(57)【要約】本発明は、ヒト化及び非ヒト化抗MUCl*抗体及びそれらを作り使用する方法に関係する。本発明は、また、癌の処置のための開裂酵素で形質転換若しくは形質導入された免疫細胞を使用することに関係する。本発明は、また、癌の処置のためのCAR及び他のタンパク質で形質転換若しくは形質導入された免疫細胞を使用することに関係する。
2020500031.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
縦列反復ドメインを欠いているMUC1アイソフォームの細胞外ドメイン若しくは開裂産物の領域に結合する、ヒト若しくはヒト化抗MUCl*抗体、抗体断片又は抗体様蛋白質。
【請求項２】
以下に特異的に結合する、請求項1に記載のヒト若しくはヒト化抗MUCl*抗体、抗体断片又は抗体様蛋白質； 
(i) MUC 1のPSMGFR領域 ; 
(ii) PSMGFRペプチド; 
(iii) 次のアミノ酸配列をもつペプチド 
SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY (SEQ ID NO:620); 
(iv) 次のアミノ酸配列をもつペプチド
SVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY (SEQ ID NO:621); 
(v) 次のアミノ酸配列をもつペプチド
VQLTLAFREGTINVHDVETQFNQY (SEQ ID NO:622); 又は 
(vi) 次のアミノ酸配列をもつペプチド
SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTIN (SEQ ID NO:623).
【請求項３】
ヒト若しくはヒト化抗MUC1*抗体が、IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 若しくは IgMである、請求項1に記載のヒト若しくはヒト化抗MUCl*抗体、抗体断片又は抗体様蛋白質。
【請求項４】
ヒト若しくはヒト化抗体断片若しくは抗体様蛋白質が、scFv 若しくは scFv-Fcである、請求項１に記載のヒト若しくはヒト化抗MUCl*抗体、抗体断片又は抗体様蛋白質。
【請求項５】
マウスモノクローナルMN-E6抗体から由来する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、及びマウスモノクローナルMN-E6抗体の配列に対して、少なくとも80%, 90% 、 95%若しくは98%配列同一性をもつ、請求項１に記載のヒト若しくはヒト化抗MUCl*抗体、抗体断片又は抗体様蛋白質。
【請求項６】
該重鎖可変領域が、SEQ ID NO: 13に、少なくとも、90%、95%若しくは98%の配列同一性を持ち、及び、該軽鎖可変領域が、SEQ ID NO: 66に、少なくとも、90%、95%若しくは98%の配列同一性を持つ、請求項５に記載のヒト若しくはヒト化抗MUCl*抗体、抗体断片又は抗体様蛋白質。
【請求項７】
以下の配列をもつCDR1, CDR2 若しくは CDR3領域に、少なくとも、90%、95%若しくは98%の配列同一性を持つ、該重鎖可変領域及び該軽鎖可変領域における相補性決定領域（CDRs）を含む、請求項５に記載のヒト若しくはヒト化抗MUCl*抗体、抗体断片又は抗体様蛋白質: 
CDR1重鎖SEQ ID NO: 17 
CDR1軽鎖SEQ ID NO:70, 
CDR2重鎖SEQ ID NO:21 
CDR2軽鎖SEQ ID NO:74, 
CDR3重鎖SEQ ID NO:25 
CDR3軽鎖SEQ ID NO:78.
【請求項８】
ヒト若しくはヒト化抗体が、IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 若しくは IgMである、請求項５に記載のヒト若しくはヒト化抗MUCl*抗体、抗体断片又は抗体様蛋白質。
【請求項９】
ヒト若しくはヒト化抗体断片又は抗体様蛋白質が、scFv 若しくは scFv-Fcである、請求項５に記載のヒト若しくはヒト化抗MUCl*抗体、抗体断片又は抗体様蛋白質。
【請求項１０】
マウスモノクローナルMN-C2抗体から由来する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、及びマウスモノクローナルMN-C2抗体の配列に対して、少なくとも80%, 90%、 95%若しくは98%配列同一性をもつ、請求項１に記載のヒト若しくはヒト化抗MUCl*抗体、抗体断片又は抗体様蛋白質。
【請求項１１】
該重鎖可変領域が、SEQ ID NO:119に、少なくとも、90%、95%若しくは98%の配列同一性を持ち、及び、該軽鎖可変領域が、SEQ ID NO:169に、少なくとも、90%、95%若しくは98%の配列同一性を持つ、請求項１０に記載のヒト若しくはヒト化抗MUCl*抗体、抗体断片又は抗体様蛋白質。
【請求項１２】
以下の配列をもつCDR1, CDR2 若しくは CDR3領域に、少なくとも、90%、95%若しくは98%の配列同一性を持つ、該重鎖可変領域及び該軽鎖可変領域における相補性決定領域（CDRs）を含む、請求項１０に記載のヒト若しくはヒト化抗MUCl*抗体、抗体断片又は抗体様蛋白質:
CDR1重鎖SEQ ID NO: 123 
CDR1軽鎖SEQ ID NO: 173, 
CDR2重鎖SEQ ID NO: 127 
CDR2軽鎖SEQ ID NO: 177, 
CDR3重鎖SEQ ID NO: 131 
CDR3軽鎖SEQ ID NO: 181。
【請求項１３】
ヒト若しくはヒト化抗体が、IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 若しくは IgMである、請求項１０に記載のヒト若しくはヒト化抗MUCl*抗体、抗体断片又は抗体様蛋白質。
【請求項１４】
ヒト若しくはヒト化抗体断片又は抗体様蛋白質が、scFv 若しくは scFv-Fcである、請求項１０に記載のヒト若しくはヒト化抗MUCl*抗体、抗体断片又は抗体様蛋白質。
【請求項１５】
マウスモノクローナルMN-C3抗体から由来する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、及びマウスモノクローナルMN-C3抗体の配列に対して、少なくとも80%, 90%、 95%若しくは98%配列同一性をもつ、請求項１に記載のヒト若しくはヒト化抗MUCl*抗体、抗体断片又は抗体様蛋白質。
【請求項１６】
該重鎖可変領域が、SEQ ID NO:414に、少なくとも、90%、95%若しくは98%の配列同一性を持ち、及び、該軽鎖可変領域が、SEQ ID NO:459に、少なくとも、90%、95%若しくは98%の配列同一性を持つ、請求項１5に記載のヒト若しくはヒト化抗MUCl*抗体、抗体断片又は抗体様蛋白質。
【請求項１７】
以下の配列をもつCDR1, CDR2 若しくは CDR3領域に、少なくとも、90%、95%若しくは98%の配列同一性を持つ、該重鎖可変領域及び該軽鎖可変領域における相補性決定領域（CDRs）を含む、請求項１5に記載のヒト若しくはヒト化抗MUCl*抗体、抗体断片又は抗体様蛋白質:
CDR1重鎖SEQ ID NO:418 
CDR1軽鎖SEQ ID NO:463, 
CDR2重鎖SEQ ID NO:422 
CDR2軽鎖SEQ ID NO:467, 
CDR3重鎖SEQ ID NO:426, 
CDR3軽鎖SEQ ID NO:471。
【請求項１８】
ヒト若しくはヒト化抗体が、IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 若しくは IgMである、請求項１５に記載のヒト若しくはヒト化抗MUCl*抗体、抗体断片又は抗体様蛋白質。
【請求項１９】
ヒト若しくはヒト化抗体断片又は抗体様蛋白質が、scFv 若しくは scFv-Fcである、請求項１５に記載のヒト若しくはヒト化抗MUCl*抗体、抗体断片又は抗体様蛋白質。
【請求項２０】
マウスモノクローナルMN-C8抗体から由来する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、及びマウスモノクローナルMN-C8抗体の配列に対して、少なくとも80%, 90%、 95%若しくは98%配列同一性をもつ、請求項１に記載のヒト若しくはヒト化抗MUCl*抗体、抗体断片又は抗体様蛋白質。
【請求項２１】
該重鎖可変領域が、SEQ ID NO:506に、少なくとも、90%、95%若しくは98%の配列同一性を持ち、及び、該軽鎖可変領域が、SEQ ID NO:544に、少なくとも、90%、95%若しくは98%の配列同一性を持つ、請求項２０に記載のヒト若しくはヒト化抗MUCl*抗体、抗体断片又は抗体様蛋白質。
【請求項２２】
以下の配列をもつCDR1, CDR2 若しくは CDR3領域に、少なくとも、90%、95%若しくは98%の配列同一性を持つ、該重鎖可変領域及び該軽鎖可変領域における相補性決定領域（CDRs）を含む、請求項２０に記載のヒト若しくはヒト化抗MUCl*抗体、抗体断片又は抗体様蛋白質:
CDR1重鎖SEQ ID NO:508 
CDR1軽鎖SEQ ID NO:546, 
CDR2重鎖SEQ ID NO:510 
CDR2軽鎖SEQ ID NO:548, 
CDR3重鎖SEQ ID NO:512, 
CDR3軽鎖SEQ ID NO:550。
【請求項２３】
ヒト若しくはヒト化抗体が、IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 若しくは IgMである、請求項２０に記載のヒト若しくはヒト化抗MUCl*抗体、抗体断片又は抗体様蛋白質。
【請求項２４】
ヒト若しくはヒト化抗体断片又は抗体様蛋白質が、scFv 若しくは scFv-Fcである、請求項２０に記載のヒト若しくはヒト化抗MUCl*抗体、抗体断片又は抗体様蛋白質。
【請求項２５】
ヒト化カッパ軽鎖若しくはヒト化ラムダ軽鎖と一対で、ヒト化IgG2重鎖若しくはヒト化IgG1重鎖によって表されるヒト化MN-E6の配列を含む、抗MUC1*細胞外ドメイン抗体。
【請求項２６】
ヒト化IgG2重鎖がSEQ ID NOS:53、ヒト化IgG1重鎖がSEQ ID NOS:57、ヒト化カッパ軽鎖がSEQ ID NO:108、そしてヒト化ラムダ軽鎖がSEQ ID NO:112である、又は、各々と90%, 95%若しくは98%の配列同一性をもつ各配列である、請求項２５に記載の抗体。
【請求項２７】
ヒト化ラムダ軽鎖及びヒト化カッパ軽鎖と一対で、ヒト化IgG1重鎖とヒト化IｇG2重鎖によって表されるヒト化MN-C2の配列を含む、抗MUC1*細胞外ドメイン抗体。
【請求項２８】
ラムダ軽鎖(SEQ ID NO:219)若しくはヒト化カッパ軽鎖(SEQ ID NO:213)と一対で、ヒト化IgG1重鎖(SEQ ID NOS:159)若しくはヒト化IｇG2重鎖(SEQ ID NOS:164)である、又は、それらと90%, 95% 若しくは 98%の配列同一性をもつ配列である、請求項２７に記載の抗体。
【請求項２９】
ヒト化ラムダ軽鎖若しくはヒト化カッパ軽鎖と一対で、ヒト化IgG1重鎖若しくはヒト化IｇG2重鎖によって表されるヒト化MN-C3の配列を含む、抗MUC1*細胞外ドメイン抗体。
【請求項３０】
ヒト化MN-C3 IgG1重鎖がSEQ ID NOS:454、IgG2重鎖がSEQ ID NOS:456、ラムダ軽鎖がSEQ ID NO:501、及びカッパ軽鎖がSEQ ID NO:503、又は、それらと90%, 95% 若しくは 98%の配列同一性をもつ配列である、請求項２９に記載の抗体。
【請求項３１】
ヒト化ラムダ軽鎖若しくはヒト化カッパ軽鎖と一対で、ヒト化IgG1重鎖若しくはヒト化IｇG2重鎖によって表されるヒト化MN-C8の配列を含む、抗MUC1*細胞外ドメイン抗体。
【請求項３２】
ヒト化MN-C8 IgG1重鎖がSEQ ID NOS:540、IgG2重鎖がSEQ ID NOS:542、ラムダ軽鎖がSEQ ID NO:580、及びカッパ軽鎖がSEQ ID NO:582、又は、それらと90%, 95% 若しくは 98%の配列同一性をもつ配列である、請求項31に記載の抗体。
【請求項３３】
MUC1*へのNME蛋白質の結合を阻害する、請求項１に記載のヒト若しくはヒト化抗MUCl*抗体、抗体断片又は抗体様蛋白質。
【請求項３４】
NMEが、NME7若しくはNME1である、請求項３３に記載のヒト若しくはヒト化抗MUCl*抗体、抗体断片又は抗体様蛋白質。
【請求項３５】
NMEが、NME6若しくはNME8である、請求項３３に記載のヒト若しくはヒト化抗MUCl*抗体、抗体断片又は抗体様蛋白質。
【請求項３６】
ヒト若しくはヒト化抗体が、IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 若しくは IgMである、請求項３３に記載のヒト若しくはヒト化抗MUCl*抗体、抗体断片又は抗体様蛋白質。
【請求項３７】
ヒト若しくはヒト化抗体断片又は抗体様蛋白質が、scFv 若しくは scFv-Fcである、請求項３３に記載のヒト若しくはヒト化抗MUCl*抗体、抗体断片又は抗体様蛋白質。
【請求項３８】
リンカーを経て結合された、重鎖と軽鎖の可変領域を含む、単鎖可変断片(scFv)であって、さらに、MUCl*細胞外ドメインへ結合する抗体のCDRｓを含む、ｓcFv。
【請求項３９】
抗MUC1*抗体のCDRsが、MN-E6, MN-C2, MN-C3 若しくはMN-C8 抗体由来である、請求項３８に記載のscFv。
【請求項４０】
抗MUC1*抗体のCDRsが、ヒト化MN-E6, MN-C2, MN-C3 若しくはMN-C8 抗体由来である、請求項３９に記載のscFv。
【請求項４１】
SEQ ID NOS:233, 235 及び 237 (E6)のグループから選ばれた、請求項３８に記載のscFv。
【請求項４２】
SEQ ID NOS:239, 241及び 243 (C2)のグループから選ばれた、請求項３８に記載のscFv。
【請求項４３】
SEQ ID NOS:245, 247及び 249 (C3)のグループから選ばれた、請求項３８に記載のscFv。
【請求項４４】
SEQ ID NOS:251, 253及び 255 (C8)のグループから選ばれた、請求項３８に記載のscFv。
【請求項４５】
縦列反復、リンカー分子、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを欠くMUC1の細胞外ドメインに結合するヒト化可変領域抗体断片若しくはscFvを含むキメラ抗原リセプター（CAR）。
【請求項４６】
請求項４５に記載のCARであって、該単鎖抗体断片が以下から選ばれる少なくとも１２の連続したアミノ酸を含むペプチドに結合する、CAR;
(i) MUC1のPSMGFR領域, 
(ii) PSMGFR ペプチド, 
(iii) 次のアミノ酸配列もつペプチド； 
SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY (SEQ ID NO:620)，
(iv) 次のアミノ酸配列もつペプチド；
SVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY (SEQ ID NO:621)，
(v) 次のアミノ酸配列もつペプチド；
VQLTLAFREGTINVHDVETQFNQY (SEQ ID NO:622); 又は 
(vi) 次のアミノ酸配列もつペプチド；
SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTIN (SEQ ID NO:623)。
【請求項４７】
請求項４６に記載のCARであって、それは、請求項２５〜３２のいづれか一に記載の可変領域のいずれかの部分を含む、又は、それらのいずれかの部分の組み合わせであって、細胞外ドメイン、膜貫通領域、及び免疫系活性化シグナルを送る配列モチーフを含む細胞質尾部における該組み合わせを含む、CAR。
【請求項４８】
請求項４５に記載のCARであって、そこにおいて、細胞外ドメインは、MN-E6 scFv, MN-C2 scFv, MN-C3 scFv 若しくは MN-C8 scFvのヒト化単鎖抗体断片を含む、CAR。 
【請求項４９】
請求項４８に記載のCARであって、そこにおいて、細胞外ドメインは、(SEQ ID NOS:233, 235, 若しくは 237)として記述のMN-E6 scFv, (SEQ ID NOS:239, 241, 若しくは 243)として記述のMN-C2 scFv, (SEQ ID NOS:245, 247, 若しくは 249)として記述のMN-C3 scFv 又は (SEQ ID NOS:251, 253, 若しくは 255)として記述のMN-C8 scFvのヒト化単鎖抗体断片を含む、CAR。
【請求項５０】
請求項４５に記載のCARであって、そこにおいて、細胞質尾部は、シグナル伝達配列モチーフである、CD3-zeta, CD27, CD28, 4-lBB, OX40, CD30, CD40, ICAm-1, LFA-l, ICOS, CD2, CD5, 若しくは CD7 の1以上を含む、CAR。
【請求項５１】
請求項４５に記載のCARであって、そこにおいて、その配列は、以下から選択される、CAR;
CAR-MN-E6 CD3z (SEQ ID NOS:295), 
CAR-MN-E6 CD28/CD3z (SEQ ID NOS:298); 
CAR-MN-E6 4-lBB/CD3z (SEQ ID NOS:301); 
CAR-MN-E6 OX40/CD3z (SEQ ID NOS:617); 
CAR-MN-E6 CD28/4-lBB/CD3z (SEQ ID NOS:304); 
CAR-MN-E6 CD28/OX40/CD3z (SEQ ID NOS:619); 
CAR-MN-E6 Fc/4-lBB/CD3z (SEQ ID NOS:311), 
CAR-MN-E6 IgD/Fc/4-lBB/CD3z (SEQ ID NOS:771), 
CAR-MN-E6 FcH/4-lBB/CD3z (SEQ ID NOS:316), 
CAR-MN-E6 IgD/FcH/4-lBB/CD3z (SEQ ID NOS:773), 
CAR-MN-E6 IgD/4-lBB/CD3z (SEQ ID NOS:324), 
CAR-MN-E6 X4/4-lBB/CD3z (SEQ ID NOS:331), 
CAR-MN-C2 CD3z (SEQ ID NOS:607); 
CAR-MN-C2 CD28/CD3z (SEQ ID NOS:609); 
CAR-MN-C2 4-lBB/CD3z (SEQ ID NOS:611); 
CAR-MN-C2 OX40/CD3z (SEQ ID NOS:613); 
CAR-MN-C2 CD28/4-lBB/CD3z (SEQ ID NOS:307); 
CAR-MN-C2-CD28/OX40/CD3z (SEQ ID NOS:615), 
CAR44 huMNC2-CD8-4-lBB-CD3z (SEQ ID NOS:719), 
CAR-MN-C2 Fc/4-lBB/CD3z (SEQ ID NOS:733), 
CAR-MN-C2 IgD/Fc/4-lBB/CD3z (SEQ ID NOS:735), 
CAR-MN-C2 FcH/4-lBB/CD3z (SEQ ID NOS:737), 
CAR-MN-C2 IgD/FcH/4-lBB/CD3z (SEQ ID NOS:739), 
CAR-MN-C2 IgD/4-lBB/CD3z (SEQ ID NOS:741), 
CAR-MN-C2 X4/4-lBB/CD3z (SEQ ID NOS:743)。
【請求項５２】
MUC1*形質転換若しくは形質導入細胞に結合する細胞外ドメインをもつCARを含む細胞。
【請求項５３】
CARを含む細胞が、免疫系細胞である、請求項５２に記載の細胞。
【請求項５４】
CARを含む免疫系細胞が、T細胞若しくはNK細胞である、請求項５３に記載の細胞。
【請求項５５】
CARを含む免疫系細胞が、樹状細胞である、請求項５３に記載の細胞。
【請求項５６】
CARを含む免疫系細胞が、マスト細胞である、請求項５３に記載の細胞。
【請求項５７】
細胞外ドメインユニットが、あるペプチドを認識するCAR分子。
【請求項５８】
当該ペプチドが、PSMGFR (SEQ ID NO:2)である、請求項５７に記載のCAR分子。
【請求項５９】
当該ペプチドが、NME7由来のペプチドである、請求項５７に記載のCAR分子。
【請求項６０】
以下のペプチドから選ばれる、請求項５９に記載のCAR;
NME7A ペプチド 1 (A domain): MLSRKEALDFHVDHQS (SEQ ID NO:7); 
NME7A ペプチド 2 (A domain): SGVARTDASES (SEQ ID NO:8); 
NME7B ペプチド 1 (B domain): DAGFEISAMQMFNMDRVNVE (SEQ ID NO:9); 
NME7B ペプチド 2 (B domain): EVYKGVVTEYHDMVTE (SEQ ID NO: 10); 又は 
NME7B ペプチド 3 (B domain): AIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF (SEQ ID NO: 11).
【請求項６１】
同じ細胞へ形質転換された異なる細胞外ドメインユニットをもつ、少なくとも２つのCARを含む組成物。
【請求項６２】
同じ細胞へ形質転換された異なる細胞外ドメインユニットをもつ、少なくとも２つのCARを含む組成物であって、ここで、ひとつのCARは、標的認識ユニットを持たず、そして、他のCARが、標的認識ユニットを持つ、組成物。
【請求項６３】
細胞外ドメイン認識ユニットのひとつが、MUC1*細胞外ドメインに結合する、請求項６１に記載の少なくとも２つのCARを含む組成物。
【請求項６４】
細胞外ドメイン認識ユニットのひとつが、PD-1に結合する、請求項６１に記載の少なくとも２つのCARを含む組成物。
【請求項６５】
細胞外ドメイン認識ユニットのひとつが、抗体断片であり、他が、あるペプチドである、請求項６１に記載の少なくとも２つのCARを含む組成物。
【請求項６６】
請求項６１に記載の少なくとも２つのCARを含む組成物であって、ひとつが、 MN-E6 抗体のscFv, MN-C2 抗体のscFv, MN-C3 抗体のscFv 若しくは MN-C8 抗体のscFv から選ばれる抗-MUCl* scFv であり、そして、他がNME7から由来するペプチド又は以下からなるグループからえらばれる、組成物； 
NME7A ペプチド 1 (A domain): MLS RKE ALDFH VDHQS (SEQ ID NO:7); 
NME7A ペプチド 2 (A domain): SGVARTDASES (SEQ ID NO:8); 
NME7B ペプチド 1 (B domain): DAGFEISAMQMFNMDRVNVE (SEQ ID NO:9); 
NME7B ペプチド 2 (B domain): EVYKGVVTEYHDMVTE (SEQ ID NO:10); 及び 
NME7B ペプチド 3 (B domain): AIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF (SEQ ID NO:11)。
【請求項６７】
加工抗体様蛋白質である、請求項1に記載の抗体。
【請求項６８】
以下に結合する物質について、ヒトである抗体若しくは抗体断片のライブラリーをスクリーニングする方法；
(i) PSMGFR ペプチド; 
(ii) 次のアミノ酸配列を持つペプチド； 
SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY (SEQ ID NO:620); 
(iii) 次のアミノ酸配列を持つペプチド
SVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY (SEQ ID NO:621); 
(iv) 次のアミノ酸配列を持つペプチド；
VQLTLAFREGTINVHDVETQFNQY (SEQ ID NO:622); 
(v) 次のアミノ酸配列を持つペプチド；
SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTIN (SEQ ID NO:623); 
(vi) NME7 蛋白質;又は 
(vii) NME7 蛋白質のペプチド断片。
【請求項６９】
対象が、MUC1を異常に発現する、疾患を患ったヒトに、上記請求項１〜６７のいづれか一に記載の抗体を投与することを含む、対象における疾患を処置する方法。
【請求項７０】
疾患が、癌である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
対象が、MUC1を異常に発現する、疾患を患ったヒトに、NMEペプチドを投与することを含む、対象における疾患を処置する方法。
【請求項７２】
請求項１〜６７のいづれか一に記載の抗体と幹細胞を接触させることを含む、幹細胞個体群の増殖若しくは拡張の方法。
【請求項７３】
ヒト化MN-C3 若しくは MN-C8 抗体、又はそれらの抗体断片若しくは単鎖抗体で表面を被覆すること、及び  該表面へ幹細胞を接触させること、を含む表面への幹細胞接着の促進方法。
【請求項７４】
ヒト化MN-C3 若しくは MN-C8 抗体、又はそれらの抗体断片若しくは単鎖抗体で表面を被覆すること、及び  該表面へ幹細胞を接触させること、及び特定の局所に幹細胞移送することの工程を含む、生体内若しくは生体外幹細胞移送方法。
【請求項７５】
ヒト化MN-C3 若しくは MN-C8 抗体、又はそれらの抗体断片若しくは単鎖抗体で表面を被覆すること、及び  該表面へ細胞の混合個体群を接触させること、及び幹細胞を単離することの工程を含む、幹細胞単離の方法。
【請求項７６】
MUC1アイソフォームの細胞外ドメイン若しくは縦列反復ドメインを欠く開裂産物に結合する抗体由来の可変ドメイン断片を含むscFv。
【請求項７７】
可変ドメイン断片が、マウスモノクローナル抗体MN-E6 (SEQ ID NO:13 及び 66)由来、若しくはヒト化MN-E6 (SEQ ID NO:39 及び 94)由来、若しくはMN-E6 scFv (SEQ ID NO:233, 235 及び 237)由来である、請求項７６に記載のｓｃFv。
【請求項７８】
可変ドメイン断片が、マウスモノクローナル抗体MN- C2 (SEQ ID NO:119 及び 169) 由来、若しくは ヒト化MN-C2 (SEQ ID NO:145 及び 195)由来, 若しくは MN-C2 scFv (SEQ ID NO:239, 241 及び 243)由来である、請求項７６に記載のscFv。
【請求項７９】
可変ドメイン断片が、マウスモノクローナル抗体MN-C3 (SEQ ID NO:414 及び 459)由来、若しくは from the humanized MN-C3 (SEQ ID NO:440 及び 487)由来、若しくは MN-C3 scFv (SEQ ID NO:245, 247 及び 249) 由来である、請求項７６に記載のscFv。
【請求項８０】
可変ドメイン断片が、マウスモノクローナル抗体MN-C8 (SEQ ID NO:505 及び 544)由来、若しくは ヒト化 MN-C8 (SEQ ID NO:526 及び 566) 由来、 若しくは MN-C8 scFv (SEQ ID NO:251, 253, 255) 由来である、請求項７６に記載のscFv。
【請求項８１】
請求項７６〜８０のいづれか一に記載のscFvの有効量をヒトに投与することを含む、MUC1若しくはMUC1*陽性癌を持つと診断された、それが疑われた、若しくは進展のリスクがあるヒトを処置する方法。
【請求項８２】
請求項７６〜８０のいづれか一に記載のscFvを含むscFv-Fc構築物。
【請求項８３】
二量体化している、請求項８２に記載のscFv-Fc構築物。
【請求項８４】
Fc要素が、scFv-Fcが単量体であるように、変異されている、請求項８２に記載のscFv-Fc構築物。
【請求項８５】
当該変異が、Fcのヒンジ領域の変異若しくは欠失することを含み、SEQ ID NO:281, 279, 285 及び 287によって表されるFCにおけるF405Q, Y407R, T366W/L368W, 及び T364R/L368R変異又はその組み合わせをおこなうことを含む、請求項８４に記載のscFv-Fc構築物。
【請求項８６】
少なくとも２つの異なるscFv 配列を含むポリペプチドであって、scFv 配列のひとつは、縦列反復ドメインを欠くMUC1アイソフォーム若しくは開裂産物の細胞外ドメインに結合する配列である、ポリペプチド。
【請求項８７】
当該ポリペプチドが、以下に結合する、請求項８６に記載のポリペプチド
(i) MUC 1のPSMGFR領域; 
(ii) PSMGFR ペプチド; 
(iii) 次のアミノ酸配列をもつペプチド 
SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY (SEQ ID NO:620); 
(iv) 次のアミノ酸配列をもつペプチド 
VQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY (SEQ ID NO:621); 
(v) 次のアミノ酸配列をもつペプチド 
VQLTLAFREGTINVHDVETQFNQY (SEQ ID NO:622); 若しくは 
(vi) 次のアミノ酸配列をもつペプチド 
SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTIN (SEQ ID NO:623)。
【請求項８８】
当該ポリペプチドは、免疫細胞のリセプターに結合する、請求項８６に記載のポリペプチド。
【請求項８９】
当該ポリペプチドは、T細胞のリセプターに結合する、請求項８８に記載のポリペプチド。
【請求項９０】
当該ポリペプチドは、T細胞のCD3に結合する、請求項８９に記載のポリペプチド。
【請求項９１】
異常にMUC1*を発現する細胞の存在を検出する方法であって、請求項８２に記載のscFv-Fcと細胞のサンプルを接触させ、該細胞へのscFv-Fcの結合の存在を検出することを含む、方法。
【請求項９２】
当該細胞が、癌細胞である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
MN-E6, MN-C2, MN-C3 若しくは MN-C8の可変領域の部分を含む組成物での処置の適合性について、対象者の癌をテストする方法であって、相当するMN-E6 scFv-Fc, MN-C3 scFv-Fc, MN-C3 scFv-Fc 若しくは MN-C8 scFv-Fcと、患者からの生体標品を接触するステップを含む、方法。
【請求項９４】
対象からのT細胞をMUC1*ペプチドに露出し、そこにおいて、成熟の種々のラウンドを通じて、T細胞がMUC1*特異的リセプターを展開し、アダプテイッド(adapted)T細胞を創生させる、
MUC1*陽性癌を持つと診断された、それが疑われた、若しくは進展のリスクがあるドナー患者に、該アダプテイッド(adapted)T細胞を拡張させ、投与すること、を含む、疾患のある対象を処置する方法。
【請求項９５】
MUCl*標的化CARで形質導入された免疫細胞の有効量を投与することを含む、MUC1陽性若しくはMUC1*陽性癌を持つと診断された、それが疑われた、若しくは進展のリスクがある患者を処置する方法。
【請求項９６】
当該免疫細胞が、患者から単離されたT細胞であり、次いで、それは、CARの標的化ヘッドがMUC1*に結合するCARで形質導入され、形質導入されたT細胞の拡張後、該CAR T細胞は該患者に有効量で投与される、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
当該免疫細胞が、患者から単離されたT細胞であり、次いで、それは、CARの標的化ヘッドがhuMN-E6, huMN-C2, huMN-C3 若しくは huMN-C8の部分を含むCARで形質導入され、形質導入されたT細胞の拡張後、該CAR T細胞は該患者に有効量で投与される、請求項９５に記載の方法。
【請求項９８】
癌治療用である、開裂酵素で形質転換若しくは形質導入された免疫細胞。
【請求項９９】
癌細胞が、MUCl陽性癌である、請求項９８に記載の免疫細胞。
【請求項１００】
免疫細胞が、T細胞若しくはNK細胞である、請求項９８に記載の免疫細胞。
【請求項１０１】
当該細胞が、処置される患者由来である、請求項１００に記載の免疫細胞。
【請求項１０２】
該開裂酵素が、MMP若しくはADAMファミリーメンバー若しくはそれらの触媒活性断片である、請求項９８に記載の免疫細胞。
【請求項１０３】
該開裂酵素が、MMP2, MMP9, MMP3, MMP14, ADAM 17, ADAM28, 若しくは ADAM TS 16である、請求項１０２に記載の免疫細胞。
【請求項１０４】
癌治療用である、抗体断片を含むCAR  及び  開裂酵素若しくはその触媒活性断片、の両方で、形質転換された若しくは形質導入された免疫細胞。
【請求項１０５】
癌が、MUCl陽性癌である、請求項１０４に記載の免疫細胞。
【請求項１０６】
免疫細胞が、T細胞若しくはNK細胞である、請求項１０４に記載の免疫細胞。
【請求項１０７】
T細胞におけるCARの抗体断片が該細胞をMUC1*陽性癌に導く、請求項１０４に記載の免疫細胞。
【請求項１０８】
免疫細胞に形質導入されたCARの抗体断片が、免疫細胞に形質導入されている開裂酵素によって開裂された後のMUC1の型を認識する、請求項１０４に記載の免疫細胞。
【請求項１０９】
CARの抗体断片は、MNC2 若しくは MNE6に由来し、及び、開裂酵素は、MMP9若しくはMMP9の断片若しくはMMP9の活性型である、請求項１０８に記載の免疫細胞。
【請求項１１０】
開裂酵素の活性化剤を、形質転換若しくは形質導入された、請求項１０４に記載の免疫細胞。
【請求項１１１】
開裂酵素がMMP9であり、開裂酵素の活性化剤がMMP3である、請求項１１０に記載の免疫細胞。
【請求項１１２】
開裂酵素をコードする核酸は、誘導可能なプロモーターにリンクする、請求項１０４に記載の免疫細胞。
【請求項１１３】
開裂酵素の発現が、免疫細胞が標的腫瘍細胞への免疫応答を開始するときに特異的におこる事象によって、誘導される、請求項１１２に記載の免疫細胞。
【請求項１１４】
誘導可能なプロモーターが、開裂酵素を発現するために、NFATファミリー蛋白質の存在によって誘導される、又は、誘導可能なプロモーターが、NFAT蛋白質の発現のためのプロモーターである、請求項１１２に記載の免疫細胞。
【請求項１１５】
NFAT蛋白質は、NFAT2として知られるNFATclである、請求項１１４の免疫細胞。
【請求項１１６】
免疫細胞は、T細胞若しくはNK細胞である、請求項１１２に記載の免疫細胞。
【請求項１１７】
当該抗体断片が、開裂酵素が、MUC1 若しくは MUCl*を開裂するとき、創生されるMUC1 若しくは MUCl*の型を認識する、請求項１０４に記載の免疫細胞。
【請求項１１８】
当該抗体断片が、CARの部分である、請求項１１２に記載の免疫細胞。
【請求項１１９】
誘導可能プロモーターにおける開裂酵素の発現は、CARの抗体断片が、腫瘍における、MUC1 若しくは MUC1*に結合する若しくは応答するときに、誘導される、請求項１１２に記載の免疫細胞。
【請求項１２０】
省略
【請求項１２１】
NFATプロモーターの下流に局在する、開裂酵素若しくはその触媒活性断片をコードする核酸を含む核酸構築物。
【請求項１２２】
NFAT が NFATclである、請求項１２１に記載の核酸構築物。
【請求項１２３】
プロモーターの配列が、SEQ ID NOS:781-783で表されるプロモーター配列、又はそれらの断片若しくは変異体であり、それは、開裂酵素若しくはその触媒活性断片の発現を誘導する活性を保持する、請求項１２１に記載の核酸構築物。
【請求項１２４】
開裂酵素が、MMP9である、請求項１２１に記載の核酸構築物。
【請求項１２５】
プラスミドである、請求項１２１に記載の核酸構築物。
【請求項１２６】
請求項１２１に記載の核酸構築物で、形質転換若しくは形質導入された免疫細胞。
【請求項１２７】
T細胞若しくはNK細胞である、請求項１２６に記載の免疫細胞。
【請求項１２８】
請求項１２６に記載の免疫細胞を患者に投与することを含む、癌の処置若しくは予防の方法。
【請求項１２９】
少なくとも一つのNFAT反応要素の下流に局在する、開裂酵素若しくはその触媒活性断片をコードする核酸を含む、核酸構築物。
【請求項１３０】
NFAT反応要素が、少なくとも２、３、若しくは４反応要素を含む、請求項１２９に記載の核酸構築物。
【請求項１３１】
該反応要素の配列が、SEQ ID NOS:804-816で表される配列、又はその断片若しくは変異体の配列のいずれかであり、開裂酵素若しくはその触媒活性断片の発現を誘導する活性を保持する、請求項１２９に記載の核酸構築物。
【請求項１３２】
開裂酵素が、MMP9である、請求項１２９に記載の核酸構築物。
【請求項１３３】
プラスミドである、請求項１２９に記載の核酸構築物。
【請求項１３４】
請求項１２９に記載の核酸構築物で、形質転換若しくは形質導入された免疫細胞。
【請求項１３５】
T細胞若しくはNK細胞である、請求項１３４に記載の免疫細胞。
【請求項１３６】
請求項１３４に記載の細胞を患者に投与することを含む、癌の処置若しくは予防の方法。
【請求項１３７】
MUCl* 及び/又は MUC1特異的開裂酵素に特異的であるCARをコードする核酸で形質転換若しくは形質導入された免疫細胞を、MUC1の欠失細胞外ドメイン配列をもつペプチドを提示する表面で、生体外で、該免疫細胞と共培養することで、予備活性化し、予備活性化（予備刺激ともいう）された免疫細胞（予備活性化免疫細胞ともいう）をえる、免疫細胞の予備活性化方法。
【請求項１３８】
免疫細胞は、T細胞である、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
さらに、予備活性化免疫細胞を含む組成物を患者に投与することを含む、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４０】
該表面が、ビーズ、細胞培養プレート、若しくは細胞である、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４１】
該細胞が、MUC1*発現細胞である、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４２】
該細胞が、MUC1*発現癌細胞である、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
該細胞が、患者由来である、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
患者への該組成物投与前に、当該表面を除去することを含む、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１４５】
該表面が細胞であるとき、該細胞は、該細胞が数回複製するように、UV光で処理若しくは化学的に不活性化して、その後、患者に投与される、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
CARをコードするプラスミド及び誘導可能プロモーターから発現される非CARの種類をコードするプラスミドで、形質転換若しくは形質導入された免疫細胞。
【請求項１４７】
CARが、抗体断片、scFv、又は腫瘍抗原に結合するペプチドを含む、請求項１４６に記載の免疫細胞。
【請求項１４８】
腫瘍抗原が、MUCl*である、請求項１４７に記載の免疫細胞。
【請求項１４９】
抗体断片が、非ヒト、ヒト、若しくはヒト化MNC2, MNE6, MNC3 若しくは MNC8由来である、請求項１４７に記載の免疫細胞。
【請求項１５０】
抗体断片、scFv、又は該ペプチドが、B細胞又はB細胞前駆体、CD19, CD20, CD22, BCMA, CD30, CD138, CD123, CD33 若しくは LeY の、表面抗原に結合する、請求項１４７に記載の免疫細胞。
【請求項１５１】
非CARの種類が、活性化免疫細胞の要素によって、活性化される、誘導可能なプロモーターから発現される、請求項１４６に記載の免疫細胞。
【請求項１５２】
非CARの種類が、NFAT誘導可能プロモーターから発現される、請求項１４６に記載の免疫細胞。
【請求項１５３】
NFATが、NFATc 1 , NFATc3 若しくは NFATc2153である、請求項１５２に記載の免疫細胞。
【請求項１５４】
非CARの種類が、開裂酵素である、請求項１４６に記載の免疫細胞。
【請求項１５５】
開裂酵素が、MMP2, MMP3, MMP9, MMP13, MMP14, MMP16, ADAMIO, ADAM 17, 若しくは ADAM28、又はこれらの触媒活性断片である、請求項１４６に記載の免疫細胞。
【請求項１５６】
非CARの種類が、サイトカインである、請求項１４６に記載の免疫細胞。
【請求項１５７】
サイトカインが、IL-7若しくは IL-15 又は IL-7 及び IL-15である、請求項１５６に記載の免疫細胞。
【請求項１５８】
請求項１４６に記載の免疫細胞を、癌患者へ投与することを含む、癌の処置若しくは予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト化及び非ヒト化抗MUCl*抗体及びそれらを作り使用する方法に関係する。
【０００２】
本発明は、また、癌の処置のための開裂酵素で形質転換若しくは形質導入された免疫細胞を使用することに関係する。本発明は、また、癌の処置のためのCAR及び他のタンパク質で形質転換若しくは形質導入された免疫細胞を使用することに関係する。
【背景技術】
【０００３】
本発明者等は、先に、MUC 1 (SEQ ID NO:l)膜貫通タンパク質の開裂型は、ヒト癌の75%以上の成長を導く成長因子リセプターであることを見出した。
【０００４】
我々が、MUCl*（ムックワンスターと発音する）と呼ぶMUC 1の開裂型は、強力な成長因子リセプターである。MUC 1の細胞外領域（以下領域の文言はドメインということもある）の大部分の開裂及び遊離は、活性化リガンド2量体NME 1, NME6, NME7, NME7AB, NME7-X1 若しくは NME8の結合サイトをマスクしない。これは、全ての癌の７５％以上で異常発現し、転移性癌の高率でさえ過剰発現するので、抗ガン医薬の理想的な標的である(Mahanta et al. (2008) A Minimal Fragment of MUC 1 Mediates Growthof Cancer Cells. PLoS ONE 3(4): e2054. doi: 10.1371/ journal.pone.0002054;Fessler et al. (2009), "MUC 1 * is a determinant of trastuzumab(Herceptin) resistance in breast cancer cells," Breast Cancer Res Treat.118(1): 113-124)。MUC1開裂後、その細胞外領域の大部分は、細胞表面から隠されている。残った部分は、 PSMGFR (SEQ ID NO:2)と呼ばれる主要成長因子リセプター配列の殆ど若しくは全てを含む欠失細胞外領域である。
【０００５】
抗体は、ヒトの疾患の治療のために増加的に利用されている。歴史的には、非ヒト種で生成された抗体、例えば馬抗体、がヒトで治療に使われてきた。より、最近では、異種抗体の拒否反応を避けるために、できるだけ、ヒト配列含むように、加工され若しくは選択されている。ヒト抗体への非ヒト抗体の認識断片を加工する工程は、一般的に、「ヒト化する：humanizing」と呼ばれる。ヒト抗体配列を置き換えるに使われる非ヒト配列の量は、それらが、キメラ化、ヒト化、完全ヒトと呼ばれるかどうかを決定する。
【０００６】
ヒト化若しくは完全ヒト抗体の生成を可能にする互換的な技術手段が存在する。これらの手段には、動物に抗原で免疫するよりむしろ、ヒト抗体若しくは抗体断片のライブラリーをスクリーニングするあるいは標的抗原に結合するようなものを同定することを含む。別のアプローチは、抗体様分子中へ抗体の可変領域を加工処理することである。別のアプローチは、ヒト化動物を免疫化することを含む。本発明は、また、MUCl*の細胞外領域に結合する、本発明者が決定した、抗体認識断片を使ってのこれらのアプローチを包含する。
【０００７】
抗体で患者を処置することに加えて、癌免疫療法は、最近、血液癌の治療に有効であることを示した。一つの癌免疫療法は、CART（キメラ抗原リセプターT細胞）と呼ばれ、T細胞を加工し、その結果、T細胞の癌抗原を認識する細胞外領域を持つ細胞外領域、膜貫通及び細胞質尾部を持つキメラリセプターを発現する (Dai H, Wang Y, Lu X, Han W.(2016) Chimeric Antigen Receptors Modified T-Cells for Cancer Therapy. J NatlCancer Inst. 108(7): djv439)。このようなリセプターは、癌抗原を認識し、T細胞膜貫通及びシグナリング領域にリンクする、単鎖抗体断片(scFv)から構成される。癌関連抗原へのリセプターの結合において、シグナルは、伝わり、T細胞活性化、伝播、癌細胞の標的化された殺滅をもたらす。実際、患者T細胞は、単離され、CARで形質導入され、増殖され、その後、患者へ注入によって戻された。患者のCAR T細胞が癌細胞上の抗原に結合するとき、該CAR T細胞は、増殖し、該癌細胞を攻撃する。この方法の欠点は、多くの癌抗原がある健康組織で発現し、しかし、癌組織で過剰発現するとき、標的抗原を担持する細胞を破滅させるように、患者免疫系を活性化することのリスクである。腫瘍オフ／標的オン効果（off-tumor/on-target effects）のリスクを最小にするためには、癌抗原は、健康組織で発現が最小であることである。
【０００８】
別の癌免疫療法は、BiTEs（２重特異的T細胞関与物：Bi-specific T cell Engagers）。BiTEアプローチは、腫瘍オフ／標的オン効果（off-tumor/on-target effects）のCAR T関連リスクを排除する試みである。CAR Tとは違って、BiTEsは、一般的な抗体ベース治療より、なんら大きなリスクを課さない２重特異的抗体である。しかしながら、癌抗原に結合しそしてブロックする典型的な抗癌抗体と異なり、癌細胞上の抗原へ結合し、同時に、T細胞のような、免疫細胞にある抗原に結合するｋとを指向する。この方法で、BiTEsは、T細胞を癌細胞へリクルートする。BiTEsは、癌関連抗原へ結合すると同時にCD3-イプシロンのようなT細胞表面タンパク質に結合する加工タンパク質である。BiTEsは、癌抗原に結合する治療用モノクローナル抗体のscFvへの抗CD3-イプシロンのように、T細胞抗原に結合する抗体のscFv'sに遺伝子工学的にリンキングさせることにより作られた抗体である(Patrick A. Baeuerle, andCarsten Reinhardt (2009) Bispecific T-cell engaging antibodies for cancertherapy. Cancer Res. 69(12):4941-4944)。
【発明の解決手段】
【０００９】
1つの態様では、本願発明は、縦列反復領域が欠けているMUClアイソフォーム若しくは開裂産物の細胞外領域の部位へ結合する非ヒト、ヒト、ヒト化抗MUCl*抗体若しくは抗体断片、若しくは、抗体様タンパク質を志向する。非ヒト、ヒト、ヒト化抗MUCl*抗体若しくは抗体断片、若しくは、抗体様タンパク質は、特異的に以下に結合できる：
【００１０】
(i)PSMGFR領域;
【００１１】
(ii)PSMGFRペプチド;
【００１２】
(iii)SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY(SEQID NO: 620)のアミノ酸配列であるペプチド;
【００１３】
(iv)SVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY(SEQID NO: 621)のアミノ酸配列であるペプチド、;
【００１４】
(v)VQLTLAFREGTINVHDVETQFNQY(SEQ ID NO: 622)のアミノ酸配列であるペプチド;若しくは
【００１５】
(vi)SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTIN(SEQ ID NO:623)のアミノ酸配列であるペプチド。
【００１６】
非ヒト、ヒト若しくはヒト化抗体は、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4若しくはIgMでありうる。
ヒト若しくはヒト化抗体断片、若しくは、抗体様タンパク質は、scFv若しくはscFv-Fcでありうる。
【００１７】
上記における、ヒト若しくはヒト化抗体、抗体断片若しくは抗体様タンパク質は、マウスモノクローナルMN-E6抗体に由来する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含んでもよい。また、マウスモノクローナルMN-E6抗体に、少なくとも80%、90%、95%若しくは98%の配列同一性を持ちうる。重鎖可変領域は、SEQ ID NO:13に、少なくとも90%、95%若しくは98%の配列同一性を持ちうる。そして、軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:66に、少なくとも90%、95%若しくは98%の配列同一性を持ちうる。
【００１８】
上記における、ヒト若しくはヒト化抗体、抗体断片若しくは抗体様タンパク質は、次のような配列をもつ、CDR1、CDR2若しくはCDR3領域へ、少なくとも90%、95%若しくは98％の配列同一性がある、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域に相補性決定領域(CDRs)を含みうる:
【００１９】
CDR1重鎖SEQ ID NO:17
【００２０】
CDR1軽鎖SEQ ID NO:70、
【００２１】
CDR2重鎖SEQ ID NO:21
【００２２】
CDR2軽鎖SEQ ID NO:74、
【００２３】
CDR3重鎖SEQ ID NO:25
【００２４】
CDR3軽鎖SEQ ID NO:78．
【００２５】
上記、ヒト若しくはヒト化抗体、抗体断片若しくは抗体様タンパク質は、マウスモノクローナルMN-C2抗体に由来する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含みうる。そして、それは、マウスモノクローナルMN-C2抗体への少なくとも80%、90%、95%若しくは98%の配列同一性をもちうる。重鎖可変領域は、SEQ ID NO:119へ、少なくとも90%、95%若しくは98%の、配列同一性をもちうる。そして、軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:169へ、少なくとも90%、95%若しくは98%の配列同一性をもちうる。重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の相補性決定領域(CDR)は、少なくとも90%、95%若しくは98%の、以下のような、CDR1、CDR2若しくはCDR3領域への配列同一性をもちうる:
【００２６】
CDR1重鎖SEQ ID NO:123
【００２７】
CDR1軽鎖SEQ ID NO:173、
【００２８】
CDR2重鎖SEQ ID NO:127
【００２９】
CDR2軽鎖SEQ ID NO:177、
【００３０】
CDR3重鎖SEQ ID NO:131
【００３１】
CDR3軽鎖SEQ ID NO:181。
【００３２】
ヒト若しくはヒト化抗体、抗体断片若しくは抗体様タンパク質は、マウスモノクローナルMN-C3抗体に由来する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含みうる。また、それは、マウスモノクローナルMN-C3抗体へ、少なくとも80%、90%、95%若しくは98%の配列同一性をもちうる。重鎖可変領域は、SEQ ID NO:414へ、少なくとも90%、95%若しくは98%の配列同一性を持ちうる。及び、軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:459へ、少なくとも90%、95%若しくは98%の配列同一性を持ちうる。重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の相補性決定領域(CDR)は、以下のような配列のCDR1、CDR2若しくはCDR3領域へ、少なくとも90%、95%若しくは98%の配列同一性をもちうる:
【００３３】
CDR1重鎖SEQ ID NO:418
【００３４】
CDR1軽鎖SEQ ID NO:463、
【００３５】
CDR2重鎖SEQ ID NO:422
【００３６】
CDR2軽鎖SEQ ID NO:467、
【００３７】
CDR3重鎖SEQ ID NO:426
【００３８】
CDR3軽鎖SEQ ID NO:471。
【００３９】
上記、ヒト若しくはヒト化抗体、抗体断片若しくは抗体様タンパク質は、マウスモノクローナルMN-C8抗体に由来する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含みうる。また、マウスモノクローナルMN-C8抗体に、少なくとも80%、90%、95%若しくは98%の配列同一性を持ちうる。重鎖可変領域は、SEQ ID NO:506へ、少なくとも90%、95%若しくは98%の配列同一性を持ちうる。及び、軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:544へ、少なくとも90%、95%若しくは98%の配列同一性を持ちえる。重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の相補性決定領域(CDR)は、少なくとも90%、95%若しくは98%の、以下のような配列のCDRl、CDR2若しくはCDR3領域への配列同一性をもちうる:
【００４０】
CDRl重鎖SEQ ID NO:508
【００４１】
CDRl軽鎖SEQ ID NO:546、
【００４２】
CDR2重鎖SEQ ID NO:510
【００４３】
CDR2軽鎖SEQ ID NO:548、
【００４４】
CDR3重鎖SEQ ID NO:512
【００４５】
CDR3軽鎖SEQ ID NO:550。
【００４６】
別の態様では、本願発明は、ヒト化ラムダ軽鎖若しくはヒト化カッパ軽鎖とペアになって、ヒト化IgG2重鎖若しくはヒト化IgGl重鎖によって表わされる、ヒト化MN-E6の配列で構成された抗MUCl*細胞外領域抗体を志向する。ヒト化IgG2重鎖は、SEQ ID NOS:53でありえ、ヒト化IgGl重鎖は、SEQ ID NO:57でありえ、ヒト化カッパ軽鎖は、SEQ ID NO:108でありえ、また、ヒト化ラムダ軽鎖は、SEQ ID NO:112でありえ、若しくはその90%、95%若しくは98%配列同一性をもちうるものでありえる。
【００４７】
別の態様では、本願発明は、ヒト化カッパ軽鎖若しくはヒト化ラムダ軽鎖とペアになって、ヒト化IgGl重鎖若しくはヒト化IgG2重鎖によって表わされる、ヒト化MN-C2の配列で構成された抗MUCl*細胞外領域抗体を志向する。ヒト化IgGl重鎖MN-C2はSEQ ID NOS:159でありえ、そして、IgG2重鎖はSEQ ID NOS:164でありえ、ラムダ軽鎖はSEQ ID NO:219、カッパ軽鎖はSEQ ID NO:213でありえ、若しくはそれの90%、95%若しくは98%の配列同一性をもちうるものである。
【００４８】
別の態様では、本願発明は、ヒト化ラムダ軽鎖若しくはヒト化カッパ軽鎖とペアになって、ヒト化IgGl重鎖若しくはヒト化IgG2重鎖によって表わされる、ヒト化MN-C3の配列で構成された抗MUCl*細胞外領域抗体を志向する。ヒト化MN-C3 IgGl重鎖はSEQ ID NOS:454でありえ、IgG2重鎖はSEQ ID NOS:456でありえ、ラムダ軽鎖はSEQ ID NO:501でありえ、カッパ軽鎖はSEQ ID NO:503でありえ、若しくはそれの90%、95%若しくは98%の配列同一性を持ちうるものである。
【００４９】
別の態様では、本願発明は、ヒト化ラムダ軽鎖若しくはヒト化カッパ軽鎖とペアになって、ヒト化IgGl重鎖若しくはヒト化IgG2重鎖によって表わされる、ヒト化MN-C8の配列で構成された抗MUCl*細胞外領域抗体を志向する。ヒト化MN-C8 IgGl重鎖はSEQ ID NOS:540でありえ、IgG2重鎖はSEQ ID NOS:542でありえ、ラムダ軽鎖はSEQ ID NO:580でありえ、カッパ軽鎖はSEQ ID NO:582でありえ、若しくはそれの90%、95%若しくは98%の配列同一性を持ちうるものである。
【００５０】
別の態様では、本願発明は、MUC1*へのNMEタンパク質の結合を阻害する、ヒト若しくはヒト化抗MUCl*抗体、抗体断片若しくは抗体様タンパク質を志向する。NMEは、NME1、NME6、NME7AB、NME7-X1、NME7若しくはNME8でありうる。
【００５１】
まだ別の態様では、本願発明は、MUCl*細胞外領域に結合する抗体のCDRsをさらに含んで、リンカーを経て接続している重及び軽鎖可変領域を含む、単一鎖可変断片(scFv)を志向する。CDRは、MN-E6、MN-C2、MN-C3若しくはMN-C8抗体若しくはそれのヒト化抗体に由来しうる。scFvは、SEQ ID NOS:233、235及び237(E6)； SEQ ID NOS:239、241及び243(C2); SEQ ID NOS:245、247及び249(C3);若しくはSEQ ID NOS:251、253及び255(C8)を保持するものでありうる。
【００５２】
まだ別の態様では、本願発明は、縦列反復、リンカー分子、膜貫通領域及び細胞質領域が欠けているMUC1の細胞外領域へ結合するscFv若しくはヒト化可変領域を含む、キメラ抗原リセプター(CAR)を志向する。単一鎖抗体断片は、以下に結合できる；
【００５３】
(i) MUC1のPSMGFR領域、
【００５４】
(ii)PSMGFRペプチド、
【００５５】
(iii)SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY(SEQID NO:620) のアミノ酸配列であるペプチド;
【００５６】
(iv)SVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY(SEQID NO:621)のアミノ酸配列であるペプチド;
【００５７】
(v)VQLTLAFREGTINVHDVETQFNQY(SEQ ID NO:622)のアミノ酸配列であるペプチド;若しくは
【００５８】
(vi)SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTIN(SEQ ID NO:623)のアミノ酸配列であるペプチド。
【００５９】
上記CARにおいて、上記及び定義された可変領域のうちのいずれかの部分、又はそれのコンビネーションは、CARの細胞外領域で使用されてもよい。CARは、さらに、膜貫通領域、及び免疫系活性化をシグナルする配列モチーフを含む細胞質尾部を含む。細胞外領域は、MN-E6 scFv、MN-C2 scFv、MN-C3 scFv若しくはMN-C8 scFvの、非ヒト若しくはヒト化単一鎖抗体断片で構成されうる。
【００６０】
上記CARでは、細胞外領域が、SEQ ID NOS :233、235若しくは237、MN-C2 scFv(SEQ IDNOS: 239、241若しくは243)、MN-C3 scFv(SEQ ID NOS:245、247若しくは249)又はMN-C8 scFv(SEQ ID NOS:251、253若しくは255) として定義された、MN-E6scFvの非ヒト若しくはヒト化単一鎖抗体断片を含みうる。
【００６１】
上記CARでは、細胞質尾部は、シグナル配列モチーフCD3-zeta、CD27、CD28、4-IBB、OX40、CD30、CD40、ICAm-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD5若しくはCD7の1つ以上で構成されうる。
【００６２】
上記CARでは、配列は、
CAR MN-E6 CD3z(SEQ ID NOS:295)、CAR MN-E6 CD28/CD3z(SEQ ID NOS:298)); CAR MN-E64-lBB/CD3z(SEQ ID NOS:301); CAR MN-E6 OX40/CD3z(SEQ ID NOS:617); CAR MN-E6CD28/4-lBB/CD3z(SEQ ID NOS:304); CAR MN-E6 CD28/OX40/CD3z(SEQ ID NOS:619); CARMN-C2 CD3z(SEQ ID NOS:607); CAR MN-C2 CD28/CD3z(SEQ ID NOS:609); CAR MN-C24-lBB/CD3z(SEQ ID NOS:611及びSEQ ID NOS:719); CAR MN-C2 OX40/CD3z(SEQ ID NOS:613); CAR MN-C2CD28/4-lBB/CD3z(SEQ ID NOS:307); CAR MN-C2 CD28/OX40/CD3z(SEQ ID NOS:615)若しくはCAR MN-C3 4-lBB/CD3z(SEQ ID NOS:601)でありうる。
【００６３】
別の態様では、CARは、ペプチドを認識する細胞外領域ユニットを持ちうる。ペプチドは、PSMGFR(SEQ IDNO:2)でありうる。ペプチドは、NME7に由来したペプチドでありうる。ペプチドは以下でありうる；
【００６４】
NME7Aペプチド1(A領域):
MLSRKE ALDFH VDHQS;(SEQ ID NO:7);
【００６５】
NME7Aペプチド2(A領域):
SGVARTDASES;(SEQ ID NO:8);
【００６６】
NME7Bペプチド1(B領域):
DAGFEISAMQMFNMDRVNVE;(SEQ ID NO:9);
【００６７】
NME7Bペプチド2(B領域):
EVYKGVVTEYHDMVTE;(SEQ ID NO:10);
若しくは
【００６８】
NME7Bペプチド3(B領域):
AIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF(SEQ ID NO:ll)。
【００６９】
別の態様では、本願発明は、同じ細胞へ形質転換された異なる細胞外領域ユニットを備えた少なくとも2つのCARを含んでいる構成を志向する。
【００７０】
少なくとも2つのCARは、腫瘍抗原標的認識ユニットがない1つのCARを持ち、別のCARは腫瘍抗原標的認識ユニットがある。本願発明の別の態様では、細胞外領域認識ユニットのうちの1つは、MUCl*細胞外領域に結合しうる。本願発明の別の態様では、細胞外領域認識ユニットのうちの1つは、抗体断片でありえ、そして、他はペプチドであり、それは膜貫通及びシグナルリングモチーフが欠けうる;該ペプチドは単一鎖抗体断片でありえる。本願発明の別の態様では、認識ユニットのうちの1つは、PD-1若しくはPDL-1を結合できる。本願発明の別の態様では、1つの細胞外領域認識ユニットは、MN-E6抗体のscFv、MN-C2抗体のscFv、MN-C3抗体のscFv若しくはMN-C8抗体のscFvからなるグループから選ばる抗MUCl* scFvであり、そして、他は、NME7に由来したペプチド若しくは以下のグループから選ばれたペプチドである；
【００７１】
NME7Aペプチド1(A領域):
MLSRKEALDFHVDHQS;(SEQ ID NO:7)；
【００７２】
NME7Aペプチド2(A領域):
SGVARTDASES;(SEQ ID NO:8)；
【００７３】
NME7Bペプチド1(B領域):
DAGFEISAMQMFNMDRVNVE;(SEQ ID NO:9)；
【００７４】
NME7Bペプチド2(B領域):
EVYKGVVTEYHDMVTE;(SEQ ID NO:10)；及び
【００７５】
NME7Bペプチド3(B領域):
AIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF(SEQ ID NO:ll)。
【００７６】
別の態様では、本願発明は、縦列反復が欠けているMUCl分子の細胞外領域へ結合する細胞外領域を備えたCARを含む細胞を志向する。別の態様では、本願発明は、MUCl*形質転換若しくは形質導入細胞に結合する、細胞外領域を備えたCARを含む細胞を志向する。CARを含んでいる細胞は、免疫系細胞、好適には、T細胞、ナチュラルキラー細胞(NK)、樹状細胞若しくはマスト細胞とイありうる。
【００７７】
別の態様では、本願発明は、加工された抗体様タンパク質を志向する。
【００７８】
別の態様では、本願発明は、次のものに結合できる、ヒトである抗体若しくは抗体断片のライブラリーをスクリーニングする方法を志向する
【００７９】
(i)PSMGFRペプチド;
【００８０】
(ii)SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY(SEQID NO:620)のアミノ酸配列であるペプチド;
【００８１】
(iii)SVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY(SEQID NO:621)のアミノ酸配列であるペプチド;
【００８２】
(iv)VQLTLAFREGTINVHDVETQFNQY(SEQ ID NO:622)のアミノ酸配列であるペプチド;
【００８３】
(v)SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTIN(SEQ ID NO:623)のアミノ酸配列であるペプチド;
【００８４】
(vi)NME7タンパク質;若しくは
【００８５】
(vii)NME7タンパク質のペプチド断片。
【００８６】
別の態様では、本願発明は、その病気に苦しむ人に、任意の上記の記述によって抗体を処理することを含む対象患者の病気を治療する方法を志向する。そこでは対象患者は、MUClを異常に発現する。当該病気は、乳癌、卵巣癌、肺癌、結腸癌、胃癌若しくは食道癌のような癌でありうる。
【００８７】
別の態様では、本願発明は、その病気に苦しむ人に、NMEペプチドを投与することを含む対象患者の病気を治療する方法を志向する。そこでは対象患者は、MUClを異常に発現する。
【００８８】
別の態様では、本願発明は、細胞を上記任意の方法若しくは構成による抗体と接触させることを含む幹細胞数を増殖若しくは拡張する方法を志向する。
【００８９】
別の態様では、本願発明は、ヒト化MN-C3若しくはMN-C8抗体、それらの抗体断片若しくは単一鎖抗体で表面を被覆し、そして、該表面への幹細胞を接触させることを含む、表面への幹細胞付着を促進する方法を志向する。
【００９０】
別の態様では、本願発明は、ヒト化MN-C3若しくはMN-C8抗体、それらの抗体断片若しくは単一鎖抗体で、表面を被覆し、該表面へ幹細胞を接触させ、そして、特定の位置に幹細胞を輸送するステップを含む、生体内若しくは生体外で、幹細胞を移送する方法を志向する。
【００９１】
別の態様では、本願発明は、ヒト化MN-C3若しくはMN-C8抗体、それらの抗体断片若しくは単一鎖抗体で、表面を被覆し、該表面へ細胞の混合物と接触させ、そして、幹細胞を単離するステップを含む、幹細胞を単離する方法を志向する。
【００９２】
別の態様では、本願発明は、縦列反復領域が欠けているMUClアイソフォーム若しくは開裂産物の細胞外領域へ結合する抗体に由来した可変領域断片を含むscFvを志向する。可変領域断片は、マウスモノクローナル抗体MN-E6(SEQ ID NO:13と66)若しくはヒト化MN-E6(SEQID NO:39と94)、若しくはMN-E6 scFv(SEQ ID NO:233、235及び237)に由来しうる。若しくは、可変領域断片は、マウスモノクローナル抗体MN-C2(SEQ ID NO:119と169)、若しくはヒト化MN-C2(SEQID NO: 145と195)、若しくはMN-C2 scFv(SEQ ID NO:239、241及び243)に由来しうる。若しくは、可変領域断片は、マウスモノクローナル抗体MN-C3(SEQ ID NO:414と459)、ヒト化MN-C3(SEQ IDNO:440と487)、若しくはMN-C3 scFv(SEQ ID NO:245、247及び249)に由来しうる。若しくは、可変領域断片は、マウスモノクローナル抗体MN-C8(SEQ ID NO:505と544)、ヒト化MN-C8(SEQ IDNO:526と566)、若しくはMN-C8 scFv(SEQ ID NO:251、253、255)に由来しうる。
【００９３】
別の態様では、本願発明は、ヒトに、有効な量の上記scFvを投与することを含む、MUC1若しくはMUCl*陽性癌を持つと診断された、それが疑われた、進展のリスクがある対象の処置法を志向する。
【００９４】
別の態様では、本願発明は、上記scFvを含むscFv-Fc構築物を志向する。scFv-Fcは、二量化しうる。scFv-Fcがモノマーであるように、Fcコンポーネントが変異されうる。該変異は、Fcのヒンジ領域を変異させるか削除し、SEQ ID NO:281、279、285及び287によって表わされるFcでの、F405Q、Y407R、T366W/L368W若しくはT364R/L368R変異若しくはそれらの組合せをつくりだす。
【００９５】
別の態様では、本願発明は少なくとも2つの異なるscFv配列を含むポリペプチドを志向し、そこでは、scFv配列のうちの1つは、縦列反復領域が欠けているMUC1アイソフォーム若しくは開裂産物の細胞外領域へ結合する配列である。該ポリペプチドは以下に結合する；
【００９６】
(i) MUC1のPSMGFR領域;
【００９７】
(ii)PSMGFRペプチド;
【００９８】
(iii)SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY(SEQID NO:620)のアミノ酸配列であるペプチド;
【００９９】
(iv)VQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY(SEQ IDNO:621)のアミノ酸配列であるペプチド;
【０１００】
(v)VQLTLAFREGTINVHDVETQFNQY(SEQ ID NO:622)のアミノ酸配列であるペプチド;若しくは
【０１０１】
(vi)SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTIN(SEQ ID NO:623)のアミノ酸配列であるペプチド。
【０１０２】
該ポリペプチドは、T細胞のような免疫細胞、特に、T細胞上のCD3にあるリセプターに結合できる。
【０１０３】
別の態様では、本願発明は、上記scFv-Fcと細胞のサンプルを接触させ、該細胞へのscFv-Fcの結合の存在を検知することを含む、MUCl*を異常に発現する細胞の存在を検出する方法を志向する。該細胞は癌細胞でありうる。
【０１０４】
別の態様では、本願発明は、対応するMN-E6 scFv-Fc、MN-C2 scFv-Fc、MN-C3 scFv-Fc若しくはMN-C8 scFv-Fcとの、患者からの体標本を接触させるステップを含む、MN-E6、MN-C2、MN-C3若しくはMN-C8の可変領域の部分を含む組成物での処置の適応性に関して対象患者の癌をテストする方法を志向する。
【０１０５】
別の態様では、本願発明は、成熟の様々な段階によって、T細胞がMUCl*特異的リセプターを展開する、MUCl*ペプチドに対象からのT細胞を露出し、適したT細胞（アドプテイッドT細胞）を作り出し、拡張し、そして、MUCl*陽性癌を持つと診断された、それが疑われた、進展のリスクがあるドナー患者へ、該アドプテイッドT細胞を投与することを含む、疾病に苦しむ対象患者を治療する方法を志向する
【０１０６】
1つの態様では、本願発明は、癌治療のために、開裂酵素で形質転換若しくは形質導入された免疫細胞に志向する。該癌はMUC1陽性癌でありうる。該免疫細胞はT細胞でありうる。該免疫細胞は、治療される患者に由来しうる。該開裂酵素は、MMP若しくはADAM ファミリーのメンバーでありうる。該開裂酵素は、MMP2、MMP9、MMP3、MMP14、ADAM 17、ADAM 28若しくはADAM  TS 16でありうる。
【０１０７】
別の態様では、本願発明は、その細胞外領域が、縦列反復が欠けているMUC1分子の細胞外領域へ結合する抗体scFvを含む、CARで形質転換若しくは形質導入された免疫細胞を志向する。
【０１０８】
別の態様では、本願発明は、癌治療のために、開裂酵素で形質転換若しくは形質導入された免疫細胞を志向する。該癌はMUC1陽性癌でありうる。該免疫細胞はT細胞でありうる。該免疫細胞はNK細胞でありうる。該開裂酵素は、縦列反復領域が膜貫通領域から分離されるようにMUC1を開裂する酵素でありうる。そのような開裂酵素は、MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP16、ADAM 9、ADAM 10、ADAM 17、ADAM 19、ADAM TS 16、ADAM 28若しくはそれの触媒活性断片が例示されるが、これらに限定されるものでない。該免疫細胞は、開裂酵素の活性化剤でさらに形質転換若しくは形質導入されうる。該開裂酵素は、制限なく、MMP2若しくはMMP9若しくはADAM 17でありえ、及び開裂酵素MMP2及びMMP9の活性化剤は、それぞれMMP14とMMP3でありうる。該開裂酵素をコードする核酸は、誘導可能なプロモーターにリンクされうる。該開裂酵素の発現は、免疫細胞が標的腫瘍細胞への免疫反応をマウントする場合、特異的に生じる事象によって誘導されうる。本発明の1つの態様では、該開裂酵素は、開裂産物が、癌組織において、特異的に、開裂したMUC1を認識する抗体によって、認識されるように、MUC1を開裂する。1つの態様では、開裂したMUC1を特異的に認識する抗体は、T細胞が正常に機能する健康組織に結合するより、癌組織において、少なくとも２倍、癌組織に結合するだろう。
【０１０９】
別の態様では、本願発明は、抗体断片を含むCARで形質転換若しくは形質導入された免疫細胞、及び癌治療のための開裂酵素を志向する。該癌は、MUC1陽性癌でありうる。
該免疫細胞は、T細胞でありうる。T細胞におけるCARの抗体断片は、細胞を、MUCl*陽性腫瘍に仕向けうる。T細胞にけるCARの抗体断片は、その特異的開裂酵素によって開裂された後、MUC1型を認識しうる。該CARの抗体断片は、MN-C2またはMN-E6に由来しうるし、また、該開裂酵素はMMP9、MMP2若しくはADAM 17、又はMMP9、MMP2若しくはADAM 17の活性化型でありうる。該免疫細胞は、開裂酵素の活性化剤でさらに形質転換若しくは形質導入されうる。該開裂酵素、恐らく、MMP2若しくはMMP9若しくはADAM 17、及び、開裂酵素MMP2及びMMP9の活性化剤は、それぞれMMP14とMMP3でありうる。該開裂酵素をコードする核酸は、誘導可能なプロモーターにリンクされうる。該開裂酵素の発現は、免疫細胞が標的腫瘍細胞への免疫反応をマウントする場合、特異的に生じる事象によって誘導されうる。該抗体断片は、開裂酵素がMUC1若しくはMUCl*を開裂する場合に、つくられるMUC1若しくはMUCl*の型を認識しうる。誘導可能なプロモーターによる開裂酵素の発現は、CARの抗体断片が、腫瘍で、MUC1若しくはMUCl*に関与するか結合する場合に、誘導されうる。
【０１１０】
別の態様では、本願発明は、チェックポイント阻害剤との組合せで、患者に上記のもののうちのいずれかの免疫細胞を投与することを含む患者の癌を処置する方法を志向する。
【０１１１】
これら及び本願発明の他の目的は、以下の詳細な説明、付記された参考文献、図面、及びクレーム、実施例の記述からより完全に理解されうる。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
本願発明は、以下の詳細な説明の記述、及び実施例、図面で与えられ、より完全に理解されるうるが、それらは本願発明を限定するものではない。
【０１１３】
【図１】図1A-1Dは、二価の「bv」抗MUCl*抗体、一価の「mv」若しくはFab、NM23-H1二量体若しくはNME7-ABで処理されたMUCl*陽性細胞の細胞増殖分析グラフを示す。二価の抗MUCl*抗体は、癌細胞の成長を促進する、しかし、一価、Fabは、成長を阻害する(A、B)。古典的な正規曲線は、リガンド誘導二量化が成長を促進することを示す。二量体のNM23-H1(aka NMEl)は、MUCl*陽性癌細胞の成長を促進するが、siRNAはMUC1発現を抑えその効果を排除する(C)。NME7-ABは、又、MUC1*陽性細胞の成長を促進する(D)。
【０１１４】
【図２】図2A-2Fは、 ELISA分析の結果を表わす。MUC1*ペプチドPSMGFR、N-末端からのマイナス10アミノ酸PSMGFR aka N-10、若しくは、C末端からのマイナス10アミノ酸PSMGFR  aka C-10が、プレートに固定化され、次のものとの、結合について分析される: NME7-AB(A)、MN-C2モノクローナル抗体(B)、MN-E6モノクローナル抗体(C)若しくは二量体NMEl(D)。これらの分析は、NMEl、NME7-AB、及びモノクローナル抗体MN-C2及びMN-E6が、すべて、結合のために、MUCl*細胞外領域の最初の膜近位10のアミノ酸を必要とすることを示す。N-末端からマイナス10アミノ酸PSMGFR、aka N-10、又はC末端からマイナス10アミノ酸PSMGFR、aka C-10、が、プレートに固定され、次に、次のものへ結合について分析される: MN-C3(E)及びMN-C8(F)。
【０１１５】
【図３】図3A-3Cは、競合的ELISA分析の結果を表わす。PSMGFR MUC1*ペプチドは、プレート上に固定される。そして、二量体のNM23-H1(aka NMEl)が、単独で若しくはMN-E6抗体の添加の後に添加された(A)。NM23-H7、NME7-AB、が単独で添加されるか、MN-E6の後に添加された後に添加され、同じ実験が行なわれた(B)。結果は、MN-E6が、MUCl*活性化リガンド、NMEl及びNME7の結合を競合的に阻害することを示す。同様の実験(C)では、PSMGFRまたはN-末端マイナス10アミノ酸PSMGFR(akaN-10)が、プレート上に固定される。その後、二量体NM23-H1が添加される。その後、抗MUCl*抗体MN-E6、MN-C2、MN-C3若しくはMN-C8は、NM23-H1を競合無効にするそれらの能力に関してテストされる。結果は、3つの抗体は、すべてPSMGFRペプチドに結合するが、MN-E6及びMN-C2は、MUCl*活性化リガンドの結合を競合的に阻害することを示す。
【０１１６】
【図４】図4A-4Fは、MUCl*陽性癌細胞及びMUCl*形質転換細胞に特異的に結合し、MUCl*若しくはMUC1陰性細胞ではおこらないことを示す、抗MUCl*抗体のFACSスキャンを図に表わす。ZR-75-1、aka 1500、MUCl*陽性乳癌細胞が、1.5 μg/mlのヒト化MN-C2の1:2若しくは1:10の稀釈液で、染色された。２度の洗浄の後、huMN-C2 scFvにおける6xHisタグを検知するために、細胞が、第2抗体〔抗ペンタHis抗体であって1:200(A)、1:50(B)若しくは1:10(C)のアレクサ488(Qiagen)稀釈液に結合される〕で染色されたフロー血球計算の分析は、MN-C2 scFvがない状態でみられない、特異的結合を示す、細胞の部分集合の濃度依存性の変異を明らかにした。別の場合では、MN-E6が、空のベクターで形質転換されたMUC1陰性HCT-116結腸癌細胞、単一細胞クローン#8(D)、MUC1*単一細胞クローン#10で形質転換されたHCT-116結腸癌細胞(E)、又は、ZR-75-1、aka 1500、MUC1*陽性乳癌細胞、を染色するために使用された。FACSが示すように、両方のMN-C2及びMN-E6のみが、MUCl*陽性細胞を染色し、MUC1若しくはMUCl*陰性細胞ではおこらない。
【０１１７】
【図５】図5は、MUCl* PSMGFRペプチド若しくはコントロールペプチドのいずれかで表面が覆われるELISAのグラフを示し、ヒト化MN-C2scFvが該表面とインキュベートされ、洗浄され、標準分析法によって検知された。ELISAは、huMN-C2 scFvが、約333nM のEC-50で、MUC1*ペプチドに結合することを示す。
【０１１８】
【図６】図6A-6Bは、MUCl*抗体可変領域断片ヒト化MN-C2 scFvによる癌細胞増殖阻害のグラフを示す。hMN-C2 scFvは、強力に、ZR-75-1、 aka 1500、MUC1*陽性乳癌細胞(A)及びT47D MUC1*陽性乳癌細胞(B)の成長を、ほぼ生体外のELISAと同じEC-50で、阻害した。
【０１１９】
【図７】図7A-7Bは、ヒト腫瘍が注入された免疫不全マウスで、抗MUCl*抗体MN-E6 Fabでの若しくは模擬の処置における腫瘍成長のグラフを示す。90日間エストロゲンペレットが注入された雌のニュー/ニュー・マウスに、Matrigelと50/50に調合された600万のT47Dヒト乳癌細胞が注入された。少なくとも150 mm3で、腫瘍ボリュームの3連続増加があった腫瘍担持マウスが、治療のために選ばれた。動物は、80mg/kgのMN-E6 Fabで皮下に1週当たり2度注入された。また、同じ選択基準に適合する等しい数のマウスが、ビークルを単独で注入された(A)。オスのNOD/SCIDマウスに、Matrigelと50/50に調合された600万のDU-145ヒト前立腺癌細胞が注入された。少なくとも150 mm3で、腫瘍ボリュームの3連続増加があった腫瘍担持マウスが、治療のために選ばれた。動物は、48時間ごとに160mg/kgのMN-E6 Fabを皮下に注入された。また、同じ選択基準に適合する等しい数のマウスが、ビークルを単独で注入された(B)。腫瘍は、2人の研究者によって独立して1週当たり2度測定され記録した。統計は、各々に対する0.0001のP価値を与える独立した統計家によって盲目的に計算された。抗MUCl*のFabは、乳癌成長及び前立腺癌成長を阻害した。治療は、重量、骨髄細胞タイプ若しくは数に影響がなかった。
【０１２０】
【図８】図8は、軽鎖がカッパまたはラムダかどうか、可変部分がヒトIgGlかIgG2に接合したかどうかに依存して、ヒト化MN-E6抗MUCl*抗体の発現の異なるレベルを示すELISA分析のグラフである。
【０１２１】
【図９】図9は、MUCl*細胞外領域に由来したPSMGFRペプチドを提示す表面への、MN-E6抗体のヒト化バージョンに対する親マウスMN-E6抗体の結合を比較するELISA分析のグラフである。
【０１２２】
【図１０】図10は、軽鎖がカッパまたはラムダかどうか、可変部分がヒトIgGlかIgG2に接合したかどうかに依存して、ヒト化MN-C2抗MUCl*抗体の発現の異なるレベルを示すELISA分析のグラフである。
【０１２３】
【図１１】図11は、MUCl*細胞外領域に由来したPSMGFRペプチドを示す表面への、MN-C2抗体のヒト化バージョンに対する親マウスMN-C2抗体の結合を比較するELISA分析のグラフである。
【０１２４】
【図１２】図12は、MUCl*細胞外領域に由来したPSMGFRペプチドを示す表面への、ヒト化単一鎖(scFv)MN-C2 の結合及びMN-E6抗体の結合を示すELISA分析のグラフである。
【０１２５】
【図１３】図13A-13Cは、 プロテインAアフニティーカラムでの、低IgG FBSにおいて成長した、MN-E6 scFv-Fc融合タンパク質の精製FPLCトレースを示す。A)は、通過フローのトレースである。B)は、溶出のトレースである。C)は、還元若しくは非還元ゲル上での精製されたンパク質を示す。
【０１２６】
【図１４】図14A-14Bは、精製MN-E6 scFv-Fc融合タンパク質の、非還元ゲルでの、SDS-PAGE特性の写真を示し、そこではMN-E6に融合されたFc部分は野生体(wt)若しくは以下のように変異された:A) F405Q、Y407R、T394D; B) T366W/L368W、T364R/L368R、T366W/L368W若しくはT364R/L368R。Fc変異体F405Q、Y407R、T366W/L368W、T364R/L368R、T366W/L368W及びT364R/L368Rはすべて、二量化形成よりモノマーを指向した。示された変異のための参照構築物アミノ酸配列は、SEQ ID NO:273である。
【０１２７】
【図１５】図15A-15Bは、プロテインAアフニティーカラムでの、低IgG FBSにおいて成長したMN-E6scFv-Fc Y407Q融合タンパク質の精製のFPLCトレースを表す。A)は通過フローのトレースである。B)は溶出のトレースである。タンパク質は、S200カラムによるサイズ排除によってさらに精製された(C)。(D)は、どの分画がモノマーの優位を持っていたか示すSDS-PAGEゲルの写真である。示された変異のための参照構築物アミノ酸配列はSEQ ID NO:273である。
【０１２８】
【図１６】図16は、非還元ゲルでの精製MN-E6 scFv-Fc変異体融合タンパク質のSDS-PAGE特性の写真を示し、そこでは、MN-E6 scFvに融合されたFc部分が、野生体(wt)、若しくはFcのヒンジ領域の除去によって変化させられた、「DHinge」、Fcのヒンジ領域除去及びY407R変異を担持する、である。Fc変異体は、すべて二量化形成よりモノマーを指向した。示された変異のための参照構築物アミノ酸配列はSEQ ID NO:273。
【０１２９】
【図１７】図17A-17C。A若しくはBは、それがモノマーであることを示す、MN-E6 scFv-Fcヒンジレス変異体の大規模発現及び精製の非還元SDS-PAGE特性の写真を示す。MN-E6scFv-Fcヒンジレス変異体のFPLC特性及び精製が示される(C)。
【０１３０】
【図１８】図18A-18Cは、非還元ゲル(A)若しくは還元ゲル(B)での、精製MN-C3scFv-Fc融合タンパク質のSDS-PAGE特性の写真を示す。タンパク質はサイズ排除によって精製された。FPLCトレースが示される(C)。
【０１３１】
【図１９】図19A-19Bは、MN-C3若しくはMN-E6 Fabs 、scFv、scFv-Fcの天然ゲルの写真を示し、そこではFc部分は、野生型、又はモノマーを指向若しくは排他的にモノマーである変異体である。天然ゲルは次のことを示し、Y407R Fc変異体(A)及び2重変異体Y407R、そしてヒンジ削除体(B)は、最上に、二量体に対してモノマーを指向したンパク質が、典型的な使用濃度よりはるかに高い濃度でゲルに載せられることに注意がいる。他のFc変異体の二量体形成は、単に、充填された濃度が非常に高いという事実を反映する。
【０１３２】
【図２０】図20は、表面が、PSMGFRペプチド、N-末端からのマイナス10アミノ酸PSMGFR、若しくはC末端からのマイナス10アミノ酸PSMGFRで固定化されたELISAのグラフを示す。huMN-E6scFv-Fcは、PSMGFRペプチド及びPSMGFR N-10ペプチドには結合し、一方PSMGFR C-10ペプチドには結合しない。親MN-E6抗体及びヒト化MN-E6は、結合のために、PSMGFRのC-末端10アミノ酸を必要とする。
【０１３３】
【図２１】図21A-21Bは、Fc領域が除去されたか変異させられた、いくつかの抗MUCl*scFv-Fc融合タンパク質のELISAグラフを表わす。huMN-E6 scFv-Fc-wt、huMN-E6 scFv-Fc-Y407R、huMN-E6 scFv-Fc-hingeless及びhuMN-E6 scFv-Fc-Y407R-hingelessが示される。変異体は、すべて、MUCl*細胞外領域のPSMGFRペプチドに結合する(A)。いくつかの抗MUCl* scFv-Fc融合タンパク質のELISAグラフが示され、Fc領域は、野生体若しくは変異がなされた。huMN-E6 scFv-Fc-wt、huMN-E6 scFv-Fc-hingeless、及びhuMN-C3 scFv-Fcが示される(B)。すべては、MUC1*細胞外領域のPSMGFRペプチドに結合する。
【０１３４】
【図２２】図22A-22Cは、分析プレート表面が、PSMGFRペプチド、N-末端からマイナス10アミノ酸PSMGFR、若しくはC末端からマイナス10アミノ酸で固定化されたELISAグラフを表わす。その後、MN-C3抗体変異体は、様々なMUCl*ペプチドへの結合性について分析された; A) 精製マウスモノクローナルMN-C3抗体; B) 未精製ヒト化MN-C3抗体;そしてC) ヒト化MN-C3 scFv-Fc。ELISAは、ある欠失ペプチドと同様にPSMGFRペプチドに結合することを示す。
【０１３５】
【図２３】図23は、MUCl*ペプチドPSMGFRへの、ヒト化MN-E6scFv-Fc-delta hinge、akA-Dはhinge若しくはhingeless、及びヒト化MN-E6 scFvの結合を定量するELISA分析のグラフを示す。
【０１３６】
【図２４】図24は、ヒト化MN-C2 scFv若しくはMN-E6 scFvが、同一の濃度依存のやり方で、MUCl*陽性乳癌細胞に特異的に結合する免疫蛍光検査法実験の写真を示す。A-G:示された濃度でT47D乳癌細胞へ結合するhuMN-C2 scFv。H-N:蛍光ラベル化scFv及びDAPI。O-U:示された濃度でT47D乳癌細胞へ結合するhuMN-E6 scFv。V-B'：蛍光ラベル化scFv及びDAPI。C:第2抗体コントロール。
【０１３７】
【図２５】図25A-25L は、1500のMUCl*陽性乳癌細胞の写真を示し、通常培地で、若しくはヒト化MN-E6 scFv存在中で、培養された。A-Dは：4X拡大で得られた明るいフィールド・イメージ。E-Hは：4X拡大で得られたカルセイン（calcein）蛍光イメージ。I-L：10X拡大で得られたcalcein蛍光イメージ。A、E、I：通常RPMI培地で培養されたコントロール細胞。B、F、J:実験ウェルに添加されるPBSにMN-E6 scFvのボリュームと等しいいPBS量をプラスされた通常RPMI培地で培養されたコントロール細胞。C、G、K：500μg/mL MN-E6 scFvプラス通常RPMI培地で培養された細胞。D、H、L：5μg/mL MN-E6 scFvプラス通常RPMI培地で培養された細胞。写真は、500 μg/mLでより大きく、5 μg/mLのMN-E6 scFvで MUCl*陽性細胞の殺滅及び/又は増殖阻害を示す。イメージは、テスト分子の添加後96時間で得られた。
【０１３８】
【図２６】図26A-26Lは、1500のMUCl*陽性乳癌細胞の写真を示し、それは通常培地で培養された、若しくはヒト化MN-E6 scFv-Fc Dhinge（hingeless若しくはデルタヒンジ変異体）の存在下で培養された。A-F：20X拡大で得られた明るいフィールド・イメージ。G-L：4X拡大で得られたcalcein蛍光イメージ。A、G：通常RPMI培地で培養されたコントロール細胞。B、H:100μg/mL hMN-E6 scFv-Fc Dhingeプラス通常RPMI培地で培養された細胞。C、I：50μg/mL hMN-E6 scFv-Fc Dhingeプラス通常RPMI培地で培養された細胞。D、J：5μg/mL hMN-E6scFv-Fc Dhingeプラス通常RPMI培地で培養された細胞。E、K：0.5μg/mL hMN-E6scFv-Fc Dhingeプラス通常RPMI培地で培養された細胞。F、L：FabMN-E6の500 μg/mLプラス通常RPMI培地で培養された細胞。写真は、100μg/mLでより大きな効果、50 μg/mLで大きな効果において、hMN-E6scFv-Fc Dhinge 5 μg/mLによって、MUCl*陽性細胞の殺滅及び/又は増殖阻害を示す。コントロール細胞への比較細胞形態において、FabMN-E6若しくは有効な量のhMN-E6scFv-Fc Dhingeで育てられた、癌細胞は、細胞死前に、形態変化がおき、細胞の球形化を示した。イメージは、テスト分子の投与後96時間で得られた。
【０１３９】
【図２７】図27は、図25及び26の蛍光イメージの画像分析のグラフを示す。イメージJは、ヒト化MN-E6scFv若しくはMN-E6 scFv-Fcデルタヒンジ(akA-Dはhinge)での処置96時間後の残存細胞数の量を計るために使用された。分析ソフトウェアは、ピクセルを数えること及び各写真の細胞の数の量を計るピクセル蛍光強度を使用する。分析は、全イメージ512X512ピクセル、8ビットイメージでに行なわれた。比較については、マウスモノクローナルMN-E6 Fabの阻害も分析された。
【０１４０】
【図２８】図28A-28Cは、CAR配列コンポーネントの概略図を図に表わす。
【０１４１】
【図２９】図29は、CAR T細胞が、MUCl*で形質転換されたK562-wt細胞若しくはK562細胞に露出された時、MN-E6-CD8-3z、MN-E6-CD8-CD28-3z、MN-E6-CD84-IBB-3z、MN-E6-CD4-CD28-3z及びMN-E6-CD4-CD284-IBB-3zを含む、CARのパネルで形質導入されたJurkatT細胞によるIL-2サイトカイン分泌を測定する実験のグラフである。
【０１４２】
【図３０】図30はCAR T細胞が、MUCl*で形質転換されたK562-wt細胞若しくはK562細胞に露出された時、MN-E6-CD8-CD28-3z、MN-E6-CD84-IBB-3z、MN-E6-CD4-CD28-3z及びMN-E6-CD44-IBB-3zを含む、CARのパネルで形質導入されたJurkatT細胞によるIL-2サイトカイン分泌を測定する実験のグラフである。
【０１４３】
【図３１】図31は、CAR T細胞が、MUCl*で形質転換されたK562-wt細胞若しくはK562細胞に露出された時、MN-E6-CD8-CD28-3z、MN-E6-CD84-IBB-3z及びMN-E6-CD4-4-IBB-3zを含むCARのパネルで形質導入された、血液サンプルから単離された、一次ヒトT細胞によるIL-2サイトカイン分泌を測定する実験のグラフである。
【０１４４】
【図３２】図32は、CAR T細胞が、MUCl*で形質転換されたK562-wt細胞若しくはK562細胞に露出された時、MN-E6-CD8-CD28-3z及びMN-E6-CD44-IBB-3zを含むCARのパネルで形質導入された、血液サンプルから単離された、一次ヒトT細胞によるインターフェロンγ(IFNg)サイトカイン分泌を測定する実験のグラフである。
【０１４５】
【図３３】図33は、CAR T細胞が、MUCl*で形質転換されたK562-wt細胞若しくはK562細胞、又は前立腺癌、乳癌若しくは膵臓癌のMUCl*陽性癌細胞に露出された時、MN-E6-CD8-CD28-3z、MN-E6-CD84-IBB-3z及びMN-E6-CD8-CD28-4-IBB-3zを含むCARのパネルで形質導入された、血液サンプルから単離された、一次ヒトT細胞によるインターフェロンγ(IFNg)サイトカイン分泌を測定する実験のグラフである。
【０１４６】
【図３４】図34は、CAR T細胞が、MUCl*で形質転換されたK562-wt細胞若しくはK562細胞に露出された時、MN-E6-CD8-CD28-3z、MN-E6-CD84-IBB-3z及びMN-E6-CD4-4-IBB-3zを含むCARのパネルで形質導入された、血液サンプルから単離された、一次ヒトT細胞  標的細胞死を測定する実験のグラフである。T細胞対標的細胞の比率は1: 1で、細胞は24時間共培養された。
【０１４７】
【図３５】図35A-35Bは、1日目から3日目までの標的細胞生存の時間的経過のFACSグラフである。血液サンプルから単離された一次ヒトT細胞は、ヒト化MN-E6-CD8-3z、MN-E6-CD8-CD28-3z、MN-E6-CD84-IBB-3z及びMN-E6-CD8-CD28-4-IBB-3zを含むCARのパネルで形質導入された。その後、CAR T細胞は、MUCl*の低レベルを自然に発現するK562-wt細胞、又はMUCl*高で形質転換されたK562細胞に露出された。標的細胞に対するMUCl*標的化CAR T細胞の比率は、1: 1と10: 1、または20: 1であった。細胞の生存は、１日目(A)または３日目(B)で検出され測定された。
【０１４８】
【図３６】図36は、共培養実験の３日目の標的細胞生存のFACS測定のグラフである。一次ヒトT細胞は、ヒト化MN-E6-CD8-3z、MN-E6-CD8-CD28-3z、MN-E6-CD84-IBB-3z及びMN-E6-CD8-CD28-4-IBB-3zを含むCARのパネルで形質導入された。その後、CAR T細胞は、MUCl*陽性T47D乳癌細胞若しくはMUCl*陽性1500 akaZR-75-1乳癌細胞に露出された。標的細胞へのMUCl*標的化CAR T細胞の比率は、1: 1または10: 1である。グラフから見ることができるように、MUCl*標的化CARで形質導入されたT細胞は、非形質導入コントロールT細胞より、MUCl*癌細胞に、はるかに大きな殺滅効果がある。さらに、T細胞:標的細胞の比率が、増加れると、殺滅結果はるかに大きい。
【０１４９】
【図３７】図37は、共培養実験の１日目での標的細胞生存のFACS測定のグラフである。一次ヒトT細胞は、ヒト化MN-E6-CD84-IBB-3z、MN-E6-CD44-IBB-3z及びMN-E6-CD8-CD28-4-IBB-3zを含むCARのパネルで形質導入された。その後、CAR T細胞は次のMUCl*陽性癌細胞に露出された:T47D乳癌;capan2膵臓癌;若しくはDU-145前立腺癌。標的細胞へのMUCl*標的化CAR T細胞の比率は、5: 1である。グラフから見ることができるように、MUCl*標的化CARで形質導入されたT細胞は、MUCl*癌細胞に対し、非形質導入コントロールT細胞よりはるかに大きな殺滅効果がある。測定は、5:1＝T細胞: 標的細胞の比率だけで、24時間後に得られたことに留意がいる。さらに、CD4の細胞外領域膜貫通-細胞質尾部を持つMUCl*標的化CARsは、CD8構築物と同じように機能することに留意がいる。
【０１５０】
【図３８】図38は、共培養実験の3日目の標的細胞生存のFACS測定のグラフである。一次ヒトT細胞は、ヒト化MN-E6-CD8-4-IBB-3z、MN-E6-CD44-IBB-3z及びMN-E6-CD8-CD28-4-IBB-3zを含むCARのパネルで形質導入された。その後、CAR T細胞は次のMUCl*陽性癌細胞に露出された: MUCl*で形質転換されたK562血液癌細胞; T47D乳癌; 1500 akaZR-75-1乳癌細胞;若しくはCAPAN-2膵臓癌細胞。非形質導入T細胞コントロールに加えて、分析は、PC3 MUCl*陰性前立腺癌細胞上で行なわれた。標的細胞へのMUCl*標的化CAR T細胞の比率は、1: 1である。グラフから見ることができるように、MUCl*標的化CARで形質導入されたT細胞は、MUCl*癌細胞に対し、非形質導入コントロールT細胞よりはるかに大きな殺滅効果がある。さらに、殺滅効果は、MUCl*陽性細胞に特異的である。さらに、CD4の細胞外領域膜貫通-細胞質尾部を持つMUCl*標的化CARsは、CD8構築物と同じように機能することに留意がいる。
【０１５１】
【図３９】図39は、 CAR T細胞と標的細胞の比率が5:1で、標的細胞と共培養での24時間の、CAR T細胞拡張のFACS測定のグラフである。一次ヒトT細胞は、ヒト化MN-E6-CD8-4-IBB-3z、MN-E6-CD44-IBB-3z及びMN-E6-CD8-CD28-4-IBB-3zを含むCARのパネルで形質導入された。CAR T細胞は、MUC1*陽性T47D乳癌細胞、MUCl*陽性Capan膵臓癌細胞及びMUC1陰性細胞HCT-116結腸癌細胞及びHEK-293ヒト胚腎臓細胞と共培養された。グラフから見ることができるように、CAR T数は、MUCl*陽性細胞がある状態で増加された。
【０１５２】
【図４０】図40は、MUCl*標的化CARのウェスタンブロットの写真を示す。1〜9は、次のものがある:l. E6scFv-Fc-8-4-IBB-CD3z  (CD8 TMを持つヒンジ領域としてのヒトFc);2: E6scFv-FcH-8-4-IBB-CD3z  (CD8 TMを持つヒンジ領域としてのヒトFc hingeless)3: E6scFv-Fc-44-IBB-CD3z  (CD4 TMを持つヒンジ領域としてのヒトFc)4: E6scFv-FcH-4-4-IBB-CD3z  (CD4 TMを持つヒンジレスヒンジ領域としてのヒトFc)5: E6scFv-IgD-8-4-IBB-CD3z  (CD8 TMを備えたヒトIgDからのヒンジ領域)6: E6scFv-IgD-4-4-IBB-CD3z  (CD4 TMを備えたヒトIgDからのヒンジ領域)7: E6scFv-X4-84-IBB-CD3z  (CD8 TMを持つヒンジ領域としての長い柔軟なリンカー)8: E6scFv-X4-44-IBB-CD3z  (CD4 TMを持つヒンジ領域としての長い柔軟なリンカー)9: E6scFv-8-4-4-IBB-CD3z  (CD4 TM を備えたCD8とCD4からのヒンジ領域)。
【０１５３】
【図４１】図41は、MN-E6scFv-Fc-8-4-IBB-CD3z、MN-E6scFv-FcH-8-4-IBB-CD3z、MN-E6scFv-Fc-4-4-IBB-CD3z、MN-E6scFv-IgD-8-4-IBB-CD3z、MN-E6scFv-X4-8-4-IBB-CD3z及びMN-E6scFv-X4-4-4-IBB-CD3zで形質導入されたヒトT細胞と共培養されたT47D乳癌細胞のFACSスキャンのグラフを示す。T細胞と癌細胞は、1:1の比率で48時間共培養された。T細胞計算は、すべての非形質導入T細胞の平均に標準化された。また、標的細胞は、非形質導入T細胞と共培養された時の、個々の特異的細胞タイプに標準化された。CAR T細胞が、MUCl*陽性癌細胞と共培養される場合、T細胞数は拡大し、そして標的癌細胞数は減少することを、グラフは示す。
【０１５４】
【図４２】図42は、MN-E6scFv-Fc-84-IBB-CD3z、MN-E6scFv-FcH-8-4-IBB-CD3z、MN-E6scFv-Fc-4-4-IBB-CD3z、MN-E6scFv-IgD-8-4-IBB-CD3z、MN-E6scFv-X4-8-4-IBB-CD3z及びMN-E6scFv-X4-4-4-IBB-CD3zで形質導入されたヒトT細胞と共培養された、T47D乳癌細胞、Capan-2膵臓癌細胞、K562-MUC1*形質転換細胞、若しくはK562-wt細胞のFACSスキャンのグラフを示す。T細胞と癌細胞は、1:1の比率で48時間共培養された。T細胞計算はすべての非形質導入T細胞の平均に標準化された。また、非形質導入T細胞と共培養された時、標的細胞は個々の特異的細胞タイプに標準化された。AR T細胞が、MUCl*陽性癌細胞と共培養される場合、T細胞数は拡大し、そして標的癌細胞数は減少することを、グラフは示す。
【０１５５】
【図４３】図43A-43J。AとBは乳癌組織アレイの写真である。A)は、MUC1-FL(全長)を認識するVU4H5で染色された;B)は、癌のMUCl*を認識するマウスモノクローナル抗体MN-C2で染色された。次に自動染色(Clarient診断法)、組織染色は強度スコア及び分配スコアを組み合わせる、アルフレッドを得点する方法を使用して得点された。C、D、E、Fは、各患者のMUC1全長染色を計算されたスコアを示すカラーコード化グラフである。G、H、、I、Jは、各患者のMUCl*染色を計算されたスコアを示すカラーコード化グラフである。
【０１５６】
【図４４】図44A-44J。AとBは、乳癌組織アレイの写真である。A)は、MUC1-FL(全長)を認識するVU4H5で染色された;B)は、癌のMUCl*を認識するマウスモノクローナル抗体MN-C2で染色された。自動染色(Clarient診断)に続き、組織染色は、強度スコア及び分配スコアを組み合わせる、オールレッド得点法を使用して得点計算された。C、D、E、Fは、各患者の組織のための、MUC1全長染色ために計算されたスコアを示すグラフをカラーコード化した。G、H、I、Jは、各患者の組織のためにMUCl*染色のために計算されたスコアを示すグラフをカラーコード化した。
【０１５７】
【図４５】図45A-45Hは、ヒト化MN-E6-scFv-Fcビオチン化抗MUCl*抗体2.5 μg/mLで染色され、その後、第2streptavidin HRP抗体で染色された、正常乳及び乳癌組織の写真を示す。A)は、正常な乳組織である。B-Dは、図中で表示されるような患者からの乳癌組織である。E-Hは、第2抗体単独で染色された、対応する連続切片の写真である。
【０１５８】
【図４６】図46A-46Fは、ヒト化MN-E6-scFv-Fcビオチン化抗MUCl*抗体2.5 μg/mLで染色され、その後、第2streptavidin HRP抗体で染色された、正常乳及び乳癌組織の写真を示す。A)は、正常な乳組織である。B-Cは、図中で表示されるような患者からの乳癌組織である。D-Fは、第2抗体単独で染色された、対応する連続切片の写真である。
【０１５９】
【図４７】図47A-47Hは、MN-E6抗MUCl*抗体10 μg/mLで染色され、その後、ウサギ抗マウス第2HRP抗体で染色した乳癌組織の写真を示す。A-Dは、患者#300からの乳癌組織である。E-Hは、転移性患者#291からの乳癌組織である。
【０１６０】
【図４８】図48A-48Fは、ヒト化MN-E6-scFv-Fcビオチン化抗MUCl*抗体2.5μg/mLで染色され、その後、第2streptavidin HRP抗体で染色された。A)は、正常な肺組織である。BとCは、図の中で表示されるような患者からの肺癌組織である。D-Fは、第2抗体単独で染色された、対応する連続切片の写真である。
【０１６１】
【図４９】図49A-49Fは、ヒト化MN-E6-scFv-Fcビオチン化抗MUCl*抗体2.5μg/mLで染色され、その後、第2streptavidin HRP抗体で染色された正常な肺及び肺癌組織の写真である。A)は、正常な肺組織である。BとCは、図の中で表示されるような患者からの肺癌組織である。D-Fは、第2抗体単独で染色された、対応する連続切片の写真である。
【０１６２】
【図５０】図50A-50Fは、ヒト化MN-E6-scFv-Fcビオチン化抗MUCl*抗体25 μg/mLで染色され、第2streptavidin HRP抗体で染色された正常な肺及び肺癌組織の写真である。A)は、正常な肺組織である。BとCは、図の中で表示されるような患者からの肺癌組織である。D-Fは、第2抗体単独で染色された、対応する連続切片の写真である。
【０１６３】
【図５１】図51A-51Fは、ヒト化MN-E6-scFv-Fcビオチン化抗MUCl*抗体25 μg/mLで染色され、その後、第2streptavidin HRP抗体で染色された、正常な肺及び肺癌組織の写真である。A)は、正常な肺組織である。BとCは、図の中で表示されるような患者からの肺癌組織である。D-Fは、第2抗体単独で染色された、対応する連続切片の写真である。
【０１６４】
【図５２】図52A-52Dは、ヒト化MN-E6-scFv-Fcビオチン化抗MUCl*抗体5μg/mLで染色され、その後、第2streptavidin HRP抗体で染色された正常な小腸及び癌の小腸組織の写真である。A)は、正常な小腸組織である。B)は、図の中で表示されるような患者からの小腸癌である。CとDは、第2抗体単独で染色された、対応する連続切片の写真である。
【０１６５】
【図５３】図53A-53Hは、ヒト化MN-E6-scFv-Fc抗MUCl*抗体50μg/mLで染色され、その後、第2ヤギ抗ヒトHRP抗体で染色された正常な小腸組織の写真である。A-Dは、正常な小腸組織である。E-Hは、第2抗体単独で染色された、対応する連続切片の写真である。
【０１６６】
【図５４】図54A-54Hは、ヒト化MN-E6-scFv-Fc抗MUCl*抗体50μg/mLで染色され、その後、第2ヤギ抗ヒトHRP抗体で染色された癌の小腸組織の写真である。A-Dは、図の中で表示されるような患者からの癌の小腸組織である。E-Hは、第2抗体単独で染色された、対応する連続切片の写真である。
【０１６７】
【図５５】図55A-55Hは、ヒト化MN-E6-scFv-Fc抗MUCl*抗体50μg/mLで染色され、その後、第2ヤギ抗ヒトHRP抗体で染色された、癌の小腸組織の写真を表わす。A-Dは、図の中で表示されるような患者からの癌の小腸組織である。E-Hは、第2抗体単独で染色された、対応する連続切片の写真である。
【０１６８】
【図５６】図56A-56Hは、ヒト化MN-E6-scFv-Fc抗MUCl*抗体50μg/mLで染色され、その後、第2ヤギ抗ヒトHRP抗体で染色された、正常な結腸組織の写真を表わす。A-Dは、正常な結腸である。E-Hは、第2抗体単独で染色された、対応する連続切片の写真である。
【０１６９】
【図５７】図57A-57Hは、ヒト化MN-E6-scFv-Fc抗MUCl*抗体50μg/mLで染色され、その後、第2ヤギ抗ヒトHRP抗体で染色されて、結腸癌組織の写真を表わす。A-Dは、図の中で表示されるような転移性の患者からの結腸癌組織である。E-Hは、第2抗体単独で染色された、対応する連続切片の写真である。
【０１７０】
【図５８】図58A-58Hは、ヒト化MN-E6-scFv-Fc抗MUCl*抗体50μg/mLで染色され、その後、第2ヤギ抗ヒトHRP抗体で染色された、結腸癌組織の写真を表わす。A-Dは、図の中で表示されるような等級2の患者からの結腸癌組織である。E-Hは、第2抗体単独で染色された、対応する連続切片の写真である。
【０１７１】
【図５９】図59A-59Hは、ヒト化MN-E6-scFv-Fc抗MUCl*抗体50μg/mLで染色され、その後、第2ヤギ抗ヒトHRP抗体で染色された結腸癌組織の写真を表わす。A-Dは、図の中で表示されるような転移性の患者からの結腸癌組織である。E-Hは、第2抗体単独で染色された、対応する連続切片の写真である。
【０１７２】
【図６０】図60A-60Hは、ヒト化MN-E6-scFv-Fc抗MUCl*抗体50μg/mLで染色され、その後、第2ヤギ抗ヒトHRP抗体で染色された前立腺癌組織の写真を表わす。A-Dは、図の中で表示されるような患者からの前立腺癌組織である。E-Hは、第2抗体単独で染色された、対応する連続切片の写真である。
【０１７３】
【図６１】図61A-61Hは、ヒト化MN-E6-scFv-Fc抗MUCl*抗体50μg/mLで染色され、その後、第2ヤギ抗ヒトHRP抗体で染色された前立腺癌組織の写真を表わす。A-Dは、図の中で表示されるような患者からの前立腺癌組織である。E-Hは、第2抗体単独で染色された、対応する連続切片の写真である。
【０１７４】
【図６２】図62A-62Hは、ヒト化MN-E6-scFv-Fc抗MUCl*抗体50μg/mLで染色され、その後、第2ヤギ抗ヒトHRP抗体で染色された前立腺癌組織の写真を表わす。A-Dは、図の中で表示されるような患者からの前立腺癌組織である。E-Hは、第2抗体単独で染色された、対応する連続切片の写真である。
【０１７５】
【図６３】図63は、抗MUCl*モノクローナル抗体MNC3若しくはMN-E6若しくはアイソタイプ・コントロール抗体で染色された、ヒトCD34+骨髄細胞の蛍光活性化細胞分類(FACS)測定を示す。FACS分析のヒストグラム、及びデータを示す棒グラフは、骨髄細胞のMUCl*陽性細胞が、1つの抗MUCl*抗体、MN-E6、によって認識され、別のMN-E6によってでは認識されないということを示す。
【０１７６】
【図６４】図64は、抗MUCl*抗体MN-C2、MN-E6、MNC3若しくはMNC8のFabで処置されたDU145前立腺癌細胞若しくはT47D乳癌細胞の写真を示す。イメージは、癌特異抗体MN-C2及びMN-E6が、有効に、前立腺と乳癌の細胞を殺すが、モノクローナル抗体MNC3及びMNC8は有効でないことを示す。
【０１７７】
【図６５】図65は、異なる細胞株で発現された広範囲の開裂酵素の発現を比較するPCR実験のグラフを示す。そこでは、該値は乳癌細胞株T47Dで発現されたものに標準化された。比較される細胞株は、前立腺癌細胞株DU145、その細胞外領域が41の縦列反復ユニット後で欠失されMUC1で形質転換されたMUClの陰性の結腸癌細胞株でありそしてMUCl*型に開裂されないHCT-MUC1-41TR、T47D乳癌細胞株及びCD34+骨髄細胞である。
【０１７８】
【図６６】図66は、図65のPCR実験のグラフを示し、但し、５にセットされたY軸最大をもつ。
【０１７９】
【図６７】図67A-67Bは、開裂酵素阻害剤のパネルの効果が、乳癌細胞株T47Dのために評価される、FACS実験のグラフを示す。図67Aは、全長MUCl抗体VU4H5、若しくは抗MUCl*モノクローナル抗体MN-C2に、陽性のテスト結果が出る細胞のパーセンテージを示す。図67Bは、抗体VU4H5対MN-C2で追跡された細胞の平均蛍光強度を示す。見ることができるように、TAPI-1阻害剤及びMMP2/9 V阻害剤は、MUC1の開裂を阻害した。
【０１８０】
【図６８】図68A-68Bは、開裂酵素阻害剤のパネルの効果が、前立腺癌細胞株DU145のために評価される、FACS実験のグラフを示す。図68Aは、全長MUC1抗体VU4H5、若しくは抗MUCl*モノクローナル抗体MN-C2に、陽性のテスト結果が出る細胞のパーセンテージを示す。図68Bは、抗体VU4H5対MN-C2で追跡された細胞の平均蛍光強度を示す。見ることができるように、開裂酵素阻害剤のどれもMUC1開裂に効果がなかった。
【０１８１】
【図６９−１】図69A-69Bは、全長抗体VU4H5（図69A）若しくは抗MUCl*抗体MN-C2(図69B)で、追跡された乳癌アレイの連続切片の写真を表わす。各組織標本のアルフレッド・スコアは、各アレイ写真下のグラフで示される（図69C-69D）。抗体で全く染色されなかったか、弱く、中間に若しくは強く染色された各アレイのパーセンテージが、円グラフとして図示され、図S7E-S7Fで示される。
【図６９−２】同上
【０１８２】
【図７０−１】図70A-70Fは、抗MUCl*抗体huMN-C2scFvで染色された3倍陰性乳癌アレイの写真を表わす。示された最初のスコアは、アルフレッド・スコアである。また、第2は腫瘍等級である。ゼロ、弱い、中間、若しくは強いとスコアされたアレイのパーセンテージが、円グラフとして図示される。図70Aは、抗MUCl*抗体染色のスコアの円グラフを示す。図70Bは、抗体で染色されたアレイの写真を示す。図70C-70Dは、アレイからの乳癌標本のうちの2つの拡大写真を示した。図70C-70Dは、ボックスによってマークされる標本の部分のもっと拡大された写真を示す。
【図７０−２】同上
【０１８３】
【図７１−１】図71A-71Fは、抗MUCl*抗体huMN-C2scFvで染色された卵巣癌アレイの写真を表わす。示された最初のスコアはアルフレッド・スコアである。また、第2は腫瘍等級である。ゼロ、弱い、中間、或いは強いを得点したアレイのパーセンテージが、円グラフとして図示される。図71Aは、抗MUCl*抗体染色のスコアの円グラフを示す。図71Bは、抗体で染色されたアレイの写真を示す。図71C-71Dは、アレイからの乳癌標本のうちの2つの拡大写真を示した。図71C-71Dは、ボックスによってマークされる標本の部分のもっと拡大された写真を示す。
【図７１−２】同上
【０１８４】
【図７２−１】図72A-72Fは、抗MUCl*抗体huMN-C2scFvで染色された膵臓癌アレイの写真を表わす。示された最初のスコアはアルフレッド・スコアである。また、第2は腫瘍等級である。ゼロ、弱い、中間、或いは強いを得点したアレイのパーセンテージが、円グラフとして図示される。図72Aは、抗MUCl*抗体染色のスコアの円グラフを示す。図72Bは、抗体で染色されたアレイの写真を示す。図72C-72Dは、アレイからの乳癌標本のうちの2つの拡大写真を示した。図72C-72Dは、ボックスによってマークされる標本の部分のもっと拡大された写真を示す。
【図７２−２】同上
【０１８５】
【図７３−１】図73A-73Fは、抗MUCl*抗体huMN-C2scFvで染色された肺癌アレイの写真を表わす。示された最初のスコアはアルフレッド・スコアである。また、第2は腫瘍等級である。ゼロ、弱い、中間、或いは強いを得点したアレイのパーセンテージが、円グラフとして図示される。図73Aは、抗MUCl*抗体染色のスコアの円グラフを示す。図73Bは、抗体で染色されたアレイの写真を示す。図73C-73Dは、アレイからの乳癌標本のうちの2つの拡大写真を示した。図73C-73Dは、ボックスによってマークされる標本の部分のもっと拡大された写真を示す。
【図７３−２】同上
【０１８６】
【図７４】図74A-74Iは、抗MUCl*抗体huMN-C2scFvで染色された正常組織の写真を表わす。
【０１８７】
【図７５】図75A-75Pは、 CARの標的抗体断片が、CAR44が4-IBB-3zetaを後に続く、CD8膜貫通領域を持っており、CAR50が4-IBB-3zetaを後に続ける、CD4膜貫通領域がある、huMN-C2scFvである、CAR T共培養分析の写真を表わす。標的癌細胞は次のとおりである: MUC1*45で形質転換されたHCT-116細胞であるHCT-FLR、及びHCT-MUC1-41TRで、それは41の縦列反復の後で欠失された細胞外領域でMUC1を発現し、MUC1*型に自身で開裂されない安定した単細胞クローンHCT-116細胞株である。HCT-MUC1-41TR癌細胞は、また、CAR T細胞と共培養の前にMMP9またはADAM 17で形質転換された細胞から調整培地でインキュベートされた。MMP9若しくはADAM 17発現細胞の調整培地は、これらの開裂酵素の活性化剤であるAPMAで細胞も培養された。示されたイメージは、4X明るいフィールド・イメージのオーバーレイ及び赤いCMTMR脂肪親和性の強い染料で染められた、癌細胞を示す同じものの蛍光イメージである。図75A、75E、75I、75Mは、非形質導入ヒトT細胞と共培養された細胞の写真である。図75B、75F、75J、75Nは、10のMOIで、抗MUCl* CAR44で形質導入されたヒトT細胞と共培養された細胞の写真である。図75C、75G、75K、75Oは、10のMOIで、抗MUCl* CAR50で形質導入されたヒトT細胞と共培養された細胞の写真を示す。図75D、75H、75L、75P は、50のMOI、それは形質導入効率を増加させる、で抗MUCl* CAR44で形質導入されたヒトT細胞と共培養された細胞の写真である。図75B、75C、75Dは、CAR44とCAR50の両方が形質導入した、T細胞は、これらの癌細胞中で発現されたMUC1*を認識し、それらへ結合し、クラスタリングを誘導し、多くの癌細胞を殺したということを示す。図75F、75G、75Hは、CAR44もCAR50でも形質導入しなかった、T細胞は、HCT-MUC1-41TR癌細胞の中で発現された全長MUC1を認識する。T細胞誘導クラスタリングはなく、また、癌細胞の数は減少しなかった。図75J、75K、75Lは、活性化MMP9は、両方のCAR44とCAR50が形質導入されたT細胞によって認識されるMUC1*型へ全長MUC1を開裂させたことを示す。はっきり確認できるCAR T細胞誘導クラスタリングがあり、及び死亡による癌細胞の数の減少がある。図75N、750、75Pは、活性化ADAM 17は、MUC1を開裂しないか、若しくはMN-C2によって認識されない位置でそれを開裂することを示す。huMN-C2-CAR44もhuMN-C2-CAR50も形質導入さないT細胞は、これらの癌細胞を認識した。
【０１８８】
【図７６】図76は、CARの標的抗体断片が、MN-C2 scFvである、CAR T共培養分析の写真を示し、ここで、CAR44は4-IBB-3zetaを後に続けて、CD8膜貫通領域を持っており、及びCAR50は、4-IBB-3zetaを後に続けて、CD4膜貫通領域をもつ。標的癌細胞は、また、MN-C2-CAR T細胞との共培養の前にMMP2、MMP9若しくはADAM 17で形質転換された細胞からの調整培地で培養された乳癌T47D細胞である。ある場合には、MMP2及びMMP9発現細胞の調整培地も、これらの開裂酵素の活性化剤であるAPMAとインキュベートされた。示されたイメージは、4X明るいフィールド・イメージのオーバーレイであり及び赤いCMTMR脂肪親和性の強い染料で染められた癌細胞を示す、同じものの蛍光イメージである。見ることができるように、MN-C2-CAR T細胞は、開裂型、MUCl*、発現する標的癌細胞に結合し攻撃する。
【０１８９】
【図７７】図77A-77Iは、抗MUCl* CAR T細胞と共培養された癌細胞の写真であり、そこではCAR T細胞との共培養前に、活性化されたMMP9で、癌細胞のうちのいくつかはあらかじめインキュベートされた。図77A-77Cで示される癌細胞は、MUCl*を発現するために安定して形質転換された、MUC1陰性結腸癌細胞株HCT-116である。図77D-77Fで示される癌細胞は、MUC1全長及びMUC1*の両方を高いレベルで発現する、MUC1陽性乳癌細胞株T47Dsである。図77G-77Iで示される癌細胞は、活性化されたMMP9とあらかじめインキュベートされたMUC1陽性乳癌細胞株T47Dsである。図77A、77D及び77Gで示される細胞は、非形質導入ヒトT細胞と共培養された、コントロールである。図77B、77E及び77Hで示される細胞は、10のMOIのhuMN-C2-CAR44で形質導入されたヒトT細胞と共培養され、ここで、MOIは、感染の多様性を表わし、高いMOIは、より多くのCARがT細胞で発現される。図77C、77F及び771で示される細胞は、50のMOIのhuMN-C2-CAR44で形質導入されたヒトT細胞と共培養された。写真で見ることができるように、CAR44 T細胞は、標的MUCl*陽性癌細胞に結合し、それらを取り囲み、それらを殺滅する。図S 15Fと図77Iの比較で、MMP9であらかじめ培養された細胞は、CARの抗体標的ヘッドがMUCl*を認識する場合、CAR T殺滅に、はるかによりセンシテイブになることを確認できる。さらに、それは、MMP9によって開裂MUC1が、huMN-C2scFvによって認識されることを実証する。
【０１９０】
【図７８】図78は、45時間にわたって、コントロールである非形質導入T細胞、若しくはhuMN-C2-CAR44T細胞との共培養でのT47D乳癌細胞のxCelligenceグラフを示す。18時間の癌細胞生育の後、触媒サブユニットMMP9が、細胞のうちのいくつかへ添加された。25時間で、T細胞が添加された。見ることができるように、T47D細胞が、開裂酵素MMP9であらかじめ培養される場合、huMN-C2-CAR44 T細胞殺滅は、非常に改善される。xCelligenceシステムでは、標的癌細胞、それらは付着している、は、電極アレイプレート上に置かれる。付着細胞は、電極を絶縁し、インピーダンスを増加させる。付着癌細胞の数はインピーダンスに正比例する。T細胞は付着せず、インピーダンスに寄与しない。したがって、インピーダンスを増加させることは、癌細胞の成長を反映する。また、インピーダンスを減少させることは、癌細胞の殺滅を反映する。
【０１９１】
【図７９】図79は、45時間にわたって、コントロールである非形質導入T細胞、若しくはhuMN-C2-CAR44T細胞との共培養でのDU145前立腺癌細胞のxCelligenceグラフを示す。18時間の癌細胞生育の後、触媒サブユニットMMP9が、細胞のうちのいくつかへ添加された。25時間で、T細胞が添加された。見ることができるように、huMN-C2-CAR44 T細胞殺滅は、開裂酵素MMP9との事前インキューベションによって影響されない。DU145癌細胞は、MUCl*と同様に全長型も含んでいる著しくより低い量のMUC1を発現する。MUC1全長のより低い密度は、T細胞の膜近位MUCl*へのアクセスを立体的に妨害しない。
【０１９２】
【図８０】図80A-80Fは、正常なヒトT細胞又はGFP陽性（グリーン）であるMUCl*標的化CARで形質導入されたヒトT細胞のいずれかで共培養されたT47DmCherry形質転換乳癌細胞の写真を示し、ここで、CARの標的ヘッドである抗体断片が、huMN-C2-scFvである。図80Aは、正常なヒトT細胞と共培養された乳癌細胞、赤を示す。T細胞誘導クラスタリングは、明白ではない。図80Bは、huMN-C2-CAR18で形質導入されたヒトT細胞と共内容された乳癌細胞、赤を示す。T細胞誘導クラスタリングが確認できる。図80Cは、huMN-C2-CAR19で共培養された癌細胞を示し、そして、T細胞誘導クラスタリングが見られる。図80Dは、huMN-C2-CAR44及びCAR49の混合物で共培養された癌細胞を示し、そして、T細胞誘導クラスタリングが見られる。図80Eは、huMN-C2-CAR44で共培養された癌細胞を示し、そして、T細胞誘導クラスタリングが見られる。図X1Fは、huMN-C2-CAR50で共培養された癌細胞を示し、そして、T細胞誘導クラスタリングが見られる。
【０１９３】
【図８１】図81A-81D は、MUCl*陽性及びGFP陽性(緑)DU145前立腺癌細胞に、granzyme B(黄色)を注入する、ヒトhuMN-C2-CAR44 T細胞の写真を表わす。図81Aは、4Xに拡大された写真である。図81Bは、20Xに拡大された写真である。図81Cは、20Xに拡大された写真である。図81Dは、40Xに拡大された写真である。
【０１９４】
【図８２】図82A-82Bは、T47D MUC1*陽性乳癌細胞に対するhuMN-C2-CAR44 T細胞の殺滅効果を示し、そこでは、乳癌細胞は、増加する量の付加的なMUCl*で形質転換された。見ることができるように、huMN-C2-CAR44 T細胞の殺滅効果は、細胞上で発現された標的MUCl*の量におうじて増加する。図82Aは、FACSによって測定される、標的細胞殺滅のグラフである。図82Bは、T47D細胞との共培養でのhuMN-C2-CAR44 T細胞からの上澄みが、分泌されたインターフェロンγ、それはT細胞活性化の表れである、の存在について検査されるELISA分析のグラフである。
【０１９５】
【図８３】図83A-83Dは、MUCl*陽性癌細胞との24時間共培養の後に、huMN-C2-CAR44T細胞のFACS分析の結果を示す。図83Aは、非形質導入T細胞(赤棒)と比較して、huMN-C2-CAR44 T細胞(青棒)によって殺滅されたT47D癌細胞のパーセンテージを示すFACSデータのグラフである。X軸は、癌細胞に対するT細胞の比率を示す。図83Bは、非形質導入T細胞(赤棒)と比較して、huMN-C2-CAR44T細胞(青棒)によって殺滅された、K562-MUC1*癌細胞のパーセンテージを示す、FACSデータのグラフである。図83Cは、T47D乳癌細胞が染料CMTMRで染色されたFACSスキャンを示す。Sytox青は、死細胞染色である。死んだ癌細胞は四分円2及び3中のものである。図83Dは、K562-MUC1*癌細胞が、染料CMTMRで染色されたFACSスキャンを示す。Sytox青は死細胞染色である。死んだ癌細胞は四分円2及び3中のものである。
【０１９６】
【図８４】図84A-84Hは、様々な分析によって測定される、MUC1*陽性DU145前立腺癌細胞における、huMN-C2-CAR44 T細胞の細胞毒性効果を示す。図84Aは、前立腺癌細胞と共培養された、非形質導入T細胞の蛍光写真である。そこではgranzymeBは赤い蛍光団で染色される。図84Bは、DAPIとgranzyme Bの融合を示す。図84Cは、前立腺癌細胞と共培養されたhuMN-C2-CAR44 T細胞の蛍光写真であり、そこではgranzyme Bは赤い蛍光団で染色される。図84Dは、DAPIとgranzyme Bの融合を示す。図84Eは、癌細胞とインキュベートされた、非形質導入T細胞についての、蛍光ラベル化granzyme BのFACSスキャンである。図84Fは、癌細胞とインキュベートされたhuMN-C2-CAR44T細胞についての、蛍光ラベル化granzyme Bの肯定的な増加を示すFACSスキャンである。図84Gは、平均の蛍光強度のグラフである。図84Hは、非形質導入T細胞(緑)ではおこらなかったが、huMN-C2-CAR44T細胞(青トレース)によるDU145癌細胞のリアルタイム殺滅をトレースするxCELLigenceスキャンである。
【０１９７】
【図８５】図85A-85Hは、様々な分析によって測定される、MUC1*陽性CAPAN-2膵臓癌細胞でのhuMN-C2-CAR44 T細胞の細胞毒性を示す。図85Aは、膵臓癌細胞と共培養された、非形質導入T細胞の蛍光写真である。そこではgranzymeBは赤い蛍光団で染色される。図85Bは、DAPIとgranzyme Bの融合を示す。図85Cは、膵臓癌細胞と共培養されたhuMN-C2-CAR44 T細胞の蛍光写真である。そこではgranzyme Bは赤い蛍光団で染色される。図85Dは、DAPI及びgranzyme Bの融合を示す。図85Eは、癌細胞とインキュベートされた、非形質導入T細胞についての蛍光ラベル化granzyme BのFACSスキャンである。図85Fは、癌細胞とインキュベートされたhuMN-C2-CAR44T細胞のための蛍光ラベル化granzyme Bの肯定的な増加を示すFACSスキャンである。図85Gは中間の蛍光強度のグラフである。図85Hは、非形質導入T細胞(緑)ではおこらなかったが、huMN-C2-CAR44T細胞(青トレース)によるCAPAN-2癌細胞のリアルタイム殺滅をトレースするxCELLigenceスキャンである。
【０１９８】
【図８６】図86A-86Cは、huMN-C2-CAR44T細胞による、MUCl*陰性細胞ではおこらなかったが、MUCl*陽性癌細胞のリアルタイム殺滅をトレースするxCELLigenceスキャンである。図86Aは、huMN-C2-CAR44 T細胞が、MUC1*で安定して形質転換されたHCT結腸癌細胞を有効に殺すことを示す。図86Bは、huMN-C2-CAR44 T細胞が、安定して全長MUC1で形質転換されたMUC1陰性癌細胞である、HCT-MUC1-41TRにほとんど効果がないことを示す。この細胞株では、細胞のわずか約10%が、MUC1*に開裂MUC1をもつ。図86Cは、MUC1陰性結腸癌細胞株であるHCT-116細胞に、huMN-C2-CAR44 T細胞が効果がないことを示す。
【０１９９】
【図８７】図87A-87Lは、非形質導入T細胞又は、刺激無し、1回のMUCl*ペプチド担持ベッド刺激若しくは2回のMUCl*陽性癌細胞刺激を受けた、huMN-C2-scFv-CAR44T細胞の4X拡大写真を示す。図87A-87Fは、非形質導入T細胞に対する影響を示す。図87G-87Lは、huMN-C2-scFv-CAR44 T細胞に対する影響を示す。図87Aと87Gは、刺激を受けなかった。図87Bと87Hは、写真前24時間に、24時間で2度、HCT-MUCl*癌細胞で刺激された。図87C-87F及び図87I-87Lは、写真前24時間に、PSMGFR MUCl*細胞外領域ペプチドで被覆された1μｍ若しくは4.5μｍビーズで、24時間で1度、刺激された。
【０２００】
【図８８】図88A-88Dは、MUCl*合成ペプチドを担持するとのビーズとの共培養によって1回の刺激、又はHCT-MUCl*癌細胞との共培養による3度の刺激の結果として、huMN-C2-scFv-CAR44で形質導入されたヒトT細胞の亜母集団のFACS分析を示す。図88Aは、刺激なしでhuMN-C2-scFv-CAR44形質導入ヒトT細胞のFACSスキャンを示す。図88Bは、MUCl*ペプチド提示ビーズとの共培養によって1回の刺激で、huMN-C2-scFv-CAR44形質導入ヒトT細胞のFACSスキャンを示す。図88C は、HCT-MUCl*癌細胞との共培養によって3度刺激されたhuMN-C2-scFv-CAR44形質導入T細胞のFACSスキャンを示す。図88Dは、FACSデータのグラフ表示を示す。図88E-88Jは、huMN-C2-scFv-CAR44形質導入ヒトT細胞が、MUCl*ペプチド提示ビーズ刺激を1度受けた後の、T細胞活性化マーカーのFACS分析のグラフを示す。図88E-88Fは、活性化マーカーCD25のFACSを示す。図88G-88Hは、活性化マーカーCD69のFACSを示す。図88I-88Jは、 活性化マーカーGranzymeBのFACSを示す。図88E、88G、88Iは、ビーズ刺激無しでのhuMN-C2-scFv-CAR44形質導入ヒトT細胞のFACSを示す。図88F、88H、88Jは、ビーズ刺激後のhuMN-C2-scFv-CAR44形質導入ヒトT細胞のFACSを示す。
【０２０１】
【図８９】図89A-89Cは、xCELLigence装置上で測定される、リアルタイムCAR T誘導癌細胞殺滅のグラフを示す。図は、MUCl*提示ビーズとの共培養による予備刺激（予備活性化ともいう）後、huMN-C2-scFv-CAR44 T細胞の増強された殺滅効果を示す。図89Aは、T細胞対癌細胞の比率が1：１で、SKOV-3卵巣癌細胞でのペプチドビーズ刺激huMN-C2-CAR44T細胞の増強された殺滅効果を示す。図89Bは、T細胞対癌細胞の比率が1：１で、BT-20-3倍陰性乳癌細胞でのペプチドビーズ刺激huMN-C2-CAR44 T細胞の増強された殺滅効果を示す。図89Cは、T細胞対癌細胞の比率が1：１で、HCT-MUC1*結腸癌細胞でのペプチドビーズ刺激huMN-C2-CAR44 T細胞の増強された殺滅効果示す。
【０２０２】
【図９０】図90A-90Dは、xCELLigence装置上で測定される、リアルタイム細胞増殖対細胞死のグラフを示す。様々な癌細胞に対するhuMN-C2-scFv-CAR44形質導入ヒトT細胞のMUCl*癌細胞刺激の効果が示され、それらのうちのいくらかは以前CAR T細胞殺滅に抵抗性であった。図90Aは、標的T47D乳癌細胞との共培養前に24時間HCT-MUCl*癌細胞との共培養によって予備刺激された、huMN-C2-scFv-CAR44形質導入ヒトT細胞の効果のxCELLigenceグラフを示す。図90Bは、標的BT-20-3倍陰性乳癌細胞との共培養前に24時間HCT-MUCl*癌細胞との共培養によって予備刺激された、huMN-C2-scFv-CAR44形質導入ヒトT細胞の効果のxCELLigenceグラフを示す。図90Cは、標的SKOV-3卵巣癌細胞との共培養前に24時間HCT-MUCl*癌細胞との共培養によって予備刺激された、huMN-C2-scFv-CAR44形質導入ヒトT細胞の効果のxCELLigenceグラフを示す。図90Dは、予備刺激の有無で、有効に殺滅された、標的HCT-MUCl*癌細胞との共培養前に24時間HCT-MUCl*癌細胞との共培養によって予備刺激された、huMN-C2-scFv-CAR44形質導入ヒトT細胞の効果のxCELLigenceグラフを示す。
【０２０３】
【図９１】図91A-91Yは、IVIS装置上で得られたマウスの蛍光写真を表わす。NSG(NOD/SCID/GAMMA)免疫不全マウスは、ルシフェラーゼで安定して形質転換された、500,000のヒトMUCl*陽性癌細胞が、脇腹に０日目に皮下移植された。腫瘍は、植え付けに成功した。IVIS測定の後５日目において、及び１２日目において、動物は、huMN-C2-scFv-CAR44で形質導入されたヒトT細胞、形質導入されなかったT細胞若しくはPBSのいずれかのうちの1000万を注入された。500万のT細胞が、腫瘍内に注入され、そして、500万のT細胞が尾静脈に注入された。IVIS写真の10分前に、マウスは、腹腔内(IP)にルシフェリンを注入された。それはルシフェラーゼによって開裂の後に蛍光を発し、結果として腫瘍細胞に蛍光を発させる。図91A、91E、911、91M、91Q、91Uは、投与前24時間、合成MUCl*、PSMGFRペプチドを付着する4μｍビーズと24時間共培養することにより予備刺激された、huMN-C2-scFv-CAR44 T細胞で処置されたマウスの写真を示す:プロトコル1。図91B、91F、91J、91N、91R、91Vは、投与前24時間、MUCl*陽性癌細胞で24時間2度の共培養により予備刺激された、huMN-C2-scFv-CAR44 T細胞で処置されたマウスの写真を示す:プロトコル2。図91C、91G、91K、910、91S、91Wは、非形質導入ヒトT細胞で処置されたマウスの写真を示す。図91D、91H、91L、91P、91T、91X は、PBSで処置されたマウスの写真を示す。図91A-91Dは、T細胞注入の前に５日目で得られたIVIS写真を示す。図91E-91Hは、７日目で得られたIVIS写真を示す。図91I-91Lは、１１日目で得られたIVIS写真を示す。図91M-91Pは、１３日目で得られたIVIS写真を示す。図91Q-91Tは、１８日目で得られたIVIS写真を示す。図91U-91Vは、２１日目で得られたIVIS写真を示す。過度の腫瘍ボリュームにより、２０日目で非形質導入T細胞及びPBS投与グループの動物は、殺した。図91W-91Xは、切除された腫瘍の写真を示す。図91 Yは、色をつけるべき光子/秒における、蛍光を関連づける色スケールである。
【０２０４】
【図９２】図92A-92Jは、IVIS装置上で得られたマウスの蛍光写真を表わす。NSG(NOD/SCID/GAMMA)免疫不全マウスは、MUCl*陽性3倍陰性乳癌細胞株である、ヒトBT-20細胞500Kを、脇腹に０日目に皮下移植された。癌細胞は、ルシフェラーゼで安定して形質転換された。腫瘍は、植え付けに成功した。６日目において、IVIS測定の後、動物は、huMN-C2-scFv-CAR44で形質導入されたヒトT細胞若しくは非形質導入T細胞の1000万の一回注入がされた。500万のT細胞が、腫瘍内に注入され、そして、500万は尾静脈に注入された。IVIS写真の10分前に、マウスは、ルシフェリン、それはルシフェラーゼによって開裂の後に蛍光を発する、をIP投与され、腫瘍細胞に蛍光を発させた。図92A、92D、92Gは、投与２４時間前、合成MUCl*、PSMGFRペプチド、を付着された4μｍビーズで24時間共培養することにより予備刺激された、huMN-C2-scFv-CAR44 T細胞で処置されたマウスの写真を示す。:プロトコル1。図92B、92E、92Hは、投与２４時間前、MUCl*陽性癌細胞と24時間２度の共培養により予備刺激された、huMN-C2-scFv-CAR44 T細胞で処置されたマウスの写真を示す。:プロトコル2。図92C、92F、921は、非形質導入ヒトT細胞で処置されたマウスの写真を示す。図92Jは、色をつけるべき光子/秒に、蛍光を関連づける色スケールである。
【０２０５】
【図９３】図93A-93Mは、IVIS装置上で得られたマウスの蛍光写真を表わす。０日目で、MUCl*陽性卵巣癌細胞株である、500KのヒトSKOV-3細胞を、腹腔内(IP)に注入されたNSG(NOD/SCID/GAMMA)の免疫不全マウスが使われた。癌細胞は、ルシフェラーゼで安定して形質転換された。腫瘍は、植え付けに成功した。４日目において、動物が、huMN-C2-scFv-CAR44形質導入ヒトT細胞、形質導入されなかったT細胞若しくはPBSの、10Mで、腹腔内のスペースに注入された。11日目において、細胞の半分が尾静脈に注入され、他方の半分はＩＰ注入された、ということを除き、動物に再度注入された。動物は、3、7、10及び15日目でIVISによってイメージ化された。IVIS写真の10分前に、マウスは、ルシフェリン、それはルシフェラーゼによって開裂の後に蛍光を発する、がＩＰ注入され、腫瘍細胞に蛍光を発させた。図93A、93D、93G及び93Jは、投与２４時間前に、合成MUCl*、 PSMGFRペプチド、を付着させた１μｍビーズで２４時間共培養による、予備刺激がなされたhuMN-C2-scFv-CAR44 T細胞で処置されたマウスの写真を示す。図93B、93E、93H及び93Kは、非形質導入ヒトT細胞で処置されたマウスの写真を示す。図93C、93F、93Ｉ及び93Ｌは、PBSと処置されたマウスの写真を示す。図93A、93B及び93Cは、CAR T、T細胞若しくはPBS投与前、3日目に得られたIVISイメージである。図93D、93E及び93Fは、７日目、ちょうど処置後４日目、の動物のIVISイメージを示す。図93G、93H及び93Ｉは、１０日目の動物のIVISイメージを示す。図93J、93K及び93Ｌは、１5日目の動物のIVISイメージを示す。図93Mは、色をつけるべき光子/秒に、蛍光を関連づける色スケールである。
【０２０６】
【図９４】図94A-94Bは、成長因子リセプターMUCl*へのT細胞のMUCl全長妨害アクセスの立体障害問題を描く漫画である。図94Aは、遅いステージの癌細胞が、T細胞が、成長因子リセプターに容易にアクセスするように、開裂MUClを主に発現することを示す漫画である。図94Bは、初期ステージの癌細胞が、MUCl*成長因子リセプター及び全長MUClの両方を発現することを示す漫画である。全長MUClは、MUCl*に結合するT細胞を立体的に妨害するように、MUCl*より10倍長い。MMP9は、分子はさみとしてここで描かれ、T細胞活性化の後に、MUCl*をよりアクセス可能にするために全長タンパク質をカットスルーする。
【０２０７】
【図９５】図95A-95Dは、全長MUCl*若しくはMUClで安定して形質転換された、MUCl陰性結腸癌細胞株であるHCT-116細胞のウェスタンブロット及び対応するFACs分析を示す。示される単細胞クローンは、HCT-MUC1-41TRであり、そしてHCT-MUC1*である。図95Aは、開裂MUClのみを認識するウサギポリクローナル抗体(SDIX)についてゲルで追跡された、親細胞株HCT-116、HCT-MUC1-41TR及びHCT-MUC1*のウェスタンブロットを示す。25と35kDaの間の可視のバンドは、HCT-MUC1*が充填された、レーン6で容易に見ることができる。ここで、小量のMUClのみが、HCT-MUC1 -41Tr細胞で開裂することを示す、レーン4及び5に弱いバンドがある。レーン2及び3に充填した親細胞株HCT-116には開裂MUClの存在はない。図95Bは、全長MUC1の縦列反復を認識するマウスモノクローナル抗体VU4H5で追跡されたウェスタンブロットである。見ることができるように、HCT-MUC1-41TRだけが全長MUC1を含んでいる。図95Cは、HCT-MUC1*が、全長MUC1のためには全くないが、単に、MUC1*に結合するSDIXに95.7%陽性であることを示すFACSスキャンである。図95Dは、HCT-MUC1-41TR細胞が、全長MUC1に95%陽性、及び開裂型、MUC1*にはほんの約11%だけ陽性であることを示すFACSスキャンを示す。
【０２０８】
【図９６】図96A-96Eは、免疫蛍光検査法実験の写真を表わす。HCT-MUC1-41TR癌細胞は、全長MUC1を発現する。顕著に、細胞株は、自然にはMUC1*へMUC1を開裂させない。MUC1のわずか約10-15%が、MUC1*型に開裂される。ここで、本願発明者等は、MMP9触媒領域への全長MUC1の露出が、抗MUCl*抗体MN-C2によって認識されるMUCl*への、MUC1開裂をもたらす、ことを示す。細胞へのMN-C2の結合の量は、細胞へ添加されたMMP9の量に比例する。それは、MMP9によって開裂される場合、MN-C2がMUC1に結合することを示す。図96Aは、コントロールで、MMP9で培養されなかったが、MN-C2で染色された、HCT-MUC1-41TR細胞を示す。図96Bは、12.5ng/mLのMMP9触媒領域と培養された、HCT-MUC1-41TR細胞を示す。図96Cは、25ng/mLのMMP9触媒領域と培養された、HCT-MUC1-41TR細胞を示す。図96Dは、50ng/mLのMMP9触媒領域と培養された、HCT-MUC1-41TR細胞を示す。図96Eは、100ng/mLのMMP9触媒領域と培養された、HCT-MUC1-41TR細胞を示す。
【０２０９】
【図９７】図97は、PBS、微量、若しくは細胞培養培地、まばら量の、2つの濃度でMMP9触媒領域によって開裂される、MMP9の蛍光発生ペプチド基質、OMNIMMPペプチドのグラフを示す。
【０２１０】
【図９８−１】図98A-98F、形質転換されたMMP9構築物を認識する抗体で追跡された細胞溶解物のウェスタンブロットの写真である。プラスミドは、HEK293T細胞へ形質転換されて、構築された。そこではMMP9触媒領域の遺伝子は、3つ若しくは4つのNFAT反応要素の下流に挿入された。NFATパスウェイは、レーン1、2、5、6、9、10、13及び14のコントロール(ctl)細胞以外において、1μM若しくは2μMのIonomycin 及び10ng/mLのPMA添加によって活性化された。NFAT反応要素の３反復を含んでいるプラスミドで形質転換された細胞からの溶解物が、レーン1、3、5、7、9、11、13及び15に充填された。NFAT反応要素の４反復を含んでいるプラスミドで形質転換された細胞からの溶解物が、レーン2、4、6、8、10、12、14及び16に充填された。図98A及び図98Cは、1分間露出した写真を示し、図98B及び図98Dは、5分間露出した写真を示す。図98A及び図98Bの細胞溶解物に、プロテアーゼ阻害剤は添加されなかった。図98C及び図98Dの細胞溶解物に、プロテアーゼ阻害剤は添加された。図98Eは、NFAT反応要素反復を発現しないMMP9触媒領域が、その溶解物が図98A及び図98Bで示される細胞の調整培地(レーン7及び8)からプルダウンされたウェスタンブロットの写真を示す。プルダウンは、MMP9構築物のC末端に組込まれたフラグ・タグを認識する抗体と組み合わされたビーズを使って行われた。レーン1は分子量コントロールを示す。レーン2、3、4及び5は、抗フラグ・タグビーズから溶出されたMMP9を示す。レーン2及び3は、第1の溶出物である。そして、レーン4及び5に示される細胞は第2の溶出物である。レーン2と4へは、NFATパスウェイが、PMA 10ng/mL及び1μMのIonomycinで活性化された細胞からの調整培地を充填した。レーン3と5へは、NFATパスウェイが、PMA 10ng/mL及び2μMのIonomycinで活性化された細胞からの調整培地を充填した。図98Fは、構築物の模型である。
【図９８−２】同上
【０２１１】
【図９９】図99A-99Cは、NFAT反応要素の４反復から下流、MMP9遺伝子を含むプラスミドで形質転換されたEK293T細胞の細胞溶解物若しくは調整培地によって開裂される、蛍光性ペプチド、OMNIMMPペプチド、MMP9の基質のグラフを示す。MMP9ペプチド基質分析は、PMA/ionomycinによるNFATパスウェイの活性化がMMP9を発現し分泌されること、そしてペプチド基質を開裂するその能力によって証拠づけられるようにそれが活性だったことを示す。図99Cは構築物の模型である。
【０２１２】
【図１００−１】図100A-100Eは、HEK293T細胞で発現されたNFAT誘導MMP9触媒領域を示し、そこでは、MMP9の天然リーダー配列が、IgKリーダー配列と置換されており、MMP9触媒領域がNFAT反応要素の４反復の下流にあることを表わす。図100Aは、NFATパスウェイの活性化の後に、細胞溶解物におけるMMP9の発現を検出するウェスタンブロットの写真を示す。図100Bは、NFATパスウェイの活性化の後に、調整培地におけるMMP9の発現を検出するウェスタンブロットの写真を示す。図l00Cは、天然リーダー配列がIgKリーダー配列によって置換され、そしてMMP9触媒領域は、NFAT反応要素の４反復の下流である、HEK293T細胞の調整培地で発現され分泌された、MMP9触媒領域によって開裂される、MMP9蛍光性ペプチド基質、OMNIMMPペプチドのグラフを示す。図100Dは、天然リーダー配列がIgKリーダー配列によって置換され、そしてMMP9触媒領域は、NFAT反応要素の４反復の下流である、HEK293T細胞の調整培地で発現され分泌された、MMP9触媒領域によって開裂される、MMP9蛍光性ペプチド基質のグラフを示す。図100Eは構築物の模型である。
【図１００−２】同上
【０２１３】
【図１０１】図101A-101Eは、MMP9は異なるリーダー配列で発現し、さらに、各々の継続した活性を呈すことが示される。図101Aは、MMP9遺伝子の上流のリーダー配列が、その天然配列若しくはIgK配列である細胞溶解物における、MMP9タンパク質を検出するウェスタンブロットを示す。図101Bは、MMP9遺伝子の上流のリーダー配列が、その天然配列若しくはIgK配列である調整培地での、MMP9を検出するウェスタンブロットを示す。図101Cは、発現されたMMP9によって開裂されたMMP9ペプチド基質のグラフを示す。図101D-101Eは、構築物の概略図である。
【０２１４】
【図１０２】図102A-102Dは、NFAT誘導可能MMP9を生産するプラスミドで形質転換された細胞の、4、6及び7の３クローンを示し、ここで、NFATclプロモーター配列が、MMP9遺伝子の上流にあり、それはこの場合その触媒領域を含む欠失MMP9である。さらに比較のために、NFAT反応要素配列の４反復がMMP9遺伝子の上流にある、NFAT誘導可能MMP9を生産するプラスミドで形質転換された細胞を使用した。図102Aは、細胞溶解物での、MMP9タンパク質を検出するウェスタンブロットを示す。図102Bは、調整培地での、MMP9を検出するウェスタンブロットを示す。図102C-102Dは、構築物の概略図である。
【０２１５】
【図１０３】図103A-103Dは、MMP9ペプチド基質開裂分析のグラフを表わす。図103Aは、NFATclプロモーターなしで、又はNFAT反応要素４反復なしで駆動されたMMP9発現をしているプラスミドで形質転換された細胞の溶解物からのMMP9の開裂活性を示す。図103Bは、NFATclプロモーターなしで、又はNFAT反応要素４反復なしで駆動されたMMP9発現をしているプラスミドで形質転換された細胞の調整培地からのMMP9の開裂活性を示す。図103C-103Dは、構築物の概略図である。
【０２１６】
【図１０４】図104A-104Bは、MMP9の活性を測定するOMNIMMP9蛍光性基質の分析結果を示す。NFAT誘導可能なMMP9で単独で若しくはCAR44との組み合わせで、形質導入されたヒトT細胞からの調整培地が、分析系に添加され、そして、MMP9基質開裂が時間の関数として測定された。図104Aは、細胞がHCT-MUCl*癌細胞と共培養することにより活性化された後、ヒトT細胞がCAR44及びNFAT誘導可能なMMP9の両方で形質導入された時の、MMP9活性を示す。時間の関数として、増加した基質開裂を示さないトレースは、活性化されなかった細胞からの調整培地である。図104Bは、細胞がT細胞を活性化すると知られている抗CD3及び抗CD28で覆われたビーズと共培養することにより活性化された後、ヒトT細胞がNFAT誘導可能なMMP9で形質導入された時の、MMP9活性を示す。時間の関数として、増加した基質開裂を示さないトレースは、活性化されなかった細胞からの調整培地である。
【０２１７】
【図１０５−１】図105A-105Eは、CAR44単独で若しくはNFAT誘導可能なMMP9単独で形質導入された又はCAR44及びNFAT誘導可能なMMP9の両方で形質導入された、ヒトT細胞のウェスタンブロットの写真を示す。ここで、得られたT細胞は、活性化されていない、化学的にPMA/Ionomycinによって活性化されていた、合成MUCl*ペプチドを提示するビーズと共培養することにより、若しくはMUCl*陽性癌細胞と共培養することにより活性化されていた。ウェスタンブロットは、DYKタグ抗体として知られている抗フラグ・タグで追跡された。MMP9触媒領域は、明白な分子量40kDaで展開される。図105A-105Dは、クリアー化細胞溶解物のウェスタンブロットの写真を示す。図105Aは、次の溶解物が充填されたレーン1-7を示す:レーン1: CAR44で形質導入されたが活性化されなかったT細胞;レーン2: CAR44で形質導入され、合成MUCl*細胞外領域ペプチドを提示するビーズで活性化されたT細胞;レーン3: CAR44で形質導入され、HCT-MUC1*癌細胞との共培養によって活性化されたT細胞;レーン4: CAR44及びNFAT誘導可能なMMP9で形質導入されたが、活性化されなかったT細胞;レーン5: CAR44及びNFAT誘導可能なMMP9で形質導入され、合成MUCl*細胞外領域ペプチドを提示するビーズで活性化されたT細胞;レーン6: CAR44及びNFAT誘導可能なMMP9で形質導入され、HCT-MUCl*癌細胞との共培養によって活性化されたT細胞;レーン7: フラグDYKタグを担持する無関係のタンパク質。結果は、NFAT誘導可能なMMP9のみで形質導入されたT細胞は、それらがPMA/Ionomycin、MUCl*ビーズ若しくはMUCl*陽性癌細胞によって活性化される場合、MMP9を発現する。CAR44及びNFAT誘導可能なMMP9の両方で形質導入されたT細胞は、T細胞がMUCl*ビーズ、若しくはMUCl*陽性癌細胞での刺激によって活性化される場合、MMP9を発現する。図105Bは、次の溶解物が充填されたレーン1-7を示す:レーン1: CAR44で形質導入されたが、活性化されなかったT細胞;レーン2: CAR44で形質導入され、T細胞を活性化すると知られている抗CD3及び抗CD28抗体を提示するビーズで活性化されたT細胞;レーン3: CAR44で形質導入され、PMA/Ionomycinとの共培養によって活性化されたT細胞;レーン4: NFAT誘導可能なMMP9で形質導入されたが、活性化されなかったT細胞;レーン5: NFAT誘導可能なMMP9で形質導入され、抗CD3及び抗CD28抗体を提示するビーズで活性化されたT細胞;レーン6: NFAT誘導可能なMMP9で形質導入され、PMA/Ionomycinによって活性化されたT細胞;レーン7: フラグDYKタグを担持する無関係のタンパク質。図105C及び105Dは、各々図105A及び105Bで示される同じウェスタンブロットのより暗い露出である。図105Eは、以下のように形質導入された細胞の細胞上澄みのウェスタンブロットの写真である:レーン1: CAR44で形質導入されたが、活性化されなかったT細胞;レーン2: CAR44で形質導入され、T細胞を活性化すると知られている抗CD3及び抗CD28抗体を提示するビーズで活性化されたT細胞;レーン3: CAR44で形質導入され、PMA/Ionomycinとの共培養によって活性化されたT細胞;レーン4: NFAT誘導可能なMMP9で形質導入されたが、活性化されなかったT細胞;レーン5: NFAT誘導可能なMMP9で形質導入され、抗CD3及び抗CD28抗体を提示するビーズで活性化されたT細胞;レーン6: NFAT誘導可能なMMP9で形質導入され、PMA/Ionomycinによって活性化されたT細胞;レーン7: フラグDYKタグを担持する無関係のタンパク質。結果は、NFAT誘導可能なMMP9で形質導入されたT細胞は���それらが活性化される時、MMP9を発現することを示す。CAR44及びNFAT誘導可能なMMP9の両方で形質導入されたT細胞は、それらが、MUCl*提示若しくは発現ビーズ若しくは細胞と共培養される場合、特異的に活性化されることを示す(図105 Aレーン5及びレーン6)。
【図１０５−２】同上
【０２１８】
【図１０６】図106A-106Bは、全長MUC1によって引き起こされた立体障害を克服するために生成された、「長い腕」CARのシリーズの漫画を示す。図106Aは、細胞膜と抗体scfvの間の、より長いリンカー領域を備えたCARの漫画を示す。図106Bは、それらが、全長MUC1の立体障害をどのように克服するかの漫画を示す。
【０２１９】
【図１０７】図107A-107Bは、コントロールとしての非形質導入T細胞、若しくはいくつかの異なる長い腕CAR T細胞との共培養でのMUC1陽性乳癌T47D細胞のxCelligenceグラフを示す。そこでは示されるように、抗体scFvと膜貫通領域の間のリンカーの長さ及び配列が変えられた。図107Aは、テストされた様々なCAR T細胞の時間の関数としてインピーダンスを示す。図107Bは同じデータを示すが、トレースの傾斜が、時間の関数として図示される。
【０２２０】
【図１０８−１】図108A-108Pは、抗体断片と膜貫通領域の間の可変長リンカー領域をもつCARで細胞が形質導入された、細胞結合分析の写真を表わす。CAR形質導入細胞は、GFPの蛍光メーカーを担持し、緑である。その後、CMTMR染料で赤に染色されたMUCl*陽性癌細胞が、CAR発現細胞に添加された。CARが、癌細胞上のそれらの標的を認識されうる程度は、黄色(緑プラス赤)の量によって反映される。図108Aは、コントロール、非形質導入細胞である。図108Bは、リンカー領域が、CD8の細胞外領域に由来する、CAR44で細胞が形質導入された。図108Cは、抗体Fc領域の一部であるリンカーを備えたCARを示す。図108Dは、そのヒンジ領域をマイナスの、抗体Fc領域の一部であるリンカーを備えたCARを示す。図108Eは、4つの反復の柔軟なリンカー配列であるリンカーを備えたCARを示す。図108Fは、IgD抗体の一部であるリンカーを備えたCARを示す。図108Gは、Fc領域とIgD抗体の一部であるリンカーを備えたCARを示す。図108Hは、そのヒンジ領域が欠けているFc領域とIgD抗体の一部であるリンカーを備えたCARを示す。図108I-108Mは、十分な洗浄ステップの後に、MUCl*発現癌細胞とインキュベーション後のCAR発現細胞の写真を示す。
【図１０８−２】同上
【０２２１】
表1は、生成されテストされた抗MUCl* CARの多くの詳細を示す。各々の示された構築物について、そのCARに割り当てられた数、使用されるプロモーター、シグナル・ペプチド、抗体種、scFvの配列、ヒンジ領域、膜貫通領域、及び各CARで使用されるシグナルするモチーフ、塩基対の数での挿入物の長さ、その分子量及び構築物の長さが表示される。
【表１−１】
2020500031.tif 000003
【表１−２】
2020500031.tif 000004
【０２２２】
表2は、ヒトT細胞へ形質導入の後にCARのうちのいくつかのためのサイトカイン・リリース・データを示し、また様々な癌細胞と共培養された。
【表２−１】
2020500031.tif 000005
【表２−２】
2020500031.tif 000006
【発明を実施するための形態】
【０２２３】
本願明細書で、「a」「an」は、単一及び複数の対象物の両方を参照するために使用される。
【０２２４】
ここに使用されるように、時々、要するに、ポリペプチドは、細胞へ「形質導入されるか形質転換される」こととして示される。
これらのケースでは、細胞へポリペプチドは形質導入するか形質転換することが不可能であるので、ポリペプチド配列をコードする核酸が、細胞に、形質導入されるか形質転換されるということは理解されうる。
【０２２５】
ここに使用されるように、動物に注入された細胞の数を若しくはそうでなければ文脈的に細胞の数を参照する時、「M」は何百万を指し、また、「K」は何千を指す。
【０２２６】
ここに使用されるように、様々なモノクローナル抗体のための交換可能な明示は、「MN-C2」、それは「C2」、「MinC2」又は「MN-C2」と交換可能である;「MN-E6」、それは「E6」、「minE6」又は「MN-E6」で交換可能である;「MN-C3」、それは「C3」、「minC3」又は「MNC3」で交換可能である;そして「MN-C8」、それは「C8」、「minC8」また「MNC8」で交換可能である。
【０２２７】
ここに使用されるように、抗体の前に記載された「h」若しくは「hu」は、ヒト化の略語である。
【０２２８】
ここに使用されるように、「抗体様」の用語は、それが抗体の部分を含んでいるが、自然界に自然には生じる抗体でないような加工された分子を意味する。例示は包含するが、例えば、CAR(キメラ抗原リセプター)Τ細胞工学及びYlanthiテクノロジーaに制限されるものではない。
CAR技術は、身体の免疫系が特定の標的タンパク質若しくは細胞を攻撃するのを指示されるように、T細胞の一部に結合された抗体エピトープを使用する。Ylanthia技術は、標的タンパク質からペプチド・エピトープに結合するためにスクリーニングされる合成ヒトFabsのコレクションである、「抗体様」ライブラリーから成る。その後、それらが抗体に似ているように、選択されたFab領域が、足場かフレームワークへ加工処理がなされうる。
【０２２９】
ここに使用されるように、「PSMGFR」は、SEQ ID NO:2によって同定されるMUC1成長因子リセプターの一次配列のための略語である。6つのアミノ酸配列と混同するべきではない。「PSMGFRペプチド」若しくは「PSMGFR領域」は、MUC1成長因子リセプター(SEQ ID NO: 2)の一次配列を具体化するペプチドか領域を指す。
【０２３０】
ここに使用されるように、“MUCl*”細胞外領域は、主としてPSMGFR配列
(GTINVHDVETQFNQ YKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQID NO:2))によって定義される。
MUC1開裂の正確なサイトは、それを切り取る酵素に依存し、開裂酵素が細胞タイプ、組織タイプ若しくは細胞の分化時間に依存して変化し、MUCl*細胞外領域の正確な配列は、N-端末で変わりうる。
【０２３１】
他の略したアミノ酸配列は、
SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY(SEQID NO:620)若しくは
SVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQ YKTEAASRY(SEQ IDNO:621) を含みうる。
【０２３２】
ここに使用されるように、用語「PSMGFR」は、
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:2)
として述べられるようなMUC1成長因子リセプターの一次配列の頭文字である。
この点では、「N-10PSMGFR」、「N-15 PSMGFR」若しくは「N-20 PSMGFR」でのような「N-数」は、PSMGFRのN-端末で削除されたアミノ酸残基の数を指す。同様に「C-10 PSMGFR」、「C-15 PSMGFR」若しくは「C-20 PSMGFR」でのような「C-数」は、PSMGFRのC-端末で削除されたアミ酸残基の数を指す。
【０２３３】
ここに使用されように、MUCl*細胞外領域は、縦列反復領域が欠けているMUC1タンパク質の細胞外の部分を指す。ほとんどの場合、MUCl*は、MUCl*部分が、縦列反復、膜貫通領域及び細胞質尾部を欠く、短い細胞外領域から成る、開裂産物である。恐らく1つを超える酵素によってそれを開裂されうるように見えるので、MUC1の開裂の正確な位置は知られていない。MUCl*細胞外領域は、ほとんどのPSMGFR配列を含むが、さらに10-20のN-末端アミノ酸があってもよい。
【０２３４】
ここに使用されるように、「配列同一性」は、同族のペプチドの機能が参照ペプチド若しくは核酸と同じであるような、核酸若しくはアミノ酸の参照配列が特定のポリペプチド若しくは核酸の配列において相同を意味する。そのような相同は、2つの配列が90%、95%、若しくは98％同一であるときに、なお、結合若しくは他の生物学的活性において同じ機能を保持するほど、参照ペプチドと非常に密接でありうる。
【０２３５】
ここに使用されるように、「MUC1陽性」細胞は、MUC1、MUC1-Y若しくはMUC1-Z若しくは他のMUC1バリアントのための遺伝子を発現させる細胞を指す。
【０２３６】
ここに使用されるように、「MUC1陰性」細胞は、MUC1のための遺伝子を発現させない細胞を指す。
【０２３７】
ここに使用されるように、「MUCl*陽性」細胞は、MUC1のための遺伝子を発現させる細胞を指す。そこでは、その遺伝子の発現されたタンパク質は、縦列反復が欠けている膜貫通型タンパク質であって、それらは翻訳後修飾、開裂、選択的スプライシング若しくは縦列反復が欠けているMUC1タンパク質で細胞を形質転換するか形質導入することの結果でありうる。
【０２３８】
ここに使用されるように、「MUCl*陰性」細胞は、MUClのための遺伝子を発現する若しくは発現しないかもしれないが、縦列反復が欠けているMUCl膜貫通型タンパク質を発現しない細胞を指す。
【０２３９】
ここに使用されるように、「MUCl陽性」癌細胞は、MUClの遺伝子を過剰発現する、異常なパターンでMUClを発現する癌細胞を指し、そこではその発現は、頂点の限界には制限されず、及び/又は縦列反復が欠けているMUClを発現する。
【０２４０】
ここに使用されるように、「MUCl陰性」癌細胞は、MUClのための遺伝子を発現する若しくは発現しないかもしれないが、MUClを過剰発現しない、若しくは縦列反復が欠けているMUCl膜貫通型タンパク質を過剰発現しない癌細胞を指す。
【０２４１】
ここに使用されるように、「MUCl*陽性」癌細胞は、縦列反復が欠けているMUCl膜貫通型タンパク質を過剰発現する癌細胞を指す。
【０２４２】
ここに使用されるように、「MUCl*陰性」癌細胞はMUClのための遺伝子を発現する若しくは発現しないかもしれないが、縦列反復が欠けているMUCl膜貫通型タンパク質を過剰発現しない癌細胞を指す。
【０２４３】
癌の治療若しくは予防用のMUCl*抗体(抗PSMGFR)
【０２４４】
本願発明者等は、MUCl(SEQID NO: l)膜貫通型タンパク質の開裂型がすべてのヒト癌の75%以上の成長を誘導する成長因子リセプターであることを発見した。MUClの開裂型(本願発明者等はそれをMUCl*(ムックワンスターと発音)と呼んだ)は、強力な成長因子リセプターである。酵素開裂は、MUClの細胞外領域の大部分をリリースする。それは、MUCl*と呼ばれる、欠失細胞外領域、膜貫通領域及び細胞質尾部を含む、残る部分である。MUClの細胞外領域の大部分の開裂及びリリースは、活性化リガンド 二量体NME1、NME6、NME8、NME7-AB、NME7-X1若しくはNME7の結合部位を露出する。細胞増殖分析は、成長を促進する、MUCl*細胞外領域のリガンド誘導二量化であることを示す (図1A-1D)。MUCl*陽性細胞が、二価の「bv」抗MUCl*抗体、一価の「mv」若しくはFab、NM23-H1二量体若しくはNME7-ABで処置された。二価の抗MUCl*抗体は、癌細胞の成長を促進する、しかし、一価Fabは、成長を阻害する。古典的正規曲線は、リガンド誘導二量化が成長を促進することを示す。二量体NM23-H1(aka NME1)は、MUCl*陽性癌細胞の成長を促進し、MUCl発現を抑えるsiRNAはその効果なくす(図1C)。NME7-ABは、さらにMUCl*陽性細胞の成長を促進する(図ID)。
【０２４５】
MUCl*は、すべての癌の75%以上で異常に発現され、恐らく転移癌のさらに高い割合で過剰発現されるようであり、MUCl*は、制癌剤の優れた標的である。MUCl開裂の後、ほとんどのその細胞外領域は細胞表面から流される。残りの部分は、一次成長要因リセプター配列、PSMGFR(SEQ ID NO: 2)を少なくとも含む欠失細胞外領域をもつ。PSMGFR配列に結合する抗体、NMEl、NME6、NME8、NME7AB、NME7-X1及びNME7を含むNMEタンパク質のような活性化リガンドの結合は、理想的な治療薬で、MUC1陽性の若しくはMUCl*陽性の癌を処置するか若しくは予防するために使用することができ、スタンド・アロンの抗体として、スタンド・アロンの抗体として、二重特異性抗体、又はCARと呼ぶキメラ抗原リセプター、その後それは免疫細胞へ形質転換若しくは形質導入される、に組み込まれた抗体断片若しくはその可変領域断片として、次に、患者に投与される。
【０２４６】
治療用の抗MUCl*抗体は、モノクローナル、ポリクローナル、抗体模倣物、加工抗体様分子、完全抗体若しくは抗体断片でありえる。抗体断片の例は、Fabs、scFv及びscFv-Fcを含むが、これに制限されない。ヒト若しくはヒト化抗体は、癌の治療若しくは予防において使用するために好適である。これらの抗体様分子では、変異は、二量体形成を防ぐ若しくは最小化するように導入されうる。MUCl*機能は、リガンド誘導二量化によって活性化されるので、一価若しくは、2重特異的抗MUCl*抗体が好適である。典型的な結合性分析は、MUCl*のPSMGFRペプチド部分に、NMEl及びNME7-ABが結合することを示す(図2A、2D)。さらに、それらは、10C末端アミノ酸を欠く場合、それらはPSMGFRペプチドに結合しないので、これらの活性化成長因子がMUCl*の膜近位に結合することを示す。同様に、抗MUCl*抗体MN-C2及びMN-E6は、10C末端アミノ酸が存在する場合にのみ、PSMGFRペプチドに結合する(図2B、2C)。抗体、MN-C3及びMN-C8は、それらがPSMGFRペプチドの10C末端アミノ酸の存在に依存しないので、MN-C2及びMN-E6とは異なるエピトープに結合する(図2E、2F)。抗体MN-C2、MN-E6、MN-C3若しくはMN-C8、又はそれらに由来した断片は、スタンド・アロンの抗体として、あるいは二重特異性抗体、BiTEs若しくは免疫細胞へ形質導入されたCARと呼ばれるキメラ抗原リセプターに組み入れて、癌の治療若しくは予防のための患者に投与されうる。NMEl及びNME7-ABの結合を競合的に阻害するMN-C2及びMN-E6、及び他の抗MUCl*抗体は、スタンド・アロンの抗体療法での使用のために好適である。
【０２４７】
スタンド・アロンの抗体療法での、又はBiTEまたはCARへの統合のために、使用される、治療用抗MUCl*抗体は、特定の基準に基づいて選択されうる。親抗体は、動物のモノクローナル抗体を生成する典型的な方法を使用して生成されうる。あるいは、それらは、MUC1*ペプチド、PSMGFRペプチド(SEQ ID NO: 2)、
SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY(SEQID NO: 620);若しくは
SVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY(SEQ IDNO: 621)
への結合性に基づき、抗体と抗体断片ライブラリーをスクリーニングすることにより選択されうる。
【０２４８】
その後、このように生成され若しくは選択されて得られた抗体若しくは抗体断片は、追加のスクリーンをへてよりさらに選択されうる。例えば、抗体若しくは抗体断片は、MUCl陰性癌細胞若しくは正常組織にではなく、MUCl*陽性癌細胞若しくは組織に結合するそれらの能力に基づいて、もっと好適となる。さらに、抗MUCl*抗体若しくは抗体断片は、それらが幹若しくは先祖細胞へ結合する場合、癌治療治療薬として脱選択されうる。抗MUCl*抗体若しくは抗体断片は、それらがMUCl*への活性化リガンド結合を競合的に阻害する能力を持っている場合に、もっと好適となる。図3A-3Cは、MN-E6及びMN-C2が、MUCl*への活性化リガンドNME1及びNME7の結合を競合的に阻害することを示す。
【０２４９】
MUCl陽性癌と診断された、MUCl陽性癌になるリスクを診断された、若しくはMUCl陽性癌を持っていることが疑われる患者の治療で使用される抗MUCl*抗体の選択プロセスは、抗体若しくは抗体断片を選択する次のステップの1つ以上を含む；
1)  PSMGFRペプチドに結合する;
2)  N-10 PSMGFRペプチドに結合する;
3)  癌細胞に結合する;
4)  幹若しくは先祖細胞へ結合しない;
そして、
5)   競合的に、PSMGFRペプチドへの、二量体NME1若しくはNME7-ABの結合を阻害する。
例えば、図3A-3Cは、モノクローナルMN-E6及びMN-C2が、5つの基準すべてを満たし、一方、モノクローナルMN-C3及びMN-C8が、活性化リガンドNME1及びNME7の結合を競合的に阻害しないことを示す(図3C)。しかしながら、MN-C3及びMN-C8に由来した抗体若しくは抗体断片は、これらの方法では、BiTEまたはCARへ組み込まれた時、抗癌剤として等しいく有力であり、免疫細胞の殺滅効果は、活性化リガンドの結合を阻害する能力より重要である。さらに、MN-E6、MN-C2、MN-C3若しくはMN-C8に結合した毒性物質は、有力な癌治療薬である。MUCl*成長因子リセプターがその細胞外領域のリガンド誘導二量化によって活性化されることを確認されたい。したがって、理想的な抗体治療は、MUCl*細胞外領域を二量化するものではない。むしろ、この点に関して、適切な抗体は、Fc部分が、ホモ二量化しないように構築される限り、ラマとラクダで生成されるような一価抗体、Fabs、scFv‘s、単一領域抗体(sdAb)、scFv-Fc、を含む。
【０２５０】
FACSスキャンは、抗MUCl*抗体MN-C2及びMN-E6が、MUCl*陰性若しくはMUCl陰性細胞ではおこらないが、
MUCl*陽性固形腫瘍癌細胞及びMUCl*形質転換細胞に特異的に結合することを示す。これらの疾病が、血液先祖細胞の最終的に分化することの不可能性によって特徴づけられるので、MNC3とMNC8は、血液癌細胞へも血液先祖細胞へも結合する。したがって、MNC3とMNC8は、スタンド・アロン治療薬、BiTEs若しくはCAR T治療薬として、血液癌の処置に好適である。1例において、ヒト化MN-C2 scFvは、ZR-75-1、aka 1500 、MUC1*陽性乳癌細胞に結合することが示される(図4A-4C)。MN-E6は、MUC1*で形質転換された場合にのみ、MUC1陰性HCT-116結腸癌細胞へ結合することが示された。MN-E6は、さらに、ZR-75-1、aka 1500、MUCl*陽性乳癌細胞のようなMUC1*陽性癌細胞に結合する(図4D-4F)。ELISA、免疫蛍光検査法などのような結合分析はすべて、MN-C2及びMN-E6が、PSMGFRペプチドに結合し、またMUC1陽性癌細胞を生かすことを確認するヒト化抗MUCl*抗体は、さらに、PSMGFRペプチドへ若しくはMUC1陽性癌細胞へ結合するそれらの能力に基づいて選択される。図5は、ヒト化MN-C2 scFvは、約333nM のEC-50で、MUC1*ペプチドPSMGFRへの高い親和性をもって結合することを示す。図6A、6Bの１実施例で示されるように、Fabsのような、ヒト化MN-C2 scFvは、強力にMUC1*陽性癌細胞の成長を阻害する。
【０２５１】
MN-E6、MN-C2のFabs若しくはそれらに由来する比較可能な単一鎖変項領域は、生体外若しくは生体内において、MUCl*陽性癌の成長を阻害する。いくつかの例において、抗MUCl*抗体のFabsは、ヒトMUCl*陽性癌の成長を、生体内で、阻害した。1つのケースでは、免疫不全マウスに、ヒト乳腫瘍が注入され、腫瘍移植成功の後に、MN-E6 Fabで処置された。図7Aは、強力に、FabMN-E6が、MUCl*陽性乳癌の成長を阻害したことを示す。90日間、エストロゲンペレットが注入された雌のニュー/ニュー・マウスに、Matrigelと50/50で調合された600万のT47Dヒト乳癌細胞が注入された。少なくとも150 mmA3であり、腫瘍ボリュームの3連続の増加があった腫瘍担持マウスが、処置に選ばれた。動物は、80mg/kgのMN-E6 Fabを皮下に1週当たり2度注入され、また、同じ選択基準に適合する等しい数のマウスは、ビークルを単独で注入された(図7A)。
【０２５２】
別の態様では、MN-E6は前立腺癌の成長を停止させることを示された。図7Bは、強力に、FabMN-E6が、MUCl*陽性前立腺癌の成長を阻害したことを示す。オスのNOD/SCIDマウスに、Matrigelと50/50で調合された600万のDU-145ヒト前立腺癌細胞が注入された。少なくとも150 mm3で、腫瘍ボリュームの3連続の増加があった腫瘍担持マウスが、処置に選ばれた。動物は、48時間ごとに160mg/kgのMN-E6 Fabを皮下投与され、また、同じ選択基準に適合する等しい数のマウスは、ビークルを単独で注入された(図7B)。腫瘍は、2人の研究者によって独立して1週当たり2度測定され記録した。統計は、各々に対する0.0001のP値を与える独立した統計家によって盲目的に計算された。抗MUCl*Fabは、乳癌成長及び前立腺癌成長を阻害した。処置はウェイト、骨髄細胞タイプ若しくは数に影響がなかった。有効に、FabMN-E6は、腫瘍の成長を阻害した。一方、対照群の腫瘍は殺処理まで成長し続けた。処置の副作用は観察されなかったし検知されなかった。
【０２５３】
FabようにモノマーのMN-E6及びMINER VA-C2の組み換え体が構築された。この場合、MN-E6はヒト化され、また、MINERVA-C2がヒト化された。抗体のヒト化について当業者に知られる多くの方法がある。ヒト化に加えて、ヒト抗体のライブラリーは、PSMGFRに結合する他の完全ヒト抗体を同定するためにスクリーニングされた。図8は、軽鎖がカッパまたはラムダか、可変部分がヒトIgGlかIgG2に融合したかどうかに依存して、ヒト化MN-E6抗MUCl*抗体の発現の異なるレベルを示すELISA分析のグラフである。図9は、MUCl*細胞外領域に由来したPSMGFRペプチドを提示する表面へのMN-E6抗体のヒト化バージョンに対する、親マウスMN-E6抗体の結合を比較するELISA分析のグラフである。図10は、軽鎖がカッパまたはラムダか、可変部分がヒトIgGlかIgG2に融合したかどうかに依存して、ヒト化MN-C2抗MUCl*抗体の発現の異なるレベルを示すELISA分析のグラフである。図11は、MUCl*細胞外領域に由来したPSMGFRペプチドを提示する表面へのMN-C2抗体のヒト化バージョンに対する、親マウスMN-C2抗体の結合を比較するELISA分析のグラフである。図12は、MUCl*細胞外領域に由来したPSMGFRペプチドを提示する表面への、ヒト化単一鎖(scFv)MN-C2 及び/又はMN-E6抗体の結合のELISA分析のグラフである。
【０２５４】
scFvと呼ばれる、ヒト化MN-E6可変領域の単一鎖が、遺伝子工学的に加工がなされ、それは、抗体(SEQ ID NO: 256と257)のFc部分に接続された。Fc領域は、治療薬として使用のための抗体断片に、ある利点を与える。抗体のFc部分は、補体を引き込み、一般的な意味で、それは、免疫系の他の態様を引き出し、標的を単に阻害することを超えて抗腫瘍反応を増幅されうる。Fc部分の付加は、又、抗体断片の半減期を増加させる(Czajkowsky DM, Hu J, Shao Z andPleass RJ. (2012) Fc-fusion proteins: new developments and future perspectives.EMBO Mol Med. 4(10): 1015-1028).。
【０２５５】
しかしながら、抗体のFc部分は、ホモ二量化し、それは抗MUCl*抗体ベースの治療薬の場合には、MUCl*リセプターのリガンド誘導二量化が成長を促進するので、最適でない。図13 Bで見ることができるように、ヒト化MN-E6scFv-Fcは、一部分、ジィスルフィド結合により、二量体である。したがって、二量体形成に抵抗するFc領域の変異は、抗MUCl*抗癌治療薬のために好適である。Fc変異体を2量体への抵抗性にするFc領域における変異及びヒンジ領域の欠失〔いくつかの図ではhingeless（ヒンジがない）はdelta hinge(デルタヒンジ)若しくはDhinge(ディヒンジ)と呼ばれSEQ ID NO:288と289が例示される〕がなされた。モノマーのscFv-Fc融合タンパク質を作るために、次の変異がCH3領域でなされた:Y407R(SEQ ID NO: 278と279)、F405Q(SEQ ID NO: 280と281)、T394D(SEQ ID NO:282と283)、T366W/L368W(SEQ ID NO: 284と285)、T364R/L368R(SE ID NO: 286と287)。図14は、非還元ゲルでの精製MN-E6 scFv-Fc融合タンパク質のSDS-PAGE特性の写真を示す、そこではMN-E6に融合されたFc部分は、野生型(wt)か、以下のように変異させた):A) F405Q、Y407R、T394D;B) T366W/L368W、T364R/L368R、T366W/L368W若しくはT364R/L368R。
Fc変異体F405Q、Y407R、T366W/L368W、T364R/L368R、T366W/L368W及びT364R/L368Rはすべて、二量体形成よりモノマーを指向した。図15は、プロテインAアフイニティカラムでの、低IgG FBSにおいて成長したMN-E6scFv-Fc Y407Q融合タンパク質の精製にFPLCトレースを示す。A)は、通過物のトレースである。B)は、溶出物のトレースである。タンパク質は、S200カラムでのサイズ排除によってさらに精製した(C)。(D)は、どの分画がモノマーの優位を持っていたか示すSDS-PAGEゲルの写真である。図16は、非還元ゲル上の精製MN-E6 scFv-Fc変異体融合タンパク質のSDS-PAGE特性の写真を示し、MN-E6 scFvに接合したFc部分は、野生型(wt)又はFcのヒンジ領域の除去、「DHinge」、による若しくはFcのヒンジ領域の除去とY407R変異を担持した変異をなされた。Fc変異体は、すべて、二量体形成よりモノマーを指向した。示された変異のための参照構築物アミノ酸配列はSEQ ID NO:273である。他の関連配列は、SEQ ID NOS:289と279である。図17A及び図17Bは、それがモノマーであることを示している、MN-E6 scFv-Fcヒンジレス変異体の大規模発現と精製の非還元SDS-PAGE特性の写真を示す。MN-E6 scFv-Fcヒンジレス変異体の、FPLC特性及び精製は示される(図17C)。図18A-18Cは、非還元ゲル(図18A)若しくは還元ゲル(図18B)上での、精製MN-C3scFv-Fc融合タンパク質のSDS-PAGE特性の写真を示す。タンパク質はサイズ排除によって精製した。FPLCトレースが示される(図18C)。図19A-19Bは、Fc部分が、野生型又は排他的にモノマーである若しくは好む変異体である、scFv-Fc、scFv、MN-C3若しくはMN-E6 Fabsの天然ゲルの写真を示す。天然ゲルは、Y407R Fc変異体(図19A)及びダブル変異体Y407R、欠失ヒンジ(図19B)が、最上に、二量体を越えてモノマーを指向した。タンパク質が、典型的な使用濃度よりはるかに高い濃度でゲルに載せられることに注意がいる。他のFc変異体の二量体形成は、単に充填濃度が非常に高いという事実を反映するものである。
【０２５６】
ある変異若しくは欠失は、高濃度でゲルに充填された時でさえ、二量体形成に抵抗するとうほど非常に有効だった(図14A、14B)。Y407R変異は、二量体scFv-Fcのほとんど純粋な集合をもたらした(図10)。同様に、Fcのヒンジ領域の欠失は、二量体よりむしろモノマーである融合タンパク質をもたらした。変異のコンビネーションは、二量体形成のより有効な抵抗をもたらしうる(図16及び17)。これら及びそれの他の変異及びそれらのコンビネーションは、scFvのようなCH2-CH3(SEQ ID NO: 274と275)及びCH3(SEQ ID NO: 276と277)融合タンパク質へ、若しくはscFvのようなヒンジレスFc融合タンパク質で導入され、二量化を排除する若しくは最小化することが示された。
【０２５７】
親マウスモノクローナル抗体のように、単鎖構築物、scFv’s、scFv-Fc融合体若しくはscFv-Fc変異体と、同様に、ヒト若しくはヒト化抗体は、特異的に合成MUCl*ペプチドに結合する(図20-22)。図23は、ヒト化MN-E6scFv-Fcデルタヒンジ、akA-Dhinge若しくはhingeless、及びMN-E6 scFvの、MUCl*ペプチドPSMGFRへの結合を定量するELISA分析のグラフを示す。
【０２５８】
ここで記述されたヒト若しくはヒト化抗MUCl*抗体断片は、MUCl及びMUCl*陽性癌細胞に結合する。図24は、ヒト化MN-C2 scFv若しくはMN-E6 scFvが、特異的に、同一の濃度依存のやり方で、MUCl*陽性乳癌細胞に結合する、免疫蛍光検査法実験の写真を示す。A〜G：示された濃度でT47D乳癌細胞へ結合するhuMN-C2scFv。H〜N：蛍光ラベル化scFv及びDAPIを示す。O〜U：示された濃度でT47D乳癌細胞へ結合するhuMN-E6 scFv。V〜B'：蛍光ラベル化scFv及びDAPIを示す。C‘は、第2抗体コントロールである。
【０２５９】
抗MUCl*抗体可変領域断片、scFv’s、scFv-Fc及びscFv-Fc変異体は、MUCl *陽性癌細胞への結合に加えて、MUCl陽性癌細胞の成長を阻害した。図25A-25Lは、通常培地若しくはヒト化MN-E6 scFvの存在下で、培養された、MUCl*陽性乳癌細胞の写真を示す。写真は、500 μg/mLでさらに大きな結果をもたらし、5μg/mLのMN-E6 scFv によるMUCl*陽性細胞の殺滅及び／又は増殖阻害を示す。図6A-26Lは、通常培地中で若しくはヒト化MN-E6scFv-Fc Dhinge、それはhingeless若しくはデルタヒンジ変異体である、の存在において培養された、MUCl*陽性乳癌細胞の写真を示す。写真は、100 μg/mLのさらに大きな結果50 μg/mLで大きな結果をもたらし、5μg/mLのhMN-E6 scFv-Fc DhingeによるMUCl*陽性細胞の殺滅及び／又は増殖阻害を示す。殺滅及び(または)MUCl*の増殖阻害を示す。図27は、図25と26の蛍光イメージの画像分析のグラフを示す。イメージJは、ヒト化MN-E6scFv若しくはMN-E6 scFv-Fcデルタヒンジ(akA-Dhinge)での、96時間処置の後に残存する細胞数の量を計るために使用された。分析ソフトウェアは、各写真の細胞の数の量を計るために、ピクセル蛍光強度及びピクセルカウンテイングを使用する。分析は、全イメージ512X512ピクセル、8ビットイメージで行なわれた。比較のために、マウスモノクローナルMN-E6 Fabの阻害も分析された。
【０２６０】
これらのデータは、ヒト若しくはヒト化MN-E6抗体若しくは抗体断片、Fab、MN-E6 scFv若しくはhuMN-E6 scFv-Fcmutは、MUCl若しくはMUCl*陽性癌と診断された、MUCl若しくはMUCl*陽性癌になるリスクを診断された、若しくはMUCl若しくはMUCl*陽性癌を持っていることが疑われる患者に投与されうる、効果的な抗癌剤であることを示す。
【０２６１】
これらの特定の実施例において、抗体断片若しくはscFvに融合された二量化抵抗性Fcは、huMN-E7 scFvである。しかしながら、二量化を除去するか最小化する、Fc領域変異若しくはそれのコンビネーションのうちのどれでも、MN-E6、MN-C2、MN-C3、MN-C8若しくは他の抗体であってそれが癌細胞または組織に存在するので、MUCl*に選択的に結合することが同定された抗体の、可変領域断片若しくは単一鎖構築物に融合されうる。さらに、これらの抗体のFabsは、癌治療剤として使用されうる。1つの態様で、MUCl若しくはMUCl*陽性癌と診断された、MUCl若しくはMUCl*陽性癌になるリスクを診断された、若しくはMUCl若しくはMUCl*陽性癌を持っていることが疑われる患者は、有効な量のヒト若しくはヒト化MN-E6 scFv、MN-C2 scFv、MN-C3 scFv若しくはMN-C8 scFvで処置可能である。別の態様で、MUCl若しくはMUCl*陽性癌と診断された、MUCl若しくはMUCl*陽性癌になるリスクを診断された、若しくはMUCl若しくはMUCl*陽性癌を持っていることが疑われる患者は、有効な量のヒト若しくはヒト化MN-E6 SCFV-FCY407R及びMN-C2 SCFV-FCY407R及びMN-C3 SCFV-FCY407Rで処置可能である。さらに別の態様で、MUCl若しくはMUCl*陽性癌と診断された、MUCl若しくはMUCl*陽性癌になるリスクを診断された、若しくはMUCl若しくはMUCl*陽性癌を持っていることが疑われる患者は、有効な量のヒト若しくはヒト化MN-E6scFv-Fc mutantDhinge、MN-C2 scFv-Fc mutantDhinge、MN-C3 scFv-Fc mutantDhinge若しくはMN-C8 scFv-Fc mutantDhingeで処置可能である。もっと別の態様で、MUCl若しくはMUCl*陽性癌と診断された、MUCl若しくはMUCl*陽性癌になるリスクを診断された、若しくはMUCl若しくはMUCl*陽性癌を持っていることが疑われる患者は、有効な量のヒト若しくはヒト化MN-E6scFv-Fc mutantY407R-Dhinge、MN-C2 scFv-Fc mutantY407R-Dhinge、MN-C3 scFv-Fc mutantY407R-Dhinge若しくはMN-C8 scFv-Fc mutantY407R-Dhingeで処置可能である。発明の1つの態様は、MUCl若しくはMUCl*陽性癌と診断された、MUCl若しくはMUCl*陽性癌になるリスクを診断された、若しくはMUCl若しくはMUCl*陽性癌を持っていることが疑われる患者を処置する方法に関し、ここで該患者は、有効な量のモノマーのMN-E6 scFv、MN-C2 scFv、MN-C3 scFv、MN-C8 scFv、若しくはMN-E6scFv-Fc及びMN-C2 scFv-Fc及びMN-C3 scFv-Fc及びMN-C8 scFv-Fcを投与され、ここで抗体様タンパク質のFc部分は、二量体形成抵抗性に変異された。
【０２６２】
ヒト化
【０２６３】
MUCl*細胞外領域へ結合する、ヒト化抗体若しくは抗体断片若しくは完全ヒト抗体は、治療の使用のために好適である。抗体のヒト化のためにここに記述された技術は、当業者に知られていた様々な方法のうちほんの少数にすぎない。本発明は、抗体をヒト化するために使用されるそのような技術によって制限されることが目的ではない。
【０２６４】
ヒト化とは、その結合特異性及び親和性を変更せずに、治療用抗体(通常マウスモノクローナル抗体)の非ヒトの領域をヒトものに取り替える過程をいう。ヒト化の主なゴールは、ヒトに投与された時、治療用モノクローナル抗体の抗原性を減少させることである。別個の3つのタイプのヒト化が可能である。第１は、キメラ抗体が、抗体の非ヒトの定常領域をヒト定常領域に取り替えることにより作られる。そのような抗体は、マウスFab領域を含み、またヒト配列の約80-90%を含む。第２は、ヒト化抗体は、ヒトCDRを交換して、ヒト抗体の可変領域にマウスCDR領域(結合特異性に関与する領域)を接合することにより作られる（CDR接合法）。そのような抗体は、ヒト配列の約90-95%を含む。第３に、そして最後であるが、完全ヒト抗体(100%のヒト配列)が、ファージディスプレイによって、そこでは、ヒト抗体のライブラリーが、抗原特異的ヒト抗体をスクリーニングする、又はヒト抗体を発現している遺伝子組み換えのマウスに免疫することによって作成されうる。
【０２６５】
抗体をヒト化するための一般的な技術は、ほぼ以下のように実行される。モノクローナル抗体が、ホスト動物、典型的にはマウス、で生成される。その後、モノクローナル抗体は、標的に結合する親和性と特異性のためにスクリーニングされる。一旦、所望の効果があり、所望の特性をもつモノクローナル抗体が同定されれば、それの配列が決定される。その後、動物に生成された抗体の配列は、その動物抗体に最も相同性をもつ配列のヒト抗体を見出すために、多くのヒト抗体の配列とアラインされる。生化学技術は、ヒト化抗体配列及び動物抗体配列をともに貼り付けるために使用される。典型的には、非ヒトCDRは、非ヒト抗体に対して最も高い相同性を持っているヒト抗体へ接合される。このプロセスは、抗体または複数抗体のどれが、所望の親和性と特異性を持っているかを同定するためにテストされる必要のある多くの候補ヒト化抗体を生成可能である。
【０２６６】
一旦、ヒト抗体若しくはヒト化抗体が生成されたならば、scFv若しくはscFv-Fcのような可変領域を含む単一鎖分子のような抗体様化合物、完全抗体、又はFab断片として使用のために修飾される。ある場合には、抗体のFc部分を持っていることが望ましイ。若しくは、抗体様分子は、それが二量化しないように変異された抗体様分子若しくは抗体Fc部分をもつことが好適である。
【０２６７】
非ヒトの種で生成された抗体へヒト配列を導入する方法に加えて、完全ヒト抗体は、抗原のペプチド断片で、ヒト化抗体ライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。MN-E6若しくはMN-C2のように機能する完全ヒト抗体は、PSMGFR N-10ペプチドの配列をもつペプチドでヒト抗体ライブラリーをスクリーニングすることにより生成される。MN-C3若しくはMN-C8のように機能する完全ヒト抗体は、PSMGFR C-10ペプチドの配列があるペプチドでヒト化抗体ライブラリーをスクリーニングすることにより生成される。
【０２６８】
ヒト化抗MUCl*抗体は、マウスモノクローナル抗体MN-E6、MN-C2、MN-C3及びMN-C8の配列に基づいて生成された。本発明の1つの態様では、MUCl*陽性癌をもつと診断された患者が、有効な量のヒト化MN-E6、MN-C2、MN-C3若しくはMN-C8で処置された。好ましい態様では、MUCl*陽性癌をもつと診断された患者が、有効な量のヒト化MN-E6若しくはMN-C2で処置された。本発明の別の態様では、MUCl*陽性癌をもつと診断された患者が、有効な量のヒト化一価MN-E6、MN-C2、MN-C3若しくはMN-C8で処置され、そこでは一価とは、相当するFab断片、相当するscFv若しくは相当するscFv-Fc融合物を意味する。好ましい態様では、MUCl*陽性癌をもつと診断された患者が、有効な量のヒト化scFv又はMN-E6若しくはMN-C2のモノマーヒト化scFv-Fcで処置された。MUCl*成長因子リセプターは、その細胞外領域のリガンド誘導二量化によって活性化されるので、、また、抗体のFc部分はホモ二量化するので、Fc部分を含む構築物は、二量化を防ぐ若しくは最小化するように変異させられたFc領域を使用することが望ましい。
【０２６９】
MUCl*リセプターの細胞外領域のPSMGFR(SEQ ID NO: 2)ペプチドに結合する抗体は、MUCl*陽性癌の治療若しくは予防に有効である、ので、有力な癌治療薬である。それらは、MUCl*細胞外領域への活性化リガンド二量体NME1(SEQ ID NOS: 3と4)及びNME7(SEQ IDNOS: 5と6)の結合を阻害することが示された。特異的に、それらがリガンド誘導リセプター二量化を阻害する場合、PSMGFR配列に結合する抗MUCl*抗体は、MUCl*陽性癌細胞の成長を阻害する。抗MUCl*抗体のFabsは、動物で、腫瘍増殖を阻害することが実証された。したがって、MUCl*の細胞外領域へ結合する抗体若しくは抗体断片は、癌組織がMUCl*を発現する癌の治療には有益である。
【０２７０】
MUC1*のPSMGFR領域へ結合するか、合成PSMGFRペプチドに結合する抗体は好適である。本願発明者等は、MUCl*の細胞外領域へ結合するいくつかのモノクローナル抗体を同定した。このグループの中には、マウスモノクローナル抗体MN-E6、MN-C2、MN-C3及びMN-C8がある。それらの可変領域は配列が決定された；MN-E6 のためにSEQ ID NOS: 12-13及び65-66、MN-C2 のためにSEQ ID NOS: 118-119及び168-169、Mn-C3のために SEQ ID NOS:413-414及び458-459、そしてMn-C8のために SEQ ID NOS:505-506及び543-554。
これらの抗体のCDRは、抗体の認識ユニットを構築し、ヒト抗体へ接合する場合、保持されるべきマウス抗体の最も重要な部分である。各マウスモノクローナルCDRの配列は以下のとおりである、軽鎖が後続する重鎖配列:
MN-E6 CDR1 (SEQ ID NO: 16-17及び69-70) CDR2(SEQ ID NO: 20-21及び73-74) CDR3(SEQ ID NO: 24-25及び77-78)、MN-C2 CDR1(SEQ ID NO: 122- 123及び172-173) CDR2(SEQ ID NO: 126-127と176-177)CDR3(SEQ ID NO: 130-131と180-181)、MN-C3 CDR1(SEQ IDNO: 417-418と462-463)CDR2(SEQID NO: 421-422と466-467)CDR3(SEQID NO: 425-426と470-471)、MN-C8 CDR1(SEQ ID NO: 507-508と545-546)CDR2(SEQ ID NO: 509-510と547-548)CDR3(SEQ ID NO: 511-512と549-550)。ある場合には、モデリングによって、CDRの3-次元の構造にとって重要であると思われる、フレームワーク領域の部分も、マウス配列から導入される。
【０２７１】
モノクローナル抗体MN-E6及びMN-C2は、癌細胞に現われる、MUCl*へのより大きな親和性がある。モノクローナル抗体MN-C3及びMN-C8は、幹細胞に現われる、MUCl*へのより大きな親和性がある。配列アラインメントによって、次のヒト化抗体が、マウスCDRの置換が標的を認識する能力を保持した抗体をもたらすマウス抗体に十分相同あるので選ばれた。マウスMN-E6重鎖可変領域は、ヒトIGHV3-21*03重鎖可変領域(SEQ ID NO: 26-27)に相同、また、軽鎖可変領域は、ヒトIGKV3-11*02軽鎖可変領域(SEQ ID NO:79-80)に相同である。マウスMN-C2重鎖可変領域は、ヒトIGHV3-21*04重鎖可変領域(SEQ ID NO:132-133)に相同、また、軽鎖可変領域は、ヒトIGKV7-3*01軽鎖可変領域(SEQ ID NO:182-183)に相同である。マウスMN-C3重鎖可変領域は、ヒトIGHV1-18*04重鎖可変領域(SEQ ID NO: 427-428)に相同、また、軽鎖可変領域は、ヒトIGKV2-29*03軽鎖可変領域(SEQ ID NO: 472-473)に相同である。マウスMN-C8重鎖可変領域は、ヒトIGHV3-21*04重鎖可変領域(SEQ ID NO:513-514)に相同、また、軽鎖可変領域は、ヒトZ00023軽鎖可変領域(SEQ ID NO:551-552)に相同である。
【０２７２】
4つの抗体はすべてヒト化された。そのプロセスは、各抗体のいくつかのヒト化型もたらした。マウス抗体の可変領域に由来したCDRは、相同なヒト抗体可変領域配列へ生化学的に接合された。MN-E6(SEQ ID NOS: 38-39と93-94)、MN-C2(SEQ ID NOS:144-145と194-195)、MN-C3(SEQ ID NOS: 439-440と486-487)及びMN-C8(SEQ ID NOS: 525-526と543-544)のヒト化可変領域は、相同なヒト抗体の可変領域へマウスCDRを接合することにより生成された。ヒト化重鎖可変構築物は、その後、ヒトIgGl重鎖定常領域(SEQ ID NOS:58-59)若しくはヒトIgG2重鎖定常領域(SEQ ID NO: 54-55)のいずれかの定常領域へ接合され、その後、それは、ヒトカッパ鎖(SEQ ID NO:109-110)に接合されたヒト化軽鎖可変構築物、又はヒトラムダ鎖(SEQ ID NO: 113-114)定常領域と、ペアに調製された。他のIgGアイソタイプは、IgG3またはIgG4を含む定常領域として使用されうる。
【０２７３】
IgG2重鎖(SEQ ID NOS: 52-53)へ及びIgGl重鎖(SEQ ID NOS:56-57)へのヒト化MN-E6可変領域、ラムダ軽鎖(SEQ ID NO: 111-112と216-219)若しくはカッパ鎖(SEQ ID NO: 107-108と210-213)のいずれかとペアになった、IgGl重鎖(SEQ ID NOS: 158-159)へ若しくはIgG2重鎖(SEQ ID NOS: 163-164)へのヒト化MN-C2可変領域、そして、ヒト化MN-C3(SEQID NOS: 455-456、453-454及び500-501、502-503)及びMN-C8(SEQ ID NOS:541-542、539-540及び579-580、581-582)抗体が、生成された。各アイソタイプは、それ自身の特徴的活性があるので、どのIgG定常領域がヒト化可変領域へ融合されるかは、所望の効果に依存する。ヒト定常領域のアイソタイプは、抗体依存性細胞傷害(ADCC)若しくは補体依存性細胞毒性(CDC)が望まれるか、さらに細胞に基-zetaンパク質発現システムで生成される抗体の産出量にも依存するような物事を基礎に選択される。好ましい態様では、ヒト化抗MUCl*抗体若しくは抗体断片は、MUCl陽性癌になるリスクをもつ若しくはそのように診断された人に投与れる。
【０２７４】
MUCl陽性癌になるリスクをもつ若しくはそのように診断された人に最も有用なヒト化抗MUCl*抗体をテストし及び選択する1つの方法は、MUCl*細胞外領域への活性化リガンドの結合を阻害するそれらの能力に関して、それらをテストすることである。二量体NME1は、MUCl*細胞外領域に結合し二量化させることができ、そして、そうすることで、癌細胞増直を刺激する。したがって、MUCl*細胞外領域への結合を、NME1と競合する抗体及び抗体断片は、抗癌剤である。NME7は、MUCl*の別の活性化リガンドである。ある場合には、MUCl*細胞外領域への、NME7、若しくはNME7欠失、開裂産物の結合を阻止する抗体を同定することは望ましい。MUCl*細胞外領域への結合について、NME7及びNME7変異体と競合する抗体及び抗体断片は、癌治療薬として有効である。これらの抗体は、これら抗体のscFvのような単鎖型及びそのヒト化型と同様に、MN-E6、MN-C2、MN-C3、MN-C8を含み、制限されない。他のNMEタンパク質は、また、NME6とNME8を含むMUC1若しくはMUCl*に結合する。MUCl*への結合についてこれらのタンパク質と競合する抗体は、さらに治療薬として有用でありうる。好ましい態様では、ヒト化抗MUCl*抗体若しくは抗体断片は、MUCl陽性癌になるリスクをもつ若しくはそのように診断された人に投与される。もっと好ましい態様では、MN-E6及びMN-C2のヒト化配列に由来した、単一鎖抗体断片、モノマーのscFv-Fc融合体は、MUCl陽性癌になるリスクをもつ若しくはそのように診断された人に投与される。
【０２７５】
さらに、一価抗体若しくは抗体様タンパク質になる単一鎖可変断片、scFv若しくは他の型は有用である。ある場合には、それがMUCl*細胞外領域の二量化を防ぐことが所望される。単一鎖可変断片、Fabs及び他の一価抗体様タンパク質は、MUCl*細胞外領域へ結合及びMUCl*二量化の阻止に有効なことを示された。このような単一鎖可変断片、Fabs及び他の一価抗体様分子は、ヒトMUCl陽性癌細胞を異種移植された動物で、及び生体外で癌増殖を阻止した。したがって、ヒト化単一鎖可変断片若しくは一価抗MUCl*抗体若しくは抗体様分子は、抗癌治療で非常に有効である。MUCl*細胞外領域に結合するか若しくはPSMGFRペプチドに結合する、このようなヒト化単一鎖抗体、Fabs及び他の一価抗体様分子は、癌治療薬として有用である。抗MUCl*単一鎖可変断片は、同族の可変領域ヒト化抗体のフレームワークへ、抗体（それらはMUCl*の細胞外領域へ結合するか、PSMGFRペプチドに結合する）の非ヒトCDR接合して、生成される。得られた、ヒト化重鎖及び軽鎖可変領域は、その後、適切なリンカーを経て互いに接続され、ここで、リンカーは、軽鎖に重鎖を結合させるが別の軽鎖と結合するのを1分子の重鎖で阻止する、柔軟性と長さを持つ必要がある。例えば、約10-15残基のリンカーが例示される。好適には、リンカーは、(Glycine)4 (Serin)1]3(SEQ ID NOS: 401-402)を持つが、特に制限されず、他の配列も可能である。
【０２７６】
1つの態様では、MN-E6(SEQ ID NOS: 38-39と93-94)、MN-C2(SEQ ID NOS:144-145と194-195)、MN-C3(SEQ ID NOS: 439-440と486-487)及びMN-C8(SEQ ID NOS: 525-526と565-566)のヒト化可変領域は、リンカーを経て重鎖及び軽鎖に接続する構築物に生化学的に接合される。MN-E6、MN-C2、MN-C3及びMN-C8の可変領域からのヒト化配列を含む、ヒト化単一鎖抗MUCl*抗体の例が、生成された。
いくつかのヒト化MN-E6単一鎖タンパク質が生成された(SEQ ID NOS: 232-237)。
いくつかのヒト化MN-C2単一鎖タンパク質が生成された(SEQ ID NOS: 238-243)。
いくつかのヒト化MN-C3単一鎖タンパク質が生成された(SEQ ID NOS: 244-249)。
いくつかのヒト化MN-C8単一鎖タンパク質が生成された(SEQ ID NOS: 250-255)。
好ましい態様で、可変断片、scFv抗体断片MN-E6 scFv、MN-C2 scFv、MN-C3 scFv若しくはMN-C8 scFv、を含む、ヒト化抗MUCl*抗体断片は、MUCl陽性癌になる危険がある、若しくはもつと診断された人に投与される。もっと好ましい態様では、MN-E6及びMN-C2のヒト化配列に由来した可変断片のような単一鎖抗体断片は、MUCl陽性癌になる危険がある、若しくはもつと診断された人に投与される。
【０２７７】
別の態様では、MN-E6(SEQID NOS: 38-39と93-94)、MN-C2(SEQ ID NOS: 144-145と194-195)、MN-C3(SEQ ID NOS: 439-440と486-487)及びMN-C8(SEQ ID NOS:525-526と565-566)のヒト化可変領域は、抗体のFc部分をさらに含んでいる、単一鎖可変断片(scFv)へ生化学的に接合される。抗体のFc領域へ接合されたMN-E6、MN-C2、MN-C3及びMN-C8のヒト化単一連鎖可変断片の例が生成された(SEQ ID NOS: 256-257、260-261、264-265及び268-269)。Fc領域の包含はいくつかの目的に役立ちます。それは、抗体断片の分子量を増加させ、それは分解を遅くし、半減期を増加させる。Fc領域は、さらに腫瘍部位への免疫系補体を補充する。さらに、第2抗体がFc部分を検知しラベルを付けると、抗体Fc領域の添加は、scFvを便利な診断のツールにする。しかしながら、Fc部分は、ホモ二量化する。したがって、scFv-Fcは、二価で、MUCl*成長因子リセプターを二量化させ、活性化することができた。MUCl*二量化を引き起こす欠点なしで、抗MUCl* scFvにFcを接合する利点を得るために、Fc領域は、Fcホモ二量化を最小化する若しくは除去するように変異させられた。モノマーのscFv-Fc融合タンパク質を作成するために、次の変異がCH3領域でなさられた:Y407R(SEQ ID NOS: 278と279)、F405Q(SEQ ID NOS: 280と281)、T394D(SEQ ID NOS:282と283)、T366W/L368W(SEQ ID NOD: 284と285)、T364R/L368R(SEQ ID NOS: 286と285)。それらの変化のどんなコンビネーションもテストすることができ、Fc(SEQ ID NOS: 272-273)、CH2-CH3(SEQ ID NOS: 274-275)若しくはCH3(SEQ ID NOS: 276-277)融合タンパク質へ、若しくはヒンジがないFc融合タンパク質(SEQ ID NOS:288-289)に導入することができた。
【０２７８】
発明の1つの態様は、MUCl若しくはMUCl*陽性癌と診断された、MUCl若しくはMUCl*陽性癌になるリスクを診断された、若しくはMUCl若しくはMUCl*陽性癌を持っていることが疑われる患者を処置する方法に関し、有効な量のモノマーのMN-E6scFv、MN-C2 scFv、MN-C3 scFv、MN-C8 scFv、若しくはMN-E6scFv-Fc及びMN-C2 scFv-Fc及びMN-C3 scFv-Fc及びMN-C8 scFv-Fcが投与され、そこでは、抗体可変断片部分は、ヒト若しくはヒト化され、そして、抗体様タンパク質のFc部分は二量体形成に抵抗するように変異されている。
【０２７９】
CAR T及び癌免疫療法技術
【０２８０】
発明の別の態様では、抗MUCl*抗体断片の単一鎖部分のうちのいくつか若しくはすべては、いくつかの異なるキメラ的な抗原リセプターを使用し、免疫系分子に生化学的に接合される、「CAR」戦略。このアイデアは、膜貫通領域、及び免疫系を活性化するシグナルを送信されうる細胞質尾部をもつ、免疫系分子に、典型的には、単一鎖可変断片として抗体の認識部分を接合させることである。認識ユニットは、抗体断片、単一鎖可変断片、scFv若しくはペプチドでありえる。1つの態様では、CARの細胞外領域の認識部分は、MN-E6(SEQ ID NOS: 38-39と93-94)、MN-C2(SEQ ID NOS:144-145と194-195)、MN-C3(SEQ ID NOS: 439-440と486-487)及びMN-C8(SEQ ID NOS: 525-526と565-566)のヒト化可変領域からなる配列で構成される。別の態様では、それは単一鎖可変断片からの配列で構成される。単一鎖構築物の例は以下である。いくつかのヒト化MN-E6単一鎖タンパク質、scFv、が生成された(SEQ ID NOS:232-237)。いくつかのヒト化MN-C2単一鎖タンパク質、scFv、が生成された(SEQ ID NOS: 238-243)。いくつかのヒト化MN-C3単一鎖タンパク質、scFv、が生成された(SEQ ID NOS: 244-249)。いくつかのヒト化MN-C8単一鎖タンパク質、scFv、が生成された(SEQ ID NOS: 250-255)。CARの膜貫通領域は、CD28、4-IBB若しくは他のもののような近位細胞質の共刺激的な領域の膜貫通領域を含むCD8、CD4、抗体領域若しくは他の膜貫通領域に由来しうるCARの細胞質尾部は、免疫系活性化をシグナルする1つ以上のモチーフで構成されうる。細胞質のシグナルするモチーフのこのグループ、時々、共刺激的な細胞質領域を参照される、は、CD3-zeta、CD27、CD28、4-IBB、OX40、CD30、CD40、ICAm-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD5、CD7及びFc受容体ガンマ領域を含むが、これに制限されない。そのとき、最小のCARには、CD3-zeta若しくはFc受容体ガンマ領域を持ち得、細胞質尾部の縦列の上記の領域のうちの1つ若しくは2をもつ。1つの態様では、細胞質尾部は、CD3-zeta、CD28、4-IBB及び/又はOX40を含みえる。
【０２８１】
表1は、私たちが生成しテストした抗MUCl* CARの多くをリストする。
MN-E6 CARのいくつかの例が生成された:CAR MN-E6 CD3z(SEQ ID NOS: 294-295);CAR MN-E6 CD28/CD3z(SEQ ID NOS:297-298);CAR MN-E6 4-lBB/CD3z(SEQ ID NOS: 300-301);CAR MN-E6 OX40/CD3z(SEQ ID NOS:616-617);CAR MN-E6 CD28/OX40/CD3z(SEQ ID NOS: 618-619);CAR MN-E6CD28/4-lBB/CD3z(SEQ ID NOS: 303-304)。
ヒト化MN-C2 CARのいくつかの例が生成された:CAR MN-C2 CD3z(SEQ ID NOS: 606-607);CAR MN-C2 CD28/CD3z(SEQ ID NOS:608-609);CAR MN-C2 4-lBB/CD3z(SEQ ID NOS: 610-611);CAR MN-C2 OX40/CD3z(SEQ ID NOS:612-613);CAR MN-C2 CD28/4-lBB/CD3z(SEQ ID NOS: 306-307);CAR MN-C2CD28/OX40/CD3z(SEQ ID NOS: 614-615)。
ヒト化MN-C3 CARが生成された:CAR MN-C34-lBB/CD3z(SEQ ID NOS: 600-601)。
【０２８２】
異なるヒンジ領域(SEQ IDNOS: 345-360)をもつヒト化MN-E6 CARのいくつかの例が生成された:CAR MN-E6-Fc/8/4-IBB/CD3z(SEQ ID NOS: 310-311);CAR MN-E6 FcH/8/4-IBB/CD3z(SEQID NOS: 315-316);CAR MN-E6 Fc/4/4-IBB/CD3z(SEQ ID NOS: 318-319);CAR MN-E6FcH/4/4-IBB/CD3z(SEQ ID NOS: 321-322);;CAR MN-E6 IgD/8/4-IBB/CD3z(SEQ ID NOS:323-324);CAR MN-E6 IgD/44-IBB/CD3z(SEQ ID NOS: 327-328);CAR MN-E6 X4/84-IBB/CD3z(SEQID NOS: 330-331);CAR MN-E6 X4/44-IBB/CD3z(SEQ ID NOS: 333-334);CAR MN-E6 8+4/4/4lBB/CD3z(SEQ ID NOS: 336-337)。さらに、いくつかのヒト化MN-C3単一鎖可変断片及びヒト化MN-C8単一鎖可変断片も生成された。
【０２８３】
CARの標的ヘッドが、抗MUCl*抗体MN-C2に由来したいくつかのCARも生成されテストした。CAR MN-C2-Fc4-IBB/CD3z(SEQID NOS: 732-733);CAR MN-C2 IgD/Fc/4-lBB/CD3z(SEQ ID NOS: 734-735);CAR MN-C2FcH/4-IBB/CD3z(SEQ ID NOS: 736-737);CAR MN-C2 IgD/FcH/4-lBB/CD3z(SEQ ID NOS:738-739);CAR MN-C2 IgD/4-IBB/CD3z(SEQ ID NOS: 740-741);CAR MN-C2 X44-IBB/CD3z(SEQID NOS: 742-743)。
【０２８４】
MUCl*標的化CARの細胞外領域認識ユニットは、PSMGFRペプチド(SEQ ID NO: 2)の少なくとも12の連続するアミノ酸に結合されうる非ヒト、ヒト、若しくはヒト化抗体の可変領域を含むことができる。1つの態様では、CARのMUC1*標的化部分は、非ヒト、ヒト化か、ヒトMN-E6、MN-C2、MN-C3若しくはMN-C8からの可変領域を含む。1つの態様では、CARの細胞外領域認識ユニットは、ヒト化MN-E6、MN-C2、MN-C3若しくはMN-C8単一鎖可変断片scFvで本質的に構成される。CARの膜貫通領域は、CD8(SEQ ID NOS: 363-364)に由来する場合があり、若しくはCD3-zeta、CD284-IBB、OX40若しくは他の膜貫通領域(SEQ ID NOS: 361-372)の膜貫通領域でありえ、及びMUCl*細胞外領域を標的にする抗体断片を備えたCARの細胞質領域は、免疫系共刺激細胞質領域を含むグループから選ばれた１若しくは２から構成されうる。免疫系共刺激領域のグループは、CD3-zeta、CD27、CD28、4-IBB、OX40、CD30、CD40、ICAm-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD5、CD7及びFc受容体ガンマ領域(SEQ ID NOS: 373-382) を含むが、これに制限されない。若しくは、CARの認識ユニット部分は、ペプチドが標的に結合するペプチドを含むことができる。NME7は、MUCl*に結合し活性化する。発明の1つの態様では、CARの認識ユニットは、NME7(SEQID NOS: 5-6)に由来したペプチド又はNME7ペプチドA１(SEQ ID NO: 7)、NME7ペプチドA2(SEQ ID NO:8)、NME7ペプチドB l(SEQ ID NO: 9)、NME7ペプチドB2(SEQ ID NO: 10)及びNME7ペプチドB3(SEQ ID NO:11)を含むNME7ペプチドに由来するペプチドであるが、これらに限定されない。
【０２８５】
CARを生成するためのいくつかの戦略は、それ自体で二量化する分子の一部を含んでいる。ある場合には、標的の二量化は望ましくない。したがって、CARは、それらがヘテロ二量体化するそのように構築されうる。1つのケースでは、第一のCARの認識ユニットは、最初の標的に結合する。その一方で第2のCARの認識ユニットは別の標的に結合する。両方の認識ユニットは抗体断片でありえ、両方がペプチドでありえ、又は、一つは抗体断片及び他方はペプチドでありえる。CARの第一の標的は、MUCl*細胞外領域でありえる。CARの認識ユニットは、MUCl*細胞外領域に結合する若しくはPSMGFRペプチドにに結合する抗体断片でありえる。又は、CARの認識ユニットは、MUCl*細胞外領域に結合するペプチドで構成されえ、そのようなペプチドは、NME1またはNME7のようなNMEタンパク質に由来したペプチドを含み、より特異的にはSEQ ID NOS: 7-11としてリストされたNME7由来ペプチドである。異種ダイマー性CARの第2の標的は、NME7に結合するペプチドまたは抗体断片でありうる。又は、異種ダイマー性CARの第２の標的は、PDl若しくはその同系統のリガンドPDL-1若しくは標的癌細胞の他の標的リガンドに結合するペプチドまたは抗体の断片でありうる。第2の標的は、NME1若しくはNME7-ABに結合するペプチドまたは抗体の断片でありうる。CARによって引き起こされたMUC1の二量化を防ぐことが望ましいので、異種ダイマー性のCARは、1つの分子の細胞外領域だけが、標的に結合する細胞外認識ユニットを持つように、構築されうる(SEQ ID NOS: 584-587)。他の分子は、標的認識ユニット若しくは抗体断片が欠けている欠失細胞外領域がありえる(SEQ ID NOS: 588-599)。
【０２８６】
記述されたCARsは、免疫系の細胞へ形質転換するか形質導入されうる。好ましい態様では、MUCl*標的化CARは、T細胞へ形質転換されるか形質導入される。1つの態様では、T細胞はCD3+/CD28+T細胞である。別の場合では、それは樹状細胞である。別の場合では、それはB細胞である。別の場合では、それはマスト細胞である。受容細胞は、患者、若しくはドナーからでありえる。ドナーから場合、それは拒絶反応を引き起こす分子を除去するために加工されうる。本願発明のCARで形質転換若しくは形質導入されたセルは、エクソビボ若しくはインビボで拡張され、その後患者に投与される。投与ルートは、骨髄移植、静脈注射、原位置注入若しくは移植のグループから選ばれるこれに制限されていない。好ましい態様では、MUCl*標的化CARは、MUC1陽性癌と診断された若しくは危険が診断された人に投与される。
【０２８７】
MUCl*陽性癌の治療若しくは予防用のT細胞若しくは他の免疫細胞へ形質導入されうる多くの可能な抗MUCl* CAR構築物がある。CARはモジュールから構成され、また、モジュールのうちのいくつかのアイデンテティは比較的重要でない。他方、他のモジュールのアイデンテティは、厳格に重要である。
【０２８８】
私たちの実験は、それが腫瘍部位へCARを運ぶ免疫細胞を標的にするので、CARの最も外側の部分の抗体認識断片が厳格に重要であることを実証した。さらに、細胞内シグナル伝達モチーフは、非常に重要であるが互換性がある。図28は、CARのコンポーネント及びCARに含まれうる様々な配列の模型を示す。図28参照。
【０２８９】
図28の式において、Rlは、次のとおりである:
無;又は、
【０２９０】
リガンド若しくは癌関連抗原のリガンドの断片;又は
【０２９１】
リガンド又はMUC1若しくはMUC1*のリガンドの断片;又は
【０２９２】
抗体または抗体の断片が、MUC1若しくはMUCl*に結合する、抗体または抗体の断片；又は、抗体か抗体断片が、PSMGFR*に結合する、そして該抗体がヒト若しくはヒト化である、抗体または抗体の断片; 又は、MN-E6、MN-C2、MN-C3若しくはMN-C8、又はヒト化MN-E6、MN-C2、MN-C3若しくはMN-C8の抗体若しくは抗体の断片; 又は、開裂MUC1若しくはMUCl*に結合する抗体(scFv)の単一鎖可変断片; 又は、ヒト化でありうるMN-E6、MN-C2、MN-C3若しくはMN-C8のscFv; 又は、MUCl*若しくはPSMGFRペプチドに結合するペプチド; 又は、MUCl*のPSMGFR部分を結合する抗体断片、scFv若しくはペプチド;又は、MN-E6(SEQ ID NOS: 38-39と93-94)、MN-C2(SEQ ID NOS: 144-145と194-195)、MN-C3(SEQ ID NOS:439-440と486-487)及びMN-C8(SEQ ID NOS: 525-526と565-566)のヒト化可変領域からの配列で構成される。
1つの態様中で、Rlは、scFvであって、それは、次の配列を含むMUCl*のPSMGFR部分を結合する；ヒト化MN-E6 scFv(SEQ ID NOS: 232-237)、ヒト化MN-C2 scFv(SEQ ID NOS: 238-243)、ヒト化MN-C3 scFv(SEQ ID NOS: 244-249)若しくはヒト化MN-C8 scFv(SEQ ID NOS: 250-255)。
別の態様では、Rlは、ヒト化MN-E6 scFv(SEQ ID NOS: 232-237)若しくはヒト化MN-C2 scFv(SEQ ID NOS: 238-243)からの配列で構成されたMUCl*のPSMGFR部分を結合するscFvである。
1例において、Rlは、ヒト化MN-E6scFv(SEQ ID NOS: 232-237)からの配列で構成されたMUC1*のPSMGFR部分を結合するscFvである。
【０２９３】
図28の式において、R2は、CARの膜貫通領域に認識部分を接続する、ポリペプチドのフレキシブルリンカーである。1つの態様では、R2は5から250のアミノ酸の異なる長さのポリペプチドリンカーになりえる。別の態様では、R2はヒト起源のポリペプチドリンカーである。1つの態様では、R2は、ヒト免疫グロブリン(IgG、IgA、IgE、IgM若しくはIgD)のヒンジ領域若しくはヒンジ領域の修飾物である。1つの態様では、R2は、T細胞レセプター(CD8a、CD28若しくはCD4)のヒンジ領域若しくはヒンジ領域の修飾物になりえる。1例において、R2は、CD8aのヒンジ領域、ヒトIgDのヒンジ領域若しくはヒトIgGlのFc領域である。
【０２９４】
図28の式において、R3は、膜貫通領域である。1つの態様では、R3は、膜貫通領域若しくは任意の膜貫通ヒトタンパク質の膜貫通領域の修飾物でありうる。別の態様では、R3は、膜貫通領域若しくはヒト細胞リセプターからの膜貫通領域の修飾物でありうる。1つの態様では、R3は、膜貫通領域若しくはT細胞レセプター(CD8a、CD4、CD28、CD3z、OX40若しくは4-IBB)の膜貫通領域の修飾物でありうる。別の態様では、R3は、CARの最初の細胞質の共刺激領域からの膜貫通領域である。1つの態様では、R3は、膜貫通領域又は膜貫通領域へ関連した細胞質領域の1、2、3、4若しくは5アミノ酸で拡張されたT細胞レセプターの膜貫通領域の修飾物でありうる。別の態様では、R3は、膜貫通領域又はジスルフイド結合のためのシステインが後続する膜貫通領域へ関連した細胞質領域の1、2、3、4若しくは5アミノ酸で拡張されたT細胞レセプターの膜貫通領域の修飾物でありうる。1例において、R3は、CD8aまたはCD4の膜貫通領域である。
【０２９５】
図28の式において、R4は、T細胞レセプターからのシグナリング領域である。1つの態様では、R4は、CD3-zeta、CD27、CD28、4-IBB、OX40、CD30、CD40、ICAm-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD5、CD7及びFc受容体ガンマ領域の細胞質のシグナリング領域になりえる。1例において、R4は、CD3-zetaの細胞質領域である。単一のシグナリング領域(CAR I)を備えたヒト化CARのいくつかの例が再生成された: CAR MN-E6 CD3z(SEQ ID NOS: 294-295);CAR MN-C2 CD3z(SEQ ID NOS:606-607)
【０２９６】
図28の式において、R5は、T細胞レセプターからの共刺激領域である。
1つの態様では、R5は、CD27、CD28、4-IBB、OX40、CD30、CD40、ICAm-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD5、CD7及びFc受容体ガンマ領域の細胞質のシグナリング領域になりえる。
R5は、R4及びR6とは異なっている。1例で、R5はCD28、4-IBB若しくはOX40の細胞質領域である。
2つのシグナリング領域(CAR II)を備えたヒト化CARのいくつかの例が再生成された:
CAR MN-E6 CD28/CD3z(SEQ ID NOS: 297-298);CARMN-E6 4-lBB/CD3z(SEQ ID NOS: 300-301);CAR MN-E6 OX40/CD3z(SEQ ID NOS: 616-617);CARMN-C2 CD28/CD3z(SEQ ID NOS: 608-609);CAR MN-C2 4-lBB/CD3z(SEQ ID NOS: 610-611);CARMN-C2 OX40/CD3z(SEQ ID NOS: 612-613);MN-C3 4-IBB/CD3z(SEQ ID NOS: 600-601);CAR MN-E6-Fc/8/4-IBB/CD3z(SEQID NOS: 310-311);CAR MN-E6 FcH/8/4-IBB/CD3z(SEQ ID NOS: 315-316);CAR MN-E6Fc/4/4-IBB/CD3z(SEQ ID NOS: 318-319);CAR MN-E6 FcH/4/4-IBB/CD3z(SEQ ID NOS:321-322);;CARMN-E6 IgD/8/4-IBB/CD3z(SEQ ID NOS: 323-324);CAR MN-E6 IgD/4/4-IBB/CD3z(SEQID NOS: 327-328);CAR MN-E6 X4/8/4-IBB/CD3z(SEQ ID NOS: 330-331);CAR MN-E6 X4/4/4-IBB/CD3z(SEQID NOS: 333-334);CAR MN-E6 8+4/4/4 IBB/CD3z(SEQ ID NOS: 336-337)。
【０２９７】
図28の式において、R6は、T細胞レセプターからの共刺激領域である。1つの態様では、R6は、CD27、CD28、4-IBB、OX40、CD30、CD40、ICAm-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD5、CD7及びFc受容体ガンマ領域の細胞質のシグナリング領域でありえる。R6は、R4及びR5とは異なっている。
1例において、R5は、CD28の細胞質領域である。2つのシグナリング領域(CAR III)を備えたヒト化CARのいくつかの例が再生成された:
CAR MN-E6 CD28/OX40/CD3z(SEQ ID NOS:618-619);CAR MN-E6 CD28/4-lBB/CD3z(SEQ ID NOS: 303-304);CAR MN-C2CD28/4-lBB/CD3z(SEQ ID NOS: 306-307);CAR MN-C2 CD28/OX40/CD3z(SEQ ID NOS:614-615)
【０２９８】
私たち及び他は、CD3-zeta(SEQ ID NOS: 373-376、CD28(SEQ ID NOS: 377-378)及び4-IBB(SEQ ID NOS: 379-380)のような、細胞内シグナル伝達モジュールが、単独若しくは組み合わせで、免疫細胞拡張、サイトカイン分泌及び免疫細胞仲介標的腫瘍細胞殺滅を刺激することを示した（(Pμle MA, Straathof KC, Dotti G,Heslop HE, Rooney CM and Brenner MK (2005) A chimeric T cell antigen receptorthat augments cytokine release and supports clonal expansion of primary human Tcells. Mol Ther. 12(5):933-941; Hombach AA, Heiders J, Foppe M, Chmielewski Mand Abken H. (2012) OX40 costimμlation by a chimeric antigen receptor abrogatesCD28 and IL-2 induced IL-10 secretion by redirected CD4(+) T cells.Oncoimmunology. 1(4):458-466; Kowolik CM, Topp MS, Gonzalez S, Pfeiffer T,Olivares S, Gonzalez N, Smith DD, Forman SJ, Jensen MC and Cooper LJ. (2006)CD28 costimμlation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptorenhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred Tcells. Cancer Res. 66(22): 10995- 11004; Loskog A, Giandomenico V, Rossig C, PμleM, Dotti G and Brenner MK. (2006) Addition of the CD28 signaling domain tochimeric T-cell receptors enhances chimeric T-cell resistance to T regμlatorycells. Leukemia. 20(10): 1819- 1828; Milone MC, Fish JD, Carpenito C, CarrollRG, Binder GK, Teachey D, Samanta M, Lakhal M, Gloss B, Danet-Desnoyers G,Campana D, Riley JL, Grupp SA and June CH. (2009) Chimeric receptors containingCD 137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells andincreased antileukemic efficacy in vivo. Mol Ther. 17(8): 1453-1464; Song DG,Ye Q, Carpenito C, Poussin M, Wang LP, Ji C, Figini M, June CH, Coukos G,Powell DJ Jr. (2011) In vivo persistence, tumor localization, and antitumoractivity of CAR-engineered T cells is enhanced by costimμlatory signalingthrough CD137 (4-lBB). Cancer Res. 71(13):4617-4627).）それほど重要でないのは、抗体断片、膜貫通領域、及び細胞内シグナル伝達モチーフの前に来る短い細胞質尾部を提示する短い細胞外ピースの同一性である。
【０２９９】
腫瘍へのCARを標的とする認識抗体断片の同一性は、厳格に重要である。MUCl陽性若しくはMUCl*陽性癌の治療のために、その抗体認識断片は、縦列反復領域を含む、細胞外領域の大部分の開裂及び解放後に残るMUCl部分の細胞外領域へ結合するに違いない。本発明の1つの態様では、残る部分は、PSMGFR配列を含みむ。発明の別の態様では、開裂及び開放後に残るMUClの部分は、より多くのアミノ酸がN-端末で拡張した9までプラスのPSMGFR配列を含んでいる。発明の別の態様では、開裂及び開放後に残るMUClの部分は、より多くのアミノ酸がN-端末で拡張した21までプラスのPSMGFR配列を含んでいる。1つの態様では、抗体認識断片は、PSMGFRペプチドの少なくとも12の連続するアミノ酸に結合する。
発明の別の態様では、抗体認識断片は、配列
SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY(SEQID NO: 620);
若しくは、
SVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY(SEQ IDNO: 621) を含むペプチドに結合する。
【０３００】
デモンストレーションとして、MN-E6若しくはMN-C2と呼ばれるモノクローナル抗MUCl*抗体の可変領域を含む単一鎖抗体断片が、CARのパネルに、加工された(表1)。その後、MUCl*標的化CARは、免疫細胞へ、別々に若しくはコンビネーションで形質導入された。MUCl*ペプチドを提示する表面でチャレンジされたとき、MUCl*で形質転換された抗原提示細胞若しくはMUCl*陽性癌細胞、MUCl*標的化CARで形質導入された免疫細胞は、免疫細胞の拡張、標的細胞の殺滅、サイトカイン・リリースを含む免疫反応を誘発した(表2)。
【０３０１】
1つのケースでは、ヒトJurkhat細胞は、MUCl*標的化CARで形質導入され、そして、PSMGFRペプチドを提示する表面、MUCl*若しくはMUCl*陽性癌細胞で形質転換されたK562抗原提示細胞、に露出され、Jurkhat細胞はIL-2を分泌した。別の場合では、精製ヒトT細胞は、MUCl*標的化CARsで形質導入され、そして、PSMGFRペプチドを提示する表面、MUCl*若しくはMUCl*陽性癌細胞で形質転換されたK562抗原提示細胞、に露出され、T細胞はIL-2、インターフェロンγを分泌し、T細胞が拡大した一方、ターゲットとされた抗原提示細胞及び癌細胞を殺滅した。実証されるように、抗体断片を含むCAR、そこで抗体断片は共刺激領域を担持する細胞質尾部、PSMGFRペプチド、膜貫通領域に結合される、は、CARが免疫細胞へ形質導入され、それはT細胞を含んでいるとき、免疫系、抗腫瘍細胞反応を誘発する。したがって、PSMGFRペプチドに結合されうる、他の抗体、抗体断片若しくは抗体模倣は、同様に履行し、癌を処置するか若しくは予防するために使用されうる。当業者は、CARで細胞を形質転換若しくは形質導入する利用可能な多くの技術があること、そして、本発明は、免疫細胞に、MUCl*標的化CARを発現させるために使用された方法によって制限されないことを理解可能である。
【０３０２】
例えば、ここに記述された、CARをコードする遺伝子及び活性化T細胞誘導遺伝子は、ウイルスを使用して、免疫細胞へウイルス形質導入されうる。それは、受容細胞のゲノムへ統合されたCAR遺伝子に帰着するかもしれないし、帰着しないかもしれない。ガンマ・レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連性ウイルス、バキュロウイルス、ポックスウイルス、単純性疱疹ウイルス、オンコリテイックウイルス、HF10、T-Vecなどを含むレトロウイルスを含む、これらに限定されない、ウイルス運搬システム及びウイルスベクターは使用されうる。ウイルス形質導入に加えて、ここに記述されたCAR及び活性化T細胞誘導遺伝子は、CRISPR技術、CRISPR-Cas9及びCPF1、TALEN、スリーピングビュウティートランスポゾン・システム及びSB 100X、のような方法を使い、受容細胞のゲノムへ直接結合されうる。
【０３０３】
同様に、細胞外領域、膜貫通領域及び細胞質領域の膜近位部分のようなCARのターゲットとしない部分を構築する分子の同一性は、MUCl*標的化CARの機能に本質的でない。例えば、細胞外領域、膜貫通領域及び細胞質領域の膜近位部分は、CD8、CD4、CD28又はFc、CH2CH3若しくはCH3のようなジェネリックな抗体領域、の部分から構成されうる。さらに、CARのターゲットとしない部分は、これらの分子若しくは他のファミリーメンバーの1つ以上の部分のコンポサイトになりえる。
【０３０４】
本発明の1つの態様は、MUCl若しくはMUCl*陽性癌と診断された、MUCl若しくはMUCl*陽性癌になるリスクを診断された、若しくはMUCl若しくはMUCl*陽性癌を持っていることが疑われる患者を処置する方法であり、そこでは患者はMUCl*標的化CARで形質導入された有効な量の免疫細胞を投与される。本発明の別の態様では、免疫細胞は、患者から単離され、その後、それはCARの標的ヘッドがMUCl*に結合するCARで形質導入され、そして、形質導入されたT細胞の拡張の後、CAR T細胞は患者へ有効量が投与される。まだ本発明の別の態様では、免疫細胞は、患者から単離され、その後、それはCARの標的ヘッドがhuMN-E6、huMN-C2、huMN-C3若しくはhuMN-C8の部分を含むCARで形質導入され、そして、形質導入されたT細胞の拡張の後、CAR T細胞は患者へ有効量が投与される。まだ本発明の別の態様では、免疫細胞へ形質導入され、MUCl若しくはMUCl*陽性癌と診断された患者に投与されるCARは、表1若しくは表2のCARのリストから選ばれ。
【０３０５】
CARのスペシフィックを作りテストした。
【０３０６】
CARの遠位端での標的抗体断片が、MN-E6、MN-C2、MN-C3若しくはMN-C8である、多くのMUCl*標的化CARが生成された。各CARのDNAは、クローニングが正確に行われたことを保証するためにシークエンス化された。その後、構築物は、発現プラスミドへ混ぜられ、細胞へ形質転換され、次に、構築物が成功裡に挿入されたことをウェスタンブロットで確認した。表面の発現は、FACSによって確認された。その後、MUCl*標的化CARは、免疫細胞へウイルスで形質導入された。1つの態様では、それらはJurkat細胞へ形質導入された。別の態様では、それらは、血液が精製された一次ヒトT細胞へ形質導入された。一連の機能分析が行なわれ、CARが機能を保持していることを確認した。機能分析は次のことを示した、MUCl*標的化CARで形質導入されたJurkat細胞及び一次T細胞は、MUCl*提示細胞または表面でチャンレンジされた時、サイトカインIL-2及びインターフェロンγ(IFN-g)を分泌した。表1は、作られテストされたCARをリストする。表2は、CARのうちのいくつかについて、ヒトT細胞へ形質導入されそして様々な癌細胞と共培養後における、サイトカイン・リリース・データをリストする。図29は、MN-E6 CD8/CD3z、MN-E6 CD8/CD28/CD3z、MN-E6 CD8/4-IBB/CD3z、MN-E6 CD4/CD28/CD3z及びMN-E6 CD4/CD28/4-IBB/CD3zを含むCARのパネルで形質導入されたJurkat細胞による、IL-2サイトカイン分泌を測定する実験のグラフである。CAR Jurkat細胞は、MUCl*で形質転換されたK562細胞若しくはK562-wt細胞に露出された時だけ、IL-2が分泌された。親K562-wt細胞は、MUCl*のまさに低レベルを発現することは注目されるべきである。Jurkat細胞へ形質転換されたCARの別のグループは、サイトカイン分泌に関して同様にテストされた。図30は、CAR T細胞が、MUCl*で形質転換されたK562細胞若しくはK562-wt細胞に露出された時、MN-E6 CD8/CD28/CD3z、MN-E6 CD8/4-IBB/CD3z、MN-E6 CD4/CD28/CD3z若しくはMN-E6 CD4/4-IBB/CD3zで形質導入されたJurkat T細胞によってIL-2分泌することを示す。同様に、図31は、MN-E6 CD8/CD28/CD3z、MN-E6 CD8/4-IBB/CD3z若しくはMN-E6 CD4/4-IBB/CD3zで形質導入された一次ヒトT細胞によるIL-2サイトカイン分泌を示す。MUC1*標的CAR T細胞が、MUCl*で形質転換されたK562細胞若しくはK562-wt細胞に露出された時のみ、サイトカイン分泌が生じた。標的細胞を見る場合、活性化T細胞によって分泌される別のサイトカインは、インターフェロンγ(IFNg)である。図32は、CAR T細胞が、MUCl*で形質転換されたK562細胞若しくはK562-wt細胞に露出された時、MN-E6 CD8/CD28/CD3z及びMN-E6 CD4/4-IBB/CD3zを含むCARのパネルで形質導入された一次ヒトT細胞によって、インターフェロンγが、分泌されたことを示す。インターフェロンγは、MUC1*標的CAR T細胞が、MUCl*、前立腺癌MUCl*陽性癌細胞(DU145)、乳癌(1500)若しくは膵臓癌(Capan)で形質導入されたK562細胞若しくはK562-wt細胞に露出された時、MN-E6CD8/CD28/CD3z、MN-E6 CD8/4-IBB/CD3z及びMN-E6 CD8/CD28/4-IBB/CD3zを含むCARのパネルで形質導入された、一次ヒトT細胞で同様に分泌された(図33)。
【０３０７】
CAR T細胞の機能の別の測定は、それらが標的細胞の殺滅を引き起こすかどうかである。MUCl*のPSMGFR配列に結合する抗体断片を含む様々なCARで形質転換されたT細胞は、共培養分析で、MUCl*発現細胞を殺滅した。1つの分析では、標的MUCl*発現細胞は、カルセイン（calcein）と培養された。CARがMN-E6、MN-C2、MN-C3若しくはMN-C8のような抗体断片を含む、CAR T細胞と混じり合った場合、CART細胞は、MUCl*提示細胞を殺滅し、それは標的細胞を溶解させ、上澄みへcalceinをリリースする。図34は、一次ヒトT細胞、それは血液サンプルから単離され、MN-E6 CD8/CD28/CD3z、MN-E6 CD8/4-IBB/CD3z及びMN-E6 CD4/4-IBB/CD3z を含むCARのパネルで形質導入され、該CART細胞が、MUCl*で形質転換されたK562細胞若しくはK562-wt細胞に露出された時の、標的細胞死を測定する実験グラフである。T細胞対標的細胞の比率は、1:１で、細胞は24時間共培養された。図35A-35Bは、1日目から3日目までの、標的細胞生存の時間的経過を測定するFACSのグラフである。血液サンプルから単離された一次ヒトT細胞は、ヒト化MN-E6-CD8-3z、MN-E6-CD8-CD28-3z、MN-E6-CD84-IBB-3z及びMN-E6-CD8-CD28-4-IBB-3zを含むCARのパネルで形質導入された。その後、CAR T細胞は、MUCl*を自然に低レベルで発現するK562-wt細胞若しくはMUCl*highで形質転換されたK562細胞に露出された。標的細胞に対するMUCl*標的化CAR T細胞の比率は、1:1、10:1、又は20:1でした。生存細胞は、1日目若しくは3日目で検出され測定された。
【０３０８】
図36は、共培養実験の3日目の標的細胞生存のFACS測定のグラフである。一次ヒトT細胞は、ヒト化MN-E6-CD8-3z、MN-E6-CD8-CD28-3z、MN-E6-CD84-IBB-3z及びMN-E6-CD8-CD28-4-IBB-3zを含むCARのパネルで形質導入された。その後、CAR T細胞は、MUCl*陽性T47D乳癌細胞若しくはMUCl*陽性1500 akaZR-75-1乳癌細胞に露出された。標的細胞に対するMUCl*標的化CAR T細胞の比率は、1:1又は10:1であった。グラフから見ることができるように、MUCl*標的化CARで形質導入されたT細胞は、MUCl*癌細胞に、非形質導入コントロールT細胞よりはるかに、大きな殺滅効果をもつ。さらに、殺滅効果は、T細胞:標的細胞の比率が増加するとさらに大きくなる。図37は、共培養実験の一日目の標的細胞生存のFACS測定のグラフである。一次ヒトT細胞は、ヒト化MN-E6-CD84-IBB-3z、MN-E6-CD44-IBB-3z及びMN-E6-CD8-CD28-4-IBB-3zを含むCARのパネルで形質導入された。その後、CAR T細胞は次のMUCl*陽性癌細胞に露出された:  T47D乳癌; capan2膵臓癌;若しくはDU-145前立腺癌。標的細胞に対するMUCl*標的化CAR T細胞の比率は、5: 1であった。グラフから見ることができるように、MUCl*標的化CARで形質導入されたT細胞は、MUCl*癌細胞に、非形質導入コントロールT細胞より、はるかに大きな殺滅効果がある。測定は、標的細胞に対するT細胞比率は5:1だけで24時間の後に得られたことに注意がいる。さらにCD8構築物と同様に、CD4細胞外領域-膜貫通-細胞質尾部をもつMUCl*標的化CARが機能することに注意がいる。
【０３０９】
図38は、一次ヒトT細胞が、ヒト化MN-E6-CD84-IBB-3z、MN-E6-CD44-IBB-3z及びMN-E6-CD8-CD28-4-IBB-3zを含むCARのパネルで形質導入された、共培養実験の3日目の標的細胞生存のFACS測定のグラフである。その後、CAR T細胞は、次のMUCl*陽性癌細胞に露出された:   MUCl*で形質転換されたK562血液癌細胞; T47D乳癌; 1500のaka ZR-75-1乳癌細胞;若しくはCAPAN-2膵臓癌細胞。分析は、非形質導入T細胞コントロールに加えて、PC3 MUCl*陰性前立腺癌細胞で行なわれた。標的細胞に対するMUCl*標的化CAR T細胞の比率は、1:1である。グラフから見ることができるように、MUCl*標的化CARで形質導入されたT細胞は、MUCl*癌細胞に、非形質導入コントロールT細胞よりはるかに大きな殺滅効果がある。さらに、殺滅結果は、MUCl*陽性細胞に特異的である。CD8構築物と同様に、CD4細胞外領域-膜貫通-細胞質尾部をもつMUCl*標的化CARが機能することに注意がいる。図39は、標的細胞へのCAR T細胞の比率5:1での、標的細胞との共培養で、24時間の間のCAR T細胞拡張のFACS測定のグラフである。一次ヒトT細胞は、ヒト化MN-E6-CD84-IBB-3z、MN-E6-CD44-IBB-3z及びMN-E6-CD8-CD28-4-IBB-3zを含むCARのパネルで形質導入された。CAR T細胞は、MUC1*陽性T47D乳癌細胞、MUCl*陽性Capan膵臓癌細胞及びMUCl陰性細胞HCT-116結腸癌細胞及びHEK-293ヒト胚腎臓細胞と共培養された。グラフから見ることができるように、CAR T数はMUCl*陽性細胞の存在状態で増加する。図40は、MUCl*標的化CARsのウェスタンブロットの写真を示す。1〜9は、次のものである: 1. MN-E6scFv-Fc-8-4-IBB-CD3z(CD8 TMを持つヒンジ領域としてのヒトFc); 2: MN-E6scFv-FcH-8-4-IBB-CD3z(CD8TMを持つヒンジ領域としてのヒトFc hingeless);3: MN-E6scFv-Fc-4-4-IBB-CD3z(CD4 TMを持つヒンジ領域としてのヒトFc); 4: MN-E6scFv-FcH-4-4-IBB-CD3z(CD4 TMを持つヒンジレスヒンジ領域としてのヒトFc); 5: MN-E6scFv-IgD-8-4-IBB-CD3z(CD8TMを持つヒトIgDからのヒンジ領域); 6: MN-E6scFv-IgD-4-4-IBB-CD3z(CD4TMを持つヒトIgDからのヒンジ領域); 7: MN-E6scFv-X4-8-4-IBB-CD3z(CD8 TMを持つヒンジ領域としての長い柔軟なリンカー); 8: MN-E6scFv-X4-4-4-IBB-CD3z(CD4TMを持つヒンジ領域としての長い柔軟なリンカー); 9:MN-E6scFv-8-4-4-IBB-CD3z。(CD4 TM をもつCD8とCD4からのヒンジ領域)。
【０３１０】
図41は、MN-E6scFv-Fc-84-IBB-CD3z、MN-E6scFv-FcH-8-4-IBB-CD3z(hingeless)、MN-E6scFv-Fc-4-4-IBB-CD3z、MN-E6scFv-IgD-8-4-IBB-CD3z、MN-E6scFv-X4-8-4-IBB-CD3z及びMN-E6scFv-X4-4-4-IBB-CD3zで、形質導入されたヒトT細胞と共培養されたT47D乳癌細胞の、FACSスキャンのグラフを示す。T細胞と癌細胞は1:1の比率で、48時間共培養された。T細胞計算はすべての非形質導入T細胞の平均に標準化された。また、非形質導入T細胞と共培養された時、標的細胞は個々の特定の細胞タイプに標準化された。CAR T細胞がMUCl*陽性癌細胞と共培養される場合、T細胞数は拡大し、標的癌細胞数は減少することをグラフはしめす。
【０３１１】
図42は、T47D乳癌細胞、Capan-2膵臓癌細胞、K562-MUC1*形質転換細胞、及びK562-wt細胞のFACSスキャンのグラフを示し、それはMN-E6scFv-Fc-8-4-IBB-CD3z、MN-E6scFv-FcH-8-4-IBB-CD3z、MN-E6scFv-Fc-4-4-IBB-CD3z、MN-E6scFv-IgD-8-4-IBB-CD3z、MN-E6scFv-X4-8-4-IBB-CD3z及びMN-E6scFv-X4-4-4-IBB-CD3zで形質導入されたヒトT細胞と共培養された。T細胞と癌細胞は、1:1の比率で48時間共培養された。T細胞計算はすべての非形質導入T細胞の平均に標準化された。また、非形質導入T細胞と共培養された時、標的細胞は個々の特定の細胞タイプに標準化された。CAR T細胞がMUCl*陽性癌細胞と共培養される場合、T細胞数は拡大し、標的癌細胞数は減少することをグラフはしめす。
【０３１２】
抗MUCl*標的化抗体の特異性
【０３１３】
これらの実験が実証するように、CARの重要な部分は、腫瘍細胞に対して免疫細胞を仕向ける抗体断片である。次のセクションで示すように、MN-E6及びMN-C2は、腫瘍細胞上で発現されるMUCl*の型に特異的である。CARの次の最も重要な部分は、免疫系共刺激領域を担持する細胞質尾部である。これらの領域の同一性は、免疫反応の程度を調整するが、特異性に影響はしない。示されるように、CARの膜貫通の部分の同一性は最も重要ではない。膜貫通の部分がある柔軟性を持ち、十分に長いので、抗体断片が腫瘍細胞上のその同系統のリセプターに達することを可能にする限り、それは十分である。これは、図40-42に実証される。MN-E6標的抗体断片及び細胞内の共同刺激領域4 IBB及びCD3-zetaを含むCARで、様々な異なる細胞外、膜貫通、短い細胞質尾部を持っているすべては、ホストT細胞の拡張を刺激する間、それらが特異的に標的細胞を殺す機能を示す。
【０３１４】
抗体特異性を実証する最も正確な方法は、癌組織標本と比較して、正常なヒト組織標本上で抗体をテストしている。MN-C2及びMN-E6は、特異的に、MUC1若しくはMUCl*陽性癌細胞に結合すると示された。いくつかの乳癌アレイは、いくつかの抗MUCl若しくはMUCl*抗体を使用して分析された。本質的に、1,200人の異なる乳癌患者からの乳癌組織標本の連続切片に関する研究は、ほとんど、全長MUC1は乳癌組織に残存しないことを示した。発現されたMUC1の大部分は、MUCl*であり、MN-C2によって染色された。その分析は、Clarient診断法によって行なわれ、また、組織染色はアルフレッド法を使用して得点化された。例えば、図43は、VU4H5（縦列反復に結合する市販の抗MUCl抗体）若しくはMUCl*に結合するMN-C2で染色された乳癌組織アレイの連続切片を示す。図43と44は、MUC1-FL(全長) を認識するVU4H5 若しくは癌のMUCl*を認識するMN-C2で、染色された乳癌組織アレイの写真である。組織染色は、強度スコア及び分配スコアを組み合わせる、アルフレッドを得点する方法を使用して得点化された。組織アレイの写真下に、結果を表示す、色分けされたグラフがある。見ることができるように、VU4H5で染色されたアレイは非常に明るく、また、多くの組織が、核酸ベースの診断法によって証拠づけられるようなすべての乳癌の96%以上にMUClが異常に発現されると公表された報告書にもかかわらず全く染色されない。対照的に、MN-C2で染色されたアレイは、非常に暗い(グラフにおいて黄色若しくは白に対して赤)。さらに、多くの組織が、抗全長MUClで全く染色されず、しかし、MN-C2で大変暗く染色された(グラフでブリーンボックスを参照)、同様に、本願発明者等は、ヒト化MN-E6scFv-Fcで、正常若しくは癌の乳組織を染色した。第2streptavidin基によってそれを視覚化することができるように、抗体断片がビオチンを付加された。
図45で見ることができるように、hMN-E6 scFv-Fcは、正常な乳組織を染色しないが、癌の乳組織を染色する。さらに、染色の程度と均質性は、患者の腫瘍等級及び転移性等級で増加する(図45-46)。同様に、hMN-E6 scFv-Fcは、正常な肺組織を染色しないが、肺癌組織を染色し(図47-51)、腫瘍等級若しくは転移等級の増加ように染色強度及び分配を増加させた。図52は、ヒト化MN-E6-scFv-Fcビオチン化抗MUCl*抗体5 μg/mLで染色された、正常な小腸及び癌の小腸組織の写真であり、その後、第2streptavidinHRP抗体で染色された。A)は、正常な小腸組織である。B)は、図の中で表示されるような患者からの小腸癌である。C）とD）は、第2抗体単独で染色された、対応する連続切片の写真である。図53は、ヒト化MN-E6-scFv-Fc抗MUCl*抗体50 μg/mLで染色され、その後、第2ヤギ抗ヒトHRP抗体で染色された正常小腸組織の写真を示す。A-Dは、正常な小腸組織である。E-Hは、第2抗体単独で染色された、対応する連続切片の写真である。
図54は、ヒト化MN-E6-scFv-Fc抗MUCl*抗体50 μg/mLで染色され、その後、第2ヤギ抗ヒトHRP抗体で染色された、癌の小腸組織の写真を示す。A-Dは、図の中で表示されるような患者からの癌の小腸組織である。E-Hは、第2抗体単独で染色された、対応する連続切片の写真である。図55は、ヒト化MN-E6-scFv-Fc抗MUCl*抗体50 μg/mLで染色され、その後、第2ヤギ抗ヒトHRP抗体で染色された、癌の小腸組織の写真を示す。A-Dは、図の中で表示されるような患者からの癌の小腸組織である。E-Hは、第2抗体単独で染色された、対応する連続切片の写真である。図56は、ヒト化MN-E6-scFv-Fc抗MUCl*抗体50 μg/mLで染色され、その後、第2ヤギ抗ヒトHRP抗体で染色された、正常な結腸組織の写真を示し、A-Dは、正常な結腸である。E-Hは、第2抗体単独で染色された、対応する連続切片の写真である。図57は、ヒト化MN-E6-scFv-Fc抗MUCl*抗体50 μg/mLで染色され、その後、第2ヤギ抗ヒトHRP抗体で染色された、結腸癌組織の写真を示す。A-Dは、図の中で表示されるような転移の患者からの結腸癌組織である。E-Hは、第2抗体単独で染色された、対応する連続切片の写真である。図58は、ヒト化MN-E6-scFv-Fc抗MUCl*抗体50 μg/mLで染色され、その後、第2ヤギ抗ヒトHRP抗体で染色された、結腸癌組織の写真を示す。A-Dは、図の中で表示されるような等級2の患者からの結腸癌組織である。E-Hは、第2抗体単独で染色された、対応する連続切片の写真である。図59は、ヒト化MN-E6-scFv-Fc抗MUCl*抗体50 μg/mLで染色され、その後、第2ヤギ抗ヒトHRP抗体で染色された、結腸癌組織の写真を示す。A-Dは、図の中で表示されるような転移の患者からの結腸癌組織である。E-Hは、第2抗体単独で染色された、対応する連続切片の写真である。図60は、ヒト化MN-E6-scFv-Fc抗MUCl*抗体50 μg/mLで染色され、その後、第2ヤギ抗ヒトHRP抗体で染色された、前立腺癌組織の写真を示す。A-Dは、図の中で表示されるような患者からの前立腺癌組織である。E-Hは、第2抗体単独で染色された、対応する連続切片の写真である。図61は、ヒト化MN-E6-scFv-Fc抗MUCl*抗体50 μg/mLで染色され、その後、第2ヤギ抗ヒトHRP抗体で染色された前立腺癌組織の写真を示す。A-Dは、図の中で表示されるような患者からの前立腺癌組織である。E-Hは、第2抗体単独で染色された、対応する連続切片の写真である。図62は、ヒト化MN-E6-scFv-Fc抗MUCl*抗体50 μg/mLで染色され、その後、第2ヤギ抗ヒトHRP抗体で染色された、前立腺癌組織の写真を示す。A-Dは、図の中で表示されるような患者からの前立腺癌組織である。E-Hは、第2抗体単独で染色された、対応する連続切片の写真である。
【０３１５】
本発明の1つの態様は、MUCl若しくはMUCl*陽性癌と診断された、MUCl若しくはMUCl*陽性癌になるリスクを診断された、若しくはMUCl若しくはMUCl*陽性癌を持っていることが疑われる患者を処置する方法であり、そこでは、標本は患者の癌から得られ、
PSMGFR SEQ ID NO:2、  
SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY(SEQID NO: 620)若しくは
SVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY(SEQ IDNO: 621)
に結合する抗体との反応性に関してテストされる。
その後、患者は、それら患者の癌標本で反応した抗体からの抗体可変断片を含むscFv、scFv-Fc若しくはCAR Tで処置される。
本発明の別の態様は、MUCl若しくはMUCl*陽性癌と診断された、MUCl若しくはMUCl*陽性癌になるリスクを診断された、若しくはMUCl若しくはMUCl*陽性癌を持っていることが疑われる患者を処置する方法であり、そこでは、標本は患者の癌から得られ、MN-E6-scFv、MN-C2-scFv、MN-C3-scFv若しくはMN-C8-scFvを持つ反動に関してテストされ、その後、患者は、それらの癌標本と反応した抗体の部分を含むscFv、scFv-Fc-mut若しくはCAR Tで処置される。
【０３１６】
本願発明者等は、MUC1は、1つを超える開裂酵素によってMUCl*に開裂することができ、その開裂のサイトが3次元畳み込みに影響し、その結果として、そのモノクローナル抗体がMUCl*のその型を認識されうるように影響することを発見した。異なる癌細胞若しくは癌組織は、異なる開裂酵素を発現する。本願発明者等は、異なる癌細胞株上の様々な開裂酵素阻害剤をテストし、一つの癌細胞株で、MUC1の開裂を阻害する阻害剤は、別の癌細胞株でその開裂を阻害しないことをみいだした。同様に、PCR実験は、異なる細胞若しくは細胞株において、異なるレベルで開裂酵素が発現されることを示した。例えば、骨髄の造血幹細胞は、モノクローナル抗体、MN-E6若しくはMN-C2ではなく、MNC3によって認識されるMUCl*を発現する(図63)。DU145前立腺癌細胞及びT47D乳癌細胞の成長は、MN-C2とMN-E6のFabsによって阻害されるが、MNC3またはMNC8のFabsによってはされない。これは、癌細胞株が、MNC3若しくはMNC8ではなく、MN-E6とMN-C2によって認識されるMUCl*を発現することを示している（図64）。PCR実験は、骨髄のCD34陽性細胞は、T47D乳癌細胞より、約2,500倍多くのMMP2及び約350倍多くのADAM28を発現し、一方、DU145前立腺癌細胞は、T47D乳癌細胞より、約2,000倍多くのADAM TS 16、約400倍多くのMMP14及び約100多くのMMP1 を発現する(図65及び図66)。反対に、T47D乳癌細胞は、骨髄細胞より約80倍多くのMMP9を発現し及びDU145前立腺癌細胞の同じ約2倍発現する。様々な開裂酵素阻害剤は、異なる種類の癌細胞中の開裂を阻害するそれらの能力に関してテストされた。MMP2、MMP9及びADAM 17を阻害するTAPI-1、及びMMP2、MMP9、MMP14を阻害するMMP2/9 V阻害剤は、T47D乳癌細胞のMUC1の開裂を阻害した、しかし、テストされた開裂酵素阻害剤のどれも、DU145前立腺癌細胞で効果がなかった(図68A、68B)。これらの実験は、これらの乳癌細胞のMUC1は、MMP2、MMP9、MMP14若しくはADAM 17又は、これら酵素のコンビネーションによって、開裂されることを示した。
【０３１７】
BiTEs
【０３１８】
ディバレント(若しくはビバレント)単一鎖可変断片(di-scFvs、bi-scFvs)は、2つの scFvsのリンキングにより加工することができる。これは２つの縦並びのscFvsを産出して、2つのVH及び2つのVL領域を持つ単一のペプチド鎖の生産により行うことができる。別の可能性は、scFvsに二量化させるのに、ともに折り重ねることが2つの可変領域にとってあまりにも短いのリンカーペプチド(約アミノ酸)での、scFvsの生成である。このタイプはダイアボデイー（diabodies）として知られている。Diabodiesは、それらの標的へのはるかに高い親和性を持っていることを意味している、対応するscFvsより40倍までの低い解離定数を持つ。従って、diabody薬は、他の治療用抗体よりはるかに低く投薬量が可能であるし、生体内で癌への極めて高い特異性のある標的化が可能である。さらに、短いリンカー(1つ若しくは2つのアミノ酸)は、三量体、いわゆるtriabodies若しくはtribodiesと呼ばれる、の形成を可能とする。Tetrabodiesも、また、生産された。それらは、diabodiesより、標的へのさらに高い親和性をもつ。
【０３１９】
これらのフォーマットの全ては、2つの異なる抗原への特異性を持つ種々の可変断片から構成されうる。その場合、それらは二重特異性抗体のタイプである。その、最も早く開発された、2重特異的T細胞エンゲガー(BiTE抗体構築物)として知られる、2重特異性縦列di-scFvsである。BiTEsは、約55キロダルトンの単一のペプチド鎖上に、異なる抗体の2 つのscFvsから成る融合タンパク質である。scFvsのうちの1つは、CDSのリセプター経由のような、T細胞に結合でき、他は、異常に発現されたMUC1*のような、腫瘍特異的分子経由癌細胞に結合できる。
【０３２０】
本発明の別の態様は、MUCl若しくはMUCl*陽性癌と診断された、MUCl若しくはMUCl*陽性癌になるリスクを診断された、若しくはMUCl若しくはMUCl*陽性癌を持っていることが疑われる患者を処置する方法であり、そこでは患者は処理される、有効な量のBiTEが投与され、BiTEの1個の抗体可変断片は、T細胞表面抗原に結合し、及びBiTEの別の抗体可変断片は、
PSMGFR （SEQ ID NO:2）、
SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY(SEQID NO: 620)
若しくは
SVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY(SEQ ID NO: 621)に結合する。
1つのケースでは、MUCl*に結合するBiTEの抗体可変断片は、huMN-E6、huMN-C2、huMN-C3若しくはhuMN-C8の部分を含む。
【０３２１】
本発明の別の態様中で、
PSMGFR  （SEQ ID NO:2）、
SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY(SEQ ID NO: 620)、若しくは、
SVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY(SEQ IDNO: 621)
のすべて若しくは大部分を含むMUC1*ペプチドが、養子関係の(adoptive)T細胞アプローチで使用される。
この場合、患者のT細胞は、MUCl*ペプチドに露出され、そして、成熟の様々な段階を経て、T細胞は、MUCl*特異的リセプターを展開する。その後、適合された(adapted)T細胞は、拡張され、MUCl若しくはMUCl*陽性癌と診断された、MUCl若しくはMUCl*陽性癌になるリスクを診断された、若しくはMUCl若しくはMUCl*陽性癌を持っていることが疑われる患者に投与される。
【０３２２】
CARの細胞外標的ヘッドとして、MN-C2及びヒト化MN-C2を持つ、CARsのシリーズも作られた。これらのCARのための構築物は、その後にLentiウイルスベクターに挿入されるプラスミドに挿入された。その後、ヒトT細胞は、MN-C2 CAR及びhuMN-C2 CARを担持するlentiウイルスベクターで形質導入された。マウス配列若しくはヒト化MN-C2-scFv-CARが生成された。MN-C2-scFv及び様々な膜貫通・細胞内共刺激領域を含むCARが、表1にリストされた構築物を含めて生成された。本発明の1つの態様では、CARは、CD8短細胞内部分-4-lBB-3zetaに由来したhuMN-C2-scFv-短ヒンジ領域膜貫通領域を含む。別の態様では、膜貫通領域は、CD4膜貫通配列に由来した。別の態様では、細胞内共刺激領域は、CD28-3zetaである。また別の態様では、細胞内共刺激領域は、CD28-4-lBB-3zetaである。
【０３２３】
T細胞が標的細胞を認識し、免疫反応をマウントする過程にあるかどうかを評価する様々な方法がある。T細胞は、標的若しくは異細胞を認識する場合、クラスターする。これは、容易に肉眼で、若しくは低倍率で見ることができる。標的癌細胞と共培養された時CAR T細胞クラスタリングの外観は、次のものの1つの物指しである: a)それらは、その細胞を、標的細胞と認めるのかどうか;そして、b) それらは、標的細胞、それらはこの場合癌細胞である、を攻撃するために活性化されるかどうか。図80A-80Fは、CARのないヒトT細胞又はhuMN-C2-scFv-CAR44、huMN-C2-scFv-CAR49、huMN-C2-scFv-CAR50、huMN-C2-scFv-CAR18若しくはhuMN-C2-scFv-CAR19で形質導入されたヒトT細胞と共培養された、mCherryで安定して形質転換された、したがって赤である、MUCl*陽性T47D乳癌細胞の写真を示す。この場合、CAR構築物は、GFPマーカーを担持し、したがって、CAR形質導入T細胞は緑である。T細胞が、CARを担持しない場合、見ることができるように、癌細胞のT細胞誘導クラスタリングはない。しかしながら、T細胞が、MUCl*標的化CARを担持するとき、MUCl*陽性癌細胞の劇的なクラスタリングがある。
【０３２４】
T細胞が、標的細胞を認識しクラスターの後、それらは、perforin及びgranzyme Bを過剰発現する。ともに、これらの2つの分子は、標的細胞の細胞死パスウェイを活性化する。Perforinが、標的細胞に穴を作り、そこへ、アポトーシス性プロテアーゼを活性化する、granzyme BをT細胞が注入し、標的細胞を溶解させるということが推定される。図81A-81Dは、標的MUCl*陽性前立腺癌細胞へ結合し、そしてgranzyme Bを注入しているhuMN-C2-scFV-CAR44 T細胞を示す。
【０３２５】
T細胞が、標的細胞を認識し、その細胞を殺すために活性化されるかどうかの別の測定の手段は、サイトカイン、特にインターフェロンγ(IFNg)のアップレギュレーションである。表2は、様々な異なる癌細胞との共培養の後に、多様なMUCl*標的化CAR T細胞によって分泌されたインターフェロンγの量を測定するELISA実験の結果をリストする。MUCl*発現とCAR T活性の間のリンクを確立するために、本願発明者等は、CAR T殺滅の量が、癌細胞によって発現されたMUCl*の量に比例したかどうか判断するための実験を行なった。T47Dは、1つの、高い、MUCl*陽性乳癌細胞である。これらの細胞はさらにある全長MUC1をも発現する。T47D細胞は、様々の変わる量の付加的なMUCl*で形質転換され、その後、CAR T細胞と共培養された。結果は、1:1のような標的(癌細胞)に対する低エフェクター(CART)で、特異的CAR T殺滅は、増加するMUCl*発現で増加され、分泌されたインターフェロンγの量もまた、増加するMUCl*につれて増加した(図82B)。CAR T反応を測定する別の方法は、蛍光活性化細胞ソーテイング(FACS)による。図X7Aは、付加的なMUCl*で形質転換されたT47D癌細胞のFACS分析のグラフを示す。E:T比率、1: 1で、CAR T媒介癌細胞殺滅は、癌細胞上で発現されたMUCl*の量の増加とように増加した。本発明者は、以前に、癌細胞が、化学療法剤への抵抗性を獲得するとき、それらが発現するMUCl*の量を増加させることを見出していたので、このことは重要である(Fesslerら、2009)。したがって、抗MUCl* CAR Tは、後期段階の癌患者の治療法として、若しくは化学療法剤に対して獲得耐性を持っているものに対して、特に有益である。いくつかのMN-C2-scFv-CARは、ヒトT細胞へ形質導入され、標的化MUCl*陽性癌細胞を殺すそれらの能力を決定するためにFACSによって分析された。図83A-83Dは、MUCl*陽性癌細胞との24時間の共培養の後に、huMN-C2-CAR44T細胞のFACS分析の結果を示す。図83Aは、非形質導入T細胞(赤棒)と比較して、huMN-C2-CAR44 T細胞(青棒)によって殺されたT47D癌細胞のパーセンテージを示すFACSデータのグラフである。X軸は、癌細胞に対するT細胞の比率を示す。図83Bは、非形質導入T細胞(赤棒)と比較して、huMN-C2-CAR44T細胞(青棒)によって殺されたK562-MUC1*癌細胞のパーセンテージを示すFACSデータのグラフである。図83Cは、T47D乳癌細胞の染料CMTMRで染色された FACSスキャンである。Sytox青は、死細胞染色である。死んだ癌細胞は、四分円2及び3中のものである。図83Dは、K562-MUC1*癌細胞が、染料CMTMRで染色された、FACSスキャンである。Sytox青は、死細胞染色である。死んだ癌細胞は、四分円2及び3中のものである。
【０３２６】
FACS分析に加えて、多くの研究者が、癌細胞のCAR T殺滅を測定するために、今や、xCELLigence装置を使用する。T細胞が標的細胞を溶解するので、FACSはT細胞誘導細胞殺滅をトレースする最良の方法ではない。FACSによると、それらが細胞残屑として除外されるので、死滅細胞を測定することは困難である。したがって、人が、細胞殺滅の量を推論しなければならず、行方不明の細胞が、T細胞若しくは癌細胞かどうかを様々な方法によって判断する
【０３２７】
xCELLigence装置は、そこに癌細胞が置かれる、電極アレイを使用する。付着している癌細胞は、電極を絶縁し、それらが成長するように、したがって、インピーダンスの増加を引き起こす。反対に、T細胞は付着せず、懸濁中に残り、その結果、インピーダンスを増加させる電極の絶縁に寄与しない。しかしながら、T細胞若しくはCAR T細胞が、電極プレート上の癌細胞を殺す場合、それが死んでいるとして癌細胞は、ボールアップ（Ball up）し、離れて浮かぶ。それは、インピーダンスを減少させる。xCELLigence装置は、時間の関数としてインピーダンスを測定する。それは癌細胞殺滅に関連づけられる。さらに、電極プレートには観察ウインドウがある。CAR T細胞が、吸着された標的癌細胞を有効に殺す場合、インピーダンスに減少があり、人は、癌細胞がプレート表面の上に残されていないことが分かりる。
【０３２８】
図84A-84Hは、様々な分析によって測定される、MUC1*陽性DU145前立腺癌細胞上のhuMN-C2-CAR44 T細胞の細胞毒性を示す。図84Aは、前立腺癌細胞と共培養された、非形質導入T細胞の蛍光写真である。そこではgranzymeBは赤い蛍光団で染色される。図X4Bは、DAPIである。また、granzyme Bはマージされる。図84Cは、前立腺癌細胞と共培養されたhuMN-C2-CAR44 T細胞の蛍光写真であり、そこではgranzyme Bは赤い蛍光団で染色される。図84Dは、DAPIであり、また、granzyme Bはマージされる。図84Eは、癌細胞とインキュベートされた、非形質導入T細胞のための蛍光ラベル化granzyme BのためのFACSスキャンである。図84Fは、癌細胞とインキュベートされた、huMN-C2-CAR44 T細胞のための蛍光ラベル化granzyme Bの肯定的な増加を示すFACSスキャンである。図84Gは、中間の蛍光強度のグラフである。図84Hは、非形質導入T細胞(緑)ではおこらなかったが、huMN-C2-CAR44T細胞(青トレース)によるDU145癌細胞のリアルタイム殺滅をトレースするxCELLigenceスキャンである。図85A-85Hは、様々な分析によって測定される、MUC1*陽性CAPAN-2膵臓癌細胞における、huMN-C2-CAR44 T細胞の細胞毒性効果を示す。図85Aは、膵臓癌細胞と共培養された、非形質導入T細胞の蛍光写真であり、そこではgranzymeBは赤い蛍光団で染色される。図85Bは、DAPIであり、granzyme Bはマージされる。図85Cは、膵臓癌細胞と共培養されたhuMN-C2-CAR44 T細胞の蛍光写真であり、そこではgranzyme Bは赤い蛍光団で染色される。図85Dは、DAPIであり、granzyme Bはマージされる。図85Eは、癌細胞とインキュベートされた、非形質導入T細胞のための蛍光ラベル化granzyme BのためにFACSスキャンである。図85Fは、癌細胞とインキュベートされた、huMN-C2-CAR44 T細胞のための蛍光ラベル化granzyme Bの肯定的な増加を示してFACSスキャンである。図85Gは、中間の蛍光強度のグラフである。図85Hは、非形質導入T細胞(緑)ではおこらなかったが、huMN-C2-CAR44T細胞(青いトレース)によるCAPAN-2癌細胞のリアルタイム殺滅をトレースするxCELLigenceスキャンである。図86A-86Cは、MUC1*陰性細胞ではなかったが、huMN-C2-CAR44 T細胞による、MUCl*陽性癌細胞のリアルタイム殺滅をトレースするxCELLigenceスキャンである。図86Aは、huMN-C2-CAR44 T細胞が、MUC1*で安定して形質転換されたHCT結腸癌細胞を有効に殺すことを示す。図86Bは、huMN-C2-CAR44T細胞が、HCT-MUC1-41TRにほとんど効果がないことを示し、それは、全長MUC1で安定して形質転換されたMUC1陰性の癌細胞である。この細胞株では、細胞のわずか約10%が、MUCl*へMUC1を開裂させる。図86Cは、MUCl陰性結腸癌細胞株であるHCT-116細胞に、huMN-C2-CAR44T細胞が効果がないことを示す。
【０３２９】
これらのデータは、抗体断片標的ヘッドがMN-C2である、CARで形質導入されたT細胞が、有効にMUCl*陽性癌細胞を殺すことを実証する。これらのデータは、ヒトT細胞へ有効に形質導入されたhuMN-C2-scFV-CAR44が、MUCl*陽性癌細胞を殺すことを特に示す。CAR Tの機能の最も重要な態様は、標的抗体断片であることを、私たち他が、今実証したので、抗体断片MN-C2-scFV若しくはhuMN-C2-scFVをもつ任意のCARで形質導入された免疫細胞若しくはT細胞が、MUCl若しくはMUCl*陽性癌細胞に対する同様の効能を持つであろうことが推定される。例えば、膜貫通の部分にscFvを接続するヒンジ領域は、任意のフレキシブルなリンカーでありえる。細胞内の共刺激領域は、CD28-3zeta、CD28-4-lBB-3zeta若しくは免疫細胞共刺激領域の任意のコンビネーションでありえる。
【０３３０】
実験は、また、より有効に標的癌細胞を殺すために、あらかじめCAR T細胞を活性化する方法の開発を行なわれた。本願発明者等は、最初に抗CD3及び抗CD28抗体を提示するビーズを使用して、CAR T細胞の予備刺激（予備活性化ともいう）をテストした。この予備刺激は、細胞殺滅の量を増加させた。しかし、増加はCARの標的には特異的ではなかった。むしろ、CD3-CD28刺激CAR T細胞は、非特異的に、MUCl*陽性及び陰性の細胞を殺滅した。次に本発明者たちは、CARの抗体部分の標的を発現するビーズ若しくは癌細胞で、CAR T細胞を予備刺激することを試験した。
合成MUCl*細胞外領域ペプチドは、１μｍ若しくは4.5μｍビーズに付着された。抗MUCl* CAR T細胞は、12〜24時間、ペプチド提示ビーズでインキュベートされた。図87A-87Lは、MUCl*ペプチド提示ビーズで24時間のインキュベーション後の、非形質導入T細胞若しくはCAR T細胞を示す。見ることができるように、CAR形質導入T細胞だけが、活性化誘導クラスタリングを示す。CAR T細胞は、遠心分離によってビーズから分けられ、次に、T細胞活性化マーカーCD25、CD69及びgranzyme Bの発現を測定するためにFACSによって分析された。図88A-88Dで見ることができるように、T細胞活性化マーカーは、T細胞がその細胞外領域が抗MUCl*抗体断片を含んだCARで形質導入された場合に及び場合にのみに、MUCl*提示ビーズでインキュベーションの後に増加する。CD3-CD28ビーズでの予備活性化に対する際立った対照では、MUCl*ペプチドビーズでの刺激が、唯一、特異的殺滅を増加させた。MUCl*陰性細胞の殺滅に増加はなかった。図89A-89Cは、MUCl*で安定して形質転換されたヒト卵巣癌細胞、3倍陰性乳癌細胞及びMUCl陰性結腸癌細胞株での、ビーズ刺激抗MUCl* CAR T細胞の増強した殺滅を示す、xCELLigenceスキャンを示す。MUCl*ペプチドビーズ刺激CAR T細胞の増強された殺滅能力は、CART細胞が、より長い期間、及び癌細胞比率へのはるかに低いT細胞で、標的癌細胞を有効に殺滅することを可能にした。本発明の1つの態様では、CAR T細胞は、MUCl若しくはMUCl*陽性癌と診断された、MUCl若しくはMUCl*陽性癌になるリスクを診断された、若しくはMUCl若しくはMUCl*陽性癌を持っていることが疑われる患者に投与される前に、MUCl細胞外領域に由来するペプチドを提示するビーズ若しくは表面とのインキュベーションによって、予備刺激がなされる。
【０３３１】
さらに、本願発明者等は標的抗原を提示する癌細胞とインキュベーションすることにより、予備活性化CAR T細胞をテストした。本願発明者等は、12-24時間、HCT-MUC1*細胞とhuMN-C2-CAR44 T細胞をインキュベーションした。この予備刺激は、１回、2回、3若しくは4回行われた。標的細胞予備刺激は、CART細胞の特異的殺滅を非常に増強した。図90A-90Dで見ることができるように、癌細胞刺激CAR T細胞による特異的殺滅は、癌細胞比率にたいする低いCAR Tでさえ、そして、より長い期間、それらの殺滅能力を増加させたことを示す。
図90A-90Dは、癌細胞刺激huMN-C2-scFv-CAR44形質導入ヒトT細胞は、有効にT47D乳癌細胞を殺す、BT-203倍陰性乳癌細胞、SKOV-3卵巣癌細胞及びHCT-MUCl*癌細胞を殺滅することを示す。本発明の1つの態様では、MUCl若しくはMUCl*陽性癌と診断された、MUCl若しくはMUCl*陽性癌になるリスクを診断された、若しくはMUCl若しくはMUCl*陽性癌を持っていることが疑われる患者に投与される前に、癌細胞でありうる、MUCl*発現細胞とのインキュベーションによって、予備刺激される。好ましい態様では、MUCl*刺激細胞は、UV若しくは化学的に、CAR T細胞との共培養の前に、不活性化される。
【０３３２】
ビーズ刺激(プロトコル１)若しくは癌細胞刺激 (プロトコル２)をされたhuMN-C2-scFv-CAR44形質導入ヒトT細胞が、動物での腫瘍成長阻害のそれらの能力に関してテストされた。ルシフェラーゼで安定して形質転換されたヒト癌細胞が、11及び15週間の年齢間で、雌のNOD/SCID/GAMMA(NSG)マウスに注入された。1つの実験では、500,000のHCT-MUCl*癌細胞が、後部側面に皮下投与された。腫瘍移植は、ルシフェリンを動物に注入し、次に、IVIS装置を使用して、蛍光癌細胞をイメージ化することにより確認された。注入後５日目に得られたIVISイメージは、腫瘍細胞の存在を示した。６日目、及び１２日目において、10M huMN-C2-scFv-CAR44 T細胞が動物に投与された。CAR T細胞の5Mが、腫瘍内注入で投与されそして別の5Mが、尾静脈注入によって投与された。対照群は、同じ投与経路によって、非形質導入T細胞の同じ数若しくはPBSの同じボリュームのいずれかを注入した。全身腫瘍組織量のIVIS測定は、7、11、13及び21日目で得られた。図91A-91Yで見ることができるように、コントロール・マウスの両方のグループは、連続的に成長した腫瘍を持っていた。しかし、ビーズ刺激されたhuMN-C2-scFv-CAR44 T細胞で処置されたマウスは、21日目で検知できる癌細胞を持たなかった。癌細胞刺激されたhuMN-C2-scFv-CAR44 T細胞で処置された、5匹のマウスの3匹で、21日目で検知できる癌細胞を持っていない。他の2匹のマウスには、21日目で残りの癌細胞がかろうじて検知できる数がある。
【０３３３】
ビーズ刺激(プロトコル１)若しくは癌細胞刺激 (プロトコル２)をされたhuMN-C2-scFv-CAR44形質導入ヒトT細胞が、動物での腫瘍成長阻害のそれらの能力に関してテストされた。ルシフェラーゼで安定して形質転換されたヒト癌細胞が、11及び15週間の年齢間で、雌のNOD/SCID/GAMMA(NSG)マウスに注入された。1つの実験では、500,000のBT-20 MUCl*癌細胞が、後部側面に皮下投与された。腫瘍移植は、ルシフェリンを動物に注入し、次に、IVIS装置を使用して、蛍光癌細胞をイメージ化することにより確認された。注入後6日目に得られたIVISイメージは、腫瘍細胞の存在を示した。6日目において、IVISイメージ化後、10M huMN-C2-scFv-CAR44 T細胞が動物に投与された。CAR T細胞の5Mが、腫瘍内注入で投与されそして別の5Mが、尾静脈注入によって投与された。対照群は、同じ投与経路によって、非形質導入T細胞の同じ数若しくはPBSの同じボリュームのいずれかを注入した。全身腫瘍組織量のIVIS測定は、6、8及び12日目で得られた。図92A-92Jで見ることができるように、huMN-C2-CAR44 T細胞で処置されたマウスの両方のグループは、対照群と比較して、全身腫瘍組織量の減少を示した。
【０３３４】
ビーズ刺激(プロトコル１)をされたhuMN-C2-scFv-CAR44形質導入ヒトT細胞が、動物での腫瘍成長阻害のそれらの能力に関してテストされた。ルシフェラーゼで安定して形質転換されたヒトSKOV-3 MUCl*陽性卵巣癌細胞が、11及び15週間の年齢間で、雌のNOD/SCID/GAMMA(NSG)マウスに注入された。1つの実験では、500,000のSKOV-3癌細胞が、後部側面に皮下投与された。腫瘍移植は、ルシフェリンを動物に注入し、次に、IVIS装置を使用して、蛍光癌細胞をイメージ化することにより確認された。注入後3日目に得られたIVISイメージは、腫瘍細胞の存在を示した。癌移植後、4及び11日目において、10M huMN-C2-scFv-CAR44 T細胞が動物に投与された。4日目にCAR T細胞が、IP注入で投与された。11日目において、CAR T細胞の半分が腹腔内のスペースに注入された。また、他方の半分は尾静脈に注入された。対照群は、同じ投与経路によって非形質導入T細胞の同じ数若しくはPBSの同じボリュームのいずれかを注入された。全身腫瘍組織量の後のIVIS測定は７日目、１０日目及び１5日目で得られた。図93A-93Lで見ることができるように、コントロール・マウスは、huMN-C2-CAR44 T細胞処理マウスよりはるかに速い速さで成長している腫瘍がある。図93Mは、色をつけるべき光子/秒に、関連づけるIVIS色スケールである。
【０３３５】
本発明の1つの態様は、MUCl若しくはMUCl*陽性癌と診断された、MUCl若しくはMUCl*陽性癌になるリスクを診断された、若しくはMUCl若しくはMUCl*陽性癌を持っていることが疑われる患者を処置する方法である。それはMUCl*標的化CARで形質導入された免疫細胞の有効量を投与することである。そこではCARは、以下からなるグループの中から選ばれる;
MN-E6-CD8-3z(SEQ ID NOS: 294-295);
MN-E6-CD4-3z(SEQ ID NOS: 746-747);
MN-E6-CD8-CD28-3z(SEQ ID NOS: 297-298);
MN-E6-CD4-CD28-3z(SEQ ID NOS: 748-749);
MN-E6-CD8-4-IBB-3z(SEQ ID NOS: 300-301);
MN-E6-CD4-4-IBB-3z(SEQ ID NOS: 750-751);
MN-E6-CD8-CD28-4-IBB-3z(SEQ ID NOS: 303-304);
MN-E6-CD4-CD28-4-IBB-3z(SEQ ID NOS:754-755);
MN-E6scFv-Fc-8-4-IBB-CD3z(SEQ ID NOS:310-311);
MN-E6scFv-IgD-Fc-8-4-IBB-CD3z(SEQ ID NOS:770-771);
MN-E6scFv-FcH-8-4-IBB-CD3z(SEQ ID NOS:315-316);
MN-E6scFv-IgD-FcH-8-4-IBB-CD3z(SEQ ID NOS:772-773);
MN-E6scFv-Fc-4-4-IBB-CD3z(SEQ ID NOS:318-319);
MN-E6scFv-FcH-4-4-IBB-CD3z(SEQ ID NOS:321-322);
MN-E6scFv-IgD-8-4-IBB-CD3z(SEQ ID NOS:323-324);
MN-E6scFv-IgD-4-4-IBB-CD3z(SEQ ID NOS:327-328);
MN-E6scFv-X4-8-4-IBB-CD3z(SEQ ID NOS:330-331);
MN-E6scFv-X4-4-4-IBB-CD3z(SEQ ID NOS:333-334);
MN-E6scFv-8-4-4-IBB-CD3z(SEQ ID NOS:336-337)、若しくは
MN-E6が、MN-C2、MN-C3若しくはMN-C8と取り替えられる上述のCARのいずれか;
MN-C2-CD8-3z(SEQ ID NOS: 606-607);
MN-C2-CD4-3z(SEQ ID NOS: 758-759);
MN-C2-CD8-CD28-3z(SEQ ID NOS: 608-609);
MN-C2-CD4-CD28-3z(SEQ ID NOS: 760-761);
MN-C2-CD8-4-IBB-3z(SEQ ID NOS: 610-611及びSEQ ID NOS: 718-719);
MN-C2-CD4-4-IBB-3z(SEQ ID NOS: 762-763);
MN-C2-CD8-CD28-4-IBB-3z(SEQ ID NOS:306-307);
MN-C2-CD4-CD28-4-IBB-3z(SEQ ID NOS:766-767);
MN-C2-Fc-84-IBB-CD3z(SEQ ID NOS: 732-733);
MN-C2IgD-Fc-8-4-IBB-CD3z(SEQ ID NOS:734-735);
MN-C2-FcH-8-4-IBB-CD3z(SEQ ID NOS:736-737);
MN-C2IgD-FcH-8-4-IBB-CD3z(SEQ ID NOS:738-739);
MN-C2IgD-8-4-IBB-CD3z(SEQ ID NOS: 740-741);
MN-C2-X4-84-IBB-CD3z(SEQ ID NOS: 742-743)。
MUCl若しくはMUCl*陽性癌と診断された、MUCl若しくはMUCl*陽性癌になるリスクを診断された、若しくはMUCl若しくはMUCl*陽性癌を持っていることが疑われる患者を処置する方法である。そこでは、有効な量の免疫細胞が投与され、それは前述のCARのうちの1つで形質導入されており、そこではMN-E6は、癌抗原に特異的である抗体可変領域断片を含むペプチドと取り替えられている。上記の方法では、免疫細胞はT細胞でありえ、さらに、治療される患者から、単離されえる。
【０３３６】
他のMUC1開裂サイト
【０３３７】
癌細胞に加えてのいくつかの正常細胞上で、成長因子リセプター形式、MUCl*に、MUC1が開裂されることは知られている。例えば、MUC1は、健康な幹及び先祖細胞でMUCl*に開裂される。骨髄細胞の大きな割合は、MUCl*陽性癌細胞である。腸の部分はMUCl*陽性である。
【０３３８】
本発明者は、互いに比較的接近している異なる位置でMUC1は開裂されうることを見出した。しかし、開裂の位置は、細胞外領域の残りの部分のフォールデイング（折り目）を変更する。その結果、最初の位置で開裂MUCl*に結合するが、別の位置で開裂MUCl*に結合しないモノクローナル抗体が同定されうる。この発見は、2013年8月14日にファイルされた、WO2014/028668に示される。それらの内容は、参照によってその全体がここに組込まれる。本願発明者等は、それが癌細胞に現われるように、MUCl*に結合するが、それが幹と先祖細胞に現われるように、MUCl*に結合しない1セットの抗MUCl*モノクローナル抗体を同定した。反対に、本願発明者等は、幹と先祖細胞に結合するが、癌細胞に結合しないモノクローナル抗体の第２のセットを同定した。幹特異的抗体を同定するために使用される1つの方法は以下のとおりである:
モノクローナルハイブリドーマからの上澄みは、2マルチウェルプレートに別々に吸着された。幹細胞、それらは非付着細胞である、は1つのプレートにのせられた。また、付着している癌細胞は、同一のプレートにのせられた。インキュベーションの後、プレートはすすがれ逆さまにされた。非付着幹細胞が、プレートにくっついた場合、その特別なウェルにあるモノクローナル抗体は、幹細胞を認識し、癌細胞を認識しない。癌細胞を捕らえた抗体若しくは幹細胞を捕らえなかった抗体は、癌特異抗体であると確認された。FACS分析は、この方法の有効性を確認した。
【０３３９】
抗体MN-E6及びMN-C2は、癌特異抗体の例である。抗体MN-C3及びMN-C8は、幹特異抗体の例である。抗体の両方のセットは、PSMGFR配列があるペプチドに結合されうるが、FACS分析は、抗MUCl*ポリクローナル抗体及びMN-C3がMUCl*陽性骨髄細胞に結合するが、MN-E6はしないことを示す。MUCl*ポリクローナル抗体はPSMGFRペプチドでウサギを免疫することにより生成された。同様に、MN-C3は腸クリプトの幹細胞に結合するが、MN-E6は結合しない。反対に、MN-E6抗体は癌組織に結合するが、幹特異MN-C3は結合しない。競合ELISA実験は、MN-C3及びMN-C8ではなく、MN-E6及びMN-C2結合に、PSMGFRペプチドのC-ターミナル10アミノ酸が必要であることを示す。したがって、癌特異的である抗体を識別する別の方法は、10N末端アミノ酸マイナスPSMGFRペプチドの配列があるペプチドで免疫すること、または癌特異的である抗体若しくは抗体断片をスクリーンするためのこのペプチドを使うことである。N-ターミナル10アミノ酸マイナスPSMGFRペプチドの配列をもつペプチドに結合するが、C-ターミナル10アミノ酸マイナスPSMGFRペプチドの配列をもつペプチドに結合しない抗体は、癌の治療若しくは予防において使用されうる癌特異抗体である。
【０３４０】
MUC1細胞外領域は、また、幹細胞及びいくつかの先祖細胞上で開裂する。ここで2量体のリガンドNME１若しくはNME７によって開裂されたMUC1の活性化は、成長と（多能化）pluripotencyを促進し、分化を阻害する。開裂後に残るMUC1の膜貫通の部分がMUCl*と呼ばれ、そして細胞外領域は、MUC1成長因子リセプターPSMGFR)配列の一次配列で本質的に構成される。しかしながら、開裂の正確なサイトは、細胞タイプ、組織タイプ若しくはある人が発現する若しくは過剰発現するどれか開裂酵素に依存して変わりうる。加えて、私たちが以前に同定した開裂サイト、それは、PSMGFR SEQ ID NO:2の大部分若しくはすべてを含み、MUCl*膜貫通部分を除去した。
他の開裂サイトは、配列
SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY(SEQID NO: 620)若しくは
SVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY(SEQ IDNO: 621)
の大部分で構成された拡張MUCl*に帰着する;
MUC1開裂のサイトは、残る細胞外領域がどのように折り重るかに影響する。
本願発明者等は、癌細胞で開裂MUCl*に結合するが、健康な幹及び先祖細胞に存在するように、開裂MUCl*に結合しないモノクローナル抗体を同定した。
【０３４１】
それがNMEl、NME6、NME8、NME7、若しくはNME7-ABのMUC1*への結合を競合的に阻害する場合、例えば、PSMGFR配列に結合する抗体、特に、該抗体がPSMGFRペプチドに結合することができない場合、10 C末端アミノ酸を欠く場合、抗MUCl*抗体若しくは抗体様分子はとても有効でありうるが、ペイロードを担持する抗体若しくは抗体様分子は、抗癌剤として有効であるために、MUCl*リガンドの結合を競合的に阻害する必要はない。例えば、毒素に接合する抗体若しくは抗体様分子は、活性化リガンドの結合を阻害する必要なしに、標的癌細胞の殺滅において有効になりえる。例えば、抗体断片が、NME6、NME8、NME7-AB若しくはNME7の結合を競合的に阻害しないような、MUCl*の部分を標的とするとしても、患者の腫瘍への免疫系を補充する、CAR T若しくはBiTEsに組み入れられた抗体若しくは抗体様分子は、抗癌剤として有効になりえる。好ましい態様では、CAR、適応性のある(adaptive)T細胞レセプター若しくはBiTEに組み入れられた抗体断片は、MUCl*への、NMEl、NME6、NME8、NME7-AB若しくはNME7の結合を競合的に阻害する。
【０３４２】
残存する膜貫通の部分の細胞外領域へ結合されうる抗体は、MUCl*細胞外領域及び活性化するリガンドの間の相互作用をブロックする、そしてこの方法で、治療薬として、例えば、癌の治療に使用されうる。さらに、抗MUCl*抗体は、生体外・生体内での幹細胞の成長、運送、同定若しくは単離に役立つ。
【０３４３】
MUC1*の細胞外領域を標的とする抗体、抗体断片及びCARを使用するための一般的な戦略
【０３４４】
モノクローナル抗体MN-C3及びMN-C8は、固形腫瘍癌細胞より血液細胞へ大きな結合親和性がある。MN-C3及びMN-C8の可変領域に由来した配列を含むヒト化抗体及び抗体断片は、スタンド・アロン治療と使用されえ、又は血液癌の治療用には、CAR Ts、BiTEs、ADCへ統合される。
【０３４５】
代替的に、MN-C3及びMN-C8の可変領域に由来した配列を含むヒト化抗体及び抗体断片は、イン・サイツ(in situ)ヒト治療薬のためのような、特定の位置に、幹細胞を運送するために使用されうる。1つのケースでは、ヒト化MN-C3若しくはMN-C8由来抗体若しくは抗体断片で覆われた基質が、幹細胞に載せられ、そして患者に挿入される。別の場合では、ヒト化MN-C3若しくはMN-C8由来抗体若しくは抗体断片で覆われた基質が、治療のために、特定のエリアへ、患者自身の幹細胞を補充するために患者に挿入される。ヒト幹細胞に結合する抗体が治療に役に立つヒト治療は、脊髄修復を含んでいる。ヒト化MN-C3若しくはMN-C8由来抗体若しくは抗体断片で覆われた基質は、抗体を同定・単離するために使われる。ヒト化MN-C3若しくはMN-C8由来抗体は、幹細胞の成長を促進するために使用されうる。
【０３４６】
CARs及び開裂酵素
【０３４７】
CAR T治療の多くの適用が、T細胞細胞膜と所望の位置にT細胞を向ける抗体断片の間の細胞外領域の長さ若しくは柔軟性によって制限される。例えば、固形腫瘍癌細胞の表面には、無数の細胞表面蛋白及び成長因子リセプターが存在する。これらの細胞表面蛋白の多くは、腫瘍細胞表面への、T細胞若しくはCAR T細胞のような免疫細胞のアクセスを制限するバルキーな細胞外領域がある。1例において、MUC1及び開裂された成長因子リセプター型MUCl*は、固形腫瘍癌の75%以上、及びいくつかの血液癌、で過剰発現される。全長MUC1細胞外領域は、約1,500アミノ酸と2,500アミノ酸の間を含んでいる。その一方で、MUCl*の細胞外領域は、約45アミノ酸〜65アミノ酸だけを含んでいる。全長MUC1の長さの変わりやすさは、発現される縦列反復ユニットの数の変わりやすさによる。MUC1が異なる開裂酵素によって開裂される場合、MUCl*の長さの変わりやすさは、異なる開裂サイトによる。癌細胞の表面に近いT細胞を得ることはとても望ましいが、アクセスは、大きくてかさばった細胞外領域を持っている、全長MUC1を含む、近隣のタンパク質によって、立体的に妨害されうる。これは、初期（段階）癌には特に真実である。組織研究は、初期（段階）癌が、任意の全長MUC1が欠けているかもしれない後期（段階）癌より、より全長MUC1を持っていることを示す。この問題は、ある場合には、厳しく、CAR T、適応性のあるT細胞治療、BiTEs及び他のT細胞エンゲガー(engager)を含む癌免疫療法の効能を制限する。
【０３４８】
この問題の1つの解決策は、腫瘍へのT細胞のアクセスを制限する、かさばったンパク質を開裂するためにターゲットとされた腫瘍細胞のエリアの開裂酵素を発現するか活性化することである。図94A-94Bは、腫瘍の近くに、MUC1*へMUC1を開裂する開裂酵素を発現する、CAR T細胞の漫画を示す。
【０３４９】
本発明の1つの態様では、開裂酵素及びCARは、同じT細胞へ形質導入される。本発明の別の態様では、開裂酵素が、CARが標的癌細胞に交戦するとき、その発現が活性化される誘導可能なプロモーター上にある。ある場合には、開裂酵素の発現が、誘導可能なプロモーターによってコントロールされる。本発明の1つの態様では、その標的を認識するか交戦する場合に、免疫細胞が例えば活性化される場合、開裂酵素の発現が引き起こされる。1例において、T細胞は、T細胞が標的癌細胞を認識する場合、その発現が引き起こされる開裂酵素が形質転換されるか形質導入される。これをする１つの方法は、NFATタンパク質が核に発現されるか移動させられる、時若しくはとすぐに、開裂酵素の発現を引き起こすことである。例えば、NFATプロモーター領域に由来した配列は、開裂酵素用の遺伝子の上流に置かれる。このように、NFATタンパク質のプロモーターに結合する転写調節因子が、NFATタンパク質の転写に結合し誘導するべき十分な濃度にある場合、それらは、さらに開裂酵素の転写のための配列の前に加工される同じそのプロモーターに結合する。NFATタンパク質は、NFATc2として知られるNFAT、NFATc若しくはNFATc 1として知られるNFAT2、NFATc4として知られるNFAT3、NFATc3として知られるNFAT4、又はNFAT5でありうる。本発明の1つの態様では、NFATはNFATc 1、NFATc3若しくはNFATc2である。本発明の1つの態様では、NFATはNFATc 1として知られるNFAT2である。SEQ ID NO: 646は、NFAT2のための上流転写調節領域の核酸配列である。NFAT遺伝子のためのプロモーター配列は、例えば、SEQ ID NO:781-783若しくはSEQ ID NO: 815の核酸配列を含みうる。しかし、開裂酵素の発現のための最適な配列若しくは最小の配列が、プロモーターの断片、拡張若しくは変異を作り、開裂酵素の発現に関してプロモーターの強さのテストすることにより、得られうることは理解可能である。本発明の1つの態様では、NFAT2のための転写調節領域は、開裂酵素MMP9(SEQ ID NO: 647)若しくはMMP9の触媒サブユニット(SEQ ID NO: 648)をコードする遺伝子の上流に加工がなされる。本発明の1つの態様では、NFATはNFATc3であり、また、NFATc3のプロモーター配列は、SEQ IDNO:816からの核酸配列を含んでいる。本発明の1つの態様では、NFATc3のための転写調節領域は、開裂酵素MMP9(SEQ ID NO: 647)若しくはMMP9の触媒サブユニット(SEQ IDNO: 648)をコードする遺伝子の上流に加工がなされる。本発明の別の態様では、NFATはNFATc2である。SEQ ID NO:817-818は、NFATc2のための上流転写調節領域の核酸配列を示す。本発明の1つの態様では、NFATc2のための転写調節領域は、開裂酵素MMP9(SEQ ID NO: 647)若しくはMMP9の触媒サブユニット(SEQ ID NO: 648)をコードする遺伝子の上流に加工がなされる。
【０３５０】
T細胞若しくはCAR T細胞が活性化される時、開裂酵素の発現を引き起こす別の方法は、NFATタンパク質がそれ自身開裂酵素の転写に結合し引き起こすところで、誘導可能なプロモーター上に開裂酵素用の遺伝子を持つことである。この場合、NFAT反応要素(NFAT RE)は、開裂酵素若しくは開裂酵素断片の遺伝子の上流に位置しうる。NFATは、開裂酵素の上流にその反応する要素に単独で若しくは複合体の一部として結合できる。NFATタンパク質は、NFATcl、NFATc2、NFATc3、NFATc4若しくはNFAT5でありうる。好ましい態様では、NFATタンパク質は、NFAT2 aka NFATcl、aka NFATcである。開裂酵素若しくはその断片の遺伝子は、NFAT-反応要素(SEQ ID NO:649)に下流にクローンされ、NFATタンパク質による開裂酵素の発現を引き起こすために、反応要素(SEQ ID NO: 650)及びCMV最小プロモーター(mCMV)(SEQ ID NO: 651)の反復でありえる。NFAT反応要素は、NFATコンセンサス配列(SEQ ID NO: 804)の核酸配列を含みうる。NFAT反応要素は、例えば、SEQ ID NOS: 805-814の核酸配列を含みうる、しかし、しかし、開裂酵素の発現のための最適な配列若しくは最小の配列が、反応要素核酸の断片、拡張若しくは変異を作り、開裂酵素の発現に関して反応要素の強さのテストすることにより、得られうることは理解可能である。Foxp3のエンハンサー領域は、さらに2079から2098(SEQ ID NO: 821)までの120-bpの内のNFAT反応要素を含んでいる。NFAT反応要素は、核酸NFATコンセンサス配列(5'-cattttttccat-3')(SEQ ID NO: 819)若しくは(5'-tttttcca-3’)(SEQ ID NO: 820)を含みえ、そのNFATclは、特異的にそれに結合し(Xu et al., Closely relatedT-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR. CD19-T cells andare preserved by IL-7 and IL-15, Blood 2014 123:3750-3759)る)結合し若しくはそれの繰り返しである。NFAT反応要素は、また、核酸スペーサー・配列によって単離されうる。他のNFAT反応要素は存在するかもしれないしさらに発見されるかもしれない、そして当業者は、NFAT反応要素を決定しようとする時、単なる実例にもかかわらず、少なくともSEQ ID NOS: NO804-814として述べられるような反応要素のガイダンスを与えられて、それを得るために分子の生物検定を実行することにより目的達成可能である。本発明の1つの態様では、NFAT反応要素及びCMV最小プロモーターの下流の開裂酵素は、MMP9(SEQ ID NO: 652)である。本発明の別の態様では、開裂酵素はMMP9の触媒サブユニット(SEQ IDNO: 653)である。
【０３５１】
NFAT 1-4は、calcineurinパスウェイによって制御されるので、患者で発生するかもしれない潜在的な毒性は、Calcineurin活性をブロックし、核へのNFAT転送を阻害するFK506、シクロスポリン、サイクロスポリンA、若しくはTacrolimusのような免疫抑制剤での治療によって止めることができる。誘導可能なプロモーター上に開裂酵素で形質導入されたか形質転換されたT細胞も、癌細胞上のタンパク質若しくは分子を認識するCARで形質転換若しくは形質導入されうる。特定の実施例において、開裂酵素は、MUC1全長を開裂することができるものであり、また、CARは、癌細胞の表面でMUCl*にそれを向ける抗体断片を担持する。
【０３５２】
どの開裂酵素が、癌細胞上のMUC1を開裂するかを決めるために、本願発明者等は、一連のMMPとADAMの酵素阻害剤をテストした。
これらの実験は、癌細胞中の重要な開裂酵素であるとしてMMP9を指摘した。MMP9が癌細胞上のMUC1を開裂することを確認するために、本願発明者等は、41縦列反復領域、HCT-MUC1-41TR、がある全長MUC1に模倣物で、HCT-116 MUC1陰性結腸癌細胞を形質転換した。単細胞クローニングによって、本願発明者等は、MUC1のみがMUCl*に最小に開裂されるこの細胞株を確立することができた。図95A-95Dは、HCT-MUC1-41 TRは、全長MUC1に95％陽性であり、開裂型MUC1*にはほんの5-10%陽性であることを示す、ウェスタンブロット及びFACS分析である。HCT-MUC1-41TR細胞は、濃度を変えて、MMP9で培養され、次に、得られたの細胞へのMN-C2モノクローナル抗体の結合を測定するために免疫蛍光検査法によって分析された。細胞へ添加されたMMP9の濃度の増加ように、図96A-96Eで見ることができるように、MN-C2の結合は増加した。これらの実験は、MMP9が、MN-C2によって認識される型へ、MUC1を開裂することを示す。私たちが行なったヒト癌組織アレイ研究(図69A-69D、図70A-70F、図71A-71F、図72A-72F、図73A-73F)は、MN-C2が、正常細胞若しくは組織でではなく癌組織に存在する、開裂MUC1の型を認識することを示す(図74A-74I)。重要なことには、MN-C2は、骨髄の健康な造血幹細胞上で発現される、開裂MUC1の型を認識しない。
【０３５３】
本発明の1つの態様では、免疫細胞は、腫瘍へ免疫細胞を標的化するCAR及び開裂酵素の両方で、形質導入される。CAR及び開裂酵素は、同じプラスミド、若しくは2つの異なるプラスミド上でコード化されうる。1つの態様では、開裂酵素が、誘導可能なプロモーター上にある。別の態様では、開裂酵素の発現は、免疫細胞が活性化される場合、発現されるタンパク質によって引き起こされる。1つのケースでは、開裂酵素の発現は、NFATタンパク質によって引き起こされる。別の態様では、開裂酵素の発現は、NFATclによって引き起こされる。別の態様では、NFATタンパク質のうちの1つが、開裂酵素若しくはそれの触媒活性断片の遺伝子の上流に挿入されるNFAT反応要素に結合する場合、開裂酵素の発現は引き起こされる。1つの態様では、開裂酵素は、MMP9若しくは触媒活性のあるMMP9の断片である。
【０３５４】
本発明の1つの態様では、開裂酵素はMMP9(SEQ ID NO: 643)である。いくつかの開裂酵素は、活性化される必要のある前駆体酵素として自然には発現される。これは生化学の手段によって、開裂酵素を活性化する補酵素の発現によって、若しくは活性型に酵素を加工することにより遂行されうる。本発明者は、その活性化剤と開裂酵素を共発現することによりこの問題を克服することを予想する。本発明の1つの態様では、開裂酵素はMMP9である。また、共活性化剤はMMP3である。本発明の別の態様では、開裂酵素は、例えば、なお触媒活性がある開裂酵素の断片の発現によるように、活性な型で発現される。1つのケースでは、開裂酵素は、触媒活性のあるMMP9断片である。MMP9触媒断片の1つの例は、SEQ ID NO:645として挙げられる。
【０３５５】
MMP9、それはMMP3によって活性化されなければならない、は、固形腫瘍で大きな割合中で過剰発現される。さらに、MMP9によって開裂された後、MN-C2抗MUCl*モノクローナル抗体は、MUC1を認識することは知られている。図69-73で示された、乳、卵巣、膵臓及び肺臓の癌アレイは、MN-C2-scFvでプローブされ、さらに、これらの癌のMUC1が、MMP9によって開裂されていることを示した。MMP9による腫瘍の開裂が、腫瘍へのT細胞アクセスを増加させるかどうか確かめるために、本願発明者等は、全長MUC1を発現する細胞株、HCT-MUC1-41TR、全長MUC1及びMUC1*の両方の高い発現をする乳癌細胞株及びMUC1*45で形質転換されたMUC1陰性細胞株を発現する細胞株を使用して、一連の実験を行った。本願発明者等は、MMP9とMMP3で細胞を形質転換した。それはMMP9を活性化する。本願発明者等は、それらの細胞、それらは活性化されたMMP9を含んでいた、の上澄みをとり、様々な細胞へそれを加えた。その後、それは抗MUCl* CAR、huMN-C2-CAR44、で形質導入されたT細胞と共培養された。結果は、MUC1開裂酵素と培養されなかったコントロール細胞にくらべ、標的MUC1/MUC1*陽性癌細胞がCAR T細胞殺滅を大きく増加させた。
【０３５６】
APMAは、MMPを活性化する生化学物質である。本願発明者等は、これらの開裂酵素が、全長MUC1を発現するHCT-MUC1-41TR細胞株上のMUC1を開裂するかどうかみるために、MMP9若しくはADAM17で形質転換した細胞の調整培地と共にAPMAを使用した。コントロールとして、本願発明者等は、さらにHCT-MUC1*細胞上の酵素をテストした。MUC1及びMUC1*発現細胞は、赤色色素、CMTMRで染色された。抗MUCl* CAR、CAR44若しくはCAR50で形質導入されたヒトT細胞は、癌細胞と共培養された。非形質導入T細胞は、コントロールとして使用された。図75B、75C及び75Dで見ることができるように、抗MUCl*CAR T細胞は、HCT-MUC1*癌細胞を認識し、クラスターした。それはT細胞活性化及び殺滅のサインである。しかしながら、CAR T細胞誘導クラスタリングは、HCT-MUC1-41 TR、全長MUC1発現細胞を含むウェルでは目視できない(図75F、75G及び75H)。しかしながら、の劇的な増加が引き起こした活性化MMP9と培養された細胞は、CAR T細胞クラスタリングのドラマティクな増加があった(図75J、75K及び751)、そして、これは、MMP9は、MN-C2モノクローナル抗体、より特異的にはhuMN-C2-scFvによって認識されるMUCl*型への全長MUC1を開裂した、ということを意味する。ADAM 17は、明白な効果がなかった。ADAM 17は、MUC1を開裂しなかった若しくはMN-C2によって認識されない位置でそれを開裂した。それはよりありそうである。
【０３５７】
本願発明者等は、おそらく、それらがMUC1*と同様にハイ・レベルに全長MUC1も発現するので、抗MUCl* CAR T細胞を使用して殺滅するのが難しかった、T47D乳癌細胞を使用して、今回同じ実験を行なった。図76B、76C、若しくは6Dで見ることができるように、抗MUCl* CAR44及びCAR50は、T47D癌細胞に効果がほとんどない。図76D、それはT細胞でCAR発現の最高水準のCAR44である、でのみ、本願発明者等は、少量のCAR T細胞誘導クラスタリングを確認できる。しかしながら、活性化MMP2(図76J、76K、76L)若しくは活性化MMP9(図76R、76S、76T)の存在は、CAR T細胞認識、クラスタリング、及び殺滅の劇的な増加を示し、そして、全長MUC1の開裂は、癌細胞へのT細胞アクセスを増加させる、ことを示す。
【０３５８】
別の例において、T47D MUC1陽性腫瘍細胞が、l00ng/mL若しくは500ng/mLのMMP9の組変え触媒領域(Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY)とインキュベートされた。ウェスタンブロット分析は、MUC1/MUC1*陽性癌細胞がMUCl*へのMUC1の広範囲な開裂をおこしたことを示した。別の例において、T47D乳癌細胞は、ヒト組み換えMMP9触媒領域タンパク質と前接触され、その後、抗MUCl* CAR44 T細胞と共培養した。CAR44 T細胞によるT47D細胞の特異的殺滅薬は、時間の関数として、インピーダンスを測定するxCelligence装置上でリアル・タイムにおいてモニターされた。この分析は、癌細胞が載せられた電極アレイを使用する。付着している癌細胞は電極を絶縁し、それらが成長するように、インピーダンスの増加を引き起こす。反対に、T細胞は付着せず、懸濁中に残存するので、インピーダンスを増加させたり、減少させたりしない。しかしながら、T細胞若しくはCAR T細胞が、電極プレート上の癌細胞を殺す場合、癌細胞は、球形化し、死滅体として浮かび、それはインピーダンスを減少させる。MMP9触媒領域の添加は、T47D癌細胞の殺滅を劇的に増加させた。図78は、コントロールとしての非形質導入T細胞又はhuMN-C2-CAR44 T細胞との、45時間にわたる、共培養のT47D乳癌細胞のxCelligenceグラフを示す。18時間の癌細胞生育の後、触媒サブユニットMMP9が、細胞のうちのいくつかへ添加された。25時間で、T細胞が添加された。見ることができるように、T47D細胞が開裂酵素MMP9と前培養される場合、huMN-C2-CAR44 T細胞殺滅は非常に改善される。xCelligenceシステムでは、標的癌細胞、それらは付着している、は電極アレイプレート上に載せられる。付着細胞は、電極を絶縁し、インピーダンスを増加させる。付着癌細胞の数は、インピーダンスに正比例する。T細胞は付着せず、インピーダンスに寄与しない。したがって、インピーダンスを増加させることは、癌細胞の成長を反映する。また、インピーダンスを減少させることは、癌細胞の殺滅を反映する。前立腺癌細胞株DU145は、MUC1及びMUCl*の両方を発現する、しかしT47D細胞よりはるかに低いレベルの発現である。DU145細胞は、開裂酵素がある状態若しくはない状態で、抗MUCl* CAR T細胞によって効率的に殺滅される。
【０３５９】
図79は、コントロールとしての非形質導入T細胞又はhuMN-C2-CAR44 T細胞との、45時間にわたる、共培養のDU145前立腺癌細胞のxCelligenceグラフを示す。18時間の癌細胞生育の後、触媒サブユニットMMP9は細胞のうちのいくつかへ添加された。25時間で、T細胞が添加された。見ることができるように、低密度MUC1/MUC1*陽性癌細胞のhuMN-C2-CAR44 T細胞殺滅は、開裂酵素MMP9との前インキューベションによって影響されない。DU145癌細胞は、MUCl*と同様に全長型も含んでいる著しくより低い量のMUC1を発現する。全長MUC1のより低い密度は、立体的に膜近位MUCl*へのT細胞アクセスを妨害しない。DU145細胞は、全長と開裂型MUC1の両方を発現する、しかしより低いレベルである、初期癌を表し、T細胞アクセスを、立体的に妨害しない。T47D細胞は、MUC1及びMUCl*の両方をハイレベルに発現する、中期癌を表わし、そこでは、全長MUC1の密度は、腫瘍へのT細胞アクセスを立体的に妨害する。HCT-MUCl*細胞は、MUC1*45で安定して形質転換されたMUC1陰性細胞株で、それは後期癌細胞を表わす。MMP9によってMUCl*に開裂されたMUC1が、抗MUCl*抗体MN-C2、それはCARの標的ヘッドである、によって認識されることは重要である。癌細胞表面上の腫瘍抗原への免疫細胞アクセスは、かさばった細胞外領域タンパク質若しくは腫瘍微小環境として知られている他の妨害要素の存在によって立体的に妨害されうる。上述の記載は、他の腫瘍抗原を標的とするCAR T治療の効能を改善するために拡張されうる実施例として役立つ。本発明の1つの態様では、免疫細胞は、腫瘍抗原を標的とする抗体断片を含むCAR及び開裂酵素の両方で形質転換されるか形質導入される。本発明の別の態様では、免疫細胞は、腫瘍抗原を標的とする抗体断片を含むCAR及びCARの抗体断片によって認識される型へ腫瘍抗原を開裂する開裂酵素の両方で形質転換されるか形質導入される。1つの態様では、免疫細胞は、腫瘍抗原を標的とする抗体断片を含むCAR及びCARの抗体断片によって認識される型へ腫瘍抗原を開裂する開裂酵素の両方で形質転換されるか形質導入され、ここで、CARの抗体断片は、MUCl*細胞外領域を認識し、そして、開裂酵素がMUC1をMUCl*に開裂する。1つの態様で、免疫細胞、それはT細胞若しくはNK細胞でありうる、は、MN-C2、MN-E6、MNC3若しくはMNC8に由来する抗体断片を含むCARで、及び、MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP16、ADAM9、ADAM 10、ADAM 17、ADAM 19、ADAMTS 16、ADAM28若しくはそれらの触媒活性断片のグループから選ばれた開裂酵素で、形質転換される若しくは形質導入される。
【０３６０】
MMP9の存在をテストする便利な方法は、例えば、OMNIMMPペプチド分析キットを使用して、蛍光性分析をおこなう。該キットはマスクされた蛍光団で誘導化されたMMP9基質であるペプチドをもつ。MMP9が、ペプチドを含んでいる溶液に添加される場合、MMP9は蛍光団を露出する位置でペプチドを開裂させ、蛍光はプレート・リーダで読むことができる。MMP-9活性は、相対的な蛍光ユニット(RFU)で読まれ、それは、328nmでサンプルを含んでいる各ウェルを賦活化するためにプレートリーダーセットに検出させる光の量と関係する任意の値であり、そして、393nmで蛍光を測定する。RFUの増加は、Gly-Leu結合の開裂、蛍光団の露出を示し、それゆえ、MMP-9の存在を示す。OMNIMMPペプチドの配列は、Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH2である。AcOH[Mca=(7-methoxycoumarin-4-yl)acetyl;Dpa=N-3-(2,4-dinitrophenyl)-L-a,P-diaminopropionyl]。図97は、MMP9触媒領域によって開裂され、蛍光を発する、MMP9のOMNIMMP蛍光性ペプチド基質のグラフを示す。MMP9触媒領域は、PBS、固体トレース、若しくは細胞培養培地、ダッシュトレース、での2つの濃度で添加された。この実験は、OMNIMMPペプチド分析が、それらが細胞増殖培地にあとしても、細胞によって分泌されたMMP9の活性を測定するであろうことを示す。
【０３６１】
NFATパスウェイの活性化を研究する方法は、IonomycinをもつPMAを使用して、該パスウェイを化学的に活性化することによりおこなわれる(Lyakh et al., Expression ofNFAT-Family proteins in normal human T cells, MOLECΜLAR AND CELLΜLAR BIOLOGY,Vol. 17, No. 5, May 1997, p. 2475-2484; Rao et al., Transcription factors ofthe NFAT family - Regμlation and function, Annu. Rev. Immunol. 1997. 15:707-47;Macian, NFAT proteins - Key regμlators of T-cell development and function,Nature Reviews Immunology, Vol. 5, pp 472-484 June (2005))。PMAとIonomycinが、NFATタンパク質の発現を引き起こすことが実証された。上記の引用された参照は、NFAT活性化の制御のスキームを示す。Ionomycinは、Calcineurin/カルモジュリン複合体を活性化するカルシウムを増加させる。Calcineurin/カルモジュリンは、それが標的遺伝子の転写を刺激するためにDNAに結合するところである、核に移動させられるためにNFAT(特にNFATcl)を脱燐する。NFATclは、T細胞活性化で核に移動させられる最初のNFATタンパク質のうちの1つである。また、それは、核を出る前に、単にそこに一時的にある。したがって、私たちがNFAT誘導可能開裂酵素で形質転換した若しくは形質導入した、細胞のPMAプラスIonomycin活性化は、生理学上適切で、ここに記述されたNFAT誘導可能開裂酵素の発現を点火する生体内T細胞活性化を模倣する。
【０３６２】
293tsA1609neoとしてもとは参照される、HEK293T細胞株(ヒト胚の腎臓細胞)は、ヒト胚腎臓293細胞の非常にトランスフェクト可能な誘導体で、SV40 T抗原を含んでいる。この細胞株は、複製のSV40領域を担持するベクターを複製するる能力がある。レトロウイルスを生産するために使用された時、それは高いタイター与える。それは、レトロウイルスの生産、遺伝子発現及びタンパク質生産に広く使用された。プラスミドがレンチウイルスベクターに挿入され、そしてヒトT細胞へ形質導入される前に、HEK293T細胞は、初期の実験のうちのいくつかで使用された。
【０３６３】
プラスミドは、構築され、そしてHEK293T細胞へ形質転換された。そこではMMP9触媒領域遺伝子は、3つ若しくは4つのNFAT反応要素の下流に挿入された。NFATパスウェイは、lμMか2μMのいずれかのIonomycin及びl0ng/mLのPMAの添加によって活性化された。NFAT反応要素3若しくは４反復を含んでいるプラスミドで形質転換された細胞からの溶解物、又は、細胞からの調整培地が、ウェスタンブロット法で、MMP9の存在について分析された。図98A-98Eで見ることができるように、MMP9の上流にNFAT反応要素を含み、NFATパスウェイはPMA/Ionomycinによって活性化されたか、細胞のみが、溶解物及び調整培地がMMP9検知可能であった。さらに、発現された若しくは分泌されたMMP9の量は、NFATパスウェイ活性化剤の濃度に比例した。本願発明者等は、次に溶解物からのMMP9、及びさらにそれがMMP9基質を開裂するのに活性であったか及び有能だったかを確かめるために調整培地へ分泌されたMMP9をテストした。図99A-99Bは、NFAT反応要素の４反復から下流MMP9遺伝子を含むプラスミドで形質転換されたHEK293T細胞の細胞溶解物若しくは調整培地によって、開裂されているMMP9の蛍光性ペプチド基質のグラフを示す。MMP9ペプチド基質分析は、PMA/ionomycinによるNFATパスウェイの活性化が、MMP9を発現し分泌されることを導き、そしてペプチド基質を開裂するその能力によって証拠づけられるようにそれが活性だったことを示す。
【０３６４】
さらに、本願発明者等は、MMP9遺伝子の前にある天然リーダー配列が不可欠かどうか、又は細胞からのその発現若しくは分泌を増加させるかもしれない他のリーダー配列とそれを取り替えることができるかどうかのテストをした。これらの次の実験は、他のリーダー配列と天然MMP9リーダー配列を取り替えることができることを示した。図100A-100Dは、MMP9の天然リーダー配列がIgKリーダー配列と取り替えられ、MMP9触媒領域はNFAT反応要素４反復の下流にある、HEK293T細胞で発現された、NFAT誘導MMP9触媒領域を示す。図100Aは、NFATパスウェイの活性化の後、細胞溶解物中にMMP9の発現を検知するウェスタンブロットの写真である。図100Bは、NFATパスウェイの活性化の後、調整培地中にMMP9の発現を検知するウェスタンブロットの写真である。図l00Cは、MMP9の天然リーダー配列がIgKリーダー配列と取り替えられており、MMP9触媒領域がNFAT反応要素4反復の下流にある、HEK293T細胞の調整培地中で発現され分泌されたMMP9触媒領域によるMMP9蛍光性ペプチド基質開裂のグラフを示す。図100Dは、MMP9の天然リーダー配列がIgKリーダー配列と取り替えられており、MMP9触媒領域がNFAT反応要素４反復の下流にある、HEK293T細胞の調整培地中で発現され分泌されたMMP9触媒領域によるMMP9蛍光性ペプチド基質開裂のグラフを示す。図101A-101Cは、MMP9は異なるリーダー配列で発現し、さらに、各々の後の活性を呈すことができる。図101Aは、MMP9遺伝子の上流のリーダー配列が、その天然配列若しくはIgK配列である、細胞溶解物でのMMP9タンパク質を検知するウェスタンブロットを示す。図101Bは、MMP9遺伝子の上流のリーダー配列が、その天然配列若しくはIgK配列である、調整培地でのMMP9を検知するウェスタンブロットを示す。図101Cは、発現されたMMP9によって開裂された、MMP9ペプチド基質のグラフを示す。
【０３６５】
発現されるか、T細胞活性化の後にだけ核に移動させられるタンパク質によって開裂酵素発現を引き起こす構築物を設計するために、反応要素の下流に、若しくはその開裂酵素のプロモーターに下流に、酵素遺伝子を持っていることは可能である。MMP9触媒領域用の遺伝子がNFATclのプロモーターの一部から下流に挿入された別のプラスミドが作られた。図102A-102Bは、で示される実験は、NFATclプロモーターなし若しくはNFAT反応要素4反復なしでの、MMP9発現レベルを比較する。それらは、両方のアプローチがうまく働くことを示す。図102A-102Bは、NFATclプロモーター配列がMMP9遺伝子、それはこの場合触媒領域を含む欠失MMP9である、の上流にあるNFATの誘導可能なMMP9を生産するプラスミドで形質転換された細胞3クローン4、6及び7をしめした。さらに比較のために、NFAT反応要素配列4反復がMMP9遺伝子の上流にある、NFAT誘導可能MMP9を生産するプラスミドで形質転換された細胞が示された。図102Aは、細胞溶解物にMMP9タンパク質を検出するウェスタンブロットを示す。図102Bは、調整培地にMMP9を検出するウェスタンブロット示す。図103A-103Bは、さらに、それらがペプチド蛍光分析のMMP9基質を開裂するように、透明溶解液中のMMP9及び調整培地中のMMP9が活性であることを示す。
【０３６６】
本願発明者等は、次にNFAT誘導可能なMMP9が、ヒトT細胞で機能するか、そして、それがT細胞活性化の後に特異的に発現され分泌されるかどうかのテストをした。これをテストするために、NFAT反応要素４反復をもつ構築物が、レンチウイルスベクターに組み入まれた。ヒトT細胞は、NFAT誘導可能なMMP9単独で、CAR44単独で、若しくはCAR44及びNFAT誘導可能なMMP9の両方で、形質導入された。ある場合には、形質導入されたT細胞が、抗CD3及び抗CD28で覆われたビーズでそれらをインキュベーションすることにより活性化された。それはT細胞を活性化すると知られている。他の場合では、形質導入されたT細胞は、合成MUCl*ペプチドを示すビーズと共培養することにより、又はHCT-MUC1*細胞のようなMUCl*陽性癌細胞と共培養することにより、活性化された。
【０３６７】
図104A-104Bは、MMP9の活性を測定するOMNIMMP9の蛍光性基質分析の結果を示す。NFAT誘導可能なMMP9で単独で若しくはCAR44との組み合わせで、形質導入されたヒトT細胞からの調整培地が、分析に添加され、そして、MMP9基質開裂が時間の関数として測定された。図104Aは、細胞がHCT-MUCl*癌細胞と共培養することにより活性化された後、ヒトT細胞にCAR44及びNFAT誘導可能なMMP9の両方で形質導入された時の、MMP9活性を示す。時間の関数として増加した基質開裂を示さないトレースは、活性化されなかった細胞からの調整培地である。図104Bは、細胞が、T細胞を活性化すると知られている抗CD3及び抗CD28で覆われたビーズと共培養することにより活性化された後、ヒトT細胞が、単に、NFAT誘導可能なMMP9で形質導入された時の、MMP9活性を示す。時間の関数として増加した基質開裂を示さないトレースは、活性化されなかった細胞からの調整培地である。図105A-105Eは、CAR44で単独で形質導入された、NFAT誘導可能なMMP9単独で、又はCAR44及びNFAT誘導可能なMMP9両方で、形質導入されたヒトT細胞のウェスタンブロットの写真を示し、ここで、得られたT細胞は、活性化されない、化学的にPMA/Ionomycinによって活性化された、合成MUCl*ペプチドを提示するビーズとの共培養することにより若しくはMUCl*陽性癌細胞と共培養することにより活性化された。ウェスタンブロットは、DYKタグ抗体として知られている抗フラグ・タグでプローブされた。MMP9触媒領域は、40kDaの明白な分子量で展開される。図105A-105Dは、明澄化細胞溶解物のウェスタンブロットの写真である。図105Aは、次の溶解物がレーン1〜7に載せられた:
レーン1: CAR44で形質導入されたT細胞、、活性化されなかった;
レーン2: CAR44で形質導入され、合成MUCl*細胞外領域ペプチドを提示するビーズで活性化されたT細胞;
レーン3: CAR44で形質導入され、HCT-MUCl*癌細胞との共培養によって活性化されたT細胞;
レーン4: CAR44及びNFAT誘導可能なMMP9で形質導入されたT細胞、しかし活性化されなかった;
レーン5: CAR44及びNFAT誘導可能なMMP9で形質導入され、合成MUCl*細胞外領域ペプチドを提示するビーズで活性化されたT細胞;
レーン6: CAR44及びNFAT誘導可能なMMP9で形質導入され、HCT-MUCl*癌細胞との共培養によって活性化されたT細胞;
レーン7: フラグDYKタグを担持する無関係のタンパク質。
結果は、NFAT誘導可能なMMP9のみで形質導入されたT細胞は、それらがPMA/Ionomycin、MUCl*ビーズ若しくはMUCl*陽性癌細胞によって活性化される場合、MMP9を発現する。
CAR44及びNFAT誘導可能なMMP9の両方のみで形質導入されたT細胞は、T細胞が、MUCl*ビーズ若しくはMUCl*陽性癌細胞での刺激によって活性化される場合、MMP9を発現する。
図105Bは、次の溶解物がレーン1〜7に載せられた:
レーン1: CAR44で形質導入されたT細胞、しかし活性化されなかった;
レーン2: CAR44で形質導入され、T細胞を活性化すると知られている抗CD3及び抗CD28抗体を示すビーズで活性化されたT細胞;
レーン3: CAR44で形質導入され、PMA/Ionomycinとの共培養によって活性化されたT細胞;
レーン4: NFAT誘導可能なMMP9で形質導入されたT細胞、しかし活性化されなかった;
レーン5: NFAT誘導可能なMMP9で形質導入され、抗CD3及び抗CD28抗体を示すビーズで活性化されたT細胞;
レーン6: NFAT誘導可能なMMP9で形質導入され、PMA/Ionomycinによって活性化されたT細胞;
レーン7: フラグDYKタグを担持する無関係のタンパク質。
図105C及び105Dは、それぞれ105A及び105Bと同じウェスタンブロットのより暗い露出である。
図105Eは、以下のように形質導入された細胞の細胞上澄みのウェスタンブロットの写真である:
レーン1: CAR44で形質導入されたT細胞、しかし活性化されなかった;
レーン2: CAR44で形質導入され、T細胞を活性化すると知られている抗CD3及び抗CD28抗体を示すビーズで活性化されたT細胞;
レーン3: CAR44で形質導入され、PMA/Ionomycinとの共培養によって活性化されたT細胞;
レーン4: NFAT誘導可能なMMP9で形質導入されたT細胞、しかし活性化されなかった;
レーン5: NFAT誘導可能なMMP9で形質導入され、抗CD3及び抗CD28抗体を示すビーズで活性化されたT細胞;
レーン6: NFAT誘導可能なMMP9で形質導入され、PMA/Ionomycinによって活性化されたT細胞;
レーン7: フラグDYKタグを担持する無関係のタンパク質。
結果は、NFAT誘導可能なMMP9で形質導入された、T細胞が、それらが活性化される時、MMP9を発現したことを示す。CAR44及びNFAT誘導可能なMMP9の両方で形質導入されたT細胞は、MUCl*を示すか発現するビーズまたはセルで共培養される場合、特異的に、活性化される(図105Aレーン5及びレーン6)。
【０３６８】
本発明の1つの態様では、癌である若しくは癌になる危険を診断された人は、CAR及び開裂酵素の両方で形質導入された十分な量の免疫細胞を投与される。本発明の別の態様では、癌である若しくは癌になる危険を診断された人は、CAR及び開裂酵素の両方で形質導入された十分な量の免疫細胞を投与される。ここで、該開裂酵素は、免疫細胞が活性化されるようになる場合に発現されるタンパク質によって活性化される誘導可能なプロモーター上にある。発明の別の態様では、癌若しくは癌になる危険でと診断された人は、CAR及び開裂酵素の両方が形質導入された十分な量の免疫細胞を投与される。ここで、開裂酵素は、1つ以上のNFATによって活性化される誘導可能なプロモーター上にある。1つのケースでは、NFATはNFATclである。別の態様では、NFATはNFATc3である。別の態様では、NFATはNFATc2である。
上記の実例では、CARの細胞外領域は、抗MUCl*抗体の断片を含む。1つの態様では、抗MUCl*抗体は、MN-C2scFv若しくはMN-C2scFvのヒト化型である。別の態様では、抗MUCl*抗体は、MN-E6scFv若しくはMN-E6scFvのヒト化型である。上記の実例では、免疫細胞は、T細胞、NK細胞、マスト細胞若しくは樹状細胞でありえる。
【０３６９】
本願発明は、活性化T細胞によって誘導された開裂酵素の発現を引き起こす、1つ若しくは2つの特定の方法に制限されることは意図されていない。本願発明者等は、NFATプロモーター配列の下流若しくはNFAT反応要素の一以上反復の下流に、開裂酵素遺伝子をもつプラスミドを構築することにより、T細胞活性化でのみ、開裂酵素の特異的発現を実証した。本発明の別の態様では、開裂酵素の発現は、開裂酵素遺伝子が、IL-2プロモーター配列の下流若しくはIL-2反応要素の下流に挿入され、次に、免疫細胞にプラスミドを挿入することで、おこなわれる。本発明の別の態様では、開裂酵素の発現は、開裂酵素遺伝子が、Calcineurinプロモーター配列の下流若しくはCalcineurin反応要素の下流に挿入され、プラスミドを構築し、次に、免疫細胞にプラスミドを挿入し、次に、それを癌の治療若しくは予防のための患者に投与することにより引き起こされる。開裂酵素の発現を引き起こすために使用されうる若しくは活性化T細胞の要素によって引き起こされた発現を止めるために使用されうる、さらに薬誘導可能なプラスミドがある。これらの薬誘導可能なシステムは、テトラサイクリン誘導可能なシステム、Tet-on、Tet-off、テトラサイクリン反応要素、ドキシサイクリン、タモキシフェン誘導可能なシステム、エクジソン誘導可能なシステム及びその他同種のものを含んでいる。
【０３７０】
CAR若しくは誘導可能な開裂酵素をコードするプラスミドで使用される、1若しくは2の特異的プロモーターに本願発明が制限されることは意図されていない。当業者に知られているように、SV40、PGK1、Ubc、CAG、TRE、UAS、Ac5、Polyhedron、CaMKIIa、GAL1、GAL 10、TEF1、GDS、ADH1、CaMV35S、Ubi、HI、及びU6のような多くのプロモーターが、互換性がある。MUC1-FLのようなかさばった細胞表面蛋白によって引き起こされる、CAR T細胞アクセスの立体障害の問題の別の解決策は、T細胞によって発現されるCARのリンカー領域の長さを増加させることである。標準設計CARでは、膜貫通の部分と抗体断片の間の細胞外のリンカー領域の長さは、約45-50のアミノ酸である。本願発明者等は細胞外のリンカーの長さが約50から217〜290のアミノ酸まで延長されるような、長い腕CARを作った。共培養分析は、より長い細胞外のリンカーを備えたCARが、標的癌細胞上の腫瘍関連抗原へのアクセスを改善したことを示す。この戦略の漫画は、図106A-106Eで示される。
【０３７１】
CARの公表された報告書は、一般に、膜貫通領域と抗体断片(scFv)の間のリンカーは、長さ45-50のアミノ酸であり、多くの場合CD8の細胞外領域の配列であるものを使用する。CAR 44は、抗MUCl* CARであり、そのリンカーはCD8の細胞外領域に由来し、長さ45のアミノ酸である。
長い腕のCARが、T細胞を、細胞表面の近くの腫瘍関連抗原により多きくアクセス可能にすることを実証するために、一連のCARを作成した。そこで、抗MUCl*抗体断片は、MN-C2 scFv(SEQ ID NO:655)で、それは可変長及び柔軟性のリンカーのパネルによって膜貫通領域に接続された。そこで、膜貫通領域は、CD8(SEQ ID NO: 657)であり、共刺激領域4-IBB(SEQ ID NO: 659)がつづき、そしてCD3-zeta(SEQ ID NO: 661)がつづく。
リンカーのパネルは、このモデルCARに組み入れられた。長さ232のアミノ酸であるIgGl Fc領域(SEQ ID NO:663)が、MN-C2 CAR(SEQ ID NO:665)のためのリンカーとして使用された。長さ290のアミノ酸であるIgD Fc領域(SEQ ID NO: 667)が、MN-C2 CAR(SEQ ID NO: 669)のためのリンカーとして使用された。長さ217のアミノ酸であるIgGlのヒンジがないFc領域リンカー(SEQ IDNO: 671)が、MN-C2 CAR(SEQ IDNO: 673)のためのリンカーとして使用された。長さで275のアミノ酸であるIgDヒンジがないFc領域リンカー(SEQ IDNO: 675)が、MN-C2 CAR(SEQ IDNO: 677)のためのリンカーとして使用された。長さ58のアミノ酸であるIgDリンカー(SEQ ID NO: 679)が、MN-C2 CAR(SEQ ID NO: 681)のためのリンカーとして使用された。長さ43のアミノ酸であるX4リンカー(SEQ ID NO: 683)が、MN-C2 CAR(SEQ ID NO: 685)のためのリンカーとして使用された。
【０３７２】
scFvと膜貫通領域の間の可変長リンカーを備えたこれらのCARは次のとおりである:
CAR15: huE6-IgDCD8-4-IBB-3z(SEQ ID NO:324);
CAR16: muE6-IgDCD8-4-IBB-3z(SEQ ID NO:823);
CAR17: muC2IgD-CD84-IBB-3z(SEQ ID NO: 825);
CAR18: huE6-Fc-CD84-IBB-3z(SEQ ID NO: 311);
CAR19: huE6-FcH-CD8-4-IBB-3z(SEQ ID NO:316);
CAR20: huE6-X4-CD84-IBB-3z(SEQ ID NO: 330);
CAR33: huE6-IgDCD44-IBB-3z(SEQ ID NO: 327);
CAR34: huE6-Fc-CD44-IBB-3z(SEQ ID NO: 319);
CAR35: huE6-FcH-CD44-IBB-3z(SEQ ID NO:321);
CAR36: huE6-X4-CD44-IBB-3z(SEQ ID NO: 334);
CAR39: muE6-CD28-CD28-CD28-3z(SEQ ID NO:827);
CAR40: muC2-CD28-CD28-CD28-3z(SEQ ID NO:829);
CAR53: huC2-Fc-CD84-IBB-3z(SEQ ID NO: 665と733);
CAR54: huC2-IgD+Fc-CD84-IBB-3z(SEQ ID NO:669と735);
CAR55: huC2-FcH-CD84-IBB-3z(SEQ ID NO: 673と737);
CAR56: huC2-IgD+FcH-CD8-4-IBB-3z(SEQ ID NO:677と739);
CAR57: huC2-IgDCD8-4-IBB-3z(SEQ ID NO: 681と741);
CAR58: huC2-X4-CD84-IBB-3z(SEQ ID NO: 685と743);
CAR63: huE6-IgD+Fc-CD8-4-IBB-3z(SEQ ID NO:771);
CAR64: huE6-IgD+FcH-CD8-4-IBB-3z(SEQ ID NO:773);
CAR42: hu CD19IgDCD8-4-IBB-3z(SEQ ID NO:831)。
これらの長いリンカーCARに関する追加の詳細は表1に示される。ヒトT細胞へ形質導入され、癌細胞と共培養された時について、表2は、CARのうちのいくつかの実験活性を示す。
【０３７３】
共培養実験では、長さを変える細胞外領域リンカーを備えた抗MUCl* CARsが、特異的に標的MUC1/MUC1*陽性癌細胞を殺すそれらの能力に関してテストされた。図107A-107Bで示されるxCELLigenceスキャンは、1つの実験の結果を示す。この実験で、長いリンカーCARがヒトT細胞に形質導入され、その後、T47D乳癌細胞と共培養させた。しかしながら、有効に標的癌細胞を殺さないように見えるCARのうちのいくつかは、単に効率的に発現されていなかったのかもしれない。別の実験が、CAR効能評価からCAR発現を分けるために行なわれた。HEK293付着細胞は、各々異なる長さのリンカーをもつCARのパネルで形質導入された。緑の細胞の量によって各CARの発現を測定することができるように、CARプラスミドはGFPマーカーを担持した。これらの細胞へ、MUCl*で安定して形質転換されたK562懸濁細胞を追加した。K562-MUC1*細胞は、赤色色素、CMTMRで染色された。洗浄ステップの後、黄色(緑プラス赤)であった細胞の量は、癌細胞上の標的腫瘍抗原を認識するCARの各々の能力を示すものである。図108A-108Hで見ることができるように、CARの発現レベルは非常に変わりうる。しかしながら、発現レベルというのは、容易に最適化され、問題とはならない。図108I-108Pを見る際に、黄色に見える細胞の数は、緑のままであるものに対して、どのCARリンカーが標的癌細胞上の他の表面分子の立体障害を克服するのに最良かに関してより多くの情報を与える。かなりの量の標的癌細胞は、CD8、IgGl FcH(hingeless)、IgD及びIgDFcH(hingeless)に由来したリンカーをもつCARのためのCAR発現細胞へ結合した。長さに加えて、これらのCARの中でテストされたリンカーは、それらの剛性において異なると予想される。
【０３７４】
表2は、長いリンカーCARのうちのいくつかで形質転換された、ヒトT細胞のためのサイトカイン・リリース・データを示す。
【０３７５】
本願発明者等は、固形腫瘍癌に対する効能を増加させた、「長い腕」のCARsが、MN-E6 scFv、MN-C2-scFv及び他の抗MUCl*抗体断片を含む腫瘍関連抗原を認識するあらゆる抗体断片によってガイドされうることに注目する。同様に、長い腕CARsの膜貫通部分は、CD8、CD4若しくは他の膜貫通領域に由来しうる。CARの細胞内尾部は、CD3-zeta及び他の共刺激領域を含むことができ、あるいは、CD28、4-IBB及びOX40を含むそれらの組み合わせを含むことができる。
【０３７６】
別の態様では、本願発明は、同じ免疫細胞へ形質転換された少なくとも2つの異なるプラスミドを含んでいる構成を志向する。そこでは1つ目は、腫瘍抗原に結合するペプチドもしくは抗体断片scFvを含むCARをコードする。また、他方は、CARでない遺伝子をコードする。ここで、CARでない遺伝子は、活性化された免疫細胞の要素によって活性化される誘導可能なプロモーターから発現する。
1つの態様では、免疫細胞は、T細胞若しくはNK細胞である。1つの態様では、CARは、MUCl*の細胞外領域へ結合するペプチド、抗体断片、若しくはscFvを含む。1つの態様では、CARは、MN-C2、MN-E6、MNC3若しくはMNC8に由来したscFvを含む。1つの態様では、非CAR種は開裂酵素である。1つの態様では、開裂酵素は、MMP2、MMP3、MMP9、MMP13、MMP14、MMP16、ADAM 10、ADAM 17、ADAM 28若しくはそれらの触媒活発断片である。別の態様では、非CAR種はサイトカインである。1つの態様では、サイトカインはIL-7である。1つの態様では、サイトカインはIL-15である。別の態様では、サイトカインはIL-7及びIL-15である。あるケースでは、非CAR種の発現は、活性化された免疫細胞の要素によって引き起こされる。1つの態様では、活性化された免疫細胞の要素はNFATである。1つの態様では、NFATはNFATcl、NFATc3若しくはNFATc2である。サイトカインIL-7及びIL-15は、T細胞持続性を促進する。発明の1つの態様では、上記免疫細胞は、癌の治療若しくは予防のためにの患者に投与される。発明の1つの態様では、癌はMUC1陽性癌若しくはMUCl*陽性癌である。
【０３７７】
別の態様では、本願発明は、同じ免疫細胞へ形質転換された少なくとも2つの異なるプラスミドを含んでいる構成を志向する。そこでは1つ目は、B細胞の表面上の抗原の細胞外領域へ結合するペプチド、抗体断片、若しくはscFvを含むCARをコードし、他方は、CARでない遺伝子をコードする。そこではCARでない遺伝子は、活性化された免疫細胞の要素によって活性化される誘導可能なプロモーターから発現する。1つの態様では、免疫細胞はT細胞若しくはNK細胞である。1つの態様では、CARは、CD 19に結合するペプチド、抗体断片、若しくはscFvを含む。1つの態様では、CARは、SEQ ID NO: 830-831に由来した配列を含む。別の態様では、抗体断片、scFv若しくはペプチドは、B細胞若しくはB細胞前駆体の表面抗原に結合する、若しくはCD 19、CD20、CD22、BCMA、CD30、CD138、CD123、CD33若しくはLeY抗原に結合する。1つの態様では、非CAR種は開裂酵素である。別の態様では、非CAR種はサイトカインである。1つの態様では、サイトカインはIL-7である。1つの態様では、サイトカインはIL-15である。別の態様では、サイトカインはIL-7及びIL-15である。あるケースで、非CAR種の発現では、活性化された免疫細胞の要素によって引き起こされる。1つの態様では、活性化された免疫細胞の要素はNFATである。1つの態様では、NFATはNFATcl、NFATc3若しくはNFATc2である。CARでない遺伝子は、その発現が活性化免疫細胞の要素によって引き起こされる誘導可能なプロモーターから発現する。1つの態様では、その構成で形質転換若しくは形質導入された免疫細胞は、癌の治療若しくは予防のために患者に投与される。1つのケースでは、癌は血液癌、リンパ腫若しくは血液癌である。
【０３７８】
本願発明は、コード化されたペプチド、活性化T細胞誘導可能なタンパク質、若しくはCARをコードする配列を含む遺伝子若しくはプラスミドを挿入する、特定の方法若しくは技術によって発明が制限される意図はない。例えば、ここに記述されたCARをコードする遺伝子及び活性化T細胞誘導遺伝子は、ウイルスを使用して、免疫細胞へウイルスで形質導入されうる。それは、受容細胞のゲノムへ統合されるCAR遺伝子になるかもしれないし、ならない場合もうる。ウイルス運搬システム及びウイルスベクターは、ガンマ・レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連性ウイルス、バキュロウイルス、ポックスウイルス、単純性疱疹ウイルス、腫瘍崩壊のウイルス、HF10、T-Vec及びその他同種のものを含むレトロウイルスを含んでいるがこれに制限されない。ウイルスの形質導入に加えて、ここに記述されたCAR及び活性化T細胞誘導遺伝子は、CRISPR技術、CRISPR-Cas9及び-CPF1、TALEN、Sleeping Beauty Transposn System及びSB 100Xのような方法を使い、受容細胞のゲノムへ直接結合されうる。
【０３７９】
MUC1-FLのようなかさばった細胞表面蛋白は、さらにBiTEsのために立体障害問題を引き起こす場合がある。BiTEは、1つの頭がT細胞に結合し、別の頭が腫瘍関連抗原に結合する、2-ヘッド2重特異的抗体である。このように、BiTEは、T細胞と腫瘍細胞ともにリンクする。T細胞に結合する抗体は、T細胞を活性化する、OKT3 scFv(SEQ ID NO: 687)若しくはCD28のようなCD3に対する抗体のような、抗体であるべきである。立体障害問題の解決には、T細胞特異的抗体と腫瘍特異的抗体間のリンカーが延長される。拡張リンカー抗-CD3リンカー抗MUCl*をもつBiTEsの例は、SEQ ID NOS:689、691、693、695、697及び699として示される。
【０３８０】
本発明の別の態様では、抗MUCl*単一鎖分子は、開裂酵素若しくは開裂酵素の触媒活性断片に結合される。本発明の1つの態様では、開裂酵素はMMP9(SEQ ID NO: 701)である。本発明の別の態様では、酵素はMMP9(SEQ ID NO: 703)の触媒活性断片である。ある場合には、CARの抗体断片は、その特定の開裂酵素によって開裂された時に、MUCl*を認識するその能力のよって選定される。1つの具体化では、開裂酵素は、MMP9、MMP3、MMP14、MMP2、ADAM 17、ADAM  TS 16及び/又はADAM 28である。
1つの態様では、抗体若しくは抗体断片は、以下の配列をもつペプチドに結合する；
SEQ ID NO:2(PSMGFR)、
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA、
PSMGFR N-10、
QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA、若しくは
PSMGFR N+18
SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA。
「PSMGFR N+18」は、SEQ ID NO: 1のMUC1リセプター内のPSMGFRセグメントのN-端末に18アミノ酸残基が加えられたMUC1リセプターの断片を指す。別の具体化では、開裂酵素MMP9及びMMP3は、MN-C2の断片である抗体断片をもつCARで形質導入されたT細胞へ形質導入される。
【０３８１】
本願発明に関しての実験を実行するのに使用される方法
【０３８２】
1．レンチウイルス生産及び免疫細胞のウイルス形質導入
【０３８３】
HEK293またはHEK293Tの細胞(ATCC)が、レンチウイルスを生産するために使用された。形質転換の前の日、プレート（６ウェルプレート）が、ポリDリジンでコートされ、細胞密度が5%CO2大気中で、形質転換及び培養の時に、細胞密度が90-95%に達するように、細胞が植え付けられた。翌日、細胞は、Lipofectamine 3000(Lifetechnologies)及びOpti-MEMTM還元血清培地で、製造マニュアルに従い形質転換された (lentiviral発現ベクターの0.75μg及びpPACKHlパッケージング・ミックスの2.25μgが使用された)。6hのインキュベーションの後に、培地は変更された。また、レンチウイルスを含んでいる培地は、24及び48時間の後に回収された。レンチウイルスは、Lenti-Xコンセントレータ(Clontech)で濃度された。また、タイターは、Lenti-X p@4、迅速タイターキット(Clontech)を使い計算された。レンチウイルスは、単一使用アリクオットに、-80℃で保存した。
【０３８４】
2.  CARを含む構築物をもつ免疫細胞の形質導入
【０３８５】
ヒトT細胞が、冷凍、100-200ユニットのIL-2及びTexMACS培地、20ml、で溶かされ、あらかじめ暖められ、遠心分離によってペレットにした。細胞は10mlの培地で再懸濁され、37℃、5%CO2において、1x106細胞s/mlで、抗CD 3 /anti-CD28ビーズ(TransActキット)を含む完全培地で培養された。
【０３８６】
培養4日後に、細胞が数えられた。また、細胞懸濁液の450μlが、ほぼ1x106cells/mlの密度で、24ウェルプレートの単一ウェルに置かれた。細胞は、定着された。150μlが、各ウェルのトップから注意深く取り除かれた。各ウェルに、1ウェルあたり最終全容積が450μlになるように、150μl において、10μg/mlの終濃度で硫酸プロタミンを含む、プレインTexMACS培地で希釈されたレンチウイルスベクターの適切な稀釈液が、添加された。その後、24時間インキュベーションされた。形質導入された細胞は除去され、遠心分離によってペレットにし、そして、新鮮培地に、細胞密度が1.0x106cells/mlを超過しないように細胞密度を調節して、再懸濁した。形質導入されたT細胞は拡張し凍結する、若しくは直接使用されうる。典型的に形質導入されたT細胞が、使用される若しくはIL-2とTransAct培地での活性化後７日目と20日目の間冷凍した。
【０３８７】
3．いくつかの抗MUCl* CARでのCAR T細胞活性の比較
【０３８８】
ヒトT細胞(ALLCELLS)が、抗MUCl* CAR18、CAR 19、CAR44、CAR49、CAR44とCAR49、若しくはCAR50で形質導入された。構築されたCARはすべてGFPマーカーをもち、そのためCAR T細胞は緑で、非形質導入T細胞(図80A)はクリアである。CAR 18は、huMN-E6scFv-FcCD84-IBB-3zである。CAR19は、scFv及び膜貫通領域の間のリンカー用のFc領域の一部の代わり以外は同じで、CAR 19はヒンジ部分が変異されたFc領域をもつ。CAR44は、huMN-C2-scFv-CD8-CD8(transmemnbrane4-IBB-3z)である。CAR49は、CAR44がCD8リーダー配列をもち、CAR49はIgKリーダー配列を持つ以外、CAR44と同じである。CAR50は、CAR50がネズミMN-C2-scFv及びCD4膜貫通領域をもつ以外は、CAR44と同じである。表1は、各CAR構築物の詳細を示す。
その後、CAR T細胞は、mCherry(赤)で安定して形質転換されたHCT-MUCl*癌細胞と18時間インキュベートされた。
T細胞が標的細胞を認識する場合、それらは標的細胞をクラスター化し、それらを殺し始める。図80A-80Fで見ることができるように、緑のCART細胞が、標的MUCl*陽性癌細胞を、効果的にクラスター化し、殺滅した。
【０３８９】
4． MUC1*陽性癌細胞に「破滅のもと：Kissof Death」を与えるCAR T細胞の共焦点画像解析。
【０３９０】
CAR44で形質導入されたヒトT細胞は、GFP(緑)で安定して形質転換されたMUCl*陽性癌細胞と、24時間共培養された。細胞は、すべてDAPI(青)で染色された。Granzyme Bは、蛍光団で染色された。T細胞活性化の後、標的癌細胞中で穴を作っていると思われるパーフォリン（perforin）を発現する。その後、T細胞は、granzyme B(黄色)をもつ癌細胞に注入した。それは、その後、癌細胞溶解に帰着するアポトーシス経路を引き起こす。図81A-81Dは、MUCl*陽性及びGFP陽性(緑)DU145前立腺癌細胞へ、granzyme B(黄色)を注入する、ヒトhuMN-C2-CAR44 T細胞の写真である。図81Aは、4Xに拡大された写真である。図81Bは、20Xに拡大された写真である。図81Cは、20Xに拡大された写真である。図81Dは、40Xに拡大された写真である。 
【０３９１】
5． FACS分析による、MUC1*陽性癌細胞のCAR T細胞誘導殺滅の分析
【０３９２】
図82A-82Bは、T47D MUC1*陽性乳癌細胞に対するhuMN-C2-CAR44 T細胞の殺滅効果を示し、そこでは、乳癌細胞は、付加的なMUCl*の量を増加し形質転換された。見ることができるように、細胞上で発現された標的MUCl*の量が増加すると、huMN-C2-CAR44T細胞の殺滅効果は増加する。図82Aは、FACSによって測定される、標的細胞殺滅のグラフである。図82Bは、ELISA分析のグラフで、それにおいて、 T47D細胞との共培養での、huMN-C2-CAR44 T細胞からの上澄みについて、T細胞活性化の表れである、分泌されたインターフェロンγの存在を追跡した。
【０３９３】
FACSによる細胞毒性を分析する多くの方法がある。この実施例において、ヒトT細胞が、標準プロトコルによって、全血から単離された。その後、T細胞は、GFPタグをもつCAR構築物を担持するレンチウイルスで別々に2度形質導入された。RPMI10%FBS及びIL-2での培養2-3日間に続いて、細胞は、MN-E6、MN-C2、MN-C3及びMN-C8の表面発現にラベルを付けるために、F(ab’)2で染色された。その後、細胞は、Fab陽性及びGFP陽性の細胞のための、フローサイトメトリーによってソートされた。それは、2倍の陽性数が挿入されたCARをもち、CARが正確な抗体断片を露出したことを意味する。そして、CAR T細胞は、MUCl*陰性のコントロール細胞若しくは標的MUCl*陽性癌細胞と、混合する準備ができた。
【０３９４】
標的細胞は以下のように準備された:標的細胞を回収し、そして、1〜1.5xl06細胞/mLで、CMTMr染料(CellTracker Orange, 5-and-6-4-chloromethyl benzoyl amino tetramethylrhodamine,Thermo Fisher)の15μMを含んでいる無血清培地で細胞を再懸濁した。特定の細胞タイプに適切な成長条件下、30分間インキュベーション。培養培地で洗って、新しいチューブに染色された細胞を移し、培地中で細胞を60min培養。超過染料をすべて取り除くために、培養培地でさらに2度洗浄。0.5mlの培地全容積で、24ウェルプレートでの分析をセットアップ。ウェルあたり常に20,000個の細胞（20,000細胞/250μl)であるように、標的細胞及びコントロール標的細胞を再懸濁。各ウェルに、250μlに置く。T細胞の250μlを添加し、結果、T細胞：標的細胞の比率は、=20: 1と10: 1と5: 1または1: 1．である。24h 及び72hの後に細胞を分析する。懸濁標的細胞について、ウェルから0.5mlの培地を取り、チューブに置き、0.5mlの培地若しくはPBSでウェルを洗浄する。接着標的細胞については、ウェルから0.5mlの培地を取り、チューブに置き、0.5mlのPBSでウェルを洗浄する。同じチューブにPBSを加え、ウェルに120μlトリプシンを加える。そして、4分間インキュベーションし、その後、トリプシンを中和するために0.5mlの培地を加え、同様にチューブにそれを置く。細胞をスピンさせ、l00μl FACSバッファーにペレットを再懸濁する。再び細胞をスピンさせる。T細胞染色のために、細胞を、氷中30分間、l00μlバッファー+5μl抗CD3抗体に再懸濁する。30分後、FACSバッファーで2度染色された細胞を洗い、250μlバッファーに再懸濁する。FACSチューブのフイルタ・キャップを通して細胞をランスルーさせる。分析10分前、各チューブに10μl 7AA-D染料を加え、細胞毒性テンプレート下のFortessaで分析する。図83A-83Dは、MUCl*陽性癌細胞と24時間の共培養の後における、huMN-C2-CAR44T細胞のFACS分析の結果を示す。図83Aは、非形質導入T細胞(赤棒)に比較しての、huMN-C2-CAR44 T細胞(青棒)によって殺されたT47D癌細胞のパーセンテージを示すFACSデータのグラフである。X軸は、癌細胞に対するT細胞の比率を示す。図83Bは、FACSデータのグラフで、それは非形質導入T細胞(赤棒)に比較しての、huMN-C2-CAR44T細胞(青棒)によって殺された、K562-MUC1*癌細胞のパーセンテージを示す。図83Cは、T47D乳癌細胞が、染料CMTMRで染色されたFACSスキャンを示す。Sytox Blueは、死細胞の染色である。死んでいる癌細胞は、四分円2及び3のものである。図83Dは、K562-MUC1*癌細胞が、染料CMTMRで染色されたFACSスキャンを示す。Sytox Blueは、死細胞の染色である。死んでいる癌細胞は四分円2及び3のものである。
【０３９５】
培地へのIFN-γの分泌は、ヒトIFN-γELISAキット(Biolegend) を使用して、測定された。プレートは抗IFN-γ抗体で、コートされた(捕捉抗体、コーテイングバッファーに１X)。4℃で、一夜インキュベーションの後、プレートは、PBS-Tで４回洗われた。また、ブロッキング溶液が、ウェル上の残りの結合部位をブロックするために添加された。RT(500rpmでシェーキング)1時間後、プレートは、PBS-Tで4度洗浄され、コンデイション化培地(CM)及びIFN-γ標準が添加された。シェーキングでのRTの2h後、プレートは、PBS-Tでの４度洗浄後、検出用抗体(lx)が、添加された。シェーキングでのRTの1時間後、プレートは、PBS-Tで４回洗われ、そして、アビデイン-HRP(lx)が添加された。シェーキングでのRTの30分後、プレートは、PBS-Tで5回洗浄(各洗浄は1分間浸された)し、そして、TMB基質溶液が添加された。反応は、停止溶液加えて、20分後に停止させ、停止後15分以内に、450nm(570nmでのマイナスの吸光度)の吸光度をよんだ。
【０３９６】
6．xCELLigenceによる、MUC1*陽性癌細胞のCAR T細胞誘導殺滅の分析
【０３９７】
FACS分析に加えて、いまや、多くの研究者が、癌細胞のCAR T殺滅を測定するために、xCELLigence装置を使用する。xCELLigence装置は、その上に癌細胞が置かれた、電極アレイを使用する。付着癌細胞は、電極を絶縁し、それらが成長するにしたがって、インピーダンスの増加を引き起こす。反対に、T細胞は付着せず、懸濁中に残り、その結果、インピーダンスを増加させる電極の絶縁に寄与しない。しかしながら、T細胞若しくはCAR T細胞が、電極プレート上の癌細胞を殺す場合、癌細胞はボールアップし、それらの死に伴い、遊離し、インピーダンスを減少させる。xCELLigence装置は、時間の関数としてインピーダンスを測定する。それは癌細胞殺滅に関連づけられる。さらに、電極プレートには、観察ウインドウがある。CAR T細胞が吸着された標的癌細胞を有効に殺す場合、インピーダンスに減少があり、また、人は、癌細胞がプレート表面上に残されていないことが確認できる。
【０３９８】
ほとんどのXCELLigence実験では、5,000癌細胞が、96ウェル電極アレイプレートにウェルごとに植えつけられた。細胞は、24時間付着し成長させた。その後、CART細胞は以下のターゲット比率(E: T)でエフェクターに添加された；0.5:1、1: 1、2: 1、5:1、10: 1、そしてまれに、20: 1。E: T比率は、実際の形質導入効率が40%である場合に、T細胞へのCARの100%形質導入を仮定するものである。
【０３９９】
xCELLigence装置は、時間の関数としてインピーダンスを記録する。また、実験は7日まで続くことができる。
【０４００】
図78、図79、図84H、図85H、図86A-86C、図89A-89C、図90A-90D及び図107A-107Bは、すべて、xCELLigence装置上で行なわれたCAR T及び癌細胞実験の結果を示す。
【０４０１】
7．ヒト腫瘍担持マウスでの、抗MUCl* CAR T細胞治療
【０４０２】
8-12週齢の雌のNOD/SCID/GAMMA(NSG)マウスに、500,000のヒト癌細胞が注入された。そこでは癌細胞は、ルシフェラーゼで安定して形質転換された。ルシフェラーゼ陽性細胞を担持するマウスは、画像化直前に酵素基質ルシフェリンを注入され、それは癌細胞に蛍光を発させる。癌細胞は、IVIS装置上で、ルシフェリン注入の後10-15分以内に、生存マウスで画像化される。読み出しは、毎秒当たりの流出若しくは光子である。腫瘍は、IVISによって明瞭に可視できるまで、植え付けられた。
【０４０３】
図91A-91Yは、IVIS装置上で得られた、マウスの蛍光写真を表わす。免疫不全マウスNSG(NOD/SCID/GAMMA)に、０日目で腹側面皮下に、ルシフェラーゼで安定して形質転換された、500,000のヒトMUCl*陽性癌細胞が移植された。腫瘍は、植え付けに成功した。IVIS測定の後5日目及び１２日目において、動物は、huMN-C2-scFv-CAR44で形質導入されたヒトT細胞若しくは非形質導入T細胞若しくはPBSの1000万を注入された。500万のT細胞は、腫瘍内に注入され。また、500万のT細胞が尾静脈に注入された。IVIS写真の10分前に、マウスは、ルシフェリンを腹腔内に(IP)注入され、それはルシフェラーゼによって開裂の後に蛍光を発し、腫瘍細胞に蛍光を発させる。
【０４０４】
図92A-92Jは、IVIS装置上で得られたマウスの蛍光写真を表わす。免疫不全マウスNSG(NOD/SCID/GAMMA)に、０日目で腹側面皮下に、ルシフェラーゼで安定して形質転換された、MUCl*陽性3倍陰性癌細胞株である、500KのヒトBT-20細胞が移植された。腫瘍は、植え付けに成功した。IVIS測定の後6日目に、動物は、huMN-C2-scFv-CAR44で形質導入されたヒトT細胞若しくは非形質導入T細胞の1000万を一回注入された。500万のT細胞は腫瘍内に注入され。また、500万は尾静脈に注入された。IVIS写真の10分前に、マウスはルシフェリンをIP注入された。
【０４０５】
図93A-93Hは、IVIS装置上で得られたマウスの蛍光写真を表わす。免疫不全マウスNSG(NOD/SCID/GAMMA)に、０日目で腹側面皮下に、ルシフェラーゼで安定して形質転換された、MUCl*陽性卵巣癌細胞株である、500KのヒトSKOV-3細胞が移植された。腫瘍は、植え付けに成功した。IVIS測定の後3日目に、動物は、huMN-C2-scFv-CAR44で形質導入されたヒトT細胞若しくは非形質導入T細胞若しくはPBSの10Mを注入された。動物は、7日目で、再度IVISイメージ化された。IVIS写真の10分前に、マウスはルシフェリンをIP注入された。
【０４０６】
8． MMP9処置細胞の共焦点分析
【０４０７】
安定して全長MUC1を発現するHCT-MUCl-18細胞として知られているHCT-MUC1-41が、DMEM+10%FCSで、6チャンネルu-スライドVI0.4(Ibidi(WI))に植え付けられた。48h後に、細胞は、PBS pH 7.4の120μLで洗浄され、そして、無血清培地(DMEM)で希釈された、MMP9触媒領域(EnzoLife Science,NY)が、異なる濃度(0、12.5、25、50及び100ng/mLの40 μl)で、添加された。CO2インキュベータで37℃lhの後、細胞は、冷PBS pH7.4の120 μlで2度洗われ、8分間４%PFA(30 μl)に固定された。細胞は、冷PBSpH 7.4で3回洗われ、シェーキングにより、4℃30分間、PBS pH 7.4(40μl)に5%BSA溶液でブロックされた。冷PBS pH 7.4(lx)と細胞を洗った後に、細胞は、PBS pH 7.4(100 μl)で希釈されたMN-C2の125 μg/mLと４℃(シェーキングによる)で夜通し培養された。次の日、細胞は、120μlのPBS pH 7.4で３X洗浄され、PBS pH 7.4 (100μl、1:200)で希釈された、ヤギ抗マウスIgG PE(Biolegend(CA))と４℃2時間インキュベート(シェーキングによる)された。インキュベーションの後、細胞は、PBS pH 7.4の120 μlでlx洗浄し、そして、PBS pH7.4+2.5μMヘキスト33342の120μlで2x洗浄した。最後に、細胞は、IbidiMountingMedia (Ibidi(WI))でマウントされた。結果は、MMP9添加が、抗MUCl*モノクローナル抗体MN-C2によって認識された、MUCl*型へ、全長MUC1の開裂を引き起こしたことを示す(図96A-96E)。これは、MMP9が、MN-C2によって認識されるサイトでMUC1を開裂することを示す。
【０４０８】
9． NFAT誘導MMP9触媒領域発現
【０４０９】
MMP9触媒領域が後続するNFATclプロモーター若しくはNFAT反応要素の４反復を含むベクターが、トランシエントリーに、メーカー・マニュアルに従い、Lipofectamine3000(ThermoFisherScientific、MA)でHEK293TN細胞(SystemBioscience,CA)へ形質転換された。24-30hの後、培地は、DMEM+1%FBS+l0ng/mL PMA(CaymanChemical(MI))及びIonomycin(1-6μM（CaymanChemical(MI)）に変更された。培地と細胞は、分析のために18hインキュベーション後に集められた。
【０４１０】
MMP9の発現及び分泌は、次のプロトコルによって、細胞溶解物と調整培地のウェスタンブロット分析によって確認された。細胞は、溶解バッファー(50mMトリス、150mM NaCl及び1%のトリトンXI 00)で、氷上20分間で溶解された。ウェスタンブロットのために、タンパク質のl00μgがゲル電気泳動(4-15% Mini-PROTEAN&reg; TGX&#8482;Precast Protein Gels, BioRad, CA)によって単離され、次いで、PVDF膜(BioRAD (CA))に移された。膜は、PBS-Tで簡単にすすがれ、次に、3%の無脂肪牛乳(BioRAD(CA))の溶液で室温にてlhブロックされた。フラグタグ化タンパク質のために、膜は、素早く洗浄され、そして、室温で2時間、1%無脂肪牛乳(1:2000)で希釈されたウサギ抗DYKDDDDKエピトープ・タグ抗体(Biolegend(CA))が、インキュベートされた。Hisタグ化タンパク質については、膜は素早く洗浄され、1%の無脂肪牛乳(1: 10000)で希釈されたウサギ抗6X Hisタグ抗体HRP(Abcam,MA)と室温で1hrインキュベートされた。フラグタグ化タンパク質のために、膜は、PBS-Tで10分間3回洗浄され、室温でlh、1%脱脂乳(1:2500)で希釈されたヤギ抗ウサギHRP抗体でインキュベートされた。Hisタグ化タンパク質ために及びフラグタグ化タンパク質ために第2抗体インキュベーション後、膜は、Clarity&#8482; Western ECL Substrate (BioRad, CA)を使ったPBS-Tと、10分間3度洗浄後、プロセスされた。
【０４１１】
ある場合には、タンパク質は、分析の前に、最初に免疫沈殿させられた。フラグタグ化MMP9触媒領域が、メーカー・マニュアルに従い、抗DYKDDDDKタグ(L5)親和ゲル(Biolegend(CA))を使用する調整培地(〜2mL)から、免疫沈殿させられた。プルダウンされたタンパク質が、ウェスタンブロット分析若しくは開裂分析に使用された。
【０４１２】
図98A-98Fは、、形質転換されたMMP9構築物を認識する抗体でプローブされた細胞溶解物のウェスタンブロットの写真である。プラスミドは構築され、次いで、HEK293T細胞へ形質転換された。そこではMMP9触媒領域用の遺伝子は、3つ若しくは4つのNFAT反応要素の下流に挿入された。NFATパスウェイは、コントロール(ctl)細胞以外において、lμM若しくは2μMのIonomycin及びl0ng/mLのPMAの添加によって活性化された。プルダウンは、MMP9構築物のC末端に組込まれたフラグ・タグを認識する抗体を結合されたビーズを使い行われた。
レーン1は、分子量コントロールを示す。レーン2、3、4及び5は、抗フラグ・タグビーズから溶出されたMMP9を示す。レーン2及び3は、第1の溶出物であり、また、レーン4及び5に示される細胞は、第2の溶出物である。レーン2と4へ、細胞からの調整培地が乗せられ、そこにおいて、NFATパスウェイは、PMA 10ng/ml及びlμMのIonomycinで活性化された。レーン3と5へ、細胞からの調整培地が乗せられ、そこにおいて、NFATパスウェイは、PMA 10ng/ml及び2μMのIonomycinで活性化された。
【０４１３】
図100A-100Eは、HEK293T細胞の中で発現されたNFAT誘導MMP9触媒領域を示し、そこでは、MMP9の天然リーダー配列が、IgKリーダー配列と取り替えられており、MMP9触媒領域がNFAT反応要素4反復の下流にある。図100Aは、NFATパスウェイの活性化の後の、細胞溶解物における、MMP9の発現を検出するウェスタンブロットの写真を示す。図100Bは、NFATパスウェイの活性化の後の、調整培地における、MMP9の発現を検出するウェスタンブロットの写真を示す。
【０４１４】
図101A-101Eは、MMP9は、異なるリーダー配列で発現し、そして、各々の活性を呈することを示す。図101Aは、MMP9遺伝子の上流のリーダー配列が、その天然配列若しくはIgK配列である細胞溶解物におけるMMP9タンパク質を検出するウェスタンブロットを示す。図101Bは、MMP9遺伝子の上流のリーダー配列が、その天然配列若しくはIgKである調整培地におけるMMP9を検出するウェスタンブロットを示す。
【０４１５】
図102A-102Dは、NFAT誘導可能MMP9を生産するプラスミドで形質転換された細胞の３クローン、（4、6及び7）を示し、そこで、NFATclプロモーター配列がMMP9遺伝子の上流にあり、このケースで、それは、その触媒領域を含む欠失MMP9である。さらに比較のために示されたは、NFAT誘導可能なMMP9を生産するプラスミドで形質転換された細胞であり、そこで、NFAT反応要素配列４反復は、MMP9遺伝子の上流にある。図102Aは、細胞溶解物におけるMMP9タンパク質を発現するウウェスタンブロットを示す。図102Bは、調整培地におけるMMP9を発現するウェスタンブロットを示す。
【０４１６】
図105A-105Eは、CAR44単独で若しくはNFAT誘導可能なMMP9単独で形質導入された、又はCAR44及びNFAT誘導可能なMMP9で形質導入されたヒトT細胞のウェスタンブロットの写真を示し、ここで、得られたT細胞は、活性化されない、化学的にPMA/Ionomycinによって活性化された、又は合成MUCl*ペプチドを提示するビーズとの共培養により若しくはMUCl*陽性癌細胞との共培養により活性化された。ウェスタンブロットは、DYKタグ抗体として知られている抗フラグ・タグでプローブされた。MMP9触媒領域は、約40kDaの明白な分子量で展開する。図105A-105Dは、明澄化細胞溶解物のウェスタンブロットの写真を示す。結果は、NFAT誘導可能なMMP9のみで形質導入されたT細胞が、それらがPMA/Ionomycin、MUCl*ビーズ若しくはMUCl*陽性癌細胞によって活性化される場合に、MMP9を発現する。CAR44及びNFAT誘導可能なMMP9の両方で形質導入されたT細胞のみが、T細胞がMUCl*ビーズ若しくはMUCl*陽性癌細胞での刺激によって活性化される場合に、MMP9を発現する。
【０４１７】
結果は、NFAT誘導可能なMMP9で形質導入されたT細胞は、それらが活性化される時、MMP9を発現することを示す。CAR44及びNFAT誘導可能なMMP9の両方で形質導入されたT細胞は、MUCl*を提示する若しくは発現するビーズ若しくは細胞との共培養されるときに、特異的に活性化される(図105Aレーン5及びレーン6)。
【０４１８】
10．蛍光性MMPペプチド基質開裂分析
【０４１９】
OMNIMMP蛍光基質(EnzoLifeScience,NY)は、分析バッファー(50mMトリスpH 7.5、300mM NaCl、1mM CaCl2、5μM ZnCl2、0.1%Brj-35及び15%グリセリン)で、20μMに希釈され、氷上に維持し、使用されるまで光から保護した。ペプチドは、PBS pH 7.4若しくは培養培地で希釈できる。0.4mg/mLまで希釈された細胞溶解物は、分析バッファーであり、若しくはPBS pH 7.4若しくは培養培地である。
分析のために、組み換えのMMP9の触媒領域の50μl、(分析バッファー、PBS pH 7.4若しくは培地中の1-2μg/mL)、希釈された細胞溶解物の50μl、調整培地の50μl若しくはプルダウンタンパク質の50 μlが、蛍光測定器をもつ96ウェルプレートコンパーチブルのウェルに添加された。まさに分析を始める前に、希釈されたペプチドの50 μlが各ウェルに添加され、速やかに混合された。終ペプチド濃度は、10 μMである。蛍光は、37℃で約6時間、10分毎に、記録された（Ex.: 328nm、Em.:393nm）。
【０４２０】
図97は、PBS、ソリッドトレース、若しくは細胞培養培地、ダッシュトレース、の2つの濃度で、MMP9触媒領域によって開裂される、MMP9の蛍光性ペプチド基質、OMNIMMPペプチド、のグラフを示す。
【０４２１】
図99A-99Cは、NFAT反応要素４反復から下流にMMP9遺伝子を含むプラスミドで形質転換されたHEK293T細胞の細胞溶解物若しくは調整培地によって開裂される、MMP9の基質、OMNIMMPペプチド、蛍光ペプチドのグラフを示す。
MMP9ペプチド基質分析は、PMA/ionomycinによるNFATパスウェイの活性化が、MMP9の発現及び分泌がおこるということ、そして、それはペプチド基質を開裂するその能力によって証拠づけられるようにそれが活性だったことを示す。
【０４２２】
図l00Cは、HEK293T細胞の調整培地で発現され分泌された、MMP9触媒領域による開裂についての、MMP9蛍光ペプチド基質、OMNIMMPペプチドのグラフを示し、そこでは、MMP9の天然リーダー配列がIgKリーダー配列で置き換わり及びMMP9触媒領域はNFAT反応要素4反復の下流にある。図100Dは、HEK293T細胞の調整培地で発現され分泌された、MMP9触媒領域によるMMP9蛍光性ペプチド基質開裂のグラフを示し、そこでは、MMP9の天然リーダー配列がIgKリーダー配列と取り替えられており、MMP9触媒領域が、NFAT反応要素4反復の下流にある。
【０４２３】
図101Cは、発現されたMMP9によって開裂されたMMP9ペプチド基質のグラフを示す。
【０４２４】
図103A-103Dは、MMP9ペプチド基質開裂分析のグラフを表わす。図103Aは、NFATclプロモーター若しくはNFAT反応要素4反復から駆動されるMMP9発現をもつプラスミドで形質転換された細胞の溶解物からのMMP9の開裂活性を示す。図103Bは、NFATclプロモーター若しくはNFAT反応要素4反復から駆動されるMMP9発現もつプラスミドで形質転換された細胞の調整培地からのMMP9の開裂活性を示す。
【０４２５】
図104A-104Bは、MMP9の活性を測定するOMNIMMP9蛍光性基質分析の結果を示す。NFAT誘導可能なMMP9単独で若しくはCAR44との組み合わせで、形質導入されたヒトT細胞からの調整培地が、該分析に添加され、また、MMP9基質開裂は時間の関数として測定された。図104Aは、ヒトT細胞が、HCT-MUCl*癌細胞と共培養することにより活性化された後、CAR44及びNFAT誘導可能なMMP9の両方で形質導入された時の、ヒトT細胞のMMP9活性を示す。時間の関数として増加した基質開裂を示さないトレースは、活性化されなかった細胞からの調整培地である。図104Bは、ヒトT細胞が、T細胞を活性化すると知られている抗CD3及び抗CD28でコートされたビーズと共培養することにより活性化された後、NFAT誘導可能なMMP9で形質導入された時の、MMP9活性を示す。時間の関数として増加した基質開裂を示さないトレースは、活性化されなかった細胞からの調整培地である。
【０４２６】
11．クローニング
【０４２７】
NFAT反応要素の下流のlentivectorにおけるMMP9触媒領域クローニング
【０４２８】
2つの配列が合成された；
(pNFAT-MMP9cat -1及びpNFAT-MMP9cat-2(SEQ ID NO: 784及びSEQ ID NO:785)。
lentivector pGreenFirel-4x NFAT(SystemBioscience,CA)は、SpelとKpnlの制限酵素(ニューイングランドバイオ研究所)で消化切断された。精製断片及び2つの合成された配列が、ギブソンアッセンブリークローニング・キット(ニューイングランドバイオ研究所)を使用して組み立てられた。得られた構築物(pGreenFirel-4xNFAT-MMP9cat)は、その天然リーダー配列を持った、最小プロモーター(mCMV)及びMMP9触媒領域が後続するNFAT反応要素4反復を含む。
【０４２９】
pGL4-14[luc2/Hygro]でのNFAT反応要素のクローニング:
【０４３０】
4X NFAT領域は次のプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によってlentivectorpGreenFirel-4x NFATから増幅された:
5'-tagatggtaccaagaggaaaatttgtttcatacag-3'(SEQ ID NO: 786)  及び
5'-tagataagcttgctggatcggtcccggtgtc-3'(SEQ IDNO: 787)。
KpnlとHindlllの制限酵素(ニューイングランドBiolabs)で消化切断の後、精製断片が、構築物pGL4-14-4xNFATを作成するために同じ制限酵素で消化切断されたプロモーター無しベクターpGL4-14[luc2/Hygro](Promega)へクローン化された。
【０４３１】
pGL4-14-4xNFATへのMMP9触媒領域のクローニング:
【０４３２】
MMP9の天然リーダー配列及びMMP9触媒領域が後続する最小のプロモーター(mCMV)を含む断片が、次のプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、lentivectorpGreenFirel-4x NFAT-MMP9catから増幅された:
5'-tcatacagaaggcgttactagttaggcgtgtacggtgg-3'(SEQ ID NO: 788)  及び
5'-acagtaccggattgccaagcttttatcacttatcgtcgtcatccttg-3'(SEQ ID NO: 789)。
pGL4-14-4xNFATは、SpelとHindlllの制限酵素(ニューイングランドバイオ研究所)で消化切断された。精製PCR断片及び消化切断されたpGL4-14-4xNFATは、構築物pGL4-14-4xNFAT-MMP9catを作成するためにギブソンアッセンブリークローニング・キット(ニューイングランドBiolab)を使用して組み立てられた。
【０４３３】
pSECTag2へのMMP9触媒領域のクローニング:
【０４３４】
その天然リーダー配列のないMMP9触媒領域が、次のプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によってlentivectorpGreenFirel-4x NFAT-MMP9catから増幅された:
5'-aagttggtaccgttccaaacctttgagggcgacc-3'(SEQ ID NO: 790)  及び
5'-aagttctcgagcaggttcagggcgaggaccatag-3'(SEQ ID NO: 791)。
KpnlとXholの制限酵素(ニューイングランドBiolabs)で消化切断の後、精製断片は、構築物pSECTag2 MMP9 cat Hisを作成するために、同じ制限酵素で消化切断されたベクターpSECTag2A(ThermoFisherScientific)へクローン化された。この構築物において、MMP9触媒領域は、あるなら、IgKリーダー配列の下流だろう。
【０４３５】
pGL4-14-4xNFATへのIgKリーダー配列を備えたMMP9触媒領域のクローニング:
【０４３６】
その天然リーダー配列を備えたMMP9触媒領域は、次のプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によってpGL4-14-4xNFAT-MMP9catから増幅された:
5'-attgactcgagctctcgacattcgtttctagagc-3'(SEQ ID NO: 792)  及び
5'-attgaaagcttttatcacttatcgtcgtcatccttg-3'(SEQ ID NO: 793)。
XholとHindlllの制限酵素(ニューイングランドBiolabs)で消化切断の後、精製断片は、構築物pGL4-14 MMP9cat XHを作成するために、同じ制限酵素で消化切断されたベクターpGL4-14[luc2/Hygro](Promega)へクローン化された。
【０４３７】
最小のプロモーター(mCMV)が後続する4x NFAT反応要素を含んでいる断片が、次のプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によってpGL4-14-4xNFAT-MMP9catから増幅された:
5'-tagcaaaataggctgtccc -3'(SEQ ID NO: 794)  及び
5'-attgactcgaggctggatcggtcccggtgtc -3'(SEQ IDNO: 795)。
KpnlとXholの制限酵素(ニューイングランドBiolabs)で消化切断の後、精製断片は、構築物pGL4-14 4xNFAT-MMP9cat KXHを作成するために同じ制限酵素で消化切断されたベクターpGL4-14 MMP9cat XHへクローン化された。
【０４３８】
MMP9触媒領域が後続するIgKリーダー配列を含んでいる断片が、次のプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によってpSECTag2MMP9 catから増幅された:
5'-aagacaccgggaccgatccagcctcgagagacccaagctggctagccacc-3' (SEQ ID NO: 796) 及び
5'-ttaccaacagtaccggattgccaagcttttatcacttatcgtcgtcatcc-3'(SEQ ID NO: 797)。
pGL4-14 4xNFAT-MMP9cat KXHが、XholとHindlllの制限酵素(ニューイングランドバイオ研究所)で消化切断された。
精製PCR断片及び消化切断されたpGL4-14 4xNFAT-MMP9cat KXHは、構築物pGL4-14-4xNFAT-IgK MMP9catを作成するためにギブソンアッセンブルクローニング・キット(ニューイングランドBiolab)を使用して組み立てられた。
【０４３９】
NFATclプロモーター下流のpEZX-PG02.1へのMMP9触媒領域のクローニング:
【０４４０】
その天然リーダー配列を備えたMMP9触媒領域は、次のプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によってlentivector pGreenFirel-4x NFAT-MMP9catから増幅された:
5'-attgaaagcttctctcgacattcgtttctagagc-3'(SEQ ID NO: 798)  及び
5'-attgagagctcttatcacttatcgtcgtcatc -3'(SEQID NO: 799)。
HindlllとSaclの制限酵素(ニューイングランドBiolabs)で消化切断の後、精製断片は、構築物pEZX-NFATc1-MMP9catを作成するために、NFACTclプロモーター(GeneCopoeia、MD)の下流ベクターpEZX-PG02.1にクローン化された。
【０４４１】
pEZX-NFATcl-MMP9catの修飾:
【０４４２】
pEZX-NFATcl-MMP9catが、NFATclプロモーターのSpelとKpnlの制限部位5’及びMMP9触媒領域のNhelとEcoRVの制限部位'3を導入するために修飾された。2つの gBLOCKsが、IDT,IA.によって、本願発明者等のリクエストによって合成された (NFAT modif 1及びNFAT modif 2、SEQ ID NO: 800及びSEQ ID NO: 801)。
pEZX-NFATcl-MMP9catベクターは、Nhel、EcoRI、Sacl及びXhol制限酵素(ニューイングランドバイオ研究所)で消化切断された。
2個の断片が精製され、ギブソンアセンブリクローニング・キット(ニューイングランドバイオ研究所)を使用して、2つの合成されたgBLOCKSで組み立てられた。
【０４４３】
lentivector pCDH-CMV-MCS-EFla-HygroへのNFATclのプロモーター/MMP9触媒領域のクローニング:
【０４４４】
修飾pEZX-NFATcl-MMP9catベクターは、SpelとNhelの制限酵素(ニューイングランドBiolabs)で消化切断された。また、MMP9触媒領域が後続するNFATclプロモーターを含む断片は、精製され、同じ制限酵素で消化切断されたlentivector pCDH-CMV-MCS-EFla-Hygro(システム・バイオササイエンス)へクローン化された。
【０４４５】
lentivector pCDH-CMV-MCS-EFla-HygroへのNFAT反応要素/MMP9触媒領域のクローニング:
【０４４６】
その天然リーダー配列を備えたMMP9触媒領域が後続するNFAT反応要素4反復を含む断片が、次のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によってベクターpGL4-14-4xNFAT-MMP9catから増幅された:
5'-acaaaattcaaaattttatcgatactagttggcctaactggccggtaccaag-3'(SEQ ID NO: 802)  及び
5'-atccgatttaaattcgaattcgctagcttatcacttatcgtcgtcatcc-3'(SEQ ID NO: 803)。
精製PCR断片及び消化切断されたpCDH-CMV-MCS-EFla-Hygro(Spel及びNhel)は、ギブソンアセンブリクローニング・キット(ニューイングランドバイオ研究所)を使用して組み立てられた。
【０４４７】
ここに引用された参照のすべては、その全体が、参照によって本願明細書に挿入される。
【０４４８】
配列表フリーテキスト
【０４４９】
a、g、c、t以外のヌクレオチド・シンボルの使用につイては、それらは、WIPO標準ST.25,付録2、表1で述べられた規定に従う。そこではkは、t若しくはgを表わす); nは、a、c、t若しくはgを表わす; mは、a若しくはcを表す; rは、a若しくはgを表す; sは、c若しくはgを表わす; wは、a若しくはtを表す、そしれ、yはc若しくはtを表わす。
MUC1 Receptor
(Mucin 1 precursor, GenbankAccession number: P15941)
MTPGTQSPFFLLLLLTVLTVVTGSGHASSTPGGEKETSATQRSSVPSSTEKNAVSMTSSVLSSHSPGSGSSTTQGQDVTLAPATEPASGSAATWGQDVTSVPVTRPALGSTTPPAHDVTSAPDNKPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDNRPALGSTAPPVHNVTSASGSASGSASTLVHNGTSARATTTPASKSTPFS IPSHHSDTPTTLASHSTKTDASSTHHSSVPPLTSSNHSTSPQLSTGVSFFFLSFHISNLQ FNSSLEDPSTDYYQELQRDISEMFLQIYKQGGFLGLSNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAAASANL (SEQ ID NO : 1 )
PSMGFR
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA (SEQ ID NO: 2)
Human NME1
(DNA)
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaatga (SEQ ID NO: 3)
(amino acids)
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYE- (SEQID NO: 4)
Human NME7
(DNA)
atgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattag (SEQ ID NO: 5)
(amino acids)
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAI SKAGEI IEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGP IIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN- (SEQ ID NO : 6 )
NME7 peptides
NME7A peptide 1 (A domain)MLSRKEALDFHVDHQS (SEQ ID NO : 7 )
NME7A peptide 2 (A domain)SGVARTDASES (SEQ ID NO : 8 )
NME7B peptide 1 (B domain)DAGFEI SAMQMFNMDRVNVE (SEQ ID NO : 9 )
NME7B peptide 2 (B domain)EVYKGVVTEYHDMVTE (SEQ ID NO : 10 )
NME7B peptide 3 (B domain)AIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF (SEQ ID NO : 11 )
Mouse E6 Heavy chain variableregion sequence:
(DNA)
gaggtgaaggtggtggagtctgggggagacttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgtagtctctggattcactttcagtagatatggcatgtcttgggttcgccagactccaggcaagaggctggagtgggtcgcaaccattagtggtggcggtacttacatctactatccagacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaagtctgaggacacagccatgtatcactgtacaagggataactacggtaggaactacgactacggtatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca (SEQ ID NO: 12)
(amino acids)
EVKVVESGGDLVKPGGSLKLSCVVSGFTFSRYGMSWVRQTPGKRLEWVATISGGGTYIYYPDSVKGRFTI SRDNAKNTLYL QMSSLKSEDTAMYHCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTSVTVSS (SEQID NO: 13)
Mouse E6 heavy chain variableframework region 1 (FWR1) sequence:
(DNA)
gaggtgaaggtggtggagtctgggggagacttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgtagtctct(SEQ ID NO: 14)
(amino acids)
EVKVVESGGDLVKPGGSLKLSCVVSGFTFS(SEQ ID NO: 15)
Mouse E6 heavy chain variablecomplementarity determining regions 1 (CDR1) sequence :
(DNA)
ggattcactttcagtagatatggcatgtct(SEQ ID NO: 16)
(amino acids)
RYGMS (SEQ ID NO: 17)
Mouse E6 heavy chain variableframework region 2 (FWR2) sequence:
(DNA)
tgggttcgccagactccaggcaagaggctggagtgggtcgca(SEQ ID NO: 18)
(amino acids)
WVRQTPGKRLEWVA (SEQ ID NO : 19 )
Mouse E6 heavy chain variablecomplementarity determining regions 2 (CDR2) sequence :
(DNA)
accattagtggtggcggtacttacatctactatccagacagtgtgaagggg(SEQ ID NO: 20)
(amino acids)
TISGGGTYIYYPDSVKG (SEQ ID NO :21 )
Mouse E6 heavy chain variableframework region 3 (FWR3) acid sequence:
(DNA)
cgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaagtctgaggacacagccatgtatcactgtacaagg (SEQ ID NO: 22)
(amino acids)
RFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYHCTR (SEQ ID NO: 23)
Mouse E6 heavy chain variablecomplementarity determining regions 3 (CDR3) sequence :
(DNA)
gataactacggtaggaactacgactacggtatggactac(SEQ ID NO: 24)
(amino acids)
DNYGRNYDYGMDY (SEQ ID NO: 25)
IGHV3-21*03 heavy chain variableregion sequence:
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtagctatagcatgaactgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcatccattagtagtagtagtagttacatatactacgcagactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgaga (SEQ ID NO: 26)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 27)
IGHV3-21*01 heavy chain variableframework region 1 (FWR1) sequence:
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagt(SEQ ID NO:28)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO : 29 )
IGHV3-21*01 heavy chain variablecomplementarity determining regions 1 (CDR1) sequence :
(DNA)
agctatagcatgaac (SEQ ID NO: 30)
(amino acids)
SYSMN (SEQ ID NO: 31)
IGHV3-21*01 heavy chain variableframework region 2 (FWR2) sequence:
(DNA)
tgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctca(SEQ ID NO: 32)
(amino acids)
WVRQAPGKGLEWVS (SEQ ID NO: 33)
IGHV3-21*01 heavy chain variablecomplementarity determining regions 2 (CDR2) sequence :
(DNA)
tccattagtagtagtagtagttacatatactacgcagactcagtgaagggc(SEQ ID NO: 34)
(amino acids)
SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO:35)
IGHV3-21*01 heavy chain variableframework region 3 (FWR3) sequence:
(DNA)
cgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgaga (SEQ ID NO: 36)
(amino acids)
RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 37)
Humanized E6 heavy chainvariable region sequence:
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtaggtatggcatgagctgggtccgccaggctccagggaagaggctggagtgggtctcaaccattagtggcggaggcacctacatatactacccagactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtaccagagataactatggccgcaactatgattatggcatggattattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagc (SEQ ID NO: 38)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKRLEWVSTISGGGTYIYYPDSVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTLVTVSS (SEQID NO : 39 )
Humanized E6 heavy chainvariable framework region 1 (FWR1) acid sequence:
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagt (SEQ ID NO: 40)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO : 41 )
Humanized E6 heavy chainvariable complementarity determining regions 1 (CDR1) sequence :
(DNA)
aggtatggcatgagc (SEQ ID NO: 42)
(amino acids)
RYGMS (SEQ ID NO: 43)
Humanized E6 heavy chainvariable framework region 2 (FWR2) acid sequence:
(DNA)
tgggtccgccaggctccagggaagaggctggagtgggtctca(SEQ ID NO: 44)
(amino acids)
WVRQAPGKRLEWVS (SEQ ID NO: 45)
Humanized E6 heavy chainvariable complementarity determining regions 2 (CDR2) sequence :
(DNA)
accattagtggcggaggcacctacatatactacccagactcagtgaagggc(SEQ ID NO: 46)
(amino acids)
TI SGGGTYIYYPDSVKG (SEQ ID NO:47)
Humanized E6 heavy chainvariable framework region 3 (FWR3) acid sequence:
(DNA)
cgattcaccatctccagagacaacgccaagaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtaccaga (SEQ ID NO: 48)
(amino acids)
RFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTR (SEQ ID NO : 49 )
Humanized E6 heavy chainvariable complementarity determining regions 3 (CDR3) sequence :
(DNA)
gataactatggccgcaactatgattatggcatggattat(SEQ ID NO: 50)
(amino acids)
DNYGRNYDYGMDY (SEQ ID NO: 51)
Humanized E6 IgG2 heavy chainsynthesized by Genescript :
(DNA)
gaattctaagcttgggccaccatggaactggggctccgctgggttttccttgttgctattttagaaggtgtccagtgtgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtaggtatggcatgagctgggtccgccaggctccagggaagaggctggagtgggtctcaaccattagtggcggaggcacctacatatactacccagactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtaccagagataactatggccgcaactatgattatggcatggattattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccagctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatagtaagtttaaactctaga (SEQ ID NO:52)
(amino acids)
EF*AWATMELGLRWVFLVAILEGVQCEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKRLEWVSTISGGG TYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFN STFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK* *V*TLX(SEQ ID NO:53)
Human IgG2 heavy chain constantregion sequence :
(DNA)
gcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccagctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatag (SEQ ID NO: 54)
(amino acids)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:55)
Humanized E6 IgGl heavy chainsequence:
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtaggtatggcatgagctgggtccgccaggctccagggaagaggctggagtgggtctcaaccattagtggcggaggcacctacatatactacccagactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacccactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtcccagagataactatggccgcaactatgattatggcatggattattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgacagtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgataa (SEQ ID NO:56)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKRLEWVSTISGGGTYIYYPDSVKGRFTI SRDNAKNPLYLQMNSLRAEDTAVYYCPRDNYGRNYDYGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK* * (SEQ ID NO: 57)
Human IgGl heavy chain constantregion sequence :
(DNA)
gctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgacagtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgataa (SEQ ID NO: 58)
(amino acids)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK** (SEQ ID NO:59)
Human IgGl heavy chain constantregion gBLOCK#l sequence:
(DNA)
atggcatggattattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgacagtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaag (SEQ ID NO: 60)
Human IgGl heavy chain constantregion gBLOCK#2 sequence :
(DNA)
tacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgataagtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttg (SEQ IDNO: 61)
E6 heavy chain variable regionoverlapping sequence:
(DNA)
atggcatggattattggggccagggcaccct(SEQ ID NO: 62)
IgGl heavy chain constant regionoverlapping region sequence:
(DNA)
tacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaag(SEQ ID NO: 63)
pCDNA3.1 V5 and pSECTag2overlapping sequence :
(DNA)
ccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttg(SEQ ID NO: 64)
Mouse E6 Light Chain variableregion sequence:
(DNA)
caaattgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggaggaggtcaccctaacctgcagtgccacctcaagtgtaagttacatacactggttccagcagaggccaggcacttctcccaaactctggatttatagcacatccaacctggcttctggagtccctgttcgcttcagtggcagtggatatgggacctcttactctctcacaatcagccgaatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcaaaggagtagttccccattcacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaa (SEQ ID NO: 65)
(amino acids)
QIVLTQSPAIMSASPGEEVTLTCSATSSVSYIHWFQQRPGTSPKLWIYSTSNLASGVPVRFSGSGYGTSYSLTISRMEAED AATYYCQQRSSSPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO : 66 )
Mouse E6 light chain variableframework region 1 (FWR1) sequence:
(DNA)
caaattgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggaggaggtcaccctaacctgc(SEQ ID NO: 67)
(amino acids)
QIVLTQSPAIMSASPGEEVTLTC (SEQ IDNO: 68)
Mouse E6 light chain variablecomplementarity determining regions 1 (CDR1) sequence :
(DNA)
AGTGCCACCTCAAGTGTAAGTTACATACAC(SEQ ID NO : 69 )
(amino acids)
SATSSVSYIH (SEQ ID NO : 70 )
Mouse E6 light chain variableframework region 2 (FWR2) sequence:
(DNA)
tggttccagcagaggccaggcacttctcccaaactctggatttat(SEQ ID NO: 71)
(amino acids)
WFQQRPGTSPKLWIY (SEQ ID NO: 72)
Mouse E6 light chain variablecomplementarity determining regions 2 (CDR2) sequence :
(DNA)
agcacatccaacctggcttct (SEQ IDNO: 73)
(amino acids)
STSNLAS (SEQ ID NO: 74)
Mouse E6 light chain variableframework region 3 (FWR3) sequence:
(DNA)
ggagtccctgttcgcttcagtggcagtggatatgggacctcttactctctcacaatcagccgaatggaggctgaagatgctgccacttattactgc (SEQ ID NO: 75)
(amino acids)
GVPVRFSGSGYGTSYSLTISRMEAEDAATYYC (SEQ ID NO : 76 )
Mouse E6 light chain variablecomplementarity determining regions 3 (CDR3) sequence :
(DNA)
cagcaaaggagtagttccccattcacg (SEQID NO: 77)
(amino acids)
QQRSSSPFT (SEQ ID NO: 78)
IGKV3-11*02 light chain variableregion sequence:
(DNA)
gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagctacttagcctggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggagagacttcactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcaactggcctcc (SEQ ID NO: 79)
(amino acids)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGRDFTLTI SSLEPEDFAVYYCQQRSNWPP (SEQ ID NO : 80 )
IGKV3-11*02 light chain variableframework region 1 (FWR1) acid sequence:
(DNA)
gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgc(SEQ ID NO: 81)
(amino acids)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC (SEQ IDNO: 82)
IGKV3-11*02 light chain variablecomplementarity determining regions 1 (CDR1) sequence :
(DNA)
agggccagtcagagtgttagcagctacttagcc(SEQ ID NO: 83)
(amino acids)
RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 84)
IGKV3-11*02 light chain variableframework region 2 (FWR2) sequence:
(DNA)
tggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctat(SEQ ID NO: 85)
(amino acids)
WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID N086)
IGKV3-11*02 light chain variablecomplementarity determining regions 2 (CDR2) sequence :
(DNA)
gatgcatccaacagggccact (SEQ IDNO: 87)
(amino acids)
DASNRAT (SEQ ID NO : 88 )
IGKV3-11*02 light chain variableframework region 3 (FWR3) sequence:
(DNA)
ggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggagagacttcactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgt (SEQ ID NO: 89)
(amino acids)
GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC (SEQ ID NO: 90)
IGKV3-11*02 light chain variablecomplementarity determining regions3 (CDR3) sequence :
(DNA)
cagcagcgtagcaactggcctcc (SEQ IDNO: 91)
(amino acids)
QQRSNWPP (SEQ ID NO: 92)
Humanized E6 light chainvariable region sequence:
(DNA)
gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctcacctgcagcgccaccagcagtgttagctacatccactggtaccaacagaggcctggccagagccccaggctcctcatctatagcacctccaacctggccagcggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggagcgactacactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcagctcccctttcacctttggcagcggcaccaaagtggaaattaaa (SEQ ID NO: 93)
(amino acids)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLTCSATSSVSYIHWYQQRPGQSPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGSDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSSPFTFGSGTKVEIK (SEQ ID NO: 94)
Humanized E6 light chainvariable framework region 1 (FWR1) acid sequence:
(DNA)
gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctcacctgc(SEQ ID NO: 95)
(amino acids)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLTC (SEQ IDNO : 96 )
Humanized E6 light chainvariable complementarity determining regions 1 (CDR1) sequence :
(DNA)
agcgccaccagcagtgttagctacatccac(SEQ ID NO: 97)
(amino acids)
SATSSVSYIH (SEQ ID NO: 98)
Humanized E6 heavy lightvariable framework region 2 (FWR2) acid sequence:
(DNA)
tggtaccaacagaggcctggccagagccccaggctcctcatctat(SEQ ID NO: 99)
(amino acids)
WYQQRPGQSPRLLIY (SEQ ID NO : 100)
Humanized E6 light chainvariable complementarity determining regions 2 (CDR2) sequence :
(DNA)
agcacctccaacctggccagc (SEQ IDNO: 101)
(amino acids)
STSNLAS (SEQ ID NO: 102)
Humanized E6 light chainvariable framework region 3 (FWR3) acid sequence:
(DNA)
ggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggagcgactacactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgt (SEQ ID NO: 103)
(amino acids)
GIPARFSGSGSGSDYTLTISSLEPEDFAVYYC (SEQ ID NO: 104)
Humanized E6 light chainvariable complementarity determining regions 3 (CDR3) sequence :
(DNA)
cagcagcgtagcagctcccctttcacc (SEQID NO: 105)
(amino acids)
QQRSSSPFT (SEQ ID NO: 106)
Humanized E6 Kappa light chainsynthesized by Genescript :
(DNA)
gaattctaagcttgggccaccatggaagccccagcgcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccactggagaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctcacctgcagcgccaccagcagtgttagctacatccactggtaccaacagaggcctggccagagccccaggctcctcatctatagcacctccaacctggccagcggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggagcgactacactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcagctcccctttcacctttggcagcggcaccaaagtggaaattaaaaggacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttagtaagtttaaactctaga (SEQ ID NO: 107)
(amino acids)
EF*AWATMEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLTCSATSSVSYIHWYQQRPGQSPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGSDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSSPFTFGSGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC**V *TLX (SEQ ID NO: 108)
Human Kappa light chain constantregion sequence:
(DNA)
aggacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag(SEQ ID NO: 109)
(amino acids)
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO : 110 )
Humanized E6 lambda light chainsequence:
(DNA)
gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctcacctgcagcgccaccagcagtgttagctacatccactggtaccaacagaggcctggccagagccccaggctcctcatctatagcacctccaacctggccagcggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggagcgactacactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcagctcccctttcacctttggcagcggcaccaaagtggaaattaaaggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccgccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctacccgggagccgtgacagtggcctggaaggcagatagcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaacaaagcaacaacaagtacgcggccagcagctatctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttcatagtaa (SEQ ID NO: 111)
(amino acids)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLTCSATSSVSYIHWYQQRPGQSPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGSDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSSPFTFGSGTKVEIKGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS * * (SEQ ID NO: 112)
Humanized lambda light chainconstant region sequence:
(DNA)
ggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccgccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctacccgggagccgtgacagtggcctggaaggcagatagcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaacaaagcaacaacaagtacgcggccagcagctatctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttcatagtaa(SEQ ID NO: 113)
(amino acids)
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS * * (SEQ ID NO: 114)
Human lambda light chainconstant region gBLOCK#3 sequence:
(DNA)
agcgccaccagcagtgttagctacatccactggtaccaacagaggcctggccagagccccaggctcctcatctatagcacctccaacctggccagcggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggagcgactacactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcagctcccctttcacctttggcagcggcaccaaagtggaaattaaaggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccgccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctacccgggagccgtgacagtggcctggaaggcagatagcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaacaaagcaacaacaagtacgcggccagcagctatctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttcatagtaagtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttg (SEQ ID NO: 115)
E6 light chain variable regionoverlapping sequence:
(DNA)
agcgccaccagcagtgttagctacatccact(SEQ ID NO: 116)
pCDNA3.1 V5 and pSECTag2overlapping sequence :
(DNA)
ccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttg(SEQ ID NO: 117)
Mouse C2 heavy chain variableregion sequence :
(DNA)
gaggtccagctggaggagtcagggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggattcactttcagtggctatgccatgtcttgggttcgccagactccggagaagaggctggagtgggtcgcaaccattagtagtggtggtacttatatctactatccagacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaggtctgaggacacggccatgtattactgtgcaagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctcctccgccaaaacgacacccccatctgtctat (SEQ IDNO: 118)
(amino acids)
EVQLEESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSGYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGTYIYYPDSVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMSSLRSEDTAMYYCARLGGDNYYEYFDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVY(SEQ ID NO : 119 )
Mouse C2 heavy chain variableframework region 1 (FWR1) sequence:
(DNA)
gaggtccagctggaggagtcagggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggattcactttcagt (SEQ ID NO: 120)
(amino acids)
EVQLEESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFS(SEQ ID NO: 121)
Mouse C2 heavy chain variablecomplementarity determining regions 1 (CDR1) sequence :
(DNA)
ggctatgccatgtct (SEQ ID NO: 122)
(amino acids)
GYAMS (SEQ ID NO: 123)
Mouse C2 heavy chain variableframework region 2 (FWR2) sequence:
(DNA)
tgggttcgccagactccggagaagaggctggagtgggtcgca(SEQ ID NO: 124)
(amino acids)
WVRQTPEKRLEWVA (SEQ ID NO: 125)
Mouse C2 heavy chain variablecomplementarity determining regions 2 (CDR2) sequence :
(DNA)
accattagtagtggtggtacttatatctactatccagacagtgtgaagggg(SEQ ID NO: 126)
(amino acids)
TISSGGTYIYYPDSVKG (SEQ ID NO:127)
Mouse C2 heavy chain variableframework region 3 (FWR3) sequence:
(DNA)
cgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaggtctgaggacacggccatgtattactgtgcaaga (SEQ ID NO: 128)
(amino acids)
RFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCAR (SEQ ID NO: 129)
Mouse C2 heavy chain variablecomplementarity determining regions 3 (CDR3) sequence :
(DNA)
cttgggggggataattactacgaatacttcgatgtc(SEQ ID NO: 130)
(amino acids)
LGGDNYYEYFDV (SEQ ID NO: 131)
IGHV3-21*04 heavy chain variableregion sequence:
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtagctatagcatgaactgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcatccattagtagtagtagtagttacatatactacgcagactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgaga (SEQ ID NO: 132)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 133)
IGHV3-21*04 heavy chain variableframework region 1 (FWR1) sequence:
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagt (SEQ ID NO: 134)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO: 135)
IGHV3-21*04 heavy chain variablecomplementarity determining regions 1 (CDR1) sequence :
(DNA)
agctatagcatgaac (SEQ ID NO: 136)
(amino acids)
SYSMN (SEQ ID NO: 137)
IGHV3-21*04 heavy chain variableframework region 2 (FWR2) sequence:
(DNA)
gggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctca(SEQ ID NO: 138)
(amino acids)
WVRQAPGKGLEWVS (SEQ ID NO: 139)
IGHV3-21*04 heavy chain variablecomplementarity determining regions 2 (CDR2) sequence :
(DNA)
tccattagtagtagtagtagttacatatactacgcagactcagtgaagggc(SEQ ID NO: 140)
(amino acids)
SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO:141)
IGHV3-21*04 heavy chain variableframework region 3 (FWR3) sequence:
(DNA)
cgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgaga (SEQ ID NO: 142)
(amino acids)
RFTI SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO: 143)
Humanized C2 heavy chainvariable region sequence:
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctcc (SEQ ID NO: 144)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTI SRDNAKNSLYL QMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYFDVWGKGTTVTVSS (SEQID NO: 145)
Humanized C2 heavy chainvariable framework region 1 (FWR1) sequence:
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagt (SEQ ID NO: 146)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO: 147)
Humanized C2 heavy chainvariable complementarity determining regions 1 (CDR1) sequence :
(DNA)
ggctatgccatgagc (SEQ ID NO: 148)
(amino acids)
GYAMS (SEQ ID NO: 149)
Humanized C2 heavy chainvariable framework region 2 (FWR2) sequence:
(DNA)
tgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaa(SEQ ID NO: 150)
(amino acids)
WVRQAPGKGLEWVS (SEQ ID NO: 151)
Humanized C2 heavy chainvariable complementarity determining regions 2 (CDR2) sequence :
(DNA)
accattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggc(SEQ ID NO: 152)
(amino acids)
TI SSGGTYIYYPDSVKG (SEQ ID NO:153)
Humanized C2 heavy chainvariable framework region 3 (FWR3) sequence:
(DNA)
cgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgaga (SEQ ID NO: 154)
(amino acids)
RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 155)
Humanized C2 heavy chainvariable complementarity determining regions 3 (CDR3) sequence :
(DNA)
cttgggggggataattactacgaatacttcgatgtc(SEQ ID NO: 156)
(amino acids)
LGGDNYYEYFDV (SEQ ID NO: 157)
Humanized C2 IgGl heavy chainsequence
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgacagtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgataa (SEQ ID NO: 157)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTI SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYFDVWGKGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK* * (SEQ ID NO: 158)
Humanized C2 gBLOCK#4 sequence:
(DNA)
actcactatagggagacccaagctggctagttaagcttgggccaccatggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgacgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagc (SEQ ID NO: 160)
pCDNA3.1 V5 overlapping sequence:
(DNA)
actcactatagggagacccaagctggctagtt(SEQ ID NO: 161)
Human IgGl constant regionoverlapping sequence:
(DNA)
gacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagc(SEQ ID NO: 162)
Humanized C2 IgG2 heavy chainsequence
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccgcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccagctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatagtaa (SEQ ID NO: 163)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTI SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYFDVWGKGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVS NKGLPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK* * (SEQ ID NO: 164)
Humanized C2 gBLOCK#5 sequence:
(DNA)
tgctctgggttccaggttccactggtgacgcggcccagccggccgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccgcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgacca (SEQ ID NO:165) pSEC Tag2 overlapping sequence:
(DNA)
tgctctgggttccaggttccactggtgacgc(SEQ ID NO: 166)
Human IgG2 constant regionoverlapping sequence:
(DNA)
gacggtgtcgtggaactcaggcgctctgacca(SEQ ID NO: 167)
Mouse C2 light chain variableregion sequence:
(DNA)
gacattgtgatcacacagtctacagcttccttaggtgtatctctggggcagagggccaccatctcatgcagggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttatatgcactggtaccaacagagaccaggacagccacccaaactcctcatctatcttgcatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacagtagggagcttccgttcacgttcggaggggggaccaagctggagataaaacgggctgatgctgcaccaactgtatcc (SEQ ID NO: 168)
(amino acids)
DIVITQSTASLGVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQRPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPFTFGGGTKLEIKRADAAPTVS (SEQ ID NO : 169 )
Mouse C2 light chain variableframework region 1 (FWR1) sequence:
(DNA)
gacattgtgatcacacagtctacagcttccttaggtgtatctctggggcagagggccaccatctcatgc(SEQ ID NO: 170)
(amino acids)
DIVITQSTASLGVSLGQRATISC (SEQ IDNO: 171)
Mouse C2 light chain variablecomplementarity determining regions 1 (CDR1) sequence :
(DNA)
agggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttatatgcac(SEQ ID NO: 172)
(amino acids)
RASKSVSTSGYSYMH (SEQ ID NO: 173)
Mouse C2 light chain variableframework region 2 (FWR2) sequence:
(DNA)
tggtaccaacagagaccaggacagccacccaaactcctcatctat(SEQ ID NO: 174)
(amino acids)
WYQQRPGQPPKLLIY (SEQ ID NO: 175)
Mouse C2 light chain variablecomplementarity determining regions 2 (CDR2) sequence :
(DNA)
cttgcatccaacctagaatc (SEQ ID NO:176)
(amino acids)
LASNLES (SEQ ID NO: 177)
Mouse C2 light chain variableframework region 3 (FWR3) sequence:
(DNA)
tggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgt (SEQ ID NO: 178)
(amino acids)
GVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC(SEQ ID NO: 179)
Mouse C2 light chain variablecomplementarity determining regions 3 (CDR3) sequence :
(DNA)
cagcacagtagggagcttccgttcacg (SEQID NO: 180)
(amino acids)
QHSRELPFT (SEQ ID NO : 181 )
IGKV7-3*01 light chain variableregion sequence:
(DNA)
gacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtgagagtgtcagtttcttgggaataaacttaattcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttaccaagcatccaataaagacactggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtctgcagagtaagaattttcctcccaca (SEQ ID NO: 182)
(amino acid)
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSFLGINLIHWYQQKPGQPPKLLIYQASNKDTGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCLQSKNFPPT (SEQ ID NO: 183)
IGKV7-3*01 light chain variableframework region 1 (FWR1) sequence:
(DNA)
gacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgc(SEQ ID NO: 184)
(amino acids)
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITC (SEQ IDNO: 185)
IGKV7-3*01 light chain variablecomplementarity determining regions 1 (CDR1) sequence :
(DNA)
agagccagtgagagtgtcagtttcttgggaataaacttaattcac(SEQ ID NO: 186)
(amino acids)
RASESVSFLGINLIH (SEQ ID NO: 187)
IGKV7-3*01 light chain variableframework region 2 (FWR2) sequence:
(DNA)
tggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttac(SEQ ID NO: 188)
(amino acids)
WYQQKPGQPPKLLIY (SEQ ID NO : 189)
IGKV7-3*01 light chain variablecomplementarity determining regions 2 (CDR2) sequence :
(DNA)
caagcatccaataaagacact (SEQ IDNO: 190)
(amino acids)
QASNKDT (SEQ ID NO: 191)
IGKV7-3*01 light chain variableframework region 3 (FWR3) sequence:
(DNA)
ggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgt (SEQ ID NO: 192)
(amino acids)
GVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYC(SEQ ID NO: 193)
Humanized C2 light chainvariable region sequence:
(DNA)
gacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaact (SEQ ID NO: 194)
(amino acids)
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSRELPFTFGGGTKVEIKRT (SEQ ID NO: 195)
Humanized C2 light chainvariable framework region 1 (FWR1) acid sequence:
(DNA)
gacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgc(SEQ ID NO: 196)
(amino acids)
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITC (SEQ IDNO: 197)
Humanized C2 light chainvariable complementarity determining regions 1 (CDR1) sequence :
(DNA)
agagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcac(SEQ ID NO: 198)
(amino acids)
RASKSVSTSGYSYMH (SEQ ID NO : 199)
Humanized C2 heavy light variableframework region 2 (FWR2) acid sequence:
(DNA)
tggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttac(SEQ ID NO: 200)
(amino acids)
WYQQKPGQPPKLLIY (SEQ ID NO : 201)
Humanized C2 light chainvariable complementarity determining regions 2 (CDR2) sequence :
(DNA)
ctggcatccaatctggagagc (SEQ IDNO: 202)
(amino acids)
LASNLES (SEQ ID NO:203)
Humanized C2 light chainvariable framework region 3 (FWR3) acid sequence:
(DNA)
ggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgt (SEQ ID NO:204)
(amino acids)
GVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYC(SEQ ID NO: 205)
Humanized C2 light chainvariable complementarity determining regions 3 (CDR3) sequence :
(DNA)
cagcacagtagggagctgcctttcaca (SEQID NO: 206)
(amino acids)
QHSRELPFT (SEQ ID NO:207)
Humanized C2 light chainvariable complementarity determining regions 3 (CDR3) sequence :
(DNA)
ctgcagagtaagaattttcctcccaca (SEQID NO: 208)
(amino acids)
LQSKNFPPT (SEQ ID NO : 209 )
Humanized C2 gBLOCK#6 sequence(Kappa light chain in pCDNA3.1 V5) :
(DNA)
actcactatagggagacccaagctggctagttaagcttgggccaccatggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgacgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttagtaagtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttg (SEQ ID NO:210)
pCDNA3.1 V5 5' overlappingsequence:
(DNA)
actcactatagggagacccaagctggctagtt(SEQ ID NO: 211)
pCDNA3.1 V5 3' overlappingsequence:
(DNA)
ccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttg(SEQ ID NO: 212)
Humanized C2 gBLOCK#7 sequence(Kappa light chain in pSEC Tag2) :
(DNA)
tgctctgggttccaggttccactggtgacgcggcccagccggccgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttagtaagtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttg (SEQ ID NO:213)
pSEC Tag2 5' overlappingsequence:
(DNA)
tgctctgggttccaggttccactggtgacgc(SEQ ID NO: 214)
pSEC Tag2 3' overlappingsequence:
(DNA)
ccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttg(SEQ ID NO: 215)
Humanized C2 gBLOCK#8 sequence(lambda light chain in pCDNA3.1 V5) :
(DNA)
actcactatagggagacccaagctggctagttaagcttgggccaccatggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgacgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccgccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctacccgggagccgtgacagtggcctggaaggcagatagcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaacaaagcaacaacaagtacgcggccagcagctatctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttcatagtaagtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttg (SEQ ID NO:216)
pCDNA3.1 V5 5' overlappingsequence:
(DNA)
actcactatagggagacccaagctggctagtt(SEQ ID NO: 217)
pCDNA3.1 V5 3' overlappingsequence:
(DNA)
ccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttg(SEQ ID NO: 218)
Humanized C2 gBLOCK#9 sequence(lambda light chain in pSEC Tag2) :
(DNA)
tgctctgggttccaggttccactggtgacgcggcccagccggccgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccgccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctacccgggagccgtgacagtggcctggaaggcagatagcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaacaaagcaacaacaagtacgcggccagcagctatctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttcatagtaagtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttg (SEQ ID NO:219)
pSEC Tag2 5' overlappingsequence:
(DNA)
tgctctgggttccaggttccactggtgacgc(SEQ ID NO: 220)
pSEC Tag2 3' overlappingsequence:
(DNA)
ccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttg(SEQ ID NO: 221)
Murine Ig kappa chain leadersequence
(DNA)
atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgac(SEQ ID NO: 222) (amino acids)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGD (SEQ IDNO: 223)
Interleukin-2 (IL-2) leadersequence
(DNA)
atgtacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttgtcacaaacagt(SEQ ID NO: 224) (amino acids)
MYRMQLLSCIALSLALVTNS (SEQ ID NO:225)
CD33 leader sequence
(DNA)
atgcctcttctgcttctgcttcctctgctttgggctggagctcttgct(SEQ ID NO: 226)
(amino acids)
MPLLLLLPLLWAGALA (SEQ ID NO:227)
IGHV3-21*03 leader sequence
(DNA)
atggaactggggctccgctgggttttccttgttgctattttagaaggtgtccagtgt(SEQ ID NO: 228)
(amino acids)
MELGLRWVFLVAILEGVQC (SEQ ID NO:229)
IGHV3-11*02 leader sequence
(DNA)
atggaagccccagcgcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccactgga(SEQ ID NO: 230) (amino acids)
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG (SEQ ID NO:231)
Humanized E6 single chain GS3
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtaggtatggcatgagctgggtccgccaggctccagggaagaggctggagtgggtctcaaccattagtggcggaggcacctacatatactacccagactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtaccagagataactatggccgcaactatgattatggcatggattattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctcacctgcagcgccaccagcagtgttagctacatccactggtaccaacagaggcctggccagagccccaggctcctcatctatagcacctccaacctggccagcggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggagcgactacactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcagctcccctttcacctttggcagcggcaccaaagtggaaattaaa
(SEQ ID NO:232)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKRLEWVSTISGGGTYIYYPDSVKGRFTI SRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLTCSATSSVSYIHWYQQRPGQSPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGSDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSSPFTFGSGTKVEIK (SEQ ID NO:233)
Humanized E6 single chainIgGlnoC
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtaggtatggcatgagctgggtccgccaggctccagggaagaggctggagtgggtctcaaccattagtggcggaggcacctacatatactacccagactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtaccagagataactatggccgcaactatgattatggcatggattattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgataaaacccatactaaaccgccaaaaccggcgccggaactgctgggtggtcctggtaccggtgaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctcacctgcagcgccaccagcagtgttagctacatccactggtaccaacagaggcctggccagagccccaggctcctcatctatagcacctccaacctggccagcggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggagcgactacactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcagctcccctttcacctttggcagcggcaccaaagtggaaattaaa (SEQ ID NO:234)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKRLEWVSTISGGGTYIYYPDSVKGRFTI SRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTLVTVSSDKTHTKPPKPAPELLGGPGTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLTCSATSSVSYIHWYQQRPGQSPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGSDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSSPFTFGSGTKVEIK (SEQ ID NO:235)
Humanized E6 single chain X4(linker is IgGl and IgG2 modified hinge region)
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtaggtatggcatgagctgggtccgccaggctccagggaagaggctggagtgggtctcaaccattagtggcggaggcacctacatatactacccagactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtaccagagataactatggccgcaactatgattatggcatggattattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgataaaacccatactaaaccgccaaaaccggcgccggaactgctgggtggtcctggtaccggtactggtggtccgactattaaacctccgaaacctccgaaacctgctccgaacctgctgggtggtccggaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctcacctgcagcgccaccagcagtgttagctacatccactggtaccaacagaggcctggccagagccccaggctcctcatctatagcacctccaacctggccagcggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggagcgactacactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcagctcccctttcacctttggcagcggcaccaaagtggaaattaaa (SEQ ID NO:236)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKRLEWVSTISGGGTYIYYPDSVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTLVTVSSDKTHTKPPKPAPELLGGPGTGTGGPTIKPPKPPKPAPNLLGGPEIVLTQSPATLSLSPGERATLTCSATSSVSYIHWYQQRPGQSPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGSDYTLTIS SLEPEDFAVYYCQQRSSSPFTFGSGTKVEIK (SEQ ID NO: 237)
Humanized C2 single chain GS3
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaact (SEQ ID NO: 238)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTI SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYFDVWGKGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSRELPFTFGGGTKVEIKRT (SEQ ID NO: 239)
Humanized C2 single chain IgG(no Cysteine)
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccgataaaacccatactaaaccgccaaaaccggcgccggaactgctgggtggtcctggtaccggtgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaact (SEQ ID NO: 240)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTI SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYFDVWGKGTTVTVSSDKTHTKPPKPAPELLGGPGTGDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSRELPFTFGGGTKVEIKRT (SEQ ID NO: 241)
Humanized C2 single chain X4(linker is IgGl and IgG2 modified hinge region)
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccgataaaacccatactaaaccgccaaaaccggcgccggaactgctgggtggtcctggtaccggtactggtggtccgactattaaacctccgaaacctccgaaacctgctccgaacctgctgggtggtccggacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaact (SEQ ID NO: 242)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTI SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYFDVWGKGTTVTVSSDKTHTKPPKPAPELLGGPGTGTGGPTIKPPKPPKPAPNLLGGPDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSRELPFTFGGGTKVEIKRT (SEQ ID NO: 243)
Humanized C3 single chain GS3
(DNA)
caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccgactacgccatgaactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggagtgatcagcaccttcagcggtaacacaaacttcaaccagaagttcaagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgagaagcgactactacggcccatacttcgactactggggccagggcaccaccctgaccgtgtccagcggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgatattgtgatgacccagactccactctctctgtccgtcacccctggacagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagaccattgtccatagtaatggaaacacctatttggagtggtacctgcagaagccaggccagtctccacagctcctgatctataaggtttccaaccggttctctggagtgccagataggttcagtggcagcgggtcagggacagatttcacactgaaaatcagccgggtggaggctgaggatgttggggtttattactgettccaaggtagccacgtgcctttcaccttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaact (SEQ ID NO:244)
(amino acids)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMNWVRQAPGQGLEWMGVISTFSGNTNFNQKFKGRVTMTTDTSTSTAYM ELRSLRSDDTAVYYCARSDYYGPYFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPFTFGGGTKVEIKRT (SEQ ID NO: 245)
Humanized C3 single chain IgGl(no Cysteine)
(DNA)
caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccgactacgccatgaactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggagtgatcagcaccttcagcggtaacacaaacttcaaccagaagttcaagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgagaagcgactactacggcccatacttcgactactggggccagggcaccaccctgaccgtgtccagcgataaaacccatactaaaccgccaaaaccggcgccggaactgctgggtggtcctggtaccggtgatattgtgatgacccagactccactctctctgtccgtcacccctggacagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagaccattgtccatagtaatggaaacacctatttggagtggtacctgcagaagccaggccagtctccacagctcctgatctataaggtttccaaccggttctctggagtgccagataggttcagtggcagcgggtcagggacagatttcacactgaaaatcagccgggtggaggctgaggatgttggggtttattactgettccaaggtagccacgtgcctttcaccttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaact (SEQ ID NO: 246)
(amino acids)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMNWVRQAPGQGLEWMGVISTFSGNTNFNQKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARSDYYGPYFDYWGQGTTLTVSSDKTHTKPPKPAPELLGGPGTGDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPFTFGGGTKVEIKRT (SEQ ID NO: 247)
Humanized C3 single chain X4(linker is IgGl and IgG2 modified hinge region)
(DNA)
caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccgactacgccatgaactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggagtgatcagcaccttcagcggtaacacaaacttcaaccagaagttcaagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgagaagcgactactacggcccatacttcgactactggggccagggcaccaccctgaccgtgtccagcgataaaacccatactaaaccgccaaaaccggcgccggaactgctgggtggtcctggtaccggtactggtggtccgactattaaacctccgaaacctccgaaacctgctccgaacctgctgggtggtccggatattgtgatgacccagactccactctctctgtccgtcacccctggacagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagaccattgtccatagtaatggaaacacctatttggagtggtacctgcagaagccaggccagtctccacagctcctgatctataaggtttccaaccggttctctggagtgccagataggttcagtggcagcgggtcagggacagatttcacactgaaaatcagccgggtggaggctgaggatgttggggtttattactgettccaaggtagccacgtgcctttcaccttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaact (SEQ ID NO: 248)
(amino acids)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMNWVRQAPGQGLEWMGVISTFSGNTNFNQKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARSDYYGPYFDYWGQGTTLTVSSDKTHTKPPKPAPELLGGPGTGTGGPTIKPPKPPKPAPNLLGGPDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKI SRVEAEDVGVYYCFQGSHVPFTFGGGTKVEIKRT (SEQ ID NO: 249)
Humanized C8 single chain GS3(linker is [Gly4Seri] 3)
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccctgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagactgggcggcgataactattatgaatattggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgacatcgtgatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgcagggccagcaagagtgttagcaccagcggctacagctacatgcactggtaccagcagaaaccaggacagcctcctaagctgctcatttacctggtgtctaacctggaatccggggtccctgaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcaacacattcgggaactgaccaggagtgaattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaact (SEQ ID NO:250)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTI SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYWGKGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLVSNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHIRELTRSEFGGGT KVEIKRT (SEQ ID NO:251)
Humanized C8 single chain IgGl(no Cysteine)
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccctgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagactgggcggcgataactattatgaatattggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccgataaaacccatactaaaccgccaaaaccggcgccggaactgctgggtggtcctggtaccggtgacatcgtgatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgcagggccagcaagagtgttagcaccagcggctacagctacatgcactggtaccagcagaaaccaggacagcctcctaagctgctcatttacctggtgtctaacctggaatccggggtccctgaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcaacacattcgggaactgaccaggagtgaattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaact (SEQ ID NO: 252)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYWGKGTTVTVSSDKTHTKPPKPAPELLGGPGTGDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLVSNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHIRELTRS EFGGGTKVEIKRT (SEQ ID NO: 253)
Humanized C8 single chain X4(linker is IgGl and IgG2 modified hinge region)
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactacccagactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagactgggcggcgacaattactatgagtattggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccgataaaacccatactaaaccgccaaaaccggcgccggaactgctgggtggtcctggtaccggtactggtggtccgactattaaacctccgaaacctccgaaacctgctccgaacctgctgggtggtccggacatcgtgatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgcagggccagcaagagtgttagcaccagcggctacagctacatgcactggtaccagcagaaaccaggacagcctcctaagctgctcatttacctggtgtctaacctggaatccggggtccctgaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcaacacattcgggaactgaccaggagtgaattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaact (SEQ ID NO:254)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTI SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYWGKGTTVTVSSDKTHTKPPKPAPELLGGPGTGTGGPTIKPPKPPKPAPNLLGGPDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLVSNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHIRELTRSEFGGGTKVEIKRT (SEQ ID NO: 255)
pSECTag2 E6 scFV-FC
(DNA)
atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgacgcggcccagccggccgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtaggtatggcatgagctgggtccgccaggctccagggaagaggctggagtgggtctcaaccattagtggcggaggcacctacatatactacccagactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtaccagagataactatggccgcaactatgattatggcatggattattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctcacctgcagcgccaccagcagtgttagctacatccactggtaccaacagaggcctggccagagccccaggctcctcatctatagcacctccaacctggccagcggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggagcgactacactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcagctcccctttcacctttggcagcggcaccaaagtggaaattaaagagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgataa (SEQ ID NO: 256)
(amino acids)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDAAQPAEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKRLEWVSTISGG GTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLTCSATSSVSYIHWYQQRPGQSPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGSDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSSPFTFGSGTKVEIKEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK* * (SEQ ID NO: 257)
E6 scFC-FC 1 gBLOCk sequence:
tgctctgggttccaggttccactggtgacgcggcccagccggccgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtaggtatggcatgagctgggtccgccaggctccagggaagaggctggagtgggtctcaaccattagtggcggaggcacctacatatactacccagactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtaccagagataactatggccgcaactatgattatggcatggattattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtc (SEQ ID NO:258)
E6 scFC-FC 2 gBLOCk sequence:
aattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctcacctgcagcgccaccagcagtgttagctacatccactggtaccaacagaggcctggccagagccccaggctcctcatctatagcacctccaacctggccagcggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggagcgactacactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcagctcccctttcacctttggcagcggcaccaaagtggaaattaaagagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagc (SEQ ID NO: 259)
pSECTag2 C2 scFV-FC
(DNA)
atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgacgcggcccagccggccgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgataa (SEQ ID
NO: 260)
(amino acids)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDAAQPAEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYFDVWGKGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSRELPFTFGGGTKVEIKRTEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK* * (SEQ ID NO: 261)
C2 scFV-FC 1 gBLOCk sequence:
(DNA)
tgctctgggttccaggttccactggtgacgcggcccagccggccgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggc (SEQ ID NO:262)
C2 scFV-FC 2 gBLOCk sequence:
(DNA)
cattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagc (SEQ ID NO: 263)
pSECTag2 C3 scFV-FC
(DNA)
atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgacgcggcccagccggcccaggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccgactacgccatgaactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggagtgatcagcaccttcageggtaacacaaacttcaaccagaagttcaagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgagaagcgactactacggcccatacttcgactactggggccagggcaccaccctgaccgtgtccagcggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgatattgtgatgacccagactccactctctctgtccgtcacccctggacagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagaccattgtccatagtaatggaaacacctatttggagtggtacctgcagaagccaggccagtctccacagctcctgatctataaggtttccaaccggttctctggagtgccagataggttcagtggcagcgggtcagggacagatttcacactgaaaatcagccgggtggaggctgaggatgttggggtttattactgettccaaggtagccacgtgcctttcaccttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgataa (SEQ ID NO:264)
(amino acids)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDAAQPAQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMNWVRQAPGQGLEWMGVISTFSGNTNFNQKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARSDYYGPYFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPFTFGGGTKVEIKRTEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK* * (SEQ ID NO: 265)
C3 GS scFV FC 1 gBLOCk sequence:
(DNA)
tgctctgggttccaggttccactggtgacgcggcccagccggcccaggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccgactacgccatgaactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggagtgatcagcaccttcagcggtaacacaaacttcaaccagaagttcaagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgagaagcgactactacggcccatacttcgactactggggccagggcaccaccctgaccgtgtccagcggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgatattgtgatgacccagactccactctctctgt (SEQ
ID NO:266)
C3 scFV FC2 gBLOCk sequence:
(DNA)
tattgtgatgacccagactccactctctctgtccgtcacccctggacagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagaccattgtccatagtaatggaaacacctatttggagtggtacctgcagaagccaggccagtctccacagctcctgatctataaggtttccaaccggttctctggagtgccagataggttcagtggcagcgggtcagggacagatttcacactgaaaatcagccgggtggaggctgaggatgttggggtttattactgettccaaggtagccacgtgcctttcaccttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagc (SEQ ID NO: 267)
pSECTag2 C8 scFV-FC
(DNA)
atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgacgcggcccagccggccgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccctgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagactgggcggcgataactattatgaatattggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgacatcgtgatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgcagggccagcaagagtgttagcaccagcggctacagctacatgcactggtaccagcagaaaccaggacagcctcctaagctgctcatttacctggtgtctaacctggaatccggggtccctgaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcaacacattcgggaactgaccaggagtgaattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgataa (SEQ ID NO:268)
(amino acids)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDAAQPAEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYWGKGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLVSNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISS LQAEDVAVYYCQHIRELTRSEFGGGTKVEIKRTEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK* * (SEQ ID NO : 269 )
C8 scFV FC 1 gBLOCk sequence:
(DNA)
tgctctgggttccaggttccactggtgacgcggcccagccggccgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccctgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagactgggcggcgataactattatgaatattggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgacatcgtgatgacccagtctccagactccctgg (SEQID
NO: 270)
C8 scFV FC2 gBLOCk sequence:
(DNA)
catcgtgatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgcagggccagcaagagtgttagcaccagcggctacagctacatgcactggtaccagcagaaaccaggacagcctcctaagctgctcatttacctggtgtctaacctggaatccggggtccctgaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcaacacattcgggaactgaccaggagtgaattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagc (SEQ ID NO: 271)
Human IgGl Fc sequence:
(DNA)
gagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgataa (SEQ ID NO: 272)
(amino acids)
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK* *(SEQ ID NO:273)
Human IgGl CH2-CH3 domainsequence:
(DNA)
ccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgataa (SEQ ID NO:274)
(amino acids)
PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK* * (SEQ ID NO:275)
Human IgGl CH3 domain sequence :
(DNA)
gggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgataa (SEQ ID NO:276)
(amino acids)
GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK* * (SEQ ID NO: 277)
Human IgGl Fc Y407R sequence:
(DNA)
gagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctcaggagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgataa (SEQ ID NO: 278)
(amino acids)
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLRSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK* *(SEQ ID NO:279)
Human IgGl Fc F405Q sequence:
(DNA)
gagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttccagctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgataa (SEQ ID NO: 280)
(amino acids)
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFQLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK* *(SEQ ID NO:281)
Human IgGl Fc T394D sequence:
(DNA)
gagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccgaccctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgataa (SEQ ID NO: 282)
(amino acids)
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTDPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK* *(SEQ ID NO:283)
Human IgGl Fc T366W/L368Wsequence:
(DNA)
gagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgtggtgctgggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgataa (SEQ ID NO: 284)
(amino acids)
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCWVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK* *(SEQ ID NO:285)
Human IgGl Fc T364R/L368Rsequence:
(DNA)
gagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcaggctgacctgcagggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgataa (SEQ ID NO: 286)
(amino acids)
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVRLTCRVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK* *(SEQ ID NO:287)
Human IgGl Fc hingelesssequence:
(DNA)
gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgataa (SEQ ID NO:288)
(amino acids)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK* * (SEQ ID NO : 289 )
Human IgGl G237A FC sequence:
(DNA)
gagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctgggggccccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO: 290)
(amino acids)
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK ( SEQ IDNO: 291)
Human IgGl L234A/L235A FCsequence:
(DNA)
gagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgccgggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO: 292)
(amino acids)
EPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK ( SEQ IDNO:293)
CAR-T E6 CD8/CD8/CD3z sequence:
N-CD81s-huMNE6scFv-CD8ecdfragment- CD8 transmembrane- CD3zeta-C
(DNA)
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atggccctgcccgtgaccgctttgctgctccccctggcgctgctgctgcacgccgccaggccagaggtccagctggttgagagtggcggtgggctggttaagcctggcggctccctgcggctgagctgcgccgcgagtggatttactttcagccgatatgggatgagttgggtgcggcaagctcccgggaagaggctggaatgggtctcaacaatctccggggggggcacttacatctattaccccgactcagtcaaggggagatttaccatttcacgagacaacgctaagaataccctgtatttgcagatgaattctctgagagcagaggacacagctgtttactattgtacccgcgacaactatggcaggaactacgactacggtatggactattggggacaagggacattggttacagtgagcagtggcggcgggggcagcggaggaggaggcagcggtggcggaggcagcgagatagtgctcacgcagtcacccgcgactctcagtctctcacctggggaacgagctaccctgacgtgctctgctacctcctcagtgtcatatattcactggtatcagcaacggcccgggcagtcccctagattgctcatttatagtacctctaatctggcctcaggtatccctgcacgattttctggatctggttcaggttctgattacaccctcactatctctagcctggagcctgaagactttgccgtttattactgccagcagaggtctagctccccattcacctttgggagtgggaccaaggttgaaattaaagagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaaatctacatttgggccccgctcgcaggcacatgtggagtgctcctcctctccctggtgattaccctgtactgcaaaaggggccgcaaaaaactcctttacatttttaagcagccttttatgaggccagtacagacgactcaagaggaagacgggtgctcatgccgctttcctgaggaggaggaaggagggtgcgaactgcgcgttaagttctcccgatcagccgacgcgcctgcttacaagcagggccagaaccaactgtacaacgagctgaatctcggtagacgggaagagtacgacgtgttggacaaacggagaggccgcgacccagaaatgggcggcaagcctcgcaggaaaaacccccaggagggactgtacaatgagttgcagaaagataagatggcagaagcttatagcgagatcggaatgaagggggaaaggagacgagggaaaggacacgacggcctttatcagggcctgtccacagcaacaaaagatacgtatgacgccctccatatgcaggcacttccaccacggtgataa (SEQ ID NO: 310)
(amino acids)
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKRLEWVSTISGGGTYIY YPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLTCSATSSVSYIHWYQQRPGQSPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGSDYTLTISSLEPEDF AVYYCQQRSSSPFTFGSGTKVEIKEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR* * ( SEQ ID NO:311)
E6 CAR pCDH gBLOCK sequence:
(DNA)
acgctgttttgacctccatagaagattctagagctagctgtagagcttggtaccgagggccaccatggccctgcccgtgaccgctttgctgctccccctggcgctgctgctgcacgccgccaggccagaggtccagctggttgagagtggcggtgggctggttaagcctggcggctccctgcggctgagctgcgccgcgagtggatttactttcagccgatatgggatgagttgggtgcggcaagctcccgggaagaggctggaatgggtctcaacaatctccggggggggcacttacatctattaccccgactcagtcaaggggagatttaccatttcacgagacaacgctaagaataccctgtatttgcagatgaattctctgagagcagaggacacagctgtttactattgtacccgcgacaactatggcaggaactacgactacggtatggactattggggacaagggacattggttacagtgagcagtggcggcgggggcagcggaggaggaggcagcggtggcggaggcagcgagatagtgctcacgcagtcacccgcgactctcagtctctcacctggggaacgagctaccctgacgtgctctgctacctcctcagtgtcatatattcactggtatcagcaacggcccgggcagtcccctagattgctcatttatagtacctctaatctggcctcaggtatccctgc (SEQ ID NO:312)
E6 CAR Fc pCDH gBLOCK sequence:
(DNA)
agtacctctaatctggcctcaggtatccctgcacgattttctggatctggttcaggttctgattacaccctcactatctctagcctggagcctgaagactttgccgtttattactgccagcagaggtctagctccccattcacctttgggagtgggaccaaggttgaaattaaagagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctg (SEQ
ID NO:313)
E6 CAR 8BB3 pCDH gBLOCKsequence:
(DNA)
agaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaaatctacatttgggccccgctcgcaggcacatgtggagtgctcctcctctccctggtgattaccctgtactgcaaaaggggccgcaaaaaactcctttacatttttaagcagccttttatgaggccagtacagacgactcaagaggaagacgggtgctcatgccgctttcctgaggaggaggaaggagggtgcgaactgcgcgttaagttctcccgatcagccgacgcgcctgcttacaagcagggccagaaccaactgtacaacgagctgaatctcggtagacgggaagagtacgacgtgttggacaaacggagaggccgcgacccagaaatgggcggcaagcctcgcaggaaaaacccccaggagggactgtacaatgagttgcagaaagataagatggcagaagcttatagcgagatcggaatgaagggggaaaggagacgagggaaaggacacgacggcctttatcagggcctgtccacagcaacaaaagatacgtatgacgccctccatatgcaggcacttccaccacggtgataagtttaaacccgctgatcaggcggccgcgaaggatctgcgatcgctccggtgcccgtcag (SEQ ID NO: 314)
CAR E6 FcH/8/4-lBB/CD3zsequence:
N-CD81s-huMNE6scFv-Human IgGlhingeless Fc Y407R- CD8 transmembrane- 4-1BB- CD3zeta-C
(DNA)
atggccctgcccgtgaccgctttgctgctccccctggcgctgctgctgcacgccgccaggccagaggtccagctggttgagagtggcggtgggctggttaagcctggcggctccctgcggctgagctgcgccgcgagtggatttactttcagccgatatgggatgagttgggtgcggcaagctcccgggaagaggctggaatgggtctcaacaatctccggggggggcacttacatctattaccccgactcagtcaaggggagatttaccatttcacgagacaacgctaagaataccctgtatttgcagatgaattctctgagagcagaggacacagctgtttactattgtacccgcgacaactatggcaggaactacgactacggtatggactattggggacaagggacattggttacagtgagcagtggcggcgggggcagcggaggaggaggcagcggtggcggaggcagcgagatagtgctcacgcagtcacccgcgactctcagtctctcacctggggaacgagctaccctgacgtgctctgctacctcctcagtgtcatatattcactggtatcagcaacggcccgggcagtcccctagattgctcatttatagtacctctaatctggcctcaggtatccctgcacgattttctggatctggttcaggttctgattacaccctcactatctctagcctggagcctgaagactttgccgtttattactgccagcagaggtctagctccccattcacctttgggagtgggaccaaggttgaaattaaagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaaatctacatttgggccccgctcgcaggcacatgtggagtgctcctcctctccctggtgattaccctgtactgcaaaaggggccgcaaaaaactcctttacatttttaagcagccttttatgaggccagtacagacgactcaagaggaagacgggtgctcatgccgctttcctgaggaggaggaaggagggtgcgaactgcgcgttaagttctcccgatcagccgacgcgcctgcttacaagcagggccagaaccaactgtacaacgagctgaatctcggtagacgggaagagtacgacgtgttggacaaacggagaggccgcgacccagaaatgggcggcaagcctcgcaggaaaaacccccaggagggactgtacaatgagttgcagaaagataagatggcagaagcttatagcgagatcggaatgaagggggaaaggagacgagggaaaggacacgacggcctttatcagggcctgtccacagcaacaaaagatacgtatgacgccctccatatgcaggcacttccaccacggtgataa (SEQ ID NO: 315)
(amino acids)
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKRLEWVSTISGGGTYIY YPDSVKGRFTI SRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLTCSATSSVSYIHWYQQRPGQSPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGSDYTLTISSLEPEDF AVYYCQQRSSSPFTFGSGTKVEIKAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR* * (SEQ ID NO: 316)
E6 CAR FcH pCDH gBLOCK sequence:
(DNA)
agtacctctaatctggcctcaggtatccctgcacgattttctggatctggttcaggttctgattacaccctcactatctctagcctggagcctgaagactttgccgtttattactgccagcagaggtctagctccccattcacctttgggagtgggaccaaggttgaaattaaagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatetcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctg (SEQ ID NO: 317)
CAR E6 Fc/4/4-lBB/CD3z sequence:
N-CD81s-huMNE6scFv-Human IgGlFc- CD4 transmembrane- CD28- 4-1BB- CD3zeta-C (DNA)
atggccctgcccgtgaccgctttgctgctccccctggcgctgctgctgcacgccgccaggccagaggtccagctggttgagagtggcggtgggctggttaagcctggcggctccctgcggctgagctgcgccgcgagtggatttactttcagccgatatgggatgagttgggtgcggcaagctcccgggaagaggctggaatgggtctcaacaatctccggggggggcacttacatctattaccccgactcagtcaaggggagatttaccatttcacgagacaacgctaagaataccctgtatttgcagatgaattctctgagagcagaggacacagctgtttactattgtacccgcgacaactatggcaggaactacgactacggtatggactattggggacaagggacattggttacagtgagcagtggcggcgggggcagcggaggaggaggcagcggtggcggaggcagcgagatagtgctcacgcagtcacccgcgactctcagtctctcacctggggaacgagctaccctgacgtgctctgctacctcctcagtgtcatatattcactggtatcagcaacggcccgggcagtcccctagattgctcatttatagtacctctaatctggcctcaggtatccctgcacgattttctggatctggttcaggttctgattacaccctcactatctctagcctggagcctgaagactttgccgtttattactgccagcagaggtctagctccccattcacctttgggagtgggaccaaggttgaaattaaagagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaaatggccctgattgtgctggggggcgtcgccggcctcctgcttttcattgggctaggcatcttcttcaaaaggggccgcaaaaaactcctttacatttttaagcagccttttatgaggccagtacagacgactcaagaggaagacgggtgctcatgccgctttcctgaggaggaggaaggagggtgcgaactgcgcgttaagttctcccgatcagccgacgcgcctgcttacaagcagggccagaaccaactgtacaacgagctgaatctcggtagacgggaagagtacgacgtgttggacaaacggagaggccgcgacccagaaatgggcggcaagcctcgcaggaaaaacccccaggagggactgtacaatgagttgcagaaagataagatggcagaagcttatagcgagatcggaatgaagggggaaaggagacgagggaaaggacacgacggcctttatcagggcctgtccacagcaacaaaagatacgtatgacgccctccatatgcaggcacttccaccacggtgataa(SEQ ID NO:318)
(amino acids)
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKRLEWVSTISGGGTYIY YPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLTCSATSSVSYIHWYQQRPGQSPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGSDYTLTISSLEPEDF AVYYCQQRSSSPFTFGSGTKVEIKEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKMALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR* * (SEQ ID NO: 319)
E6 CAR 44BB3 pCDH gBLOCKsequence:
(DNA)
agaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaaatggccctgattgtgctggggggcgtcgccggcctcctgcttttcattgggctaggcatcttcttcaaaaggggccgcaaaaaactcctttacatttttaagcagccttttatgaggccagtacagacgactcaagaggaagacgggtgctcatgccgctttcctgaggaggaggaaggagggtgcgaactgcgcgttaagttctcccgatcagccgacgcgcctgcttacaagcagggccagaaccaactgtacaacgagctgaatctcggtagacgggaagagtacgacgtgttggacaaacggagaggccgcgacccagaaatgggcggcaagcctcgcaggaaaaacccccaggagggactgtacaatgagttgcagaaagataagatggcagaagcttatagcgagatcggaatgaagggggaaaggagacgagggaaaggacacgacggcctttatcagggcctgtccacagcaacaaaagatacgtatgacgccctccatatgcaggcacttccaccacggtgataagtttaaacccgctgatcaggcggccgcgaaggatctgcgatcgctccggtgcccgtcag (SEQ ID NO: 320)
CAR E6 FcH/4/4-lBB/CD3zsequence:
N-CD81s-huMNE6scFv-Human IgGlhingeless Fc Y407R- CD4 transmembrane- CD28- 4-1BB- CD3zeta-C
(DNA)
atggccctgcccgtgaccgctttgctgctccccctggcgctgctgctgcacgccgccaggccagaggtccagctggttgagagtggcggtgggctggttaagcctggcggctccctgcggctgagctgcgccgcgagtggatttactttcagccgatatgggatgagttgggtgcggcaagctcccgggaagaggctggaatgggtctcaacaatctccggggggggcacttacatctattaccccgactcagtcaaggggagatttaccatttcacgagacaacgctaagaataccctgtatttgcagatgaattctctgagagcagaggacacagctgtttactattgtacccgcgacaactatggcaggaactacgactacggtatggactattggggacaagggacattggttacagtgagcagtggcggcgggggcagcggaggaggaggcagcggtggcggaggcagcgagatagtgctcacgcagtcacccgcgactctcagtctctcacctggggaacgagctaccctgacgtgctctgctacctcctcagtgtcatatattcactggtatcagcaacggcccgggcagtcccctagattgctcatttatagtacctctaatctggcctcaggtatccctgcacgattttctggatctggttcaggttctgattacaccctcactatctctagcctggagcctgaagactttgccgtttattactgccagcagaggtctagctccccattcacctttgggagtgggaccaaggttgaaattaaagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaaatggccctgattgtgctggggggcgtcgccggcctcctgcttttcattgggctaggcatcttcttcaaaaggggccgcaaaaaactcctttacatttttaagcagccttttatgaggccagtacagacgactcaagaggaagacgggtgctcatgccgctttcctgaggaggaggaaggagggtgcgaactgcgcgttaagttctcccgatcagccgacgcgcctgcttacaagcagggccagaaccaactgtacaacgagctgaatctcggtagacgggaagagtacgacgtgttggacaaacggagaggccgcgacccagaaatgggcggcaagcctcgcaggaaaaacccccaggagggactgtacaatgagttgcagaaagataagatggcagaagcttatagcgagatcggaatgaagggggaaaggagacgagggaaaggacacgacggcctttatcagggcctgtccacagcaacaaaagatacgtatgacgccctccatatgcaggcacttccaccacggtgataa (SEQ ID NO: 321)
(amino acids)
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKRLEWVSTISGGGTYIY YPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLTCSATSSVSYIHWYQQRPGQSPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGSDYTLTISSLEPEDF AVYYCQQRSSSPFTFGSGTKVEIKAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKMALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR* * (SEQ ID NO: 322)
CAR E6 IgD/8/4-lBB/CD3zsequence:
N-CD81s-huMNE6scFv-IgD hingeregion- CD8 transmembrane- 4-1BB- CD3zeta-C
(DNA)
atggccctgcccgtgaccgctttgctgctccccctggcgctgctgctgcacgccgccaggccagaggtccagctggttgagagtggcggtgggctggttaagcctggcggctccctgcggctgagctgcgccgcgagtggatttactttcagccgatatgggatgagttgggtgcggcaagctcccgggaagaggctggaatgggtctcaacaatctccggggggggcacttacatctattaccccgactcagtcaaggggagatttaccatttcacgagacaacgctaagaataccctgtatttgcagatgaattctctgagagcagaggacacagctgtttactattgtacccgcgacaactatggcaggaactacgactacggtatggactattggggacaagggacattggttacagtgagcagtggcggcgggggcagcggaggaggaggcagcggtggcggaggcagcgagatagtgctcacgcagtcacccgcgactctcagtctctcacctggggaacgagctaccctgacgtgctctgctacctcctcagtgtcatatattcactggtatcagcaacggcccgggcagtcccctagattgctcatttatagtacctctaatctggcctcaggtatccctgcacgattttctggatctggttcaggttctgattacaccctcactatctctagcctggagcctgaagactttgccgtttattactgccagcagaggtctagctccccattcacctttgggagtgggaccaaggttgaaattaaagagtctccaaaggcacaggcctcctcagtgcccactgcacaaccccaagcagagggcagcctcgccaaggcaaccacagccccagccaccacccgtaacacaggaagaggcggcgaagagaagaaaaaggagaaggagaaagaggaacaagaagagagagagacaaagacaccaatctacatttgggccccgctcgcaggcacatgtggagtgctcctcctctccctggtgattaccctgtactgcaaaaggggccgcaaaaaactcctttacatttttaagcagccttttatgaggccagtacagacgactcaagaggaagacgggtgctcatgccgctttcctgaggaggaggaaggagggtgcgaactgcgcgttaagttctcccgatcagccgacgcgcctgcttacaagcagggccagaaccaactgtacaacgagctgaatctcggtagacgggaagagtacgacgtgttggacaaacggagaggccgcgacccagaaatgggcggcaagcctcgcaggaaaaacccccaggagggactgtacaatgagttgcagaaagataagatggcagaagcttatagcgagatcggaatgaagggggaaaggagacgagggaaaggacacgacggcctttatcagggcctgtccacagcaacaaaagatacgtatgacgccctccatatgcaggcacttccaccacggtgataa (SEQ ID NO: 323)
(amino acids)
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKRLEWVSTISGGGTYIY YPDSVKGRFTI SRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLTCSATSSVSYIHWYQQRPGQSPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGSDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSSPFTFGSGTKVEIKESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTP IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR* * (SEQ ID NO: 324)
E6 CAR IgD8 pcDH gBLOCKsequence:
(DNA)
agtacctctaatctggcctcaggtatccctgcacgattttctggatctggttcaggttctgattacaccctcactatctctagcctggagcctgaagactttgccgtttattactgccagcagaggtctagctccccattcacctttgggagtgggaccaaggttgaaattaaagagtctccaaaggcacaggcctcctcagtgcccactgcacaaccccaagcagagggcagcctcgccaaggcaaccacagccccagccaccacccgtaacacaggaagaggcggcgaagagaagaaaaaggagaaggagaaagaggaacaagaagagagagagacaaagacaccaatctacatttgggccccgctcgcaggcacatgtggagtgctcctcctctccctggtgattaccctgtactgcaaaaggggccgcaaaaaactcctttacatttttaagcagccttttatgaggccag (SEQID
NO: 325)
E6 CAR BB 3 pCDH gBLOCKsequence:
(DNA)
acatttttaagcagccttttatgaggccagtacagacgactcaagaggaagacgggtgctcatgccgctttcctgaggaggaggaaggagggtgcgaactgcgcgttaagttctcccgatcagccgacgcgcctgcttacaagcagggccagaaccaactgtacaacgagctgaatctcggtagacgggaagagtacgacgtgttggacaaacggagaggccgcgacccagaaatgggcggcaagcctcgcaggaaaaacccccaggagggactgtacaatgagttgcagaaagataagatggcagaagcttatagcgagatcggaatgaagggggaaaggagacgagggaaaggacacgacggcctttatcagggcctgtccacagcaacaaaagatacgtatgacgccctccatatgcaggcacttccaccacggtgataagtttaaacccgctgatcaggcggccgcgaaggatctgcgatcgctccggtgcccgtcag (SEQ ID NO: 326)
CAR E6 IgD/4/4-lBB/CD3zsequence:
N-CD81s-huMNE6scFv-IgD hingeregion- CD4 transmembrane- 4-1BB- CD3zeta-C
(DNA)
atggccctgcccgtgaccgctttgctgctccccctggcgctgctgctgcacgccgccaggccagaggtccagctggttgagagtggcggtgggctggttaagcctggcggctccctgcggctgagctgcgccgcgagtggatttactttcagccgatatgggatgagttgggtgcggcaagctcccgggaagaggctggaatgggtctcaacaatctccggggggggcacttacatctattaccccgactcagtcaaggggagatttaccatttcacgagacaacgctaagaataccctgtatttgcagatgaattctctgagagcagaggacacagctgtttactattgtacccgcgacaactatggcaggaactacgactacggtatggactattggggacaagggacattggttacagtgagcagtggcggcgggggcagcggaggaggaggcagcggtggcggaggcagcgagatagtgctcacgcagtcacccgcgactctcagtctctcacctggggaacgagctaccctgacgtgctctgctacctcctcagtgtcatatattcactggtatcagcaacggcccgggcagtcccctagattgctcatttatagtacctctaatctggcctcaggtatccctgcacgattttctggatctggttcaggttctgattacaccctcactatctctagcctggagcctgaagactttgccgtttattactgccagcagaggtctagctccccattcacctttgggagtgggaccaaggttgaaattaaagagtctccaaaggcacaggcctcctcagtgcccactgcacaaccccaagcagagggcagcctcgccaaggcaaccacagccccagccaccacccgtaacacaggaagaggcggcgaagagaagaaaaaggagaaggagaaagaggaacaagaagagagagagacaaagacaccaatggccctgattgtgctggggggcgtcgccggcctcctgcttttcattgggctaggcatcttcttcaaaaggggccgcaaaaaactcctttacatttttaagcagccttttatgaggccagtacagacgactcaagaggaagacgggtgctcatgccgctttcctgaggaggaggaaggagggtgcgaactgcgcgttaagttctcccgatcagccgacgcgcctgcttacaagcagggccagaaccaactgtacaacgagctgaatctcggtagacgggaagagtacgacgtgttggacaaacggagaggccgcgacccagaaatgggcggcaagcctcgcaggaaaaacccccaggagggactgtacaatgagttgcagaaagataagatggcagaagcttatagcgagatcggaatgaagggggaaaggagacgagggaaaggacacgacggcctttatcagggcctgtccacagcaacaaaagatacgtatgacgccctccatatgcaggcacttccaccacggtgataa (SEQ ID NO: 327)
(amino acids)
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKRLEWVSTISGGGTYIY YPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEI VLTQSPATLSLSPGERATLTCSATSSVSYIHWYQQRPGQSPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGSDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSSPFTFGSGTKVEIKESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPMALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR* * (SEQ ID NO: 328)
E6 CAR IgD4 pcDH gBLOCKsequence:
(DNA)
agtacctctaatctggcctcaggtatccctgcacgattttctggatctggttcaggttctgattacaccctcactatctctagcctggagcctgaagactttgccgtttattactgccagcagaggtctagctccccattcacctttgggagtgggaccaaggttgaaattaaagagtctccaaaggcacaggcctcctcagtgcccactgcacaaccccaagcagagggcagcctcgccaaggcaaccacagccccagccaccacccgtaacacaggaagaggcggcgaagagaagaaaaaggagaaggagaaagaggaacaagaagagagagagacaaagacaccaatggccctgattgtgctggggggcgtcgccggcctcctgcttttcattgggctaggcatcttcttcaaaaggggccgcaaaaaactcctttacatttttaagcagccttttatgaggccag (SEQ ID
NO: 329)
CAR E6 X4/8/4-lBB/CD3z sequence:
N-CD81s-huMNE6scFv- X4 linker-CD8 transmembrane- 4-1BB- CD3zeta-C
(DNA)
atggccctgcccgtgaccgctttgctgctccccctggcgctgctgctgcacgccgccaggccagaggtccagctggttgagagtggcggtgggctggttaagcctggcggctccctgcggctgagctgcgccgcgagtggatttactttcagccgatatgggatgagttgggtgcggcaagctcccgggaagaggctggaatgggtctcaacaatctccggggggggcacttacatctattaccccgactcagtcaaggggagatttaccatttcacgagacaacgctaagaataccctgtatttgcagatgaattctctgagagcagaggacacagctgtttactattgtacccgcgacaactatggcaggaactacgactacggtatggactattggggacaagggacattggttacagtgagcagtggcggcgggggcagcggaggaggaggcagcggtggcggaggcagcgagatagtgctcacgcagtcacccgcgactctcagtctctcacctggggaacgagctaccctgacgtgctctgctacctcctcagtgtcatatattcactggtatcagcaacggcccgggcagtcccctagattgctcatttatagtacctctaatctggcctcaggtatccctgcacgattttctggatctggttcaggttctgattacaccctcactatctctagcctggagcctgaagactttgccgtttattactgccagcagaggtctagctccccattcacctttgggagtgggaccaaggttgaaattaaagacaagacgcacaccaagccacctaaaccagctccagaactgctcggaggtcctggcaccggaaccggaggacctaccatcaaaccacctaagccacctaagcctgctcctaacctgctcggaggacctatctacatttgggccccgctcgcaggcacatgtggagtgctcctcctctccctggtgattaccctgtactgcaaaaggggccgcaaaaaactcctttacatttttaagcagccttttatgaggccagtacagacgactcaagaggaagacgggtgctcatgccgctttcctgaggaggaggaaggagggtgcgaactgcgcgttaagttctcccgatcagccgacgcgcctgcttacaagcagggccagaaccaactgtacaacgagctgaatctcggtagacgggaagagtacgacgtgttggacaaacggagaggccgcgacccagaaatgggcggcaagcctcgcaggaaaaacccccaggagggactgtacaatgagttgcagaaagataagatggcagaagcttatagcgagatcggaatgaagggggaaaggagacgagggaaaggacacgacggcctttatcagggcctgtccacagcaacaaaagatacgtatgacgccctccatatgcaggcacttccaccacggtgataa (SEQ ID NO:330)
(amino acids)
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKRLEWVSTISGGGTYIY YPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLTCSATSSVSYIHWYQQRPGQSPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGSDYTLTISSLEPEDF AVYYCQQRSSSPFTFGSGTKVEIKDKTHTKPPKPAPELLGGPGTGTGGPTIKPPKPPKPAPNLLGGPIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR* * (SEQ ID NO:331)
E6 CAR X48 pCDH gBLOCK sequence:
(DNA)
agtacctctaatctggcctcaggtatccctgcacgattttctggatctggttcaggttctgattacaccctcactatctctagcctggagcctgaagactttgccgtttattactgccagcagaggtctagctccccattcacctttgggagtgggaccaaggttgaaattaaagacaagacgcacaccaagccacctaaaccagctccagaactgctcggaggtcctggcaccggaaccggaggacctaccatcaaaccacctaagccacctaagcctgctcctaacctgctcggaggacctatctacatttgggccccgctcgcaggcacatgtggagtgctcctcctctccctggtgattaccctgtactgcaaaaggggccgcaaaaaactcctttacatttttaagcagccttttatgaggccag (SEQ ID NO: 332)
CAR E6 X4/4/4-lBB/CD3z sequence:
N-CD81s-huMNE6scFv-X4 linker-CD4 transmembrane- 4-1BB- CD3zeta-C
(DNA)
atggccctgcccgtgaccgctttgctgctccccctggcgctgctgctgcacgccgccaggccagaggtccagctggttgagagtggcggtgggctggttaagcctggcggctccctgcggctgagctgcgccgcgagtggatttactttcagccgatatgggatgagttgggtgcggcaagctcccgggaagaggctggaatgggtctcaacaatctccggggggggcacttacatctattaccccgactcagtcaaggggagatttaccatttcacgagacaacgctaagaataccctgtatttgcagatgaattctctgagagcagaggacacagctgtttactattgtacccgcgacaactatggcaggaactacgactacggtatggactattggggacaagggacattggttacagtgagcagtggcggcgggggcagcggaggaggaggcagcggtggcggaggcagcgagatagtgctcacgcagtcacccgcgactctcagtctctcacctggggaacgagctaccctgacgtgctctgctacctcctcagtgtcatatattcactggtatcagcaacggcccgggcagtcccctagattgctcatttatagtacctctaatctggcctcaggtatccctgcacgattttctggatctggttcaggttctgattacaccctcactatctctagcctggagcctgaagactttgccgtttattactgccagcagaggtctagctccccattcacctttgggagtgggaccaaggttgaaattaaagacaagacgcacaccaagccacctaaaccagctccagaactgctcggaggtcctggcaccggaaccggaggacctaccatcaaaccacctaagccacctaagcctgctcctaacctgctcggaggacctatggccctgattgtgctggggggcgtcgccggcctcctgcttttcattgggctaggcatcttcttcaaaaggggccgcaaaaaactcctttacatttttaagcagccttttatgaggccagtacagacgactcaagaggaagacgggtgctcatgccgctttcctgaggaggaggaaggagggtgcgaactgcgcgttaagttctcccgatcagccgacgcgcctgcttacaagcagggccagaaccaactgtacaacgagctgaatctcggtagacgggaagagtacgacgtgttggacaaacggagaggccgcgacccagaaatgggcggcaagcctcgcaggaaaaacccccaggagggactgtacaatgagttgcagaaagataagatggcagaagcttatagcgagatcggaatgaagggggaaaggagacgagggaaaggacacgacggcctttatcagggcctgtccacagcaacaaaagatacgtatgacgccctccatatgcaggcacttccaccacggtgataa(SEQ ID NO:333)
(amino acids)
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKRLEWVSTISGGGTYIY YPDSVKGRFTI SRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLTCSATSSVSYIHWYQQRPGQSPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGSDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSSPFTFGSGTKVEIKDKTHTKPPKPAPELLGGPGTGTGGPTIKPPKPPKPAPNLLGGPMALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR** (SEQ ID NO:334)
E6 CAR X44 pCDH gBLOCK sequence:
(DNA)
agtacctctaatctggcctcaggtatccctgcacgattttctggatctggttcaggttctgattacaccctcactatctctagcctggagcctgaagactttgccgtttattactgccagcagaggtctagctccccattcacctttgggagtgggaccaaggttgaaattaaagacaagacgcacaccaagccacctaaaccagctccagaactgctcggaggtcctggcaccggaaccggaggacctaccatcaaaccacctaagccacctaagcctgctcctaacctgctcggaggacctatggccctgattgtgctggggggcgtcgccggcctcctgcttttcattgggctaggcatcttcttcaaaaggggccgcaaaaaactcctttacatttttaagcagccttttatgaggccag (SEQ ID NO: 335)
CAR E6 8+4/4/4-lBB/CD3zsequence:
N-CD81s-huMNE6scFv- CD8ecd +CD4ecd fragment - CD4 transmembrane- 4-1BB- CD3zeta-C
(DNA)
atggccctgcccgtgaccgctttgctgctccccctggcgctgctgctgcacgccgccaggccagaggtccagctggttgagagtggcggtgggctggttaagcctggcggctccctgcggctgagctgcgccgcgagtggatttactttcagccgatatgggatgagttgggtgcggcaagctcccgggaagaggctggaatgggtctcaacaatctccggggggggcacttacatctattaccccgactcagtcaaggggagatttaccatttcacgagacaacgctaagaataccctgtatttgcagatgaattctctgagagcagaggacacagctgtttactattgtacccgcgacaactatggcaggaactacgactacggtatggactattggggacaagggacattggttacagtgagcagtggcggcgggggcagcggaggaggaggcagcggtggcggaggcagcgagatagtgctcacgcagtcacccgcgactctcagtctctcacctggggaacgagctaccctgacgtgctctgctacctcctcagtgtcatatattcactggtatcagcaacggcccgggcagtcccctagattgctcatttatagtacctctaatctggcctcaggtatccctgcacgattttctggatctggttcaggttctgattacaccctcactatctctagcctggagcctgaagactttgccgtttattactgccagcagaggtctagctccccattcacctttgggagtgggaccaaggttgaaattaaaacgacaaccccggcccccagaccaccaacgccagcccccaccatcgccagccaacccctgtctctgagaccagaagcctgtaggcctgccgccggtggagctgtgcacacaagaggactggatttcgcctgtgatatggccctgattgtgctggggggcgtcgccggcctcctgcttttcattgggctaggcatcttcttcaaaaggggccgcaaaaaactcctttacatttttaagcagccttttatgaggccagtacagacgactcaagaggaagacgggtgctcatgccgctttcctgaggaggaggaaggagggtgcgaactgcgcgttaagttctcccgatcagccgacgcgcctgcttacaagcagggccagaaccaactgtacaacgagctgaatctcggtagacgggaagagtacgacgtgttggacaaacggagaggccgcgacccagaaatgggcggcaagcctcgcaggaaaaacccccaggagggactgtacaatgagttgcagaaagataagatggcagaagcttatagcgagatcggaatgaagggggaaaggagacgagggaaaggacacgacggcctttatcagggcctgtccacagcaacaaaagatacgtatgacgccctccatatgcaggcacttccaccacggtgataa (SEQ ID NO:336)
(amino acids)
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKRLEWVSTISGGGTYIY YPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLTCSATSSVSYIHWYQQRPGQSPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGSDYTLTISSLEPEDF AVYYCQQRSSSPFTFGSGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDMALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR* * (SEQ ID NO:337)
E6 CAR CD844 pCDH gBLOCK sequence:
(DNA)
agtacctctaatctggcctcaggtatccctgcacgattttctggatctggttcaggttctgattacaccctcactatctctagcctggagcctgaagactttgccgtttattactgccagcagaggtctagctccccattcacctttgggagtgggaccaaggttgaaattaaaacgacaaccccggcccccagaccaccaacgccagcccccaccatcgccagccaacccctgtctctgagaccagaagcctgtaggcctgccgccggtggagctgtgcacacaagaggactggatttcgcctgtgatatggccctgattgtgctggggggcgtcgccggcctcctgcttttcattgggctaggcatcttcttcaaaaggggccgcaaaaaactcctttacatttttaagcagccttttatgaggccag (SEQ ID NO: 338)
Humanized C2 scFV sequence inCAR:
(DNA)
gagggccaccatggccttgccagtgacggccctgctgctgccattggctcttctgttgcacgctgccaggcctgaagtgcagctcgtagagagtggcgggggactggtgaagcccggtggaagcctcagactcagttgcgccgcctcaggtttcactttttcaggttacgccatgtcctgggtaagacaggcaccggggaaaggactcgagtgggtgtctactatcagctcaggaggcacttatatatattatcctgactctgtaaaaggccgatttacgatttctcgcgacaatgcaaagaactccctctacctccaaatgaacagtcttagggcagaagacactgctgtatactattgtgcacgcctcggcggcgacaactactacgagtactttgacgtgtgggggaaagggactaccgtgacagtttcaagcggaggaggtggctcaggtggaggcgggtcaggggggggaggaagtgatattgtgctcacacaatccccagcctccctggctgtgtctcccggccaacgcgctacaattacatgtcgggcctccaaaagcgtgagcaccagcggctacagctacatgcactggtatcaacagaaaccaggacaaccccccaaactgttgatttatctcgcttcaaacttggagtccggcgtgcctgcgcgcttttcagggagtgggagcggcacagattttacgctgactatcaaccccgtagaagcaaacgatacagcgaattattattgtcaacattcccgggaactcccctttacgttcggcgggggcacaaaggtcgaaattaagagaacc (SEQ ID NO: 339)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTI SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYFDVWGKGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSRELPFTFGGGTKVEIKRT (SEQ ID NO: 340)
Humanized E6 scFV sequence inCAR:
(DNA)
gaggtccagctggttgagagtggcggtgggctggttaagcctggcggctccctgcggctgagctgcgccgcgagtggatttactttcagccgatatgggatgagttgggtgcggcaagctcccgggaagaggctggaatgggtctcaacaatctccggggggggcacttacatctattaccccgactcagtcaaggggagatttaccatttcacgagacaacgctaagaataccctgtatttgcagatgaattctctgagagcagaggacacagctgtttactattgtacccgcgacaactatggcaggaactacgactacggtatggactattggggacaagggacattggttacagtgagcagtggcggcgggggcagcggaggaggaggcagcggtggggggggcagcgagatagtgctcacgcagtcacccgcgactctcagtctctcacctggggaacgagctaccctgacgtgctctgctacctcctcagtgtcatatattcactggtatcagcaacggcccgggcagtcccctagattgctcatttatagtacctctaatctggcctcaggtatccctgcacgattttctggatctggttcaggttctgattacaccctcactatctctagcctggagcctgaagactttgccgtttattactgccagcagaggtctagctccccattcacctttgggagtgggaccaaggttgaaattaaa(SEQ ID NO:341)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKRLEWVSTISGGGTYIYYPDSVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLTCSATSSVSYIHWYQQRPGQSPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGSDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSSPFTFGSGTKVEIK (SEQ ID NO:342)
CD8 leader sequence:
(DNA)
atggccctgcccgtgaccgctttgctgctccccctggcgctgctgctgcacgccgccaggcca(SEQ ID NO: 343) (amino acids)
MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ IDNO: 344)
CD8 hinge domain sequence :
(DNA)
acgacaaccccggcccccagaccaccaacgccagcccccaccatcgccagccaacccctgtctctgagaccagaagcctgtaggcctgccgccggtggagctgtgcacacaagaggactggatttcgcctgtgat (SEQ ID NO: 345)
(amino acids)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO: 346)
CD4 hinge domain sequence :
(DNA)
tcgggacaggtcctgctggaatccaacatcaaggttctgcccacatggtccaccccggtgcagcca(SEQ ID NO: 347) (amino acids)
SGQVLLESNIKVLPTWSTPVQP (SEQ IDNO: 348)
CD28 hinge domain sequence:
(DNA)
aaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagccc(SEQ ID NO: 349)
(amino acids)
KHLCPSPLFPGPSKP (SEQ ID NO: 350)
CD8+CD4 hinge domain sequence:
(DNA)
acgacaaccccggcccccagaccaccaacgccagcccccaccatcgccagccaacccctgtctctgagaccagaagcctgtaggcctgccgccggtggagctgtgcacacaagaggactggatttcgcctgtgattcgggacaggtcctgctggaatccaacatcaaggttctgcccacatggtccaccccggtgcagcca (SEQ ID NO: 351)
(amino acids)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDSGQVLLESNIKVLPTWSTPVQP(SEQ ID NO: 352)
CD8+CD28 hinge domain sequence:
(DNA)
acgacaaccccggcccccagaccaccaacgccagcccccaccatcgccagccaacccctgtctctgagaccagaagcctgtaggcctgccgccggtggagctgtgcacacaagaggactggatttcgcctgtgataaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagccc (SEQ ID NO: 353)
(amino acids)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO: 354)
CD28+CD4 hinge domain sequence:
(DNA)
aaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagccctcgggacaggtcctgctggaatccaacatcaaggttctgcccacatggtccaccccggtgcagcca (SEQ ID NO: 355)
(amino acids)
KHLCPSPLFPGPSKPSGQVLLESNIKVLPTWSTPVQP(SEQ ID NO: 356)
Human IgD hinge domain sequence:
(DNA)
gagtctccaaaggcacaggcctcctcagtgcccactgcacaaccccaagcagagggcagcctcgccaaggcaaccacagccccagccaccacccgtaacacaggaagaggcggcgaagagaagaaaaaggagaaggagaaagaggaacaagaagagagagagacaaagacacca (SEQ ID NO: 357)
(amino acids)
ESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTP(SEQ ID NO: 358)
X4 linker (IgGl and IgG2modified hinge region) sequence:
(DNA)
gacaagacgcacaccaagccacctaaaccagctccagaactgctcggaggtcctggcaccggaaccggaggacctaccatcaaaccacctaagccacctaagcctgctcctaacctgctcggaggacct (SEQ ID NO: 359)
(amino acids)
DKTHTKPPKPAPELLGGPGTGTGGPTIKPPKPPKPAPNLLGGP(SEQ ID NO: 360)
CD3 zeta transmembrane domainsequence :
(DNA)
ctctgctacctgctggatggaatcctcttcatctatggtgtcattctcactgccttgttcctg(SEQ ID NO: 361) (amino acids)
LCYLLDGILFIYGVILTALFL (SEQ IDNO: 362)
CD8 transmembrane domainsequence :
(DNA)
atctacatttgggccccgctcgcaggcacatgtggagtgctcctcctctccctggtgattaccctgtactgc(SEQ ID NO: 363)
(amino acids)
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC (SEQ IDNO: 364)
CD4 transmembrane domainsequence :
(DNA)
atggccctgattgtgctggggggcgtcgccggcctcctgcttttcattgggctaggcatcttcttc(SEQ ID NO: 365) (amino acids)
MALIVLGGVAGLLLFIGLGIFF (SEQ IDNO : 366 )
CD28 transmembrane domainsequence:
(DNA)
ttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtg (SEQ ID NO:367)
(amino acids)
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQID NO: 368)
4-1BB transmembrane domainsequence:
(DNA)
atcatctccttctttcttgcgctgacgtcgactgcgttgctcttcctgctgttcttcctcacgctccgtttctctgttgtt (SEQ ID NO:369)
(amino acids)
IISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVV(SEQ ID NO: 370)
OX40 transmembrane domainsequence:
(DNA)
gttgccgccatcctgggcctgggcctggtgctggggctgctgggccccctggccatcctgctggccctgtacctgctc(SEQ ID NO:371)
(amino acids)
VAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLL (SEQID NO: 372)
CD3 zeta domain sequence:
(DNA)
cgcgttaagttctcccgatcagccgacgcgcctgcttacaagcagggccagaaccaactgtacaacgagctgaatctcggtagacgggaagagtacgacgtgttggacaaacggagaggccgcgacccagaaatgggcggcaagcctcgcaggaaaaacccccaggagggactgtacaatgagttgcagaaagataagatggcagaagcttatagcgagatcggaatgaagggggaaaggagacgagggaaaggacacgacggcctttatcagggcctgtccacagcaacaaaagatacgtatgacgccctccatatgcaggcacttccaccacgg (SEQ ID NO: 373)
(amino acids)
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 374)
CD3 zeta domain variantsequence:
(DNA)
agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc (SEQ ID NO: 375)
(amino acids)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 376)
CD28 domain sequence:
(DNA)
agaagcaagcggtctcggctcctgcattctgattacatgaacatgaccccaagaagaccaggccccaccaggaaacattaccagccctacgctccgccacgcgacttcgctgcctaccggtcc (SEQ ID NO: 377)
(amino acids)
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO: 378)
4-1BB domain sequence:
(DNA)
aaaaggggccgcaaaaaactcctttacatttttaagcagccttttatgaggccagtacagacgactcaagaggaagacgggtgctcatgccgctttcctgaggaggaggaaggagggtgcgaactg (SEQ ID NO: 379)
(amino acids)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO: 380)
0X40 domain sequence:
(DNA)
cggagggaccagaggctgccccccgatgcccacaagccccctgggggaggcagtttccggacccccatccaagaggagcaggccgacgcccactccaccctggccaagatc (SEQ ID NO: 381)
(amino acids)
RRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEQ ID NO: 382)
Humanized anti CD3 scFV clone12F6 (VH-VL) sequence:
(DNA)
caggtgcagctggtgcagagcggaggtggagtggtccaacctggaagatctctgagactgagctgtaaggctagcgggtacacgttcacatcttacacgatgcactgggtgaggcaagcccccggtaagggcctggaatggatcggatatataaaccccagctcagggtataccaaatataatcagaagttcaaagatcggttcacgatttctgctgataaaagtaagtccaccgctttcctgcagatggactcactcaggccagaagatactggtgtttatttctgtgcaaggtggcaggactacgacgtgtactttgactattgggggcaggggacgcctgtaacagtatcaagcggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgatattcagatgacccagagcccgagcagcctgagcgcgagcgtgggcgatcgcgtgaccatgacctgccgcgcgagcagcagcgtgagctatatgcattggtatcagcagaccccgggcaaagcgccgaaaccgtggatttatgcgaccagcaacctggcgagcggcgtgccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattataccctgaccattagcagcctgcagccggaagatattgcgacctattattgccagcagtggagcagcaacccgccgacctttggccagggcaccaaactgcagattacccgc (SEQ ID NO:383)
(amino acids)
QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTSYTMHWVRQAPGKGLEWIGYINPSSGYTKYNQKFKDRFTISADKSKSTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARWQDYDVYFDYWGQGTPVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTMTCRASSSVSYMHWYQQTPGKAPKPWIYATSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPPTFGQGTKLQITR (SEQ ID NO:384)
Humanized anti CD3 scFV clone12F6 (VL-VH) sequence:
(DNA)
gatattcagatgacccagagcccgagcagcctgagcgcgagcgtgggcgatcgcgtgaccatgacctgccgcgcgagcagcagcgtgagctatatgcattggtatcagcagaccccgggcaaagcgccgaaaccgtggatttatgcgaccagcaacctggcgagcggcgtgccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattataccctgaccattagcagcctgcagccggaagatattgcgacctattattgccagcagtggagcagcaacccgccgacctttggccagggcaccaaactgcagattacccgcggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatcccaggtgcagctggtgcagagcggaggtggagtggtccaacctggaagatctctgagactgagctgtaaggctagcgggtacacgttcacatcttacacgatgcactgggtgaggcaagcccccggtaagggcctggaatggatcggatatataaaccccagctcagggtataccaaatataatcagaagttcaaagatcggttcacgatttctgctgataaaagtaagtccaccgctttcctgcagatggactcactcaggccagaagatactggtgtttatttctgtgcaaggtggcaggactacgacgtgtactttgactattgggggcaggggacgcctgtaacagtatcaage (SEQ ID NO:385)
(amino acids)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTMTCRASSSVSYMHWYQQTPGKAPKPWIYATSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPPTFGQGTKLQITRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTSYTMHWVRQAPGKGLEWIGYINPSSGYTKYNQKFKDRFTISADKSKSTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARWQDYDVYFDYWGQGTPVTVSS (SEQ ID NO:386)
Humanized anti CD3 scFV cloneOKT3 (VH-VL) sequence:
(DNA)
caggtgcagctggtgcagagcggaggcggagtggtgcagcctggaagaagcctgcgcctgagctgcaaagcgagcggctatacctttacccgctataccatgcattgggtgcgccaggcgccgggcaaaggcctggaatggattggctatattaacccgagccgcggctataccaactataaccagaaagtgaaagatcgctttaccattagcaccgataaaagcaaaagcaccgcgtttctgcagatggatagcctgcgcccggaagataccgcggtgtattattgcgcgcgctattatgatgatcattattgcctggattattggggccagggcaccaccctgaccgtgagcagcggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgatattcagatgacccagagcccgagcagcctgagcgcgagcgtgggcgatcgcgtgaccattacctgcagcgcgagcagcagcgtgagctatatgaactggtatcagcagaccccgggcaaagcgccgaaacgctggatttatgataccagcaaactggcgagcggcgtgccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattatacctttaccattagcagcctgcagccggaagatattgcgacctattattgccagcagtggagcagcaacccgtttacctttggccagggcaccaaactgcagattacccgc (SEQ ID NO:387)
(amino acids)
QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKGLEWIGYINPSRGYTNYNQKVKDRFTISTDKSKSTAFLQMDSLRPEDTAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLQITR (SEQ ID NO:388)
Humanized anti CD3 scFV cloneOKT3 (VH-VL) sequence:
(DNA)
gatattcagatgacccagagcccgagcagcctgagcgcgagcgtgggcgatcgcgtgaccattacctgcagcgcgagcagcagcgtgagctatatgaactggtatcagcagaccccgggcaaagcgccgaaacgctggatttatgataccagcaaactggcgagcggcgtgccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattatacctttaccattagcagcctgcagccggaagatattgcgacctattattgccagcagtggagcagcaacccgtttacctttggccagggcaccaaactgcagattacccgcggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatcccaggtgcagctggtgcagagcggaggcggagtggtgcagcctggaagaagcctgcgcctgagctgcaaagcgagcggctatacctttacccgctataccatgcattgggtgcgccaggcgccgggcaaaggcctggaatggattggctatattaacccgagccgcggctataccaactataaccagaaagtgaaagatcgctttaccattagcaccgataaaagcaaaagcaccgcgtttctgcagatggatagcctgcgcccggaagataccgcggtgtattattgcgcgcgctattatgatgatcattattgcctggattattggggccagggcaccaccctgaccgtgagcage (SEQ ID NO:389)
(amino acids)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLQITRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKGLEWIGYINPSRGYTNYNQKVKDRFTISTDKSKSTAFLQMDSLRPEDTAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO:390)
HumanizeE6 scFV (VH-VL)sequence:
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtaggtatggcatgagctgggtccgccaggctccagggaagaggctggagtgggtctcaaccattagtggcggaggcacctacatatactacccagactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtaccagagataactatggccgcaactatgattatggcatggattattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctcacctgcagcgccaccagcagtgttagctacatccactggtaccaacagaggcctggccagagccccaggctcctcatctatagcacctccaacctggccagcggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggagcgactacactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcagctcccctttcacctttggcagcggcaccaaagtggaaattaaa(SEQ ID NO:391)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKRLEWVSTISGGGTYIYYPDSVKGRFTI SRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLTCSATSSVSYIHWYQQRPGQSPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGSDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSSPFTFGSGTKVEIK (SEQ ID NO:392)
HumanizeE6 scFV (VL-VH)sequence:
(DNA)
gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctcacctgcagcgccaccagcagtgttagctacatccactggtaccaacagaggcctggccagagccccaggctcctcatctatagcacctccaacctggccagcggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggagcgactacactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcagctcccctttcacctttggcagcggcaccaaagtggaaattaaaggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtaggtatggcatgagctgggtccgccaggctccagggaagaggctggagtgggtctcaaccattagtggcggaggcacctacatatactacccagactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtaccagagataactatggccgcaactatgattatggcatggattattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagc(SEQ ID NO:393)
(amino acids)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLTCSATSSVSYIHWYQQRPGQSPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGSDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSSPFTFGSGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKRLEWVSTI SGGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTLVT VSS (SEQ ID NO: 394)
HumanizeC2 scFV (VH-VL)sequence:
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaact (SEQ ID NO: 395)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYFDVWGKGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSRELPFTFGGGTKVEIKRT (SEQ ID NO : 396 )
HumanizeE6 scFV (VL-VH)sequence:
(DNA)
gacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctcc (SEQ ID NO: 397)
(amino acids)
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSRELPFTFGGGTKVEIKRTGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTI SSGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYFDVWG KGTTVTVSS (SEQ ID NO: 398)
G4S1 linker sequence:
(DNA)
ggcggtggcggatcc (SEQ ID NO: 399)
(amino acids)
GGGGS (SEQ ID NO:400)
[G4Si]x3 linker sequence:
(DNA)
ggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatcc(SEQ ID NO: 401)
(amino acids)
GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 402)
8 aa GS linker sequence:
(DNA)
ggcggttccggcggtggatccgga (SEQ IDNO: 403)
(amino acids)
GGSGGGSG (SEQ ID NO:404)
12 aa GS linker sequence:
(DNA)
ggcggttccggcggtggatccggcggtggcggatccgga(SEQ ID NO: 405)
(amino acids)
GGSGGGSGGGSG (SEQ ID NO: 406)
13 aa GS linker sequence
ggcggtggatccggcggtggcggatccggcggtggatcc(SEQ ID NO: 407)
(amino acids)
GGGSGGGGSGGGS (SEQ ID NO: 408)
22 aa GS linker sequence:
(DNA)
ggcggtggaagcggcggtggcggatccggcagcggcggaagcggcggtggcggatccggcggtgga(SEQ ID NO: 409)
(amino acids)
GGGSGGGGSGSGGSGGGGSGGG (SEQ IDNO: 4110)
24 aa GS linker sequence:
(DNA)
ggcggttccggcggtggatccggcggtggcggatccggaggcggttccggcggtggatccggcggtggcggatccgga(SEQ ID NO:411)
(amino acids)
GGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSG (SEQ IDNO: 412)
Mouse C3 Heavy chain variableregion sequence:
(DNA)
caggtccagctgcagcagtctgggcctgagctggtgaggcctggggtctcagtgaagatttcctgcaagggttccggctacagattcactgattatgctatgaactgggtgaagcagagtcatgcaaagagtctagagtggattggagttattagtactttctctggtaatacaaacttcaaccagaagtttaagggcaaggccacaatgactgtagacaaatcctccagcacagcctatatggaacttgccagattgacatctgaggattctgccatgtattactgtgcaagatcggattactacggcccatactttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctca (SEQ ID NO: 413)
(amino acids)
QVQLQQSGPELVRPGVSVKISCKGSGYRFTDYAMNWVKQSHAKSLEWIGVI STFSGNTNFNQKFKGKATMTVDKSSSTAYMELARLTSEDSAMYYCARSDYYGPYFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 414)
Mouse C3 heavy chain variableframework region 1 (FWR1) sequence:
(DNA)
caggtccagctgcagcagtctgggcctgagctggtgaggcctggggtctcagtgaagatttcctgcaagggttccggctacagattcact (SEQ ID NO: 415)
(amino acids)
QVQLQQSGPELVRPGVSVKI SCKGSGYRFT(SEQ ID NO: 416)
Mouse C3 heavy chain variablecomplementarity determining regions 1 (CDR1) sequence :
(DNA)
gattatgctatgaac (SEQ ID NO: 417)
(amino acids)
DYAMN (SEQ ID NO : 418 )
Mouse C3 heavy chain variableframework region 2 (FWR2) sequence:
(DNA)
tgggtgaagcagagtcatgcaaagagtctagagtggattgga(SEQ ID NO: 419)
(amino acids)
WVKQSHAKSLEWIG (SEQ ID NO: 420)
Mouse C3 heavy chain variablecomplementarity determining regions 2 (CDR2) sequence :
(DNA)
gttattagtactttctctggtaatacaaacttcaaccagaagtttaagggc(SEQ ID NO: 421)
(amino acids)
VI STFSGNTNFNQKFKG (SEQ ID NO:422)
Mouse C3 heavy chain variableframework region 3 (FWR3) acid sequence:
(DNA)
aaggccacaatgactgtagacaaatcctccagcacagcctatatggaacttgccagattgacatctgaggattctgccatgtattactgtgcaaga (SEQ ID NO: 423)
(amino acids)
KATMTVDKSSSTAYMELARLTSEDSAMYYCAR(SEQ ID NO: 424)
Mouse C3 heavy chain variablecomplementarity determining regions 3 (CDR3) sequence :
(DNA)
tcggattactacggcccatactttgactac(SEQ ID NO: 425)
(amino acids)
SDYYGPYFDY (SEQ ID NO: 426)
IGHV1-18*04 heavy chain variableregion sequence:
(DNA)
caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccagctacggtatcagctgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggatcagcgcttacaatggtaacacaaactatgcacagaagctccagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgagaga (SEQ ID NO: 427)
(amino acids)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 428)
IGHV1-18*04 heavy chain variableframework region 1 (FWR1) sequence:
(DNA)
caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttacc (SEQ ID NO: 429)
(amino acids)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT(SEQ ID NO: 430)
IGHV1-18*04 heavy chain variablecomplementarity determining regions 1 (CDR1) sequence :
(DNA)
agctacggtatcagc (SEQ ID NO: 431)
(amino acids)
SYGIS (SEQ ID NO:432)
IGHV1-18*04 heavy chain variableframework region 2 (FWR2) sequence:
(DNA)
tgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatggga(SEQ ID NO: 433)
(amino acids)
WVRQAPGQGLEWMG (SEQ ID NO: 434)
IGHV1-18*04 heavy chain variablecomplementarity determining regions 2 (CDR2) sequence :
(DNA)
tggatcagcgcttacaatggtaacacaaactatgcacagaagctccagggc(SEQ ID NO: 435)
(amino acids)
WISAYNGNTNYAQKLQG (SEQ ID NO:436)
IGHV1-18*04 heavy chain variableframework region 3 (FWR3) sequence:
(DNA)
agagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgaga (SEQ ID NO: 437)
(amino acids)
RVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAR(SEQ ID NO: 438)
Humanized C3 heavy chainvariable region sequence:
(DNA)
caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccgactacgccatgaactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggagtgatcagcaccttcagcggtaacacaaacttcaaccagaagttcaagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgagaagcgactactacggcccatacttcgactactggggccagggcaccaccctgaccgtgtccagc (SEQ ID NO: 439)
(amino acids)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMNWVRQAPGQGLEWMGVISTFSGNTNFNQKFKGRVTMTTDTSTSTAY MELRSLRSDDTAVYYCARSDYYGPYFDYWGQGTTLTVSS (SEQ IDNO: 440)
Humanized C3 heavy chainvariable framework region 1 (FWR1) acid sequence:
(DNA)
caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttacc (SEQ ID NO:441)
(amino acids)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT(SEQ ID NO: 442)
Humanized C3 heavy chainvariable complementarity determining regions 1 (CDR1) sequence :
(DNA)
gactacgccatgaac (SEQ ID NO: 443)
(amino acids)
DYAMN (SEQ ID NO: 444)
Humanized C3 heavy chainvariable framework region 2 (FWR2) acid sequence:
(DNA)
tgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatggga(SEQ ID NO: 445)
(amino acids)
WVRQAPGQGLEWMG (SEQ ID NO: 446)
Humanized C3 heavy chainvariable complementarity determining regions 2 (CDR2) sequence :
(DNA)
gtgatcagcaccttcagcggtaacacaaacttcaaccagaagttcaagggc(SEQ ID NO: 447)
(amino acids)
VI STFSGNTNFNQKFKG (SEQ ID NO:448)
Humanized C3 heavy chainvariable framework region 3 (FWR3) acid sequence:
(DNA)
agagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgaga (SEQ ID NO: 449)
(amino acids)
RVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAR(SEQ ID NO: 450)
Humanized C3 heavy chainvariable complementarity determining regions 3 (CDR3) sequence :
(DNA)
agcgactactacggcccatacttcgactac(SEQ ID NO: 451)
(amino acids)
SDYYGPYFDY (SEQ ID NO: 452)
Humanized C3 IgGl heavy chainsequence
(DNA)
caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccgactacgccatgaactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggagtgatcagcaccttcagcggtaacacaaacttcaaccagaagttcaagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgagaagcgactactacggcccatacttcgactactggggccagggcaccaccctgaccgtgtccagcgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgacagtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgataa (SEQ ID NO: 453)
(amino acids)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMNWVRQAPGQGLEWMGVISTFSGNTNFNQKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARSDYYGPYFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK* * (SEQ ID NO: 454)
Humanized C3 IgG2 heavy chainsequence
(DNA)
caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccgactacgccatgaactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggagtgatcagcaccttcagcggtaacacaaacttcaaccagaagttcaagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgagaagcgactactacggcccatacttcgactactggggccagggcaccaccctgaccgtgtccagcgcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccagctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatagtaa (SEQ ID NO: 455)
(amino acids)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMNWVRQAPGQGLEWMGVISTFSGNTNFNQKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARSDYYGPYFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCK VSNKGLPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK* * ( SEQ ID NO:456)
Humanized C3 heavy chain IgGlgBLOCK sequence:
(DNA)
tgctctgggttccaggttccactggtgacgcggcccagccggcccaggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccgactacgccatgaactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggagtgatcagcaccttcagcggtaacacaaacttcaaccagaagttcaagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgagaagcgactactacggcccatacttcgactactggggccagggcaccaccctgaccgtgtccagcgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagc (SEQ ID NO: 457)
Mouse C3 Light Chain variableregion sequence:
(DNA)
gatgttttgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagaccattgtacatagtaatggaaacacctatttagaatggtacctgcagaaaccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcaacagagtggaggctgaggatctgggagtttattactgetttcaaggttcacatgttccattcacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaa (SEQ ID NO: 458)
(amino acids)
DVLMTQTPLSLPVSLGDQAS ISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKINRVEAEDLGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 459)
Mouse C3 light chain variableframework region 1 (FWR1) sequence :
(DNA)
gatgttttgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgc(SEQ ID NO: 460)
(amino acids)
DVLMTQTPLSLPVSLGDQAS ISC (SEQ IDNO: 461)
Mouse C3 light chain variablecomplementarity determining regions 1 (CDR1) sequence :
(DNA)
agatctagtcagaccattgtacatagtaatggaaacacctatttagaa(SEQ ID NO: 462)
(amino acids)
RSSQTIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO:463)
Mouse C3 light chain variableframework region 2 (FWR2) sequence:
(DNA)
tggtacctgcagaaaccaggccagtctccaaagctcctgatctac(SEQ ID NO: 464)
(amino acids)
WYLQKPGQSPKLLIY (SEQ ID NO: 465)
Mouse C3 light chain variablecomplementarity determining regions 2 (CDR2) sequence :
(DNA)
aaagtttccaaccgattttct (SEQ IDNO: 466)
(amino acids)
KVSNRFS (SEQ ID NO: 467)
Mouse C3 light chain variableframework region 3 (FWR3) sequence:
(DNA)
ggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcaacagagtggaggctgaggatctgggagtttattactgc (SEQ ID NO: 468)
(amino acids)
GVPDRFSGSGSGTDFTLKINRVEAEDLGVYYC(SEQ ID NO : 469 )
Mouse C3 light chain variablecomplementarity determining regions 3 (CDR3) sequence :
(DNA)
tttcaaggttcacatgttccattcacg (SEQID NO: 470)
(amino acids)
FQGSHVPFT (SEQ ID NO: 471)
IGKV2-29*03 light chain variableregion sequence:
(DNA)
gatattgtgatgacccagactccactctctctgtccgtcacccctggacagccggcctccatctcctgcaagtctagtcagagcctcctgcatagtgatggaaagacctatttgtattggtacctgcagaagccaggccagtctccacagctcctgatctatgaagtttccagccggttctctggagtgccagataggttcagtggcagcgggtcagggacagatttcacactgaaaatcagccgggtggaggctgaggatgttggggtttattactgcatgcaaggtatacaccttcct (SEQ ID NO: 472)
(amino acids)
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLHSDGKTYLYWYLQKPGQSPQLLIYEVSSRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGIHLP (SEQ ID NO: 473)
IGKV2-29*03 light chain variableframework region 1 (FWR1) acid sequence:
(DNA)
gatattgtgatgacccagactccactctctctgtccgtcacccctggacagccggcctccatctcctgc(SEQ ID NO: 474)
(amino acids)
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISC (SEQ IDNO: 475)
IGKV2-29*03 light chain variablecomplementarity determining regions 1 (CDR1) sequence :
(DNA)
aagtctagtcagagcctcctgcatagtgatggaaagacctatttgtat(SEQ ID NO: 476)
(amino acids)
KSSQSLLHSDGKTYLY (SEQ ID NO:477)
IGKV2-29*03 light chain variableframework region 2 (FWR2) sequence:
(DNA)
tggtacctgcagaagccaggccagtctccacagctcctgatctat(SEQ ID NO: 478)
(amino acids)
WYLQKPGQSPQLLIY (SEQ ID NO: 479)
IGKV2-29*03 light chain variablecomplementarity determining regions 2 (CDR2) sequence :
(DNA)
gaagtttccagccggttc (SEQ ID NO:480)
(amino acids)
EVSSRFS (SEQ ID NO : 481 )
IGKV2-29*03 light chain variableframework region 3 (FWR3) sequence:
(DNA)
ggagtgccagataggttcagtggcagcgggtcagggacagatttcacactgaaaatcagccgggtggaggctgaggatgttggggtttattactgc (SEQ ID NO: 482)
(amino acids)
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC (SEQ ID NO: 483)
IGKV2-29*03 light chain variablecomplementarity determining regions3 (CDR3) sequence :
(DNA)
atgcaaggtatacaccttcct (SEQ ID NO:484)
(amino acids)
MQGIHLP (SEQ ID NO: 485)
Humanized C3 light chainvariable region sequence:
(DNA)
gatattgtgatgacccagactccactctctctgtccgtcacccctggacagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagaccattgtccatagtaatggaaacacctatttggagtggtacctgcagaagccaggccagtctccacagctcctgatctataaggtttccaaccggttctctggagtgccagataggttcagtggcagcgggtcagggacagatttcacactgaaaatcagccgggtggaggctgaggatgttggggtttattactgettccaaggtagccacgtgcctttcaccttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaact (SEQ ID NO: 486)
(amino acids)
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPFTFGGGTKVEIKRT (SEQ ID NO: 487)
Humanized C3 light chainvariable framework region 1 (FWR1) acid sequence:
(DNA)
gatattgtgatgacccagactccactctctctgtccgtcacccctggacagccggcctccatctcctgc(SEQ ID NO: 488)
(amino acids)
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISC (SEQ IDNO : 489 )
Humanized C3 light chainvariable complementarity determining regions 1 (CDR1) sequence :
(DNA)
ggtctagtcagaccattgtccatagtaatggaaacacctatttggag(SEQ ID NO: 490)
(amino acids)
RSSQTIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO:491)
Humanized C3 light chainvariable framework region 2 (FWR2) acid sequence:
(DNA)
tggtacctgcagaagccaggccagtctccacagctcctgatctat(SEQ ID NO: 492)
(amino acids)
WYLQKPGQSPQLLIY (SEQ ID NO: 493)
Humanized C3 light chainvariable complementarity determining regions 2 (CDR2) sequence :
(DNA)
aaggtttccaaccggttctct (SEQ IDNO: 494)
(amino acids)
KVSNRFS (SEQ ID NO: 495)
Humanized C3 light chainvariable framework region 3 (FWR3) acid sequence:
(DNA)
ggagtgccagataggttcagtggcagcgggtcagggacagatttcacactgaaaatcagccgggtggaggctgaggatgttggggtttattactgc (SEQ ID NO: 496)
(amino acids)
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC (SEQ ID NO: 497)
Humanized C3 light chainvariable complementarity determining regions 3 (CDR3) sequence :
(DNA)
ttccaaggtagccacgtgcctttcacc (SEQID NO: 498)
(amino acids)
FQGSHVPFT (SEQ ID NO : 499 )
Humanized C3 lambda light chainsequence
(DNA)
gatattgtgatgacccagactccactctctctgtccgtcacccctggacagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagaccattgtccatagtaatggaaacacctatttggagtggtacctgcagaagccaggccagtctccacagctcctgatctataaggtttccaaccggttctctggagtgccagataggttcagtggcagcgggtcagggacagatttcacactgaaaatcagccgggtggaggctgaggatgttggggtttattactgettccaaggtagccacgtgcctttcaccttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccgccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctacccgggagccgtgacagtggcctggaaggcagatagcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaacaaagcaacaacaagtacgcggccagcagctatctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttcatagtaa (SEQ ID NO: 500)
(amino acids)
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPFTFGGGTKVEIKRTGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS * * (SEQ ID NO:501)
Humanized C3 Kappa light chain
(DNA)
gatattgtgatgacccagactccactctctctgtccgtcacccctggacagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagaccattgtccatagtaatggaaacacctatttggagtggtacctgcagaagccaggccagtctccacagctcctgatctataaggtttccaaccggttctctggagtgccagataggttcagtggcagcgggtcagggacagatttcacactgaaaatcagccgggtggaggctgaggatgttggggtttattactgettccaaggtagccacgtgcctttcaccttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttagtaa (SEQ ID NO: 502)
(amino acids)
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPFTFGGGTKVEIKRTTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC* * (SEQ ID NO: 503)
Humanized C3 Kappa light gBLOCK sequence:
(DNA)
agctggctaggtaagcttggtaccgagctcggatccacgccaccatggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgacgatattgtgatgacccagactccactctctctgtccgtcacccctggacagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagaccattgtccatagtaatggaaacacctatttggagtggtacctgcagaagccaggccagtctccacagctcctgatctataaggtttccaaccggttctctggagtgccagataggttcagtggcagcgggtcagggacagatttcacactgaaaatcagccgggtggaggctgaggatgttggggtttattactgettccaaggtagccacgtgcctttcaccttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttagtaagtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgc (SEQ ID NO:504)
Mouse C8 heavy chain variableregion sequence
(DNA)
gaagtgatggtcgtggaaagcggcggtggtctggtaaagccggggggatcccttaagctttcttgcgccgcatccgggttcacgttctccggctatgccatgtcctgggtccgacagactcccgaaaagcgcttggaatgggtggccactatctcctccggggggacgtacatctactaccccgacagtgtgaaaggaagatttacaatatctcgcgacaacgcaaaaaataccttgtatcttcaaatgagctccctgcggtcagaggacactgccatgtactattgcgcccgcctgggcggcgacaattactatgagtat(SEQ ID NO:505)
(amino acids)
EVMVVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSGYAMSWVRQTPEKRLEWVATI SSGGTYIYYPDSVKGRFTI SRDNAKNTLYL QMSSLRSEDTAMYYCARLGGDNYYEY (SEQ ID NO: 506)
Mouse C8 heavy chain variablecomplementarity determining region 1 (CDR1) sequence :
(DNA)
ggctatgccatgtcc (SEQ ID NO: 507)
(amino acids)
GYAMS (SEQ ID NO: 508)
Mouse C8 heavy chain variablecomplementarity determining region 2 (CDR2) sequence :
(DNA)
actatctcctccggggggacgtacatctactaccccgacagtgtgaaagga(SEQ ID NO: 509)
(amino acids)
T I SSGGTYIYYPDSVKG (SEQ ID NO:510)
Mouse C8 heavy chain variablecomplementarity determining region 3 (CDR3) sequence :
(DNA)
ctgggcggcgacaattactatgagtat (SEQID NO: 511)
(amino acids)
LGGDNYYEY (SEQ ID NO: 512)
IGHV3-21*04 heavy chain variableregion sequence:
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtagctatagcatgaactgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcatccattagtagtagtagtagttacatatactacgcagactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcga (SEQ ID NO: 513)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 514)
IGHV3-21*04 heavy chain variableframework region 1 (FWR1) sequence:
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagt (SEQ ID NO: 515)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO: 516)
IGHV3-21*04 heavy chain variablecomplementarity determining regions 1 (COR1) sequence :
(DNA)
agctatagcatgaac (SEQ ID NO: 517)
(amino acids)
SYSMN (SEQ ID NO: 518)
IGHV3-21*04 heavy chain variableframework region 2 (FWR2) sequence:
(DNA)
tgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtc(SEQ ID NO: 519)
(amino acids)
WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 520)
IGHV3-21*04 heavy chain variablecomplementarity determining regions 2 (COR2) sequence :
(DNA)
tcatccattagtagtagtagtagttacatatactacgcagactcagtgaagggc(SEQ ID NO: 521)
(amino acids)
SSISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO:522)
IGHV3-21*04 heavy chain variableframework region 3 (FWR3) sequence:
(DNA)
cgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcga (SEQ ID NO: 523)
(amino acids)
RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 524)
Humanized C8 heavy chainvariable region sequence:
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccctgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagactgggcggcgataactattatgaatattggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctcc (SEQ ID NO: 525)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYWGKGTTVTVSS (SEQ IDNO: 526)
Humanized C8 heavy chainvariable framework region 1 (FWR1) sequence:
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagt (SEQ ID NO: 527)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS (SEQID NO: 528)
Humanized C8 heavy chainvariable complementarity determining region 1 (CDR1) sequence :
(DNA)
ggctatgccatgagc (SEQ ID NO: 529)
(amino acids)
GYAMS (SEQ ID NO: 530)
Humanized C8 heavy chainvariable framework region 2 (FWR2) sequence:
(DNA)
tgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctca(SEQ ID NO: 531)
(amino acids)
WVRQAPGKGLEWVS (SEQ ID NO: 532)
Humanized C8 heavy chainvariable complementarity determining region 2 (CDR2) sequence :
(DNA)
accattagtagtggcggaacctacatatactaccctgactcagtgaagggc(SEQ ID NO: 533)
(amino acids)
TI SSGGTYIYYPDSVKG (SEQ ID NO:534)
Humanized C8 heavy chainvariable framework region 3 (FWR3) sequence:
(DNA)
cgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgaga (SEQ ID NO: 535)
(amino acids)
RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 536)
Humanized C8 heavy chainvariable complementarity determining region 3 (CDR3) sequence :
(DNA)
ctgggcggcgataactattatgaatat (SEQID NO: 537)
(amino acids)
LGGDNYYEY (SEQ ID NO: 538)
Humanized C8 IgGl heavy chainsequence
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccctgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagactgggcggcgataactattatgaatattggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgacagtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgataa (SEQ ID NO: 539)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTI SRDNAKNSLYL QMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYWGKGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK* * (SEQ ID NO: 540)
Humanized C8 IgG2 heavy chainsequence
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccctgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagactgggcggcgataactattatgaatattggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccgcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccagctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatagtaa (SEQ ID NO: 541)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTI SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYWGKGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKG LPAPIEKTI SKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK* * (SEQ ID NO: 542)
Mouse C8 light chain variableregion sequence
(DNA)
gacatcgtcattacgcagacccctgccagtcttgccgtttctctgggccagagggccactatcagttacagggcgagtaagtctgtgagtaccagcggctatagttacatgcattggaaccagcagaaaccgggacagccaccacgcctgcttatttatctggtgtctaatcttgagtccggggtgcccgccaggttcagcggcagcggctctgggaccgacttcacactcaacattcatccagtggaagaagaggacgctgctacatactactgtcaacacattcgggaactgaccaggagtgaa (SEQ ID NO:543) (amino acids)
DIVITQTPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSE (SEQ ID NO: 544)
Mouse C8 light chain variablecomplementarity determining region 1 (CDR1) sequence :
(DNA)
agggcgagtaagtctgtgagtaccagcggctatagttacatgcat(SEQ ID NO: 545)
(amino acids)
RASKSVSTSGYSYMH (SEQ ID NO: 546)
Mouse C8 light chain variablecomplementarity determining region 2 (CDR2) sequence :
(DNA)
ctggtgtctaatcttgagtcc (SEQ IDNO: 547)
(amino acids)
LVSNLES (SEQ ID NO: 548)
Mouse C8 light chain variablecomplementarity determining region 3 (CDR3) sequence :
(DNA)
caacacattcgggaactgaccaggagtgaa(SEQ ID NO: 549)
(amino acids)
QHIRELTRSE (SEQ ID NO: 550)
NCBI germline z00023 light chainvariable region sequence:
(DNA)
gacatcgtgatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgcaagtccagccagagtgttttatacagctccaacaataagaactacttagcttggtaccagcagaaaccaggacagcctcctaagctgctcatttactgggcatctacccgggaatccggggtccctgaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcagcaatattatagtactcct (SEQ ID NO: 551)
(amino acids)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTP (SEQ ID NO: 552)
NCBI germline z00023 light chainvariable framework region 1 (FWR1) acid sequence:
(DNA)
gacatcgtgatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgc(SEQ ID NO: 553)
(amino acids)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC (SEQ IDNO: 554)
NCBI germline z00023 light chainvariable complementarity determining regions 1 (CDR1 ) sequence :
(DNA)
aagtccagccagagtgttttatacagctccaacaataagaactacttagct(SEQ ID NO: 555)
(amino acids)
KSSQSVLYSSNNKNYLA (SEQ ID NO:556)
NCBI germline z00023 light chainvariable framework region 2 (FWR2) sequence:
(DNA)
tggtaccagcagaaaccaggacagcctcctaagctgctcatttac(SEQ ID NO: 557)
(amino acids)
WYQQKPGQPPKLLIY (SEQ ID NO: 558)
NCBI germline z00023 light chainvariable complementarity determining regions 2 (CDR2 ) sequence :
(DNA)
tgggcatctacccgggaatcc (SEQ IDNO: 559)
(amino acids)
WASTRES (SEQ ID NO: 560)
NCBI germline z00023 light chainvariable framework region 3 (FWR3) sequence:
(DNA)
ggggtccctgaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgt (SEQ ID NO: 561)
(amino acids)
GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC (SEQ ID NO: 562)
NCBI germline z00023 light chainvariable complementarity determining regions3 (CDR3) sequence :
(DNA)
cagcaatattatagtactcct (SEQ IDNO: 563)
(amino acids)
QQYYSTP (SEQ ID NO: 564)
Humanized C8 light chainvariable region sequence
(DNA)
gacatcgtgatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgcagggccagcaagagtgttagcaccagcggctacagctacatgcactggtaccagcagaaaccaggacagcctcctaagctgctcatttacctggtgtctaacctggaatccggggtccctgaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcaacacattcgggaactgaccaggagtgaattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaact (SEQ ID NO: 565)
(amino acids)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLVSNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTIS SLQAEDVAVYYCQHIRELTRSEFGGGTKVEIKRT (SEQ ID NO : 566 )
Humanized C8 light chainvariable framework region 1 (FWR1) sequence:
(DNA)
gacatcgtgatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgc(SEQ ID NO: 567)
(amino acids)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC (SEQ IDNO: 568)
Humanized C8 light chainvariable complementarity determining region 1 (CDR1) sequence :
(DNA)
agggccagcaagagtgttagcaccagcggctacagctacatg(SEQ ID NO: 569)
(amino acids)
RASKSVSTSGYSYM (SEQ ID NO: 570)
Humanized C8 light chainvariable framework region 2 (FWR2) sequence:
(DNA)
cactggtaccagcagaaaccaggacagcctcctaagctgctcatttac(SEQ ID NO: 571)
(amino acids)
HWYQQKPGQPPKLLIY (SEQ ID NO:572)
Humanized C8 light chainvariable complementarity determining region 2 (CDR2) sequence :
(DNA)
ctggtgtctaacctggaatcc (SEQ IDNO: 573)
(amino acids)
LVSNLES (SEQ ID NO: 574)
Humanized C8 light chainvariable framework region 3 (FWR3) sequence:
(DNA)
ggggtccctgaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgt (SEQ ID NO: 575)
(amino acids)
GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC (SEQ ID NO: 576)
Humanized C8 light chainvariable complementarity determining region 3 (CDR3) sequence :
(DNA)
caacacattcgggaactgaccaggagtgaa(SEQ ID NO: 577)
(amino acids)
QHIRELTRSE (SEQ ID NO: 578)
Humanized C8 Lambda light chainsequence
(DNA)
gacatcgtgatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgcagggccagcaagagtgttagcaccagcggctacagctacatgcactggtaccagcagaaaccaggacagcctcctaagctgctcatttacctggtgtctaacctggaatccggggtccctgaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcaacacattcgggaactgaccaggagtgaattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccgccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctacccgggagccgtgacagtggcctggaaggcagatagcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaacaaagcaacaacaagtacgcggccagcagctatctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttcatagtaa (SEQ ID NO: 579)
(amino acids)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLVSNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHIRELTRSEFGGGTKVEIKRTGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS * * (SEQ ID NO: 580)
Humanized C8 Kappa light chainsequence
(DNA)
gacatcgtgatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgcagggccagcaagagtgttagcaccagcggctacagctacatgcactggtaccagcagaaaccaggacagcctcctaagctgctcatttacctggtgtctaacctggaatccggggtccctgaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcaacacattcgggaactgaccaggagtgaattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttagtaa (SEQ ID NO: 581)
(amino acids)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLVSNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHIRELTRSEFGGGTKVEIKRTTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC* * (SEQ ID NO: 582)
Humanized C8 Kappa light chaingBLOCk sequence:
(DNA)
agctggctaggtaagcttggtaccgagctcggatccacgccaccatggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgacgacatcgtgatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgcagggccagcaagagtgttagcaccagcggctacagctacatgcactggtaccagcagaaaccaggacagcctcctaagctgctcatttacctggtgtctaacctggaatccggggtccctgaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcaacacattcgggaactgaccaggagtgaattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttagtaagtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgc (SEQ ID NO:583)
CAR-T E6 CD8 sequence:
(DNA)
gaggtccagctggttgagagtggcggtgggctggttaagcctggcggctccctgcggctgagctgcgccgcgagtggatttactttcagccgatatgggatgagttgggtgcggcaagctcccgggaagaggctggaatgggtctcaacaatctccggggggggcacttacatctattaccccgactcagtcaaggggagatttaccatttcacgagacaacgctaagaataccctgtatttgcagatgaattctctgagagcagaggacacagctgtttactattgtacccgcgacaactatggcaggaactacgactacggtatggactattggggacaagggacattggttacagtgagcagtggcggcgggggcagcggaggaggaggcagcggtggggggggcagcgagatagtgctcacgcagtcacccgcgactctcagtctctcacctggggaacgagctaccctgacgtgctctgctacctcctcagtgtcatatattcactggtatcagcaacggcccgggcagtcccctagattgctcatttatagtacctctaatctggcctcaggtatccctgcacgattttctggatctggttcaggttctgattacaccctcactatctctagcctggagcctgaagactttgccgtttattactgccagcagaggtctagctccccattcacctttgggagtgggaccaaggttgaaattaaaacgacaaccccggcccccagaccaccaacgccagcccccaccatcgccagccaacccctgtctctgagaccagaagcctgtaggcctgccgccggtggagctgtgcacacaagaggactggatttcgcctgtgatatctacatttgggccccgctcgcaggcacatgtggagtgctcctcctctccctggtgattaccctgtactgctgataa (SEQ ID NO: 584)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKRLEWVSTISGGGTYIYYPDSVKGRFTI SRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLTCSATSSVSYIHWYQQRPGQSPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGSDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSSPFTFGSGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC* *(SEQ ID NO:585)
CAR-T C2 CD8 CD8 sequence:
N-CD81s-huMNC2scFv-CD8ecdfragment- CD8 transmembrane-C
(DNA)
gaagtgcagctcgtagagagtggcgggggactggtgaagcccggtggaagcctcagactcagttgcgccgcctcaggtttcactttttcaggttacgccatgtcctgggtaagacaggcaccggggaaaggactcgagtgggtgtctactatcagctcaggaggcacttatatatattatcctgactctgtaaaaggccgatttacgatttctcgcgacaatgcaaagaactccctctacctccaaatgaacagtcttagggcagaagacactgctgtatactattgtgcacgcctcggcggcgacaactactacgagtactttgacgtgtgggggaaagggactaccgtgacagtttcaagcggaggaggtggctcaggtggaggcgggtcaggggggggaggaagtgatattgtgctcacacaatccccagcctccctggctgtgtctcccggccaacgcgctacaattacatgtcgggcctccaaaagcgtgagcaccagcggctacagctacatgcactggtatcaacagaaaccaggacaaccccccaaactgttgatttatctcgcttcaaacttggagtccggcgtgcctgcgcgcttttcagggagtgggagcggcacagattttacgctgactatcaaccccgtagaagcaaacgatacagcgaattattattgtcaacattcccgggaactcccctttacgttcggcgggggcacaaaggtcgaaattaagagaaccacgacaaccccggcccccagaccaccaacgccagcccccaccatcgccagccaacccctgtctctgagaccagaagcctgtaggcctgccgccggtggagctgtgcacacaagaggactggatttcgcctgtgatatctacatttgggccccgctcgcaggcacatgtggagtgctcctcctctccctggtgattaccctgtactgctgataa (SEQ ID
NO: 586)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTI SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYFDVWGKGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSRELPFTFGGGTKVEIKRTTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC** (SEQ ID NO:587)
CD8/4-1BB sequence
N- CD8 transmembrane- 4-lBB-C
(DNA)
acgacaaccccggcccccagaccaccaacgccagcccccaccatcgccagccaacccctgtctctgagaccagaagcctgtaggcctgccgccggtggagctgtgcacacaagaggactggatttcgcctgtgatatctacatttgggccccgctcgcaggcacatgtggagtgctcctcctctccctggtgattaccctgtactgcaaaaggggccgcaaaaaactcctttacatttttaagcagccttttatgaggccagtacagacgactcaagaggaagacgggtgctcatgccgctttcctgaggaggaggaaggagggtgcgaactgtgataa (SEQ ID NO: 588)
(amino acids)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL* * (SEQ ID NO: 589)
CD8/CD28 sequence
N- CD8 transmembrane- CD28-C
(DNA)
acgacaaccccggcccccagaccaccaacgccagcccccaccatcgccagccaacccctgtctctgagaccagaagcctgtaggcctgccgccggtggagctgtgcacacaagaggactggatttcgcctgtgatatctacatttgggccccgctcgcaggcacatgtggagtgctcctcctctccctggtgattaccctgtactgcagaagcaagcggtctcggctcctgcattctgattacatgaacatgaccccaagaagaccaggccccaccaggaaacattaccagccctacgctccgccacgcgacttcgctgcctaccggtcctgataa (SEQ ID NO: 590)
(amino acids)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS * * (SEQ ID NO: 591)
CD8/CD3z sequence:
N- CD8 transmembrane- CD3zeta-C
(DNA)
acgacaaccccggcccccagaccaccaacgccagcccccaccatcgccagccaacccctgtctctgagaccagaagcctgtaggcctgccgccggtggagctgtgcacacaagaggactggatttcgcctgtgatatctacatttgggccccgctcgcaggcacatgtggagtgctcctcctctccctggtgattaccctgtactgccgcgttaagttctcccgatcagccgacgcgcctgcttacaagcagggccagaaccaactgtacaacgagctgaatctcggtagacgggaagagtacgacgtgttggacaaacggagaggccgcgacccagaaatgggcggcaagcctcgcaggaaaaacccccaggagggactgtacaatgagttgcagaaagataagatggcagaagcttatagcgagatcggaatgaagggggaaaggagacgagggaaaggacacgacggcctttatcagggcctgtccacagcaacaaaagatacgtatgacgccctccatatgcaggcacttccaccacggtgataa (SEQ ID NO:592)
(amino acids)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR* * (SEQ ID NO: 593)
CD8/CD28/CD3z sequence:
N- CD8 transmembrane- CD28-CD3zeta-C
(DNA)
acgacaaccccggcccccagaccaccaacgccagcccccaccatcgccagccaacccctgtctctgagaccagaagcctgtaggcctgccgccggtggagctgtgcacacaagaggactggatttcgcctgtgatatctacatttgggccccgctcgcaggcacatgtggagtgctcctcctctccctggtgattaccctgtactgcagaagcaagcggtctcggctcctgcattctgattacatgaacatgaccccaagaagaccaggccccaccaggaaacattaccagccctacgctccgccacgcgacttcgctgcctaccggtcccgcgttaagttctcccgatcagccgacgcgcctgcttacaagcagggccagaaccaactgtacaacgagctgaatctcggtagacgggaagagtacgacgtgttggacaaacggagaggccgcgacccagaaatgggcggcaagcctcgcaggaaaaacccccaggagggactgtacaatgagttgcagaaagataagatggcagaagcttatagcgagatcggaatgaagggggaaaggagacgagggaaaggacacgacggcctttatcagggcctgtccacagcaacaaaagatacgtatgacgccctccatatgcaggcacttccaccacggtgataa (SEQ ID NO: 594)
(amino acids)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR* * (SEQ ID NO:595)
CD8/4-lBB/CD3z sequence:
N- CD8 transmembrane- 4-1BB-CD3zeta-C
(DNA)
acgacaaccccggcccccagaccaccaacgccagcccccaccatcgccagccaacccctgtctctgagaccagaagcctgtaggcctgccgccggtggagctgtgcacacaagaggactggatttcgcctgtgatatctacatttgggccccgctcgcaggcacatgtggagtgctcctcctctccctggtgattaccctgtactgcaaaaggggccgcaaaaaactcctttacatttttaagcagccttttatgaggccagtacagacgactcaagaggaagacgggtgctcatgccgctttcctgaggaggaggaaggagggtgcgaactgcgcgttaagttctcccgatcagccgacgcgcctgcttacaagcagggccagaaccaactgtacaacgagctgaatctcggtagacgggaagagtacgacgtgttggacaaacggagaggccgcgacccagaaatgggcggcaagcctcgcaggaaaaacccccaggagggactgtacaatgagttgcagaaagataagatggcagaagcttatagcgagatcggaatgaagggggaaaggagacgagggaaaggacacgacggcctttatcagggcctgtccacagcaacaaaagatacgtatgacgccctccatatgcaggcacttccaccacggtgataa (SEQ ID NO: 596)
(amino acids)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR* * (SEQ ID NO:597)
CD8/CD28/4-lBB/CD3z sequence:
N- CD8 transmembrane- CD28-4-1BB- CD3zeta-C
(DNA)
acgacaaccccggcccccagaccaccaacgccagcccccaccatcgccagccaacccctgtctctgagaccagaagcctgtaggcctgccgccggtggagctgtgcacacaagaggactggatttcgcctgtgatatctacatttgggccccgctcgcaggcacatgtggagtgctcctcctctccctggtgattaccctgtactgcagaagcaagcggtctcggctcctgcattctgattacatgaacatgaccccaagaagaccaggccccaccaggaaacattaccagccctacgctccgccacgcgacttcgctgcctaccggtccaaaaggggccgcaaaaaactcctttacatttttaagcagccttttatgaggccagtacagacgactcaagaggaagacgggtgctcatgccgctttcctgaggaggaggaaggagggtgcgaactgcgcgttaagttctcccgatcagccgacgcgcctgcttacaagcagggccagaaccaactgtacaacgagctgaatctcggtagacgggaagagtacgacgtgttggacaaacggagaggccgcgacccagaaatgggcggcaagcctcgcaggaaaaacccccaggagggactgtacaatgagttgcagaaagataagatggcagaagcttatagcgagatcggaatgaagggggaaaggagacgagggaaaggacacgacggcctttatcagggcctgtccacagcaacaaaagatacgtatgacgccctccatatgcaggcacttccaccacggtgataa (SEQ ID
NO: 598)
(amino acids)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR* * (SEQ ID NO: 599)
CAR-T C3 CD8/CD8/4-lBB/CD3zsequence:
N-CD81s-huMNC3scFv-CD8ecdfragment- CD8 transmembrane- 4-1BB- CD3zeta-C
(DNA)
atggccctgcccgtgaccgctttgctgctccccctggcgctgctgctgcacgccgccaggccacaggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccgactacgccatgaactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggagtgatcagcaccttcagcggtaacacaaacttcaaccagaagttcaagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgagaagcgactactacggcccatacttcgactactggggccagggcaccaccctgaccgtgtccagcggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgatattgtgatgacccagactccactctctctgtccgtcacccctggacagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagaccattgtccatagtaatggaaacacctatttggagtggtacctgcagaagccaggccagtctccacagctcctgatctataaggtttccaaccggttctctggagtgccagataggttcagtggcagcgggtcagggacagatttcacactgaaaatcagccgggtggaggctgaggatgttggggtttattactgettccaaggtagccacgtgcctttcaccttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactacgacaaccccggcccccagaccaccaacgccagcccccaccatcgccagccaacccctgtctctgagaccagaagcctgtaggcctgccgccggtggagctgtgcacacaagaggactggatttcgcctgtgatatctacatttgggccccgctcgcaggcacatgtggagtgctcctcctctccctggtgattaccctgtactgcaaaaggggccgcaaaaaactcctttacatttttaagcagccttttatgaggccagtacagacgactcaagaggaagacgggtgctcatgccgctttcctgaggaggaggaaggagggtgcgaactgcgcgttaagttctcccgatcagccgacgcgcctgcttacaagcagggccagaaccaactgtacaacgagctgaatctcggtagacgggaagagtacgacgtgttggacaaacggagaggccgcgacccagaaatgggcggcaagcctcgcaggaaaaacccccaggagggactgtacaatgagttgcagaaagataagatggcagaagcttatagcgagatcggaatgaagggggaaaggagacgagggaaaggacacgacggcctttatcagggcctgtccacagcaacaaaagatacgtatgacgccctccatatgcaggcacttccaccacggtgataa (SEQ ID NO: 600)
(amino acids)
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C3 CAR gBLOCK 1 sequence:
(DNA)
atccacgctgttttgacctccatagaagattctagagctagctgtagagcttggtaccgagggccaccatggccctgcccgtgaccgctttgctgctccccctggcgctgctgctgcacgccgccaggccacaggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccgactacgccatgaactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggagtgatcagcaccttcagcggtaacacaaacttcaaccagaagttcaagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgagaagcgactactacggcccatacttcgactactggggccagggcaccaccctgaccgtgtccagcggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgatattgtgatgacccagactccactctctctgt(SEQ ID NO: 602)
C3 CAR gBLOCK 2 sequence:
(DNA)
tattgtgatgacccagactccactctctctgtccgtcacccctggacagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagaccattgtccatagtaatggaaacacctatttggagtggtacctgcagaagccaggccagtctccacagctcctgatctataaggtttccaaccggttctctggagtgccagataggttcagtggcagcgggtcagggacagatttcacactgaaaatcagccgggtggaggctgaggatgttggggtttattactgettccaaggtagccacgtgcctttcaccttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactacgacaaccccggcccccagaccaccaacgccagcccccaccatcgccagccaacccctgtctctgagaccagaagcctgtaggcctgccgccggtggagctgtgcacacaagaggactggatttcgcctgtgatatctacatttgggccccgctcgcaggcacatgtg (SEQ ID NO: 603)
E6 scFV gBLOCK 1 sequence:
(DNA)
tgctctgggttccaggttccactggtgacgcggcccagccggccgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtaggtatggcatgagctgggtccgccaggctccagggaagaggctggagtgggtctcaaccattagtggcggaggcacctacatatactacccagactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtaccagagataactatggccgcaactatgattatggcatggattattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatcc (SEQ ID NO: 604)
E6 scFV gBLOCK 2 sequence:
(DNA)
ggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctcacctgcagcgccaccagcagtgttagctacatccactggtaccaacagaggcctggccagagccccaggctcctcatctatagcacctccaacctggccagcggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggagcgactacactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcagctcccctttcacctttggcagcggcaccaaagtggaaattaaaaccggtcatcatcaccatcaccactgataagtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagt (SEQ ID NO: 605)
CAR-T C2 CD8/CD8/CD3z sequence:
N-CD81s-huMNC2scFv-CD8ecdfragment- CD8 transmembrane- CD3zeta-C
(DNA)
atggccttgccagtgacggccctgctgctgccattggctcttctgttgcacgctgccaggcctgaagtgcagctcgtagagagtggcgggggactggtgaagcccggtggaagcctcagactcagttgcgccgcctcaggtttcactttttcaggttacgccatgtcctgggtaagacaggcaccggggaaaggactcgagtgggtgtctactatcagctcaggaggcacttatatatattatcctgactctgtaaaaggccgatttacgatttctcgcgacaatgcaaagaactccctctacctccaaatgaacagtcttagggcagaagacactgctgtatactattgtgcacgcctcggcggcgacaactactacgagtactttgacgtgtgggggaaagggactaccgtgacagtttcaagcggaggaggtggctcaggtggaggcgggtcaggggggggaggaagtgatattgtgctcacacaatccccagcctccctggctgtgtctcccggccaacgcgctacaattacatgtcgggcctccaaaagcgtgagcaccagcggctacagctacatgcactggtatcaacagaaaccaggacaaccccccaaactgttgatttatctcgcttcaaacttggagtccggcgtgcctgcgcgcttttcagggagtgggagcggcacagattttacgctgactatcaaccccgtagaagcaaacgatacagcgaattattattgtcaacattcccgggaactcccctttacgttcggcgggggcacaaaggtcgaaattaagagaaccacgacaaccccggcccccagaccaccaacgccagcccccaccatcgccagccaacccctgtctctgagaccagaagcctgtaggcctgccgccggtggagctgtgcacacaagaggactggatttcgcctgtgatatctacatttgggccccgctcgcaggcacatgtggagtgctcctcctctccctggtgattaccctgtactgccgcgttaagttctcccgatcagccgacgcgcctgcttacaagcagggccagaaccaactgtacaacgagctgaatctcggtagacgggaagagtacgacgtgttggacaaacggagaggccgcgacccagaaatgggcggcaagcctcgcaggaaaaacccccaggagggactgtacaatgagttgcagaaagataagatggcagaagcttatagcgagatcggaatgaagggggaaaggagacgagggaaaggacacgacggcctttatcagggcctgtccacagcaacaaaagatacgtatgacgccctccatatgcaggcacttccaccacggtgataa (SEQ ID NO:606)
(amino acids)
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CAR-T C2 CD8/CD8/CD28/CD3zsequence:
N-CD81s-huMNC2scFv-CD8ecdfragment- CD8 transmembrane- CD28- CD3zeta-C
(DNA)
atggccttgccagtgacggccctgctgctgccattggctcttctgttgcacgctgccaggcctgaagtgcagctcgtagagagtggcgggggactggtgaagcccggtggaagcctcagactcagttgcgccgcctcaggtttcactttttcaggttacgccatgtcctgggtaagacaggcaccggggaaaggactcgagtgggtgtctactatcagctcaggaggcacttatatatattatcctgactctgtaaaaggccgatttacgatttctcgcgacaatgcaaagaactccctctacctccaaatgaacagtcttagggcagaagacactgctgtatactattgtgcacgcctcggcggcgacaactactacgagtactttgacgtgtgggggaaagggactaccgtgacagtttcaagcggaggaggtggctcaggtggaggcgggtcaggggggggaggaagtgatattgtgctcacacaatccccagcctccctggctgtgtctcccggccaacgcgctacaattacatgtcgggcctccaaaagcgtgagcaccagcggctacagctacatgcactggtatcaacagaaaccaggacaaccccccaaactgttgatttatctcgcttcaaacttggagtccggcgtgcctgcgcgcttttcagggagtgggagcggcacagattttacgctgactatcaaccccgtagaagcaaacgatacagcgaattattattgtcaacattcccgggaactcccctttacgttcggcgggggcacaaaggtcgaaattaagagaaccacgacaaccccggcccccagaccaccaacgccagcccccaccatcgccagccaacccctgtctctgagaccagaagcctgtaggcctgccgccggtggagctgtgcacacaagaggactggatttcgcctgtgatatctacatttgggccccgctcgcaggcacatgtggagtgctcctcctctccctggtgattaccctgtactgcagaagcaagcggtctcggctcctgcattctgattacatgaacatgaccccaagaagaccaggccccaccaggaaacattaccagccctacgctccgccacgcgacttcgctgcctaccggtcccgcgttaagttctcccgatcagccgacgcgcctgcttacaagcagggccagaaccaactgtacaacgagctgaatctcggtagacgggaagagtacgacgtgttggacaaacggagaggccgcgacccagaaatgggcggcaagcctcgcaggaaaaacccccaggagggactgtacaatgagttgcagaaagataagatggcagaagcttatagcgagatcggaatgaagggggaaaggagacgagggaaaggacacgacggcctttatcagggcctgtccacagcaacaaaagatacgtatgacgccctccatatgcaggcacttccaccacggtgataa (SEQ ID NO: 608)
(amino acids)
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CAR-T C2 CD8/CD8/4-lBB/CD3z sequence#13:
N-CD81s-huMNC2scFv-CD8ecdfragment- CD8 transmembrane- 4-1BB- CD3zeta-C (DNA)
atggccttgccagtgacggccctgctgctgccattggctcttctgttgcacgctgccaggcctgaagtgcagctcgtagagagtggcgggggactggtgaagcccggtggaagcctcagactcagttgcgccgcctcaggtttcactttttcaggttacgccatgtcctgggtaagacaggcaccggggaaaggactcgagtgggtgtctactatcagctcaggaggcacttatatatattatcctgactctgtaaaaggccgatttacgatttctcgcgacaatgcaaagaactccctctacctccaaatgaacagtcttagggcagaagacactgctgtatactattgtgcacgcctcggcggcgacaactactacgagtactttgacgtgtgggggaaagggactaccgtgacagtttcaagcggaggaggtggctcaggtggaggcgggtcaggggggggaggaagtgatattgtgctcacacaatccccagcctccctggctgtgtctcccggccaacgcgctacaattacatgtcgggcctccaaaagcgtgagcaccagcggctacagctacatgcactggtatcaacagaaaccaggacaaccccccaaactgttgatttatctcgcttcaaacttggagtccggcgtgcctgcgcgcttttcagggagtgggagcggcacagattttacgctgactatcaaccccgtagaagcaaacgatacagcgaattattattgtcaacattcccgggaactcccctttacgttcggcgggggcacaaaggtcgaaattaagagaaccacgacaaccccggcccccagaccaccaacgccagcccccaccatcgccagccaacccctgtctctgagaccagaagcctgtaggcctgccgccggtggagctgtgcacacaagaggactggatttcgcctgtgatatctacatttgggccccgctcgcaggcacatgtggagtgctcctcctctccctggtgattaccctgtactgcaaaaggggccgcaaaaaactcctttacatttttaagcagccttttatgaggccagtacagacgactcaagaggaagacgggtgctcatgccgctttcctgaggaggaggaaggagggtgcgaactgcgcgttaagttctcccgatcagccgacgcgcctgcttacaagcagggccagaaccaactgtacaacgagctgaatctcggtagacgggaagagtacgacgtgttggacaaacggagaggccgcgacccagaaatgggcggcaagcctcgcaggaaaaacccccaggagggactgtacaatgagttgcagaaagataagatggcagaagcttatagcgagatcggaatgaagggggaaaggagacgagggaaaggacacgacggcctttatcagggcctgtccacagcaacaaaagatacgtatgacgccctccatatgcaggcacttccaccacggtgataa (SEQ ID NO: 610)
(amino acids)
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CAR-T C2 CD8/CD8/OX40/CD3zsequence:
N-CD81s-huMNC2scFv-CD8ecdfragment- CD8 transmembrane- OX40- CD3zeta-C
(DNA)
atggccttgccagtgacggccctgctgctgccattggctcttctgttgcacgctgccaggcctgaagtgcagctcgtagagagtggcgggggactggtgaagcccggtggaagcctcagactcagttgcgccgcctcaggtttcactttttcaggttacgccatgtcctgggtaagacaggcaccggggaaaggactcgagtgggtgtctactatcagctcaggaggcacttatatatattatcctgactctgtaaaaggccgatttacgatttctcgcgacaatgcaaagaactccctctacctccaaatgaacagtcttagggcagaagacactgctgtatactattgtgcacgcctcggcggcgacaactactacgagtactttgacgtgtgggggaaagggactaccgtgacagtttcaagcggaggaggtggctcaggtggaggcgggtcaggggggggaggaagtgatattgtgctcacacaatccccagcctccctggctgtgtctcccggccaacgcgctacaattacatgtcgggcctccaaaagcgtgagcaccagcggctacagctacatgcactggtatcaacagaaaccaggacaaccccccaaactgttgatttatctcgcttcaaacttggagtccggcgtgcctgcgcgcttttcagggagtgggagcggcacagattttacgctgactatcaaccccgtagaagcaaacgatacagcgaattattattgtcaacattcccgggaactcccctttacgttcggcgggggcacaaaggtcgaaattaagagaaccacgacaaccccggcccccagaccaccaacgccagcccccaccatcgccagccaacccctgtctctgagaccagaagcctgtaggcctgccgccggtggagctgtgcacacaagaggactggatttcgcctgtgatatctacatttgggccccgctcgcaggcacatgtggagtgctcctcctctccctggtgattaccctgtactgccggagggaccagaggctgccccccgatgcccacaagccccctgggggaggcagtttccggacccccatccaagaggagcaggccgacgcccactccaccctggccaagatccgcgttaagttctcccgatcagccgacgcgcctgcttacaagcagggccagaaccaactgtacaacgagctgaatctcggtagacgggaagagtacgacgtgttggacaaacggagaggccgcgacccagaaatgggcggcaagcctcgcaggaaaaacccccaggagggactgtacaatgagttgcagaaagataagatggcagaagcttatagcgagatcggaatgaagggggaaaggagacgagggaaaggacacgacggcctttatcagggcctgtccacagcaacaaaagatacgtatgacgccctccatatgcaggcacttccaccacggtgataa (SEQ ID NO: 612)
(amino acids)
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CAR-T C2 CD8/CD8/CD28/OX40/CD3zsequence:
N-CD81s-huMNC2scFv-CD8ecdfragment- CD8 transmembrane- CD28- OX40- CD3zeta-C (DNA)
atggccttgccagtgacggccctgctgctgccattggctcttctgttgcacgctgccaggcctgaagtgcagctcgtagagagtggcgggggactggtgaagcccggtggaagcctcagactcagttgcgccgcctcaggtttcactttttcaggttacgccatgtcctgggtaagacaggcaccggggaaaggactcgagtgggtgtctactatcagctcaggaggcacttatatatattatcctgactctgtaaaaggccgatttacgatttctcgcgacaatgcaaagaactccctctacctccaaatgaacagtcttagggcagaagacactgctgtatactattgtgcacgcctcggcggcgacaactactacgagtactttgacgtgtgggggaaagggactaccgtgacagtttcaagcggaggaggtggctcaggtggaggcgggtcaggggggggaggaagtgatattgtgctcacacaatccccagcctccctggctgtgtctcccggccaacgcgctacaattacatgtcgggcctccaaaagcgtgagcaccagcggctacagctacatgcactggtatcaacagaaaccaggacaaccccccaaactgttgatttatctcgcttcaaacttggagtccggcgtgcctgcgcgcttttcagggagtgggagcggcacagattttacgctgactatcaaccccgtagaagcaaacgatacagcgaattattattgtcaacattcccgggaactcccctttacgttcggcgggggcacaaaggtcgaaattaagagaaccacgacaaccccggcccccagaccaccaacgccagcccccaccatcgccagccaacccctgtctctgagaccagaagcctgtaggcctgccgccggtggagctgtgcacacaagaggactggatttcgcctgtgatatctacatttgggccccgctcgcaggcacatgtggagtgctcctcctctccctggtgattaccctgtactgcagaagcaagcggtctcggctcctgcattctgattacatgaacatgaccccaagaagaccaggccccaccaggaaacattaccagccctacgctccgccacgcgacttcgctgcctaccggtcccggagggaccagaggctgccccccgatgcccacaagccccctgggggaggcagtttccggacccccatccaagaggagcaggccgacgcccactccaccctggccaagatccgcgttaagttctcccgatcagccgacgcgcctgcttacaagcagggccagaaccaactgtacaacgagctgaatctcggtagacgggaagagtacgacgtgttggacaaacggagaggccgcgacccagaaatgggcggcaagcctcgcaggaaaaacccccaggagggactgtacaatgagttgcagaaagataagatggcagaagcttatagcgagatcggaatgaagggggaaaggagacgagggaaaggacacgacggcctttatcagggcctgtccacagcaacaaaagatacgtatgacgccctccatatgcaggcacttccaccacggtgataa (SEQ ID NO: 614)
(amino acids)
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ID NO: 616)
(amino acids)
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CAR-T E6 CD8/CD8/CD28/OX40/CD3zsequence:
N-CD81s-huMNC2scFv-CD8ecdfragment- CD8 transmembrane- CD28- OX40- CD3zeta-C (DNA)
atggccctgcccgtgaccgctttgctgctccccctggcgctgctgctgcacgccgccaggccagaggtccagctggttgagagtggcggtgggctggttaagcctggcggctccctgcggctgagctgcgccgcgagtggatttactttcagccgatatgggatgagttgggtgcggcaagctcccgggaagaggctggaatgggtctcaacaatctccggggggggcacttacatctattaccccgactcagtcaaggggagatttaccatttcacgagacaacgctaagaataccctgtatttgcagatgaattctctgagagcagaggacacagctgtttactattgtacccgcgacaactatggcaggaactacgactacggtatggactattggggacaagggacattggttacagtgagcagtggcggcgggggcagcggaggaggaggcagcggtggggggggcagcgagatagtgctcacgcagtcacccgcgactctcagtctctcacctggggaacgagctaccctgacgtgctctgctacctcctcagtgtcatatattcactggtatcagcaacggcccgggcagtcccctagattgctcatttatagtacctctaatctggcctcaggtatccctgcacgattttctggatctggttcaggttctgattacaccctcactatctctagcctggagcctgaagactttgccgtttattactgccagcagaggtctagctccccattcacctttgggagtgggaccaaggttgaaattaaaacgacaaccccggcccccagaccaccaacgccagcccccaccatcgccagccaacccctgtctctgagaccagaagcctgtaggcctgccgccggtggagctgtgcacacaagaggactggatttcgcctgtgatatctacatttgggccccgctcgcaggcacatgtggagtgctcctcctctccctggtgattaccctgtactgcagaagcaagcggtctcggctcctgcattctgattacatgaacatgaccccaagaagaccaggccccaccaggaaacattaccagccctacgctccgccacgcgacttcgctgcctaccggtcccggagggaccagaggctgccccccgatgcccacaagccccctgggggaggcagtttccggacccccatccaagaggagcaggccgacgcccactccaccctggccaagatccgcgttaagttctcccgatcagccgacgcgcctgcttacaagcagggccagaaccaactgtacaacgagctgaatctcggtagacgggaagagtacgacgtgttggacaaacggagaggccgcgacccagaaatgggcggcaagcctcgcaggaaaaacccccaggagggactgtacaatgagttgcagaaagataagatggcagaagcttatagcgagatcggaatgaagggggaaaggagacgagggaaaggacacgacggcctttatcagggcctgtccacagcaacaaaagatacgtatgacgccctccatatgcaggcacttccaccacggtgataa (SEQ ID NO: 618)
(amino acids)
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKRLEWVSTISGGGTYIY YPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLTCSATSSVSYIHWYQQRPGQSPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGSDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSSPFTFGSGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR* * (SEQ ID NO: 619)
MUC1 truncated cytoplasmicsequence
(amino acids)
SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY(SEQ ID NO: 620)
MUC1 truncated cytoplasmicsequence
(amino acids)
SVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY(SEQ ID NO: 621)
MUC1 truncated cytoplasmicsequence
(amino acids)
VQLTLAFREGTINVHDVETQFNQY (SEQ IDNO: 622)
MUC1 truncated cytoplasmicsequence
(amino acids)
SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTIN (SEQ IDNO: 623)
Primers
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tctagagtttaaacttactatttacccggagacagggagag(SEQ ID NO: 625)
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attctaagcttgggccaccatggaagc (SEQID NO: 628)
tctagagtttaaacttactaacactctcccctgttgaagc(SEQ ID NO: 629)
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actgtcatatggaggtgcagctggtggagtctg(SEQ ID NO: 634)
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cttcttcctcaggagcaagctcaccgtgg(SEQ ID NO: 636)
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gcacctgaactcctgggg (SEQ ID NO:638)
tttaatttccactttggtgccg (SEQ IDNO: 639)
cgcggctagcttaagcttggtaccgagggcca(SEQ ID NO: 640)
cgcggcggccgcctgatcagcgggtttaaacttatc(SEQ ID NO: 641)
MMP9
(DNA)
atgagcctctggcagcccctggtcctggtgctcctggtgctgggctgctgctttgctgcccccagacagcgccagtccacccttgtgctcttccctggagacctgagaaccaatctcaccgacaggcagctggcagaggaatacctgtaccgctatggttacactcgggtggcagagatgcgtggagagtcgaaatctctggggcctgcgctgctgcttctccagaagcaactgtccctgcccgagaccggtgagctggatagcgccacgctgaaggccatgcgaaccccacggtgcggggtcccagacctgggcagattccaaacctttgagggcgacctcaagtggcaccaccacaacatcacctattggatccaaaactactcggaagacttgccgcgggcggtgattgacgacgcctttgcccgcgccttcgcactgtggagcgcggtgacgccgctcaccttcactcgcgtgtacagccgggacgcagacatcgtcatccagtttggtgtcgcggagcacggagacgggtatcccttcgacgggaaggacgggctcctggcacacgcctttcctcctggccccggcattcagggagacgcccatttcgacgatgacgagttgtggtccctgggcaagggcgtcgtggttccaactcggtttggaaacgcagatggcgcggcctgccacttccccttcatcttcgagggccgctcctactctgcctgcaccaccgacggtcgctccgacggcttgccctggtgcagtaccacggccaactacgacaccgacgaccggtttggcttctgccccagcgagagactctacacccaggacggcaatgctgatgggaaaccctgccagtttccattcatcttccaaggccaatcctactccgcctgcaccacggacggtcgctccgacggctaccgctggtgcgccaccaccgccaactacgaccgggacaagctcttcggcttctgcccgacccgagctgactcgacggtgatggggggcaactcggcgggggagctgtgcgtcttccccttcactttcctgggtaaggagtactcgacctgtaccagcgagggccgcggagatgggcgcctctggtgcgctaccacctcgaactttgacagcgacaagaagtggggcttctgcccggaccaaggatacagtttgttcctcgtggcggcgcatgagttcggccacgcgctgggcttagatcattcctcagtgccggaggcgctcatgtaccctatgtaccgcttcactgaggggccccccttgcataaggacgacgtgaatggcatccggcacctctatggtcctcgccctgaacctgagccacggcctccaaccaccaccacaccgcagcccacggctcccccgacggtctgccccaccggaccccccactgtccacccctcagagcgccccacagctggccccacaggtcccccctcagctggccccacaggtccccccactgctggcccttctacggccactactgtgcctttgagtccggtggacgatgcctgcaacgtgaacatcttcgacgccatcgcggagattgggaaccagctgtatttgttcaaggatgggaagtactggcgattctctgagggcagggggagccggccgcagggccccttccttatcgccgacaagtggcccgcgctgccccgcaagctggactcggtctttgaggagcggctctccaagaagcttttcttcttctctgggcgccaggtgtgggtgtacacaggcgcgtcggtgctgggcccgaggcgtctggacaagctgggcctgggagccgacgtggcccaggtgaccggggccctccggagtggcagggggaagatgctgctgttcagcgggcggcgcctctggaggttcgacgtgaaggcgcagatggtggatccccggagcgccagcgaggtggaccggatgttccccggggtgcctttggacacgcacgacgtcttccagtaccgagagaaagcctatttctgccaggaccgcttctactggcgcgtgagttcccggagtgagttgaaccaggtggaccaagtgggctacgtgacctatgacatcctgcagtgccctgaggacgattacaaggatgacgacgataagtgataa (SEQ ID NO: 642)
(amino acids)
MSLWQPLVLVLLVLGCCFAAPRQRQSTLVLFPGDLRTNLTDRQLAEEYLYRYGYTRVAEMRGESKSLGPALLLLQKQLSLPETGELDSATLKAMRTPRCGVPDLGRFQTFEGDLKWHHHNITYWIQNYSEDLPRAVIDDAFARAFALWSAVTPLTFTRVYSRDADIVIQFGVAEHGDGYPFDGKDGLLAHAFPPGPGIQGDAHFDDDELWSLGKGVVVPTRFGNADGAACHFPFIFEGRSYSACTTDGRSDGLPWCSTTANYDTDDRFGFCPSERLYTQDGNADGKPCQFPFIFQGQSYSACTTDGRSDGYRWCATTANYDRDKLFGFCPTRADSTVMGGNSAGELCVFPFTFLGKEYSTCTSEGRGDGRLWCATTSNFDSDKKWGFCPDQGYSLFLVAAHEFGHALGLDHSSVPEALMYPMYRFTEGPPLHKDDVNGIRHLYGPRPEPEPRPPTTTTPQPTAPPTVCPTGPPTVHPSERPTAGPTGPPSAGPTGPPTAGPSTATTVPLSPVDDACNVNIFDAIAEIGNQLYLFKDGKYWRFSEGRGSRPQGPFLIADKWPALPRKLDSVFEERLSKKLFFFSGRQVWVYTGASVLGPRRLDKLGLGADVAQVTGALRSGRGKMLLFSGRRLWRFDVKAQMVDPRSASEVDRMFPGVPLDTHDVFQYREKAYFCQDRFYWRVSSRSELNQVDQVGYVTYDILQCPEDDYKDDDDK* *(SEQ ID NO: 643)
MMP9 catalytic domain
(DNA)
atgttccaaacctttgagggcgacctcaagtggcaccaccacaacatcacctattggatccaaaactactcggaagacttgccgcgggcggtgattgacgacgcctttgcccgcgccttcgcactgtggagcgcggtgacgccgctcaccttcactcgcgtgtacagccgggacgcagacatcgtcatccagtttggtgtcgcggagcacggagacgggtatcccttcgacgggaaggacgggctcctggcacacgcctttcctcctggccccggcattcagggagacgcccatttcgacgatgacgagttgtggtccctgggcaagggcgtcgtggttccaactcggtttggaaacgcagatggcgcggcctgccacttccccttcatcttcgagggccgctcctactctgcctgcaccaccgacggtcgctccgacggcttgccctggtgcagtaccacggccaactacgacaccgacgaccggtttggcttctgccccagcgagagactctacacccaggacggcaatgctgatgggaaaccctgccagtttccattcatcttccaaggccaatcctactccgcctgcaccacggacggtcgctccgacggctaccgctggtgcgccaccaccgccaactacgaccgggacaagctcttcggcttctgcccgacccgagctgactcgacggtgatggggggcaactcggcgggggagctgtgcgtcttccccttcactttcctgggtaaggagtactcgacctgtaccagcgagggccgcggagatgggcgcctctggtgcgctaccacctcgaactttgacagcgacaagaagtggggcttctgcccggaccaaggatacagtttgttcctcgtggcggcgcatgagttcggccacgcgctgggcttagatcattcctcagtgccggaggcgctcatgtaccctatgtaccgcttcactgaggggccccccttgcataaggacgacgtgaatggcatccggcacctctatggtcctcgccctgaacctgattacaaggatgacgacgataagtgataa (SEQ ID NO: 644)
(amino acids)
MFQTFEGDLKWHHHNITYWIQNYSEDLPRAVIDDAFARAFALWSAVTPLTFTRVYSRDADIVIQFGVAEHGDGYPFDGKDGLLAHAFPPGPGIQGDAHFDDDELWSLGKGVVVPTRFGNADGAACHFPFIFEGRSYSACTTDGRSDGLPWCSTTANYDTDDRFGFCPSERLYTQDGNADGKPCQFPFIFQGQSYSACTTDGRSDGYRWCATTANYDRDKLFGFCPTRADSTVMGGNSAGELCVFPFTFLGKEYSTCTSEGRGDGRLWCATTSNFDSDKKWGFCPDQGYSLFLVAAHEFGHALGLDHSSVPEALMYPMYRFTEGPPLHKDDVNGIRHLYGPRPEPDYKDDDDK* * (SEQ ID NO: 645)
NFATcl Promoter (NFATclP)
(DNA)
aggcaggaggaagaggaaaggggcgcagggcgctcggggagcagagccgggggcccgcggtggccgcagaggccgggccggggcgcagaggccgggcgagctggccgcgctctgggccgccgcctccggaactccctgcgcctggcgcgcggccaccgtggtcccggcaacggcattaaacagagggaaacagacccgggattccgtcacccgggcggggggataaggacggctttgagagcagacaggaaaagggagcttttctgcatggggtgaaaaaattatttattgaaggaggaggaggcggcagcggaggaaggggaggggcgggaggaggaggaagagccggccgcccccgccccggccccggctcctcaggagccaagggcagcctcgccaggtcggtcccgggctcgaggaccgcggctggggtcgaggggctcagtctcccacgtgaccggctgggcgcgccccgccagacccggcctcgggattccctcctcccggcgagtctccgcccgccccgtcctggaggtggggagaaggagggcggggcgggggggacggaaactctccccgccaaatcctggccccaggcctggggacactcgcggcgggaagatttggaggggaggggagggggaggggcgtgggggcgcggcctcgctggagtccccctgaccccccgacccccgcccaccggcctgggcgtcctcccgcggcccctcctcccctcccggcgcccggtgctctggggcgcgtgccacgcctggctcggcgccgtaggggcccccgcaggtagagacccctggaaatggcctcgacgccgcaggagcgaggcggccaccaccccgctaatccgggcacgtctctccaggccgaggcctgcggtggaaaagccggggttccatttgtgctgagtcggggcggccgaatggagccaggcctcgggacgcgggacggacgggctctggccgcgcaccttcgcgggctctgcagcgcccgaccgcctcccccggcagggaggaggcgcttgtggggggcacccacggggcacagtgatccctgggggtctgcggacctcctgggccccgcagcagacacgagtttagcctttgggtttagtttaaatcacataagggtgtcgtgcaatcgatttatggtttctacacaccagacactttaacctccaaccccccccatccaagccaacaagaaaatgcggtgccgtgttggcagctgagctgcgcccgaagagacgcagggagacgtaagagaggaaagtgtgagtggccggggggcctccccccgtcagaagtcgcgcagtcgcgcccataaaacgccccctccgggcggctagggcaggtgagcgcgtccccgggcctccccacgccggcccctgccacagagccgtctaggtcgagcagatatttacagaataaaaatgacaataactcgacgtcccgggacggccacgcaatctgttagtaatttagcgggatgggaatttcctttctagggcctgccagtgaagcgcttttccaaatttccacagcgggggaagcctgcgattttacataatgacttcagcatgccgggctttctcgacacccctccccggcccccggcccccgccccccgccccttttccagcagggccgggctccctccggacacccgcgtggactcaggcgtcccgtctggcccgttcgcccccgtttcccccgccagccccagcgcccccctgcccggcccccggattccccgttcccgcccctacgcccccatcccctccccgtgcgcccctccccgtgcgcccccctccccgtgcgccccccctccccgtgcgcccccctccccgtgcgccccccctccccgggcgcccccctccccgggcgccccccctccccgtgcgcccccccctccccgtgcgccccccctccccgtgcgcgccccgcctcttgcgcccctgcccccaggcgagcggctgccgcggcgcggggaggggcgggcgctcggcgactcgtccccggggccccgcgcgggcccgggcagcaggggcgtgatgtcacggcagggagggggcgcgggagccgccgggccggcggggaggcgggggaggtgttttccagctttaaaaaggcaggaggcagagcgcggccctgcgtcagagcgagactcagagg (SEQ ID NO: 646)
NFATclP&#8212;MMP9
(DNA)
aggcaggaggaagaggaaaggggcgcagggcgctcggggagcagagccgggggcccgcggtggccgcagaggccgggccggggcgcagaggccgggcgagctggccgcgctctgggccgccgcctccggaactccctgcgcctggcgcgcggccaccgtggtcccggcaacggcattaaacagagggaaacagacccgggattccgtcacccgggcggggggataaggacggctttgagagcagacaggaaaagggagcttttctgcatggggtgaaaaaattatttattgaaggaggaggaggcggcagcggaggaaggggaggggcgggaggaggaggaagagccggccgcccccgccccggccccggctcctcaggagccaagggcagcctcgccaggtcggtcccgggctcgaggaccgcggctggggtcgaggggctcagtctcccacgtgaccggctgggcgcgccccgccagacccggcctcgggattccctcctcccggcgagtctccgcccgccccgtcctggaggtggggagaaggagggcggggcgggggggacggaaactctccccgccaaatcctggccccaggcctggggacactcgcggcgggaagatttggaggggaggggagggggaggggcgtgggggcgcggcctcgctggagtccccctgaccccccgacccccgcccaccggcctgggcgtcctcccgcggcccctcctcccctcccggcgcccggtgctctggggcgcgtgccacgcctggctcggcgccgtaggggcccccgcaggtagagacccctggaaatggcctcgacgccgcaggagcgaggcggccaccaccccgctaatccgggcacgtctctccaggccgaggcctgcggtggaaaagccggggttccatttgtgctgagtcggggcggccgaatggagccaggcctcgggacgcgggacggacgggctctggccgcgcaccttcgcgggctctgcagcgcccgaccgcctcccccggcagggaggaggcgcttgtggggggcacccacggggcacagtgatccctgggggtctgcggacctcctgggccccgcagcagacacgagtttagcctttgggtttagtttaaatcacataagggtgtcgtgcaatcgatttatggtttctacacaccagacactttaacctccaaccccccccatccaagccaacaagaaaatgcggtgccgtgttggcagctgagctgcgcccgaagagacgcagggagacgtaagagaggaaagtgtgagtggccggggggcctccccccgtcagaagtcgcgcagtcgcgcccataaaacgccccctccgggcggctagggcaggtgagcgcgtccccgggcctccccacgccggcccctgccacagagccgtctaggtcgagcagatatttacagaataaaaatgacaataactcgacgtcccgggacggccacgcaatctgttagtaatttagcgggatgggaatttcctttctagggcctgccagtgaagcgcttttccaaatttccacagcgggggaagcctgcgattttacataatgacttcagcatgccgggctttctcgacacccctccccggcccccggcccccgccccccgccccttttccagcagggccgggctccctccggacacccgcgtggactcaggcgtcccgtctggcccgttcgcccccgtttcccccgccagccccagcgcccccctgcccggcccccggattccccgttcccgcccctacgcccccatcccctccccgtgcgcccctccccgtgcgcccccctccccgtgcgccccccctccccgtgcgcccccctccccgtgcgccccccctccccgggcgcccccctccccgggcgccccccctccccgtgcgcccccccctccccgtgcgccccccctccccgtgcgcgccccgcctcttgcgcccctgcccccaggcgagcggctgccgcggcgcggggaggggcgggcgctcggcgactcgtccccggggccccgcgcgggcccgggcagcaggggcgtgatgtcacggcagggagggggcgcgggagccgccgggccggcggggaggcgggggaggtgttttccagctttaaaaaggcaggaggcagagcgcggccctgcgtcagagcgagactcagaggtctagagccaccatgagcctctggcagcccctggtcctggtgctcctggtgctgggctgctgctttgctgcccccagacagcgccagtccacccttgtgctcttccctggagacctgagaaccaatctcaccgacaggcagctggcagaggaatacctgtaccgctatggttacactcgggtggcagagatgcgtggagagtcgaaatctctggggcctgcgctgctgcttctccagaagcaactgtccctgcccgagaccggtgagctggatagcgccacgctgaaggccatgcgaaccccacggtgcggggtcccagacctgggcagattccaaacctttgagggcgacctcaagtggcaccaccacaacatcacctattggatccaaaactactcggaagacttgccgcgggcggtgattgacgacgcctttgcccgcgccttcgcactgtggagcgcggtgacgccgctcaccttcactcgcgtgtacagccgggacgcagacatcgtcatccagtttggtgtcgcggagcacggagacgggtatcccttcgacgggaaggacgggctcctggcacacgcctttcctcctggccccggcattcagggagacgcccatttcgacgatgacgagttgtggtccctgggcaagggcgtcgtggttccaactcggtttggaaacgcagatggcgcggcctgccacttccccttcatcttcgagggccgctcctactctgcctgcaccaccgacggtcgctccgacggcttgccctggtgcagtaccacggccaactacgacaccgacgaccggtttggcttctgccccagcgagagactctacacccaggacggcaatgctgatgggaaaccctgccagtttccattcatcttccaaggccaatcctactccgcctgcaccacggacggtcgctccgacggctaccgctggtgcgccaccaccgccaactacgaccgggacaagctcttcggcttctgcccgacccgagctgactcgacggtgatggggggcaactcggcgggggagctgtgcgtcttccccttcactttcctgggtaaggagtactcgacctgtaccagcgagggccgcggagatgggcgcctctggtgcgctaccacctcgaactttgacagcgacaagaagtggggcttctgcccggaccaaggatacagtttgttcctcgtggcggcgcatgagttcggccacgcgctgggcttagatcattcctcagtgccggaggcgctcatgtaccctatgtaccgcttcactgaggggccccccttgcataaggacgacgtgaatggcatccggcacctctatggtcctcgccctgaacctgagccacggcctccaaccaccaccacaccgcagcccacggctcccccgacggtctgccccaccggaccccccactgtccacccctcagagcgccccacagctggccccacaggtcccccctcagctggccccacaggtccccccactgctggcccttctacggccactactgtgcctttgagtccggtggacgatgcctgcaacgtgaacatcttcgacgccatcgcggagattgggaaccagctgtatttgttcaaggatgggaagtactggcgattctctgagggcagggggagccggccgcagggccccttccttatcgccgacaagtggcccgcgctgccccgcaagctggactcggtctttgaggagcggctctccaagaagcttttcttcttctctgggcgccaggtgtgggtgtacacaggcgcgtcggtgctgggcccgaggcgtctggacaagctgggcctgggagccgacgtggcccaggtgaccggggccctccggagtggcagggggaagatgctgctgttcagcgggcggcgcctctggaggttcgacgtgaaggcgcagatggtggatccccggagcgccagcgaggtggaccggatgttccccggggtgcctttggacacgcacgacgtcttccagtaccgagagaaagcctatttctgccaggaccgcttctactggcgcgtgagttcccggagtgagttgaaccaggtggaccaagtgggctacgtgacctatgacatcctgcagtgccctgaggacgattacaaggatgacgacgataagtgataa (SEQ ID NO: 647)
NFATclP-MMP9cat
(DNA)
aggcaggaggaagaggaaaggggcgcagggcgctcggggagcagagccgggggcccgcggtggccgcagaggccgggccggggcgcagaggccgggcgagctggccgcgctctgggccgccgcctccggaactccctgcgcctggcgcgcggccaccgtggtcccggcaacggcattaaacagagggaaacagacccgggattccgtcacccgggcggggggataaggacggctttgagagcagacaggaaaagggagcttttctgcatggggtgaaaaaattatttattgaaggaggaggaggcggcagcggaggaaggggaggggcgggaggaggaggaagagccggccgcccccgccccggccccggctcctcaggagccaagggcagcctcgccaggtcggtcccgggctcgaggaccgcggctggggtcgaggggctcagtctcccacgtgaccggctgggcgcgccccgccagacccggcctcgggattccctcctcccggcgagtctccgcccgccccgtcctggaggtggggagaaggagggcggggcgggggggacggaaactctccccgccaaatcctggccccaggcctggggacactcgcggcgggaagatttggaggggaggggagggggaggggcgtgggggcgcggcctcgctggagtccccctgaccccccgacccccgcccaccggcctgggcgtcctcccgcggcccctcctcccctcccggcgcccggtgctctggggcgcgtgccacgcctggctcggcgccgtaggggcccccgcaggtagagacccctggaaatggcctcgacgccgcaggagcgaggcggccaccaccccgctaatccgggcacgtctctccaggccgaggcctgcggtggaaaagccggggttccatttgtgctgagtcggggcggccgaatggagccaggcctcgggacgcgggacggacgggctctggccgcgcaccttcgcgggctctgcagcgcccgaccgcctcccccggcagggaggaggcgcttgtggggggcacccacggggcacagtgatccctgggggtctgcggacctcctgggccccgcagcagacacgagtttagcctttgggtttagtttaaatcacataagggtgtcgtgcaatcgatttatggtttctacacaccagacactttaacctccaaccccccccatccaagccaacaagaaaatgcggtgccgtgttggcagctgagctgcgcccgaagagacgcagggagacgtaagagaggaaagtgtgagtggccggggggcctccccccgtcagaagtcgcgcagtcgcgcccataaaacgccccctccgggcggctagggcaggtgagcgcgtccccgggcctccccacgccggcccctgccacagagccgtctaggtcgagcagatatttacagaataaaaatgacaataactcgacgtcccgggacggccacgcaatctgttagtaatttagcgggatgggaatttcctttctagggcctgccagtgaagcgcttttccaaatttccacagcgggggaagcctgcgattttacataatgacttcagcatgccgggctttctcgacacccctccccggcccccggcccccgccccccgccccttttccagcagggccgggctccctccggacacccgcgtggactcaggcgtcccgtctggcccgttcgcccccgtttcccccgccagccccagcgcccccctgcccggcccccggattccccgttcccgcccctacgcccccatcccctccccgtgcgcccctccccgtgcgcccccctccccgtgcgccccccctccccgtgcgcccccctccccgtgcgccccccctccccgggcgcccccctccccgggcgccccccctccccgtgcgcccccccctccccgtgcgccccccctccccgtgcgcgccccgcctcttgcgcccctgcccccaggcgagcggctgccgcggcgcggggaggggcgggcgctcggcgactcgtccccggggccccgcgcgggcccgggcagcaggggcgtgatgtcacggcagggagggggcgcgggagccgccgggccggcggggaggcgggggaggtgttttccagctttaaaaaggcaggaggcagagcgcggccctgcgtcagagcgagactcagaggtctagagccaccatgttccaaacctttgagggcgacctcaagtggcaccaccacaacatcacctattggatccaaaactactcggaagacttgccgcgggcggtgattgacgacgcctttgcccgcgccttcgcactgtggagcgcggtgacgccgctcaccttcactcgcgtgtacagccgggacgcagacatcgtcatccagtttggtgtcgcggagcacggagacgggtatcccttcgacgggaaggacgggctcctggcacacgcctttcctcctggccccggcattcagggagacgcccatttcgacgatgacgagttgtggtccctgggcaagggcgtcgtggttccaactcggtttggaaacgcagatggcgcggcctgccacttccccttcatcttcgagggccgctcctactctgcctgcaccaccgacggtcgctccgacggcttgccctggtgcagtaccacggccaactacgacaccgacgaccggtttggcttctgccccagcgagagactctacacccaggacggcaatgctgatgggaaaccctgccagtttccattcatcttccaaggccaatcctactccgcctgcaccacggacggtcgctccgacggctaccgctggtgcgccaccaccgccaactacgaccgggacaagctcttcggcttctgcccgacccgagctgactcgacggtgatggggggcaactcggcgggggagctgtgcgtcttccccttcactttcctgggtaaggagtactcgacctgtaccagcgagggccgcggagatgggcgcctctggtgcgctaccacctcgaactttgacagcgacaagaagtggggcttctgcccggaccaaggatacagtttgttcctcgtggcggcgcatgagttcggccacgcgctgggcttagatcattcctcagtgccggaggcgctcatgtaccctatgtaccgcttcactgaggggccccccttgcataaggacgacgtgaatggcatccggcacctctatggtcctcgccctgaacctgattacaaggatgacgacgataagtgataa (SEQ ID NO: 648)
NFAT response element
(DNA)
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NFAT response element repeats
(DNA)
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CMV minimal promoter
(DNA)
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NFATREmCMV-MMP9
(DNA)
ggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtagatctagactcaggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatctctagagccaccatgagcctctggcagcccctggtcctggtgctcctggtgctgggctgctgctttgctgcccccagacagcgccagtccacccttgtgctcttccctggagacctgagaaccaatctcaccgacaggcagctggcagaggaatacctgtaccgctatggttacactcgggtggcagagatgcgtggagagtcgaaatctctggggcctgcgctgctgcttctccagaagcaactgtccctgcccgagaccggtgagctggatagcgccacgctgaaggccatgcgaaccccacggtgcggggtcccagacctgggcagattccaaacctttgagggcgacctcaagtggcaccaccacaacatcacctattggatccaaaactactcggaagacttgccgcgggcggtgattgacgacgcctttgcccgcgccttcgcactgtggagcgcggtgacgccgctcaccttcactcgcgtgtacagccgggacgcagacatcgtcatccagtttggtgtcgcggagcacggagacgggtatcccttcgacgggaaggacgggctcctggcacacgcctttcctcctggccccggcattcagggagacgcccatttcgacgatgacgagttgtggtccctgggcaagggcgtcgtggttccaactcggtttggaaacgcagatggcgcggcctgccacttccccttcatcttcgagggccgctcctactctgcctgcaccaccgacggtcgctccgacggcttgccctggtgcagtaccacggccaactacgacaccgacgaccggtttggcttctgccccagcgagagactctacacccaggacggcaatgetgatgggaaaccctgccagtttccatteatcttccaaggccaatcctactccgcctgcaccacggacggtcgctccgacggctaccgctggtgcgccaccaccgccaactacgaccgggacaagctcttcggcttctgcccgacccgagctgactcgacggtgatggggggcaactcggcgggggagctgtgcgtcttccccttcactttcctgggtaaggagtactcgacctgtaccagcgagggccgcggagatgggcgcctctggtgcgctaccacctcgaactttgacagcgacaagaagtggggcttctgcccggaccaaggatacagtttgttcctcgtggcggcgcatgagttcggccacgcgctgggcttagatcattcctcagtgccggaggcgctcatgtaccctatgtaccgcttcactgaggggccccccttgcataaggacgacgtgaatggcatccggcacctctatggtcctcgccctgaacctgagccacggcctccaaccaccaccacaccgcagcccacggctcccccgacggtctgccccaccggaccccccactgtccacccctcagagcgccccacagctggccccacaggtcccccctcagctggccccacaggtccccccactgctggcccttctacggccactactgtgcctttgagtccggtggacgatgcctgcaacgtgaacatcttcgacgccatcgcggagattgggaaccagctgtatttgttcaaggatgggaagtactggcgattctctgagggcagggggagccggccgcagggccccttccttatcgccgacaagtggcccgcgctgccccgcaagctggactcggtctttgaggagcggctctccaagaagcttttcttcttctctgggcgccaggtgtgggtgtacacaggcgcgtcggtgctgggcccgaggcgtctggacaagctgggcctgggagccgacgtggcccaggtgaccggggccctccggagtggcagggggaagatgctgctgttcagcgggcggcgcctctggaggttcgacgtgaaggcgcagatggtggatccccggagcgccagcgaggtggaccggatgttccccggggtgcctttggacacgcacgacgtcttccagtaccgagagaaagcctatttctgccaggaccgcttctactggcgcgtgagttcccggagtgagttgaaccaggtggaccaagtgggctacgtgacctatgacatcctgcagtgccctgaggacgattacaaggatgacgacgataagtgataa (SEQ ID NO: 652)
NFATREmCMV-MMP9cat
(DNA)
ggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtagatctagactcaggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatctctagagccaccatgttccaaacctttgagggcgacctcaagtggcaccaccacaacatcacctattggatccaaaactactcggaagacttgccgcgggcggtgattgacgacgcctttgcccgcgccttcgcactgtggagcgcggtgacgccgctcaccttcactcgcgtgtacagccgggacgcagacatcgtcatccagtttggtgtcgcggagcacggagacgggtatcccttcgacgggaaggacgggctcctggcacacgcctttcctcctggccccggcattcagggagacgcccatttcgacgatgacgagttgtggtccctgggcaagggcgtcgtggttccaactcggtttggaaacgcagatggcgcggcctgccacttccccttcatcttcgagggccgctcctactctgcctgcaccaccgacggtcgctccgacggcttgccctggtgcagtaccacggccaactacgacaccgacgaccggtttggcttctgccccagcgagagactctacacccaggacggcaatgctgatgggaaaccctgccagtttccattcatcttccaaggccaatcctactccgcctgcaccacggacggtcgctccgacggctaccgctggtgcgccaccaccgccaactacgaccgggacaagctcttcggcttctgcccgacccgagctgactcgacggtgatggggggcaactcggcgggggagctgtgcgtcttccccttcactttcctgggtaaggagtactcgacctgtaccagcgagggccgcggagatgggcgcctctggtgcgctaccacctcgaactttgacagcgacaagaagtggggcttctgcccggaccaaggatacagtttgttcctcgtggcggcgcatgagttcggccacgcgctgggcttagatcattcctcagtgccggaggcgctcatgtaccctatgtaccgcttcactgaggggccccccttgcataaggacgacgtgaatggcatccggcacctctatggtcctcgccctgaacctgattacaaggatgacgacgataagtgataa (SEQ ID NO: 653)
C2 scFv
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaact (SEQ ID NO: 654)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTI SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYFDVWGKGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSRELPFTFGGGTKVEIKRT (SEQ ID NO: 655)
CD8 transmembrane domain
(DNA)
atctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgc( SEQ ID NO: 656)
(amino acids)
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC (SEQ IDNO: 657)
4-1BB domain
(DNA)
aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg (SEQ ID NO: 658)
(amino acids)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO: 659)
CD3zeta domain
(DNA)
agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc (SEQ ID NO: 660)
(amino acids)
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 661)
Human IgGl Fc linker
(DNA)
gagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO: 662)
(amino acids)
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQID NO: 663)
C2 CAR FC linker
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaaatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctgataa (SEQ ID NO: 664)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTI SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYFDVWGKGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSRELPFTFGGGTKVEIKRTEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR* * (SEQ ID NO: 665)
IgD/Fc linker
(DNA)
gagtctccaaaggcacaggcctcctcagtgcccactgcacaaccccaagcagagggcagcctcgccaaggcaaccacagccccagccaccacccgtaacacaggaagaggcggcgaagagaagaaaaaggagaaggagaaagaggaacaagaagagagagagacaaagacaccagagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO: 666)
(amino acids)
ESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 667)
C2 CAR IgD/FC linker
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactgagtctccaaaggcacaggcctcctcagtgcccactgcacaaccccaagcagagggcagcctcgccaaggcaaccacagccccagccaccacccgtaacacaggaagaggcggcgaagagaagaaaaaggagaaggagaaagaggaacaagaagagagagagacaaagacaccagagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaaatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctgataa (SEQ ID NO: 668)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTI SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYFDVWGKGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSRELPFTFGGGTKVEIKRTESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR** (SEQ ID NO: 669)
Fc hingeless Y407R linker
(DNA)
gcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctcaggagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO: 670)
(amino acids)
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLRSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 671)
C2 CAR FCHingeless/Y407R linker
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactgcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctcaggagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaaatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctgataa (SEQID NO: 672)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTI SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYFDVWGKGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSRELPFTFGGGTKVEIKRTAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLRSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR** (SEQ ID NO: 673)
IgD/FCHingeless/Y407R linker
(DNA)
gagtctccaaaggcacaggcctcctcagtgcccactgcacaaccccaagcagagggcagcctcgccaaggcaaccacagccccagccaccacccgtaacacaggaagaggcggcgaagagaagaaaaaggagaaggagaaagaggaacaagaagagagagagacaaagacaccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatetcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctcaggagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO: 674)
(amino acids)
ESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLRSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 675)
C2 CAR IgD/FCHingeless/Y407Rlinker
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactgagtctccaaaggcacaggcctcctcagtgcccactgcacaaccccaagcagagggcagcctcgccaaggcaaccacagccccagccaccacccgtaacacaggaagaggcggcgaagagaagaaaaaggagaaggagaaagaggaacaagaagagagagagacaaagacaccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctcaggagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaaatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctgataa (SEQ ID NO: 676)
(amino acids)
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IgD linker
(DNA)
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(amino acids)
ESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTP(SEQ ID NO: 679)
C2 CAR IgD linker
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactgagtctccaaaggcacaggcctcctcagtgcccactgcacaaccccaagcagagggcagcctcgccaaggcaaccacagccccagccaccacccgtaacacaggaagaggcggcgaagagaagaaaaaggagaaggagaaagaggaacaagaagagagagagacaaagacaccaatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcageaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctgataa (SEQ ID NO: 680)
(amino acids)
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X4 linker
(DNA)
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(amino acids)
DKTHTKPPKPAPELLGGPGTGTGGPTIKPPKPPKPAPNLLGGP(SEQ ID NO: 683)
C2 CAR X4 linker
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactgacaagacgcacaccaagccacctaaaccagctccagaactgctcggaggtcctggcaccggaaccggaggacctaccatcaaaccacctaagccacctaagcctgctcctaacctgctcggaggacctatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctgataa (SEQ ID NO: 684)
(amino acids)
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OKT3 scFv
(DNA)
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(amino acids)
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R** (SEQ ID NO: 687)
C2-FC-OKT3
(DNA)
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(amino acids)
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C2-IgD/FC-OKT3
(DNA)
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(amino acids)
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C2-FCHingeless/Y407R-OKT3
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C2-IgD/FCHingeless/Y407R-OKT3
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactgagtctccaaaggcacaggcctcctcagtgcccactgcacaaccccaagcagagggcagcctcgccaaggcaaccacagccccagccaccacccgtaacacaggaagaggcggcgaagagaagaaaaaggagaaggagaaagaggaacaagaagagagagagacaaagacaccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctcaggagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaaggcggtggcggatcccaggtgcagctggtgcagagcggaggcggagtggtgcagcctggaagaagcctgcgcctgagctgcaaagcgagcggctatacctttacccgctataccatgcattgggtgcgccaggcgccgggcaaaggcctggaatggattggctatattaacccgagccgcggctataccaactataaccagaaagtgaaagatcgctttaccattagcaccgataaaagcaaaagcaccgcgtttctgcagatggatagcctgcgcccggaagataccgcggtgtattattgcgcgcgctattatgatgatcattattgcctggattattggggccagggcaccaccctgaccgtgagcagcggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgatattcagatgacccagagcccgagcagcctgagcgcgagcgtgggcgatcgcgtgaccattacctgcagcgcgagcagcagcgtgagctatatgaactggtatcagcagaccccgggcaaagcgccgaaacgctggatttatgataccagcaaactggcgagcggcgtgccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattatacctttaccattagcagcctgcagccggaagatattgcgacctattattgccagcagtggagcagcaacccgtttacctttggccagggcaccaaactgcagattacccgctgataa (SEQ ID NO: 694)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTI SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYFDVWGKGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSRELPFTFGGGTKVEIKRTESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLRSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSQVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKGLEWIGYINPSRGYTNYNQKVKDRFTISTDKSKSTAFLQMDSLRPEDTAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS GGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLQITR* * (SEQ ID NO: 695)
C2-IgD-OKT3
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactgagtctccaaaggcacaggcctcctcagtgcccactgcacaaccccaagcagagggcagcctcgccaaggcaaccacagccccagccaccacccgtaacacaggaagaggcggcgaagagaagaaaaaggagaaggagaaagaggaacaagaagagagagagacaaagacaccaggcggtggcggatcccaggtgcagctggtgcagagcggaggcggagtggtgcagcctggaagaagcctgcgcctgagctgcaaagcgagcggctatacctttacccgctataccatgcattgggtgcgccaggcgccgggcaaaggcctggaatggattggctatattaacccgagccgcggctataccaactataaccagaaagtgaaagatcgctttaccattagcaccgataaaagcaaaagcaccgcgtttctgcagatggatagcctgcgcccggaagataccgcggtgtattattgcgcgcgctattatgatgatcattattgcctggattattggggccagggcaccaccctgaccgtgagcagcggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgatattcagatgacccagagcccgagcagcctgagcgcgagcgtgggcgatcgcgtgaccattacctgcagcgcgagcagcagcgtgagctatatgaactggtatcagcagaccccgggcaaagcgccgaaacgctggatttatgataccagcaaactggcgagcggcgtgccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattatacctttaccattagcagcctgcagccggaagatattgcgacctattattgccagcagtggagcagcaacccgtttacctttggccagggcaccaaactgcagattacccgctgataa (SEQ ID NO: 696)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTI SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYFDVWGKGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSRELPFTFGGGTKVEIKRTESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPGGGGSQVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKGLEWIGYINPSRGYTNYNQKVKDRFTISTDKSKSTAFLQMDSLRP EDTAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLQITR* *(SEQ ID NO: 697)
C2-X4-OKT3
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactgacaagacgcacaccaagccacctaaaccagctccagaactgctcggaggtcctggcaccggaaccggaggacctaccatcaaaccacctaagccacctaagcctgctcctaacctgctcggaggacctggcggtggcggatcccaggtgcagctggtgcagagcggaggcggagtggtgcagcctggaagaagcctgcgcctgagctgcaaagcgagcggctatacctttacccgctataccatgcattgggtgcgccaggcgccgggcaaaggcctggaatggattggctatattaacccgagccgcggctataccaactataaccagaaagtgaaagatcgctttaccattagcaccgataaaagcaaaagcaccgcgtttctgcagatggatagcctgcgcccggaagataccgcggtgtattattgcgcgcgctattatgatgatcattattgcctggattattggggccagggcaccaccctgaccgtgagcagcggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgatattcagatgacccagagcccgagcagcctgagcgcgagcgtgggcgatcgcgtgaccattacctgcagcgcgagcagcagcgtgagctatatgaactggtatcagcagaccccgggcaaagcgccgaaacgctggatttatgataccagcaaactggcgagcggcgtgccgagccgctttagcggcagcggcagcggcaccgattatacctttaccattagcagcctgcagccggaagatattgcgacctattattgccagcagtggagcagcaacccgtttacctttggccagggcaccaaactgcagattacccgctgataa(SEQ ID NO: 698)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTI SSGGTYIYYPDSVKGRFTI SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYFDVWGKGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSRELPFTFGGGTKVEIKRTDKTHTKPPKPAPELLGGPGTGTGGPTIKPPKPPKPAPNLLGGPGGGGSQVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKGLEWIGYINPSRGYTNYNQKVKDRFTISTDKSKSTAFLQMDSLRPEDTAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLQITR* * (SEQ ID NO : 699)
C2-MMP9
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactggcggtggcggatccagcctctggcagcccctggtcctggtgctcctggtgctgggctgctgctttgctgcccccagacagcgccagtccacccttgtgctcttccctggagacctgagaaccaatctcaccgacaggcagctggcagaggaatacctgtaccgctatggttacactcgggtggcagagatgcgtggagagtcgaaatctctggggcctgcgctgctgcttctccagaagcaactgtccctgcccgagaccggtgagctggatagcgccacgctgaaggccatgcgaaccccacggtgcggggtcccagacctgggcagattccaaacctttgagggcgacctcaagtggcaccaccacaacatcacctattggatccaaaactactcggaagacttgccgcgggcggtgattgacgacgcctttgcccgcgccttcgcactgtggagcgcggtgacgccgctcaccttcactcgcgtgtacagccgggacgcagacatcgtcatccagtttggtgtcgcggagcacggagacgggtatcccttcgacgggaaggacgggctcctggcacacgcctttcctcctggccccggcattcagggagacgcccatttcgacgatgacgagttgtggtccctgggcaagggcgtcgtggttccaactcggtttggaaacgcagatggcgcggcctgccacttccccttcatcttcgagggccgctcctactctgcctgcaccaccgacggtcgctccgacggcttgccctggtgcagtaccacggccaactacgacaccgacgaccggtttggcttctgccccagcgagagactctacacccaggacggcaatgctgatgggaaaccctgccagtttccattcatcttccaaggccaatcctactccgcctgcaccacggacggtcgctccgacggctaccgctggtgcgccaccaccgccaactacgaccgggacaagctcttcggcttctgcccgacccgagctgactcgacggtgatggggggcaactcggcgggggagctgtgcgtcttccccttcactttcctgggtaaggagtactcgacctgtaccagcgagggccgcggagatgggcgcctctggtgcgctaccacctcgaactttgacagcgacaagaagtggggcttctgcccggaccaaggatacagtttgttcctcgtggcggcgcatgagttcggccacgcgctgggcttagatcattcctcagtgccggaggcgctcatgtaccctatgtaccgcttcactgaggggccccccttgcataaggacgacgtgaatggcatccggcacctctatggtcctcgccctgaacctgagccacggcctccaaccaccaccacaccgcagcccacggctcccccgacggtctgccccaccggaccccccactgtccacccctcagagcgccccacagctggccccacaggtcccccctcagctggccccacaggtccccccactgctggcccttctacggccactactgtgcctttgagtccggtggacgatgcctgcaacgtgaacatcttcgacgccatcgcggagattgggaaccagctgtatttgttcaaggatgggaagtactggcgattctctgagggcagggggagccggccgcagggccccttccttatcgccgacaagtggcccgcgctgccccgcaagctggactcggtctttgaggagcggctctccaagaagcttttcttcttctctgggcgccaggtgtgggtgtacacaggcgcgtcggtgctgggcccgaggcgtctggacaagctgggcctgggagccgacgtggcccaggtgaccggggccctccggagtggcagggggaagatgctgctgttcagcgggcggcgcctctggaggttcgacgtgaaggcgcagatggtggatccccggagcgccagcgaggtggaccggatgttccccggggtgcctttggacacgcacgacgtcttccagtaccgagagaaagcctatttctgccaggaccgcttctactggcgcgtgagttcccggagtgagttgaaccaggtggaccaagtgggctacgtgacctatgacatcctgcagtgccctgaggacgattacaaggatgacgacgataagtgataa (SEQ
ID NO:700)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTI SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYFDVWGKGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSRELPFTFGGGTKVEIKRTGGGGSSLWQPLVLVLLVLGCCFAAPRQRQSTLVLFPGDLRTNLTDRQLAEEYLYRYGYTRVAEMRGESKSLGPALLLLQKQLSLPETGELDSATLKAMRTPRCGVPDLGRFQTFEGDLKWHHHNITYWIQNYSEDLPRAVIDDAFARAFALWSAVTPLTFTRVYSRDADIVIQFGVAEHGDGYPFDGKDGLLAHAFPPGPGIQGDAHFDDDELWSLGKGVVVPTRFGNADGAACHFPFIFEGRSYSACTTDGRSDGLPWCSTTANYDTDDRFGFCPSERLYTQDGNADGKPCQFPFIFQGQSYSACTTDGRSDGYRWCATTANYDRDKLFGFCPTRADSTVMGGNSAGELCVFPFTFLGKEYSTCTSEGRGDGRLWCATTSNFDSDKKWGFCPDQGYSLFLVAAHEFGHALGLDHSSVPEALMYPMYRFTEGPPLHKDDVNGIRHLYGPRPEPEPRPPTTTTPQPTAPPTVCPTGPPTVHPSERPTAGPTGPPSAGPTGPPTAGPSTATTVPLSPVDDACNVNIFDAIAEIGNQLYLFKDGKYWRFSEGRGSRPQGPFLIADKWPALPRKLDSVFEERLSKKLFFFSGRQVWVYTGASVLGPRRLDKLGLGADVAQVTGALRSGRGKMLLFSGRRLWRFDVKAQMVDPRSASEVDRMFPGVPLDTHDVFQYREKAYFCQDRFYWRVSSRSELNQVDQVGYVTYDILQCPEDDYKDDDDK* * (SEQ ID NO : 701 )
C2-MMP9cat
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactggcggtggcggatccttccaaacctttgagggcgacctcaagtggcaccaccacaacatcacctattggatccaaaactactcggaagacttgccgcgggcggtgattgacgacgcctttgcccgcgccttcgcactgtggagcgcggtgacgccgctcaccttcactcgcgtgtacagccgggacgcagacatcgtcatccagtttggtgtcgcggagcacggagacgggtatcccttcgacgggaaggacgggctcctggcacacgcctttcctcctggccccggcattcagggagacgcccatttcgacgatgacgagttgtggtccctgggcaagggcgtcgtggttccaactcggtttggaaacgcagatggcgcggcctgccacttccccttcatcttcgagggccgctcctactctgcctgcaccaccgacggtcgctccgacggcttgccctggtgcagtaccacggccaactacgacaccgacgaccggtttggcttctgccccagcgagagactctacacccaggacggcaatgctgatgggaaaccctgccagtttccattcatcttccaaggccaatcctactccgcctgcaccacggacggtcgctccgacggctaccgctggtgcgccaccaccgccaactacgaccgggacaagctcttcggcttctgcccgacccgagctgactcgacggtgatggggggcaactcggcgggggagctgtgcgtcttccccttcactttcctgggtaaggagtactcgacctgtaccagcgagggccgcggagatgggcgcctctggtgcgctaccacctcgaactttgacagcgacaagaagtggggcttctgcccggaccaaggatacagtttgttcctcgtggcggcgcatgagttcggccacgcgctgggcttagatcattcctcagtgccggaggcgctcatgtaccctatgtaccgcttcactgaggggccccccttgcataaggacgacgtgaatggcatccggcacctctatggtcctcgccctgaacctgattacaaggatgacgacgataagtgataa (SEQ ID NO: 702)
(amino acids)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTI SRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYFDVWGKGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSRELPFTFGGGTKVEIKRTGGGGSFQTFEGDLKWHHHNITYWIQNYSEDLPRAVIDDAFARAFALWSAVTPLTFTRVYSRDADIVIQFGVAEHGDGYPFDGKDGLLAHAFPPGPGIQGDAHFDDDELWSLGKGVVVPTRFGNADGAACHFPFIFEGRSYSACTTDGRSDGLPWCSTTANYDTDDRFGFCPSERLYTQDGNADGKPCQFPFIFQGQSYSACTTDGRSDGYRWCATTANYDRDKLFGFCPTRADSTVMGGNSAGELCVFPFTFLGKEYSTCTSEGRGDGRLWCATTSNFDSDKKWGFCPDQGYSLFLVAAHEFGHALGLDHSSVPEALMYPMYRFTEGPPLHKDDVNGIRHLYGPRPEPDYKDDDDK* * (SEQ ID NO:703)
Other linkers for BiTES betweentwo scFvs and between C2 and MMP9 include but are not limited to those shown asSEQ ID NOS:705, 707, 709, 711, 713, 715 and 717.
[G4Si]x2 linkersequence:
(DNA)
ggcggtggcggatccggcggtggcggatcc(SEQ ID NO: 704)
(amino acids)
GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 705)
[G4Si]x3 linker sequence:
(DNA)
ggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatcc(SEQ ID NO: 706)
(amino acids)
GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 707)
Long GS linker sequence:
(DNA)
ggcggtggaagcggcggtggcggatccggcagcggcggaagcggcggtggcggatccggcggtgga(SEQ ID NO: 708)
(amino acids)
GGGSGGGGSGSGGSGGGGSGGG (SEQ IDNO: 709)
13 aa GS linker sequence:
(DNA)
ggcggtggatccggcggtggcggatccggcggtggatcc(SEQ ID NO: 710)
(amino acids)
GGGSGGGGSGGGS (SEQ ID NO: 711)
8 aa GS linker sequence:
(DNA)
ggcggttccggcggtggatccgga (SEQ IDNO: 712)
(amino acids)
GGSGGGSG (SEQ ID NO:713)
12 aa GS linker sequence:
(DNA)
ggcggttccggcggtggatccggcggtggcggatccgga(SEQ ID NO: 714)
(amino acids)
GGSGGGSGGGSG (SEQ ID NO: 715)
24 aa GS linker sequence:
(DNA)
ggcggttccggcggtggatccggcggtggcggatccggaggcggttccggcggtggatccggcggtggcggatccgga(SEQ ID NO:716)
(amino acids)
GGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSG (SEQ IDNO: 717)
CAR-T C2 CD8/CD8/4-lBB/CD3z #44
N-CD81s-huMNC2scFv-CD8ecdfragment- CD8 transmembrane- 4-1BB- CD3zeta-C
(DNA)
atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactacaacaacccctgcccccagacctcctaccccagcccctacaattgccagccagcctctgagcctgaggcccgaggcttgtagacctgctgctggcggagccgtgcacaccagaggactggatttcgcctgcgacatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctgataa (SEQ ID NO: 718)
(amino acids)
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIY YPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYFDVWGKGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSRELPFTFGGGTKVEIKRTTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR* * (SEQ ID NO : 719 )
CAR-T IgK C2 CD8/CD8/4-lBB/CD3z#45
N-IgKls-huMNC2scFv-CD8ecdfragment- CD8 transmembrane- 4-1BB- CD3zeta-C
(DNA)
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(amino acids)
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CAR-T C2 op CD8/CD8/4-lBB/CD3z#46
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(DNA)
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(amino acids)
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CAR-T IgK C2 opCD8/CD8/4-lBB/CD3z #47
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(DNA)
atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgaagtgcagctggtggaatctggcggcggactcgtgaagcctggcggctctctgagactgagctgtgccgccagcggcttcacctttagcggctacgccatgagctgggtgcgccaggctcctggcaaaggcctggaatgggtgtccaccatctctagcggcggcacctacatctactaccccgacagcgtgaagggccggttcaccatcagccgggacaacgccaagaacagcctgtacctgcagatgaactccctgcgggccgaggacaccgccgtgtactattgtgctagactgggcggcgacaactactacgagtacttcgacgtgtggggcaagggcaccaccgtgacagtgtctagcggaggcggaggatcaggcggcggaggaagtggcggagggggatctgatatcgtgctgacccagagccctgccagcctggctgtgtctcctggacagagggccaccatcacctgtcgggccagcaagagcgtgtccacctccggctacagctacatgcactggtatcagcagaagcccggccagccccccaagctgctgatctacctggccagcaacctggaaagcggcgtgcccgctagattttccggctctggcagcggcaccgacttcaccctgaccatcaaccccgtggaagccaacgacaccgccaattactactgccagcacagcagagagctgcccttcaccttcggcggaggcaccaaggtggaaatcaagcggaccacaacaacccctgcccccagacctcctaccccagcccctacaattgccagccagcctctgagcctgaggcccgaggcttgtagacctgctgctggcggagccgtgcacaccagaggactggatttcgcctgcgacatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctgataa (SEQ ID NO: 724)
(amino acids)
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CAR-T C2 CD8/CD8/4-lBB/CD3z op#48
N-CD81s-huMNC2scFv -CD8ecdfragment- CD8 transmembrane- 4-1BB- CD3zeta (all domains codon optimized) -C
(DNA)
atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggaagtgcagctggtggaatctggcggcggactcgtgaagcctggcggctctctgagactgagctgtgccgccagcggcttcacctttagcggctacgccatgagctgggtgcgccaggctcctggcaaaggcctggaatgggtgtccaccatctctagcggcggcacctacatctactaccccgacagcgtgaagggccggttcaccatcagccgggacaacgccaagaacagcctgtacctgcagatgaactccctgcgggccgaggacaccgccgtgtactattgtgctagactgggcggcgacaactactacgagtacttcgacgtgtggggcaagggcaccaccgtgacagtgtctagcggaggcggaggatcaggcggcggaggaagtggcggagggggatctgatatcgtgctgacccagagccctgccagcctggctgtgtctcctggacagagggccaccatcacctgtcgggccagcaagagcgtgtccacctccggctacagctacatgcactggtatcagcagaagcccggccagccccccaagctgctgatctacctggccagcaacctggaaagcggcgtgcccgctagattttccggctctggcagcggcaccgacttcaccctgaccatcaaccccgtggaagccaacgacaccgccaattactactgccagcacagcagagagctgcccttcaccttcggcggaggcaccaaggtggaaatcaagcggaccacaacaacccctgcccccagacctcctaccccagcccctacaattgccagccagcctctgagcctgaggcccgaggcttgtagacctgctgctggcggagccgtgcacaccagaggactggatttcgcctgcgacatctacatctgggcccctctggccggcacatgtggcgtgctgctgctgagcctcgtgatcaccctgtactgcaagcggggcagaaagaagctgctgtacatcttcaagcagcccttcatgcggcccgtgcagaccacccaggaagaggacggctgctcctgcagattccccgaggaagaagaaggcggctgcgagctgagagtgaagttcagcagatccgccgacgcccctgcctacaagcagggccagaaccagctgtacaacgagctgaacctgggcagacgggaagagtacgacgtgctggacaagcggagaggcagggaccctgagatgggcggcaagcccagaagaaagaacccccaggaaggcctgtataacgaactgcagaaagacaagatggccgaggcctacagcgagatcggaatgaagggcgagcggagaagaggcaagggccacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccaccaaggacacctatgacgccctgcacatgcaggccctgcctcccagatgataa (SEQ ID NO: 726)
(amino acids)
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CAR-T IgK C2 CD8/CD8/4-lBB/CD3zop #49
N-IgKls-huMNC2scFv -CD8ecdfragment- CD8 transmembrane- 4-1BB- CD3zeta (all domains codon optimized) -C
(DNA)
atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgaagtgcagctggtggaatctggcggcggactcgtgaagcctggcggctctctgagactgagctgtgccgccagcggcttcacctttagcggctacgccatgagctgggtgcgccaggctcctggcaaaggcctggaatgggtgtccaccatctctagcggcggcacctacatctactaccccgacagcgtgaagggccggttcaccatcagccgggacaacgccaagaacagcctgtacctgcagatgaactccctgcgggccgaggacaccgccgtgtactattgtgctagactgggcggcgacaactactacgagtacttcgacgtgtggggcaagggcaccaccgtgacagtgtctagcggaggcggaggatcaggcggcggaggaagtggcggagggggatctgatatcgtgctgacccagagccctgccagcctggctgtgtctcctggacagagggccaccatcacctgtcgggccagcaagagcgtgtccacctccggctacagctacatgcactggtatcagcagaagcccggccagccccccaagctgctgatctacctggccagcaacctggaaagcggcgtgcccgctagattttccggctctggcagcggcaccgacttcaccctgaccatcaaccccgtggaagccaacgacaccgccaattactactgccagcacagcagagagctgcccttcaccttcggcggaggcaccaaggtggaaatcaagcggaccacaacaacccctgcccccagacctcctaccccagcccctacaattgccagccagcctctgagcctgaggcccgaggcttgtagacctgctgctggcggagccgtgcacaccagaggactggatttcgcctgcgacatctacatctgggcccctctggccggcacatgtggcgtgctgctgctgagcctcgtgatcaccctgtactgcaagcggggcagaaagaagctgctgtacatcttcaagcagcccttcatgcggcccgtgcagaccacccaggaagaggacggctgctcctgcagattccccgaggaagaagaaggcggctgcgagctgagagtgaagttcagcagatccgccgacgcccctgcctacaagcagggccagaaccagctgtacaacgagctgaacctgggcagacgggaagagtacgacgtgctggacaagcggagaggcagggaccctgagatgggcggcaagcccagaagaaagaacccccaggaaggcctgtataacgaactgcagaaagacaagatggccgaggcctacagcgagatcggaatgaagggcgagcggagaagaggcaagggccacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccaccaaggacacctatgacgccctgcacatgcaggccctgcctcccagatgataa (SEQ ID NO: 728)
(amino acids)
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CAR-T C2 CD4/CD4/4-lBB/CD3z #50
N-CD81s-huMNC2scFv-CD4ecdfragment- CD4 transmembrane- 4-1BB- CD3zeta-C
(DNA)
atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaacttcgggacaggtcctgctggaatccaacatcaaggttctgcccacatggtccaccccggtgcagccaatggccctgattgtgctggggggcgtcgccggcctcctgcttttcattgggctaggcatcttcttcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctgataa (SEQ ID NO: 730)
(amino acids)
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CAR-T C2 FC/CD8/ 4-lBB/CD3z"Fc" CAR53
N-CD81s-huMNC2scFv-Human IgGlFc- CD8 transmembrane- 4-1BB- CD3zeta-C
(DNA)
atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaaatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctgataa (SEQ ID NO: 732)
(amino acids)
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CAR-T C2 IgD/FC/CD8/4-lBB/CD3z"IgD-Fc" CAR54
N-CD81s-huMNC2scFv- IgD hinge-Human IgGl Fc- CD8 transmembrane- 4-1BB- CD3zeta-C
(DNA)
atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactgagtctccaaaggcacaggcctcctcagtgcccactgcacaaccccaagcagagggcagcctcgccaaggcaaccacagccccagccaccacccgtaacacaggaagaggcggcgaagagaagaaaaaggagaaggagaaagaggaacaagaagagagagagacaaagacaccagagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaaatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctgataa (SEQ ID NO: 734)
(amino acids)
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CAR-T C2 FCHingelessY407R/CD8/4-lBB/CD3z "FcH" CAR55
N-CD81s-huMNC2scFv-Human IgGlhingeless Fc Y407R- CD8 transmembrane- 4-1BB- CD3zeta-C
(DNA)
atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactgcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctcaggagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaaatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctgataa (SEQ ID NO:736)
(amino acids)
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CAR-T C2 IgD/FCHingeless Y407R/CD8/4-lBB/CD3z"IgD FcH" CAR56
N-CD81S- huMNC2scFv- IgD hinge-Human IgGl hingeless Fc Y407R- CD8
transmembrane- 4-1BB- CD3zeta-C
(DNA)
atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactgagtctccaaaggcacaggcctcctcagtgcccactgcacaaccccaagcagagggcagcctcgccaaggcaaccacagccccagccaccacccgtaacacaggaagaggcggcgaagagaagaaaaaggagaaggagaaagaggaacaagaagagagagagacaaagacaccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctcaggagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaaatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctgataa (SEQ ID NO: 738)
(amino acids)
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CAR-T C2 IgD/CD8/4-lBB/CD3z"IgD" CAR57
N-CD81s-huMNC2scFv- IgD hinge-CD8 transmembrane- 4-1BB- CD3zeta-C
(DNA)
atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactgagtctccaaaggcacaggcctcctcagtgcccactgcacaaccccaagcagagggcagcctcgccaaggcaaccacagccccagccaccacccgtaacacaggaagaggcggcgaagagaagaaaaaggagaaggagaaagaggaacaagaagagagagagacaaagacaccaatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctgataa (SEQ ID NO:740)
(amino acids)
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CAR-T C2 X4/CD8/4-lBB/CD3z"X4" CAR58
N-CD81s-huMNC2scFv- X4 linker-CD8 transmembrane- 4-1BB- CD3zeta-C
(DNA)
atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactgacaagacgcacaccaagccacctaaaccagctccagaactgctcggaggtcctggcaccggaaccggaggacctaccatcaaaccacctaagccacctaagcctgctcctaacctgctcggaggacctatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctgataa (SEQ ID NO: 742)
(amino acids)
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CAR-T E6 CD8/CD4/41BB/CD3z CAR37
N-CD81s-huMNE6scFv- CD8ecd- CD4transmembrane- 4-1BB- CD3zeta-C
(DNA)
atggccctgcccgtgaccgctttgctgctccccctggcgctgctgctgcacgccgccaggccagaggtccagctggttgagagtggcggtgggctggttaagcctggcggctccctgcggctgagctgcgccgcgagtggatttactttcagccgatatgggatgagttgggtgcggcaagctcccgggaagaggctggaatgggtctcaacaatctccggggggggcacttacatctattaccccgactcagtcaaggggagatttaccatttcacgagacaacgctaagaataccctgtatttgcagatgaattctctgagagcagaggacacagctgtttactattgtacccgcgacaactatggcaggaactacgactacggtatggactattggggacaagggacattggttacagtgagcagtggcggcgggggcagcggaggaggaggcagcggtggcggaggcagcgagatagtgctcacgcagtcacccgcgactctcagtctctcacctggggaacgagctaccctgacgtgctctgctacctcctcagtgtcatatattcactggtatcagcaacggcccgggcagtcccctagattgctcatttatagtacctctaatctggcctcaggtatccctgcacgattttctggatctggttcaggttctgattacaccctcactatctctagcctggagcctgaagactttgccgtttattactgccagcagaggtctagctccccattcacctttgggagtgggaccaaggttgaaattaaaacgacaaccccggcccccagaccaccaacgccagcccccaccatcgccagccaacccctgtctctgagaccagaagcctgtaggcctgccgccggtggagctgtgcacacaagaggactggatttcgcctgtgatatggccctgattgtgctggggggcgtcgccggcctcctgcttttcattgggctaggcatcttcttcaaaaggggccgcaaaaaactcctttacatttttaagcagccttttatgaggccagtacagacgactcaagaggaagacgggtgctcatgccgctttcctgaggaggaggaaggagggtgcgaactgcgcgttaagttctcccgatcagccgacgcgcctgcttacaagcagggccagaaccaactgtacaacgagctgaatctcggtagacgggaagagtacgacgtgttggacaaacggagaggccgcgacccagaaatgggcggcaagcctcgcaggaaaaacccccaggagggactgtacaatgagttgcagaaagataagatggcagaagcttatagcgagatcggaatgaagggggaaaggagacgagggaaaggacacgacggcctttatcagggcctgtccacagcaacaaaagatacgtatgacgccctccatatgcaggcacttccaccacggtgataa (SEQ ID NO:744)
(amino acids)
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(amino acids)
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CAR-T E6 CD4/CD4/CD28/CD3zsequence CAR25:
N-CD81s-huMNE6scFv- CD4ecd- CD4transmembrane- CD28- CD3zeta-C
(DNA)
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(amino acids)
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CAR-T E6 CD4/CD4/4-lBB/CD3z sequence CAR31:
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(DNA)
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(amino acids)
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CAR-T E6 CD4/CD4/OX40/CD3zsequence:
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(DNA)
atggccctgcccgtgaccgctttgctgctccccctggcgctgctgctgcacgccgccaggccagaggtccagctggttgagagtggcggtgggctggttaagcctggcggctccctgcggctgagctgcgccgcgagtggatttactttcagccgatatgggatgagttgggtgcggcaagctcccgggaagaggctggaatgggtctcaacaatctccggggggggcacttacatctattaccccgactcagtcaaggggagatttaccatttcacgagacaacgctaagaataccctgtatttgcagatgaattctctgagagcagaggacacagctgtttactattgtacccgcgacaactatggcaggaactacgactacggtatggactattggggacaagggacattggttacagtgagcagtggcggcgggggcagcggaggaggaggcagcggtggggggggcagcgagatagtgctcacgcagtcacccgcgactctcagtctctcacctggggaacgagctaccctgacgtgctctgctacctcctcagtgtcatatattcactggtatcagcaacggcccgggcagtcccctagattgctcatttatagtacctctaatctggcctcaggtatccctgcacgattttctggatctggttcaggttctgattacaccctcactatctctagcctggagcctgaagactttgccgtttattactgccagcagaggtctagctccccattcacctttgggagtgggaccaaggttgaaattaaatcgggacaggtcctgctggaatccaacatcaaggttctgcccacatggtccaccccggtgcagccaatggccctgattgtgctggggggcgtcgccggcctcctgcttttcattgggctaggcatcttcttccggagggaccagaggctgccccccgatgcccacaagccccctgggggaggcagtttccggacccccatccaagaggagcaggccgacgcccactccaccctggccaagatccgcgttaagttctcccgatcagccgacgcgcctgcttacaagcagggccagaaccaactgtacaacgagctgaatctcggtagacgggaagagtacgacgtgttggacaaacggagaggccgcgacccagaaatgggcggcaagcctcgcaggaaaaacccccaggagggactgtacaatgagttgcagaaagataagatggcagaagcttatagcgagatcggaatgaagggggaaaggagacgagggaaaggacacgacggcctttatcagggcctgtccacagcaacaaaagatacgtatgacgccctccatatgcaggcacttccaccacggtgataa (SEQ ID NO: 752)
(amino acids)
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CAR-T E6 CD4/CD4/CD28/4-lBB/CD3z sequence CAR38 :
N-CD81s-huMNE6scFv- CD4ecd- CD4transmembrane- CD28- 4-1BB- CD3zeta-C
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(amino acids)
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CAR-T E6 CD4/CD4/CD28/OX40/CD3zsequence:
N-CD81s-huMNE6scFv- CD4ecd- CD4transmembrane- CD28- OX40- CD3zeta-C
(DNA)
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捧慴慣捧慴慣杴慣瑣杧慴捴慡慣慧慡捣条慧慣捡捣捣慣慡瑣瑧杴瑡瑴瑡瑣杣瑣捴慡捡瑴杧条捴杣捧瑧捧瑣捧捧捧瑴瑴慣杧慧瑧杧慧捧杧慣慣慧瑴瑴捡捧杴捡慴捴慡捣捣瑧条慡捧慡捡慧慴慣捧慧瑡慴瑴瑡杴捴慡慣瑴捣杣杧慡瑣捣捣瑴慴杣瑴杣捧杧杧捧捡慡条瑧杣慡瑡慴条条慡捣捴杧慧慣杧捴瑣捧杴慧瑡捣慡慣捴慡杧瑴瑣捧捣捡瑡杧捴慣捣捣杧杴慣捧慣瑡杧捣瑣慧瑴瑧捧杴杧杧捧瑧杣捣杧捣捴瑣捧瑴瑴慣瑴杧捧慴杧慣捴瑴瑣捴杣慧杧慧捣条条捧杴捣捣捣慧杴捣慣慣条捣捣瑣杧杧慧杧慣瑧瑴捣杧捡捣捣瑡捣慡慧杧条慣杧捣慧杣捣慣瑣捣捡捣杴捧慣条瑡捣捧瑧慴条瑴瑣捣杣瑡慣捧杣捡捧捧瑣捧瑴捡慡捧条杧捣条慡捣慡瑣瑧捡慡杣条瑣慧瑡瑣杣瑧条捡杧慧条条慴杣捡瑧瑧杴慧慣慡杣慧慧杧捣捧慧捣慣慧慡杴杧杣捧慡捧瑣杣慣杧慡慡捡捣捣条慧杧慧瑣瑧捡慡杴条瑴捧条慡条瑡慡慧杴捧条慡捧瑴瑡条杣条瑡杣慧瑡慧条杧杧慡条慧慧杣条杧慡条慧慣杣捡杧捣瑴慴捴条杧捣杴捴慣慣捧慡慣慡条瑡捡瑧瑡慧杣捣瑣捣瑡瑡捧条捧捡瑴捣捡慣杣瑧慧慴⁡匨充䤠⁄低›㘷⤴戼㹲⠊浡湩⁯捡摩⥳戼㹲䴊䱁噐䅔䱌偌䅌䱌䡌䅁偒噅䱑䕖䝓䝇噌偋䝇䱓䱒䍓䅁䝓呆卆奇䵁坓剖䅑䝐䝋䕌噗呓卉䝓呇䥙⁙偙卄䭖則呆⁉剓乄䭁华奌兌乍䱓䅒䑅䅔奖䍙剁䝌䑇奎䕙䙙噄䝗䝋呔呖卖䝓䝇升䝇䝇䝓䝇升䥄䱖兔偓十䅌卖䝐剑呁呉剃十卋卖協奇奓䡍套兑偋兇偐䱋䥌䱙十䱎卅噇䅐䙒䝓䝓䝓䑔呆呌义噐䅅䑎䅔奎䍙䡑剓䱅䙐䙔䝇呇噋䥅剋協兇䱖䕌乓䭉䱖呐南偔兖䵐䱁噉䝌噇䝁䱌䙌䝉䝌䙉剆䑒剑偌䑐䡁偋䝐䝇䙓呒⁐光䕅䅑䅄午䱔䭁剉䭖卆卒䑁偁奁克兇兎奌䕎乌䝌剒䕅䑙䱖䭄剒則偄䵅䝇偋剒之児䝅奌䕎兌䑋䵋䕁奁䕓䝉䭍䕇剒䝒䝋䑈䱇兙䱇呓呁䑋奔䅄䡌免䱁偐⩒⨠⠠䕓⁑䑉丠㩏㘷⤵戼㹲㰊牢ਾ䅃ⵒ⁔㉃䌠㑄䌯㑄䌯㉄⼸ⴴ䉬⽂䑃稳敳畱湥散㰺牢ਾⵎ䑃ㄸ⵳畨乍㉃捳癆‭䑃攴摣‭䑃琴慲獮敭扭慲敮‭䑃㠲‭ⴴ䈱ⵂ䌠㍄敺慴䌭戼㹲⠊乄⥁戼㹲愊杴捧瑣杴捣条杴捡杧捣瑣捧杴瑣捧慣瑴杧瑣瑣捴杴瑴捧捡捧杴捣条捧瑣慧条杴慣捧捴瑧条条条杴捧杧杧慧瑣杧杴慡捧捣杧杴慧条捣捴条捡捴条瑴捧捧杣捣捴条瑧瑴慣瑣瑴瑴慣杧瑴捡捧慣杴捴瑣杧瑧慡慧慣杧慣捣杧杧慡条慧瑣杣条杴杧杴捴慴瑣瑡慣捧捴条慧杧慣瑣慴慴慴慴瑴瑡捣杴捡捴杴慴慡条捧杣瑡瑴捡慧瑴捴捴捧慧慣瑡捧慡条慡瑣捣瑣瑣捡瑣捣慡瑡慧捡条捴瑴条杧慣慧条捡捡杴瑣瑧瑡捡慴瑴瑧捧捡捧瑣杣捧杧杣捡慡瑣捡慴杣条慴瑣瑴慧杣杴杴杧杧慡条杧捡慴捣瑧慧慣瑧瑴慣条杣慧杧条瑧杧瑣慣杧杴慧杧杣杧捴条杧杧杧慧杧慡瑧慧慴瑴瑧捧捴捡捡慡捴捣慣捧瑣捣瑣杧瑣瑧瑧瑣捣杣捧慣捡捧捧慴慣瑡慴慣杴捴杧捧瑣捣慡慡捧瑧慧捧捡慣捧杧瑣捡条瑣捡瑡捧捡杴瑧瑡慣捡条慡捡慣杧捡慡捣捣捣慡捡杴瑴慧瑴慴捴捴捧瑴慣慡瑣杴慧瑧捣杧杣杴捣杴杣杣瑣瑴捴条杧条杴杧条杣捧捡条瑡瑴慴杣瑣慧瑣瑡慣捡捣杣慴慧条慣慡杣瑡捡条杣慡瑴瑡慴瑴瑧慣捡瑡捴捣杧慧捡捴捣瑣瑴捡瑧捴杧杣杧杧慣慣慡杧捴慧慡瑴慡慧慧捡瑣杣杧捡条瑧捣杴瑣杧慡捴慣捡瑡慣条瑧捴杴捣慣慣杴瑧捣捡捣杣瑧捧条捣慡杴捧捣杴瑡杴杴瑣杧杧杧杣捴捧杣捧瑣捣杴瑣瑴捴瑡杴杧瑣条捧瑡瑣捴瑴慣慧条慣条杣瑧瑣杣捧捴瑣捧瑡捴杴瑡慴慣杴慡慣杴捡捣慣条慡慧捣条捧捣慣捣条慧慡慣瑴捡慣捧捣慴杣瑣捣捧慣杣杣捡瑴杣瑣捧瑣捡杣瑧捣慡慡杧杧捣捧慡慡慡瑣捣瑴慴慣瑴瑴慴条慣捧瑣瑴慴杴条捧慣瑧捡条捡慧瑣慣条条慧条捡杧瑧捧捴瑡捧杣瑣瑴捣杴条慧杧条慧条慧杧瑧捧慧捡杴杣杣瑴慡瑧捴捴捣慧捴条捣慧杣杣捣杴瑣慴慣条慣杧捧慣慧捡慣捡杴慴慣捡慧捧杴慡捴捴杧慴慧杣杧慡慧瑧捡慧杣杴瑴杧捡慡捡杧条条捧杣杣捡捣条慡瑡杧捧杧慣条捣捴捧条慧慡慡捣捣慣杧条杧捡杴慴慣瑡慧瑧杴慣慧慡慧慴条瑡杧慣慧条瑣慴慴捧慧慧捴杧慡杴慡杧杧慧慡杧条捡慧杧慧慡杧捡捡慧杣捧瑣瑴瑡慣杧捧瑣瑧捣捡条慣捡慡慡慧慴杣慴杴捡捧捣捴慣慴杴慣杧慣瑣捴慣捣捡杧杴瑡慡⠠䕓⁑䑉丠㩏㜠㘶㰩牢ਾ愨業潮愠楣獤㰩牢ਾ䅍偌呖䱁䱌䱐䱁䱌䅈剁䕐兖噌卅䝇䱇䭖䝐升剌卌䅃十䙇䙔䝓䅙卍噗兒偁䭇䱇坅卖䥔卓䝇奔奉夠䑐噓䝋䙒䥔剓乄䭁华奌兌乍䱓䅒䑅䅔奖䍙剁䝌䑇奎䕙䙙噄䝗䝋呔呖卖䝓䝇升䝇䝇䝓䝇升䥄䱖兔偓十䅌卖䝐剑呁呉剃十卋卖協奇奓䡍套兑偋兇偐䱋䥌䱙十䱎卅噇䅐䙒䝓䝓䝓䑔呆呌义噐䅅䑎䅔奎䍙䡑剓䱅䙐䙔䝇呇噋䥅剋協兇䱖䕌乓䭉䱖呐南偔兖䵐䱁噉䝌噇䝁䱌䙌䝉䝌䙉剆䭓卒䱒䡌䑓䵙䵎偔剒䝐呐䭒奈偑䅙偐䑒䅆奁卒剋則䭋䱌䥙䭆偑䵆偒兖呔䕑䑅䍇䍓䙒䕐䕅䝅䍇䱅噒䙋剓䅓䅄䅐䭙䝑乑䱑乙䱅䱎則䕒奅噄䑌剋䝒䑒䕐䝍䭇剐䭒偎䕑䱇乙䱅䭑䭄䅍䅅卙䥅䵇䝋剅剒䭇䡇䝄奌䝑卌䅔䭔呄䑙䱁䵈䅑偌剐‪‪匨充䤠⁄低›㘷⤷戼㹲㰊牢ਾ䅃ⵒ⁔㉃䌠㑄䌯㑄䌯㉄⼸塏〴䌯㍄獺煥敵据㩥戼㹲上䌭㡄猱栭䵵䍎猲䙣⵶䌠㑄捥ⵤ䌠㑄牴湡浳浥牢湡ⵥ䌠㉄ⴸ传㑘ⴰ䌠㍄敺慴䌭戼㹲⠊乄⥁戼㹲愊杴捧瑣杴捣条杴捡杧捣瑣捧杴瑣捧慣瑴杧瑣瑣捴杴瑴捧捡捧杴捣条捧瑣慧条杴慣捧捴瑧条条条杴捧杧杧慧瑣杧杴慡捧捣杧杴慧条捣捴条捡捴条瑴捧捧杣捣捴条瑧瑴慣瑣瑴瑴慣杧瑴捡捧慣杴捴瑣杧瑧慡慧慣杧慣捣杧杧慡条慧瑣杣条杴杧杴捴慴瑣瑡慣捧捴条慧杧慣瑣慴慴慴慴瑴瑡捣杴捡捴杴慴慡条捧杣瑡瑴捡慧瑴捴捴捧慧慣瑡捧慡条慡瑣捣瑣瑣捡瑣捣慡瑡慧捡条捴瑴条杧慣慧条捡捡杴瑣瑧瑡捡慴瑴瑧捧捡捧瑣杣捧杧杣捡慡瑣捡慴杣条慴瑣瑴慧杣杴杴杧杧慡条杧捡慴捣瑧慧慣瑧瑴慣条杣慧杧条瑧杧瑣慣杧杴慧杧杣杧捴条杧杧杧慧杧慡瑧慧慴瑴瑧捧捴捡捡慡捴捣慣捧瑣捣瑣杧瑣瑧瑧瑣捣杣捧慣捡捧捧慴慣瑡慴慣杴捴杧捧瑣捣慡慡捧瑧慧捧捡慣捧杧瑣捡条瑣捡瑡捧捡杴瑧瑡慣捡条慡捡慣杧捡慡捣捣捣慡捡杴瑴慧瑴慴捴捴捧瑴慣慡瑣杴慧瑧捣杧杣杴捣杴杣杣瑣瑴捴条杧条杴杧条杣捧捡条瑡瑴慴杣瑣慧瑣瑡慣捡捣杣慴慧条慣慡杣瑡捡条杣慡瑴瑡慴瑴瑧慣捡瑡捴捣杧慧捡捴捣瑣瑴捡瑧捴杧杣杧杧慣慣慡杧捴慧慡瑴慡慧慧捡瑣杣杧捡条瑧捣杴瑣杧慡捴慣捡瑡慣条瑧捴杴捣慣慣杴瑧捣捡捣杣瑧捧条捣慡杴捧捣杴瑡杴杴瑣杧杧杧杣捴捧杣捧瑣捣杴瑣瑴捴瑡杴杧瑣条捧瑡瑣捴瑴慣慧条慣条杣瑧瑣杣捧捴瑣捧瑡捴杴瑡慴慣杴慡慣杴捡捣慣条慡慧捣条捧捣慣捣条慧慡慣瑴捡慣捧捣慴杣瑣捣捧慣杣杣捡瑴杣瑣捧瑣捡杣瑧捣杣慧杧慧捣条条捧杴捣捣捣慧杴捣慣慣条捣捣瑣杧杧慧杧慣瑧瑴捣杧捡捣捣瑡捣慡慧杧条慣杧捣慧杣捣慣瑣捣捡捣杴捧慣条瑡捣捧瑧慴条瑴瑣捣杣瑡慣捧杣捡捧捧瑣捧瑴捡慡捧条杧捣条慡捣慡瑣瑧捡慡杣条瑣慧瑡瑣杣瑧条捡杧慧条条慴杣捡瑧瑧杴慧慣慡杣慧慧杧捣捧慧捣慣慧慡杴杧杣捧慡捧瑣杣慣杧慡慡捡捣捣条慧杧慧瑣瑧捡慡杴条瑴捧条慡条瑡慡慧杴捧条慡捧瑴瑡条杣条瑡杣慧瑡慧条杧杧慡条慧慧杣条杧慡条慧慣杣捡杧捣瑴慴捴条杧捣杴捴慣慣捧慡慣慡条瑡捡瑧瑡慧杣捣瑣捣瑡瑡捧条捧捡瑴捣捡慣杣瑧慧慴⡡䕓⁑䑉丠㩏㘷⤸戼㹲⠊浡湩⁯捡摩⥳戼㹲䴊䱁噐䅔䱌偌䅌䱌䡌䅁偒噅䱑䕖䝓䝇噌偋䝇䱓䱒䍓䅁䝓呆卆奇䵁坓剖䅑䝐䝋䕌噗呓卉䝓呇䥙⁙偙卄䭖則呆卉䑒䅎之䱓䱙䵑华剌䕁呄噁奙䅃䱒䝇乄奙奅䑆坖䭇呇噔噔卓䝇䝇䝓䝇升䝇䝇䑓噉呌卑䅐䱓噁偓兇䅒䥔䍔䅒䭓噓呓䝓卙䵙坈兙䭑䝐偑䭐䱌奉䅌乓䕌䝓偖剁卆升升呇䙄䱔䥔偎䕖乁呄乁奙元午䕒偌呆䝆䝇䭔䕖䭉呒䝓噑䱌卅䥎噋偌坔呓噐偑䅍䥌䱖䝇䅖䱇䱌䥆䱇䥇䙆卒剋剓䱌午奄乍呍剐偒假剔䡋兙奐偁剐䙄䅁剙剓䑒剑偌䑐䡁偋䝐䝇䙓呒䥐䕑充䑁䡁呓䅌䥋噒䙋剓䅓䅄䅐䭙䝑乑䱑乙䱅䱎則䕒奅噄䑌剋䝒䑒䕐䝍䭇剐䭒偎䕑䱇乙䱅䭑䭄䅍䅅卙䥅䵇䝋剅剒䭇䡇䝄奌䝑卌䅔䭔呄䑙䱁䵈䅑偌剐‪‪匨充䤠⁄低㨠㜠㤶⤠戼㹲㰊牢ਾ䅃ⵒ⁔㙅䤠䑧䘯⽃䑃⼸ⴴ䉬⽂䑃稳戼㹲上䌭㡄猱栭䵵䕎猶䙣⵶䤠䑧栠湩敧䠭浵湡䤠䝧⁬捆‭䑃‸牴湡浳浥牢湡ⵥ㐠ㄭ䉂‭䑃稳瑥ⵡ㱃牢ਾ䐨䅎㰩牢ਾ瑡杧捣瑣捧捣瑧慧捣捧瑴杴瑣捧捴捣捣杴捧捧杴瑣捧杴慣杣捣捧慣杧捣条条瑧捣条瑣杧瑴慧慧瑧杧杣瑧杧捧杴瑧慴条捣杴捧杧瑣捣瑣捧杧瑣慧捧杴杣捣捧慧瑧杧瑡瑴捡瑴捴条捣慧慴杴杧瑡慧瑧杴杧杴杣捧慡捧捴捣杧慧条条捧杴慧瑡杧瑧瑣慣捡慡捴捴杣杧杧杧捧捡瑴捡瑡瑣瑡慴捣捣慧瑣慣瑧慣条杧慧慧瑴慴捣瑡瑴慣杣条捡慡杣瑣慡慧瑡捡捣杴慴瑴杴慣慧杴慡瑴瑣瑣慧慧捧条条慧慣慣捧杴瑴慴瑣瑡杴慴捣杣杣捡慡瑣瑡杧慣杧慡瑣捡慧瑣捡杧慴杴慧瑣瑡杴杧慧慣条杧捡瑡杴瑧慴慣瑧慧捧条杴捧杧杣杧杧慣捧杧条慧杧条捧条杣瑧杧杣慧杧慣捧慧慧慴瑧捧捴捡捧条捴捡捣捧慧瑣瑣慣瑧瑣瑣慣捣杴杧慧捡慧捧慴捣瑣慧杣杴瑣瑣捧慴捣捴瑣慣瑧瑧慣慴慴瑴慣瑣杧慴捴条慣捡杧捣杣杧慣瑧捣捣慴慧瑴捧捴瑡瑴瑡条慴捣捴慴瑡瑣杧捣捴条瑧瑡捣瑣捧捡慧瑴瑴瑣杧瑡瑣杧瑴慣杧瑴瑣慧瑴捡捡捣捴捡慴捴捴慴捧瑣杧条捣杴慡慧瑣瑴捧杣瑴慴瑴捡杴捣条慣慧杧捴慴捧捴捣慣瑴慣捣瑴杴杧条杴杧捡慣条瑧杴慡瑡慴慡慧瑧瑣捣慡条捧捡条捧瑣捣捴条杴捣慣瑣捧捡慡捣捣慡捧条条杧慣捧瑣杣捣慡杧慣捡慣慣捧捣慣捧慣捣捡捣瑧慡慣慣杧慡慧杧杣捧慧条条慡慧慡慡杧条慡杧条慡条条慧捡慡慧条条条条条捡慡条捡捡慣慧捧捣慡瑡瑣杴杴捡慡慡瑣慣慣慣杴捣慣捣瑧捧捣条慣捣杴慡瑣捣杴杧杧慧捣瑧慣瑧瑣捴瑣瑣捴捣捣慣慡捡捣慡杧捡捡捣捴瑡慧捴捴捣杧捡捣瑣慧杧捴捡瑡捧瑧杧杴瑧杧捡瑧慧捧慣杣慡慧捣瑣慧杧捴慡瑧捴慡瑣杧慴杣杴慧杣捧瑧杧条瑧捧瑡慡杴捣慡慧慣慡捧杣杣杧条慧捧条慴慣捡条慣杣慴捣瑧瑧杧捴条杣捴瑣慣捣瑧捣杴慣捣条慧瑣杧瑣慧瑡杧慣条慧瑧捡慡瑧捧慡杧捴捴慣捡慡条捣瑣捣慣捧捣捣瑡杣条慡慡捣瑡瑣捣慡条捣慡条杧慣捧捣杣条慡捣捡条瑧瑧捡捡捣杴捣捣慣捴捣杧慧杧条瑡慧捣慡慧捡慣杧捴条捣杴捡瑣捧瑣杧捴慡条捧瑴瑣瑡捣慣捧慧慣捴捧杣杴慧瑧杧慧慧捧慡杴杧慣捧杣慧慧捡慡瑣捡慡慧捣捡捧瑣捣杣杴瑣杧捡捴杣捡杧瑣捣瑴瑣捴瑣瑣捡条慣条瑣慣捣瑧杧捡慡慧捧条瑧杧慣捧条杧慧捡瑧瑣捴捴瑡捧捴杣杴瑡捧瑡慧杧瑣瑣捧捡慡捣捡慴慣杣慣慧条条捣捴捴捣杴捴捴杣杧慴慡瑡瑣捡瑡瑣杧捧捧捣瑴杧捣杧慧瑣杴杴杧瑧捣瑴瑣捣杴捴捡杴瑧慴捴捡捣瑴慴瑣捧慡捡杧杧慣慧慡慧慡瑣捣杴慴慴慴瑴慣慡慣捡慣瑴慴杴条捡慣瑧捡慡捡慴瑣慣条条慧条瑡杧瑣瑧条瑣捧杣瑡瑴捣条慡慧条慡慧条慧杧瑡瑧慧捡杴条条杴慡瑧捴条慣杧条杣慣慧杣捣捣杣杣慴慣条慣杧捧慣慧捡慣捧捴慴慴捡慧捧捴慡捴慴杧捡慧条条条慧瑧捡慧杴瑴瑴杧捡慡慧慧杣杴捧杣杧捡捣杴条瑡杧杧杧慡条捣慧慧条慧条慡捣瑣慣杧慡杧捣杴慴慣瑡慧捡杴慣慧慡慧慴条瑡杧杣慧杧捣慴慣瑧慧慧瑴杧慧杴慡条捧慧捧捧杣慧杧杧慣条杧捧捡慧杴捧瑣瑴捡慣杧瑧瑣慣瑧捡条捣捡慣条慧慣捣慴杣捡捧捣瑴慣慣杴慣杧捣瑣捧捣捣捴捧杴瑡慡⠠䕓⁑䑉丠㩏㜠〷㰩牢ਾ愨業潮愠楣獤㰩牢ਾ䅍偌呖䱁䱌䱐䱁䱌䅈剁䕐兖噌卅䝇䱇䭖䝐升剌卌䅃十䙇䙔剓䝙卍噗兒偁䭇䱒坅卖䥔䝓䝇奔奉夠䑐噓䝋䙒䥔剓乄䭁呎奌兌乍䱓䅒䑅䅔奖䍙剔乄䝙乒䑙䝙䑍坙兇呇噌噔卓䝇䝇䝓䝇升䝇䝇䕓噉呌卑䅐䱔䱓偓䕇䅒䱔䍔䅓協噓奓䡉套兑偒兇偓䱒䥌卙協䱎十䥇䅐䙒䝓䝓䝓䑓呙呌卉䱓偅䑅䅆奖䍙兑卒卓䙐䙔升呇噋䥅䕋偓䅋䅑卓偖䅔偑䅑䝅䱓䭁呁䅔䅐呔乒䝔䝒䕇䭅䭋䭅䭅䕅䕑剅呅呋䕐䭐䍓䭄䡔䍔偐偃偁䱅䝌假噓䱆偆䭐䭐呄䵌卉呒䕐呖噃噖噄䡓䑅䕐䭖乆套䑖噇噅么䭁䭔剐⁅充乙呓剙噖噓呌䱖先坄乌䭇奅䍋噋乓䅋偌偁䕉呋⁉䭓䭁兇剐偅噑呙偌卐䕒䵅䭔兎卖呌䱃䭖䙇偙䑓䅉䕖䕗乓兇䕐乎䭙呔偐䱖卄䝄䙓䱆卙䱋噔䭄剓兗䝑噎卆千䵖䕈䱁么奈兔卋卌卌䝐䥋䥙䅗䱐䝁䍔噇䱌卌噌呉奌䭃䝒䭒䱋奌䙉克䙐前噐呑兔䕅䝄千剃偆䕅䕅䝇䕃剌䭖卆卒䑁偁奁克兇兎奌䕎乌䝌剒䕅䑙䱖䭄剒則偄䵅䝇偋剒之児䝅奌䕎兌䑋䵋䕁奁䕓䝉䭍䕇剒䝒䝋䑈䱇兙䱇呓呁䑋奔䅄䡌免䱁偐⩒⨠⠠䕓⁑䑉丠㩏㜠ㄷ㰩牢ਾ戼㹲䌊剁吭䔠‶杉⽄䍆楈杮汥獥女〴刷䌯㡄㐯氭䉂䌯㍄㱺牢ਾⵎ䑃ㄸⵓ栠䵵䕎猶䙣⵶䤠䑧栠湩敧䠭浵湡䤠䝧⁬楨杮汥獥⁳捆夠〴刷‭䑃㰸牢ਾ牴湡浳浥牢湡ⵥ㐠ㄭ䉂‭䑃稳瑥ⵡ㱃牢ਾ䐨䅎㰩牢ਾ瑡杧捣瑣捧捣瑧慧捣捧瑴杴瑣捧捴捣捣杴捧捧杴瑣捧杴慣杣捣捧慣杧捣条条瑧捣条瑣杧瑴慧慧瑧杧杣瑧杧捧杴瑧慴条捣杴捧杧瑣捣瑣捧杧瑣慧捧杴杣捣捧慧瑧杧瑡瑴捡瑴捴条捣慧慴杴杧瑡慧瑧杴杧杴杣捧慡捧捴捣杧慧条条捧杴慧瑡杧瑧瑣慣捡慡捴捴杣杧杧杧捧捡瑴捡瑡瑣瑡慴捣捣慧瑣慣瑧慣条杧慧慧瑴慴捣瑡瑴慣杣条捡慡杣瑣慡慧瑡捡捣杴慴瑴杴慣慧杴慡瑴瑣瑣慧慧捧条条慧慣慣捧杴瑴慴瑣瑡杴慴捣杣杣捡慡瑣瑡杧慣杧慡瑣捡慧瑣捡杧慴杴慧瑣瑡杴杧慧慣条杧捡瑡杴瑧慴慣瑧慧捧条杴捧杧杣杧杧慣捧杧条慧杧条捧条杣瑧杧杣慧杧慣捧慧慧慴瑧捧捴捡捧条捴捡捣捧慧瑣瑣慣瑧瑣瑣慣捣杴杧慧捡慧捧慴捣瑣慧杣杴瑣瑣捧慴捣捴瑣慣瑧瑧慣慴慴瑴慣瑣杧慴捴条慣捡杧捣杣杧慣瑧捣捣慴慧瑴捧捴瑡瑴瑡条慴捣捴慴瑡瑣杧捣捴条瑧瑡捣瑣捧捡慧瑴瑴瑣杧瑡瑣杧瑴慣杧瑴瑣慧瑴捡捡捣捴捡慴捴捴慴捧瑣杧条捣杴慡慧瑣瑴捧杣瑴慴瑴捡杴捣条慣慧杧捴慴捧捴捣慣瑴慣捣瑴杴杧条杴杧捡慣条瑧杴慡瑡慴慡慧瑧瑣捣慡条捧捡条捧瑣捣捴条杴捣慣瑣捧捡慡捣捣慡捧条条杧慣捧瑣杣捣慡杧慣捡慣慣捧捣慣捧慣捣捡捣瑧慡慣慣杧慡慧杧杣捧慧条条慡慧慡慡杧条慡杧条慡条条慧捡慡慧条条条条条捡慡条捡捡慣捧捡瑣慧捡捴瑣杧杧杧捡杣捴条捴瑴捣捴瑴捣捣捣慡慡捣慣条慧慣捣瑣慣杴瑡瑣捣杣慧捣捣杴条瑧慣慣杴杣杴瑧杧杴慧杣杴条捣捡慧条捡捣杴条瑧慣条瑴慣捡杴瑧捡瑧杧捡杧杣杴慧杧杴慣慴瑡捧慣条捡慡条捣捧杧慧杧条慣瑧捡慡慣捧捡瑧捡杣杴杴瑧慣捧瑧捣捴捡杣捴瑣捧捡慣杧捡杴捧杴慡杴捧慡杧条慴慣条杴慣条瑧瑣捣慡慣慡捧捣捴捣条捣捣慣捴慧慧慡捡慣捴捴慣慡捧慣慡杧捧条捣捣慧慧捡慣慣杧杴慴慣捣瑣捧捣捣瑡捣杣杧条慧慧杴捡慣条慡捣条瑧慣捧瑣慧捣杴捣杴瑧慣慡杧瑣捴慴捴捣条杣捡瑡杣捣瑧杧条杴杧条条慣瑡杧捧条捣杧条慡慣捡慴慣条捡慣杣捣捴捣瑧捧杴慧瑣捣慧杣捧捴瑣捴瑴捣捴条慧捧慡捧捴捡杣杴慧慣条条慣杧杴捧条慣杧杧慡杣捴瑴瑣慣杴瑣捣瑧慧杴慣杴条捧捴杴慣慣捡慣瑣捡捡捧条慡慧捧瑣瑣捣瑣瑧瑣捣杧瑧慡慡捴慴慣捴杴杧杣捣瑣杴捧杣杧捡瑴瑧杧杧捴瑣捴捴瑣瑧慣瑣杧瑴瑡慣捣瑣瑴捡杴慣慡杣杧捧条慡条慡捡捴瑣瑧瑡瑡瑡捴慡捡慡捣瑡瑴瑡慧慧捣条慴慣慡瑣捡捴慡慧杧慡慧杴捧杴慴捧杴捣慧瑴捴慣慧条慡慧条慡杧条慧杴杴慡瑣慧慧瑧慧条瑴慣捧条慧捧捧条捡捧捣捣捧瑧捡慡捧条杧捣条慡捣条瑣瑣瑡慡杣条瑣慣瑡瑣条慧杣慡慧慧杧条慴杣瑡瑧瑴杴慧慣条条捡瑧杧捣杧慧捣瑣慧慧杴杧杧慧慡捧杣条慡杧慡慧捡捣捴条慧条捧瑣瑧捡慡杴慡瑣捧条慡条瑡慡慧杴捧杧条捧瑣捡条杴条瑡杴杧瑡慧慡杧杣条杣捣杧条杧捧慡杧杧慣杣瑡杧捣瑴慴捣条杧捴捴条慴慣捧慣捣慡杧捡捡瑣捡慧杣捣瑣捴捡瑡捧条捧捣杴捣捣瑣杣瑣慧慴⁡匨充䤠⁄低›㜷⤲戼㹲⠊浡湩⁯捡摩⥳戼㹲䴊䱁噐䅔䱌偌䅌䱌䡌䅁偒噅䱑䕖䝓䝇噌偋䝇䱓䱒䍓䅁䝓呆卆奒䵇坓剖䅑䝐剋䕌噗呓卉䝇呇䥙⁙偙卄䭖則呆⁉剓乄䭁呎奌兌乍䱓䅒䑅䅔奖䍙剔乄䝙乒䑙䝙䑍坙兇呇噌噔卓䝇䝇䝓䝇升䝇䝇䕓噉呌卑䅐䱔䱓偓䕇䅒䱔䍔䅓協噓奓䡉套兑偒兇偓䱒䥌卙協䱎十䥇䅐䙒䝓䝓䝓䑓呙呌卉䱓偅䑅䅆奖䍙兑卒卓䙐䙔升呇噋䥅䕋偓䅋䅑卓偖䅔偑䅑䝅䱓䭁呁䅔䅐呔乒䝔䝒䕇䭅䭋䭅䭅䕅䕑剅呅呋䅐䕐䱌䝇卐䙖䙌偐偋䑋䱔䥍匠呒䕐呖噃噖噄䡓䑅䕐䭖乆套䑖噇噅么䭁䭔剐䕅契华奔噒卖䱖噔䡌䑑䱗䝎䕋䭙䭃卖䭎䱁䅐⁐䕉呋卉䅋䝋偑䕒児奖䱔偐剓䕅呍之噑䱓䍔噌䝋奆卐䥄噁坅卅䝎偑久奎呋偔噐䑌䑓升䙆剌䭓呌䑖卋坒兑乇䙖䍓噓䡍䅅䡌䡎呙䭑䱓䱓偓䭇奉坉偁䅌呇䝃䱖䱌䱓䥖䱔䍙剋則䭋䱌䥙䭆偑䵆偒兖呔䕑䑅䍇䍓䙒䕐䕅䝅䍇䱅噒䙋剓䅓䅄䅐䭙䝑乑䱑乙䱅䱎則䕒奅噄䑌剋䝒䑒䕐䝍䭇剐䭒偎䕑䱇乙䱅䭑䭄䅍䅅卙䥅䵇䝋剅剒䭇䡇䝄奌䝑卌䅔䭔呄䑙䱁䵈䅑偌剐⨪⠠䕓⁑䑉丠㩏㜷⤳戼㹲㰊牢ਾ䙎呁汣㉐愦灭⌻㈸㈱䴻偍㰹牢ਾ䐨䅎㰩牢ਾ慣杧捣杴杧慧慣瑣杣杣捧杧慧条瑡瑴杧条杧慧杧杧条杧杧条杧捧瑧杧杧捧捧杧捣捴捧杴慧瑧捣捣瑣慧捣捣捣慧捣捣杣捣慣捣杧捣杴杧杣捴瑣捣杣杣捧捣瑣捣捴捣瑣捣杣捧捧捣杧杴瑣瑣杧杧杣杣杴捣捡捧瑣杧瑣杣捧捧杣慴杧杧捣捣杣慣杧慴慧慧捣捣杴慧慡杴捧瑣杣捡捧杣慣杧条杣条捧杧捣捡慣捣捣捧慴瑡捣杧捧捡瑧瑣瑣捣条捧杣条捧瑣捧杧杴慧慡条捣杧杧瑴捣瑡瑴瑧捧杴条捴杧杧杣捧杣慡杴慧捧慣杧捣捴杧慧杣杣杧捡杧捡杧捧捴杴捧杣杣慣捣瑴杣杣杧瑣瑣捧条杣捣杣捡杣捣捴捣捣杧慣杧慧杧条捧捧瑴瑧杧杧杧慣捣慣杣杧捧捡条杴瑡捣瑣杧杧瑧瑣捧杧捡瑣捣杴杧捣捣捧条慣慧慣杣条瑴慴捧瑣瑴杧瑧瑴条瑴慴慡捴捡瑡慡杧瑧瑧杣杴慣瑡杣瑡瑴瑡杧瑴捴慴慣慣捣条捡捡瑴慴捡瑣捣慡捣捣捣捣瑡捣慡条捣慡慣条慡慡杴杣瑧捧杣杴瑴杧慣捧杴条瑣捧捧捣慧条条捡捧条杧条捡瑧慡慧慧杧慡条杴杴条杴捧杣杧杧捧瑣捣捣捣瑧慣慧条捴捧捧条捴捧捧捣瑡慡慡杣捣捣瑣捣杧捧杧瑣条杧慣杧杴条杣杣捴捣杣杧捣捴捣慣杣捣杧捣捣杴捣捡条捧杣捴慴杧捴慧捧条瑡瑡瑴捡条慡慴慡慡杴捡慡慴捡捴慧杣捴捣杧慧杣捧慣杣慣瑡瑣瑧慴瑧慡瑴慴捧杧慧杴杧慡瑴捴瑣瑴瑣条杧捣杴捣条杴慡捧捧瑴瑴捣慡瑡瑴捣捡条杣杧杧慡捧瑣捧慧瑴瑴捡瑡慡杴捡瑴慣捧瑡捧杣杧瑣瑴瑣杣捡捡捣瑣捣捣杧捣捣杣捧捣捣捧捣捣杣捣捣瑴瑴捣条慣杧捧杣杧瑣捣瑣捣杧捡捡捣捧瑧杧捡捴条捧瑧捣杣捴杴捧捣瑧捴捧捣捣瑧瑴捣捣杣捣条捣捣条杣捣捣捣杴捣杣捧捣捣杧瑡捴捣杣瑴捣杣捣捣慴杣捣捣慣捴捣瑣捣捣瑧捧捧捣瑣捣捣瑧捧捧捣捣瑣捣捣瑧捧捧捣捣捣捴捣杣杴杣捣捣捣捴捣杣杴杣捣捣捣瑣捣捣杧捧捧捣捣瑣捣捣杧捧捧捣捣捣捴捣杣杴杣捣捣捣捣捴捣杣杴杣捣捣捣瑣捣捣瑧捧捧捧捣杣捣捴瑴捧捧捣瑣捧捣捣条捧慧捧杧瑣捧杣杣捧捧杧杧条杧捧杧捧捧捴杧杣捡捴瑧捣捣杧杧捣捣捧捧杧捧捣杧捧条慣杧杧杣杴瑡瑧慣杣捧条杧条杧杧杣杣杧条捣捧杣杧捣杧杣杧慧杧杣杧杧条瑧瑧瑴捴慣捧瑴慴慡慡杧慣杧条捧条条杣杣捧捣杴杣捴条条杣条捡捴条条捧捴杣慡瑣杣捣杧杣慧瑧杣捣捧捧慣慧捴捣条慣捧条杧杣杣慧条瑣捴捴捴慧慣瑴杣瑴捴慴慧捧慣捣瑡慧捧瑣瑣杧慣捧捣瑣杧捴瑣杧杴瑣捣杴瑧捧杴杧瑣捧杴瑣瑴捧杴捣捣慣慧慣捧捧慣瑧捣捡捣瑴瑧捧捴瑴捣瑣杧条捡瑣慧慧捡慣瑡瑣慣捣慧慣杧慣捧杴捧条条慧瑡捡瑣瑧捡杣瑣瑡杧瑴捡捡捴杧瑧杧慣慧慧杴杣杴慧慧瑧杣慡瑡瑣瑣杧杧捣杴杣瑣捧杴瑣捴捴慣慧条慣捡杴捴捣杴捣杣条捡杣瑧慧捧杴慧慴捧捧慣杣瑣慧条捧慣杴杣慡捣捣捡杧杴杣杧瑧捣慣慧捣杴杧慣慧瑴捣慡捡瑣瑴慧杧捧慧捣捴慡瑧杧慣捣捡慣慣捡瑡慣捣慴瑴杧瑡捣慡慡瑣捡捴杧慡慧瑣杴捣捧杧捧杧杴瑡杴捡慧杣捣瑴杴捣杣杣捣瑴杣慣瑣瑧杧条杣杣瑧慧杣捣捧捴捡瑣捴捡捴捧瑧瑧捡条捣杧慧杣慣慧慣捴瑧慣捴慣瑧瑴杧杴捴捧杧条慣杣慧慧杣杧慴捴捣瑴杣捡杧慧条慧杣杧瑣捣杴捧捡捡捧瑣瑴捣捴瑣杧捣捣杧慣瑴慣杧慧慧杣捣慣瑴捴慧杣瑡慧杣条瑴瑧杧捴捣杴杧慣条杧杣捴瑧杧瑴捣慡瑣杣瑧瑴杧慡捡捧条瑡杧杣杣捧瑣捧慣瑣捴捣瑣捴瑡瑣捴慧杧捧杣瑣捣慴瑣瑣捧瑣捧捡慣捣慧杣瑧杣瑣捣慧杣捧瑴捧捣杴瑧捧条慴捣捡杧捣慡瑣捡慧慣捣慧杣捡杣瑧瑴杧瑣捴杴捣捣条杣条条捡捴慴慣捣慣杧捡杧慣瑡捧杴瑡杧慧慡捣瑣捧慣瑧瑴捣瑡捴瑡瑣捴慣条捧慣瑡捣慴瑣捣捧瑣捧捡慣杣慧杣瑧杣瑣捣慧杣捧慴捣捧杴瑧捧捧慣捣捡杣捣慡瑣捡慧捣杧慧慣条瑣瑣捴杧瑣捴杴捣杣捡捣慧捧杴捡捴慧杣瑧慧杴杧杧捧慡瑣杣捧杧杧慧捧杴杴杣捴瑴捣捣瑴慣瑣瑴捣杴杧慴条慧瑧捡捴慧捣杴慴捣条杣条杧捣捧杧条瑡杧捧捧瑣瑣杧杴杣瑣捡慣捣捴慧捡瑴杴捡条杣捡慡慧条杴杧捧瑴瑣捧捣杧捡慣条慧慴慣瑧瑴瑧捴瑣杣杴捧杧杣慣杴条瑴杣捧慣杣杣瑣杧捧瑴条瑡慣瑴捣捴条杴捣杧条捧捧捴瑡瑧捡捣慴杴慴捣捧瑴慣瑣慧杧杧捣捣捣瑴捧瑡慡杧捡慧杣杴慡杴捧瑡捣杧慣捣捴慴杴瑧捣捴捧捣杴慡捣杴条捣捡杧捣捴慣捡慣捣捡慣慣捣捧条捣慣杣捧捴捣捣慧杣瑧瑣捧捣慣捣杧捡捣捣慣瑣瑧捣捡捣瑣慣慧捧捧捣慣慣捧杴捧捣慣慣杧捴捣捣瑣慣捧杴捧捣慣慣杧捴捣捣慣瑣捧杴捧捣瑴瑣捡杧捣捡慴瑣瑧捧瑣瑴慧瑧捣杧杴慧杣瑡捧瑣捧慡杣杴慡慣捴瑴杣捡捧慣捴捧杧条瑡杴杧慡捣条瑣瑧瑡瑴瑧捴慡杧瑡杧慧条慴瑣杧杣瑡捴捴杴条杧慣杧杧慧捧杣捧杣慣杧捧捣瑣捴瑣慴捴捧杣捡慡瑧杧捣杣杣瑣捧捣杣慣条瑣杧捡捴杧捴瑴杴条慧捧杧瑣瑣捣慡慧条瑣瑴捴瑴瑣捴捴杴杧杣捣条瑧瑧杧瑧瑧捡捡条捧捧瑧杣瑧捧杴杧捣杣条捧瑧瑣杧捡慡捧杴杧捣杴杧条捣慧杣杴捧捣条瑧慧捣杧杧捣瑣捣杧条杴捧条杧杧慡慧杴瑣捧杴瑴慣捧杧捧杧杣捣捴杴慧杧瑴杣捡瑧慧条捧捧条瑡杧杴慧捴捣杣慧捧捧慣捧慧杧杴慧捣杧瑡瑧捴捣杣杧瑧捧瑣瑴杧捡捡捧捡慧杣捴瑴捣条慴捣慧慧慧慡捧瑣瑡瑴瑣捧慣杧捡杣瑣捴慴瑣杧杣杣杴条瑴捣杣慧瑧慧瑧杴慡捣条瑧杧捡慣条杴杧瑣捡瑧慧捣慴杴捡瑡捣杴慣瑧捧捣杴条慧杣瑡慴慣条慧杴捡慧杣瑡慡瑧慧慴⁡匨充䤠⁄低›㜷⤴戼㹲㰊牢ਾ䙎呁汣㉐䴭偍挹瑡戼㹲⠊乄⥁戼㹲挊条捧瑣杧杧捡捡捴捧杧杣杧慡慧瑴杴慧杧杧条杧慧杧杧慧杧杧杣杴杧杧杣杣捧瑣杣瑣杧条捴捣捣杴捡捣捣杣捡捣捣捧捣捡杣捧瑣杧捧瑧捣捴捣捧杧捣捣捴瑣捣捣捴捣杧杣捣杣瑧捧捴杴杧捧捧瑧捧慣杣捣杴捧捴杧杣捣瑧条杧捧捣捣捧条瑧条条捡捣瑣杧慡瑡杧捣捴慧杣捣捧条慧捧慧杧杣捧慣捣捡捣杣瑣慡捴杣杧慣杣捴捴捴慣杧捣慧杧捣杴杣瑧杧慡慡捧杣杧瑧捴慣瑴杴杴瑣慧瑧杣杧捧杧捣慧瑡杧条捣条捧瑣杣杧捡捧杧慧杣慧杣杧瑣瑣杧捣捧捧捡瑣捴捧杧捧捴杴慣捧捧捣慧捣捧瑣捣捣杣捧条杧条慧杧杣瑣杴杴杧杧捧捡捣捡杧杧慣慣瑧慧捴捣杴杧杧捴杴杣慧捣捴瑣杧捧捣杣慣捧条捡捡慧瑧瑴条捣瑴杴杧瑴慴瑧瑴慡瑡慣慣慴条杧杴捴瑧捧慡捴慧瑴慴杴瑧瑴瑣捡捡捡慣慧慣瑣瑴慡捣捴慣捡捣捣捣慣捴慣慡捧慣捡慡慧慡瑡捧杧杴捣瑧瑧杴捧条瑣慧捧杴杣捣杣慡慧慧杣慣杧慧慧杣慴条条条慧慡瑧瑧慧瑧杧捣杧杧杧捣捴捣捣杣捴条慡瑧杣杣慣瑧杣杣捣慣慴慡捡捧捣捣捴杣杧杣捧慴杧捧条瑧慧捧捧瑧捣捣杧捧瑣捣捣捡捧杣捧捣瑣捧慣慣杧捣瑧瑣条瑧杣条慣慧慴瑴慴慣慧瑡慡慡瑡慧慣瑡慡瑣杣捡瑧捣杣杧捡杧捣捡捧慡捴杴瑴条慴瑡瑴条杣杧瑡杧慧瑡瑴捣瑴捴慴杧捧瑣捧慣瑧慧条杣瑣瑴捴慣慡瑴捴慣慣捧杧杧慧条捣杴杣瑡瑴慴慣慴瑡慧瑣捴条慣杴捣杧捧瑴捴捴慧慣捣捣捴捣杣捧捣捣杧捣捣杣捣捣捣捧捣瑣瑴捴慣捧条杧捣杧捧捴捣捴杣慧慣捣杣杣杴慧瑣慣杧杣捴捣瑧瑣杧捣杣瑴杣捣捣杣瑴捴捣捣捧慣捧捣慣捧捧捣捣瑣捧捣杧捣捣杣慧瑴捣捣瑧捴捣捧捣瑣捡捧捣捣瑡捣捣捴捣杣杴杣捣捣捴捣杣杴杣捣捣捣捴捣杣杴杣捣捣捣瑣捣捣瑧捧捧捣捣瑣捣捣瑧捧捧捣捣捣捴捣杣杧杣捣捣捣捴捣杣杧杣捣捣捣瑣捣捣瑧捧捧捣捣捣瑣捣捣瑧捧捧捣捣捣捴捣杣杴杣杣捣捣捧瑣瑣杴杣捣捣杴捣捣慣杧杣条杣捧杴捣捧杧杣杣杧慧杧杧杣杧杣瑣杣捧慧瑣杣捴捣杣杧捧捣杣杣杣杧捣杣杧慣捧条杧捧瑧慧杴捴捡杧慣杧慧杧杧捧捧杧慧捧杣捣杧捧杣捧杧杧条捧杧杧慧杧杴瑴瑴捣条瑣瑴慡慡条捧条慧杧慣慧捧捧杧捣瑣捧瑧慣慧捧慧慧瑣慣慧杧瑣捣慧捡捴捧杣捧杧条捴捧杣杣捣条瑡捣慣捧条慣杧捧捧杧慡捧瑴瑣瑣杣捡瑡捴瑧瑴瑣条条捣捡慣杴条捣捴杴捧条捣捣杴瑧捣杴瑧捧捴瑣杧杴瑣杧捧杴瑣捧瑴杴瑣瑴捣慡捡瑣瑴慧杧捧慧捣捴慡瑧杧慣捣捡慣慣捡瑡慣捣慴瑴杧瑡捣慡慡瑣捡捴杧慡慧瑣杴捣捧杧捧杧杴瑡杴捡慧杣捣瑴杴捣杣杣捣瑴杣慣瑣瑧杧条杣杣瑧慧杣捣捧捴捡瑣捴捡捴捧瑧瑧捡条捣杧慧杣慣慧慣捴瑧慣捴慣瑧瑴杧杴捴捧杧条慣杣慧慧杣杧慴捴捣瑴杣捡杧慧条慧杣杧瑣捣杴捧捡捡捧瑣瑴捣捴瑣杧捣捣杧慣瑴慣杧慧慧杣捣慣瑴捴慧杣瑡慧杣条瑴瑧杧捴捣杴杧慣条杧杣捴瑧杧瑴捣慡瑣杣瑧瑴杧慡捡捧条瑡杧杣杣捧瑣捧慣瑣捴捣瑣捴瑡瑣捴慧杧捧杣瑣捣慴瑣瑣捧瑣捧捡慣捣慧杣瑧杣瑣捣慧杣捧瑴捧捣杴瑧捧条慴捣捡杧捣慡瑣捡慧慣捣慧杣捡杣瑧瑴杧瑣捴杴捣捣条杣条条捡捴慴慣捣慣杧捡杧慣瑡捧杴瑡杧慧慡捣瑣捧慣瑧瑴捣瑡捴瑡瑣捴慣条捧慣瑡捣慴瑣捣捧瑣捧捡慣杣慧杣瑧杣瑣捣慧杣捧慴捣捧杴瑧捧捧慣捣捡杣捣慡瑣捡慧捣杧慧慣条瑣瑣捴杧瑣捴杴捣杣捡捣慧捧杴捡捴慧杣瑧慧杴杧杧捧慡瑣杣捧杧杧慧捧杴杴杣捴瑴捣捣瑴慣瑣瑴捣杴杧慴条慧瑧捡捴慧捣杴慴捣条杣条杧捣捧杧条瑡杧捧捧瑣瑣杧杴杣瑣捡慣捣捴慧捡瑴杴捡条杣捡慡慧条杴杧捧瑴瑣捧捣杧捡慣条慧慴慣瑧瑴瑧捴瑣杣杴捧杧杣慣杴条瑴杣捧慣杣杣瑣杧捧瑴条瑡慣瑴捣捴条杴捣杧条捧捧捴瑡瑧捡捣慴杴慴捣捧瑴慣瑣慧杧杧捣捣捣瑴捧瑡慡杧捡慧杣杴慡杴捧瑡捣杧慣捣捴慴杴瑧捣捴捧捣杴慡捣杴瑡慴慣条慧杴捡慧杣瑡慡瑧慧慴⁡匨充䤠⁄低›㜷⤵戼㹲㰊牢ਾ䙎呁爠獥潰獮⁥汥浥湥⁴㰲牢ਾ䐨䅎㰩牢ਾ慡慧杧慡慡瑴杴瑴捴瑡捡条慡杧杣瑴匨充䤠⁄低›㜷⤶戼㹲㰊牢ਾ䙎呁爠獥潰獮⁥汥浥湥⁴′敲数瑡㱳牢ਾ䐨䅎㰩牢ਾ慡慧杧慡慡瑴杴瑴捴瑡捡条慡杧杣瑴慡慧杧慡慡瑴杴瑴捴瑡捡条慡杧杣瑴慡慧杧慡慡瑴杴瑴捴瑡捡条慡杧杣瑴慡慧杧慡慡瑴杴瑴捴瑡捡条慡杧杣瑴⠠䕓⁑䑉丠㩏㜠㜷㰩牢ਾ戼㹲䌊噍洠湩浩污瀠潲潭整⁲㰲牢ਾ䐨䅎㰩牢ਾ慴杧杣杴慴杣瑧杧慧杧捣慴慴慴条慣慧捧捴瑧瑴条杴慡捣瑧慣慧捴捧瑣杧条捡捧慣捴慣杣瑣瑧瑴杴捡瑣捣瑡条慡慧慣捣杧慧捣慧捴慣捧⠠䕓⁑䑉丠㩏㜠㠷㰩牢ਾ戼㹲上䅆剔㉅䍭噍ⴲ䵍㥐戼㹲⠊乄⥁戼㹲愊条条慧慡瑡瑴瑧瑴慣慴慣慧条捧瑧慴条条慧慡瑡瑴瑧瑴慣慴慣慧条捧瑧慴条条慧慡瑡瑴瑧瑴慣慴慣慧条捧瑧慴条条慧慡瑡瑴瑧瑴慣慴慣慧条捧瑧慴瑣条瑴条捧瑧瑧捡杧杴杧条捧瑣瑡瑡慡捧条条瑣杣瑴慴瑧慧捡杣捴条瑡杣捣杴慧慧杣捣瑡捣捡捧杴瑴瑴慧捣捴慣慴慧条捡捡杣杧捡杣瑡捣条捣捴捴慧慣瑴杣瑴捴慴慧捧慣捣瑡慧捧瑣瑣杧慣捧捣瑣杧捴瑣杧杴瑣捣杴瑧捧杴杧瑣捧杴瑣瑴捧杴捣捣慣慧慣捧捧慣瑧捣捡捣瑴瑧捧捴瑴捣瑣杧条捡瑣慧慧捡慣瑡瑣慣捣慧慣杧慣捧杴捧条条慧瑡捡瑣瑧捡杣瑣瑡杧瑴捡捡捴杧瑧杧慣慧慧杴杣杴慧慧瑧杣慡瑡瑣瑣杧杧捣杴杣瑣捧杴瑣捴捴慣慧条慣捡杴捴捣杴捣杣条捡杣瑧慧捧杴慧慴捧捧慣杣瑣慧条捧慣杴杣慡捣捣捡杧杴杣杧瑧捣慣慧捣杴杧慣慧瑴捣慡捡瑣瑴慧杧捧慧捣捴慡瑧杧慣捣捡慣慣捡瑡慣捣慴瑴杧瑡捣慡慡瑣捡捴杧慡慧瑣杴捣捧杧捧杧杴瑡杴捡慧杣捣瑴杴捣杣杣捣瑴杣慣瑣瑧杧条杣杣瑧慧杣捣捧捴捡瑣捴捡捴捧瑧瑧捡条捣杧慧杣慣慧慣捴瑧慣捴慣瑧瑴杧杴捴捧杧条慣杣慧慧杣杧慴捴捣瑴杣捡杧慧条慧杣杧瑣捣杴捧捡捡捧瑣瑴捣捴瑣杧捣捣杧慣瑴慣杧慧慧杣捣慣瑴捴慧杣瑡慧杣条瑴瑧杧捴捣杴杧慣条杧杣捴瑧杧瑴捣慡瑣杣瑧瑴杧慡捡捧条瑡杧杣杣捧瑣捧慣瑣捴捣瑣捴瑡瑣捴慧杧捧杣瑣捣慴瑣瑣捧瑣捧捡慣捣慧杣瑧杣瑣捣慧杣捧瑴捧捣杴瑧捧条慴捣捡杧捣慡瑣捡慧慣捣慧杣捡杣瑧瑴杧瑣捴杴捣捣条杣条条捡捴慴慣捣慣杧捡杧慣瑡捧杴瑡杧慧慡捣瑣捧慣瑧瑴捣瑡捴瑡瑣捴慣条捧慣瑡捣慴瑣捣捧瑣捧捡慣杣慧杣瑧杣瑣捣慧杣捧慴捣捧杴瑧捧捧慣捣捡杣捣慡瑣捡慧捣杧慧慣条瑣瑣捴杧瑣捴杴捣杣捡捣慧捧杴捡捴慧杣瑧慧杴杧杧捧慡瑣杣捧杧杧慧捧杴杴杣捴瑴捣捣瑴慣瑣瑴捣杴杧慴条慧瑧捡捴慧捣杴慴捣条杣条杧捣捧杧条瑡杧捧捧瑣瑣杧杴杣瑣捡慣捣捴慧捡瑴杴捡条杣捡慡慧条杴杧捧瑴瑣捧捣杧捡慣条慧慴慣瑧瑴瑧捴瑣杣杴捧杧杣慣杴条瑴杣捧慣杣杣瑣杧捧瑴条瑡慣瑴捣捴条杴捣杧条捧捧捴瑡瑧捡捣慴杴慴捣捧瑴慣瑣慧杧杧捣捣捣瑴捧瑡慡杧捡慧杣杴慡杴捧瑡捣杧慣捣捴慴杴瑧捣捴捧捣杴慡捣杴条捣捡杧捣捴慣捡慣捣捡慣慣捣捧条捣慣杣捧捴捣捣慧杣瑧瑣捧捣慣捣杧捡捣捣慣瑣瑧捣捡捣瑣慣慧捧捧捣慣慣捧杴捧捣慣慣杧捴捣捣瑣慣捧杴捧捣慣慣杧捴捣捣慣瑣捧杴捧捣瑴瑣捡杧捣捡慴瑣瑧捧瑣瑴慧瑧捣杧杴慧杣瑡捧瑣捧慡杣杴慡慣捴瑴杣捡捧慣捴捧杧条瑡杴杧慡捣条瑣瑧瑡瑴瑧捴慡杧瑡杧慧条慴瑣杧杣瑡捴捴杴条杧慣杧杧慧捧杣捧杣慣杧捧捣瑣捴瑣慴捴捧杣捡慡瑧杧捣杣杣瑣捧捣杣慣条瑣杧捡捴杧捴瑴杴条慧捧杧瑣瑣捣慡慧条瑣瑴捴瑴瑣捴捴杴杧杣捣条瑧瑧杧瑧瑧捡捡条捧捧瑧杣瑧捧杴杧捣杣条捧瑧瑣杧捡慡捧杴杧捣杴杧条捣慧杣杴捧捣条瑧慧捣杧杧捣瑣捣杧条杴捧条杧杧慡慧杴瑣捧杴瑴慣捧杧捧杧杣捣捴杴慧杧瑴杣捡瑧慧条捧捧条瑡杧杴慧捴捣杣慧捧捧慣捧慧杧杴慧捣杧瑡瑧捴捣杣杧瑧捧瑣瑴杧捡捡捧捡慧杣捴瑴捣条慴捣慧慧慧慡捧瑣瑡瑴瑣捧慣杧捡杣瑣捴慴瑣杧杣杣杴条瑴捣杣慧瑧慧瑧杴慡捣条瑧杧捡慣条杴杧瑣捡瑧慧捣慴杴捡瑡捣杴慣瑧捧捣杴条慧杣瑡慴慣条慧杴捡慧杣瑡慡瑧慧慴⡡䕓⁑䑉丠㩏㜷⤹戼㹲㰊牢ਾ䙎呁䕒洲䵃㉖䴭偍挹瑡戼㹲⠊乄⥁戼㹲愊条条慧慡瑡瑴瑧瑴慣慴慣慧条捧瑧慴条条慧慡瑡瑴瑧瑴慣慴慣慧条捧瑧慴条条慧慡瑡瑴瑧瑴慣慴慣慧条捧瑧慴条条慧慡瑡瑴瑧瑴慣慴慣慧条捧瑧慴瑣条瑴条捧瑧瑧捡杧杴杧条捧瑣瑡瑡慡捧条条瑣杣瑴慴瑧慧捡杣捴条瑡杣捣杴慧慧杣捣瑡捣捡捧杴瑴瑴慧捣捴慣慴慧条捡捡杣杧捡杣瑡捣条捣捴慧捧捴捴慧慣瑴杣瑴捴慴慧捧慣捣瑡慧捧瑣瑣杧慣捧捣瑣杧捴瑣杧杴瑣捣杴瑧捧杴杧瑣捧杴瑣瑴捧瑴捴慣慡捣瑴杴条杧杣捡瑣慣条杴捧捡慣捣捡慡慣捴捡瑣瑡杴慧捴慣慡捡慴瑣杣慧条捡瑴捧杣杣杧杣瑧慧瑴慧杣捡捧瑣瑴捧捣捧捧瑣捴捧捡杴杴慧捧捧杧杴捡捧杣瑣慣捣瑴慣瑣杣杣杴慴慣捧杣杧捡捧条捡瑡杣捴瑡捣条瑴杴瑧瑧杣杣慧捧捡杧条捡杧瑧瑡捣瑣捴慧杣杧慡杧捡杧捧捴瑣杧慣慣杣捣瑴捴瑣捣杴捧捣杣捧瑡捴条杧条捡捧捣瑡瑴杣捡慧杴捡慧瑧杴杴瑧捣瑣杧捧慡杧捧瑧杣杴瑧捴慣捡捴杧瑴杴慧慡杣慣慧杴捧捧杧捣杴捣捡瑴捣捣瑴慣捴瑴杣条杧捣捧捴瑣捡捴杴捣杴慣捣捡杣捡杧捴捧捴杣捡杧瑣杴捣瑣杧杴慣瑧捡慣杣捧慣捡慴杣捡捡杣捡慧捣杧瑴杴捧瑴瑣捧捣慣捧慧慧慧瑣瑣捡捡捣条慧杣捧慡杴瑣慧杴杧慡捡捣杴捣条瑴捴慣瑴慣捴瑴捣慡杧捣慡捴瑣捡捴杣捣杴慣捣捡杧捡杧捴捧捴杣捡杧瑣捡杣瑣杧杴杣捣捡慣捣捧慣捡慴杣捡杣杧捡慡捧捴瑴杣捧瑴瑣捧捣慧捣杣条瑣慧瑣杣捡杧杴瑡杧杧杧慣捡捴杧杣杧杧条瑣瑧捧瑧瑣捴捣瑣捴捡瑴捴瑣杧瑧慡杧条慴瑣杣捡瑣瑧捡慣捧慧杧捧杣杣慧慧杴杧杣捣捴杴瑧捧捧慴捣捡瑣杣慡瑣瑴慧慣捧慧慣条慡瑧杧杧瑣捴杴捣杣慧捣慡杧瑡捡条瑴杴瑴捣捴瑧杧杣捧捧瑡慧瑧捴杧捣捡捧捧杴杧瑣慴慧捴瑡捴瑣慣瑧捧杣慧杧杣瑣慣杴慴捣瑣瑡瑧捡杣瑣捴捡杴条杧捧捣捣瑣杴慣慴条慧杣捡瑧慧瑡杧慣捴杣捧捡瑣瑣瑡杧捴瑣杣捣瑣慧捡瑣慧瑴捡慡杧瑡慧杣捡慧慴条杴瑡慡⠠䕓⁑䑉丠⁏㜺〸㰩牢ਾ戼㹲上䅆捔⁬牐浯瑯牥映慲浧湥⁴倨⥉戼㹲⠊乄⥁戼㹲愊杧慣杧条慧条条慧慡杧杧杣慣杧捧捧捴杧杧条慣慧捧杣杧杧捣杣杣瑧杧捣捧条条捧杣杧捣杧杧杣慣慧杧捣杧捧慧捧杴捧杣杣瑣瑣杧捧杣捣捧瑣捣杧慡瑣捣瑣捧捧瑣杧杣杣杣捧慣捣瑧杧捴捣杧慣捡杧慣瑴慡捡条条杧慡捡条捡捣杧慧瑴捣瑧慣捣杣杧杣杧杧慧慴条慧杣捧瑴杴条条慣慧慣杧慡慡杧慧捧瑴瑴瑣捧瑡杧杧杴慡慡慡瑴瑡瑴瑡杴慡杧条慧杧条捧杧慣捧杧条慧条杧慧杧杧杣杧条慧杧条慧条条捣杧捣捧捣捣捧捣杣捧捣杣捧捴瑣慣杧条捣慡杧捧条捣捴捧慣杧捴杧捴捣杧捧捴慧杧捡杣杣捧杴杧瑧杣条杧捧捴条捴捴捣捡瑧慧捣杧瑣杧捧捧捧捣杣捣条捡捣杧捣捴杧慧瑴捣瑣捣捴捣杧杣条捴捴杣捣杣捣捣瑧捣杴慧杧杴杧慧慧条慧杧捧杧杧杣杧杧杧捡杧慡捡捴捴捣杣捣慡瑡捣杴捧捣慣杧捣杴杧慧慣瑣杣杣捧杧慧条瑡瑴杧条杧慧杧杧条杧杧条杧捧瑧杧杧捧捧杧捣捴捧杴慧瑧捣捣瑣慧捣捣捣慧捣捣杣捣慣捣杧捣杴杧杣捴瑣捣杣杣捧捣瑣捣捴捣瑣捣杣捧捧捣杧杴瑣瑣杧杧杣杣杴捣捡捧瑣杧瑣杣捧捧杣慴杧杧捣捣杣慣杧慴慧慧捣捣杴慧慡杴捧瑣杣捡捧杣慣杧条杣条捧杧捣捡慣捣捣捧慴瑡捣杧捧捡瑧瑣瑣捣条捧杣条捧瑣捧杧杴慧慡条捣杧杧瑴捣瑡瑴瑧捧杴条捴杧杧杣捧杣慡杴慧捧慣杧捣捴杧慧杣杣杧捡杧捡杧捧捴杴捧杣杣慣捣瑴杣杣杧瑣瑣捧条杣捣杣捡杣捣捴捣捣杧慣杧慧杧条捧捧瑴瑧杧杧杧慣捣慣杣杧捧捡条杴瑡捣瑣杧杧瑧瑣捧杧捡瑣捣杴杧捣捣捧条慣慧慣杣条瑴慴捧瑣瑴杧瑧瑴条瑴慴慡捴捡瑡慡杧瑧瑧杣杴慣瑡杣瑡瑴瑡杧瑴捴慴慣慣捣条捡捡瑴慴捡瑣捣慡捣捣捣捣瑡捣慡捧慣捡慡慧慡瑡捧杧杴捣瑧瑧杴捧条瑣慧捧杴杣捣杣慡慧慧杣慣杧慧慧杣慴条条条慧慡瑧瑧慧瑧杧捣杧杧杧捣捴捣捣杣捴条慡瑧杣杣慣瑧杣杣捣慣慴慡捡捧捣捣捴杣杧杣捧慴杧捧条瑧慧捧捧瑧捣捣杧捧瑣捣捣捡捧杣捧捣瑣捧慣慣慧捧杣捴慴杧捴慧捧条瑡瑡瑴捡条慡慴慡慡杴捡慡慴捡捴慧杣捴捣杧慧杣捧慣杣慣瑡瑣瑧慴瑧慡瑴慴捧杧慧杴杧慡瑴捴瑣瑴瑣条杧捣杴捣条杴慡捧捧瑴瑴捣慡瑡瑴捣捡条杣杧杧慡捧瑣捧慧瑴瑴捡瑡慡杴捡瑴慣捧瑡捧杣杧瑣瑴瑣杣捡捡捣瑣捣捣杧捣捣杣捧捣捣捧捣捣杣捣捣瑴瑴捣条慣杧捧杣杧瑣捣瑣捣杧捡捡捣捧瑧杧捡捴条捧瑧捣杣捴杴捧捣瑧捴捧捣捣瑧瑴捣捣杣捣条捣捣条杣捣捣捣杴捣杣捧捣捣杧瑡捴捣杣瑴捣杣捣捣慴杣捣捣慣捴捣瑣捣捣瑧捧捧捣瑣捣捣瑧捧捧捣捣瑣捣捣瑧捧捧捣捣捣捴捣杣杴杣捣捣捣捴捣杣杴杣捣捣捣瑣捣捣杧捧捧捣捣瑣捣捣杧捧捧捣捣捣捴捣杣杴杣捣捣捣捣捴捣杣杴杣捣捣捣瑣捣捣瑧捧捧捧捣杣捣捴瑴捧捧捣瑣捧捣捣条捧慧捧杧瑣捧杣杣捧捧杧杧条杧捧杧捧捧捴杧杣捡捴瑧捣捣杧杧捣捣捧捧杧捧捣杧捧条慣杧杧杣杴瑡瑧慣杣捧条杧条杧杧杣杣杧条捣捧杣杧捣杧杣杧慧杧杣杧杧条瑧瑧瑴捴慣捧瑴慴慡慡杧慣杧条捧条条杣杣捧捣杴杣捴条条杣条捡捴条条捧捴杣慡瑣杣捣杧杣慧瑧杣捣捧捧慣慧捴捣条慣捧条杧杣杣⡧䕓⁑䑉丠㩏㠷⤱戼㹲㰊牢ਾ䙎呁汣倠潲潭整⁲牦条敭瑮戼㹲⠊乄⥁戼㹲愊杧慣杧条慧条条慧慡杧杧杣慣杧捧捧捴杧杧条慣慧捧杣杧杧捣杣杣瑧杧捣捧条条捧杣杧捣杧杧杣慣慧杧捣杧捧慧捧杴捧杣杣瑣瑣杧捧杣捣捧瑣捣杧慡瑣捣瑣捧捧瑣杧杣杣杣捧慣捣瑧杧捴捣杧慣捡杧慣瑴慡捡条条杧慡捡条捡捣杧慧瑴捣瑧慣捣杣杧杣杧杧慧慴条慧杣捧瑴杴条条慣慧慣杧慡慡杧慧捧瑴瑴瑣捧瑡杧杧杴慡慡慡瑴瑡瑴瑡杴慡杧条慧杧条捧杧慣捧杧条慧条杧慧杧杧杣杧条慧杧条慧条条捣杧捣捧捣捣捧捣杣捧捣杣捧捴瑣慣杧条捣慡杧捧条捣捴捧慣杧捴杧捴捣杧捧捴慧杧捡杣杣捧杴杧瑧杣条杧捧捴条捴捴捣捡瑧慧捣杧瑣杧捧捧捧捣杣捣条捡捣杧捣捴杧慧瑴捣瑣捣捴捣杧杣条捴捴杣捣杣捣捣瑧捣杴慧杧杴杧慧慧条慧杧捧杧杧杣杧杧杧捡杧慡捡捴捴捣杣捣慡瑡捣杴捧捣慣杧捣杴杧慧慣瑣杣杣捧杧慧条瑡瑴杧条杧慧杧杧条杧杧条杧捧瑧杧杧捧捧杧捣捴捧杴慧瑧捣捣瑣慧捣捣捣慧捣捣杣捣慣捣杧捣杴杧杣捴瑣捣杣杣捧捣瑣捣捴捣瑣捣杣捧捧捣杧杴瑣瑣杧杧杣杣杴捣捡捧瑣杧瑣杣捧捧杣慴杧杧捣捣杣慣杧慴慧慧捣捣杴慧慡杴捧瑣杣捡捧杣慣杧条杣条捧杧捣捡慣捣捣捧慴瑡捣杧捧捡瑧瑣瑣捣条捧杣条捧瑣捧杧杴慧慡条捣杧杧瑴捣瑡瑴瑧捧杴条捴杧杧杣捧杣慡杴慧捧慣杧捣捴杧慧杣杣杧捡杧捡杧捧捴杴捧杣杣慣捣瑴杣杣杧瑣瑣捧条杣捣杣捡杣捣捴捣捣杧慣杧慧杧条捧捧瑴瑧杧杧杧慣捣慣杣杧捧捡条杴瑡捣瑣杧杧瑧瑣捧杧捡瑣捣杴杧捣捣捧条慣慧慣杣条瑴慴捧瑣瑴杧瑧瑴条瑴慴慡捴捡瑡慡杧瑧瑧杣杴慣瑡杣瑡瑴瑡杧瑴捴慴慣慣捣条捡捡瑴慴捡瑣捣慡捣捣捣捣瑡捣慡捧慣捡慡慧慡瑡捧杧杴捣瑧瑧杴捧条瑣慧捧杴杣捣杣慡慧慧杣慣杧慧慧杣慴条条条慧慡瑧瑧慧瑧杧捣杧杧杧捣捴捣捣杣捴条慡瑧杣杣慣瑧杣杣捣慣慴慡捡捧捣捣捴杣杧杣捧慴杧捧条瑧慧捧捧瑧捣捣杧捧瑣捣捣捡捧杣捧捣瑣捧慣慣慧捧杣捴慴杧捴慧捧条瑡瑡瑴捡条慡慴慡慡杴捡慡慴捡捴慧杣捴捣杧慧杣捧慣杣慣瑡瑣瑧慴瑧慡瑴慴捧杧慧杴杧慡瑴捴瑣瑴瑣条杧捣杴捣条杴慡捧捧瑴瑴捣慡瑡瑴捣捡条杣杧杧慡捧瑣捧慧瑴瑴捡瑡慡杴捡瑴慣捧瑡捧杣杧瑣瑴瑣杣捡捡捣瑣捣捣杧捣捣杣捧捣捣捧捣捣杣捣捣瑴瑴捣条慣杧捧杣杧瑣捣瑣捣杧捡捡捣捧瑧杧捡捴条捧瑧捣杣捴杴捧捣瑧捴捧捣捣瑧瑴捣捣杣捣条捣捣条杣捣捣捣杴捣杣捧捣捣杧瑡捴捣杣瑴捣杣捣捣慴杣捣捣慣捴捣瑣捣捣瑧捧捧捣瑣捣捣瑧捧捧捣捣瑣捣捣瑧捧捧捣捣捣捴捣杣杴杣捣捣捣捴捣杣杴杣捣捣捣瑣捣捣杧捧捧捣捣瑣捣捣杧捧捧捣捣捣捴捣杣杴杣捣捣捣捣捴捣杣杴杣捣捣捣瑣捣捣瑧捧捧捧捣杣捣捴瑴捧捧捣瑣捧捣捣条捧慧捧杧瑣捧杣杣捧捧杧杧条杧捧杧捧捧捴杧杣捡捴瑧捣捣杧杧捣捣捧捧杧捧捣杧捧条慣杧杧杣杴瑡瑧慣杣捧条杧条杧杧杣杣杧条捣捧杣杧捣杧杣杧慧杧杣杧杧条瑧瑧瑴捴慣捧瑴慴慡慡杧慣杧条捧条条杣杣捧捣杴杣捴条条杣条捡捴条条⁧匨充䤠⁄低›㠷⤲戼㹲㰊牢ਾ䙎呁汣倠潲潭整⁲牦条敭瑮⠠㍐㰩牢ਾ䐨䅎㰩牢ਾ慣杧捣杴杧慧慣瑣杣杣捧杧慧条瑡瑴杧条杧慧杧杧条杧杧条杧捧瑧杧杧捧捧杧捣捴捧杴慧瑧捣捣瑣慧捣捣捣慧捣捣杣捣慣捣杧捣杴杧杣捴瑣捣杣杣捧捣瑣捣捴捣瑣捣杣捧捧捣杧杴瑣瑣杧杧杣杣杴捣捡捧瑣杧瑣杣捧捧杣慴杧杧捣捣杣慣杧慴慧慧捣捣杴慧慡杴捧瑣杣捡捧杣慣杧条杣条捧杧捣捡慣捣捣捧慴瑡捣杧捧捡瑧瑣瑣捣条捧杣条捧瑣捧杧杴慧慡条捣杧杧瑴捣瑡瑴瑧捧杴条捴杧杧杣捧杣慡杴慧捧慣杧捣捴杧慧杣杣杧捡杧捡杧捧捴杴捧杣杣慣捣瑴杣杣杧瑣瑣捧条杣捣杣捡杣捣捴捣捣杧慣杧慧杧条捧捧瑴瑧杧杧杧慣捣慣杣杧捧捡条杴瑡捣瑣杧杧瑧瑣捧杧捡瑣捣杴杧捣捣捧条慣慧慣杣条瑴慴捧瑣瑴杧瑧瑴条瑴慴慡捴捡瑡慡杧瑧瑧杣杴慣瑡杣瑡瑴瑡杧瑴捴慴慣慣捣条捡捡瑴慴捡瑣捣慡捣捣捣捣瑡捣慡条捣慡慣条慡慡杴杣瑧捧杣杴瑴杧慣捧杴条瑣捧捧捣慧条条捡捧条杧条捡瑧慡慧慧杧慡条杴杴条杴捧杣杧杧捧瑣捣捣捣瑧慣慧条捴捧捧条捴捧捧捣瑡慡慡杣捣捣瑣捣杧捧杧瑣条杧慣杧杴条杣杣捴捣杣杧捣捴捣慣杣捣杧捣捣杴捣捡条捧杣捴慴杧捴慧捧条瑡瑡瑴捡条慡慴慡慡杴捡慡慴捡捴慧杣捴捣杧慧杣捧慣杣慣瑡瑣瑧慴瑧慡瑴慴捧杧慧杴杧慡瑴捴瑣瑴瑣条杧捣杴捣条杴慡捧捧瑴瑴捣慡瑡瑴捣捡条杣杧杧慡捧瑣捧慧瑴瑴捡瑡慡杴捡瑴慣捧瑡捧杣杧瑣瑴瑣杣捡捡捣瑣捣捣杧捣捣杣捧捣捣捧捣捣杣捣捣瑴瑴捣条慣杧捧杣杧瑣捣瑣捣杧捡捡捣捧瑧杧捡捴条捧瑧捣杣捴杴捧捣瑧捴捧捣捣瑧瑴捣捣杣捣条捣捣条杣捣捣捣杴捣杣捧捣捣杧瑡捴捣杣瑴捣杣捣捣慴杣捣捣慣捴捣瑣捣捣瑧捧捧捣瑣捣捣瑧捧捧捣捣瑣捣捣瑧捧捧捣捣捣捴捣杣杴杣捣捣捣捴捣杣杴杣捣捣捣瑣捣捣杧捧捧捣捣瑣捣捣杧捧捧捣捣捣捴捣杣杴杣捣捣捣捣捴捣杣杴杣捣捣捣瑣捣捣瑧捧捧捧捣杣捣捴瑴捧捧捣瑣捧捣捣条捧慧捧杧瑣捧杣杣捧捧杧杧条杧捧杧捧捧捴杧杣捡捴瑧捣捣杧杧捣捣捧捧杧捧捣杧捧条慣杧杧杣杴瑡瑧慣杣捧条杧条杧杧杣杣杧条捣捧杣杧捣杧杣杧慧杧杣杧杧条瑧瑧瑴捴慣捧瑴慴慡慡杧慣杧条捧条条杣杣捧捣杴杣捴条条杣条捡捴条条捧捴杣慡瑣杣捣杧杣慧瑧杣捣捧捧慣慧捴捣条慣捧条杧杣杣⁧匨充䤠⁄低›㠷⤳戼㹲㰊牢ਾ买䅆ⵔ䵍㥐慣⵴‱䉧佌䭃猠煥敵据㱥牢ਾ䐨䅎㰩牢ਾ慡慧杧慡慡瑴杴瑴捴瑡捡条慡杧杣瑴捡慴瑧慴杧杣杴慴杣瑧杧慧杧捣慴慴慴条慣慧捧捴瑧瑴条杴慡捣瑧慣慧捴捧瑣杧条捡捧慣捴慣杣瑣瑧瑴杴捡瑣捣瑡条慡慧慣捣杧慧捣慧捴慣捧瑣瑣杣捡瑡捴瑧瑴瑣条条捣捡慣杴条捣捴杴捧条捣捣杴瑧捣杴瑧捧捴瑣杧杴瑣杧捧杴瑣捧瑴杴瑣瑴捣慡捡瑣瑴慧杧捧慧捣捴慡瑧杧慣捣捡慣慣捡瑡慣捣慴瑴杧瑡捣慡慡瑣捡捴杧慡慧瑣杴捣捧杧捧杧杴瑡杴捡慧杣捣瑴杴捣杣杣捣瑴杣慣瑣瑧杧条杣杣瑧慧杣捣捧捴捡瑣捴捡捴捧瑧瑧捡条捣杧慧杣慣慧慣捴瑧慣捴慣瑧瑴杧杴捴捧杧条慣杣慧慧杣杧慴捴捣瑴杣捡杧慧条慧杣杧瑣捣杴捧捡捡捧瑣瑴捣捴瑣杧捣捣杧慣瑴慣杧慧慧杣捣慣瑴捴慧杣瑡慧杣条瑴瑧杧捴捣杴杧慣条杧杣捴瑧杧瑴捣慡瑣杣瑧瑴杧慡捡捧条瑡杧杣杣捧瑣捧慣瑣捴捣瑣捴瑡瑣捴慧杧捧杣瑣捣慴瑣瑣捧瑣捧捡慣捣慧杣瑧杣瑣捣慧杣捧瑴捧捣杴瑧捧条慴捣捡杧捣慡瑣捡慧慣捣慧杣捡杣瑧瑴杧瑣捴杴捣捣条杣条条捡捴慴慣捣慣杧捡杧慣瑡捧杴瑡杧慧慡捣瑣捧慣瑧瑴捣瑡捴瑡瑣捴慣条捧慣瑡捣慴瑣捣捧瑣捧捡慣杣慧杣瑧杣瑣捣慧杣捧慴捣捧杴瑧捧捧慣捣捡杣捣慡瑣捡慧捣杧慧慣条瑣瑣捴杧瑣捴杴捣杣捡捣慧捧杴捡捴⁧匨充䤠⁄低›㠷⤴戼㹲㰊牢ਾ买䅆ⵔ䵍㥐慣ⴠ′䉧佌䭃猠煥敵据㩥戼㹲⠊乄⥁戼㹲琊捴杧瑣捴杴捣杣捡捣慧捧杴捡捴慧杣瑧慧杴杧杧捧慡瑣杣捧杧杧慧捧杴杴杣捴瑴捣捣瑴慣瑣瑴捣杴杧慴条慧瑧捡捴慧捣杴慴捣条杣条杧捣捧杧条瑡杧捧捧瑣瑣杧杴杣瑣捡慣捣捴慧捡瑴杴捡条杣捡慡慧条杴杧捧瑴瑣捧捣杧捡慣条慧慴慣瑧瑴瑧捴瑣杣杴捧杧杣慣杴条瑴杣捧慣杣杣瑣杧捧瑴条瑡慣瑴捣捴条杴捣杧条捧捧捴瑡瑧捡捣慴杴慴捣捧瑴慣瑣慧杧杧捣捣捣瑴捧瑡慡杧捡慧杣杴慡杴捧瑡捣杧慣捣捴慴杴瑧捣捴捧捣杴慡捣杴瑡慴慣条慧杴捡慧杣瑡慡瑧慧慴条瑣条瑣杣捡捴慧慣瑡慣捡瑣瑣杧瑡慴慣慡瑡瑴瑧慧慡慧瑴慧瑣杧慴瑴瑣慴捡慴杴瑴捧捴瑣瑴慴杣瑣瑡瑧杧瑡捡捧杴瑣瑴慡杴捣瑴杴慴捴瑡捧慴瑴捧瑴捣杣慴杴捧瑴捴瑡瑴捴捴瑣捣瑴瑧瑡慡瑡捣杴瑧杴瑣瑧瑣瑣瑴瑡慧杧条瑴瑧杧捣杣瑴瑧慣杧慣捡瑧杧杣杴瑧瑧捧捡杴杴瑴杴瑣慧杣慣捡捣捣捡杴瑧杴杧捧瑡杴捣捡慣捣杴捴条瑣捣瑴捴杣杧捡瑴捴捧瑴捴捣捣捴捣慴瑴捧慣杣捧杧慡瑣慣捴捧杣捣杴捣瑴捧捣捧杴瑣杧捡条杧捧捴杧瑣瑧杴杧慣瑣慧慣瑡捴杣杴瑧瑧杴捴杧杧慡瑡慣捴瑧捣瑴捴瑣杴捧杴瑣杣捣杴杴瑴捧慣捣杴慧瑴瑣捧捧杧慧杣捴瑣捴杴瑣捡瑧捣瑣捴杧捣瑣慣瑡捣条杣慧捣瑴捣瑴捣杣杣捧瑣捧杴捣杧瑣瑣捧杧捣捴瑴捣捧瑡瑣捴捧瑣捴捧捣捴条捡慧瑧杣慧捴捴捣瑴杴杧捣捧瑣捣捣捧瑣杧慡瑴慡瑴杣条瑣杣瑧捡瑣瑴慡慧捣慡杴捡瑴捡慡杧慣捧杴慴⁧匨充䤠⁄低›㠷⤵戼㹲㰊牢ਾ牐浩牥戼㹲⠊乄⥁戼㹲琊条瑡杧慴捣慡慧杧慡慡瑴杴瑴捴瑡捡条匨充䤠⁄低›㠷⤶戼㹲㰊牢ਾ牐浩牥戼㹲⠊乄⥁戼㹲琊条瑡慡捧瑴捧杴慧捴杧捴捣杧杴捴匨充䤠⁄低›㠷⤷戼㹲㰊牢ਾ牐浩牥戼㹲⠊乄⥁戼㹲琊慣慴慣慧条捧瑧慴瑣条瑴条捧瑧瑧捡杧杴⡧䕓⁑䑉丠㩏㜠㠸㰩牢ਾ戼㹲倊楲敭㱲牢ਾ䐨䅎㰩牢ਾ捡条慴捣杧瑡杴捣慡捧瑴瑴瑡慣瑣慴捴瑧杣捴瑡捣瑴⡧䕓⁑䑉丠㩏㜠㤸㰩牢ਾ戼㹲倊楲敭㱲牢ਾ䐨䅎㰩牢ਾ慡瑧杴瑧捡杣瑴捣慡捡瑣瑴慧杧捧慧捣匨充䤠⁄低›㤷⤰戼㹲㰊牢ਾ牐浩牥戼㹲⠊乄⥁戼㹲愊条瑴瑣杣条慣杧瑴慣杧捧慧杧捡慣慴⡧䕓⁑䑉丠㩏㜠ㄹ㰩牢ਾ戼㹲倊楲敭㱲牢ਾ䐨䅎㰩牢ਾ瑡杴捡捴慧捧捴捴慧慣瑴杣瑴捴慴慧捧匨充䤠⁄低›㤷⤲戼㹲㰊牢ਾ牐浩牥戼㹲⠊乄⥁戼㹲愊瑴慧慡捧瑴瑴瑡慣瑣慴捴瑧杣捴瑡捣瑴⡧䕓⁑䑉丠㩏㜠㌹㰩牢ਾ戼㹲倊楲敭㱲牢ਾ䐨䅎㰩牢ਾ慴捧慡慡慴杧瑣瑧捣⁣匨充䤠⁄低㜺㐹㰩牢ਾ戼㹲倊楲敭㱲牢ਾ䐨䅎㰩牢ਾ瑡杴捡捴慧杧瑣杧瑡杣瑧捣杣瑧瑧⡣䕓⁑䑉丠㩏㜠㔹㰩牢ਾ戼㹲倊楲敭㱲牢ਾ䐨䅎㰩牢ਾ慡慧慣捣杧慧捣慧捴慣捧瑣杣条条捡捣慡捧杴捧慴捧慣捣匨充䤠⁄低›㤷⤶戼㹲㰊牢ਾ牐浩牥戼㹲⠊乄⥁戼㹲琊慴捣慡慣瑧捡杣慧瑴捧慣条瑣瑴慴捴捡瑴瑡杣捴瑧慣捴⡣䕓⁑䑉丠㩏㜠㜹㰩牢ਾ戼㹲倊楲敭㱲牢ਾ䐨䅎㰩牢ਾ瑡杴慡条瑣捴捴捴慧慣瑴杣瑴捴慴慧捧匨充䤠⁄低›㤷⤸戼㹲㰊牢ਾ牐浩牥戼㹲⠊乄⥁戼㹲愊瑴慧慧捧捴瑴瑡慣瑣慴捴瑧杣捴瑡⡣䕓⁑䑉丠㩏㜠㤹㰩牢ਾ戼㹲上䅆⁔潭楤⁦‱䉧佌䭃猠煥敵据㩥戼㹲⠊乄⥁戼㹲愊瑴瑣瑧杧瑡慡捣瑧瑡慴捣捧慴捧瑡杧瑡瑣杣杧慧杣捴慴捡慴瑣慡捧慧慧瑧条杧慡瑣捧慣杧慣捴慡瑡慡慡杣慡条捧捴条捴杧慡慧瑣杧捧瑣瑴杣瑴瑴瑡瑣瑧杴瑴杴捴杧杴慡杣瑣瑣捣杴条慴杧捡慡瑡捣捧杣杧条杣慧瑴杴慡杣瑴瑧慧条慣捡杧捣杣慧杧瑧杧杣杧慣杧捡捧捣捧慣慴慡瑣捧慣杧慣捴慡捡慴条慣慧条捧慣捴瑣慧杣慧杴捧瑣瑴瑴捧瑧瑴瑣捡慡捡捴瑴捣杴瑴条瑴条瑴捡瑴慡捧捴杧捧捣慣慡瑴瑡慧瑴瑴瑧捴杴捡杴瑡条杴捡瑣瑧捴瑧杴慣捡慡瑡杴瑡慡捧慡杴瑣瑴瑴慴慴瑡捧慣捡瑴杴慴慣慡慡条慣杧瑣捴捧杴杴捣瑴瑣条瑴捧慣捧慣捴杴瑴瑧瑴捧捣瑣捣捣杣杴捣瑴捣瑴慧捣瑣杧慡杧杴捣捡捴捣捡杴捴瑣瑴捣慴瑡慡慡杴条慧慡瑴捧瑡杣慣瑴瑧瑣慧瑧条瑧瑧慣瑴瑣瑡捴杴杧杧瑧杧杧杴杧捧条慧慣捧慡杧杧慧杧瑡杴杧慡慧慣瑡条慣杧慣杴瑣杧杧瑡捧杧杴杧瑣瑣瑡杧瑴杣慡杧条瑡条慡捣条瑡瑣杴捡慴瑧杧慴捣慧瑡捴慣杧捣杴杧慧慣瑣杣杣捧杧慧⁡匨充䤠⁄低›〸⤰戼㹲㰊牢ਾ䙎呁洠摯晩㈠朠䱂䍏⁋敳畱湥散⁳㰺牢ਾ䐨䅎㰩牢ਾ捡慡杧瑡慧杣捡慧慴条杴瑡慡慧捧捴捧慴捧慧慴捴捧慣捣瑡杧杧瑧慡慡瑧捴瑴瑴杣杣瑣慴捴杴慴捴捧杧瑴捧条慡捧慴慡捣慡慣慧慡瑡慡杴慡慧瑣瑴慡慣瑴瑧杴捣瑧杧慣捴慧捡瑴杣捣捡慡捣慧瑴杴慧杣瑣慧捴捧杧慧慡瑣捧捣杧慣捧慣捣捡杧瑣杣慣慡捧捴杧瑴杴捣杣慧瑣杴慣捣瑧杴杴杧杣杣杧慣条杣慣捴瑧慧捧条杣捴捧瑴捧条慣捣瑧杧捧捧杧捣条慣瑡慴杣杣捡慣杣慧条捣瑧杴瑴慡捣捡捧慧条慴捧捡瑧慣条慡捧杴捣捧杴慧杧杴瑣慣慡慧捧杴慧条捣慡杴捣杣慧慡捧杴捧杴慣捣条杧捧杴捴杴瑡瑣捧瑣瑧捣慣慣捴慡瑧捧捡捧捣慡慧杴慡慧条瑴慣捴捣条慧杣瑣捧慣慣捣慴杣慡杧杣捡慡条条捴杣慣慣杧捧杧慣慴杧杣条捧慧捴瑧杣捡瑡捴瑣慧慧瑴捣杴杧瑴慣条慧瑣杴慧捧捣瑣杧条慣瑧捴瑡杣慣慣杧捴慧捴杴杴杴杴慧瑣捧捡慡瑣杧瑣捧瑣慣慡杧捧瑴捧慣捡瑧捧条杴瑴瑣慧捣杴瑣慣条慡瑧杧瑣捧杣慣捡捧杴杴杣捡瑣瑴捧慣捧慡慧捴慣杧捧慣杧杴慧慣条瑡慣条杧杧捣杧杴瑧慧瑣慡捧杧捣捧捴慧捧瑡捧瑡瑣条慡瑡慡瑴瑣慴瑣瑧⠠䕓䥑⁄低›〸⤱戼㹲㰊牢ਾ牐浩牥戼㹲⠊乄⥁戼㹲愊慣慡瑡捴慡慡瑴瑴瑡杣瑡捡慴瑧杴捧瑣慡瑣杧捣杧慴捣慡⡧䕓⁑䑉丠㩏㠠㈰㰩牢ਾ戼㹲倊楲敭㱲牢ਾ䐨䅎㰩牢ਾ瑡捣慧瑴慴慡瑴杣慡瑴杣瑣条瑣慴捴捡瑴瑡杣捴瑧慣捴⡣䕓⁑䑉丠㩏㠠㌰㰩牢ਾ戼㹲上䅆⁔潣獮湥畳⁳敳畱湥散㨠戼㹲⠊⽁⥔䜠䅇䅁⠠⽁⥎⠠⽁⽔⥃丠⠠䕓䥑⁄低㠺㐰㰩牢ਾ戼㹲䌊牵敲瑮丠䅆⁔䕒⠠潆浲匠獹整䉭潩捳敩据獥⸠吠敨猠煥敵据⁥獩映潲⁭桴⁥潭獵⁥䱉′牰浯瑯牥戼㹲⠊乄⥁戼㹲愊条条慧慡瑡瑴瑧瑴慣慴慣慧条捧瑧⡴䕓⁑䑉丠㩏㠠㔰㰩牢ਾ戼㹲䴊畯敳䤠㉌倠潲潭整⁲栨杩汨杩瑨摥湩朠敲湥琠敨丠䅆⁔䕒甠敳Ɽ栠杩汨杩瑨摥椠⁮敹汬睯椠⁳桴⁥瑳牡⁴潣潤⥮戼㹲⠊乄⥁戼㹲愊捡慴慧慧慣慴慴慡瑡慡慣捣慡慣捴瑣慴慧慴慣捡捣瑴捣杴条慡瑴慴瑴杧捡瑡慣慴瑣瑣瑴瑴慡慡条慣慴瑡慡捡瑡慣条捡捡瑴捡捡慡慡慴杴瑴慡瑡慴慡瑴慴慡捡慡慣捡慧慣慡瑡条慴捣捴慡捧捴慡慣条慣瑴瑴条瑧瑧捣瑴条瑣慴瑣瑡瑴瑣瑣杧瑣慡瑣瑧瑡慧条捣瑡瑣瑡慣捣瑣瑧瑧捧慡瑴条瑣慣瑴瑧瑧条瑡慡慧条瑧慡慡捣瑡瑣杴慡捡条慧慡捣慡慴捴瑣捴瑣瑧瑣慡捴慡慣慡捴慴慡条瑡瑴瑡捴瑴瑴慣捴慴捴捴瑣瑣杴杣瑴杴捴慣捣捡慡慣杧瑣捧瑴捡条瑧捴条慧杴瑧瑴杴捡慡条条慡慣瑴瑴慣杴条瑴捡瑴瑴瑧瑧瑣捣捡捣慣慡慧杧慡慡瑴杴瑴捴瑡捡条慡杧杣瑴慣瑴瑧瑡慧瑡慴慡捡杴捣捡瑣慡瑧瑧杧捧慴捡捣慧捣慡慧杧慧瑴捴捡瑣慡瑡捣瑡捴条捴条杴慴杴杧杧瑴慴慡慧慡瑴捣条条条捴瑡慣慧条条慧慡慡慣慡条瑧慡杴瑣瑴瑣捧慣慣慣杧慴慧瑣瑣瑴慧慡瑡瑡瑧瑧慡慴杴慴慡捡瑡杣杴捡捡捣捣瑡瑡慴瑴瑴捴慣捧瑡慴捡条慴慴慡瑴捧瑣捣慣杴瑣慧条条瑣捧瑣瑡慣捣瑣杴瑣慡捴捡捴瑣慣慣瑧慧捣捴慡瑧捣杴慣杧慣杴慴慣捧瑡捧条瑣杣慣捴瑣瑧瑧慣⁣匨充䤠⁄低›〸⤶戼㹲㰊牢ਾ䙎呁删⁅䘨牯⁭剐浯来⹡吠敨敳畱湥散椠⁳牦浯琠敨栠浵湡⁥䱉′牰浯瑯牥戼㹲⠊乄⥁戼㹲朊慧杧慡慡捡杴瑴捴瑡捡条慡杧杣⡴䕓⁑䑉丠㩏㠠㜰㰩牢ਾ戼㹲倊獯楳汢⁥䙎呁删⁅牦浯䔠ⵔ瀱潲潭整㱲牢ਾ䐨䅎㰩牢ਾ捴慣杧慧慡瑡杣慧瑧条慡慣条条杧瑡⡧䕓⁑䑉丠㩏㠠㠰㰩牢ਾ戼㹲倊獯楳汢⁥䙎呁删⁅牦浯䔠ⵔ瀱潲潭整㱲牢ਾ䐨䅎㰩牢ਾ捡杴瑴杧慡慡杣慴慡慣杣瑴瑡慴慡杣瑧匨充䤠⁄低›〸⤹戼㹲㰊牢ਾ潐獳扩敬丠䅆⁔䕒映潲⁭畨慭⁮䑃夳戼㹲⠊乄⥁戼㹲琊捣瑴慡杣慧慡慡慣慡⁡匨充䤠⁄低㠺〱㰩牢ਾ戼㹲倊獯楳汢⁥䙎呁删⁅牦浯栠浵湡䌠㍄㱙牢ਾ䐨䅎㰩牢ਾ慡条慧慡慡瑧瑡瑡瑧捴⠠䕓⁑䑉丠㩏ㄸ⤱戼㹲㰊牢ਾ潐獳扩敬丠䅆⁔䕒映潲⁭畨慭⁮䱉瀳潲潭整㱲牢ਾ䐨䅎㰩牢ਾ瑡捧慣杴慧慡杧瑧⁧匨充䤠⁄低㠺㈱㰩牢ਾ戼㹲倊獯楳汢⁥䙎呁删⁅牦浯栠浵湡䜠䍐㰶牢ਾ䐨䅎㰩牢ਾ慡杧杧慡瑡瑧杴条捴慴慧⠠䕓⁑䑉低›ㄸ⤳戼㹲㰊牢ਾ潐獳扩敬丠䅆⁔䕒映潲⁭畨慭杮潲瑷⁨潨浲湯ⵥ敲敬獡湩⁧潨浲湯㱥牢ਾ䙎呁汣瀠潲潭整⁲慬杲㱥牢ਾ䐨䅎㰩牢ਾ瑴瑡捧杣捴慴慧杧条捡瑡捡瑴捴慴瑣慣慡捧慴慣慣慣慴慧瑣捡慡杣瑡杧慧慡条捡慧慣慣捣慡慣捧慧瑣捴条慧慡捧杴慧瑧杧瑣捧慴瑡瑧慴慧慣慡瑡条捧瑴瑴慴慡慡条瑧瑴慴瑴慡条条慧瑡瑧瑴杣慴瑡慧慴慡条慣瑣慡捴杴杴条慡条瑡捡慡慣瑡慧慴慡慣慴杣杴慣捧慴瑡慡慧慧捧捴慣慡瑡瑣瑡慧条慣慡慡瑣慣慣慧瑡慧杧杧条慡捧条瑴瑣捡慡慣慧慧瑡杧杧捡瑴杣瑡捡捴慣瑣瑴慣瑡慡杴慧慴慣捡慡捣条捧条瑡慡慣条捧慡慣慧条捧瑣慧捡慡慣瑧瑡慡捡慣瑡慴慧捣慴捣条瑡瑡瑣瑡条瑣条慣慣瑣捣捡捣慡杣捡条慣慧瑡捡捡瑡捴瑴瑣慣条杣慣慣条慴捡瑡捣捴慣杧瑡杧捧慣杴瑴瑣条捧慣捴慡捡慡捡捴条瑧杧瑴杴条捧慣慧杧捣捴捴瑴瑴慡捣捡慣慣瑣条杧捣瑴杣慧杧条捧慡捧条条条瑴瑧慣慡慧杧捣瑣慣杧捡杴杧杴慣瑧杧瑣慣杴捡杴慴瑡捣慣捧捡瑴慴慧条捧杴条捧捡慡杧瑡瑣瑴杴条瑣慣杧条瑴慣条慡瑡慧捧捡瑴瑡捣捡杴杧杣杣瑧杧瑣慣杣捣条慴瑡捣条慣瑣瑴杧慧杧瑣慴杧杣杧杣慧捴慡慧杧捴条慡捧捴慡慧捣条捣杴捡慣捡瑡杧杴慡捡捣杣捴捴慴瑣慡慡瑧捡慡慡瑡慴捧杣杧杣杴瑧杧杣慣慣捣杴慴瑡捣慣捧慴瑣杴杧条捧杴条捧条慧慧瑡慣瑣杴慡捣杣杧条瑧杧条瑧杴慣瑧慧瑧杧条瑡慣慣捣瑡杴慣捣捣条捣杴杧慣捡条条杣条捡捴杣捴捴慡慡慡慡慡慡慡慡慡慡条慡条慡条慡慡条慡慡慡慡条杴条慣杴慴瑴瑴捧慣慧瑧瑣杧条瑡慴慧瑡慴慡瑴条慣慡捣条慡瑴瑡条慡慡条瑣瑡瑴捡瑴瑴慡瑧慡捡条瑣慧慧瑴瑴瑴瑴瑴慴条捴条杴杴慡杴慡捧捴捡条捣瑡杧瑴杧条瑣慧慧慡慧条慧瑴捴捣瑴慴瑧慴杴慣捣杴杴捴条慣捣瑴瑣慧瑣瑴捣瑴瑣慡条捴杴杧瑧瑧捴瑣慧杧瑡捣瑧慡瑧瑴杧杧瑴慣杧瑧瑴瑣捡条慣杴瑣瑧慴瑣杴杴慡捡瑡瑣瑣瑴慡捣瑡瑧捣慣慧瑧杴捣慣杧条瑴慴条捡慣捧瑣慧捧慡慣慴捧慡慧捣捴瑡瑣慣捡慡慣捡慡慡瑡慴慧慡慴慡瑴条捣条瑧瑧杧杴捡瑡瑧捧瑣瑧条捴捣条瑣捡捴条慡杧瑣慧杧慣杴条慧捴捡瑴杧捧捣条慧条瑴杧杧瑣捧条杧条捣瑣瑧捴瑡捧杣瑣捧捡捴慣捧瑣捧慡慧慣慧捧条慡慡慡条慡捴条慧捴瑣杧捧条条杧条慧慧杧杧捡杣杧瑧捣条慣条慣瑣杴杧慧瑴慧瑣慧瑡杧杣瑴杧杧条条瑡慧瑣捣慡条捴瑣杧条杴杧杴条慡杴捡杴杣条杴捧瑴瑴条瑧杧杧条瑧捴瑣捧瑣杧捣捡捴杣杧条杧慧杣杴杧捧杴慡杧瑧瑡慣杧杴捣瑧捧杴条慣瑧瑴杧捣瑴慧捴瑣慡杴捣瑣杧捡捡捡瑧瑣条杧慴杧慡条瑴慧瑣慧捴慣瑴杧杴瑡瑣慧瑧瑴瑴条捡瑡杧杴瑧条捴慣杴条瑧杧瑧瑧捴瑡捧慴条条瑴慴慧慣杧慧慡捣慴杴慡捧捣瑴条慣捡捣捴慣杧慧条杧捧瑧杧瑴慡条条瑡瑧瑴慣慴条慴捡条慣杴瑧瑡条慡捡捴杴慡捣捣慡瑡瑧瑡杧瑧捣捴条慧捡捡捣慣慧瑣瑴条慡杧慡条捴条慡杧杴瑣慧慣杣杧杴慴慴捡慴慡杧慧慡捴瑣捴瑴捴捴条瑣捣慡捣瑡杧瑣瑧慧杧瑴慣瑴慣慣瑣慧瑣慴慡慡慡慡慡捴捴条瑴慴瑣慴慡条慴慡慴捧瑴瑴捴慴慴瑡捴杴瑧瑴捧慴瑡瑴慡捴瑣条捴捴慣慧捣瑣杧瑣慡瑡慡瑡捧捣瑡瑴瑣捣条瑡杧捴捴慡慧瑧瑣瑣杧捡瑡杣杴杧杧捣瑣捴捣杴瑴杧瑴杧慡杧杴捣捴条慧条慡杧杧瑧杧瑡捴杴条瑴慧瑧慣慡捡瑣慣慡慧捣捣杴瑡杧慧慡条瑣瑣慣条杴捡慣捣捧杴杴杧捣条慡杴慣慡捡杴慣杧慡慣慧捡瑡捴捧条慧捡条慡慣慣瑧杣慴瑴慡瑧慧瑴瑴捣杣条慣杧慡瑧杧慣捴杴捧瑣捧杧瑴慣瑧条杧杧条慧慡杧瑧杧捧捧捡瑣捧捣瑣杧瑣杧杣慣捣杴捣条瑧条捣捣捡捧杧慣捣捧瑧瑧捧杣条杣捣捣杴条慧杴慧慡捧捣慣杣杣杧捧条瑧杧慣捣慣捣瑣捣慧条捡杧慧杣杧瑡杧条杣瑴慧捧瑴杣杧捧条瑣捣杧捣杣捧捣捧捧杴慧慧杣捣杣慣捴杴捣条慧杴捧瑧瑣慣慴捧捣杴瑧捧捴捡捡瑡慧杣捣条慧条捣捣条慣捡条杴捡杣捣慣杧瑣瑣条慡慡慴瑴杧捡杧杧杴慧杴慡慣捣慣条杴杣瑣捣条慧慧条杧瑡瑴杧慣捣捣慡杧杧瑣瑴慴慡捡杧慴条瑣捴慴杧杧杴捴瑴杴捣捣慣瑡慡捴慣慴慧慡慣捡条捴瑡瑣慡慡瑡条捴瑴瑧瑴捴杴捴瑣慡捧捴瑣瑴慴捡瑴杴瑴条捴瑡慣捣慡捴瑣慡慡慴慡捡捣瑧瑧慡杣捴捴捣瑣条慴捧杧瑣瑡慡捡慡捡瑣捡慧杧条捧条慧杧慡慧杧慡条杧捧捧条杧杣瑣杣杧慧捧条条捣杧杧捧捣捧杧杴捧杣慣慧杧捣杧捧杣杧捧捧条条捧杣杧杣条瑣杧捣捧捧捴杴杧捣捧杣捣捴杣慧捡捴捣杴杣捣杴捧捧捧杧捣捡杣杴瑧捣杣捧慡杣捧瑡慴慡慣慧杧慧慡慣慧捣杣杧瑡捴杣捴捡捣杧捧杧杧杧瑡慡杧捡杧瑣瑴慧慧捧条捡条慧慡条杧条瑣瑴捴杴慣杴杧瑧慧慡慡瑡慴瑴慴瑴慧条慧杧条慧杧杣捧条杣慧杧慡杧杧条杧捧杧慧杧条慧杧慡慧捧杣捧杣捣捣杣捣捣杧捣捣杧瑣捣捴条慧捧慣条杧慣捧瑣杣捣条瑧杣瑧捣杣杧瑣杣条慧捣捧杧瑣杧杧捴慧杧杧瑣慣瑧瑣捣慣杣杴捡杣捧杴杧杣杣捣捣捧慣慧捣杣捧瑣杣杧瑡捴捣捴瑣捣杣捧慧瑧瑣捣捧捣捧捣杣捴瑣杧条瑧杧杧条慡杧条杧杣杧捧杧杧杧慧杣慧慡瑣瑣捣捣捧慣慡捴瑣杧捣捣条捧瑣杧杧捡捡捴捧杧杣杧慡慧瑴杴慧杧杧条杧慧杧杧慧杧杧杣杴杧杧杣杣捧瑣杣瑣杧条捴捣捣杴捡捣捣杣捡捣捣捧捣捡杣捧瑣杧捧瑧捣捴捣捧杧捣捣捴瑣捣捣捴捣杧杣捣杣瑧捧捴杴杧捧捧瑧捧慣杣捣杴捧捴杧杣捣瑧条杧捧捣捣捧条瑧条条捡捣瑣杧慡瑡杧捣捴慧杣捣捧条慧捧慧杧杣捧慣捣捡捣杣瑣慡捴杣杧慣杣捴捴捴慣杧捣慧杧捣杴杣瑧杧慡慡捧杣杧瑧捴慣瑴杴杴瑣慧瑧杣杧捧杧捣慧瑡杧条捣条捧瑣杣杧捡捧杧慧杣慧杣杧瑣瑣杧捣捧捧捡瑣捴捧杧捧捴杴慣捧捧捣慧捣捧瑣捣捣杣捧条杧条慧杧杣瑣杴杴杧杧捧捡捣捡杧杧慣慣瑧慧捴捣杴杧杧捴杴杣慧捣捴瑣杧捧捣杣慣捧条捡捡慧瑧瑴条捣瑴杴杧瑴慴瑧瑴慡瑡慣慣慴条杧杴捴瑧捧慡捴慧瑴慴杴瑧瑴瑣捡捡捡慣慧慣瑣瑴慡捣捴慣捡捣捣捣慣捴慣慡捧慣捡慡慧慡瑡捧杧杴捣瑧瑧杴捧条瑣慧捧杴杣捣杣慡慧慧杣慣杧慧慧杣慴条条条慧慡瑧瑧慧瑧杧捣杧杧杧捣捴捣捣杣捴条慡瑧杣杣慣瑧杣杣捣慣慴慡捡捧捣捣捴杣杧杣捧慴杧捧条瑧慧捧捧瑧捣捣杧捧瑣捣捣捡捧杣捧捣瑣捧慣慣杧捣瑧瑣条瑧杣条慣慧慴瑴慴慣慧瑡慡慡瑡慧慣瑡慡瑣杣捡瑧捣杣杧捡杧捣捡捧慡捴杴瑴条慴瑡瑴条杣杧瑡杧慧瑡瑴捣瑴捴慴杧捧瑣捧慣瑧慧条杣瑣瑴捴慣慡瑴捴慣慣捧杧杧慧条捣杴杣瑡瑴慴慣慴瑡慧瑣捴条慣杴捣杧捧瑴捴捴慧慣捣捣捴捣杣捧捣捣杧捣捣杣捣捣捣捧捣瑣瑴捴慣捧条杧捣杧捧捴捣捴杣慧慣捣杣杣杴慧瑣慣杧杣捴捣瑧瑣杧捣杣瑴杣捣捣杣瑴捴捣捣捧慣捧捣慣捧捧捣捣瑣捧捣杧捣捣杣慧瑴捣捣瑧捴捣捧捣瑣捡捧捣捣瑡捣捣捴捣杣杴杣捣捣捴捣杣杴杣捣捣捣捴捣杣杴杣捣捣捣瑣捣捣瑧捧捧捣捣瑣捣捣瑧捧捧捣捣捣捴捣杣杧杣捣捣捣捴捣杣杧杣捣捣捣瑣捣捣瑧捧捧捣捣捣瑣捣捣瑧捧捧捣捣捣捴捣杣杴杣杣捣捣捧瑣瑣杴杣捣捣杴捣捣慣杧杣条杣捧杴捣捧杧杣杣杧慧杧杧杣杧杣瑣杣捧慧瑣杣捴捣杣杧捧捣杣杣杣杧捣杣杧慣捧条杧捧瑧慧杴捴捡杧慣杧慧杧杧捧捧杧慧捧杣捣杧捧杣捧杧杧条捧杧杧慧杧杴瑴瑴捣条瑣瑴慡慡条捧条慧杧慣慧捧捧杧捣瑣捧瑧慣慧捧慧慧瑣慣慧杧瑣捣慧捡捴捧杣捧杧条捴捧杣杣捣条瑡捣慣捧条慣杧捧捧杧捧捡杣杧捧捧杧捧条杧瑣杣慧捧慣捣捧捧条瑧捣慴杧捧杣杣捧杣杧捣捣捧慣杣杣杣慣慣杣捣捣捴慧杴⠠䕓⁑䑉丠㩏㠠㔱㰩牢ਾ戼㹲上䅆捔″牰浯瑯牥猠煥敵据㱥牢ਾ䐨䅎㰩牢ਾ捧条捣条捧条杧杴杧杣杣杣慴杧杧捧杧杧捣杧捧捧捧杧慣杧捧捧慧慧捧捧捡捣捧杧杣捧杧杴捧杧杣捡杴杴杧杧杧杣捧杧杧慡慣瑴杧瑣慡捧杣捡条杴慧杧瑣慴杧慣捣杧杴捧杧捧杧瑣捧杧瑴捣杴瑧捧杴瑣杣捧捧捧杧捣条瑣瑴杣慧捡杧慡杣瑣杣捧瑧杣杣杧捣捣捧捣杧慡条瑴杴捣瑧杧条捴捧慧捣捴瑴杧捣杣杣杣捧捣杧慣杴慡捧杧杣瑴慧杧条瑣捧杴捣捧杣瑣杴捣捧杴捣捧杣捣捧杣捣杴条慧杧条瑣捧条慣捣瑣杧捧慣杣捣⁧匨充䤠⁄低›ㄸ⤶戼㹲㰊牢ਾ䙎呁㉣瀠潲潭整⁲敳畱湥散ㄠ戼㹲⠊乄⥁戼㹲挊条条条条捧杴杣瑴慣慧瑣杧杧慣瑣捧慣捴捣瑣捣捧瑡慣戼㹲琊杧杧捴杴杴慧捣慡杧慴捡杴捡捴捴慧捴捣瑴捣条捣瑴瑴捣捧捴捧捴瑣捣杣捧捣瑴捴瑣捧杴瑣捣杣捴捣杧捧条慣瑣瑴慣捧捴捣杧慣慧杧捴杧杴杣杧条捧瑣杧杧捡捣杣瑣杣捣瑣杣捧捧捡条瑧条杣杧捧捣捧杧条杧捧捧捣捧捧捣杣捧慣杧慧条杧捡捡瑴杧慧条捧慧瑣瑴杧捡慡瑣瑴捡捧杧杧捧条杧慡瑧瑧捣慣杧捣杧慧瑴捣瑣条捧慣瑧瑣瑧杣杧条慧瑴瑴捣捴捴慣杣杧捡捡杣杧条杧瑡捴捴捧慴瑣慡捣捧杴捧杴瑴慴捡杣瑴捴条慣瑣杣捧瑴瑴慧慣捧慡⠠䕓⁑䑉丠㩏㠠㜱㰩牢ਾ戼㹲上䅆捔′牰浯瑯牥猠煥敵据⁥㰲牢ਾ䐨䅎㰩牢ਾ慣捴瑡杧杧捴杴杴慧捣慡杧慴捡杴捡捴捴慧捴捣瑴捣条捣瑴瑴捣捧捴捧捴匨充䤠⁄低›ㄸ⤸戼㹲㰊牢ਾ䙎呁汣爠獥潰獮⁥汥浥湥捴湯敳獮獵戼㹲⠊乄⥁戼㹲挊瑡瑴瑴捴慣⁴匨充䤠⁄低›ㄸ⤹戼㹲㰊牢ਾ䙎呁汣爠獥潰獮⁥汥浥湥捴湯敳獮獵戼㹲⠊乄⥁戼㹲琊瑴瑴捣⁡匨充䤠⁄低›㈸⤰戼㹲㰊牢ਾ䙎呁爠獥潰獮⁥汥浥湥獴挠湯慴湩摥楷桴湩琠敨䘠硯㍰攠桮湡散⁲敲楧湯戼㹲⠊乄⥁戼㹲愊瑣杴慡慡杴条瑡慡瑡瑧捴捡瑣瑡瑧杴捧瑴瑣条捴捴瑴瑴瑡杧瑣捴瑡㱴牢ਾ瑴瑴捣瑡瑴捡慴慴慧杧瑴慡慧瑧瑧杧瑧捡杴慧捧慣慧瑣瑧瑣杧慧慣⡡䕓⁑䑉丠㩏㠠ㄲ 戼㹲㰊牢ਾ畭㙅䤠䑧䌯㡄㐯䈱⽂䑃稳戼㹲⠊乄⥁戼㹲愊杴捧捣杴捣杣杴捡杣瑣瑴捧杴瑣捣捣瑣杧杣瑣捧杴瑣捧捡捧杣捣条捧慣慧杧杴慡杧杴瑧杧条捴杴杧杧条捡瑴条杴慡捧瑣杧条杧捴捣杴慡捡捴捴瑣瑧瑧条捴捴杴慧瑴慣瑣瑴慣瑧条瑡瑡杧慣杴捴瑴杧瑧捴捧慣慧瑣捣条捧慡慧杧瑣杧条杴杧捴捧慡捣瑡慴瑧杧杴捧杧慴瑣慴慣捴慴瑣瑡捣条捡条杴杴慡杧杧杣瑡捴捡慣捴捴慣慧慧慣瑡捧慣条慡慣捣瑣瑧捡瑣捧慡瑡慧捧条捴杴慡瑧瑣慧杧捡捡条捣瑡瑧瑡慣瑣瑧捡慡杧慧慴捡慴杣瑧条慧捡慴杣捡慴杣瑧瑡杧捡慴瑣杧杧捴慡杧慡捣捴条捴捡杣捴捴瑣慣杧杣瑧杧杣慧捴杣捧杧杴捧杧瑡捣杧杣瑧杧杣慧捴捣慡瑡杴瑴瑣慣捣慣瑧瑣捣条慣瑡慣杴捴杴慣捴捴慣杧杧条慧杧捴捡捣慴捡瑣捧条杴捣捡瑣慣条杴慴条瑴捡瑡捡捡杴瑧捴慣捧条条捧慣杧慣瑣捴捴捣慡捡捴杴慧瑴慴慴捧捡瑡捣慡捣杴捧瑴瑣杧条捴捣杴瑴杣瑣捴条杴捧条杴慧慴杴杧捡瑣瑣慴瑣瑣瑣慣慣瑡慣捧杣慡杴慧杧瑣慧条瑡捧杴捣捡瑴瑡慴瑣捧慣捧慡条慧瑧条瑴捣捣瑡捴捡瑧捴杧瑣杣杧慧慣慡瑧杴慧慡慴慡条条捴捴慣慡杧慣慣杧捣捴瑣慣瑧捧捣捡杴慣慣捡捣慣条慣慧杧捧条捣捴捧慣条捧慡捣捡条捣捣条捣捡慣捣杣慴捡捡条慧条条捧杧杣慡慧慧条慡慡条慧慧条慧慧慡慧杧慡慣条慡慧慧慧慧慧慣慡慧慣捣慡捴慴慣瑴杴杧捣捣捧捴捧条捧捡瑡瑧杧条杴瑣捣捴瑣瑣捣瑣杧杴瑡慴捣瑣瑧捡杴慣慡条杧捧杣慣慡慡捡捴瑣瑴捡瑡瑴瑴慡捧条捣瑴瑴瑡慧杧捣条慴慣慧杣捡捴慡慧杧慡慧杣杧杴瑣慣杴捣捧瑴捴瑣慧杧条慧杧慡杧条杧杴杣慡瑣捧捧瑧慴条瑴瑣捣杣瑡慣捧杣捡捧捧瑣捧瑴捡慡捧条杧捣条慡捣慡瑣瑧捡慡杣条瑣慧瑡瑣杣瑧条捡杧慧条条慴杣捡瑧瑧杴慧慣慡杣慧慧杧捣捧慧捣慣慧慡杴杧杣捧慡捧瑣杣慣杧慡慡捡捣捣条慧杧慧瑣瑧捡慡杴条瑴捧条慡条瑡慡慧杴捧条慡捧瑴瑡条杣条瑡杣慧瑡慧条杧杧慡条慧慧杣条杧慡条慧慣杣捡杧捣瑴慴捴条杧捣杴捴慣慣捧慡慣慡条瑡捡瑧瑡慧杣捣瑣捣瑡瑡捧条捧捡瑴捣捡慣杣瑧慧慴⁡匨充䤠⁄低›㈸⤲戼㹲⠊浡湩⁯捡摩⥳戼㹲䴊䱁噐䅔䱌偌䅌䱌䡌䅁偒噅噋䕖䝓䑇噌偋䝇䱓䱋䍓噖䝓呆卆奒䵇坓剖呑䝐剋䕌噗呁卉䝇呇䥙⁙偙卄䭖則呆卉䑒䅎之䱔䱙䵑卓䭌䕓呄䵁䡙呃䑒奎則奎奄䵇奄䝗䝑協呖卖䝓䝇升䝇䝇䝓䝇升䥑䱖兔偓䥁卍十䝐䕅呖呌千呁卓卖䥙坈兆剑䝐協䭐坌奉呓乓䅌䝓偖剖卆升奇呇奓䱓䥔剓䕍䕁䅄呁奙元剑卓偓呆䝆䝓䭔䕌䭉卅䭐允十噓呐允児䕁升䅌䅋呔偁呁剔呎則䝇䕅䭋䕋䕋䕋充䕅䕒䭔偔䤠䥙䅗䱐䝁䍔噇䱌卌噌呉奌䭃䝒䭒䱋奌䙉克䙐前噐呑兔䕅䝄千剃偆䕅䕅䝇䕃剌䭖卆卒䑁偁奁克兇兎奌䕎乌䝌剒䕅䑙䱖䭄剒則偄䵅䝇偋剒之児䝅奌䕎兌䑋䵋䕁奁䕓䝉䭍䕇剒䝒䝋䑈䱇兙䱇呓呁䑋奔䅄䡌免䱁偐⩒⨠⠠䕓⁑䑉丠㩏㠠㌲㰩牢ਾ戼㹲洊䍵′杉⽄䑃⼸ㄴ䉂䌯㍄㱺牢ਾ䐨䅎㰩牢ਾ瑡杧捣瑣捧捣瑧慧捣捧瑴杴瑣捧捴捣捣杴捧捧杴瑣捧杴慣杣捣捧慣杧捣条条瑧捣条瑣杧条慧瑧慣杧杧慧杧瑣慴瑧慧条捣杴慧杧瑧捣瑣慧慡瑣瑣捣杴杴慣捧瑣瑣杧瑡捴捡瑴捴条杴捧慴杴捣瑡瑧瑣杴杧瑴杣捣条捡捴杣慧慧条条捧杴慧瑧杧瑧杣慣捡慣瑴条慴瑧杧杴瑧捡瑴瑡瑡瑣捡慴捴慣慧慣瑧瑧慧条杧捧慧瑴慣捣瑡瑣捣条条捡慡杴捣慡慧捡捡捣杴慴捣杴慣慡杴条慣瑧瑣慧杧捴杴条慧慣杣捧慣杴慴瑴捡杴杴慣条捡瑴杧杧杧慧慴瑡慴瑣捡慧瑡捡瑴杣瑡瑧瑣杧杧杣慣杧慧捣捡杧捴捡杣捴捴瑣捣杧杣瑧杧杣慧捴杣捧杧杴捧杧瑡捣杧杣瑧杧杣慧捴杣捡瑡杴杴瑡慣慣慣瑧瑣捡条瑣捴瑣慴杧杴慴捴捴杴杧捧条条杧捣捡慣捴捴瑡捧条杧捣条慣慡条杴捴条慴慣捴杴捧慴慴瑧慴慴杴慣瑣杧慴捣慡慣慧慧捣条慧慣捧慣捣慣慡瑣捣捴瑡瑣瑡瑣杴慣捴慣捡瑣条慡捴杴杧瑧捣瑣捧慣杧瑴慣瑧杧慣瑧杧瑧瑣杧慧慣慧瑣捴捡捣捴慡慣捴慣捴瑣瑧杧条慧杧条慧杴瑣捧慡捣慴瑴捡杴捴条慣慣瑧条杧条瑣捴杣瑴慣杣瑴杣慧杧杧杧捡慣条瑣杧条瑡慡慡慧瑧瑣捣慡条捧捡条捧瑣捣捴条杴捣慣瑣捧捡慡捣捣慡捧条条杧慣捧瑣杣捣慡杧慣捡慣慣捧捣慣捧慣捣捡捣瑧慡慣慣杧慡慧杧杣捧慧条条慡慧慡慡杧条慡杧条慡条条慧捡慡慧条条条条条捡慡条捡捡慣瑡瑣捡瑡瑴杧捧捣杣瑣杣慣杧慣慣杴杴慧瑧捧捴瑣捣捴捴捣杴瑧慧瑴捡捣杴慴瑣捧慡慡杧杧捣捧慡慡慡瑣捣瑴慴慣瑴瑴慴条慣捧瑣瑴慴杴条捧慣瑧捡条捡慧瑣慣条条慧条捡杧瑧捧捴瑡捧杣瑣瑴捣杴条慧杧条慧条慧杧瑧捧慧捡杴杣杣瑴慡瑧捴捴捣慧捴条捣慧杣杣捣杴瑣慴慣条慣杧捧慣慧捡慣捡杴慴慣捡慧捧杴慡捴捴杧慴慧杣杧慡慧瑧捡慧杣杴瑴杧捡慡捡杧条条捧杣杣捡捣条慡瑡杧捧杧慣条捣捴捧条慧慡慡捣捣慣杧条杧捡杴慴慣瑡慧瑧杴慣慧慡慧慴条瑡杧慣慧条瑣慴慴捧慧慧捴杧慡杴慡杧杧慧慡杧条捡慧杧慧慡杧捡捡慧杣捧瑣瑴瑡慣杧捧瑣瑧捣捡条慣捡慡慡慧慴杣慴杴捡捧捣捴慣慴杴慣杧慣瑣捴慣捣捡杧杴瑡慡⠠䕓⁑䑉丠㩏㈸⤴戼㹲⠊浡湩⁯捡摩⥳戼㹲䴊䱁噐䅔䱌偌䅌䱌䡌䅁偒噅䱑䕅䝓䝇噌偋䝇䱓䱋䍓䅁䝓呆卆奇䵁坓剖呑䕐剋䕌噗呁卉䝓呇䥙⁙偙卄䭖則呆卉䑒䅎之䱔䱙䵑卓剌䕓呄䵁奙䅃䱒䝇乄奙奅䑆坖䅇呇噔噔卓䝇䝇䝓䝇升䝇䝇䑓噉呉卑䅔䱓噇䱓兇䅒䥔䍓䅒䭓噓呓䝓卙䵙坈兙剑䝐偑䭐䱌奉䅌乓䕌䝓偖剁卆升升呇䙄䱔䥎偈䕖䔠䑅䅁奔䍙䡑剓䱅䙐䙔䝇呇䱋䥅䕋偓䅋䅑卓偖䅔偑䅑䝅䱓䭁呁䅔䅐呔乒䝔䝒䕇䭅䭋䭅䭅䕅䕑剅呅呋䥐䥙䅗䱐䝁䍔噇䱌卌噌呉奌䭃䝒䭒䱋奌䙉克䙐前噐呑兔䕅䝄千剃偆䕅䕅䝇䕃剌䭖卆卒䑁偁奁克兇兎奌䕎乌䝌剒䕅䑙䱖䭄剒則偄䵅䝇偋剒之児䝅奌䕎兌䑋䵋䕁奁䕓䝉䭍䕇剒䝒䝋䑈䱇兙䱇呓呁䑋奔䅄䡌免䱁偐⩒⨠⠠䕓⁑䑉丠㩏㠠㔲㰩牢ਾ戼㹲洊䕵‶䑃㠲䌯㉄⼸䑃㠲䌯㍄㱺牢ਾ䐨䅎㰩牢ਾ瑡杧捣瑣捧捣瑧慧捣捧瑴杴瑣捧捴捣捣杴捧捧杴瑣捧杴慣杣捣捧慣杧捣条条瑧慧条瑧杧杴慧瑧瑣杧杧慧慧瑣慴瑧慧条捣杴慧杧瑧捣瑣慧慡瑣瑣捣杴杴慴瑧瑣瑣杧瑡捴捡瑴捴条慴慧慴杴捧瑡瑧瑣杴杧瑴杣捣条捡捴慣杧慣条条捧杴慧瑧杧瑧杣慣捡慣瑴条杴瑧杧杣瑧捡瑴捡瑡瑣捡慴捴慣慧慣瑧瑧慧条杧捧慧瑴慣捣瑡瑣捣条条捡慡杴捣慡慧捡捡捣杴慴捣杴慣慡杴条慣瑧瑣慧条捴杴条慧慣慣捧慣杴慴捴捡杴慴慣条杧瑡慡瑣捡杧慴杧慡瑣捡慧瑣捡杧慴杴慧瑣捡杴杧瑧慣条慧捡瑣慣瑧慣捣瑧瑣捣捴条捧杧杴捧杧瑡捣杧杣瑧杧杣慧捴杣捧杧杴捧杧瑡捣慣慡瑴瑧捴捴捡捣条捴捴慣捧慡捴瑡瑧瑣捧瑡瑣捣条杧慧杧条瑧慣捣瑣慡捣杴慣瑧捧慣捣捴慡瑧瑧慡瑧慴慣慴慣瑣杧瑴捣条慣慧杧捣条捧捡瑴瑣捣慣慡瑣瑣杧瑡瑴瑡条慣慣捴慣捡瑣杧瑣捴杴慧瑧捣瑣瑧捴捧瑴慣瑧杧慣瑧杧瑡瑡杧慧捣捴瑴捡捴捴捴捡慡捴条捣慧瑡杧条捧杴慡慧杴瑣捧慣瑣慴瑴捡杴捣条慣慡杧条慴瑧捴捣慣瑴慣杣瑴杣捧捴杧杧捡慡条瑴杧慡瑡慡慡慡捡捡瑣瑴瑧捣慡瑧捣捣慴瑴捴捣杧捡瑣捴慴条捣瑣瑴杴杧杴瑣杧杴瑧杧瑴杧杴慧瑧捣杴捧瑴捧慴慴捧瑴捧慴瑧慡慣瑧杧捣瑴慴瑴瑡瑴捴杴杧杴条慡捧慡捧杧捴捴杧瑣捣杴慣瑴瑣慧瑴捡瑡慧捡瑡慧捣捣慡慧条捡慣杧捣捣捡慣杧慡捡瑡慴捣条捣瑣捡捧捴杣捣捡捧慧瑣捴捧杴捣慴捣杧捴捣捧瑧慴条瑴瑣捣杣瑡慣捧杣捡捧捧瑣捧瑴捡慡捧条杧捣条慡捣慡瑣瑧捡慡杣条瑣慧瑡瑣杣瑧条捡杧慧条条慴杣捡瑧瑧杴慧慣慡杣慧慧杧捣捧慧捣慣慧慡杴杧杣捧慡捧瑣杣慣杧慡慡捡捣捣条慧杧慧瑣瑧捡慡杴条瑴捧条慡条瑡慡慧杴捧条慡捧瑴瑡条杣条瑡杣慧瑡慧条杧杧慡条慧慧杣条杧慡条慧慣杣捡杧捣瑴慴捴条杧捣杴捴慣慣捧慡慣慡条瑡捡瑧瑡慧杣捣瑣捣瑡瑡捧条捧捡瑴捣捡慣杣瑧慧慴⁡匨充䤠⁄低›㈸⤶戼㹲⠊浡湩⁯捡摩⥳戼㹲䴊䱁噐䅔䱌偌䅌䱌䡌䅁偒噅噋䕖䝓䑇噌偋䝇䱓䱋䍓噖䝓呆卆奒䵇坓剖呑䝐剋䕌噗呁卉䝇呇䥙⁙偙卄䭖則呆卉䑒䅎之䱔䱙䵑卓䭌䕓呄䵁䡙呃䑒奎則奎奄䵇奄䝗䝑協呖卖䝓䝇升䝇䝇䝓䝇升䥑䱖兔偓䥁卍十䝐䕅呖呌千呁卓卖䥙坈兆剑䝐協䭐坌奉呓乓䅌䝓偖剖卆升奇呇奓䱓䥔剓䕍䕁䅄䄠奔䍙兑卒卓䙐䙔升呇䱋䥅䭋䱈偃偓䙌䝐卐偋坆䱖噖䝖噇䅌奃䱓噌噔䙁䥉坆剖䭓卒䱒䡌䑓䵙䵎偔剒䝐呐䭒奈偑䅙偐䑒䅆奁卒噒䙋剓䅓䅄䅐䭙䝑乑䱑乙䱅䱎則䕒奅噄䑌剋䝒䑒䕐䝍䭇剐䭒偎䕑䱇乙䱅䭑䭄䅍䅅卙䥅䵇䝋剅剒䭇䡇䝄奌䝑卌䅔䭔呄䑙䱁䵈䅑偌剐‪‪匨充䤠⁄低›㈸⤷戼㹲㰊牢ਾ畭㉃䌠㉄⼸䑃㠲䌯㉄⼸䑃稳戼㹲⠊乄⥁戼㹲愊杴捧捣杴捣杣杴捡杣瑣瑴捧杴瑣捣捣瑣杧杣瑣捧杴瑣捧捡捧杣捣条捧慣慧杧捴慣捧杴慧杧条捴条杧杧条捧瑴条杴慡捧瑣杧条杧捴捣杴慡捡捴捴瑣瑧捧条捣捴杴慧瑴慣瑣瑴慣瑧杧瑣瑡捧慣杴捴瑴杧瑧捴捧慣慧瑣捣杧条慡慧杧瑣杧条杴杧捴捧慡捣瑡慴瑧条杴瑧杧慴瑣慴慴捴慴瑣瑡捣条捡条杴杴慡杧杧杣瑡捴捡慣捴捴慣慧慧慣瑡捧慣条慡慣捣瑣瑧捡瑣捧慡瑡慧捧条捴杴条瑧瑣慧杧捡捡杧捣瑡瑧瑡慴瑣瑧捧慡慧瑣杴杧杧杧瑡慡瑴捡慴杣慡慴瑣捴慧杴捴杴杧捧捧条杧捡慣杣瑧慣捣瑧瑣捣捴杣捧杧杴捧杧瑡捣杧杣瑧杧杣慧捴杣捧杧杴捧杧瑡捣慧慣瑴瑧慧捴捡捡条捴慴慣捧瑴捣瑴条瑧瑧瑡瑣瑣杧杧慣慧杧捧慣捣瑡瑣慣杴慣杧捧慣捧慡慡瑧瑧慣瑧捡瑡瑣杧瑣瑡条瑴瑡瑡捧捡杴瑧捡慣捡条条捡慣杧捡条捣捡捣慡捡捴瑣慣捴慴捴瑴捧瑡捣慡捣慴慧瑡瑣杧杧捴捣杴捣条瑧捴条杴捧条杴杧捴杴杧捡条捡瑴慣捣瑣慣捡瑡捣瑡捣杴杴慧杧条慧杧瑡捧杴慣捡瑣瑡慴瑣瑧慣捧捡条慴杧慧捧瑴捣瑧捴捡瑧捴杧条杧杧慧捣慡捧杴慧慧慴慡慡慡慣捣瑴杴捴慣条捴捣瑣瑡瑴捣杣慧捣瑴瑣慡捧捣瑴瑴杧瑧捧杴瑧杧杴瑧杴瑧杧条捴瑣杧瑣杴瑣瑡条瑣杴瑣条慴捡条杴捧瑣瑴瑡慴瑴瑴瑣杧瑧慧慧条慣条杣瑧瑣杣捧捴瑣捧瑡捴杴瑡慴慣杴慡慣杴捡捣慣条慡慧捣条捧捣慣捣条慧慡慣瑴捡慣捧捣慴杣瑣捣捧慣杣杣捡瑴杣瑣捧瑣捡杣瑧捣杣杣瑴慡瑧捴捴捣慧捴条捣慧杣杣捣杴瑣慴慣条慣杧捧慣慧捡慣捡杴慴慣捡慧捧杴慡捴捴杧慴慧杣杧慡慧瑧捡慧杣杴瑴杧捡慡捡杧条条捧杣杣捡捣条慡瑡杧捧杧慣条捣捴捧条慧慡慡捣捣慣杧条杧捡杴慴慣瑡慧瑧杴慣慧慡慧慴条瑡杧慣慧条瑣慴慴捧慧慧捴杧慡杴慡杧杧慧慡杧条捡慧杧慧慡杧捡捡慧杣捧瑣瑴瑡慣杧捧瑣瑧捣捡条慣捡慡慡慧慴杣慴杴捡捧捣捴慣慴杴慣杧慣瑣捴慣捣捡杧杴瑡慡⠠䕓⁑䑉丠㩏㠠㠲㰩牢ਾ愨業潮愠楣獤㰩牢ਾ䅍偌呖䱁䱌䱐䱁䱌䅈剁䕐兖䕌卅䝇䱇䭖䝐升䭌卌䅃十䙇䙔䝓䅙卍噗兒偔䭅䱒坅䅖䥔卓䝇奔奉夠䑐噓䝋䙒䥔匠䑒䅎之䱔䱙䵑卓剌䕓呄䵁奙䅃䱒䝇乄奙奅䑆坖䅇呇噔噔卓䝇䝇䝓䝇升䝇䝇䑓噉呉卑䅔䱓噇䱓兇䅒䥔䍓䅒䭓噓呓䝓卙䵙坈兙剑䝐偑䭐䱌奉䅌乓䕌䝓偖剁卆升升呇䙄䱔䥎偈䕖䕅䅄呁奙元午䕒偌呆䝆䝇䭔䕌䭉䡋䍌卐䱐偆假䭓䙐噗噌噖䝇䱖䍁卙䱌呖䅖䥆䙉噗卒剋剓䱌午䐠䵙䵎偔剒䝐呐䭒奈偑䅙偐䑒䅆奁卒噒䙋剓䅓䅄䅐䭙䝑乑䱑乙䱅䱎則䕒奅噄䑌剋䝒䑒䕐䝍䭇剐䭒偎䕑䱇乙䱅䭑䭄䅍䅅卙䥅䵇䝋剅剒䭇䡇䝄奌䝑卌䅔䭔呄䑙䱁䵈䅑偌剐‪‪匨充䤠⁄低㠺㤲㰩牢ਾ戼㹲䌊ㅄ‹杉⽄䑃⼸ㄴ䉂䌯㍄㱺牢ਾ䐨䅎㰩牢ਾ瑡杧捣瑣捧捣瑧慧捣捧瑴杴瑣捧捴捣捣杴捧捧杴瑣捧杴慣杣捣捧慣杧捣条捡瑡捡条瑡慧杣慣慧杣捡慣捧条捣瑴捴杣瑣捴捣杴杧杣捡杣条慴捡慣瑴条瑴瑧条条慣捴捴条慧慴瑴捴慴条慴捴杴慡瑴杧慴捣慡慣慧慡捣杴瑡杧慣瑣瑧慣条瑣瑣杴瑡瑡瑡慣慣捣条捴慧瑣捣瑡捴条捧瑧捣瑣捴慣慧瑴慣瑧杧慧瑧杧慣捧杧慧瑣慧瑴捡捴捣捴捡慴捴捴慴捡瑣杧慡慣杧慡慧慣捴捧慴慣慴瑣捴杴捴条慣杧慧慡慣瑣瑣捣捣慴慴捣瑴杴杧杧条慧捡慣条瑴杧慡瑡慡慣杧杣瑧杧杣慧捴杣捧杧杴捧杧瑡捣杧杣瑧杧杣慧捴杣条瑧慧慡瑣捧条慧瑧慣杧捡瑣杧捣杴瑧杧杣捣瑣慣慣慧捧瑣瑧捣瑧慣慣杴慣瑣瑧瑣慣杧杧捴捴瑡慴捣杣捡慴杴瑧瑧慡捧杴慧瑴杣捣条捣捴慣杣慡条杧捴杴慧瑧杧瑣杧慧瑧慡慴杴杧瑧条杴慡捡慣慣慴瑣瑡慡瑴慣捧捴捴慡瑡捣条捡杴捡慣捴瑡慣条慧慣捡捴慣条条捣慡瑧瑴捴瑴慡慡瑡慧捡条捴杴慣慡瑣慧杴捡捡条捣瑡瑴捡慴瑣瑧捧慣慡慣瑴瑡慴瑣捡杧杴瑧条瑣瑡捧慴杴慧瑣捡杴杧捧慣条慧捡瑣慣瑧慣捣瑧瑣捣捴条条捴捴慣慡杧慣慣杧捣捴瑣慣瑧捧捣捡杴慣慣捡捣慣条慣慧杧捧条捣捴捧慣条捧慡捣捡条捣捣条捣捡慣捣杣慴捡捡条慧条条捧杧杣慡慧慧条慡慡条慧慧条慧慧慡慧杧慡慣条慡慧慧慧慧慧慣慡慧慣捣慡捴慴慣瑴杴杧捣捣捧捴捧条捧捡瑡瑧杧条杴瑣捣捴瑣瑣捣瑣杧杴瑡慴捣瑣瑧捡杴慣慡条杧捧杣慣慡慡捡捴瑣瑴捡瑡瑴瑴慡捧条捣瑴瑴瑡慧杧捣条慴慣慧杣捡捴慡慧杧慡慧杣杧杴瑣慣杴捣捧瑴捴瑣慧杧条慧杧慡杧条杧杴杣慡瑣捧捧瑧慴条瑴瑣捣杣瑡慣捧杣捡捧捧瑣捧瑴捡慡捧条杧捣条慡捣慡瑣瑧捡慡杣条瑣慧瑡瑣杣瑧条捡杧慧条条慴杣捡瑧瑧杴慧慣慡杣慧慧杧捣捧慧捣慣慧慡杴杧杣捧慡捧瑣杣慣杧慡慡捡捣捣条慧杧慧瑣瑧捡慡杴条瑴捧条慡条瑡慡慧杴捧条慡捧瑴瑡条杣条瑡杣慧瑡慧条杧杧慡条慧慧杣条杧慡条慧慣杣捡杧捣瑴慴捴条杧捣杴捴慣慣捧慡慣慡条瑡捡瑧瑡慧杣捣瑣捣瑡瑡捧条捧捡瑴捣捡慣杣瑧慧慴⁡匨充䤠⁄低›㌸⤰戼㹲⠊浡湩⁯捡摩⥳戼㹲䴊䱁噐䅔䱌偌䅌䱌䡌䅁偒䥄䵑兔呔卓卌十䝌剄呖卉剃十䑑卉奋乌套兑偋䝄噔䱋䥌䡙協䱒午噇卐䙒䝓䝓䝓䑔卙呌卉䱎充䑅䅉奔䍆兑乇䱔奐䙔䝇呇䱋䥅䝔䝇升䝇䝇䝓䝇升噅䱋䕑䝓䝐噌偁兓䱓噓䍔噔䝓卖偌奄噇坓剉偑剐䝋䕌䱗噇坉升呅奔乙䅓䭌剓呌䥉䑋华卋噑䱆䵋华兌䑔呄䥁奙䅃䡋奙䝙升䅙䑍坙兇呇噓噔卓卅䭐允十噓呐允児䕁升䅌䅋呔偁呁剔呎則䝇䕅䭋䕋䕋䕋充䕅䕒䭔偔䤠䥙䅗䱐䝁䍔噇䱌卌噌呉奌䭃䝒䭒䱋奌䙉克䙐前噐呑兔䕅䝄千剃偆䕅䕅䝇䕃剌䭖卆卒䑁偁奁克兇兎奌䕎乌䝌剒䕅䑙䱖䭄剒則偄䵅䝇偋剒之児䝅奌䕎兌䑋䵋䕁奁䕓䝉䭍䕇剒䝒䝋䑈䱇兙䱇呓呁䑋奔䅄䡌免䱁偐⩒⨠⠠䕓⁑䑉丠㩏㠠ㄳ਩⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯邼胣㲑䐯噉ਾ뷥궥胨꾁胣鎁臣ꮁ꣨낿臣겜ꇩ몙飦꺁觧낕髧讅꟦ꮁ鷥覭臣骤臣꺁胣ꎅ铧蒚껥鎨苣뾽臣몢ꫨꞁ臣膀诨鞁臣꾁ꫨ颭臣趁苣몙飦节鳦颡駧躘臣蒯鯥ꮁ賥ꮐ臣貂苣鎁臣銂郧ꎧ迥붃臣芁苣芀㰊䐯噉ਾ⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀鯥醼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㜰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔰〰㌰⸱楴≦㈾㈰㔰〰㌰⸱楴쉦゠〰〰㰸愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥鎼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㤰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔰〰㌰⸱楴≦㈾㈰㔰〰㌰⸱楴쉦゠〰㄰㰰愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥閼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰ㄱ⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔰〰㌰⸱楴≦㈾㈰㔰〰㌰⸱楴쉦゠〰㄰㰲愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥鞼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㌱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢㈰㔰〰㌰⸱楴≦㈾㈰㔰〰㌰⸱楴쉦゠〰㄰㰴愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥馼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㔱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㘱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㜱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㠱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鎼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㤱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯钼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰〲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯閼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰ㄲ⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯隼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㈲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鞼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㌲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯颼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㐲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯馼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㔲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㘲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㜲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㠲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鎼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㤲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯钼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰〳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯閼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰ㄳ⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯隼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㈳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鞼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㌳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯颼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㐳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯馼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㔳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㘳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㜳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㠳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鎼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㤳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯钼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰〴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯閼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰ㄴ⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯隼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㈴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鞼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㌴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯颼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㐴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯馼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㔴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㘴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㜴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㠴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鎼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㤴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯钼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰〵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯閼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰ㄵ⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯隼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㈵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鞼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㌵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯颼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㐵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯馼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㔵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㘵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㜵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㠵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鎼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰㤵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯钼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲〲〵〰ㄳ琮晩㸢〲〲〵〰ㄳ琮晩ꃂ〰〰〶⼼㹡⼼䥄㹖 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