(57)【要約】  本発明は、ヒストンアセチル化を調節するためまたは神経学的疾患または障害を治療または予防するための組成物および方法を提供する。【選択図】図１Ａ
2020535164.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経学的および認知的疾患または障害を治療または予防する方法であって、その治療を必要とする対象にACSS2の阻害剤を含む組成物を投与することを含む方法。
【請求項２】
神経学的および認知的疾患または障害が、心的外傷後ストレス障害（PTSD）、双極性障害、うつ病、トゥレット症候群、統合失調症、強迫性障害、不安障害、パニック障害および恐怖症からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記神経学的および認知的疾患または障害が、PTSDである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ACSS2の阻害剤が、化合物、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、抗体、リボザイム、小分子化合物、核酸、ベクター、アンチセンス核酸分子からなる群のうちの少なくとも１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ACSS2の阻害剤が、小分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記小分子が、式（1）〜式（4）の１つ：
【化１】
2020535164.tif 000028
（式中、
X11が、C(R14)(R15)、O、SおよびNR15からなる群より選択され、
X12の各々の存在が、C(R14)(R15)、O、S およびNR15からなる群より選択され、
R11が、水素、-OR15、アルキル、シクロアルキル、-C4-C6ヘテロシクリル、アリール、および-C4-C6ヘテロアリールからなる群より選択され、ここでR11が、任意に置換され；
R12およびR13が、互いに独立に水素、アルキル、アリール、および-C4-C6ヘテロアリールからなる群より選択され、ここでR12およびR13が、任意に置換され；
R14およびR15の各々の存在が、独立に水素、ハロゲン、-OHおよび-C1-C6アルキルからなる群より選択され；および
nが、0〜8の整数である）；
【化２】
2020535164.tif 000029
（式中、
R21が、-C(R23)m、シクロアルキル、ヘテロシクリル、シクロアルキル−オン、およびヘテロシクリル−オンからなる群より選択され；
R22が、アルキル、アリール、ヘテロアリール、-C1-C3アルキル−(C3-C6アリール)、および-C1-C3アルキル−(C3-C6ヘテロアリール)からなる群より選択され；
R23の各々の存在が、水素、アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、-OH、および-CNからなる群より選択され；および
mが、1〜3の整数である）；
【化３】
2020535164.tif 000030
（式中、
R31が、-C(R35)p、シクロアルキル、ヘテロシクリル、シクロアルキル-オン、ヘテロシクリル-オンからなる群より選択され；
R32が、アルキル、アリール、ヘテロアリール、-C1-C3アルキル-(C3-C6アリール)、および-C1-C3アルキル-(C3-C6ヘテロアリール)からなる群より選択され；
R33およびR34が、互いに独立に水素、ハロゲン、アルキル、アリール、ヘテロアリールからなる群より選択され；
R35の各存在が、独立に水素、アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、-OHおよび-CNからなる群より選択され；および
pが、1〜3の整数である）；
【化４】
2020535164.tif 000031
（式中、
X41が、OおよびSからなる群より選択され；
R41が、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、およびそれらの組み合わせからなる群より選択され、ここでR41が、任意に置換され；および
R42およびR43が、各々独立にフェニル、チオフェニルおよびフラニルからなる群より選択される）
に該当する化合物である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
式（1）の化合物が、
【化５】
2020535164.tif 000032
からなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
式（2）の化合物が
【化６】
2020535164.tif 000033
からなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
式（3）の化合物が
【化７】
2020535164.tif 000034
からなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
式（4）の化合物が
【化８】
2020535164.tif 000035
からなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
依存症または依存症関連疾患または障害を治療または予防する方法であって、その治療を必要とする対象にACSS2の阻害剤を含む組成物を投与することを含む方法。
【請求項１２】
前記依存症が、アルコール依存症である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記依存症関連疾患または障害が、急性および／または慢性アルコール誘発性記憶障害である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ACSS2の阻害剤が、化合物、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、抗体、リボザイム、小分子化合物、核酸、ベクター、アンチセンス核酸分子からなる群のうちの少なくとも１つである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記小分子が、式（1）から式（4）のうちの１つ：
【化９】
2020535164.tif 000036
（式中、
X11が、C(R14)(R15)、O、SおよびNR15からなる群より選択され、
X12の各々の存在が、C(R14)(R15)、O、S およびNR15からなる群より選択され、
R11が、水素、-OR15、アルキル、シクロアルキル、-C4-C6ヘテロシクリル、アリール、および-C4-C6ヘテロアリールからなる群より選択され、ここでR11が、任意に置換され；
R12およびR13が、互いに独立に水素、アルキル、アリールおよび-C4-C6ヘテロアリールからなる群より選択され、ここでR12およびR13が、任意に置換され；
R14およびR15の各々の存在が、独立に水素、ハロゲン、-OHおよび-C1-C6アルキルからなる群より選択され；および
nが、0〜8の整数である）；
【化１０】
2020535164.tif 000037
（式中、
R21が、-C(R23)m、シクロアルキル、ヘテロシクリル、シクロアルキル−オン、およびヘテロシクリル−オンからなる群より選択され；
R22が、アルキル、アリール、ヘテロアリール、-C1-C3アルキル−(C3-C6アリール)、および-C1-C3アルキル−(C3-C6ヘテロアリール)からなる群より選択され；
R23の各々の存在が、水素、アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、-OH、および-CNからなる群より選択され；および
mが、1〜3の整数である）；
【化１１】
2020535164.tif 000038
（式中、
R31が、-C(R35)p、シクロアルキル、ヘテロシクリル、シクロアルキル-オン、ヘテロシクリル-オンからなる群より選択され；
R32が、アルキル、アリール、ヘテロアリール、-C1-C3 アルキル-(C3-C6 アリール)、および-C1-C3 アルキル-(C3-C6ヘテロアリール)からなる群より選択され；
R33およびR34が、互いに独立に水素、ハロゲン、アルキル、アリール、ヘテロアリールからなる群より選択され；
R35の各存在が、独立に水素、アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、-OHおよび-CNからなる群より選択され；および
pが、1〜3の整数である）；
【化１２】
2020535164.tif 000039
（式中、
X41が、O およびSからなる群より選択され；
R41が、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、およびそれらの組み合わせからなる群より選択され、ここでR41が、任意に置換され；および
R42およびR43が、各々独立にフェニル、チオフェニルおよびフラニルからなる群より選択される）
に該当する化合物である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
式（1）の化合物が
【化１３】
2020535164.tif 000040
からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
式（2）の化合物が、
【化１４】
2020535164.tif 000041
からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
式（3）の化合物が、
【化１５】
2020535164.tif 000042
からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
式（4）の化合物が、
【化１６】
2020535164.tif 000043
からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
式（1）から式（4）の１つ：
【化１７】
2020535164.tif 000044
（式中、
X11が、C(R14)(R15)、O、SおよびNR15からなる群より選択され、
X12の各々の存在が、C(R14)(R15)、O、S およびNR15からなる群より選択され、
R11が、水素、-OR15、アルキル、シクロアルキル、-C4-C6ヘテロシクリル、アリールおよび-C4-C6ヘテロアリールからなる群より選択され、ここでR11が、任意に置換され；
R12およびR13が、互いに独立に水素、アルキル、アリールおよび-C4〜C6ヘテロアリールからなる群より選択され、ここでR12およびR13が、任意に置換され；
R14およびR15の各々の存在が、独立に水素、ハロゲン、-OHおよび-C1-C6アルキルからなる群より選択され；および
nが、0〜8の整数である）；
【化１８】
2020535164.tif 000045
（式中、
R21が、-C(R23)m、シクロアルキル、ヘテロシクリル、シクロアルキル−オン、およびヘテロシクリル−オンからなる群より選択され；
R22が、アルキル、アリール、ヘテロアリール、-C1-C3アルキル−(C3-C6アリール)、および-C1-C3アルキル−(C3〜C6ヘテロアリール)からなる群より選択され；
R23の各存在が、独立に水素、アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、-OH、および-CNからなる群より選択され；および
mが、1〜3の整数である）；
【化１９】
2020535164.tif 000046
（式中、
R31が、-C(R35)p、シクロアルキル、ヘテロシクリル、シクロアルキル-オン、ヘテロシクリル-オンからなる群より選択され；
R32が、アルキル、アリール、ヘテロアリール、-C1-C3 アルキル-(C3-C6アリール)、および-C1-C3アルキル-(C3-C6ヘテロアリール)からなる群より選択され；
R33およびR34が、互いに独立に水素、ハロゲン、アルキル、アリール、ヘテロアリールからなる群より選択され；
R35の各存在が、独立に水素、アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、-OH、および-CNからなる群より選択され；および
pが、1〜3の整数である）；
【化２０】
2020535164.tif 000047
（式中、
X41が、O およびSからなる群より選択され；
R41が、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、およびそれらの組み合わせからなる群より選択され、ここでR41が、任意に置換され；および
R42およびR43が、各々独立にフェニル、チオフェニルおよびフラニルからなる群より選択される）
に該当する化合物。
【請求項２１】
式（1）の化合物が、
【化２１】
2020535164.tif 000048
からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
式（2）の化合物が、
【化２２】
2020535164.tif 000049
からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
式（3）の化合物が、
【化２３】
2020535164.tif 000050
からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
式（4）の化合物が、
【化２４】
2020535164.tif 000051
からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
〔関連出願への相互参照〕
本願は2017年9月26日に出願の米国仮特許出願第62/563,148号に対する優先権を主張し、該出願の全内容が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
〔連邦政府による支援を受けた研究開発に関する言及〕
本発明は国立衛生研究所により授与された認可番号P01AG031862の下で政府の支援を受けて行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
〔発明の背景〕
記憶の形成はシナプスの再構成を伴い、まだ十分に解明されていないクロマチン修飾過程を通した、連係したニューロン遺伝子の発現を必要とする（Kandel, E.R.他、2014, Cell, 157: 163-186; Zovkic, I.B.他、2013, Learn. Mem., 20:61-74）。ヒストンアセチル化は記憶の保存の重要な調節因子であり、学習と記憶に関係づけられている個別の脳領域、最も顕著には海馬においてクロマチンを再構成する (Graff, J. 他, 2013, Nat. Rev. Neurosci., 14:97-111）。海馬での記憶の固定は転写因子CREBとコアクチベータCREB結合タンパク質（CBP）を必要とし、具体的にはCBPのヒストンアセチルトランスフェラーゼ（HAT）活性を必要とする (Wood, M. A.他, 2005, Learn. Mem., 12:111-119; Korzus, E. 他, 2004, Neuron, 42:961-972）。更に、ヒストンデアセチラーゼの阻害剤は記憶の連係を強化する (Graff, J.他, 2013, Nat. Rev. Neurosci., 14:97-111）。しかしながら、長期記憶においてニューロンヒストンアセチル化を調節する機構は完全には解明されていない。
【０００４】
アセチルトランスフェラーゼのようなクロマチン修飾酵素による中間代謝産物の直接感作は、クロマチン構造と遺伝子発現を動的に適合させることが可能である (Kaelin, W. G. Jr. 他, 2013, Cell, 153:56-69; Katada, S., 他, 2012, Cell, 148:24-28）。細胞内アセチルCoAのプールの変更はヒストンアセチル化をコントロールする (Cai, L., 他, 2011, Mol. Cell, 42:426-437; Wellen, K. E. 他, 2009, Science, 324:1076-1080); よって、核アセチルCoAを生成する代謝酵素が直接ヒストンアセチル化と遺伝子発現を制御すると考えられている (Gut, P.他, 2013, Nature, 502:489-498; Pietrocola, F.他, 2015, Cell Metab., 21:805-821)。哺乳類細胞では、ヒストン化セチル化に向けてアセチルCoAを産生する２つの主要な酵素が認められる：すなわち酢酸依存性アセチルCoAシンセターゼ２（ACSS2）とクエン酸依存性ATP-クエン酸塩リアーゼ（ACL）(Pietrocola, F.他, 2015, Cell Metab., 21:805-821）。ACSS2およびACLの相対的重要性は、組織のタイプ、発生段階および疾病により異なる（Wellen, K. E. 他, 2009, Science, 324:1076-1080; Pietrocola, F. 他, 2015, Cell Metab., 21:805-821）が、有糸分裂後ニューロン細胞におけるそれらの酵素の役割は不明である。
【発明の概要】
【０００５】
よって、神経学的および認識の疾患および障害を治療するための治療法へのニーズが依然として当業界に存在する。本発明はこのニーズに対処する。
【０００６】
下記の本発明の実施形態の詳細な説明は、添付図面と併せて読むとより理解できるだろう。本発明が図面に示された実施形態の正確な配置と手段に限定されないことは理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１Ａ〜図１Ｇを含む図１は、ACSS2がニューロン遺伝子発現を支援することを証明する代表的実験の結果を示す。[図１Ａ] ACSS2は未分化CADニューロン中の細胞質に局在している。ACSS2をCAD細胞において免疫蛍光顕微鏡法により画像化した。（4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI) およびα-チューブリン(α-Tub)免疫染色はそれぞれ核と細胞質を示す）。[図１Ｂ] ACSS2は分化したCADニューロン中の核に局在する。[図１Ｃ] 未分化CAD細胞（undiff.）および分化CADニューロン（diff.）からの細胞質（CE）と核（NE）抽出物のACSS2、ACLおよびヒストンH3についてのウエスタンブロット分析。核内ACSS2発現は分化細胞のほうがより高い (p.d.u., 操作により規定される単位；ｔ検定P = 0.002, n = 3, 平均±標準偏差(s.d.))。[図１Ｄ] ACSS2のノックダウンは、ニューロン遺伝子発現プログラムの分化に関連したアップレギュレーション（上方制御）を減少させる。散布図は、野生型（WT）細胞とACSS2ノックダウン（KD）細胞との間の、ミリオンマッピングされた誘導遺伝子あたりの転写物1キロ塩基あたりの倍率変化フラグメント（FPKM）を対比する。周辺分布は、ヒストグラムとカーネル密度推定を示す。通常の最小二乗法線形回帰は、95％信頼区間と共に示される。[図１Ｅ] レンチウイルス対照（WT）またはACSS2ノックダウンベクター（shACSS2）を用いて感染させた分化CADニューロンからの溶解物のウエスタンブロット(定量化は図５Ｇに示す；n = 3）。[図１Ｆ] ACSS2ノックダウンは遺伝子アップレギュレーションを大幅に減少させる。野生型細胞（灰色）における最大の倍率変化増加を有するアップレギュレートされた遺伝子（図６Ｃの赤色ドット）の５分位値。対応する遺伝子の五分位値はACSS2ノックダウン細胞（緑色）における倍率変化FPKM（各々の五分位値について、縦列は遺伝子の平均誘導率を表す：平均±s.e.m.)。[図１Ｇ] 分化CADニューロンのACSS2i処置は分化誘導遺伝子の発現低下をもたらす。全ての遺伝子を、野生型CAD分化の倍率変化の次数においてプロットし、ACSS2i処置と対照についてｚスコアを計算し、アップレギュレーションを青で、そしてダウンレギュレーションを赤で表示した（24時間ACSS2i処置およびDMSO処置対照ニューロンにおけるRNA-seq、ｚスコア＜0.5を有する遺伝子を除いた)。スケールバー、10μm (図１Ａ、図１Ｂ）。
【図２−１】図２Ａ〜図２Ｊを含む図２は、ACSS2が転写活性クロマチンにリクルートされ、そしてニューロンのヒストンアセチル化を促進することを証明する代表的実験からの結果を表す。[図２Ａ] Camk2a遺伝子座全般に関するChIP-seqを示すゲノムブラウザトラックは、H4K5、H4K12およびH3K9アセチル化の増加が、CADニューロン分化による直接的ACSS2濃縮と同時に起こることを示す（第18染色体：60,920,000-60,990,000)。[図２Ｂ] CADニューロン分化の間にACS22結合状態になる、上位５％の遺伝子のGO term(遺伝子オントロジー語彙）濃縮分析はニューロン経路を示す。[図２Ｃ]バイオリン等高線図は、指摘したヒストンアセチル化のChIP-seq濃縮が、CAD細胞のニューロン分化の間の上位にランク付けされたACSS2濃縮と同時に起こることを示す。[図２Ｄ] ACSS2i処置によって減少される299遺伝子のChIP-seq濃縮（実施例１の方法を参照）は、分化段階でのヒストンアセチル化と高い相関（いずれについてもP＜2.2×10-16)を示す（AUC、曲線下面積；d、分化；u、未分化）。[図２Ｅ] ニューロン分化に以前に関連付けられた全ての遺伝子（ND遺伝子、1,315遺伝子のAmiGOアノテーションセット）、およびCAD細胞の分化の間に誘導される既知ND遺伝子のサブセット（Induced）の分析は、DMSO処置対照ニューロン（con.)に比較した、ACSS2i処置CADニューロン（inh.）における発現の減少を示す。阻害剤処置群対対照群、P＜2.2×10-16。[図２Ｆ] 核アセチルCoAレベルはACSS2のノックダウン(shACSS2; 平均Δ＝-0.19 ± 0.03, **P = 0.003) またはACSS2阻害剤の適用（平均Δ＝-0.25 ± 0.05, **P = 0.006; n = 3, 平均± s.d.)のいずれかに応答して減少する。[図２Ｇ] 全細胞溶解物のウエスタンブロット分析は、ACSS2のレンチウイルスshRNA-媒介ノックダウンがH3K9とH3K27アセチル化を減少させることを示す（図10Ａにおいて定量化）。[図２Ｈ] 免疫沈降溶出液のウエスタンブロットは、CBPがACSS2と共免疫沈降するが対照Igとは共免疫沈降しないことを示す。[図２Ｉ] 初代海馬ニューロンにおける免疫沈降は、ACSS2の核限局化を示す（C57BL/6胎児から単離されたインビトロ分化培養の７日目）。スケールバー、50μm。[図２Ｊ] ACSS2iにより24時間処置し、そして指摘の抗体で探査した初代海馬ニューロンからの溶解物（d7）（図10Ｃにおいて定量化）は、ヒストンアセチル化の減少を示す。
【図２−２】図２Ａ〜図２Ｊを含む図２は、ACSS2が転写活性クロマチンにリクルートされ、そしてニューロンのヒストンアセチル化を促進することを証明する代表的実験からの結果を表す。[図２Ａ] Camk2a遺伝子座全般に関するChIP-seqを示すゲノムブラウザトラックは、H4K5、H4K12およびH3K9アセチル化の増加が、CADニューロン分化による直接的ACSS2濃縮と同時に起こることを示す（第18染色体：60,920,000-60,990,000)。[図２Ｂ] CADニューロン分化の間にACS22結合状態になる、上位５％の遺伝子のGO term(遺伝子オントロジー語彙）濃縮分析はニューロン経路を示す。[図２Ｃ]バイオリン等高線図は、指摘したヒストンアセチル化のChIP-seq濃縮が、CAD細胞のニューロン分化の間の上位にランク付けされたACSS2濃縮と同時に起こることを示す。[図２Ｄ] ACSS2i処置によって減少される299遺伝子のChIP-seq濃縮（実施例１の方法を参照）は、分化段階でのヒストンアセチル化と高い相関（いずれについてもP＜2.2×10-16)を示す（AUC、曲線下面積；d、分化；u、未分化）。[図２Ｅ] ニューロン分化に以前に関連付けられた全ての遺伝子（ND遺伝子、1,315遺伝子のAmiGOアノテーションセット）、およびCAD細胞の分化の間に誘導される既知ND遺伝子のサブセット（Induced）の分析は、DMSO処置対照ニューロン（con.)に比較した、ACSS2i処置CADニューロン（inh.）における発現の減少を示す。阻害剤処置群対対照群、P＜2.2×10-16。[図２Ｆ] 核アセチルCoAレベルはACSS2のノックダウン(shACSS2; 平均Δ＝-0.19 ± 0.03, **P = 0.003) またはACSS2阻害剤の適用（平均Δ＝-0.25 ± 0.05, **P = 0.006; n = 3, 平均± s.d.)のいずれかに応答して減少する。[図２Ｇ] 全細胞溶解物のウエスタンブロット分析は、ACSS2のレンチウイルスshRNA-媒介ノックダウンがH3K9とH3K27アセチル化を減少させることを示す（図10Ａにおいて定量化）。[図２Ｈ] 免疫沈降溶出液のウエスタンブロットは、CBPがACSS2と共免疫沈降するが対照Igとは共免疫沈降しないことを示す。[図２Ｉ] 初代海馬ニューロンにおける免疫沈降は、ACSS2の核限局化を示す（C57BL/6胎児から単離されたインビトロ分化培養の７日目）。スケールバー、50μm。[図２Ｊ] ACSS2iにより24時間処置し、そして指摘の抗体で探査した初代海馬ニューロンからの溶解物（d7）（図10Ｃにおいて定量化）は、ヒストンアセチル化の減少を示す。
【図３−１】図３Ａ〜図３Ｆを含む図３は、ACSS2 ChIP-seq局在化が、マウス海馬におけるインビボでのヒストンアセチル化と関連していることを証明する実施例の実験からの結果を表す。[図３Ａ] マウス海馬におけるACSS2およびH3K9acについてのChIP-seq。トラックビューは、記憶に関連する３つのニューロン遺伝子：Arc、Egr2およびNr2f2 (それぞれchr15:74,496,025-74,506,488; chr10:66,991,018-67,006,804;および chr7:77,488,549-77,516,626)を示す。[図３Ｂ]インビボ海馬ACSS2およびH3K9acピークは、全てのRefSeq転写物の中で最も近傍の遺伝子TSSと同位置に存在する(ピークから＜1 kb）。[図３Ｃ]背側海馬（dHPC）におけるRNA-seq発現は、海馬ACSS2結合およびH3K9アセチル化の強化と相関する。[図３Ｄ] それらのACSS2およびH3K9ac濃縮段階により分類される遺伝子の発現プロファイル。[図３Ｅ] 全ピークセットについてのACSS2標的遺伝子（海馬）とCRPおよびH3K27ac濃縮との間のオーバーラップ (マウス前脳と皮質におけるENCODE CBP および H3K27ac ChIP-seq）。[図３Ｆ] ニューロン転写因子NRF1の最大濃縮を示す、海馬におけるインビボChIP-seqからのACSS2ピークのモチーフ分析。
【図３−２】図３Ａ〜図３Ｆを含む図３は、ACSS2 ChIP-seq局在化が、マウス海馬におけるインビボでのヒストンアセチル化と関連していることを証明する実施例の実験からの結果を表す。[図３Ａ] マウス海馬におけるACSS2およびH3K9acについてのChIP-seq。トラックビューは、記憶に関連する３つのニューロン遺伝子：Arc、Egr2およびNr2f2 (それぞれchr15:74,496,025-74,506,488; chr10:66,991,018-67,006,804;および chr7:77,488,549-77,516,626)を示す。[図３Ｂ]インビボ海馬ACSS2およびH3K9acピークは、全てのRefSeq転写物の中で最も近傍の遺伝子TSSと同位置に存在する(ピークから＜1 kb）。[図３Ｃ]背側海馬（dHPC）におけるRNA-seq発現は、海馬ACSS2結合およびH3K9アセチル化の強化と相関する。[図３Ｄ] それらのACSS2およびH3K9ac濃縮段階により分類される遺伝子の発現プロファイル。[図３Ｅ] 全ピークセットについてのACSS2標的遺伝子（海馬）とCRPおよびH3K27ac濃縮との間のオーバーラップ (マウス前脳と皮質におけるENCODE CBP および H3K27ac ChIP-seq）。[図３Ｆ] ニューロン転写因子NRF1の最大濃縮を示す、海馬におけるインビボChIP-seqからのACSS2ピークのモチーフ分析。
【図４−１】図４Ａ〜図４Ｆを含む図４は、背側海馬におけるACSS2ノックダウンが、訓練後の物体位置記憶および最初期遺伝子のアップレギュレーションを妨害することを証明する実施例の実験からの結果を表す。[図４Ａ] 背側海馬中にAAV9ノックダウンベクターを送達するために定位手術を実施した（AP, −2.0 mm; DV, −1.4 mm; ML, ±1.5 mm ブレグマからの計測); ４週間後、馴化マウスを物体位置記憶に関して訓練した（OLM; ３つの異なる物体を用いて室内での４回の５分間の訓練セッション）。24時間後、マウスに１つの物体を新たな場所に移動させるという記憶試験を行った(コホートあたりn = 10)。[図４Ｂ]背側（d）または腹側（v）海馬中にeGFP対照ベクターまたはACSS2ノックダウンベクターのいずれかを注入したマウスから取り出した海馬組織のウエスタンブロット分析は、背側海馬におけるACSS2の特異的減少を示す。[図４Ｃ]ACSS2-ノックダウンマウスは、物体位置記憶が損なわれる。eGFP対照およびshACSS2 AAV9マウスは、物体位置記憶訓練セッション（TR）の間、３つの物体（Ｏ1〜3）のいずれに対しても何も嗜好性を示さない。24時間後の記憶保持試験では、対照マウスは新しい物体位置（NL）に嗜好性を示し、一方でノックダウンマウスは全くそのような嗜好性を示さない。*** P＜0.001; n = 10, 平均± s.d. [図４Ｄ] ACSS2ノックダウンマウスにおける空間記憶障害は、対照マウスに比較して低下した識別指数（% DI = (t NL−t FL)/(t NL＋t FL))に現れる（ΔDI = −29.5 ± 11.4, * P = 0.02; n = 10, 平均± s.d.)。[図４Ｅ]最初期遺伝子のコホートの訓練誘導発現（図12Ｈ）は、ACSS2ノックダウンマウスにおいて大幅に減弱された(n = 4 マウス/群、各条件について正副２通り試行、P＜0.0001、対応のあるｔ検定、平均± s.d.)。[図４Ｆ]アセチルCoAを局所的に提供してヒストンアセチル化と最初期遺伝子の活性誘導アップレギュレーションを促進する、クロマチン結合コアクチベータとしてのACSS2機能のモデル。
【図４−２】図４Ａ〜図４Ｆを含む図４は、背側海馬におけるACSS2ノックダウンが、訓練後の物体位置記憶および再初期遺伝子のアップレギュレーションを妨害することを証明する実施例の実験からの結果を表す。[図４Ａ] 背側海馬中にAAV9ノックダウンベクターを送達するために定位手術を実施した（AP, −2.0 mm; DV, −1.4 mm; ML, ±1.5 mm ブレグマからの計測); ４週間後、馴化マウスを物体位置記憶に関して訓練した（OLM; ３つの異なる物体を用いて室内での４回の５分間の訓練セッション）。24時間後、マウスに１つの物体を新たな場所に移動させるという記憶試験を行った(コホートあたりn = 10)。[図４Ｂ]背側（d）または腹側（v）海馬中にeGFP対照ベクターまたはACSS2ノックダウンベクターのいずれかを注入したマウスから取り出した海馬組織のウエスタンブロット分析は、背側海馬におけるACSS2の特異的減少を示す。[図４Ｃ]ACSS2-ノックダウンマウスは、物体位置記憶が損なわれる。eGFP対照およびshACSS2 AAV9マウスは、物体位置記憶訓練セッション（TR）の間、３つの物体（Ｏ1〜3）のいずれに対しても何も嗜好性を示さない。24時間後の記憶保持試験では、対照マウスは新しい物体位置（NL）に嗜好性を示し、一方でノックダウンマウスは全くそのような嗜好性を示さない。*** P＜0.001; n = 10, 平均± s.d. [図４Ｄ] ACSS2ノックダウンマウスにおける空間記憶障害は、対照マウスに比較して低下した識別指数（% DI = (t NL−t FL)/(t NL＋t FL))に現れる（ΔDI = −29.5 ± 11.4, * P = 0.02; n = 10, 平均± s.d.)。[図４Ｅ]最初期遺伝子のコホートの訓練誘導発現（図12Ｈ）は、ACSS2ノックダウンマウスにおいて大幅に減弱された(n = 4 マウス/群、各条件について正副２通り試行、P＜0.0001、対応のあるｔ検定、平均± s.d.)。[図４Ｆ]アセチルCoAを局所的に提供してヒストンアセチル化と最初期遺伝子の活性誘導アップレギュレーションを促進する、クロマチン結合コアクチベータとしてのACSS2機能のモデル。
【図５−１】図５Ａ〜図５Ｇを含む図５は、ACSS2がニューロンの核に局在化することを示す代表的実施例の実験からの結果を表す。[図５Ａ] ACSS2免疫蛍光実験において核染色する細胞の割合（undiff., 未分化CAD細胞；diff., 分化CADニューロン；海馬の初代海馬ニューロン７日目；最低50個の細胞を３重複製の免疫蛍光実験において調べた; ｔ検定undiff. 対diff. P＜0.0001, undiff. 対 海馬P＜0.0001; 誤差バー, s.e.m.)。[図５Ｂ]未分化CAD細胞と分化CADニューロンからの細胞質（CE）および核（NE）抽出物のウエスタンブロットを、指摘の抗体により探査した。[図５Ｃおよび図５Ｄ] C57BL/6マウス胚から単離した初代皮質ニューロンにおける、インビトロ分化培養の７日目[図５Ｃ]と１４日目[図５Ｄ]の免疫蛍光。ACSS2は分化初代皮質ニューロンの核に優先的に局在する。全てのスケールバー、25μm。[図５Ｅ]インビトロ分化培養における14日目にC57BL/6胚から単離された初代海馬ニューロンの免疫蛍光。ACSS2は分化した初代ニューロンの核に優先的に存在する。[図５Ｆ]７日目の初代海馬ニューロンの免疫蛍光は、ACLが主として細胞質に局在化されることを示す。ニューロン分化マーカーはACSS2ノックダウン細胞において減少する。CAD細胞にレンチウイルス対照 (WT)またはノックダウンベクター(shACSS2)を感染させた。安定に感染した細胞からの溶解物のウエスタンブロットを、意図する抗体を用いて探査し、そしてImageJを使って定量化した (n = 3; 誤差バー, s.e.m.)。
【図５−２】図５Ａ〜図５Ｇを含む図５は、ACSS2がニューロンの核に局在化することを示す代表的実施例の実験からの結果を表す。[図５Ａ] ACSS2免疫蛍光実験において核染色する細胞の割合（undiff., 未分化CAD細胞；diff., 分化CADニューロン；海馬の初代海馬ニューロン７日目；最低50個の細胞を３重複製の免疫蛍光実験において調べた; ｔ検定undiff. 対diff. P＜0.0001, undiff. 対 海馬P＜0.0001; 誤差バー, s.e.m.)。[図５Ｂ]未分化CAD細胞と分化CADニューロンからの細胞質（CE）および核（NE）抽出物のウエスタンブロットを、指摘の抗体により探査した。[図５Ｃおよび図５Ｄ] C57BL/6マウス胚から単離した初代皮質ニューロンにおける、インビトロ分化培養の７日目[図５Ｃ]と１４日目[図５Ｄ]の免疫蛍光。ACSS2は分化初代皮質ニューロンの核に優先的に局在する。全てのスケールバー、25μm。[図５Ｅ]インビトロ分化培養における14日目にC57BL/6胚から単離された初代海馬ニューロンの免疫蛍光。ACSS2は分化した初代ニューロンの核に優先的に存在する。[図５Ｆ]７日目の初代海馬ニューロンの免疫蛍光は、ACLが主として細胞質に局在化されることを示す。ニューロン分化マーカーはACSS2ノックダウン細胞において減少する。CAD細胞にレンチウイルス対照 (WT)またはノックダウンベクター(shACSS2)を感染させた。安定に感染した細胞からの溶解物のウエスタンブロットを、意図する抗体を用いて探査し、そしてImageJを使って定量化した (n = 3; 誤差バー, s.e.m.)。
【図６−１】図６Ａ〜図６Ｏを含む図６は、ACSS2がニューロン遺伝子発現を制御することを証明する代表的実験からの結果を表す。[図６Ａ、図６Ｂ]スクランブル対照に対する未分化CAD細胞（図６Ａ）と分化CADニューロン（図６Ｂ）における複製RNA-seqの相関プロット。２つの高度に相関性のある生物学的複製物において実施した、RNA-seqによる転写分析は、分化CADニューロンでアップレギュレートされるようになる894個の遺伝子を同定した（赤色ドットは＞1.6倍増加を有する遺伝子を表す）。[図６Ｃ]高度に相関のある２つの生物学的複製物において行ったRNA-seqによるトランスクリプトーム解析は、分化したCADニューロンでアップレギュレートされるようになった894個の遺伝子を同定した（赤色ドットは＞1.6倍増加を有する遺伝子を表す）。[図６Ｄ] StringDBを使った、894個のアップレギュレートした遺伝子（図２Ａ中の赤色ドット）のパスウェイ解析。タンパク質-タンパク質間相互作用グラフは、活性依存性のシグナル伝達とシナプス可塑性におけるキープレイヤー：Itpr1, Grin1, Nefh, Dync1h1 および Calm1を中心とする結合パートナーのネットワークを表す。[図６Ｅ]遺伝子オントロジー濃縮分析は、ニューロン経路のアップレギュレーションを示す。遺伝子オントロジー分析は、分化CADニューロンでアップレギュレートされるようなった894個の遺伝子に対して使用した（図６Ｃ；RNA-seqにより同定、倍率濃縮 (FE)＞3.5, FDR＜0.005)。[図６Ｆ] RNA-seqとChIP-seqからのNudtのゲノムブラウザビュー (H4K12ac, H4K5acおよびH3K9ac: mm10 chr5: 140,327,500-140,339,000)。[図６Ｇ] 他の全ての遺伝子（黒色バー）に対してCADニューロン分化中にアップレギュレートされる遺伝子（＞1.6倍、灰色のバー）の所でのH3K9ac、H4K5ac、および H4K12ac の相対的遺伝子濃縮。[図６Ｈ、図６Ｉ] 未分化CAD細胞における、ACLノックダウン（図６Ｈ）およびACSS2ノックダウン（図６Ｉ）に関する複製RNA-seqの相関プロット。[図６Ｊ、図６Ｋ] 分化CADニューロンにおける、ACLノックダウン（図６Ｊ）およびACSS2ノックダウン（図６Ｋ）に関する複製RNA-seqの相関プロット。[図６Ｌ] ACLノックダウンはニューロン遺伝子発現の分化関連アップレギュレーションに対してごく小さい効果であった（図１Ｄに比較して）。散布図は、野生型細胞とACLノックダウン細胞との間の誘導遺伝子（図６Ｃ）の倍率変化を対比する。周辺分布は、ヒストグラムとカーネル密度推定を示す。最小二乗法線形回帰は、95％信頼区間と共に示される。[図６Ｍ] 最大の倍率変化FPKMを有するアップレギュレートされた遺伝子（図６Ｃ中の赤色ドット）の対応する五分位値は野生型細胞において増加する。ACLノックダウンは、野生型細胞と同じ上方傾向を示し（赤色バー、図１Ｆの黒色バーに比較して）、これはACSS2ノックダウン細胞における重大な欠損と対照的である (緑色のバー；各五分位値について、カラムは平均誘導値を表し、そして誤差バーはSEMを表す）。[図６Ｎ] 野生型（スクランブル対照ノックダウン；灰色）、ACSS2ノックダウン（shACSS2 #25ノックダウン；緑色）およびACLノックダウン（shACL #17ノックダウン；赤色）細胞のRNA-seqからの未分化および分化CADニューロンにおける網羅的mRNA転写物レベルのボックスブロット。全ゲノム転写物レベルは、分化野生型細胞に比較して分化ACLノックダウン細胞において減少し（誤差バ��、SEM）、一方で分化ACSS2ノックダウン細胞におけるグローバルな減少は、分化野生型細胞に比較してあまり有意でなかった (誤差バー、s.d.)。[図６Ｏ] ACSS2ノックダウンに感受性の遺伝子（Top 20％）は、全ての遺伝子に比較してそれらの発現を低下させるACSS2i処置に対しても感受性である。
【図６−２】図６Ａ〜図６Ｏを含む図６は、ACSS2がニューロン遺伝子発現を制御することを証明する代表的実験からの結果を表す。[図６Ａ、図６Ｂ]スクランブル対照に対する未分化CAD細胞（図６Ａ）と分化CADニューロン（図６Ｂ）における複製RNA-seqの相関プロット。２つの高度に相関性のある生物学的複製物において実施した、RNA-seqによる転写分析は、分化CADニューロンでアップレギュレートされるようになる894個の遺伝子を同定した（赤色ドットは＞1.6倍増加を有する遺伝子を表す）。[図６Ｃ]高度に相関のある２つの生物学的複製物において行ったRNA-seqによるトランスクリプトーム解析は、分化したCADニューロンでアップレギュレートされるようになった894個の遺伝子を同定した（赤色ドットは＞1.6倍増加を有する遺伝子を表す）。[図６Ｄ] StringDBを使った、894個のアップレギュレートした遺伝子（図２Ａ中の赤色ドット）のパスウェイ解析。タンパク質-タンパク質間相互作用グラフは、活性依存性のシグナル伝達とシナプス可塑性におけるキープレイヤー：Itpr1, Grin1, Nefh, Dync1h1 および Calm1を中心とする結合パートナーのネットワークを表す。[図６Ｅ]遺伝子オントロジー濃縮分析は、ニューロン経路のアップレギュレーションを示す。遺伝子オントロジー分析は、分化CADニューロンでアップレギュレートされるようなった894個の遺伝子に対して使用した（図６Ｃ；RNA-seqにより同定、倍率濃縮 (FE)＞3.5, FDR＜0.005)。[図６Ｆ] RNA-seqとChIP-seqからのNudtのゲノムブラウザビュー (H4K12ac, H4K5acおよびH3K9ac: mm10 chr5: 140,327,500-140,339,000)。[図６Ｇ] 他の全ての遺伝子（黒色バー）に対してCADニューロン分化中にアップレギュレートされる遺伝子（＞1.6倍、灰色のバー）の所でのH3K9ac、H4K5ac、および H4K12ac の相対的遺伝子濃縮。[図６Ｈ、図６Ｉ] 未分化CAD細胞における、ACLノックダウン（図６Ｈ）およびACSS2ノックダウン（図６Ｉ）に関する複製RNA-seqの相関プロット。[図６Ｊ、図６Ｋ] 分化CADニューロンにおける、ACLノックダウン（図６Ｊ）およびACSS2ノックダウン（図６Ｋ）に関する複製RNA-seqの相関プロット。[図６Ｌ] ACLノックダウンはニューロン遺伝子発現の分化関連アップレギュレーションに対してごく小さい効果であった（図１Ｄに比較して）。散布図は、野生型細胞とACLノックダウン細胞との間の誘導遺伝子（図６Ｃ）の倍率変化を対比する。周辺分布は、ヒストグラムとカーネル密度推定を示す。最小二乗法線形回帰は、95％信頼区間と共に示される。[図６Ｍ] 最大の倍率変化FPKMを有するアップレギュレートされた遺伝子（図６Ｃ中の赤色ドット）の対応する五分位値は野生型細胞において増加する。ACLノックダウンは、野生型細胞と同じ上方傾向を示し（赤色バー、図１Ｆの黒色バーに比較して）、これはACSS2ノックダウン細胞における重大な欠損と対照的である (緑色のバー；各五分位値について、カラムは平均誘導値を表し、そして誤差バーはSEMを表す）。[図６Ｎ] 野生型（スクランブル対照ノックダウン；灰色）、ACSS2ノックダウン（shACSS2 #25ノックダウン；緑色）およびACLノックダウン（shACL #17ノックダウン；赤色）細胞のRNA-seqからの未分化および分化CADニューロンにおける網羅的mRNA転写物レベルのボックスブロット。全ゲノム転写物レベルは、分化野生型細胞に比較して分化ACLノックダウン細胞において減少し（誤差バ��、SEM）、一方で分化ACSS2ノックダウン細胞におけるグローバルな減少は、分化野生型細胞に比較してあまり有意でなかった (誤差バー、s.d.)。[図６Ｏ] ACSS2ノックダウンに感受性の遺伝子（Top 20％）は、全ての遺伝子に比較してそれらの発現を低下させるACSS2i処置に対しても感受性である。
【図７−１】図７Ａ〜図７Ｐを含む図７は、ACSS2が分化CADニューロンにおいてクロマチン結合型であることを証明する代表的実験からの結果を表す。[図７Ａ] 分化CADニューロンにおけるChIP-seqを、ACSS2に対する２種の異なる抗体を用いて正副二通りに実施した。相関プロットは、対応するMACSピークを上回る相対的濃縮を示す（対照として入力時のデフォルトパラメータを使用、1,598ピーク）。[図７Ｂ] 相関プロットは、相対的全ゲノムChIP-seq濃縮を示す。[図７Ｃ] ChIP-seqトラックのUCSCゲノムブラウザビューは、CADニューロン分化により、Nudt1遺伝子座でのH4K5, H4K12および H3K9 アセチル化の増加が、ACSS2 濃縮と同時に起こることを示す (chr5: 140,326,845-140,339,655)。[図７Ｄ] Tab2遺伝子座(chr10: 7,875,000-8,004,000)上での未分化CAD細胞と分化CADニューロンにおける指摘のChIP-seqトラックのUCSCゲノムブラウザビュー。[図７Ｅ] ACSS2ピークに最も近接した遺伝子の遺伝子オントロジー濃縮解析は、ニューロン特異的遺伝子が濃縮されることを示す。[図７Ｆ] ヒストンアセチル化に関連したそれらの標的遺伝子の上流に位置するACSS2ピーク（T抗体）の度数。[図７Ｇ] ヒストンアセチル化に関連したそれらの標的遺伝子の上流に位置するACSS2ピーク（CS抗体）の度数。[図７Ｈ] 表は、H3K9ac、H4K5acおよび H4K12acブロードMACSピークとACSS2ピークとの直接重複％を示す。[図７Ｉ、図７Ｊ、図７Ｋ] 十分位数プロットは、ランク付けしたACSS2ピーク濃縮の十分位数（を上回るH3K9ac (図７Ｉ), H4K5ac (図７Ｊ)およびH4K12ac (図７Ｋ)の濃縮を表す（ゼロを除く）。[図７Ｌ、図７Ｍ、図７Ｎ] ACSS2およびアセチルブロードピーク（MACS）の分化誘導同時濃縮。ピーク濃縮相関は、H3K9ac (図７Ｌ）、H4K5ac (図７Ｍ)およびH4K12ac (図７Ｎ)について示したピーク濃縮相関。[図７Ｏ] 分化CADニューロンにおいてMACSによりコールされた全ACSS2 ChIP-seqピークから、HOMERにより推測された転写因子結合部位の発見された新モチーフ。[図７Ｐ] グループとして分化誘導遺伝子のChIP-seq濃縮は、分化CADニューロン中のヒストンアセチル化との相関を示す。
【図７−２】図７Ａ〜図７Ｐを含む図７は、ACSS2が分化CADニューロンにおいてクロマチン結合型であることを証明する代表的実験からの結果を表す。[図７Ａ] 分化CADニューロンにおけるChIP-seqを、ACSS2に対する２種の異なる抗体を用いて正副二通りに実施した。相関プロットは、対応するMACSピークを上回る相対的濃縮を示す（対照として入力時のデフォルトパラメータを使用、1,598ピーク）。[図７Ｂ] 相関プロットは、相対的全ゲノムChIP-seq濃縮を示す。[図７Ｃ] ChIP-seqトラックのUCSCゲノムブラウザビューは、CADニューロン分化により、Nudt1遺伝子座でのH4K5, H4K12および H3K9 アセチル化の増加が、ACSS2 濃縮と同時に起こることを示す (chr5: 140,326,845-140,339,655)。[図７Ｄ] Tab2遺伝子座(chr10: 7,875,000-8,004,000)上での未分化CAD細胞と分化CADニューロンにおける指摘のChIP-seqトラックのUCSCゲノムブラウザビュー。[図７Ｅ] ACSS2ピークに最も近接した遺伝子の遺伝子オントロジー濃縮解析は、ニューロン特異的遺伝子が濃縮されることを示す。[図７Ｆ] ヒストンアセチル化に関連したそれらの標的遺伝子の上流に位置するACSS2ピーク（T抗体）の度数。[図７Ｇ] ヒストンアセチル化に関連したそれらの標的遺伝子の上流に位置するACSS2ピーク（CS抗体）の度数。[図７Ｈ] 表は、H3K9ac、H4K5acおよび H4K12acブロードMACSピークとACSS2ピークとの直接重複％を示す。[図７Ｉ、図７Ｊ、図７Ｋ] 十分位数プロットは、ランク付けしたACSS2ピーク濃縮の十分位数（を上回るH3K9ac (図７Ｉ), H4K5ac (図７Ｊ)およびH4K12ac (図７Ｋ)の濃縮を表す（ゼロを除く）。[図７Ｌ、図７Ｍ、図７Ｎ] ACSS2およびアセチルブロードピーク（MACS）の分化誘導同時濃縮。ピーク濃縮相関は、H3K9ac (図７Ｌ）、H4K5ac (図７Ｍ)およびH4K12ac (図７Ｎ)について示したピーク濃縮相関。[図７Ｏ] 分化CADニューロンにおいてMACSによりコールされた全ACSS2 ChIP-seqピークから、HOMERにより推測された転写因子結合部位の発見された新モチーフ。[図７Ｐ] グループとして分化誘導遺伝子のChIP-seq濃縮は、分化CADニューロン中のヒストンアセチル化との相関を示す。
【図８−１】図８Ａと８Ｂを含む図８は、ACSS2濃縮が、分化中のCADニューロンの神経遺伝子におけるヒストンアセチル化と同時に起こることを証明する実験からの結果を表す。[図８Ａ] ChIP-seqトラックのゲノムブラウザビューは、H4K5、H4K12およびH3K9アセチル化の増加が、CADニューロン分化によるIdua（α-1-イズロニダーゼ）遺伝子座(chr5: 108,649,457-108,687,261)におけるACSS2濃縮と同時に起こることを証明する。[図８Ｂ] Slc19A1（溶質キャリアファミリー19メンバー１）遺伝子では、上昇したヒストンH4K5、H4K12およびH3K9アセチル化レベルが、分化CADニューロン中のACSS2濃縮の増加と相応する(chr10: 76,761,141-77,170,455)。
【図８−２】図８Ａと８Ｂを含む図８は、ACSS2濃縮が、分化中のCADニューロンの神経遺伝子におけるヒストンアセチル化と同時に起こることを証明する実験からの結果を表す。[図８Ａ] ChIP-seqトラックのゲノムブラウザビューは、H4K5、H4K12およびH3K9アセチル化の増加が、CADニューロン分化によるIdua（α-1-イズロニダーゼ）遺伝子座(chr5: 108,649,457-108,687,261)におけるACSS2濃縮と同時に起こることを証明する。[図８Ｂ] Slc19A1（溶質キャリアファミリー19メンバー１）遺伝子では、上昇したヒストンH4K5、H4K12およびH3K9アセチル化レベルが、分化CADニューロン中のACSS2濃縮の増加と相応する(chr10: 76,761,141-77,170,455)。
【図９】図９Ａ〜９Ｉを含む図９は、CADニューロン分化による遺伝子ACSS2濃縮がヒストンアセチル化の増加と相応することを表す。[図９Ａ、９Ｂ、図９Ｃ、図９Ｄ]メタ遺伝子濃縮（エンリッチメント）解析は、分化CADニューロン中でACSS2が濃縮された遺伝子の上位５％に渡る、ACSS2（図９Ａ）、H3K9ac（図９Ｂ）、H4K5ac(図９Ｃ)およびH4K12ac (図９Ｄ)についてのChIP占有率を示す(Top ５％DE；赤色）。遺伝子の下位80％（Bot 80％DE）は青色で示され、そして全遺伝子に渡る平均シグナル（All genes DE)は緑色で示される。[図９Ｅ、図９Ｆ、図９Ｇ、図９Ｈ] ニューロン分化時にACSS2により動的に結合した状態になる遺伝子の上位５％における、ACSS2 (図９Ｅ)、H3K9ac (図９Ｆ)、H4K5ac (図９Ｇ)およびH4K12ac (図９Ｈ) のChIP占有率を示す（Top 5％ DE; 赤色）。遺伝子の下位80％（Bot 80% DE) は青色で示され、そして全遺伝子に渡る平均シグナル（All genes DE) は緑色で示される。[図９Ｉ] 多重線形回帰分析は、遺伝子ACSS2濃縮と野生型遺伝子発現変化の間の相互作用をモデル化するため、および分化関連遺伝子発現変化とクロマチンへのACSS2動員（呼び込み）との間の相互作用を可視化するために実装された。この近似回帰モデルの等高線図は、ACSS2濃縮の高レベルは赤色で、低レベルは青色で示され、そして独立遺伝子発現変数の散布図と重ね合わせられている。視覚化されたモデルは、高ACSS2濃縮が分化CADニューロンにおける遺伝子発現の増加と相応することを示す。
【図１０−１】図１０Ａ〜図１０Ｃを含む図１０は、ACSS2がニューロンヒストンアセチル化に機能を果たすことを証明する実験からの結果を表す。[図１０Ａ] 全細胞溶解物のウエスタンブロット分析は、ACSS2のレンチウイルスshRNA媒介ノックダウンがH3K9とH3K27のアセチル化を低減させる（図２Ｇに比較して）ことを示し、それはImageJを使って定量化された（n = 3, 誤差バーはs.e.m.を表す）。[図１０Ｂ] IgG対照およびACSS2の共免疫沈降実験の溶出液と上清のウエスタンブロット分析は、ACSS2がアセチル化クロマチンに結合することを示す。[図１０Ｃ] 24時間ACSS2iで処置し、指摘の抗体で探索し(図２Ｊと比較）、そしてImageJを使って定量した、初代海馬ニューロン（７日目）からの溶解物のウエスタンブロット(n = 3, 誤差バーはs.e.m.を示す)。
【図１０−２】図１０Ａ〜図１０Ｃを含む図１０は、ACSS2がニューロンヒストンアセチル化に機能を果たすことを証明する実験からの結果を表す。[図１０Ａ] 全細胞溶解物のウエスタンブロット分析は、ACSS2のレンチウイルスshRNA媒介ノックダウンがH3K9とH3K27のアセチル化を低減させる（図２Ｇに比較して）ことを示し、それはImageJを使って定量化された（n = 3, 誤差バーはs.e.m.を表す）。[図１０Ｂ] IgG対照およびACSS2の共免疫沈降実験の溶出液と上清のウエスタンブロット分析は、ACSS2がアセチル化クロマチンに結合することを示す。[図１０Ｃ] 24時間ACSS2iで処置し、指摘の抗体で探索し(図２Ｊと比較）、そしてImageJを使って定量した、初代海馬ニューロン（７日目）からの溶解物のウエスタンブロット(n = 3, 誤差バーはs.e.m.を示す)。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｃを含む。図１１は、ACSS2 クロマチン会合と背側海馬のH3K9ac がニューロン組織におけるH3K27ac とCBPの濃縮と対応することを証明する代表的実験の結果を表す。[図１１Ａ] H3K9acのインビボ海馬ChIP-seqおよびENCODEからのマウス前脳H3K9ac ChIP-seqの全ゲノムコンパートメント解析は、全ゲノムで同様なピーク分布を示す：それらは異なる脳領域に由来するが、インビボH3K9ac ChIPデータは強力な一致を示す（Spearman R = 0.67)。[図１１Ｂ] 意図する酵素または修飾により標的とされるRefSeq 転写物のオーバーラップ (マウス皮質ニューロンにおけるCBP (GSM1629373) および H3K27ac (GSM1629397)のピークは、入力時ソニケーション効率対照(GSM1629381)を用いてMACS2 (狭ピーク, FDR 0.1%)を使って呼び出した；ピークは全RefSeq転写物の中で最も近いTSSに関連付けられた）。[図１１Ｃ] 一般のCBP-ACSS2 ターゲットに対して実施したオントロジー濃縮分析は、それらの酵素が、シナプス生物学およびシナプス膜電位を調節する遺伝子を同時ターゲティングすることを示す。
【図１２−１】図１２Ａ〜図１２Ｈを含む。図１２は、背側海馬におけるACSS2発現の減衰が物体位置記憶を低下させることを証明する実験からの結果を表す。[図１２Ａ] 海馬領域CA1の矢状切片のACSS2 上へのACSS2 RNA in situハイブリダイゼーション（左、Allen Mouse Brain Atlas12から適応させた参照Atlas；右、in situハイブリダイゼーション；HPC, 正常な海馬)。[図１２Ｂ] 頭蓋内手術前、および物体位置記憶（OLM）訓練前の回復後の、eGFPAAV9対照およびshACSS2-AAV9ノックダウンマウスの体重（NS、群あたりｎ＝10、誤差バーはs.d.を示す)。[図１２Ｃ、図１２Ｄ] ACSS2ノックダウンマウスは、オープンフィールド試験において５分間に渡って数量化した、活動性または走触性（オープンフィールドで垂直面の近くにとどまる性質、不安の尺度）に全く欠損を示さなかった。（図１２Ｃ）は追跡データの代表的ヒートマップを示す（NS, n = 10 /群、誤差バーはs.d.を示す)。[図１２Ｅ] 最初のOLM訓練期間（TR）および24時間保存試験（NL、新規位置にある物体；FL、元の位置にある物体）の間に、３つの物体（Ｏ1〜3）について記録した、eGFP-AAV9対照とshACSS2-AAV9ノックダウンマウスによる探査時間。[図１２Ｆ] 対照のeGFPAVV9マウスに比較して、ACSS2-ノックダウンマウスは、状況恐怖記憶に全く欠陥を示さなかった。状況恐怖条件付けの日にチャンバ中での凍結挙動を記録し、ショック前に定量化した(FC 訓練； NS, n = 10/コホート、誤差バーはs.d.を示す)。恐怖記憶は、状況恐怖条件付けの１日後にその状況に再暴露した後の凍結反応として測定された（嫌悪刺激：1.5 mA電気ショック；NS, n = 10 /コホート、誤差バーはs.d.を示す)。[図１２Ｇ] eGFPコントロールおよびshACSS2ノックダウン動物の背側海馬にRNA-seq を実装した。グローバル転写レベルは、ACSS2ノックダウンにより影響されなかった（dHPC, 背側海馬；グループあたり４匹のマウス、各条件について２回反復、誤差バーはs.d.を示す)。[図１２Ｈ] 未訓練の動物における最初期遺伝子のベースライン発現は、ACSS2ノックダウンマウスでは変化しなかった。eGFP対照とshACSS2-ノックダウンマウスの背側海馬においてRNA-seqを実施した(r = 0.82, P＜0.0001; HCC, ホームケージ概日リズム制御）。
【図１２−２】図１２Ａ〜図１２Ｈを含む。図１２は、背側海馬におけるACSS2発現の減衰が物体位置記憶を低下させることを証明する実験からの結果を表す。[図１２Ａ] 海馬領域CA1の矢状切片のACSS2 上へのACSS2 RNA in situハイブリダイゼーション（左、Allen Mouse Brain Atlas12から適応させた参照Atlas；右、in situハイブリダイゼーション；HPC, 正常な海馬)。[図１２Ｂ] 頭蓋内手術前、および物体位置記憶（OLM）訓練前の回復後の、eGFPAAV9対照およびshACSS2-AAV9ノックダウンマウスの体重（NS、群あたりｎ＝10、誤差バーはs.d.を示す)。[図１２Ｃ、図１２Ｄ] ACSS2ノックダウンマウスは、オープンフィールド試験において５分間に渡って数量化した、活動性または走触性（オープンフィールドで垂直面の近くにとどまる性質、不安の尺度）に全く欠損を示さなかった。（図１２Ｃ）は追跡データの代表的ヒートマップを示す（NS, n = 10 /群、誤差バーはs.d.を示す)。[図１２Ｅ] 最初のOLM訓練期間（TR）および24時間保存試験（NL、新規位置にある物体；FL、元の位置にある物体）の間に、３つの物体（Ｏ1〜3）について記録した、eGFP-AAV9対照とshACSS2-AAV9ノックダウンマウスによる探査時間。[図１２Ｆ] 対照のeGFPAVV9マウスに比較して、ACSS2-ノックダウンマウスは、状況恐怖記憶に全く欠陥を示さなかった。状況恐怖条件付けの日にチャンバ中での凍結挙動を記録し、ショック前に定量化した(FC 訓練； NS, n = 10/コホート、誤差バーはs.d.を示す)。恐怖記憶は、状況恐怖条件付けの１日後にその状況に再暴露した後の凍結反応として測定された（嫌悪刺激：1.5 mA電気ショック；NS, n = 10 /コホート、誤差バーはs.d.を示す)。[図１２Ｇ] eGFPコントロールおよびshACSS2ノックダウン動物の背側海馬にRNA-seq を実装した。グローバル転写レベルは、ACSS2ノックダウンにより影響されなかった（dHPC, 背側海馬；グループあたり４匹のマウス、各条件について２回反復、誤差バーはs.d.を示す)。[図１２Ｈ] 未訓練の動物における最初期遺伝子のベースライン発現は、ACSS2ノックダウンマウスでは変化しなかった。eGFP対照とshACSS2-ノックダウンマウスの背側海馬においてRNA-seqを実施した(r = 0.82, P＜0.0001; HCC, ホームケージ概日リズム制御）。
【図１３】図１３Ａ〜図１３Ｆを含む。図１３は、ACSS2がインビボで最初期遺伝子の検索誘導性アップレギュレーションを調節することを証明する実験からの結果を表す。[図１３Ａ] eGFP対照とshACSS2ノックダウンマウスの背側海馬に、全ゲノムRNA-seqを実行した。記憶の回復後の感作期間の間にアップレギュレートされるようになる、以前に同定され確証された遺伝子のセットについて解析を集中した。未訓練の動物の最初期遺伝子のベースライン発現は、eGFP-AAV9対照マウス (CC, 概日リズム制御）に比較したときhsACSS2-AAV9マウスにおいて変化が認められなかった。[図１３Ｂ] 状況記憶の回復後の感受期の間 (RT, 恐怖条件付けの24時間後に条件付けチャンバへの暴露後30分）、最初期遺伝子は対照注射マウスの背側海馬においてアップレギュレートされた。対照的に、それらの初期応答遺伝子の動的検索誘導性発現は、ACSS2ノックダウンマウスでは欠損している (P = 0.001, 対応のあるｔ検定)。[図１３Ｃ] shACSS2-AAV9 注入マウス(RT/CC)における最初期遺伝子の誘導欠損。[図１３Ｄ] 状況記憶の回復後にダウンレギュレートされた遺伝子のベースライン発現は、ACSS2ノックダウンマウスでは改変されない。[図１３Ｅ]検索応答遺伝子のダウンレギュレーションは、Cldn5を除いてeGFP 対照マウスとACSS2ノックダウンマウスの両方で起こった。[図１３Ｆ] eGFP対照対shACSS2ノックダウンマウスの背側海馬における検索応答遺伝子の検索誘導性ダウンレギュレーション。
【図１４】図１４は図１Ｃ、２Ｇ、１Ｅおよび５Ｇに示したウエスタンブロットのもとのゲルブロットを表す。ボックスは、図１Ｃ、２Ｇ、１Ｅおよび５Ｇに示したトリミング領域を表す。
【図１５】図１５は、図２Ｈおよび２Ｊに示したウエスタンブロットの元のゲルブロットを表す。ボックスは、図２Ｈおよび２Ｊに示したトリミング領域を表す。
【図１６】図１６は、図４Ｂ，５Ｂおよび１０Ｂに示したウエスタンブロットの元のゲルブロットを表す。ボックスは、図４Ｂ、５Ｂおよび１０Ｂに示したトリミング領域を表す。
【図１７】図１７は、酢酸塩の生理的供給源を表す。
【図１８】図１８は、EtOH-13C2の腹腔内注射後のマウスの皮質、海馬および肝臓におけるヒストンアセチル化を測定したグラフを表す。
【図１９】ACSS2ノックダウンマウスの海馬におけるヒストンアセチル化を測定したグラフを表す。
【図２０】図２０は、ACSS2ノックダウンマウス対野生型マウスの背側HPC、腹側HPCおよび筋肉におけるヒストンアセチル化の差を示すグラフである。
【図２１−１】図２１Ａ〜図２１Ｅを含む図２１Ａは、インビボEtOH-d6質量分析の実験概要を表す。図２１Ｂは、代謝された重質EtOH-d6が海馬のヒストンアセチル化領域に取り込まれることを示す実験結果を表す。アラクネプロット軸は、Ｄ3標識形態に相当するアセチル化ペプチドの三番目の同位体の％を表す；その同位体の自然相対存在度は、「無処置」および「食塩水 1h」処置群では明らかである。図２１Ｃは、海馬と同様なパターンを示す、皮質ヒストンアセチル化中への標識の取り込みを証明する実験結果を表す。図２１Ｄは、ヒストンアセチル化中への標識の取り込みが、アルコール代謝の主要部位である肝臓においてより早期に起こることを示す実験結果を表す。図２１Ｅは、ヒストンアセチル化が、ACSS2発現の低い組織である骨格筋での肝臓アルコール代謝に比較的無関係であることを証明する実験結果を表す。
【図２１−２】図２１Ａ〜図２１Ｅを含む図２１Ａは、インビボEtOH-d6質量分析の実験概要を表す。図２１Ｂは、代謝された重質EtOH-d6が海馬のヒストンアセチル化領域に取り込まれることを示す実験結果を表す。アラクネプロット軸は、Ｄ3標識形態に相当するアセチル化ペプチドの三番目の同位体の％を表す；その同位体の自然相対存在度は、「無処置」および「食塩水 1h」処置群では明らかである。図２１Ｃは、海馬と同様なパターンを示す、皮質ヒストンアセチル化中への標識の取り込みを証明する実験結果を表す。図２１Ｄは、ヒストンアセチル化中への標識の取り込みが、アルコール代謝の主要部位である肝臓においてより早期に起こることを示す実験結果を表す。図２１Ｅは、ヒストンアセチル化が、ACSS2発現の低い組織である骨格筋での肝臓アルコール代謝に比較的無関係であることを証明する実験結果を表す。
【図２２】図２２Ａ〜図２２Ｄを含む図２２は、野生型マウスのヒストンアセチル化を表す。図２２Ａ〜２２Ｃは、野生型マウスの背側海馬における重水素化ヒストンH4−トリアセチルペプチド（aa 4-17）の相対量を示す質量スペクトルを表す。図２２Ａは、ベースラインでの質量スペクトルを表す。図２２Ｂはd6-EtOH注射の30分後の質量スペクトルを表す。図２２Ｃは、d6-EtOH注射後４時間目の質量スペクトルを表す。図２２Ｄは、ヒストンアセチル化が骨格筋での肝臓アルコール代謝に比較的無関係であることを示す実験結果を表す。骨格筋組織では30分後、野生型（WT）マウスでは４時間後、そして海馬ACSS2 KDマウスでは30分後の重水素化ヒストンアセチル化の相対量が示される（図２１Ｅに比較して）。
【図２３】図２３Ａ〜図２３Ｅを含む図２３は、背側海馬（dHPC) ACSS2ノックダウン(KD)におけるEtOH-d6の質量スペクトル分析を表す。図２３Ａは、背側海馬でのACSS2発現のノックダウンがヒストンアセチル化への重質標識の取り込みを防止することを示す実験結果を表す。図２３Ｂは、同じ動物において、腹側海馬（ACSS2レベルが正常である）での重質標識の取り込みが対照マウスに比較して変化がないことを証明する実験結果を表す。図２３Ｃは、腹腔内注射により導入された重質酢酸塩（アセテート）が、背側海馬でのヒストンアセチル化を容易に標識することを示す実験結果を表す。図２３Ｄは、腹腔内注射により導入された重質酢酸塩が皮質におけるヒストンアセチル化を容易に標識することを示す実験結果を表す。図２３Ｅは、肝臓アルコール分解からの酢酸塩が、脳内のニューロンACSS2により活性化され、そして遺伝子調節性ヒストンアセチル化を容易に誘導することを示す実験結果を表す。
【図２４】図２４Ａ〜図２４Ｅを含む図２４は、初代海馬ニューロンにおけるACSS2媒介性の酢酸塩誘導転写を表す。 図２４Ａと図２４Ｂは、C57/B16マウス胚から単離されそしてACSS2の小分子阻害剤（ACSS2i）の存在下または非存在下で酢酸塩（10 mM）で処置した、初代海馬ニューロンにおけるRNA-seqを表す。図２４Ａは、酢酸塩処置によって差次的に発現された7,600個の遺伝子（発現変動遺伝子）を示すヒートマップを表し、３番目のカラムはACSS2阻害剤の存在下でのそれらの遺伝子の挙動を示す。3613個の酢酸塩誘導遺伝子のうち2107個が、ACSS2iの存在下でアップレギュレートすることができなかった（群あたりN=4)。図２４Ｂは、酢酸塩の存在下でのACSS2i処置により酢酸誘導遺伝子が調節されなかったことを示す実験結果を表す。図２４Ｃは、青色で初代海馬ニューロン中の酢酸塩誘導遺伝子を表し；下にACSS2i感受性遺伝子析（黄色の重なっていないもの、酢酸塩＋ACSS2i）が示される。図２４Ｄは、酢酸塩に感受性でかつ、ACSS2により直接結合した遺伝子のGO term解析を表す（ACSS2 ChIP-seqより)。図２４Ｅは、酢酸塩感受性遺伝子をターゲッティングするACSS2海馬結合部位のHOMER無監督デノボ（de novo）モチーフ解析を表す。
【図２５−１】図２５Ａ〜図２５Ｄを含む図２５は、酢酸塩により調節される遺伝子を表す。図２５Ａは、10 mM酢酸塩で処置した初代海馬ニューロンにおいて差次的に調節された遺伝子（発現変動遺伝子）を示すRNAseqを示す。図２５Ｂは、有意にアップレギュレートされた遺伝子（赤色）および有意にダウンレギュレートされた遺伝子（青色）の遺伝子オントロジー（GO）解析を表す。図２５Ｃは、エタノール注入マウスの海馬のアップレギュレートされた214の遺伝子のうち81個が、インビトロでの初代海馬ニューロンにおいても酢酸塩によりアップレギュレートされることを示す実験結果を表す（p＝6.60e-17）。図２５Ｄは、ACSS2ピークの累積数がアセチル化ACSS2i感受性遺伝子の転写開始部位（TSS）の近傍にあることを示す実験結果を表す。これは、大部分のACSS2結合現象がプロモーター遺伝子の上にまたは近位に起こることを示す。
【図２５−２】図２５Ａ〜図２５Ｄを含む図２５は、酢酸塩により調節される遺伝子を表す。図２５Ａは、10 mM酢酸塩で処置した初代海馬ニューロンにおいて差次的に調節された遺伝子（発現変動遺伝子）を示すRNAseqを示す。図２５Ｂは、有意にアップレギュレートされた遺伝子（赤色）および有意にダウンレギュレートされた遺伝子（青色）の遺伝子オントロジー（GO）解析を表す。図２５Ｃは、エタノール注入マウスの海馬のアップレギュレートされた214の遺伝子のうち81個が、インビトロでの初代海馬ニューロンにおいても酢酸塩によりアップレギュレートされることを示す実験結果を表す（p＝6.60e-17）。図２５Ｄは、ACSS2ピークの累積数がアセチル化ACSS2i感受性遺伝子の転写開始部位（TSS）の近傍にあることを示す実験結果を表す。これは、大部分のACSS2結合現象がプロモーター遺伝子の上にまたは近位に起こることを示す。
【図２６】図２６Ａと図２６Ｂを含む図２６は、アルコール代謝産物が胎児脳におけるヒストンアセチル化の供給源となることを表す。図２６Ａは、代謝された重質d6-EtOHが母体の脳のヒストンアセチル化に取り込まれることを示す実験結果を表す。図２６Ｂは、胎児脳におけるヒストンアセチル化への重質標識の取り込みを表す。データは母性d6-EtOH注射からの４体の胎児の２つのプールを表す。Arachneプロットの軸は、D3標識形態に相当する、アセチル化ペプチドの３番目の同位体の割合を表す。
【図２７】図２７は、３個のアセチルを有するペプチドH4 aa 4-17（海馬）を示す実験結果を表す。
【図２８】図２８は、SILAC-質量スペクトル実験の実験結果を表す。
【図２９】図２９は、触媒性ACSS2活性とヒストンH3のリジン９アセチル化を試験管内で減少させる効力を決定するためのアッセイ計画を表す。Ntera2 細胞を、10％FBSとGlutaMAX（Gibco）を含むDMEM（Gibco)中に維持した。細胞をグルコース不在の5 mM酢酸ナトリウムおよび化合物ADG-204、ADG-205、ADG-206またはビヒクル（DMSO）で24時間処置した。細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Life Technologies、型番78446）と10 mM酪酸ナトリウムが補足された50 mM Tris pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% NP40, 1% SDS を含有するRIPA緩衝液中で溶解させ、そして同量のタンパク質を直接ポリアクリルアミドゲル上に負荷した。タンパク質を4-12％ビス-トリスポリアクリルアミドゲル(NuPAGE)上で分離した。ニトロセルロース膜への移行後、0.1％Tween 20が補足されたTBS（TBST）中の３％BSAを用いて、室温で１時間膜をブロックした。一次抗体はTBST中に希釈し、４℃で一晩インキュベートした。使用した抗体は抗-H3 (Abcam ab1791)、抗-H3K9ac (Abcam ab4441)、抗-GAPDH (Fitzgerald Industries 10R-G109A)であった。膜をTBSTで各々10分間ずつ３回洗浄し、次いでHRP結合二次抗体と共に室温で１時間TBST中でインキュベートした。膜を更に３回再洗浄し、富士フィルム製LAS-4000 イメージャーを用いて画像化した。
【図３０】図３０は、ADG-204の化学構造と活性を表す。
【図３１】図３１は、ADG-205の化学構造と活性を表す。
【図３２】図３２は、ADG-206の化学構造と活性を表す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
〔詳細な説明〕
本発明は、神経学的疾患と障害および認知疾患と障害を治療するための組成物および方法に関する。幾つかの実施形態では、本発明は、記憶関連疾患および障害を治療するための組成物と方法を提供する。様々な実施形態において、本発明の組成物と方法は、恐怖症、パニック障害、心理的ストレス（例えば災害、破局または暴力被害者に見られるような）、強迫性障害、全般性不安障害および外傷後ストレス障害（PTSD）といった不安疾患および障害を治療するのに有用である。幾つかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、長期記憶の保存または統合を調節するために有用である。
【０００９】
本発明はまた、依存および／または依存に関連する疾患または疾病を治療するための組成物および方法に関する。様々な実施形態において、本発明の組成物および方法は、急性アルコール誘発性記憶障害および慢性アルコール誘発性記憶障害を予防または治療するために有用である。
【００１０】
幾つかの実施形態では、本発明の方法は、クロマチンアセチル化を調節することを含む。一実施形態では、本発明の方法は、クロマチンアセチル化を減少させる。一実施形態では、クロマチンはニューロンのクロマチンである。一実施形態では、当該方法は、対象にACSS2の阻害剤を含む有効量の組成物を投与することを含む。
【００１１】
ある場合には、本明細書に記載の組成物と方法は、酢酸（アセテート）依存性アセチルCoAシンセターゼ２（ACSS2）を阻害することに関する。一実施形態では、本発明の組成物は、ACSS2の阻害剤を含む。一実施形態では、ACSS2の阻害剤は、ACSS2の発現、活性またはその両方を阻害する。
【００１２】
定義
特に定めが無い限り、本明細書中で使用する全ての技術用語と科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載のものと同様または同等である何れかの方法と材料を、本発明の実施または試験に使用することができる。
【００１３】
一般に、本明細書中で用いる命名法、並びに細胞培養、分子遺伝学、有機化学、核酸化学およびハイブリダイゼーションにおける実験手順は、当業者に周知でありかつ、常用されるものである。
【００１４】
核酸とペプチド合成には標準技術が用いられる。それらの技術と手順は、通常、当業界の従来法と様々な一般的参考文献（例えば、Sambrook & Russell, 2012, Molecular Cloning, A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, and Ausubel他, 2002, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY、これらは本明細書全体に渡って提供される）に従って実施される。
【００１５】
本明細書中で用いる場合、次の各用語は、本章でそれに関連付けられる意味を有する。
【００１６】
冠詞「a」と「an」は本明細書中、その冠詞の文法上の対象物の１または複数（すなわち少なくとも１つ）を指すために用いられる。例として、「１つの要素」は、１つの要素または複数（２以上）の要素を意味する。
【００１７】
量、時間的な持続時間などの測定可能な値を指すときに本明細書中で用いられる「約」は、指定された値から±20％、±10％、±５％、±１％または±0.1％の変動を包含することを意味し、これは、そのような変動が本開示の方法を実施するのに妥当であるためである。
【００１８】
生物体、組織、細胞またはその構成成分との関連で用いられる時の「異常」という用語は、少なくとも１つの観察可能なまたは検出可能な特性（例えば年齢、治療法、時間または日にちなど）が、「正常な」（期待される）各特性を示す生物体、組織、細胞またはその構成成分とは異なる生物体、組織、細胞またはその構成成分を指す。ある１つの細胞または組織タイプにとって正常であるまたは期待される特性は、異なる細胞または組織タイプにとっては異常であることがある。
【００１９】
「アンチセンス」は、タンパク質をコードする二本鎖DNA分子の非コード鎖の核酸配列、または該非コード鎖に実質的に相同である配列を指す。本明細書中で定義される通り、アンチセンス配列は、タンパク質をコードする二本鎖DNA分子の配列に相補的である。該アンチセンス配列はDNA分子のコード鎖のコード部分に対してのみ相補的である必要はない。アンチセンス配列はタンパク質をコードするDNA分子のコード鎖上に特定された調節配列に相補的であってよく、その調節配列はコード配列の発現を制御する。
【００２０】
「疾患」は、動物がホメオスタシス（恒常性）を維持することができず、かつその疾患が緩和されなければ動物の健康が悪化し続けるような動物の健康状態である。
【００２１】
対比して、動物の「障害」は、その動物がホメオスタシスを維持できるが、その動物の健康状態が障害のない場合よりも好ましくないような健康状態である。未処置のままにしても、障害は必ずしも動物の健康状態の更なる悪化を引き起こすわけではない。
【００２２】
疾患または障害は、該疾患または障害の徴候または症状の重症度、患者がそのような兆候または症状を経験する頻度、またはその両方が低減されるならば、「緩和される」。
【００２３】
化合物の「有効量」または「治療有効量」は、該化合物が投与される対象に対して有益な効果を提供するのに十分である化合物の量である。
【００２４】
「コードする」とは、限定されたヌクレオチド配列（すなわちrRNA、tRNAおよびmRNA）または限定されたアミノ酸配列のいずれかを有する生物学的過程における別のポリマーや巨大分子の合成のための鋳型として働くこと、およびポリヌクレオチド、例えば遺伝子、cDNAまたはmRNAのようなポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定配列の固有の性質、およびそれから生じる生物学的特性を指す。よって、ある遺伝子に相当するmRNAの転写と翻訳が細胞または他の生体系において或るタンパク質を産生するならば、その遺伝子はそのタンパク質をコードする。コード鎖、すなわちmRNA配列と同一でありかつ、一般に配列表中に提供されるヌクレオチド配列と、非コード鎖、すなわち遺伝子またはcDNAの転写のための鋳型として用いられる配列の両方とも、該遺伝子またはcDNAのタンパク質産物または他の産物をコードすると称することが可能である。
【００２５】
用語「患者」、「対象」、「個体」等は本明細書中互換的に用いられ、インビトロかインビボかに関係なく、本明細書に記載の方法に適している任意の動物またはそれの細胞を指す。ある非限定的実施形態では、患者、対象または個体は、ヒトである。
【００２６】
「治療的」処置は、患者または障害の徴候または症状を発現している対象に、それらの徴候または症状を低減または除去する目的で投与される処置である。
【００２７】
本明細書中で用いる場合、「疾患または障害を治療する」とは、患者が該疾患または障害の徴候または症状を経験する重症度および／または頻度を減少させることを意味する。
【００２８】
抗体に関して本明細書中で用いられる用語「特異的に結合する」とは、特異的抗原を認識するが、サンプル中の別の分子は実質的に認識または結合しない抗体を意味する。例えば、１つの種からの抗原に特異的に結合する抗体は、１以上の種からの同抗原にも結合しうる。しかし、そのような異種間反応性は、それ自体、特異的抗体としての抗体の分類を変更しない。別の例では、抗原に特異的に結合する抗体は、該抗原の異なる対立遺伝子形態に結合することができる。しかしながら、そのような交差反応性は特異的抗体としての抗体の分類を変更しない。
【００２９】
幾つかの場合、用語「特異的結合」または「特異的に結合する」という用語は、抗体、、タンパク質またはペプチドと第二の化学種との相互作用に関連して、該相互作用が前記化学種上の特定構造（例えば抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味するために用いることができる；例えば抗体が一般にタンパク質に対してよりも特定のタンパク質構造を認識しかつそれに結合することを意味する。抗体がエピトープ「Ａ」に特異的であるならば、標識「Ａ」と抗体とを含む反応においてエピトープＡを含む分子（または遊離の未標識Ａ）が存在すると、抗体に結合する標識Ａの量が減少するだろう。
【００３０】
遺伝子の「コード領域」は、該遺伝子のコード鎖のヌクレオチド残基と該遺伝子の非コード鎖のヌクレオチドとから成り、その各々はそれぞれ、該遺伝子の転写により産生されるmRNA分子のコード領域と相同であるかまたはそれに相補的である。
【００３１】
mRNA分子の「コード領域」は、mRNA分子の翻訳の間にトランスファーRNA分子のアンチコドン領域（非翻訳領域）と一致するか、または終結コドンをコードする該mRNA分子のヌクレオチド残基から成る。よって、コード領域は、mRNA分子によりコードされる成熟タンパク質中には存在しないアミノ酸残基（例えばタンパク質排出シグナル配列）のコドンを含むヌクレオチド残基からも構成される。
【００３２】
本明細書中で用いる「相補的」とは、核酸を指し、２本の核酸鎖の領域間または同一の核酸鎖の２領域間の配列相補性の幅広い概念を指す。第一の核酸領域のアデニン残基は、第二の核酸領域の１残基がチミンまたはウラシルであるならば、第一領域に逆平行である第二の核酸領域のその残基と特異的な水素結合（「塩基対合」）を形成することは知られている。同様に、第一の核酸鎖のシトシン残基は、第二の核酸鎖の残基がグアニンであるならば、第一鎖に逆平行である第二の核酸鎖のその残基と塩基対合を形成することができる。２つの領域が逆平行形式で配列された時、第一領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基が第二領域の１残基と塩基対を形成できるならば、核酸の第一領域は同一または異なる核酸の第二領域に対して相補的である。一実施形態では、第一領域が第一の部分を含み、そして第二領域が第二の部分を含み、それによって第一部分と第二部分がアンチパラレル形式で配置されると、第一部分のヌクレオチド残基の少なくとも50％が、第二部分のヌクレオチド残基と塩基対を形成することができる。一実施形態では、第一部分のヌクレオチド残基の少なくとも約75％、少なくとも約90％、または少なくとも約95％が第二部分のヌクレオチド残基と塩基対合することができる。一実施形態では、第一部分の全てのヌクレオチド残基が第二部分のヌクレオチド残基と塩基対合することができる。
【００３３】
本明細書中で用いる場合の用語「DNA」は、デオキシリボ核酸として定義される。
【００３４】
本明細書中で用いる場合の用語「発現」は、プロモーターにより作動される特定のヌクレオチド配列の転写および／翻訳として定義される。
【００３５】
本明細書中で用いる場合の用語「発現ベクター」は、転写可能である遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含むベクターを指す。幾つかの場合、RNA分子は次いでタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに翻訳される。別の場合、それらの配列は翻訳されず、例えば、アンチセンス分子、siRNA、リボザイム等の生産においては翻訳されない。発現ベクターは、様々な調節配列を含み、調節配列とは、特定の宿主生物体において作動可能に連結されたコード配列の転写におよびおそらく翻訳にも必要である核酸配列を言う。転写と翻訳を指令する調節配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、別の機能も同様に果たす核酸配列を含み得る。
【００３６】
用語「融合ポリペプチド」は、異種配列（例えば非ルシフェラーゼアミノ酸またはタンパク質）に連結された目的のタンパク質（例えばルシフェラーゼ）を含むキメラタンパク質を指す。
【００３７】
用語「相同性」は、相補性の程度を指す。それには部分相同または完全相同（すなわち同一性）がある。相同性は多くの場合、配列分析ソフトウェア (例えばGenetics Computer Group のSequence Analysis Software Package、University of Wisconsin Biotechnology Center. 1710 University Avenue. Madison, Wis. 53705)を使って測定される。そのようなソフトウェアは、様々な置換、欠失、挿入および他の修飾に対して相同性の程度を割り付けることにより類似配列とマッチングさせる。保存的置換としては典型的には次の群内での置換が挙げられる：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。
【００３８】
「単離された」とは、天然状態から変更または分離されたことを意味する。例えば、生存動物中それの通常の状態で天然に存在する核酸またはペプチドは「単離され」ていないが、しかしそれの天然状況での共存物質から部分的にもしくは完全に分離された同核酸またはペプチドは「単離され」ている。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に純粋な形態で存在することができ、または非天然環境で、例えば宿主細胞中で存在することができる。
【００３９】
用語「単離された」は、それが「単離されたオリゴヌクレオチド」または「単離されたポリヌクレオチド」中のように核酸に関連して用いられる場合、それがその起源において通常付随している少なくとも１つの汚染物質から分離され同定されている核酸を指す。よって、単離された核酸は、それが天然に見つかるものとは異なる形態または状況（環境）で存在する。対照的に、単離されていない核酸（例えばDNAまたはRNA）は、それが天然に存在する状態で認められる。例えば、一定のDNA配列（例えば遺伝子）は、隣接遺伝子に近接して宿主細胞染色体上に見つかり、RNA配列（例えば特定のタンパク質をコードする特定のmRNA配列）は、多数のタンパク質をコードする多数の別のmRNAとの混合物として細胞中に見つかる。しかしながら、単離された核酸は、一例として、核酸が天然細胞のものとは異なる染色体位置中に存在するか、そうでなければ天然に見つかるものとは異なる核酸配列により隣接されている、前記核酸を本来発現している細胞にある核酸が挙げられる。単離された核酸またはオリゴヌレクレオチドは、一本鎖または二本鎖形態で存在しうる。単離された核酸またはオリゴヌクレオチドがタンパク質を発現させるために使用することになる場合、該オリゴヌクレオチドは最低でもセンス鎖とコード鎖を含む（すなわちオリゴヌクレオチドが一本鎖であってよい）が、センス鎖とアンチセンス鎖の両方を含んでもよい（すなわち、オリゴヌクレオチドが二本鎖であってよい）。
【００４０】
「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」のようにポリペプチドに関連して用いられる場合の「単離された」という用語は、それがもとの源では通常付随している少なくとも１つの汚染物質から分離され同定されているポリぺプチドを指す。よって、単離されたポリぺプチドは、それが天然に見つかるものとは異なる形態または状況（環境）で存在する。対照的に、単離されていないポリペプチド（例えばタンパク質および酵素）は、それらが天然に存在する状態で見出される。
【００４１】
「核酸」とは、デオキシリボヌクレオシドまたはリボヌクレオシドのいずれから構成されるに関係なく、そしてホスホジエステル結合またはホスホトリエステル、ホスホロアミデート、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミド、カルバメート、チオエステル、架橋ホスホロアミデート、架橋メチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、架橋ホスホロチオエート、またはスルホン結合といった修飾結合、およびそのような結合の組み合わせから構成されるかに関係なく、任意の核酸を意味する。核酸という用語は、具体的には５つの生物学的に存在する塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）以外の塩基から構成される核酸も包含する。「核酸」という用語は、典型的には大きなポリヌクレオチドを指す。
【００４２】
ポリヌクレオチド配列を記載するためには通常の表記法が用いられる：一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は５′端であり；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は５′方向と称される。
【００４３】
新生RNA転写物に対する５′→３′ヌクレオチド付加方向は、転写方向と呼ばれる。mRNAと同じ配列を有するDNA鎖は「コード鎖」と呼ばれ；DNA上の基準点に対して５′に位置するDNA鎖上の配列は「上流配列」と呼ばれ；DNA上の基準点に対して３′にあるDNA鎖上の配列は「下流配列」と呼ばれる。
【００４４】
「発現カセット」とは、コード配列の転写および場合により翻訳に必要なプロモーター／調節配列に作動可能に連結されたコード鎖を含む核酸分子を意味する。
【００４５】
本明細書中で用いる「作動可能に連結された」とは、所定の遺伝子の転写および／または所望のタンパク質分子の合成を指令することができる核酸分子が生産されるような方法での核酸配列の結合を指す。この用語は、機能的（酵素的に活性である、結合相手に結合できる、阻害することができる等）なタンパク質またはポリペプチドが生産されるような方法でアミノ酸をコードする配列の結合を指す。
【００４６】
本明細書中で用いる場合、用語「プロモーター／調節配列」は、該プロモーター／調節配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に必要とされる核酸配列を意味する。幾つかの場合、この配列はコアプロモーター配列であってよく、別の場合にはこの配列はエンハンサー配列および該遺伝子産物の発現に必要である他の調節要素を含んでもよい。プロモーター／調節配列は、例えば、誘導性形式で遺伝子産物を発現するものであってよい。
【００４７】
「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードするまたは特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されると、プロモーターに相当するインデューサーが存在する時にのみ遺伝子産物を実質的に生産させるヌクレオチド配列である。
【００４８】
「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコードするまたは特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されると、細胞の大部分または全ての生理学的条件下で細胞内で遺伝子産物を生産させるヌクレオチド配列である。
【００４９】
本明細書中で用いる場合の「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの鎖として定義される。更に、核酸はヌクレオチドのポリマーである。よって、本明細書中で用いる場合の核酸とポリヌクレオチドは、相互に交換可能である。当業者は、核酸が、モノマーの「ヌクレオチド」へと加水分解され得るポリヌクレオチドであるという一般的知識を持っている。モノマーのヌクレオチドは、ヌクレオシドに加水分解され得る。本明細書中で用いる場合、ポリヌクレオチドには、限定されないが、当業界で入手可能な任意手段、例えば非限定的に、組換え手段、すなわち通常のクローニング技術およびPCR等を使った、組換えライブラリーまたは細胞ゲノムからの核酸配列のクローニングにより、および合成手段により、得ることができる全ての核酸配列が挙げられる。
【００５０】
本発明との関連では、通常存在する核酸塩基には次の略語が使用される。「Ａ」はアデノシンを指し、「Ｃ」はシトシンを指し、「Ｇ」はグアノシンを指し、「Ｔ」はチミジンを指し、そして「Ｕ」はウリジンを指す。
【００５１】
本明細書中で用いる場合、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、互換的に用いられ、そしてペプチド結合によって共有結合的に連結されたアミノ酸残基から構成される化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならないが、アミノ酸の最大数には何も制限が設けられず、タンパク質またはペプチドの配列を含むことができる。ポリペプチドは、ペプチド結合により互いに連結された２以上のアミノ酸を含む任意ペプチドまたはタンパク質を包含する。本明細書中で用いる場合、その用語は、当業界で通常ペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称される短鎖のものと、当業界で通常タンパク質（様々なタイプがある）と称される長鎖のものの両方を指す。「ポリペプチド」には、中でも、例えば、生物学的活性断片、実質的に相同のポリペプチド、オリゴペプチド、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、変異体、類似体、融合タンパク質が挙げられる。ポリペプチドは天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはそれらの組み合わせを含む。
【００５２】
本明細書中で用いる場合、「ペプチド模倣体」は、親のペプチドの生物学液作用を模倣することができる非ペプチド性構造要素を含む化合物である。ペプチド模倣体はペプチド結合を含んでも含まなくてもよい。
【００５３】
本明細書中で用いる「RNA」という用語は、リボ核酸として定義される。
【００５４】
「組換えポリヌクレオチド」とは、天然には一緒に連結されていない配列を有するポリヌクレオチドを指す。増幅または集成された組換えポリヌクレオチドは、適当なベクター中に含めることができ、そして該ベクターを用いて適当な細胞を形質転換せしめることができる。
【００５５】
組換えポリヌクレオチドは、非コード機能（例えばプロモーター、複製開始点、リボソーム結合部位など）も同様に果たすことができる。
【００５６】
本明細書中で用いる用語「組換えポリペプチド」は、組換えDNA法を使うことによって生産されるポリペプチドとして定義される。
【００５７】
本明細書中で用いる場合、「連結した」とは、１つの分子が第二の分子に共有結合することを指す。
【００５８】
本明細書中で用いる場合、「トランスドミナント・ネガティブ変異体遺伝子」とは、突然変異されていない（すなわち野生型配列を有する）同一遺伝子または遺伝子産物の別のコピーが正しく機能するのを妨げる（例えば野生型タンパク質機能を阻害することにより）ポリペプチドまたはタンパク質産物をコードする遺伝子を指す。トランスドミナント・ネガティブ変異体遺伝子の生産物は、本明細書中では「ドミナント・ネガティブ」または「DN」と称される（例えばドミナント・ネガティブタンパク質またはDNタンパク質）。
【００５９】
本明細書中で用いられる「阻害する」という表現は、分子、反応、相互作用、遺伝子、mRNAおよび／またはタンパク質の発現、安定性、機能または活性を、測定可能な量だけ減少させること、あるいは完全に防止することを意味する。阻害剤は、タンパク質、遺伝子およびmRNAに結合する、刺激を部分的にもしくは完全にブロックする、活性を減少させる、活性化を遅らせる、不活性化する、脱感作する、またはタンパク質、遺伝子およびmRNAの安定性、発現、機能および活性をダウンレギュレートすることを意味する（例えばアンタゴニスト）。
【００６０】
本明細書中で用いられる「変異体」という用語は、参照（基準）核酸配列またはペプチド配列それぞれとは配列が異なっているが、その参照分子の重要な生物学的特性を保持している、核酸配列またはペプチド配列である。核酸変異体の配列中の変化は、参照核酸によりコードされるペプチドのアミノ酸配列を変更しなくてもよく、またはアミノ酸置換、付加、欠失、融合および短縮をもたらしてもよい。ペプチド変異体の配列中の変化は、参照ペプチドの配列と変異体の配列とが全体として密接に類似しており、そして多くの領域中で同一であるように、典型的には限定的または保存的である。変異体と参照ペプチドとは、任意組み合わせでの１以上の置換、付加、欠失によってアミノ酸配列が異なることができる。核酸またはペプチドの変異体は、対立遺伝子変異体のように天然に存在するものであることができ、あるいは天然に存在することが知られていない変異体であることもできる。核酸およびペプチドの非天然型変異体は、突然変異誘発技術により、または直接合成により作製することができる。
【００６１】
「ベクター」は、単離された核酸を含み且つ細胞の内部へと運ぶために用いることができる物質の組成物である。多数のベクターが当業界で既知であり、例えば、限定されないが、線状ポリヌクレオチド、イオン性または両性化合物と会合されたポリヌクレオチド、およびウイルスが挙げられる。よって、「ベクター」という用語は、自己複製性プラスミドまたはウイルスを包含する。この用語は、細胞中への核酸の輸送を促進する非プラスミド性または非ウイルス性化合物、例えばポリリシン化合物、リポソーム、等を包含するものと解釈すべきである。ウイルスベクターの例としては、限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター等が挙げられる。
【００６２】
本明細書中で用いる場合、「医薬組成物」という用語は、本発明の範囲内で有用な少なくとも１つの混合物と薬学的に許容される担体との混合物を指す。該医薬組成物は、患者または対象への化合物の投与を容易にする。化合物を投与する多数の技術が当業界に存在し、例としては限定されないが、静脈内、経口、エーロゾル、非経口、眼科的、肺内および局所投与が挙げられる。
【００６３】
本明細書中で用いる場合、用語「薬学的に許容される」とは、化合物の生物活性または性質を無効にせず、かつ比較的非毒性である担体や希釈剤などの材料を指し、すなわち該材料が、それが含められる組成物の任意の成分に対して有害な形で相互作用したり望ましくない生物作用を引き起こしたりすることなく、個体に投与することができる。
【００６４】
本明細書中で用いる場合、「薬学的に許容される塩」という語句は、薬学的に許容される非毒性の酸、例えば無機酸、有機酸、それの溶媒和物、水和物または包接化合物から調製された投与化合物の塩を指す。そのような無機酸の例は塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸、酢酸、ヘキサフルオロリン酸、クエン酸、グルコン酸、安息香酸、プロピオン酸、酪酸、スルホサリチル酸、マレイン酸、ラウリン酸、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸、酒石酸、アニソール酸、パモ酸、ｐ−トルエンスルホン酸、およびメシル酸を指す。適当な有機酸は、例えば、脂肪族、芳香族、カルボン酸およびスルホン酸クラスの有機酸から選択することができ、その例は、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、カンファースルホン酸、クエン酸、フマル酸、グルコン酸、イセチオン酸、乳酸、リンゴ酸、ムコ酸、酒石酸、パラ−トルエンスルホン酸、グリコール酸、グルクロン酸、マレイン酸、フロン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、サリチル酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボン酸（パモ酸）、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、パントテン酸、ベンゼンスルホン酸（ベシル酸）、ステアリン酸、スルファニル酸、アルギン酸、ガラクツロン酸等である。更に、薬学的に許容される塩としては、非限定例として、アルカリ土類金属塩（例えばカルシウムまたはマグネシウム)、アルカリ金属塩（例えばナトリウム依存性またはカリウム）、およびアンモニウム塩が挙げられる。
【００６５】
本明細書中で用いる場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的に許容される物質、組成物または担体、例えば液体もしくは固体の充填剤、安定化剤、分散剤、懸濁化剤、希釈剤、賦形剤、増粘剤、溶剤、または封入材料（それが意図する機能を果たせるように患者にまたは患者内に、本発明の範囲内で有用な化合物を送達または輸送する際に関与する）を意味する。典型的には、そのような構成物は、１つの器官または体の一部分から別の器官へと運搬または輸送される。各担体は、本発明内で有用な化合物を含む製剤の他の成分と適合でき、かつ、患者にとって有害でないという意味で、「許容され」なければならない。薬学的に許容される担体として機能できる材料の幾つかの例としては、以下が挙げられる：糖類、例えばラクトース、グルコース、およびショ糖；デンプン、例えばコーンスターチおよびポテトスターチ；セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース；粉末状トラガカント；モルト；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えばココアバターおよび坐剤用ワックス；オイル、例えば落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油および大豆油；グリコール、例えばプロピレングリコール；ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；寒天；緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；界面活性剤；アルギン酸；発熱物質不含有水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸塩緩衝溶液；および医薬製剤に使用される他の非毒性適合性物質。本明細書中で用いる場合、「薬学的に許容される担体」には、あらゆるコーティング、抗菌剤および抗真菌剤、並びに吸収遅延剤等も含まれ、それらは本発明内の有用な化合物の活性と適合性であり、かつ患者にとって生理学的に許容されるものである。補足的な活性化合物を組成物中に含めることも可能である。「薬学上許容される担体」には、本発明内で有用な化合物の薬学的に許容される塩も含まれる。本発明の実施に使用される医薬組成物中に含めることができる別の追加の成分は、当業界で既知であり、そして例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (Genaro編, Mack Publishing Co., 1985, Easton, PA)中に記載されており、これは参考として本明細書中に組み入れられる。
【００６６】
本明細書中で用いる場合、「効力」という用語は、最大応答の半値を生成するのに必要である投与量(ED50)を指す。
【００６７】
本明細書中で用いる場合、「有効性」という用語は、アッセイ内で達成される最大効果
(Emax) を指す。
【００６８】
本明細書中で用いる場合、単独でのまたは別の置換基と組み合わせた「アルキル」という用語は、特に断わらない限り、表示した炭素数を有する直鎖または分枝鎖炭化水素を意味し（すなわちC1〜C6は１〜６個の炭素原子を意味する）、そして直鎖、分枝鎖または環状の置換基を含む。例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert-ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、およびシクロプロピルメチルが挙げられる。
【００６９】
本明細書中で用いる場合、「置換されたアルキル」という語は、ハロゲン、-OH、アルコキシ、-NH2、アミノ、アジド、-N(CH3)2、-C(=O)OH、トリフルオロメチル、-C≡N、-C(=O)O(C1〜C4)アルキル、-C(=O)NH2、-SO2NH2、-C(=NH)NH2、および-NO2からなる群より選択された１、２または３個の置換基により置換された、上記に定義したアルキルを意味する。置換されたアルキルの例としては、限定されないが、2,2-ジフルオロプロピル、2-カルボキシシクロペンチルおよび3-クロロプロピルが挙げられる。
【００７０】
本明細書中で用いる場合、単独でのまたは別の用語と組み合わせた「ヘテロアルキル」という用語は、特に定めが無い限り、所定の数の炭素原子並びにO、NおよびSからなる群より選択された１もしくは２個のヘテロ原子からなる安定な直鎖または分枝鎖アルキル基を意味し、ここで窒素と硫黄原子は場合により酸化されることがあり、そして窒素ヘテロ原子は場合により四級化されることがある。ヘテロ原子はヘテロアルキル基の任意の位置に置かれてよく、例えばヘテロアルキル基の残余部分とそれが連結されている断片との間に置かれてよく、並びにヘテロアルキル基中の最も遠位の炭素原子に連結されてもよい。以下の例が挙げられる: -O-CH2-CH2-CH3、-CH2-CH2-CH2-OH、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、および-CH2CH2-S(=O)-CH3。例えば-CH2-NH-OCH3または-CH2-CH2-S-S-CH3のように２個以下のヘテロ原子が連続してもよい。
【００７１】
本明細書中で使用する時、単独でまたは他の用語と組み合わせて用いられる「アルコキシ」という用語は、特に定めが無い限り、酸素原子を介して分子の残部に連結された、上記で定義したような表示した数の炭素原子を有するアルキル基、例えば、メトキシ、エトキシ、１−プロポキシ、２−プロポキシ（イソプロポキシ）およびより高次の相同体および異性体を意味する。
【００７２】
本明細書中で用いる場合、単独でまたは別の置換基の一部としての「ハロ」または「ハロゲン」という用語は、特に別記されない限り、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素原子を意味する。
【００７３】
本明細書中で用いる場合、「シクロアルキル」という用語は、単環式または多環式非芳香族基を指し、ここで環を形成する各原子（すなわち骨格原子）は炭素原子である。一実施形態では、シクロアルキル基は、飽和または部分不飽和である。別の実施形態では、シクロアルキル基は、芳香環と縮合される。シクロアルキル基は３〜１０個の環原子を有する基を含む。シクロアルキル基の典型例としては、限定されないが、下記の成分が挙げられる：
【化１】
2020535164.tif 000003
【００７４】
単環式シクロアルキルとしては、限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルおよびシクロオクチルが挙げられる。二環式シクロアルキルとしては、限定されないが、テトラヒドロナフチル、インダニルおよびテトラヒドロペンタレンが挙げられる。多環式シクロアルキルとしては、アダマンチンとノルボルナンが挙げられる。用語シクロアルキルには、「不飽和非芳香族炭素環」または「非芳香族不飽和炭素環」基が含まれ、その両者は本明細書中で定義されるような、少なくとも１つの炭素二重結合または１つの炭素三重結合を含む非芳香族炭素環を指す。
【００７５】
本明細書中で用いる時、用語「ヘテロシクロアルキル」または「ヘテロシクリル」は、各々がＯ、ＳおよびＮから選択された１〜４個の環ヘテロ原子を含むヘテロ脂環式基を指す。一実施形態では、各ヘテロシクロアルキル基は、その環系中に４〜10個の原子を有し、ただし前記基の環が２個の隣接ＯまたはＳ原子を含まないことを前提とする。別の実施形態では、ヘテロシクロアルキル基が芳香環と縮合される。一実施形態では、窒素および硫黄ヘテロ原子が場合により酸化されることがあり、そして窒素原子が場合により四級化されることがある。複素環系は、特に定めが無い限り、安定な構造を提供する任意のヘテロ原子または炭素原子の所に連結され得る。複素環は性質上芳香族性であっても非芳香族性であってもよい。一実施形態では、複素環はヘテロアリールである。
【００７６】
３員のヘテロシクロアルキル基の例としては、限定されないが、アジリジンが挙げられる。４員のヘテロシクロアルキル基の例としては、限定されないが、アゼチジンおよびβラクタムが挙げられる。５員のヘテロシクロアルキル基の例としては、限定されないが、ピロリジン、オキサゾリジンおよびチアゾリジンジオンが挙げられる。６員のヘテロシクロアルキル基の例としては、限定されないが、ピペリジン、モルホリンおよびピペラジンが挙げられる。ヘテロシクロアルキル基の別の非限定例は次のものである：
【化２】
2020535164.tif 000004
【００７７】
非芳香族複素環の例としては、単環式基、例えばアジリジン、オキシラン、チイラン、アゼチジン、オキセタン、チエタン、ピロリジン、ピロリン、ピラゾリジン、イミダゾリン、ジオキソラン、スルホラン、2,3-ジヒドロフラン、2,5-ジヒドロフラン、テトラヒドロフラン、チオファン、ピペリジン、1,2,3,6-テトラヒドロピリジン、1,4-ジヒドロピリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、ピラン、2，3-ジヒドロピラン、テトラヒドロピラン、1,4-ジオキサン、1,3-ジオキサン、ホモピペラジン、ホモピペリジン、1,3-ジオキセパン、4,7-ジヒドロ-1,3-ジオキセピン、およびヘキサメチレンオキシドが挙げられる。
【００７８】
本明細書中で用いる時、「芳香族」という用語は、１もしくは複数の多不飽和環を有しかつ、芳香族性を有する、即ち（4n + 2）非局在化π（パイ）電子（ここでｎは整数である）を有する、炭素環または複素環を指す。
【００７９】
本明細書中で用いる時、単独でまたは他の用語と組み合わせて使用される用語「アリール」は、特に定めが無い限り、１以上の環（典型的には１，２または３つの環）を含む炭素環式芳香族系を意味し、そのような環は、ビフェニルのように懸垂形式で一緒に連結されてよく、またはナフタレンのように縮合されてよい。アリール基の例はフェニル、アントラシル（anthracyl）およびナフチルを含む。
【００８０】
本明細書中で用いる時、用語「アリール-(C1-C3)アルキル」は、１〜３個の炭素アルキレン鎖がアリール基に連結されている官能基、例えば-CH2CH2-フェニルを意味する。一実施形態では、アリール-(C1-C3)アルキルはアリール-CH2- またはアリール-CH(CH3)-である、用語「置換アリール-(C1-C3)アルキル」は、アリール基が置換されている、アリール-(C1-C3)アルキル官能基を意味する。同様に、用語「ヘテロアリール-(C1-C3)アルキル」は、１〜３個の炭素アルキレン鎖がヘテロアリール基に連結されている官能基、例えば-CH2CH2-ピリジルを意味する。用語「置換ヘテロアリール-(C1-C3)アルキル」は、ヘテロアリール基が置換されている、ヘテロアリール-(C1-C3)アルキル官能基を意味する。
【００８１】
本明細書中で用いる時、用語「ヘテロアリール」または「ヘテロ芳香族」は、芳香族性を有する複素環を指す。多環式ヘテロアリールは、部分不飽和である１以上の環を含みうる。その例として以下の成分が挙げられる：
【化３】
2020535164.tif 000005
【００８２】
ヘテロアリール基の例としては、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル（特に2-および4-ピリミジニル）、ピリダジニル、チエニル、フリル、ピロリル（特に2-ピロリル）、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、ピラゾリル（特に3-および5-ピラゾリル）、イソチアゾリル、1,2,3-トリアゾリル、1,2,4-トリアゾリル、1,3,4-トリアゾリル、テトラゾリル、1,2,3-チアジアゾリル、1,2,3-オキサジアゾリル、1,3,4-チアジアゾリルおよび1,3,4-オキサジアゾリルも挙げられる。
【００８３】
多環式複素環およびヘテロアリールの例としては、インドリル（特に3-, 4-, 5-, 6-および7-インドリル）、インドリニル、キノリル、テトラヒドロキノリル、イソキノリル（特に1- および5-イソキノリル)、1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリル、シンノリニル、キノキサリニル（特に2-および5-キノキサリニル)、キナゾリニル、フタラジニル、1,8-ナフチリジニル、1,4-ベンゾジオキサニル、クマリン、ジヒドロクマリン、1,5-ナフチリジニル、ベンゾフリル（特に3-, 4-, 5-, 6- および7-ベンゾフリル）、2,3-ジヒドロベンゾフリル、1,2-ベンゾイソキサゾリル、ベンゾチエニル（特に3-, 4-, 5-, 6-,および7-ベンゾチエニル）、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル（特に2-ベンゾチアゾリルおよび5-ベンゾチアゾリル）、プリニル、ベンゾイミダゾリル（特に2-ベンゾイミダゾリル）、ベンゾトリアゾリル、チオキサンチニル、カルバゾリル、カルボリニル、アクリジニル、ピロリジジニル、およびキノリジニルが挙げられる。
【００８４】
本明細書中で用いる時、用語「置換された」とは、原子または原子の群が、別の基に連結された置換基として水素を置換していることを意味する。用語「置換された」は更に、任意の置換レベル、すなわち、そのような置換が許容される場合には単置換、二置換、三置換、四置換、または五置換を指す。置換基は独立に選択され、そして置換は任意の化学的に接近できる位置にあってよい。一実施形態では、置換基は１〜４の間で数が異なる。別の実施形態では、置換基は１〜３の間で数が異なる。更に別の実施形態では、置換基は１と２の間の数で異なる。
【００８５】
本明細書中で用いる時、「任意に置換される」とは、言及される基が置換されていても置換されていなくてもよいことを意味する。一実施形態では、言及される基が、場合によりゼロ個の置換基で置換され、すなわち、言及される基が非置換である。別の実施形態では、言及される基が場合により、本明細書中に記載される基から個別におよび独立に選択された１以上の追加の基で置換されることがある。
【００８６】
一実施形態では、置換基は、オキソ、ハロゲン、-CN、-NH2、-OH、-NH(CH3)、-N(CH3)2、アルキル(直鎖、分枝鎖および／または不飽和アルキル)、置換または未置換シクロアルキル、置換または未置換ヘテロシクロアルキル、フルオロアルキル、置換または未置換ヘテロアルキル、置換または未置換アルコキシ、フルオロアルコキシ、-S-アルキル、S(=O)2アルキル、-C(=O)NH[置換または未置換アルキル、置換または未置換フェニル]、-C(=O)N[Hまたはアルキル]2、-OC(=O)N[置換または未置換アルキル]2、-NHC(=O)NH[置換または未置換アルキル、置換または未置換フェニル]、-NHC(=O)アルキル、-N[置換または未置換アルキル]C(=O)[置換または未置換アルキル]、-NHC(=O)[置換または未置換アルキル]、-C(OH)[置換または未置換アルキル]2、および-C(NH2)[置換または未置換アルキル]2からなる群より独立に選択される。別の実施形態では、例として、任意の置換基は、オキソ、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、-CN、-NH2、-OH、-NH(CH3)、-N(CH3)2、-CH3、-CH2CH3、-CH(CH3)2、-CF3、-CH2CF3、-OCH3、-OCH2CH3、-OCH(CH3)2、-OCF3、- OCH2CF3、-S(=O)2-CH3、-C(=O)NH2、-C(=O)-NHCH3、-NHC(=O)NHCH3、-C(=O)CH3、-ON(O)2、および-C(=O)OHから選択される。更に別の実施形態では、置換基は、C1-6 アルキル、-OH、C1-6 アルコキシ、ハロ、アミノ、アセトアミド、オキソおよびニトロからなる群より独立に選択される。更に別の実施形態では、置換基はC1-6 アルキル、C1-6 アルコキシ、ハロ、アセトアミドおよびニトロからなる群より選択される。本明細書中で用いる場合、置換基がアルキルまたはアルコキシであるならば、炭素鎖は分枝状、直鎖状または環状であることができる。
【００８７】
範囲：本明細書全体を通して、本発明の様々な観点が一定の範囲形式で与えられる。その範囲形式での記載は単に利便性と簡潔さのためであり、本発明の範囲に対する確固たる限定として解釈すべきでないことは理解すべきである。従って、ある一定範囲の記載は、全ての可能な部分的範囲、並びに、その範囲内の個々の数値を具体的に開示していると見なされるべきである。例えば、1〜6のような範囲の記載は、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6等のような部分範囲、並びにその範囲内の個々の数字、例えば1、2、2.7、3、4、5、5.3、および6を具体的に開示していると見なされるべきである。これは、範囲の広さ（幅）に関係なく適用される。
【００８８】
説明
本発明は、記憶関連疾患または障害、例えば限定されないが、PTSD、依存および依存関連疾患または障害を治療または予防するための組成物および方法に関する。本発明は、一部は、ACSS2がヒストンアセチル化とニューロン遺伝子転写を制御するという発見に基づく。ACSS2発現の阻害（例えばRNA干渉による等）またはACSS2活性の阻害（例えば小分子による）は、ヒストンアセチル化を減少させ、そして長期空間記憶を損傷する。よって、本発明は、ヒストンアセチル化を阻害しそして記憶関連疾患または障害を治療するための、ACSS2を阻害する組成物および方法に関する。
【００８９】
幾つかの実施形態では、本発明の組成物は、ACSS2活性の阻害剤を含む。幾つかの実施形態では、組成物は、ACSS2発現の阻害剤を含む。よって、様々な実施形態において、組成物は、細胞中のACSS2の発現レベルを低減させる、単離された核酸（例えばsiRNA, miRNA, リボザイム、アンチセンスRNA等）を含む。
【００９０】
幾つかの実施形態では、該組成物は、ACSS2活性の阻害剤を含む。よって、様々な実施形態において該組成物は、ACSS2の活性を減少させる小分子、核酸、ペプチド、抗体、アンタゴニスト、アプタマー、またはペプチド模倣体を含む。
【００９１】
幾つかの実施形態では、本発明は、対象において神経学的または認知上の疾患または障害を治療するための方法を提供する。一実施形態では、神経学的または認知上の疾患または障害は、記憶関連疾患または障害である。一実施形態では、当該方法は対象にACSS2の阻害剤を含む組成物の有効量を投与することを含む。一実施形態では、該方法は、PTSDを治療するのに有用である。
【００９２】
別の実施形態では、本発明は、対象において依存または依存関連の疾患または障害を治療する方法を提供する。幾つかの実施形態では、本発明の方法は、急性アルコール誘導性記憶障害を治療するのに有用である。別の実施形態では、本発明の方法は、慢性アルコール誘導性記憶障害を治療するのに有用である。幾つかの実施形態では、該方法は、ACSS2の阻害剤を含む組成物の有効量を対象に投与することを含む。
【００９３】
阻害剤
幾つかの実施形態では、本発明は対象において神経学的または認知上の疾患または障害を治療するための組成物を提供する。一実施形態では、神経学的または認知上の疾患または障害が記憶関連の疾患または障害である。一実施形態では、当該方法は、ACSS2の阻害剤を含む組成物の有効量を対象に投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、依存または依存関連の疾患または障害を治療するための組成物を提供する。幾つかの実施形態では、本発明の方法は、急性アルコール誘導性記憶障害を治療するのに有用である。別の実施形態では、本発明の方法は慢性アルコール誘導性記憶障害を治療するのに有用である。幾つかの実施形態では、該組成物は、対象におけるACSS2の発現、活性またはその両方を阻害する。
【００９４】
一実施形態では、本発明の組成物はACSS2の阻害剤を含む。様々な実施形態において、ACSS2の阻害剤は、ACSS2の発現、活性または機能を減少させる、阻害する、または予防する何れかの化合物、分子または剤である。よって、ACSS2の阻害剤は、ACSS2の発現、活性またはその両方を減少させる何れかの化合物、分子または剤である。様々な実施形態において、ACSS2の阻害剤は、核酸、ペプチド、小分子、siRNA、リボザイム、アンチセンス核酸、アゴニスト、アプタマー、ぺプチド模倣体、またはその何れかの組み合わせである。
【００９５】
小分子阻害剤
幾つかの実施形態では、阻害剤は、阻害剤は小分子である。阻害剤が小分子である時、小分子は当業者に既知の標準的な方法を使って得ることができる。そのような方法としては、化学有機合成または生物学的手法が挙げられる。生物学的手法には、当業者に周知の方法を使った、生物学的源からの精製、組換え合成およびインビトロ翻訳系がある。一実施形態では、本発明の小分子阻害剤は、有機分子、無機分子、生体分子、合成分子等を含む。
【００９６】
様々な疾患および状態を治療するのに潜在的に有用である、分子上多岐にわたる化合物のコンビナトリアル・ライブラリーは当業界で周知であり、該ライブラリーを作製する方法も同様に周知である。そのような方法は、当業者に周知の様々な技術を利用し、その例としては固相合成、液相法、単一化合物の並行合成、化学混合物の合成、強固なコア構造、柔軟な線状配列、デコンボリューション方策、タグ付け法、およびリード化合物発見のための偏りのない分子ランドスケープに対比して、リード化合物発見のための偏りのある構造体の構築が挙げられる。
【００９７】
小ライブラリー合成の一般法では、活性化されたコア分子が多数の構成単位と縮合され、共有結合したコア−構成単位集合体のコンビナトリアル・ライブラリーをもたらす。コアの形状と剛性が形状空間での構成単位の配向を決定する。該ライブラリーは、コア、連結基、または構成単位を変更することにより、特徴づけられた生物学的構造を標的するようにバイアスを設けることができ（「集中的ライブラリー（focused library）」。あるいはフレキシブルなコアを使って構造的バイアスの少ないものを合成することができる。
【００９８】
本明細書に記載の小分子および小分子化合物は、たとえ塩が言及されなくても塩として存在することができ、本発明は、当業者により十分理解される通り、阻害剤の非塩形と非溶媒和物形に加えて、本明細書中に記載の阻害剤の全ての塩と溶媒和物も包含すると理解される。幾つかの実施形態では、本発明の阻害剤の塩は薬学的に許容される塩である。
【００９９】
本発明書に記載の阻害剤のいずれかに互換異性体が存在しうる場合は、たとえ互換異性体の１つのみまたは一部のみが明示されていても、ありとあらゆる互換異性体が本発明に含められると意図される。例えば、2−ヒドロキシピリジル成分が記述される時、対応する2−ピリドン互変異性体も意図される。
【０１００】
本発明は、記載の阻害剤の任意のエナンチオマー形とジアステレオマー形を含む、あらゆる立体化学的形態を包含する。本明細書での構造または名称の記述は、列挙される阻害剤の全ての可能な立体異性体を包含することを意図する。阻害剤の全ての形態も本発明に包含され、例えば、阻害剤の結晶形または非結晶形も包含される。本発明の阻害剤を含む組成物も意図され、例えば実質的に純粋な阻害剤の組成物、例えばそれの特定の立体化学的形態、または本発明の阻害剤の任意の比率での混合物、例えば２以上の立体化学的形態、例えばラセミ体混合物または非ラセミ体混合物を含む組成物も意図される。
【０１０１】
一実施形態では、本発明の小分子阻害剤は本明細書に記載の類似体または誘導体を含む。
【０１０２】
一実施形態では、本明細書に記載の小分子は、誘導体化の候補である。そのようなものには、効能、選択性および溶解性が変更されている本明細書に記載の小分子の類似体が含まれる場合があり、それらは薬剤の発見と医薬品開発のための有用なリード化合物を提供する。よって、幾つかの場合には、最適化の間に、薬物送達、代謝、新規性および安全性の問題点を考慮に入れながら新規類似体がデザインされる。
【０１０３】
ある場合、本明細書に記載の小分子阻害剤は、コンビナトリアル化学および医薬品化学の技術分野の当業者に周知のように誘導体化／類似体化される。そのような類似体または誘導体は、様々な位置で官能基を付加および／または置換することにより調製することができる。そのようにして、本明細書に記載の小分子を、周知の化学合成手順を使って誘導体／類似体に変換することができる。例えば、水素原子または置換基の全てを選択的に修飾して新規な類似体を作製することができる。また、連結している原子または基を、炭素骨格またはヘテロ原子を有する更に長いまたは短いリンカーへと変更することができる。また、環中に異なる数の原子を有するようにそして／またはヘテロ原子を含むように、環基を変更することができる。更に、芳香族基は環状の環基に変換でき、また逆も可能である。例えば、環は５〜７原子から構成されてよく、炭素環でも複素環でもよい。
【０１０４】
本明細書中で用いる時、用語「類似体」、「同族体」または「誘導体」とは、１以上の化学反応により、親の化合物または分子から製造された化合物または分子を指す。そのようなものとして、類似体は、本明細書に記載の小分子阻害剤のものと類似した構造を有する構造体であることができ、あるいは本明細書に記載の小分子の骨格に基づいているが、ある種の成分または構造の構成に関してそれとは異なっている構造物であることができ、それは代謝的に同様のまたは反対の作用を有することができる。本発明にかかる小分子阻害剤の何れかの類似体または誘導体は、自己免疫疾患または障害を治療するのに用いることができる。
【０１０５】
一実施形態では、本明細書中に記載の小分子阻害剤は、独立に、互いに独立に水素原子を別の置換基に修飾することにより誘導体化／類似体化することができる。すなわち、各分子上の各原子を、同分子上の別の原子に関して独立に修飾することができる。誘導体／類似体を製造するためには何れかの典型的修飾を利用できる。例えば、原子および置換基は、水素、アルキル、脂肪族、直鎖脂肪族、鎖ヘテロ原子を有する脂肪族、分枝状脂肪族、置換脂肪族、環状脂肪族、１以上のヘテロ原子を有する複素環式脂肪族、芳香族、ヘテロ芳香族、多芳香族、ポリアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、それの組み合わせ、ハロゲン、ハロ置換脂肪族、ハロゲン、ハロ置換脂肪族等から独立に構成され得る。その上、化合物上の任意の環基を誘導体化し、環サイズを増加および／または減少させることができ、並びに骨格原子を炭素原子またはヘテロ原子に変更することができる。
【０１０６】
一実施形態では、小分子阻害剤は式（1）の化合物である：
【０１０７】
【化４】
2020535164.tif 000006
（式中、
X11はC(R14)(R15)、O、SおよびNR15からなる群より選択され、
X12の各々の存在はC(R14)(R15)、O、SおよびNR15からなる群より選択された基であり、
R11は水素、-OR15、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、ここでR11は場合により置換されることがあり；
R12およびR13は互いに独立に水素、アルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群より選択され、ここでR12とR13は場合により置換されることがあり；
R14およびR15の各々は独立に水素、ハロゲン、-OHおよびアルキルからなる群より選択され；および
n は0-8の整数である）。
【０１０８】
一実施形態では、nは0である。一実施形態では、nは1である。一実施形態では、nは2である。一実施形態ではnは3である。
【０１０９】
一実施形態では、R11はOR15である。一実施形態では、R15はアルキルである。一実施形態では、R15はメチルである。
一実施形態では、R11はピペリジニルである。
一実施形態では、R11はモルホリニルである。
一実施形態では、R11はピロリジニルである。
一実施形態では、R11はフラニルである。
一実施形態では、R11はヒドロキシル基で置換されている。
一実施形態では、R12はアルキルである。一実施形態では、R12はメチルである。
一実施形態では、R12はアリールである。一実施形態では、R12はフェニルである。
一実施形態では、R12はC5-C6ヘテロアリールである。一実施形態では、R12はフランである。一実施形態では、R12はチオフェニルである。一実施形態では、R12はピリジニルである。
一実施形態では、R12とR13が同一である。
【０１１０】
一実施形態では、式（1）の化合物には、限定されないが、下記が含まれる：
【０１１１】
【化５】
2020535164.tif 000007
【０１１２】
一実施形態では、小分子阻害剤は、式（2）の化合物である：
【化６】
2020535164.tif 000008
（式中、
R21は-C(R23)m、シクロアルキル、ヘテロシクリル、シクロアルキル−オン、およびヘテロシクリル−オンからなる群より選択され；
R22はアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキル−アリール、およびアルキル−ヘテロアリールからなる群より選択され；
R23の各々の存在は独立に水素、アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、-OH、および-CNからなる群より選択され；そして
mは1〜3の整数である）。
【０１１３】
一実施形態では、R23の各々はフェニル、-OH、メチル、エチル、および-CNからなる群より選択される。
【０１１４】
一実施形態では、mが3である場合、R23の２つの基が同一であり、そしてR23の１つの基が異なる。一実施形態では、mが3である場合、R23の各々の基が同一である。
【０１１５】
一実施形態では、R1は、式(2a)により表される基である：
【化７】
2020535164.tif 000009
（式中、
X21はO、NまたはSからなる群より選択され；そして
R24は、水素、アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、およびヘテロシクリルからなる群より選択される）。
【０１１６】
一実施形態では、式(2)の化合物は、限定されないが、下記を含む：
【化８】
2020535164.tif 000010
【０１１７】
一実施形態では、小分子阻害剤は式(3)の化合物である：
【化９】
2020535164.tif 000011
（式中、
R31は、-C(R35)p、シクロアルキル、ヘテロシクリル、シクロアルキル-オン、ヘテロシクリル-オンからなる群から選択され；
R32は、アルキル、アリール、ヘテロアリール、-C1-C3アルキル-(C3-C6アリール)、および-C1-C3アルキル-(C3-C6ヘテロアリール)からなる群より選択され；
R33およびR34は、互いに独立に水素、ハロゲン、アルキル、アリール、ヘテロアリールからなる群より選択され；
R35の各々は、独立に水素、アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、-OHおよび-CNからなる群より選択され；そして
pは、1〜3の整数である）。
【０１１８】
一実施形態では、R32は、エチルである。
【０１１９】
一実施形態では、R33およびR34は、各々独立に水素および-Clからなる群より選択される。
【０１２０】
一実施形態では、R33とR34は、同一である。
【０１２１】
一実施形態では、R35の各基は独立にフェニル、-OH、メチル、エチル、および-CNからなる群より選択される。
【０１２２】
一実施形態では、pが3である場合、R35の２つの基は同一であり、R35の１つの基が異なる。一実施形態では、pが3である場合、R35の各基は同一である。
【０１２３】
一実施形態では、式 (3)の化合物は、限定されないが、下記のものを含む：
【化１０】
2020535164.tif 000012
【０１２４】
一実施形態では、小分子阻害剤は、式(4)の化合物である：
【化１１】
2020535164.tif 000013
（式中、
X41は、OおよびSからなる群より選択され；
R41は、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、およびそれの組み合わせからなる群より選択され、ここでR41は、任意に置換されることがあり；そして
R42およびR43は、各々独立にフェニル、チオフェニルおよびフラニルからなる群より選択される。
【０１２５】
一実施形態では、R42とR43が、同一である。
一実施形態では、R41が、アダマンチルである。
一実施形態では、R41が、ピペリジニルである。
一実施形態では、R41が、モルホリニルである。
一実施形態では、R41が、ピロリジニルである。
一実施形態では、R41が、フラニルである。
一実施形態では、R41が、アルキルである。一実施形態では、R41が、C1-C25アルキルである。一実施形態では、前記アルキルが、分枝鎖アルキルである。一実施形態では、前記アルキルが、直鎖アルキルである。
【０１２６】
一実施形態では、R21は、-C3-C10シクロアルキルであり、それは場合により置換されることがある。一実施形態では、シクロアルキル基は、置換されている。一実施形態では、シクロアルキル基は、未置換である。一実施形態では、シクロアルキル基は、単環式である。単環式シクロアルキル基の非限定例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、等が挙げられる。別の実施形態では、シクロアルキル基は、多環式である。例えば、多環式シクロアルキル基は、２以上の-C3-C10シクロアルキル基を連結することにより形成させることができる。多環式シクロアルキル基の非限定例としては、アダマンタンおよびノルボルナンが挙げられる。一実施形態では、シクロアルキル基は、アダマンタンであり、それは場合により置換されることがある。シクロアルキル基は、限定されないが、テトラヒドロナフチル、インダニルおよびテトラヒドロペンタレンを含む二環式であってもよい。一実施形態では、シクロアルキル基は、飽和または部分不飽和である。飽和または部分不飽和シクロアルキル基の非限定例としては、シクロペンテニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニル、シクロヘプテニル、シクロヘプタジエニル、シクロヘプタトリエニル、シクロオクテニル、シクロオクタジエニル、シクロオクタトリエニル、シクロオクタテトラエニル、シクロノネニル、シクロノナジエニル、シクロデセニル、シクロデカジエニル、シクロオクチニル、シクロノニニル、シクロデシニル等が挙げられる。一実施形態では、シクロアルキル基は、芳香環と縮合される。
【０１２７】
一実施形態では、式(4)の化合物は下記からなる群より選択される：
【化１２】
2020535164.tif 000014
【０１２８】
本発明の小分子阻害剤の調製
式(1)〜(4)の化合物は、当業者に周知の合成法を用い、本明細書に記載の一般スキームによって調製することができる。以下の実施例は、本発明の非限定的な実施形態を説明する。
【０１２９】
非限定的実施形態において、式(1)および(4)の化合物の合成は、4-ニトロ-o-フェニレンジアミン（a）をジケトン（b）で処理して6-ニトロキノキサリン（c）を形成し、続いてそれをPd/Cで触媒される水素化によって還元し、6-アミノキノキサリン（d）を生成させることにより達成される。ジケトン（a）は、当業界で既知の方法を使って製造することができる (Tet. Lett., 1995, 36:7305-7308, これは参考によりその全内容が本明細書中に組み込まれる）。
【化１３】
2020535164.tif 000015
【０１３０】
キノキサリン（d）を次いでイソシアネートで処理し、式(1)または(4)の化合物を形成させる。
【化１４】
2020535164.tif 000016
【０１３１】
別の非限定的実施形態では、キノキサリン（d）を最初にトリホスゲンで処理し、次いでアミンを添加して式（1）または（4）の化合物を形成させる。
【化１５】
2020535164.tif 000017
【０１３２】
本発明の化合物は１以上の立体中心を持つ場合があり、各立体中心は独立にＲ配置またはＳ配置のいずれかで存在し得る。一実施形態では、本明細書に記載の化合物は光学活性形またはラセミ形で存在する。本明細書に記載の化合物は、本明細書に記載される治療的に有用な特性を有するラセミ体、光学活性体、位置異性体、および立体異性体の形を包含する。光学活性形態の調製は、任意の適当な方法、例えば非限定例として、再結晶技術、光学活性出発物質からの合成、キラル合成、またはキラル固定相を使ったクロマトグラフィー分離によって、ラセミ体形を分離することにより達成される。一実施形態では、１つ以上の異性体の混合物が、本明細書中に記載の治療用化合物として利用される。別の実施形態では、本明細書に記載の化合物は、１つ以上のキラル中心を含む。それらの化合物は、任意の手段、例えば立体選択的合成、エナンチオ選択的合成、および／または、エナンチオマーおよび／またはジアステレオマーの分離により調製される。化合物およびその異性体の分割は、例えば非限定例として化学的方法、酵素的方法、分別結晶、蒸留およびクロマトグラフィーを初めとする任意手段により達成される。
【０１３３】
本明細書に記載の方法および製剤は、本発明の任意化合物の構造を有する化合物のＮ−オキシド（適当な場合）、結晶形（多型としても知られる）、溶媒和物、非晶質状態および／または薬学的に許容される塩、並びに同じ種類の活性を有するそれらの化合物の代謝産物および活性代謝産物の使用を含む。溶媒和物は、水、エーテル（例えばテトラヒドロフラン、メチルtert-ブチルエーテル）またはアルコール（例えばエタノール）溶媒和物、アセテート等を含む。一実施形態では、本明細書中に記載の化合物は、薬学的に許容される溶媒（例えば水やエタノール）と共に溶媒和形態で存在する。別の実施形態では、本明細書に記載の化合物は、非溶媒和形で存在する。
【０１３４】
一実施形態では、本発明の化合物は、互変異性体として存在する。全ての互変異性体が、本明細書に提供される化合物の範囲内に含められる。
【０１３５】
本発明の化合物は、同位体標識化合物も包含し、それらの化合物では、１以上の原子が同じ原子番号を有するが、自然界で通常見られる原子質量または質量数とは異なる原子質量または質量数を有する原子によって置き換えられている。本発明の化合物に含めるために適当な同位体の例としては、限定されないが、2H、3H、11C、13C、14C、36Cl、18F、123I、125I、13N、15N、15O、17O、18O、32P、および35Sを含む。同位体標識化合物は、任意の適当な方法により、または他の方法で使用される未標識試薬の代わりに適当な同位体標識試薬を使った方法により調製される。
【０１３６】
一実施形態では、本明細書に記載の化合物は、他の手段、例えば限定されないが、発色団または蛍光成分、生物発光標識または化学発光標識などの手段により標識される。
【０１３７】
本明細書に記載の化合物および異なる置換基を有する他の関連化合物は、本明細書に記載の技術と材料を使って、そして例えばFieser & Fieser's Reagents for Organic Synthesis, 第1-17巻 (John Wiley & Sons, 1991); Rodd's Chemistry of Carbon Compounds, 第1-5巻および増補 (Elsevier Science Publishers, 1989); Organic Reactions, 第1-40巻 (John Wiley & Sons, 1991), Larock's Comprehensive Organic Transformations (VCH Publishers Inc., 1989), March, Advanced Organic Chemistry 第4版(Wiley 1992); Carey & Sundberg, Advanced Organic Chemistry 第4版, 第A & B巻 (Plenum 2000,2001), およびGreen & Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis 第3版 (Wiley 1999) (その全てがそのような開示への参照により本明細書に組み込まれる）に記載の通りに合成される。本明細書中に記載の化合物の調製のための一般法は、本明細書中に提供されるような構造式に見られる種々の成分の導入のため、適当な試薬と条件を使用することによって改変することができる。
【０１３８】
本明細書に記載の化合物は、商業源から入手可能である化合物から出発する任意の適当な手順を使って合成され、あるいは本明細書に記載の手順を使って調製される。
【０１３９】
一実施形態では、反応性官能基、例えはヒドロキシル、アミノ、イミノ、チオまたはカルボキシ基は、それらの望ましくない反応への関与を避けるために保護される。保護基は、反応性成分の一部または全部をブロックしかつ、保護基が除去されるまでそのような基が化学反応に関与するのを防ぐために用いられる。別の実施形態では、各保護基は様々な手段により除去可能である。完全に異なる反応条件下で開裂される保護基は、差次的な除去の要件を満たす。
【０１４０】
一実施形態では、保護基は、酸、塩基、還元条件（例えば水素化分解）および／または酸化条件により除去される。トリチル、ジメトキシトリチル、アセタール、およびｔ−ブチルジメチルシリルといった基は、酸に不安定であり、Cbz基（水素化分解によって除去可能である）およびFmoc基（塩基に不安定である）で保護されたアミノ基の存在下でカルボキシ基およびヒドロキシ基を保護するのに用いられる。カルボン酸およびヒドロキシ反応性成分は、酸に不安定な基、例えばt-ブチルカルバメートで、または酸と塩基の両方に安定であるが加水分解により除去可能であるカルバメートで、保護されているアミンの存在下で、塩基に不安定な基、例えば限定されないが、メチル、エチルおよびアセチル基で保護される。
【０１４１】
一実施形態では、カルボン酸およびヒドロキシ反応成分は、ベンジル基のような加水分解で除去可能である保護基により保護され、一方で酸と共に水素結合を形成できるアミン基は、Fmocのような塩基に不安定な基で保護される。カルボン酸反応性成分は、本明細書に例示されるような単純なエステル化合物への変換（アルキルエステルへの変換を含む）により保護され、あるいは、共存するアミノ基がフッ素に不安定なシリルカルバメートで保護されている場合に、2,4−ジメトキシベンジルのような酸化的除去可能な保護基で保護される。
【０１４２】
アリル保護基は、酸および塩基保護基の存在下で有用である。その理由は、前者は安定でありその後金属またはπ酸触媒によって除去されるためである。例えば、アリルで保護されたカルボン酸は、酸に不安定なt-ブチルカルバメートまたは塩基に不安定なアセテートアミン保護基の存在下でのパラジウム触媒反応を使って脱保護される。更に別の保護基の形態は、化合物または中間体が取り付けられた樹脂である。残基が樹脂に取り付けられている限り、その官能基はブロックされ反応しない。樹脂から遊離されると、官能基は反応に利用可能である。
【０１４３】
典型的には、ブロック／保護基は以下から選択される：
【化１６】
2020535164.tif 000018
【０１４４】
他の保護基と、保護基の構築とそれらの除去に利用できる技術の詳細な説明は、Greene & Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 第3版、John Wiley & Sons, New York, NY, 1999, およびKocienski, Protective Groups, Thieme Verlag, New York, NY, 1994に記載されており、それらはそのような開示の参考により本明細書中に組み込まれる。
【０１４５】
核酸阻害剤
幾つかの実施形態において、阻害剤は核酸である。種々の実施形態で、阻害剤は、ACSS2を阻害するsiRNA、miRNA、shRNA、またはアンチセンス分子である。一実施形態では、核酸は、該核酸が阻害剤核酸の発現を指令することができるように、プロモーター／調節配列を含む。従って、本発明は、例えば、Sambrook他（2012、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbour Laboratory、New York）、およびAusubel他（1997、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley＆Sons、New York）中に記載されているような、並びに本明細書中のいずれかの箇所に記載されているような、細胞中での外来DNAの同時発現を伴う外来DNAの細胞への導入のための発現ベクターおよび方法を包含する。
【０１４６】
本発明の別の態様において、ACSS2は、ACSS2を不活性化および／または隔離することによって阻害され得る。そのため、ACSS2の活性の阻害は、トランスドミナント・ネガティブ変異体を使用することで達成できる。
【０１４７】
一実施形態では、siRNAは、ACSS2タンパク質のレベルを低下させるために使用される。RNA干渉（RNAi）は、二本鎖RNA（dsRNA）を様々な種類の生物や細胞タイプに導入すると、相補的mRNAが分解される現象である。細胞内では、長鎖のdsRNAは、ダイサー（Dicer）として知られるリボヌクレアーゼにより、21〜25ヌクレオチドの短い低分子干渉RNAすなわちsiRNAに切断される。続いて、siRNAはタンパク質成分とともにRNA誘導サイレンシング複合体（RISC）に集成され、その過程で鎖が巻き戻る。次に、活性化されたRISCは、siRNAアンチセンス鎖とmRNAの間の塩基対相互作用によって相補的転写物に結合する。結合したmRNAはmRNAの配列特異的分解により切断されて遺伝子サイレンシングが起こる。例えば、米国特許第6,506,559号明細書を参照のこと。Fire他、1998、Nature 391 (19)：306-311; Timmons 他、1998、Nature 395：854; Montgomery他、1998、TIG 14 (7)：255-258; David R. Engelke編、RNAi Interference (RNAi) Nuts & Bolts of RNAi Technology, DNA Press, Eagleville, PA (2003); およびGregory J. Hannon編、RNAi A Guide to Gene Silencing、Cold Spring Harbour Laboratory Press、Cold Spring Harbour、NY（2003）。Soutschek他（2004、Nature 432：173-178）は、静脈内全身送達を助けるsiRNAへの化学修飾について説明している。siRNAの最適化には、全体的なG/C含量、末端のC/T含量、Tm、および3'突出末端のヌクレオチド含有量の考慮が必要である。例えば、Schwartz他、2003、Cell、115：199-208およびKhvorova他、2003、Cell 115：209-216を参照のこと。従って、本発明は、RNAi技術を使ったACSS2のレベルを低下させる方法も包含する。
【０１４８】
別の態様において、本発明は、siRNAまたはアンチセンス核酸を含むベクターを包含する。一実施形態では、siRNAまたはアンチセンスポリヌクレオチドは、標的ポリペプチドがACSS2である標的ポリペプチドの発現を阻害することができる。ベクターへの所望のポリヌクレオチドの組み込みおよびベクターの選択は、例えば、Sambrook他（2012）中、およびAusubel他（1997）中、並びに本明細書の他の場所に記載されている。
【０１４９】
特定の実施形態では、本明細書に記載される発現ベクターは、短いヘアピンRNA（shRNA）阻害剤をコードする。shRNA阻害剤は当技術分野で周知であり、標的のmRNAに対して向けられ、それにより標的の発現を減少させる。特定の実施形態では、コードされたshRNAは細胞中で発現され、次いでsiRNAにプロセシングされる。例えば、ある所定の場合には、細胞はshRNAを切断してsiRNAを形成させる天然酵素（例えば、ダイサー）を保有する。
【０１５０】
本明細書の他の箇所に記載されているように、siRNA、shRNA、またはアンチセンス核酸は、多数のタイプのベクター中にクローニングすることができる。siRNAまたはアンチセンスポリヌクレオチドの発現のためには、各プロモーターの少なくとも１つのモジュールがRNA合成の開始部位を位置決定する機能を果たす。
【０１５１】
siRNA、shRNA、またはアンチセンス核酸の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターは、ウイルスベクターを使ってトランスフェクトまたは感染させようと試みた細胞集団から発現している細胞の同定と選択を容易にする目的で、選択可能マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかまたは両方を含むこともできる。他の実施形態では、選択可能なマーカーは、別個のDNA片上に担持され、そして同時トランスフェクション手順において使用することができる。選択可能マーカーとレポーター遺伝子の両方に、適切な調節配列を隣接させて宿主細胞での発現を可能にしてもよい。有用な選択可能マーカーは当技術分野で知られており、例えば、ネオマイシン耐性などの抗生物質耐性遺伝子が含まれる。
【０１５２】
従って、別の態様では、本発明は、本発明のヌクレオチド配列または本発明の構築物を含むベクターに関する。ベクターの選択は、その後導入される宿主細胞に依存する。特定の実施形態では、本発明のベクターは発現ベクターである。適切な宿主細胞には、多種多様な原核および真核宿主細胞が含まれる。特定の実施形態では、発現ベクターは、ウイルスベクター、細菌ベクターおよび哺乳動物細胞ベクターからなる群から選択される。原核生物および／または真核生物ベクターに基づく系は、ポリヌクレオチドまたはそれらの同族のポリペプチドを生産するために本発明と共に使用することができる。そのような系の多くは市販されており、広く入手可能である。
【０１５３】
更に、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供されてもよい。ウイルスベクター技術は当技術分野で周知であり、例えば、Sambrook他（2012）およびAusubel他（1997）中、並びに他のウイルス学と分子生物学のマニュアル中に記載されている。ベクターとして有用なウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されない。一般に、適切なベクターは、少なくとも１つの生物体において機能的な複製開始点、プロモーター配列、使いやすい制限エンドヌクレアーゼ部位、および１つ以上の選択可能マーカーを含む。（例えば、国際公開WO 01/96584号、同WO 01/29058号パンフレット、および米国特許第6,326,193号明細書を参照されたい。）
【０１５４】
例示として、核酸配列が導入されるベクターは、それが細胞中に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれるかまたは組み込まれないプラスミドであり得る。本発明のヌクレオチド配列または本発明の遺伝子構築物を挿入することができるベクターの例示的で非限定的な例としては、真核生物細胞中での発現のためのtet-on誘導性ベクターが含まれる。
【０１５５】
ベクターは、当業者に知られている従来の方法によって得ることができる（Sambrook他、2012）。特定の実施形態では、ベクターは動物細胞を形質転換するのに有用なベクターである。
【０１５６】
一実施形態では、組換え発現ベクターは、本明細書の他の場所に記載されている本発明のペプチドまたはペプチド模倣物阻害剤をコードする核酸分子も含むことができる。
【０１５７】
プロモーターは、コードセグメントおよび／またはエクソンの上流に置かれた5'非コード配列を単離することにより得ることができるような、遺伝子またはポリヌクレオチド配列と天然に付随しているものであってよい。このようなプロモーターは、「内因性」と呼ぶことができる。同様に、エンハンサーは、ポリヌクレオチド配列の下流または上流のいずれかに置かれた、ポリヌクレオチド配列と天然に付随しているものであることができる。あるいは、コードしているポリヌクレオチドセグメントを組換えまたは異種プロモーターの制御下に配置することにより一定の利点が得られ、そのようなプロモーターはその本来の環境ではポリヌクレオチド配列と通常付随しないプロモーターを言う。組換えまたは異種エンハンサーとは、その自然環境においてポリヌクレオチド配列と通常関連しないエンハンサーを指す。そのようなプロモーターまたはエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、および他の原核生物、ウイルスまたは真核生物細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、並びに「天然に存在」しないプロモーターまたはエンハンサー、即ち、異なる転写調節領域の異なる要素を含むもの、および／または発現を変化させる突然変異を含むプロモーターまたはエンハンサーを包含する。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に生産することに加えて、配列は、本明細書に開示される組成物との関連で、PCRをはじめとする組換えクローニング技術および／または核酸増幅技術を利用して生産され得る（米国特許第4,683,202号、米国特許第5,928,906号明細書）。更に、ミトコンドリア、葉緑体などの非核オルガネラ内の配列の転写および／または発現を指令する調節配列も使用できると考えられる。
【０１５８】
当然のことながら、発現のために選択された細胞型、オルガネラ、および生物体におけるDNAセグメントの発現を効果的に指令するプロモーターおよび／またはエンハンサーを使用することが重要であろう。分子生物学の当業者は、タンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサー、および細胞型の組み合わせの使用方法を一般に知っている。例えば、Sambrook他（2012）を参照のこと。使用されるプロモーターは、組換えタンパク質および／またはペプチドの構成的、組織特異的、誘導性および／または大規模生産に有利であるような、導入されたDNAセグメントの高レベル発現を指令する適切な条件下で有用である。プロモーターは、異種であっても内因性であってもよい。
【０１５９】
組換え発現ベクターはまた、形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の選択を容易にする選択可能マーカー遺伝子を含むことができる。適切な選択可能マーカー遺伝子は、特定の薬物、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、または免疫グロブリンのFc部分などの免疫グロブリンまたはその一部、例えばIgGに耐性を与えるG418およびハイグロマイシンなどのタンパク質をコードする遺伝子である。選択可能マーカーは、目的の核酸とは別のベクターに導入されてもよい。
【０１６０】
siRNAポリヌクレオチドの産生後、当業者は、siRNAポリヌクレオチドが治療用化合物としてのsiRNAを改良するように修飾できる特定の特徴を有することを理解するであろう。従って、siRNAポリヌクレオチドは、ホスホロチオエートまたは他の結合、例えばメチルホスホネート、スルホン、スルフェート、ケチル、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、リン酸エステルなどを含むように修飾することにより、分解に対して抵抗するようにさらに設計することができる（例えば、Agrwal他、1987、Tetrahedron Lett. 28：3539-3542; Stec他、1985 Tetrahedron Lett. 26：2191-2194; Moody他、1989 Nucleic Acids Res. 12：4769-4782; Eckstein、1989 Trends Biol. Sci. 14：97-100; Stein、In：Oligodeoxynucleotides. Antisense Inhibitors of Gene Expression、Cohen編、Macmillan Press、London、97-117頁（1989）を参照のこと）。
【０１６１】
何れかのポリヌクレオチドをさらに修飾して、生体内での安定性を高めることができる。可能な改変としては、限定されないが、5'および／または3'末端での隣接配列の付加；骨格中にホスホジエステル結合ではなく、ホスホロチオエートまたは2'-O-メチルの使用；および／またはイノシン、クオシン、およびワイブトシン等の非典型的な塩基、並びにアデニン、シチジン、グアニン、チミンおよびウリジンのアセチル-、メチル-、チオ-および他の修飾形態の包含が挙げられる。
【０１６２】
本発明の一実施形態では、プラスミドベクターによって発現されるアンチセンス核酸配列を使用してACSS2 タンパク質発現を阻害する。アンチセンス発現ベクターは、哺乳動物細胞または哺乳動物自体をトランスフェクトするために使用され、それによりACSS2の内因性発現の低下を引き起こす。
【０１６３】
アンチセンス分子および遺伝子発現を阻害するためのそれらの使用は、当技術分野で周知である（例えば、Cohen、1989、In：Oligodeoxyribonucleosides, Antisense Inhibitors of Gene Expression、CRC Pressを参照）。アンチセンス核酸は、その用語が本明細書の他の場所で定義されているように、特定のmRNA分子の少なくとも一部に対して相補的であるDNAまたはRNA分子である（Weintraub、1990、Scientific American 262：40）。細胞内では、アンチセンス核酸は対応するmRNAにハイブリダイズし、二本鎖分子を形成して、それにより遺伝子の翻訳を阻害する。
【０１６４】
遺伝子の翻訳を阻害するためのアンチセンス法の使用は当技術分野で知られており、例えば、Marcus-Sakura（1988、Anal. Biochem. 172：289）に記載されている。そのようなアンチセンス分子は、Inoue, 1993、米国特許第5,190,931号によって教示されているように、アンチセンス分子をコードするDNAを使用する遺伝子発現を介して細胞に提供することができる。
【０１６５】
あるいは、本発明のアンチセンス分子は、合成的に作製され、次いで細胞に提供され得る。一実施形態では、アンチセンスオリゴマーは約10から約30ヌクレオチドの間である。一実施形態では、アンチセンスオリゴマーは約15ヌクレオチドである。一実施形態では、約10〜約30ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーが容易に合成され、標的細胞に導入される。本発明により検討される合成アンチセンス分子は、非修飾オリゴヌクレオチドと比較して改善された生物学的活性を有する、当該技術分野で既知のオリゴヌクレオチド誘導体を含む（米国特許第5,023,243号明細書を参照）。
【０１６６】
本発明の一実施形態では、リボザイムを使用してACSS2タンパク質発現を阻害する。標的分子の発現を阻害するのに有用なリボザイムは、例えばACSS2をコードするmRNA配列に相補的である基本的リボザイム構造に標的配列を組み込むことによって設計することができる。ACSS2を標的とするリボザイムは、市販の試薬（Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA）を使用して合成するか、それらをコードするDNAから遺伝的に発現させることが可能である。
【０１６７】
一実施形態では、ACSS2の阻害剤は、CRISPR-Casシステムの１つ以上の構成要素を含むことができる。CRISPR法は、小さなRNAをガイド（gRNA）として複合体化するヌクレアーゼであるCRISPR関連（Cas）を使用して、任意のゲノム位置でプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）の上流に配列特異的方法でDNAを切断する。CRISPRは、crRNAおよびtracrRNAとして知られる個別のガイドRNAを使用する。これらの２つの別々のRNAは単一のRNAに結合されており、短いガイドRNAの設計を通じて部位特異的な哺乳類ゲノム切断を可能にする。CasおよびガイドRNA（gRNA）は既知の方法で合成できる。Cas/ガイドRNA（gRNA）は、非特異的DNA切断タンパク質CasおよびRNAオリゴを使用してハイブリダイズし、Cas/gRNA複合体を標的として動員する。一実施形態では、ACSS2をコードする遺伝子を標的とするガイドRNA（gRNA）とCRISPR関連（Cas）ペプチドとが複合体を形成して、標的遺伝子内に突然変異を誘発する。一実施形態では、阻害剤は、gRNAまたはgRNAをコードする核酸分子を含む。一実施形態では、阻害剤はCasペプチドまたはCasペプチドをコードする核酸分子を含む。
【０１６８】
ポリペプチド阻害剤
幾つかの実施形態で、阻害剤は、ACSS2を阻害するペプチドまたはポリペプチド阻害剤である。例えば、一実施形態では、本発明のペプチド阻害剤は、ACSS2に結合することによりACSS2を直接阻害し、それによってACSS2の正常な機能的活性を阻害する。別の実施形態では、本発明のペプチド阻害剤は、内因性ACSS2と競合することによりACSS2を阻害する。更に別の実施形態では、本発明のペプチド阻害剤は、トランスドミナント・ネガティブ変異体として作用することにより、ACSS2の活性を阻害する。
【０１６９】
本発明によるペプチドおよびポリペプチドの変異体は、（i）１つ以上のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸残基で置換されており、そのような置換アミノ酸残基が遺伝暗号によってコードされているかコードされていない場合があるもの、（ii）1つ以上の修飾アミノ酸残基、例えば置換基の結合によって修飾されている残基が含まれるもの、（iii）ポリペプチドが本発明のポリペプチドの選択的スプライス変異体であるもの、（iv）ポリペプチドの断片、および/または（v）ポリペプチドが別のポリペプチド、例えばリーダーもしくは分泌配列または精製に使用される配列（例えばHis-tag）または検出に使用される配列（例えばSv5エピトープタグ）と融合されているものが挙げられる。断片には、元の配列のタンパク質開裂（多点タンパク質分解を含む）によって生成したポリペプチドが含まれる。変異体は、翻訳後修飾による変異体であるかまたは化学的に修飾された変異体であり得る。そのような変異体は、本明細書の教示から当業者の技術の範囲内であると見なされる。
【０１７０】
抗体阻害剤
幾つかの実施形態では、阻害剤は抗体または抗体断片（フラグメント）である。幾つかの実施形態では、阻害剤は、ACSS2に特異的に結合する抗体または抗体断片である。すなわち、抗体はACSS2を阻害して有益な効果を提供することができる。
【０１７１】
抗体は、完全なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、および免疫学的に活性な断片（例えばFabまたは(Fab)2 断片）、抗体重鎖、抗体軽鎖、ヒト化抗体、遺伝子操作された一本鎖FV 分子（Ladner他、米国特許第4,946,778号）、またはキメラ抗体、例えば、マウス抗体の結合特異性を含むが残りの部分はヒト起源のものである抗体である。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、ヒト化抗体、断片およびキメラ抗体をはじめとする抗体は、当業者に既知の方法を使用して調製することができる。
【０１７２】
抗体は、重鎖および軽鎖の相補性決定領域（「CDR」）セットを含むことができ、それらはそれぞれ、CDRを支えかつ互いに関するCDRの空間的関係を限定する、重鎖と軽鎖のフレームワーク（「FR」）セットの間に挿入される。CDRセットは重鎖または軽鎖Ｖ領域の３つの超可変領域を含む場合がある。重鎖または軽鎖のＮ末端から順に、それらの領域はそれぞれ「CDR1」、「CDR2」、「CDR3」と表わされる。従って、抗原結合部位は６つのCDRを含み、それらは重鎖および軽鎖Ｖ領域の各々からのCDRセットを含む。
【０１７３】
抗体は免疫グロブリン（Ig）であることができる。Igは、例えば、IgA、IgM、IgD、IgE、およびIgGであり得る。免疫グロブリンは重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドを含むことができる。免疫グロブリンの重鎖ポリペプチドは、VH領域、CH1領域、ヒンジ領域、CH2領域、およびCH3領域を含むことができる。免疫グロブリンの軽鎖ポリペプチドは、VL領域、ヒンジ領域、CH2領域およびCH3領域を含み得る。免疫グロブリンの軽鎖ポリペプチドは、VL領域とCL領域を含み得る。
【０１７４】
抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。抗体は、キメラ抗体、一本鎖抗体、親和性成熟抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体であり得る。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（CDR）とヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域とを有する、所望の抗原に結合する非ヒト種由来の抗体であり得る。
【０１７５】
抗体は二重特異性抗体であってよい。二重特異性抗体は、２つの抗原、例えば、下記により詳細に記載される２つの抗原と結合または反応することができる。二重特異性抗体は、本明細書に記載の２つの抗体断片から構成されることができ、それにより二重特異性抗体が、２つの所望の標的分子（これは下記に詳細に記載される抗原、受容体上にリガンド結合部位を含む受容体、リガンド−受容体複合体、およびマーカーを含み得る）と結合または反応できる。二重特異性抗体は、第一の標的に特異的に結合する第一の抗原結合部位と、第二の標的に特異的に結合する第二の抗原結合部位とを含み、特に有利な特性、例えば生産性、安定性、結合親和性、生物活性、ある一定のＴ細胞の特異的ターゲティング、ターゲティング効率および低減した毒性を具備している。ある場合には、二重特異性抗体は高親和性で第一の標的に結合し、低い親和性で第二の標的に結合する二重特異性抗体である。他の場合では、二重特異性抗体は、低親和性で第一の標的に結合し、高い親和性で第二の標的に結合する。他の場合では、所望の親和性で第一の標的と結合し、所望の親和性で第二の標的に結合する二重特異性抗体である。
【０１７６】
抗体は、目的の免疫化抗原を含む完全なポリペプチドまたは断片を使用して調製することができる。動物を免疫するために使用されるポリペプチドまたはオリゴペプチドは、RNAの翻訳から得るか、化学的に合成することができ、必要に応じて担体タンパク質に結合させることができる。ペプチドに化学的に結合することができる適切な担体には、ウシ血清アルブミンおよびチログロブリン、キーホールリンペット（KLH）ヘモシアニンが含まれる。次に、結合したポリペプチドを使用して、動物（例えば、マウス、ラットまたはウサギ）を免疫処置することができる。
【０１７７】
組み合わせ
幾つかの実施形態では、組成物の本発明は、本明細書に記載のACSS2阻害剤の組み合わせを含む。特定の実施形態では、本明細書に記載の阻害剤の組み合わせを含む組成物は相加効果を有し、この場合、組み合わせの総合効果は個々の阻害剤の効果の総和にほぼ等しい。他の実施形態では、本明細書に記載の阻害剤の組み合わせを含む組成物は相乗効果を有し、この場合、組み合わせの総合効果は、個々の阻害剤の効果の総和よりも大きい。
【０１７８】
幾つかの実施形態では、本発明の組成物は、ACSS2阻害剤と第二の治療剤との組み合わせを含む。例えば、一実施形態では、第二の治療薬として、例えば限定されないが、PTSD治療薬、不安の治療薬、および薬物乱用の治療薬が含まれる。
【０１７９】
幾つかの実施形態では、第二の治療薬はPTSD治療薬である。例示的な療法としては、限定されないが、例えば抗不安治療薬、抗うつ薬、およびアドレナリン作動薬が挙げられる、一実施形態では、PTSD処置は療法的処置である。例えば、一実施形態では、PTSD処置として、心理療法、行動または認知行動療法、眼球運動による脱感作および再処理法（EMDR）集団療法、経頭蓋磁気刺激療法、脳深部刺激療法および脳波フィードバック技術、並びにケタミンおよびd-シクロセリンを含む薬物療法が挙げられる。
【０１８０】
一実施形態では、緊急治療室中または集中治療室中でのACSS2阻害剤の投与をPTSD予防に使用することができる。外傷前後の段階では、再活性化された記憶の痕跡は寸断に対して脆弱であるため、ACSS2阻害は外傷性記憶の再統合に影響を与える可能性がある。
【０１８１】
幾つかの実施形態では、第二の治療薬は薬物乱用治療薬である。例えば、一実施形態では、薬物乱用治療薬は、限定されないが、ナルトレキソン、ジスルフィラム、アカンプロサート、トピラメート、ニコチン置換療法剤、ニコチン受容体拮抗薬、ニコチン受容体部分作動薬、スボキソン、酢酸レボメタジル、ジヒドロコデイン、ブプレノルフィン、ケタミン、メタドン、およびジヒドロエトルフィンを含む。
【０１８２】
阻害剤の組み合わせを含む組成物は、任意の適切な比率で個々の阻害剤を含む。例えば、一実施形態では、組成物は、１：１の比率の２つの個々の阻害剤を含む。ただし、組み合わせは特定の比率に限定されない。むしろ、効果的であることが示される何れかの比率が含まれる。
【０１８３】
方法
幾つかの実施形態では、本発明は、それを必要とする対象においてACSS2を阻害する方法を提供する。一実施形態では、方法は、ACSS2阻害剤を含む組成物の有効量を対象に投与することを含む。
【０１８４】
一実施形態では、本発明は、対象におけるクロマチンアセチル化を調節する方法を提供する。一実施形態では、クロマチンアセチル化はヒストンアセチル化である。一実施形態では、クロマチンは神経クロマチンである。一実施形態では、本発明の方法は、対象の神経可塑性を調節する。一実施形態では、本方法はACSS2の阻害剤を含む組成物の有効量を対象に投与することを含む。一実施形態では、ACSS2の阻害剤はヒストンのアセチル化を低下させる。
【０１８５】
一態様において、本発明は対象において神経学的または認知疾患または障害を治療する方法を提供する、一実施形態では、神経学的または認知疾患または障害は、記憶関連の疾患または障害である。一実施形態では、神経学的または認知疾患または障害は、神経精神障害である。例えば、一実施形態では、神経精神障害は、限定されないが、不安障害、精神病性障害、気分障害および体因性障害を含む。
【０１８６】
例示的な神経学的または認知疾患または障害としては、心的外傷後ストレス障害（PTSD）、双極性障害、うつ病、トゥレット症候群、統合失調症、強迫性障害、全身性不安障害、パニック障害、恐怖症、人格障害、例えば反社会的人格障害、および困難な記憶を伴う他の障害が挙げられるが、それに限定されない。一実施形態では、神経学的または認知疾患または障害は、PTSDである。
【０１８７】
別の実施形態では、本発明は、対象における依存または依存関連の疾患または障害を治療する方法を提供する。一実施形態では、依存症は、限定されないが、アルコール、タバコ、オピオイド、鎮静剤、催眠薬、抗不安薬、コカイン、大麻、アンフェタミン、幻覚剤、吸入剤、フェンシクリジン、衝動調節障害および行動中毒を含む。
【０１８８】
一実施形態では、依存はアルコール中毒である。一実施形態では、本発明の方法は、急性および／または慢性のアルコール誘発性記憶障害を治療する。
【０１８９】
一実施形態では、本発明は、増強された心理療法におけるアルコール関連記憶およびキュー（刺激）誘発性の渇望を治療するための方法を提供する。一実施形態では、方法は、ACSS2の阻害剤を含む組成物の有効量を対象に投与することを含む。一実施形態では、ACSS2の阻害剤はヒストンのアセチル化を低下させる。
【０１９０】
一実施形態では、当該方法は、ACSS2の発現または活性を低減または阻害する有効量の組成物を対象に投与することを含む。
【０１９１】
当業者は、本発明の阻害剤を単独でまたは任意の組み合わせで投与できることを理解するであろう。更に、本発明の阻害剤は、それらが同時に、または互いの前および／または後に投与され得るという点で、単独でまたは時間的意味での任意の組み合わせで投与され得る。本明細書で提供される開示に基づいて、当業者は、本発明の阻害剤組成物を使用して自己免疫疾患または障害を予防または治療することができ、阻害剤組成物を単独でまたは治療結果に影響を与える別のモジュレーターとの任意組み合わせで使用できることを理解するであろう。様々な実施形態では、本明細書に記載の本発明の阻害剤組成物のいずれかを、単独で、または自己免疫疾患に関連する他の分子の他のモジュレーターと組み合わせて投与することができる。
【０１９２】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載の阻害剤の組み合わせを投与することを含む方法を含む。特定の実施形態では、本方法は相加効果を有し、阻害剤の組み合わせを投与することの全体的な効果は、個々の阻害剤を投与することの効果の合計にほぼ等しい。他の実施形態では、本方法は相乗効果を有し、阻害剤の組み合わせを投与することの全体的な効果は、個々の阻害剤を投与することの効果の合計よりも大きい。
【０１９３】
この方法は、阻害剤の組み合わせを任意の適切な比率で投与することを含む。例えば、一実施形態では、本方法は、２つの個々の阻害剤を１：１の比率で投与することを含む。しかしながら、本方法は特定の比率に限定されない。むしろ、効果的であることが示されている何れかの比率が含まれる。
【０１９４】
医薬組成物および製剤
本発明はまた、本発明の方法を実施するための本発明の医薬組成物またはその塩の使用を包含する。そのような医薬組成物は、対象への投与に適した形態の本発明の少なくとも１つのモジュレーター（例えば阻害剤）組成物またはその塩からなり、または医薬組成物は、本発明の少なくとも１つのモジュレーター（例えば阻害剤）組成物またはその塩、および１もしくは複数の薬学的に許容される担体、1つ以上の追加の成分、またはこれらの幾つかの組み合わせを含むことができる。本発明の化合物は、当技術分野で周知のように、生理学的に許容されるカチオンまたはアニオンと組み合わせてなど、生理学的に許容される塩の形態で医薬組成物中に存在することができる。
【０１９５】
一実施形態では、本発明の方法を実施するのに有用な医薬組成物を投与して、１ng／kg／日〜100 mg／kg／日の用量を送達することができる。別の実施形態では、本発明を実施するのに有用な医薬組成物を投与して、1 ng／kg／日〜500 mg／kg／日の用量を送達することができる。
【０１９６】
本発明の医薬組成物中の有効成分、薬学的に許容される担体および任意の追加成分の相対量は、治療対象のアイデンティティ、サイズおよび状態に応じて、更には組成物が投与される経路に応じて、異なるだろう。例として、組成物は0.1％〜100％（w/w）の有効成分を含み得る。
【０１９７】
本発明の方法において有用な医薬組成物は、経口、直腸、膣、非経口、局所、肺、鼻腔内、口腔、眼、または別の投与経路のために適切に開発され得る。本発明の方法内で有用な組成物は、哺乳動物の皮膚または任意の他の組織に直接投与され得る。他の期待される製剤には、リポソーム製剤、有効成分を含有する再封入赤血球、および免疫学に基づいた製剤が含まれる。投与経路は、当業者には容易に判断され、治療される疾患の種類および重症度、治療される家畜またはヒト対象の種類および年齢などを含む幾つかの要因に依存するであろう。
【０１９８】
本明細書に記載の医薬組成物の製剤は、薬理学の分野で既知であるかまたは今後開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、そのような予備的方法には、有効成分を担体または他の１もしくは複数の他の補助成分と組み合わせ、その後、必要または望ましい場合、製品を所望の単回または複数回投与単位に成形または包装するというステップが含まれる。
【０１９９】
本明細書で使用される場合、「単位用量」は、所定量の有効成分を含む医薬組成物の個別の量である。有効成分の量は、一般に、対象に投与されるであろう有効成分の投与量、または、例えばそのような投与量の半分または３分の１などのかかる投与量の好都合な画分に等しい。単位剤形は、単一の日用量または複数の日用量（例えば、１日あたり約１〜４回分またはそれ以上）であり得る。複数の日用量が使用される場合、単位剤形は、各用量で同じであっても異なっていてもよい。
【０２００】
一実施形態において、本発明の組成物は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤または担体（キャリア）を使用して製剤化される。一実施形態では、本発明の医薬組成物は、治療有効量の本発明の化合物またはコンジュゲート（複合体）と、薬学的に許容される担体とを含む。有用な薬学的に許容される担体には、グリセロール、水、生理食塩水、エタノール、およびリン酸塩や有機酸の塩などの他の薬学的に許容される塩溶液が含まれるが、これらに限定されない。前記および他の薬学的に許容される担体の例は、Remington's Pharmaceutical Sciences（1991、Mack Publication Co.、New Jersey）に記載されている。
【０２０１】
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒であってよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散体の場合には必要な粒子径を維持することによって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物による作用の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロザールなどの様々な抗菌剤および抗真菌剤によって達成することができる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖類、塩化ナトリウム、またはマンニトールやソルビトールなどの多価アルコールが組成物に含められる。注射可能な組成物の長期吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤を組成物に含めることによって達成することができる。一実施形態では、薬学的に許容される担体はDMSOのみではない。
【０２０２】
製剤は、従来の賦形剤、すなわち、経口、経膣、非経口、経鼻、静脈内、皮下、経腸、または当技術分野で知られている他の適切な投与方法に適した薬学的に許容される有機または無機担体物質と混合して使用することができる。医薬製剤を滅菌し、必要に応じて、補助剤、例えば、潤滑剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧緩衝剤に影響を与える塩、着色剤、着香剤および／または芳香物質などと混合してもよい。それらはまた、所望の場合、他の活性剤、例えば他の鎮痛剤と組み合わせることができる。
【０２０３】
本明細書中で使用する場合、「追加の成分」には、以下の１または複数が含まれるが、これらに限定されない。賦形剤；界面活性剤；分散剤；不活性希釈剤；造粒剤および崩壊剤；結合剤；滑沢剤；甘味剤；着香剤；着色剤；保存剤；ゼラチンなどの生理学的に分解可能な組成物；水性ビヒクルと溶剤；油性ビヒクルと溶剤；懸濁化剤；分散剤または湿潤剤；乳化剤、増粘剤；緩衝剤；塩；増粘剤；充填剤；乳化剤；抗酸化剤；抗生物質；抗真菌剤；安定化剤；および薬学的に許容されるポリマーまたは疎水性材料。本発明の医薬組成物に含めることができる他の「追加の成分」は、当技術分野で知られており、例えばGenaro編（1985、Remington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Co.、Easton、PA）中に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【０２０４】
本発明の組成物は、組成物の総重量の約0.005％〜2.0％の防腐剤を含み得る。防腐剤は環境の汚染物質への露出がある場合には腐敗を防ぐのに使用される。本発明に従って有用な防腐剤の例には、ベンジルアルコール、ソルビン酸、パラベン、イミド尿素およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるものが含まれるが、これらに限定されない。例示的な防腐剤は、約0.5％〜2.0％のベンジルアルコールと0.05％〜0.5％のソルビン酸の組み合わせである。
【０２０５】
一実施形態では、組成物は、抗酸化剤および化合物の分解を阻害するキレート剤を含む。幾つかの化合物の例示的な抗酸化剤としては、BHT、BHA、α-トコフェロール、およびアスコルビン酸が挙げられ、好ましい範囲は約0.01％〜0.3％である。一実施形態では、抗酸化剤は、組成物の総重量の0.03重量％〜0.1重量％の範囲のBHTである。一実施形態では、キレート剤は、組成物の総重量の0.01重量％〜0.5重量％の量で存在する。例示的なキレート剤は、約0.01％〜0.20％の重量範囲のエデト酸塩（例えばエデト酸二ナトリウム）およびクエン酸を含む。一実施形態では、キレート剤は、組成物の総重量の0.02重量％〜0.10重量％の範囲である。キレート剤は、製剤の貯蔵寿命に有害となりうる組成物中の金属イオンをキレート化するために有用である。BHTおよびエデト酸二ナトリウムはそれぞれ、幾つかの化合物のための代表的な抗酸化剤およびキレート剤であるが、当業者に知られるように、他の適切な同等の抗酸化剤およびキレート剤で置き換えることができる。
【０２０６】
液体懸濁液は、水性または油性ビヒクル中の有効成分の懸濁を達成するための従来の方法を使用して調製され得る。水性ビヒクルには、例えば、水および等張食塩水が含まれる。油性ビヒクルには、例えば、落花生油、油性エステル、エチルアルコール、落花生油、オリーブ油、ゴマ油、またはヤシ油などの植物油、分留植物油、および流動パラフィンなどの鉱物油が含まれる。液状懸濁液剤は、懸濁化剤、分散剤または湿潤剤、乳化剤、粘滑剤、保存剤、緩衝剤、塩、香味剤、着色剤、および甘味剤を含むがこれらに限定されない１または複数の追加の成分を更に含み得る。油性懸濁液剤は、増粘剤を更に含み得る。既知の懸濁化剤としては、限定されないが、ソルビトールシロップ、水素化食用油脂、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、アカシアゴム、およびカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース誘導体を含む。既知の分散剤または湿潤剤は、限定されないが、レシチンのような天然のホスファチド、アルキレンオキシドと脂肪酸との、長鎖脂肪族アルコールとの、脂肪酸とヘキシトールとから誘導された部分エステルとの、または脂肪酸とヘキシトール無水物とから誘導された部分エステルとの、縮合生成物（例えばそれぞれ、ステアリン酸ポリオキシエチレン、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）を含む。既知の乳化剤には、限定されないが、レシチンおよびアカシアを含む。既知の防腐剤は、限定されないが、メチル-、エチル-、またはn-プロピル-p-ヒドロキシベンゾエート、アスコルビン酸、およびソルビン酸を含む。既知の甘味剤は、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、スクロース、およびサッカリンを含む。油性懸濁液のための既知の増粘剤は、例えば、蜜蝋、固形パラフィンおよびセチルアルコールを含む。
【０２０７】
水性または油性溶媒中の有効成分の液体溶液は、液状懸濁液と実質的に同じ方法で調製することができ、主な違いは、有効成分が溶媒に懸濁されるのではなく溶解されることである。本明細書で使用される場合、「油性」液体は、炭素含有液体分子を含み、水よりも極性の低い特性を示す液体である。本発明の医薬組成物の液体状の液剤は、液状懸濁液剤に関して記載された各成分を含んでもよく、懸濁化剤は必ずしも溶媒中の有効成分の溶解を助けるとは限らないことが理解される。水性溶媒には、例えば、水および等張食塩水が含まれる。油性溶媒には、例えば、落花生油、油性エステル、エチルアルコール、落花生油、オリーブ油、ゴマ油、またはヤシ油などの植物油、分留植物油、および流動パラフィンなどの鉱物油が含まれる。
【０２０８】
本発明の医薬製剤の粉末状および粒状製剤は、既知の方法を使用して調製することができる。そのような製剤は、例えば錠剤を成形するため、カプセルを充填するため、または水性もしくは油性ビヒクルをそれに添加することによって水性または油性の懸濁液剤または液剤を調製するために使用される対象に直接投与され得る。これらの製剤のそれぞれは、分散剤または湿潤剤、懸濁化剤、および保存剤のうちの１つまたは複数を更に含み得る。充填剤および甘味剤、香味剤、または着色剤などの追加の賦形剤もこれらの製剤に含めることができる。
【０２０９】
本発明の医薬組成物はまた、水中油型乳剤もしくは油中水型乳剤（エマルション）の形で調製され、包装され、または販売されてもよい。油相は、オリーブ油または落花生油などの植物油、流動パラフィンなどの鉱物油、またはこれらの組み合わせであり得る。そのような組成物は、アカシアゴムまたはトラガカントゴムなどの天然に存在するゴム、大豆またはレシチンホスファチドなどの天然に存在するホスファチド、脂肪酸とヘキシトール無水物との組み合わせから誘導されたエステルまたは部分エステル、例えばソルビタンモノオレエート、およびそのような部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルブタンモノオレエートを含むことができる。これらの乳剤はまた、例えば、甘味剤または香味剤を含む追加の成分を含み得る。
【０２１０】
化学組成物を材料に含浸させる方法または化学組成物で材料をコーティングする方法は、当技術分野で知られており、限定されないが、表面に化学組成物を堆積または結合する方法、化学組成物を材料の構造中に組み込む方法（すなわち、生理学的に分解可能な材料を用いてなど）、およびその後の乾燥の有無にかかわらず、吸収材料中に水性または油性溶液もしくは懸濁液を吸収させる方法を含む。
【０２１１】
投与計画は、有効量を構成するものに影響を与える可能性がある。治療用製剤は、疾患の診断の前または後のいずれかに対象に投与することができる。更に、数回の分割された投薬、ならびに互い違いの投薬は、毎日または連続的に施されるか、あるいは投薬は連続的に点滴注入され得るか、またはボーラス注射であり得る。更に、治療製剤の投与量は、治療または予防状況の緊急要件によって示されるように、比例的に増加または減少させることができる。
【０２１２】
対象、例えば、ヒトを含む哺乳動物への本発明の組成物の投与は、既知の手順を使用して、疾患を予防または治療するのに有効な用量および期間で行われ得る。治療効果を達成するために必要な治療化合物の有効量は、使用される特定化合物の活性；投与の時間；化合物の排泄率；治療期間；化合物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物または材料；治療対象の疾患もしくは障害の状態、年齢、性別、体重、コンディション、一般的な健康状態および既往病歴、並びに医学分野で周知の同様の要因といった要因に従って変化し得る。投与計画は、最適な治療応答を提供するように調整することができる。例えば、幾つかの分割用量を毎日投与してもよく、または治療状況の緊急要件により示されるように、用量を比例的に減らしてもよい。本発明の治療化合物の有効量の範囲の非限定的な例は、約１〜5,000 mg／kg体重／日である。当業者は、関連する要因を研究し、過度の実験をすることなく、治療用化合物の有効量に関する決定を行うことができるであろう。
【０２１３】
化合物は、１日に数回という頻度で対象に投与することができ、またはより低頻度、例えば１日１回、１週間に１回、２週間に１回、月１回などで、または数カ月毎に１回または更には１年に１回以下のような、より低頻度で投与することができる。非限定的な例では、１日当たりに投与される化合物の量は、毎日、隔日、２日毎、３日毎、４日毎、または５日毎に投与できることが理解される。例えば、隔日投与では、5 mg／日の用量を月曜日に開始し、最初の後続の5 mg/日の用量を水曜日に投与し、２番目の後続の5 mg/日の用量を金曜日に投与するなど、以下同様に投与することができる。投与の頻度は、当業者に容易に明らかであり、そして処置される疾患のタイプおよび重症度、動物のタイプおよび年齢などの任意の数の要因に依存するがこれらに限定されない。
【０２１４】
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、対象にとって毒性にならないように、特定の対象、組成物および投与方法に対して所望の治療応答を達成するのに有効である有効成分の量を得るように変化させることができる。
【０２１５】
当技術分野における通常の技能を有する医師、例えば医師または獣医は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定および処方することができる。例えば、医師または獣医は、所望の治療効果を達成するために必要なレベルよりも低いレベルで医薬組成物に使用される本発明の化合物の用量で開始し、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加させることができる。
【０２１６】
特定の実施形態では、投与を容易にし、投与量を均等にするために、化合物を投与量単位形態で処方することが特に有利である。本明細書で使用される単位剤形は、治療される対象の単位用量として適した物理的に個別の単位を指す。各単位は、必要な医薬ビヒクルと関連して所望の治療効果を生み出すように計算された所定量の治療化合物を含む。本発明の投与単位形態は、（a）治療化合物の固有の特徴および達成されるべき特定の治療効果、および（b）対象の疾患の治療のためのそのような治療薬を配合／製剤化する技術に固有の制限によって決定される。
【０２１７】
一実施形態では、本発明の組成物は、１日あたり１回から５回以上の範囲の投与量で対象に投与される。別の実施形態において、本発明の組成物は、限定されないが、毎日１回、２日毎、３日毎から１週間に１回、および２週間毎に１回を含む用量範囲で対象に投与される。本発明の様々な組み合わせ組成物の投与頻度は、治療される対象の年齢、疾患または障害、性別、全体的な健康状態、その他の要因を含むがこれらに限定されない多くの要因に応じて異なることは、当業者に容易に明らかであろう。したがって、本発明は、特定の投与計画に限定されると解釈されるべきではなく、任意の対象に投与される正確な用量および組成は、対象に関する他のすべての要因を考慮に入れて、主治医によって決定される。
【０２１８】
投与のための本発明の化合物は、約１mg〜約10,000 mg、約20 mg〜約9,500 mg、約40 mg〜約9,000 mg、約75 mg〜約8,500 mg、約150 mg〜約7,500 mg、約200 mg〜約7,000 mg、約3050 mg〜約6,000 mg、約500 mg〜約5,000 mg、約750 mg〜約4,000 mg、約1 mg〜約3,000 mg、約10 mg〜約2,500 mg 、約20 mg〜約2,000 mg、約25mg〜約1,500 mg、約50 mg〜約1,000 mg、約75 mg〜約900 mg、約100 mg〜約800 mg、約250 mg〜約750 mg、約300 mg〜約600 mg、約400 mg〜約500 mgの範囲、およびその間のあらゆる全もしくは部分増分であることができる。
【０２１９】
幾つかの実施形態では、本発明の化合物の用量は、約１mg〜約2,500 mgである。幾つかの実施形態では、本明細書に記載の組成物で使用される本発明の化合物の用量は、約10,000 mg未満、または約8,000 mg未満、または約6,000 mg未満、または約5,000 mg未満、または約3,000未満、または約2,000 mg未満、または約1,000 mg未満、または約500 mg未満、または約200 mg未満、または約50 mg未満である。同様に、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される第２の化合物（すなわち、本発明の組成物によって治療されるものと同じまたは別の疾患を治療するために使用される薬物）の用量は、約1,000 mg未満、または約8,000 mg未満、または約600 mg未満、または約500 mg未満、または約400 mg未満、または約300 mg未満、または約200 mg未満、または約100 mg未満、または約50 mg未満、または約40 mg未満、または約30 mg未満、または約25 mg未満、または約20 mg未満、または約15 mg未満、または約10 mg未満、または約5 mg未満、または約2 mg未満、または約1 mg未満、または約0.5 mg未満、およびその間のあらゆる全もしくは部分増分であることができる。
【０２２０】
一実施形態では、本発明は、治療有効量の本発明の化合物またはコンジュゲートを単独で、または第２の医薬品と組み合わせて保有する容器；および該化合物またはコンジュゲートを使用して、対象の疾患の１または複数の症状を治療、予防、または軽減するための説明書を含む包装された医薬組成物に関する。
【０２２１】
「容器」という用語は、医薬組成物を保持するための任意の容器を含む。例えば、一実施形態では、容器は、医薬組成物を含む包装である。他の実施形態では、容器は、医薬組成物を含む包装ではない、すなわち、容器は、包装された医薬組成物または包装されていない医薬組成物および医薬組成物の使用説明書を含む、箱またはバイアルなどの容器である。さらに、包装技術は当技術分野でよく知られている。医薬組成物の使用説明書は、医薬組成物を含む包装に含まれていてもよく、従って、その説明書は、包装された製品との機能的関係が増大することを理解されたい。しかしながら、説明書は、例えば、対象における疾患の治療または予防、または造影剤または診断剤の対象への送達など、その意図する機能を果たす化合物の能力に関する情報を含み得ることを理解されたい。
【０２２２】
本発明の組成物のいずれかの投与経路には、経口、経鼻、非経口、舌下、経皮、経粘膜[例えば、舌下、舌、（経）頬、および（経）鼻]、膀胱内、十二指腸内、胃内、直腸、腹腔内、皮下、筋肉内、皮内、動脈内、静脈内投与が含まれる。
【０２２３】
適切な組成物および剤形には、例えば、錠剤、カプセル、カプレット、ピル、ゲルキャップ、トローチ、分散液、懸濁液、溶液、シロップ、顆粒、ビーズ、経皮パッチ、ゲル、粉末、ペレット、マグマ、ロゼンジ、クリーム、ペースト、プラスター、ローション、ディスク、坐剤、経鼻または経口投与用の液体スプレー、乾燥粉末または吸入用のエアロゾル製剤、膀胱内投与用の組成物および製剤などを含む。本発明において有用であろう製剤および組成物は、本明細書に記載される特定の製剤および組成物に限定されないことが理解されるべきである。
【実験例】
【０２２４】
次の実験例を参照することにより、本発明を更に詳細に説明する。これらの例は、例示目的にのみ提供され、特に指定のない限り限定することを意図しない。よって、本発明は、けっして以下の実施例に限定されると解釈してはならず、むしろ、本明細書に提供される教示の結果として明らかになるあらゆる変形を包含すると解釈すべきである。
【０２２５】
更に説明しなくても、当業者は、前述の説明および下記の典型的な実施例を使用して、本発明を構築および利用し、本発明の特許請求の方法を実施することができると考えられる。従って、次の実施例は、いかなる形でも本開示の残部を限定するものとして解釈してはならない。
【０２２６】
実施例１：アセチルCoA-シンセターゼは、ヒストンアセチル化と海馬の記憶を調節する。
アセチル補酵素Ａ（アセチルCoA）の代謝産物は、ヒストンアセチル化と遺伝子調節に関連付けられているが、このプロセスは大部分が未知である。本明細書で提供するデータは、代謝酵素アセチルCoAシンセターゼ２（ACSS2）が哺乳類におけるニューロン中のヒストンアセチル化と空間記憶を直接調節することを証明する。神経細胞培養モデルにおいて、ACSS2は、分化しているニューロンの核で増加し、上昇したヒストンアセチル化の部位の近傍のアップレギュレートされたニューロン遺伝子に局在している。ACSS2の減少は、核のアセチルCoAレベル、ヒストンアセチル化およびニューロン遺伝子のコホートの応答性発現を減少させる。成体マウスでは、海馬ACSS2発現が減衰すると、ヒストンアセチル化に依存する認識プロセスである長期空間記憶を損なう。海馬におけるACSS2の減少は、ACSS2により予め連関された記憶関連ニューロン遺伝子のアップレギュレーションの欠損も引き起こす。それらの結果は、細胞代謝、遺伝子調節および神経可塑性の間の関係を明らかにし、そしてヒストンアセチル化のためのクロマチン上のアセチルCoA生成の「オンサイト」と、鍵となるニューロン遺伝子の転写との間の関連性を確立する。
【０２２７】
ACSS2がマウス海馬において高度に発現されるという知見（Lein, E. S. 他、2007, Nature, 445:168-176) は、本発明者がニューロンのヒストンアセチル化と遺伝子発現におけるACSS2の役割を調べるきっかけとなった。それらの知見は、ニューロンACSS2が、ACSS2によるクロマチンの直接結合を介して酢酸代謝をニューロン遺伝子調節に結び付けるうえで重要な役割を果たすという仮説を支持し、そして海馬の記憶の固定におけるこのメカニズムの顕著な役割を明らかにする。
【０２２８】
これらの実験に使用する材料と方法を以下に記載する。
【０２２９】
マウス実験
サンプルサイズを事前に決定するために何も統計的手法は使用しなかった、薬理学的または遺伝子操作を用いる関連の行動分析を使用する予備実験から、群の大きさが少なくとも７〜９匹の動物である時に効果が達成されることが判明した。その実験は無作為化され、研究者は実験の間とアウトカム評価の間の割り付けに対して盲検化された。
【０２３０】
細胞培養
CAD細胞(Cath.-a-differentiated) を、ダルベッコ改良イーグル培（DMEM）：2 mM グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび10％ウシ胎仔血清（FBS）が補充されたハムのF12培地（1；1）中で増殖させた。ニューロン分化を誘導するために、サブコンフルエントCAD細胞培養物（50〜60％）を無血清培地（DMEM：2 mMグルタミンが補足されたハムF12（1：1）中に移し、15 cm2の培養皿中で５日間維持した。分化誘導すると、CADニューロンは、ニューロンに特徴的な形態学的変化を示す。ノックダウン実験用に、CAD細胞にACL (#TRCN0000055217) またはACSS2 (#TRCN0000076124, #TRCN0000076125) に対して設計されたレンチウイルス・ヘアピン構築物（TRCコレクション）を8 mg/mLポリブレンと10％FBSを含む培地中で24時間感染させた。次いで0.5 mg/mLのピューロマイシンが補充された培地中で５日間細胞を選別し、安定に感染した集団を得た。ACSS2i [1-(2,3-ジ（チオフェン-2-イル)キノキサリン-6-イル) -3-(2-メトキシエチル）尿素 (DMSO中)]での細胞処理を、20μMの最終濃度で24時間行った（DMSO単独での処置は対照として働いた）。
【０２３１】
RNA-seq
RNA-seq用のライブラリーを構築するために、Dynabeads mRNA Directキット (Ambion製)を使って製造元の指示に従ってポリ(A)+RNAを抽出した。RNA-seqライブラリーをスクランブル対照（野生型と称する）、shACLおよび shACSS2用に、ScriptSeq v2 RNA-seq Library Preparation Kit (Illumina製)を使って作製した。それらのライブラリーの量と質をBioAnalyzer (Agilent製)およびqPCR (Kapa Biosystems製)を使って評価した。多重化ライブラリーをプールし、Illumina NextSeq 500プラットホーム (50 bp, シングルエンド読取り）上の単一レーンにてシーケンシングした、全てのRNA-seqデータは、次の通り分析用に用意した： NextSeq シーケンシングデータは、bcl2fastq2-v02.14.01.07を使って逆多重化した。逆多重化したFASTQs を、iGenome UCSC mm10 FASTQ ゲノム配列から生成されたゲノムインデックスmm10を使用して、RNA-STAR 2.3.0.eによりアラインした。アラインされた読みを、cufflinks-2.2.1 (既知の特長のみを定量化するための-Gパラメータ）およびiGenomes mm10 UCSC ゲノム転写遺伝子座を使用して、ゲノム機能上にマッピングした。マウスゲノムのrRNA、mRNA、およびtRNAは、goldenPath UCSC FTPからダウンロードし、転写物定量化からマスキングされた。定量化後、全てのデータ処理は、フィトン・パンダス（Phyton pandas）ライブラリーv.0.14.0を使って実装した。CADニューロンにおける発現変動遺伝子は、倍数変化による上位10％の遺伝子として定義され、これはほぼ1.6倍以上のアップレギュレーションに該当する。阻害剤存在下での変動発現およびインビボでの海馬ACSS2ノックダウンは、Cuffdiffを使って定義された。CAD細胞分化と阻害剤機能との関係（図１Ｇ）は、未処置細胞とACSS2i-処置細胞の各々で２つのRNA-seq複製に渡り標準化スコアを評価することにより、推測した。それらの結果を平均化し、そしていずれかの条件で|z|＜0.5を有する遺伝子を脱落させた。CAD分化の倍数変化の増加順において、残りの遺伝子のスコアをプロットした。ノックダウンにおける発現の低下による上位20％の遺伝子を採用することにより、そして阻害剤処置細胞におけるこれらの遺伝子の発現を、このセットの外側の遺伝子のランダムサンプルに対し比較することにより、傾向と再現性の統計的有意性を評価した（マン・ホイントニー検定）。
【０２３２】
ChIP-seq
CAD細胞を１%ホルムアルデヒド中で10分間固定し、125 mMへのグリシンの添加によって追加の５分間、固定をクエンチさせた。プレートから掻き取りにより細胞を取得し、１×PBS中で２回洗浄した後、−80℃で保存した。Covaris S220超音波処理器を使って＜500 bpの平均サイズにクロマチンをせん断したことを除き、以前に記載された通り（Shah, P. P.他、2013, Genes Dev., 27:1787-1799）にChIPを実施した。等アリコートの未分化および分化CADニューロンからの超音波処理したクロマチンを、各免疫沈降反応に使用し、その量の10％をインプットとして保存した。サンプル当たり2,000μgの抽出物と4μgの抗体を使ってACSS2 ChIPを実施した; サンプル当たり500μgの抽出物と4μgの抗体を使って他の全てのChIPを実施した。免疫沈降はプロテインA Dynabeads (Life Technologies製)を使って実施した。シーケンシングライブラリーは、NEBNext Ultra ライブラリー調製方法を使って作製し、次いでBioAnalyzer (Agilent製) とqPCR (Kapa Biosystems製)により量と質について評価した。シーケンシングは、Illumina製 NextSeq 500 プラットホーム上で実施した。全てのChIP-seqデータは、次のように分析用に調製した： NextSeq シーケンシングデータをbcl2fastqを使って逆多重化した。全てのリードを、bowtie2.2.1を使ってmm9またはmm10参照ゲノムにアラインした。リード当たり１アライメントを可能にし、そしてシード領域（-N1 -k1）中に１つのミスマッチを許容した。リードを固定ウィンドウ中で一覧表にし、またはサブリード1.4.6ソフトウェアパッケージからの特徴カウント（feature counts）を使って、iGenome mm10 UCSC アノテーション中に提供された遺伝子に対して表にした。CAD細胞ACSS2 ChIP-seq データをインプット対照に対して正規化し、一方で全てのヒストンアセチル化ChIP-seq データをH3-引き算した。図９Ｉ中のプロットは、未分化CADと分化CAD細胞における発現（レグレッサー）および分化CAD細胞におけるACSS2の濃縮（ターゲット）の間の関係を決定するための多重線形回帰を実施した結果である。その関係を用いて、ACSS2結合の傾向によるプロット中のネガティブスペースを着色した。インビボChIPでは、２匹の動物からの海馬組織を細かくミンチし、ホルムアルデヒド（１％最終濃度）を用いて室温で15分間架橋結合させ、続いて追加の10分間４℃でグリシンによるクエンチングを行った。単細胞懸濁液を作製するために、サンプルを氷冷PBSで１回洗浄し、次いで22ゲージ注射針を10回通過させることによってホモジナイズした。次のステップは、インビトロChIPに関して記載したのと同じ方法で実施した。インビボChIP ピーク（ACSS2 (T), H3K9ac, CBP-GSM1629373 およびH3K27ac-GSM1629397）を、１％にコントロールされた偽発見率（FDR）でMACS v2.1.0を使ってコールした。ピークスコアは、数百万の整列タグにアジャストし、そしてバックグランドを減算することにより評価した。トラックを同様に正規化し、そして最大値関数を有するUCSCゲノムブラウザを使って、そして５ピクセルで補正（スムージング）するか（インビトロChIP-seq）またはデフォルトパラメータを使って（インビボChIP-seq）視覚化した。図３Ｂ中のベン図は、最も近傍のTSSの１kb以内にあるChIP-seqピークを特徴づける遺伝子の重複（オフィシャル遺伝子シンボル）を示す。図３Ｅと図１１Ｂ中のベン図は、ChIP-seqピークの全セットに割り付けられた標的遺伝子セット（RefSeq転写物）の重複を示す。何故なら、CBPはTSSの１kb以内にある数個の遺伝子にだけ結合するためである。ホームケージ内の対照マウスのlog2変換した発現値の上に遺伝子をソートし、次いで１ kbの距離以内のTSSに最も近接したピークについての各遺伝子のChIP-seq AUCs（RPM調整ChIPマイナスRPM調整バックグラウンド、長さ調整済）を提示することにより、インビボmRNA発現対ChIP解析（図３Ｃ）関係を作製した（より遠位のピークを有する全ての遺伝子は、ゼロのスコアを有すると見なされた）。遺伝子標的は、TSSに近接したピーク（１kb以内）の存在により推定された。富化されたモチーフを同定するために（図３Ｆ）、分化CAD細胞においてアップレギュレートされたインビボACSS2ピークを標的とする遺伝子（最も近傍のTSSに対する距離については考慮せずに）を、HOMERを使って遺伝子リッチ領域から選択された同サイズの領域のバックグラウンドセットと比較した（ピークサイズは300 bpに固定した）。発見されたモチーフを、標的ピークの３分の１またはそれ以上の所に存在するもの、および遺伝子リッチバックグラウンドを上回る２倍以上の富化を有するものについてフィルターをかけた。ACSS2とヒストンアセチル化との重複（図７Ｆ、図７Ｇ）を評価するために、それらの最も近傍の標的遺伝子の上流のものだけを含むようにフィルターをかけた。下流のアセチル化は、同細胞からの同様にフィルタリングしたH3K9ac、H4K5acおよびH4K12ac並びに皮膚のH3K27acのピークについて評価した。インビボ分析（図３Ｂ）では、最も近位のTSSの１kb以内にあるACSS2 またはH3K9acピークの遺伝子標的を重複について調べた。誘導または阻害剤感受性遺伝子における分化によるアセチル化パターン（図３Ｄ、図７Ｐ）を、TSSの周囲に20 kbウィンドウを捕集し、そしてインプット調整ChIP-seqシグナルを測定することにより評価した。H3K9acデータを、CEAS（デフォルトパラメータ、TSSとTESの周辺の1-10 kbウィンドウを使用）を使って、ENCODEの共通反復ピークと比較することにより正当性を立証した。追加の比較は、H3K9ac (NCBI GEO: GSE82643) とH3K27ac (GSE82428)に対して行い、超音波効率について調整するためにインプット (GSE82659)に対比させた。皮膚のH3K27ac (NCBI GEO: GSM1629397) および CBP (GSM1629373) を、bowtie2 (パラメータ-k 1 -N 1-local)を使って、対応するインプット (GSM1629381)と一緒にアラインし、 MACS2（インプット対照、１％でFDR調整）を使ってピークをコールした（図３Ｅ、図11Ｂ）。ACSS2それ自体、H3K9acそれ自体、ACSS2＋H3K9ac、またはいずれも存在しない場合によって、標的とされる遺伝子の所でのホームケージ対照マウスにおける箱ひげ図での発現により、インビボでの遺伝子発現を標的とするヒストンアセチル化とACSS2との組み合わせ効果が証明された。ACSS2によるプロモーター（距離１kb）に結合した遺伝子のみを考慮した。
【０２３３】
アセチルCoA定量化
分化CADニューロンからアセチルCoAを抽出し定量するために、4×106個の細胞を溶解緩衝液中で30分間洗浄しインキュベートした (10 mM Tris pH 8, 1 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM DTT)。核を3,000g で５分間ペレット化し、すぐにPicoProbe Acetyl CoAアッセイキット（Abcam, ab87546）中に提供されたアセチルCoAアッセイ緩衝液中に再懸濁した。除タンパク工程を含むアセチルCoAアッセイは、製造業者の指示に従って準備した。PicoProbe アッセイを96ウェル透明底プレート中で実施し、生じた蛍光をSynergy HTX Multi-Mode マイクロプレートリーダー (BioTek Instruments製)を使って定量した。
【０２３４】
ウエスタンブロット
細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Life Technologies製, 型番78446)が補充された50 mM Tris pH 8.0、0.5 mM EDTA、150 mM NaCl、1％NP40、1％SDS中で溶解させた。細胞以下の分画実験のため、細胞を、製造業者の指示に従って、培養細胞用の細胞以下分画キット（Thermo Scientific製、型番78840) を使って処理した。タンパク質濃度をBCAタンパク定量アッセイ (Life Technologies製、型番23227)により測定し、そして等量のタンパク質を共免疫沈降実験に使用するか、またはポリアクリルアミドゲル上に直接充填した。内因性共免疫沈降実験は、抗体結合プロテインA Dynabeads (Life Technologies製)を使って、以下を含む緩衝液中で実施した：20 mM Tris、pH 8.0、137 mM NaCl、1 mM MgCl2、1 mM CaCl2、1％NP-40、10％グリセロール、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤、並びに12.5 U/mL ベンゾナーゼ(Novagen製, 70746)。タンパク質または共免疫沈降溶出液を12％ビス‐12％トリスポリアクリルアミドゲル(NuPAGE)上に充填し分離した。ニトロセルロース膜への転写後、0.1％Tween 20が補充されたTBS（TBST）中の3％BSAを用いて、室温で１時間膜をブロックした。一次抗体をTBST中で希釈し、４℃で一晩インキュベートした。一次抗体を下記の表に列挙する。膜をTBSTで各回10分ずつ３回洗浄し、次いでHRP結合二次抗体と共にTBST中で室温、１時間インキュベートした。膜を再び３回洗浄し、富士フィルム製LAS-4000イメージャーで画像化した。元のゲルブロットを図１４〜１６に提供する。
【０２３５】
免疫蛍光
細胞を室温で20分間PBS中の4％PFAで固定した。細胞をPBSで２回洗浄し、次いでPBS中の0.5％Triton X-100で10分間浸透性を高めた。２回洗浄した細胞をPBS中の10％BSAで室温にて１時間ブロックした。0.1％Tween 20が補充されたPBS中の5％BSA（PBST）中で細胞を一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。抗体を下記に列挙する。次いで細胞をPBSTで４回、各回10分間洗浄し、続いてPBST中5％BSA中で、フルオロフォア団と結合した二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。Alexa Fluor488ファロイジン（Thermo A12379）を使ってF-アクチンを標識した。次いで細胞をPBST中で３回洗浄し、PBSで１回洗浄し、そして１μg/mLのDAPIと共に５分間インキュベートした。次いでPBで洗浄し、細胞をProLong Gold (Invitrogen製)上にのせた。ニコン社製Eclipse顕微鏡を使ってスライドを観察し、画像を撮像した。顕微鏡設定はサンプル間で変更しなかった。
【０２３６】
抗体
使用した抗体は、抗-H3 (Abcam ab1791)、抗-H3K9ac (Abcam ab4441)、抗-H3K27ac (Abcam ab4729)、抗-H3K122ac (Abcam ab33308)、抗-H4 (Millipore 05-858)、抗-H4K5ac (Millipore 39-584)、抗-H4K12ac (Abcam ab1761)、抗-ACSS2 (T) (Thermo MA5-145810)、 抗-ACSS2 (CS) (Cell Signaling 3658)、抗-ACL (Proteintech 15421-1-AP)、抗-α-tubulin (Sigma T8328)、抗-GAPDH (Fitzgerald Industries 10R-G109A)、抗-KAT3A/CBP (Abcam ab2832)、抗-SNAP25 (Abcam ab5666)、抗-synaptophysin (Millipore MAB368)、抗-MAP2 C/D (Cell Signaling 8707)、抗-NR4A2 (Santa Cruz sc-991) および抗-NeuN (Millipore ABN78)であった。
【０２３７】
ウイルスベクターの頭蓋内注射
成体マウス(8+週齢)をイソフルランガス(手術面を維持するために1〜5％)で麻酔し、定位装置内の無菌フィールドに置いた。局所麻酔用にブピバカイン（2.5 mg/kg）の注射を行った後、マウスの皮膚をベタジン溶液で消毒し、そして無菌の手術器具を使って短い切開で頭蓋を露出させた。十分な潤滑を確保するため、人工涙を眼に適用した。定位固定および定位ドリルを用いて標的領域上の頭蓋に小孔（約0.5 mm）を穿設した。ウイルス性ベクターを充填したマイクロシリンジを背側海馬に挿入し、注射後（AP、-2.0 mm；DV、-1.4 mm；14 ML、±1.5 mm）にゆっくり取り除いた。ACSS2ノックダウンベクター、AAV2/9；U6.shACSS2.CMV.EGFP。全ての動物に誘導時の鎮痛剤として皮下メロキシカム（5 mg/kg）を単回投与し、必要に応じて術後２日間に渡り１日１回投与を行った。
【０２３８】
物体位置記憶試験
空間記憶を試験するために、物体位置記憶法を使用した。この手法は、訓練段階と試験段階から成る。訓練前に、各マウスを３日間に渡り１日３分間ずつ処置した。訓練日に、マウスを３つの異なる物体を入れたアリーナ（約１平方フィート）に置いた。使用した物体は、ガラス瓶、金属製タワー（h×w×l、5×2×2 インチ）およびプラスチックシリンダーであった。マウスを、黒と白の縞模様の空間キューを壁面に有する空のアリーナの中で馴らし、次いで３分間間隔で３回×６分間の試行で物体に暴露した。アリーナと物体は、試行の間に70％エタノールで消毒した。バイアスを減らすため、記憶試験は、対照とノックダウンマウスについて同一アリーナ中で同日に、物体位置の全組み合わせを使って実施した（試験群あたりn＝10匹のマウス）。24時間後、個々のマウスを試験段階に使用したアリーナに戻した。試験のため、物体のうちの１つをアリーナ中の別の位置に移動した。マウスに５分間自由に探査させた。各セッションを、ビデオカメラを使って記録し、各物体を探査（接近と匂いを嗅ぐ動作）するのに費やした時間をオフラインで評価した。全ての動物は、試験の前日に無作為抽出されてアリーナと物体に予め割り当てられ、確実に全ての処置群が全ての物体配置を探索できるようにした。
【０２３９】
文脈恐怖条件付け
マウスを条件付け用実験室に５分間入れ、その後、未条件付け刺激（US）である1.5 mAの連続足ショックを開始した。嫌悪条件付け刺激として穏やかな２秒間の1.5 mA足ショックを使用した：これはマウスに害を与えないが、条件付けに必要である一時的な衝撃的および嫌悪の刺激を提供する。実験室内で更に30分間後、マウスを元のホームケージに戻した。24時間後、試験が行われる実験室（文脈）に対する「すくみ応答」についてマウスを評価した。室内ですくみ状態で過ごす時間（呼吸の動きを除いて不動状態）を５分間連続して評価した。
【０２４０】
データ入手可能性
ChIP-seqおよびRNA-seqデータは、SuperSeriesアクセスコードGSE76854の下にGene Expression Omnibus (GEO) 格納庫から入手可能であった。実験の結果を以下に説明する。
【０２４１】
ACSS2はニューロン遺伝子発現を調節する
ニューロン中のACSS2の機能を、マウスのカテコールアミン産生細胞に由来するCath.-a-分化（CAD）細胞系を使って評価した。血清枯渇により、CAD細胞は分化してニューロン過程を形成し、機能的ニューロンと同様に興奮性状態になる (Qi, Y. 他、1997, J. Neurosci., 17:1217-1225)。免疫蛍光分析は、内因性ACSS2が未分化CAD細胞では主に細胞質にある（図１Ａ）が、分化と同時に大部分が核へと移行する（図１Ｂ、図５Ａ）ことを示した。ACSS2の全細胞および核内レベルは、CAD細胞のニューロンへの分化と共に増加し、一方で細胞質のACL発現は一定に保持された（図１Ｃ）。マウス脳からの初代海馬および皮質ニューロンでは、単離後１４日目であっても、ACSS2が主に核にあり、ACLは主として細胞質に存在していた（図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅ、図５Ｆ）。ACSS2は、ACLとは異なり、ニューロン分化の間は核に限局化されると結論づけられた。
【０２４２】
分化したCADニューロン中の標準のニューロン特異的タンパク質マーカーのアップレギュレーションに果たすACSS2の役割を調べた。ACSS2の分化前ノックダウンは、核NeuN、活性調節Nr4a2、並びに細胞質マーカーのスナプトフィジン、Map2およびSnap25の分化関連発現を減少させたが、ACLの付随増加は伴わず（図５Ｇ）、このことは、ACSS2がニューロン分化に重要な役割を果たすことを示している。
【０２４３】
mRNAシーケンシングによるCADニューロン分化時のトランスクリプトーム分析は、894のアップレギュレートされた遺伝子を同定した（図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ；表１）。GO解析は、それらの分化関連遺伝子が、ニューロン特異的であることを証明した；ここでGo termはニューロン分化、シナプス伝達、イオン輸送、およびニューロン突起形態形成（図７Ｅ）を含んでいた。活性依存性シグナル伝達およびシナプス可塑性を中心としたニューロンネットワークを形成する、タンパク質相互作用フレームワークが発見された：カルモジュリン１(Calm1)、グルタミン酸イオンチャンネル型受容体NMDA 型サブユニット１(Grin1)、およびイノシトール1,4,5−三リン酸受容体タイプ1 (Itpr1) (図７Ｄ）。Calm1は、Ca2+／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII（CaMKII）を含む、シナプス可塑性の間のCa2+による神経タンパク質の調節を媒介する。そのようなCa2+シグナル伝達は、グルタミン酸電位差イオンチャンネルのNMDA受容体サブタイプであるGrin1により、および細胞内Ca2+の貯蔵を結集するイオンチャンネルItpr1によっても調節され、これは学習の間のシナプス可塑性に基づく活性依存型シグナル伝達において重要な過程である。
【０２４４】
【表１−１】
2020535164.tif 000019
【表１−２】
2020535164.tif 000020
【表１−３】
2020535164.tif 000021
【表１−４】
2020535164.tif 000022
【表１−５】
2020535164.tif 000023
【表１−６】
2020535164.tif 000024
【表１−７】
2020535164.tif 000025
【０２４５】
代謝産物であるアセチルCoAは、ヒストンアセチル化のためのHAT酵素に必要である。CAD細胞のニューロンへの分化の間のヒストンアセチル化を調べるために、ヒストンH3のリシン9アセチル化(H3K9ac)、H4K5ac、H4K12acについて、ハイスループットDNAシーケンシング（ChIP-seq）を用いてクロマチン免疫沈降を行った（方法の欄を参照）。全ての記号は、アップレギュレートされたニューロン遺伝子（例えば、nudix型モチーフ1(Nudt1))（図６Ｆ）の位置で分化時に富化されたことを示す。全体的に、894個のアップレギュレートされた神経遺伝子は、他の全ての遺伝子よりも高いアセチル化を示した（図６Ｇ）。
【０２４６】
ACSS2またはACLのレベルは、細胞分化とRNA-seqの前に短いヘアピンRNA（shRNA）を使って低減された（図６Ｈ、図６Ｉ、図６Ｊ、図６Ｋ）。ACSS2ノックダウン細胞ではニューロン遺伝子の誘導が失われた（ピアソン係数＝0.15；図１Ｄ、図１Ｅ）が、一方でACLノックダウン細胞では同遺伝子が転写倍数変化に強い相関を保持していた（ピアソン係数＝0.53；図５Ｌ）。分化した野生型細胞中のアップレギュレートされた遺伝子の上位10％を五分位数に層別化した（図１Ｉ）ところ、ACSS2ノックダウンが全五分位数に渡ってアップレギュレートされることが分かった（図１Ｉ：緑色バー；P＝7.2×10-252、ウィルコクソン順位和検定）。ACL-ノックダウン細胞は、ACSS2-ノックダウン細胞における重度の欠損とは対照的に、野生型細胞と同じ上方傾向を示した（図６Ｍ； P＝1.1×10-25、ウィルコクソン順位和検定）。特に、ACL-ノックダウン細胞は、重症度の低い全ゲノム欠損を示したACSS2-ノックダウン細胞（図６Ｎ；P＝0.04、マン・ホイットニーＵ検定）とは異なり、より低い全ゲノム転写物レベル（P＝1.91×10-7、マン・ホイットニーＵ検定）を示した。従ってACLが遺伝子発現に対して広域であるが非特異的効果を有するのに対し、ACSS2は、CAD細胞のニューロンへの分化の際のニューロン遺伝子発現プログラムのアップレギュレーションに必要である。
【０２４７】
更に、ACSS2触媒活性がニューロン遺伝子発現プログラムに必要であるか否かをACSS2の小分子特異的阻害剤(ACSS2i)(Comerford, S.A.他、2014、Cell、159：1591-1602）を使って調べた。RNA-seqは、分化誘導遺伝子の減少を示し（図１Ｇ）、そしてその発現がACSS2-ノックダウンにより影響を受けた遺伝子も、ACSS2iに対して高い感受性を有した（図６О、P＝1.62×10-6）。
【０２４８】
ACSS2のクロマチンへの動員（リクルート）
ACSS2とクロマチンとの直接の関連を、分化したCAD細胞のChIP-seqを用いて調べた（方法の欄を参照）。２つのACSS2抗体が、ChIP-seq（MACS)重複ピークのモデルベース解析（スピアマン係数 r＝0.82；図７Ａ）と、1kbゲノムウィンドウのグローバル富化（スピアマン係数 r＝0.73；図７Ｂ）について高い相関性を示した。ACSS2の結合は、未分化CAD細胞に対して分化細胞において、例えばNudt1およびTab2（TAK1結合タンパク質２；図７Ｃ、図７Ｄ）のプロモーターの所で、ヒストンH3K9ac、H4K5acおよびH4K12acの増加と相関があった。両遺伝子は、神経変性疾患に関連付けられている；Nudt1ヒドロラーゼはプリンヌクレオシド三リン酸を酸化してRNAの取り込みを阻害し、そしてTab2はニューロン中のシグナル伝達経路を調節する（Sardi、S.P.他、2006、Cell、127：185-197）。遺伝子オントロジー解析は、ACSS2ピークに近接した遺伝子が神経分化に関連があることを示した（図７Ｅ）。よって、クロマチンに会合したニューロン遺伝子プロモーターに近位のACSS2が、HAT酵素へのアセチルCoAの局所的供給源となりうる。
【０２４９】
ヒストンアセチル化に関するACSS2結合を調べたところ、最も近位の標的遺伝子の上流にあるACSS2ピークの80％がアセチル化ピークと重なっているか、または標的転写開始部位（TSS；図７Ｆ、図７Ｇ）に向かう下流にアセチル化ピークを有していることが判明した。相当数（ゲノム規模での全ACSS2ピークの13〜15％）が、H3およびH4アセチル化のピークとまさに重なっていた（図７Ｈ）。加えて、ACSS2ピークの高さは、交差したヒストンアセチル化ピークと全体的に相関していた（図７Ｉ、図７Ｊ、図７Ｋ）。このピーク高さの相関は、H4アセチル化がACSS2由来のアセチルCoA、特にH4K12acに対して最も敏感であることを示唆しており、ここでH4K12acは加齢による記憶形成の欠損に関連づけられている標識である（Peleg、S．他、2010、Science、328：753-756）。一般に、最も富化されたACSS2ピークは、最も強いヒストンアセチル化濃縮を示した(図７Ｌ、図７Ｍ、図７Ｎ)。
【０２５０】
転写因子結合によるACSS2の推定上の動員（リクルート）は、ACSS2 ChIP-seqピーク全体に渡る新生（de novo）モチーフの発見を使って調査した。これは、神経転写因子について予測される結合配列を明らかにした。最も富化されたモチーフは、Yin Yang 1 (YY1)（図７Ｏ；P＝１×10-599）であり、この結果はACSS2が触媒HAT活性を刺激するという考えと一致した。ここで前記モチーフは２個のアセチルCoA依存性HAT酵素CREB-結合タンパク質(CBP)およびE1A結合タンパク質(p300)(17)を動員するモチーフである。
【０２５１】
初期ピーク分析は、ACSS2またはアセチル化の全てのピークを同定したわけではなかった（図８Ａ、図８Ｂ）ので、遺伝子本体の濃縮を分析したところ、海馬の長期増強（LTR; long-term potentiation）と空間的学習に必要とされるCaMKIIα鎖をコードする、Camk2aのような、更なる顕著な例が認められた。ACSS2およびアセチル化共占有率プロファイルは、Camk2aとNudtlで同様であった（図７Ｃ）。メタ遺伝子解析は、ACSS2濃縮遺伝子の上位5％が、全遺伝子の平均よりも最大３倍高いアセチル化レベルを有し（図９Ａ、図９Ｂ、図９Ｃ、図９Ｄ）、そして異なるACSS2結合において最大倍率変化を有する遺伝子が、最高のヒストンアセチル化レベルを有することを示した（図２Ｃ；図９Ｅ、図９Ｆ、図９Ｇ、図９Ｈ）。GO term（遺伝子オントロジー語彙）の富化は、ACSS2に結合しアセチル化した最上位の遺伝子がニューロン特異的なものであることを示した（図２Ｂ）。
【０２５２】
全ての誘導遺伝子において、ACSS2結合はヒストンアセチル化の増加と同時に起こり（図７Ｐ）、ACSS2i処置により減少した発現を示した299個の遺伝子は、ヒストンアセチル化における最大の分化関連の増加を有するものであった。合計で、神経分化に以前関連付けられた遺伝子（ND遺伝子、1,315遺伝子のAmiGOアノテーションセット）の約９％が、分化したCAD細胞において誘導され、それらの誘導遺伝子は、ACSS2i処置に対して例外的に感受性であった（図２Ｅ、「Induced」）。更に、全てのND遺伝子クラスは、分化したCAD細胞において発現に変化はなかったが、ACSS2i処置によってそれらの発現が著しく低減された（図２Ｅ、「ND genes」）。分化関連遺伝子発現の変化とクロマチンへのACSS2動員との間の相互作用を、複数の線形回帰分析を用いて可視化した。すると、より高いACSS2富化（赤色）と増加した遺伝子発現との間に顕著な関連性が認められた（図９Ｉ）。全体として、CAD細胞ゲノムデータは、ヒストンアセチル化の増加に関連付けられたニューロン遺伝子の動的ACSS2富化と、ニューロン遺伝子の転写アップレギュレーションへの関与を証明する。
ニューロンのヒストンアセチル化におけるACSS2機能
【０２５３】
ACSS2ノックダウン細胞（図２Ｆ；平均Δ＝-0.19±0.03、P＝0.003）およびACSS2iで処置した細胞（図２Ｆ；平均Δ＝-0.25±0.05、P＝0.006）において核アセチルCoAレベルを測定したところ、アセチルCoAレベルが同様に減少することが判明した。この知見は、ACSS2酵素活性が核アセチルCoAを供給するという理論を支持する。転写関連のH3K27acおよびH3K9acの網羅的ヒストンアセチル化レベルは、ACSS2ノックダウン細胞において減少し（図２Ｇ、図10Ａ）、これらの標識は、海馬LTPおよび長期記憶において役割を果たす転写コアクチベータCBPおよびp300（18）の主要基質である。ACSS2は、アセチル化クロマチン、具体的にはH3K9ac、H3K27acおよびH4K12ac（図10Ｂ）、並びにCBP（図２Ｈ）と共に共免疫沈降し、このことは、ACSS2が、インビボでの記憶形成の間にヒストンアセチル化を増加させる転写活性遺伝子の所でクロマチンと結合することを示唆している（Wood、M.A.他、2005、Lean. Mem.、12：111-119；Korzus、E.他、2004、Neuron、42：961-972；Vecsey, C.G.他、2007、J. Neurosci. 27：6128-6140）。
【０２５４】
ACSS2を、重要な記憶関連のニューロン遺伝子の脱分極と発現についての能力を考慮して、初代マウス海馬ニューロンにおいて調査した。ACSS2は核に局在し（図２Ｉ）、ACSS2i処置は、ACSS2レベルを低下させることなく、神経マーカー発現とヒストンアセチル化を減少させた（図２Ｊ、図10Ｃ）。ACLの発現は変化しなかった（図２Ｊ）。このことは、海馬ニューロンにおけるヒストンアセチル化の調節において、ACLがACSS2ほどには重要でないことを示している。
【０２５５】
ACSS2とH3K9acのクロマチン会合を、マウス海馬においてChIP-seqを用いてインビボで評価した。海馬H3K9acマッピングは、ENCODEマウス前脳H3K9ac ChIP-seqと強く相関し（重相関のスピアマン係数 R＝0.67)、同様なピーク分布を有した（図11Ａ）。海馬ACSS2とH3K9acは、全ゲノムで一致し、記憶に関与する３つの基準ニューロン遺伝子（Arc、Egr2およびNr2f2；図３Ａ、図３Ｂ）に渡り一致する。また、ACSS2プロモーター結合とH3K9acは海馬のRNA-seqと相関した（図３Ｃ）。ACSS2またはH3K9acが富化されていない遺伝子と同様に、ACSS2に結合しているがH3K9acが富化されていないサイレントな少数の遺伝子が見出された（図３Ｄ）。これとは対照的に、H3K9acが富化された遺伝子が活発に転写されたが、ACSS2とH3K9acの両方が富化された遺伝子が最も高く発現された（図３Ｄ）。
【０２５６】
分化したCAD細胞でのACSS2とCBPの物理的会合（図２Ｈ）は、HK27acと共に、海馬でのACSS2とCPBの遺伝子共局在化と相関した（公開されているマウス皮質CBPおよびH3K27acのChIP-seqデータから；ACSS2：CBP重複P＝3.23×10-16、超幾何学的検定法による）。全体的に、ACSS2結合遺伝子の57％がH3K27acにより同時標的され（図３Ｅ）、ACSS2とCBPで同時標的される遺伝子は、シナプス膜電位に関与する遺伝子オントロジーtermが富化された（図11Ｂ、図11Ｃ）。海馬ACSS2ピークのモチーフ分析は、Nrfl（神経突起成長を調節する転写因子）が、ACSS2部位の45％での結合を予測し（図３Ｆ）、ACSS2-CBP補充メカニズムを惹起することを示す。更に、ACSS2i感受性遺伝子（50％：289中の145）は、TSSの10 kb以内に近接したACSS2を有し（超幾何学的分析、P＝7.6986×10-8）、転写の際のクロマチン結合型ACSS2に対する直接的な役割と一致していた。
【０２５７】
ACSS2は長期記憶保存を調節する
海馬依存性空間記憶は、部分的にはエピジェネティック修飾、具体的にはヒストンアセチル化を通して連係された、遺伝子発現の活性依存性変化を通して起こる（Barrett, R.M.他、2011、Neuropsychopharmacology、36：1545-1556；Graff, J.他、2012、Nat. Commun. 3：991）。ACSS2は、海馬全体にわたって発現され（Lein, E.S.etal、2007、Nature、445：168-176；Ariyanet, P.S.他、2010、J. Comp. Neurol., 518：2952-2977）（図12Ａ）、従って記憶の固定の間にニューロン遺伝子発現をアップレギュレートするようにヒストンアセチル化を媒介することができる（図12Ａ）（Barrett, R.M.他、2011、Neuropsychopharmacology、36：1545-1556；Maren, S.他、2000、Behav. Brain Res. 110：97-108）。成体海馬におけるACSS2の役割を調査するために、ウイルスベクターを用いたshRNAノックダウンにより背側海馬においてACSS2発現を減弱化させた（図４Ａ、図４Ｂ）。対照注射マウスと比較して、ACSS2ノックダウンマウスは、オープンフィールド試験中に同様なレベルの活動、協調、体重、および不安に関連した接触走性を示した（Stanford, S.C., 2007、J. Psychopharmacol. 21：134-135）（図12Ｂ、12Ｃ、12Ｄ；有意でない、グループ当たりn＝10）；従って、ACSS2ノックダウンは、全体的な挙動変化を引き起こさなかった。
【０２５８】
海馬依存性空間記憶を評価するために、物体位置記憶パラダイムを使用した（Balderas, I,他、2008、Learn. Mem., 15：618-624）。動物は訓練中に３つの異なる物体を探索し、そして１つの物体を別の位置に移動した24時間後に、再暴露により長期記憶を試験した（図４Ａ、右）。訓練において、対照マウスとノックダウンマウスは探査指数に全く差がなかった（図４Ｃ、左）。記憶検索の間、対照マウスは、移動させた物体の探査の増加を示した（図４Ｃ）。対照的に、ACSS2ノックダウンマウスは、空間的物体記憶に障害があり（図４Ｃおよび図12Ｅ、平均Δ＝-5.01±1.21；P＝8.3×10-5）、より低い識別指数を示した（図４Ｄ；％ΔDI＝-29.5±11.4；P＝0.02）。ACSS2ノックダウンマウスは、試験中に全ての物体探索の減少を示し（図４Ｃ）、このことは、訓練セッションから物体の完全認識に関連した新奇性（新規探索行動）の低下を示唆している（平均Δ＝-6.13±2.15；P＝0.02、n=10／群）。
【０２５９】
以前の研究は、訓練前に背側海馬の操作が起こると、腹側海馬によって特定の状況による長期恐怖記憶（contextural fear memory）が媒介されることを示している（Rogers, J.L.他、2006、Neurobiol. Learn. Mem., 86：72-81）。従って、対照実験として、背側海馬にACSS2ノックダウンshRNAまたはeGFPを注射したマウスを、特定の状況による恐怖条件付けパラダイムに供した。24時間の試験期間中、ACSS2ノックダウンマウスとeGFPマウスとの間に凍結挙動の量に有意な差は認められなかった（図12Ｆ、図12Ｇ）。このことは、腹側海馬が状況とショックの連関を首尾よく媒介したことを示唆する。全体として、ACSS2が背側海馬により媒介される長期空間記憶に重要な役割を果たすと結論づけられた。
【０２６０】
ACSS2は、最初期遺伝子のアップレギュレーションを調節する
長期空間記憶は、迅速なヒストンアセチル化と最初期遺伝子転写の増加が感受性時間ウィンドウにおいて起こることを必要とし、それにより記憶の固定を可能にする（Barrett, R.M.他、2011、Neuropsychopharmacology、36：1545-1556；Peixoto, L.L.他、2015、BMC Genomics, 16:S5）。記憶検索の間に、記憶の再固定のために遺伝子転写が起こるが、これは感受性検索後の期間中のmRNA合成を阻害することにより防止することができる（Mamiya, N.他、2009、J. Neurosci. 29：402-413）。ACSS2が海馬での記憶の固定および再固定のための動的遺伝子アップレギュレーションに関与するかどうかを、背側海馬上でmRNA-seqを実行することにより試験した。全ゲノム規模では以前に研究されたことがなかった空間物体訓練により誘発されるグローバルな遺伝子発現の変化を初めて同定した。対照マウスおよびshACSS2-ノックダウンマウスから、空間物体訓練後の記憶の固定の感受性期間の間に背側海馬を取り出した。概日振動を制御するために、処置されているが訓練されていない注射動物を試験に含めた。
【０２６１】
訓練後に差次的に発現された遺伝子（発現変動遺伝子）を、訓練してない概日制御-注射マウスに対する訓練後の対照注射マウスのCuffdiffを使ったトランスクリプトーム比較によって、同定した。訓練直後に少数の遺伝子が誘導され、それにはEgr2、Fos、Nr2f2、SgklおよびArcのような最初期遺伝子が含まれた（図４Ｅ）。重要なことに、訓練してない対照マウスとACSS2-ノックダウンマウスにおけるそれらの記憶関連遺伝子のベースライン発現は、著しく類似していた（図12Ｈ）。対照的に、訓練によるこれらの最初期遺伝子の動的アップレギュレーションは、ACSS2ノックダウンによって大幅に低減された（図４Ｅ）。
【０２６２】
更に、ACSS2が、記憶の再固定中の背側海馬での最初期遺伝子発現も調節するかどうかを試験した。従って、記憶検索後にアップレギュレートされるようになる、以前に同定され正当性を立証された遺伝子に絞って、海馬mRNA-seq解析を実施した（Peixoto, L.L.他、2015、BMC Genomics, 16:S5；Poplawski、S.G.他、2014、Neurobiol. Learn. Mem., 116：90-95）。感受性再固定期間の間の最初期遺伝子の検索関連誘導は、ACSS2ノックダウンによって阻止され、その一方で、同じ期間中の検索関連のダウンレギュレーションは阻止されなかった（図13Ａ、図13Ｂ、図13Ｃ、図13Ｄ、図13Ｅ、図13Ｆ）。
要約
【０２６３】
代謝状態は、特にヒストン修飾を誘導することにより、クロマチン構造を調節することができる（Gut, P.他、Nature, 502：489-498)。ここで、細胞代謝と神経可塑性との間に連関が樹立され、そしてヒストンアセチル化と遺伝子発現を刺激するクロマチン結合転写コアクチベータとしてのACSS2の神経的な機能が明らかにされる。
【０２６４】
アセチルCoA代謝は細胞および組織特異的であり、悪性形質転換されるとしばしば調節不能である（Commerford, S.A.他、2014、Cell、159：1591-1602；Mashimo, T.他、2014、Cell、159：1603-1614）。脂肪細胞では、ACSS2は部分的に核に局在し、低グルコース条件下でヒストンアセチル化に寄与する（Wellen, K.E.他、2009、Science、324：1076-1080；Gao, X.他、2016、Nat. Commun. 7：11960）が、ヒストンアセチル化の主要な代謝決定基はACL9である。これに対して、本明細書では、有糸分裂後ニューロンがクロマチンに動員されるACSS2に依存し、アセチルCoAをヒストンアセチル化に供給することが示される。特に、絶食は、ほとんどの組織においてアセチルCoAおよびタンパク質のアセチル化を低下させるが、脳内ではアセチルCoAレベルは変化しないままである（Marino、G.他、2014、Mol. Cell, 53：710-725）。このことは、クエン酸塩依存性ACLによりアセチルCoAの産生が低減されると、ニューロンのACSS2が絶食状態で重要な役割を果たすことを示す。
【０２６５】
最適アセチルトランスフェラーゼ活性は、局所アセチルCoA対CoA比の増加を必要とし、これはHAT酵素の触媒活性と基質特異性を決定する(Cai, L.他、2011, Mol.Cell. 42：426-437；Wellelen、K.E.他、2009、Science、324：1076-1080；Takahashi, H.他、2006、Mol. Cell、23：207-217）。この知見は、核アセチルCoAのレベルを変化させることによりヒストンアセチル化を制御できることを示唆している。したがって、クロマチン結合ACSS2は、アセチルCoAを提供してHAT活性を局所的に刺激することができ、それにより即座にCoAを再循環させ、そして脱アセチル化反応から酢酸塩を再捕獲することもできる。本明細書に提示されるデータは、ニューロン遺伝子におけるACSS2による特異的クロマチン結合、並びに空間記憶におけるヒストンアセチル化と遺伝子転写のアップレギュレーションへのリンク局在化を実証し（図４Ｆ）、これは増加したヒストンアセチル化を必要とする（Graff、J.他、Nat. Rev. Neurosci. 14：97-111；Graff、J.他, 2012、Nat.Commun. 3：991）。神経可塑性および記憶の重要な機能を有する最初期遺伝子のアップレギュレーションにおいてACSS2 が重要な役割を果たすことが実証され、それは長期の記憶の固定におけるこの分子の重要な役割につながる。
【０２６６】
神経機能および挙動の重要な調節因子として、エピジェネティック機構が明らかになりつつあり、不安障害やうつ病を含む神経精神病に関係づけられている（Kandel, E.R.他、2014、Cell、157：163-186；Graff, J.他、2013, Nat. Rev. Neurosci. 14：97-111；Walker, D.M.他、Curr. Opin. Neurobiol、30：112-121）。代謝環境および神経クロマチンの界面における重要な調節因子としてACSS2を確立する際に、本実施例は、神経および認知障害を治療するための治療法の開発のための以前に認識されていない酵素標的を提供する。
実施例２：ACSS2およびアルコール
【０２６７】
酢酸塩の生理的供給源としては、(1)アセチル化タンパク質、(2)大腸内の細菌発酵、および(3)摂取したエタノールがある。しかしながら、アルコールが神経クロマチンに向かうことになるかは不明である（図17）。
【０２６８】
急性アルコール投与の効果を研究するために、マウスにEtOH-13C2を腹腔内注射し、短時間での大量飲酒（binge drinking）を模倣した。質量分析を用いて肝臓および脳ヒストンのアセチル化を測定した。重質Ｃ（重質炭素の）酢酸塩は、IP注射後１時間までに肝臓および脳ヒストン中に取り込まれた（図18）。
【０２６９】
次に、海馬アセチル化ヒストンへの重質Ｃ酢酸塩の取り込みのためにACSS2が必要であるか否かを調べた。背側HPCにおけるACSS2 KDは、背側HPC中への取り込みの低下(4h)を引き起こす。レーダープロットは、(軽質のものと比較した）重質同位体の相対量を表示する。重質同位体は、腹側海馬と筋肉においてのみ、野生型と比較してノックダウンマウスにおいて高くなった。背側海馬では、それはWTマウス（未標識EtOHを注射したマウス）と同じ位低レベルに維持された（図19−20）。
【０２７０】
実施例３：肝臓アルコール代謝は、脳内のヒストンアセチル化を直接刺激する
成体の脳では、遺伝子発現のエピジェネティック制御が神経活性の処理において重要な役割を有する。新たな証拠は、エピジェネティック調節が代謝状態に依存し、挙動を支配する神経機能に特異的な代謝因子に関係することを示唆している。ニューロンでは、ヒストンアセチル化は、クロマチン結合型ACSS2によって酢酸塩から産生される代謝物であるアセチルCoAに依存している（News他、Nature、2017、546：381-386）。ここでは、生体内安定型同位体標識を用いて、ACSS2依存形式においてアルコール由来のアセチル基をヒストンに直接沈着させることにより、肝アルコール代謝が脳内のヒストンアセチル化を迅速に刺激することが示される。同様の誘導が、生体内での重質標識した酢酸塩注射でも観察された。また、妊娠中マウスへの標識アルコールの注入は、母体内胎児の脳への標識アセチル基の取り込みをもたらす。インビトロでの単離された初代海馬ニューロンにおいて、ACSS2阻害に対し感受性であった細胞外酢酸塩誘発の学習・記憶関連転写プログラムが発見された。これらの知見は、肝臓アルコール代謝と神経ヒストンアセチル化との間の新奇で直接的な連関（リンク）を確立し、肝臓代謝からニューロン中のエピジェネティック調節へ向かう動的シグナル伝達のための最初の証拠を提供する。
【０２７１】
アルコール中毒の神経生物学に関する現存の研究は、辺縁系報酬回路、神経伝達の変化、および細胞内神経シグナル伝達カスケードに焦点を当てている。しかしながら、アルコールがその精神作用効果を発揮する正確なメカニズムは完全に理解されていない。アルコールは神経チャネルタンパク質と直接相互作用するが、この経路は、脳機能に及ぼすアルコール中毒の様々な影響を説明することができない（Ron他、Nat. Publ. Gr., 2016, 17：576-591）。実際、最近の研究は、調節不能な遺伝子発現が、標的組織に対するアルコール作用の主要な分子機構であるという概念に集中している（Ron他、Nat. Publ. Gr., 2016, 17：576-591；Zakhari、Alcohol Res、35：6-16）。脳においては、遺伝子発現のエピジェネティック調節が、神経活性の統合を可能にし、それにより回路接続を連続的に適応させることができ、適当な行動の発現またはアルコール中毒の場合には不適切な行動の発現に決定的な重要性をもつ（Ron, Nat. Publ. Gr., 2016、17：576-591；Mews他、Prog. Brain Res., 2017, 235：19-63；Robinson他、Nat. Rev. Neurosci., 2011, 12：623-637；Egervari他、Neurosci. Biobehav. Rev., 2018, 85：117-125）。新たな証拠は、そのようなエピジェネティック調節が代謝状態に依存することを示唆している。実際に、海馬の記憶形成を制御するヒストンアセチル化が、クロマチン結合型ACSS2によって酢酸塩から生産される代謝産物であるアセチルCoAに依存することが最近示された（Mews他、Nature、2017、546：381-386）。特に、酢酸塩の主な生理的供給源は、肝臓におけるアルコールの分解を介するものであり、それは血中酢酸濃度を増加させる（Sarkola他、Alcohol. Clin. Exp. Res., 2002, 26：239-245）。従って、ニューロンのヒストンアセチル化は、酢酸塩の細胞外レベルの影響下にある可能性がある（Soliman他、Mol. Cell. Biochem., 2011, 352：173-180）。しかし、肝アルコール代謝が脳内のヒストンアセチル化に直接影響を及ぼすかどうかは不明である。
本発明の方法および材料を以下に説明する。
【０２７２】
ヒストン抽出
細胞を、核単離緩衝液（NIB）（15 mM Tris-HCl、15 mM NaCl、60mM KC1、5 mM MgCl2、1 mM CaCl2、250 mMショ糖、pH7.5、および0.5 mM AEBSF、10 mM酪酸ナトリウム、5 nMマイクロシステイン、1 mM DTTが新たに添加された）中で0.2％NP-40と共に氷上で５分間インキュベートした。４℃で５分間700×gで遠心分離することにより核を回収した。得られた核ペレットをNP-40を含まない同体積の核分離緩衝液で２回洗浄した。次いで４℃で３時間攪拌しながら0.2 M H2SO4で酸抽出した。不溶性核デブリを、４℃で５分間3400×gでペレット化し、上清を保持した。次に、100％トリクロロ酢酸(TCA)を1：3 (v/v)の割合で添加することにより４℃で１時間ヒストンタンパク質を沈殿させた。ペレットをアセトンで洗浄して酸残渣を除去した。ヒストンを50 mM NH4HCO3 (pH8.0)の30μL中に再懸濁させた。
【０２７３】
ヒストンのプロピオニル化および消化
試料を、1：3（v/v）の比で、プロピオン酸無水物とアセトニトリルからなる15μLの誘導体化混合物と混合し、直ちに7.5μLの水酸化アンモニウムでpH 8.0を維持した。試料を37℃で15分間インキュベートし、乾燥させ、同じ誘導体化手順をもう１回繰り返した。次いで、試料を50 mM NH4HC03中に再懸濁し、トリプシンと共に室温で一晩インキュベートした（酵素：試料比1：20）。消化後、誘導体化反応を再度２回行い、ペプチドＮ末端を誘導体化した。LC-MS分析の前にC18 ステージチップを用いて試料を脱塩した。
【０２７４】
ナノLC-MS/MS
試料をナノLC-MS/MSセットアップを用いて分析した。ナノLCは、EASY-nLC nano-HPLC（Thermo Scientific、San Jose、CA、USA）を使用して、自社で充填した75μm ID×25 cmのReprosil-Pur （商標）C18-AQ（3μm; Dr. Maisch GmbH, ドイツ）ナノカラムを用いて構成された。HPLC勾配は以下の通りであった：45分間に渡る５％〜32％溶媒Ｂ（溶媒Ａ＝0.1％ギ酸；溶媒Ｂ＝80％アセトニトリル、0.1％ギ酸）に続き、５分間で32％〜90％溶媒Ｂ、次いで10分間90％Ｂ；300 nL/分の流速。ナノLCは、Orbitrap Elite（商標）質量分析器（Thermo Scientific、San Jose、CA、USA）に接続された。取得方法は、記載されたようにデータ独立性取得(DIA)であった。簡単に述べると、２つのフルスキャンMSスペクトル（m/z 300-1100）をDIA負荷サイクル内でイオントラップにおいて取得し、50 Daの分離ウィンドウを用いて16 ms/msを実行した。正規化衝突エネルギー(CE)は35％に設定された。
【０２７５】
データ解析
生のMSデータを手動で分析した。アセチル化を含むヒストンH3およびH4のうち最強の７つのペプチドを選択し、４番目の同位体の相対存在量を抽出した（モノアイソトピックシグナルと比較して）。その他のペプチドは、それらの存在量が低いため、全ての同位体の相対的存在量を正確に定量することができなかったために、考慮に入れなかった。
【０２７６】
RNAシーケンシング
全てのRNA-seqデータを以下のように分析用に調製した：NextSeqシーケンシングデータを、BaseSpace上の天然appsを使用して逆多重化した。逆多重化FASTQをRNA-STAR 2.5.2によりアラインし、mm10 (GRCm38)にアセンブルした。アラインされた読みを、HTSeq 0.6.1.（商標）を用いてゲノム特徴へと対応させた（マッピング）。定量化、ライブラリーサイズ調整および示差的遺伝子発現分析は、DESeq2およびワルド検定（阻害剤処置細胞または未処置細胞における酢酸塩とDMSO処置の間の一対比較に続き、示差的に発現された遺伝子のセット重複）を使用して行った。超幾何学的試験を用いて、遺伝子リストの重複を有意性について検定した。
【０２７７】
機能分析
FDRカットオフが10％であるDAVID（商標）を用いて、10遺伝子未満、またはバックグラウンドを超える2.5×倍濃縮未満のフィルタリングカテゴリを有する、遺伝子オントロジー解析を実施した。300 bpの固定ウィンドウを用いたプロモーターの位置にH3K9aを有する酢酸塩に感受性の遺伝子をターゲッティングする（最も近傍のTSSにより）公開インビボデータ（Mews他、Nature、2017、546：381-386）からの全ACSS2ピークについて、HOMER v4.6を使ってモチーフ解析を行った（Mews他、Nature、2017、546：381-386）。 
【０２７８】
マウス実験
８週齢の成体雄マウスまたはE18.5妊娠雌マウスを使用した。エタノール、エタノール-d6、および酢酸ナトリウム-d3（Sigma-Aldrich）を腹腔内(ip)注射により投与し、2 g/kg(生理食塩水中の20％溶液、Stericup GVフィルターを通してろ過したもの）で投薬した。Cunningham et al.に従って、条件付け場所嗜好性（CPP）を実施した。簡単に説明すると、外形寸法35×18×29 cmを有するUgo Basile (Italy) マウスCPP実験箱（型番：42553）を使用した。この装置を、壁と床の模様が異なる２つの区画（16×15×25 cm）に分割した。縞模様の壁を円形の切り抜き（1 cm）と組み合わせ、そして無垢の灰色の壁を正方形の切り抜き(0.5 cm)と組み合わせた。訓練は周囲温度、暗室中で実行した。実験箱は動物ごとに70％エタノールで消毒した。パラダイムは、馴化日（中立環境で５分間の探査）１日、予備訓練セッション（20分間）１日、訓練日（偏りのある対象割り当て、５分間のセッションの直前に生理食塩水またはエタノールi.p.投与の交互セッション）８日、および訓練後試験セッション（20分）１日から成った。条件付け区画の中で消費した時間を測定した。シャピロ・ウィルク（Shapiro-Wilks）検定を用いて正常分布を評価し、そしてマン・ホイットニー（Mann-Whitney）検定を用いて学習を判定した。
【０２７９】
ウイルスベクターの頭蓋内注射 
成体マウス(8+週齢)をイソフルランガス(手術面を維持するために1〜5％)で麻酔し、定位装置内の無菌フィールドに置いた。局所麻酔用にブピバカイン（2.5 mg/kg）の注射を行った後、マウスの皮膚をベタジン溶液で消毒し、そして無菌の手術器具を使って短い切開で頭蓋を露出させた。十分な潤滑を確保するため、人工涙を眼に適用した。定位固定および定位ドリルを用いて標的領域上の頭蓋に小孔（約0.5 mm）を穿設した。ウイルス性ベクターを充填したマイクロシリンジを背側海馬に挿入し、注射後（AP、-2.0 mm；DV、-1.4 mm；14 ML、±1.5 mm）にゆっくり取り除いた。ACSS2ノックダウンベクター、AAV2/9；U6.shACSS2.CMV.EGFP。誘導時の鎮痛剤として皮下メロキシカム(5 mg/kg)を単回投与し、必要に応じて術後２日間に渡り１日１回投与を行った。
【０２８０】
その結果を以下に説明する 
肝臓アルコール分解からの酢酸塩が、脳における動的ヒストンアセチル化を刺激する（供給源となる）か否かを決定するために、タンパク質アセチル化のインビボ安定同位体標識を用い、質量分析法(MS)によりモニターした（Mews他、Methods Enzymol. 2016、574：311-329）。具体的には、マウスに、2 g/kgの重水素化エタノール(d6-EtOH)または対照の生理食塩水を腹腔内に投与し、アセチル化ヒストンへの重水素の取り込みをベースライン、並びに腹腔内注射後１時間および４時間後に評価した（図21Ａ、下図）。先進型定量液体クロマトグラフィー-MS技術を使用して、脳および末梢組織における同位体標識ヒストンアセチル化の相対量を定量した（図21Ａ、上図）。EtOH由来のアセチル基は、海馬および前頭前野皮質の両方において脳内ヒストンアセチル化に急速に取り込まれた（図21Ｂ、図21Ｃ、図22Ａ〜22Ｄ）。ヒストンアセチル化への標識取り込みは動的であり、重質標識は腹腔内（i.p.）注射から８時間後に基準レベルへと減少した。アルコール代謝の主要部位であり、高レベルのACSS2を発現することが以前に示されている（Zakhari、Alcohol Res., 2013, 35：6-16；Comerford他、Cell, 2014, 159：1591-1602）肝臓において、同様な応答が生じた（図21Ｄ）。対照的に、ヒストンアセチル化のこのような迅速な標識は、比較的低いレベルのACSS2を発現する骨格筋（m.gastrocnemius、図21Ｅ）においては観察されなかった。
【０２８１】
脳内のアルコール依存性アセチル化におけるACSS2の直接的役割を調べるために、背側海馬(dHPC)でのACSS2発現を、以前に検証されたウイルスベクターを用いたshRNAノックダウンによって減衰させた（Mews他、Nature, 2017, 546：381-386）。これらのACSS2ノックダウン(KD)動物において、重質アルコール由来ヒストンアセチル化を別々に比較し、dHPCではACSS2は減少され(ACSS2 KD)、腹側海馬(vHPC)ではACSS2は正常に発現された。驚くべきことに、ACSS2 KDは、ヒストンアセチル化へのアルコール由来重質アセチル基の取り込みを阻害した（図23Ａ）。対照的に、同じ動物で、重質標識のvHPC取り込みは影響を受けなかった（図23Ｂ）。これらの生体内データは、肝アルコール代謝に由来する酢酸塩が脳に輸送され、ヒストンアセチル化へと容易に取り込まれることを示している。特に、肝臓で大量のアルコール代謝が発生しても、酵素カタラーゼとCYP2E1を介して脳内でアルコール画分を酢酸塩に変換することができる（Zimatkin他、Alchohol. Clin. Exp. Res、2006、30：1500-1505）。従って、脳内のヒストンアセチル化への細胞外酢酸塩（アセテート）由来アセチル基の寄与を評価した。2 g/kgの重水素化酢酸（d3-酢酸塩)を腹腔内注射したマウスにおいて、脳ヒストンアセチル化への迅速な標識取り込みが、海馬および皮質の両方において同様のレベルで検出された（図23Ｃおよび図23Ｄ）。注目すべきことに、相対的標識は30分目に最大であり、注射後４時間でバックグラウンドレベルに戻った。このことは、酢酸塩由来のアセチル基の迅速な取り込み、並びに脳ヒストンアセチル化の迅速な代謝回転を示している（図23Ｃおよび23Ｄ）。まとめると、これらのデータは肝アルコール代謝からの血中酢酸塩濃度の増加（図23Ｅ、左）が、脳におけるACSS2媒介動的ヒストンアセチル化（図23Ｅ、右）を刺激することを証明する。
【０２８２】
次に、海馬遺伝子発現を調節することにおけるACSS2依存性ヒストンアセチル化へのアルコール由来酢酸塩の機能的関連性を調べた（図23Ｅ、右）。野生型(WT)マウスへのアルコール投与は、H3K9acおよびH3K27acピークの顕著な富化を引き起こすことが分かった。驚くべきことに、この応答はACSS2 KD動物では排除され、dHPC中でのEtOH処置によって有意なレベルのH3K9acピークおよび有意な量のH3K27acピークを誘導することができなかった。次いで、転写応答を特徴付けるためにRNA-seqを実施し、EtOH処置WT動物においてH3K9acおよびH3K27acが、遺伝子発現をゲノム規模で作動させることが見出された。しかしながら、ChIP-seqデータとの関連では、この応答はACSS2 KDマウスにおいて著しく鈍化された。まとめると、インビボの知見は、アルコール投与が、ACSS2依存的方式でhHPCでのヒストンアセチル化および転写活性の増加をもたらすことを強く示唆している。アルコールおよび酢酸塩は脳の回路と代謝に多面的作用を有するので、遺伝子発現に対する外因性酢酸塩の直接効果をより厳密にモデル化したインビトロアッセイを開発した。単離したマウス初代海馬ニューロンを利用し、アルコール中毒の間の外因性酢酸塩の流入を模倣する、超生理学的レベルの酢酸塩に対する転写応答（細胞を単離後１週間培養し、続いて10 mM酢酸塩で24時間処置した）を調査した。さらに、酢酸塩に対する転写応答におけるACSS2の特異的役割を決定するために、ACSS2の高度に特異的な小分子阻害剤(ACSS2i)を使用した（Mews他、Nature、2017、546：381-386；Commerford他、Cell、2014、159：1591-1602）。
【０２８３】
初代海馬ニューロンでは、酢酸塩の補給は、GO term（遺伝子オントロジー語彙）解析を介して、シグナル伝達および学習と記憶を含む神経系プロセスに関与している3613個の遺伝子（図24Ａ、図25Ａ）を誘導した。対照的に、酢酸塩処置は、免疫系プロセスに関与する遺伝子のダウンレギュレーションをもたらした（図25Ｂ、青色の下図）。ACSS2iの存在下では、酢酸塩誘導遺伝子の2107個がアップレギュレートされなかった（図24Ａおよび24Ｃ）。これは、酢酸塩で誘導される転写がACSS2の触媒活性に大きく依存していることを示す。重要なことに、酢酸塩誘導遺伝子は、酢酸塩の非存在下ではACSS2i処置により調節されなかった（図24Ｂ）。ACSS2i感受性アップレギュレート遺伝子のGO解析は、神経系プロセス、行動、および学習と記憶の濃縮（強化）を示した（図24Ｃ、下図）。特に、これらの酢酸塩誘導遺伝子は、インビボで海馬の急性アルコールによりアップレギュレートされた遺伝子との顕著な重複を示し（Mulligan他、Alcohol Clin. Exp. Res., 2011, 35：659-670）（214個のアルコール応答性海馬遺伝子の38％、図25Ｃ）、インビトロモデルの翻訳有効性を強く支持する。
【０２８４】
さらなる解析は、ACSS2i感受性アップレギュレート遺伝子の40％がインビボでアセチル化されたことを明らかにし（Mews他、Nature, 2017, 546：381-386）(H3K9ac ChIP-seq、2107個のACSS2i感受性遺伝子のうち908個）、そして海馬ACSS2(ChIP-seq)の直接結合は、インビボでの直接的行動刺激なしにベースラインでプロモーターに近接であることを明らかにした（Mews他、Nature、2017、546：381-386）（図23Ｄ）。GO解析は、これらの遺伝子を、軸索発生および電位ゲート依存型イオンチャネル活性をはじめとする複雑な脳可塑性関連メカニズムに連関させた（図24Ｄ）。これに対応して、ACSS2標的化、酢酸塩誘導およびACSS2i感受性の遺伝子のモチーフ分析は、神経分化と薬物乱用による行動の制御に連関している、ニューロン転写因子（E2F3およびNR5A2を含む）（図24Ｅ）の関与を暗示した（Catese他、Biol. Psychiatry, 2018, 84：167-179；Stergiopoulos他、Nat. Commun., 2016, 7：1-16）。
【０２８５】
まとめると、これらの知見は、アルコール誘導ヒストンアセチル化と遺伝子発現とを連携させることにより、ACSS2がアルコール関連学習において重要な役割を果たすことを強く示唆する（図23Ｃ）。これを行動的に試験するために、WTおよびACSS2 KDマウスにおいて、エタノール条件付け場所嗜好性（CPP）試験を実施した。このパラダイムでは、動物を、環境要因によって区別された別個の区画における中性刺激および報酬刺激に暴露する。条件付け後、動物を両方の環境にアクセスできるようにし、そしてアルコール関連チャンバ内で過ごした時間を測定することにより、CPPを測定する。WTマウスでは、エタノールのような報酬刺激は、薬物関連環境で過ごす時間を増加させた（マン・ホイットニー検定、p＝0.022）。重要なことは、CPPの発生は背側HPCの空間記憶形成に依存するので、従って背側HPCの病変は場所条件付けを妨害するという点である。驚くべきことに、エタノールCPPは、ACSS2 KD(dHPC)マウス（マンホイットニー検定 p＝0.184）で完全に廃止され、このことはアルコール関連の連想記憶形成がACSS2に依存することを示唆する。まとめると、インビトロ、インビボ、および行動試験の観察結果は、ACSS2が記憶関連遺伝子発現およびアルコール関連連想的学習を駆動する、背側HPCにおけるアセチル化ヒストン中への重質標識された酢酸塩の取り込みには、ACSS2が必要であることを示す。これらの結果は、アルコール常用障害における治療介入の有望な候補としてACSS2を確立し、ここでアルコール関連の環境要因の記憶は、長期間の禁制後であっても、渇望や再発の一次的動因である。
【０２８６】
重要なことは、アルコール暴露は、成体脳でのエピジェネティック過程および転写過程を破壊するだけでなく、その上発達上の胎児におけるエピジェネティック異常調節にも関連付けられることである（Vezley他、Epigenetics Chromatin, 2015, 8：39；Starkman他、Alcohol Research：Current Reviews、2011, 34：293-305）。子宮内（in utero）では、アルコールは、神経発生遺伝子発現に影響を与えかつ、胎児性アルコールスペクトル障害(FASD)として分類されている、多数のアルコール関連出生後疾患表現型を惹起させ得る（Mead他、Front. Genet. 2014, 5：1-10）。子宮におけるアルコール媒介性エピジェネティック変化（後成的変化）の最近の研究は、FASDでのヒストンアセチル化の変化と関係づけたが、基礎となるメカニズムは、いまだ解明されていない（Kim他、Alcohol Alcohol., 2006, 41：126-132；Manal他、Int. J. Biol. Sci., 2017, 13：1100-1108）。
【０２８７】
妊娠時アルコール暴露が、発達中の胎児脳におけるヒストンアセチル化に影響を及ぼすか否かを、ヒストン上へのアルコール由来アセチル基の直接的付着によって調べた。重質標識したアルコール注射（2 mg/kg i.p.）に続き単離されたヒストンタンパク質の質量分析という確立されたパラダイムを用いて、妊娠中雌マウスにおけるニューロンのヒストンアセチル化へのアルコール代謝産物の取り込み（注射後４時間）を確認したところ、雄マウスにおける以前の結果と一致していた（図26Ａおよび21Ｃ）。次いで、同様にアルコールが発達中の中脳と前脳における子宮内での動的ヒストンアセチル化に影響を及ぼすか否かを調べた（E18.5）（図26Ｂ）。
【０２８８】
胎児脳MSデータは、ニューロンのヒストンアセチル化の母体標識と並行して、「一気飲み様の（binge drinking-like）」アルコール暴露が、早期の神経発達期にある胎児の前脳と中脳のヒストン上へのアルコール由来アセチル基の沈着を引き起こすことを示す（図26Ｂ）。まとめると、これらの結果は、アルコール由来アセチル基の直接的取り込みが胎児脳におけるヒストンアセチル化を駆動させ、これはFASDの病因についての予期せぬ潜在的機序を示唆している。
【０２８９】
成体脳において、遺伝子発現を制御するエピジェネティック機序は、神経活性を処理する上で重要な役割を果たす。このデータは、ニューロンACSS2による代謝産物活性化を介して、肝アルコール代謝からニューロン中のインビボでのエピジェネティック調節へ直接的に動的シグナル伝達する最初の証拠を提供する。海馬では、アルコール由来アセチル基の取り込みは、長期間の禁制の後であっても、渇望、捜索および消費を駆動するアルコール関連の環境信号をコード化する、アルコール関連の連想的学習にとって決定的な重大性となり得る。重要なことは、これらの知見は、生理的酢酸塩の他の周辺供給源―主に腸内微生物叢―が同様にニューロンのヒストンアセチル化および脳機能に影響を与えることを示唆し、これは他のメタボリックシンドロームを抑制または促進しうる。末梢の代謝活性と神経エピジェネティック調節との間のこのネクサス（結び付き）をターゲットとする翻訳段階での治療方法は、アルコールの常用または他の神経精神疾患のための新規治療介入への道を切り開くだろう。
【０２９０】
実施例４：H3K3アセチル化の小分子阻害
未分化Ntera2細胞を、ADG-204、ADG-205またはADG-206を用いて24時間阻害剤で処置した（図27）。ウエスタンブロットを用いて、ADG-204（図28）、ADG-205（図29）またはADG-206（図30）での処置後のH3K3acレベルを決定した。
【化１７】
2020535164.tif 000026
【０２９１】
ADG-I-206：l-(2,3-ジ(チオフェン-2-イル)キノキサリン-6-イル)-3-メチル尿素 (R=Me)。無水CH2Cl2 (5.4 mL)中の2,3-ジ(チオフェン-2-イル)キノキサリン-6-アミン(333 mg, 1.08ミリモル、１当量)の攪拌溶液に、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.375 mL、2.15ミリモル、２当量)、続いて無水CH2Cl2(5.4 mL)中のトリホスゲン(105 mg, 0.36ミリモル、0.33当量)を添加して、赤橙色溶液を得た。反応混合物を室温で4時間撹拌し、次いでメチルアミン(THF中2 M、0.67 mL、1.35ミリモル、1.25当量)を滴下添加した。その反応混合物を室温で16時間撹拌した。アルゴン流を反応混合物に吹き付けて溶媒および過剰のホスゲンを除去し、得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィー（80％EtOAc／ヘキサン）により精製して、黄色固体として標題化合物を得た（196 mg、50％）。
【０２９２】
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 9.17 (s, 1H), 8.24 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.90 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.84 - 7.54 (m, 3H), 7.16 (dd, J = 13.9, 3.7 Hz, 2H), 7.12 - 7.06 (m, 2H), 6.29 (q, J = 4.6 Hz, 1H), 2.71 (d, J = 4.6 Hz, 3H). 13C NMR (126 MHz, DMSO) δ 155.51, 146.08, 143.15, 142.62, 141.39, 141.19, 141.10, 135.76, 129.65, 129.00, 128.91, 128.72, 128.66, 127.77, 127.65, 123.80, 111.56, 26.29。HRMS (ESI) m/z C18H15N4OS2 についての[M+H]+ 計算値 367.0687、実測値 367.0689。
【０２９３】
ADG-I-205：l-(2,3-ジ(チオフェン-2-イル)キノキサリン-6-イル)-3-(2-メトキシエチル)尿素 (R=MeOCH2CH2)。無水CH2Cl2 (5.5 mL)中の2,3-ジ(チオフェン-2-イル)キノキサリン-6-アミン(337 mg, 1.09ミリモル、１当量)の攪拌溶液に、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.38 mL、2.18ミリモル、２当量)、続いて無水CH2Cl2(5.5 mL)中のトリホスゲン(107 mg, 0.36ミリモル、0.33当量)を添加して、赤橙色溶液を得た。反応混合物を室温で4時間撹拌し、次いでメトキシエチルアミン(0.12 mL、1.36ミリモル、1.25当量)を滴下添加した。その反応混合物を室温で16時間撹拌した。アルゴン流を反応混合物に吹き付けて溶媒および過剰のホスゲンを除去し、得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィー（70％EtOAc／ヘキサン）により精製して、黄色固体として表題化合物を得た（196 mg、50％）。
【０２９４】
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 9.19 (s, 1H), 8.23 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.91 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.76 (ddd, J = 9.7, 5.1, 1.1 Hz, 2H), 7.68 (dd, J = 9.1, 2.4 Hz, 1H), 7.18 (dd, J = 3.7, 1.2 Hz, 1H), 7.15 (dd, J = 3.7, 1.1 Hz, 1H), 7.10 (ddd, J = 6.9, 5.1, 3.7 Hz, 2H), 6.47 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 3.43 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 3.33 (t, J = 5.5 Hz, 2H), 3.30 (s, 3H)。13C NMR (126 MHz, DMSO) δ 154.83, 146.12, 143.21, 142.42, 141.37, 141.17, 141.07, 135.79, 129.68, 129.02, 128.94, 128.80, 128.68, 127.77, 127.65, 123.70, 111.55, 71.06, 57.90, 38.87。HRMS (ESI) m/z C20H19N4O2S2 について[M+H]+ 計算値 411.0949, 実測値 411.0926。
【０２９５】
ADG-I-204: 1-(2,3-ジ(チオフェン-2-イル)キノキサリン-6-イル)-3-ペンチル尿素 (R＝n-C5H11)。無水CH2Cl2 (34 mL)中の2,3-ジ(チオフェン-2-イル)キノキサリン-6-アミン(1.04 g, 3.36ミリモル、１当量)の攪拌溶液に、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(1.17 mL、6.72ミリモル、２当量)、続いて無水CH2Cl2(1 mL、最終濃度0.1 M)中のトリホスゲン(329mg, 1.11ミリモル、0.33当量)を添加して、赤橙色溶液を得た。反応混合物を室温で4時間撹拌し、次いでアミルミン (0.49 mL、4.20ミリモル、1.25当量)を滴下添加した。その反応混合物を室温で16時間撹拌した。アルゴン流を反応混合物に吹き付けて溶媒および過剰のホスゲンを除去し、得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィー（50−60％EtOAc／ヘキサン）により精製して、黄色固体として表題化合物を得た（872 mg, 61％）。
【０２９６】
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 9.07 (s, 1H), 8.23 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 7.90 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.76 (dd, J = 9.7, 5.0 Hz, 2H), 7.69 (dd, J = 9.1, 2.4 Hz, 1H), 7.16 (dd, J = 16.6, 3.6 Hz, 2H), 7.13 - 7.05 (m, 2H), 6.41 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 3.14 (q, J = 6.5 Hz, 2H), 1.48 (p, J = 7.1 Hz, 2H), 1.40 - 1.11 (m, 4H, グリースと重複), 0.90 (t, J = 6.7 Hz, 3H)。 13C NMR (126 MHz, DMSO) δ 154.87, 146.09, 143.13, 142.59, 141.40, 141.19, 141.08, 135.75, 129.67, 129.00, 128.91, 128.74, 128.66, 127.77, 127.65, 123.77, 111.49, 29.26, 28.55, 21.83, 13.91. HRMS (ESI) m/z C22H23N4OS2 について[M+H]+ 計算値423.1313, 実測値423.1336。
【０２９７】
実施例5：アセチルCoAの阻害はヒストンアセチル化および海馬の記憶に影響を及ぼす 
成体海馬におけるACSS2の役割を調査するために、低分子ACSS2阻害剤ADG-204、ADG-205、ADG-206またはADG-207を用いた処置により、背側海馬においてACSS2発現を減弱させた。
【化１８】
2020535164.tif 000027
【０２９８】
対照で処置したマウスに比較して、ACSS2阻害剤で処置したマウスは、オープンフィールド探索試験の間、同様なレベルの活動、協調、体重、不安関連の接触走性を示した。従って、ACSS2阻害は、全体的な行動変化を引き起こさない。
【０２９９】
海馬依存性空間記憶を評価するために、物体（オブジェクト）位置記憶パラダイムを使用した。動物は訓練中に３つの異なる物体を探索し、そして１つの物体が異なる位置に動かされてから24時間後に再暴露により長期記憶を試験した。訓練中、対照および阻害剤で処置したマウスは、探索行動に全く差がなかった。記憶検索の間、対照マウスは、移動させた物体の探査の増大を示した。対照的に、ACSS2阻害剤で処置したマウスは、空間的物体記憶が損なわれ、より低い識別指数を示した。ACSS2で処置したマウスは、試験の間、全物体探索の減少を示し、これは訓練セッションからの物体の完全認識に関連する新奇性の減退を示唆している。
【０３００】
対照実験として、対照マウスとACSS2阻害剤で処置したマウスに、恐怖条件付け文脈学習パラダイムを実施した。24時間の試験セッション中に、対照マウスまたはACSS2阻害剤処置マウスとの間のすくみ行動（freezing behavior）の量に有意な差はなかった。これは、腹側海馬が文脈−ショックの連係をうまく媒介することを示唆する。全体として、ACSS2は背側海馬媒介型の長期空間記憶において重要な役割を果たす。
【０３０１】
実施例６：アセチルCoAシンセターゼの阻害は、アルコール由来重質アセチル基のヒストンアセチル化への取り込みを防止する
脳におけるアルコール依存性アセチル化におけるACSS2の直接的役割を調べるために、ACSS2阻害剤であるADG-204、ADG-205、ADG-206またはADG-207でマウスを処置した。ACSS2阻害剤による処置は、ヒストンアセチル化へのアルコール由来重質アセチル基の取り込みを防止した。対照的に、対照マウスでは、重質標識のvHPC取り込みは影響を受けなかった。よって、肝アルコール代謝に由来する酢酸塩は、脳に輸送されて容易にヒストンアセチル化に取り込まれる。
【０３０２】
実施例７：ADG-207：l-((1S,3s)-アダマンタン-1-イル)-3-(2,3-ジ(チオフェン-2-イル)キノキサリン-6-イル)尿素 (R＝l-アダマンチル)の合成
無水CH2Cl2(0.6 mL)中の2,3-ジ(チオフェン-2-イル)キノキサリン-6-アミン(32 mg、0.1ミリモル、１当量)の攪拌溶液に、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.04 mL、0.2ミリモル、２当量)、続いて無水CH2Cl2（0.6 mL, 最終濃度0.08 M）中のトリホスゲン(10 mg, 0.034ミリモル、0.33当量)を加えて、赤橙色溶液を得た。反応混合物を室温で4時間撹拌し、次いで1-アダマンタンアミン(0.49 mL、4.20ミリモル、1.25当量)を滴下添加した。次いで、反応混合物を室温で16時間撹拌した。アルゴン流を反応混合物に吹き付けて溶媒および過剰のホスゲンを除去し、得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィー(40％EtOAc／ヘキサン)により精製して、1,1-ジ-アダマンタニル尿素が混入した表題化合物を得た。生成物をフラッシュクロマトグラフィーにより２回再精製して、黄色固体(4 mg、8％)として分析上純粋な表題化合物を得た。
【０３０３】
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.91 (s, 1H), 8.20 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.89 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.76 (ddd, J = 9.2, 5.1, 1.2 Hz, 2H), 7.61 (dd, J = 9.1, 2.4 Hz, 1H), 7.19 (dd, J = 3.7, 1.2 Hz, 1H), 7.14 (dd, J = 3.7, 1.2 Hz, 1H), 7.10 (ddd, J = 11.0, 5.0, 3.6 Hz, 2H), 6.15 (s, 1H), 2.06 (s, 3H), 1.99 (d, J = 2.9 Hz, 6H), 1.66 (t, J = 3.1 Hz, 6H). 13C NMR (126 MHz, DMSO) δ 153.55, 146.09, 143.03, 142.57, 141.48, 141.25, 141.06, 135.67, 129.73, 128.98, 128.87, 128.76, 128.65, 127.77, 127.64, 123.66, 111.24, 50.15, 41.50, 36.00, 28.88. HRMS (ESI) m/z C27H27N4OS2 について[M+H]+ 計算値 487.1626, 実測値487.1625。
【０３０４】
本明細書に引用されるあらゆる特許、特許出願および刊行物の開示は、その全内容が本明細書中に参考として援用される。本発明を特定の実施形態を参照して開示してきたが、本発明の真の本質と範囲から逸脱することなく、本発明の他の実施形態および変形が当業者により考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、全てのそのような実施形態および均等な変形を含むように解釈されるものである。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【国際調査報告】
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