＲＰでコートし（１μｇ／ｍＬ、４℃、一夜）、ブロッキング剤（カゼイン−ＰＢＳ）でブロックし、コートした組み換えＧＡＲＰの上にＬＡＰ（５μｇ／ｍＬ）を捕捉させた。ＬＡＰの結合は抗ＬＡＰ−ＨＲＰで検出した。抗ＬＡＰ−ＨＲＰの結合は、ＧＡＲＰ−ＬＡＰ複合体がインビトロで形成されていることを実証している。しかし、ＡＲＧＸ−１１５はＧＡＲＰ−ＬＡＰ複合体への結合を何ら示さなかった。さらに、ＥＬＩＳＡプレートをＡＲＧＸ−１１５でコートし（１μｇ／ｍＬ、４℃、一夜）、組み換えＧＡＲＰ（５μｇ／ｍＬ）、続いてＬＡＰ（５μｇ／ｍＬ）を加えると、抗ＬＡＰ−ＨＲＰの結合は測定されなかった。これらの結果より、ＡＲＧＸ−１１５のＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β複合体への結合には成熟ＴＧＦ−βが必要なことが確認される。
【０３２２】
４．２  ＡＲＧＸ−１１５の中和活性に対するＧＡＲＰと複合したｈＴＧＦ−βにおける変異の影響
インテグリンαｖβ６を安定的に発現する２９３Ｔ細胞（２９３ｃｌ．ＩＴＧＢ６）を、３つのプラスミド、（ｉ）ＣＡＧＡ−ｌｕｃレポータープラスミド、（ｉｉ）ヒトＧＡＲＰ（ｐＥＦ−ＢＯＳ−ｐｕｒｏ−ｈＧＡＲＰ）、及び（ｉｉｉ）ＷＴヒトＴＧＦ−β又はミュータントＴＧＦ−β（ｐＤｉｓｐｌａｙ）の混合物（プラスミドミックス）で過渡的にトランスフェクトした。インテグリンαｖβ６は２つのＴＧＦ−β活性化インテグリンのうちの１つである。２９３ｃｌ．ＩＴＧＢ６細胞をセミコンフルエントの７５ｃｍ２のフラスコから脱着して収穫し、計数して１Ｅ＋０６細胞／ｍＬに希釈し、エッペンドルフチューブあたり１ｍＬに分注した。トランスフェクションのため、各チューブに２５０μｌのプラスミドミックスを加えた。トランスフェクションの直後に、トランスフェクトした細胞を、試験のための異なったｍＡｂ（ＡＲＧＸ−１１５、ＬＨＧ１０．６、１Ｄ１１及びＭＨＧ−８を１００μｌ／ｍＬで）を含むウェルあたり５０μｌ（４Ｅ＋０４細胞）で９６ウェルの光学プレートに分注した。１Ｄ１１はＴＧＦ−βのアイソフォーム−１、−２及び−３の活性型に対するｍＡｂである。ＭＨＧ−８及びＬＨＧ１０．６はＷＯ２０１５／０１５００３及びＷＯ２０１６／１２５０１７に記載されている。３７℃で２４時間のインキュベーションの後、ルシフェラーゼ活性を測定した。ミュータントＴＧＦ−βのトランスフェクションで得られた値を、ＷＴ−ＴＧＦ−βについて得られた値の百分率として表した。結果を図２０に示す。図から分かるように、Ｒ５８Ａの置換を含むＴＧＦ−βミュータント及びＫ３３８Ｅの置換を含むＴＧＦ−βミュータントに対して測定したＡＲＧＸ−１１５の中和活性は顕著に低減していた。これは、ＧＡＲＰ−ＴＧＦ−β複合体中のこれら２つの残基がＡＲＧＸ−１１５の中和活性に特に重要であることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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