(57)【要約】  本発明は、癌細胞の細胞死に関し、特に細胞死受容体リガンド（ＤＲＬ）誘導性の細胞死に対して感受性のある癌細胞を同定するために使用され得るバイオマーカーに関する。本発明はまた、ＤＲＬ誘導性の細胞死に対して感受性がある癌細胞を同定するための予測方法およびキットにも及ぶ。本発明はさらに、癌を治療するための新規組成物およびそのような組成物を使用する治療方法にも及ぶ。【選択図】図１０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体の癌細胞が細胞死受容体リガンド（ＤＲＬ）誘導性の細胞死に対して感受性があるかどうかを判定する方法であって、前記個体から採取された生物学的試料において、
（ｉ）変異型ＢＡＰ１遺伝子もしくは変異型ＢＡＰ１タンパク質の存在；
（ｉｉ）ＤＲＬ誘導性の細胞死に耐性がある、ＢＡＰ１野生型細胞である参照細胞における発現レベルもしくはタンパク質濃度と比較した、野生型ＢＡＰ１遺伝子の発現レベルの減少もしくは野生型ＢＡＰ１タンパク質濃度の減少；または
（ｉｉｉ）ＤＲＬ誘導性の細胞死に耐性がある、ＢＡＰ１野生型細胞である参照細胞における結合レベルと比較した、野生型ＢＡＰ１タンパク質に対するＡＳＸＬタンパク質の結合の減少または非結合、
を検出することを含み、
前記試料中の、前記変異型ＢＡＰ１遺伝子もしくは前記変異型ＢＡＰ１タンパク質の、または前記野生型ＢＡＰ１遺伝子の発現レベルの減少もしくはタンパク質濃度の減少の存在、あるいはＡＳＸＬタンパク質の野生型ＢＡＰ１タンパク質への結合の減少もしくは非結合が、前記個体の癌細胞がＤＲＬ誘導性の細胞死に対して感受性があることを示している、方法。
【請求項２】
前記変異型ＢＡＰ１遺伝子が、非機能的もしくは酵素的に不活性なＢＡＰ１タンパク質、またはＤＲＬ誘導性の細胞死に耐性がある、参照細胞における結合レベルと比較して、ＡＳＸＬタンパク質への結合の減少を示すＢＡＰ１タンパク質をコードする遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＡＳＸＬタンパク質が、ＡＳＸＬ１、ＡＳＸＬ２、またはＡＳＸＬ３である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
変異型ＢＡＰ１タンパク質が、非機能的であるまたは酵素的に不活性であるまたはＡＳＸＬタンパク質に結合できないまたはＤＲＬ誘導性の細胞死に耐性がある、参照細胞における結合レベルと比較して、ＡＳＸＬタンパク質への結合の減少を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記発現レベルの減少が、前記参照細胞と比較して、少なくとも１０％、１５％、２５％、３５％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の減少である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記野生型ＢＡＰ１タンパク質の濃度の減少が、前記参照細胞と比較して、少なくとも１０％、１５％、２５％、３５％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の減少であり得る、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記変異型ＢＡＰ１タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号４またはその断片もしくは変異体によってコードされている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記変異型ＢＡＰ１遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号５またはその断片もしくは変異体によってコードされている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
個体の癌細胞がＤＲＬ誘導性の細胞死に対して感受性があるかどうかを判定するためのキットであって、変異型ＢＡＰ１遺伝子もしくは変異型ＢＡＰ１タンパク質の発現を検出するための、またはＤＲＬ誘導性の細胞死に耐性がある参照細胞中の発現レベルもしくはタンパク質濃度と比較した、野生型ＢＡＰ１遺伝子の発現レベルの減少もしくは野生型ＢＡＰ１タンパク質濃度の減少を検出するための、またはＤＲＬ誘導性の細胞死に耐性があるＢＡＰ１野生型細胞である参照細胞における結合レベルと比較した、ＢＡＰ１タンパク質へのＡＳＸＬタンパク質の非結合もしくは結合の減少を検出するための、検出手段を備え、前記試料中の、前記変異型ＢＡＰ１遺伝子もしくは前記ＢＡＰ１タンパク質の、または前記野生型ＢＡＰ１遺伝子の発現レベルの減少もしくは野生型ＢＡＰ１タンパク質濃度の減少の存在、あるいは野生型ＢＡＰ１タンパク質に対するＡＳＸＬタンパク質の結合の減少もしくは非結合が、前記個体の癌細胞がＤＲＬ誘導性の細胞死に対して感受性があることを示している、キット。
【請求項１０】
前記キットが、少なくとも１つの対照または参照試料を含む、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前記キットが、陰性対照および／または陽性対照を含む、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記陰性対照が、ＤＲＬ誘導性の細胞死に耐性がある野生型ＢＡＰ１タンパク質を含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記陽性対照が、変異型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡ、または変異型ＢＡＰ１タンパク質、またはブランク試料を含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１４】
（ｉ）変異型ＢＡＰ１遺伝子もしくは変異型ＢＡＰ１タンパク質、または（ｉｉ）ＢＡＰ１野生型細胞である参照細胞における発現レベルもしくはタンパク質濃度と比較して、野生型ＢＡＰ１遺伝子の発現レベルの減少もしくは野生型ＢＡＰ１タンパク質濃度の減少を有する癌細胞の、ＤＲＬ誘導性の細胞死に対して感受性があるバイオマーカーとしての、使用。
【請求項１５】
（ｉ）ＢＡＰ１阻害剤またはＢＡＰ１阻害の効果を模倣する薬剤、および（ｉｉ）細胞死受容体リガンドを含む、組成物。
【請求項１６】
治療に使用するための、または医薬品として使用するための、（ｉ）ＢＡＰ１阻害剤もしくはＢＡＰ１阻害の効果を模倣する薬剤、および（ｉｉ）細胞死受容体リガンドを含む、組成物。
【請求項１７】
癌の治療、予防、または改善に使用するための、（ｉ）ＢＡＰ１阻害剤もしくはＢＡＰ１阻害の効果を模倣する薬剤、および（ｉｉ）細胞死受容体リガンドを含む、組成物。
【請求項１８】
請求項１７に記載の使用のための、（ｉ）ＢＡＰ１阻害剤もしくはＢＡＰ１阻害の効果を模倣する薬剤、および（ｉｉ）細胞死受容体リガンドを含む、組成物であって、前記癌が、中皮腫、悪性胸膜中皮腫、ブドウ膜黒色腫、黒色腫、非黒色腫皮膚癌、腎臓癌、肺癌、胸膜癌、腹部癌、腹膜癌、心膜癌、頭頸部癌、脳腫瘍、乳癌、肝臓または胆道癌、上部管および下部管を含む消化器癌、尿路上皮癌、前立腺癌、精巣癌、精巣鞘膜癌、卵巣癌、子宮頸癌、肉腫、リンパ腫、または白血病である、組成物。
【請求項１９】
請求項１７に記載の組成物と、薬学的に許容されるビヒクルと、を含む、薬学的組成物。
【請求項２０】
治療有効量のＢＡＰ１阻害剤またはＢＡＰ１阻害の効果を模倣する薬剤および細胞死受容体リガンド、ならびに薬学的に許容されるビヒクルを接触させることを含む、請求項１９に記載の薬学的組成物を調製するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌細胞の細胞死に関し、特に、細胞死受容体リガンド（ＤＲＬ）誘導性の細胞死(death receptor ligand (DRL)-induced cell death)に対して感受性がある癌細胞を同定するために使用され得るバイオマーカーに関する。本発明はまた、ＤＲＬ誘導性の細胞死に対して感受性がある癌細胞を同定するための予測方法およびキットにも及ぶ。本発明はさらに、癌を治療するための新規な組成物およびそのような組成物を使用する治療方法にも及ぶ。
【背景技術】
【０００２】
悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）は、胸膜に最も頻繁に発生し、ほとんど常にアスベスト曝露に関連する、まれであるが常に致命的な悪性腫瘍である（１、２）。アスベストの採掘と使用は、多くの国で法的規制の対象となっているが、世界的な工業化への傾向が高まるにつれて、アスベストの使用と生成が増加しているという証拠が残っている（３）。１０〜４０年のいずれかの癌潜伏期間を考えると、それゆえ、そのような国々では、アスベストに関連する癌は、今後５０年間で増加する可能性が高い。ＭＰＭと診断された患者に対する現在の治療法の選択肢は限られている。例えば、根治手術は限られた利益しか提供せず、癌はほとんどの化学療法薬に対して難治性である（４）。実際、ペメトレキセドにシスプラチンを加えた現在のゴールドスタンダードである化学療法投与計画では、全生存期間中央値は１２．１カ月、進行までの期間は５．７カ月である（５）。
【０００３】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌ）は、インビトロおよびインビボで腫瘍細胞において細胞死を誘導するが、ほとんどの正常細胞においてはそうではないＴＮＦリガンドファミリーのメンバーである。多数の化学療法薬もまた、ＴＲＡＩＬ媒介細胞死に対して腫瘍細胞を感受性にすることが示されている。中皮腫細胞の中には、ＴＲＡＩＬ誘導性の細胞死に対して感受性があるものもあれば、インビトロでの細胞死の誘導に耐性があるものもあり、コア細胞死機構のこの破壊は、臨床的に観察されている従来の細胞傷害剤に対する一般的な耐性における関係が示唆されている（１１）。
【０００４】
ある種の癌は、既知の細胞死受容体リガンドの前細胞死効果に対して感受性があるが、他のものはそうではない。どの癌がＤＲＬ誘導性の細胞死に対して感受性があるかがわからなければ、癌を有する個体は、毒性および問題が記述されている、化学療法のような非特異的細胞傷害療法による治療に頼らなければならない（５）。さらに、患者が反応するか否かについての明確な指示による前治療がなければ、そのような治療の利点は、最初は不確実である。
【発明の概要】
【０００５】
したがって、細胞死受容体リガンド（ＤＲＬ）誘導性の細胞死によって引き起こされる細胞死に対して感受性がある癌の治療のためのより効果的な治療的介入に対する強い要望がある。ＴＲＡＩＬ受容体１および２（細胞死受容体４および５）、ＴＮＦ受容体およびＦＡＳ受容体などの、細胞死受容体に結合された際に細胞死受容体リガンドによって引き起こされる細胞死に対して感受性がある癌性細胞を同定するために使用され得るバイオマーカーを提供する必要もある。
【０００６】
したがって、本発明の第１の態様では、個体の癌細胞が細胞死受容体リガンド（ＤＲＬ）誘導性の細胞死に対して感受性があるかどうかを判定する方法であって、個体から採取された生物学的試料において、
（ｉ）変異型ＢＡＰ１遺伝子もしくは変異型ＢＡＰ１タンパク質の存在、
（ｉｉ）ＤＲＬ誘導性の細胞死に耐性がある、ＢＡＰ１野生型細胞である参照細胞における発現レベルもしくはタンパク質濃度と比較した、野生型ＢＡＰ１遺伝子の発現レベルの減少、もしくは野生型ＢＡＰ１タンパク質濃度の減少、または
（ｉｉｉ）ＤＲＬ誘導性の細胞死に耐性がある、ＢＡＰ１野生型細胞である参照細胞における結合レベルと比較した、野生型ＢＡＰ１タンパク質に対するＡＳＸＬタンパク質の結合の減少または非結合、を検出することを含み、
試料中の、変異型ＢＡＰ１遺伝子もしくは変異型ＢＡＰ１タンパク質の、または野生型ＢＡＰ１遺伝子の発現レベルの減少もしくはタンパク質濃度の減少の存在、あるいはＡＳＸＬタンパク質の野生型ＢＡＰ１タンパク質への結合の減少もしくは非結合が、個体の癌細胞がＤＲＬ誘導性の細胞死に対して感受性があることを示している、方法を提供する。
【０００７】
以前の遺伝子解析は、ＣＤＫＮ２Ａ、ＮＦ２、およびＢＡＰ１の不活性化、ならびに多数の染色体アームの頻繁な喪失および獲得を含む、いくつかの重要な反復性の変化を同定している。さらに最近になって、２２人の悪性中皮腫患者の最初の全エクソーム配列分析により、腫瘍発生における可能性のあるドライバー事象としてのこれら３つの遺伝子の重要性が確認され、さらにＳＣＦ  Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体の必須の成分であるＣＵＬ１中の反復性の非同義変異が同定された（６）。
【０００８】
ＢＡＰ１は、中皮腫（７）、ブドウ膜黒色腫（８）、腎細胞癌（９）、および胆管癌（１０）を含む、様々な種類の癌で体細胞変異している腫瘍抑制遺伝子である。本発明者らは、癌細胞におけるＢＡＰ１変異体の発現が、細胞死受容体リガンドによって誘導される細胞死に対する感受性を増大させることを発見し、これは標的外効果がより少ないことを示す。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）は、例えば、インビトロおよびインビボで腫瘍細胞において細胞死を誘導するが、ほとんどの正常細胞においてはそうではない。したがって、有益なことに、本発明は、変異型ＢＡＰ１遺伝子の発現もしくは変異型ＢＡＰ１タンパク質の合成、または野生型ＢＡＰ１遺伝子の発現レベルの減少もしくは野生型ＢＡＰ１タンパク質濃度の減少に関連する、癌を有する個体が、細胞死受容体リガンド療法で治療されたときに肯定的な結果を示すであろう可能性を増加させる。したがって、本発明の方法は、予想(prognosis)を提供する。したがって、そのような個体は、非特異的療法で治療されて、関連する望ましくない副作用を被る可能性が低くなる。
【０００９】
ＢＡＰ１は、ＢＡＰ１遺伝子によってコードされる脱ユビキチン化酵素である。それは、核局在化配列およびユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼ（ＵＣＨ）ドメインを含む、８０．４ｋＤａのタンパク質であり、これは脱ユビキチン活性をＢＡＰ１に提供する。ＢＡＰ１遺伝子は、生殖細胞系でまたは体細胞的に様々な形態の癌で変異され得る。ヒト野生型ＢＡＰ１遺伝子（ＢＡＰ１全遺伝子配列＞ｇｉ｜５６８８１５５９５：ｃ５２４１０１０５−５２４０１００４ホモサピエンス染色体３）の一実施形態をコードするヌクレオチド配列は、本明細書では以下のように、配列番号１として提供される。
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［配列番号１］
ヒト野生型ＢＡＰ１遺伝子の一実施形態をコードするｃＤＮＡ配列は、本明細書では以下のように、配列番号２として提供される。
ＡＴＧＡＡＴＡＡＧＧＧＣＴＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＡＧＡＧＣＧＡＣＣＣＡＧＧＣＣＴＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＣＴＣＧＴＧＧＡＡＧＡＴＴＴＣＧＧＴＧＴＣＡＡＧＧＧＧＧＴＧＣＡＡＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＴＡＣＧＡＣＣＴＴＣＡＧＡＧＣＡＡＡＴＧＴＣＡＧＧＧＣＣＣＴＧＴＡＴＡＴＧＧＡＴＴＴＡＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＣＧＡＡＧＡＧＣＧＣＣＧＧＴＣＣＣＧＧＣＧＡＡＡＧＧＴＣＴＣＴＡＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡＴＧＡＴＡＣＧＴＣＣＧＴＧＡＴＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＡＴＴＧＴＧＡＡＴＡＡＣＡＴＧＴＴＣＴＴＴＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＴＧＡＴＡＣＣＣＡＡＣＴＣＴＴＧＴＧＣＡＡＣＴＣＡＴＧＣＣＴＴＧＣＴＧＡＧＣＧＴＧＣＴＣＣＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＡＣＣＴＧＧＧＡＣＣＣＡＣＣＣＴＧＡＧＴＣＧＣＡＴＧＡＡＧＧＡＣＴＴＣＡＣＣＡＡＧＧＧＴＴＴＣＡＧＣＣＣＴＧＡＧＡＧＣＡＡＡＧＧＡＴＡＴＧＣＧＡＴＴＧＧＣＡＡＴＧＣＣＣＣＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＡＧＧＣＣＣＡＴＡＡＴＡＧＣＣＡＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＧＡＧＣＣＡＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＣＴＧＡＧＡＡＧＣＡＧＡＡＴＧＧＣＣＴＴＡＧＴＧＣＡＧＴＧＣＧＧＡＣＣＡＴＧＧＡＧＧＣＧＴＴＣＣＡＣＴＴＴＧＴＣＡＧＣＴＡＴＧＴＧＣＣＴＡＴＣＡＣＡＧＧＣＣＧＧＣＴＣＴＴＴＧＡＧＣＴＧＧＡＴＧＧＧＣＴＧＡＡＧＧＴＣＴＡＣＣＣＣＡＴＴＧＡＣＣＡＴＧＧＧＣＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＧＧＡＣＧＡＧＧＡＧＴＧＧＡＣＡＧＡＣＡＡＧＧＣＣＣＧＧＣＧＧＧＴＣＡＴＣＡＴＧＧＡＧＣＧＴＡＴＣＧＧＣＣＴＣＧＣＣＡＣＴＧＣＡＧＧＧＧＡＧＣＣＣＴＡＣＣＡＣＧＡＣＡＴＣＣＧＣＴＴＣＡＡＣＣＴＧＡＴＧＧＣＡＧＴＧＧＴＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＡＧＧＡＴＣＡＡＧＴＡＴＧＡＧＧＣＣＡＧＧＣＴＧＣＡＴＧＴＧＣＴＧＡＡＧＧＴＧＡＡＣＣＧＴＣＡＧＡＣＡＧＴＡＣＴＡＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＡＴＡＡＧＡＧＴＡＡＣＡＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＴＧＡＴＴＣＡＧＡＣＣＣＡＣＡＡＧＴＣＴＣＡＡＧＡＧＴＣＡＣＡＧＣＴＧＣＣＴＧＡＧＧＡＧＴＣＣＡＡＧＴＣＡＧＣＣＡＧＣＡＡＣＡＡＧＴＣＣＣＣＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＧＡＡＧＣＡＡＡＣＡＧＧＧＣＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＡＧＧＧＣＡＡＣＣＡＣＡＣＡＧＡＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＧＡＧＧＣＧＧＣＴＧＧＴＴＣＡＴＧＣＧＣＡＣＡＡＧＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＣＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＡＣＡＡＡＣＣＣＡＡＧＣＴＡＧＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＣＣＡＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＣＡＡＴＧＧＧＧＴＴＣＡＣＣＣＣＡＡＣＣＣＣＡＣＴＣＣＣＡＴＴＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＧＣＣＧＧＣＣＴＴＴＣＴＡＧＡＣＡＡＴＣＡＣＡＡＴＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＡＣＣＴＧＧＣＧＧＣＡＧＧＴＧＴＧＧＧＣＣＧＣＡＧＣＣＧＡＧＴＴＣＣＡＧＴＣＣＧＣＣＣＡＣＣＣＣＡＧＣＡＧＴＡＣＴＣＡＧＡＴＧＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡＣＴＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＧＧＡＧＧＡＴＧＡＣＧＴＧＣＡＧＡＡＣＡＣＣＡＡＣＴＣＴＧＣＣＣＴＴＡＧＧＴＡＴＡＡＧＧＧＧＡＡＧＧＧＡＡＣＡＧＧＧＡＡＧＣＣＡＧＧＧＧＣＡＴＴＧＡＧＣＧＧＴＴＣＴＧＣＴＧＡＴＧＧＧＣＡＡＣＴＧＴＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＧＣＣＣＡＡＣＡＣＣＡＴＣＡＡＣＧＴＣＴＴＧＧＣＴＧＡＧＡＡＧＣＴＣＡＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＧＡＡＧＧＡＣＣＴＣＴＣＡＡＴＴＣＣＴＣＴＧＴＣＣＡＴＣＡＡＧＡＣＴＡＧＣＡＧＣＧＧＧＧＣＴＧＧＧＡＧＴＣＣＧＧＣＴＧＴＧＧＣＡＧＴＧＣＣＣＡＣＡＣＡＣＴＣＧＣＡＧＣＣＣＴＣＡＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡＧＣＡＡＴＧＡＧＡＧＴＡＣＡＧＡＣＡＣＧＧＣＣＴＣＴＧＡＧＡＴＣＧＧＣＡＧＴＧＣＴＴＴＣＡＡＣＴＣＧＣＣＡＣＴＧＣＧＣＴＣＧＣＣＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＧＣＣＡＡＣＣＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＣＣＴＧＴＣＡＣＣＴＣＣＣＡＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＧＧＡＧＡＧＧＡＴＧＡＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＧＴＧＴＴＧＡＣＴＧＣＡＴＡＣＧＣＴＡＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＧＴＣＣＧＴＧＡＴＣＴＧＧＧＴＣＣＴＧＴＣＡＴＣＡＧＣＡＣＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＧＧＧＧＴＧＣＴＧＡＧＴＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣＴＧＡＣＡＧＡＧＧＧＴＧＧＧＡＡＧＧＧＴＴＣＣＴＣＧＣＣＣＴＣＣＡＴＣＡＧＡＣＣＡＡＴＣＣＡＡＧＧＣＡＧＣＣＡＧＧＧＧＴＣＣＡＧＣＡＧＣＣＣＡＧＴＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧＧＴＣＧＴＧＧＡＡＧＣＣＡＣＧＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＡＧＡＡＧＡＣＧＧＧＧＡＴＧＧＴＧＡＧＧＣＣＴＧＧＣＧＡＧＣＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＧＧＡＧＡＡＡＴＡＣＴＣＡＣＣＣＡＡＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＣＴＧＣＴＧＡＡＧＴＧＴＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＴＴＧＣＡＡＡＣＴＡＴＧＡＧＧＣＧＴＧＣＣＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧＴＡＧＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＡＴＴＧＡＴＧＡＣＣＡＧＡＧＡＡＧＧＡＣＣＣＡＣＡＡＣＴＡＣＧＡＴＧＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＴＴＴＡＴＣＴＣＣＡＴＧＣＴＧＧＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＡＴＧＣＴＧＧＣＣＡＡＣＣＴＡＧＴＧＧＡＧＣＡＧＡＡＣＡＴＣＴＣＣＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＧＣＣＡＡＧＧＧＧＴＣＡＧＣＡＴＣＧＧＣＣＧＧＣＴＣＣＡＣＡＡＧＣＡＧＣＧＧＡＡＧＣＣＴＧＡＣＣＧＧＣＧＧＡＡＡＣＧＣＴＣＴＣＧＣＣＣＣＴＡＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＣＧＣＣＡＧＴＧＡ
［配列番号２］
ヒト野生型ＢＡＰ１の一実施形態のアミノ酸配列は、本明細書では以下のように、配列番号３と呼ばれる。
ＭＮＫＧＷＬＥＬＥＳＤＰＧＬＦＴＬＬＶＥＤＦＧＶＫＧＶＱＶＥＥＩＹＤＬＱＳＫＣＱＧＰＶＹＧＦＩＦＬＦＫＷＩＥＥＲＲＳＲＲＫＶＳＴＬＶＤＤＴＳＶＩＤＤＤＩＶＮＮＭＦＦＡＨＱＬＩＰＮＳＣＡＴＨＡＬＬＳＶＬＬＮＣＳＳＶＤＬＧＰＴＬＳＲＭＫＤＦＴＫＧＦＳＰＥＳＫＧＹＡＩＧＮＡＰＥＬＡＫＡＨＮＳＨＡＲＰＥＰＲＨＬＰＥＫＱＮＧＬＳＡＶＲＴＭＥＡＦＨＦＶＳＹＶＰＩＴＧＲＬＦＥＬＤＧＬＫＶＹＰＩＤＨＧＰＷＧＥＤＥＥＷＴＤＫＡＲＲＶＩＭＥＲＩＧＬＡＴＡＧＥＰＹＨＤＩＲＦＮＬＭＡＶＶＰＤＲＲＩＫＹＥＡＲＬＨＶＬＫＶＮＲＱＴＶＬＥＡＬＱＱＬＩＲＶＴＱＰＥＬＩＱＴＨＫＳＱＥＳＱＬＰＥＥＳＫＳＡＳＮＫＳＰＬＶＬＥＡＮＲＡＰＡＡＳＥＧＮＨＴＤＧＡＥＥＡＡＧＳＣＡＱＡＰＳＨＳＰＰＮＫＰＫＬＶＶＫＰＰＧＳＳＬＮＧＶＨＰＮＰＴＰＩＶＱＲＬＰＡＦＬＤＮＨＮＹＡＫＳＰＭＱＥＥＥＤＬＡＡＧＶＧＲＳＲＶＰＶＲＰＰＱＱＹＳＤＤＥＤＤＹＥＤＤＥＥＤＤＶＱＮＴＮＳＡＬＲＹＫＧＫＧＴＧＫＰＧＡＬＳＧＳＡＤＧＱＬＳＶＬＱＰＮＴＩＮＶＬＡＥＫＬＫＥＳＱＫＤＬＳＩＰＬＳＩＫＴＳＳＧＡＧＳＰＡＶＡＶＰＴＨＳＱＰＳＰＴＰＳＮＥＳＴＤＴＡＳＥＩＧＳＡＦＮＳＰＬＲＳＰＩＲＳＡＮＰＴＲＰＳＳＰＶＴＳＨＩＳＫＶＬＦＧＥＤＤＳＬＬＲＶＤＣＩＲＹＮＲＡＶＲＤＬＧＰＶＩＳＴＧＬＬＨＬＡＥＤＧＶＬＳＰＬＡＬＴＥＧＧＫＧＳＳＰＳＩＲＰＩＱＧＳＱＧＳＳＳＰＶＥＫＥＶＶＥＡＴＤＳＲＥＫＴＧＭＶＲＰＧＥＰＬＳＧＥＫＹＳＰＫＥＬＬＡＬＬＫＣＶＥＡＥＩＡＮＹＥＡＣＬＫＥＥＶＥＫＲＫＫＦＫＩＤＤＱＲＲＴＨＮＹＤＥＦＩＣＴＦＩＳＭＬＡＱＥＧＭＬＡＮＬＶＥＱＮＩＳＶＲＲＲＱＧＶＳＩＧＲＬＨＫＱＲＫＰＤＲＲＫＲＳＲＰＹＫＡＫＲＱ
［配列番号３］
腫瘍は、癌原遺伝子または腫瘍抑制遺伝子の変異によって生じる。癌原遺伝子における機能獲得型変異(gain-of-function mutation)は、それを癌遺伝子に変換し、それが腫瘍形成を引き起こす。このような機能獲得型変異は、通常、ＤＮＡ塩基におけるミスセンス変異であり、これはアミノ酸配列の変化、または遺伝子のコピー数の獲得をもたらす。腫瘍抑制遺伝子における機能喪失変異もまた、腫瘍形成を招くであろう。しかしながら、腫瘍抑制因子における機能喪失変異は、数個のアミノ酸の変化に限定されない。タンパク質の機能を損なうアミノ酸のいずれかの変化が、機能喪失変異をもたらす。それゆえ、癌遺伝子とは異なり、腫瘍抑制遺伝子の機能の喪失をもたらす特定の変異を同定することは必ずしも可能ではない。したがって、腫瘍抑制因子の機能喪失短縮型変異(Loss-of-function truncating mutations)は、典型的には、遺伝子のコーディングエクソン全体を通して同定される。
【００１０】
ＢＡＰ１は、腫瘍抑制遺伝子である。本発明によると、変異型ＢＡＰ１遺伝子は、変異を含むものである。変異型ＢＡＰ１遺伝子は、非機能的もしくは酵素的に不活性なＢＡＰ１タンパク質、またはＤＲＬ誘導性の細胞死に耐性がある、参照細胞における結合レベルと比較して、ＡＳＸＬタンパク質への結合の減少を示すＢＡＰ１タンパク質、をコードする遺伝子である。したがって、変異型ＢＡＰ１タンパク質は、非機能的もしくは酵素的に不活性であるか、またはＡＳＸＬタンパク質に結合することができないか、あるいはＤＲＬ誘導性の細胞死に耐性がある、参照細胞における結合レベルと比較して、ＡＳＸＬタンパク質への結合の減少を示すものである。実施例に記載されるように（図７ｄを参照のこと）、ＢＡＰ１は、驚くべきことに、ＡＳＸＬ１、ＡＳＸＬ２、またはＡＳＸＬ３と複合体を形成することが示された。これらのタンパク質は、本明細書では一括して、ＡＳＸＬタンパク質と称する。ＢＡＰ１−ＡＳＸＬ複合体は、ヒストン２Ａおよび他の基質を脱ユビキチン化することが示されている。この複合体の形成を阻害することにより、ＢＡＰ１は機能しなくなるか、または酵素的に不活性になる。
【００１１】
変異型ＢＡＰ１タンパク質は、特定の遺伝子座に変異を有する全長タンパク質であり得る。変異型ＢＡＰ１タンパク質は、野生型ＢＡＰ１タンパク質の部分的もしくは完全な欠失もしくは変異であり得る。部分的な欠失もしくは変異は、核局在化配列（ＮＬＳ）、野生型ＢＡＰ１の活性部位、ＡＳＸＬの結合部位、またはＢＡＰ１の機能の喪失をもたらすであろう遺伝子中の任意の場所で起こり得る。変異は、１つ以上の点変異を含み得る。点変異は、置換、挿入、欠失、またはフレームシフト変異であり得る。
【００１２】
参照細胞における発現レベルと比較した、野生型ＢＡＰ１遺伝子の発現レベルの減少は、同じ参照細胞におけるタンパク質濃度と比較した、野生型ＢＡＰ１タンパク質濃度の減少をもたらし得る。野生型ＢＡＰ１遺伝子の発現レベルの減少は、参照細胞と比較して、少なくとも１０％、１５％、２５％、３５％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の減少であり得る。同様に、野生型ＢＡＰ１タンパク質の濃度の減少は、参照細胞と比較して、少なくとも１０％、１５％、２５％、３５％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の減少であり得る。当業者であれば、ＢＡＰ１遺伝子発現の減少またはＢＡＰ１タンパク質発現の減少の程度を検出する方法を知っているであろう。
【００１３】
野生型ＢＡＰ１タンパク質の発現の減少は、エピジェネティックサイレンシング(epigenetic silencing)、メチル化、または低レベルのＢＡＰ１遺伝子発現によって引き起こされる可能性がある。「非機能的ＢＡＰ１タンパク質」という用語は、脱ユビキチン化酵素（酵素）活性を示さないＢＡＰ１タンパク質を指すことができるが、これに限定されない。当業者であれば、脱ユビキチン化酵素活性を測定するための標準的なアッセイには、ユビキチン−アミドメチルクマリンなどの蛍光発生基質を使用する蛍光アッセイ；および脱ユビキチン化活性を監視するためのモデル基質としてユビキチンエチルエステルまたはユビキチン融合ペプチドを使用するＨＰＬＣアッセイが含まれるが、これらに限定されないことを理解するであろう。
【００１４】
一実施形態では、変異型ＢＡＰ１遺伝子のアミノ酸配列（ｐ．Ｒ６０Ｑ）は、本明細書では以下のように、配列番号４と呼ばれる。
【００１５】
【化１】
2020500502.tif 000003
【００１６】
したがって、変異型ＢＡＰ１タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４またはその断片もしくは変異体によってコードされ得る。
【００１７】
一実施形態では、変異型ＢＡＰ１遺伝子のヌクレオチド配列は、本明細書では以下のように、配列番号５と呼ばれる。
ＡＴＧＡＡＴＡＡＧＧＧＣＴＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＡＧＡＧＣＧＡＣＣＣＡＧＧＣＣＴＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＣＴＣＧＴＧＧＡＡＧＡＴＴＴＣＧＧＴＧＴＣＡＡＧＧＧＧＧＴＧＣＡＡＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＴＡＣＧＡＣＣＴＴＣＡＧＡＧＣＡＡＡＴＧＴＣＡＧＧＧＣＣＣＴＧＴＡＴＡＴＧＧＡＴＴＴＡＴＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＡＡＡＴＧＧＡＴＣＧＡＡＧＡＧＣＧＣＣＧＧＴＣＣＣＧＧＣＡＡＡＡＧＧＴＣＴＣＴＡＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡＴＧＡＴＡＣＧＴＣＣＧＴＧＡＴＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＡＴＴＧＴＧＡＡＴＡＡＣＡＴＧＴＴＣＴＴＴＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＴＧＡＴＡＣＣＣＡＡＣＴＣＴＴＧＴＧＣＡＡＣＴＣＡＴＧＣＣＴＴＧＣＴＧＡＧＣＧＴＧＣＴＣＣＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＡＣＣＴＧＧＧＡＣＣＣＡＣＣＣＴＧＡＧＴＣＧＣＡＴＧＡＡＧＧＡＣＴＴＣＡＣＣＡＡＧＧＧＴＴＴＣＡＧＣＣＣＴＧＡＧＡＧＣＡＡＡＧＧＡＴＡＴＧＣＧＡＴＴＧＧＣＡＡＴＧＣＣＣＣＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＡＧＧＣＣＣＡＴＡＡＴＡＧＣＣＡＴＧＣＣＡＧＧＣＣＣＧＡＧＣＣＡＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＣＴＧＡＧＡＡＧＣＡＧＡＡＴＧＧＣＣＴＴＡＧＴＧＣＡＧＴＧＣＧＧＡＣＣＡＴＧＧＡＧＧＣＧＴＴＣＣＡＣＴＴＴＧＴＣＡＧＣＴＡＴＧＴＧＣＣＴＡＴＣＡＣＡＧＧＣＣＧＧＣＴＣＴＴＴＧＡＧＣＴＧＧＡＴＧＧＧＣＴＧＡＡＧＧＴＣＴＡＣＣＣＣＡＴＴＧＡＣＣＡＴＧＧＧＣＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＧＧＡＣＧＡＧＧＡＧＴＧＧＡＣＡＧＡＣＡＡＧＧＣＣＣＧＧＣＧＧＧＴＣＡＴＣＡＴＧＧＡＧＣＧＴＡＴＣＧＧＣＣＴＣＧＣＣＡＣＴＧＣＡＧＧＧＧＡＧＣＣＣＴＡＣＣＡＣＧＡＣＡＴＣＣＧＣＴＴＣＡＡＣＣＴＧＡＴＧＧＣＡＧＴＧＧＴＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＡＧＧＡＴＣＡＡＧＴＡＴＧＡＧＧＣＣＡＧＧＣＴＧＣＡＴＧＴＧＣＴＧＡＡＧＧＴＧＡＡＣＣＧＴＣＡＧＡＣＡＧＴＡＣＴＡＧＡＧＧＣＴＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＡＴＡＡＧＡＧＴＡＡＣＡＣＡＧＣＣＡＧＡＧＣＴＧＡＴＴＣＡＧＡＣＣＣＡＣＡＡＧＴＣＴＣＡＡＧＡＧＴＣＡＣＡＧＣＴＧＣＣＴＧＡＧＧＡＧＴＣＣＡＡＧＴＣＡＧＣＣＡＧＣＡＡＣＡＡＧＴＣＣＣＣＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＧＡＡＧＣＡＡＡＣＡＧＧＧＣＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＡＧＧＧＣＡＡＣＣＡＣＡＣＡＧＡＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＧＡＧＧＣＧＧＣＴＧＧＴＴＣＡＴＧＣＧＣＡＣＡＡＧＣＣＣＣＡＴＣＣＣＡＣＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＡＣＡＡＡＣＣＣＡＡＧＣＴＡＧＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＣＣＡＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＣＡＡＴＧＧＧＧＴＴＣＡＣＣＣＣＡＡＣＣＣＣＡＣＴＣＣＣＡＴＴＧＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＧＣＣＧＧＣＣＴＴＴＣＴＡＧＡＣＡＡＴＣＡＣＡＡＴＴＡＴＧＣＣＡＡＧＴＣＣＣＣＣＡＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＡＣＣＴＧＧＣＧＧＣＡＧＧＴＧＴＧＧＧＣＣＧＣＡＧＣＣＧＡＧＴＴＣＣＡＧＴＣＣＧＣＣＣＡＣＣＣＣＡＧＣＡＧＴＡＣＴＣＡＧＡＴＧＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡＣＴＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＧＧＡＧＧＡＴＧＡＣＧＴＧＣＡＧＡＡＣＡＣＣＡＡＣＴＣＴＧＣＣＣＴＴＡＧＧＴＡＴＡＡＧＧＧＧＡＡＧＧＧＡＡＣＡＧＧＧＡＡＧＣＣＡＧＧＧＧＣＡＴＴＧＡＧＣＧＧＴＴＣＴＧＣＴＧＡＴＧＧＧＣＡＡＣＴＧＴＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＧＣＣＣＡＡＣＡＣＣＡＴＣＡＡＣＧＴＣＴＴＧＧＣＴＧＡＧＡＡＧＣＴＣＡＡＡＧＡＧＴＣＣＣＡＧＡＡＧＧＡＣＣＴＣＴＣＡＡＴＴＣＣＴＣＴＧＴＣＣＡＴＣＡＡＧＡＣＴＡＧＣＡＧＣＧＧＧＧＣＴＧＧＧＡＧＴＣＣＧＧＣＴＧＴＧＧＣＡＧＴＧＣＣＣＡＣＡＣＡＣＴＣＧＣＡＧＣＣＣＴＣＡＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡＧＣＡＡＴＧＡＧＡＧＴＡＣＡＧＡＣＡＣＧＧＣＣＴＣＴＧＡＧＡＴＣＧＧＣＡＧＴＧＣＴＴＴＣＡＡＣＴＣＧＣＣＡＣＴＧＣＧＣＴＣＧＣＣＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＧＣＣＡＡＣＣＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＣＴＣＣＡＧＣＣＣＴＧＴＣＡＣＣＴＣＣＣＡＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＧＧＡＧＡＧＧＡＴＧＡＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＧＴＧＴＴＧＡＣＴＧＣＡＴＡＣＧＣＴＡＣＡＡＣＣＧＴＧＣＴＧＴＣＣＧＴＧＡＴＣＴＧＧＧＴＣＣＴＧＴＣＡＴＣＡＧＣＡＣＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＧＧＧＧＴＧＣＴＧＡＧＴＣＣＣＣＴＧＧＣＧＣＴＧＡＣＡＧＡＧＧＧＴＧＧＧＡＡＧＧＧＴＴＣＣＴＣＧＣＣＣＴＣＣＡＴＣＡＧＡＣＣＡＡＴＣＣＡＡＧＧＣＡＧＣＣＡＧＧＧＧＴＣＣＡＧＣＡＧＣＣＣＡＧＴＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧＧＴＣＧＴＧＧＡＡＧＣＣＡＣＧＧＡＣＡＧＣＡＧＡＧＡＧＡＡＧＡＣＧＧＧＧＡＴＧＧＴＧＡＧＧＣＣＴＧＧＣＧＡＧＣＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＧＧＡＧＡＡＡＴＡＣＴＣＡＣＣＣＡＡＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＣＴＧＣＴＧＡＡＧＴＧＴＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＡＴＴＧＣＡＡＡＣＴＡＴＧＡＧＧＣＧＴＧＣＣＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧＴＡＧＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＡＴＴＧＡＴＧＡＣＣＡＧＡＧＡＡＧＧＡＣＣＣＡＣＡＡＣＴＡＣＧＡＴＧＡＧＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＴＴＴＡＴＣＴＣＣＡＴＧＣＴＧＧＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＡＴＧＣＴＧＧＣＣＡＡＣＣＴＡＧＴＧＧＡＧＣＡＧＡＡＣＡＴＣＴＣＣＧＴＧＣＧＧＣＧＧＣＧＣＣＡＡＧＧＧＧＴＣＡＧＣＡＴＣＧＧＣＣＧＧＣＴＣＣＡＣＡＡＧＣＡＧＣＧＧＡＡＧＣＣＴＧＡＣＣＧＧＣＧＧＡＡＡＣＧＣＴＣＴＣＧＣＣＣＣＴＡＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＣＧＣＣＡＧＴＧＡ
［配列番号５］
したがって、変異型ＢＡＰ１遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号５またはその断片もしくは変異体によってコードされ得る。
【００１８】
ＡＳＸＬタンパク質（ＡＳＸＬ１、ＡＳＸＬ２、またはＡＳＸＬ３）と野生型ＢＡＰ１タンパク質との間の結合の減少または非結合は、野生型ＢＡＰ１タンパク質とＡＳＸＬタンパク質との間の結合が生じる参照細胞と比較して、少なくとも１０％、１５％、２５％、３５％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の減少であり得る。当業者であれば、ＡＳＸＬタンパク質に結合する野生型ＢＡＰ１タンパク質の減少の程度を検出する方法を知っているだろう。野生型ＢＡＰ１タンパク質とＡＳＸＬタンパク質との間の結合を測定するための標準的なアッセイとしては、タンパク質複合体免疫沈降法または蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
「ＤＲＬ誘導性の細胞死(DRL-induced cell death)」という用語は、ネクロプトーシスおよび壊死のような細胞死受容体リガンド（ＤＲＬ）によって引き起こされるアポトーシスおよび他の種類の細胞死を指し得るが、これらに限定されない。したがって、「細胞死受容体リガンド(death receptor ligand)」という用語は、細胞受容体に結合し、受容体が位置する細胞の死を誘導する任意の薬剤を指す。「細胞死」という用語は、細胞アポトーシス、壊死、およびネクロプトーシスを指すことができる。好ましくは、それは、細胞アポトーシスを指す。アポトーシスとは、アポトーシスシグナル伝達経路の活性化によって引き起こされるプログラムされた細胞死を指す。これは、ＤＲＬの細胞死受容体への結合を通して達成することができる。細胞死受容体リガンドは、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦアルファ、ＦＡＳリガンド（ＦＡＳＬ）、組換えＴＲＡＩＬ（デュラネルミン）、細胞死受容体に対する抗体、特にリガンドＴＲＡＩＬの細胞死受容体に対する抗体（マパツムアブ、ドロジツムマブ、コナツムマブ、レキサツムマブ、チガツズマブ、ＬＢＹ−１３５など）、またはそれらの組み合わせであり得る。
【００２０】
ＤＲＬは、Ｍｅｄｉ−３０３９などのアゴニスト分子、またはアポトーシスシグナル伝達経路を活性化する任意の薬剤であり得る。外因性アポトーシスシグナル伝達経路は、ＦＡＳリガンド経路、ＴＮＦアルファ経路、またはＴＲＡＩＬ経路であり得る。
【００２１】
「発現（された）」または「発現」という用語は、転写された遺伝子（すなわち、ＤＮＡ）、またはポリペプチドもしくはタンパク質に翻訳された対応するＲＮＡを指すことができる。ＢＡＰ１変異遺伝子もしくはＢＡＰ１ポリペプチドの発現は、細胞の任意の区画中に（例えば、核、細胞質ゾル、小胞体、ゴルジ装置、または原形質膜の細胞内表面中に）検出され得る。
【００２２】
第１の態様の（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）に従って検出することは、試料中の遺伝子もしくはその対応するタンパク質の存在を検出するための以下のアッセイ：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；ノーザンブロッティング；ハイブリダイゼーションに基づく検出技術；フローサイトメトリー；酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫検定法（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降、もしくは免疫組織化学などの免疫検定法；免疫蛍光法；発色（酵素活性）アッセイ；蛍光測定画像化プレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）アッセイ；高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）タンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）のうちのいずれか１つの使用を含み得る。
【００２３】
生物学的試料は、好ましくは、試験個体から採取された癌性の身体試料である。したがって、試料中のＢＡＰ１変異遺伝子または変異型ＢＡＰ１タンパク質の存在の検出は、好ましくはインビトロで実施される。試料は、組織、血液、血漿、血清、髄液、尿、汗、唾液、痰、涙液、乳房吸引液、前立腺液、精液、膣液、糞便、頸部掻爬、羊水、眼内液、粘液、呼気中の水分、動物組織、細胞溶解物、腫瘍組織、髪の毛、皮膚、頬側掻き取り、爪、骨髄、軟骨、プリオン、骨粉、耳垢、またはそれらの組み合わせを含み得る。試料は、生検であり得る。
【００２４】
別の実施形態では、試料は、実験動物（例えば、マウスもしくはラット）またはヒトであり得る、試験対象内に含有されてもよく、この方法は、インビボに基づく試験である。代替的に、試料は、エクスビボ試料またはインビトロ試料であり得る。したがって、試験される細胞は、組織試料中に存在し得るか（エクスビボに基づく試験のために）、または細胞は、培養中で増殖され得る（インビトロ試料）。好ましくは、生物学的試料は、エクスビボ試料である。
【００２５】
本発明者らは、ＤＲＬ誘導性の細胞死に対する対象の感受性または別様を判定するための予測キット(prognostic kit)を開発した。
【００２６】
第２の態様によると、個体の癌細胞がＤＲＬ誘導性の細胞死に対して感受性があるかどうかを判定するためのキットであって、変異型ＢＡＰ１遺伝子もしくは変異型ＢＡＰ１タンパク質の発現を検出するための、またはＤＲＬ誘導性の細胞死に耐性がある参照細胞における発現レベルもしくはタンパク質濃度と比較した、野生型ＢＡＰ１遺伝子の発現レベルの減少もしくは野生型ＢＡＰ１タンパク質濃度の減少を検出するための、またはＤＲＬ誘導性の細胞死に耐性があるＢＡＰ１野生型細胞である参照細胞における結合レベルと比較した、ＡＳＸＬタンパク質のＢＡＰ１タンパク質への非結合もしくは結合の減少を検出するための、検出手段を備え、試料中の、変異型ＢＡＰ１遺伝子もしくはＢＡＰ１タンパク質の、または野生型ＢＡＰ１遺伝子の発現レベルの減少もしくは野生型ＢＡＰ１タンパク質濃度の減少の存在、あるいは野生型ＢＡＰ１タンパク質へのＡＳＸＬタンパク質の結合の減少もしくは非結合が、個体の癌細胞がＤＲＬ誘導性の細胞死に感受性があることを示している、キットを提供する。
【００２７】
好ましくは、キットを使用して、細胞死受容体リガンド（ＤＲＬ）またはアポトーシス経路を活性化する任意の薬剤で治療されている個体の予後を提供する。細胞死受容体リガンドは、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦアルファ、ＦＡＳリガンド（ＦＡＳＬ）、組換えＴＲＡＩＬ（デュラネルミン）、細胞死受容体抗体（マパツムアブ、ドロジツムマブ、コナツムマブ、レキサツムマブ、チガツズマブなど）、Ｍｅｄｉ−３０３８またはＭｅｄｉ−３０３９などの細胞死受容体アゴニスト、またはそれらの組み合わせであり得る。
【００２８】
好ましくは、キットは、少なくとも１つの対照または参照試料を含む。キットは、陰性対照および／または陽性対照を含み得る。陰性対照は、ＤＲＬ誘導性の細胞死に耐性がある野生型ＢＡＰ１タンパク質を含み得る。陽性対照は、変異型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡ、または変異型ＢＡＰ１タンパク質、またはブランク試料を含み得る。当業者であれば、試料中のｍＲＮＡのレベルが細胞中の遺伝子発現のレベルを示していることを理解するであろう。
【００２９】
検出手段は、好ましくは、試験個体から採取された生物学的試料中の変異型ＢＡＰ１タンパク質もしくはｍＲＮＡ、または野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡもしくはＢＡＰ１タンパク質の発現または濃度を検出するように構成される。試料中の、変異型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡもしくは変異型ＢＡＰ１タンパク質の存在、または対照に対する野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡの発現レベルの減少もしくはタンパク質発現の減少は、試験試料がＤＲＬ誘導性の細胞死に対して感受性があることを示している。生物学的試料中の野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡの発現レベルもしくはＢＡＰ１タンパク質の濃度は、陰性対照における野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡもしくはタンパク質の濃度もしくは発現レベルと比較して、減少または低下し得る。発現の減少は、陰性対照と比較して、少なくとも１０％、１５％、２５％、３５％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の減少であり得る。同様に、生物学的試料中の野生型ＢＡＰ１タンパク質の濃度は、少なくとも１０％、１５％、２５％、３５％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％減少し得る。逆に、試料中の、変異型ＢＡＰ１遺伝子もしくはタンパク質の不存在、または野生型ＢＡＰ１遺伝子もしくはタンパク質の正常〜高い発現は、試料がＤＲＬ誘導性の細胞死に対して感受性がないことを示している。
【００３０】
ＢＡＰ１遺伝子またはタンパク質における変異の検出は、数多くの配列判定アプローチを使用して達成され得る。１つのアプローチでは、全エクソームまたは標的遺伝子配列判定は、市販のＲＮＡベイトを使用して濃縮された標的遺伝子を有する腫瘍ＤＮＡの大規模並列配列判定を用いて行われる。
【００３１】
別の実施形態では、ＢＡＰ１遺伝子フットプリント内のエクソンの各々に対して設計されたＰＣＲプライマーを用いてキャピラリー配列判定アプローチを利用する。したがって、検出手段は、プライマーであり得る。
【００３２】
一実施形態では、野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡのエクソン１２（ｃｈｒ３：５２４３８２５５〜５２４３８８１７Ｆ）を検出するために使用されるフォワードプライマーの核酸配列は、本明細書では以下のように、配列番号６と呼ばれる。
ａｃｃｔａｇａａｃｃｔｇｇｔａｇｃｃｔｔａｇ
［配列番号６］
一実施形態では、野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡのエクソン８（ｃｈｒ３：５２４４０６３１〜５２４４１１３８Ｆ）を検出するために使用されるフォワードプライマーの核酸配列は、本明細書では以下のように、配列番号７と呼ばれる。
ｇｔａｃａｇｃｔｃｃａｇａｇａｇｔａｇａａｃ
［配列番号７］
一実施形態では、野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡのエクソン１（ｃｈｒ３：５２４４３６４４〜５２４４４０９４Ｆ）を検出するために使用されるフォワードプライマーの核酸配列は、本明細書では以下のように、配列番号８と呼ばれる。
ｔｃｔｔａｃｃｇａａａｔｃｔｔｃｃａｃｇａｇ
［配列番号８］
一実施形態では、野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡのエクソン３（ｃｈｒ３：５２４４３３５６〜５２４４３８３９Ｆ）を検出するために使用されるフォワードプライマーの核酸配列は、本明細書では以下のように、配列番号９と呼ばれる。
ｃｔｇｃｔｇｃｔｔｔｃｔｇｔｇａｇａｔｔｔｔ
［配列番号９］
一実施形態では、野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡのエクソン６（ｃｈｒ３：５２４３６４０４〜５２４３６９０５Ｆ）を検出するために使用されるフォワードプライマーの核酸配列は、本明細書では以下のように、配列番号１０と呼ばれる。
ａｇｇｇｃａｔｔｃｃａｇｔｔａａｇａｃａｇ
［配列番号１０］
一実施形態では、野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡのエクソン１７（ｃｈｒ３：５２４３６１０５〜５２４３６６５２Ｆ）を検出するために使用されるフォワードプライマーの核酸配列は、本明細書では以下のように、配列番号１１と呼ばれる。
ｃａａｇａｇｔｇｇｇｃｔｇｃａｇａｇ
［配列番号１１］
一実施形態では、野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡのエクソン６（ｃｈｒ３：５２４４１２０１〜５２４４１６９１Ｆ）を検出するために使用されるフォワードプライマーの核酸配列は、本明細書では以下のように、配列番号１２と呼ばれる。
ａｃｔａａｇｇｃｃａｔｔｃｔｇｃｔｔｃｔｃ
［配列番号１２］
一実施形態では、野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡのエクソン４（ｃｈｒ３：５２４４２２７６〜５２４４２８３７Ｆ）を検出するために使用されるフォワードプライマーの核酸配列は、本明細書では以下のように、配列番号１３と呼ばれる。
ａｔｃｃｃａｃｃｃｔｃｃａａａｃａａａｇ
［配列番号１３］
一実施形態では、野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡのエクソン１３ａ（ｃｈｒ３：５２４３７２１８〜５２４３７７８６Ｆ）を検出するために使用されるフォワードプライマーの核酸配列は、本明細書では以下のように、配列番号１４と呼ばれる。
ｃａｃｃａａｇｔｇｇｃｃａｇｔｇａｇ
［配列番号１４］
一実施形態では、野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡのエクソン１３ｂ（ｃｈｒ３：５２４３７３８８〜５２４３７９５６Ｆ）を検出するために使用されるフォワードプライマーの核酸配列は、本明細書では以下のように、配列番号１５と呼ばれる。
ｇｇｃｔｇｔｃａｔｃｃｔｃｔｃｃａａａａ
［配列番号１５］
一実施形態では、野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡのエクソン１３ｃ（ｃｈｒ３：５２４３７５５８〜５２４３８１２５Ｆ）を検出するために使用されるフォワードプライマーの核酸配列は、本明細書では以下のように、配列番号１６と呼ばれる。
ｇａｇｇｇｃｔｇｃｇａｇｔｇｔｇｔｇ
［配列番号１６］
一実施形態では、野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡのエクソン１４（ｃｈｒ３：５２４３６９４０〜５２４３７５２９Ｆ）を検出するために使用されるフォワードプライマーの核酸配列は、本明細書では以下のように、配列番号１７と呼ばれる。
ｃｔｃｔｇｃｃａｇｇａｔｔａａａｇｇａｇａａ
［配列番号１７］
一実施形態では、野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡのエクソン９（ｃｈｒ３：５２４４００５５〜５２４４０６０７Ｆ）を検出するために使用されるフォワードプライマーの核酸配列は、本明細書では以下のように、配列番号１８と呼ばれる。
ｇａａｔｇｃａｇｇｇａｇｇｇｔｔｇｇ
［配列番号１８］
一実施形態では、野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡのエクソン５（ｃｈｒ３：５２４４１７６０〜５２４４２３０８Ｆ）を検出するために使用されるフォワードプライマーの核酸配列は、本明細書では以下のように、配列番号１９と呼ばれる。
ａｃｃｃａａｔａｔｃａｔｇｔｇｇｔａｇｃａｔ
［配列番号１９］
一実施形態では、野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡのエクソン２（ｃｈｒ３：５２４４３５１６〜５２４４３９７４Ｆ）を検出するために使用されるフォワードプライマーの核酸配列は、本明細書では以下のように、配列番号２０と呼ばれる。
ａａｇｇａｃａｇｃｃｃｃｔｇａｔｇａ
［配列番号２０］
一実施形態では、野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡのエクソン７（ｃｈｒ３：５２４４０９７６〜５２４４１５４７Ｆ）を検出するために使用されるフォワードプライマーの核酸配列は、本明細書では以下のように、配列番号２１と呼ばれる。
ｇｔａｇｇｃａｇａｇａｃａｃｃｃａａｃ
［配列番号２１］
一実施形態では、野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡのエクソン１５（ｃｈｒ３：５２４３６５８１〜５２４３７１０２Ｆ）を検出するために使用されるフォワードプライマーの核酸配列は、本明細書では以下のように、配列番号２２と呼ばれる。
ｃｃｔｔｃｔｃｔｇｇｔｃａｔｃａａｔｃｔｇｔ
［配列番号２２］
一実施形態では、野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡのエクソン１０（ｃｈｒ３：５２４３９５６７〜５２４４０１４３Ｆ）を検出するために使用されるフォワードプライマーの核酸配列は、本明細書では以下のように、配列番号２３と呼ばれる。
ｃｔｃｔｇａｇｇｔｃｃａｃａａｇａｇｇｔ
［配列番号２３］
一実施形態では、野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡのエクソン１１（ｃｈｒ３：５２４３８９１２〜５２４３９５２５Ｆ）を検出するために使用されるフォワードプライマーの核酸配列は、本明細書では以下のように、配列番号２４と呼ばれる。
ｔｃａａｇｔａｇａｇａａｔｃｃｔｇｃａａｇｇ
［配列番号２４］
一実施形態では、野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡのエクソン１２（ｃｈｒ３：５２４３８２５５〜５２４３８８１７Ｒ）を検出するために使用されるリバースプライマーの核酸配列は、本明細書では以下のように、配列番号２５と呼ばれる。
ｇａｇｃａｇｃａｃｔｔｇｔｔｔｇｔａａｃｔｇ
［配列番号２５］
一実施形態では、野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡのエクソン８（ｃｈｒ３：５２４４０６３１〜５２４４１１３８Ｒ）を検出するために使用されるリバースプライマーの核酸配列は、本明細書では以下のように、配列番号２６と呼ばれる。
ｃｔｃａａｃｔｇｃｔｃｔｔｃｔｃｔｇｔｃｔｔ
［配列番号２６］
一実施形態では、野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡのエクソン１（ｃｈｒ３：５２４４３６４４〜５２４４４０９４Ｒ）を検出するために使用されるリバースプライマーの核酸配列は、本明細書では以下のように、配列番号２７と呼ばれる。
ｇａｇｇｇａｇｇｇｃｃｔｇｇａｃａｔ
［配列番号２７］
一実施形態では、野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡのエクソン３（ｃｈｒ３：５２４４３３５６〜５２４４３８３９Ｒ）を検出するために使用されるリバースプライマーの核酸配列は、本明細書では以下のように、配列番号２８と呼ばれる。
ｃｔｇｔｃｃｔｔｃｃｃｔａｃｔｇｃｔｔｔｃ
［配列番号２８］
一実施形態では、野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡのエクソン１６（ｃｈｒ３：５２４３６４０４〜５２４３６９０５Ｒ）を検出するために使用されるリバースプライマーの核酸配列は、本明細書では以下のように、配列番号２９と呼ばれる。
ｇａａｇｔｔｃａａｇｇｔｇｇｇｔｇａｔｔｔｃ
［配列番号２９］
一実施形態では、野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡのエクソン１７（ｃｈｒ３：５２４３６１０５〜５２４３６６５２Ｒ）を検出するために使用されるリバースプライマーの核酸配列は、本明細書では以下のように、配列番号３０と呼ばれる。
ｃｔｃａｇｃｔｃｃｔｇｇｃｃｔｇａｇ
［配列番号３０］
一実施形態では、野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡのエクソン６（ｃｈｒ３：５２４４１２０１〜５２４４１６９１Ｒ）を検出するために使用されるリバースプライマーの核酸配列は、本明細書では以下のように、配列番号３１と呼ばれる。
ｇｇａｇａａａｔｔａｔｔｃｔｇａｔａｃｇｇｃｃ
［配列番号３１］
一実施形態では、野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡのエクソン４（ｃｈｒ３：５２４４２２７６〜５２４４２８３７Ｒ）を検出するために使用されるリバースプライマーの核酸配列は、本明細書では以下のように、配列番号３２と呼ばれる。
ｇａａｇｇｇａａｔｇｃｔｇａｔｔｇｔｃｔｔｃ
［配列番号３２］
一実施形態では、野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡのエクソン１３ａ（ｃｈｒ３：５２４３７２１８〜５２４３７７８６Ｒ）を検出するために使用されるリバースプライマーの核酸配列は、本明細書では以下のように、配列番号３３と呼ばれる。
ｃｔａｔｃｃｇｃｔｃａｇｃｃａａｃｃ
［配列番号３３］
一実施形態では、野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡのエクソン１３ｂ（ｃｈｒ３：５２４３７３８８〜５２４３７９５６Ｒ）を検出するために使用されるリバースプライマーの核酸配列は、本明細書では以下のように、配列番号３４と呼ばれる。
ｃｔｃｔｃａａｔｔｃｃｔｃｔｇｔｃｃａｔｃａ
［配列番号３４］
一実施形態では、野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡのエクソン１３ｃ（ｃｈｒ３：５２４３７５５８〜５２４３８１２５Ｒ）を検出するために使用されるリバースプライマーの核酸配列は、本明細書では以下のように、配列番号３５と呼ばれる。
ｃｇｔｔｃｃｃｔｔｇｃｔｔｃａｃａｔｃｔ
［配列番号３５］
一実施形態では、野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡのエクソン１４（ｃｈｒ３：５２４３６９４０〜５２４３７５２９Ｒ）を検出するために使用されるリバースプライマーの核酸配列は、本明細書では以下のように、配列番号３６と呼ばれる。
ｔｃｃｔｇｃａｃｔｃｔｇａｔｇａｔｔｔｔｃｔ
［配列番号３６］
一実施形態では、野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡのエクソン９（ｃｈｒ３：５２４４００５５〜５２４４０６０７Ｒ）を検出するために使用されるリバースプライマーの核酸配列は、本明細書では以下のように、配列番号３７と呼ばれる。
ｇａｔａｔｃｔｇｃｃｔｃａａｃｃｔｇａｔｇｇ
［配列番号３７］
一実施形態では、野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡのエクソン５（ｃｈｒ３：５２４４１７６０〜５２４４２３０８Ｒ）を検出するために使用されるリバースプライマーの核酸配列は、本明細書では以下のように、配列番号３８と呼ばれる。
ｇｔｇｃｔｇｔｇｔａｔｇｇｇｔｇａｃｔａ
［配列番号３８］
一実施形態では、野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡのエクソン２（ｃｈｒ３：５２４４３５１６〜５２４４３９７４Ｒ）を検出するために使用されるリバースプライマーの核酸配列は、本明細書では以下のように、配列番号３９と呼ばれる。
ｇａａｇａｔｇａａｔａａｇｇｇｃｔｇｇｃｔ
［配列番号３９］
一実施形態では、野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡのエクソン７（ｃｈｒ３：５２４４０９７６〜５２４４１５４７Ｒ）を検出するために使用されるリバースプライマーの核酸配列は、本明細書では以下のように、配列番号４０と呼ばれる。
ｔｇａｔｇｔｇｇｇｇｔｇｇｇａｇｔａｇ
［配列番号４０］
一実施形態では、野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡのエクソン１５（ｃｈｒ３：５２４３６５８１〜５２４３７１０２Ｒ）を検出するために使用されるリバースプライマーの核酸配列は、本明細書では以下のように、配列番号４１と呼ばれる。
ｃｃｃｇａｔｃａｇａｇｇｔｇｃａａｔ
［配列番号４１］
一実施形態では、野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡのエクソン１０（ｃｈｒ３：５２４３９５６７〜５２４４０１４３Ｒ）を検出するために使用されるリバースプライマーの核酸配列は、本明細書では以下のように、配列番号４２と呼ばれる。
ａｇｃｔａｔｔｔａａｇｇｔａｇａａｇｃｃｃｇ
［配列番号４２］
一実施形態では、野生型ＢＡＰ１  ｍＲＮＡのエクソン１１（ｃｈｒ３：５２４３８９１２〜５２４３９５２５Ｒ）を検出するために使用されるリバースプライマーの核酸配列は、本明細書では以下のように、配列番号４３と呼ばれる。
ａｃｔｇｔｇａｇｃｔｔｔｔｃｔｔｇｇａｇａｔ
［配列番号４３］
当業者であれば、ＡＳＸＬタンパク質の野生型ＢＡＰ１タンパク質への結合は、タンパク質複合体免疫沈降、二分子蛍光相補、アフィニティー電気泳動、免疫電気泳動、化学架橋、近接ライゲーションアッセイ、およびＦＲＥＴを含む、当該技術分野において知られている様々な技術を使用して達成され得ることを認識するであろう。
【００３３】
本発明者らは、彼らの知見（すなわち、変異型ＢＡＰ１遺伝子もしくは変異型ＢＡＰ１タンパク質を含有する細胞、または野生型ＢＡＰ１遺伝子の減少したレベルを発現する細胞、またはＢＡＰ１タンパク質の濃度が減少した細胞は、ＤＲＬ誘導性の細胞死に対して感受性がある）は、それらがＤＲＬ誘導性の細胞死に対する感受性についての頑健なバイオマーカーを同定したことを意味すると考えている。
【００３４】
したがって、本発明の第３の態様では、ＤＲＬ誘導性の細胞死に対して感受性があるバイオマーカーとしての、（ｉ）変異型ＢＡＰ１遺伝子もしくは変異型ＢＡＰ１タンパク質、または（ｉｉ）ＢＡＰ１野生型細胞である参照細胞における発現レベルもしくはタンパク質濃度と比較して、野生型ＢＡＰ１遺伝子の発現レベルが減少したもしくは野生型ＢＡＰ１タンパク質濃度が減少した癌細胞の使用を提供する。
【００３５】
本発明者らは、癌に罹患している対象、特に細胞死受容体リガンド誘導性の細胞死に対して完全にまたは部分的に感受性がない癌に罹患している対象を治療する方法を開発した。
【００３６】
したがって、第４の態様では、癌に罹患している個体を治療する方法であって、
（ｉ）変異型ＢＡＰ１遺伝子もしくは変異型ＢＡＰ１タンパク質の存在、またはＤＲＬ誘導性の細胞死に耐性があるＢＡＰ１野生型細胞である参照細胞における発現レベルもしくはタンパク質濃度と比較した、野生型ＢＡＰ１遺伝子の発現レベルの減少もしくは野生型ＢＡＰ１タンパク質濃度の減少、あるいはＤＲＬ誘導性の細胞死に耐性がある、ＢＡＰ１野生型細胞である参照細胞における結合レベルと比較した、野生型ＢＡＰ１タンパク質に対するＡＳＸＬタンパク質の結合の減少もしくは非結合を検出することと、
（ｉｉ）治療有効量の細胞死受容体リガンドを個体に投与することと、を含む、方法を提供する。
【００３７】
細胞死受容体リガンドは、単剤療法として、または癌細胞を殺傷することができる他の薬剤と組み合わせて投与することができる。
【００３８】
「対象」または「個体」は、脊椎動物、哺乳動物、または家畜であり得る。したがって、本発明による医薬品は、任意の哺乳動物、例えば、家畜（例えば、ウマ）、ペットを治療するために使用することができる、または他の獣医学的用途に使用することができる。最も好ましくは、対象は、ヒトである。
【００３９】
前述の通り、中皮腫細胞は、細胞死の誘導に耐性がある。コア細胞死機構のこの破壊は、一般に臨床的に観察されている従来の細胞傷害剤に対する耐性における関係が示唆されている。細胞死機構の破壊は、ＩＡＰ（アポトーシスの阻害剤）ファミリーまたはＢＣＬ−２ファミリーのメンバーなどの抗細胞死タンパク質の発現の上昇を通して下流で媒介されると考えられている。ＩＡＰファミリーは、８つのメンバー（ＢＩＲＣ２、ＢＩＲＣ３、ＢＩＲＣ５、ＢＩＲＣ６、ＢＩＲＣ７、ＢＩＲＣ８、ＮＡＩＰ、ＸＩＡＰ）からなる。ＩＡＰタンパク質の明確な特徴としては、タンパク質−タンパク質の相互作用を媒介する約７０アミノ酸のバキュロウイルスＩＡＰリピート(baculovirus IAP repeat)（ＢＩＲ）ドメインの存在がある（１２）。これらのドメインを通して、ＩＡＰメンバーは、細胞死の主な執行者であるカスパーゼの内因性阻害剤として作用し、カスパーゼ分解の直接カスパーゼ阻害またはユビキチン媒介調整のいずれかを通して作用する（１３）。
【００４０】
本発明者らは、ＢＡＰ１  ｓｈＲＮＡ発現レンチウイルスを使用して中皮腫細胞株においてＢＡＰ１遺伝子発現を減少させることができ、このＢＡＰ１遺伝子発現の減少により、これらの細胞株におけるＤＬＲ誘導性の細胞死に対する感受性が増加することを実証した。したがって、本発明者らは、ＢＡＰ１阻害剤を投与することによって、ＤＲＬ誘導性の細胞死に通常は感受性がない癌に罹患している個体を、ＤＲＬ誘導性の細胞死に対して感受性をもつ(sensitise)ようにさせることが可能であると判定した。
【００４１】
したがって、本発明の第５の態様では、以下の方法：
ＤＲＬ誘導性の細胞死に対して感受性がない癌に罹患している個体を、ＤＲＬ誘導性の細胞死に対して感受性をもつ(sensitise)ようにさせる方法、または
ＤＲＬ誘導性の細胞死に対して感受性がある癌に罹患している個体におけるＤＲＬ誘導性の細胞死に対する感受性を増強させる方法であって、
前記方法が、ＢＡＰ１阻害剤もしくはＢＡＰ１阻害の効果を模倣する薬剤を個体に投与することを含む、方法を提供する。
【００４２】
したがって、ＢＡＰ１阻害剤は、ＢＡＰ１遺伝子またはタンパク質を直接標的とする任意の薬剤であり、ＢＡＰ１阻害の効果を模倣する薬剤は、ＢＡＰ１遺伝子／タンパク質シグナル伝達経路の下流のシグナル伝達分子を標的とする分子である。
【００４３】
ＢＡＰ１阻害剤は、脱ユビキチン化酵素阻害剤もしくはアンタゴニストなどのＢＡＰ１タンパク質機能を不活性化する、またはＢＡＰ１遺伝子もしくはタンパク質の発現もしくは機能を沈黙もしくは減少させる（ＢＡＰ１の小分子阻害剤など）、または野生型ＢＡＰ１タンパク質のＡＳＸＬタンパク質への結合を防止もしくは減少させる、任意の分子であり得る。ＢＡＰ１阻害剤または薬剤はまた、野生型ＢＡＰ１遺伝子を変異させて、変異型ＢＡＰ１遺伝子を創成する任意の分子であり得る。したがって、ＢＡＰ１阻害剤もしくは薬剤は、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、およびアンチセンス分子を含む、ＲＮＡｉ分子；ＴＡＬＥＮ（転写活性化剤様エフェクターヌクレアーゼ(Transcriptional Activator Like-Effector Nuclease)）；またはＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９ヌクレアーゼであり得る。本発明者らは、以下の実施例において、レンチウイルスを発現するｓｈＲＮＡを使用して、中皮腫細胞株においてＢＡＰ１遺伝子発現を減少させることができ、このＢＡＰ１遺伝子発現の減少が、これら細胞株におけるＤＬＲ誘導性の細胞死に対する感受性の増大をもたらすことを実証した。
【００４４】
ＢＡＰ１阻害剤に加えて、ＢＡＰ１阻害の効果を模倣する薬剤は、ＢＡＰ１の下流のシグナル伝達分子またはエフェクター分子を標的とする薬剤であり、このような薬剤は、癌細胞においてＤＬＲ耐性を誘導するために使用され得る。一実施形態では、ＢＡＰ１阻害剤は、ＩＡＰ阻害剤（ＳＭＡＣ模倣物）であり得る。ＩＡＰは、ＢＩＲＣ２、ＢＩＲＣ３、ＢＩＲＣ５、ＢＩＲＣ６、ＢＩＲＣ７、ＢＩＲＣ８、ＮＡＩＰ、ＸＩＡＰ、またはそれらの断片であり得る。本発明者らは、ＢＡＰ１発現がＢＩＲＣ３タンパク質の発現を増加させること、およびＬＣＬ１６１などのＩＡＰ阻害剤によるＢＩＲＣ３タンパク質の阻害により、ＤＲＬ誘導性の細胞死に対する感受性をもたらすことを見出した。ＩＡＰ阻害剤は、ＩＡＰの発現もしくは翻訳を減少させるか、またはＩＡＰを機能的に不活性にする、薬剤である。ＩＡＰ阻害剤もしくは薬剤はまた、ＩＡＰ遺伝子もしくはタンパク質を変異させて、変異型ＩＡＰ遺伝子もしくはタンパク質を創成する、任意の分子であり得る。したがって、ＩＡＰ１阻害剤もしくは薬剤は、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、およびアンチセンス分子を含むＲＮＡｉ分子；ＴＡＬＥＮ（転写活性化剤様エフェクターヌクレアーゼ）；またはＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９ヌクレアーゼであり得る。ＢＡＰ１阻害の効果を模倣する薬剤は、ＹＫ−４２７９などのＲＮＡヘリカーゼ阻害剤、またはソラフェニブなどのチロシンキナーゼ阻害剤であり得る。
【００４５】
本発明者らは、それらの驚くべき観察（すなわち、ＢＡＰ１がＤＲＬ誘導性の癌細胞の細胞死の調整において役割を果たす）を使用して、ＢＡＰ１の変異体を含む任意の癌の治療のための新規の標的アプローチを開発することができる。
【００４６】
したがって、本発明の第６の態様では、（ｉ）ＢＡＰ１阻害剤もしくはＢＡＰ１阻害の効果を模倣する薬剤、および（ｉｉ）細胞死受容体リガンドを含む、組成物を提供する。
【００４７】
第７の態様では、治療に使用するための、または医薬品として使用するための、（ｉ）ＢＡＰ１阻害剤もしくはＢＡＰ１阻害の効果を模倣する薬剤、および（ｉｉ）細胞死受容体リガンドを含む、組成物を提供する。
【００４８】
第８の態様では、癌の治療、予防、または改善に使用するための、（ｉ）ＢＡＰ１阻害剤もしくはＢＡＰ１阻害の効果を模倣する薬剤、および（ｉｉ）細胞死受容体リガンドを含む、組成物を提供する。
【００４９】
第９の態様では、癌に罹患している個体を治療、予防、または改善する方法であって、治療有効量の第６の態様の組成物を個体に投与することを含む、方法を提供する。
【００５０】
ＢＡＰ１阻害剤もしくはＢＡＰ１阻害の効果を模倣する薬剤、および細胞死受容体リガンドは、同時に投与され得る、またはＢＡＰ１阻害剤は、細胞死受容体リガンドの前に投与され得る。
【００５１】
ＢＡＰ１阻害剤の投与は、最初に、ＤＲＬ誘導性の細胞死に対して対象を感作させることが理解されるだろう。次に、細胞死受容体リガンドの投与は、癌性細胞において細胞死を誘導するために効果的に使用され得る。
【００５２】
好ましくは、ＢＡＰ１阻害剤は、脱ユビキチン化酵素阻害剤もしくはアンタゴニストなどのＢＡＰ１タンパク質機能を不活性化する、またはＢＡＰ１遺伝子転写もしくはＢＡＰ１タンパク質発現を沈黙もしくは減少させるか、または野生型ＢＡＰ１遺伝子を変異させて、ＢＡＰ１変異遺伝子およびタンパク質を創成する、任意の分子もしくはアプローチである。ＢＡＰ１阻害剤は、ＷＰ１１３０、Ｕｓｐ９ｘ、Ｕｓｐ５、Ｕｓｐ１４、Ｕｓｐ２４、ＵＣＨ３７、ｂ−ＡＰ１５、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９、またはＢＡＰ１の小分子阻害剤であり得る。
【００５３】
好ましい細胞死受容体リガンドは、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦアルファ、ＦＡＳリガンド（ＦＡＳＬ）、組換えＴＲＡＩＬ（デュラネルミン）、細胞死受容体抗体（マパツムアブ、ドロジツムマブ、コナツムマブ、レキサツムマブ、チガツズマブ、ＬＢＹ−１３５など）、またはＭｅｄｉ  ３０３８もしくはＭｅｄｉ  ３０３９などの細胞死受容体アゴニスト、またはそれらの組み合わせであり得るが、これらに限定されない。
【００５４】
中皮腫（または悪性胸膜中皮腫）は、体の内臓のうちの多くを覆っている保護粘膜層である、中皮の細胞から発生するまれな形態の癌である。中皮腫の最も一般的な解剖学的部位は、胸膜（肺の外側の内層と胸部の内壁）であるが、腹膜（腹腔の内層）、心膜（心臓を囲む嚢）、または精巣鞘膜（精巣を囲む嚢）にも発生し得る。したがって、本発明の任意の態様に従って治療され得る癌は、中皮腫、悪性胸膜中皮腫、ブドウ膜黒色腫、黒色腫、非黒色腫皮膚癌、腎臓癌、胆管癌、肺癌、胸膜癌、腹部癌、腹膜癌、心膜癌、頭頸部癌、脳腫瘍、乳癌、肝臓および胆道癌、上部管および下部管を含む胃腸癌、尿路上皮癌、前立腺癌、精巣癌、精巣鞘膜癌、卵巣癌、子宮頸癌、肉腫、リンパ腫、ならびに白血病から選択され得る。
【００５５】
より好ましくは、治療される癌は、中皮腫である。最も好ましくは、治療される癌は、アスベスト誘導性癌である。
【００５６】
本発明による組成物は、特に組成物の使用方法に応じて、多数の異なる形態を有し得る。したがって、例えば、組成物は、粉末剤、錠剤、カプセル剤、液剤、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、エアロゾル、スプレー、ミセル溶液、経皮パッチ、リポソーム懸濁液、または治療を必要とするヒトもしくは動物に投与され得る任意の他の好適な形態であり得る。本発明による医薬品のビヒクルは、それが与えられる対象によって良好な忍容性が示されるものでなければならないことが理解されるであろう。
【００５７】
本発明による組成物は、数多くの方法で使用することができる。例えば、経口投与が必要とされる場合があり、その場合、薬剤は、例えば、錠剤、カプセル剤、または液剤の形態で経口摂取され得る組成物内に含有され得る。本発明の薬剤を含む組成物は、吸入（例えば、鼻腔内）によって投与されてもよい。組成物はまた、局所使用のためにも製剤化され得る。例えば、クリームまたは軟膏が、皮膚に塗布されてもよい。
【００５８】
本発明による薬剤もしくは組成物はまた、徐放型もしくは遅延型放出デバイス内に組み込まれ得る。そのようなデバイスは、例えば、皮膚の上もしくは下に挿入されてもよく、医薬品は、数週間もしくは数ヶ月にわたって放出され得る。デバイスは、少なくとも治療部位に隣接して配置され得る。そのようなデバイスは、本発明に従って使用される薬剤による長期治療が必要とされ、通常頻繁な投与を必要とするであろう（例えば、少なくとも毎日の注射）場合に、特に有益であり得る。
【００５９】
好ましい実施形態では、本発明による組成物および薬剤は、血流中への注射または治療を必要とする部位への直接注射によって対象に投与され得る。例えば、医薬品は、少なくとも感受性細胞に隣接して、または腫瘍内に注射することができる。注射は、静脈内（ボーラスもしくは注入）、または皮下（ボーラスもしくは注入）、または皮内（ボーラスもしくは注入）であり得る。
【００６０】
必要とされる組成物および薬剤の量は、その生物学的活性および生物学的利用能によって判定され、次に、投与方法、モジュレーターの生理化学的特性、およびそれが単独療法としてまたは組み合わせ療法において使用されるかどうかに応じて判定されることが理解されるであろう。投与頻度はまた、治療される対象内のＢＡＰ１阻害剤およびＤＲＬの半減期によっても影響されるだろう。投与される最適投与量は、当業者によって判定されてよく、使用中の特定の薬剤、薬学的組成物の強度、投与方法、および癌の進行によって変わるだろう。対象の年齢、体重、性別、食事、および投与時間を含む、治療される特定の対象に応じたさらなる要因は、投与量を修正する必要性をもたらすであろう。
【００６１】
一般に、どの薬剤を使用するかに応じて、０．０１μｇ／ｋｇ体重〜５００ｍｇ／ｋｇ体重という本発明による薬剤（例えば、阻害剤もしくはＤＲＬ）の１日用量が、癌を治療、改善、または予防するために使用され得る。より好ましくは、１日用量が、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜４００ｍｇ／ｋｇ体重であり、より好ましくは、０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜２００ｍｇ／ｋｇ体重であり、最も好ましくは、約１ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００６２】
組成物もしくは薬剤（複数可）は、癌の発症前、発症中、または発症後に投与することができる。１日用量は、単回投与（例えば、１日１回の注射）として与えられてもよい。代替的に、薬剤は、１日に２回以上の投与を必要とし得る。一例として、薬剤は、２５ｍｇ〜７０００ｍｇ（すなわち、７０ｋｇの体重と仮定）の１日用量を２回（または治療される疾患の重症度によってはそれ以上）投与され得る。治療を受けている患者は、起床時に最初の用量を服用し、次に、夕方に（２回投与計画の場合）またはその後３〜４時間間隔で２回目の用量を服用し得る。代替的に、徐放放出デバイスを使用して、反復用量を投与する必要なく、本発明による薬剤の最適用量を患者に提供してもよい。
【００６３】
製薬業界によって従来用いられるもの（例えば、インビボ実験、臨床試験など）などの既知の手順を使用して、本発明による薬剤を含む特定の製剤および（薬剤の１日用量および投与頻度などの）厳密な治療計画を形成することができる。本発明者らは、細胞死受容体誘導性の細胞死に対して対象を感作させるためのＢＡＰ１阻害剤、および細胞死受容体を発現し、かつ以前は細胞死受容体誘導性の細胞死に対して感受性がなかった細胞の細胞死を誘導する、細胞死受容体リガンドの使用に基づいて、癌を治療するための薬学的組成物を最初に記載していると考える。
【００６４】
第１０の態様によると、第６の態様による組成物と薬学的に許容されるビヒクルとを含む薬学的組成物を提供する。
【００６５】
第１１の態様によると、治療有効量のＢＡＰ１阻害剤またはＢＡＰ１阻害の効果を模倣する薬剤および細胞死受容体リガンドと、薬学的に許容されるビヒクルとを接触させることを含む、第１０の態様による薬剤組成物を調製するための方法を提供する。
【００６６】
ＢＡＰ１阻害剤の「治療有効量」は、対象に投与されたときに、個体の細胞を細胞死受容体誘導性の細胞死に対して感作させるのに必要な量である。細胞死受容体リガンドの「治療有効量」は、対象に投与されたときに、癌を治療するか、または所望の効果を生成するのに必要な量である。
【００６７】
例えば、使用される活性薬剤（すなわち、ＢＡＰ１阻害剤および細胞死受容体リガンド）の治療有効量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約８００ｍｇ／ｋｇであり得、好ましくは、約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇであり得る。薬剤の量は、約０．１ｍｇ〜約２５０ｍｇの量であることが好ましく、最も好ましくは、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００６８】
本明細書で言及される「薬学的に許容されるビヒクル」は、薬学的組成物を製剤化するのに有用であることが当業者に知られている、任意の既知の化合物または既知の化合物の組み合わせである。
【００６９】
一実施形態では、薬学的に許容されるビヒクルは、固体であってよく、組成物は、粉末剤または錠剤の形態であってよい。固体の薬学的に許容されるビヒクルは、香味剤、滑沢剤、可溶化剤、懸濁剤、染料、充填剤、流動促進剤、圧縮助剤、不活性結合剤、甘味剤、防腐剤、染料、コーティング剤、または錠剤崩壊剤としても作用し得る、１つ以上の物質を含み得る。ビヒクルは、封入材料でもあり得る。粉末剤では、ビヒクルは、本発明による微粉化活性剤と混合されている微粉化固体である。錠剤では、活性剤（例えば、ペプチド、抗体、ＤＲＬ、またはＢＡＰ１阻害剤）を、必要な圧縮特性を有するビヒクルと好適な割合で混合し、所望の形状およびサイズに小型化することができる。粉末剤および錠剤は、好ましくは、最大９９％の活性剤を含有する。好適な固体ビヒクルとしては、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン、低融点ワックス、およびイオン交換樹脂が挙げられる。別の実施形態では、薬学的ビヒクルは、ゲルであってもよく、組成物は、クリームなどの形態であってよい。
【００７０】
しかしながら、薬学的ビヒクルは、液体であってもよく、薬学的組成物は、溶液の形態である。液体ビヒクルは、液剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ剤、エリキシル剤、および加圧組成物を調製するのに使用される。本発明による活性剤は、水、有機溶媒、それらの両方の混合物、または薬学的に許容される油もしくは脂肪などの薬学的に許容される液体ビヒクル中に溶解もしくは懸濁することができる。液体ビヒクルは、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、防腐剤、甘味剤、香味剤、懸濁剤、増粘剤、着色剤、粘度調整剤、安定化剤、または浸透圧調整剤などの他の好適な薬学的添加剤を含有することができる。経口および非経口投与のための液体ビヒクルの好適な例には、水（上記の添加剤、例えば、セルロース誘導体、好ましくは、カルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を部分的に含有する）、アルコール（一価アルコールおよび多価アルコール、例えば、グリコールを含む）およびそれらの誘導体、ならびに油（例えば、分別ヤシ油および落花生油）が含まれる。非経口投与の場合、ビヒクルは、オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルなどの油性エステルでもあり得る。滅菌液体ビヒクルは、非経口投与用の滅菌液体形態の組成物において有用である。加圧組成物用の液体ビヒクルは、ハロゲン化炭化水素または他の薬学的に許容される推進剤であり得る。
【００７１】
滅菌溶液または懸濁液である、液体薬学的組成物は、例えば、筋肉内、髄腔内、硬膜外、腹腔内、静脈内、および特に皮下注射によって利用することができる。組成物もしくは抗体は、滅菌水、食塩水、もしくは他の適切な滅菌注射用媒体を使用して、投与時に溶解または懸濁することができる滅菌固体組成物として調製することができる。
【００７２】
本発明の薬剤および組成物は、他の溶質もしくは懸濁剤（例えば、溶液を等張にするのに十分な食塩水もしくはグルコース）、胆汁酸塩、アカシアゴム、ゼラチン、ソルビタンモノレート、ポリソルベート８０（ソルビトール及びその無水物のオレイン酸エステとエチレンオキシドと共重合したもの）などを含有する、滅菌溶液もしくは懸濁液の形態で経口投与され得る。本発明による薬剤もしくは組成物は、液体もしくは固体のいずれかの組成物の形態で経口投与することもできる。経口投与に好適な組成物および薬剤には、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、錠剤、および粉末剤などの固体形態、ならびに液剤、シロップ剤、エリキシル剤、および懸濁液などの液体形態が含まれる。非経口投与に有用な形態としては、滅菌溶液、乳剤、および懸濁液が挙げられる。
【００７３】
本発明は、実質的に本明細書で言及される配列のうちのいずれかのアミノ酸もしくは核酸配列（その変異体または断片を含む）を含む、あらゆる核酸もしくはペプチドまたはその変異体、誘導体もしくは類似体に及ぶことが理解されるであろう。「実質的にアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列」、「変異体」および「断片」という用語は、本明細書で言及される配列のうちのいずれか１つのアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列と少なくとも４０％の配列同一性、例えば、配列番号３または４として同定されるポリペプチドと４０％の同一性などを有する配列であり得る。
【００７４】
言及される配列のうちのいずれかに対して、５０％よりも大きい、より好ましくは、６５％よりも大きい、７０％よりも大きい、７５％よりも大きい、さらにより好ましくは、８０％よりも大きい配列同一性を有する、アミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列もまた、想定される。好ましくは、アミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列は、言及される配列のうちのいずれかと少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、最も好ましくは、本明細書で言及される配列のうちのいずれかと少なくとも９９％の同一性を有する。
【００７５】
当業者であれば、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性百分率を計算する方法を理解するであろう。２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性百分率を計算するためには、最初に、２つの配列のアライメントを調製し、続いて配列同一性値を計算しなければならない。２つの配列についての同一性百分率は、以下：（ｉ）配列を整列させるために使用される方法、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（異なるプログラムで実施される）、または３Ｄ比較による構造的アライメント；ならびに（ｉｉ）アライメント方法によって使用されるパラメータ、例えば、ローカル対グローバルアライメント、使用されるペア−スコアマトリックス（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２、ＰＡＭ２５０、Ｇｏｎｎｅｔなど）、およびギャップペナルティ、例えば、機能形式および定数に応じて異なる値を取り得る。
【００７６】
アライメントをしたので、２つの配列間の同一性百分率を計算するための多くの異なる方法がある。例えば、同一性の数を次のもの：（ｉ）最短配列の長さ；（ｉｉ）アライメントの長さ；（ｉｉｉ）配列の平均長さ、（ｉｖ）非ギャップ位置の数、または（ｉｖ）オーバーハングを除いた同値位置の数で割ることができる。さらに、同一性百分率もまた、長さに強く依存することが理解されるであろう。したがって、一対の配列が短いほど、偶然に起こると予想され得る配列同一性が高くなる。したがって、タンパク質またはＤＮＡ配列の正確なアライメントは、複雑なプロセスであることが理解されるであろう。一般的なマルチプルアライメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２、４６７３〜４６８０；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２４、４８７６〜４８８２）は、本発明によるタンパク質またはＤＮＡのマルチプルアライメントを生成するための好ましい方法である。ＣｌｕｓｔａｌＷの好適なパラメータは、以下の通りであり得る：ＤＮＡアライメントについて：ギャップオープンペナルティ＝１５．０、ギャップエクステンションペナルティ＝６．６６、およびマトリックス＝同一性。タンパク質アライメントについて：ギャップオープンペナルティ＝１０．０、ギャップエクステンションペナルティ＝０．２、およびマトリックス＝Ｇｏｎｎｅｔ。ＤＮＡおよびタンパク質アライメントについて：ＥＮＤＧＡＰ＝−１、およびＧＡＰＤＩＳＴ＝４。当業者であれば、最適な配列アライメントのために、これらおよび他のパラメータを変えることが必要であり得ることを認識しているだろう。好ましくは、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性百分率の計算は、（Ｎ／Ｔ）＊１００のようなアライメントから計算することができ、ここでＮは、配列が同一の残基を共有する位置の数であり、Ｔは、ギャップを含むがオーバーハングを除く、比較された位置の総数である。したがって、２つの配列間の同一性百分率を計算するための最も好ましい方法は、（ｉ）例えば、上述のような好適なパラメータのセットを使用して、ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを使用した配列アライメントを準備することと、（ｉｉ）ＮおよびＴの値を以下の式：配列同一性＝（Ｎ／Ｔ）＊１００に挿入することと、を含む。
【００７７】
類似の配列を同定するための代替方法は、当業者に知られているであろう。例えば、実質的に類似のヌクレオチド配列は、本明細書で言及される任意の配列またはそれらの相補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列によってコードされるであろう。ストリンジェントな条件とは、ヌクレオチドが、３倍の塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中に約４５℃でフィルタ結合ＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズし、続いて、０．２倍のＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中に約２０〜６５℃で少なくとも１回洗浄することを意味する。代替的に、実質的に類似のポリペプチドは、配列番号３または４に示される配列と少なくとも１つ、しかし５、１０、２０、５０、または１００個未満のアミノ酸だけ異なり得る。
【００７８】
遺伝暗号の縮重のために、それによってコードされるタンパク質の配列に実質的に影響を及ぼすことなく、本明細書に記載の任意の核酸配列を、変えるかまたは変更して、その変異体を提供することができるであろうことは明らかである。好適なヌクレオチド変異体は、配列内の同じアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって改変された配列を有するものであり、したがってサイレント変化を生成する。他の好適な変異体は、相同なヌクレオチド配列を有するが、それが置換するアミノ酸と類似の生物物理学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって改変されて保存的な変化を生成する、配列の全部または一部を含むものである。例えば、小さな非極性の疎水性アミノ酸には、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、およびメチオニンが含まれる。大きな非極性の疎水性アミノ酸には、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンが含まれる。極性中性アミノ酸には、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれる。正荷電（塩基性）アミノ酸には、リシン、アルギニン、およびヒスチジンが含まれる。負帯電（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。したがって、どのアミノ酸が類似の生物物理学的特性を有するアミノ酸と置換され得るかが理解され、当業者であれば、これらのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を知っているであろう。
【００７９】
本明細書に記載される特徴のうちの全て（任意の添付の特許請求の範囲、要約、および図面を含む）、および／またはそのように開示される任意の方法もしくはプロセスのステップのうちの全ては、そのような特徴および／もしくはステップのうちの少なくともいくつかが相互に排他的である組み合わせを除き、任意の組み合わせで上記態様のうちのいずれかと組み合わせされ得る。
【００８０】
本発明をよりよく理解するために、また本発明の実施形態が実施され得る方法を示すために、添付の図面を、これより例として参照する。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１Ａ】図１Ａは、異なる悪性胸膜中皮腫（ＭＰＭ）細胞株における様々な種類の変異を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＢＡＰ１機能喪失変異の濃縮のためのＴＣＧＡエクソームの分析である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、５１８０個のＴＣＧＡエクソームから注釈を付けられた変異を有するＢＡＰ１遺伝子エクソンの概略図である。
【図２Ａ】図２Ａは、ＭＰＭにおける薬物とゲノムとの相互作用を示すボルケーノプロット(volcano plot)である。ボルケーノプロットは、９２個のライブラリー化合物についての遺伝子型による平均デルタＡＵＣを表示する。Ｙ軸は、修正されたｐ値を表し、Ｘ軸は、効果の大きさを表す。円のサイズは、試験されたコホートにおける変異体株の数を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、複数の中皮腫細胞株（ｎ＝１９）についての６日間生存率アッセイの結果を示すヒストグラムである。ｒＴＲＡＩＬ（４０ｎｇ／ｍｌ）。Ｍｅｔ  ５ａは、中皮の正常対照株である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＢＡＰ１変異状態によって離散化された(discretized)細胞株における、４０ｎｇ／ｍｌのｒＴＲＡＩＬ（ＤＭＳＯ処理対照に対して正規化された）に反応した６日間生存率アッセイ後のＡＵＣを示す散布プロットである。ＢＡＰ１変異状態は、ｒＴＲＡＩＬに対する反応と有意に相関している。両側ｔ検定(two-tailed t-test)、ｐ＝０．０１５。
【図３Ａ】図３Ａは、様々なＭＰＭ細胞株をｒＴＲＡＩＬで処理した生存率アッセイの結果を示す。ＭＰＭ細胞株を、０．５ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの用量範囲で処理し、細胞生存率をＳｙｔｏ−６０アッセイを使用して測定した。それらの細胞生存率に基づいて、細胞株を、耐性（赤）、部分的感受性（橙色）、および感受性（緑）に分類した。細胞株を、ウエスタンブロットして、ＢＡＰ１タンパク質発現の発現を調べた。
【図３Ｂ】図３Ｂは、様々なＭＰＭ細胞株をｒＴＲＡＩＬで処理した生存率アッセイの結果を示す。３つのＢＡＰ１野生型細胞株（ＭＰＰ−８９、Ｈ２８６９およびＨ２８１８）および４つのＢＡＰ１変異型細胞株（Ｈ２７２２、Ｈ２４６１、Ｈ２８、およびＨ２７３１）を、ＴＲＡＩＬ（０〜１０００ｎｇ／ｍｌ）で２４時間処理し、細胞の死亡率をアネキシンＶ／ＤＡＰＩ細胞死アッセイを使用して定量した。
【図４】図４は、ＢＡＰ１野生型中皮腫細胞株Ｈ２８１８においてＢＡＰ１をノックダウンすると、ｒＴＲＡＩＬに対する細胞死反応が増加することを示す、グラフ（およびウエスタンブロット）である。
【図５Ａ】図５Ａは、空ベクターおよびＢＡＰ１発現ベクターでトランスフェクションした後の、ＢＡＰ１ヌル中皮腫株(BAP1 null mesothelioma lines)におけるＢＡＰ１タンパク質のイムノブロットである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＢＡＰ１ヌルＨ２２６親株(BAP1 null H226 parental line)、ＢＡＰ１  ｗｔ過剰発現安定株(BAP1 wt overexpressing stable line)、およびＢＡＰ１  ｃ９１ヒドロラーゼ不活性安定細胞株(BAP1 c91 hydrolase inactive stable cell line)について、ｒＴＲＡＩＬを用いて行われたアネキシンＶ／ＤＡＰＩ細胞死アッセイの用量反応曲線である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、非形質導入Ｈ２２６細胞株、ＢＡＰ１（形質導入）細胞株、およびＮＬＳが欠失したＨ２２６細胞株の細胞生存率に対するｒＴＲＡＩＬの効果を示すグラフである。
【図６Ａ】図６Ａは、細胞死がＢＡＰ１触媒ユビキチン水酸化ドメイン(BAP1 catalytic ubiquitin hydrolation domain)の喪失により著しく調整不全になっていることを示す。ａｄｊ  ｐ＜０．０５およびＦＤＲ＜２０％の有意に調整不全な遺伝子分析に関する、Ｃ９１変異体（触媒的に不活性）のＢＡＰ１形質導入Ｈ２２６のＧＥＸプロファイルとＨ２２６  ＢＡＰ１野生型形質導入Ｈ２２６Ｋｅｇｇ経路分析との比較。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ｃ９１変異型ＢＡＰ１対野生型ＢＡＰ１発現Ｈ２２６細胞株におけるＩＡＰ遺伝子ＢＩＲＣ２およびＢＩＲＣ３のＲＭＡ正規化遺伝子中心ｍＲＮＡ発現を示すグラフである。ウエスタンブロットは、触媒的に不活性化されたＣ９１変異体ＢＡＰ１を発現するＨ２２６細胞株におけるＩＡＰファミリータンパク質の調整不全を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、ｒＴＲＡＩＬを９４の単剤化合物のライブラリーと組み合わせてアンカー薬として使用したときの薬物とゲノムとの相互作用を示すボルケーノプロット(volcano plot)である。相乗効果を、デルタＡＵＣ測定基準を使用して説明した。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＬＣＬ１６１存在下でのＭＰＭ細胞の細胞生存率に関するｒＴＲＡＩＬの効果を示すグラフである。ＴＲＡＩＬ耐性ＭＰＭ細胞を、０〜１０００ｎｇ／ｍｌのＴＲＡＩＬ単独、または５μＭのＬＣＬ１６１と０〜１０００ｎｇ／ｍｌのＴＲＡＩＬとの組み合わせのいずれかで２４時間処理し、細胞の死亡率をアネキシンＶ／ＤＡＰＩアッセイによって定量した。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ＬＣＬ１６１存在下でのＭＰＭ細胞の細胞生存率に関するｒＴＲＡＩＬの効果を示すグラフである。ＴＲＡＩＬ耐性ＭＰＭ細胞を、０〜１０００ｎｇ／ｍｌのＴＲＡＩＬ単独、または５μＭのＬＣＬ１６１と０〜１０００ｎｇ／ｍｌとのＴＲＡＩＬの組み合わせのいずれかで２４時間処理し、細胞の死亡率をアネキシンＶ／ＤＡＰＩアッセイによって定量した。
【図７Ｄ】図７Ｄは、ＩＡＰ阻害剤ＬＣＬ１６１の存在下での細胞生存率に関するｒＴＲＡＩＬの効果を示すグラフである。ＢＡＰ１形質導入またはＢＡＰ１  Ｃ９１Ａ形質導入Ｈ２２６細胞を、０〜１０００ｎｇ／ｍｌのＴＲＡＩＬ単独または５μＭのＬＣＬ１６１と０〜１０００ｎｇ／ｍｌのＴＲＡＩＬとの組み合わせのいずれかで２４時間処理し、細胞の死亡率をアネキシンＶ／ＤＡＰＩアッセイによって定量した。
【図８Ａ】図８Ａは、様々な癌細胞株の生存率に関するｒＴＲＡＩＬの効果を示すグラフである。ＢＡＰ１においてナンセンス変異を有する膀胱（ＲＴ４）および乳（ＨＣＣ１１８７）癌細胞株はｒＴＲＡＩＬに対する感受性を示す一方、ミスセンス変異を有する腎細胞癌細胞株（７６９ＰおよびＲＣＣ１０ＲＧＢ）ならびに野生型腎臓（ＢＢ６５ＲＣＣ）および膀胱癌（ＳＷ１７１０）細胞株は、ＴＲＡＩＬに耐性がある。
【図８Ｂ】図８Ｂは、乳癌細胞株ＭＤＡ  ＭＢ−２３１におけるＢＡＰ１のノックダウンが、ｒＴＲＡＩＬに対する感受性を増大させることを示す。
【図９Ａ】図９Ａは、インビボ実験のプロトコルである。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ｒＴＲＡＩＬでの処理後の、変異型または野生型ＢＡＰ１発現細胞を注射されたマウスから抽出された腫瘍の重量を示す箱ひげプロットである。変異されたＢＡＰ１異種移植片の腫瘍重量は、ＴＲＡＩＬ処理後の野生型ＢＡＰ１異種移植片よりも有意に小さい。
【図９Ｃ】図９Ｃは、ＴＲＡＩＬ処理済みの野生型ＢＡＰ１異種移植片または未処理のＢＡＰ１変異およびＢＡＰ１野生型異種移植片と比較したときに、ＴＲＡＩＬ処理が変異型ＢＡＰ１異種移植片の腫瘍量(tumor burden)（生物発光により測定された）を減少させることを示すグラフである。
【図１０】図１０は、ＢＡＰ１の触媒ドメインであるＢＡＰ１が、細胞死誘導リガンド、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳＬ、およびＴＮＦαに対するＨ２２６細胞の感受性も調整することを示すグラフである。非形質導入ＢＡＰ１陰性Ｈ２２６細胞、ＢＡＰ１発現および触媒活性を示さない(catalytically dead)ＢＡＰ１発現Ｈ２２６細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのＦＡＳＬ、ＴＲＡＩＬ、およびＴＮＦ−アルファで２４時間処理し、細胞の死亡率をアネキシンＶ／ＤＡＰＩアッセイによって定量した。＊ｐ＜０．０５は、非形質導入Ｈ２２６細胞とＨ２２６  ＢＡＰ１発現細胞との間の有意差を示す。ＮＳは、非形質導入Ｈ２２６細胞とＢＡＰ１  Ｃ９１Ａ形質導入細胞との間に有意差を示さなかった。＃ｐ＜０．０５は、非形質導入Ｈ２２６細胞とＢＡＰ１  Ｃ９１Ａ形質導入細胞との間の有意差を示す。
【図１１】図１１は、ＢＡＰ１の触媒ドメインであるＢＡＰ１が、細胞死誘導リガンド、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳＬ、およびＴＮＦαに対するＨ２２６細胞の感受性も調整することを示すグラフである。非形質導入ＢＡＰ１陰性Ｈ２２６細胞、ＢＡＰ１発現、ＡＳＸＬ結合部位欠失ＢＡＰ１発現Ｈ２２６細胞、および触媒活性を示さない(catalytically dead)ＢＡＰ１発現Ｈ２２６細胞を、１００ｎｇ／ｍｌのＦＡＳＬ、ＴＲＡＩＬ、およびＴＮＦ−アルファで２４時間処理し、細胞の死亡率をアネキシンＶ／ＤＡＰＩアッセイにより定量した。
【００８２】
実施例
本発明者らは、ＢＡＰ１腫瘍抑制遺伝子の変異が、ヒト癌におけるアポトーシス経路の治療的調節に対する感受性を付与することを発見した。本発明者らは、悪性胸膜中皮腫、膀胱癌、および乳癌におけるこの関連性を調査および検証し、腎細胞癌、子宮頸癌、およびブドウ膜黒色腫を含む、１〜３６％のヒト癌にも及び得るという証拠を有している。本明細書に記載されるデータは、ｒＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬ受容体１（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、細胞死受容体４としても知られる；ＤＲ４）およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５としても知られる）に結合することによってＴＲＡＩＬ経路を活性化する組換えタンパク質に焦点を合わせているが、ＢＡＰ１は、ＦＡＳリガンド経路もしくはＴＮＦ経路または内因性アポトーシス経路などの他のプロアポトーシス経路を調節することも見出されている（実施例６を参照のこと）。
【００８３】
材料および方法
全エクソーム配列判定
製造業者の指示（ＱＩＡＧＥＮ）に従って、カラム抽出技術を使用して、ＤＮＡを抽出した。製造業者の指示に従って、イルミナのペアエンド試料調製キット(Illumina paired end sample prep kit)を使用して、ゲノムライブラリーを調製した。製造業者の推奨プロトコルに従って、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  Ｈｕｍａｎ  Ａｌｌ  Ｅｘｏｎ  ５０Ｍｂキットを使用して、エクソーム濃縮を行った。各エクソームを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００  ＤＮＡアナライザーで７５−ｂｐペアエンドプロトコルを使用して配列判定し、エクソーム当たり約５〜１０Ｇｂの配列を生成した。デフォルト設定でＢｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒアライナ（ＢＷＡ）アルゴリズムを使用して、配列判定リードをヒトゲノム整列させた（ＮＣＢＩ  ｂｕｉｌｄ  ＧｒＣｈ  ３７）（１７）。マッピングされていないリードおよびＰＣＲ重複は、分析から除外された。２０倍以上の細胞株エクソームの平均カバレッジは、８０％であった。
【００８４】
コピー数注釈
上記のようにＤＮＡを抽出した。ＳＮＰ６．０アレイについては、ＤＮＡをＡＲＯＳにアウトソーシングした（ｈｔｔｐ：／／ａｒｏｓａｂ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ／ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ／）。コピー数注釈を、ＰＩＣＮＩＣアルゴリズムから導いた［１８］。
【００８５】
変異体検出
単一ヌクレオチド置換を呼び出すために、ＣａＶＥＭａｎアルゴリズムを使用した［１９］。このアルゴリズムは、単純ベイズ分類器(naive Bayesian classifier)を使用して、各塩基における可能性のある各遺伝子型（野生型、生殖系列、または体細胞変異）の事後確率(posterior probability)を推定する。挿入と欠失を呼び出すために、分割リードマッピング(split read mapping)を、Ｐｉｎｄｅｌアルゴリズムの修正として実装した［１９］。Ｐｉｎｄｅｌは、ゲノム上に固定された一方のリードを、２つの部分にマッピングされた他方のリードにより検索し、推定の挿入／欠失に及ぶ。両方のアルゴリズムについて、利用可能な適合正常組織なしで研究された全ての細胞株において使用されている腫瘍のＣＧＰパネルからの同一の推定正常を正規化した。可能な限り多くの生殖細胞系一塩基多型を排除するために、その後、正常の様々なパネルに対する有意な後処理フィルタリングを行った。これらには、１０００ゲノムデータベース、ＤＢ  ＳＮＰ、およびＣＧＰ正常の内部パネルが含まれる。これらのステップに続いて、変異体の潜在的な機能的影響に関して、ＦＡＴＨＭアルゴリズム（Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ）を使用して、ミスセンス変異に注釈を付けた。
【００８６】
組み合わせ（ゲノムと薬物との）治療スクリーニングアプローチ
手動の「単回投与」組み合わせスクリーニングを、９６ウェルフォーマットを使用して行った。細胞を１日目に１８０μｌ培地中に予め最適化された播種密度で蒔いた。２日目に、薬物のストックから２０μｌの１０倍の濃度の培地を加えた。次に、細胞を７２時間または６日間増殖させ、アッセイ終了時に固定した。薬物ウェルを、ＤＭＳＯ処理済みの対照ウェルと比較した。
【００８７】
４％パラホルムアルデヒドで固定してＳｙｔｏ６０核酸染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で生存率について染色することによる、ロボット式液体処理(robotic liquid handling)を使用して、３８４ウェルフォーマット［１８］で単剤ハイスループット５点生存率スクリーニング(Single agent high throughput 5 point viability screening)を行った（以下を参照のこと）。使用された実験に従って、８５〜９５個の薬物の各ライブラリーについて単剤用量反応曲線を導き、以前に導き出された式［１８］に従って各細胞株中の各ライブラリー化合物について、ｌｏｇ  ＩＣ５０または曲線下面積（ＡＵＣ）測定基準を導いた。このデータを使用して、様々な２薬物相乗作用を、デルタＡＵＣ測定基準を用いて測定した。
【００８８】
コピー数およびエクソームデータを集計することによって、中皮腫スクリーニングにおける細胞株についてバイナリイベントマトリックスを編集し、これをゲノム相関のための入力分類子として使用した。次に、この治療スクリーニングからのデータを、多変量分散分析（ＭＡＮＯＶＡ）［１８］を使用して分析し、用量反応に対する遺伝子型の感作効果に注釈を付けた。結果は、相互作用の有意性（Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｈｏｃｈｂｅｒｇの誤発見閾値を超える）および効果の大きさの程度を示すボルケーノプロットとして提示されている。
【００８９】
ＴＣＧＡデータの分析
様々な癌種におけるＢＡＰ１切断型変異の頻度は、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）研究ネットワークによって作成されたデータに基づいている：ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／。
【００９０】
細胞培養
２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、非必須アミノ酸、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン、および１％ピルビン酸ナトリウムを添加した、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。ヒト中皮腫細胞株を、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、および１％ピルビン酸ナトリウムを添加した、ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｈ２３６９、Ｈ２３７３、Ｈ２４６１、Ｈ２５９１、Ｈ２５９５、Ｈ２７２２、Ｈ２７３１、Ｈ２７９５、Ｈ２８０３、Ｈ２８０４、Ｈ２８６９、Ｈ２９０、Ｈ５１３、ＩＳＴ−ＭＥＳ１、ＭＰＰ−８９、ＭＳＴＯ−２１１Ｈ、ＮＣＩ−Ｈ２０５２、ＮＣＩ−Ｈ２４５２、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ２８）、または１０％ＦＢＳ、非必須アミノ酸、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン、および１％ピルビン酸ナトリウムを添加した、ダルベッコの改変イーグル培地／栄養混合物Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）（Ｈ２８１８、Ｈ２８１０）中で培養した。細胞を、５％ＣＯ２で３７℃に維持した。
【００９１】
ウエスタンブロッティング
細胞単層を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄し、氷上で放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびプロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ−ｍｉｎ；Ｒｏｃｈｅ）中に溶解させた。溶解物を、１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を吸引した。タンパク質濃度を、製造業者の指示に従って、ＢＣＡアッセイ（Ｃａｌｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、ウシ血清アルブミンの標準曲線から計算した。溶解物を、適切な濃度に調製し、４倍のＬａｅｍｅｌｌｉ緩衝液および１０倍の還元剤を添加した後、試料を７０℃で１０分間加熱した。溶解物を、プレキャスト４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で、２００Ｖで１時間のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。製造業者の指示に従って、ｉＢｌｏｔゲル転写装置（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、タンパク質をニトロセルロース膜に転写した。４℃で一晩、一次抗体を添加する前に（別段明記しない限り、ＴＢＳ−Ｔ中に１：１０００で）、膜をＴｗｅｅｎ  ２０（ＴＢＳ−Ｔ）を含むトリス緩衝食塩水中の５％のミルク（ＴＢＳ−Ｔ）中でブロックした。翌日、膜を、ＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、二次抗体を添加した（ＴＢＳ−Ｔ中に１：２５００で）。使用された抗体としては、ＢＡＰ１（Ｃ−４；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−２８３８３）、アルファチューブリン（細胞シグナル伝達＃２１２５）、ｃ−ＩＡＰ１（細胞シグナル伝達＃７０６５）、ｃＩＡＰ２（細胞シグナル伝達＃３１３０）、リビン(Livin)（細胞シグナル伝達＃５４７１）、サバイビン(Survivin)（細胞シグナル伝達＃２８０３）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａ−２１２０２）がある。イムノブロットを、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（商標）ＬＡＳ  ４０００バイオモレキュラーイメージャー(biomolecular imager)を使用して画像化した。
【００９２】
細胞生存率アッセイ
接着性細胞株を、薬物投与の２４時間前に播種した。細胞をトリプシン処理し、播種前にウェルのサイズ（９６または３８４）およびアッセイ期間に最適な密度で計数した。薬物処理してから７２時間後に、細胞を４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定した。ｄＨ２Ｏで２回洗浄した後、１００μｌのＳｙｔｏ６０核酸染色剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、１μＭの最終濃度で添加し、プレートを室温で１時間固定した。６３０／６９５ｎＭの励起／発光波長を使用して、蛍光シグナルの定量化を行った。
【００９３】
細胞の死亡率アッセイ
付着性中皮腫細胞株を、１ウェル当たり約１００００個の細胞で９６ウェルプレートに蒔いた。細胞を蒔いて、薬物を添加した時点で１日間付着させた。４８時間後、浮遊細胞を含む培地を、各ウェルから集めた。残りの接着細胞をＰＢＳで洗浄し、ＥＤＴＡ中０．０５％トリプシンで動かした(mobilize)。全ての細胞を、以前に除去された培地を含むチューブに集め、遠心分離（３００ｇ、５分間）によりペレット化した。次に、細胞を、１０μｌ／１ｍｌ濃度のアネキシンＶ−６４７抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む１ＸアネキシンＶ結合緩衝液に再懸濁し、室温で１５分間インキュベートした。次に、以下のようにフローサイトメトリー分析の前に、ＤＡＰＩ（２μｇ／ｍｌ）を各試料に添加した。アネキシンＶ−／ＤＡＰＩ細胞は、生存可能であると判断され、アネキシンＶ＋／ＤＡＰＩ細胞は、アポトーシスを受けている（初期アポトーシス期）と考えられ、アネキシンＶ＋／ＤＡＰＩ＋細胞は、後期アポトーシスまたは壊死と考えられ、死滅と記録された。
【００９４】
フローサイトメトリー分析
細胞を、リン酸緩衝食塩水で洗浄し、４％パラホルムアルデヒド中、室温で２０分間インキュベートすることにより固定した。細胞内ＢＡＰ１染色のために、固定された細胞を、氷上で２０分間ＰＢＳ中０．１％トリトンＸ−１００で透過処理し、ＰＢＳで２回洗浄し、氷上で２０分間一次抗体（Ｃ−４；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−２８３８３、１：１００）と共にインキュベートし、再度２回洗浄し、蛍光二次抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、１：２００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａ−２１２０２））と共にインキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、フローサイトメトリー分析のためにＰＢＳに懸濁した。細胞死アッセイの一部として分析された細胞を、上記のように調製した。
【００９５】
フローサイトメトリー分析をＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ細胞アナライザー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行い、データをＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。
【００９６】
ｍＲＮＡマイクロアレイ
触媒的に不活性なＢＡＰ１発現Ｈ２２６細胞（Ｈ２２６  Ｃ９１Ａ）およびＷＴ  ＢＡＰ１発現Ｈ２２６細胞（Ｈ２２６  ＢＡＰ１）からｍＲＮＡを抽出し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨＴ１２アレイに流した(run)。
【００９７】
経路分析
ｍＲＮＡマイクロアレイから同定された有意に差次的に発現された遺伝子を、ＫＥＧＧ経路分析を使用して分析した。
【００９８】
プラスミド
ヒトＢＡＰ１のｃＤＮＡ全長クローンを、ｐＣＭＶ６−ＡＣバックボーン（Ｏｒｉｇｅｎｅ、ＳＣ１１７２５６）で得て、これをさらなる実験のために、ＰＣＣＬ．ＣＭＶレンチウイルスバックボーン中にクローニングした。部位特異的変異誘発キット（ＮＥＢ）を使用して、ＢＡＰ１変異構築物を生成し、全長ＤＮＡ配列判定によって確認した。ＧＩＰＺ  ｓｈＲＮＡｍｉｒレンチウイルスベクター（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｖ２ＬＨＳ４１４７３）中のＵＣＬ  ＲＮＡｉライブラリーにより、短鎖ヘアピンＲＮＡを得た。短鎖ヘアピンの配列（配列番号４４）は、以下の通りである。
ＴＡＡＡＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＣ
［配列番号４４］
レンチウイルスの生成および濃度
トランスフェクション試薬としてｊｅｔＰＥＩ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）を使用して、パッケージングプラスミドｐＣＭＶｄＲ８．２およびエンベローププラスミドｐＭＤＧ．２と共に、２９３Ｔ細胞をレンチウイルスベクタープラスミドでトランスフェクションすることによって、レンチウイルスを生成した。２９３Ｔ細胞を、３７℃でインキュベートし、レンチウイルスを含有する培地を、２４時間および４８時間で回収した。レンチウイルスを、４℃で２時間１８０００ｒｐｍで超遠心分離（ＳＷ２８ローター、Ｏｐｔｉｍａ  ＬＥ８０Ｋ  Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ、Ｂｅｃｋｍａｎ）によって濃縮し、使用前は−８０℃で保存した。
【００９９】
４μｇ／ｍｌポリブレンの存在下で、２９３Ｔ細胞にウイルスの段階希釈物を形質導入することによって、レンチウイルス滴定を行った。４日後、フローサイトメトリーを使用して、ＢＡＰ１陽性細胞の割合（％）について細胞を分析した。以下のように、ウイルスを計算した。
【０１００】
【数１】
2020500502.tif 000004
【０１０１】
次に、ＭＰＭ細胞を、４μｇ／ｍｌポリブレンの存在下で、一定範囲の感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入し、形質導入効率を、フローサイトメトリー分析によって評価した。最適集団（＞９０％の形質導入が達成される最低のＭＯＩ）を、さらなる実験のために選択した。
【０１０２】
ｓｈＲＮＡ実験
上記のレンチウイルス生成プロトコルに従って、ＢＡＰ１を標的とするｓｈＲＮＡをコート゛するレンチウイルスを生成した。ＭＰＭ細胞（Ｈ２８１８）を形質導入し、純粋な集団が達成されるまでピューロマイシン２００μｇ／ｍＬで処理した。ｓｈＲＮＡノックダウンの有効性を評価するために、イムノブロッティングを行った。
【０１０３】
動物
全ての動物実験は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｌｏｎｄｏｎの生物学的サービス倫理審査委員会によって承認され、英国内務省の規則および１９８６年の動物操作の証拠（科学的手続き）法（英国、ロンドンの本社）の下で認可された。マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから購入し、特定の病原体のない条件下で個別に換気されたケージで飼育され、滅菌照射食品およびオートクレーブ処理された水を自由に摂取できるようにした。
【０１０４】
異種移植マウスモデル
８週齢のＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／ＮｃｒＣｒｌ（ＮＯＤ  ＳＣＩＤ）マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）の群の各脇腹に、マトリゲルおよび培地の１：１の混合物中の１００万個の細胞のルシフェラーゼ形質導入中皮腫細胞株（Ｈ２２６  ＢＡＰおよびＨ２２６  Ｃ９１Ａ）を注射した。腫瘍細胞の注射後１４日目に、生物発光画像化（ＩＶＩＳ）によって評価した場合に腫瘍が構築されたとき、ビヒクルまたはイソロイシンジッパーＴＲＡＩＬ（ｉｚＴＲＡＩＬ）のいずれかを用いて、処置を開始した［２０］。実験期間中、ビヒクルまたはｉｚＴＲＡＩＬのいずれかを、１日１回６００ｍｃｇの用量で腹腔内投与した。腫瘍サイズを、生物発光画像化（ＩＶＩＳ）を使用して、０、１３、１９、２６、および４１日目に評価した。マウスを４２日目に処分し、腫瘍を除去して秤量した。１群当たり６匹のマウスを処置した。研究者らは、これらの実験で予備知識を持っていなかった。
【０１０５】
統計分析
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｖ．４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、統計分析を行った。反復測定ＡＮＯＶＡを使用して、複数の群を用いたインビボ実験を分析し、単一群データを、Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定を使用して評価した。別段明記しない限り、全てのインビトロ実験を、三連で行った。
【０１０６】
実施例１−ＴＲＡＩＬは、ＢＡＰ１変異型中皮腫細胞を標的とする
本発明者らは、単独で、またはリガンド腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連の細胞死誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）と組み合わせてのいずれかで、９４個の小分子阻害剤および化学療法剤（表１を参照のこと）を使用して、１５種の中皮腫細胞株（Ｍｅｔ５ａ中皮正常対照株と共に）でコンビナトリアルケミカルスクリーニングを実施した。極端な薬物感受性の例を検出するために、本発明者らは、中皮腫における候補癌遺伝子であると最近同定された８個の遺伝子のセットに基づいて、反応とこれらの細胞株の変異状態との間の統計的関連について分析した（図１Ａを参照のこと）。注目すべきことに、ＢＡＰ１変異は、癌の種類わたってよく認識されている（図１ＢおよびＣを参照のこと）。薬物反応に対する変異の最大の効果は、脱ユビキチン化酵素ＢＡＰ１に変異を保有し、ＴＲＡＩＬで処理された中皮腫細胞のそれであった（図２Ａを参照のこと）。スクリーンに含まれる対照正常中皮細胞株ＭＥＴ−５Ａにおいて観察される細胞生存率では有意な効果はなかった（図２Ｂを参照のこと）。ＢＡＰ１変異細胞は、それらの野生型対応物よりもＴＲＡＩＬに対して有意に感受性が高かった（図２Ｂおよび図２Ｃを参照のこと）。さらに、これらの細胞株で検出されたＢＡＰ１変異は、切断型であると予測されるだろう（表２を参照のこと）。本発明者らは、ＢＡＰ１変異が、通常、タンパク質発現の喪失と関連しており、変異細胞株は、一般に、ＴＲＡＩＬに対して感受性があることをイムノブロット法によって確認した（図３Ａを参照のこと）。
【０１０７】
【表１−１】
2020500502.tif 000005
【０１０８】
【表１−２】
2020500502.tif 000006
【０１０９】
【表１−３】
2020500502.tif 000007
【０１１０】
【表２】
2020500502.tif 000008
【０１１１】
実施例２−ＢＡＰ１発現の調節は、細胞死の活性化を通してＴＲＡＩＬ感受性を決定する
ＴＲＡＩＬは、２つの活性な膜貫通型細胞死受容体、ＤＲ４およびＤＲ５を介して結合し、カスパーゼカスケードおよびその後の細胞死を引き起こす。ＢＡＰ１変異細胞において観察されたＴＲＡＩＬの生存率効果は、アポトーシスマーカーアネキシンＶで染色された細胞の画分の増加と実際に関連していた（図３Ｂを参照のこと）。
【０１１２】
したがって、本発明者らは、次に、中皮腫細胞におけるＢＡＰ１発現の調節がＴＲＡＩＬ感受性の変化をもたらすかどうかを調べた。ＢＡＰ１野生型細胞株Ｈ２８１８におけるレンチウイルスｓｈＲＮＡの使用によるＢＡＰ１タンパク質の除去は、ＢＡＰ１コンピテント親株と比較して、ＢＡＰ１ヌルにおいて感受性の増加へのシフトを促進した（図４を参照のこと）。野生型全長ＢＡＰ１（図５Ａを参照のこと）または触媒活性を示さない(catalytically dead)Ｃ９１Ａ変異体の発現を回復させるために、ＢＡＰ１のホモ接合性欠失を有するＢＡＰ１ヌル細胞株ＮＣＩ−Ｈ２２６を、ＢＡＰ１発現ベクターで形質導入した。投与量範囲のＴＲＡＩＬでヌルＮＣＩ−Ｈ２２６細胞株を処理すると、細胞死が増加し、これはＢＡＰ１発現Ｈ２２６細胞株において有意に減少した（図５ｂを参照のこと）。しかしながら、Ｃ９１Ａ変異体は、ＢＡＰ１ヌル親細胞株の反応を模写し(phenocopy)、これから機能的ユビキチンヒドロラーゼ触媒ドメインがＴＲＡＩＬに対する感受性にとって決定的に重要であることが示される。ＮＬＳの欠失はＢＡＰ１誘導ＴＲＡＩＬ耐性の有意な減少をもたらすので、核局在化シグナル（ＮＬＳ）も、ＴＲＡＩＬ耐性を付与するのに重要な役割を果たす（図５ｃを参照のこと）。
【０１１３】
実施例３−ＢＡＰ１の発現および機能の喪失は、アポトーシス機構の成分を調節する
Ｈ２２６中皮腫細胞株は、ＢＡＰ１のホモ接合性欠失を有し、その結果、ＢＡＰ１発現の完全な喪失をもたらす。本発明者らはさらに、以前に記載されたように（ＰＭＩＤ  １８９９０７２２）、示差的ｍＲＮＡ遺伝子発現に関するこの触媒的に不活性なＢＡＰ１の効果を調べ、さらにシグナル伝達経路影響分析(signalling pathway impact analysis)（ＳＰＩＡ）を実施した。野生型とｃ９１ａ  ｍｔ  ＢＡＰ１とを比較した場合に有意に改変されたこれらの経路の中には、細胞死経路の経路があった（図６Ａを参照のこと）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｄｂｇｅｔ−ｂｉｎ／ｗｗｗ＿ｂｇｅｔ？ｐａｔｈ：ｍａｐ０４２１０）。特に、触媒活性を示さない(catalytically dead)Ｃ９１Ａ変異体で安定的に形質導入されたＨ２２６細胞において、ＩＡＰファミリーのメンバーの発現が減少した（図６Ｂを参照のこと）。最大の効果がＣＩＡＰ２で見られ、これはウエスタンブロットによって確認された（図６Ｃを参照のこと）。
【０１１４】
実施例４−組み合わせ薬物スクリーニングにより、ＢＡＰ１コンピテント細胞株におけるＳＭＡＣ模倣物ＬＣＬ１６１とｒＴＲＡＩＬとの間の相乗効果が示される
ｒＴＲＡＩＬを、上記に記載される９４個の単剤化合物のライブラリーと組み合わせて、アンカー薬として使用した。デルタＡＵＣ測定基準（Ｗｅｓｓｌｅｓらを参照のこと）を使用して、相乗効果を記載し、これは、以前に記載されるゲノムサブ群と相関した。本発明者らは、ＳＭＡＣ模倣物ＬＣＬ１６１、ＤＮＡヘリカーゼ阻害剤ＹＫ−４２７９、およびチロシンキナーゼ阻害剤ソラフェニブなどの薬物が、別様に耐性細胞におけるＤＲＬ誘導アポトーシスの有効性を増大させることを示した。このスクリーニングの最も相乗的な知見の１つは、ＢＡＰ１野生型ＭＰＭにおけるＳＭＡＣ模倣物ＬＣＬ１６１およびｒＴＲＡＩＬに対する感受性の関連性であった（図７Ａを参照のこと）。これは、ＴＲＡＩＬ耐性野生型ＢＡＰ１発現細胞をＬＣＬ１６１とＴＲＡＩＬとの組み合わせで処理することによって検証された。ＴＲＡＩＬ単独に耐性があることが以前に実証された野生型ＢＡＰ１を安定的に発現するＨ２２６細胞株においても、さらなる検証を行った（図５および７Ｂ〜Ｄを参照のこと）。ＩＡＰ阻害剤、ＬＣＬ１６１、およびＴＲＡＩＬの組み合わせは、変異型および野生型の両方の株において細胞死の相乗的な増加を示し、これは、ＢＡＰ１変異体および野生型細胞におけるＤＲＬ誘導性の細胞死が、他の薬剤との組み合わせによって向上され得ることを示す（図７Ｂ〜Ｄを参照のこと）。特に図７Ｄは、ＢＡＰ１変異体および野生型細胞の両方が、ＴＲＡＩＬとＬＣＬ１６１との組み合わせによる処理に反応して細胞死することを示す。内因性ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏは、ＩＡＰの特異的な天然の阻害剤である（１４）。このデータは、ＢＡＰ１コンピテント状態において、ＩＡＰに対するこの阻害効果を特異的に模倣することによってＢＡＰ１喪失を模写することができ、その結果、ＩＡＰの正味の不活性化およびｒＴＲＡＩＬに対する感受性がもたらされることを示唆する。これは、見られたＢＡＰ１／外因性アポトーシス経路の混乱が、ＩＡＰの正味の活性の特異的な調整不全に関連しているという考えをさらに支持するであろう。
【０１１５】
実施例５−ＢＡＰ１機能喪失変異を有する他の組織へのＢＡＰ１／ＴＲＡＩＬ効果の拡大
脱ユビキチン化酵素ＢＡＰ１は、前述のような、胸膜中皮腫（３６％）、ブドウ膜黒色腫（４７％）、および肝内胆管癌（２５％）で頻繁に変異している。この治療アプローチにも適している可能性がある追加のＢＡＰ１変異型腫瘍が発生するかどうかを判定するために、本発明者らは、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）（ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）の変異データを使用して、２０種の癌における５１８０個の腫瘍試料のコホートにまでこの分析を拡張した。切断型ＢＡＰ１変異は、最大６％の頻度で、多様な範囲の癌の種類においても観察された（図１ｂおよびｃを参照のこと）Ｃａｒｂｏｎｅ、Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １３、１５３−１５９（２０１３年３月）。本発明者らが、以前に全エクソームおよびコピー数分析のために提出された１００１個の癌細胞株のパネルにそれらの分析を拡張したとき、彼らは、ＢＡＰ１における切断変異を有する１７個の細胞株を同定した（ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｃｅｌｌ＿ｌｉｎｅｓ／）。これらには、明細胞腎臓癌、膀胱癌、および乳癌細胞株が含まれた。ＴＲＡＩＬでこれらの細胞株を処理すると、同じ癌の種類のＢＡＰ１野生型細胞株と比較して、顕著な生存率効果が得られた（図８Ａを参照のこと）。本発明者らはまた、乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ２３１中のレンチウイルスｓｈＲＮＡを使用して、ＢＡＰ１を不活性化し、ｒＴＲＡＩＬに対する誇張されたアポトーシス反応を観察した（図８Ｂを参照のこと）。これは、ＴＲＡＩＬ療法が（中皮腫に加えて）他の形態の癌において有効であり得ること、およびＢＡＰ１の阻害、またはＢＡＰ１がＴＲＡＩＬ耐性を誘導する経路を標的とすることによってＴＲＡＩＬに対して癌細胞を感受性をもつようにさせる(sensitise)ことが可能であることを示唆する。
【０１１６】
本発明者らは、マウス異種移植片モデルによってインビボでＴＲＡＩＬを用いてＢＡＰ１変異細胞を標的とすることの有効性を実証した。変異体および野生型ＢＡＰ１細胞を、マウスの左右の脇腹に皮下注射した。マウスを、ｒＴＲＡＩＬまたはビヒクルのいずれかで処理した（図９Ａを参照のこと）。実験の終わりに腫瘍を秤量したところ、ＴＲＡＩＬを受けたマウスにおける変異型ＢＡＰ１腫瘍の重量は、ＴＲＡＩＬ処理をした野生型ＢＡＰ１腫瘍またはビヒクル処理をしたマウスの変異体および野生型腫瘍よりも有意に少なかった（図９Ｂを参照のこと）。４週間にわたってリアルタイムで腫瘍量を追跡した。ＴＲＡＩＬを受けたマウスにおける変異型ＢＡＰ１異種移植片の腫瘍量は、ＴＲＡＩＬ処理をした野生型ＢＡＰ１異種移植片またはビヒクル処理をしたマウスの変異体および野生型異種移植片よりも有意に少なかった（図９Ｃを参照のこと）。
【０１１７】
実施例６−ＢＡＰ１機能上のＡＳＸＬ結合部位の役割
本発明者らはまた、ＢＡＰ１遺伝子のＡＳＸＬタンパク質結合部位における変異が、ＢＡＰ１誘導ＴＲＡＩＬ耐性を損なうことを実証した（図１１を参照のこと）。ＢＡＰ１は、ＡＳＸＬ１、ＡＳＸＬ２、またはＡＳＸＬ３と複合体を形成することが示された。ＡＳＸＬタンパク質に対する結合部位の変異は、ＢＡＰ１−ＡＳＸＬ複合体の形成を阻害する。ＢＡＰ１−ＡＳＸＬ複合体は、ヒストン２Ａおよび他の基質を脱ユビキチン化することが示されており、ＢＡＰ１およびＡＳＸＬ１、ＡＳＸＬ２、またはＡＳＸＬ３の両方が、この脱ユビキチン化機能に必要とされる。この複合体は、ポリコームレスプレッサー複合体(Polycomb Respressor Complex)および遺伝子転写の重要な調整因子である。本発明者らは、ＢＡＰ１野生型およびＡＳＸＬ３変異体（切断型変異）細胞株Ｈ５１３がＴＲＡＩＬに感受性があることを示した。それゆえ、ＡＳＸＬ１、ＡＳＸＬ２、またはＡＳＸＬ３の機能喪失は、ＤＲＬ誘導性の細胞死に対する細胞の感受性を増大させる。ＡＳＸＬ１、ＡＳＸＬ２、またはＡＳＸＬ３の変異はまた、ＤＬＲに対する感受性を予測するため、ＢＡＰ１変異状態とは無関係に、細胞死のバイオマーカーとして使用することができる。
【０１１８】
実施例７−ＢＡＰ１／ＴＲＡＩＬ効果の他の外因性細胞死経路への拡張
本願におけるデータは、ＤＲ４およびＤＲ５受容体に結合することによってＴＲＡＩＬ経路を活性化する組換えタンパク質である、ｒＴＲＡＩＬに焦点を合わせているが、観察されたＢＡＰ１変異−感受性付与(mutation-sensitisation)は、ＦＡＳリガンド経路およびＴＮＦアルファ経路を含む、他の外因性アポトーシス経路に及ぶ（図１０を参照のこと）。
【０１１９】
概要
本発明者らは、ＢＡＰ１が、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦアルファ（ＴＮＦα）、およびＦＡＳリガンド（ＦＡＳＬ）などの、細胞死受容体リガンドによる細胞死受容体の活性化に反応して、細胞が細胞死を受けるかどうかの重要な調整因子であることを見出した。具体的には、野生型ＢＡＰ１の非機能的発現または低発現は、細胞を細胞死受容体リガンド誘導性の細胞死に対して感受性にする。結果として、変異型ＢＡＰ１遺伝子もしくは変異型ＢＡＰ１タンパク質、または野生型ＢＡＰ１タンパク質の発現が低い癌細胞が、ＤＲＬ誘導性の細胞死に対する感受性のバイオマーカーとして使用され得ることが発見された。
【０１２０】
したがって、本発明はまた、以下の有利な点を包含する。
【０１２１】
●個体の癌細胞が細胞死受容体リガンド（ＤＲＬ）誘導性の細胞死に対して感受性があるかどうかを判定する方法、
●個体の癌細胞がＤＲＬ誘導性の細胞死に対して感受性があるかどうかを判定するためのキット、
●細胞死受容体リガンド誘導性の細胞死に対して感受性がない癌に罹患している個体において、細胞死受容体リガンド誘導性の細胞死を選択的に誘導する方法、
●ＤＲＬ誘導性の細胞死に対して感受性がない癌に罹患している個体を、ＤＲＬ誘導性の細胞死に感作させる方法、
●ＢＡＰ１阻害剤および細胞死受容体リガンドを含む組成物、ならびに
●ＤＲＬ誘導性の細胞死に対して感受性がない癌に罹患している個体を治療、予防、または改善する方法。
【０１２２】
参考文献
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６．  Ｇｕｏ  Ｇ，Ｃｈｍｉｅｌｅｃｋｉ  Ｊ，Ｇｏｐａｒａｊｕ  Ｃ，Ｈｅｇｕｙ  Ａ，Ｄｏｌｇａｌｅｖ  Ｉ，Ｃａｒｂｏｎｅ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｗｈｏｌｅ−ｅｘｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｆｒｅｑｕｅｎｔ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＢＡＰ１，ＮＦ２，ＣＤＫＮ２Ａ，ａｎｄ  ＣＵＬ１  ｉｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｌｅｕｒａｌ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１５；７５（２）：２６４−９．Ｅｐｕｂ  ２０１４／１２／１０
７．  Ｂｏｔｔ  Ｍ，Ｂｒｅｖｅｔ  Ｍ，Ｔａｙｌｏｒ  ＢＳ，Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｓ，Ｉｔｏ  Ｔ，Ｗａｎｇ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｄｅｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｓｅ  ＢＡＰ１  ｉｓ  ｃｏｍｍｏｎｌｙ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ３ｐ２１．１  ｌｏｓｓｅｓ  ｉｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｌｅｕｒａｌ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ．Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１１；４３（７）：６６８−７２．Ｅｐｕｂ  ２０１１／０６／０７
８．  Ｍａｒｔｉｎ  Ｍ，Ｍａｓｓｈｏｆｅｒ  Ｌ，Ｔｅｍｍｉｎｇ  Ｐ，Ｒａｈｍａｎｎ  Ｓ，Ｍｅｔｚ  Ｃ，Ｂｏｒｎｆｅｌｄ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＥＩＦ１ＡＸ  ａｎｄ  ＳＦ３Ｂ１  ｉｎ  ｕｖｅａｌ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｗｉｔｈ  ｄｉｓｏｍｙ  ３．Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１３；４５（８）：９３３−６．Ｅｐｕｂ  ２０１３／０６／２６
９．  Ｇｅｒｌｉｎｇｅｒ  Ｍ，Ｈｏｒｓｗｅｌｌ  Ｓ，Ｌａｒｋｉｎ  Ｊ，Ｒｏｗａｎ  ＡＪ，Ｓａｌｍ  ＭＰ，Ｖａｒｅｌａ  Ｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｒｅｇｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１４；４６（３）：２２５−３３．Ｅｐｕｂ  ２０１４／０２／０４
１０．  Ｃｈａｎ−Ｏｎ  Ｗ，Ｎａｉｒｉｓｍａｇｉ  ＭＬ，Ｏｎｇ  ＣＫ，Ｌｉｍ  ＷＫ，Ｄｉｍａ  Ｓ，Ｐａｉｒｏｊｋｕｌ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｉｎ  ｌｉｖｅｒ  ｆｌｕｋｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｂｉｌｅ  ｄｕｃｔ  ｃａｎｃｅｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１３；４５（１２）：１４７４−８．Ｅｐｕｂ  ２０１３／１１／０５
１１．  Ｎａｒａｓｉｍｈａｎ  ＳＲ，Ｙａｎｇ  Ｌ，Ｇｅｒｗｉｎ  ＢＩ，Ｂｒｏａｄｄｕｓ  ＶＣ．Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｐｌｅｕｒａｌ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｔｏ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｃｌ−２  ａｎｄ  Ｂａｘ．Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．１９９８；２７５（１  Ｐｔ  １）：Ｌ１６５−７１．Ｅｐｕｂ  １９９８／０８／０５
１２．  Ｈｉｎｄｓ  ＭＧ，Ｎｏｒｔｏｎ  ＲＳ，Ｖａｕｘ  ＤＬ，Ｄａｙ  ＣＬ．Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  （ＩＡＰ）  ｒｅｐｅａｔ．Ｎａｔｕｒｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ．１９９９；６（７）：６４８−５１．Ｅｐｕｂ  １９９９／０７／１５
１３．  ｄｅ  Ａｌｍａｇｒｏ  ＭＣ，Ｖｕｃｉｃ  Ｄ．Ｔｈｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  （ＩＡＰ）  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｒｅ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２０１２；３４（３）：２００−１１．Ｅｐｕｂ  ２０１２／１０／１７
１４．  Ｙｕ  Ｊ，Ｗａｎｇ  Ｐ，Ｍｉｎｇ  Ｌ，Ｗｏｏｄ  ＭＡ，Ｚｈａｎｇ  Ｌ．ＳＭＡＣ／Ｄｉａｂｌｏ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＵＭＡ  ｂｙ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ＰＵＭＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｅｖｅｎｔｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００７；２６（２９）：４１８９−９８．Ｅｐｕｂ  ２００７／０１／２４
１５．  Ｂｅｈｊａｔｉ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ＰＴＰＲＢ  ａｎｄ  ＰＬＣＧ１  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２０１４  Ａｐｒ；４６（４）：３７６−９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｇ．２９２１
１６．  Ｔａｒｐｅｙ  ＰＳ  ｅｔ  ａｌ  Ｆｒｅｑｕｅｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｇｅｎｅ  ＣＯＬ２Ａ１  ｉｎ  Ｃｈｏｎｄｒｏｓａｒｃｏｍａ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２０１３  Ａｕｇ；  ４５（８）：９２３−９２６
１７．  Ｌｉ，Ｈ  ａｎｄ  Ｄｕｒｂｉｎ，Ｒ  Ｆａｓｔ  ａｎｄ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ｓｈｏｒｔ  ｒｅａｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００９．２５（１４）：ｐ１７５４−６０
１８．  Ｇａｒｎｅｔｔ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ，２０１２．４８３  （７３９１）：ｐ．４７３−８１
１９．  Ｂｅｈｊａｔｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｂｉｌｅ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＤＮＡ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  Ｌ１  ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１４．３４５（６１９６）：ｐ．１２５１３４３
２０．  Ｇａｎｔｅｎ  Ｔ，Ｋｏｓｃｈｎｙ  Ｒ，Ｓｙｋｏｒａ  Ｊ，Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｂｅｒｇｋａｍｅｎ  Ｈ，Ｂｕｃｈｌｅｒ  Ｐ，Ｈａａｓ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｐｐａｒｅｎｔｌｙ  ｓａｆｅ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ  ｈｅｐａｔｏｔｏｘｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＴＲＡＩＬ  ｅｉｔｈｅｒ  ａｌｏｎｅ  ｏｒ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００６；１２：２６４０−６
【図１Ａ】
2020500502.tif 000009
【図１Ｂ】
2020500502.tif 000010
【図１Ｃ】
2020500502.tif 000011
【図２Ａ】
2020500502.tif 000012
【図２Ｂ】
2020500502.tif 000013
【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
2020500502.tif 000015
【図３Ｂ】
2020500502.tif 000016
【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
2020500502.tif 000020
【図６Ａ】
2020500502.tif 000021
【図６Ｂ】
2020500502.tif 000022
【図７Ａ】
2020500502.tif 000023
【図７Ｂ】
2020500502.tif 000024
【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
2020500502.tif 000031
【図１０】
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【図１１】
2020500502.tif 000033
【配列表】
2020500502000001.app
【国際調査報告】
2020500502.tif 000034
2020500502.tif 000035
2020500502.tif 000036
2020500502.tif 000037