(57)【要約】【課題】本発明は、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）の治療のためのエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）の使用に関する。【解決手段】より詳細には、本発明は、潰瘍性大腸炎に罹患している被験体において炎症を低減するための、少なくとも９５％の純度を有する高純度の、遊離脂肪酸としてのエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ−ＦＦＡ）の使用に関し、ここでＩＬ−１０またはＳＯＣＳ−３のレベルが増加し、かつ超粘膜組織の微生物叢が好ましく調節される。【選択図】図１
2020508286.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
潰瘍性大腸炎を有する被験体においてＩＬ−１０およびサイトカインシグナル伝達抑制因子（ＳＯＣＳ３）を誘導するおよび／またはそれらのレベルを増加させる方法であって、少なくとも９５％の純度を有する遊離脂肪酸形態のエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ−ＦＦＡ）の治療量を前記被験体に投与することを含み、前記治療量が１日当たり約２５０ｍｇ〜４ｇの量である、方法。
【請求項２】
ＥＰＡ−ＦＦＡの純度が少なくとも９９％である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
治療量が１日当たり６００ｍｇ〜約２ｇの量である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＳＯＣＳ３の増加がシグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）の部分的阻害を引き起こす、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＥＰＡ−ＦＦＡが約４５日〜約６ヶ月間投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＥＰＡ−ＦＦＡが約９０日間投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
潰瘍性大腸炎に罹患している被験体において粘膜組織の腸内微生物叢を調節するための方法であって、少なくとも９５％の純度を有する遊離脂肪酸形態のエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ−ＦＦＡ）の治療量を被験体に投与することを含み、前記治療量が１日当たり約２５０ｍｇ〜４ｇの量である、方法。
【請求項８】
Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ科およびＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科のレベルが増加し、かつ粘液溶解性Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種のレベルが減少する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＥＰＡ−ＦＦＡの純度が少なくとも９９％である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
治療量が１日当たり６００ｍｇ〜約２ｇの量である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
ＥＰＡ−ＦＦＡが約４５日〜約６ヶ月間投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
ＥＰＡ−ＦＦＡが約９０日間投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
杯細胞分化を促進するためにＫＬＦ−４を誘導する方法であって、少なくとも９５％の純度を有する遊離脂肪酸形態のエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ−ＦＦＡ）の治療量を潰瘍性大腸炎に罹患している被験体に投与することを含み、前記治療量が１日当たり約２５０ｍｇ〜４ｇの量である、方法。
【請求項１４】
ＥＰＡ−ＦＦＡの純度が少なくとも９９％である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
治療量が１日当たり６００ｍｇ〜約２ｇの量である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ＥＰＡ−ＦＦＡが約４５日〜約６ヶ月間投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
ＥＰＡ−ＦＦＡが約９０日間投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
ＵＣに罹患している被験体において、ＩＬ−１０またはＳＯＣＳ−３のレベルを増加させるため、杯細胞分化に関連するＨｅｓ−１およびＫＬＦ−４の誘導のため、および腸粘膜組織のマイクロバイオームを好ましく調節するための、少なくとも９５％の純度を有する遊離脂肪酸形態のエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ−ＦＦＡ）の使用であって、前記ＥＰＡ−ＦＦＡが１用量当たり約２５０ｍｇ〜４ｇの量である、使用。
【請求項１９】
ＥＰＡ−ＦＦＡが約４５日〜約６ヶ月間投与される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
ＥＰＡ−ＦＦＡが約９０日間投与される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２１】
前記ＥＰＡ−ＦＦＡが用量あたり約６００ｍｇ〜約２ｇの量である、請求項１８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
［0001］  本出願は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年２月１４日に出願された米国特許仮出願第６２／４５８，７１５号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
［0002］技術分野
［0003］  本発明は、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）の治療のためのエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）の使用に関し、より詳細には、潰瘍性大腸炎に罹患している被験体において炎症を低減するため、および微生物叢(microbiota)を改変するための高純度の、遊離脂肪酸としてのエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ−ＦＦＡ）の使用に関する。
【０００３】
［0004］  関連技術
［0005］  潰瘍性大腸炎（ＵＣ）の患者は、大腸炎関連発癌（ＣＡＣ）を発症するリスクが高く、これは疾患の期間および程度に比例的に関連する（１）。ＣＡＣの発症を予防するための現在の戦略は主に、悪性転化する可能性のある異形成を阻害し根絶するための内視鏡サーベイランスに基づいている（２）。しかしながら、持続的で活動的な腸炎症は、内視鏡検査中に異形成部位の同定を妨げる可能性がある。したがって、定期的な内視鏡サーベイランスで得られる進行癌発現率の低下にもかかわらず、ＣＡＣ予防の重要な目標は依然として、組織学的寛解の状態を維持すること（３、４）、および内視鏡サーベイランスがより効果的であろう患者を示す予測マーカーを入手することにある。糞便カルプロテクチン（ＦＣ）は、好中球顆粒球中に豊富な、ＳＩ００タンパク質ファミリーに属する細胞質タンパク質であり（５）、無症候性ＵＣ患者においても内視鏡的活動性の良好な予測因子である（６）。
【０００４】
［0006］  いくつかの関連する分子機構が、慢性的腸炎症の間の悪性上皮形質転換に寄与する。これらの中で、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）の異常な活性化、およびインターロイキン（ＩＬ）−１０の欠乏または機能障害は、ＣＡＣの発症に決定的に関与している（７、８）。
【０００５】
［0007］  さらに、薄くて浸透性の粘液層は、細菌と上皮との直接接触を可能にし、結腸炎症を持続させ、したがってＵＣ患者の大腸癌発症を促進する（９）。実際、炎症性結腸粘膜における粘膜および糞便細菌の過剰増殖がＵＣ患者で観察され、ＵＣの病因およびＣＡＣへの進行における腸内微生物叢の重要な役割を支持している（１０、１１）。
【０００６】
［0008］  カノニカルＮｏｔｃｈシグナル伝達経路は、転写標的であるｈａｉｒｙ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｓｐｌｉｔ  １（ＨＥＳ１）、アンタゴニスト無調ホモログ１（ＨＡＴＨ１）およびクルッペル様因子４（ＫＬＦ４）標的の調節を介し、適切な腸分化を維持するために重要である（１２、１３）。本発明者らは近年、ＣＡＣ進行間のＨＥＳ１の腫瘍抑制機能を提案したが、一方でＣＡＣにおけるＫＬＦ４の役割はなお議論の余地がある（１５）。これらの転写因子の調節異常は、上皮分化を損なわせ、これは病原微生物の増殖の不十分な制御をもたらし、腫瘍が発生しやすい微小環境に好都合となる（１６）。
【０００７】
［0009］  ＣＡＣ予防のためのツールとしての抗炎症剤の使用は、研究の集中的な焦点であった（１７、１８）。今日まで、議論がなされていないＣＡＣのための化学予防剤は存在していない。長期にわたる潰瘍性大腸炎患者は大腸癌（ＣＡＣ）を発症するリスクが高い。潰瘍性大腸炎（ＵＣ）は、結腸に影響を与える慢性炎症状態であり、活動期および寛解期が交互にあることを特徴とする。臨床的活動性の前には、常に進行性の無症状の粘膜炎症がある。重要なことに、ＵＣの治療は癌の発症を阻害または減らす可能性がある。
【０００８】
［0010］  したがって、潰瘍性大腸炎に罹患している患者において炎症を減少する、および杯細胞分化マーカーおよび微生物叢の両方に影響する最終結果を伴いＵＣを低減および／または治療する能力を有する治療に対する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００９】
［0011］  本発明は、潰瘍性大腸炎に罹患している被験体において炎症を軽減するため、ＳＯＣＳ−３のＩＬ−１０レベルを増加するため、杯細胞分化に関連するＨｅｓ−１およびＫＬＦ−４を誘導するため、ならびにそのような被験体における腸粘膜組織のマイクロバイオームを有利に調節するための、少なくとも９５％の純度、より好ましくは９９％の純度を有する、高純度の、遊離脂肪酸としてのエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ−ＦＦＡ）の使用に関する。
【００１０】
［0012］  別の態様では、本発明はＩＬ−１０およびサイトカインシグナル伝達抑制因子（ＳＯＣＳ３）を誘導するならびにそれらのレベルを上昇させる方法を提供し、本方法は、潰瘍性大腸炎に罹患している被験体に、少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％の純度を有する遊離脂肪酸形態のエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ−ＦＦＡ）の治療量を投与することを含み、ここで治療量は、１日あたり約２５０ｍｇ〜４ｇの量であり、より好ましくは１日当たり約６００ｍｇ〜約２ｇである。
【００１１】
［0013］  特に、ＳＯＣＳ３の増加に伴い、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）の活性の部分的阻害がある。
【００１２】
［0014］  好ましくは、ＥＰＡ−ＦＦＡは、約４５日〜少なくとも６ヶ月間、より好ましくは約９０日間投与される。
【００１３】
［0015］  さらに別の態様では、本発明は、潰瘍性大腸炎に罹患している対象において粘膜組織の腸内微生物叢を調節する方法を提供し、本方法は、被験体に、少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％の純度を有する遊離脂肪酸形態のエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ−ＦＦＡ）の治療量を投与することを含み、ここで治療量は１日あたり約２５０ｍｇ〜４ｇの量であり、より好ましくは１日当たり約６００ｍｇ〜約２ｇであり、期間は約４５日〜少なくとも６ヶ月、より好ましくは約９０日であり、ここでＰｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ科（糞便プレボテラ科）およびＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科（ポルフィロモナス科）のレベルが増加し、かつ、粘液レベルでの粘液溶解性Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種（バクテロイデス属）のレベルが減少する。
【００１４】
［0016］  さらに別の態様において、本発明は、杯状細胞の分化を促進するＫＬＦ−４を誘導する方法を提供し、本方法は、潰瘍性大腸炎に罹患している被験体に、少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％の純度を有する遊離脂肪酸形態のエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ−ＦＦＡ）の治療量を投与することを含み、ここで治療量は１日あたり約２５０ｍｇ〜４ｇの量であり、より好ましくは１日当たり約６００ｍｇ〜約２ｇであり、期間は約４５日〜少なくとも６ヶ月、より好ましくは約９０日である。
【００１５】
［0017］  別の態様では、本発明は、ＵＣに罹患している被験体におけるＩＬ−１０またはＳＯＣＳ−３レベルの増加のため、杯細胞分化に関連するＨｅｓ−１およびＫＬＦ−４の誘導のため、かつ腸粘膜組織のマイクロバイオームを好ましく調節するための、少なくとも９５％の純度を有する遊離脂肪酸形態のエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ−ＦＦＡ）の使用を提供し、ＥＰＡ−ＦＦＡは１日あたり約２５０ｍｇ〜４ｇの量であり、より好ましくは１日当たり約６００ｍｇ〜約２ｇであり、期間は好ましくは約４５日〜少なくとも６ヶ月、より好ましくは約９０日である。
【００１６】
［0018］  本発明のこれらの利点および他の利点ならびに特徴は、以下の好ましい実施形態の詳細な説明においてより完全に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】［0020］図１は、Ｔ０およびＴ３でのすべての患者（ｎ＝１９）における（ａ）赤血球細胞中のエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ；Ｃ２０：５ｎ−３）の割合（％）および（ｂ）ＦＣレベル（μｇ／ｇ）（Ｂ）を示す。統計的有意性は、対になった両側ｔ検定を用いて計算した。データは、平均±ＳＥＭとして示す。
【図２】［0021］図２は、Ｔ０およびＴ３でのコンプライアンス患者およびレスポンダー患者（ｎ＝１５）における（ａ）Ｍａｙｏ内視鏡スコアおよび（ｂ）Ｇｅｂｏｅｓ組織学的スコアを示す。データは、ＭａｙｏおよびＧｅｂｏｅｓカットオフによる患者の割合（％）として提示される。
【図３】［0022］図３は、Ｔ０およびＴ３でのコンプライアンス患者およびレスポンダー患者（ｎ＝１５）におけるホモジナイズしたＳ状結腸組織での（ａ）ＩＬ−１０および（ｂ）ＳＯＣＳ３のｍＲＮＡ発現レベル、（ｃ）ｐ−ＳＴＡＴ３／ＳＴＡＴ３のタンパク質レベルを示す。統計的有意性は、１つのサンプルの両側ｔ検定を用いて計算した。データは、平方根変換値±ＳＥＭの平均として示される。（ｄ）Ｔ０およびＴ３（ｎ＝３）でのｐ−ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５）およびＳＴＡＴ３のウェスタンブロットの代表的画像を示す。
【図４】［0023］図４は、Ｔ０およびＴ３でのコンプライアンス患者およびレスポンダー患者（ｎ＝１５）におけるホモジナイズしたＳ状結腸組織での（ａ）ＨＥＳ１および（ｂ）ＫＬＦ４のタンパク質発現レベルを示す。統計的有意性は、１つのサンプルの両側ｔ検定を用いて計算した。データは、平方根変換値±ＳＥＭの平均として示される。（ｃ）Ｔ０およびＴ３（ｎ＝３）でのＨＥＳ１およびＫＬＦ４のウェスタンブロットの代表的画像を示す。Ｔ０（左パネル）およびＴ３（右パネル）での（ｄ）アルシアンブルーランクおよび（ｅ）染色された杯細胞の代表的画像を示す。アルシアンブルーランクの統計的有意性は、対になった両側ｔ検定を用いて計算した。データはランク±ＳＥＭの平均として示される。
【図５】［0024］図５は、コンプライアンスおよびレスポンダー患者からの入手可能なサンプルにおいて、円グラフとして表される、（ａ）健康な成人、（ｂ）Ｔ０でのＵＣ患者、（ｃ）Ｔ３でのＵＣ患者、ならびに（ｄ）Ｔ０でのＵＣ患者および（ｅ）Ｔ３でのＵＣ患者の大腸生検中の科レベルでの糞便中の微生物叢の組成の中央値を示す。配列決定された試料の少なくとも１０％における総微生物叢の少なくとも０．２％に相当する属の平均相対的存在量が示される。最も豊富な細菌の科（少なくとも１つのサンプル群において平均存在量＞１％で存在する）の色彩コードが、おおよその減少順で報告される。マン・ホイットニーのＵ検定を用いて中央値群間の差を検定した。
【図６】［0025］図６は、Ｔ０およびＴ３でのすべての患者（ｎ＝１９）における赤血球細胞中の（ａ）ω−３  ＰＵＦＡ（ＥＰＡ＋ＤＰＡ＋ＤＨＡ）および（ｂ）ω−６  ＰＵＦＡ（アラキドン酸＋リノール酸）の割合（％）を示す。統計的有意性は、対になった両側ｔ検定を用いて計算した。データは±ＳＥＭの平均として示される。
【図７】［0026］図７は、Ｔ０およびＴ３でのコンプライアンス患者およびレスポンダー患者（ｎ＝１５）におけるＩＬ−２２のｍＲＮＡ発現レベルを示す。データは、平方根変換値±ＳＥＭの平均として示される。
【図８】［0027］図８は、Ｔ０およびＴ３でのコンプライアンス患者およびレスポンダー患者（ｎ＝１５）におけるホモジナイズしたＳ状結腸組織での（ａ）ＩＬ−１０および（ｂ）ＳＯＣＳ３のタンパク質レベルを示す。データは、平方根変換値±ＳＥＭの平均として示される。
【図９】［0028］図９は、Ｔ０およびＴ３でのコンプライアンス患者およびレスポンダー患者（ｎ＝１５）におけるＳＴＡＴ３のｍＲＮＡ発現レベルを示す。データは、平方根変換値±ＳＥＭの平均として示される。
【図１０】［0029］図１０は、Ｔ３でのコンプライアンス患者およびレスポンダー患者（ｎ＝１５）における（ａ）ＩＬ−１０のｍＲＮＡおよび（ｂ）ｐ−ＳＴＡＴ３／ＳＴＡＴ３タンパク質とのＳＯＣＳ３のｍＲＮＡのスピアマン相関分析を示す。
【図１１】［0030］図１１は、Ｔ０およびＴ３でのコンプライアンス患者およびレスポンダー患者（ｎ＝１５）における（ａ）ＨＥＳ１および（ｂ）ＫＬＦ４のｍＲＮＡ発現レベルを示す。データは、平方根変換値±ＳＥＭの平均として示される。
【図１２】［0031］図１２は、Ｔ３でのコンプライアンス患者およびレスポンダー患者（ｎ＝１５）におけるＨＥＳ１およびＫＬＦ−４のスピアマン相関分析を示す。
【図１３】［0032］図１３は、（ａ）コンプライアンス患者およびレスポンダー患者（ｎ＝１５）におけるＭＵＣ２のｍＲＮＡ発現レベルを示す。データは、平方根変換値±ＳＥＭの平均として示される。（ｂ）コンプライアンス患者およびレスポンダー患者（ｎ＝１５）におけるＴ０およびＴ３での免疫組織化学によって分析したＭＵＣ２タンパク質を示す。データは、ＭＵＣ２陽性面積／総面積の割合（％）として示される。
【図１４】［0033］図１４は、（ａ）コンプライアンス患者およびレスポンダー患者（ｎ＝１５）におけるＴ０およびＴ３での免疫組織化学によって分析したＫｉ−６７タンパク質を示す。データは、Ｋｉ−６７陽性／総核の割合（％）として示される。コンプライアンス患者およびレスポンダー患者（ｎ＝１５）における（ｂ）Ｃ−ＭＹＣおよび（ｃ）ＬＧＲ５のｍＲＮＡの発現を示す。データは、平方根変換値±ＳＥＭの平均として示される。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
［0034］発明の詳細な説明
［0035］  本発明は、ＥＰＡ−ＦＦＡの投与が潰瘍性大腸炎に罹患している被験体において結腸直腸癌の発症を減少させるのに有効であるというインビボでの知見に基づいている。さらに、本発明は、腸管のマイクロバイオームの調節を提供する。さらに本発明は、ＳＴＡＴ３の活性化を部分的に阻害する一方で、ＩＬ−１０およびＳＯＣＳ３の誘導を提供する。
【００１９】
［0036］  本発明の医療用製剤、医薬品、または組成物を調製するのに使用されるＥＰＡ−ＦＦＡは、少なくとも９０％の純度を有し、任意の他の多価不飽和脂肪酸は、最低限か、または薬学的に僅かな量しか含んでいないことが好ましい。９５％超の純度が推奨され、任意の他の多価不飽和脂肪酸を実質的に含まない商業的に入手可能な最高グレードの素材（純度約９９％）が最も好ましい。
【００２０】
［0037］  従って、本発明の１つの態様によれば、高純度の、遊離脂肪酸としてのエイコサペンタエン酸が哺乳動物の悪性腫瘍の治療のための医療用製剤または医薬品の製造に使用される。
【００２１】
［0038］  ＥＰＡは、遊離脂肪酸として魚油、植物、または微生物中に見出され、あるいはアシルグリセロール、リン脂質、スルホリピド、または糖脂質などのコンジュゲートとして見出され、当業界で周知の種々の手段により抽出されてよい。斯かる手段には、メタノールやクロロホルムなどの有機溶媒による抽出、超音波処理、二酸化炭素などを使用する超臨界流体抽出、圧搾などの物理的手段、またはそれらの組み合わせが含まれる。必要であれば、水層を酸性化して負荷電部分をプロトン化し、それにより、有機層への目的産物の分配を増大させてもよい。抽出後、窒素流下に有機溶媒を蒸発させ除去してもよい。コンジュゲートとして単離される場合は、目的産物を酵素的または化学的に切断し、遊離脂肪酸またはより複雑性の減った目的コンジュゲートを放出させ、それを更なる操作の対象とすることにより、望ましい最終産物を製造してもよい。
【００２２】
［0039］  更なる精製が必要な場合には標準的方法が使用できる。斯かる方法には、抽出、尿素処理、分別結晶化、ＨＰＬＣ、分別蒸留、シリカゲルクロマトグラフィー、高速遠心分離または蒸留、あるいは斯かる技術の組み合わせが含まれる。酸やアルケニル基などの反応基の保護は、アルキル化やヨウ素化などの周知の技術を用いて任意の工程で行ってよい。保護基は任意の工程で除去してよい。ＥＰＡを含む画分の精製は、初期エステル化、尿素処理、超臨界流体抽出、およびクロマトグラフィーを実施して遊離脂肪酸を単離することにより達成するのが望ましい。
【００２３】
［0040］  トリグリセリドからＥＰＡを単離するには、加水分解またはエステル交換により脂肪酸を遊離させて、精製を成功させる必要がある。精製は、分別蒸留、分子蒸留、クロマトグラフィーなどの技術で達成できる。特に望ましいクロマトグラフィー法では、欧州特許ＥＰ  ０７１２  ６５１などに記載されるように、超臨界流体を使用し、移動相として二酸化炭素が用いられる。斯かる技術を使用することにより、ＥＰＡを１００%近くのレベルまで精製できることが見出された。実際的には、ＥＰＡはエチルエステルまたはメチルエステルとして精製し、それを加水分解することにより、遊離脂肪酸の形態へ戻してもよい。精製することにより、高度に濃縮された産物、最終産物には望ましくない他の脂肪酸を含まない産物を調製できる。加えて、他の化学物質、例えば、モノグリセリド、ジグリセリド、炭化水素、農薬残留物などが除去できる。毒素、嗜好性の悪さに寄与する化合物、または飽和脂肪酸などの望ましくない脂肪酸のレベルが実質的に減少しているので、高純度のＥＰＡは人が消化するのに適している。遊離脂肪酸形態のＥＰＡは、予め酵素変換する必要なく、消化管で容易に吸収できる。斯かる方法を使用することにより、約１５０ｋｇの未精製ＥＰＡは、実質的に純粋なＥＰＡ−ＦＦＡ（少なくとも純度９０％）５０ｋｇに変換できる。
【００２４】
［0041］  更なる精製が必要な場合には標準的方法が使用できる。斯かる方法には、抽出、尿素処理、分別結晶化、ＨＰＬＣ、分別蒸留、シリカゲルクロマトグラフィー、高速遠心分離または蒸留、あるいは斯かる技術の組み合わせが含まれる。酸やアルケニル基などの反応基の保護は、アルキル化やヨウ素化などの周知の技術を用いて任意の工程で行ってよい。保護基は任意の工程で除去してよい。ＥＰＡを含む画分の精製は、初期エステル化、尿素処理、超臨界流体抽出、およびクロマトグラフィーを実施して遊離脂肪酸を単離することにより達成するのが望ましい。
【００２５】
［0042］  好ましいＥＰＡ遊離脂肪酸は、ＡＬＦＡ（商標）の商標名で商業的に入手可能（Ｓ．Ｌ．Ａ．  Ｐｈａｒｍａ社、英国）である。このＰＵＦＡは遊離脂肪酸形態の９９％純粋なＥＰＡであり、小腸でｐＨ５．５で内容物が確実に放出されるように設計されたｐＨ依存性腸溶コーティングカプセル形態に製剤化できる。他の成分としては、ＡＡ（０．５％以下）および微量の他の脂肪酸が含まれる。斯かるＥＰＡ調製物の主な利点は、多くの魚油製品と比べて純度が高いこと、全身での生物利用能を最大化する遊離脂肪酸であること、５００ｍｇのカプセル入りなので投与量設定が容易であること、および消化管の副作用を最小化する遅延放出の特徴を有していることである。
【００２６】
［0043］  純度９９％のＥＰＡ−ＦＦＡは、一日当たり約２５０ｍｇから４ｇの量で投与されるのが好ましく、一日当たり約６００ｍｇから約２ｇの量であるのが更に好ましい。投与は、毎日であっても、毎週またはより長い期間に一度であってもよく、約１か月から１２か月行うことができる。特に、純度９９％ＥＰＡのＡＬＦＡ（商標）カプセルの忍容性は素晴らしく、主に小腸でのＥＰＡの送達は、他の魚油製剤を用いた以前の治療において妨げとなっていた不快な味や臭いを最大限抑えるものである。
【００２７】
［0044］  ＥＰＡ−ＦＦＡは、単独でまたはＵＣの治療に使用される別の治療剤と組み合わせて、複数の送達形式で製剤化してもよい。活性成分は、液体または固体組成物として経口で投与してもよい。経口投与に適した組成物には、丸薬、カプセル、顆粒、錠剤、粉末などの固体形態、および液体、シロップ、エリクシル剤、懸濁物などの液状形態が含まれる。非経口投与に役立つ形態には、滅菌溶液、乳濁液、懸濁液などが含まれる。
【００２８】
［0045］  固体組成物の形態は、固体キャリア、および香味剤、潤滑剤、溶解剤、懸濁剤、充填剤、滑剤、圧縮剤、結合剤、または錠剤崩壊剤として作用する１つ以上の物質を含んでもよいし、カプセル化用の素材を含んでもよい。粉末の場合、キャリアは、微粉化状態の活性成分と混合された微粉化状態の固体である。錠剤の場合、活性成分は、必要な圧縮特性を有するキャリアと適切な割合で混合され、望ましい形状およびサイズに成形される。適切な固体キャリアには、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン、低融点ワックス、イオン交換樹脂などが含まれる。
【００２９】
［0046］  溶液、懸濁液、乳濁液、シロップ、エリクシル剤、および加圧組成物を調製するのに、液体キャリアが使用される。活性成分は、水、有機溶媒、両者の混合物、または薬学的に許容されるオイルまたは脂質などの薬学的に許容される液体キャリアに溶解または懸濁してもよい。液体キャリアは、溶解剤、乳化剤、緩衝液、保存剤、甘味剤、香味剤、懸濁剤、増粘剤、着色剤、粘性調整剤、安定化剤、浸透圧調節剤などの他の適切な医薬品添加物を含んでもよい。経口投与および非経口投与用の液体キャリアの適切な例には、水（部分的には上記の添加物、例えばセルロース誘導体、好ましくはカルボキシメチルセルロースナトリウム液を含む）、アルコール（一価アルコールおよび多価アルコール、例えばグリコールを含む）およびそれらの誘導体、並びにオイル（例えば、分留ココナッツオイルおよび落花生油）が含まれる。非経口投与に関しては、キャリアはオレイン酸エチルやミリスチン酸イソプロピルなどの油状エステルであってもよい。非経口投与用の滅菌液体組成物において、滅菌液体キャリアは有用である。加圧組成物用の液体キャリアは、ハロゲン化炭化水素または他の薬学的に許容される推進薬であってよい。
【００３０】
［0047］  本発明を詳細に記載したが、添付の請求項に規定された本発明の範囲を逸脱することなく、変更および変形が可能であることは明白である。更に、以下の実施例は非限定的な例として提供されている点は理解されるべきである。
【００３１】
［0048］実施例
［0049］  この研究では、長期のＵＣを有する２０人の患者が登録された。ベースライン大腸内視鏡検査後、患者の１人がＥＰＡ−ＦＦＡの補給を開始する前に臨床的再発を示し、試験から除外された。１９人の患者が研究を完了した。Ｔ０における全患者（ｎ＝１９）の臨床病理学的特徴を表１に示す。注目すべきは、ＥＰＡ−ＦＦＡ補給中に、臨床的再発は観察されなかったことである。
【００３２】
［0050］  具体的には、安定した臨床的寛解（ＳＣＣＡＩ＝０）にあり、および便で測定される糞便カルプロテクチン（ＦＣ）＞１５０μｇ／ｇを有する２０名の長期のＵＣ患者を募集し、９０日間２ｇ／日のＥＰＡ−ＦＦＡで処置した。生検および生物学的試料を、研究開始時（Ｔ０）および研究終了時（Ｔ３）に回収した。適合性を、赤血球膜へのＥＰＡ取り込みによって評価した。Ｊａｇｇｅｄ１、Ｈｅｓ１、ＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３およびＫＬＦ−４のタンパク質レベルを、ウェスタンブロッティングによって決定した。ＩＬ−２２、ＩＬ−１０およびＳＯＣＳ３のｍＲＮＡレベルを、ｑＲＴ−ＰＣＲによって分析した。杯細胞を、アルシアンブルーで染色した。微生物叢分析を、細菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３−Ｖ４領域をシーケンシングして糞便および生検ＤＮＡ試料について実施した。参照として我々は、以前に微生物叢の組成について分析された健康な成人集団を用いた。内視鏡的および組織学的疾患活動を、それぞれＭａｙｏおよびＧｅｂｏｅｓスコアによって測定した。
【００３３】
［0051］  脂肪酸組成物を、精製した赤血球細胞膜で評価した。Ｔ０と比較して、ＥＰＡ−ＦＦＡ補給はＥＰＡの有意な増加をもたらした（Ｐ＜０．０００１；図１ａ）。ＥＰＡ含量の平均割合値（％）は、Ｔ０での０．２６からＴ３での２．５１に変化した。カプセル計数は、１７人の患者が治療に従っており、全体のコンプライアンスが８９．５％であることを明らかにした。ＥＰＡはドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）を介してインビボでｃｏ−３  ＰＵＦＡドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）に変換され得るため（１９）、患者において、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡを含めた全体の３ＰＵＦＡ含量も測定した。興味深いことに、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡの合計含量は、Ｔ０と比較してＴ３で有意に増加し（Ｐ＜０．０００１；図６ａ）、一方でω−６  ＰＵＦＡ（アラキドン酸＋リノール酸）の含量はＥＰＡ−ＦＦＡ補給により変化しなかった（図６ｂ）。
【００３４】
［0052］  重要なことに、Ｔ３でのＦＣの有意な減少が観察された（Ｐ＜０．０００１；図１ｂ）。平均ＦＣ値はＴ０での２３０からＴ３での８７．７μｇ／ｇに変化した。試験中に副作用または重篤な有害事象は報告されなかった。２人の患者は、治療後Ｔ３で＞１５０μｇ／ｇのＦＣレベルを維持し、非レスポンダーとみなされた。ＥＰＡ−ＦＦＡ処置は、コンプライアンス患者およびレスポンダー患者（ｎ＝１５）において内視鏡的および組織学的寛解を有意に促進した。
【００３５】
［0053］  実際、ベースラインと比較して、内視鏡的改善が８人の患者で観察されたが、一方で７人には変化が見られなかった（Ｐ＝０．００４；図２ａ）。さらに、Ｔ３での組織学的炎症の解決が５人の患者で観察されたが、一方で組織学的スコアは１０人で変化しなかった（Ｐ＝０．０３；図２ｂ）。内視鏡的および組織学的な悪化は観察されなかった。
【００３６】
［0054］  ＥＰＡ−ＦＦＡ補給は、ＩＬ−１０およびＳＯＣＳ３発現の両方を誘導し、ＳＴＡＴ３活性化を減少させる
［0055］  長期のＵＣ患者におけるＥＰＡ−ＦＦＡの防御作用を担う機構を解明するため、ＩＬ−１０／ＳＴＡＴ３／ＳＯＣＳ３軸の調節を、コンプライアンス患者およびレスポンダー患者（ｎ＝１５）において調べた。Ｔ０と比較して、Ｔ３でのＩＬ−１０（Ｐ＝０．０３；図３ａ）およびＳＯＣＳ３（Ｐ＝０．０４；図３ｂ）のｍＲＮＡレベルの同時の有意なアップレギュレーションが、ＩＬ−２２のｍＲＮＡの増加傾向に関連して観察された（図７）。そうでなければ、ＩＬ−１０およびＳＯＣＳ３タンパク質発現に有意差は観察されなかった（図８ａおよびｂ）。ＳＴＡＴ３はＳＯＣＳ３の主要な調節因子の１つであるため、これらの患者においてＳＴＡＴ３活性化を特徴づけることにした。ＥＰＡ−ＦＦＡによる処置は、ＳＴＡＴ３転写に影響を与えずに、６０％の患者（９／１５）（図３ｃおよびｄ）においてＳＴＡＴ３  Ｔｙｒ７０５リン酸化（Ｐ−ＳＴＡＴ３）を減少させた（図９）。注目すべきは、Ｔ３で最高レベルのｐ−ＳＴＡＴ３を示す４／５人の患者が、補給後の赤血球細胞中のＥＰＡの割合（％）が低い、コンプライアンスの低い患者であったことである。これらのデータは、ＥＰＡ−ＦＦＡ補給後のＳＯＣＳ３の過剰発現が、おそらくＩＬ−１０誘導の下流効果として、特に赤血球細胞膜中のＥＰＡの割合（％）が最も高い患者におけるＳＴＡＴ３活性化を低下させることを示唆する。相関分析は、Ｔ３においてＳＯＣＳ３のレベルならびにＩＬ−１０のｍＲＮＡレベル（Ｐ＝０．０２；図１０ａ）およびｐ−ＳＴＡＴ３タンパク質（Ｐ＝０．０３；図１０ｂ）の両方の転写レベル間の有意な正の相関を示し、提案された仮説を支持する。
【００３７】
［0056］  ＥＰＡ−ＦＦＡ補給は、ＨＥＳ１およびＫＬＦ４を調節し、杯細胞分化を刺激する
［0057］  Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、転写標的ＨＥＳ１およびＫＬＦ４の調節を介して、腸の吸収性細胞系と分泌性細胞系との間の適切なバランスを維持するために重要である（１３、２０）。ＨＥＳ１（Ｐ＝０．０２；図４ａおよびｃ）およびＫＬＦ４タンパク質（Ｐ＝０．０４；図４ｂおよびｃ）の有意なアップレギュレーションが、Ｔ０と比較してＴ３で特に長期のＵＣを有する患者において観察され、一方でｍＲＮＡレベルでの違いは観察されなかった（図１１ａおよびｂ）。相関分析は、これらの２つの転写因子が互いに正に相関することを示した（Ｐ＝０．０００７；図１２）。重要なことに、杯細胞の枯渇が患者の２０％に認められたＴ０と比較して、ＭＵＣ２のｍＲＮＡ（図１３ａ）およびタンパク質の変化は見られなかったが（図１３ｂ）、ＥＰＡ−ＦＦＡの３ヶ月間の毎日の補給は、結腸中の杯細胞の数の有意な増加に関連していた（Ｐ＝０．０４；図４ｄおよびｅ）。したがって、これらの結果は、ＫＬＦ４およびＨＥＳ１の同時誘導を介する分泌系統分化および腸上皮細胞代謝回転の改善におけるＥＰＡ−ＦＦＡの役割を明らかにした。ＥＰＡ−ＦＦＡ補給時のＫｉ−６７（図１４ａ）、ｃ−ＭＹＣ（図１４ｂ）およびＬＧＲ５（図１４ｃ）によって測定された腸内増殖に関して差は見られなかった。
【００３８】
［0058］  ＥＰＡ−ＦＦＡはＵＣ患者において微生物叢の組成を調節する
［0059］  ＵＣの病因における腸内微生物不均衡の重要な役割を考慮して、糞便および粘膜微生物叢の組成も患者において評価した。長期のＵＣ疾患に関連する主要な微生物叢の腸内菌共生バランス失調(dysbioses)を同定するために、Ｔ０におけるＵＣ患者の糞便微生物叢の組成を、イタリア人の健康な成人（２２〜４８歳、ＵＣ患者の同一地理的地域で登録）と比較した（２１）。クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ）（４．７ｖｓ．１％、Ｐ＝０．００３；特にＳＭＢ５３属、Ｐ＝０．００１）およびルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）（３５．７ｖｓ．２４．１％、Ｐ＝０．００８）科の富化、ならびにウェルコミクロビウム（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ）（０ｖｓ０．４％、Ｐ＝０．００２；特にアッカーマンシア属（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ）、０ｖｓ．０．４％、Ｐ＝０．００２）、ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）（０ｖｓ．０．３％、Ｐ＝０．０００９）およびポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）（０ｖｓ．０．５％、Ｐ＝０．００６；特にパラバクテロイデス属（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、０ｖｓ．０．５％、Ｐ＝０．００６）科の減少が、Ｔ０でのＵＣ患者に見られた（図５ａ（健康）およびｂ（Ｔ０のＵＣ））。注目すべきことに、ＥＰＡ−ＦＦＡ補給は、ＵＣ患者の糞便においてポルフィロモナス科（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）を０％から０．２％に増加させ、ルミノコッカス科（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）を３５．７％から２８％に減少させた（図５ｂ（Ｔ０のＵＣ）およびｃ（Ｔ３のＵＣ））。さらに、ＥＰＡ−ＦＦＡは、多量のバクテロイデス科（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ）の粘膜付着性メンバーを減少させることによってＵＣ患者の粘膜微生物叢にも影響を及ぼした（特に、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）に属するもの、２７．４ｖｓ．１４．７％）（図５ｄ（Ｔ０のＵＣ結腸）と５ｅ（Ｔ３のＵＣ結腸）の比較に示される）。
【００３９】
［0060］考察
［0061］  ＣＡＣ予防についての異なる治療アプローチが、長年にわたって炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を有する患者において試験されている。重要なことに、インビトロ実験ならびに動物および臨床研究から得られる増え続けるデータは、ＣＲＣを含む胃腸がん予防におけるω−３  ＰＵＦＡ（ＥＰＡおよびＤＨＡ）の防御的役割を支持する（Ｅｌｔｗｅｒｉらによるレビュー（２２））。
【００４０】
［0062］  しかし、ＩＢＤ患者における抗癌剤としての薬理学的化合物および天然化合物に関するデータは、分かりにくく、依然として矛盾が多い（２３）。ＩＢＤにおける兆候と血清バイオマーカーが粘膜の炎症度を常に適切に反映しているとは限らないことはよく知られている（２４）。ＦＣは、粘膜の炎症状態および治療に対するレスポンスをモニターするための、ならびにＩＢＤ患者での臨床的再発を予測するための最も有用な非侵襲的ツールとなっている（２５）。
【００４１】
［0063］  本発明では、初めて、安定した維持療法にもかかわらず高いＦＣレベル（＞１５０μｇ／ｇ）を保持した臨床的寛解での長期のＵＣを有する無症候性患者について、ＥＰＡ−ＦＦＡの効果を試験した。２ｇ／日（９０日）の投与量での短期ＥＰＡ−ＦＦＡ補給が、ＲＢＣ中のＥＰＡおよび全体のω−３  ＰＵＦＡ含量（ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡ）の有意な増加と関連することが見出され、ＥＰＡは大部分の患者（１７／１９）に取り入れられ、ＤＰＡおよびＤＨＡに効率的に変換されたことを示唆する。
【００４２】
［0064］  主要エンドポイントはＥＰＡ−ＦＦＡの臨床的利点を試験するのではなく、長期のＵＣ中の粘膜炎症および新たな潜在的化学予防メカニズムに対するその効果を調べることであったが、短期ＥＰＡ−ＦＦＡ補給が、ほとんど全ての患者において内視鏡的および組織学的炎症の改善に有利に、粘膜炎症を減少（ＦＣの有意な低下を伴う）させることが見出された。ＦＣレベルは好中球浸潤の強さと相関することが実証されているので（１２）、本明細書に見出されかつ組織学的評価によって支持された結果は、ＥＰＡ−ＦＦＡが長期のＵＣ患者の炎症状態を改善したことを示す。本明細書で見出された結果は、試験方法で使用されたＥＰＡの遊離脂肪酸−高純度製剤によって、少なくとも部分的に、説明され得ると理論付けられる。
【００４３】
［0065］  これまでの証拠は、さまざまな状況でのＣＲＣの予防におけるＥＰＡとＤＨＡの両方を含むω−３  ＰＵＦＡ摂取の防御的役割を支持する（２６，２７，２８）。しかし、ＵＣの患者およびネズミモデルにおけるω−３  ＰＵＦＡ補給からのデータはまだ議論の余地があり（２９，３０，３１）、ＣＡＣ予防に対する食品によるω−３  ＰＵＦＡ補給の影響ははっきりとは明かされていない。
【００４４】
［0066］  この研究での患者におけるω−３  ＰＵＦＡ含量の増加を考慮すると、観察された防御効果がＥＰＡおよびＤＨＡの両方に起因する可能性があると推測することは妥当である。特筆すべきことは、ＥＰＡ−ＦＦＡ補給時にω−６  ＰＵＦＡ含量において関連する相違が見出されなかったことである。この結果は、研究中の登録患者の食事習慣に変更がないことにより説明され得る。際だったことに、増加したω−３  ＰＵＦＡ含量は、ＵＣ患者において関連する防御反応を誘導するのに十分であり、一方で以前に示唆されたように同じω−６  ＰＵＦＡ含量をおそらく維持している（３２）。
【００４５】
［0067］  この研究では、長期のＵＣ患者におけるＥＰＡ−ＦＦＡ短期効果の特性を決定するために、試験はまず、ＩＬ−１０／ＳＴＡＴ３／ＳＯＣＳ３シグナル伝達に対するＥＰＡ−ＦＦＡ補給の効果に焦点を当てた。ＵＣの間のＳＴＡＴ３の役割は、実際には議論の余地がある。実際に、ＩＢＤの動物モデルに関する研究は、大腸炎の間のＳＴＡＴ３の過剰活性化の有害なかつ防御的な役割の両方を示唆した（３３、３４）。重要なことに、増加したレベルのリン酸化ＳＴＡＴ３が、活性型ＵＣ患者ならびに異形成および癌において検出され、一方でＳＯＣＳ３レベルの漸進的な減少傾向が、低レベルの異形成〜ＵＣ−ＣＲＣで観察された（３５）。しかしながら、ＵＣ患者より得られたより最近の知見は、短期間の疾患再発およびＳＴＡＴ３活性化を損なう粘膜炎症におけるＳＯＣＳ３の過剰発現の役割を支持した（３６，３７）。この研究では、ＥＰＡ−ＦＦＡ補給時にＩＬ−１０およびＳＯＣＳ３のｍＲＮＡの同時の有意なアップレギュレーションが見出され、Ｔ３での最高ＥＰＡ割合（％）レベルを有する患者の大部分におけるＳＴＡＴ３活性化の低下を伴った。しかし、ＩＬ−１０およびＳＯＣＳ３タンパク質の変化は、患者のＥＰＡ−ＦＦＡ補給時に認められなかった。以前に文献データによって示唆されたように、我々は、複数の転写後機構がＳＯＣＳ３およびＩＬ−１０タンパク質の調節に寄与すると仮定し、これによりそれらのｍＲＮＡとタンパク質レベルの変化の間に相関関係がないことを説明した（３８、３９、４０、４１、４２）。
【００４６】
［0068］  重要なことに、レスポンダーを考慮すると、いずれの患者においても内視鏡的または組織学的悪化は観察されなかった。したがって、本明細書で論じるデータは、ＳＯＣＳ３転写誘導を介してＳＴＡＴ３活性化をオフにすることによる、ＵＣ寛解時のＥＰＡ−ＦＦＡの防御的役割を支持する。
【００４７】
［0069］  Ｎｏｔｃｈシグナル伝達はまた、腸上皮細胞の分化および代謝回転を維持するための、粘膜障壁の完全性のための、および結腸における悪性上皮形質転換を調節するための重要な決定因子でもある（２０）。証拠は、散発的な条件におけるＨＥＳ１およびＫＬＦ４の発がん性および腫瘍抑制活性の可能性を、それぞれ示す（４３，４４）。ＡＯＭ−ＤＳＳマウスモデルにおいて、ＣＡＣ発生中のＮｏｔｃｈ１シグナル伝達の喪失が、ＥＰＡ−ＦＦＡによって部分的に対抗されることが既に示されており、炎症誘発性の腸腫瘍形成の最中のこの経路の腫瘍抑制因子の役割を支持している（１４）。したがって、Ｇａｒｇと同僚らは以前同じ動物モデルにおいて、Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達を活性化しｐ５３カスケードを制御するマトリックスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）が、ＣＡＣ発生に対して強力な防御効果を発揮することを示した（４５）。別な方法では、最近のｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究では、活性化マクロファージによって分泌される複数の前炎症性サイトカインを含む馴化培地（ＣＭ）に曝露されたＣＲＣ細胞において、Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達のＭＭＰ−９依存性活性化が観察された。ＭＭＰ−９／Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の活性化はＣＲＣ細胞浸潤性の増加と関連しており、散発性ＣＲＣにおけるＮｏｔｃｈ１シグナル伝達の腫瘍傾向の役割を示唆している。興味深いことに、ＣＭに曝露されたＣＲＣ細胞株のＥＰＡ−ＦＦＡ前処理は、Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達スイッチをオフにすることにより侵襲を減少させた（４６）。これらの結果は、最近レビューされたように（４７）、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達活性化に対する細胞応答は、特異的な病理学的状況に応じて発癌性または腫瘍抑制性の機序をもたらす一義的なものではないことを明確に示している。
【００４８】
［0070］  ＥＰＡ−ＦＦＡは、ＨＥＳ１およびＫＬＦ４タンパク質の両方を誘導し杯細胞の数を増加させる腸分化を調節した。
【００４９】
［0071］  寛解期のＵＣ患者は、一般的には粘液層が無傷であることを特徴とするが、一部の症例では欠損および浸透した腸管障壁が残存している可能性がある（４８）。ＫＬＦ４は結腸における杯細胞の成熟および分化の両方に重要な役割を果たしており（４９）、かつ炎症時の杯細胞活性化の調節におけるＩＬ−１０の重要な役割も以前に記載されている（５０）。さらに、本試験で行われた微生物叢分析は、Ｔ０でＵＣ群に存在する腸内微生物叢の群構成が、ＥＰＡ−ＦＦＡ処置によって部分的に調節されたことを示す。実際、ＵＣにおいて減少することが知られている（５１）パラバクテロイデス属（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）のパポルフィロモナス科（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）は、Ｔ０と比較してＴ３試料で有意に増加した。また、プレボテラ科（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ）の増加も示された。さらに、ＥＰＡ−ＦＦＡは、Ｔ０と比較して糞便のクロストリジウム種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）の量を減少させる能力を示した。興味深いことに、これらのタンパク質分解性微生物は、他の種、すなわちバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）において粘液溶解代謝を誘導することが知られている（５２）。注目すべきことに、粘液溶解種を含むことが知られているバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）の粘膜付着性メンバーは、ＥＰＡ−ＦＦＡ処置後に減少することが見出され、おそらく上皮の保護に寄与する。したがって、杯細胞集団を促進するＥＰＡ−ＦＦＡ処置の能力は、ＫＬＦ−４およびＩＬ−１０の誘導ならびに粘液溶解性細菌の減少を含む複数のメカニズムの結果であり得ると理論付けられる。
【００５０】
［0072］  結論として、ＥＰＡ−ＦＦＡの使用は、内視鏡的および組織学的炎症を改善し、ＩＬ−１０／ＳＴＡＴ３／ＳＯＣＳ３カスケードに影響し、杯細胞分化を刺激しかつ腸内微生物叢の長期のＵＣ関連結腸変化を調節した。
【００５１】
［0073］  方法
【００５２】
［0074］  研究デザイン
［0075］  適格患者は、安定な臨床的寛解（単純な臨床的大腸炎活性指数；ＳＣＣＡＩ＝０）、および１５０μｇ／ｇより高いＦＣレベルで、長年（＞８年）のＵＣを有する１８−７０歳の無症状の被験体であった（５３）。患者は、書面による同意書に署名した後、研究に参加した。過去３ヶ月間に変更のないＵＣに対する安定な併用療法（メサラミン、免疫調節薬および／または生物学的薬剤）が許容された。
除外基準は、（１）ステロイド（＜２ヵ月）または他の実験的薬物（＜３ヵ月）の最近の使用；（２）抗凝固剤の併用；（３）プロバイオティックの使用；（４）妊娠または授乳；（５）エイコサペンタエン酸またはω−３  ＰＵＦＡに対する過敏症が知られているかまたは疑われる；（６）重度合併症、であった。被験体に９０日間、２ｇ／日（１日２回５００ｍｇカプセル２回）のＥＰＡ−ＦＦＡ（ＡＬＦＡ（商標）、ＳＬＡ  Ｐｈａｒｍａ  ＡＧ、スイス）経口補給を与えた。研究中、被験体は食生活を守るように求められた。患者は、入院時（Ｔ０）および９０日のＥＰＡ−ＦＦＡ補給後（Ｔ３）に内視鏡検査を受けた。各時点でＳ状結腸から６回の生検を行った。血液試料を、末梢赤血球の分離のために得た。ＥＰＡ−ＦＦＡ補給に対する遵守を、カプセル計数および赤血球細胞（ＲＢＣ）膜へのＥＰＡ取り込みの評価の両方によって評価した。コンプライアンスのよい患者は、１４日間より多く連続してプロトコルを中断することなく、カプセルの少なくとも８０％を摂取した患者とみなされた。この研究は、ヘルシンキ宣言に従って実施され、聖オルソラ−マルピーギ総合病院（ボローニャ、イタリア）の倫理委員会によって承認された。
【００５３】
［0076］  糞便カルプロテクチン投与量
［0077］  糞便試料を、内視鏡検査前の２４時間以内に収集し、検査まで２〜８℃で保存した。ＦＣの定量は、製造元のプロトコルに従ってＣａｌＦａｓｔ（Ｅｕｒｏｓｐｉｔａｌ、トリエステ、イタリア）を使用して行った。ＦＣ値＞１５０μｇ／ｇが、先に実証されたように、粘膜内視鏡的活動性を予測すると考えた（５３）。
【００５４】
［0078］  内視鏡的および組織学的評価
［0079］  ２人の研究者がすべての内視鏡検査を行った。Ｍａｙｏ内視鏡サブスコアにより、カットオフ＞１を用いて内視鏡的炎症の存在を識別した（５４）。組織学的活性を、１人の専門の盲検病理学者（Ｔ．Ｂ．）によって評価し、Ｇｅｂｏｅｓ評価システムに従って点数化した（５５）。Ｇｅｂｏｅｓカットオフ値＞３．１が、活性組織学的炎症を定義すると仮定された（５６）。生検材料が異なる程度の活性を示した場合、最も高い程度の炎症を考慮した。
【００５５】
［0080］  酸性ムチン定量
［0081］  ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生検材料をトルエン中で１０分間脱蝋し、再水和し、アルシアンブルー溶液（３％酢酸溶液中のアルシアンブルー８ＧＸ、ｐＨ２．５）中に３０分間置き、ヘマトキシリンで対比染色した。分析のために、スライドを、ランク順スコアリングシステム（１＝より低いランク；３６＝より高いランク）を用いてアルシアンブルー染色強度が増加する順に配置した。ランク順位付け方法は、グループ間の微妙な違いを識別するために、分類別スコアリングシステムより優れていることが示されている（５７）。
【００５６】
［0082］  免疫組織染色
［0083］  免疫組織染色（ＩＨＣ）を、ＦＦＰＥ結腸切片で行った。スライドを脱蝋し、内因性過酸化水素を阻害し、再水和し、抗原賦活化のために１２０℃で１５分間クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で処理した。次に、スライドをＫｉ−６７およびＭＵＣ２に対するモノクローナル抗体と＋４℃で一晩インキュベートした（表２）。二次抗体ウサギ／マウス（１：１０００、ＤＡＫＯ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）とのインキュベート後、シグナルをジアミノベンジジン（ＤＡＢ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス、米国）で検出した。Ｋｉ６７陽性核およびＭＵＣ２陽性ＤＡＢ領域の割合（％）を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、メリーランド州、米国）を用いて定量した。
【００５７】
［0084］  膜脂肪酸分析
［0085］  膜脂質含量を赤血球細胞中で測定した。赤血球細胞膜からの脂質抽出、リン脂質分離および試料調製を、以前に記載されたようにして行った（５８）。抽出された脂肪酸メチルエステルを次いで、ガスクロマトグラフィー質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）によって分析した。脂肪酸のレベルを、全脂肪酸の相対的な割合（％）として表した。
【００５８】
［0086］  ウェスタンブロッティング
［0087］  全タンパク質溶解物を、ＲＩＰＡ緩衝液中での超音波処理により生検から分離した。各試料について４０μｇのタンパク質を、ＭＯＰＳ緩衝液（Ｎｏｖｅｘ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中の４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム、米国）上で分離し、ニトロセルロース膜上に転写した。ブロッキング後、膜をＨＥＳ１、ＫＬＦ４、リン酸化ＳＴＡＴ３（Ｙ７０５）、ＳＴＡＴ３、ＩＬ−１０、ＳＯＣＳ３およびＧＡＰＤＨ（表２）に対する一次抗体と＋４℃で一晩インキュベートした。適切な二次ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、リトル・チャルフォント、英国）とのインキュベーション後、シグナルをルミノールエンハンサー溶液（ＷＥＳＴＡＲ  ＥｔａＣ、Ｃｙａｎａｇｅｎ、ボローニャ、イタリア）で検出し、画像をＣｈｅｍｉｄｏｃＴＭ  ＸＲＳ  ＋（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア、米国）を用いて取得した。Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂ（商標）ソフトウェアを用いて濃度測定分析を行った。
【００５９】
［0088］  遺伝子発現解析
［0089］  全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）（Ａｍｂｉｏｎ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて生検から抽出した。１μｇの全ＲＮＡを、製造元の指示に従ってＨｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ−Ｔｏ−ｃＤＮＡ  ＴＭキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してｃＤＮＡに変換した。ｑＲＴ−ＰＣＲ反応を、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｓｅｌｅｃｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｆｏｒ  ＣＦＸ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＴＭ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＩＬ−１０、ＩＬ−２２、ＬＧＲ５、Ｃ−ＭＹＣ、ＭＵＣ２、ＨＥＳ１およびＫＬＦ４に対する特異的プライマーを用いて、ＭＸ３０００ｐ  ＱＰＣＲｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州サンディエゴ、米国）で二重で実施した。プライマー配列を表３に列挙する（配列識別番号１〜１６）。ＳＯＣＳ３およびＳＴＡＴ３のｍＲＮＡ発現を、５’ヌクレアーゼプローブ（アッセイＩＤ：Ｈｓ．ＰＴ．５８．４３０３５２９；Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、アイオワ州コーラルビル、米国）およびＴａｑｍａｎ（登録商標）遺伝子発現アッセイ（Ｈｓ００３７４２８０＿ｍ１  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてそれぞれ分析した。誘導倍率レベルを、基準遺伝子ＲＰＳ９に対して正規化することによる２-ΔΔＣｔ法を用いて得た。
【００６０】
［0090］  微生物学的分析
［0091］  糞便試料を内視鏡的洗浄の前に収集し、粘膜試料を内視鏡検査の間に採取した。全細菌ＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｓｔｏｏｌ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、ヒルデン、ドイツ）を用いて糞便から、およびＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて生検から抽出した。抽出されたＤＮＡの質または量が低かったため、糞便および粘膜の微生物叢のデータは、研究に参加した１９人の患者のうちそれぞれ１４人および１６人から入手可能であった。全ての試料について、細菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３−Ｖ４領域を増幅し、２×３００ｂｐ  ｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄプロトコルを用いるＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて配列決定した。インデックス化ライブラリを等モル濃度でプールし、変性し、６ｐｍｏｌ／Ｌに希釈してからＭｉＳｅｑフローセル上にロードした。生の配列を、ＰＡＮＤＡｓｅｑ［Ｓ６］とＱＩＦＭＥ［Ｓ７］を組み合わせたパイプラインを用いて処理した。高品質のリードを、ＵＣＬＵＳＴ［Ｓ８］および「ｄｅ  ｎｏｖｏ」アプローチを使用して、０．９７の類似性閾値で操作的分類単位（ＯＴＵ）に分類した。分類を、Ｇｒｅｅｎｇｅｎｅｓデータベースに対するＲＤＰ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒを使用して割り当てた（２０１３年５月リリース）。すべてのシングルトンＯＴＵを、キメラ配列の大部分を破棄するために除去した。科または属レベルでの相対存在量プロファイルを得てプロットした。糞便微生物分析のために、以前の研究に登録されたイタリアの健康な成人の対照集団との比較も実施した（２１）。健康な被験体からの糞便試料を収集し、この研究で採用したＵＣ患者に適用したのと同じ手順を用いて処理した。
【００６１】
［0092］  統計分析
［0093］  データを、Ｇｒａｐｈｐａｄ５．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア、米国）およびＳｔａｔｉｓｔｉｘ９．０を用いて分析した。２つの一致したグループの平均（Ｔ０ｖｓ．Ｔ３）を、対になった両側ｔ検定を用いて比較した。統計分析（倍数変化に基づく）のために、Ｔ０サンプルの平均を１と仮定し、両側１サンプルｔ検定を用いてＴ０とＴ３の差を比較した。対比較間の単純な＋／−差異を分析するための検定である符号検定（５９）を使用して、ＭａｙｏサブスコアおよびＧｅｂｏｅｓスコアでの差異を分析した。相関分析を、スピアマンの相関係数（ｒｓ）を用いて行った。ｑＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロット分析のために、データを平方根変換で提示した。微生物学的分析のために、群間の中央値の差をノンパラメトリックアプローチ（マン・ホイットニーのＵ検定）を用いて試験し；Ｐ値を、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を用いて複数の比較のために補正した。Ｐ値＜０．０５を統計的に有意であると考えた。
【００６２】
[0094]本明細書中で引用される参考文献の内容は、全ての目的のために、参照として本明細書中に組み込まれる。
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【表１】
2020508286.tif 000003
【表２】
2020508286.tif 000004
【表３】
2020508286.tif 000005
【図１】
2020508286.tif 000006
【図２】
2020508286.tif 000007
【図３】
2020508286.tif 000008
【図４】
2020508286.tif 000009
【図５】
2020508286.tif 000010
【図６】
2020508286.tif 000011
【図７】
2020508286.tif 000012
【図８】
2020508286.tif 000013
【図９】
2020508286.tif 000014
【図１０】
2020508286.tif 000015
【図１１】
2020508286.tif 000016
【図１２】
2020508286.tif 000017
【図１３】
2020508286.tif 000018
【図１４】
2020508286.tif 000019
【配列表】
2020508286000001.app
【国際調査報告】
2020508286.tif 000020
2020508286.tif 000021
2020508286.tif 000022
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