(57)【要約】  本発明は、微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）を用いて、抗体−ペイロードコンジュゲートを生成する方法に関する。この方法は、第一級アミン残基を有するリンカーであって、ペプチド構造（ＮからＣの方向に示す）（Ａａｘ）ｍ−（Ａａｘ）（ＮＨ２）−（Ａａｘ）ｎ−Ｂ−（Ａａｘ）ｏ、または（Ａａｘ）ｍ−Ｂ−（Ａａｘ）ｎ−（Ａａｘ）（ＮＨ２）−（Ａａｘ）ｏを有するリンカーを、抗体の重鎖または軽鎖に含まれるＧｌｎ残基にコンジュゲートするステップを含む。Ａａｘ（ＮＨ２）は、第一級アミン基を有する側鎖を含む、アミノ酸、アミノ酸誘導体、またはアミノ酸ミメティックである（図１）。
2020534030.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）を用いて、抗体−ペイロードコンジュゲートを生成する方法であって、第一級アミン残基を有するリンカーを、抗体の重鎖または軽鎖に含まれるＧｌｎ残基にコンジュゲートするステップを含み、前記リンカーは、ペプチド構造（ＮからＣの方向に示す）
【化１】
2020534030.tif 000029
［式中、
・ｍは、０以上１２以下の整数であり、
・ｎは、０以上１２以下の整数であり、
・ｏは、０以上１２以下の整数であり、
・ｍ＋ｎ＋ｏは、０以上であり、
・Ａａｘは、任意の天然に存在するまたは天然に存在しないＬ−アミノ酸もしくはＤ−アミノ酸、またはアミノ酸誘導体もしくはミメティックであってもよく、
・Ｂは、ペイロードまたは連結部分であり、
ここで、
【化２】
2020534030.tif 000030
は、第一級アミン基を有する側鎖を含む、アミノ酸、アミノ酸誘導体、またはアミノ酸ミメティックである］を有する、方法。
【請求項２】
【化３】
2020534030.tif 000031
が、リジン、またはリジン誘導体、またはリジンミメティックである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リンカーが、カテプシンＢで切断できない、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記リンカーが、バリン−アラニンモチーフまたはバリン−シトルリンモチーフを含まない、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記リンカーが、ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール誘導体を含まない、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ｍ＋ｎ＋ｏが２５以下、好ましくは２０以下、より好ましくは１５以下、より好ましくは１２以下、より好ましくは１０以下、より好ましくは８以下、より好ましくは７以下、より好ましくは６以下、より好ましくは５以下、より好ましくは４以下である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ペイロードまたは連結部分Ｂを含む前記リンカーが、分子操作により前記抗体の重鎖または軽鎖に導入されたＧｌｎ残基にコンジュゲートされる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ペイロードまたは連結部分Ｂを含む前記リンカーが、前記抗体のＦｃドメインのＧｌｎにコンジュゲートされる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ペイロードまたは連結部分Ｂを含む前記リンカーが、前記抗体のＣＨ２ドメインのＧｌｎ残基Ｑ２９５（ＥＵナンバリング）にコンジュゲートされる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ペイロードまたは連結部分Ｂを含む前記リンカーがコンジュゲートされる前記抗体が、グリコシル化されている、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記リンカーの正味の電荷が、中性または正である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記リンカーが、負荷電アミノ酸残基を含まない、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記リンカーが、正荷電アミノ酸残基を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記リンカーが、
・リジン、またはリジン誘導体、またはリジンミメティック、
・アルギニン、および／または
・ヒスチジン
からなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸残基を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体が、前記抗体のＣＨ２ドメインにＡｓｎ残基Ｎ２９７（ＥＵナンバリング）を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｎ２９７残基が、グリコシル化されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ペイロードまたは連結部分Ｂを含む前記リンカーが、前記Ｇｌｎ残基のアミド側鎖にコンジュゲートされる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
Ｂが連結部分である場合、実際の前記ペイロードを前記連結部分に連結させるさらなるステップが実施される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記微生物トランスグルタミナーゼが、ストレプトミセス・モバラエンシス（Streptomyces mobaraensis）に由来する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記連結部分Ｂが、
・生体直交型マーカー基
・架橋のための他の非生体直交型実体
からなる群から選択される少なくとも１つである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記生体直交型マーカー基または前記非生体直交型実体が、
・−Ｎ−Ｎ≡Ｎまたは−Ｎ３
・Ｌｙｓ（Ｎ３）
・テトラジン
・アルキン
・ＤＢＣＯ
・ＢＣＮ
・ノルボレン
・トランスシクロオクテン
・−ＲＣＯＨ（アルデヒド）
・アシルトリフルオロボレート
・−ＳＨ、および／または
・システイン
からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ペイロードＢが、
・毒素
・サイトカイン
・成長因子
・放射性核種
・ホルモン
・抗ウイルス剤
・抗細菌剤
・蛍光色素
・免疫調節／免疫刺激剤
・半減期増大部分
・溶解性増大部分
・ポリマー−毒素コンジュゲート
・核酸
・ビオチンまたはストレプトアビジン部分
・ビタミン
・標的結合部分、および／または
・抗炎症剤
からなる群から選択される少なくとも１つである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記毒素が、
・ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）
・アウリスタチン（例えば、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ）
・メイタンシノイド（メイタンシン、ＤＭ１、ＤＭ４）
・デュオカルマイシン
・ツブリシン
・エンジイン（例えば、カリケアマイシン）
・ＰＮＵ、ドキソルビシン
・ピロールベースのキネシンスピンドルタンパク質（ＫＳＰ）阻害剤
・カリケアマイシン
・アマニチン（例えば、α−アマニチン）、および／または
・カンプトテシン（例えば、エキサテカン、デルクステカン）
からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体が、
・ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ
・ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ
・または標的結合特性を保持し、ＣＨ２ドメインを含む、それらの断片もしくは組換え変異体
からなる群から選択される少なくとも１つである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記リンカーが２つ以上の連結部分Ｂを有する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
２つ以上の連結部分Ｂが、互いに異なる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記請求項のいずれか一項に記載の方法で生成された、抗体−ペイロードコンジュゲート。
【請求項２８】
ペプチド構造（ＮからＣの方向に示す）
【化４】
2020534030.tif 000032
［式中、
・ｍは、０以上１２以下の整数であり、
・ｎは、０以上１２以下の整数であり、
・ｏは、０以上１２以下の整数であり、
・ｍ＋ｎ＋ｏは、０以上であり、
・Ａａｘは、任意の天然に存在するまたは天然に存在しないＬ−アミノ酸もしくはＤ−アミノ酸、またはアミノ酸誘導体もしくはミメティックであってもよく、
・Ｂは、ペイロードまたは連結部分であり、
ここで、
【化５】
2020534030.tif 000033
は、第一級アミン基を有する側鎖を含む、アミノ酸、アミノ酸誘導体、またはアミノ酸ミメティックである］を有するリンカー。
【請求項２９】
【化６】
2020534030.tif 000034
が、リジン、またはリジン誘導体、またはリジンミメティックである、請求項２８に記載のリンカー。
【請求項３０】
前記リンカーが、カテプシンＢで切断できない、請求項２８または２９に記載のリンカー。
【請求項３１】
前記リンカーが、バリン−アラニンモチーフまたはバリン−シトルリンモチーフを含まない、請求項２８から３０のいずれか一項に記載のリンカー。
【請求項３２】
前記リンカーが、ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール誘導体を含まない、請求項２８から３１のいずれか一項に記載のリンカー。
【請求項３３】
ｍ＋ｎ＋ｏが２５以下、好ましくは２０以下、より好ましくは１５以下、より好ましくは１２以下、より好ましくは１０以下、より好ましくは８以下、より好ましくは７以下、より好ましくは６以下、より好ましくは５以下、より好ましくは４以下である、請求項２８から３２のいずれか一項に記載のリンカー。
【請求項３４】
前記リンカーの正味の電荷が、中性または正である、請求項２８から３３のいずれか一項に記載のリンカー。
【請求項３５】
前記リンカーが、負荷電アミノ酸残基を含まない、請求項２８から３４のいずれか一項に記載のリンカー。
【請求項３６】
前記リンカーが、正荷電アミノ酸残基を含む、請求項２８から３５のいずれか一項に記載のリンカー。
【請求項３７】
前記リンカーが、
・リジン、またはリジン誘導体、またはリジンミメティック、
・アルギニン、および／または
・ヒスチジン
からなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸残基を含む、請求項２８から３６のいずれか一項に記載のリンカー。
【請求項３８】
前記第一級アミン基が、微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）の基質として働くのに適している、請求項２８から３７のいずれか一項に記載のリンカー。
【請求項３９】
微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）を用いて抗体−ペイロードコンジュゲートを生成するのに適している、請求項２８から３８のいずれか一項に記載のリンカー。
【請求項４０】
ａ）表５に示されるリスト、および／または
ｂ）配列番号１〜３５および３８〜４５のいずれか１つ
から選択される、請求項２８から３９のいずれか一項に記載のリンカー。
【請求項４１】
少なくとも、
ａ）請求項２８から４０のいずれか一項に記載のリンカーと、
ｂ）１つまたは複数のペイロードと
を含むリンカー−ペイロードコンストラクトであって、前記コンストラクトにおいて、前記リンカーおよび／または前記ペイロードが、場合により、結合時に、前記コンストラクトを形成するために、共有結合または非共有結合が可能になるように化学修飾されている、リンカー−ペイロードコンストラクト。
【請求項４２】
ａ）請求項４１に記載の１つまたは複数のリンカー−ペイロードコンストラクトと、
ｂ）重鎖または軽鎖中に少なくとも１つのＧｌｎ残基を含む抗体と
を含む抗体−ペイロードコンジュゲートであって、前記コンジュゲートにおいて、前記リンカー−ペイロードコンストラクトおよび／または前記抗体が、場合により、コンジュゲーション時に、前記コンジュゲートを形成するために、共有結合または非共有結合コンジュゲーションが可能になるように化学修飾されている、抗体−ペイロードコンジュゲート。
【請求項４３】
請求項２８から４０のいずれか一項に記載のリンカー、請求項４１に記載のリンカー−ペイロードコンストラクト、および／または請求項４２に記載の抗体−ペイロードコンジュゲートを含む、医薬組成物。
【請求項４４】
請求項４２に記載の抗体−ペイロードコンジュゲートまたは請求項４３に記載の医薬組成物と、少なくとも１つのさらなる薬学的に許容される成分とを含む、医薬製品。
【請求項４５】
新生物性疾患、神経性疾患、自己免疫性疾患、炎症性疾患、または感染性疾患について
・罹患している、
・発症するリスクがある、および／または
・診断されている
患者の処置もしくは予防のため、またはそのような状態の予防のための（医薬を製造するための）、請求項４２に記載の抗体−ペイロードコンジュゲート、請求項４３に記載の医薬組成物、または請求項４４に記載の製品。
【請求項４６】
新生物性疾患を処置または予防する方法であって、請求項４２に記載の抗体−ペイロードコンジュゲート、請求項４３に記載の医薬組成物、または請求項４４に記載の製品を、それを必要とする患者に投与するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物トランスグルタミナーゼを用いて、抗体−ペイロードコンジュゲートを生成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
非常に強力なペイロードを抗体に結合させることは、がんまたは炎症性疾患の標的処置において関心が高まっている。これにより作製されるコンストラクトは、抗体−ペイロードコンジュゲート、または抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）と呼ばれている。
【０００３】
現在、４つのＡＤＣが、ＦＤＡの承認を得ており（アドセトリス、カドサイラ、ベスポンサ、およびマイロターグ）、これらのＡＤＣはすべて、それらのペイロードが抗体に部位非特異的に化学結合している。したがって、得られる生成物は、抗体とペイロードの化学量論的関係（ペイロード抗体比、または薬物対抗体比、ＤＡＲ）についても、抗体上のコンジュゲーション部位に関しても、極めて不均質である。得られる種それぞれは、同一の薬物製品中にあっても、異なる特性を有する可能性があり、それにより、インビボ薬物動態特性および活性が大きく異なる恐れがある。
【０００４】
過去のインビボ試験（Lhospice et al., 2015）では、部位特異的薬物結合が、ＦＤＡ承認ＡＤＣと比較して、腫瘍取り込み率の有意な増加（約２倍）および非標的組織における取り込み率の低下をもたらすとともに、最大耐用量が少なくとも３倍高いことが示された。これらのデータは、化学量論的に明確に定義されたＡＤＣが、化学修飾されたＡＤＣと比較して、改善された薬物動態、およびより優れた治療指数を示すことを示唆している。
【０００５】
部位特異的技術として、酵素コンジュゲーションは、そのようなコンジュゲーション反応が、典型的には迅速であり、かつ生理的条件下で実施できることから、大きな重要性を示している。使用可能な酵素の中でも、ストレプトミセス・モバラエンシス（Streptomyces mobaraensis）種由来の微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）は、抗体を含めた機能性部分の従来の化学的タンパク質コンジュゲーションに代わる魅力的な手段として、ますます関心が高まっている。ＭＴＧは、生理的条件下で、タンパク質またはペプチドの「反応性」グルタミンとタンパク質またはペプチドの「反応性」リジン残基とのアミド基転移反応を触媒するが、このリジン残基は、５−アミノペンチル基のような単純な低分子量第一級アミンであってもよい（Jeger et al., 2010, Strop et al., 2014）。
【０００６】
形成される結合は、イソペプチド結合であり、これは、それぞれのポリペプチドまたはタンパク質のペプチド結合骨格の一部をなさないアミド結合である。これは、アシルグルタミン含有アミノ酸供与体配列のグルタミル残基のγ−カルボキサミドと、本発明によるアミノ供与体を含む基質の第一級（１°）アミンとの間に形成される。
【０００７】
本発明者の経験および他者の経験から、典型的には、わずかなグルタミンのみがＭＴＧの標的となると考えられ、そのため、ＭＴＧは、部位特異的かつ化学量論的なタンパク質修飾のための魅力的な手段となっている。
【０００８】
これまでに、グルタミン２９５（Ｑ２９５）は、低分子量第一級アミン基質とともに、ＭＴＧが特異的に標的とする、さまざまなタイプのＩｇＧの重鎖の唯一の反応性グルタミンとして同定されている（Jeger et al. 2010）。
【０００９】
しかしながら、Ｑ２９５との定量的コンジュゲーションは、ＰＮＧａｓｅ  Ｆによってアスパラギン残基２９７（Ｎ２９７）のグリカン部分を除去した場合にのみ可能であり、グリコシル化抗体は、効率的にコンジュゲートすることができなかった（コンジュゲーション効率＜２０）。この発見は、Mindt et al. (2008)およびJeger et al. (2010)の研究によっても裏付けられている。
【００１０】
脱グリコシル化を不要にするために、Ｎ２９７残基に点突然変異を挿入して、それにより、非グリコシル化と呼ばれるグリコシル化の消失をもたらすことも可能である。
【００１１】
しかしながら、いずれの手法も、大きな不利益を伴う。酵素による脱グリコシル化ステップは、高純度の製品を確保するために、脱グリコシル化酵素（例えば、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）と切断されたグリカンの双方ともが媒体から除去されていることを確認しなければならないため、ＧＭＰの面で望ましくない。
【００１２】
また、Ｎ２９７の別のアミノ酸による置換も、ＣＨ２ドメインの全般的安定性、ひいてはコンジュゲート全体の有効性に影響し得ることから、望ましくない効果がある。さらに、Ｎ２９７に存在するグリカンは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）をトリガーするなど、重要な免疫調節作用を有する。このような免疫調節作用は、脱グリコシル化またはＮ２９７の別のアミノ酸による置換を行うと、失われることになる。
【００１３】
さらに、ペイロードを結合するための抗体の遺伝子操作は、配列挿入が免疫原性を高め、抗体の全般的安定性を低下させる可能性があるという点で、不利益となり得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、本発明の１つの目的は、事前に抗体、具体的にはＮ２９７の脱グリコシル化を必要としない、トランスグルタミナーゼに基づく抗体コンジュゲーション手法を提供することである。
【００１５】
本発明のまた別の目的は、ＣＨ２ドメインにおけるＮ２９７の置換または修飾を必要としない、トランスグルタミナーゼに基づく抗体コンジュゲーション手法を提供することである。
【００１６】
本発明のもう１つの目的は、コンジュゲーションの化学量論性および部位特異性の双方について極めて均質なコンジュゲーション製品の製造を可能にするような、抗体コンジュゲーション技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
これらおよびその他の目的は、本発明の独立クレームによる方法および手段により達成される。従属クレームは、特定の実施形態に関する。
【００１８】
本発明は、微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）を用いて、抗体−ペイロードコンジュゲートを生成するための方法およびリンカー構造に関する。本発明およびその特徴の一般的利点について、以下に詳しく記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の一態様の説明図である。ＭＴＧ＝微生物トランスグルタミナーゼ。星印は、ペイロードまたは連結部分Ｂを例示する。Ｋｐは、リジン残基、リジン誘導体、またはリジンミメティックであり、これは、ペプチドのＮ末端もしくはＣ末端、または鎖内にあってもよく、またこれは、ＭＴＧの基質である。このプロセスにより、Ｎ２９７におけるグリコシル化を維持することが可能になることに留意されたい。Ｂ／星印は、連結部分であり、実際のペイロードをさらにこの部分にコンジュゲートさせなければならないことに留意されたい。  本明細書の別の部分に記載されるように、Ｂ／星印は、例えば、ＤＢＣＯ含有ペイロード（例えば、毒素、または蛍光色素、またはＤＯＴＡもしくはＮＯＤＡ−ＧＡのような金属キレート剤）との歪み促進型アルキン−アジド環化付加（ＳＰＡＡＣ）クリックケミストリー反応に適した生体直交型の基（例えば、アジド／Ｎ３基）のような、連結部分であってもよい。機能性部分を抗体に結合させるための、このクリックケミストリーに基づく「２ステップ化学酵素」手法は、抗体に対する低い分子過剰量、典型的には、例えば、コンジュゲーション部位当たり５当量以下でクリック結合できるという大きな利点を有する（Dennler et al. 2014）。これにより、費用効果の高いＡＤＣの生成が可能になる。さらに、蛍光色素から金属キレート剤に及ぶ事実上すべてのプローブは、この手法でクリック結合させることができる（Spycher et al. 2017, Dennler et al. 2015を参照）。  Ｂ／星印はまた、実際のペイロード、例えば毒素であってもよい。そのような実施形態により、結果として得られる化合物が１ステップで迅速に製造できるようになり、精製および作製が容易になる。
【図２】本発明によるオリゴペプチドを含むリンカーペプチドの例を示す図である。配列は、ＡｒｇＡｌａＬｙｓＡｌａＡｒｇＬｙｓ（Ｎ３）（ＲＡＫ１ＡＲＫ２、このときＫ２＝Ｌｙｓ（Ｎ３））である。Ｌｙｓ（Ｎ３）は、第一級アミンがアジド（−Ｎ−Ｎ≡Ｎ、または−Ｎ３）で置き換えられたＬｙｓ残基である。本発明の命名法によれば、Ｌｙｓ（Ｎ３）またはＮ３のみのいずれも連結部分Ｂとみなすことができる（この例では、Ｎ３がクリックケミストリーに適している）。  このペプチドは、天然ＩｇＧ１抗体にＱ２９５位で効率的にコンジュゲートする（非最適化条件下でのＬＣ−ＭＳ分析からの推定で約７７％）。  本明細書に示される一部のリンカーペプチドでは、Ｃ末端の部分が単にＮ３として指定されていることを理解することが重要である。しかしながら、これは、Ｌｙｓ（Ｎ３）の略記として理解すべきである。例えば、ＲＡＫＡＲ（Ｎ３）またはＡｒｇＡｌａＬｙｓＡｌａＡｒｇ（Ｎ３）は、実際には、ＲＡＫ１ＡＲＫ２（Ｋ２＝Ｌｙｓ（Ｎ３））、またはＡｒｇＡｌａＬｙｓＡｌａＡｒｇＬｙｓ（Ｎ３）を意味する。  さらに、本明細書に示されるさまざまなリンカーペプチドにおいて、Ｃ末端および／またはＮ末端は、そうではないように示されていたとしても、保護されていても、または保護されていなくてもよいことを理解することも重要である。保護は、例えば、Ｃ末端のアミド化、および／またはＮ末端のアセチル化によって達成することができる。本発明の文脈では、保護および非保護リンカーペプチドの双方が包含される。  例えば、ＲＡＫＡＲＫ（Ｎ３）は、実際、ａ）両末端とも上述のように保護された変異体、ｂ）Ｎ末端のみ、またはＣ末端のみが上述のように保護された変異体、またはｃ）両末端とも保護されていない変異体、の４つの変異体を包含する。  下図は、Ｃ末端がアミド化されたＣ末端Ｌｙｓ（Ｎ３）を示している。
【化１】
2020534030.tif 000003
【図３】所与のペプチドライブラリーのスクリーニング結果を示す図である。ＭＴＧ反応性リジン残基を含む、長さおよび電荷が異なるさまざまなペプチドをスクリーニングした。分析には、ＬＣ−ＭＳを使用した。明らかに、負荷電ペプチドが低いコンジュゲーション収率をもたらす一方、正荷電ペプチドは、Ｑ２９５コンジュゲーションに有利であるとみられる。
【図４】リンカーが、マレイミドを含む毒素リンカーコンストラクトをコンジュゲートするのに適した、遊離スルフヒドリル基を有するＣｙｓ残基を含む、実施形態を示す図である。図４は、結合反応を示す。
【図５】リンカーが、マレイミドを含む毒素リンカーコンストラクトをコンジュゲートするのに適した、遊離スルフヒドリル基を有するＣｙｓ残基を含む、実施形態を示す図である。図５は、いくつかの可能なリンカーコンストラクトを示している。
【表１】
2020534030.tif 000004
【図６】ペプチドが抗体のＧｌｎ（Ｑ２９５または分子操作によるもの）にコンジュゲートされる２ステップコンジュゲーションプロセス（図６Ａ）、および本発明による１ステップコンジュゲーションプロセス（図６Ｂ）を示す図である。  ２ステッププロセスでは、リンカーペプチドは、（Ａａｘ）ｍ−Ｌｙｓ−（Ａａｘ）ｎ−連結部分である。Ｌｙｓ残基は、微生物トランスグルタミナーゼにより、抗体中のＧｌｎ残基にコンジュゲートされ、次いで、連結部分（この場合、遊離スルフヒドリル基を有するＣｙｓ残基）は、マレイミドを介して、ペイロード（この場合、ＭＣ／ＶＣ／ＰＡＢＤＣリンカー構造を担持するＭＭＡＥ毒素）にコンジュゲートされる。  １、２ステッププロセスでは、リンカーペプチド（Ａａｘ）ｍ−Ｌｙｓ−（Ａａｘ）ｎは、ペイロードにすでにコンジュゲートされている。Ｌｙｓ残基は、抗体中のＧｌｎ残基にコンジュゲートされ、ペイロードは、ＶＣ／ＰＡＢＤＣ構造を担持するＭＭＡＥ毒素からなる。ＶＣ構造のバリン残基は、ペプチド結合により、リンカーペプチドの最後のアミノ酸にコンジュゲートされる。
【図７】二重ペイロード結合に適したリンカーを含む、リンカーの３つの例を示す図である。    （図７Ａ）アジド（Ｎ３）である第１の連結部分を有し、第２の連結部分はテトラジンである（双方とも生体直交型）、ペプチドを示す図である。このオリゴペプチドの構造は、ＡｒｇＡｌａＬｙｓＬｙｓ（Ｎ３）−ＡｒｇＡｌａＬｙｓ（テトラジン）（ＲＡＫ１Ｋ２ＲＡＫ３、このときＫ２＝Ｌｙｓ（Ｎ３）、Ｋ３＝Ｌｙｓ（テトラジン））である。    （図７Ｂ）アジド（Ｎ３）およびＣｙｓ部分からの遊離スルフヒドリル基を担持するペプチドを示す図である。このオリゴペプチドの構造は、Ｌｙｓ（Ｎ３）ＣｙｓＡｒｇＡｌａＬｙｓ（Ｋ１ＣＲＡＫ２、このときＫ１＝Ｌｙｓ（Ｎ３））である。    （図７Ｃ）アジド（Ｎ３）およびＣｙｓ部分からの遊離スルフヒドリル基を担持する別のペプチドを示す図である。このオリゴペプチドの構造は、ＬｙｓＡｌａＡｒｇＣｙｓＬｙｓ（Ｎ３）（Ｋ１ＡＲＣＫ２、このときＫ２＝Ｌｙｓ（Ｎ３））である。  結合部分のそれぞれは、同時にクリック結合することができる、生体直交的に適合性の基である。  これらのリンカーは、このように、２つの異なるペイロードを抗体のＣＨ２ドメインのＱ２９５にコンジュゲートすることを可能にする。第２のペイロードを使用することにより、有効性および力価に関して現在の治療手法を超える、全く新しいクラスの抗体ペイロードコンジュゲートを開発することが可能となる。また、新しい応用分野、例えば、イメージングおよび治療、または外科手術中／後のためのデュアル式イメージング法も想定される（Azhdarinia A. et al., Molec Imaging and Biology, 2012を参照）。例えば、術前ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）のための分子イメージング剤とガイド下での切除マージン設定のための近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）色素とを含む二重標識抗体は、がんの診断、ステージ分類、および切除を大きく向上させ得る（Houghton JL. et al., PNAS 2015を参照）。ＰＥＴとＮＩＲＦ光学イメージングは、相補的な臨床応用を提供し、それぞれ、疾患の位置を特定するための非侵襲的全身イメージング、および手術中の腫瘍マージンの同定を可能にする。しかしながら、そのような二重標識プローブの生成は、これまで、適切な部位特異的な方法がなかったため困難であり、化学的手段により２つの異なるプローブを結合すると、その結果、プローブの無秩序なコンジュゲーションにより、分析および再現性がほぼ不可能であった。さらに、Levengood M. et al., Angewandte Chemie, 2016の研究では、２つの異なるアウリスタチン毒素（異なる生理化学的性質を有し、相補的な抗がん活性を発揮する）を結合させた二重薬物標識抗体が、個々のアウリスタチン要素からなるＡＤＣでは効果がなかった細胞株および異種移植モデルにおいて、活性を付与した。このことは、二重標識ＡＤＣが、単一の従来のＡＤＣのみの場合より、がんの不均一性および耐性により効果的に対処することを可能にすることを示唆している。ＡＤＣに対する１つの耐性機序は、がん細胞から細胞傷害性部分を能動的に排出することを含むため、別の二重薬物応用例は、細胞傷害性薬物の排出機序を特異的に阻害する薬物の付加的な同時送達を含んでもよい。そのような二重標識ＡＤＣは、このように、従来のＡ���Ｃよりも効果的に、ＡＤＣに対するがん耐性を克服する一助となり得る。  アルキンまたはテトラジン／ｔｒａｎｓ−シクロオクテンがリンカーとして使用されている類似の構造は、同様に適切であり、本発明の範囲および趣旨に含まれる。  本明細書に示される一部のリンカーペプチドでは、Ｃ末端の部分が単にＮ３として指定されていることを理解することが重要である。しかしながら、これは、Ｌｙｓ（Ｎ３）の略記として理解すべきである。例えば、ＲＡＫＡＲ（Ｎ３）またはＡｒｇＡｌａＬｙｓＡｌａＡｒｇ（Ｎ３）は、実際には、ＲＡＫ１ＡＲＫ２（Ｋ２＝Ｌｙｓ（Ｎ３））、またはＡｒｇＡｌａＬｙｓＡｌａＡｒｇＬｙｓ（Ｎ３）を意味する。  さらに、本明細書に示されるさまざまなリンカーペプチドにおいて、Ｃ末端および／またはＮ末端は、そうではないように示されていたとしても、保護されていても、または保護されていなくてもよいことを理解することも重要である。保護は、Ｃ末端のアミド化、および／またはＮ末端のアセチル化によって達成することができる。本発明の文脈では、保護および非保護リンカーペプチドの双方が包含される。例えば、ＲＡＫＡＲＫ（Ｎ３）は、実際、ａ）両末端とも上述のように保護された変異体、ｂ）Ｎ末端のみ、またはＣ末端のみが上述のように保護された変異体、またはｃ）両末端とも保護されていない変異体、の４つの変異体を包含する。  Ｃ末端および／またはＮ末端アミド化および／またはアセチル化の有無の問題は、コンジュゲーション条件（緩衝液、媒体、他の反応要素の反応性など）による、実践上の問題である。
【図８】２つのアジドリンカー部分を有する、可能なリンカー構造を示す図である。図８Ａは、Ｌｙｓ（Ｎ３）ＡｒｇＡｌａＬｙｓＡｌａＡｒｇＬｙｓ（Ｎ３）（Ｋ１ＲＡＫ２ＡＲＫ３、このときＫ１およびＫ３＝Ｌｙｓ（Ｎ３））を示している。図８Ｂは、ＬｙｓＡｌａＡｒｇＬｙｓ（Ｎ３）Ｌｙｓ（Ｎ３）（Ｋ１ＲＫ２Ｋ３、このときＫ２およびＫ３＝Ｌｙｓ（Ｎ３））を示している。このようにして、抗体ペイロード比４を達成することができる。荷電Ａｒｇ残基の存在は、疎水性ペイロードを溶液中に保持するのを助ける。  本明細書に示される一部のリンカーペプチドでは、Ｃ末端の部分が単にＮ３として指定されていることを理解することが重要である。しかしながら、これは、Ｌｙｓ（Ｎ３）の略記として理解すべきである。例えば、ＲＡＫＡＲ（Ｎ３）またはＡｒｇＡｌａＬｙｓＡｌａＡｒｇ（Ｎ３）は、実際には、ＲＡＫ１ＡＲＫ２（Ｋ２＝Ｌｙｓ（Ｎ３））、またはＡｒｇＡｌａＬｙｓＡｌａＡｒｇＬｙｓ（Ｎ３）を意味する。  さらに、本明細書に示されるさまざまなリンカーペプチドにおいて、Ｃ末端および／またはＮ末端は、そうではないように示されていたとしても、保護されていても、または保護されていなくてもよいことを理解することも重要である。保護は、Ｃ末端のアミド化、および／またはＮ末端のアセチル化によって達成することができる。本発明の文脈では、保護および非保護リンカーペプチドの双方が包含される。例えば、ＲＡＫＡＲＫ（Ｎ３）は、実際、ａ）両末端とも上述のように保護された変異体、ｂ）Ｎ末端のみ、またはＣ末端のみが上述のように保護された変異体、またはｃ）両末端とも保護されていない変異体、の４つの変異体を包含する。
【図９】天然抗体とのＭＴＧ媒介コンジュゲーションに適したさらなるリンカーを示す図である。これらのリンカー構造は、第２のステップにおける機能性ペイロードのクリックケミストリーに基づく結合に適した連結部分（アジド、Ｎ３）、またはマレイミドとの結合に適したチオール基を備えるＣｙｓ残基を含む。これらの構造は、化学的性質が十分に理解されている、単一のアミノ酸のビルディングブロックから構築されたペプチドに基づくことから、新しいリンカーは、迅速かつ容易に合成および評価することができる。
【表２】
2020534030.tif 000005
【図１０】ＩｇＧ１抗体の軽鎖が、コンジュゲーションにより修飾されていないことを示す図である。図示されているのは、ＩｇＧ１軽鎖のデコンボリュートしたＬＣ−ＭＳスペクトルである。
【図１１】Ｎ３機能性ペプチドで選択的に修飾された、２つの異なる天然ＩｇＧ１重鎖のデコンボリュートしたＬＣ−ＭＳスペクトルを示す図である。これらのスペクトルから、測定された質量差が推定されたペプチドの質量シフトと一致することにより、両重鎖が１つのみのペプチドリンカーで選択的かつ定量的（＞９５％）に修飾されたことが認められる。
【図１２】異なるＤＢＣＯ機能性プローブ（ＦＡＭ色素およびカルボキシローダミン色素）のアジド機能化天然ＩｇＧ１抗体への変換／クリック結合実験の結果（＞９５％）を示す図である。これは、単一の残基（Ｑ２９５）で選択的に修飾された、部位特異的に修飾された天然ＩｇＧ１抗体を生じる。
【図１３−１】（図１３Ａ）参照として脱グリコシル化変異体を使用した、２つの天然ＩｇＧ１のフローサイトメトリー実験の結果を示す図である。ＦＡＭ色素を使用した。ペプチドとしてＲＡＫＡＲ−Ｋ（Ｎ３）を使用し、クリック結合にＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−５／６−ＦＡＭ色素を使用した。ＬＣ−ＭＳによると、９５％を超える効率のクリック結合が達成された。
【図１３−２】（図１３Ｂ）参照として脱グリコシル化変異体を使用した、２つの天然ＩｇＧ１のフローサイトメトリー実験の結果を示す図である。ＦＡＭ色素を使用した。ペプチドとしてＲＡＫＡＲ−Ｋ（Ｎ３）を使用し、クリック結合にＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−５／６−ＦＡＭ色素を使用した。ＬＣ−ＭＳによると、９５％を超える効率のクリック結合が達成された。
【図１４】さまざまなナンバリングスキームで、Ｉｇ  ＣＨ２ドメインの概要を示す表である。本発明の目的では、ＥＵナンバリングを使用する。
【図１５】遊離第一級アミンを含むＬｙｓ残基（鎖内またはＮ末端／Ｃ末端）を有するリンカーを抗体のＱ２９５残基の遊離第一級アミンにコンジュゲートする、トランスグルタミナーゼ反応を示す図である。
【図１６】リンカーＡｒｇＡｌａＬｙｓＬｙｓ（Ｎ３）（ＲＡＫ１Ｋ２、このときＫ２＝Ｌｙｓ（Ｎ３））をペイロードで標識したジベンゾシクロオクチンにコンジュゲートする、クリックケミストリー反応スキーム（歪み促進型アルキン−アジド環化付加（ＳＰＡＡＣ）を示す図である。
【図１７】トリプシン消化後にＬＣ−ＭＳ／ＭＳを実施した、ＭＴＧを使用してグリコシル化ＩｇＧ１参照抗体にコンジュゲートしたＡｒｇＡｌａＬｙｓＡｌａＡｒｇ（ＲＡＫＡＲ）のペプチドマッピングを示す図である。ペプチド断片化により、断片ＥＥＱＹＤＳＴＹＲ（１＊ペプチド＿２３＿ＡＫＡＲ、Ｍｗ：推定および測定１６１７．７Ｄａ）内の修飾部位として、抗体重鎖中のＱ２９５が明確に同定された。
【図１８−１】本発明に関連して使用可能なさまざまなペプチドリンカーを示す図である。図１８Ａは、非天然アミノ酸を含むペプチドリンカーを示している。
【図１８−２】図１８Ｂは、トランスグルタミナーゼ反応のための第一級アミンを備えるリジン誘導体またはミメティックを含むペプチドリンカーを示している。これらのペプチド変異体またはペプチドミメティックはすべて、ＡｒｇＡｌａＬｙｓＬｙｓ（Ｎ３）ペプチド（ＲＡＫ１Ｋ２、このときＫ２＝Ｌｙｓ（Ｎ３））に由来する。Ｌｙｓ（Ｎ３）の代わりに、本明細書の別の部分に記載されるように、他の連結部分Ｂも使用できることに留意されたい。
【図１８−３】図１８Ｂの続きである。
【図１９−１】本発明に関連して使用可能なさらなるペプチドリンカーを示す図である。
【図１９−２】本発明に関連して使用可能なさらなるペプチドリンカーを示す図である。
【図２０】本発明に関連して使用可能なさらなるペプチドリンカーを示す図である。ＡｒｇＬｙｓ（Ｎ３）Ｌｙｓは、（Ｎ末端でもＣ末端でもなく）鎖内にＬｙｓ（Ｎ３）連結部分を有するペプチドである。ＬｙｓＬｙｓ（Ｎ３）およびＬｙｓＣｙｓは、極めて短いリンカーである。
【図２１】本明細書に記載の方法により、抗体にコンジュゲートすることができるさまざまなリンカー毒素コントラクトを示す図である。すべての場合において、Ｌｙｓ残基は、トランスグルタミナーゼコンジュゲーションのための第一級アミンを担持する。  図２１Ａ：ＲＫＲ−ＤＭ１。この図は、疎水性ペイロードＤＭ１の溶解性を向上させるのに役立つ２つのアルギニン基を有する、切断不可能なＲＫＲ−ＤＭ１ペプチド−毒素コンジュゲートを示している。リジンは、ＭＴＧによる抗体とのコンジュゲーションに役立つ。Ａｈｘスペーサは、正荷電アルギニンをＤＭ１から分離させるのに役立ち、リンカーが切断できないことから、ＤＭ１がその標的により効率的に結合するのを助ける。  図２１Ｂ：ＲＫＲ−ＤＭ１。この図は、２つのアルギニン基およびＰＥＧ４−スペーサを有し、これら３つの部分すべてが疎水性ペイロードＤＭ１の溶解性を向上させるのに役立つ、切断不可能なＲＫＲ−ＤＭ１ペプチド−毒素コンジュゲートを示している。リジンは、ＭＴＧによる抗体とのコンジュゲーションに役立つ。ＰＥＧ４は、正荷電アルギニンをＤＭ１から分離させるのをさらに助け、リンカーが切断できないことから、ＤＭ１がその標的により効率的に結合するのを助ける。  図２１Ｃ：ＲＫＲ−ＭＭＡＥ。この図は、２つのアルギニン基、ＰＥＧ４−スペーサ、ＰＡＢＣ基、およびｖａｌ−ｃｉｔ配列を有する、切断可能なＲＫＲ−ＭＭＡＥペプチド−毒素コンジュゲートを示している。リジンは、ＭＴＧによる抗体とのコンジュゲーションに役立ち、アルギニン基およびＰＥＧ４−スペーサは、溶解性を向上させるのに役立ち、ＰＡＢＣ基およびｖａｌ−ｃｉｔ配列は、毒素の放出を助ける。  図２１Ｄ：ＲＫＲ−ＭＭＡＥ。この図は、２つのアルギニン基およびＰＡＢＣ基を有し、ＰＥＧ−スペーサおよびｖａｌ−ｃｉｔ配列を有さない、切断可能なＲＫＲ−ＭＭＡＥペプチド−毒素コンジュゲートを示している。ＲＫＲ−ペプチドは本来ペプチダーゼにより分解可能であるため、毒素放出のためにｖａｌ−ｃｉｔ配列は必要でないかもしれず、２つのアルギニン基は極めて親水性であるため、ＰＥＧ−スペーサは必要とされない可能性があるので、それにより、ペプチド−毒素コンジュゲート全体をできるだけ小さく保ち、循環血液中での他の分子との望ましくない相互作用を最小限に抑えている。
【図２２】実施例２により実施した細胞毒性アッセイの結果を示す図である。内製ＡＤＣは、ＳＫ−ＢＲ３細胞に対する力価がカドサイラと同様である。したがって、新規のリンカー技術によってもたらされる利益（製造が容易なこと、部位特異性、安定した化学量論性、抗体を脱グリコシル化する必要がないこと）は、細胞毒性に関して、いかなる不利益も伴わない。
【図２３】二重ペイロードコンジュゲーションおよび細胞結合試験の結果を示す図である（実施例６）。図２３Ａ：二重ペイロードコンジュゲーション後のヒト化ＩｇＧ１の軽鎖：純度＞９５％。図２３Ｂ：二重ペイロードコンジュゲーションならびにマレイミド−ＮＯＤＡＧＡおよびＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−Ａｈｘ−ＤＭ１結合後のヒト化ＩｇＧ１の重鎖：純度＞９０％。
【図２４】二重ペイロードコンジュゲーションおよび細胞結合試験のさらなる結果を示す図である（実施例６）。
【図２５】ヒト化ＩｇＧ１とのコンジュゲーションにおける、Ａｃ−ＲβＡＫ（Ｎ３）−ＮＨ２（Ａｃ−ＡｒｇβＡｌａＬｙｓ（Ｎ３）−ＮＨ２）（すなわち、側鎖に第一級アミンを有するアミノ酸を含まないリンカー）の対照コンジュゲーションの結果を示す図である（実施例７）。コンジュゲーションは、検出されなかった。
【図２６−１】ヒトＩｇＧ４抗体へのコンジュゲーション実験の結果を示す図である（実施例８）。図２６Ａ：ヒトＩｇＧ４の軽鎖：コンジュゲーション検出されず。図２６Ｂ：グリコシル化パターンを示す、ヒトＩｇＧ４の天然重鎖。
【図２６−２】図２６Ｃ：単一残基における選択的修飾を示す、ＲＡＫＡＲとのコンジュゲーション後のヒトＩｇＧ４の天然重鎖。非最適化条件下で、コンジュゲーション効率８５％が達成された。
【図２７−１】ヒト化ＩｇＧ１からＡＤＣを調製後にＬＣ−ＭＳを実施した結果を示す図である（実施例９）。図２７Ａ：天然グリコシル化パターンを示す、ヒト化ＩｇＧ１の天然重鎖。図２７Ｂ：Ａｃ−ＲＡＫ−Ｌｙｓ（Ｎ３）−ＮＨ２とのコンジュゲーション後のヒト化ＩｇＧ１の天然重鎖。コンジュゲーション効率９８％が達成された。
【図２７−２】図２７Ｃ：Ａｃ−ＲＡＫ−Ｌｙｓ（Ｎ３）−ＮＨ２とのコンジュゲーションおよびＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−Ａｈｘ−ＤＭ１とのクリック結合後のヒト化ＩｇＧ１の天然重鎖。クリック結合効率９８％が達成された。
【図２８−１】ＳＥＣ−ＭＡＬＳ実験の結果を示す図である。図２８Ａ：ハーセプチン、図２８Ｂ：特許請求の範囲に記載されるリンカー技術を使用した、抗ＨＥＲ２−リンカーコンストラクト。
【図２８−２】図２８Ｃ：内製ＡＤＣ、図２８Ｄ：カドサイラ（登録商標）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明を詳細に説明する前に、本発明が、記載される方法の特定の構成要素またはプロセスステップに限定されず、そのような装置および方法は、変更可能であることを理解されたい。また、本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を説明するためにすぎず、制限するものではないことも理解されたい。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形（「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」）は、文脈からそうでないことが明らかである場合を除き、単数および／または複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。さらに、数値によって範囲が定められたパラメータ範囲が示される場合、その範囲は、それらの境界値を含むものとみなされることも理解されたい。
【００２１】
また、本明細書において開示される実施形態は、互いに関連しない個々の実施形態として理解されるよう意図していないことも理解されたい。１つの実施形態について説明される特徴は、本明細書に示される他の実施形態にも関連して開示されるよう意図される。ある事例で、特定の特徴が、１つの実施形態について開示されておらず、別の実施形態について開示されている場合、当業者は、そのことが、前記の特徴が前記の別の実施形態について開示されるよう意図されていないことを必ずしも意味するものではないことを理解するであろう。当業者は、前記の特徴を別の実施形態についても開示することが本出願の趣旨であり、これがなされていないのは、わかりやすくし、かつ明細書の長さを適度に抑えるためにすぎないと理解するであろう。
【００２２】
また、本明細書に引用されている文書の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。これは、標準的または常套的な方法を開示している文書について、特に当てはまる。その場合、参照による組み込みは、主に、十分な実施可能な程度の開示を提供し、かつ冗長な繰り返しを避ける目的を有する。
【００２３】
第１の態様によれば、微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）を用いて、抗体−ペイロードコンジュゲートを生成する方法が提供されるが、この方法は、第一級アミン残基を有するリンカーを、抗体の重鎖または軽鎖に含まれるＧｌｎ残基にコンジュゲートするステップを含み、前記リンカーは、ペプチド構造（ＮからＣの方向に示す）
【００２４】
【化２】
2020534030.tif 000006
［式中、
・ｍは、０以上１２以下の整数であり、
・ｎは、０以上１２以下の整数であり、
・ｏは、０以上１２以下の整数であり、
・ｍ＋ｎ＋ｏは、０以上であり、
・Ａａｘは、任意の天然に存在するまたは天然に存在しないＬ−アミノ酸もしくはＤ−アミノ酸、またはアミノ酸誘導体もしくはミメティック（mimetic）であってもよく、
・Ｂは、ペイロードまたは連結部分であり、
ここで、
【００２５】
【化３】
2020534030.tif 000007
は、第一級アミン基を有する側鎖を含む、アミノ酸、アミノ酸誘導体、またはアミノ酸ミメティックである］を有する。
【００２６】
本明細書において使用される際、「第一級アミン」という用語は、一般式Ｒ−ＮＨ２を有する、２つの水素原子で置換されたアミンに関する。
【００２７】
本明細書に示されるさまざまなリンカーペプチドにおいて、Ｃ末端および／またはＮ末端は、そうではないように示されていたとしても、保護されていても、または保護されていなくてもよいことを理解することが重要である。保護は、Ｃ末端のアミド化、および／またはＮ末端のアセチル化によって達成することができる。本発明の文脈では、保護および非保護リンカーペプチドの双方が包含される。
【００２８】
一実施形態によれば、
【００２９】
【化４】
2020534030.tif 000008
は、リジン、またはリジン誘導体、またはリジンミメティックである。好ましくは、前記リジン、またはリジン誘導体、またはリジンミメティックは、下記の表１に示すような、第一級アミンを有するアミノ酸（Ｄ型およびＬ型の両方）である。
【００３０】
【表３】
2020534030.tif 000009
【００３１】
したがって、最も単純な形態では、Ｂは、Ｌｙｓ、またはリジン誘導体、またはリジンミメティックに直接コンジュゲートしていてもよい。そのような場合、ｍ＋ｎ＋ｏ＝０である。
【００３２】
そのような、リジン、またはリジン誘導体、またはリジンミメティックが毒素に直接コンジュゲートされる実施形態の２つの例を以下に示す。
【００３３】
【化５】
2020534030.tif 000010
【００３４】
一部の実施形態では、ペプチド構造のＮ末端またはＣ末端は、適切な保護基（アミド化またはアセチル化）で保護することができる。
【００３５】
別の実施形態では、Ｌｙｓ誘導体は、第一級アミンを含み、かつトランスグルタミナーゼ酵素により許容される有機分子であってもよい。
【００３６】
リンカー構造は、したがって、下記の表２（表中、Ｌｙｓは、Ａａｘ−ＮＨ２、またはリジン、またはリジン誘導体もしくはミメティックを表す）のいずれの例であってもよい。
【００３７】
【表４】
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【００３８】
本発明者らは、このプロセスが、極めて高い費用効果で迅速に（２４〜３６時間）、部位特異的抗体−ペイロードコンジュゲートを作製するのに適しており、それによって、そのような分子の大きなライブラリーを作製し、続いてそれをハイスループットスクリーニングシステムでスクリーニングすることが可能となることを示した。
【００３９】
これとは対照的に、抗体ペイロードコンジュゲート（antibody payload conjugate）が作製されるＣｙｓ操作プロセスでは、遺伝子（分子）操作されたＣｙｓ残基を介してペイロードが抗体にコンジュゲートされるが、これには、少なくとも約３〜４週間を要する。
【００４０】
一般に、本方法により、多数のペイロードを抗体にコンジュゲートすることが可能になる。ペイロードごとに、大きなリンカーのプールから適切なペプチドリンカー構造を同定して、最適な臨床的および非臨床的特徴を与えることができる。これは、リンカー構造が固定されている他の方法では不可能である。
【００４１】
本明細書において使用される際、「天然に存在しないアミノ酸」またはアミノ酸類似体という用語は、一般構造−ＮＨ−ＣＨＲ−ＣＯ−を有するが、生体のタンパク質中には存在しないアミノ酸に関する。この用語は、β−アラニン、α−アミノ酪酸、γ−アミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、ε−リジン、オルニチン、ヒドロキシプロリン、アグマチン、（Ｓ）−２−アミノ−４−（（２−アミノ）ピリミジニル）ブタン酸、４−アミノ酪酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、６−アミノヘキサン酸、α−アミノイソ酪酸、ベンゾフェノン、ｔ−ブチルグリシン、シトルリン、シクロヘキシルアラニン、デスアミノチロシン、Ｌ−（４−グアニジノ）フェニルアラニン、ホモアルギニン、ホモシステイン、ホモセリン、ホモリジン、ｎ−ホルミルトリプトファン、ノルロイシン、ノルバリン、フェニルグリシン、（Ｓ）−４−ピペリジル−Ｎ−アミジノ）グリシン、オルニチン、パラベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、サルコシン、スタチン、２−チエニルアラニン、および／または天然に存在するまたは天然に存在しないアミノ酸のＤ−異性体を含むが、これらに限定されない。
【００４２】
「Ｄ−アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸の双方のＤ型のものを含むと理解される。
【００４３】
一実施形態では、ペプチド構造を有するリンカーは、カテプシンＢで切断できない。さらなる一実施形態では、ペプチド構造を有するリンカーは、バリン−アラニンモチーフまたはバリン−シトルリンモチーフを含まない。
【００４４】
ＡＤＣリンカーに使用されるがＬｙｓ残基を有さない、１つの典型的なジペプチド構造は、例えばブレンツキシマブベドチン中に備えられ、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ａｎｄ  Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅ  ２００２に記載されているような、バリン−シトルリンモチーフである。このリンカーは、疾患の側で毒素を放出するように、カテプシンＢで切断することができる。同じことが、例えばＳＧＮ−ＣＤ３３Ａ中に備えられるような、バリン−アラニンモチーフにも当てはまる。
【００４５】
さらなる一実施形態では、リンカーは、ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール誘導体を含まない。
【００４６】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、工業生産から医薬に及ぶ多くの用途を有する、ポリエーテル化合物である。ＰＥＧはまた、その分子量により、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）またはポリオキシエチレン（ＰＯＥ）としても知られている。ＰＥＧの構造は、一般に、Ｈ−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−ＯＨとして表現される。
【００４７】
したがって、Ｂはペイロードであっても連結部分であってもよいため、本発明による方法は、下記の表３に示すような２つの主要な実施形態を有する、ということを理解することが重要である。
【００４８】
【表５】
2020534030.tif 000012
【００４９】
本発明の一実施形態によれば、ｍ＋ｎ＋ｏは、２５以下、好ましくは２０以下、より好ましくは１５以下、より好ましくは１２以下、より好ましくは１０以下、より好ましくは８以下、より好ましくは７以下、より好ましくは６以下、より好ましくは５以下、より好ましくは４以下である。
【００５０】
本発明のさらなる一実施形態によれば、ペイロードまたは連結部分は、分子操作により抗体の重鎖または軽鎖に導入されたＧｌｎ残基にコンジュゲートされる。
【００５１】
本発明のさらなる一実施形態によれば、ペイロードまたは連結部分は、抗体のＦｃドメインのＧｌｎにコンジュゲートされる。
【００５２】
本発明のさらなる一実施形態によれば、ペイロードまたは連結部分は、抗体のＣＨ２ドメインＧｌｎ残基Ｑ２９５（ＥＵナンバリング）にコンジュゲートされる。
【００５３】
Ｑ２９５が、ＩｇＧ型抗体において非常によく保存されているアミノ酸残基であることを理解することが重要である。これは、とりわけヒトＩｇＧ１、２、３、４、ならびにウサギおよびラット抗体などで保存されている。したがって、Ｑ２９５を使用できることは、治療用抗体−ペイロードコンジュゲート、または抗体が非ヒト由来のものである場合が多い診断用コンジュゲートを作製する上で、重要な利点である。本発明による方法は、したがって、非常に万能であり、広範囲に適用できる手段を提供する。
【００５４】
さらに、ペイロードの結合にＱ２９５を使用する、操作されたコンジュゲートは、良好な薬物動態および有効性を示し（Lhospice et al. 2015）、分解しやすい不安定な毒素でさえ担持することができる（Dorywalska et al. 2015）。したがって、この部位特異的方法でも、グリコシル化抗体のものではあるが、同じ残基が修飾されていることから、類似の効果が見られることが予想される。グリコシル化は、全般的ＡＤＣ安定性をさらに助長する可能性があり、グリカン部分の除去は、上述の手法と同様に、抗体の安定性を低下させることが示されている（Zheng et al. 2011）。
【００５５】
本発明のさらなる一実施形態によれば、ペイロードまたは連結部分をコンジュゲートする抗体は、グリコシル化されている。
【００５６】
典型的なＩｇＧ型抗体は、ＣＨ２ドメインのＮ２９７位（Ａｓｐ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−モチーフ）でＮ−グリコシル化されている。
【００５７】
トランスグルタミナーゼを用いた、リンカーのＣＨ２  Ｇｌｎ残基へのコンジュゲーションについて記載している文献では、小さい、低分子量の基質に重点が置かれている。しかしながら、従来技術文献には、そのようなコンジュゲーションを達成するために、Ｎ２９７位における脱グリコシル化ステップ、または非グリコシル化抗体の使用が必要であると常に記載されている（国際公開第２０１５／０１５４４８号パンフレット、国際公開第２０１７／０２５１７９号パンフレット、国際公開第２０１３／０９２９９８号パンフレット）。
【００５８】
しかしながら、かなり驚くべきことに、予想に反して、グリコシル化抗体のＱ２９５への部位特異的コンジュゲーションは、実際には、前述のオリゴペプチド構造を使用することにより、効率的に行うことが可能である。
【００５９】
Ｑ２９５は、天然の状態でグリコシル化されているＮ２９７と極めて近接しているが、規定のリンカーを使用する本発明による方法は、それでも、リンカーまたはペイロードをＱ２９５にコンジュゲートすることを可能にする。
【００６０】
しかしながら、示されるように、本発明による方法は、事前にＱ２９５の酵素による脱グリコシル化も、非グリコシル化抗体の使用も、Ｎ２９７の別のアミノ酸による置換も、グリコシル化を防ぐためのＴ２９９Ａ変異の導入も必要としない。
【００６１】
これら２つの点は、製造の面で大きな利益をもたらす。酵素による脱グリコシル化ステップは、脱グリコシル化酵素（例えば、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）と切断されたグリカンの双方ともが媒体から除去されていることを確認しなければならないため、ＧＭＰの面で望ましくない。
【００６２】
さらに、ペイロードを結合するための抗体の遺伝子操作は不要であり、それにより、免疫原性を高め、抗体の全般的安定性を低下させる可能性がある配列挿入を回避することができる。
【００６３】
また、Ｎ２９７の別のアミノ酸による置換も望ましくない効果があるが、これは、Ｆｃドメイン全体の全般的安定性（Subedi et al, 2015）、ひいてはコンジュゲート全体の有効性に影響する可能性があり、その結果、抗体の凝集性増加および溶解性の低下につながる恐れがあり（Zheng et al. 2011）、これはＰＢＤのような疎水性ペイロードの場合に特に重要となるからである。さらに、Ｎ２９７に存在するグリカンは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）をトリガーするなど、重要な免疫調節作用を有する。このような免疫調節作用は、脱グリコシル化、または非グリコシル化抗体を得るための上述の他の手法のいずれかを行うと、失われることになる。さらに、樹立抗体のいかなる配列修飾も、規制問題につながる可能性があり、これは、多くの場合、承認を受け臨床的に確認された抗体が、ＡＤＣコンジュゲーションの出発点として使用されることから、問題となる。
【００６４】
したがって、本発明による方法は、部位特異的ペイロード結合により、化学量論的に明確に定義されたＡＤＣを容易に、かつ不利益を伴わずに、作製することを可能にする。
【００６５】
本発明のさらなる一実施形態によれば、リンカーの正味の電荷は、中性または正である。
【００６６】
ペプチドの正味の電荷は、通常は、中性のｐＨ（７．０）で計算される。最も簡易な手法では、正味の電荷は、正荷電アミノ酸残基（ＡｒｇおよびＬｙｓ、ならびに場合により、Ｈｉｓ）の数、および負荷電アミノ酸残基（ＡｓｐおよびＧｌｕ）の数を加算し、これら２群の差を計算することによって決定される。
【００６７】
本発明のさらなる一実施形態によれば、リンカーは、負荷電アミノ酸残基を含まない。
【００６８】
好ましくは、オリゴペプチドは、負荷電アミノ酸残基ＧｌｕおよびＡｓｐを含まない。
【００６９】
本発明のさらなる一実施形態によれば、リンカーは、正荷電アミノ酸残基を含む。
【００７０】
本発明の一実施形態によれば、リンカーは、
・リジン、またはリジン誘導体、またはリジンミメティック、
・アルギニン、および／または
・ヒスチジン
からなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸残基を含む。
【００７１】
本発明のさらなる一実施形態によれば、Ｂは、遊離スルフヒドリル基を有するＣｙｓ残基である。
【００７２】
そのようなＣｙｓ残基（または誘導体）の遊離スルフヒドリル基は、それにマレイミドを含むリンカー毒素コンストラクトをコンジュゲートするために使用することができる。もう少し詳細なコンジュゲーション反応、およびいくつかの可能なリンカーコンストラクトについては、図５を参照されたい。
【００７３】
マレイミドリンカーを含む毒素は、しばしば使用されており、また、アドセトリスなどは、医療当局の承認を得ている。上述のように、ＭＭＡＥ毒素を含む薬物は、（ｉ）ｐ−アミノベンジルスペーサ、（ｉｉ）ジペプチド、および（ｉｉｉ）マレイミドカプロイルリンカーを含むリンカーにコンジュゲートされ、それにより、このコンストラクトを抗体中のＣｙｓ残基の遊離スルフヒドリル基にコンジュゲートすることが可能になる。
【００７４】
本発明によりリンカー中にＣｙｓ残基を備えることには、したがって、既成の毒素−マレイミドコンストラクトを使用して抗体−ペイロードコンジュゲートを作出することができるという利点、またはより一般的には、Ｃｙｓ−マレイミド結合の化学的性質の利益を十分に活用できるという利点がある。同時に、脱グリコシル化の必要がない既成の抗体を使用することができる。
【００７５】
特定の実施形態では、Ｃｙｓ残基は、ペプチドリンカーのＣ末端、鎖内、またはＮ末端にある。
【００７６】
本発明のさらなる一実施形態によれば、抗体は、抗体のＣＨ２ドメインに、Ａｓｎ残基Ｎ２９７（ＥＵナンバリング）を含む。
【００７７】
本発明のさらなる一実施形態によれば、Ｎ２９７残基は、グリコシル化されている。
【００７８】
本発明のさらなる一実施形態によれば、リンカーまたはペイロードは、Ｇｌｎ残基のアミド側鎖にコンジュゲートされる。
【００７９】
本発明のさらなる一実施形態によれば、Ｂが連結部分である場合、実際のペイロードを連結部分に連結させるさらなるステップが実施されることが規定される。
【００８０】
本発明のさらなる一実施形態によれば、微生物トランスグルタミナーゼは、ストレプトミセス・モバラエンシス（Streptomyces mobaraensis）に由来し、優先的には、天然酵素との配列同一性が８０％である。
【００８１】
そのような微生物トランスグルタミナーゼの１つは、Ｚｅｄｉｒａ社（ドイツ）から市販されている。これは、大腸菌（E. coli）から組換えにより産生されたものである。ストレプトミセス・モバラエンシス（Streptomyces mobaraensis）トランスグルタミナーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ６Ｅ０Ｙ３（Ｑ６Ｅ０Ｙ３＿ＳＴＲＭＢ））は、配列番号３６において開示されるアミノ酸配列を有する。
【００８２】
別の実施形態では、微生物トランスグルタミナーゼストレプトミセス・ラダカヌム（旧称は、ストレプトベルティシリウム・ラダカヌム（Streptoverticillium ladakanum））が使用される。ストレプトミセス・ラダカヌム（Streptomyces ladakanum）トランスグルタミナーゼ（米国特許第６，６６０，５１０号明細書）は、配列番号３７において開示されるアミノ酸配列を有する。
【００８３】
上記の両トランスグルタミナーゼは、配列が修飾されていてもよい。いくつかの実施形態では、配列番号３６または配列番号３７との配列同一性が８０％以上のトランスグルタミナーゼを使用することができる。
【００８４】
別の適切な微生物トランスグルタミナーゼは、Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ社から市販されており、ＡＣＴＩＶＡ  ＴＧと称される。Ｚｅｄｉｒａ社製のトランスグルタミナーゼと比較すると、ＡＣＴＩＶＡ  ＴＧは、４つのＮ末端アミノ酸を欠いているが、同様の活性を示す。
【００８５】
本発明に関連して使用可能なさらなる微生物トランスグルタミナーゼは、Kieliszek and Misiewicz 2014、国際公開第２０１５１９１８８３号パンフレット、国際公開第２００８１０２００７号パンフレット、および米国特許第２０１００１４３９７０号明細書に開示されている（これらの内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００８６】
本発明のさらなる一実施形態によれば、連結部分Ｂは、
・生体直交型マーカー基
・架橋のための他の非生体直交型実体
からなる群から選択される少なくとも１つである。
【００８７】
「生体直交型マーカー基」という用語は、天然の生化学的プロセスに干渉することなく、生体系内で化学反応を生じることが可能な反応性基を指して、Sletten and Bertozzi(2011)によって確立された。
【００８８】
生体直交性の要件を満たすいくつかの化学ライゲーション戦略が開発されているが、これには、アジドとシクロオクチン間（銅フリークリックケミストリーとも称される、Baskin et al (2007)）、ニトロンとシクロオクチン間（Ning et al (2010)）の１，３−双極子付加環化、アルデヒドおよびケトンからのオキシム／ヒドラゾン形成（Yarema, et al (1998)）、テトラジンライゲーションBlackman et al (2008)、イソニトリルに基づくクリック反応（Stockmann et al (2011)）、および最近では、クアドリシクランライゲーション（Sletten & Bertozzi (JACS, 2011)）、銅（Ｉ）触媒アジド−アルキン環化付加（ＣｕＡＡＣ、Kolb & Sharpless 2003）、歪み促進型アジド−アルキン環化付加（ＳＰＡＡＣ、Agard et al 2006）、または歪み促進型アルキン−ニトロン環化付加（ＳＰＡＮＣ、MacKenzie et al 2014）が含まれる。
【００８９】
これらすべての文書は、十分な実施可能な程度の開示を提供し、かつ冗長な繰り返しを避けるために、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９０】
本発明のさらなる一実施形態によれば、生体直交型マーカー基または非生体直交型実体は、
・−Ｎ−Ｎ≡Ｎまたは−Ｎ３
・Ｌｙｓ（Ｎ３）
・テトラジン
・アルキン
・ＤＢＣＯ
・ＢＣＮ
・ノルボレン（Norborene）
・トランスシクロオクテン
・−ＲＣＯＨ（アルデヒド）
・アシルトリフルオロボレート、
・−ＳＨ、および／または
・システイン
からなる群から選択される少なくとも１つである。
【００９１】
これらの基は、例えば、以下の結合反応のいずれかに関与することができる。
【００９２】
【表６】
2020534030.tif 000013
【００９３】
上記の表４において、前記連結部分は、表中で「結合パートナー１」または「結合パートナー２」とされるもののいずれであってもよい。
【００９４】
本発明のさらなる一実施形態によれば、ペイロードＢは、
・毒素
・サイトカイン
・成長因子
・放射性核種
・ホルモン
・抗ウイルス剤
・抗細菌剤
・蛍光色素
・免疫調節／免疫刺激剤
・半減期増大部分
・溶解性増大部分
・ポリマー−毒素コンジュゲート
・核酸
・ビオチンまたはストレプトアビジン部分
・ビタミン
・標的結合部分、および／または
・抗炎症剤
からなる群から選択される少なくとも１つである。
【００９５】
半減期増大部分は、例えば、ＰＥＧ部分（ポリエチレングリコール部分、ＰＥＧ化）、他のポリマー部分、ＰＡＳ部分（プロリン、アラニン、およびセリンを含むオリゴペプチド、ＰＡＳ化）、または血清アルブミンバインダーである。溶解性増大部分は、例えば、ＰＥＧ部分（ＰＥＧ化）またはＰＡＳ部分（ＰＡＳ化）である。
【００９６】
ポリマー−毒素コンジュゲートは、多くのペイロード分子を担持することができるポリマーである。そのようなコンジュゲートはまた、フレキシマー（fleximer）と呼ばれることもあり、例えば、Ｍｅｒｓａｎａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社が販売している。
【００９７】
核酸ペイロードの１つの例は、ＭＣＴ−４８５であるが、これは、ＭｕｌｔｉＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ社により開発された、腫瘍溶解性および免疫賦活性を有する、極めて小さい非コード２本鎖ＲＮＡである。
【００９８】
抗炎症剤には、例えば、抗炎症性サイトカインがあるが、これは、標的特異的抗体にコンジュゲートすると、例えば自己免疫性疾患に起因する、炎症を改善し得る。
【００９９】
本発明のさらなる一実施形態によれば、毒素は、
・ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）
・アウリスタチン（例えば、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ）
・メイタンシノイド（メイタンシン、ＤＭ１、ＤＭ４）
・デュオカルマイシン
・ツブリシン
・エンジイン（例えば、カリケアマイシン）
・ＰＮＵ、ドキソルビシン
・ピロールベースのキネシンスピンドルタンパク質（ＫＳＰ）阻害剤
・カリケアマイシン
・アマニチン（例えば、α−アマニチン）、および／または
・カンプトテシン（例えば、エキサテカン、デルクステカン）
からなる群から選択される少なくとも１つである。
【０１００】
ビタミンは、葉酸、ホラシン、およびビタミンＢ９を含む葉酸塩からなる群から選択することができる。
【０１０１】
標的結合部分は、タンパク質もしくは非タンパク質標的に特異的に結合することができる、タンパク質または小分子であってもよい。一実施形態では、そのような標的結合部分は、ｓｃＦｖ型抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ナノボディ、アフィボディ、ダイアボディ、ＶＨＨ型抗体、またはＤＡＲＰＩＮを含む抗体ミメティックである。
【０１０２】
本発明のさらなる一実施形態によれば、抗体は、
・ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ
・ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ、ならびに／または
・標的結合特性を保持し、ＣＨ２ドメインを含む、それらの断片もしくは組換え変異体
からなる群から選択される少なくとも１つである。
【０１０３】
抗体は、好ましくは、モノクローナル抗体である。
【０１０４】
抗体は、ヒト由来であってもよいが、さらに、マウス、ラット、ヤギ、ロバ、ハムスター、またはウサギ由来であってもよい。コンジュゲートが治療用である場合、マウスまたはウサギ抗体は、場合により、キメラ化またはヒト化してもよい。
【０１０５】
ＣＨ２ドメインを含む、抗体の断片または組換え変異体は、例えば、
・重鎖ドメイン（サメ抗体／ＩｇＮＡＲ（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４−ＣＨ５）２またはラクダ科動物抗体／ｈｃＩｇＧ（ＶＨ−ＣＨ２−ＣＨ３）２）のみを含む抗体フォーマット
・ｓｃＦｖ−Ｆｃ（ＶＨ−ＶＬ−ＣＨ２−ＣＨ３）２
・Ｆｃドメインおよび１つまたは複数の受容体ドメインを含む、Ｆｃ融合ペプチド
である。
【０１０６】
抗体はまた、二重特異性（例えば、ＤＶＤ−ＩｇＧ、ｃｒｏｓｓＭａｂ、付加ＩｇＧ−ＨＣ融合体）またはバイパラトピックであってもよい。概説については、Brinkmann and Kontermann (2017)を参照されたい。
【０１０７】
本発明のさらなる一実施形態によれば、リンカーは、２つ以上の連結部分Ｂを有する。
【０１０８】
そのような実施形態では、抗体−ペイロードコンジュゲートは、例えば、それぞれのＱ２９５残基に２つのペイロードをコンジュゲートして、抗体対ペイロード比２で作出することができる。
【０１０９】
本発明のさらなる一実施形態によれば、２つ以上の連結部分Ｂは、互いに異なる。
【０１１０】
そのような実施形態では、第１の連結部分は、例えば、アジド（Ｎ３）であってもよく、第２の連結部分は、テトラジンであってもよい。そのようなオリゴペプチドリンカーは、このように、２つの異なるペイロードを抗体の２つのＧｌｎ残基、すなわち、抗体のＣＨ２ドメインのＱ２９５にコンジュゲートすることを可能にする。
【０１１１】
このようにして、抗体ペイロード比２＋２を達成することができる。第２のペイロードを使用することにより、有効性および力価に関して現在の治療手法を超える、全く新しいクラスの抗体ペイロードコンジュゲートを開発することが可能となる。
【０１１２】
そのような実施形態は、とりわけ、細胞中の２つの異なる構造、例えば、ＤＮＡと微小管を標的にすることを可能にする。がんによっては、１つの薬物、例えば、微小管毒素に耐性を示す可能性があるが、それでもなお、ＤＮＡ毒素が、がん細胞を殺傷することができる。
【０１１３】
別の実施形態によれば、同時に同一組織で放出された場合にはじめて十分な効能を発揮する、２つの薬物を使用することができる。これは、正常組織において抗体が部分的に分解された場合、または１つの薬物が早期に消失した場合に、標的外毒性を低下させることができる。
【０１１４】
さらに、二重標識プローブは、非侵襲的イメージングおよび治療、または術中／術後のイメージング／手術のために使用することができる。そのような実施形態では、非侵襲的イメージングを用いて、腫瘍患者を選択することができる。次いで、執刀医またはロボットがすべての癌組織を同定するのを助ける、もう一方のイメージング剤（例えば、蛍光色素）を使用して、腫瘍を外科的に切除することができる。
【０１１５】
本発明の別の態様によれば、前述のステップのいずれか１つによる方法で生成された、抗体−ペイロードコンジュゲートが提供される。
【０１１６】
本発明の別の態様によれば、ペプチド構造（ＮからＣの方向に示す）
【０１１７】
【化６】
2020534030.tif 000014
［式中、
・ｍは、０以上１２以下の整数であり、
・ｎは、０以上１２以下の整数であり、
・ｏは、０以上１２以下の整数であり、
・ｍ＋ｎ＋ｏは、０以上であり、
・Ａａｘは、任意の天然に存在するまたは天然に存在しないＬ−アミノ酸もしくはＤ−アミノ酸、またはアミノ酸誘導体もしくはミメティックであってもよく、
・Ｂは、ペイロードまたは連結部分であり、
ここで、
【０１１８】
【化７】
2020534030.tif 000015
は、第一級アミン基を有する側鎖を含む、アミノ酸、アミノ酸誘導体、またはアミノ酸ミメティックである］を有するリンカーが提供される。
【０１１９】
一般に、本発明の方法による前述の利益および実施形態はまた、本態様、すなわち、組成物としてのリンカーにも適用される。したがって、それらの実施形態は、組成物としてのリンカーについても開示されるとみなすものとする。
【０１２０】
本明細書に示されるさまざまなリンカーペプチドにおいて、Ｃ末端および／またはＮ末端は、そうではないように示されていたとしても、保護されていても、または保護されていなくてもよいことを理解することも重要である。保護は、Ｃ末端のアミド化、および／またはＮ末端のアセチル化によって達成することができる。本発明の文脈では、保護および非保護リンカーペプチドの双方が包含される。
【０１２１】
その一実施形態では、
【０１２２】
【化８】
2020534030.tif 000016
は、リジン、またはリジン誘導体、またはリジンミメティックである。
【０１２３】
さらなる実施形態では、リンカーは、カテプシンＢで切断できず、および／またはリンカーは、バリン−アラニンモチーフもしくはバリン−シトルリンモチーフを含まず、および／またはリンカーは、ポリエチレングリコールもしくはポリエチレングリコール誘導体を含まない。
【０１２４】
一実施形態によれば、ｍ＋ｎ＋ｏは、２５以下、好ましくは２０以下、より好ましくは１５以下、より好ましくは１２以下、より好ましくは１０以下、より好ましくは８以下、より好ましくは７以下、より好ましくは６以下、より好ましくは５以下、より好ましくは４以下である。
【０１２５】
一実施形態によれば、連結部分Ｂは、
・生体直交型マーカー基
・架橋のための他の非生体直交型実体
からなる群から選択される少なくとも１つである。
【０１２６】
一実施形態によれば、生体直交型マーカー基または非生体直交型実体は、
・−Ｎ−Ｎ≡Ｎまたは−Ｎ３
・Ｌｙｓ（Ｎ３）
・テトラジン
・アルキン
・ＤＢＣＯ
・ＢＣＮ
・ノルボレン
・トランスシクロオクテン
・−ＲＣＯＨ（アルデヒド）
・アシルトリフルオロボレート、
・−ＳＨ、および／または
・システイン
からなる群から選択される少なくとも１つである。
【０１２７】
さらなる実施形態では、リンカーの正味の電荷は、中性もしくは正であり、および／またはリンカーは、負荷電アミノ酸残基を含まず、および／またはリンカーは、正荷電アミノ酸残基を含み、および／またはリンカーは、
・リジン、またはリジン誘導体、またはリジンミメティック、
・アルギニン、および／または
・ヒスチジン
からなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸残基を含む。
【０１２８】
一実施形態によれば、第一級アミン基は、微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）の基質として働くのに適している。
【０１２９】
さらなる一実施形態によれば、リンカーは、微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）を用いて抗体−ペイロードコンジュゲートを生成するのに適している。
【０１３０】
さらなる一実施形態によれば、リンカーは、
ａ）表５に示されるリスト、および／または
ｂ）配列番号１〜３５および３８〜４５のいずれか１つ
から選択される。
【０１３１】
本発明のまた別の態様によれば、少なくとも、
ａ）上記に記載のいずれかのリンカーと、
ｂ）１つまたは複数のペイロードと
を含むリンカー−ペイロードコンストラクトであって、前記コンストラクトにおいて、リンカーおよび／またはペイロードが、場合により、結合時に、前記コンストラクトを形成するために、共有結合または非共有結合が可能になるように化学修飾されている、リンカー−ペイロードコンストラクトが提供される。
【０１３２】
２つ以上のペイロードが使用される場合、これらは、互いに同一であっても異なってもよい。
【０１３３】
一実施形態では、ペイロードは、
・毒素
・サイトカイン
・成長因子
・放射性核種
・ホルモン
・抗ウイルス剤
・抗細菌剤
・蛍光色素
・免疫調節／免疫刺激剤
・半減期増大部分
・溶解性増大部分
・ポリマー−毒素コンジュゲート
・核酸
・ビオチンまたはストレプトアビジン部分
・ビタミン
・標的結合部分、および／または
・抗炎症剤
からなる群から選択される少なくとも１つである。
【０１３４】
別の実施形態では、毒素は、
・ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）
・アウリスタチン（例えば、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ）
・メイタンシノイド（メイタンシン、ＤＭ１、ＤＭ４）
・デュオカルマイシン
・ツブリシン
・エンジイン（例えば、カリケアマイシン）
・ＰＮＵ、ドキソルビシン
・ピロールベースのキネシンスピンドルタンパク質（ＫＳＰ）阻害剤
・カリケアマイシン
・アマニチン（例えば、α−アマニチン）、および／または
・カンプトテシン（例えば、エキサテカン、デルクステカン）
からなる群から選択される少なくとも１つである。
【０１３５】
本発明の別の態様によれば、抗体−ペイロードコンジュゲートであって、
ａ）上記の記載による１つまたは複数のリンカー−ペイロードコンストラクトと、
ｂ）重鎖または軽鎖中に少なくとも１つのＧｌｎ残基を含む抗体と
を含み、前記コンジュゲートにおいて、リンカー−ペイロードコンストラクトおよび／または抗体が、場合により、コンジュゲーション時に、前記コンジュゲートを形成するために、共有結合または非共有結合コンジュゲーションが可能になるように化学修飾されている、抗体−ペイロードコンジュゲートが提供される。
【０１３６】
本発明の別の態様によれば、上記の記載によるリンカー、上記の記載によるリンカー−ペイロードコンストラクト、および／または上記の記載による抗体−ペイロードコンジュゲートを含む医薬組成物が提供される。
【０１３７】
本発明の別の態様によれば、上記の記載による抗体−ペイロードコンジュゲートまたは上記の記載による医薬組成物と、少なくとも１つのさらなる薬学的に許容される成分とを含む、医薬製品が提供される。
【０１３８】
本発明の別の態様によれば、新生物性疾患、神経性疾患、自己免疫性疾患、炎症性疾患、または感染性疾患について
・罹患している、
・発症するリスクがある、および／または
・診断されている
患者の処置もしくは予防のため、またはそのような状態の予防のための（医薬を製造するための）、上記の記載による医薬組成物、または上記の記載による製品が提供される。
【０１３９】
本発明の別の態様によれば、新生物性疾患を処置または予防する方法であって、上記の記載による抗体−ペイロードコンジュゲート、上記の記載による医薬組成物、または上記の記載による製品を、それを必要とする患者に投与するステップを含む方法が提供される。
【０１４０】
炎症性疾患は、自己免疫性疾患であってもよい。感染性疾患は、細菌感染症またはウイルス感染症であってもよい。
【０１４１】
前記コンジュゲートまたは製品は、疾患を効率的に処置する量または投薬量で、ヒトまたは動物対象に投与される。あるいは、それに対応する処置法が提供される。
【０１４２】
下記の表５は、本発明に関連して使用可能なさまざまなリンカーおよびその配列番号を示している。疑義を避けるために、電子形式のＷＩＰＯ  ＳＴ  ２５配列表と矛盾がある場合、この表の配列が正しい配列であるとみなすものとする。
【０１４３】
本明細書に示される一部のリンカーペプチドでは、Ｃ末端の部分が単にＮ３として指定されていることを理解することが重要である。しかしながら、これは、Ｌｙｓ（Ｎ３）の略記として理解すべきである。例えば、ＲＡＫＡＲ（Ｎ３）またはＡｒｇＡｌａＬｙｓＡｌａＡｒｇ（Ｎ３）は、実際には、ＲＡＫ１ＡＲＫ２（Ｋ２＝Ｌｙｓ（Ｎ３））、またはＡｒｇＡｌａＬｙｓＡｌａＡｒｇＬｙｓ（Ｎ３）を意味する。
【０１４４】
さらに、本明細書に示されるさまざまなリンカーペプチドにおいて、Ｃ末端および／またはＮ末端は、そうではないように示されていたとしても、保護されていても、または保護されていなくてもよいことを理解することも重要である。
【０１４５】
保護は、Ｃ末端のアミド化、および／またはＮ末端のアセチル化によって達成することができる。本発明の文脈では、保護および非保護リンカーペプチドの双方が包含される。
【０１４６】
例えば、ＲＡＫＡＲＫ（Ｎ３）は、実際、ａ）両末端とも上述のように保護された変異体、ｂ）Ｎ末端のみ、またはＣ末端のみが上述のように保護された変異体、またはｃ）両末端とも保護されていない変異体、の４つの変異体を包含する。
【０１４７】
一方、ＮＨ２−ＡｒｇＡｌａＬｙｓＬｙｓ（Ｎ３）−ＣＯＯＨは、例えば、保護されていないペプチド、すなわち、保護されていないＮ末端およびＣ末端を有するペプチドを明確に指定している。
【０１４８】
【表７−１】
2020534030.tif 000017
【０１４９】
【表７−２】
2020534030.tif 000018
【０１５０】
【表７−３】
2020534030.tif 000019
【実施例】
【０１５１】
図面および上記の記載において、本発明について詳細に説明および記載してきたが、そのような説明および記載は、説明または例示のためのものであり、制限するものではないとみなすべきである。本発明は、開示される実施形態に限定されない。開示される実施形態の他の変形形態は、図面、開示、および添付の特許請求の範囲を検討することにより、特許請求の範囲に記載の発明を実施する上で、当業者により理解および達成が可能である。特許請求の範囲において、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含むこと）」という用語は、他の要素またはステップを除外するものではなく、不定冠詞「ａ（１つの）」または「ａｎ（１つの）」は、複数であることを除外するものではない。ある特定の手段が互いに異なる従属クレームに記載されていても、それだけで、それらの手段の組み合わせを使用して利益を得ることができないことを示すものではない。特許請求の範囲における参照記号は、その範囲を制限するものと解釈すべきではない。
【０１５２】
本明細書に開示されるすべてのアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端の方向に示され、本明細書に開示されるすべての核酸配列は、５’から３’の方向に示される。
【０１５３】
[実施例１]
適切なＬｙｓ含有ペプチドについてのリンカーライブラリーのスクリーニング
本明細書に記載のように、微生物トランスグルタミナーゼを用いて天然抗体のＱ２９５への定量的コンジュゲーション（すなわち、＞９５％）を達成するのに適したオリゴペプチド構造を同定するために、３つのリジン含有オリゴペプチドライブラリーをスクリーニングした。ライブラリー１のペプチドは、ある程度はCaporale et al., 2015に由来するものであるが、独自のペプチドも設計した。一方、ライブラリー２およびライブラリー３は、先行するライブラリーに関して得た知識から生成および開発したものである。グリコシル化ＩｇＧ（ＩｇＧ１）を参照抗体として使用した。
【０１５４】
反応条件は、以下の通りである。天然ヒト化ＩｇＧ１参照抗体１ｍｇ／ｍＬ、抗体に対して８０過剰モルのペプチド、ＭＴＧ６〜１２Ｕ／ｍｌ、２０時間、３７℃、緩衝液ｐＨ７．６。ＬＣ−ＭＳ−ＥＳＩ（ＬＣＴ−Ｐｒｅｍｉｅｒ、Ｗａｔｅｒｓ社、米国ミルフォード）で反応混合物を分析した。分析のために、抗体−コンジュゲートをＤＴＴ５０ｍＭで還元して（３７℃で１５分）、軽鎖を重鎖から分離した。これは、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）およびＡｅｒｉｓ  ＷＩＤＥＰＯＲＥ  ＸＢ−Ｃ１８カラム（３．６μｍ、１００ｍｍ×２．１ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社、米国）を用い、カラム温度８０℃で、下記の表６に示すＬＣグラジエントを使用して達成した。
【０１５５】
【表８】
2020534030.tif 000020
【０１５６】
得られたＭＳスペクトルをＭａｓｓＬｙｎｘ  Ｖ４．１を用いて分析し、ＭａｘＥｎｔ１アルゴリズムを利用してデコンボリュートした。コンジュゲーション率Ｒｃを下記の通り計算した。
【０１５７】
【数１】
2020534030.tif 000021
【０１５８】
図３は、３つのライブラリーのスクリーニング結果を示している。正荷電アミノ酸がコンジュゲーション反応に有利であるのに対し、負荷電アミノ酸は、しばしばコンジュゲーション反応を抑制するということがわかった。しかしながら、正荷電アミノ酸を導入することによって、負荷電アミノ酸を上回ることが可能である。したがって、トランスグルタミナーゼ酵素は、そのようなペプチドを許容する。
【０１５９】
これらのペプチドは、機能性ではなく、すなわち、リンカー部分、例えば、生体直交型の基を担持していないが、単に、最も高い効率でコンジュゲートされるリジン含有ペプチドを発見するためにのみ使用した。
【０１６０】
荷電オリゴペプチド構造を非脱グリコシル化（＝天然）抗体のＱ２９５に効率的にコンジュゲートできることは有利であるが、これは、そのことにより、ピロロベンゾジアゼピン毒素（ＰＢＤ毒素）のような最も疎水性のペイロードでさえ結合することも可能となり、ポリ（エチレングリコール）ベースの親水性に乏しい低分子量基質と比較して、凝集の可能性を最小限に抑えながら、効果的に溶液中に維持することができるからである。
【０１６１】
[実施例２]
細胞毒性アッセイ
細胞株および培養：アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＫ−ＢＲ−３を入手し、標準的な細胞培養手順に従って、ＲＰＭＩ−１６４０で培養した。
【０１６２】
ＳＫ−ＢＲ−３は、１９７０年にメモリアル・スローン・ケタリングがんセンターにより単離された乳がん細胞株であり、治療法の研究において、特にＨＥＲ２標的化との関連で使用されている。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、「基底」型のヒト乳腺癌に由来し、トリプルネガティブ（ＥＲ、ＰＲ、およびＨＥＲ２陰性）である。アドセトリス（ブレンツキシマブベドチン）は、ＣＤ３０を標的とし、したがってＣＤ３０を発現しない細胞、例えば、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＳＫ−ＢＲ−３に対しては活性を有さないことが予想される、市販の抗体薬物コンジュゲートである。カドサイラ（トラスツズマブエムタンシン）は、Ｈｅｒ２を標的とし、したがってＨｅｒ２を発現する細胞（例えば、ＳＫ−ＢＲ−３）に対しては活性を有し、Ｈｅｒ２を発現しない細胞（例えば、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）に対しては活性を有さないことが予想される、市販の抗体薬物コンジュゲートである。ＡＤＣ（内製）は、本明細書に規定のリンカー技術により、非脱グリコシル化抗体を用いて作製した抗体薬物コンジュゲートであり、Ｈｅｒ２を標的とし、薬物対抗体比は２であり、したがって２つのエムタンシン（ＤＭ−１）分子を有する。抗ＨＥＲ２  ｍＡｂは、Ｈｅｒ２を標的とする、非脱グリコシル化、非コンジュゲート抗体である。
【０１６３】
細胞毒性アッセイ：９６ウェルプレート（白壁、透明平底プレート）に、１ウェル当たり細胞１０，０００個の密度で細胞を播種し、３７ｏＣ、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）および抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を培地で１：４に段階希釈した（出発濃度１０μｇ／ｍＬ（６６．７ｎＭ））。細胞から培地を除去し、ｍＡｂ／ＡＤＣ希釈物を加えた。培地のみで処置した細胞を生存率１００％の参照とした。細胞を抗体とともに、３７ｏＣ、５％ＣＯ２で３日間インキュベートした。
【０１６４】
製造業者の説明書に従って、本明細書に簡単に概説するように、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ社）により細胞生存率を評価した。プレートを室温に３０分間平衡化させた。Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ緩衝液を基質に添加することにより、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬を作製した。１ウェル当たり５０μＬのＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬を添加し、室温で振盪しながら２分間インキュベートしたあと、室温でさらに３０分間インキュベートした。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ２０３０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｒｅａｄｅｒ  Ｖｉｃｔｏｒ（商標）  Ｘ３プレートリーダーで、１秒の積分時間で発光を検出した。
【０１６５】
データを以下のように処理した。培地のみで処置したウェルの発光値を平均し、生存率１００％の参照とした。下式を用いて、ｍＡｂ／ＡＤＣ処置ウェルの生存率（％）を計算した。
【０１６６】
【数２】
2020534030.tif 000022
【０１６７】
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７．００を使用して、正規化生存率（％）をｍＡｂ／ＡＤＣ濃度の対数に対してプロットし、データを当てはめた。
【０１６８】
図２２に見られるように、ＡＤＣ（内製）は、ＳＫ−ＢＲ３細胞に対して、カドサイラと同じ力価を有する。したがって、新規のリンカー技術によってもたらされる利益（製造が容易なこと、部位特異性、安定した化学量論性、抗体を脱グリコシル化する必要がないこと）は、細胞毒性に関して、いかなる不利益も伴わない。このことは、カドサイラの平均ＤＡＲが３．５３±０．０５である一方、ＡＤＣ（内製）のＤＡＲは２であり、したがってより多くの毒素を標的細胞に送達することができるため、さらに重要となる。
【０１６９】
[実施例３]
部位特異的にコンジュゲートしたＩｇＧ１抗体の調製
コンジュゲーション後にも天然のままである、部位特異的にコンジュゲートしたＩｇＧ１抗体の調製（図１０〜図１２）。以下のコンジュゲーション条件を使用した：標準緩衝液中の天然ＩｇＧ１（最終濃度１ｍｇ／ｍＬ）、アジド含有ペプチド８０当量、微生物トランスグルタミナーゼ１２Ｕ／ｍＬ、緩衝液ｐＨ７．６（２５℃）、３７℃で２０時間のインキュベーション。次いで、コンジュゲートした抗体を、ＰＤ１０カラムを用いて精製し、続いてＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４  ５０ｋＤａフィルターでの遠心ステップを実施した。次に、ＤＭＳＯに溶解させた１０当量のＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−５／６−ＦＡＭ色素または１０当量のＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−５／６−カルボキシローダミン色素を添加して、室温の暗所で４時間クリック反応を実施した。緩衝液ｐＨ７．６および５０ｋＤａ  Ａｍｉｃｏｎを用い、反復洗浄ステップによりクリーンアップを行った。ＵＶ−ＶＩＳ分光法により、抗体濃度を測定した。Ａｅｒｉｓ  ＷＩＤＥＰＯＲＥ  ＸＢＣ１８カラム、および実施例１に記載の条件を使用して、ＬＣ−ＭＳにより、コンジュゲーションを定量化した。
【０１７０】
[実施例４]
フローサイトメトリー実験
ＳＫＯＶ３ｉｐ細胞（およそ１５×１０６）をＰＢＳ１０ｍＬ（３７℃）で洗浄した。上清を廃棄し、Ａｃｃｕｔａｓｅ２．５ｍＬを添加して、３７℃で１０〜３０分間、表面から細胞を溶解した。ＰＢＳさらに７．５ｍＬを加え、細胞を穏やかにピペットで混合し、１５ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに移した。Ｎｅｕｂａｕｅｒ細胞計数チャンバーで細胞を計数した。Ｆａｌｃｏｎチューブを１０００ｇで５分間遠心し、上清を廃棄し、細胞ペレットを氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋３％ＦＣＳ）に再懸濁させた。使用した緩衝液の量は、試料１００μＬ当たり細胞５００，０００個の濃度に相当する。ここからは、これを氷上で操作した。９６ウェルプレートの対照ウェルに細胞１００μＬを分注した。ヒトＩｇＧ１を５μｇ添加し、ピペット操作によって慎重に混合した。細胞が入った９６ウェルプレート全体を穏やかに振盪しながら３０分間インキュベートした。インキュベーションの１５分後、ピペット混合ステップを実施した。次に、このウェルにＦＡＣＳ−緩衝液をさらに１００μＬ添加し、予冷した遠心分離機を用いて、４℃、５分／５００ｇで細胞をペレット化した。上清を廃棄し、細胞をＦＡＣＳ緩衝液２００μＬに穏やかに再懸濁させた。細胞を再びペレット化し、洗浄手順を少なくとももう一度繰り返した。次に、ＦＡＣＳ緩衝液１００μＬを使用して細胞を再懸濁させ、二次ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ（１：７５希釈、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、米国）１μＬを添加した。次に、残りの他のウェルに、細胞１００μＬを加えた。対照ウェルには細胞のみを入れ、試料ウェルには、５μｇの対応する抗体（アイソタイプＩｇＧ１対照を含め、コンジュゲーションおよびクリック結合を行ったＩｇＧ１）を加えた。３０分間のインキュベーションステップおよびすべての洗浄ステップを上記と同様に実施した。二度目の洗浄ステップ後、ＦＡＣＳ緩衝液１２０μＬを使用してペレットを再懸濁させ、Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、スイス）でフローサイトメトリー分析を行った。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ  Ｉｎｃ社、米国）でデータを分析した。結果を図１３に示す。
【０１７１】
[実施例５]
コンジュゲーション効率
ペプチドを入手したままで使用し、製造業者の説明書に従って、適切な原液濃度（例えば、２５ｍＭ）で溶解し、アリコートを調製して−２０℃で保管した。ＩｇＧサブクラスの２種の抗体（抗体１：抗Ｈｅｒ２  ＩｇＧ１、抗体２：抗ＣＤ３８  ＩｇＧ１）を下記の通り修飾した。１ｍｇ／ｍＬの非脱グリコシル化抗体（約６．６７μＭ）をペプチドリンカー８０モル当量（すなわち、約５３３μＭ）、ＭＴＧ  ６Ｕ／ｍＬ、および緩衝液と混合した。反応混合物を３７℃で２０時間インキュベートしたあと、還元条件下でＬＣ−ＭＳ分析を行った。Ｌｙｓ（Ｎ３）−ＲＡＫＡＲ−Ｌｙｓ（Ｎ３）には、ＭＴＧ  １２Ｕ／ｍｌを使用した。
【０１７２】
下表は、本発明によるいくつかの例示的リンカーのコンジュゲーション効率を示している。
【０１７３】
【表９】
2020534030.tif 000023
【０１７４】
陰性比較として、本発明によるものではない３つのリンカーを使用した。
【０１７５】
【表１０】
2020534030.tif 000024
【０１７６】
これらのリンカーは、いずれもアミノ酸側鎖に第一級アミン基を備えず、したがって、非脱グリコシル化抗体へのコンジュゲーションは生じなかった。
【０１７７】
[実施例６]
二重ペイロードコンジュゲーションおよび細胞結合試験
６．１．二重機能化ヒト化ＩｇＧ１の調製
ＩｇＧ１抗体を８０当量のペプチドＮＨ２−Ｋ（Ｎ３）ＣＲＡＫ−ＣＯＯＨおよび抗体１ｍｇ当たり６ＵのＭＴＧとともに、緩衝液ｐＨ７．６中、３７℃で２４時間インキュベートした。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  １６／６００  ＨｉＬｏａｄ  ２００カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーにより、コンジュゲートした抗体から過剰リンカーおよびＭＴＧ酵素を取り除いた。Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ遠心フィルター装置（３０ＭＷＣＯ）で画分を濃縮した。次いで、抗体−リンカーコンジュゲートを３０当量のジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元し、精製したあと、１０当量のデヒドロアスコルビン酸に８℃で１時間曝露した。３０ＭＷＣＯのＡｍｉｃｏｎフィルターチューブを使用して、記載のようにさらなる浄化ステップを３回行った。次いで、抗体−コンジュゲート試料を２０当量のマレイミド−ＮＯＤＡＧＡとともにインキュベートし、８℃で一晩置いた。Ａｍｉｃｏｎ洗浄で過剰リンカーを除去したあと、試料を２０当量のＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−Ａｈｘ−ＤＭ１とともに４時間インキュベートした。精製後、試料をＬＣ−ＭＳで分析した。結果を図２３Ａおよび２３Ｂに示す。
【０１７８】
６．２．抗体標識および細胞結合試験（Ｌｉｎｄｍｏアッセイ）
７０μｌの機能化抗体（１．３ｍｇ／ｍＬ）に、１５μＬのインジウム−１１１（１１１Ｉｎ）（７．７ＭＢｑ）、１５μＬのＨＣｌ  ０．０５Ｍ、および３０μＬの炭酸アンモニウム０．５Ｍを加えた。この混合物を３７℃で１時間インキュベートしたあと、Ａｍｉｃｏｎ  ３０  ＭＷＣＯクリーンアップを６回行った。Ｔ１５０フラスコ中の標的発現細胞をまずＰＢＳ１０ｍＬで洗浄し、３７℃でＰＢＳ１０ｍＬ＋ＥＤＴＡ１ｍＭを用いて分離した。完全細胞培地１０ｍＬを添加し、細胞をＦａｌｃｏｎチューブで遠心した（５分間、１０００ｒｐｍ）。次に、ＰＢＳで細胞を洗浄してから、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡに懸濁させて、細胞４×１０６個／０．５ｍＬの原液を作製した。細胞は、以下のステップの間、氷上に維持した。チューブ中、0.5mLに細胞0.25×106個〜4×106個（0.25 Mio cells  up to 4 Mio cells）を含む５種の細胞希釈物（３連）を作製した。５０μＬの標識抗体（２５，０００ｃｐｍに対して標準化）を各チューブに添加した。非特異的結合のための対照に、まず、さらに１５μｇの非標識天然ＩｇＧ１抗体を加えた。チューブを３７℃、２２０ｒｐｍで３０分間インキュベートした。続いて、２ｍＬの氷冷ＰＢＳ＋１％ＢＳＡを添加し、試料を４℃、１５００ｒｐｍで５分間遠心した。上清を除去し、さらに２ｍＬのＰＢＳ＋１％ＢＳＡを添加した。次いで、遠心ステップを繰り返した。上清を除去したあと、ガンマカウンターで試料を測定した。結果は、二重標識ＡＤＣ（マレイミド−ＮＯＤＡＧＡおよびＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−Ａｈｘ−ＤＭ１にコンジュゲートしている）が結合特異性を維持しながら、インジウム−１１１で効率的に標識することができたことを示している。結果を図２４Ａおよび２４Ｂに示す。
【０１７９】
[実施例７]
Ａｃ−ＲβＡＫ（Ｎ３）−ＮＨ２（Ａｃ−ＡｒｇβＡｌａＬｙｓ（Ｎ３）−ＮＨ２）（すなわち、側鎖に第一級アミンを有するアミノ酸を含まないリンカー）のヒト化ＩｇＧ１との対照コンジュゲーション
上記の実施例５に概説したように、コンジュゲーションを実施した。ＬＣ−ＭＳ分析後、抗体重鎖の修飾は、予想通り検出されなかった。このことは、ＭＴＧが、例えば、リジン残基、またはアナログもしくはミメティックの第一級アミンと選択的に反応することを示している。しかしながら、アルギニンの側鎖のアミン基は、グアニジン基の一部であり、したがって、本発明の意味での第一級アミンではない。結果として、非脱グリコシル化抗体とのコンジュゲーションは生じなかった。結果を図２５に示す。
【０１８０】
[実施例８]
ヒトＩｇＧ４抗体とのコンジュゲーション
Ａｃ−ＲＡＫＡＲ−ＮＨ２ペプチドを用いて、標準的なコンジュゲーション手順に従って、ヒトＩｇＧ４抗体をインキュベートした。コンジュゲーション後、ＬＣ−ＭＳ分析により、ＩｇＧ４が単一の残基の重鎖のみで選択的に修飾されたことが明らかになった。結果を図２６Ａ、２６Ｂ、および２６Ｃに示す。
【０１８１】
[実施例９]
ヒト化ＩｇＧ１からＡＤＣ調製後のＬＣ−ＭＳ
３．９ｍｇ／ｍｌのヒト化ＩｇＧ１抗体を抗体１ｍｇ当たり２．４ＵのＭＴＧおよび８０当量のＡｃ−ＲＡＫ−Ｌｙｓ（Ｎ３）−ＮＨ２とともに、緩衝液ｐＨ７．６中、３７℃でインキュベートし、インキュベーション後、９８％を超えるコンジュゲーション率を達成した。サイズ排除クロマトグラフィーにより過剰リンカーおよびＭＴＧを除去したあと、試料を濃縮し、１０当量のＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−Ａｈｘ−ＤＭ１と１９時間反応させ、精製して、９８％を超えるクリック結合効率が達成された。それぞれのステップ後にＬＣ−ＭＳを行い、それによって、ＡＤＣの結合状態をステップごとに示した。いずれのステップでも、軽鎖の修飾は検出されなかった。結果を図２７Ａ、２７Ｂ、および２７Ｃに示す。
【０１８２】
[実施例１０]
ＳＥＣ−ＭＡＬＳ実験
抗体および抗体コンジュゲート（ハーセプチン、特許請求の範囲に記載されるリンカー技術を使用した抗ＨＥＲ２−ｍＡｂ−リンカーコンストラクト、特許請求の範囲に記載されるリンカー技術を使用した抗−ＨＥＲ２−ｍＡｂ−リンカー−ＤＭ１コンジュゲート（本明細書の別の部分では、内製ＡＤＣと称する）、およびカドサイラ（登録商標）を緩衝液Ａ（緩衝液Ａ：２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に対して、室温で３時間透析した。続いて、透析緩衝液を０．１μｍフィルターで濾過した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  １０／３００  ＧＬカラムを濾過した透析緩衝液で、安定した光散乱ベースラインが達成されるまで室温で一晩平衡化させた。試料を透析緩衝液Ａで４ｍｇ／ｍＬに希釈し、１３０００ＲＰＭで５分間遠心して調製してから、３０μＬをサイズ排除カラムにロードした。流速を０．５ｍＬ／分に設定し、光散乱および屈折率をそれぞれＷｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＭｉｎｉＤＡＷＮ  ＴＲＥＯＳおよびｏｐｔｉｌａｂ−ｔ−ｒｅｘ  ｄｅｔｅｃｔｏｒでモニターした。ベースライン補正およびデータ分析にＡＳＴＲＡクロマトグラフィーソフトウェアを使用した。
【０１８３】
結果を図２８Ａ〜Ｄに示す。内製ＡＤＣが、光散乱実験（ＳＥＣ、ピークライン）および多角度光散乱（ＭＡＬＳ）実験（中間の傾斜ライン）の双方において、良く定義されていることがわかる。両値とも、そのままのハーセプチンと同等であり、断片または凝集体が存在しないことを示している。本リンカー技術は、したがって、単一ステップで、極めて純粋な生成物をもたらす。それとは対照的に、マレイミド化学によってコンジュゲートされるカドサイラは、より広いピークを有し、断片および凝集体がより多いことを示している。
参考文献：
【０１８４】
【表１１−１】
2020534030.tif 000025
【０１８５】
【表１１−２】
2020534030.tif 000026
【０１８６】
【表１１−３】
2020534030.tif 000027
【０１８７】
【表１１−４】
2020534030.tif 000028
【０１８８】
注意事項
本明細書に示される一部のリンカーペプチドでは、Ｃ末端の部分が単にＮ３として指定されていることを理解することが重要である。しかしながら、これは、Ｌｙｓ（Ｎ３）の略記として理解すべきである。例えば、ＲＡＫＡＲ（Ｎ３）またはＡｒｇＡｌａＬｙｓＡｌａＡｒｇ（Ｎ３）は、実際には、ＲＡＫ１ＡＲＫ２（Ｋ２＝Ｌｙｓ（Ｎ３））、またはＡｒｇＡｌａＬｙｓＡｌａＡｒｇＬｙｓ（Ｎ３）を意味する。
【０１８９】
さらに、本明細書に示されるさまざまなリンカーペプチドにおいて、Ｃ末端および／またはＮ末端は、そうではないように示されていたとしても、保護されていても、または保護されていなくてもよいことを理解することも重要である。保護は、Ｃ末端のアミド化、および／またはＮ末端のアセチル化によって達成することができる。本発明の文脈では、保護および非保護リンカーペプチドの双方が包含される。例えば、ＲＡＫＡＲＫ（Ｎ３）は、実際、ａ）両末端とも上述のように保護された変異体、ｂ）Ｎ末端のみ、またはＣ末端のみが上述のように保護された変異体、またはｃ）両末端とも保護されていない変異体、の４つの変異体を包含する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2020534030.tif 000052
【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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