(57)【要約】Ｔ細胞数を選択的に増幅する方法が開示される。方法は、ＴＣＲを発現するようにヒトＴ細胞を改変し、ＴＣＲがマウス定常領域を含むこと；ＴＣＲを発現する幾らかのヒトＴ細胞及びＴＣＲを発現しない幾らかのヒトＴ細胞を含む細胞集団を製造すること；並びに（ｉ）放射線照射されたフィーダー細胞、（ｉｉ）１以上のサイトカイン、及び（ｉｉｉ）抗体又はその抗原結合部分、の存在下で細胞集団を培養し、抗体が該ＴＣＲのマウス定常領域に対して抗原特異性を有し、ＴＣＲを発現しないＴ細胞の数に対してＴＣＲを発現するＴ細胞の数を選択的に増幅することを含み得る。関連する細胞集団、医薬組成物、及びがんを治療又は予防する方法も開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞数を選択的に増幅する方法であって、
ＴＣＲを発現するようにヒトＴ細胞を改変し、ＴＣＲがマウス定常領域を含むこと；
ＴＣＲを発現する幾らかのヒトＴ細胞及びＴＣＲを発現しない幾らかのヒトＴ細胞を含む細胞集団を製造すること；並びに
（ｉ）放射線照射されたフィーダー細胞、（ｉｉ）１以上のサイトカイン、及び（ｉｉｉ）抗体又はその抗原結合部分の存在下で細胞集団を培養し、抗体が該ＴＣＲのマウスの定常領域に特異的に結合し、ＴＣＲを発現しないＴ細胞の数に対してＴＣＲを発現するＴ細胞の数を選択的に増幅すること
を含む、方法。
【請求項２】
抗体又はその抗原結合部分を用いて、ＴＣＲを発現するＴ細胞を、ＴＣＲを発現しないＴ細胞から分離することを更に含む、請求項１の方法。
【請求項３】
ＴＣＲががん抗原に対して抗原特異性を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＴＣＲがウイルス抗原に対して抗原特異性を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
１以上のサイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、及びＩＬ−２１のうち１以上を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
（ｉ）放射線照射された同種フィーダー細胞及び放射線照射された自己フィーダー細胞の一方又は両方、（ｉｉ）１以上のサイトカイン、及び（ｉｉｉ）ヒトＣＤ３複合体に特異的に結合する抗体又はその抗原結合部分、の存在下でヒトＴ細胞を培養することを更に含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
抗体がＴＣＲのβ鎖のマウス定常領域に特異的に結合する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ＴＣＲを発現するようにヒトＴ細胞を改変することが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）又は、クラスター化反復短回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）−Ｃａｓシステムを用いてＴＣＲを発現するようにヒトＴ細胞を改変することを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
抗体が、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸残基Ｄ２、Ｒ４、Ｎ５、Ｔ７、Ｅ１０１、Ｄ１０３、Ｋ１０４、Ｗ１０５、Ｐ１０６、Ｅ１０７、Ｇ１０８、Ｓ１０９及びＰ１１０に特異的に結合する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
抗体が、配列番号３及び配列番号４の両方のアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
選択的に増幅された細胞集団を製造し、選択的に増幅された集団中の細胞の約１０％〜約７５％がマウス定常領域を含むＴＣＲを発現する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
選択的に増幅された細胞集団を製造し、選択的に増幅された集団中の細胞の約２０％〜約９９％がマウス定常領域を含むＴＣＲを発現する、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
マウス定常領域を含むＴＣＲを発現するＴ細胞の数を約１０倍〜約１，０００倍増加させることを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ＴＣＲがマウス可変領域を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ＴＣＲがヒト可変領域を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項の方法に従って調製された、選択的に増幅された数のＴ細胞を含む細胞集団。
【請求項１７】
請求項１６の集団及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項１８】
哺乳動物における疾患の治療又は予防において使用するための、請求項１〜１５のいずれか１項の方法に従って選択的に増幅されているＴ細胞。
【請求項１９】
疾患がウイルス性疾患である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
疾患ががんである、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、２０１７年１０月５日に出願された米国仮特許出願番号第６２／５６８，３３９号（参照によりその全体が本明細書に組込まれる）の利益を主張する。
【０００２】
連邦によって支援された研究開発に関する陳述
本発明は、連邦政府の支援を受け、プロジェクト番号Ｚ１Ａ  ＢＣ  ０１０９８５の下、米国国立衛生研究所、米国国立がん研究所によりなされた。本発明において、連邦政府は一定の権利を有する。
【０００３】
電子的に提出された物件の参照による組込み
本明細書と同時に提出され、以下の通り識別される、コンピューターで読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸の配列表は、参照により、その全体が本明細書に組込まれる：２０１８年９月２４日付の「７４０３５８＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名前の８，８７６バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル１件。
【背景技術】
【０００４】
外因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように改変されている細胞を投与することによるがんの治療は、一部の患者において建設的な臨床結果をもたらしている。それにもかかわらず、かかる治療法のより広範な成功への障害は残っている。例えば、外因性ＴＣＲをコードする遺伝子の送達効率が低いと、外因性ＴＣＲを発現する細胞の数が少なくなる可能性がある。従って、外因性ＴＣＲを発現する細胞を製造する改善された方法に対する満たされていないニーズが存在する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の実施形態は、Ｔ細胞数を選択的に増幅する方法であって：ＴＣＲを発現するようにヒトＴ細胞を改変し、ＴＣＲがマウス定常領域を含むこと；ＴＣＲを発現する幾らかのヒトＴ細胞及びＴＣＲを発現しない幾らかのヒトＴ細胞を含む細胞集団を製造すること；並びに（ｉ）放射線照射されたフィーダー細胞、（ｉｉ）１以上のサイトカイン、及び（ｉｉｉ）抗体又はその抗原結合部分の存在下で細胞集団を培養し、抗体が該ＴＣＲのマウス定常領域に対して抗原特異性を有し、ＴＣＲを発現しないＴ細胞の数に対してＴＣＲを発現するＴ細胞の数を選択的に増幅することを含む、方法を提供する。
【０００６】
本発明の更なる実施形態は、本発明の方法に従って調製された、選択的に増幅された数のＴ細胞を含む、関連する細胞集団及び該細胞集団を含む医薬組成物を提供する。
【０００７】
本発明の更に別の実施形態は、哺乳動物におけるがんを治療又は予防する方法（ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ）を提供し、該方法は、本発明の方法に従ってＴ細胞数を選択的に増幅し、選択的に増幅された数のＴ細胞を、哺乳動物におけるがんを治療又は予防するのに有効な量で哺乳動物に投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】図１Ａは、ヒトＴＣＲα鎖可変領域（ｈＶα）、マウスＴＣＲα鎖定常領域（ｍＣα）、合成リンカー配列（Ｌ）、ヒトＴＣＲβ鎖可変領域（ｈＶβ）、及びマウスＴＣＲβ鎖定常領域（ｍＣβ）をコードするヌクレオチドコンストラクトを説明する模式図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明の実施形態による、ｍＴＣＲを発現するＴ細胞の数を選択的に増幅する方法を説明する模式図である。
【図２】図２は、（ｉ）ＣＤ３、ＣＤ４、又はＣＤ８発現及び（ｉｉ）ＯＫＴ３  Ａｂを用いる標準の急速増幅プロトコル（Ｒａｐｉｄ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）（ＲＥＰ）又はＨ５７  Ａｂを用いる選択的増幅を経た、抗変異ＥＲＢＢ２  ｍＴＣＲ又は抗変異ＥＲＢＢ２ＩＰ  ｍＴＣＲをエレクトロポレーションした細胞（ＥＲＢＢ２ｍｕｔＴＣＲ又はＥＲＢＢ２ＩＰｍｕｔＴＣＲ）におけるＦＡＣＳにより検出したｍＴＣＲβ発現を説明する実験データ（ドットプロット）を示す。エレクトロポレーション緩衝液のみ（モック；ＤＮＡ／ＴＣＲなし）とエレクトロポレーションしたＴ細胞が、ネガティブコントロールとして機能した。ドットプロット中の数は、検出したｍＴＣＲ＋細胞のパーセンテージである。
【図３Ａ】図３Ａ及び３Ｂは、さまざまな濃度（ｎｇ／ｍＬ）のＨ５７  Ａｂによる選択的増殖後に検出した、ＣＤ３、ＣＤ４、又はＣＤ８も発現する抗変異ＥＲＢＢ２ＩＰ  ｍＴＣＲβ＋（ＥＲＢＢ２ＩＰｍｕｔＴＣＲ）（Ａ）又は抗変異ＥＲＢＢ２（ＥＲＢＢ２ｍｕｔＴＣＲ）ｍＴＣＲβ＋（Ｂ）細胞のパーセンテージ（％）を示すグラフである。エレクトロポレーション緩衝液のみ（モック；ＤＮＡ／ＴＣＲなし）とエレクトロポレーションしたＴ細胞が、ネガティブコントロールとして機能した。Ｈ５７  Ａｂによる選択的増殖の代わりにＯＫＴ３  Ａｂによる標準ＲＥＰを経た、エレクトロポレーションした細胞が、非特異的Ｔ細胞増殖についてのポジティブコントロールとして機能した。
【図３Ｂ】図３Ａ及び３Ｂは、さまざまな濃度（ｎｇ／ｍＬ）のＨ５７  Ａｂによる選択的増殖後に検出した、ＣＤ３、ＣＤ４、又はＣＤ８も発現する抗変異ＥＲＢＢ２ＩＰ  ｍＴＣＲβ＋（ＥＲＢＢ２ＩＰｍｕｔＴＣＲ）（Ａ）又は抗変異ＥＲＢＢ２（ＥＲＢＢ２ｍｕｔＴＣＲ）ｍＴＣＲβ＋（Ｂ）細胞のパーセンテージ（％）を示すグラフである。エレクトロポレーション緩衝液のみ（モック；ＤＮＡ／ＴＣＲなし）とエレクトロポレーションしたＴ細胞が、ネガティブコントロールとして機能した。Ｈ５７  Ａｂによる選択的増殖の代わりにＯＫＴ３  Ａｂによる標準ＲＥＰを経た、エレクトロポレーションした細胞が、非特異的Ｔ細胞増殖についてのポジティブコントロールとして機能した。
【図４Ａ】図４Ａは、本発明の実施形態による、マウス定常領域（ｍＴＣＲ）を含むＴＣＲを発現するＴ細胞の数を選択的に増幅する方法を説明する模式図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＴＣＲのマウスＴＣＲβ鎖定常領域（ｍＣβ）へのＨ５７  Ａｂの結合を説明する模式図である。ＴＣＲの他の構成要素としては、ヒトＴＣＲα鎖可変領域（ｈＶα）、マウスＴＣＲα鎖定常領域（ｍＣα）、合成リンカー配列（Ｌ）、及びヒトＴＣＲβ鎖可変領域（ｈＶβ）が挙げられる。
【図５】図５Ａ〜５Ｄは、非トランスフェクション未染色細胞（Ａ）、非トランスフェクション染色細胞（Ｂ）、エレクトロポレーション緩衝液のみ（モック）（ＴＣＲ／トランスポゾン（Ｔｎ）なし）とエレクトロポレーションした細胞（Ｃ）、並びにｍＴＣＲ（４１４９−ＴＣＲａ２ｂ２／ｐＳＢＳＯ）をコードするＳＢＴＳプラスミド及び実施例３に記載のトランスポザーゼをコードするＳＢＴＳプラスミド（ｐＫａｎ−ＣＭＶ−ＳＢ１１）とエレクトロポレーションした細胞（Ｄ）におけるＦＡＣＳにより検出したＣＤ３発現及びマウスＴＣＲβ鎖（ｍＴＣＲβ）発現を説明する実験データ（ドットプロット）を示す。ドットプロット中の数は、ＣＤ３＋／ｍＴＣＲβ＋（右上象限）、ＣＤ３＋／ｍＴＣＲβ−（右下象限）、ＣＤ３−／ｍＴＣＲβ−（左下象限）、及びＣＤ３−／ｍＴＣＲβ＋（左上象限））の細胞のパーセンテージである。
【図６】図６は、表示した初期数のエレクトロポレーションした細胞（表示した濃度（ｎｇ／ｍＬ）のＨ５７  ＡｂによるＲＥＰにおけるｍＴＣＲ＋細胞）で選択的増幅を経た、ｍＴＣＲをエレクトロポレーションした細胞におけるＦＡＣＳにより検出したＣＤ３発現及びｍＴＣＲβ発現を説明する実験データ（ドットプロット）を示す。エレクトロポレーション緩衝液のみ（モック）（ＴＣＲなし）とエレクトロポレーションした細胞が、ネガティブコントロールとして機能した。ドットプロット中の数は、ＣＤ３＋／ｍＴＣＲβ＋（右上の象限）、ＣＤ３＋／ｍＴＣＲβ−（右下象限）、ＣＤ３−／ｍＴＣＲβ−（左下象限）、及びＣＤ３−／ｍＴＣＲβ＋（左上象限）の細胞のパーセンテージである。
【図７】図７は、Ｈ５７  Ａｂ又はＯＫＴ３  Ａｂによる第２の増幅を経た、染色したか又は未染色の、ｍＴＣＲをエレクトロポレーションした細胞におけるＦＡＣＳにより検出したＣＤ３発現及びｍＴＣＲβ発現を説明する実験データ（ドットプロット）を示す。ＯＫＴ３  Ａｂによる２回目の増幅を経た、ｍＴＣＲをエレクトロポレーションした細胞におけるＦＡＣＳにより検出したＣＤ４及びＣＤ８の発現を説明する実験データ（ドットプロット）も示す。
【図８】図８Ａ及び８Ｂは、増殖前（プレ−急速増幅プロトコル（ＲＥＰ））の、非形質導入（ＵＴ）細胞（図８Ｂ）及び形質導入細胞（図８Ａ）についてのＦＡＣＳにより検出したＣＤ８発現及び抗ＭＡＲＴ−１  ＴＣＲ発現を説明する実験データ（ドットプロット）を示す。図８Ｃは、増幅前（プレ−ＲＥＰ）且つ約５％ｍＴＣＲｂ＋細胞への希釈後の図８Ａの形質導入細胞についてのＦＡＣＳにより検出したＣＤ８発現及び抗ＭＡＲＴ−１  ＴＣＲ発現を説明する実験データ（ドットプロット）を示す。
【図９】図９は、（ｉ）５０ＣＵ又は５００ＣＵのＩＬ−２及び（ｉｉ）ＯＫＴ３  Ａｂ又はＨ５７  Ａｂ（「ｍＴＣＲｂ」）による増幅後のＵＴ細胞又は図８Ｃの希釈形質導入細胞についてのＦＡＣＳにより検出したＣＤ８発現及び抗ＭＡＲＴ−１  ＴＣＲ発現を説明する実験データ（ドットプロット）を示す。図３Ａ及び３Ｂは、さまざまな濃度（ｎｇ／ｍＬ）のＨ５７  Ａｂによる選択的増殖後に検出した、ＣＤ３、ＣＤ４、又はＣＤ８も発現する抗変異ＥＲＢＢ２ＩＰ  ｍＴＣＲβ＋（ＥＲＢＢ２ＩＰｍｕｔＴＣＲ）（Ａ）又は抗変異ＥＲＢＢ２（ＥＲＢＢ２ｍｕｔＴＣＲ）ｍＴＣＲβ＋（Ｂ）細胞のパーセンテージ（％）を示すグラフである。エレクトロポレーション緩衝液のみ（モック；ＤＮＡ／ＴＣＲなし）とエレクトロポレーションしたＴ細胞が、ネガティブコントロールとして機能した。Ｈ５７  Ａｂによる選択的増殖の代わりにＯＫＴ３  Ａｂによる標準ＲＥＰを経た、エレクトロポレーションした細胞が、非特異的Ｔ細胞増殖についてのポジティブコントロールとして機能した。
【図１０】図１０Ａは、（ｉ）５０ＣＵ又は５００ＣＵのＩＬ−２及び（ｉｉ）ＯＫＴ３  Ａｂ又はＨ５７  Ａｂ（「ｍＴＣＲｂ」）による増幅後のＵＴ細胞又は図８Ｃの希釈形質導入細胞について検出した形質導入細胞のパーセンテージを示すグラフである。図１０Ｂは、（ｉ）５０ＣＵ又は５００ＣＵのＩＬ−２及び（ｉｉ）ＯＫＴ３  Ａｂ又はＨ５７  Ａｂ（「ｍＴＣＲＢ」）による増幅後のＵＴ細胞又は図８Ｃの希釈形質導入細胞について達成した増幅倍数を示すグラフである。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｃは、ＵＴ細胞（図１１Ａ）又は４倍希釈前（図１１Ｂ）又は後（図１１Ｃ）に抗ＭＡＲＴ−１  ＴＣＲで形質導入した細胞の増幅前のＦＡＣＳにより検出したＣＤ８発現及びｍＴＣＲｂ発現を説明する実験データ（ドットプロット）を示す。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｅは、ＵＴ細胞（図１２Ｅ）の増幅、又はＯＫＴ３及び５００ＣＵ  ＩＬ−２（図１２Ａ）、Ｈ５７（ｍＴＣＲｂ）及び５００  ＣＵ  ＩＬ−２（図１２Ｂ）、Ｈ５７（ｍＴＣＲｂ）及び５０ＣＵ  ＩＬ−２（図１２Ｃ）、又はＨ５７（ｍＴＣＲｂ）及びＩＬ−２なし（図１２Ｄ）による図１１Ｃの希釈したＴＣＲ形質導入細胞の増幅後にＦＡＣＳにより検出したＣＤ８発現及びｍＴＣＲｂ発現を説明する実験データ（ドットプロット）を示す。
【図１３】図１３Ａは、ＵＴ細胞又は、（ｉ）０ＣＵ、５０ＣＵ若しくは５００ＣＵのＩＬ−２及び（ｉｉ）ＯＫＴ３  Ａｂ若しくはＨ５７  Ａｂ（「ｍＴＣＲｂ」）による増幅後の、図１１Ｃの希釈した形質導入細胞について検出した形質導入細胞のパーセンテージを示すグラフである。図１３Ｂは、ＵＴ細胞又は、（ｉ）０ＣＵ、５０ＣＵ若しくは５００ＣＵのＩＬ−２及び（ｉｉ）ＯＫＴ３  Ａｂ若しくはＨ５７Ａｂ（「ｍＴＣＲｂ」）による増幅後の、図１１Ｃの希釈した形質導入細胞について達成した増幅倍数を示すグラフである。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｆは、増幅前（図１４Ａ）又はＯＫＴ３（３０ｎｇ／ｍｌ）（図１４Ｂ）又は、Ｈ５７（ｍＴＣＲｂ）（５ｎｇ／ｍｌ）（図１４Ｆ）、１０ｎｇ／ｍｌ（図１４Ｅ）、５０ｎｇ／ｍｌ（図１４Ｄ）、若しくは５００ｎｇ／ｍｌ（図１４Ｃ））による形質導入細胞の増幅後にＦＡＣＳにより検出したＣＤ８発現及びｍＴＣＲｂ発現を説明する実験データ（ドットプロット）を示す。
【図１５】図１５は、ＯＫＴ３（３０ｎｇ／ｍｌ）又はＨ５７（ｍＴＣＲｂ）（５、１０、５０、又は５００ｎｇ／ｍｌ）による増幅後に、ｍＴＣＲ形質導入細胞について達成した増幅倍数を示すグラフである。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｅは、Ｈ５７による第１回目の増幅を経たｍＴＣＲ形質導入細胞の、第２回目の増幅後にＦＡＣＳにより検出したＣＤ８発現及びｍＴＣＲｂ発現を説明する実験データ（ドットプロット）を示す。２回目の増幅は、ＯＫＴ３（３０ｎｇ／ｍｌ）（図１６Ａ）又はＨ５７（ｍＴＣＲｂ）（５ｎｇ／ｍｌ（図１６Ｅ）、１０ｎｇ／ｍｌ（図１６Ｄ）、５０ｎｇ／ｍｌ（図１６Ｃ）、又は５００ｎｇ／ｍｌ（図１６Ｂ））により行った。
【図１７】図１７は、Ｈ５７による第１回目の増殖を経たｍＴＣＲ形質導入細胞の、第２回目の増幅後にｍＴＣＲ形質導入細胞について達成した増幅倍数を示すグラフである。第２回目の増幅は、ＯＫＴ３（３０ｎｇ／ｍｌ）又はＨ５７（ｍＴＣＲｂ）（５、１０、５０、又は５００ｎｇ／ｍｌ）により行った。
【図１８】図１８は、４１４９−ＨＵＷＥ１−ＴＣＲ１又は４１４９−ＴＰ５３−ＴＣＲａ２ｂ２によるドナー１及び２からのＰＢＭＣのエレクトロポレーションの翌日にＦＡＣＳにより検出したＣＤ３発現及びｍＴＣＲｂ発現を説明する実験データ（ドットプロット）を示す。未染色ＰＢＭＣ、非トランスフェクションＰＢＭＣ、及びエレクトロポレーション緩衝液のみ（モック）（ＴＣＲなし）とエレクトロポレーションしたＰＢＭＣが、ネガティブコントロールとして機能した。
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｂは、４１４９−ＨＵＷＥ１−ＴＣＲ１又は４１４９−ＴＰ５３−ＴＣＲａ２ｂ２が転移（ｔｒａｎｓｐｏｓｅ）し、Ｈ５７による１回目の増幅を経たドナー１及び２からのＰＢＭＣによるＣＤ３発現及びｍＴＣＲｂ発現を説明する実験データ（ドットプロット）を示す（図１９Ｂ）。未染色ＰＢＭＣ（図１９Ａ）及びエレクトロポレーション緩衝液のみ（モック）（ＴＣＲなし）とエレクトロポレーションしたＰＢＭＣ（図１９Ｂ）が、ネガティブコントロールとして機能した。
【図２０】図２０Ａ〜２０Ｂは、４１４９−ＨＵＷＥ１−ＴＣＲ１又は４１４９−ＴＰ５３−ＴＣＲａ２ｂ２が転移し、Ｈ５７による１回目の増幅後、標準のＲＥＰを用いる増幅を経たドナー１及び２からのＰＢＭＣによるＣＤ３発現及びｍＴＣＲｂ発現を説明する実験データ（ドットプロット）を示す（図２０Ｂ）。未染色ＰＢＭＣ（図２０Ａ）及びエレクトロポレーション緩衝液のみ（モック）（ＴＣＲなし）とエレクトロポレーションしたＰＢＭＣ（図２０Ｂ）が、ネガティブコントロールとして機能した。
【図２１】図２１Ａは、（ｉ）ＤＭＳＯ、ＷＴ  ＨＵＷＥ１ペプチド、又は変異（ｍｕｔ）ＨＵＷＥ１ペプチドでパルスしたＤＣの、（ｉｉ）４１４９ＨＵＷＥ１−ＴＣＲ１が転移したドナー１からの細胞との共培養後に分泌されたＩＦＮ−γの濃度を示すグラフである。単独で培養したＤＣがコントロールとして機能した。平均±ＳＥＭ；ｎ＝３のテクニカルレプリケート。図２１Ｂは、（ｉ）ＤＭＳＯ、ＷＴ  ＴＰ５３ペプチド、又はｍｕｔ  ＴＰ５３ペプチドでパルスしたＤＣの、（ｉｉ）４１４９−ＴＰ５３−ＴＣＲａ２ｂ２が転移したドナー１由来の細胞との共培養後に分泌されたＩＦＮ−γの濃度を示すグラフである。単独で培養したＤＣがコントロールとして機能した。平均±ＳＥＭ；ｎ＝３のテクニカルレプリケート。図２１Ｃは、（ｉ）ＤＭＳＯ、ＷＴ  ＨＵＷＥ１ペプチド、ｍｕｔ  ＨＵＷＥ１ペプチドでパルスしたＤＣの、（ｉｉ）４１４９−ＨＵＷＥ１−ＴＣＲ１が転移したドナー２からの細胞との共培養後に分泌されたＩＦＮ−γの濃度を示すグラフである。単独で培養したＤＣがコントロールとして機能した。平均±ＳＥＭ；ｎ＝３のテクニカルレプリケート。図２１Ｄは、（ｉ）ＤＭＳＯ、ＷＴ  ＴＰ５３ペプチド、又はｍｕｔ  ＴＰ５３ペプチドでパルスしたＤＣの、（ｉｉ）４１４９−ＴＰ５３−ＴＣＲａ２ｂ２が転移したドナー２由来の細胞との共培養後に分泌されたＩＦＮ−γの濃度を示すグラフである。単独で培養したＤＣがコントロールとして機能した。平均±ＳＥＭ；ｎ＝３のテクニカルレプリケート。
【図２２】図２２は、本発明の実施形態による、マウス定常領域（ｍＴＣＲ）を含むＴＣＲを発現するＴ細胞の数を選択的に増幅する方法を説明する模式図である。
【図２３】図２３Ａは、実施例１４に記載の方法中の４時点：エレクトロポレーション後（白棒）、Ｈ５７による選択的増幅後（縞模様棒）、Ｈ５７結合ビーズによる濃縮後（灰色棒）、及びＯＫＴ３による標準ＲＥＰ後（黒棒）、で測定した１キュベット内の細胞の総数を示すグラフである。細胞を４１４９−ＨＵＷＥ１−ＴＣＲ１又は４１４９−ＴＰ５３−ＴＣＲａ２ｂ２とエレクトロポレーションした。示すデータが平均値＋／−ＳＥＭ（ｎ＝３）であるように、トリプリケートのキュベットを並行して進めた。図２３Ｂは、実施例１４に記載の方法中の４時点：エレクトロポレーション後（白棒）、Ｈ５７による選択的増幅後（縞模様棒）、Ｈ５７結合ビーズによる濃縮後（灰色棒）、及びＯＫＴ３による標準のＲＥＰ後（黒棒）、で測定した１キュベット内のＣＤ３＋ｍＴＣＲ＋細胞のパーセンテージを示すグラフである。細胞を４１４９−ＨＵＷＥ１−ＴＣＲ１又は４１４９−ＴＰ５３−ＴＣＲａ２ｂ２とエレクトロポレーションした。示すデータが平均値＋／−ＳＥＭ（ｎ＝３）であるように、トリプリケートのキュベットを並行して進めた。図２３Ｃ〜２３Ｄは、実施例１４に記載の方法の２８日目（ＯＫＴ３  ＲＥＰ後）に測定した４１４９−ＨＵＷＥ１−ＴＣＲ１転移（ｍＴＣＲ＋）（図２３Ｃ）細胞又は４１４９−ＴＰ５３−ＴＣＲａ２ｂ２転移（ｍＴＣＲ＋）（図２３Ｄ）細胞のパーセンテージを示すグラフである。エレクトロポレーション緩衝液のみ（モック）（ＴＣＲなし）とエレクトロポレーションしたＰＢＭＣが、ネガティブコントロールとして機能した。モックは（１）で表示し、ＴＣＲ転移細胞は（２）で表示する。示すデータが平均値＋／−ＳＥＭ（ｎ＝３）であるように、トリプリケートのキュベットを並行して進めた。図２３Ｅは、実施例１４に記載の方法の２８日目（ＯＫＴ３  ＲＥＰ後）に測定したＣＤ４＋ｍＴＣＲβ＋細胞（白棒）又はＣＤ８＋ｍＴＣＲβ＋細胞（黒棒）のパーセンテージを示すグラフである。ＴＣＲは４１４９−ＨＵＷＥ１−ＴＣＲ１又は４１４９−ＴＰ５３−ＴＣＲａ２ｂ２であった。示すデータが平均値＋／−ＳＥＭ（ｎ＝３）であるように、トリプリケートのキュベットを並行して進めた。
【図２４】図２４Ａは、細胞数の増幅前（１日目）（白棒）又は後（２８日目）（黒棒）に測定した、表示したマーカーについて陽性の細胞のパーセンテージを示すグラフである。細胞では、４１４９−ＨＵＷＥ１−ＴＣＲ１が転移した。図２４Ｂは、細胞数の増幅前（１日目）（白棒）又は後（２８日目）（黒棒）に測定した、表示した表現型を有するｍＴＣＲβ＋細胞のパーセンテージを示すグラフである。細胞では、４１４９−ＨＵＷＥ１−ＴＣＲ１が転移した。表現型は、中央記憶Ｔ（ＴＣＭ）細胞、記憶幹Ｔ細胞（ｍｅｍｏｒｙ  ｓｔｅｍ  Ｔ  ｃｅｌｌ）（ＴＳＣＭ細胞）、ナイーブＴ細胞（ＴＮ）、エフェクター記憶Ｔ細胞（ＴＥＭ）、及びエフェクター記憶ＲＡ  Ｔ細胞（ＴＥＭＲＡ）である。図２４Ｃは、細胞数の増幅前（１日目）（白棒）又は後（２８日目）（黒棒）に測定した、表示したマーカーについて陽性の細胞のパーセンテージを示すグラフである。細胞では、４１４９−ＴＰ５３−ＴＣＲａ２ｂ２が転移した。図２４Ｄは、細胞数の増幅前（１日目）（白棒）又は後（２８日目）（黒棒）に測定した、表示した表現型を有するｍＴＣＲβ＋細胞のパーセンテージを示すグラフである。細胞では、４１４９−ＴＰ５３−ＴＣＲａ２ｂ２が転移した。
【図２５】図２５Ａは、（ｉ）ＤＭＳＯ又は１０、１、若しくは０．１μｇ／ｍＬのＷＴ  ＨＵＷＥ１ペプチド（白棒）又はｍｕｔ  ＨＵＷＥ１ペプチド（黒棒）でパルスしたＤＣの、（ｉｉ）４１４９−ＨＵＷＥ１−ＴＣＲ１が転移した細胞との共培養後に分泌されたＩＦＮ−γの濃度を示すグラフである）。図２５Ｂは、（ｉ）ＤＭＳＯ又は１０、１、若しくは０．１μｇ／ｍＬのＷＴ  ＴＰ５３ペプチド（白棒）又はｍｕｔ  ＴＰ５３ペプチド（黒棒）でパルスしたＤＣの、（ｉｉ）４１４９−ＴＰ５３−ＴＣＲａ２ｂ２が転移した細胞との共培養後に分泌されたＩＦＮ−γの濃度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明の実施形態は、Ｔ細胞数を選択的に増幅する方法を提供する。該方法は、ＴＣＲを発現するようにヒトＴ細胞を改変することを含み得、該ＴＣＲは、マウス定常領域（以下、「ｍＴＣＲ」）を含む。本発明の方法は、様々な利点のいずれか１以上を提供し得る。例えば、本発明の方法は、ｍＴＣＲを発現しない細胞の数に対する、ｍＴＣＲを発現するＴ細胞の数の選択的増幅を提供し得る。本発明の方法は、本明細書に記載の通り、Ｔ細胞の数を選択的に増幅しない方法により調製される細胞集団と比較して、より高い割合の、ｍＴＣＲを発現する細胞を含む細胞集団を提供し得る。特定の理論又はメカニズムには拘束されないが、より高い割合の、ｍＴＣＲを発現する細胞を含む細胞集団は、より少ない割合の、ｍＴＣＲを発現する細胞を含む細胞集団と比較して、標的がん細胞の破壊の改善とがんの治療の改善の一方又は両方を提供し得ると考えられている。
【００１０】
ＴＣＲは、一般に、ＴＣＲのα鎖、ＴＣＲのβ鎖、ＴＣＲのγ鎖、ＴＣＲのδ鎖、又はそれらの組み合わせ等の、２つのポリペプチド（即ち、ポリペプチド鎖）を含む。ＴＣＲのかかるポリペプチド鎖は、当該技術分野で公知である。ｍＴＣＲが、マウス定常領域を含み、疾患関連抗原等の抗原又はそのエピトープに特異的に結合し、免疫学的に認識することができるという条件で、ｍＴＣＲは任意のアミノ酸配列を含み得る。
【００１１】
ｍＴＣＲは、外因性のＴＣＲ、即ち、Ｔ細胞に固有ではない（天然に生じない）ＴＣＲであり得る。外因性ＴＣＲは組換えＴＣＲであり得る。組換えＴＣＲは、１つ以上の外因性ＴＣＲα−、β−、γ−、及び／又はδ−鎖をコードする遺伝子の組換え発現によって生成されているＴＣＲである。組換えＴＣＲを作製する方法は当該技術分野で公知である。
【００１２】
本発明の実施形態においては、ｍＴＣＲは２つのポリペプチド鎖を含み、そのそれぞれは、ＴＣＲの相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む可変領域を含む。好ましくは、ｍＴＣＲは、α鎖のＣＤＲ１、α鎖のＣＤＲ２、α鎖のＣＤＲ３、β鎖のＣＤＲ１、β鎖のＣＤＲ２、及びβ鎖のＣＤＲ３を含む。
【００１３】
一実施形態においては、ｍＴＣＲは、上記のＣＤＲを含むＴＣＲの可変領域のアミノ酸配列を含み得る。これに関して、ＴＣＲは、α鎖可変領域及びβ鎖可変領域を含み得る。
【００１４】
本発明の実施形態においては、ｍＴＣＲは、上記の可変領域又はＣＤＲに加えて、マウス定常領域を更に含む。好ましくは、ｍＴＣＲは、α鎖マウス定常領域及びβ鎖マウス定常領域の両方を含む。本明細書で用いられる場合、用語「マウス」は、本明細書に記載のＴＣＲ又はＴＣＲの任意の構成要素（例、相補性決定領域（ＣＤＲ）、可変領域、定常領域、アルファ鎖、及び／又はベータ鎖）に言及するとき、マウスに由来するＴＣＲ（又はその構成要素）、即ち、マウスＴ細胞起源であるか、又はマウスＴ細胞によってかつて発現されたＴＣＲ（又はその構成要素）を意味する。
【００１５】
ｍＴＣＲは、可変領域及び定常領域を含むＴＣＲα鎖並びに可変領域及び定常領域を含むＴＣＲβ鎖を含み得る。以下、α鎖可変領域及びβ鎖可変領域を総称して、ＴＣＲの「可変領域」という。以下、α鎖定常領域及びβ鎖定常領域を総称して、ＴＣＲの「定常領域」という。
【００１６】
本発明の実施形態においては、ｍＴＣＲはマウスＴＣＲである。マウスＴＣＲは、完全にマウスに由来するポリペプチド鎖を含み得る。これに関して、マウスＴＣＲは、マウス可変領域及びマウス定常領域を含み得る。マウスＴＣＲの例としては、米国特許番号第８，２１６，５６５号及び９，４８７，５７３号並びに米国特許出願番号第１５／５２８，８１３号に開示されているものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１７】
本発明の別の実施形態においては、ｍＴＣＲは、２つの異なる哺乳動物種、即ち、マウス及び非マウス種からのＴＣＲに由来するアミノ酸配列で構成されるキメラ又はハイブリッドＴＣＲである。例えば、ｍＴＣＲは、ヒト可変領域及びマウス定常領域を含み得る。ヒト可変領域及びマウス定常領域を含むキメラＴＣＲの例は、特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５０８７５号、第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４４６１５号、第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２７８６５号、米国特許出願公開番号第２０１３／０２７４２０３号、第２０１７／０１４５０７０号、及び第２０１６／０１５２６８１号；及び米国特許番号第８，７８５，６０１号に開示されている。
【００１８】
本発明の実施形態においては、ｍＴＣＲは抗原特異的ＴＣＲである。本明細書で用いられる場合、語句「抗原特異的」及び「抗原特異性」は、ｍＴＣＲの、抗原又はそのエピトープへの結合が免疫反応を誘発するように、ｍＴＣＲが抗原又はそのエピトープに特異的に結合し、免疫学的に認識できることを意味する。
【００１９】
抗原特異的ｍＴＣＲによって認識される抗原は、疾患に特徴的な任意の抗原であり得る。例えば、抗原は、がん抗原（腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原とも呼ばれる）又はウイルス抗原であり得るが、それらに限定されない。ウイルス抗原は当該技術分野で公知であり、例えば、任意のウイルスタンパク質、例、ｅｎｖ、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｇｐ１２０、チミジンキナーゼ等が挙げられる。
【００２０】
本明細書で用いられる場合、用語「がん抗原」は、抗原が腫瘍又はがんに関連付けられるように、腫瘍細胞又はがん細胞によって単独で又は主に発現又は過剰発現される任意の分子（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、脂質、炭水化物等）を指す。がん抗原は更に、正常、非腫瘍、又は非がん性細胞によって発現され得る。しかしながら、かかる場合、正常、非腫瘍、又は非がん性細胞によるがん抗原の発現は、腫瘍又はがん細胞による発現ほど確固としていない。これに関して、腫瘍細胞又はがん細胞は、正常細胞、非腫瘍細胞、又は非がん性細胞による抗原の発現と比較して、抗原を過剰発現し得るか、又は抗原を有意に高いレベルで発現し得る。がん抗原は、発生又は成熟の異なる状態の細胞によっても更に発現され得る。例えば、がん抗原は、胚又は胎児期の細胞によって更に発現され得、これらの細胞は、通常、成体宿主では見出されない。或いは、がん抗原は幹細胞又は前駆細胞によって更に発現され得、これらの細胞は通常、成体宿主では見出されない。がん抗原は当該技術分野で公知であり、例えば、メソセリン、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２７６（Ｂ７Ｈ３）、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１、上皮成長因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲＶＩＩＩ）、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ、変異ＫＲＡＳ、ＮＹ−ＥＳＯ−１（ＣＡＧ−３としても知られる）、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３等が挙げられる。
【００２１】
一実施形態においては、がん抗原はネオ抗原である。ネオ抗原は、腫瘍性形質転換中に腫瘍細胞又はがん細胞で生じる遺伝子変異から生成される腫瘍特異的又はがん特異的抗原である。ネオ抗原は患者に特有であり得る。好ましい実施形態においては、ネオ抗原は免疫原性ネオ抗原である。
【００２２】
がん抗原は、本明細書に記載のがん及び腫瘍を含む、任意のがん又は腫瘍の任意の細胞によって発現される抗原であり得る。がん抗原は、がん抗原が１タイプのみのがん又は腫瘍に関連するか又は特徴的であるように、１タイプのがん又は腫瘍のみのがん抗原であり得る。或いは、がん抗原は、１超のタイプのがん又は腫瘍のがん抗原であり得る（例、それに特徴的であり得る）。例えば、がん抗原は、乳がん細胞及び前立腺がん細胞の両方によって発現され得、正常、非腫瘍、又は非がん細胞によっては全く発現されない場合がある。
【００２３】
抗原特異的ｍＴＣＲによって認識される抗原に関連するか又は特徴的である疾患は、任意の疾患であり得る。例えば、状態は、本明細書で検討される通り、がんの又はウイルス性の疾患であり得る。
【００２４】
がんは、急性リンパ球性がん、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、骨がん、脳がん、乳がん、肛門、肛門管又は肛門直腸のがん、目のがん、肝内胆管のがん、関節のがん、首、胆嚢又は胸膜のがん、鼻、鼻腔又は中耳のがん、口腔のがん、外陰部のがん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄がん、結腸がん、食道がん、子宮頸がん、胃腸カルチノイド腫瘍、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、肝臓がん、肺がん、悪性中皮腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、卵巣がん、膵臓がん、腹膜、大網及び腸間膜のがん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎臓がん（例、腎細胞がん（ＲＣＣ））、小腸がん、軟組織がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、尿管がん及び膀胱がんのいずれかを含む、任意のがんであり得る。
【００２５】
本明細書の目的のために、「ウイルス性疾患」は、人から人へ又は生物から生物へ伝染し得、ウイルスによって引き起こされる疾患を意味する。本発明の実施形態においては、ウイルス性疾患は、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ヘパドナウイルス、パピローマウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス（ｃｏｒｏｎｏｖｉｒｕｓｅｓ）、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、フラビウイルス、及びカリシウイルスからなる群から選択されるウイルスによって引き起こされる。例えば、ウイルス性疾患は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタイン−バーウイルス、水痘ウイルス、サイトメガロウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴリンパ向性ウイルス、カリシウイルス、アデノウイルス、アリーナウイルスからなる群から選択されるウイルスによって引き起こされ得る。
【００２６】
ウイルス性疾患は、例えば、インフルエンザ、肺炎、ヘルペス、肝炎、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、慢性疲労症候群、突発性急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、胃腸炎、腸炎、心臓炎、脳炎、細気管支炎、呼吸器乳頭腫症、髄膜炎、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、及び単核球症であり得る。
【００２７】
本発明の実施形態においては、方法は、ｍＴＣＲを発現するようにヒトＴ細胞を改変することを含む。Ｔ細胞は単離又は精製され得る。本明細書で用いられる場合、用語「単離された」は、その自然環境から取り出されていることを意味する。本明細書で用いられる場合、用語「精製された」は、純度が増加していることを意味し、「純度」は相対的な用語であり、必ずしも絶対的な純度と解釈されるべきではない。「精製された」Ｔ細胞は、組織、細胞、タンパク質、核酸等の他の天然成分から分離されているＴ細胞を指す。
【００２８】
Ｔ細胞は、培養Ｔ細胞、例、初代Ｔ細胞、又は培養Ｔ細胞株由来のＴ細胞、例、Ｊｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴ１等、又は非マウス哺乳動物から得られたＴ細胞等の任意のＴ細胞であり得る。非マウス哺乳動物から得られる場合、Ｔ細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺、脾臓又は他の組織若しくは体液を含むが、これらに限定されない多数のソースから得られ得る。細胞は、濃縮又は精製もされ得る。好ましくは、Ｔ細胞はヒトＴ細胞である。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、例、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例、細胞傷害性Ｔ細胞）、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、末梢血白血球（ＰＢＬ）、腫瘍浸潤細胞、記憶Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞等を含むが、これらに限定されない、任意の型のＴ細胞であり得、任意の発生段階のＴ細胞であり得る。Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋Ｔ細胞であり得る。
【００２９】
方法は、ｍＴＣＲ又はｍＴＣＲをコードする核酸をヒトＴ細胞に導入するのに好適な任意の技術を用いて、ｍＴＣＲを発現するようにヒトＴ細胞を改変すること、及びヒトＴ細胞によるｍＴＣＲの発現を得ることを含み得る。かかる技術は、例えば、Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第４版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ，ＮＹ（２０１２）に記載されている。ヒトＴ細胞を改変してＴＣＲを発現させるのに有用であり得る技術の例としては、トランスフェクション、形質転換、形質導入、エレクトロポレーション、及び遺伝子編集技術が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の実施形態においては、ヒトＴ細胞は、トランスポゾン、レンチウイルスベクター、又はレトロウイルスベクターを用いて改変される。トランスポゾンの例としては、ＳＬＥＥＰＩＮＧ  ＢＥＡＵＴＹトランスポゾンシステム（ＳＢＴＳ）（Ｉｎｔｒｅｘｏｎ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）及びＺｉｏｐｈａｒｍ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から入手可能）、ＰＩＧＧＹＢＡＣトランスポゾンシステム（Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＫＹから入手可能）及びＴｏｌ２トランスポゾンシステムが挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子編集技術の例としては、クラスター化反復短回文配列リピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓシステム（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２３：１１６３−７１（２０１３））、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、及び転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が挙げられ得る。
【００３０】
方法は更に、ｍＴＣＲを発現する幾らかのヒトＴ細胞及びｍＴＣＲを発現しない幾らかのヒトＴ細胞を含む細胞集団を製造することを含み得る。ｍＴＣＲを発現するようにヒトＴ細胞を改変することは、様々な効率で行われ得る。従って、ｍＴＣＲを発現するようにヒトＴ細胞を改変することは、ｍＴＣＲを発現する細胞及びｍＴＣＲを発現しない細胞を含む細胞の混合集団をもたらし得る。
【００３１】
方法は、（ｉ）放射線照射されたフィーダー細胞、（ｉｉ）１以上のサイトカイン、及び（ｉｉｉ）抗体又はその抗原結合部分の存在下で細胞集団を培養することを更に含み得る。ここで抗体は、ｍＴＣＲを発現しないＴ細胞の数に対してｍＴＣＲを発現するＴ細胞の数を選択的に増やす（本明細書では「選択的増幅」とも呼ばれる）ように、ｍＴＣＲのマウス定常領域に特異的に結合する。
【００３２】
放射線照射されたフィーダー細胞は、Ｔ細胞の数を増幅するのに好適な、任意の放射線照射されたフィーダー細胞を含み得る。本発明の実施形態においては、放射線照射されたフィーダー細胞は、（ｉ）放射線照射された同種フィーダー細胞；（ｉｉ）放射線照射された自己フィーダー細胞；又は（ｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の両方を含む。用いられる放射線照射されたフィーダー細胞の数は限定されず、例、用途及び得られる細胞の所望の数等の様々な要因に応じて、当業者により選択され得る。例えば、２×１０７の倍数単位の放射線照射されたフィーダー細胞は、小規模な研究における増幅に有用であり得る。１×１０８の倍数単位の放射線照射されたフィーダー細胞は、中規模の増幅に有用であり得る。約２から約３０の５×１０８の倍数単位の放射線照射されたフィーダー細胞は、大規模な増幅（例えば、臨床上の生産）（通常、最大約１．５×１０１０）に有用であり得る。例えば、方法は、約１×１０９〜約４×１０９同種フィーダー細胞及び／又は自己フィーダー細胞、好ましくは約２×１０９〜約３×１０９同種フィーダー細胞及び／又は自己フィーダー細胞を用い得る。
【００３３】
１以上のサイトカインは、Ｔ細胞の数を増幅するのに好適な任意の１以上のサイトカインを含み得る。本発明の実施形態においては、１以上のサイトカインは、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、及びＩＬ−２１のいずれか１以上を含む。
【００３４】
方法は、細胞集団を、抗体又はその抗原結合部分の存在下で培養することを更に含み得、抗体は、ｍＴＣＲのマウス定常領域に特異的に結合する。抗体は、当該技術分野で公知の任意のタイプの免疫グロブリンであり得る。例えば、抗体は組換え抗体であり得る。抗体は、任意のアイソタイプ、例、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（例、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）、ＩｇＭ等であり得る。抗体は、モノクローナル又はポリクローナルであり得る。抗体は、天然に生じる抗体、例、哺乳動物、例、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、ハムスター、ヒト等から単離及び／又は精製された抗体であり得る。或いは、抗体は、遺伝子操作された抗体、例、ヒト化抗体又はキメラ抗体、であり得る。抗体は、単量体型又は多量体型であり得る。抗体又はその抗原結合断片は、ｍＴＣＲのマウス定常領域に対して任意のレベルの親和性又は結合力（ａｖｉｄｉｔｙ）も有し得る。
【００３５】
本発明の実施形態においては、抗体は、２つのポリペプチド鎖（重鎖及び軽鎖）を含み、そのそれぞれは、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む可変領域を含む。抗体は、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、及び軽鎖ＣＤＲ３を含み得る。本発明の実施形態においては、抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。
【００３６】
抗体の抗原結合部分は、少なくとも１つの抗原結合部位を有する任意の部分であり得る。本発明の実施形態においては、抗原結合部分は、抗体の重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、及び軽鎖ＣＤＲ３を含み得る。本発明の別の実施形態においては、抗原結合部分は、抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み得る。抗体の抗原結合部分は、Ｆａｂ断片（Ｆａｂ）、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片、一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化可変領域断片（ｄｓＦｖ）、ｓｃＦｖ２ＣＨ３、ｓｃＦｖ４、ｓｃＦｖ３、ｓｃＦｖ２、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、又は（ｓｃＦｖ）２であり得る。合成ペプチドを介して抗体軽鎖の可変（Ｖ）ドメインに連結された抗体重鎖のＶドメインを含む融合タンパク質である一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）は、通常の組換えＤＮＡ技術の技法を用いて生成され得る。同様に、ジスルフィド安定化可変領域断片（ｄｓＦｖ）は、組換えＤＮＡ技術によって調製され得る。しかしながら、抗体の抗原結合部分は、これらの例示的なタイプの抗原結合部分に限定されない。抗体、及びその抗原結合部分は、特に明記しない限り、以下「抗体」と総称される。
【００３７】
抗体は、ｍＴＣＲのマウス定常領域に特異的に結合する任意の抗体であり得る。本発明の実施形態においては、抗体は、ｍＴＣＲのマウス定常領域に特異的に結合し、ヒトＴＣＲの任意の部分、例、ヒトＴＣＲ定常領域、又はヒトＴＣＲ複合体の任意の部分には結合しない。ＴＣＲ複合体はＴＣＲのα及びβ鎖と３つの二量体シグナル伝達鎖：ＣＤ３δ／ε、ＣＤ３γ／ε及びＣＤ２４７ζ／ζ又はζ／η、を含む。ＣＤ３δ／ε及びＣＤ３γ／ε鎖は、まとめてＣＤ３複合体と呼ばれる。
【００３８】
抗体は、ｍＴＣＲのα鎖のマウス定常領域又はｍＴＣＲのβ鎖のマウス定常領域に特異的に結合し得る。好ましい実施形態においては、抗体は、ｍＴＣＲのβ鎖のマウス定常領域に特異的に結合する。抗体が特異的に結合するｍＴＣＲβ鎖のマウス定常領域は、配列番号１のアミノ酸配列（ｍＴＣＲβ鎖の全長マウス定常領域のアミノ酸配列）を含み得るか、又はそれからなり得る。抗体は、ｍＴＣＲβ鎖のマウス定常領域の任意の部分に特異的に結合し得る。例えば、抗体は、配列番号２のアミノ酸配列（ｍＴＣＲβ鎖の全長マウス定常領域の例示的な最小エピトープのアミノ酸配列）に特異的に結合し得る。本発明の実施形態においては、抗体は、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸残基Ｄ２、Ｒ４、Ｎ５、Ｔ７、Ｅ１０１、Ｄ１０３、Ｋ１０４、Ｗ１０５、Ｐ１０６、Ｅ１０７、Ｇ１０８、Ｓ１０９、及びＰ１１０に特異的に結合する。
【００３９】
ｍＴＣＲのマウス定常領域に特異的に結合する抗体は市販されている。例えば、ｍＴＣＲのβ鎖のマウス定常領域に特異的に結合する抗体は、Ｈ５７抗体（Ｈ５７−５９７とも呼ばれる）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能）である。Ｈ５７はアルメニアンハムスターのＩｇＧ抗体であり、例えばＫｕｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２（８）：２７３６−４２（１９８９）及びＧｒeｇｏｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ、８８：８０７７−８１（１９９１）に記載されている。Ｈ５７抗体のエピトープは、例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１７（１）：１０−２６（１９９８）に記載されている。Ｈ５７抗体は、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸残基Ｄ２、Ｒ４、Ｎ５、Ｔ７、Ｅ１０２、Ｄ１０４、Ｋ１０５、Ｗ１０６、Ｐ１０７、Ｅ１０８、Ｇ１０９、Ｓ１１０、及びＰ１１１に特異的に結合する。
【００４０】
本発明の実施形態においては、抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。例えば、抗体（Ａｂ）は、配列番号３（Ｈ５７  Ａｂ重鎖の可変領域）若しくは配列番号４（Ｈ５７  Ａｂ軽鎖の可変領域）又は配列番号３及び４の両方のアミノ酸配列を含み得るか、それらからなり得るか、又はそれらから実質的に成り得る。好ましくは、抗体は、配列番号３及び４の両方のアミノ酸配列を含む。本発明の実施形態においては、抗体は、配列番号３のＨ５７  Ａｂ重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、並びに配列番号４のＨ５７  Ａｂ軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。
【００４１】
本発明の実施形態においては、抗体は、上記の可変領域を含む重鎖及び軽鎖を含む。例えば、抗体は、配列番号５（Ｈ５７  Ａｂ重鎖）若しくは配列番号６（Ｈ５７  Ａｂ軽鎖）、又は配列番号５及び６の両方のアミノ酸配列を含み得るか、それらからなり得るか、又はそれらから実質的になり得る。好ましくは、抗体は、配列番号５及び６の両方のアミノ酸配列を含む。
【００４２】
本明細書に記載の通り、（ｉ）放射線照射されたフィーダー細胞、（ｉｉ）１以上のサイトカイン、及び（ｉｉｉ）抗体の存在下で細胞集団を培養することにより、好都合に、ｍＴＣＲを発現するＴ細胞の数が、ｍＴＣＲを発現しないＴ細胞の数に対して選択的に増幅される。これに関して、本発明の方法は、ＴＣＲのマウス定常領域に特異的に結合する抗体を用いない、細胞数を増幅する方法と比較して、好都合に、より高い割合の、ｍＴＣＲを発現する細胞を含む細胞集団を提供し得る。本発明の実施形態においては、方法は、ｍＴＣＲを発現するＴ細胞の数を、約５倍以下から約４，０００倍以上まで増加させる。例えば、本発明の方法は、ｍＴＣＲ発現細胞の数を約５倍〜約４，０００倍、約１００倍〜約３，５００倍、約１，０００倍〜約３，０００倍、約１，５００倍〜約２，５００倍、約１０倍〜約１，０００倍、約５０倍〜約８５０倍、約１００倍〜約９００倍、約１５０倍〜約８５０倍、約２００倍〜約８００倍、約２５０倍〜約７５０倍、約３００倍〜約７００倍、約３５０倍〜約６５０倍、又は約４００倍〜約６００倍増加させ得る。例えば、本発明の方法は、ｍＴＣＲ発現細胞の数を、約１０倍、約５０倍、約１００倍、約１５０倍、約２００倍、約２５０倍、約３００倍、約３５０倍、約４００倍、約４５０倍、約５００倍、約５５０倍、約６００倍、約６５０倍、約７００倍、約７５０倍、約８００倍、約８５０倍、約９００倍、約９５０倍、約１，０００倍、又は前述の値のいずれか２つの範囲で増加させ得る。前述の増幅倍数は、約１０〜約１４日、好ましくは約１４日の期間にわたって達成され得る。本発明の方法によって達成される増幅倍数は、非常に変動しやすく、ドナー依存性であり得る。
【００４３】
本発明の実施形態においては、方法は、選択的に増幅された細胞集団を製造し、選択的に増幅された集団における約１０％〜約９５％の細胞が、マウス定常領域を含むＴＣＲを発現する。これに関して、方法は、選択的に増幅された集団における約１０％〜約９５％、約１５％〜約９０％、約２０％〜約８５％、約２５％〜約８０％、約３０％〜約７５％、約３５％〜約７０％、又は約４０％〜約６５％の細胞がｍＴＣＲを発現する、選択的に増幅された細胞集団を製造し得る。方法は、選択的に増幅した集団における、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は前述の値のいずれか２つの範囲の細胞がｍＴＣＲを発現する、選択的に増幅された細胞集団を製造し得る。
【００４４】
本発明の方法は、好都合に、様々な用途のいずれかに好適であり得る、任意の数のｍＴＣＲ発現Ｔ細胞を製造し得る。本発明の実施形態においては、方法は、ｍＴＣＲを発現する約１×１０６〜約１×１０１１以上のＴ細胞を製造し得る。例えば、本発明の方法は、小さな容器（例えば、Ｔ２５フラスコ）において、ｍＴＣＲを発現する約１×１０６〜約１×１０７のＴ細胞を製造し得る。本発明の方法は、より大きな容器（例えば、Ｔ１７５フラスコ）において、ｍＴＣＲを発現する約５×１０６〜約３×１０７のＴ細胞を製造し得る。本発明の方法は、他の容器（例えば、Ｗｉｌｓｏｎ  Ｗｏｌｆ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｂｒｉｇｈｔｏｎ，ＭＮから入手可能なＧＲＥＸフラスコ）において、ｍＴＣＲを発現する約１×１０９〜約１×１０１０のＴ細胞を製造し得る。ｍＴＣＲを発現する約１×１０６〜約１×１０１０のＴ細胞の集団は、小規模のスクリーニング実験に有用であり得る。ｍＴＣＲを発現するより多くの数、例、約１．５×１０１０以上、の細胞も、本発明の方法を用いて、例えば、臨床適用のために得られ得る。本発明の方法によって製造されるｍＴＣＲ発現Ｔ細胞の数は、非常に変動しやすく、ドナー依存性であり得る。
【００４５】
方法は、ｍＴＣＲ発現細胞の数の１回以下の選択的増幅、又はｍＴＣＲ発現細胞の数の複数回の選択的増幅を行うことを含み得る。本発明の実施形態においては、方法は、本発明の他の態様に関して本明細書に記載された、１回以上の選択的増幅を行い、その後、細胞数の１回以上の非選択的増幅を行うことを含む。これに関して、方法は、（ｉ）放射線照射された同種フィーダー細胞及び放射線照射された自己フィーダー細胞の一方又は両方、（ｉｉ）１以上のサイトカイン、及び（ｉｉｉ）ヒトＣＤ３複合体に特異的に結合する抗体、又は、その抗原結合部分の存在下でヒトＴ細胞を培養すること（本明細書では「非選択的増幅」とも呼ばれる）を更に含み得る。Ｔ細胞の数の増幅は、例えば、米国特許第８，０３４，３３４号；米国特許第８，３８３，０９９号；米国特許出願公開番号第２０１２／０２４４１３３号；Ｄｕｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２６：３３２−４２（２００３）；及びＲｉｄｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２８：１８９−２０１（１９９０）に記載の通りの多くの方法のいずれかによって達成され得る。例えば、Ｔ細胞の数は、フィーダーリンパ球及びインターロイキン−２（ＩＬ−２）又はインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）のいずれか（ＩＬ−２が好ましい）の存在下でヒトＣＤ３複合体に特異的に結合する抗体又はその抗原結合部分を用いて非選択的に増幅され得る。ヒトＣＤ３複合体に特異的に結合する抗体の例は、ＯＫＴ３（Ｏｒｔｈｏ−ＭｃＮｅｉｌ，Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪから入手可能）である。
【００４６】
複数回の選択的増幅、又は１回以上の選択的増幅後の１回以上の非選択的増幅は、ｍＴＣＲの数を約１００，０００倍以上増加させ得る。本発明の実施形態においては、方法は、集団中の約２０％〜約９９％の細胞がマウス定常領域を含むＴＣＲを発現する、細胞集団を製造する。複数回の選択的増殖、又は１回以上の選択的増殖後の１回以上の非選択的増殖は、集団中の約２５％〜約９５％、約３０％〜約９０％、約３５％〜約８５％、約４０％〜約８０％、約４５％〜約７５％、又は約５０％〜約７０％の細胞がｍＴＣＲを発現する、細胞集団を製造し得る。方法は、集団中の約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、又は前述の値のいずれか２つの範囲の細胞がｍＴＣＲを発現する、細胞集団を製造し得る。
【００４７】
本発明の実施形態においては、方法は、ＴＣＲのマウス定常領域に特異的に結合する抗体又はその抗原結合部分を用いて、ＴＣＲを発現するＴ細胞を、ＴＣＲを発現しないＴ細胞から分離することを更に含む。これに関して、方法は、抗体がＴＣＲのマウス定常領域に特異的に結合するように、ｍＴＣＲを発現する細胞及びｍＴＣＲを発現しない細胞を含む細胞の混合集団を抗体と物理的に接触させることを含み得る。抗体は、支持体、例、ビーズ、に接着され得る。方法は、ｍＴＣＲを発現しない細胞の全部又は一部が、ｍＴＣＲを発現する細胞から除去されるように、抗体及び細胞を洗浄することを更に含み得る。方法は、抗体からｍＴＣＲ発現細胞を溶出することを更に含み得る。Ｔ細胞を分離するための技術の例は、例えば、Ｄｅｎｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２４（６）：１０７８−８９（２０１６）及びＦｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，８（６）：ｅ６８２０１（２０１３）に記載されている。
【００４８】
本発明の方法は、好都合に、ｍＴＣＲを発現する細胞が濃縮されている細胞集団を提供し得る。従って、本発明の実施形態は、本明細書に記載の方法のいずれかに従って調製された、幾らかの選択的に増幅されたＴ細胞を含む細胞集団を提供する。細胞集団は、少なくとも１つの他の細胞（例、ｍＴＣＲを発現しないＴ細胞）又はＴ細胞以外の細胞（例、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球、赤血球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋肉細胞、脳細胞等）と共に、ｍＴＣＲを発現するＴ細胞を含む不均一集団であり得る。或いは、細胞集団は、集団が、ｍＴＣＲを発現するＴ細胞を主に含む（例、実質的にそれからなる）、実質的に均一な集団であり得る。集団は、集団の全ての細胞がｍＴＣＲを発現するように、集団の全ての細胞が、ｍＴＣＲを発現する単一のＴ細胞のクローンである、細胞のクローン集団でもあり得る。本発明の一実施形態においては、細胞集団は、ｍＴＣＲを発現するＴ細胞を含むクローン集団である。
【００４９】
本発明の細胞集団は、単離及び／又は精製され得る。本明細書において用いられる場合、用語「単離された」は天然環境から取り出されていることを意味する。本明細書において用いられる場合、用語「精製された」は純度が増加していることを意味し、「純度」は、相対的な用語であり、必ずしも絶対的な純度と解釈されるべきではない。純度は、例えば、少なくとも約５０％であり得、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％超であり得、又は約１００％であり得る。
【００５０】
本発明の細胞集団は、医薬組成物等の組成物に製剤化され得る。これに関して、本発明は、本明細書に記載の細胞集団のいずれか、及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、例、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、メトトレキセート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）等の化学療法剤等の、他の医薬的な活性剤（複数可）又は薬剤（複数可）との組合せで、本発明の細胞集団のいずれかを含み得る。
【００５１】
好ましくは、担体は医薬的に許容可能な担体である。医薬組成物に関して、担体は、Ｔ細胞のために従来用いられているもののいずれかであり得る。投与可能な組成物を調製するための方法は、当業者に公知であるか、又は明らかであり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２版，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（２０１２）により詳細に記載されている。医薬的に許容可能な担体は、使用条件下で有害な副作用又は毒性を有さないものであることが好ましい。
【００５２】
担体の選択は、本発明の細胞集団を投与するために用いられる特定の方法によって決定され得る。従って、本発明の医薬組成物の種々の好適な製剤がある。好適な製剤としては、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、腫瘍内、又は腹腔内投与用のもののいずれかが挙げられ得る。本発明の細胞集団を投与するために１超の経路が用いられ得、特定の例においては、ある経路が、別の経路よりも即時の、効果的な応答を提供し得る。
【００５３】
好ましくは、本発明の細胞集団は、注射、例、静脈内、によって投与される。注射用の細胞のための医薬的に許容可能な担体は、例えば、通常の生理食塩水（水中約０．９０％  ｗ／ｖのＮａＣｌ、水中約３００ｍＯｓｍ／ＬのＮａＣｌ、又は水１リットル当たり約９．０ｇのＮａＣｌ）、ＮＯＲＭＯＳＯＬ  Ｒ電解質溶液（Ａｂｂｏｔｔ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）、ＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ（Ｂａｘｔｅｒ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）、水中約５％のデキストロース、又は乳酸リンゲル液等の任意の等張性の担体が挙げられ得る。一実施形態においては、医薬的に許容可能な担体には、ヒト血清アルブミンが補充される。注入用の医薬組成物はＩＬ−２を含有する場合としない場合がある。医薬組成物がＩＬ−２を含有する場合、約３００ＩＵ／ｍＬの濃度が用いられ得る。
【００５４】
本発明の目的のために、投与される量又は用量（例、細胞の数）は、合理的な時間枠に亘り、哺乳動物における、例、治療的又は予防的応答、をもたらすために十分であるべきである。例えば、用量（例、細胞の数）は、疾患関連抗原に結合するか、又は投与時から、約２時間以上から、例、約１２〜約２４時間以上の期間で、疾患を検出、治療若しくは予防するために十分であるべきである。特定の実施形態においては、期間は更に長くなる場合がある。用量は、細胞集団の効能及び哺乳動物（例、ヒト）の状態、並びに治療される哺乳動物（例、ヒト）の体重によって決定される。
【００５５】
投与量を決定するための多くのアッセイが、当該技術分野において公知である。本発明の目的のために、Ｔ細胞の種々の用量がそれぞれ与えられる１組の哺乳動物間で、哺乳動物にかかるＴ細胞のある特定の用量が投与される際に、ｍＴＣＲを発現するＴ細胞により標的細胞が溶解され又はＩＦＮ−γが分泌される程度を比較することを含むアッセイが、哺乳動物に投与する開始用量を決定するために用いられ得る。特定の用量の投与の際に標的細胞が溶解され又はＩＦＮ−γが分泌される程度は、当該技術分野において公知の方法によってアッセイされ得る。
【００５６】
本発明の細胞集団の用量は、特定の細胞集団の投与に伴う可能性のある任意の有害な副作用の存在、性質及び程度によっても決定される。通常、主治医は、年齢、体重、一般的な健康状態、食事、性別、投与される本発明の細胞集団、投与経路、及び治療される疾患の重篤度等のさまざまな要因を考慮して、各個人の患者を治療する細胞集団の投与量を決定する。一実施形態においては、注入ごとに投与される細胞の数は、例えば、約１×１０６細胞から約１×１０１２細胞以上まで変動し得る。特定の実施形態においては、少なくとも約１．５×１０１０細胞が投与され得る。
【００５７】
本発明の方法によって製造された細胞集団は、疾患、例、がん、を治療又は予防するのに有用であり得る。従って、本発明の別の実施形態は、哺乳動物における疾患を治療又は予防する方法を提供し、該方法は、本発明の他の態様に関して本明細書に記載された方法のいずれかに従って、Ｔ細胞数を選択的に増幅すること、及び選択的に増幅された数のＴ細胞を、哺乳動物における疾患を治療又は予防するのに有効な量で、哺乳動物に投与することを含む。
【００５８】
本発明の方法の目的のために、細胞集団が投与され、該細胞は、哺乳動物に対して同種又は自己である細胞であり得る。好ましくは、該細胞は哺乳動物に対して自己である。
【００５９】
本発明の実施形態においては、疾患はがんである。がんは、本発明の他の態様に関して本明細書に記載されたがんのいずれかであり得る。
【００６０】
本発明の実施形態においては、疾患はウイルス性疾患である。ウイルス性疾患は、本発明の他の態様に関して本明細書に記載されたウイルス性疾患のいずれかであり得る。
【００６１】
本明細書中で用いられる場合、用語「哺乳動物」は、マウス及びハムスター等のネズミ目の哺乳動物、並びにウサギ等のウサギ目の哺乳動物を含むが、これらに限定されない任意の哺乳動物を指す。哺乳動物がネコ科動物（ネコ）及びイヌ科動物（イヌ）を含むネコ目由来であることが好ましい。哺乳動物がウシ亜科動物（ウシ）及びイノシシ科動物（ブタ）を含むウシ目由来、又はウマ科動物（ウマ）を含むウマ目のものであることがより好ましい。哺乳動物が霊長目、セボイド目若しくはシモイド目（サル）又は類人目（ヒト及び類人猿）のものであることが最も好ましい。特に好ましい哺乳動物はヒトである。
【００６２】
本明細書中で用いられる場合、用語「治療」及び「予防」、並びにそれに由来する語は、必ずしも１００％又は完全な治療若しくは予防を意味しない。むしろ、当業者が潜在的な利益又は治療効果を有すると認識する、治療又は予防の様々な程度がある。これに関して、本発明の方法は、哺乳動物における、任意の量の任意のレベルのがんの治療又は予防を提供し得る。更には、本発明の方法によって提供される治療又は予防は、治療又は予防される、疾患、例、がん、の１以上の状態又は症状の治療又は予防を含み得る。例えば、本発明の方法により提供される治療又は予防は、腫瘍の退縮を促進することを含み得る。本明細書の目的のために、「予防」は、疾患、又はその症状若しくは状態の発症を遅延させることも包含し得る。
【００６３】
以下の実施例は本発明を更に説明するが、当然ながら、決してその範囲を限定すると解釈すべきではない。
【実施例】
【００６４】
実施例１
本実施例は、マウス定常領域（ｍＴＣＲ）を含むＴＣＲを発現するＴ細胞の数を選択的に増幅することにより、ｍＴＣＲを発現する細胞の数が増加することを実証する。
【００６５】
一方はがん特異的変異ＥＲＢＢ２ネオ抗原に対して抗原特異性を有し、他方はがん特異的変異ＥＲＢＢ２ＩＰネオ抗原に対して抗原特異性を有する、２つのＴＣＲをコードするＲＮＡを、がん患者から単離した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）から単離した。逆転写を介してＲＮＡからｃＤＮＡを増幅した後、ｃＤＮＡコピーのＰＣＲ増幅を行った。ｍＴＣＲコンストラクト（ＴＣＲごとに１つ）は、Ｄｅｎｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２４（６）：１０７８−８９（２０１６）に記載の通り調製した。簡単に述べると、ヒトＴＣＲ−α−Ｖ−Ｊ領域をマウスＴＣＲ−α定常鎖に融合し、ヒトＴＣＲ−β−Ｖ−Ｄ−Ｊ領域をマウスＴＣＲ−β定常鎖に融合し、合成リンカー配列をアルファ（α）及びベータ（β）鎖間に配置させた（図１Ａ）。両方のｍＴＣＲコンストラクトを合成し、ＳＬＥＥＰＩＮＧ  ＢＥＡＵＴＹ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＳＢＴＳ））プラスミド（Ｉｎｔｒｅｘｏｎ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）及びＺｉｏｐｈａｒｍ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から入手可能）中にクローン化した（Ｄｅｎｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，１０（６）：ｅ０１２８１５１（２０１５）及びＳｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，７１（１０）：３５１６−２７（２０１１）に記載）。
【００６６】
本発明の実施形態による、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をｍＴＣＲとエレクトロポレーションし、ｍＴＣＲ＋Ｔ細胞の数を選択的に増幅する方法を示す模式図を図１Ｂに示す。図１Ｂに示すように、ＡＭＡＸＡ  ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ  ＩＩ装置及びキット（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、２つのｍＴＣＲのそれぞれの１つをコードするＳＢＴＳプラスミド（１５μｇ）及びトランスポザーゼをコードするＳＢＴＳプラスミド（５μｇ）を、それぞれ自己ＰＢＭＣ（２×１０７）にエレクトロポレーションした。２４時間後、ｍＴＣＲを発現する細胞とｍＴＣＲを発現しない細胞を含む、エレクトロポレーションした細胞の混合集団を得た。
【００６７】
図１Ｂに示す通り、混合集団において、マウスＴＣＲ定常領域を発現するＴ細胞（ｍＴＣＲ＋Ｔ細胞）の数を選択的に増幅した。ｍＴＣＲ＋Ｔ細胞を選択的に増幅するために、エレクトロポレーションした細胞の混合集団（２×１０６）からの細胞を、（ｉ）Ｈ５７抗体（Ａｂ）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）又はＯＫＴ３抗体、（ｉｉ）ＩＬ−２、及び（ｉｉｉ）ＩＬ−２１の存在下で放射線照射した末梢血リンパ球（ＰＢＬ）（２×１０７）と共培養した。
【００６８】
ｍＴＣＲ＋Ｔ細胞の数を選択的に増幅した後、細胞を（ｉ）抗ＣＤ３  Ａｂ、抗ＣＤ４  Ａｂ、又は抗ＣＤ８  Ａｂ及び（ｉｉ）抗ｍＴＣＲβ抗体（Ｈ５７）で染色した。エレクトロポレーション緩衝液のみ（モック）（ＴＣＲなし）とエレクトロポレーションしたＰＢＭＣが、ネガティブコントロールとして機能した。
【００６９】
染色した細胞を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって計数した。結果を図２に示す。図２に示す通り、Ｈ５７  Ａｂによる選択的増幅により、ＯＫＴ３と比較して、抗変異ＥＲＢＢ２  ｍＴＣＲ＋Ｔ細胞の数と抗変異ＥＲＢＢ２ＩＰ  ｍＴＣＲ＋Ｔ細胞の数が増加した。
【００７０】
実施例２
本実施例は、より高い濃度のＨ５７  Ａｂでより多数のｍＴＣＲ＋が得られることを実証する。
【００７１】
実施例１に記載の通り、ＰＢＭＣを抗ＥＲＢＢ２ＩＰ  ｍＴＣＲ又は抗ＥＲＢＢ２  ｍＴＣＲコンストラクトとエレクトロポレーションした。混合集団中のマウスＴＣＲ定常領域を発現するＴ細胞（ｍＴＣＲ＋Ｔ細胞）の数を、さまざまな濃度のＨ５７  Ａｂ（０ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、又は５００ｎｇ／ｍＬ）で、実施例１に記載の通り、選択的に増幅した。
【００７２】
ｍＴＣＲ＋Ｔ細胞の数の選択的増殖後に、細胞を、（ｉ）抗ＣＤ３  Ａｂ、抗ＣＤ４  Ａｂ、又は抗ＣＤ８  Ａｂ及び（ｉｉ）抗ｍＴＣＲβ抗体（Ｈ５７）で染色した。エレクトロポレーション緩衝液のみ（モック）（ＴＣＲなし）とエレクトロポレーションしたＰＢＭＣが、ネガティブコントロールとして機能した。Ｈ５７  Ａｂでの選択的増殖の代わりにＯＫＴ３  Ａｂ（３０ｎｇ／ｍＬ）による標準ＲＥＰを経たエレクトロポレーションした細胞が、非特異的Ｔ細胞増殖のポジティブコントロールとして機能した。
【００７３】
染色した細胞をＦＡＣＳにより計数した。結果を図３Ａ及び３Ｂに示す。図３Ａ及び３Ｂに示す通り、より高濃度のＨ５７  Ａｂにより、より多数の抗変異ＥＲＢＢ２  ｍＴＣＲ＋及び抗変異ＥＲＢＢ２ＩＰ  ｍＴＣＲ＋細胞を得た。
【００７４】
実施例３
本実施例は、ｍＴＣＲを発現するＴ細胞の数を選択的に増幅する方法を実証する。
【００７５】
がん特異的ｐ５３−Ｙ２２０Ｃネオ抗原に対する抗原特異性を有するＴＣＲをコードするＲＮＡを、卵巣がん患者４１４９から単離した腫瘍浸潤リンパ球から単離した。ｃＤＮＡを、ＲＮＡから逆転写により増幅し、その後、ｃＤＮＡコピーをＰＣＲ増幅した。ｍＴＣＲコンストラクトを、ヒトＴＣＲ−α−Ｖ−Ｊ領域をマウスＴＣＲ−α定常鎖に融合させ、ヒトＴＣＲ−β−Ｖ−Ｄ−Ｊ領域をマウスＴＣＲ−β定常鎖に融合させ、合成リンカー配列をα及びβ鎖間に位置させることにより調製した（図４Ｂ）。ｍＴＣＲコンストラクトを合成し、ＳＢＴＳプラスミドにクローニングした。  
【００７６】
本発明の実施形態による、ＰＢＭＣをｍＴＣＲとエレクトロポレーションし、ｍＴＣＲ＋Ｔ細胞の数を選択的に増幅する方法を示す模式図を、図４Ａに示す。図４Ａに示す通り、患者から自己のＰＢＭＣを得て、凍結保存した。凍結保存したＰＢＭＣ（２００ｇ）を２０〜２３℃で１０分間解凍した。ＰＢＭＣを５０／５０培地（３×１０６細胞／ｍＬ）に入れ、３７℃で２時間培養した。ｍＴＣＲをコードするＳＢＴＳプラスミド及びトランスポザーゼをコードするＳＢＴＳプラスミドを、ＡＭＡＸＡ  ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ  ＩＩ装置及びキット（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて自己ＰＢＭＣにエレクトロポレーションした。ヒトＴ細胞ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ溶液（３００μＬ）には、ｍＴＣＲをコードするＳＢＴＳプラスミド（４５μｇ）及びトランスポザーゼをコードするＳＢＴＳプラスミド（１５μｇ）が含まれていた。このヒトＴ細胞ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ溶液をキュベットに加えた（１００μＬ／キュベット）。エレクトロポレーションした細胞をウェル（５ｍＬ  ５０／５０培地／ウェル）内で３７℃で一晩培養した。１８時間超後、５０Ｕ／ｍＬベンゾナーゼを３７℃で１時間インキュベートした。ｍＴＣＲを発現する細胞とｍＴＣＲを発現しない細胞を含む、エレクトロポレーションした細胞の混合集団を得た。
【００７７】
図４Ａに示す通り、３７℃で１８時間超の培養後、混合集団中でマウスＴＣＲ定常領域を発現するＴ細胞（ｍＴＣＲ＋Ｔ細胞）の数が選択的に増幅された。ｍＴＣＲ＋Ｔ細胞を選択的に増幅するために、Ｈ５７  Ａｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）（２５０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−２（５０ＩＵ／ｍＬ）、及びＩＬ−２１（３０ｎｇ／ｍＬ）の存在下で、ｍＴＣＲ＋Ｔ細胞（５×１０５）を放射線照射した末梢血リンパ球（ＰＢＬ）（１×１０８）と共培養した。
【００７８】
ｍＴＣＲ＋Ｔ細胞の数の選択的増幅後に、ｍＴＣＲ＋Ｔ細胞の数を、標準的な急速増幅プロトコル（ＲＥＰ）を用いて更に増幅した（実施例５を参照）。標準的なＲＥＰにおいては、選択的に増幅したｍＴＣＲ＋Ｔ細胞（５×１０６）を、放射線照射したＰＢＬ（５×１０８）、ＯＫＴ３抗体（３０ｎｇ／ｍＬ）、及びＩＬ−２（３０００ＩＵ／ｍＬ）と共培養した。ＯＫＴ３抗体は、ヒトＣＤ３複合体内のイプシロンサブユニットにおけるエピトープと反応する。
【００７９】
比較例１
本例は、選択的増幅がないときにｍＴＣＲを発現するエレクトロポレーションした細胞の数を実証する。
【００８０】
自己ＰＢＭＣを、実施例４に記載の通り、ｍＴＣＲをコードするＳＢＴＳプラスミド及びトランスポザーゼをコードするＳＢＴＳプラスミドとエレクトロポレーションした。ネガティブコントロールは、非トランスフェクション自己ＰＢＭＣ及びエレクトロポレーション緩衝液のみ（モック）とエレクトロポレーションしたＰＢＭＣを含んだ。エレクトロポレーションした細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ｍＴＣＲβ抗体（Ｈ５７）で染色した。未染色非トランスフェクション自己ＰＢＭＣが、更に別のネガティブコントロールとして機能した。
【００８１】
エレクトロポレーションの翌日に、染色した細胞を、選択的増幅を経ることなく、実施例４に記載の通りＦＡＣＳにより計数した。ＦＡＣＳにより、リンパ球／ＰＩ（ｎｅｇ）細胞にゲートした。ＰＩは死んだ細胞のための染色である。ＰＩ（ｎｅｇ）細胞は生細胞である。
【００８２】
結果を図５Ａ〜５Ｄに示す。図５Ａ〜５Ｄに示す通り、全集団中の若干数の細胞（全細胞の約５％）が、選択的増殖を経ることなく、エレクトロポレーション後にｍＴＣＲを発現した。
【００８３】
実施例４
本実施例は、エレクトロポレーションしたＴ細胞をＨ５７抗体により選択的に増幅することによって、混合集団におけるマウス定常領域を含むＴＣＲを発現する細胞の数が選択的に増加することを実証する。
【００８４】
自己ＰＢＭＣを、実施例３に記載の通り、ｍＴＣＲをコードするＳＢＴＳプラスミド及びトランスポザーゼをコードするＳＢＴＳプラスミドとエレクトロポレーションした。様々な開始数のｍＴＣＲ＋Ｔ細胞（１×１０５、５×１０５、又は１０×１０５）を、さまざまな濃度のＨ５７  Ａｂ（２５０ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、又は７５０ｎｇ／ｍＬ）を用いて、実施例３に記載の通り選択的に増幅した。本実験では、初期頻度に基づいて、インプットを５×１０５ｍＴＣＲ＋Ｔ細胞に揃えた。例えば、５％ｍＴＣＲ発現は、合計１×１０７個の細胞を増幅プロトコルに移行し、５×１０５ｍＴＣＲ＋Ｔ細胞を達成することを意味した。エレクトロポレーション緩衝液のみ（モック）とエレクトロポレーションしたＰＢＭＣが、ネガティブコントロールとして機能した。エレクトロポレーションした、選択的に増幅した細胞を、抗ＣＤ３抗体及び抗ｍＴＣＲβ抗体（Ｈ５７）で染色した。
【００８５】
染色した細胞を、ＦＡＣＳにより計数した。ＦＡＣＳにより、リンパ球／ＰＩ（ｎｅｇ）細胞にゲートした。結果を図６と表１〜２に示す。図６及び表１〜２に示す通り、Ｈ５７  Ａｂによる選択的増幅により、集団内のｍＴＣＲ＋Ｔ細胞の数が増加した。
【００８６】
【表１−１】
2020535832.tif 000002
【００８７】
【表１−２】
2020535832.tif 000003
【００８８】
【表２】
2020535832.tif 000004
【００８９】
実施例５
本実施例は、Ｈ５７  Ａｂによる第１の増幅後の、ＯＫＴ３  Ａｂによる第２の増幅がｍＴＣＲ＋細胞の数を更に増加させることを実証する。
【００９０】
実施例４に記載の通り、既に、（ｉ）初期数５×１０５のｍＴＣＲ＋Ｔ細胞で、（ｉｉ）２５０ｎｇ／ｍＬのＨ５７  Ａｂによる選択的増殖（本実施例では、「１回目の増幅」と称する）を経た、エレクトロポレーションした細胞を、ＧＲＥＸフラスコ（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｗｏｌｆ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｓｔ  Ｐａｕｌ，ＭＮ）中で、（ｉ）実施例３に記載の通りの、ＯＫＴ３  Ａｂによる標準ＲＥＰを用いて、又は（ｉｉ）実施例４に記載の通り、Ｈ５７  Ａｂを用いて、更に増幅した（本実施例では、「２回目の増幅」と称する）。
【００９１】
２回目の増幅後、細胞を抗ＣＤ３抗体及び抗ｍＴＣＲβ抗体（Ｈ５７）で染色した。染色した細胞をＦＡＣＳにより計数した。ＦＡＣＳにより、リンパ球／ＰＩ（ｎｅｇ）細胞にゲートした。結果を図７に示す。
【００９２】
図７に示す通り、Ｈ５７  Ａｂによる１回目の増幅後の、ＯＫＴ３  Ａｂでの２回目の増幅により、ｍＴＣＲ＋細胞の数が更に増加する。ＯＫＴ３  Ａｂによる２回目の増幅により、Ｈ５７  Ａｂによる２回目の増幅と比較して、ｍＴＣＲ＋細胞の数が大幅に増加した。
【００９３】
生細胞のパーセンテージ、細胞の総数、２回目の増殖により達成した細胞の数の変化倍数、ｍＴＣＲ＋細胞の数、及び２回目の増殖により達成したｍＴＣＲ＋細胞の変化倍数も、ＯＫＴ３  Ａｂ及びＨ５７  Ａｂによる２回目の増幅を経た細胞で測定し、比較した。結果を表３に示す。表３に示す通り、Ｈ５７  Ａｂによる１回目の増幅後の、ＯＫＴ３  Ａｂによる２回目の増幅によって、ｍＴＣＲ＋細胞の数が更に増加する。ＯＫＴ３  Ａｂによる２回目の増幅によって、Ｈ５７  Ａｂによる２回目の増幅と比較して、ｍＴＣＲ＋細胞の数が大幅に増加した。
【００９４】
【表３】
2020535832.tif 000005
【００９５】
実施例６
本実施例は、ｍＴＣＲを発現するＴ細胞の数を選択的に増幅することにより、ｍＴＣＲを発現する細胞の数が増加することを実証する。
【００９６】
ＰＢＬを、標準的な方法を用いて、０日目に、マウスＦ５（ｍＦ５）抗ＭＡＲＴ−１  ＴＣＲをコードするガンマレトロウイルスベクターで形質導入した。１０日目に、形質導入した細胞を、二回目の増幅用に調製した。増幅を、（ｉ）さまざまな濃度のＩＬ−２、（ｉｉ）さまざまな比率のフィーダー細胞、及び（ｉｉｉ）表４に記載の通りのＯＫＴ３  Ａｂ（３０ｎｇ／ｍｌ）又はＨ５７  Ａｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）のいずれかを用いて行った。
【００９７】
【表４】
2020535832.tif 000006
【００９８】
図８Ａ〜８ＢにおけるＦＡＣＳプロットは、非形質導入細胞及びＯＫＴ３  Ａｂ又はＨ５７  Ａｂによる増幅前の、ＣＤ８及びマウスＦ５（ｍＦ５）抗ＭＡＲＴ−１  ＴＣＲを発現する形質導入細胞（プレ−急速増幅プロトコル（ＲＥＰ））のパーセンテージを示す。増幅前の形質導入効率は８３．９％であった。この形質導入した集団を細胞培養培地で希釈して、増幅前に約５％のマウスＴＣＲベータ鎖陽性（ｍＴＣＲｂ＋）細胞（図８Ｃ）にした。
【００９９】
図８Ｃの５％ｍＴＣＲｂ＋開始集団における細胞数の、（ｉ）ＯＫＴ３（５０ｎｇ／ｍｌ）又はＨ５７（５０ｎｇ／ｍｌ）による、（ｉｉ）５００又は５０ＣＵ／ＩＬ−２のいずれかにおける増幅後の結果を、図９及び１０Ａ〜１０Ｂに示す。細胞の数はＯＫＴ３により約１５００〜２３００倍に増幅したが、ｍＴＣＲｂ＋細胞集団中の細胞の数の選択的な増幅は見られなかった。或いは、Ｈ５７により増幅する細胞の数は少ない（５００〜８００倍）が、それらはｍＴＣＲｂ＋細胞のパーセンテージにおいて４〜８倍の増加を示した。全体として、増殖におけるＨ５７の使用により、より多くのｍＴＣＲｂ＋細胞がもたらされた。
【０１００】
実施例７
本実施例は、ｍＴＣＲを発現するＴ細胞の数を選択的に増幅することにより、ｍＴＣＲを発現する細胞の数が増加することを実証する。
【０１０１】
ＰＢＬを、実施例６に記載の通り、マウスＦ５  ＴＣＲをコードするレトロウイルスベクターで形質導入した。Ｈ５７又はＯＫＴ３による増幅前の形質導入細胞（開始細胞集団）によるＣＤ８及びｍＴＣＲｂの発現を、図１１Ａ〜１１Ｃに示す。開始ｍＴＣＲ＋集団は、元々６４．７％のｍＴＣＲｂ＋細胞を有していた（図１１Ｂ）。開始ｍＴＣＲ＋集団を、４倍に希釈して１４％ｍＴＣＲｂ＋にした（図１１Ｃ）。
【０１０２】
形質導入細胞及びＵＴ細胞の数を、（ｉ）ＩＬ−２なし、５０ＣＵ  ＩＬ−２、又は５００ＣＵ  ＩＬ−２で、（ｉｉ）ＯＫＴ３  Ａｂ又はＨ５７  Ａｂを用いて増幅した。結果を図１２Ａ〜１２Ｅ及び１３Ａ〜１３Ｂに示す。
【０１０３】
増幅後、ＯＫＴ３集団は、ほぼ等しいパーセンテージ（５％）のＣＤ８＋及びＣＤ８−形質導入細胞を有するｍＴＣＲｂ＋細胞集団全体の選択的増幅を示さなかった。比較すると、両方のＨ５７増幅集団（それぞれ５００又は５０ＣＵ／ＩＬ−２）は、それぞれ３１．２％及び５９．１％の選択的ｍＴＣＲｂ＋増幅を示した。５０ＣＵ／ＩＬ−２を用いたＨ５７増幅は、５００ＣＵ／ＩＬ−２中で増殖した細胞と比較して、ほぼ２倍高いｍＴＣＲｂ＋細胞の増幅を示した。
【０１０４】
図１３〜１３Ｂに示すように、ＯＫＴ３又はＨ５７により増幅した細胞の数は、５００ＣＵ／ＩＬ−２の存在下で約１４００〜１６００倍増幅された。しかし、５０ＣＵ／ＩＬ−２を加えたＨ５７増幅により、約３５００倍（試験した他の条件の２倍超）に増幅された。
【０１０５】
実施例８
本実施例は、ｍＴＣＲを発現するＴ細胞の数を選択的に増幅することにより、ｍＴＣＲを発現する細胞の数が増加することを実証する。
【０１０６】
ＰＢＬを、実施例６に記載の通り、マウスＦ５  ＴＣＲをコードするレトロウイルスベクターで形質導入した。Ｈ５７又はＯＫＴ３による増幅前の形質導入細胞（プレ−ＲＥＰ）によるＣＤ８及びｍＴＣＲｂの発現を、図１４Ａ〜１４Ｆに示す。
【０１０７】
形質導入した細胞の数を、（ｉ）５０ＣＵ  ＩＬ−２及び（ｉｉ）ＯＫＴ３  Ａｂ（３０ｎｇ／ｍｌ）又はＨ５７  Ａｂ（５００、５０、１０、５ｎｇ／ｍｌ）を用いて増幅した。結果を図１４Ａ〜１４Ｆ及び図１５に示す。図１４Ａ〜１４Ｆ及び図１５に示す通り、Ｈ５７抗体の濃度は、選択的ｍＴＣＲｂ＋増幅に何ら悪影響を与えることなく、力価を１０倍低減できる。全体的な増幅倍数も、試験したすべての群間で同様であった。Ｈ５７による増幅後のＣＤ８−細胞の優先的な増殖も観察された。
【０１０８】
実施例９
本実施例は、実施例８におけるＨ５７による第１回目の増幅を経た細胞の数の、ＯＫＴ３又はＨ５７による第２回目の増幅による更なる増幅を示す。
【０１０９】
実施例８においてＨ５７  Ａｂによる増幅を経たｍＴＣＲ形質導入細胞を、ＯＫＴ３又はＨ５７による２回目の増幅に供して、ｍＴＣＲｂ＋細胞の更なる濃縮が達成し得るかどうかを決定した。増幅条件は、実施例８に記載のものと同一であった。
【０１１０】
結果を図１６Ａ〜１６Ｅ及び図１７に示す。ＯＫＴ３による２回目の増幅によっては、ｍＴＣＲｂ＋細胞に関しては更に濃縮しなかったが、細胞の数は、更に１０００倍増幅した。Ｈ５７による２回目の増幅によっては、ｍＴＣＲｂ＋細胞については何ら更なる濃縮は加えられず、５００及び５０ｎｇ／ｍｌでｍＴＣＲｂ＋細胞におけるわずかな減少がもたらされた可能性がある。Ｈ５７による２回目の増幅を経た集団の増幅倍数は低く、２００〜５００倍の範囲であった。
【０１１１】
実施例１０
本実施例は、エレクトロポレーションの翌日に、変異特異的ＴＣＲがトランスポゾンによって発現することを実証する。
【０１１２】
図４Ａに示す通り、自己ＰＢＭＣを、健康なドナー１及び健康なドナー２から得て、凍結保存した。凍結保存したＰＢＭＣを解凍し、２０〜２３℃で１０分間遠心分離した（２００ｇ）。ＰＢＭＣを５０／５０培地に入れ（３×１０６細胞／ｍＬ）、３７℃で２時間培養した。２つのｍＴＣＲの一方をコードするＳＢＴＳプラスミド及びトランスポザーゼをコードするＳＢＴＳプラスミドを、ＡＭＡＸＡ  ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ  ＩＩ装置及びキット（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて自己ＰＢＭＣにエレクトロポレーションした。２つのｍＴＣＲは、（１）４１４９−ＨＵＷＥ１−ＴＣＲ１（クラスＩ）及び（２）４１４９−ＴＰ５３−ＴＣＲａ２ｂ２（クラスＩＩ）であった。ヒトＴ細胞ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ溶液（３００μＬ）には、ｍＴＣＲをコードするＳＢＴＳプラスミド（４５μｇ）及びトランスポザーゼをコードするＳＢＴＳプラスミド（１５μｇ）が含まれていた。２時間の休止期間後、非接着性のＰＢＭＣを２０〜２３℃で１０分間遠心分離（２００ｇ）することにより回収し、培地を除去して、ＳＢＴＳプラスミドを含むヒトＴ細胞ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ溶液に置き換えた（１キュベットあたり１００μＬを加えた）。エレクトロポレーションした細胞をウェル（５ｍＬ  ５０／５０培地／ウェル）内で３７℃で一晩培養した。＞１８時間後、５０Ｕ／ｍＬベンゾナーゼを３７℃で１時間インキュベートした。ｍＴＣＲを発現する細胞とｍＴＣＲを発現しない細胞を含む、エレクトロポレーションした細胞の混合集団を得た。
【０１１３】
エレクトロポレーションの翌日、エレクトロポレーションした細胞を、（ｉ）抗ＣＤ３  Ａｂ及び（ｉｉ）抗ｍＴＣＲβ  Ａｂで染色した。未染色ＰＢＭＣ、非トランスフェクションＰＢＭＣ、及びエレクトロポレーション緩衝液のみ（モック）（ＴＣＲなし）とエレクトロポレーションしたＰＢＭＣが、ネガティブコントロールとして機能した。エレクトロポレーションした細胞によるＣＤ３及びｍＴＣＲの発現をＦＡＣＳにより測定した（ゲート：リンパ球＼生細胞（ＰＩ−））。結果を図１８に示す。図１８に示す通り、エレクトロポレーションの翌日に、トランスポゾンによって変異特異的ＴＣＲが発現した。
【０１１４】
実施例１１
本実施例は、Ｈ５７による１回の増幅が、ｍＴＣＲ＋Ｔ細胞の数の選択的増殖をもたらすことを実証する。
【０１１５】
ドナー１及び２からのＰＢＭＣを実施例１０に記載の通りエレクトロポレーションした。図４Ａに示す通り、３７℃で１８時間超の培養後、混合集団中の、マウスＴＣＲ定常領域を発現するＴ細胞（ｍＴＣＲ＋Ｔ細胞）の数を選択的に増幅した。ｍＴＣＲ＋Ｔ細胞の数を選択的に増幅するために、ｍＴＣＲ＋Ｔ細胞（５×１０５）を、放射線照射したＰＢＬ（１×１０８）と、Ｈ５７  Ａｂ（Ｍａｉｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＭＥ）（２５０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−２（５０ＩＵ／ｍＬ）、及びＩＬ−２１（３０ｎｇ／ｍＬ）の存在下で共培養した。
【０１１６】
選択的に増幅した細胞を染色し、実施例１０に記載の通りＦＡＣＳにより評価した。未染色のＰＢＭＣ（図１９Ａ）及びエレクトロポレーション緩衝液のみ（モック）（ＴＣＲなし）とエレクトロポレーションしたＰＢＭＣ（図１９Ｂ）がネガティブコントロールとして機能した。結果を図１９Ａ〜１９Ｂに示す。図１９Ａ〜１９Ｂにおいては、細胞数を、１つのＴ１７５フラスコからの、Ｈ５７による１回の増幅後の１４日目に決定した。図１９Ａ〜１９Ｂにす通り、Ｈ５７による１回の増幅により、ｍＴＣＲ＋Ｔ細胞の数の選択的増殖がもたらされた。
【０１１７】
実施例１２
本実施例は、ガス透過性フラスコ中で、ＯＫＴ３による第２回目の増殖を伴う、Ｈ５７による第１回目の増殖を経た細胞の数の更なる増幅が、ＴＣＲ転移Ｔ細胞の数の大幅な増幅をもたらすことを実証する。
【０１１８】
ドナー１及び２からのＰＢＭＣを実施例１０に記載の通りエレクトロポレーションした。転移細胞の数を、実施例１１に記載の通り、Ｈ５７抗体により選択的に増殖させた。ｍＴＣＲ＋Ｔ細胞の数の選択的増幅後に、ｍＴＣＲ＋Ｔ細胞の数を、標準のＲＥＰを用いて更に増幅した。標準的なＲＥＰにおいては、選択的に増幅したｍＴＣＲ＋Ｔ細胞（５×１０６）を、放射線照射したＰＢＬ（５×１０８）、ＯＫＴ３抗体（３０ｎｇ／ｍＬ）、及びＩＬ−２（３０００ＩＵ／ｍＬ）と共培養した。
【０１１９】
選択的に増幅した細胞を、実施例１０に記載の通り染色及びＦＡＣＳにより評価した。未染色ＰＢＭＣ（図２０Ａ）及びエレクトロポレーション緩衝液のみ（モック）（ＴＣＲなし）とエレクトロポレーションしたＰＢＭＣ（図２０Ｂ）がネガティブコントロールとして機能した。１つのＧＲＥＸ−１００ガス透過性フラスコ（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｗｏｌｆ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）からの、標準ＲＥＰ後１４日目の細胞数を表５に示す。Ｈ５７による選択的増幅後１４日目のｍＴＣＲ＋細胞のパーセンテージを表６に示す。
【０１２０】
【表５】
2020535832.tif 000007
【０１２１】
【表６】
2020535832.tif 000008
【０１２２】
結果を図２０Ａ〜２０Ｂに示す。図２０Ａ〜２０Ｂに示す通り、ガス透過性フラスコ中でＯＫＴ３による第２回目の増幅を伴うＨ５７による、第１回目の増殖を経た細胞の数の更なる増幅により、ＴＣＲ転移Ｔ細胞の数の大幅な増幅がもたらされた。
【０１２３】
実施例１３
本実施例は、Ｈ５７抗体により選択的に増幅したＴＣＲ転移Ｔ細胞が、同種変異ネオ抗原に特異的であることを実証する。
【０１２４】
ドナー１及び２からのＰＢＭＣを、実施例１０に記載の通りエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションした細胞の数を、実施例１１に記載の通り、Ｈ５７抗体により選択的に増幅した。４１４９− ＨＵＷＥ１−ＴＣＲ１は変異ＨＵＷＥ１を認識する。４１４９−ＴＰ５３−ＴＣＲａ２ｂ２は変異ＴＰ５３（Ｙ２２０Ｃ）を認識する。
【０１２５】
未成熟ＤＣを、野生型（ＷＴ）ＨＵＷＥ１ペプチド、変異ＨＵＷＥ１ペプチド、ＷＴ  ＴＰ５３、又は変異ＴＰ５３でパルスした。ＨＵＷＥ１ペプチドは１μｇ／ｍＬでパルスした。ＴＰ５３ペプチドは１０ｎｇ／ｍＬでパルスした。５×１０４個のペプチドパルス未成熟ＤＣと１０５個のＴ細胞の共培養物を３７℃で一晩インキュベートした。ＤＣを単独で培養し、ＤＭＳＯでパルスしたＤＣがコントロールとして機能した。ＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）により測定した。
【０１２６】
結果を図２１Ａ〜２１Ｄに示す。図２１Ａ〜２１Ｄに示す通り、Ｈ５７抗体により選択的に増幅したＴＣＲ転移Ｔ細胞は、同種変異ネオ抗原を認識した。
【０１２７】
実施例１４
本実施例は、ｍＴＣＲを発現するＴ細胞の数を選択的に増幅する方法を実証する。
【０１２８】
ＰＢＭＣをｍＴＣＲとエレクトロポレーションし、本発明の実施形態に従ってｍＴＣＲ＋Ｔ細胞の数を選択的に増幅する方法を説明する模式図を図２２に示す。図２２に示す通り、自己ＰＢＭＣを患者から得て、凍結保存した。一部のＰＢＭＣを、ＬＤカラムによりＣＤ４＋細胞を枯渇させた。凍結保存したＰＢＭＣを完全培地（ＣＭ）中で解凍し、１７５ｇで、約２２℃で１０分間遠心分離した。細胞をハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中で洗浄し、計数した。細胞数は６×１０７であった。
【０１２９】
図２２に示す通り、ｍＴＣＲ（４１４９−ＨＵＷＥ１−ＴＣＲ１又は４１４９−ＴＰ５３−ＴＣＲａ２ｂ２）をコードするＳＢＴＳプラスミド及びトランスポザーゼをコードするＳＢＴＳプラスミドを、ＡＭＡＸＡ  ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ  ＩＩ装置及びキット（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて自己ＰＢＭＣにエレクトロポレーションした。ヒトＴ細胞ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ溶液（３００μＬ）には、ｍＴＣＲをコードするＳＢＴＳプラスミド（４５μｇ）及びトランスポザーゼをコードするＳＢＴＳプラスミド（１５μｇ）が含まれていた。このヒトＴ細胞ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ溶液を細胞に加え、次いで細胞とＤＮＡとの混合物をキュベットに加えた（キュベットあたり１００μＬ）。
【０１３０】
図２２に示す通り、エレクトロポレーションした細胞を、ウェル（ウェルあたりＣＭ（５ｍＬ）、ＩＬ−２（５０ＩＵ／ｍＬ）、及びＩＬ−２１（３０ｎｇ／ｍＬ））中で３７℃で一晩培養した。＞１８時間後、５０Ｕ／ｍＬベンゾナーゼを３７℃で１時間インキュベートした。細胞を採取し、染色し、ｍＴＣＲ発現をＦＡＣＳにより測定した。ｍＴＣＲを発現する細胞（ｍＴＣＲ＋＞１％）及びｍＴＣＲを発現しない細胞を含む、エレクトロポレーションした細胞の混合集団を得た。
【０１３１】
図２２に示す通り、３７℃で１８時間超の培養後、混合集団においてマウスＴＣＲ定常領域を発現するＴ細胞（ｍＴＣＲ＋Ｔ細胞）の数を選択的に増幅した。ｍＴＣＲ＋Ｔ細胞を選択的に増幅するために、エレクトロポレーションした細胞（５×１０６）を、放射線照射したＰＢＬ（１×１０８）とＨ５７  Ａｂ（Ｍａｉｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＭＥ）（２５０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−２（５０ＩＵ／ｍＬ）、及びＩＬ−２１（３０ｎｇ／ｍＬ）の存在下で共培養した。
【０１３２】
図２２に示す通り、細胞を１３日間培養した。この１３日の期間の間、２〜３日ごとにＩＬ−２（５０ＩＵ／ｍＬ）及びＩＬ−２１（３０ｎｇ／ｍＬ）を含む５０／５０ＣＭを細胞に供給した。
【０１３３】
図２２に示す通り、ｍＴＣＲ＋細胞を、ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）において抗ビオチン抗体及びビオチン化Ｈ５７抗体とコンジュゲートしたマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と細胞を接触させることにより更に濃縮した。
【０１３４】
Ｈ５７結合ビーズによるｍＴＣＲ＋細胞の濃縮後に、ｍＴＣＲ＋Ｔ細胞の数を、標準的なＲＥＰを用いて更に増幅した。標準的なＲＥＰにおいては、選択的に増幅したｍＴＣＲ＋Ｔ細胞（５×１０６）を、放射線照射したＰＢＬ（５×１０８）、ＯＫＴ３抗体（３０ｎｇ／ｍＬ）、及びＩＬ−２（３０００ＩＵ／ｍＬ）と共培養した。
【０１３５】
辿ったスケジュールは以下の通りであった：
・０日目＝エレクトロポレーション（２×１０７の総ＰＢＭＣ（ＴＰ５３−ＴＣＲ）又はＣＤ４を枯渇したＰＭＢＣ（ＨＵＷＥ１−ＴＣＲ））
・１日目＝Ｈ５７  ＲＥＰ（Ｔ１７５フラスコ；５×１０６細胞、１×１０８の放射線照射したＰＢＭＣ、２５０ｎｇ／ｍＬ  Ｈ５７、５０ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２、３０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−２１）
・１４日目＝Ｈ５７ビーズ濃縮（Ｈ５７−ビオチンｍＡｂ（ＧＭＰ）、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳビオチンビーズ、ＬＳカラム）
・１５日目＝ＯＫＴ３  ＲＥＰ（ＧＲＥＸ−１００フラスコ；５ｅ６細胞、５ｅ８の放射線照射したＰＢＭＣ、３０ｎｇ／ｍＬ  ＯＫＴ３、３０００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２）
・２８日目＝採取、表現型、共培養。
【０１３６】
実施例１５
本実施例は、実施例１４に記載の方法中の４時点で得た細胞の総数及びＣＤ３＋ｍＴＣＲ＋細胞のパーセンテージを実例で示す。
【０１３７】
実施例１４に記載の方法を行った。１つのキュベット中の細胞の総数及び１つのキュベット中のＣＤ３＋ｍＴＣＲ＋細胞のパーセンテージを、実施例１４に記載した方法中の４時点：エレクトロポレーション後、Ｈ５７による選択的増幅後、Ｈ５７結合ビーズによる濃縮後、及びＯＫＴ３による標準のＲＥＰ後、に測定した。
【０１３８】
細胞を、エレクトロポレーション及びＨ５７結合ビーズ濃縮の後に残した。計数を、理論上の収率ではなく実際の収率を反映するように調整した。
【０１３９】
結果を図２３Ａ（細胞の総数）及び図２３Ｂ（ＣＤ３＋ｍＴＣＲ＋細胞のパーセンテージ）に示す。
【０１４０】
実施例１６
本実施例は、実施例１４に記載の方法の２８日目（ＯＫＴ３  ＲＥＰ後）に測定したｍＴＣＲβ＋細胞のパーセンテージを実例で示す。
【０１４１】
実施例１４に記載の方法を行った。ｍＴＣＲβ＋細胞のパーセンテージを２８日目（ＯＫＴ３  ＲＥＰ後）にＦＡＣＳで測定した。結果を図２３Ｃ〜２３Ｄに示す。エレクトロポレーション緩衝液のみ（モック）（ＴＣＲなし）とエレクトロポレーションしたＰＢＭＣが、図２３Ｃ〜２３Ｄにおいてネガティブコントロールとして機能した。
【０１４２】
ＣＤ４＋ｍＴＣＲβ＋又はＣＤ８＋ｍＴＣＲβ＋細胞のパーセンテージを、２８日目（ＯＫＴ３  ＲＥＰ後）にＦＡＣＳにより測定した。結果を図２３Ｅに示す。
【０１４３】
実施例１７
本実施例は、実施例１４に記載の通りの細胞数の増幅前（１日目）及び後（２８日目）の細胞の記憶細胞表現型を実例で示す。
【０１４４】
実施例１４に記載の方法を行った。記憶表現型マーカーの発現を、細胞の数の増幅前（１日目）又は後（２８日目）に測定した。結果を図２４Ａ〜２４Ｄに示す。
【０１４５】
実施例１８
本実施例は、実施例１４に記載通りの細胞数の増幅後の、Ｔ細胞の特異性を実証する。
【０１４６】
実施例１４に記載の方法を行った。未成熟ＤＣに、１０、１、又は０．１μｇ／ｍＬの濃度のＷＴ  ＨＵＷＥ１ペプチド、変異ＨＵＷＥ１ペプチド、ＷＴ  ＴＰ５３ペプチド、又は変異ＴＰ５３ペプチドをパルスした。ペプチドパルス未成熟ＤＣと転移Ｔ細胞の共培養物を３７℃で一晩インキュベートした。ＤＭＳＯでパルスしたＤＣがコントロールとして機能した。ＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＡによって測定した。結果を図２５Ａ〜２５Ｂに示す。
【０１４７】
刊行物、特許出願及び特許を含む、本明細書中に引用した全ての参考文献は、それぞれの参考文献が参照によって組込まれることが個々に且つ具体的に示されているのと同程度及びその全体が本明細書中に記載されているのと同程度まで、参照によって本明細書中に組込まれる。
【０１４８】
本発明の説明に関して（特に、以下の特許請求の範囲に関して）、用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び「少なくとも１つの」並びに同様の指示対象の使用は、本明細書中に特記しない又は文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方をカバーすると解釈すべきである。１以上の事項の列挙の後での用語「少なくとも１つの」の使用（例えば、「Ａ及びＢのうち少なくとも１つの」）は、本明細書中に特記しない又は文脈と明らかに矛盾しない限り、列挙した事項から選択された１つの事項（Ａ若しくはＢ）又は列挙した事項のうちの２以上の任意の組合せ（Ａ及びＢ）を意味すると解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特記しない限り、オープンエンドの用語（即ち、「〜を含むがこれらに限定されない」を意味する）と解釈すべきである。本明細書中の値の範囲の記載は、本明細書中に特記しない限り、その範囲内に入る各個別の値に個々に言及する省略方法として働くことのみを意図しており、各個別の値は、それが本明細書中に個々に記載されているかのように本明細書中に組込まれる。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中に特記しない又は文脈と特に明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施できる。本明細書中に提供される任意の及び全ての例又は例示的語句（例、「等（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）の使用は、本発明をよりよく説明することのみを意図しており、特段特許請求されない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中の全ての語句は、特許請求されていない任意の要素を本発明の実施に必須のものとして示していると解釈すべきではない。
【０１４９】
発明を実施するための、発明者が知る最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が本明細書中に記載される。これらの好ましい実施形態のバリエーションは、上述の説明を読めば当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者がかかるバリエーションを適宜使用することを予期しており、本発明者らは、本明細書中に具体的に記載されたのとは異なる方法で本発明が実施されることを意図している。従って、本発明は、適用法によって許容されるとおり、本明細書中に添付した特許請求の範囲に記載される主題の全ての改変及び均等物を含む。更に、その全ての可能なバリエーションでの上記要素の任意の組合せが、本明細書中に特記しない又は特に文脈と明らかに矛盾しない限り、本発明によって包含される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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