(57)【要約】  前立腺がんを有する患者に対する患者リスクを層別化する、及び、ホスホジエステラーゼ４Ｄバリアント７（ＰＤＥ４Ｄ７）リスクスコアに基づき患者に治療推奨を提供する方法が記載されている。また、ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアの分析及び決定のための診断キット及びコンピュータプログラムプロダクトも記載されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リスク層別化の方法であって、
ヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）、チューブリン−アルファ−１ｂ（ＴＵＢＡ１Ｂ）、ヒトプミリオＲＮＡ−結合ファミリーメンバー（ＰＵＭ１）、及びヒトＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）、並びにその組み合わせを含む群から選択される１つ又は複数の参照遺伝子のセットに関して、ホスホジエステラーゼ４Ｄバリアント７（ＰＤＥ４Ｄ７）を含む単一のマーカー遺伝子の正規化された遺伝子発現プロファイルを決定するステップと、
前記正規化された遺伝子発現プロファイルに基づき、スコアリング関数を用いて予後リスクスコアを決定するステップであり、前記スコアリング関数は、前立腺がんについてモニターされた対象から採取された生物学的試料に対する遺伝子発現プロファイルから得られた、ステップと、
を含む方法。
【請求項２】
前記予後リスクスコア及び第２のリスク決定に基づき、組み合わされた予後リスクスコアを決定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２のリスク決定がＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  （ＮＣＣＮ）の分類であることによってさらに特徴づけられる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記組み合わされた予後リスクスコアが、前立腺がんについてモニターされた対象から得られた回帰関数を用いて決定されることによってさらに特徴づけられる、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つの前記参照遺伝子が、ＨＰＲＴ１、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＰＵＭ１、及びＴＢＰのうち少なくとも２つ、又は少なくとも３つ、又は全てを含むことによってさらに特徴づけられる、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記予後リスクスコアが、唯一のマーカー遺伝子としてのＰＤＥ４Ｄ７に対する発現レベルを含む前記正規化された遺伝子発現プロファイルに基づくことによってさらに特徴づけられる、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子発現プロファイルを決定するステップが、生物学的試料から抽出されたＲＮＡに対してＲＴ−ｑＰＣＲを行うステップを含むことによってさらに特徴づけられる、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝子発現プロファイルを決定するステップが、ＰＤＥ４Ｄ７及び前記少なくとも１つの参照遺伝子のそれぞれのＣｑ値を決定することを含むことによって、及び、前記予後リスクスコアを決定するステップが、前記セットにおける前記参照遺伝子のそれぞれの値を使用して前記ＰＤＥ４Ｄ７の値を正規化すること、及び、正規化されたスコアの線形関数として前記リスクスコアを計算することを含むことによってさらに特徴づけられる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記予後リスクスコア又は前記組み合わされた予後リスクスコアに基づき、予め定義された少なくとも２つ又は少なくとも３つのリスクグループのセットの１つに対象を分類することによってさらに特徴づけられる、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
割り当てられたリスクグループに基づき対象に対する治療法を提案するステップであって、前記リスクグループのうち少なくとも２つが異なる治療法と関連している、ステップ、
前立腺手術前後の対象の疾患進行リスク予測を計算するステップ、及び
前立腺手術前後の対象の治療応答予測を計算するステップ、
のうち少なくとも１つをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
提案された前記治療法が、
ａ）少なくとも前立腺部分切除術、
ｂ）放射線治療、ホルモン療法、化学療法、及びその組み合わせから選択される積極的治療法、
ｃ）ａ）又はｂ）を行うことなく観察、
を含む群から選択されることによってさらに特徴づけられる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
割り当てられたリスクグループに基づく前記提案された治療法が、前記第２のリスク決定のみに基づく提案された治療法とは異なることによってさらに特徴づけられる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
コンピュータによって実行される場合に、請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の方法を行う指示を記憶するコンピュータプログラム。
【請求項１４】
診断キットであって、
ホスホジエステラーゼ４Ｄバリアント７（ＰＤＥ４Ｄ７）の発現レベルを決定するための少なくとも１つのプライマー及び／又はプローブ、
ヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）、チューブリン−アルファ−１ｂ（ＴＵＢＡ１Ｂ）、ヒトプミリオＲＮＡ−結合ファミリーメンバー（ＰＵＭ１）、及びヒトＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）、並びにその組み合わせを含む群から選択される少なくとも１つの参照遺伝子の遺伝子発現レベルを決定するための少なくとも１つのプライマー及び／又はプローブ、
任意的に、決定された前記発現レベルに基づきリスクスコアを計算するための指示であり、任意的に、コンピュータによって実行される場合に方法を行うコンピュータプログラムに記憶され、前記方法は、
前記少なくとも１つの参照遺伝子に関して、前記ホスホジエステラーゼ４Ｄバリアント７（ＰＤＥ４Ｄ７）の正規化された遺伝子発現プロファイルを決定するステップと、
前記正規化された遺伝子発現プロファイルに基づき、スコアリング関数を用いて予後リスクスコアを決定するステップと、
を含む、指示、及び
任意的に、前記予後リスクスコア及び第２のリスク決定に基づき、組み合わされた予後リスクスコアを計算するための指示であり、任意的に、コンピュータによって実行され得るコンピュータプログラムに記憶される指示、
を含む診断キット。
【請求項１５】
リスク層別化のための遺伝子発現プロファイルの使用であって、
対象から得られた生物学的試料の遺伝子発現プロファイルを決定するステップであり、前記遺伝子発現プロファイルは、ヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）、チューブリン−アルファ−１ｂ（ＴＵＢＡ１Ｂ）、ヒトプミリオＲＮＡ−結合ファミリーメンバー（ＰＵＭ１）、及びヒトＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）、並びにその組み合わせを含む群から選択される１つ又は複数の参照遺伝子のセットに関して正規化されたホスホジエステラーゼ４Ｄバリアント７（ＰＤＥ４Ｄ７）の発現レベルである、ステップと、
スコアリング関数を用いて、前記遺伝子発現プロファイルに基づき前記対象に対する予後リスクスコアを決定するステップであり、前記スコアリング関数は、前立腺がんについてモニターされた対象から採取された生物学的試料に対する遺伝子発現プロファイルから得られる、ステップと、
任意的に、前記予後リスクスコア及び第２のリスク決定に基づき、組み合わされた予後リスクスコアを決定するステップと、
を含む使用。
【請求項１６】
コンピュータプログラムであって、コンピュータ上で実行される場合に、前記コンピュータに
ヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）、チューブリン−アルファ−１ｂ（ＴＵＢＡ１Ｂ）、ヒトプミリオＲＮＡ−結合ファミリーメンバー（ＰＵＭ１）、及びヒトＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）、並びにその組み合わせを含む群から選択される１つ又は複数の参照遺伝子のセットに関して、ホスホジエステラーゼ４Ｄバリアント７（ＰＤＥ４Ｄ７）の正規化された遺伝子発現プロファイルを計算するステップと、
スコアリング関数を用いて、前記遺伝子発現プロファイルに基づき対象に対する予後リスクスコアを計算するステップであり、前記スコアリング関数は、任意的に、前立腺がんについてモニターされた対象から採取された生物学的試料に対する遺伝子発現プロファイルから得られる、ステップと、
任意的に、前記予後リスクスコア及び第２のリスク決定に基づき、組み合わされた予後リスクスコアを計算するステップと、
を含む方法を行わせる、コンピュータプログラム。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
がんは、ある細胞群が制御不能な増殖、浸潤、時折転移を示す疾患の一種である。これら３つのがんの悪性の特徴は、自己限定的で浸潤も転移もしない良性腫瘍からそれらを区別する。前立腺がん（ＰＣａ）は、男性において最も一般的に発生する皮膚以外の悪性腫瘍である。人口の高齢化により、ＰＣａの発生率は将来劇的に増加すると予想される。前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の血中濃度の決定、直腸診（ＤＲＥ）、及び経直腸的超音波分析（ＴＲＵＳ）によるルーチン診断は、非がん性の良性前立腺疾患の重大な過剰診断につながる。約２５０，０００の新たな症例を発見するために米国において毎年行われている約１００万件の前立腺生検のうち、約７５％が不必要に行われており、患者において実質的な合併症（尿路性敗血症、出血、及び尿閉等）も、高額な費用も発生している。生検が陰性であった男性１００人のうち少なくとも４人は副作用のために入院する可能性が高く、生検を受けた患者１０，０００人のうち９人は現在使用されている手技で死亡するリスクがある。
【０００２】
約２５０，０００の米国で毎年新たに検出されるＰＣａ症例のうち、約２００，０００の症例が、最初に、限局性疾患、すなわち前立腺臓器に限局するがんとして特徴づけられる。この状態は、放射線療法又は手術による前立腺の部分除去又は完全除去（前立腺摘除術）等、一次治療のアプローチによってある程度まで治癒可能である。しかし、これらの介入治療は、典型的には、重篤な副作用、特に前立腺切除術の非常に頻繁な結果として尿失禁及び／又は勃起不全を伴う。さらに、限局性ＰＣａに対するルーチン的に適用される治療は高価である。
【０００３】
米国では、診断時に臨床的に限局化された疾患を有する約２００，０００の男性の中で、５０％までが超低リスク又は低リスクのがんを有している。従って、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  （ＮＣＣＮ）は最近、そのＰＣａ治療ガイドラインを改訂し、そのような低リスクの疾患を有する患者に対する穏やかで便利な治療の代替案として、積極的監視（ＡＳ）を拡大した。適切な患者をＡＳに照会することによって、そのような患者のクオリティオブライフは、一次治療を受けた男性と比較して有意に改善され、ＡＳの５年費用は、患者ごとに有意に低いと報告されている。
【０００４】
さらに、所与の患者にとって好まれる治療法として手術が（ＡＳと比較して）選択される場合、患者の腫瘍の潜在的な高悪性度に従って手術の程度を層別化することが重要な利点である。例えば、神経温存の手術技術は、前立腺全摘除術の効力に関連する有害作用を最小限に抑えるために、低リスクと予測される疾患を有する男性により一般的に適用され得る。同様に、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ  （ＥＡＵ）の最新の前立腺がんガイドラインによると、手技が複雑で、時間がかかり、より制限された手技と比較して高い合併症発生率を伴うという事実にもかかわらず、高いリスクのがんが予測される場合には、拡大リンパ節郭清が推奨される。従って、制限の少ないリンパ節郭清ではリンパ節転移の約５０％を見逃すことを示したけれども、限局性前立腺がんを有する男性に対する治療管理は、個々の腫瘍の高悪性度の可能性を術前に非常に正確に予測して、各患者に最適なケアを提供することから恩恵を被るであろう。
【０００５】
積極的治療の選択肢（例えば、手術、放射線療法等）の副作用は、治療の代替案として積極的監視を選択することによって回避又は軽減することができる。しかし、積極的監視では腫瘍は治療されないため、積極的監視下で進行し得る患者数が、かなりの可能性で、積極的監視から積極的介入治療に切りかえることによって治癒されるということを確実にするために、疾患の進行の可能性は非常に低くあるべきである。疾患進行の患者リスクを決定する伝統的な方法は、多くの患者をＡＳではなく積極的介入治療のカテゴリーに割り当てる傾向があり、その結果、患者のクオリティオブライフを低下させ、そのような患者を侵襲的治療の有害な副作用に不必要にさらす。従って、患者リスクを層別化し、積極的監視対積極的介入治療を選択するかどうかについて患者に改善された推奨を提供する新たな方法が所望される。
【０００６】
特許文献１は、ホスホジエステラーゼ４ＤバリアントＰＤＥ４Ｄ７の発現レベルを決定することによって、悪性のホルモン感受性前立腺がんを診断又は検出する方法を開示している。この文献は、良性疾患と悪性疾患を効果的に識別するためのＰＤＥ−Ｉｎｄｅｘの使用も開示しており、ＰＤＥ４Ｄ７の発現が、内部標準としてのＰＤＥ４Ｄ５に対して正規化されている。
【０００７】
特許文献２は、ＰＤＥ４Ｄ７の発現レベルを決定することによって、ホルモン抵抗性前立腺がん対ホルモン感受性前立腺がんを診断する方法を記載している。ＰＤＥ４Ｄ７の発現レベルは、ＰＤＥ４Ｄ５であり得る参照遺伝子に対して正規化されている。
【０００８】
非特許文献１では、ＰＤＥ４Ｄ７がアンドロゲン感受性前立腺がん細胞において高発現である一方、アンドロゲン非感受性前立腺がん細胞においては有意に減少するという証拠が提示されており、アンドロゲン非感受性前立腺がんのバイオマーカーとしてのあり得る用途並びに治療可能性が示唆されている。
【０００９】
特許文献３は、遺伝子発現を調節するその能力を分析することによって化合物の生物活性を決定するための転写活性アッセイを記載している。あり得る標的発現産物にはＰＤＥ４Ｄアイソザイムがある。記載されたスクリーニングにおいて同定された化合物は、乳がんの治療において治療効果のある抗体であり得る。
【００１０】
特許文献４は、ホスホジエステラーゼ−４（ＰＤＥ４）の阻害剤、並びに、脳卒中、心筋梗塞、心血管炎症性疾患及び障害並びに中枢神経系障害の治療及び予防におけるその使用を記載している。
【００１１】
特許文献５は、アテローム性動脈硬化症の治療又は再狭窄の治療に使用することができる化合物の同定のための標的としての、ＰＤＥ４Ｄ、特にＰＤＥ４Ｄ５又はＰＤＥ４Ｄ７の使用を開示している。
【００１２】
特許文献６は、ホスホジエステラーゼ４Ｄの発現を調節するためのアンチセンス化合物、組成物、及び方法、並びに、ホスホジエステラーゼ４Ｄの発現に関連する疾患の治療のためのこれらの化合物の使用を記載している。
【００１３】
非特許文献２は、前立腺がんの進行におけるｃＡＭＰ及びｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼの役割に関する研究を記載している。この研究に関して、ＰＤＥ４Ｄ発現はがん組織において増加すると述べられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】ＷＯ２０１０／１３１１９４  Ａ１
【特許文献２】ＷＯ２０１０／１３１１９５  Ａ１
【特許文献３】ＥＰ１４７１１５３  Ａ２
【特許文献４】ＷＯ２０１０／０５９８３８  Ａ２
【特許文献５】ＷＯ２００４／０９０１５７  Ａ１
【特許文献６】ＵＳ２００３／２２０２７３  Ａ１
【特許文献７】Ｕ．Ｓ．６，７９４，１４１
【特許文献８】ＰＣＴ／ＵＳ０１／５０３４０
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｔｈｅ  ｃＡＭＰ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ−４Ｄ７  （ＰＤＥ４Ｄ７）  ｉｓ  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ａｎｄｒｏｇｅｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚｉｎｇ  ｃＡＭＰ  ａｔ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｏｆ  ＶＣａＰ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ”  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，  １１０（５）  １２７８−１２８７  （２０１４）
【非特許文献２】Ｍｅｒｋｌｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｃＡＭＰ  ａｎｄ  ｃＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ：  Ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ”  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ，  ２３（３）  ５０７−５１５，  （２０１１）
【非特許文献３】Ｒ．  Ｈ．  Ｄ．  Ｂｏｅｔｔｃｈｅｒ，  “Ｈｕｍａｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ４Ｄ７  （ＰＤＥ４Ｄ７）  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎ  ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ  ａｄｄｓ  ｔｏ  ａ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｐｏｓｔ−ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ，”  Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，  １１３，  １５０２−１５１１  （２０１５）
【非特許文献４】Ｓｐｅｒｌｉｎｇ，  “Ｒｅｖｉｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｌｅａｓｏｎ  ｇｒａｄｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  ｍａｋｅ  ｉｔ  ｍｏｒｅ  ａｃｃｕｒａｔｅ，”  Ｓｐｅｒｌｉｎｇ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃｅｎｔｅｒ，  ２０１６
【非特許文献５】Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０，  （１９９０）
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、前立腺がん又は前立腺がんの進行状態を診断、モニター、又は予後判定する方法に関する。特に、本発明は、ＰＤＥ４Ｄ７等のＰＤＥ４Ｄバリアントの発現レベルに基づき、前立腺がんを有する患者における療法選択のためのリスク層別化の方法、及び、前立腺がんを有する男性のリスクスコアを決定するために使用される診断キットに関する。ＰＤＥ４Ｄ７は、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）ファミリーの環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）（４）、アイソフォームＤ、バリアント７を指す。
【００１７】
例証的な実施形態の一態様によると、リスク層別化の方法は、ヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）、チューブリン−アルファ−１ｂ（ＴＵＢＡ１Ｂ）、ヒトプミリオＲＮＡ−結合ファミリーメンバー（ＰＵＭ１）、及びヒトＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）、並びにその組み合わせを含む群から選択される参照遺伝子のセットに関して、ホスホジエステラーゼ４Ｄバリアント７（ＰＤＥ４Ｄ７）を含む単一のマーカー遺伝子の正規化された遺伝子発現プロファイルを決定するステップを含む。当該方法は、正規化された遺伝子発現プロファイルに基づき、スコアリング関数を用いて予後リスクスコアを決定するステップをさらに含み、スコアリング関数は、前立腺がんについてモニターされた対象から採取された生物学的試料に対する遺伝子発現プロファイルから得られた。当該方法は、予後リスクスコア及び第２のリスク決定に基づき、組み合わされた予後リスクスコアを決定するステップをさらに含んでもよい。
【００１８】
別の態様によると、診断キットが、ＰＤＥ４Ｄ７を含む少なくとも１つのホスホジエステラーゼ４Ｄ（ＰＤＥ４Ｄ）バリアントの発現レベルを決定するための少なくとも１つのプライマー及び／又はプローブ、及び、少なくとも１つの参照遺伝子の遺伝子発現レベルを決定するための少なくとも１つのプライマー及び／又はプローブを含む。当該キットは、任意的に、決定された発現レベルに基づきリスクスコアを計算するための指示を含む。任意的に、指示は、コンピュータプログラムプロダクトに記憶され、コンピュータによって実行される場合に、少なくとも１つの参照遺伝子に関して、ホスホジエステラーゼ４Ｄバリアント７（ＰＤＥ４Ｄ７）の正規化された遺伝子発現プロファイルを決定するステップと、正規化された遺伝子発現プロファイルに基づき、スコアリング関数を用いて予後リスクスコアを決定するステップとを含む方法を行う。任意的に、指示が、コンピュータプログラムプロダクトに記憶され、コンピュータによって実行される場合に、予後リスクスコア及び第２のリスク決定に基づき、組み合わされた予後リスクスコアを計算する。
【００１９】
別の態様によると、前立腺がんを有する対象に対する治療推奨を提供する方法が、対象からの生物学的試料の遺伝子発現プロファイルを決定するステップを含む。遺伝子発現プロファイルは、ホスホジエステラーゼ４Ｄバリアント７（ＰＤＥ４Ｄ７）の発現レベルを含む。遺伝子発現プロファイルは、ＨＰＲＴ１、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＰＵＭ１、及びＴＢＰから選択される少なくとも１つの参照遺伝子の発現レベルを使用して正規化される。予後リスクスコアは、正規化された遺伝子発現プロファイルに基づき対象に対して決定される。対象は、予後リスクスコアに基づき、ＰＤＥ４Ｄ７リスクグループに分類される。治療推奨が、ＰＤＥ４Ｄ７リスクグループに基づき、対象に対して提供される。当該方法は、対象に対する予後リスクスコア及び第２のリスク決定に基づき、対象に対する組み合わされた予後リスクスコアを決定するステップも含み得る。対象は、組み合わされた予後リスクスコアに基づき、リスクグループに分類される。リスクグループに基づき、治療推奨が対象に提供される。
【００２０】
別の態様によると、コンピュータプログラムプロダクトが、指示を記憶する非一時的記録媒体を含み、指示は、コンピュータ上で実行される場合に、コンピュータに：ヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）、チューブリン−アルファ−１ｂ（ＴＵＢＡ１Ｂ）、ヒトプミリオＲＮＡ−結合ファミリーメンバー（ＰＵＭ１）、及びヒトＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）、並びにその組み合わせを含む群から選択される参照遺伝子のセットに関して、ホスホジエステラーゼ４Ｄバリアント７（ＰＤＥ４Ｄ７）の正規化された遺伝子発現プロファイルを計算するステップ；及び、スコアリング関数を用いて、遺伝子発現プロファイルに基づき対象に対する予後リスクスコアを計算するステップ；を含む方法を行わせる。スコアリング関数は、前立腺がんについてモニターされた対象から採取された生物学的試料に対する遺伝子発現プロファイルから得られたものであってもよい。当該方法は、予後リスクスコア及び第２のリスク決定に基づき、組み合わされた予後リスクスコアを計算するステップをさらに含んでもよい。
【００２１】
第２のリスク決定は、ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコア（予後リスクスコア）以外のリスク決定であり、例えば、グリーソンスコアに基づいてもよい。好ましくは、第２のリスク決定は、超低リスク（ＶＬＲ）、低リスク（ＬＲ）、好ましい中リスク（ｆａｖｏｒａｂｌｅ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｒｉｓｋ）（ＦＩＲ）、好ましくない中リスク（ｕｎｆａｖｏｒａｂｌｅ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｒｉｓｋ）（ＵＩＲ）、及び高リスク（ＨＲ）のうち１つ又は複数等、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＮＣＣＮ）の分類である。組み合わされた予後リスクスコアは、前立腺がんについてモニターされた対象から得られる回帰関数を用いて決定されてもよい。
【００２２】
上記の態様のいずれかの一部の実施形態では、遺伝子発現プロファイルは、前立腺がんの存在及び／又は非存在、及び／又は、前立腺がん進行状態を示す少なくとも１つの前立腺がんＰＤＥリスクスコア（予後リスクスコア）に変換される。ＰＤＥリスクスコアの導入によって、前立腺がんの診断又は予後判定における良好な予測が提供される。具体的には、ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアを使用して、このリスクスコアの測定されたレベルに基づき前立腺がんを有する対象を層別化することができ、そのような対象を、これらの対象に対する標準的治療である積極的治療（例えば、手術、放射線療法等）ではなく、積極的監視（ＡＳ）に置くかどうかを示すことができる。
【００２３】
遺伝子発現プロファイルは、１つ又は複数の他のＰＤＥ４Ｄバリアントに対する発現レベルをさらに含んでもよい。例えば、１つ又は複数の他のＰＤＥ４Ｄバリアントは、ＰＤＥ４Ｄ１、ＰＤＥ４Ｄ２、ＰＤＥ４Ｄ３、ＰＤＥ４Ｄ４、ＰＤＥ４Ｄ５、ＰＤＥ４Ｄ６、ＰＤＥ４Ｄ８、及びＰＤＥ４Ｄ９のうち１つ又は複数を含んでもよい。
【００２４】
遺伝子発現プロファイルは、個体の前立腺からの生検等、個体からの生物学的試料の遺伝子発現プロファイルであってもよい。
【００２５】
遺伝子発現プロファイルは、少なくとも１つの参照遺伝子の発現に対して少なくともＰＤＥ４Ｄ７バリアントの発現レベルを正規化することによって得られる正規化された遺伝子発現プロファイルであってもよい。当該方法は、少なくともＰＤＥ４Ｄ７バリアントの発現レベルを正規化する前に、試料における１つ又は複数の参照遺伝子の発現レベルを決定するステップを含んでもよい。
【００２６】
１つ又は複数の参照遺伝子は、ヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）、チューブリン−アルファ−１ｂ（ＴＵＢＡ１Ｂ）、ヒトプミリオＲＮＡ−結合ファミリーメンバー（ＰＵＭ１）、及びヒトＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）、並びにその組み合わせから、これらのうち少なくとも２つ、又は少なくとも３つ、又は全て等、選択することができる。
【００２７】
予後リスクスコアは、ＰＤＥ４Ｄ７に対する発現レベルを含む正規化された遺伝子発現プロファイルに基づいてもよい。
【００２８】
遺伝子発現レベルは、１つ又は複数のプライマー及び／又はプローブ、及び／又は、その１つ又は複数のセットを使用してｍＲＮＡ発現を検出することによって決定することができる。
【００２９】
遺伝子発現レベルは、増幅ベースの方法、及び／又はマイクロアレイ分析、及び／又はＲＮＡ配列決定によって決定することができる。
【００３０】
遺伝子発現プロファイルの決定には、生物学的試料から抽出されたＲＮＡにおいてリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ‐ｑＰＣＲ）を行うことが含まれてもよい。他の実施形態では、遺伝子発現レベルは、ＲＮＡ配列決定、（例えば、ゲル電気泳動によるエンドポイント分析を使用した）従来のＰＣＲ、又はマルチプレックス−ＰＣＲによって決定される。
【００３１】
ＲＴ−ｑＰＣＲの場合、遺伝子発現プロファイルの決定は、ＰＤＥ４Ｄ７及び少なくとも１つの参照遺伝子のそれぞれに対する閾値サイクル（Ｃｔ）値を決定することを含んでもよい。
【００３２】
予後リスクスコアの決定には、少なくとも１つの参照遺伝子のうちそれぞれの値を使用してＰＤＥ４Ｄ７値を正規化することが含まれてもよい。予後リスクスコアの決定は、正規化された値の線形関数等の関数としてリスクスコアを計算することを含んでもよい。関数は、生物学的試料の取得に続く患者の転帰に基づき得ることができる。
【００３３】
ＰＣＲは、ＨＰＲＴ１、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＰＵＭ１、及びＴＢＰから選択される参照遺伝子を測定するための少なくとも１つのプライマー及び／又はプローブを用いて行われてもよい。
【００３４】
対象に対する予後リスクスコアは、予め定義された範囲内の値であってもよい。
【００３５】
当該方法は、予後リスクスコア又は組み合わされた予後リスクスコアに基づき、予め定義されたリスクグループのセットのうちの１つに対象を分類するステップをさらに含んでもよい。少なくとも２つ又は少なくとも３つのリスクグループが、予後リスクスコア又は組み合わされた予後リスクスコアに基づきあってもよい。
【００３６】
当該方法は：ａ）割り当てられたリスクグループに基づき対象に対する治療法を提案するステップであって、リスクグループのうち少なくとも２つが異なるあり得る治療法と関連している、ステップ；ｂ）前立腺手術前後の対象の疾患進行リスク予測を計算するステップ；及びｃ）前立腺手術前後の対象の治療応答予測を計算するステップ；のうち少なくとも１つをさらに含み得る。治療法を提案する場合、提案された治療は：ａ）少なくとも前立腺部分切除術；ｂ）放射線治療、ホルモン療法、化学療法、及びその組み合わせから選択される積極的療法；及びｃ）ａ）又はｂ）を行うことなく観察；から選択することができる。提案された治療法には：前立腺手術、前立腺除去、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、及び限局又は拡大リンパ節郭清、又はその組み合わせが含まれてもよい。
【００３７】
割り当てられたリスクグループに基づく提案された治療法は、第２のリスク決定のみに基づき提案された治療法とは異なっていてもよい。
【００３８】
当該方法及びキットは、ＰＤＥ４Ｄ１、ＰＤＥ４Ｄ２、ＰＤＥ４Ｄ３、ＰＤＥ４Ｄ４、ＰＤＥ４Ｄ５、ＰＤＥ４Ｄ６、ＰＤＥ４Ｄ７、ＰＤＥ４Ｄ８、及びＰＤＥ４Ｄ９から選択される少なくとも１つのＰＤＥ４Ｄバリアントのコード配列に相補的且つハイブリダイズ可能な１つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブを含む核酸アレイを含んでもよく、さらに、本明細書において記載されるリスクスコアを決定するために、ＴＢＰ、ＨＰＲＴ１、ＰＵＭ１、及びＴＵＢＡ１Ｂから選択される参照遺伝子のうち少なくとも１つに相補的且つハイブリダイズ可能な１つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブを含んでもよい。
【００３９】
例証的な実施形態の別の態様は、リスク層別化のためのＰＤＥ４Ｄ７バリアント及び参照遺伝子の使用に関する。
【００４０】
本発明のさらなる態様は、前立腺がんを診断、モニター、又は予後判定するための、又は、前立腺がんの進行リスクを層別化するための、本明細書において記載される方法のステップを含むコンピュータ実装方法を指す。
【００４１】
本発明のさらなる態様は、指示が記憶される非一時的記録媒体を含むコンピュータプログラムプロダクトに関し、指示は、コンピュータ上で実行される場合に、コンピュータに：ヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）、チューブリン−アルファ−１ｂ（ＴＵＢＡ１Ｂ）、ヒトプミリオＲＮＡ−結合ファミリーメンバー（ＰＵＭ１）、及びヒトＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）、並びにその組み合わせを含む群から選択される参照遺伝子のセットに関して、ホスホジエステラーゼ４Ｄバリアント７（ＰＤＥ４Ｄ７）の正規化された遺伝子発現プロファイルを計算するステップ、及び、前立腺がんについてモニターされた対象から採取された生物学的試料に対する遺伝子発現プロファイルから得られるスコアリング関数を用いて、遺伝子発現プロファイルに基づき対象に対する予後リスクスコアを計算するステップを含む方法を行わせる。当該方法は、予後リスクスコア及び第２のリスク決定に基づき、組み合わされた予後リスクスコアを計算するステップをさらに含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】前立腺がんを有する患者における治療法選択のためのリスク層別化の方法を例示した流れ図である。
【図２】ＰＤＥ４Ｄ７の正規化された遺伝子発現プロファイル（左）及びＰＤＥ４Ｄ７リスクスコア変換（右）を示した図である。
【図３】全患者コホート（５０３人の患者を含む）の多変量Ｃｏｘ回帰分析後のハザード比（ＨＲ）及び９５％信頼区間（９５％ＣＩ）のフォレストプロットを示した図であり、ここで、試験した臨床エンドポイントは、手術後の生化学的再発（ＢＣＲ）までの時間である。
【図４】ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアグループに対する、前立腺切除術後の前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の再発までの時間のカプランマイヤー分析を示した図である。リスクスコアグループあたりの２０ヵ月の時間間隔ごとのリスクを有する患者（すなわち男性）の数及びハザード比のグループ単位の比較も示さている。
【図５】全患者コホート（５０３人の患者）の多変量Ｃｏｘ回帰分析後のハザード比（ＨＲ）及び９５％信頼区間（９５％ＣＩ）のフォレストプロットを示した図であり、ここで、試験した臨床エンドポイントは、手術後の生化学的再発（ＢＣＲ）までの時間である。
【図６】生化学的再発、救援放射線療法、救援アンドロゲン除去療法、臨床的再発、前立腺がん特異的死亡率、及び全死亡率を含む多数の臨床術後エンドポイントに対する、ハザード比及び９５％信頼区間（９５％ＣＩ）のフォレストプロットを示した図である。
【図７】ＮＣＣＮリスクグループ対ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアグループにおける５年生化学的再発（ＢＣＲ）のリスクのグラフを示した図である。
【図８】ＮＣＣＮリスクグループ対ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアグループにおける１０年臨床的再発（ＣＲ）のリスクのグラフを示した図である。
【図９】ＮＣＣＮリスクグループ対ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアグループにおける１０年前立腺がん特異的死亡率（ＰＣＳＭ）のリスクのグラフを示した図である。
【図１０】ＮＣＣＮリスクグループ対ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアグループにおける１０年全死亡率（ＯＭ）のリスクのグラフを示した図である。
【図１１】ＮＣＣＮ臨床リスクグループ対ＰＤＥ４Ｄ７リスクグループにおけるリスク進行マトリックスを例示した図である。
【図１２】ＮＣＣＮ好ましい中リスクグループ（１２８人の患者）における生化学的再発に対する生検グリーソンスコアのカプランマイヤー分析を示した図である。生検グリーソンスコアは、グリーソングレードグループ３＋３（図における下側の線）及び３＋４（図における上側の線）に分類される。また、ハザード比（ＨＲ）の対単位のリスクグループ比較も例示されている。
【図１３】ＮＣＣＮ好ましい中リスクグループ（１２８人の患者）における生化学的再発に対するＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアグループのカプランマイヤー分析を示した図である。また、ハザード比（ＨＲ）の対単位のリスクグループ比較も例示されている。
【図１４】ＮＣＣＮ好ましくない中及び高リスクグループ（１６４人の患者）における生化学的再発に対する生検グリーソンスコアのカプランマイヤー分析を示した図である。生検グリーソンスコアは、グリーソングレードグループ３＋３、３＋４、４＋３、及び≧４＋４に分類される。また、ハザード比（ＨＲ）の対単位のリスクグループ比較も例示されている。
【図１５】ＮＣＣＮ好ましくない中＆高リスクグループ（１６４人の患者）における生化学的再発に対するＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアグループのカプランマイヤー分析を示した図である。また、ハザード比（ＨＲ）の対単位のリスクグループ比較も例示されている。
【図１６】完全な５年間のフォローアップを伴う、４４９人の患者コホートのＨｏｓｍｅｒ−Ｌｅｍｅｓｈｏｗ検定後の分割表に基づき、手術後の５年生化学的再発を予測するためのＮＣＣＮ＆ＰＤＥ４Ｄ７スコアのロジスティック回帰モデルの較正プロットを示した図である。
【図１７】完全な５年間のフォローアップを伴う、４４９人の患者コホートのＨｏｓｍｅｒ−Ｌｅｍｅｓｈｏｗ検定後の分割表に基づき、手術後の５年生化学的再発を予測するためのＮＣＣＮ＆ＰＤＥ４Ｄ７スコアのロジスティック回帰モデルの較正プロットを示した図である。
【図１８】完全な５年間のフォローアップを伴う、患者コホート（４４９人の患者）におけるＮＣＣＮ＆ＰＤＥ４Ｄ７スコアのロジスティック回帰モデルの手術後の２年生化学的再発（ＢＣＲ）のＲＯＣ分析を示した図である。
【図１９】完全な５年間のフォローアップを伴う、患者コホート（４４９人の患者）におけるＮＣＣＮ＆ＰＤＥ４Ｄ７スコアのロジスティック回帰モデルの手術後の５年生化学的再発（ＢＣＲ）のＲＯＣ分析を示した図である。
【図２０】完全な１０年間のフォローアップを伴う、患者コホート（３７９人の患者）におけるＮＣＣＮ＆ＰＤＥ４Ｄ７スコアのロジスティック回帰モデルの手術後の１０年生化学的再発（ＢＣＲ）のＲＯＣ分析を示した図である。
【図２１】ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアの関数として、ＮＣＣＮグループにあたる予測されたリスクの分析を示した図であり、最も低いＮＣＣＮ臨床リスクグループでも、不均一な５年進行リスク（ＢＣＲ）の分布を明らかにしている。
【図２２】５年間の完全なフォローアップを伴う、患者サブコホートにおける無生化学的再発（ＢＣＲ）生存のカプランマイヤー分析の結果を示した図である（４４９人の患者）。４つのリスクカテゴリーを、生化学的再発を経験する５年確率ｐを計算したロジスティック回帰モデルに基づき定義した：リスクグループ１（０から＜０．２５；１３９人の患者）；リスクグループ２（０．２５から＜０．５；１７０人の患者）；リスクグループ３（０．５から＜０．７５；１１２人の患者）；リスクグループ４（０．７５から１．０；２８人の患者）。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
例証的な実施形態の態様は、前立腺がんに対する臨床的関連性を有する関心のあるバイオマーカー遺伝子（マーカー遺伝子又はＧＯＩ（関心のある遺伝子）とも呼ばれる）の遺伝子発現プロファイル、遺伝子発現シグネチャー、又は遺伝子発現パターンの同定及び使用に関する。特に、当該方法は、生物学的試料から得られたバイオマーカー遺伝子の転写物等、核酸の遺伝子発現分析を使用する。これらのマーカー遺伝子の発現解析は、特定の臨床転帰に達する患者のリスクを層別化するための前立腺がんＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアを提供する際に使用することができる。
【００４４】
より具体的には、ＰＤＥ４Ｄ７発現プロファイルに基づきリスクスコアを決定する方法が記載されており、これは、生化学的再発、臨床的再発、前立腺がん特異的死亡率、及び全死亡率を含む特定の術前及び術後のエンドポイントを発生する患者のリスクを層別化するための独特の手段を提供することがわかってきている。ＰＤＥリスクスコアは、前立腺がん患者の診断、予後判定、及び治療に関する個別化医療に非常に有用なパラメータを提供する。ＰＤＥリスクスコアは、単独で、又は、患者の個人的な病状又は病期に関する情報を提供する他の手段及び方法と組み合わせて使用されてもよい。
【００４５】
医師及び／又は病理医は、ＰＤＥリスクスコアを有利に使用して、患者を診断、同定、及び予後判定する他の方法において得られた結果を確証させることができる。従って、本発明によって提供される方法及び手段は、より良い診断、予後等を確立し、患者にとって最善の治療法を見つけ出す、及び、副作用により危険である不必要な手術又は他の治療を回避し、コスト削減をもたらすのに寄与する。
【００４６】
本明細書において使用される場合、「ＰＤＥ４Ｄトランスクリプトバリアント」、又は「ＰＤＥ４Ｄアイソフォーム」、又は「ＰＤＥ４Ｄバリアント」という用語は、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４ＤのＰＤＥ４Ｄスプライスバリアント、すなわちヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄ遺伝子、例えばＰＤＥ４Ｄ１、ＰＤＥ４Ｄ２、ＰＤＥ４Ｄ３、ＰＤＥ４Ｄ４、ＰＤＥ４Ｄ５、ＰＤＥ４Ｄ６、ＰＤＥ４Ｄ７、ＰＤＥ４Ｄ８、及びＰＤＥ４Ｄ９等のうちいずれかに関する。
【００４７】
「マーカー」、「マーカー遺伝子」、「ＧＯＩ」、又は「ＰＤＥ４Ｄバリアントマーカー」という用語は、交換可能に使用することができ、さらに、本明細書において先に記載した遺伝子、遺伝学的単位、又は遺伝子配列（ヌクレオチド配列又はアミノ酸若しくはタンパク質の配列）に関し、その発現レベルは、対照レベルと比較した場合、正常組織における発現と比較した場合、悪性又は良性の前立腺がん細胞若しくは組織又はそのような細胞、組織若しくはその一部や断片を含む任意のタイプの試料において増加する又は減少する。この用語は、また、上記の遺伝学的単位又は遺伝子配列の任意の発現産物、特に、ＰＤＥ４ＤバリアントのｍＲＮＡ転写物、ＰＤＥ４Ｄバリアント転写物によってコードされるポリペプチド又はタンパク質又はその断片、並びに、本明細書において先に記載したその相同誘導体も指す。特に、「マーカー」、「マーカー遺伝子」、「ＧＯＩ」、又は「ＰＤＥ４Ｄバリアントマーカー」という用語は、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４ＤのＰＤＥ４Ｄスプライスバリアント、すなわちヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄ遺伝子、例えばＰＤＥ４Ｄ１、ＰＤＥ４Ｄ２、ＰＤＥ４Ｄ３、ＰＤＥ４Ｄ４、ＰＤＥ４Ｄ５、ＰＤＥ４Ｄ６、ＰＤＥ４Ｄ７、ＰＤＥ４Ｄ８、及びＰＤＥ４Ｄ９のいずれかを指す。
【００４８】
「ホスホジエステラーゼ４Ｄ１」又は「ＰＤＥ４Ｄ１」という用語は、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄのスプライスバリアント１、すなわちヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄ１遺伝子、例えば、ＮＣＢＩ参照配列において定義される配列：ＮＭ＿００１１９７２２２．１、具体的には、上記のＰＤＥ４Ｄ１転写物のＮＣＢＩ参照配列の配列に対応する配列番号：１において記載されるヌクレオチド配列に関し、また、例えばＰＤＥ４Ｄ１ポリペプチドをコードするＮＣＢＩタンパク質受入参照配列において定義されるタンパク質配列ＮＰ＿００１１８４１５１．１に対応する配列番号：２において記載される対応するアミノ酸配列にも関する。「ホスホジエステラーゼ４Ｄ１」又は「ＰＤＥ４Ｄ１」という用語はまた、プライマー対であるＰＤＥ１Ｄ１Ｄ２＿フォワード（配列番号：３）及びＰＤＥ１Ｄ１Ｄ２＿リバース（配列番号：４）によって生成することができ、プローブである配列番号：５によって検出することができるアンプリコンにも関する。
【００４９】
「ホスホジエステラーゼ４Ｄ２」又は「ＰＤＥ４Ｄ２」という用語は、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄのスプライスバリアント２、すなわちヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄ２遺伝子、例えば、ＮＣＢＩ参照配列において定義される配列：ＮＭ＿００１１９７２２１．１、具体的には、上記のＰＤＥ４Ｄ２転写物のＮＣＢＩ参照配列の配列に対応する配列番号：６において記載されるヌクレオチド配列を指し、また、例えばＰＤＥ４Ｄ２ポリペプチドをコードするＮＣＢＩタンパク質受入参照配列において定義されるタンパク質配列ＮＰ＿００１１８４１５０．１に対応する配列番号：７において記載される対応するアミノ酸配列にも関する。
【００５０】
「ホスホジエステラーゼ４Ｄ３」又は「ＰＤＥ４Ｄ３」という用語は、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄのスプライスバリアント３、すなわちヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄ３遺伝子、例えば、ＮＣＢＩ参照配列において定義される配列：ＮＭ＿００６２０３．４、具体的には、上記のＰＤＥ４Ｄ３転写物のＮＣＢＩ参照配列の配列に対応する配列番号：８において記載されるヌクレオチド配列を指し、また、例えばＰＤＥ４Ｄ３ポリペプチドをコードするＮＣＢＩタンパク質受入参照配列において定義されるタンパク質配列ＮＰ＿００６１９４．２に対応する配列番号：９において記載される対応するアミノ酸配列にも関する。
【００５１】
「ホスホジエステラーゼ４Ｄ４」又は「ＰＤＥ４Ｄ４」という用語は、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄのスプライスバリアント４、すなわちヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄ４遺伝子、例えば、ＮＣＢＩ参照配列において定義される配列：ＮＭ＿００１１０４６３１．１、具体的には、上記のＰＤＥ４Ｄ４転写物のＮＣＢＩ参照配列の配列に対応する配列番号：１０において記載されるヌクレオチド配列を指し、また、例えばＰＤＥ４Ｄ４ポリペプチドをコードするＮＣＢＩタンパク質受入参照配列において定義されるタンパク質配列ＮＰ＿００１０９８１０１．１に対応する配列番号：１１において記載される対応するアミノ酸配列にも関する。
【００５２】
「ホスホジエステラーゼ４Ｄ５」又は「ＰＤＥ４Ｄ５」という用語は、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄのスプライスバリアント５、すなわちヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄ５遺伝子、例えば、ＮＣＢＩ参照配列において定義される配列：ＮＭ＿００１１９７２１８．１、具体的には、上記のＰＤＥ４Ｄ５転写物のＮＣＢＩ参照配列の配列に対応する配列番号：１２において記載されるヌクレオチド配列を指し、また、例えばＰＤＥ４Ｄ５ポリペプチドをコードするＮＣＢＩタンパク質受入参照配列において定義されるタンパク質配列ＮＰ＿００１１８４１４７．１に対応する配列番号：１３において記載される対応するアミノ酸配列にも関する。「ホスホジエステラーゼ４Ｄ５」又は「ＰＤＥ４Ｄ５」という用語はまた、プライマー対であるＰＤＥ４Ｄ５＿フォワード（配列番号：１４）及びＰＤＥ４Ｄ５＿リバース（配列番号：１５）によって生成することができ、プローブである配列番号：１６によって検出することができるアンプリコンにも関する。
【００５３】
「ホスホジエステラーゼ４Ｄ６」又は「ＰＤＥ４Ｄ６」という用語は、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄのスプライスバリアント６、すなわちヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄ６遺伝子、例えば、ＮＣＢＩ参照配列において定義される配列：ＮＭ＿００１１９７２２３．１、具体的には、上記のＰＤＥ４Ｄ６転写物のＮＣＢＩ参照配列の配列に対応する配列番号：１７において記載されるヌクレオチド配列を指し、また、例えばＰＤＥ４Ｄ６ポリペプチドをコードするＮＣＢＩタンパク質受入参照配列において定義されるタンパク質配列ＮＰ＿００１１８４１５２．１に対応する配列番号：１８において記載される対応するアミノ酸配列にも関する。
【００５４】
「ホスホジエステラーゼ４Ｄ７」又は「ＰＤＥ４Ｄ７」という用語は、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄのスプライスバリアント７、すなわちヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄ７遺伝子、例えば、ＮＣＢＩ参照配列において定義される配列：ＮＭ＿００１１６５８９９．１、具体的には、上記のＰＤＥ４Ｄ７転写物のＮＣＢＩ参照配列の配列に対応する配列番号：１９において記載されるヌクレオチド配列を指し、また、例えばＰＤＥ４Ｄ７ポリペプチドをコードするＮＣＢＩタンパク質受入参照配列において定義されるタンパク質配列ＮＰ＿００１１５９３７１．１に対応する配列番号：２０において記載される対応するアミノ酸配列にも関する。「ホスホジエステラーゼ４Ｄ７」又は「ＰＤＥ４Ｄ７」という用語はまた、プライマー対であるＰＤＥ４Ｄ７＿フォワード（配列番号：２１）及びＰＤＥ４Ｄ７＿リバース（配列番号：２２）によって生成することができ、プローブである配列番号：２３によって検出することができるアンプリコンにも関する。
【００５５】
ＰＤＥ４Ｄ７ポリペプチドはまた、プライマー対であるＰＤＥ４Ｄ７−２＿フォワード（配列番号：２４）及びＰＤＥ４Ｄ７＿リバース（配列番号：２５）を用いて検出することもでき、プローブである配列番号：２６によって検出することもできる。
【００５６】
「ホスホジエステラーゼ４Ｄ８」又は「ＰＤＥ４Ｄ８」という用語は、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄのスプライスバリアント８、すなわちヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄ８遺伝子、例えば、ＮＣＢＩ参照配列において定義される配列：ＮＭ＿００１１９７２１９．１、具体的には、上記のＰＤＥ４Ｄ８転写物のＮＣＢＩ参照配列の配列に対応する配列番号：２７において記載されるヌクレオチド配列に関し、また、例えばＰＤＥ４Ｄ８ポリペプチドをコードするＮＣＢＩタンパク質受入参照配列において定義されるタンパク質配列ＮＰ＿００１１８４１４８．１に対応する配列番号：２８において記載される対応するアミノ酸配列にも関する。
【００５７】
「ホスホジエステラーゼ４Ｄ９」又は「ＰＤＥ４Ｄ９」という用語は、ヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄのスプライスバリアント９、すなわちヒトホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｄ９遺伝子、例えば、ＮＣＢＩ参照配列において定義される配列：ＮＭ＿００１１９７２２０．１、具体的には、上記のＰＤＥ４Ｄ９転写物のＮＣＢＩ参照配列の配列に対応する配列番号：２９において記載されるヌクレオチド配列に関し、また、例えばＰＤＥ４Ｄ９ポリペプチドをコードするＮＣＢＩタンパク質受入参照配列において定義されるタンパク質配列ＮＰ＿００１１８４１４９．１に対応する配列番号：３０において記載される対応するアミノ酸配列にも関する。「ホスホジエステラーゼ４Ｄ９」又は「ＰＤＥ４Ｄ９」という用語はまた、プライマー対であるＰＤＥ４Ｄ９＿フォワード（配列番号：３１）及びＰＤＥ４Ｄ９＿リバース（配列番号：３２）によって生成することができ、プローブである配列番号：３３によって検出することができるアンプリコンにも関する。
【００５８】
「ＰＤＥ４Ｄ１」、「ＰＤＥ４Ｄ２」、「ＰＤＥ４Ｄ３」、「ＰＤＥ４Ｄ４」、「ＰＤＥ４Ｄ５」、「ＰＤＥ４Ｄ６」、「ＰＤＥ４Ｄ７」、「ＰＤＥ４Ｄ８」、及び「ＰＤＥ４Ｄ９」という用語はまた、それぞれＰＤＥ４Ｄ１、ＰＤＥ４Ｄ２、ＰＤＥ４Ｄ３、ＰＤＥ４Ｄ４、ＰＤＥ４Ｄ５、ＰＤＥ４Ｄ６、ＰＤＥ４Ｄ７、ＰＤＥ４Ｄ８、及びＰＤＥ４Ｄ９に対して高度の相同性を示すヌクレオチド配列も含み、例えば、核酸配列が、それぞれ配列番号：１、６、８、１０、１２、１７、１９、２７、又は２９において記載されている配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるか、又は、アミノ酸配列が、それぞれ配列番号：２、７、９、１１、１３、１８、２０、２８、又は３０において記載されている配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるか、又は、アミノ酸配列をコードする核酸配列が、配列番号：２、７、９、１１、１３、１８、２０、２８、又は３０において記載されている配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるか、又は、核酸配列によってコードされるアミノ酸配列が、配列番号：１、６、８、１０、１２、１７、１９、２７、又は２９において記載されている配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である。
【００５９】
本明細書において使用される場合「発現レベル」という用語は、既定数の細胞又は既定された組織の一部から導き出せるＰＤＥ４Ｄバリアント転写物及び／又はＰＤＥ４Ｄタンパク質の量、特に、標準的な核酸（例えばＲＮＡ等）又はタンパク質の抽出手順において得られるＰＤＥ４Ｄバリアント転写物及び／又はＰＤＥ４Ｄバリアントタンパク質の量を指す。適した抽出方法は、当業者には既知である。
【００６０】
本明細書において使用される場合「対照レベル」（又は「対照状態」）という用語は、例えば、非癌性の、正常な又は良性の前立腺腫瘍、進行性前立腺がん等の状況又は病状が知られている１人又は複数の対象から以前に収集及び貯蔵された１つ又は複数の試料を使用することによって、試験試料と同時に、及び／又は、類似若しくは同等の条件下で決定され得る発現レベルを指す。「病状」又は「癌の病状」という用語は、非癌性の細胞状態から末期の癌性の細胞状態（この状態を含む）の間の任意の状態又はタイプの細胞又は分子の状況に関する。特に、この用語は、非癌性の細胞状態（この状態を含まない）から末期の癌性の細胞状態（この状態を含む）の間の生物における様々な癌性の増殖／発達の段階又は腫瘍発達のレベルを含む。そのような発達の段階は、ＵＩＣＣによって定義されている悪性腫瘍のＴＮＭ（腫瘍、リンパ節、転移）分類系の全てのステージ、例えばステージ０及びＩ乃至ＩＶを含み得る。この用語は、また、ＴＮＭのステージ０よりも前のステージ、例えば、当業者には既知のがんバイオマーカーが修飾を受けた発現又は発現パターンを示す発達段階等も含む。
【００６１】
上述した発現レベルは、本明細書において先に記載したＰＤＥ４Ｄバリアントの発現レベルであってもよい。或いは又は加えて、発現レベルはまた、細胞内で発現するいかなる他の適した遺伝子又は遺伝的要素の発現レベル、例えば、ヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）、チューブリン−アルファ−１ｂ（ＴＵＢＡ１Ｂ）、ヒトプミリオＲＮＡ−結合ファミリーメンバー（ＰＵＭ１）、及びヒトＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）のうち１つ又は複数等、例えば１つの参照遺伝子の発現レベル又は参照遺伝子の組み合わせの発現レベルであってもよい。一実施形態では、発現レベルは、参照遺伝子の組み合わせに対して決定される。
【００６２】
「癌性の」という用語は、本明細書において記載される癌性の病状を指す。「非癌性の」という用語は、良性の増殖も悪性の増殖も検出することができない状況を指す。検出のための適した手段は、当該技術分野において既知である。
【００６３】
「前立腺がん」という用語は、男性生殖器系における前立腺のがんを指し、これは、前立腺の細胞が突然変異し、制御不能に増殖し始めると発生する。典型的には、前立腺がんは、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）レベルの上昇に関連づけられる。本発明の一実施形態では、「前立腺がん」という用語は、４．０を上回るＰＳＡレベルを示すがんに関する。別の実施形態では、この用語は、２．０を上回るＰＳＡレベルを示すがんに関する。「ＰＳＡレベル」という用語は、血中ＰＳＡ濃度（単位はｎｇ／ｍｌ）を指す。
【００６４】
「非進行性の前立腺がん状態」という用語は、個体の試料が「生化学的再発」及び／又は「臨床的再発」を示すパラメータ値を示さないということを意味する。
【００６５】
「進行性の前立腺がん状態」という用語は、個体の試料が「生化学的再発」及び／又は「臨床的再発」を示すパラメータ値を示すということを意味する。
【００６６】
「生化学的再発」という用語は、一般的に、試料中の前立腺がん細胞の存在を示す増加したＰＳＡの再発性の生物学的値を指す。しかし、そのような存在の検出において使用することができる、又は、そのような存在の疑いを生じさせる他のマーカーを使用することもまた可能である。
【００６７】
「臨床的再発」という用語は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングを使用して測定される腫瘍細胞の存在を示す臨床徴候の存在を指す。
【００６８】
（同義的に使用され得る）「増加した」、又は「増加した発現レベル」、又は「増加する発現レベル」、又は「発現レベルの増加」という用語は、分析されることになる状況、例えば、患者の試料から導き出せる状況と、正常な対照レベル又は任意の適した前立腺腫瘍又は当業者には既知のがんのステージから導き出せる癌性の対照レベルであり得る基準点の間の発現レベルにおける上昇を表している。ＰＤＥ４Ｄバリアント遺伝子の発現が、例えば分析されることになる生物学的試料において、対照レベルと比較して、例えば５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％若しくは５０％を超える分だけ、又は、対照レベルと比較して、少なくとも０．１倍、少なくとも０．２倍、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍若しくはそれ以上異なる、すなわち高い場合、発現レベルは「増加した」と思われる。対照レベルは、本明細書において先に記載したように、正常な対照レベル又は癌性の対照レベルであってもよい。癌性の対照レベルとの比較が実行されることになる場合、正常な対照レベルとのさらなる比較が好ましい。そのようなさらなる比較は、変化の傾向の決定を可能にし、例えば、発現レベルの増加の大きさを観察することができ、及び／又は、対応する結論を引き出すことができる。そのようなさらなる比較は、良性の前立腺腫瘍、又は、健康な個体から得られる健康な組織若しくは試料に対する比較であり得る。
【００６９】
「前立腺がんをモニターする」という用語は、本明細書において使用される場合、例えば、治療手技の間又は特定の期間の間の、典型的には、２か月、３か月、４か月、６か月、１年、２年、３年、５年、１０年若しくは任意の他の期間の間の、診断又は検出された前立腺がんの疾患又は障害の付随物（ａｃｃｏｍｐａｎｉｍｅｎｔ）に関する。「付随物」という用語は、試料におけるＰＤＥ４Ｄバリアントマーカーの発現レベルを、本明細書において先に記載された正常な対照レベル、特に、進行性の腫瘍対照、非進行性の腫瘍対照、若しくは健康な対照から得られる対照発現レベルと比較することによって、又は、確立された、例えば独立して確立された前立腺がん細胞若しくは細胞株、又は、例えば毎週、２週毎、毎月、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２か月毎、１．５年毎、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０年毎等、任意のタイプの周期的な時間セグメントにおける、例えばそれぞれ、２週間、３週間、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２か月間、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、若しくは２０年間等の任意の期間の間の細胞株の発現レベルと比較することによって、本明細書において先に記載された疾患の状態、特にこれらの疾患の状態の変化が検出され得ることを意味する。さらなる対照レベルを生じさせる確立された、例えば独立して確立された前立腺がん細胞又は細胞株は、がん発達の異なるステージ、例えば、ＴＮＭ分類系のステージ０及びＩ乃至ＩＶに対応する試料から得られてもよい。一実施形態では、上記の用語は、診断された前立腺がん、特に進行性又は非進行性の前立腺がんの付随物に関する。モニターは、さらなる遺伝子又は遺伝的要素、例えば参照遺伝子の発現の検出も含んでよい。
【００７０】
本明細書において使用される場合「前立腺がんを予後判定する」という用語は、例えば、特定の期間中、治療中、又は治療後等の、診断又は検出された前立腺がんの経過又は転帰の予測を指す。この用語はまた、病気からの回復又は生存の見込みの決定、並びに、予想される対象の生存期間の予測も指す。予後は、具体的には、６か月、１年、２年、３年、５年、１０年、又は任意の他の期間等、将来にわたる期間中の対象の生存についての可能性を確立することを含んでもよい。
【００７１】
「診断する」及び「予後判定する」という用語はまた、予測及び可能性の分析も含むように意図されている。従って、マーカーとしてのＰＤＥ４Ｄバリアントは、疾患の監視等の診断基準又は治療的介入を含む治療法について決断する際に臨床的に使用されてもよい。本発明によると、対象の状態を検査するための中間結果が提供されてもよい。そのような中間結果は、対象が病気を患っていることを医師、看護師、又は他の専門家が診断するのに寄与するさらなる情報と組み合わせることができる。或いは、本発明は、対象由来の組織におけるがん細胞を検出し、対象が病気を患っていることを診断するのに有用な情報を医師に提供するために使用することができる。
【００７２】
本明細書において使用される場合「参照遺伝子」又は「対照遺伝子」という用語は、任意の適した遺伝子、例えば、好まれる生物における、任意の着実に発現し且つ連続的に検出可能な遺伝子、遺伝子産物、発現産物、タンパク質、又はタンパク質バリアント等を指す。この用語はまた、発現タンパク質、ペプチド、ポリペプチド等の遺伝子産物、並びに、その改変バリアントも含む。従って、参照遺伝子という用語は、特に明記しない限り、参照遺伝子から得られる参照タンパク質も含む。また、参照遺伝子から導き出せる全ての種類の転写物、並びに、その改変体又はそれに関連がある二次パラメータも包含される。或いは又は加えて、例えば、代謝濃度、細胞のサイズ等、他の参照パラメータも参照目的のために使用されてもよい。
【００７３】
発現は、同じ試料において実行されてもよく、すなわち、ＰＤＥ４Ｄバリアントのレベル及び参照遺伝子のレベルは、同じ試料において決定される。試験が同じ試料において実行される場合、本明細書において記載される単一検出又は多重検出のアプローチが行われてもよい。多重検出を行うために、プライマー及び／又はプローブのオリゴヌクレオチドの濃度は変更されてもよい。さらに、緩衝液、イオン等のようなさらなる成分の濃度及び存在が変更されてもよく、例えば、製造者の指示と比較して増加又は減少されてもよい。
【００７４】
特定の実施形態では、２つ以上の参照遺伝子又は着実に発現する遺伝子の発現が決定され得る。例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、３０又はそれ以上の参照遺伝子の発現が決定されてもよい。そのような測定の結果は、平均発現指数を得るために組み合わせることができるか又は個別に計算することができる。さらに、参照遺伝子発現のパターンを、その後のステップに対する基準として決定及び／又は使用することができる。そのようなパターンは、特定のがんにおける、特に前立腺がんの病期又は病状における遺伝子の既知の発現挙動に基づいていてもよい。
【００７５】
前立腺がん又は前立腺がんの進行状態が診断、モニター、又は予後判定されることになる患者又は個人等の対象は、例えばヒト等、哺乳動物等の動物である。
【００７６】
ＰＤＥ４Ｄバリアントのレベルは、本明細書において記載されるように、核酸レベル、タンパク質レベル、又は活性レベルで決定され得る。好ましいのは、１つ又は複数のＰＤＥ４Ｄバリアントの転写物及び／又はタンパク質の量の決定である。加えて、試料における参照遺伝子のレベルが決定され得る。
【００７７】
一実施形態では、本明細書において述べられる診断、モニター、予後判定、リスクの層別化、及び推奨の提供は、個体から得られる生物学的試料において実行されることになる。「生物学的試料」又は「個体から得られる試料」という用語は、当業者には既知の適した方法を介して個体から得られるいかなる生物学的材料も指す。使用される生物学的試料は、例えば核酸（特にＲＮＡ）又はタンパク質が保存される方法等、臨床的に許容される様式で収集することができる。
【００７８】
１つ又は複数の生物学的試料は、体組織及び／又は血液、汗、及び尿等の体液を含んでもよいが、それらに限定されない。さらに、生物学的試料は、がん性上皮細胞又はがん性であると疑われる組織から得られる上皮細胞等の上皮細胞から得られる細胞抽出物、又はそれらを含む細胞集団を含有してもよい。生物学的試料は、腺組織から得られる細胞集団を含有してもよく、例えば、試料は、雄個体の前立腺から得ることができる。加えて、必要に応じて、細胞は、得られた体組織及び体液から精製され、次に、生物学的試料として使用されてもよい。一部の実施形態では、試料は、組織試料、尿試料、尿沈渣試料、血液試料、唾液試料、精液試料、循環腫瘍細胞を含む試料、細胞外小胞、前立腺分泌エキソソームを含有する試料、又は細胞株若しくはがん細胞株である。
【００７９】
一実施形態では、生検試料又は切除試料を得る及び／又は使用することができる。そのような試料は、細胞又は細胞可溶化物を含んでもよい。
【００８０】
特定の実施形態において、生物学的試料の内容物はまた、濃縮ステップにも供され得る。例えば、試料は、例えば磁性粒子で官能基を持たされた、例えば前立腺細胞等の特定の細胞タイプの細胞膜又は細胞小器官に特異的なリガンドと接触させてもよい。その後、磁性粒子によって濃縮された材料は、本明細書において先に又は後に記載されるように、検出及び分析ステップに使用することができる。
【００８１】
さらに、例えば腫瘍細胞等の細胞は、例えば血液、尿等の流体又は液体試料の濾過プロセスを介して濃縮することができる。そのような濾過プロセスはまた、本明細書において先に記載されたリガンド特異的相互作用に基づく濃縮ステップと組み合わせることができる。
【００８２】
前立腺がん患者の管理は、リスクプロファイリングに強く依存している。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＮＣＣＮ）は、治療前のパラメータに基づき５つのリスクカテゴリー（超低リスク、ＶＬＲ；低リスク、ＬＲ；好ましい中リスク、ＦＩＲ；好ましくない中リスク、ＵＩＲ；及び、高リスク、ＨＲ）を定義しており、これらは表１及び２において例示されている。
【００８３】
【表１】
2020500527.tif 000002
【００８４】
【表２】
2020500527.tif 000003
超低リスクから、低リスク、中リスク、高リスク、及び超高リスクに及ぶリスクグループ毎に、いくつかの介入治療の選択肢がガイドラインにおいて提示されている。この患者リスク評価は、行うのが容易であり、一般的に入手可能な臨床データに基づいているけれども、その単純さもまた、その主な欠点に寄与しており、この欠点は、臨床リスクグループ化に関係なく、患者１人あたりの個々のリスクではなく非重複グループへの患者の分類にある。結果として、推奨される治療が１つのある患者には理想的であり得るが、同じ臨床リスクグループにおける別の患者には適していない可能性がある。従って、本発明の一態様は、ＰＤＥ４Ｄ７のような分子マーカーを使用して、より層別化された治療選択のための臨床リスクの記載に直交の且つ独立した情報を加えることである。
【００８５】
図１を参照すると、前立腺がんを有する患者における治療選択のためのリスク層別化の方法が例示されている。当該方法は、Ｓ１００において始まる。
【００８６】
Ｓ１０２において、生物学的試料が、前立腺がんと診断された第１の患者（個人）のセットのそれぞれから得られ、それらの患者に対しては、生物学的試料を得た後、少なくとも１年、又は少なくとも２年、又は約５年等の期間にわたって前立腺がんのモニタリングを行った。
【００８７】
Ｓ１０４において、少なくとも１つのマーカー遺伝子（例えばＰＤＥ４Ｄ７等）に対する遺伝子発現プロファイルが、例えば、それぞれの生物学的試料から抽出されたＲＮＡにおいてＲＴ−ｑＰＣＲ（リアルタイム定量的ＰＣＲ）を行うことによって、第１の患者のセットから得られた生物学的試料のそれぞれに対して得られる。例証的な発現プロファイルは、ＨＰＲＴ１、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＰＵＭ１、及び／又はＴＢＰ等、参照遺伝子のセットのそれぞれに対する１つ又は複数の値を使用して正規化することができるＰＤＥ４Ｄ７の発現レベル（例えば値）を含む。一実施形態では、使用される唯一のマーカー遺伝子はＰＤＥ４Ｄ７であり、使用される唯一の参照遺伝子は、ＨＰＲＴ１、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＰＵＭ１、及びＴＢＰを含む群、例えば、これらの参照遺伝子の少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、又は少なくとも３つ、又は全てから選択される。
【００８８】
Ｓ１０６において、予後リスクスコアを割り当てるためのスコアリング関数が、第１の患者のセットに対して得られた生物学的試料の少なくとも一部について得られたマーカー遺伝子（ＰＤＥ４Ｄ７）に対する遺伝子発現プロファイル及びモニタリングから得られたそれぞれの結果に基づき決定される。
【００８９】
Ｓ１０８において、生物学的試料が、患者（個人）から得られる。患者は、新たな患者又は第１のセットの１人であってもよい。
【００９０】
Ｓ１１０において、遺伝子発現プロファイルが、少なくとも１つのマーカー遺伝子（例えばＰＤＥ４Ｄ７等）に対して、例えば、生物学的試料においてＰＣＲを行うことによって得られる。遺伝子発現プロファイルは、ホスホジエステラーゼ４Ｄバリアント７（ＰＤＥ４Ｄ７）及び１つ又は複数の参照遺伝子に対する遺伝子発現レベルを含む。適した参照遺伝子には、ＨＰＲＴ１、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＰＵＭ１、及びＴＢＰが含まれる。一実施形態において、使用される唯一のマーカー遺伝子はＰＤＥ４Ｄ７であり、使用される唯一の参照遺伝子は、ＨＰＲＴ１、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＰＵＭ１、及びＴＢＰを含む群、例えば、これらの参照遺伝子の少なくとも１つ、又は少なくとも２つ、又は少なくとも３つ、又は全てから選択される。マーカー遺伝子及び参照遺伝子は、Ｓ１０４において使用されるものと同じである。
【００９１】
Ｓ１０４及びＳ１１０のステップにおいて加えて又は代替的に使用され得る他の参照遺伝子には、ヒトアクチン、ベータ、ｍＲＮＡ（ＡＣＴＢ）；ヒト６０Ｓ酸性リボソームリン酸化タンパク質Ｐ０  ｍＲＮＡ（ＲＰＬＰ０）；ポリメラーゼ（ＲＮＡ）ＩＩ（ＤＮＡ指向性）ポリペプチドＡ、２２０ｋＤａ（ＰＯＬＲ２Ａ）；ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）；及び、アミノレブリン酸−デルタ−シンターゼ（ＡＬＡＳ−１）；が含まれる。
【００９２】
Ｓ１１２において、予後リスクスコアが、得られたスコアリング関数を使用して、遺伝子発現プロファイルに基づき患者に対して決定される。
【００９３】
Ｓ１１４において、患者は、予後リスクスコアに基づき、既定のリスクグループのセットの１つに分類され得る。
【００９４】
Ｓ１１６において、治療推奨が、患者のリスクグループに基づき、例えば、患者若しくはその保護者、医師、又は別の医療従事者に提供され得る。これには、ａ）割り当てられたリスクグループに基づき、患者に対する治療法を提案することであって、リスクグループのうち少なくとも２つが異なる治療法に関連していること；ｂ）前立腺手術前後の患者の疾患進行リスク予測を計算すること；及び、ｃ）前立腺手術前後の患者に対する治療応答予測を計算すること；のうち１つ又は複数が含まれてもよい。例証的な治療法には、少なくとも前立腺部分切除術、放射線治療、化学療法、及びその組み合わせから選択される積極的療法、並びに、観察のみ、すなわち、前立腺切除術又は積極的療法を行わない観察（すなわち積極的監視）が含まれる。
【００９５】
当該方法は、Ｓ１１８において終了する。
【００９６】
例証的なスコアリング関数によって、新たな患者が、そのモニタリングの結果に基づき、第１の患者のセットが割り当てられたリスクグループのセットのそれぞれ１つに分類されることが可能になる。リスクグループのそれぞれは、それぞれの提案された治療法に関連していてもよく、その高悪性度は異なる。それぞれの提案された治療法は、そのリスクグループに割り当てられた第１のセットからの患者の結果に基づいていてもよく、前立腺がん発達に対する閾値臨床リスクを超えない最も積極的ではない治療法を提供すると予測される治療法である。場合によっては、これは、グリーソンスコアを使用するもの等、他のリスクプロファイリング法の場合よりも積極的ではない提案された治療法に関連しているリスクグループに新たな患者が割り当てられることを可能にする。
【００９７】
一実施形態において、Ｓ１０４、Ｓ１１０における遺伝子発現レベルは、１つ又は複数のプライマー及び／又はプローブ、及び／又は、１つ又は複数のそのセットを使用してｍＲＮＡ発現を検出することによって決定される。
【００９８】
この方法の異型においては、組み合わされた予後リスクスコアが、Ｓ１１２において、予後リスクスコア及び第２のリスク決定に基づき、患者に対してさらに決定される。
【００９９】
Ｓ１１４において、患者は、（予後リスクスコアに基づいてではなく）組み合わされた予後リスクスコアに基づき、既定のリスクグループのセットの１つに分類され得る。
【０１００】
第２のリスク決定は、ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコア（予後リスクスコア）以外のリスク決定であり、例えば、グリーソンスコアに基づいてもよい。好ましくは、第２のリスク決定は、超低リスク（ＶＬＲ）、低リスク（ＬＲ）、好ましい中リスク（ＦＩＲ）、好ましくない中リスク（ＵＩＲ）、及び高リスク（ＨＲ）のうち１つ又は複数等、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  （ＮＣＣＮ）の分類である。組み合わされた予後リスクスコアは、前立腺がんについてモニターされた対象から得られた回帰関数を用いて決定されてもよい。さらなる態様は、図１において記載されている方法のステップを含む、前立腺がんを診断、モニター、若しくは予後判定するための、又は、前立腺がんの進行リスクを層別化するためのコンピュータ実装方法に関する。
【０１０１】
本願に関して、「前立腺がんを診断、モニター、若しくは予後判定するための、又は、前立腺がんの進行リスクを層別化するためのコンピュータ実装方法」という表現は、ソフトウェアアルゴリズムがリスクスコアを計算し、それに基づき、分析される患者の予後を提供する方法を指し、この方法は、本明細書において言及される遺伝子の遺伝子発現レベルの測定、及び、以下に記載される方程式を使用したリスクスコアへのその変換の際に得られた生データを使用する。
【０１０２】
図１において例示されている方法の１つ又は複数のステップは、コンピュータ上で実行され得るコンピュータプログラムプロダクトにおいて実装することができる。コンピュータプログラムプロダクトは、ディスク又はハードドライブ等、制御プログラムが記録（記憶）される非一時的コンピュータ可読記録媒体を含んでもよい。非一時的コンピュータ可読媒体の一般的な形態には、例えば、フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、又はいかなる他の磁気記憶媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、又はいかなる他の光学媒体、ＲＡＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ−ＥＰＲＯＭ、又は他のメモリチップ又はカートリッジ、又はコンピュータが読み出して使用することができるいかなる他の非一時的媒体も含まれる。
【０１０３】
或いは、当該方法は、伝送可能な搬送波等の一時的媒体において実装することができ、制御プログラムが、電波及び赤外線データ通信等の間に生成されるもの等、音波又は光波等の伝送媒体を使用するデータ信号として具体化される。
【０１０４】
例証的な方法は、１つ又は複数の汎用コンピュータ、１つ又は複数の専用コンピュータ、プログラムされたマイクロプロセッサ又はマイクロコントローラ及び周辺集積回路素子、ＡＳＩＣ又は他の集積回路、デジタル信号プロセッサ、個別の素子回路等のハードウェアにより実現されている電子回路又は論理回路、ＰＬＤ、ＰＬＡ、ＦＰＧＡ、グラフィックカードＣＰＵ（ＧＰＵ）、又はＰＡＬ等のプログラマブル論理デバイスにおいて実装されてもよい。一般に、図１において示されている流れ図を実施することができる有限状態マシンを実装することができる任意の装置を使用して、例示されている前立腺がんを有する患者における治療選択のためのリスク層別化方法の１つ又は複数のステップを実施することができる。正しく理解されるように、方法のステップは全てコンピュータで実施することができるけれども、一部の実施形態では、ステップのうち１つ又は複数を、少なくとも部分的に手動で行うことができる。
【０１０５】
コンピュータ又は他のプログラマブル装置上で実行される指示が、本明細書において特定される機能／行為を実施するためのプロセスを提供するように、コンピュータプログラムの指示はまた、コンピュータ、他のプログラマブルデータ処理装置、又は他の装置にロードされて、一連の動作ステップがコンピュータ、他のプログラマブル装置、又は他の装置上で行われるようにさせ、コンピュータ実施プロセスが生成されてもよい。
【０１０６】
「１つ又は複数のマーカー遺伝子又はＧＯＩのレベルを決定する」、又は「遺伝子発現レベルを決定する」、又は「ＰＤＥ４Ｄバリアントの発現レベルを決定する」という用語は、１つ又は複数のマーカー遺伝子若しくはＧＯＩ又はＰＤＥ４Ｄバリアントの発現産物の存在又は量の決定を指す。従って、「１つ又は複数のマーカー遺伝子又はＧＯＩのレベル」という用語は、１つ又は複数のマーカー遺伝子又はＧＯＩの発現産物、例えば、１つ又は複数の転写物の存在又は量、及び／又は、１つ又は複数のマーカー遺伝子又はＧＯＩの存在又は量の決定を意味する。１つ又は複数のマーカー遺伝子又はＧＯＩの発現産物の存在又は量の決定は、当技術分野において既知のいかなる手段によっても成し遂げることができる。
【０１０７】
１つ又は複数のマーカー遺伝子又はＧＯＩの発現産物の存在又は量の決定は、核酸の測定によって成し遂げることができる。従って、１つ又は複数の発現レベルは、遺伝子によってコードされるｍＲＮＡの検出を含む方法によって決定されてもよい。
【０１０８】
例えば、１つ又は複数のマーカー遺伝子又はＧＯＩの発現の核酸レベルの測定は、試料から得られた核酸分子（例えば、ＲＮＡ又はｃＤＮＡ等）の精製、続いて、本明細書において先に記載した特定のオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションによって評価することができる。発現レベルの比較は、視覚的に又は適切な装置によって成し遂げることができる。ｍＲＮＡ又は発現産物の検出方法は、当業者には既知である。
【０１０９】
或いは、１つ又は複数のマーカー遺伝子又はＧＯＩの発現の核酸レベルは、ＤＮＡアレイ又はマイクロアレイのアプローチで検出されてもよい。典型的には、試験されることになる患者から得られた試料の核酸は、処理され、例えば蛍光標識等で標識される。その後、そのような核酸分子を、例証的なマーカー遺伝子に対応する固定化された捕獲プローブとのハイブリダイゼーションのアプローチにおいて使用することができる。マイクロアレイ分析を実行するための適した手段は、当業者には既知である。
【０１１０】
標準的な装置において、ＤＮＡアレイ又はマイクロアレイは、多くの遺伝子を検出するために固定化された高密度のプローブを含む。アレイ上のプローブは、マーカー遺伝子の配列の１つ又は複数の部分に相補的である。典型的には、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ産物、及びオリゴヌクレオチドがプローブとして有用である。
【０１１１】
ＤＮＡアレイ又はマイクロアレイに基づく検出方法は、典型的には、以下のステップを含む：（１）試料からｍＲＮＡを単離し、任意的に、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、その後、このＲＮＡ又はｃＤＮＡを標識するステップ。ＲＮＡを単離し、それをｃＤＮＡに変換する及び核酸を標識する方法は、マイクロアレイ技術のマニュアルに記載されている。（２）ステップ１からの核酸を、マーカー遺伝子に対するプローブとハイブリダイズするステップ。試料からの核酸は、蛍光色素Ｃｙ３（赤）又はＣｙ５（青）等の色素で標識することができる。一般的に、対照試料は、異なる色素で標識される。（３）試料からの核酸のプローブとのハイブリダイゼーションを検出し、調査したマーカー遺伝子についての試料におけるｍＲＮＡの量を少なくとも定性的に、より具体的には定量的に決定するステップ。試料と対照との発現レベルの差は、信号強度の差に基づき推定することができる。これらは、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘにより提供されるソフトウェア等の適切なソフトウェアによって測定及び分析することができるが、それらに限定されない。
【０１１２】
ＤＮＡアレイ上にスポットされる、使用されるマーカー遺伝子に対応するプローブの数に制限はない。また、マーカー遺伝子は、遺伝子の異なる部分にハイブリダイズする２つ以上のプローブによって表すことができる。プローブは、選択されるマーカー遺伝子毎に設計される。そのようなプローブは、典型的には、５〜５０ヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチドである。より長いＤＮＡは、ＰＣＲによって又は化学的に合成することができる。そのようなオリゴヌクレオチドを合成し、それらを基板上に適用する方法は、マイクロアレイの分野において良く知られている。マーカー遺伝子以外の遺伝子も、ＤＮＡアレイ上にスポットすることができる。例えば、発現レベルが有意に変化しない遺伝子に対するプローブをＤＮＡアレイ上にスポットして、アッセイ結果を正規化するか、又は、多数のアレイ又は異なるアッセイのアッセイ結果を比較することができる。
【０１１３】
一実施形態において、１つ又は複数のマーカー遺伝子又はＧＯＩの発現の核酸レベルは、定量的ＲＴ−ＰＣＲのアプローチ、例えば、関心のある逆転写反応の転写物に続くリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）のアプローチで検出することができる。典型的には、第１のステップとして、当業者には既知の任意の適した方法に従って、転写物はｃＤＮＡ分子に逆転写される。その後、定量的又はリアルタイムＰＣＲのアプローチを、上記のように得られた第１のＤＮＡ鎖に基づき実行することができる。
【０１１４】
一実施形態において、Ｔａｑｍａｎ又はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎプローブを、このタイプの主要なＦＲＥＴベースのプローブとして、定量的ＰＣＲ検出のために使用することができる。いずれの場合においても、プローブは、本明細書において先に記載した１つ又は複数のマーカー遺伝子特異的オリゴヌクレオチドのセット等、関心のある標的領域に隣接する対向するプライマーの対と共に使用される内部プローブとして役立つ。標的セグメントの増幅の際に、プローブは、プライマー部位間の同定配列にて産物に選択的に結合し、その結果、標的頻度の増加に相対してＦＲＥＴ信号伝達の増加を引き起こし得る。
【０１１５】
定量的ＰＣＲのアプローチに使用されることになるＴａｑｍａｎプローブは、ＦＲＥＴ対で両末端が標識された約２２から３０塩基の上記の特定のオリゴヌクレオチドを含んでもよい。典型的には、５′末端は、フルオレセイン（例えばＦＡＭ）等、より短い波長のフルオロフォアを有することになり、３´末端は、一般的に、より長い波長の蛍光クエンチャー（例えばＴＡＭＲＡ）又は非蛍光クエンチャー化合物（例えばブラックホールクエンチャー）で標識される。一実施形態において、定量的ＰＣＲに使用されることになるプローブ、特に本明細書において先に記載したプローブは、プローブが分解された後のレポーター蛍光のクエンチングを回避するために、レポーター色素に隣接する５´末端にグアニン（Ｇ）を有さない。
【０１１６】
定量的ＰＣＲのアプローチに使用されることになるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎプローブは、ＦＲＥＴ相互作用を使用して、ＰＣＲ産物を検出及び定量化することができ、各プローブは、５´蛍光標識末端及び３´クエンチャー標識末端を有する。プローブ構造のこのヘアピン又はステム−ループの構成は、２つの短い自己結合末端を有するステム、及び、約２０から３０塩基の長い内部標的特異的領域を有するループを含んでもよい。
【０１１７】
本発明に関して利用することもできる別の検出機構は、ループ構造のみを有し、短い相補的なステム領域を有さずに作製されたプローブに向けられる。同様に使用することができる定量的ＰＣＲに対する別のＦＲＥＴベースのアプローチは、標的上の隣接部位に結合する２つのハイブリダイゼーションプローブの使用に基づいており、第１のプローブは３´末端にて蛍光ドナー標識を有し、第２のプローブはその５´末端にて蛍光アクセプター標識を有する。
【０１１８】
特定の実施形態では、遺伝子発現レベルは、増幅ベースの方法、及び／又はマイクロアレイ分析、及び／又はＲＮＡ配列決定によって決定される。
【０１１９】
例証的な遺伝子発現プロファイルは、少なくとも１つの参照遺伝子の発現に対して少なくともＰＤＥ４Ｄ７バリアントの発現レベルを正規化することによって得られる正規化された遺伝子発現プロファイルである。
【０１２０】
転写物ＩＤ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ）、並びに、プライマー対及びプローブの対応するアミノ酸配列を含む参照遺伝子の詳細な説明が表３において示されている。表３はまた、参照遺伝子毎に、センスプライマー及びアンチセンスプライマー、並びに、アンプリコンに特異的に結合するプローブの配列も示している。
【０１２１】
【表３−１】
2020500527.tif 000004
【表３−２】
2020500527.tif 000005
特定の実施形態では、予後リスクスコアは、少なくともＰＤＥ４Ｄ７の正規化された発現レベルを含む正規化された遺伝子発現プロファイルに基づく。一部の実施形態において、ＰＤＥ４Ｄバリアントのいずれも参照遺伝子として使用されない。言い換えると、１つ又は複数のＰＤＥ４Ｄバリアントは、測定された発現レベルを正規化するための参照遺伝子として使用されない。発現結果は、当業者には既知の任意の適した方法に従って正規化することができる。典型的には、当業者には既知であるだろうそのような試験又は対応する式は、発現データを標準化して、遺伝子発現レベルにおける実際の変動と測定プロセスによる変動との区別を可能にするために使用されるであろう。マイクロアレイに対しては、Ｒｏｂｕｓｔ  Ｍｕｌｔｉ−ａｒｒａｙ  Ａｖｅｒａｇｅ（ＲＭＡ）が、正規化のアプローチとして使用されてもよい。
【０１２２】
正規化された値は、以下の式を適用することによって生成され得る。
【０１２３】
【数１】
2020500527.tif 000006
ここで、Ｎ（Ｃｑｇｅｎｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ）は、選択された関心のある遺伝子の正規化された遺伝子発現値（定量化サイクル、Ｃｑ）であり；
Ｍｅａｎ（Ｃｑｒｅｆ  ｇｅｎｅ）は、１つ又は複数の参照遺伝子のＰＣＲ  Ｃｑ値の加算平均であり；
Ｃｑｇｅｎｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔは、関心のある遺伝子のＰＣＲ  Ｃｑ値である。
【０１２４】
特定の実施形態では、ＰＤＥバリアント及び参照遺伝子の発現レベルを、本明細書において援用する非特許文献３（以下「Ｂｏｅｔｔｃｈｅｒ  ２０１５」と呼ぶ）において記載されているように、リアルタイムＰＣＲによって決定した。
【０１２５】
図２を参照すると、特定の実施形態において、ＰＤＥ４Ｄ７の発現レベルが決定及び正規化されると、予後リスクスコアが、以下の式を適用することによって決定され得る。
【０１２６】
【数２】
2020500527.tif 000007
ここで、「ＰＤＥ４Ｄ７  Ｒｉｓｋ  Ｓｃｏｒｅ」は、患者からの試料の遺伝子発現プロファイルに基づく予後リスクスコアであり、ＰＤＥ４Ｄ７＿ｎｏｒｍは、正規化されたＰＤＥ４Ｄ７の発現値（すなわち、Ｎ（Ｃｑｇｅｎｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ））であり、Ａ及びＢは変数である。
【０１２７】
特定の実施形態において、Ａは、６．７１６７４９９９９９９９９等、約６〜８であってもよく、Ｂは、０．４２０７８０２３１７４４７１３等、０．４〜０．４５であってもよい。従って、ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアは、１．０から５．０の値であり得る。次に、ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアは、ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアに基づき、少なくとも２つのリスクグループのうちの１つに分類又はカテゴリー化することができる。例えば、２つのリスクグループ、又は３つのリスクグループ、又は４つのリスクグループ、又は４つ以上の既定のリスクグループがあってもよい。各リスクグループは、それぞれの（重複していない）ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアの範囲をカバーする。例えば、リスクグループには１．０から２．０の、別のリスクグループには２．０から３．０の、別のリスクグループには３．０から４．０の、別のリスクグループには４．０から５．０の全てのＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアが含まれてもよい。
【０１２８】
一部の実施形態において、提案された治療法は、予後リスクスコア及び第２のリスク決定に基づいてもよい。例えば、第２のリスク決定は、病理組織学によって決定されるグリーソンスコアであり得る。例えば、非特許文献４を参照されたい。第２のリスク決定はまた、臨床的に定義された進行ステージ（ｃＴ値）、病理学的に定義されたステージ（ｐＴ値）、生検グリーソンスコア又はグループ化、病理学グリーソンスコア又はグループ化、前立腺特異的抗原測定、前立腺特異的抗原密度測定、又はその組み合わせであってもよい。
【０１２９】
第２のリスク決定は、ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコア以外の異なるリスク決定の組み合わせであってもよい。例えば、第２のリスク決定は、超低リスク（ＶＬＲ）、低リスク（ＬＲ）、好ましい中リスク（ＦＩＲ）、好ましくない中リスク（ＵＩＲ）、及び高リスク（ＨＲ）のうちの１つ等、ＮＣＣＮの分類であり得る。
【０１３０】
特定の実施形態では、割り当てられたＰＤＥ４Ｄ７リスクグループに基づく提案された治療法は、第２のリスク決定のみに基づくあり得る提案された治療法とは異なる。すなわち、割り当てられたＰＤＥ４Ｄ７リスクグループに基づく提案された治療法は、ＰＤＥ４Ｄ７リスクグループを伴わない第２のリスク決定に基づく提案された治療法とは異なる。
【０１３１】
さらなる実施形態において、ＰＤＥ４Ｄ７リスクグループの決定は、第２のリスク決定に基づき、結果及び推奨される治療法を層別化する。言い換えると、ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアは、積極的治療介入（すなわち積極的治療）を要求しないとして患者を同定することができ、代わりに積極的監視を受けることができるが、一方、第２のリスク決定のみでは、積極的治療介入が必要であることが示されるであろう。或いは、ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアは、積極的監視ではなく積極的治療介入を要求するとして患者を同定することができるが、一方、第２のリスク決定のみでは、積極的治療介入はまだ必要ではないことが示されるであろう。
【０１３２】
さらなる態様は、ＰＤＥ４Ｄ７、ＰＤＥ４Ｄ１、ＰＤＥ４Ｄ２、ＰＤＥ４Ｄ３、ＰＤＥ４Ｄ４、ＰＤＥ４Ｄ５、ＰＤＥ４Ｄ６、ＰＤＥ４Ｄ８、及びＰＤＥ４Ｄ９を含む群から選択される少なくとも１つのホスホジエステラーゼ４Ｄ（ＰＤＥ４Ｄ）バリアントの発現レベルを決定するためのプライマー及び／又はプローブを含み、さらに、ＨＰＲＴ１、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＰＵＭ１、ＴＢＰ、及びその組み合わせから選択される参照遺伝子の遺伝子発現レベルを決定するためのプライマー及び／又はプローブを含む製品に関する。一部の実施形態では、核酸分子のセットを含む組成物が提供され、それぞれが、１つ又は複数のＰＤＥ４Ｄバリアントの遺伝子発現の分析のための少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー及び／又はプローブ配列、及び、参照遺伝子の遺伝子発現の分析のための少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー及び／又はプローブ配列を含む。一部の実施形態では、１つ又は複数のＰＤＥ４Ｄバリアントのコード配列に相補的且つハイブリダイズ可能な１つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブ、及び、本明細書において記載される予後リスクスコアを決定するための１つ又は複数の参照遺伝子に相補的且つハイブリダイズ可能な１つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブを含む核酸アレイが提供される。
【０１３３】
「マイクロアレイ」は、分離した領域の線形又は二次元アレイであり、それぞれが、限定されるわけではないが、ガラス、プラスチック、又は合成膜等の一般的に固体の支持体の表面上に形成された画定された領域を有する。マイクロアレイ上の分離した領域の密度は、一部の実施形態において、少なくとも約５０／ｃｍ２、少なくとも約１００／ｃｍ２、少なくとも約５００／ｃｍ２あるが、約１，０００／ｃｍ２未満等、単一の固相の支持体の表面上で検出されることになる固定化されるオリゴヌクレオチドの総数によって決定される。アレイは、全体で約５００、約１０００、約１５００、約２０００、約２５００、又は約３０００未満の固定化されたオリゴヌクレオチドを有してもよい。本明細書において使用される場合、ＤＮＡマイクロアレイは、試料由来の増幅されたか又はクローン化されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするために使用されるチップ又は他の表面上に置かれたオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドのアレイである。アレイにおけるそれぞれ特定のオリゴヌクレオチドのグループの位置が既知であるため、試料オリゴヌクレオチドの同一性は、マイクロアレイにおける特定の位置へのその結合に基づき決定することができる。
【０１３４】
「オリゴヌクレオチド」は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドの重合体形態である。この用語は分子の一次構造のみを指す。従って、この用語は、二本鎖及び一本鎖のＤＮＡ及びＲＮＡを含む。この用語はまた、当技術分野において既知の標識、メチル化、「キャップ」、自然発生ヌクレオチドのうち１つ又は複数の、類似体との置換、及び無電荷結合（例えば、ホスホロチオエート、ジチオリン酸）等のヌクレオチド間修飾、並びに、オリゴヌクレオチドの未修飾形態を含む既知のタイプの修飾も含む。
【０１３５】
「増幅する」という用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼを用いて酵素的に増幅産物を作製することができることを意味するよう広い意味で使用される。「増幅」は、本明細書において使用される場合、一般的に、所望の配列、特に、試料の配列の多数のコピーを生成するプロセスを指す。「多数のコピー」とは、少なくとも２つのコピーを意味する。「コピー」は、必ずしも鋳型配列に対する完璧な配列相補性又は同一性を意味するわけではない。ＧＯＩの配列を同定するために、当技術分野において既知の任意の配列決定方法をさらに使用することが可能である。
【０１３６】
「対応する」という用語は、適切な場合には、別の核酸分子と実質的な量の配列同一性を共有するものとして核酸分子を指し得る。実質的な量とは、少なくとも９５％、通常は少なくとも９８％、より通常は少なくとも９９％を意味し、非特許文献５に記載されているように、（公開されているデフォルト設定、すなわちパラメータｗ＝４、ｔ＝１７を使用して）配列同一性はＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して決定される。ｍＲＮＡを増幅する方法は、一般的に、当技術分野において知られており、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）と、特許文献７並びに特許文献８に記載されているものとを含む。使用され得る別の方法は、定量的ＰＣＲ（又はＱ−ＰＣＲ）である。或いは、ＲＮＡは、当技術分野において既知の方法によって、対応するｃＤＮＡとして直接標識されてもよい。
【０１３７】
過剰発現又は過少発現した遺伝子（又は発現された配列）の同定に頼ることによって、一実施形態は、特定の遺伝子配列に特有のオリゴヌクレオチドに対する試料細胞のｍＲＮＡ、又は、その増幅されたか若しくはクローン化されたバージョン（ＤＮＡ又はｃＤＮＡ等）のハイブリダイゼーションによる発現の決定を含む。このタイプのオリゴヌクレオチドは、他の遺伝子配列には見られない遺伝子配列の少なくとも約２０、少なくとも約２２、少なくとも約２４、少なくとも約２６、少なくとも約２８、少なくとも約３０、又は少なくとも約３２の連続した塩基対を有し得る。前文において使用された「約」という用語は、記載された数値からの１の増減を指す。他の実施形態は、他の遺伝子配列には見られない遺伝子配列の少なくとも又は約５０、少なくとも又は約１００、少なくとも又は約１５０、少なくとも又は約２００、少なくとも又は約２５０、少なくとも又は約３００、少なくとも又は約３５０、又は、少なくとも又は約４００の塩基対のオリゴヌクレオチドを使用してもよい。前文において使用された「約」という用語は、記載された数値からの１０％の増減を指す。そのようなオリゴヌクレオチドはまた、本明細書において記載される遺伝子の配列又はその特有の部分にハイブリダイズする能力を有するオリゴヌクレオチドプローブと呼ぶこともできる。多くの場合、ハイブリダイゼーションの条件は、ハイブリダイゼーションに対する約３０％ｖ／ｖから約５０％ホルムアミド、及び、約０．０１Ｍから約０．１５Ｍの塩、並びに、約５５から約６５℃以上の洗浄条件については約０．０１Ｍから約０．１５Ｍの塩、又はそれらと同等の条件という厳しい条件である。
【０１３８】
他の実施形態において、本明細書において有用なオリゴヌクレオチドプローブは、発現が決定されるはずであるマーカー遺伝子配列と約又は９５％、約又は９６％、約又は９７％、約又は９８％、又は、約又は９９％の同一性を有し得る。同一性は、上記のようにＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して決定される。これらのプローブはまた、上記のような厳しい条件下又はそれと同等の条件下で、例証的な方法において使用される発現されたマーカー遺伝子にハイブリダイズする能力に基づき記載され得る。
【０１３９】
多くの場合、配列は、マーカー遺伝子によってコードされるｍＲＮＡの配列、そのようなｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ、及び／又はそのような配列の増幅されたバージョンである。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは、アレイ、他のデバイス上、又はプローブを局在化させる個々のスポットにおいて固定化される。
【０１４０】
本発明に従って使用することができる適した標識には、放射性同位元素、ヌクレオチド発色団、酵素、基質、蛍光分子、化学発光部分、磁性粒子、及び生物発光部分等が含まれる。そのようなものとして、標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、又は化学的手段によって検出可能な任意の組成物である。「支持体」という用語は、ビーズ、粒子、ディップスティック、ファイバー、フィルター、膜、及びガラススライド等のシラン又はシリケート支持体等、従来の支持体を指す。
【０１４１】
一部の実施形態では、製品は、限局性前立腺がんを有する対象に対するリスクスコアを決定するために使用されるキットとして提供され、このキットは、ａ）少なくとも１つのホスホジエステラーゼ４Ｄ（ＰＤＥ４Ｄ）バリアントの発現レベルを決定するための少なくとも１つのプライマー及び／又はプローブであって、少なくとも１つのＰＤＥ４Ｄバリアントは、ＰＤＥ４Ｄ７を含む、プライマー及び／又はプローブ、ｂ）少なくとも１つの参照遺伝子の遺伝子発現レベルを決定するための少なくとも１つのプライマー及び／又はプローブ、及びｃ）例えば紙又はディスク上で、決定された発現に基づきリスクスコアを計算するための指示を含む。
【０１４２】
診断キットは、本明細書において先に記載された１つ又は複数のマーカー遺伝子又はＧＯＩの特異的検出を可能にする１つ又は複数の薬剤を有してもよい。診断キットの薬剤又は成分は、１つ又は複数の容器又は別々の実体に含有されてもよい。薬剤の性質は、キットの目的とする検出方法によって決定される。
【０１４３】
さらに、キットは、キットの較正のために又は内部対照として使用することができるある量の既知の核酸分子を含んでもよい。典型的には、１つ又は複数のマーカー遺伝子又はＧＯＩの発現産物の検出のための診断キットは、ＰＣＲ緩衝液、ｄＮＴＰ、ポリメラーゼ、二価カチオン又は一価カチオンのようなイオン、ハイブリダイゼーション溶液等のような副成分を含み得る。そのような成分は当業者には既知であり、実行される検出方法に応じて変わり得る。加えて、キットは、指示リーフレットを含んでもよく、及び／又は、得られた結果の関連性に関する情報を提供してもよい。
【０１４４】
さらなる態様は、上記の製品及び／又はキット、並びに、上記のコンピュータプログラムプロダクトを含むシステムに関する。特定の実施形態において、当該システム、上記の製品及び／又はキット、並びに、上記のコンピュータプログラムプロダクトは、前立腺がんの治療において使用することができる。
【０１４５】
例証的な実施形態の範囲の限定を意図することなく、以下の実施例は、当該方法の態様を例示している。
【０１４６】
実施例
前立腺がんに対するＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアを構築するために使用される遺伝子選択及びコホート試料
ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアを構築するための遺伝子の候補を選択するために、ＰＤＥ４Ｄ７発現を、５００人を超える患者のコホート内で検査し、一次治療後の長期的な臨床的及び生物学的に関連性のある患者の転帰と比較した。２０００年から２００４年の間に継続的に手術を受けた患者５５０人からの切除された前立腺由来の代表的な腫瘍領域から組織の小さな生検パンチ（約１ミリメートル×２ミリメートル）を収集した。この患者コホートは、例えば、米国のＮＣＣＮの前立腺がんガイドラインの定義による全ての臨床リスクグループの混合を表している。ｑＰＣＲによるバイオマーカー定量化に対する既定の品質基準を満たさなかった試料を取り除き、術後にアジュバントホルモン療法を受けた患者を取り除いた後、表４において示されているように、合計で５０３の患者試料が分析に適格であった。
【０１４７】
【表４−１】
2020500527.tif 000008
【表４−２】
2020500527.tif 000009
患者の年齢、術前ＰＳＡ、生検における腫瘍の割合、前立腺体積、及びＰＳＡ密度について、コホートにおける最小値及び最大値が示されており、中央値及びＩＱＲ値が括弧内に表されている。ＮＣＣＮリスクカテゴリーについては、リスクグループあたりの患者の数が示されている。術前病理学の場合、生検グリーソングレードグループ並びに臨床ステージが（患者の数の割合によって）示されている。術後病理学は、病理学グリーソングレードグループ、病理学ステージ、前立腺切除術後の切除断端状態、精嚢及び骨盤リンパ節の腫瘍浸潤状態によって（患者の数の割合により）表されている。
【０１４８】
フォローアップによって、全患者に対する、術後の何か月という平均及び中央値のフォローアップ期間が実証されている。転帰カテゴリーは、一次治療後の累積５年及び１０年の生化学的再発（ＢＣＲ）及び転移に対する臨床的再発（ＣＲ）を例示している。治療は、手術後の５年及び１０年の救援放射線療法（ＳＲＴ）又は救援アンドロゲン除去療法（ＳＡＤＴ）の開始を列挙している。死亡率は、前立腺がん特異的死亡率（ＰＣＳＭ）並びに全死亡率（ＯＭ）として示されている。
【０１４９】
検査室手法
関心のある遺伝子並びに参照遺伝子を測定するために定量的リアルタイムＰＣＲに使用されるプライマー及びプローブは、表３において記載されている通りである。本明細書において使用される全ての分子生物学の方法は、Ｂｏｅｔｔｃｈｅｒ  ２０１５において以前に記載されている。
【０１５０】
データ分析及び統計
異なる実験にわたるｑＰＣＲデータの比較を可能にするために、式（１）に従って、ＰＤＥ４Ｄ７に対するＣｑ値が、参照遺伝子に対するＣｑ値の平均に対して正規化され、正規化されたＰＤＥ４Ｄ７発現値が生成される。ここで、使用される参照遺伝子は、ＨＰＲＴ１、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＰＵＭ１、及びＴＢＰである。
【０１５１】
臨床転帰に対するＰＤＥ４Ｄ７の相関性を決定するために、図２において見られるように、正規化されたＰＤＥ４Ｄ７発現を、線形変換（式２）によってＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアに変換した。
【０１５２】
次に、ＰＤＥ４Ｄ７リスクカテゴリーを、１から２、２から３、３から４、及び４から５の全てのＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアを統合することによって定義した。
【０１５３】
次に、ＰＤＥ４Ｄ７リスクカテゴリーを、様々な利用可能な生物学的転帰及び治療関連転帰に対して試験した。統計的分析には、ソフトウェアパッケージＭｅｄＣａｌｃ（ＭｅｄＣａｌｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＢＶＢＡ，Ｏｓｔｅｎｄ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用した。
【０１５４】
結果
表５を参照すると、ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアの差次的発現が、４４６人及び３４７人の患者をカバーした患者コホートのサブセットにおいて、術後の生化学的再発に対する完全な５年及び１０年のフォローアップでそれぞれ評価されている。参照として、２つのさらなる予後リスクスコアを、同様に前立腺において発現することが知られている２つの他のＰＤＥ４Ｄ転写物ＰＤＥ４Ｄ５及びＰＤＥ４Ｄ９に基づき決定した。
【０１５５】
【表５】
2020500527.tif 000010
表５において見られるように、ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアは、５年若しくは１０年の生化学的再発を有する患者と有さない患者間で有意に異なって発現したが、ＰＤＥ４Ｄ５もＰＤＥ４Ｄ９も、これら２つの患者コホートのサブセット間で識別することはできなかった。このことは、臨床転帰を区別するＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアの特有の能力を実証している。
【０１５６】
表６及び図３を参照すると、単変量及び多変量Ｃｏｘ回帰分析が、手術後の生化学的再発（ＢＣＲ）までの時間に対する連続的なＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアの非常に有意な相関性を実証している（ＨＲ＝０．５；９５％  ＣＩ＝０．４−０．７；ｐ＝２．５Ｅ−０７）。さらに、既知の予後術後臨床パラメータに調整した場合、ＰＤＥ４Ｄ７は回帰モデルに有意な独立値を追加し続けた（ＨＲ＝０．５；９５％  ＣＩ＝０．４−０．７；ｐ＝９．７Ｅ−０６）。最も低いＰＤＥ４Ｄ７リスクグループ（すなわち、ＰＤＥ４Ｄ７（１−２））を参照として使用する場合、ＰＤＥ４Ｄ７の発現レベルがより高いＰＤＥ４Ｄ７リスクカテゴリーは、ＰＤＥ４Ｄ７参照リスクカテゴリーと比較して、多変量分析において時間の経過に伴い生化学的再発のリスクの大幅な減少を実証した（ＰＤＥ４Ｄ７（４−５）：ＨＲ＝０．１；９５％  ＣＩ＝０．１−０．５；ｐ＝１．４Ｅ−０４；ＰＤＥ４Ｄ７（３−４）：ＨＲ＝０．３；９５％  ＣＩ＝０．１−０．８；ｐ＝１．４Ｅ−０２）。
【０１５７】
【表６】
2020500527.tif 000011
このことは、図４において見られるように、ＰＤＥ４Ｄ７リスクカテゴリーにおいて行われるカプランマイヤー分析によって確かめられ、臨床エンドポイントはＰＳＡ再発までの時間である。ＰＤＥ４Ｄ７の最も高いリスクカテゴリーには、５年ＢＣＲの確率が５％未満の男性が含まれるが、ＰＳＡ再発を経験する見込みは、ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアのレベルが最も低い患者グループにおいて５０％を超える値まで増加する。特に、ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアが最も低い患者コホートにおける全てのＢＣＲイベントが、術後約３．５年以内に発生するが、この期間以降はさらなるイベントは認められない。
【０１５８】
表７及び図５を参照すると、同様に既知の予後術前臨床パラメータに調整した場合の多変量分析におけるＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアの独立値も決定した。以上のように、連続的ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアに対する術前臨床データを用いた多変量分析と比較した場合、類似の結果が観察された。
【０１５９】
【表７】
2020500527.tif 000012
表８及び図６を参照すると、生化学的再発ではなく手術後の臨床エンドポイントまでの時間に対する単変量分析における連続的なＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアの相関性が示されており、エンドポイントは：救援放射線療法（ＳＲＴ）の開始；救援アンドロゲン除去療法（ＳＡＤＴ）の開始；臨床的再発（ＣＲ）；前立腺がん特異的死亡率（ＰＣＳＭ）；及び全死亡率（ＯＭ）；を含む。以上のように、ＰＤＥ４Ｄ７は、全てのエンドポイントの時点と有意に負に相関しており、ハザード比は０．２から０．５である。さらに、転移（ＣＲ）又は前立腺がんによる死亡（ＰＣＳＭ）のような重篤な臨床エンドポイントを経験する可能性は、特に、ＰＤＥ４Ｄ７のレベルの低下に伴って増加する。加えて、ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアは、全生存との有意な相関性を有するように思われる。
【０１６０】
【表８】
2020500527.tif 000013
従って、図３、５、及び６において見られるように、腫瘍組織におけるＰＤＥ４Ｄ７発現が、ＢＣＲ等の生物学的転帰に対して有意な負の相関性を有するだけでなく、この負の相関性は、既知の予後術前臨床パラメータ及び予後術後臨床パラメータの範囲に調整した場合に、多変量モデリングにおいて独立値を提供すると示されてきた。さらに、ＰＤＥ４Ｄ７発現レベルはまた、救援治療の開始のような他の臨床エンドポイント、並びに、疾患進行及びがん特異的死亡に関するエンドポイントを予測することができる。
【０１６１】
層別化−臨床的に定義されたリスクグループにおけるＰＤＥ４Ｄ７リスクスコア分析
図７〜１０を参照すると、前立腺がんＮＣＣＮガイドラインのリスクグループの定義によって例証される臨床的に定義されたリスクグループの上のＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアの追加された値が例示されている。手術後のエンドポイントの生化学的再発（ＢＣＲ）を経験する５年の見込み（図７）；エンドポイントの臨床的再発（ＣＲ）に達する１０年の見込み（図８）；前立腺がん特異的死亡率（ＣＳＭ）のエンドポイントに達する１０年の見込み（図９）；及び、全死亡率（ＯＭ）のエンドポイントに達する１０年の見込み（図１０）；について、４つの定義されたＰＤＥ４Ｄ７リスクグループがＮＣＣＮリスクグループと比較されている。ＮＣＣＮリスクグループには：（１）超低リスク及び低リスクグループ（ＶＬ＆ＬＲ）；（２）好ましい中リスクグループ（ＦＩＲ）；（３）好ましくない中リスクグループ（ＵＩＲ）；及び（４）高リスクグループ（ＨＲ）；が含まれた。これらのＮＣＣＮリスクグループを：（１）ＰＤＥ４Ｄ７（４−５）；（２）ＰＤＥ４Ｄ７（３−４）；（３）ＰＤＥ４Ｄ７（２−３）；及び（４）ＰＤＥ４Ｄ７（１−２）；を含む４つのＰＤＥ４Ｄ７リスクグループとそれぞれ比較した。
【０１６２】
図７〜１０において見られるように、増加するリスクグループは、調査したエンドポイントの１つに達する確率の増加に寄与するけれども、低リスクスキーマによるリスク分布は、それぞれ４つのリスクカテゴリーにわたって異なる。これは、特に図９及び１０において示されており、ＮＣＣＮリスクグループに沿ったリスクの増加は非常に直線的であり、勾配の増加は非常に急であるというわけではない。対照的に、２つの最も高いＰＤＥ４Ｄ７リスクカテゴリー（３−４及び４−５）における転移又は前立腺がん関連死亡の１０年リスクはわずかであるが、ＰＤＥ４Ｄ７リスクがより低いグループ（２−３及び１−２）における勾配の増加は急であり、ＮＣＣＮ高リスクグループでは１０〜１５％と比較して、最も低いＰＤＥ４Ｄ７リスクカテゴリーでは２５％の最終リスクレベルに達する。
【０１６３】
ＮＣＣＮリスクグループとＰＤＥ４Ｄ７リスクグループとのこれらの差は、前立腺がんの診断を受けた患者を、例えば、即時の積極的介入治療を遅らせて、代わりに積極的監視による治療を受けることができる患者、及び、積極的介入治療法による治療を受けるべきではない患者に層別化するのに寄与し得る。言い換えると、ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコア及びリスクグループは、ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアによって提供されるさらなる情報に基づき異なる又は代替の治療法を医療供給者が患者に推奨するのに寄与し得る。すなわち、他の臨床測定指標に従って患者がより高いリスクに分類されている場合でも、ＰＤＥ４Ｄ７に基づき、１つ又は複数の特定の臨床エンドポイントを経験する患者のリスクは少ない又は特定の閾値を下回るため、ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアは、積極的介入治療法を受けるのではなく積極的監視を受けるよう医療供給者が患者に推奨するのに寄与し得る。
【０１６４】
図１１を参照すると、４つのＮＣＣＮリスクグループ対全てのＰＤＥ４Ｄ７リスクカテゴリーの全ての組み合わせにわたる５年ＢＣＲの見込みが例示されている。これまでの分析から予想されるように、最も高いＰＤＥ４Ｄ７リスクカテゴリー（４〜５）を表す患者グループでは、超低リスク＆低リスクのＮＣＣＮの臨床グループと比較して、測定された長期的な転帰の１つを経験する見込みは低く、ＮＣＣＮの臨床的に高リスクのグループと比較して、最も低いＰＤＥ４Ｄ７リスク（１〜２）を有する患者コホートに対しては逆である。特に、腫瘍内の高レベルのＰＤＥ４Ｄ７発現によって定義され、臨床的に超低リスク及び低リスクのグループと比較して手術後５年以内のＢＣＲに対して＞５０％少ないリスクを有する男性のコホートが存在する（それぞれ、４．２％対９．５％）。このことは、臨床的に超低リスクのグループのみを考慮した場合にも依然として当てはまる（それぞれ４．２％対６．６％；図示せず）。さらに、この高いＰＤＥ４Ｄ７発現コホートは、好ましくない中及び高リスクグループを含む全ての臨床リスクグループ由来の男性で構成されている。
【０１６５】
従って、図１１において見られるように、推奨又は提案された療法又は治療を決定するために、ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアは、ＮＣＣＮリスクグループ等の第２のリスク決定と組み合わせて使用することができる。さらに、ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアのさらなる情報は、異なる、代替の、又はより適切な治療を提供するために患者を層別化するのに寄与し得る。例えば、図１７において見られるように、１４８人の患者が、ＮＣＣＮ  ＵＩＲ（好ましくない中）リスクグループ及びＨＲ（高リスク）リスクグループに分類される。その分析のみに基づき、５年ＢＣＲの見込みが３４．４％及び４６．５％であるため、これらの患者は即時の積極的介入治療を選んでもよい。しかし、ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアを考慮することによって、これらの患者は、５年ＢＣＲのその実際のリスクを区別する方法で層別化され得る。結果として、５年ＢＣＲの見込みが１４．３％であった１４人の患者、５年ＢＣＲの見込みが１０％であった１０人の患者、及び５年ＢＣＲの見込みが２８．８％であった５９人の患者でさえも、積極的介入治療法ではなく積極的監視を代わりに選ぶことができ、その結果、積極的介入治療法の多くの重篤な副作用を遅らせ、さらに、これらの患者のクオリティオブライフを改善することができる。言い換えると、ＮＣＣＮリスクグループは何らかの積極的介入治療を受けるべきであると示唆するかもしれないけれども、医療供給者はこれらの２４又は８３人の患者に、積極的介入治療ではなく積極的監視を受けるよう推奨することができる。
【０１６６】
図１２〜１５を参照すると、臨床リスクサブグループの超低リスク及び低リスク（ＶＬ＆ＬＲ）、好ましい中リスク（ＦＩＲ）、及び好ましくない中リスク＆高リスク（ＵＩ＆ＨＲ）における生検グリーソンスコア対ＰＤＥ４Ｄ７リスクカテゴリーの影響を、生化学的再発及び臨床的再発までの時間についてのカプランマイヤー生存分析によって測定した。ＶＬ＆Ｌリスクグループ（図示せず）の場合、患者のサブコホートをさらに異なるリスクグループに層別化するためのＰＤＥ４Ｄ７リスクカテゴリーの有意な影響はなかった。このことは、このグループにおける全体的なリスクがすでに非常に低いことを示している可能性があり、結果的に、この患者コホートをさらに下位層別化（ｓｕｂ−ｓｔｒａｔｉｆｙ）することは困難である。言い換えると、臨床的低リスクグループ（ＰＳＡ＜１０ｎｇ／ｍＬ、生検グリーソン≦３＋３；ｃＴ≦Ｔ２）は、ゲノム変化がほとんどなく、将来の疾患の高悪性度のリスクはほとんど抱えることのない異なるグループであり、＜１０％の５年生化学的再発の見込み、＜１％の１０年の転移への進行の見込み、及び一次治療後１０年にわたって前立腺がん特異的死亡のリスクはないことが反映される。
【０１６７】
しかし、図１２及び１３において見られるように、好ましい中リスクグループを分析する場合、生検グリーソンは、このグループをさらに有意にリスク層別化しないことが明らかであり（図１２、ｐ＝０．１９）、ＰＤＥ４Ｄ７リスクカテゴリーは、異なる長期的リスクプロファイルを有する様々な患者のサブセットを明確に定める（図１３、ｐ＝０．０１）。
【０１６８】
同様に、図１４において見られるように、好ましくない中リスク及び高リスクの患者の分析によって、生検グリーソンスコアは臨床的再発の転帰の差について患者を層別化するけれども、このパラメータは、主に、手術後の生化学的再発の高リスクの男性を示すということが示されている。これは、特に、生検グリーソンスコアが４＋４の小さい男性グループに当てはまる。
【０１６９】
対照的に、図１５を参照すると、ＰＤＥ４Ｄ７リスクカテゴリーは、手術後１０年にわたる臨床的再発のリスクが非常に低く（１１４人の患者中１例のイベントのみ；０．９％）、ＰＤＥ４Ｄ７スコアが最も高い（３〜５）２つのリスクグループに患者を下位層別化する。一方、ＰＤＥ４Ｄ７リスクが最も低いカテゴリーにおけるイベント（６例中２例）は、手術後２０ヵ月以内に発生し、この患者グループでは再発リスクが高い（３３．３％）だけでなく、再発が発生する場合には手術後の再発が早いことも示している。
【０１７０】
このように、前立腺がんを有する患者に対してリスクスコアにＰＤＥ４Ｄ７を定量化することによって、独立した補完的な値が、臨床パラメータによって定義される集団のリスク層別化に追加される。特に、高レベルのＰＤＥ４Ｄ７発現は、全ての臨床リスクグループにわたって、臨床情報のみの場合と比較してリスクがより低い患者を選択するための追加の決断力を提供することができる可能性がある。同時に、低いＰＤＥ４Ｄ７発現は、ＰＳＡ再発のようなエンドポイントにおける高速の失敗のリスクが非常に高い患者の再層別化に寄与する可能性がある。さらに、本明細書において開示されているように決定されたＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアは、異なる無増悪生存リスクに患者を下位層別化することができ、これは他のリスク決定によって可能ではなかった。
【０１７１】
第２のリスク決定とのＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアの組み合わせ
ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアによって提供される疾患進行のリスクが、前立腺がん亜集団への新規の洞察を提供し、従って、現在の診療基準（第２のリスク決定）によって提供されるリスクに補完的であるように設定されるということを、提示されているデータは本明細書において示している。従って、計算モデルによる両方のリスクスコアの組み合わせは、いずれか１つのスコアのみを使用することと比較して、より効果的に長期の疾患の転帰を予測し得ると仮定した。この仮説を評価するために、完全な５年の転帰歴を有する４４９人の患者のサブコホート（９２例のイベント；２０．５％）を選択して、手術後の生化学的再発の５年リスクを予測するために、ロジスティック回帰モデルを生成した。モデリングによって、ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアの独立した予測値が提供された（オッズ比＝０．４２；９５％  ＣＩ＝０．２８−０．６３；ｐ＜１．０Ｅ−０４；表３）。全４４９人の患者に対する個々の５年進行リスク（ＢＣＲ）を予測するために使用した回帰モデルのロジット関数は以下の通りであり：
【０１７２】
【数３】
2020500527.tif 000014
ここで、ＬＲ＝ＮＣＣＮの低リスク、ＦＩＲ＝ＮＣＣＮの好ましい中リスク、ＵＩＲ＝ＮＣＣＮの好ましくない中リスク、ＨＲ＝ＮＣＣＮの高リスクであり、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＦは重みであり、ＰＤＥ４Ｄ７＿ｓｃｏｒｅは、連続的なＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアである。
【０１７３】
特定の実施形態において、Ａは、０．ｌ６等、約（−０．５）〜０．５であってもよく、Ｂは、０．５９等、約０．０〜１．０であってもよく、Ｃは、１．０７等、約０．０〜２．０であってもよく、Ｄは、２．０３等、約１．０〜３．０であってもよく、Ｅは、２．５２等、約２．０〜３．０であってもよく、さらに、Ｆは、−０．８７等、約（−１．５）〜（−０．５）であってもよい。回帰モデルの計算において、患者が分類されるＮＣＣＮリスクカテゴリーに対してロジット関数に１の値を挿入し、他のＮＣＣＮリスクカテゴリーに対して０の値を挿入した。例えば、患者をＮＣＣＮの高リスクとして分類した場合、ＨＲに対してロジット関数に１の値を挿入し、ＬＲ、ＦＩＲ、及びＵＩＲのそれぞれに対して０の値を挿入した。
【０１７４】
予測されたイベントを患者が経験する確率ｐは、以下の通りである。
【０１７５】
【数４】
2020500527.tif 000015
確率ｐは、ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコア及び第２のリスク決定、ここではＮＣＣＮの分類（以下においては、ＮＣＣＮ＆ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアでもある）に基づく組み合わされた予後リスクスコアを提供する。組み合わされた予後リスクスコアは、少なくとも２つのリスクグループのうち１つに分類又はカテゴリー化することができる。例えば、２つのリスクグループ、又は３つのリスクグループ、又は４つのリスクグループ、又は５つ以上の既定されたリスクグループがあってもよい。各リスクグループは、（重複しない）確率ｐのそれぞれの範囲をカバーする。例えば、あるリスクグループは０．０から＜０．１までの、別のリスクグループは０．１から＜０．２５までの、別のリスクグループは０．２５から＜０．５までの、さらに、別のリスクグループは０．５から＜１．０までの全ての確率ｐを含んでもよい。
【０１７６】
表９は、ロジスティック回帰モデルに関するさらなる詳細を示している。上述のように、モデルの入力変数として、ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアを、ＮＣＣＮの臨床リスクカテゴリー：疾患進行の超低リスク（ＶＬＲ）、低リスク（ＬＲ）、好ましい中リスク（ＦＩＲ）、好ましくない中リスク（ＵＩＲ）、及び高リスク（ＨＲ）と組み合わせて使用した。臨床リスクが非常に低いグループを参照グループとして定義し、すなわち、ＮＣＣＮの臨床リスクカテゴリーＶＬＲに分類された患者については、ＮＣＣＮ＆ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアは、式（３）から重みＡ（すなわち、表における「定数」の回帰係数）及び式（３）からの重みつきの連続的なＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアＦ＊ＰＤＥ４Ｄ７＿ｓｃｏｒｅ（重みＦは、表における「ＰＤＥ４Ｄ７＿ｓｃｏｒｅ」の回帰係数である）を介してのみ計算される。ロジスティック回帰モデルのそれぞれのパラメータが表において示されている。ロジット（ｐ）関数を構築するための回帰係数（重み）は、オッズ比、９５％信頼区間（９５％  ＣＩ）、及びｐ値と共に与えられている。加えて、標準誤差及びＷａｌｄ統計が示されている。
【０１７７】
【表９】
2020500527.tif 000016
回帰モデルの試験は、イベントグループ及び無イベントグループの両方において、予想されたイベント対観察されたイベントの優れた較正を示した。
【０１７８】
図１６は、完全な５年間のフォローアップを伴う４４９人の患者コホートのＨｏｓｍｅｒ−Ｌｅｍｅｓｈｏｗ試験（カイ二乗３．９；ｐ＝０．８７）後の分割表に基づく、手術後の５年生化学的再発を予測するためのＮＣＣＮ＆ＰＤＥ４Ｄ７スコアのロジスティック回帰モデルの較正プロットを示している。このグラフは、全体的なコホートの１０デシルサブグループにおける、一次治療後５年以内にＰＳＡ再発がなかった患者の観察された数対予想された数（すなわち、ロジスティック回帰モデルにより予測された数）を示している。決定の係数は０．９３３６であり、プロットした回帰直線ｙ＝Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ＋Ｓｌｏｐｅ＊ｘ（直線の破線）に対する式の詳細は以下の通りである：標準誤差＝３．３６２１を有したＩｎｔｅｒｃｅｐｔ＝０．７００６、９５％  ＣＩ＝−７．０５２５−８．４５３７、ｔ＝０．２０８４、及びｐ＝０．８４０１；標準誤差＝０．０９２４３を有したＳｌｏｐｅ＝０．９８０４、９５％  ＣＩ＝０．７６７２−１．１９３５、ｔ＝１０．６０７２、及びｐ＜０．０００１。曲がった破線は、９５％信頼区間を示している。
【０１７９】
図１７は、完全な５年間のフォローアップを伴う４４９人の患者コホートのＨｏｓｍｅｒ−Ｌｅｍｅｓｈｏｗ試験（カイ二乗３．９；ｐ＝０．８７）後の分割表に基づく、手術後の５年生化学的再発を予測するためのＮＣＣＮ＆ＰＤＥ４Ｄ７スコアのロジスティック回帰モデルの較正プロットを示している。このグラフは、全体的なコホートの１０デシルサブグループにおける、一次治療後５年以内にＰＳＡ再発を有した患者の観察された数対予想された数（すなわち、ロジスティック回帰モデルにより予測された数）を示している。決定の係数は０．９２９１であり、プロットした回帰直線ｙ＝Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ＋Ｓｌｏｐｅ＊ｘ（直線の破線）に対する式の詳細は以下の通りである：標準誤差＝１．０８９５を有したＩｎｔｅｒｃｅｐｔ＝０．２０８３、９５％  ＣＩ＝−２．３０４１−２．７２０７、ｔ＝０．１９１２、及びｐ＝０．８５３２；標準誤差＝０．０９５４４を有したＳｌｏｐｅ＝０．９７７４、９５％  ＣＩ＝０．７５７３−１．１９７５、ｔ＝１０．２４０５、及びｐ＜０．０００１。曲がった破線は、９５％信頼区間を示している。
【０１８０】
次に、ＲＯＣ（受信者動作特性）分析を行って、２、５、及び１０年のＡＵＣ（ＲＯＣ曲線下面積）をそれぞれ０．７７９、０．７４９、及び０．７４８と計算した。
【０１８１】
図１８は、完全な５年間のフォローアップを伴う、４４９人の患者コホートにおける、ＮＣＣＮ＆ＰＤＥ４Ｄ７スコアのロジスティック回帰モデルの手術後の２年生化学的再発（ＢＣＲ）のＲＯＣ分析を示している。グラフは、偽陽性（感度）対偽陰性（特異度）のプロットのＲＯＣ曲線を示している。ＲＯＣ分析の統計学的詳細は以下の通りである：陽性のグループ＝４７（１０．４７％）、陰性のグループ４０２（８９．５３％）、疾病の罹患＝１０．５％、ＡＵＣ＝０．７７９、標準誤差＝０．０３３４、９５％  ＣＩ＝０．７３８−０．８１７、ｚ統計＝８．３６８、ｐ（面積＝０．５）＜０．０００１。
【０１８２】
図１９は、完全な５年間のフォローアップを伴う、４４９人の患者コホートにおける、ＮＣＣＮ＆ＰＤＥ４Ｄ７スコアのロジスティック回帰モデルの手術後の５年生化学的再発（ＢＣＲ）のＲＯＣ分析を示している。グラフは、偽陽性（感度）対偽陰性（特異度）のプロットのＲＯＣ曲線を示している。ＲＯＣ分析の統計学的詳細は以下の通りである：陽性のグループ＝９２（２０．４９％）、陰性のグループ３５７（７９．５１％）、疾病の罹患＝未知、ＡＵＣ＝０．７４９、標準誤差＝０．０２８４、９５％  ＣＩ＝０．７０６−０．７８８、ｚ統計＝８．７３９、ｐ（面積＝０．５）＜０．０００１。
【０１８３】
図２０は、完全な１０年間のフォローアップを伴う、３７９人の患者コホートにおける、ＮＣＣＮ＆ＰＤＥ４Ｄ７スコアのロジスティック回帰モデルの手術後の１０年生化学的再発（ＢＣＲ）のＲＯＣ分析を示している。グラフは、偽陽性（感度）対偽陰性（特異度）のプロットのＲＯＣ曲線を示している。ＲＯＣ分析の統計学的詳細は以下の通りである：陽性のグループ＝１３４（３５．３６％）、陰性のグループ２４５（６４．６４％）、疾病の罹患＝未知、ＡＵＣ＝０．７４８、標準誤差＝０．０２５９、９５％  ＣＩ＝０．７０１−０．７９１、ｚ統計＝９．５４９、ｐ（面積＝０．５）＜０．０００１。
【０１８４】
図２１において示されているように、ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアの関数としてのＮＣＣＮ臨床リスクカテゴリーあたりの予測されたリスクの分析によって、最も低いＮＣＣＮ臨床リスクグループ内でも、不均一な５年進行リスク（ＢＣＲ）の分布が明らかになった。図において、それぞれ個々のＮＣＣＮリスクカテゴリーのＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアに対して５年の予測された確率ｐが、プロットされている。
【０１８５】
患者あたりの予測されたリスクに基づき、４つのリスクグループを、一次治療後の５年（＜１０％）又は１０年（＜１５％）ＢＣＲの低い可能性（図２２におけるリスクグループ０から＜０．１）、又は、ＰＳＡ失敗の非常に多くの５年術後リスク（＞７０％）（図２２におけるリスクグループ（０．５から１．０））のいずれかを用いて定義し、イベントに対するリスクの中央値はわずか２７．１ヵ月であった。リスクグループ（０．２５から＜０．５）に対するリスクの中央値は、１４９．７ヵ月であったが、無増悪生存率の中央値には、リスクグループ（０から＜０．１）及び（０．１から＜０．２５）は達しなかった。カプランマイヤー分析における参照としてリスクグループ（０から＜０．１）を使用する場合、リスクグループ（０．１から＜０．２５）、（０．２５から＜０．５）、及び（０．５から１．０）に対するハザード比は、それぞれ２．２（９５％  ＣＩ  １．７−３．５）、４．３（９５％  ＣＩ  ２．８−６．６）、及び１１．５（９５％  ＣＩ  ４．６−２８．８）であった（図２２、表１０）。
【０１８６】
【表１０】
2020500527.tif 000017
考察
患者毎に個々のリスクを評価するために、ＮＣＣＮリスクグループ及びＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアに基づく回帰モデルを開発した。回帰モデルによって、ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアは、広く重複した現代のＮＣＣＮリスクカテゴリーにおける個々のリスクの分布を定義したことが示された。個々の患者について決定したＮＣＣＮリスクグループに無関係に、ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアが高いほど、進行リスクは低いことが定義され、ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアが低いほど、所与の患者に対する進行性疾患のリスクは高いことが示された。
【０１８７】
ごく最近、Ｇｏｅｔｅｂｏｒｇのランダム化前立腺がんスクリーニング試験内の積極的監視コホートの長期結果が発表された。これらは、臨床的に低リスクの疾患を有する男性は、延期された治療レジメンのもとで進行性疾患を経験するかなりのリスクを有する可能性があるということを示している。従って、著者らは、超低リスクの疾患を有する男性以外の男性が待機的管理の戦略に適格であるかどうか疑問を呈した。最近発表されたＰｒｏｔｅｃＴ試験の１０年転帰は、本試験のアクティブモニタリングアームにおいても類似の結論を示している。現代の診療におけるこれらの結果の妥当性については議論が分かれているけれども、超低リスクである患者のみが、延期された治療管理中のいかなる進行に対しても安全であるということが示唆され得る。臨床的基準の使用により、そのような超低リスクではあるが小規模の患者コホート（例えば、本コホートにおける４４９人の患者中６２例；１３．８％）の選択が可能であるけれども、分子マーカーの追加が、この超低リスクの患者グループを拡大する（例えば、ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアがＮＣＣリスクカテゴリーと組み合わされた場合、本コホートにおける４４９人の患者中１２２例、２７．２％に相当）と本発明者等によって期待される。
【０１８８】
本明細書及び付随の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の不定冠詞は、その前後で何か他に明確に指示していない限り、それぞれの複数形も含む。
【０１８９】
「約」及び「ほぼ」という用語は、くだんの特徴の技術的効果を依然として保証すると当業者が理解するであろう正確さの差を示している。この用語は、典型的には、±２０％、又は±１５％、又は±１０％、又は±５％の示された数値からの偏差を示している。
【０１９０】
「含む」という用語は限定的ではないと理解されたい。本発明の解釈上、「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語は、「から構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ｏｆ）」という用語の好ましい具体化であると考慮される。以後、群が少なくとも特定数の具体化を含むよう定義される場合、これは、これらの具体化から成る群のみを包含するとも意味する。
【０１９１】
さらに、本明細書及び特許請求の範囲において「第１」、「第２」、「第３」、又は、「（ａ）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」等の用語は、類似の要素を区別するために使用され、必ずしも順番又は時系列順を記述するために使用されているのではない。そのように使用されている用語は、適切な状況下で交換可能であり、本明細書において記述されている本発明の実施形態は、本明細書に記述又は例示された順序以外の順序で操作できることが理解されたい。
【０１９２】
「第１」、「第２」、「第３」、又は、「（ａ）」、「（ｂ）」、「（ｃ）」、「（ｄ）」等の用語が方法又は使用のステップに関する場合、ステップ間の時間又は時間間隔の一貫性はなく、すなわち、ステップは、同時に実行することができるか、又は、本明細書において上記又は下記に定められたように本願において示されていない限り、そのようなステップ間には秒、分、時、日、週、月、若しくは年さえの時間間隔があってもよい。本発明は、本明細書において記載される特定の方法論、プロトコル、タンパク質、細菌、ベクター、試薬等は変わり得るためこれらに限定されないことを理解されたい。本明細書において使用される用語法は特定の実施形態を記載する目的のみにあり、付随の特許請求の範囲によってのみ限定されることになる本発明の範囲を限定すると意図されないことも理解されたい。他に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術的及び科学的用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【図１】
2020500527.tif 000018
【図２】
2020500527.tif 000019
【図３】
2020500527.tif 000020
【図４】
2020500527.tif 000021
【図５】
2020500527.tif 000022
【図６】
2020500527.tif 000023
【図７】
2020500527.tif 000024
【図８】
2020500527.tif 000025
【図９】
2020500527.tif 000026
【図１０】
2020500527.tif 000027
【図１１】
2020500527.tif 000028
【図１２】
2020500527.tif 000029
【図１３】
2020500527.tif 000030
【図１４】
2020500527.tif 000031
【図１５】
2020500527.tif 000032
【図１６】
2020500527.tif 000033
【図１７】
2020500527.tif 000034
【図１８】
2020500527.tif 000035
【図１９】
2020500527.tif 000036
【図２０】
2020500527.tif 000037
【図２１】
2020500527.tif 000038
【図２２】
2020500527.tif 000039
【配列表】
2020500527000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年8月2日(2019.8.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リスク層別化の方法であって、
ヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）、チューブリン−アルファ−１ｂ（ＴＵＢＡ１Ｂ）、ヒトプミリオＲＮＡ−結合ファミリーメンバー（ＰＵＭ１）、及びヒトＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）、並びにその組み合わせを含む群から選択される１つ又は複数の参照遺伝子のセットに関して、ホスホジエステラーゼ４Ｄバリアント７（ＰＤＥ４Ｄ７）を含む単一のマーカー遺伝子の正規化された遺伝子発現プロファイルを決定するステップと、
前記正規化された遺伝子発現プロファイルに基づき、スコアリング関数を用いて予後リスクスコアを決定するステップであり、前記スコアリング関数は、前立腺がんについてモニターされた対象から採取された生物学的試料に対する遺伝子発現プロファイルから得られた、ステップと、
前記予後リスクスコア、及び、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  （ＮＣＣＮ）の分類である第２のリスク決定に基づき、組み合わされた予後リスクスコアを決定するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
前記組み合わされた予後リスクスコアが、前立腺がんについてモニターされた対象から得られた回帰関数を用いて決定されることによってさらに特徴づけられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つの前記参照遺伝子が、ＨＰＲＴ１、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＰＵＭ１、及びＴＢＰのうち少なくとも２つ、又は少なくとも３つ、又は全てを含むことによってさらに特徴づけられる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記予後リスクスコアが、唯一のマーカー遺伝子としてのＰＤＥ４Ｄ７に対する発現レベルを含む前記正規化された遺伝子発現プロファイルに基づくことによってさらに特徴づけられる、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝子発現プロファイルを決定するステップが、生物学的試料から抽出されたＲＮＡに対してＲＴ−ｑＰＣＲを行うステップを含むことによってさらに特徴づけられる、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子発現プロファイルを決定するステップが、ＰＤＥ４Ｄ７及び前記少なくとも１つの参照遺伝子のそれぞれのＣｑ値を決定することを含むことによって、及び、前記予後リスクスコアを決定するステップが、前記セットにおける前記参照遺伝子のそれぞれの値を使用して前記ＰＤＥ４Ｄ７の値を正規化すること、及び、正規化されたスコアの線形関数として前記リスクスコアを計算することを含むことによってさらに特徴づけられる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記組み合わされた予後リスクスコアに基づき、予め定義された少なくとも２つ又は少なくとも３つのリスクグループのセットの１つに対象を分類することによってさらに特徴づけられる、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
割り当てられたリスクグループに基づき対象に対する治療法を提案するステップであって、前記リスクグループのうち少なくとも２つが異なる治療法と関連している、ステップ、
前立腺手術前後の対象の疾患進行リスク予測を計算するステップ、及び
前立腺手術前後の対象の治療応答予測を計算するステップ、
のうち少なくとも１つをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
提案された前記治療法が、
ａ）少なくとも前立腺部分切除術、
ｂ）放射線治療、ホルモン療法、化学療法、及びその組み合わせから選択される積極的治療法、
ｃ）ａ）又はｂ）を行うことなく観察、
を含む群から選択されることによってさらに特徴づけられる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
割り当てられたリスクグループに基づく前記提案された治療法が、前記第２のリスク決定のみに基づく提案された治療法とは異なることによってさらに特徴づけられる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
コンピュータによって実行される場合に、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の方法を行う指示を記憶するコンピュータプログラム。
【請求項１２】
診断キットであって、
ホスホジエステラーゼ４Ｄバリアント７（ＰＤＥ４Ｄ７）の発現レベルを決定するための少なくとも１つのプライマー及び／又はプローブ、
ヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）、チューブリン−アルファ−１ｂ（ＴＵＢＡ１Ｂ）、ヒトプミリオＲＮＡ−結合ファミリーメンバー（ＰＵＭ１）、及びヒトＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）、並びにその組み合わせを含む群から選択される少なくとも１つの参照遺伝子の遺伝子発現レベルを決定するための少なくとも１つのプライマー及び／又はプローブ、
決定された前記発現レベルに基づきリスクスコアを計算するための指示であり、コンピュータによって実行される場合に方法を行うコンピュータプログラムに記憶され、前記方法は、
前記少なくとも１つの参照遺伝子に関して、前記ホスホジエステラーゼ４Ｄバリアント７（ＰＤＥ４Ｄ７）の正規化された遺伝子発現プロファイルを決定するステップと、
前記正規化された遺伝子発現プロファイルに基づき、スコアリング関数を用いて予後リスクスコアを決定するステップと、
前記予後リスクスコア、及び、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  （ＮＣＣＮ）の分類である第２のリスク決定に基づき、組み合わされた予後リスクスコアを決定するステップと、
を含む、指示、
を含む診断キット。
【請求項１３】
リスク層別化のための遺伝子発現プロファイルの使用であって、
対象から得られた生物学的試料の遺伝子発現プロファイルを決定するステップであり、前記遺伝子発現プロファイルは、ヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）、チューブリン−アルファ−１ｂ（ＴＵＢＡ１Ｂ）、ヒトプミリオＲＮＡ−結合ファミリーメンバー（ＰＵＭ１）、及びヒトＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）、並びにその組み合わせを含む群から選択される１つ又は複数の参照遺伝子のセットに関して正規化されたホスホジエステラーゼ４Ｄバリアント７（ＰＤＥ４Ｄ７）の発現レベルである、ステップと、
スコアリング関数を用いて、前記遺伝子発現プロファイルに基づき前記対象に対する予後リスクスコアを決定するステップであり、前記スコアリング関数は、前立腺がんについてモニターされた対象から採取された生物学的試料に対する遺伝子発現プロファイルから得られる、ステップと、
前記予後リスクスコア、及び、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  （ＮＣＣＮ）の分類である第２のリスク決定に基づき、組み合わされた予後リスクスコアを決定するステップと、
を含む使用。
【請求項１４】
コンピュータプログラムであって、コンピュータ上で実行される場合に、前記コンピュータに
ヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）、チューブリン−アルファ−１ｂ（ＴＵＢＡ１Ｂ）、ヒトプミリオＲＮＡ−結合ファミリーメンバー（ＰＵＭ１）、及びヒトＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）、並びにその組み合わせを含む群から選択される１つ又は複数の参照遺伝子のセットに関して、ホスホジエステラーゼ４Ｄバリアント７（ＰＤＥ４Ｄ７）の正規化された遺伝子発現プロファイルを計算するステップと、
スコアリング関数を用いて、前記遺伝子発現プロファイルに基づき対象に対する予後リスクスコアを計算するステップであり、前記スコアリング関数は、任意的に、前立腺がんについてモニターされた対象から採取された生物学的試料に対する遺伝子発現プロファイルから得られる、ステップと、
前記予後リスクスコア、及び、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  （ＮＣＣＮ）の分類である第２のリスク決定に基づき、組み合わされた予後リスクスコアを計算するステップと、
を含む方法を行わせる、コンピュータプログラム。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
例証的な実施形態の一態様によると、リスク層別化の方法は、ヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）、チューブリン−アルファ−１ｂ（ＴＵＢＡ１Ｂ）、ヒトプミリオＲＮＡ−結合ファミリーメンバー（ＰＵＭ１）、及びヒトＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）、並びにその組み合わせを含む群から選択される参照遺伝子のセットに関して、ホスホジエステラーゼ４Ｄバリアント７（ＰＤＥ４Ｄ７）を含む単一のマーカー遺伝子の正規化された遺伝子発現プロファイルを決定するステップを含む。当該方法は、正規化された遺伝子発現プロファイルに基づき、スコアリング関数を用いて予後リスクスコアを決定するステップをさらに含み、スコアリング関数は、前立腺がんについてモニターされた対象から採取された生物学的試料に対する遺伝子発現プロファイルから得られた。当該方法は、予後リスクスコア、及び、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  （ＮＣＣＮ）の分類である第２のリスク決定に基づき、組み合わされた予後リスクスコアを決定するステップをさらに含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
別の態様によると、診断キットが、ＰＤＥ４Ｄ７を含む少なくとも１つのホスホジエステラーゼ４Ｄ（ＰＤＥ４Ｄ）バリアントの発現レベルを決定するための少なくとも１つのプライマー及び／又はプローブ、及び、少なくとも１つの参照遺伝子の遺伝子発現レベルを決定するための少なくとも１つのプライマー及び／又はプローブを含む。当該キットは、決定された発現レベルに基づきリスクスコアを計算するための指示を含む。指示は、コンピュータプログラムプロダクトに記憶され、コンピュータによって実行される場合に、少なくとも１つの参照遺伝子に関して、ホスホジエステラーゼ４Ｄバリアント７（ＰＤＥ４Ｄ７）の正規化された遺伝子発現プロファイルを決定するステップと、正規化された遺伝子発現プロファイルに基づき、スコアリング関数を用いて予後リスクスコアを決定するステップと、予後リスクスコア、及び、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  （ＮＣＣＮ）の分類である第２のリスク決定に基づき、組み合わされた予後リスクスコアを決定するステップとを含む方法を行う。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
別の態様によると、前立腺がんを有する対象に対する治療推奨を提供する方法が、対象からの生物学的試料の遺伝子発現プロファイルを決定するステップを含む。遺伝子発現プロファイルは、ホスホジエステラーゼ４Ｄバリアント７（ＰＤＥ４Ｄ７）の発現レベルを含む。遺伝子発現プロファイルは、ＨＰＲＴ１、ＴＵＢＡ１Ｂ、ＰＵＭ１、及びＴＢＰから選択される少なくとも１つの参照遺伝子の発現レベルを使用して正規化される。予後リスクスコアは、正規化された遺伝子発現プロファイルに基づき対象に対して決定される。対象は、予後リスクスコアに基づき、ＰＤＥ４Ｄ７リスクグループに分類される。当該方法は、予後リスクスコア、及び、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  （ＮＣＣＮ）の分類である第２のリスク決定に基づき、対象に対する組み合わされた予後リスクスコアを決定するステップも含む。対象は、組み合わされた予後リスクスコアに基づき、リスクグループに分類される。リスクグループに基づき、治療推奨が対象に提供される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
別の態様によると、コンピュータプログラムプロダクトが、指示を記憶する非一時的記録媒体を含み、指示は、コンピュータ上で実行される場合に、コンピュータに：ヒトヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）、チューブリン−アルファ−１ｂ（ＴＵＢＡ１Ｂ）、ヒトプミリオＲＮＡ−結合ファミリーメンバー（ＰＵＭ１）、及びヒトＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）、並びにその組み合わせを含む群から選択される参照遺伝子のセットに関して、ホスホジエステラーゼ４Ｄバリアント７（ＰＤＥ４Ｄ７）の正規化された遺伝子発現プロファイルを計算するステップ；及び、スコアリング関数を用いて、遺伝子発現プロファイルに基づき対象に対する予後リスクスコアを計算するステップ；を含む方法を行わせる。スコアリング関数は、前立腺がんについてモニターされた対象から採取された生物学的試料に対する遺伝子発現プロファイルから得られたものであってもよい。当該方法は、予後リスクスコア、及び、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  （ＮＣＣＮ）の分類である第２のリスク決定に基づき、組み合わされた予後リスクスコアを計算するステップをさらに含む。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
上述のように、第２のリスク決定は、超低リスク（ＶＬＲ）、低リスク（ＬＲ）、好ましい中リスク（ｆａｖｏｒａｂｌｅ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｒｉｓｋ）（ＦＩＲ）、好ましくない中リスク（ｕｎｆａｖｏｒａｂｌｅ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｒｉｓｋ）（ＵＩＲ）、及び高リスク（ＨＲ）のうち１つ又は複数等、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＮＣＣＮ）の分類である。組み合わされた予後リスクスコアは、前立腺がんについてモニターされた対象から得られる回帰関数を用いて決定されてもよい。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
当該方法は、組み合わされた予後リスクスコアに基づき、予め定義されたリスクグループのセットのうちの１つに対象を分類するステップをさらに含んでもよい。少なくとも２つ又は少なくとも３つのリスクグループが、組み合わされた予後リスクスコアに基づきあってもよい。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
【図１】前立腺がんを有する患者における治療法選択のためのリスク層別化の方法を例示した流れ図である。
【図２】ＰＤＥ４Ｄ７の正規化された遺伝子発現プロファイル（左）及びＰＤＥ４Ｄ７リスクスコア変換（右）を示した図である。
【図３】全患者コホート（５０３人の患者を含む）の多変量Ｃｏｘ回帰分析後のハザード比（ＨＲ）及び９５％信頼区間（９５％ＣＩ）のフォレストプロットを示した図であり、ここで、試験した臨床エンドポイントは、手術後の生化学的再発（ＢＣＲ）までの時間である。
【図４】ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアグループに対する、前立腺切除術後の前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の再発までの時間のカプランマイヤー分析を示した図である。リスクスコアグループあたりの２０ヵ月の時間間隔ごとのリスクを有する患者（すなわち男性）の数及びハザード比のグループ単位の比較も示さている。
【図５】全患者コホート（５０３人の患者）の多変量Ｃｏｘ回帰分析後のハザード比（ＨＲ）及び９５％信頼区間（９５％ＣＩ）のフォレストプロットを示した図であり、ここで、試験した臨床エンドポイントは、手術後の生化学的再発（ＢＣＲ）までの時間である。
【図６】生化学的再発、救援放射線療法、救援アンドロゲン除去療法、臨床的再発、前立腺がん特異的死亡率、及び全死亡率を含む多数の臨床術後エンドポイントに対する、ハザード比及び９５％信頼区間（９５％ＣＩ）のフォレストプロットを示した図である。
【図７】ＮＣＣＮリスクグループ対ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアグループにおける５年生化学的再発（ＢＣＲ）のリスクのグラフを示した図である。
【図８】ＮＣＣＮリスクグループ対ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアグループにおける１０年臨床的再発（ＣＲ）のリスクのグラフを示した図である。
【図９】ＮＣＣＮリスクグループ対ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアグループにおける１０年前立腺がん特異的死亡率（ＰＣＳＭ）のリスクのグラフを示した図である。
【図１０】ＮＣＣＮリスクグループ対ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアグループにおける１０年全死亡率（ＯＭ）のリスクのグラフを示した図である。
【図１１】ＮＣＣＮ臨床リスクグループ対ＰＤＥ４Ｄ７リスクグループにおけるリスク進行マトリックスを例示した図である。
【図１２】ＮＣＣＮ好ましい中リスクグループ（１２８人の患者）における生化学的再発に対する生検グリーソンスコアのカプランマイヤー分析を示した図である。生検グリーソンスコアは、グリーソングレードグループ３＋３（図における下側の線）及び３＋４（図における上側の線）に分類される。また、ハザード比（ＨＲ）の対単位のリスクグループ比較も例示されている。
【図１３】ＮＣＣＮ好ましい中リスクグループ（１２８人の患者）における生化学的再発に対するＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアグループのカプランマイヤー分析を示した図である。また、ハザード比（ＨＲ）の対単位のリスクグループ比較も例示されている。
【図１４】ＮＣＣＮ好ましくない中及び高リスクグループ（１６４人の患者）における生化学的再発に対する生検グリーソンスコアのカプランマイヤー分析を示した図である。生検グリーソンスコアは、グリーソングレードグループ３＋３、３＋４、４＋３、及び≧４＋４に分類される。また、ハザード比（ＨＲ）の対単位のリスクグループ比較も例示されている。
【図１５】ＮＣＣＮ好ましくない中＆高リスクグループ（１６４人の患者）における生化学的再発に対するＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアグループのカプランマイヤー分析を示した図である。また、ハザード比（ＨＲ）の対単位のリスクグループ比較も例示されている。
【図１６】完全な５年間のフォローアップを伴う、４４９人の患者コホートのＨｏｓｍｅｒ−Ｌｅｍｅｓｈｏｗ検定後の分割表に基づき、手術後の５年生化学的再発を予測するためのＮＣＣＮ＆ＰＤＥ４Ｄ７スコアのロジスティック回帰モデルの較正プロットを示した図である。
【図１７】完全な５年間のフォローアップを伴う、４４９人の患者コホートのＨｏｓｍｅｒ−Ｌｅｍｅｓｈｏｗ検定後の分割表に基づき、手術後の５年生化学的再発を予測するためのＮＣＣＮ＆ＰＤＥ４Ｄ７スコアのロジスティック回帰モデルの較正プロットを示した図である。
【図１８】完全な５年間のフォローアップを伴う、患者コホート（４４９人の患者）におけるＮＣＣＮ＆ＰＤＥ４Ｄ７スコアのロジスティック回帰モデルの手術後の２年生化学的再発（ＢＣＲ）のＲＯＣ分析を示した図である。
【図１９】完全な５年間のフォローアップを伴う、患者コホート（４４９人の患者）におけるＮＣＣＮ＆ＰＤＥ４Ｄ７スコアのロジスティック回帰モデルの手術後の５年生化学的再発（ＢＣＲ）のＲＯＣ分析を示した図である。
【図２０】完全な１０年間のフォローアップを伴う、患者コホート（３７９人の患者）におけるＮＣＣＮ＆ＰＤＥ４Ｄ７スコアのロジスティック回帰モデルの手術後の１０年生化学的再発（ＢＣＲ）のＲＯＣ分析を示した図である。
【図２１】ＰＤＥ４Ｄ７リスクスコアの関数として、ＮＣＣＮグループにあたる予測されたリスクの分析を示した図であり、最も低いＮＣＣＮ臨床リスクグループでも、不均一な５年進行リスク（ＢＣＲ）の分布を明らかにしている。
【図２２】５年間の完全なフォローアップを伴う、患者サブコホートにおける無生化学的再発（ＢＣＲ）生存のカプランマイヤー分析の結果を示した図である（４４９人の患者）。４つのリスクカテゴリーを、生化学的再発を経験する５年確率ｐを計算したロジスティック回帰モデルに基づき定義した：リスクグループ１（０から＜０．１；１３９人の患者）；リスクグループ２（０．１から＜０．２５；１７０人の患者）；リスクグループ３（０．２５から＜０．５；１１２人の患者）；リスクグループ４（０．５から１．０；２８人の患者）。
【国際調査報告】
2020500527.tif 000040
2020500527.tif 000041
2020500527.tif 000042