(57)【要約】本発明は、細胞表面に抗原を発現する細胞を標的とすることによる疾患の治療を、広く包含する。特に、本発明は組換え抗原受容体及びその使用に関する。そのような抗原受容体を発現するように改変した T 細胞は、抗原受容体が結合する 1 つ以上の抗原が発現することを特徴とする疾患の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第 1 ペプチド鎖と第 2 ペプチド鎖を含む抗原受容体であって、
ここで
前記第 1 ペプチド鎖は、第 1 ドメイン、第 2 ドメイン、T  細胞受容体鎖の可変領域又はその一部、及び免疫受容体シグナル伝達ドメインを含む；
前記第 2 ペプチド鎖は、第 1 ドメイン、第 2 ドメイン、T  細胞受容体鎖の可変領域又はその一部、及び免疫受容体シグナル伝達ドメインを含む；
ここで、前記第 1 ペプチド鎖の第 1 ドメインは、前記第 2 ペプチド鎖のドメインのうちの 1 つと一緒に第 1 抗原結合部位を形成する、及び
ここで、前記第 1 ペプチド鎖の第 2 ドメインは、前記第 2 ペプチド鎖のもう 1 つの他のドメインと一緒に第 2 抗原結合部位を形成する、
抗原受容体。
【請求項２】
前記免疫受容体シグナル伝達ドメインが、T 細胞受容体鎖の定常領域若しくは不変領域、若しくは免疫細胞 Fc 受容体鎖の定常領域若しくは不変領域、又は前記定常領域若しくは不変領域の一部を含む、請求項１に記載の受容体。
【請求項３】
前記第 1 及び／又は第 2 ペプチド鎖が、前記第 1 及び第 2 ドメイン間、並びに／又は前記第 1 及び第 2 ドメイン並びに T 細胞受容体鎖の可変領域又はその一部との間にリンカーを更に含む、請求項１又は２に記載の受容体。
【請求項４】
前記リンカーが任意のアミノ酸配列である、請求項３に記載の受容体。
【請求項５】
前記第 1 及び／又は第 2 ドメインがそれぞれ免疫グロブリン鎖の可変領域若しくは T 細胞受容体鎖の可変領域、又は前記可変領域の一部を含む、請求項１から４の何れか一項に記載の受容体。
【請求項６】
（i）前記第 1 ペプチド鎖は、T 細胞受容体アルファ鎖の可変領域若しくはその一部、及び T 細胞受容体アルファ鎖の定常領域若しくはその一部、を含み、並びに前記第 2 ペプチド鎖は、T 細胞受容体ベータ鎖の可変領域若しくはその一部、及び T 細胞受容体ベータ鎖の定常領域若しくはその一部、を含む、又は、
（ii）前記第 1 ペプチド鎖は、T 細胞受容体ベータ鎖の可変領域若しくはその一部、及び T 細胞受容体ベータ鎖の定常領域若しくはその一部、を含み、並びに前記第 2 ペプチド鎖は、T 細胞受容体アルファ鎖の可変領域若しくはその一部、及び T 細胞受容体アルファ鎖の定常領域若しくはその一部、を含む、
請求項１から５の何れか一項に記載の受容体。
【請求項７】
前記免疫受容体シグナル伝達ドメインがヒト起源である、請求項１から６の何れか一項に記載の受容体。
【請求項８】
前記第 1 ペプチド鎖の第 1 ドメインが、抗原に対して特異性を有する免疫グロブリン重鎖の可変領域又はその一部を含み、及び前記第 1 ペプチド鎖の第 1 ドメインと一緒に抗原結合部位を形成する第 2 ペプチド鎖のドメインが、前記抗原に対して特異性を有する免疫グロブリン軽鎖の可変領域又はその一部を含む、請求項１から７の何れか一項に記載の受容体。
【請求項９】
前記第 1 ペプチド鎖の第 2 ドメインが、抗原に対して特異性を有する免疫グロブリン重鎖の可変領域又はその一部を含み、及び前記第 1 ペプチド鎖の第 2 ドメインと一緒に抗原結合部位を形成する第 2 ペプチド鎖のドメインが、前記抗原に対して特異性を有する免疫グロブリン軽鎖の可変領域又はその一部を含む、請求項１から８の何れか一項に記載の受容体。
【請求項１０】
前記第 1 及び第 2 抗原結合部位が、同じ抗原又は異なる抗原に結合する、請求項１から９の何れか一項に記載の受容体。
【請求項１１】
前記第 1 及び第 2 抗原結合部位が、同じ抗原上の異なるエピトープに結合する、請求項１から１０の何れか一項に記載の受容体。
【請求項１２】
前記抗原が疾患特異的抗原、好ましくは腫瘍抗原である、請求項１から１１の何れか一項に記載の受容体。
【請求項１３】
前記抗原が細胞の表面で発現している、請求項１２に記載の受容体。
【請求項１４】
前記第 1 ペプチド鎖の第 1 及び第 2 ドメインはそれぞれ、免疫グロブリン重鎖の可変領域又はその一部を含む；並びに
前記第 2 ペプチド鎖の第 1 及び第 2 ドメインはそれぞれ、免疫グロブリン軽鎖の可変領域又はその一部を含む、
請求項１から１３の何れか一項に記載の受容体。
【請求項１５】
前記第 1 ペプチド鎖の N 末端ドメインは、前記第 2 ペプチド鎖の N 末端ドメインと一緒に抗原結合部位を形成する；及び
前記第 1 ペプチド鎖の C 末端ドメインは、前記第 2 ペプチド鎖の C 末端ドメインと一緒に抗原結合部位を形成する、
請求項１から１４の何れか一項に記載の受容体。
【請求項１６】
第 1 及び第 2 ドメインを含むペプチド鎖であって、それぞれのドメインは免疫グロブリン重鎖の可変領域若しくはその一部を含む、又はそれぞれのドメインは免疫グロブリン軽鎖の可変領域若しくはその一部を含む、並びにここで、前記ペプチド鎖は、 T 細胞受容体鎖の可変領域若しくはその一部、及び免疫受容体シグナル伝達ドメイン、を更に含む、ペプチド鎖。
【請求項１７】
請求項１から１５の何れか一項で定義される、第 1 ペプチド鎖、第 2 ペプチド鎖、若しくは第 1 及び第 2 ペプチド鎖の両方を発現するか、又は請求項１６のペプチド鎖を発現する、組換え細胞。
【請求項１８】
第 1 ペプチド鎖及び第 2 ペプチド鎖を含む抗原受容体を発現する細胞を作製する方法であって、以下：
（a）細胞を用意すること；
（b）少なくとも第 1 ドメイン、第 2 ドメイン、T 細胞受容体鎖の可変領域又はその一部、及び免疫受容体シグナル伝達ドメインを含む、第 1 ペプチド鎖をコードする第 1 遺伝子構築物を用意すること；
（c）少なくとも第 1 ドメイン、第 2 ドメイン、T 細胞受容体鎖の可変領域又はその一部、及び免疫受容体シグナル伝達ドメインを含む、第 2 ペプチド鎖をコードする第 2 遺伝子構築物を用意すること；
（d）前記第 1 及び第 2 遺伝子構築物を前記細胞に導入すること； 
（e）前記構築物を前記細胞内で発現させること;
ここで、前記第 1 ペプチド鎖の第 1 ドメインは、前記第 2 ペプチド鎖のドメインのうちの 1 つと一緒に第 1 抗原結合部位を形成することができる、
ここで、前記第 1 ペプチド鎖の第 2 ドメインは、前記第 2 ペプチド鎖のもう 1 つの他のドメインと一緒に第 2 抗原結合部位を形成することができる、
を含む、方法。
【請求項１９】
前記抗原受容体の発現が細胞表面である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第 1 ペプチド鎖及び前記第 2 ペプチド鎖が、単一の遺伝子構築物上で提供される、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞がヒト細胞である、請求項１８から２０の何れか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞が T 細胞である、請求項１８から２１の何れか一項に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１８から２２の何れか一項に記載の方法により産生される、組換え細胞。
【請求項２４】
請求項１から１５の何れか一項で定義される第 1 ペプチド鎖、第 2 ペプチド鎖、若しくは第 1 及び第 2 ペプチド鎖の両方をコードする、又は請求項１６のペプチド鎖をコードする、核酸。
【請求項２５】
前記核酸が DNA 又は RNA である、請求項２４に記載の核酸。
【請求項２６】
請求項１から１５の何れか一項に記載の抗原受容体、請求項１７若しくは２３に記載の組換え細胞、又は請求項２４若しくは２５に記載の核酸；及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項２７】
薬剤として使用するための請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記抗原受容体が結合する少なくとも １ 種の抗原の発現を特徴とする疾患を治療する際に使用するための請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記抗原が腫瘍抗原である、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記疾患が、がんである、請求項２８又は２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
治療有効量の請求項２６に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、疾患の治療方法であって、ここで前記疾患が、前記抗原受容体が結合する少なくとも 1 種の抗原の発現を特徴とする、疾患の治療方法。
【請求項３２】
前記抗原が腫瘍抗原である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記疾患が、がんである、請求項３１又は３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え抗原受容体及びその使用に関する。そのような抗原受容体を発現するように改変した T 細胞は、抗原受容体が結合する 1 種以上の抗原の発現を特徴とする疾患の治療に有用である。
【背景技術】
【０００２】
T 細胞は、ヒト及び動物の細胞性免疫において中心的な役割を果たす。特定の抗原の認識と結合は、T 細胞の表面に発現する T 細胞受容体（T cell receptors（TCRs））によって媒介される。T 細胞の TCR は、主要組織適合遺伝子複合体（major histocompatibility complex（MHC））分子に結合し、及び標的細胞の表面で提示される免疫原性ペプチド（エピトープ）と相互作用することができる。TCR の特異的結合は T 細胞内のシグナル・カスケードを引き起こし、増殖、及び成熟エフェクター T 細胞への分化、を引き起こす。
【０００３】
前記 TCR は、TCRα 鎖と β 鎖のヘテロダイマー複合体、共受容体 CD4 又は CD8、及び CD3 シグナル伝達モジュール、を含む複雑なシグナル伝達機構の一部である。CD3 鎖自体が細胞内のアダプター・タンパク質に入力シグナルを伝達する一方で、TCR α/β ヘテロダイマーは、抗原認識、及び CD3 と協同した細胞膜を介した活性化シグナルの中継、を担っている。従って、前記 TCRα/β 鎖を移入させることは、T 細胞を、目的とする任意の抗原に変更して仕向けさせる機会を提供する。
【０００４】
養子細胞移植（Adoptive cell transfer（ACT））をベースとした免疫療法とは、予め感作した T 細胞を、少ない数の前駆細胞を臨床的に意味のある細胞数にまで、ex vivo で増殖させた後に、免疫が無いレシピエント又は自己宿主に移植する、受動免疫の形態として広く定義できる。ACT 実験に使用されてきている細胞タイプには、リンホカイン活性化キラー（lymphokine-activated killer（LAK））細胞（Mule, J.J. et al. (1984) Science 225, 1487-1489；Rosenberg, S.A. et al. (1985) N. Engl. J. Med. 313, 1485-1492）、腫瘍浸潤リンパ球（tumor-infiltrating lymphocytes（TILs））（Rosenberg, S.A. et al. (1994) J. Natl. Cancer Inst. 86, 1159-1166）、造血幹細胞移植（hematopoietic stem cell transplantation（HSCT））後のドナー・リンパ球、及び腫瘍特異的 T 細胞株又はクローン（Dudley, M.E. et al. (2001) J. Immunother. 24, 363-373；Yee, C. et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 99, 16168-16173）、が含まれる。養子 T 細胞移植は、CMV 等のヒト・ウイルス感染症に対して治療活性を有することが示された。黒色腫の養子免疫療法については、Rosenberg と同僚は、骨髄非破壊的リンパ球除去化学療法（non-myeloablative lymphodepleting chemotherapy）と高用量 IL2 とを組み合わせた、切除した腫瘍から単離し、in vitro で増殖させた自己の腫瘍浸潤リンパ球（TIL）を注入するという ACT アプローチを確立した。臨床試験の結果、転移性黒色腫を患う治療患者の客観的奏効率（objective response rate）は約 50 ％であった（Dudley, M.E. et al. (2005) J. Clin. Oncol. 23: 2346-2357）。
【０００５】
別のアプローチは、定義した特異性を有する腫瘍反応性免疫受容体を発現するように、短時間の ex vivo 培養中にリプログラミングした自己 T 細胞を養子移植し、その後、前記患者に再注入することである（Kershaw M.H. et al. (2013) Nature Reviews Cancer 13 (8):525-41）。この戦略により、患者に腫瘍反応性 T 細胞が存在しない場合でも、ACT を様々な一般的な悪性腫瘍に適用できるようになる。T 細胞の抗原特異性は TCRα 鎖及び β 鎖のヘテロダイマー複合体に完全に依存しているため、クローン化した TCR 遺伝子を T 細胞に移入することによって、それら T 細胞を、目的とする任意の抗原に変更して仕向けさせることが可能になる。従って、TCR 遺伝子治療は、治療オプションとして、自己リンパ球を用いた抗原特異的な免疫療法を開発するための魅力的な戦略を提供する。TCR 遺伝子を移入することの主な利点は、数日以内に治療量の抗原特異的な T 細胞を作成できることと、及び患者の内因性 TCR レパートリーには存在しない特異性を導入できること、である。幾つかのグループは、TCR 遺伝子を移入することが、初代 T 細胞の抗原特異性を変更して仕向けさせる魅力的な戦略であることを実証した（Morgan, R.A. et al. (2003) J. Immunol. 171, 3287-3295; Cooper, L.J. et al. (2000) J. Virol. 74, 8207-8212; Fujio, K. et al. (2000) J. Immunol. 165, 528-532; Kessels, H.W. et al. (2001) Nat. Immunol. 2, 957-961; Dembic, Z. et al. (1986) Nature 320, 232-238）。ヒトにおける TCR 遺伝子治療の実現可能性は、Rosenberg と彼のグループによって、悪性黒色腫の治療についての臨床試験で最初に実証された。メラノーマ／メラノサイト抗原に特異的な TCRs をレトロウイルスで形質導入した自己リンパ球を養子移植することによって、治療を受けたメラノーマ患者の最大 30 ％で、がんの退縮がもたらされた（Morgan, R.A. et al. (2006) Science 314, 126-129; Johnson, L.A. et al. (2009) Blood 114, 535-546）。一方、TCR 遺伝子治療の臨床試験は、多くの種々の腫瘍抗原を標的として、黒色腫以外のがんにも拡大された（Park, T.S. et al., (2011) Trends Biotechnol. 29, 550-557）。
【０００６】
遺伝子改変的なアプローチを使用して、定義された特異性を有する、抗原標的化した受容体を T 細胞に挿入することによって、ACT の潜在的な可能性が大幅に拡張された。キメラ抗原受容体（Chimeric antigen receptors (CARs)）は、細胞外抗原結合ドメイン（最も一般的にはモノクローナル抗体の単鎖可変フラグメント（scFv’s））に融合した細胞内 T 細胞シグナル伝達ドメイン、で構成される抗原標的化受容体の一種である。CARs によって、MHC が介する提示とは無関係に、細胞表面抗原を直接認識し、全ての患者において、任意の抗原に対して特異的な単一の受容体構築物を使用することが可能になる。最初の CARs は、抗原認識ドメインを T 細胞受容体（TCR）複合体の CD3ζ活性化鎖に融合させた。その次の世代の CAR には、CD28 又は 4-1BB（CD137）及び OX40（CD134）等の様々な TNF 受容体ファミリー分子に由来する細胞内ドメイン等を含む、CD3ζと連携する二次共刺激シグナルが含まれている。更に、第 3 世代の受容体には、CD3ζに加えて、最も一般的には CD28 及び 4-1BB に由来する 2 つの共刺激シグナルが含まれる。第 2 及び第 3 世代の CARs は、in vitro 及び in vivo で抗腫瘍効果が劇的に改善していて（Zhao et al., (2009) J. Immunol., (183) 5563-5574）、ある場合には、進行がん患者に完全寛解を誘導した（Porter et al., (2011) N.Engl.J.Med., (365) 725-733）。
【０００７】
古典的 CAR は、膜貫通ドメイン及び CD3ζ等のシグナル伝達ドメインに融合した、抗原特異的な単鎖抗体（scFv）フラグメントで構成されている。T 細胞に導入されると、それは膜結合タンパク質として発現し、その同種抗原に結合すると、免疫応答を誘導する（Eshhar et al., (1993) PNAS, (90) 720-724）。誘導された抗原特異的な免疫応答により、細胞傷害性 CD8+ T 細胞が活性化され、特定の抗原を発現する腫瘍細胞又はウイルス感染細胞等の特定の抗原を発現する細胞が根絶される。しかしながら、これらの古典的 CAR 構築物は、T 細胞の活性化に通常不可欠な内因性の CD3 複合体を介して、T 細胞を活性化／刺激するものではない。前記抗原結合ドメインを CD3ζに融合させることにより、T 細胞の活性化が、生化学的な「近道（short circuit）」により誘導される（Aggen et al., (2012) Gene Therapy, (19) 365-374）。この非生理学的な T 細胞の活性化は、T 細胞の過剰な活性化が望ましくない副作用を引き起こす可能性があるため、この方法の治療を受ける患者に対してリスクをもたらす。例えば、CAR 発現により、組換え T 細胞が、基底レベルで、長期的に活性化されることが in vitro で観察されており（「強直性シグナル伝達（tonic signaling）」）、これによって、組換え CAR 発現 T 細胞の表面上で、LAG-3、TIM-3 及び PD-1 等の阻害分子の蓄積が増加し、これによって、次に、T 細胞が早期に消耗することになって、in vivo での腫瘍細胞に対する反応に強い負の影響がもたらされる（Long et al., (2015) Nat. Med., (21) 581-590）。この有害作用は、この抗体のフレームワーク残基を介した scFv フラグメントの不規則なクラスター化と関連している。更に、このタイプの古典的な CAR 構築物は、白血病等の種々の新生物に対する試験において、奏功を示してきている（Porter et al., (2011) N.Engl.J.Med., (365) 725-733）一方で、正常組織において、前記標的抗原（標的腫瘍抗原）が基底レベルで発現していることにより、致命的な自己免疫疾患ももたらした（オン−ターゲット／オフ−腫瘍反応；Morgan et al., (2010) Mol Ther., (18) 843-51）。
【０００８】
T 細胞の活性化をより生理学的なメカニズムを介して行う別のアプローチは、T 細胞受容体（TCR）に由来する Cβ 定常ドメインに融合した単鎖 TCR（scTv）フラグメントのアナログを作成し、TCR 由来の Cα 定常ドメインと共発現させることであり（Voss et al., (2010) Blood, (115) 5154-5163）、後者によって、必須の内因性 CD3ζホモダイマーが集められる（Call et al., (2002) Cell, (111) 967-79.）。しかし、これらの構築物が免疫系活性化因子として機能するためには、それらの定常ドメインをマウス TCRs に由来するものにするか、又はマウス化して（Cohen et al., (2006) Cancer Res., (66) 8878-86; Bialer et al., (2010) J. Immunol., (184) 6232-41）、scTCR と Cα 間で鎖を対合（chain pairing）させることが必須であった。これらの構築物が、機能するために異種配列を持たなければならないという事実によって、投与した場合に免疫系がそれらに対して反応し、それらの治療効果が損なわれるか又は破壊されるリスクが高まる。
【０００９】
従って、代替の組換え抗原受容体を提供することに対して、であって、前記受容体が、例えば、抗原結合時に、内因性 CD3 複合体を介した正常な生理学的様式で、前記受容体を発現する T 細胞を十分に活性化することができ、前記組換え抗原受容体自身に対する望ましくない免疫応答を誘発する可能性があるヒト起源ではないアミノ酸配列の存在を、少なくとも前記抗原受容体のシグナル伝達ドメイン内において、全く必要としない、代替の組換え抗原受容体、を提供することに対して、ニーズがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、少なくとも 2 つの抗原結合部位を有する組換え抗原受容体に関する。前記抗原受容体は 2 つのペプチド鎖を含む。前記ペプチド鎖はそれぞれ、T 細胞受容体鎖の可変領域又はその一部に加えて、少なくとも 2 つのドメイン、及び免疫受容体シグナル伝達ドメインとを含み、1 つのペプチド鎖上の前記 2 つのドメインのそれぞれが、もう 1 つの他のペプチド鎖上のドメインのうちの 1 つと抗原結合部位を形成する、ある実施形態では、本発明の抗原受容体は T 細胞受容体の構造を有し、その鎖はそれぞれ、抗原結合部位を形成する前記少なくとも 2 つのドメインを、好ましくは T 細胞受容体鎖の N 末端に、含む。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
ある態様では、本発明は抗原受容体に関するもので、この受容体は、第 1 ペプチド鎖と第 2 ペプチド鎖を含み、ここで、前記第 1 ペプチド鎖は、第 1 ドメイン、第 2 ドメイン、T 細胞受容体鎖の可変領域又はその一部、及び免疫受容体シグナル伝達ドメインを含む；前記第 2 ペプチド鎖は、第 1 ドメイン、第 2 ドメイン、T 細胞受容体鎖の可変領域又はその一部、及び免疫受容体シグナル伝達ドメインを含む；ここで、前記第 1 ペプチド鎖の第 1 ドメインは、前記第 2 ペプチド鎖のドメインのうちの 1 つと一緒に第 1 抗原結合部位を形成する、及びここで、前記第 1 ペプチド鎖の第 2 ドメインは、前記第 2 ペプチド鎖のもう 1 つの他のドメインと一緒に第 2 抗原結合部位を形成する。この態様の抗原受容体において、それぞれの抗原結合部位を形成するドメインは、好ましくは異なるペプチド鎖上に位置する。その結果、抗原結合部位はドメインの分子間相互作用によって形成される。
【００１２】
ある実施形態では、第 1 及び／又は第 2 ドメインはそれぞれ、免疫グロブリン鎖の可変領域若しくは T 細胞受容体鎖の可変領域、又は前記可変領域の一部を含む。
【００１３】
ある実施形態では、第 1 抗原結合部位を形成するドメインのうちの 1 つは、抗原に対して特異性を有する免疫グロブリン重鎖の可変領域又はその一部を含み、第 1 抗原結合部位を形成するもう 1 つの他のドメインは、抗原に対して特異性を有する免疫グロブリン軽鎖の可変領域又はその一部を含む。ある実施形態では、第 2 抗原結合部位を形成するドメインのうちの 1 つは、抗原に対して特異性を有する免疫グロブリン重鎖の可変領域又はその一部を含み、第 2 抗原結合部位を形成するもう 1 つの他のドメインは、抗原に対して特異性を持つ免疫グロブリン軽鎖の可変領域又はその一部を含む。
【００１４】
ある実施形態では、前記第 1 ペプチド鎖の第 1 ドメインが、抗原に対して特異性を有する免疫グロブリン重鎖の可変領域又はその一部を含み、及び前記第 1 ペプチド鎖の第 1 ドメインと一緒に抗原結合部位を形成する第 2 ペプチド鎖のドメインが、前記抗原に対して特異性を有する免疫グロブリン軽鎖の可変領域又はその一部を含む。ある実施形態では、前記第 1 ペプチド鎖の第 2 ドメインが、抗原に対して特異性を有する免疫グロブリン重鎖の可変領域又はその一部を含み、及び前記第 1 ペプチド鎖の第 2 ドメインと一緒に抗原結合部位を形成する第 2 ペプチド鎖のドメインが、前記抗原に対して特異性を有する免疫グロブリン軽鎖の可変領域又はその一部を含む。
【００１５】
ある実施形態では、前記第 1 ペプチド鎖の第 1 及び第 2 ドメインはそれぞれ、免疫グロブリン重鎖の可変領域又はその一部を含む；並びに前記第 2 ペプチド鎖の第 1 及び第 2 ドメインはそれぞれ、免疫グロブリン軽鎖の可変領域又はその一部を含む。
【００１６】
ある実施形態では、前記第 1 ペプチド鎖の N 末端ドメインは、前記第 2 ペプチド鎖の N 末端ドメインと一緒に抗原結合部位を形成する；及び、前記第 1 ペプチド鎖の C 末端ドメインは、前記第 2 ペプチド鎖の C 末端ドメインと一緒に抗原結合部位を形成する。
【００１７】
ある実施形態では、前記第 1 ペプチド鎖の N 末端ドメインは、前記第 2 ペプチド鎖の C 末端ドメインと一緒に抗原結合部位を形成する；及び、前記第 1 ペプチド鎖の C 末端ドメインは、前記第 2 ペプチド鎖の N 末端ドメインと一緒に抗原結合部位を形成する。
【００１８】
本発明の抗原受容体のある実施形態では、前記免疫受容体シグナル伝達ドメインが、T 細胞受容体鎖の定常領域若しくは不変領域、若しくは免疫細胞 Fc 受容体鎖の定常領域若しくは不変領域、又は前記定常領域若しくは不変領域の一部を含む。本発明の抗原受容体のある実施形態では、（i）前記第 1 ペプチド鎖は、T 細胞受容体アルファ鎖の可変領域若しくはその一部、及び T 細胞受容体アルファ鎖の定常領域若しくはその一部、を含み、並びに前記第 2 ペプチド鎖は、T 細胞受容体ベータ鎖の可変領域若しくはその一部、及び T 細胞受容体ベータ鎖の定常領域若しくはその一部、を含み、又は、（ii）前記第 1 ペプチド鎖は、T 細胞受容体ベータ鎖の可変領域若しくはその一部、及び T 細胞受容体ベータ鎖の定常領域若しくはその一部、を含み、並びに前記第 2 ペプチド鎖は、T 細胞受容体アルファ鎖の可変領域若しくはその一部、及び T 細胞受容体アルファ鎖の定常領域若しくはその一部、を含む。この実施形態では、T 細胞受容体アルファ鎖の可変領域又はその一部、及び T 細胞受容体アルファ鎖の定常領域又はその一部は、T 細胞受容体のアルファ鎖に対応するか、又は本質的に対応し、並びに、T 細胞受容体ベータ鎖の可変領域又はその一部、及び T 細胞受容体ベータ鎖の定常領域又はその一部は、T 細胞受容体（好ましくは、T 細胞受容体のアルファ鎖が由来する同じ T 細胞受容体）のベータ鎖に対応するか、又は本質的に対応する。抗原結合部位を形成するドメインは、好ましくは前記鎖の N 末端で融合し、任意選択的に、リンカーにより隔てられている。
【００１９】
本発明の抗原受容体のある実施形態では、T 細胞受容体鎖の可変領域又はその一部、及び／又は T 細胞受容体の定常領域又はその一部等の免疫受容体シグナル伝達ドメインは、ヒト起源である。従って、T 細胞受容体鎖の可変領域又はその一部、及び T 細胞受容体鎖の定常領域又はその一部が、対応する、又は本質的に対応する T 細胞受容体鎖は、ヒト起源のものであることがある。
【００２０】
ある実施形態では、本発明の抗原受容体は、前記抗原受容体のドメインを繋げるリンカーを含む。ある実施形態では、本発明の抗原受容体は、抗原結合部位を形成するドメイン間及び／又は抗原結合部位を形成するドメインと T 細胞受容体鎖の可変領域又はその一部との間に、1 つ以上のリンカーを含む。前記リンカーは、抗原受容体が、抗原と結合する作用、内因性 CD3 複合体と会合する作用、等の抗原受容体の機能を阻害しない限り、又は 抗原結合時に免疫応答を誘導する抗原受容体の作用を阻害しない限り、任意の長さの任意のアミノ酸配列とすることができる。
【００２１】
本発明の抗原受容体のある実施形態では、前記第 1 及び第 2 抗原結合部位は同じ抗原又は異なる抗原に結合する。本発明の抗原受容体のある実施形態では、前記第 1 及び第 2 抗原結合部位は同じ抗原上の異なるエピトープに結合する。従って、第 1 抗原結合部位を形成するドメインは、好ましくは同じ免疫グロブリンに由来し、第 2 抗原結合部位を形成するドメインは、好ましくは同じ免疫グロブリンに由来するが、第 1 抗原結合部位を形成するドメイン及び第 2 抗原結合部位を形成するドメインは、同じ又は異なる免疫グロブリンに由来し、前記異なる免疫グロブリンは同じ又は異なる抗原に結合する。
【００２２】
ある実施形態では、前記抗原は疾患特異的抗原、好ましくは腫瘍抗原である。ある実施形態では、前記抗原は細胞の表面で発現している。
【００２３】
ある態様では、本発明は、本発明の抗原受容体のペプチド鎖に関する。ある実施形態では、本発明は、第 1 ドメイン及び第 2 ドメインを含むペプチド鎖に関するものであり、それぞれは免疫グロブリン重鎖の可変領域若しくはその一部を含む、又はそれぞれは免疫グロブリン軽鎖の可変領域若しくはその一部を含み、並びにここで、前記ペプチド鎖は、T 細胞受容体鎖の可変領域又はその一部、及び T 細胞受容体鎖の定常領域又はその一部等の免疫受容体シグナル伝達ドメインを更に含む。本発明のペプチド鎖の更なる実施形態は、本発明の抗原受容体について本明細書に記載されている通りである。
【００２４】
ある態様では、本発明は細胞に関するものであり、特に T 細胞等の免疫エフェクター細胞、本発明の抗原受容体を発現するように遺伝的に改変した細胞に関する。ある態様において、本発明は組換え細胞、特に T 細胞等の免疫エフェクター細胞、に関するものであり、本発明の抗原受容体の第 1 ペプチド鎖、第 2 ペプチド鎖、若しくは第 1 及び第 2 ペプチド鎖の両方を発現する、又は本発明のペプチド鎖を発現する。本発明の細胞又は組換え細胞の更なる実施形態は、本発明の抗原受容体又は本発明のペプチド鎖について本明細書に記載されるとおりである。
【００２５】
ある態様では、本発明は、本発明の抗原受容体を発現する細胞を作製する方法に関する。前記方法は以下を含む：（a）細胞を用意すること；（b）本発明の抗原受容体の第 1 ペプチド鎖をコードする第 1 遺伝子構築物を用意すること；（c）本発明の抗原受容体の第 2 ペプチド鎖をコードする第 2 遺伝子構築物を用意すること；（d）前記第 1 及び第 2 遺伝子構築物を前記細胞に導入すること；及び（e）前記構築物を前記細胞内で発現させること。ある実施形態では、本発明は、第 1 ペプチド鎖及び第 2 ペプチド鎖を含む抗原受容体を発現する細胞を作製する方法に関する。前記方法は以下を含む：（a）細胞を用意すること；（b）第 1 ドメイン、第 2 ドメイン、T 細胞受容体鎖の可変領域又はその一部、及び免疫受容体シグナル伝達ドメインを含む、第 1 ペプチド鎖をコードする第 1 遺伝子構築物を用意すること；（c）少なくとも第 1 ドメイン、第 2 ドメイン、T 細胞受容体鎖の可変領域又はその一部、及び免疫受容体シグナル伝達ドメインを含む、第 2 ペプチド鎖をコードする第 2 遺伝子構築物を用意すること；（d）前記第 1 及び第 2 遺伝子構築物を前記細胞に導入すること；（e）前記構築物を前記細胞内で発現させること；ここで、前記第 1 ペプチド鎖の第 1 ドメインは、前記第 2 ペプチド鎖のドメインのうちの 1 つと一緒に第 1 抗原結合部位を形成することができる、及びここで、前記第 1 ペプチド鎖の第 2 ドメインは、前記第 2 ペプチド鎖のもう 1 つの他のドメインと一緒に第 2 抗原結合部位を形成することができる。本発明の方法のある実施形態では、前記抗原受容体は細胞表面に発現する。本発明の方法のある実施形態では、前記第 1 ペプチド鎖及び第 2 ペプチド鎖が、単一の遺伝子構築物上で提供される。本発明の方法のある実施形態では、前記細胞がヒト細胞である。本発明の方法のある実施形態では、前記細胞が T 細胞等の免疫エフェクター細胞である。本発明の方法のある実施形態では、前記遺伝子構築物は DNA 及び／又は RNA を含む。本発明の方法の更なる実施形態は、本発明の抗原受容体について本明細書に記載されるとおりである。
【００２６】
ある態様では、本発明は組換え細胞、特に T 細胞等の免疫エフェクター細胞、に関するものであり、抗原受容体を発現する細胞を産生するための本発明の方法により産生される細胞に関する。本発明の組換え細胞の更なる実施形態は、本発明の抗原受容体について、又は抗原受容体を発現する細胞を作製するための本発明の方法について本明細書に記載されるとおりである。
【００２７】
ある態様では、本発明は、本発明の抗原受容体の第 1 ペプチド鎖、第 2 ペプチド鎖、若しくは第 1 及び第 2 ペプチド鎖の両方、又は本発明のペプチド鎖をコードする、DNA 又は RNA 等の核酸に関する。本発明の核酸の更なる実施形態は、本発明の抗原受容体について又は本発明のペプチド鎖について本明細書に記載されている通りである。
【００２８】
本発明は一般に、例えば、細胞表面に 1 種以上の疾患特異的抗原を発現する疾患細胞等、特に細胞表面に 1 種以上の腫瘍抗原を発現するがん細胞等、の細胞表面に 1 種以上の抗原を発現する細胞を、本発明の抗原受容体を使用して、標的化することによる疾患の治療を包含する。前記方法は、表面に 1 種以上の抗原を発現する細胞を選択的に根絶することを提供し、それにより、前記抗原を発現しない正常細胞への悪影響を最小限に抑える。ある実施形態では、抗原への結合を介して細胞を標的化する本発明の抗原受容体を発現するように、遺伝的に改変した T 細胞を投与する。T 細胞は、前記細胞表面に前記抗原を発現している疾患細胞を認識することができ、その結果、疾患細胞を根絶する。ある実施形態では、前記標的細胞集団又は標的組織は、腫瘍細胞又は腫瘍組織である。
【００２９】
ある態様では、本発明は、本発明の抗原受容体、本発明の組換え細胞、又は本発明の核酸；及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、薬剤として使用することができ、特に、本発明の抗原受容体が結合する 1 種以上の抗原、例えば 1 種以上の腫瘍抗原、の発現を特徴とするがん等の疾患を治療する際に、薬剤として使用することがある。
【００３０】
ある態様では、本発明は、対象に治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む、がん等の疾患を治療する方法に関するものであり、ここで前記疾患は、前記抗原受容体が結合する、腫瘍抗原等の少なくとも 1 種の抗原の発現によって特徴付けられる。
【００３１】
ある態様では、本発明は、少なくとも 1 種の抗原の発現又は発現の上昇に関連する疾患、障害又は状態を有する対象を治療する方法に関するものであり、少なくとも 1 種の抗原を標的とする本発明の抗原受容体を発現するように遺伝的に改変した T 細胞を、対象に投与することを含む方法に関する。ある実施形態では、前記疾患、障害又は状態はがんである。ある実施形態では、前記 T 細胞は前記対象に対して自己、同種異系又は同系であることがある。
【００３２】
本発明のある実施形態において、前記抗原受容体は、（例えば、単一特異性（monospecific）で同じエピトープを認識することにより、又は二重特異性（bispecific）又は多重特異性（multispecific）で同じ抗原上の異なるエピトープを認識することにより）ただ 1 種の抗原のみに結合する、又は異なる抗原、特に 2 種の異なる抗原、に結合する。
【００３３】
本発明の全ての態様のうちのある実施形態では、治療方法は、対象から細胞のサンプルを得ることを更に含み、前記サンプルは T 細胞又は T 細胞前駆体を含み、及び本発明の抗原受容体をコードする核酸で前記細胞をトランスフェクトして前記抗原受容体を発現するように遺伝子改変をした T 細胞を提供することを含む。本発明の全ての態様のうちのある実施形態では、前記抗原受容体を発現するように遺伝的に改変した T 細胞は、前記抗原受容体をコードする核酸で安定的に又は一過的にトランスフェクトされたものである。そうして、前記抗原受容体をコードする核酸は、前記 T 細胞のゲノムに組み込まれる、又は組み込まれない。本発明の全ての態様のうちのある実施形態では、前記 T 細胞及び／又は前記細胞のサンプルは、前記抗原受容体を発現するように遺伝的に改変した T 細胞を投与する対象に由来する。本発明の全ての態様のうちのある実施形態では、前記 T 細胞及び／又は前記細胞のサンプルは、前記抗原受容体を発現するように遺伝的に改変した T 細胞を投与する哺乳動物とは異なる哺乳動物に由来する。
【００３４】
本発明の全ての態様のうちのある実施形態では、前記抗原受容体を発現するように遺伝的に改変した T 細胞は、内因性 T 細胞受容体及び／又は内因性 HLA の発現が不活性化されている。
【００３５】
本発明の全ての態様のうちのある実施形態では、抗原はがん細胞等の疾患細胞で発現している。ある実施形態では、抗原はがん細胞等の疾患細胞の表面で発現している。ある実施形態では、抗原受容体は、抗原の細胞外ドメイン又は細胞外ドメインのエピトープに結合する。ある実施形態では、抗原受容体は、生細胞の表面に存在する抗原の天然のエピトー プに結合する。本発明の全ての態様のうちのある実施形態では、前記抗原は腫瘍抗原である。本発明の全ての態様のうちのある実施形態では、前記抗原は、クローディン 6 及びクローディン 18.2 等のクローディン、CD19、CD20、CD22、CD33、CD123、メソセリン（mesothelin）、CEA、c-Met、PSMA、GD-2、及び NY-ESO-1 からなる群から選択される。本発明の全ての態様のうちのある実施形態では、前記抗原は病原体抗原である。前記病原体は、真菌、ウイルス、又はバクテリアの病原体であることがある。本発明の全ての態様のうちのある実施形態では、前記抗原の発現は細胞表面で起こる。ある実施形態では、抗原はクローディン、特にクローディン 6 又はクローディン 18.2 であり、前記抗原受容体は前記クローディンの第 1 細胞外ループに結合する。ある実施形態では、前記抗原受容体が T 細胞によって発現される及び／又は T 細胞上に存在する場合、前記抗原受容体が細胞上に存在する抗原に結合することは、サイトカインの放出等の前記 T 細胞の免疫エフェクター機能をもたらす。ある実施形態では、前記抗原受容体が T 細胞によって発現される及び／又は T 細胞上に存在する場合、前記抗原受容体が抗原提示細胞等の細胞上に存在する抗原に結合することは、前記 T 細胞の刺激、プライミング及び／又は増殖をもたらす。ある実施形態では、前記抗原受容体が T 細胞によって発現される及び／又は T 細胞上に存在する場合、前記抗原受容体が、がん細胞等の疾患細胞上に存在する抗原に結合することは、前記疾患細胞の細胞溶解及び／又はアポトーシスをもたらす。ここで、好ましくは、前記 T 細胞は細胞毒性因子、例えばパーフォリンとグランザイム、を放出する。
【００３６】
本発明の全ての態様のうちのある実施形態では、抗原結合部位を形成する抗原受容体のドメインは、前記抗原受容体の外部ドメインに含まれる。本発明の全ての態様のうちのある実施形態では、本発明の抗原受容体は膜貫通ドメインを含む。ある実施形態では、前記膜貫通ドメインは、前記膜を貫通する疎水性アルファ・ヘリックスである。
【００３７】
本発明の全ての態様のうちのある実施形態では、本発明の抗原受容体は、新生タンパク質が小胞体の中に運ばれるようにするシグナル・ペプチドを含む。ある実施形態では、前記シグナル・ペプチドは、抗原結合部位を形成するドメインより前にある。
【００３８】
本発明の全ての態様のうちのある実施形態では、本発明の抗原受容体は、標的とする抗原に対して、特に疾患細胞又は抗原提示細胞等の細胞の表面に存在する場合、特異的であることが好ましい。
【００３９】
本発明の全ての態様のうちのある実施形態では、本発明の抗原受容体は、T 細胞（好ましくは細胞傷害性 T 細胞）等の免疫反応性細胞の表面で、発現している及び／又は存在している、ことがある。ある実施形態では、前記 T 細胞は、本発明の抗原受容体が標的とする抗原と反応する。
【００４０】
更なる態様では、本発明は、本明細書に記載の方法で使用するための、本明細書に記載の薬剤及び組成物を提供する。
【００４１】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、本実験で使用した全ての T 細胞受容体（TCR）‐及びキメラ抗原受容体（CAR）‐構築物の概略図を含む。Ａ）及びＢ）TCR はヘテロ二量体クラス I 膜タンパク質で構成され、各鎖は不変 C ドメインと可変 V ドメインを含み、後者は MHC によって制限された様式でプロセシングを受けたペプチドを特異的に認識する。マウス（Mu、A）及びヒト（Hu、B）TCR の配列の相同性及び構造の相同性はかなり高い。前記マウス TCR はタイトジャンクション・タンパク質であるクローディン 6 に由来するヒト腫瘍抗原を認識するが、前記ヒト TCR はメラノサイト分化抗原 gp100 に由来する腫瘍抗原を認識する。Ｃ）一価の一本鎖 CAR は、細胞膜に輸送されるためのシグナル・ペプチドが先行し、続いて、マウス Cβドメイン及び自律（autonomous）TCR Cαドメインに繋がった一本鎖（sc）Fv フラグメントを含む。任意選択的に、TCR C ドメイン間の人工ジスルフィド結合によって、このCARが細胞表面に発現すること及び機能することを改善させることがある。この例示的な構築物及び以下の全ての例示的な構築物における scFv フラグメントは、クローディン 6 に対して向けられている。Ｄ）古典的 scCAR C16 は、scFv フラグメント、抗体ヒンジ領域、スペーサー領域としての CH2CH3-ドメイン、共刺激分子 CD28 及び CD3ζのそれぞれ細胞膜及び細胞内シグナル伝達ドメイン、が各々並ぶホモ二量体を含む。ホモ二量体化によって、抗原を二価で認識するようになり、各鎖は単一の抗原に結合する（即ち、鎖内（inter-chain））。Ｅ）プロトタイプの組合せ CAR は、直列に繋がった対立遺伝子関連 V ドメイン（即ち、VH-VH 又は VL-VL）を持ち、それぞれ TCR Cα 又は Cβ のどちらかに繋がっている。認識には、組合せ（即ち、鎖間）及び二価様式での両方の鎖にわたる抗原結合が必要である。Ｆ）全長 TCRαgp100 又は TCRβのいずれかに scFv フラグメントがあるヘテロダイマー TCR-CAR C16 は、同種抗原を 2 価であるが、非‐組合せで認識する。Ｇ）非‐組合せ TCR-CAR Cl6 (F) の TCR gp100 部分が同種ペプチド gp100(280-288) を認識することを除去するために、「サイレンシング」（sil）S109Q（IMGT 命名法による）点突然変異を、TCRα（silCDR3α）の CDR3 ループに導入する。Ｈ）組合せ TCR-CAR C16 は、Ｅ）で概説したように、全長 TCRαgp100 鎖又は全長 TCRβ 鎖のいずれかで、対立遺伝子関連 V ドメインをそれぞれ直列に繋げることにより生成される。ここで融合パートナーとして利用される完全な長さの TCR は、代わりに TCR C ドメインのみを含む、短い TCR（Ｅ）よりも優れた生理学的な T 細胞シグナル伝達を提供する。Ｉ）組合せ TCR-CAR Cl6（Ｈ）に関して TCR gp100 部分による同種ペプチド gp100(280-288) の認識を除去するために、「サイレンシング」（sil）S109Q（IMGT 命名法による）点突然変異を、Ｇ）のように、TCRα（silCDR3α）の CDR3 ループに導入する。
【図２】図２Ａ／Ｂは、共培養をセットアップする前、APCs でクローディン 6 が発現し、ヒト T 細胞で種々の CAR が発現していることをそれぞれ示す。Ａ）未成熟樹状細胞（iDCs）を、同種の完全長抗原クローディン 6 の量を増やしながら、又は無関係な抗原 gp100 を単一の高用量で、エレクトロポレーションした。ここでは、Cl6 の発現が用量依存的に全体的にシフトすることがフロー・サイトメトリーで観察され、このドナーの iDCs が、高度に、細胞が RNA を取り込み、タンパク質を翻訳し、細胞表面に輸送することを示している。高い CD86 発現は、単球から良好に抗原提示を行う iDCs へと強く分化していることを示す。Ｂ）事前に活性化させた CD8+ T 細胞を種々の CAR をコードする RNA でエレクトロポレーションし、フロー・サイトメトリーで CAR 発現を評価した。一価及び古典的 scCAR を除く全ての CARs は、抗イディオタイプ染色で僅かに検出された。一価の CAR は最も少なく発現したが、古典的scCAR は最も良く発現した。図２Ｃは、APC/T 細胞の共培養をセットアップした後、クローディン 6 発現 iDCs を認識することにおける、CAR C16 リプログラミングされたヒト T 細胞の効率を、IFNγ-ELISA で示す。CAR をエレクトロポレーションした T 細胞を、10:1 の E:T 比（エフェクター：標的細胞の比）で、２Ａ／Ｂで説明したように、Cl6-エレクトロポレーションをした APCs と一晩共培養した。Cl6 タイトレーション（titration）の全範囲を見ると、全ての CARs で、より低い Cl6 用量（0.02 ug）が最適であった。クローディン 6 の発現が高い場合、古典的 scCAR C16 は他の全ての CARs と比較して、最も良く IFN-分泌を示したが、最も低い Cl6 投与量では、組合せ CAR が古典的 scCAR よりもいくらか良い傾向であった。結論として、高い抗原発現から低い抗原発現になるに従って、前記組合せ CARs は、古典的 CAR に、機能効率において、近くなった：それらは、組合せ CARs 及び scCAR Cl6 について、それぞれ、20-30.000 pg/ml IFNγまでの非常に多量の IFNγ を産生し、C16 の最低用量では、全ての構築物について、12-15.000 pg/ml IFNγになった。この用量では、組合せ間 Cα/Cβ-CAR が最も効率的なものであることが分かった。
【図３】図３Ａ／Ｂは、共培養をセットアップする前、APCs でクローディン 6 が発現し、ヒト T 細胞で種々の CAR が発現していることをそれぞれ示す。Ａ）未成熟樹状細胞（iDCs）を、同種の完全長抗原クローディン 6 の量を増やしながら、エレクトロポレーションした。ここでは、Cl6 の発現が用量依存的に部分的にのみシフトすることがフロー・サイトメトリーで観察され、このドナーの iDCs が、かなりより少なく、細胞が RNA を取り込み、タンパク質を翻訳し、細胞表面に輸送することを示している。高い CD86 発現は、単球から良好に抗原提示を行う iDCs へと強く分化していることを示す。Ｂ）事前に活性化させた CD8+ T 細胞を種々の CAR をコードする RNA でエレクトロポレーションし、フロー・サイトメトリーで CAR 発現を評価した。一価及び古典的 scCAR を除く全ての CARs は、抗イディオタイプ染色でほんの僅か検出されただけで、ここでもこのドナーの細胞は、RNA の取り込み及びプロセシングについて、より少ないことが示された。しかしながら、抗原提示が不十分な iDCs は、最小限の腫瘍抗原陽性 APC の状況を表しているといっても良い。なぜなら、これは初期のクローン腫瘍エスケープ変異体又は最小限の腫瘍抗原提示の状況に似ていることがあるからである。図３Ｃは、APC/T 細胞の共培養をセットアップした後、クローディン 6 発現 iDCs を認識することにおける、CAR C16 リプログラミングされたヒト T 細胞の効率を、IFNγ-ELISA で示す。CAR をエレクトロポレーションした T 細胞を、10:1 の E:T 比（エフェクター：標的細胞の比）で、３Ａ／Ｂで説明したように、Cl6-エレクトロポレーションをした APCs と一晩共培養した。Cl6 タイトレーション（titration）の全範囲を見ると、全ての CARs で、より低い Cl6 用量（0.2 ug）が最適であった。前に説明したように、クローディン 6 の発現は最小限であるため、組合せ CARs C16 は、全ての用量で、古典的 scCAR C16 と比較して、最も良い IFN-分泌を示した。最も低用量でエレクトロポレーションした Cl6 でより顕著な傾向であった。結論として、少量の抗原の場合、組合せ CARs は IFNγ分泌に関して、古典的 scCAR C16 よりも更に優れていた。分泌された IFNγの総量は、抗原及び前記 CARs の発現が非常に低いために、全てのタイトレーション範囲で 1.000 pg/ml を下回った。
【図４】図４は、HLA-A2.1+APC/T 細胞の共培養をセットアップした後、クローディン 6 を発現する iDCs 又は gp100 ペプチドを負荷した iDCs を認識することにおける、TCR gp100-CAR C16 リプログラミングされたヒト T 細胞の効率を、IFNγ-ELISA で示す。CAR をエレクトロポレーションした T 細胞を、Cl6 をエレクトロポレーションした APCs 又は gp100(280-288) ペプチドを負荷した iDCs と、5:1 の E:T 比で一晩共培養した。この実験の最終目標は、まず第一に、（Ａ）二価の組合せ TCR-CARs が、二価の非‐組合せ TCR-CARs よりも IFNγ を分泌するのにより効率的であるかどうか、第二に（Ｂ）それらが、ここで使用される TCR gp100 バックボーンの gp100 ペプチドを、どの程度依然として認識するか、を検証することである。TCRα gp100 の CDR3 内における「サイレンシング」変異 S109Q により、抗原結合を完全に除去しようとした。TCR Cl6 及び TCR gp100 を、同種抗原を認識することに対する陽性対照として使用した。Ａ）CDR3α内でサイレンシングしたかどうかに関係なく、前記組合せ TCR-CARs は、前記非‐組合せ CARs よりも、特に抗原の最低用量において、機能的であることが分かった。Ｂ）サイレンシングしていない非‐組合せ TCR-CAR C16 は、10-6M のペプチドで、gp100 を依然として認識した。突然変異 S109Q を導入することにより、IFNγの分泌は全く無くなった。組合せ TCR-CARs C16 に関しては、機能的にサイレンシングされているかどうかに関係なく、サイトカインの分泌はまったく観察されなかった。いずれかの鎖にある、直列に繋がった VH-VH- 及び VL-VL-ドメインの鎖間結合は、APCs 上で、HLA-A2.1 によって制限された方法で提示する gp100 ペプチドへの結合を、立体的に妨げる可能性が非常に高い。
【図５】図５は、APC/T 細胞の共培養をセットアップした後、Cl6-発現 iDCs との抗原遭遇（antigen encounter）をした時の種々の CARs C16 の増殖能力を示す。CAR をエレクトロポレーションした T 細胞を、10:1 の E:T 比で、Cl6 をエレクトロポレーションして、タイトレーションした APCs と、5 日間共培養した。T 細胞をカルボキシフルオレセイン・スクシンイミジル・エステル（CFSE）でまず最初に染色して、細胞分裂により CFSE が希釈化されることを定量化した。得られた娘集団の数と頻度を、フロー・サイトメトリーの各密度プロットの右側に示した。Ａ）一価の抗原結合 CARs は最も弱い増殖を示したが、前記組合せ TCR-CARs と古典的 CARs は非常に類似した増殖パターンを示した。Ｂ）Ａ）に示す T 細胞集団の頻度の棒グラフ。一価の CAR を備えた大部分の T 細胞は増殖しなかった（40-60％）が、組合せ TCR-CARs 及び古典的 CARs の非‐増殖性 T 細胞の頻度は約 10-20％の範囲であった。古典的 CAR C16 を有する T 細胞の増殖は、抗原の高用量（0.2 μg Cl6）で最も高く（組合せ TCR-CARs の 80％ に対して 90％）、一方、最低用量（0.002μg）では、組合せ TCR -CARs は、少なくとも古典的 CAR と同程度に増殖した（ほぼ 80％）。結論として、T 細胞増殖の観点において、抗原が高い用量から非常に低い用量になるのに従って、ここでも、前記組合せ TCR-CARs は、その機能効率が古典的 CAR に近づいた。古典的 CAR よりも更に効果的である傾向がある。
【図６】図６は、APC/T 細胞の共培養をセットアップした後、組合せ TCR-CAR Cl6 をエレクトロポレーションした娘 T 細胞上で、共刺激バイオマーカー CD27 がアップレギュレーションすることを示す。CAR をエレクトロポレーションした T 細胞を、3:1 の E:T 比で、Cl6 をエレクトロポレーションした iDCs と 6 日間共培養した。T 細胞を CPD-450 でまず最初に染色し、細胞分裂によりこの蛍光体が希釈されることを定量化した。得られた娘集団の数と頻度を、フロー・サイトメトリーの各密度プロットの左側に示した。T 細胞を CD8 特異的抗体で染色して、組合せ及び古典的 CARs について、この共受容体マーカーが中程度及び同程度アップレギュレーションしていることが示された。並行して、共刺激分子 CD27 に特異的な抗体で染色し、全ての CARs の親／娘集団 G0-G6 における、CD27 の調節を見積もった。両方のマーカーは約 2 倍アップレギュレーションし、及び、更に、CD8 の平均発現は、全ての CARs について同じであったが、CD27 の平均発現は、組合せ CARs、特に組合せ間 TCR-CAR Cl6 で、古典的 CAR よりもはるかに高かった。CD27 は、in vivo で T 細胞が長期間存在し続けることのバイオマーカーであり、CD27 の発現レベルは、僅かに増殖する T 細胞（G2-G4）に関して、はるかにより高いプラトーに達した後に、G6 で基底レベルに低下した。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
発明の詳細な説明
本発明を以下に詳細に説明するが、本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル及び試薬に限定されず、これらは異なる場合があることを理解されたい。又、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明するためだけを目的とし、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものではないことも理解されたい。別に定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００４４】
以下、本発明の要素について説明する。これらの要素は、特定の実施形態とともに記載されているが、実施形態を追加するために、それらを任意の方式及び任意の数で組み合わせることができることを理解されたい。様々に説明する実施例及び好ましい実施形態は、明示的に説明する実施形態のみに本発明を限定するように解釈されるべきではない。本説明は、明示的に説明する実施形態と任意の数の開示する要素及び／又は好ましい要素とを組み合わせた実施形態を、サポート及び包含するものと理解されるべきである。更に、本出願に記載されている全て要素に関して、如何様に置換し、及び組み合わせることも、文脈がそうでないことを示さない限り、本出願の説明により開示されているとみなされるべきである。
【００４５】
好ましくは、本明細書で使用される用語は、「バイオテクノロジー用語の多言語用語集：（IUPAC 勧告）」、H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, 及び H. Kolbl, 編., (1995) Helvetica Chimica Acta, CH-4010 バーゼル、スイスに記載されているように、定義される。
【００４６】
本発明を実施することは、特に明記しない限り、当該分野の文献（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第 2 版, J. Sambrook et al. 編、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989）で説明されている生化学、細胞生物学、免疫学、及び組換え DNA 技術に関する従来の方法を使用する。
【００４７】
以下の本明細書及び特許請求の範囲を通して、文脈が別段を求めない場合、「含む（comprise）」という単語、及び「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」等の変形は、述べられたメンバー、整数若しくはステップ、又はメンバー群、整数群若しくはステップ群を包含することを意味すると理解されるが、他のメンバー、整数若しくはステップ、又はメンバー群、整数群若しくはステップ群を除外することを意味するとは理解されない。しかし、ある場合には、そのような他のメンバー、整数若しくはステップ、又はメンバー群、整数群若しくはステップ群は除外されることがある。即ち、対象となる物事は、記載したメンバー、整数若しくはステップ、又はメンバー群、整数群若しくはステップ群、を含むことで構成される。本発明を説明する文脈で（特に特許請求の範囲で）使用される用語「a」及び「an」及び「the」及び類似の参照は、本明細書で別段記載しない場合、又は文脈から明らかに矛盾していない限り、単数及び複数の両方を包含すると解釈される。本明細書における値の範囲を記載することは、前記範囲内に入る個々の値を個別に参照する速記方法として機能することを意図しているにしか過ぎない。本明細書で別段記載しない場合、個々の値は、あたかも本明細書で個別に引用されているかのように明細書に組み込まれる。
【００４８】
本明細書で記載する全ての方法は、本明細書で別段の指示がない限り、又は文脈により明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行することができる。本明細書で提供される、ありとあらゆる例又は例示的な言葉（例えば、「等（such as）」）を使用することは、単に本発明をより良く説明することを意図しているにしか過ぎない、それ以外に特許請求される本発明の範囲を限定するものではない。明細書中の言語は、本発明を実施するのに不可欠な、請求されていない要素を示すものと解釈されるべきではない。
【００４９】
この明細書の本文全体でいくつかの文献が引用されている。本明細書で引用された各文献（全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様、指示書等を含む）は、上記又は以下に関わらず、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなるものも、本発明が先行発明のおかげで、そのような開示に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。
【００５０】
用語「免疫応答（immune response）は、抗原に対する統合された身体的応答を指し、好ましくは、細胞性免疫応答又は細胞性及び体液性免疫応答を指す。前記免疫応答は、保護的／予防的（preventive）／予防的（prophylactic）及び／又は治療的であることがある。
【００５１】
「免疫応答を提供する（Providing an immune response）」とは、免疫応答を提供する前に、特定の標的抗原、標的細胞及び／又は標的組織に対する免疫応答がなかったことを意味することがあるが、免疫応答を提供する前に、特定の標的抗原、標的細胞及び／又は標的組織に対する免疫応答がある程度あり、そして免疫応答を提供した後、前記免疫応答が高められることを意味することもある。従って、「免疫応答を提供する」には、「免疫応答を誘導する」及び「免疫応答が高められる」が含まれる。好ましくは、対象に免疫応答を提供した後、前記対象は、免疫応答を提供することにより、がん疾患等の疾患の発症から保護される、又は疾患状態が改善される。例えば、腫瘍抗原に対する免疫応答は、がん疾患を有する患者、又はがん疾患を発症するリスクのある対象に提供されることがある。この場合に免疫応答を提供することは、前記対象の病状が改善されること、前記対象が転移を発症しないこと、又はがん疾患を発症するリスクがある対象が、がん疾患を発症しないこと、を意味することがある。
【００５２】
「細胞性免疫（Cell-mediated immunity）」又は「細胞性免疫（cellular immunity）」又は類似の用語は、抗原の発現を特徴とする（特にクラス I 又はクラス II MHC による抗原の提示を特徴とする）細胞に対する細胞応答を含むことを意味する。前記細胞応答は、「ヘルパー」又は「キラー」のどちらかとして機能する T 細胞又は T リンパ球と呼ばれる細胞に関連する。前記ヘルパー T 細胞（CD4+ T 細胞とも呼ばれる）は免疫応答を調節することで中心的な役割を果たし、前記キラー細胞（細胞傷害性 T 細胞、細胞溶解性 T 細胞、CD8+ T 細胞又は CTLs とも呼ばれる）はがん細胞等の疾患細胞を殺傷し、より多くの疾患細胞が産生されることを予防する。
【００５３】
用語「抗原」は、免疫応答が生成される及び／又は向けられるエピトープを含む作用因子に関する。好ましくは、本発明の文脈における抗原は、任意選択的にプロセシングをした後に、好ましくは前記抗原又は前記抗原を（好ましくは前記細胞表面で）発現する細胞、に対して特異的な免疫反応を誘導する分子である。用語「抗原」には、具体的には、タンパク質及びペプチドが含まれる。抗原は、好ましくは、天然に存在する抗原に、対応する、又は由来する産物である。そのような天然に存在する抗原は、アレルゲン、ウイルス、バクテリア、真菌、寄生虫、及び他の感染性因子及び病原体を含むことがあり、若しくはこれらに由来することがあり、又は、抗原は腫瘍抗原であることもある。本発明によれば、抗原は、天然に存在する産物、例えば、ウイルス・タンパク質、又はその一部に対応することがある。
【００５４】
用語「病原体」は、病原性微生物に関するものであり、ウイルス、バクテリア、真菌、単細胞生物、及び寄生虫を含む。病原性ウイルスの例には、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、サイトメガロウイルス（CMV）、ヘルペス・ウイルス（HSV）、A 型肝炎ウイルス（HAV）、HBV、HCV、パピローマ・ウイルス、及びヒト T リンパ好性ウイルス（human T-lymphotrophic virus（HTLV））が含まれる。単細胞生物には、プラスモディア、トリパノソーム、アメーバ等が含まれる。
【００５５】
好ましい実施形態では、抗原は疾患特異的抗原又は疾患関連抗原である。用語「疾患特異的抗原（disease-specific antigen）」又は「疾患関連抗原（disease-associated antigen）」は、病理学的に重要な全ての抗原を指す。特に好ましいある実施形態では、前記抗原は、疾患細胞、組織及び／又は臓器には存在するが、健常細胞、組織及び／又は臓器には存在しないか又は減少した量で存在するため、疾患細胞を標的とするために使用されることがある（例えば、抗原受容体を有する T 細胞によって、前記抗原を標的とする）。ある実施形態において、疾患特異的抗原又は疾患関連抗原は、疾患細胞の表面に存在する。
【００５６】
好ましい実施形態では、抗原は、腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原、即ち、細胞質、細胞表面及び細胞核に由来するがん細胞の構成要素、であり、特にそれらの抗原は、がん細胞の表面抗原として、好ましくは大量に、産生される。
【００５７】
本発明の文脈において、用語「腫瘍抗原」又は「腫瘍関連抗原」は、正常な条件下では、限られた数の組織及び／若しくは臓器で、又は特定の発生段階で、特異的に発現するタンパク質に関する。例えば前記腫瘍抗原は、正常な条件下で、胃組織（好ましくは胃粘膜）、生殖器（例えば精巣）、栄養膜組織（例えば胎盤）、又は生殖細胞で、特異的に発現することがあり、及び、1 種以上の腫瘍又はがん組織で発現又は異常発現することがある。この文脈において、「限られた数（a limited number）」は、好ましくは 3 以下、より好ましくは 2 以下を意味する。本発明の文脈における腫瘍抗原には、例えば、分化抗原、好ましくは細胞型特異的分化抗原（即ち、正常な条件下で、特定の分化段階にある特定の細胞型で特異的に発現するタンパク質）、がん／精巣抗原（即ち、正常な条件下で、精巣で、時には胎盤で特異的に発現するタンパク質）、及び生殖系列特異的抗原、が含まれる。本発明の文脈において、前記腫瘍抗原は、好ましくはがん細胞の細胞表面に結合しており、好ましくは正常組織では発現していない、又は極めて稀にしか発現しない。好ましくは、前記腫瘍抗原又は前記腫瘍抗原の異常な発現により、がん細胞が特定される。本発明の文脈において、対象、例えばがん疾患に罹患している患者、のがん細胞が発現する腫瘍抗原は、好ましくは前記対象の自己のタンパク質である。好ましい実施形態では、本発明の文脈における腫瘍抗原は、正常な条件下で、必須ではない組織若しくは臓器（即ち、免疫系によって損傷を受けた場合に、対象を死に至らせない組織若しくは臓器）において、又は免疫系がアクセスできない、若しくは殆どアクセスできない身体の臓器又は構造において、発現する。好ましくは、前記腫瘍抗原のアミノ酸配列は、正常組織で発現する腫瘍抗原とがん組織で発現する腫瘍抗原との間で同一である。
【００５８】
本発明において有用であり得る腫瘍抗原の例は、p53、ART-4、BAGE、β-カテニン/m、Bcr-abL CAMEL、CAP-1、CASP-8、CDC27/m、CDK4/m、CEA、クローディン・ファミリーの細胞表面タンパク質（CLAUDIN-6、CLAUDIN-18.2、及び CLAUDIN-12 等）、c-MYC、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、Gap100、HAGE、HER-2/neu、HPV-E7、HPV-E6、HAST-2、hTERT（若しくは hTRT）、LAGE、LDLR/FUT、MAGE-A（好ましくは MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、若しくは MAGE-A12）、MAGE-B、MAGE-C、MART-1/Melan -A、MC1R、ミオシン/m、MUC1、MUM-1、-2、-3、NA88-A、NF1、NY-ESO-1、NY-BR-1、p190 マイナー BCR-abL、Pm1/RARa、PRAME 、プロテイナーゼ 3、PSA、PSM、RAGE、RU1 若しくは RU2、SAGE、SART-1 若しくは SART-3、SCGB3A2、SCP1、SCP2、SCP3、SSX、SURVIVIN、TEL/AML1、TPI/m、TRP-1、TRP- 2、TRP-2/INT2、TPTE 及び WT である。特に好ましい腫瘍抗原には、CLAUDIN-18.2（CLDN18.2）及び CLAUDIN-6（CLDN6）が含まれる。
【００５９】
本明細書で使用される用語「CLDN」又は単に「Cl」は、クローディンを意味し、CLDN6 及び CLDN18.2 を含む。好ましくは、クローディンはヒトのクローディンである。クローディンは、タイト・ジャンクションの最も重要な構成要素であるタンパク質のファミリーであり、上皮細胞間の細胞間空間での分子の流れを制御する傍細胞バリア（paracellular barrier）を確立する。クローディンは、細胞膜を 4 回貫通する膜貫通タンパク質であり、N 末端と C 末端の両方が細胞質側に位置する。EC1 又は ECL1 と呼ばれる 1 番目の細胞外ループは平均 53 個のアミノ酸から成り、EC2 又は ECL2 と呼ばれる 2 番目の細胞外ループは約 24 個のアミノ酸から成る。クローディン・ファミリーの細胞表面タンパク質は、様々な起源の腫瘍で発現しており、その選択的な発現（毒性に関連する正常組織での発現は無い）及び細胞膜への局在化により、がんを標的にした免疫療法に関連する標的構造として特に適している。
【００６０】
CLDN6 と CLDN18.2 は腫瘍組織で様々に発現することが確認されており、CLDN18.2 を発現する唯一の正常組織が胃（胃粘膜の分化上皮細胞）であり、CLDN6 を発現する唯一の正常組織が胎盤である。
【００６１】
CLDN18.2 は、膵臓がん、食道がん、胃がん、気管支がん、乳がん、ENT 腫瘍等の様々な起源のがんで発現している。CLDN18.2は、胃がん、食道がん、膵臓がん、非小細胞肺がん（non small cell lung cancer（NSCLC））等の肺がん、卵巣がん、結腸がん、肝臓がん、頭頸部がん、及び胆嚢のがん、等の原発腫瘍、並びにそれらの転移（特にクルケンベルク腫瘍（Krukenberg tumors）、腹膜転移、及びリンパ節転移等の胃がん転移）、を予防する及び／又は治療するための重要な標的である。少なくとも CLDN18.2 を標的とする抗原受容体は、そのようながん疾患の治療に有用である。
【００６２】
CLDN6 は、例えば、卵巣がん、肺がん、胃がん、乳がん、肝臓がん、膵臓がん、皮膚がん、黒色腫、頭頸部がん、肉腫、胆管がん、腎細胞がん、及び膀胱がん、で発現していることが分かってきている。CLDN6は、卵巣がん（特に卵巣腺がん及び卵巣奇形がん）、小細胞肺がん（small cell lung cancer（SCLC））及び非小細胞肺がん（NSCLC）を含む肺がん（特に肺扁平上皮がん及び腺がん）、胃がん、乳がん、肝がん、膵臓がん、皮膚がん（特に基底細胞がん及び扁平上皮がん）、悪性黒色腫、頭頸部がん（特に悪性多形腺腫）、肉腫（特に滑膜肉腫及びがん肉腫）、胆管がん、膀胱がん（特に移行上皮がん及び乳頭がん）、腎がん（特に明細胞腎細胞がん及び乳頭腎細胞がんを含む腎細胞がん）、結腸がん、小腸がん（回腸のがん等を含み、特に小腸腺がん及び回腸の腺がん）、精巣胚がん、胎盤絨毛がん、子宮頸がん、精巣がん（特に精巣セミノーマ、精巣奇形腫及び胚精巣がん）、子宮がん、奇形がん又は胚がん等の胚細胞腫瘍（特に精巣の胚細胞腫瘍）、並びにそれらの転移形態、を予防する及び／又は治療するための、特に好ましい標的である。少なくとも CLDN6 を標的とする抗原受容体は、そのようながん疾患を治療するのに有用である。
【００６３】
本発明の実施形態の文脈において、抗原は好ましくは細胞（好ましくは抗原提示細胞又は疾患細胞）の表面に存在する。本発明によれば、抗原は、抗原受容体が結合した場合、任意選択的に適切な共刺激シグナルが存在する下で、抗原に結合する抗原受容体を有する T 細胞の、刺激、プライミング及び／又は増殖を、好ましくは、誘導することができる。疾患細胞の表面上の抗原を認識することにより、前記抗原（又は抗原を発現する細胞）に対する免疫反応が引き起こされることがある。
【００６４】
本発明の様々な態様によれば、本目的は、好ましくは、腫瘍抗原（特に CLDN6 又は CLDN18.2）等の抗原を発現するがん細胞等の前記抗原を発現する疾患細胞に対する免疫応答を提供し、腫瘍抗原等の抗原を発現する細胞が関与するがん疾患等の疾患を治療することである。好ましくは、本発明は、抗原を発現する疾患細胞を標的とする T 細胞等の、抗原受容体を改変した免疫エフェクター細胞の投与を含む。表面に抗原を発現している細胞は、前記抗原を標的とする抗原受容体を有する免疫エフェクター細胞による標的になりうる。
【００６５】
「細胞表面」は、当技術分野におけるその通常の意味に従って使用され、それ故に、タンパク質及び他の分子が結合するのにアクセス可能な細胞の外側を含む。抗原が、前記細胞の表面に位置し、及び前記細胞に加えられた抗原受容体又は抗原特異的抗体等の抗原結合分子が結合するのにアクセス可能な場合、その抗原は細胞の表面に発現している。ある実施形態では、細胞の表面に発現する抗原は、抗原受容体によって認識される細胞外部分を有する内在性膜タンパク質である。抗原受容体が前記細胞の表面に位置し、抗原（例えば、前記抗原受容体が特異的である抗原で、前記細胞に添加された抗原）が結合するのにアクセス可能な場合、その抗原受容体は細胞の表面に発現している。ある実施形態では、前記細胞の表面に発現する抗原受容体は、抗原を認識する細胞外部分を有する内在性膜タンパク質である。
【００６６】
本発明の文脈において、用語「細胞外部分（extracellular portion）」又は「外部ドメイン（ectodomain）」は、細胞の細胞外空間に面し、好ましくは前記細胞の外側から（例えば、前記細胞の外側にある抗体等の結合分子が）アクセス可能である、タンパク質等の分子の一部を指す。好ましくは、前記用語は、1 つ以上の細胞外ループ若しくはドメイン又はそれらのフラグメントを指す。
【００６７】
用語「部分／一部（portion）」又は「部分／一部（part）」は、本明細書で互換的に使用され、アミノ酸配列等の構造の連続的な又は不連続的な要素を指す。用語「フラグメント（fragment）」は、アミノ酸配列等の構造の連続的な要素を指す。タンパク質配列の一部又は一部（A portion or part of a protein sequence）は、好ましくは、少なくとも 6 個、特に少なくとも 8 個、少なくとも 12 個、少なくとも 15 個、少なくとも 20 個、少なくとも 30 個、少なくとも 50 個、又は少なくとも 100 個の連続的な及び／又は非連続的な前記タンパク質配列のアミノ酸を含む。タンパク質配列のフラグメントは、好ましくは、少なくとも 6 個、特に少なくとも 8 個、少なくとも 12 個、少なくとも 15 個、少なくとも 20 個、少なくとも 30 個、少なくとも 50 個、又は少なくとも 100 個の前記タンパク質配列の連続的なアミノ酸を含む。構造の一部、一部、又はフラグメント（A portion, part or fragment of a structure）は、好ましくは、前記構造の 1 つ以上の機能的特性（例えば、抗原性、免疫学的な及び／又は結合の特性）を含む。例えば、T 細胞受容体鎖の可変領域の一部は、抗原認識部位を形成し、抗原に結合できることが好ましい。従って、T 細胞受容体鎖の可変領域が V アルファである場合、その一部は、対応する V ベータ又はその一部と相互作用して、機能的な抗原認識部位を依然として形成できることが好ましい。T 細胞受容体鎖の可変領域が V ベータである場合、その一部は、対応する V アルファ又はその一部と相互作用して機能的抗原認識部位を依然として形成できることが好ましい。同様に、T 細胞受容体鎖の定常領域の一部は、そのシグナル伝達機能を実行できることが好ましい。
【００６８】
本発明によれば、抗原の発現レベルが検出限界を下回る場合、及び／又は抗原の発現レベルが低すぎて細胞に加えた抗原特異的抗体が結合することができない場合、前記抗原は前記細胞で（実質的に）発現していない。本発明によれば、抗原の発現レベルが検出限界を超える場合、及び／又は抗原発現レベルが細胞に加えた抗原特異的抗体が結合できる程に十分高い場合、前記抗原は前記細胞で発現している。好ましくは、細胞で発現している抗原は、前記細胞の表面で発現している又は露出していて（即ち、存在している）、そのことにより、細胞に加えられた抗体又は抗原受容体等の抗原特異的分子が前記抗原に結合することが、可能である。
【００６９】
「標的細胞」とは、細胞性免疫応答等の免疫応答の標的である細胞を意味するものとする。標的細胞には、がん細胞等のあらゆる望ましくない細胞が含まれる。好ましい実施形態において、前記標的細胞は、標的抗原（特に疾患特異的抗原）を発現する細胞であり、好ましくは、前記標的抗原は前記細胞の表面に存在する。
【００７０】
用語「エピトープ」は、抗原等の分子中にある抗原決定基、即ち、免疫系によって認識される（即ち、結合する）、例えば、抗体又は抗原受容体によって認識される、分子の一部又はフラグメント、を指す。例えば、エピトープは、抗原上の別個の三次元部位であり、免疫系によって認識される。エピトープは通常、アミノ酸や糖側鎖等の分子が化学的に活性な表面グルーピングをすることで構成され、通常は特定の三次元構造特性と特定の電荷特性を持っている。立体配座エピトープと非‐立体配座エピトープは、変性溶媒の存在下では前者への結合が失われ、後者への結合は失われないという点で区別される。好ましくは、エピトープは、抗原又は抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘導することができる。好ましくは、前記用語は、抗原の免疫原性部分に関する。腫瘍抗原等のタンパク質のエピトープは、好ましくは前記タンパク質の連続部分又は不連続部分を含み、好ましくは 5 個から 100 個、好ましくは 5 個から 50 個、より好ましくは 8 個から 30 個、最も好ましくは 10 個から 25 個のアミノ酸である。例えば、前記エピトープは、好ましくは、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は 25 個のアミノ酸の長さであることがある。
【００７１】
「抗原プロセシング（Antigen processing）」とは、プロセション生成物（procession products）（プロセション生成物とは前記抗原のフラグメントである）に抗原が分解されること（例えば、ペプチドにタンパク質が分解されること）、及び、細胞によって提示される（好ましくは、抗原提示細胞によって特定の T 細胞に提示される）ために、これらのフラグメントのうちの 1 つ以上が MHC と相互作用する（例えば、結合による）ことを指す。
【００７２】
抗原提示細胞（antigen-presenting cell（APC））は、その表面において、主要組織適合遺伝子複合体（major histocompatibility complex（MHC））のコンテキスト（context）で、抗原を提示する細胞である。T 細胞は、T 細胞受容体（TCR）を使用してこの複合体を認識することがある。抗原提示細胞は抗原をプロセシングし、それらを T 細胞に提示する。本発明によれば、用語「抗原提示細胞」は、プロフェッショナルな抗原提示細胞（professional antigen-presenting cells）及び非‐プロフェッショナルな抗原提示細胞（non-professional antigen-presenting cells）を含む。
【００７３】
プロフェッショナルな抗原提示細胞は、貪食作用又は受容体媒介エンドサイトーシスのいずれかによって、抗原を内部に取り込み、クラス II MHC 分子に結合した前記抗原のフラグメントを膜上に提示するのに非常に効率的である。T 細胞は、抗原提示細胞の膜上の抗原クラス II MHC 分子複合体を認識し、それと相互作用する。次に、抗原提示細胞によって共刺激シグナルが追加的に生成され、前記 T 細胞の活性化を引き起こす。共刺激分子の発現は、プロフェッショナルな抗原提示細胞の特徴を規定する。主な種類のプロフェッショナルな抗原提示細胞は樹状細胞であり（これは、最も広範囲に抗原提示を行い、おそらく最も重要な抗原提示細胞）、マクロファージ、B 細胞、及びある特定の活性化上皮細胞である。
【００７４】
非‐プロフェッショナルな抗原提示細胞は、ナイーブ T 細胞との相互作用に必要な MHC クラス II タンパク質を構成的に発現しない；MHC クラス II タンパク質は、IFNγ 等の特定のサイトカインによって、非‐プロフェッショナルな抗原提示細胞を刺激したときのみに発現する。
【００７５】
樹状細胞（DC）は、末梢組織で捕捉した抗原を、MHC クラス II 及び I の両方の抗原提示経路を介して、T 細胞に提示する白血球の集団である。樹状細胞は免疫応答の強力な誘導因子であり、これらの細胞を活性化することは抗腫瘍免疫の誘導にとって重要なステップであることはよく知られている。樹状細胞及び前駆細胞は、末梢血、骨髄、腫瘍浸潤細胞、腫瘍周囲組織浸潤細胞（peritumoral tissues-infiltrating cells）、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血、若しくはその他の適切な組織又は体液から入手できる。例えば、樹状細胞は、GM-CSF、IL-4、IL-13、及び／又は TNFa 等のサイトカインの組み合わせを、末梢血から採取した単球の培養物に加えることにより、ex vivo で分化させることができる。或いは、樹状細胞の分化、成熟、及び増殖を誘導する GM-CSF、IL-3、TNFα、CD40 リガンド、LPS、flt3 リガンド及び／又は他の化合物の組み合わせを培地に加えることにより、末梢血、臍帯血又は骨髄から採取した CD34 陽性細胞を樹状細胞に分化させることがある。樹状細胞は、「未成熟」細胞と「成熟」細胞に便宜的に分類され、この分類を、よく特徴付けられた 2 つの表現型間を区別する簡単な方法として使用することができる。しかし、この命名法によって、分化に関して可能な全ての中間段階が除外されると解釈されるべきではない。未成熟樹状細胞は、抗原の取り込み及びプロセシングの能力が高い抗原提示細胞として特徴付けられ、Fcγ 受容体及びマンノース受容体が高発現することと相関している。成熟の表現型は、通常、これらのマーカーの発現はより低いが、クラス I 及びクラス II MHC、接着分子（例えば、CD54 及び CD11）、及び共刺激分子（例えば、CD40、CD80、CD86、及び 4-1 BB）等の T 細胞活性化を担う細胞表面分子を高発現することによって、特徴付けられる。樹状細胞の成熟とは、樹状細胞が活性化した状態を指し、そのような抗原提示樹状細胞が T 細胞のプライミングをもたらし、未成熟樹状細胞による提示は免疫寛容（tolerance）をもたらす。樹状細胞の成熟は、主に、生来の受容体によって検出される微生物の特徴を持つ生体分子（バクテリア DNA、ウイルス RNA、エンドトキシン等）、向炎症性サイトカイン（TNF、IL-1、IFNs）、CD40L が樹状細胞表面の CD40 に結合すること、及びストレスの多い細胞死にある細胞から放出される物質によって引き起こされる。前記樹状細胞は、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子（GM-CSF）や腫瘍壊死因子アルファ等のサイトカインを用いて、骨髄細胞を in vitro で培養することで得ることができる。
【００７６】
用語「免疫原性（immunogenicity）」は、免疫反応を誘導する抗原の相対的な効率に関する。
【００７７】
本発明の文脈における用語「免疫エフェクター機能（immune effector functions）」は、例えば、腫瘍細胞等の疾患細胞を殺傷すること、若しくは腫瘍の成長を阻害すること、並びに／又は腫瘍の播種及び転移の阻害等を含む腫瘍の発達を阻害すること、をもたらす、免疫系の成分が介する任意の機能を含む。好ましくは、本発明の文脈における免疫エフェクター機能は、T 細胞が介するエフェクター機能である。そのような機能は、ヘルパー T 細胞（CD4+ T 細胞）の場合、インターロイキン-2 等のサイトカインの放出並びに／又はCD8+ リンパ球（CTL）及び／若しくは B 細胞の活性化を含み、CTL の場合、例えば、アポトーシス又はパーフォリンを介した細胞溶解、IFN-γ 及び TNF-α 等のサイトカインの産生、並びに抗原発現標的細胞の特異的な細胞溶解性殺傷、を介して、細胞（即ち、抗原が発現していることを特徴とする細胞）を除去すること、を含む。
【００７８】
本発明の文脈における用語「免疫反応性細胞」又は「免疫エフェクター細胞」は、免疫反応中にエフェクター機能を発揮する細胞に関する。「免疫反応性細胞」は、好ましくは、細胞の表面に発現する抗原等の抗原と結合し、免疫応答を媒介することができる。例えば、そのような細胞は、サイトカイン及び／又はケモカインを分泌し、微生物を殺傷し、抗体を分泌し、感染した又はがん性の細胞を認識し、任意選択的にそのような細胞を除去する。例えば、免疫反応性細胞には、T 細胞（細胞傷害性 T 細胞、ヘルパー T 細胞、腫瘍浸潤 T 細胞）、B細胞、ナチュラル・キラー細胞、好中球、マクロファージ、及び樹状細胞が含まれる。好ましくは、本発明の文脈において、「免疫反応性細胞」は T 細胞、好ましくは CD4+ 及び／又は CD8+ T 細胞である。本発明によれば、用語「免疫反応性細胞」は、適切な刺激で免疫細胞（例えば T 細胞、特に T ヘルパー細胞、又は細胞溶解性 T 細胞等）に成熟できる細胞も含む。免疫反応性細胞には、CD34+ 造血幹細胞、未成熟及び成熟 T 細胞、未成熟及び成熟 B 細胞が含まれる。抗原に暴露されたときに、T 細胞前駆体が細胞溶解性 T 細胞へ分化することは、免疫系のクローン選択に似ている。
【００７９】
好ましくは、「免疫反応性細胞」又は「免疫エフェクター細胞」は、抗原（特に抗原提示細胞又はがん細胞等の疾患細胞の表面に存在する場合）を、ある程度の特異性をもって認識する。好ましくは、前記認識により、抗原を認識する細胞が応答性又は反応性になることが可能になる。前記細胞がヘルパー T 細胞（CD4+ T 細胞）である場合、そのような応答性又は反応性には、サイトカインの放出、並びに／又はCD8+ リンパ球（CTLs）及び／若しくは B 細胞の活性化が含まれることがある。前記細胞が CTL である場合、そのような応答性又は反応性は、アポトーシス又はパーフォリンを介した細胞溶解、を介して、細胞（即ち、抗原が発現していることを特徴とする細胞）を除去すること、を含むことがある。本発明によれば、CTL 応答性には、持続的なカルシウムの流入、細胞分裂、IFN-α 及び TNF-α 等のサイトカインの産生、CD44 及び CD69 等の活性化マーカーのアップレギュレーション、並びに抗原発現標的細胞を特異的に細胞溶解性殺傷をすることが含まれることがある。CTL の応答性は、CTL 応答性を正確に示す人工レポーターを使用して測定することもある。抗原を認識し、応答性又は反応性であるそのような CTL を、本明細書では「抗原応答性 CTL」とも呼ぶ。
【００８０】
「リンパ系細胞」とは、任意選択的に適切な改変をした後、例えば T 細胞受容体又は抗原受容体を移入した後、細胞性免疫応答等の免疫応答を生じさせることができる細胞又はそのような細胞の前駆細胞であり、リンパ球、好ましくは T リンパ球、リンパ芽球、及び形質細胞を含む。リンパ系細胞は、本明細書に記載の免疫反応性細胞又は免疫エフェクター細胞であることがある。好ましいリンパ系細胞は、細胞表面上に T 細胞受容体又は抗原受容体を発現するように改変しうる T 細胞である。ある実施形態では、前記リンパ系細胞は、T 細胞受容体の内因性発現を欠いている。
【００８１】
用語「T 細胞」及び「T リンパ球」は、本明細書で互換的に使用され、細胞溶解性 T 細胞を含む、T ヘルパー細胞（CD4+ T 細胞）及び細胞傷害性 T 細胞（CTLs、CD8+ T 細胞）を含む。
【００８２】
T 細胞はリンパ球として知られる白血球のグループに属し、細胞性免疫の中心的な役割を果たす。T 細胞は、細胞表面に T 細胞受容体（TCR）と呼ばれる特別な受容体が存在することにより、B 細胞及びナチュラル・キラー細胞等の他のリンパ球タイプと区別することができる。胸腺は、T 細胞の成熟を担う主要な器官である。T 細胞のいくつかの異なるサブセットが発見されており、それぞれが異なる機能を有する。
【００８３】
T ヘルパー細胞は、とりわけ、B細胞の形質細胞への成熟、細胞傷害性 T 細胞及びマクロファージの活性化等を含む、免疫プロセスにおける他の白血球を支援する。これらの細胞は、その表面に CD4 タンパク質を発現するので、CD4+ T 細胞としても知られている。ヘルパー T 細胞は、抗原提示細胞（APCs）の表面に発現する MHC クラス II 分子によってペプチド抗原が提示されると、活性化する。活性化すると、急速に分裂し、能動的な免疫応答を調節又は支援する、サイトカインと呼ばれる小さなタンパク質を分泌する。
【００８４】
細胞傷害性 T 細胞は、ウイルス感染細胞及び腫瘍細胞を破壊し、移植片拒絶反応にも関与している。これらの細胞は、その表面に CD8 糖タンパク質を発現するので、CD8+ T 細胞としても知られている。これらの細胞は、体のほぼ全ての細胞の表面に存在する MHC クラス I と相互作用する抗原に結合することにより、その標的を認識する。
【００８５】
T 細胞の大部分は、いくつかのタンパク質の複合体として存在する T 細胞受容体（TCR）を持っている。実際の T 細胞受容体は、2 つの別々のペプチド鎖で構成されていて、これら 2 つの別々のペプチド鎖は独立した T 細胞受容体アルファ及びベータ（TCRα及びTCRβ）遺伝子から生成され、α-及び β-TCR 鎖と呼ばれる。γδ T 細胞（ガンマ・デルタ T 細胞）は、表面に異なる T 細胞受容体（TCR）を持つ T 細胞の小さなサブセットを表す。しかしながら、γδ T 細胞では、前記 TCR は 1 つのγ鎖及び 1 つのδ鎖で構成される。T 細胞のこのグループは、αβ T 細胞よりもはるかに一般的ではない（総 T 細胞の 2％）。
【００８６】
T 細胞受容体の各鎖は、2 つの細胞外ドメイン：可変（V）領域と定常（C）領域、で構成されている。前記定常領域は細胞膜に近接しており、膜貫通領域と短い細胞質尾部がその後に続き、一方で、前記可変領域はペプチド／MHC 複合体に結合する。本発明の目的に関して、用語「T 細胞受容体鎖の定常領域又はその一部」には、T 細胞受容体鎖の定常領域の後に、（N 末端から C 末端に向かって）T 細胞受容体鎖の定常領域に自然に連結している膜貫通領域及び細胞質尾部等の、膜貫通領域及び細胞質尾部が続く、という実施形態もまた含まれる。
【００８７】
全ての T 細胞は、骨髄の造血幹細胞に由来する。造血幹細胞に由来する造血前駆細胞は胸腺に分布し、細胞分裂により増殖して未成熟な胸腺細胞の大きな集団を生成する。最初期の胸腺細胞は CD4 も CD8 も発現しないため、二重陰性（CD4-CD8-）細胞として分類される。発生が進むにつれて、それらの細胞は二重陽性胸腺細胞（CD4+CD8+）になり、最終的に胸腺から末梢組織に放出される単一陽性（CD4+CD8- 又は CD4-CD8+）胸腺細胞に成熟する。
【００８８】
T 細胞は一般に、標準的な手順を使用して、in vitro 又は ex vivo で調製することができる。例えば、T 細胞は、市販の細胞分離システムを使用して、患者等の哺乳動物の骨髄、末梢血又は骨髄若しくは末梢血の一部から単離することができる。あるいは、T 細胞は、血縁関係にある又は非血縁関係にあるヒト、非‐ヒト動物、細胞株又は培養物、に由来することがある。T 細胞を含むサンプルは、例えば、末梢血単核細胞（PBMC）であることがある。
【００８９】
本発明に従って使用される T 細胞は、内因性 T 細胞受容体を発現していることがある、又は内因性 T 細胞受容体の発現を欠いていることがある。
【００９０】
抗原受容体をコードする RNA 等の核酸は、溶解能力のある T 細胞又は他の細胞、特にリンパ系細胞、に導入される。
【００９１】
用語「抗原を標的とする抗原受容体（antigen receptor targeted to an antigen）」又は類似の用語は、T 細胞等の免疫エフェクター細胞上に存在する場合、抗原提示細胞又はがん細胞等の疾患細胞の表面等にある抗原を認識する抗原受容体に関する。ここで、前記免疫エフェクター細胞は、上述のように、刺激される、プライミングされる、及び／若しくは増殖する、又は免疫エフェクター細胞のエフェクター機能を発揮する。
【００９２】
用語「抗原特異的 T 細胞」又は類似の用語は、特に抗原受容体を備えている場合、抗原提示細胞又はがん細胞等の疾患細胞の表面等にある、抗原受容体が標的とする抗原を認識し、好ましくは上述のように T 細胞のエフェクター機能を発揮する、T 細胞に関する。前記細胞が抗原を発現する標的細胞を殺傷する場合、T 細胞及び他のリンパ系細胞は抗原に特異的であるとみなされる。T 細胞の特異性は、例えば、クロム放出アッセイ又は増殖アッセイ内の、様々な標準技術の何れかを使用して評価することができる。或いは、リンホカイン（インターフェロン-γ等）の合成を測定することができる。
【００９３】
用語「主要組織適合遺伝子複合体（major histocompatibility complex）」及び略語「MHC」には、MHC クラス I 及び MHC クラス II 分子が含まれ、全ての脊椎動物にある遺伝子の複合体に関する。MHC タンパク質又は分子は、免疫反応においてリンパ球と抗原提示細胞又は疾患細胞との間のシグナル伝達に重要であり、ここで、前記 MHC タンパク質又は分子はペプチドに結合し、T 細胞受容体が認識するようにそれらペプチドを提示する。MHC によってコードされるタンパク質は、細胞の表面に発現し、T 細胞に対して自己抗原（前記細胞自身に由来するペプチド・フラグメント）と非自己抗原（例えば、侵入微生物のフラグメント）の両方を提示する。
【００９４】
本発明によれば、用語「抗原受容体（antigen receptor）」には、改変した受容体が含まれ、これは、モノクローナル抗体の特異性等の任意の特異性を T 細胞等の免疫エフェクター細胞に付与する。このようにして、養子細胞移入のために、多数の抗原特異的 T 細胞を生成することができる。従って、本発明による抗原受容体は、例えば、T 細胞自身の T 細胞受容体の代わりに、又はそれに加えて、T 細胞上に存在することがある。そのような T 細胞は、前記標的細胞を認識するために、抗原のプロセシング及び提示を必ずしも必要とせず、寧ろ標的細胞上に存在する任意の抗原を特異性をもって、優先的に認識することがある。好ましくは、前記抗原受容体は前記細胞の表面で発現する。本発明の目的のために、抗原受容体を含む T 細胞は、本明細書で使用される用語「T 細胞」に含まれる。具体的には、本発明によれば、用語「抗原受容体」は（例えば、抗原結合部位又は抗原結合ドメインが標的細胞の表面に発現する抗原に結合することにより）、がん細胞等の標的細胞上の標的構造（例えば、抗原）を認識する（即ち、結合する）、単一分子又は分子の複合体を含む人工受容体を含み、及び細胞表面に前記抗原受容体を発現する T 細胞等の免疫エフェクター細胞に特異性を付与することがある。好ましくは、抗原受容体がその標的構造を認識することによって、前記抗原受容体を発現する免疫エフェクター細胞は活性化する。抗原受容体は、本明細書に記載の 1 つ以上のドメインを含む 1 つ以上のタンパク質ユニットを含むことがある。好ましくは、用語「抗原受容体」は、T 細胞受容体を含まない。本発明によれば、好ましくは、用語「抗原受容体」は、用語「キメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor (CAR)）」、「キメラ T 細胞受容体」及び「人工 T 細胞受容体」と同義である。
【００９５】
本発明によれば、抗原は、異なるペプチド鎖に存在することがある、抗体及び T 細胞受容体の抗原結合部分を介して等、抗原結合部位を形成することができる任意の抗原認識ドメイン（本明細書では単に「ドメイン」ともいう）を介して、抗原受容体によって認識され得る。ある実施形態では、抗原結合部位を形成する 2 つのドメインは免疫グロブリンに由来する。別の実施形態では、抗原結合部位を形成する 2 つのドメインは T 細胞受容体に由来する。特に好ましいのは、モノクローナル抗体由来の単鎖可変フラグメント（scFv）等の抗体可変ドメイン、及び T 細胞受容体可変ドメインであり、特に TCR アルファ及びベータ単鎖である。実際には、所与のターゲットに、高い親和性で結合するほとんど全てのものを、抗原認識ドメインとして使用することができる。
【００９６】
ある実施形態では、本発明の抗原受容体は、少なくとも 2 つの結合部位を形成する少なくとも 4 つの免疫グロブリン可変ドメインを含み、ここで、前記 2 つの結合部位は同じ又は異なるエピトープに結合し、そのエピトープは同じ又は異なる抗原上に位置していることがある。ある実施形態では、前記抗原受容体は、第 1 エピトープに対して特異性を有する免疫グロブリンの重鎖の可変ドメイン（又は領域）（VH）（VH(1)）、第 1 エピトープに対して特異性を有する免疫グロブリンの軽鎖の可変ドメイン（又は領域）（VL）（VL(1)）、第 2 エピトープに対して特異性を有する免疫グロブリンの重鎖の可変ドメイン（又は領域）（VH）（VH(2)）、及び第 2 エピトープに対して特異性を有する免疫グロブリンの軽鎖の可変ドメイン（又は領域）（VL）（VL(2)）を含み、第 1 及び第 2 エピトープは同じ又は異なっていても良く、及び同じ又は異なる抗原上に位置していても良い。ある実施形態では、VH(1) は VL(1) と相互作用して抗原結合部位を形成することができ、VH(2) はVL(2) と相互作用して抗原結合部位を形成することができるが、一方で、VH(1) はVL(2) と相互作用して抗原結合部位を形成することはできず、及び VH(2) はVL(1) と相互作用して抗原結合部位を形成することはできない。別の実施形態では、しかしながら、VH(1) はVL(1) 並びに VL(2) と相互作用して抗原結合部位を形成でき、及び VH(2) は VL(2) 並びに VL(1) と相互作用して抗原結合部位を形成できる。後者の実施形態では、VH(1) 及び VH(2) は同一又は少なくとも同じ免疫グロブリンに由来することがあり、VL(1) 及び VL(2) は同一又は少なくとも同じ免疫グロブリンに由来することがある。
【００９７】
ある態様では、本発明は、本明細書において組合せ抗原受容体（combinatory antigen receptor）とも呼ばれる抗原受容体に関するものであり、この受容体は、第 1 ペプチド鎖と第 2 ペプチド鎖を含み、ここで、前記第 1 ペプチド鎖は、第 1 ドメイン、第 2 ドメイン、T  細胞受容体鎖の可変領域又はその一部、及び免疫受容体シグナル伝達ドメインを含む；前記第 2 ペプチド鎖は、第 1 ドメイン、第 2 ドメイン、T  細胞受容体鎖の可変領域又はその一部、及び免疫受容体シグナル伝達ドメインを含む；ここで、前記第 1 ペプチド鎖の第 1 ドメインは、前記第 2 ペプチド鎖のドメインのうちの 1 つと一緒に第 1 抗原結合部位を形成し、及び、ここで、前記第 1 ペプチド鎖の第 2 ドメインは、前記第 2 ペプチド鎖のもう 1 つの他のドメインと一緒に第 2 抗原結合部位を形成する。
【００９８】
ある実施形態では、本発明の組合せ抗原受容体は、両方のペプチド鎖のそれぞれにある軽鎖可変ドメインに接続した重鎖可変ドメインを含み、ここで、2 つの抗原結合部位の形成が、異なるペプチド鎖上の重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとの間の相互作用を通じて起こる。ある実施形態では、本発明の組合せ抗原受容体は 2 つのペプチド鎖を含み、1 つのペプチド鎖は VL(1) 及び VH(2) を含み、及び他のポリペプチド鎖は VH(1) 及び VL(2) を含む。別の実施形態では、本発明の組合せ抗原受容体は、一方のペプチド鎖に、重鎖可変ドメインに接続した重鎖可変ドメインと、及び他方のペプチド鎖に、軽鎖可変ドメインに接続した軽鎖可変ドメインとを含む。ここで、2 つの抗原結合部位の形成は、異なるペプチド鎖上の重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの間の相互作用を通じて起こる。ある実施形態では、本発明の組合せ抗原受容体は 2 つのペプチド鎖を含み、ここで 1 つのペプチド鎖は VH(1) 及び VH(2) を含み、他のペプチド鎖は VL(1) 及び VL(2) を含む。
【００９９】
ある実施形態では、本発明の組合せ抗原受容体は、重鎖可変領域（VH）及び軽鎖可変領域（VL）が、好ましくは、N 末端から C 末端に向かって、VH(1)-VL(2) の順に配列した第 1 ペプチド鎖、及び重鎖可変領域（VH）及び軽鎖可変領域（VL）が、好ましくは、N 末端から C 末端に向かって、VL(1)-VH(2) の順に配列した第 2 ペプチド鎖を含む。T 細胞受容体鎖の可変領域又はその一部、及び免疫受容体シグナル伝達ドメインは、可変領域の配列の C 末端に位置することが好ましい。T 細胞受容体鎖の可変領域又はその一部、及び免疫受容体シグナル伝達ドメインは、ペプチド鎖のうちの一つの上に位置する T 細胞受容体アルファ鎖の可変領域又はその一部及び T 細胞受容体アルファ鎖の定常領域又はその一部を、及び他のもう 1 つのペプチド鎖の上に位置する T 細胞受容体ベータ鎖の可変領域又はその一部及び T 細胞受容体ベータ鎖の定常領域を、好ましくは、含む。ある実施形態では、T 細胞受容体アルファ鎖の可変領域又はその一部及び T 細胞受容体アルファ鎖の定常領域又はその一部は、T 細胞受容体のアルファ鎖を含む。ある実施形態では、T 細胞受容体ベータ鎖の可変領域又はその一部及び T 細胞受容体ベータ鎖の定常領域又はその一部は、T 細胞受容体のベータ鎖を含む。T 細胞受容体のアルファ鎖と T 細胞受容体のベータ鎖は、同じ T 細胞受容体に由来することが好ましい。
【０１００】
ある実施形態では、本発明の組合せ抗原受容体は、重鎖可変領域（VH）及び軽鎖可変領域（VL）が、好ましくは、N 末端から C 末端に向かって、VH(1)-VH(2) の順に配列した第 1 ペプチド鎖、及び重鎖可変領域（VH）及び軽鎖可変領域（VL）が、好ましくは、N 末端から C 末端に向かって、VL(1)-VL(2) の順に配列した第 2 ペプチド鎖を含む。T 細胞受容体鎖の可変領域又はその一部、及び免疫受容体シグナル伝達ドメインは、可変領域の配列の C 末端に位置することが好ましい。T 細胞受容体鎖の可変領域又はその一部、及び免疫受容体シグナル伝達ドメインは、好ましくは、ペプチド鎖のうちの一つの上に位置する T 細胞受容体アルファ鎖の可変領域又はその一部及び T 細胞受容体アルファ鎖の定常領域又はその一部を、及び他のもう 1 つのペプチド鎖の上に位置する T 細胞受容体ベータ鎖の可変領域又はその一部及び T 細胞受容体ベータ鎖の定常領域又はその一部を、含む。ある実施形態では、T 細胞受容体アルファ鎖の可変領域又はその一部及び T 細胞受容体アルファ鎖の定常領域又はその一部は、T 細胞受容体のアルファ鎖を含む。ある実施形態では、T 細胞受容体ベータ鎖の可変領域又はその一部及び T 細胞受容体ベータ鎖の定常領域又はその一部は、T 細胞受容体のベータ鎖を含む。T 細胞受容体のアルファ鎖と T 細胞受容体のベータ鎖は、同じ T 細胞受容体に由来することが好ましい。
【０１０１】
本発明の抗原受容体は少なくとも 2 つの抗原結合部位を有し、従って、少なくとも二価である。上記のように、本発明の抗原受容体の結合部位は、同じ又は異なるエピトープに結合することがあり、そのエピトープは同じ又は異なる抗原上に位置していることがある。前記結合部位が同じエピトープ、特に同じ抗原に結合する場合、前記 2 つの結合部位は同一又は本質的に同一であることがある、及び／又は同一又は本質的に同一のドメインによって形成されることがある。ここで、そのような同一又は本質的に同一のドメインは、例えば、同じ免疫グロブリンに由来することがある。前記結合部位が、同じか又は異なるどちらかの抗原上の、異なるエピトープに結合する場合、前記 2 つの結合部位は異なる、及び異なるドメインによって形成される。ここで、そのような異なるドメインは異なる免疫グロブリンに由来することがある。そのような異なるドメインの場合、異なるエピトープ特異性を有するドメインは互いに相互作用しないか、実質的に相互作用しない（即ち、VH(1) はVL(2) と相互作用できず、抗原結合部位を形成できない、及び VH(2) はVL(1) と相互作用できず、抗原結合部位を形成できない）ことが好ましい。結果的に、VH(1) はVL(1) と相互作用して抗原結合部位を形成し、及び VH(2) はVL(2) と相互作用して抗原結合部位を形成する。本発明の組合せ抗原受容体は 2 つのペプチド鎖を含み、ここで 1 つのペプチド鎖が VH(1) 及び VL(2) を含み、他のペプチド鎖が VH(2) 及び VL(1) を含む場合、このことによって、ドメインの分子内相互作用を介して抗原結合部位を形成することができないペプチド鎖となる。
【０１０２】
抗原結合部位を形成する本発明の抗原受容体の 2 つのドメインはまた、例えば T 細胞受容体の可変領域等、T 細胞受容体に由来することもあり、抗原特異的結合（特にペプチド-MHC 複合体への結合）を維持するそのフラグメント又は部分であることがある。
【０１０３】
本発明によれば、用語「T 細胞受容体の可変領域」は、TCR 鎖の可変ドメインに関する。TCRα 鎖と β 鎖の両方の可変領域には 3 つの超可変領域又は相補性決定領域（complementarity determining regions（CDRs））があり、ここで、前記 β 鎖の可変領域には、通常は抗原と接触せず、それ故に、CDR とは見なされない追加的な超可変性領域（HV4）がある。α鎖の CDR1 は抗原性ペプチドの N 末端部分と相互作用することが示されていて、一方で β 鎖の CDR1 は前記ペプチドの C 末端部分と相互作用するが、CDR3 が、プロセシングを受けた抗原の認識を担う主要な CDR である。CDR2 は MHC を認識すると考えられている。β 鎖の CDR4 は抗原認識に関与するとは考えられていないが、スーパー抗原と相互作用することが示されてきている。
【０１０４】
免疫グロブリン可変ドメインに関する上記の開示は、対応する方法で、T 細胞受容体可変ドメインに適用される。本発明の抗原受容体は、第 1 エピトープに対して特異性を有する免疫グロブリン重鎖の可変ドメイン（VH）（VH(1)）、及び第 1 エピトープに対して特異性を有する免疫グロブリン軽鎖の可変ドメイン（VL）（VL(1)）の代わりに、第 1 エピトープに対して特異性を有する TCR の TCRα 鎖の可変ドメイン、及び第 1 エピトープに対して特異性を有する TCR の TCRβ 鎖の可変ドメインを含むことがある。代替的に又は追加的に、本発明の抗原受容体は、第 2 エピトープに対して特異性を有する免疫グロブリン重鎖の可変ドメイン（VH）（VH(2)）、及び第 2 エピトープに対して特異性を有する免疫グロブリン軽鎖の可変ドメイン（VL）（VL(2)）の代わりに、第 2 エピトープに対して特異性を有する TCR のTCRα 鎖の可変ドメイン、及び第 2 エピトープに対して特異性を有する TCR のTCRβ 鎖の可変ドメインを含むことがある。
【０１０５】
各抗原結合部位は 2 つのドメインから形成されるため、各ドメインはそれぞれ免疫グロブリン又は T 細胞受容体の一部又はフラグメントを含むことがある。個々の一部又はフラグメントだけでは抗原に結合できないかもしれないが、2 つの個々の部分又はフラグメントが結合すると、元の免疫グロブリン又は T 細胞受容体の抗原結合構造が形成される、又は再形成され、それ故に、好ましくは同じ親和性で、同じ抗原に結合することができる。
【０１０６】
抗原認識に続いて、受容体は好ましくはクラスター化し、シグナルが前記細胞に伝達される。これに関して、「免疫受容体シグナル伝達ドメイン（immunoreceptor signal transmission domain）」又は「T 細胞シグナル伝達ドメイン（T cell signaling domain）」は、抗原が結合した後に T 細胞に活性化シグナルを伝達することに関与するドメインである。そのようなシグナル伝達は、一方のペプチド鎖上にある、T 細胞受容体アルファ鎖の定常領域又はその一部等の、T 細胞受容体鎖の定常領域若しくは不変領域、若しくは免疫細胞 Fc 受容体鎖の定常領域若しくは不変領域、又は前記定常領域若しくは不変領域の一部を含む、本発明の抗原受容体、並びに、他のもう 1 つのペプチド鎖上にある、T 細胞受容体ベータ鎖の定常領域又はその一部等の、対応する T 細胞受容体鎖の定常領域若しくは不変領域、若しくは対応する免疫細胞 Fc 受容体鎖の定常領域若しくは不変領域、又は前記定常領域若しくは不変領域の一部を含む、本発明の抗原受容体、によって可能になりことがある。これに関して、前記 CD3 複合体は、多分子 T 細胞受容体（TCR）複合体の一部として、成熟したヒト T 細胞、胸腺細胞、及びナチュラル・キラー細胞のサブセットで、発現する抗原を表す。前記 T 細胞共受容体はタンパク質複合体であり、4 つの異なる鎖で構成されている。哺乳類では、前記複合体は、CD3γ鎖、CD3δ鎖、及び 2 つの CD3ε鎖を含む。これらの鎖は T 細胞受容体（TCR）及びζ鎖と結合して、T リンパ球で活性化シグナルを生成する。前記 TCR、ζ鎖、及び CD3 分子が一緒になって TCR 複合体を構成する。CD3 は TCR のシグナル伝達を担っている。Lin and Weiss, Journal of Cell Science 114, 243-244 (2001) に記載されているように、MHC によって提示される特定の抗原エピトープが結合することによって TCR 複合体が活性化すると、Src ファミリー・キナーゼによって、免疫受容体のチロシンをベースとした活性化モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based activation motifs （ITAMs））がリン酸化され、更なるキナーゼの動員が引き起こされ、Ca2+ 放出等を含む T 細胞活性化を引き起こされる。例えば、固定化した抗 CD3 抗体により、T 細胞上に CD3 をクラスタリングさせると、T 細胞受容体が関与している場合と同様の T 細胞活性化がもたらされるが、そのクローンの特徴でもある特異性とは無関係である。
【０１０７】
抗原受容体シグナル伝達ドメインは、好ましくは、最低限、天然の細胞シグナル伝達複合体（例えば、CD3 複合体）と相互作用する働きをして、これは、抗原が抗原受容体に結合したことのシグナルを細胞内に伝達することを担い、免疫細胞の活性化をもたらす。前記シグナル伝達ドメインに関する固有性（identity）は、抗原が抗原受容体に結合すると、前記ドメインは天然のシグナル伝達複合体と相互作用をし、免疫細胞の活性化を誘導する作用がある、という点においてのみに限定される。
【０１０８】
好ましくは、一方のペプチド鎖上のシグナル伝達ドメインは、例えば、ジスルフィド架橋を介して、もう一方の鎖上のシグナル伝達ドメインと二量体を形成するであろう。好ましいシグナル伝達ドメインは、T 細胞受容体鎖の定常若しくは不変領域、若しくは免疫細胞 Fc 受容体鎖の定常若しくは不変領域、又は定常若しくは不変領域の一部を含むことがある。好ましいシグナル伝達ドメインは、T 細胞受容体のアルファ、ベータ、ガンマ若しくはデルタ鎖の定常領域又はその一部、並びに免疫細胞 Fc 受容体の定常ドメインの D2 若しくは D3 不変領域又はその一部を含むことがある。好ましい実施形態では、第 1 ペプチド鎖は、T 細胞受容体アルファ鎖の定常領域又はその一部を含み、第 2 ペプチド鎖は、T 細胞受容体ベータ鎖の定常領域又はその一部を含む。この実施形態では、前記第 1 ペプチド鎖は、好ましくは T 細胞受容体アルファ鎖の可変領域又はその一部を含み、前記第 2 ペプチド鎖は T 細胞受容体ベータ鎖の可変領域又はその一部を含み、ここで前記可変領域は前記定常領域の N 末端に位置する。或いは、前記第 1 ペプチド鎖は、T 細胞受容体ベータ鎖の定常領域又はその一部を含み、前記第 2 ペプチド鎖は、T 細胞受容体アルファ鎖の定常領域又はその一部を含む。この実施形態では、前記第 1 ペプチド鎖は好ましくは T 細胞受容体ベータ鎖の可変領域又はその一部を含み、前記第 2 ペプチド鎖は T 細胞受容体アルファ鎖の可変領域又はその一部を含み、ここで、前記可変領域は前記定常領域の N 末端に位置する。別の実施形態では、前記第 1 ペプチド鎖は、T 細胞受容体ガンマ鎖の定常領域又はその一部を含み、前記第 2 ペプチド鎖は、T 細胞受容体デルタ鎖の定常領域又はその一部を含む。この実施形態では、前記第 1 ペプチド鎖は好ましくは T 細胞受容体ガンマ鎖の可変領域又はその一部を含み、前記第 2 ペプチド鎖は T 細胞受容体デルタ鎖の可変領域又はその一部を含み、ここで、前記可変領域は前記定常領域の N 末端に位置する。或いは、前記第 1 ペプチド鎖は、T 細胞受容体デルタ鎖の定常領域又はその一部を含み、前記第 2 ペプチド鎖は、T 細胞受容体ガンマ鎖の定常領域又はその一部を含む。この実施形態では、前記第 1 ペプチド鎖は好ましくは T 細胞受容体デルタ鎖の可変領域又はその一部を含み、前記第 2 ペプチド鎖は T 細胞受容体ガンマ鎖の可変領域又はその一部を含み、ここで、前記可変領域は前記定常領域の N 末端に位置する。任意選択的に、前記シグナル伝達ドメイン、又は T 細胞受容体鎖の可変領域若しくはその一部を、鎖間に追加のジスルフィド結合が生成され、その結果、より効果的な二量体が形成されるように、及び前記二量体がより安定になるように、改変することがある。
【０１０９】
特定の作用機序に限定されることを望まないが、本発明の抗原受容体の 2 つのペプチド鎖は、免疫細胞の表面で発現すると、少なくとも2本の鎖上の個々の免疫受容体シグナル伝達ドメイン間で相互作用（例えば、ジスルフィド結合）することにより二量体を形成し、及び、生理的な T 細胞受容体シグナル伝達に関与する内因性 CD3 複合体と複合体を形成すると考えられている。しかし、本発明はまた、TCR Cα 及び Cβ ドメインの代わりに、CD3ζ又は他の免疫細胞シグナル伝達ドメイン（CD3、CD3 サブユニット FcγR）への直接的な融合も含むことがある。抗原が結合すると、シグナルが細胞内に伝達され、前記免疫細胞の活性化と抗原特異的免疫応答の生成につながると考えられている。更に、一価受容体及び鎖内の抗原結合のみが可能な二価受容体と比較して、鎖間（inter-chain）の抗原結合は、より安定した抗原‐抗原受容体‐内因性 CD3 シグナル伝達モジュールを提供すると考えられており、これにより、相互の安定性が高まり、抗原特異的免疫応答をより効果的に刺激することが可能になる。このより大きな安定性により、ヒト由来の免疫受容体シグナル伝達ドメインのみを使用する選択肢も可能になると考えられている（例えば、ヒト由来のアミノ酸配列を、マウス等の別の種に由来するアミノ酸配列で最小限の置換をする、又は置換をしない）。従って、抗原受容体自体に対する、あらゆる可能性のある望ましくない免疫応答を回避することができる。
【０１１０】
本発明による抗原受容体又はそのペプチド鎖は、抗原結合部位を形成するドメイン、T 細胞受容体鎖の可変領域又はその一部、及び CD3ζ又は他の免疫細胞シグナル伝達ドメイン等を含む免疫受容体シグナル伝達ドメインに加えて、1 つ以上の共刺激ドメインも含む。前記共刺激ドメインは、前記抗原受容体が標的部分に結合したときに、細胞傷害性 T 細胞等の T 細胞の増殖及び生存を高めるのに役立つ。共刺激ドメインに関する固有性（identity）は、前記抗原受容体が標的部分に結合したときに、前記ドメインは細胞の増殖及び生存を高める作用がある、という点においてのみに限定される。好適な共刺激ドメインには、CD28、CD137（4-1BB）（腫瘍壊死因子（TNF）受容体ファミリーのメンバー）、CD134（OX40）（TNFR-スーパーファミリーのメンバーの受容体）、及びCD278（ICOS）（活性化 T 細胞に発現する CD28-スーパーファミリー共刺激分子）が含まれる。当業者は、これらの共刺激ドメインの配列変異体が、本発明に悪影響を与えることなく使用でき、前記変異体が、それがモデルとしたドメインと同じ又は類似の活性を有することを理解するであろう。そのような変異体は、それらが由来するドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも約 80 ％の配列同一性を有するであろう。本発明のいくつかの実施形態では、前記抗原受容体構築物又はそのペプチド鎖は 2 つの共刺激ドメインを含む。特定の組み合わせには、4 種の記載したドメインの全ての可能なバリエーションが含まれるが、具体例には CD28+CD137（4-1BB）及び CD28+CD134（OX40）が含まれる。
【０１１１】
本発明の抗原受容体又はそのペプチド鎖は、N 末端から C 末端方向に連結された 1 つ以上の共刺激ドメイン、及び免疫受容体シグナル伝達ドメインを含むことがある。しかし、本発明の抗原受容体又はそのペプチド鎖はこの配置に限定されず、他の配置も許容され、免疫受容体シグナル伝達ドメイン、及び 1 つ以上の共刺激ドメインが含まれる。
【０１１２】
抗原結合部位を形成するドメインは抗原に自由に結合しなければならないため、融合タンパク質におけるこれらのドメインの配置は、一般に、細胞の外側に、その領域が提示されるようなものである、と理解されよう。同様に、共刺激ドメイン及び免疫受容体シグナル伝達ドメインは、T 細胞の活性及び増殖を誘導するのに役立つため、融合タンパク質は一般にこれらのドメインを細胞内部に提示する。前記抗原受容体には、前記融合タンパク質が前記細胞表面に適切に運ばれることを保証するシグナル・ペプチド、前記融合タンパク質が内在性膜タンパク質として維持されることを保証する膜貫通ドメイン、及び抗原結合部位を形成するドメインに柔軟性を与え、抗原への強い結合を可能にする、ヒンジ・ドメイン（又はスペーサー領域）等の追加要素が含まれることがある。
【０１１３】
任意選択的に、本発明の抗原受容体は更にリンカーを含むことがあり、前記リンカーは、任意のアミノ酸配列又はアミノ酸配列間のスペーサーとして有用なアミノ酸以外の化合物であることがある。前記リンカーは、一般に、柔軟性とプロテアーゼ耐性を付与するように設計される。例えば、前記リンカーは、本発明の組合せ抗原受容体の第 1 ペプチド鎖上の第 1 と第 2 ドメイン間及び／又は第 2 ペプチド鎖上の第 1 と第 2 ドメイン間に存在することがある。任意選択的に、前記リンカーは、前記抗原結合部位を形成するドメインと T 細胞受容体鎖の可変領域又はその一部との間に存在することがある。前記ドメインが抗原結合部位を形成することを可能にする、又は抗原結合を妨げない、当技術分野で知られている任意のタイプのリンカーは、本発明に含まれる。特定の実施形態では、前記リンカーは任意のアミノ酸配列であることがあり、少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 又は少なくとも 100 アミノ酸残基の長さであることがある。アミノ酸リンカーは、通常、柔軟であることを目的としてグリシンに富み、並びに溶解度を目的としてセリンとスレオニンに富む。ある実施形態では、前記リンカーは、4 つのグリシン残基の後にセリン残基が続くもの（Gly4Ser）の 1 回以上（1、2、3、4、5、6、7、8 又は 9 回）の繰り返しである。ある実施形態では、前記リンカーは、抗体のヒンジ領域又はそのフラグメントであることがある。
【０１１４】
本発明の抗原受容体は、古典的な膜貫通ドメイン等、前記抗原受容体を細胞膜上に留める別のドメインを更に含むことがある。好ましくは、前記膜貫通ドメインは、シグナル伝達ドメインの中に組み込まれているか、又はその一部である。
【０１１５】
他の実施形態では、本発明の抗原受容体又は抗原受容体のペプチド鎖は、抗原結合に関与する又は抗原結合を高める追加ドメイン、膜結合発現をする又は分泌するためのシグナル配列、二量体化を改善するドメイン、免疫受容体シグナル伝達ドメインの一部ではない場合における膜貫通ドメイン等の他のドメインを更に含むことがある。ある特定の実施形態では、前記膜貫通ドメインは、前記膜を貫く疎水性アルファ・ヘリックスであることがある。
【０１１６】
好ましくは、シグナル配列又はシグナル・ペプチドは、例えば、抗原受容体が細胞外環境に存在する抗原に結合できるように、分泌経路を通って、及び細胞表面で発現する、ことを十分に可能にする配列又はペプチドである。好ましくは、前記シグナル配列又はシグナル・ペプチドは切断可能であり、成熟ペプチド鎖から除去される。前記シグナル配列又はシグナル・ペプチドは、前記ペプチド鎖を産生する細胞又は生物を考慮して選択することが好ましい。
【０１１７】
特定の実施形態では、本発明の組合せ抗原受容体のペプチド鎖は、以下の構造を含むことがある：NH2‐シグナル・ペプチド‐抗原結合に関与する第 1 ドメイン‐任意選択的なリンカー‐抗原結合に関与する第 2 ドメイン‐任意選択的なリンカー‐T 細胞受容体鎖の可変領域又はその一部‐免疫受容体シグナル伝達ドメイン‐COOH。
【０１１８】
本発明の例示的な抗原受容体には、限定されるものではないが、以下の表１に列挙する構造を有する第 1 及び第 2 ペプチド鎖によって形成されるものが含まれる（VH は免疫グロブリン重鎖の可変領域又はその一部；VL は免疫グロブリン軽鎖の可変領域又はその一部；V1 及び V2 は、互いに二量体を形成する T 細胞受容体鎖の可変領域又はその一部であり、C1 及び C2 は、互いに二量体を形成する免疫受容体シグナル伝達ドメインである（例えば、免疫細胞 Fc 受容体鎖の定常領域若しくは不変領域、T 細胞受容体鎖の定常領域若しくは不変領域、又は前記定常領域若しくは不変領域の一部）。C1 及び C2 がそれぞれ T 細胞受容体鎖の定常領域である場合、V1 及び C1 は好ましくは同じ T 細胞受容体鎖に由来し、V2 及び C2 は好ましくは同じ T 細胞受容体鎖に由来し、前記 T 細胞受容体鎖は好ましくは同じ T 細胞受容体に由来する。特に、ある実施形態における V1-C1 は本質的に T 細胞受容体鎖の配列（TCR アルファ又はTCR ベータ）に対応し、V2-C2 は本質的に相補的な T 細胞受容体鎖（V1-C1 が TCR アルファの場合は TCR ベータ、又は V1-C1 が TCR ベータの場合は TCR アルファ）の配列に対応する。
【０１１９】
【表１】
2020509783.tif 000002
【０１２０】
上記で定義されたように、前記抗原受容体は、第 1 エピトープに対して特異性を有する免疫グロブリンの重鎖の可変ドメイン（VH）（VH(1)）、第 1 エピトープに対して特異性を有する免疫グロブリンの軽鎖の可変ドメイン（VH）（VL(1)）、第 2 エピトープに対して特異性を有する免疫グロブリンの重鎖の可変ドメイン（VH）（VH(2)）、及び第 2 エピトープに対して特異性を有する免疫グロブリンの軽鎖の可変ドメイン（VH）（VL(2)）を含み、第 1 及び第 2 エピトープは同じ又は異なっていても良く、及び同じ又は異なる抗原上に位置していても良い。ある実施形態では、VH(1) はVL(1) と相互作用して抗原結合部位を形成することができ、VH(2) はVL(2) と相互作用して抗原結合部位を形成することができるが、一方で、VH(1) はVL(2) と相互作用して抗原結合部位を形成することはできず、及び VH(2) はVL(1) と相互作用して抗原結合部位を形成することはできない。別の実施形態では、しかしながら、VH(1) はVL(1) 並びに VL(2) と相互作用して抗原結合部位を形成でき、及び VH(2) は VL(2) 並びに VL(1) と相互作用して抗原結合部位を形成できる。後者の実施形態では、VH(1) 及び VH(2) は同一であるか又は少なくとも同じ免疫グロブリンに由来することがあり、VL(1) 及び VL(2) は同一であるか又は少なくとも同じ免疫グロブリンに由来することがある。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、表１に記載した第 1 及び第 2 ペプチド鎖の V1 及び V2 ドメインは、それぞれ T 細胞受容体アルファ鎖及びベータ鎖の可変領域又はその一部である。ある特定の実施形態では、表１に記載した第 1 及び第 2 ペプチド鎖の C1 及び C2 ドメインは、それぞれ T 細胞受容体アルファ鎖及びベータ鎖の定常領域又はその一部である。
【０１２２】
ある実施形態において、表１に記載した第 1 ペプチド鎖の V1 及び C1 ドメインは、T 細胞受容体アルファ鎖の可変領域及び定常領域又はその一部である。この実施形態では、表１に記載した第 2 ペプチド鎖の V2 及び C2 ドメインは、好ましくは、T 細胞受容体ベータ鎖の可変領域及び定常領域又はその一部である。
【０１２３】
ある実施形態において、表１に記載した第 1 ペプチド鎖の V1 及び C1 ドメインは、T 細胞受容体ベータ鎖の可変領域及び定常領域又はその一部である。この実施形態では、表１に記載した第 2 ペプチド鎖の V2 及び C2 ドメインは、好ましくは、T 細胞受容体アルファ鎖の可変領域及び定常領域又はその一部である。
【０１２４】
好ましい実施形態では、一方のペプチド鎖上の 2 つのドメインが両方とも免疫グロブリン重鎖可変領域又はその一部であり、他のもう一方の鎖上の 2 つのドメインが両方とも免疫グロブリン軽鎖可変領域又はその一部である場合、両方のペプチド鎖の第 1 と第 2 ドメインの間にリンカーが存在する。前記リンカーは、長さが 10 から 25 アミノ酸、より好ましくは長さが 15 アミノ酸の任意のアミノ酸配列であることがある。特定の実施形態では、前記リンカーは 5-マーのアミノ酸配列（Gly4Ser）の 3 回の反復である。
【０１２５】
本発明のある特定の実施形態では、前記抗原結合部位を形成する 1 つ以上のドメイン、T 細胞受容体鎖の可変領域又はその一部、又は免疫受容体シグナル伝達ドメインを含む第 1 及び第 2 ペプチド鎖等の、第 1 及び第 2 ペプチド鎖のアミノ酸配列は、哺乳動物起源、好ましくはマウス起源、より好ましくはヒト起源のものである。ある実施形態では、前記アミノ酸配列はヒト起源であるが、前記ヒト配列の 1 つ以上のアミノ酸をマウス配列の対応する位置に見られるアミノ酸で置換することにより、マウス化されている。そのような置換によって、より大きな二量体化若しくは安定性、又は抗原結合の際に細胞にシグナルを伝達する作用が付与されることがある。更に別の実施形態では、前記アミノ酸配列はマウス起源であり、ヒト化されている。
【０１２６】
本発明によれば、上記の通り、抗原受容体は、T 細胞受容体の機能に取って代わることがあり、特に、上記の通り、細胞溶解活性等の反応性を T 細胞等の細胞に付与することがある。しかし、上記の通り、抗原ペプチド-MHC 複合体に T 細胞受容体が結合することとは対照的に、ある特定の実施形態では、抗原受容体は、特に細胞表面で発現される場合、抗原に結合することがある。
【０１２７】
何れのドメイン又はリンカー等を含むペプチド鎖のアミノ酸配列は、改変することができる。例えば、当業者には理解されるように、抗体及び T 細胞受容体の可変領域の配列は、標的に結合する作用を失うことなく改変することができ、その結果、前記抗原結合部位のアミノ酸配列は標的に結合する機能を失うことなく、同様に改変することができる。例えば、抗原結合部位を形成するドメインのアミノ酸配列は、由来する抗体の可変領域と同一又は高度に相同であることがある。「高度に相同（highly homologous）」とは、1 から5 個の置換、好ましくは 1 から 4 個の置換、例えば 1 から 3 個の置換又は 1 個若しくは 2 個の置換等、がなされることがある。
ある実施形態において、ペプチド鎖は、天然アミノ酸及び非天然アミノ酸を含むことがある。別の実施形態では、ペプチド鎖は単に天然アミノ酸を含む。用語「非天然アミノ酸」は、20 種の天然アミノ酸種の構造とは異なる構造を有するアミノ酸を指す。非天然アミノ酸の構造は天然アミノ酸の構造と似ているため、非天然アミノ酸は、所与の天然アミノ酸の誘導体又は類似体として分類される場合がある。
【０１２８】
ある実施形態において、1 つ以上の T 細胞受容体の可変領域又はその部分、特に抗原結合部位を形成しないもののアミノ酸配列は、その抗原への（残留）結合を除去するために改変されることがある。特に、そのような「サイレンシング」改変は、TCR アルファ及び／又は TCR ベータの可変領域の CDR3 に 1 つ以上の突然変異を導入することによってもたらされることがある。
【０１２９】
本発明は、本明細書に記載の抗原受容体及びペプチド鎖の誘導体も包含する。本発明によれば、「誘導体」は、タンパク質及びペプチドを改変した形態である。そのような修飾には、あらゆる化学修飾が含まれ、炭水化物、脂質及び／又はタンパク質若しくはペプチド等の抗原受容体又はペプチド鎖に関連するあらゆる分子の単一又は複数の置換、欠失及び／又は付加が含まれる。ある実施形態では、タンパク質又はペプチドの「誘導体」には、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、パルミトイル化、ミリストイル化、イソプレニル化、脂質化、アルキル化、誘導体化、保護基／ブロッキング基の導入、タンパク質分解性切断又は抗原への結合から生じる、タンパク質又はペプチドを改変した類似体が含まれる。用語「誘導体」は、前記抗原受容体及びペプチド鎖の、全ての機能的な化学的均等物にも拡張される。好ましくは、改変した抗原受容体又はそのペプチド鎖は、結合又は二量体化能及び／又は免疫活性化能が増加している。
【０１３０】
本発明の抗原受容体システムに関連して使用される細胞は、好ましくは T 細胞、特に、好ましくは細胞傷害性 T 細胞、ナチュラル・キラー（NK）細胞、及びリンホカイン活性化キラー（LAK）細胞から選択される、細胞傷害性リンパ球である。活性化すると、これらの細胞傷害性リンパ球のそれぞれが標的細胞の破壊を引き起こす。例えば、細胞傷害性 T 細胞は、以下の手段のいずれか又は両方によって標的細胞の破壊を引き起こす。まず最初に、T 細胞は活性化するとパーフォリン、グランザイム、及びグラニュリシン等の細胞毒を放出する。パーフォリンとグラニュリシンは前記標的細胞に孔を作り、グランザイムは前記細胞に入り、細胞質のカスパーゼ・カスケードを引き起こし、細胞のアポトーシス（プログラム細胞死）を誘導する。第二に、アポトーシスは、T 細胞と標的細胞間のFas−Fas リガンド相互作用を介して誘導されることがある。前記細胞傷害性リンパ球は、好ましくは自己細胞であるが、異種細胞又は同種細胞を使用することができる。
【０１３１】
用語「免疫グロブリン」は、免疫グロブリン・スーパーファミリーのタンパク質、好ましくは抗体又は B 細胞受容体（BCR）等の抗原受容体に関する。免疫グロブリンは、特徴的な免疫グロブリン（Ig）フォールドを有する構造ドメイン（即ち、免疫グロブリン・ドメイン）によって特徴付けられる。前記用語には、膜結合免疫グロブリン及び可溶性免疫グロブリンが含まれる。膜結合免疫グロブリンは、表面免疫グロブリン又は膜免疫グロブリンとも呼ばれ、一般に BCR の一部である。可溶性免疫グロブリンは一般的に抗体と呼ばれる。免疫グロブリンは一般に、いくつかの鎖、典型的にはジスルフィド結合を介して繋がった 2 つの同一の重鎖と 2 つの同一の軽鎖を含む。これらの鎖は、VL（可変軽鎖）ドメイン、CL（定常軽鎖）ドメイン、CH（定常重鎖）ドメインCH1、CH2、CH3、及び CH4 等の、免疫グロブリン・ドメインで主に構成される。哺乳動物の免疫グロブリン重鎖には 5 種類ある（即ち、α、δ、ε、γ及びμで、これらは抗体の様々なクラス、即ち IgA、IgD、IgE、IgG 及び IgM を構成する）。可溶性免疫グロブリン重鎖とは対照的に、膜又は表面免疫グロブリン重鎖は、そのカルボキシ末端に膜貫通ドメインと短い細胞質ドメインを含む。哺乳動物には、2 種類の軽鎖、即ち、ラムダとカッパがある。免疫グロブリン鎖は、可変領域と定常領域を含む。前記定常領域は、免疫グロブリンの異なるアイソタイプ内で本質的に保存されており、前記可変部は非常に多様であり、抗原認識を構成する。
【０１３２】
用語「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも 2 つの重（H）鎖と 2 つの軽（L）鎖を含む糖タンパク質を指す。用語「抗体」には、モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体及びキメラ抗体が含まれる。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書では VH と略記）及び重鎖定常領域から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書では VL と略記）及び軽鎖定常領域から構成される。前記 VH 及び VL 領域は、相補性決定領域（complementarity determining regions (CDR)）と呼ばれる超可変性の領域に更に細分化され、フレームワーク領域（FR）と呼ばれるより保存された領域が散在することがある。各 VH 及び VL は、3 つの CDRs と 4 つの FRs で構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4 の順序で配置されている。重鎖及び軽鎖の可変領域には、抗原と相互作用する結合ドメインが含まれている。前記抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的な補体系の第 1 成分（Clq）等を含む宿主組織又は因子に免疫グロブリンが結合することを媒介する。
【０１３３】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、単一分子を組成とする抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体は、単一の結合特異性と親和性を示す。ある実施形態では、前記モノクローナル抗体は、不死化細胞に融合した非-ヒト動物、例えばマウス、から得られた B 細胞を含むハイブリドーマによって産生される。
【０１３４】
用語「組換え抗体」は、本明細書で使用される場合、（a）トランスジェニック又はトランス染色体（transchromosomal）である動物（例えば、マウス）から調製された免疫グロブリン遺伝子又はハイブリドーマという点において、当該動物から単離された抗体、（b）抗体を発現するように形質転換された宿主細胞（例えば、トランスフェクトーマ（transfectoma））から単離された抗体、（c）組換え、コンビナトリアル抗体ライブラリーから単離された抗体、及び（d）免疫グロブリン遺伝子配列を他の DNA 配列にスプライシングすることを含む他の手段により、調製、発現、作成又は単離された抗体、等、組換え手段によって調製、発現、作成又は単離された全ての抗体を含む。
【０１３５】
用語「ヒト抗体」は、本明細書で使用される場合、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含むことを意図している。ヒト抗体には、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基が含まれることがある（例えば、in vitro でのランダム若しくは部位特異的な突然変異誘発又は in vivo での体細胞突然変異により、導入された突然変異）。
【０１３６】
用語「ヒト化抗体」は、非-ヒト種由来の免疫グロブリンに実質的に由来する抗原結合部位を有する分子を指し、ここで、前記分子の残りの免疫グロブリン構造は、ヒト免疫グロブリンの構造及び／又は配列に基づく。前記抗原結合部位は、定常ドメインに融合した完全な可変ドメイン、又は可変ドメイン内の適切なフレームワーク領域に移植した相補性決定領域（CDR）のみ、のどちらかを含むことがある。抗原結合部位は野生型であっても、又は 1 つ以上のアミノ酸置換によって改変（例えば、よりヒト免疫グロブリンに似るように改変）されていてもよい。いくつかの形態のヒト化抗体は、全ての CDR 配列を保持する（例えば、マウス抗体の 6 つの CDRs 全てを含むヒト化マウス抗体）。他の形態は、元の抗体に対して変更した 1 つ以上の CDRs を有する。
【０１３７】
用語「キメラ抗体」は、重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列のそれぞれの一部が、ある特定の種に由来する又はある特定のクラスに属する抗体の対応する配列と相同であり、一方で、前記鎖の残りのセグメントが、別の抗体の対応する配列と相同である、抗体を指す。典型的には、軽鎖と重鎖の両方の可変領域は、ある種の哺乳類に由来する抗体の可変領域によく似ていて、一方、定常部分は別の種に由来する抗体の配列と相同である。そのようなキメラ型の明確な利点の 1 つは、例えば、ヒト細胞調製物に由来する定常領域と組み合わせて、容易に入手可能な非-ヒト宿主生物由来の B 細胞又はハイブリドーマを使用する現在知られている材料から、前記可変領域を簡単に誘導することができることである。前記可変領域には調製が容易であるという利点があり、その特異性は材料に影響されないが、前記定常領域がヒトであると、ヒト以外の材料に由来する定常領域よりも、前記抗体を投与したときにヒトから免疫応答が誘発される可能性が低くなる。ただし、前記定義はこの特定の実施例に限定されない。
【０１３８】
抗体は、様々な種に由来することがあり、限定されるものではないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、及びヒト等が含まれる。
【０１３９】
本明細書に記載の抗体には、IgA1 又は IgA2 等の IgA、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgM 及び IgD 抗体が含まれる。様々な実施形態において、前記抗体は IgG1 抗体、より具体的には IgG1、カッパ又は IgG1、ラムダ・アイソタイプ（即ち、IgG1、κ、λ）、IgG2a 抗体（例えば、IgG2a、κ、λ）、IgG2b 抗体（例えば、IgG2b、κ、λ）、IgG3 抗体（例えば、IgG3、κ、λ）又は IgG4抗体（例えば、IgG4、κ、λ）である。
【０１４０】
本明細書に記載の抗原受容体は、1 つ以上の抗体の抗原結合部分を含むことがある。抗体の用語「抗原結合部分（antigen-binding portion）」（若しくは単に「結合部分（binding portion）」）又は抗体の「抗原結合フラグメント」（若しくは単に「結合フラグメント」）又は同様の用語は、抗原に特異的に結合する作用を保持する抗体の 1 つ以上のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体のフラグメントによって実行できることが示されている。抗体の用語「抗原結合部分」に包含される結合フラグメントの例には、（i）Fab フラグメント、VL、VH、CL 及び CH ドメインからなる一価のフラグメント；（ii）F(ab')2 フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により繋がった 2 つの Fab フラグメントを含む二価のフラグメント；（iii）VH 及び CH ドメインからなる Fd フラグメント；（iv）抗体の単一アームの VL 及び VH ドメインからなる Fv フラグメント、（v）VH ドメインからなる dAb フラグメント（Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546）；（vi）単離した相補性決定領域（CDR）、及び（vii）合成リンカーによって任意選択的に結合され得る 2 つ以上の単離した CDRs の組み合わせ、が含まれる。更に、Fv フラグメントの 2 つのドメイン、VL 及び VH、は別々の遺伝子によってコードされているが、それらは、組換え法を使用して、VL 及び VH 領域が対になって一価の分子（一本鎖 Fv（scFv）として知られている；例えば、Bird et al. (1988) Science 242: 423-426；及び Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 を参照）が形成されるようにする合成リンカーによって、結合されることがある。そのような単鎖抗体も、抗体の用語「抗原結合フラグメント」の中に包含されることも意図されている。さらなる例は、（i）免疫グロブリン・ヒンジ領域ポリペプチドに融合した結合ドメイン・ポリペプチド、（ii）前記ヒンジ領域に融合した免疫グロブリン重鎖 CH2 定常領域、及び（iii）前記 CH2 定常領域に融合した免疫グロブリン重鎖CH3定常領域、を含む結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質である。結合ドメイン・ポリペプチドは、重鎖可変領域又は軽鎖可変領域であることがある。前記結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質は、US 2003/0118592 及び US 2003/0133939 に更に開示されている。これらの抗体フラグメントは、当業者に知られている従来の技術を使用して得られ、前記フラグメントは、無傷の抗体（intact antibodies）と同じ方法で、効用に関してスクリーニングされる。
【０１４１】
単鎖可変フラグメント（scFv）は、リンカー・ペプチドで繋げられた免疫グロブリン重鎖（VH）と軽鎖（VL）の可変領域の融合タンパク質である。前記リンカーは、VH の N 末端と VL の C 末端とを繋げることができる、又はその逆向きで繋げることができる。2 価（Divalent）（又は 2 価（bivalent））の単鎖可変フラグメント（di-scFv、bi-scFv）は、2 つの scFvs を繋げることにより設計できる。これは、2 つの VH 領域と 2 つの VL 領域を持つ単一のペプチド鎖を生成し、タンデム scFvs を生成することで実現できる。
【０１４２】
用語「結合ドメイン」又は単に「ドメイン」は、本発明に関連して、任意選択的に別のドメインと相互作用する場合、構造（例えば、所与の標的構造／抗原／エピトープに結合する／相互作用する抗体の構造）を特徴付ける。それ故に、本発明によるこれらのドメインは、「抗原結合部位」と呼ばれる。
【０１４３】
抗体及び抗体の誘導体は、抗体フラグメント等の結合ドメインを用意するのに、特に VL 及び VH 領域を用意するのに、有用である。
【０１４４】
抗原受容体内に存在することがある抗原の結合ドメインは、抗原に結合する（ターゲティングする（targeting））作用、即ち、抗原に存在するエピトープ（好ましくは抗原の細胞外ドメイン内に位置するエピトープ）に結合する（ターゲティングする（targeting））作用を有する。好ましくは、抗原の結合ドメインは抗原に特異的である。好ましくは、抗原の結合ドメインは、細胞表面に発現した抗原に結合する。特に好ましい実施形態では、抗原の結合ドメインは、生細胞の表面に存在する抗原の天然のエピトープ（native epitopes）に結合する。
【０１４５】
本発明の目的のために本明細書に記載した抗体フラグメント等の抗体及び抗体誘導体は全て、用語「抗体」に包含される。
【０１４６】
抗体は、従来のモノクローナル抗体法、例えば、Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975) の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術、等を含む、様々な技術によって生産することができる。体細胞ハイブリダイゼーションの手法が好ましいが、原理的には、モノクローナル抗体を産生する他の技術、例えば、B リンパ球をウイルス的に又は腫瘍形成的に形質転換すること、又は抗体遺伝子のライブラリーを使用するファージ・ディスプレイ技術、を使用することができる。
【０１４７】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製するための好ましい動物の系は、マウスの系である。前記マウスにおけるハイブリドーマ産生は非常に良く確立された手法である。免疫化プロトコル及び免疫した脾細胞を融合するために単離する技術は、当該分野で公知である。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）及び融合手法もまた知られている。
【０１４８】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製するための他の好ましい動物の系は、ラット及びウサギの系である（例えば、Spieker-Polet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:9348 (1995) に記載されている、Rossi et al., Am. J. Clin. Pathol. 124: 295 (2005) も参照）。
【０１４９】
抗体を生成するために、記載のように、キャリアに結合させた、前記抗原配列（即ち、前記抗体が向けられる配列）に由来するペプチドで、組換え的に発現させた抗原又はそのフラグメントを濃縮した調製物で、及び／又は前記抗原を発現する細胞で、マウスを免疫することがある。或いは、抗原又はそのフラグメントをコードする DNA で、マウスを免疫することがある。精製した又は濃縮した前記抗原の調製物を使用した免疫によって抗体ができない場合、前記抗原を発現する細胞（例えば、細胞株）でマウスを免疫して、免疫応答を促進することもある。
【０１５０】
前記免疫反応は、尾静脈又は眼窩後部からの採血によって得られる血漿及び血清サンプルを用いて、免疫化プロトコルの過程を通してモニターすることができる。免疫グロブリンの力価が十分なマウスを細胞融合に使用することができる。サクリファイス（sacrifice）及び脾臓摘出の 3 日前に、マウスを抗原発現細胞で腹腔内に又は静脈内に追加免疫して、特異的な抗体を分泌するハイブリドーマの割合を増加させることができる。
【０１５１】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを生成するために、免疫したマウスから脾細胞及びリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞株等の適切な不死化細胞株に融合させることがある。次に、得られたハイブリドーマを、抗原特異的抗体の産生について、スクリーニングすることがある。そして、抗体を分泌するハイブリドーマについて、個々のウェルを ELISA でスクリーニングすることがある。抗原発現細胞を用いた免疫蛍光法及び FACS 解析により、前記抗原に特異性のある抗体を同定することができる。抗体を分泌するハイブリドーマを再播種し、再度スクリーニングし、モノクローナル抗体が依然として陽性の場合は、限界希釈によりサブクローニングすることがある。その後、安定したサブクローンを in vitro で培養して、特性評価をするために、組織培養培地中に抗体を産生させることがある。
【０１５２】
抗原に結合する抗体及び他の結合剤の作用は、標準的な結合アッセイ（例えば、ELISA、ウェスタンブロット、免疫蛍光法、フロー・サイトメトリー解析）を使用して測定することができる。
【０１５３】
本発明による用語「結合（binding）」は、好ましくは特異的な結合に関する。
【０１５４】
本発明によれば、抗原受容体等の薬剤は、所定の標的に有意な親和性を有し、及び標準アッセイで前記所定の標的に結合する場合、前記所定の標的に結合する（ターゲティングする）ことができる。「親和性」又は「結合親和性」は、しばしば平衡解離定数（KD）によって測定される。好ましくは、用語「有意な親和性（significant affinity）」は、10-5 M 以下、10-6 M 以下、10-7 M 以下、10-8 M 以下、10-9 M 以下、10-10 M 以下、10-11 M 以下、又は 10-12 M 以下の解離定数（KD）で所定の標的に結合すること、を指す。
【０１５５】
薬剤が、標的に対して有意な親和性がなく、標準アッセイにおいて前記標的に有意に結合しない、特に検出可能な程に結合しない、場合、その薬剤は前記標的に結合する（ターゲティングする）ことが（実質的に）できない。好ましくは、前記薬剤は、2、好ましくは 10、より好ましくは 20、特に 50 又は 100 μg/ ml 以上の濃度で存在する場合に、前記標的に検出可能な程に結合しない。好ましくは、薬剤が結合することができる所定の標的に結合することに対する KD値よりも、少なくとも 10倍、100 倍、103 倍、104 倍、105 倍、又は 106 倍高い KD値で、前記薬剤がある標的に結合する場合、前記薬剤は前記標的に対して有意な親和性を持たない。例えば、薬剤が結合することができる所定の標的に前記薬剤が結合することに対する KD値が 10-7 M である場合、前記薬剤が有意な親和性を持たない標的に結合することの KD値は少なくとも 10-6 M、10-5M、10-4M、10-3M、10-2M、又は 10-1 M になるであろう。
【０１５６】
薬剤が所定の標的に結合することができ、一方で前記薬剤が他の標的に（実質的に）結合できない（即ち、前記薬剤が他の標的に有意な親和性を持たず、標準的なアッセイにおいて他の標的に有意に結合しない）場合、前記薬剤は前記所定の標的に対して特異的である。好ましくは、そのような他の標的に対する親和性及び結合が、ウシ血清アルブミン（BSA）、カゼイン、又はヒト血清アルブミン（HSA）等の所定の標的に関連しないタンパク質に対する親和性又は結合を有意に超えない場合、薬剤は所定の標的に対して特異的である。好ましくは、薬剤が特異的ではない標的に結合する KD値よりも、少なくとも 10倍、100 倍、103 倍、104 倍、105 倍、又は 106 倍低い KD 値で、前記薬剤が所定の標的に結合する場合、前記薬剤は前記標的に対して特異的である。例えば、特異的である標的に薬剤が結合することの KD値 10-7 M である場合、特異的ではない標的に前記薬剤が結合することの KD値は少なくとも 10-6 M、10-5M、10-4M、10-3M、10-2M、又は  10-1 M になるであろう。
【０１５７】
標的に薬剤が結合することは、任意の適切な方法を使用して実験的に測定することができる；例えば、Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology、Paul, W. E., 編, Raven Press New York, N Y (1984)、Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, N Y (1992) 及び本明細書に記載の方法を参照のこと。親和性は、平衡透析；BIAcore 2000 機器を、製造者が概説した一般的な手順書を使用して、使用する；放射性標識した標的抗原を使用した放射性免疫測定法；又は当業者に知られている別の方法、等の従来の手法を使用して容易に測定することができる。その親和性のデータを、例えば、Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. ScL, 51:660 (1949) の方法によって解析しても良い。特定の抗体‐抗原相互作用に関して測定される親和性は、異なる条件（例えば、塩濃度、pH）で測定した場合、変化する可能性がある。従って、親和性及び他の抗原結合パラメーター（例えば、KD、IC50）は、抗体及び抗原の標準化した溶液、及び標準化したバッファーを使用して、測定することが好ましい。
【０１５８】
本発明は、抗原受容体をコードする核酸を T 細胞等の細胞に、in vitro 又は in vivo で導入すること、即ち、トランスフェクション、を含むことがある。
【０１５９】
本発明の目的のために、用語「トランスフェクション」は、核酸を細胞に導入すること、又は核酸を細胞に取り込ませることを含み、ここで、前記細胞は対象（例えば、患者）中に存在することがある。従って、本発明によれば、本明細書に記載の核酸のトランスフェクション用の細胞は、in vitro 又は in vivo で存在することがある（例えば、前記細胞は、患者の臓器、組織及び／又は有機体の一部を形成することがある）。本発明によれば、トランスフェクションは一過的又は安定的（stable）であることがある。トランスフェクションの用途によっては、トランスフェクションした遺伝物質が一過的に発現すれば十分である。トランスフェクション・プロセスで導入された核酸は、通常、核ゲノムに組み込まれないため、外来核酸は有糸分裂の過程で希釈される、又は分解される。核酸がエピソーマルに増幅することが可能である細胞では、その希釈率は大幅に低下する。トランスフェクションされた核酸が実際に細胞及びその娘細胞のゲノムに残ることを望む場合、安定的トランスフェクション（stable transfection）を行わなければならない。RNA を細胞にトランスフェクトして、コードされたタンパク質を一過的に発現させることができる。
【０１６０】
本発明によれば、核酸を細胞に導入する（即ち、移入する、又はトランスフェクションする）のに有用な任意の技術を使用しても良い。好ましくは、RNA 等の核酸は、標準的な技術により細胞にトランスフェクトされる。そのような技術には、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクションが含まれる。本発明の特に好ましいある実施形態では、エレクトロポレーションにより RNA が細胞に導入される。エレクトロポレーション又はエレクトロパーミアビリゼーション（electropermeabilization）は、外部から加えた電場によって引き起こされる、細胞形質膜の電気伝導率と透過性の大幅な増加に関係する。それは、分子生物学において、ある物質を細胞に導入する方法として、通常的に使用される。本発明によれば、タンパク質又はペプチドをコードする核酸を細胞に導入ことによって、前記タンパク質又はペプチドの発現が生じること、が好ましい。
【０１６１】
非ウイルス‐ベースの DNA トランスフェクション、トランスポゾン‐ベースのシステム及びウイルス‐ベースのシステム等を含む、様々な方法を使用して、抗原受容体構築物を T 細胞に導入することがある。非ウイルス‐ベースの DNA トランスフェクションは、挿入変異のリスクが低い。トランスポゾン‐ベースのシステムは、組み込み要素（integrating element）を含まないプラスミドよりも効率的に導入遺伝子をゲノム中に組み込ませることができる。ウイルス‐ベースのシステムには、γ-レトロウイルスとレンチウイルス・ベクターを使用することが含まれる。γ-レトロウイルスは、生産が比較的容易で、効率的に及び永続的にT 細胞に形質導入し、初代ヒト T 細胞に組み込むことの観点から安全であることが、予め証明されている。レンチウイルス・ベクターもまた、T 細胞を効率的及び永続的に形質導入するが、製造コストが高くなる。レンチウイルス・ベクターはまた、レトロウイルス‐ベースのシステムよりも安全である可能性がある。
【０１６２】
In vivo で細胞にトランスフェクションするためには、抗原受容体をコードする核酸を含む医薬組成物を使用してもよい。前記核酸を T 細胞等の特定の細胞にターゲティングする送達媒体（vehicle）を患者に投与して、in vivo でトランスフェクションを行うことがある。
【０１６３】
本発明によれば、抗原受容体をコードする核酸を、裸の形態で又は担体に入れて投与することが好ましい。本発明での使用が企図される脂質担体等の担体には、RNA 等の核酸が結合する（例えば、核酸と複合体を形成する、又は、核酸を封入した又はカプセル化した小胞を形成する）ことができる任意の物質又は媒体が含まれる。これにより、裸の核酸と比較して、核酸の安定性が向上する場合がある。特に、血液中の核酸の安定性が向上することがある。例えば、規定の粒子サイズを有するナノ粒子 RNA 製剤（例えば RNA 由来のリポプレックス）、及びリポソーム（例えば DOTMA 及び DOPE 又は DOTMA 及びコレステロールを含むリポプレックス）を使用できる。
【０１６４】
本明細書で使用する場合、用語「ナノ粒子」は、特に、核酸の全身投与、特に非経口投与、に適した直径を有する任意の粒子を指し、通常は 1000 ナノメートル（nm）未満の直径を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は 600 nm 未満の直径を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は 400 nm 未満の直径を有する。
【０１６５】
本明細書で使用する場合、用語「ナノ粒子製剤」又は類似の用語は、少なくとも 1 つのナノ粒子を含む任意の物質を指す。いくつかの実施形態において、ナノ粒子組成物は、ナノ粒子の均一な集合体である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は分散液又はエマルジョンである。一般に、少なくとも 2 つの非混和性材料が組み合わされると、分散液又はエマルジョンが形成される。
【０１６６】
用語「リポプレックス」又は「核酸リポプレックス」、特に「RNA リポプレックス」は、脂質と核酸（特に RNA）の複合体を指す。しばしば中性の「ヘルパー」脂質も含むカチオン性リポソームを核酸と混合すると、リポプレックスが自発的に形成される。
【０１６７】
カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、及び正電荷を持つ他の物質は、負電荷を持つ核酸と複合体を形成することがある。これらのカチオン性分子を使用して核酸を複合体化させ、それにより、例えば、いわゆるリポプレックス又はポリプレックス、をそれぞれ形成させる。そして、これらの複合体は核酸を細胞に送達することが示されている。
【０１６８】
本発明で使用するためのナノ粒子核酸調製物は、様々なプロトコルにより、及び様々な核酸複合体化化合物（nucleic acid complexing compounds）から得ることができる。脂質、ポリマー、オリゴマー、又は両親媒性物質は、典型的な複合体化剤である。ある実施形態では、前記複合体化化合物は、プロタミン、ポリエチレンイミン、ポリ‐L‐リジン、ポリ‐L‐アルギニン又はヒストンからなる群から選択される少なくとも 1 つの薬剤を含む。
【０１６９】
本発明によれば、プロタミンはカチオン性担体剤として有用である。用語「プロタミン」は、アルギニンに富む比較的低分子量の様々な強塩基性タンパク質を指し、様々な動物（魚など）の精子細胞で、特に DNA と、体細胞ヒストンの代わりに結合している。特に、用語「プロタミン」は、魚の精子に見られる、塩基性が強く、水に溶けやすく、熱によって凝固せず、加水分解時に主にアルギニンを生成する、タンパク質を指す。精製された形態では、それらはインスリンの長時間作用型製剤で使用され、ヘパリンの抗凝固効果を中和する。
【０１７０】
本発明によれば、本明細書で使用する用語「プロタミン」は、天然材料又は生物材料から得られる、又は由来するあらゆるプロタミン・アミノ酸配列を含むことを意味し、そのフラグメント、及び前記アミノ酸配列又はそのフラグメントの多量体型等を含むことを意味する。更に、この用語は、人工的であり、及び特定の目的のために特別に設計され、並びに天然材料又は生物材料から分離できない、（合成された）ポリペプチドを包含する。
【０１７１】
本発明に従って使用されるプロタミンは、硫酸化プロタミン又は塩酸塩プロタミンであることがある。好ましい実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子を製造するために使用するプロタミン材料は、等張塩溶液中に 10 mg/ml（ml あたり 5000 ヘパリン中和単位）を超えるプロタミンを含むプロタミン 5000 である。
【０１７２】
リポソームは、多くの場合、リン脂質等の小胞形成脂質の 1 つ以上の二重層をしばしば有する微細な脂質小胞であり、薬物をカプセル化することができる。本発明の文脈において、種々のタイプのリポソームを使用することができるが、それには、限定されるものではないが、多重膜小胞（MLV）、小さな単膜小胞（SUV）、大きな単膜小胞（LUV）、立体的に安定化したリポソーム（SSL）、多胞小胞（MV）、及び大型多小胞（LMV）、並びに当技術分野で知られている他の二重層形態、が含まれる。前記リポソームのサイズと層状性は、調製方法に依存し、及び使用する小胞のタイプの選択は、好ましい投与モードに依存する。脂質が水性媒体に存在することができる超分子組織化に関する他のいくつかの形態があり、それには、ラメラ相、六方晶相及び逆六方晶相、立方相、ミセル、単層からなる逆ミセル、が含まれる。これらの相は、DNA 又は RNA と組み合わせて取得することもあり、RNA 及び DNA との相互作用が前記相状態に実質的に影響することがある。記載した相は、本発明のナノ粒子状核酸製剤で存在していることが有る。
【０１７３】
核酸及びリポソームから核酸リポプレックスを形成するために、想定される核酸リポプレックスを提供する限り、リポソームを形成する任意の適切な方法を使用することができる。リポソームを、逆蒸発法（REV）、エタノール注入法、脱水‐再水和法（DRV）、超音波処理又は他の適切な方法等の標準的な方法を使用して、形成することがある。
【０１７４】
リポソームを形成した後、実質的に均一なサイズ範囲を有するリポソームの集団を得るために、前記リポソームのサイズを決定することができる。
【０１７５】
二重層を形成する脂質は通常、2 つの炭化水素鎖（特にアシル鎖）、及び極性又は非極性の頭部基を持つ。二重層を形成する脂質は、天然に存在する脂質又は合成起源の脂質で構成されており、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチド酸、ホスファチジルイノシトール、及びスフィンゴミエリン等のリン脂質を含み、そこでは、前記 2 つの炭化水素鎖は通常、約 14-22 個の炭素原子の間の長さであり、及び不飽和の程度が異なる。本発明の組成物での使用に適した他の脂質には、糖脂質並びにコレステロール及びその様々な類似体等のステロールが含まれ、これらは前記リポソームでも使用できる。
【０１７６】
カチオン性脂質は、通常、ステロール、アシル又はジアシル鎖などの親油性部分を持ち、全体として正味の正電荷を持つ。脂質の頭部基は通常、正電荷を有する。カチオン性脂質は、好ましくは 1 から 10 価の正電荷、より好ましくは 1 から 3 価の正電荷、より好ましくは 1 価の正電荷を有する。カチオン性脂質の例には、限定されるものではないが、1,2-ジ-O-オクタデセニル-3-トリメチルアンモニウム・プロパン（DOTMA）；ジメチルジオクタデシルアンモニウム（DDAB）；1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン（DOTAP）；1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウム‐プロパン（DODAP）；1,2-ジアシルオキシ-3-ジメチルアンモニウム・プロパン；1,2-ジアルキルオキシ-3-ジメチルアンモニウム・プロパン；塩化ジオクタデシルジメチル・アンモニウム（DODAC）、1,2-ジミリストイルオキシプロピル-1,3-ジメチルヒドロキシエチル・アンモニウム（DMRIE）及び 2,3-ジオレオイルオキシ-N-［2（スペルミンカルボキサミド）エチル］-N,N-ジメチル-1-プロパナミウム・トリフルオロ酢酸（DOSPA）、が含まれる。DOTMA、DOTAP、DODAC、及び DOSPA が好ましい。最も好ましいのは DOTMA である。
【０１７７】
加えて、本明細書に記載のナノ粒子は、構造安定性等の観点から中性脂質を更に含むことが好ましい。前記中性脂質は、核酸‐脂質複合体の送達効率を考慮して適切に選択することができる。中性脂質の例には、限定されるものではないが、1,2-ジ-（9Z-オクタデセノイル）-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DOPE）、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DOPC）、ジアシルホスファチジル・コリン、ジアシルホスファチジル・エタノール・アミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、ステロール、及びセレブロシドが含まれる。DOPE 及び／又は DOPC が好ましい。最も好ましいのは DOPE である。カチオン性リポソームがカチオン性脂質と中性脂質の両方を含む場合、リポソームの安定性等を考慮して、カチオン性脂質と中性脂質のモル比を適宜決定することができる。
【０１７８】
ある実施形態によれば、本明細書に記載されるナノ粒子は、リン脂質を含むことがある。前記リン脂質はグリセロリン脂質であることがある。グリセロリン脂質の例には、限定されないが、以下の 3 種類の脂質が含まれる：（i）双性イオン性リン脂質、例えば、ホスファチジルコリン（PC）、卵黄ホスファチジルコリン、天然にある部分水素化又は完全水素化形態の大豆由来 PC、ジミリストイル・ホスファチジルコリン（DMPC）スフィンゴミエリン（SM）；（ii）負に帯電したリン脂質：例えば、ホスファチジルセリン（PS）、ホスファチジルイノシトール（PI）、ホスファチジン酸（PA）、ホスファチジルグリセロール（PG）ジパルミポイル PG、ジミリストイル・ホスファチジルグリセロール（DMPG）；メトキシポリエチレン、グリコール‐ジステアロイル・ホスファチジルエタノールアミン（mPEG-DSPE）の場合等の、複合体が双性イオン性リン脂質を負に帯電させる合成誘導体；及び（iii）カチオン性リン脂質、これには、例えば、ホスホモノエステルが O-メチル化されてカチオン性脂質を形成している、ホスファチジルコリン又はスフィンゴミエリン、が含まれる。
【０１７９】
核酸が脂質担体に結合することは、例えば、前記核酸が前記担体の間隙空間を満たすことによって、前記担体が物理的に前記核酸を捕捉するように、又は共有結合、イオン結合、又は水素結合により、又は非特異的結合による吸着により起こることがある。前記結合のモードが何であれ、前記核酸はその治療的（即ち、コードしている）特性を保持しなければならない。
【０１８０】
本発明によれば、ある実施形態において抗原受容体をコードする核酸は RNA、好ましくは mRNA である。前記 RNA は、in vitro 転写により得ることが好ましい。
【０１８１】
用語「核酸」は、本明細書で使用する場合、ゲノム DNA、cDNA、mRNA、組換えにより生成された分子及び化学的に合成された分子等の DNA 及び RNA を含むことを意図している。核酸は一本鎖又は二本鎖であることがある。RNA には、in vitro で転写された RNA（IVT RNA）又は合成 RNA が含まれる。本発明によれば、核酸は好ましくは単離された核酸である。
【０１８２】
核酸はベクターに含まれていることがある。本明細書で使用される用語「ベクター」には、プラスミド・ベクター、コスミド・ベクター、ラムダ・ファージ等のファージ・ベクター、アデノウイルス・ベクター又はバキュロウイルス・ベクター等のウイルス・ベクター、又はバクテリア人工染色体（BAC）、酵母人工染色体（YAC）、又はP1人工染色体（PAC）等の人工染色体ベクター、等の当業者に知られている任意のベクターが含まれる。前記ベクターには、発現ベクター及びクローニング・ベクターが含まれる。発現ベクターには、プラスミド及びウイルス・ベクターが含まれ、一般に、特定の宿主生物（例えば、バクテリア、酵母、植物、昆虫、又は哺乳動物）において、又は in vitro 発現システムにおいて、機能するように繋げたコーディング配列が発現するのに必要な、所望のコーディング配列及び適切な DNA 配列が含まれる。クローニング・ベクターは、一般に、ある特定の所望の DNA フラグメントを操作及び増幅するために使用され、前記所望の DNA フラグメントを発現させるのに必要な機能的配列は欠くことがある。
【０１８３】
本発明の文脈において、用語「RNA」は、リボヌクレオチド残基を含み、好ましくは完全に又は実質的にリボヌクレオチド残基から構成される分子に関する。「リボヌクレオチド」は、β-D-リボフラノシル基の 2' 位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドに関する。前記用語には、二本鎖 RNA、一本鎖 RNA、部分精製 RNA 等の単離RNA、本質的に純粋な RNA、合成 RNA、組換えによって作製した RNA、及び 1 つ以上のヌクレオチドを付加、欠失、置換及び／又は改変することにより、天然の RNA とは異なる改変 RNA、が含まれる。そのような改変には、RNA の末端又は内部等に、例えば、RNA の 1 つ以上のヌクレオチドで、非ヌクレオチド物質を付加することが含まれることがある。RNA 分子中のヌクレオチドには、非天然のヌクレオチド又は化学的に合成されたヌクレオチド又はデオキシヌクレオチド等の非標準的なヌクレオチドが含まれることがある。これらの改変した RNAs は、類似体又は天然に存在する RNA の類似体と呼ばれることがある。
【０１８４】
本発明によれば、用語「RNA」は、「メッセンジャー RNA 」を意味する「mRNA」を含み、好ましくはこれに関するものであり、並びにテンプレートとして DNA を使用して産生され、及びペプチド又はタンパク質をコードする「転写物」に関するものである。mRNA は、典型的には、5' 非翻訳領域（5'-UTR）、タンパク質又はペプチドをコードする領域、及び 3' 非翻訳領域（3'-UTR）を含む。mRNA は、細胞内及び in vitro での半減期が限られている。好ましくは、mRNA は、DNA テンプレートを使用した in vitro 転写により生成される。本発明のある実施形態では、前記 RNA は、in vitro 転写又は化学合成により得られる。in vitro 転写の方法論は、当業者に知られている。例えば、様々な in vitro 転写キットが市販されている。
【０１８５】
本発明のある実施形態では、RNA は、一本鎖自己複製 RNA 等の自己複製 RNA である。ある実施形態では、自己複製 RNA は正のセンス（positive sense）の一本鎖 RNA である。ある実施形態では、前記自己複製 RNA は、ウイルス RNA 又はウイルス RNA に由来する RNA である。ある実施形態では、前記自己複製 RNA はアルファウイルス・ゲノム RNA であるか、アルファウイルス・ゲノム RNA に由来する。ある実施形態では、前記自己複製 RNA はウイルス遺伝子発現ベクターである。ある実施形態では、ウイルスはセムリキ森林ウイルス（Semliki forest virus）である。ある実施形態では、前記自己複製 RNA は、本明細書に記載の薬剤をコードする前記導入遺伝子のうちの少なくとも 1 つ以上の導入遺伝子を含む。ある実施形態において、前記 RNA がウイルス RNA 又はウイルス RNA に由来する場合、前記導入遺伝子は、構造タンパク質をコードするウイルス配列等のウイルス配列を部分的に又は完全に置き換えてもよい。ある実施形態では、前記自己複製 RNA は in vitro で転写された RNA である。
【０１８６】
本発明に従って使用される RNA の発現及び／又は安定性を高めるために、発現するペプチド又はタンパク質の配列を、好ましくは変更することなく、前記 RNA を修飾することがある。
【０１８７】
本発明に従って使用される RNA の文脈における用語「修飾／改変（modification）」は、天然に存在しないRNAの任意の修飾／改変を前記 RNA 中に含む。
【０１８８】
本発明の一実施形態では、本発明に従って使用されるRNAは、キャップされていない 5'-三リン酸を有さない。そのようなキャップされていない 5'-三リン酸を除去することは、RNA をホスファターゼで処理することにより行うことができる。
【０１８９】
本発明による RNA は、その安定性を高め、及び／又は細胞毒性を低下させるために、改変した天然リボヌクレオチド又は合成リボヌクレオチドを有することがある。例えば、ある実施形態では、本発明に従って使用される RNA において、5-メチルシチジンが、シチジンを部分的に又は完全に、好ましくは完全に、置換する。或いは又は加えて、ある実施形態では、本発明に従って使用される RNA において、プソイドウリジン（pseudouridine）が、ウリジンを部分的に又は完全に、好ましくは完全に、置換する。
【０１９０】
ある実施形態では、用語「修飾／改変（modification）」は、RNA に 5’-キャップ又は 5’-キャップ類似体を提供することに関する。用語「5’-キャップ」は、mRNA 分子の 5'-末端に見られるキャップ構造を指し、一般的に、稀な5'-5' 三リン酸結合を介して前記 mRNA に接続したグアノシン・ヌクレオチドからなる。ある実施形態では、このグアノシンは 7 位でメチル化されている。用語「従来の5’-キャップ」は、天然に存在する RNA 5’-キャップ、好ましくは 7-メチルグアノシン・キャップ（m7G）を指す。本発明の文脈において、用語「5'-キャップ」は、RNA キャップ構造に類似し、並びに RNA に結合した場合に、好ましくは in vivo 及び／又は細胞内で、RNA を安定化する作用を有するように改変した 5'-キャップ類似体を含む。
【０１９１】
RNA に 5’-キャップ又は 5’-キャップ類似体を加えることは、前記 5’-キャップ又は 5’-キャップ類似体の存在下での DNA テンプレートの in vitro 転写によって行うことがあり、ここで、前記 5’-キャップは、生成された RNA 鎖に、転写的に一緒に組み込まれる。又は、前記 RNA は、例えば、in vitro 転写により、生成され、5'-キャップは、キャッピング酵素、例えば、ワクシニア・ウィルスのキャッピング酵素、を使用して転写後に前記 RNA に付加される。
【０１９２】
前記 RNA を更に修飾することがある。例えば、本発明で使用する RNA の更なる修飾は、天然のポリ（A）尾部を伸ばすこと又は短く削ること、又は 5'- 又は 3'-非翻訳領域（UTR）を改変すること（例えば、前記 RNA のコーディング領域に関係しない UTR を導入すること、例えば、アルファ 2−グロビン、アルファ 1−グロビン、ベータ‐グロビン、好ましくはベータ‐グロビン、より好ましくはヒト・ベータ‐グロビン等のグロビン遺伝子に由来する 3’-UTR の 1 つ以上、好ましくは 2 つのコピーを挿入すること等）であることがある。
【０１９３】
従って、本発明によって使用される RNA の安定性及び／又は発現を増加させるために、前記 RNA を、好ましくは 10 から 500 個、より好ましくは 30 から 300 個、更により好ましくは 65 から 200 個、特に 100 から 150 個のアデノシン残基の長さのポリ-A 配列が繋がっているように修飾することがある。特に好ましい実施形態では、前記ポリ-A 配列は約 120 個のアデノシン残基の長さを有する。更に、2 つ以上の 3’-非翻訳領域（UTR）を RNA 分子の 3' 非翻訳領域に組み込ませると、翻訳効率が向上することがある。ある特定の実施形態では、前記 3'-UTR はヒトβ-グロビン遺伝子に由来する。
【０１９４】
RNA の用語「安定性」は、RNA の「半減期」に関する。「半減期」は、分子の活性、量、又は数の半分が除去されるために必要な期間に関する。本発明の文脈において、RNA の半減期は、前記 RNA の安定性の指標である。RNA の半減期は、前記 RNA の「発現の持続時間」に影響を与える可能性がある。長い半減期を有する RNA は長期間発現することが予想される。
【０１９５】
本発明の文脈において、用語「転写」は、DNA 配列中の遺伝暗号が RNA に転写されるプロセスに関する。その後に、前記 RNA はタンパク質に翻訳される。本発明によれば、用語「転写」は「in vitro 転写」を含み、ここで、用語「in vitro 転写」は、RNA（特に mRNA）が、無細胞系で（好ましくは、適切な細胞抽出物を使用して）in vitro で合成されるプロセスに関する。好ましくは、クローニング・ベクターを転写産物の生成に使用する。これらのクローニング・ベクターは一般に転写ベクターと呼ばれ、本発明によれば用語「ベクター」に含まれる。
【０１９６】
本発明による用語「翻訳」は、細胞のリボソームにおけるプロセスに関するものであり、それによってメッセンジャー RNA の鎖がアミノ酸配列のアセンブリ（assembly）を指示してペプチド又はタンパク質が作製される。
【０１９７】
核酸は、本発明によれば、単独で、又は同種又は異種であることがある他の核酸と組み合わせて存在することがある。好ましい実施形態では、核酸は、この核酸に対して同種（homologous）又は異種（heterologous）であることがある発現制御配列に機能的に繋がっている。用語「同種（homologous）」は、核酸が生来的に機能的に結合していることも意味し、用語「異種（heterologous）」は、核酸が生来的に機能的には結合していないことを意味する。
【０１９８】
核酸及び発現制御配列は、前記核酸の発現又は転写が、前記発現制御配列の制御下又は影響下にあるように、お互い共有結合している場合、互いに「機能的に」繋がっている。コーディング配列に機能的に繋げられた発現制御配列を用いて、前記核酸が機能的タンパク質に翻訳される場合、前記発現制御配列に誘導がかけられることによって、前記コーディング配列にフレームシフトを引き起こすことなく、又は前記コーディング配列が所望のタンパク質又はペプチドに翻訳することができないことがなく、前記核酸が転写される。
【０１９９】
用語「発現制御配列」又は「発現制御要素」は、本発明によれば、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー、及び遺伝子の転写又は mRNA の翻訳を調節する他の制御要素を含む。本発明の特定の実施形態では、前記発現制御配列を調節することがある。発現制御配列の正確な構造は、種又は細胞型に応じて異なる場合があるが、一般に、例えば、TATA ボックス、キャッピング配列、CAAT 配列等の、転写及び翻訳の開始に、それぞれ関与する 5'-非転写配列及び 5'- 及び 3'-非翻訳配列を含む。より具体的には、5'-非転写発現制御配列は、機能的に繋げられた核酸の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。発現制御配列は、エンハンサー配列又は上流アクチベーター配列を含むこともある。
【０２００】
用語「発現」は、その最も一般的な意味で本発明に従って使用され、例えば、転写及び／又は翻訳による、RNA 及び／又はペプチド又はタンパク質の産生を含む。RNA に関して、用語「発現」又は「翻訳」は、特にペプチド又はタンパク質の産生に関する。また、核酸の部分的な発現も含まれる。更に、発現は一過的又は安定的であることがある。本発明によれば、用語である発現は、「異常な発現（aberrant expression）」又は「異常な発現（abnormal expression）」も含む。
【０２０１】
「異常な発現（aberrant expression）」又は「異常な発現（abnormal expression）」とは、本発明によれば、対照（ある特定のタンパク質（例えば腫瘍抗原）の異常な（aberrant）又は異常な（abnormal）発現に関連する疾患を持たない対象の状態）と比較して発現が変化する、好ましくは増加する、ことを意味する。発現の増加とは、少なくとも 10％、特に少なくとも 20％、少なくとも 50％、又は少なくとも 100％、又はそれより多く増加することを指す。ある実施形態では、発現は疾患組織でのみ見られ、健常な組織での発現は抑制されている。
【０２０２】
用語「特異的に発現している（specifically expressed）」は、タンパク質が本質的に特定の組織又は臓器でのみ発現していることを意味する。例えば、胃粘膜で特異的に発現する腫瘍抗原は、前記タンパク質が主に胃粘膜で発現していて、他の組織では発現していない、又は他の組織若しくは臓器タイプで有意な程度に発現していないことを意味する。それ故に、胃粘膜の細胞でのみ発現し、精巣等の他の組織では著しく少ない程度に発現するタンパク質は、胃粘膜の細胞で特異的に発現する。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、正常の条件下で、2 つ又は 3 つの組織型又は臓器等の 2 つ以上の組織型又は器官で、しかし好ましくは 3 つ以下の異なる組織又は臓器型で、特異的に発現していることもある。この場合、前記腫瘍抗原はこれらの臓器で特異的に発現する。例えば、腫瘍抗原が正常な条件下で、好ましくは肺と胃でほぼ等しい程度で発現している場合、前記腫瘍抗原は肺と胃で特異的に発現している。
【０２０３】
本発明によれば、用語「コードする核酸（nucleic acid encoding）」は、適切な環境、好ましくは細胞内、に存在する場合、核酸が発現して、核酸がコードするタンパク質又はペプチドを産生することができることを意味する。
【０２０４】
本発明による用語「ペプチド」は、オリゴペプチド及びポリペプチドを含み、ペプチド結合により共有結合している、2 個以上、好ましくは 3 個以上、好ましくは 4 個以上、好ましくは 6 個以上、好ましくは 8 個以上、好ましくは 9 個以上、好ましくは 10 個以上、好ましくは 13 個以上、好ましくは 16 個以上、好ましくは 21 個以上、及び最大好ましくは 8、10、20、30、40 又は 50 個、特に 100 個のアミノ酸を含む物質を指す。用語「タンパク質」は、大きなペプチド、好ましくは 100 個以上のアミノ酸残基を有するペプチド、を指すが、一般に、用語「ペプチド」、「ペプチド鎖」及び「タンパク質」は同義語であり、本明細書では互換的に使用される。
【０２０５】
上述のように、本明細書に記載のペプチド鎖及び抗原受容体のアミノ酸配列は、前記アミノ酸配列の変異体を得るために改変することがある。従って、本発明は、本明細書に記載のペプチド及びタンパク質配列の変異体を含み、天然に存在するアミノ酸配列の変異体（前記配列と機能的に等価／均等な配列、例えば、前記配列の特性と同一又は類似の特性を示すアミノ酸配列、になっている）を含む。重要な特性は、抗原受容体がその標的に結合すること、又は T 細胞等の細胞に抗原結合シグナルを伝達すること、を保持することである。ある実施形態では、変異体分子又は配列は、その親分子又は配列と免疫学的に等価／均等である。
【０２０６】
本発明による用語「変異体／変異型／バリアント（variant）」は、特に、変異体（mutants）、スプライス・バリアント、コンフォメーション、アイソフォーム、対立遺伝子バリアント、種バリアント、及び種相同体、特に自然に存在するもの、を指す。対立遺伝子バリアントは、遺伝子の正常な配列における変化に関するものであり、その重要性はしばしば不明である。遺伝子シークエンシングを完全に行うと、多くの場合、所与の遺伝子について、多数の対立遺伝子バリアントが同定される。種相同体とは、所与の核酸又はアミノ酸配列の種の起源とは異なる種の起源を持つ核酸又はアミノ酸配列である。用語「変異体／変異型／バリアント（variant）」は、翻訳後修飾されたあらゆるバリアント及び立体構造バリアントを包含するものとする。
【０２０７】
用語「免疫学的に等価／均等（immunologically equivalent）」は、免疫学的に等価／均等なアミノ酸配列等の免疫学的に等価／均等な分子が同じ又は本質的に同じ免疫学的特性を示し、及び／又は、例えば、免疫学的効果のタイプに関して、同じ又は本質的に同じ免疫学的効果を発揮することを意味する。本発明の文脈において、用語「免疫学的に等価／均等」は、好ましくは、治療に使用する抗原受容体の免疫学的効果又は特性に関して使用される。
【０２０８】
特に、前記 CDR 配列、超可変領域及び可変領域の配列は、標的に結合する作用を失うことなく、改変することができることが当業者には理解されるであろう。例えば、CDR 領域は、親抗体の領域と同一又は高度に相同のいずれかであることがある。「高度に相同（highly homologous）」とは、前記 CDRs において 1 から 5 個の置換、好ましくは 1 から 4 個の置換、例えば 1 から 3 個の置換又は 1 個若しくは 2 個の置換等が行われていることがあると考えられる。
【０２０９】
本発明の目的のために、アミノ酸配列の「変異体／変異型／バリアント」には、アミノ酸挿入変異体／変異型／バリアント、アミノ酸付加変異体／変異型／バリアント、アミノ酸欠失変異体／変異型／バリアント、及び／又はアミノ酸置換変異体／変異型／バリアントが含まれる。タンパク質の N 末端及び／又は C 末端に欠失を含むアミノ酸欠失変異体／変異型／バリアントは、N 末端及び／又は C 末端切断変異体／変異型／バリアントとも呼ばれる。
【０２１０】
アミノ酸挿入変異体／変異型／バリアントには、特定のアミノ酸配列内に、単一又は 2 個以上のアミノ酸が挿入されているものが含まれる。挿入されているアミノ酸配列変異体／変異型／バリアントの場合、ランダムに挿入して、適切なスクリーニングを行い、その結果として得られる産物であることも可能であるが、1 個以上のアミノ酸残基がアミノ酸配列の特定の部位に挿入される。
【０２１１】
アミノ酸付加変異体／変異型／バリアントには、1、2、3、5、10、20、30、50 個、又はそれ以上のアミノ酸等、1 個以上のアミノ酸がアミノ末端及び／又はカルボキシ末端に融合しているものが含まれる。
【０２１２】
アミノ酸欠失変異体／変異型／バリアントには、1、2、3、5、10、20、30、50 個、又はそれ以上のアミノ酸が除去される等、前記配列から 1 個以上のアミノ酸が除去されていることを特徴とする。前記欠失はタンパク質のどの位置にあってもよい。
【０２１３】
アミノ酸置換変異体／変異型／バリアントには、前記配列内の少なくとも 1 個の残基が除去され、その場所に別の残基が挿入されることを特徴とする。相同タンパク質又はペプチド間で保存されていないアミノ酸配列の位置で改変されること、及び／又はアミノ酸を似た特性を有する他のアミノ酸と置換されること、が好ましい。好ましくは、タンパク質変異体／変異型／バリアントのアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、即ち、同様に荷電している又は荷電していないアミノ酸による置換である。保存的アミノ酸変化には、側鎖に関連するアミノ酸のファミリーのうちの 1 つによる置換が含まれる。天然アミノ酸は一般に 4 つのファミリー：酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、及び非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）アミノ酸、に分類される。フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは、芳香族アミノ酸としてまとめて分類される場合がある。
【０２１４】
好ましくは、類似性の程度、好ましくは所与のアミノ酸配列と前記所与のアミノ酸配列の変異体／変異型／バリアントであるアミノ酸配列との間の同一性、は、少なくとも約 60％、65％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、又は 99％であろう。前記類似性又は同一性の程度を、好ましくは、対照となるアミノ酸配列の全長の少なくとも約 10％、少なくとも約 20％、少なくとも約 30％、少なくとも約 40％、少なくとも約 50％、少なくとも約 60％、少なくとも約 70％、少なくとも約 80％、少なくとも約 90％又は約 100％のアミノ酸領域が示す。例えば、対照となるアミノ酸配列が 200 個のアミノ酸からなる場合、前記類似性又は同一性の程度を、少なくとも約 20 個、少なくとも約 40 個、少なくとも約 60 個、少なくとも約 80 個、少なくとも約 100 個、少なくとも約 120 個、少なくとも約 140 個、少なくとも約 160 個、少なくとも約 180 個、又は約 200 個のアミノ酸、好ましくは連続したアミノ酸、が示す。好ましい実施形態において、前記類似性又は同一性の程度を、対照となるアミノ酸配列の全長が示す。配列類似性、好ましくは配列同一性を決定するためのアライメントは、技術的に既知のツールで、好ましくは最良の配列アライメントを使用して、例えば、標準設定（好ましくは、EMBOSS::needle、Matrix: Blosum62、Gap Open 10.0、Gap Extend 0.5）で使用する Align を使用して、実行することができる。
【０２１５】
「配列類似性」は、同一であるか、保存的アミノ酸置換を表すアミノ酸のパーセントを示す。2 つのアミノ酸配列間の「配列同一性」は、前記配列間で同一のアミノ酸のパーセントを示す。
【０２１６】
用語「同一性パーセント」は、比較対象の 2 つの配列間で同一のアミノ酸残基のパーセントを示し、最適なアライメントをした後に得られる。このパーセントは純粋に統計的であり、2 つの配列間の差は、ランダムに、及びそれらの全長にわたって分布する。2 つのアミノ酸配列間の配列比較は、従来、これらの配列を最適にアライメントさせた後に比較することにより行われ、前記比較は、局所領域の配列類似性を同定する、及び比較するために、セグメント又は「比較のウィンドウ（window of comparison）」毎に行う。比較するために配列を最適にアラインメントすることは、手作業に加えて、Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482 の局所相同性アルゴリズムによって、Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443 の局所相同性アルゴリズムによって、Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444 の類似性検索の方法によって、又はこれらのアルゴリズムを使用するコンピューター・プログラム（ウィスコンシン・ジェネティクス・ソフトウェア・パッケージ（Wisconsin Genetics Software Package、Genetics Computer Group、575 Science Drive、Madison、Wis.） に入っている GAS、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N 及びTFASTA）によって、行うことがある。
【０２１７】
同一性パーセントは、比較対象の 2 つの配列間の同一である位置の数を決定し、この数を比較対象の位置の数で割り、得られた結果に 100 を掛けて、これら 2 つの配列間の同一性パーセントを取得するために計算する。
【０２１８】
本発明によれば、相同アミノ酸配列は、前記アミノ酸残基の少なくとも 40％、特に少なくとも 50％、少なくとも 60％、少なくとも 70％、少なくとも 80％、少なくとも 90％、及び好ましくは少なくとも 95％、少なくとも 98 又は少なくとも 99％ の同一性を示す。
【０２１９】
本発明によれば、アミノ酸配列、ペプチド又はタンパク質の変異体／変異型／バリアント、フラグメント、部分（part）、部分（portion）又は誘導体は、好ましくは、それぞれが由来するアミノ酸配列、ペプチド又はタンパク質の機能的特性を有する（即ち、機能的に等価／均等である）。ある実施形態では、アミノ酸配列、ペプチド又はタンパク質の変異体／変異型／バリアント、フラグメント、部分（part）、部分（portion）又は誘導体は、それぞれが由来するアミノ酸配列、ペプチド又はタンパク質と免疫学的に等価／均等など、機能的に等価／均等である。ある実施形態では、前記機能的特性は、抗原に結合する、又は細胞内で結合シグナルを伝達するという特性である。
【０２２０】
用語「由来する（derived）」は、本発明によれば、特定の実体、特に特定の配列が、それが由来する物体、特に生物又は分子に存在することを意味する。アミノ酸配列、特に特定の配列領域の場合、「由来する」とは、関連するアミノ酸配列が、それが存在するアミノ酸配列に由来することを特に意味する。
【０２２１】
用語「細胞（cell）」又は「宿主細胞（host cell）」は、好ましくは無傷の細胞（即ち、酵素、細胞小器官、又は遺伝物質等の正常な細胞内成分を放出していない、無傷の膜を有する細胞）に関する。無傷の細胞は、好ましくは、生存可能な細胞、即ち、その通常の代謝機能を実行できる生細胞である。好ましくは、前記用語は、本発明によれば、外因性核酸でトランスフェクトされうる任意の細胞に関する。好ましくは、前記細胞は、外因性核酸でトランスフェクトされ、レシピエントに移された場合、レシピエントで前記核酸を発現することができる。用語「細胞」には、バクテリア細胞が含まれる；他の有用な細胞は、酵母細胞、真菌細胞又は哺乳類細胞である。好適なバクテリア細胞には、大腸菌、プロテウス、及びシュードモナスの株等のグラム陰性バクテリア株、並びにバチルス、ストレプトミセス、ブドウ球菌、及びラクトコッカスの株等のグラム陽性バクテリア株、に由来する細胞が含まれる。好適な真菌細胞には、トリコデルマ、ニューロスポラ、及びアスペルギルスの種に由来する細胞が含まれる。好適な酵母細胞には、サッカロミセス（例えば、サッカロミセス・セレビシエ）、シゾサッカロミセス（例えば、シゾサッカロミセス・ポンベ）、ピキア（例えば、ピキア・パストリス及びピキア・メタノリカ）、及びハンセヌラの種由来の細胞が含まれる。好適な哺乳動物細胞には、例えば、CHO 細胞、BHK 細胞、HeLa 細胞、COS 細胞、293 HEK 等が含まれる。しかし、異種タンパク質を発現させるために当技術分野で使用される、両生類細胞、昆虫細胞、植物細胞、及び他の細胞も同様に使用することができる。哺乳類細胞は、ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギ、及び霊長類からの細胞等であり、養子移入に特に好ましい。前記細胞は、多数の組織タイプに由来し、免疫系の細胞等（特に樹状細胞や T 細胞等の抗原提示細胞）の初代細胞及び細胞株、造血幹細胞や間葉系幹細胞等の幹細胞及びその他の細胞タイプが含まれる。本発明による使用に特に好ましい細胞は、免疫反応性細胞又は免疫エフェクター細胞、特に T 細胞である。
【０２２２】
核酸分子を含む細胞は、好ましくは、前記核酸によりコードされるペプチド又はタンパク質を発現する。
【０２２３】
用語「クローン増殖（clonal expansion）」又は「増殖（expansion）」は、特定の実体（entity）が増殖する（multiplied）プロセスを指す。本発明の文脈において、前記用語は、リンパ球が抗原によって刺激され、増殖し、前記抗原を認識する特定のリンパ球が増幅される免疫学的応答の文脈で使用されることが好ましい。好ましくは、クローン増殖はリンパ球の分化をもたらす。用語「プライミング（priming）」は、T 細胞がその特定の抗原と最初に接触し、エフェクター T 細胞への分化を引き起こすプロセスを指す。
【０２２４】
本明細書に記載の核酸、ペプチド鎖又は抗原受容体、又は細胞等の分子は、組換え及び／又は単離されたものであることがある。
【０２２５】
本明細書で使用される用語「単離された（isolated）」は、他の細胞物質等の他の分子を実質的に含まない実体（entity）を指すことを意図している。前記用語「単離された」は、好ましくは、単離された実体がその自然環境から分離されたことを意味する。単離された実体は、本質的に精製された状態であることがある。用語「本質的に精製された（essentially purified）」とは、好ましくは、実体が自然界で又は in vivo で結合する他の物質を、前記実体が本質的に含まないことを意味する。
【０２２６】
本発明の文脈における用語「組換え」は、「遺伝子改変により作られた（made through genetic engineering）」ことを意味する。好ましくは、本発明の文脈における組換え細胞等の「組換え物（recombinant object）」は、天然には存在しない。
【０２２７】
本明細書で使用される用語「天然に存在する（naturally occurring）」は、物が自然界で見つかるという事実を指す。例えば、生物（ウイルスを含む）中に存在し、自然界の材料から単離することができ、実験室で人が意図的に改変していないペプチド又は核酸は、天然に存在する。
【０２２８】
用語「自己／自家（autologous）」は、同じ対象に由来するあらゆるものを表すために使用される。例えば、「自家移植（autologous transplant）」とは、同じ対象に由来する組織又は臓器を移植することを指す。そのような手順は、そうでなければ拒絶をもたらす免疫学的障壁を、克服するので、有利である。
【０２２９】
用語「同種異系（allogeneic）」は、同じ種の異なる個体に由来するあらゆるものを表すために使用される。1 つ以上の遺伝子座の遺伝子が同一でない場合、2 以上の個体は互いに同種異系であると言われる。
【０２３０】
用語「同系（syngeneic）」は、同一の遺伝子型を有する個体又は組織（即ち、同一の双子又は同一の近交系の動物、又はそれらの組織）に由来するあらゆるものを記述するために使用される。
【０２３１】
用語「異種（heterologous）」は、複数の異なる要素で構成されるものを表すために使用される。例として、ある個体の骨髄を別の個体に移入することは、異種移植を構成する。異種遺伝子は、対象以外の材料に由来する遺伝子である。
【０２３２】
本明細書で使用する「低減する（Reduce）」又は「阻害する（inhibit）」とは、全体的な減少を引き起こす作用を意味し、レベルでは、好ましくは 5％以上、10％以上、20％以上、より好ましくは 50％以上、最も好ましくは 75％以上である。用語「阻害する」又は同様の表現は、完全又は本質的に完全な阻害（即ち、ゼロ又は本質的にゼロへの減少）を含む。
【０２３３】
「増加する（increase）」又は「強化する／高める（enhance）」等の用語は、好ましくは少なくとも約 10％、好ましくは少なくとも 20％、好ましくは少なくとも 30％、より好ましくは少なくとも 40％、より好ましくは少なくとも 50％、更により好ましくは少なくとも 80％、最も好ましくは少なくとも 100％ 増加すること、又は強化することに関する。
【０２３４】
本発明の抗原受容体は、疾患特異的抗原等を含む実質的にあらゆる抗原を標的とするように改変することができるため、本発明の抗原受容体は幅広い治療用途を有する。従って、本発明は、治療及び予防方法において、本発明の抗原受容体、そのペプチド鎖、それをコードする核酸、及び他の関連分子を使用することを対象とする。そのような用途の 1 つは、抗原特異的免疫細胞の産生であり、その細胞は、疾患を予防又は治療するために患者に投与されることがあり、その疾患は、免疫細胞で発現している本発明の抗原受容体が結合できる 1 種以上の抗原が発現することを特徴とする。好ましくは、前記疾患はがんである。更に、本発明の抗原受容体及び関連分子は、所定の抗原を発現する細胞を選択的に根絶する、並びに所定の抗原が発現する疾患に対する免疫又はワクチン接種にも使用することができ、その抗原は、本発明の抗原受容体の少なくとも 1 つの抗原結合部位に結合することがある。
【０２３５】
ある実施形態では、疾患を治療する又は予防する方法は、本発明の抗原受容体をコードする核酸の有効量を患者に投与することを含み、そこにおいては、前記抗原受容体の少なくとも 1 つの抗原結合部位は、治療する又は予防する疾患に関連する抗原（ウイルス抗原又は腫瘍抗原など）に結合することができる。別の実施形態では、疾患を治療する又は予防する方法は、有効量の組換え免疫エフェクター細胞又は増殖させた前記免疫エフェクター細胞の集団を患者に投与することを含み、免疫エフェクター細胞又は細胞集団は、本発明の抗原受容体を組換え的に発現し、前記抗原受容体の少なくとも 1 つの抗原結合部位は、治療する又は予防する疾患に関連する抗原に結合することができる。好ましい実施形態では、前記疾患はがんであり、前記抗原は腫瘍関連抗原である。
【０２３６】
別の実施形態において、本発明は、特定の抗原に関連する疾患に対して、又は特定の抗原を発現する疾患を引き起こす生物に対して、免疫化する又はワクチン接種する方法を提供し、この方法は、本発明の抗原受容体をコードする有効量の核酸を患者に投与することを含み、そこにおいては、前記抗原受容体の少なくとも 1 つの抗原結合部位が特定の抗原に結合することができる。別の実施形態では、本発明は、特定の抗原に関連する疾患に対して、又は特定の抗原を発現する疾患を引き起こす生物に対して、免疫化する又はワクチン接種する方法を提供し、この方法は、有効量の組換え免疫エフェクター細胞又は増殖させた前記免疫エフェクター細胞の集団を患者に投与することを含み、免疫エフェクター細胞又は細胞集団は、本発明の抗原受容体を組換え的に発現し、前記抗原受容体の少なくとも 1 つの抗原結合部位は、特定の抗原と結合することができる。
【０２３７】
ある特定の実施形態では、前記免疫エフェクター細胞の集団は、クローン的に増殖させた集団であることがある。前記組換え免疫エフェクター細胞又はその集団は、抗原特異的な方法で治療的な又は予防的な免疫エフェクター機能を提供する。好ましくは、本発明の抗原受容体は、前記免疫エフェクター細胞の細胞表面で発現する。
【０２３８】
本発明の治療する及び予防する方法に関連して使用される細胞は、好ましくは免疫エフェクター細胞であり、前記免疫エフェクター細胞は好ましくは T 細胞である。特に、本明細書で使用される細胞は細胞傷害性リンパ球であり、好ましくは細胞傷害性 T 細胞、ナチュラル・キラー（NK）細胞、及びリンフォカイン活性化キラー（LAK）細胞から選択される。活性化／刺激すると、これらの細胞傷害性リンパ球のそれぞれが標的細胞の破壊を引き起こす。例えば、細胞傷害性 T 細胞は、以下の手段のいずれか又は両方によって標的細胞の破壊を引き起こす。まず、活性化すると、前記 T 細胞はパーフォリン、グランザイム、グラニュリシン等の細胞毒を放出する。パーフォリンとグラニュリシンは前記標的細胞に孔を作り、グランザイムは前記細胞の中に入り、細胞質のカスパーゼ・カスケードを引き起こし、細胞のアポトーシス（プログラム細胞死）を誘導する。第二に、アポトーシスは、T 細胞と標的腫瘍細胞間の Fas-Fas リガンド相互作用を介して誘導されることがある。前記 T 細胞及び他の細胞傷害性リンパ球は、好ましくは自己細胞であるが、異種細胞又は同種細胞を使用することができる。
【０２３９】
従って、本明細書に記載の薬剤、組成物及び方法は、疾患（例えば、抗原を発現する疾患細胞の存在を特徴とする疾患）有する対象を治療するために使用することができる。特に好ましい疾患はがん疾患である。
【０２４０】
本明細書に記載の薬剤、組成物及び方法は、本明細書に記載の疾患を予防するための免疫化又はワクチン接種に使用されることもある。
【０２４１】
用語「疾患（disease）」は、個体の身体に影響を及ぼす異常な状態を指す。病気は多くの場合、特定の症状や徴候と結びついた病状として解釈される。病気は、感染症等の外部からの要因に起因する場合もあれば、自己免疫疾患等の内部機能障害に起因する場合もある。ヒトでは、「疾患」はしばしばより広く使用され、個体に対して、痛み、機能不全、苦痛、社会問題、又は死で苦しませる、又は前記個体と接触する個体に対して同様の問題を引き起こす、あらゆる症状を指す。この広い意味では、傷害、障害（disabilities）、障害（disorders）、症候群、感染、単発症状（isolated symptoms）、逸脱した行動、及び構造と機能の非定型のバリエーションが含まれることがあるが、他の文脈や他の目的では、これらは区別可能なカテゴリーと見なされる場合がある。多くの病気にかかって生活することは、人生や人格に対する見方を変える可能性があるため、病気は通常、身体的にだけでなく感情的にも個人に影響を与える。本発明によれば、前記用語「疾患」には、感染症及びがん疾患、特に本明細書に記載のがんの形態が含まれる。本明細書において、がん又はがんの特定の形態に言及することは、そのがん転移も含まれる。
【０２４２】
本発明に従って治療される疾患は、好ましくは抗原が関与する疾患である。「抗原が関与する疾患（Disease involving an antigen）」、「抗原の発現又は発現の上昇に関連する疾患（disease associated with expression or elevated expression of an antigen）」又は類似の表現は、本発明によれば、前記抗原が疾患組織又は臓器の細胞で発現することを意味する。疾患組織又は臓器の細胞での発現は、健常な組織又は臓器の状態と比較して増加する場合がある。ある実施形態では、発現は疾患組織でのみ見られ、健常な組織での発現は見られない（例えば、発現が抑制されている）。本発明によれば、抗原が関与する疾患には、感染症及びがん疾患が含まれ、その疾患関連抗原は、好ましくは、それぞれ感染性因子の抗原及び腫瘍抗原である。好ましくは、抗原が関与する疾患は、好ましくは細胞表面上に、抗原を発現する細胞が関与する疾患であることが好ましい。
【０２４３】
用語「健常な」又は「正常な」は、非‐病的な状態を指し、好ましくは感染していないこと又はがんではないことを意味する。
【０２４４】
用語「がん疾患（cancer disease）」又は「がん（cancer）」は、無秩序な細胞増殖を典型的に特徴とする個体の生理学的状態を指す、又は記載する。がんの例には、限定されるものではないが、がん腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。より具体的には、そのようながんの例には、骨がん、血液がん、肺がん、肝臓がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚又は眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん、結腸がん、乳がん、前立腺がん、子宮がん、性器及び生殖器のがん、ホジキン病、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟部組織の肉腫、膀胱のがん、腎臓のがん、腎細胞がん、腎盂のがん腫、中枢神経系（CNS）の新生物、神経外胚葉がん、脊柱腫瘍、神経膠腫、髄膜腫、及び下垂体腺腫、が含まれる。本発明による用語「がん」は、がん転移も含む。好ましくは、「がん疾患」は、腫瘍抗原を発現する細胞によって特徴付けられ、がん細胞は腫瘍抗原を発現する。
【０２４５】
ある実施形態では、がん疾患は、退形成、侵襲性、及び転移の特性を特徴とする悪性疾患である。悪性腫瘍はその成長において自己制限されず、隣接する組織に侵入することができ、遠位の組織に広がる（転移する）ことができる一方で、良性腫瘍にはこれらの特性は無いという点において、悪性腫瘍は非がん性の良性腫瘍とは対照的である。
【０２４６】
本発明によれば、用語「腫瘍」又は「腫瘍疾患」は、細胞（新生細胞又は腫瘍細胞と呼ばれる）の異常な増殖により形成される腫脹又は病変を指す。「腫瘍細胞」とは、急速で制御されない細胞増殖によって増殖し、その新しい増殖を開始させた刺激が止まった後も、増殖し続ける異常な細胞を意味する。腫瘍は、構造的な秩序性及び正常組織との機能的協調性が部分的に又は完全に欠如することを示し、通常、良性、前悪性又は悪性の何れかである、明確な組織の塊を形成する。
【０２４７】
本発明によれば、「がん」は上皮細胞に由来する悪性腫瘍である。このグループは、乳がん、前立腺がん、肺がん、及び結腸がん等の最も一般的ながんを代表する。
【０２４８】
「腺がん（Adenocarcinoma）」は、腺組織に発生するがんである。この組織は、上皮組織として知られる、より大きな組織カテゴリーの一部でもある。上皮組織には、皮膚、腺、及び体腔と臓器の内側を覆う他の様々な組織が含まれる。上皮は、発生学的には、外胚葉、内胚葉、及び中胚葉に由来する。腺がんとして分類されるために、前記細胞は、分泌特性を持っている限り、必ずしも腺の一部である必要はない。この形態のがん腫は、ヒトを含む一部の高等哺乳類で発生することがある。高い分化度の腺がんは、それらが由来する腺組織に似ている傾向があるが、低い分化度の腺がんはそうではないことがある。病理学者は、生検の細胞を染色することにより、腫瘍が腺がんか他の種類のがんかを判断する。体内の腺は遍在しているために、腺がんは、体の多くの組織で発生する可能性がある。各腺は同じ物質を分泌していないことがあるが、細胞に外分泌機能がある限り、その細胞は腺と考えられ、その悪性形態を腺がんと呼ぶ。悪性腺がんは他の組織に浸潤し、十分な時間があるとしばしば転移する。卵巣腺がんは、卵巣がんの最も一般的なタイプである。卵巣腺がんには、漿液性及び粘液性腺がん、明細胞腺がん、類内膜腺がんが含まれる。
【０２４９】
リンパ腫と白血病は、造血（hematopoietic）（血液を形成する（blood-forming））細胞に由来する悪性腫瘍である。
【０２５０】
芽球性腫瘍又は芽細胞腫は、未成熟又は胚組織に似た腫瘍（通常は悪性）である。これらの腫瘍の多くは子供に最もよく見られる。
【０２５１】
「転移（metastasis）」とは、がん細胞が元の部位から身体の別の部位に広がることを意味する。転移の形成は非常に複雑なプロセスであり、原発腫瘍からの悪性細胞の剥離、細胞外マトリックスへの浸潤、体腔及び血管に進入するための内皮基底膜への浸透、そして血液によって運ばれた後には、標的臓器への浸潤、に依存する。最後に、標的部位での新しい腫瘍の増殖は血管新生に依存する。原発腫瘍を除去した後でも、腫瘍細胞又は成分が残って転移能を発現する可能性があるため、腫瘍の転移がしばしば発生する。ある実施形態では、本発明による用語「転移」は、原発腫瘍及び所属リンパ節系から離れた転移に関する「遠隔転移」に関する。ある実施形態では、本発明による用語「転移」は、リンパ節転移に関する。
【０２５２】
過去にある人に影響を与えた状態によって、その人が再び影響を受ける場合、再発（relapse）又は再発（recurrence）が発生する。例えば、患者が腫瘍疾患を患ったことがあり、前記疾患の治療に成功し、再び前記疾患を発症した場合、前記新たに発症した疾患は再発又は再発（relapse or recurrence）とみなされることがある。しかし、本発明によれば、腫瘍疾患の再発又は再発（relapse or recurrence）は、必ずしも元の腫瘍疾患の部位で起こるとは限らない。従って、例えば、患者が卵巣腫瘍を患ったことがあり、受けた治療が成功した場合、再発又は再発（relapse or recurrence）とは、卵巣腫瘍が発生すること、又は卵巣とは異なる部位で腫瘍が発生すること、であるかもしれない。腫瘍の再発又は再発（relapse or recurrence）には、元の腫瘍の部位とは異なる部位で、並びに元の腫瘍の部位で、発生する状況も含まれる。好ましくは、患者が治療を受けた元の腫瘍は原発腫瘍であり、元の腫瘍の部位とは異なる部位の腫瘍は続発性又は転移性腫瘍である。
【０２５３】
本発明によって治療する、又は予防することができる感染症は、限定されるものではないが、ウイルス、バクテリア、真菌、原生動物、寄生蠕虫、及び寄生虫等を含む感染性因子によって引き起こされる。
【０２５４】
ヒト及び非-ヒト脊椎動物の両方の感染性ウイルスには、レトロウイルス、RNA ウイルス、及び DNA ウイルスが含まれる。ヒトで発見されたウイルスの例には、限定されるものではないが、以下が含まれる：レトロウイルス科（例えば、HIV-1 等のヒト免疫不全ウイルス（HTLV-III、LAV 又は HTLV-III/LAV、又は HIV-III とも呼ばれる）；及び HIV-LP 等の他の分離株；ピコルナウイルス科（例えば、ポリオ・ウイルス、A 型肝炎ウイルス、エンテロウイルス、ヒト・コクサッキー・ウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カルシウイルス科（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（例えば、デング・ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例、パラインフルエンザ・ウイルス、おたふく風邪ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；オルソミクソウイルス科（例えば、インフルエンザ・ウイルス）；ブンガウイルス科（例えば、ハンタ・ウイルス、ブンガ・ウイルス、フレボウイルス、ナイロ・ウイルス）；アリーナ・ウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オルビウィルス及びロタウイルス）；ビルナウイルス科；ヘパドナウイルス科（B 型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポバウイルス科（乳頭腫ウイルス、ポリオーマ・ウイルス）；アデノウイルス科（ほとんどのアデノウイルス）； ヘルペスウイルス科（単純ヘルペス・ウイルス（HSV） 1 及び 2、水痘帯状ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス（CMV）、ヘルペス・ウイルス；ポキシウイルス科（天然痘ウイルス、ワクシニア・ウイルス、ポックス・ウイルス）；及びイリドウイルス科（例えば、アフリカ・ブタ・コレラウイルス）；並びに未分類ウイルス（例えば、海綿状脳症の病原体、デルタ型肝炎の病原体（agent）（B 型肝炎ウイルスの欠陥性のサテライトであると考えられる）、非‐A、非‐B 型肝炎の病原体（agent）（クラス 1 =内部伝播；クラス2 =非経口感染（C型肝炎など）；ノーウォーク及び関連ウイルス、並びにアストロウイルス）。
【０２５５】
意図されるレトロウイルスには、単純なレトロウイルスと複雑なレトロウイルスの両方が含まれる。複雑なレトロウイルスには、レンチウイルス、T 細胞白血病ウイルス、泡沫状ウイルスのサブグループが含まれる。レンチウイルスには HIV-1 が含まれるが、HIV-2、SIV、ビスナ・ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（feline immunodeficiency virus（FIV））、及びウマ伝染性貧血ウイルス（equine infectious anemia virus（EIAV））も含まれる。前記 T 細胞白血病ウイルスには、HTLV-1、HTLV-II、サル T 細胞白血病ウイルス（STLV）、及びウシ白血病ウイルス（BLV）が含まれる。前記泡沫状ウイルスには、ヒト泡沫状ウイルス（HFV）、サル泡沫状ウイルス（SFV）、及びウシ泡沫状ウイルス（BFV）が含まれる。
【０２５６】
本発明によって治療する又は予防することができるバクテリア感染症又は疾患は、限定されるものではないが、マイコバクテリア（例えば、結核菌、ウシ型結核菌（M. bovis）、マイコバクテリウム・アビウム（M. avium）、らい菌（M leprae）、又はアフリカ型結核菌（M. africanum）、リケッチア、マイコプラズマ、クラミジア、及びレジオネラ等、生活環のなかで、細胞内のステージがあるバクテリアによって引き起こされる。考えられるバクテリア感染症の他の例には、限定されるものではないが、グラム陽性バチルス（例えば、リステリア、炭疽菌等のバチルス、エリシペロトリクス種）、グラム陰性バチルス（例えば、バルトネラ、ブルセラ、カンピロバクター、エンテロバクター、エシェリヒア、フランシセラ、ヘモフィルス、クレブシエラ、モルガネラ、プロテウス、プロビデンシア、シュードモナス、サルモネラ、セラチア、シゲラ、ビブリオ、及びエルシニアの種）、スピロヘータ・バクテリア（例えば、ライム病を引き起こすボレリア・ブルグドルフェリを含むボレリア種）、嫌気性バクテリア（例えば、アクチノマイセス及びクロストリジウム種）、グラム陽性及び陰性球菌、腸球菌種、連鎖球菌種、肺炎球菌種、ブドウ球菌種、ナイセリア種、によって引き起こされる感染症が含まれる。感染性バクテリアの具体例には、限定されるものではないが：ヘリコバクター・ピロリ、ボレリア・ブルグドルフェリ、レジオネラ・ニューモフィリア、結核菌、マイコバクテリウム・アビウム（M. avium）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（M. intracellulare）、マイコバクテリウム・カンサシ（M. kansaii）、マイコバクテリウム・ゴルドネ（M. gordonae）、ブドウ球菌、淋菌、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、リステリア髄膜炎菌、化膿連鎖球菌（グループ A 連鎖球菌）、アガラクチア菌（Streptococcus agalactiae）（グループ B 連鎖球菌）、ビリダンス型連鎖球菌（Streptococcus viridans）、糞便連鎖球菌（Streptococcus aecalis）、ウシ連鎖球菌（Streptococcus bovis）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、ヘモフィルス・インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、炭疽菌（Bacillus antracis）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）、ブタ丹毒菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringers）、破傷風菌（Clostridium tetani）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneunmoniae）、パスツレラ・ムルトシダ（Pasturella multocida）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Fusobacterium nucleatuin）、ストレプトバチルス・モニリホルム（Streptobacillus moniliformis）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidium）、トレポネーマ・ペルテニュ（Treponema pertenue）、レプトスピラ（Leptospira）、リケッチア（Rickettsia）、及びアクチノイセス・イスラエリ（Actinoyyces israelli）、が含まれる。.
【０２５７】
本発明によって治療する、又は予防することができる真菌性疾患には、限定されるものではないが、アスペルギルス症、クリプトコッカス症、スポロトリコーシス症、コクシジオイデス症、パラコクシジオイデス症、ヒストプラスマ症、芽球菌症、接合菌症、及びカンジダ症が含まれる。
【０２５８】
本発明によって治療する、又は予防することができる寄生虫疾患には、限定されるものではないが、アメーバ症、マラリア、リーシュマニア、コクシジウム、ジアルジア症、クリプトスポリジウム症、トキソプラズマ症、及びトリパノソーマ症が含まれる。また、限定されるものではないが、回虫症、鉤虫症、鞭虫症、糞線虫症、トキソカラ症、旋毛虫症、オンコセルカ症、フィラリア、及びディロフィラリア症等の様々な虫による感染も含まれる。又、住血吸虫症、放線菌症、及び肝吸虫症等の様々な吸虫による感染も含まれる。
【０２５９】
用語「治療（treatment）」又は「治療的処置（therapeutic treatment）」は、個体の健康状態を改善し、及び／又は寿命を延ばす（増加させる）あらゆる処置に関する。前記治療は、個体において疾患を除去し、個体において疾患の発症を停止させる又は遅延させ、個体において疾患の発症を阻害又は遅延させ、個体において症状の頻度又は重症度を減少させ、及び／又は現在病気にかかっているか、以前病気にかかったことがある個体において再発を減少させる。
【０２６０】
用語「予防的治療（prophylactic treatment）」又は「予防的治療（preventive treatment）」は、個体に病気が発生するのを防ぐことを目的とするあらゆる治療に関する。用語「予防的治療（prophylactic treatment）」又は「予防的治療（preventive treatment）」は、本明細書では互換的に使用される。
【０２６１】
用語「個体（individual）」及び「対象（subject）」は、本明細書では互換的に使用される。それらは、病気又は障害（例えば、がん）に苦しむ、又は影響を受けやすいヒト、非-ヒトの霊長類、又は他の哺乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、又は霊長類）を指すが、疾患又は障害を持っている場合と持っていない場合がある。多くの実施形態では、前記個体はヒトである。特に別記しない限り、前記用語「個体」及び「対象」は特定の年齢を示すものではなく、そのため、成人、高齢者、子供、及び新生児が含まれる。本発明の好ましい実施形態では、前記「個体」又は「対象」は「患者」である。前記用語「患者」は、本発明によれば、治療の対象、特に疾患に罹っている対象を意味する。
【０２６２】
「危険にさらされている（being at risk）」とは、一般集団と比較して、疾患（特にがん）を発症する可能性が通常よりも高いと特定された対象、即ち患者を意味する。更に、疾患、特にがんを患ったことがある、又は現在患っている対象は、疾患を発症し続ける可能性があるため、疾患を発症するリスクが高い対象である。現在がんを患っている、又はがんを患ったことがある被験者も、がん転移のリスクが高い。
【０２６３】
用語「免疫療法（immunotherapy）」は、特定の免疫反応又は応答を伴う治療に関する。
【０２６４】
本発明の文脈において、「保護する（protect）」、「予防する（prevent）」、「予防的な（prophylactic）」、「予防的な（preventive）」、又は「保護的な（protective）」等の用語は、対象における疾患の発生及び／若しくは伝播の予防若しくは治療、又は両方に関する、並びに、特に、対象が疾患を発症する可能性を最小限に抑えることに関する、又は疾患の発症を遅らせることに関する。例えば、前述のように、腫瘍のリスクがある人は、腫瘍を予防する治療法の候補者になる。
【０２６５】
免疫療法を予防的に投与することは（例えば、本発明の薬剤又は組成物を予防的に投与することは）、好ましくは、レシピエントを疾患の発症から保護する。免疫療法を治療的に投与することは（例えば、本発明の薬剤又は組成物を治療的に投与することは）、前記疾患が進行すること／大きくなることを阻害することがある。これは、疾患が進行すること／大きくなることを減速させること、特に疾患が進行することを途絶させることを含み、これは好ましくは疾患を除去することにつながる。
【０２６６】
免疫療法は、本明細書で提供される薬剤が、好ましくは患者から抗原発現細胞を除去するように機能する、様々なあらゆる技術を使用して実施することがある。そのような除去は、抗原又は抗原を発現する細胞に対して特異的な患者において、免疫応答を高める、又は誘導する結果として起こることがある。
【０２６７】
用語「免疫化」又は「ワクチン接種」は、治療的な又は予防的な理由で免疫応答を誘導する目的で、対象を治療するプロセスを表す。
【０２６８】
用語「in vivo」は、対象の中の状況に関する。
【０２６９】
本発明の抗原受容体、ペプチド鎖、核酸、組換え細胞、免疫エフェクター細胞、好ましくは T 細胞、並びに本明細書に記載の他の化合物及び薬剤は、任意の適切な医薬組成物の形態で投与してもよい。
【０２７０】
本発明の医薬組成物は、好ましくは無菌であり、所望の反応又は所望の効果を生み出すために、本明細書に記載の薬剤及び任意選択的に本明細書に記載の更なる薬剤の有効量を含む。
【０２７１】
医薬組成物は通常、均一な剤形で提供され、それ自体既知の方法で調製してもよい。医薬組成物は、例えば、溶液又は懸濁液の形態であることがある。
【０２７２】
医薬組成物は、塩、緩衝物質、防腐剤、担体、希釈剤及び／又は賦形剤を含むことがあり、これらはすべて薬学的に許容されることが好ましい。用語「薬学的に許容される（pharmaceutically acceptable）」は、前記医薬組成物の活性成分の作用と相互作用しない材料が無毒性であることを指す。
【０２７３】
薬学的に許容されない塩は、薬学的に許容される塩を調製するために使用されることがあり、本発明に含まれる。この種の薬学的に許容される塩は、非限定的に、以下の酸から調製されたものを含む：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸等。薬学的に許容される塩は、ナトリウム塩、カリウム塩又はカルシウム塩等のアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩として調製することもある。
【０２７４】
医薬組成物で使用するのに適した緩衝物質には、塩の酢酸、塩のクエン酸、塩のホウ酸、及び塩のリン酸が含まれる。
【０２７５】
医薬組成物での使用に適した防腐剤には、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベン、及びチメロサールが含まれる。
【０２７６】
注射製剤は、乳酸リンゲル等の薬学的に許容される賦形剤を含むことがある。
【０２７７】
用語「担体」は、天然又は合成の性質の有機又は無機成分を指し、適用を促進、強化、又は可能にするために前記活性成分と組合せられる。本発明によれば、前記用語「担体」には、患者への投与に適した 1 つ以上の適合性のある固体又は液体の充填剤、希釈剤、又はカプセル化物質が含まれる。
【０２７８】
非経口投与のための可能な担体物質には、例えば、滅菌水、リンゲル液、乳酸リンゲル液、滅菌塩化ナトリウム溶液、ポリアルキレン・グリコール、水素化ナフタレン、及び、特に、生体適合性ラクチド・ポリマー、ラクチド／グリコリド共重合体又はポリオキシエチレン／ポリオキシ‐プロピレン共重合体が含まれる。
【０２７９】
本明細書で使用される用語「賦形剤」は、医薬組成物中に存在する可能性があり、例えば、担体、結合剤、潤滑剤、増粘剤、界面活性剤、防腐剤、乳化剤、緩衝液、香料、又は着色料等の活性成分ではない全ての物質を示すことを意図している。
【０２８０】
本明細書に記載の薬剤及び組成物は、注射又は点滴を含む非経口投与による等、任意の従来の経路を介して投与することができる。投与は、好ましくは非経口的、例えば、静脈内、動脈内、皮下、皮内又は筋肉内である。
【０２８１】
非経口投与に適した組成物は、通常、活性化合物の滅菌した水性の又は非水性の製剤を含み、これは好ましくはレシピエントの血液と等張である。適合性のある担体及び溶媒の例は、リンガー溶液及び等張性塩化ナトリウム溶液である。更に、通常、無菌の固定油を溶液又は懸濁媒体として使用する。
【０２８２】
本明細書に記載の薬剤及び組成物は、有効量で投与される。「有効量」とは、単独で又は更なる用量と一緒に、所望の反応又は所望の効果を達成する量を指す。特定の疾患又は特定の状態を治療する場合、所望の反応は、好ましくは前記疾患の経過を阻害することに関する。これは、疾患の進行を遅くすること、特に、疾患の進行を中断又は逆転させることを含む。疾患又は状態を治療する際における所望の反応はまた、前記疾患又は前記状態の発症の遅延又は発症の予防であることもある。
【０２８３】
本明細書に記載の薬剤又は組成物の有効量は、治療する状態、前記疾患の重症度、年齢、生理学的状態、大きさ及び体重を含む前記患者の個々のパラメータ、治療期間、併用治療（もし、あれば）の種類、特定の投与経路、及び同様の要因、に依存する。従って、本明細書に記載の薬剤の投与量は、様々なそのようなパラメータに依存することがある。患者における反応が初期用量では不十分である場合、より高い用量（又は種々の、より局所的な投与経路により達成される、実質的により高い用量）を使用することがある。
【０２８４】
本明細書に記載される薬剤及び組成物は、本明細書に記載されるような様々な障害を治療又は予防するために、例えば in vivo で患者に投与することがある。好ましい患者には、本明細書に記載の薬剤及び組成物を投与することにより矯正又は改善できる障害を有するヒト患者が含まれる。これには、抗原の発現を特徴とする細胞が関与する障害が含まれる。
【０２８５】
例えば、ある実施形態において、本明細書に記載の薬剤は、がん疾患、例えば、抗原を発現するがん細胞の存在を特徴とする本明細書に記載のがん疾患、を有する患者を治療するために使用することがある。
【０２８６】
本発明に従って記載される医薬組成物及び治療方法は、本明細書に記載される疾患を予防するための免疫化又はワクチン接種に使用されることもある。
【０２８７】
本発明の医薬組成物は、1 つ以上のアジュバント等の免疫増強物質を補充して投与することがあり、その有効性を更に高めるために、好ましくは免疫刺激の相乗効果を得るために、1 つ以上の免疫増強物質を含むことがある。用語「アジュバント」は、免疫応答を延ばす、又は増強する、又は加速する化合物に関する。この点で、様々な種類のアジュバントに応じて、様々なメカニズムが可能である。例えば、DC の成熟を可能にする化合物（例えば、リポ多糖又は CD40 リガンド）は、適切なアジュバントの第一クラスを形成する。一般に、「危険信号」（LPS、GP96、dsRNA 等）又は GM-CSF 等のサイトカインといったタイプの免疫系に影響を与える任意の薬剤は、免疫応答を強化できる及び／又は制御された方法で影響を与えるアジュバントとして使用できる。上記のように、特定の状況下で発生する副作用を考慮する必要があるが、CpG オリゴデオキシヌクレオチドをこの状況で任意選択的に使用することもできる。特に好ましいアジュバントは、モノカイン、リンホカイン、インターロイキン又はケモカイン等のサイトカイン（例えば IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IFNα、IFNγ、GM-CSF、LT-α）又は成長因子（例えば hGH）、である。更に知られているアジュバントは、水酸化アルミニウム、フロイントのアジュバント、又はMontanide（登録商標）（最も好ましくは Montanide（登録商標）ISA51）等の油である。Pam3Cys 等のリポペプチドも、本発明の医薬組成物におけるアジュバントとしての使用に適している。
【０２８８】
前記医薬組成物は、局所的に又は全身的に、好ましくは全身的に投与することがある。
【０２８９】
用語「全身投与」は、薬剤が個体の体内にかなりの量で広く分布し、所望の効果を発揮するような薬剤の投与を指す。例えば、前記薬剤は、血液中でその所望の効果を発現し、及び／又は血管系を介してその所望の作用部位に到達することがある。典型的な全身性の投与経路には、前記薬剤を血管系に直接導入することによる投与、又は前記薬剤が吸収され、血管系に入り、血液を介して 1 つ以上の所望の作用部位に運ばれる経口、肺、又は筋肉内投与が含まれる。
【０２９０】
本発明によれば、全身性の投与は非経口投与によることが好ましい。前記用語「非経口投与」は、薬剤が腸を通過しないように前記薬剤を投与することを指す。前記用語「非経口投与」には、静脈内投与、皮下投与、皮内投与又は動脈内投与が含まれるが、これらに限定されない。
【０２９１】
投与は、例えば、経口、腹腔内又は筋肉内で実施することもある。
【０２９２】
本明細書で提供される薬剤及び組成物は、単独で、又は外科手術、放射線照射、化学療法及び／又は骨髄移植（自己、同系、同種異系又は無関係）等の従来の治療レジメンと組合せて使用することがある。
【０２９３】
本発明を、以下の図及び実施例において、より詳細に説明するが、これらは例示目的のみに使用するものであり、限定することを意味するものではない。その記載及び実施例により、本発明に同様に含まれる更なる実施形態に、当業者はアクセス可能である。
【実施例】
【０２９４】
本明細書で使用される技術及び方法は、本明細書に記載されるか、又はそれ自体既知の方法で、及び、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第 2 版 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.、に記載されている通りに行われる。キット及び試薬の使用等を含む全ての方法は、特に指定がない限り、製造元の情報に従って実施される。
【０２９５】
実施例１：フロー・サイトメトリーによる、iDCs におけるクローディン ６ 及び T 細胞における抗原受容体の発現解析。
5'-リーディング・シーケンス（5’-leading sequence）に T7 プロモーターを、及び 3’ 末端に最適化した polyA-テール（polyA-tail）を有する RNAベクター pST1 中でクローン化したオープン・リーディング・フレーム（ORF）を in vitro 転写（ivt-RNA）することにより、種々のコンストラクトの RNA を調製した。ヒト未成熟樹状細胞におけるクローディン 6 の発現は、軟膜由来の、GM-CSF/IL-4 処理をした CD14+ 単球に、RNA をエレクトロポレーション（2-0.002μg、300 V、12 ms、1 パルス）した 1 日後に、フルオロフォア Dylight-650 で標識したクローディン 6 特異的な抗体を使用して、評価した。自己ヒト T 細胞における様々な抗原受容体構築物の発現は、OKT3（抗 CD3ε マウス・モノクローナル抗体）で事前活性化した CD8+T 細胞に、RNA をエレクトロポレーション（両鎖で合計 10-30 μg、495V、9 ms、1 パルス）した 1 日後に、フルオロフォア Dylight-649 で標識した Cl6 scFv イディオタイプ特異的抗体を使用して、評価した。ヒト iDCs 及び T 細胞の調製に関する詳細な説明は、実施例２に記載する。発現について試験した CAR 構築物は、（i）マウス T 細胞受容体 TCR C16；（ii）ヒト TCR gp100；（iii）一価の非‐組合せ CAR C16；（iv）古典的 scCAR（二価）；（v）ヒト TCRCα/β-ドメインに融合した組合せ間 CAR C16（二価）；（vi）全長 TCR gp100 (280-288)に融合した非‐組合せ CAR C16（二価）；（vii）ペプチド認識を除去するために TCRαgp100 の CDR3 内でサイレンシングを加えた、対応する非‐組合せ CAR C16（二価）；（viii）完全な長さの TCR gp100(280-288) と融合した組合せ間 CAR C16（二価）及び（ix）ペプチド認識を除去するために TCRα gp100 の CDR3 内でサイレンシングを加えた、対応する組合せ CAR C16（二価）、である。種々の抗原受容体構築物は、図１Ａ‐Ｉに概略的に示す。前記細胞の染色は、フロー・サイトメトリー緩衝液中の 0.2x106細胞に対して 4℃で 20 分間、通常やるように行い、洗浄し、1 ％パラホルムアルデヒド含有フロー・サイトメトリー緩衝液で固定した。図２Ａのデータは、クローディン 6 のタイトレーションした発現を示す。ここでは、このドナーからの iDCs は、Cl6 RNAを非常に許容し、エレクトロポレーションした RNA 量が増加するのに伴い、クローディン 6 の発現は全体的にシフトした。CD86 の発現は、前記単球が強力な抗原提示 iDCs にうまく分化していることを示した。図２Ｂは、この実験で使用した種々の CARs が、ヒト CD8 陽性で選択したヒト T 細胞において発現していることを示す。古典的 scCAR C16 は、最も高く発現したが、おそらく T 細胞表面で、その内因性 の CD3 に非依存的な発現をするためである。組合せ CARs は、一価の CAR よりもわずかに良好な発現を示した。後者は、それが一価の抗原結合作用しか持っていないことにより、「弱い対照」として機能した。
【０２９６】
図３Ａのデータは、独立した実験での、クローディン 6 のタイトレーションした発現を示す。ここでは、このドナーからの iDCs は、Cl6 RNAをあまり許容せず、エレクトロポレーションした RNA 量が増加するのに伴い、クローディン 6 の発現は部分的にしかシフトしなかった。しかし、CD86 の発現は、前記単球が強力な抗原提示 iDCs にうまく分化していることを示した。図３Ｂは、この実験で使用した種々の CARs が、ヒト CD8 陽性で選択したヒト T 細胞において発現していることを示す。前記ヒト T 細胞は、自家の環境で分化した単球と同じドナーに由来するため、前記 T 細胞はエレクトロポレーションした RNA に対する許容性が低く、図２Ｂに示した実験よりも、CARs の発現はより弱いものでしかなかった。しかしながら、古典的 scCAR C16 は、先に概説したのと同じ理由で、再び最も高く発現した。以前の観察と一致して、前記組合せ CARs は一価の CAR よりもわずかに良好な発現を示した。CAR 発現のオーダーは、図２Ａ／Ｂで概説した実験と比較して同じであるため、この実験は、抗原提示細胞（APCs）での Cl6 発現が微量である場合における、種々の CARs の有効性を研究するのに適している。
【０２９７】
実施例２：抗原をタイトレーションした IFN-γ分泌アッセイ
本実験の 1 日目に、新鮮な末梢血単核細胞（「PBMCs」）を 1 人の健常なドナーの軟膜から分離した。1/4 の PBMCs から、MACS ソートを使用して CD14+ 細胞を分離した。MACS でのフロー・スルー及び残った PBMCs は、次に CD8+ T 細胞について MACS でソートした。1、3、6 日目に IL-4 及び GM-CSF（1000U/ml）を投与することにより、CD14+ 細胞を未成熟樹状細胞（「iDCs」）に分化させた。CD8+ T 細胞は、OKT3 でコートした 6 ウェル・プレートに移した。3 日目に、T 細胞を新しい 6 ウェル・プレートに移した。7 日目に、Cl6 ivt-RNA とは無関係なものを、及び 2-0.002 μg RNA の範囲で用量依存的に Cl6 IVT-RNA を、iDCs にエレクトロポレーションした。OKT3 で活性化させた T 細胞に、コントロール、又は個々の図で示し及び実施例１で記載した抗原受容体構築物を、同じ日にエレクトロポレーションした。質を確保するために、iDCs 上の Cl6 発現及び T 細胞上の抗原受容体の表面発現を、8 日目に、先に説明したように、蛍光標識した特異的な抗体で解析した。このエレクトロポレーションした T 細胞と抗原をエレクトロポレーションした iDCs は、続いて 96 ウェル・プレートで 20 時間、3:1-10:1 の E:T 比で、2 連（duplicate）で共培養した。通常通り、2.5x104 個の iDCs を播種し、200μl の T 細胞培地の容量で、7.5x104-2.5x105個の CAR をエレクトロポレーションした T 細胞と共培養した。9 日目に、種々の量の培養上清（10-50 μl）を採取し、eBioscience の IFN-γReady Set Go！ キット（＃88-7316-88）を使用するサンドイッチ ELISA で分泌された IFNγ の量を解析した。Tecan Sunrise ELISA リーダーを使用して、吸光度を検出した。
【０２９８】
図２Ｃは、同じドナーの iDCs 及び T 細胞に関して、分泌された IFNγ の量を示す。これら細胞は RNA エレクトロポレーションを非常に許容し、その結果、iDCs での Cl6 の用量依存的な全体的な発現及び T 細胞での CARs の高発現がもたらされた（図２Ａ／Ｂ）。全ての CAR T 細胞は、0.02μg のエレクトロポレーションした Cl6 RNA で、IFNγ 分泌が最大になり、古典的 scCAR では最大 30.000 pg/ml の IFNγ、TCRCα/β 又は全長の TCR gp100 と融合した組合せ CARs では 20.000 pg/ml となった。予想通り、一価の CAR 改変 T 細胞が、最も弱いエフェクター細胞であることがわかった。興味深いことに、高い Cl6 エレクトロポレーション・レベルでは、前記組合せ CARs は古典的 scCAR Cl6 の反応性の、約 50 ％の反応性しか示さなかったが、この反応性は、エレクトロポレーションした Cl6 が 0.02 μg である最適用量で、70％に増加した。重要なことに、ここでテストした最小量の Cl6（0.002μg RNA）で、組合せ CARs は古典的 scCAR Cl6 と同じくらい効率的であり、又は TCR Cα/β と融合した組合せ CAR の場合には、より効率的ですらあった。Cl6 がこの非常に低いレベルで全体的に存在するとき、前記組合せ CARs は、10.000 pg/ml の範囲で、依然として大量の IFNγ を分泌することができた。
【０２９９】
図３Ｃは、同じドナーの iDCs 及び T 細胞に関して、分泌された IFNγの量を例示しており、これら細胞は RNA エレクトロポレーションの許容性が低く、その結果、iDCs での Cl6 の用量依存的な発現が部分的になり、T 細胞での CARs の発現もより低かった（図３Ａ／Ｂ）。これによって、許容度が高く抗原をタイトレーションした iDCs における Cl6 の低発現レベルの状況よりも、iDCs で見られる Cl6 が更に少ない状況になることがある（図３Ａ／Ｂ対２Ａ／Ｂ）。ここで、タイトレーションした全ての微量の Cl6 について、前記組合せ CARs は、IFNγ-分泌において、古典的 scCAR よりも効率的であることが証明された。この傾向は、iDCs の細胞表面上の Cl6 の量が減少すると更に顕著になる。分泌した IFNγの量は少ない（<1000 pg / ml）が、第一に、CAR の発現がより良くなることによって改善されるかもしれないし、及び第二に、非常に低い抗原発現の（初期の）腫瘍エスケープ変異体を抱えるクリニックの患者、又は僅かに残っている疾患に立ち向かうことに対して有益になるかもしれない。
【０３００】
図４Ａは、CAR 特異的抗原 C16 に対する、（二価の）非‐組合せ TCR-CARs と組合せ TCR-CARs の IFNγ分泌における効率を比較する。全ての組合せ CARs は、タイトレーションした抗原の広い範囲に渡って、抗原認識において、より効率的であった。より高用量の抗原では、二価の CARs は、「サイレンシングされた」非‐組合せ TCR-CAR を除いて、エフェクター機能がほぼ同等であった。CDR3α内の S109Q 点突然変異は、僅かに gp100(280-288)-抗原結合を損なうことが知られている（Knies et al., Oncotarget 2016）。「サイレンシングされた」組合せ TCR-CAR による、V ドメインの鎖間結合と抗原の結合それ自身は、この突然変異によって引き起こされる機能の喪失をはっきりと補う。重要なことに、低レベルの Cl6-発現（0.02 μg）では、機能的にサイレンシングされた又はサイレンシングされていない、のどちらであっても、組合せ TCR-CARs は、サイトカイン分泌に対して、非‐組合せ TCR-CARs よりも優れていた。
【０３０１】
図４Ｂは、ペプチドをタイトレーションした、IFNγ-分泌において、gp100(280-288) 抗原の認識が残留していることを示す。ここで、TCRαβ gp100 は陽性コントロールとして機能し、TCRαβ Cl6 はサイトカインのバックグラウンド分泌を推定する特異性コントロールとして機能した。非‐組合せ TCR-CAR は、高いペプチド負荷量で、A2-1-制限された抗原を依然として認識できる。サイレンシング変異 S109Q を導入すると、全く認識しないようになった。重要なことに、タンデムの順序で繋げた V-ドメイン（VH-VH-、VL-VL-）の鎖間組合せ配置によって、TCR gp100 の部分による同種抗原の認識は、完全に妨げられるようであった。従って、サイレンシング変異を導入することは、これらの CARs の TCR 部分の機能的不応答性を保証するための、並びに鎖ペアリングを安定化する足場として及び生理学的な T 細胞シグナリングのための完全長アダプター分子として、そのバックボーンを利用することに焦点を合わせるための、正にセーフガードとして、役立つかもしれない。
【０３０２】
実施例３：バイオマーカー表現型解析と組み合わせた、抗原をタイトレーションした増殖アッセイ
本実験の 1 日目に、新鮮な PBMCs を 1 人の健常なドナーの軟膜から単離した。1/4 の PBMCs から、MACS ソートを使用して CD14+ 細胞を分離し、残った PBMCs は凍結した。CD14+ 細胞は、1、3、6 日目に、IL-4 及び GM-CSF（1000U/ml）を投与することにより、iDCs に分化させた。7 日目に、Cl6 ivt-RNA とは無関係なものを、及び 2-0.002 μg RNA の範囲で用量依存的に Cl6 IVT-RNA を、iDCs にエレクトロポレーションした。凍結した PBMCs を同じ日に解凍し、MACS で CD8+ 細胞を選別した。事前に活性化（OKT3）をしないで、ナイーブ T 細胞（約 7x106個の細胞）に、続けて、図１に示すような古典的、一価、及び組合せ TCR-CARs を、エレクトロポレーションした。
【０３０３】
質を確保するために、8 日目に、CAR で改変した T 細胞をフロー・サイトメトリー染色で解析した。続いて、T 細胞を細胞内蛍光増殖マーカー CFSE（0.8μM）又は CPD-450（10μM）で標識した。その後、エレクトロポレーションした T 細胞と iDCs を、96 ウェル・プレートで 5 日間、10:1 の E:T 比（又はバイオマーカー表現型の場合は 3:1）で、2 連（duplicate）で共培養した。通常通り、2.5x104個の iDCs を、200μl の T 細胞培地の容量で、96 ウェル・プレートで、2.5x105 個の CAR をエレクトロポレーションした T 細胞と共培養した。5 日目に、培養細胞を APC-Cy7 で標識した CD4 又は CD8 抗体で、96ウェル・プレート中で、染色した。T 細胞の増殖は、フロー・サイトメトリーを介して、増殖中の娘細胞で、希釈によりフルオロフォア‐シグナルが左シフトすることをもって、検出した。非‐増殖性の親集団 G0 及び娘集団 G1-G7 の頻度は、フロー・サイトメトリー・ソフトウェア・パッケージ FlowJo v7.6.5 にある増殖ツールを使用して評価した。全娘 T 細胞の頻度は、全増殖性集団 G1-G7 の合計から計算した。T 細胞のバックグラウンド増殖を、無関係な完全長 gp100 をエレクトロポレーションした iDCs と一緒に培養した細胞、又は APCs 無しで播種した T 細胞、について評価した。増殖性の細胞を CD8 で染色して、それらを T 細胞として明確に同定した。或いは、APCs との共培養の 5 又は 6 日後に、増殖性の T 細胞を CD27、CD28、PD-1、CD95、CD45RA、及び CCR7 等のバイオマーカーで染色して、G0 にある元々ナイーブな非‐増殖性 T 細胞及び増殖中（evolving）の娘集団 G1-G7、の分化状態をそれぞれ定量化した。抗体及び対応するアイソタイプ対照をタイトレーションして、最適な信号対雑音比（signal-to-noise ratio）を推定した。FACS-Canto II-HTS システム（BD）で、96 ウェル・フォーマットで、前記アッセイを定量化した。
【０３０４】
図５Ａは、「弱い対照」としての一価の CAR C16、TCR CDR3 中にサイレンシング変異 S109Q を有する又は有しない組合せ TCR-CARs、及び参照 CAR としての古典的 scCAR C16、で改変した増殖性 T 細胞の密度プロットを示す。無関係な抗原 gp100 を負荷した iDCs に対して、非特異的な増殖はほとんど観察されなかった。同種抗原を負荷した APCs に対する増殖は、最大 6 つの異なる娘集団をもたらし、その頻度は容易に識別された（各プロットの右側に記載）。一価の CAR C16 を除く全ての CARs は、低い抗原密度でも高い増殖率を示した。最大頻度は、ほとんど全ての場合、G3 であった。
【０３０５】
図５Ｂは、親 T 細胞 G0 のままのものと増殖性 T 細胞 G1-G7 のパーセントを棒グラフでまとめたものである。抗原負荷が高い場合、G0 の大きな棒（40％）及び G1-G7 の、他の CARs と比較して、より小さな棒（60％）は、一価の CAR で改変した T 細胞の増殖傾向が弱いことを明確に示す。古典的 scCAR で改変した T 細胞は、IFNγ分泌アッセイの結果と一致して、組合せ CARs（80％）よりも幾分優れている（90％）ことが証明された。その結果、抗原の量が減ると、組合せ CAR で改変した T 細胞は、古典的 scCAR と少なくともほぼ同じ効率になった（ほぼ 80％）。この傾向から、抗原密度が更に低くなると、増殖能の点で、組合せ CARs が古典的 scCAR よりも更に優れたものになる、と推測されるかもしれない。
【０３０６】
図６は、左側に、古典的 scCAR（上）、組合せ Cα/β-CAR Cl6（中央）、又は組合せ TCR-CAR Cl6 silCDR3α（下）の何れかを利用した増殖性 T 細胞の頻度を示す。右側には、全親及び娘集団の中での補助受容体（coreceptor）CD8 及び共刺激受容体 CD27 に関して、非特異的結合（即ちアイソタイプ結合）を差し引いた平均強度が示されている。T 細胞を CD8-特異的抗体で染色して、組合せ及び古典的 CARs に関して、この補助受容体マーカーが中程度で及びほぼ等しくアップレギュレーションしていることを視覚化した。従って、CD8 染色は正規化マーカーとして機能し、この「不活性（inert）」分子が、ここで精査した全ての CARs の間で、均等に調節されていることを強調しても良い。並行して、種々の蛍光チャネルの、共刺激分子 CD27 に特異的な抗体で染色し、全ての CARs の親／娘集団 G0-G6 での、CD27 の調節を推定した。両方のマーカーは約 2 倍アップレギュレーションし、更に、CD8 の平均発現は全ての CARs でほぼ同じであるが、CD27 の平均発現は、組合せ CARs で、特に組合せ間 TCR-CAR Cl6で、古典的 CAR よりも、はるかに高かった。CD27 は、in vivo で T 細胞が長期間存在し続けることに関するバイオマーカーであり、CD27 の発現レベルは、僅かに増殖する T 細胞（G2-G4）についてはるかに高いプラトーに達した後に、G6 で基底レベルに低下した。このことから、組合せ CAR で改変した T 細胞は、僅かに増殖する集団において、より少なく最終分化したものであり、及びより少なく消耗した表現型（即ち、共刺激分子のダウンレギュレーション）であるかもしれなく、及び、それ故に、in vivo でより長く存在し続けるかもしれない、という仮説を立てることができるかもしれない。共培養した、組合せ CAR をエレクトロポレーションした T 細胞のサイズ（前方散乱）及び顆粒化（側方散乱）は、古典的 CAR の場合よりも低くすらあった（データは示していない）。従って、CD27 がより高くアップレギュレーションしたことは、細胞表面が増加することによって引き起こされるのではなく、従って、より大きな表面上により多くの CD27 があることによるものである。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【国際調査報告】
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