(57)【要約】  本発明は、心肥大に関連する心臓疾患およびその後の心臓の病理学的リモデリングの治療または予防、特に心不全（ＨＦ）を防ぐおよび／または治療するためのヒトマイクロＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５に関する。開示された使用のための前記ｍｉＲＮＡを含むベクターおよび医薬組成物も本発明の範囲内である。
2020509766.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
心肥大により特徴づけられる心臓病の予防または治療のための使用のための、マイクロＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５またはかかるマイクロＲＮＡの一次転写産物またはかかるマイクロＲＮＡの前駆体またはかかるマイクロＲＮＡの模倣体またはかかるマイクロＲＮＡをコードするＤＮＡ。
【請求項２】
前記心臓病が心不全、心筋症、病的心肥大、特に虚血後病的肥大、遺伝的および非遺伝的起源の心筋症、特に肥大型表現型を有する心筋症、心筋梗塞、虚血性または非虚血性由来の心筋症、心筋虚血および拡張機能障害の増加により特徴づけられる病因不明の心筋症からなる群から選択される、請求項１に記載の使用のためのマイクロＲＮＡ。
【請求項３】
前記心臓病が駆出率が保持された心不全（ＨＦｐＥＦ）である、請求項１に記載の使用のためのマイクロＲＮＡ。
【請求項４】
マイクロＲＮＡが心肥大を発症するリスクのある状態において使用される、請求項１に記載の使用のためのマイクロＲＮＡ。
【請求項５】
心肥大を発症するリスクのある状態が慢性高血圧、心臓弁疾患、肥大型表現型につながる遺伝性心筋症、心筋梗塞、慢性のまたは突発性の虚血損傷による心筋細胞損失および虚血性または非虚血性由来の心筋症からなる群から選択される、請求項４に記載の使用のためのマイクロＲＮＡ。
【請求項６】
遺伝子治療における使用のための請求項１に記載のマイクロＲＮＡ。
【請求項７】
少なくとも請求項１に記載のマイクロＲＮＡおよび／または前記マイクロＲＮＡの一次転写産物および／または前記マイクロＲＮＡの前駆体および／または前記マイクロＲＮＡの模倣体および／または前記マイクロＲＮＡをコードするＤＮＡおよび／または一次転写産物をコードするＤＮＡ、マイクロＲＮＡの前駆体または模倣体、またはそれらの組み合わせを含む、心肥大により特徴づけられる心臓病の予防または治療のための使用のためのベクター。
【請求項８】
天然または人工のいずれかの任意のカプシド血清型のアデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）である、請求項７に記載の使用のためのベクター。
【請求項９】
心肥大により特徴づけられる心臓病の予防または治療のための使用のための、少なくとも請求項１に記載のマイクロＲＮＡおよび／または前記マイクロＲＮＡの一次転写産物、および／または前記マイクロＲＮＡの前駆体、および／または前記マイクロＲＮＡの模倣体および／または前記マイクロＲＮＡをコードするＤＮＡ、それについての一次転写産物または前駆体または模倣体、またはそれらの組み合わせ、ならびに少なくとも１つの薬学的に許容可能な媒体または賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１０】
心不全の治療のための、請求項９に記載の使用のための組成物。
【請求項１１】
心肥大により特徴づけられる心臓病の予防または治療のための使用のためのＲＮＡストレッチであって、該ストレッチは、インビトロにおいて無細胞転写法によって得られるか、合成によって生成されるか、関連するＤＮＡコーディング配列の移入によって細胞内で発現されるか、またはプラスミド、ウイルスもしくは他の種類のベクターの投与によって細胞内に導入もしくは発現される、請求項１に記載のマイクロＲＮＡ、一次転写産物、前駆体またはそれについての模倣体を含む、ストレッチ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品およびバイオテクノロジーの分野に関する。
【０００２】
特に、本発明は、心肥大に関連する心臓疾患およびその後の心臓の病理的なリモデリングの治療のための、特に心不全（ＨＦ）を防ぐおよび／または治療するための、ヒトマイクロＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
心臓血管の手術と治療の最近の進歩にもかかわらず、心臓血管疾患（ＣＶＤ）は毎年１７００万人以上の死亡の原因であり、全世界の死亡の３１％に相当する（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ＿ｄｉｓｅａｓｅｓ／ｅｎ／）。これらの死亡の８０％は中所得国および低所得国で発生するため、ＣＶＤの負担は高所得人口にもはや制限されない。
【０００４】
ＣＶＤの範囲内で、心不全（ＨＦ）はさまざまな根本的な病理学的原因によって決定される最終的な状態を表す。アメリカ心臓病学会／アメリカ心臓協会ガイドラインは、ＨＦを「心室が血液を充満または排出する能力を損なう任意の構造的または機能的心臓障害から生じる複雑な臨床症候群」と定義している［１］［２］。この症候群は世界中で２６００万人以上の人々に影響を与えており、そのうち７４％が少なくとも１つの併存疾患を患っており、ＨＦによってかなり悪化する［３］。
【０００５】
成体の心臓は動的器官であり、異なる外因性および内因性の刺激に応じて大幅にリモデリングできる。病理学的刺激の大部分は、個々の心筋細胞サイズの代償的増加に起因する心肥大の段階を最初に誘導する。後に、これはしばしば非代償性肥大の形に発展し、最終的にＬＶ解剖学のリモデリングを決定し、顕性ＨＦに陥らせる（引用文献［４］−［５］で総説される）。代償性肥大は、慢性または突発性の虚血性損傷（虚血性心筋症または、心筋梗塞）による心筋細胞損失、慢性高血圧または心臓弁疾患によって決定され得る（［５］に概説される）。同じ反応が、肥大型表現型につながる遺伝性心筋症の様々な遺伝子変異の結果としても観察されている（［５］に概説される）。
【０００６】
心筋細胞肥大はまた、保持された左心室（ＬＶ）駆出率（ＥＦ）を伴うＨＦ、ＨＦｐＥＦの発症と一般的に関連しており、現在ＨＦ症例の約５０％を占める。この条件に関する限り、ＥＦが低下したＨＦと比較したＨＦｐＥＦの有病率（ＨＦｒＥＦは通常、虚血性心疾患により観察される）は１０年ごとに１０％増加しており、蔓延していることを疫学的観察は示唆する［６、７］。この傾向は、ＨＦｐＥＦに関連した併存疾患（特に高血圧と肥満）の増加率、人口の平均寿命の延長、および冠動脈疾患（ＣＡＤ）患者のより良い管理によって維持されている。ＨＦｐＥＦ患者の死亡率は５年で６０％に近く、入院率が高く、生活の質が著しく損なわれる。
【０００７】
現在、ＣＡＤに起因するＨＦｒＥＦの治療（特に、アンジオテンシンアルドステロンシステム阻害剤、ベータ遮断薬、ＬＣＺ６９６、ペースメーカー／デバイス療法）は、ＨＦｐＥＦ患者ではほとんど効果がない［８］。スタチンでの治療は、ＨＦｐＥＦを有する１８５人の患者についての小さな臨床試験において、相対的な利益を示した［９］；しかしながら、この薬物の作用機構は依然として欠けており（ｍｉｓｓｉｎｇ）、この結果は、より多数の患者において再現されていない。
【０００８】
ＨＦｐＥＦの生理学および分子の相関関係は複雑であり、非常に部分的に理解されている。当該疾患は、無症候性から症候性に漸進的に進行し、かつＬＶ肥大、緩慢なＬＶ弛緩、ＬＶ弛緩性硬直、減少したＬＶ収縮性性能、左心房リモデリング、末梢血管抵抗、内皮機能障害、肺動脈および静脈抵抗の増加、神経ホルモン活性化および心室−動脈結合によりさまざまに特徴づけられる［１０］。ＨＦｐＥＦの根底にある病因は不明のままであるが、この状態の２つの最も顕著な表現型相関は、増加した心筋細胞の硬直の増加［１１］および心筋細胞の収縮性の障害［１２］であるという十分なコンセンサスが存在する。加齢は、コラーゲンの蓄積および架橋［１３］、心筋細胞損失および反応性肥大［１４］により、弛緩を長くし、ＬＶ硬直を高める。
【０００９】
したがって、心肥大およびその結果、特に心不全の治療のための、より特には、保持された左心室（ＬＶ）駆出率（ＥＦ）形態（ＨＦｐＥＦ）の現在不治の心不全の治療のための治療ツールの必要性が依然として存在する。
【００１０】
さらに、心肥大状態に介入して関連疾患の発症を防ぐことが望ましい。
【００１１】
マイクロＲＮＡは進化的に保存された小さな非コーディングＲＮＡであり、標的メッセンジャーｍＲＮＡに存在する相補配列への不完全な塩基対形成により、転写後レベルで遺伝子発現を調節し、より頻繁には３’−ＵＴＲにあるが、５’ＵＴＲおよびコーディング配列にもある。ペアリングにより、翻訳抑制、ｍＲＮＡ分解、またはその両方が発生する［１５］。マイクロＲＮＡのｍＲＮＡへの結合に不可欠なマイクロＲＮＡシード配列は保存された配列であり、ほとんどの場合、マイクロＲＮＡ５’末端から２−８の位置にある［１６］。
【００１２】
マイクロＲＮＡは、一般的にＲＮＡポリメラーゼＩＩによってプライマリマイクロＲＮＡ（ｐｒｉマイクロＲＮＡ）に転写されるゲノムコード化された配列である。ｐｒｉ−マイクロＲＮＡは、異なる細胞エンドヌクレアーゼによって連続的に処理され、最終的に約１９〜２３ヌクレオチドの２つの鎖を含有する二本鎖を生成する。その後、マイクロＲＮＡ二本鎖が解かれ、成熟したマイクロＲＮＡがＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、マイクロＲＮＡによるサイレンシングを媒介する（［１７］で総説される）。
【００１３】
心臓の発達、肥大および心不全におけるさまざまなマイクロＲＮＡの役割が広く研究されている（［１８］；［１９］で総説される）。特に、マイクロＲＮＡが適切な心臓の発達に関与していることが示された。ダイサーのノックアウトによるマイクロＲＮＡネットワーク全体の除去は、発達中の心臓と成人の心臓の両方で、重度の心不全と死につながる［２０］。さらに、機能の獲得および喪失に関する多くの研究は、病理学的心臓リモデリングに関与するマイクロＲＮＡファミリーまたは単一のマイクロＲＮＡを強調しており、これらのマイクロＲＮＡを、バイオマーカーまたは新規治療の標的のいずれかとして使用する可能性を高めている（引用文献で総説される：［２１］および［２２］）。心筋細胞増殖（ｍｉＲ−１［２３］、ｍｉＲ−１３３ａ［２４］、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ［２５］）、心筋細胞肥大（ｍｉＲ−２０８ａ［２６］、マイクロＲＮＡ−２１２／１３２ファミリー［２７］、ｍｉＲ−３７８［２８］）、心臓線維化（ｍｉＲ−２９［２９］、ｍｉＲ−２１［３０］、ｍｉＲ−３７８［２８］）、心筋細胞収縮性（ｍｉＲ−２０８ａ［２６］）を含む心臓の生態学における特定のプロセスを調節するために、いくつかのマイクロＲＮＡが記載されている。
【００１４】
ほぼすべてのヒト疾患におけるマイクロＲＮＡの役割を考えると、それらの多くは革新的な治療法の標的と考えられており、いくつかは治療薬自体としても考えられている。
【００１５】
しかしながら、これらの潜在的な適用のうち、これまでに臨床実験に至ったのはごくわずかであり、これらはいずれも心疾患の治療には使用されていない。
【００１６】
従って、現在不治のＨＦｐＥＦ形態に特に関連して、心不全に関与し、心不全および関連疾患の治療に使用できるマイクロＲＮＡが強く望まれている。
【００１７】
心筋細胞機能の調節におけるマイクロＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５のこれまで知られていなかった役割が発見された。
【００１８】
実際、当該マイクロＲＮＡは、前肥大状態のラットおよびマウスの新生児心筋細胞のサイズを効果的に減少させることがわかっている。
【００１９】
以前に公開された証拠は、このマイクロＲＮＡが心不全患者の血液中で増加することを報告している［３１］。逆に、別の報告では、心不全の患者は同じマイクロＲＮＡの心臓内レベルがさらに低いことが示されている［３２］。
【００２０】
しかしながら、先行技術では、心不全の発生ましてや治療における、このマイクロＲＮＡの原因となるまたは効果的な役割は示されておらず、示唆すらされていない。
【００２１】
現在、生体内での培養心筋細胞および心臓に外因的に投与されたｈｓａ−ｍｉＲ−６６５のこれまで知られていなかった薬理学的役割が発見された。
【００２２】
特に、肥大状態では、マイクロＲＮＡが心肥大および病理学的心臓リモデリングをブロックし、減少させると同時に心機能を高めることがわかっている。また、このマイクロＲＮＡは、生体力学的ストレス応答の調節に関与する遺伝子の発現を特異的にダウンレギュレートし、肥大状態での治療的使用をさらにサポートすることがわかっている。
【００２３】
十分に評価され、受け入れられている動物モデルで得られたこれらの結果により、ヒト対象の心疾患の治療用のｈｓａ−ｍｉＲ−６６５を含む医薬品の開発が可能になった。
【００２４】
ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５は、病的肥大に対抗し、心不全を防ぐおよび／または治療するための治療オプションとして使用できる。
【００２５】
マイクロＲＮＡはまた、病的心肥大、特に、例えば虚血後病的肥大、ＨＦｐＥＦおよび肥大型表現型を伴う遺伝的に決定された心筋症などの心筋細胞硬直の増加に関与する、により特徴づけられる全状態を防ぐおよび／または治療するために使用され得る。
【発明の概要】
【００２６】
本発明の１つの対象は、心肥大により特徴づけられる心臓の病態の予防および／または治療のためのマイクロＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５である。
【００２７】
特に、当該疾病は病的心肥大、駆出率が保持された心不全（ＨＦｐＥＦ）、減少した駆出率を有する心不全（ＨＦｒＥＦ）ならびに遺伝的および非遺伝的起源の心筋症からなる群から選択され得る。
【００２８】
特に、本発明の１つの対象は、特に心不全が心肥大の結果または心肥大に関連する場合に、心不全の予防および／または治療のためのマイクロＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５である。
【００２９】
より特には、当該マイクロＲＮＡは肥大の発症後に心臓機能を回復させるために使用され得る。
【００３０】
また、例えば、心筋梗塞および虚血性または非虚血性由来の心筋症などの心肥大を発症するリスクのある状態において使用され得る。
【００３１】
それを必要とする対象にｈｓａ−ｍｉＲ−６６５の投与を含む、生体内で心肥大を調節する、防ぐおよび／または治療する方法も本発明の範囲内である。
【００３２】
上述した使用のためのｈｓａ−ｍｉＲ−６６５の投与のための組成物、ベクターおよび製剤も本発明の範囲内である。
【００３３】
本発明の詳細な説明
定義
本発明の意味の範囲内で、心不全については、心室の血液を充填または排出する能力を損なう任意の構造的または機能的心障害から生じ得る複雑な臨床症候群が意図される。
【００３４】
本発明の意味の範囲内で、心肥大については、これは、心筋細胞のサイズの増加および細胞外マトリックスなどの他の心筋成分の変化に起因する心筋の異常な拡大または肥厚を意図しており、これにより心機能が低下する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】心筋細胞の細胞サイズを調節するマイクロＲＮＡのハイコンテンツスクリーニング。Ａ．スクリーニングワークフロー。Ｂ．スクリーニングの反復にわたるＣＭサイズ間の相関、Ｓｐｅａｒｍａｎ係数＝０．８４。各ドットは、個々のマイクロＲＮＡの効果を表す。点線は、通常のコントロールＣＭの平均面積を示す。８７５マイクロＲＮＡでのトランスフェクション後のコントロール（ＣＴＲＬ）に対するＣＭ面積倍率変化。マイクロＲＮＡ／反復あたり約２５００個の細胞が分析された。ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５の効果が具体的に示されている。８７５マイクロＲＮＡでのトランスフェクション後のコントロール（ＣＴＲＬ）へのＣＭ面積倍率変化；約２５００細胞をマイクロＲＮＡ／反復あたり解析した。ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５の効果が具体的に示される。
【図２】ラットＣＭにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−６６５抗肥大効果の検証。Ａ、実験モデル。Ｂ．フェニレフリンＰＥ（４０μＭ）でのラットＣＭの処理後のまたはフェニレフリンＰＥ（４０μＭ）で処理され、かつｈｓａ−ｍｉＲ−６６５で遺伝子導入されたラットＣＭのｑＲＴ−ＰＣＲにより評価される、示された遺伝子の発現レベル。結果は、少なくとも３つの異なる実験の平均値±ｓ．ｄ．である。＊＊Ｐ＜０．０１はｈｓａ−ｍｉＲ−６６５ｖｓ．未処理心筋細胞。
【図３】慢性圧負荷のＴＡＣモデルにおけるｈｓａ−ｍｉＲ−６６５の過剰発現の効果。Ａ．実験モデル：偽（ｓｈａｍ）手術または胸部大動脈狭窄（ＴＡＣ）は１０週齢雌性ＣＤ１マウスで実施した。同時にＴＡＣ手術を受けたマウス（ｎ＝８）をＡＡＶ９−ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５またはＡＡＶ９コントロールで注射した（１×１０１１ｖｇ／動物）。心臓機能をＴＡＣ後１５、３０日および６０日に心エコーにより解析し、マウスを組織学的解析のためにＴＡＣ後３０または６０日にと殺した。Ｂ．ＴＡＣ後３０日および６０日の偽、ＡＡＶ９−空、ＡＡＶ９−ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５についての脛骨の長さに対する心臓の重量の比率として報告される心臓の質量。＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。Ｃ．パネルＢと同じ処置でのマウスにおける心臓切片の過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色後のＣＭ断面積の測定。ＤおよびＥ．ＡＡＶ−コントロールまたはＡＡＶ−ｍｉＲ−６６５心臓内注射後（１×１０１１ｖｇ／動物）３０、４５および６０日に拡張期および駆出率（ＥＦ）中のＬＶ前壁の厚さ（ＬＶＡＷ）の心エコー評価（それぞれパネルＤおよびＥ）。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図４】確立した肥大型表現型に対するｈｓａ−ｍｉＲ−６６５の過剰発現の効果。Ａ．実験モデル：偽手術または胸部大動脈狭窄（ＴＡＣ）を１０週齢雌性ＣＤ１マウスで実施した。ＴＡＣ後１５日、ＴＡＣ手術を受けたマウス（ｎ＝８）はＡＡＶ９−ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５またはＡＡＶ９コントロールで注射し（１×１０１１ｖｇ／動物）、ＴＡＣ後３０、４５および６０日に心臓機能を心エコーにより解析し、マウスを組織学的解析のためにＴＡＣ後４５または６０日にと殺した。ＴＡＣ後３０、４５および６０日の拡張期中のＬＶＡＷｄ−左心室前壁の厚さ（Ｂ）、ＥＦ−駆出率（Ｃ）、ＬＶＩＤ−左心室内径（Ｄ）の心エコー測定。
【図５】ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５はＦＨｌ１、ＥｎａｈおよびＸｉｒｐ２を直接標的化する。Ａ．コントロールと比較したＴＡＣ下でのｈｓａ−ｍｉＲ−６６５過剰発現時のマウス試料の生体内でのｍＲＮＡｓｅｑ；ＡＡＶ９−Ｃｔｒｌで注射されたＴＡＣ−マウス（ｎ＝３）に対するＡＡＶ９−ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５で注射されたＴＡＣ−マウス（ｎ＝３）におけるアップ／ダウンレギュレートされたｍＲＮＡのＬｏｇ２倍率変化。Ｂ．３’−ＵＴＲルシフェラーゼレポーターアッセイをｃｅｌ−ｍｉＲ−６７（非標的コントロール）またはｈｓａ−ｍｉＲ−６６５で遺伝子導入されたＨｅＬａ細胞で行った。結果はＦｈｌ１、Ｅｎａｈの３’−ＵＴＲについて、およびＸｉｒｐ２の５’ＵＴＲについて、並びに空ベクター（ベクター）について、示される；ウミシイタケルシフェラーゼ活性はホタルルシフェラーゼの活性に標準化した。値は平均値±ｓ．ｄ．として表示される。＊ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１
【００３６】
ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５の配列はＩＤ  ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５（ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ；Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２１；ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＭＩ０００５５６３，  ｍａｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＭＩＭＡＴ０００４９５２）で最新で入手可能である。
【００３７】
特に、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５は以下の配列のいずれか１つを有し得る：
受託番号ＭＩ０００５５６３に対応する５’−ＵＣＵＣＣＵＣＧＡＧＧＧＧＵＣＵＣＵＧＣＣＵＣＵＡＣＣＣＡＧＧＡＣＵＣＵＵＵＣＡＵＧＡＣＣＡＧＧＡＧＧＣＵＧＡＧＧＣＣＣＣＵＣＡＣＡＧＧＣＧＧＣ−３’（配列番号１）；
成熟配列受託番号ＭＩＭＡＴ０００４９５２に対応する５’−ＡＣＣＡＧＧＡＧＧＣＵＧＡＧＧＣＣＣＣＵ−３’（配列番号２）。
本発明によれば、上記配列のいずれか１つが使用され得る。
【００３８】
本発明のマイクロＲＮＡは８７５のマイクロＲＮＡ模倣体のライブラリーを使用して新生児ラット心筋細胞（ＣＭ）において実施されるハイコンテンツ、蛍光顕微鏡ベースの、ハイスループットスクリーニングにより請求された使用について同定された。
【００３９】
本発明はまた、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５について本願明細書に開示される使用のためのｈｓａ−ｍｉＲ−６６５の一次転写産物、前駆体および模倣体を含む。マイクロＲＮＡ一次転写産物、前駆体および模倣体の概念は、当技術分野で周知であり、さらなる説明を必要としない。特に、マイクロＲＮＡ模倣体につき、ネイティブマイクロＲＮＡの活性および機能の「模倣」を目的としたＲＮＡ分子が意図される。ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５をコードするＤＮＡの使用も本発明の範囲内である。かかるＤＮＡ、例えば、ｃＤＮＡは、当該分野の一般的な知識に従って設計できる。
【００４０】
マイクロＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５は抗肥大作用を有することがわかっている。実際、心筋細胞のサイズを小さくできる。
【００４１】
より特には、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５が効果的に、強い前肥大状態でラットおよびマウス新生児心筋細胞のサイズを減少させ、かつ心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、α−骨格アクチン（ｓｋ−αアクチン）および脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）などの病的肥大後の病理学的心臓リモデリングに関連する遺伝子の発現を負に制御し、一方で正常な心臓機能に関与する遺伝子（Ｓｅｒｃａ２ａ、リアノジン受容体（Ｒｙｒ）およびα−ミオシン重鎖（Ｍｙｈ６）を正に制御することが見出された。ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５が心肥大および病理学的心臓リモデリングをブロックし、一方でＬＶ圧負荷のマウスモデルにおけるこのマイクロＲＮＡを発現するウイルスベクターの心臓内注射後に心臓機能を増加させることも見出された。
【００４２】
従って、当該マイクロＲＮＡは、病的肥大後に起こりうる病理学的心臓を防ぐことができる。
【００４３】
さらに、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５は、ＬＶの拡張とＨＦを防ぐことにより、病理学的表現型を救い、病理学的ＬＶ圧負荷にさらされるマウスの寿命を延ばすことができることが見出された。
【００４４】
従って、当該マイクロＲＮＡは心肥大の治療および心不全の予防に使用できる。
【００４５】
最後に、特定の作用メカニズムに限定されることなく、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５活性が心筋細胞収縮性に関与する転写後調節に関与すること、および、特に、細胞の剛性および弾性を調節することにより圧負荷に対する心筋細胞応答を調節し、それにより、心肥大の調節におけるこのマイクロＲＮＡの役割をさらに強化することが見出された。
【００４６】
したがって、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５は、特に心筋細胞の硬直の増加を伴う、心肥大により特徴づけられる任意の状態の治療に使用できる。
【００４７】
特に、心肥大により特徴づけられる任意の心臓病の予防また治療において使用され得る。
【００４８】
当業者、例えば、心臓病の分野に特化した医師は、当該分野の常識に従って心肥大により特徴づけられる病態を同定できる。ファースターと他の著者、Ｍｃ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｉｌｌによるハーストの「Ｔｈｅ  Ｈｅａｒｔ」の最終版も参照できる。
【００４９】
当該マイクロＲＮＡはまた、心肥大を発症するリスクのある任意の状態において有利に使用され得る。
【００５０】
実際、予防について、心肥大の状態、従って例えば、遺伝的素因、環境条件または高血圧などのいくつかの条件または病態の存在に起因する関連心疾患、にかかりやすいまたは発症するリスクのある対象へのマイクロＲＮＡの投与が意図される。
【００５１】
例えば、虚血性心筋症および心筋梗塞などの慢性のまたは突発性の虚血損傷による心筋細胞損失、慢性高血圧、心臓弁疾患、肥大型表現型を引き起こす遺伝性心筋症および病因不明の心筋症により特徴づけられる、特に拡張機能障害の増加により特徴づけられる状態で使用され得る。
【００５２】
心筋細胞サイズおよび硬さに対するその活性のおかげで、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５は特に保持された左心室駆出率を有する心不全（ＨＦｐＥＦ）の予防または治療のために有利に使用され得る。
【００５３】
本発明のマイクロＲＮＡにより防がれ得る、または治療され得る疾病は、好ましくは病的心肥大、特に虚血後病的肥大、遺伝的および非遺伝的な起源の心筋症、心筋梗塞、虚血性または非虚血性由来の心筋症、心筋虚血ならびに駆出率が保持された心不全（ＨＦｐＥＦ）および減少した駆出率を有する心不全（ＨＦｒＥＦ）を含む心不全からなる群から選択される。
【００５４】
遺伝子治療におけるｈｓａ−ｍｉＲ−６６５の使用はまた、本発明の好ましい実施形態である。
【００５５】
遺伝子治療について、疾患を治療するための医薬として患者の細胞への核酸ポリマーの治療的送達が意図される。本発明によれば、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５はかかる疾病を治療するためにそれを必要とする対象、例えば、心肥大または心不全または任意の上述の疾病に罹患するまたは発症するリスクのある対象の細胞に送達され得る。
【００５６】
本発明のさらなる対象はマイクロＲＮＡを含むＲＮＡストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）である。ＲＮＡの連続領域としてのＲＮＡストレッチの概念は、この分野で一般的に知られている。当該ＲＮＡストレッチは、インビトロにおいて無細胞転写法によって得られるか、合成によって生成されるか、または関連するＤＮＡコーディング配列の移入によって細胞内で発現されるか、またはプラスミド、ウイルスもしくは他の種類のベクターの投与によって細胞内に導入もしくは発現される。
【００５７】
本発明は、心肥大および上述した疾病のいずれかの予防および／または治療についての医薬としての使用のためのＲＮＡストレッチを提供する。
【００５８】
本発明の実施形態では、マイクロＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５は従来の方法により医薬として対象に投与され得る。
【００５９】
便宜的には、当該医薬は非経口、冠動脈内、静脈内または心臓内投与用の製剤の形態であるが、他の形態も同様に本発明を実施するのに適している。当業者は、患者の状態、疾患の重症度、患者の反応、およびこの問題の一般的な知識内の任意の他の臨床パラメーターに応じて、有効な投与時間を決定するであろう。
【００６０】
本発明の別の対象は、心肥大および任意の関連する状態、特に心不全の予防および／または治療のための有効成分としてのマイクロＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５を含む医薬組成物である。
【００６１】
本発明の医薬組成物は、以下：本発明のマイクロＲＮＡに対応する合成ＲＮＡまたはその一次転写産物または前駆体、当該マイクロＲＮＡをコードするＤＮＡ、一次転写産物をコードするＤＮＡまたはこのＤＮＡを含有する細胞の内側で産生されるマイクロＲＮＡなどのＲＮＡについての前駆体、の少なくとも１つを含有する。
【００６２】
本発明のマイクロＲＮＡ（または一次転写産物または前駆体）または対応するコーディングＤＮＡは当該技術分野では、送達を促進できるカチオン性脂質などの脂質分子またはペプチドとともに、またはポリマー足場の状況で、投与され得る。
【００６３】
リポソームなどの脂質分子をベクターとして使用してｍｉＲＮＡを投与する場合、ｍｉＲＮＡの配列は好ましくは配列番号２である（受託番号ＭＩＭＡＴ０００４９５２）。
【００６４】
かかるマイクロＲＮＡまたはその対応するＤＮＡを投与する別の方法は、ＲＮＡまたはＤＮＡの投与で知られている適切なベクターによるものである。
【００６５】
好ましいベクターは、任意のカプシド血清型のアデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）、天然の（ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９などであるがこれらに限定されない）または人工のいずれか、生体内でのＤＮＡの投与について周知のウイルスベクター［３３］である。
【００６６】
ウイルスベクターをベクターとして使用してｍｉＲＮＡを投与する場合、ｍｉＲＮＡの配列は好ましくは配列番号１（受託番号ＭＩ０００５５６３）である。
【００６７】
少なくともマイクロＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５および／または少なくとも当該マイクロＲＮＡをコードするＤＮＡおよび／または少なくとも一次転写産物または前駆体をコードするＤＮＡまたは当該マイクロＲＮＡの模倣体、またはそれらの組み合わせを含む本発明の使用のためのベクターも本発明の対象である。
【００６８】
本発明のマイクロＲＮＡに対応する合成ＲＮＡ、マイクロＲＮＡをコードするＤＮＡ、一次転写産物をコードするＤＮＡまたはこのＤＮＡを含有する細胞の内側で産生されるマイクロＲＮＡなどのＲＮＡについての前駆体を投与するための、すべてのこれらの方法および製剤は従来のものであり、当技術分野で周知であり、さらに説明する必要はない。
【００６９】
特に、当業者は、当該分野の一般的な知識に従って、例えばヒト投与のために、適切な投与モードおよびベクターを選択する方法がわかる。
【００７０】
心臓内注射および全身注射が好ましい投与経路である。しかしながら、当業者は、任意の従来の医薬組成物によりマイクロＲＮＡを投与することを決定できる。レミントンのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、最終版を参照できる。
【００７１】
投与計画、用量および薬量は、医師の経験、治療される疾患および患者の状態に従って医師により決定されるだろう。
【００７２】
選択された投与経路によれば、組成物は、経口、非経口、静脈内または動脈内投与に適した固体または液体の形である。
【００７３】
本発明による組成物は、有効成分とともに、少なくとも１つの薬学的に許容可能な媒体または賦形剤を含む。これらは、特に有用な製剤補助剤、例えば、可溶化剤、分散剤、懸濁剤、および乳化剤であり得る。
【００７４】
活性剤の平均量は異なる場合があり、特に資格のある医師の推奨と処方に基づいているべきである。
【実施例】
【００７５】
以下の実施例は、本発明をさらに説明する。
実施例１
ハイコンテンツ、蛍光顕微鏡ベースの、ハイスループットスクリーニングは、心筋細胞サイズを改変できるマイクロＲＮＡを同定する。
【００７６】
８７５マイクロＲＮＡ模倣体のライブラリー（９８８  ｍａｔｕｒｅ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ，  ８７５  ｕｎｉｑｕｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，  ｍｉＲＢａｓｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  １３．０（２００９、ｈｔｔｐ：／／ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ）を使用して、ハイコンテンツ、蛍光顕微鏡ベースの、ハイスループットスクリーニングを新生児ラット心筋細胞（ＣＭ）において実施した。新生児ラット心室のＣＭの培養をマイクロＲＮＡ模倣体のライブラリーで逆遺伝子導入した。７２時間後、細胞をサルコメアα−アクチニンで染色して、ＣＭのサイズと数を特異的に測定した。（図１における実験模式図、パネルＡ）。スクリーニングは二連で行った。；反復試験は非常に良好な再現性を示した（Ｓｐｅａｒｍａｎ係数０．８４；図１Ｂ）。図１パネルＣは各マイクロＲＮＡがＣＭ細胞サイズに及ぼす影響を、模擬遺伝子導入ＣＭに対する倍率変化として表している。平均して、実験条件ごとに約２５００個の細胞が分析され、再現された。
【００７７】
１１個のマイクロＲＮＡが、ＣＭ細胞サイズをコントロールに対して１  Ｌｏｇ２倍以上減少できることがわかった（ｍｉＲ−ｃｅｌ６７でトランスフェクトされたＣＭ）；ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５は最も効果的な抗肥大性マイクロＲＮＡであった。
【００７８】
実施例２
スクリーニングヒットの検証
スクリーニング結果に基づいて、各マイクロＲＮＡが肥大表現型に対抗または誘導する能力を評価するという特定の目的で、抗肥大および肥前肥大状態の下での選択されたトップマイクロＲＮＡの効果を検証および特性化することにした。最初に、以前に病的肥大（胎児の心臓遺伝子プログラム：心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、β−ミオシン重鎖（ＭＹＨ７）およびα−骨格アクチン（ｓｋ−αアクチン）［４］または生理的な肥大（Ｓｅｒｃａ２ａ、α−ミオシン重鎖（ＭＹＨ６）およびリアノジン受容体（ＲＹＲ）［４］に関連していた遺伝子のセットの発現に対する各マイクロＲＮＡの効果を調べた。特に、ＣＭ細胞サイズを減少させることができるマイクロＲＮＡの効果を調べるために、これらの細胞を既知の前肥大刺激であるフェニレフリン（ＰＥ）で刺激し、同時に個々のマイクロＲＮＡで遺伝子導入した。トランスフェクションの７２時間後に総ＲＮＡを抽出し、調査した遺伝子サブセットに特異的なＴａｑＭａｎプローブを使用したｑＲＴ−ＰＣＲで分析した（実験模式図、図２、パネルＡ）。０．１％ＦＢＳで培養したラットＣＭに対するＰＥ（４０μＭ）の純粋な効果を、マイクロＲＮＡの非存在下で７２時間の処理後にｑＲＴ−ＰＣＲにより評価した。ＰＥは、胎児心臓遺伝子プログラムに典型的な遺伝子のサブセット（ＡＮＰ、ＢＮＰおよびｓｋ−αアクチン）を強くアップレギュレートし、コントロールと比較してＣＭサイズを有意に増加させた（図２、パネルＢ）。
【００７９】
ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５は、ＡＮＰとＢＮＰのレベルを下げることにより、ＰＥによって誘導される病的肥大のシグネチャを元に戻すことができ、同時に、良い収縮性の全既知のマーカーＳｅｒｃａ２ａ、ＲｙＲおよびＭＹＨ６をアップレギュレートした（図２、パネルＢ）［３４、３５］。
【００８０】
実施例３
ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５はマウスにおける横行大動脈狭窄後の肥大の発症に対抗し、かつ心臓機能を維持する。
生体内でのｈｓａ−ｍｉＲ−６６５の抗肥大性効果を評価するために、このマイクロＲＮＡが慢性心臓の圧負荷の横行大動脈狭窄（ＴＡＣ）モデルにおける肥大を防ぐことができるかどうかを調べた。８週齢のＣＤ１マウスをＴＡＣまたは偽手術に供し、同時にｈｓａ−ｍｉＲ−６６５を発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型９（ＡＡＶ９）ベクターまたはコントロールベクターでＬＶ前壁（ＬＶＡＷ）に注射した（１×１０１１ｖｇ／動物；ｎ＝群当たり８；図３、パネルＡ）。我々の以前の経験ではこの手順が効率的な心筋形質導入および導入遺伝子の１か月間の発現をもたらすことを示している［２５］。
【００８１】
図３パネルＢで報告されているように、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５の過剰発現は３０日および６０日の両方で心臓の肥大性リモデリングに対抗することができ、生理学的レベルで心臓質量を維持した（ＴＡＣ後３０日、脛骨の長さ（ｍｍ）で正規化された心臓質量（ｇｒ）は０．０９±０．０２０であった；コントロールベクター受けた動物については０．０１３±０．０１９、Ｐ＜０．００１；ＴＡＣ後６０日、ＡＡＶ９−ｍｉＲ−６６５注射動物について０．０１０±０．０００６およびコントロールベクター受けた動物について０．０１５±０．０００８、Ｐ＜０．０１）。
【００８２】
処理およびコントロールマウスの心臓切片の過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色はＴＡＣ後３０日で心筋細胞断面積の顕著な減少を明らかにした（ＡＡＶ９−ｍｉＲ−６６５注射動物について２４２．２６±７６．０２０μｍ２、コントロールベクター受けた動物について比較して４８７．２６±１０４．２７μｍ２、Ｐ＜０．００１）。（図３、パネルＣ）。
【００８３】
ＴＡＣの１５、３０、および６０日後に心エコー検査で評価されたように、拡張期のＬＶ前壁厚（ＬＶＡＷ）は、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５処理マウスで３０日と６０日の両方でコントロールと比較して有意に減少した。
ＴＡＣ後１５、３０日および６０日で心エコーで評価すると、拡張期におけるＬＶ前壁の厚さ（ＬＶＡＷ）は３０日および６０日の両方でコントロールと比較してｈｓａ−ｍｉＲ−６６５−処理マウスで有意に減少した。ＴＡＣ後３０日で、ＡＡＶ９−ｍｉＲ−６６５注射動物がＬＶＡＷ厚さ−ｄは１．０１±０．０５ｍｍを有し、コントロールベクター受けた動物については１．３６±０．６５ｍｍ、Ｐ＜０．０１、この効果はＴＡＣ後６０日まで維持された、ＡＡＶ９−ｍｉＲ−６６５について１．０２±０．１５ｍｍおよびコントロール処理動物について１．４４±０．８ｍｍ；Ｐ＜０．０１（図３、パネルＤ）。
【００８４】
注目すべきことに、ＴＡＣ後３０日および６０日に、左心室駆出率（ＬＶＥＦ）も、コントロール動物と比較してＡＡＶ９−ｍｉＲ−６６５で処理した狭窄マウスで顕著に保持された（図３、パネルＥ）（ＴＡＣ後３０日、ＡＡＶ９−ｍｉＲ−６６５注射動物のＬＶＥＦは５６．５±５．４であった、コントロール処理動物では４２．５４±５．９０％、Ｐ＜０．０５；ＴＡＣ後６０日でＡＡＶ９−ｍｉＲ−６６５注射動物のＬＶＥＦは５１．３±５．８であった、コントロール処理動物では３４．８２±０．７７％、Ｐ＜０．０１）。
【００８５】
総合すると、これらの結果は大動脈バンディング後のｈｓａ−ｍｉＲ−６６５の過剰発現は心肥大の減少および慢性心臓過負荷モデルにおける心臓の機能の維持に有利な効果を奏することを指し示し、このマイクロＲＮＡがインビトロで病理学的心筋細胞肥大を減少させることを示した効果と一致する。
【００８６】
実施例４
ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５は心臓の拡張および肥大性心臓における機能障害発症を遅らせる。
これらの結果の可能な橋渡し応用（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）に焦点を当てて、次に、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５が病的肥大の発症を救い、正常な心臓表現型に戻すことができるかどうかを検証することにした。
【００８７】
このレスキュー実験では、ＴＡＣ手術の２週間後に、ＡＡＶ９−ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５またはＡＡＶ９コントロールをマウスにＬＶＡＷで注射した（１×１０１１ｖｇ／動物；１０週齢雌性ＣＤ１マウス、ｎ＝群当たり８）。動物に３０、４５および６０日続いた（図４における実験模式図、パネルＡ）。フォローアップ中に軽度の肥大表現型の有意な救出は観察されなかったが（ＡＡＶ注射後１５／３０日−ＴＡＣ後４５および６０、ＬＶＡＷ−ｄ厚さ：ＡＡＶ９−ｍｉＲ−６６５処理動物について０．８８±１．１３／０．９１±０．０８ｍｍ、コントロールでは０．８±０．１１／０．９６±０．３３ｍｍ）、ＬＶＩＤ−ｄおよびＥＦは、コントロールについて、処理動物で正常範囲に強く維持された（最終時点でＬＶＥＦはそれぞれ処理およびコントロール動物で５７．５％±５．６０  ｖｓ  ２８．４％±１５、ｐ＜０．００１；最終時ＬＶＩＤ−ｄ：それぞれ処理およびコントロール動物で４．０５±０．１６ｍｍ、４．８±０．６９ｍｍ、ｐ＜０．００１）（図４パネルＢ、ＣおよびＤ）。
【００８８】
まとめると、これらの結果は、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５が大動脈狭窄誘導圧負荷後の心臓機能の維持に大きな有利な効果を発揮することを示している。これらの結果は、ｅｘ  ｖｉｖｏおよび生体内での両方で心筋細胞肥大を防ぐこのｍｉｃｒｏＲＮＡの能力と一致するようである。
【００８９】
実施例５
ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５はＦｏｕｒ  ａｎｄ  Ｈａｌｆ  Ｌｉｍドメイン１（ＦＨＬ１）を標的化し、かつＬＶコンプライアンスを促進する
ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５の関連する標的を同定するために、ＴＡＣおよびｈｓａ−ｍｉＲ−６６５またはＡＡＶ−コントロールでの形質導入後のＲＮＡディープシーケンシングにより心臓における全体的なトランスクリプトーム変化を評価した。この解析は９０のダウンレギュレートされた転写産物（ＦＰＫＭ＞２０、２倍のダウンレギュレートに設定された閾値）および４７のアップレギュレートされたｍＲＮＡ（ＦＰＫＭ＞２０、２倍のアップレギュレートに設定された閾値）を同定した（図５、パネルＡ）。次に、サルコメアＩバンドメカノトランスダクションと筋原線維リモデリングに機能的に結合されたダウンレギュレートされた転写産物を探した。
【００９０】
このアプローチはＵＴＲ−ルシフェラーゼレポーターアッセイによりｈｓａ−ｍｉＲ−６６５の直接の標的であることが示された３つのサルコメアタンパク質（すなわちＥｎａｈ、Ｆｈｌ１およびＸｉｒｐ２）を同定した（図５、パネルＢ）。
【００９１】
これらのすべての転写産物は、介在板（ＩＤ）の近くに局在するタンパク質をコードする。ここで、それらは複数の機械的刺激を統合および伝達し、それにより、転写レベルおよび構造レベルの両方で心臓肥大リモデリングを促進する［３６−３９］。さらに、Ｓｈｅｉｋｈ  Ｆ．ら（［４０］）は、ＦＨＬ１がタイチンのＮ２Ｂ領域に結合することを示し、それは、拡張機能中の筋原線維受動張力の原因となるばね様ドメインである［４１］［４２］。実際、ＦＨＬ１−／−マウスの心臓は、心筋硬直の減少、収縮機能の増加、ＴＡＣ後の肥大した表現型の鈍化を示す［４０］。
【００９２】
これらの結果は、心筋細胞の生体力学的ストレス応答を媒介することが知られている遺伝子のダウンレギュレーションを介して、少なくとも部分的に、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５の抗肥大効果が発揮されることを示す。
【００９３】
引用文献
【表１】
2020509766.tif 000003
【表２】
2020509766.tif 000004
【表３】
2020509766.tif 000005
【表４】
2020509766.tif 000006
【図１】
2020509766.tif 000007
【図２】
2020509766.tif 000008
【図３】
2020509766.tif 000009
【図４】
2020509766.tif 000010
【図５】
2020509766.tif 000011
【配列表】
2020509766000001.app
【国際調査報告】
2020509766.tif 000012
2020509766.tif 000013
2020509766.tif 000014