(57)【要約】  本発明は、造血細胞移植片を調製する、または長期多系統生着および自己再生が可能な造血幹細胞についての細胞の集団を濃縮する方法に関する。それはまた、前記造血幹細胞を含む造血移植片ならびに治療におけるそれらの使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血細胞移植片を調製する、または長期多系統生着および自己再生が可能な造血幹細胞の細胞の集団を濃縮する、インビトロの方法であって、前記方法は、
ａ）造血幹細胞を含む細胞の集団を提供すること、および
ｂ）細胞表面抗原ＣＤ１３５および／またはＣＤ１１０の発現に基づいて、前記集団の細胞を選別すること、および
ｃ）ＣＤ１３５＋および／またはＣＤ１１０＋である細胞を回収すること
を含む、方法。
【請求項２】
ステップｂ）において、細胞は、細胞表面抗原ＣＤ１１０の前記発現に基づいて選別され、ステップｃ）において、回収された細胞は、ＣＤ１１０＋である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップｂ）において、細胞は、細胞表面抗原ＣＤ１３５の前記発現に基づいてさらに選別され、ステップｃ）において、回収された細胞は、ＣＤ１１０＋ＣＤ１３５＋である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップｂ）の前、後、またはそれと同時に、アペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）の前記発現に基づいて細胞を選別すること、および、ＡＰＬＮＲ＋である細胞を回収することをさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ステップａ）で提供される細胞の前記集団は、末梢血、胎盤血、臍帯血、骨髄、肝臓および／もしくは脾臓から得られる造血幹細胞を含み、ならびに／または、不死化造血幹細胞を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ステップａ）において提供される細胞の前記集団は、多能性幹細胞のインビトロ分化から得られる、好ましくは、人工多能性幹細胞または胚性幹細胞、より好ましくは人工多能性幹細胞から選択される、造血幹細胞を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記方法はさらに、ステップａ）の前に、
多能性幹細胞、好ましくは、胚様体（ＥＢ）の形成を誘導する人工多能性幹細胞を提供すること、
内皮造血系統への多能性幹細胞の分化を誘発する液体培養培地中でＥＢを培養すること、および
ＥＢ細胞を解離すること
を含み、
それによって、ステップａ）で提供される細胞の前記集団を得る、
請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記液体培養培地は、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）リガンド、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン３（ＩＬ３）、インターロイキン６（ＩＬ６）、インターロイキン１（ＩＬ１）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）およびインスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記多能性幹細胞は、１４〜１９日間、好ましくは１５〜１８日間、より好ましくは１７日間、前記液体培養培地で培養される、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
生着、具体的には、長期多系統生着および自己再生が可能な造血幹細胞のマーカとしてのＣＤ１３５および／またはＣＤ１１０の使用。
【請求項１１】
細胞および薬学的に許容可能なキャリアを含む造血細胞移植片であって、細胞の少なくとも１０％は、ＣＤ１３５＋および／またはＣＤ１１０＋造血幹細胞であり、好ましくは細胞の少なくとも１０％は、ＣＤ１１０＋造血幹細胞である、造血細胞移植片。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれかに記載の方法に従って調製される造血細胞移植片。
【請求項１３】
多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、慢性リンパ球性白血病、若年性慢性骨髄性白血病、神経芽細胞腫、卵巣癌および生殖細胞腫瘍などの悪性疾患、または、自己免疫疾患、アミロイドーシス、再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿症、ファンコーニの貧血、ブラックファン・ダイアモンド貧血、重症型サラセミア、鎌状赤血球貧血、重症複合免疫不全症、ウィスコット・アルドリッチ症候群および先天性代謝異常などの非悪性疾患の処置に使用するための請求項１１または１２に記載の造血細胞移植片。
【請求項１４】
前記移植片は自家、同系または同種異系移植において使用される、請求項１３に記載の使用のための造血幹細胞移植片。
【請求項１５】
（ｉ）血漿、血清、血小板溶解物および／または血清アルブミン、ならびに（ｉｉ）トランスフェリンまたはその代替物、好ましくはトランスフェリン、インスリンまたはその代替物、好ましくはインスリン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３−Ｌ）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン３（ＩＬ３）、インターロイキン６（ＩＬ６）、インターロイキン１（ＩＬ１）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）およびインスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）を含む液体細胞培養培地。
【請求項１６】
（ｉ）血漿、血清および／または血小板溶解物、ならびに（ｉｉ）トランスフェリン、インスリン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３−Ｌ）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン３（ＩＬ３）、インターロイキン６（ＩＬ６）、インターロイキン１（ＩＬ１）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）およびインスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）を含む、請求項１５に記載の液体細胞培養培地。
【請求項１７】
１０〜１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、好ましくは１０〜５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ；および／または、
１０〜１００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、好ましくは１０〜５０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ；および／または、
１０〜１００ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ３−Ｌ、好ましくは１０〜５０ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ３−Ｌ；および／または、
５０〜３００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、好ましくは１５０〜２５０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４；および／または、
５０〜３００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、好ましくは１５０〜２５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ；および／または、
１０〜１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ３、好ましくは２０〜８０ｎｇ／ｍＬのＩＬ３；および／または、
１０〜１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ６、好ましくは２０〜８０ｎｇ／ｍＬのＩＬ６；および／または、
１〜２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ１、好ましくは１〜１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ１；および／または、
１０〜２００ｎｇ／ｍＬのＧＣＳＦ、好ましくは５０〜１５０ｎｇ／ｍＬのＧＣＳＦ；および／または、
１〜２０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ１、好ましくは１〜１０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ１；
を含む、請求項１５または１６に記載の液体細胞培養培地。
【請求項１８】
１％〜２０％の血漿もしくは血清、好ましくは２％〜１０％の血漿もしくは血清；または０．１％〜２％の血小板溶解物、好ましくは０．２％〜１％の血小板溶解物；または０．１％〜２％の血清アルブミン、好ましくは０．５％〜１％の血清アルブミン；および／または、
５μｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬのインスリンまたはその代替物、好ましくはインスリン、好ましくは８μｇ／ｍＬ〜１２μｇ／ｍＬのインスリンまたはその代替物、好ましくはインスリン；および／または、
１０μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬのトランスフェリンまたはその代替物、好ましくはトランスフェリン、好ましくは３０μｇ／ｍＬ〜６０μｇ／ｍＬのトランスフェリンまたはその代替物、好ましくはトランスフェリン；
を含む、請求項１５〜１７のいずれかに記載の液体細胞培養培地。
【請求項１９】
前記液体培養培地は、請求項１５〜１８のいずれかに定義された通りである、請求項８または９に記載の方法。
【請求項２０】
造血系統の細胞の成長および／または分化のため、胚様体の分化のため、および／または、造血細胞移植片の産生のための、請求項１５〜１８のいずれかに記載の液体細胞培養培地の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学の分野、具体的にはヒト造血移植片に関する。つまり、本発明は、長期多系統生着および自己再生が可能な造血幹細胞、すなわち、造血移植に適した造血幹細胞の同定および選択に関する。
【背景技術】
【０００２】
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、血液疾患における同種異系造血細胞移植または以下の放射線／化学療法の終生治療効果を担うヒトの骨髄（ＢＭ）および血液内の希少な細胞である。これらの細胞は、ＢＭ、動員末梢血またはヒト臍帯血を含むいくつかの供給源から採取されることができる。臍帯血は、いくつかの利点、すなわち、ＨＬＡ適合の必要性の減少および移植片対宿主病のリスクの減少を提供する。しかし、ＨＳＣの操作における進歩にもかかわらず、その数は、多くの場合、同種異系移植には不十分なままであり、得られた細胞は、新たに単離されたＨＳＣと比較して多系統および生着可能性の減少を示す。これらの知見に基づけば、非造血源からの移植可能ＨＳＣの生成が、再生医療における主要目標の１つとなっている。
【０００３】
細胞融合を含む複数の細胞タイプの直接変換、転写因子の強制発現を介した分化細胞の再プログラミング、または、ヒト多能性幹細胞からの分化のいずれかを使用する、多数のプロトコルが開発された（ＷａｈｌｓｔｅｒおよびＤａｌｅｙ、Ｎａｔｕｒｅ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ、２０１６、１８、１１１１−１１１７）。多くの場合、癌遺伝子をコードするプラスミドの導入または非ＧＭＰグレードのフィーダー細胞の受容細胞への利用は、臨床応用についてのそれらの使用を不可能にする。結局、これらのプロトコルの多くは、真の移植可能臍帯血または成人ＨＳＣに近い表面表現型を有する細胞の集団の産生を目指し、戦略は、乏しい生着可能性を有する細胞を生成することしか実証していない。
【０００４】
その結果、移植細胞の生着可能性の増強および骨髄置換の改良を含む、造血移植効率を向上させる産物および方法が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、造血移植効率を向上させる産物および方法を提供することを目的とする。具体的には、本発明は、インビボでの長期多系統生着および自己再生が可能な造血幹細胞を取得および選択する方法を提供する。本発明は、ＨＳＣ移植についての細胞の供給源として、多能性幹細胞、具体的には人工多能性幹細胞の使用への道を開く。
【０００６】
したがって、本発明は、造血細胞移植片を調製する、または長期多系統生着および自己再生が可能な造血幹細胞の細胞の集団を濃縮するインビトロの方法に関し、前記方法は、
ａ）造血幹細胞、好ましくは初期原始造血幹細胞を含む細胞の集団を提供すること、および、
ｂ）細胞表面抗原ＣＤ１３５および／またはＣＤ１１０の発現に基づいて、前記集団の細胞を選別すること、および、
ｃ）ＣＤ１３５＋および／またはＣＤ１１０＋である細胞を回収すること
を含む。
【０００７】
好ましくは、ステップｂ）において、細胞は、細胞表面抗原ＣＤ１１０の発現に基づいて選別され、ステップｃ）において、回収された細胞は、ＣＤ１１０＋である。任意でステップｂ）において、細胞は、細胞表面抗原ＣＤ１３５の発現に基づいてさらに選別され得、ステップｃ）において、回収された細胞は、ＣＤ１１０＋ＣＤ１３５＋であり得る。
【０００８】
本方法はさらに、ステップｂ）の前、後またはそれと同時に、アペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）の発現に基づいて細胞を選別すること、および、ＡＰＬＮＲ＋である細胞を回収することを含み得る。
【０００９】
ステップａ）で提供される細胞の集団は、末梢血、胎盤血、臍帯血、骨髄、肝臓および／もしくは脾臓から得られる造血幹細胞を含み得、ならびに／または、不死化造血幹細胞を含み得る。
【００１０】
あるいは、または、さらに、ステップａ）において提供される細胞の集団は、好ましくは、人工多能性幹細胞または胚性幹細胞、より好ましくは人工多能性幹細胞から選択される、多能性幹細胞のインビトロ分化から得られる造血幹細胞を含み得る。
【００１１】
いくつかの実施形態において、本方法はさらに、ステップａ）の前に、
多能性幹細胞、好ましくは、胚様体（ＥＢ）の形成を誘導する人工多能性幹細胞を提供すること、
内皮造血系統への多能性幹細胞の分化を誘発する液体培養培地中でＥＢを培養すること、
ＥＢを液体培養培地で培養し、多能性幹細胞を造血細胞内系統に分化すること、および
ＥＢ細胞を解離すること
を含み得、
それによって、ステップａ）で提供される細胞の集団を得る。
【００１２】
好ましくは、液体培養培地は、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）リガンド、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン３（ＩＬ３）、インターロイキン６（ＩＬ６）、インターロイキン１（ＩＬ−１）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）およびインスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）を含む。
【００１３】
好ましくは、多能性幹細胞は、１４〜１９日間、好ましくは１５〜１８日間、より好ましくは１７日間、液体培養培地で培養される。
【００１４】
別の態様において、本発明はまた、生着、具体的には、長期多系統生着および自己再生が可能な造血幹細胞のマーカとしてのＣＤ１３５および／またはＣＤ１１０の使用に関する。
【００１５】
さらなる態様において、本発明は、細胞および薬学的に許容可能なキャリアを含む造血細胞移植片に関し、細胞の少なくとも１０％は、ＣＤ１３５＋および／またはＣＤ１１０＋造血幹細胞である。それはまた、本発明の方法に従って調製される造血細胞移植片に関する。
【００１６】
別の態様において、本発明はまた、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、慢性リンパ性白血病、若年性慢性骨髄性白血病、神経芽細胞腫、卵巣癌および生殖細胞腫瘍などの悪性疾患、または、自己免疫疾患、アミロイドーシス、再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿症、ファンコーニの貧血、ブラックファン・ダイアモンド貧血、重症型サラセミア、鎌状赤血球貧血、重症複合免疫不全症、ウィスコット・アルドリッチ症候群および先天性代謝異常などの非悪性疾患の処置に使用するための本発明の造血細胞移植片に関する。
【００１７】
造血幹細胞移植片は自家、同系または同種異系移植において使用され得る。
【００１８】
さらなる態様において、本発明はまた、（ｉ）血漿、血清、血小板溶解物および／または血清アルブミン、ならびに（ｉｉ）トランスフェリンまたはその代替物、インスリンまたはその代替物、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３−Ｌ）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン３（ＩＬ３）、インターロイキン６（ＩＬ６）、インターロイキン１（ＩＬ１）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）およびインスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）を含む液体細胞培養培地、好ましくは（ｉ）血漿、血清および／または血小板溶解物、ならびに（ｉｉ）トランスフェリン、インスリン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３−Ｌ）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン３（ＩＬ３）、インターロイキン６（ＩＬ６）、インターロイキン１（ＩＬ１）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）およびインスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）を含む液体細胞培養培地に関する。
【００１９】
具体的には、液体細胞培養培地は、
１０〜１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、好ましくは１０〜５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ；
１０〜１００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、好ましくは１０〜５０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ；
１００〜５００ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ３−Ｌ、好ましくは２５０〜３５０ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ３−Ｌ；
１０〜１００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、好ましくは１０〜５０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４；
５０〜３００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、好ましくは１５０〜２５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ；
１０〜１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ３、好ましくは２０〜８０ｎｇ／ｍＬのＩＬ３；
１０〜１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ６、好ましくは２０〜８０ｎｇ／ｍＬのＩＬ６；
１〜２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ１、好ましくは１〜１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ１；
１０〜２００ｎｇ／ｍＬのＧＣＳＦ、好ましくは５０〜１５０ｎｇ／ｍＬのＧＣＳＦ；および／または、
１０〜１５０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ１、好ましくは１０〜１００ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ１；
を含み得る。
【００２０】
好ましくは、液体細胞培養培地は、
１０〜１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、好ましくは１０〜５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ；
１０〜１００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、好ましくは１０〜５０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ；
１０〜１００ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ３−Ｌ、好ましくは１０〜５０ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ３−Ｌ；
５０〜３００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、好ましくは１５０〜２５０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４；
５０〜３００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、好ましくは１５０〜２５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ；
１０〜１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ３、好ましくは２０〜８０ｎｇ／ｍＬのＩＬ３；
１０〜１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ６、好ましくは２０〜８０ｎｇ／ｍＬのＩＬ６；
１〜２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ１、好ましくは１〜１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ１；
１０〜２００ｎｇ／ｍＬのＧＣＳＦ、好ましくは５０〜１５０ｎｇ／ｍＬのＧＣＳＦ；および／または、
１〜２０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ１、好ましくは１〜１０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ１；
を含む。
【００２１】
液体培養培地はさらに、（ｉ）血漿、血清、血小板溶解物および／または血清アルブミン、好ましくは血漿、血清および／または血小板溶解物、ならびに（ｉｉ）インスリンまたはその代替物、およびトランスフェリンまたはその代替物、好ましくはインスリンおよびトランスフェリンを含み得る。具体的には、液体培養培地はさらに、
１％〜２０％の血漿もしくは血清、好ましくは２％〜１０％の血漿もしくは血清；または０．１％〜２％の血小板溶解物、好ましくは０．２％〜１％の血小板溶解物；および
５μｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬ、好ましくは８μｇ／ｍＬ〜１２μｇ／ｍＬのインスリン；および
１０μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン、好ましくは３０μｇ／ｍＬ〜６０μｇ／ｍＬのトランスフェリン；および
を含み得る。
【００２２】
本発明はまた、造血系統の細胞の成長および／または分化のため、胚様体の分化のため、造血細胞移植片の産生のための、本発明の液体細胞培養培地の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、ｈｉＰＳＣ由来細胞の特徴付けである。（Ａ）実験スキーム。ＨｉＰＳＣは、成長因子およびサイトカインの連続的な存在下で１７日間にわたってＥＢに分化した。ＥＢ細胞は、ｑ−ＰＣＲおよびフローサイトメトリを使用して、異なる時点で特徴付けられた。画像はそれぞれ、Ｄ１３および１７での代表ＥＢを描写した。（Ｂ）Ｄ３、Ｄ７、Ｄ９、Ｄ１３、Ｄ１５およびＤ１７のＥＢおよびＣＤ３４＋臍帯血細胞の経時的な内皮、造血内皮および造血細胞の４９の遺伝子特性のセットの発現を要約する階層的クラスタリング。（Ｃ）Ｄ１３から１７へのＥＢ細胞分化のＥＨＴバランスを代表する遺伝子でのＱ−ＰＣＲパターン。各遺伝子について、倍率変化は６回の実験の平均＋／−ＳＥＭである。（Ｄ）ＥＢ培養のＤ１３および１７でのヒトＣＤ３０９、ＩＴＧＡ２、ＭＰＬおよびＣＫＩＴのフローサイトメトリ分析。（Ｅ）ＥＢ培養のＤ７から１７日目へのＡＰＬＮＲおよびＣＸＣＲ４の発現のフローサイトメトリ分析。
【図２】図２は、Ｄ１５およびＤ１７の間の機能的内皮造血プロファイリングである。（Ａ）経時的なＥＢにおける内皮（１−３）および造血（４−５）前駆細胞の存在をプロービングするインビトロ試験。解離されたＤ１５−１７のＥＢ細胞は、（１）ＣＦＣ−ＥＣ、（２）擬似微小管、（３）いくつかの継代が可能なＥＣ様細胞、（４）ＣＦＣ、および（５）ＬＴＣ−ＩＣを生成する。（Ｂ）Ｄ１６細胞の内皮能力をプロービングするためのインビボ試験についての実験スキーム。（Ｃ）Ｄ１６細胞／ｈＭＳＣプラグセクション。マッソンのトリクローム染色。（Ｄ）Ｄ１６細胞／ｈＭＳＣプラグセクション。ヒト血漿由来フォン・ヴィレブランド因子＋細胞（青色）免疫染色。（Ｅ）Ｄ１６細胞／ｈＭＳＣプラグセクションヒトＣＤ３１＋細胞（赤色）。
【図３】図３は、免疫無防備ＮＳＧマウスにおけるＤ１７ＥＢ細胞のインビボ生着である。（Ａ）実験計画。（Ｂ）一次レシピエントにおけるヒト対マウスＣＤ４５＋細胞生着の代表フローサイトメトリ分析。（Ｃ−Ｄ）移植後２０週の一次（Ｃ）または二次（Ｄ）マウス骨髄におけるｈＣＤ３４＋ｈＣＤ４３＋ｈＣＤ４５＋細胞のパーセンテージ。データは、平均＋／−ＳＥＭである。（Ｅ）一次および二次レシピエントにおけるヒト造血系統分布。数値は１００％に正規化されている。（Ｆ）一次および二次レシピエントから単離されたＢＭ細胞に対するクローン原性試験。ＣＦＵ−ＧＭ、ＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニーの頻度。（Ｇ）一次および二次ＢＭレシピエントからのＣＦＵ−ＧＥＭＭ（１）、ＢＦＵ−Ｅ（２）およびＣＦＵ−ＧＭ（３）の代表コロニー。（Ｈ）サイトスピン。一次および二次レシピエントにて行われたクローン原性試験から単離された細胞のメイグリュンワルドギムザ染色。成熟マクロファージ（１）、組織単球（２）、骨髄球（２）および赤芽球（３）。（Ｉ）ＣＢ  ＣＤ３４＋赤血球培養、一次および二次レシピエントからのＢＭ、ならびに一次レシピエントのＢＭからのＢＦＵ−Ｅにおけるヒトグロビン発現。データは、平均＋／−ＳＥＭである。（Ｊ）ヒトＴ細胞の成熟。ｈＴＣＲαβおよびｈＴＣＲγδに対する抗体で染色したｈＣＤ２＋末梢血選別細胞。（Ｋ）ヒトＴ細胞の機能性。全胸腺集団は、Ｄ０でＣＦＳＥ標識され、ｈＣＤ３＋（緑）で開閉する。Ｄ５において刺激されていない集団は赤である一方、刺激された親集団は青である。
【図４】図４は、ＡＰＬＮＲ＋集団の機能および分子特性である。（Ａ）移植後１８週のＮＯＤ−ＳＣＩＤ  ＢＭ一次レシピエントにおける、接種材料中のＡＰＬＮＲ＋細胞のパーセンテージと＋ｈＣＤ４５＋細胞のパーセンテージとの相関。（Ｂ）ＡＰＮＬＲ＋（ｎ＝６、青色ドット）およびＡＰＮＬＲ−（ｎ＝４、赤色ドット）集団の生着能力。再構成可能性を含む細胞は、ＡＰＬＮＲ＋集団にある。データは、移植後１８週のヒト生着の平均＋／−ＳＥＭパーセンテージとして表される。（Ｃ）ＣＤ４５、ＴＩＥ、ＥＮＧおよびＣＫＩＴ抗ヒト抗体を用いたＡＰＬＮＲ＋集団のコンビナトリアルフローサイトメトリ分析。（Ｄ）変数として４９個のｍＲＮＡのセットおよび観察として６個の細胞の集団を用いたＰＣＡ。ＰＣ１対ＰＣ２スコアプロット。ＰＣ１次元は、分散の４４．９％を占める、形質≪造血分化≫におそらく対応している。ＨｉＰＳＣは、主軸から分離されている。（Ｅ）変数としての４９個のｍＲＮＡのセットと移植可能性を有するまたは有しない集団とを用いたＰＣＡ。分散の１９．２３％を占めるＰＣ３次元は、２つのグループに分離する。（Ｆ）２つのグループの分離を可能にする８つの遺伝子のヒートマップ。
【図５】図５は、ＡＰＬＮＲ＋および−集団の特性である。Ｄ１７のＡＰＬＮＲ−（左）または＋細胞画分のいずれかで移植されたマウスＢＭにおけるｈＣＤ４５およびｈＣＤ４３発現の代表的なプロファイル。
【図６】図６は、主マップ上で４．７５Ｅ−８のｐ値を有する有意に識別されたサンプルグループにされたグループ間の５８５９個の差次的遺伝子上で行われた、教師なし主成分分析である。
【図７】図７は、ＳＲＣ−ＩＰＳＣの各グループ内のＨＳＣバイオマーカ発見のために各異種移植グループとＨＳＣグループとの間でマイクロアレイ有意分析（ＳＡＭ）による教師あり分析が行われたことを説明するサーコスプロットである。
【図８】図８は、共通の任意の遺伝子を示したＳＲＣ−ＩＰＳＣの各グループにおいて濃縮されたＨＳＣバイオマーカを比較するベン図である。
【図９】図９は、免疫無防備ＮＳＧマウスにおける選別されたＤ１７ＥＢ細胞のインビボ生着の実験計画である。
【図１０】図１０は、移植後２０週の一次または二次マウス骨髄におけるｈＣＤ３４＋ｈＣＤ４３＋ｈＣＤ４５＋細胞のパーセンテージである。データは、平均＋／−ＳＥＭである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
第１の移植可能ＨＳＣは、造血内皮と呼ばれる内皮細胞（ＥＣ）の特殊化集団から胚発生時に産生される。内皮から造血への移行（ＥＨＴ）に続き、これらの造血ＥＣは、ＨＳＣを含む造血細胞（ＨＣ）に分化し、循環に入り、胎児の肝臓で増幅され、定着の決定的な部位であるＢＭに到達する。発生的造血のこれらの初期ステップは、胚様体（ＥＢ）の培養、特に、造血ＥＣの生成およびＨＣの出芽に完全に反復する。
【００２５】
本発明者らはここで、内皮造血系統にヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の分化を方向づける、１ステップのベクターフリーおよびストロマフリーのシステム手順を開発した。標準プロトコルにおいてＣＤ３４＋ＣＤ４５＋前駆細胞が１０日目（Ｄ）におけるバーストＥＢからｌ４日目まで出現したが、本発明者によって適用される培養条件により、Ｄ１７胚様体が提供され、バーストのない明確に定義されたコンパクトな球状構造が示され、したがって、分化プロセスの劇的な遅延を評価した。これらの培養条件は、同様の分化効能を有する、例えばエピソームまたはレトロウイルスの、それらの再プログラミングプロトコルによって異なる、３つの異なるｈｉＰＳＣ細胞株に適用され、したがって方法の頑丈さが示された。
【００２６】
これらの分化した胚様体細胞の分析、ならびに一次生着のみまたは一次および二次生着が可能な造血幹細胞のトランスクリプトームの生命情報科学分析に基づき、本発明者らは本明細書中で、高生着能力だけでなく堅牢で長期自己再生能力をも示す初期原始造血幹細胞のサブ画分を同定し、これらの細胞を造血移植についての理想的な供給源とした。本発明者らは、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３受容体（ＦＬＴ３またはＣＤ１３５）、および／またはトロンボポエチン受容体（ＭＰＬまたはＣＤ１１０）および／またはアペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）の発現によってこのサブ画分を特徴付けることができることを見出した。
【００２７】
したがって、第１の態様において、本発明は、造血細胞移植片を調製する方法、好ましくはインビトロの方法に関し、方法は、
ａ）造血幹細胞を含む細胞の集団を提供すること、および
ｂ）細胞表面抗原ＣＤ１３５および／もしくはＣＤ１１０、ならびに／またはアペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）の発現に基づいて、好ましくは細胞表面抗原ＣＤ１１０に基づいて、前記集団の細胞を選別すること、および
ｃ）ＣＤ１３５＋および／もしくはＣＤ１１０＋ならびに／またはＡＰＬＮＲ＋、好ましくはＣＤ１１０＋である細胞を回収すること
を含む。
【００２８】
本発明はまた、造血移植に適している、すなわち、長期多系統生着および自己再生が可能である造血幹細胞についての細胞の集団を濃縮する方法、好ましくはインビトロの方法に関し、方法は、
ａ）造血幹細胞を含む細胞の集団を提供すること、および
ｂ）細胞表面抗原ＣＤ１３５および／もしくはＣＤ１１０、ならびに／またはアペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）の発現に基づいて、好ましくは細胞表面抗原ＣＤ１１０に基づいて、前記集団の細胞を選別すること、および
ｃ）ＣＤ１３５＋、ＣＤ１１０＋および／またはＡＰＬＮＲ＋、好ましくはＣＤ１１０＋である細胞を回収すること
を含む。
【００２９】
ＣＤ１３５＋および／もしくはＣＤ１１０＋ならびに／またはＡＰＬＮＲ＋回収細胞は、造血移植片として使用され得る、または、前記移植片の効力を改善するために造血移植片（例えば、骨髄または臍帯血移植）に含まれるか、もしくは添加され得る。
【００３０】
本明細書で使用する場合、用語「ＣＤ１３５」または「ＦＬＴ３」は、細胞外ドメインへのサイトカインＦｌｔ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）の結合により活性化されたクラスＩＩＩ受容体チロシンキナーゼを指す。ヒトでは、この遺伝子はＦＬＴ３遺伝子（遺伝子ＩＤ：２３２２）によってコードされる。活性化時に、ＣＤ１３５は、骨髄中の造血細胞のアポトーシス、増殖、および分化に関与する過程において、複数の細胞質エフェクター分子をリン酸化および活性化する。この受容体の構成的活性化をもたらす突然変異は、急性骨髄性白血病および急性リンパ芽球性白血病をもたらす。
【００３１】
本明細書で使用する場合、用語「ＣＤ１１０」または「ＭＰＬ」は、骨髄増殖性白血病タンパク質としても知られるトロンボポエチン受容体を指す。ヒトでは、ＣＤ１１０は、ＭＰＬ（骨髄増殖性白血病ウイルス）癌遺伝子（遺伝子ＩＤ：４３５２）によってコードされる。ＣＤ１１０は、２つの細胞外サイトカイン受容体ドメインおよび２つの細胞内サイトカイン受容体ボックスモチーフを有する、６３５アミノ酸膜貫通ドメインである。そのリガンド、すなわちトロンボポエチンは、巨核球形成および血小板形成の主要な調節因子であることが示された。
【００３２】
用語「ＡＰＬＮＲ」は、本明細書で使用する場合、アペリン受容体、すなわち、アペリンと結合するＧタンパク質共役受容体を指す。この受容体は、グルコース代謝において、胚および腫瘍血管新生において、および、ヒト免疫不全ウイルスコレセプターとして、心血管系および中枢神経系にて関与することが示された。ヒトでは、この受容体は、ＡＰＬＮＲ遺伝子（遺伝子ＩＤ：１８７）によってコードされる。
【００３３】
本明細書で使用する場合、用語「造血細胞移植片」または「造血移植片」は、造血移植に使用するエクスビボでの細胞産物を指す。造血細胞移植片は、動員末梢血、胎盤血、臍帯血、羊水、骨髄、肝臓および／または脾臓から得られた造血幹細胞、ならびに、不死化ＨＳＣ、ならびに／または、多能性幹細胞（例えば、人工多能性幹細胞）および／もしくは胚性幹細胞の分化から得られたＨＳＣを含み得る。
【００３４】
ステップａ）で提供される細胞の集団は、造血幹細胞（ＨＳＣ）、具体的には、初期原始ＨＳＣを含む。
【００３５】
好ましくは、ステップａ）で提供される細胞の集団は、ヒト細胞の集団である。
【００３６】
本明細書で使用する場合、用語「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」は、多能性および自己再生の両方の能力を有する細胞を指す。多能性は、すべての機能的血液細胞、例えばＢ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、リンパ樹状細胞、骨髄樹状細胞、顆粒球、マクロファージ、巨核球および赤血球細胞に分化する能力である。自己再生は、分化せずにＨＳＣ自体を生じさせる能力である。
【００３７】
用語「初期原始ＨＳＣ」は、本明細書中で使用する場合、ＣＤ３４＋／ＣＤ４５＋  ＨＳＣの前駆体であって多能性および自己再生の両方の能力を有するＨＳＣを指す。初期原始ＨＳＣは、内皮から造血への移行が可能な造血内皮に属し、ＣＤ３４−／ＣＤ４５−またはＣＤ３４＋／ＣＤ４５−であり得る。初期原始ＨＳＣはまた、ＣＸＣＲ４を発現し得、および／または、初期造血コミットメント（例えばＨＯＸＢ４、ｃ−ＭＹＣおよびＭＩＴＦ）、自己再生（例えばＨＯＸＡ９、ＥＲＧおよびＲＯＲＡ）および幹細胞性（例えばＳＯＸ４およびＭＹＢ）に関与する遺伝子のアップレギュレーションを示し得、および／または、長期培養開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）、すなわち、骨髄（ＢＭ）ストロマでの５〜８週間（３５〜６０日）の培養の後、コロニー形成単位細胞（ＣＦＵ）を生成することができるＨＳＣであり得る（ＭｉｌｌｅｒおよびＥａｖｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２００２；６３：１２３−４１）。いくつかの好ましい実施形態では、用語「初期原始ＨＳＣ」は、ＣＤ３４−／ＣＤ４５−またはＣＤ３４＋／ＣＤ４５−  ＬＴＣ−ＩＣ細胞を指す。いくつかの他の実施形態において、用語「初期原始ＨＳＣ」はまた、ＣＤ３４＋／ＣＤ４５＋またはＣＤ３４−／ＣＤ４５＋  ＬＴＣ−ＩＣ細胞を指し得る。
【００３８】
ステップａ）で提供される細胞の集団は、末梢血、胎盤血、臍帯血、羊水、骨髄、肝臓および／もしくは脾臓から得られるＨＳＣ、不死化ＨＳＣ、多能性幹細胞ならびに／または胚性幹細胞を含み得る。
【００３９】
実施形態では、ステップａ）で提供される細胞の集団は、末梢血、胎盤血、臍帯血、羊水、骨髄、肝臓および／または脾臓から得られる細胞、好ましくは、末梢血、胎盤血、臍帯血および／または骨髄から得られる細胞を含む、またはそれらからなる。具体的には、ステップａ）で提供される細胞の集団は、末梢血、胎盤血、臍帯血、羊水、骨髄、肝臓または脾臓から得られる細胞の集団、好ましくは、末梢血、胎盤血、臍帯血または骨髄から得られる細胞の集団であり得る。
【００４０】
ＨＳＣは、当業者に公知の任意の方法を用いて、上述の異なる供給源から得られ得る。
【００４１】
例えば、末梢血幹細胞は、総血液サンプル中に見出され得、アフェレーシスとして知られるプロセスを介して血液から収集され得る。末梢幹細胞の収率は、末梢循環へのドナーの骨髄からの幹細胞の遊走を刺激する化合物の投与でブーストされ得る。このような化合物は、例えば顆粒球コロニー刺激因子、またはＭｏｚｏｂｉｌ（プレリキサフォル）を含む。このような処置の後、末梢血は通常、「動員末梢血」と命名される。
【００４２】
ＨＳＣはまた、被験体の骨髄から取得できる。この場合、ＨＳＣは、骨の中心に達する大型針を通して、被験体の大きな骨、典型的には骨盤から取り出される。
【００４３】
出産後、母親が自身の乳児の臍帯および胎盤を寄付したときに、臍帯血または胎盤血が得られ得る。臍帯血または胎盤血は、成人の血液中に通常、見られるよりもＨＳＣの濃度が高い。
【００４４】
より具体的な実施形態では、ステップａ）で提供される細胞の集団は、末梢血、好ましくは、動員末梢血、骨髄、臍帯血または胎盤血のサンプルである。
【００４５】
別の実施形態では、ステップａ）で提供される細胞の集団は、不死化ＨＳＣ、好ましくはヒト不死化ＨＳＣを含む、またはそれらからなる。ＨＳＣは、β−カテニンのレトロウイルス媒介遺伝子導入などの当業者に公知の任意の方法を用いて不死化され得る（Ｔｅｍｐｌｉｎら、Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００８  Ｆｅｂ：３６（２）２０４−１５）。
【００４６】
さらなる実施形態では、ステップａ）で提供される細胞の集団は、多能性幹細胞、好ましくは、人工多能性幹細胞または胚性幹細胞から選択されるもの、より好ましくは、人工多能性幹細胞のインビトロ分化から得られるＨＳＣを含む、またはそれらからなる。
【００４７】
ヒト胚性幹細胞からＨＳＣを産生することは、倫理的な課題に遭遇し得る。実施形態では、胚性幹細胞は、非ヒト胚性幹細胞である。別の実施形態では、胚性幹細胞は、方法自体またはいずれの関連作用もヒト胚の破壊を含まないとの条件で、ヒト胚性幹細胞である。
【００４８】
胚性幹細胞は、着床前胚盤胞の内部細胞塊に由来する。胚性幹細胞は、未分化状態を維持することができる、または、外胚葉、内胚葉および中胚葉の３つのすべての胚葉由来の系統に沿って成熟するように方向づけられることができる。ｈＥＳＣは、インビトロでの不確定の増殖能を有し、造血細胞運命に分化することが示され、種々の分化手順を用いて赤血球、骨髄、およびリンパ系統を生じさせる（Ｂｈａｔｉａ、Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｅｄｕｃ  Ｐｒｏｇｒａｍ．２００７：１１−６）。
【００４９】
好ましい実施形態では、ステップａ）で提供される細胞の集団は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の分化から、好ましくはヒトｉＰＳＣの分化から得られるＨＳＣを含む、または、それらからなる。
【００５０】
ｉＰＳＣは、非多能性細胞、典型的には成人体細胞に由来し、再プログラミングとして知られるプロセスによって、細胞を多能性にするのに少数の特定の遺伝子の導入を必要とするのみである。遺伝子の種々の組み合わせにより、Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２／Ｎａｎｏｇ／Ｌｉｎ２８またはＯｃｔ４／Ｓｏｘ２／ＫＬＦ／ｃＭｙｃなどの細胞を多能性にすることが示された。ｉＰＳＣの使用の１つの利点は、胚細胞使用の完全回避できることで、したがって、それに伴うすべての倫理的問題の完全回避である。
【００５１】
ｉＰＳＣは、処置すべき被験体（移植患者）から、または別の被験体から取得できる。好ましくは、ｉＰＳＣは、処置すべき被験体、具体的にはこの被験体の線維芽細胞に由来する。
【００５２】
多能性幹細胞、具体的にはｉＰＳＣまたは胚性幹細胞は、Ｂａｔｈｉａ（前出）、Ｄｏｕｌａｔｏｖら（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２０１３  Ｏｃｔ  ３；１３（４）：１０．１０１６）またはＳａｎｄｌｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ．２０１４  Ｊｕｌ  １７；５１１（７５０９）：３１２−８）に記載された任意の方法などの、当業者に公知の任意の方法を使用して、ＨＳＣ、より具体的には初期原始ＨＳＣに分化され得る。
【００５３】
特定の実施形態では、本発明の方法は、ステップａ）の前に、
多能性幹細胞、具体的にはｉＰＳＣまたは胚性幹細胞、好ましくはヒトｉＰＳＣまたはヒト胚性幹細胞、より好ましくはヒトｉＰＳＣを提供すること、
胚様体（ＥＢ）の形成を誘導すること、
内皮造血系統への多能性幹細胞の分化を誘発する液体培養培地でＥＢを培養すること、および
ＥＢ細胞を解離すること
をさらに含み、
それにより、本発明の方法のステップａ）で提供される上記のような細胞の集団を取得する。
【００５４】
多能性幹細胞からの胚様体の形成は、当業者に公知の任意のプロトコルによって得られ得る。例えば、多能性幹細胞は、コラゲナーゼＩＶで処理され、液体培養培地中の低接着プレートに移され得る。
【００５５】
内皮造血系統への多能性幹細胞の分化はそして、前記分化を誘発する液体培養培地中で胚様体を培養することによって得られる。この液体培養培地は、胚様体の形成中に使用される培養培地と同じであり得る。
【００５６】
内皮造血系統への多能性幹細胞の分化を誘発するいくつかの培養培地は、記載されており（例えば、Ｌａｐｉｌｌｏｎｎｅら、ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ、２０１０；９５（１０）、Ｄｏｕｌａｔｏｖら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２０１３、１３（４）を参照）、本発明において使用することができる。
【００５７】
しかし、本発明者らは、サイトカインおよび成長因子の特定の組み合わせを含む培養培地が、バーストなしに明確に定義されたコンパクトな球状構造を呈する分化した胚様体を提供することを見出した。したがって、特定の実施形態において、内皮造血系統への多能性幹細胞の分化を誘発する培養培地は、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）リガンド、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン３（ＩＬ３）、インターロイキン６（ＩＬ６）、インターロイキン１（ＩＬ１）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）およびインスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）を含む。この培養培地はさらに、血漿、血清、血小板溶解物、血清アルブミン、トランスフェリンもしくはその代替物、および／またはインスリンもしくはその代替物、好ましくは（ｉ）血漿、血清、および／または血小板溶解物、ならびに（ｉｉ）トランスフェリンおよびインスリンを含み得る。
【００５８】
好ましい実施形態では、内皮造血系統への多能性幹細胞の分化を誘発する培養培地は、以下に説明する本発明の培養培地である。
【００５９】
好ましくは、胚様体は、１４〜１９日間、より好ましくは１５〜１８日間、さらに好ましくは１７日間、液体培養培地で培養される。好ましい実施形態では、胚様体は、１４〜１９日間、より好ましくは１５〜１８日間、さらに好ましくは１７日間、以下に説明される本発明の液体培養培地中で培養される。
【００６０】
分化した胚様体はそして、例えば、コラゲナーゼＢおよび細胞解離緩衝液でのインキュベーション、または当業者に公知の任意の他の方法により、解離される。
【００６１】
本願の実験セクションに示されているように、解離した細胞の集団は、ＨＳＣ、具体的には初期原始ＨＳＣを含み、本発明の方法のステップａ）で提供され得る。
【００６２】
ＨＳＣを含む細胞の集団における初期原始ＨＳＣの存在は、当業者に公知の任意の方法によって、例えば、Ｌｉｕら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１３；９４６：２４１−５６に記載のような長期培養開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）アッセイを用いて、評価され得る。
【００６３】
初期原始ＨＳＣを含むＨＳＣは、本発明の方法で使用される前に貯蔵され得る。具体的には、細胞は、必要に応じてＤＭＳＯなどの低温保存剤の存在下で、長期間、凍結保存されることができる。
【００６４】
本発明の方法のステップｂ）において、ステップａ）において提供される上述したような集団の細胞は、細胞表面抗原ＣＤ１３５および／もしくはＣＤ１１０の発現、ならびに／またはＡＰＬＮＲの発現に基づいて選別される。
【００６５】
本明細書で使用される場合、細胞の「選別」という用語は、マーカ発現などの指定された基準に従ってグループに細胞を分離する操作を指す。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を含むがこれらに限定されない、指定された基準に従って細胞を分離する当業者に公知の任意の方法が使用され得る。本明細書で使用する場合、特定のタンパク質、例えば細胞表面抗原「の発現に基づく選別」との表現は、前記タンパク質を発現する細胞および前記タンパク質を発現しない細胞を分離する操作を指す。好ましい実施形態において、ＣＤ１３５、ＣＤ１１０またはＡＰＬＮＲの発現は、細胞の表面で検出される。しかし、ｍＲＮＡを検出する方法（例えばＲＴ−ＰＣＲ）などの、当業者に公知であって、この発現の検出を可能にする任意の他の方法が使用され得る。
【００６６】
細胞は、
細胞表面抗原ＣＤ１３５およびＣＤ１１０の発現、ならびに、必要に応じてＡＰＬＮＲの発現、または、
細胞表面抗原ＣＤ１３５の発現、ならびに、必要に応じてＡＰＬＮＲおよびＣＤ１１０の発現、または、
細胞表面抗原ＣＤ１３５の発現、および、必要に応じてＡＰＬＮＲの発現、または、
細胞表面抗原ＣＤ１３５の発現、および、必要に応じてＣＤ１１０の発現、または、
細胞表面抗原ＣＤ１１０の発現、および、必要に応じてＡＰＬＮＲの発現、または、
細胞表面抗原ＣＤ１１０の発現、および、必要に応じて細胞表面抗原ＣＤ１３５の発現、または、
細胞表面抗原ＣＤ１１０の発現、ならびに、必要に応じてＡＰＬＮＲおよびＣＤ１３５の発現、または、
細胞表面抗原ＣＤ１３５およびＣＤ１１０の発現、ならびに、ＡＰＬＮＲの発現、または、
細胞表面抗原ＣＤ１３５の発現、および、ＡＰＬＮＲの発現、または、
細胞表面抗原ＣＤ１１０の発現、および、ＡＰＬＮＲの発現。または、
ＡＰＬＮＲの発現、ならびに、必要に応じて細胞表面抗原ＣＤ１３５およびＣＤ１１０の発現、または、
ＡＰＬＮＲの発現、および、必要に応じて細胞表面抗原ＣＤ１３５の発現、または、
ＡＰＬＮＲの発現、および、必要に応じて細胞表面抗原ＣＤ１１０の発現
に基づいて選別され得る。
【００６７】
細胞が２つまたは３つのマーカ、例えばＣＤ１３５、ＣＤ１１０およびＡＰＬＮＲの発現に基づいて選別される実施形態では、これらのマーカのそれぞれに基づく選択は、同時または任意の順序で、連続的であり得る。
【００６８】
特定の実施形態では、ステップｂ）において、細胞は、細胞表面抗原ＣＤ１３５および／またはＣＤ１１０、好ましくはＣＤ１３５またはＣＤ１１０の発現に基づいて選別される。好ましい実施形態では、ステップｂ）において、細胞は、細胞表面抗原ＣＤ１１０の発現、必要に応じて細胞表面抗原ＣＤ１３５の発現に基づいて選別される。これらの実施形態では、方法はさらに、ステップｂ）の前、後、またはそれと同時に、ＡＰＬＮＲの発現に基づいて細胞を選別することを含み得る。
【００６９】
本発明の方法のステップｃ）において、ＣＤ１３５＋および／またはＣＤ１１０＋および／またはＡＰＬＮＲ＋である細胞を回収する。
【００７０】
好ましい実施形態では、ＣＤ１１０＋である細胞を回収する。
【００７１】
本明細書で使用する場合、用語「＋」は、好ましくは細胞表面での、関心対象のマーカの発現を指す。例えば、ＣＤ１３５＋細胞は、細胞表面抗原ＣＤ１３５を発現する細胞であり、ＣＤ１１０＋／ＡＰＬＮＲ＋細胞は、細胞表面抗原ＣＤ１１０およびＡＰＬＮＲを発現する細胞である。逆に、用語「−」は、好ましくは細胞表面での、関心対象のマーカの発現の欠如を指す。例えば、ＣＤ１３５−細胞は、細胞表面抗原ＣＤ１３５を発現しない細胞であり、ＣＤ１１０＋／ＡＰＬＮＲ−細胞は、細胞表面抗原ＣＤ１１０を発現するがＡＰＬＮＲを発現しない細胞である。
【００７２】
細胞を選別するために使用される方法によれば、ステップｂ）およびｃ）は、連続的または同時であり得る。
【００７３】
選別ステップ中に使用されるマーカによれば、回収される細胞は、ＣＤ１３５＋細胞、ＣＤ１１０＋細胞、ＡＰＬＮＲ＋細胞、ＣＤ１３５＋／ＣＤ１１０＋細胞、ＣＤ１３５＋／ＡＰＬＮＲ＋細胞、ＣＤ１１０＋／ＡＰＬＮＲ＋細胞、またはＣＤ１３５＋／ＣＤ１１０＋／ＡＰＬＮＲ＋細胞であり得る。好ましくは、細胞は、ＣＤ１１０＋細胞、ＣＤ１３５＋／ＣＤ１１０＋細胞、ＣＤ１１０＋／ＡＰＬＮＲ＋細胞、またはＣＤ１３５＋／ＣＤ１１０＋／ＡＰＬＮＲ＋細胞である。
【００７４】
これらの細胞は、長期多系統生着および自己再生が可能であり、ＨＳＣ移植のために使用され得る。
【００７５】
必要であれば、本発明の方法は、ＣＤ１３５＋、ＣＤ１１０＋および／またはＡＰＬＮＲ＋  ＨＳＣについての細胞産物を濃縮するために、ＣＤ１３５、ＣＤ１１０および／またはＡＰＬＮＲの発現に基づく、いくつかの連続する選別ステップを含み得る。
【００７６】
必要に応じて使用前に、これらの細胞は、貯蔵され得、具体的には、必要に応じてＤＭＳＯなどの低温保存剤の存在下で、短期または長期にわたって凍結保存され得る。
【００７７】
別の態様において、本発明はまた、造血移植に適している、すなわち長期多系統生着および自己再生が可能である、造血幹細胞を同定および／または選択する方法、好ましくはインビトロの方法に関し、方法は、
ａ）造血幹細胞を含む細胞の集団を提供すること、および、
ｂ）細胞表面抗原ＣＤ１３５および／もしくはＣＤ１１０の発現、ならびに／またはアペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）の発現について、好ましくは、細胞表面抗原ＣＤ１１０の発現について前記細胞を評価すること、および、
ｃ）ＣＤ１３５＋および／もしくはＣＤ１１０＋ならびに／またはＡＰＬＮＲ＋、好ましくはＣＤ１１０＋である細胞を同定および／または選択すること
を含む。
【００７８】
本発明の造血細胞移植片を調製する方法について上述したすべての実施形態はまた、この態様に包含される。
【００７９】
細胞表面抗原ＣＤ１３５および／もしくはＣＤ１１０の発現、ならびに／またはアペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）の発現は、ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳ、免疫組織化学、ウェスタンブロット、タンパク質もしくは抗体アレイ、ＲＴ−ＰＣＲまたはトランスクリプトームアプローチなどの当業者に公知の任意の方法によって評価され得る。
【００８０】
ＣＤ１３５、ＣＤ１１０またはＡＰＬＮＲの発現を評価するために使用される方法によれば、ステップｂ）およびｃ）は、連続的または同時であり得る。例えば、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳを使用すると、発現の検出および選択は同時であり得る。
【００８１】
ＣＤ１３５＋および／またはＣＤ１１０＋および／またはＡＰＬＮＲ＋が同定および／または選択された細胞は、造血移植片として使用され得、前記移植片の効力を改善するために造血移植片に含まれ、またはそれに添加され得る（例えば、骨髄または臍帯血移植）。
【００８２】
さらなる態様において、本発明はまた、多能性幹細胞から移植可能ＨＳＣを産生する方法、好ましくはインビトロ方法に関し、方法は、
多能性幹細胞、具体的にはｉＰＳＣまたは胚性幹細胞、好ましくはヒトｉＰＳＣまたはヒト胚性幹細胞、より好ましくはヒトｉＰＳＣを提供すること、
胚様体（ＥＢ）形成を誘導すること、
内皮造血系統への多能性幹細胞の分化を誘発する液体培養培地でＥＢを培養すること、
ＥＢ細胞を解離すること、
細胞表面抗原ＣＤ１３５および／もしくはＣＤ１１０、ならびに／またはアペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）の発現に基づいて、好ましくは細胞表面抗原ＣＤ１１０に基づいて解離ＥＢ細胞を選別すること、および、
ＣＤ１３５＋、ＣＤ１１０＋および／またはＡＰＬＮＲ＋、好ましくはＣＤ１１０＋である細胞を回収すること
を含む。
【００８３】
本発明の造血細胞移植片を調製する方法について上述したすべての実施形態はまた、この態様に包含される。
【００８４】
本明細書で使用する場合、用語「移植可能ＨＳＣ」は、造血移植に適している、すなわち、長期多系統生着および自己再生が可能である造血幹細胞を指す。
【００８５】
好ましくは、内皮造血系統への多能性幹細胞の分化を誘発する培養培地は、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）リガンド、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン３（ＩＬ３）、インターロイキン６（ＩＬ６）、インターロイキン１（ＩＬ１）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）およびインスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）を含む。この培養培地はさらに、血漿、血清、血小板溶解物、血清アルブミン、トランスフェリンもしくはその代替物、および／またはインスリンもしくはその代替物、好ましくは（ｉ）血漿、血清および／または血小板溶解物、ならびに（ｉｉ）トランスフェリンおよびインスリンを含み得る。
【００８６】
好ましい実施形態では、内皮造血系統への多能性幹細胞の分化を誘発する培養培地は、以下で説明される本発明の培養培地である。
【００８７】
好ましくは、胚様体は、１４〜１９日間、より好ましくは１５〜１８日間、さらに好ましくは１７日間、液体培養培地で培養される。好ましい実施形態では、胚様体は、１４〜１９日間、より好ましくは１５〜１８日間、さらに好ましくは１７日間、以下で説明される本発明の液体培養培地で培養される。
【００８８】
本明細書で実証されるように、ＣＤ１３５＋、ＣＤ１１０＋および／またはＡＰＬＮＲ＋  ＨＳＣは、インビボでの多系統造血再構成および自己再生をサポートする長期多能ＨＳＣであり、したがって、ＨＳＣ移植についての細胞の優れた供給源を構成する。
【００８９】
したがって、別の態様において、本発明は、造血移植に適している、すなわち生着、具体的には、長期多系統生着および自己再生が可能な造血幹細胞のマーカとしてのＣＤ１３５、ＣＤ１１０および／またはＡＰＬＮＲの使用に関する。
【００９０】
本発明はまた、造血細胞移植片の効力を評価するためのマーカとしての、ならびに／または造血移植結果および／もしくは性能を予測するためのマーカとしての、ＣＤ１３５、ＣＤ１１０および／またはＡＰＬＮＲの使用に関する。
【００９１】
本発明はさらに、造血細胞移植片の効力を評価する方法、好ましくはインビトロの方法に関し、方法は、ＣＤ１３５、ＣＤ１１０および／またはＡＰＬＮＲを発現するＨＳＣの存在または不在、好ましくはＣＤ１１０を発現するＨＳＣの存在または不在、すなわち、長期多系統生着および自己再生が可能な細胞の存在または不在について、造血細胞移植片を評価することを含み、前記細胞の不在は、低効力または効力欠如を示す。逆に、ＣＤ１３５、ＣＤ１１０および／またはＡＰＬＮＲを発現するＨＳＣの存在は、良好な効力を示すと考えることができる。
【００９２】
本明細書で使用する場合、用語「効力」は、所与の結果に影響を与える細胞産物の特定の能力、具体的には、移植の際にインビボでの多系統造血再構成および自己再生を提供する、すなわち、移植患者における免疫造血系を再生する造血細胞産物の能力を指す。
【００９３】
低効力または効力欠如の造血細胞移植片の移植は、移植の失敗をもたらし得る。その結果、ＣＤ１３５、ＣＤ１１０および／またはＡＰＬＮＲを発現するＨＳＣをまったく含まない造血細胞移植片は、移植に使用されるべきではない。
【００９４】
本発明はまた、ＨＳＣ移植の転帰を予測する方法、好ましくはインビトロの方法に関し、方法は、ＣＤ１３５、ＣＤ１１０および／またはＡＰＬＮＲを発現する、好ましくはＣＤ１１０を発現するＨＳＣの存在または不在を造血細胞移植片において検出することを含み、前記細胞の不在は、予後不良、すなわち、移植不全のリスクが高いことを示す。逆に、ＣＤ１３５、ＣＤ１１０および／またはＡＰＬＮＲを発現するＨＳＣの存在は、予後良好を示すものと考えることができる。
【００９５】
本明細書で使用する場合、用語「予後不良」とは、患者の生存率低下および／または移植不全の高リスク、すなわち、移植が移植患者における免疫造血系を再生できない高リスクを指す。逆に、用語「予後良好」は、患者の生存率増加および移植成功確率増加、すなわち、移植が移植患者における免疫造血系の再生を可能にする確率の増加を指す。
【００９６】
本発明はさらに、造血細胞移植片の生着可能性を予測する方法、好ましくはインビトロの方法に関し、方法は、ＣＤ１３５、ＣＤ１１０および／またはＡＰＬＮＲを発現する、好ましくはＣＤ１１０を発現するＨＳＣの存在または不在を造血細胞移植片において検出することを含み、前記細胞の不在は、乏しい移植可能性、すなわち移植不全の高リスクを示す。逆に、ＣＤ１３５、ＣＤ１１０および／またはＡＰＬＮＲを発現するＨＳＣの存在は、良好な移植可能性、すなわち移植成功確率の増加を示すものと考えることができる。
【００９７】
ＣＤ１３５、ＣＤ１１０および／またはＡＰＬＮＲを発現するＨＳＣの存在または不在は、当業者に公知のまたは上述の任意の方法によって評価され得る。例えば、ＣＤ１３５＋、ＣＤ１１０＋および／またはＡＰＬＮＲ＋細胞は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）、またはＣＤ１３５、ＣＤ１１０またはＡＰＬＮＲに対して向けられた抗体を使用する任意の免疫学的検査を使用して検出され得る。ＣＤ１３５、ＣＤ１１０またはＡＰＬＮＲに対するモノクローナル抗体は市販されている。
【００９８】
上記のような、造血細胞移植片の効力を評価する、ＨＳＣ移植の結果を予測する、または造血細胞移植片の生着可能性を予測する方法は、総生存有核細胞数（ＴＮＣ）のカウント、および／または生存可能なＣＤ３４＋細胞総数の測定、および／または刺激性成長因子を補充したメチルセルロースベース培養培地中で造血細胞コロニーを産生可能な機能性前駆細胞の数の測定（ＣＦＵアッセイ）、および／またはＬＴＣ−ＩＣ頻度の測定などの、日常的に当業者によって使用される任意の他の表現型または機能的アッセイを含み得る。
【００９９】
別の態様において、本発明は、本発明の任意の方法に従って調製された造血細胞移植片に関する。
【０１００】
それはさらに、細胞の少なくとも１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０または７０％がＣＤ１３５＋、ＣＤ１１０＋および／またはＡＰＬＮＲ＋造血幹細胞、好ましくはＣＤ１１０＋造血幹細胞である造血細胞移植片と、薬学的に許容可能なキャリアとに関する。好ましくは、造血細胞移植片の細胞の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％が、ＣＤ１３５＋、ＣＤ１１０＋および／またはＡＰＬＮＲ＋造血幹細胞、好ましくはＣＤ１１０＋造血幹細胞である。より好ましくは、造血細胞移植片の細胞の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％が、ＣＤ１３５＋および／またはＣＤ１１０＋  ＨＳＣ、好ましくＣＤ１１０＋  ＨＳＣである。
【０１０１】
ＣＤ１３５＋、ＣＤ１１０＋および／またはＡＰＬＮＲ＋  ＨＳＣの割合は、当業者に公知のまたは本明細書に記載の任意の方法を用いて容易に決定され得る。
【０１０２】
本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容可能」は、動物および／またはヒトにおける使用について欧州薬局方などの規制機関または認知された薬局方による承認を意味する。用語「キャリア」または「賦形剤」は、細胞が投与される希釈剤、アジュバント、キャリア、またはビヒクルを指す。当技術分野で公知のように、薬学的に許容可能な賦形剤は、比較的に不活性な物質、好ましくは当業者に公知の注射可能な物質である。
【０１０３】
本発明の造血細胞移植片を調製する方法について上述したすべての実施形態はまた、この態様に包含される。
【０１０４】
さらなる態様において、本発明は、疾患、状態、または骨髄破壊的処置により引き起こされる造血における欠陥に関連するさまざまな障害の処置に使用するため、具体的には、悪性または非悪性疾患の処置のための、本発明の造血細胞移植片に関する。
【０１０５】
それはまた、疾患、状態、または骨髄破壊的処置により引き起こされる造血における欠陥に関連する障害の処置のため、具体的には、悪性または非悪性疾患の処置のために、医薬を調製するための本発明の造血細胞移植片の使用に関する。
【０１０６】
それはさらに、疾患、状態、または骨髄破壊的処置により引き起こされる造血における欠陥に関連する障害の処置のため、具体的には、悪性または非悪性疾患の処置のための方法に関し、方法は、それを必要とする被験体において、その被験体に有効量の本発明の造血細胞移植片を投与することを含む。
【０１０７】
それはまた、疾患、状態、または骨髄破壊的処置により引き起こされる造血における欠陥に関連する障害の処置のため、具体的には、悪性または非悪性疾患の処置のための方法に関し、方法は、それを必要とする被験体において、上述した本発明の方法による造血細胞移植片の効力を評価すること、および、効力が良好であれば被験体に有効量の前記造血細胞移植片を投与することを含む。
【０１０８】
本発明の造血細胞移植片を調製する方法について、造血細胞移植片の効力の評価について、または本発明の造血細胞移植片について、上述したすべての実施形態はまた、この態様に包含される。
【０１０９】
悪性疾患の例としては、これらに限定されないが、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性障害、慢性リンパ球性白血病、若年性慢性骨髄性白血病、神経芽細胞腫、卵巣癌および生殖細胞腫瘍が挙げられる。
【０１１０】
非悪性疾患の例としては、これらに限定されないが、自己免疫疾患、アミロイドーシス、再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿症、ファンコーニの貧血、ブラックファン・ダイアモンド貧血、重症型サラセミア、鎌状赤血球貧血、重症複合免疫不全症、ウィスコット・アルドリッチ症候群および先天性代謝異常が挙げられる。
【０１１１】
用語「被験体」または「患者」は、動物、好ましくは哺乳動物、さらにより好ましくは、成人、子供、および出生前段階のヒトを含むヒトを指す。
【０１１２】
本明細書で使用する場合、用語「処置」、「処置する」または「処置すること」は、疾患の治療、防止、予防および遅滞などの患者の健康状態を改善することを意図する任意の行為を指す。特定の実施形態では、そのような用語は、疾患または疾患に関連する症状の改善または根絶を指す。他の実施形態では、この用語は、そのような疾患を有する被験体への１つ以上の治療薬の投与に起因する疾患の拡散または悪化を最小限にすることを指す。いくつかの実施形態では、この用語は、移植患者における免疫造血系の再生を指し得る。
【０１１３】
「治療有効量」とは、上記で定義した悪性または非悪性疾患の処置を構成するのに十分である被験体に投与される造血細胞移植片の量を意図する。いくつかの実施形態では、この用語は、移植患者における免疫造血系を再生するのに必要な造血細胞移植片の量を指し得る。
【０１１４】
治療有効量は、患者の生理学的データ（例えば年齢、サイズ、および重量）および処置される疾患に応じて、造血細胞移植片におけるＣＤ１３５＋、ＣＤ１１０＋および／またはＡＰＬＮＲ＋細胞の割合に応じて変化し得る。
【０１１５】
実施形態では、１０４〜１０７、好ましくは１０５〜１０７、より好ましくは３．１０５〜６．１０６のＣＤ１３５＋、ＣＤ１１０＋および／またはＡＰＬＮＲ＋細胞／患者体重ｋｇを投与する。特定の実施形態では、１０５〜１０６、好ましくは１．１０５〜５．１０５のＣＤ１３５＋および／またはＣＤ１１０＋細胞、好ましくはＣＤ１１０＋細胞／患者体重ｋｇを投与する。別の具体的な実施形態では、１０６〜１０７、好ましくは３．１０６〜８．１０６のＡＰＬＮＲ＋細胞／患者体重ｋｇを投与する。
【０１１６】
本発明による造血細胞移植片は、治療される疾患に応じて、他の化学療法、免疫療法、放射線療法または手術などの他の療法と組み合わせて使用され得る。
【０１１７】
用語「免疫療法」は、悪性腫瘍細胞または疾患を担う細胞を攻撃するために、患者の免疫系を刺激する治療処置を指す。それは、（例えば、癌ワクチンを投与することによる）特定の抗原を有する患者の免疫、サイトカインなどの免疫系を刺激する分子の投与、または薬物などの治療抗体の投与を含む。
【０１１８】
用語「放射線療法」は、内部および外部放射線療法、放射免疫療法、ならびにＸ線、ガンマ線、アルファ粒子、ベータ粒子、光子、電子、中性子、放射性同位元素、および電離放射線の他の形態などのさまざまな種類の放射線の使用を含む複数の種類の放射線療法を指すために当技術分野で一般に使用される用語である。具体的には、放射線療法を、幹細胞移植の前に骨の痛みを緩和するためにまたは全身照射のために、骨髄の外に広がっているかもしれない疾患を治療するために使用することができる。
【０１１９】
化学療法は、悪性疾患を処置するために使用され得、例えば、ビンクリスチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、シタラビン、アスパラギナーゼ、エトポシド、テニポシド、メルカプトプリン、メトトレキサート、シクロホスファミド、プレドニゾン、デキサメタゾン、ブスルファン、ヒドロキシ尿素またはインターフェロンアルファ、または任意の他の関連する化学療法を含み得る。
【０１２０】
造血細胞移植片は、自家、同系または同種異系移植で使用され得る。本明細書で使用する場合、「同種異系移植」は、遺伝的にレシピエントとは非同一であるが同じ種であるドナーに由来または起因する細胞の移植を指す。「自家移植」は、同じ被験体に由来または起因する細胞の移植を指す。ドナーおよびレシピエントが同一の人である。「同系移植」は、レシピエントと遺伝的に同一であるドナーに由来または起因する細胞の移植を指す。
【０１２１】
特定の実施形態において、造血細胞移植片は、自家移植において使用されることが意図され、ＨＳＣ、具体的にはＣＤ１３５＋、ＣＤ１１０および／またはＡＰＬＮＲ＋細胞は、処置される被験体に起因する人工多能性幹細胞に由来する。
【０１２２】
別の具体的な実施形態では、造血細胞移植片は、同種異系移植において使用されることが意図され、ＨＳＣ、具体的にはＣＤ１３５＋、ＣＤ１１０および／またはＡＰＬＮＲ＋細胞は、胎盤血または臍帯血に由来する。
【０１２３】
実験セクションに示すように、本発明者らは、多能性幹細胞から得られた胚様体の内皮造血系統への分化プロセスが遅延される液体細胞培養培地を開発した。この培養培地は、したがって、ＧＭＰグレード培養条件下での、インビボでの長期多系統生着および自己再生が可能な初期原始造血幹細胞、すなわちＣＤ１３５＋、ＣＤ１１０＋および／またはＡＰＬＮＲ＋  ＨＳＣの産生および選択を可能とする。
【０１２４】
したがって、別の態様において、本発明はまた、（ｉ）血漿、血清、血小板溶解物および／または血清アルブミン、ならびに（ｉｉ）トランスフェリンまたはその代替物、インスリンまたはその代替物、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３−Ｌ）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン３（ＩＬ３）、インターロイキン６（ＩＬ６）、インターロイキン１（ＩＬ１）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）およびインスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）を含む、または本質的にそれらからなる液体細胞培養培地に関する。好ましくは、液体細胞培養培地は、（ｉ）血漿、血清および／または血小板溶解物、ならびに（ｉｉ）トランスフェリン、インスリン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３−Ｌ）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン３（ＩＬ３）、インターロイキン６（ＩＬ６）、インターロイキン１（ＩＬ１）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）およびインスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）を含む、または本質的にそれらからなる。
【０１２５】
本明細書で使用する場合、用語「細胞培養培地」は、真核細胞、具体的には哺乳動物細胞、より具体的にはヒト細胞の成長を維持しやすいベース培養培地を含む、任意の培養培地、具体的には、任意の液体培養培地に関する。ベース培養培地は、当業者に公知である。
【０１２６】
本明細書で使用される場合、用語「から本質的になる」は、（ｉ）血漿、血清、血小板溶解物および／または血清アルブミン、好ましくは血漿、血清および／または血小板溶解物、ならびに（ｉｉ）トランスフェリンまたはその代替物、好ましくはトランスフェリン、インスリンまたはその代替物、好ましくはインスリン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３−Ｌ）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン３（ＩＬ３）、インターロイキン６（ＩＬ６）、インターロイキン１（ＩＬ１）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）およびインスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）を含み、任意の他のサイトカインまたは成長因子を含まない培養培地を指す。
【０１２７】
具体的な実施形態において、本発明の培養培地は、（ｉ）血漿、血清、血小板溶解物および／または血清アルブミン、好ましくは血漿、血清および／または血小板溶解物、ならびに、（ｉｉ）トランスフェリンまたはその代替物、好ましくはトランスフェリン、インスリンまたはその代替物、好ましくはインスリン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３−Ｌ）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン３（ＩＬ３）、インターロイキン６（ＩＬ６）、インターロイキン１（ＩＬ１）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）およびインスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）が付加されたベース培養培地として、グルタミンまたはグルタミン含有ペプチドで必要に応じて補完されたイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）を含む。
【０１２８】
好ましくは、本発明の培養培地は、５μｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬのインスリン、より好ましくは８μｇ／ｍＬ〜１２／ｍＬ、さらにより好ましくは約１０μｇ／ｍＬのインスリンを含む。好ましい実施形態では、インスリンは、ヒトインスリン、好ましくはヒト組換えインスリンである。
【０１２９】
インスリン代替物は、細胞培養培地中のインスリンと同じ機能を果たすために当業者に公知の任意の化合物とすることができる。具体的には、この代替物は、小分子またはアプタマー作用物資などの任意のインスリン受容体作用物資とすることができる。小分子インスリン受容体作用物資は、例えば、Ｑｉａｎｇら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ．２０１４  Ａｐｒ；６３（４）：１３９４−４０９に記載され、アプタマー作用物資は、例えば、Ｙｕｎｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１５  Ｓｅｐ  １８；４３（１６）：７６８８−７０１に記載されている。好ましくは、インスリンは、Ｗｏｎｇら、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２００４  Ｊｕｌ；４５（３）：１０７−１５に記載されているように、亜鉛塩で置換される。亜鉛塩の例としては、これらに限定されないが、塩化亜鉛、硝酸亜鉛、臭化亜鉛または硫酸亜鉛が挙げられる。好ましい実施形態では、インスリン代替物は亜鉛塩である。インスリン代替物の濃度は、前記化合物の性質に依存し、当業者によって容易に決定することができる。
【０１３０】
好ましくは、本発明の培養培地は、１０μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン、好ましくは３０μｇ／ｍＬ〜６０μｇ／ｍＬのトランスフェリン、さらにより好ましくは約４５μｇ／ｍＬのトランスフェリンを含む。好ましい実施形態では、トランスフェリンは、鉄飽和ヒトトランスフェリン、好ましくは組換え鉄飽和ヒトトランスフェリンである。
【０１３１】
トランスフェリン代替物は、細胞培養培地中でトランスフェリンと同様の機能を果たすことが当業者に公知の任意の化合物とすることができる。具体的には、トランスフェリンは、クエン酸第二鉄、硝酸第二鉄または硫酸第一鉄などの鉄キレート剤または無機の鉄塩で置換され得る。適切な鉄キレート剤の例としては、これらに限定されないが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、グリコールエーテルシアミン四酢酸（エグタジン酸）（ＥＧＴＡ）、メシル酸デフェロキサミン、ジメルカプロールまたはペンテト酸（ＤＰＴＡ）が挙げられる。トランスフェリン代替物の濃度は、前記化合物の性質に依存し、当業者によって容易に決定することができる。
【０１３２】
培養培地は、血漿、血清、血小板溶解物および／または血清アルブミン、好ましくは血漿、血清および／または血小板溶解物、より好ましくは血漿または血清または血小板溶解物または血清アルブミン、さらにより好ましくは血漿または血清または血小板溶解物を含み得る。培養培地は、１％〜２０％の血漿または血清、好ましくは２％〜１０％の血漿または血清、より好ましくは約５％の血漿または血清を含み得る。好ましい実施形態において、血漿または血清は、ヒト血漿または血清である。あるいは、またはさらに、培養培地は、０．１％〜２％の血小板溶解物、好ましくは０．２％〜１％の血小板溶解物、より好ましくは約０．５％の血小板溶解物を含み得る。好ましい実施形態では、血小板溶解物は、ヒト血小板溶解物である。あるいは、またはさらに、培養培地は、０．１％〜２％の血清アルブミン、好ましくは０．５％〜１％の血清アルブミンを含み得る。好ましい実施形態において、血清アルブミンは、ヒト血清アルブミンである。
【０１３３】
好ましくは、本発明の培養培地は、１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、さらにより好ましくは約２４ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを含む。好ましい実施形態では、ＳＣＦは、ヒトＳＣＦ、好ましくは組換えヒトＳＣＦである。
【０１３４】
好ましくは、本発明の培養培地は、１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、さらにより好ましくは約２１ｎｇ／ｍＬのＴＰＯを含む。好ましい実施形態では、ＴＰＯは、ヒトＴＰＯ、好ましくは組換えヒトＴＰＯである。
【０１３５】
好ましくは、本発明の培養培地は、１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ３−Ｌ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ３−Ｌ、さらにより好ましくは約２１ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ３−Ｌを含む。好ましい実施形態では、ＦＬＴ３−Ｌは、ヒトＦＬＴ３−Ｌ、好ましくは組換えヒトＦＬＴ３−Ｌである。
【０１３６】
好ましくは、本発明の培養培地は、５０ｎｇ／ｍＬ〜３００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、より好ましくは１５０ｎｇ／ｍＬ〜２５０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、さらにより好ましくは約１９４ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４を含む。好ましい実施形態では、ＢＭＰ４は、ヒトＢＭＰ４、好ましくは組換えヒトＢＭＰ４である。
【０１３７】
好ましくは、本発明の培養培地は、５０ｎｇ／ｍＬ〜３００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、より好ましくは１５０ｎｇ／ｍＬ〜２５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、さらにより好ましくは約２００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦを含む。好ましい実施形態では、ＶＥＧＦは、ヒトＶＥＧＦ、好ましくは組換えヒトＶＥＧＦ、より好ましくは組換えヒトＶＥＧＦ−Ａ１６５である。
【０１３８】
好ましくは、本発明の培養培地は、１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ３、より好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ〜８０ｎｇ／ｍＬのＩＬ３、さらにより好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ３を含む。好ましい実施形態では、ＩＬ３は、ヒトＩＬ３、好ましくは組換えヒトＩＬ３である。
【０１３９】
好ましくは、本発明の培養培地は、１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ６、より好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ〜８０ｎｇ／ｍＬのＩＬ６、さらにより好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ６を含む。好ましい実施形態では、ＩＬ６は、ヒトＩＬ６、好ましくは組換えヒトＩＬ６である。
【０１４０】
好ましくは、本発明の培養培地は、１ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ１、より好ましくは１ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ１、さらにより好ましくは約５ｎｇ／ｍＬのＩＬ１を含む。好ましい実施形態では、ＩＬ１は、ヒトＩＬ１、好ましくは組換えヒトＩＬ１である。
【０１４１】
好ましくは、本発明の培養培地は、１０ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬのＧＣＳＦ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ〜１５０ｎｇ／ｍＬのＧＣＳＦ、さらにより好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬのＧＣＳＦを含む。好ましい実施形態では、ＧＣＳＦは、ヒトＧＣＳＦ、好ましくは組換えヒトＧＣＳＦである。
【０１４２】
好ましくは、本発明の培養培地は、１ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ１、より好ましくは１ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ１、さらにより好ましくは約５ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ１を含む。好ましい実施形態では、ＩＧＦ１は、ヒトＩＧＦ１、好ましくは組換えヒトＩＧＦ１である。
【０１４３】
特定の実施形態において、本発明の液体細胞培養培地は、
１％〜２０％の血漿もしくは血清、好ましくは２％〜１０％の血漿もしくは血清、または、０．１％〜２％の血小板溶解物、好ましくは０．２％〜１％の血小板溶解物、または、０．１％〜２％の血清アルブミン、好ましくは０．５％〜１％の血清アルブミン、および／または、
５μｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬのインスリンまたはその代替物、好ましくはインスリン、好ましくは８μｇ／ｍＬ〜１２／ｍＬのインスリンまたはその代替物、好ましくはインスリン、および／または、
１０μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬのトランスフェリンまたはその代替物、好ましくはトランスフェリン、好ましくは３０μｇ／ｍＬ〜６０μｇ／ｍＬのトランスフェリンまたはその代替物、好ましくはトランスフェリン、および／または、
１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、および／または、
１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、および／または、
１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ３−Ｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ３−Ｌ、および／または、
１００ｎｇ／ｍＬ〜５００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、好ましくは１５０ｎｇ／ｍＬ〜２５０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、および／または、
５０ｎｇ／ｍＬ〜３００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、好ましくは１５０ｎｇ／ｍＬ〜２５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、および／または、
１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ３、好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ〜８０ｎｇ／ｍＬのＩＬ３、および／または、
１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ６、好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ〜８０ｎｇ／ｍＬのＩＬ６、および／または、
１ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ１、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ１、および／または、
１０ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬのＧＣＳＦ、好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ〜１５０ｎｇ／ｍＬのＧＣＳＦ、および／または、
１ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ１、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ１
を含む。
【０１４４】
好ましくは、培地は、これらすべての特徴を満たしている。
【０１４５】
別の特定の実施形態において、本発明の液体細胞培養培地は、
１％〜２０％の血漿もしくは血清、好ましくは２％〜１０％の血漿もしくは血清、または、０．１％〜２％の血小板溶解物、好ましくは０．２％〜１％の血小板溶解物、および／または、
５μｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬのインスリン、好ましくは８μｇ／ｍＬ〜１２μｇ／ｍＬのインスリン、および／または、
１０μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン、好ましくは３０μｇ／ｍＬ〜６０μｇ／ｍＬのトランスフェリン、および／または、
１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、および／または、
１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、および／または、
１００ｎｇ／ｍＬ〜５００ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ３−Ｌ、好ましくは２５０ｎｇ／ｍＬ〜３５０ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ３−Ｌ、および／または、
１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、および／または、
５０ｎｇ／ｍＬ〜３００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、好ましくは１５０ｎｇ／ｍＬ〜２５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、および／または、
１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ３、好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ〜８０ｎｇ／ｍＬのＩＬ３、および／または、
１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ６、好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ〜８０ｎｇ／ｍＬのＩＬ６、および／または、
１ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ１、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ１、および／または、
１０ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬのＧＣＳＦ、好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ〜１５０ｎｇ／ｍＬのＧＣＳＦ、および／または、
１０ｎｇ／ｍＬ〜１５０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ１、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ１
を含む。
【０１４６】
好ましくは、培地は、これらすべての特徴を満たしている。
【０１４７】
別の特定の実施形態において、本発明の液体細胞培養培地は、
１％〜２０％の血漿もしくは血清、好ましくは２％〜１０％の血漿もしくは血清、または、０．１％〜２％の血小板溶解物、好ましくは０．２％〜１％の血小板溶解物、および／または、
５μｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬのインスリン、好ましくは８μｇ／ｍＬ〜１２μｇ／ｍＬのインスリン、および／または、
１０μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬのトランスフェリン、好ましくは３０μｇ／ｍＬ〜６０μｇ／ｍＬのトランスフェリン、および／または、
１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、および／または、
１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、および／または、
１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ３−Ｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ３−Ｌ、および／または、
１００ｎｇ／ｍＬ〜５００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、好ましくは１５０ｎｇ／ｍＬ〜２５０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、および／または、
５０ｎｇ／ｍＬ〜３００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、好ましくは１５０ｎｇ／ｍＬ〜２５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、および／または、
１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ３、好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ〜８０ｎｇ／ｍＬのＩＬ３、および／または、
１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ６、好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ〜８０ｎｇ／ｍＬのＩＬ６、および／または、
１ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ１、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ１、および／または、
１０ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬのＧＣＳＦ、好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ〜１５０ｎｇ／ｍＬのＧＣＳＦ、および／または、
１ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ１、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ１
を含む。
【０１４８】
好ましくは、培地は、これらすべての特徴を満たしている。
【０１４９】
別の具体的な実施形態において、本発明の液体細胞培養培地は、（ｉ）約５％の血漿もしくは血清または約０．５％の血小板溶解物、および（ｉｉ）約１０μｇ／ｍＬのインスリン、約４５μｇ／ｍＬのトランスフェリン、約２２ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、約２０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、約３００ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ３−Ｌ、約２２ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、約２００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、約５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ３、約５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ６、約５ｎｇ／ｍＬのＩＬ１、約１００ｎｇ／ｍＬのＧＣＳＦおよび約５０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ１を含む。
【０１５０】
さらに具体的な実施形態において、本発明の液体細胞培養培地は、（ｉ）約５％の血漿もしくは血清または約０．５％の血小板溶解物、および（ｉｉ）約１０μｇ／ｍＬのインスリン、約４５μｇ／ｍＬのトランスフェリン、約２４ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、約２１ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、約２１ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ３−Ｌ、約１９４ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、約２００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、約５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ３、約５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ６、約５ｎｇ／ｍＬのＩＬ１、約１００ｎｇ／ｍＬのＧＣＳＦおよび約５ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ１を含む。
【０１５１】
培養培地が血漿または血清を含む実施形態において、それは、有利にはさらにヘパリン、好ましくは０．５Ｕ／ｍＬ〜５Ｕ／ｍＬのヘパリン、より好ましくは２Ｕ／ｍＬ〜４Ｕ／ｍＬのヘパリン、さらにより好ましくは約３Ｕ／ｍＬのヘパリンを含む。
【０１５２】
本発明はまた、具体的にはフィーダー細胞の不在時の、造血系統の細胞の成長および／または分化のための、胚様体の分化のための、造血細胞移植片の産生のための、本発明の液体細胞培養培地の使用に関する。
【０１５３】
本明細書で使用する場合、用語「成長」は、培養細胞の成長を指し、用語「分化」は、造血系統に細胞をコミットさせる細胞特性の培養培地中で培養される細胞による獲得を指す。本明細書で使用する場合、用語「造血系統の細胞」は、哺乳動物の、具体的にはヒトの血液中に見出される細胞を指す。
【０１５４】
本発明の細胞培養培地は、胚性幹細胞およびｉＰＳＣなどの多能性幹細胞、胚様体、ならびに、ＣＤ１３５＋、ＣＤ１１０＋および／またはＡＰＬＮＲ＋  ＨＳＣなどの初期原始ＨＳＣを含むＨＳＣの成長および／または分化について特に有用である。
【０１５５】
本明細書にて参照または引用されるすべての特許、特許出願、仮出願、および刊行物は、それらが本明細書の明白な教示と矛盾しない程度において、すべての図および表を含め、その全体が参照として援用される。
【０１５６】
以下の実施例は、例示目的のために与えられ、限定されるものではない。
【実施例】
【０１５７】
実施例１
材料および方法
ｈｉＰＳＣ増幅
本研究は、３つの異なるｈｉＰＳＣ株：レトロウイルスベクターおよびトムソンの組み合わせで再プログラムされたＦＤ１３６−２５（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８の内因性発現）；エピソームで再プログラムされたＰｃｉ−１４２６およびＰｃｉ−１４３２株（Ｐｈｅｎｏｃｅｌｌ社）（Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、ＫＬＦ、ｃＭｙｃ）、を用いて行った。ｈｉＰＳＣは、ＴＥＳＲ２培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において、ＣｅｌｌＳｔａｒｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＵＳＡ）で維持し、細胞を、ＴＲＹｐｌｅセレクト（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）での標準クランプ継代を使用して５日ごとに新たにコーティングされたプレート上に１：６で継代した。
【０１５８】
ＥＢ分化
２４時間後、細胞を、２４ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、２１ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、２１ｎｇ／ｍＬのＦＬＴ３Ｌ、１９４ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、２００ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ３、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ６、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ１、１００ｎｇ／ｍＬのＧＣＳＦ、５ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ１を含む分化培地に移した（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社、Ｎｅｕｉｌｌｙ−ｓｕｒ−ｓｅｉｎｅ、フランス）。培地は１日おきに交換された。ＥＢは、１５、１６、１７日目に解離させた。
【０１５９】
コロニーアッセイ
示された時間において、１×１０５の解離ＥＢ細胞または３×ｌ０４の異種移植レシピエントＢＭからの細胞を、ＳＣＦ、ＩＬ−３、ＥＰＯおよびＧＭ−ＣＳＦの存在下で３ｍＬの完全メチルセルロース培地中に播種した（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社、Ｎｅｕｉｌｌｙ−ｓｕｒ−ｓｅｉｎｅ、フランス）。Ｇ−ＣＳＦがまたマウス前駆細胞を刺激するので、それは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）で置換された。混合物のアリコート（１ｍＬ）を２回、１つの３０ｍｍシャーレに分配し、１４日間、加湿チャンバ中で維持した。コロニー形成細胞（ＣＦＣ）は、１４日目にスコアリングされた。
【０１６０】
長期培養開始細胞アッセイ
長期培養開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）アッセイを、ＥＢについて１７日目に、対照ＣＤ３４＋について０日目に、１５〜１００，０００細胞／ウェルで、前述のように実施した（例えば、ＭｉｌｌｅｒおよびＥａｖｅｓ、Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＭｅｄｉｃｉｎｅシリーズのＶｏｌｕｍｅ  ６３  ｐｐ１２３−１４１を参照されたい）。絶対ＬＴＣ−ＩＣカウントは、ポアソン統計を用いて３７％の陰性ウェルをもたらす細胞濃度に相当した。
【０１６１】
擬似微小管およびＥＰＣ様細胞
擬似微小管形成のために、細胞を、成長因子低減マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）およびＥＧＭ２培地（Ｌｏｎｚａ社）での培養に移した。
【０１６２】
ＥＰＣ様細胞の生成のために、細胞をまずゼラチンに播種し、ＥＢＭ２（Ｌｏｎｚａ社）で培養し、数回分割し、最初の継代後、ゼラチンはもはや必須ではなくなった。
【０１６３】
フローサイトメトリ
ＢＭ細胞または解離ＥＢの染色を、１００μＬの染色バッファ（２％ＦＢＳを含有するＰＢＳ）中の２×１０５細胞について、暗所において室温で２０分間、各抗体の５：１００希釈で行った。データ収集は、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＣａｎｔｏIIサイトメータで行った。
【０１６４】
血管新生可能性のインビボ分析
１．７５０  １０６Ｄ１６単一細胞またはｈＥＰＣおよび１．７５０  １０６ｈＭＳＣを、１００μｌのマトリゲルフェノールレッドフリーおよび成長因子低減し（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）と混合し、ヌードマウスの背中に皮下注入した（２つの異なるプラグ／マウス）。対照も同様に行ったが、３．５  １０６ｈＭＳＣまたはＤ１６単一細胞またはｈＥＰＣｓであった：各条件についてｎ＝３。２週間後、マウスを犠牲にし、マトリゲルプラグを切開し、パラフィン切片用に加工した。切片を、脱パラフィンし、水和させ、マッソントリクローム、ヘマトキシリンでの核染色を含む３色プロトコル、酸性フクシン／キシキジンポンソーでの細胞質染色およびライトグリーンＳＦでのコラーゲン染色（すべてＶＷＲ社から）で、または、ヒトフォンヴィレブランド因子（Ｄａｋｏ社）で染色し、染色をヒストグリーン基質（Ａｂｃｙｓ社）で発色させ、Ｆａｓｔ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｄ（Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ社）で対比染色し、脱水し、マウントし、または、一次抗体としてのｈＣＤ３１（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍ社）および二次抗体としてのロバ抗ウサギＣｙ３（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｃｈ社）およびＤＡＰＩを用い、フルオロマウントＧでマウントした。
【０１６５】
ＡＰＬＮＲ陽性細胞の選別
上記のように、細胞を抗体ｈＡＰＪ−ＡＰＣで染色した。選別は、Ｍｏｆｌｏ  ＡＳＴＲＩＯＳ  Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社装置上で実行され、純度は９８．１％のＡＰＬＮＲ陽性細胞であった。
【０１６６】
マウス移植
ＮＯＤ／ＳＣＩＤ−ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）またはＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩ１２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）またはＦｏｘｎ１−／−ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社、Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ、フランス）を、ＩＲＳＮ動物介護施設で飼育した。すべての実験および手順は、動物実験についてのフランス農務省規制を遵守して行われ、地元倫理委員会によって承認された。
【０１６７】
６〜８週齢および無菌条件下飼育のマウスに、セシウム１３７源から２．５グレイ（２．１１５Ｇｙ／分）で細胞注入の２４時間前に、致死量未満で照射した。実験間の整合性を確保するために、雄マウスのみを用いた。移植前に、マウスをケタミンおよびキシラジンの腹腔内注射で一時的に鎮静させた。細胞（０．４×１０６／マウス）を、２８．５ゲージのインスリン針を用い、１００μＬの容量で眼窩後部注射により移植した。合計１４０匹のマウスを、この研究に使用した。
３つの異なるｈｉＰＳＣ株のＤ１７細胞の生着可能性について：
７０匹のＮＳＧマウスを次のように使用した：３０匹の一次レシピエント、３０匹の二次レシピエントおよび対照としての１０匹。
【０１６８】
４８匹のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスを次のように使用した：２０匹の一次レシピエントおよび１６匹の二次レシピエント、３匹の三次レシピエントおよび対照としての９匹。
ＡＰＬＮＲ＋およびＡＰＬＮＲ−集団の生着可能性について：１０匹のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスを使用し、３匹のＮＯＤ−ＳＣＩＤを対照とした。
【０１６９】
内皮および造血可能性のインビボ評価を、９匹のヌードマウスでプロービングした。
【０１７０】
ヒト細胞生着評価
マウスを１２、１８または２０週で屠殺した。大腿骨、脛骨、肝臓、脾臓および胸腺を除去した。単一細胞懸濁液を標準的なフラッシングによって調製し、１×１０６個の細胞を含むアリコートを総容積２００μＬの染色緩衝液で染色した。
【０１７１】
サンプルを、次のマーカを用いて生着評価のために染色した：ｈＣＤ４５クローンＪ３３、ｈＣＤ４３クローンＤＦＴ１、ｈＣＤ３４クローン５８１（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）およびｈＣＤ４５クローン５Ｂ１、ｍＣＤ４５クローン３０Ｆ１１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）。
【０１７２】
ＢＭをプールして、ｈＣＤ４５マイクロビーズ濃縮（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を可能にし、多系統を、次のヒトマーカを用いて評価した：ｈＣＤ３クローンＵＣＨＴ１、ｈＣＤ４クローン１３Ｂ８．２、ｈＣＤ８クローンＢ９．１１、ｈＣＤ１４クローンＲＭＯ５２、ｈＣＤ１５クローン８０Ｈ５、ｈＣＤ１９クローンＪ３−１１９、ｈＣＤ２０クローンＢ９Ｅ９、ｈＣＤ４１クローンＰ２、ｈＣＤ６１クローンＳＺ２１、ｈＣＤ４３クローンＤＦＴ１、ｈＣＤ３４−ＡＰＣ、ｈＣＤ７１クローンＹＤＪ１．２．２（すべてＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社、ブレア、ＵＳＡの抗体から）、ＣＤ４５クローン５Ｂ１（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）、ＣＤ２３５ａクローンＧＡ−Ｒ２（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）。
【０１７３】
血液サンプルをプールし、ｈＣＤ４５マイクロビーズ選別（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を可能にした。多系統可能性を、次のヒトマーカを用いて評価した：ｈＣＤ３クローンＵＣＨＴ１、ｈＣＤ４クローン１３Ｂ８．２、ｈＣＤ８クローンＢ９．１１、ｈＣＤ１４クローンＲＭＯ５２、ｈＣＤ１５クローン８０Ｈ５、ｈＣＤ１９クローンＪ３−１１９、ｈＣＤ２０クローンＢ９Ｅ９、ｈＣＤ４１クローンＰ２、ｈＣＤ６１クローンＳＺ２１（すべてＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社、ブレア、ＵＳＡの抗体から）。
【０１７４】
非注入マウスＢＭを、非特異的染色のための対照として使用した。
【０１７５】
代償作用を抗マウスＩｇを用いたＦＭＯ法により行い、データをＢＤＣａｎｔｏＩＩサイトメータで得た。
【０１７６】
Ｔ細胞成熟および機能アッセイ
３匹のマウスの血液をプールしてｈＣＤ２マイクロビーズ選別（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を可能にし、ＴＣＲαβおよびＴＣＲγδの存在を、次のヒトマーカを用いてフローサイトメトリによって評価した：ＴＣＲαβクローンＩＰ２６ＡおよびＴＣＲγδクローンＩＭＭＵ５１０（すべてＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社、ブレア、ＵＳＡの抗体から）。
【０１７７】
胸腺および脾臓細胞を単離し、ＣＦＳＥ標識し、ｈＣＤ３およびｈＣＤ２８（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社、両方とも１μｇ／ｍＬ）で補完したかまたはしていない細胞培養培地中に播種した。５日後、細胞を採取し、抗ｈＣＤ３クローンＵＣＨＴ１で染色し、ＢＤＣａｎｔｏＩＩサイトメータにて分析した。ＦｌｏｗＪｏ分析ソフトウェアを使用して、ＣＤ３＋Ｔ細胞上でゲートし、重ね合わせヒストグラムプロットを生成した。
【０１７８】
胸腺細胞の存在を評価するために、胸腺細胞を、ｈＣＤ１ＡクローンＢＬ６（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社、ブレア、ＵＳＡの抗体から）でマークした。
【０１７９】
ＡＰＬＮＲ細胞安全性評価
３匹を致死量以下に照射したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにそれぞれ、３００万のＡＰＬＮＲ陽性細胞を皮下注射した。奇形腫は、ＦＤＡガイドライン（材料および方法）による２ヶ月のフォローアップ後には発見されなかった。
【０１８０】
また、臓器分析後（１４０匹／１４０匹のマウス）、または異なる組織（脳、肺、腎臓、ＢＭ、肝臓および腸）の顕微鏡分析後（１４０匹／１４０匹のマウス）に、いずれのマウスにおいてもまったく腫瘍は肉眼で検出されなかった。
【０１８１】
定量的ＰＣＲ
総ｍＲＮＡを、ＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社、クルタブフ、フランス）を用いて単離した。ｍＲＮＡ完全性を、バイオアナライザー２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、マッシー、フランス）で確認した。ｃＤＮＡを、スーパースクリプト（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、カールスバード、ＵＳＡ）での逆転写により構築した。ＴａｑＭａｎＰＣＲマスターミックス（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）および選択された遺伝子（下記の表を参照）についての特異的プライマー（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社、カールスバード、ＵＳＡ）を配列検出システム（ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ１２Ｋ  ＦｌｅｘＲｅａｌ−ＴｉｍｅＰＣＲシステム、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）とともに用いて、ＰＣＲアッセイを実施した。各サンプルにおいて、各標的遺伝子の蛍光ＰＣＲ信号は、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の蛍光シグナルに正規化された。
【０１８２】
マウスＢＭからのｍＲＮＡのヒト起源を、ｈＣＤ４５、ｈＣＤ１５、ｈＭＰＯ、ｈＩＴＧＡ２およびｈＧＡＰＤＨを測定することによって評価した。マウスＢＭにおけるＣＦＣポスト移植およびグロビン型発現から、我々は、Ｔａｑｍａｎプローブを使用して、ベータ、ガンマおよびイプシロングロビンを測定した。
【０１８３】
対照は、臍帯血ＣＤ３４＋から生成された培養赤芽球であった。
【０１８４】
【表１】
2020511150.tif 000002
【０１８５】
統計分析
すべての統計は、Ｒソフトウェア３．１．１（２０１４年７月１０日）（Ｒコアチーム社、２０１３）、ＩＮＧＥＮＵＩＴＹおよびＳＡＭソフトウェアを用いて決定した。データは、階層的クラスタリングおよびＰＣＡで表現されている。
【０１８６】
結果
第１の移植可能ＨＳＣは、内皮細胞（ＥＣ）の特殊化集団から胚発生時に産生され、造血内皮と呼ばれる。内皮造血移行（ＥＨＴ）に続き、これらの造血ＥＣは、ＨＳＣを含む造血細胞（ＨＣ）に分化し、循環に入り、胎児の肝臓で増幅され、定着の決定的な部位であるＢＭを実現する。発達上の造血のこれらの初期ステップは、胚様体（ＥＢ）の培養、特に、造血ＥＣの生成およびＨＣの出芽に完全に繰り返される。
【０１８７】
本発明者らは、内皮造血系統にｈｉＰＳＣの分化を方向づける、１ステップのベクターフリーおよび間質フリーのシステム手順を開発した。すべてのサイトカインおよび成長因子は、任意の必要性を満たすために、０日目（Ｄ）から培養期間の最後まで存在する。多くの研究は、１４Ｄ長プロトコルを使用し、ＥＢにおける造血バーストの存在に基づいてＤ１１〜１４間の細胞を単離する。本発明者らは、Ｄ１７においてもバーストを得ることなく、したがって、分化プロセスの劇的な遅延を評価した（図１Ａ）。これらの培養条件は、同様の分化効力を有する、例えばエピソームまたはレトロウイルスの、それらの再プログラミングプロトコルによって異なる、３つの異なるｈｉＰＳＣ細胞株に適用され、したがって方法の頑丈さが示された。
【０１８８】
造血ＥＣ／初期ＨＣコミットメントの点を決定することを目指し、本発明者らは、多能性遺伝子の発現について、およびキーとなる内皮および造血特異的遺伝子の４９個について、ＣＤ３４＋臍帯血ＨＳＣの分子プロファイルを参照としつつ、Ｄ３、７、９、１３、１５、１６および１７におけるｑＲＴ−ＰＣＲによってＥＢ細胞を分析した。階層的クラスタリング分析（図１Ｂ）は、２つの主要なグループ、すなわち、ＣＤ３４＋臍帯血細胞に関連したもの、およびＥＢ細胞に関連したもの、の存在を示した（Ｄ３〜１７日目）。後者は、２つの異なるクラスタに分割される：初期ＥＢ細胞（Ｄ３〜１３）を含むもの、および、Ｄ１３〜１５の間のバランスポイントの存在を示唆する後期ＥＢ細胞（Ｄ１５〜１７）を包含するもの。ｑＰＣＲパターンのより徹底した分析により、Ｄ１３がＣＤ３０９（ＶＥＧＦＲ２）ｍＲＮＡ発現に基づくＥＣコミットメントの点として同定され、Ｄ１６がＲＵＮＸ１  ｍＲＮＡ発現に基づく推定造血内皮コミットメントの点とされた（図１Ｃ）。ＩＴＧＡ２（インテグリンアルファ−２）およびＣＥＢＰＡ（ＣＣＡＡＴエンハンサー結合タンパク質アルファ）などの造血細胞特異的マーカも、ＲＵＮＸｌ発現の開始に合わせてＤ１６からアップレギュレートされた。Ｄ１７細胞は、ＨＣ特異的遺伝子の発現の増加によって示されるように、ＣＤ３４＋細胞プロファイルに向かって収束する傾向を示した（データは示さず）。バランスポイントを確認するために、本発明者らは、ＥＣマーカとしてＣＤ３０９の、初期ＨＣマーカとしてＭＰＬ、ＣＫＩＴおよびＩＴＧＡ２の表面発現についてフローサイトメトリによって細胞集団を分析した。ｑ−ＰＣＲ分析（図１Ｃ）に合わせて、フローサイトメトリ分析は、Ｄ１３〜１７のＣＤ３０９の減少およびＩＴＧＡ２、ＣＫＩＴおよびＭＰＬの増加を確認した（図１Ｄ）。彼らはさらに、Ｄ１５〜１７細胞における初期造血コミットメントに関するアペリン受容体（ＡＰＬＮＲ）の発現を示す細胞集団を同定し、その中で、サブ画分は、運動およびホーミング受容体ＣＸＣＲ４の発現を徐々に獲得した（図１Ｅ）。
【０１８９】
彼らは次に、専用のインビトロ機能試験を使用して、Ｄ１５、１６および１７におけるＥＢ細胞の内皮および造血可能性を評価した（図２Ａ）。内皮コロニー形成細胞（ＣＦＣ−ＥＣ）（図２Ａ１）、擬似微小管（図２Ａ２）およびＥＣ様細胞（図２Ａ３）を生成するその能力によって明らかにされるように、Ｄ１５細胞は、強力な内皮形成可能性を示したが、造血形成能力を欠いており、クローン原性コロニーを生成することができず、長期培養開始細胞の非常に低い頻度を示した。対照的に、Ｄ１７細胞は、内皮可能性は欠けていたが、造血能の有意な増加を示し（図２Ａ４、Ａ５）、この期間内の造血コミットメントの開始が確認された。
【０１９０】
Ｄ１６バランスポイントは、マトリゲル（成長因子減少）プラグにおいてヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を含むまたは含まない細胞を免疫無防備Ｆｏｘｎ１−／−（ヌード）マウスに皮下移植することによってインビボで調査された（図２Ｂ）。移植後２週間で、ヒトＣＤ３１＋細胞およびフォン・ヴィレブランド＋細胞から作られたヒト血管構造（図２Ｃ、Ｄ）が、Ｄ１６細胞および（／）ｈＭＳＣを含む移植片において検出された。ＱＲＴ  ＰＣＲは、Ｄ１６細胞／ｈＭＳＣで作られた移植片において、そして予想通り、内皮前駆細胞／ｈＭＳＣで作られた移植片において、ｈＶＥＧＦＲ２、ｈＥＮＧ（ＥＮＤＯＧＬＩＮ）、ｈＰＥＣＡＭ−１の発現を明らかにした（データは示していない）。また、Ｄ１６細胞／ｈＭＳＣプラグが、ヒトベータ、ガンマおよびイプシロングロビン転写物を発現する一方、Ｄ１６細胞のみのプラグは、成熟のブロックを示すヒトイプシロングロビン転写物を発現するのみであった。Ｄ１６細胞はしたがって、インビトロの結果に合わせてバランスされた内皮造血パターンを示した。
【０１９１】
Ｄ１７細胞が最強の造血能力を示したので、本発明者らは、致死量以下の照射（３．５グレイ）した８週齢の免疫無防備マウスに２０週間にわたって４×１０５個の細胞を移植し、続いて、２０週間の追加期間にわたって同様に処理した免疫無防備レシピエントに困難な二次移植を行った（図３Ａ）。ヒトＨＣの存在は、ｈＣＤ３４、ｈＣＤ４３およびｈＣＤ４５のそれらの表面発現を介して定量化された（図３Ｂ、Ｃ、Ｄ）。多系統ヒト造血は、３０匹／３０匹の一次レシピエントマウスにおいて明らかであり（図３Ｃ）、総マウスＢＭ単核細胞間で、平均２０．３＋／−２．９％のｈＣＤ４５＋細胞となり、すなわち、通常、ＮＳＧマウスにおけるヒトＨＣ生着について陽性と考えられる０．１％の閾値の２０３倍であり（Ｔｏｕｒｉｎｏら、Ｔｈｅ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ｊｏｕｒｎａｌ：ｔｈｅ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ／ＥＨＡ２、１０８−１１６（２００１））、１２．２＋／−１．５％のｈＣＤ４３＋および７．２９＋／−１．０％のｈＣＤ３４＋であった（図３Ｃ）。ｈＣＤ４５＋ＢＭ集団内で、いくつかのヒトＨＣ系統は、Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ４５＋）、Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４５＋、ＣＤ４＋ＣＤ４５＋）、マクロファージ（ＣＤ１４＋ＣＤ４５＋、ＣＤ１５＋ＣＤ４５＋）（図３Ｅ、図Ｓ３Ｈ）、および赤血球前駆細胞／前駆体（ＣＤ２３５ａ＋ＣＤ４５＋）（図示せず）を含むことが検出された。選別されたｈＣＤ４５＋末梢血細胞は、移植細胞の末梢化を示す同じ多系統パターンを示した。移植細胞のヒト起源が、ＣＤ４５、ＣＤ１５、ＭＰＯ、ＩＴＧＡ２およびＧＡＰＤＨ遺伝子についてヒト特異的プライマーを用いたｑ−ＰＣＲによって確認された（ｎ＝３０／３０）。ヒト特異的クローン原性アッセイは、第１のレシピエントマウスから単離されたＢＭ細胞上で行われ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ、ＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−ＧＭコロニー（図３Ｇ１、２、３）に分配された１０４個の総ＢＭ細胞（図３Ｆ）から１７．５＋／−４．３クローンとの全体的頻度を明らかにした。サイトスピン分析は、成熟マクロファージ、ヒスチオモノサイト、骨髄球および赤芽球の存在を明らかにした（図３Ｈ１、２、３）。一次レシピエントの７．１０６個のＢＭ細胞は、二次（ｎ＝３０）レシピエントに免疫試験され、および（図３Ｂ、Ｄ）、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの場合には最終的に三次レシピエント（ｎ＝３）免疫試験をされた（データは示さず）。ヒトＣＤ４５＋細胞は、単核ＢＭ細胞の１２．６＋／−３．９％を示し（図３Ｂ、Ｄ）、持続的再構成能力を示した。多系統生着は、３０匹／３０匹マウスにおいて見出された（図３Ｅ）。ヒトＣＦＣの全体的なクローニング効率は、１０４個の総マウスＢＭ細胞の５．５＋／−３．１％であり、堅牢で長期の自己再生能力（図３Ｆ−Ｈ）を示した。移植された細胞のヒト起源は、上記のように確認された。
【０１９２】
移植細胞の機能性を確保するために、本発明者らは、マウス骨髄からヒト赤血球前駆体の能力を分析し、インビボでヘモグロビンスイッチングを行い、Ｔ細胞の表現型および機能性を試験した。一次および二次レシピエントの両方からの移植細胞は、高いβ（それぞれ３９．５１＋／−４．９５および３６．６１＋／−５．８６）およびγグロビン（それぞれ５７．４９＋／−３．９５および６１．３９＋／−４．８６）の量を示すヒト赤血球前駆体を生成することができた一方、εグロビンはそれぞれ総グロビンの３．０＋／−１．２％、２．１＋／−１．１％に劇的に減少した（図３Ｉ）。胚性サイレンシングおよび成人グロビン発現の活性化は、決定的な赤血球の指標である。末梢血単離ｈＣＤ２＋Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞能力の成熟を評価する多量のＴＣＲαβ（図３Ｊ）および非常に少量のＴＣＲγδを示した。ｈＣＤ３およびｈＣＤ２８刺激の下で、ＣＳＦＥ標識によって測定されるように、胸腺および脾臓細胞を、それらのインビトロの能力拡大について試験した。５日後、ｈＣＤ３＋発現にてゲートされた胸腺（図３Ｋ）および脾臓（データは示していない）細胞は、高い増殖能力を示し、それによって、ヒトＴ細胞の機能性を実証した。
【０１９３】
図４Ａは、移植後１８週の一次ＮＯＤ−ＳＣＩＤレシピエントにおけるｈＣＤ４５＋細胞のパーセンテージに対する、報告された培養起端におけるＥＢのＡＰＬＮＲ＋細胞のパーセンテージを示す。本発明者らは、ＡＰＬＮＲ＋および−集団を選別し、ＮＯＤ−ＳＣＩＤモデルにおいてインビボでそれらの生着能力を比較した。ＡＰＬＮＲ＋細胞は、正常に１８週間後に造血を再構成した（図４Ｂ）。移植されたマウス６匹／６匹において、ヒトＣＤ４５＋細胞は、マウスＢＭにおける単核細胞の６．６＋／−１．９％を占め、３．４＋／−２．５％がｈＣＤ４３＋であり、１．１＋／−０．４％がｈＣＤ３４＋であった（図４Ｂ、図５）。ＢＭ細胞のフローサイトメトリ分析は、ヒト多系統表現型を明らかにした（データは示していない）。Ｄ１７のＡＰＬＮＲ＋細胞は、任意のＣＤ４５＋細胞を保有せず、したがって再構成能力がｈＣＤ４５＋コミット前駆細胞の存在によるものではなかったことを示した（図４Ｃ）。対照的に、ＡＰＬＮＲ−細胞は、マウスＢＭ中の０．０８＋／−０．０１％ｈＣＤ４５＋細胞を伴う４匹／４匹マウスでは、有意なレベルの生着に失敗した（図４Ｂおよび図５）。興味深いのは、ＡＰＬＮＲ＋画分は、マウスで説明したＥＮＧ＋／ＴＩＥ＋／ＣＫＩＴ＋（図４Ｃ）の均質な集団が決定的造血を増強することを示した。
【０１９４】
ＡＰＮＬＲ＋集団をさらに特徴付けるために、本発明者らは、多能性状態および内皮、造血内皮または造血コミットメントを表す遺伝子セットの発現に関して、ＡＰＬＮＲ＋および−細胞の分子プロファイルを、ｈｉＰＳＣの分子プロファイルおよび対照ＣＤ３４＋ＨＳＣと比較した。研究される４９個のｍＲＮＡのセットを変数として用い、６つの細胞集団を観察として用いる、ΔＣｔによって表されるときの遺伝子発現レベルの主成分分析（ＰＣＡ）（図４Ｄ）は、第１の成分が、同様に因子「造血分化」に対応し、分散の４４．９％を占めることを明らかにした。移植可能性に関わる特性をさらに明らかにすることを目指して、彼らはＰＣＡによってＡＰＬＮＲ＋、Ｄ１７およびＨＳＣ集団を、ＡＰＬＮＲ−およびｈｉＰＳＣ集団と比較した。分散の１９．２３％を占める第３の成分は、集団をそれらの移植可能性によって異なる２つのグループに分離した（図４Ｅ）。遺伝子発現および応答変数間の関係の強さを測定する統計ＳＡＭ試験は、内皮遺伝子をそれらの間で移植できないグループにおいて有意によりアップレギュレートされる８つの遺伝子（ＦＤＲ＜１０％）をＴＥＫ、ＰＥＣＡＭ、およびＫＤＲと指摘した（図４Ｆ）。
【０１９５】
これらの知見に基づいて、本発明者らは、インビボでの多系統造血再構成および自己再生をサポートする長期多能ＨＳＣの生成は、初期分化細胞を通過して、ＥＨＴを受けてＡＰＬＮＲを発現することを示した。これらの実験は、ＧＭＰグレード培養条件の下で行われ、それによって、ＨＳＣ移植についての細胞の優先的供給源として多能性幹細胞の使用に道を開いた。
【０１９６】
実施例２
材料および方法
ｈｉＰＳＣ増幅、ＥＢ分化、ヒト細胞生着の評価、Ｔ細胞の成熟および機能性アッセイ、定量的ＰＣＲを、上述のように行った。
【０１９７】
細胞選別
解離されたＥＢ細胞を、抗体ＣＤ１１０−ＰＥ（ＭＰＬ）またはＣＤ１３５−ＰＥ（ＦＬＴ３）で染色し、そしてＰＥマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）で再染色し、最終的にＭＡＣＳ（登録商標）細胞分離装置で選別した。
【０１９８】
マウス移植
ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩ１２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社、ラルブレル、フランス）を、ＩＲＳＮ動物介護施設で飼育した。すべての実験および手順は、動物実験についてのフランス農務省規制を遵守して行われ、地元倫理委員会によって承認された。
【０１９９】
６〜８週齢および無菌条件下飼育のマウスに、セシウム１３７源から３．５グレイ（２．１１５Ｇｙ／分）で細胞注入の２４時間前に、致死量未満に照射した。実験間の整合性を確保するために、雄マウスのみを用いた。移植前に、マウスをケタミンおよびキシラジンの腹腔内注射で一時的に鎮静させた。ＭＰＬ＋またはＦＬＴ３＋細胞（１０４／マウス）を、２８．５ゲージのインスリン針を用い、１００μＬの容量で後眼窩注射により移植した。
３つの異なるｈｉＰＳＣ株のＤ１７細胞の生着可能性について：
５０匹のＮＳＧマウスを次のように使用した：２５匹の一次レシピエント、２５匹の二次レシピエント。
【０２００】
バイオインフォマティクス
バイオインフォマティクス分析を、Ｒ環境ソフトウェア  バージョン３．０．２で行った。公開利用可能なトランスクリプトームデータセットが、遺伝子発現オムニバス（ＧＥＯ）データベースで、正規化されたマトリックス（ＧＳＥフォーマット：遺伝子発現マトリックス）としてダウンロードされた（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／）。
【０２０１】
結果
多能性細胞（ＩＰＳＣ：人工多能性細胞）の分化に由来するｓｃｉｄ再増殖細胞（ＳＲＣ）を良好に特徴付けるために、本発明者らは、行われる一次または二次移植の成功への異種移植能力を考慮してトランスクリプトームのサンプルを分析した。トランスクリプトームシリーズは統合され、一次異種移植能力のみを有するＩＰＳＣのグループ（グループＧＩ、ｎ＝３）、ならびに、一次および二次異種移植能力を有するＩＰＳＣのグループ（グループＧＩおよびＧＩＩ、ｎ＝３）と比較して、造血幹細胞（ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ９０＋の表現型を有するＨＳＣ、ｎ＝３）を選別する対照グループを構築した。バッチ効果の数学的補正後、一方向ＡＮＯＶＡ（分散分析、ｐ値１Ｅ−４未満）の教師あり分析を、３つの定義サンプルグループ（ＨＳＣ、ＧＩ、ＧＩ＆ＩＩ）間で行った。教師なし主成分分析を、グループ間の５８５９個の差次的遺伝子上で行い、主要マップ（図６）上で４．７５Ｅ−８のｐ値を有するサンプルのグループを有意に識別することができた。これらの結果は、一次および／または二次移植を与える能力を考慮すると選択遺伝子がＳＲＣ−ＩＰＳＣの異種移植表現型の研究に潜在的に関連があることを示唆している。また、トランスクリプトームデータセットに関連するバッチ効果は、この教師なし分析の間に表現型グループ判別に影響を与えないことを示した。各異種移植グループとＨＳＣグループとの間のマイクロアレイ有意分析（ＳＡＭ）による教師あり分析を、ＳＲＣ−ＩＰＳＣの各グループ内のＨＳＣバイオマーカを発見するために行った。リレーショナルサーコスプロット（図７）において、ＨＳＣバイオマーカのより大きな多様性が、ＧＩグループよりもＧＩ＆ＧＩＩグループについて見出された。ＧＩ＆ＧＩＩグループについてのこの特定の多様性は、中胚葉、多能性幹細胞およびＩＰＳＣなどの機能カテゴリを構成した。ＧＩグループについてのバイオマーカの特異性は、骨芽細胞および脂肪細胞などのより間葉系の表現型に関係する。他の方法では、共通のバイオマーカは、造血前駆細胞、赤芽球前駆細胞、ＣＤ３４＋細胞、骨髄およびＣＤ１４＋細胞などの造血系統でより多く発見された。ＳＲＣ−ＩＰＳＣの特性におけるＨＳＣ発現プロファイル（ＣＤ３４＋３８−９０＋）の影響を見るために、ＳＲＣ−ＩＰＳＣグループを比較するための教師あり分析にＨＳＣグループが導入された。教師なし分類によって行われる発現ヒートマップは、各異種移植ＳＲＣ−ＩＰＳＣグループが、いくつかのＨＳＣ関連バイオマーカ、すなわち、ＳＲＣ−ＩＰＳＣのＧＩグループとの関係でのＨＳＣバイオマーカ、ＳＲＣ−ＩＰＳＣのＧＩおよびＧＩＩグループとの関係でのＨＳＣバイオマーカを発現することを示した（データは示さず）。ＳＲＣ−ＩＰＳＣの各グループにおいて濃縮されたＨＳＣバイオマーカを比較するベン図は、共通に任意の遺伝子を示した（図８）。ＧＩおよびＧＩＩ能力を有するＳＲＣ−ＩＰＳＣ細胞は、ＧＩグループ：ＦＬＴ３（ＣＤ１３５）およびＭＰＬ（ＣＤ１１０）と比較していくつかの細胞表面分子を特に発現した。
【０２０２】
このインシリコ研究に基づき、本発明者らは、その免疫磁気スクリーニングが可能である抗体が利用可能であるＭＰＬおよびＦＬＴ３受容体をより具体的に研究することにした。
【０２０３】
適切な培地中でのＥＢにおけるｈｉＰＳＣ分化（実施例１を参照）の１７日後、本発明者らは、スクリーニングを行い、そして、１０，０００細胞／ＮＳＧ免疫抑制マウス（ＦＬＴ３についてｎ＝１５およびＭＰＬについてｎ＝１５）を移植した（図９）。２０週後、マウスを屠殺し、その骨髄、脾臓、肝臓および胸腺ならびに血液サンプルを調べた。
【０２０４】
両方の集団（ＦＬＴ３＋およびＭＰＬ＋細胞）について、高レベルの生着を得て（ＦＬＴ３＋集団について１２．６＋／−０．７％のｈＣＤ４５＋およびＭＰＬ＋集団について９．９＋／−１．７％）（図１０）、すべての造血系統からのヒト細胞が見つかった。ヒト赤血球は、βグロビンを産生することが見出され、血液循環Ｔリンパ球は、その表面にＴＣＲγδを発現し、胸腺または脾臓からのリンパ球は、活性化後にインビトロ増殖することができ、ＦＬＴ３＋またはＭＰＬ＋細胞の決定的造血を可能とする基礎となった。
各一次マウスについて、７００万個の骨髄細胞を、二次マウスに移植した。２０週後、これらの二次マウスを屠殺し、上記のように分析した。
【０２０５】
すべての二次マウスは、高レベルの移植を示し（ＦＬＴ３＋集団について１５．２＋／−３．４％のｈＣＤ４５＋およびＭＰＬ＋集団について９．８＋／−２．１％）（図１０）、多系統が示され、ヒト移植細胞は、決定的な造血が可能であった。
【０２０６】
それゆえ、発明者のプロトコルに従ったｈｉＰＳＣ分化を介して得られ、その表面にＦＬＴ３またはＭＰＬを発現する細胞は、インビボでの長期多系統生着および自己再生が可能である。
【図１】
2020511150.tif 000003
【図２】
2020511150.tif 000004
【図３】
2020511150.tif 000005
【図４】
2020511150.tif 000006
【図５】
2020511150.tif 000007
【図６】
2020511150.tif 000008
【図７】
2020511150.tif 000009
【図８】
2020511150.tif 000010
【図９】
2020511150.tif 000011
【図１０】
2020511150.tif 000012
【国際調査報告】
2020511150.tif 000013
2020511150.tif 000014
2020511150.tif 000015