(57)【要約】本発明は、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼまたはその他の代謝酵素および補因子再生酵素を含む代謝的に自給的酵素系を含む磁気バイオナノ触媒（ＢＮＣ）を製造するための組成物および方法を提供する。
2020500532.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
磁気ナノ粒子の自己集合メソ多孔性凝集体および
ａ．第１酵素活性を有する拡散性補因子を必要とする第１酵素；
ｂ．補因子再生活性を含む第２酵素、
を含む組成物であって、
ここで前記補因子は前記第１酵素活性において利用され；前記第１および第２酵素は、磁気ナノ粒子の前記凝集体によって形成された前記メソ細孔内に磁気的に封入され、前記第１および第２酵素は、拡散性基質を拡散性生成物に変換させることによって機能する組成物。
【請求項２】
前記補因子は、前記第１および第２酵素とともに磁気ナノ粒子の前記メソ多孔性凝集体内に封入されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
磁気ナノ粒子の前記メソ多孔性凝集体は、酸化鉄組成物を有する、請求項１または２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４】
磁気ナノ粒子の前記メソ多孔性凝集体は、磁気ナノ粒子の少なくとも９０％が少なくとも３ｎｍ〜３０ｎｍまでのサイズを有する磁気ナノ粒子サイズ分布、および磁気ナノ粒子の前記メソ多孔性凝集体の少なくとも９０％が少なくとも１０ｎｍ〜５００ｎｍまでのサイズを有する凝集粒径分布を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
磁気ナノ粒子の前記メソ多孔性凝集体は、少なくとも１０ｅｍｕ／ｇの飽和磁化を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
磁気ナノ粒子の前記メソ多孔性凝集体は、５ｅｍｕ／ｇまでの残留磁化を有する、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記第１および第２酵素は、磁気ナノ粒子の前記メソ多孔性凝集体中に１００％までの飽和容量で含有される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記第１および第２酵素は、微生物に物理的に接近できない、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記第１酵素は、酸化酵素である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記酸化酵素は、フラビン含有オキシゲナーゼであり；ここで、前記組成物は、前記第１酵素と共局在化している補因子レダクターゼを有する第３酵素をさらに含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記酸化酵素は、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼであり；ここで、前記組成物は、前記第１酵素と共局在化している補因子レダクターゼ活性を有する第３酵素をさらに含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記Ｐ４５０モノオキシゲナーゼおよび前記第３酵素は、単一タンパク質中に含まれる、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
前記単一タンパク質は、二官能性シトクロムＰ４５０／ＮＡＤＰＨ−−Ｐ４５０レダクターゼを含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記単一タンパク質は、ＢＭ３活性を有し、配列番号１との少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、脂質膜内で前記第３酵素と共局在化している、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記第３酵素は、シトクロムＰ４５０レダクターゼである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、哺乳動物であるＰ４５０配列を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
前記Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、ヒトであるＰ４５０配列を含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ａ７、ＣＹＰ２Ａ１３、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１８、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｆ１、ＣＹＰ２Ｊ２、ＣＹＰ２Ｒ１、ＣＹＰ２Ｓ１、ＣＹＰ２Ｕ１、ＣＹＰ２Ｗ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ３Ａ４３、ＣＹＰ４Ａ１１、ＣＹＰ４Ａ２２、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ４Ｆ２、ＣＹＰ４Ｆ３、ＣＹＰ４Ｆ８、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＣＹＰ４Ｆ２２、ＣＹＰ４Ｖ２、ＣＹＰ４Ｘ１、ＣＹＰ４Ｚ１、ＣＹＰ５Ａ１、ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ７Ｂ１、ＣＹＰ８Ａ１、ＣＹＰ８Ｂ１、ＣＹＰ１１Ａ１、ＣＹＰ１１Ｂ１、ＣＹＰ１１Ｂ２、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ１９Ａ１、ＣＹＰ２０Ａ１、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＹＰ２４Ａ１、ＣＹＰ２６Ａ１、ＣＹＰ２６Ｂ１、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＣＹＰ２７Ａ１、ＣＹＰ２７Ｂ１、ＣＹＰ２７Ｃ１、ＣＹＰ３９Ａ１、ＣＹＰ４６Ａ１またはＣＹＰ５１Ａ１を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジおよびヤギからなる群から選択される起源のＰ４５０配列を含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２１】
前記Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、昆虫、魚、真菌、酵母、原生動物および植物からなる群から選択される起源のＰ４５０配列を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２２】
前記第２酵素は、カルボニルレダクターゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アリール−アルコールデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、Ｄ−１キシロースデヒドロゲナーゼ、オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ、イソプロパノールデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼおよびイソクエン酸デヒドロゲナーゼからなる群から選択される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記補因子は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド＋水素（ＮＡＤＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸＋水素（ＮＡＤＰＨ）、フラビンアデニンジヌクレオチド＋水素（ＦＡＤＨ）またはグルタチオンである、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
反応性酸素種（ＲＯＳ）を還元する第４酵素をさらに含む、請求項９〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記第４酵素は、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）またはグルタチオンペルオキシダーゼ／グルタチオン−ジスルフィドレダクターゼである、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記第１酵素は、第Ｉ相代謝に関与する、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
第ＩＩ相または第ＩＩＩ相代謝に関与する第５酵素をさらに含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記第５酵素は、ＵＤＰ−グルコロノシルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、モノアミンオキシダーゼまたはカルボキシエステラーゼである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
メソ多孔性凝集体の前記組成物は、マクロ多孔性磁気骨格上で集合している、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記マクロ多孔性磁気骨格は、架橋結合水不溶性ポリマーおよび埋め込まれた磁気マイクロ粒子（ＭＭＰ）のほぼ均一な分布を含むポリマーハイブリッド骨格である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記磁気マクロ多孔性ポリマーハイブリッド骨格は、ＰＶＡと、ＣＭＣ、アルギン酸塩、ＨＥＣおよびＥＨＥＣからなる群から選択されるポリマーとを含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
１種以上の前記酵素は、組み換えＤＮＡテクノロジーによって生成される、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
１種以上の前記酵素は、無細胞タンパク質合成によって生成される、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載の前記組成物を第１反応で前記拡散性基質に曝露させる工程を含む、化学物質を製造する方法。
【請求項３５】
前記第１反応を磁気的に混合する工程をさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記拡散性生成物を回収する工程をさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記第１反応の他の成分から前記組成物を磁気的に回収する工程をさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記組成物を第２反応に曝露させる工程をさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記拡散性生成物を前記第２反応から回収する工程をさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記第１反応は、バッチ反応である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
前記バッチ反応は、マイクロプレート内にある、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記第１反応は、充填層反応である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４３】
前記第１反応は、連続フロー反応である、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照により本明細書に全体として組み込まれる、２０１６年１２月３日に出願された米国仮特許出願第６２／４２９，７６５号明細書の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明は、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼまたはその他の代謝酵素および補因子再生酵素を含む代謝的に自己充足的系の酵素を含む磁気バイオナノ触媒（ＢＮＣ）を製造するための組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
磁気酵素固定化は、酵素の周りで自己集合するメソ多孔性磁気クラスター内への酵素の封入を含む。固定化効率は、酵素およびナノ粒子の初期濃度、酵素表面の性質、酵素の静電位、ナノ粒子表面ならびに接触時間を含む多数の因子に依存する。バイオ触媒プロセスにおいて工業的または医学的製造のために使用される酵素は、高度に効率的、プロセス前およびプロセス中に安定性、数回にわたるバイオ触媒サイクルにおいて再使用可能、さらに経済的でなければならない。スクリーニング用および試験用の薬物および化学物質のために使用される酵素は、安定性であり、信頼性があり、感受性があり、経済的である上に高スループット自動化と適合しなければならない。
【０００４】
Ｐ４５０生成薬理学的活性代謝産物は、新薬の発見および開発のための潜在資源である。薬物代謝産物を有効成分として使用することには、それらが先発薬品と比較して優れた特性を示すことができるので、複数の利点がある。これには改良された薬力学、改良された薬物動態、薬物−薬物相互作用の低い確率、低可変性の薬力学および／または薬物動態、改良された総合的安全性プロファイルおよび改良された物理化学的特性が含まれる。
【０００５】
シトクロムＰ４５０（Ｐ４５０またはＣＹＰと呼ばれる）は、Ｅ．Ｃ．１．１４クラスの酵素である（参照により全体として本明細書に組み込まれるＢｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１５８（Ｓｕｐｐｌ  １）：Ｓ２１５−Ｓ２１７（２００９）を参照）。それらは、薬物、生体異物、アルカン、テルペンおよび芳香族化合物の生体内変化に関係するモノオキシゲナーゼの１ファミリーを構成する。それらはさらに、化学的発癌物質の代謝ならびに例えばステロイド、脂肪酸、エイコサノイド、脂溶性ビタミン類および胆汁酸などの生理学的に重要な化合物の生合成にも関与する。さらに、それらは例えば殺虫剤などの環境内の生体異物および他の工業的有機汚染物質の分解にも関係している。それらは多数の代謝経路において見いだされる基質中に１つのヒドロキシル基を組み込むことによって機能する。この反応では、二酸素が、例えばＮＡＤ（Ｐ）Ｈなどの補因子の同時酸化によって、１つのヒドロキシル基および１つのＨ２Ｏ分子に還元させられる。
【０００６】
モノオキシゲナーゼは、全ての生物系において解毒性バイオ触媒として作用し、内因性または外因性毒性分子の分解を開始する鍵酵素である。生体異物の第Ｉ相代謝は、例えば、酸化、還元、加水分解、水化および脱ハロゲン化などの官能化反応を含む。シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼは、代謝の７５〜８０％に関係する最も重要なクラスの酵素を表す。その他の第Ｉ相酵素としては、モノアミンオキシダーゼ、フラビン含有オキシゲナーゼ、アミダーゼおよびエステラーゼが挙げられる。
【０００７】
第ＩＩ相代謝は、第Ｉ相代謝産物上での極性基（例えば、グルクロン酸、硫酸およびアミノ酸）の共役結合反応（グルクロン酸化、硫酸化、ＧＳＨ共役結合、アセチル化、アミノ酸共役結合およびメチル化）を含んでいる。
【０００８】
近年では、特に高度の立体選択性および位置選択性が必要とされる場合に、バルク化学物質、医薬品、農薬および食品添加物を工業的合成するために、Ｐ４５０バイオ触媒を適用することへの関心が高まっている。
【０００９】
Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ酵素は、不安定でバイオ触媒反応に使用するのが困難であることは有名である。しかしそれらは、薬物および生体異物変換の代謝経路にとって重要な成分であるため、薬物代謝産物の生成および化学物質の解毒において重要な役割を果たす。Ｐ４５０を含む代謝酵素によって化学的代謝産物の多様性を生じさせるための新規な方法に対するニーズが高まっている。それらは、新薬開発において化学物質の薬物動態研究および生分解研究のために使用されている。組み換えシトクロムＰ４５０  ＢＭ３（ＢＭ３）は、その活性が高いため、および例えば、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）またはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの一般的宿主内での組み換えベクターから発現させるのが容易であるために、生体工学的および化学的用途のための最も前途有望なモノオキシゲナーゼの１つであると考えられている。ＢＭ３は、それらが酸化活性および補因子還元活性を有するので、一体型触媒である。構造的に、Ｐ４５０ドメインは、レダクターゼドメインと融合しているので電子の直接移動を容易にする。さらに、分子は可溶性であり、膜結合される必要はない。これは、バイオ触媒反応における製造および使用のための利点を提供する。そこで、バイオ触媒反応においてＰ４５０を使用するための新規な方法を開発することには、商業的関心が有意に高い。
【００１０】
Ｐ４５０および一般に大多数の代謝性酸化酵素は、それらの標的化合物を変換させるためには補因子を必要とする。陽子（Ｈ＋）は、通常はＣＹＰ酵素内の特異アミノ酸を通して補因子ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨから送達される。それらは陽子を活性部位に中継し、そこでそれらは単一原子を基質に添加できるように酸素分子を還元的に分割する。ＣＹＰ酵素は、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）およびギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）を含むがそれらに限定されないある範囲の様々な酸化還元パートナー酵素からの電子を受け入れる。
【００１１】
ＧＤＨ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．４７）は、ＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨまたはＮＡＤ＋からＮＡＤＨへの同時の還元を伴ってβ−Ｄ−グルコースからβ−Ｄ−１，５−ラクトンへの酸化を触媒する。ＦＤＨ（ＥＣ１．２．１．２）は、ギ酸から二酸化炭素への酸化を触媒する１組の酵素を意味する。それらは、例えばＮＡＤ＋などの第２基質へ電子を供与する。特に真核生物起源由来のこれらの酵素は、あらゆる酵素の中で最少の総代謝回転数を有している。シトクロムＰ４５０を用いたバイオ触媒反応は、基質酸化には副生成物として、例えば過酸化水素および過酸化物の反応性酸素種（ＲＯＳ）産生が結び付いているために、高度に非効率である。酵素からの活性化酸素の大きな分画である真核生物モノオキシゲナーゼは、ペルオキシシトクロムＰ４５０のプロトン化および酸素の４電子還元がＨ２Ｏ２を生成する間に、スーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ−２）を生成する一電子還元三元複合系のいずれかの崩壊によって、標的の酸化から流用されてＲＯＳへ変換させられる。そこで、真核生物Ｐ４５０酵素は、極めて実質的部分（＞３０％）のＲＯＳ生成のための消費還元当量を消失する。
【００１２】
真核生物Ｐ４５０と比較して、細菌性Ｐ４５０は、ＲＯＳへ流用される全電子取り込みが１０％未満であり、酸化経路におけるＯ２のより優れた効率および電子転換効率を生じさせるので、より効率的である。反応速度を緩徐化させることなくＲＯＳの集積を防止するレベルで溶存酸素濃度を制御するためには、バイオリアクターの特別設計が不可欠である。
【００１３】
反応性酸化種（ＲＯＳ）の生成に起因する酸化阻害は、Ｐ４５０バイオ触媒の主要な制限の１つである。反応性酸素種（ＲＯＳ）は、Ｐ４５０ならびにＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ＮＯＸ）、リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）およびシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）を含む他のオキシダーゼの代謝反応の主要な副生成物である。反応性酸素種（ＲＯＳ）には、高度に反応性の酸素ラジカル［スーパーオキシド（Ｏ２・−）、ヒドロキシル（・ＯＨ）、ペルオキシル（ＲＯ２・）、アルコキシル（ＲＯ・）］ならびに酸化剤である、および／またはラジカルに容易に転換されるいずれかであるノンラジカルが含まれる。例としては、次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）、オゾン（Ｏ３）、一重項酸素（１Ｏ２）ならびに反応が酸素過剰で発生する場合の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）およびスーパーオキシドイオン（Ｏ２−）としての過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）が挙げられる。高レベルのＲＯＳは変換反応の効率を減少させるだけではなく、さらに酸化変性に起因する反応を阻害もする。酸化反応中のＲＯＳ集積を防止する１つの方法は、例えばカタラーゼまたはスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）などのＲＯＳ分解酵素を使用して重要な中間物を捕捉することである。それらは、二酸素を生成しながらＲＯＳから汚染除去し、Ｐ４５０酸化サイクルのために使用できるように酸素ラジカルをリサイクルする。
【００１４】
第Ｉ相、第ＩＩ相および第ＩＩＩ相代謝において代謝産物を生成する、当技術分野において公知である他の代謝酵素には、ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、フラビン含有モノオキシゲナーゼ、モノアミンオキシダーゼおよびカルボキシエステラーゼが含まれる。代謝酵素は低活性を有しており、特にｅｘ−ｖｉｖｏで不安定である。スクリーニング用または生化学物質生成における化学的代謝産物の高度で迅速な生成を得るために、Ｐ４５０の濃度は歴史的に高かった（５０〜２００％の基質負荷）。標的化合物の酸化速度を増加させるために、酸素レベルは、化学量論を超える濃度でさらに高いことが必要である。これは、酵素を変性させ、反応の効率を制限するスーパーオキシドアニオンの生成をもたらす。
【００１５】
化学的代謝産物を定性的および定量的に生成するためには、例えばＰ４５０などの代謝酵素を規定比率で組み合わせる、安定化させる、使用する、および再使用するための新規な方法が必要とされる。何千種という化学物質の代謝スクリーニングに使用されるためには、Ｐ４５０および代謝酵素の組み合わせを自動化と適合する高スループットフォーマットで状態調節する必要がある。これは、マイクロプレート内で反応を実施することによって達成できる。二酸素は、Ｐ４５０反応の収率に影響を及ぼす限定因子になり得る。
【００１６】
Ｐ４５０の反応速度および生産性を増加させるためには、長い反応経過にわたり混合することによって二酸素の拡散を増加させることが重要である。しかしマイクロプレートフォーマットでの撹拌は、限定された体積およびウエルの数に起因して困難である。緩徐な混合は、材料を損傷させることなく反応ミックスの酸化を増加させ、酵素は、当技術分野において重要な未だ満たされていないニーズである。インキュベーション、混合および上清収集の順序が、自動化高スループットワークフローに組み込まれなければならない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、補因子再生酵素と組み合わされた拡散性補因子を必要とする磁気固定化された酵素を含むバイオナノ触媒（ＢＮＣ）を生成するための組成物および方法を提供する。一部の実施形態では、補因子依存性酵素は、レダクターゼと組み合わされたＰ４５０モノオキシゲナーゼである。一部の例では、補因子は、生産性を増加させるために酵素と共固定化される。
【００１８】
したがって、本発明は、磁気ナノ粒子の自己集合メソ多孔性凝集体および第１酵素活性を有する拡散性補因子を必要とする第１酵素；補因子再生活性を含む第２酵素を含む組成物であって；ここで補因子は第１酵素活性において利用され、磁気ナノ粒子の凝集体ならびに第１および第２酵素機能によって形成されたメソ細孔内に磁気的に封入されており、第１および第２酵素は、拡散性基質を拡散性生成物に変換させられることによって組成物を提供する。
【００１９】
一部の実施形態では、補因子は、第１および第２酵素とともに磁気ナノ粒子のメソ多孔性凝集体内に封入されている。他の実施形態では、磁気ナノ粒子のメソ多孔性凝集体は、酸化鉄組成物を有する。他の実施形態では、磁気ナノ粒子のメソ多孔性凝集体は、磁気ナノ粒子の少なくとも９０％が少なくとも３ｎｍ〜３０ｎｍまでのサイズを有する磁気ナノ粒子サイズ分布、および磁気ナノ粒子のメソ多孔性凝集体の少なくとも９０％が少なくとも１０ｎｍ〜５００ｎｍまでのサイズを有する凝集粒径分布を有する。他の実施形態では、磁気ナノ粒子のメソ多孔性凝集体は、少なくとも１０ｅｍｕ／ｇの飽和磁化を有する。好ましい実施形態では、磁気ナノ粒子のメソ多孔性凝集体は、５ｅｍｕ／ｇまでの残留磁化を有する。他の実施形態では、第１および第２酵素は、飽和容量の１００％までで磁気ナノ粒子のメソ多孔性凝集体中に含有される。
【００２０】
本発明の一部の実施形態では、第１および第２酵素は、微生物を物理的に寄せ付けない。
【００２１】
本発明の一部の実施形態では、第１酵素は、酸化酵素である。好ましい実施形態では、酸化酵素は、フラビン含有オキシゲナーゼであり；ここで、組成物は、第１酵素と共局在化している補因子レダクターゼ活性を有する第３酵素をさらに含む。他の実施形態では、酸化酵素は、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼであり；ここで、組成物は、第１酵素と共局在化している補因子レダクターゼ活性を有する第３酵素をさらに含む。好ましい実施形態では、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼおよび第３酵素は、単一タンパク質内に含まれる。より好ましい実施形態では、単一タンパク質は、二官能性シトクロムＰ４５０／ＮＡＤＰＨ−−Ｐ４５０レダクターゼを含む。より好ましい実施形態では、単一タンパク質はＢＭ３活性を有し、配列番号１との少なくとも９０％の配列同一性を有する。他の実施形態では、Ｐ４５０は、配列番号２〜７のいずれか１つの少なくとも９０％の配列同一性を有する。
【００２２】
本発明の一部の実施形態では、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、脂質膜内で第３酵素と共局在化している。好ましい実施形態では、第３酵素は、シトクロムＰ４５０レダクターゼである。
【００２３】
一部の実施形態では、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、哺乳動物であるＰ４５０配列を含む。他の実施形態では、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、ヒトであるＰ４５０配列を含む。他の実施形態では、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ａ７、ＣＹＰ２Ａ１３、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１８、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ２Ｆ１、ＣＹＰ２Ｊ２、ＣＹＰ２Ｒ１、ＣＹＰ２Ｓ１、ＣＹＰ２Ｕ１、ＣＹＰ２Ｗ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ３Ａ７、ＣＹＰ３Ａ４３、ＣＹＰ４Ａ１１、ＣＹＰ４Ａ２２、ＣＹＰ４Ｂ１、ＣＹＰ４Ｆ２、ＣＹＰ４Ｆ３、ＣＹＰ４Ｆ８、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＣＹＰ４Ｆ１２、ＣＹＰ４Ｆ２２、ＣＹＰ４Ｖ２、ＣＹＰ４Ｘ１、ＣＹＰ４Ｚ１、ＣＹＰ５Ａ１、ＣＹＰ７Ａ１、ＣＹＰ７Ｂ１、ＣＹＰ８Ａ１、ＣＹＰ８Ｂ１、ＣＹＰ１１Ａ１、ＣＹＰ１１Ｂ１、ＣＹＰ１１Ｂ２、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ１９Ａ１、ＣＹＰ２０Ａ１、ＣＹＰ２１Ａ２、ＣＹＰ２４Ａ１、ＣＹＰ２６Ａ１、ＣＹＰ２６Ｂ１、ＣＹＰ２６Ｃ１、ＣＹＰ２７Ａ１、ＣＹＰ２７Ｂ１、ＣＹＰ２７Ｃ１、ＣＹＰ３９Ａ１、ＣＹＰ４６Ａ１またはＣＹＰ５１Ａ１を含む。
【００２４】
一部の実施形態では、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジおよびヤギからなる群から選択される起源のＰ４５０配列を含む。他の実施形態では、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、昆虫、魚、真菌、酵母、原生動物および植物からなる群から選択される起源のＰ４５０配列を含む。
【００２５】
一部の実施形態では、第２酵素は、カルボニルレダクターゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アリール−アルコールデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、Ｄ−１キシロースデヒドロゲナーゼ、オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ、イソプロパノールデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ギ酸デヒドロゲナーゼ、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼおよびイソクエン酸デヒドロゲナーゼからなる群から選択される。
【００２６】
本発明の一部の実施形態では、補因子は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド＋水素（ＮＡＤＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸＋水素（ＮＡＤＰＨ）、フラビンアデニンジヌクレオチド＋水素（ＦＡＤＨ）またはグルタチオンである。
【００２７】
本発明の一部の実施形態は、反応性酸素種（ＲＯＳ）を還元する第４酵素をさらに含む。好ましい実施形態では、第４酵素は、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）またはグルタチオンペルオキシダーゼ／グルタチオン−ジスルフィドレダクターゼである。
【００２８】
一部の実施形態では、第１酵素は、第Ｉ相代謝に関与する。他の実施形態では、本発明は、第ＩＩ相または第ＩＩＩ相代謝に関与する第５酵素を提供する。好ましい実施形態では、第５酵素は、ＵＤＰ−グルコロノシルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、モノアミンオキシダーゼまたはカルボキシエステラーゼである。
【００２９】
本発明は、メソ多孔性凝集体の組成物がマクロ多孔性磁気骨格上で集合できることを提供する。好ましい実施形態では、マクロ多孔性磁気骨格は、架橋結合水不溶性ポリマーおよび埋め込まれた磁気マイクロ粒子（ＭＭＰ）のほぼ均一な分布を含むポリマーハイブリッド骨格である。好ましい実施形態では、磁気マクロ多孔性ポリマーハイブリッド骨格は、ＰＶＡ、ならびにＣＭＣ、アルギン酸塩、ＨＥＣおよびＥＨＥＣからなる群から選択されるポリマーを含む。
【００３０】
本発明は、１種以上の酵素が、組み換えＤＮＡテクノロジーまたは無細胞タンパク質合成によって生成されることを提供する。
【００３１】
本発明は、本明細書に開示した組成物を第１反応における拡散性基質に曝露させる工程を含む、化学物質を製造する方法を提供する。
【００３２】
好ましい実施形態は、第１反応を磁気的に混合する工程をさらに含む。好ましい実施形態は、拡散性生成物を回収する工程をさらに含む。他の好ましい実施形態は、第１反応の他の成分から組成物を磁気的に回収する工程を含む。より好ましい実施形態は、組成物を第２反応に曝露させる工程を含む。より好ましい実施形態は、第２反応から拡散性生成物を回収する工程を含む。
【００３３】
一部の実施形態では、第１反応は、バッチ反応である。好ましい実施形態では、バッチ反応は、マイクロプレート内で行われる。他の実施形態には、充填層反応または連続フロー反応が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】バイオナノ触媒（ＢＮＣ）中に磁気固定化された代謝酵素を示す図である。ＢＮＣには、固定化された＼Ｐ４５０−ＢＭ３（モノオキシゲナーゼに融合したレダクターゼ）、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、カタラーゼ（ＣＡＴ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）およびＮＡＤＰＨ補因子が含まれる。
【図２】バイオナノ触媒（ＢＮＣ）中に磁気固定化された代謝第Ｉ相代謝酵素を示す図である。レダクターゼ酵素を含む、小胞膜中のヒト組み換えＰ４５０モノオキシゲナーゼ。ＢＮＣには、固定化されたグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、カタラーゼ（ＣＡＴ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）およびＮＡＤＰＨ補因子がさらに含まれる。
【図３】遊離酵素系と比較した、支持体酵素および補因子と共固定化されたＢＭ３シトクロムＰ４５０の活性および再利用可能性を示す図である。ＢＭ３−ｐ４５０変異体は、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、カタラーゼ（ＣＡＴ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）およびＮＡＤＰＨを含む２０％の総タンパク質を用いてＢＮＣ中に固定化した。これらのＢＮＣは、０．５％の総タンパク質負荷および０．１７％のＰ４５０負荷を用いてバイオマイクロ触媒（ＢＭＣ）を形成する磁気マクロ多孔性ポリマーハイブリッド骨格上にテンプレート化した。ＢＭＣを連続１０回のｐ−ニトロフェニルラウレートの酸化アッセイ（１８時間のインキュベーション）において再使用した。調製した遊離酵素ストックを固定化について毎日試験したが、２日後には活性を示さなかった。
【図４】図４Ａ−４Ｃは、固定化Ｐ４５０からの細菌増殖抑制を示す図である。２４時間後に、凍結乾燥物から新しく調製した遊離ＢＭ３変異体を含有する液体細菌培地は混濁した。混濁ストックからの試料は、３７℃のＬＢブロス内で２４時間増殖させ、次にＬＢ寒天上に画線培養し、次に３７℃で２４時間インキュベートした（図４Ａ）。固定化ＢＭ３−Ｐ４５０からの上清を同様に培養したが、細菌増殖を産生しなかった（図４Ｂ）。全コロニーが同一の形態を有していた。位相コントラスト顕微鏡検査（図４Ｃ）は細菌がバチルス属（ｂａｃｉｌｌｕｓ）であることを明らかにした。これらのデータは、細菌が単一種であることを示唆し、実際に、組み換えＰ４５０−ＢＭ３を発現させるために使用された宿主である可能性がある。
【図５】図５Ａ−５Ｄは、高スループットマイクロプレートフォーマット（９６ウエルプレート）内での磁気ＢＭＣ混合を示す図である。静止密封９６ウエルマイクロプレートの上下に縦一列で移動した永久磁石は（図５Ａおよび５Ｂ）、反応培地中のＢＭＣを弾ませる。電子的混合については、静止密封９６ウエルマイクロプレートのすぐ上下に配置された電磁石の交番活性化は（図５Ｃおよび５Ｄ）、反応培地中のＢＭＣを弾ませる。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、強化された代謝性能および安定性のために、他の代謝酵素および支持酵素と組み合わせて例えばＰ４５０モノオキシゲナーゼなどの代謝酵素を含むＢＮＣを製造およびおよび使用するための組成物および方法を提供する。ＢＮＣＳは自己集合によって形成され、ナノ粒子１ｇ当たり５〜２０，０００μｇのＰ４５０または総タンパク質を含有する。ＢＮＣは固定化後の酵素活性の消失を防止し、酵素負荷を最大化する、または磁気混合装置を用いた加工処理の容易さのために固定化酵素が磁性材料上で骨格化されることを許容する。酵素を磁性材料内に固定化する工程は、これらの磁気バイオ触媒を磁気ミキサー内のマイクロプレートフォーマットでインキュベートする工程、および磁性材料を反応の撹拌成分として使用する工程を可能にする。反応の終了時に、材料は、関心対象の化合物を含有する上清を回収できるようにプレートの底部で捕捉することができる。代謝産物の大規模製造に適用されると、磁性材料は後続または連続反応のために酵素をリサイクルすることを許容する。
【００３６】
磁気固定化された酵素を含む自己集合メソ多孔性ナノクラスターは、使用前および使用中に高度に活性および安定性である。磁気固定化された酵素は、磁気ナノ粒子（ＭＮＰ）によって形成された自己集合メソ細孔内に組み込むために結合剤を必要としない。ＭＮＰへの酵素の永久的化学修飾または架橋結合は必要とされない。このテクノロジーは、組織化の３つの統合レベルでの生化学、ナノテクノロジーおよび生体工学のブレンドである：レベル１は、磁気メソ多孔性ナノクラスターの合成のためのＭＮＰを備える酵素の自己集合である。このレベルは、酵素および補因子を固定化するための分子自己封入の機構を使用する。自己集合磁気ナノ粒子中に固定化された酵素は、本明細書では「バイオナノ触媒」（ＢＮＣ）と呼ばれる。本発明は、ＢＮＣ中に組み込まれたＰ４５０および支持酵素および補因子などの代謝酵素を提供する。レベル２は、磁気マトリックスまたはポリマーマトリックスなどの他の集合体中へのＭＮＰの安定化である。特定の実施形態では、ＢＮＣは、商業用途または他の用途のためにマイクロまたはマクロ構造上または構造中に「テンプレート化」される。１つの実施形態では、レベル２テンプレートは磁気マイクロ粒子（ＭＭＰ）である。レベル３は、レベル１＋２の固定化酵素を使用するための製品状態調節である。
【００３７】
一部の実施形態では、本発明のＢＮＣは、架橋結合水不溶性ポリマーおよび埋め込まれた磁気マイクロ粒子（ＭＭＰ）のほぼ均一な分布を含む磁気マクロ多孔性ポリマーハイブリッド骨格中で提供される。ポリマーは、少なくともポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を含み、サイズが約５０〜５００ｎｍのＭＭＰ、サイズが約１〜約５０μｍの細孔、約２０％〜９５％ｗ／ｗのＭＭＰを有するが、ここで骨格は総計約１〜１５ｍ２／ｇであるバイオナノ触媒（ＢＮＣ）を組み込むための有効表面積を含み；酵素を組み込むための総有効表面積は約５０〜２００ｍ２／ｇであり；骨格は約０．０１〜約１０ｇ／ｍＬのバルク密度を有し；および骨格は約１．０×１０−３〜約１×１０−４ｍ３ｋｇ−１の質量磁化率を有する。好ましい実施形態では、磁気マクロ多孔性ポリマーハイブリッド骨格は、骨格と水との約０〜９０度の接触角を含む。
【００３８】
好ましい実施形態では、架橋結合水不溶性ポリマーは、本質的にポリビニルアルコール（ＰＶＡ）である。より好ましい実施形態では、骨格は、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリアクリレート塩、ポリメタクリル酸、ポリメタクリレート塩、ポリメチルメタクリレート、酢酸ポリビニル、ポリフッ化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、フェノール樹脂、レゾルシノールホルムアルデヒド樹脂、ポリアミド、ポリウレタン、ポリエステル、ポリイミド、ポリベンズイミダゾール、セルロース、ヘミセルロース、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、２−ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、エチルヒドロキシエチルセルロース（ＥＨＥＣ）、キシラン、キトサン、イヌリン、デキストラン、アガロース、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリシロキサン、ポリジメチルシロキサンおよびポリホスファゼンからなる群から選択されるポリマーをさらに含む。
【００３９】
他のより好ましい実施形態では、磁気マクロ多孔性ポリマーハイブリッド骨格は、ＰＶＡおよびＣＭＣ、ＰＶＡおよびアルギン酸塩、ＰＶＡおよびＨＥＣまたはＰＶＡおよびＥＨＥＣを含む。マクロ多孔性ポリマーハイブリッド骨格は、参照により本明細書にその全体が組み込まれる米国仮特許出願第６２／３２３，６６３号明細書に教示されている。
【００４０】
ＭＮＰは、例えば、温度、イオン強度、ｐＨおよび溶媒などのバイオ触媒プロセスにおいて酵素を使用するためのより幅広い範囲の作動条件を許容する。ＭＮＰのサイズおよび磁化は、ＢＮＣの形成および構造に影響を及ぼす。これは、封入された酵素の活性に有意な強い影響を及ぼす。様々な反応条件下でのそれらの驚くべき回復力によって、自己集合ＭＮＰクラスターは、ポリマー樹脂、架橋結合ゲル、架橋結合酵素凝集体（ＣＬＥＡ）、架橋結合磁気ビーズなどに置換する酵素のための優れた固定化材料として使用できる。さらに、それらは拡散性基質上の酵素の任意の用途において使用できる。
【００４１】
ＢＮＣは、クラスター化磁気ナノ粒子間の格子間隙であるメソ細孔を含有している。酵素は、磁気ＢＮＣのメソ細孔の少なくとも一部分内に固定化される。本明細書で使用する用語「磁気」には、永久磁性、超常磁性、常磁性および強磁性挙動を含む、全てのタイプの有用な磁気特性が含まれている。
【００４２】
本発明のＢＮＣサイズは、ナノスケールにある、つまり一般に５００ｎｍ以下である。本明細書で使用する用語「サイズ」は、磁気ナノ粒子がほぼまたは実質的に球形である場合に磁気ナノ粒子の直径を意味することができる。磁気ナノ粒子がほぼまたは実質的に球形ではない（例えば、実質的に卵形または不規則形）場合には、用語「サイズ」は、磁気ナノ粒子の３つの寸法の最長寸法または平均値のいずれかを意味することができる。用語「サイズ」は、磁気ナノ粒子の集団内の計算平均サイズを意味することができる。
【００４３】
様々な実施形態では、磁気ナノ粒子は、そのサイズを正確に、約、少なくとも、超、まで、または未満として表したとき、例えば、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、１００ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２５ｎｍ、２０ｎｍ、１５ｎｍ、１０ｎｍ、５ｎｍ、４ｎｍ、３ｎｍ、２ｎｍもしくは１ｎｍのサイズ、または上記の例示的なサイズのいずれか２つに挟まれる範囲内のサイズを有する。
【００４４】
ＢＮＣ内では、個々の磁気ナノ粒子は、上記に提供したサイズのいずれかを有する一次ナノ粒子（すなわち、初晶）であってよい。ＢＮＣ中のナノ粒子の凝集体は、ナノ粒子よりサイズが大きく、一般に少なくとも約５ｎｍのサイズ（すなわち、二次サイズ）を有する。様々な実施形態では、凝集体は、そのサイズを正確に、約、少なくとも、超、まで、または未満として表したとき、例えば、５ｎｍ、８ｎｍ、１０ｎｍ、１２ｎｍ、１５ｎｍ、２０ｎｍ、２５ｎｍ、３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍもしくは８００ｎｍのサイズ、または上記の例示的なサイズのいずれか２つに挟まれる範囲内のサイズを有する。
【００４５】
典型的には、一次および／または凝集磁気ナノ粒子もしくはそれらのＢＮＣは、ある分布のサイズを有する、すなわち、それらのサイズは一般に狭いサイズまたは広いサイズのいずれかで分散している。様々な実施形態では、任意の範囲の一次もしくは凝集体サイズは、一次もしくは凝集体サイズの全範囲の大きい、もしくは小さい割合を構成することができる。例えば、一部の実施形態では、一次粒径の特定範囲（例えば、少なくとも約１、２、３、５もしくは１０ｎｍおよび約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０ｎｍまで）または凝集体粒径の特定範囲（例えば、少なくとも約５、１０、１５もしくは２０ｎｍおよび約５０、１００、１５０、２００、２５０もしくは３００ｎｍまで）は一次粒径の全範囲の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％またはそれ以上を構成する。他の実施形態では、一次粒径の特定範囲（例えば、約１、２、３、５もしくは１０ｎｍ未満または約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０ｎｍ超）または凝集体粒径の特定範囲（例えば、約２０、１０もしくは５ｎｍ未満または約２５、５０、１００、１５０、２００、２５０もしくは３００ｎｍ超）は、一次粒径の全範囲の約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％、１％、０．５％もしくは０．１％以下もしくは未満を構成する。
【００４６】
磁気ナノ粒子の凝集体（すなわち、「凝集体」）もしくはそれらのＢＮＣは、それらがそれから製造されている個々の初晶の量に依存して、多孔性の実質的な欠如を含む任意の程度の多孔性を有し得る。特定の実施形態では、凝集体は、格子間のメソ細孔（すなわち、充填配置によって形成された、一次磁気ナノ粒子間に位置するメソ細孔）を含有することによってメソ多孔性である。メソ細孔のサイズは、一般に、少なくとも２ｎｍ〜５０ｎｍまでである。様々な実施形態において、メソ細孔は、正確にまたは約、例えば、２、３、４、５、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０ｎｍの孔径、または上記の例示的な孔径のいずれか２つに挟まれる範囲内の孔径を有し得る。粒径の場合と同様に、メソ細孔は、典型的には、ある分布のサイズを有する、すなわち、それらのサイズは一般に狭いサイズまたは広いサイズのいずれかで分散している。様々な実施形態では、メソ細孔径の任意の範囲は、メソ細孔径もしくは全孔容積の全範囲の大きい、もしくは小さい割合を構成することができる。例えば、一部の実施形態では、メソ細孔径の特定の範囲（例えば、少なくとも約２、３もしくは５、および８、１０、１５、２０、２５もしくは３０ｎｍまで）は、メソ細孔径の全範囲または全細孔容積の少なくとも、または約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、もしくは１００％超を占める。他の実施形態において、メソ細孔径の特定の範囲（例えば、約２、３、４もしくは５ｎｍ未満、または約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０ｎｍ超）は、メソ細孔径の全範囲または全細孔容積の約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％、１％、０．５％もしくは０．１％以下もしくは未満を占める。
【００４７】
磁気ナノ粒子は、当技術分野において公知の組成物のいずれかを有することができる。一部の実施形態では、磁気ナノ粒子は、磁性であるゼロ価金属部分であるか、またはそれを含む。そのようなゼロ価の金属の一部の例としては、コバルト、ニッケルおよび鉄ならびにそれらの混合物および合金が挙げられる。他の実施形態では、磁気ナノ粒子は、例えばコバルト、ニッケル、もしくは鉄またはそれらの混合物の酸化物などの、磁性金属の酸化物であるかまたはそれを含む。一部の実施形態では、磁気ナノ粒子は、特徴的なコアおよび表面部分を有する。例えば、磁気ナノ粒子は、元素の鉄、コバルトもしくはニッケルで構成されるコア部分、および金属酸化物または例えば金、白金、パラジウムもしくは銀の層などの貴金属コーティングなどの不動態化層で構成される表面部分を有し得る。他の実施形態では、金属酸化物磁気ナノ粒子もしくはそれらの凝集体は、貴金属コーティングの層で被覆される。貴金属コーティングは、例えば、磁気ナノ粒子表面上の電荷数を減少させることができ、それにより、溶液中の分散性を有益に高め、ＢＮＣのサイズをより良好に制御することができる。貴金属コーティングは、酸化、浸出または例えばクエン酸塩、マロン酸塩もしくは酒石酸塩などの有機酸をキレート化する工程が生化学反応もしくはプロセスにおいて使用される場合はキレート化による可溶化に対して磁気ナノ粒子を保護する。不動態化層は、任意の好適な厚さ、例えば、特に少なくとも、約、例えば、０．１ｎｍ、０．２ｎｍ、０．３ｎｍ、０．４ｎｍ、０．５ｎｍ、０．６ｎｍ、０．７ｎｍ、０．８ｎｍ、０．９ｎｍ、１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍもしくは１０ｎｍまでもしくは未満、またはこれらの値のいずれか２つに挟まれる範囲内の厚さを有し得る。
【００４８】
本発明のために有用である磁性材料は、当技術分野において周知である。非限定的な例は、鉄鉱石（マグネタイトもしくは磁鉄鉱）、コバルトおよびニッケルなどの鉱石を含む強磁性体および強磁性材料を含む。他の実施形態では、希土類磁石が使用される。非限定的な例としては、ネオジム、ガドリニウム、ジスプロシウム（ｓｙｓｐｒｏｓｉｕｍ）、サマリウム−コバルト、ネオジム−鉄−ホウ素などが挙げられる。さらに他の実施形態において、磁石は、複合材料を含む。非限定的な例としては、セラミック、フェライト、およびアルニコ磁石が挙げられる。好ましい実施形態では、磁気ナノ粒子は、酸化鉄組成物を有する。酸化鉄組成物は、当該技術分野において公知の磁性もしくは超常磁性酸化鉄組成物、例えば、マグネタイト（ＦｅｓＯ／Ｏ、赤鉄鉱（α−Ｆｅ２θ  ３）、磁赤鉄鉱（γ−Ｆｅ２Ｃ＞３）または式ＡＢ２Ｏ４（式中、Ａは二価金属（例えば、Ｘｎ２＋、Ｎｉ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋もしくはそれらの組合せ）であり、Ｂは三価金属（例えば、Ｆｅ３＋、Ｃｒ３＋もしくはそれらの組合せ）である）によるスピネルフェライトのいずれかであり得る。
【００４９】
一部の実施形態では、ＢＮＣは、超常磁性ＮＰの不安定性を利用することによって形成される。マグネタイトのゼロ電荷電位（ＰＺＣ）は、その周囲では磁性ＮＰが互いに反発し合うことができずに容易にクラスター化するｐＨ７．９である。ＮＰは、ＰＺＣより下では正帯電しており、それより上では負帯電している。クラスター形成は、静電相互作用によって駆動され得る。荷電アミノ酸からの酵素の表面での反対静電電荷は、ＮＰの表面電荷を相殺することができる。酵素は、複数のＮＰの電荷を中和するポリアニオンもしくはポリカチオンに同化させることができる。各酵素は、その固有の等電点（ｐＩ）およびナノ粒子の凝集を誘発するであろう荷電アミノ酸の表面組成を有する。酵素は次に、メソ多孔性クラスター内に封入および安定化され得る。初期ＮＰおよび酵素濃度、ｐＨおよびイオン強度は、凝集速度および最終クラスターサイズを制御する主要なパラメーターである。クラスターのサイズは、クラスターから出入りする基質および生成物の物質移行に制限があるために、反応の有効性に大きく影響を及ぼす。クラスターのサイズは、酵素負荷および基質拡散速度を制御するために、１００ｎｍ〜１０μｍのクラスターに調整することができる。
【００５０】
封入された酵素は、レベル１と呼ばれる。剛性骨格内の「ロックされた」クラスターは、より大きい、もしくはより安定性の磁気骨格もしくはポリマー骨格上もしくはその中でそれらをテンプレート化することの結果として生じる可能性があり、レベル２と呼ばれる。これは、過剰凝集を防止し、外部磁石による捕捉が容易になるように質量磁化率を加える。
【００５１】
特定の実施形態では、磁気ナノ粒子（ＢＮＣ）の上記のメソ多孔性凝集体は、連続マクロ多孔性骨格中に組み込まれて第１および第２レベルの集合体を含む階層的触媒集合体を形成する。第１レベルの集合体は、ＢＮＣ中で見いだされる。第２レベルの集合体は、連続マクロ多孔性骨格中へのＢＮＣの組み込み中に見いだされる。一部の実施形態では、レベル２集合体には磁気がある。
【００５２】
本明細書でマクロ多孔性磁気骨格に対して使用される用語「連続」は、微粒子集合体でない材料、すなわち、互いに集合して巨視的構造を形成する粒子や離散物体で構築されてない材料を意味する。微粒子集合体とは対照的に、連続構造は、シームレスおよび均一な構造を周期的に中断する、マクロ細孔の周りで実質的にシームレスおよび均一である。したがって、連続骨格中のマクロ細孔は、凝集粒子間の格子間隙ではない。それにもかかわらず、一次連続骨格の集合または凝集が一次連続骨格間の格子間隙により形成されたマクロ細孔（例えば、約５０ｎｍ超〜約１００まで）を含んでいない限り、より小さい一次連続骨格の集合または凝集から連続骨格を構築することができる。特にセラミック材料や元素材料などの無機材料の場合、連続骨格は結晶ドメインもしくは相界を含んでいても含んでいなくてもよい。
【００５３】
特定の実施形態では、磁気ナノ粒子（ＢＮＣ）の上記のメソ多孔性凝集体は、連続マクロ多孔性骨格中に組み込まれて第１および第２レベルの集合体を含む階層的触媒集合体を形成する。第１レベルの集合体は、ＢＮＣ中に見いだされる。第２レベルの集合体は、連続マクロ多孔性骨格中へのＢＮＣの組み込み中に見いだされる。全階層的触媒集合体には、少なくともＢＮＣの存在によって磁気がある。
【００５４】
マクロ多孔性骨格は、５０ｎｍ超のサイズを有するマクロ細孔（すなわち、マクロスケールサイズの細孔）を含有する。様々な実施形態では、マクロ細孔は、そのサイズを正確に、約、少なくとも、超、まで、または未満として表したとき、例えば、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ、８００ｎｍ、９００ｎｍ、１ミクロン（１μｍ）、１．２μｍ、１．５μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、もしくは１００μｍのサイズ、または上記の例示的なサイズの任意の２つに挟まれる範囲内のサイズを有する。
【００５５】
マクロ多孔性骨格は、マクロ細孔を収容可能である限り、任意の好適なサイズを有し得る。典型的な実施形態では、マクロ多孔性骨格は、少なくとも１つのマクロスケールのサイズ寸法を有する。少なくとも１つのマクロスケールの寸法は５０ｎｍ超であり、上記に提供したマクロ細孔の値のいずれかであり得るとともに特に、その寸法を正確に、約、少なくとも、超、まで、または未満として表したとき、例えば、１μｍ、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、６０μｍ、７０μｍ、８０μｍ、９０μｍ、１００μｍ、２００μｍ、３００μｍ、４００μｍ、５００μｍ、６００μｍ、７００μｍ、８００μｍ、９００μｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、５ｍｍもしくは１ｃｍの寸法、または上記の例示的なサイズの任意の２つに挟まれる範囲内のサイズであり得る。サイズ寸法の１つのみまたは２つがマクロスケールである場合、残りの１つまたは２つの寸法は、ナノスケール、例えば、上記に提供した磁気ナノ粒子の値のいずれか（例えば、独立して、その値を正確に、約、少なくとも、超、まで、または未満として表したとき、例えば、１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００ｎｍの値、または上記の値の任意の２つに挟まれる範囲内の値）であり得る。一部の実施形態では、マクロ多孔性骨格のサイズ寸法の少なくとも２つもしくは全てがマクロスケールである。
【００５６】
第１セットの実施形態では、ＢＮＣが取り込まれる連続マクロ多孔性骨格には磁気がある、すなわち、ＢＮＣの不在下でさえも磁気がある。例えば、連続マクロ多孔性骨格には、磁気ポリマー組成物で構成されることにより磁気がある場合もある。磁気ポリマーの例は、当技術分野で周知のように、テトラシアノキノジメタン（ＴＣＮＱ）とエメラルジン塩基形式のポリアニリン（ＰＡＮｉ）との組合せでのＰＡＮｉＣＮＱである。あるいは、追加して、連続マクロ多孔性骨格には、ＢＮＣに属さない磁気粒子が埋め込まれたことによって磁気がある場合もある。ＢＮＣに属さない磁気粒子は、例えば、ＦＲＰ酵素やいずれの酵素にも一体化されていない磁気ナノ粒子もしくはマイクロ粒子であり得る。磁気マイクロ粒子は、マクロ細孔サイズと無関係ではあるが、マクロ細孔について上記に提供したサイズもしくはサイズ分布を有し得る。特定の実施形態では、磁気マイクロ粒子は、約、正確にもしくは少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｎｍのサイズ、または上記の例示的なサイズの任意の２つに挟まれる範囲内のサイズを有する。一部の実施形態では、連続マクロ多孔性骨格は、ＢＮＣの少なくとも一部分に吸着された磁気マイクロ粒子がその中に埋め込まれているか、または磁気マイクロ粒子がＢＮＣに一体化されても吸着もされていない。
【００５７】
第２セットの実施形態では、ＢＮＣが組み込まれている連続骨格には磁気がない。それにもかかわらず、非磁気骨格を含有する全階層的触媒集合体には、少なくともその中に組み込まれたＢＮＣの存在によって磁気が残留する。
【００５８】
１つの実施形態では、連続マクロ多孔性骨格（もしくはその前駆体）はポリマー組成物を有する。ポリマー組成物は、当技術分野で公知の固体の有機、無機、またはハイブリッド有機−無機のポリマー組成物のいずれかである可能性があり、バインダーとして作用する合成ポリマーもしくはバイオポリマーであり得る。好ましくは、ポリマーマクロ多孔性骨格は、水中またはその中で階層的触媒の使用が意図される他の媒体中で溶解も分解もしない。合成有機ポリマーの一部の例としては、ビニル付加ポリマー（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリル酸もしくはポリアクリレート塩、ポリメタクリル酸もしくはポリメタクリレート塩、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリビニルアセテート、ポリビニルアルコールなど）、フルオロポリマー（例えば、ポリフッ化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレンなど）、エポキシド（例えば、フェノール樹脂、レソルシノール−ホルムアルデヒド樹脂）、ポリアミド、ポリウレタン、ポリエステル、ポリイミド、ポリベンゾイミダゾールおよびそれらのコポリマーが挙げられる。バイオポリマーの一部の例としては、多糖類（例えば、セルロース、ヘミセルロース、キシラン、キトサン、イヌリン、デキストラン、アガロースおよびアルギン酸）、ポリ乳酸ならびにポリグリコール酸が挙げられる。セルロースの特定の例では、セルロースは、微生物または藻類に由来するセルロースであり得る。無機もしくはハイブリッド有機−無機ポリマーの一部の例としては、ポリシロキサン（例えば、ポリジメチルシロキサンなどのゾルゲル合成により調製されるもの）およびポリホスファゼンが挙げられる。一部の実施形態では、上記に提供したいずれか１つ以上のクラスまたは特定のタイプのポリマー組成物は、マクロ多孔性骨格として除外される。
【００５９】
また別の実施形態では、連続マクロ多孔性骨格（もしくはその前駆体）は、非ポリマー組成物を有する。非ポリマー組成物は、例えば、セラミック組成物または元素組成物を有し得る。セラミック組成物は、結晶、多結晶もしくは非晶質であってよく、ならびに酸化物組成物（例えば、アルミナ、ベリリア、セリア、イットリアもしくはジルコニア）および非酸化物組成物（例えば、炭化物、ケイ化物、窒化物、ホウ化物もしくは硫化物の組成物）を含む当技術分野で公知の組成物のいずれかを有し得る。元素組成物もまた、結晶、多結晶もしくは非晶質であってよく、および炭素、アルミニウムまたはケイ素などの任意の好適な元素組成物を有し得る。
【００６０】
他の実施形態では、ＢＮＣは、磁気マイクロ粒子間の格子間隙としてマクロ細孔を含む磁気マイクロ粒子（ＭＭＰ）の集合体（すなわち凝集体）を含む（もしくはそれにより構築される）非連続マクロ多孔性支持体中に存在する。磁気マイクロ粒子は典型的には強磁性であり、マグネタイトもしくは他の強磁性材料で作製可能である。ＢＮＣは、磁気マイクロ粒子の凝集のマクロ細孔の少なくとも一部分に埋め込まれているが、さらに磁気マイクロ粒子の表面上にも存在し得る。ＢＮＣは、磁気相互作用によって磁気マイクロ粒子の表面に一体化可能である。磁気マイクロ粒子は、金属酸化物または貴金属のコーティング層で被覆されてもされなくてもよい。一部の実施形態では、ＢＮＣ−ＭＭＰ集合体は、階層的触媒集合体を提供するために、上記に記載した連続マクロ多孔性骨格中に組み込まれる（すなわち、埋め込まれる）。
【００６１】
一部の実施形態では、骨格は、架橋結合水不溶性ポリマーおよび埋め込まれた磁気マイクロ粒子（ＭＭＰ）のほぼ均一な分布を含む。架橋結合ポリマーは、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）および任意選択的に追加のポリマー材料を含む。骨格は、骨格の調製中に注型を使用することによって任意の形状を取ることができる。または、骨格は、バイオ触媒反応において使用するためにマイクロ粒子に粉砕されてよい。または、骨格は、バイオ触媒反応において使用するためにビーズとして成形されてよい。または、骨格は、モノリスであってよい。骨格を調製および使用するための方法もまた提供される。
【００６２】
他の実施形態では、磁気マクロ多孔性ポリマーハイブリッド骨格は、架橋結合水不溶性ポリマーおよび埋め込まれた磁気マイクロ粒子（ＭＭＰ）のほぼ均一な分布を含む。ポリマーは、少なくともポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を含み、サイズが約５０〜５００ｎｍのＭＭＰ、サイズが約１〜約５０μｍの細孔、約２０％〜９５％ｗ／ｗのＭＭＰを有するが、ここで骨格はバイオナノ触媒（ＢＮＣ）を組み込むための総計約１〜１５ｍ２／ｇである有効表面積を含み；酵素を組み込むための総有効表面積は約５０〜２００ｍ２／ｇであり；骨格は約０．０１〜約１０ｇ／ｍＬのバルク密度を有し；および骨格は約１．０×１０−３〜約１×１０−４ｍ３ｋｇ−１の質量磁化率を有する。好ましい実施形態では、磁気マクロ多孔性ポリマーハイブリッド骨格は、骨格と水との約０〜９０度の接触角を含む。マクロ多孔性ポリマーハイブリッド骨格の実施形態の詳細は、参照により本明細書にその全体が組み込まれる米国仮特許出願第６２／３２３，６６３号明細書に教示されている。
【００６３】
個別の磁気ナノ粒子もしくはそれらの凝集体またはそれらのＢＮＣは、任意の好適な磁性度を有する。例えば、磁気ナノ粒子、ＢＮＣもしくはＢＮＣ骨格集合体は、少なくとも、もしくは約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００ｅｍｕ／ｇまでの飽和磁化（Ｍｓ）を有し得る。磁気ナノ粒子、ＢＮＣもしくはＢＮＣ−骨格集合体は、好ましくは、５ｅｍｕ／ｇ以下（すなわち、〜まで）もしくは未満、より好ましくは、４ｅｍｕ／ｇ、３ｅｍｕ／ｇ、２ｅｍｕ／ｇ、１ｅｍｕ／ｇ、０．５ｅｍｕ／ｇもしくは０．１ｅｍｕ／ｇまでもしくは未満の残留磁化（Ｍｒ）を有する。磁気ナノ粒子、ＢＮＣもしくはＢＮＣ−骨格集合体の表面磁場は、約もしくは少なくとも、例えば、約０．５、１、５、１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００もしくは１０００ガウス（Ｇ）、または上記の値のいずれか２つに挟まれる範囲内の磁場であり得る。マイクロ粒子が含まれる場合、マイクロ粒子はまた、上記の磁気強度のいずれかを有し得る。
【００６４】
磁気ナノ粒子もしくはそれらの凝集体は、結果として生じるＢＮＣを生成するために、用途に応じて、飽和レベルまでもしくは未満の好適な量の酵素を吸着するように作製することができる。様々な実施形態では、磁気ナノ粒子もしくはそれらの凝集体は、約〜、少なくとも〜、〜までもしくは〜未満で表したときに、例えば、１、５、１０、１５、２０、２５もしくは３０ｐｍｏｌ／ｍ２の酵素を吸着し得る。または、磁気ナノ粒子もしくはそれらの凝集体は、飽和レベルの約〜、少なくとも〜、〜までもしくは〜未満で表したときに、例えば、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは１００％である量の酵素を吸着し得る。
【００６５】
磁気ナノ粒子もしくはそれらの凝集体またはそれらのＢＮＣは、任意の好適な細孔容積を有する。例えば、磁気ナノ粒子もしくはそれらの凝集体は、約〜、少なくとも〜、〜までもしくは〜未満で表したときに、例えば、約０．０１、０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５もしくは１ｃｍ３／ｇの細孔容積、または上記の値のいずれか２つに挟まれる範囲内の細孔容積を有し得る。
【００６６】
磁気ナノ粒子もしくはそれらの凝集体またはそれらのＢＮＣは、任意の好適な比表面積を有する。例えば、磁気ナノ粒子もしくはそれらの凝集体は、約〜、少なくとも〜、〜までもしくは〜未満で表したときに、例えば、約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０もしくは２００ｍ２／ｇの比表面積を有し得る。
【００６７】
ＭＮＰ、それらの構造、組織、好適な酵素および使用は、全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２１２２４３７号パンフレット、同第２０１４０５５８５３号パンフレット、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／３１４１９号明細書および米国仮特許出願第６２／１６３，０３２号明細書および同第６２／３２３，６６３号明細書に記載されている。
【００６８】
ＢＮＣの自動連続製造については、参照により本明細書に全体として組み込まれる米国仮特許出願第６２／１９３，０４１号明細書に開示されている。
【００６９】
本発明は、磁気的に封入されたモノオキシゲナーゼを有するＢＮＣ（Ｅ．Ｃ．１．１３）を提供する。１つの実施形態では、モノオキシゲナーゼは、Ｐ４５０（ＥＣ＿１．１４．−．−））である。１つの好ましい実施形態では、モノオキシゲナーゼは、ヒト起源である。（例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ２８８４６２５／を参照されたい。）また別の好ましい実施形態では、モノオキシゲナーゼは、細菌起源である。他の好ましい実施形態では、モノオキシゲナーゼは、藻類、真菌、植物もしくは動物起源である。
【００７０】
一部の実施形態では、Ｐ４５０は、例えばバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来のＢＭ３  Ｐ４５０などの可溶形にある。例えば、配列番号１を参照されたい。他の実施形態では、ＢＭ３  Ｐ４５０は、野生型由来の１つ以上の変異アミノ酸を有する。他の実施形態では、Ｐ４５０は、配列番号１との少なくとも９０％の配列同一性を有する。
【００７１】
一部の実施形態では、Ｐ４５０は、ヒトである。他の実施形態では、ヒトＰ４５０は不溶形にあり、小胞オルガネラの膜内に埋め込まれている。オルガネラは、モノオキシゲナーゼの活性とともに作用する、またはモノオキシゲナーゼの活性を増強する他の酵素を含有し得る。他の実施形態では、Ｐ４５０は、ｓｕｐｅｒｓｏｍｅ内に含まれている。（例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ，ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｏｒｎｉｎｇ．ｃｏｍ／ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ／ｅｎ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｌｉｆｅ−ｓｃｉｅｎｃｅｓ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ａｄｍｅ−ｔｏｘ−ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ−ｍｅｔａｂｏｌｉｃ−ｅｎｚｙｍｅｓ．ｈｔｍｌ．を参照されたい）。他の実施形態では、Ｐ４５０は、バクトソーム（ｂａｃｔｏｓｏｍｅ）内にある。（例えば、Ｃｙｐｅｘ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｙｐｅｘ．ｃｏ．ｕｋ／ｅｚｃｙｐｂｕｆ．ｈｔｍ．を参照されたい）。
【００７２】
一部の実施形態では、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジおよびヤギからなる群から選択される起源のＰ４５０配列またはそれらの誘導体を含む。他の実施形態では、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼは、昆虫、魚、真菌、酵母、原生動物および植物からなる群から選択される起源のＰ４５０配列を含む。
【００７３】
シトクロムｐ４５０（ＣＹＰ）（ＥＣ１．１４．１３．−）は、全生物中に存在するＮＡＰＤＨ依存性酸化ヘムタンパク質の多様なファミリーである。組織間で異なる発現プロファイルを備えるこれらの酵素は、生体異物または非内因性化学物質の代謝を実施する。（本明細書にその全体として参照により組み込まれるＤｅｎｉｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０５（６）：２２５３−７８（２００５）を参照）。ＣＹＰは、身体からの排泄を促進するためにそれらの親化合物より高い溶解度を備える代謝産物を生成する。ＣＹＰの基質範囲は広く、特に、ヒドロキシル化、エポキシ化、脱アミノ化、脱アルキル化および脱アリール化反応を実施できるアイソフォーム間で異なる。
【００７４】
薬物、消費者製品および食品添加物の開発に関する安全注意義務（ｓａｆｅｔｙ  ｄｕｅ  ｄｉｌｉｇｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇｓ，ｃｏｎｓｕｍｅｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ａｎｄ  ｆｏｏｄ  ａｄｄｉｔｉｖｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）の一部として、組織ミクロソームおよび組み換えＣＹＰは、それらの毒性を評価するための代謝産物を生成するために使用されている。しかし、ＣＹＰは、反応性酸素種（ＲＯＳ）がＣＹＰ媒介性酸化の副生成物として形成されるために低いプロセス安定性を有することが多く、酸化的変性に屈するので、工業において使用するためには困難であることが有名である。ヒトＣＹＰは、膜結合性であり、小胞体近シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）およびシトクロムｂ５内に局在化しているが、後者は時々ＣＹＰ活性を改善し、前者は活性のために必要とされる。（図２）。
【００７５】
本発明のＰ４５０は、エステルの脂肪族ヒドロキシル化、芳香族ヒドロキシル化、エポキシ化、ヘテロ原子脱アルキル化、アルキン酸化、ヘテロ原子酸化、芳香族エポキシ化およびＮＩＨシフト、脱ハロゲン化、脱水素化、還元および開裂を実施することができる。
【００７６】
本発明は、第Ｉ相、第ＩＩ相および第ＩＩＩ相代謝において代謝産物を生成する、ＢＮＣ中の他の代謝酵素を使用する工程を提供する。例としては、ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、フラビン含有モノオキシゲナーゼ、モノアミンオキシダーゼおよびカルボキシエステラーゼが挙げられる。
【００７７】
ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ、ＥＣ．２．４．１．１７）酵素は、生体異物へのグルクロン酸部分の添加を触媒する。ＵＧＴの経路は、頻回に処方される薬物、生体異物、食物中の物質、毒素および内因性毒素のヒト身体からの排出の主要経路である。
【００７８】
スルホトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．８．２．）のスーパーファミリーは、ドナー分子からアクセプターのアルコールもしくはアミンへのスルホ基の移動を触媒するトランスフェラーゼ酵素である。最も一般的なスルホ基ドナーは、３’−ホスホアデノシン−５’−ホスホ硫酸（ＰＡＰＳ）である。大多数の生体異物および小さな内因性基質の例では、スルホン化は、一般により水溶性生成物を生じさせ、それによって腎臓もしくは胆汁を介してそれらの排泄に役立つ解毒経路であると見なされている。
【００７９】
フラビン含有モノオキシゲナーゼ（ＦＭＯ、Ｅ．Ｃ．１．１４．１３．８）酵素は、それらの排泄を促進するために生体異物の酸化を実施する。これらの酵素は、多種多様なヘテロ原子、特に軟質求核基、例えばアミン、硫化物および亜リン酸塩を酸化することができる。この反応は、二酸素、ＮＡＤＰＨ補因子およびＦＡＤ補欠分子族を必要とする。
【００８０】
モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ、Ｅ．Ｃ．１．４．３．４）は、モノアミンの酸化的脱アミノ化を触媒する。酸素は、１つの分子から１つのアミン基を除去するために使用され、結果として対応するアルデヒドおよびアンモニアを生じさせる。ＭＡＯは、それらが数多くのモノアミンオキシダーゼ阻害剤薬の作用にとっての基質であるため、薬理学における周知の酵素である。
【００８１】
カルボキシルエステラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．１）は、カルボン酸エステルおよびＨ２Ｏをアルコールおよびカルボキシレートに変換する。それらは哺乳動物肝臓内で一般的であり、例えば毒素もしくは薬物などの生体異物の代謝に関与する；結果として生じるカルボキシレートは、次に他の酵素によって共役結合されて溶解度を増加させ、最終的には排出される。
【００８２】
一部の実施形態では、本発明のオキシドレダクターゼは、カタラーゼである。カタラーゼ（ＥＣ．１．１１．１．６）は、ほぼ全ての生物中で酸素に曝露されると見いだされる酵素である。それらは水および酸素（Ｏ２）への過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の分解を触媒する。それらは、細胞を反応性酸素種（ＲＯＳ）による酸化損傷から保護する。カタラーゼは、全酵素の最高代謝回転数の一部を有している；典型的には、カタラーゼ分子１個は毎秒何百万個の過酸化水素分子を水および酸素に転換させることができる。カタラーゼは、各々が５００アミノ酸長を超える４本のポリペプチド鎖の四量体である。それらは過酸化水素と反応することを許容する４つのポルフィリンヘム（鉄）基を含有する。カタラーゼは、食品工業において、例えばチーズ製造の前に牛乳から過酸化水素を除去するため、および例えばグルコン酸などの酸性度調節剤を製造するために使用される。カタラーゼは、繊維工業において、織物から過酸化水素を除去するためにも使用される。
【００８３】
他の実施形態では、本発明のオキシドレダクターゼは、スーパーオキシドジスムターゼ（例えば、ＥＣ１．１５．１．１）である。これらは、通常の分子酸素（Ｏ２）もしくは過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）いずれかへのスーパーオキシド（Ｏ２−）ラジカルの不均化を交互に触媒する酵素である。スーパーオキシドは、酸素代謝の副生成物として生成され、および調節されない場合は、酸化損傷を誘発する。過酸化水素もまた損傷性であるが、例えばカタラーゼなどの他の酵素によって分解され得る。
【００８４】
他の実施形態では、オキシドレダクターゼは、グルコースオキシダーゼ（例えば、ＥＣ１．１．３．４）である。オキシドレダクターゼは、グルコースから過酸化水素およびＤ−グルコノ−δ−ラクトンへの酸化を触媒する。オキシドレダクターゼは、例えば、ペルオキシダーゼなどの過酸化水素消費酵素のための酸化剤として過酸化水素を生成するために使用される。
【００８５】
他の実施形態では、代謝酵素は、カルボキシルエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．１）である。カルボキシルエステラーゼは、自然に広く分布しており、哺乳動物肝臓内で一般的である。多くは、例えば毒素もしくは薬物などの生体異物の第Ｉ相代謝に関与する；結果として生じるカルボキシレートは、次に他の酵素によって共役結合されて溶解度を増加させ、最終的には排出される。進化的に関連するタンパク質（相互に対して明白な配列相同性を備えるタンパク質）のカルボキシルエステラーゼファミリーには、例えばアセチルコリンエステラーゼなどの様々な基質特異性を備える多数のタンパク質が含まれる。
【００８６】
本発明は、Ｐ４５０の化学的代謝産物を製造するための磁気固定化されたＰ４５０触媒系を提供する。一部の実施形態では、酵素の安定性もしくは活性は、補因子要件を低下させながら最大化される。他の実施形態では、酵素は、代謝産物製造のための再使用可能な磁性キャリア上に固定化される。他の実施形態では、磁気固定化されたＰ４５０は、化学物質製造能力を増加させる、酵素回収を強化する、またはコストおよび環境汚染を減少させる。本発明の他の実施形態では、酵素活性における損失が最小からゼロまでである。好ましい実施形態では、酵素活性の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６〜２０もしくは２０〜３０％しか消失しない。本発明の他の実施形態では、酵素活性および生産性の増加が見られる。他の実施形態では、Ｐ４５０に加えて１種以上の酵素が磁気固定化される。これは、現行の製造基盤中への磁気プロセスと結合された磁性材料の採用を促進できる、または環境に優しい化学方法を可能にする可能性がある。
【００８７】
本発明は、さもなければ伝統的化学によっては合成するのが困難である生物学的に重要な代謝産物を生成するＰ４５０代謝酵素／ＢＮＣ系のバイオ触媒合成を提供する。一部の実施形態では、本発明は、生体異物に曝露させられると生物によって生成される代謝産物の多様性を模倣する。これは、酸化代謝産物が有害な作用を有し得る、またはその反対に、それがそれに由来する親分子より高い薬理効果を有する薬物の評価において特に重要である。ここで、メタボリックプロファイリングは、新薬の安全性を増加させる可能性がある。（例えば、参照によりその全体として本明細書に組み込まれる米国食品医薬品局（ＦＤＡ）による代謝産物安全性試験ガイドライン、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／Ｄｒｕｇｓ／．．．／Ｇｕｉｄａｎｃｅｓ／ｕｃｍ０７９２６６．ｐｄｆを参照されたい）。薬物および化学物質のメタボリックプロファイリングは、一般に、十分な量の生物学的に重要な代謝産物を製造するのが困難であること、または高スループット法で多様な代謝産物を製造するのが困難であることによって制限される。
【００８８】
Ｐ４５０シトクロムは、薬物を含む広範囲の生体異物の酸化代謝に責任を負う酵素の遺伝子スーパーファミリーを表す。Ｗｒｉｇｈｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｏｘ．２２（１）：１−２１（１９９２）；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ  ２７（７）：６５７−６６５（１９９７）：Ｔａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐ．，２９３（２）：４５３−４５９（２０００）；Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ３３（４）：５００−５０７（２００５）；Ｔｒｅｆｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７３（１３）：４３１７−４３２５（２００７）；Ｄｒｅｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ３８（１）：４１−５７（２０１２）。新薬開発において薬物代謝産物を生成するために、ヒト肝臓ミクロソーム、ヒト組み換えミクロソームもしくは精製ヒト組み換えＰ４５０モノオキシゲナーゼは、市販で入手できるが、典型的にはプロセス不安定性および不良な活性レベルに悩まされる。Ｉｒｉｂａｒｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘ．９（２）：ｐ．３６５−３７３（１９９６）；Ｙａｍａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘ．１１（６）：ｐ．６５９−６６５（１９９８）；Ｊｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９９（６７３７）：６７０−６７３（１９９９）。上記の文献は、参照によりそれらの全体として組み込まれる。
【００８９】
本発明のＰ４５０  ＢＮＣは、例えば薬物もしくは特殊化学物質製造において使用することができる。一部の実施形態では、製造される化合物は、小分子である。他の実施形態では、製造される化合物は、医薬品有効成分（ＡＰＩ）である。他の実施形態では、製造される化合物は、殺虫剤などの農薬有効成分である。他の実施形態では、製造される化合物は、ホルモンおよびフェロモンなどの有効成分である。他の実施形態では、製造される化合物は、香味料、香料および食用着色料である。
【００９０】
Ｐ４５０酵素は、不安定であり、バイオ触媒反応に使用するのが困難であることは有名である。しかしそれらは、薬物および生体異物変換の代謝経路にとって重要な成分であるため、薬物代謝産物の生成において重要な役割を果たす。ヒトＰ４５０は、広範囲の基質を有する。例えば、ヒトＣＹＰ１Ａ１は、ＥＲＯＤをレゾフリン（ｒｅｓｏｆｕｒｉｎ）に変換する；ヒトＣＹＰ１Ａ２は、フェナセチンをアセトアミノフェンに変換し、さらにクロザピン、オランゼピン、イミプラミン、プロプラノールおよびテオフィリン上で活性である；ヒトＣＹＰ２Ａ６は、クマリンを７−ヒドロキシクマリンに変換する；ヒトＣＹＰ２Ｂ６はブプロピオンをヒドロキシブプロピオンに変換し、さらにシクロホスファミド、エファビレンツ、ネビラピン、アルテミシシン、メタドンおよびプロフォフォール上で活性である；ヒトＣＹＰ２Ｃ８は、パクリタキセルを６α−ヒドロキシパクリタキセルに変換する；ヒトＣＹＰ２Ｃ９は、ジクロフェナクを４’−ヒドロキシジクロフェナクに変換し、さらにフルルビプロフェン、イブプロフェン、ナプロキセン、フェニトイン、ピロキシカム、トルブタミドおよびワルファリン上で活性である；ヒトＣＹＰ２Ｃ１９は、メフェニトインを４’−ヒドロキシフェニトインに変換し、さらにアミトリプチリン、シクロホスファミド、ジアゼパム、イミプラミン、オメプラゾールおよびフェニトイン上で活性である；ヒトＣＹＰ２Ｄ６は、デキストロメトルファンをデキストロファンに変換し、さらにアミトリプチリン、イミプラミン、プロパノール、コデイン、デキストロメトルファン、デシプラミンおよびブファラロール上で活性である；ヒトＣＹＰ２Ｅ１は、クロルゾキサノンから６−ヒドロキシクロロゾキサノン上で活性であり、さらにアセトアミノフェンを変換する；ヒトＣＹＰ２Ａ４は、ミダゾラムを１−ヒドロキシミダゾラムに変換し、さらにアルプラゾラム、カルバマゼピン、テステロン、シクロスポリン、ミダゾラム、シンバスタチン、トリアゾラムおよびジアゼパム上で活性である。
【００９１】
例えばヒトＵＧＴなどの他の代謝酵素は、例えば、７−ヒドロキシクマリンを７−ヒドロキシクマリングルクロニドに変換し、ヒトＳＵＬＴは、７−ヒドロキシクマリンを７−ヒドロキシクマリン硫酸塩に変換する。
【００９２】
工業プロセスにおいてモノオキシゲナーゼを使用することにおける１つの困難は、補因子再生、および特にβ−１，４−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）である。ＮＡＤＰＨは、化学量論的に使用するには高価すぎる。したがって、一部の実施形態では、本発明は、Ｐ４５０  ＢＮＣとともに使用される補因子再生組成物および方法を提供する。好ましい実施形態では、ＢＮＣは、再生酵素と一緒に使用される。より好ましい実施形態では、再生酵素は、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）である。他の好ましい実施形態では、例えばＧＤＨなどの再生酵素は、Ｐ４５０とともに共固定化される。
【００９３】
本発明は、ＢＮＣ内に磁気固定化されたＰ４５０代謝酵素を使用するためのプロセスを提供する。一部の実施形態では、機械は磁気混合を提供し、Ｐ４５０を捕捉する。
【００９４】
本発明は、酵素ポリペプチドをコードする核酸から発現させられる酵素を提供する。所定の実施形態では、酵素ポリペプチドをコードする組み換え核酸は、発現構築物中の１つ以上の調節ヌクレオチド配列に機能的に連結させられてよい。調節ヌクレオチド配列は、発現のために使用される宿主細胞にとって一般に適切であろう。数多くのタイプの適切な発現ベクターおよび好適な調節配列は、様々な宿主細胞について当技術分野において公知である。
【００９５】
典型的には、１つ以上の調節ヌクレオチド配列には、プロモーター配列、リーダーもしくはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始および転写終結配列、翻訳開始および翻訳終結配列ならびにエンハンサーもしくはアクチベーター配列が含まれ得るがそれらに限定されない。当技術分野において公知である構成的もしくは誘導性プロモーターもまた企図されている。プロモーターは、天然型プロモーターまたは２つ以上のプロモーターの要素を結合するハイブリッドプロモーターのいずれかであってよい。発現構築物は、細胞内で例えばプラスミドなどのエピソーム上に存在してよい、または発現構築物は染色体中に挿入されてよい。特定の実施形態では、発現ベクターには、形質転換宿主細胞の選択を可能にするための選択可能なマーカー遺伝子が含まれる。所定の実施形態には、少なくとも１つの調節配列に機能的に連結した酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターが含まれる。本明細書で使用するための調節配列には、プロモーター、エンハンサーおよびその他の発現制御要素が含まれる。所定の実施形態では、発現ベクターは、形質転換される宿主細胞の選択、発現するのが望ましい特定酵素ポリペプチド、ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力または例えば抗生物質マーカーなどのベクターによってコードされた任意の他のタンパク質の発現を考慮に入れて設計される。
【００９６】
また別の態様には、本明細書に記載した核酸のコンビナトリアル突然変異誘発によって生成されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングする工程が含まれる。そのようなスクリーニング法には、例えば、複製可能な発現ベクター内に遺伝子ライブラリーをクローニングする工程、結果として生じたベクターのライブラリーを用いて適切な細胞を形質転換させる工程およびそのようなライブラリーを形成するための条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現させる工程が含まれる。スクリーニング法は、任意選択的にさらに所望の活性を検出する工程および検出された産物を単離する工程をさらに含む。下記に記載する例示的なアッセイの各々は、コンビナトリアル突然変異誘発技術によって作り出された極めて多数の縮退配列をスクリーニングするために必要であるような高スループット分析に適用できる。
【００９７】
所定の実施形態には、微生物中で核酸を発現させる工程が含まれる。１つの実施形態には、核酸を細菌系中、例えばバチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、カウロバクター・クレセンツス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）およびそれらの誘導体中で発現させる工程が含まれる。典型的なプロモーターには、ｌ−アラビノース誘導性ａｒａＢＡＤプロモーター（ＰＢＡＤ）、ｌａｃプロモーター、ｌ−ラムノース誘導性ｒｈａＰ  ＢＡＤプロモーター、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ｔｒｃおよびｔａｃプロモーター、λファージプロモーターＰｌおよびアンヒドロテトラサイクリン誘導性ｔｅｔＡプロモーター／オペレーターが含まれる。
【００９８】
他の実施形態には、酵母発現系中で核酸を発現させる工程が含まれる。酵母ベクター中で使用される典型的なプロモーターには、３−ホスホグリセレートキナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３（１９８０））；他の糖分解酵素（Ｈｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓ．７：１４９（１９６８）；Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７：４９００（１９７８））のためのプロモーターが含まれる。その他のプロモーターは、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸ソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、グルコキナーゼアルコールオキシダーゼＩ（ＡＯＸ１）、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素および上記のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼならびにマルトースおよびガラクトース利用について責任を担う酵素である。複製起源を含む、もしくは含まない酵母適合性プロモーターおよび終結配列を含有する任意のプラスミドベクターは適切である。所定の酵母発現系は、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ．Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．、例えばＳ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のためのベクターのＰｙｅｘ  ４Ｔファミリー）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．、例えばＰｐｉｃｚシリーズＥａｓｙ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｐｉｃｈｉａ発現キット）およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．、例えばＳ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）のためのＥＳＰ（商標）酵母タンパク質発現および精製システムならびにＳ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のためのＰｅｓｃベクター）から市販で入手できる。
【００９９】
他の実施形態には、哺乳動物発現系中で核酸を発現させる工程が含まれる。好適な哺乳動物プロモーターの例としては、例えば、下記の遺伝子からのプロモーター：ハムスターのユビキチン／Ｓ２７ａプロモーター（国際公開第９７／１５６６４号パンフレット）、サル空胞化ウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の長い末端反復配列領域、マウス哺乳動物腫瘍ウイルスプロモーター（ＭＭＴＶ）、モロニーマウス白血病ウイルスの長い末端反復配列領域およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターが挙げられる。その他の非相同哺乳動物プロモーターの例は、アクチン、免疫グロブリンもしくは熱ショックプロモーターである。特定の実施形態では、酵母アルコールオキシダーゼプロモーターが使用される。
【０１００】
追加の実施形態では、哺乳動物宿主細胞中で使用するためのプロモーターは、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（１９８９年７月５日に公表された英国特許第２，２１１，５０４号明細書）、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得ることができる。さらに別の実施形態では、非相同哺乳動物プロモーターが使用される。例としては、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーターおよび熱ショックプロモーターが挙げられる。ＳＶ４０の初期および後期プロモーターは、便宜的にもＳＶ４０ウイルス複製起源をさらに含有するＳＶ４０制限断片として得られる。Ｆｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２７３：１１３−１２０（１９７８）。ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーターは、便宜的にもＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限断片として入手される。Ｇｒｅｅｎａｗａｙ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １８：３５５−３６０（１９８２）。上記の文献は、参照によりそれらの全体として組み込まれる。
【０１０１】
他の実施形態には、昆虫細胞発現系中で核酸を発現させる工程が含まれる。昆虫細胞宿主を使用する真核生物発現系は、プラスミドもしくはバキュロウイルス発現系のいずれかに依存することができる。典型的な昆虫宿主細胞は、ツマジロクサヨトウ（スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ））に由来する。異種タンパク質を発現させるためには、これらの細胞はウイルスポリヘドロンプロモーターの制御下で発現させられた関心対象の遺伝子を有するバキュロウイルスオートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多核体病ウイルスの組換形により感染させる。このウイルスによって感染した他の昆虫には、キャベツルーパー（イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ））に由来する「Ｈｉｇｈ  ５」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）として商業的に公知の細胞系が含まれる。時々使用されるまた別のバキュロウイルスは、カイコ（カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ））に感染するカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）核多核体病（ｐｏｌｙｈｅｄｏｒｓｉｓ）ウイルスである。数多くのバキュロウイルス発現系は、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ（Ｂａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ（商標）ｋもしくはＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣ（商標）系）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（ＢａｃＰＡＫ（商標）バキュロウイルス発現系）、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｂａｃ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標））から市販で入手できる、またはその他はＰｈａｒｍｉｎｇｅｎもしくはＱｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手できる。また別の昆虫細胞宿主は、一般的ミバエ、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）であり、それに対しては一過性もしくは安定性プラスミドに基づくトランスフェクションキットがＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ（ＤＥＳ（商標）系）によって市販で提供されている。
【０１０２】
一部の実施形態では、細胞は、本明細書に記載した核酸を発現するベクターを用いて形質転換させられる。新規な遺伝物質を動物細胞および植物細胞を含む真核細胞内に挿入するための形質転換技術は、周知である。発現カセットを宿主細胞ゲノム内に挿入するためにはウイルスベクターを使用できる。または、ベクターは、宿主細胞内にトランスフェクトさせることができる。トランスフェクションは、リン酸カルシウム沈降法、エレクトロポレーション法、光学的トランスフェクション法、プロトプラスト融合法、インペールフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）法および流体力学的送達によって遂行されてよい。
【０１０３】
所定の実施形態には、哺乳動物細胞系、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）およびベロ細胞内で酵素ポリペプチドをコードする核酸を発現させる工程が含まれる。この方法は、任意選択的に酵素ポリペプチドを回収する工程をさらに含む。
【０１０４】
一部の実施形態では、本発明の酵素は、天然型酵素と相同である。「相同体」は、ヌクレオチド配列、ペプチド配列、機能的もしくは構造的レベルで参照分子に類似する生物活性分子である。相同体は、参照配列と所定の同一性パーセントを共有する配列誘導体を含み得る。したがって、１つの実施形態では、相同もしくは誘導体配列は、少なくとも７０％の配列同一性を共有する。特定の実施形態では、相同もしくは誘導体配列は、少なくとも８０もしくは８５％の配列同一性を共有する。特定の実施形態では、相同もしくは誘導体配列は、少なくとも９０％の配列同一性を共有する。特定の実施形態では、相同もしくは誘導体配列は、少なくとも９５％の配列同一性を共有する。より特定の実施形態では、相同もしくは誘導体配列は、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９％の配列同一性を共有する。相同もしくは誘導体核酸配列は、さらに高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でそれらが参照核酸配列に結合したままで留まる能力によって定義することもできる。参照分子との構造的もしくは機能的類似性を有する相同体は、参照分子の化学的誘導体であってよい。構造的および機能的相同体ならびに誘導体を検出、生成およびスクリーニングする方法は、当技術分野において周知である。
【０１０５】
２つ以上の核酸配列もしくはポリペプチド配列の状況下での用語「同一性」パーセントは、下記で記載する配列比較アルゴリズムの１つ（例えば、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮもしくは当業者であれば利用できる他のアルゴリズム）または視覚的検査を使用して測定した、最大一致について比較およびアラインメントした場合に同一である規定パーセンテージのヌクレオチドもしくはアミノ酸残基を有する２つ以上の配列もしくは部分配列に関する。用途に依存して、「同一性」パーセントは、比較対象の配列の領域にわたって、例えば機能的ドメインにわたって存在し得る、または比較対象の２つの配列の全長にわたって存在し得る。配列比較のためには、典型的には１つの配列は、それと試験配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列がコンピューターに入力され、必要であれば配列座標が指定され、および配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。配列比較アルゴリズムは、次に指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に比較して試験配列について配列同一性パーセントを計算する。
【０１０６】
比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）による相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．に記載のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）または視覚的検査（一般に、下記のＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい）によって実施することができる。
【０１０７】
配列同一性パーセントおよび配列類似性を決定するために好適であるアルゴリズムの１つの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウエアは、全米バイオテクノロジー情報センター（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に入手できる。
【０１０８】
本発明のまた別の態様には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成反応において合成される酵素ポリペプチドが含まれる。１つの例では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成反応は、当技術分野において周知である無細胞タンパク質合成、液相タンパク質合成および固相タンパク質合成からなる群から選択される。
【０１０９】
本明細書に記載した本発明をより十分に理解するために、以下の実施例を記載する。これらの実施例は、例示することだけを目的としており、決して本発明を限定すると見なすべきではないと理解すべきである。
【実施例】
【０１１０】
実施例１
磁気支持体中へのグルコースデヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼおよびＮＡＤＰＨを用いた細菌性ＢＭ３ｐ４５０シトクロムの共固定化
本実施例では、高レベル（約１２％の無水細胞集団）で発現させることができ、ほぼ全ての他のＣＹＰとは異なり、そのヒドロキシラーゼ、レダクターゼおよび電子移動ドメインは全部が１本の隣接ポリペプチド鎖内にあるために、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来の細菌性Ｐ４５０  ＢＭ３（ＣＹＰ１０２Ａ１としても公知である）を使用した。（本明細書にその全体として参照により組み込まれるＳａｗａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １５（４３）：１１７２３−９（２００９））。磁気固定化ＢＭ３融合タンパク質（ＭＷ≒１２０ｋＤａ）は、効率的およびリサイクル可能な脂肪酸ヒドロキシラーゼ活性を示した。最終負荷は、ＢＮＣ中でＢＭ３のおよそ８０（ｇ／ｇ）％となることを目指し、次に１％の全タンパク質負荷に対して粉砕磁気マクロ多孔性ポリマーハイブリッド骨格上でテンプレート化した。ＢＮＣ中の固定化収率は、１００％であった。粗抽出物の純度は、ＢＭ３のおよそ３０％含量であった。これは、０．３％のＣＹＰ負荷を備えるＢＭＣを生じさせた。ＮＡＤＰＨは、補因子リサイクリングのためにＧＤＨと一緒に共固定化した。ＳＯＤおよびＣＡＴもまたＲＯＳを制御するために共固定化した。
【０１１１】
材料および設備。バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）中で発現させたｐ−ニトロフェニルラウレートおよびＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させた細菌性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）上で活性の組み換えＢＭ３シトクロムＰ４５０を使用した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウシ肝臓カタラーゼ（ＣＡＴ）、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させたウシ赤血球細胞質スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、グルコース（β−ｄ−グルコース）、ｐ−ニトロフェニルラウレート（ｐ−ＮＰＬ）、ｐ−ニトロフェノール（ｐ−ＮＰ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元）四ナトリウム塩（ＮＡＤＰＨ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｆａｉｒ  Ｌａｗｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）から購入した。塩酸、水酸化ナトリウム、塩化マグネシウムおよびリン酸緩衝塩は、Ｍａｃｒｏｎ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ，ＵＳＡ）から購入した。Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ（商標）Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。ストック液は、Ｂａｒｎｓｔｅａｄ（商標）Ｎａｎｏｐｕｒｅ（商標）によって精製された１８．２ＭΩ−ｃｍ水を用いて作製した。吸光度は、Ｇｅｎ５（商標）ソフトウエアを用いて作動させたＢｉｏｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ４（商標）プレートリーダーを使用してＣｏｓｔａｒ（商標）３６３５  ＵＶ透過マイクロプレート内で３回ずつ測定した。１／８’’プローブを備えるソニケーター（ＦＢ−５０５）は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から購入した。ＺｙｍＴｒａｐ（商標）（粉末、１００〜５００μｍ、ＭＯ３２−４０、Ｚｙｍｔｒｏｎｉｘ，Ｉｔｈａｃａ，ＮＹ、本明細書に参照によりその全体として組み込まれるＣｏｒｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｄａｙ，３４：１５−２０（２０１６））は、固定化Ｐ４５０酵素系のための磁気骨格として使用した。
【０１１２】
試薬。ＢＭ３は、その中で組み換え発現させられた細菌の凍結乾燥粗抽出物から入手した。全水性ストックは、超純粋（ＭＱ）水を用いて調製した。凍結乾燥ＢＭ３、ＧＤＨおよびＮＡＤＰＨは、氷温無酸素２ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に溶解させ、毎日新しく調製した。ＣＹＰおよびＧＤＨは、細胞断片をペレット化するために１０分間にわたり１２，０００ｇ、４℃で遠心した。それらの上清を収集し、ＢＳＡ規格を用いたＢｒａｄｆｏｒｄアッセイを使用してタンパク質含量を定量した。ｐ−ＮＰＬおよびｐ−ＮＰのストック液は、１００ｍＭへ純粋ＤＭＳＯ中で調製し、４℃で保存した。塩化マグネシウム（１Ｍ）およびグルコース（１００ｍＭ）を水中に溶解させ、４℃で保存した。全ストック液を氷上で保管した。アッセイで使用する直前に希釈液を作製し、室温（２１℃）へ平衡化させた。
【０１１３】
固定化。ＢＭ３固定化は、国際公開第２０１２１２２４３７号パンフレットおよび同第２０１４０５５８５３号パンフレット、米国仮特許出願第６２／３２３，６６３号明細書およびＣｏｒｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｄａｙ，３４：１５−２０（２０１６）に教示された方法を使用して最適化した。上記の文献は、参照によりそれらの全体として本明細書に組み込まれる。固定化された非ＣＹＰ生物学的および化学的成分は、ＣＹＰ支持体系（ＳＳ）と呼ばれた：補因子再生のためにはＧＤＨ、反応性酸素種（ＲＯＳ）制御のためにはＣＡＴ／ＳＯＤおよび固定化中の安定性のためにはＮＡＤＰＨ。遊離ＣＹＰ／ＧＤＨ／ＣＡＴ／ＳＯＤ／ＮＡＤＰＨストック（５００μｇ／ｍＬのＣＹＰ、１００：１００：１：１：１００のモル比）は、新鮮酵素ストックを使用して低温バッファー中で調製した。５ｍＬの２５００μｇ／ｍＬのＭＮＰストックは、１分間にわたり４０％の振幅で超音波処理し、水浴を用いて室温へ平衡化させ、そのｐＨを３に調整した。遊離ＣＹＰ＋ＳＳ（５００μＬ）および等量の超音波処理ＭＮＰを２ｍＬの微小遠心管内に分注し、１０回ピペット混合した。ＣＹＰ＋ＳＳ  ＢＭＣは、１ｍＬのＢＮＣを４８．７５ｍｇのＭＯ３２−４０  ＺｙｍＴｒａｐ粉末に１０回添加することによって調製した。これらのＢＭＣを１時間にわたり回転器上で緩徐に混合し、次に磁気的にペレット化した。それらの上清は、固定化タンパク質を定量するために保存した。
【０１１４】
ＢＭ３活性アッセイ。ＢＭ３活性決定法は、マイクロプレートに適応させて、記載した方法に基づいていた（本明細書にその全体として参照により組み込まれるＴｓｏｔｓｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，１７：１１９−１３１（２００２））。手短には、ＢＭ３は、ｐ−ＮＰＬの酸化を触媒してｐ−ＮＰおよびω−１ヒドロキシラウリン酸を形成させた（反応１）。酵素活性は、ｐ−ＮＰの形成に起因する４１０ｎｍでの吸光度の増加によって分光光度法によって測定した。（本明細書にその全体として組み込まれるＤｅｎｉｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１０５（６）：２２５３−２２７８（２００５））。ＢＭ３反応は、２ｍＬの微量遠心管中で１００ｍＭのｐＨ８．２のリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）、０．２５ｍＭのｐ−ＮＰＬ（０．２５％のＤＭＳＯ）、０．１５ｍＭのＮＡＤＰＨ、１ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭのグルコースおよび３．６μｇ／ｍＬのＣＹＰ（約６０ｎＭ）を含有する０．５ｍＬの総反応量を使用して１８時間にわたり２１℃で実行した）。遊離酵素コントロールもまた６０ｎＭのＧＤＨを含有していた。固定化ＢＭ３は、磁気的にペレット化し、その上清を吸光度について読み取った。ｐ−ＮＰは、１００ｍＭのｐＨ８．２のＰＢＳ中に０〜０．５ｍＭのｐ−ＮＰを含有する線形標準曲線を使用して定量した（Ｒ２＞０．９８）。１単位（Ｕ）のＢＭ３活性は、２１℃の１００ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ８．２）中で１分間当たりに生成された１μモルのｐ−ＮＰであると規定された。
【０１１５】
固定化ＣＹＰの再使用可能性。活性アッセイを完了した後、ＣＹＰ  ＢＭＣを磁気的にペレット化し、それらの上清を分析のために除去した。ＢＭＣは次にアッセイ量の低温超純水を用いてすすぎ洗いした。次に第２回反応サイクルを開始するために、基質バッファーをＢＭＣに加えた。ＣＹＰ  ＢＭ３の再使用可能性を証明するためにこのプロセスを１０回繰り返した。（図３）。固定化酵素は、固定化と同じ日に調製し、氷上で保存した遊離酵素のストックと比較した。
【０１１６】
タンパク質の定量。ＢＭＣを磁気的にペレット化し、線形ＢＳＡ標準曲線（Ｒ２＞０．９９）を含むＢｒａｄｆｏｒｄ法を使用して上清中のタンパク質含量を決定した。（本明細書にその全体として参照により組み込まれるＢｒａｄｆｏｒｄ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７２（１−２）２４８−２５４（１９７６））。
【０１１７】
結果
ＢＮＣは、ＢＭ３をグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ、補因子再生のため）、カタラーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼ（ＣＡＴ／ＳＯＤ、ＲＯＳ制御のため）およびＮＡＤＰＨ（固定化中の改良された安定性のため）とともに共固定化した場合に、遊離酵素と類似の活性を示した。最適化した固定化ＢＭ３は、ｐ−ニトロフェニルラウレートの酸化生成物としてのｐ−ニトロフェノールの形成について遊離酵素と比較して＞９９％の活性を提示した。ＢＭ３＋ＳＳは、２．５％の総負荷および０．３％のＣＹＰ負荷を用いて＞９９％の固定化収率で固定化された。コントロールは、非触媒化ｐ−ＮＰ形成が１８時間後に２％の変換率にしか到達しないことを証明した。完全ＳＳを備える固定化酵素は２５％の変換率を有していたが、他方遊離酵素は１６％にしか到達しなかった。固定化からのＮＡＤＰＨおよびＲＯＳコントロールの除去は、変換率をたった１０％に低下させた。ＮＡＤＰＨを含まないＲＯＳコントロールの包含は、１４％の変換率を生じさせた（図３）。これらの結果は、ＲＯＳコントロールおよびＮＡＤＰＨはどちらも固定化ＢＭ３の活性を向上させることを証明した。ＢＭ３＋ＳＳは、１０サイクルのｐ−ＮＰＬ酸化について一貫した活性を証明した。活性は、標準条件下で約２５％の変換率で安定性であった。初期ストック（４℃で保存した）からの遊離酵素変換率は、第２日に４％へ低下した。第３日までに、遊離酵素変換率は、全活性が消失していることを示しているｐ−ＮＰＬのベースライン非触媒化酸化率と同等であった。
【０１１８】
予想外にも、経時的に、細菌は遊離ＢＭ３粗抽出物を含有する反応中では増殖したが、固定化抽出物中では増殖しなかった。遊離ＢＭ３のより濃縮されたストックは、氷上では２４時間後には混濁して見えた。ＬＢ寒天プレートに接種するために、１０μＬの無菌ループを使用した。３７℃でのプレートの２４時間のインキュベーション後に小さなベージュ色のコロニー（１〜２ｍｍ）が出現した。これらのコロニーは、おそらくＢＭ３についての発現宿主である、単離桿菌様細菌に起因して形成されることが確証された。固定化ＢＭ３の上清を使用して類似の接種材料が調製された場合、コロニーは発現しなかった（図４）。これは、固定化が粗酵素調製物もしくは外部起源由来の潜在的細菌汚染物質の増殖を防止したことを証明している。この系は殺菌性であるとは考えられないが、タンパク質および酵素がＢＮＣ中に封入され、細菌が接近することができないために、細菌増殖が減少すると仮説が立てられている。
【０１１９】
実施例２：
磁気支持体上でグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼおよびＮＡＤＰＨ共固定化を備えるヒトシトクロムｐ４５０
磁気固定化されたＰ４５０活性およびリサイクル可能性。組み換えヒトＣＹＰを含有するＢＮＣ（ＭＷ＝５６〜５８ｋＤａ）を調製した。小胞体近接シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）は、シトクロムｂ５を伴って、または伴わずに発現させた。磁気ナノ粒子は、約２０％の負荷を用いて調製し、次に粉砕磁気マクロ多孔性ポリマーハイブリッド骨格上でテンプレート化すると、結果として０．１％を超えるＣＹＰ負荷のＢＭＣ上での計画された最終負荷が生じた）。代謝能力を収率および代謝産物プロファイルについて評価した。ＣＹＰ３Ａ４活性は、テルフェナジン上で決定した。ＣＹＰ１Ａ２活性は、フェナセチン上で決定した。ＣＹＰ２Ｂ６活性は、ブプロピオン上で決定した。混合ヒトＣＹＰ系についても、代謝能力を評価した。代謝能力試験からの代謝産物を使用して、ヒト胎児腎細胞への細胞傷害性についての濃度反応曲線を生成した。
【０１２０】
材料および設備。ＨＥＫ２９３細胞、トリプシン−ＥＤＴＡバッファー、ダルベッコの最小必須培地（ＤＭＥＭ）およびウシ胎児血清は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｓｕｐｅｒｓｏｍｅｓ（商標）ヒトＣＹＰ＋オキシドレダクターゼ＋ｂ５  ３Ａ４、１Ａ２、２Ｂ６および２Ｅ１（ｂ５を含まない）は、Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）から購入した。ＡＴＰ定量アッセイキット（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ）は、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から購入した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウシ肝臓カタラーゼ（ＣＡＴ）、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させたウシ赤血球細胞質スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、グルコース（β−ｄ−グルコース）、ｐ−ニトロフェニルラウレート（ｐ−ＮＰＬ）、ｐ−ニトロフェノール（ｐ−ＮＰ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）四ナトリウム塩（ＮＡＤＰＨ）、ペニシリン、ストレプトマイシン、グルコース−６−リン酸、グルコース−６リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）、エトキシレゾルフィン、レゾルフィン、クマリン、７−ヒドロキシクマリン、テルフェナジン、ヒドロキシテルフェナジン、フェナセチン、アセトアミノフェン、ブプロピオンおよび１−ヒドロキシブプロピオンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｆａｉｒ  Ｌａｗｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）から購入した。塩酸、水酸化ナトリウム、塩化マグネシウムおよびリン酸緩衝塩は、Ｍａｃｒｏｎ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ，ＵＳＡ）から購入した。Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ（商標）Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。ストック液は、Ｂａｒｎｓｔｅａｄ（商標）Ｎａｎｏｐｕｒｅ（商標）によって精製された１８．２ＭΩ−ｃｍ水を用いて作製した。吸光度は、Ｇｅｎ５（商標）ソフトウエアを用いて作動させたＢｉｏｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ４（商標）プレートリーダーを使用してＣｏｓｔａｒ（商標）３６３５  ＵＶ透過マイクロプレート内で３回ずつ測定した。蛍光は、Ｃｏｓｔａｒ（商標）３５７４黒色底マイクロプレート内で測定した。ルミネセンスは、Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ（Ｍｏｎｒｏｅ，ＮＣ）製の乳白色の組織培養処理マルチウエルマイクロプレート中で測定した。１／８’’プローブを備えるソニケーター（ＦＢ−５０５）は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から購入した。ＺｙｍＴｒａｐ（商標）（粉末、１００〜５００μｍ、ＭＯ３２−４０、Ｚｙｍｔｒｏｎｉｘ、Ｉｔｈａｃａ  ＮＹ）は、Ｐ４５０の固定化酵素系のための磁気骨格として使用した。
【０１２１】
試薬。全水性ストックは、超純粋（ＭＱ）水を用いて調製した。凍結乾燥Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｓｕｐｅｒｓｏｍｅｓ（商標）、Ｇ６ＰＤＨおよびＮＡＤＰＨは、氷温無酸素の５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中に溶解させ、毎日新しく調製した。エトキシレゾルフィン、レゾルフィン、クマリンおよび７−ヒドロキシクマリン、テルフェナジンのストック液は、純粋ＤＭＳＯ中で１００ｍＭへ調製し、４℃で保存した。塩化マグネシウム（１Ｍ）、グルコース（１００ｍＭ）およびグルコース−６−リン酸（１００ｍＭ）を水中に溶解させ、４℃で保存した。全ストック液を氷上で保管した。アッセイで使用する直前に希釈液を作製し、室温（２１℃）へ平衡化させた。
【０１２２】
組織培養。ＨＥＫ２９３細胞は、本明細書に参照により全体として組み込まれるＸｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，１１６（３）：２８４−２９１（２００８）によって使用された手法にしたがって培養した。
【０１２３】
固定化。Ｓｕｐｅｒｓｏｍｅ固定化は、国際公開第２０１２１２２４３７号パンフレットおよび同第２０１４０５５８５３号パンフレット、米国仮特許出願第６２／３２３，６６３号明細書およびＣｏｒｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｄａｙ，３４：１５−２０（２０１６）に教示された方法を使用して最適化した。上記の文献は、参照によりそれらの全体として本明細書に組み込まれる。下記の固定化の非ＣＹＰ生物学的および化学的成分は、ＣＹＰ支持体系（ＳＳ）：補因子再生のためにはＧ６ＰＤＨ、反応性酸素種（ＲＯＳ）制御のためにはＣＡＴ／ＳＯＤおよび固定化中の安定性のためにはＮＡＤＰＨと呼ばれる。遊離Ｇ６ＰＤＨ）／ＣＡＴ／ＳＯＤ／ＮＡＤＰＨストック（５００μｇ／ｍＬのＣＹＰ、１００：１００：１：１：１００モル比）は、新鮮酵素ストックを使用して低温バッファー中で調製した。５ｍＬの２５００μｇ／ｍＬのＭＮＰストックは、１分間にわたり４０％の振幅で超音波処理し、水浴を用いて室温へ平衡化させ、そのｐＨを３に調整した。遊離ＣＹＰ＋ＳＳ（５００μＬ）を２ｍＬの微量遠心管中に分注し、それに等量の超音波処理ＭＮＰを添加し、次に１０回ピペット混合した。ＣＹＰ＋ＳＳ  ＢＭＣは、１ｍＬのＢＮＣを９８．７５ｍｇのＭＯ３２−４０  ＺｙｍＴｒａｐ粉末に１０回添加することによって調製し、１０回ピペット混合した。これらのＢＭＣを１時間にわたり回転器上で緩徐に混合し、次に磁気的にペレット化した。それらの上清は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法およびＮＡＤＰＨを使用して、３４０ｎｍでのそのモル吸光係数を使用して固定化タンパク質の定量のために保存した（ε＝６．２２ｍＭ−１ｃｍ−１）。
【０１２４】
Ｓｕｐｅｒｓｏｍｅ固定化のスクリーニングアッセイおよび活性アッセイ。ＳｕｐｅｒｓｏｍｅＣＹＰ最適固定化条件は、一部の修飾を加えてＣｏｒｇｉｅの方法（２０１６）にしたがってマイクロプレート内での２相スクリーニングを通して決定することである。初期スクリーニングは、最高活性および最高固定化収率を生じさせるＭＮＰのｐＨおよび酵素バッファー濃度の組み合わせを決定する。第２相は、ＭＮＰの濃度を最適化する。ＣＹＰ３Ａ４について決定した最適固定化条件を他のヒトＣＹＰおよび混合ヒトＣＹＰ系に適用した。スクリーニングのために使用した活性アッセイは、エトキシレゾルフィンからレゾルフィンへの変換（脱アルキル化活性）またはクマリンから７−ヒドロキシクマリンへの変換（ヒドロキシル化活性）いずれかに起因する蛍光の変化を測定する。Ｓｕｐｅｒｓｏｍｅ（商標）反応は、２ｍＬの微量遠心管中で１００ｍＭのｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）、０．０５ｍＭの基質（０．０５％のＤＭＳＯ）、０．１５ｍＭのＮＡＤＰＨ、１ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭのグルコース−６−リン酸および２０ｎＭのＣＹＰを含有する０．１５ｍＬの総反応量を使用して１８時間にわたり３７°Ｃで実行した。遊離酵素コントロールもまた２００ｎＭのＧ６ＰＤＨを含有していた。固定化Ｓｕｐｅｒｓｏｍｅは、磁気的にペレット化し、それらの上清を蛍光強度について読み取った。レゾルフィンおよび７−ヒドロキシクマリン励起／発光波長は、各々５３０／５８０ｎｍおよび３７０／４５０ｎｍであった。反応生成物は、０．０５％のＤＭＳＯを含む１００ｍＭのｐＨ７．４のＰＢＳ中に０〜０．１ｍＭの生成物を含有する線形標準曲線を使用して定量した。１単位（Ｕ）のＣＹＰ脱アルキル化活性は、１００ｍＭのＰＢＳ中の３７℃で１分当たり生成された１μモルのレゾルフィンであると規定された。１単位（Ｕ）のＣＹＰ脱アルキル化活性は、１００ｍＭのＰＢＳ中の３７℃で１分当たり生成された１μモルのレゾルフィンであると規定された。１単位（Ｕ）のＣＹＰヒドロキシル化活性は、１００ｍＭのＰＢＳ中の３７℃で１分当たり生成された１μモルの７−ヒドロキシクマリンであると規定された。
【０１２５】
代謝能力は、代謝産物プロファイルと固定化ＣＹＰの収率をそれらの非固定化類似体と比較する測定基準である。最適化した固定化ヒトＣＹＰ＋ＳＳを使用して、これらの系の代謝能力は、テルフェナジン上のＣＹＰ３Ａ４活性、フェナセチン上のＣＹＰ１Ａ２活性およびブプロピオン上のＣＹＰ２Ｂ６活性を使用して評価した。混合ヒトＣＹＰ系についても代謝能力をさらに評価した。上記の活性は、反応上清のＨＰＬＣ分析を使用して測定した。個別の反応は、蛍光黒色底マイクロプレート内で１００ｍＭのｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）、０．０５ｍＭの基質（０．０５％のＤＭＳＯ）、０．１５ｍＭのＮＡＤＰＨ、１ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭのグルコース−６−リン酸および２００ｎＭのＣＹＰを含有する０．１５ｍＬ（３回）の総反応量を使用して３０分間および１８時間にわたり３７℃で実行した。遊離酵素コントロールもまた２００ｎＭのＧ６ＰＤＨを指定のエンドポイントで含有しており、３０μＬの上清を保存して−８０℃で凍結し、さらに３０μＬを６０μＬのアセトニトリル中に移し、ＨＰＬＣ分析のために−８０℃で凍結した。アセトニトリルを含まないサンプルは、１００ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で１：２００、１：４００、１：８００、１：１６００、１：３２００、１：６４００、１：１２８００、１：２５６００に希釈し、細胞生存性アッセイのために保存した。
【０１２６】
細胞生存性アッセイ。ＡＴＰ定量に基づく細胞生存性アッセイは、Ｘｉａ（２００８）によって教示されている。このアッセイは、代謝産物濃度反応（すなわち、細胞傷害性）を評価するために使用される。
【０１２７】
タンパク質の定量。ＢＭＣを磁気的にペレット化し、上清中のタンパク質含量はＢｒａｄｆｏｒｄ法および線形ＢＳＡ標準曲線（Ｒ２＞０．９９）を使用して決定した。（本明細書にその全体として参照により組み込まれるＢｒａｄｆｏｒｄ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７２（１−２）２４８−２５４（１９７６））。
【０１２８】
結果
最適化した固定化ヒトＣＹＰ＋ＳＳは、代謝産物プロファイルおよび収率（ＨＰＬＣ分析から）とそれらの非固定化対応物としての類似の用量反応曲線の重複を達成することによって代謝能力を証明した。代謝能力は、単一ＣＹＰおよび混合ＣＹＰ系両方について観察することができる。
【０１２９】
実施例３：
高スループットマイクロプレートフォーマットにおいて固定化酸化酵素を使用するための磁気ミキサー
シトクロムＰ４５０は分子二酸素を必要とした。初期モデリングは、二酸素が３７℃で２４０μＭを超える基質濃度に対して制限的になり得ることを示していた。さらにＯ２の有意な（３０％以上の）部分は、基質酸化のための溶存Ｏ２の有効濃度を低下させるＲＯＳに変換させられた。最後に、反応中のＯ２の局所消費量は、特に酵素が固定化され、不均一触媒として使用された場合には、Ｏ２枯渇量またはＯ２濃度勾配を生じさせる可能性があった。勾配の場合には、二酸素の濃度は、気／液界面で最高であった。そこで二酸素の均質および非限定的濃度を保証するために混合が必要とされた。
【０１３０】
マイクロプレート内での均質混合は、振とうまたは微量撹拌子によって実施した。または、マイクロプレートフォーマット内で固定化Ｐ４５０酵素系を使用するための非限定的濃度の二酸素を保証するために、磁気混合装置を設計して構築した。目標は、磁気固定化された酵素を垂直に弾ませ（図５Ａ〜５Ｄ）、気／液界面からウエルの底部へ粒子の運動を使用して反応容量を混合することであった。プロトタイプは、アレイ間の任意の磁気相互作用を回避するために各々が３’’ずつ離れた２アレイのネオジム磁石５’’×４’’×１／８’’を使用した。これらのアレイを３Ｄ印刷担体内に配置し、垂直運動のためにステッパーモーターに接続した主ネジに取り付けた。マイクロプレートおよび保持トレイをアレイ間に取り付け、主ネジおよびステッパーモーターに接続した。マイクロプレートを容易に配置したり取り外したりするための十分な間隙を提供するためにトレイは水平に移動した。アレイの最高移動距離は３’’であったが、ギャップの長さである０．７５’’の距離が磁気触媒を十分に弾ませることが見いだされた。モーターは、マイクロコントローラーおよびモータードライバーによって制御された。マイクロコントローラーは、ユーザーからの指令を受け取り、それらをモータードライバーの方へ転送した。電源装置に接続されたモータードライバーは、モーターに電力供給するために十分な電圧および電流を提供した。移動のコマンドは、個別に、またはスクリプトとしてのいずれかでマイクロコントローラーへアップロードされた。コマンドは、連続的に実行されるコマンドのリストを含んでいた。スクリプトが磁気アレイの移動を自動化している間に、個別コマンドを較正のために使用した。モーターの速度、および結果としての振動期間は、マイクロコントローラーを通して制御可能であった。
【０１３１】
一部の実施形態では、磁気インキュベーションミキサーは、マイクロプレートを加工処理するために設計された完全密閉系であった。主要成分は、インキュベーションチャンバー、磁気アレイ、加熱コントロールシステムおよびピペッティング移動ヘッドであった。マイクロプレートは、インキュベーターの内側に引っ込められるトレイ上に配置された。インキュベーターは、加熱コントロールシステムによって調節される温度を効果的に維持するために断熱材でライニングされた。インキュベーターは、さらに電磁石または永久磁石のいずれかを用いて構築された磁石アレイおよび加熱システムを含有していた。これらのアレイは、マイクロプレートウエル内の磁性材料を移動させるために使用された。電磁石を使用する場合、電磁石のアレイはマイクロプレートの上面および底面と同一平面に取り付けられた。アレイに供給された電力は、磁性材料を垂直に移動させるために交番された。永久磁石を使用する場合、磁石のアレイは、マイクロプレートの上方および下方に規定の垂直距離を空けて取り付けられた。アレイ間の間隙は、常に同一のままであった。アレイは、磁場がアレイから磁性材料を移動させることを許容するために上下に繰り返し移動させられた。混合プロセス中、周囲温度は、ユーザーによって設定されたインキュベーション温度へ上昇させられた。温度は、温度センサー、加熱装置およびフィードバックループを使用して制御された。センサーは、内部周囲温度を検知し、示度をフィードバックループへ送信した。フィードバックループは、インキュベーションチャンバー内の定常温度を維持することに責任を担い、温度示度および所望の温度に基づいて加熱装置に送達された電力量を制御した。磁気加工処理が完了したら、プレートはインキュベーターから取り出された。統合ピペッティングステーションは、磁性材料だけを残して上清を代替マイクロプレートに移した。トレイの下方に所在する永久磁石は、磁性材料が上清とともに誤って移されないことを保証した。
【０１３２】
典型的な配列
配列番号１：
二官能性Ｐ４５０／ＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０レダクターゼ［バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）］
【化１】
2020500532.tif 000003
配列番号２：
シトクロムＰ４５０  ３Ａ４アイソフォーム１［ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）］
【化２】
2020500532.tif 000004
配列番号３：
シトクロムＰ４５０  １Ａ２［ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）］
【化３】
2020500532.tif 000005
配列番号４：
ＣＹＰ２Ｄ６［ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）］
【化４】
2020500532.tif 000006
配列番号５：
シトクロムＰ４５０−２Ｅ１［ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）］
【化５】
2020500532.tif 000007
配列番号６：
シトクロムＰ４５０−２Ｅ１［ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）］
【化６】
2020500532.tif 000008
配列番号７：
シトクロムＰ４５０、ファミリー２、サブファミリーＣ、ポリペプチド９［ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）］
【化７】
2020500532.tif 000009
【０１３３】
本明細書で開示および言及した全ての刊行物および特許文献は、参照によりそれらの全体として本明細書に組み込まれる。上記の説明は、例示および説明のためだけに提示されている。この説明は、本発明を本明細書に開示した正確な形態に限定することは意図されていない。本発明の範囲は、本明細書に添付の特許請求項によって規定されることが意図されている。
【図１】
2020500532.tif 000010
【図２】
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【図３】
2020500532.tif 000012
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2020500532.tif 000014
【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
2020500532.tif 000016
【図５Ｂ】
2020500532.tif 000017
【図５Ｃ】
2020500532.tif 000018
【図５Ｄ】
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【国際調査報告】
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2020500532.tif 000021
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