(57)【要約】  異なる条件下で培養されたアリコート中の生細胞と死細胞の相対レベルの変化を決定することによって3次元マイクロ流体デバイス中の腫瘍細胞スフェロイドを評価するための方法が本明細書で提供される。本明細書に記載される方法は、腫瘍組織の処置における試験化合物のin vivoでの有効性を予測することができるように、腫瘍微小環境のex vivoでの再現を可能にする。
2020515260.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
3次元マイクロ流体デバイス中の腫瘍細胞スフェロイドを評価するための方法であって、
酵素処理された腫瘍試料から腫瘍スフェロイドを取得する工程、
腫瘍スフェロイドの第1のアリコートを生体適合性ゲル中に懸濁する工程;
腫瘍スフェロイドの第2のアリコートを生体適合性ゲル中に懸濁する工程;
生体適合性ゲル中の腫瘍スフェロイドの第1のアリコートを第1の3次元デバイスに入れる工程、
第1のアリコートと、死細胞に選択的な第1のフルオロフォア色素であって、死細胞に結合した場合に第1の波長で蛍光を放出する、第1のフルオロフォア色素とを接触させる工程、
第1のアリコートと、生細胞に選択的な第2のフルオロフォア色素であって、生細胞に結合した場合に第1の波長とは異なる第2の波長で蛍光を放出する第2のフルオロフォア色素とを接触させる工程、
第1のアリコート中の第1及び第2のフルオロフォア色素のそれぞれによって放出された総蛍光を測定する工程、
第2のアリコートを第2の3次元デバイス中で培養する工程、
第2のアリコートと、第1のフルオロフォア色素とを接触させる工程、
第2のアリコートと、第2のフルオロフォア色素とを接触させる工程(第2のアリコートと、第1のフルオロフォア色素及び第2のフルオロフォア色素との接触が、第1のアリコートと、第1のフルオロフォア色素及び第2のフルオロフォア色素との接触の少なくとも24時間後に実行される)、
第2のアリコート中の第1及び第2のフルオロフォア色素のそれぞれによって放出された総蛍光を測定する工程、
を含み、それぞれのアリコート中の生細胞の死細胞に対する比の増加又は減少を評価することができる方法。
【請求項２】
第1及び第2のフルオロフォア色素のそれぞれによって放出される総蛍光が、好ましくは、それぞれの3次元デバイスの直上又は直下から、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍以上の解像度でカメラを使用して測定され、及び好ましくは、3次元デバイスが、移動可能なステージ上に置かれ、それぞれのアリコート中の総蛍光をカメラに捕捉することが可能になる、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
第2のアリコートを、第2のアリコートの培養中に少なくとも1つの試験化合物と接触させ、試験化合物の存在下での第2のアリコートの前記培養が少なくとも24時間、少なくとも2日間、少なくとも3日間、少なくとも4日間、少なくとも5日間、又は少なくとも6日間にわたって行われる、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
第2のアリコートを、第2のアリコートの培養中に少なくとも2つの試験化合物と接触させ、試験化合物の存在下での第2のアリコートの前記培養が少なくとも24時間、少なくとも2日間、少なくとも3日間、少なくとも4日間、少なくとも5日間、又は少なくとも6日間にわたって行われ、好ましくは、少なくとも1つの試験化合物が免疫チェックポイント阻害剤である、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項５】
第1及び第2のアリコートがそれぞれ、約15〜30個のスフェロイド、好ましくは、約20〜25個のスフェロイドを含有する、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
第1の3次元デバイスが第1の3次元マイクロ流体デバイスであり、第2の3次元デバイスが第2の3次元マイクロ流体デバイスであり、場合により、前記方法が、第1の3次元マイクロ流体デバイス中で第1のアリコートを培養することを含み、前記培養が、第1のアリコートと、第1及び第2のフルオロフォア色素とを接触させる前の6時間未満、3時間未満、2時間未満及び更には1時間未満にわたるものである、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
第1の3次元マイクロ流体デバイス中の第1のアリコートを、第1のアリコートと、第1及び第2のフルオロフォア色素とを接触させる前に培養しない、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
酵素がコラゲナーゼである、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
第1のフルオロフォア色素が、ヨウ化プロピジウム、DRAQ7、7-AAD、eBioscience Fixable Viability Dye eFluor(登録商標) 455UV、eBioscience Fixable Viability Dye eFluor(登録商標) 450、eBioscience Fixable Viability Dye eFluor(登録商標) 506、eBioscience Fixable Viability Dye eFluor(登録商標) 520、eBioscience Fixable Viability Dye eFluor(登録商標) 660、eBioscience Fixable Viability Dye eFluor(登録商標) 780、BioLegend Zombie Aqua(商標)、BioLegend Zombie NIR(商標)、BioLegend Zombie Red(商標)、BioLegend Zombie Violet(商標)、BioLegend Zombie UV(商標)、若しくはBioLegend Zombie Yellow(商標)であり、及び/又は第2のフルオロフォア色素が、アクリジンオレンジ、核グリーンLCS1 (ab138904)、DRAQ5 (ab108410)、CyTRAK Orange、NUCLEAR-ID Red DNAステイン(ENZ-52406)、SiR700-DNA、カルセインAM、カルセインバイオレットAM、カルセインブルーAM、Vybrant(登録商標) DyeCycle(商標) Violet、Vybrant(登録商標) DyeCycle(商標) Green、Vybrant(登録商標) DyeCycle(商標) Orange、若しくはVybrant(登録商標) DyeCycle(商標) Rubyである、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
腫瘍スフェロイドが、
血清を添加した培地中で原発腫瘍試料を細断する工程;
細断された原発腫瘍試料を酵素で処理する工程;及び
酵素処理された試料から腫瘍スフェロイドを収集する工程
によって取得され、好ましくは、細断された原発腫瘍試料が、細断された原発腫瘍試料の部分的消化を得るのに十分な量で、又は時間にわたって酵素で処理され、好ましくは、処理が、25℃〜39℃の温度で、10分〜60分間、より好ましくは、15分〜45分にわたる、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
生体適合性ゲルがコラーゲン、BD Matrigel(商標)Matrix Basement Membrane、又はフィブリンヒドロゲルである、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
腫瘍試料が、膀胱MBT-2、乳腺4T1、EMT6、結腸、Colon26、CT-26、MC38、線維肉腫WEHI-164、腎臓Renca、白血病C1498、L1210、肝臓H22、KLN205、LL/2、LewisLung、リンパ腫A20 S、E.G7-OVA、EL4、肥満細胞腫P815、メラノーマB16-BL6、B16-F10、S91、骨髄腫MPC-11、神経芽腫Neuro-2a、卵巣: ID8、膵臓Pan02、形質細胞腫J558、又は前立腺RM-1マウスモデルのマウス組織に由来する、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
腫瘍試料が患者由来異種移植片(PDX)である、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
3次元デバイスが、1つ又は複数のゲルケージ領域が隣接した1つ又は複数の流体チャネルを含み、1つ又は複数のゲルケージ領域が、腫瘍スフェロイドが包埋された生体適合性ゲルを含み、デバイスがin vivoでの腫瘍微小環境を再現する、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
3次元デバイスが、光学的に透過性の材料を含む基材を含み、
i)1つ又は複数の流体チャネル;
ii)1つ又は複数の流体チャネル入口;
iii)1つ又は複数の流体チャネル出口;
iv)1つ又は複数のゲルケージ領域;及び
v)複数のポスト
を更に含み;
それぞれのゲルケージ領域の全部又は一部に、1つ又は複数の流体チャネルの全部又は一部が隣接することによって、1つ又は複数のゲルケージ領域-流体チャネル境界面領域を作出し;それぞれのゲルケージ領域が、ゲルケージ領域を形成する少なくとも1行のポストを含み;1つ又は複数のゲルケージ領域が、500μm未満の高さを有する、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
第1の試験化合物が、低分子、核酸分子、RNAi化合物、アプタマー、タンパク質若しくはペプチド、抗体若しくは抗原結合性抗体断片、リガンド若しくは受容体結合タンパク質、遺伝子療法ベクター、又はその組合せである、請求項3から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
第1の試験化合物が、化学療法化合物、免疫調節化合物、又は放射線である、請求項3から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
第1の試験化合物が、アルキル化化合物、代謝拮抗物質、アントラサイクリン、プロテアソーム阻害剤、又はmTOR阻害剤である、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
第1の試験化合物が、免疫調節剤である、請求項3から15のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2017年3月31日に出願された米国仮特許出願第62/480,192号の利益を請求し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦支援研究
本発明は、米国立衛生研究所(National Institutes of Health)により授与されたK08 CA138918-01A1及びR01CA 190394-01の下で、政府の支援と共に為された。政府は、本発明においてある特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
循環腫瘍細胞(CTC)、オルガノイド培養、及び患者由来異種移植片(PDX)を含む、現行の患者由来がんモデルは、高精度がん療法を指導することができるが、生成するのに数週間から数カ月かかり、天然の腫瘍免疫微小環境を欠く。患者における抗腫瘍免疫応答を研究するための現在の手法もまた、全血若しくは血漿中における測定が遠隔で行われ、又は生検の評価が静的であることによって制限される。
【０００４】
最近、マウス及び患者由来器官型腫瘍スフェロイドの短期培養のための3Dマイクロ流体デバイスが開発された。培養腫瘍スフェロイドは、天然の免疫微小環境と、ある程度乃至より密接に、似ていると考えられる。
【０００５】
腫瘍微小環境中の腫瘍細胞に対する単一の薬物及び薬物の組合せの効果を評価することができることが望ましい。ex vivoで免疫遮断剤と抗がん化合物との組合せの効果を同時に評価するための方法が存在していたなら、それは特に有用である。現在まで、腫瘍細胞を評価するための努力は、(i)身体から取り出された場合の腫瘍細胞の変化、(ii)腫瘍細胞が身体から取り出された場合に腫瘍微小環境と連絡を取るインタクトな免疫系の不在、(iii)腫瘍除去及び培養の効果と、in vitroで適用される薬物の効果とを区別することができないこと、並びに(iv)免疫に基づくマーカー及び薬物がin vitroで行われた実験に基づいてin vivoで作用するかどうかを予測することができる他のマーカーを分子レベルで測定する複雑性が障害となってきた。現在まで、天然の腫瘍微小環境中でのヒトがん細胞に対する薬物の効果を高効率様式で評価するための単純なアッセイは存在しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO2016/112172
【特許文献２】US2013/0143230
【特許文献３】EP2741083
【特許文献４】US2014/0057311
【特許文献５】US8748180
【特許文献６】US20150344473
【特許文献７】米国特許出願公開第20130280265号
【特許文献８】米国特許出願公開第20130237580号
【特許文献９】米国特許出願公開第20130230514号
【特許文献１０】米国特許出願公開第20130109843号
【特許文献１１】米国特許出願公開第20130108651号
【特許文献１２】米国特許出願公開第20130017199号
【特許文献１３】米国特許出願公開第20120251537号
【特許文献１４】米国特許出願公開第2011/0271358号
【特許文献１５】EP2170959B1
【特許文献１６】US8168179
【特許文献１７】US20150320859
【特許文献１８】US20130309250
【特許文献１９】PCT公開第WO 2001/014424号
【特許文献２０】PCT公開第WO 2004/035607号
【特許文献２１】米国特許出願公開第2005/0201994号
【特許文献２２】欧州特許第EP 1212422 B1号
【特許文献２３】米国特許第5,811,097号
【特許文献２４】米国特許第5,855,887号
【特許文献２５】米国特許第6,051,227号
【特許文献２６】米国特許第6,984,720号
【特許文献２７】米国特許第7,034,121号
【特許文献２８】米国特許第8,475,790号
【特許文献２９】米国特許出願公開第2002/0039581号
【特許文献３０】米国特許出願公開第2002/086014号
【特許文献３１】US8318916
【特許文献３２】WO2011120013
【特許文献３３】US20140105912
【特許文献３４】US20140220012
【特許文献３５】US20130177557
【特許文献３６】WO2015097536
【特許文献３７】EP2552947
【特許文献３８】WO2011120013
【特許文献３９】US20140056892
【特許文献４０】US8236304
【特許文献４１】WO2014039983
【特許文献４２】WO2015191881
【特許文献４３】US20140341920
【特許文献４４】CN105246507
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Morton CL、Houghton PJ (2007)、「Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice」、Nature Protocols 2 (2): 247〜50頁
【非特許文献２】Siolas D、Hannon GJ (September 2013)、「Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models」、Cancer Research 73 (17): 5315〜9頁
【非特許文献３】Arefら、Integr Biol (Camb). 2013 Feb;5(2):381〜9頁
【非特許文献４】Yu, T.ら、「TBK1 inhibitors: a review of patent literature (2011-2014)」、Exp. Opin. On Ther. Patents 25(12)
【非特許文献５】Hasan, M.ら、J. Immunol. 195(10):4573〜77頁
【非特許文献６】T. Shinohara 5ら、Genomics 23 (3): 704〜6頁(1995)
【非特許文献７】Y. Ishidaら、EMBO J. 11 (11): 3887〜95頁(1992)
【非特許文献８】M. A. Curranら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107、4275頁(2010)
【非特許文献９】S. L. Topalianら、New Engl. J. Med. 366, 2443頁(2012)
【非特許文献１０】J. R. Brahmerら、New Engl. J. Med. 366、2455頁(2012)
【非特許文献１１】D.E. Dolanら、Cancer Control 21、3頁(2014)
【非特許文献１２】Stewartら、2015、3(9):1052〜62頁
【非特許文献１３】Herbstら、2014、Nature 515:563〜567頁
【非特許文献１４】Brahmerら、N Engl J Med 2012; 366:2455〜2465頁
【非特許文献１５】Hurwitzら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(17):10067〜10071頁(1998)
【非特許文献１６】Camachoら、J. Clin. Oncology, 22(145): Abstract No. 2505 (2004)
【非特許文献１７】Mokyrら、Cancer Res., 58:5301〜5304頁(1998)
【非特許文献１８】Lipson及びDrake、Clin Cancer Res; 17(22) 2011年11月15日
【非特許文献１９】Wangら、2011、JEM. 208(3):577〜92頁
【非特許文献２０】Linesら、2014、Cancer Res. 74(7):1924〜32頁
【非特許文献２１】Kondoら、2015、J. of Immuno.V194.
【非特許文献２２】Liuら、2015. PNAS. 112(21):6682〜6687頁
【非特許文献２３】Aref, A. R.ら、Integr. Biol. (Camb.) (2013)
【非特許文献２４】Zhu, Z.ら、Cancer Discov. (2014)
【非特許文献２５】Hugo, W.ら、Cell (2016)
【非特許文献２６】Chen, P. L.ら、Cancer Discov. (2016)
【非特許文献２７】Van Allen, E. M.ら、Science (2015)
【非特許文献２８】Cancer Genome Atlas、N. Cell (2015)
【非特許文献２９】Kim, D.ら、Genome Biol. (2013)
【非特許文献３０】Love, M.I.ら、Genome Biol. (2014)
【非特許文献３１】Bindea, G.ら、Immunity (2013)
【非特許文献３２】US_SOPvP_EF0314「General Procedures for Efficacy Studies」
【非特許文献３３】Deng, R.ら、MAbs (2016)
【非特許文献３４】Zhang, J.ら、Cell Rep. (2016)
【非特許文献３５】Newman AMら、「Robust enumeration of cell subsets from tissue expression profiles」、Nat Methods. 2015年5月;12(5):453〜7頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
驚くべきことに、培養腫瘍スフェロイドの腫瘍微小環境が、in vivoで投与された場合の薬物の活性を予測するのに十分な免疫成分を含有することが発見された。驚くべきことに、培養腫瘍スフェロイドの腫瘍微小環境が、免疫遮断化合物と抗がん薬との組合せを評価することができ、その結果がin vivoでの薬物の投与を予測するような十分な免疫成分を含有することが発見された。驚くべきことに、培養腫瘍スフェロイドの腫瘍微小環境を光学的かつ再現可能に評価して、腫瘍細胞を培養する操作の結果得られる腫瘍細胞に対する効果を区別しながら、スフェロイド内の腫瘍細胞に対する薬物の効果を確立することができることが発見された。驚くべきことに、腫瘍スフェロイドを評価するためのそのような技術を、in vivoで起こることを模倣する環境中の生細胞及び死細胞の相対量を決定するための高効率方法において使用することができることが発見された。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一態様では、本発明は、3次元マイクロ流体システム中で培養されたマウス及び患者由来器官型腫瘍スフェロイド(MDOTS/PDOTS)を使用して、免疫チェックポイント遮断剤(ICB)に対するex vivoでの応答を評価するための新規手法を含む。新鮮なマウス及びヒト腫瘍試料から単離されたスフェロイドは、抗原を経験した腫瘍浸潤性CD4及びCD8 Tリンパ球を含む、自己リンパ系細胞及び骨髄性細胞集団を保持し、短期間のex vivoでの培養においてICBに応答する。抗PD-1感受性MC38同系マウスがんモデルに由来するMDOTSを使用して腫瘍殺傷をex vivoで再現され、一方、抗PD-1療法に対する相対的耐性は、CT26及びB16F10同系モデルにおいて保存された。メラノーマ及び他の腫瘍を有する患者に由来するPDOTSにおけるPD-1遮断後の体系的サイトカイン/ケモカインプロファイリングは、免疫誘引物質CCL19及びCXCL13の有意な誘導を同定し、これはin vivoで確認され、腫瘍内免疫細胞浸潤の証拠と相関していた。MDOTS及びPDOTSにおける抗PD-1処置に対する耐性も、免疫抑制性ケモカインの同時誘導と共に追跡した。ex vivoでのプロファイリングは、この設定におけるPD-1遮断剤に対する感受性を増強するための新規治療戦略としての組合せ療法を示し、in vivoでの腫瘍応答を効率的に予測した。これらの知見は、PD-1遮断剤のex vivoでのプロファイリングの実現可能性を証明し、高精度イムノオンコロジーを容易にし、新規組合せ治療剤を開発するための新規な機能的手法を提供する。
【００１０】
本発明の一態様によれば、3次元マイクロ流体デバイス中の腫瘍細胞スフェロイドを評価するための方法が提供される。方法は、
酵素処理された腫瘍試料から腫瘍スフェロイドを取得し、腫瘍スフェロイドの第1のアリコートを生体適合性ゲル中に懸濁する工程;腫瘍スフェロイドの第2のアリコートを生体適合性ゲル中に懸濁する工程;
生体適合性ゲル中の腫瘍スフェロイドの第1のアリコートを第1の3次元デバイスに入れる工程、
第1のアリコートと、死細胞に選択的な第1のフルオロフォア色素であって、死細胞に結合した場合に第1の波長で蛍光を放出する、第1のフルオロフォア色素とを接触させる工程、
第1のアリコートと、生細胞に選択的な第2のフルオロフォア色素であって、生細胞に結合した場合に第1の波長とは異なる第2の波長で蛍光を放出する第2のフルオロフォア色素とを接触させる工程、
第1のアリコート中の第1及び第2のフルオロフォア色素のそれぞれによって放出された総蛍光を測定する工程、
第2のアリコートを第2の3次元デバイス中で培養する工程、
第2のアリコートと、第1のフルオロフォア色素とを接触させる工程、
第2のアリコートと、第2のフルオロフォア色素とを接触させる工程(第2のアリコートと、第1のフルオロフォア色素及び第2のフルオロフォア色素との接触が、第1のアリコートと、第1のフルオロフォア色素及び第2のフルオロフォア色素との接触の少なくとも24時間後に実行される)、
第2のアリコート中の第1及び第2のフルオロフォア色素のそれぞれによって放出された総蛍光を測定する工程、
を含み、それぞれのアリコート中の生細胞の死細胞に対する比の増加又は減少を評価することができる。
【００１１】
一実施形態では、第1及び第2のフルオロフォア色素のそれぞれによって放出される総蛍光は、好ましくは、それぞれの3次元デバイスの直上又は直下から、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍以上の解像度でカメラを使用して測定され、及び好ましくは、3次元デバイスが、移動可能なステージ上に置かれ、それぞれのアリコート中の総蛍光をカメラに捕捉することが可能になる。
【００１２】
一部の実施形態では、死細胞の蛍光及び生細胞の蛍光を一緒に加えて、生細胞と死細胞の合計を得ることができる。死細胞の量を、総蛍光に対する死細胞の蛍光のパーセンテージとして表すことができる。生細胞の量を、総蛍光に対する生細胞の蛍光のパーセンテージとして表すことができる。一部の実施形態では、死細胞の蛍光及び生細胞の蛍光を、比、すなわち、死細胞/生細胞又は生細胞/死細胞として表すことができる。この様式で、生細胞に対する死細胞の数の変化を経時的に追跡することができ、ここで、初期比は培養前に確立され、比に対する変化は経時的に決定される。
【００１３】
一部の実施形態では、腫瘍スフェロイドの複数のアリコート、例えば、3若しくは4、又は5、又は6若しくは6より多いアリコートが存在し、第3、第4、第5、第6又は第6より大きいそのようなアリコートと、第1のフルオロフォア色素及び第2のフルオロフォア色素との接触は、第1のアリコートと、第1のフルオロフォア色素及び第2のフルオロフォア色素との接触の、例えば、2日後、3日後、4日後、5日後、及び5日よりも後に実行される。アリコートを試験するタイミングを、1日、1日未満、2日又は3日以上等の任意の期間で分離してもよい。一実施形態では、アリコートは、スフェロイドをゲル中に入れた6日後に試験される。
【００１４】
実施形態のいずれかにおいて、第2(又は任意のその後の)アリコートを、第2のアリコートの培養中に少なくとも1つの試験化合物と接触させ、ここで、試験化合物の存在下での第2のアリコートの前記培養は、少なくとも24時間、少なくとも2日間、少なくとも3日間、少なくとも4日間、少なくとも5日間、又は少なくとも6日間以上にわたって行われる。
【００１５】
前記実施形態のいずれかにおいて、第2のアリコートを、第2のアリコートの培養中に少なくとも2つの試験化合物と接触させることができ、ここで、試験化合物の存在下での第2のアリコートの前記培養は、少なくとも24時間、少なくとも2日間、少なくとも3日間、少なくとも4日間、少なくとも5日間、又は少なくとも6日間にわたって行われ、好ましくは、少なくとも1つの試験化合物は、免疫チェックポイント阻害剤である。
【００１６】
スフェロイドの数は、研究者にとって好都合であり、利用可能な任意数のスフェロイドであってよいが、以下に記載されるシステムでは、第1及び第2のアリコート中のスフェロイド数はそれぞれ、約15〜30個のスフェロイド、好ましくは、約20〜25個のスフェロイドを含有する。
【００１７】
一部の実施形態では、第1の3次元デバイスは、第1の3次元マイクロ流体デバイスであってよく、第2の3次元デバイスは、第2の3次元マイクロ流体デバイスであってよい。一部の実施形態では、第1の3次元マイクロ流体デバイス中での第1のアリコートの培養は、第1のアリコートと、第1及び第2のフルオロフォア色素とを接触させる前に6時間未満、3時間未満、2時間未満、更には1時間未満にわたるものである。特に、本質的にはスフェロイドを3次元デバイスに導入する際に全てのスフェロイドを培養する前に第1のアリコートと色素とを接触させることが望ましいことがある。
【００１８】
前記実施形態のいずれかにおいて、酵素はコラゲナーゼであってもよい。
【００１９】
前記実施形態のいずれかにおいて、第1のフルオロフォア色素は、ヨウ化プロピジウム、DRAQ7、7-AAD、eBioscience Fixable Viability Dye eFluor(登録商標) 455UV、eBioscience Fixable Viability Dye eFluor(登録商標) 450、eBioscience Fixable Viability Dye eFluor(登録商標) 506、eBioscience Fixable Viability Dye eFluor(登録商標) 520、eBioscience Fixable Viability Dye eFluor(登録商標) 660、eBioscience Fixable Viability Dye eFluor(登録商標) 780、BioLegend Zombie Aqua(商標)、BioLegend Zombie NIR(商標)、BioLegend Zombie Red(商標)、BioLegend Zombie Violet(商標)、BioLegend Zombie UV(商標)、若しくはBioLegend Zombie Yellow(商標)であってもよく、及び/又は第2のフルオロフォア色素は、アクリジンオレンジ、核グリーンLCS1 (ab138904)、DRAQ5 (ab108410)、CyTRAK Orange、NUCLEAR-ID Red DNAステイン(ENZ-52406)、SiR700-DNA、カルセインAM、カルセインバイオレットAM、カルセインブルーAM、Vybrant(登録商標) DyeCycle(商標) Violet、Vybrant(登録商標) DyeCycle(商標) Green、Vybrant(登録商標) DyeCycle(商標) Orange、若しくはVybrant(登録商標) DyeCycle(商標) Rubyであってもよい。
【００２０】
前記実施形態のいずれかにおいて、腫瘍スフェロイドを、血清を添加した培地中の原発腫瘍試料を細断する工程;細断された原発腫瘍試料を酵素で処理する工程;及び酵素処理された試料から腫瘍スフェロイドを収集する工程によって取得することができる。一部の実施形態では、細断された原発腫瘍試料は、細断された原発腫瘍試料の部分的消化を得るのに十分な量で、及び/又は時間にわたって酵素で処理され、好ましくは、処理は、25℃〜39℃の温度で、10分〜60分間、より好ましくは、15分〜45分にわたる。
【００２１】
上記実施形態のいずれかにおいて、生体適合性ゲルは、コラーゲン、BD Matrigel(商標)Matrix Basement Membrane、又はフィブリンヒドロゲルであってもよい。
【００２２】
上記実施形態のいずれかにおいて、腫瘍試料は、マウスモデルに由来するものであってもよい。一部の実施形態では、マウスモデルは、膀胱MBT-2、乳腺4T1、EMT6、結腸、Colon26、CT-26、MC38、線維肉腫WEHI-164、腎臓Renca、白血病C1498、L1210、肝臓H22、KLN205、LL/2、LewisLung、リンパ腫A20 S、E.G7-OVA、EL4、肥満細胞腫P815、メラノーマB16-BL6、B16-F10、S91、骨髄腫MPC-11、神経芽腫Neuro-2a、卵巣: ID8、膵臓Pan02、形質細胞腫J558、及び前立腺RM-1からなる群から選択される同系モデルである。
【００２３】
上記実施形態のいずれかにおいて、腫瘍試料は、ヒト腫瘍試料であってもよい。
【００２４】
上記実施形態のいずれかにおいて、腫瘍試料は、患者由来異種移植片(PDX)であってもよい。
【００２５】
上記実施形態のいずれかにおいて、3次元デバイスは、1つ又は複数のゲルケージ領域が隣接した1つ又は複数の流体チャネルを含んでもよく、ここで、1つ又は複数のゲルケージ領域が、腫瘍スフェロイドが包埋された生体適合性ゲルを含み、デバイスがin vivoでの腫瘍微小環境を再現する。前記実施形態のいずれかにおいて、3次元デバイスは、光学的に透過性の材料を含む基材を含んでもよく、i)1つ又は複数の流体チャネル; ii)1つ又は複数の流体チャネル入口; iii)1つ又は複数の流体チャネル出口; iv)1つ又は複数のゲルケージ領域;及びv)複数のポストを更に含み;それぞれのゲルケージ領域の全部又は一部に、1つ又は複数の流体チャネルの全部又は一部が隣接することによって、1つ又は複数のゲルケージ領域-流体チャネル境界面領域を作出し;それぞれのゲルケージ領域は、ゲルケージ領域を形成する少なくとも1行のポストを含み;1つ又は複数のゲルケージ領域は、500μm未満の高さを有する。
【００２６】
前記実施形態のいずれかにおいて、試験化合物は、低分子、核酸分子、RNAi化合物、アプタマー、タンパク質若しくはペプチド、抗体若しくは抗原結合性抗体断片、リガンド若しくは受容体結合タンパク質、遺伝子療法ベクター、又はその組合せであってもよい。前記実施形態のいずれかにおいて、第1の試験化合物は、化学療法化合物、免疫調節化合物、又は放射線であってもよい。前記実施形態のいずれかにおいて、第1の試験化合物は、アルキル化化合物、代謝拮抗物質、アントラサイクリン、プロテアソーム阻害剤、又はmTOR阻害剤であってもよい。前記実施形態のいずれかにおいて、第1の試験化合物は、免疫調節剤であってもよい。
【００２７】
当業者であれば、本明細書に記載される図面が、例示目的に過ぎないことを理解するであろう。一部の例では、本発明の理解を容易にするために、本発明の様々な態様を誇張又は拡大して示してもよいことが理解されるべきである。図面において、同類の参照文字は、一般に、様々な図面を通して、同類の特徴、機能的に類似する、及び/又は構造的に類似する要素を指す。図面は、拡大縮小する必要はなく、その代わりに強調が教示の原理を例示する際に置かれる。図面は、いかなる意味でも本教示の範囲を限定することを意図するものではない。
【００２８】
本発明の特徴及び利点は、図面と併用された場合、以下に記載される詳細な説明からより明らかとなるであろう。
【００２９】
図面を参照して実施形態を記載する場合、方向の参照(「上」、「下」、「最高」、「最低」、「左」、「右」、「水平」、「垂直」等)を使用することができる。そのような参照は、読者が通常の配向で図面を見るための単なる補助として意図されるものである。これらの方向の参照は、具現化されるデバイスの好ましい、又は唯一の配向を記載することを意図するものではない。デバイスは、他の配向で具現化することができる。
【００３０】
詳細な説明から明らかであるように、図面に記載され、本出願を通して例示のために更に記載される実施例は、非限定的な実施形態を記載し、一部の場合、ある特定のプロセスを単純化するか、又はより明確な例示のために特徴若しくは工程を省略することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１Ａ】マウス又は患者由来腫瘍標本に由来するMDOTS/PDOTS(S2画分)の調製及び分析のための図である。
【図１Ｂ】バルク腫瘍(n=5)と、S1、S2、S3(n=6)スフェロイド画分とを比較するフローサイトメトリーによるMC38同種移植片の免疫プロファイリングを示す図である(Dunnの多重比較検定を用いるKruskal-Wallis検定、α=0.05; ns=有意でない)。
【図１Ｃ】腫瘍型によってグループ化され、%CD8+T細胞によって順位付けられた、示された患者/腫瘍特徴を有するPDOTS(S2; n=40)(上パネル=生細胞%、下パネル=%CD45+細胞)の免疫プロファイリングを示す図である。
【図１Ｄ】S2/S3画分(CD45、n=14; CD3、n=15; CD4/CD8、n=13; CD4+CD45RO+、n=9; CD8+CD45RO+、n=8;活性化=CD38+及び/又はCD69+、n=6)の免疫細胞相関を示す図である。R2、全ての比較について有意。
【図１Ｅ】S2/S3画分(n=6)中のCD4及びCD8 T細胞集団上でのPD-1、CTLA-4、TIM-3の発現を示す図である。R2、全ての比較について有意。
【図２Ａ】3Dマイクロ流体培養におけるMC38 MDOTSの位相差画像(4x)を示す図である。
【図２Ｂ】1日目と比較したlog-2倍数変化として表される培養されたMC38 MDOTSに由来するサイトカインヒートマップである。
【図２Ｃ】1日目と比較したlog-2倍数変化として表される培養されたB16F10 MDOTSに由来するサイトカインヒートマップである。
【図２Ｄ】アイソタイプ対照IgG(n=10)又はラット抗マウス抗PD-1抗体(n=10)処理後のMC38同種移植片の腫瘍体積を示す図である。
【図２Ｅ】22日目のMC38腫瘍体積(対応のない両側t検定、p<0.05)を示す図である。
【図２Ｆ】MDOTS生/死細胞イメージングのワークフローの図である。
【図２Ｇ】IgG対照又は示された抗PD-1抗体用量後、0日目(ローディングの直後)、3日目、及び6日目のMC38 MDOTSの生(AO=緑色)/死(PI=赤色)の定量化を示す図である; n=4、生物学的反復、**p<0.01、****p<0.0001、多重比較検定を用いるKruskal-Wallis Dunnett's検定。
【図２Ｈ】免疫細胞を欠くMC38スフェロイド±抗PD-1(n=4、生物学的反復)の生/死細胞分析を示す図である。
【図２Ｉ】CT26 MDOTS±抗PD1(n=3、生物学的反復、****p<0.0001)の生/死細胞分析を示す図である。
【図２Ｊ】B16F10 MDOTS±抗PD1(n=3、生物学的反復)の生/死細胞分析を示す図である。
【図２Ｋ】6日目のMC38及びB16F10 MDOTS±抗PD1の解析蛍光顕微鏡観察を示す図である(代表的な画像を示す)。
【図３Ａ】未処理対照と比較したlog2倍数変化(L2FC)として表される、3日目±抗PD-1(n=28)を示すサイトカインヒートマップである。
【図３Ｂ】未処理対照と比較したlog2倍数変化(L2FC)として表される、3日目±抗CTLA-4(n=24)を示すサイトカインヒートマップである。
【図３Ｃ】未処理対照と比較したlog2倍数変化(L2FC)として表される、3日目±抗PD-1 +抗CTLA-4(n=24)を示すサイトカインヒートマップである。
【図３Ｄ】単一チェックポイント遮断後の絶対CCL19/CXCL13レベルを示す図である(対応のある両側t検定、α=0.05)。
【図３Ｅ】単一チェックポイント遮断後の絶対CCL19/CXCL13レベルを示す図である(対応のある両側t検定、α=0.05)。
【図３Ｆ】二重チェックポイント遮断後の絶対CCL19/CXCL13レベルを示す図である(対応のある両側t検定、α=0.05)。
【図３Ｇ】qRT-PCRによるプレ-PD-1(L2FC)と比較した抗PD1処理上のメラノーマ生検試料に由来するCCL19/CXCL13 mRNAレベルを示すヒートマップである(n=12)。
【図３Ｈ】RNA-seqによるプレ-PD-1(L2FC)と比較した抗PD1処理上のメラノーマ生検試料に由来するCCL19/CXCL13 mRNAレベルを示すヒートマップである(10人の患者に由来するn=17)。
【図３Ｉ】チェックポイント遮断に由来する臨床利益が確立された患者(CB)又は臨床利益がない患者(NCB)に由来するメラノーマ生検標本(処理前及び処理中)におけるCCL19及びCXCL13に関する絶対発現(RPKM)を示す図である。
【図３Ｊ】チェックポイント遮断に由来する臨床利益が確立された患者(CB)又は臨床利益がない患者(NCB)に由来するメラノーマ生検標本(処理前及び処理中)における、CCL19及びCXCL13の対応する受容体であるCCR7及びCXCR5に関する絶対発現(RPKM)を示す図である。
【図３Ｋ】臨床利益が確立された患者(CB、4人の患者に由来するn=10の試料)又は臨床利益がない患者(NCB、6人の患者に由来するn=17の試料)に由来するメラノーマ生検標本(処理前及び処理中)における、免疫シグネチャー(GSEA)を示すヒートマップである。
【図３Ｌ】CCL19/CXCL13発現(高い対低い)によるKaplan-Meierの生存曲線を示す図である。
【図３Ｍ】皮膚メラノーマ(SKCM)TCGAデータ20(ログランクMantel-Cox検定)を使用する4つの方法の選別によるKaplan-Meierの生存曲線を示す図である。
【図３Ｎ】皮膚メラノーマ(SKCM)TCGAにおけるCCL19及びCXCL13の発現が変化している患者のクラスターにおけるメラノーマ生検標本(処理前及び処理中)における免疫シグネチャー(GSEA)を示す図である。
【図３Ｏ】抗PD-1療法に対する応答及び試料収集のタイミングによって注釈された、正規化された行(L2FC; n=14)として表された、3日目のPDOTS抗PD1誘導サイトカインの教師なし階層的クラスター分析を示すヒートマップである。
【図４Ａ】腫瘍細胞及びT細胞からのサイトカイン産生に対するTBK1/IKKε阻害の影響のスキームを示す図である
【図４Ｂ】化合物1の化学構造と共に、TBK1/IKKεに対するIC50、及びHCT116細胞中でのEC50を示す図である。
【図４Ｃ】ビヒクル対照と比較したlog2倍数変化(L2FC)として表された、1日目、3日目、及び6日目のCT26スフェロイド(免疫細胞を欠く)±化合物1(n=3、生物学的反復)に関するサイトカインヒートマップを示す図である。
【図４Ｄ】ヒトCD4(n=3)及びCD8(n=5)T細胞中でのIL-2に対する化合物1の用量応答曲線である。
【図４Ｅ】ヒトCD4(n=3)及びCD8(n=5)T細胞中でのIFNγに対する化合物1の用量応答曲線である。
【図４Ｆ】ビヒクル対照を用いるアイソタイプ対照IgGと比較した、L2FCとしてプロットされた、n=3の生物学的反復の平均に由来する、IgG+Cmpd1(1μM)、αPD-1(10μg/mL)、又はαPD-1+Cmpd1(1μM)で処理されたCT26 MDOTSに関するサイトカインヒートマップを示す図である。不等分散を用いる両側Welchの2サンプルt検定(α=0.05)。
【図４Ｇ】IgG-DMSO、Cmpd1(1μM)、αPD-1、及びαPD-1 + Cmpd1で処理した6日後のCT26 MDOTSの生(AO=緑色)/死(PI=赤色)の定量化を示す図である(*p<0.05、多重比較を用いるKruska-WallisのANOVA; n=3)。
【図４Ｈ】IgG-DMSO、Cmpd1(1μM)、αPD-1、及びαPD-1 + Cmpd1で処理した6日後のCT26 MDOTSの生(AO=緑色)/死(PI=赤色)の定量化に対応するイメージング結果を示す図である(*p<0.05、多重比較を用いるKruska-WallisのANOVA; n=3)。
【図４Ｉ】IgG +ビヒクル、IgG + Cmpd1、αPD-L1 +ビヒクル、及びαPD-L1 + Cmpd1後の経時的なCT26同種移植片の腫瘍体積を示す図である(n=10/群、**p<0.01、腫瘍体積に関してはTukeyの多重比較検定を用いる一元配置分散分析、全群及びペアワイズ比較に関してはKaplan-Meier分析のためのログランクMantel-Cox検定)。
【図４Ｊ】IgG +ビヒクル、IgG + Cmpd1、αPD-L1 +ビヒクル、及びαPD-L1 + Cmpd1後のCT26同種移植片の腫瘍体積の変化率を示す図である(n=10/群、**p<0.01、腫瘍体積に関してはTukeyの多重比較検定を用いる一元配置分散分析、全群及びペアワイズ比較に関してはKaplan-Meier分析のためのログランクMantel-Cox検定)。
【図４Ｋ】IgG +ビヒクル、IgG + Cmpd1、αPD-L1 +ビヒクル、及びαPD-L1 + Cmpd1後のCT26同種移植片の生存率を示す図である(n=10/群、**p<0.01、腫瘍体積に関してはTukeyの多重比較検定を用いる一元配置分散分析、全群及びペアワイズ比較に関してはKaplan-Meier分析のためのログランクMantel-Cox検定)。
【図５Ａ】多色フローサイトメトリー実験による免疫細胞プロファイリングにおける生きたCD45+細胞に関する一般的なゲーティングを示す図である。
【図５Ｂ】多色フローサイトメトリー実験による免疫細胞プロファイリングにおけるT細胞系列及び表現型マーカーに関するゲーティング階層を示す図である。
【図５Ｃ】多色フローサイトメトリー実験による免疫細胞プロファイリングにおける骨髄性細胞のゲーティング階層を示す図である。
【図５Ｄ】多色フローサイトメトリー実験による免疫細胞プロファイリングにおけるNK系列及びTregに関するゲーティングを示す図である。
【図６Ａ】MDOTSの免疫細胞プロファイリングに由来するMC38腫瘍及び/又はスフェロイド中の免疫細胞サブ集団を示す図である。MC38(a)バルク腫瘍(n=5)からS1、S2,S3(n=6)までの免疫細胞サブ集団を、図1bに示されるように、フローサイトメトリーによって評価した(Dunnの多重比較検定を用いるKruskal-Wallis検定、α=0.05; *p<0.05; ns=有意でない)。
【図６Ｂ】MC38腫瘍、S1、S2、及びS3スフェロイドにおける21種の細胞表面マーカーの混合物を使用するPearsonの相関マトリックスを示す図である。
【図６Ｃ】MDOTSの免疫細胞プロファイリングに由来するB16F10腫瘍及び/又はスフェロイド中の免疫細胞サブ集団を示す図である。B16F10(a)バルク腫瘍(n=5)からS1(n=4)、S2(n=5)、及びS3(n=4)までの免疫細胞サブ集団を、フローサイトメトリーによって評価した(Dunnの多重比較検定を用いるKruskal-Wallis検定、α=0.05; *p<0.05; ns=有意でない)。
【図６Ｄ】MC38(n=6)、B16F10(n=5)、及びCT26(n=5)のMDOTS(S2)におけるCD45+細胞(生細胞%)を示す図である。Dunnの多重比較検定を用いるKruskal-Wallis検定、α=0.05; *p<0.05。
【図６Ｅ】MC38(n=6)、B16F10(n=5)、及びCT26(n=5)のMDOTS(S2)における免疫サブ集団(%CD45+細胞)を示す図である。Tukeyの多重比較検定を用いる二元配置分散分析、α=0.05; *p<0.05、***p<0.001、****p<0.0001。
【図６Ｆ】PDOTSの免疫細胞プロファイリングに由来するPDOTS(n=40)のCD4及びCD8集団上でのT細胞疲弊マーカー(PD-1、CTLA-4、TIM-3)の表面発現を示す図である。
【図６Ｇ】顆粒球性骨髄由来抑制細胞(gMDSC)、単球、腫瘍関連マクロファージ(TAM)、単球性骨髄由来抑制細胞(mMDSC)、及び形質細胞様樹状細胞(pDC)を含む、骨髄サブ集団上でのPD-L1及びPD-L2の表面発現を示す図である。
【図６Ｈ】CD45+(n=8)、CD3+(n=8)、CD4+(n=7)、CD8+(n=7)、CD14+(n=7)、及びCD15+(n=6)に関する、フローサイトメトリーにより評価されたPDOTS画分(S1、S2、S3)の免疫細胞サブ集団を示す図である。Dunnの多重比較検定を用いるKruskal-Wallis検定、α=0.05; ns=有意でない。
【図６Ｉ】PDOTS画分中のCD4集団上での、抗原を経験したサブ集団(CD45RO+)、エフェクター記憶(CD45RO+CCR7-)サブタイプ、T細胞疲弊マーカー(PD-1、CTLA-4、TIM-3)の表面発現を示す図である(n≧3; Dunnの多重比較検定を用いるKruskal-Wallis検定、α=0.05; ns=有意でない)。
【図６Ｊ】PDOTS画分中のCD8集団上での、抗原を経験したサブ集団(CD45RO+)、エフェクター記憶(CD45RO+CCR7-)サブタイプ、T細胞疲弊マーカー(PD-1、CTLA-4、TIM-3)の表面発現を示す図である(n≧3; Dunnの多重比較検定を用いるKruskal-Wallis検定、α=0.05; ns=有意でない)。
【図７Ａ】MC38 MDOTSの免疫蛍光染色を示す図である。
【図７Ｂ】NSCLC PDOTSの免疫蛍光染色を示す図である。
【図７Ｃ】NSCLC PDOTSの免疫蛍光染色を示す図である。
【図７Ｄ】IgG(10μg/mL)又は抗PD-1(10μg/mL)による処理後7日目での、生細胞を染色するカルセイン(緑色)及び全ての細胞核を染色するHoechst(青色)と共に、CD45+免疫細胞(紫色)及びCD8+T細胞(黄色)について染色されたMC38 MDOTSの免疫蛍光染色を示す図である(スケールバー=20μm)。
【図７Ｅ】独立実験室によって実施されたMC38 MDOTS±抗PD-1の生/死細胞分析を示す図である(n=3、生物学的反復)。
【図７Ｆ】アイソタイプIgG対照(10μg/mL)又は抗PD-1(10μg/mL)±抗CD8(10μg/mL)による処理後6日目に実施されたCT26 MDOTSの生/死細胞分析を示す図である(n=6、生物学的反復; Tukeyの多重比較検定を用いる二元配置分散分析; ****p<0.0001、ns=有意でない)。
【図７Ｇ】CD8+T細胞数を評価する腫瘍内と腫瘍間不均一性の比較(IF、4日目に実施)及びCT26 MDOTSの生/死細胞分析(AO/PI染色)(5日目)を示す図である。
【図８Ａ】対照条件下、又はTh1及びIFN-γエフェクターサイトカインによってグループ化されたαPD-1に対する応答における、PDOTSのビーズに基づくサイトカインプロファイリングにより得られた絶対サイトカインレベル(pg/mL)を示す図である(n=28;対応のある両側t検定、α=0.05)。
【図８Ｂ】対照条件下、又は顆粒球化学誘引物質によってグループ化されたαPD-1に対する応答における、PDOTSのビーズに基づくサイトカインプロファイリングにより得られた絶対サイトカインレベル(pg/mL)を示す図である(n=28;対応のある両側t検定、α=0.05)。
【図８Ｃ】対照条件下、又はIPRES免疫抑制性サイトカインによってグループ化されたαPD-1に対する応答における、PDOTSのビーズに基づくサイトカインプロファイリングにより得られた絶対サイトカインレベル(pg/mL)を示す図である(n=28;対応のある両側t検定、α=0.05)。
【図８Ｄ】試料MGH-16(メラノーマ)に由来するPDOTSを使用して実施された、アイソタイプ対照IgG抗体(50μg/mL)(n=2)を用いる、及び用いない標準的な増殖条件で3日後のPDOTSサイトカインプロファイルの比較を示す図である。
【図８Ｅ】対照及び処理(αPD-1)条件におけるデバイスあたりのスフェロイド数と比較したCCL19及びCXCL13レベル(pg/mL)を示す図である(R2=Pearsonの相関係数)。
【図８Ｆ】PD-1遮断に応答したMGH-16 PDOTSに関する生物学的反復の結果を示す図である(n=3、3日目の未処理対照と比較したL2FC)。
【図８Ｇ】PD-1遮断に応答したMGH-16 PDOTSに関する生物学的反復に由来するCCL19及びCXCL13レベル(pg/mL)を示す図である(n=3、3日目の未処理対照と比較したL2FC)。
【図８Ｈ】αPD-1、αCTLA-4、又はαPD-1 +αCTLA-4に応答したCCL19とCXCL13の上方調節間の相関(未処理対照と比較したlog2倍数変化)を示す図である(R2=Pearsonの相関係数)。
【図８Ｉ】αPD-1処理後のサイトカインプロファイルに対するマイクロ流体デバイス中での培養の効果を示す図である。患者のMGH-16に由来する等量のPDOTS(コラーゲンヒドロゲル中)を、マイクロ流体デバイスに、又は等量の培養培地中、96ウェルプレートの単一のウェル中にロードした。サイトカインプロファイリングのために、培地を3日目(対照及びαPD-1)に収集した。サイトカインの誘導を、未処理対照と比較した倍数変化として表した。
【図９Ａ】DFCI-25におけるαPD-1、αCTLA-4、又はαPD-1 +αCTLA-4を用いるex vivoでのマイクロ流体培養の示された時点で得られた条件化培地を使用するサイトカインプロファイルのlog(2)倍数変化(未処理対照と比較、最高から最低まで順位付けた)を示すヒートマップである(メラノーマPDOTS)。矢印は、免疫媒介性細胞溶解と関連するエフェクターサイトカイン(例えば、IFN-γ、IL-2)を示す。
【図９Ｂ】MGH-12におけるαPD-1、αCTLA-4、又はαPD-1 +αCTLA-4を用いるex vivoでのマイクロ流体培養の示された時点で得られた条件化培地を使用するサイトカインプロファイルのlog(2)倍数変化(未処理対照と比較、最高から最低まで順位付けた)を示すヒートマップである(メラノーマPDOTS)。矢印は、免疫媒介性細胞溶解と関連するエフェクターサイトカイン(例えば、IFN-γ、IL-2)を示す。
【図９Ｃ】DFCI-16におけるαPD-1、αCTLA-4、又はαPD-1 +αCTLA-4を用いるex vivoでのマイクロ流体培養の示された時点で得られた条件化培地を使用するサイトカインプロファイルのlog(2)倍数変化(未処理対照と比較、最高から最低まで順位付けた)を示すヒートマップである(甲状腺癌PDOTS)。矢印は、免疫媒介性細胞溶解と関連するエフェクターサイトカイン(例えば、IFN-γ、IL-2)を示す。
【図９Ｄ】DFCI-19におけるαPD-1、αCTLA-4、又はαPD-1 +αCTLA-4を用いるex vivoでのマイクロ流体培養の示された時点で得られた条件化培地を使用するサイトカインプロファイルのlog(2)倍数変化(未処理対照と比較、最高から最低まで順位付けた)を示すヒートマップである(膵臓腺癌PDOTS)。矢印は、免疫媒介性細胞溶解と関連するエフェクターサイトカイン(例えば、IFN-γ、IL-2)を示す。
【図１０Ａ】選択されたサイトカイン、サイトカイン受容体、細胞傷害性T細胞(CTL)関連遺伝子、及びIPRES転写物(10セットの患者試料における処理前対照と比較したL2FC)を示すRNA-seqを示す図である。
【図１０Ｂ】チェックポイント遮断に由来する臨床利益が確立された患者(CB、4人の患者に由来するn=10の試料)又は臨床利益がない患者(NCB、6人の患者に由来するn=17の試料)に由来する細胞傷害性T細胞エフェクター関連遺伝子(IFNG、IFNGR1、グランザイムA、グランザイムB)に関するRNA-seq絶対発現(RPKM)を示す図である。
【図１０Ｃ】チェックポイント遮断に由来する臨床利益が確立された患者(CB、4人の患者に由来するn=10の試料)又は臨床利益がない患者(NCB、6人の患者に由来するn=17の試料)に由来するメラノーマ生検標本(処理前及び処理中)における選択されたIPRES遺伝子に関するRNA-seq絶対発現(RPKM)を示す図である。
【図１０Ｄ】PD-1遮断に対する応答者(n=15)及び非応答者(n=13)におけるCCL19及びCXCL13の処理前発現を示す図である。発現データは、標準偏差を示すエラーバーと共に、100万あたりの転写物(TPM)として表される(ns=有意でない;対応のない両側Mann-Whitney検定、α=0.05)。
【図１０Ｅ】イピリムマブ(αCTLA-4)に由来する、臨床利益を経験した患者(CB、n=14)、臨床利益を経験しなかった患者(NCB、n=22)、及び臨床利益を経験しなかったが、長期生存を経験した患者(NCB + LTS、n=5)におけるCCL19及びCXCL13の処理前発現を示す図である。発現データは、標準偏差を示すエラーバーと共に、100万あたりの転写物(TPM)として表される(ns=有意でない; Dunnの多重比較検定を用いるKruskal-Wallis検定、α=0.05)。
【図１０Ｆ】示されたサイトカインの発現におけるlog(2)倍数変化(αPD-1中/αPD-1前)を示すヒートマップである。
【図１０Ｇ】抗PD-1療法に対する応答者(R; n=7)及び非応答者(NR; n=4)に関する一致した血漿試料(処理中/処理前)を使用する血漿サイトカインのlog(2)倍数変化を示すヒートマップである。
【図１０Ｈ】尿路上皮膀胱癌(BLCA)、頭頸部扁平上皮癌(HNSC)、及び乳癌(BRCA)TCGAデータを使用するCCL19/CXCL13発現(高-高、高-低、低-高、及び低-低)による4つの方法のKaplan-Meierの生存曲線を示す図である(ログランクMantel-Cox検定を使用するペアワイズ分析、*p<0.05)。
【図１１Ａ】腫瘍関連三次リンパ球構造(TA-TLS)のH&E画像(10x対物)、より高い倍率(40x対物)、及び52のH&Eスライドにおいて同定されたTA-TLSの定量を示す図である。
【図１１Ｂ】L2FC中央値によるCCL19/CXCL13高(n=14)及びCCL19/CXCL13低(n=14)に分割されたPDOTSを示す図である(Mann-Whitney検定、****p<0.0001)。
【図１１Ｃ】CCL19/CXCL13のex vivo発現(高対低)を示すPDOTS間の免疫細胞組成の中央値(CD45+、CD4+、CD8+、CD14+、CD15+)を示す図である。
【図１１Ｄ】CCL19/CXCL13高対低PDOTSにおける免疫細胞組成の中央値(CD4+PD1+及びCD8+PD-1+)を示す図である。
【図１１Ｅ】4つの方法の細胞選別(n=2、MGH-16に由来する技術的反復)後のがん関連線維芽細胞(CD45-CD90+)、がん関連内皮細胞(CD31+CD144+)、CD45-(がん細胞等)及びCD45+免疫細胞中でのqRT-PCRによるCCL19及びCXCL13の相対的発現を示す図である。
【図１１Ｆ】メラノーマ標本におけるCCL19、CXCL13、αSMA(がん関連線維芽細胞)、及びCD31(内皮細胞)の免疫組織化学染色を示す図である(pt422、処理中; 40xの倍率、スケールバー400μm)。
【図１２Ａ】PD-1遮断に由来する臨床利益を示す患者(n=5; PR/SD)及び臨床利益を示さない患者(n=9; MR/PD)におけるex vivoでのPD-1遮断後のPDOTSからの平均サイトカイン変化を示す図である(*p<0.05)。
【図１２Ｂ】メラノーマTCGAデータを使用するCX3CL1/CCL20発現(高-高、高-低、低-高、及び低-低)による4つの方法のKaplan-Meierの生存曲線を示す図である(ログランクMantel-Cox検定を使用するペアワイズ分析、α=0.05、ns=有意でない)。
【図１２Ｃ】PD-1遮断に由来する臨床利益を示す患者(PR/SD)及び臨床利益を示さない患者(MR/PD)に由来するPDOTS試料におけるex vivoでのPD-1遮断に対して応答する複合IPRES6スコア(CCL2、CCL7、CCL8、CCL13、IL-10のL2FCの合計)を示す図である。
【図１２Ｄ】未処理対照と比較したL2FCとして表される、試料DFCI-13、-16、-18、及び-21(転移性乳頭状甲状腺がんを有する同じ患者からの連続試料採取)に関する3日目のPDOTS抗PD1誘導性サイトカインのヒートマップを示す図である。
【図１２Ｅ】示された処理を受けている同じ患者に由来する試料DFCI-13、-16、-18、-21、及び-22の連続免疫プロファイリングを示す図である。
【図１２Ｆ】MC38及びB16F10 MDOTSに由来する相対的抗PD1誘導性サイトカイン変化のヒートマップである(アイソタイプ対照と比較したL2FC; n=3、生物学的反復)。
【図１２Ｇ】経時的なCT26 MDOTSにおける絶対サイトカインレベルを示す図である(n=3、生物学的反復)。
【図１２Ｈ】1、3及び6日目に抗CCL2±抗PD-1で処理されたCT26 MDOTSにおける6日目での生/死細胞分析を示す図である(アイソタイプ対照と比較したL2FC; n=3、生物学的反復)。
【図１２Ｉ】1、3及び6日目に抗CCL2±抗PD-1で処理されたCT26 MDOTSにおける相対的サイトカイン変化のヒートマップである(アイソタイプ対照と比較したL2FC; n=3、生物学的反復)。
【図１３Ａ】化合物1の化学合成を示すスキームである。
【図１３Ｂ】化合物1で処理された示された酵素に関するIC50値を示す図である。
【図１３Ｃ】TBK1に関するIC50曲線を示す図である。
【図１３Ｄ】IKKε(IKBKE)に関するIC50曲線を示す図である。
【図１３Ｅ】免疫細胞を欠くCT26スフェロイドの生存能力に対する化合物1の効果を示す図である(n=3、生物学的反復)。
【図１３Ｆ】増加する用量の化合物1を用いてJurkat細胞により産生されたIL-2レベルの倍数変化を示す図である。
【図１３Ｇ】抗PD-L1 +化合物1で予め処理されたマウスの脇腹へのCT26及びEMT-6細胞の再埋込み後の腫瘍体積の変化を示す図である。
【図１４Ａ】ビヒクル対照(DMSO 0.1%)を用いるアイソタイプ対照IgG(10μg/mL)と比較したL2FCとしてプロットされた、n=3の生物学的反復の平均に由来する、IgG + Cmpd1(1μM)、αPD-1(10μg/mL)、又はαPD-1 + Cmpd1(1μM)で処理されたMC38 MDOTSに関するサイトカインヒートマップである。不等分散を用いる両側Welchの2サンプルt検定(α=0.05)。
【図１４Ｂ】ビヒクル対照(DMSO 0.1%)を用いるアイソタイプ対照IgG(10μg/mL)と比較したL2FCとしてプロットされた、n=3の生物学的反復の平均に由来する、IgG + Cmpd1(1μM)、αPD-1(10μg/mL)、又はαPD-1 + Cmpd1(1μM)で処理されたB16F10 MDOTSに関するサイトカインヒートマップである。不等分散を用いる両側Welchの2サンプルt検定(α=0.05)。
【図１４Ｃ】IgG-DMSO、Cmpd1(1μM)、αPD-1、及びαPD-1 + Cmpd1で処理した5日後のMC38 MDOTSの生(AO=緑色)/死(PI=赤色)の定量化を示す図である(*p<0.05、多重比較を用いるKruskal-Wallis ANOVA; n=3)。
【図１４Ｄ】IgG +ビヒクル、IgG + Cmpd1、αPD-L1 +ビヒクル、及びαPD-L1 + Cmpd1後のMC38同種移植片の腫瘍体積のウォーターフォールプロットを示す図である(n=10/群、*p<0.05、**p<0.01、腫瘍体積に関するTukeyの多重比較検定を用いる一元配置分散分析、全群及びペアワイズ比較に関するKaplan-Meier分析のためのログランクMantel-Cox検定)。
【図１４Ｅ】IgG +ビヒクル、IgG + Cmpd1、αPD-L1 +ビヒクル、及びαPD-L1 + Cmpd1後の生存率を示す図である(n=10/群、*p<0.05、**p<0.01、腫瘍体積に関するTukeyの多重比較検定を用いる一元配置分散分析、全群及びペアワイズ比較に関するKaplan-Meier分析のためのログランクMantel-Cox検定)。
【図１４Ｆ】IgG-DMSO、Cmpd1(1μM)、αPD-1、及びαPD-1 + Cmpd1で処理した6日後のB16F10 MDOTSの生(AO=緑色)/死(PI=赤色)の定量化を示す図である(α=0.05、ns=有意でない。多重比較を用いるKruskal-Wallis ANOVA; n=3)。
【図１４Ｇ】IgG +ビヒクル、IgG + Cmpd1、αPD-L1 +ビヒクル、及びαPD-L1 + Cmpd1後のB16F10尾静脈注射モデルにおける小さい肺転移の定量化を示す図である(n=10/群、Tukeyの多重比較検定を用いる一元配置分散分析、ns=有意でない)。
【図１４Ｈ】IgG +ビヒクル、IgG + Cmpd1、αPD-L1 +ビヒクル、及びαPD-L1 + Cmpd1後のB16F10尾静脈注射モデルにおける中程度の肺転移の定量化を示す図である(n=10/群、Tukeyの多重比較検定を用いる一元配置分散分析、ns=有意でない)。
【図１４Ｉ】IgG +ビヒクル、IgG + Cmpd1、αPD-L1 +ビヒクル、及びαPD-L1 + Cmpd1後のMB49同種移植片の腫瘍体積のウォーターフォールプロットを示す図である(n=10/群、*p<0.05、腫瘍体積に関するTukeyの多重比較検定を用いる一元配置分散分析、全群及びペアワイズ比較に関するKaplan-Meier分析のためのログランクMantel-Cox検定)。
【図１４Ｊ】IgG +ビヒクル、IgG + Cmpd1、αPD-L1 +ビヒクル、及びαPD-L1 + Cmpd1後の棒グラフとしてのMB49同種移植片の腫瘍体積のウォーターフォールプロットを示す図である(n=10/群、*p<0.05、腫瘍体積に関するTukeyの多重比較検定を用いる一元配置分散分析、全群及びペアワイズ比較に関するKaplan-Meier分析のためのログランクMantel-Cox検定)。
【図１４Ｋ】IgG +ビヒクル、IgG + Cmpd1、αPD-L1 +ビヒクル、及びαPD-L1 + Cmpd1後の生存率を示す図である(n=10/群、*p<0.05、腫瘍体積に関するTukeyの多重比較検定を用いる一元配置分散分析、全群及びペアワイズ比較に関するKaplan-Meier分析のためのログランクMantel-Cox検定)。
【図１５】パイロットRNA抽出、QC、及び定量化の集計表(左)、並びにMDOTSに由来する完全にインタクトな総RNAを示す代表的なバイオアナライザートレース(右)を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
他の態様の中でも、本開示は、生細胞の死細胞に対する比をモニタリングすることによって3次元マイクロ流体デバイス中の腫瘍細胞スフェロイドを評価するための方法を提供する。一部の態様では、方法は、試験化合物の含有又は排除等の、異なる条件に腫瘍スフェロイド試料の別々のアリコートを曝露する工程を含む。そのため、一部の実施形態では、試験化合物の効果を、生細胞の死細胞に対する比に対するその効果をモニタリングすることによって評価することができる。驚くべきことに、培養腫瘍スフェロイドの腫瘍微小環境を光学的かつ再現可能に評価して、腫瘍細胞を培養する操作の結果得られる腫瘍細胞に対する効果を区別しながら、スフェロイド内の腫瘍細胞に対する薬物の効果を確立することができることが発見された。
【００３３】
本明細書で使用される用語「腫瘍」とは、新生物、すなわち、細胞又は組織の異常な増殖を指し、良性の、すなわち、非がん性の増殖、及び悪性の、すなわち、原発性又は転移性がん性増殖を含むがん性の増殖を含むことが理解される。
【００３４】
新生物の例としては、限定されるものではないが、中皮腫、肺がん(例えば、小細胞肺がん、非小細胞肺がん)、皮膚がん(例えば、メラノーマ)、胃がん、肝臓がん、結腸直腸がん、乳がん、膵がん、前立腺がん、血液がん、骨肉腫、骨髄がん、及び他のがんが挙げられる。
【００３５】
本明細書で使用される用語「腫瘍スフェロイド」又は「腫瘍細胞スフェロイド」とは、腫瘍細胞の小さい集団、又は塊を構成する腫瘍細胞の凝集体を指す。一部の実施形態では、腫瘍スフェロイドは、約3cm未満、約2cm未満、約1cm未満、約5mm未満、約2.5mm未満、約1mm未満、約100μm未満、約50μm未満、約25μm未満、約10μm未満、又は約5μm未満の直径である。一部の実施形態では、腫瘍スフェロイドは、10μm〜500μmの直径を有する。一部の実施形態では、腫瘍スフェロイドは、40μm〜100μmの直径を有する。一部の実施形態では、腫瘍スフェロイドは、40μm〜70μmの直径を有する。
【００３６】
本明細書で使用される用語「原発性腫瘍試料」とは、がんを有する対象から得られた腫瘍材料を含む試料を指す。この用語は、腫瘍組織試料、例えば、外科的切除によって得られた組織及び例えば、コア生検又は細針生検等の生検によって得られた組織を包含する。この用語はまた、患者由来異種移植片(PDX)も包含する。患者由来異種移植片は、患者の原発腫瘍に由来するがん性組織が免疫不全マウスに直接埋め込まれる場合に作出される(例えば、Morton CL、Houghton PJ (2007)、「Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice」、Nature Protocols 2 (2): 247〜50頁; Siolas D、Hannon GJ (September 2013)、「Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models」、Cancer Research 73 (17): 5315〜9頁を参照されたい)。PDXは、患者の組織病理学的及び遺伝学的プロファイルを映す。それは、前臨床がんモデルとしての改善された予測力を有し、真の個別化療法及び予測的バイオマーカーの発見を可能にする。
【００３７】
一部の実施形態では、対象は、ヒトである。一部の実施形態では、対象は、非ヒト哺乳動物又は非ヒト脊椎動物である。一部の実施形態では、対象は、実験動物、マウス、ラット、げっ歯類、農業用動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、コンパニオンアニマル、イヌ、ネコ、又はモルモットである。
【００３８】
一部の実施形態では、本明細書で使用される腫瘍試料は、特定の治療的処置に対する耐性又は感受性を有することが知られる対象に由来する。例えば、一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、特定の処置、例えば、がんの処置におけるPD-1阻害に対する耐性を克服する新規組合せ療法及び/又は新規単剤療法を同定することができる。一部の実施形態では、PD-1組合せ療法を評価しようとする場合、腫瘍試料は、PD-1阻害療法に対する同じか、又は変化したレベルの感受性を有する1又は複数の対象に由来するものであってもよい。一部の実施形態では、腫瘍試料は、B16F10マウスモデルに由来する。B16F10は、PD-1遮断に対して最小限に感受性であるマウスモデルである。一部の実施形態では、腫瘍試料は、MC38マウスモデルに由来する。MC38は、B16F10と比較してPD-1遮断に対して高度に感受性であるマウスモデルである。一部の実施形態では、腫瘍試料は、CT26マウスモデルに由来する。CT26は、B16F10及びMC38モデルと比較して中間の感受性のものであるマウスモデルである。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、B16F10、MC38、又はCT26モデルに由来する2つ以上の腫瘍試料の組合せを評価する工程を含む。
【００３９】
腫瘍細胞スフェロイドを、当業界で公知の任意の方法によって調製することができる。腫瘍細胞スフェロイドを調製するための例示的方法は、WO2016/112172に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００４０】
一部の実施形態では、原発腫瘍試料を、血清添加培地、例えば、限定されるものではないが、10%ウシ胎仔血清を添加したRPMI培地中で収集する。次いで、試料を細断する、すなわち、小片に切断するか、又は切り刻む。一部の実施形態では、試料を、氷上で細断する。一部の実施形態では、細断された原発腫瘍試料は、約3mm、2.5mm、2.0mm、1.5mm、1.0mm、0.5mm、又は0.25mmのサイズの腫瘍小片を含む。
【００４１】
一部の実施形態では、原発腫瘍試料を凍結及び解凍しない。
【００４２】
一部の実施形態では、細断された原発腫瘍試料を、血清を添加した培地中で凍結し、酵素を含む組成物で処理する前に解凍する。一部の実施形態では、細断された原発腫瘍試料を、少なくとも6時間、12時間、24時間、2日間、1週間又は1カ月間凍結する。一部の実施形態では、細断された原発腫瘍試料を、-80℃で凍結する。一部の実施形態では、細断された原発腫瘍試料を、液体窒素中で凍結する。一部の実施形態では、細断された原発腫瘍試料を、血清を添加した培地中で凍結する。一部の実施形態では、細断された原発腫瘍試料を、血清及びジメチルスルホキシド(DMSO)等の溶媒を含有する混合物中で凍結する。一部の実施形態では、細断された原発腫瘍試料を、ウシ胎仔血清及びジメチルスルホキシド(DMSO)を含有する混合物中で凍結する。
【００４３】
一部の実施形態では、凍結された細断された原発腫瘍試料を解凍、すなわち、デフロストした後、試料を、酵素を含む組成物で処理する。一部の実施形態では、細断された原発腫瘍試料を、約37℃(例えば、35℃、36℃、37℃、38℃、又は39℃)に保持した水浴中で解凍する。一部の実施形態では、細断された原発腫瘍試料を、室温で解凍する。
【００４４】
細断された原発腫瘍試料を、酵素ミックスで処理して、腫瘍試料を消化する。一部の実施形態では、酵素を含む組成物は、コラゲナーゼを含む。一部の実施形態では、酵素を含む組成物は、血清を添加した培養培地、インスリン、1つ又は複数のコルチコステロイド、1つ又は複数の抗生物質、コラゲナーゼ及び場合により、1つ又は複数の増殖因子を含む。血清を添加した培養培地、コルチコステロイド、抗生物質、及び増殖因子は、当業界で周知である。一部の実施形態では、酵素を含む組成物は、DMEM又はRPMI、ウシ胎仔血清、インスリン、上皮増殖因子、ヒドロコルチゾン、ペニシリン及び/又はストレプトマイシン、並びにコラゲナーゼを含む。一部の実施形態では、酵素を含む組成物は、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)等の緩衝剤を更に含む。
【００４５】
「細断された原発腫瘍試料を、酵素を含む組成物で処理すること」は、細断された腫瘍試料を、酵素組成物と共に少なくとも1時間インキュベートすることを含む。一部の実施形態では、細断された腫瘍試料を、酵素ミックスと共に少なくとも2時間、少なくとも4時間、少なくとも6時間、少なくとも8時間、少なくとも10時間、少なくとも12時間、少なくとも15時間又は少なくとも24時間インキュベートする。一部の実施形態では、細断された原発腫瘍試料を、酵素ミックスと共に25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、又は39℃でインキュベートする。一部の実施形態では、細断された原発腫瘍試料を、酵素ミックスと共に37℃でインキュベートする。
【００４６】
一部の実施形態では、細断された原発腫瘍試料を、細断された原発腫瘍試料の部分的消化を得るのに十分な量で、又は時間にわたって、酵素を含む組成物で処理する。一部の実施形態では、細断された原発腫瘍試料を、25℃〜39℃の温度で30分〜15時間にわたって酵素を含む組成物で処理する。
【００４７】
酵素ミックスで処理された試料からの腫瘍スフェロイドの収集は、試料を少なくとも2回、遠心分離及び洗浄した後、所望のサイズの消化された腫瘍スフェロイドを単離することを含む。一部の実施形態では、酵素ミックスで処理された試料を、少なくとも2回、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を使用して遠心分離及び洗浄する。所望のサイズの腫瘍スフェロイドを、ふるいを使用して収集する。一部の実施形態では、10μm、50μm、100μm、200μm、300μm、400μm、450μm、及び500μmの直径を有する腫瘍スフェロイドを、ふるいを使用して、酵素ミックスで処理された試料から収集する。一部の実施形態では、40μm〜100μmの直径を有する腫瘍スフェロイドを、ふるいを使用して、酵素ミックスで処理された試料から収集する。一部の実施形態では、40μm、50μm、60μm及び70μmの直径を有する腫瘍スフェロイドを、ふるいを使用して、酵素ミックスで処理された試料から収集する。
【００４８】
所望の直径を有する腫瘍スフェロイドを、細胞ストレーナーを通して酵素ミックスで処理された試料をふるいにかけることによって収集する。一部の実施形態では、10μm〜500μmの直径を有する腫瘍スフェロイドを、500μm及び10μmの細胞ストレーナーを介して酵素ミックスで処理された試料をふるいにかけて、10μm〜500μmの直径を有する腫瘍スフェロイドを得ることによって収集する。一部の実施形態では、40μm〜100μmの直径を有する腫瘍スフェロイドを、100μm及び40μmの細胞ストレーナーを介して酵素ミックスで処理された試料をふるいにかけて、10μm〜500μmの直径を有する腫瘍スフェロイドを得ることによって収集する。所望の直径の腫瘍スフェロイドを収集し、生体適合性ゲル中に懸濁する。生体適合性ゲルの例としては、コラーゲン、BD Matrigel(商標)Matrix Basement Membrane、又はフィブリンヒドロゲル(例えば、フィブリノゲンのトロンビン処理から生成されるフィブリンヒドロゲル)が挙げられる。
【００４９】
一部の実施形態では、収集された腫瘍スフェロイドを、生体適合性ゲル中に懸濁する前に凍結、次いで、解凍しない。一部の実施形態では、収集された腫瘍スフェロイドを、収集後2時間未満内、1時間未満内、30分未満内、20分未満内、10分未満内、又はそれより短い時間内に3次元細胞培養デバイス中に導入する。
【００５０】
一部の実施形態では、収集された腫瘍スフェロイドを、生体適合性ゲルに懸濁する前に、凍結培地中で凍結した後、解凍する。一部の実施形態では、収集された腫瘍スフェロイドを、少なくとも6時間、12時間、24時間、2日間、1週間又は1カ月間凍結する。一部の実施形態では、収集された腫瘍スフェロイドを、-80℃で凍結する。一部の実施形態では、収集された腫瘍スフェロイドを、液体窒素中で凍結する。一部の実施形態では、収集された腫瘍スフェロイドを、-80℃で一晩凍結した後、保存のために液体窒素に移す。一部の実施形態では、収集された腫瘍スフェロイドを、血清を添加した培地中で凍結する。一部の実施形態では、収集された腫瘍スフェロイドを、DMEM又はRPMI等の培養培地、ウシ胎仔血清及びジメチルスルホキシド(DMSO)等の溶媒を含有する混合物中で凍結する。凍結されたスフェロイドを、例えば、4℃で一晩解凍した後、生体適合性ゲル中に懸濁する。
【００５１】
腫瘍スフェロイドを、3次元(3D)マイクロ流体デバイス中で培養する、すなわち、増殖させる。一部の実施形態では、腫瘍スフェロイドを、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)等の内皮細胞と共に培養する。一部の実施形態では、腫瘍スフェロイドを、内皮細胞と共に培養しない。一部の実施形態では、腫瘍スフェロイドを、少なくとも1日間、少なくとも2日間、少なくとも4日間、少なくとも6日間、少なくとも1週間、又は少なくとも2週間にわたって内皮細胞と共に培養する、又は共に培養しない。
【００５２】
3Dマイクロ流体デバイスは、当業界で公知であり、例えば、限定されるものではないが、US2013/0143230、EP2741083、US2014/0057311、US8748180、及びWO2016/112172に記載されたデバイスが挙げられ、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００５３】
一部の実施形態では、3Dマイクロ流体デバイスは、1つ又は複数のゲルケージ領域が隣接した1つ又は複数の流体チャネルを含むデバイスであって、1つ又は複数のゲルケージ領域が、腫瘍スフェロイドが包埋された生体適合性ゲルを含み、デバイスがin vivoでの腫瘍微小環境を再現する、すなわち、模倣する、デバイスを指す。可視化を容易にするために、マイクロ流体デバイスは、典型的には、本明細書では「光学的に透過性の材料」と呼ばれる、光を透過させる基材を含む。当業者には理解されるように、好適な光学的に透過性の材料としては、ポリマー、プラスチック、及びガラスが挙げられる。好適なポリマーの例は、ポリジメチルシロキサン(PDMS)、ポリ(メチルメタクリレート)(PMMA)、ポリスチレン(PS)、SU-8、及び環状オレフィンコポリマー(COC)である。一部の実施形態では、デバイスの全部又は一部は、生体適合性材料から作られる、例えば、材料は、生体材料(例えば、細胞、組織)と適合する、又はそれに対して毒性でも有害でもない。
【００５４】
流体チャネルを使用して、(1つ又は複数の)流体(例えば、細胞培養培地)、内皮細胞等の細胞、細胞材料、組織、フルオロフォア色素、及び/又は評価しようとする化合物(例えば、薬物)を含有させることができるが、ゲルケージ領域を使用して、ゲル(例えば、コラーゲン、Matrigel(商標)、又はフィブリンヒドロゲル(例えば、フィブリノゲンのトロンビン処理から生成されるフィブリンヒドロゲル)等の生物学的に関連するゲル)を含有させることができる。一部の実施形態では、3Dマイクロ流体デバイスは、US2014/0057311に記載されたデバイスを含み、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。特に、領域、チャネル、チャンバー、ポスト、及びポストの配置を記載する段落[0056]〜[0107]、並びにデバイスを作製する方法を記載する段落[0127]〜[0130]が、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５５】
一部の実施形態では、がんを処置するための化合物を同定するための方法は、1つ又は複数の試験化合物の存在下及び非存在下で、本明細書に記載の3次元マイクロ流体デバイス中で腫瘍細胞スフェロイドの第1及び第2のアリコートを培養する工程、腫瘍細胞スフェロイドのアリコート中の生細胞の死細胞に対する比の変化を検出する工程を含む。
【００５６】
一部の実施形態では、腫瘍細胞スフェロイド中のアリコート中の生細胞の死細胞に対する比の変化を、第1及び第2のフルオロフォア色素のそれぞれによって放出される総蛍光を測定することによってモニタリングする。したがって、一部の実施形態では、死細胞の蛍光と生細胞の蛍光とを一緒に加算して、生細胞と死細胞の合計を得ることができる。一部の実施形態では、死細胞の量を、死細胞の蛍光の、総蛍光に対するパーセンテージとして表すことができる。一部の実施形態では、生細胞の量を、生細胞の蛍光の、総蛍光に対するパーセンテージとして表すことができる。一部の実施形態では、死細胞の蛍光と、生細胞の蛍光とを、比として表すことができる。例えば、一部の実施形態では、比は、死細胞/生細胞又は生細胞/死細胞として表される。この様式において、比としての表現は、腫瘍細胞スフェロイドを評価する標準化された方法を提供する。
【００５７】
一部の実施形態では、腫瘍細胞スフェロイドの増殖及び/又は分散も評価される。
【００５８】
一部の実施形態では、がんを処置するための化合物又は化合物の組合せを同定するための方法は、酵素処理された腫瘍試料から腫瘍スフェロイドを取得する工程、生体適合性ゲル中に腫瘍スフェロイドの第1のアリコートを懸濁する工程、及び生体適合性ゲル中に腫瘍スフェロイドの第2のアリコートを懸濁する工程を含む。一部の実施形態では、方法は、第1の3次元デバイス中の生体適合性ゲルに腫瘍スフェロイドの第1のアリコートを入れる工程、並びに第1のアリコートと、死細胞について選択的な第1のフルオロフォア色素及び生細胞について選択的な第2のフルオロフォア色素とを接触させる工程を更に含み、ここで、第1のフルオロフォア色素は、死細胞に結合した場合に第1の波長で蛍光を放出し、第2のフルオロフォア色素は、生細胞に結合した場合に第1の波長とは異なる第2の波長で蛍光を放出する。一部の実施形態では、方法は、第1のアリコート中の第1及び第2のフルオロフォア色素のそれぞれによって放出される総蛍光を測定することを更に含む。一部の実施形態では、方法は、第2の3次元デバイス中で第2のアリコートを培養する工程、第2のアリコートと、第1のフルオロフォア色素及び第2のフルオロフォア色素とを接触させる工程を更に含み、ここで、第2のアリコートと、第1のフルオロフォア色素及び第2のフルオロフォア色素との接触は、第1のアリコートと、第1のフルオロフォア色素及び第2のフルオロフォア色素との接触の少なくとも24時間後に実行される。一部の実施形態では、方法は、第2のアリコート中の第1及び第2のフルオロフォア色素のそれぞれによって放出された総蛍光を測定する工程を更に含み、ここで、それぞれのアリコート中の生細胞の死細胞に対する比の増加又は減少を評価することができる。
【００５９】
「試験化合物の存在下で患者由来腫瘍細胞スフェロイドを培養すること」は、本明細書に記載のデバイスの1つ又は複数の流体チャネル中に試験化合物を導入することであって、デバイスの1つ又は複数のゲルケージ領域が、腫瘍スフェロイドが包埋されたゲルを含む、こと;及び好適な培養条件下で腫瘍スフェロイドを培養することを含む。好適な条件は、標準的な細胞培養条件(例えば、80%を超える相対湿度の空気の加湿雰囲気及び5〜10%CO2中、37℃)下で腫瘍細胞スフェロイドを増殖させることを含む。
【００６０】
一部の実施形態では、本明細書で提供される技術は、腫瘍細胞スフェロイド培養物中で1つ又は複数の治療的処置の効果を評価することに関する。一部の実施形態では、腫瘍細胞スフェロイド培養物中での変化を、1つ又は複数の発光プローブ(例えば、1つ又は複数の蛍光色素)を使用して評価する。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、腫瘍細胞スフェロイド培養物と、他方と異なる細胞型にそれぞれ選択的に結合する第1のフルオロフォア色素及び第2のフルオロフォア色素であって、フルオロフォア色素が、それぞれの細胞型に結合した場合に異なる波長で蛍光を放出する、第1のフルオロフォア色素及び第2のフルオロフォア色素とを接触させる工程を含む。一部の実施形態では、第1のフルオロフォア色素は死細胞に選択的であり、第2のフルオロフォア色素は生細胞に選択的である。一部の実施形態では、第1のフルオロフォア色素は生細胞に選択的であり、第2のフルオロフォア色素は死細胞に選択的である。
【００６１】
一部の実施形態では、1つ又は複数のフルオロフォア色素(例えば、1つ又は複数の第1のフルオロフォア色素、1つ又は複数の第2のフルオロフォア色素)を、細胞培養デバイスの1つ又は複数の流体チャネル中に導入する。本開示で提供される技術は、任意の好適なフルオロフォア色素(例えば、フルオロフォア含有色素、ステイン、蛍光標識等)と適合することが想定される。好適なフルオロフォア色素は当業界で公知であり、実務者であれば本明細書に記載の技術の望ましい適用を考慮してこれを選択することができる。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載の技術において使用される1つ又は複数のフルオロフォア色素は、固定又は非固定条件下での染色と適合してもよい。
【００６２】
非固定条件での死細胞の検出のために使用することができるフルオロフォア色素としては、例えば、限定されるものではないが、ヨウ化プロピジウム、DRAQ7、及び7-AAD等のDNA依存的ステインが挙げられる。固定又は非固定条件のいずれかでの死細胞の検出のために使用することができるフルオロフォア色素としては、例えば、限定されるものではないが、Table 1(表1)に列挙される色素が挙げられる。
【００６３】
【表１】
2020515260.tif 000003
【００６４】
本開示で提供される技術は、当業界で公知の生細胞に選択的な任意の好適なフルオロフォア色素と適合することが想定される。生細胞又は固定細胞の検出のために使用することができるフルオロフォア色素としては、例えば、限定されるものではないが、アクリジンオレンジ、核グリーンLCS1(ab138904)、DRAQ5(ab108410)、CyTRAK Orange、NUCLEAR-ID Red DNAステイン(ENZ-52406)、及びSiR700-DNA等のDNA依存的ステインが挙げられる。生細胞を染色する非DNA依存的フルオロフォア色素の例は、当業界で公知であり、例えば、限定されるものではないが、カルセインAM、カルセインバイオレットAM、及びカルセインブルーAMが挙げられる。生細胞又は固定細胞の検出のために使用することができるフルオロフォア色素としては、例えば、限定されるものではないが、Table 2(表2)に示される色素が挙げられる。
【００６５】
【表２】
2020515260.tif 000004
【００６６】
更に、2色細胞生存能力アッセイが利用可能であり、本明細書に記載の技術と共に使用することができる。生/死細胞傷害性キットの例としては、例えば、限定されるものではないが、Table 3(表3)に示されるキットが挙げられる。
【００６７】
【表３】
2020515260.tif 000005
【００６８】
試験化合物の存在下又は非存在下での腫瘍細胞スフェロイドの増殖及び/又は分散の減少を予測又は証明する腫瘍細胞スフェロイド培養物中の変化を、化学的方法若しくは物理的方法、又はその組合せ等の当業界で公知の方法を使用して検出することができる。
【００６９】
本明細書で記載される場合、腫瘍細胞スフェロイド試料は、試料の別々のアリコート中の生細胞及び死細胞の相対量を分析することによって評価される。一部の実施形態では、アリコート中の生細胞及び死細胞の相対量は、蛍光測定によって決定される。例えば、一部の実施形態では、蛍光測定は、死細胞に選択的に結合する第1のフルオロフォア色素及び生細胞に選択的に結合する第2のフルオロフォア色素から検出される放出の総蛍光獲得を含む。そのような測定に基づいて、相対放出レベルを解析して、アリコート中の死細胞の量と比較した生細胞の量を提供することができる。
【００７０】
一部の実施形態では、アリコート中の生細胞の死細胞に対する相対量又は比を、
[(%生細胞)+(%死細胞)=100%]
となるように、総蛍光のパーセンテージとして表すことができる。一部の実施形態では、第1のアリコート中の生細胞及び死細胞の相対レベルを、試験化合物で処理された第2のアリコートについて得られた同様の測定値と比較する。第1のアリコートと比較した試験化合物の存在下での(%死細胞)の増加は、試験化合物が細胞死を誘導するのに有効であることを示す。一部の実施形態では、有効な試験化合物の存在下での死細胞のパーセンテージは、試験化合物の非存在下と比較して、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、又はそれより大きく増加する。
【００７１】
一部の実施形態では、腫瘍細胞スフェロイド培養物の変化を、視覚的に、例えば、共焦点顕微鏡イメージングを使用して更に検出することができる。得られた画像を、その全体が参照により本明細書に組み込まれるArefら、Integr Biol (Camb). 2013 Feb;5(2):381〜9頁に記載されたように分析することができる。特に、画像獲得及び分析(正規化された分散、Δ/Δ0、及び正規化された細胞数(N/N0))に関する387〜388頁の段落は、その全体が参照により組み込まれる。
【００７２】
一部の実施形態では、腫瘍細胞スフェロイド培養物の変化は、培養物中の1つ又は複数の腫瘍細胞スフェロイドの周囲での免疫細胞のクラスタリングである。一部の実施形態では、腫瘍細胞スフェロイド培養物の変化は、培養物中の1つ又は複数の腫瘍細胞スフェロイドの細胞のサイズ及び/又は数の減少である。
【００７３】
一部の実施形態では、腫瘍細胞培養物の変化は、化学的に更に検出される。例えば、一部の実施形態では、腫瘍細胞スフェロイド培養物の変化は、培養上清中に分泌される生体分子の存在の検出によって決定される。一部の実施形態では、生体分子は、タンパク質、炭水化物、脂質、核酸、代謝物、又はその組合せである。一部の実施形態では、生体分子は、ケモカイン又はサイトカインである。一部の実施形態では、生体分子は、免疫系の活性化又はそうでなければ免疫応答の増強と関連することが知られる。
【００７４】
一部の実施形態では、検出される生体分子は、デバイス中で活性化されるようになる腫瘍スフェロイドに結合したCD4及びCD8 T細胞上のT細胞受容体の単一細胞配列決定を含む。
【００７５】
一部の実施形態では、腫瘍細胞スフェロイド培養上清の試料を、3D培養デバイスから取得することができる。一部の実施形態では、分泌された生体分子又は分泌された生体分子のプロファイル、例えば、サイトカインプロファイル又はケモカインプロファイルを、腫瘍細胞スフェロイド培養上清中で検出することができる。
【００７６】
分泌された生体分子を検出するための方法は、当業界で公知である。例示的なアッセイ及びサイトカインは、例えば、WO2016/112172に開示されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００７７】
一部の実施形態では、腫瘍細胞スフェロイドの試料は、核酸含量によって分析される。例えば、当業界で公知の方法を使用して、細胞外核酸、例えば、腫瘍細胞スフェロイド試料の培養培地中に存在する核酸を分析することができる。或いは、当業界で公知の方法を使用して、培養された試料中の細胞から核酸を単離することができる。一部の実施形態では、そのような分析を使用して、遺伝子発現を評価する、例えば、サイトカイン及びサイトカイン受容体等の、細胞傷害性と関連する遺伝子の発現を評価することができる。一部の実施形態では、試料に由来するDNA及び/又はRNA(例えば、mRNA、rRNA、tRNA等)を分析することができる。一部の実施形態では、試料のRNA含量を、RNA-seqを使用して分析する。
【００７８】
一部の実施形態では、試験化合物は、上皮間葉移行(EMT)を阻害する。一部の実施形態では、試験化合物は、低分子化合物である。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、試験化合物のライブラリー、例えば、化学的化合物のライブラリーをスクリーニングするために使用される。一部の実施形態では、試験化合物は、一本鎖、又は二本鎖の、核酸分子、例えば、DNA分子、RNA分子、又はDNA/RNAハイブリッド分子を含む。一部の実施形態では、試験化合物は、RNAi化合物、例えば、アンチセンスRNA、siRNA、shRNA、snoRNA、マイクロRNA(miRNA)、又は小型一時的RNA(stRNA)を含む。一部の実施形態では、試験化合物は、アプタマーを含む。一部の実施形態では、試験化合物は、タンパク質又はペプチドを含む。一部の実施形態では、試験化合物は、抗体又は抗原結合性抗体断片、例えば、F(ab')2断片、Fab断片、Fab'断片、若しくはscFv断片を含む。一部の実施形態では、抗体は、単一ドメイン抗体である。一部の実施形態では、化合物は、リガンド又は受容体結合タンパク質を含む。一部の実施形態では、化合物は、遺伝子療法ベクターを含む。
【００７９】
一部の実施形態では、より多くの原発腫瘍細胞スフェロイドを、1つより多い化合物、例えば、第1の試験化合物及び第2の試験化合物、場合により、第3の試験化合物、第4の試験化合物等の存在下で培養する。
【００８０】
一部の実施形態では、試験化合物は、抗がん化合物である。一部の実施形態では、試験化合物は、化学療法化合物、免疫調節化合物、又は放射線である。
【００８１】
例示的な化学療法化合物としては、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン等が挙げられる。一部の実施形態では、試験化合物は、ビンカアルカロイド、例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビンである。一部の実施形態では、試験化合物は、アルキル化化合物、例えば、シクロホスファミド、デカルバジン、メルファラン、イホスファミド、テモゾロミドである。一部の実施形態では、試験化合物は、代謝拮抗物質、例えば、葉酸アンタゴニスト、ピリミジンアナログ、プリンアナログ又はアデノシンデアミナーゼ阻害剤、例えば、フルダラビンである。一部の実施形態では、試験化合物は、mTOR阻害剤である。一部の実施形態では、試験化合物は、プロテアソーム阻害剤、例えば、アクラシノマイシンA、グリオトキシン又はボルテゾミブである。
【００８２】
一部の実施形態では、試験化合物は、低分子阻害剤、例えば、TBK1阻害剤、MEK阻害剤、FAK阻害剤、BRD/BET阻害剤、CDK4/6阻害剤、HDAC阻害剤、DNMT阻害剤(若しくは低メチル化化合物)、MET阻害剤、EGFR阻害剤、又はBRAF阻害剤である。一部の実施形態では、試験化合物は、キナーゼ阻害剤、例えば、TBK1阻害剤、MEK阻害剤、FAK阻害剤、又はCDK4/6阻害剤である。例えば、TBK-1阻害剤は、当業界で公知であり、例えば、Yu, T.ら、「TBK1 inhibitors: a review of patent literature (2011-2014)」、Exp. Opin. On Ther. Patents 25(12); Hasan, M.ら、J. Immunol. 195(10):4573〜77頁;及びUS20150344473(それぞれの内容は参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
【００８３】
例示的な免疫調節化合物としては、CTLA-4、PD-1、PD-L1、TIM3、LAG3、B7-H3 (CD276)、B7-H4、4-1BB (CD137)、OX40、ICOS、CD27、CD28、PD-L2、CD80、CD86、B7RP1、HVEM、BTLA、CD137L、OX40L、CD70、CD40、CD40L、GAL9、A2aR、及びVISTAからなる群から選択される免疫チェックポイントタンパク質の免疫活性化化合物又は阻害剤が挙げられる。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ペプチド、抗体、干渉RNA、又は低分子である。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤、例えば、阻害剤は、モノクローナル抗体、又はIg融合タンパク質である。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体又はその抗原結合断片である。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗PD-1抗体である。
【００８４】
一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、PD1を阻害する。ヒトにおいては、プログラム細胞死タンパク質1(PD-1)は、PDCD1遺伝子によってコードされる。PDCD1は、CD279(分化クラスター279)とも呼ばれている。この遺伝子は、免疫グロブリンスーパーファミリーの細胞表面膜タンパク質をコードする。PD-1は、288アミノ酸の細胞表面タンパク質分子である。PD-1は、B7ファミリーのメンバーである2つのリガンド、PDL1及びPD-L2を有する。PD-1は、活性化されたT細胞、B細胞、及びマクロファージの表面上に発現される。PD-1は、プロ-B細胞中で発現され、その分化において役割を果たすと考えられる。T. Shinohara 5ら、Genomics 23 (3): 704〜6頁(1995)を参照されたい。PD-1は、T細胞調節因子の拡張CD28/CTLA-4ファミリーのメンバーである(Y. Ishidaら、EMBO J. 11 (11): 3887〜95頁(1992))。PD-1は、免疫応答を負に調節することができる。PD1は、自己免疫及び感染に対する炎症応答の時点での末梢組織中でのT細胞の活性を制限する。
【００８５】
本明細書で使用される場合、PD-1を阻害する免疫チェックポイント阻害剤、又はPD-1アンタゴニストは、PD-1に結合し、PD-1活性化を阻害又は防止する分子である。理論によって束縛されることを望むものではないが、そのような分子は、PD-1と、そのリガンドであるPD-L1及び/又はPD-L2との相互作用を遮断すると考えられる。
【００８６】
PD-1活性を、PD-1に選択的に結合し、その活性を遮断する抗体によって妨げることができる。PD-1の活性を、PD-1に結合する抗体以外の分子によって阻害又は遮断することもできる。そのような分子は、低分子であってもよく、又はPD-1に結合するが、PD-1を活性化しないPD-L1及びPD-L2のペプチド模倣体であってもよい。PD-1活性と拮抗する分子としては、米国特許出願公開第20130280265号、第20130237580号、第20130230514号、第20130109843号、第20130108651号、第20130017199号、及び第20120251537号、第2011/0271358号、EP 2170959B1に記載されたものが挙げられ、それらの開示全体が参照により本明細書に組み込まれる。また、M. A. Curranら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 107、4275頁(2010); S. L. Topalianら、New Engl. J. Med. 366, 2443頁(2012); J. R. Brahmerら、New Engl. J. Med. 366、2455頁(2012);及びD.E. Dolanら、Cancer Control 21、3頁(2014)も参照されたい。ここで、PD-1アンタゴニストとしては、PD-1に対する完全ヒトIgG4モノクローナル抗体である、BMS-936558(Bristol-Meyers Squibb社、MDX-1106又はONO-4538としても知られる)としても知られるニボルマブ;PD-1に結合するヒト化IgG1モノクローナル抗体である、CT-011(CureTech社)としても知られる、ピジリズマブ;抗PD-1抗体であるMK-3475(Merck社、SCH900475としても知られる);及びPD-1に対する活性を有するヒト化IgG4-カッパモノクローナル抗体である、ペンブロリズマブ(Merck社、MK-3475、ランブロリズマブ、又はKeytrudaとしても知られる)が挙げられる。PD-1をコードするDNA又はmRNAへの結合を妨害する化合物も、PD-1阻害剤として作用することができる。例としては、低分子阻害的抗PD-1 RNAi、抗PD-1アンチセンスRNA、又はドミナントネガティブタンパク質が挙げられる。PD-L2融合タンパク質AMP-224(Glaxo Smith Kline社とAmplimmune社とによって共同開発された)は、PD-1に結合し、これを遮断すると考えられる。
【００８７】
一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、PD-L1を阻害する。ヒトにおいては、B7ホモログ1(B7-H1)又は分化クラスター274(CD274)としても知られるプログラム細胞死リガンド1(PD-L1)は、CD274遺伝子によってコードされる40kDaの1型膜貫通タンパク質である。外来抗原は通常、抗原特異的CD8+T細胞等の抗原特異的T細胞の増殖を誘発する免疫応答を誘導する。PD-L1は、そのような免疫応答を遮断するか、又は低下させることができる免疫チェックポイント阻害剤である。PD-L1は、妊娠、組織同種移植、自己免疫疾患、並びに肝炎及びがん等の他の疾患状態等の事象の間に免疫系を抑制する際に大きな役割を果たし得る。PD-L1リガンドは、活性化されたT細胞、B細胞、及び骨髄細胞上に見出される、その受容体PD-1に結合し、それによって、活性化又は阻害をモジュレートする。PD-1に加えて、PD-L1も、共刺激分子CD80(B7-1)に対する親和性を有する。IFN-γ刺激の際に、PDL1は、T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、マクロファージ、骨髄性樹状細胞(DC)、B細胞、上皮細胞、及び血管内皮細胞上で発現される。
【００８８】
PD-L1活性を、PD-L1に選択的に結合し、その活性を遮断する分子によって遮断することができる。抗PD-L1抗体は、PD-L1と、PD-1とB7-1(CD80としても知られる)との両方との相互作用を遮断する。遮断とは、PD-L1によって媒介される阻害シグナルの伝達の阻害又は遮断を意味する。PD-L1アンタゴニストとしては、例えば、PD-L1に対する完全ヒト高親和性免疫グロブリン(Ig)G4モノクローナル抗体である、MDX-1105としても知られるBMS-30936559 (Bristol-Myers Squibb社);PDL1を標的とする操作されたヒトモノクローナル抗体である、RG7446又はアテゾリズマブとしても知られるMPDL3280A (Genentech社/Roche社);PD-L1に結合する完全ヒトIgG1モノクローナル抗体である、アベルマブとしても知られるMSB0010718C (Merck社);及びその5つの受容体に結合するPD-L1を遮断するヒト免疫グロブリン(Ig)G1κモノクローナル抗体である、MEDI473 (AstraZeneca社/MedImmune社)が挙げられる。PD-L1をコードするDNA又はmRNAに結合する化合物もまた、PD-L1阻害剤、例えば、低分子阻害的抗PDL1 RNAi、低分子阻害的抗PD-L1 RNA、抗PD-L1アンチセンスRNA、又はドミナントネガティブPD-L1タンパク質として作用することができる。PD-L1のアンタゴニスト又はPD-L1に拮抗する化合物、例えば、抗PD-L1抗体及びPD-L1アンタゴニストは、限定されるものではないが、以前に記載されたもの、並びにStewartら、2015、3(9):1052〜62頁; Herbstら、2014、Nature 515:563〜567頁; Brahmerら、N Engl J Med 2012; 366:2455〜2465頁; US8168179; US20150320859;及び/又はUS20130309250(全て参照により本明細書に組み込まれる)に開示されたもののいずれかを含んでもよい。
【００８９】
一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、CTLA-4を阻害する。CTLA-4(CTLA-4又は分化クラスター152(CD152)としても知られる)は、ヒトにおいて、CTLA-4遺伝子によってコードされる膜貫通糖タンパク質である。CTLA-5は、ヘルパーT細胞の表面上に発現され、調節性T細胞中に存在する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、免疫機能にとって重要であり得る。CTLA-4は、相同なCD28と同様、抗原提示細胞(APC)上のB7分子、特に、CD80/B7-1及びCD86/B7-2に結合し、それによって、阻害シグナルをT細胞に送る。CTLA-4は、免疫系を阻害する免疫チェックポイントとして機能し、免疫寛容の維持にとって重要である。
【００９０】
CTLA-4活性を、CTLA-4に選択的に結合し、その活性を遮断するか、又はその対抗受容体、例えば、CD80、CD86等に選択的に結合し、CTLA-4の活性を遮断する分子によって遮断することができる。遮断とは、CTLA-4による阻害シグナルの伝達の阻害又は防止を意味する。CTLA-4アンタゴニストとしては、例えば、CD80、CD86、及び/又はCTLA-4に対する阻害抗体;CD80、CD86、及びCTLA-4の低分子阻害剤;CD80、CD86、及び/又はCTLA-4に対するアンチセンス分子;CD80、CD86、及び/又はCTLA-4に対するアドネクチン;並びにCD80、CD86、及び/又はCTLA-4のRNAi阻害剤(一本鎖と二本鎖との両方)が挙げられる。
【００９１】
好適なCTLA-4アンタゴニスト及び/又は抗CTLA-4抗体としては、MDX-010/イピリムマブ(Bristol-Myers Squibb社)、トレメリムマブ/CP-675,206(Pfizer社;AstraZeneca社)、並びにPCT公開第WO 2001/014424号、PCT公開第WO 2004/035607号、米国特許出願公開第2005/0201994号、欧州特許第EP 1212422 B1号、米国特許第5,811,097号、第5,855,887号、第6,051,227号、第6,984,720号、第7,034,121号、第8,475,790号、米国特許出願公開第2002/0039581号及び/又は第2002/086014号(それらの開示全体が参照により本明細書に組み込まれる)に開示されている抗体等の、ヒト化抗CTLA-4抗体が挙げられる。本開示の方法において使用することができる他の抗CTLA-4抗体及び/又はCTLA-4アンタゴニストとしては、例えば、Hurwitzら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(17):10067〜10071頁(1998); Camachoら、J. Clin. Oncology, 22(145): Abstract No. 2505 (2004) (抗体CP9675206); Mokyrら、Cancer Res., 58:5301〜5304頁(1998)、並びにLipson及びDrake、Clin Cancer Res; 17(22) 2011年11月15日; US8318916;及び/又はEP1212422B1(これらは全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)に開示されたものが挙げられる。
【００９２】
一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、VISTAを阻害する。T細胞活性化のVドメインIgサプレッサー(VISTA)(PD-H1、PD-1ホモログ、又はDies1としても知られる)は、T細胞機能の負の調節因子である。VISTAは、7個のエクソンから構成される309アミノ酸のI型膜貫通タンパク質であり、1個のIg-V様ドメインを有し、その配列はCD28及びB7ファミリーのメンバーのIg-Vドメインと類似する。VISTAは、腫瘍微小環境(TME)中で、及び造血幹細胞上で高度に発現される。それはまた、マクロファージ、樹状細胞、好中球、ナチュラルキラー細胞、並びにナイーブな、及び活性化されたT細胞上でも発現される。その発現は、骨髄抗原提示細胞(APC)及びT細胞上で高度に調節されるが、CD4+T細胞、CD8+T細胞、及びTreg細胞上ではより低レベルで見出される。VISTAは、PD-1リガンドであるPD-L1とのいくらかの配列相同性を示すが、2つの免疫チェックポイント阻害剤は構造的に異なり、異なるシグナル伝達経路を有する。VISTA遮断は、マウスにおいては抗腫瘍免疫応答を増強することが示されているが、ヒトにおいては、関連するPD-1経路の遮断は、臨床免疫療法治験において大きな可能性を示した。VISTAは、T細胞活性化を抑制する負のチェックポイント調節因子であり、その遮断は、ヒトがんのための有効な免疫療法戦略であり得る。VISTA(その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Wangら、2011、JEM. 208(3):577〜92頁; Linesら、2014、Cancer Res. 74(7):1924〜32頁; Kondoら、2015、J. of Immuno.V194.; WO2011120013; US20140105912; US20140220012; US20130177557)。
【００９３】
VISTA活性を、VISTAに選択的に結合し、その活性を遮断する分子によって遮断することができる。VISTAアンタゴニストである分子又は化合物としては、VISTAに結合するペプチド、VISTAに対するアンチセンス分子、VISTAを分解又は阻害するように標的化された一本鎖又は二本鎖RNAi分子、VISTAの低分子阻害剤、抗VISTA抗体、VISTAに対する阻害抗体、及びVISTAに選択的に結合し、それを阻害するヒト化抗体が挙げられる。VISTAのアンタゴニスト又はVISTAに拮抗する化合物、例えば、抗VISTA抗体及びVISTAアンタゴニストは、限定されるものではないが、Liuら、2015. PNAS. 112(21):6682〜6687頁; Wangら、2011. JEM. 208(3):577〜92頁; Linesら、2014. Cancer Res. 74(7):1924〜32頁; Kondoら、2015. J. of Immuno.V194; WO2015097536、EP2552947、WO2011120013、US20140056892、US8236304、WO2014039983、US20140105912、US20140220012、US20130177557; WO2015191881; US20140341920; CN105246507;及び/又はUS20130177557(全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)に開示されているもののいずれかを含んでもよい。
【００９４】
一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、TIM-3を阻害する。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、LAG-3を阻害する。
【００９５】
一部の実施形態では、試験化合物の組合せは、細胞培養物中で試験される。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤の組合せは、PD1阻害剤と、CTLA-4阻害剤とを含む。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤の組合せは、PD1阻害剤と、TIM-3阻害剤とを含む。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤の組合せは、PD1阻害剤と、LAG-3阻害剤とを含む。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤の組合せは、PD-L1阻害剤と、CTLA-4阻害剤とを含む。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤の組合せは、PD-L1阻害剤と、TIM-3阻害剤とを含む。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤の組合せは、PD-L1阻害剤と、LAG-3阻害剤とを含む。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤の組合せは、CTLA-4阻害剤と、TIM-3阻害剤とを含む。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤の組合せは、CTLA-4阻害剤と、LAG-3阻害剤とを含む。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤の組合せは、TIM-3阻害剤と、LAG-3阻害剤とを含む。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤の組合せは、PD1阻害剤、CTLA-4阻害剤、及びTIM-3阻害剤を含む。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤の組合せは、PD1阻害剤、CTLA-4阻害剤、及びLAG-3阻害剤を含む。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤の組合せは、PD1阻害剤、TIM-3阻害剤、及びLAG-3阻害剤を含む。一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤の組合せは、CTLA-4阻害剤、TIM-3阻害剤、及びLAG-3阻害剤を含む。
【００９６】
一部の実施形態では、試験化合物の組合せは、免疫チェックポイント阻害剤と、低分子化合物とを含む。一部の実施形態では、試験化合物の組合せは、免疫チェックポイント阻害剤と、TBK-1阻害剤とを含む。一部の実施形態では、試験化合物の組合せは、PD-1阻害剤と、TBK-1阻害剤とを含む。一部の実施形態では、試験化合物の組合せは、PD-L1阻害剤と、TBK-1阻害剤とを含む。一部の実施形態では、試験化合物の組合せは、CTLA-4阻害剤と、TBK-1阻害剤とを含む。一部の実施形態では、試験化合物の組合せは、VISTA阻害剤と、TBK-1阻害剤とを含む。一部の実施形態では、試験化合物の組合せは、TIM-3阻害剤と、TBK-1阻害剤とを含む。一部の実施形態では、試験化合物の組合せは、LAG-3阻害剤と、TBK-1阻害剤とを含む。
【００９７】
一部の実施形態では、免疫活性化化合物は、CD28アンタゴニスト、例えば、抗CD28抗体である。抗体、又は免疫グロブリンは、それぞれ、約200個のアミノ酸を含有する2個の同一の軽鎖(L鎖)と、一般的には、L鎖の少なくとも2倍の長さである2個の同一の重鎖(H鎖)とを含有する糖タンパク質である。抗体のパラトープは、抗原の特定のエピトープに特異的であり、その空間的相補性(結合)は、更なる作用のために微生物を「タグ付け」するか、又はその作用を直接中和する。抗体は、保存されたグリコシル化部位を含むその結晶性断片(Fc)領域を介して免疫応答の他の成分と連絡する。5つの異なる抗体アイソタイプ:IgA、IgD、IgE、IgG、及びIgMをもたらす5つのFc領域が存在する。IgDは、抗原に曝露されていないB細胞上で抗原受容体として機能し、好塩基球及び肥満細胞を活性化し、抗微生物因子の産生をもたらす。4つの形態で発現されるIgGは、侵入病原体に対する抗体に基づく免疫の大部分を提供する。IgMは、単量体としてB細胞の表面上に発現され、五量体として分泌形態で発現される。それは、十分なレベルのIgGが存在する前に初期段階の体液性(B細胞媒介性)免疫の間に病原体を排除する。IgGは、免疫療法において頻繁に使用される。
【００９８】
抗体という用語は、最も広い意味で使用され、具体的には、例えば、単一のモノクローナル抗体、多エピトープ性特異性を有する抗体組成物、一本鎖抗体、及び抗体の抗原結合性断片を含む。抗体は、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4サブタイプ、IgA(IgA1及びIgA2を含む)、IgE、IgD又はIgM等の任意の免疫グロブリンに由来する免疫グロブリン定常ドメインを含んでもよい。
【００９９】
蛍光光源は、フルオロフォアを励起するための励起波長を提供する。蛍光光源を、励起されたフルオロフォアによって放出される総蛍光を検出することができる感光検出器と接続して使用して、画像を生成することができる。蛍光顕微鏡を、蛍光光源と、感光検出器とを含むように構成することができる。蛍光顕微鏡は、当業界で入手可能であり、市販されている。当業者であれば、所望のイメージング及び/又は分析のための適切な能力を有する顕微鏡を選択することができる。
【０１００】
蛍光顕微鏡は、直立又は倒立構成で利用可能であり、そのいずれかは提供される方法と共に使用するのに好適である。直立顕微鏡構成では、対象物及び感光検出器、例えば、カメラは、ステージの上に配置され、下を向いている。例示的な直立蛍光顕微鏡としては、限定されるものではないが、Nikon Eclipse 80i蛍光顕微鏡が挙げられる。倒立顕微鏡構成では、光源はステージの上に配置され、下を向いており、対象物はステージの下に配置され、上を向いている。
【０１０１】
一部の実施形態では、蛍光顕微鏡は、適切な励起波長の光が、対物レンズを通って、検査しようとする試料上に行く落射蛍光顕微鏡である。一部のそのような実施形態では、蛍光は、光が最初に通過したのと同じ対物レンズを通って試料から放出され、次いで、感光検出器、例えば、カメラを介して検出される。一部の例では、二色性ビームスプリッターを使用して、シグナル対ノイズ比を増大させるために、残りの蛍光を反射しながら、特定の波長の蛍光が通過するのを可能にすることによって、放出された蛍光を濾過することができる。一部の実施形態では、蛍光顕微鏡は、共焦点顕微鏡である。共焦点顕微鏡を使用して、例えば、一連の光学切片画像から3次元構造を生成することができる。一部の実施形態では、蛍光顕微鏡は、全内部反射蛍光顕微鏡である。
【０１０２】
一部の実施形態では、蛍光顕微鏡は、異なる波長で2つ以上の異なるフルオロフォア色素からの蛍光の放出の測定を可能にするように構成される。例えば、一部の実施形態では、蛍光顕微鏡は、2つ以上の異なるフルオロフォア色素によって放出される蛍光の分離を可能にするフィルター配置を含有する。
【０１０３】
一部の実施形態では、顕微鏡は、マイクロ流体デバイスが配置されるステージを動かすことによって同じマイクロ流体デバイスの複数の捕捉画像の測定を可能にするように構成される。一部の実施形態では、ステージは、電動ステージである。電動ステージは当業界で公知であり、市販されている。一部の実施形態では、ステージは、1次元的に動く、例えば、x軸で動くように構成される。一部の実施形態では、ステージは、2次元的に動く、例えば、x軸とy軸で動くように構成される。一部の実施形態では、ステージは、3次元で動かないように、例えば、z軸で動かないように構成される。一部のそのような実施形態では、3次元マイクロ流体デバイス中の腫瘍細胞スフェロイドの焦点面は、蛍光検出を通して同じままである。
【０１０４】
一部の実施形態では、腫瘍細胞スフェロイドの3次元分析が実施される。例えば、一部の実施形態では、ステージは、3次元で動くように構成され、例えば、x、y及びz軸で動く。そのような実施形態では、複数の切片(例えば、焦点面)の画像を取得して、当業界で利用可能な顕微鏡、感光検出器、及びソフトウェアを使用して、Zスタックを生成することができる。例えば、市販のProScanコントローラー及びTTL Breakout Box (Prior Scientific社、Rockland、MA)を使用して、Zスタック画像獲得のためのCCDカメラを制御することができる。
【０１０５】
蛍光放出検出の全体的な解像度は、検出シグナルが通過する対物レンズの倍率、及び/又は感光検出デバイス、例えば、カメラの倍率に依存する。一部の実施形態では、対物レンズの倍率は、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも10倍、少なくとも40倍、少なくとも100倍である、又はそれより大きい。一部の実施形態では、感光検出デバイス、例えば、カメラの倍率は、0倍である。一部の実施形態では、感光検出デバイス、例えば、カメラの倍率は、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも10倍であるか、又はそれより大きい。一部の実施形態では、蛍光検出の全体的な解像度は、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも10倍、少なくとも40倍、少なくとも100倍、少なくとも400倍、少なくとも1000倍であるか、又はそれより大きい。一部の実施形態では、蛍光が検出される解像度は、腫瘍細胞スフェロイドを含有する3次元デバイスの全視野を、焦点面を調整することなく画像化することができるようなものである。
【０１０６】
フルオロフォア色素によって放出される蛍光の画像は、感光検出器を使用して検出及び/又は捕捉される。総蛍光を検出することができる感光検出器は、当業界で公知であり市販されている。一部の実施形態では、感光検出器は、カメラ又はフォトダイオードである。一部の実施形態では、カメラは、CCDカメラである。例示的なカメラとしては、限定されるものではないが、CoolSNAP CCDカメラ(Roper Scientific社)が挙げられる。一部の実施形態では、フォトダイオードは、アバランシェフォトダイオードである。
【０１０７】
画像を感光検出器によって獲得し、例えば、市販のソフトウェアを使用して分析することができる。例示的な画像捕捉及び分析ソフトウェアとしては、限定されるものではないが、NIS-Elements ARソフトウェアパッケージ(Nikon)が挙げられる。一部の実施形態では、マイクロ流体デバイスの複数の画像を、検出器によって捕捉し、一緒に縫合する。画像を、AutoQuant (Media Cybernetics社)等の市販のプログラムを使用して解析することができる。
【０１０８】
本発明を、いかなる意味でも更なる限定と解釈されるべきではない以下の実施例によって更に例示する。本出願を通して引用される全ての参考文献(文献参照、発行された特許、公開された特許出願、及び係属中の特許出願を含む)の全内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【実施例】
【０１０９】
(実施例1)
ex vivoでのプロファイリングのための材料及び方法
患者試料
Massachusetts General Hospital及びDana-Farber Cancer Instituteで処置された患者のコホート(Table S1-1(表4)及びTable S1-2(表5))を、2015年8月から2016年8月までの間、PDOTSプロファイリング及び培養のために集めた。全ての対象からインフォームドコンセントを取得した。腫瘍試料を収集し、Dana-Farber/Harvard Cancer Center IRBによって認可されたプロトコールに従って分析した。これらの研究は、Declaration of Helsinkiに従って行われ、MGH及びDFCI IRBによって認可された。MGH Melanoma Tissue Bankに由来する脱同定された記録一致した血漿及び組織試料を、示されたように抗PD-1療法を用いる処置前又は処置中の患者から取得した。変異分析を、MGH及びDFCIでの臨床的に検証された次世代配列決定(NGS)プラットフォーム上で実施した。PD-1に対する臨床利益(CB)を、疾患の非存在、腫瘍体積の減少(X線若しくは臨床)、又は安定疾患と定義したが、臨床利益を示さない患者(NCB)は、混合応答を示す患者、進行又は処置、及び一次非応答者を含んでいた。
【０１１０】
【表４Ａ】
2020515260.tif 000006
【０１１１】
【表４Ｂ】
2020515260.tif 000007
【０１１２】
【表５Ａ】
2020515260.tif 000008
【０１１３】
【表５Ｂ】
2020515260.tif 000009
【０１１４】
【表５Ｃ】
2020515260.tif 000010
【０１１５】
【表５Ｄ】
2020515260.tif 000011
【０１１６】
同系マウスモデル
全ての動物実験は、確立された倫理規則を順守して実施され、Dana-Farber Animal Care and Use Committeeによって認可されたものであった。MC38マウス結腸腺癌細胞は、Dr. Gordon Freeman (DFCI)によって寛大に提供され、NCI (Bethesda、MD)のDr. Jeffrey SchlomからMTAの下で受領した。B16F10メラノーマ細胞、CT26結腸癌細胞、及びEMT6乳腺癌細胞は、ATCCから取得した。細胞を拡張し、マイコプラズマ及びマウス病原体について試験したところ、それらを含んでいなかった。解凍した細胞を、5%CO2で維持した加湿されたインキュベーター中、37℃で10%熱不活化FBSを添加したDMEM(MC38、B16F10)又はRPMI1640(CT26)中で最大3回の継代にわたって培養した。血球計とInvitrogen Countess Cell Counterの両方による実行の前に細胞の計数を実施した。滅菌PBS(Ca+、Mg+を含まない)中に再懸濁した、MC38結腸癌細胞、CT26結腸癌細胞、及びB16F10メラノーマ細胞(100μL中の5x105個の細胞/マウス)を、8週齢のメスのC57BL/6アルビノマウス又はBalb/c (Jackson社)に注入し、埋込みの2〜3週後に、又はサイズが2000mm3に達した際(又は1週間で15%を超えるBWの減少若しくは瀕死等の人道的な理由が存在していた場合)に腫瘍を収集し、以下に記載のようにMDOTSを調製した。CT26結腸癌細胞の埋込みを、同一の様式でBALB/cマウスを使用して実施した。in vivo処置研究のために、マウスを無作為化(決定論的方法を使用する)した後、10mg/kgのアイソタイプ対照IgG(クローン2A3、BioXCell社)又はラット抗マウスPD-1(クローンRMP1-14、BioXCell社)を、3日毎に8用量分注射し、示されるように腫瘍体積を測定した。調査者は処置群に対して盲検ではなかった。初期腫瘍体積が約100mm3になった後、週ベースで腫瘍体積(TV)をモニタリングした。指数腫瘍増殖期に週2回、TVを測定し、埋込み後、週ベースで体重をモニタリングした。
【０１１７】
スフェロイドの調製及びマイクロ流体培養
新鮮な腫瘍標本(マウス及びヒト患者)を、氷上、培地(DMEM)中で受け取り、滅菌鉗子及び外科用メスを使用して10cm皿(氷上)中で細断した。細断された腫瘍を、RPMI中で調製したCT26腫瘍を除いて、DMEM(4.5mMグルコース、100mMピルビン酸ナトリウム、1:100ペニシリン-ストレプトマイシン)(Corning CellGro社、Manassas、VA)+10%FBS(Gemini Bio-Products社、West Sacramento、CA)、100U/mLコラゲナーゼIV型(Life Technologies社、Carlsbad、CA)、及び15mM HEPES(Life Technologies社、Carlsbad、CA)中に再懸濁した。試料を沈降させ、10〜20mLの培地中に再懸濁した。RBC Lysis Buffer (Boston Bio-Products社、Ashland、MA)を使用して、目に見えて血液性の試料から赤血球を除去した。試料を沈降させた後、新鮮なDMEM + 10%FBS中に再懸濁し、100μmフィルター及び40μmフィルター上で濾してS1(100μmを超える)、S2(40〜100μm)、及びS3(40μm未満)スフェロイド画分を生成した後、超低接着組織培養プレート中で維持した。S2画分を、ex vivoでの培養のために使用した。S2画分のアリコートを沈降させ、NaOHを使用してpHを調整した(pH7.0〜7.5、PANPEHA Whatman用紙(Sigma-Aldrich社、St.Louis、MO)を使用して確認した)フェノールレッドを含む10xPBSを添加した後、I型ラット尾部コラーゲン(Corning社、Corning、NY)中に、2.5mg/mLの濃度で再懸濁した。次いで、スフェロイド-コラーゲン混合物を、3Dマイクロ流体培養デバイスの中心ゲル領域中に注入した。PDOTS/MDOTSを含有するコラーゲンヒドロゲルを、37℃で30分後、示された治療的モノクローナル抗体を含む、又は含まない培地で水和した。MDOTSを、アイソタイプ対照IgG(10μg/mL、クローン2A3)又は抗PD-1(0.1、1.0、10μg/mL、クローンRMP1-14)で処理した。モノクローナルラット抗マウスCCL2(5μg/mL、クローン123616、R&D Systems社)を、MDOTS中でのCCL2中和のために使用した。PDOTSを、抗PD-1(ペンブロリズマブ、250μg/mL)、抗CTLA-4(イピリムマブ、50μg/mL)、又は組合せ(250μg/mLのペンブロリズマブ+50μg/mLのイピリムマブ)で処理した。10mg/kg(FDA CDER適用)の投与後、各薬物の報告されたピーク血漿濃度と一致するように用量を選択した(臨床的に使用されるストック濃度の1:100希釈液)。選択実験では、PDOTSを、InVivoMAbヒトIgGアイソタイプ対照(BioXCell社)で処理した。免疫細胞を欠くスフェロイド培養のために、MC38又はCT26細胞(1x106個)を、24時間にわたって低接着条件で播種し、濾過した(上記のように)。S2画分を沈降させ、コラーゲン中に再懸濁した後(上記のように)、マイクロ流体培養を行った。
【０１１８】
マウス腫瘍及びMDOTSのフローサイトメトリーによる免疫プロファイリング
MC38及びB16F10同系マウスモデルに由来する腫瘍を、上記のように調達した。PBS中で1:500に希釈したZombie NIR Fixable Viability Kit (Biolegend社、423105)を使用して、暗室中、室温で20分間、細胞をインキュベートした。フローサイトメトリー染色緩衝液(PBS + 5%FBS)中、1:100希釈率で、4℃で15分間、抗マウスCD16/CD32クローン2.4G2ブロッキングAb(Fisher Scientific社)と共にインキュベートすることにより、FcRを遮断した。フローサイトメトリー染色緩衝液中に希釈された以下のAb(総染色容量100μL):リンパ球染色パネル-CD45 AF488(BioLegend社、103122)、CD25 PE(BioLegend社、101904)、CD19 PE-Dazzle (115554)、CD49b PE-Cy7 (BioLegend社、108922)、CD3 BV421 (BioLegend社、100228)、CD8 BV510 (BioLegend社、100752)、CD4 BV786 (Fisher Scientific社、#BDB563331);骨髄染色パネル-F4/80 AF488 (BioLegend社、#123120)、MHCII PE (BioLegend社、#107608)、CD11c BV421 (BioLegend社、#117330)、Ly6G BV510 (BioLegend社、#127633)、CD11b BV650 (BioLegend社、#101239)、Ly6C BV711 (BioLegend社、#128037)、CD45 BV786 (Fisher Scientific社、#BDB564225)、CD19 APC-Cy7 (BioLegend社、#115530)、及びCD49b APC-Cy7 (BioLegend社、#108920)を使用して、4℃で20分間インキュベートすることにより、細胞表面染色を実施し、これらはZombie NIR生存能力染色によって決定された死細胞と共にダンプチャネルとして使用される骨髄染色パネルと共に含まれていた。細胞表面染色の後、室温で10分間、200μLのIC Fixation Buffer (eBioscience社、#00-8222-49)中でインキュベートすることにより、細胞を固定した。細胞を洗浄し、フローサイトメトリー染色緩衝液中に再懸濁し、次の日、BD LSR Fortessaフローサイトメーター上で読み取った。データを、FlowJoソフトウェアバージョン10.0.8を使用して分析した。
【０１１９】
PDOTS及びヒト腫瘍試料のフローサイトメトリーによる免疫プロファイリング
100mgの元の試料質量あたり、250μLのL/D 1X希釈液の比で、FACS緩衝液(PBS + 2%FBS)中、暗室中、室温で8分間、Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit (Life Technologies社、Carlsbad、CA)又は暗室中、室温で5分間、Live/Dead Fixable Zombie NIRTM (Biolegend社、San Diego、CA)と共に細胞をインキュベートした。表面マーカー及び細胞内染色を、製造業者のプロトコール(eBioscience社、San Diego、CA)に従って実施した。Human FcR Blocking Reagent (Miltenyi社、San Diego、CA)を使用して、表面抗体染色の前にFcRを遮断した。細胞を1%PBS + 2%FBS中で固定し、洗浄した後、FACSDivaソフトウェア(BD Biosciences社、San Jose、CA)を含むBD LSRFortessa上で分析した。データを、FlowJo (Ashland社、OR)ソフトウェアバージョン10.0.8を使用して分析した。細胞生存能力を、陰性生/死細胞染色によって決定した。抗体は、以下のヒトマーカー: CD3 (HIT3a; UCHT1)、CD8 (RPA-T8)、CD14 (M5E2; MphiP9)、CD45 (HI30)、CD56 (B159)、CCR7 (150503)、EpCAM (EBA-1)、HLA-DR (G46-6)、PD-1 (EH12.1)、及びBD Biosciences社(San Jose、CA)製のIgG1アイソタイプ対照(MOPC-21); CD3 (UCHT1)、CD4 (RPA-T4)、CD14 (M5E2)、CD15 (W6D3)、CD16 (3G8)、CD19 (HIB19)、CD25 (BC96)、CD33 (WM53)、CD38 (HIT2)、CD40L (24-31)、CD45 (HI30)、CD45RA (HI100)、CD45RO (UCHL1)、CD56 (HCD56; 5.1H11)、CD66b (G10F5)、CD69 (FN50)、CD123 (6H6)、CD163 (GHI/61)、CTLA-4 (L3D10)、CX
CR5 (J252D4)、EpCAM (9C4)、Ki-67 (Ki-67)、PD-1 (EH12.2H7)、PD-L1 (29E.2A3)、PD-L2 (24F.10C12)、TIM-3 (F38-2E2)、BioLegend社(San Diego、CA)製のIgG2aアイソタイプ対照(MOPC-173)、IgG2bアイソタイプ対照(MPC-11)、及びIgG1アイソタイプ対照(MOPC-21); Cell Signaling Technologies社(Danvers、MA)製のパン-サイトケラチン(C11)及びPD-L1 (E1L3N); Affymetrix社/eBioscience社(San Diego、CA)製のCD45 (2D1)、FOXP3 (236A/E7)、及びIL-10 (236A/E7)に特異的であった。免疫細胞(CD45+)、腫瘍細胞(CD45-CD31-CD90-)、がん関連線維芽細胞(CD45-CD31-CD90+)、及び内皮細胞(CD45-CD31+CD144+)の4つの方法でのフロー選別を、単一ステイン対照を使用するゲートセット及び以下の抗体: CD31-APC (Biolegend社、303115)、CD45-BV711 (Biolegend社、304050)、CD90-PE/Cy7 (Biolegend社、328123)、及びCD144-PE (Biolegend社、348505)を使用する手動補正を用いてBD Aria II SORP上で行った。細胞を、冷PBS中で選別し、氷上で保存した後、確立された技術を使用してmRNAを抽出した。
【０１２０】
マイクロ流体デバイスの設計及び製造
マイクロ流体デバイスの設計及び製造を、より大きい容量の培地を収容するためにデバイスの寸法を改変して、当業界で公知の方法に従って実施した(例えば、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれるAref, A. R.ら、Integr. Biol. (Camb.) (2013))。また、選択研究のために、DAX-1 3D細胞培養チップ(AIM Biotech社、Singapore)を使用して、MDOTSも評価した。
【０１２１】
生/死細胞染色
マイクロ流体デバイスに、Nexcelom ViaStain(商標)AO/PI Staining Solution (Nexcelom社、CS2-0106)をロードすることにより、二重標識化を実施した。色素と共にインキュベートした後(暗室中、室温で20分間)、Zスタック(Prior社)及びCoolSNAP CCDカメラ(Roper Scientific社)を装備したNikon Eclipse 80i蛍光顕微鏡上で画像を捕捉した。画像の捕捉及び分析を、NIS-Elements ARソフトウェアパッケージを使用して実施した。AutoQuant Moduleを使用して、画像解析を行った。複数の捕捉物を縫い合わせることにより、全デバイス画像を達成した。生細胞及び死細胞の定量化を、それぞれの色素の総細胞面積を測定することによって実施した。3つの異なる研究室が、PD-1遮断後のMC38 MDOTSの免疫媒介性細胞死を検証した。CD8+T細胞の細胞傷害性を阻害するために、CT26 MDOTSを、10μg/mLの抗CD8α  Ab(クローン53-6.72、BioXCell社)で処理した。上記のようなCT26同種移植片を使用して、腫瘍間及び腫瘍内不均一性実験を実施した。より小さい同種移植片から調製されたMDOTSと共に、より大きい腫瘍の別々の小片を使用してMDOTSを調製した。MDOTSを、上記のようにプロセシングし、処理し、プロファイリングした。CD8+T細胞に関する免疫蛍光を、以下に記載のように実施した。
【０１２２】
免疫蛍光及び低速度撮影イメージング
免疫蛍光研究のために、PDOTS及びMDOTSをPBSで洗浄し、室温で30分間、FcRブロッキング試薬(PDOTS-Miltenyi社、Cambridge、MA、MDOTS-BioLegend社、San Diego、CA)で遮断した。PDOTSのための直接コンジュゲート化抗体は、CD326 EpCAM-PE (クローン9C4)、CD45-AlexaFluor-488 (HI30)、CD8a-AlexaFluor488 (RPA-T8)であり; MDOTSについては、CD45-AlexaFluor488又は647 (30-F11)、CD8a-PE (53-6.7) (BioLegend社、San Diego、CA)であった。抗体を、PBS中のHoechst 33342 (Thermo Fisher Scientific社、Waltham、MA)の10μg/mL溶液中で1:50に希釈し、暗室中、室温で1時間のインキュベーションのためにマイクロ流体デバイス中にロードした。スフェロイドを、0.1%Tween20を含むPBSで2回洗浄した後、PBSで洗浄した。生存能力評価のために、マイクロ流体デバイスに、PBS中のカルセインAM(Thermo Fisher Scientific社、Waltham、MA)の1:1000溶液をロードした。Zスタック(Prior社)及びCoolSNAP CCDカメラ(Roper Scientific社)を装備したNikon Eclipse 80i蛍光顕微鏡上で画像を捕捉した。画像の捕捉及び分析を、NIS-Elements ARソフトウェアパッケージを使用して実施した。明視野低速度撮影画像を、加湿され、温度制御されたチャンバー中、10x NA 0.3対物及び冷却したCCDカメラ(Orca R2、Hamamatsu社)を用いて捕捉した。発光は、CoolLED pe-100白色LEDによるものであった。経時的ないくつかの視野の低速度撮影イメージングを、LED及びカメラと共にPrior電動ステージのNISElementsソフトウェアによって制御した。
【０１２３】
サイトカインプロファイリング
Bio-plex 200システム(カタログ番号171000201)上で、2つの多重アッセイ、Bio-Plex Pro(商標)Human Cytokine 40-plex Assay (カタログ番号171AK99MR2)及びBio-Plex Pro(商標)Mouse Cytokine Panel 1,23-plex (カタログ番号M60009RDPD)を、ビーズに基づく免疫アッセイ手法を使用して実施した。それぞれのタンパク質のMDOT/PDOT条件化培地濃度レベル[pg/mL]は、5パラメータ曲線適合モデルに由来するものであった。MDOT/PDOT対照と比較した倍数変化を算出し、log2FCとしてプロットした。定量の下限及び上限(LLOQ/ULOQ)を、検出より上又は下のサイトカインに関する標準曲線から帰属させた。PDOTSに由来する条件化培地をきちんとアッセイし、血漿を1:4に希釈した。
【０１２４】
三次リンパ様構造評価
抗PD-1による療法前及び療法中のメラノーマのヘマトキシリン&エオシン(H&E)で染色した52の切片を、これらの腫瘍の末梢での三次リンパ様構造(TLS)の存在について2人の皮膚科医によって独立に評価した。これらのものは、図10Aに示されるように、時には、胚中心形成及び関連する高内皮細静脈と共に、顕著なリンパ球浸潤を特徴とする。
【０１２５】
RNA-seq
新鮮に単離された患者腫瘍試料(DF/HCCプロトコール11-181に同意した患者由来)を、液体窒素中で簡易凍結し、Qiagen RNeasy Miniキットを使用してRNAを収集した。RNAライブラリーを、標準的なIllumina社のプロトコールを使用して、試料あたり250ngのRNAから調製した。RNA配列決定を、Broad Institute (Illumina社、HiSeq2000)及びWistar Institute (Illumina社、NextSeq 500)で実施した。RNA試料をリボゼロ処理した後、Epicentre社のScriptSeq Complete Goldキットを使用してライブラリープレップにかけた。品質チェックを、High Sensitivity DNAキットを使用してBioanalyzer上で行い、定量化を、KAPA Quantificationキットを使用して実行した。生のRNA-seqデータ(BAMファイル)のリード数を、ペアエンドのみし、キメラではなかったパラメータを用いるfeatureCountsによってまとめ、良好にマッピングされた(20以上のマッピング品質)リードを計数する。次いで、正規化を適用して、edgeR、かくして、RPKM(100万のマッピングされたリードあたり転写物1キロベースあたりのリード)により、配列決定深度及び遺伝子長に由来する偏りを除去した。
【０１２６】
定量的リアルタイムPCR
定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)によるCCL19及びCXCL13の発現レベルの分析を、転移性メラノーマを有する患者から得られた組織試料を使用して実施した。試料を、処理前及び処理中に利用可能な組織と共に抗PD-1療法で処置した患者から選択した。全ての患者が、DF/HCCプロトコール11-181(Melanoma Tissue and Blood Collection)に対する同意文書を提供した。組織試料を液体窒素中で簡易凍結し、プロセシングしてRNAを得て、抽出後に-80℃で保存した。正常リンパ節組織を、CCL19及びCXCL13の発現に関する陽性対照として使用した。プライマーを、CXCL13(Fwd: 5'-GAGGCAGATGGAACTTGAGC-3'(配列番号1)、Rev: 5'-CTGGGGATCTTCGAATGCTA-3'(配列番号2))及びCCL19 (Fwd: 5'-CCAACTCTGAGTGGCACCAA-3' (配列番号3)、Rev: 5'-TGAACACTACAGCAGGCACC-3'(配列番号4))のために設計し、総RNAを、QIAGEN TissueRuptorを用いて粉砕した後、QIAGEN RNeasy Mini Kitにより抽出した。抽出プロセスを、QIAGEN QIAcubeによって自動化した。RNAを、1.5mLのRNAse非含有EPチューブ中で保存した後、QIAGEN Qubitを使用して定量した。Applied Biosystems 2720 Thermo Cycler上でInvitrogen Superscript VILOキットを使用して、cDNAをRNAから逆転写した後、後に使用するまで-40℃の冷凍庫中、1.5mLチューブ中で保存した。qPCRのために、ウェルあたり20μLの総容量でBio-Rad社のSsoAdvanced Universal SYBR Green Supermixを使用するRoche社のLightCycler 96上で3回、試料を泳動した。β-チューブリン(Fwd: 5'-CGCAGAAGAGGAGGAGGATT-3'(配列番号5)、Rev: 5'-GAGGAAAGGGGCAGTTGAGT-3'(配列番号6))を使用して、標的遺伝子の発現を正規化した。4回の泳動を実施した。RT-PCRを3回実施し、値を平均した。PD-1遮断の効果を、処理前試料と比較した処理中試料に由来するCCL19又はCXCL13発現(β-チューブリンに対して正規化される)のlog2倍数変化として記載した。選別された細胞集団中でのCCL19/CXCL13発現の分析のために(図10H)、以下のプライマー: CXCL13 (Fwd: 5'-CTCTGCTTCTCATGCTGCTG-3'(配列番号7)、Rev: 5-TGAGGGTCCACACACACAAT-3'(配列番号8))及びCCL19 (Fwd: 5'-ATCCCTGGGTACATCGTGAG-3'(配列番号9)、Rev: 5'- GCTTCATCTTGGCTGAGGTC-3'(配列番号10))を使用して、また、遺伝子発現を正規化するためには、36B4 (Fwd: 5'-CAGATTGGCTACCCAACTGTT-3'(配列番号11)、Rev: 5'-GGAAGGTGTAATCCGTCTCCAC-3'(配列番号12))を使用して、当業界で公知の方法(例えば、その内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Zhu, Z.ら、Cancer Discov. (2014))に従ってqRT-PCRを実施した。
【０１２７】
免疫組織化学
4μmのホルマリン固定パラフィン包埋切片上で、免疫組織化学染色を実施した。全ての手順を、自動化Ventana Discovery Ultra染色システム上で行った。切片を、EZ prep溶液を使用して最初に脱パラフィン化し、Cell Conditioning溶液1を使用して抗原回収を達成した。切片を、Discovery Inhibitor(全てVentana社製)で遮断した。切片を、集団マーカーについては16分間並びにCXCL13及びCCL19については12時間、一次抗体と共にインキュベートした後、洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)(Ventana社、カタログ番号760-4310及び760-4311)とコンジュゲートさせたOmniMap抗マウス又は抗ウサギ抗体と共に更に16分間インキュベートした。次いで、Discovery Purple又はOmniMAP DAB色原体キット(カタログ番号760-229又は760-159)を適用して、呈色反応を生成させた。次いで、スライドを、ヘマトキシリンII、次いで、ブルーイング試薬(Ventana社、カタログ番号790-2208及びカタログ番号760-2037)で対抗染色した。染色のために使用した一次抗体は、抗CCL19抗体(RD Systems社、カタログ番号MAB361-100; 1:200)及び抗CXCL13抗体(Abcam社、カタログ番号ab112521; 1:150)、CD31 (Cell Marque社、カタログ番号131M-94; 1:500); αSMA (Abcam社、カタログ番号ab5694; 1:400)であった。
【０１２８】
供給源データ
示差的CCL19及びCXCL13遺伝子発現分析のためのデータを、公開された報告(例えば、それぞれの内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Hugo, W.ら、Cell (2016)、Chen, P. L.ら、Cancer Discov. (2016)、Van Allen, E. M.ら、Science (2015)、Cancer Genome Atlas、N. Cell (2015))から取得した。Hugoら、及びVan Allenらのデータについて、トランスクリプトーム配列決定データを、TopHatを使用して整列させ、100万あたりの転写物(TPM)として提示される、正規化された遺伝子発現を、DESeq2(例えば、それぞれの内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Kim, D.ら、Genome Biol. (2013)、及びLove, M.I.ら、Genome Biol. (2014)を参照されたい)を使用して定量した(Table S3(表10))。PD-1応答者(n=4)及び非応答者(n=8)に関するNanoString供給源データ(Chenら)を比較し(PD-1中/PD-1前)、log-2倍数変化として表した。TCGA分析のために、TCGA SKCM試料の生のRNA-Seqデータ(BAMファイル)を、Genomic Data Commonsからダウンロードし、リードカウントをまとめ(featureCounts)、edgeRを使用して正規化して、RPKMを生成した。CCL19及びCXCL13試料を、RPKM値のk平均クラスタリングによって2群:高群及び低群に分け、それぞれの群の中央値を使用して、高い又は低いと標識した。これらの2群(高;n=206及び低;n=257)上で、Kaplan-Meier法に従って生存曲線を構築し、ログランク(Mantel-Cox)検定(α=0.05)を使用して群間で生存を比較した。高発現及び低発現を定義するための中央カットオフを使用して、4つの方法のグループ分けを実施した。単一試料のGSEA(ssGSEA)を、当業界で公知の方法(例えば、内容全体が参照により本明細書に組み込まれるBindea, G.ら、Immunity (2013))に従って免疫細胞シグネチャーを使用して実施した。
【０１２９】
化合物1,5-(4-((4-(4-(オキセタン-3-イル)ピペラジン-1-イル)フェニル)アミノ)-1,3,5-トリアジン-2-イル)-2-((テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)オキシ)ベンゾニトリルの合成
工程1:0℃のN,N-ジメチルホルムアミド(150mL)中の2,4-ジクロロ-1,3,5-トリアジン(9.5g、63mmol)の溶液(アルゴンバルーンでフラッシュ)に、N,N-ジメチルホルムアミド(100mL)中の4-(4-オキセタン-3-イル)ピペラジン-1-イル)アニリン(14.1g、60.2mmol)の溶液を、カニューレを介して5分かけて添加し、氷浴中で1時間撹拌した。40%メタノール/CH2Cl2の溶液(200mL)を反応混合物に添加し、室温で撹拌した。1時間後、形成された固体を濾過し、ジエチルエーテルで2回洗浄した。固体を収集して、第1の生成物ロットを提供した。濾液に、ジエチルエーテル(200mL)を添加し、室温で一晩撹拌した。固体を濾過によって分離して、第2の生成物ロットを提供した。両ロットを合わせて、合計収量20g(91%)の4-クロロ-N-(4-(4-(オキセタン-3-イル)ピペラジン-1-イル)フェニル)-1,3,5-トリアジン-2-アミンを提供し、これを精製することなく使用した。LCMS-ESI+ (m/z): C16H19ClN6Oに関する計算値: 346.1; 実測値: 347.1 (M+H)。
【０１３０】
工程2:4-クロロ-N-(4-(4-(オキセタン-3-イル)ピペラジン-1-イル)フェニル)-1,3,5-トリアジン-2-アミン(4.6g、13.2mmol)、2-フルオロ-5-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)ベンゾニトリル(3.5g、14.5mmol)、Pd(dppf)Cl2CH2Cl2(1.2g、1.6mmol)及び炭酸カリウム(3.6g、26.4mmol)の混合物に、アルゴン下で、脱気した溶媒(1,2-ジメトキシエタン(53mL)/水(27mL)の混合物を添加し、全ての固体が溶液中に行くまで(約5分間)超音波処理した。混合物を、アルゴン下、100℃で、加熱ブロック中で1時間撹拌した。室温まで冷却した後、水(200mL)を反応混合物中に注ぎ入れ、固体を濾過除去し、ジエチルエーテル(100mL)で洗浄した。得られた暗褐色の固体を、アセトニトリル(20mL)中に懸濁し、還流で撹拌(約2分間)した後、室温で2時間撹拌した。この懸濁液に、ジエチルエーテル(20mL)を添加し、混合物を室温で一晩撹拌した。固体を濾過によって採取して、粗い暗褐色の生成物を得た。1gのバッチ中で、粗生成物を、分液漏斗中のジクロロメタン(150mL)中に懸濁した。全ての固体が溶液中に行くまで、懸濁液に、トリフルオロ酢酸を添加した。水を添加し(150mL)、黒色の沈降物が出現するまで混合物を激しく振とうした。黒色の固体を濾過除去した。濾液に、NaHCO3の飽和水性溶液をゆっくりと添加し、混合物を完全に中和させた。このプロセスの間に固体は沈降しなかった。有機相をMgSO4上で乾燥し、減圧下で蒸発させて、明黄色の材料(合計収量3.1g、55%収率)を得た。LCMS-ESI+ (m/z): C23H22FN7Oに関する計算値: 431.1;実測値: 432.2 (M+H)。
【０１３１】
工程3:0℃のTHF(200mL)中のテトラヒドロ-2H-ピラン-4-オール(4.7mL、49mmol)の溶液に、カリウムt-ブトキシド(3.8g、51mmol)を添加し、反応混合物を室温まで温めた。30分後、固体の2-フルオロ-5-[4-([4-[4-(オキセタン-3-イル)ピペラジン-1-イル]フェニル]アミノ)-1,3,5-トリアジン-2-イル]ベンゾニトリル(10g、23.2mmol)を添加し、60℃で一晩撹拌した。次いで、反応混合物を水/氷浴を用いて0℃に冷却し、30分間かけて水(1.2L)でゆっくりと希釈し、室温で45分間撹拌した。形成された固体を濾過し、乾燥したところ、黄色の固体として5-(4-((4-(4-(オキセタン-3-イル)ピペラジン-1-イル)フェニル)アミノ)-1,3,5-トリアジン-2-イル)-2-((テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)オキシ)ベンゾニトリル(10.6g、90%収率)が得られた。LCMS-ESI+ (m/z): C28H31N7O3に関する計算値: 513.3; 実測値: 514.5 (M+H) 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ10.23 (d, J = 19.4 Hz, 1H), 8.80 (s, 1H), 8.74 - 8.50 (m, 2H), 7.68 (br, 2H), 7.60 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.11 (br, 2H), 4.99 (m, 1H), 4.91 - 4.74 (m, 4H), 4.52 (m, 1H), 3.91 (m, 2H), 3.59 (ddd, J = 11.6, 8.5, 3.0 Hz, 2H), 3.80 - 3.30 (m, 4H), 3.30 - 2.90 (m, 4H), 2.09 (m, 2H), 1.87 - 1.64 (m, 2H)。
【０１３２】
化合物1のin vitroでの特徴付け
TBK1、IKKε(IKBKE)、及びオフターゲットキナーゼの生化学的単一点阻害及びIC50濃度を、SelectScreen Kinase Profiling Services (Madison、WI、USA)を使用してThermoFisher Scientific社で決定した(Table S4A(表11)及びTable S4B-1〜7(表12〜表18))。細胞効力を決定するために、ヒト結腸直腸がん細胞株HCT116(ATCC、Manassas、VA)を、完全RPMI培地;10%FBS、1Xペニシリン-ストレプトマイシン溶液及び1X MEM(非必須アミノ酸)を添加したRPMI 1640中、T175フラスコ中で維持した。HCT116細胞を、完全RPMI培地を含有するT175フラスコ中で90〜95%の集密度まで増殖させ、70μgのISG54-ルシフェラーゼリポータープラスミド(Elim Biopharmaceuticals Inc.社、Hayward、CA)と共にLipofectamine 2000(Invitrogen社、Carlsbad、CA)を使用してバルクでトランスフェクトした。リポータープラスミドは、ヒトインターフェロン刺激遺伝子54(ISG54)のプロモーターの転写調節下にルシフェラーゼ遺伝子発現カセットを含有する。細胞のトランスフェクションを6時間にわたって起こさせた後、0.25%トリプシンEDTA(Corning Inc.社、Corning、NY)を用いる処理により、細胞を収集した。トリプシン処理された細胞を、384ウェルのポリ-d-リシン処理された黒色透明底の組織培養アッセイプレート(Greiner Bio-One GmbH社、Kremsmunster、Austria)に、80μLの完全RPMI培地中、20,000個の細胞/ウェルの密度で添加し、一晩インキュベートした。トランスフェクションの16〜18時間後、アッセイプレートをPBS(Corning Inc.社、Corning、NY)で洗浄した後、1Xペニシリン-ストレプトマイシン溶液、1X MEM及び350nLのDMOSO又は化合物1の滴定物を含有する80μL/ウェルの無血清RPMI 1640培地を添加した。化合物1の滴定物を、2つの重複する連続希釈系列中、1.5倍の希釈段階によって生成して、40点の化合物用量範囲を生成した。37℃で1時間インキュベートした後、Optimem培地(Life Technologies社、Rockville、MD)中、15μg/mLの最終濃度のポリ(I:C) (InvivoGen社、San Diego、CA)で細胞を刺激した。アッセイプレートを、37℃で5時間インキュベートした後、1:1の容量/ウェルでOne-Glo蛍ルシフェラーゼ試薬(Promega社、Madison、WI)を添加し、EnVision Multilabel Plate Reader (PerkinElmer社、Santa Clara、CA)中で発光を測定した。EC50値を、用量応答曲線の適合から4パラメータ式まで算出した。全てのEC50値は、4つの決定値の最小の幾何平均値を表す。
【０１３３】
インターロイキン-2及びインターフェロンガンマ分析
新鮮に単離されたヒトCD4+及びCD8+T細胞を、AllCells社(Alameda、CA、USA)から入手した。細胞をスピンダウンし、5ng/mLのIL-17を添加した無血清Xvivo15培地(Lonza Walkersville, Inc.社、Chicago、IL、USA)中に再懸濁し、37℃で一晩インキュベートした。細胞を、2μg/mLの抗CD28抗体(eBioscience社、Dallas、TX、USA)と共に抗CD3抗体被覆プレート(5μg/mLのOKT3、eBioscience社、Dallas、TX、USA、一晩)上に塗布した。IL-2については24時間及びIFNγについては96時間にわたる化合物1の用量滴定を用いて、反復プレート中で細胞を処理した。上清中のIL-2及びIFNγを、単一又は多重免疫アッセイ(Mesoscale Discovery社、Rockville、MD、USA)を使用して測定した。抗CD3抗体被覆プレート上に塗布されたJurkat T細胞白血病細胞(ATCCから取得したクローンE61)を、化合物1の用量滴定を用いて24時間処理した。上清中のIL-2を、上記のように測定した。
【０１３４】
in vivoでの化合物1の組合せ処置
組合せ試験を、vivoPharm社(Hummelstown、PA、USA)によって実施した。これらの試験の実施において使用された全手順を、US_SOPvP_EF0314「General Procedures for Efficacy Studies」を特に参照して、vivoPharm社のStandard Operating Proceduresに従って実行した。CT26結腸癌細胞(100μL中の1x106個の細胞/マウス、継代2〜3)を、無血清DMEM中に再懸濁し、11〜12週齢のメスのBalb/cマウス(Charles River Laboratories社)の右上脇腹に埋め込んだ。CT26に関する腫瘍サイズに基づくマッチドペア分布法を使用して、マウスを10匹の4分に無作為化した。処置を、125.85mm3の投与開始時の平均腫瘍体積を接種した12日後に開始した。ビヒクル又は化合物1(40mg/kg)を、26日間にわたって経口強制摂取により毎日投与し、アイソタイプ対照又は文献報告(例えば、内容全体が参照により本明細書に組み込まれるDeng, R.ら、MAbs (2016))からクローニングされ、マウスIgG1フレームワーク(10mg/kg)中に入れたリバースキメラ抗PD-L1抗体を、合計6用量にわたって5日毎に投与した。調査者は、処置群に対して盲検ではなかった。αPD-L1と化合物1との組合せ療法に対する例外応答を示すCT26腫瘍を担持するマウスに、CT26細胞(1x106個、左下脇腹)及びEMT6細胞(0.5x106個、左上脇腹)を再度埋め込んで、免疫記憶の発達を評価した。MB49及びMC38のin vivoでの組合せ試験を、B6マウスにおいて同一の条件下で実施した。B16F10尾静脈注射試験を、当業界で公知の方法(例えば、内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Zhang, J.ら、Cell Rep. (2016))に従って実施した。尾静脈注射(100μL中の1x105個の細胞)後、マウスを、13日間にわたって毎日、ビヒクル又は40mg/kgの化合物1で、0、5、及び10日目に±抗PD-L1(10mg/kg)又はアイソタイプ対照で処置した。マウスを13日目に犠牲にし、肺転移を定量した(小≦1mm、中>1mmかつ≦3mm、大>3mm)。大きい肺転移は検出されなかった。
【０１３５】
統計学的方法及びデータ分析
全てのグラフは、別途指摘しない限り、平均±s.d.を意味する。グラフを生成し、GraphPad/Prism (v7.0)及びR統計パッケージを使用して統計学的分析を実施した。MDOTSのための21種の細胞表面マーカーを使用するPearsonの相関マトリックスを、腫瘍及び異なるサイズのスフェロイドにわたってRを用いて算出した。教師なし階層的クラスター分析を、GenePatternを使用して実施した。
【０１３６】
(実施例2)
器官型腫瘍スフェロイドを使用するPD-1遮断のex vivoでのプロファイリング
循環腫瘍細胞(CTC)、オルガノイド培養、及び患者由来異種移植片(PDX)等の現行の患者由来がんモデルは、高精度がん療法を指導することができるが、生成するのに数週間から数カ月かかり、天然の腫瘍免疫微小環境を欠く。患者における抗腫瘍免疫応答を研究するための現在の手法もまた、全血若しくは血漿中における測定が遠隔で行われ、又は生検の評価が静的であることによって制限される。これらの課題を克服し、ex vivoでの免疫チェックポイント遮断(ICB)をモデル化するために、3Dマイクロ流体デバイスを、マウス及び患者由来器官型腫瘍スフェロイド(MDOTS/PDOTS)の短期培養に適用した。新鮮な腫瘍標本の限定的なコラゲナーゼ消化の後、自己免疫細胞を有する多細胞器官型スフェロイドを単離した。MDOTS/PDOTSを、フローサイトメトリー(図5)によって分析したか、又はコラーゲン中、抗PD-1又は抗CTLA-4抗体への曝露のためにデバイスの中心チャネルにロードした(図1A)。
【０１３７】
MC38及びB16F10免疫コンピテント同系マウス腫瘍モデルを使用して、バルク腫瘍のリンパ系及び骨髄系免疫細胞組成を、異なるスフェロイド集団と比較した(S1>100μm;S2 40〜100μm;及びS3<40μm)。フローサイトメトリー分析により、検査した全ての免疫細胞画分間で類似する集団が示された(図1B、図6A〜図6C、Table S2-1(表6)〜Table S2-4(表9))。B16F10に由来するMDOTS(S2)は、MC38及び別のモデル、CT26(拡張データ、図2d)よりも少ないCD45+細胞を示したが、免疫サブ集団は、MC38、B16F10、及びCT26モデル間で比較的一致していた(図6E)。S2 MDOTSはマイクロ流体デバイス中での培養のために最適のサイズであったため、この画分を、その後の研究のために使用した。
【０１３８】
PDOTSの大きいパネル(n=40)を、フローサイトメトリーにより免疫表現型分析し、PD-1遮断に応答するがん(例えば、メラノーマ、メルケル細胞癌)について富化した(図1C、Table 1A及びTable 1B)。一定範囲のリンパ球(CD19+B細胞、CD4+及びCD8+ T細胞)並びに骨髄細胞(CD15+顆粒球、CD14+単球系列、CD123+樹状細胞)集団が、PDOTSにおいて一貫して検出された(図1C)。疲弊マーカー(PD-1、CTLA-4、TIM-3)の可変的表面発現が、樹状細胞、骨髄由来抑制細胞(MDSC)、及び腫瘍関連マクロファージ(TAM)等の骨髄細胞集団上のCD4+及びCD8+ T細胞(図6F)並びにPD-1リガンド(PD-L1及びPD-L2)(図6G)上で検出された。T細胞プロファイルの強力な相関が、スフェロイドのサイズに関係なく、抗原を経験した(CD45RO+)(図1D)及び疲弊したCD4及びCD8 T細胞(図1E)等のPDOTS(S2)及びS3画分と、免疫表現型の全体的な保存(図6H〜図6J)との間で確認された。これらのデータは、PDOTSが、重要な腫瘍浸潤性Tリンパ球集団等の自己免疫細胞を保持することを示している。
【０１３９】
MDOTS及びPDOTSの3Dマイクロ流体培養は、条件化培地中での長時間にわたる増殖及び拡張(図2A)並びにサイトカイン同化(図2B〜図2C)をもたらした。スフェロイド中での腫瘍/免疫細胞混合物を、免疫蛍光顕微鏡によって更に証明した(図7A〜図7C)。力学的細胞相互作用を、ライブイメージングによって観察し、ex vivoでのCD45+免疫細胞の生存をデバイス中で確認した(図7D)。かくして、PDOTS/MDOTSの短期培養及びサイトカインプロファイリングが、この3Dマイクロ流体デバイスを使用して実現可能である。
【０１４０】
in vivoで抗PD-1処置に応答するMC38同種移植片から開始して、MDOTSをex vivoでのPD-1遮断に曝露した(図2D〜図2E)。MC38 MDOTSを、デバイス中で、抗PD-1抗体(又はアイソタイプ対照)で3日間又は6日間処理した(図2F)。アクリジンオレンジ(AO、生細胞)及びヨウ化プロピジウム(PI、死細胞)を使用する二重標識解析蛍光顕微鏡観察は、スフェロイドローディングの時点(0日目)で、及び対照を用いる培養物中で長時間にわたって、90%を超えるMDOTSの生存能力を示した(図2G)。抗PD-1抗体による処理は、自己免疫/間質細胞を欠く細胞株由来MC38スフェロイド(図2H)とは対照的に、MC38 MDOTSの用量及び時間依存的殺傷(図2G、図2K、図7E)をもたらした。中間程度に感受性のCT26モデルにおいては中程度の殺傷が明らかであった(図2I)が、PD-1耐性B16F10モデルに由来するMDOTSは、同一の処理にも拘わらず、わずかな細胞死しか示さなかった(図2J〜図2K)。CT26 MDOTSの抗PD-1抗体により誘導される殺傷は、CD8+ T細胞を必要とし(図7F)、単一の腫瘍に由来する異なる領域の間ではなく、異なるサイズの腫瘍の間で変化した(図7G)。これらのデータは、明確に定義されたマウスモデルを使用してex vivoでのPD-1遮断に対する感受性及び耐性を再現する能力を示している。
【０１４１】
PDOTS中でのPD-1遮断に対する応答を評価した。PDOTSにおけるex vivoでのICBの体系的評価を実施するために、急性サイトカイン産生を、MDOTSにおいてよりロバストであるex vivoでの殺傷よりもむしろ、初期の免疫活性化の量的尺度として使用した。PDOTS(n=28)からの3日目のサイトカイン放出±PD-1遮断を分析したところ、大部分の試料(23/28)において、CCL19及びCXCL13の上方調節が観察された(図3A、図3D、図8A〜図8C)。CCL19/CXCL13の誘導は、アイソタイプIgG対照に関しては観察されず(図8D)、CTLA-4遮断後に比較的最小限であった(図4B、図4E)。CCL19/CXCL13の生成も、一定範囲のスフェロイド数にわたって保持され(図8E)、アッセイ内変動性はわずかであった(図8F〜図8G)。CCL19は、PDOTS試料間でCXCL13と相関し、ロバストな誘導のためにはマイクロ流体デバイスが必要であった(図8H〜図8I)。CCL19/CXCL13の上方調節もまた、二重PD-1 + CTLA-4遮断の後に明らかであり(図3C、図3F)、選択試料中での更なるエフェクターサイトカイン(例えば、IFN-γ、IL-2、及びTNF-α)の誘導を伴っていた(図9)。
【０１４２】
PDOTSプロファイリングの結果と一致して、CCL19/CXCL13 mRNA発現は、PD-1遮断で処置した患者において増加した(図3G〜図3H、Table S4A(表11)及びTable S4B-1(表12)〜Table S4B-7(表18))。CCL19/CXCL13の倍数誘導は応答と明確に相関しなかったが(図10A)、CCL19及びCXCL13、並びにその受容体(CCR7及びCXCR5)のより高い絶対レベルが、チェックポイント遮断に由来する臨床利益(CB)を示すメラノーマ患者に由来する保存試料中で明らかであった(図3I〜図3J、図10B〜図10C)。処理前のCCL19/CXCL13 mRNA発現レベルのみでは、メラノーマRNAseqデータセット中のPD-1又はCTLA-4遮断に対する応答性と相関を示すことはできなかった(図10D〜図10E)。一致したホルマリン固定及びパラフィン包埋組織又は保存血漿に由来するNanoStringデータも、応答との相関を検出するのに不十分であった(図10F〜図10G)。
【０１４３】
PD-1遮断はin vivoで免疫細胞浸潤を促進するため、公開された免疫シグネチャーを使用して遺伝子セット富化分析(GSEA)を実施したところ、チェックポイント遮断に対するCBを示す患者において多様な免疫細胞集団の富化が示された(図3K)。CCL19/CXCL13の臨床的有意性を評価するために、Cancer Genome Atlasメラノーマ(SKCM)データを分析した。CCL19/CXCL13のより高い発現を示すメラノーマ標本において改善された患者生存が明らかであった(図3L〜図3M;p<0.001)。他のがん(例えば、膀胱がん、頭頸部がん、及び乳がん)に関するTCGAデータの評価により、類似するパターンが示された(図10H)。メラノーマTCGAデータを使用する免疫GSEAにより、CCL19とCXCL13との両方のレベルが高いメラノーマ患者における多様な免疫細胞遺伝子セットの富化が確認され(図3N)、化学誘引物質としてのそれらの確立された役割と一致していた。
【０１４４】
CCL19/CXCL13はリンパ節及び三次リンパ球構造(TLS)における体液性及び細胞媒介性適応免疫を調整し、がん関連TLSは予後の改善と関連していた。抗PD1抗体のみの前及び間のメラノーマ生検標本の組織学的再検討は、おそらくコア生検による限定的な試料採取のため、稀なTLSを同定した(図11A)。メラノーマTME中でのCCL19の発現は、がん関連線維芽細胞(CAF)と関連し、CXCL13はCD8+疲弊T細胞と関連していた。CCL19はまた、リンパ節高内皮細静脈中で強く発現される。抗PD1抗体によるCCL19/CXCL13の最も強力な誘導は、PDOTS中の総CD45+細胞又は他の免疫サブ集団の数とは無関係であることがわかった(図11B〜図11D)。したがって、CCL19及びCXCL13のロバストな抗PD1抗体により誘導される分泌によって印を付けられた試料(MGH-16)に由来するCD45+及びCD45-細胞集団を選別して、PDOTS中のCCL19及びCXCL13の細胞源を決定した。実際、CD90+CD45-がん関連線維芽細胞、CD31+CD144+内皮細胞、及び腫瘍細胞(CD45-)を含む間質集団は、特に、CCL19を発現したが、CD45+細胞中ではCXCL13も検出された(図11E)。免疫組織化学染色により、がん関連線維芽細胞(αSMA)及び内皮細胞(CD31)等の間質エレメント中でのCCL19及びCXCL13の発現が確認された(図11F)。
【０１４５】
抗PD1抗体により誘導されるPDOTSサイトカインプロファイルと、ICBに対する臨床利益との関係をより良く理解するために、抗PD-1療法で特異的に処置された患者に由来するサイトカインプロファイルの教師なし階層的クラスター分析を実施した。抗PD-1療法上での混合応答又は進行を示す患者に由来するPDOTSは、CCL19/CXCL13に加えて、複数の免疫抑制サイトカイン/ケモカイン(例えば、CCL2)を生産した(図3O)。PD-1遮断に対する臨床利益を示さない患者(NCB)における有意に高レベルのCCL20及びCX3CL1の誘導(図12A)が見られ、生存との関連の欠如(図12B)及び抗PD-L1耐性を示すCX3CL1誘導の以前の関連と一致していた。PDOTS中で誘導されたこれらの免疫抑制サイトカイン/ケモカインのいくつかも、固有のPD-1耐性(IPRES)遺伝子発現シグネチャーの成分であり(図12B)、非応答性であるが、失われた統計的有意性(p=0.08、図12C)と相関していた。個々の患者に由来する連続PDOTSプロファイリングにより、複数の顆粒球及び単球の化学誘引物質の誘導が、in vivoでの抗PD-1療法への疾患進行後にこれらの対応する骨髄集団の浸潤を予測することが示された(図12D〜図12E)。これらのデータは、ICB後のCCL19/CXCL13誘導にも拘わらず、無効な抗腫瘍免疫応答と関連するサイトカイン変化を同定するためのこのアッセイの能力を強調する。
【０１４６】
また、MC38 MDOTS(図12F)、並びに特に高レベルのCCL2を生産した中程度に耐性のCT26 MDOTSモデル(図12G)と比較して、抗PD-1耐性B16F10 MDOTSにおいて、より高レベルの免疫抑制サイトカインが誘導された。抗PD1抗体に対するその部分的感受性のため、CT26モデルを使用して、MDOTSプロファイリングが耐性を克服する新規組合せ療法を同定することができるかどうかを決定した。しかしながら、CCL2の中和のみでは、CT26 MDOTSのPD-1媒介性殺傷を増強することができなかった(図12H〜図12I)が、これは、TME内の免疫抑制シグナル伝達をより広く阻害し、T細胞を再活性化する代替的な戦略の必要性を示唆している。
【０１４７】
相同な固有の免疫シグナル伝達キナーゼTBK1及びIKKεは、自己分泌/傍分泌サイトカインシグナル伝達を促進するだけでなく、T細胞活性化も抑制することがわかったが、これは、TMEに対するTBK1/IKKε阻害の二重の影響が、PD-1遮断の抗腫瘍活性を増強することができることを示唆している(図4A)。多標識阻害剤モメロチニブ(CYT387)と対照的に、JAK阻害活性を欠く、新規な強力/選択的なTBK1/IKKε阻害剤である化合物1(Cmpd1)を合成した(図4B、図13A〜図13D、Table S5-1(表19)及びTable S5-2(表20))。Cmpd1は、細胞傷害効果なしに、CT26細胞株スフェロイドによる免疫抑制サイトカイン生産を遮断し(図4C、図13E)、精製されたCD4+及びCD8+ T細胞からのIL-2及びIFN-γの分泌(図4D〜図4E)並びにJurkat細胞からのIL-2の分泌(図13F)を増強した。活性化された先天性免疫応答に関与するサイトカイン(例えば、G-CSF)の同時的誘導と共に、CCL4、CCL3、及びIL-1βのレベルの低下が、Cmpd1±抗PD-1で処理されたCT26 MDOTSにおいて観察された(図4F)。ex vivoでの組合せ処置は、CT26 MDOTSの殺傷を増強し(図4G〜図4H)、Cmpd1又は抗PD-L1のみで処置されたマウスよりも大きい腫瘍制御及び長い生存を示すin vivoでの応答を予測した(図4I〜図4K)。組合せ療法に対する例外応答を示すマウスへのCT26の再埋込みは、増殖を示さなかったが、これは、CT26腫瘍に関する免疫記憶を示唆している(図13F)。
【０１４８】
PD-1感受性MC38 MDOTSモデルにおける組合せ処置は、ex vivoでの殺傷及びin vivoでの生存を増強したが、これらのものはいずれも、PD1/PD-L1単剤と比較して有意性に達しなかった(図14A〜図14D)。本質的に耐性のB16F10モデルは、おそらく、CT26及びMC38 MDOTSと比較してB16F10 MDOTSにおける免疫細胞の相対的不足のため、Cmpd1処置で感作することができなかった(図14E〜図14H)。実際、B16F10 MDOTSにおけるいくつかの免疫抑制ケモカイン(例えば、CCL2、CCL5)の下方調節が観察されたが、G-CSF及び関連する先天性免疫応答サイトカインの同時的誘導はなかった(図14A〜図14B)。しかしながら、Cmpd1との組合せ処置に対する応答の増強を、第4の部分的に抗PD1抗体感受性である同系モデル(MB49膀胱癌)を使用してin vivoで確認し、その活性を更に検証した。重要なことに、3つのモデル(CT26、MC38、及びB16F10)におけるMDOTS応答は、PD-1遮断±TBK1/IKKε阻害に対するin vivoでの応答を効率的に再現した(又はそれを欠いた)が、これは、組合せ免疫療法をより一般的に開発するためのMDOTSにおけるex vivoスクリーニングの能力を強調している。
【０１４９】
(実施例3)
ex vivoでの処置後のMDOTS/PDOTSのトランスクリプトーム分析
上清を収集した後に、デバイス内のMDOTSのサブセットからRNAを収集し、RNA配列決定のためのcDNAライブラリーを生成して、薬物処置あたりの単一の試料上での処置レジメンと関連する全体的なトランスクリプトーム変化を評価する。これらの型のデータを、様々な臨床標本から生成することができる。溶出容量がRNA-Seqライブラリー調製のための試料入力に従うのを容易にする、ビーズ洗浄に基づく分離技術である、RNA Advance組織RNA単離法(Beckman Coulter社)を使用する。自動化ライブラリー調製を、わずか10ngの良品質RNAを使用して実施することができる。ゲノムのコード領域を富化する、Illumina社製のRNA Access法を使用する。ライブラリーを、NextSeq500プラットフォーム上で、75bpの単一末端として配列決定して、試料あたり約2000万のリードを生成する。適切なアダプターを用いて、24の試料をそれぞれのNextSeq500泳動上で多重化する。MDOTSに由来する、濃度[ng/μl]、収量[ng]及びRNAの品質(バイオアナライザーによる高いRIN数)は、その後の配列決定のための良品質ライブラリーを確保するために十分過ぎるほどである(図15)。
【０１５０】
STAR RNA配列決定アラインメントツール(Spliced Transcripts Alignment to a Reference)[STAR_2.5.0a])を使用して、データをゲノムと整列させる(RefSeq遺伝子注釈)。DeSeq2を使用して、示差的発現分析を実施する(±2倍、P値<0.05)。Molecular Signature Database又はMSigDB中での示差的に発現される遺伝子と、注釈された免疫遺伝子セットとの重複(FDR q値<0.05)を算出する。CIBERSORT(Newman AMら、「Robust enumeration of cell subsets from tissue expression profiles」、Nat Methods. 2015年5月;12(5):453〜7頁)を使用して、生成されたトランスクリプトームデータを使用する、20を超える免疫サブセットを含む混合細胞集団中でのメンバー細胞型の存在量の見積もりを提供する。
【０１５１】
全トランスクリプトーム分析から蓄積された更なる情報は、PD-1免疫遮断自体及び他の免疫遮断化合物又はMEK阻害剤と組み合わせたPD-1免疫遮断に対する生物学的応答のより深い理解を提供する。この知識は、応答と耐性の両方の新規機構を同定するための分泌プロファイリングを補完する。更に、GSEA及びCIBERSORTを含む「immunone」を評価するための計算方法は、確立された遺伝子シグネチャーを使用する免疫細胞集団中での変化の推定を可能にする。
【０１５２】
実施例2に関する支援データを含む表。
【０１５３】
【表６】
2020515260.tif 000012
【０１５４】
【表７】
2020515260.tif 000013
【０１５５】
【表８】
2020515260.tif 000014
【０１５６】
【表９】
2020515260.tif 000015
【０１５７】
【表１０】
2020515260.tif 000016
【０１５８】
【表１１Ａ】
2020515260.tif 000017
【０１５９】
【表１１Ｂ】
2020515260.tif 000018
【０１６０】
【表１２】
2020515260.tif 000019
【０１６１】
【表１３】
2020515260.tif 000020
【０１６２】
【表１４Ａ】
2020515260.tif 000021
【０１６３】
【表１４Ｂ】
2020515260.tif 000022
【０１６４】
【表１５】
2020515260.tif 000023
【０１６５】
【表１６】
2020515260.tif 000024
【０１６６】
【表１７】
2020515260.tif 000025
【０１６７】
【表１８】
2020515260.tif 000026
【０１６８】
【表１９Ａ】
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【０１６９】
【表１９Ｂ】
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【０１７０】
【表１９Ｃ】
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【０１７１】
【表１９Ｄ】
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【０１７２】
【表１９Ｅ】
2020515260.tif 000031
【０１７３】
【表１９Ｆ】
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【０１７４】
【表１９Ｇ】
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【０１７５】
【表１９Ｈ】
2020515260.tif 000034
【０１７６】
【表１９Ｉ】
2020515260.tif 000035
【０１７７】
【表１９Ｊ】
2020515260.tif 000036
【０１７８】
【表１９Ｋ】
2020515260.tif 000037
【０１７９】
【表１９Ｌ】
2020515260.tif 000038
【０１８０】
【表１９Ｍ】
2020515260.tif 000039
【０１８１】
【表１９Ｎ】
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【０１８２】
【表１９Ｏ】
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【０１８３】
【表１９Ｐ】
2020515260.tif 000042
【０１８４】
【表１９Ｑ】
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【０１８５】
【表１９Ｒ】
2020515260.tif 000044
【０１８６】
【表１９Ｓ】
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【０１８７】
【表１９Ｔ】
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【０１８８】
【表１９Ｕ】
2020515260.tif 000047
【０１８９】
【表１９Ｖ】
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【０１９０】
【表１９Ｗ】
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【０１９１】
【表１９Ｘ】
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【０１９２】
【表１９Ｙ】
2020515260.tif 000051
【０１９３】
【表１９Ｚ】
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【０１９４】
【表１９ＡＡ】
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【０１９５】
【表１９ＡＢ】
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【０１９６】
【表１９ＡＣ】
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【０１９７】
【表１９ＡＤ】
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【０１９８】
【表１９ＡＥ】
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【０１９９】
【表１９ＡＦ】
2020515260.tif 000058
【０２００】
【表１９ＡＧ】
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【０２０１】
【表１９ＡＨ】
2020515260.tif 000060
【０２０２】
【表２０Ａ】
2020515260.tif 000061
【０２０３】
【表２０Ｂ】
2020515260.tif 000062
【０２０４】
均等物及び範囲
いくつかの発明の実施形態を本明細書に記載及び例示してきたが、当業者であれば、本明細書に記載の機能を実施するため、並びに/又は本明細書に記載の結果及び/若しくはその1つ若しくは複数の利点を得るために様々な他の手段及び/又は構造を容易に想定することができ、そのような変更及び/又は改変はそれぞれ、本明細書に記載の発明の実施形態の範囲内にあると見なされる。より一般的には、当業者であれば、本明細書に記載の全てのパラメータ、寸法、材料、及び構成が例示を意味すること、並びに実際のパラメータ、寸法、材料、及び/又は構成が、発明の教示が使用される特定の用途又は複数の用途に依存することを容易に理解できる。当業者であれば、日常的なものを超えない実験を使用して、本明細書に記載の特定の発明の実施形態に対する多くの均等物を認識する、又は確認することができる。したがって、前記実施形態は、ほんの一例によって提供されるものであること、並びに添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内で、具体的に記載され、特許請求されるもの以外の発明の実施形態を実施することができることが理解されるべきである。本開示の発明の実施形態は、本明細書に記載のそれぞれ個々の特徴、システム、品目、材料、キット、及び/又は方法に関するものである。更に、そのような特徴、システム、品物、材料、キット、及び/又は方法が相互に矛盾しない場合、2つ以上のそのような特徴、システム、品物、材料、キット、及び/又は方法の任意の組合せが、本開示の発明の範囲内に含まれる。
【０２０５】
本明細書で定義され、使用される全ての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文献中の定義、及び/又は定義される用語の通常の意味を制御することが理解されるべきである。
【０２０６】
本明細書に開示される全ての参考文献、特許、及び特許出願は、一部の場合、文献の全体を包含し得る、それぞれが引用される主題に関して参照により組み込まれる。
【０２０７】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される不定冠詞「a」及び「an」は、それとは反対に明確に示されない限り、「少なくとも1」を意味すると理解されるべきである。
【０２０８】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される語句「及び/又は」は、そのように結合された要素、すなわち、一部の場合、結合して存在し、他の場合、分離して存在する要素の「いずれか又は両方」を意味すると理解されるべきである。「及び/又は」と共に列挙される複数の要素は、同じ様式で、すなわち、そのように結合された「1又は複数の」要素と解釈されるべきである。場合により、具体的に同定されたこれらの要素と関連するか、又は関連しない、「及び/又は」条項によって具体的に同定された要素以外の他の要素が存在してもよい。かくして、非限定例として、「含む(comprising)」等の開口的な言語と共に使用される場合、「A及び/又はB」に対する参照は、一実施形態では、Aのみ(場合により、B以外の要素を含む);別の実施形態では、Bのみ(場合により、A以外の要素を含む);更に別の実施形態では、AとBの両方(場合により、他の要素を含む)等を指してもよい。
【０２０９】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、「又は」は、上記で定義された「及び/又は」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、一覧中の項目を分離する場合、「又は」又は「及び/又は」は、包括的である、すなわち、要素の数又は一覧、及び場合により、更なる列挙されていない項目の、少なくとも1つを含むが、1より多いものも含むと解釈されるべきである。「ただ1つの」若しくは「正確に1つの」等の、それとは反対に明確に示された唯一の用語、又は特許請求の範囲で使用される場合、「からなる(consisting of)」は、要素の数又は一覧の正確に1つの要素の含有を指すであろう。一般に、本明細書で使用される用語「又は」は、「いずれか」、「1つの」、「ただ1つの」又は「正確に1つの」等の、排他性の用語に先行する場合にのみ、排他的な選択肢(すなわち、「1つの又は両方ではないが他のもの」)を示すと解釈されるべきである。特許請求の範囲で使用される場合、「から本質的になる(consisting essentially of)」は、特許法の分野で使用されるその通常の意味を有するべきである。
【０２１０】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、1つ又は複数の要素の一覧を参照する語句「少なくとも1」は、要素の一覧内に具体的に列挙されるそれぞれの要素及び全ての要素のうちの少なくとも1つを含む必要はなく、要素の一覧中の要素の任意の組合せを含まない、要素の一覧中の任意の1又は複数の要素から選択される少なくとも1つの要素を意味すると理解されるべきである。この定義はまた、場合により、具体的に同定される要素と関連するか、又は関連しない、語句「少なくとも1」が指す要素の一覧内で具体的に同定される要素以外の要素が存在してもよいことを可能にする。かくして、非限定例として、「A及びBの少なくとも1」(又は、同等に、「A又はBの少なくとも1」又は同等に、「A及び/又はBの少なくとも1」)は、一実施形態では、場合により、Bが存在しない、1より多いものを含む、少なくとも1のA(及び場合により、B以外の要素を含む);別の実施形態では、場合により、Aが存在しない、1より多いものを含む、少なくとも1のB(及び場合により、A以外の要素を含む);更に別の実施形態では、場合により、1より多いものを含む、少なくとも1のA、及び場合により、1より多いものを含む、少なくとも1のB(及び場合により、他の要素を含む)等を指してもよい。
【０２１１】
また、それとは反対に明確に示されない限り、1より多い工程又は動作を含む本明細書で特許請求される任意の方法において、方法の工程又は動作の順序は、方法の工程又は動作が記載される順序に必ずしも限定されないことも理解されるべきである。
【０２１２】
特許請求の範囲、並びに上記の明細書において、「含む(comprising)」、「含む(including)」、「担持する(carrying)」、「有する(having)」、「含有する(containing)」、「含む(involving)」、「保持する(holding)」、「から構成される(composed of)」等の全ての暫定的語句は、開口的である、すなわち、限定されるものではないが、含むと意味すると理解されるべきである。暫定的語句「からなる(consisting of)」及び「から本質的になる(consisting essentially of)」のみが、特許審査手順の米国特許商標庁マニュアル、セクション2111.03に記載されたように、それぞれ、閉じた、又は半分閉じた暫定的語句であるべきである。開口的な暫定的語句(例えば、「含む(comprising)」)を使用して本文献で記載される実施形態も、代替的な実施形態では、開口的な暫定的語句によって記載される特徴「からなる(consisting of)」及び「から本質的になる(consisting essentially of)」として企図されることが理解されるべきである。例えば、本開示が「A及びBを含む組成物」を記載する場合、本開示はまた、代替的な実施形態である「A及びBからなる組成物」及び「A及びBから本質的になる組成物」も企図する。
【図１Ａ】
2020515260.tif 000063
【図１Ｂ】
2020515260.tif 000064
【図１Ｃ−１】
2020515260.tif 000065
【図１Ｃ−２】
2020515260.tif 000066
【図１Ｄ】
2020515260.tif 000067
【図１Ｅ】
2020515260.tif 000068
【図２Ａ】
2020515260.tif 000069
【図２Ｂ】
2020515260.tif 000070
【図２Ｃ】
2020515260.tif 000071
【図２Ｄ】
2020515260.tif 000072
【図２Ｅ】
2020515260.tif 000073
【図２Ｆ】
2020515260.tif 000074
【図２Ｇ】
2020515260.tif 000075
【図２Ｈ】
2020515260.tif 000076
【図２Ｉ】
2020515260.tif 000077
【図２Ｊ】
2020515260.tif 000078
【図２Ｋ】
2020515260.tif 000079
【図３Ａ】
2020515260.tif 000080
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
2020515260.tif 000082
【図３Ｄ】
2020515260.tif 000083
【図３Ｅ】
2020515260.tif 000084
【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図３Ｌ】
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【図３Ｍ】
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【図３Ｎ】
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【図３Ｏ】
2020515260.tif 000094
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
2020515260.tif 000102
【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
2020515260.tif 000104
【図４Ｋ】
2020515260.tif 000105
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
2020515260.tif 000108
【図５Ｄ】
2020515260.tif 000109
【図６Ａ−Ｂ】
2020515260.tif 000110
【図６Ｃ】
2020515260.tif 000111
【図６Ｄ】
2020515260.tif 000112
【図６Ｅ】
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【図６Ｆ−Ｇ】
2020515260.tif 000114
【図６Ｈ】
2020515260.tif 000115
【図６Ｉ】
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【図６Ｊ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図８Ｉ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１０Ｈ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１２Ｈ】
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【図１２Ｉ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１４Ｇ】
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【図１４Ｈ】
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【図１４Ｉ】
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【図１４Ｊ】
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【図１４Ｋ】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2020515260.tif 000180
2020515260.tif 000181