(57)【要約】  本発明は、骨格筋肥大誘発剤として、並びに、骨格筋再生を促進するため、骨格筋萎縮を防止するための、又は骨格筋組織喪失及び／若しくは筋衰弱をもたらす疾患若しくは損傷の処置若しくは防止における、ＬＳＤ１阻害剤とその使用とに関する。さらに本発明は、対象における筋量、筋力、及び／又は筋パフォーマンスを増加させるための、そうした化合物の非治療的使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨格筋組織喪失及び／又は筋衰弱をもたらす疾患又は障害の処置又は防止に使用される、ＬＳＤ１阻害剤。
【請求項２】
前記ＬＳＤ１阻害剤は、ＬＳＤ１デメチラーゼ活性を阻害する小分子、ＬＳＤ１発現に特異的に干渉する核酸分子、ベイト基質、及びＬＳＤ１に対するアプタマー又は抗体よりなる群から選択される、請求項１に記載の使用のためのＬＳＤ１阻害剤。
【請求項３】
前記ＬＳＤ１阻害剤は、ＬＳＤ１デメチラーゼ活性を阻害する小分子である、請求項１又は２に記載の使用のためのＬＳＤ１阻害剤。
【請求項４】
前記ＬＳＤ１阻害剤は、シクロプロピルアミド系ＬＳＤ１阻害剤、ペプチド系阻害剤、フェネルジン及びその類似体、ポリアミン類似体、尿素及びチオ尿素等価体、グアニジウム基を有する化学阻害剤、Ｎａｍｏｌｉｎｅ、ＳＰ２５０９、並びにパルギリンよりなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の使用のためのＬＳＤ１阻害剤。
【請求項５】
前記ＬＳＤ１阻害剤は、ペプチド系阻害剤、フェネルジン及びその類似体、尿素及びチオ尿素等価体、並びにＮａｍｏｌｉｎｅ、好ましくはフェネルジン及びその類似体よりなる群から選択され、より好ましくはｂｉｚｉｎｅである、請求項１〜４のいずれかに記載の使用のためのＬＳＤ１阻害剤。
【請求項６】
前記ＬＳＤ１阻害剤は、シクロプロピルアミン系ＬＳＤ１阻害剤である、請求項１〜４のいずれかに記載の使用のためのＬＳＤ１阻害剤。
【請求項７】
前記ＬＳＤ１阻害剤は、２-フェニルシクロプロパン-１-アミン及びその誘導体から選択される、請求項６に記載の使用のためのＬＳＤ１阻害剤。
【請求項８】
前記ＬＳＤ１阻害剤は、
【表１】
2020500197.tif 000015
2020500197.tif 000016
ＯＲＹ−２００１、並びに以下の化合物１、２、３、及び４、
【化１】
2020500197.tif 000017
から選択される小分子、又はそれらの任意の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくはプロドラッグである、請求項６に記載の使用のためのＬＳＤ１阻害剤。
【請求項９】
前記ＬＳＤ１阻害剤は、トラニルシプロミン、ＲＮ−１、及びＧＳＫ  ＬＳＤ１よりなる群、又はそれらの任意の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくはプロドラッグから選択される、請求項６〜８のいずれかに記載の使用のためのＬＳＤ１阻害剤。
【請求項１０】
前記ＬＳＤ１阻害剤は、トラニルシプロミン、又はその任意の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくはプロドラッグである、請求項６〜８のいずれかに記載の使用のためのＬＳＤ１阻害剤。
【請求項１１】
前記ＬＳＤ１阻害剤は、２-フェニルシクロプロパン-１-アミン誘導体、又はその任意の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくはプロドラッグである、請求項７に記載の使用のためのＬＳＤ１阻害剤。
【請求項１２】
前記ＬＳＤ１阻害剤は、請求項８に規定するＧＳＫ  ＬＳＤ１、ＲＮ−１、ＯＧ−Ｌ００２、Ｔｒａｎｓ−Ｎ−（（２、３−ジヒドロベンゾ［ｂ］（１、４］ジオキシン−６−イル）メチル）−２−フェニルシクロプロパン−１−アミン、Ｔｒａｎｓ−Ｎ−（（２−メトキシピリジン−３−イル）メチル）−２−フェニルシクロプロパン−１−アミン、ＯＲＹ−１００１、ＯＧ８６、ＧＳＫ２８７９５５２、ＯＲＹ−２００１、並びに化合物１、２、３、及び４よりなる群、並びにそれらの任意の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくはプロドラッグから選択される、請求項１１に記載の使用のためのＬＳＤ１阻害剤。
【請求項１３】
前記ＬＳＤ１阻害剤は、ＧＳＫ  ＬＳＤ１、又はその任意の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくはプロドラッグ、好ましくはＧＳＫ  ＬＳＤ１ジヒドロクロリドである、請求項１２に記載の使用のためのＬＳＤ１阻害剤。
【請求項１４】
骨格筋肥大誘発剤として使用する、並びに／又は骨格筋再生を促進する及び／若しくは骨格筋萎縮を防止するために使用する、請求項１〜１３のいずれかに記載の使用のためのＬＳＤ１阻害剤。
【請求項１５】
前記骨格筋組織喪失及び／又は筋衰弱をもたらす疾患又は障害は、サルコペニア、悪液質、神経筋疾患、廃用性筋萎縮、食欲不振性飢餓により誘発された萎縮、及び急性筋損傷又はオーバーユース筋損傷を含む筋損傷から選択される、請求項１〜１４のいずれかに記載の使用のためのＬＳＤ１阻害剤。
【請求項１６】
前記骨格筋組織喪失及び／又は筋衰弱をもたらす疾患又は障害は、サルコペニアである、請求項１〜１５のいずれかに記載の使用のためのＬＳＤ１阻害剤。
【請求項１７】
前記骨格筋組織喪失及び／又は筋衰弱をもたらす疾患又は障害は、悪液質である、請求項１〜１５のいずれかに記載の使用のためのＬＳＤ１阻害剤。
【請求項１８】
前記骨格筋組織喪失及び／又は筋衰弱をもたらす疾患又は障害は、神経筋疾患である、請求項１〜１５のいずれかに記載の使用のためのＬＳＤ１阻害剤。
【請求項１９】
前記骨格筋組織喪失及び／又は筋衰弱をもたらす疾患又は障害は、筋ジストロフィーである、請求項１８に記載の使用のためのＬＳＤ１阻害剤。
【請求項２０】
前記骨格筋組織喪失及び／又は筋衰弱をもたらす疾患又は障害は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、筋強直性筋ジストロフィー、三好型筋ジストロフィーなどの遠位型筋ジストロフィー、及び肢帯型筋ジストロフィーよりなる群から選択される筋ジストロフィー、好ましくはデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項１９に記載の使用のためのＬＳＤ１阻害剤。
【請求項２１】
前記骨格筋組織喪失及び／又は筋衰弱をもたらす疾患又は障害は、廃用性筋萎縮、食欲不振性飢餓により誘発された萎縮、及び急性筋損傷又はオーバーユース筋損傷を含む筋損傷から選択される、請求項１〜１５のいずれかに記載の使用のためのＬＳＤ１阻害剤。
【請求項２２】
共に、個別に、又は連続して使用するための組合せ製剤としての、請求項１〜１４のいずれかに記載のＬＳＤ１阻害剤と骨格筋萎縮を誘発する化合物とを含有する製品。
【請求項２３】
前記骨格筋萎縮を誘発する化合物は治療剤である、請求項２２に記載の製品。
【請求項２４】
前記骨格筋萎縮を誘発する化合物は、副腎皮質ステロイド、コルヒチン、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、Ｄ−ペニシラミン、抗生物質、β遮断薬、アミオダロン、シメチジン、ジドブジン、ビンクリスチン、クロフィブラート、スタチン、フィブラート、シクロスポリン、Ｌ−トリプトファン、低カリウム血症誘発薬剤、脂質降下剤、及び、ワクチンなど筋肉内経路で投与される治療剤よりなる群から選択される、請求項２３に記載の製品。
【請求項２５】
前記骨格筋萎縮を誘発する化合物は脂質降下剤であり、好ましくはスタチン及びフィブラートから選択される、請求項２４に記載の製品。
【請求項２６】
対象における筋量、筋力、及び／又は筋パフォーマンスを増加させるための、請求項１〜１４のいずれかに記載のＬＳＤ１阻害剤の非治療的使用。
【請求項２７】
動物用飼料組成物の材料又は添加剤としての、請求項１〜１４のいずれかに記載のＬＳＤ１阻害剤の非治療的使用。
【請求項２８】
対象における骨格筋量の喪失を防止するための、請求項１〜１４のいずれかに記載のＬＳＤ１阻害剤の非治療的使用。
【請求項２９】
家畜の性能を向上させる方法であって、請求項１〜１４のいずれかに記載のＬＳＤ１阻害剤を前記家畜に与えることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨格筋肥大を誘発する、萎縮を防止する、又は骨格筋組織喪失及び／若しくは筋衰弱をもたらす疾患若しくは損傷を処置若しくは防止するための治療方針に関する。本発明はまた、骨格筋肥大誘発剤の非治療的使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
筋消耗及び筋衰弱は、代謝疾患、神経疾患、筋疾患、急性又は慢性の病気（悪液質）、加齢、無活動、飢餓、及びさらに中毒を含む大きな一群の疾患病態及び状態からもたらされ得るものである。この１５年の間に、広範な研究により、筋量喪失に関連するとされるシグナル経路のより深い理解につながっている。しかしながら、現在のところ、筋肉を直接的に標的とする治療方針は十分に提供されていない。
【０００３】
筋喪失は、特に加齢とともに起こり得、フレイル症候群の要素となる。この退化性の喪失は、「サルコペニア」と名付けられ、直接的な筋萎縮をもたらし、転倒、障害の発生、入院、及び死亡を含む結果的な不健康状態のリスクを増大させる。高齢者人口が増加する中、サルコペニアはますます健康における世界的な懸念となっており、サルコペニアの影響に対抗して年齢に関連する衰えや能力低下を抑える手法の開発が大きく注目されている。サルコペニアの可能性のある治療的介入は身体活動や栄養補助を含み得るが、現在のところ、薬理的介入について有効性は限定的である。
【０００４】
また、筋衰弱は、ミオパチー、神経筋接合部疾患、又は運動ニューロン疾患などの神経筋障害から直接もたらされ得る。
【０００５】
ミオパチーは、骨格筋線維の機能障害による筋衰弱を主要な症状とする神経筋障害である。ミオパチーは、遺伝性又は後天性で有り得、例えば、筋ジストロフィー、ミトコンドリアミオパチー又は薬剤誘発性ミオパチーなどの代謝性ミオパチー、及び皮膚筋炎、多発性筋炎又は封入体筋炎などの自己免疫性ミオパチーを含むものである。
【０００６】
ミオパチーのなかでも、筋ジストロフィーは、筋線維の進行性変性を引き起こして筋量喪失をもたらす大グループを代表するものである。筋ジストロフィーを引き起こす３０以上の遺伝子の突然変異が同定されている。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Duchenne Muscular Dystrophy、DMD）は、筋ジストロフィーの最も一般的な形態であり、世界的に３５００人の男性に約１人の発生率である。
【０００７】
神経筋障害の処置は、疾患及び特定の原因に応じたものであるが、現在のところ、いずれの形態の筋ジストロフィーも止める又は回復させる具体的な処置は存在しない。運動や栄養的介入は、いくつかの筋消耗状態における筋萎縮の速度を遅らせる利点があるが、多くの場合、消耗プロセスを止めることはできない。
【０００８】
ゆえに、筋萎縮を効果的に抑え、筋成長を促進し、筋量を増加させ、最終的に患者の生活の質を向上させることができる新規の治療オプションが強く求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、骨格筋肥大を誘発する、又は筋萎縮を防止する、骨格筋再生を促進する、及び骨格筋消耗を治療若しくは防止する、新規の治療方針を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
第１の態様において、本発明は、骨格筋肥大誘発剤として使用する、骨格筋再生を促進する及び／若しくは骨格筋萎縮を防止するために使用する、又は骨格筋組織喪失及び／若しくは筋衰弱をもたらす疾患若しくは障害の処置若しくは防止において使用する、ＬＳＤ１阻害剤に関する。
【００１１】
好ましくは、ＬＳＤ１阻害剤は、ＬＳＤ１デメチラーゼ活性を阻害する小分子、ＬＳＤ１発現に特異的に干渉する核酸分子、ベイト基質、及びＬＳＤ１に対するアプタマー又は抗体よりなる群から選択される。
【００１２】
特に、ＬＳＤ１阻害剤は、ＬＳＤ１デメチラーゼ活性を阻害する小分子であり得、好ましくはシクロプロピルアミド系ＬＳＤ１阻害剤、ペプチド系阻害剤、フェネルジン、ポリアミン類似体、尿素及びチオ尿素等価体、グアニジウム基を有する化学阻害剤、Ｎａｍｏｌｉｎｅ、ＳＰ２５０９、並びにパルギリンよりなる群から選択され得る。あるいは、ＬＳＤ１阻害剤は、ペプチド系阻害剤、フェネルジン及びその類似体、尿素及びチオ尿素等価体、並びにＮａｍｏｌｉｎｅ、好ましくはフェネルジン及びその類似体よりなる群から選択され得、より好ましくはｂｉｚｉｎｅである。あるいは、ＬＳＤ１阻害剤は、シクロプロピルアミド系ＬＳＤ１阻害剤、ペプチド系阻害剤、フェネルジン及びその類似体、尿素及びチオ尿素等価体、並びにｎａｍｏｌｉｎｅよりなる群から、好ましくはシクロプロピルアミド系ＬＳＤ１阻害剤、並びにフェネルジン及びその類似体、好ましくはｂｉｚｉｎｅよりなる群から選択され得る。
【００１３】
より好ましくは、ＬＳＤ１阻害剤は、シクロプロピルアミン系ＬＳＤ１阻害剤、特に２-フェニルシクロプロパン-１-アミン又はその誘導体である。
【００１４】
好ましい実施形態において、ＬＳＤ１阻害剤は、
【表１】
2020500197.tif 000002
2020500197.tif 000003
ＯＲＹ−２００１、並びに以下の化合物１、２、３、及び４、
【化１】
2020500197.tif 000004
よりなる群、又は、それらの任意の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくはプロドラッグから選択される。
【００１５】
好ましくは、ＬＳＤ１阻害剤は、トラニルシプロミン、ＲＮ−１（ヒドロクロリド）、及びＧＳＫ  ＬＳＤ１よりなる群、又はそれらの任意の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくはプロドラッグから選択され、より好ましくは、トラニルシプロミン、又はその任意の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくはプロドラッグである。
【００１６】
一部の実施形態において、ＬＳＤ１阻害剤は、２-フェニルシクロプロパン-１-アミン誘導体、又はその任意の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくはプロドラッグであり、好ましくは、上述のようなＧＳＫ  ＬＳＤ１ジヒドロクロリド、ＲＮ−１（ヒドロクロリド）、ＯＧ−Ｌ００２、Ｔｒａｎｓ−Ｎ−（（２、３−ジヒドロベンゾ［ｂ］（１、４］ジオキシン−６−イル）メチル）−２−フェニルシクロプロパン−１−アミン、Ｔｒａｎｓ−Ｎ−（（２−メトキシピリジン−３−イル）メチル）−２−フェニルシクロプロパン−１−アミン、ＯＲＹ−１００１、ＯＧ８６、ＧＳＫ２８７９５５２、ＯＲＹ−２００１、並びに化合物１、２、３、及び４よりなる群、並びにそれらの任意の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくはプロドラッグから選択される。より好ましくは、ＬＳＤ１阻害剤は、ＧＳＫ  ＬＳＤ１ジヒドロクロリド、又はその任意の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくはプロドラッグである。
【００１７】
特定の実施形態において、ＬＳＤ１阻害剤は、シクロプロピルアミン系ＬＳＤ１阻害剤及びｂｉｚｉｎｅ、好ましくは、トラニルシプロミン、ＲＮ−１、ＧＳＫ  ＬＳＤ１、及びｂｉｚｉｎｅ、さらにより好ましくはＲＮ−１、ＧＳＫ  ＬＳＤ１、及びｂｉｚｉｎｅよりなる群、並びにそれらの任意の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくはプロドラッグから選択される。あるいは、ＬＳＤ１阻害剤は、２-フェニルシクロプロパン-１-アミン誘導体及びｂｉｚｉｎｅよりなる群、好ましくは、上述のようなｂｉｚｉｎｅ、ＧＳＫ  ＬＳＤ１ジヒドロクロリド、ＲＮ−１（ヒドロクロリド）、ＯＧ−Ｌ００２、Ｔｒａｎｓ−Ｎ−（（２、３−ジヒドロベンゾ［ｂ］（１、４］ジオキシン−６−イル）メチル）−２−フェニルシクロプロパン−１−アミン、Ｔｒａｎｓ−Ｎ−（（２−メトキシピリジン−３−イル）メチル）−２−フェニルシクロプロパン−１−アミン、ＯＲＹ−１００１、ＯＧ８６、ＧＳＫ２８７９５５２、ＯＲＹ−２００１、並びに化合物１、２、３、及び４よりなる群、並びにそれらの任意の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくはプロドラッグから選択され得る。
【００１８】
好ましい実施形態において、ＲＮ−１はＲＮ−１ヒドロクロリドであり、及び／又はＧＳＫ  ＬＳＤ１はＧＳＫ  ＬＳＤ１ジヒドロクロリドである。
【００１９】
骨格筋組織喪失及び／又は筋衰弱をもたらす疾患又は障害は、サルコペニア、悪液質、神経筋疾患、廃用性筋萎縮、食欲不振性飢餓により誘発された萎縮、及び急性筋損傷又はオーバーユース筋損傷を含む筋損傷から、好ましくは、サルコペニア、悪液質、及び神経筋疾患、特にデュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、筋強直性筋ジストロフィー、三好型筋ジストロフィーなどの遠位型筋ジストロフィー、及び肢帯型筋ジストロフィーから、より好ましくは、サルコペニア及び悪液質から選択することができ、さらにより好ましくは、サルコペニアであり得る。
【００２０】
他の態様において、本発明はまた、共に、個別に、又は連続して使用するための組合せ製剤として、ＬＳＤ１阻害剤と骨格筋萎縮を誘発する化合物とを含有する製品にも関する。
【００２１】
好ましくは、骨格筋萎縮を誘発する化合物は治療剤であり、より好ましくは、副腎皮質ステロイド、コルヒチン、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、Ｄ−ペニシラミン、抗生物質、β遮断薬、アミオダロン、シメチジン、ジドブジン、ビンクリスチン、クロフィブラート、スタチン、フィブラート、シクロスポリン、Ｌ−トリプトファン、低カリウム血症誘発薬剤、脂質降下剤、及び、ワクチンなど筋肉内経路で投与される治療剤よりなる群から選択され、さらにより好ましくは、スタチン及びフィブラートなどの脂質降下剤である。
【００２２】
他の態様において、本発明はまた、対象における筋量、筋力、及び／又は筋パフォーマンスを増加させるため、並びに特に対象における骨格筋量、骨格筋力、及び／又は骨格筋パフォーマンスを増加させるための、ＬＳＤ１阻害剤の非治療的使用にも関する。
【００２３】
本発明はまた、対象における骨格筋量の喪失を防止する、又は動物用飼料組成物のための材料若しくは添加剤としての、ＬＳＤ１阻害剤の非治療的使用にも関する。
【００２４】
本発明は、さらに、家畜の性能を向上させる方法であって、ＬＳＤ１阻害剤、好ましくはＬＳＤ１阻害剤を含む飼料組成物、材料、添加剤、又はダイエタリーサプリメントを該家畜に与えることを含む方法に関する。
【００２５】
本発明はまた、動物用飼料組成物のための材料又は添加剤としての、ＬＳＤ１阻害剤の使用、好ましくはＬＳＤ１阻害剤の非治療的使用にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、ドナー５（図１Ａ）及びドナー３（図１Ｂ）について、筋管総面積によってノーマライズしたアセチルコリンクラスター総面積である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
リジン特異的ヒストンデメチラーゼ１Ａとしても知られるヒトリジン特異的デメチラーゼ１Ａ（LSD1）は、ＫＤＭ１Ａ遺伝子によってコードされるとともに、フラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）依存的アミンオキシダーゼのスーパーファミリーに属する酵素である。ＬＳＤ１は、レドックスプロセスによって、モノメチル化又はジメチル化したヒストンＨ３のリジン４（H3K4）及びＨ３のリジン９（H3K9）を特異的に脱メチル化するＬＳＤ１は、細胞増殖、脂肪生成、精子形成、染色体分離、及び胚発生を含む生物学的プロセスの広い範囲において重要な役割を果たすことが示されている。Ｃ２Ｃ１２マウス筋芽細胞から得た結果に基づき、ＬＳＤ１は、筋細胞エンハンサー因子２（MEF2）を脱メチル化し、その転写活性を促進して、骨格筋細胞分化を刺激することも見いだされている（Choi等、Nucleic Acids Research、2014、Vol.42、No.1）。
【００２８】
マイクロパターン技術における確固たる知識と、ヒト一次筋芽細胞の十分な成熟を可能にするとともに高レベルの横紋、アライメントされた核を伴う高い融合指数、及び低い形態学的変動性を有する筋管を得る、所有の生理学的ヒト骨格筋モデル（MyoScreen、サイトー）とにより、本発明者らは驚くべきことに、ＬＳＤ１阻害剤がこの先行技術の教示とは反対に骨格筋肥大活性を示し、筋芽細胞からの筋管分化及びサイズを増大可能なだけでなく、筋収縮を防止可能であるということを本明細書において示した。
【００２９】
したがって、第１の態様において、本発明は、骨格筋再生を促進するため、骨格筋萎縮を防止するため、又は骨格筋組織喪失及び／若しくは筋衰弱をもたらす疾患若しくは損傷の処置若しくは防止における、骨格筋肥大誘発剤としてのＬＳＤ１阻害剤の使用に関する。
【００３０】
つまり、本発明は、骨格筋肥大誘発剤として使用されるＬＳＤ１阻害剤に関する。
【００３１】
本明細書に使用するとき、「ＬＳＤ１阻害剤」という用語は、特にヒストンＨ３のリジン４（H3K4me）及びリジン９（H3K9me）において、ＬＳＤ１の活性を阻害又は低減する、すなわちＬＳＤ１のデメチラーゼ活性を阻害又は低減する分子に関する。
【００３２】
ＬＳＤ１のデメチラーゼ活性は、当該技術分野で既知の任意の方法によって容易にアッセイすることができる。特に、数多くのアッセイキットが、ケイマンケミカル、エピジェンテック、又はアブカムなどの様々な供給者から市販にて入手可能である。ＬＳＤ１酵素阻害は、Ｆｅｎｇ等（Feng等、Journal of Hematology & Oncology(2016) 9:24）又はＷａｎｇ等（Wang等、CancerRes. 2011 71(23): 7238-7249）により公開されている阻害アッセイなどの任意の既知の方法を使用して行うことができる。
【００３３】
ＬＳＤ１阻害剤は、ＬＳＤ１又はＦＡＤに共有結合又は非共有結合して、立体障害又は修飾により活性を改変することができる。この阻害剤は、例えば、小分子、基質様ペプチド阻害剤（すなわちベイト基質）、ＬＳＤ１に対するアプタマー又は抗体であり得る。また、この阻害は、例えば特異的ＲＮＡｉ、アンチセンス、又はリボザイムの使用によって、ＫＤＭ１Ａ遺伝子発現を低下又は抑制させることによるものであり得る。
【００３４】
好ましくは、ＬＳＤ１阻害剤は、ＬＳＤ１デメチラーゼ活性を阻害する小分子、ＬＳＤ１発現に特異的に干渉する核酸分子、ベイト基質、及びＬＳＤ１に対するアプタマー又は抗体よりなる群から選択される。より好ましくは、ＬＳＤ１阻害剤は、ＬＳＤ１デメチラーゼ活性を阻害する小分子、ＬＳＤ１発現に特異的に干渉する核酸分子、及びベイト基質よりなる群から選択される。さらにより好ましくは、ＬＳＤ１阻害剤は、ＬＳＤ１デメチラーゼ活性を阻害する小分子、及びＬＳＤ１発現に特異的に干渉する核酸分子よりなる群から選択される。
【００３５】
実施形態において、ＬＳＤ１阻害剤は、ＬＳＤ１発現に特異的に干渉する核酸分子である。
【００３６】
本明細書に使用するとき、「核酸分子」という用語は、ＲＮＡｉ、アンチセンス、及びリボザイム分子を含むが、これらに限定されない。本発明において、「ＬＳＤ１発現に特異的に干渉する核酸分子」は、特異的方法で、ＫＤＭ１Ａ遺伝子発現を低下又は抑制可能である核酸分子である。本明細書に使用するとき、「ＲＮＡｉ」という用語は、標的タンパク質の発現を下方調節することができる任意のＲＮＡを指す。該用語は、低分子干渉ＲＮＡ（siRNA）、二本鎖ＲＮＡ（dsRNA）、一本鎖ＲＮＡ（ssRNA）、マイクロＲＮＡ（miRNA）、及び短鎖ヘアピンＲＮＡ（shRNA）分子を含む。そうした干渉核酸分子を設計、作製及び使用する方法は、当業者に既知である。
【００３７】
そうした干渉核酸分子の例は、ＬＳＤ１標的ｓｈＲＮＡ（Fiskus等、Leukemia. 2014 Nov;28(11):2155-2164）、その３´ＵＴＲを標的にすることでＬＳＤ１発現を抑えるｍｉＲＮＡ１３７（Sun等、Nature Communications 2011）、又はＬＳＤ１標的ｓｉＲＮＡ（Kong等、Oncology Letters.2016 ;11 :2475-2480）を含むが、これらに限定されない。
【００３８】
他の実施形態において、ＬＳＤ１阻害剤はベイト基質である。
【００３９】
本明細書に使用するとき、「ベイト基質」という用語は、基質様ペプチド阻害剤、すなわちＬＳＤ１に結合して、その基質、特にヒストンＨ３とのＬＳＤ１の相互作用を防止可能なペプチドを指す。
【００４０】
そうしたベイト基質の例は、リジン４がメチオニンに置換されたヒストンＨ３ペプチドのＮ末端の２１アミノ酸残基由来のベイト基質を含むが、これに限定されない。このベイトは、高結合親和性でＬＳＤ１と結合し、阻害剤として作用する（Wang等、2011, supra）。ヒストンＨ３ペプチド系ＬＳＤ１選択的阻害剤の他の一連の候補が設計及びテストされており、ヒストンＨ３の２１アミノ酸残基のリジン４でフェニルシクロプロピルアミン（PCPA）部分を有するペプチドの同定につながっている（T.Kakizawa等、Bioorg.Med.Chem.Lett. 25 (2015)1925-1928）。
【００４１】
他の実施形態において、ＬＳＤ１阻害剤は、ＬＳＤ１に対する抗体である。
【００４２】
本明細書における「抗体」という用語は、対象の分子標的に特異的に結合する限りにおいて、最も広範な意味で使用され、特にモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント、及びその誘導体を網羅する。本明細書に使用するとき、「抗体フラグメント」という用語は、抗体全長の一部、一般にその抗原結合ドメイン又は可変ドメインを含むタンパク質を指す。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ´）２、Ｆ（ａｂ）３、Ｆｖ（通常、抗体のシングルアームのＶＬ及びＶＨドメイン）、単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）、ｄｓＦｖ、Ｆｄ（通常、ＶＨ及びＣＨ１ドメイン）、及びｄＡｂ（通常、ＶＨドメイン）フラグメント、ナノボディ、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、カッパボディ、直鎖状抗体、並びに抗原結合機能を保持する他の抗体フラグメントを含む（例えば、Holliger及びHudson、NatBiotechnol. 2005 Sep;23(9):1126-36）。抗体フラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質消化及び組換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）を含むがこれらに限定されない、様々な技術によって作製可能である。これらの技術は当業者に既知であり、文献に広く記載されている。「抗体誘導体」という用語は、本明細書に使用するとき、１つ以上のアミノ酸が例えばアルキル化、ペグ化、アシル化、エステル又はアミド形成などによって化学的に修飾された、本明細書において提供される抗体、例えば全長抗体又は抗体のフラグメントを指す。特に、この用語は、当該技術分野で既知であるとともに容易に入手可能なさらなる非タンパク質性部分を含有するようにさらに修飾した、本明細書において提供される抗体を指し得る。
【００４３】
他の実施形態において、ＬＳＤ１阻害剤は、ＬＳＤ１に対するアプタマーである。アプタマーは、ペプチドアプタマー又は核酸アプタマーであってもよい。
【００４４】
ペプチドアプタマーは、細菌タンパク質のチオレドキシン−Ａなどのタンパク質足場に両端で付着した可変短鎖ペプチドループからなる。通常、可変ループ長は１０〜２０アミノ酸から構成される。対象の標的に特異的なペプチドアプタマーは、酵母ツーハイブリッドシステム又はファージディスプレイなどの当業者に既知の任意の方法を使用して選択され得る。ペプチドアプタマーは、組換え細菌における化学合成又は作製とその後の精製などの当業者に既知の任意の方法によって作製され得る。
【００４５】
核酸アプタマーは、ＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドからなる一群の低分子核酸リガンドであり、標的に高い特異性及び親和性を有する。対象の標的に特異的な核酸アプタマーを構築する、指数関数的増加によるリガンドのシステマティックな展開（Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment、SELEX）技術は、当業者に既知であり、特定の分子標的に特異的なアプタマーを得るために使用することができる。核酸アプタマーは、化学合成又はＲＮＡアプタマーのインビトロ転写などの当業者に既知の任意の方法によって作製され得る。核酸アプタマーは、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、ＸＮＡアプタマー（ゼノヌクレオチドを含む核酸アプタマー）、及びＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒ（登録商標）（全体的に非天然Ｌ−リボ核酸骨格から構成される）よりなる群から選択され得る。
【００４６】
好ましい実施形態において、ＬＳＤ１阻害剤は、ＬＳＤ１デメチラーゼ活性を阻害する小分子である。
【００４７】
本明細書に使用するとき、「ＬＳＤ１デメチラーゼ活性を阻害する小分子」という用語は、ＬＳＤ１活性を阻害又は低下させる能力を有する、通常１０００ダルトン未満の有機化合物又は無機化合物であり得る小分子を指す。この小分子は、任意の既知の生体（動物、植物、細菌、真菌、及びウイルスを含むがこれらに限定されない）又は合成分子のライブラリーに由来するものであり得る。
【００４８】
小分子は、シクロプロピルアミド系ＬＳＤ１阻害剤、Ｃｕｌｈａｎｅ等による記載のもの(J Am Chem Soc.2006 Apr 12;128(14):4536-7、及びJ.Am. Chem. Soc.、2010、132(9)、pp3164-3176)などのペプチド系阻害剤、フェネルジン及びその類似体（Culhane等、J. Am. Chem. Soc.、2010、132 (9)、pp3164-3176、Prusevich等、ACSChem. Biol.、2014、9(6)、pp1284-1293）、ポリアミン類似体２ｄ（1,15-ビス{N(5)-[3,3-(ジフェニル)プロピル]-N(1)-ビグアニド}-4,12-ジアザペンタデカン）及びＨｕａｎｇ等による記載のポリアミン類似体（Proc Natl Acad Sci USA. 2007 May 8;104(19):8023-8、及びClin Cancer Res. 2009 Dec 1;15(23):7217-28）などのポリアミン類似体、Ｓｈａｒｍａ等による記載のもの（J. Med. Chem.、2010、53(14)、pp5197-5212）などの尿素及びチオ尿素等価体、アルギニンを模倣するとともにＬＳＤ１の負電荷残基と強力な水素結合を形成するグアニジウム基を有する化学阻害剤（Wang等、2011、supra;特にCBB1002、CBB1003、CBB1004、CBB1005、CBB1006、CBB1007及びCBB1008）、Ｎａｍｏｌｉｎｅ（Willmann等、Int J Cancer. 2012 Dec 1;131(11):2704-9、Schmitt等、J. Med. Chem. 2013、56(18)、7334-7342）、ＳＰ２５０９（CAS番号:1423715-09-6、Sankar等、Clin. Cancer Res. 20(17)、4584-4597(2014)、及びFiskus等、Leukemia 28(11)、2155-2164(2014)）、並びにパルギリン（CAS番号:555-57-7、Wand等、Biochemicaland Biophysical Research Communications (2015)）よりなる群から選択することができる。
【００４９】
特に、ＬＳＤ１阻害剤は、シクロプロピルアミド系ＬＳＤ１阻害剤、ペプチド系阻害剤、フェネルジン及びその類似体、好ましくはｂｉｚｉｎｅ（CAS番号:1591932-50-1）、尿素及びチオ尿素等価体よりなる群から選択することができる。より具体的には、ＬＳＤ１阻害剤は、シクロプロピルアミド系ＬＳＤ１阻害剤、並びにフェネルジン及びその類似体よりなる群から、好ましくはシクロプロピルアミド系ＬＳＤ１阻害剤、及びｂｉｚｉｎｅよりなる群から選択することができる。
【００５０】
好ましくは、小分子はシクロプロピルアミン系ＬＳＤ１阻害剤であり、特に２-フェニルシクロプロパン-１-アミン及びその誘導体、並びにＧｏｏｄｅｎ等によって記載されたもの（Bioorg Med Chem Lett 2008;18:3047-51）などの置換したｔｒａｎｓ−２−アリールシクロプロピルアミンから選択される。
【００５１】
特定の実施形態において、ＬＳＤ１阻害剤は、２-フェニルシクロプロパン-１-アミン及びその誘導体から選択され、好ましくはｔｒａｎｓ−２-フェニルシクロプロパン-１-アミン（トラニルシプロミン）及びその誘導体から選択される小分子である。
【００５２】
好ましい実施形態において、ＬＳＤ１阻害剤は、
【表２】
2020500197.tif 000005
2020500197.tif 000006
ＯＲＹ−２００１（Oryzon Genomics）、並びに化合物１、２、３、及び４（Feng等、2016（supra））、
【化２】
2020500197.tif 000007
から選択される小分子、又はそれらの任意の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくはプロドラッグである。
【００５３】
特定の実施形態において、ＬＳＤ１阻害剤は、トラニルシプロミン、ＲＮ−１好ましくはヒドロクロリド、及びＧＳＫ  ＬＳＤ１よりなる群、又はそれらの任意の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくはプロドラッグから選択される。さらに特定の実施形態において、ＬＳＤ１阻害剤は、トラニルシプロミン、又はその任意の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくはプロドラッグである。
【００５４】
他の特定の実施形態において、ＬＳＤ１阻害剤は、シクロプロピルアミン系ＬＳＤ１阻害剤であるが、トラニルシプロミンではない。好ましくは、ＬＳＤ１阻害剤は２-フェニルシクロプロパン-１-アミン誘導体である。
【００５５】
特に、ＬＳＤ１阻害剤は、ＲＮ−１好ましくはヒドロクロリド、ＧＳＫ  ＬＳＤ１、ＯＧ−Ｌ００２、Ｔｒａｎｓ−Ｎ−（（２、３−ジヒドロベンゾ［ｂ］（１、４］ジオキシン−６−イル）メチル）−２−フェニルシクロプロパン−１−アミン、Ｔｒａｎｓ−Ｎ−（（２−メトキシピリジン−３−イル）メチル）−２−フェニルシクロプロパン−１−アミン、ＯＲＹ−１００１、ＯＧ８６、ＧＳＫ２８７９５５２、ＯＲＹ−２００１、並びに化合物１、２、３、及び４（Feng等、2016（supra））から選択することができる。好ましくは、ＬＳＤ１阻害剤は、ＧＳＫ  ＬＳＤ１、又はその任意の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、若しくはプロドラッグである。好ましい実施形態において、ＧＳＫ  ＬＳＤ１はＧＳＫ  ＬＳＤ１ジヒドロクロリドである。
【００５６】
ＬＳＤ１阻害剤は、薬学的に許容される塩、水和物、及び溶媒和物の形態で使用することができる。
【００５７】
該薬学的に許容される塩、水和物、及び溶媒和物は、適切な場合、当業者に既知の方法で形成されてもよい。
【００５８】
「薬学的に許容される塩」という用語は、患者に非毒性であり、治療剤の安定性を維持するとともに該薬剤を標的細胞又は組織に送達することができることに適した塩を指す。薬学的に許容される塩は当該技術分野で既知である。
【００５９】
本明細書において使用するとき、「溶媒和物」という用語は、化学量論的量又は非化学量論的量の溶媒を含有する溶媒添加形態を指す。一部の化合物は、結晶性固体状態で一定のモル比の溶媒分子を捕らえる傾向があり、溶媒和物を形成する。溶媒が水である場合、形成される溶媒和物は水和物である。溶媒がアルコールである場合、形成される溶媒和物はアルコラートである。水和物は、水がＨ２Ｏとしてその分子状態を保持する物質の１つと１つ以上の水分子の組合せによって形成され、そうした組合せは１つ以上の水和物を形成可能である。
【００６０】
ＬＳＤ１阻害剤はまた、プロドラッグの形態でも使用することができる。プロドラッグは、一般に、個体への投与とそれに続く吸収の後、代謝経路による変換などのいくつかのプロセスによって活性である又はより活性である種に変換される薬剤前駆体である。一部のプロドラッグは、例えばあまり活性でないようにする、その溶解性を増大させる、及び／又は親薬剤の投与よりも安全特性を向上させる、プロドラッグに存在する化学基を有する。一部の態様では、プロドラッグはインビボで分解しにくく、その親薬剤よりも長い半減期を示すことができる。化学基がプロドラッグから切断及び／又は修飾されたら、活性薬剤を生じる。プロドラッグは、一部の状況において、親薬剤よりも投与しやすいので有効であることがある。プロドラッグは、例えば、経口投与によって生体に利用可能であるが、親薬剤はそうではない。所定の態様では、プロドラッグはまた、親薬剤よりも医薬組成物における溶解性が向上する。プロドラッグの限定的ではない例は、投与されると続いてインビボで生体内変化を受けて治療上有効な濃度の活性剤を得る、本発明に記載されるような化合物であり得る。さらなる一般の例について、ＢｕｎｄｇａａｒｄによるＡ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔの「Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ」（Krosgaard-Larsen及びBundgaard、Ed.、1991、Chapter5、113-191）が参照され、これは参照することにより本明細書に組み込まれる。プロドラッグは、例えば、化合物に存在する官能基を修飾して、修飾が親化合物に対してルーチン操作又はインビボで切断されるようにすることで、調製することができる。
【００６１】
本発明はまた、好ましくは骨格筋肥大誘発剤として使用される、ＬＳＤ１阻害剤、及び薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を含む医薬組成物にも関する。
【００６２】
骨格筋肥大誘発剤としてのＬＳＤ１阻害剤について上述したすべての実施形態はまた、この態様にも包含される。
【００６３】
本発明の医薬組成物は、当業者に既知の標準的な薬務（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.)、ed. A.R.Gennaro、Lippincott Williams &Wilkins、2000、並びにEncyclopedia ofPharmaceutical Technology、eds. J.Swarbrick及びJ.C.Boylan、1988-1999、Marcel Dekker、New York参照）にしたがって製剤化される。
【００６４】
可能な医薬組成物は、経口、経粘膜（経鼻、経直腸、若しくは経膣を含む）、局所（経皮、経口腔、及び舌下を含む）、又は非経口（皮下、筋肉内、静脈内、及び皮内を含む）の投与に適するものを含む。これらの製剤には、当業者に既知の技術にしたがって従来の賦形剤を使用可能である。好ましくは、本発明の医薬組成物は経口投与に適する。
【００６５】
非経口投与のための組成物は、固体又は凍結乾燥形態から使用直前に任意的に調製可能な、一般に生理学的に適合する滅菌液剤又は懸濁剤である。局所麻酔剤、保存剤、及び緩衝剤などのアジュバントをビヒクルに溶解させてもよく、界面活性剤又は湿潤剤は、有効成分を均一に分散しやすくするために組成物に含むことができる。
【００６６】
経口投与では、組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、並びにシロップ剤、エリキシル剤、及び濃縮滴剤などの液体製剤などの従来の経口投与剤形に製剤化することができる。非毒性の固体担体又は希釈剤を使用することができ、これらは例として、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、マグネシウム、カーボネートなどを含む。圧縮錠剤では、粉末材料に粘着特性を与える薬剤である結合剤も必要とされる。例として、デンプン、ゼラチン、ラクトース又はデキストロースなどの糖、及び天然ガム又は合成ガムを結合剤として使用可能である。また、崩壊剤も錠剤を崩壊しやすくするために錠剤に必要とされる。崩壊剤は、デンプン、クレイ、セルロース、アルギン、ガム、及び架橋ポリマーを含む。さらに、潤滑剤及び滑剤も、製造プロセスにおいて錠剤材料が表面に付着しないように、及び製造時に粉末材料の流動特性を向上させるために、錠剤に含まれる。コロイド状二酸化ケイ素が滑剤として最も一般に使用され、タルク又はステアリン酸などの化合物が潤滑剤として最も一般に使用される。
【００６７】
経皮投与では、組成物は、軟膏剤、クリーム剤、又はゲル剤の形態に製剤化可能であり、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、及びジメチルホルムアミドなどの適切な浸透剤又は界面活性剤が浸透しやすくするために使用可能である。
【００６８】
経粘膜投与では、経鼻噴霧剤、経直腸又は経膣の坐剤を使用することができる。活性化合物は、当該技術分野で既知の方法で任意の既知の坐剤基剤に取り込むことができる。そうした基剤の例は、カカオ脂、ポリエチレングリコール（カーボワックス）、モノステアリン酸ポリエチレンソルビタン、及びそれらの混合物とともに融点又は溶解速度を改変するためにその他の適合した材料が含まれる。
【００６９】
本発明における医薬組成物は、実質的に投与直後、又は投与後の任意の所定の時点若しくは期間に活性薬剤を放出するように製剤化することができる。
【００７０】
本発明における医薬組成物は、１つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤及び／又は担体と共に１つ以上のＬＳＤ１阻害剤を含むことができる。これらの賦形剤及び／又は担体は、上述のような投与の形態に応じて選択される。
【００７１】
本発明の医薬組成物はまた、１つ又は複数のさらなる活性化合物をも含むことができる。該さらなる活性化合物は、例えば、抗炎症剤、タンパク質同化剤（例えば、成長ホルモン又はインスリン様成長因子Ｉ）、抗悪性腫瘍剤、抗生物質、局所麻酔剤、アナボリック／アンドロジェニックステロイド（例えば、テストステロン）、グルココルチコイド、食欲刺激剤（例えば、ドロナビノール）、サイトカインモジュレーター（例えば、サリドマイド）、アンジオテンシン及びβアドレナリン受容体阻害剤、ＮＨＥ−１阻害剤（例えば、リメポリド（rimeporide））、抗線維化剤（例えば、ロサルタン又はリシノプリル）、ホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）阻害剤（例えば、タダラフィル又はシルデナフィル）、デヒドロエピアンドロステロン、ビタミンＤ、ウルソール酸、オメガ３酸（omega 3 acid）、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、プロテアソーム阻害剤、シクロフィリンＤ阻害剤、ＰＧＣ−１α（アルファ）経路モジュレーター、ミオスタチン及びアクチビンＡアンタゴニスト、グレリンアンタゴニスト、β２−アドレナリン受容体アンタゴニスト、クレアチンサプリメント、ロサルタン及びリシノプリルなどの抗線維化剤、タダラフィル及びシルデナフィルなどの筋虚血治療剤、エクソンスキッピング治療などの突然変異特異的治療剤（例えば、ＤＭＤ症例に関する突然変異を標的とするモルフォリノホスホロジアミデートアンチセンスオリゴマーであるエテプリルセン）、並びにアタルレンなどの治療的ナンセンス抑制用薬剤、ＳＭＴ−Ｃ１１００などのユートロフィン上方調節因子よりなる群から選択することができる。
【００７２】
実験の項において、本発明者らは、ＬＳＤ１阻害剤が筋芽細胞の筋管への分化を促進させ、筋管の数及びサイズを増大させ、並びに／又は再生する細胞の能力を反映する融合指数を増大させることができることを示した。
【００７３】
したがって、本発明は、骨格筋肥大誘発剤として使用される、本発明のＬＳＤ１阻害剤又は医薬組成物に関する。
【００７４】
骨格筋線維は、筋芽細胞の連続的な融合から発生する合胞体である。プロセスには、ｉ）筋芽細胞の筋細胞への分化、ｉｉ）新生筋管を形成するための筋細胞の融合、及びｉｉｉ）さらに成熟した筋管を形成するための新生筋管との筋細胞のさらなる融合に関する。したがって、本明細書に使用するとき、＜骨格筋肥大＞という表現は、既存の筋線維のサイズの増大、及び／又は筋線維の数の増加、及び／又は筋管毎の核の平均数の増加、及び／又は融合指数の増加（筋芽細胞及び筋管の核の総数によって除算した筋管の核の数）によって特徴づけられる骨格筋量の増加を指す。好ましくは、＜骨格筋肥大＞という表現は、既存の筋線維のサイズの増大、及び／又は筋線維の数の増加、及び／又は融合指数の増加によって示される。本明細書に使用するとき、「筋管」及び「筋線維」という用語は互換的に使用される。
【００７５】
また、本発明は、骨格筋肥大の誘発を必要とする対象に骨格筋肥大を誘発する方法であって、本発明のＬＳＤ１阻害剤又は医薬組成物の治療有効量を該対象に投与することを含む方法にも関する。
【００７６】
投与される治療有効量は、当業者によって容易に選択されることができ、対象の骨格筋量又は骨格筋力を増大させるために十分である必要がある。
【００７７】
本明細書に使用するとき、対象は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。好ましくは、対象は、以下に記載する疾患又は障害などの骨格筋組織喪失及び／若しくは筋衰弱をもたらす疾患若しくは障害に起因する筋消耗又は筋衰弱に罹患した患者である。
【００７８】
本発明は、骨格筋肥大を誘発する薬剤を調製するための、本発明のＬＳＤ１阻害剤又は医薬組成物の使用にさらに関する。
【００７９】
また、本発明は、好ましくは筋線維の変性による、不随意の骨格筋量喪失を防止するために使用される、骨格筋量増加を促進若しくは刺激するために使用される、骨格筋量を十分に有するために使用される、並びに／又は、骨格筋量及び／若しくは骨格筋力を増加させるために使用される、本発明のＬＳＤ１阻害剤又は医薬組成物にも関する。
【００８０】
また、本発明は、それらを必要とする対象における、好ましくは筋線維の変性による不随意の骨格筋量喪失を防止するため、骨格筋量増加を促進若しくは刺激するため、骨格筋量を十分に有するため、並びに／又は、骨格筋量及び／若しくは骨格筋力を増加させるための方法であって、本発明におけるＬＳＤ１阻害剤又は医薬組成物の治療有効量を該対象に投与することを含む方法にも関する。
【００８１】
投与される治療有効量は、当業者によって容易に選択されることができ、不随意の骨格筋量喪失を防止するため、骨格筋量増加を促進若しくは刺激するため、骨格筋量を十分に有するため、並びに／又は、骨格筋量及び／若しくは骨格筋力を増加させるために十分である必要がある。
【００８２】
対象は上述のとおりであってもよい。
【００８３】
本発明は、好ましくは筋線維の変性による不随意の骨格筋量喪失を防止する、骨格筋量増加を促進若しくは刺激する、骨格筋量を十分に有するようにする、並びに／又は、骨格筋量及び／若しくは骨格筋力を増加させる薬剤を調製するための、本発明におけるＬＳＤ１阻害剤又は医薬組成物の使用にさらに関する。
【００８４】
実験の項において、本発明者らは、ＬＳＤ１阻害剤が筋芽細胞の筋管への分化を促進して、再生する細胞の能力を反映する融合指数を増大させることができるだけでなく、骨格筋萎縮、特にＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ミオスタチン、ＴＧＦ−β、及びデキサメタゾンによって誘発された萎縮も防止することができると示した。
【００８５】
したがって、本発明はまた、骨格筋再生を促進する、及び／又は骨格筋萎縮を防止するために使用される、本発明におけるＬＳＤ１阻害剤又は医薬組成物にも関する。
【００８６】
骨格筋肥大誘発剤としてのＬＳＤ１阻害剤について上述したすべての実施形態はまた、この態様にも包含される。
【００８７】
本明細書に使用するとき、「骨格筋再生」という表現は、再生する、すなわち筋芽細胞から新しい筋管を作製する筋細胞又は筋組織の能力を指す。つまり、「骨格筋再生を促進する」という表現は、筋芽細胞の筋管への分化を促進する、及び／又は筋管の数を増加させる、及び／又は筋肉組織及び特に筋管の再生能力を向上させる、ＬＳＤ１阻害剤の能力を指す。
【００８８】
本明細書に使用するとき、「骨格筋萎縮を防止する」という用語は、筋消耗を防止、停止、又は遅延させるＬＳＤ１阻害剤の能力を指す。筋萎縮は、例えば疾患状態、又は加齢、飢餓、若しくは無活動などの特定の生理学的な条件、又は薬剤（スタチン）若しくは毒（ボツリヌス毒素）などの萎縮剤に起因し得る。筋萎縮の防止は、好ましくは、筋量産生を増大させて筋喪失を補うことで得られる。
【００８９】
また、本発明は、骨格筋再生の促進及び／又は骨格筋萎縮の防止を必要とする対象に骨格筋再生の促進及び／又は骨格筋萎縮の防止をする方法であって、本発明のＬＳＤ１阻害剤又は医薬組成物の治療有効量を該対象に投与することを含む方法にも関する。
【００９０】
投与される治療有効量は、当業者によって容易に選択されることができ、好ましくは筋量産生を増大させて筋喪失を補うことで、骨格筋再生を刺激し、及び／又は筋消耗を防止、停止、又は遅延させるために十分である必要がある。
【００９１】
対象は上述のとおりであってもよい。
【００９２】
本発明は、骨格筋再生の促進及び／又は骨格筋萎縮の防止をする薬剤を調製するための、本発明のＬＳＤ１阻害剤又は医薬組成物の使用にさらに関する。
【００９３】
本発明は、筋消耗の処置又は防止、特に骨格筋組織喪失及び／又は骨格筋衰弱をもたらす疾患又は障害の処置又は防止に使用される、本発明におけるＬＳＤ１阻害剤又は医薬組成物にさらに関する。
【００９４】
また、本発明は、筋消耗、特に骨格筋組織喪失及び／又は骨格筋衰弱をもたらす疾患又は障害を処置する薬剤を調製するための、本発明におけるＬＳＤ１阻害剤又は医薬組成物の使用にも関する。
【００９５】
そして、本発明は、それらを必要とする対象における、筋消耗、特に骨格筋組織喪失及び／又は骨格筋衰弱をもたらす疾患又は障害を処置する方法であって、本発明におけるＬＳＤ１阻害剤又は医薬組成物の治療有効量を該対象に投与することを含む方法に関する。
【００９６】
骨格筋肥大誘発剤としてのＬＳＤ１阻害剤について上述したすべての実施形態はまた、この態様にも包含される。
【００９７】
本明細書において使用するとき、「処置」、「処置する」、又は「処置すること」という用語は、疾患の治療、防止、予防、及び遅延など患者の健康状態を改善することを意図する任意の行為を指す。所定の実施形態において、そうした用語は、疾患の又は疾患に関連した症状の改善又は根絶を指す。他の実施形態において、この用語は、そうした疾患を有する対象に１つ以上の治療剤を投与することでもたらされた疾患の広がり又は悪化の最小化を指す。
【００９８】
本明細書において使用するとき、「筋消耗の処置」という用語は、好ましくは筋線維の変性による不随意の骨格筋量喪失の治療、防止、又は遅延を指し得る。
【００９９】
特に、「骨格筋組織喪失及び／又は骨格筋衰弱をもたらす疾患又は障害の処置」という用語は、患者の骨格筋量及び／若しくは骨格筋力の維持又は増加、又は患者の骨格筋量喪失及び／若しくは骨格筋力喪失の遅延を指し得る。
【０１００】
有効量は、治療的又は予防的有効量であり得る。「治療有効量」とは、所望の治療的又は予防的結果を得るために、必要な投与量及び期間において有効な量を指す。治療有効量は、個人の疾患又は障害、疾患の段階、年齢、性別、及び体重などの要因に応じて変化し得る。治療有効量は、任意の毒性又は有害な作用を治療的に有益な作用が上回る量を含む。「予防有効量」とは、所望の予防的結果を得るために、必要な投与量及び期間において有効な量を指す。必ずしもそうではないが一般に、予防用量は疾患に先立って又は疾患の早い段階で対象に使用されるので、予防有効量は治療有効量未満であり得る。
【０１０１】
処置される疾患又は障害は、骨格筋組織若しくは骨格筋量の喪失及び／又は骨格筋衰弱をもたらす任意の疾患又は障害であり得る。
【０１０２】
筋消耗（すなわち、骨格筋組織喪失）及び筋衰弱は、代謝疾患（例えば、糖原蓄積症、脂肪蓄積症、若しくはプリンヌクレオチド代謝障害）、神経疾患（例えば、遺伝性感覚運動性ニューロパチータイプＩＩＩ）及び神経筋疾患、悪液質（すなわち、がん、ＡＩＤＳ、うっ血性心不全、慢性閉塞性肺疾患、重度の熱傷、腎不全、若しくは肝不全などの疾患に起因する筋萎縮）、サルコペニア、廃用性筋萎縮（すなわち、長期無活動に起因する萎縮）、神経性無食欲症による飢餓などの過度の飢餓により誘発された萎縮、又は急性筋損傷、オーバーユース筋損傷若しくは戦傷損傷を含む筋損傷などの大きな一群の疾患又は障害からもたらされ得るものである。
【０１０３】
好ましくは、処置される疾患又は障害は、神経筋疾患、悪液質、サルコペニア、廃用性筋萎縮、食欲不振性飢餓により誘発された萎縮、及び急性筋損傷又はオーバーユース筋損傷を含む筋損傷から選択される。より好ましくは、処置される疾患又は障害は、神経筋疾患、悪液質、及びサルコペニアから選択される。
【０１０４】
特定の実施形態において、疾患又は障害は、好ましくは筋疾患（すなわちミオパチー）、神経筋接合部疾患、又は運動ニューロン疾患から選択される、神経筋疾患である。
【０１０５】
ミオパチーは、骨格筋線維の機能障害による筋衰弱を主要な症状とする神経筋障害である。ミオパチーは、遺伝性又は後天性で有り得、例えば、筋ジストロフィー、ミトコンドリアミオパチー又は薬剤誘発性ミオパチーなどの代謝性ミオパチー、及び皮膚筋炎、多発性筋炎又は封入体筋炎などの自己免疫性ミオパチーを含むものである。
【０１０６】
筋ジストロフィーは、筋線維の進行性変性を引き起こして筋量喪失をもたらす大グループのミオパチーを代表するものである。筋ジストロフィーを引き起こす３０以上の遺伝子の突然変異が同定されている。筋ジストロフィーの例は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、筋強直性筋ジストロフィー、三好型筋ジストロフィーなどの遠位型筋ジストロフィー、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、及び眼咽頭筋型筋ジストロフィーを含むがこれらに限定されない。
【０１０７】
運動ニューロン疾患は、随意筋を制御する運動ニューロンの緩徐な変性及び死によって特徴づけられる障害である。つまり、運動ニューロンは、筋肉にメッセージを送ることを停止して、筋肉は緩徐に衰弱して萎縮する。運動ニューロン疾患は、例として、筋萎縮性側索硬化症、原発性側索硬化症、進行性筋萎縮、進行性球麻痺、偽性球麻痺、及び脊髄性筋萎縮を含む。
【０１０８】
神経筋接合部疾患には、神経筋接合部を介した神経伝達の混乱が共通してあるとともに筋力低下による進行性衰弱をもたらす障害である。神経筋接合部疾患は、例えば、重症筋無力症、自己免疫性神経性筋強直（アイザックス症候群）、ランバート・イートン筋無力症症候群を含み、又はヘビ毒若しくは神経毒（例えば、クロストリジウム属ボツリヌス毒素）などの神経筋接合部機能に作用する毒の形態に起因し得る。
【０１０９】
好ましくは、神経筋疾患は、筋ジストロフィーから、特にデュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、筋強直性筋ジストロフィー、三好型筋ジストロフィーなどの遠位型筋ジストロフィー、及び肢帯型筋ジストロフィーから選択される。
【０１１０】
他の特定の実施形態において、疾患又は障害は、悪液質及びサルコペニアから選択され、好ましくはサルコペニアである。
【０１１１】
本発明の方法において、本発明におけるＬＳＤ１阻害剤又は医薬組成物は、防止又は処置される疾患に応じて選択可能な他の有効成分と組み合わせて使用してもよい。他の有効成分の例は、例えば、抗炎症剤、タンパク質同化剤（例えば、成長ホルモン若しくはインスリン様成長因子Ｉ）、抗悪性腫瘍剤、抗生物質、局所麻酔剤、アナボリック／アンドロジェニックステロイド（例えば、テストステロン）、グルココルチコイド、食欲刺激剤（例えば、ドロナビノール）、サイトカインモジュレーター（例えば、サリドマイド）、アンジオテンシン及びβアドレナリン受容体阻害剤、ＮＨＥ−１阻害剤（例えば、リメポリド（rimeporide））、抗線維化剤（例えば、ロサルタン若しくはリシノプリル）、ホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）阻害剤（例えば、タダラフィル若しくはシルデナフィル）、デヒドロエピアンドロステロン、ビタミンＤ、ウルソール酸、オメガ３酸（omega 3 acid）、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、プロテアソーム阻害剤、シクロフィリンＤ阻害剤、ＰＧＣ−１α（アルファ）経路モジュレーター、ミオスタチン及びアクチビンＡアンタゴニスト、グレリンアンタゴニスト、β２−アドレナリン受容体アンタゴニスト、クレアチンサプリメント、ロサルタン及びリシノプリルなどの抗線維化剤、タダラフィル及びシルデナフィルなどの筋虚血治療剤、エクソンスキッピング治療などの突然変異特異的治療剤（例えば、ＤＭＤ症例に関する突然変異を標的とするモルフォリノホスホロジアミデートアンチセンスオリゴマーであるエテプリルセン）、アタルレンなどの治療的ナンセンス抑制用薬剤、ＳＭＴ−Ｃ１１００などのユートロフィン上方調節因子、遺伝子置換治療剤（rAAV2.5-CMV-Mini-dystrophy、rAAVrh74.MCK.Mini-dystrophy、若しくはrAAV1.CMV.huFollistatin344を使用するなど）、又は筋前駆細胞若しくは幹細胞を使用する細胞治療を含むがこれらに限定されない。
【０１１２】
上述したそうした組合せ治療は、組合せ投与（同じ又は個別の製剤に２つ以上の治療剤を含む）、及び個別投与（この場合、ＬＳＤ１阻害剤の投与は、さらなる治療剤の投与の前に、共に、及び／又は後に行われ得る）を含む。
【０１１３】
ＬＳＤ１阻害剤（及び任意のさらなる治療剤）は、非経口、経口、経粘膜、又は局所の投与、好ましくは経口の投与を含む、任意の適切な手段で投与可能である。
【０１１４】
投与に使用する用量は、種々のパラメータに応じて、特に使用される投与モード、関連する病理学、あるいは求められる治療存続期間に応じて、適応可能である。ＬＳＤ１阻害剤（及び任意のさらなる治療剤）は単一用量として又は複数用量で投与することができる。
【０１１５】
特定の障害又は状態の処置に有効であるＬＳＤ１阻害剤の量は、障害又は状態の特徴に応じたものであり、標準的な臨床技術によって定めることができる。
【０１１６】
好ましい実施形態において、各用量は、体重キログラムあたり約０．０５ｍｇ〜約２５０ｍｇのＬＳＤ１阻害剤、好ましくは体重キログラムあたり約０．１ｍｇ〜約２００ｍｇ、より好ましくは体重キログラムあたり約１ｍｇ〜約１５０ｍｇのＬＳＤ１阻害剤、さらにより好ましくは体重キログラムあたり約１０ｍｇ〜約１２０ｍｇのＬＳＤ１阻害剤の範囲であってもよい。
【０１１７】
投与の投薬スケジュールは、疾患のタイプ、疾患の重症度、及び治療剤に対する対象の感受性を含む多くの臨床的要因に応じて月に一回から毎日まで変わり得る。
【０１１８】
実験の項で示すように、ＬＳＤ１阻害剤は、筋萎縮を防止することができる。
【０１１９】
このように、本発明はまた、共に、個別に、又は連続して使用するための組合せ製剤として、上述のようなＬＳＤ１阻害剤と骨格筋萎縮を誘発する化合物とを含有する製品にも関する。
【０１２０】
骨格筋肥大誘発剤としてのＬＳＤ１阻害剤について上述したすべての実施形態はまた、この態様にも包含される。
【０１２１】
特定の実施形態において、骨格筋萎縮を誘発する化合物は治療剤である。この実施形態において、ＬＳＤ１阻害剤は、薬剤誘発性ミオパチーを防止又は限定するために使用される。
【０１２２】
本発明は、対象において治療剤によって誘発された骨格筋萎縮を防止又は限定する方法であって、上述のようなＬＳＤ１阻害剤の治療有効量を、該対象に、骨格筋萎縮を誘発する該治療剤の投与に対して共に、個別に、又は連続して投与することを含む方法にもさらに関する。
【０１２３】
骨格筋萎縮を誘発する治療剤の例は、副腎皮質ステロイド、コルヒチン、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、Ｄ−ペニシラミン、抗生物質、β遮断薬、アミオダロン、シメチジン、ジドブジン、ビンクリスチン、クロフィブラート、スタチン、フィブラート、シクロスポリン、Ｌ−トリプトファン、低カリウム血症誘発薬剤、及び脂質降下剤、又はフィブラートとスタチン、若しくはシクロスポリンとコルヒチンなどの薬剤の組合せ、並びにワクチンなどの筋肉内経路によって投与される治療剤を含むが、これらに限定されない。
【０１２４】
好ましい実施形態において、骨格筋萎縮を誘発する治療剤は脂質降下剤であり、好ましくはスタチン及びフィブラートから選択される。
【０１２５】
ＬＳＤ１阻害剤及び骨格筋萎縮を誘発する治療剤は、共に投与することができる。あるいは、ＬＳＤ１阻害剤は、骨格筋萎縮を誘発する治療剤の投与前又は投与後に対象に投与することができる。好ましくは、治療剤とＬＳＤ１阻害剤とが個別に投与されるとき、これらは２４時間以内に投与される。
【０１２６】
上述のようなＬＳＤ１阻害剤、すなわち骨格筋肥大誘発剤はまた、飼料及び食品産業において、特にダイエタリーサプリメントとしての用途も見いだされる。
【０１２７】
つまり、さらなる態様において、本発明はまた、ＬＳＤ１阻害剤を含むダイエタリーサプリメント組成物にも関する。
【０１２８】
本発明はまた、対象における筋量、筋力、及び／又は筋パフォーマンスを増加させるための、上述のようなＬＳＤ１阻害剤、又は本発明のダイエタリーサプリメント組成物の非治療的使用にも関する。
【０１２９】
本発明は、骨格筋量喪失、好ましくは不随意及び／又は望ましくない骨格筋量喪失を防止するために使用される、上述のようなＬＳＤ１阻害剤、又は本発明のダイエタリーサプリメント組成物の非治療的使用にさらに関する。
【０１３０】
対象は、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。
【０１３１】
実施形態において、対象は非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、さらにより好ましくは家畜動物又は競走馬などのスポーツ若しくはレジャー用動物である。家畜動物は、非ヒト哺乳動物、好ましくは肉用哺乳動物である。特に、家畜動物は、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、バイソン、シカ、エルク、又はムースから選択することができる。
【０１３２】
他の実施形態において、対象はヒト、好ましくは成人のヒトである。
【０１３３】
特定の実施形態において、対象は、例えば６０歳を超える高齢の成人のヒトであり、ダイエタリーサプリメント組成物は、筋機能及び／又は筋量低下の停止、遅延、又は防止に使用される又は適する。
【０１３４】
対象は、好ましくは健康な対象、すなわち骨格筋組織喪失及び／又は筋衰弱をもたらす疾患又は障害に罹患していない対象である。
【０１３５】
ダイエタリーサプリメント組成物は、粉末、液体、又は固体の形態であってもよい。
【０１３６】
好ましくは、ダイエタリーサプリメント組成物は経口投与用に製剤化される。特に、該ダイエタリーサプリメント組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、並びにシロップ剤、エリキシル剤、及び濃縮滴剤などの液体製剤などの従来の経口投与剤形に製剤化することができる。非毒性の固体担体又は希釈剤を使用することができ、これらは例として、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、マグネシウム、カーボネートなどを含む。圧縮錠剤では、粉末材料に粘着特性を与える薬剤である結合剤も必要とされる。例として、デンプン、ゼラチン、ラクトース又はデキストロースなどの糖、及び天然ガム又は合成ガムを結合剤として使用可能である。また、崩壊剤も錠剤を崩壊しやすくするために錠剤に必要とされる。崩壊剤は、デンプン、クレイ、セルロース、アルギン、ガム、及び架橋ポリマーを含む。さらに、潤滑剤及び滑剤も、製造プロセスにおいて錠剤材料が表面に付着しないように、及び製造時に粉末材料の流動特性を向上させるために、錠剤に含まれる。コロイド状二酸化ケイ素が滑剤として最も一般に使用され、タルク又はステアリン酸などの化合物が潤滑剤として最も一般に使用される。
【０１３７】
ダイエタリーサプリメント組成物は、ビタミン（例えばビタミンＤ）、アミノ酸、タンパク質、脂質（オメガ３脂肪酸）、ウルソール酸、トマチジン（tomaditine）、抗酸化剤、ポリフェノール、大豆に存在するイソフラボン及び誘導体、茶葉成分、並びににんにく化合物などの、対象に有益な作用を与えるさらなる成分を含むことができる。
【０１３８】
ＬＳＤ１阻害剤及び特に骨格筋肥大誘発剤としてのその使用について上述したすべての実施形態はまた、この態様にも包含される。
【０１３９】
本発明はまた、動物用飼料組成物のための材料又は動物用飼料組成物のための添加剤としての、上述のようなＬＳＤ１阻害剤の使用にも関する。本発明はまた、動物用飼料組成物のための材料若しくは添加剤を調製するための、ＬＳＤ１阻害剤の使用にも関する。本発明は、上述のようなＬＳＤ１阻害剤を含む動物用飼料組成物のための材料又は添加剤にさらに関する。
【０１４０】
本発明は、材料又は添加剤として、上述のようなＬＳＤ１阻害剤を含む家畜用飼料組成物にさらに関する。
【０１４１】
本発明の飼料組成物、材料、添加剤、又はダイエタリーサプリメントは、例えばトウモロコシグルテンフィード、ヒマワリ外皮、蒸留かす、グアー外皮、コムギミドリング粉、米籾殻、米糠、油糧種子粉末、乾燥血粉、動物副産物粉末、魚副産物、魚粉、可溶性干し魚、羽毛粉、家禽副産物、肉粉、骨粉、乾燥ホエー、大豆濃縮タンパク質、大豆粉、酵母、コムギ、オートムギ、穀実用モロコシ、トウモロコシフィード粉末、ライムギ、トウモロコシ、オオムギ、吸引穀物画分、乾燥醸造かす、トウモロコシ粉、トウモロコシグルテン粉末、飼料オートムギ粉末、モロコシ穀粒粉、コムギミルラン、コムギレッドドッグ、ホミニーフィード、コムギ粉、コムギふすま、コムギ胚芽粉末、オートムギグローツ、ライムギミドリング粉、子葉繊維、粉砕穀物、又はそれらの混合物などの任意の食用ＧＲＡＳ（一般に安全と認められる（generally recognized as safe））材料をさらに含むことができる。
【０１４２】
好ましくは、本発明の飼料組成物、材料、添加剤、又はダイエタリーサプリメントは、特に家畜の性能を向上させるため、すなわち増体量を増加させるため、非治療的骨格筋肥大誘発剤として使用される。つまり、好ましくは、飼料組成物、材料、添加剤、又はダイエタリーサプリメントは、健康な対象、すなわち骨格筋組織喪失及び／又は筋衰弱をもたらす疾患又は障害に罹患していない対象に投与するために用いられる。対象は、本発明のダイエタリーサプリメント組成物について上述したとおりであってもよい。
【０１４３】
本発明はまた、家畜の性能及び／又は健康を向上させる方法であって、上述のようなＬＳＤ１阻害剤、特に本発明の飼料組成物、材料、添加剤、又はダイエタリーサプリメントを該家畜に与えることを含む方法にも関する。好ましくは、本明細書において使用するとき、「家畜の性能を向上させる」という用語は、増体量を増加させることを指す。この使用は上述のような非治療的使用であることを意図し、好ましくは、化合物、飼料組成物、材料、添加剤、又はダイエタリーサプリメントは、健康な家畜、すなわち骨格筋組織喪失及び／又は筋衰弱をもたらす疾患又は障害に罹患していない家畜に投与するために用いられる。
【０１４４】
飼料組成物、材料、添加剤、又はダイエタリーサプリメントは、粉末、液体、又は固体の形態であってもよい。
【０１４５】
ＬＳＤ１阻害剤以外の本発明の飼料組成物の成分は、家畜の特徴に応じたものであり、当業者によって容易に選択されることができる。
【０１４６】
好ましくは、本発明の飼料組成物は、国立食品局（例えば、仏国のＡＮＳＥＳ、加国のＡＣＩＡ、又は米国のＦＡＤ）などの政府機関によって承認された形態及び／又は組成物である。
【０１４７】
ＬＳＤ１阻害剤及び特に骨格筋肥大誘発剤としてのその使用について上述したすべての実施形態はまた、この態様にも包含される。
【０１４８】
以下の実施例は例示の目的で提供され、限定するものではない。
【実施例】
【０１４９】
〔実施例１〕
［材料及び方法］
＜細胞源及び細胞培養＞
健康なドナーの一次骨格細胞（ドナー１及びドナー３）はクロネテイクス（Clonetics）のヒト骨格筋筋芽細胞（Human Skeletal MuscleMyoblasts(HSMM)であった。
【０１５０】
ドナーの特徴を以下の表３に詳細に示す。
【表３】
2020500197.tif 000008
【０１５１】
入手先の指示にしたがって、ロンザより入手したサプリメント及びウシ胎仔血清（ＦＢＳ）とともに筋細胞を培養液に保持した。スクリーニングプレートに播種するために十分な細胞を得るため、増殖ステップを行った。
【０１５２】
＜肥大アッセイ及び萎縮回復アッセイ＞
ＭｙｏＳｃｒｅｅｎ（サイトー、仏国）と呼称されるインビトロの完全自動ヒト筋管モデルを使用して、肥大及び萎縮回復アッセイを行った。このモデルは、ヒト一次筋芽細胞の分化をガイドするミクロ環境の厳密な制御に依存するものである。ＭｙｏＳｃｒｅｅｎ微小パターンに形成される筋管は、高度に画一化された形態とともに高レベルの成熟性を示す。
【０１５３】
ドナーのヒト一次筋芽細胞をＭｙｏＳｃｒｅｅｎ微小パターンの９６ウェルプレート（サイトー、仏国）に播種し、増殖培地において２４時間接着させ、ウマ低血清培地において少なくとも５日間分化させた。
【０１５４】
０日目に、微小パターンを含むＭｙｏＳｃｒｅｅｎプレート（サイトー、仏国）を２００μｌ／ｗｅｌｌの増殖培地で前もって充填し、インキュベーターに３７℃で保管した。ヒト一次筋芽細胞をフラスコから剥離して、カウントし、１００μｌの増殖培地においてウェルにつき１５０００細胞でプレートに播種した。
【０１５５】
１日目に、増殖培地を３００μｌ／ｗｅｌｌの分化培地（０．１％ウマ血清を含むＤＭＥＭ）に変え、その中で、筋芽細胞が分化及び筋管形成を開始した。
【０１５６】
２日目に、分化培地を交換した。そして、候補の化合物を分化培地で希釈して、プレートに移した。ＤＭＳＯの最終濃度は０．１％以下である必要がある。少なくとも６ウェルを基本コントロールとしてビヒクルで処理し、６ウェルを肥大正コントロールとして１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１で処理した。
【０１５７】
萎縮回復アッセイでは、候補化合物添加の１時間後、萎縮誘発剤である最終濃度が１５０ｎｇ／ｍＬのミオスタチン、２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１β、２ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−α、０．５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β、及び１００μＭのデキサメタゾンを添加した。
【０１５８】
６日目に、細胞をホルマリン５％で３０分間室温で固定して、ＰＢＳ内にて０．１％トリトンＸ−１００で１５分間透過処理し、ＰＢＳ＋ＢＳＡ１％で２０分間ブロックした。筋管をブロッキングバッファ内で１．５時間トロポニンＴに対する一次抗体とともにインキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄して、二次抗体及びヘキスト（１／１００００）とともに１．５時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した。
【０１５９】
＜画像分析＞
オペレッタハイコンテンツイメージングシステムにて画像を１０倍倍率で得た。サイトーによるアカペラハイコンテンツイメージングソフトウエア（Perkin Elmer）において開発された専用のアルゴリズムを用いて、画像処理及び分析を行った。ウェルごとに１１視野を得た。
【０１６０】
まず、それぞれトロポニンＴ染色強度とヘキスト染色とを使用して、筋管及び核のセグメンテーションを行った。通常、微小パターンごとに１〜２の筋管を同定した（筋管は少なくとも２つの核を含むトロポニンＴ染色領域である）。バックグラウンドノイズの検出を回避して異常な小筋管構造を排除するために、セグメンテーションのしきい値を設定した。この第１ステップの終了時に、核カウント及び融合指数（トロポニンＴ染色に含まれる核のパーセンテージ）など、特定の読み出しを全ウェルにおいて計算した。通常、コントロール条件において約５０〜６０の筋管をウェルごとに検出した。
【０１６１】
そして、画像の境界に接する筋管を取り除くためにトロポニンＴ画像に画像クリーンアップステップを行った。筋管幅及び面積を含む筋管形態パラメータ、並びに筋管ごとの核の数を抽出するために、最終の有効な筋管を使用した。
【０１６２】
筋管分化並びに萎縮及び肥大誘発に関連し、影響を受ける読み出しとして、核カウント、融合指数、平均筋管面積、及び筋管ごとの核の数を検証した。
【０１６３】
＜一次スクリーニング＞
筋管分化及び筋管サイズを増加させる肥大化合物を特定するために一次スクリーニングを行った。候補化合物を、ドナー３の細胞においてモノプリケートにて１０μＭでテストした。
【０１６４】
＜再テスト＞
再テストをチェリーピッキングにて行った（一次スクリーニングと同じ化合物群）。各ヒットを６ウェルのレプリケートにおいて一次スクリーニングにおけるものと同じ条件（ドナー３、１０μＭ）でテストした。
【０１６５】
＜２人の健康なドナーにおける用量反応＞
用量反応アッセイを２人の健康なドナーにおいて（健康なドナー３及び１）、３３μＭ〜０．０１５μＭの８用量の候補化合物、用量ごとに２ウェルのレプリケートにて行った。
【０１６６】
＜ＥＣ５０算出＞
用量ごとにトリプリケートのウェルで対象の化合物を用量反応において数回テストした。結果をコントロール条件（基本レベル）に対してノーマライズし、グラフパッドｍプリズムを使用してプロットした。「核カウント」の読み出しにより任意の毒性作用を検出できた。「融合指数」及び「ミオシン面積」の読み出しを、グラフパッドプリズムフィッティングソリューションを使用してＥＣ５０値を測定するために使用した。
【０１６７】
＜萎縮回復評価＞
萎縮誘発剤、すなわち、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ミオスタチン、ＴＧＦ−β、及びデキサメタゾン、並びに１μＭトラニルシプロミンの存在下でトリプリケートにて萎縮回復アッセイを行った。
【０１６８】
［結果］
以下の表４に示すように、トラニルシプロミンは、＋３０％を超える融合指数及び／又は筋管面積の読み出し増加を誘発して、一次スクリーニング及び再テスト時に骨格筋肥大誘発剤として特定された。
表４は、健康なドナー３における肥大活性を示す。
【表４】
2020500197.tif 000009
（％活性＝筋管融合指数（化合物）×１００／筋管融合指数（基本コントロール））
【０１６９】
２人の健康なドナーにおいて用量反応を行った。結果を表５に示す。トラニルシプロミンは健康な男性及び女性ドナーの両方で活性であった。用量反応範囲が、最小及び最大活性レベルを検出するには非常に高かったため、そのＥＣ５０を正確に測定できなかった。
表５は、２人の異なるドナーにおける第１用量反応アッセイの結果を示す。
【表５】
2020500197.tif 000010
【０１７０】
ＥＣ５０をより正確に測定するために、第２用量反応を健康なドナー３に行い、より低い濃度をテストした。さらに、２つのさらなるＬＳＤ１阻害剤、すなわちＲＮ１ジヒドロクロリド及びＧＳＫ  ＬＳＤ１をテストした。結果を表６に示す。マイクロモル範囲より低いＥＣ５０値を確認した。
表６は、健康なドナー３における第２用量反応アッセイの結果を示す。
【表６】
2020500197.tif 000011
【０１７１】
トラニルシプロミンに対して萎縮回復アッセイを行った。健康なドナー３の筋管を種々の誘発剤、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ミオスタチン、ＴＧＦ−β、及びデキサメタゾンを使用して萎縮させた。これらの種々の萎縮誘発剤によって誘発された萎縮を抑制するトラニルシプロミンの能力を測定した。
【０１７２】
表７に示す結果は、トラニルシプロミンがＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ミオスタチン、ＴＧＦ−β、及びデキサメタゾンにより誘発された萎縮を阻害可能であることを示す。
表７は、萎縮回復アッセイの結果を示す。
【表７】
2020500197.tif 000012
(+++:全回復、++:部分回復、+：低回復)
【０１７３】
〔実施例２〕
５人の健康なドナーにおいてＧＳＫ  ＬＳＤ１及びＢｉｚｉｎｅで用量反応アッセイを行った。ドナーの特徴を以下の表８に詳細に示す。
【表８】
2020500197.tif 000013
【０１７４】
アッセイを実施例１に記載のように行い、結果を表９に示す。
表９は、健康なドナー３、５、７、Ｃ１、及びＣ１３における用量反応アッセイの結果を示す。
【表９】
2020500197.tif 000014
【０１７５】
〔実施例３−インビボアッセイ〕
デュシェンヌ型筋ジストロフィーマウスモデル、ＤＭＤｍｄｘマウスの骨格筋機能におけるＧＳＫ−ＬＳＤ１の有益性を評価する。
【０１７６】
１０ｍｇ／ｄａｙ／ｋｇでの６週の処置後、１）インビボにおいて、グリップテスト及びワイヤテストを実施すること、２）原位置において、分離した筋肉の収縮特性を分析すること、３）インビトロにおいて、ＤＭＤｍｄｘマウスの最も影響の及ぶ筋肉の１つとされる筋肉である横隔膜の分離した透過処理線維の収縮特性を分析することによって、筋機能の分析を行った。これらの手法は、筋損傷の指標である血漿クレアチンキナーゼレベル（ＣＫ）の分析により完了させた。
【０１７７】
〔実施例４〕
［材料及び方法］
＜アセチルコリン受容体（AchR）クラスター形成アッセイ＞
ＭｙｏＳｃｒｅｅｎプロトコルを実施例１の肥大及び萎縮回復アッセイにおいて記載したように行ったが、６日目ではなく９日目に停止した。アッセイの終了時に、トロポニンＴ及び核に加えて、ＡｃｈＲが特異的抗体を使用して免疫染色された。ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒのオペレッタハイコンテンツイメージングシステムにて画像を２０倍で得た。アカペラハイコンテンツイメージングソフトウエア（Perkin Elmer）において開発された専用のアルゴリズムを用いて、画像処理及び分析を行った。核カウント及び筋管融合指数、ＡｃｈＲの数、ＡｃｈＲ平均面積、筋管総面積によってノーマライズしたＡｃｈＲ総面積である、特定の読み出しを各ウェルにおいて計算した。
【０１７８】
［結果］
注目すべきことには、特異的抗ＡｃｈＲ抗体で標識すると、分化後６日のＭｙｏＳｃｒｅｅｎ筋管は、筋管線維の中途部及び筋管端部の特定領域において筋鞘膜に沿って区切るＡｃｈＲクラスターを示す。自動ＡｃｈＲクラスターアッセイを開発するため、オペレッタ／アカペラシステム（材料及び方法を参照）を使用して画像におけるクラスターの凝集数及びサイズを分析するために十分な感受性があり堅牢なＡｃｈＲ検出ルーチンを開発した。ＡｃｈＲクラスター形成におけるＧＳＫ−ＬＳＤ１の効果は、２人の健康なドナー（ドナー３及びドナー５）を用いて、神経筋接合部における化合物の正の効果を示すために評価された。処置の７日後、ＧＳＫ−ＬＳＤ１は、ＡｃｈＲクラスター総面積を、ドナー５モデルにおいて＋２６０％、及びドナー３において＋５０％、有意に増加させる（図１を比較のこと）。
【図１】
2020500197.tif 000018
【国際調査報告】
2020500197.tif 000019
2020500197.tif 000020