(57)【要約】  本発明は、ＶＮＡＲを含むマルチドメイン特異的結合分子の形成に関する。腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）に結合する特異的結合ドメインをも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上の特異的抗原の同一または異なるエピトープに結合する２以上のＶＮＡＲドメインを含むマルチドメイン特異的結合分子。
【請求項２】
前記マルチドメイン特異的結合分子中の前記ＶＮＡＲドメインのうちの１以上が、モノマーＶＮＡＲと比較して、それらの標的に対するより高い結合親和性を示す、請求項１に記載のマルチドメイン特異的結合分子。
【請求項３】
前記ＶＮＡＲドメイン間にスペーサー配列をさらに含む、請求項１または２に記載のマルチドメイン特異的結合分子。
【請求項４】
前記スペーサー配列が、結合分子において示される独立した機能を有する、請求項３に記載のマルチドメイン特異的結合分子。
【請求項５】
前記スペーサー配列が、ＶＮＡＲドメインまたはその機能的断片である、請求項４に記載のマルチドメイン特異的結合分子。
【請求項６】
前記スペーサー配列が、血清アルブミンに結合するＶＮＡＲまたはその機能的断片である、請求項５に記載のマルチドメイン特異的結合分子。
【請求項７】
前記スペーサー配列が、ヒト血清アルブミンに結合するＶＮＡＲまたはその機能的断片である、請求項６に記載のマルチドメイン特異的結合分子。
【請求項８】
前記スペーサー配列が、配列番号６７、配列番号６７、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７もしくは８８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する機能的断片を有する、請求項７に記載のマルチドメイン特異的結合分子。
【請求項９】
前記スペーサー配列が、免疫グロブリンＦｃ領域に由来する、請求項４に記載のマルチドメイン特異的結合分子。
【請求項１０】
前記スペーサー配列が、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域に由来する、請求項９に記載のマルチドメイン特異的結合分子。
【請求項１１】
１以上の非ＶＮＡＲドメインをさらに含む、請求項１または２に記載のマルチドメイン特異的結合分子。
【請求項１２】
前記非ＶＮＡＲドメインが、前記ＶＮＡＲドメインのＣ末端またはＮ末端にある、請求項１１に記載のマルチドメイン特異的結合分子。
【請求項１３】
前記非ＶＮＡＲドメインの少なくとも１つが、ＴＮＦ  Ｒ１および免疫グロブリンＦｃを含む群から選択される、請求項１１または１２に記載のマルチドメイン特異的結合分子。
【請求項１４】
前記特異的抗原が、サイトカイン、成長因子、酵素、ホルモン、細胞表面結合分子(cell surface associated molecule)、細胞表面膜成分、細胞内分子、細胞外マトリックス成分、間質抗原、血清タンパク質、骨格抗原、微生物抗原、または通常は免疫特権のある位置の抗原を含む群からのものであることをさらに特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のマルチドメイン特異的結合分子。
【請求項１５】
以下のＣＤＲおよび超可変領域（ＨＶ）を含むＴＮＦ−α特異的ＶＮＡＲ結合ドメイン：
ＣＤＲ１：ＨＣＡＴＳＳまたはＮＣＧＬＳＳまたはＮＣＡＬＳＳ
ＨＶ２：ＴＮＥＥＳＩＳＫＧ
ＨＶ４：ＳＧＳＫＳまたはＥＧＳＫＳ
ＣＤＲ３：ＥＣＱＹＧＬＡＥＹＤＶまたはＳＷＴＱＮＷＲＣＳＮＳＤＶまたはＹＩＰＣＩＤＥＬＶＹＭＩＳＧＴＳＧＰＩＨＤＶ
または少なくとも６０％の配列同一性を有するその機能的変異体。
【請求項１６】
前記ＶＮＡＲ結合ドメインが、配列番号２、７もしくは１２のアミノ酸配列、または少なくとも６０％の配列同一性を有するその機能的変異体を含む、請求項１５に記載のＴＮＦ−α特異的ＶＮＡＲ結合ドメイン。
【請求項１７】
前記ＶＮＡＲドメインがヒト化または脱免疫化されている、請求項１５または１６に記載のＴＮＦ−α特異的ＶＮＡＲ結合ドメイン。
【請求項１８】
前記ＶＮＡＲドメインのうちの１以上が、配列番号２、７もしくは１２を含む群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも６０％の配列同一性を有するその機能的変異体を有する、請求項１に記載のマルチドメイン特異的結合分子。
【請求項１９】
前記ＶＮＡＲドメインのうちの２以上が、配列番号２、７もしくは１２を含む群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも６０％の配列同一性を有するその機能的変異体を有する、請求項１７に記載のマルチドメイン特異的結合分子。
【請求項２０】
前記ＶＮＡＲドメインのうちの１以上が、配列番号６５もしくは６６を含む群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも６０％の配列同一性を有するその機能的変異体を有する、請求項１に記載のマルチドメイン特異的結合分子。
【請求項２１】
前記ＶＮＡＲドメインのうちの２以上が、配列番号６５もしくは６６を含む群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも６０％の配列同一性を有するその機能的変異体を有する、請求項１９に記載のマルチドメイン特異的結合分子。
【請求項２２】
前記ＶＮＡＲドメインのうちの２以上が、配列番号２、７もしくは１２を含む群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも６０％の配列同一性を有するその機能的変異体を有する、請求項８に記載のマルチドメイン特異的結合分子。
【請求項２３】
前記ＶＮＡＲドメインのうちの２以上が、配列番号６５もしくは６６を含む群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも６０％の配列同一性を有するその機能的変異体を有する、請求項８に記載のマルチドメイン特異的結合分子。
【請求項２４】
前記ＶＮＡＲドメインのうちの２以上が、配列番号２、７もしくは１２を含む群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも６０％の配列同一性を有するその機能的変異体を有する、請求項１０に記載のマルチドメイン特異的結合分子。
【請求項２５】
前記ＶＮＡＲドメインのうちの２以上が、配列番号６５もしくは６６を含む群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも６０％の配列同一性を有するその機能的変異体を有する、請求項１０に記載のマルチドメイン特異的結合分子。
【請求項２６】
ヒトに投与されると潜在的な免疫原性を減少させるように、１以上のアミノ酸配列位置で修飾される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の結合分子。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の結合分子をコードするポリヌクレオチド配列を有する、単離された核酸。
【請求項２８】
宿主細胞が結合分子を産生するような条件下で請求項２６に記載のポリヌクレオチドを含む前記宿主細胞を培養または維持することを含み、必要に応じて、前記結合分子を単離することをさらに含む、結合分子を調製する方法。
【請求項２９】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載のマルチドメイン特異的結合分子、および必要であれば少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３０】
治療に使用するための、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のマルチドメイン特異的結合分子。
【請求項３１】
それを必要とする患者における疾患の治療のための薬剤の製造における、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の特異的抗原結合分子の使用。
【請求項３２】
治療を必要とする患者における疾患を治療する方法であって、前記患者に治療上有効な量の請求項２８に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項３３】
ＴＮＦαによって媒介される状態を治療するための方法であって、ＴＮＦαに特異的に結合する請求項２８に記載の組成物を治療上有効量投与することを含む方法。
【請求項３４】
ＩＣＯＳＬによって媒介される少なくとも１つの状態を治療するための方法であって、ＩＣＯＳＬに特異的に結合する請求項２８に記載の組成物を有効量投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＶＮＡＲを含むマルチドメイン特異的結合分子(multi-domain specific binding molecule)の形成に関する。腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に結合する特異的結合ドメインも提供される。
【背景技術】
【０００２】
背景
疾病と闘うための、特定の、ますます効果的で、多様化した治療用兵器に関する探索では、無数の異なる様式が利用されてきた。伝統的な小分子から漸増的により大きな生物学的医薬品、例えば、単一結合ドメイン（１０〜１５ｋＤａ）から完全ＩｇＧ(〜１５０ｋＤａ）まで。潜在的な治療薬として現在研究されている単一ドメインとしては、多種多様な別個のタンパク質足場(protein scaffolds)があり、これらはすべて、関連する利点および欠点を伴う。
【０００３】
このような単一ドメイン足場は、異なる種のタンパク質のアレイに由来し得る。新規または新しい抗原レセプター（ＩｇＮＡＲ）は軟骨魚(cartilaginous fish)の血清中で発見された約１６０ｋＤａのホモ二量体タンパク質である(Greenberg A. S., et al., Nature, 1995. 374(6518): p. 168-173, Dooley, H., et al, Mol. Immunol, 2003. 40(1): p. 25-33; Muller, M.R., et al., mAbs, 2012. 4(6): p. 673-685))。各分子は、単一のＮ末端可変ドメイン（ＶＮＡＲ）および５つの定常ドメイン（ＣＮＡＲ）から構成される。ＩｇＮＡＲドメインは、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＶＮＡＲは、免疫グロブリンおよびＴ細胞レセプター可変ドメインにならびに細胞接着分子に対して構造的およびいくつかの配列類似性を有する密に折り畳まれたドメインであり、古典的な免疫グロブリンおよびＴ細胞レセプターのＮ末端可変ドメイン(N Variable terminal domain)に対する類似性によってＶＮＡＲと呼ばれる。ＶＮＡＲは、免疫グロブリンに対して限定された配列相同性、例えば、ＶＮＡＲとヒト軽鎖配列との間の２５〜３０％類似性を共有する(Dooley, H. and Flajnik, M. F., Eur. J. Immunol., 2005. 35(3): p. 936-945)。
【０００４】
Kovaleva M. et al Expert Opin. Biol. Ther. 2014. 14(10): p. 1527-1539およびZielonka S. et al mAbs 2015. 7(1): p. 15-25は、最近、ＶＮＡＲの構造的特徴と生成の要約を提供し、これらは参照により組み込まれている。
【０００５】
ＶＮＡＲは、古典的な免疫グロブリン抗体祖先から進化したとは思われない。ＶＮＡＲの明確な構造的特徴は、従来の免疫グロブリン可変ドメインに存在するＣＤＲ２ループと等価な配列の切断、およびＩｇＮＡＲ構造に存在しない軽鎖ドメインとの会合を通常可能にする疎水性ＶＨ／ＶＬ界面残基の欠損、ならびにＣＤＲ１および３にＮ末端で隣接するフレームワーク１および３領域におけるシステイン間のカノニカル免疫グロブリンスーパーファミリー架橋(canonical Immunoglobulin superfamily bridge)に加えて追加のジスルフィド架橋を形成することが観察されるＣＤＲ領域における追加のシステイン残基のいくつかのＶＮＡＲサブタイプにおける存在である。
【０００６】
現在まで、Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩとして知られるサメＩｇＮＡＲの３つの定義されたタイプがある（図１）。これらは、強い選択圧下にあり、したがってほとんど置換されない非カノニカルシステイン残基(non-canonical cysteine residues)の位置に基づいて分類されている。
【０００７】
３つのタイプは全て、３６番目の位置の不変トリプトファンと共に、標準免疫グロブリンフォールドを安定化する、３５および１０７番目の位置に古典的免疫グロブリンカノニカルシステインを有する（Kabat, E.A. et al. Sequences of proteins of immunological interest. 5th ed. 1991, Bethesda: US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIHにおけるように番号付け）。ＣＤＲ２自体は定義されていないが、ＴＣＲ  ＨＶ２およびＨＶ４とより密接に比較される配列変異の領域は、それぞれフレームワーク２および３において定義されている。タイプＩには、フレームワーク２とフレームワーク４に生殖細胞系列でエンコードされたシステイン残基およびＣＤＲ３内に偶数の追加のシステインとを有する。リゾチームに対しておよびリゾチームとの複合体中で単離されたタイプＩ  ＩｇＮＡＲの結晶構造研究により、これらのシステイン残基の寄与を決定することができた。フレームワーク２および４のシステインは双方とも、ＣＤＲ３ループがＨＶ２領域に向かってしっかりと保持される密に充填された構造を形成するＣＤＲ３中のものとジスルフィド架橋を形成する。今日まで、タイプＩ  ＩｇＮＡＲはコモリザメ(nurse shark)においてのみ同定されており、同じオーダーのメンバーを含む、他の全てのエラスモブランチは、タイプＩＩまたはこの型のバリエーションのみを有する。
【０００８】
タイプＩＩ  ＩｇＮＡＲは、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３にシステイン残基を有するものとして定義され、これらは、これらの２つの領域を近接して保持する分子内ジスルフィド結合を形成し、結合ポケットまたは溝に導く突出したＣＤＲ３（図２）を生じる。タイプＩ配列は、一般的に、タイプＩＩより長いＣＤＲ３を有し、それぞれ平均２１および１５残基である。これは、タイプＩ  ＣＤＲ３中の２以上のシステイン残基がそれらのフレームワーク２および４カウンターパートと会合するための強い選択圧(selective pressure)に起因すると考えられる。体細胞突然変異の蓄積に関する研究により、タイプＩよりもタイプＩＩのＣＤＲ１により多数の突然変異が存在するが、タイプＩのＨＶ２領域はタイプＩＩよりも大きな配列変異を示すことが示される。この証拠は、抗原結合部位内のこれらの領域の決定された位置とよく相関する。
【０００９】
タイプＩＩＩとして知られる第３のＩｇＮＡＲ型が、新生児において同定されている。ＩｇＮＡＲファミリーのこのメンバーは、Ｖ遺伝子とのＤ１およびＤ２領域（ＣＤＲ３を形成する）の生殖細胞融合(germline fusion)のためＣＤＲ３内の多様性を欠く。ほとんどすべての公知のクローンは、配列多様性をほとんどまたは全く有さない１５残基のＣＤＲ３長を有する。
【００１０】
ＶＮＡＲの別の構造型は、タイプ（ＩＩＩｂまたはＩＶ）と呼ばれ、２つのカノニカルシステイン残基のみを有する。これまで、このタイプは、主にドッグフィッシュシャーク(dogfish shark)において見出されており(Liu, J.L., et al. Mol. Immunol. 2007. 44(7): p. 1775-1783; Kovalenko O.V., et al. J Biol Chem. 2013. 288(24): p. 17408-19)、ウォベゴングシャーク(wobbegong shark)由来の半合成Ｖ−ＮＡＲライブラリーからも単離された(Streltsov, V.A. et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(34): p. 12444-12449)。
【００１１】
しかし、ＶＮＡＲ配列から形成された合成ライブラリーから単離された特異的ＶＮＡＲが他のタンパク質に高い親和性で結合することができ(Shao C.Y. et al. Mol Immunol. 2007. 44(4): p. 656-65; WO2014/173959)、軟骨魚(cartilaginous fish)が抗原および抗原に結合する得られた応答性ＩｇＮＡＲで免疫化できるので、ＩｇＮＡＲが適応免疫系の一部である(Dooley, H., et al, Mol. Immunol, 2003. 40(1): p. 25-33; WO2003/014161)ことが示されている。ＩｇＮＡＲは、免疫グロブリンおよびＴ細胞レセプターと類似のＤおよびＪ配列とＶ様配列との組み合わせ結合(combinatorial joining)のためのメカニズムを有することが示されている(Zielonka S. et al mAbs 2015. 7(1): p. 15-25に要約されている）。
【００１２】
ＶＮＡＲ結合表面は、他の天然免疫グロブリン中の可変ドメインとは異なり、ＦＷ１−ＣＤＲ１−ＦＷ２−ＨＶ２−ＦＷ３ａ−ＨＶ４−ＦＷ３ｂ−ＣＤＲ３−ＦＷ４の順序で介在するフレームワーク配列(intervening framework sequences)によって連結された、多様な４つの領域：ＣＤＲ１、ＨＶ２、ＨＶ４およびＣＤＲ３に由来する（Stanfield, R. L., et al, Science, 2004. 305(5691): p. 1770-1773; Streltsov, V.A., et al, Protein Sci., 2005. 14(11): p. 2901-2909; Stanfield, R. L., et al., J Mol. Biol., 2007. 367(2): p. 358-372をも参照）。天然の軽鎖パートナーの欠如およびＣＤＲ２の欠如の組み合わせにより、ＶＮＡＲは脊椎動物界における最小の天然に存在する結合ドメインとなる。
【００１３】
ＩｇＮＡＲは、ラクダ科（ラクダ、ヒトコブラクダおよびラマ、Hamers-Casterman, C. et al. Nature, 1993. 363, 446-448; Wesolowski, J., et al., Med Microbiol Immunol, 2009. 198(3): p. 157-74）において見出される重鎖のみの免疫グロブリン（ＨＣＡｂ）といくつかの偶発的特徴を共有する。ＩｇＮＡＲとは異なり、ＨＣＡｂは免疫グロブリンファミリーに明確に由来し、標準的な免疫グロブリンに対して有意な配列相同性を共有する。重要なことに、ＶＮＡＲの１つの重要な区別としては、古典的な免疫グロブリンまたはＨＣＡｂとは異なり、分子がその進化のいかなる時点においてもパートナー軽鎖を有していないことがある。Flajnik M.F. et al PLoS Biol 2011. 9(8): e1001120およびZielonka S. et al mAbs 2015. 7(1): p. 15-25は、ＶＮＡＲとラクダ科動物由来の免疫グロブリン由来ＶＨＨ単一結合ドメインとの間の類似性および差異、ならびにそれらの異なる進化的起源についてコメントしている。
【００１４】
古典的な免疫グロブリンの軽鎖および重鎖（それぞれＶＬおよびＶＨ）に由来する結合ドメインは、一緒に連結して、免疫グロブリンＶＬおよびＶＨドメインが短いペプチドリンカーによって結合するTraunecker et al. (Traunecker A, et al. EMBO J.1991. 10, p. 3655-36, Traunecker A, et al. Int J Cancer Suppl.7, 51-52; Neri D. J Mol Biol. 1995. 246(3): p. 367-73)、ｓｃＦｖフォーマット(Bird et al., 1988; Huston et al., 1988)において、またはダイアボディとして(Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993. 90, 6444-6448; Holliger P. et al. Nat. Biotechnol. 15, 632-636。他の初期の例では、Mack M, et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995. 92, p. 7021-7025, Jost CR, et al Mol. Immunol. 1996. 33, p. 211-219を参照)で、二価または多価の二重特異性結合体を形成し得ることが示されている。Ｔａｎｄａｂｓは、単一のポリペプチド鎖に連結された２対のＶＬおよびＶＨドメインを含む(Kipriyanov S.M. et al., J. Mol. Biol. 293, 41-56、分子に対して二重特異性および二価を形成する）。
【００１５】
さらに、ＶＨＨは、一緒に連結して、二価または多価の二重特異性結合体を形成し得ることが示されている(Els Conrath et al. J Biol Chem. 2001. 276(10) p.7346-7350)。同様にして、Ｔ細胞レセプター由来の可変ドメインは免疫グロブリンｓｃＦｖに連結して、二重特異性フォーマットを形成し得る(McCormack E. et al. Cancer Immunol Immunother. 2013. 62(4): p. 773-85)。古典的免疫グロブリン由来の単一抗体可変ドメイン(ｄＡＢｓ： Ward E.S. et al. Nature 1989, 341, p. 544-546)もまた、二量体化され得る。二重特異性結合分子の全体的な概念およびそれらの開発における現在の進歩は最近、例えば、Kontermann R. mAbs 2012. 4(2): 185-197; Jost C. and Pluckthun A. Curr Opin Struct Biol. 2014. 27: p. 102-112; Spiess C. et al. Mol Immunol 2015. 67(2): 95-106によって概説されている。
【００１６】
別々の分子上のエピトープを認識する二重特異性分子に加えて、同じタンパク質上の隣接するエピトープを認識する２つの抗体結合ドメインを連結する概念（ビパラトピック(biparatopic)）は、長い歴史を有する(Neri D. J Mol Biol. 1995. 246(3): p. 367-73を参照のこと）。ビパラトピックＶＨＨ分子が開示されている（例えば、Jahnichen S. et al Proc Natl Acad Sci U S A. 2010. 107(47): p. 20565-70; Roovers R.C. et al Int J Cancer. 2011 129(8): p. 2013-24）。
【００１７】
しかし、ＶＨＨとは異なり、ＶＮＡＲは二量体融合分子を効率的に形成することができないかもしれないことが示唆されている(Simmons D.P. et al. Immunol Methods. 2006 315(1-2): p. 171-84)。（Bispecific Antibodies Konterman R.E. Springer Publishing 2011のコメントもまた参照のこと； Strohl W.R. and Strohl L.M., Therapeutic Antibody Engineering, Woodhead Publishing 2012のｐ３２２／３２３のコメントも参照のこと）。
【発明の概要】
【００１８】
発明の要約
本発明は、２以上のＶＮＡＲドメインを含むマルチドメイン特異的結合分子の提供に関する。より詳細には、本発明は、二価および多価ＶＮＡＲの提供に関する。本発明者らは、最近、当技術分野における一般的な理解に反して、実際に、ＶＮＡＲの二量体、三量体および二重特異性融合体が形成され得ることを示した。
【００１９】
最近、Muller M.R. et al mAbs 2012. 4(6): p. 673-685; WO2013/167883)は、１つのドメインがヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対する特異性を有するＶＮＡＲを含む二重特異的ＶＮＡＲを開示し、これは、二価構造物が血清中でＨＳＡに結合して、これによりパートナードメインの生物学的半減期を延長することを可能にする。ＨＳＡ結合ＶＮＡＲのＮ末端およびＣ末端の両方におけるＶＮＡＲの融合は、ＨＳＡ結合ドメインの機能の保持と共に実証された。より最近では、ＷＯ  ２０１４／１７３９７５で、Ｂ細胞、活性化単球および樹状細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で構成的に発現される細胞表面抗原であるＩＣＯＳＬ(ＣＤ２７５）に結合することができ、Ｂ７ファミリーメンバー、ＩＣＯＳ(ＣＤ２７８）のリガンドであるＶＮＡＲＳを開示されている(Yoshinaga.S., K., et al., Int. Immunol., 2000. 12(10): p. 1439-1447)。これらのＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲのいくつかは、ＨＳＡ結合ＶＮＡＲＳに連結することができ、両方のドメインが機能性を保持することが示された。それぞれ異なる抗原（ｈＩＣＯＳＬ、ｍＩＣＯＳＬおよびＨＳＡ）を認識する三量体を調製することができ、各ドメインは機能を保持することが示された。
【００２０】
しかし、同じ抗原上の同じまたは異なるエピトープを認識する二重特異性または多重特異的ＶＮＡＲが形成され得ることは、以前に示されていない。さらに、そして予想外にも、この形態の二重特異性分子は、構成モノマー、またはモノマー形態自体、またはＨＳＡを認識するＶＮＡＲに結合したモノマーから形成される二価分子よりも改善された特性を示す。
【００２１】
本発明は、多価または多重特異性エンティティに組み合わされる能力を有し、そのマルチドメインエンティティ内で各ドメインが結合機能を保持する特異的ＶＮＡＲドメイン配列に関する。
【００２２】
従って、本発明の第１の態様において、１以上の特異的抗原の同一または異なるエピトープに結合する２以上のＶＮＡＲドメインを含むマルチドメイン特異的結合分子(multi-domain specific binding molecule)が提供される。
【００２３】
特定の好ましい実施形態において、本発明の第１の態様のマルチドメイン特異的結合分子中のＶＮＡＲは、特異的抗原上の同じ抗原に結合する。
【００２４】
さらに好ましい実施形態において、マルチドメイン特異的結合分子のＶＮＡＲは、特異的抗原上の異なるエピトープに結合する。これらの実施形態によるマルチドメイン特異的結合分子は、本明細書にさらに記載されるように、バイパラトピック分子(bi-paratopic molecule)と呼ぶことができる。
【００２５】
一実施形態において、特異的ＶＮＡＲ結合ドメイン配列が多価または多重特異性エンティティに組み合わされ(combine into)、そのマルチドメインエンティティ内で、各ドメインが結合機能を保持し、上記結合ドメインは単一の抗原上の異なるエピトープを認識する。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態は、結合特異性が単一の特異的抗原上の異なるエピトープに対するものであり、得られたエンティティが個々のＶＮＡＲ結合ドメインと比較して改善された特性を示す２つ（またはそれ以上）の異なるＶＮＡＲドメインを含む二重特異性または多重特異性結合分子である。改善された特性の例としては、モノマーＶＮＡＲと比較してアゴニスト効果またはアンタゴニスト効果の増加がある。
【００２７】
好ましくは、本発明のマルチドメイン特異的結合分子のＶＮＡＲドメインは、スペーサー配列によって分離される。より好ましくは、前記スペーサー配列は、結合分子で示される独立した機能性を有する。一実施形態では、前記スペーサー配列は、ＶＮＡＲドメインまたはその機能的断片である。特定の例では、前記スペーサーは、ヒト血清アルブミンまたはＩＣＯＳＬなどの、血清アルブミンに結合するＶＮＡＲまたはその機能的断片であり得る。特定の実施形態では、前記スペーサー配列は、配列番号：６７、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７または８８のいずれか１つのアミノ酸配列、またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する機能的断片を有する。さらなる実施形態では、前記スペーサー配列は、以下に制限されないがヒト免疫グロブリンＦｃ領域などの、免疫グロブリンのＦｃ部分であってもよい。改善された特性は、例えば、ＶＮＡＲドメインを間隔をあけて(in space)受動的に分離することによって、または得られるエンティティについてインビボ半減期をより長くし得る血清アルブミン結合等のスペーサーの固有の特性によって、またはＩＣＯＳＬ等の第２の治療的自己免疫標的(second therapeutic auto-immune target)の認識によって、または免疫グロブリンＦｃ領域の場合には、免疫系または補体の細胞との結合(engagement)能の導入によって、スペーサーの特性に部分的または完全に由来し得る。
【００２８】
スペーサー配列によって分離される２以上のＶＮＡＲドメインを含む本発明のマルチドメイン特異的結合分子の実施形態は、本明細書では、Ｑｕａｄ−Ｘフォーマット(Quad-X format)と呼ぶことができる。
【００２９】
他の好ましい実施形態では、マルチドメイン特異的結合分子は、１以上の非ＶＮＡＲドメインをさらに含み得る。前記１以上の非ＶＮＡＲドメインは、ＶＮＡＲドメインに対して任意の位置に配置され得る。典型的には、および好ましい実施形態では、前記非ＶＮＡＲドメインは、ＶＮＡＲドメインに対してＣ末端またはＮ末端であろう。
【００３０】
２以上のＶＮＡＲドメインと、ＶＮＡＲドメインに対してＣ末端またはＮ末端にある非ＶＮＡＲドメインとを含む本発明のマルチドメイン特異的結合分子の実施形態は、本明細書では、Ｑｕａｄ−Ｙフォーマット(Quad-Y format)と呼ぶことができる。
【００３１】
例示的な非ＶＮＡＲドメインとしては、ＴＮＦ  Ｒ１および免疫グロブリンＦｃがあるが、これらに限定されない。
【００３２】
特異的抗原(specific antigen)は、サイトカイン、成長因子、酵素、細胞表面関連分子(cell surface associated molecule)、細胞表面膜成分(cell-surface membrane component)、細胞内分子、細胞外マトリックス成分、間質抗原、血清タンパク質、骨格抗原(skeletal antigen)、微生物抗原、または通常は免疫特権のある位置(normally immune-privileged location)の抗原からなる群からであり得る。
【００３３】
本発明のさらなる態様は、サイトカインを認識するＶＮＡＲ結合ドメインの特定の組み合わせである。
【００３４】
また、本発明によって、ヒトＴＮＦを認識し、疾患を治療するために現在使用されている全ての他の十分に特徴付けられた抗ＴＮＦ抗体およびＶＨＨバインダーとは異なるエピトープに結合する特異的ドメインが提供される。
【００３５】
従って、第２の態様において、本発明は、以下のＣＤＲおよび超可変領域（ＨＶ）を含むＴＮＦ−α特異的ＶＮＡＲ結合ドメイン、または少なくとも６０％の配列同一性を有するその機能的変異体(functional variant thereof)を提供する：
【００３６】
【化１】
2020535811.tif 000002
【００３７】
特に好ましい実施形態では、ＴＮＦ−α特異的ＶＮＡＲ結合ドメインは、配列番号２、７または１２のアミノ酸配列、または少なくとも６０％の配列同一性を有するその機能的変異体を含む。
【００３８】
好ましい実施形態では、本発明のＴＮＦ−α特異的ＶＮＡＲドメインは、特異的抗原上の特異的エピトープに対する機能的結合活性は保持しながら、例えば、ヒト化、脱免疫化または類似の技術によって、インビボでの免疫原性の可能性を減少させるように、１以上のアミノ酸配列位置で修飾される。
【００３９】
本発明の一実施形態は、ＴＮＦαを認識し、本発明に概説される形態において、個々の結合ドメインよりも改善された機能的特性を提供する、得られるマルチドメイン結合分子へのＶＮＡＲ結合ドメインの特定の組み合わせ(specific combination)である。ＴＮＦαを認識すると主張されているＶＮＡＲを産生できることが知られている(Camacho-Villegas T, et al MAbs. 2013. 5(1): P. 80-85; Bojalil R, et al BMC Immunol. 2013. 14:17; WO2011/056056; US20110129473; US20140044716)。しかし、これらのＶＮＡＲは、二量体または二重特異性形態を形成するように連結されていない。さらに、単量体フォーマットのこれらのドメインは、ここで説明した単量体抗ＴＮＦ  ＶＮＡＲドメインよりも７０倍から２００倍効力が低い。
【００４０】
したがって、本発明の第２の態様のＴＮＦ−α特異的ＶＮＡＲ結合ドメインは、第１の態様のマルチドメイン特異的結合分子における一方または両方のＶＮＡＲドメインとして使用することができる。したがって、好ましい実施形態では、１以上のＶＮＡＲドメインが配列番号２、７もしくは１２からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも６０％の配列同一性を有するその機能的変異体を有する、第１の態様のマルチドメイン特異的結合分子が提供される。他の好ましい実施形態では、２以上のＶＮＡＲドメインが配列番号２、７もしくは１２からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも６０％の配列同一性を有するその機能的変異体を有する、第１の態様のマルチドメイン特異的結合分子が提供される。
【００４１】
本発明の第１の態様の他の好ましい実施形態としては、配列番号６５もしくは６６からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも６０％の配列同一性を有するその機能的変異体を有する１以上のＶＮＡＲドメインを含む、第１の態様のマルチドメイン特異的結合分子がある。第１の態様のさらに別の実施形態としては、配列番号６５もしくは６６からなる群から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも６０％の配列同一性を有するその機能的変異体を有する２以上のＶＮＡＲドメインを含む、第１の態様のマルチドメイン特異的結合分子がある。
【００４２】
本発明の第１の態様において使用される１以上のＶＮＡＲドメインは、特異的抗原上の特異的エピトープに対する機能的結合活性を保持しながら、例えば、ヒト化、脱免疫化または類似の技術によって、インビボでの免疫原能を減少させるように、１以上のアミノ酸配列位置で修飾され得る。
【００４３】
本発明はまた、本明細書中に記載される任意の態様または実施形態による結合分子をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。さらに、本明細書では、前記ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、該宿主細胞が結合分子を産生するような条件下で培養または維持することを含み、必要であれば前記結合分子を単離することをさらに含む、本発明に係る結合分子を調製する方法が提供される。
【００４４】
本発明のさらなる態様によれば、特異的抗原結合分子および／または本発明の前記態様のマルチドメイン特異的結合分子を含む医薬組成物が提供される。
【００４５】
本発明の医薬組成物は、任意の適切かつ薬学的に許容可能な担体、希釈剤、アジュバントまたは緩衝溶液を含み得る。本組成物は、さらなる薬学的に活性のある薬剤を含み得る。そのような担体としては、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、リポソーム、水、グリセロール、エタノールおよびこれらの組み合わせが挙げられ得るが、これらに限定されない。このような組成物は、示されるようなさらなる薬学的に活性のある薬剤を含み得る。追加の薬剤は、治療用化合物、例えば、抗炎症薬、細胞毒性剤、細胞増殖抑制剤または抗生物質であってもよい。このような追加の薬剤はそれを必要とする患者への投与に適した形態で存在してもよく、このような投与は同時、別々、または連続であってもよい。上記成分は、必要に応じて説明書を含んでもよいキットの形態で調製することができる。
【００４６】
医薬組成物は、例えば、とりわけ、経口、局所、静脈内、筋肉内、鼻腔内、または皮内経路による投与などの、患者の疾患を治療するのに有効な任意の有効で便利な様式で投与することができる。治療においてまたは予防として、活性のある薬剤は、注射可能な組成物として、例えば、好ましくは等張の、滅菌水性分散液として、個体に投与され得る。
【００４７】
哺乳動物、特にヒトへの投与を目的として、活性のある薬剤の１日あたりの用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重以上、典型的には約１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇ以下であると予想される。いずれにせよ、医師は、個体の年齢、体重、性別および応答を含む因子に依存するであろう個体に最も適した実際の投薬量を決定するであろう。上記の用量は、平均的な場合の例示である。もちろん、より高い用量またはより低い用量が有益である場合もあり得、そのような場合も本発明の範囲内である。本発明はまた、使用説明書と共に本明細書に規定される医薬組成物を含むキットを提供する。
【００４８】
本発明のさらなる態様によれば、医薬に使用するための先の態様の医薬組成物が提供される。このような使用は、上記に規定されるような本発明の医薬組成物の治療有効量の投与による、本発明の結合ドメインの標的抗原とそのリガンドパートナーとの間の相互作用に関連する疾患の治療のための方法を含む。本組成物は、本発明の少なくとも１つの特異的抗原結合分子（ＶＮＡＲドメイン）もしくはマルチドメイン特異的結合分子、またはこのような分子の組み合わせおよび／またはそのヒト化変異体を含み得る。
【００４９】
本発明のこの態様によると、本発明の結合ドメインの標的抗原とそのリガンドパートナーとの間の相互作用に関連する疾患の治療のための医薬の製造に使用される組成物が提供される。
【００５０】
このような組成物は、示されるようなさらなる薬学的に活性のある薬剤を含み得る。追加の薬剤は、治療化合物、例えば、抗炎症薬、細胞毒性剤、細胞増殖抑制剤または抗生物質であってもよい。このような追加の薬剤はそれを必要とする患者への投与に適した形態で存在してもよく、このような投与は同時、別々、または連続であってもよい。上記成分は、必要に応じて説明書を含んでもよいキットの形態で調製することができる。
【００５１】
本発明によれば、医薬に使用される本発明の抗原特異的抗原結合分子(antigen specific antigen binding molecule)またはマルチドメイン特異的結合分子が提供される。従って、本発明のこの態様は、それを必要とする患者における疾患の治療のための医薬の製造における、本発明の抗原特異的抗原結合分子またはマルチドメイン結合分子のそのような使用に及ぶ。本発明の抗原特異的抗原結合分子はまた、本発明の医薬組成物に関連して上記で規定されるような特異的結合分子またはマルチドメイン結合分子を含む融合タンパク質を調製するために使用され得る。このような使用はまた、本発明の抗原特異的抗原結合分子またはマルチドメイン結合分子を含む、本明細書中に規定されるような医薬組成物の治療的に有効な用量の患者への投与を有する、治療を必要とする患者における疾患の治療方法を包含する。
【００５２】
本明細書で使用される、「治療(treatment)」という用語は、ヒトまたは非ヒト動物に利益を与えることができる任意のレジメを含む。獣医学における「非ヒト動物」の治療は、ウマおよびコンパニオンアニマル（例えば、ネコおよびイヌ）を含む家畜、ならびにヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシおよびウマ科のメンバーを含む農場／農業動物の治療に及ぶ。治療は、任意の既存の状態または疾患に関する治療的処置であり得る、または予防的（予防的処置）であり得る。治療は、遺伝性または後天性疾患の治療であってもよい。治療は、急性または慢性状態の治療であってもよい。治療は、炎症および／または癌に関連する状態／疾患の治療であってもよい。本発明の抗原特異的抗原結合分子またはマルチドメイン特異的結合分子は、以下に制限されないが、変形性関節症、強皮症、腎疾患、関節リウマチ、炎症性腸疾患、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化症、または任意の炎症性疾患などの、疾患の治療に使用され得る。
【００５３】
さらなる態様において、本発明は、ＴＮＦαに特異的に結合する本発明の組成物の治療有効量の投与を含む、ＴＮＦαによって媒介される状態を治療する方法を提供する。
【００５４】
さらなる態様において、本発明は、ＩＣＯＳＬに特異的に結合する本発明の組成物の有効量の投与を含む、ＩＣＯＳＬによって媒介される少なくとも１つの状態を治療する方法を提供する。
【００５５】
本発明のさらなる態様は、細胞表面分子を認識するＶＮＡＲ結合ドメインの特定の組み合わせである。特定の実施形態では、マルチドメイン結合分子のＶＮＡＲは、異なるクラスのリガンドまたは標的に結合する。本明細書に包含される１つの非限定的な例としては、少なくとも１つのＶＮＡＲドメインが自己免疫疾患に関連する標的に結合し、少なくとも１つのＶＮＡＲドメインが炎症応答に関連する標的に結合する、本発明の第１の態様のマルチドメイン特異的結合分子がある。
【００５６】
本発明の特に好ましいマルチドメイン特異的抗原結合分子は、ＴＮＦに特異的なＶＮＡＲおよびＩＣＯＳＬに特異的なＶＮＡＲを含む。好ましくは、ＴＮＦに特異的なＶＮＡＲが本発明の第２の態様のＶＮＡＲである。
【００５７】
本発明の１つの実施形態としては、ＩＣＯＳＬを認識し、本発明に概説されるフォーマットにおいて、個々の結合ドメインよりも改善された機能的特性を提供する、得られるマルチドメイン結合分子へのＶＮＡＲ結合ドメインの特定の組み合わせがある。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
本出願では、下記の多数の図面を参照する：
【図１】図１は、抗コモリザメＩｇＮＡＲハイブリドーマ抗体(anti-Nurse shark IgNAR hybridoma antibody)を用いた免疫処置されたコモリザメ血漿の抗ｈＴＮＦ−α  ＩｇＮＡＲ滴定(Anti-hTNF-alpha IgNAR titration)を示す。免疫処置された動物、予備免疫、および出血５(bleed 5)後の血清のＥＬＩＳＡ滴定、免疫処置されたコモリザメにおける抗ｒｈＴＮＦ−α  ＩｇＮＡＲ力価の結合ＥＬＩＳＡ測定。検出は、ＧＡ８モノクローナル抗コモリザメＩｇＮＡＲ抗体を用いて行われ、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合抗体を二次抗体として用いた。
【図２】図２は、Ｌ９２９細胞におけるｈＴＮＦ−α誘発細胞毒性の中和を示す。このアッセイでは、抗ＴＮＦドメイン（Ｄ１およびＣ４）および対照抗ヒト血清アルブミンドメイン（ＢＡ１１）の細胞バイオアッセイにおけるｈＴＮＦ−αの活性の中和能を測定した。Ｄ１およびＣ４ドメインは双方とも、同様のレベルの濃度依存性中和を示した（計算値については表２を参照のこと）。ＢＡ１１対照は、ｈＴＮＦを認識せず、最高濃度でも中和は観察されなかった。ｈＴＮＦ−α＋アクチノマイシン−Ｄは、中和ドメインの非存在下では古典的な細胞毒性を示す対照として作用した。
【図３】図３は、Ｌ９２９線維肉腫細胞株におけるインビトロのｒｈＴＮＦα中和アッセイを示す。Ａ．１×ＬＤ８０［０．３ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＴＮＦα］の中和、１回の実験あたり重複してｎ＝３、±ＳＥＭ；Ｂ．１０×ＬＤ８０［３ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＴＮＦα］の中和、１回の実験あたり重複してｎ＝２、±ＳＤ。ＴＮＦ３０−Ｆｃは、ＩｇＧ  Ｆｃに融合された免疫処置されたラクダ科から単離された抗ｒｈＴＮＦα  ＶＨＨナノボディ(anti-rhTNFα VHH nanobody)の融合体である(Coppieters et al., Arthritis and Rheumatism, 2006, 54 (6): 1856-1866; Riechmann et al., J. Immunol. Methods, 1999. 231: 25-38)。Ａｌｂ８−Ｆｃは、ＩｇＧ  Ｆｃに融合した、ＨＳＡを認識するＶＨＨドメインである。２Ｖは、既知の標的を認識しないネガティブ対照である。２Ｖ−Ｆｃは、２ＶとＩｇＧ  Ｆｃとの融合体である。ｈＴＮＦに特異的な結合剤（Ｄ１、Ｃ４およびＴＮＦ−３０）のみが、遊離ｈＴＮＦの活性の中和を濃度依存的に示すことができた。中和能は、単量体から二価Ｆｃフォーマットへの変換によって増強された。Ｄ１−ＦｃとＣ４−Ｆｃとの組み合わせは、Ｄ１−Ｆｃ単独またはＣ４−Ｆｃ単独よりも優れた中和能をもたらした。（全ての計算された中和値について表２を参照のこと）。両方の対照、Ａｌｂ−８および２Ｖは、この二価Ｆｃフォーマットにおいてさえ中和することができなかった。
【図４】図４は、二価および二重特異性構築物のフォーマットの図である。
【図５】図５は、二量体ＶＮＡＲおよびＴＮＦ−３０  ＶＨＨ対照（ＴＮＦ３０−ＴＮＦ３０）のＥＬＩＳＡ結合を示す。試験したＶＮＡＲドメインＤ１、Ｃ４、Ｂ４はすべて、両方の可能な配向（例えば、Ｃ４−Ｄ１、Ｂ４−Ｄ１）において、それ自体と対になっているか（例えば、Ｄ１−Ｄ１、Ｃ４−Ｃ４など）、または互いに対になっていた（例えば、Ｄ１−Ｃ４、Ｄ１−Ｂ４）。ＥＬＩＳＡランキングでは、Ｄ１−Ｄ１二量体対が最良（飽和シグナルに到達するのに必要な最低濃度のＶＮＡＲ）として、そしてＢ４−Ｃ４およびＢ４−Ｂ４がこのＥＬＳＡフォーマットにおいて最悪の性能として位置付けられた。数多くのＶＮＡＲ対が、ＶＨＨ二量体対照よりも良好であった。
【図６】図６は、ＶＮＡＲ二量体対によるＴＮＦ中和を測定するためのＬ９２９アッセイを示す。抗ＴＮＦα  ＶＮＡＲ二量体対であるＤ１−Ｄ１、Ｄ１−Ｃ４、Ｄ１−Ｂ４および陽性対照である抗ＴＮＦ  ＶＨＨ二量体（ＴＮＦ３０−ＴＮＦ３０）の中和能を、適切なバイオアッセイを用いて評価した。このアッセイフォーマットにおいて最も強力な中和活性を示すドメイン対は、ＶＮＡＲ対Ｄ１−Ｃ４であった（中和の計算値については表２を参照のこと）。中和ドメインを含まないｈＴＮＦα＋アクチノマイシン−Ｄ処置細胞は、適切な古典的非阻害細胞毒性対照を提供した。
【図７】図７は、三量体抗ｈＴＮＦ−αＶＮＡＲを用いた、Ｌ９２９細胞におけるｈＴＮＦα誘導細胞毒性の中和を示す。リード抗ｈＴＮＦ  αＶＮＡＲ二量体(lead anti-hTNFα VNAR dimers)（Ｄ１−Ｄ１およびＤ１−Ｃ４）を、両方の二量体構築物の中央に抗ＨＳＡヒト化ＶＮＡＲ(ｓｏｌｏＭＥＲ(商標）ＢＡ１１）を組み込むことによって多価三量体構築物に再フォーマットして、それぞれＤ１−ＢＡ１１−Ｄ１およびＤ１−ＢＡ１１−Ｃ４を得た。これらの多価三量体構築物およびＨｕｍｉｒａ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）およびＴＮＦ３０−ＢＡ１１−ＴＮＦ３０のｈＴＮＦαを中和能を、古典的Ｌ９２９アッセイで評価した。Ｄ１−ＢＡ１１−Ｃ４構築物はＡｄａｌＩｍｕｍａｂと同等の中和能を示し、ＶＨＨ三量体構築物、および抗ｈＴＮＦα二量体（Ｄ１−Ｃ４およびＤ１−Ｄ１）ＶＮＡＲよりも有意に改善された効力を示した（ＮＤ５０計算値については表２を参照のこと）。
【図８】図８は、極性を有するＣａｃｏ２細胞(Polarized Caco2 cells)におけるＣａｃｏ２上皮透過性を示す。Ｃａｃｏ−２細胞を、１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦα、ＬＰＳおよびＩＦＮγ＋／−抗ＴＮＦαタンパク質と共に１８時間、処置、インキュベートした。１０ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ−デキストラン［３０００〜５０００ｋＤａ］５μｌを頂端チャンバー(apical chamber)に添加し、膜を横切って基底外側チャンバー(basolateral chamber)への輸送を、２４時間後に測定した。ＶＮＡＲ／ＶＨＨ単量体およびＶＮＡＲ対照タンパク質による処理は５０ｎＭ濃度で行ったが、ＶＮＡＲ二量体（２Ｃおよび２Ｄ）およびＡｄａｌｉｍｕｍａｂによる処理は２５ｎＭで行った。ＢＡ１１および２Ｖは非ＴＮＦα結合性ＶＮＡＲ対照であり、Ｂ４は非中和ＴＮＦ結合性ＶＮＡＲである。サイトカイン処理Ｃａｃｏ−２細胞における、抗ｈＴＮＦα  ＶＮＡＲ構築物（単量体Ｄ１、Ｃ４、Ｂ４；二量体Ｄ１−Ｄ１、Ｄ１−Ｃ４；三量体Ｄ１−ＢＡ１１−Ｄ１、Ｄ１−ＢＡ１１−Ｃ４）、ＶＨＨ構築物ＴＮＦ３０、ＴＮＦ３０−ＴＮＦ３０、ＴＮＦ３０−ＢＡ１１−ＴＮＦ３０、およびＡｄａｌｉｍｕｍａｂの腸壁機能不全(intestinal barrier dysfunction)の予防能を、この古典的アッセイを用いて評価した。ＶＮＡＲドメインＤ１−Ｃ４およびＤ１−ＢＡ１１−Ｃ４は、Ａｄａｌｉｍｕｍａｂに匹敵する有効性を示した。陰性対照であるＢＡ１１および２Ｖは、腸壁機能不全を予防することができなかった。
【図９】図９は、極性を有するＣａｃｏ２細胞(Polarized Caco2 cells)における上皮抵抗性を示す。分化したＣａｃｏ−２細胞を、１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦαおよびＩＦＮγ＋／−抗ＴＮＦαと共に２４時間、処置、インキュベートした。経上皮抵抗に関するサイトカイン処理の効果を、ボルトオームメーター(volt-ohm meter)を用いて測定した。抵抗は、処理中の表面積に対して正規化した（オーム・ｃｍ２）。ＶＮＡＲ／ＶＨＨ単量体およびＶＮＡＲ対照タンパク質による処理は５０ｎＭ濃度で行ったが、ＶＮＡＲ二量体（２Ｃおよび２Ｄ）およびＡｄａｌｉｍｕｍａｂによる処理は２５ｎＭで行った。ＢＡ１１および２Ｖは非ＴＮＦα結合性ＶＮＡＲ対照であり、Ｂ４は非中和ＴＮＦ結合性ＶＮＡＲである。［１回の処置あたり８回以上の反復でｎ＝１±ＳＤ、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５を用いた一方向ＡＮＯＶＡ(one-way ANOVA)、およびＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ  ｔｅｓｔ］。抗ｈＴＮＦα  ＶＮＡＲドメインの、サイトカイン処置Ｃａｃｏ−２細胞における上皮抵抗性の回復効力を、等モル用量範囲でＶＨＨ  ＴＮＦ３０および臨床的に利用可能なＡｄａｌＩｍｕｍａｂの効力と比較して調査した。抗ｈＴＮＦα二量体および三量体ＶＮＡＲドメインは、Ａｄａｌｉｍｕｍａｂで観察された効果に匹敵する様式で上皮抵抗性を回復する有意な能力を示した。陰性対照ＢＡ１１および２Ｖは、上皮抵抗性を回復しなかった。
【図１０】図１０は、ＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲ−Ｆｃ融合体のフォーマットを示す。
【図１１】図１１は、ＩＣＯＳＬ  ＥＬＩＳＡ結合データを示す。異なる抗ＩＣＯＳＬ  Ｑｕａｄ−Ｘ（商標）構築物のヒトおよびマウスＩＣＯＳリガンド双方への結合性ＥＬＩＳＡ。
【図１２】図１２は、ＴＮＦ  Ｒ１ドメイン、ＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲおよびヒトＩｇＧ  Ｆｃを組み込んだ本発明の多価および多重特異的ＶＮＡＲのフォーマットである。
【図１３】図１３は、ＴＮＦ  Ｒ１ドメイン、ＩＣＯＳＬを組み込んだ多価および多重特異的ＶＮＡＲの有効性データである。ＶＮＡＲおよびヒトＩｇＧ  Ｆｃは、さらなる改善された機能特性を提供する。ＶＮＡＲ−ＴＮＦＲ１  Ｆｃ二機能性構築物は、細胞を用いた中和アッセイにおいて特異的かつ強力な効力を示す。フォーマット１：抗ＴＮＦα  ｓｃＦｖフォーマット２：抗ｍＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲ（ＣＣ３）フォーマット３：抗ｈＩＣＯＳＬ  ｓｃＦｖフォーマット４：抗ｈＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲ（２Ｄ４）。
【図１４】図１４は、ＶＮＡＲ  Ｔ４３ホーンシャーク(horn shark)クローンとＶＮＡＲ  コモリザメ(Nurse shark)Ｄ１およびＣ４との間のｈＴＮＦ−α結合プロフィールを示す。ホーンシャークのＶＮＡＲ  Ｔ４３ならびにＶＮＡＲ  Ｄ１およびＣ４の１μｇ／ｍｌのｈＴＮＦα被覆ウェルへの結合性ＥＬＩＳＡ。Ｔ４３クローンの結合プロフィールは、使用した実験濃度では決定できなかった。
【図１５】図１５は、ＶＮＡＲ  Ｔ４３  ホーンシャーク(horn shark)クローンならびにＶＮＡＲ  コモリザメ(Nurse shark)  Ｄ１およびＣ４のＬ９２９細胞におけるｈＴＮＦ−α中和効力を示す。等モル用量範囲でのホーンシャーク(horn shark)  Ｔ４３  ＶＮＡＲと比較した抗ｈＴＮＦα  ＶＮＡＲ単量体Ｄ１およびＣ４の中和効力の比較。Ｔ４３ドメインは、いかなる用量依存性中和効果も示さず、ｈＴＮＦαおよびアクチノマイシン−Ｄで処置された保護されていない細胞と同様のプロフィールを有する（表２を参照のこと）。
【図１６】図１６は、成功裏にヒト化された抗ｈＴＮＦ−α  Ｄ１（Ｄ１  ｓｏｌｏＭＥＲ（商標）としても知られる）の結合プロフィールを示す。ＶＮＡＲ  Ｄ１ドメインの多数の漸進的に改善されたフレームワークヒト化バージョン(progressively improved framework humanised versions)の結合プロフィール。Ｄ１−ｖ１、Ｄ１−ｖ２、Ｄ１−ｖ３、およびＤ１−ｖ４は、様々なヒト化の程度を表し、ＶＮＡＲ  Ｄ１（ｗｔ）は、親のＶＮＡＲ  Ｄ１ドメインである。コモリザメフレームワークアミノ酸残基をＤＰＫ−９のもので置換すると、ヒト生殖細胞κ(human germline kappa)は、ヒト化Ｄ１バージョンのｈＴＮＦα認識能を破壊しなかった。
【図１７】図１７は、Ｄ１  ＳｏｌｏＭＥＲTMのＬ９２９細胞における中和効力を示す。Ｌ９２９細胞におけるｈＴＮＦα媒介細胞毒性(hTNFα mediated cytotoxicity)を中和する能力を、ヒト化ＶＮＡＲ  Ｄ１変異体で評価した。ｓｏｌｏＭＥＲ  Ｄ１−ｖ２は、ｈＴＮＦα誘導細胞毒性に対する中和力を保持した。
【図１８】図１８は、ヒトＩｇＧ  Ｆｃを組み込んだ本発明の多価および多重特異的ＶＮＡＲのフォーマットである。
【図１９】図１９は、多価／多重特異的ＶＮＡＲ−Ｆｃ構築物のｈＴＮＦ−α結合プロフィールを示す。バイパラトピック／二重特異性(biparatopic/bispecific)Ｄ１−Ｆｃ−Ｃ４（Ｑｕａｄ−Ｘ（商標））  ｖｓ  バイパラトピック(biparatopic)ＶＮＡＲ  Ｆｃ構築物  Ｄ１−ＦｃおよびＣ４−Ｆｃの結合プロフィールを示す。抗ｈＴＮＦ−α  ＶＮＡＲ  Ｑｕａｄ−Ｘ（商標）Ｄ１−Ｆｃ−Ｃ４は、ｈＴＮＦαへの結合性を保持し、結合性プロフィールがＤ１−ＦｃおよびＣ４−Ｆｃに匹敵し、これらの比べてわずかに改善された。
【図２０】図２０は、Ｌ９２９における多価／多重特異的ＶＮＡＲ−Ｆｃ構築物のｈＴＮＦ−α中和活性の評価を示す。ＶＮＡＲ  Ｑｕａｄ−Ｘ（商標）  Ｄ１−Ｆｃ−Ｃ４  ｖｓ  Ｈｕｍｉｒａ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）の中和能を、ｈＴＮＦα媒介細胞毒性(hTNFα mediated cytotoxicity)のＬ９２９細胞を用いたアッセイで評価する。ＶＮＡＲ  Ｑｕａｄ−Ｘ（商標）  Ｄ１−Ｆｃ−Ｃ４は、中和能力を保持し、Ｈｕｍｉｒａと比較して優れた中和活性を示した（ＮＤ５０値については表２を参照のこと）。
【図２１】図２１は、抗マウスＴＮＦ−α  ＶＮＡＲ；および抗ＨＳＡ  ｓｏｌｏＭＥＲ（商標）  ＢＡ１１またはＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲドメイン、Ａ５またはマウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃを組み込んだ、本発明の多価バイ−パラトピック(bi-paratopic)ＶＮＡＲのフォーマットを示す。
【図２２】図２２Ａは、バイ−パラトピック抗マウスＴＮＦ−α  ＶＮＡＲ構築物のマウスＴＮＦ−α結合プロフィールを示す。抗ＩＣＯＳリガンドＶＮＡＲ  Ａ５または抗ＨＳＡヒト化ＶＮＡＲ、ｓｏｌｏＭＥＲ（商標）ＢＡ１１のいずれかを組み込んだ多価／多重特異的三量体としてＶＮＡＲ抗マウスＴＮＦα  Ｓ１７ドメインを再フォーマットする。両方の構築物は、マウスＴＮＦ−αに対する認識を保持した。図２２Ｂは、バイ−パラトピック抗マウスＴＮＦ−α  ＶＮＡＲ構築物のＨＳＡ結合プロフィールを示す。抗ＩＣＯＳリガンドＶＮＡＲ  Ａ５または抗ＨＳＡヒト化ＶＮＡＲ、ｓｏｌｏＭＥＲ（商標）ＢＡ１１のいずれかを組み込んだ多価／多重特異的三量体としてＶＮＡＲ抗マウスＴＮＦα  Ｓ１７ドメインを再フォーマットする。Ｓ１７−ＢＡ１１−Ｓ１７は、ＨＳＡへの結合を保持し、陰性対照であるＳ１７−Ａ５−Ｓ１７はＨＳＡを認識しなかった。図２２Ｃは、バイパラトピック二量体／三量体抗ＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲ構築物のマウスＩＣＯＳリガンド結合プロフィールを示す。マウスＩＣＯＳリガンドへの再フォーマットされたＳ１７−Ａ５−Ｓ１７およびＡ５−Ａ５ホモ二量体の結合プロフィールから、Ｓ１７−Ａ５−Ｓ１７として中央に抗マウスＩＣＯＳリガンドＶＮＡＲ  Ａ５を組み込んだ再フォーマットされた三量体構築物はマウスＩＣＯＳリガンドへの結合を保持することが示された。
【図２３】図２３Ａおよび図２３Ｂは、それぞれ、バイ−パラトピックおよびＩｇＧ２ａ  Ｆｃ融合抗マウスＴＮＦ−α  ＶＮＡＲ  Ｓ１７構築物のＬ９２９プロフィールにおけるマウスＴＮＦ−α中和を示す。抗マウスＴＮＦα構築物（Ｓ１７−Ａ５−Ｓ１７、Ｓ１７−ＢＡ１１−Ｓ１７、Ｓ１７−Ｆｃ）の中和効力を、マウスＴＮＦα媒介細胞毒性Ｌ９２９アッセイで評価した。三量体Ｓ１７およびバイ−パラトピックＳ１７−Ｆｃ構築物は双方とも、Ｌ９２９細胞におけるマウスＴＮＦα媒介細胞毒性に対する中和活性を示した。Ｓ１７−Ａ５−Ｓ１７は、３つの構築物の中で最も高い効力を示した。ＢＡ１１は、アッセイにおいて陰性対照であり、また、ｈＴＮＦα＋アクチノマイシンＤは、抗マウスＴＮＦα阻害剤／中和剤の非存在下で観察された古典的な細胞毒性効果を示した。細胞単独は、健常な未処置細胞を示す。
【図２４】図２４は、ＣＨＯ系ｈｕＩＣＯＳ／組換えマウスＩＣＯＳリガンド−Ｆｃ（ＩＣＯＳＬ−Ｆｃ）中和（ブロッキング）アッセイ−ＥＬＩＳＡ系(CHO-based huICOS/recombinant mouse ICOS Ligand-Fc (ICOSL-Fc) Neutralisation (blocking) Assay-ELISA based)を示す。このブロッキングアッセイにおいて、多価ＶＮＡＲ構築物は、マウスＩＣＯＳＬ−ＦｃがＣＨＯ細胞上のその同族結合パートナー(cognate binding partner)であるＩＣＯＳと相互作用するのをブロックする有意な能力を示した。これにより、細胞を用いたＥＬＩＳＡフォーマットに抗ヒトＦｃ−ＨＲＰ抗体を用いてマウスＩＣＯＳＬ−ＦｃのＦｃ部分が減少して／損なわれて検出された(leads to reduced/compromised detection)。Ａ５−Ａ５二量体は最も強力な遮断剤であり、Ｓ１７−Ａ５−Ｓ１７がこれに続くが、Ｓ１７単量体はこのアッセイでは陰性対照である。
【図２５】図２５は、抗ｈＴＮＦ−α  ＶＮＡＲとＶＨＨ  ＴＮＦ３０およびＨｕｍｉｒａ（登録商標）との結合交差反応性の相違を示す。この図は、ＶＨＨ  ＴＮＦ３０およびＨｕｍｉｒａと比較したＶＮＡＲ  Ｄ１−Ｃ４の結合交差反応プロフィールを示す。ＶＮＡＲ  Ｄ１−Ｃ４は、ヒト、イヌおよびカニクイザルのＴＮＦαのみに結合し；ヒト、イヌおよびカニクイザルのＴＮＦαへの結合を含むＶＨＨ  ＴＮＦ３０はブタのＴＮＦαおよびヒトＴＮＦβに弱く結合する。Ｈｕｍｉｒａは、ヒト、イヌ、カニクイザルおよびマウスのＴＮＦαに結合する。また、これらの抗ＴＮＦαドメインの詳細な結合および中和プロフィールについては、表３Ａおよび表３Ｂを参照のこと。
【図２６】図２６は、抗ｈＴＮＦ−α  ＶＮＡＲ四量体  ｖｓ  ＶＨＨ  ＴＮＦ３０二量体のＢＩＡｃｏｒｅＴＭ  Ｔ２００エピトープビニング分析(epitope binning analysis)を示す。このエピトープビニングデータから、ＶＮＡＲ  Ｄ１−Ｃ４がＶＨＨ  ＴＮＦ３０ドメインによって認識されるのとは異なるｈＴＮＦα分子上のエピトープを認識し、それと相互作用することが示される。このアッセイは、第１の結合ドメイン（この場合、そのＫＤ値の１００倍として決定される飽和濃度を用いたＶＮＡＲ  Ｄ１−Ｃ４）、次に第２の結合ドメイン（ＴＮＦ３０）で利用可能なエピトープ飽和に到達することを含む。
【図２７】図２７は、ＥＬＩＳＡフォーマットにおけるＱｕａｄ−ＸＴＭおよびＱｕａｄ−ＹＴＭ構築物によるｈＴＮＦ−αへの機能的結合を示す。
【図２８】図２８は、Ｌ９２９における多価／多重特異的ＶＮＡＲ−Ｆｃ構築物のｈＴＮＦ−α中和活性の評価を示す。ｈＴＮＦα媒介細胞毒性のＬ９２９細胞を用いたアッセイにおけるＶＮＡＲ  Ｑｕａｄ−ＸＴＭ  Ｄ１−Ｆｃ−Ｃ４、Ｑｕａｄ−ＹＴＭ  Ｄ１−Ｃ４−ＦｃおよびＣ４−Ｄ１−Ｆ  ｖｓ  Ｈｕｍｉｒａ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）の中和力を評価する。ＶＮＡＲ  Ｑｕａｄ−ＹＴＭ構築物は中和能を保持し、Ｄ１−Ｃ４−Ｆｃ構築物は０．３ｎｇ／ｍｌまたは３ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αの存在下でＱｕａｄ−ＸＴＭと同等の中和活性を示す（ＮＤ５０については表２を参照のこと）。
【図２９】図２９は、実験Ｔｇ１９７マウスの体重増加に関するＤ１−Ｆｃ−Ｃ４（Ｑｕａｄ−Ｘ（商標））およびＨｕｍｉｒａ（登録商標）の効果を示す。研究終了（１０週齢）まで、３週目から週２回処置した全群の平均体重は以下の通りであった：Ｇ１−ビヒクル＝１９．３±１．４ｇ、Ｇ４−Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）１０ｍｇ／ｋｇ＝２４．４±１．５ｇ、Ｇ２−Ｄ１−Ｆｃ−Ｃ４  ３ｍｇ／ｋｇ＝２４．１±１．５ｇ、Ｇ５−Ｄ１−Ｆｃ−Ｃ４  １０ｍｇ／ｋｇ＝２４．１±１．７ｇおよびＧ３−Ｄ１−Ｆｃ−Ｄ４  ３０ｍｇ／ｋｇ＝２３．４±１．４ｇ。３週目の対照マウスは９．８±０．２ｇの平均体重を有していた。エラーバーは、平均の標準誤差を示す。
【図３０】図３０は、実験Ｔｇ１９７マウスのインビボ関節炎スコアに関するＤ１−Ｆｃ−Ｃ４（Ｑｕａｄ−Ｘ（商標））およびＨｕｍｉｒａ（商標）の効果を示す。研究終了（１０週齢）まで、３週目から週２回処置した全群の平均インビボ疾患重篤度スコアは以下の通りであった：Ｇ１−ビヒクル＝１．３６±０．０７、Ｇ４−Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）１０ｍｇ／ｋｇ＝０．２５±０．０５、Ｇ２−Ｄ１−Ｆｃ−Ｃ４  ３ｍｇ／ｋｇ＝０．１７±０．０４、Ｇ５−Ｄ１−Ｆｃ−Ｃ４  １０ｍｇ／ｋｇ＝０．１７±０．０４およびＧ３−Ｄ１−Ｆｃ−Ｄ４  ３０ｍｇ／ｋｇ＝０．１７±０．０４。３週目の対照マウスは、インビボ関節炎スコア＝０．１３±０．０５であった。エラーバーは、平均の標準誤差を示す。
【図３１】図３１は、実験Ｔｇ１９７マウスの関節炎組織病理学スコアに関するＤ１−Ｆｃ−Ｃ４（Ｑｕａｄ−Ｘ（商標））およびＨｕｍｉｒａ（登録商標）の効果を示す。研究終了（１０週齢）まで、３週目から週２回処置した全群の平均関節炎組織病理学スコアは以下の通りであった：Ｇ１−ビヒクル＝２．９４±０．１２、Ｇ４−Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）１０ｍｇ／ｋｇ＝０．４２±０．０７、Ｇ２−Ｄ１−Ｆｃ−Ｃ４  ３ｍｇ／ｋｇ＝０．４１±０．０３、Ｇ５−Ｄ１−Ｆｃ−Ｃ４  １０ｍｇ／ｋｇ＝０．５０±０．０５およびＧ３−Ｄ１−Ｆｃ−Ｄ４  ３０ｍｇ／ｋｇ＝０．４２±０．０７。３週目の対照マウスは、組織病理学スコア＝１．２２±０．１０であった。エラーバーは、平均の標準誤差を示す。
【図３２】図３２は、実験Ｔｇ１９７マウスのインビボ関節炎スコア対足首組織病理学スコアに関するＤ１−Ｆｃ−Ｃ４（Ｑｕａｄ−Ｘ（商標））およびＨｕｍｉｒａ（登録商標）の効果の比較である。研究終了（１０週齢）まで、３週目から週２回処置した全群の平均疾患重篤度スコアは以下の通りであった：Ｇ１−ビヒクル＝２．９４±０．１２（ＨＳ）および１．３６±０．０７（ＡＳ）、Ｇ４−Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）１０ｍｇ／ｋｇ＝０．４２±０．０７（ＨＳ）および０．２５±０．０５（ＡＳ）、Ｇ２−Ｄ１−Ｆｃ−Ｃ４  ３ｍｇ／ｋｇ＝０．４１±０．０３（ＨＳ）および０．１７±０．０４（ＡＳ）、Ｇ５−Ｄ１−Ｆｃ−Ｃ４  １０ｍｇ／ｋｇ＝０．５０±０．０５（ＨＳ）および０．１７±０．０４（ＡＳ）およびＧ３−Ｄ１−Ｆｃ−Ｄ４  ３０ｍｇ／ｋｇ＝０．４２±０．０７（ＨＳ）および０．１７±０．０４（ＡＳ）であった。エラーバーは、平均の標準誤差を示す。
【図３３】図３３は、関節炎のＴｇ１９７モデルの関節炎病理の改善における、０．５、１および３ｍｇ／ｋｇのＤ１−Ｆｃ−Ｃ４（Ｑｕａｄ−Ｘ（商標））ならびに３０ｍｇ／ｋｇのＤ１−ＢＡ１１−Ｃ４  ｖｓ  １ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇのＨｕｍｉｒａ（登録商標）の有効性評価である。
【図３４】図３４は、関節炎のＴｇ１９７モデルの平均群体重に関する、０．５、１および３ｍｇ／ｋｇのＤ１−Ｆｃ−Ｃ４（Ｑｕａｄ−Ｘ（商標））ならびに３０ｍｇ／ｋｇのＤ１−ＢＡ１１−Ｃ４  ｖｓ  １ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇのＨｕｍｉｒａ（登録商標）の効果を示す。
【図３５】図３５は、インビボでの関節炎スコアおよび組織病理学スコアに関する異なるＨｕｍｉｒａ（登録商標）投薬レジメの効果を示す。これは、図２９〜図３２について記載されたものと同一の試験法を使用して、別個の実験として行われた。
【図３６】図３６は、１２匹のラットを光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）で免疫処置して、実験的自己免疫性ブドウ膜炎（Experimental Auto-Immune Uveitis）（ＥＡＵ）を誘導した。４匹の動物それぞれに対し、８日目、１０日目および１２日目に、２０ｍｇ／ｋｇの（げっ歯類タンパク質特異的）抗ＴＮＦα  ＶＮＡＲ−Ｆｃを腹腔内注射により処置した；４匹の動物を同じ日にデキサメタゾンで腹腔内処置し、４匹の動物を同様にビヒクルで処置した。０、７、１０、１２、１３、および１４日目に、ラットの眼の前眼部および後眼部の両方の光学コヒーレンストモグラフィー(Optical Coherence Tomography)（ＯＣＴ）を行った。結果のあらゆる科学的偏りを最小限にするために、ＯＣＴ画像は、有効なスコアリングシステムを使用して全炎症について「実験内容を知らない観察者(experimentally blinded observer)」によってスコアリングされた。実験はまた、ビヒクル対照および標準用量のデキサメタゾンステロイドを使用した陽性対照を含んだ。
【図３７】図３７Ａおよび図３７Ｂは、Ｌ９２９細胞におけるｓｏｌｏＭＥＲ  ＶＮＡＲ二量体構築物のｈＴＮＦ−α中和活性の評価を示す。
【図３８】図３８は、Ｌ９２９細胞におけるＳ１７−Ｆｃ  ｖｓ  Ｓ１７−Ｆｃ−Ｓ１７（Ｑｕａｄ−Ｘ（商標））構築物のｈＴＮＦ−α中和活性の評価を示す。Ｓ１７構築物に使用されたＦｃは、マウスＩｇＧ２ａに由来する。
【図３９】図３９Ａ、図３９Ｂおよび図３９Ｃは、ヒトおよびマウスＴＮＦ−αに対するＳ１７−Ｑｕａｄ−Ｘ（商標）およびＤ１−Ｃ４  Ｑｕａｄ−Ｘ（商標）の交差反応結合プロフィールを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
種々のヌクレオチドおよびアミノ酸配列が、以下のように本明細書中に提供される：
【００６０】
【化２】
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【００６１】
【化３】
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【００６２】
【化４】
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【００６３】
【化５】
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【００６４】
【化６】
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【００６５】
【化７】
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【００６６】
【化８】
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【００６７】
【化９】
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【００６８】
【化１０】
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【００６９】
【化１１】
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【００７０】
【化１２】
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【００７１】
【化１３】
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【００７２】
【化１４】
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【００７３】
【化１５】
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【００７４】
【化１６】
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【００７５】
【化１７】
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【００７６】
【化１８】
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【００７７】
【化１９】
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【００７８】
【化２０】
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【００７９】
【化２１】
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【００８０】
【化２２】
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【００８１】
発明の詳細な説明
定義
アミノ酸は、本明細書では一文字コードもしくは３文字コードのいずれかとしてまたは両方として表される。
【００８２】
「アフィニティー精製」という用語は、分子がパートナー部分に結合された(bound)または誘引された(attracted)ままで不純物から分離されることを可能にする組合せまたは複合体を形成するための、化学的パートナーまたは結合パートナーへの分子の特異的誘引または結合に基づく分子の精製を意味する。
【００８３】
「相補性決定領域」またはＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３）という用語は、その存在が抗原結合に必要であるＶＮＡＲドメインのアミノ酸残基を指す。各ＶＮＡＲは、典型的には、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３として同定されるＣＤＲ領域を有する。各相補性決定領域は、「相補性決定領域」のアミノ酸残基および／または「超可変ループ」（ＨＶ）のアミノ酸残基を含み得る。場合によっては、相補性決定領域は、ＣＤＲ領域および超可変ループ両方のアミノ酸を含み得る。ＶＮＡＲ分子について一般に受け入れられている命名法によれば、ＣＤＲ２領域は存在しない。
【００８４】
「フレームワーク領域」（ＦＷ）は、ＣＤＲ残基以外のＶＮＡＲ残基である。各ＶＮＡＲは、典型的には、ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３ａ、ＦＷ３ｂおよびＦＷ４として同定される５つのフレームワーク領域を有する。したがって、ＶＮＡＲドメインは、典型的には、Ｎ−末端からＣ−末端方向にＦＷ１−ＣＤＲ１−ＦＷ２−ＨＶ２−ＦＷ３ａ−ＨＶ４−ＦＷ３ｂ−ＣＤＲ３−ＦＷ４の構造を有する。
【００８５】
「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」は、（文脈上別段の指示がない限り）互換的に使用され、このような名称には細胞または細胞株のすべての子孫が含まれる。したがって、例えば、「形質転換体」および「形質転換細胞」のような用語には、初代対象細胞および移入(transfer)回数に関係なく上記に由来する培養物が含まれる。また、全ての子孫は、故意または不注意による突然変異により、ＤＮＡの内容が正確に同一であるとは限らないことは理解される。元の形質転換された細胞に付きスクリーニングされるのと同一の機能または生物学的活性を有する突然変異体子孫は含まれる。
【００８６】
発現に言及する場合の、「制御配列」は、特定の宿主生物における作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を意味する。例えば、原核生物に適した制御配列には、プロモーター、必要であればオペレーター配列、リボソーム結合部位などが含まれる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーなどの制御配列を使用する。
【００８７】
「コートタンパク質」という用語は、少なくともその一部がウイルス粒子の表面上に存在するタンパク質を意味する。機能的な観点から、コートタンパク質は宿主細胞におけるウイルスアセンブリプロセスの間にウイルス粒子と会合し、他の宿主細胞に感染するまでアセンブリされたウイルスと会合したままであるタンパク質である。
【００８８】
特定のアッセイにおける化学エンティティの「検出限界」は、当該アッセイのバックグラウンドレベルを超えて検出され得る当該エンティティの最小濃度である。例えば、ファージＥＬＩＳＡでは、特定の抗原結合断片を提示する特定のファージの「検出限界」は、特定のファージが抗原結合断片を提示しない対照ファージによって産生されるシグナルを超えるＥＬＩＳＡシグナルを産生するファージ濃度である。
【００８９】
「融合タンパク質」および「融合ポリペプチド」は、２つの部分が一緒に共有結合してなるポリペプチドを指し、この際、上記部分はそれぞれ異なる特性を有するポリペプチドである。上記特性は、インビトロまたはインビボでの活性などの、生物学的特性であってもよい。上記特性はまた、標的抗原への結合性、反応の触媒作用などの、単純な化学的または物理的特性であってもよい。上記２つの部分は、単一のペプチド結合によってまたは１以上のアミノ酸残基を含むペプチドリンカーを介して直接連結されてもよい。一般的に、上記２つの部分およびリンカーは、互いにリーディングフレームに存在するであろう。好ましくは、ポリペプチドの２つの部分は異種のまたは異なるポリペプチドから得られる。
【００９０】
本明細書における「融合タンパク質」という用語は、一般的な用語において、水素結合もしくは塩橋等の、化学的手段によって、またはタンパク質合成を介したペプチド結合によってまたはその両方によって一緒に結合された１以上のタンパク質を意味する。
【００９１】
「異種ＤＮＡ」は、宿主細胞に導入される任意のＤＮＡである。ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡおよびこれらの融合物または組み合わせを含む種々の供給源に由来し得る。ＤＮＡとしては、宿主またはレシピエント細胞と同じ細胞もしくは細胞型由来のＤＮＡまたは異なる細胞型由来のＤＮＡ、例えば、同種または異種供給源由来のＤＮＡがあり得る。ＤＮＡは、必要に応じて、マーカーまたは選択遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子、温度耐性遺伝子など）を含み得る。
【００９２】
「高度に多様な位置(highly diverse position)」とは、既知および／または天然に存在する抗体または抗原結合断片のアミノ酸配列を比較した場合にある位置に表される多数の異なるアミノ酸を有する軽鎖および重鎖の可変領域に位置するアミノ酸の位置をいう。高度に多様な位置は、典型的にはＣＤＲ領域にある。
【００９３】
「同一性」は、配列を比較することによって決定される、２以上のポリペプチド配列または２以上のポリヌクレオチド配列間の関係を記載する。同一性は、場合によっては、そのような配列のストリング間の一致によって決定される、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列間の配列関連性（相同性）の程度を意味する。２つのポリペプチド配列または２つのポリヌクレオチド配列間の同一性を測定するための多くの方法が存在するが、同一性を決定するために一般的に使用される方法は、コンピュータープログラムに体系化されている。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラムとしては、ＧＣＧプログラムパッケージ(Devereux, et al., Nucleic Acids Res, 1984, 12, 387 BLASTP, BLASTN, and FASTA (Atschul et al., J. Molec. Biol. (1990) 215, 403)があるが、これらに限定されない。
【００９４】
好ましくは、タンパク質のアミノ酸配列は、ＨＧＭＰ(Human Genome Mapping Project)によって提供されるＢＬＡＳＴコンピュータプログラム（Atschul et al., J. Mol. Biol. 1990 215, 403-410)のデフォルトパラメーターを用いて、本明細書に開示されるアミノ酸配列に対して、アミノ酸レベルで少なくとも６０％の同一性を有する。
【００９５】
より好ましくは、タンパク質配列は、本明細書中に示されるアミノ酸配列に対して、核酸またはアミノ酸レベルで、少なくとも６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、さらにより好ましくは９５％（なおより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％）の同一性を有し得る。
【００９６】
タンパク質はまた、ＨＧＭＰによって提供されるＢＬＡＳＴコンピュータープログラムのデフォルトパラメーターを使用して、本明細書中に開示される配列と、少なくとも６０％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含み得る。
【００９７】
「ライブラリー」とは、複数のＶＮＡＲもしくはＶＮＡＲ断片配列またはこれらの配列をコードする核酸をいう。ライブラリーの起源は、多様性が天然のフレームワークもしくは天然のフレームワークの組み合わせになるように設計される性質を有する非天然の供給源もしくは合成由来であり得る、または免疫動物から抽出されたＲＮＡから単離されたＶＮＡＲドメインから例示されるような天然の供給源由来であり得る。
【００９８】
「連結(ligation)」は、２つの核酸断片間にホスホジエステル結合を形成するプロセスである。２つの断片の連結を目的として、断片の末端は、互いに適合するものでなければならない。場合によっては、末端はエンドヌクレアーゼ消化後に直接適合するであろう。しかしながら、連結に適合させるために、まずエンドヌクレアーゼ消化後に一般的に生成される互い違いの末端(staggered ends)を平滑末端に変換する必要があるかもしれない。末端を平滑化するために、ＤＮＡを、４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸の存在下で、ＤＮＡポリメラーゼＩまたはＴ４  ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片約１０単位を用いて、１５℃で少なくとも１５分間、適切な緩衝液中で処理する。次いで、ＤＮＡを、フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によってまたはシリカ精製によって精製する。一緒に連結されるＤＮＡ断片を、ほぼ等モル量で溶液中に仕込む。この溶液はまた、ＡＴＰ、リガーゼ緩衝液、およびリガーゼ（例えば、０．５／ｉｇのＤＮＡあたり約１０単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ）を含むであろう。ＤＮＡをベクターに連結する場合には、ベクターを適切な制限エンドヌクレアーゼでの消化によってまず線状化する。次いで、線状化された断片を、細菌アルカリホスファターゼまたはウシ腸ホスファターゼで処理して、連結工程中の自己連結を防止する。
【００９９】
「突然変異」は、野生型配列などの、参照ヌクレオチド配列に対するヌクレオチドの欠失、挿入、または置換である。
【０１００】
「天然の」または「天然に存在する」ＶＮＡＲは、例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏで得られた組織源から等の、非合成源から、またはＥｌａｓｍｏｂｒａｎｃｈｉｉサブクラスの動物の血清から同定されたＶＮＡＲを指す。これらのＶＮＡＲとしては、天然または誘導された、任意のタイプの免疫応答で生成されたＶＮＡＲがあり得る。天然のＶＮＡＲはアミノ酸配列、およびこれらの抗体を構成するまたはコードするヌクレオチド配列を含む。本明細書で使用されるように、天然のＶＮＡＲは「合成ＶＮＡＲ」とは異なり、合成ＶＮＡＲは、例えば、異なるアミノ酸による特定の位置の、１アミノ酸または１を超えるアミノ酸の置換、欠失、または付加によって、源または鋳型配列から変化させたＶＮＡＲ配列を指し、前記異なるアミノ酸により源の抗体配列とは異なる抗体配列が提供される。
【０１０１】
「核酸構築物」との用語は、一般的に、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはクローニングによって得られるまたは化学合成によって製造されるｍＲＮＡなどのＲＮＡであり得る任意の長さの核酸を指す。ＤＮＡは、一本鎖または二本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡは、コードセンス鎖であっても、または非コード鎖もしくはアンチセンス鎖であってもよい。治療用途を目的として、核酸構築物は、好ましくは処置される対象において発現され得る形態である。
【０１０２】
核酸に言及する場合の「作動可能に連結された(Operably linked)」とは、核酸が別の核酸配列と機能的な関係にあることを意味する。例えば、プレシーケンス(presequence)または分泌リーダー(secretory leader)のＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合には、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結する；プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合には、コード配列に作動可能に連結する；または、リボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように位置する場合には、コード配列に作動可能に連結する。一般的に、「作動可能に連結された(Operably linked)」とは、連結されるＤＮＡ配列が隣接しており、そして分泌リーダーの場合には、付随しリーディングフレームにあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは必ずしも隣接している必要はない。便利な制限部位でのライゲーションによって連結が行われる。このような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが従来のプラクティスに従って使用される。
【０１０３】
「ファージディスプレイ」は、それによって変異ポリペプチドがファージ（例えば、糸状ファージ）粒子の表面上のコートタンパク質の少なくとも一部への融合タンパク質としてディスプレイさせる技術である。ファージディスプレイ技術により、高い親和性で標的抗原に結合する配列について迅速かつ効率的に選別することができるランダムなタンパク質変異体の大きなライブラリーを調製できる。ファージ上のペプチドおよびタンパク質ライブラリーのディスプレイは、特異的結合特性を有するものについて何百万ものポリペプチドをスクリーニングするために使用できる。多価ファージディスプレイ法は、糸状ファージのコートタンパク質であるｐｉｌｌ、ｐＶ  ＩＩＩ、ｐＶＩ、ｐＶＩＩまたはｐＩＸをコードする遺伝子への融合を介して小さなランダムなペプチドおよび小さなタンパク質をディスプレイするために使用されてきた。
【０１０４】
「ファージミド」は、細菌の複製起点、例えば、ＣｏｌＥＩ、およびバクテリオファージの遺伝子間領域のコピーを有するプラスミドベクターである。ファージミドは、糸状バクテリオファージおよびラムドイドバクテリオファージなどの、任意の既知のバクテリオファージで使用され得る。このプラスミドはまた、一般的に、抗生物質耐性のための選択マーカーを含むであろう。これらのベクターにクローニングされたＤＮＡのセグメントは、プラスミドとして増殖され得る。ファージ粒子の産生に必要な全ての遺伝子を有するこれらのベクターを有する細胞が提供されると、プラスミドの複製の様式はローリングサークル複製(rolling circle replication)に変化し、プラスミドＤＮＡの１本鎖のコピーを生成し、ファージ粒子をパッケージする。ファージミドは、感染性または非感染性ファージ粒子を形成し得る。この用語は、異種ポリペプチドがファージ粒子の表面上にディスプレイされるように、遺伝子融合物として異種ポリペプチド遺伝子に連結されたファージコートタンパク質遺伝子またはその断片を含むファージミドを包含する。ファージミドディスプレイベクターの一例としては、ｐＷＲＩＬ−１がある。
【０１０５】
「ファージベクター」という用語は、異種遺伝子を含み、複製可能なバクテリオファージの二本鎖複製形態を意味する。ファージベクターは、ファージ複製およびファージ粒子形成を可能にするファージ複製起点を有する。ファージは、好ましくは、Ｍ１３、ｆｌ、ｆｄ、Ｐｆ３ファージもしくはその誘導体等の、糸状バクテリオファージ、またはラムダ、２１、ｐｈｉ８０、ｐｈｉ８１もしくはその誘導体等の、ラムドイドファージである。
【０１０６】
「タンパク質」という用語は、概して、ペプチド結合によって一緒に結合された複数のアミノ酸残基を意味する。それは、ペプチド、オリゴペプチド、オリゴマー、またはポリペプチドと交換可能に使用され、これらと同じ意味であり、糖タンパク質およびその誘導体を含む。「タンパク質」という用語は、タンパク質の断片、類似体、変異体および誘導体を包含すると解され、この際、断片、類似体、変異体または誘導体は参照タンパク質と本質的に同一の生物学的活性または機能を保持する。タンパク質類似体および誘導体の例としては、ペプチド核酸、およびＤＡＲＰｉｎｓ（設計されたアンキリン反復タンパク質(Designed Ankyrin Repeat Proteins)）がある。本発明の「ポリペプチド」は本明細書で定義されるＴＮＦα特異的抗原結合分子である。
【０１０７】
タンパク質の断片、類似体、変異体または誘導体は、それが由来する元のタンパク質配列の長さに応じて、少なくとも２５、好ましくは少なくとも３０もしくは４０、または５０もしくは１００以下、または６０〜１２０アミノ酸長であり得る。９０〜１２０、１００〜１１０のアミノ酸の長さは、場合によっては便利であり得る。
【０１０８】
タンパク質の断片、誘導体、変異体または類似体は、（ｉ）１以上のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは、保存アミノ酸残基）で置換され、このような置換されたアミノ酸残基は遺伝暗号によってコードされているものであってもなくてもよいもの、または（ｉｉ）１以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、または（ｉｉｉ）ポリペプチドの精製に使用されるリーダーまたは補助配列などの、追加のアミノ酸が成熟ポリペプチドに融合されているものであってもよい。このような断片、誘導体、変異体および類似体は、本明細書の示唆から当業者の範囲内に含まれるとみなされる。
【０１０９】
「オリゴヌクレオチド」は、既知の方法（固相技術を用いた、ホスホトリエステル、ホスファイト、またはホスホラミダイト化学など）によって化学的に合成される短鎖、一本鎖または二本鎖のポリデオキシヌクレオチドである。さらなる方法としては、遺伝子の全核酸配列が既知である、またはコード鎖に相補的な核酸の配列が利用可能である場合に使用されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）がある。あるいは、標的アミノ酸配列が既知である場合には、各アミノ酸残基について既知であり、好ましいコード残基を使用して潜在的な核酸配列が推測し得る。オリゴヌクレオチドは、ポリアクリルアミドゲルまたは分子サイジングカラム(molecular sizing columns)でまたは沈殿によって精製することができる。ＤＮＡが非核酸不純物（極性、非極性、イオン性などであり得る）から分離される場合、ＤＮＡは「精製」される。
【０１１０】
本明細書中で使用される、「供給源(source)」または「鋳型(template)」ＶＮＡＲは、その抗原結合配列が本明細書中に記載される基準に従う多様化が実施される鋳型配列として機能する、ＶＮＡＲまたはＶＮＡＲ抗原結合断片を指す。抗原結合配列は、一般的に、ＶＮＡＲ内に、好ましくはフレームワーク領域を含む、少なくとも１つのＣＤＲを含むことが好ましい。
【０１１１】
「転写調節エレメント」は、以下の成分：エンハンサーエレメント、プロモーター、オペレーター配列、リプレッサー遺伝子、および転写終結配列のうちの１以上を含むであろう。
【０１１２】
「形質転換」とは、細胞がＤＮＡを取り込んで「形質転換体」になる過程を意味する。ＤＮＡの取り込みは永続的であっても一過性であってもよい。「形質転換体」は、ＤＮＡに関連する表現型（例えば、ＤＮＡによってコードされるタンパク質によって与えられる抗生物質耐性）の発現によって証明されるように、ＤＮＡを取り込んで維持した細胞である。
【０１１３】
融合タンパク質（ポリペプチド）または異種ポリペプチド（ファージに対して異種）などの、出発または参照ポリペプチド（例えば、供給源ＶＮＡＲまたはそのＣＤＲ）の「変異体(variant)」または「突然変異体(mutant)」は、（１）出発または参照ポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有し、（２）天然または人工突然変異誘発のいずれかによって出発または参照ポリペプチドから誘導されたポリペプチドである。このような変異体としては、例えば、目的のポリペプチドのアミノ酸配列内の残基の欠失、および／または挿入および／または置換がある。例えば、（供給源ＶＮＡＲまたは抗原結合断片中の対応する位置に見出されるアミノ酸に関して）変異アミノ酸(variant amino acid)を有する配列をコードするノンランダムコドンセット(nonrandom codon set)を含むオリゴヌクレオチドを使用して生成される本発明の融合ポリペプチドは、供給源ＶＮＡＲまたは抗原結合断片に関して変異ポリペプチド(variant polypeptide)である。従って、変異ＣＤＲ(variant CDR)は、出発または参照ポリペプチド配列（供給源ＶＮＡＲまたは抗原結合断片のものなど）に関して変異配列を含むＣＤＲを指す。本明細書において、変異アミノ酸は、出発または参照ポリペプチド配列（供給源ＶＮＡＲまたは抗原結合断片のものなど）中の対応する位置のアミノ酸とは異なるアミノ酸を指す。欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせは、最終的な構築物が所望の機能的特徴を有することを条件として、最終的な変異体または突然変異体構築物に到達するためになされ得る。アミノ酸の変化はまた、グリコシル化部位の数または位置を変えるなど、ポリペプチドの翻訳後プロセスを変化させるものであってもよい。コートタンパク質、または供給源ＶＮＡＲのＣＤＲなどの、「野生型」または「参照」配列または「野生型」または「参照」タンパク質／ポリペプチドの配列は、変異ポリペプチドが突然変異(mutation)の導入によって誘導される参照配列であってもよい。一般的に、所定のタンパク質の「野生型」配列は、天然で最も一般的な配列である。
【０１１４】
同様に、「野生型」遺伝子配列は、自然界で最も共通して見られる遺伝子の配列である。突然変異は、自然の過程によってまたは人為的な手段によって「野生型」遺伝子（したがって、それがコードするタンパク質）に導入することができる。このような過程の産物は、元の「野生型」タンパク質または遺伝子の「変異体」または「突然変異体」である。
【０１１５】
ＤＮＡ操作、トランスフェクション方法および培養方法のための一般的な方法は、当業者に周知である。この点に関して、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition) Cold Spring Harbor Publishingを参照されたい。
【０１１６】
ＶＮＡＲの単離
ＶＮＡＲドメインは、標的免疫処置サメ由来の組織を用いて構築されたファージディスプレイライブラリーから得ることができる(Dooley, H., et al. Mol Immunol, 2003. 40(1): p. 25-33; Nuttall, S.D., et al, Proteins, 2004. 55(1): p. 187-97; and Dooley, H., et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2006. 103(6): p. 1846-51)、ＷＯ  ２００３／０１４１６１（参考として援用される）には、サメを免疫処置して、結合ドメインを得るための有用な方法が記載される。
【０１１７】
ＶＮＡＲ結合ドメインはまた、ＶＮＡＲ配列を含む合成ライブラリーから得られ得る。ＷＯ  ２０１４／１７３９５９（参考として援用される）には、ＶＮＡＲライブラリーを開発して、結合ドメインを得るための有用な方法が記載される。
【０１１８】
さらに、ＣＤＲ３を標的とする合成多様性を有するライブラリーを使用して、ＶＮＡＲ構造に基づく結合ドメインを得ることができることが示されている(Nuttall, S.D., et al. Mol Immunol, 2001. 38(4): p. 313-26; Nuttall, S.D., et al. Eur J Biochem, 2003. 270(17): p. 3543-54; Shao, C.Y., et al. Mol Immunol, 2007. 44(4): p. 656-65 and Liu, J.L., et al. BMC Biotechnol, 2007. 7: p. 78; WO2005/118629。
【０１１９】
本発明のＶＮＡＲＳは、ヒトに投与された場合に、潜在的な免疫原性を減少させるようにさらに適合され得る（ヒト化）。
【０１２０】
抗体可変ドメイン(antibody variable domains)のヒト化は、ヒト化形態がヒト被検者に投与された場合に望ましくない免疫学的反応を回避し得るように、治療的に有用な標的に対して、ヒト以外の種において、産生された抗体を改変するための当該分野で周知の技術である。ヒト化に関連する方法は、Almagro J.C and William Strohl W. Antibody Engineering: Humanization, Affinity Maturation, and Selection Techniques in Therapeutic Monoclonal Antibodiesに：Bench to Clinic. Edited by An J. 2009 John Wiley & Sons, IncからおよびStrohl W.R. and Strohl L.M., Therapeutic Antibody Engineering, Woodhead Publishing 2012に概説される。
【０１２１】
ＩｇＮＡＲは免疫グロブリンと比較して異なる起源を有し、免疫グロブリン可変ドメインと比較して配列相同性が非常に少ないが、免疫グロブリン可変ドメインとＩｇＮＡＲ可変ドメインとの間にはいくつかの構造的類似性があり、その結果、類似のプロセスがＶＮＡＲドメインに適用され得る。例えば、ＷＯ  ２０１３／１６７８８３（参考として援用される）には、ＶＮＡＲのヒト化の説明が提供される、Kovalenko O.V., et al. J Biol Chem. 2013. 288(24): p. 17408-19をも参照のこと。
【０１２２】
タンパク質の発現
本発明の抗原特異的抗原結合分子またはマルチドメイン特異的結合分子をコードする核酸配列は、核酸構築物中に存在し得る。このような核酸構築物は、ベクター、例えば、発現ベクターの形態であってもよく、とりわけ、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクター、例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入エレメント、酵母染色体エレメント、ウイルス、例えばバキュロウイルス、ＳＶ４０等の、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスに由来するベクター、ならびに、例えばコスミドおよびファージミドなどの、プラスミドおよびバクテリオファージ遺伝エレメントに由来するものなどの、これらの組み合わせに由来するベクターが挙げられる。一般的に、宿主でポリペプチドを発現させるために核酸を維持、増殖または発現させるのに適した任意のベクターを、この点において発現のために使用することができる。
【０１２３】
核酸構築物は、適切には、核酸の発現を制御するプロモーターまたは他の調節配列を適切に含み得る。核酸の発現を制御するプロモーターおよび他の調節配列は、同定されており、当該分野で既知である。当業者は、プロモーター全体または他の調節配列を利用する必要がないかもしれないことを知っているであろう。最小限の必須調節エレメントのみが必要とされ、そして実際、このようなエレメントは、キメラ配列または他のプロモーターを構築するために使用され得る。もちろん、必須の要件は、組織および／または時間的特異性を保持することである。プロモーターは、任意の適切な既知のプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＣＭＶ即時初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０プロモーター、またはレトロウイルスＬＴＲのプロモーター（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）、およびメタロチオニンプロモーター（例えば、マウスメタロチオニン−Ｉプロモーター）であり得る。プロモーターは、プロモーター活性にかかわる(comcompromised for)最小限（ＴＡＴＡエレメントなど、必要であればエンハンサーエレメントを含まない）、例えばＣＭＶプロモーターの最小配列を含んでもよい。好ましくは、プロモーターは核酸配列に隣接する。
【０１２４】
本明細書中に記載されるように、核酸構築物は、ベクターの形態であり得る。ベクターは、しばしば、それらでトランスフェクトされた（または形質転換された）細胞の選択を可能にし、好ましくは、異種ＤＮＡを組み込むベクターを含む細胞の選択を可能にする、１以上の発現マーカーを含む。適切な開始および停止シグナルが一般的に存在するであろう。
【０１２５】
ベクターは、ｐＥＴなどの任意の適切な発現ベクターであってもよい。ベクターは、必要であれば追加の制御配列、例えば、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性、蛍光など）、転写制御配列およびプロモーター（開始配列および終結配列を含む）を含み得る。
【０１２６】
プロモーターは、本発明の核酸配列によってコードされるタンパク質の発現を引き起こすのに適切なプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ｈＰＧＫ）プロモーター）であり得る。
【０１２７】
このようなベクターは、宿主細胞中に存在し得る。本発明の核酸構築物の発現のための適切な宿主細胞の代表的な例としては、ウイルスベクターへの核酸のカプセル化を可能にするウイルスパッケージング細胞(virus packaging cells)；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｅ．  ｃｏｌｉ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ等の、細菌細胞; 酵母細胞、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ細胞などの、単一細胞；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９細胞などの、昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＰＨＫ．２９３、ならびにＢｏｗｅｓメラノーマ細胞および他の適切なヒト細胞などの、動物細胞；ならびに植物細胞、例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａが挙げられる。適切には、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞などの、真核細胞である。
【０１２８】
宿主細胞への発現ベクターの導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン−脂質媒介トランスフェクション(cationic - lipid-mediated transfection)、エレクトロポレーション、トランスダクション、スクレープロード(scrape loading)、弾道導入(ballistic introduction)、感染または他の方法によって達成され得る。このような方法は、Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)などの、多くの標準的な実験室マニュアルに記載されている。
【０１２９】
成熟タンパク質は、適切なプロモーターの制御下で、哺乳動物細胞（ＣＨＯ細胞、酵母、細菌、または他の細胞など）などの宿主細胞で発現され得る。無細胞翻訳系を用いて、本発明の第３の態様の核酸構築物に由来するＲＮＡを用いてこのようなタンパク質を生産してもよい。原核生物および真核生物宿主と共に使用するための適切なクローニングおよび発現ベクターは、Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に記載される。
【０１３０】
本発明はまた、本明細書中に記載される本発明のポリヌクレオチドおよび／またはベクターのいずれかを含む宿主細胞を提供する。本発明によれば、本発明の抗原特異的抗原結合分子またはマルチドメイン特異的結合分子の製造方法であって、本明細書に規定されるように適切な宿主細胞中で前記分子をコードする核酸配列を発現させる工程を含む方法が提供される。
【０１３１】
タンパク質は、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、レクチンおよび／またはヘパリンクロマトグラフィーを含む標準的な方法によって組換え細胞培養物から回収および精製することができる。治療を目的として、例えば、組換えベクターの形態の、核酸構築物を、Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に記載されるようなカラムクロマトグラフィー手段によるなどの、当技術分野で既知の技術によって精製することができる。
【０１３２】
したがって、本発明のこの態様は、宿主細胞での発現による融合タンパク質の組換え的産生、ペプチド結合(peptide bond linkage)、水素もしくは塩結合または化学的架橋の手段による発現融合タンパク質の精製を含む、本発明の融合タンパク質の調製方法に及ぶ。本発明のこの態様のいくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ペプチドが可能である水素もしくは塩結合または多量体化、例えば、二量体化もしくは三量体化を使用して調製することができる。
【０１３３】
抗原特異的抗原結合分子またはマルチドメイン特異的結合分子は、本明細書に記載されるように分子の生産のためのプロセスの間の精製および／または単離を補助し得る使用前に切断される追加のＮ末端またはＣ末端配列を含んでもよい。例えば、分子のＣ末端の（Ａｌａ）3（Ｈｉｓ）6。
【０１３４】
いくつかの、例えば、５〜１０、または１〜５、または１〜３、２、１、または０のアミノ酸残基が任意の組み合わせで置換、欠失、または付加されるタンパク質のアミノ酸配列を有する変異体、類似体、誘導体および断片もまた、本発明に含まれる。本発明のタンパク質の特性および活性を変化させないサイレント置換、付加および欠失がこれらの中で特に好ましい。また、本発明のタンパク質の特性が元の形態と比較して変異形態で保存される保存的置換も、この点で特に好ましい。また、変異体としては、本発明に係る抗原特異的抗原結合分子を含む融合タンパク質がある。
【０１３５】
上記したように、本発明の変異体の例としては、１以上のアミノ酸が１以上の他のアミノ酸で置換されているタンパク質がある。当業者は、種々のアミノ酸が類似の特性を有することを知っている。物質の１以上のこのようなアミノ酸は、しばしば、その物質の所望の活性を妨害または排除することなく、１以上の他のこのようなアミノ酸によって置換され得る。このような置換は、「非保存的」アミノ酸置換(“non-conservative” amino acid substitutions)と呼ばれ得る。
【０１３６】
したがって、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンのアミノ酸は、しばしば、互いに置換され得る（脂肪族側鎖を有するアミノ酸）。これらの可能な置換のうち、グリシンおよびアラニンが互いに置換するために使用され（それらは比較的短い側鎖を有するため）、バリン、ロイシンおよびイソロイシンが互いに置換するために使用される（それらは疎水性であるより大きな脂肪族側鎖を有するため）ことが好ましい。しばしば互いに置換され得る他のアミノ酸としては、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；リジン、アルギニンおよびヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；アスパラギン酸およびグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）；アスパラギンおよびグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；ならびにシステインおよびメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）が挙げられる。この性質の置換はしばしば、「保存的」または「半保存的」アミノ酸置換と呼ばれる。
【０１３７】
アミノ酸の欠失または挿入はまた、上記の融合タンパク質のアミノ酸配列に対してなされ得る。従って、例えば、ポリペプチドの活性に対して実質的な効果を有さないまたは少なくともこのような活性を排除しないアミノ酸は欠失され得る。このような欠失は、活性は維持したままポリペプチドの全長および分子量を減少させることができるので、有利であり得る。これにより、特定の目的に必要なポリペプチドの量を減少させることができる、例えば、用量レベルを減少させることができる。
【０１３８】
上記の融合タンパク質の配列に対するアミノ酸の挿入もまた、なされ得る。これは、本発明の物質の特性を変化させるために（例えば、融合タンパク質に関して上記で説明したように、同定、精製または発現を補助するために）行うことができる。
【０１３９】
本発明の融合タンパク質の配列に対するアミノ酸の変更は、適切な技術を使用して、例えば、部位特異的突然変異誘発を使用することによって、なされ得る。
【０１４０】
本発明の範囲に含まれるアミノ酸の置換または挿入は、天然に存在するまたは天然に存在しないアミノ酸を使用してなされ得ると理解されるべきである。天然または合成アミノ酸が使用されるか否かにかかわらず、Ｌ−アミノ酸のみが存在することが好ましい。
【０１４１】
本発明に係るタンパク質は、Ｎ末端および／またはＣ末端アミノ酸配列をさらに有し得る。このような配列は種々の理由（例えば、グリコシル化）のために提供され得る。
【０１４２】
融合タンパク質は、本発明の抗原特異的抗原結合分子が融合タンパク質に構造エレメントを提供する異種ペプチドまたはタンパク質配列に融合されてなり得る。他の実施形態では、融合タンパク質は、本発明の抗原特異的抗原結合分子が生物学的活性を有する分子と融合されてなり得る。この分子は、ペプチドもしくはタンパク質配列、または別の生物学的に活性な分子であり得る。
【０１４３】
例えば、抗原特異的抗原結合分子は、ポリアミノ酸配列、例えば、複数のヒスチジン残基もしくは複数のリジン残基（適切には２、３、４、５、もしくは６残基）、または免疫グロブリンドメイン（例えば、Ｆｃドメイン）であり得る異種ペプチド配列に融合され得る。
【０１４４】
異種ペプチド配列への言及には、他の哺乳動物種（例えば、マウスおよびヒト）由来の配列、ならびに他のＶＮＡＲドメインに由来する異種ペプチド配列が含まれる。
【０１４５】
融合タンパク質が本発明の抗原特異的抗原結合分子が生物学的活性を有する分子と融合されてなる場合、生物学的に活性な部分は、酵素、免疫グロブリン、サイトカインまたはその断片のような生物学的活性を有するペプチドまたはタンパク質であり得る。あるいは、生物学的に活性な分子は、抗生物質、抗癌剤、ＮＳＡＩＤ、ステロイド、鎮痛剤、毒素または他の薬学的に活性な薬剤であり得る。抗癌剤には、細胞傷害性または細胞増殖抑制性の薬剤が含まれ得る。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、本発明の抗原特異的抗原結合分子が別の免疫グロブリン可変または定常領域、または本発明の別の抗原特異的抗原結合分子に融合されてなり得る。換言すれば、可変長の本発明の抗原特異的抗原結合分子、例えば、二量体、三量体、四量体、またはより高い多量体の融合体（すなわち、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、または十量体、またはそれ以上）。特定の実施形態では、これは単量体ＶＮＡＲサブユニットの多量体として表すことができる。
【０１４７】
本発明の融合タンパク質において、抗原特異的抗原結合分子は、融合タンパク質の他のエレメントに、直接融合されてもまたはリンカー部分を介して連結されてもよい。リンカーは、ペプチド、ペプチド核酸、またはポリアミド結合であり得る。適切なペプチドリンカーとしては、（Ｇｌｙ）4、（Ｇｌｙ）5、（Ｇｌｙ）4Ｓｅｒ、（Ｇｌｙ）4（Ｓｅｒ）（Ｇｌｙ）4、またはそれらの組み合わせもしくはそれらの多量体（例えば、二量体、三量体、四量体またはそれ以上）などの、複数のアミノ酸残基、例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０または２５アミノ酸を含み得る。例えば、好適なリンカーは（ＧＧＧＧＳ）3であってもよい。別のリンカーとしては、（Ａｌａ）3（ＨＩｓ）6またはその多量体が挙げられる。ＨＧＭＰによって提供されるＢＬＡＳＴコンピュータープログラムのデフォルトパラメーターを使用して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列もまた含まれる。
【０１４８】
本発明に従って記載されるように構築されたベクターは、増幅および／または発現のために宿主細胞に導入される。ベクターは、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿などの標準的な形質転換法を用いて宿主細胞に導入することができる。ベクターがウイルスのような感染性粒子である場合には、ベクター自体が宿主細胞への侵入を提供する。標準的な手順による遺伝子融合物をコードする複製可能な発現ベクターを含む宿主細胞のトランスフェクションおよびファージ粒子の産生により、融合タンパク質がファージ粒子の表面上に提示されるファージ粒子が提供される。
【０１４９】
複製可能な発現ベクターは、種々の方法を用いて宿主細胞に導入される。一実施形態では、ベクターは以下を使用して細胞に導入され得る：必要であれば約３７℃で約６〜４８時間（またはＯＤ６００＝０．６〜０．８になるまで）、標準的な培養ブロス中で培養して細胞を成育させた後、ブロスを遠心分離して上清を除去する（例えば、デカントする）。最初の精製は、好ましくは緩衝溶液（例えば、１．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ７．４）中で細胞ペレットを再懸濁した後、再遠心分離および上清除去を行うことによる。得られた細胞ペレットを希釈グリセロール（例えば、５〜２０％  ｖ／ｖ）に再懸濁し、再び遠心分離して、細胞ペレットを形成し、上清を除去する。最終細胞濃度は、細胞ペレットを水または希釈グリセロール中に所望の濃度になるように再懸濁することによって得られる。
【０１５０】
エレクトロポレーション中により高いＤＮＡ濃度（約１０倍）を使用することにより、形質転換効率を増加させ、宿主細胞に形質転換されるＤＮＡの量を増加させる。また、高い細胞濃度を使用することにより、効率を増加させる（約１０倍）。移入されたＤＮＡの量が多いほど、より大きな多様性を有し、コンビナトリアルライブラリーのより多数の独特なメンバーを表すより大きなライブラリーが生成される。形質転換された細胞は、一般的に、抗生物質含有培地で成育することにより選択される。
【０１５１】
医薬組成物および用途
本発明によれば、本発明の抗原特異的抗原結合分子またはマルチドメイン特異的結合分子の医薬組成物が提供される。このような組成物は、前記抗原特異的抗原結合分子を含む融合タンパク質を含む。
【０１５２】
医薬組成物はまた、治療用タンパク質に融合された本発明の抗原特異的抗原結合分子、またはその断片を含んでもよい。治療用タンパク質は、ホルモン、成長因子（例えば、ＴＧＦβ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、肝細胞成長因子、インスリン様成長因子、胎盤成長因子）；分化因子；血液凝固因子（例えば、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、フォンヴィレブランド因子(VonWillebrand Factor)またはプロテインＣ）；または血液凝固カスケード由来の別のタンパク質（例えば、アンチトロンビン）；サイトカイン、例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２もしくはＩＬ−３３）、またはインターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子（ＴＧＦ）、ＩＦＮ−γ誘導因子（ＩＧＩＦ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ、例えば、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３）；インターロイキンレセプターアンタゴニスト（例えば、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−ＲＩＩ）；ケモカイン（例えば、ＭＩＰ（マクロファージ炎症性タンパク質）、例えば、ＭＩＰ１αおよびＭＩＰ１β；ＭＣＰ（単球走化性タンパク質）、例えば、ＭＣＰ１、２または３；ＲＡＮＴＥＳ（活性化、正常なＴ細胞の発現と分泌で調節((regulated upon activation normal T-cell expressed and secreted)）；栄養因子；サイトカインインヒビター；サイトカインレセプター；酵素、例えば、フリーラジカル捕捉酵素(free-radical scavenging enzyme)、例えば、スーパーオキシドジスムターゼまたはカタラーゼまたはプロドラッグ変換酵素（例えば、アンギオテンシン変換酵素、デアミナーゼ、デヒドロゲナーゼ、レダクターゼ、キナーゼおよびホスファターゼ）；ペプチド模倣体(peptide mimetic)；プロテアーゼインヒビター；メタロプロテイナーゼの組織インヒビター（ＴＩＭＰ、例えば、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ２、ＴＩＭＰ３またはＴＩＭＰ４）またはセルピン(serpin)（セリンプロテアーゼのインヒビター）であってもよい。
【０１５３】
本発明の他の実施形態では、融合タンパク質中の治療用タンパク質は、抗体、またはＦａｂ、Ｆｃ、Ｆ（ａｂ’）2（化学的に連結されたＦ（ａｂ’）2鎖を含む）、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ(その多量体形態、すなわち、ｄｉ−ｓｃＦｖ、またはｔｒｉ−ｓｃＦｖを含む）、ｓｄＡｂ、またはＢｉＴＥ(二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）などの、その操作された断片であってもよい。抗体断片はまた、可変ドメインおよびその断片、ならびに他のＶＮＡＲ型断片（ＩｇＮＡＲ分子）を含む。
【０１５４】
医薬組成物は、多数の本発明の抗原特異的抗原結合分子、例えば、二量体、三量体、またはより高次の多量体、すなわち、２、３、４、５、６、７、または８量体が治療用タンパク質に融合されて構成され得る。
【０１５５】
本発明の抗原特異的抗原結合分子の治療用タンパク質への融合は、タンパク質上の任意の好都合な部位で行われてもよく、Ｎ−末端、Ｃ−末端および／またはＮ−／Ｃ−末端融合であってもよい。本発明の一実施形態では、本発明の抗原特異的抗原結合分子の融合は、治療タンパク質のＮ末端およびＣ末端の両方に対するものである。
【０１５６】
本発明の医薬組成物は、適切かつ薬学的に許容できる担体、希釈剤、アジュバントまたは緩衝溶液を含み得る。組成物は、さらなる薬学的に活性のある薬剤を含み得る。そのような担体としては、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、リポソーム、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組み合わせが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０１５７】
このような組成物は、示されるような追加の薬学的に活性のある薬剤を含み得る。追加の薬剤は、治療化合物、例えば、抗炎症薬、細胞傷害剤、細胞増殖抑制剤または抗生物質であってもよい。そのような追加の薬剤はそれを必要とする患者への投与に適した形態で存在してもよく、そのような投与は同時、別々、または連続であってもよい。成分は、必要に応じて説明書を含むことができるキットの形態で調製されてもよい。
【０１５８】
医薬組成物は、例えば、とりわけ、経口、局所、静脈内、筋肉内、鼻腔内、または皮内経路による投与を含む、患者の疾患を治療するのに有効な任意の有効で便利な様式で投与することができる。治療においてまたは予防として、活性のある薬剤は、注射可能な組成物として、例えば、好ましくは等張の、無菌水性分散液として個体に投与され得る。
【０１５９】
哺乳動物、特にヒトへの投与のために、活性のある薬剤の１日の用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重以上、典型的には約１ｍｇ／ｋｇ以上、２ｍｇ／ｋｇ以上または４ｍｇ／ｋｇ以下であると予想される。いずれにせよ、医師が個体に最も適した実際の投薬量を決定するが、この量は個体の年齢、体重、性別および応答を含む因子に依存するであろう。上記の用量は、平均的な場合の例示である。もちろん、より高い用量またはより低い用量が有益である場合もあり得、そのような場合も本発明の範囲内である。
【０１６０】
本発明によれば、医薬に使用するための本発明の抗原特異的抗原結合分子またはマルチドメイン特異的結合分子が提供される。したがって、本発明のこの態様は、それを必要とする患者における疾患の治療のための医薬の製造における本発明の抗原特異的抗原結合分子またはマルチドメイン特異的結合分子のそのような使用に及ぶ。本発明の抗原特異的抗原結合分子はまた、本発明の薬剤組成物に関連して上記で規定されるような特異的結合分子を含む融合タンパク質を調製するために使用できる。
【０１６１】
このような使用はまた、治療を必要とする患者における疾患の治療方法であって、本発明の抗原特異的抗原結合分子またはマルチドメイン特異的結合分子を含む本明細書中に規定されるような医薬組成物の治療的に有効な投薬量を患者に投与することを含む方法を包含する。
【０１６２】
本明細書で使用される「治療(treatment)」という用語は、ヒトまたは非ヒト動物に利益を与えることができる任意のレジメを含む。獣医学における「非ヒト動物」の治療は、ウマを含む家畜およびコンパニオンアニマル（例えば、ネコおよびイヌ）およびヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシおよびウマ科のメンバーを含む農場／農業動物の治療に及ぶ。治療は、現在の症状(condition)または障害(disorder)に関する治療的処置であっても、または予防（予防的処置）であってもよい。治療は、遺伝性または後天性病気の治療であってもよい。治療は、急性または慢性状態の治療であってもよい。治療は、炎症および／または癌に関連する症状／障害であってもよい。本発明の抗原特異的抗原結合分子またはマルチドメイン特異的結合分子は、変形性関節症、強皮症、腎疾患、関節リウマチ、炎症性腸疾患、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化症、または任意の炎症性疾患を含むがこれらに限定されない障害の処置に使用され得る。
【０１６３】
本発明の抗原特異的抗原結合分子またはマルチドメイン特異的結合分子はまた、患者における疾患状態の性質を調べるために使用され得る。抗原特異的抗原結合分子またはマルチドメイン特異的結合分子は、Ｘ線、ガンマ線、またはＰＥＴスキャニングなどの画像診断技術(imaging techniques)を用いて被検体の身体における疾患部位の画像を調製するために使用され得る。したがって、本発明は、適切に検出可能に標識された抗原特異的抗原結合分子またはマルチドメイン特異的結合分子を被検体に投与し、続いて被検体の身体をスキャンすることを含む、被検体における疾患の部位を画像診断する(imaging)方法に及ぶことができる。あるいは、被検体に前記分子を投与することにより、分子の投与後に被検体からのサンプルを分析することによって、試験結果が得られ得る。このような実施形態は、本発明の抗原特異的抗原結合分子またはマルチドメイン特異的結合分子の投与を含む、被検体における病気(disease)または医学的状態の診断方法を含み得る。本発明のマルチドメイン特異的結合分子は、特に同じ抗原上の異なるエピトープを標的とする複数のＶＮＡＲが使用される場合に、診断感度に関して特に有用であり得る。
【０１６４】
結合の測定
標的へのＶＮＡＲの結合の検出および測定は、ＥＬＩＳＡおよび表面プラズモン共鳴などの当該分野で周知の多くの方法で測定することができる。
【０１６５】
機能活性
本発明のＶＮＡＲは、サイトカインなどの分子への結合及び当該分子の生物学的効果の中和、リガンド結合を妨げるレセプターへの結合、または結合後の生物学的効果を引き起こすことを含む、多くの方法で機能し得る。
【０１６６】
結合ドメインの機能的活性を測定する方法は、当該分野で知られている。
【０１６７】
以下の非限定的な実施例によって、本発明をさらに詳細に説明する。
【０１６８】
実施例１：特異的抗原結合ＶＮＡＲの単離
Ａ．ＴＮＦ結合ＶＮＡＲ
免疫処置および選択
コモリザメ(Nurse sharks)［Ｇｉｎｇｌｙｍｏｓｔｏｍａ  ｃｉｒｒａｔｕｍ］を、０．１％（ｗ／ｖ）トリカインメタンスルホネート(tricaine methanesulfonate)［ＭＳ−２２２］を含む人工海水を含有する容器に入れた。所望のレベルの麻酔を行った後、コモリザメを免疫処置または採血(bleeding)のため取り出した。完全フロイントアジュバント［ＣＦＡ］中に乳化させたｈＴＮＦα［２５０μｇ］を、２０ゲージ針を用いてサメの横ひれ(lateral fin)に注射した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）における可溶性抗原［試料０．４５μＭ滅菌濾過］として、ブーストを４週間隔で尾静脈に静脈内投与した。血液サンプルを、尾静脈から２００μｌのブタヘパリン［ＰＢＳ中１０００Ｕ／ｍｌ］を含む３０ｍｌシリンジ中に集めた。血液サンプルを２０００ｒｐｍで１０分間遠心して、血漿から血液細胞を分離した。血漿上清画分を、ＲＮＡ安定化緩衝液を含む滅菌チューブ中に注意深く除去し、−８０℃で保存した。
【０１６９】
サメ血清中のｈＴＮＦα特異的ＩｇＮＡＲの検出
ＥＬＩＳＡプレートを１μｇ／ｍｌのｒｈＴＮＦαでコーティングし、３７℃で１時間インキュベートした後、４％（ｗ／ｖ）ＭＰＢＳ中で３７℃で１時間ブロッキングした。サメ血清［プレブリード(pre-bleed)、ブリード４および５］を、１：２希釈系列で所定のウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ中で１：２００の希釈率で１００μｌ／ウェルの精製抗コモリザメ(Nurse shark)ＩｇＮＡＲモノクローナル抗体［ＧＡ８］と共にインキュベートした。結合シグナルは０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０  ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中で１：２０００の希釈率で抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰを添加することによって生成し、室温で１時間インキュベートした。プレートを、各工程後にＰＢＳＴで３回洗浄し、抗マウスＩｇＧ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗体［Ｓｉｇｍａ］とのインキュベーション後にさらに３回ＰＢＳで洗浄した。ＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質(SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate)［Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］を添加することによってプレートを発色させ、１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させ、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。
【０１７０】
各追加免疫(boost)後に得られた血清を用いて結合性ＥＬＩＳＡ(binding ELISA)によって、各免疫処置追加免疫(immunisation boost)後のｒｈＴＮＦα特異的ＩｇＮＡＲ応答を測定した。ＰＢＳ中のハイブリドーマ組織培養上清として希釈した、マウスモノクローナル抗コモリザメＩｇＮＡＲ抗体であるＧＡ８を検出抗体として使用した(Haines et al., 2005; Muller, et al. 2012)。結果から、ブリード４および５に示されるように、免疫処置後は経時的にＩｇＮＡＲが増加する説得力のある傾向が示され、また、プレブリードサンプルにおいて見られるバックグラウンド応答から、免疫処置前には有意なｒｈＴＮＦα特異的ＩｇＮＡＲ応答がないことが示唆された［図１］。
【０１７１】
ＰＢＬからの全ＲＮＡ単離およびＰＣＲ増幅
末梢血リンパ球［ＰＢＬ］を、ＩｇＮＡＲ応答が最もよかったブリード［ブリード５］の血漿から採取し、全ＲＮＡを調製した。集めたＰＢＬからの全ＲＮＡを、Superscript III First strand synthesis supermix [Invitrogen]を用いてｃＤＮＡ合成用の鋳型として約２μｇ／μｌで使用した。フレームワーク特異的プライマーである、ＮＡＲＦ４Ｆｏｒ１［５’−ＡＴＡ  ＡＴＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＡ  ＴＴＣ  ＡＣＡ  ＧＴＣ  ＡＣＧ  ＡＣＡ  ＧＴＧ  ＣＣＡ  ＣＣＴ  Ｃ−３’］（配列番号７４）およびＮＡＲＦ４Ｆｏｒ２［５’−ＡＴＡ  ＡＴＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＡ  ＴＴＣ  ＡＣＡ  ＧＴＣ  ＡＣＧ  ＧＣＡ  ＧＴＧ  ＣＣＡ  ＴＣＴ  Ｃ−３’］（配列番号７５）を用いて、ｃＤＮＡを得た（Dooley, H., et al, Mol. Immunol, 2003. 40(1): p. 25-33を参照のこと）。ｃＤＮＡ合成後、共通フレームワークワン特異的プライマー(common framework one specific primer)である、ＮＡＲＦ１Ｒｅｖ［５’−ＡＴＡ  ＡＴＡ  ＡＧＧ  ＡＡＴ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣＴ  ＣＧＡ  ＧＴＧ  ＧＡＣ  ＣＡＡ  ＡＣＡ  ＣＣＧ−３’］（配列番号７６）を導入し、３段階ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅プロトコールを用いてＩｇＮＡＲ  Ｖ領域ＤＮＡを増幅した。得られた約４００塩基対のＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルで泳動し、ＮＡＲ  Ｖ領域を切り出し、精製した[QIAquick purification kit, QIAGEN]。精製したＤＮＡを、制限酵素ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ[New England Biolabs]を用いてプライマーコード制限部位［下線］で消化し、再精製した。
【０１７２】
ライブラリー構築
ファージミドベクターｐＨＥＮ２を制限酵素ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、ＰＣＲ精製し[QIAquick PCR purification]、同様に調製したＰＣＲ産物に連結した。連結した材料を、エレクトロポレーション−コンピテント大腸菌ＴＧ１細胞(Electroporation-competent E. coli TG1 cells)［Lucigen］に形質転換した。形質転換細胞を、２％グルコース［ｗ／ｖ］、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＴＹＥ寒天プレート上に播種し、３７℃で一晩成育させた。ライブラリーサイズを計算し、コロニーをプレートから掻き取り、ライブラリーストックのアリコートを−８０℃で保存した。
【０１７３】
ファージディスプレイの選択
ＯＤ６００が０．１に相当するライブラリーストックの単一アリコートを、２％グルコース［ｗ／ｖ］、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＴＹ増殖培地に添加し、３７℃で対数期中期［ＯＤ６００が０．４〜０．６］になるまで増殖させた後、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージ[New England Biolabs]で感染させた。ライブラリーの発現を、２×ＴＹ培地、０．２％グルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌカナマイシン中で、３０℃で一晩行った。ファージをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で培養上清から沈殿させ、バイオパニング(bio-panning)に使用した。ライブラリーを、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０ストレプトアビジンビーズ[Dynabeads, Invitrogen]上に捕捉されたビオチン化ｒｈＴＮＦαに対してパニングした。ライブラリファージおよびＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０ストレプトアビジンビーズを、別々に、室温で回転させながら、ブロック液［ＰＢＳにおいて、３％（ｗ／ｖ）ミルク、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ］で１時間予めブロックした。ビオチン化−ｒｈＴＮＦα［４００ｎＭ］をブロックしたビーズに添加し、室温で回転させながら１時間インキュベートした。異なるチューブにおいて、ライブラリーファージを、予めブロックしたストレプトアビジンビーズと共に、室温で１時間回転させながらインキュベートした。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ磁気ラック(Dynabeads magnetic rack)を用いて非結合ファージを回収し、回収したファージをここでは非選択ファージと呼ぶ。室温で回転させながら、１時間、ブロックされたビーズと一緒にインキュベートすることにより、ファージを選択解除した(deselected)。ビオチン−ｒｈＴＮＦα修飾ビーズを、室温で回転させながら、非選択ファージと１時間インキュベートした。ビーズを５×ＰＢＳＴおよび５×ＰＢＳで洗浄した後、１００ｍＭトリエチルアミン（ＴＥＡ）４００μｌで厳密に８分間溶出し、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）２００μｌを添加することによって中和した。対数中期の大腸菌ＴＧ１細胞［１０ｍｌ］を、３７℃で３０分間、４００μｌの溶出ファージで感染させた。次に、２％グルコース（ｗ／ｖ）、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＴＹＥ寒天プレート上で３７℃で一晩増殖させた。さらに３ラウンドの選択を行い、ビオチン−ｒｈＴＮＦαの濃度を２００ｎＭに低下させることにより、ラウンド３および４においてストリンジェンシーを増加させた。
【０１７４】
クローンのスクリーニングおよび選択
抗原結合モノクローナルファージの富化を、４％［ｗ／ｖ］ミルク−ＰＢＳでブロックした、１μｇ／ｍｌのｒｈＴＮＦαでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを用いて評価した。結合は、抗Ｍ１３−ＨＲＰ結合モノクローナル抗体[GE Healthcare]を用いて検出した。また、ストレプトアビジンおよびＨＳＡ被覆ＥＬＩＳＡプレートに対する選択性および特異性について、それぞれモノクローナルファージを分析した。
【０１７５】
ライブラリーをｒｈＴＮＦαに対する４回の反復パニングに供した。バイオパニング抗原濃度はラウンド１およびラウンド２では一定に保ったが、高親和性バインダーを優先するために、次のラウンドのパンニングでは半減した。陽性モノクローナルファージ結合体の富化(Enrichment)を、ＥＬＩＳＡによるｒｈＴＮＦα結合に関するバイオパニングの各ラウンドの終わりに評価した。予め選択されたクローンからラウンド２までは抗原結合の着実な増加が観察され、ラウンド３および４後にモノクローナルファージ結合体の数が減少した。ｒｈＴＮＦαモノクローナル結合体は、ラウンド０［予め選択されたライブラリ］での約６％［１１／１８４］からラウンド２後の９９．４６％［１８３／１８４］にまで増加した。
【０１７６】
ライブラリーパニングから多数のユニークな配列が同定された。これらには、Ｄ１、Ｃ４およびＢ４と称されるＶＮＡＲがある。
【０１７７】
【化２３】
2020535811.tif 000024
【０１７８】
ＣＤＲ１およびＣＤＲ３におけるシステイン（Ｃ）残基（二重下線）は、タイプＩＩ  ＶＮＡＲに典型的であり、ＦＷ１およびＦＷ３ｂにおけるシステイン（一重下線）間の標準的な免疫グロブリンスーパーファミリー架橋(canonical Immunoglobulin superfamily bridge)に加えて第２のジスルフィド架橋を形成することが観察される。
【０１７９】
ＴＮＦαに結合するＶＮＡＲの発現
ＳＨｕｆｆｌｅ細胞の細胞質における可溶性ＶＮＡＲタンパク質の調製
モノクローナルファージスクリーニングから同定された目的のＩｇＮＡＲ  Ｖ領域インサートを、ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素部位を介して発現ベクターｐＥＴ２８ｂ（＋）(Novagen)にクローニングした。ＶＮＡＲ  ＤＮＡを（QIAprep miniprep kit, QIAGENを用いて）大腸菌ＴＧ１培養物から調製し、ｉｎ−ｈｏｕｓｅ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ  ｐａｉｒ  ＸｂａＩ＿ＮＡＲＦＷ１＿＃１２７（配列番号２６）およびＥｃｏＲＩ＿ｓｔｏｐ＿ｍｙｃ＿＃１２９（配列番号２９）を用いてＰＣＲ増幅して、それぞれクローニング部位ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩを導入する一方、プライマー配列番号２９を組み込んだｃ−ｍｙｃ(primer SEQ ID 29 incorporated c-myc)、６ｘヒスチジンタグおよび終止コドンをＶＮＡＲ遺伝子配列に導入した。精製したＶＮＡＲ  ＤＮＡ  ＰＣＲ産物およびｐＥＴ２８ｂ（＋）プラスミドＤＮＡを、５０Ｕ  ＸｂａＩおよび１０Ｕ  ＥｃｏＲＩ−ＨＦで、３７℃で２時間消化した。消化サンプルを精製し、ライゲーションし、エレクトロコンピテン大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｔ７  Ｅｘｐｒｅｓｓ細胞[New England Biolabs]に形質転換し、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＴＹＥ寒天プレート上で選択した。ＶＮＡＲ抗ｈＴＮＦα−Ｄ１、Ｃ４およびＢ４融合タンパク質を、３０℃でのＩＰＴＧでの誘導に際してＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）細胞の細胞質において発現させた。細胞を遠心分離によって回収し、細胞ペレットをＢｕｇｂｕｓｔｅｒ（商標）タンパク質抽出試薬[Novagen]で処理して、細胞を溶解し、可溶性タンパク質を放出させた。ＶＮＡＲ可溶性タンパク質を、ヘキサ−ヒスチジンテールを介して固定化金属アフィニティークロマトグラフィー[IMAC]によって精製し、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８でＩＭＡＣ樹脂から溶出させた。タンパク質サンプルを、使用前にＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）で透析した。タンパク質濃度をUltraspec 6300 pro UV/Visible spectrophotometer [Amersham, Biosciences]を用いて測定した。全精製タンパク質をクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥで可視化した。精製されたＶＮＡＲ単量体タンパク質は約１４ｋＤａの単一バンド［ヘキサヒスチジンおよびｃ−ｍｙｃタグを含む］として移動し、タンパク質凝集は認められなかった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに基づく純度は約９０％と推定された。
【０１８０】
タンパク質の完全性および純度の決定
変性ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［ＳＤＳ−ＰＡＧＥ］を用いて、精製タンパク質の純度およびサイズを評価した。タンパク質サンプルを、５％  β−メルカプトエタノールを含有するＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳサンプルバッファー[Life Technologies]中で調製し、９５℃に５分間加熱した。変性タンパク質サンプルを、ＭＥＳ  ＳＤＳ泳動緩衝液に浸漬したＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル[Life Technologies]上にのせ、電気泳動を、１６０ボルトで５５分間行った。全範囲の組換えタンパク質分子量マーカー[GE Healthcare]を分子量ラダー標準物質として使用した。ゲルを蒸留水で洗浄し、クーマシーブルーで１時間染色した後、蒸留水中で一晩脱染色した。
【０１８１】
選択性および特異性の決定
結合の特異性および選択性を、１μｇ／ｍｌ  ビオチン−ＴＮＦおよびｒｈＴＮＦα、または１０μｇ／ｍｌ  ＨＳＡ、ＢＳＡ、ストレプトアビジン、一本鎖ＤＮＡ、サイログロブリンもしくはリゾチームのいずれかで被覆したＥＬＩＳＡプレートで測定した。ＥＬＩＳＡプレートを４％［ｗ／ｖ］％のミルク−ＰＢＳで適切にブロッキングし、タンパク質サンプルを１μｇ／ｍｌのトップ濃度でのせ、系列希釈を行った。抗ｃ−ｍｙｃ−ＨＲＰ結合モノクローナル抗体[Roche]を用いて、結合を検出した。
【０１８２】
また、より正確な結合データを得るために、ＢＩＡＣｏｒｅ  Ｔ２００またはＯｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６機器による表面プラズモン共鳴を用いて、特定の分子を測定した。
【０１８３】
ＢＩＡＣｏｒｅＴＭ  Ｔ２００(GE Healthcare)
アミンカップリングは、リガンドをチップ表面に固定化するための非常に一般的なアプローチである。チップ表面は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）による活性化後、リガンド上の利用可能な第一級アミン基（例えば、リジン）を介してリガンドを共有結合捕捉(covalent capturing)できる反応性スクシンイミドエステルを形成するカルボキシル基で誘導体化されたデキストランマトリックスを有する。
【０１８４】
ＴＮＦαを１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で１／１０倍に希釈し、活性化チップに注入した。「エイム  フォー」ソフトウェア固定化ウィザード(“aim for” software immobilisation wizard)または特定の期間を使用して、２００ＲＵの固定化ＴＮＦαを目指して(aim for)もよい。さらに、おそらく界面活性剤がリガンド活性に影響を及ぼし得ると考えられるので、泳動緩衝液を０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０が存在しないＰＢＳに変更した。２０２ＲＵの最終リガンド固定化レベルが得られた。
【０１８５】
スタートアップサイクルは、３０μｌ／分の流速での６０秒の緩衝液注入、続いて３０秒の解離期間から構成された。抗ＴＮＦαサンプルサイクルは、サンプルを３０μｌ／分で１２０秒注入した後、１０ｍＭグリシン（ｐＨ  ２）を３０μｌ／分で６０秒注入する再生工程を含んだ。最後に、次のサイクルを開始する前に、ベースライン平衡を可能にするために、各サイクルの終わりに１２０秒の安定化期間を含めた。
【０１８６】
スクリーニングした濃度系列および解離期間は可変であり、以下の通りであった：解離時間が６００秒であったすべての単量体ドメインＤ１、Ｃ４、Ｂ４、ＴＮＦ４３およびＴＮＦ３０を除いて、すべてのサンプルを、１００ｎＭのトップスタート濃度および１２００秒解離時間でアッセイした。Ｂ４およびＴＮＦ４３  ＶＮＡＲを、それぞれ５００ｎＭおよび５μＭのトップスタート濃度でアッセイした。５つのブランクサンプルサイクルを含めて、二重参照データセットを生成するために使用した。
【０１８７】
ドメインに対する結合応答を、ＢＩＡＣｏｒｅ（商標）Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して分析し、二重参照データを１：１ラングミュアモデルに適合させて、動力学的および親和性の特徴を得た。
【０１８８】
ＯＣＴＥＴ（登録商標）  ＲＥＤ９６［ＦｏｒｔｅＢｉｏ（商標）］
バイオレイヤ干渉法(Biolayer interferometry )（ＢＬＩ）を用いて、平衡解離定数（ＫＤ）を決定した。ディップアンドリードストレプトアビジンバイオセンサー(Dip and read streptavidin biosensors)を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で少なくとも３０分間再水和した。センサーに２０μｇ／ｍｌのビオチン化ｈＴＮＦ−αをのせ、抗ＴＮＦ−α  ＶＮＡＲタンパク質を１００ｎＭのトップ濃度で連続希釈し、一方、ＴＮＦ４３およびＶＮＡＲ陰性対照を１μＭのトップ濃度でアッセイした。結合会合(Binding association)を１０分間モニターし、続いて５分間の解離時間をモニターした。すべての抗ＴＮＦ−α  ＶＮＡＲ測定について、カーブフィットデータが複雑な多相曲線を示したので、動態データセットを２部位モデル(two-site model)を用いてフィッティングしたが、対照の抗ＴＮＦ−αナノボディ、ＴＮＦ３０については、質量輸送モデル(Mass Transport model)での１：１ラングミュア結合を用いた。
【０１８９】
得られたデータを表１に示す。表１から、試験した単量体ＶＮＡＲがＴＮＦ  ４３  ＶＮＡＲと比較して、ＴＮＦαに対して少なくとも５００倍低い結合親和性を有することを示す。
【０１９０】
【表１】
2020535811.tif 000025
【０１９１】
インビトロでの中和試験
ＶＮＡＲドメインに関する中和能力およびＮＤ５０を決定するために、マウス線維肉腫細胞株Ｌ９２９［ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−１］を、１０％熱不活化ウシ胎仔血清[GIBCO]および１μｇ／ｍｌアクチノマイシンＤ[R & D systems]を補充したダルベッコ改変イーグル培地[GIBCO]中で成育させた。それぞれのＶＮＡＲクローンについて、１ウェルあたり５，０００個の細胞を、５％のＣＯ２および湿気を用いて、３７℃で２４時間、９６ウェルプレート中で二連でインキュベートした。ＬＤ５０［０．２５ｎｇ／ｍｌで１ｘ］および１０ｘ  ＬＤ５０［２．５ｎｇ／ｍｌ］のｒｈＴＮＦαを、連続希釈したＶＮＡＲタンパク質または細胞単独のいずれかを含むウェルに添加した。次いで、プレートを３７℃で２４時間、５％のＣＯ２および湿気でインキュベートした。５０μＬの１：２０希釈ＷＳＴ−１細胞増殖剤[Roche]を添加し、５％  ＣＯ２および湿気で３７℃で４〜８時間インキュベートすることによって、細胞毒性または細胞生存を測定した。吸光度を４５０〜５６０ｎｍで読み取った。
【０１９２】
１μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤの存在下でのＴＮＦαは、Ｌ９２９線維肉腫細胞において細胞毒性を引き起こし、この際、ＬＤ５０は０．２５〜０．３ｎｇ／ｍｌであす。我々は、ナノモル濃度でのＶＮＡＲタンパク質ドメインがｒｈＴＮＦαのＬＤ５０を最大１０倍中和することができることを示した［図３］。この実験では、対照抗ＴＮＦα抗体ＭＡＢ２１０と比較するための二価分子を形成するために、ＶＮＡＲのＣ末端をペプチドリンカーによってＩｇＧ  Ｆｃドメインに結合させた。
【０１９３】
中和アッセイにおいて単一ドメインとして測定した場合、Ｄ１およびＣ４  ＶＮＡＲは、ＴＮＦ３０  ＶＨＨナノボディほど有効ではなかった（図２）。これは、単一部位結合親和性と相関すると考えられる。しかしながら、混合物（図３）としてまたは二価もしくは二重特異性フォーマット（図ｘｘｘｘ）で組み合わせた場合、予想できなったことに、それらは二量体ＴＮＦ３０  ＶＨＨナノボディを超える改善された特性を示した。
【０１９４】
傍細胞フラックスアッセイ(Paracellular flux assay)
ヒト上皮結腸直腸腺癌細胞（Ｃａｃｏ−２）を、１０（％  ｖ／ｖ）熱不活性化ＦＢＳおよび１％（ｖ／ｖ）ペニシリン−ストレプトマイシン（それぞれ、１０，０００単位／ｍｌおよび１０，０００μｇ／ｍｌ）を補充したＤＭＥＭ中で培養した。細胞をＴ７５フラスコ中で９０％コンフルエンスまで増殖させた後、２４ウェルの０．４μｍ半透過性組織培養トランスウェルインサート(semipermeable tissue culture transwell inserts)(Corning Inc.)に播種した。１０μｌの細胞懸濁液を９０μｌの０．４％トリパンブルー排除色素(trypan blue exclusion dye)(Beckman Coulter)に懸濁し、カバースリップを取り付けた血球計上に混合物を注意深く移すことによって、生存細胞数を測定した。
【０１９５】
生存細胞数を測定した後、トランスウェルインサート当たり１×１０５個の細胞を１００μｌの最終ＤＭＥＭ容積に播種する一方、細胞を含まない６００μｌのＤＭＥＭを外側含有ウェル(outer containing wells)に移した。トランスウェルプレートを、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２で３７℃でインキュベートし、この際、使用済みのＤＭＥＭ＋１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを４８時間毎に交換した。細胞増殖を、細胞が１００％コンフルエンスに達するまで（通常、播種後５〜７日間）、位相差顕微鏡（倍率４０倍の対物レンズ）下でモニターした。Ｃａｃｏ−２細胞をさらに２１日間増殖させて分化させ、この際、使用済みの培地を分化まで４８時間毎に交換した。
【０１９６】
１０％（ｖ／ｖ）ＨＩ−ＦＢＳを含む１００μｌのＤＭＥＭ中に極性を有する細胞(polarized cells)（頂端側(apical side)）を含有する所定のインサートウェルを、抗ＴＮＦα  ＶＮＡＲタンパク質を含むまたは含まない１０ｎｇ／ｍｌのｈＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＬＰＳで処理した。処理細胞を、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２で３７℃で１８時間インキュベートした。サイトカイン±抗ＴＮＦα  ＶＮＡＲと共に１８時間インキュベートした後、処理細胞の位相差画像を得、続いて、Ｃａｃｏ−２単層の頂端側(apical side)（インサートウェル）に５μｌの１０ｍｇ／ｍｌフルオレセインイソチオシアネート標識デキストラン、分子量（３〜５ｋＤａ）を添加した。ＦＩＴＣ−デキストランを添加してから２４時間後に、トランスウェルチャンバーの基底外側(basolateral side)の培地を回収した。
【０１９７】
蛍光強度を、Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ（ＢｉｏＴｅｋ（登録商標））マイクロプレートリーダーを使用して、４８５ｎｍ励起および５２０ｎｍ発光波長で測定した。
【０１９８】
上皮抵抗性機能不全アッセイ
ヒト上皮結腸直腸腺癌細胞（Ｃａｃｏ−２）を、１０（％  ｖ／ｖ）熱不活性化ＦＢＳおよび１％（ｖ／ｖ）ペニシリン−ストレプトマイシン（それぞれ、１０，０００単位／ｍｌおよび１０，０００μｇ／ｍｌ）を補充したＤＭＥＭ中で培養した。細胞をＴ７５フラスコ中で９０％コンフルエンスになるまで増殖させた後、１２または２４ウェルの０．４μｍ半透過性組織培養トランスウェルインサート(semipermeable tissue culture transwell inserts)(Corning Inc.)に播種した。細胞が完全に分化するまで、前記プロトコールと同様に行った。
【０１９９】
１０％（ｖ／ｖ）ＨＩ−ＦＢＳを含む１００μｌのＤＭＥＭ中に極性を有する細胞(polarized cells)（頂端側(apical side)）を含有する所定のインサートウェルを、抗ＴＮＦα  ＶＮＡＲタンパク質を含むまたは含まない１０ｎｇ／ｍｌのｈＴＮＦα、およびＩＦＮγで処理した。処理細胞を、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２および湿気で３７℃で２４時間インキュベートした。サイトカイン±抗ＴＮＦα  ＶＮＡＲと共に２４時間インキュベートした後、上皮間電気抵抗(transepithelial electrical resistance)（ＴＥＥＲ）を、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ（登録商標）ＥＲＳ−２  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ（Ｖｏｌｔ／Ｏｈｍ）メーターおよびＭＥＲＳＳＴＸ０１プローブ(Merck Millipore)を使用して頂端チャンバー中で測定した。測定された抵抗値は、処理下の表面積に対して正規化された。
【０２００】
１２ウェルの組織培養トランスウェルインサートに、５００μＬのＤＭＥＭを含有するウェルあたり５×１０６個の細胞を播種し、外側ウェル（基底外側(basolateral side)）が１．５ｍＬのＤＭＥＭを含有することに留意することが重要である。また、ＴＥＥＲ測定中に、インサートウェルおよび外側ウェル中のＤＭＥＭ容積を、それぞれ５００μｌおよび１．５ｍｌに増加させて、ボルト−オームメーター電極(volt-ohm meter electrodes)が、ウェルの底部に触れることなく、培地中に完全に浸漬させた。
【０２０１】
Ｂ．ＩＣＯＳＬ結合ＶＮＡＲＳ
ＩＣＯＳＬ結合ＶＮＡＲＳ  ２Ｄ４およびＣＣ３の単離および特徴付けは、ＷＯ２０１４／１７３９７５およびＷＯ２０１４／１７３９５９に開示されている。
【０２０２】
２．多価および多重特異的ＶＮＡＲの形成
Ａ．ＴＮＦ結合ドメイン
図３から、Ｄ１−ＦｃおよびＣ４−Ｆｃ分子の組み合わせが、二価形態で中和能力が増加することが示された。したがって、ＶＮＡＲ  ＤＮＡ１およびＣ４ならびに他の組み合わせを、二価または二重特異性融合体として調製し、融合体として一緒に組み合わせた場合、中和能力における同じ改善が見られることが示された。
【０２０３】
二量体および三量体の構築
図４は、二価および二重特異性構築物のフォーマットの図を提供する。
【０２０４】
２または３の別々のＰＣＲ反応を設定して、以下に列挙するオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、Ｎ末端、中間末端（三量体の場合）、およびＣ末端ＶＮＡＲドメインを増幅し、各オリゴヌクレオチドは、それぞれ、精製および検出を容易にするための特異的／独特のクローニング部位、ならびに／または６×ｈｉｓタグおよびｃ−ｍｙｃタグを有する。
【０２０５】
【化２４】
2020535811.tif 000026
【０２０６】
三量体構築ＰＣＲオリゴヌクレオチド：ここでは、それぞれＮ末端およびＣ末端上のＸｂａ１／ＢａｍＨ１およびＡＰＡ１／ＥｃｏＲ１クローニング部位に隣接する中間断片としてＢＡ１１遺伝子を有するインハウス設計ＤＮＡカセット(in-house designed DNA cassette)を利用した。上記に列挙したオリゴヌクレオチド対、ならびにＮ末端フォワードオリゴヌクレオチド中のＸｂａ１およびＢｓｓＨ１１部位の両方を有するオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ増幅工程において利用することができ、これによりインハウス真核生物発現ベクター(in-house eukaryotic expression vector)、ｐＥＥＥ２Ａ中への三量体遺伝子をサブクローニングすることができる。それ以外は、全てのクローニングは、ｐＥＴ２８ｂ(+)発現ベクターで行われる。
【０２０７】
【化２５】
2020535811.tif 000027
【０２０８】
２μｌのＶＮＡＲ  ＤＮＡ（５０〜１００ｎｇ）、２μｌのフォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマー（最終濃度１μＭ）、５μｌの１０Ｘ  Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液、０．２５μｌのＴａｑポリメラーゼ（最終濃度２５Ｕ／ｍｌ）、０．５μｌのｄＮＴＰ（最終濃度０．１ｍＭ）、および３８．２５μｌのＨ２Ｏを含むＰＣＲ反応物（最終反応容積は５０μｌ）。ＰＣＲプログラムを、９８℃で５分間で開始した。次いで、９４℃で３０秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で１分間を３０サイクルを行った。７２℃で５分間の最終延長を行った。アンプリコンをアガロースゲル電気泳動によりチェックし、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。溶出したＤＮＡを適切な制限エンドヌクレアーゼで消化した。
【０２０９】
大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ(E. coli SHuffle)（登録商標）Ｔ７発現細胞における二量体および三量体の発現
ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素部位を介して発現ベクターｐＥＴ２８ｂ（＋）にクローニングされたＶＮＡＲ領域、および得られたＶＮＡＲ遺伝子を含有する精製プラスミドを、エレクトロコンピテント(electrocompetent)大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ(E. coli SHuffle)（登録商標）Ｔ７発現細胞[NEB]に形質転換し、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するＴＹＥ寒天プレート上で選択した。抗ｈＴＮＦα  ＶＮＡＲ−Ｄ１、Ｃ４およびＢ４融合タンパク質を、３０℃でＩＰＴＧで誘導した際にＳＨｕｆｆｌｅ細胞の細胞質において発現させた。
【０２１０】
形質転換大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｔ７発現細胞の単一コロニーを、ＯＤ６００が０．４〜０．６になるまで（通常、３７℃、２５０回転／分で、４〜６時間のインキュベーション）、５ｍＬの２×ＴＹ−カナマイシン培地中で成育させた。この対数期培養物を用いて、カナマイシンおよびＰＯ４塩を含む５０ｍＬのＴＢ培地に接種し、ＯＤ６００が６．０〜１０．０に達するまで３０℃、２５０ｒｐｍで一晩インキュベートした。細胞を４０００ｒｐｍ、３０℃で１５分間遠心分離し、次いで新鮮なＴＢ−カナマイシン−ＰＯ４塩培地に再懸濁し、３０℃、２５０ｒｐｍで１〜２時間回復させた。最終ＩＰＴＧ濃度１ｍＭを用いて細胞質タンパク質発現を誘導し、細胞を誘導後１２〜１６時間、３０℃、２００ｒｐｍでインキュベートした。６０００ｒｐｍ、２５℃で１０分間の遠心分離によって細胞を回収し、細胞ペレット湿重量を測定した。細胞ペレットを、５ｍｌ／ｇの湿潤細胞ペーストＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）タンパク質抽出試薬＋Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）(Novagen, UK)に再懸濁し、細胞懸濁液を１０〜１５ｒｐｍ、室温で２０分間、振盪プラットフォームに置いた。細胞懸濁液を６０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離し、上清中に収集した可溶性タンパク質を、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(immobilised metal affinity chromatography)（ＩＭＡＣ）レジン（ニッケル−ニトリロ三酢酸、Ｎｉ−ＮＴＡまたはＮｉ−セファロース）を用いたポリヒスチジンタグによるアフィニティー精製のために準備した。ＶＮＡＲ融合タンパク質を、３００〜５００ｍＭイミダゾール（ｐＨ  ８．０）で溶出し、溶出物をＰＢＳ（１Ｌ  ＰＢＳ／１ｍｌ溶出タンパク質）（ｐＨ  ７．４）に対して一晩透析した後、ＰＢＳを交換してさらに３〜４時間透析した。タンパク質の質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価し、Ultraspec 6300 pro uv/visible spectrophotometer (Amersham Biosciences, GE Healthcare)を用いて定量した。
【０２１１】
真核細胞発現のために、ＢＡ１１三量体カセットにクローニングしたドメインを、ＢｓｓＨＩＩおよびＥｃｏＲ１酵素を用いて消化し、ＣＭＶプロモーターを用いてｐＥＥＥ２Ａ真核発現ベクターにサブクローニングし、プラスミド増殖のために大腸菌株に形質転換した。ＶＮＡＲ三量体遺伝子を含む単離・精製されたプラスミドベクターを、線状ポリエチレンイミン［ＰＥＩ］と室温で２０分間共インキュベートした。プラスミドＤＮＡ：ＰＥＩの混合物を、９０％コンフルエンスの細胞増殖密度を有するＨＥＫ２９３細胞を含有する細胞培養フラスコに移した。トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を３７℃、５％ｖ／ｖ  ＣＯ２で５〜７日間インキュベートした。細胞培養上清を集め、ＩＭＡＣ樹脂を用いて発現タンパク質を精製し、ＰＢＳに対して透析した。
【０２１２】
結合性およびＴＮＦ中和データ
図５は、二量体および二重特異性構築物のＴＮＦαへのＥＬＩＳＡ結合性を示す。
【０２１３】
最初のＥＬＩＳＡデータから、二重特異性Ｄ１−Ｃ４構築物がＴＮＦ３０ナノボディ二量体構築物と比較してアビディティ(avidity)（結合親和性と組み合わせた）が増加したことが示された。
【０２１４】
これらのいくつかを、後に、表面プラズモン共鳴における固定化ＴＮＦへの結合性について測定した。
【０２１５】
表１から、測定された二量体分子のうち、Ｄ１−Ｃ４二重特異性分子が、ＴＮＦ３０二価ナノボディ構築物と比較して優れた結合親和性（アビディティ(avidity)）を示したことが示される。
【０２１６】
図６は、二価ＴＮＦナノボディと比較した、多くの二価または二重特異的ＶＮＡＲ融合体についてのＴＮＦ中和データを示す。結合分子を、Ｌ９２９アッセイにおいてＴＮＦ中和について試験した場合、Ｄ１−Ｃ４二量体は、ＴＮＦ３０ナノボディ二量体構築物と同等またはそれより優れていた。この実験では、Ｄ１−Ｄ１二量体はＤ１−Ｂ４二量体よりも劣っていた。
【０２１７】
表１は、試験した三量体構築物についてのＳＰＲ結合データを示す。これから、ＴＮＦα結合ドメイン間のスペーサーとして作用する、追加のドメインの導入がＴＮＦαに対する分子の相対親和性（アビディティ(avidity)）を有意に改善するように見えることが示される。
【０２１８】
ＴＮＦα中和アッセイで測定した場合、Ｄ１−ＢＡ１１−Ｃ４三量体構築物はａｄａｌｉｍｕｍａｂと同等であり、ＴＮＦ３０ナノボディ構築物よりも優れていた。このアッセイにおいて、Ｄ１ドメインを含む二価分子は、ＴＮＦ３０ナノボディ構築物と有効性が同等であった。
【０２１９】
図７は、種々のＶＮＡＲフォーマットのＴＮＦα機能の中和能を測定した実験の結果を示す。
【０２２０】
表２は、中和データを要約する。スペーサードメインが含まれる場合、Ｄ１−ＢＡ１１−Ｄ１およびＤ１−ＢＡ１１−Ｃ４は双方とも中和能において１０倍以上の改善を示し、Ｄ１−ＢＡ１１−Ｃ４はａｄａｌｉｍｕｍａｂおよびＭＡＢ２１０とほぼ同等の効力を示す。また、ＴＮＦ３０−ＢＡ１１−ＴＮＦ３０は、ＴＮＦ３０−ＴＮＦ３０二量体形態よりも改善を示すが、それほど顕著ではない。Ｄ１−Ｃ４構築物（配列番号２７および２８）のＧｌｙＳｅｒリンカー長は、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２から（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３に延長され、その結果ｈＴＮＦ−α中和能が改善した。
【０２２１】
これらの実験からのデータを表２に示す。さらなる比較データを表３に示す。
【０２２２】
【表２】
2020535811.tif 000028
【０２２３】
【表３−１】
2020535811.tif 000029
【０２２４】
【表３−２】
2020535811.tif 000030
【０２２５】
機能活性
背景
ヒト上皮結腸直腸腺癌細胞（Ｃａｃｏ−２）は、適切なプラットフォーム（例えば、プラスチックディッシュ、ニトロセルロースフィルター）上で増殖させると、正常な腸細胞の形態学的特徴を発達させる。さらにコラーゲンコーティングされたポリカーボネートまたはポリエステル膜は、腸上皮輸送モデルシステムとしてのＣａｃｏ−２単層に適していることが示された(Wang, F., et al. Am. J. Path. 166.2 (2005): 409-419.; Hidalgo, I.J., et al Gastroenterology 1989. 96: 736-49.)。
【０２２６】
上皮膜の主な機能としては、イヌリンおよびデキストランなどの親水性溶質に対する障壁の維持がある。この障壁は、以下に制限されないが、感染性、免疫媒介性および特発性疾患などの、腸上皮にかかわる特定の疾患で損なわれる(Clayburgh, D.R., et al Lab Invest. 2004. 84(3): 282-291; Wang, F., et al. Am. J. Path. 2005. 166(2): 409-419)。傍細胞透過性の増加および腸上皮抵抗性の減少として測定される、腸障壁機能不全(intestinal barrier dysfunction)は、クローン病等の、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）と密接に関連する(Irvine E.J. and Marshall J.K., Gastroenterology 2000. 119.6: 1740-1744.; Wyatt et al., The Lancet 1993. 341(8858): 1437-1439.)。また、その結果漏出流下痢(leak flux diarrhea)を生じる溶質の損失に寄与する、ＩＢＤにおける上皮タイトジャンクションタンパク質(epithelial tight junction proteins)の減少を支持する証拠がある(Schulzke J.D. et al., Ann N Y Acad Sci. 2009 1165:294-300; Schmitz H. et al., J. Cell Sci 1999. 112(1): 137-146)。最後に、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、ＴＮＦαおよびリポ多糖（ＬＰＳ）は、ヒト上皮細胞株において腸上皮障壁機能不全を相乗的に誘導することが示されている(Wang et al., J. Cell Science 1999. 112(1): 137-146; Schuerer-Maly C.C et al., Immunology 1994. 81(1): 85)。
【０２２７】
抗ＴＮＦα処置はクローン病における腸障壁機能不全を修復することが示されており(Suenaert P. et al., Am J Gastroenterol 2002. 97(8): 2000-2004)、ゆえに、我々は、我々の抗ＴＮＦ  ＶＮＡＲドメインがインビトロで誘導されるこれらの機能不全を修復することを示すために、抗ＴＮＦ  ＶＮＡＲドメインを試験した。我々は、二重特異性／多価ＶＮＡＲドメインが、ＶＮＡＲ単量体と比較した場合、これらの機能不全の予防により有効であると仮定した。
【０２２８】
Ｃａｃｏ−２細胞の極性を有する単層を横切るＦＩＴＣ−デキストラン傍細胞流(FITC-Dextran paracellular flux across polarised monolayer of Caco-2 cells)
ヒト上皮結腸直腸腺癌細胞（Ｃａｃｏ−２）を、１０（％ｖ／ｖ）熱不活性化ＦＢＳおよび１％（ｖ／ｖ）ペニシリン−ストレプトマイシン（それぞれ、１０，０００単位／ｍｌおよび１０，０００μｇ／ｍｌ）を補充したＤＭＥＭ中で培養した。細胞をＴ７５フラスコ中で９０％コンフルエンスまで増殖させた後、２４ウェルの０．４μｍ半透性組織培養トランスウェルインサート(semipermeable tissue culture transwell inserts)(Corning Inc.)に播種した。１０μｌの細胞懸濁液を９０μｌの０．４％トリパンブルー排除色素(trypan blue exclusion dye)(Beckman Coulter)に懸濁し、この混合物をカバースリップを取り付けた血球計上に注意深く移した。
【０２２９】
生存細胞数を測定した後、トランスウェルインサート当たり１×１０５個の細胞を１００μｌの最終ＤＭＥＭ容積に播種する一方、細胞を含まない６００μｌのＤＭＥＭを外側含有ウェル(outer containing wells)に移した。トランスウェルプレートを、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２および湿気で３７℃でインキュベートし、この際、使用済みのＤＭＥＭ＋１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを毎に交換した。細胞増殖を、細胞が１００％コンフルエンスに達するまで（通常、播種後５〜７日間）、位相差顕微鏡（倍率４０倍の対物レンズ）下でモニターした。Ｃａｃｏ−２細胞をさらに２１日間増殖させて分化させ、この際、使用済みの培地を分化まで４８時間毎に交換した。
【０２３０】
１０％（ｖ／ｖ）ＨＩ−ＦＢＳを含む１００μｌのＤＭＥＭ中に極性を有する細胞（頂端側）を含有する所定のインサートウェルを、抗ＴＮＦα  ＶＮＡＲタンパク質を含むまたは含まない１０ｎｇ／ｍｌのｈＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＬＰＳで処理した。処理細胞を、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２および湿気で３７℃で１８時間インキュベートした。サイトカイン±抗ＴＮＦα  ＶＮＡＲと共に１８時間インキュベートした後、処理細胞の位相差画像を得、続いて、Ｃａｃｏ−２単層の頂端側(apical side)（インサートウェル）に５μｌの１０ｍｇ／ｍｌフルオレセインイソチオシアネート標識デキストラン、分子量（３〜５ｋＤａ）を添加した。ＦＩＴＣ−デキストランを添加してから２４時間後に、トランスウェルチャンバーの基底外側(basolateral side)の培地を回収した。
【０２３１】
蛍光強度を、Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ（ＢｉｏＴｅｋ（登録商標））マイクロプレートリーダーを使用して、４８５ｎｍ励起および５２０ｎｍ発光波長で測定した。
【０２３２】
図８は、いくつかのＴＮＦ  ＶＮＡＲマルチドメイン結合分子を比較した、Ｃａｃｏ−２細胞の極性を有する単層(polarised monolayer)を横切る傍細胞流(paracellular flux)を測定する実験の透過性データを示す。この実験から、より低い濃度の二量体または三量体がチャレンジセル(challenged cells)のより高い保護レベルをもたらしたため、様々な二価および二重特異性形態が単量体形態よりも改善された機能を示すことが示される。
【０２３３】
極性を有するＣａｃｏ−２細胞単層における上皮抵抗性機能不全アッセイ
ヒト上皮結腸直腸腺癌細胞（Ｃａｃｏ−２）を、１０（％  ｖ／ｖ）熱不活性化ＦＢＳおよび１％（ｖ／ｖ）ペニシリン−ストレプトマイシン（それぞれ、１０，０００単位／ｍｌおよび１０，０００μｇ／ｍｌ）を補充したＤＭＥＭ中で培養した。細胞をＴ７５フラスコ中で９０％コンフルエンスになるまで増殖させた後、１２または２４ウェルの０．４μｍ半透過性組織培養トランスウェルインサート(semipermeable tissue culture transwell inserts)(Corning Inc.)に播種した。細胞が完全に分化するまで、セクション０に前記したプロトコールと同様に行った。
【０２３４】
１０％（ｖ／ｖ）ＨＩ−ＦＢＳを含む２００μｌのＤＭＥＭ中に極性を有する細胞(polarized cells)（頂端側(apical side)）を含有する所定のインサートウェルを、抗ＴＮＦα  ＶＮＡＲタンパク質を含むまたは含まない１０ｎｇ／ｍｌのｈＴＮＦα、およびＩＦＮγで処理した。処理細胞を、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２および湿気で３７℃で２４時間インキュベートした。サイトカイン±抗ＴＮＦα  ＶＮＡＲと共に２４時間インキュベートした後、上皮間電気抵抗(transepithelial electrical resistance)（ＴＥＥＲ）を、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ（登録商標）ＥＲＳ−２  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ（Ｖｏｌｔ／Ｏｈｍ）メーターおよびＭＥＲＳＳＴＸ０１プローブ(Merck Millipore)を使用して頂端チャンバー中で測定した。測定された抵抗値は、処理下の表面積に対して正規化された。１２ウェルの組織培養トランスウェルインサートに、５００μＬのＤＭＥＭを含有するウェルあたり５×１０６個の細胞を播種し、外側ウェル（基底外側(basolateral side)）が１．５ｍＬのＤＭＥＭを含有することに留意することが重要である。また、ＴＥＥＲ測定中に、インサートウェルおよび外側ウェル中のＤＭＥＭ容積を、それぞれ５００μｌおよび１．５ｍｌに増加させて、ボルト−オームメーター電極(volt-ohm meter electrodes)が、ウェルの底部に触れることなく、培地中に完全に浸漬させた。
【０２３５】
図９は、極性を有するＣａｃｏ−２細胞における上皮抵抗性を測定するアッセイを示す。この実験から、種々の二価および二重特異性形態が単量体形態よりも改善された機能を示すことが示される。
【０２３６】
Ｂ  ＩＣＯＳＬ結合ドメイン
多価形態の構築の構築および有効性データ
２Ｄ４およびＣＣ３  Ｆｃ融合体
図１０は、ＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲ（およびヒトＩｇＧ  Ｆｃ、これはさらなる改善された機能的特性を提供する）を組み込んだ本発明の多価および多重特異的ＶＮＡＲのためのフォーマットを示す。
【０２３７】
方法
所定のＶＮＡＲ単量体ドメインをＰＣＲ増幅し、真核生物発現ベクターにサブクローニングした。このクローニングは、ヒトＩｇＧ１  ＦｃをコードするＤＮＡ断片（このヒトＩｇＧ１  Ｆｃ断片はまた、セリンに変異した軽鎖に通常ジスルフィド架橋する５プライム最多Ｃｙｓ残基(5 prime most Cys residue)を有する全長ヒトＩｇＧ１ヒンジ配列をコードした）の５’末端上に行った。
【０２３８】
ＰＣＲ増幅に供する間、オリゴヌクレオチドを用いて、ＶＮＡＲドメインのカルボキシル末端とヒトＩｇＧ１ヒンジ領域のＮ末端残基との間にリンカー配列を挿入するアミノ酸残基、ならびに哺乳動物ベクター発現系と適合する制限エンドヌクレアーゼ部位を導入した。このプロセスによって導入されたリンカー配列は、下線を引いたＲＴアミノ酸残基をコードする核酸配列がＢｓｉＷ１制限エンドヌクレアーゼ部位を導入するＧＧＧＧＳＧＧＧＧＲＴ、または下線を引いたＧＡＤＱアミノ酸残基のコドンの使用がＢｃｌ１部位を導入するＧＧＧＧＳＧＧＧＡＤＱのいずれかであった。これらの部位は双方とも、Ｆｃ真核生物発現ベクターの異なるバージョンにおけるクローニング部位と適合する。全てのアンプリコンの５’末端に、真核生物ベクター構築に適合する独特のＢｓｓＨＩＩ部位を導入する。
【０２３９】
Ｆｃのカルボキシル末端にリンカーＶＮＡＲドメイン融合体を導入するためのＤＮＡ配列を設計し、これらの中間体断片の合成をＧｅｎｅＡｒｔ(InvItrogen)によって行った。これらの断片のＮ末端は、ヒトＩｇＧ１由来ＣＨ３領域内の天然に存在するＢｓｒＧＩ部位、およびベクター中のＥｃｏＲ１部位を利用した。これらの構築物は、Ｆｃドメインのカルボキシル末端とＶＮＡＲドメインのアミノ末端との間に、アミノ酸配列ＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡを有するリンカーを導入した。リンカーの下線を引いた三重アラニン領域でのコドンを使用することによりＮｏｔＩ制限部位の導入を可能にし、これは、さらなる二重特異的ＶＮＡＲ構築物を組み立てるためのその後のクローニング作業において利用され得る。
【０２４０】
血清を含まない培地を用いたＨＥＫ  ２９３細胞懸濁液におけるＰＥＩ仲介トランフェクションおよび一時的発現後(Post PEI-mediated transfection and transient expression)、ＥＬＩＳＡによりＮＡＲ  Ｆｃ融合タンパク質の発現レベルを測定した。細胞残屑を除去するための最初の０．２μｍ濾過清澄化工程の後に、ＶＮＡＲ  Ｆｃタンパク質を精製するためのプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを行った。アフィニティー精製タンパク質を完成するための第２のクロマトグラフィー工程を、必要に応じて工程間で緩衝液を交換して、イオン交換クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーを使用して行った。Ａｍｉｃｏｎ限外濾過ユニットを用いてタンパク質を濃縮し、ＵＶ分光法によって最終タンパク質濃度を測定した。分析ＳＥＣおよびＳＤＳ  ＰＡＧＥを使用して、最終精製タンパク質の完全性(integrity)を決定した。
【０２４１】
ＩＣＯＳＬ中和アッセイ
リガンド−レセプター中和アッセイを以下のようにして行った：ヒトＩＣＯＳレセプターを発現するＣＨＯ細胞を、９６ウェル細胞培養プレート(Greiner, Bio-One)のＤＭＥＭ／Ｆ１２＋５％  ＦＢＳ培地中でコンフルエントになるまで増殖させた。１μｇ／ｍｌのｒｍＢ７−Ｈ２／Ｆｃ（１５８−Ｂ７、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の計２０μｌを、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％  ＦＢＳ中の４０μｌの連続希釈抗ＩＣＯＳＬ−ＶＮＡＲ−Ｆｃと共に１時間プレインキュベートした後、細胞に添加した。１６℃で１時間インキュベートした後、細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２＋２％  ＦＢＳで３回穏やかに洗浄し、同じ培地で１：１０，０００に希釈したヤギ抗ヒトＦｃ−ＨＲＰ(SIGMA)と共に１６℃で４０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、ＴＭＢ基質で発色させた。
【０２４２】
図１１は、ＥＬＩＳＡ結合データを示し、ＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲＳがこれらのフォーマットにおいてそれらの同族抗原に結合することを示す。
【０２４３】
図１２は、ＴＮＦ  Ｒ１ドメイン、ＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲおよびヒトＩｇＧ  Ｆｃを組み込んだ本発明の多価および多重特異的ＶＮＡＲのフォーマットを示し、これらはさらなる改善された機能特性を提供する。
【０２４４】
図１３は、ＴＮＦ  Ｒ１ドメイン、ＩＣＯＳＬ  ＶＮＡＲおよびヒトＩｇＧ  Ｆｃを組み込んだ本発明の多価および多重特異的ＶＮＡＲについての有効性のデータを示し、これはさらなる改善された機能特性を提供する。
【０２４５】
これらのデータから、融合体が、ＴＮＦＲ１を介してＴＮＦに、およびＶＮＡＲドメインを介してｍＩＣＯＳＬおよびｈＩＣＯＳＬに結合することができることが示される。これらの構築物は、ｍＩＣＯＳＬまたはｈＩＣＯＳＬのそれらの同族のＣＨＯ発現レセプターへの結合を阻害することができる。
【０２４６】
これらのデータから、多価フォーマットに組み合わされたＶＮＡＲがそれらの標的に結合することができ、上記分子が単量体ＶＮＡＲよりも改善された特性を示すことができることが示される。
【０２４７】
インビボでの前臨床研究
研究の背景
関節リウマチのＴｇ１９７マウスモデルは、野生型および３’修飾ヒト腫瘍壊死因子（ｈＴＮＦ−α）トランスジーンを保有し、発現するトランスジェニックマウス系である。これらのトランスジェニックマウスは、生物活性ヒトＴＮＦ−αの過剰発現に依存して、４〜７週齢で１００％の発生率で慢性多発性関節炎を発症する(Keffer et al. 1991, EMBO J., Vol. 10, pp. 4025-4031)。第１の抗ＴＮＦ−α治療抗体である、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）および他の抗ＴＮＦ−α生物製剤の治療効力の例示はＴｇ１９７マウスモデルを使用して確立された(Shealy et al., 2002, Arthritis Research & Therapy, 4(5), p.R7; Shealy et al., 2010, MAbs (Vol. 2, No. 4, pp. 428-439). Taylor & Francis)。
【０２４８】
本研究の目的は、関節炎のＴｇ１９７トランスジェニックマウスモデルにおける関節炎症状の予防における、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）と比較した抗ＴＮＦ−α  Ｄ１−Ｆｃ−Ｃ４（Ｑｕａｄ−Ｘ（商標））の治療効果を評価することであった。
【０２４９】
方法
合計４０匹のマウスを、５つの試験群、Ｇ１〜Ｇ５の各々に割り当てた（表４）。この研究の目的のために、トランスジェニックマウスを、８匹のマウスからなる群に割り当て、それぞれに、試験化合物またはビヒクルバッファー（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ、ｐＨ  ７．４）を、関節炎の確立前の、第３週齢から週２回、皮下に投与を開始して、第１０週齢まで７週間にわたって継続した。トランスジェニックマウス（２匹の雄および２匹の雌）の未処置動物の追加の１群を、組織病理学的状態のために３週齢の対照マウスとして使用し、最初の用量投与の前に剖検した。
【０２５０】
最初の関節炎スコアリングを行う前に、マウスをグループに分けた。年齢および性別のバランスのとれた研究は、離乳時に同調した交配の異なる同腹仔からプールしたＧ１〜Ｇ５群の８匹（４匹の雄および４匹の雌）のヘテロ接合性Ｔｇ１９７から構成された。異なる実験群へのマウスの割り当ては、研究の開始時に異なる群で体重が確実に等しく分布するように行った。インビボ関節炎スコアを表５に記載のように評価した。
【０２５１】
１０週齢で、すべての動物を剖検し、各動物の血液（血清を単離し、−８０℃で保存）および２つの足首関節を集めた。すべての実験動物の足関節を解剖し、石灰化し、さらに処理して関節炎の組織病理学的評価を行った。足首の組織病理学は、表６に記載される組織病理学スコアリングシステムに従って顕微鏡検査によって評価され、代表的な画像のみが結果セクションに含まれた。
【０２５２】
【表４】
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【０２５３】
【表５】
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【０２５４】
群の平均スコアを有するインビボでの関節炎スコアを、結果セクションでグラフとして示す。
【０２５５】
【表６】
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【０２５６】
グループ平均スコアを有する組織病理学的スコアを、結果のセクションで棒グラフとしておよび付録に表として示す。２５倍の倍率での例示的な組織病理学的画像もまた、付録に提示される。
【０２５７】
結果
Ｔｇ１９７関節炎モデルに対する抗ｈＴＮＦ−α  Ｄ１−Ｆｃ−Ｃ４（Ｑｕａｄ−Ｘ（商標））およびＨｕｍｉｒａ（登録商標）の効力の評価を予防的投与計画に従って行った、すなわち、マウスがインビボ関節炎病理学および初期組織病理学的病変の軽度の証拠を示したマウスの３週齢で処置を開始した。１０週齢まで、ビヒクル処置対照群Ｇ１におけるインビボでの関節炎スコアは３週齢の未処置動物と比較して劇的に増加したが、同じ年齢ではＧ１の動物において観察された組織病理学的病変が３週齢対照マウス群において観察されたものよりも統計的により重篤であった。
【０２５８】
被験物質Ｄ１−Ｆｃ−Ｃ４  抗ｈＴＮＦαのインビボおよび組織病理学的ならびに体重関節炎症状における治療効果の有効性評価
・Ｄ１−Ｆｃ−Ｃ４被験物質の３、１０および３０ｍｇ／ｋｇ用量レジメにより、Ｇ１のビヒクル処置マウスと比較して、インビボおよび組織病理学的関節炎病理学において、Ｔｇ１９７の統計的に有意な強固な阻害が与えられた。より具体的には、週に２回、７週間の期間にわたり１４回の用量を投与した後、用量レジメは以下の結果をもたらした：
Ｇ２の動物の３ｍｇ／ｋｇのＤ１−Ｆｃ−Ｄ４被験物質処置後のインビボでの約８８の阻害および関節炎の組織病理スコアの約８６％の阻害
Ｇ５の動物の１０ｍｇ／ｋｇのＤ１−Ｆｃ−Ｃ４被験物質処置後のインビボでの約８８％の有意な阻害および関節炎の組織病理学的スコアの約８３％の阻害
Ｇ３の動物の３０ｍｇ／ｋｇのＤ１−Ｆｃ−Ｃ４被験物質処置後のインビボでの約８８％の有意な阻害および関節炎の組織病理学的スコアの約８６％の阻害
・統計的有意性は３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ用量レジメにおいてのみ得られたが、Ｇ１のビヒクル処置マウスと比較して全ての用量レベルにおいてより多くの体重増加が見られた同様の知見が、Ｄ１−Ｆｃ−Ｃ４被験物質処置マウスの平均体重曲線において観察された。
【０２５９】
Ｄ１−Ｆｃ−Ｃ４被験物質の用量反応有効性評価
・３、１０および３０ｍｇ／Ｋｇ用量のＤ１−Ｆｃ−Ｄ４被験物質による処置では、インビボでの関節炎評価および体重スコア、ならびにすべての用量が同様に作用し、それらの治療効果は統計的に区別されなかった(undifferentiated)組織病理学的評価によって示される用量依存的な応答効果を示さなかった。
【０２６０】
Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）のインビボおよび病理組織学的ならびに体重関節炎症状における治療効果の有効性評価
・Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）の１０ｍｇ／ｋｇ用量レジメにより、Ｇ１のビヒクル処置マウスと比較して、インビボおよび組織学的関節炎病理学において、Ｔｇ１９７の強固な統計的に有意な阻害が与えられた。より具体的には、週２回、７週間の期間にわたり１４回の容量を投与した後、我々は以下を観察した：
Ｇ４の動物の１０ｍｇ／ｋｇのＨｕｍｉｒａ（登録商標）処置後のインビボでの約８２％の阻害および関節炎の組織病理スコアの約８６％の阻害
・Ｇ１のビヒクル処置マウスと比較してより多くの体重増加が見られた同様の知見が、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）処置マウスの平均体重曲線において観察された。
【０２６１】
Ｄ１−Ｆｃ−Ｃ４被験物質とＨｕｍｉｒａ（登録商標）との用量反応の比較
１０ｍｇ／ｋｇ用量でのＤ１−Ｆｃ−Ｃ４試験物質とＨｕｍｉｒａ（登録商標）との阻害効果の比較試験から、体重、インビボでの関節炎スコア及び組織病理学的評価を含む、全ての評価パラメータにおいて統計的に区別されないことが判明した。
【０２６２】
３週齢対照動物に対するＤ１−Ｆｃ−Ｃ４被験物質およびＨｕｍｉｒａ（登録商標）の効果の組織病理学的比較
３、１０および３０ｍｇ／ＫｇのＤ１−Ｆｃ−Ｃ４被験物質ならびに１０ｍｇ／Ｋｇ  Ｈｕｍｉｒａの阻害作用により、１０週目でより組織病理学的病変が軽減し、３週齢の対照未処置動物と統計的に区別された。
【０２６３】
【表７】
2020535811.tif 000034
【０２６４】
【表８】
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【０２６５】
【表９】
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【０２６６】
さらに、マウスＴＮＦ−αを標的とするＶＮＡＲ  Ｓ１７  Ｑｕａｄ−Ｘ（商標）構築物を用いたインビトロでの効力促進の第２の例示を行った。
【０２６７】
ＶＮＡＲ  Ｓ１７は、ヒトＴＮＦ−αに対する結合または中和活性を有さない特異的抗マウスＴＮＦ−αである。ＶＮＡＲ  Ｓ１７−Ｆｃは、約８ｎＭのインビトロ効力（ＮＤ５０）を有するマウスＴＮＦ−αの強力な中和剤である。Ｑｕａｄ−ＸＴＭ構築物（Ｓ１７−Ｆｃ−Ｓ１７）として設計した場合、インビトロでの中和能は０．２ｎＭにまで約４０倍向上した（図３０）。
【０２６８】
さらに、Ｓ１７  Ｑｕａｄ−ＸＴＭおよびＤ１−Ｃ４  Ｑｕａｄ−ＸＴＭ構築物がＴＮＦ−αの異なる種を認識することが示された（図３１）。
【０２６９】
討論および結論
この研究の結果から、参照Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）およびＤ１−Ｆｃ−Ｃ４（Ｑｕａｄ−Ｘ（商標））およびＤ１−ＢＡ１１−Ｃ４抗ｈＴＮＦ−α物質がＴｇ１９７動物において観察される関節炎表現型を阻害し、これにより、ビヒクル処置動物と比較して、体重が増加しならびにインビボおよび組織病理学的関節炎病理学が軽減することが示される。
【０２７０】
参照Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）の治療効果は、１０ｍｇ／ｋｇ用量で評価され（図２９〜図３２）、ビヒクル処置マウスと比較した場合、インビボ関節炎および足首の組織病理学的評価の統計的に有意な阻害をもたらした。図３３において、１ｍｇ／ｋｇのＨｕｍｉｒａ（登録商標）は、８週間で有意な疾患の改善(breakthrough)を示す。１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇのＨｕｍｉｒａ（登録商標）の投薬レジメを用いた以前のＴｇ１９７マウスモデル研究では、１ｍｇ／ｋｇ（図３３）または３ｍｇ／ｋｇのＨｕｍｉｒａ（登録商標）（図３５）のいずれかで処置されたマウスの群において有意な疾患の改善が存在することが示された。これらのマウス群は未処置群と同様の時間依存性疾患進行を有し、インビボ関節炎（ＡＳ）および組織病理学スコア（ＨＳ）は１０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇのＨｕｍｉｒａ（登録商標）のいずれかで処置した群よりも有意に高かった（図３３）。
【０２７１】
Ｄ１−Ｆｃ−Ｃ４（Ｑｕａｄ−Ｘ（商標））被験物質は、全ての評価された用量、すなわち、０．５、１、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇが疾患の完全な制御を伴う類似のかつ統計的に区別できない治療効果を示したため、用量依存性応答を示さなかった。さらに、インビボでの関節炎および組織病理学的評価から、３ｍｇ／ｋｇ用量のＤ１−Ｆｃ−Ｃ４被験物質の治療効果が１０ｍｇ／ｋｇのＨｕｍｉｒａ（登録商標）の治療効果に統計的に匹敵することが明らかになった。また、１０週齢の３ｍｇ／ｋｇのＤ１−Ｆｃ−Ｃ４処置マウスにおいて、疾患改善の徴候は観察されず、８週齢の０．５および１ｍｇ／ｋｇのＤ１−Ｆｃ−Ｃ４についても観察されなかった。
【０２７２】
したがって、我々はさらに、Ｄ１−Ｆｃ−Ｃ４  抗ｈＴＮＦ−αドメインが標準的な治療法であるＨｕｍｉｒａ（登録商標）よりも、インビトロ（Ｌ９２９およびＣａｃｏ２データ−−図２、３、６〜８、２０、２３および２８）およびインビボ（図２９〜３５）双方におけるＴＮＦ−αの効果を中和する効果が大きいことを示した。また、我々は、非Ｆｃベースのタンデム多価ＶＮＡＲ(non-Fc based tandem multivalent VNAR)である、Ｄ１−ＢＡ１１−Ｃ４のインビボ有効性を示した（図３３および図３４）。
【０２７３】
最後に、我々は、抗ＴＮＦ  ＶＮＡＲ（Ｄ１−Ｆｃ）がまた、Ｆｃ単独フォーマットで全身投与された場合、炎症性眼疾患のラットモデルにおいて（デキサメタゾンと同様の効力で）ブドウ膜炎を制御および治療し得ることを示すことができた（図３６）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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