(57)【要約】【解決手段】  高親和性でＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗体又はその機能性断片。前記抗体又はその機能性断片をコードする核酸分子、前記抗体又はその機能性断片を発現するための発現ベクター及び宿主細胞、並びに前記抗体又はその機能性断片の生産方法。前記抗体又はその機能性断片を含む免疫抱合体及び医薬組成物、並びに前記抗体又はその機能性断片を用いて、Ｔ細胞の機能を増強して細胞仲介免疫応答を向上させることで、Ｔ細胞機能不全疾患を治療する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、且つアミノ酸配列番号７、８、９、１３、１４、１５、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２８、２９、３０若しくは前記配列のいずれかの変異体からなる群から選ばれる重鎖ＣＤＲ、及び／又はアミノ酸配列番号１、２、３、４、５、６、１０、１１、１２、１６、１７、１８、２５、２６、２７若しくは前記配列のいずれかの変異体からなる群から選ばれる軽鎖ＣＤＲを含む抗体又はその機能性断片。
【請求項２】
前記重鎖ＣＤＲのＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３のアミノ酸配列は、以下の各アミノ酸配列若しくはその変異体の組み合わせからなる群から選ばれる１種の組み合わせである：
【表１】
2020508079.tif 000011
；及び／又は、前記軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３のアミノ酸配列は、以下の各アミノ酸配列若しくはその変異体の組み合わせからなる群から選ばれる１種の組み合わせである：
【表２】
2020508079.tif 000012
ことを特徴とする、請求項１に記載の抗体又はその機能性断片。
【請求項３】
その重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３及び軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３のアミノ酸配列は、以下の各アミノ酸配列若しくはその変異体の組み合わせからなる群から選ばれる１種の組み合わせであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の抗体又はその機能性断片。
【表３】
2020508079.tif 000013
【請求項４】
アミノ酸配列番号３３、３５、３７、３８、４０若しくは前記配列のいずれかの変異体からなる群から選ばれる重鎖可変領域、及び／又はアミノ酸配列番号３１、３２、３４、３６、３９若しくは前記配列のいずれかの変異体からなる群から選ばれる軽鎖可変領域を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又はその機能性断片。
【請求項５】
前記重鎖可変領域は配列番号３３若しくはその変異体であり、且つ前記軽鎖可変領域は配列番号３１若しくはその変異体であり、又は前記重鎖可変領域は配列番号３３若しくはその変異体であり、且つ前記軽鎖可変領域は配列番号３２若しくはその変異体であり、又は前記重鎖可変領域は配列番号３５若しくはその変異体であり、且つ前記軽鎖可変領域は配列番号３４若しくはその変異体であり、又は前記重鎖可変領域は配列番号３７若しくはその変異体であり、且つ前記軽鎖可変領域は配列番号３６若しくはその変異体であり、又は前記重鎖可変領域は配列番号３８若しくはその変異体であり、且つ前記軽鎖可変領域は配列番号３６若しくはその変異体であり、又は前記重鎖可変領域は配列番号４０若しくはその変異体であり、且つ前記軽鎖可変領域は配列番号３９若しくはその変異体であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体又はその機能性断片。
【請求項６】
キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体又はその機能性断片。
【請求項７】
アミノ酸配列番号４４、配列番号４８若しくは前記配列のいずれかの変異体からなる群から選ばれる重鎖、及び／又はアミノ酸配列番号４２、配列番号４６若しくは前記配列のいずれかの変異体からなる群から選ばれる軽鎖を含む抗体又はその機能性断片。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体又はその機能性断片をコードする分離された核酸分子及びその相補配列、並びに前記核酸分子又はその相補配列を含む発現ベクター又は宿主細胞。
【請求項９】
配列番号１〜４０、４２、４４、４６及び４８に示すアミノ酸配列をコードする分離された核酸分子及びその相補配列、並びに前記核酸分子又はその相補配列を含む発現ベクター又は宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体又はその機能性断片、或いは請求項８に記載の核酸分子、発現ベクター又は宿主細胞、或いはそれらの任意の組み合わせと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜７に記載の抗体又はその機能性断片、或いは請求項８に記載の核酸分子、発現ベクター又は宿主細胞の、Ｔ細胞機能不全疾患を治療する薬物の製造における使用、並びにＴ細胞の機能を増強して細胞仲介免疫応答を向上させる薬物の製造における使用；前記疾患は、癌又は炎症性疾患であることが好ましい。
【請求項１２】
治療剤とカップリングした請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体又はその機能性断片を含む免疫抱合体；前記治療剤は、毒素、放射性同位体、薬物又は細胞毒剤であることが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオ医薬分野に属し、ＰＤ−Ｌ１から誘導される分子に結合できる抗体の産生に適用できる抗原性ポリペプチドを提供する。本発明はさらに、高親和性でＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗体又はその機能性断片に関する。本発明はさらに、本発明にかかる抗体又はその機能性断片をコードする核酸分子、本発明にかかる抗体又はその機能性断片を発現するための発現ベクター及び宿主細胞、並びに本発明にかかる抗体又はその機能性断片の生産方法を提供する。本発明はさらに、本発明にかかる抗体又はその機能性断片を含む免疫抱合体及び医薬組成物、並びに本発明にかかる抗体又はその機能性断片を用いて、Ｔ細胞の機能を増強して細胞仲介免疫応答を向上させることで、Ｔ細胞機能不全疾患を治療する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
プログラム細胞死リガンド１（Programmed death-ligand 1、ＰＤ−Ｌ１）は、分化抗原群２７４（cluster of differentiation 274、ＣＤ２７４）又はＢ７ホモログ１（B7 homolog 1、Ｂ７−Ｈ１）とも称され、腫瘍壊死因子スーパーファミリーに属し、２９０個のアミノ酸残基からなるＩ型膜貫通糖タンパク質であり、一つのＩｇＶ様領域、一つのＩｇＣ様領域、一つの膜貫通疎水領域、及び一つの３０個のアミノ酸からなる細胞内尾部を含み、全体分子量は４０ｋＤａである。ＰＤ−Ｌ１  ｍＲＮＡは殆どの組織に発現されるが、ＰＤ−Ｌ１タンパク質は、肝臓、肺、扁桃腺及び眼や胎盤等の免疫特権組織を含むごく一部の組織に持続的に発現される。ＰＤ−Ｌ１は活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞、単球、樹状細胞、マクロファージ等にも発現される。
【０００３】
ＰＤ−Ｌ１の受容体はＰＤ−１で、主にＣＤ４+Ｔ細胞、ＣＤ８+Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞や活性化単球等の免疫細胞表面に発現される。ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１の結合により、ＰＤ−１細胞質側領域ＩＴＩＭ（免疫受容体チロシン依存性抑制モチーフ）のチロシン残基のリン酸化を引き起こし、チロシンホスホリパーゼとＳＨＰ２の結合を促進し、ＳＨＰ２を活性化し、下流のＳｙｋとＰＩ３Ｋを脱リン酸化させて終止シグナルを伝達し、抗原提示細胞若しくは樹状細胞とＴ細胞の相互作用を抑制することができる。このような結合により、さらに、Ｔ細胞の代謝を抑制し、抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−Ｘ２の分泌を阻害し、エフェクターサイトカインであるＩＬ−２、ＩＦＮ−γの分泌を低減し、Ｔ細胞の疲弊とアポトーシスを誘発することで、免疫Ｔ細胞の関与する免疫応答を低下させる負の制御機能を奏することもできる。
【０００４】
Ｔ細胞は抗原を認識して活性化されると、ＩＦＮ−γを分泌する。Ｔ細胞から由来のＩＦＮ−γは、Ｔ細胞の機能を増幅・維持させること、例えばＭＨＣ分子をアップレギュレートし、標的細胞による抗原の処理と提示を増強し、Ｔ細胞の分化を促進することができる。それと共に、ＩＦＮ−γは免疫炎症部位の組織にＰＤ−Ｌ１の発現を誘導させ、過剰免疫による組織の傷害を防止する。ＩＦＮ−γは、普通の上皮細胞、血管内皮細胞、骨髄系細胞、ナイーブＴ細胞等の細胞表面にＰＤ−Ｌ１の発現を誘導させることができる。ＩＦＮ−γに誘導されて発生するインターフェロン制御因子１（ＩＲＦ−１）も、ＰＤ−Ｌ１の転写開始点の上流２００ｂｐと３２０ｂｐにあるインターフェロン制御因子結合部位に結合し、転写レベルでＰＤ−Ｌ１を制御することができる。ＰＤ−Ｌ１はＴ細胞表面のＰＤ−１に結合して負の制御機能を奏することで、炎症性部位を保護することができる。
【０００５】
ＰＤ−Ｌ１の負の制御機能は、腫瘍免疫において重要な役割を果たす。２００４年、Ｋｏｎｉｓｈｉらは初めて、非小細胞肺癌患者の組織検体からＰＤ−Ｌ１の発現を発見し、その後、ＰＤ−Ｌ１の発現は、胃癌、肺癌、肝癌、肝内胆管癌、結腸癌、膵癌、卵巣癌、乳癌、子宮頸癌、頭頸部扁平上皮癌、上咽頭癌、食管癌、膀胱癌、腎細胞癌、皮膚癌、口腔扁平上皮癌等を含む各種の腫瘍患者の組織から発見される。細胞の癌化過程において、遺伝子突然変異、外来遺伝子（ウイルス）の発現や沈黙遺伝子の活性化等の原因で、新規なタンパク質分子が生じ、これらのタンパク質は細胞内で分解されると、分解されたあるペプチドフラグメントは細胞表面に腫瘍抗原として発現することができる。免疫系は免疫監視によって腫瘍抗原を認識して腫瘍細胞を絶滅できるが、腫瘍細胞はＰＤ−Ｌ１を利用して免疫攻撃から逃げる。
【０００６】
腫瘍部位におけるＰＤ−Ｌ１の発現は多種の経路を通して腫瘍細胞を傷害から保護できる。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）が分泌するＩＦＮ−γは、腫瘍細胞及び周囲のマトリックス細胞にＰＤ−Ｌ１の発現を誘導できる。一方、腫瘍細胞のＰＤ−Ｌ１はＴＩＬにおけるＰＤ−１と結合し、ＴＩＬ細胞の活性化を抑制することができ、且つさらにそのアポトーシスにも繋がる。インビトロ実験により、腫瘍細胞関連ＰＤ−Ｌ１は腫瘍特異性Ｔ細胞のアポトーシスを増加できるが、ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体はこの作用を弱めることが証明された。腫瘍関連ＰＤ−Ｌ１はＴ細胞にＩＬ−１０の発現を促進し、免疫反応をさらに抑制することができる。ＰＤ−Ｌ１はＰＤ−１のリガンドだけではなく、受容体として逆方向のシグナルを伝達して、腫瘍細胞をＦＡＳ−ＦＡＳＬ等の他の抗腫瘍経路で誘発されるアポトーシスから保護することもできる。
【０００７】
多種の慢性及び急性ウイルスもＰＤ−Ｌ１シグナルを利用して人体の免疫監視から逃げる。Ｗａｎｇらは、ＨＩＶ感染者の骨髄から由来の樹状細胞におけるＰＤ−Ｌ１の発現は明らかに向上し、抗ウイルス感染を経てＨＩＶの複製を抑制した後、ＰＤ−Ｌ１の発現の低下と伴い、Ｔ細胞数も増加したことを見出した。Ｃｈｅｎらの研究により、慢性ＨＢＶ感染者のＴリンパ球と樹状細胞におけるＰＤ−Ｌ１の発現も向上したことを見出した。ウイルス感染は、感染細胞にＰＤ−Ｌ１の高発現を誘導すると共に、ＣＤ８+Ｔ細胞にＰＤ−１の発現を誘導することで、Ｔ細胞の作用を抑制し、エフェクターＴ細胞の疲弊に繋がる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の一つの目的は、Ｔ細胞機能の増強に関連する標的の抗体及び前記抗体の機能性断片、並びに前記抗体又は抗体の機能性断片を用いて、Ｔ細胞の機能を増強して細胞仲介免疫応答を向上させることで、Ｔ細胞機能不全疾患を治療する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の発明者らは、前記目的を果たすために鋭意検討したところ、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し且つＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１の結合を阻害することで、Ｔ細胞の機能を増強する抗体及び前記抗体の機能性断片を見出し、以下の内容を含む本発明に至った。
【００１０】
本発明の一つにおいて、本発明にかかる抗体又はその機能性断片は、アミノ酸配列番号７、８、９、１３、１４、１５、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２８、２９、３０若しくは前記配列のいずれかの変異体からなる群から選ばれる重鎖ＣＤＲ、及び／又はアミノ酸配列番号１、２、３、４、５、６、１０、１１、１２、１６、１７、１８、２５、２６、２７若しくは前記配列のいずれかの変異体からなる群から選ばれる軽鎖ＣＤＲを含む。
【００１１】
本発明のもう一つにおいて、ＰＤ−Ｌ１に結合できる抗体又はその機能性断片をさらに提供し、ただし、前記重鎖ＣＤＲのＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３のアミノ酸配列は、以下の各アミノ酸配列若しくはその変異体の組み合わせからなる群から選ばれる１種の組み合わせである：
【００１２】
【表１】
2020508079.tif 000002
【００１３】
及び／又は、前記軽鎖ＣＤＲのＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３のアミノ酸配列は、以下の各アミノ酸配列若しくはその変異体の組み合わせからなる群から選ばれる１種の組み合わせである：
【００１４】
【表２】
2020508079.tif 000003
【００１５】
本発明のもう一つにおいて、ＰＤ−Ｌ１に結合できる抗体又はその機能性断片を提供し、ただし、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３並びに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３のアミノ酸配列は、以下の各アミノ酸配列若しくはその変異体の組み合わせからなる群から選ばれる１種の組み合わせである：
【００１６】
【表３】
2020508079.tif 000004
【００１７】
本発明のもう一つにおいて、ＰＤ−Ｌ１に結合できる抗体又はその機能性断片を提供し、ただし、それは、アミノ酸配列番号３３、３５、３７、３８、４０若しくは前記配列のいずれかの変異体からなる群から選ばれる重鎖可変領域、及び／又はアミノ酸配列番号３１、３２、３４、３６、３９若しくは前記配列のいずれかの変異体からなる群から選ばれる軽鎖可変領域を含む。
【００１８】
本発明のもう一つにおいて、ＰＤ−Ｌ１に結合できる抗体又はその機能性断片を提供し、ただし、それはキメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体である。
本発明のもう一つにおいて、本発明にかかるＣＤＲ、軽鎖可変領域又は重鎖可変領域をコードする核酸分子及びその相補配列、並びにそれらの核酸分子又はその相補配列を含む発現ベクター及び宿主細胞を提供し、ただし、前記核酸分子は、配列番号１〜４０、４２、４４、４６及び４８に示すアミノ酸配列をコードする核酸分子を含むが、それらに限定されるものではない。
【００１９】
本発明のもう一つは、本発明にかかるＰＤ−Ｌ１に結合できる抗体又はその機能性断片をコードする分離された核酸分子及びその相補配列、並びに前記核酸分子又はその相補配列を含む発現ベクター及び宿主細胞を提供する。
【００２０】
本発明のもう一つにおいて、ＰＤ−Ｌ１に結合できる抗体又はその機能性断片、或いはそれらをコードする核酸分子、或いは発現ベクター又は宿主細胞の、Ｔ細胞の機能を増強して細胞仲介免疫応答を向上させる薬物の製造、或いは腫瘍や炎症性疾患等の疾患のようなＴ細胞機能不全疾患を治療する薬物の製造における使用を提供する。
【００２１】
本発明のもう一つにおいて、本発明にかかるＰＤ−Ｌ１に結合できる抗体又はその機能性断片、本発明にかかるＰＤ−Ｌ１に結合できる抗体又はその機能性断片をコードする分離された核酸分子及び発現ベクター又は宿主細胞、或いはそれらの任意の組み合わせと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００２２】
本発明のもう一つにおいて、治療剤とカップリングした本発明にかかるＰＤ−Ｌ１に結合できる抗体又はその機能性断片を含む免疫抱合体を提供し、ただし、前記治療剤は、毒素、放射性同位体、薬物又は細胞毒剤であることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】ｐＣＤＮＡ３．１プラスミドを改造してｐＳｅｃ  ＣＡＧＡ２  ＥＣＤを獲得するプロセスである。
【図１Ｂ】ヒトＰＤ−Ｌ１細胞外領域タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図である。
【図２】ＥｌｉｓａによるヒトＰＤ−Ｌ１細胞外領域タンパク質とＰＤ−１の結合の検出である。
【図３】ＦＡＣＳによるヒトＰＤ−Ｌ１細胞外領域タンパク質と２９３Ｆ細胞におけるＰＤ−１の結合の検出である。
【図４】ＦＡＣＳによるＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１の結合に対する候補ハイブリドーマ細胞上澄の阻害効果の検出である。
【図５】候補ハイブリドーマ細胞上澄のＪｕｒｋａｔ・フルオレセイン分析である。
【図６】キメラ抗体とヒトＰＤ−Ｌ１の結合である。
【図７】キメラ抗体と２９３Ｆ細胞におけるＰＤ−Ｌ１の結合である。
【図８】キメラ抗体によるヒトＰＤ−Ｌ１と２９３Ｆ細胞におけるＰＤ−１の結合に対する阻害である。
【図９】キメラ抗体のＪｕｒｋａｔ・フルオレセイン分析である。
【図１０】ヒト化抗体とヒトＰＤ−Ｌ１の結合である。
【図１１】ヒト化抗体と２９３Ｆ細胞におけるＰＤ−Ｌ１の結合である。
【図１２】ヒト化抗体によるヒトＰＤ−Ｌ１と２９３Ｆ細胞におけるＰＤ−１の結合に対する阻害である。
【図１３】ヒト化抗体のＪｕｒｋａｔ・フルオレセイン分析である。
【図１４】Ｅｌｉｓａによる比較ヒト化抗体とヒトＰＤ−Ｌ１の結合の検出である。
【図１５】インビボ実験による腫瘍成長に対するヒト化抗体の抑制作用の検出である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本文に記載の参考書類は全て明確に本文に組み込まれる。
［汎用技術］
特に断らない限り、本発明の実施において、分子生物学（組換え技術も含む）、微生物学、細胞生物学、生物化学及び免疫学の通常技術を採用するが、それらはいずれも本分野の技術の範囲内に入る。それらの技術は、例えばMolecular Cloning ：A Laboratory Manual(モレキュラー クローニング：ア ラボラトリー マニュアル)、第二版(Sambrookら，1989)；Oligonucleotide Synthesis(オリゴヌクレオチド合成)(M.J.Gait編集，1984)；Animal Cell Culture(動物細胞培養)(R.I.Freshney編集，1987)；Methods in Enzymology(酵素学における方法)(Academic Press，Inc.)；Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学カレント・プロトコル)(F.M.Ausubelら編集，1987，及び定期的に更新する)；PCR ：The Polymerase Chain Reaction(PCR ：ポリメラーゼ連鎖反応)，(Mullisら編集，1994)；A Practical Guide to Molecular Cloning(モレキュラー クローニングの実用的ガイド)(Perbal Bernard V.，1988)；Phage Display ：A Laboratory Manual(ファージディスプレイ：ア ラボラトリー マニュアル)(Barbasら，2001)などの文献において十分に解釈されてある。
【００２５】
［１．宿主免疫］
（１．１．リンパ球の発育と活性化）
ヒトのリンパ球の２種類の主要なタイプはＴ（胸腺由来）とＢ（骨髄由来）である。それらの細胞は、既にリンパ球系発育経路に付された骨髄及び胎児肝臓（fetal liver）中の造血幹細胞から由来する。それらの幹細胞の子孫は、枝分かれした経路をたどってＢ又はＴリンパ球に成熟する。ヒトＢリンパ球の発育は完全に骨髄内で生じる。他方で、Ｔ細胞は骨髄を出て血流を通って胸腺に移動した未熟な前駆細胞から発育するものであり、それらは胸腺で増殖し且つ成熟なＴリンパ球に分化する。
【００２６】
胸線又は骨髄から出現する成熟リンパ球は、静止状態又は「休止」状態にあり、即ち、それらは有糸分裂という点で不活性である。血流中に分散されたとき、それらの「ナイーブ」又は「処女」リンパ球は、多様な二次又は末梢リンパ系器官、例えば脾臓、リンパ節又は扁桃腺に移動する。大半の処女リンパ球は固有の短い寿命を有し、骨髄又は胸線を出てから数日後で死亡する。しかしながら、そのような細胞は抗原の存在を示すシグナルを受け取ると、それらは活性化して連続の細胞分裂サイクルを経る。その後、結果として得られる子孫細胞の一部は休止状態に戻り、メモリーリンパ球であるＢ及びＴ細胞となるが、該メモリーリンパ球は、刺激を引き起こすアレルゲンとの次の遭遇により本性的にプライミングされる。活性化処女リンパ球の他の子孫はエフェクター細胞であり、それらはほんの数日間しか生存できないが、特異的な防御活性を発揮する。
【００２７】
リンパ球の活性化とは、休止リンパ球が刺激されたときに分裂して子孫を生じ、子孫の一部がエフェクター細胞になるという秩序的な一連の事象を指す。完全な応答は、細胞増殖（有糸分裂の発生）の誘発及び免疫学的機能の発現の両方を含む。リンパ球は、それらの表面の受容体に特異的リガンドが結合したときに活性化される。該リガンドはＴ細胞及びＢ細胞について異なるが、細胞内で生じる生理学的メカニズムは類似である。
【００２８】
一部の外来抗原そのもの、特にＢ細胞の表面免疫グロブリン又はＴ細胞の他の糖タンパク質と架橋する大きなポリマー抗原は、リンパ球の活性化を誘発することができる。しかしながら、殆どの抗原はポリマー性ではなく、多数のＢ細胞との直接結合でさえも活性化をもたらすことができない。それらより一般的な抗原は、隣接する活性化ヘルパーＴリンパ球と共刺激するときに、Ｂ細胞を活性化する。そのような刺激は、Ｔ細胞によって分泌されるリンホカインから生じ得るが、Ｂ細胞をＴ細胞表面タンパク質と直接に接触させることは最も効率的な伝達であり、ただし、該Ｔ細胞表面タンパク質はあるＢ細胞の表面受容体と相互作用して二次シグナルを生じる。
【００２９】
（１．２．Ｔ細胞）
Ｔリンパ球は免疫グロブリンを発現しないが、その代わりに、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と称される表面タンパク質を経由して外来物質の存在を検出する。それらの受容体は、直接な接触によって、又は他の免疫細胞の活性に対して影響を与えることによって、抗原を認識する。Ｔ細胞はマクロファージと共に、細胞仲介免疫に関与する主要な細胞タイプである。
【００３０】
Ｔ細胞はＢ細胞と異なり、特定の環境でのみ外来物質を検出できる。具体的に言えば、Ｔリンパ球は、外来タンパク質がまず小ペプチドに切断され、その後第二の宿主細胞（抗原提示細胞（ＡＰＣ）と称される）の表面に提示される場合にのみ、前記外来タンパク質を認識する。多くのタイプの宿主細胞はいくつかの条件下で抗原を提示できるが、マクロファージ及び他のＢ細胞を含むあるタイプはこの目的にとってより特異的に適切であり、且つＴ細胞活性の制御において特に重要である。抗原の提示は、部分的には、提示細胞の表面にある、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質と称される特異的タンパク質に依存する。したがって、細胞仲介免疫を刺激するために、外来ペプチドは、ＭＨＣペプチドと組み合わせてＴ細胞に提示されねばならず、こういう組み合わせは、Ｔ細胞受容体に認識されねばならない。
【００３１】
細胞傷害性Ｔリンパ球（Ｔｃ細胞又はＣＴＬ）及びヘルパーＴ（ＴＨ）細胞という２種類の主要なＴ細胞サブセットが存在し、それらは、細胞表面に発現されるマーカーのＣＤ８及びＣＤ４を基準にして大ざっぱに同定できる。Ｔｃ細胞はウイルス防御において重要であり、ある細胞の表面に発現されるウイルスペプチドを認識することによってウイルスを直接に死滅させることができる。ＴＨ細胞は、他の細胞タイプの増殖、成熟及び免疫学的機能、例えばリンホカインの分泌を促進することで、Ｂ細胞、マクロファージ及び細胞傷害性Ｔ細胞の活性を制御する。処女リンパ球もメモリーＴリンパ球も通常休止状態にあり、この状態では、それらは顕著なヘルパー活性も細胞傷害性活性も示さない。活性化されたときに、それらの細胞は数回の有糸分裂サイクルを経て、娘細胞を生じる。それらの娘細胞の一部はメモリー細胞として休止状態に戻るが、その他は、ヘルパー活性又は細胞傷害性活性を活発に発現するエフェクター細胞に成る。それらの娘細胞はそれらの親に類似する：ＣＤ４+細胞はＣＤ４+子孫のみを生じ、一方、ＣＤ８+細胞はＣＤ８+子孫のみを生じる。エフェクターＴ細胞は、例えばＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ４０Ｌ、トランスフェリン受容体及びＭＨＣクラスＩＩタンパク質のような、休止Ｔ細胞には発現されない細胞表面マーカーを発現する。活性化刺激がなくなると、細胞傷害性又はヘルパー活性は、エフェクター細胞が死亡するか又は休止状態に戻ることに従って、数日の期間の間に徐々に静まっていく。
【００３２】
Ｂ細胞の活性化に類似するように、殆どの抗原に対するＴリンパ球の応答にもまた２種類のタイプの同時刺激が必要である。第一は抗原であり、それは、ＭＨＣタンパク質によって抗原提示細胞に適切に提示されると、Ｔ細胞受容体に認識されて結合することができる。このような抗原−ＭＨＣ複合体は確かに細胞内部へシグナルを伝達するが、通常はＴ細胞の活性化にとって不十分である。例えばヘルパーＴ細胞で生じるもののような完全な活性化は、抗原提示細胞表面に発現される、共刺激因子と称される他の特異的リガンドとの共刺激を必要とする。他方、細胞傷害性Ｔ細胞の活性化は通常、活性化ヘルパーＴ細胞によって分泌されるＩＬ−２を必要とする。
【００３３】
（１．３．免疫応答）
他の生体防御から区別される哺乳動物の免疫系の三つの一次機能特性は、（１）特異性―大多数の標的分子の間で個別に認識する、並びに応答する若しくは応答しない能力と、（２）認識―非自己のものから自己のものを特定することで、数え切れないあらゆるタンパク質や他の有機分子と穏やかに共存できるが、依然として生体に導入される外来物質に対して強烈に反応できる能力と、並びに（３）記憶―経験に沿ってモデルを構築することで、特定の外来病原体との次の遭遇が、最初の遭遇で生じたものよりも迅速で活発な応答を惹起する能力と、を含む。それらの機能の中の一つ又は複数が障害されると、生理的病症がもたらされてしまう。
【００３４】
処女リンパ球は、一次リンパ系器官から末梢へ持続的に放出され、各々が抗原結合を可能にする表面受容体を携える。Ｂ細胞での抗原結合は表面に結合される免疫グロブリンによって仲介されるが、Ｔ細胞ではＴ細胞受容体によって仲介される。しかしながら、処女リンパ球が活性化されると、それらは増殖し、次に活性化と増殖のさらなるサイクルを起こし得る娘細胞を生じる。所定の抗原に対する応答の速度及び強度は、殆どがクローン選択によって決定される。特定の抗原に対して特異的な娘細胞又はクローンが大きいほど、免疫応答を認識してそれに関与できる細胞の数も多くなる。それぞれの免疫応答は複雑であり、且つ複数種の細胞タイプに関連する順次的な事象によって複雑に制御される。それは、免疫原が生体内に入って且つ特殊の種類の細胞（抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）と称される）に遭遇したときに誘発される。それらのＡＰＣｓは微量の免疫原を捕捉し、且つ抗原特異的ヘルパーＴリンパ球に認識できる形態で提示することができる。その後、ヘルパーＴ細胞は活性化され、且つ逆にＢ細胞や細胞傷害性Ｔ細胞のような他のタイプのリンパ球の活性化を促進する。その後、活性化リンパ球は増殖して、それらの特異的なエフェクター機能を行う。このようなプロセスの各段階で、リンパ球とＡＰＣは、直接な接触によって、又は調節性サイトカインを分泌することによって、互いに連絡を取り合う。
【００３５】
ＡＰＣにより捕捉された外来抗原は、抗原プロセシングと称される一連の変化を経る。このようなプロセシング（特にタンパク質免疫原のプロセシング）は、変性及び部分的なタンパク質分解・消化に関わり、これで該免疫原が短いペプチドに切断される。その後、結果として得られる限られた数のペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質と非共有結合し、且つＡＰＣ表面に輸送され、該プロセスは抗原提示と称される。ＡＰＣと直接に接触するＣＤ４+ヘルパーＴリンパ球が活性化され得るが、それは、ＡＰＣにより提示される特定のペプチド−ＭＨＣ複合体を認識して結合することのできるＴ細胞受容体タンパク質が発現された場合にのみ活性化される。
【００３６】
ヘルパーＴ（ＴＨ）細胞は免疫応答の主要なオーケストレイター（orchestrators）である。なぜなら、それらは、２種類の他のリンパ系エフェクター細胞：細胞傷害性Ｔ（Ｔｃ）細胞及び抗体分泌形質細胞の活性化のために必要とされるからである。ＴＨの活性化は、免疫応答の早期において発生し、且つ少なくとも２つのシグナルを必要とする。１つ目のシグナルは、ＡＰＣ表面での、ＣＤ３タンパク質複合体を介して伝達された抗原性ペプチド−ＭＨＣ複合体へのＴ細胞抗原受容体の結合により提供され、その一方で、２つ目の、ＡＰＣを介した共刺激シグナルは、Ｔ細胞表面における独立のシグナル伝達タンパク質への、ＡＰＣにおける特異的リガンドの結合に起因すると考えられる。１つの公知のそのような相互作用は、Ｔ細胞タンパク質ＣＤ２８及びＢ７として公知されるＡＰＣ表面タンパク質ファミリーである。他の表面タンパク質のペアも共刺激を仲介することができる。共刺激のプロセスは続いてより詳細に説明する。本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−Ｌ１を介したシグナル伝達により提供される負の共刺激シグナルに拮抗することで、共刺激を増強すると考えられる。
【００３７】
とにかく、２つのシグナルはヘルパーＴ細胞を誘導してサイトカインのインターロイキン２（ＩＬ−２）の分泌を開始させ、また、その表面で特異的な高親和性ＩＬ−２受容体の発現を開始させる。ＩＬ−２は、Ｔリンパ球にとって高度に強力な有糸分裂促進因子であり、活性化Ｔ細胞の増殖性応答にとって必須である。ＩＬ−２の、それを分泌する細胞に対する効果は、オートクライン効果として公知される現象である。Ｔ細胞は両方のシグナルとも受けている場合でさえ、その自身のＩＬ−２受容体が遮断されていると、それは増殖しないであろうことがさらに示されている。ＩＬ−２は、いわゆるパラクリン効果によって周辺の細胞に作用することもできる。この効果は、Ｔｃ細胞を活性化するために特に重要であり、Ｔｃ細胞は通常、それら自身の増殖を刺激するために十分なＩＬ−２を産生しない。ＩＬ−２に加えて、活性化ＴＨ細胞は他のサイトカインを分泌し、Ｂ細胞、マクロファージ及び他の細胞タイプの増殖、分化及び機能を促進する。
【００３８】
ＡＰＣと抗原特異的ＴＨ細胞の間での接触は、ＡＰＣに対する効果も有する―その中の最も重要なものの１つはＩＬ−１の放出である。このサイトカインはオートクラインの形態で作用し、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質及び種々の接着分子の表面発現を増加させ、それによりＴＨ細胞の結合を強化し、抗原提示を増強すると考えられる。同時に、ＩＬ−１はＴＨ細胞に対してパラクリンの形態で機能し、ＩＬ−２分泌及びＩＬ−２受容体の発現を促進する。
【００３９】
以上に記載された形態でのＴＨ細胞の活性化の過程において、一部のＢ細胞は、後に分泌される膜結合形態の抗体であるそれらの抗原受容体を介して免疫原に結合することもできる。Ｂ細胞はＴ細胞と異なり、遊離の非プロセシング形態で免疫原を認識する。特異的抗原結合は、Ｂ細胞を活性化に導くことができるタイプのシグナルを提供する。
【００４０】
第２の種類は、活性化ＴＨ細胞により提供され、該細胞は、その表面で非免疫グロブリン受容体に結合することによってＢ細胞の活性化を補助するタンパク質を発現する。それらのＴＨ由来シグナル（その抗原特異性にかかわらずＢ細胞に作用するもの）は、ヘルパー因子と称される。それらのヘルパー因子はＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＬ−６を含む。しかしながら、補助は細胞−細胞接触を介してより効率的に達成され、該細胞−細胞接触により、Ｔ細胞表面におけるタンパク質がＢ細胞におけるタンパク質と直接に接触することが可能になる。接触仲介性補助の最も効果的な形態は、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）と称されるタンパク質（それらはＴＨ細胞が活性化された後にのみＴＨ細胞に発現される）がＢ細胞におけるＣＤ４０と称されるタンパク質に結合する際に生じる。バイスタンダー（by-stander）活性化と称されるプロセスにおいて、活性化Ｂ細胞との接触は、該Ｂ細胞の表面免疫グロブリンが抗原に結合していなくても、休止Ｂ細胞を活性化するのに十分であり得る。
【００４１】
Ｔｃリンパ球は機能して、それらの表面に外来抗原を発現する細胞（例えば、ウイルス感染宿主細胞など）を絶滅させる。大半のＴｃ細胞はＣＤ４より、むしろＣＤ８を発現する故に、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質より、むしろクラスＩに関連する抗原を認識する。体細胞がウイルスにより感染される場合、一部の免疫原性ウイルスタンパク質が細胞内でプロセシングを受け得るが、結果として得られるペプチドは次にＭＨＣクラスＩ分子との表面複合体として現れる。その後、それらのペプチド−ＭＨＣ複合体は抗原特異的クローンのＴ細胞受容体によって認識され、Ｔｃ細胞の活性化のために必要な２つのシグナルの１つを提供することができる。この第１のシグナルは単独で、Ｔｃ細胞に高親和性ＩＬ−２受容体を誘導する。第２のシグナルは、隣接する活性化ＴＨリンパ球から分泌されたＩＬ−２により提供される。両方のシグナルとも受けると、活性化Ｔｃ細胞は細胞傷害活性を得て、それに結合した細胞、並びに同じペプチド−ＭＨＣクラスＩ複合体を携える他の細胞を死滅させることができるようになる。一部の場合において、死滅は、Ｔｃが標的細胞に特異的毒素を放出することで発生する。他の場合において、Ｔｃは標的細胞にアポトーシスによる自殺を誘発する。活性化Ｔｃ細胞も増殖し、同じ抗原特異性を持つ追加のＴｃ細胞を生じる。
【００４２】
［２．ＰＤ−１経路］
Ｔ細胞の活性化を制御する重要な負の共刺激シグナルは、プログラム細胞死−１受容体（ＰＤ−１）（ＣＤ２７９）並びにそのリガンド結合パートナーのＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１、ＣＤ２７４）及びＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ、ＣＤ２７３）によって提供される。ＰＤ−１の負の制御作用は、自己免疫に陥りやすいＰＤ−１ノックアウト（Ｐｄｃｄ１−／−）によって示される。Nishimuraら，Immunity(免疫)11：141-51(1999)；Nishimuraら，Science(サイエンス)291 ：319-22(2001)。ＰＤ−１はＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４に関連するが、ホモダイマー形成を可能にする膜基部システインを欠いている。ＰＤ−１の細胞質側ドメインは、免疫受容体チロシン依存性抑制モチーフ（ＩＴＩＭ、Ｖ／ＩｘＹｘｘＬ／Ｖ）を含む。ＰＤ−１はＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２にのみ結合する。Freemanら，J.Exp.Med.(実験医学雑誌)192：1-9(2000)；Dongら，Nature Med.(ネイチャー メディシン)5 ：1365-1369(1999)；Latchmanら，Nature Immunol.(ネイチャー イミュノロジー)2：261-268(2001)；Tsengら，J.Exp.Med.(実験医学雑誌)193：839-846(2001)。
【００４３】
ＰＤ−１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、活性化単球及び樹状細胞（ＤＣ）に発現することができる。ＰＤ−１は、活性化されたヒトＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞、Ｂ細胞及び骨髄系細胞によって発現されるが、未刺激のそれら細胞には発現されない。このことは、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４のより制限的な発現と対照的である。Nishimuraら，Int.Immunol.(国際免疫学)8：773-80(1996)；Boettlerら，J.Virol.(ウイルス学雑誌)80：3532-40(2006)。活性化ヒトＴ細胞からは、既に（ｉ）エクソン２、（ｉｉ）エクソン３、（ｉｉｉ）エクソン２及び３、又は（ｉｖ）エクソン２から４を欠く転写物を含む少なくとも４種類のＰＤ−１変異体がクローニングされた。Nielsenら，Cell.Immunol.(細胞免疫学)235：109-16(2005)。ＰＤ１Δｅｘ３を除いて、いずれの変異体も休止末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中で完全長ＰＤ−１として同様なレベルで発現される。全ての変異体の発現は、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８によってヒトＴ細胞を活性化する際に顕著に誘導される。ＰＤ１Δｅｘ３変異体は膜貫通ドメインを欠いており、且つ自己免疫で重要な役割を果たす可溶性ＣＴＬＡ−４に類似する。Uedaら，Nature(ネイチャー)423：506-11(2003)。このような変異体は、関節リウマチ患者の滑液及び血清中で富化する。Wanら，J.Immunol.(免疫学雑誌)177：8844-50(2006)。
【００４４】
２種類のＰＤ−１リガンドは、それらの発現パターンで異なっている。ＰＤ−Ｌ１は、マウスのＴ及びＢ細胞、ＣＤ、マクロファージ、間葉系幹細胞及び骨髄由来マスト細胞において構成的に発現される。Yamazakiら，J.Immunol.(免疫学雑誌)169：5538-45(2002)。ＰＤ−Ｌ１は広範囲の非造血細胞（例えば角膜、肺、血管上皮、肝非実質細胞、間葉系幹細胞、膵島、胎盤の合胞体性栄養膜細胞、角化細胞）に発現され［Keirら，Annu. Rev. Immunol.， 26:677-704, 2008]、多数の細胞タイプの活性化後にアップレギュレートされる。Ｉ型及びＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ’ｓ）の両方はＰＤ−Ｌ１をアップレギュレートする。Eppihimerら，Microcirculation(微小循環)9：133-45(2002)；Schreinerら，J.Neuroimmunol.(神経免疫学雑誌)155：172-82(2004)。ＭｙＤ８８、ＴＲＡＦ６及びＭＥＫが阻害されたとき、細胞におけるＰＤ−Ｌ１発現は低下する。Liuら，Blood(血液)110：296-304(2007)。ＪＡＫ２もＰＤ−Ｌ１の誘導に関与する。Leeら，FEBSLett.580：755-62(2006)；Liuら，Blood(血液)110：296-304(2007)。ホスファターゼ・テンシン・ホモログ（ＰＴＥＮ）（ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）−Ａｋｔシグナル伝達を修飾させる細胞性ホスファターゼ）の喪失又は阻害は、癌で転写後ＰＤ−Ｌ１の発現を増加させる。Parsaら，Nat.Med.(ネイチャー メディシン)13：84-88(2007)。
【００４５】
ＰＤ−Ｌ２の発現はＰＤ−Ｌ１よりも制限されている。ＰＤ−Ｌ２は、ＤＣ、マクロファージ及び骨髄由来マスト細胞において誘導発現される。ＰＤ−Ｌ２は約１／２〜２／３の休止腹膜Ｂ１細胞にも発現されるが、通常のＢ２Ｂ細胞には発現されない。Zhong ら，Eur.J.Immunol.(ヨーロッパ免疫学雑誌)37：2405-10(2007)。ＰＤ−Ｌ２＋Ｂ１細胞はホスファチジルコリンに結合し、細菌抗原に対抗する生来の免疫応答にとって重要であり得る。ＩＦＮ−γによるＰＤ−Ｌ２の誘導は部分的にＮＦ−ＫＢに依存する。Liangら，Eur.J.Immunol.(ヨーロッパ免疫学雑誌)33：2706-16(2003)。ＰＤ−Ｌ２は、ＧＭ−ＣＦ、ＩＬ−４及びＩＦＮ−γによって単球及びマクロファージにおいても誘導できる。Yamazakiら，J.Immunol.(免疫学雑誌)169：5538-45(2002)；Lokeら，PNAS 100：5336-41(2003)。
【００４６】
ＰＤ−１シグナル伝達は、典型的に、細胞増殖よりもサイトカインの産生に大きな効果を有し、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＩＬ−２の産生に顕著な効果を示す。ＰＤ−１によって仲介される阻害性シグナル伝達もＴＣＲシグナル伝達の強度に依存し、低レベルのＴＣＲ刺激で、より強い阻害が伝達される。このような低下は、ＣＤ２８による共刺激によって（Freemanら, J. Exp. Med., 192:1027-34, 2000）、又はＩＬ−２の存在によって（Carterら, Eur. J. Immunol., 32:634-43, 2002）克服できる。
【００４７】
ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２によるシグナル伝達が二方向性であるという証拠は増えつつある。即ち、ＴＣＲ又はＢＣＲシグナル伝達の修飾に加えて、シグナル伝達はＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２を発現する細胞に伝達し戻される可能性もある。（ワルデンストロームマクログロブリン血症の患者から単離された）天然のヒト抗ＰＤ−Ｌ２抗体による樹状細胞の処理では、ＭＨＣ  ＩＩ又はＢ７共刺激分子をアップレギュレートすることが認められないが、そのような細胞は確かにより大量の炎症誘発性サイトカイン、特にＴＮＦ−α及びＩＬ−６を生じ、且つＴ細胞の増殖を刺激する。Nguyenら，J.Exp.Med.(実験医学雑誌)196：1393-98(2002)。このような抗体によるマウスの処理もまた、（１）移植（transplated）ｂｌ６メラノーマに対する耐性を増強し、且つ腫瘍特異的ＣＴＬを迅速に誘導する。Radhakrishnanら，J.Immunol.(免疫学雑誌)170：1830-38(2003)；Radhakrishnanら，Cancer Res.(癌研究)64：4965-72(2004)；Heckmanら，Eur.J.Immunol.(ヨーロッパ免疫学雑誌)37：1827-35(2007)；（２）マウスのアレルギー喘息モデルにおける気道の炎症性疾患の進行を阻止する。Radhakrishnanら，J.Immunol.(免疫学雑誌)173：1360-65(2004)；Radhakrishnanら，J.Allergy Clin.Immunol.(アレルギー反応臨床免疫学雑誌)116：668-74(2005)。
【００４８】
樹状細胞（「ＤＣ’ｓ」）への逆方向シグナル伝達のさらなる証拠は、可溶性ＰＤ−１（Ｉｇ定常領域と融合させたＰＤ−１  ＥＣドメインである「ｓ−ＰＤ−１」）と共に培養した骨髄由来ＤＣに対する研究から得られる。Kuipersら，Eur.J.Immunol.(ヨーロッパ免疫学雑誌)36：2472-82(2006)。このようなｓ−ＰＤ−１は、抗ＰＤ−１の投与により逆転できる形態で、ＤＣの活性化を抑制し、ＩＬ−１０の産生を増加させる。
【００４９】
さらにまた、いくつかの研究により、ＰＤ−１に依存しないＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２の受容体が示唆される。Ｂ７．１は既にＰＤ−Ｌ１の結合パートナーとして同定されている。Butteら，Immunity(免疫)27：111-22(2007)。化学的架橋研究により、ＰＤ−Ｌ１及びＢ７．１はそれらのＩｇＶ様ドメインを介して相互作用できることが示唆される。Ｂ７．１：ＰＤ−Ｌ１相互作用はＴ細胞への阻害性シグナルを誘導できる。Ｂ７．１によるＣＤ４+Ｔ細胞へのＰＤ−Ｌ１の結合又はＰＤ−Ｌ１によるＣＤ４+Ｔ細胞へのＢ７．１の結合は阻害性シグナルを伝達する。ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４を欠くＴ細胞は、抗ＣＤ３+Ｂ７．１被覆ビーズによって刺激されたとき、増殖及びサイトカイン産生の低下を示す。Ｂ７．１に対する全ての受容体（即ちＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−Ｌ１）を欠くＴ細胞では、Ｔ細胞の増殖及びサイトカインの産生はもはや抗ＣＤ３+Ｂ７．１被覆ビーズによって阻害されなくなる。このことは、Ｂ７．１は、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４の非存在下でＴ細胞においてＰＤ−Ｌ１を介して特異的に作用を発揮することを示している。類似に、ＰＤ−１を欠くＴ細胞は、抗ＣＤ３+ＰＤ−Ｌ１被覆ビーズの存在下で刺激されたとき、増殖及びサイトカイン産生の低下を示し、このことは、Ｔ細胞でのＢ７．１に対するＰＤ−Ｌ１結合の阻害効果を示している。Ｔ細胞がＰＤ−Ｌ１に対する全ての既知の受容体を欠く（即ちＰＤ−１及びＢ７．１が存在しない）とき、Ｔ細胞はもはや抗ＣＤ３+ＰＤ−Ｌ１被覆ビーズによって障害されなくなる。したがって、ＰＤ−Ｌ１はＢ７．１又はＰＤ−１を介してＴ細胞に対して阻害的効果を発揮することができる。
【００５０】
Ｂ７．１とＰＤ−Ｌ１の間での直接な相互作用は、共刺激に対する従来の理解が不完全であり、Ｔ細胞に対するこれらの分子の発現の重要性が過小評価されていることを示唆する。ＰＤ−Ｌ１−／−Ｔ細胞の研究により、Ｔ細胞におけるＰＤ−Ｌ１はＴ細胞のサイトカイン産生をダウンレギュレートできることが示唆される。Latchmanら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(米国科学アカデミー紀要)101：10691-96(2004)。Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＤＣ及びマクロファージにはＰＤ−Ｌ１及びＢ７．１が両方とも発現されるので、これらの細胞タイプにおいて、Ｂ７．１とＰＤ−Ｌ１の間には指向性の相互作用が存在する可能性がある。さらにまた、非造血細胞におけるＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞におけるＢ７．１及びＰＤ−１と相互作用できるので、ＰＤ−Ｌ１がそれらの制御に関与するか否かという問題は浮上する。Ｂ７．１：ＰＤ−Ｌ１相互作用の阻害的効果についての１つの可能な解釈は、Ｔ細胞のＰＤ−Ｌ１が、ＣＤ２８との相互作用からＡＰＣ  Ｂ７．１を捕捉若しくは隔離できるかもしれないということである。
【００５１】
したがって、ＰＤ−Ｌ１を介するシグナル伝達に拮抗すること（ＰＤ−１、Ｂ７．１又はその両方との相互作用からＰＤ−Ｌ１を遮断することも含む）により、ＰＤ−Ｌ１がＴ細胞及び他の抗原提示細胞に負の共刺激シグナルを伝達するのを妨げるということで、感染症（例えば急性及び慢性のもの）及び腫瘍免疫に応答する免疫を増強する可能性がある。さらにまた、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達の他の成分の拮抗剤（例えば拮抗的な抗ＰＤ−１及び抗ＰＤ−Ｌ２抗体）と組み合わせることができる。
【００５２】
［用語］
本文で用いられる全ての科学技術用語は、当業者の理解と同様な意味を有する。本分野の定義及び用語について、当業者は具体的に分子生物学カレント・プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology（Ausubel））に参考できる。アミノ酸残基の略語は、本分野で用いられる、２０つの通常Ｌ−アミノ酸のうちの１つを表記するための３文字及び／又は１文字の標準コードである。
【００５３】
「抗体」という用語は、モノクローナル抗体（免疫グロブリンＦｃ領域を有する完全長抗体を含む）、多重エピトープ特異性を有する抗体組成物、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、ダイアボディ及び一本鎖分子、並びに抗体断片（例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ）を含む。本文において、「免疫グロブリン（Ｉｇ）」という用語は「抗体」と互換的に用いられる。
【００５４】
基本的な４本鎖抗体ユニットは、２本の同一の軽鎖（Ｌ）及び２本の同一の重鎖（Ｈ）からなるヘテロテトラマー糖タンパク質である。ＩｇＭ抗体は、５つの基本的なヘテロテトラマーユニットと、Ｊ鎖と称される追加のポリペプチドからなり、１０つの抗原結合部位を含むが、ＩｇＡ抗体は、Ｊ鎖と組み合わせて集合して多価集合物を形成できる２〜５つの基本的な４本鎖ユニットを含む。ＩｇＧの場合、４本鎖ユニットは通常約１５０，０００ダルトンである。各軽鎖はそれぞれ、１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖と連結されるが、２本の重鎖は、１つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結され、ジスルフィド結合の数は重鎖のアイソタイプに応じて決定される。各重鎖及び軽鎖はさらに、規則的な間隙を有する鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖はＮ−末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、その後に続くのは、（各種のα及びγ鎖のそれぞれに相応する）３つの定常ドメイン（ＣＨ）、並びに（μ及びεアイソタイプに相応する）４つの定常ドメイン（ＣＨ）である。各軽鎖はＮ−末端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その後に続くのは、その他方の末端の定常ドメインである。ＶＬはＶＨと一列に並ぶが、ＣＬは重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）と一列に並ぶ。特定のアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖の可変ドメインの間で境界を形成すると考えられる。ペアになるＶＨとＶＬは一緒になって、１つの抗原結合部位を形成する。異なるタイプの抗体の構造及び特性については、例えばBasic and Clinical Immunology(基礎及び臨床免疫学)，第八版，Daniel P.Sties，Abba I.TerrとTristram G.Parsolw(編集)，Appleton & Lange，Norwalk，CT，1994，ページ71および第6章を参照できる。任意の脊椎動物種から由来の軽鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κ及びλと称される２種類の全く異なるタイプのうちの１種に割り当てることができる。免疫グロブリンは、それらの重鎖の定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列に基づいて、別個のクラス又はアイソタイプに割り当てることができる。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭという５種類の免疫グロブリンクラスが存在し、それぞれα、δ、ε、γ及びμと称される重鎖を有する。γ及びαクラスは、ＣＨ配列及び機能の比較的小さな相違に基づいて、さらにサブクラスに分割することができ、例えばヒトは以下のサブクラスを発現する：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２。
【００５５】
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ「ＶＨ」及び「ＶＬ」と言ってもよい。それらのドメインは通常、（同じクラスの他の抗体と比べて）抗体の最も可変的な部分であり、且つ抗原結合部位を含む。
【００５６】
「可変」という用語は、可変ドメインのあるセグメントが抗体の間で配列に関して広範囲に相違するという事実を指す。Ｖドメインは抗原結合を仲介し、且つその特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を規定する。しかしながら、可変性は、可変ドメインのアミノ酸全体にわたって均等に分布しているわけではない。代わりに、それは、（軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方にもある）超可変領域（ＨＶＲ）と称される３つのセグメントに集中する。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と称される。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ４つのＦＴ領域を含み、その大部分はベータ・シート配座を取っており、ループ状連結を形成し且つ一部の場合にベータ・シート構造の一部を形成する３つのＨＶＲによって連結される。各鎖のＨＶＲはＦＲ領域によって極めて近接して一緒に保持され、且つ他の鎖のＨＶＲと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabatら，Sequences of Immunological Interest(免疫学に興味のある配列)，第五版.National Institute of Health(国立衛生研究所)，Bethesda，MD.(1991)を参照する）。定常ドメインは、抗体と抗原の結合に直接に関与しないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞介在性細胞傷害性における抗体の関与などを示す。
【００５７】
「モノクローナル抗体」という用語は、本文で使用する通り、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、即ち、この集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る天然の突然変異及び／又は翻訳後修飾（例えば異性化、アミド化）を除き、同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に向けられる。（異なる決定基（エピトープ）に向けられる異なる抗体を典型的に含む）ポリクローナル抗体製剤と対照的に、各モノクローナル抗体は抗原における単一の決定基に向けられる。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらがハイブリドーマ培養によって合成され、他の免疫グロブリンによる混雑がないという点で有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を要求していると解釈されるべきではない。例えば、本発明に用いられるモノクローナル抗体は、例えば以下を含む多様な技術によって製造できる：ハイブリドーマ法(例えばKohlerとMilstein，Nature(ネイチャー)，256：495-97(1975)；Hongoら，Hybridoma(ハイブリドーマ)，14(3)：253-260(1995)，Harlowら，Antibodies：A Laboratory Manual(抗体：ア ラボラトリー マニュアル)，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第二版.1988)；Hammerlingら，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas(モノクローナル抗体とＴ細胞ハイブリドーマ)563-681，(Elsevier，N.Y.，1981))、組換えＤＮＡ法(例えば米国特許第4,816,567号を参照する)、ファージディスプレイ技術(例えばClacksonら，Nature(ネイチャー)，352：624-628(1991)；Marksら，J.Mol.Biol.(分子生物学雑誌)，222：581-597(1992)；Sidhuら，J.Mol.Biol.(分子生物学雑誌)338(2)：299-310(2004)；Leeら，J.Mol.Biol.(分子生物学雑誌)340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(米国科学アカデミー紀要)101(34)：12467-12472(2004)；及びLeeらJ.Immunol.Methods(免疫学方法雑誌)284(1-2)：119-132(2004)を参照する)、並びにヒト免疫グロブリン遺伝子座又はヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部又は全部を有する動物でヒト抗体又はヒト様抗体を製造するための技術(例えばWO1998/24893；WO1996/34096；WO1996/33735；WO 1991/10741；Jakobovitsら，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(米国科学アカデミー紀要)，90：2551(1993)；Jakobovitsら，Nature(ネイチャー)，362：255-258(1993)；Bruggemannら，Year in Immunol.(イヤー・イン・イミュノロジー)，7：33(1993)；米国特許第5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；及び5,661,016号，Marksら，Bio/Technology(生物／技術)，10：779-783(1992)；Lonbergら，Nature(ネイチャー)，368：856-859(1994)；Morrison，Nature(ネイチャー)，368：812-813(1994)；Fishwildら，Nature Biotechnol.(ネイチャー：生物技術)，14：845-851(1996)；Neuberger，Nature Biotechnol.(ネイチャー：生物技術)，14：826(1996)；及びLonbergとHuszar，Intern.Rev.Immunol.，13：65-93(1995)を参照する)。
【００５８】
「完全長抗体」、「インタクト抗体」、又は「抗体全体」という用語は互換的に使用することができ、（抗体断片と対照的に）その実質的にインタクトな形態の抗体を指す。具体的には、抗体全体はＦｃ領域を含む重鎖及び軽鎖を備えるものを含む。定常ドメインは、天然配列の定常ドメイン（例えばヒト天然配列の定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列変異体であってもよい。一部の場合において、インタクト抗体は１つ又は複数のエフェクター機能を有してもよい。
【００５９】
「抗体断片」は、インタクト抗体の一部、好ましくはインタクト抗体の抗原結合領域及び／又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片；ダイアボディ；直鎖状抗体（米国特許第5,641,870号，実施例2；Zapataら, Protein Eng.(タンパク質工学) 8(10): 1057-1062 [1995]を参照する）；一本鎖抗体分子、並びに抗体断片から形成される多重特異性抗体を含む。抗体をパパインで消化することにより、「Ｆａｂ」断片と称される２つの同一の抗原結合性断片、及び残りの「Ｆｃ」断片（容易に結晶化する能力を反映する命名）は産生される。Ｆａｂ断片は、軽鎖の全体と、重鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）と、１つの重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）とからなる。各Ｆａｂ断片は抗原結合の点で一価であり、即ち、それらは単一の抗原結合部位を有する。抗体をペプシンで処理することにより、ジスルフィド結合を介して連結されている２つのＦａｂ断片に大まかに対応し、異なる抗原結合活性を有するが抗原を架橋することが依然として可能である単一の大きなＦ（ａｂ’）２断片が産出される。Ｆａｂ’断片は、ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端でいくつかの追加残基（抗体ヒンジ領域から由来の１つ又は複数のシステインを含む）を有することにより、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は元々、その間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片のペアとして産生される。抗体断片の他の化学カップリングも公知である。Ｆｃ断片は、ジスルフィド結合によって一緒に保持されている２本の重鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、ある細胞タイプで見出されるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって認識される領域でもあるＦｃ領域における配列により決定される。
【００６０】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識・結合部位を含む最小限の抗体断片である。該断片は、堅固に非共有結合した１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。それらの２つのドメインのフォールディングから、抗原結合のためのアミノ酸残基を与え、且つ抗体に抗原結合特異性を付与する６つの超可変ループ（重鎖と軽鎖からはそれぞれ３つのループ）が突出している。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＨＶＲしか含まないＦｖの半分）でさえも、親和性が結合部位の全体より低いが、抗原を認識して結合する能力を有する。
【００６１】
「一本鎖Ｆｖ」は、「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも略され、抗体ＶＨ及びＶＬドメインを含むものが一本のポリペプチド鎖に連結してなる抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドはＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それによりｓＦｖが所望の抗原結合構造を形成することを可能にする。ｓＦｖの概説については、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies(モノクローナル抗体の薬理学), vol. 113, RosenburgとMoore編集, Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994)を参照する。
【００６２】
本発明の抗体の「機能性断片」はインタクト抗体の一部を含み、一般的に、インタクト抗体の抗原結合領域若しくは可変領域、又はＦｃＲ結合能を保持するか又は修飾されたＦｃＲ結合能を有する抗体のＦｃ領域を含む。抗体断片の実例は、直鎖抗体、一本鎖抗体分子、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体を含む。特に、例えばＦｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃとは一本鎖を指す）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃ断片のような抗体断片若しくはダイアボディ（diabody）、或いは、例えばポリエチレングリコール等のポリ（アルキレン）グリコールの添加（「ポリエチレングリコール化、ＰＥＧ化」）のような化学修飾若しくはリポソームへの封入によって半減期の増加が可能になり、且つＥＧＦＲ結合活性を有するいずれかの断片（Ｆｖ−ＰＥＧ、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ、Ｆａｂ−ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ’）２−ＰＥＧ又はＦａｂ’−ＰＥＧと称されるポリエチレングリコール化断片（「ＰＥＧ」はポリエチレングリコールである））を指す。好ましくは、前記機能性断片は、その由来である抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域の部分配列からなるもの或いはそれらを含むものであり、前記部分配列はその由来である抗体と同様な結合特異性及び十分な親和性を十分に保持でき、ＰＤ−Ｌ１に対して、その親和性は、好ましくはその由来である抗体の親和性の少なくとも１／１００に、より好ましい形態では少なくとも１／１０に等しい。このような機能性断片は、最小で５個のアミノ酸を、好ましくはその由来である抗体配列の１０、１５、２５、５０及び１００個の連続アミノ酸を含む。
【００６３】
本文におけるモノクローナル抗体は、具体的には、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、並びにそのような抗体の断片（それらが所望の生物学的活性を示す限り）を含み、それらにおいて、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種から由来する又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における相応の配列と同一又は相同であるが、鎖の残りの部分が、別の種から由来する又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における相応の配列と同一又は相同である（米国特許第4,816,567号； Morrisonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA(米国科学アカデミー紀要), 81: 6851-6855 (1984)）。本文の目的のキメラ抗体はＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ抗体を含み、ただし、該抗体の抗原結合領域は、例えば、マカクザルを目的の抗原で免疫化することによって産生される抗体から由来する。本文で使用する通り、「ヒト化抗体」は「キメラ抗体」のサブセットとして使用される。
【００６４】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形態とは、非ヒト免疫グロブリンから由来の配列を最小限で含むキメラ抗体を指す。
「ヒト抗体」とは、ヒトから作製された抗体のアミノ酸性配列に相応するアミノ酸配列を有し、及び／又は、本文で開示されるヒト抗体を産生するためのいずれかの技術を用いて産生される抗体を指す。ヒト抗体のこのような定義では、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体が明確に除外される。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含む本分野で公知の種々の技術を使用して産生することができる。HoogenboomとWinter，分子生物学雑誌(J.Mol.Biol.)227：381(1991)；Marksら，分子生物学雑誌(J.Mol.Biol.)222：581(1991)。ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能な方法は、Coleら, モノクローナル抗体と癌療法（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy）, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boernerら, J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)に記載される。さらに、van Dijkとvan de Winkel，カレント・オピニオン・イン・ファーマコロジー(Curr.Opin.Pharmacol.)，5：368-74(2001)を参照する。ヒト抗体は、抗原攻撃に応答してそのような抗体を産生するように修飾されているが、その内因性遺伝子座が無能になっているトランスジェニック動物（例えば免疫化ゼノマウス）に対して、抗原を投与することにより調製することができる（例えばゼノマウスTM技術に関する米国特許第6,075,181号及び第6,150,584号を参照する）。さらに、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して産生されるヒト抗体に関しては、例えばLiら, 米国科学アカデミー紀要（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）, 103: 3557-3562 (2006)を参照する。
【００６５】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基とは、本文で定義するＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基を指す。
本発明は、ＰＤ−Ｌ１に結合できる抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその機能性断片を提供する。本発明にかかる抗体又はその機能性断片は、以下の特性の少なくとも１種を有する：高親和性でＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１の相互作用を遮断できること；ＰＤ−Ｌ１に高特異性で結合できること。
【００６６】
本発明はさらに、ヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその機能性断片を提供する。前記ヒト化抗体は、免疫化マウスから産生されるマウス化抗体から、コンピューターシミュレーション設計によって、且つファージディスプレイ技術も併せて利用して得られるものである。
【００６７】
抗体活性に実質的に影響を与えない限り、当業者は本発明の配列に１個又はそれ以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０個、又はそれ以上）のアミノ酸を置換、添加及び／又は欠失することで、前記抗体又はその機能性断片の配列の変異体を得ることができる。それらはいずれも本発明の保護範囲内に含まれるとみなされる。例えば、可変領域において類似の性質を持つアミノ酸で置換することができる。本発明にかかる変異体の配列は、その由来である配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有してもよい。本発明にかかる配列同一性は、配列解析ソフトウェアを用いて計測することができる。例えばデフォルトパラメータのコンピュータープログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰ又はＴＢＬＡＳＴＮを使用してもよい。
【００６８】
本発明の抗体は、完全長のもの（例えばＩｇＧ１又はＩｇＧ４抗体）であってもよく、或いは抗原結合部分（例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2又はｓｃＦｖ断片）のみを含んでもよく、或いは修飾されてその機能が影響されてもよい。本発明は、修飾されたグリコシル化パターンを有する抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む。ある応用において、修飾によって不要のグリコシル化部位を除去することは役に立ち、或いは、例えば抗体の抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）機能を増強させるように、オリゴ糖鎖にフコース部分を存在させない。他のある応用において、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を改変するように、ガラクトシル化修飾を行ってもよい。
【００６９】
当業者は、本発明にかかる抗ＰＤ−Ｌ１抗体をコードするＤＮＡ分子をベクターにクローニングし、そして宿主細胞を形質転換することができる。したがって、本発明はさらに、本発明にかかる抗ＰＤ−Ｌ１抗体をコードするＤＮＡ分子を含む組換えＤＮＡベクターを提供する。
【００７０】
好ましくは、前記組換えＤＮＡベクターは発現ベクターであり、当業者が前記抗体のＤＮＡ分子を発現ベクターにクローニングし、宿主細胞を形質転換し、誘導発現によって抗体を得る。本発明にかかる発現ベクターは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の重鎖可変領域、軽鎖可変領域及び／又は定常領域のＤＮＡ配列を含む。しかしながら、重鎖可変領域及び定常領域を含むものと、軽鎖可変領域及び定常領域を含むものとの２種類の発現ベクターを別々に構築し、哺乳動物細胞をコトランスフェクションすることもできる。一つの好ましい実施形態において、前記発現ベクターはさらに、プロモーター及び分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、並びに少なくとも１種のスクリーニング用薬剤耐性遺伝子を含む。
【００７１】
本発明にかかる宿主細胞は、原核宿主細胞、真核宿主細胞又はファージであってもよい。前記原核宿主細胞は、大腸菌、枯草菌、ストレプトマイセス又はミラビリス変形菌等であってもよい。前記真核宿主細胞は、ピキア・パストリス、シゾサッカロミセスセレビシエ、分裂酵母、トリコデルマ等の真菌、ツマジロクサヨトウ等の昆虫細胞、タバコ等の植物細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、骨髄腫細胞等の哺乳動物細胞であってもよい。ある実施形態において、本発明にかかる宿主細胞は、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞又はＣＯＳ細胞である。
【００７２】
本文で用いられる「医薬組成物」という用語は、ある特定の目的を果たすために共に組み合わせる、少なくとも１種の薬物と、任意の薬学的に許容される担体又は補助剤との組み合わせを示す。ある実施形態において、前記医薬組成物は、共同に作用して本発明の目的を果たすことさえできれば、時間的に及び／又は空間的に分かれる組み合わせを含む。例えば、前記薬物組成物に含まれる成分（例えば本発明にかかる抗体、核酸分子、核酸分子の組み合わせ及び／又は抱合体）は、全体として対象に投与してもよく、又は別々に対象に投与してもよい。前記医薬組成物に含まれる成分が別々に対象に投与される場合、前記成分は同時に又は順次に対象に投与してもよい。好ましくは、前記薬学的に許容される担体は、水、緩衝水溶液、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝液）のような等張塩溶液、葡萄糖、マンニトール、デキストロース、乳糖、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸マグネシウム、０．３％グリセリン、ヒアルロン酸、エタノール又はポリプロピレングリコールのようなポリアルキレングリコール、トリグリセリド等である。前記薬学的に許容される担体のタイプは、特に、本発明にかかる組成物が経口、経鼻、皮内、皮下、筋肉内又は静脈内の投与のために配合されるか否かによるものである。本発明にかかる組成物は、湿潤剤、乳化剤又は緩衝液物質を添加剤として含んでもよい。
【００７３】
本発明にかかる医薬組成物は、適切な経路のいずれかを経って投与してもよく、例えば、経口、経鼻、皮内、皮下、筋肉内又は静脈内で投与することができる。
一つの関連する点で、本発明は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体と第２の治療剤の組み合わせである医薬組成物を提供する。一つの実施形態において、前記第２の治療剤は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体と有利に組み合わせる任意の試薬である。抗ＰＤ−Ｌ１抗体と有利に組み合わせる例示的な試薬は、ＰＤ−Ｌ１活性を抑制する他の試薬（他の抗体又はその抗原結合断片、ペプチド阻害剤、小分子拮抗剤等を含む）及び／又はＰＤ−Ｌ１上流又は下流のシグナル伝達を阻害する試薬を含むが、それらに限定されるものではない。
【００７４】
本文で用いられる「ＰＤ−Ｌ１活性を消失、抑制又は低下させることで疾患又は病症を予防又は治療する」という用語とは、ＰＤ−Ｌ１の発現によって引き起こされる、或いはＰＤ−Ｌ１の発現を症状／特徴とする疾患又は病症を指し、癌や炎症性疾患のようなＴ細胞機能不全疾患を含む。ある実施形態において、本発明にかかる癌は、胃癌、肺癌、肝癌、肝内胆管癌、結腸癌、膵癌、卵巣癌、乳癌、子宮頸癌、頭頸部扁平上皮癌、上咽頭癌、食管癌、膀胱癌、腎細胞癌、皮膚癌、口腔扁平上皮癌を含むが、それらに限定されるものではない。
【００７５】
本文で用いられる「治療有効量」とは、投与対象に対するメリットを示すのに十分な投与量を指す。実際の投与量、並びに投与の速度と時間スケジュールは、治療を受ける者自身の状況及び重篤度に応じて決定される。治療の処方（例えば投与量の決定等）は、最終的に、総合診療医及び他の医者の責任で、それらによって決定され、通常は治療される疾患、患者の個人状況、送達部位、投与手段及び医者にとって既知の他の要素を考慮する。
【００７６】
本文で用いられる「対象」という用語は、ヒトのような哺乳動物を指すが、他の動物、例えば野生動物（例えばアオサギ、コウノトリ、ツル等）、家畜（例えばカモ、ガチョウ等）又は実験動物（例えばオランウータン、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモット等）であってもよい。
【００７７】
本発明の一つにおいて、本発明にかかる抗体又はその機能性断片は、アミノ酸配列番号７、８、９、１３、１４、１５、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２８、２９、３０若しくは前記配列のいずれかの変異体からなる群から選ばれる重鎖ＣＤＲ、及び／又はアミノ酸配列番号１、２、３、４、５、６、１０、１１、１２、１６、１７、１８、２５、２６、２７若しくは前記配列のいずれかの変異体からなる群から選ばれる軽鎖ＣＤＲを含む。ある好ましい実施形態において、本発明にかかる抗体又はその機能性断片において、重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列は、配列番号７、８、９、１３、１４、１５、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２８、２９及び３０に示す配列から選ばれる、及び／又は軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、１０、１１、１２、１６、１７、１８、２５、２６及び２７に示す配列から選ばれる。
【００７８】
ある好ましい実施形態において、本発明にかかる抗体又はその機能性断片の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号７、１３、１９、２２若しくは２８又は前記配列のいずれかの変異体に示す。ある好ましい実施形態において、本発明にかかる抗体又はその機能性断片の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号８、１４、２０、２３若しくは２９又は前記配列のいずれかの変異体に示す。本発明にかかる抗体又はその機能性断片の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号９、１５、２１、２４若しくは３０又は前記配列のいずれかの変異体に示す。
【００７９】
ある好ましい実施形態において、本発明にかかる抗体又はその機能性断片の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号７、１３、１９、２２若しくは２８又は前記配列のいずれかの変異体に示す；重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号８、１４、２０、２３若しくは２９又は前記配列のいずれかの変異体に示す；及び、重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号９、１５、２１、２４若しくは３０又は前記配列のいずれかの変異体に示す。
【００８０】
ある好ましい実施形態において、前記抗体又はその機能性断片の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３のアミノ酸配列は、以下の各アミノ酸配列若しくはその変異体の組み合わせからなる群から選ばれる１種の組み合わせである：
【００８１】
【表４】
2020508079.tif 000005
。
【００８２】
ある好ましい実施形態において、本発明にかかる抗体又はその機能性断片の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号１、４、１０、１６若しくは２５又は前記配列のいずれかの変異体に示す。ある好ましい実施形態において、本発明にかかる抗体又はその機能性断片の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号２、５、１１、１７若しくは２６又は前記配列のいずれかの変異体に示す。本発明にかかる抗体又はその機能性断片の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号３、６、１２、１８若しくは２７又は前記配列のいずれかの変異体に示す。
【００８３】
ある好ましい実施形態において、本発明にかかる抗体又はその機能性断片の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号１、４、１０、１６若しくは２５又は前記配列のいずれかの変異体に示す；軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号２、５、１１、１７若しくは２６又は前記配列のいずれかの変異体に示す；及び、軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号３、６、１２、１８若しくは２７又は前記配列のいずれかの変異体に示す。
【００８４】
ある好ましい実施形態において、前記抗体又はその機能性断片の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３のアミノ酸配列は、以下の各アミノ酸配列若しくはその変異体の組み合わせからなる群から選ばれる１種の組み合わせである：
【００８５】
【表５】
2020508079.tif 000006
。
【００８６】
ある好ましい実施形態において、本発明にかかる抗体又はその機能性断片の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号７、１３、１９、２２若しくは２８又は前記配列のいずれかの変異体に示す；重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号８、１４、２０、２３若しくは２９又は前記配列のいずれかの変異体に示す；及び、重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号９、１５、２１、２４若しくは３０又は前記配列のいずれかの変異体に示す；並びに、軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号１、４、１０、１６若しくは２５又は前記配列のいずれかの変異体に示す；軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号２、５、１１、１７若しくは２６又は前記配列のいずれかの変異体に示す；及び、軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号３、６、１２、１８若しくは２７又は前記配列のいずれかの変異体に示す。
【００８７】
ある好ましい実施形態において、前記抗体又はその機能性断片の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３のアミノ酸配列は、以下の各アミノ酸配列若しくはその変異体の組み合わせからなる群から選ばれる１種の組み合わせである：
【００８８】
【表６】
2020508079.tif 000007
【００８９】
；及び／又は、前記軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３のアミノ酸配列は、以下の各アミノ酸配列若しくはその変異体の組み合わせからなる群から選ばれる１種の組み合わせである：
【００９０】
【表７】
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。
【００９１】
ある好ましい実施形態において、本発明にかかる抗体又はその機能性断片の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３及び軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３のアミノ酸配列は、以下の各アミノ酸配列若しくはその変異体の組み合わせからなる群から選ばれる１種の組み合わせである：
【００９２】
【表８】
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【００９３】
ある実施形態において、本発明にかかる抗体又はその機能性断片は、アミノ酸配列番号３３、３５、３７、３８、４０若しくは前記配列のいずれかの変異体からなる群から選ばれる重鎖可変領域、及び／又はアミノ酸配列番号３１、３２、３４、３６、３９若しくは前記配列のいずれかの変異体からなる群から選ばれる軽鎖可変領域を含む。ある実施形態において、本発明にかかる抗体又はその機能性断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号３３、３５、３７、３８若しくは４０に示す、及び／又はその軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号３１、３２、３４、３６若しくは３９に示す。
【００９４】
一つの好ましい実施形態において、前記重鎖可変領域は配列番号３３又はその変異体であり、且つ前記軽鎖可変領域は配列番号３１又はその変異体である。
もう一つの好ましい実施形態において、前記重鎖可変領域は配列番号３３又はその変異体であり、且つ前記軽鎖可変領域は配列番号３２又はその変異体である。
【００９５】
さらに一つの好ましい実施形態において、前記重鎖可変領域は配列番号３５又はその変異体であり、且つ前記軽鎖可変領域は配列番号３４又はその変異体である。
さらに一つの好ましい実施形態において、前記重鎖可変領域は配列番号３７又はその変異体であり、且つ前記軽鎖可変領域は配列番号３６又はその変異体である。
【００９６】
さらに一つの好ましい実施形態において、前記重鎖可変領域は配列番号３８又はその変異体であり、且つ前記軽鎖可変領域は配列番号３６又はその変異体である。
さらに一つの好ましい実施形態において、前記重鎖可変領域は配列番号４０又はその変異体であり、且つ前記軽鎖可変領域は配列番号３９又はその変異体である。
【００９７】
本発明にかかる抗体又はその機能性断片は、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体であってもよい。
本発明にかかる抗体又はその機能性断片はヒト化のものであってもよい。ヒト化抗体を調製する方法は当業者によく知られる。例えば、本発明のＣＤＲ配列をヒト抗体可変領域に転移することにより、本発明のヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体を調製することができる。前記ヒト化抗体は、抗抗体反応（ＡＡＲ）及びヒト抗マウス抗体反応（ＨＡＭＡ）を発生せず、抗抗体に中和されて早速に排除されるものではなく、且つ免疫エフェクター機能を有する。
【００９８】
ある好ましい実施形態において、本発明にかかるヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体又はその機能性断片は、アミノ酸配列番号３３、３５、３７、３８、４０若しくは前記配列のいずれかの変異体からなる群から選ばれる重鎖可変領域、及び／又はアミノ酸配列番号３１、３２、３４、３６、３９若しくは前記配列のいずれかの変異体からなる群から選ばれる軽鎖可変領域を含む。ある実施形態において、本発明にかかるヒト化抗ＰＤ−Ｌ１抗体又はその機能性断片の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号３３、３５、３７、３８若しくは４０に示す、及び／又はその軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号３１、３２、３４、３６若しくは３９に示す。
【００９９】
本発明にかかるヒト化抗体又はその機能性断片の一つの好ましい実施形態において、前記重鎖可変領域は配列番号３３又はその変異体であり、且つ前記軽鎖可変領域は配列番号３１又はその変異体である。
【０１００】
本発明にかかるヒト化抗体又はその機能性断片の一つの好ましい実施形態において、前記重鎖可変領域は配列番号３３又はその変異体であり、且つ前記軽鎖可変領域は配列番号３２又はその変異体である。
【０１０１】
本発明にかかるヒト化抗体又はその機能性断片のもう一つの好ましい実施形態において、前記重鎖可変領域は配列番号３５又はその変異体であり、且つ前記軽鎖可変領域は配列番号３４又はその変異体である。
【０１０２】
本発明にかかるヒト化抗体又はその機能性断片のもう一つの好ましい実施形態において、前記重鎖可変領域は配列番号３８又はその変異体であり、且つ前記軽鎖可変領域は配列番号３６又はその変異体である。
【０１０３】
本発明にかかるヒト化抗体又はその機能性断片のさらに一つの好ましい実施形態において、前記重鎖可変領域は配列番号３７又はその変異体であり、且つ前記軽鎖可変領域は配列番号３６又はその変異体である。
【０１０４】
本発明にかかるヒト化抗体又はその機能性断片のさらに一つの好ましい実施形態において、前記重鎖可変領域は配列番号４０又はその変異体であり、且つ前記軽鎖可変領域は配列番号３９又はその変異体である。
【０１０５】
本発明にかかるヒト化抗体又はその機能性断片のさらに一つの好ましい実施形態において、前記重鎖可変領域は配列番号４４又はその変異体であり、且つ前記軽鎖可変領域は配列番号４２又はその変異体である。
【０１０６】
本発明にかかるヒト化抗体又はその機能性断片のさらに一つの好ましい実施形態において、前記重鎖可変領域は配列番号４８又はその変異体であり、且つ前記軽鎖可変領域は配列番号４６又はその変異体である。
【０１０７】
本発明はさらに、本発明にかかる抗体又はその機能性断片をコードする分離された核酸分子を提供する。したがって、本発明は、本発明にかかるＣＤＲ、軽鎖可変領域又は重鎖可変領域をコードする核酸分子を提供し、それは、配列番号１〜４０、４２、４４、４６及び４８に示すアミノ酸配列をコードする核酸分子を含むが、それらに限定されるものではない。一つの好ましい実施形態において、前記核酸分子は、配列番号４３、４７及び／又は４５、４９に示すヌクレオチド配列又はその組み合わせを含む。ある実施形態において、本発明にかかる核酸分子は配列番号４３、４７、４５又は４９に示す。
【０１０８】
本発明はさらに、前記核酸分子を含む発現ベクター、並びに前記発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
本発明は、前記抗体又はその機能性断片の産生が可能である条件下で本発明にかかる前記宿主細胞を培養すること、並びにそれによって産生した前記抗体又はその機能性断片を回収することを含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体又はその機能性断片を産生する方法を提供する。
【０１０９】
本発明のもう一つにおいて、治療剤と抱合した本発明にかかる抗体又はその機能性断片を含む免疫抱合体に関する。前記治療剤は、毒素、放射性同位体、薬物又は細胞毒剤であることが好ましい。
【０１１０】
本発明はさらに、本発明にかかる抗体又はその機能性断片と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
本発明のもう一つにおいて、その必要のある対象に、治療有効量の本発明にかかる抗体又はその機能性断片、核酸、発現ベクター、宿主細胞、免疫抱合体又は医薬組成物を投与することを含む、ＰＤ−Ｌ１活性を消失、抑制又は低下させることで疾患又は病症を予防又は治療する方法を提供する。
【０１１１】
本発明はさらに、本発明にかかる抗体又はその機能性断片、核酸、発現ベクター、宿主細胞、免疫抱合体又は医薬組成物の、疾患又は病症を治療する薬物の製造における使用を提供する。
【実施例】
【０１１２】
以下の実施例を提供することで、本発明のある好ましい実施形態と方面をさらに証明・解釈するが、それらは発明の範囲に対する制限と解釈すべきではない。
【０１１３】
［実施例１］ヒトＰＤ−Ｌ１細胞外ドメインの真核発現プラスミドへのクローニング
義翹神州からヒトＰＤ−Ｌ１遺伝子ｃＤＮＡ配列を含有するプラスミドＨＧ１００８４−Ｍを購入し、フォワードプライマー５’−ＧＴＡＣＧＣＴＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＧＡＴＡＴＴＴＧＣＴＧＴＣ−３’（配列番号５０）とリバースプライマー５’−ＧＡＴＣＣＴＣＧＡＧＣＧＴＧＡＧＴＣＣＴＴＴＣＡＴＴＴＧＧ−３’（配列番号５１）を利用して、ヒトＰＤ−Ｌ１細胞外断片（ヌクレオチド配列は配列番号４１に示す）をＰＣＲ増幅した。増幅した断片をＮｈｅＩとＸｈｏＩで二重酵素切断した後、自力で構築した真核発現プラスミド系（pSec CAGA2 ECD、pCDNA3.1プラスミドを基に改造して得られたもの、図１Ａに示す）にクローニングし、該プラスミドでＰＥＩによって２９３  Ｅ細胞をトランスフェクションし、６日後、培地上澄を収集し、アフィニティークロマトグラフィーで精製し、ヒトＰＤ−Ｌ１細胞外領域タンパク質を得た。結果は図１Ｂに示すように、ヒトＰＤ−Ｌ１細胞外領域タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥをクマシーブリリアントブルーで染色すると、７５Ｋダルトン程度の大きさを示した。
【０１１４】
［実施例２］ＥｌｉｓａによるヒトＰＤ−Ｌ１組換えタンパク質とヒトＰＤ−１の結合の検出
（２．１  ビオチン標識ヒトＰＤ−Ｌ１組換えタンパク質）
ヒトＰＤ−Ｌ１組換えタンパク質（即ち実施例１で得られたヒトＰＤ−Ｌ１細胞外領域タンパク質）と、ＤＭＳＯに溶解されたビオチン−ＮＨＳとを１：１０のモル比の割合で混合し、摂氏４度で２時間放置し、反応混合物を１０ｋＤの限外濾過カラムに通過させることで、ビオチン標識ヒトＰＤ−Ｌ１と遊離のビオチンを分離した。
【０１１５】
（２．２  ＥＬＩＳＡによるビオチン標識ヒトＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１の結合）
ヒトＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１の結合能を検討するために、９６ウェルマイクロプレートにおいて、２μｇ／ｍｌのＰＤ−１を被覆緩衝液中に展開させ、４℃で一晩経過した。翌日、ウェル内の溶液を捨て、洗浄緩衝液で３回洗浄した。その後、２％牛乳含有ＰＢＳ溶液を加え、６０分間ブロッキングした。洗浄緩衝液で３回洗浄してから、異なる濃度のビオチン標識ヒトＰＤ−Ｌ１を１００μｌ加え、室温で１時間インキュベートした後、洗浄緩衝液で３回リンスし、洗浄緩衝液で１：１００００倍でＨＲＰ−ストレプトアビジンを希釈し、室温で１時間インキュベートし、洗浄緩衝液で３回リンスしてから、ＴＭＢ基質溶液を５０μｌ加えて発色し、室温で８分間反応させた後、２Ｍの塩酸溶液１００μｌで反応を中止させ、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。
【０１１６】
結果は図２に示すように、ビオチン標識ヒトＰＤ−Ｌ１組換えタンパク質はＰＤ−１に特異的に結合できる。
【０１１７】
［実施例３］ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１の結合の細胞レベル検出
（３．１  ２９３ＦヒトＰＤ−１安定発現細胞株の樹立）
構築されたピューロマイシンスクリーニング系付きＰＤ−１完全長配列真核発現ベクターを２９３Ｆ接着細胞にＰＥＩトランスフェクションした。トランスフェクションの２４ｈ後、ピューロマイシン（２μｇ／ｍｌ）によって、２９３Ｆ  ＰＤ−１安定発現細胞が形成するまでスクリーニングした。同時に、限界希釈法により、１ウェルあたり０．８個の細胞を９６ウェルプレートに播き、１５日後、２９３Ｆ  ＰＤ−１モノクローンを選別して継代し、２９３Ｆ  ＰＤ−１安定発現細胞株を形成した。
【０１１８】
（３．２  ビオチン標識ヒトＰＤ−Ｌ１と２９３Ｆ  ＰＤ−１安定発現細胞株の結合）
異なる濃度のビオチン標識ヒトＰＤ−Ｌ１組換えタンパク質（即ち実施例１で得られたヒトＰＤ−Ｌ１細胞外領域タンパク質）を２９３Ｆ  ＰＤ−１安定発現細胞懸濁液と混合し、摂氏３７度で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  Ｃａ2+、１％  ＦＢＳ、ｐＨ  ７．４）で３回洗浄した後、ストレプトアビジン−アロフィコシアニン（ＳＡ−ＡＰＣ，２μｇ／ｍｌ）を加え、室温で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した後、フローサイトメーターで検出した。
【０１１９】
結果は図３に示すように、ビオチン標識ＰＤ−Ｌ１は２９３Ｆ細胞におけるＰＤ−１に特異的に結合できる。
【０１２０】
［実施例４］抗ＰＤ−Ｌ１マウス化抗体の調製
（４．１  動物の免疫）
実施例１で得られたヒトＰＤ−Ｌ１組換えタンパク質を抗原として等量の免疫アジュバント（フロインドアジュバント）と混合し、５匹の６週齢メスＦＶＢマウスにて皮下免疫を行った。初回免疫の後、週に１回追加免疫し、合計で４回の免疫を行った。
【０１２１】
（４．２  細胞の融合）
最終の追加免疫の後、マウスの脚の付け根のリンパ節を取り、生理食塩水中で磨砕した後、リンパ球リッチ懸濁液を取り、通常のエレクトロポレーション方法（ＢＴＸ社のエレクトロポレーターハンドブックを参照する）でそれをＳＰ２／０細胞と融合させた。融合細胞をＨＡＴ含有ＲＰＭＩ−１６４０完全培地（Ｓｉｇｍａ）中において、５％  ＣＯ2、３７℃の条件下で培養した。
【０１２２】
［実施例５］ハイブリドーマ細胞のスクリーニング実験
１２０００株の異なるモノクローナルハイブリドーマ細胞から、酵素（Ｅｌｉｓａ）反応により、分泌される抗体がヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質に結合できるクローンを９５０株スクリーニングした。それらの９５０株のクローンの中で、１３９株は２９３Ｆ細胞に発現されるＰＤ−Ｌ１に結合できた。それらの１３９株のクローンの中で、２３株はビオチン標識ヒトＰＤ−Ｌ１と２９３におけるＰＤ−１の結合を阻害する能力を備えた。我々はこの２３株のクローンをめぐって次の実験を行った。
【０１２３】
以上で得られた２３株の抗体を直接にビオチン標識ヒトＰＤ−Ｌ１（１０μｇ／ｍｌ）と混合し、室温で３０分間インキュベートした。その後、混合物と２９３Ｆ  ＰＤ−１安定発現細胞株懸濁液を摂氏３７度で３０分間インキュベートし、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した後、５μｇ／ｍｌのＳＡ−ＡＰＣを加え、３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した後、フローサイトメーター検出により、ハイブリドーマ細胞から分泌される抗体がヒトＰＤ−Ｌ１と２９３Ｆ細胞表面におけるＰＤ−１の結合を阻害できるか否かを検討した。
【０１２４】
結果は図４に示すように、クローン１、２、４、６、１６、１７、１８、２１は、ＰＤ−Ｌ１と２９３Ｆ細胞におけるＰＤ−１の結合に対して良好な阻害効果を有する。
【０１２５】
［実施例６］候補抗体のＪｕｒｋａｔ・フルオレセイン分析
ＰＤ−Ｌ１を発現するＣＨＯ細胞を９６ウェルプレートに播き、１ウェルあたりの細胞量を５×１０4にし、３７℃、７％  ＣＯ2で一晩培養し、細胞上澄を取り除き、各ウェルに抗体希釈液（初期濃度が６０μｇ／ｍｌで、３倍の濃度勾配で希釈した）を４０μｌ加え、ＰＤ−１及びＮＦＡＴ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子を持続発現できるＪｕｒｋａｔレポーター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ社から購入した）を４０μｌ加え、総細胞数を１×１０5細胞にし、３７℃、７％  ＣＯ2で６時間培養し、ルシフェラーゼ試薬を加え、マイクロプレートリーダーで発光値を検出した。
【０１２６】
結果は図５に示すように、フルオレセインの検出結果から明らかなように、クローン４、６、１６、１７、１８及び２１はＰＤ−Ｌ１のＪｕｒｋａｔ細胞におけるルシフェラーゼ発現に対する阻害現象に対して、顕著な回復作用を有する。
【０１２７】
［実施例７］候補抗体とヒトＰＤ−Ｌ１組換えタンパク質の結合定数の測定
表９に示すように、ＦｏｒｔｅＢｉｏ装置により、異なるマウス化抗体とヒトＰＤ−Ｌ１の間の結合定数を測定した。結果から明らかなように、実施例５で調製したマウス化抗体４、６、１６、１７、１８及び２１はいずれもヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合できる。
【０１２８】
【表９】
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【０１２９】
［実施例８］候補抗体可変領域配列の獲得
ハイブリドーマ細胞に発現される抗体の発現量、活性、タイプ等を考慮して、クローン６、１６、１８、２１を選択して、引き続き実験を行った。候補ハイブリドーマ細胞を培養し、１０００ｒｐｍ遠心で細胞を収集し、Ｔｒｉｚｏｌで全ＲＮＡを抽出した。それを鋳型として第一鎖ｃＤＮＡを合成してから、該第一鎖ｃＤＮＡを次の鋳型として、ハイブリドーマ細胞に相応する可変領域ＤＮＡ配列を増幅した。増幅反応に用いられたプライマー配列は、抗体可変領域の第一フレームワーク領域及び定常領域と相補していた(Larrick，J.W.ら，1990，Scand.J.Immunol.，32，121-128及びColoma，J.J.ら，(1991)BioTechniques，11，152-156)。５０μｌの反応系において、それぞれｃＤＮＡを１μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液を５μｌ、上流及び下流プライマーをそれぞれ１μｌ（２５  ｐｍｏｌ）、ｄＮＴＰを１μｌ、２５  ｍｍｏｌＰＬ  ＭｇＣｌ2を１μｌ、Ｈ2Ｏを３９μｌ加え、９５℃で１０  ｍｉｎ初期変性し、Ｔａｑ酵素を１μｌ加え、温度のサイクルに入ってＰＣＲ増幅を行った。反応条件は、９４℃で１  ｍｉｎの変性、５８℃で１  ｍｉｎのアニーリング、７２℃で１５ｓの伸長というサイクルを、合計で３２回行い、そして７２℃で１０  ｍｉｎ保温した。
【０１３０】
NCBI Ig-Blast(http://www.ncbi.nlm.nih. gov/projects/igblast/)を用いて、生殖系列及び再配列Ｉｇ可変領域配列データベースから共有配列を検索した。Ｋａｂａｔ（Wu,T.TとKabat,E.A. 1970 J.Exp.Med.,132:211-250）及びＩＭＧＴシステム（Lefranc M.-P.ら，1999 Nucleic Acids Research,27,209-212)に基づき、配列ラベリング及びインターネットに基づく配列解析（http ://www. Imgt.org/IMGT_vquest/share/ textes/index.html与http ://www.ncbi.nlm.nih. gov/igblast/)により相補性決定領域（CDR)を同定した。
【０１３１】
ハイブリドーマ細胞にコードされる軽鎖と重鎖の可変領域及びＣＤＲのアミノ酸配列は下表に示す（配列表で開示された配列に相応する）：
増幅産物のシーケンシングをすると、得られた候補ハイブリドーマの重鎖と軽鎖の可変領域配列は：
クローン６：
軽鎖：配列番号３１；
ＬＣＤＲ１：配列番号１；
ＬＣＤＲ２：配列番号２；
ＬＣＤＲ３：配列番号３；
軽鎖変異体：配列番号３２；
ＬＣＤＲ１：配列番号４；
ＬＣＤＲ２：配列番号５；
ＬＣＤＲ３：配列番号６；
重鎖：配列番号３３；
ＨＣＤＲ１：配列番号７；
ＨＣＤＲ２：配列番号８；
ＨＣＤＲ３：配列番号９。
【０１３２】
クローン１６：
軽鎖：配列番号３４；
ＬＣＤＲ１：配列番号１０；
ＬＣＤＲ２：配列番号１１；
ＬＣＤＲ３：配列番号１２；
重鎖：配列番号３５；
ＨＣＤＲ１：配列番号１３；
ＨＣＤＲ２：配列番号１４；
ＨＣＤＲ３：配列番号１５。
【０１３３】
クローン１８：
軽鎖：配列番号３６；
ＬＣＤＲ１：配列番号１６；
ＬＣＤＲ２：配列番号１７；
ＬＣＤＲ３：配列番号１８；
重鎖：配列番号３７；
ＨＣＤＲ１：配列番号１９；
ＨＣＤＲ２：配列番号２０；
ＨＣＤＲ３：配列番号２１；
重鎖変異体：配列番号３８；
ＨＣＤＲ１：配列番号２２；
ＨＣＤＲ２：配列番号２３；
ＨＣＤＲ３：配列番号２４。
【０１３４】
クローン２１：
軽鎖：配列番号３９；
ＬＣＤＲ１：配列番号２５；
ＬＣＤＲ２：配列番号２６；
ＬＣＤＲ３：配列番号２７；
重鎖：配列番号４０；
ＨＣＤＲ１：配列番号２８；
ＨＣＤＲ２：配列番号２９；
ＨＣＤＲ３：配列番号３０であった。
【０１３５】
［実施例９］キメラ抗体発現ベクターの構築
ヒト血細胞（北京血液研究所）から重鎖定常領域Ｆｃ断片及び軽鎖ｋ定常領域をクローニングし、ｐＣＤＮＡ３．１プラスミドに組み込んで(Walls MA，Hsiao HとHarris LJ(1993)，Nucleic Acids Research，Vol.21，No.122921-2929を参照する)改造を行った。実施例８に記載のクローン６、１６、１８、２１の重鎖と軽鎖の可変領域配列断片をＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社に合成してもらい、重鎖をＢｓｐｑ  Ｉで切断し、軽鎖をＢｓｐｑ  Ｉで切断した後、相応に改造されたｐＣＤＮＡ３．１プラスミドに組み込み、且つシーケンシングによって正確なクローンを決定した。次の実験材料はいずれも、該シリーズのプラスミドで細胞をトランスフェクションしてから抽出して得られるものであった。
【０１３６】
［実施例１０］Ｅｌｉｓａによるキメラ抗体とヒトＰＤ−１の結合の検出
９６ウェルマイクロプレートを０．５μｇ／ｍｌのヒトＰＤ−Ｌ１で被覆し、摂氏３７度で６０分間恒温インキュベートした。その後、ウェル内の溶液を捨て、洗浄緩衝液で３回洗浄し、２％  ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液を加えて６０分間ブロッキングした。洗浄緩衝液で３回洗浄してから、勾配希釈した抗体を加え、摂氏３７度で６０分間インキュベートした後、洗浄緩衝液で３回リンスし、次に１：１００００倍で希釈したビオチン−抗ＩｇＧ４抗体を加え、摂氏３７度で１時間インキュベートし、洗浄緩衝液で３回リンスしてから、洗浄緩衝液で１：１００００倍で希釈したＨＰＲ−ストレプトアビジンを加え、室温で１時間インキュベートし、洗浄緩衝液で３回リンスしてから、ＴＭＢ基質溶液を１００μｌ加えて発色し、室温で３０分間反応させた後、２Ｍの塩酸溶液１００μｌで反応を中止させ、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。
【０１３７】
図６の結果から分かるように、キメラ抗体２４、２５はＰＤ−Ｌ１に特異的に結合でき、それらのＥＣ５０はそれぞれ７．７８２  ｎｇ／ｍＬと９．２３３  ｎｇ／ｍＬであった。
【０１３８】
［実施例１１］キメラ抗体と２９３Ｆ細胞におけるＰＤ−Ｌ１の結合
ＰＤ−Ｌ１を発現する２９３Ｆ細胞を消化してから、遠心でＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、細胞量が〜２．５×１０4で体積が５０μｌになるように１．５ｍｌ  ＥＰチューブに入れ、異なる濃度のキメラ抗体希釈液を５０μｌ加えて均一に混合し、室温で３０ｍｉｎインキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を２回洗浄してから、ヒツジ抗ヒトＩｇＧ−ＰＥ抗体を１００μｌ加え、遮光で３０ｍｉｎインキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄してから、ＦＡＣＳ検出を行った。
【０１３９】
結果は図７に示すように、キメラ抗体２４、２５は２９３Ｆ細胞におけるＰＤ−Ｌ１に特異的に結合できる。それらのＥＣ50はそれぞれ０．０９０９２μｇ／ｍＬと０．１３２９μｇ／ｍＬであった。
【０１４０】
［実施例１２］キメラ抗体によるヒトＰＤ−Ｌ１と２９３Ｆ細胞におけるＰＤ−１の結合に対する阻害
組換え発現のキメラ抗体を取り（１０μｇ／ｍｌ）、ビオチン標識ヒトＰＤ−Ｌ１（即ち実施例１で得られたヒトＰＤ−Ｌ１細胞外領域タンパク質、１μｇ／ｍｌ）と混合し、室温で３０分間インキュベートした。その後、混合物と２９３Ｆ  ＰＤ−１安定発現細胞株（１．５×１０5細胞）懸濁液を摂氏３７度で１５分間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した後、５μｇ／ｍｌのＳＡ−ＡＰＣを加え、室温で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、フローサイトメーター検出により、キメラ抗体がヒトＰＤ−Ｌ１と２９３Ｆ細胞表面におけるＰＤ−１の結合を阻害できるか否かを検討した。
【０１４１】
結果は図８に示すように、キメラ抗体２４及び２５はヒトＰＤ−Ｌ１と２９３Ｆ細胞表面におけるＰＤ−１の結合を特異的に阻害できる。それらのＥＣ50はそれぞれ１３３．１μｇ／ｍＬと２１．１７μｇ／ｍＬであった。
【０１４２】
［実施例１３］キメラ抗体のＪｕｒｋａｔ・フルオレセイン分析
ＰＤ−Ｌ１を発現するＣＨＯ細胞を９６ウェルプレートに播き、１ウェルあたりの細胞量を５×１０4にし、３７℃、７％  ＣＯ2で一晩培養し、細胞上澄を取り除き、各ウェルに抗体希釈液（初期濃度が６０μｇ／ｍｌで、３倍の濃度勾配で希釈した）を４０μｌ加え、ＰＤ−１及びＮＦＡＴ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子を持続発現できるＪｕｒｋａｔレポーター細胞を４０μｌ加え、総細胞数を１×１０5細胞にし、３７℃、７％  ＣＯ2で６時間培養し、ルシフェラーゼ試薬を加え、マイクロプレートリーダーで発光値を検出した。
【０１４３】
結果は図９に示すように、キメラ抗体２４及び２５は、ヒトＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１の結合を特異的に阻害し、レポーター遺伝子の発現を促進することができる。それらのＥＣ50はそれぞれ０．１７９６μｇ／ｍＬと０．０６１６６μｇ／ｍＬであった。
【０１４４】
［実施例１４］抗体のヒト化修飾
以上で得られたハイブリドーマ細胞が分泌した抗体の可変領域配列に応じて、ヒト化修飾を行った。簡単に言えば、ヒト化修飾過程は以下の工程に関する：Ａ、各ハイブリドーマ細胞が分泌した抗体の遺伝子配列をヒト胎児性抗体遺伝子配列とアラインメントし、相同性の高い配列を見出す；Ｂ、ＨＬＡ−ＤＲの親和性を解析・調査し、親和性の低いヒト胎児性フレームワーク配列を選別する；Ｃ、コンピューターシミュレーション技術を利用し、分子ドッキングを用いて、可変領域及びその周辺のフレームワークのアミノ酸配列を解析し、その三次元的な結合形態を調査した。静電力、ファン・デル・ワールス力、親疎水性及びエントロピーを計算することにより、各ハイブリドーマ細胞が分泌した抗体の遺伝子配列の中で、ＰＤ−１と作用でき且つ三次元的フレームワークを維持できる肝心なアミノ酸個体を解析し、それを選択されたヒト胎児性遺伝子フレームワークにグラフトした上で、保留の必要があるフレームワーク領域のアミノ酸部位を標示し、ヒト化抗体を合成した（Pini, A.ら, (1998). Design and Use of a Phage Display Library: HUMAN ANTIBODIES WITH 10 SUBNANOMOLAR AFFINITY AGAINST A MARKER OF ANGIOGENESIS ELUTED FROM A TWO-DIMENSIONAL GEL.,Journal of Biological Chemistry, 273(34): 21769-21776）。それに基づき、以下の２つのヒト化抗体３０及び３８が得られた：
ヒト化抗体３０軽鎖：
配列番号４２、軽鎖アミノ酸配列；
配列番号４３、軽鎖ヌクレオチド配列；
ヒト化抗体３０重鎖：
配列番号４４、重鎖アミノ酸配列；
配列番号４５、重鎖ヌクレオチド配列。
【０１４５】
ヒト化抗体３８軽鎖：
配列番号４６、軽鎖アミノ酸配列；
配列番号４７、軽鎖ヌクレオチド配列；
ヒト化抗体３８重鎖：
配列番号４８、重鎖アミノ酸配列；
配列番号４９、重鎖ヌクレオチド配列。
【０１４６】
［実施例１５］Ｅｌｉｓａによるヒト化抗体とヒトＰＤ−１の結合の検出
９６ウェルマイクロプレートに播き、ＰＤ−Ｌ１で被覆し、摂氏３７度で６０分間恒温インキュベートした。その後、ウェル内の溶液を捨て、洗浄緩衝液で３回洗浄し、２％  ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液を加えて６０分間ブロッキングした。洗浄緩衝液で３回洗浄してから、１ウェルあたりにビオチン標識ＩｇＧ４抗体を１００μｌ加え、摂氏３７度で３０分間インキュベートした後、洗浄緩衝液で３回リンスし、次に異なる倍数で希釈したヒト化抗体を加え、摂氏３７度で１時間インキュベートし、洗浄緩衝液で３回リンスしてから、洗浄緩衝液で１：１００００倍で希釈したＨＰＲ標識マウス抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を加え、室温で１時間インキュベートし、洗浄緩衝液で３回リンスしてから、ＴＭＢ基質溶液を１００μｌ加えて発色し、室温で３０分間反応させた後、２Ｍの塩酸溶液１００μｌで反応を中止させ、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。
【０１４７】
結果は図１０に示すように、ヒト化抗体３０及び３８がＰＤ−Ｌ１に結合するＥＣ50値はそれぞれ５５８ｐｇ／ｍＬと８３７ｐｇ／ｍＬであった。
【０１４８】
［実施例１６］ヒト化抗体と２９３Ｆ細胞におけるＰＤ−Ｌ１の結合
ＰＤ−Ｌ１を発現する２９３Ｆ細胞を消化してから、遠心でＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、細胞量が〜２．５×１０4で体積が５０μｌになるように１．５ｍｌ  ＥＰチューブに入れ、異なる濃度の抗体（人化抗体３０、３８）を５０μｌ加えて均一に混合し、室温で３０ｍｉｎインキュベートした；ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を２回洗浄してから、ヒツジ抗ヒトＩｇＧ−ＰＥ抗体を１００μｌ加え、遮光で３０ｍｉｎインキュベートした；ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄してから、ＦＡＣＳ検出を行った。
【０１４９】
結果は図１１に示すように、ヒト化抗体３０、３８は２９３Ｆ細胞におけるＰＤ−Ｌ１に特異的に結合できる。ＥＣ50値はそれぞれ０．２８６６μｇ／ｍＬと０．３４７６μｇ／ｍＬであった。
【０１５０】
［実施例１７］ヒト化抗体によるヒトＰＤ−Ｌ１と２９３Ｆ細胞におけるＰＤ−１の結合に対する阻害
組換え発現のヒト化抗体を取り（１０μｇ／ｍｌ）、ビオチン標識ヒトＰＤ−Ｌ１（即ち実施例１で得られたヒトＰＤ−Ｌ１細胞外領域タンパク質、１μｇ／ｍｌ）と混合し、室温で３０分間インキュベートした。その後、混合物と２９３Ｆ  ＰＤ−１安定発現細胞株（１．５×１０5細胞）を摂氏３７度で１５分間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した後、５μｇ／ｍｌのＳＡ−ＡＰＣを加え、摂氏４度で１５分間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、フローサイトメーター検出により、ヒト化抗体がヒトＰＤ−Ｌ１と２９３Ｆ細胞表面におけるＰＤ−１の結合を阻害できるか否かを検討した。
【０１５１】
結果は図１２に示すように、ヒト化抗体３０及び３８はヒトＰＤ−Ｌ１と２９３Ｆ細胞表面におけるＰＤ−１の結合を特異的に阻害できる。それらのＥＣ50値はそれぞれ０．６４７４μｇ／ｍＬと０．８８８７μｇ／ｍＬであった。
【０１５２】
［実施例１８］ヒト化抗体のＪｕｒｋａｔ・フルオレセイン分析
ＰＤ−Ｌ１を発現するＣＨＯ細胞を９６ウェルプレートに播き、１ウェルあたりの細胞量を５×１０4にし、３７℃、７％  ＣＯ2で一晩培養し、細胞上澄を取り除き、各ウェルに抗体希釈液（初期濃度が６０μｇ／ｍｌで、３倍の濃度勾配で希釈した）を４０μｌ加え、ＰＤ−１及びＮＦＡＴ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子を持続発現できるＪｕｒｋａｔレポーター細胞を４０μｌ加え、総細胞数を１×１０5細胞にし、３７℃、７％  ＣＯ2で６時間培養し、ルシフェラーゼ試薬を加え、マイクロプレートリーダーで発光値を検出した。
【０１５３】
結果は図１３に示すように、ヒト化抗体３０及び３８は、ヒトＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１の結合を特異的に阻害し、レポーター遺伝子の発現を促進することができる。それらのＥＣ50値はそれぞれ０．０７８１６μｇ／ｍＬと０．０８２０２μｇ／ｍＬであった。
【０１５４】
［実施例１９］Ｅｌｉｓａによる比較ヒト化抗体とヒトＰＤ−１の結合の検出
９６ウェルマイクロプレートに播き、ｈＰＤ−Ｌ１−ｈｉｓで被覆し、摂氏３７度で９０分間恒温インキュベートした。室温で平衡状態を約５分間取り、マイクロプレートウォッシャーでマイクロプレートを３００μＬ／ウェル×６回で洗浄し、２％  ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液を加えて３７度で９０分間ブロッキングした。マイクロプレートウォッシャーでマイクロプレートを３００μＬ／ウェル×６回で洗浄し、１ウェルあたりに試料溶液を１００μｌ加え、摂氏３７度で６０分間インキュベートした後、マイクロプレートウォッシャーでマイクロプレートを３００μＬ／ウェル×６回で洗浄し、希釈液で１：５０００倍でＨＰＲ標識抗人ＩｇＧ（ＦＣ特異性）−ペルオキシダーゼ抗体を希釈し、摂氏３７度で１時間インキュベートし、マイクロプレートウォッシャーでマイクロプレートを３００μＬ／ウェル×６回で洗浄し、ＴＭＢ基質溶液を１００μｌ加えて発色し、摂氏３７度で３０分間反応させた後、２Ｍの塩酸溶液１００μｌで反応を中止させ、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。
【０１５５】
結果は図１４に示すように、ヒト化抗体３０がヒトＰＤ−Ｌ１に結合するＥＣ50値は１１．０９ｎｇ／ｍＬであり、デュルバルマブ（ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）のＥＣ50値は２１．５６ｎｇ／ｍＬであり、アテゾリズマブ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）のＥＣ50値は４７．１３ｎｇ／ｍＬであった。
【０１５６】
［実施例２０］マウス腫瘍成長に対するヒト化抗体の抑制作用
６〜８週齢メスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを１５匹取り、右腋下から１×１０6個の（５０μＬの）ＭＣ３８−Ｂ７Ｈ１結腸癌細胞を注射し、５〜７日目で腫瘍の形成が触れるようになった後，マウスの腫瘍の体積を計測した。１群あたりに５匹で、３群に分けた。群１は、各匹にＫＬＨを１００μＬ腹腔内注射した。群２は、抗体３０を１５０μｇ／１００μＬ腹腔内注射した。群３は抗体３８を１５０μｇ／１００μＬ腹腔内注射した。週に２回注射し、継続的に３週間注射した。週に３回計測した。横×縦2／２で腫瘍体積を計算した。
【０１５７】
結果は図１５に示すように、ヒト化抗体３０及び３８はＭＣ３８−Ｂ７Ｈ１で誘発された腫瘍の成長を顕著に抑制できる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年10月23日(2019.10.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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