(57)【要約】ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐの発現を伴う、非家族性遅発型アルツハイマー病に関係する１つまたは複数の症状または徴候を特徴とする遺伝子改変マウスであって、マウスのゲノムが、１）プロモーターに動作可能に連結されたヒトＡＰＯＥ４タンパク質（ＡＰＯＥ４ｐ）をコードするＤＮＡ配列、および２）プロモーターに動作可能に連結された、ｐ．Ｒ４７Ｈ変異を有するマウスＴｒｅｍ２タンパク質（Ｔｒｅｍ２ｐ）をコードするＤＮＡ配列を含み、これによりマウスが、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現する、遺伝子改変マウスが提供される。このような遺伝子改変マウスを使用して、アルツハイマー病の処置における使用のための化合物についてスクリーニングするための方法が提供される。
2020515248.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐの発現を伴う、非家族性遅発型アルツハイマー病に関係する１つまたは複数の症状または徴候を特徴とする遺伝子改変マウスであって、前記マウスのゲノムが、１）プロモーターに動作可能に連結されたヒトＡＰＯＥ４タンパク質（ＡＰＯＥ４ｐ）をコードするＤＮＡ配列、および２）プロモーターに動作可能に連結された、ｐ．Ｒ４７Ｈ変異を有するマウスＴｒｅｍ２タンパク質（Ｔｒｅｍ２ｐ）をコードするＤＮＡ配列を含み、前記マウスが、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現する、遺伝子改変マウス。
【請求項２】
前記ＡＰＯＥ４ｐが、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、または前記ＡＰＯＥ４ｐが、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号２とハイブリダイズする核酸の相補体によりコードされる、請求項１に記載の遺伝子改変マウス。
【請求項３】
前記マウスＴｒｅｍ２ｐが、配列番号３のアミノ酸配列を含むか、または前記マウスＴｒｅｍ２ｐが、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号４とハイブリダイズする核酸の相補体によりコードされる、請求項１に記載の遺伝子改変マウス。
【請求項４】
前記マウスのゲノムが、１）プロモーターに動作可能に連結されたヒトＡＰＯＥ４タンパク質（ＡＰＯＥ４ｐ）をコードするＤＮＡ配列、および２）プロモーターに動作可能に連結された、ｐ．Ｒ４７Ｈ変異を有するマウスＴｒｅｍ２タンパク質（Ｔｒｅｍ２ｐ）をコードするＤＮＡ配列を含む、Ｂ６（ＳＪＬ）−Ａｐｏｅｔｍ１．１（ＡＰＯＥ＊４）ＡｄｉｕｊＴｒｅｍ２ｅｍ１Ａｄｉｕｊ／Ｊマウスであり、前記マウスが、ＡＰＯＥ４ｐをコードするＤＮＡ配列について、およびＴｒｅｍ２ｐをコードするＤＮＡ配列についてホモ接合性であり、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現する、請求項１に記載の遺伝子改変マウス。
【請求項５】
アルツハイマー病の処置における使用のための化合物についてスクリーニングするための方法であって、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の遺伝子改変マウスに化合物を投与するステップと、
非家族性遅発型アルツハイマー病に関係する、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐの発現を伴う１つまたは複数の症状または徴候の処置に対する前記化合物の作用をマウスにおいて評価するステップと
を含む、方法。
【請求項６】
前記化合物の作用を評価するステップが、請求項１〜４のいずれか一項に記載の遺伝子改変マウスに対する前記化合物の作用を、対照と比較することを含む、請求項５に記載のアルツハイマー病の処置における使用のための化合物についてスクリーニングするための方法。
【請求項７】
前記対照が、
ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現しないマウスに前記化合物を投与するステップと、
前記化合物の作用を前記マウスにおいて評価するステップと
を含む、請求項６に記載のアルツハイマー病の処置における使用のための化合物についてスクリーニングするための方法。
【請求項８】
前記対照が、
野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに前記化合物を投与するステップと、
前記化合物の作用を前記野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて評価するステップと
を含む、請求項６または７に記載のアルツハイマー病の処置における使用のための化合物についてスクリーニングするための方法。
【請求項９】
前記対照が、
ＡＰＯＥ３発現マウスに前記化合物を投与するステップと、
前記化合物の作用を前記ＡＰＯＥ３発現マウスにおいて評価するステップと
を含む、請求項６または７に記載のアルツハイマー病の処置における使用のための化合物についてスクリーニングするための方法。
【請求項１０】
ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐの発現を伴う、実質的に本明細書で記載される非家族性遅発型アルツハイマー病に関係する１つまたは複数の症状または徴候を特徴とする遺伝子改変マウス。
【請求項１１】
実質的に本明細書で記載されるアルツハイマー病の処置における使用のための化合物についてスクリーニングするための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１７年３月２１日に出願された米国仮特許出願番号第６２／４７４，３５８号からの優先権を主張しており、その全体の内容は、参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
政府支援
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＡＧ０５４３４５の下、政府支援でなされた。政府は本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、概して、ヒトアルツハイマー病のモデルとして有用な遺伝子改変マウスに関する。特定の態様では、本発明は、ヒトＡＰＯＥ４およびマウスＴｒｅｍ２  ｐ．Ｒ４７Ｈを発現する遺伝子改変マウスならびにその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
アルツハイマー病（ＡＤ）のための療法の開発に対する主要な障害のうちの１つは、前臨床試験において使用する動物モデルが存在しないことである。この１つの理由は、既存のモデルが、家族性の変異に基づいているが、臨床集団の大半が、非家族性遅発型ＡＤを有するためであり得る。
【０００５】
家族性または早発型アルツハイマー病は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子における変異もしくはその過剰発現、またはプレセニリン遺伝子（ＰＳＥＮ１またはＰＳＥＮ２）における変異により引き起こされる。これらのすべては、神経毒性であると考えられているＡベータ４２ペプチド産生の増加を生じる。家族性アルツハイマー病の態様を模倣する、数百とまではいかないまでも多数のマウスモデルが作成されている。多くの処置は、これらの家族性アルツハイマー病マウスモデルにおいて有効であることが明らかとなっているが、臨床試験において試験した場合は、いずれも有効ではなかった。
【０００６】
対照的に、遅発型アルツハイマー病は、ヒトアルツハイマー病患者集団の９５〜９８％を占めるが、単純で明解な遺伝的病因を有しない。遅発型アルツハイマー病は、老化のプロセスと相互作用する多様な遺伝的および環境的要因に起因する多因子症候群であると考えられる。この複雑さのため、遺伝的要因は、未だ十分には理解されておらず、ヒトにおける遅発型アルツハイマー病の有用なマウスモデルは、これまでに報告されていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の要旨
ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐの発現を伴う、非家族性遅発型アルツハイマー病に関係する１つまたは複数の症状または徴候を特徴とする遺伝子改変マウスであって、マウスのゲノムが、１）プロモーターに動作可能に連結されたヒトＡＰＯＥ４タンパク質（ＡＰＯＥ４ｐ）をコードするＤＮＡ配列、および２）プロモーターに動作可能に連結された、ｐ．Ｒ４７Ｈ変異を有するマウスＴｒｅｍ２タンパク質（Ｔｒｅｍ２ｐ）をコードするＤＮＡ配列を含み、マウスが、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現する、遺伝子改変マウスが本発明の態様に従って提供される。本発明の態様によれば、マウスは、ＡＰＯＥ４ｐをコードするＤＮＡ配列について、およびＴｒｅｍ２ｐをコードするＤＮＡ配列についてホモ接合性である。
【０００８】
ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐの発現を伴う、非家族性遅発型アルツハイマー病に関係する１つまたは複数の症状または徴候を特徴とする遺伝子改変マウスであって、マウスのゲノムが、１）プロモーターに動作可能に連結されたヒトＡＰＯＥ４タンパク質（ＡＰＯＥ４ｐ）をコードするＤＮＡ配列、および２）プロモーターに動作可能に連結された、ｐ．Ｒ４７Ｈ変異を有するマウスＴｒｅｍ２タンパク質（Ｔｒｅｍ２ｐ）をコードするＤＮＡ配列を含み、マウスが、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現し、ＡＰＯＥ４ｐが、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、またはＡＰＯＥ４ｐが、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号２とハイブリダイズする核酸の相補体によりコードされる、遺伝子改変マウスが本発明の態様に従って提供される。本発明の態様によれば、マウスは、ＡＰＯＥ４ｐをコードするＤＮＡ配列について、およびＴｒｅｍ２ｐをコードするＤＮＡ配列についてホモ接合性である。
【０００９】
ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐの発現を伴う、非家族性遅発型アルツハイマー病に関係する１つまたは複数の症状または徴候を特徴とする遺伝子改変マウスであって、マウスのゲノムが、１）プロモーターに動作可能に連結されたヒトＡＰＯＥ４タンパク質（ＡＰＯＥ４ｐ）をコードするＤＮＡ配列、および２）プロモーターに動作可能に連結された、ｐ．Ｒ４７Ｈ変異を有するマウスＴｒｅｍ２タンパク質（Ｔｒｅｍ２ｐ）をコードするＤＮＡ配列を含み、マウスが、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現し、マウスＴｒｅｍ２ｐが、配列番号３のアミノ酸配列を含むか、またはマウスＴｒｅｍ２ｐが、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号４とハイブリダイズする核酸の相補体によりコードされる、遺伝子改変マウスが本発明の態様に従って提供される。本発明の態様によれば、マウスは、ＡＰＯＥ４ｐをコードするＤＮＡ配列について、およびＴｒｅｍ２ｐをコードするＤＮＡ配列についてホモ接合性である。
【００１０】
ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐの発現を伴う、非家族性遅発型アルツハイマー病に関係する１つまたは複数の症状または徴候を特徴とする遺伝子改変マウスであって、マウスのゲノムが、１）プロモーターに動作可能に連結されたヒトＡＰＯＥ４タンパク質（ＡＰＯＥ４ｐ）をコードするＤＮＡ配列、および２）プロモーターに動作可能に連結された、ｐ．Ｒ４７Ｈ変異を有するマウスＴｒｅｍ２タンパク質（Ｔｒｅｍ２ｐ）をコードするＤＮＡ配列を含み、マウスが、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現し、ＡＰＯＥ４ｐが、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、またはＡＰＯＥ４ｐが、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号２とハイブリダイズする核酸の相補体によりコードされ、マウスＴｒｅｍ２ｐが、配列番号３のアミノ酸配列を含むか、またはマウスＴｒｅｍ２ｐが、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号４とハイブリダイズする核酸の相補体によりコードされる、遺伝子改変マウスが本発明の態様に従って提供される。本発明の態様によれば、マウスは、ＡＰＯＥ４ｐをコードするＤＮＡ配列について、およびＴｒｅｍ２ｐをコードするＤＮＡ配列についてホモ接合性である。
【００１１】
ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐの発現を伴う、非家族性遅発型アルツハイマー病に関係する１つまたは複数の症状または徴候を特徴とする遺伝子改変マウスであって、マウスのゲノムが、１）プロモーターに動作可能に連結されたヒトＡＰＯＥ４タンパク質（ＡＰＯＥ４ｐ）をコードするＤＮＡ配列、および２）プロモーターに動作可能に連結された、ｐ．Ｒ４７Ｈ変異を有するマウスＴｒｅｍ２タンパク質（Ｔｒｅｍ２ｐ）をコードするＤＮＡ配列を含む、Ｂ６（ＳＪＬ）−Ａｐｏｅｔｍ１．１（ＡＰＯＥ＊４）ＡｄｉｕｊＴｒｅｍ２ｅｍ１Ａｄｉｕｊ／Ｊマウスであり、マウスが、ＡＰＯＥ４ｐをコードするＤＮＡ配列について、およびＴｒｅｍ２ｐをコードするＤＮＡ配列についてホモ接合性であり、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現する、遺伝子改変マウスが本発明の態様に従って提供される。
【００１２】
アルツハイマー病の処置における使用のための処置についてスクリーニングするための方法であって、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐの発現を伴う、非家族性遅発型アルツハイマー病に関係する１つまたは複数の症状または徴候を特徴とする、本発明の態様に従って提供される遺伝子改変マウスであって、マウスのゲノムが、１）プロモーターに動作可能に連結されたヒトＡＰＯＥ４タンパク質（ＡＰＯＥ４ｐ）をコードするＤＮＡ配列、および２）プロモーターに動作可能に連結された、ｐ．Ｒ４７Ｈ変異を有するマウスＴｒｅｍ２タンパク質（Ｔｒｅｍ２ｐ）をコードするＤＮＡ配列を含み、マウスが、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現する、遺伝子改変マウスに処置を施すステップと、非家族性遅発型アルツハイマー病に関係する、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐの発現を伴う１つまたは複数の症状または徴候に対する処置効果をマウスにおいて評価するステップとを含む、方法が本発明の態様に従って提供される。本発明の態様によれば、マウスは、ＡＰＯＥ４ｐをコードするＤＮＡ配列について、およびＴｒｅｍ２ｐをコードするＤＮＡ配列についてホモ接合性である。本発明の態様によれば、処置効果を評価するステップは、遺伝子改変マウスに対する処置効果を対照と比較することを含む。本発明の態様によれば、対照は、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現しないマウスに処置を施すステップと、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現しないマウスに対する処置効果を評価するステップとを含む。本発明の態様によれば、対照は、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに処置を施すステップと、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対する処置効果を評価するステップとを含む。本発明の態様によれば、対照は、ＡＰＯＥ３発現マウスに処置を施すステップと、ＡＰＯＥ３発現マウスに対する処置効果を評価するステップとを含む。
【００１３】
アルツハイマー病の処置における使用のための処置についてスクリーニングするための方法であって、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐの発現を伴う、非家族性遅発型アルツハイマー病に関係する１つまたは複数の症状または徴候を特徴とする、本発明の態様に従って提供される遺伝子改変マウスであって、マウスのゲノムが、１）プロモーターに動作可能に連結されたヒトＡＰＯＥ４タンパク質（ＡＰＯＥ４ｐ）をコードするＤＮＡ配列、および２）プロモーターに動作可能に連結された、ｐ．Ｒ４７Ｈ変異を有するマウスＴｒｅｍ２タンパク質（Ｔｒｅｍ２ｐ）をコードするＤＮＡ配列を含み、マウスが、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現し、ＡＰＯＥ４ｐが、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、またはＡＰＯＥ４ｐが、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号２とハイブリダイズする核酸の相補体によりコードされる、遺伝子改変マウスに処置を施すステップと、非家族性遅発型アルツハイマー病に関係する、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐの発現を伴う１つまたは複数の症状または徴候に対する処置効果をマウスにおいて評価するステップとを含む、方法が本発明の態様に従って提供される。本発明の態様によれば、マウスは、ＡＰＯＥ４ｐをコードするＤＮＡ配列について、およびＴｒｅｍ２ｐをコードするＤＮＡ配列についてホモ接合性である。本発明の態様によれば、処置効果を評価するステップは、遺伝子改変マウスに対する処置効果を対照と比較することを含む。本発明の態様によれば、対照は、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現しないマウスに処置を施すステップと、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現しないマウスに対する処置効果を評価するステップとを含む。本発明の態様によれば、対照は、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに処置を施すステップと、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対する処置効果を評価するステップとを含む。本発明の態様によれば、対照は、ＡＰＯＥ３発現マウスに処置を施すステップと、ＡＰＯＥ３発現マウスに対する処置効果を評価するステップとを含む。
【００１４】
アルツハイマー病の処置における使用のための処置についてスクリーニングするための方法であって、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐの発現を伴う、非家族性遅発型アルツハイマー病に関係する１つまたは複数の症状または徴候を特徴とする、本発明の態様に従って提供される遺伝子改変マウスであって、マウスのゲノムが、１）プロモーターに動作可能に連結されたヒトＡＰＯＥ４タンパク質（ＡＰＯＥ４ｐ）をコードするＤＮＡ配列、および２）プロモーターに動作可能に連結された、ｐ．Ｒ４７Ｈ変異を有するマウスＴｒｅｍ２タンパク質（Ｔｒｅｍ２ｐ）をコードするＤＮＡ配列を含み、マウスが、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現し、マウスＴｒｅｍ２ｐが、配列番号３のアミノ酸配列を含むか、またはマウスＴｒｅｍ２ｐが、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号４とハイブリダイズする核酸の相補体によりコードされる、遺伝子改変マウスに処置を施すステップと、非家族性遅発型アルツハイマー病に関係する、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐの発現を伴う１つまたは複数の症状または徴候に対する処置効果をマウスにおいて評価するステップとを含む、方法が本発明の態様に従って提供される。本発明の態様によれば、マウスは、ＡＰＯＥ４ｐをコードするＤＮＡ配列について、およびＴｒｅｍ２ｐをコードするＤＮＡ配列についてホモ接合性である。本発明の態様によれば、処置効果を評価するステップは、遺伝子改変マウスに対する処置効果を対照と比較することを含む。本発明の態様によれば、対照は、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現しないマウスに処置を施すステップと、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現しないマウスに対する処置効果を評価するステップとを含む。本発明の態様によれば、対照は、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに処置を施すステップと、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対する処置効果を評価するステップとを含む。本発明の態様によれば、対照は、ＡＰＯＥ３発現マウスに処置を施すステップと、ＡＰＯＥ３発現マウスに対する処置効果を評価するステップとを含む。
【００１５】
ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐの発現を伴う、非家族性遅発型アルツハイマー病に関係する１つまたは複数の症状または徴候を特徴とする、本発明の態様に従って提供される遺伝子改変マウスであって、マウスのゲノムが、１）プロモーターに動作可能に連結されたヒトＡＰＯＥ４タンパク質（ＡＰＯＥ４ｐ）をコードするＤＮＡ配列、および２）プロモーターに動作可能に連結された、ｐ．Ｒ４７Ｈ変異を有するマウスＴｒｅｍ２タンパク質（Ｔｒｅｍ２ｐ）をコードするＤＮＡ配列を含み、マウスが、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現し、ＡＰＯＥ４ｐが、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、またはＡＰＯＥ４ｐが、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号２とハイブリダイズする核酸の相補体によりコードされ、マウスＴｒｅｍ２ｐが、配列番号３のアミノ酸配列を含むか、またはマウスＴｒｅｍ２ｐが、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号４とハイブリダイズする核酸の相補体によりコードされる、遺伝子改変マウスに処置を施すステップと、非家族性遅発型アルツハイマー病に関係する、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐの発現を伴う１つまたは複数の症状または徴候に対する処置効果をマウスにおいて評価するステップとを含む、方法が本発明の態様に従って提供される。本発明の態様によれば、マウスは、ＡＰＯＥ４ｐをコードするＤＮＡ配列について、およびＴｒｅｍ２ｐをコードするＤＮＡ配列についてホモ接合性である。本発明の態様によれば、処置効果を評価するステップは、遺伝子改変マウスに対する処置効果を対照と比較することを含む。本発明の態様によれば、対照は、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現しないマウスに処置を施すステップと、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現しないマウスに対する処置効果を評価するステップとを含む。本発明の態様によれば、対照は、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに処置を施すステップと、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対する処置効果を評価するステップとを含む。本発明の態様によれば、対照は、ＡＰＯＥ３発現マウスに処置を施すステップと、ＡＰＯＥ３発現マウスに対する処置効果を評価するステップとを含む。
【００１６】
アルツハイマー病の処置における使用のための処置についてスクリーニングするための方法であって、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐの発現を伴う、非家族性遅発型アルツハイマー病に関係する１つまたは複数の症状または徴候を特徴とする、本発明の態様に従って提供される遺伝子改変マウスであって、マウスのゲノムが、１）プロモーターに動作可能に連結されたヒトＡＰＯＥ４タンパク質（ＡＰＯＥ４ｐ）をコードするＤＮＡ配列、および２）プロモーターに動作可能に連結された、ｐ．Ｒ４７Ｈ変異を有するマウスＴｒｅｍ２タンパク質（Ｔｒｅｍ２ｐ）をコードするＤＮＡ配列を含む、Ｂ６（ＳＪＬ）−Ａｐｏｅｔｍ１．１（ＡＰＯＥ＊４）ＡｄｉｕｊＴｒｅｍ２ｅｍ１Ａｄｉｕｊ／Ｊマウスであり、マウスが、ＡＰＯＥ４ｐをコードするＤＮＡ配列について、およびＴｒｅｍ２ｐをコードするＤＮＡ配列についてホモ接合性であり、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現する、遺伝子改変マウスに処置を施すステップと、非家族性遅発型アルツハイマー病に関係する、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐの発現を伴う１つまたは複数の症状または徴候に対する処置効果をマウスにおいて評価するステップとを含む、方法が本発明の態様に従って提供される。本発明の態様によれば、処置効果を評価するステップは、遺伝子改変マウスに対する処置効果を対照と比較することを含む。本発明の態様によれば、対照は、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現しないマウスに処置を施すステップと、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現しないマウスに対する処置効果を評価するステップとを含む。本発明の態様によれば、対照は、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに処置を施すステップと、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対する処置効果を評価するステップとを含む。本発明の態様によれば、対照は、ＡＰＯＥ３発現マウスに処置を施すステップと、ＡＰＯＥ３発現マウスに対する処置効果を評価するステップとを含む。
【００１７】
ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐの発現を伴う、非家族性遅発型アルツハイマー病に関係する１つまたは複数の症状または徴候を特徴とする、本発明の態様に従って提供される遺伝子改変マウスであって、マウスのゲノムが、１）プロモーターに動作可能に連結されたヒトＡＰＯＥ４タンパク質（ＡＰＯＥ４ｐ）をコードするＤＮＡ配列、および２）プロモーターに動作可能に連結された、ｐ．Ｒ４７Ｈ変異を有するマウスＴｒｅｍ２タンパク質（Ｔｒｅｍ２ｐ）をコードするＤＮＡ配列を含み、マウスが、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現する、遺伝子改変マウスに化合物を投与するステップと、非家族性遅発型アルツハイマー病に関係する、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐの発現を伴う１つまたは複数の症状または徴候に対する化合物の作用をマウスにおいて評価するステップとを含む、アルツハイマー病の処置における使用のための化合物についてスクリーニングするための方法が本発明の態様に従って提供される。本発明の態様によれば、マウスは、ＡＰＯＥ４ｐをコードするＤＮＡ配列について、およびＴｒｅｍ２ｐをコードするＤＮＡ配列についてホモ接合性である。本発明の態様によれば、化合物の作用を評価するステップは、遺伝子改変マウスに対する化合物の作用を対照と比較することを含む。本発明の態様によれば、対照は、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現しないマウスに化合物を投与するステップと、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現しないマウスに対する化合物の作用を評価するステップとを含む。本発明の態様によれば、対照は、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに化合物を投与するステップと、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対する化合物の作用を評価するステップとを含む。本発明の態様によれば、対照は、ＡＰＯＥ３発現マウスに化合物を投与するステップと、ＡＰＯＥ３発現マウスに対する化合物の作用を評価するステップとを含む。
【００１８】
アルツハイマー病の処置における使用のための化合物についてスクリーニングするための方法であって、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐの発現を伴う、非家族性遅発型アルツハイマー病に関係する１つまたは複数の症状または徴候を特徴とする、本発明の態様に従って提供される遺伝子改変マウスであって、マウスのゲノムが、１）プロモーターに動作可能に連結されたヒトＡＰＯＥ４タンパク質（ＡＰＯＥ４ｐ）をコードするＤＮＡ配列、および２）プロモーターに動作可能に連結された、ｐ．Ｒ４７Ｈ変異を有するマウスＴｒｅｍ２タンパク質（Ｔｒｅｍ２ｐ）をコードするＤＮＡ配列を含み、マウスが、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現し、ＡＰＯＥ４ｐが、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、またはＡＰＯＥ４ｐが、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号２とハイブリダイズする核酸の相補体によりコードされる、遺伝子改変マウスに化合物を投与するステップと、非家族性遅発型アルツハイマー病に関係する、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐの発現を伴う１つまたは複数の症状または徴候に対する化合物の作用をマウスにおいて評価するステップとを含む、方法が本発明の態様に従って提供される。本発明の態様によれば、マウスは、ＡＰＯＥ４ｐをコードするＤＮＡ配列について、およびＴｒｅｍ２ｐをコードするＤＮＡ配列についてホモ接合性である。本発明の態様によれば、化合物の作用を評価するステップは、遺伝子改変マウスに対する化合物の作用を対照と比較することを含む。本発明の態様によれば、対照は、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現しないマウスに化合物を投与するステップと、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現しないマウスに対する化合物の作用を評価するステップとを含む。本発明の態様によれば、対照は、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに化合物を投与するステップと、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対する化合物の作用を評価するステップとを含む。本発明の態様によれば、対照は、ＡＰＯＥ３発現マウスに化合物を投与するステップと、ＡＰＯＥ３発現マウスに対する化合物の作用を評価するステップとを含む。
【００１９】
ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐの発現を伴う、非家族性遅発型アルツハイマー病に関係する１つまたは複数の症状または徴候を特徴とする、本発明の態様に従って提供される遺伝子改変マウスであって、マウスのゲノムが、１）プロモーターに動作可能に連結されたヒトＡＰＯＥ４タンパク質（ＡＰＯＥ４ｐ）をコードするＤＮＡ配列、および２）プロモーターに動作可能に連結された、ｐ．Ｒ４７Ｈ変異を有するマウスＴｒｅｍ２タンパク質（Ｔｒｅｍ２ｐ）をコードするＤＮＡ配列を含み、マウスが、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現し、マウスＴｒｅｍ２ｐが、配列番号３のアミノ酸配列を含むか、またはマウスＴｒｅｍ２ｐが、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号４とハイブリダイズする核酸の相補体によりコードされる、遺伝子改変マウスに化合物を投与するステップと、非家族性遅発型アルツハイマー病に関係する、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐの発現を伴う１つまたは複数の症状または徴候に対する化合物の作用をマウスにおいて評価するステップとを含む、アルツハイマー病の処置における使用のための化合物についてスクリーニングするための方法が本発明の態様に従って提供される。本発明の態様によれば、マウスは、ＡＰＯＥ４ｐをコードするＤＮＡ配列について、およびＴｒｅｍ２ｐをコードするＤＮＡ配列についてホモ接合性である。本発明の態様によれば、化合物の作用を評価するステップは、遺伝子改変マウスに対する化合物の作用を対照と比較することを含む。本発明の態様によれば、対照は、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現しないマウスに化合物を投与するステップと、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現しないマウスに対する化合物の作用を評価するステップとを含む。本発明の態様によれば、対照は、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに化合物を投与するステップと、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対する化合物の作用を評価するステップとを含む。本発明の態様によれば、対照は、ＡＰＯＥ３発現マウスに化合物を投与するステップと、ＡＰＯＥ３発現マウスに対する化合物の作用を評価するステップとを含む。
【００２０】
アルツハイマー病の処置における使用のための化合物についてスクリーニングするための方法であって、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐの発現を伴う、非家族性遅発型アルツハイマー病に関係する１つまたは複数の症状または徴候を特徴とする、本発明の態様に従って提供される遺伝子改変マウスであって、マウスのゲノムが、１）プロモーターに動作可能に連結されたヒトＡＰＯＥ４タンパク質（ＡＰＯＥ４ｐ）をコードするＤＮＡ配列、および２）プロモーターに動作可能に連結された、ｐ．Ｒ４７Ｈ変異を有するマウスＴｒｅｍ２タンパク質（Ｔｒｅｍ２ｐ）をコードするＤＮＡ配列を含み、マウスが、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現し、ＡＰＯＥ４ｐが、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、またはＡＰＯＥ４ｐが、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号２とハイブリダイズする核酸の相補体によりコードされ、マウスＴｒｅｍ２ｐが、配列番号３のアミノ酸配列を含むか、またはマウスＴｒｅｍ２ｐが、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号４とハイブリダイズする核酸の相補体によりコードされる、遺伝子改変マウスに化合物を投与するステップと、非家族性遅発型アルツハイマー病に関係する、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐの発現を伴う１つまたは複数の症状または徴候に対する化合物の作用をマウスにおいて評価するステップとを含む、方法が本発明の態様に従って提供される。本発明の態様によれば、マウスは、ＡＰＯＥ４ｐをコードするＤＮＡ配列について、およびＴｒｅｍ２ｐをコードするＤＮＡ配列についてホモ接合性である。本発明の態様によれば、化合物の作用を評価するステップは、遺伝子改変マウスに対する化合物の作用を対照と比較することを含む。本発明の態様によれば、対照は、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現しないマウスに化合物を投与するステップと、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現しないマウスに対する化合物の作用を評価するステップとを含む。本発明の態様によれば、対照は、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに化合物を投与するステップと、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対する化合物の作用を評価するステップとを含む。本発明の態様によれば、対照は、ＡＰＯＥ３発現マウスに化合物を投与するステップと、ＡＰＯＥ３発現マウスに対する化合物の作用を評価するステップとを含む。
【００２１】
アルツハイマー病の処置における使用のための化合物についてスクリーニングするための方法であって、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐの発現を伴う、非家族性遅発型アルツハイマー病に関係する１つまたは複数の症状または徴候を特徴とする、本発明の態様に従って提供される遺伝子改変マウスであって、マウスのゲノムが、１）プロモーターに動作可能に連結されたヒトＡＰＯＥ４タンパク質（ＡＰＯＥ４ｐ）をコードするＤＮＡ配列、および２）プロモーターに動作可能に連結された、ｐ．Ｒ４７Ｈ変異を有するマウスＴｒｅｍ２タンパク質（Ｔｒｅｍ２ｐ）をコードするＤＮＡ配列を含む、Ｂ６（ＳＪＬ）−Ａｐｏｅｔｍ１．１（ＡＰＯＥ＊４）ＡｄｉｕｊＴｒｅｍ２ｅｍ１Ａｄｉｕｊ／Ｊマウスであり、マウスが、ＡＰＯＥ４ｐをコードするＤＮＡ配列について、およびＴｒｅｍ２ｐをコードするＤＮＡ配列についてホモ接合性であり、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現する、遺伝子改変マウスに化合物を投与するステップと、非家族性遅発型アルツハイマー病に関係する、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐの発現を伴う１つまたは複数の症状または徴候に対する化合物の作用をマウスにおいて評価するステップとを含む、方法が本発明の態様に従って提供される。本発明の態様によれば、マウスは、ＡＰＯＥ４ｐをコードするＤＮＡ配列について、およびＴｒｅｍ２ｐをコードするＤＮＡ配列についてホモ接合性である。本発明の態様によれば、化合物の作用を評価するステップは、遺伝子改変マウスに対する化合物の作用を対照と比較することを含む。本発明の態様によれば、対照は、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現しないマウスに化合物を投与するステップと、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現しないマウスに対する化合物の作用を評価するステップとを含む。本発明の態様によれば、対照は、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに化合物を投与するステップと、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対する化合物の作用を評価するステップとを含む。本発明の態様によれば、対照は、ＡＰＯＥ３発現マウスに化合物を投与するステップと、ＡＰＯＥ３発現マウスに対する化合物の作用を評価するステップとを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、本明細書の実施例において詳細に記載するヒト化ＡｐｏＥ４発現構築物の模式図である。
【００２３】
【図２】図２は、Ｂ６（ＳＪＬ）−Ａｐｏｅｔｍ１．１（ＡＰＯＥ＊４）ＡｄｉｕｊＴｒｅｍ２ｅｍ１Ａｄｉｕｊ／Ｊ（一般名Ｂ６Ｊ．ＡＰＯＥ４／Ｔｒｅｍ２）マウス（レーン４〜６）由来の脳組織および対照（野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６Ｊと略す））マウス（レーン１〜３）脳組織のウエスタンブロットの画像である。
【００２４】
【図３Ａ】図３Ａは、１２カ月齢のＢ６Ｊ．ＡＰＯＥ４／Ｔｒｅｍ２マウスおよび１２カ月齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ対照マウスから得られる血液試料における高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）についてのアッセイの結果を示すグラフである。
【００２５】
【図３Ｂ】図３Ｂは、１２カ月齢のＢ６Ｊ．ＡＰＯＥ４／Ｔｒｅｍ２マウスおよび１２カ月齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ対照マウスから得られる血液試料における低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）についてのアッセイの結果を示すグラフである。
【００２６】
【図３Ｃ】図３Ｃは、１２カ月齢のＢ６Ｊ．ＡＰＯＥ４／Ｔｒｅｍ２マウスおよび１２カ月齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ対照マウスから得られる血液試料における総コレステロールについてのアッセイの結果を示すグラフである。
【００２７】
【図４】図４は、免疫染色してコラーゲンＩＶ（ＣｏｌＩＶ）およびフィブリン（フィブリノゲン）を示す７〜８カ月齢のＢ６Ｊ．ＡＰＯＥ４／Ｔｒｅｍ２組織の代表的画像とともに、同様に免疫染色した、対照Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６Ｊと略す）マウス由来の脳の類似の矢状切片から取得した代表的画像を示す。
【００２８】
【図５】図５は、野生型対照Ｂ６Ｊマウスと比較した、Ｂ６Ｊ．ＡＰＯＥ４／Ｔｒｅｍ２マウスにおける発現変動遺伝子の遺伝子発現ヒートマップである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
発明の詳細な説明
本発明は、概して、非家族性遅発型アルツハイマー病のモデルであり、そのゲノムに外因的に導入した非家族性遅発型ＡＤの２つのリスク因子をコードし、これによりマウスが、ヒトアポリポタンパク質Ｅ４（ＡＰＯＥ４）およびマウスＴｒｅｍ２  ｐ．Ｒ４７Ｈタンパク質を産生する遺伝子改変マウスに関する。
【００３０】
ヒトアポリポタンパク質は、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ４と名付けられた３つのアイソフォームを有する多型タンパク質である。これらの３つのアイソフォームは、タンパク質のアミノ酸配列の１３０位および１７６位のアミノ酸（アミノ酸シグナルペプチド１８個を有しない成熟ＡＰＯＥタンパク質の１１２位および１５８位に対応する）の同一性に関して互いに異なる。ＡｐｏＥ２は、１３０位および１７６位の両方のシステインを特徴とし、ＡｐｏＥ３は、１３０位のシステインおよび１７６位のアルギニンを特徴とし、ＡｐｏＥ４は、１３０位および１７６位の両方のアルギニンを特徴とする。１つまたは複数のＡｐｏＥ４対立遺伝子を有する個体は、非家族性遅発型ＡＤを発症するリスクがより高く、病理に関するいくつかの機構が提唱されている。例えば、DiBattistaら、２０１６年、Exp.  Neurol.２８０巻：９７〜１０５頁；Buら、Nature  Reviews  Neuroscience、２００９年、１０巻：３３３〜３４４頁；Huangら、Cell、２０１７年、１６８巻：１〜１５頁；およびTambiniら、EMBO  Reports、２０１６年、１７巻：２７〜３６頁を参照されたい。
【００３１】
Ｔｒｅｍ２（ミエロイド細胞に発現するトリガー受容体２）は、脳ミクログリアにより発現する免疫食作用受容体である。Ｔｒｅｍ２は、細胞片の食作用を引き起こし、炎症応答の態様を制御する。ＴＲＥＭ２  ｐ．Ｒ４７Ｈにおける稀なバリアントは、ヒトにおいて、アルツハイマー病と著しく関連する。
【００３２】
特定の実施形態では、本発明は、そのゲノムが、ヒトＡＰＯＥ４タンパク質をコードするＤＮＡ配列、およびＲ４７Ｈ点変異を有するマウスＴｒｅｍ２タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む遺伝子改変マウスに関する。
【００３３】
ヒトＡＰＯＥ４タンパク質（以下ＡＰＯＥ４ｐまたは「ヒトＡＰＯＥ４」）をコードするヒトＡＰＯＥ４  ＤＮＡ配列（以下ＡＰＯＥ４ｇ）を本明細書において配列番号２として示す。コードされるＡＰＯＥ４ｐを本明細書において配列番号１として示す。
【００３４】
Ｒ４７Ｈ点変異を有するマウスＴｒｅｍ２タンパク質（以下Ｔｒｅｍ２ｐまたは「マウスＴｒｅｍ２ｐ」）をコードするマウスＴｒｅｍ２変異体ＤＮＡ配列（以下Ｔｒｅｍ２ｇ）を本明細書において配列番号４として示す。コードされるＴｒｅｍ２ｐを本明細書において配列番号３として示す。
【００３５】
本発明の方法の実施形態による遺伝子改変マウスにおいて、１つまたは複数の遺伝子改変をマウスゲノム内に導入して、ＡＰＯＥ４ｐのバリアントおよび／またはＴｒｅｍ２ｐのバリアントをコードすることができる。
【００３６】
本明細書において使用する場合、用語「バリアント」は、配列番号１または配列番号３の対応するタンパク質と比較して、そのアミノ酸配列に１つまたは複数の変異を含む、ＡＰＯＥ４ｐまたはＴｒｅｍ２ｐを指す。例えば、このような変異は、ＡＰＯＥ４ｐまたはＴｒｅｍ２ｐのバリアントが、配列番号１または配列番号３のＡＰＯＥ４ｐまたはＴｒｅｍ２ｐの機能的特性をそれぞれ保持する限り、１つまたは複数のアミノ酸の置換、付加、および／または欠失であり得る。
【００３７】
特定の実施形態では、本発明の実施形態によるＡＰＯＥ４ｐバリアントは、配列番号１に対してその全長にわたって少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い同一性を有し、本明細書において配列番号１として示す、アミノ酸シグナルペプチド１８個を含むＡＰＯＥ４タンパク質のアミノ酸１３０位および１７６位としてＲ（アルギニン）およびＲ（アルギニン）を有し、さらに配列番号１のＡＰＯＥ４ｐの機能的特性を保持する。
【００３８】
特定の実施形態では、本発明の実施形態によるＡＰＯＥ４ｐバリアントは、配列番号１５に対してその全長にわたって少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い同一性を有し、本明細書において配列番号１５として示す、アミノ酸シグナルペプチド１８個を含まないＡＰＯＥ４タンパク質のアミノ酸１１２位および１５８位としてＲ（アルギニン）およびＲ（アルギニン）を有し、さらに配列番号１５のＡＰＯＥ４ｐの機能的特性を保持する。
【００３９】
特定の実施形態では、本発明の実施形態によるＴｒｅｍ２ｐバリアントは、配列番号３に対してその全長にわたって少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い同一性を有し、配列番号３のＴｒｅｍ２ｐの機能的特性を保持する。
【００４０】
変異は、ＣＲＩＳＰＲ技術等の標準的な分子生物学的技術を使用して導入することができる。代替的技術は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲによる変異誘発等を含む。当業者は、ＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐタンパク質の機能特性を変えることなく、１つまたは複数のアミノ酸の変異を導入することができることを認識しているであろう。
【００４１】
ＡＰＯＥ４ｐ、Ｔｒｅｍ２ｐおよびバリアントの機能特性の評価のためのアッセイは、当技術分野において公知である。
【００４２】
保存的アミノ酸置換をＡＰＯＥ４ｐおよびＴｒｅｍ２ｐタンパク質に行って、ＡＰＯＥ４ｐおよびＴｒｅｍ２ｐバリアントを生成することができる。保存的アミノ酸置換は、当技術分野において認識されている、あるアミノ酸を、類似の特性を有する別のアミノ酸で置換することである。例えば、各アミノ酸は、次の特性：電気陽性、電気陰性、脂肪族、芳香族、極性、疎水性および親水性のうちの１つまたは複数を有するものと記載され得る。保存的置換は、特定の構造的または機能的特性を有するあるアミノ酸を、同一の特性を有する別のアミノ酸と置換することである。酸性アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸を含み、塩基性アミノ酸は、ヒスチジン、リシン、アルギニンを含み、脂肪族アミノ酸は、イソロイシン、ロイシンおよびバリンを含み、芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン、グリシン、チロシンおよびトリプトファンを含み、極性アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リシン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニンおよびチロシンを含み、疎水性アミノ酸は、アラニン、システイン、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、バリンおよびトリプトファンを含み、保存的置換は、各群におけるアミノ酸間の置換を含む。アミノ酸はまた、相対的サイズ、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グリシン、アスパラギン、プロリン、スレオニン、セリン、バリン、典型的に低分子であると考えられるすべてに関して記載され得る。
【００４３】
ＡＰＯＥ４ｐおよびＴｒｅｍ２ｐバリアントは、合成アミノ酸類似体、アミノ酸誘導体および／または非標準アミノ酸を含むことができ、例示的に、アルファ−アミノ酪酸、シトルリン、カナバニン、シアノアラニン、ジアミノ酪酸、ジアミノピメリン酸、ジヒドロキシ−フェニルアラニン、ジエンコル酸、ホモアルギニン、ヒドロキシプロリン、ノルロイシン、ノルバリン、３−ホスホセリン、ホモセリン、５−ヒドロキシトリプトファン、１−メチルヒスチジン、３−メチルヒスチジン、およびオルニチンを含むが、これらに限定されない。
【００４４】
遺伝コードの縮重の性質により、配列番号２および配列番号４以外の核酸配列が、ＡＰＯＥ４ｐおよびＴｒｅｍ２ｐをそれぞれコードし、このような選択的核酸をマウスゲノム内に導入して、ＡＰＯＥ４ｐおよびＴｒｅｍ２ｐを発現する本開示の遺伝子改変マウスを作製することができることが当業者により理解されよう。
【００４５】
単数形の用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、限定することを意図せず、他に明示的に記述しない限り、または文脈上他に明らかに指示しない限り、複数形の指示対象を含む。
【００４６】
用語「発現すること」および「発現する」は、遺伝子を転写して対応するｍＲＮＡを産生すること、および／またはｍＲＮＡを翻訳して対応するタンパク質を産生することを指す。
【００４７】
ＡＰＯＥ４ｐおよびＴｒｅｍ２ｐバリアントは、配列番号２または配列番号４と高度な同一性を有する核酸によりそれぞれコードされる。ＡＰＯＥ４ｐバリアントをコードする核酸の相補体は、高ストリンジェンシー条件下で、ＡＰＯＥ４ｐをコードする配列番号２と特異的にハイブリダイズさせる。Ｔｒｅｍ２ｐバリアントをコードする核酸の相補体は、高ストリンジェンシー条件下で、Ｔｒｅｍ２ｐをコードする配列番号４と特異的にハイブリダイズさせる。
【００４８】
用語「核酸」は、１本鎖、２本鎖、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む任意の形態の１つより多くのヌクレオチドを有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子を指す。用語「ヌクレオチド配列」は、核酸の１本鎖形態のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの順序付けを指す。
【００４９】
用語「ハイブリダイゼーション」および「ハイブリダイズさせる」は、相補性核酸の対形成および結合を指す。ハイブリダイゼーションは、当技術分野において周知のように、核酸の相補性の程度、核酸の融解温度Ｔｍ、およびハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシー等の因子に応じて、２つの核酸間において様々な程度で生じる。
【００５０】
用語「ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシー」は、温度、イオン強度、ならびにホルムアミドおよびデンハルト液等の特定の一般的な添加剤に関するハイブリダイゼーション培地の組成の条件を指す。特定の核酸に関する特定のハイブリダイゼーション条件の決定は、例えば、J.  SambrookおよびD.W.  Russell、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press；第３版、２００１年；ならびにF.M.  Ausubel編、Short  Protocols  in  Molecular  Biology,  Current  Protocols；第５版、２００２年に記載のように、慣例的なものであり、当技術分野において周知である。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、実質的に相補性な核酸のハイブリダイゼーションのみを可能とする条件である。典型的には、約８５〜１００％の相補性を有する核酸は、高度に相補性であるとみなされ、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズさせる。中程度のストリンジェンシー条件は、中程度の相補性、すなわち約５０〜８４％の相補性を有する核酸、ならびに高度な相補性を有する核酸がハイブリダイズする条件により例示される。対照的に、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、低度の相補性を有する核酸がハイブリダイズする条件である。
【００５１】
用語「特異的ハイブリダイゼーション」および「特異的にハイブリダイズさせる」は、特定の核酸を、試料中の標的核酸以外の核酸と実質的にハイブリダイズさせずに、標的核酸とハイブリダイズさせることを指す。
【００５２】
ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件のストリンジェンシーは、当業者に周知のように、プローブおよび標的のＴｍならびにハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件のイオン強度を含む、いくつかの因子に依存する。ハイブリダイゼーションおよび所望のハイブリダイゼーションストリンジェンシーを達成する条件は、例えば、Sambrookら、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、２００１年；およびAusubel,  F.ら（編）、Short  Protocols  in  Molecular  Biology、Wiley、２００２年に記載されている。
【００５３】
高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の例は、約１００ヌクレオチドを超える長さの核酸を、６×ＳＳＣ、５×デンハルト液、３０％のホルムアミド、および１００マイクログラム／ｍｌの変性サケ精子を含む溶液中に３７℃で一晩ハイブリダイズさせ、その後、０．１×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳの溶液中で６０℃で１５分間洗浄することである。ＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌ／０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａである。デンハルト液は、０．０２％のウシ血清アルブミン／０．０２％のフィコール／０．０２％のポリビニルピロリドンである。
【００５４】
用語「相補性」は、ヌクレオチド間のワトソン−クリック塩基対形成を指し、詳細には、２つの水素結合によりアデニン残基に連結するチミンまたはウラシル残基、および３つの水素結合により連結するシトシンおよびグアニン残基と相互に水素結合するヌクレオチドを指す。一般には、核酸は、特定の第２のヌクレオチド配列に対して「パーセント相補性」を有すると記載されるヌクレオチド配列を含む。例えば、ヌクレオチド配列は、特定の第２のヌクレオチド配列に対して８０％、９０％または１００％の相補性を有することができ、これは、配列の１０分の８、１０分の９または１０分の１０のヌクレオチドが、特定の第２のヌクレオチド配列に対して相補性であることを示す。例えば、ヌクレオチド配列３’−ＴＣＧＡ−５’は、ヌクレオチド配列５’−ＡＧＣＴ−３’に対して１００％相補性である。さらに、ヌクレオチド配列３’−ＴＣＧＡ−は、ヌクレオチド配列５’−ＴＴＡＧＣＴＧＧ−３’の領域に対して１００％相補性である。
【００５５】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性を判定するために、配列を整列させて最適に比較する（例えば、第１のアミノ酸または核酸の配列にギャップを導入して、第２のアミノ酸または核酸配列と最適にアラインメントを行うことができる）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列の位置が、第２の配列の対応する位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合は、分子は、その位置において同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、それらの配列により共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一の重複位置の数／位置の総数×１００％）。一実施形態では、２つの配列は、同一の長さであるか、または対照配列の全長の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％以下で長さが異なる。
【００５６】
２つの配列間のパーセント同一性の判定はまた、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。２つの配列の比較に利用する数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、KarlinおよびAltschul、１９９３年、PNAS９０巻：５８７３  ５８７７頁のように改変されたKarlinおよびAltschul、１９９０年、PNAS８７巻：２２６４  ２２６８頁のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Altschulら、１９９０年、J.  Mol.  Biol.２１５巻：４０３頁のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込む。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、例えば、スコア＝１００、ワード長＝１２に設定したＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメータにより行って、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、例えば、スコア５０、ワード長＝３に設定したＸＢＬＡＳＴプログラムパラメータにより行って、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得る。ギャップを挿入したアラインメントを得て比較するために、Altschulら、１９９７年、Nucleic  Acids  Res.２５巻：３３８９  ３４０２頁に記載のようにＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用する。あるいは、ＰＳＩ  ＢＬＡＳＴを使用して、分子間の距離関係を検出する反復検索を行う（同文献）。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ  Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合は、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴのパラメータ）を使用する（例えば、ＮＣＢＩのウェブサイトを参照）。配列の比較に利用する数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例は、MyersおよびMiller、１９８８年、CABIOS４巻：１１  １７頁のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込む。ＡＬＩＧＮプログラムを利用してアミノ酸配列を比較する場合は、ＰＡＭ１２０加重残基表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用する。
【００５７】
２つの配列間のパーセント同一性は、上記のものと同様の技術を使用して、ギャップありか、またはなしで判定する。パーセント同一性の算出では、典型的に、完全な一致のみを計数する。
【００５８】
ＡＰＯＥ４ｐ、Ｔｒｅｍ２ｐまたはそれらのいずれかのバリアントをコードする核酸は、周知の方法を使用して、天然のソースから単離するか、組換えにより作製するか、または化学合成技術により生成することができる。
【００５９】
遺伝子改変マウス
【００６０】
そのゲノムが、プロモーターに動作可能に連結されたＡＰＯＥ４ｐをコードする核酸を含み、この場合、その動物が、コードされるＡＰＯＥ４ｐを発現し、そのゲノムが、プロモーターに動作可能に連結されたＴｒｅｍ２ｐをコードする核酸を含み、この場合、この動物が、コードされるＴｒｅｍ２ｐを発現する、遺伝子改変マウスが本発明の実施形態に従って提供される。
【００６１】
そのゲノムが、内在性マウスＡｐｏｅプロモーターに動作可能に連結されたＡＰＯＥ４ｐをコードする核酸を含み、この場合、この動物が、コードされるＡＰＯＥ４ｐを発現し、そのゲノムが、内在性マウスＴｒｅｍ２プロモーターに動作可能に連結されたＴｒｅｍ２ｐをコードする核酸を含み、この場合、この動物が、コードされるＴｒｅｍ２ｐを発現する、遺伝子改変マウスが本発明の実施形態に従って提供される。
【００６２】
種々の方法のいずれかを使用して、遺伝子改変をマウスゲノム内に導入し、ＡＰＯＥ４ｐおよびＴｒｅｍ２ｐを発現する遺伝子改変マウスを作製することができる。
【００６３】
そのゲノムが、プロモーターに動作可能に連結されたＡＰＯＥ４ｐをコードする核酸を含み、この場合、この動物が、コードされるＡＰＯＥ４ｐを発現し、そのゲノムが、プロモーターに動作可能に連結されたＴｒｅｍ２ｐをコードする核酸を含み、この場合、この動物が、コードされるＴｒｅｍ２ｐを発現する、本発明の実施形態による遺伝子改変マウスを作製するためのゲノム編集方法は、部位特異的変異誘発、組換えに基づいた方法およびヌクレアーゼゲノム編集技術を含むが、これらに限定されない。
【００６４】
ゲノム編集技術を使用して、ゲノムの所定の標的部位に別々の変異を導入することによりゲノム配列を改変することができる。
【００６５】
例えば、ゲノム配列の１つまたは複数のヌクレオチドは、ゲノム編集技術を使用して１つまたは複数の種々のヌクレオチドと置換し、これによりゲノム配列に、非改変ゲノム配列と比較して、単一のアミノ酸が異なるか、または複数のアミノ酸が異なるタンパク質をコードさせることができる。
【００６６】
ゲノム編集技術をまた使用して、ゲノム内の所定の標的部位にコード配列を挿入する、「ノックイン」技術によりゲノム配列を改変することができる。
【００６７】
本明細書において使用する場合、用語「標的部位」および「標的配列」は、遺伝子編集技術の一般的文脈において、編集する染色体配列の部分を定義する核酸配列を指す。
【００６８】
例えば、タンパク質をコードする核酸配列をゲノムの所定の標的部位に挿入し、これによりタンパク質をコードする核酸をゲノムに含有させ、タンパク質を発現させることができる。核酸配列はまた、プロモーターを含有させて、コードされるタンパク質の発現を推進することができるか、またはある位置に核酸を挿入し、これにより核酸が内在性プロモーターに動作可能に連結される場合、コードされるタンパク質の発現を内在性プロモーターにより推進することができる。
【００６９】
本発明の特定の態様によれば、ゲノム編集技術を使用して第１のマウスのゲノム内に点変異を導入し、これによりマウスにＴｒｅｍ２ｐをコードさせ、「ノックイン」ゲノム編集技術により第２のマウスのゲノムのＡｐｏｅ４遺伝子内にヒトＡＰＯＥ４をコードする核酸を挿入し、これにより、図１に示すように、マウスＡｐｏｅ４遺伝子のエキソン１ならびにヒトＡＰＯＥ４遺伝子のエキソン２、３および４を含む「ヒト化」ＡＰＯＥ４遺伝子を第２のマウスのゲノムに含有させる。次いで、第１および第２のマウスを自然に、または人工的方法により繁殖させて、そのゲノムがＡＰＯＥ４ｐをコードするＤＮＡ配列およびＴｒｅｍ２ｐをコードするＤＮＡ配列を含む遺伝子改変マウスを得る。
【００７０】
本発明の特定の態様によれば、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集技術を使用して第１のマウスのゲノム内に点変異を導入して、これによりマウスにＴｒｅｍ２ｐをコードさせ、「ノックイン」ＣＲＩＳＰＲゲノム編集技術により第２のマウスのゲノムのＡｐｏｅ４遺伝子内にヒトＡＰＯＥ４をコードする核酸を導入し、これにより、図１に示すように、マウスＡｐｏｅ４遺伝子のエキソン１ならびにヒトＡＰＯＥ４遺伝子のエキソン２、３および４を含む「ヒト化」ＡＰＯＥ４遺伝子を第２のマウスのゲノムに含有させる。次いで、第１および第２のマウスを自然に、または人工的方法により繁殖させて、そのゲノムがＡＰＯＥ４ｐをコードするＤＮＡ配列およびＴｒｅｍ２ｐをコードするＤＮＡ配列を含む遺伝子改変マウスを作製する。
【００７１】
ゲノム編集は、例えば、本明細書に記載の方法、ならびにJ.  P.  SundbergおよびT.  Ichiki編、Genetically  Engineered  Mice  Handbook、CRC  Press、２００６年；M.  H.  HofkerおよびJ.  van  Deursen編、Transgenic  Mouse  Methods  and  Protocols、Humana  Press、２００２年；A.  L.  Joyner、Gene  Targeting:  A  Practical  Approach、Oxford  University  Press、２０００年；Manipulating  the  Mouse  Embryo:  A  Laboratory  Manual、第３版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、２００２年１２月１５日；ＩＳＢＮ−１０：０８７９６９５９１９；Kursad  Turksen（編）、Embryonic  stem  cells:  methods  and  protocols  in  Methods  Mol  Biol.２００２年、１８５巻、Humana  Press；Current  Protocols  in  Stem  Cell  Biology、ＩＳＢＮ：９７８０４７０１５１８０；Meyerら、PNAS  USA、２０１０年、１０７巻（３４号）、１５０２２〜１５０２６頁；およびDoudna,  J.ら（編）CRISPR-Cas:  A  Laboratory  Manual、２０１６年、CSHPで詳述される方法により行う。いくつかのゲノム編集技術の簡潔な説明を本明細書において記載する。
【００７２】
マウスの遺伝子改変のためのヌクレアーゼ技術
【００７３】
遺伝子改変方法、例えば、これに限定されないが、ヌクレアーゼ遺伝子編集技術を使用して、ゲノム内の所定の標的部位に所望のＤＮＡ配列を導入することができ、これには例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ、インテグラーゼ、メガヌクレアーゼ、トランスポゾンを使用する方法、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様（ＴＡＬ）、クラスター化した規則的配置の短回文構造リピート（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣａｓまたはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ組換え関連タンパク質（ＤＲＡＰ）を使用するヌクレアーゼ媒介プロセスがある。簡潔には、使用し得る遺伝子改変方法は、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、体細胞、受精した卵母細胞または胚内に標的ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、ＣＲＩＳＰＲまたはＤＲＡＰをコードするＲＮＡ分子および少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを導入し、次いで、所望の遺伝子改変を有する、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、体細胞、受精した卵母細胞または胚を選択するステップを含む。
【００７４】
例えば、これらに限定されないが、ＣＲＩＳＰＲ法、ＴＡＬ（転写活性化因子様）エフェクター法、ジンクフィンガー媒介ゲノム編集、またはＤＲＡＰ等のヌクレアーゼ技術によりマウスのゲノム内の所定の標的部位に所望の核酸配列を導入して、そのゲノムがプロモーターに動作可能に連結されたＡＰＯＥ４ｐをコードする核酸を含み、この場合、この動物が、コードされるＡＰＯＥ４ｐを発現し、そのゲノムがプロモーターに動作可能に連結されたＴｒｅｍ２ｐをコードする核酸を含み、この場合、この動物が、コードされるＴｒｅｍ２ｐを発現する、本発明の実施形態に従って提供される遺伝子改変マウスを作製することができる。
【００７５】
本明細書において使用する場合、用語「標的部位」および「標的配列」は、ヌクレアーゼ遺伝子編集技術の文脈において、編集する染色体配列の部分を定義する核酸配列、ならびに結合に十分な条件が存在する場合、認識および結合するようにヌクレアーゼを改変する核酸配列を指す。
【００７６】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム
【００７７】
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化した規則的配置の短回文構造リピート）は、配列決定された細菌の約４０％および配列決定された古細菌の９０％のゲノムに見出される複数の短い直列リピートを含む座位であり、外来ＤＮＡエレメントに対する抵抗性を付与する。Horvath、２０１０年、Science、３２７巻：１６７〜１７０頁；Barrangouら、２００７年、Science、３１５巻：１７０９〜１７１２頁；およびMakarovaら、２０１１年、Nature  Reviews  Microbiology.９巻：４６７〜４７７頁を参照されたい。
【００７８】
ＣＲＩＳＰＲリピートは、２４〜４８塩基対のサイズ範囲である。これらは通常、ヘアピン等の２次構造の形成を意味するおよその２回転対称構造を示すが、正確には回文構造ではない。ＣＲＩＳＰＲリピートは、同様の長さのスペーサーにより分離される。
【００７９】
ＣＲＩＳＰＲ関連（ｃａｓ）遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲリピート−スペーサーアレイを伴うことが多い。４０個を超える種々のＣａｓタンパク質ファミリーが記載されている（Haftら２００５年、PLoS  Comput  Biol.１巻（６号）：ｅ６０頁）。ｃａｓ遺伝子と反復構造との特定の組合せを使用して、８つのＣＲＩＳＰＲサブタイプが定義されており、そのいくつかは、リピート関連ミステリアスタンパク質（ＲＡＭＰ）をコードするさらなる遺伝子モジュールと関連している。
【００８０】
種々の生物において多種多様なＣＲＩＳＰＲシステムが存在し、最も単純なもののうちの１つは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムであり、Ｃａｓ９タンパク質および２つのＲＮＡをコードする単一の遺伝子のみ、成熟ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）ならびに部分的相補性のトランス作用ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）は、外来ＤＮＡのＲＮＡガイドサイレンシングに必要十分である（Gasiunasら、２０１２年、PNAS１０９巻：Ｅ２５７９〜Ｅ２５８６頁；Jinekら、２０１２年、Science３３７巻：８１６〜８２１頁）。ｃｒＲＮＡの成熟には、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびＲＮａｓｅＩＩＩを必要とする（Deltchevaら、２０１１年、Nature４７１巻：６０２〜６０７頁）。しかし、この必要性は、ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ複合体を模倣する、デザインしたヘアピンを含む改変低分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を使用することにより回避することができる（Jinekら、２０１２年、Science３３７巻：８１６〜８２１頁）。ｓｇＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の塩基対形成では、Ｃａｓ９のエンドヌクレアーゼ活性により２本鎖切断（ＤＳＢ）を生じる。結合特異性は、ｓｇＲＮＡ−ＤＮＡ塩基対形成とＤＮＡ相補領域に並置される短鎖ＤＮＡモチーフ（プロトスペーサー隣接モチーフ［ＰＡＭ］配列：ＮＧＧ）の両方により判定する（MarraffiniおよびSontheimer、２０１０年、Nature  Reviews  Genetics、１１巻：１８１〜１９０頁）。例えば、ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｃａｓ９タンパク質およびｓｇＲＮＡの２つの分子の最小のセットを必要とし、したがって、宿主に依存しない遺伝子標的化プラットフォームとして使用することができる。Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲは、部位選択的ＲＮＡガイドゲノム編集、例えば、標的化挿入に利用することができる。例えば、Carroll、２０１２年、Molecular  Therapy２０巻：１６５８〜１６６０頁；Changら、２０１３年、Cell  Research２３巻：４６５〜４７２頁；Choら、２０１３年、Nature  Biotechnol３１巻：２３０〜２３２頁；Congら、２０１３年、Science３３９巻：８１９〜８２３頁；Hwangら、２０１３年、Nature  Biotechnol３１巻：２２７〜２２９頁；Jiangら、２０１３年、Nature  Biotechnol３１巻：２３３〜２３９頁；Maliら、２０１３年、Science３３９巻：８２３〜８２６頁；Qiら、２０１３年、Cell１５２巻：１１７３〜１１８３頁；Shenら、２０１３年、Cell  Research２３巻：７２０〜７２３頁；およびWangら、２０１３年、Cell１５３巻：９１０〜９１８頁を参照されたい。特に、Wangら、２０１３年、Cell１５３巻：９１０〜９１８頁は、オリゴヌクレオチドと組み合わせてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用した標的挿入を記載している。
【００８１】
ＴＡＬ（転写活性化因子様）エフェクター
【００８２】
転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターまたはＴＡＬＥ（転写活性化因子様エフェクター）は、植物病原菌属のＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓに由来し、これらのタンパク質は、植物転写活性化因子を模倣して植物転写物を操作する。Kayら、２００７年、Science、３１８巻：６４８〜６５１頁を参照されたい。
【００８３】
ＴＡＬエフェクターは、タンデムリピートを集中させたドメインを含み、各リピートがアミノ酸を約３４個含む。このアミノ酸は、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性の鍵である。加えて、このＴＡＬエフェクターは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含む。総説については、Schornackら２００６年、J.  Plant  Physiol.、１６３巻（３号）：２５６〜２７２頁；ScholzeおよびBoch、２０１１年、Curr  Opin  Microbiol、１４巻：４７〜５３頁を参照されたい。
【００８４】
ＴＡＬエフェクターの特異性は、タンデムリピートに見出される配列に依存する。この反復配列は、約１０２ｂｐを含み、このリピートは、典型的に、相互に９１〜１００％相同である（Bonasら、１９８９年、Mol  Gen  Genet２１８巻：１２７〜１３６頁）。リピートの多型は、通常１２位および１３位に位置し、ＴＡＬエフェクター標的配列の連続するヌクレオチドの同一性とともに、１２位および１３位の高頻度可変性２残基間の同一性において１対１対応関係があると考えられる。MoscouおよびBogdanove２００９年、Science３２６巻：１５０１頁；ならびにBochら、２００９年、Science３２６巻：１５０９〜１５１２頁を参照されたい。２つの高頻度可変性残基は、反復可変２残基（ＲＶＤ）として公知であり、これによって、あるＲＶＤが、ＤＮＡ配列のあるヌクレオチドを認識し、各ＴＡＬエフェクターのＤＮＡ結合ドメインが、広範な認識部位（１５〜３０ｎｔ）を高精度で標的とすることができることを確実とする。実験的には、これらのＴＡＬエフェクターのＤＮＡ認識のコードは、１２位および１３位のＨＤ配列が、シトシン（Ｃ）への結合を生じ、ＮＧがＴに結合し、ＮＩがＡ、Ｃ、ＧまたはＴに結合し、ＮＮがＡまたはＧに結合し、ＩＧがＴに結合するように決定されている。これらのＤＮＡ結合リピートを、リピートの新たな組合せおよび数を有するタンパク質に構築して、新たな配列と相互作用可能な人工転写因子を作製し、植物細胞におけるレポーター遺伝子の発現を活性化している（Bochら２００９年、Science３２６巻：１５０９〜１５１２頁）。これらのＤＮＡ結合ドメインは、すべての細胞型における、標的ゲノム編集または標的遺伝子制御の分野において一般的適用性を有することが明らかとなっている。Gajら、Trends  in  Biotechnol、２０１３年、３１巻（７号）：３９７〜４０５頁を参照されたい。さらに、改変ＴＡＬエフェクターは、哺乳動物細胞の天然Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ＴＡＬエフェクターまたはタンパク質において自然に見出されない、ヌクレアーゼ等の外因性の機能性タンパク質エフェクタードメインと関連して機能することが明らかとなっている。ＴＡＬヌクレアーゼ（ＴＡＬＮまたはＴＡＬＥＮ）は、ＴＡＬをヌクレアーゼと組み合わせることにより構築することができ、例えば、Ｎ末端またはＣ末端のＦｏｋＩヌクレアーゼドメインがある。Kimら１９９６年、PNAS９３巻：１１５６〜１１６０頁；Christianら２０１０年、Genetics１８６巻：７５７〜７６１頁；Liら、２０１１年、Nucleic  Acids  Res３９巻：６３１５〜６３２５頁；およびMillerら、２０１１年、Nat  Biotechnol２９巻；１４３〜１４８頁。ＮＨＥＪにより欠失を引き起こすＴＡＬＥＮの機能性は、ラット、マウス、ゼブラフィッシュ、Ｘｅｎｏｐｕｓ、メダカ、ラットおよびヒト細胞において明らかとなっている。Ansaiら、２０１３年、Genetics、１９３巻：７３９〜７４９頁；Carlsonら、２０１２年、PNAS、１０９巻：１７３８２〜１７３８７頁；Hockemeyerら、２０１１年、Nature  Biotechnol.、２９巻：７３１〜７３４頁；Leiら、２０１２年、PNAS、１０９巻：１７４８４〜１７４８９頁；Mooreら、２０１２年、PLoS  ONE、７巻：ｅ３７８７７頁；Stroudら、２０１３年、J.  Biol.  Chem.、２８８巻：１６８５〜１６９０頁；Sungら、２０１３年、Nature  Biotechnol３１巻：２３〜２４頁；Wefersら、２０１３年、PNAS１１０巻：３７８２〜３７８７頁。
【００８５】
このようなＴＡＬＥＮの生成方法は、米国特許第８，４２０，７８２号、第８，４５０，４７１号、第８，４５０，１０７号、第８，４４０，４３２号および第８，４４０，４３１号、ならびに米国特許出願公開第２０１３／０１３７１６１号および第２０１３／０１３７１７４号にさらに記載されている。
【００８６】
他の有用なエンドヌクレアーゼは、例えば、ＨｈａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＢｂｖＣＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｂｇ／ＩおよびＡｌｗＩを含むことができる。いくつかのエンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）は２量体としてのみ機能するという事実を利用して、ＴＡＬエフェクターの標的特異性を増強することができる。例えば、いくつかの場合では、各ＦｏｋＩ単量体は、異なるＤＮＡ標的配列を認識するＴＡＬエフェクター配列に融合させることができ、２つの認識部位が近接している場合のみ、不活性単量体は、実際に集合して機能性酵素を生成する。ヌクレアーゼを活性化するＤＮＡ結合を必要とすることにより、高度に部位特異的な制限酵素を生成することができる。
【００８７】
一部の実施形態では、ＴＡＬＥＮは、核局在化シグナルまたは配列（ＮＬＳ）をさらに含むことができる。ＮＬＳは、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼタンパク質を標的化して、染色体の標的配列において２本鎖切断端を核内に導入することを促進するアミノ酸配列である。
【００８８】
核局在化シグナルは、当技術分野において公知であり、例えば、Makkerhら１９９６年、Curr  Biol.６巻：１０２５〜１０２７頁を参照されたい。ＮＬＳは、ＳＶ４０ラージＴ抗原由来の配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１６）、Kalderon１９８４年、Cell、３９巻：４９９〜５０９頁；ヌクレオプラスミン由来のＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫ（配列番号１７）、Dingwalletら、１９８８年、J  Cell  Biol.、１０７巻、８４１〜９頁を含む。さらなる例は、McLaneおよびCorbett２００９年、IUBMB  Life、６１巻、６９７〜７０頁；Dopieら２０１２年、PNAS、１０９巻、Ｅ５４４〜Ｅ５５２頁に記載されている。
【００８９】
切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来し得るエンドヌクレアーゼの非限定的な例は、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼを含むが、これらに限定されない。例えば、２００２〜２００３年Catalog、New  England  Biolabs、Beverly,  Mass.；およびBelfortら（１９９７年）Nucleic  Acids  Res.２５巻：３３７９〜３３８８頁を参照されたい。ＤＮＡを切断するさらなる酵素は、公知であり、例えば、ＳＩヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓ＤＮａｓｅＩ、小球菌ヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼがある。Linnら（編）Nucleases、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、１９９３年をまた参照されたい。これらの酵素のうちの１つもしくは複数、またはこれらの機能性断片は、切断ドメインのソースとして使用することができる。
【００９０】
ジンクフィンガー媒介ゲノム編集
【００９１】
遺伝子編集のため、例えば、相同性による修復プロセスを介する標的挿入のためのジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の使用は、十分に確立されている。例えば、Carberyら、２０１０年、Genetics、１８６巻：４５１〜４５９頁；Cuiら、２０１１年、Nature  Biotechnol.、２９巻；６４〜６８頁；Hauschildら、２０１１年、PNAS、１０８巻：１２０１３〜１２０１７頁；Orlandoら、２０１０年、Nucleic  Acids  Res.、３８巻：ｅ１５２〜ｅ１５２頁；ならびにPorteusおよびCarroll、２００５年、Nature  Biotechnology、２３巻：９６７〜９７３頁を参照されたい。
【００９２】
ＺＦＮ媒介プロセスの構成要素は、ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインを有するジンクフィンガーヌクレアーゼを含む。このようなものは、例えば、Beerliら（２００２年）Nature  Biotechnol.、２０巻：１３５〜１４１頁；Paboら（２００１年）Ann.  Rev.  Biochem.、７０巻：３１３〜３４０頁；Isalanら（２００１年）Nature  Biotechnol.１９巻：６５６〜６６０頁；Segalら（２００１年）Curr  Opin.  Biotechnol.、１２巻：６３２〜６３７頁；およびChooら（２０００年）Curr  Opin.  Struct.  Biol.、１０巻：４１１〜４１６頁；ならびに米国特許第６，４５３，２４２号および第６，５３４，２６１号に記載されている。標的配列に対するジンクフィンガー結合ドメインをデザインおよび選択する方法は、当技術分野において公知であり、例えば、Seraら、Biochemistry２００２年、４１巻、７０７４〜７０８１頁；米国特許第６，６０７，８８２号、第６，５３４，２６１号および第６，４５３，２４２号を参照されたい。
【００９３】
一部の実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、核局在化シグナルまたは配列（ＮＬＳ）をさらに含むことができる。ＮＬＳは、ジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質を標的化して、染色体の標的配列において２本鎖切断端を核内に導入することを促進するアミノ酸配列である。核局在化シグナルは、当技術分野において公知である。例えば、Makkerhら（１９９６年）Current  Biology  ６巻：１０２５〜１０２７頁を参照されたい。
【００９４】
切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来し得るエンドヌクレアーゼの非限定的な例は、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼを含むが、これらに限定されない。例えば、２００２〜２００３年Catalog、New  England  Biolabs、Beverly,  Mass.；およびBelfortら（１９９７年）Nucleic  Acids  Res.２５巻：３３７９〜３３８８頁を参照されたい。ＤＮＡを切断するさらなる酵素は、公知である（例えば、ＳＩヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓ＤＮａｓｅＩ、小球菌ヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ）。Linnら（編）Nucleases、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、１９９３年をまた参照されたい。これらの酵素のうちの１つもしくは複数（またはこれらの機能性断片）は、切断ドメインのソースとして使用することができる。切断ドメインはまた、上記のように、２量体を形成して切断を活性化することを必要とする、酵素またはその部分に由来し得る。
【００９５】
２つのジンクフィンガーヌクレアーゼは、各ヌクレアーゼが活性酵素２量体のうちの単量体を含むため、切断に必要とされ得る。あるいは、単一のジンクフィンガーヌクレアーゼは、活性酵素２量体を生成する両方の単量体を含むことができる。制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、ＤＮＡに（認識部位に）配列特異的に結合し、結合部位で、または結合部位付近でＤＮＡを切断することが可能である。特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から除去された部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合および切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖のその認識部位から９番目のヌクレオチド、および他方の鎖のその認識部位から１３番目のヌクレオチドのＤＮＡの２本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号、第５，４３６，１５０号および第５，４８７，９９４号ならびにLiら（１９９２年）PNAS８９巻：４２７５〜４２７９頁；Liら（１９９３年）PNAS９０巻：２７６４〜２７６８頁；Kimら（１９９４年）PNAS９１巻：８８３〜８８７頁；Kimら（１９９４年）J.  Biol.  Chem.２６９巻：３１号、９７８頁〜３１号、９８２頁を参照されたい。したがって、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素由来の切断ドメインおよび１つまたは複数のジンクフィンガー結合ドメインを含むことができ、これらは、改変してもしなくてもよい。例示的ＩＩＳ型制限酵素は、例えば、国際公開ＷＯ０７／０１４２７５に記載されており、この開示の全体を参照により本明細書に組み込む。さらなる制限酵素はまた、分離可能な結合および切断ドメインを含み、これらも本開示により検討する。例えば、Robertsら（２００３年）Nucleic  Acids  Res.３１巻：４１８〜４２０頁を参照されたい。切断ドメインが結合ドメインから分離可能である、例示的なＩＩＳ型制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、２量体として活性である（Bitinaiteら、１９９８年、PNAS９５巻：１０号、５７０頁〜１０号、５７５頁）。したがって、本開示の目的において、ジンクフィンガーヌクレアーゼに使用するＦｏｋＩ酵素の部分は、切断単量体とみなされる。したがって、ＦｏｋＩ切断ドメインを使用する標的２本鎖切断では、それぞれがＦｏｋＩ切断単量体を含む、２つのジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して、活性酵素２量体を再構成することができる。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋＩ切断単量体を含む単一のポリペプチド分子も使用することができる。ある特定の実施形態では、例えば、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２００５／００６４４７４号、第２００６／０１８８９８７号、および第２００８／０１３１９６２号に記載されているように、切断ドメインは、ホモ２量体化を最小化するか、または防ぐ１つまたは複数の改変切断単量体を含むことができる。非限定的な例として、ＦｏｋＩの４４６位、４４７位、４７９位、４８３位、４８４位、４８６位、４８７位、４９０位、４９１位、４９６位、４９８位、４９９位、５００位、５３１位、５３４位、５３７位および５３８位のアミノ酸残基はすべて、ＦｏｋＩ切断半ドメインの２量体化に影響する標的である。偏性ヘテロ２量体を形成する、ＦｏｋＩの例示的改変切断単量体は、第１の切断単量体がＦｏｋＩのアミノ酸残基４９０位および５３８位に変異を含み、第２の切断単量体がアミノ酸残基４８６位および４９９位に変異を含む、対を含む。したがって、一実施形態では、アミノ酸４９０位の変異は、Ｇｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）と置換し、アミノ酸残基５３８位の変異は、Ｉｌｅ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）と置換し、アミノ酸残基４８６位の変異は、Ｇｌｎ（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）と置換し、４９９位の変異は、Ｉｌｅ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）と置換する。詳細には、改変切断単量体は、ある切断単量体において４９０位をＥからＫに、および５３８位をＩからＫに変異させて「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と呼ばれる改変切断単量体を作製することにより、ならびに別の切断単量体において４８６位をＱからＥに、および４９９位をＩからＬに変異させて「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と呼ばれる改変切断単量体を作製することにより調製することができる。上記の改変切断単量体は、異常な切断が最小化または消失した偏性ヘテロ２量体変異体である。改変切断単量体は、適した方法を使用して、例えば、米国特許公開第２００５／００６４４７４号に記載の野生型切断単量体（ＦｏｋＩ）の部位特異的変異誘発により調製することができる。
【００９６】
上記のジンクフィンガーヌクレアーゼは、２本鎖切断を標的組込み部位に導入するために改変することができる。２本鎖切断は、標的組込み部位であり得るか、または組込み部位から最大１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００もしくは１０００ヌクレオチド離れ得る。一部の実施形態では、２本鎖切断は、組込み部位から最大１、２、３、４、５、１０、１５または２０ヌクレオチド離れ得る。他の実施形態では、２本鎖切断は、組込み部位から最大１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチド離れ得る。さらに他の実施形態では、２本鎖切断は、組込み部位から最大５０、１００または１０００ヌクレオチド離れ得る。
【００９７】
ＤＲＡＰ技術は、米国特許第６，５３４，６４３号、第６，８５８，７１６号および第６，８３０，９１０号ならびにWattら、２００６年に記載されている。
【００９８】
必要に応じて、タンパク質をコードする核酸配列をゲノムのランダム標的部位に挿入し、これによりゲノムにタンパク質をコードする核酸を含有させることができる。典型的には、ランダム挿入では、核酸配列にはまた、プロモーターを含有させて、挿入した核酸の発現を推進させる。
【００９９】
さらに必要に応じて、所望のタンパク質、ＡＰＯＥ４ｐ、Ｔｒｅｍ２ｐまたはＡＰＯＥ４ｐとＴｒｅｍ２ｐの両方をコードする核酸をＡｐｏｅ４遺伝子またはＴｒｅｍ２遺伝子以外のゲノムの所定の標的部位に挿入する。
【０１００】
例えば、所望のタンパク質、ＡＰＯＥ４ｐ、Ｔｒｅｍ２ｐまたはＡＰＯＥ４ｐとＴｒｅｍ２ｐの両方をコードする核酸を、確実な発現を生じさせることが公知のゲノムの所定の標的部位、例えば、ＨｐｒｔまたはＲｏｓａ２６座位に挿入する。
【０１０１】
態様によれば、所定の標的部位でのゲノム編集では、標的化構築物は、組換えＤＮＡ技術を使用して作製し、細胞内の標的内在性遺伝子と相同な５’および３’配列を含む。標的化構築物は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンまたはピューロマイシン等の選択可能なマーカー、所望のタンパク質、ＡＰＯＥ４ｐ、Ｔｒｅｍ２ｐまたはＡＰＯＥ４ｐとＴｒｅｍ２ｐの両方をコードする核酸、ならびに必要に応じてポリアデニル化シグナルをさらに含む。所望のタンパク質をコードする核酸の的確な転写および翻訳を確実とするために、所望のタンパク質をコードする核酸は、内因性遺伝子座を有するフレーム内、またはスプライス受容部位にあり、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を含むことができる。
【０１０２】
このような標的化構築物は、これに限定されないが、幹細胞等の所望の細胞型にトランスフェクトし、細胞をスクリーニングして、的確なゲノム編集イベントをＰＣＲ、サザンブロットまたは配列解析を使用して検出する。的確なゲノム編集イベントを有する細胞を、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロット解析等のタンパク質解析により、コードされるタンパク質の発現について、さらに解析することができる。必要に応じて、Ｃｒｅリコンビナーゼまたはフリッパーゼ（Ｆｌｐ）等のリコンビナーゼで幹細胞を処理することにより、選択可能なマーカーをコードする核酸を除去するように構成することができる。リコンビナーゼ処理の後、所望のタンパク質をコードする核酸の存在について細胞を解析する。
【０１０３】
的確なゲノム編集イベントを有する細胞を選択し、上記のように着床前胚内に注入する。キメラの雄を選択して繁殖させる。毛色、およびＰＣＲ、サザンブロットまたは配列決定等の遺伝子解析により、ＥＳ細胞ゲノムの遺伝について子を解析することができ、例えば、タンパク質解析（ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ）または他の機能性アッセイにより、所望のタンパク質の発現について試験することができる。的確なタンパク質を発現する子を相互交雑させて、遺伝子改変（単数または複数）についてホモ接合性のマウスを作製する。
【０１０４】
ＡＰＯＥ４ｐおよびＴｒｅｍ２ｐを発現する遺伝子改変マウスの作製は、適切な核酸、例えば、所望のタンパク質をコードする１つもしくは複数の核酸、および／または１つもしくは複数の発現構築物、例えば、タンパク質もしくはＲＮＡ（例えば、ＣＲＩＳＰＲにおける使用のためのｃａｓ９またはガイドＲＮＡ）をコードする発現構築物を、着床前胚または幹細胞、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ）細胞または誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞内へ注入またはトランスフェクションすることを含むことができる。
【０１０５】
用語「発現構築物」および「発現カセット」は、配列をコードする所望の核酸を含み、動作可能に連結されたコード配列の発現に必要な、または望ましい１つまたは複数の制御エレメントを含む２本鎖組換えＤＮＡ分子を指すために本明細書において使用する。
【０１０６】
用語「制御エレメント」は、本明細書において使用する場合、核酸配列の発現のある態様を調節するヌクレオチド配列を指す。例示的な制御因子は、例示的に、エンハンサー、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、イントロン、複製起点、ポリアデニル化シグナル（ｐＡ）、プロモーター、転写終結配列、および上流制御ドメインを含み、これらは、核酸配列の複製、転写、転写後プロセシングに寄与する。当業者は、発現構築物における、これらの、および他の制御エレメントを、単なる慣例的実験で選択および使用することが可能である。発現構築物は、組換えまたは合成により、周知の方法を使用して作製することができる。
【０１０７】
用語「動作可能に連結された」は、本明細書において使用する場合、第２の核酸と機能的な関係にある核酸を指す。
【０１０８】
制御エレメントは、特定の実施形態において、プロモーターである発現カセットに含まれる。用語「プロモーター」は、本明細書において使用する場合、所望の分子をコードする核酸配列等の転写される核酸配列に動作可能に連結されたＤＮＡ配列を指す。プロモーターは、一般に、転写される核酸配列の上流に位置し、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子により特異的に結合させるための部位をもたらす。特定の実施形態では、プロモーターは、一般に、転写されて所望の分子を生成する核酸配列の上流に位置し、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子により特異的に結合させるための部位をもたらす。含まれるプロモーターは、構成的プロモーターであり得るか、または誘導発現をもたらすことができ、遍在性の組織特異的または細胞型特異的発現をもたらすことができる。
【０１０９】
発現構築物に含むことができる遍在性プロモーターは、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ−１）プロモーター、ベータ−アクチンプロモーター、ＲＯＳＡ２６プロモーター、熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）プロモーター、ＥＦ−１アルファ遺伝子コード伸長因子１アルファ（ＥＦ１）プロモーター、真核生物翻訳開始因子４Ａ（ｅＩＦ−４Ａ１）プロモーター、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）プロモーターおよびＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーターを含むが、これらに限定されない。
【０１１０】
これらのプロモーターおよび他のプロモーターは、Abboud,  S.  L.ら、J.  HistochemおよびCytochem.、５１巻（７号）：９４１〜９４９頁、２００３年；Schorppら、Nucl.  Acids  Res.、２４巻（９号）：１７８７〜１７８８頁、１９９６年；McBurney,  M.  W.ら、Devel.  Dynamics、２００巻：２７８〜２９３頁、１９９４年；ならびにMajumder,  M.ら、Blood、８７巻（８号）：３２０３〜３２１１頁、１９９６年に例示するように当技術分野において公知である。
【０１１１】
プロモーターに加えて、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメントおよびＳＶ４０エンハンサーエレメント等の１つまたは複数のエンハンサー配列を含むことができるが、これらに限定されない。
【０１１２】
さらに含まれる配列は、ベータ−グロビンイントロンまたはジェネリックイントロン、転写終結配列、ならびにこれらに限定されないが、ＳＶ４０−ｐＡ、ベータ−グロビン−ｐＡおよびＳＣＦ−ｐＡ等のｍＲＮＡポリアデニル化（ｐＡ）配列等のイントロン配列を含む。
【０１１３】
発現構築物は、細菌細胞における増幅に必要な配列、例えば、選択マーカー（例えば、カナマイシンまたはアンピシリン抵抗性遺伝子）およびレプリコンを含むことができる。
【０１１４】
発現構築物を着床前胚内へＤＮＡ注入する方法では、発現構築物は、必要に応じて、線状化した後、マウス着床前胚内に注入する。好ましくは、発現構築物は、受精卵母細胞内に注入する。受精卵母細胞は、過排卵させた雌から交配の翌日（０．５ｄｐｃ）に採取し、発現構築物を用いて注入する。注入した卵母細胞は、一晩培養するか、または０．５日ｐ．ｃの偽妊娠させた雌の卵管内に直接移植する。
【０１１５】
過排卵、卵母細胞の回収、発現構築物注入および胚移植の方法は、当技術分野において公知であり、Manipulating  the  Mouse  Embryo:  A  Laboratory  Manual、第３版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、２００２年１２月１５日；ＩＳＢＮ−１０：０８７９６９５９１９に記載されている。
【０１１６】
ＰＣＲ、サザンブロットまたは配列決定等のＤＮＡ解析により、所望の変異または挿入配列の存在について子を試験することができる。例えば、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロット解析により、所望の変異または挿入配列を保有しているマウスをタンパク質発現について試験することができる。
【０１１７】
あるいは、核酸または発現構築物は、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿およびリポフェクション等の周知の方法を使用して、幹細胞（ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞）内にトランスフェクトすることができる。ＰＣＲ、サザンブロットまたは配列決定等のＤＮＡ解析により、所望の変異または挿入配列の存在について細胞をスクリーニングする。例えば、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロット解析等のタンパク質解析により、所望の変異または挿入配列を有する細胞を機能発現について試験することができる。
【０１１８】
特定の株用に最適化した培地中でマウスＥＳ細胞を増殖させる。典型的には、ＥＳ培地は、１５％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）または合成もしくは半合成の等価物、２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸Ｎａ、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、５０Ｕ／ｍｌのペニシリンおよびストレプトマイシン、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノールならびに１０００Ｕ／ｍｌのＬＩＦ（いくつかの細胞株用に、これらに加えて分化の化学阻害物質）をダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に含む。詳細な説明は、当技術分野において公知である（Tremmlら、２００８年、Current  Protocols  in  Stem  Cell  Biology、第１章：ユニット１Ｃ．４）。ＥＳ細胞分化阻害物質の総説については、Buehr,  M.ら（２００３年）、Genesis  of  embryonic  stem  cells、Philosophical  Transactions  of  the  Royal  Society  B:  Biological  Sciences３５８巻、１３９７〜１４０２頁を参照されたい。
【０１１９】
所望の変異または挿入配列を組み込む選択された細胞は、着床前胚内に注入することができる。マイクロインジェクションでは、トリプシンとＥＤＴＡの混合物を使用してＥＳまたはｉＰＳ細胞を単一細胞にし、その後、ＥＳ培地中に再懸濁する。精密に引き延ばされたガラス針（内径２０〜２５マイクロメートル）を使用して単一細胞の群を選択し、マイクロマニピュレーターを装着した倒立顕微鏡を使用して、胚透明帯を介して胚盤胞腔（胞胚腔）内に導入する。
【０１２０】
胚盤胞注入に代わって、幹細胞を初期胚（例えば、２細胞、４細胞、８細胞、前桑実胚または桑実胚）内に注入することができる。レーザーまたはピエゾパルスで穿孔した透明帯の開口により、注入を促進することができる。胚盤胞１つ、または８細胞期の胚１つあたり選択された幹細胞（ＥＳまたはｉＰＳ細胞）約９〜１０個、４細胞期の胚１つあたり幹細胞６〜９個、および２細胞期の胚１つあたり幹細胞約６個を注入する。幹細胞の導入後、５％ＣＯ２、窒素中５％Ｏ２において、３７℃で数時間、胚を回復させるか、または一晩培養し、その後、偽妊娠させたレシピエントの雌に移植する。幹細胞注入のさらなる代替法では、桑実胚期の胚を用いて幹細胞を凝集することができる。これらのすべての方法は、十分に確立されており、幹細胞キメラを作製するために使用することができる。より詳細な説明については、Manipulating  the  Mouse  Embryo:  A  Laboratory  Manual、第３版（A.  Nagy、M.  Gertsenstein、K.  Vintersten、R.  Behringer、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、２００２年１２月１５日；ＩＳＢＮ−１０：０８７９６９５９１９；Nagyら、１９９０年、Development１１０巻、８１５〜８２１頁；ＵＳ７，５７６，２５９：Method  for  making  genetic  modifications；ＵＳ７６５９４４２；ＵＳ７，２９４，７５４；およびKrausら２０１０年、Genesis４８巻、３９４〜３９９頁を参照されたい。
【０１２１】
偽妊娠させた胚レシピエントは、当技術分野において公知の方法を使用して用意する。簡潔には、６〜８週齢の繁殖性の雌マウスを、精管切除されたまたは繁殖不能な雄と交配して、外科的に導入された胚の維持に役立つホルモン状態を誘導する。交尾後２．５日（ｄｐｃ）に、胚盤胞を含む幹細胞を最大１５個、子宮と卵管の接合部に非常に近い子宮角内に導入する。初期の胚および桑実胚では、このような胚をｉｎ  ｖｉｔｒｏで胚盤胞に培養するか、または胚形成期に応じて０．５ｄｐｃまたは１．５ｄｐｃの偽妊娠させた雌の卵管に移植する。移植胚由来のキメラの子は、移植時の胎齢に応じて移植後１６〜２０日で産まれる。キメラの雄を選択して繁殖させる。毛色、およびＰＣＲ、サザンブロットまたは配列決定等の遺伝子解析により、ＥＳ細胞ゲノムの遺伝について、子を解析することができる。さらに、タンパク質解析（ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ）または他の機能性アッセイにより、コードされるタンパク質（単数または複数）の発現を解析することができる。
【０１２２】
本発明の遺伝子改変マウスは、遺伝子改変についてヘテロ接合性またはホモ接合性であり得る。
【０１２３】
本発明の態様によれば、本発明の遺伝子改変マウスは、マウスがＡＰＯＥ４ｐを発現する「ノックイン」ヒト化ＡＰＯＥ４改変についてヘテロ接合性またはホモ接合性であり得、また、マウスがＴｒｅｍ２ｐを発現する、Ｔｒｅｍ２ｐをコードする変異ゲノム配列についてヘテロ接合性またはホモ接合性であり得る。
【０１２４】
ＡＰＯＥ４ｐを発現するホモ接合性遺伝子改変マウスは、Ｔｒｅｍ２ｐを発現するホモ接合性遺伝子改変マウスと交雑させて、改変と、ＡＰＯＥ４ｐおよびＴｒｅｍ２ｐの両方の発現とについて、ともにホモ接合性の共通遺伝子系統を実施形態に従って作製することができる。
【０１２５】
本発明の遺伝子改変マウスは、種々の系統のいずれかであり得る。
【０１２６】
遺伝子改変は、単離したマウス胚性幹（ＥＳ）細胞、マウス誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、マウス体細胞、受精したマウス卵母細胞（接合子）またはマウス胚のゲノム内にノックイン法により導入して、本発明の遺伝子改変マウスを作製することができる。
【０１２７】
本発明の実施形態は、その細胞のすべて、または実質的にすべてにおいて所望の遺伝子改変を含む遺伝子改変マウス、ならびにその細胞のすべてではないが、いくつかにおいて所望の遺伝子改変を含む遺伝子改変マウスを提供する。
【０１２８】
本発明の態様による遺伝子改変マウスは、ヒトにおける遅発型アルツハイマー病のリスクの増加と関連する１つまたは複数のさらなる遺伝子バリアントを含むことができる。
【０１２９】
処置および化合物の同定
【０１３０】
ヒトアルツハイマー病の推定処置についてスクリーニングするための方法であって、マウスのゲノムが、１）プロモーターに動作可能に連結されたヒトＡＰＯＥ４タンパク質（ＡＰＯＥ４ｐ）をコードするＤＮＡ配列、および２）プロモーターに動作可能に連結された、ｐ．Ｒ４７Ｈ変異を有するマウスＴｒｅｍ２タンパク質（Ｔｒｅｍ２ｐ）をコードするＤＮＡ配列を含み、マウスが、ＡＰＯＥ４ｐおよびＴｒｅｍ２ｐを発現し、マウスが、非家族性遅発型アルツハイマー病に関係する、ＡＰＯＥ４ｐおよびＴｒｅｍ２ｐの発現を伴う１つまたは複数の症状または徴候を特徴とする、本発明の遺伝子改変マウスに、アルツハイマー病の推定処置を施すステップと、マウスに対する推定処置の効果を評価するステップとを含む、方法が本発明の実施形態に従って提供される。
【０１３１】
ヒトアルツハイマー病の推定処置についてスクリーニングするための方法であって、マウスゲノムが、１）プロモーターに動作可能に連結されたヒトＡＰＯＥ４タンパク質（ＡＰＯＥ４ｐ）をコードするＤＮＡ配列、および２）プロモーターに動作可能に連結された、ｐ．Ｒ４７Ｈ変異を有するマウスＴｒｅｍ２タンパク質（Ｔｒｅｍ２ｐ）をコードするＤＮＡ配列を含む、Ｂ６（ＳＪＬ）−Ａｐｏｅｔｍ１．１（ＡＰＯＥ＊４）ＡｄｉｕｊＴｒｅｍ２ｅｍ１Ａｄｉｕｊ／Ｊマウスであって、ＡＰＯＥ４ｐをコードするＤＮＡ配列について、およびＴｒｅｍ２ｐをコードするＤＮＡ配列についてホモ接合性であり、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現するマウスに、アルツハイマー病の推定処置を施すステップと、マウスに対する推定処置の効果を評価するステップとを含む、方法が本発明の実施形態に従って提供される。
【０１３２】
アルツハイマー病の処置における使用のための化合物についてスクリーニングするための方法であって、本発明の遺伝子改変マウスに化合物を投与するステップと、非家族性遅発型アルツハイマー病に関係する、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐの発現を伴う１つまたは複数の症状または徴候の処置における化合物の作用を評価するステップとを含む、方法が本発明の態様に従って提供される。非家族性遅発型アルツハイマー病に関係する、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐの発現を伴う１つまたは複数の症状または徴候の処置における化合物の作用を評価するステップは、好ましくは、評価の結果を適した対照、例えば、これらに限定されないが、ＡＰＯＥ３発現マウスまたは野生型マウス（例えば、Ａｐｏｅ遺伝子を保有するマウス）等の対照に対する化合物の作用と比較することを含む。
【０１３３】
このような徴候および症状は、１）ＡＰＯＥ３発現マウスまたは野生型対照マウス等の対照と比較して、本発明の遺伝子改変マウスの脳において著しく多いミクログリアの存在と、２）ＡＰＯＥ３発現マウスまたは野生型対照マウス等の対照と比較して、本発明の遺伝子改変マウスの脳において著しく多いアミロイド斑の存在と、３）ＡＰＯＥ３発現マウスまたは野生型対照マウス等の対照と比較して、本発明の遺伝子改変マウスの脳において著しく多いタウ凝集物の存在と、４）ＡＰＯＥ３発現マウスまたは野生型対照マウス等の対照と比較して、本発明の遺伝子改変マウスの脳において著しく多い炎症の存在と、５）ＡＰＯＥ３発現マウスまたは野生型対照マウス等の対照と比較して、本発明の遺伝子改変マウスの脳において著しく多いシナプスおよび／またはニューロンの欠損の存在と、６）ＡＰＯＥ３発現マウスまたは野生型対照マウス等の対照と比較して、本発明の遺伝子改変マウスの脳において著しく多い認知障害の存在と、７）ＡＰＯＥ３発現マウスまたは野生型対照マウス等の対照と比較して、加齢した本発明の遺伝子改変マウスにおいて著しく多いフレイルの徴候の存在と、８）ＡＰＯＥ３発現マウスまたは野生型対照マウス等の対照と比較して、本発明の遺伝子改変マウスの脳において著しく多い血流障害の存在と、９）ＡＰＯＥ３発現マウスまたは野生型対照マウス等の対照と比較して、本発明の遺伝子改変マウスの血液、血清、または組織における非家族性遅発型アルツハイマー病の１つまたは複数のバイオマーカーの存在、レベル、および／または機能の著しい差と、１０）ＡＰＯＥ３発現マウスまたは野生型対照マウス等の対照と比較した、本発明の遺伝子改変マウスにおける脳血管外漏出と、１１）ＡＰＯＥ３発現マウスまたは野生型対照マウス等の対照と比較した、本発明の遺伝子改変マウスにおける高密度リポタンパク質、および低密度リポタンパク質、ならびに／またはコレステロール等の１つまたは複数の血中リポタンパク質のレベルとのうちの任意の１つまたは複数を含むが、これらに限定されない。
【０１３４】
本発明の態様によれば、化合物の作用を評価するステップが、マウスのゲノムが、１）プロモーターに動作可能に連結されたヒトＡＰＯＥ４タンパク質（ＡＰＯＥ４ｐ）をコードするＤＮＡ配列、および２）プロモーターに動作可能に連結された、ｐ．Ｒ４７Ｈ変異を有するマウスＴｒｅｍ２タンパク質（Ｔｒｅｍ２ｐ）をコードするＤＮＡ配列を含み、マウスが、ＡＰＯＥ４ｐおよびＴｒｅｍ２ｐを発現し、非家族性遅発型アルツハイマー病に関係するＡＰＯＥ４ｐおよびＴｒｅｍ２ｐの発現を伴う１つまたは複数の症状または徴候を特徴とする、本発明の遺伝子改変マウスに対する化合物の作用を、対照と比較することを含む、ヒトアルツハイマー病の推定処置についてスクリーニングするための方法が提供される。
【０１３５】
本発明の態様によれば、化合物の作用を評価するステップが、Ｂ６（ＳＪＬ）−Ａｐｏｅｔｍ１．１（ＡＰＯＥ＊４）ＡｄｉｕｊＴｒｅｍ２ｅｍ１Ａｄｉｕｊ／Ｊマウスに対する化合物の作用を、対照と比較することを含む、ヒトアルツハイマー病の推定処置についてスクリーニングするための方法が提供される。
【０１３６】
適した対照は、例えば、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現しないマウスに化合物を投与するステップと、このマウスに対する化合物の作用を評価するステップとを含む。適した対照は、例えば、ＡＰＯＥ３発現マウスまたは野生型対照マウスに化合物を投与するステップを含む。野生型対照マウスは、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐを発現しない任意のマウスであり得る。適した対照は、例えば、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに化合物を投与するステップと、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対する化合物の作用を評価するステップとを含む。
【０１３７】
非家族性遅発型アルツハイマー病に関係する、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐの発現を伴う症状または徴候は、これらに限定されないが、イムノアッセイ、核酸アッセイ、組織化学的染色、認知アッセイ、ｉｎ  ｖｉｖｏ画像診断法、動物の身体的評価、脳血管外漏出の評価、ならびに組織および／または細胞の形態学的評価を含む、当技術分野において周知の方法により評価することができる。
【０１３８】
使用し得るイムノアッセイは、当技術分野において周知であり、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、例えば、これらに限定されないが、抗原捕捉ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、固定細胞ＥＬＩＳＡ；免疫クロマトグラフィー；抗原捕捉法；フローサイトメトリー；免疫ブロット；免疫沈降法；免疫拡散法；競合イムノアッセイ；免疫細胞化学法；ラジオイムノアッセイ；およびこれらのいずれかの組合せを含むが、これらに限定されない。イムノアッセイの一般化した詳細は、例示的にWild,  D.、The  Immunoassay  Handbook、第３版、Elsevier  Science、２００５年；Gosling,  J.  P.、Imunoassays:  A  Practical  Approach,  Practical  Approach  Series、Oxford  University  Press、２００５年；E.HarlowおよびD.  Lane、Antibodies:  A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、１９８８年；F.  BreitlingおよびS.  Dubel、Recombinant  Antibodies、John  Wiley  &  Sons、New  York、１９９９年；H.  Zola、Monoclonal  Antibodies:  Preparation  and  Use  of  Monoclonal  Antibodies  and  Engineered  Antibody  Derivatives,  Basics:  From  Background  to  Bench、BIOS  Scientific  Publishers、２０００年；B.K.C.  Lo、Antibody  Engineering:  Methods  and  Protocols、Methods  in  Molecular  Biology、Humana  Press、２００３年；F.  M.  Ausubelら編、Short  Protocols  in  Molecular  Biology、Current  Protocols、Wiley、２００２年；Ormerod,  M.  G.、Flow  Cytometry:  a  practical  approach、Oxford  University  Press、２０００年；ならびにGivan,  A.  L.、Flow  Cytometry:  first  principles、Wiley、New  York、２００１年を含む、標準的参考文献に記載されている。
【０１３９】
本発明の態様によれば、非家族性遅発型アルツハイマー病に関係する核酸解析物を、本発明の遺伝子改変マウスにおいて、野生型マウスと比較して検出する核酸アッセイは、核酸増幅技術、例えば、これらに限定されないが、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ライゲーションによるＰＣＲおよびｐｈｉ−２９ＰＣＲ；核酸ハイブリダイゼーション技術、例えば、これらに限定されないが、ノーザンブロット、サザンブロット、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、ドットブロット、トランスクリプトーム解析、およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含むが、これらに限定されない。試料中の核酸の定性的および定量的アッセイの両方のための核酸アッセイは、例示的に、J.  SambrookおよびD.W.  Russell、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press；第３版、２００１年；F.  M.  Ausubelら編、Short  Protocols  in  Molecular  Biology,  Current  Protocols、Wiley、２００２年；C.W.  Dieffenbachら、PCR  Primer:  A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、２００３年；ならびにV.  Demidovら、DNA  Amplification:  Current  Technologies  and  Applications、Taylor  &  Francis、２００４年を含む、標準的参考文献に詳細に記載されている。
【０１４０】
使用し得るバイオマーカーアッセイは、当技術分野において周知であり、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液、血清、または組織中の、Ａβおよびタウ種、ニューロフィラメント、ニューログラニン、インターロイキン、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦ、および可溶性Ｔｒｅｍ２のアッセイを含むが、これらに限定されない。
【０１４１】
使用し得る認知アッセイは、当技術分野において周知であり、空間記憶、短期記憶、長期記憶のアッセイ、実行機能のアッセイ、注意を要する作業課題、例えば、３および５択の系列反応時間試験、処理速度試験、セットシフティング試験、逆転学習作業課題、物体記憶アッセイ、パターン認識アッセイ、受動的回避記憶アッセイ、馴化アッセイ、および新規物体認識アッセイ、水迷路試験、恐怖条件付け試験、ラジアルアームの水迷路試験、Ｙ字迷路試験、Ｔ字迷路試験、ならびにオープンフィールド馴化試験を含むが、これらに限定されない。
【０１４２】
使用し得る動物の身体的評価法は、当技術分野において周知であり、ＡＰＯＥ３発現マウスまたは野生型マウス等の対照と、正常な加齢に対する対照として比較した本発明の遺伝子改変マウスにおけるフレイルの指標の評価を含むが、これに限定されない。
【０１４３】
使用し得るｉｎ  ｖｉｖｏ画像診断法は、当技術分野において周知であり、磁気共鳴画像診断法（ＭＲＩ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）画像診断法、Ｘ線、光学画像診断法、および超音波画像診断法を含むが、これらに限定されない。このような画像診断技術を使用して、これらに限定されないが、アミロイドまたはタウの凝集物、血流異常、病理学的なニューロンの欠損、およびグルコース代謝異常を含む、非家族性遅発型アルツハイマー病に関係する、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐの発現を伴う１つまたは複数の症状または徴候を評価することができる。
【０１４４】
野生型マウスと比較した、および／または臨床試料と比較した、本発明の遺伝子改変マウスのトランスクリプトームのプロファイル、プロテオミクスのプロファイル、および代謝プロファイルのうちの１つまたは複数に対する変化の評価は、当技術分野において周知の方法を使用して行うことができる。
【０１４５】
炎症の評価は、これらに限定されないが、ＩＬ−８、ＩＬ−１１、ＴＮＦ−アルファ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＴＧＦ−ベータ、ＶＥＧＦ、単球走化因子−１、マクロファージ遊走阻害因子、ｓ１００Ｂ、フィブリノゲン、およびインターフェロンガンマ誘導性タンパク質１０等の１つまたは複数の炎症バイオマーカーのアッセイにより行うことができる。このようなアッセイは、本発明の遺伝子改変マウスおよび野生型マウスから得られる試料、例えば、脳、脊髄、血液、血漿、血清、脳脊髄液または他の関連する組織もしくは体液の試料について行うことができる。
【０１４６】
組織および／または細胞の形態学的評価は、組織および／または細胞の組織化学的または細胞化学的染色を用いた、または用いない、肉眼解剖学の身体検査ならびに／または組織および／もしくは細胞の顕微鏡検査を含むことができる。組織および／または細胞の形態学的評価は、シナプスおよびニューロンの欠損の評価を含むことができる。
【０１４７】
アルツハイマー病の処置における使用のための化合物についてスクリーニングするための方法であって、本発明の遺伝子改変マウスに化合物を投与するステップと、非家族性遅発型アルツハイマー病に関係する、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐの発現を伴う、アミロイドおよび／またはタウに対する化合物の作用をマウスにおいて評価するステップとを含む、アルツハイマー病を有するか、アルツハイマー病を有すると疑われる個々のヒト対象における、方法が本発明の態様に従って提供される。特定の実施形態によれば、アミロイドおよび／またはタウに対する化合物の作用を評価するステップは、アミロイドおよび／またはタウのレベルおよび／または局在性を評価することを含む。特定の実施形態によれば、アミロイドおよび／またはタウに対する化合物の作用を評価するステップは、本発明の遺伝子改変マウスにおけるアミロイドおよび／またはタウ凝集物を評価すること、例えば、凝集物のサイズ、数、位置またはこれらのいずれか２つもしくはそれよりも多くの組合せの評価を含む。
【０１４８】
脳血管外漏出は、非家族性遅発型アルツハイマー病の鍵となる態様であり、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐの発現により脳血管外漏出が生じることは、本発明の驚くべき予想外の知見である。
【０１４９】
非家族性遅発型アルツハイマー病を有するか、または非家族性遅発型アルツハイマー病を有することが疑われる個々のヒト対象における、非家族性遅発型アルツハイマー病の処置における使用のための化合物についてスクリーニングするための方法であって、本発明の遺伝子改変マウスに化合物を投与するステップと、非家族性遅発型アルツハイマー病に関係する、ヒトＡＰＯＥ４ｐおよびマウスＴｒｅｍ２ｐの発現を伴う脳血管外漏出に対する化合物の作用をマウスにおいて評価するステップとを含む、方法が本発明の態様に従って提供される。脳血管外漏出に対する化合物の作用を評価するステップは、脳血管透過性の評価を含むが、これに限定されない。用語「脳血管透過性」は、フィブリノゲンまたはアルブミン等の大型の分子および物質の移動に対してはバリアとして作用する一方で、水、イオン、特定の薬物および栄養素等の小型の分子または物質が、血管壁を超えて、正常に移動することを可能とする血管壁の能力を指す。用語「脳血管外漏出」は、フィブリノゲンおよびアルブミン等の大型の分子および物質が血管壁から漏出することとなる、血管の異常性を指す。脳血管外漏出を評価するためのアッセイは、当技術分野において周知であり、本発明の遺伝子改変マウスから単離した細胞または組織を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、およびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを含む。脳血管外漏出のｉｎ  ｖｉｖｏアッセイの非限定的な例としては、標識したタンパク質（例えば、エバンスブルー標識アルブミン）の静脈内注入、および脳組織における色素標識タンパク質の外観の評価が挙げられ、例えば、Raduら、An  in  vivo  Assay  to  Test  Blood  Vessel  Permeability.、J.  Vis.  Exp.２０１３年、（７３号）：５００６２頁を参照されたい。
【０１５０】
推定処置は、化合物の投与等の任意の処置法であり得るが、これに限定されない。用語「化合物」は、本明細書において使用する場合、限定されず、低分子の化学物質および生物学的製剤、例えば、抗体を含む、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質等を包含する。
【０１５１】
本発明の組成物および方法の実施形態を以下の実施例において説明する。これらの実施例は、例示目的のために提供され、本発明の組成物および方法の範囲に対する限定とはみなされない。
【実施例】
【０１５２】
実施例
【０１５３】
ＡＰＯＥ４ｐをコードするＤＮＡ配列をそのゲノムに有する遺伝子改変マウスの作製
【０１５４】
マウスＡｐｏｅ４遺伝子は、第７染色体上の１９，６９６，１０９〜１９，６９９，１６６に位置する。マウスＡｐｏＥのエキソン１を含むマウス５’ホモロジーアームを定義する４９８０ｂｐのマウス配列（配列番号９）、ヒト遺伝子のエキソン２〜４をコードするヒトタンパク質を含む４２９２ｂｐのヒトＡＰＯＥ４配列（配列番号１０）、ならびに１．５ｋｂのさらなるフランキングヒト配列を３’ＵＴＲの後に含有させて任意の潜在的制御配列を含む、ＡＰＯＥ４遺伝子標的化構築物を作製した。
【０１５５】
図１は、ヒト化ＡｐｏＥ４構築物（「ｍ／ｈＡＰＯＥ標的化ベクターＥ４」を参照）の模式図を示す。図１では、エキソン４’上の（ＣＣ）は、アイソフォームＥ４のｐ．Ｒ３１０およびＲ１７６においてそれぞれアルギニンをコードするエキソン４に存在するｎｔを示す。（ＴＴ）を有するアイソフォームＥ２は、Ｃ１３０とＣ１７６の両方においてシステインをコードするが、Ｅ３（ＴＣ）は、Ｃ１３０Ｒ部位においてシステインを、Ｒ１７６部位においてアルギニンをコードする。
【０１５６】
ヒトＡＰＯＥ４エキソン４は、この遺伝子のＡｐｏＥ４アイソフォームをコードする配列を含み、Ｒ１３０およびＲ１７６においてアルギニンをコードするヌクレオチド配列をコードする。ＡＰＯＥ４は、アミノ酸シグナルペプチド１８個をタンパク質のＮ末端に含み、これによりシグナルペプチドを含むＡＰＯＥ４が、３１７個のアミノ酸となり、ＡＰＯＥ２、ＡＰＯＥ３およびＡＰＯＥ４の間で異なる変異アミノ酸が、１３０位および１７６位に存在することに留意されたい。成熟ＡＰＯＥタンパク質（アミノ酸２９９個）では、ＡＰＯＥ２、ＡＰＯＥ３およびＡＰＯＥ４の間で異なる変異アミノ酸は、１１２位および１５８位に存在する。
【０１５７】
Ｆｒｔ  ｎｅｏ  Ｆｒｔ選択カセット（ＦＮＦカセット、配列番号１１）をヒト配列の後に挿入し、その後、Ｎｄｅ１制限部位を挿入した（サザンスクリーニングを容易とするため）。ＦＮＦカセットの後に５１６６ｂｐのマウス配列（配列番号１２）である３’ホモロジーアームが続く。得られる１４，４３８ｂｐの合成構築物を、リコンビニアリング技術を使用してｐＢｌｉｇｈｔベクターにクローン化し、ｍＡｐｏＥ＿ｈＡＰＯＥ４＿ＰＧＫｎｅｏ＿ｍＡＰＯＥと呼ばれる、胚性幹細胞における遺伝子標的化のための構築物を作製した。
【０１５８】
ＡｐｏＥ４遺伝子標的化構築物を、Ｃ５７Ｂｌ６マウス系統の培養した胚性幹（ＥＳ）細胞内にエレクトロポレーションにより導入した。相同組換えにより、すべての正常マウス制御配列（加えて非コードエキソン配列）をヒトＡＰＯＥ４タンパク質コードエキソン２〜４とともに保持する座位を作製した。的確な標的化を確かめるために、トランスフェクトしたＥＳ細胞をサザンブロットによりスクリーニングした。的確に標的化された３つのクローンを確認した。的確に標的化された座位を含むＥＳ細胞をＣ５７ＢＬ／６Ｊの胚に導入し、得られたキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと繁殖させた。生殖系列において改変座位を保有する子を同系交配させて、ホモ接合遺伝子改変ゲノムを作製した。すべてのＦ１交配により、メンデルの座位分布による正常な産仔数が生じた。
【０１５９】
Ｔｒｅｍ２ｐをコードするＤＮＡ配列をそのゲノムに有する遺伝子改変マウスの作製
【０１６０】
Ｃａｓ９  ＲＮＡ（１００ｎｇ）および単一のガイド配列（５０ｎｇ）ＧＡＡＧＣＡＣＴＧＧＧＧＧＡＧＡＣＧＣＡ（配列番号７）を前核注入することにより、ヌクレオチドＧ＞Ａ点変異（配列番号８における８９番目のｎｔの下線の大文字「Ａ」）を、アミノ酸配列をＲ４７Ｈで変化させるため、ならびに２つのサイレント変異（リシンＡＡＧ＞ＡＡＡ（配列番号８における９３番目のｎｔの下線の小文字「ａ」）およびアラニンＧＣＣ＞ＧＣＡ（配列番号８における９６番目のｎｔの下線の小文字「ａ」））を（相同性による修復におけるドナー配列の再切断を防ぐために）遺伝子内に含む、１８３ｎｔのドナーオリゴ（４０ｎｇ）を有するＴｒｅｍ２  Ｒ４７Ｈ  ＫＩ対立遺伝子
【化１】
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をジャクソン研究所（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）において作製した。ＣＲＩＳＰＲ法により特異的Ｒ４７Ｈノックインが生じ、サイレント変異がファウンダーマウスのＴｒｅｍ２遺伝子に存在した。
【０１６１】
生殖系列において改変対立遺伝子を保有する子を同系交配させて、ホモ接合遺伝子改変ゲノムを作製した。すべてのＦ１交配により、メンデルの座位分布による正常な産仔数が生じた。得られた近交マウス系統は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｒｅｍ２ｅｍ１Ａｄｐｍｃ／Ｊ（一般名Ｔｒｅｍ２  Ｒ４７Ｈ  ＫＩ（ＪＡＸ））と名付けられ、Ｔｒｅｍ２ｐを発現する。
【０１６２】
ＡＰＯＥ４ｐをコードするＤＮＡ配列およびＴｒｅｍ２ｐをコードするＤＮＡ配列をそのゲノムに有する遺伝子改変マウスの作製
【０１６３】
本実施例では、ヒトＡＰＯＥ４ｐを発現する近交マウス系統であるＢ６（ＳＪＬ）−Ａｐｏｅｔｍ１．１（ＡＰＯＥ＊４）Ａｄｐｍｃ／Ｊ（一般名ＡＰＯＥ＊４  ＫＩ（ＪＡＸ））を、マウスＴｒｅｍ２ｐを発現する近交マウス系統であるＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｒｅｍ２ｅｍ１Ａｄｐｍｃ／Ｊ（一般名Ｔｒｅｍ２  Ｒ４７Ｈ  ＫＩ（ＪＡＸ））と交雑させることにより遺伝子改変マウスを作製した。ヒト化ＡＰＯＥ４対立遺伝子とマウスＴｒｅｍ２遺伝子のＲ４７Ｈ対立遺伝子の両方についてホモ接合性である得られる遺伝子改変マウスは、Ｂ６（ＳＪＬ）−Ａｐｏｅｔｍ１．１（ＡＰＯＥ＊４）ＡｄｉｕｊＴｒｅｍ２ｅｍ１Ａｄｉｕｊ／Ｊ（かつてはＢ６（ＳＪＬ）−Ａｐｏｅｔｍ１．１（ＡＰＯＥ＊４）ＡｄｐｍｃＴｒｅｍ２ｅｍ１Ａｄｐｍｃ／Ｊであり、ＡＰＯＥ４  Ｘ  Ｔｒｅｍ２  Ｒ４７Ｈ（ＪＡＸ）マウスと略す）、一般名Ｂ６Ｊ．ＡＰＯＥ４／Ｔｒｅｍ２と名付けられ、ヒトＡＰＯＥ４とマウスＴｒｅｍ２ｐの両方を発現する。
【０１６４】
非家族性遅発型アルツハイマー病の遺伝子改変マウスモデルの検証
【０１６５】
組織の回収、タンパク質の単離および切片作製
【０１６６】
マウスに致死量のケタミン／キシラジンを腹腔内注入により投与し、１×ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で経心的に灌流を行った。脳を解剖し、右半球は、急速凍結させてタンパク質を単離し、一方、左半球は、４％のパラホルムアルデヒド中に４℃で一晩固定した。固定した半球を１×ＰＢＳですすぎ、１０％のスクロース中に、その後、３０％のスクロース中に４℃で凍結保護し、最終的にＯＣＴ（最適切断温度化合物）に包埋した。凍結脳を２５μｍの切片にし、必要とされるまで−８０℃で保存した。タンパク質をトリゾール試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃１５５９６−０１８）により製造者のガイドラインに従って抽出した。タンパク質ペレットを８Ｍの尿素と１％のＳＤＳが１：１の溶液中に再懸濁した。
【０１６７】
免疫蛍光法、チオフラビンＳ染色、および画像取込
【０１６８】
凍結切片をＰＢＴ（１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加えた１×ＰＢＳ）で５分間すすぎ、次いで、Ｌｉｂｅｒａｔｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌ．Ａ．Ｂ．−Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）溶液５００μＬを用いて室温（ＲＴ）で２０分間インキュベートして抗原を回収した。次いで、スライドを次の１次抗体：ウサギポリクローナル抗ＧＦＡＰ（１：２００、Ｄａｋｏ）、ウサギポリクローナル抗ＩＢＡ１（１：２５０、Ｗａｋｏ）、ウサギポリクローナル抗ＮｅｕＮ（１：１００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｉｎｃ）、マウスモノクローナル抗非リン酸化ニューロフィラメント（１：２００、Ｃｏｖａｎｃｅ）およびヒツジポリクローナル抗ＴＲＥＭ２（１：２００、ＲＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）中に４℃で一晩インキュベートした。ヒツジポリクローナル抗ＴＲＥＭ２抗体は、Ｔｒｅｍ２欠損マウスを使用してあらかじめ検証した。すべての抗体を１０％の正常なヤギまたはロバ血清を含むＰＢＴＢ（１×ＰＢＳ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および１％のＢＳＡ）中に希釈した。１次インキュベーションの後、切片をＰＢＴ中で３回洗浄し、適切な２次抗体（ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８／５９４／６３３、ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、ロバ抗ヒツジＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４、１：１０００希釈、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とともにＲＴで２時間インキュベートした。
【０１６９】
次いで、すべての切片をＤＡＰＩで対比染色し、ＡｑｕａＰｏｌｙＭｏｕｎｔ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてマウントした。チオフラビンＳ染色では、ＩＢＡ１およびＧＦＡＰで染色した切片を１％のチオフラビンＳ（水：エタノール比１：１で希釈）でさらに対比染色した。スライドを１％のチオフラビンＳ中にＲＴで８分間インキュベートし、８０％のエタノールで、次いで、９５％エタノールで、最終的にはｄＨ２Ｏで洗浄し、マウントした。ＬｅｉｃａＳＰ５共焦点顕微鏡またはＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｉｍａｇｅｒ．Ｚ２を使用して画像を取得した。各抗体については、正確な定量化のために同一のパラメータを使用してすべての画像を取り込んだ。
【０１７０】
雄雌両方由来の切片において最初の観察を行った。性別間の明白な差が存在しなかったため、少なくとも４〜６匹の雄マウス由来の脳切片について細胞数の定量化を行った。プラークの計数では、各マウスの嗅内皮質領に存在するプラークの数を定量した。ＩＢＡ１＋細胞では、各マウスの中央の脳の切片由来の、嗅内皮質領または海馬領の皮質の等しく間隔をあけた５つの画像を取り込んだ（２０×の光学レンズを使用）。ＮｅｕＮ＋細胞では、等しく間隔をあけた５つの画像を取り込んだ（２０×の光学レンズを使用）。プラークと関連するＩＢＡ１＋細胞では、１つの脳あたり８＋プラークの画像を画像化した（２０×の光学レンズを使用）。
【０１７１】
画像を処理し、ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｅｒ  ｐｌｕｇｉｎ  ｆｏｒ  ＩｍａｇｅＪ／ＦＩＪＩを使用して２０×画像におけるすべての細胞を計数した。細胞特異的抗体染色（例えば、ＩＢＡ１またはＮＥＵＮ）と関連するＤＡＰＩ染色核として単一細胞を決定した。各マウス由来の５つの画像の細胞数を集計し、次いで、全マウスで平均化した。すべての細胞計数アッセイについて、マウスの数および食餌を研究者に対してマスクした。
【０１７２】
ウエスタンブロット解析によりＢ６（ＳＪＬ）−Ａｐｏｅｔｍ１．１（ＡＰＯＥ＊４）ＡｄｉｕｊＴｒｅｍ２ｅｍ１Ａｄｉｕｊ／Ｊ（一般名Ｂ６Ｊ．ＡＰＯＥ４／Ｔｒｅｍ２）マウスにおけるヒトＡＰＯＥ４の発現を実証する
【０１７３】
脳抽出物（タンパク質約２５マイクログラム）を２×Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ１６１０７３７）で希釈し、４〜２０％の勾配で泳動し（ＢｉｏＲａｄミニプロティアンＴＧＸ４５６−１０９６）、ニトロセルロース膜（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  ＩＢ３０１００１）に移した。
【０１７４】
５％の脱脂粉乳でブロットをブロッキングし、１：１００に希釈したヒトＡＰＯＥ４特異的抗体（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ＮＢＰ１−４９５２９）により＋４℃で一晩プローブした。次いで、ブロットを１：３０，０００に希釈した２次抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅヤギ抗マウスＨＲＰ  ＡＰ１９１Ｐ）により室温で２時間プローブした。ＥＣＬ化学発光試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＲＰＮ２１０９）を使用してＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ２８９０６８３８）上でブロットを検出した。
【０１７５】
ヒトＡＰＯＥ４バリアントに特異的な抗体を（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ＮＢＰ１−４９５２９を１：１００希釈で）使用して、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６Ｊと略す）またはＢ６Ｊ．ＡＰＯＥ４／Ｔｒｅｍ２の脳組織由来のタンパク質約２５マイクログラムのウエスタンブロットをプローブした。図２は、Ｂ６Ｊ．ＡＰＯＥ４／Ｔｒｅｍ２（レーン４〜６）由来の脳組織および対照（ＷＴ（Ｂ６Ｊ）、レーン１〜３）脳組織のウエスタンブロットの画像である。図２に示すように、ヒトＡＰＯＥ４タンパク質発現は、Ｂ６Ｊ．ＡＰＯＥ４／Ｔｒｅｍ２マウス由来のタンパク質においてのみ検出された。
【０１７６】
血液化学検査はＢ６Ｊ．ＡＰＯＥ４／Ｔｒｅｍ２マウスにおける代謝の変化を示す
【０１７７】
ＡＰＯＥバリアントは、リポタンパク質およびコレステロール代謝を差次的に制御することが明らかとなっている。ＡＰＯＥ４バリアントによりアルツハイマー病のリスクが増加する機構は未知であるが、代謝の変化に対するこれらの作用が役割を果たすものと考えられている。１２カ月齢のＢ６Ｊ．ＡＰＯＥ４／Ｔｒｅｍ２（図３Ａ、３Ｂおよび３ＣにおいてＡＰＯＥ４／Ｔｒｅｍ２と略す）マウスおよび１２カ月齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ対照マウスから得られる血液試料を、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）および総コレステロールについて、標準的血液化学検査法に従って試験した。
【０１７８】
回収時に抽出した血液をＥＤＴＡでコーティングしたバイアルに氷上で保存し、さらに、５０００ＲＰＭで１５分間遠心分離した。血漿を採取し、アリコートに分けて−８０℃で長期保存した。血漿アリコートを次：総コレステロール（ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬ（ｍｇ／ｄＬ）、ＨＤＬ（ｍｇ／ｄＬ）についてプロファイリングした。高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールは、Ｗａｋｏ  ＬタイプＨＤＬ−Ｃキット（Ｗａｋｏ９９１００１０１）を使用して製造者の指示に従って試験した。ＬＤＬは、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＬＤＬコレステロールキット（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＯＳＲ６１９６）を使用して製造者の指示に従って試験した。総コレステロールは、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒコレステロールキット（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ  ＯＳＲ６１１６）を使用して試験した。
【０１７９】
結果を図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃにそれぞれ示す。これらのデータは、Ｂ６Ｊ．ＡＰＯＥ４／Ｔｒｅｍ２マウスが、総コレステロールの減少およびＬＤＬとＨＤＬの両方のレベルの減少を含む、コレステロール代謝のＡＰＯＥ４依存的変化を有することを示す。
【０１８０】
免疫組織化学的検査はＢ６Ｊ．ＡＰＯＥ４／Ｔｒｅｍ２マウスにおける脳血管外漏出および炎症を示す
【０１８１】
１２／１２時間の明／暗サイクルにより、すべてのマウスを繁殖および飼育した。ＩＡＣＵＣ承認手順に従って８カ月齢のマウスに致死量のケタミン／キシラジンを腹腔内に注入した。マウスに１×ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で灌流を行い、脳全体を摘出した。一方の半球を４％のパラホルムアルデヒド中に＋４℃で一晩固定した。固定の後、組織を１×ＰＢＳですすぎ、１０％のスクロース中に＋４℃で一晩インキュベートし、次いで、３０％のスクロース中に４℃で一晩インキュベートした。次いで、脳を最適切断温度（ＯＣＴ）化合物中に凍結し、切片作製まで−８０℃で保存した。凍結した脳を２５ミクロンの切片にし、スライドガラス上にマウントし、免疫蛍光染色に必要とされるまで−８０℃で保存した。
【０１８２】
スライドを乾燥させ、４％のＰＦＡ中で後固定した。その後、切片をｄｉＨ２Ｏ中に３７℃で３分間浸漬し、次いで、０．２ＮのＨＣｌ中０．５ｍｇ／ｍＬのペプシンに移して３７℃で１５分間インキュベートした。切片をｄｉＨ２Ｏ中で３分間さらに洗浄し、加湿したチャンバーに移して１×ＰＢＳ中で洗浄した。切片は、１×ＰＢＴ中のウサギ抗フィブリン（１：２００）およびヤギ抗ＣｏｌＩＶ（抗コラーゲンＩＶ）（１：４０）中に＋４℃で一晩インキュベートした。スライドを１×ＰＢＴ中で洗浄し、１：１０００の濃度の適切な２次抗体（ロバ抗ウサギＩｇＧ５９４、ロバ抗ヤギ４８８）中に室温で２時間インキュベートした。組織をＤＡＰＩで対比染色し、Ａｑｕａ−Ｐｏｌｙ  ｍｏｕｎｔ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ）を使用してマウントした。拡大率２０×のＺｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ上で染色を画像化した。
【０１８３】
Ｂ６Ｊ．ＡＰＯＥ４／Ｔｒｅｍ２マウスの脳の矢状切片をフィブリノゲン（フィブリン）について免疫染色して、脳血管外漏出を検出した。７〜８カ月齢のＢ６Ｊ．ＡＰＯＥ４／Ｔｒｅｍ２の組織の代表的な画像を、対照Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６Ｊと略す）マウス由来の脳の類似の矢状切片から取得した代表的な画像とともに図４に示す。矢印は、血管外部のフィブリン免疫染色により示されるように脳血管外漏出を示す。血管は、コラーゲンＩＶ（Ｃｏｌ  ＩＶ）の免疫染色により示される。
【０１８４】
血管損傷は、遅発型アルツハイマー病理の鍵となる態様であり得る。家族性アルツハイマー病のいくつかの既存のマウスモデルは、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）を実証しているが、Ｂ６Ｊ．ＡＰＯＥ４／Ｔｒｅｍ２マウスは、家族性アルツハイマー病変異を過剰発現せずに血管障害を示す最初のモデルである。
【０１８５】
転写解析はＢ６Ｊ．ＡＰＯＥ４／Ｔｒｅｍ２モデルにおける遺伝子発現のＡＤと関連する変化を実証する
【０１８６】
ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ遺伝子パネルを用いて遺伝子発現解析を実行した。このアッセイでは、７７０種の神経病理関連遺伝子の発現を測定する。およそ８カ月齢の雌マウスをＢ６Ｊ．ＡＰＯＥ４／Ｔｒｅｍ２系統およびＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６Ｊと略す）系統について、各系統の３つの生物学的複製を用いて試験した。
【０１８７】
全ＲＮＡを脳ホモジネートから抽出した。組織をＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｂｉｏｎ）中に溶解およびホモジナイズし、次いで、必要に応じてＤＮａｓｅ分解ステップを含む製造者のプロトコールに従って、ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ＲＮＡを単離した。試料の濃度および質をＮａｎｏｄｒｏｐ  ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏ  ＬａｂＣｈｉｐ  ａｓｓａｙ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して試験した。
【０１８８】
ＲＮＡをハイブリダイズし、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇプローブを用いて製造者の指示に従ってマルチプレックス解析を行った。ＲＮＡ含量の変動性を説明するために、標的遺伝子数をハウスキーピング遺伝子に対して正規化した。Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ｎＳｏｌｖｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用してデータを解析した。
【０１８９】
Ｂ６Ｊ．ＡＰＯＥ４／Ｔｒｅｍ２系統における各遺伝子の発現を対照Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統と比較し、有意な（ｐ＜０．０５）発現を有する遺伝子を、図５に示すように、直線回帰モデルにより同定した。図５は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊと比較した、Ｂ６Ｊ．ＡＰＯＥ４／Ｔｒｅｍ２における発現変動遺伝子の遺伝子発現ヒートマップである。発現値は、各遺伝子のＣ５７ＢＬ／６Ｊの平均と比較したＬｏｇ２倍の変化である。
【０１９０】
このパネルにおいて使用するプローブは、マウスＡｐｏｅは検出するが、ヒトＡＰＯＥは検出しない。このモデルマウスでは、ＡｐｏｅがヒトＡＰＯＥ４バリアントにより置換されているためにＡｐｏｅ発現が検出されず、これは、最も強力に下方制御された転写物として示される。
【０１９１】
発現変動遺伝子のリストには、脳機能および神経変性に関連する複数の遺伝子が含まれる。Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ＰｒｏｃｅｓｓおよびＰａｎｔｈｅｒ  Ｐａｔｈｗａｙアノテーションデータベースを検索して、これらの遺伝子により表されるプロセスおよび経路を同定した。関係するプロセスは、Ｂ６Ｊ．ＡＰＯＥ４／Ｔｒｅｍ２系統における発現変動遺伝子により表される経路およびプロセスを示す表Ｉの結果を含むが、これらに限定されない。注目すべきことに、これらの関連し合うプロセスおよび経路は、多くの神経変性との高度な関係を含む。
【表１】
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【０１９２】
本明細書において使用する科学的および技術的用語は、当業者により一般に理解される意味を有することを意図する。このような用語は、例示的に、J.  SambrookおよびD.W.  Russell、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、第３版、２００１年；F.M.  Ausubel編、Short  Protocols  in  Molecular  Biology,  Current  Protocols、第５版、２００２年；B.  Albertsら、Molecular  Biology  of  the  Cell、第４版、Garland、２００２年；D.L.  NelsonおよびM.M.  Cox、Lehninger  Principles  of  Biochemistry、第４版、W.H.  Freeman  &  Company、２００４年；Herdewijn,  P.（編）、Oligonucleotide  Synthesis:  Methods  and  Applications,  Methods  in  Molecular  Biology、Humana  Press、２００４年；A.  Nagy、M.  Gertsenstein、K.  Vintersten、R.  Behringer（編）２００２年、Manipulating  the  Mouse  Embryo:  A  Laboratory  Manual、第３版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、ＩＳＢＮ−１０：０８７９６９５９１９；ならびにK.  Turksen（編）Embryonic  stem  cells:  methods  and  protocols  in  Methods  in  Molecular  Biology、２００２年、１８５頁、Humana  Press；Current  Protocols  in  Stem  Cell  Biology、ＩＳＢＮ：９７８０４７０１５１８０８を含む種々の標準的参考文献の文脈において見出され、定義および使用されている。
【０１９３】
配列
ＡＰＯＥ４ｐのアミノ酸配列を、ＡＰＯＥ４ｐをコードする例示的核酸配列とともに示す。
【０１９４】
配列番号１：ＡＰＯＥ４ｐ（アミノ酸３１７個）
【化２】
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【０１９５】
配列番号２：アミノ酸シグナルペプチド１８個を含むヒトＡＰＯＥ４ｐをコードするヒトＡＰＯＥ４ゲノムＤＮＡ配列のエキソン２、３および４
【化３−１】
2020515248.tif 000006
【化３−２】
2020515248.tif 000007
【０１９６】
配列番号３：Ｔｒｅｍ２ｐ（アミノ酸２４９個、Ｒ４７Ｈ変異）
【化４】
2020515248.tif 000008
【０１９７】
配列番号４：Ｔｒｅｍ２ｐをコードする変異マウスゲノムＤＮＡ配列（１０５６ヌクレオチド）
【化５】
2020515248.tif 000009
【０１９８】
配列番号５：Ｔｒｅｍ２ｐ（アミノ酸２４９個、マウス野生型タンパク質、Ｒ４７Ｈ変異なし）
【化６】
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【０１９９】
配列番号６：Ｔｒｅｍ２マウス野生型タンパク質をコードするマウス野生型ゲノムＤＮＡ配列（１０５６ヌクレオチド）
【化７】
2020515248.tif 000011
【０２００】
配列番号７：Ｔｒｅｍ２  ＣＲＩＳＰＲガイド
ＧＡＡＧＣＡＣＴＧＧＧＧＧＡＧＡＣＧＣＡ
【０２０１】
配列番号８：ヌクレオチドＧ＞Ａ点変異（このオリゴ配列における８９番目のヌクレオチドにおける）を、アミノ酸配列をＲ４７Ｈで変化させるため、ならびに２つのサイレント変異（リシンＡＡＧ＞ＡＡＡ（このオリゴ配列における９３番目のヌクレオチドにおける）およびアラニンＧＣＣ＞ＧＣＡ（このオリゴ配列における９６番目のヌクレオチドにおける））を、相同性による修復におけるドナー配列の再切断を防ぐために遺伝子内に含むＴｒｅｍ２修復オリゴ（１８３ヌクレオチド）
【化８−１】
2020515248.tif 000012
【化８−２】
2020515248.tif 000013
【０２０２】
配列番号９：マウスゲノム内に挿入される「ヒト化」マウスＡｐｏＥ構築物に含まれる５’ホモロジーアーム（４９８０ヌクレオチド：マウスＡｐｏｅ４エキソン１およびマウスＡｐｏｅ４イントロン２配列の７５７ヌクレオチド）。
【化９−１】
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【化９−２】
2020515248.tif 000015
【化９−３】
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【０２０３】
配列番号１０：ヒトＡＰＯＥ４遺伝子のエキソン２、３および４、ならびにヒトＡＰＯＥ４遺伝子の１５００ヌクレオチド３’ＵＴＲをエキソン４の後に含む、マウスゲノム内に挿入される「ヒト化」マウスＡｐｏＥ構築物に含まれるＤＮＡ配列（４２９２ヌクレオチド）。
【化１０−１】
2020515248.tif 000017
【化１０−２】
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【０２０４】
配列番号１１：「ヒト化」マウスＡｐｏＥ構築物の９２７２および９２７３ヌクレオチドの間に挿入して、リコンビナーゼによるこのカセットの除去前に選択を可能とする、Ｆｒｔ  ＰＧＫｎｅｏ  Ｆｒｔカセットと後続のＮｄｅ１制限酵素部位（ＣＡＴＡＴＧ）（１８３４ヌクレオチド）。
【化１１−１】
2020515248.tif 000019
【化１１−２】
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【０２０５】
配列番号１２：マウスゲノム内に挿入される「ヒト化」マウスＡｐｏＥ構築物に含まれる３’ホモロジーアーム（５１６６ヌクレオチド）。
【化１２−１】
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【化１２−２】
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【化１２−３】
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【０２０６】
配列番号１３：野生型アミノ酸配列−マウスＡｐｏｅ
【化１３】
2020515248.tif 000024
【０２０７】
配列番号１４：アミノ酸配列−ヒトＡＰＯＥ３
【化１４−１】
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【化１４−２】
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【０２０８】
配列番号１５：ＡＰＯＥ４ｐ（アミノ酸２９９個）
【化１５】
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【０２０９】
本明細書において言及するいかなる特許または刊行物も、各刊行物それぞれが参照により組み込まれるものと詳細かつ個別に示されるのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込む。
【０２１０】
本明細書に記載の遺伝子改変マウスおよび使用方法は、現在のところ、例示的な好ましい実施形態の代表的なものであり、本発明の範囲を限定することを意図しない。その範囲内の変化や他の使用は、当業者であれば思いつくものと予想される。このような変化および他の使用は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を逸脱することなくなされ得る。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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