(57)【要約】  開示されるのは、ＰＭ２１粒子の使用を通してＮＫ細胞を骨髄に指向するための組成物および方法である。【選択図】図５
2020509021.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＫ細胞をＰＭ２１粒子およびＦＣ２１フィーダー細胞の１つまたは複数と接触させることを含む、ＮＫ細胞を骨髄にトラフィッキングする方法。
【請求項２】
前記ＮＫ細胞をＩＬ−２、ＩＬ−１２および／またはＩＬ−１８で刺激することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＰＭ２１粒子および／またはＦＣ２１フィーダー細胞と前記ＮＫ細胞との前記接触が、患者への前記ＮＫ細胞の移入の前に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＭ２１粒子および／またはＦＣ２１フィーダー細胞と前記ＮＫ細胞との前記接触が、患者への前記ＮＫ細胞の移入に続いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＮＫ細胞内の細胞内メカニズムを誘導して、前記ＮＫ細胞表面のＰＳＧＬ−１のフコシル化を誘導する、請求項１、３または４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記ＮＫ細胞表面のＰＳＧＬ−１のフコシル化に相関させて、ＮＫ細胞内のＦＵＴ７の発現を誘導する、請求項１、３または４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
対象における骨髄悪性腫瘍または骨髄由来の悪性腫瘍を処置する方法であって、ＮＫ細胞をＰＭ２１粒子および／またはＦＣ２１フィーダー細胞と接触させること、ならびに前記ＮＫ細胞を前記対象に養子移入すること、を含む、方法。
【請求項８】
対象における骨髄に関連するウイルス感染を処置する方法であって、ＮＫ細胞をＰＭ２１粒子およびＦＣ２１フィーダー細胞の１種または複数と接触させること、ならびに前記ＮＫ細胞を前記対象に養子移入すること、を含む、方法。
【請求項９】
前記ＰＭ２１粒子および／またはＦＣ２１フィーダー細胞と前記ＮＫ細胞との接触が、患者への前記ＮＫ細胞の移入の前に行われる、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＰＭ２１粒子および／またはＦＣ２１フィーダー細胞と前記ＮＫ細胞との接触が、患者への前記ＮＫ細胞の移入に続いて行われる、請求項７または８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、全体として参照により本明細書に組み入れられる、２０１７年２月２８日出願の米国仮特許出願第６２／４６４，７４７号の利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｉ．背景
養子ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞療法は、骨髄悪性腫瘍を含む腫瘍学のための有望な新規介入法である。それゆえ、養子として用いられるＮＫ細胞のトラフィッキングの効率は、非常に重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
必要とされるのは、ＮＫ細胞を骨髄に効率的にトラフィッキングし得る方法である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
ＩＩ．概要
１．開示されるのは、ＮＫ細胞をＰＭ２１粒子および／またはＦＣ２１フィーダー細胞と接触させることを含む、ＮＫ細胞を骨髄にトラフィッキングすることに関係する方法および組成物である。一態様において、該方法は、ＮＫ細胞をＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８および／またはＩＬ−１８で刺激することをさらに含み得る。
【０００５】
２．同じく開示されるのは、ＮＫ細胞をＰＭ２１粒子および／またはＦＣ２１フィーダー細胞と接触させること、ならびにＮＫ細胞を該対象に養子移入すること、を含む、骨髄悪性腫瘍もしくは骨髄由来の悪性腫瘍を処置する方法、および／またはウイルス感染（骨髄向性（ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒｏｐｉｃ）ウイルス感染または骨髄に有害作用を及ぼすウイルス感染をはじめとする骨髄関連ウイルス感染など）を処置する方法である。幾つかの態様において、ＰＭ２１粒子および／またはＦＣ２１フィーダー細胞とＮＫ細胞との接触は、患者へのＮＫ細胞の移入の前に行うことができる。別の態様において、ＰＭ２１粒子および／またはＦＣ２１フィーダー細胞とＮＫ細胞との接触は、患者の体内で行うことができる。
【０００６】
ＩＩＩ．図の簡単な説明
３．本明細書に組み入れられ、その一部を構成する添付の図面は、複数の実施形態を例示しており、記載と一緒になって、開示された組成物および方法を例示している。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】４．ＰＭ２１粒子が細胞傷害性ＮＫ細胞を効率的かつ選択的に増幅する（ｅｘｐａｎｄ）ことを示す。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、白血球供給源から単離し、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘおよび５０Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−２を補充されたＳＣＧＭ中で０．１×１０６ＮＫ細胞／ｍＬに播種した。ＰＢＭＣを、２００μｇ／ｍＬのＰＭ１５（□、黒色）またはＰＭ２１（〇、青色）粒子で２７日間刺激し、細胞含量を２〜３日ごとにテストして、ＮＫ細胞増幅の相対的倍率（Ａ）および懸濁細胞のパーセンテージ（Ｂ）を示す。ＮＫ細胞増幅についての１４日目のデータの累積分析に基づくと、ＰＭ２１粒子（８２５±１８８倍、Ｎ＝１３、ドナー４名）（青色）は、ＰＭ１５粒子（４２５±７１、Ｎ＝３５、ドナー９名）（黒色）に比較してＮＫ細胞増幅がより効率的である（Ｃ）。寛解中のＡＭＬ患者３名から単離されたＰＢＭＣを、ＰＭ２１粒子（２００μｇ／ｍＬ）と共に１４日間培養し、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ、５０Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−２を含むＳＣＧＭ中で０．５×１０６ＮＫ細胞／ｍＬに播種した。原発性ＰＢＭＣ（Ｄ）およびリンパ球含量（Ｅ）（ＣＤ５６＋ＣＤ３−ＮＫ細胞(●、赤色）、ＣＤ５６−ＣＤ３＋Ｔ細胞（■、青色）およびＣＤ５６＋ＣＤ３＋ＮＫＴ細胞(▲、黒色））からのＮＫ細胞増幅の倍率が示されている。患者Ｆ０２１からのＰＢＭＣを、先に通り１６日間培養して、同患者からのＡＭＬ腫瘍への自家細胞傷害性を分析した（Ｆ）。増幅されたＰＭ２１−ＮＫ細胞をＴＦＬ４で標識し、活動性疾患の際の同患者からのＡＭＬ細胞と共に示されたＥ：Ｔ比でコインキュベートして（２時間）、フローサイトメトリーにより分析した。自然死標的細胞の量を、「標的のみ」対照を用いて計測した。各データは、二重測定で計測された。
【図２】５．ＰＭ２１粒子での非選択ＰＢＭＣの予備活性化が、インビボＮＫ細胞増幅を誘導することを示す。ＮＳＧマウスに、非活性化ＰＢＭＣ（ＡおよびＢ）、またはＰＭ２１粒子および１００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−２によりエクスビボで２日間予備活性化されたＰＢＭＣ（ＰＭ２１−ＰＢＭＣ）（ＣおよびＤ）のいずれかを２×１０６細胞で腹腔内注射した。全群のマウスが、１０００ＵのＩＬ−２を腹腔内に週３回受けた。マウスの群は、ＰＭ２１粒子  ４００μｇも腹腔内に週２回注射された（ＢおよびＤ）。末梢血を、連続での頬からの出血により採取し、ｈＣＤ４５＋ヒトリンパ球について、６日目から開始して週２回、フローサイトメトリーにより分析した。ＮＫ、ＴおよびＢ細胞の量を、ｈＣＤ３、ｈＣＤ５６、ｈＣＤ１９についての染色に基づいて計測した。各実験群における左のプロットは、ＰＢ  １μＬあたりのｈＮＫ細胞の濃度を示す。右のプロットは、総ｈＣＤ４５＋細胞の割合としてのｈＮＫ細胞（〇、赤色）およびＴ細胞（▽、黒色）のパーセンテージを示す。
【図３】６．増殖分析がＰＭ２１−ＰＢＭＣからのインビボＮＫ細胞増幅を証明することを示す。解凍されたばかりのＰＢＭＣ、またはＰＭ２１粒子および１００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−２で２日間予備活性化されたＰＢＭＣ（ＰＭ２１−ＰＢＭＣ）を、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ（ＣＴ）  Ｖｉｏｌｅｔで標識した。２×１０６の非活性化ＰＢＭＣ（ＡおよびＢ）またはＰＭ２１−ＰＢＭＣ（ＣおよびＤ）を、ＮＳＧマウスに腹腔内注射した。全群のマウスが、１０００Ｕ  ＩＬ−２を腹腔内に週３回受けた。２つのマウス群はまた、ＰＭ２１粒子４００μｇを腹腔内に週２回注射された（ＢおよびＤ）。各群のマウス２匹を６日目に安楽死させて、腹膜洗浄液をｈＣＤ４５＋、ｈＣＤ３−、ｈＣＤ５６＋ＮＫ細胞のＣＴ  Ｖｉｏｌｅｔ蛍光について、フローサイトメトリーにより分析した。ＣＴ  Ｖｉｏｌｅｔ蛍光のヒストグラムを、ＦｌｏｗＬｏｇｉｃ内の増殖分析スイートを利用したカーブフィッティングを通して分析した。
【図４】７．ＰＭ２１のインビボ適用が末梢血中のＮＫ細胞の増加を可能にすることを示す。ＰＢＭＣは、ＰＭ２１粒子および１００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−２によりエクスビボで２日間、予備活性化させた。生存可能なＮＫ細胞０．２×１０６個を含有する量のＰＭ２１−ＰＢＭＣを、ＮＳＧマウスに腹腔内注射した。全群のマウスが、１０００ＵのＩＬ−２を腹腔内に週３回受けた。マウスはまた、ＰＭ２１粒子０(Ａ）、４００(Ｂ）、８００(Ｃ）、１，６００μｇ(Ｄ）を週２回、腹腔内に注射された。末梢血を、ｈＣＤ４５＋リンパ球について、５日目から開始して週２回、フローサイトメトリーにより分析し、ｈＮＫ、ｈＴおよびｈＢ細胞量を、ｈＣＤ３、ｈＣＤ５６、ｈＣＤ１９の染色に基づいて計測した。各実験群における左のプロットは、ＰＢ  １μＬあたりのｈＮＫ細胞の濃度を示す。右のプロットは、総ｈＣＤ４５＋細胞の割合としてのｈＮＫ細胞（〇、赤色）およびＴ細胞（▽、黒色）のパーセンテージを示す。ＰＭ２１−ＰＢＭＣの初回腹腔内注射の後１２日目からのＰＢ試料の分析から、インビボＰＭ２１粒子投与に応答したＰＢ  ｈＮＫ細胞の用量依存的増加が示されるが（Ｅ左）、総ＣＤ３＋Ｔ細胞の有意な用量依存的増加は、観察されなかった（Ｅ右）。
【図５】８．重要な生理学的部位に生体内分布するインビボ増幅されたＮＫ細胞、および該ＮＫ細胞の生体内分布が、ＰＭ２１粒子のインビボ適用により増加することを示す。ＰＭ２１−ＰＢＭＣの一部として、ＰＭ２１粒子および１００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−２によりエクスビボで２日間、予備活性化されたＮＫ細胞（０．２×１０６細胞）を、ＮＳＧマウスに腹腔内注射した。全群のマウスが、１０００ＵのＩＬ−２を腹腔内に週３回受けた。マウスはまた、ＰＭ２１粒子０または８００μｇを週２回、腹腔内に注射された。マウスは、ＰＭ２１−ＰＢＭＣの初回腹腔内注射の後１６日目に殺処分された。安楽死当日に、骨髄（大腿部）、脾臓、肺、脳および肝臓を採取して、臓器を灌流し、大腿部は洗浄して細胞を回収した。細胞を、フローサイトメトリー分析のためにｈＣＤ３、ｈＣＤ４５、ｈＣＤ５６、ｈＣＤ１９に対する抗体で染色した。骨髄、脾臓、脳、肺および肝臓（左から右）のデータを、ｈＣＤ４５＋ｈＣＤ５６＋ｈＣＤ３−ＮＫ細胞の量（各臓器の上のプロット）と共に示し、ｈＣＤ４５＋ｈＣＤ５６＋ｈＣＤ３−ＮＫ細胞（〇、赤色）、ｈＣＤ４５＋ｈＣＤ３＋Ｔ細胞（□、青色）およびｈＣＤ４５＋、ｈＣＤ５６−ｈＣＤ３−のその他のリンパ球（△、黒色）のパーセンテージ（各臓器の下のプロット）を示す。それぞれの太いバーは、平均を表す。
【図６】９．異なるドナー供給源からのインビボＮＫ細胞の増幅が、一貫していることを示す。インビボＮＫ細胞増幅で刺激されたＰＭ２１粒子の一貫性を、健常ドナーから得られた３種の異なるＰＢＭＣを用いてテストした。ＰＢＭＣを、ＰＭ２１粒子および１００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−２によりエクスビボで２日間、予備活性化して（ＰＭ２１−ＰＢＭＣ）、ＮＳＧマウスに腹腔内注射した。全群のマウスが、１０００ＵのＩＬ−２を腹腔内に週３回受けた。末梢血を、ｈＣＤ４５＋リンパ球について、５日目から開始して週２回、フローサイトメトリーにより分析し、ｈＮＫ、ｈＴおよびｈＢ細胞量を、ｈＣＤ３、ｈＣＤ５６、ｈＣＤ１９の染色に基づいて計測した。腹腔内ＰＢＭＣ注射後１２日目の血中のｈＮＫ細胞の濃度（Ａ）および腹腔内ＰＢＭＣ注射後１４日目の腹膜洗浄液中に回収されたＮＫ細胞の量（Ｃ）は、異なるＮＫ細胞供給源を注射された異なる群の間で類似していた（ＰＢのｐ＝０．８４、およびｐ＝０．６９）。ｈＮＫ細胞（〇、赤色）、ｈＴ細胞（□、青色）および他のｈＣＤ４５＋細胞（△、黒色）の対応する細胞含量もまた、末梢血（Ｂ）および腹腔内（Ｄ）の異なるＰＢＭＣ供給源を注射された群の間で一致していた。それぞれの太いバーは、平均を表す。
【図７】１０．０、１、７、および１０日の刺激にて、可溶性サイトカインで処置されたＮＫ細胞のＨＥＣＡ−４５２染色を示す。
【図８】１１．１０、１２、および１４日の刺激に続いてＫ５６２フィーダー細胞と共に培養されたＮＫ細胞のＨＥＣＡ−４５２染色を示す。
【図９】１２．１０日の刺激に続いて様々な条件下で刺激されたＮＫ細胞のＨＥＣＡ−４５２染色の比較を示す。
【図１０】１３．１０日の刺激に続いて様々な条件下で培養されたＮＫ細胞のＨＥＣＡ−４５２染色を示す。
【図１１】１４．１０日の刺激に続く休止（ｒｅｓｔ）の３日後のＮＫ細胞のＨＥＣＡ−４５２染色を示す。
【図１２】１５．ＰＭ２１粒子の１４日増幅に続く解凍前および解凍後のＨＥＣＡ−４５２染色を示す。
【図１３】１６．ＳＴＡＴ３がヒトＮＫ細胞中のＦＵＴ７遺伝子発現のＩＬ−２１介在性モジュレーションに関与することを示す。（Ａ）ＣｈＩＰ−ｓｅｑを、ＳＴＡＴ３に対する抗体を用いてＩＬ−２１刺激されたナイーブおよび増幅ヒトＮＫ細胞で実施した。矢印は、転写の方向性を示す。スケールは、遺伝子およびアイランドについて一致している；（Ｂ）ＲＮＡ−ｓｅｑから、ＩＬ−２１刺激に応答したＦＵＴ７遺伝子発現の差別的調節が明らかである；（Ｃ）ＩＬ−２１は、増幅ＮＫ細胞におけるＦＵＴ７遺伝子へのＳＴＡＴ３結合を増進する；そして（Ｄ）ＩＬ−２１は、増幅ＮＫ細胞におけるＦＵＴ７遺伝子発現を上方制御する。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
ＩＶ．詳細な記載
１７．本発明の化合物、組成物、物品、装置、および／または方法を開示および記載する前に、それらが、他に断りがない限り特定の合成法もしくは特定の組換え生体工学法に限定されず、または他に断りがない限り特別な試薬に限定されず、もちろん変動し得ることが、理解されなければならない。本明細書で用いられる用語法が、特別な実施形態を記載する目的のものであり、限定される意図がないこともまた、理解されなければならない。
【０００９】
Ａ．定義
１８．本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる通り、単数の形態「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈で他に明確に示されない限り複数の対象物を包含する。つまり例えば「医薬担体」の対象物は、２つ以上のそのような担体の混合物などを包含する。
【００１０】
１９．範囲は、本明細書において、「約」１つの特別な値から、そして／または「約」別の特別な値まで、として表すことができる。そのような範囲を表す場合、別の実施形態は、その１つの特別な値から、そして／または別の特別な値までを包含する。同様に、値が、先行する「約」の使用により近似値として表される場合、特別な値が別の実施形態を形成することは、理解されよう。範囲それぞれのエンドポイントが、他のエンドポイントに関係して、そして他のエンドポイントと独立して意義があることが、さらに理解されよう。本明細書に開示された複数の値が存在し、各値が、その値そのものに加えた「約」特定の値として開示されることも、理解されよう。例えば、値「１０」が、開示される場合、「約１０」もまた、開示される。値が、その値「以下」であると開示される場合、当業者に適宜、理解される通り、「その値以上」、および値の間の可能な範囲もまた、開示されることも理解されよう。例えば、値「１０」が、開示される場合、「１０以下」および「１０以上」もまた、開示される。本出願全体を通して、データが異なる形式で提供されること、およびこのデータがエンドポイントおよびスターティングポイントと、これらのデータポイントの任意の組み合わせの範囲内であることも、理解されよう。例えば、特別なデータポイント「１０」および特別なデータポイント１５が、開示される場合、１０および１５より大きな、１０および１５以上、１０および１５未満、１０および１５以下、および１０および１５と等しい、が１０〜１５の間と同様に開示されると見なされることが、理解されよう。２つの特別な単位の間の各単位もまた開示されることも、理解されよう。例えば１０および１５が開示される場合、１１、１２、１３、および１４もまた、開示される。
【００１１】
２０．本明細書および以下の特許請求の範囲において、以下の意味を有すると定義される複数の用語が参照されよう。
【００１２】
２１．「任意選択による」または「場合により」は、続いて記載される事象または状況が起こっても、または起こらなくてもよく、その記載が、前記事象または状況が起こる例と起こらない例を含むことを意味する。
【００１３】
Ｂ．組成物を使用する方法
２２．養子ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞療法は、骨髄悪性腫瘍および骨髄由来の悪性腫瘍など、そしてそれの獣医学的適用をはじめとする腫瘍学のための有望な新規介入法である。別の態様において、養子ＮＫ細胞は、例えば再生不良性貧血を誘発するパルボウイルスなど、骨髄常在ウイルスの処置に治療的に用いられ得る。それゆえ、養子的に用いられるＮＫ細胞のトラフィッキングの効率は、非常に重要である。特に、移入された細胞を処置として効果的になり得る骨髄にどのようにして誘導するかが、極めて重要である。
【００１４】
２３．骨髄ホーミングの決定因子の１つが、セレクチン結合のためのリガンドである。Ｌ−セレクチンの結合の場合、重大な決定因子は、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）に付着したシアリルルイスｘ（ｓＬｅｘ）炭水化物鎖のフコシル化状態である。一態様において、ＩＬ−２１および／または４１ｂｂｌの操作された膜結合形態を発現するように形質転換されたＫ５６２細胞（Ｋ５６２．ｍｂ２１．４１ｂｂｌ）から調製されたＰＭ２１粒子および／またはＦＣ２１フィーダー細胞によるＮＫ細胞の刺激は、ＮＫ細胞の効率的な特異的増幅を誘導し、ｓＬｅｘの全フコシル化を誘導することが、開示され、本明細書で企図される。
【００１５】
２４．したがって一態様において、本明細書に開示されるのは、ＮＫ細胞をＰＭ２１粒子および／またはＦＣ２１フィーダー細胞と接触させること、ならびにＮＫ細胞を必要とする患者に養子移入すること、を含む、骨髄へのＮＫ細胞のトラフィッキングに関する方法、および骨髄悪性腫瘍または骨髄由来の悪性腫瘍を処置する方法である。一態様において、該方法は、ＮＫ細胞をＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１によりエクスビボまたはインビボ（患者の体内）のいずれかで刺激することをさらに含み得る。
【００１６】
２５．幾つかの態様において、ＰＭ２１粒子および／またはＦＣ２１フィーダー細胞とＮＫ細胞との接触は、患者へのＮＫ細胞の移入の前に行うことができる。別の態様において、ＰＭ２１粒子および／またはＦＣ２１フィーダー細胞とＮＫ細胞との接触は、患者の体内で行うことができる。
【００１７】
２６．一態様において、ＮＫ細胞免疫療法の有効性が、患者に投与されるＮＫ細胞、またはインビボ増幅を通して輸液後に到達されるＮＫ細胞の用量に依存的であることが、理解され、本明細書で企図される。現在利用可能な技術は、患者において治療効果を実現するのに必要となるＮＫ細胞増幅のレベルを実現することが不能であることにより限定される。より簡潔な臨床増幅プロトコルを欠くことが、ＮＫ細胞を基にした免疫療法の進行および広範の普及にとって大きな障壁である。現行のエクスビボ増幅プロトコルは、白血病由来フィーダー／刺激細胞株で発現される、高用量のサイトカインとリガンドの活性化との組み合わせを利用し、ほとんどの施設にある臨床環境に移設するための少なからぬ欠点を提起し、直接的なインビボ増幅に修正可能でない。本明細書に記載されたエキソソームをはじめとする粒子技術の利用が、刺激細胞の要件を排除し、こうして方法論が簡潔化して、養子療法のためのエクスビボ増幅が可能になる、または選択的インビボ増幅のためにインビボで適用される。したがって一態様において、本明細書で開示されるのは、ＮＫ細胞を、ＮＫ細胞エフェクター剤を含む１種または複数の小胞と接触させることを含む、ＮＫ細胞の養子移入を通して骨髄悪性腫瘍および骨髄由来の悪性腫瘍を処置するための方法ならびに／または骨髄にＮＫ細胞をトラフィッキングする方法である。一態様において、同じく開示されるのは、少なくとも１種のＮＫ細胞を少なくとも１種または複数の刺激性サイトカインと接触させることにより、インビボＮＫ細胞を予備活性化または活性化させることをさらに含む、骨髄悪性腫瘍、骨髄由来の悪性腫瘍、および／またはウイルス感染（骨髄向性のウイルスを含む）を処置する方法である。したがって一態様において、ＰＭ２１粒子および／もしくはＦＣ２１フィーダー細胞によりエクスビボで増幅されたＮＫ細胞、またはＰＭ２１もしくはＦＣ２１フィーダー細胞により直接インビボ刺激されたＮＫ細胞を使用して、再生不良性貧血を誘発する骨髄常在ウイルスの疾病または症候群（例えば、パルボウイルス）を処置することができる。
【００１８】
２７．開示された方法は、少なくともＮＫ細胞上で少なくとも１種または複数の刺激性サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−１８）と接触させることにより、ＮＫ細胞の予備活性化または活性化を完遂する。したがって一態様において、本明細書で開示されるのは、１種または複数のＮＫ細胞を、２または３種の刺激性サイトカインと接触させることなど、１種または複数のＮＫ細胞を、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１５および／もしくはＩＬ−１８、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される１種または複数の刺激性サイトカインと接触させることによりＮＫ細胞を予備活性化させることを含む、 ＮＫ細胞の養子移入を通して骨髄悪性腫瘍および骨髄由来の悪性腫瘍を処置する方法ならびに／または骨髄にＮＫ細胞をトラフィッキングする方法である。例えば具体的に本明細書に開示されるのは、該予備活性化または活性化ステップが、ＮＫ細胞とＩＬ−２；ＩＬ−１２；ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５；ＩＬ−１２およびＩＬ−１８；ＩＬ−１５およびＩＬ−１８；またはＩＬ−１２、ＩＬ−１５、およびＩＬ−１８との接触を含む、方法である。一態様において、開示された、ＮＫ細胞の養子移入を通して骨髄悪性腫瘍および骨髄由来の悪性腫瘍を処置する方法、ならびに／または骨髄にＮＫ細胞をトラフィッキングする方法は、ＮＫ細胞を、可溶性形態の、またはＰＭ２１粒子もしくはＦＣ２１フィーダー細胞の形態の、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、ＩＬ−２１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＵＬＢＰ２、ＩＣＡＭ−１、２Ｂ４、ＢＣＭ１／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＣＣＲ７、ＤＡＰ１２、Ｎｏｔｃｈリガンドおよび／またはＤＡＰ１０からなる群から選択される１種または複数のサイトカインと接触させることをさらに含み得る。
【００１９】
２８．可溶性形態の、またはＰＭ２１粒子もしくはＦＣ２１フィーダー細胞の形態の予備活性化または活性化の持続期間（即ち、ＮＫ細胞と刺激性サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−１８）との接触の持続期間）が、ＮＫ細胞の所望の予備活性化または活性化を実現するのに必要となる時間の任意の長さであり得ることが、理解され、本明細書で企図される。例えば該接触は、１分という短時間、または７日もの長時間であり得る（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−１８の存在下でＮＫ細胞を７日間培養すること）。一態様において、本明細書で開示されるのは、１種または複数のＮＫ細胞をＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、および／またはＩＬ−１８と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、３６、または４８時間接触させることによりＮＫ細胞を予備活性化または活性化させることを含む、ＮＫ細胞の養子移入を通して骨髄悪性腫瘍および骨髄由来の悪性腫瘍を処置する方法ならびに／または骨髄にＮＫ細胞をトラフィッキングする方法である。培養でのサイトカインの半減期が、所望の接触時間より短くなり得ることが、理解され、本明細書で企図される。したがって本明細書で開示されるのは、１種または複数のＮＫ細胞をＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−１８と、接触期間内で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２時間ごとに（例えば、２４時間の接触時間内で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２時間ごとに）接触させる方法である。
【００２０】
２９．接触してＮＫ細胞を活性化および／または増幅させる１種または複数のＮＫ細胞のエフェクター剤（即ち、刺激性ペプチド、サイトカイン、および／または接着分子）を含む形質膜（ＰＭ）粒子、エキソソーム（ＥＸ）またはフィーダー細胞（ＦＣ）の使用を通して、サイトカイン毒性に関連する多くのハードルが乗り越えられる。ＮＫ細胞活性化剤および刺激性ペプチドの例としては、４１ＢＢＬ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１８、ＭＩＣＡ、ＬＦＡ−１、２Ｂ４、ＢＣＭ／ＳＬＡＭＦ２、ＣＣＲ７、Ｎｏｔｃｈリガンドおよび／または他のホーミング誘導シグナル伝達分子が挙げられるが、これらに限定されない。サイトカインの例としては、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、およびＩＬ−１８が挙げられるが、これらに限定されない。接着分子の例としては、ＬＦＡ−１、ＭＩＣＡ、ＢＣＭ／ＳＬＡＭＦ２が挙げられるが、これらに限定されない。例えば形質膜（ＰＭ）粒子、フィーダー細胞（ＦＣ）、またはエキソソーム（ＥＸ）は、膜結合ＩＬ−２１を発現するフィーダー細胞（それぞれ、ＦＣ２１細胞、ＰＭ２１粒子、およびＥＸ２１エキソソーム）から調製される。膜結合ＩＬ−２１を発現するＦＣ２１細胞、ＰＭ２１粒子、およびＥＸ２１エキソソームは、非限定的に４１ＢＢＬ、ＩＬ-２、ＩＬ-１２、ＩＬ-１５、ＩＬ-１８、ＭＩＣＡ、ＬＦＡ-１、２Ｂ４、ＢＣＭ／ＳＬＡＭＦ２、ＣＣＲ７をはじめとする追加の１種または複数の活性化剤、刺激性ペプチド、サイトカイン、および／または接着分子（例えば、４１ＢＢＬおよび膜結合インターロイキン−２１を発現するＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、またはＦＣ細胞）をさらに含み得る。したがって一態様において、本明細書で開示されるのは、ＮＫ細胞を、ＮＫ細胞エフェクター剤を含む少なくとも１種の小胞と接触させることを含み、該小胞を含むＮＫ細胞エフェクター剤が、ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１粒子、および／またはＦＣフィーダー細胞のうちの１つまたは複数の任意の組み合わせである、ＮＫ細胞の養子移入を通して骨髄悪性腫瘍および骨髄由来の悪性腫瘍を処置する方法ならびに／または骨髄にＮＫ細胞をトラフィッキングする方法である。例えば本明細書で開示されるのは、他のステップと共に、ＮＫ細胞を、ＮＫ細胞エフェクター剤を含む少なくとも１種の小胞と接触させることを含み、該小胞を含むＮＫ細胞エフェクター剤が、ＰＭ２１粒子；ＥＸ２１エキソソーム；ＦＣ２１フィーダー細胞；ＰＭ２１粒子およびＥＸ２１エキソソーム；ＰＭ２１粒子およびＦＣ２１フィーダー細胞；ＥＸ２１エキソソームおよびＦＣ２１フィーダー細胞；またはＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、およびＦＣ２１フィーダー細胞を含む、ＮＫ細胞の養子移入を通して骨髄悪性腫瘍および骨髄由来の悪性腫瘍を処置するための方法ならびに／または骨髄にＮＫ細胞をトラフィッキングする方法である。
【００２１】
３０．幾つかの態様において、ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、またはＦＣフィーダー細胞のエフェクター剤は、膜挿入ペプチド（例えば、Ｆｃ、ＧＰＩ、膜貫通Ｔ細胞受容体、またはｐＨＬＩＰ）にカップリングされた１種または複数の刺激性ペプチドを含む。膜挿入ペプチドは、膜への挿入を促進する分子であってもよい。膜挿入ペプチドは、脂質二重層への親和性を有するＣＤ４またはＩｇＧのセグメントを含んでいてもよい。加えて、代わりの膜挿入ペプチドは、ヒトＦｃ、ＧＰＩ、膜貫通Ｔ細胞受容体、またはｐＨＬＩＰを含んでいてもよい。膜自己挿入ペプチド（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｅｌｆ−ｉｎｓｅｒｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ）は、細胞膜に挿入することが知られる任意のペプチドであってもよい。膜自己挿入ペプチドコンジュゲートの使用に応じて、特定の膜自己挿入ペプチドは、他よりも良好な選択になり得る。当業者は、どの膜自己挿入ペプチドが異なる状況下で理想的であるかを理解するであろう。例えばインビボ使用の場合、ｐＨＬＩＰ膜自己挿入ペプチドが、適切になり得る。ｐＨＬＩＰ膜自己挿入ペプチドは、低ｐＨ条件下のみで膜に挿入する。それゆえｐＨＬＩＰコンジュゲートは、正常な生理学的条件下では細胞膜に挿入しない。しかし、腫瘍環境に注入すると、腫瘍環境は、正常な生理学的条件よりも酸性であるため、ｐＨＬＩＰコンジュゲートが、腫瘍細胞の細胞膜に挿入することができる。腫瘍環境へのこの挿入は、腫瘍エリアにおけるＮＫ細胞の活性化を可能にする。したがってｐＨＬＩＰの使用は、ランダムな細胞膜への望ましくない挿入を予防する。
【００２２】
３１．膜挿入ペプチドは、種々の方法で１種または複数の刺激性ペプチドにカップリングされてもよく、ペプチドをカップリングさせる技術は、当該技術分野で周知である。刺激性ペプチドにカップリングされた膜挿入ペプチドは、膜挿入ペプチドコンジュゲートとも称することができる。幾つかの態様において、膜挿入ペプチドにカップリングされた該１種または複数の刺激性ペプチドは、組換えＤＮＡによりコードされた融合タンパク質を含んでいてもよく、そのような融合タンパク質は、細菌細胞内で産生されてもよい。特定の実施形態において、融合タンパク質は、リポソームまたは細胞膜中への固定のために疎水性ペプチド、ＧＰＩ、またはヒトＦｃなどの親油性分子にコンジュゲートまたはカップリングされた１種または複数の刺激性ペプチドからなってもよい。これらの融合タンパク質のためのｃＤＮＡベクターが、細菌（大腸菌）、昆虫、または哺乳動物細胞における発現を可能にする発現プラスミド中にライゲートされていてもよい。特定の実施形態において、ｃＤＮＡベクターは、ＦＬＡＧ−またはＨＩＳ−タグされていてもよい。細菌細胞が、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ.２ｎｄ  ｅｄ. Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ （１９８９）に記載されるような標準的なＣａＣｌトランスフェクション法を利用してトランスフェクトされてもよい。細菌細胞はまた、ＬＢ培地で培養されてもよく、細胞を回収し、フレンチプレスを用いて溶解することができる。該当するタンパク質を、アフィニティークロマトグラフィーにより溶解物から精製することができる。パルミチン酸コンジュゲートプロテインＡおよび精製されたＦｃ融合タンパク質を、４℃で１：２（ｗ／ｗ）で混合することにより、文献に記載された通りコンジュゲートすることができる。コンジュゲートは、その後、腫瘍内に直接注入してもよく、またはリポソームに取り込まれてもよい。
【００２３】
３２．カップリングのタイプおよびカップリングのための方法は、当業者に公知である。本明細書で用いられる用語「カップリングする」は、膜自己挿入ペプチドがコンジュゲート、連結、または他の方法でペプチドもしくはタンパク質などの別の分子につながることを指す。例えば刺激性ペプチドにカップリングされた膜挿入ペプチドは、膜挿入ペプチドがジスルフィド結合を介して別のタンパク質にカップリングされた誘導タンパク質であり得る。カップリングまたはコンジュゲーティングは、膜自己挿入ペプチドとＮＫ細胞エフェクター剤との間に化学的なつながりが存在することを意味し得る。
【００２４】
３３．幾つかの態様において、１つまたは複数の刺激性ペプチドが、膜自己挿入ペプチドまたは本来の場所での自己組立て（ｉｎ ｓｉｔｕ ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ）のためのＧＰＩアンカーにカップリングされていてもよい。例えば４１−ＢＢＬおよびＩＬ−２１が、酸性条件下で細胞膜に単独で挿入するｐＨＬＩＰペプチドにカップリングされていて、それにより腫瘍近辺の細胞への刺激性リガンドの固定を可能にしてもよい。刺激性ペプチド：４１ＢＢＬ、ＩＬ-２、ＩＬ-１２、ＩＬ-２１、ＢＣＭ／ＳＬＡＭＦ２、ＣＣＲ７ および／または他のホーミング受容体が、細菌細胞内で産生されてもよく、または市販の供給元から購入されてもよく、これらのタンパク質のｃＤＮＡベクターは、場合により細菌（大腸菌）、昆虫、または哺乳動物細胞における発現を可能にするｐＴｒｉＥＸ発現プラスミド中にライゲートされていてもよい。ｃＤＮＡベクターが、ＦＬＡＧ−またはＨＩＳ−タグの発現をコードしてもよい。細菌細胞は、標準的なＣａＣｌトランスフェクション法を利用してトランスフェクトすることができ、ＬＢ培地で培養されてもよい。細胞を回収して、フレンチプレスを用いて溶解することができ、該当するタンパク質を、その後、アフィニティークロマトグラフィーにより溶解物から精製してもよい。
【００２５】
３４．幾つかの実施形態において、ｐＨＬＩＰは、９−フルオレニルメチルオキシカルボニルの化学作用を利用した固相ペプチド合成により調製されてもよく、該生成物が、逆相クロマトグラフィーによりＣ１８カラムで精製されてもよい。ｐＨＬＩＰはその後、ベンゾフェノン−４−ヨードアセトアミドなどの架橋剤と共にインキュベートすることにより刺激性ヒトタンパク質リガンドにコンジュゲートされてもよい。複数回洗浄した後、コンジュゲートされたｐＨＬＩＰタンパク質を培地（例えば、生理食塩水）で再懸濁させて、腫瘍内または静脈内に注入してもよい。前述の文献からの、そして実験結果に表された証拠に基づいて、そのような修飾された腫瘍細胞表面でのＮＫ細胞とＩＬ−２１および４１−ＢＢＬなどの刺激性リガンドとの相互作用で、本来の場所でのＮＫ細胞増幅を刺激し、腫瘍への細胞傷害性応答を惹起してもよい。このタイプの刺激性アプローチを、卵巣癌などの固形腫瘍の処置に用いることができ、そこで酸性ｐＨ条件下で本来の位置の腫瘍細胞内に挿入するＮＫ刺激性リガンドを、低用量のＩＬ−２のみと、またはＮＫ細胞と共に、患者の腹腔に注射することができる。ＮＫ細胞などの高レベルのＦＣγｌＩＩＲ（ＣＤ１６）を発現する細胞傷害性リンパ球が治療性抗体を用いた癌治療の有効性に不可欠であるという強力な証拠がある。したがってこのアプローチは、治療性抗体と組み合わせて用いることもできる。
【００２６】
３５．ＮＫ細胞と小胞を含むＮＫ細胞エフェクター剤（即ち、ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、および／またはＦＣフィーダー細胞）との接触期間が、メモリーＮＫ細胞の所望の増幅を実現するのに必要となる時間の任意の長さであり得ることが、理解され、本明細書で企図される。例えば該接触は、１分という短時間、または６０日もの長時間であり得る（例えば、ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、および／またはＦＣフィーダー細胞の存在下でＮＫ細胞を７日間培養すること）。一態様において、ＮＫ細胞と小胞を含むＮＫ細胞エフェクター剤との接触は、約６日〜約６０日の間であり得、より好ましくは該接触は、約６日〜約４０日の間であり得る。同じく本明細書で開示されるのは、ＮＫ細胞をＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、および／またはＦＣフィーダー細胞と、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、または７２日間接触させることを含む、ＮＫ細胞の養子移入を通して骨髄悪性腫瘍および骨髄由来の悪性腫瘍を処置する方法ならびに／または骨髄にＮＫ細胞をトラフィッキングする方法である。幾つかの例において、該ＮＫ細胞とＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、および／またはＦＣフィーダー細胞との複数回の接触が望ましくなり得、用いられ得ることが、理解され、本明細書で企図される。例えば該ＮＫ細胞を、ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、および／またはＦＣフィーダー細胞と、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、２４時間、２、３、４、５、６、７、８、９、０、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１日ごとに１回接触させることができる。したがって一態様において、本明細書に開示されるのは、該ＮＫ細胞をＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、および／またはＦＣフィーダー細胞と１回より多く接触させ、該接触が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、２４時間、２、３、４、５、６、７、８、９、０、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１日ごとに行われる、ＮＫ細胞の養子移入を通して骨髄悪性腫瘍および骨髄由来の悪性腫瘍を処置する方法ならびに／または骨髄にＮＫ細胞をトラフィッキングする方法である。
【００２７】
３６．一態様において、該形質膜粒子、フィーダー細胞、またはエキソソームは、ＮＫ細胞を刺激するフィーダー細胞から精製され得る。本明細書で開示される、形質膜粒子またはエキソソームを作製する際の使用のための、請求された本発明における使用のためのＮＫ細胞刺激フィーダー細胞は、放射線照射された自家もしくは同種末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、または自家もしくは同種末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む非放射線照射自家もしくはＰＢＭＣ、ＲＰＭＩ８８６６、ＨＦＷＴ、Ｋ５６２、ＳＫＯＶ３、もしくはＥＢＶ-ＬＣＬ、または膜結合ＩＬ−２１および４１ＢＢＬをトランスフェクトされた非放射線照射自家もしくはＰＢＭＣ、ＲＰＭＩ８８６６、ＨＦＷＴ、Ｋ５６２、ＳＫＯＶ３、もしくはＥＢＶ-ＬＣＬ細胞のいずれかであり得る。幾つかの態様において、該ＮＫ細胞フィーダー細胞は、膜結合ＩＬ−２１および４１ＢＢＬをトランスフェクトされたＫ５６２細胞であり得る。
【００２８】
３７．開示された組成物を用いて、癌、特に骨髄に影響をおぼすまたは骨髄に局在化する悪性腫瘍など、非制御型細胞増殖を起こす任意の疾患を処置することができる。異なる型の癌の非限定的列挙は、以下の通りである：リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキン）、白血病、癌腫、固形組織の癌腫、扁平細胞の癌腫、腺癌、サルコーマ、グリオーマ、高異型度グリオーマ、ブラストーマ、神経芽腫、形質細胞腫、細胞球腫、メラノーマ、アデノーマ、低酸素性腫瘍、骨髄腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫もしくはサルコーマ、転移性癌、または一般的な癌。
【００２９】
３８．開示された組成物を用いて処置することが可能な癌の代表的で非限定的な列挙は、以下の通りである：リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱癌、脳癌、神経系の癌、頭頸部癌、頭頸部の扁平細胞癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｃａｎｃｅｒ）、小細胞肺癌および非小細胞肺癌などの肺癌（ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ）、神経芽腫／膠芽腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、肝臓癌、メラノーマ、口、喉、喉頭および肺の扁平細胞癌、結腸癌、子宮頸癌、子宮頸癌腫、乳癌、および上皮癌、腎臓癌（ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、尿生殖器癌、肺癌（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｃａｎｃｅｒ）、食道癌腫、頭頸部癌腫、大腸癌、造血系癌；精巣癌；結腸および直腸癌、前立腺癌、または膵臓癌。
【００３０】
３９．開示された組成物を用いて、骨髄に関連するウイルス疾患を処置することもできる。本明細書で用いられる骨髄に関連するウイルス疾患は、骨髄がウイルスを宿す（即ち、ウイルス感染（慢性、急性、潜伏性、および持続性感染など）、さもなければ骨髄への向性を有する）、または骨髄が再生不良性貧血を誘発するウイルス、例えばパルボウイルスなどのウイルスにより有害な影響を受けたウイルス疾患を指す（幾つかの例において、骨髄に有害な影響を及ぼす疾患または疾病は、骨髄のウイルス感染である）。したがって一態様において、本明細書で開示されるのは、ＮＫ細胞をＰＭ２１粒子および／またはＦＣ２１フィーダー細胞と接触させることを含む、対象における骨髄に関連する（例えば、骨髄に悪影響を及ぼす）ウイルス感染を処置する方法、およびＮＫ細胞を、ウイルス感染を有する対象に養子移入する方法である。一態様において、該ウイルスは、再生不良性貧血を誘発する可能性があり、そして／または骨髄における潜伏性もしくは慢性感染を成立させる骨髄向性感染もしくはウイルス感染であり得る。例えば該ウイルスとしては、デング、肝炎ウイルス（非限定的に、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、およびＧ型肝炎ウイルスなど）、エプスタイン−バーウイルス（ヒトヘルペスウイルス４としても知られる）、サイトメガロウイルス（ヒトヘルペスウイルス５としても知られる）、パルボウイルス（非限定的にパルボウイルスＢ１９など）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、および呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００３１】
Ｃ．組成物
４０．開示されるのは、開示された組成物を調製するために用いられる成分、および本明細書で開示された方法の中で用いられる該組成物そのものである。これらおよび他の材料は、本明細書で開示されており、これらの材料の組み合わせ、部分集合、相互作用、群などが開示され、これらの化合物の各様々な個体および集合的組み合わせおよび順列の具体的参照が明確に開示されなくてもよいが、それぞれが本明細書に具体的に企図および記載されることが、理解されよう。例えば、特別なＰＭ２１粒子またはＦＣ２１フィーダー細胞が開示および議論され、複数の修飾が、複数の分子に施され得る場合、具体的に企図されるのは、反することが具体的に示されない限り、可能な修飾のあらゆる組み合わせおよび順列である。したがって、分子Ａ、Ｂ、およびＣのクラスが開示され、分子Ｄ、Ｅ、およびＦのクラス、ならびに組み合わせた分子の例Ａ−Ｄが開示される場合、それぞれが個別に列挙されていないとしても、それぞれは個別に、そして集合的に企図され、組み合わせ：Ａ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−ＥおよびＣ−Ｆが開示を見込まれることを意味する。同様に、これらの任意の部分集合または組み合わせもまた、開示される。したがって例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、およびＣ−Ｅの亜群が、開示を見込まれるであろう。この概念は、非限定的に、開示された組成物を作製および使用する方法におけるステップなど、本出願の全ての態様に適用される。したがって、実施され得る種々の追加のステップが存在すれば、これらの追加のステップのそれぞれを、開示される方法の任意の具体的実施形態または実施形態の組み合わせで実施し得ることが理解されよう。
【００３２】
４１．開示された、ＮＫ細胞の養子移入を通して骨髄悪性腫瘍および骨髄由来の悪性腫瘍を処置する方法、ならびに／または骨髄にＮＫ細胞をトラフィッキングする方法は、１種または複数のサイトカイン（例えば、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−１８）を、例えばＰＭ２１粒子、ＦＣフィーダー細胞、および／またはＥＸ２１エキソソームなどのＮＫ細胞エフェクター剤を含む小胞と組み合わせて利用する。開示された方法で使用される成分を、開示された方法を人に即座に実施させるパッケージ内で提供することが有利になることが、理解され、本明細書で企図される。
【００３３】
したがって一態様において、本明細書で開示されるのは、１種または複数のサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−１８）と、ＮＫ細胞エフェクター剤を含む１種または複数の小胞と、を含む、骨髄悪性腫瘍および骨髄由来の悪性腫瘍をＮＫ細胞で処置するためのキットである。一態様において、該小胞は、ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、および／またはＦＣフィーダー細胞であり得る。例えば、開示されたキットは、ＩＬ−１２およびＰＭ２１粒子；ＩＬ−１５およびＰＭ２１粒子；ＩＬ−１８およびＰＭ２１粒子；ＩＬ−１２およびＥＸ２１エキソソーム、ＩＬ−１５およびＥＸ２１エキソソーム；ＩＬ−１８およびＥＸ２１エキソソーム；ＩＬ−１２およびＦＣ２１フィーダー細胞；ＩＬ−１５およびＦＣ２１フィーダー細胞；ＩＬ−１８およびＦＣ２１フィーダー細胞；ＩＬ−１２、ＩＬ１５、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ−１２、ＩＬ１５、およびＥＸ２１エキソソーム；ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、およびＥＸ２１エキソソーム；ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、およびＥＸ２１エキソソーム；ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、およびＥＸ２１エキソソーム；ＩＬ−１２、ＩＬ１５、およびＦＣ２１フィーダー細胞；ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、およびＦＣ２１フィーダー細胞；ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、およびＦＣ２１フィーダー細胞；ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、およびＦＣ２１フィーダー細胞；ＩＬ−１２、ＥＸ２１エキソソーム、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ−１５、ＥＸ２１エキソソーム、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ−１８、ＥＸ２１エキソソーム、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ−１２、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ−１５、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ−１８、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ−１２、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＥＸ２１エキソソーム；ＩＬ−１５、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＥＸ２１エキソソーム；ＩＬ−１８、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＥＸ２１エキソソーム；ＩＬ−１２、ＦＣ２１フィーダー細胞、ＰＭ２１粒子、およびＥＸ２１エキソソーム；ＩＬ−１５、ＦＣ２１フィーダー細胞、ＰＭ２１粒子、およびＥＸ２１エキソソーム；ＩＬ−１８、ＦＣ２１フィーダー細胞、ＰＭ２１粒子、およびＥＸ２１エキソソーム；ＩＬ−１２、ＩＬ１５、ＥＸ２１エキソソーム、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＥＸ２１エキソソーム、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＥＸ２１エキソソーム、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＥＸ２１エキソソーム、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ−１２、ＩＬ１５、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ−１２、ＩＬ１５、ＥＸ２１エキソソーム、およびＦＣ２１フィーダー細胞；ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＥＸ２１エキソソーム、およびＦＣ２１フィーダー細胞；ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＥＸ２１エキソソーム、およびＦＣ２１フィーダー細胞；ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＥＸ２１エキソソーム、およびＦＣ２１フィーダー細胞；ＩＬ−１２、ＥＸ２１エキソソーム、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ−１５、ＥＸ２１エキソソーム、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ−１８、ＥＸ２１エキソソーム、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ−１２、ＩＬ１５、ＥＸ２１エキソソーム、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＥＸ２１エキソソーム、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子；ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＥＸ２１エキソソーム、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子；またはＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＥＸ２１エキソソーム、ＦＣ２１フィーダー細胞、およびＰＭ２１粒子を含み得る。
【００３４】
４２．小胞に含まれるＮＫ細胞エフェクター剤（例えば、ＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、および／またはＦＣフィーダー細胞）が、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、ＩＬ−２１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＵＬＢＰ２、ＩＣＡＭ−１、２Ｂ４、ＢＣＭ１／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＣＣＲ７、ＤＡＰ１２、ＮｏｔｃｈリガンドおよびＤＡＰ１０からなるＮＫ細胞エフェクター剤の群から選択され得ることが、理解され、本明細書で企図される。
【００３５】
４３．開示されたキットまたは装置が、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、および／またはＩＬ−１８に加えてサイトカインを含み得ることが、理解され、本明細書で企図される。したがって一態様において、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＵＬＢＰ２、ＩＣＡＭ−１、２Ｂ４、ＢＣＭ１／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＣＣＲ７、ＤＡＰ１２、およびＤＡＰ１０をさらに含む、ＮＫ細胞の養子移入を通して骨髄悪性腫瘍および骨髄由来の悪性腫瘍を処置する方法、ならびに／または骨髄にＮＫ細胞をトラフィッキングする方法のためのキットがある。
【００３６】
４４．一態様において、該開示されたキットまたは装置が、末梢血単核細胞の非選択集団から得られたＮＫ細胞など、ドナー供給物から得られたＮＫ細胞と共に用いられ得ることが、本明細書で企図される。幾つかの例において、骨髄悪性腫瘍および骨髄由来の悪性腫瘍を処置するための開示されたキットにおいて用いられるＮＫ細胞のためのドナー供給源はまた、ＮＫ細胞のレシピエントであり得る。したがって該ＮＫ細胞は、自家供給源のものであり得る。他の例において、該ＮＫ細胞のドナー供給源は、ハプロタイプ一致の、または同種のドナー供給源であり得る。
【００３７】
４５．ＮＫ細胞をキットまたは装置中で提供することが有益である例があることが、本明細書でさらに企図される。したがって一態様において、本明細書で開示されるのは、ＮＫ細胞またはＮＫ細胞株をさらに含む骨髄悪性腫瘍を処置するためのキットである。
【００３８】
１．医薬担体／医薬製品の送達
４６．先に記載された通り、該組成物はまた、医薬的に許容できる担体中でインビボで投与され得る。「医薬的に許容できる」は、生物学的または他の点で望ましからぬものでない材料を意味し、即ち該材料は、任意の望ましくない生物学的影響を誘発することなく、または含有される医薬組成物の他の成分のいずれかと有害な手法で相互作用することなく、核酸またはベクターと共に対象に投与され得る。該担体は、当業者に周知の通り、当然、有効成分の任意の分解を最小限にするように、そして対象における任意の有害副作用を最小限にするように選択されるであろう。
【００３９】
４７．該組成物は、外用（ｔｏｐｉｃａｌ）での鼻内投与または吸入により投与など、経口的に、非経口的に（例えば、静脈内で）、筋肉内注射により、腹腔内注射により、経皮的に、体外で、外用などで投与されてもよい。本明細書で用いられる「外用での鼻内投与」は、鼻孔の一方または両方からの鼻および鼻腔への該組成物の送達を意味し、噴霧機構もしくは液滴機構による、または核酸もしくはベクターのエアロゾル化を通した、送達を含み得る。吸入による該組成物の投与は、噴霧または液滴機構による送達を介する鼻または口を通したものであり得る。送達は、挿管を介した呼吸器系（例えば、肺）の任意のエリアに直接であり得る。必要となる組成物の厳密な量は、対象の種、年齢、体重および全般的状態、処置されるアレルギー障害の重症度、用いられる個々の核酸またはベクター、投与様式などに応じて、対象ごとに変動するであろう。したがって、各組成物の厳密な量を特定することは、可能でない。しかし、適当な量を、当業者が本明細書の教示を条件に日常的実験のみを利用して決定することができる。
【００４０】
４８．該組成物の非経口投与は、用いられる場合には、一般に注射を特徴とする。注射液は、液体溶液または懸濁液、注射前の液体への懸濁の溶液に適した固体形態、またはエマルジョンのいずれかとして、従来の形態で調製され得る。非経口投与のためのより近年になり修正されたアプローチは、一定の投与量が維持されるように遅延放出または持続放出系の利用を含む。例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第３，６１０，７９５号を参照されたい。
【００４１】
４９．該材料は、溶液、懸濁液中にあり得る（例えば、微粒子、リポソーム、または細胞中に取り込まれる）。これらは、抗体、受容体、または受容体リガンドを介して特別な細胞型に標的化されてもよい。以下の参考資料は、特異的タンパク質を腫瘍組織に標的化させるこの技術の利用の例である（Ｓｅｎｔｅｒ，  ｅｔ ａｌ., Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ., ２：４４７−４５１, （１９９１）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，  Ｋ．Ｄ．, Ｂｒ. Ｊ. Ｃａｎｃｅｒ，  ６０：２７５−２８１,  (１９８９）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，  ｅｔ ａｌ., Ｂｒ. Ｊ. Ｃａｎｃｅｒ，  ５８：７００−７０３, （１９８８）；Ｓｅｎｔｅｒ，  ｅｔ ａｌ., Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ., ４：３−９, （１９９３）；Ｂａｔｔｅｌｌｉ，  ｅｔ ａｌ., Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ. Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ., ３５：４２１−４２５, （１９９２）；Ｐｉｅｔｅｒｓｚ ａｎｄ  ＭｃＫｅｎｚｉｅ, Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ. Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２９：５７−８０, （１９９２）；およびＲｏｆｆｌｅｒ，  ｅｔ ａｌ., Ｂｉｏｃｈｅｍ. Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，  ４２：２０６２−２０６５, （１９９１））。「ステルス」などのビヒクルおよび他の抗体コンジュゲート化リポソーム（結腸癌種を標的とする脂質介在性薬物など）、細胞特異性リガンドを通したＤＮＡの受容体介在性標的化、リンパ球指向性腫瘍標的化、およびインビボでのネズミグリオーマ細胞の高特異的治療性レトロウイルス標的化。以下の参考資料は、特異的タンパク質を腫瘍組織に標的化させるこの技術の利用の例である（Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ., Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９：６２１４−６２２０,（１９８９）；およびＬｉｔｚｉｎｇｅｒ ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，  １１０４：１７９−１８７,（１９９２））。一般に受容体は、構成的またはリガンド誘導性のいずれかのエンドサイトーシスの経路に関与する。これらの受容体は、クラスリンがコーティングされたピットの中に密集し、クラスリンがコーティングされた小胞を介して細胞に進入し、酸性化されたエンドソームを通過し、そこで受容体が選別され、その後、細胞表面にリサイクルして、細胞内に貯蔵されるようになるか、またはリソゾーム内で分解される。内在化経路は、栄養素の取り込み、活性化タンパク質の除去、巨大分子のクリアランス、ウイルスおよび毒素の日和見的進入、リガンドの解離および分解、ならびに受容体レベルの調節など、種々の機能の働きがある。多くの受容体は、細胞型、受容体濃度、リガンドの型、リガンドの価数、およびリガンドの濃度に応じて、１つより多くの細胞内経路に従う。受容体介在性エンドサイトーシスの分子および細胞機構は、再考されている（Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｅ，  ＤＮＡ ａｎｄ  Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：６, ３９９−４０９  (１９９１））。
【００４２】
ａ）医薬的に許容できる担体
５０．抗体を含む組成物は、医学的に許容できる担体と併せて治療に使用することができる。
【００４３】
５１．適切な担体およびそれらの配合物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ  (１９ｔｈ ｅｄ.）  ｅｄ. Ａ．Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ，  Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ, Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ １９９５に記載されている。典型的には医薬的に許容できる塩の適当な量が、配合物を等張にさせるのに配合物中で用いられる。医薬的に許容できる担体の例としては、生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液が挙げられるが、これらに限定されない。該溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８、より好ましくは約７〜約７．５である。さらなる担体としては、マトリクスが成形体の形態である抗体を含有する固形疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの持続放出性調製物、例えばフィルム、リポソームまたは微粒子が挙げられる。例えば投与経路および投与される組成物の濃度に応じて、特定の担体がより好ましくなり得ることは、当業者に明白であろう。
【００４４】
５２．医薬担体は、当業者に公知である。これらのほとんどは、典型的には滅菌水、生理食塩水、および生理学的ｐＨの緩衝溶液などの溶液をはじめとする、ヒトへの薬物等投与のための標準的担体であろう。該組成物は、筋肉内または皮下に投与され得る。他の化合物は、当業者により用いられる標準的手順に従って投与されよう。
【００４５】
５３．医薬組成物は、選択された分子に加えて、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤などを含んでいてもよい。医薬組成物は、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔薬などの１種または複数の有効成分も含んでいてよい。
【００４６】
５４．該医薬組成物は、局所または全身処置が望ましいか否か、そして処置されるエリアに応じて複数の方法で投与されてもよい。投与は、外用（眼科的、膣内、経直腸、鼻内）、経口、吸入による、または非経口、例えば静脈内ドリップ、皮下、腹腔内、または筋肉内注射によるものであってもよい。開示された抗体は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、体腔または経皮的に投与され得る。
【００４７】
５５．非経口投与用の調製物としては、滅菌水性または非水性溶液、懸濁液、およびエマルジョンが挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体としては、生理食塩水および緩衝媒体をはじめとする、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、ブドウ糖加リンゲル液、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、または不揮発油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流体および栄養素の補液、電解質補液（ブドウ糖加リンゲル液を基にしたものなど）などが挙げられる。例えば抗微生物薬、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガスなどの防腐剤および他の添加剤もまた、存在してよい。
【００４８】
５６．外用投与用の配合物としては、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点滴薬、坐剤、スプレー、液体および粉末を挙げることができる。従来の医薬担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤などが、必須である場合または望ましい場合がある。
【００４９】
５７．経口投与用の組成物としては、粉末もしくは顆粒、水もしくは非水性媒体中の懸濁液もしくは溶液、カプセル、サシェ剤、または錠剤が挙げられる。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が望ましい場合がある。
【００５０】
５８．該組成物の幾つかは、潜在的には、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸などの無機酸、ならびにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸などの有機酸との反応により、または水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基、ならびにモノ−、ジ−、トリアルキルおよびアリールアミン、および置換されたエタノールアミンなどの有機塩基との反応により、形成された医薬的に許容できる酸または塩基付加塩として投与されてもよい。
【００５１】
ｂ）治療的使用
５９．該組成物を投与するための効果的な投与量および投与計画は、経験的に決定されてもよく、そのような決定は、当該技術分野の技能の範囲内である。該組成物の投与のための投与量範囲は、該障害の症状に影響を及ぼす所望の効果を生じるのに充分大きな範囲である。該投与量は、望まない交差反応、アナフィラキシー反応など、有害な副作用を誘発するほど大きくすべきではない。一般に該投与量は、患者の年齢、状態、性別および疾患の程度、投与経路、または他の薬物がレジメンに含まれるか否かにより変動し、当業者により決定され得る。該投与量は、任意の禁忌（ｃｏｕｎｔｅｒｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ）の事象の際に各医師により調整され得る。投与量は、変動させることができ、１日または数日間に１日１回または複数回、投与され得る。所与のクラスの医薬製品に向けた適当な投与量について、ガイダンスを文献に見出すことができる。例えば抗体の適当な用量を選択するためのガイダンスは、抗体の治療的使用についての文献、例えばＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｆｅｒｒｏｎｅ  ｅｔ ａｌ., ｅｄｓ., Ｎｏｇｅｓ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｐａｒｋ Ｒｉｄｇｅ，  Ｎ.Ｊ., （１９８５）ｃｈ． ２２ ａｎｄ  ｐｐ. ３０３−３５７；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ., Ａｎｔｉｂｏｄｉｅs ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｈａｂｅｒ ｅｔ ａｌ., ｅｄｓ., Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ  (１９７７）ｐｐ. ３６５−３８９に見出すことができる。単独で用いられる抗体の典型的な日用量は、上述の因子に応じて、１日あたり約１μｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重まで、またはより多い範囲内であってもよい。
【００５２】
Ｄ．実施例
６０．以下の実施例は、本明細書で請求された化合物、組成物、物品、装置、および／または方法がどのようにして作製および評価されたかの完全な開示および記載を当業者に提供するために述べられており、純粋に模範であり、本開示を限定するものではない。数（例えば、量、温度など）に関する正確さを確保するよう努めたが、若干に誤差および偏差が、考慮されなければならない。他に示されない限り、部は、重量部であり、温度は、℃であるか、または周囲温度であり、圧力は、大気圧またはほぼ大気圧である。
【００５３】
１．実施例１：ＰＭ２１粒子はインビボでＮＫ細胞増幅を刺激する
６１．ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、ＣＤ５６＋ＣＤ３−であることにより同定された自然免疫系の成分であり、ウイルス汚染された、または悪性である細胞を自然に認識して溶解することができる。ＮＫ細胞での細胞療法は、癌処置として有望であり、複数の臨床試験が、実施を終え、様々な癌（ＡＭＬ、リンパ腫、乳癌、卵巣癌、神経芽腫、非小細胞肺癌）の処置のために現在進行中である。ＮＫ細胞での効果的抗癌治療のために、３つの一般的態様が考慮されなければならない：１）ＮＫ細胞の充分に大きな用量が送達されなければならないこと；２）ＮＫ細胞が高度に細胞傷害性でなければならないこと；および３）ＮＫ細胞が疾患部位に到達して、ことによると局在化し、残留して、腫瘍細胞を特異的に標的化しなければならないこと。
【００５４】
６２．ＡＭＬ環境における臨床有効性のために、Ｍｉｌｌｅｒと共同研究者らは、輸液投与後２週間目に末梢血（ＰＢ）１μＬあたり少なくとも１００のＮＫ細胞を提供する用量の到達を推奨した。養子ＮＫ細胞療法での処置が有効となる幾つかの例において、ＰＢ１μＬあたり１，０００を超えるＮＫ細胞が観察された。これらの観察から、全処置有効性に充分な用量の送達のための熟達したＮＫ細胞増幅法の重要性が強調される。
【００５５】
６３．現在、養子細胞療法のためのＮＫ細胞増幅には、大きく３種の異なる臨床使用される方策が存在する。第一に、宿主リンパ球枯渇／放射線照射と組み合わせた、ＩＬ−１５およびＩＬ−２などのサイトカインでのインビボ増幅が、相対的に少量の注射されたドナーＮＫ細胞からのインビボ増幅を刺激することができる。第二に、サイトカイン、主にＩＬ−２およびＩＬ−１５を用いたエクスビボ法は、ＮＫ細胞を活性化することができるが、増幅は相対的に低く、変動性がある。同じく、サイトカインによりエクスビボで活性化されたＮＫ細胞は、輸液後にサイトカインの排出（ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）を受け、ＮＫ細胞は、アポトーシスを受ける。第三に、エクスビボＮＫ細胞増幅のためのフィーダー細胞法は、刺激性の他の細胞との共培養を利用する。ＮＫ細胞刺激のためのフィーダー細胞法は、エプスタイン・バーウイルスーＬＣＬ、または操作された腫瘍細胞を含む。膜結合ＩＬ−１５（ｍｂ１５）および４−１ＢＢリガンド（４１ＢＢＬ）を発現するＫ５６２ＣＭＬ細胞（Ｋ５６２−ｍｂ１５−４１ＢＢＬ）との共培養は、ＮＫ細胞を約２週間以内に数百倍に増幅することが可能であるが、この方法により増幅されたＮＫ細胞は、老化に見舞われる。加えて、ＩＬ−１５で活性化されたＮＫ細胞は、ＡＤＡＭ１７のタンパク質分解活性により表面ＣＤ１６を損失する。むしろ、ｍｂ１５の代わりにｍｂ２１を発現するＫ５６２細胞は、テロメア短縮と、その結果のＮＫ細胞老化を回避しながら、ＮＫ細胞増幅を有意に改善する。Ｋ５６２−ｍｂ２１−４１ＢＢＬでのＮＫ細胞増幅は、非常に効率的であり、平均４８，０００倍の増幅と、８５％を超える濃縮率が、典型的には３週間以内に実現される。これらの方法の全てが、臨床試験で積極的に検討されている。
【００５６】
６４．ＮＫ細胞増幅法は、改善されたが、依然として欠点および難題がある。ＩＬ−２の高い毒性用量は、増幅法に関わらず、輸液投与されたＮＫ細胞の生存に必要であるが、ＮＫ細胞の持続性が限定された。フィーダー細胞でのエクスビボ法は、多量のＮＫ細胞を生成するための増幅に効果的であったが、ＮＫ細胞の長期エクスビボ培養が骨髄などの疾患部位へのホーミング能力の喪失を引き起こす、という問題が生じた。こうして、インビボ増幅ｖｓエクスビボ増幅で全利益についての討論がなされた。最適なＮＫ細胞増幅手順は、エクスビボフィーダー細胞に基づく方法の増殖能力を有する方法であるが、エクスビボまたはインビボのいずれかで実施することができる。
【００５７】
６５．ＰＢ単核細胞（ＰＢＭＣ）で出発する細胞傷害性ＮＫ細胞の急速かつ選択的な増幅のための新規なＰＭ２１粒子に基づく方法。閉鎖した形質膜小胞に対応する粒子を、Ｋ５６２−ｍｂ１５−４１ＢＢＬ細胞の形質膜から調製し（ＰＭ１５粒子）、１４日以内の２５０倍の、そして１７日後に１，２６５倍の選択的ＮＫ細胞増幅を可能にし、それは共培養されたＫ５６２−ｍｂ１５−４１ＢＢＬフィーダー細胞を用いた増幅効率と同等である。フィーダー細胞で増幅されたＮＫ細胞と類似のＰＭ１５粒子活性化ＮＫ細胞は、エクスビボでＣＭＬおよびＡＭＬ細胞に対して高い細胞傷害性があった。重要なこととして、これらの粒子は、フィーダー細胞法を上回る多くの利点を提供する。第一にそれらは、予め調製され、テストして１年より長く貯蔵することができ、単一のＧＭＰ施設に拘束することなく「オフザシェルフ試薬」として用いることができ、養子ＮＫ細胞療法の臨床物流を大幅に簡素化する。第二に、ＮＫ細胞を刺激するのにフィーダー細胞の代わりにＰＭ粒子を使用すると、フィーダー細胞の放射線照射など腫瘍由来フィーダー細胞を用いる場合、および最終生成物中の存在および増殖をテストする場合、安全性測定に必要となるステップが排除される。第三に、腫瘍由来フィーダー細胞は、アジュバント療法として注射することができないが、ＰＭ粒子は、ＮＫ細胞のインビボ増幅を刺激するために注射可能になり得る。ＮＫ細胞増幅のためのＰＭ粒子に基づく方法により提供される利点は、顕著な臨床上の利益を可能にする。
【００５８】
６６．この研究のこの時点で、Ｋ５６２−ｍｂ２１−４１ＢＢＬから調製されたＰＭ粒子の有効性を、養子移入されたＮＫ細胞のインビボ増幅についてテストし、臨床環境で容易に実行され得る相対的に短く簡単な手順で予備活性化した。該方法は、非常に少ないインビボＮＫ細胞増幅および限定された持続性のみを可能にする養子ＮＫ細胞の静脈内輸液により、これまでの試験の欠点を克服する。この試験では、有効性は、インキュベーションおよびＰＭ２１粒子による刺激のための本来の部位として働く予定の腹腔に注射された非選択ＰＢＭＣからのＮＫ細胞のＰＭ２１粒子刺激エクスビボおよびインビボ増幅について示す。この方法は、治療に関連する量のＮＫ細胞のインビボ増幅に有用であることが予測され、ＮＫ細胞介在性免疫療法を、患者により広く利用し易くするという意味を表す。
【００５９】
ａ）材料と方法
（１）ヒト試料
６７．原発性白血病芽細胞を、ＩＲＢ認可のインフォームドコンセントに署名した活動疾患時の患者から得て、同等のＰＢを、寛解時のこれらの患者から回収した。白血球供給源（Ｏｎｅ Ｂｌｏｏｄ、フロリダ州オーランド所在）、またはＩＲＢ認可のインフォームドコンセントに署名した健常志願者から回収された新鮮な血液を、健常試料として用いた。ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ(ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ペンシルベニア州ピッツバーグ所在）を用いて単離した。試料は全て、再同定して、生存できる状態で凍結保存した。
【００６０】
（２）試薬および細胞株
６８．Ｋ５６２細胞株を、ＡＴＣＣ（バージア州マナサス所在）から得た。細胞傷害性アッセイのためのＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ ＦＩＴＣキットおよびＥｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ Ｆｌｏｗ−Ｃｏｕｎｔビーズは、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ(フロリダ州マイアミ所在）から購入した。以下の色素コンジュゲート抗体を、表現型決定に用いた：ＣＤ１６−ＦＩＴＣ、ＮＫＧ２Ａ−ＰＥ、ＮＫｐ４６−ＰＥ、ＣＤ３−ＡＰＣ(Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）；ＣＤ４−ＡＰＣ−Ｃｙ７、ＣＤ８−ＰＥ、ＣＤ５６−ＢＶ４２１、ＣＤ９４−ＡＰＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；ＣＤ３−Ａｌｅｘａ４８８、ＮＫＧ２Ｄ−ＡＰＣ、ＣＤ６２Ｌ−ＰＥ−Ｃｙ７、ＣＤ４５−ｅＦｌｕｏｒ４５０、ＣＤ４５−ＡＰＣ(ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；ＣＤ５６−ＰＥ、ＫＩＲ２Ｄ−ＡＰＣ(Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）；ＮＫＧ２Ｃ−ＰＥ ＮＫｐ４４−ＡＰＣ、ＴＲＡＩＬ−ＰＥ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）。
【００６１】
（３）形質膜粒子の調製および特徴づけ
６９．ＰＭ粒子を、Ｋ５６２−ｍｂ２１−４１ＢＢＬ細胞から調製した。細胞は、５％ウシ胎児血清を補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地で生育させた。細胞を遠心分離（１，０００×ｇ、１０分間）により回収し、２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＤＰＢＳで洗浄した。細胞を、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２およびＡＥＢＳＦ、アプロチニン、ロイペプチンおよびペプスタチンＡを含有する溶解緩衝液に再懸濁させた。細胞を、３００ｐｓｉおよび４℃で３０分間での窒素キャビテーションにより破壊した（Ｐａｒｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、イリノイ州モリーン所在）。細胞溶解物を遠心分離し（１，０００×ｇ、１０分間）、その後、上清を遠心分離して（１００，０００×ｇ）、粗細胞膜をペレット化した。粗膜を、ショ糖勾配遠心分離によりさらに精製して、閉鎖した形質膜小胞に対応する画分を回収した。全ての手順を、無菌技術を利用して実施し、生成物の滅菌性を、培養でテストした。ＰＭ粒子調製物を、ＢＣＡアッセイによるタンパク質濃度により定量し、膜タンパク質μｇ／ｍＬとして明示した。ＰＭ粒子上のＩＬ−２１および４１ＢＢＬの存在を、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットにより確証した。
【００６２】
（４）ＰＢＭＣからのエクスビボＮＫ細胞増幅
７０．ＰＢＭＣからのＮＫ細胞を、ＰＭ２１粒子を用いて増幅させた。手短に述べると、ＰＢＭＣを、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ、１００ Ｕ／ｍＬ ＩＬ−２(Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ロッキーヒル所在）および２００μｇ／ｍＬ  ＰＭ２１粒子を補充されたＳＣＧＭ(ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ、ニューハンプシャー州ポーツマス所在）中で０．１×１０６ＮＫ細胞／ｍＬで播種した。補充された培地は、日常的に、５日目の後に２〜３日ごとに交換した。
【００６３】
（５）患者の自家ＮＫ細胞の細胞傷害性アッセイ
７１．自家ＡＭＬ腫瘍細胞に対する患者由来ＮＫ細胞の細胞傷害性アッセイを、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ(ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でアッセイした。１６日間増幅されたＮＫ細胞（ＮＫ細胞含量＞９０％）を、ＴＦＬ４色素で染色した。標的腫瘍細胞を、Ｅ：Ｔ比  １：１、２：１、５：１、および１０：１のＮＫ細胞と共に０．５×１０６ＣＤ３４＋細胞／ｍＬで、３７℃、５％ＣＯ２の大気圧で２時間共培養した。その後、細胞を遠心分離し、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ３４−ＰＥ、および抗−ＣＤ５６−ＰＣ７を含有するＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ標識緩衝液に再懸濁させ、４℃で１５分間インキュベートした。標識された細胞を２５０μＬで希釈し、Ａｃｃｕｒｉ機器(ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でのフローサイトメトリーにより分析した。
【００６４】
（６）ＮＳＧマウスにおけるＮＫ細胞のインビボ増幅
７２．解凍されたばかりのＰＢＭＣ、または２００μｇ／ｍｌ  ＰＭ２１および１００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−２で２日間予備活性化されたＰＢＭＣを、２回洗浄し、フェノールレッド不含ＲＰＭＩ培地に再懸濁させた。全ＰＢＭＣ細胞懸濁液中の１×１０５ＮＫ細胞を、ＮＳＧ（ＮＯＤ−ｓｃｉｄ  ＩＬ−２Ｒｇａｍｍａｎｕｌｌ）マウスに腹腔内注射した。ＰＭ２１粒子（図の凡例に指定された量、週２回）およびＩＬ−２（１，０００Ｕ、週３回）もまた、腹腔内注射し、ＰＢを、頬からの出血または心穿刺により採取した。臓器を剖検で回収し、分析のために灌流して単一細胞懸濁液を得た。
【００６５】
ｂ）結果
（１）健常ドナーおよび白血病患者から得られたＮＫ細胞のエクスビボおよびインビボ増幅
７３．ｍｂＩＬ２１を発現するよう操作されたＫ５６２細胞が、老化のないＮＫ細胞増幅により良好な効率を有することが報告されたため、ＰＭ粒子をＫ５６２−ｍｂ２１−４１ＢＢＬ細胞から調製し、ＰＭ２１粒子と表した。ＰＭ２１粒子は、サイズ分布およびｍｂＩＬ２１量の一貫性について特徴づけ（図Ｓ１）、ＮＫ細胞増幅能力についてテストした。
【００６６】
７４．ＰＢＭＣを、ＰＭ２１粒子（２００μｇ／ｍｌ）と共に２８日間培養した。ＰＭ２１粒子で刺激されたＮＫ細胞は増幅して、ＮＫ細胞量が、ＰＭ２１粒子刺激のＮＫ細胞培養物ｃにおいて１４日目までに９０％を超える程に達した（図１ＡＢ）。培養の１４±１日目のＮＫ細胞増幅の累積分析から、ＰＭ２１粒子（平均８２５倍増幅、範囲１６３〜２，２１６、ｎ＝１３）がＰＭ１５粒子（平均４２４倍、範囲２９０〜５７０、ｎ＝３０）に比較して有意に（ｐ＝０．０２１）より効果的であることが示された（図１Ｃ）。さらに、ＰＭ２１粒子で刺激されたＮＫ細胞が、２８日の期間に指数関数的に増幅し、老化により培養２２日目までに停止したＰＭ１５粒子でのＮＫ細胞増幅と対照的に、１００，０００倍を超える増幅に達した。したがってＰＭ２１粒子は、ＰＭ１５粒子よりも改善されたＮＫ細胞増幅の熟達を有し、ＰＭ２１粒子でのＮＫ細胞増幅は、ＰＭ２１粒子が誘導されたＫ５６２−ｍｂ２１−４１ＢＢＬフィーダー細胞で報告されたものと同等であった。ＰＭ２１増幅ＮＫ細胞はまた、白血病細胞株に対して細胞傷害性があった（図Ｓ２）。
【００６７】
７５．ＰＭ２１粒子のＮＫ細胞増幅能力を、寛解時の白血病患者からのＰＢＭＣでさらにテストした。ＰＭ２１粒子は、培養１４日間に患者３名に由来する試料全てからＮＫ細胞増幅を相対的に効率的に誘導した（Ｆ０２１では１１３±７倍、Ｍ０３８では８１０±８１倍、およびＭ０５０では３５２±８６倍、図１Ｄ）。増幅は、ＮＫ細胞に特異的であり、総ｈＣＤ４５＋細胞に対するＮＫ細胞のパーセンテージが、優先的に上昇した（図１Ｅ）。試料Ｆ０２１の場合、増幅されたＮＫ細胞の細胞傷害性を、活動疾患時の同じ患者から得られた腫瘍芽細胞に対して自家環境でテストした（図１Ｆ）。相対的に低いエフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ）１：１では、７８±３％の腫瘍細胞が、アポトーシス性であった。したがってこの方法は、自家移植設定で用いることができる。
【００６８】
７６．ＰＭ粒子の先例にない能力は、インビボ増幅を促す注射液としてである。ＰＭ２１粒子がインビボＮＫ細胞増幅を刺激するか否かをテストし、エクスビボ予備活性化が必要であるか否かを決定するために、ＮＳＧマウスに、未処置ＰＢＭＣまたはＰＭ２１粒子予備活性化ＰＢＭＣ（ＰＭ２１−ＰＢＭＣ）の一部として０．１×１０６ＮＫ細胞を腹腔内注射した。非活性化ＰＢＭＣを注射されたマウスは、ＰＢ中に少量のヒトＮＫ（ｈＮＫ）細胞を有し、ｈＴ細胞のみが、注射後１５日にわたり総ｈＣＤ４５＋細胞のパーセンテージとして増加した（図２ＡＢ）。著しく対照的なこととして、ＰＭ２１−ＰＢＭＣを注射されたマウスのＰＢが、腹腔内注射後１２日目をピークとするｈＮＫ細胞量の増加を有することが見出された（図２ＣＤ）。ＮＫ細胞量は、ｈＣＤ４５＋細胞を５３±８％に濃縮した。同じ実験において、有効性を、ＰＭ２１粒子のインビボ腹腔内適用についてテストして、より良好なインビボＮＫ細胞増幅を促進した。正常なＰＢＭＣを注射されたマウスの場合、さらなるインビボＰＭ２１粒子は、ｈＮＫ細胞増幅を刺激しなかった。しかし、ＰＭ２１−ＰＢＭＣを移植されたマウスへのＰＭ２１粒子のインビボ適用は影響を有し、ｈＮＫ細胞量が、インビボＰＭ２１粒子を受けなかったＰＭ２１−ＰＢＭＣ移植マウスに比較してより高かった（図２Ｄ）。
【００６９】
７７．ＰＭ２１粒子がインビボＮＫ細胞増殖を誘導するという証拠を提供するために、腹腔内接種後６日目にインビボで増幅したＣＴＶｉｏｌｅｔ標識ｈＮＫ細胞を用いて分析を実施した。非活性化ＰＢＭＣを注射されたマウスからの細胞から、ＣＴＶｉｏｌｅｔ蛍光が全く、またはほとんど減少しないことが示され、ＮＫ細胞の細胞分裂が全く、またはほとんどないことが示された（図３ＡＢ）。ＰＭ２１−ＰＢＭＣを注射されたマウスからのｈＮＫ細胞から、ＣＴＶｉｏｌｅｔ蛍光強度の有意な減弱が示された（図３ＣＤ）。蛍光強度のフィッティングから、該強度の低下が、６日以内にインビボで７回の細胞分裂を行った大きな集団（ｍａｊｏｒ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）と相関することを示した。ＰＭ２１粒子の腹腔内注射を受けたマウスから得られたｈＮＫ細胞の場合、１回多い分裂が観察され得る。インビボＰＭ２１粒子の投与によるこのさらなる倍増は、インビボＰＭ２１粒子でのＰＢで観察されたより高いＮＫ細胞量と相関する。
【００７０】
７８．インビボＰＭ２１粒子がインビボＮＫ細胞増幅を増進するか否かをさらに検証するために、インビボＰＭ２１粒子の用量依存性を試験した（図４）。ＰＢ中のｈＮＫ細胞の用量依存的増加が、注射１回あたりＰＭ２１粒子０〜８００μｇで観察された（図４Ｅ）。８００μｇ用量（ｍｂＩＬ２１  約１００ｎｇに対応）では、ＰＢの１μｇあたり４７０±４０ｈＮＫ細胞が、ＰＭ２１−ＰＢＭＣの腹腔内注射後１２日目に観察された。このＰＢ中のＮＫ細胞濃度は、ＡＭＬ環境における治療有効性があると一般に考えられる濃度よりも５倍高かった。インビボ増幅についての用量依存的効果は、Ｔ細胞量が有意に増加しなかったｈＮＫ細胞に特異的であった（図４Ｅ）。注射１回あたり１，６００μｇというより多量では、ＰＢ  ｈＮＫ細胞量が、エクスビボで観察された効果と類似して低減し、約２００〜４００μｇ／ｍＬは、ＰＭ２１粒子またはＰＭ１５粒子に最適であり、より多量では、ＮＫ細胞増幅が減弱した。
【００７１】
７９．ＰＢ中のｈＮＫ細胞の有意な量の観察から、腹腔内注射されたＰＭ２１−ＰＢＭＣ中で増幅されたｈＮＫ細胞が、腹腔からＰＢに遊走し得ることが示される。養子移入されたｈＮＫ細胞が潜在的疾患部位に遊走し得ることを検証するために、様々な臓器内のｈＮＫ細胞を定量した（図５）。ヒトＮＫ細胞が、検査された各臓器に見出され、より多量のｈＮＫ細胞が、ＰＭ２１粒子８００μｇをインビボ処置されたマウスの臓器に見出され、肝臓以外の全てで有意であった（ｐ＜０．０５）。さらに、ＰＭ２１粒子８００μｇで処置されたマウスからの臓器は、総ｈＣＤ４５＋細胞の割合としてより高いパーセンテージのｈＮＫ細胞を有した。
【００７２】
８０．本明細書に記載されたマウスを基にした試験から、ＰＭ２１粒子でのエクスビボでの短い予備活性化と、ＰＭ２１粒子のインビボ投与と、を組み合わせた手順が、潜在的に治療に関連する範囲内で、有意なインビボＮＫ細胞増幅を誘導することが示された。臨床使用に必要となる一貫性を示すために、この手順を、３名の異なるドナーからの白血球供給源（他の実験で用いられたドナーと異なる）に適用した（図６）。ＰＢおよび腹膜洗浄液の両方におけるｈＮＫ細胞の平均量は、白血球供給源の間で相対的に一致していた。ｈＮＫ、ｈＴ細胞および他のｈＣＤ４５＋細胞のパーセンテージもまた、特別な白血球供給源（ｎ＝３）からのＰＭ２１−ＰＢＭＣを注射された群のマウスで、そして白血球供給源Ｌ８とＬ１０の間でも非常に一致した。
【００７３】
（２）Ｐ２１粒子で増幅されたＮＫ細胞の表現型
８１．ＮＫ細胞の抗腫瘍性細胞溶解活性を、活性化シグナルと阻害シグナルからの刺激のバランスにより決定する。ここで、詳細な比較検査を、１）ＰＭ２１により１２日間エクスビボで増幅された、２）インビボで増幅されてＰＢから単離された、３）インビボで増幅されて腹膜洗浄液（ＡＷ）から単離された、ＰＭ２１粒子刺激ＮＫ細胞について実施した。これらの比較は、この環境の全てにおいて単一ドナーからの細胞を利用して行われ、平衡して実施される（図Ｓ３）。
【００７４】
８２．ＮＫ細胞上の、Ｆｃγ受容体であるＣＤ１６の存在が、効果的な抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）に必要となる。インビボ増幅からのほぼ全てのＮＫ細胞が、ＣＤ１６の発現を示す（ＰＢおよびＡＷでそれぞれ９７％および８７％）。ＣＤ９４は、ＮＫＧ２ＣまたはＮＫＧ２Ａとヘテロダイマー複合体を形成する表面受容体である。エクスビボで増幅されたＮＫ細胞の約半分は、ＣＤ９４発現を有する。インビボで増幅されたＮＫ細胞の場合、ＡＷ（６４±９％）からの細胞は、ＰＢ（３８±１３％）からのＮＫ細胞よりも高い発現を有する。活性化受容体としてのＮＫＧ２Ｃと、阻害性受容体としてのＮＫＧ２Ａとを含むＮＫＧ２ファミリーの受容体は両者とも、ＣＤ９４に結合する。エクスビボで増幅されたＮＫ細胞は、ＮＫＧ２Ｃの相対的に低い発現を有したが、ＡＷからのＮＫ細胞は、より高く（５３±８％）、ＰＢからのＮＫ細胞ではより高かった（６１±２％）。ＮＫＧ２Ａを発現するＮＫ細胞の割合は、ＰＢ（６７±１２％）およびエクスビボ増幅からのもの（７４％）よりもＡＷで高かった（８２±８％）。ＮＫＧ２Ｄは、ＮＫ細胞上に見出される別の重要な活性化受容体であり、その発現は、ＡＷ  ＮＫ細胞の６１±６％、ＰＢからは２６±３％、エクスビボ増幅されたＮＫ細胞の約７５％に見出された。骨髄ホーミングに相関することが知られるＣＤ６２Ｌの発現は、ＰＢ中のＮＫ細胞ではより高く（６３±１０％）、ＡＷ中ではより低く（３９±１４）、発現が動員された細胞上でより高いことと一致する。ＮＫｐ４４およびＮＫｐ４６は、天然の細胞傷害性受容体ファミリーのメンバーであり、ＮＫ細胞介在性細胞溶解において役割を担う。ＮＫｐ４６は、ＰＢ（７６±９％）およびＡＷ（８９±５％）の両方からのＮＫ細胞で発現された。ＮＫｐ４４は、全ての供給源からのこれらのＮＫ細胞で、相対的に充分には発現されなかった。その一方でＮＫｐ４６は、ＰＢ（８９±５）およびＡＷ（７６±９）の両方から充分に発現された。ＴＲＡＩＬは、細胞死受容体経路を介して標的のアポトーシスを誘導するＮＫ細胞上のリガンドである。ＴＲＡＩＬは、ＡＷからのＮＫ細胞の３６±６％、ＰＢの２０±４％、エクスビボ増幅された細胞の２６％で発現された。ＫＩＲ２Ｄは、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）２Ｄサブタイプであり、インビボまたはエクスビボ発現されたＫＩＲ２ＤからのＮＫ細胞の少数成分（約１／３）である。ＣＤ８およびＣＤ４  Ｔ細胞の割合を分析して、ＣＤ８  Ｔ細胞がインビボ試料からのＣＤ４  Ｔ細胞よりも豊富であることが見出された。ＮＫ抑制性Ｔｒｅｇ細胞の存在も探査して、非常にわずか（全ＣＤ３＋細胞の０．１％未満）が、インビボ試料中で観察された。
【００７５】
ｃ）考察
（１）ＰＭ２１粒子は治療に関連する量までのエクスビボおよびインビボＮＫ細胞増幅を促進する
８３．養子ＮＫ細胞療法は、様々な腫瘍の初期処置および寛解維持のための癌治療として高い期待を有する。ＮＫ細胞の治療的使用の要件は、安全、簡潔かつ全体的な治療有効性がある急速かつ選択的ＮＫ細胞増幅のための方法である。複数のサイトカインおよびフィーダー細胞に基づく方法が、現在、臨床研究され、Ｋ５６２−ｍｂ２１−４１ＢＢＬ細胞株を用いた方法論は、中でもエクスビボＮＫ細胞増幅に最も効果的である。フィーダー細胞法は、高い初回用量を提供するのに効果的であり、反復投与を可能にするが、白血病処置に重要な骨髄へのホーミングのためのエクスビボ増幅されたＮＫ細胞の能力が影響を受ける可能性があり、輸液投与されたＮＫ細胞のインビボ持続性が、最適でない場合がある。本明細書に記載された、エクスビボとインビボのＰＭ２１粒子に基づくＮＫ細胞増幅法の組み合わせは、ＮＫ細胞養子療法の有効性を有意に増進し得る。
【００７６】
８４．重要なこととして、ＰＭ２１粒子は、インビボ増幅および持続を促進するインビボ刺激に用いることができる。本明細書で開発された方法論は、短い２日間のエクスビボ予備活性化と、その後のＰＭ２１粒子のインビボ投与を利用した。ＰＭ２１粒子のインビボ適用は、インビボ適用されたＰＭ２１粒子に用量依存的に、より高いインビボＮＫ細胞増幅を誘導する。この最適化手順を用いると、ＰＢ  ＮＫ細胞の平均３６０倍のインビボ増加が、ＰＭ２１−ＰＢＭＣの腹腔内注射後５日目〜１２日目の間に観察され、おそらく腹腔内ではより高い増幅倍率であっただろう。比較として、１〜２×１０６ＮＫ細胞の静脈内輸液後に、約５〜１７ＮＫ細胞／μＬ血液のみが、輸液後１４日目に観察可能であったことが、近年の試験で示されている。対照的に、ＰＭ２１粒子刺激を用いたこの試験では、２．０×１０６ＰＭ２１−ＰＢＭＣの腹腔内輸液後１２日目に４００ＮＫ細胞／μＬ血液を超えることが観察された（１１％、即ち、０．２×１０６ＮＫ細胞）。同じく先の試験は、ＩＬ−２またはＩＬ−１５のいずれかの注射（週３回）あたり５μｇ（約５０，０００Ｕ）を使用したが、この試験では、相対的に低用量のＩＬ−２（１，０００Ｕ／注射、週３回）が用いられた。異なる試験では、Ｋ５６２−ｍｂ１５−４１ＢＢＬフィーダー細胞で優先的にエクスビボ増幅された３０×１０６ＮＫ細胞を静脈内注射し、その後、抗ＣＤ４５抗体（抗ＣＤ５６と抗ＣＤ３の組み合わせではない）を用いて注射されたヒトリンパ球を追跡した。この方法では、高用量の腹腔内注射されたＩＬ−２（２５，０００Ｕ／日）は、リンパ球の持続性に必要であり、ＮＫ細胞濃度は決定されず、どちらかといえば示唆であった。これらの過去の方法に比較すると、ＰＭ２１粒子で刺激されたインビボＮＫ細胞増幅の規模は、先例になく、該ＰＭ２１粒子の独特の能力である。
【００７７】
８５．ここでは、ＮＳＧマウスへのＰＭ２１−ＰＢＭＣの送達経路は、過去の予備臨床試験と類似の、腹腔内注射によるものであった。これらの過去の試験に比較して、該ＰＭ２１粒子に基づく方法は、複数の態様において有利である。第一に、エクスビボ予備活性化とＰＭ２１粒子でのインビボ刺激との組み合わせは、アフェレーシスによる多量のリンパ球回収と、その後のＮＫ細胞濃縮のための大規模な検査室処理とを必要とする単離ＮＫ細胞のサイトカイン活性化に比較して、かなり少ない量の非選択ＰＢＭＣの使用を可能にする。第二に、該ＰＭ２１粒子に基づく方法は、２週間培養に基づく増幅の代わりに短い２日間の予備活性化を必要とするに過ぎず、生理学的に関連する機能性のより良好な保持を可能にする。第三に、本発明の方法は、増幅ができない過去の方法に比較してかなり大きなインビボ増殖、または臨床毒性に関連づけられた高用量のＩＬ−２を使用しないインビボ持続性を可能にする。腹膜腫瘍では、本明細書に記載される方法の利点は、全抗腫瘍効果を有意に増進し得る。ＣＴＶｉｏｌｅｔでの増殖分析により明確に示される通り、腹膜腫瘍の非存在下では、腹腔は、ＰＭ２１粒子をこの容積に閉じ込めて良好なインビボ増幅を助長することにより、快適な環境を提供することができ、その後、ＮＫ細胞は、有意な量がＰＢおよび臓器に遊走し得る。ＮＫ細胞は、ＰＢ中で観察されただけでなく、臓器中にも見出され、ＰＭ２１粒子のインビボ適用ではより豊富であった。骨髄中で測定されたＮＫ細胞量は、ＣＤ３４＋臍帯血幹細胞から作製されたＮＫ細胞を用いた試験の量と同等であり、これらのＮＫ細胞が、骨髄ホーミングに適格であることが示される。
【００７８】
８６．エクスビボまたはインビボで並行して増幅されたＮＫ細胞の表現型決定から（図Ｓ３）、得られた細胞が、アプローチにかかわらず類似していることが示された。インビボで増幅されたＮＫ細胞のほとんどで観察され、エクスビボ環境では観察されなかった、ＮＫＧ２Ａ−およびＮＫＧ２Ｃ＋亜集団の増幅に関して、興味深い差異が観察された。ＮＫＧ２Ｃ＋  ＮＫ細胞集団が、「メモリー様の」応答に関連してウイルス再活性化の際に観察されており、ＩＬ−１２産生については単球に依存することが近年になり示された。ＡＭＬのための幹細胞移植後にＣＭＶ再活性化された患者におけるＮＫＧ２Ｃ＋  ＮＫ細胞の存在が、良好な転帰および低い再燃にも関連した。同じく、ＨＬＡ−Ｅ誘導性阻害に抵抗性があるＮＫＧ２Ａ−  ＮＫ細胞の少なからぬ集団の存在が、多発性骨髄腫患者の処置に重要になり得、細胞がＨＬＡクラスＩを下方制御するがＨＬＡ−Ｅを発現してＮＫ細胞応答を呼び起こす。ＮＫＧ２Ａの下方制御を目指すアプローチは、ＮＫ細胞の細胞障害性、つまり治療的潜在性を改善する手段として提案された。エクスビボ増幅細胞は、ほとんどがＮＫＧ２Ａ＋であったため、エクスビボ培養と、続くインビボ増幅の時間を短縮することで、より大きな表現型多様性と、標的への潜在的に良好な細胞障害性を有するＮＫ細胞の作製において追加的利益が提供され得る。
【００７９】
（２）ＰＭ２１粒子の潜在的な臨床有用性
８７．ＮＫ細胞増幅のためのＰＭ２１粒子の能力は、癌処置のため、そして潜在的に他の病弊でも、養子ＮＫ細胞療法の広範な使用を可能にする。該ＰＭ２１粒子は、臨床試験で現在用いられているフィーダー細胞に容易に置き換えられ、運搬を容易にし、リスクを軽減する。腫瘍由来のフィーダー細胞の使用が禁じられている、または認可が獲得し難いという規制の管理区の場合、該ＰＭ２１粒子は、エクスビボ増幅および活性化のための即時解決法となる。同種環境でのエクスビボを増幅するためのＰＭ２１粒子の使用では、Ｔ細胞枯渇が、エクスビボＮＫ細胞増幅の前に実施され得る。Ｋ５６２−ｍｂＩＬ２１で生育されたＮＫ細胞の現行の臨床試験は、ＮＫ細胞増幅前にＴ細胞枯渇を利用して、ＧｖＨＤを誘発し得る同種Ｔ細胞を排除する。その上、ＰＭ２１粒子のインビボ投与はさらに、先例にない能力としてＮＫ細胞をインビボで増幅させ、ことによるとＴ細胞増幅を低減してＧｖＨＤを軽減することができる。腹膜癌、および持続的卵巣上皮癌または線維形成小細胞腫瘍などの他の腹膜腫瘍の処置の場合、このＮＫ細胞増幅法は、臨床に転換することができる。腹膜腫瘍の排除のための抗腫瘍有効性実験が、現在進行中である。自家処置のためのＰＭ２１−ＰＢＭＣおよびＰＭ２１粒子の使用が、可能であり、Ｔ細胞枯渇を組み入れるための方法論は、同種環境での適用が模索されている。
【００８０】
８８．重要なこととして、この方法により増幅されたＮＫ細胞は、腹腔から末梢血および様々な他の癌の潜在的部位である複数の臓器に生体分布する。注射の腹腔内経路は、血液悪性腫瘍の処置には非慣例的であるが、この腹腔内経路によるＮＫ細胞の送達は、ＡＭＬ処置に関連するＮＫ細胞のＰＢ濃度をもたらす。
【００８１】
８９．ＮＫ細胞特異性シグナル伝達のための該粒子に基づくアプローチは、ホーミング、抗腫瘍細胞障害性および持続性を増進するＮＫ細胞のさらなる標的化刺激のために、他のシグナル伝達分子、または薬剤のパッケージ化された送達のためのビヒクルを含むプラットフォームであり得る。該ＰＭ２１粒子は、開発中の革新的なＮＫ細胞特異的免疫療法（チェックポイント阻害剤、ＣＡＲ、二重特異性エンゲージャー（ＢｉＫＥ）、Ｔｒｅｇ枯渇のためのＤＴ融合ＩＬ−２など）の全て、およびＰＭ２１刺激でのＮＫ細胞のインビボ増幅の際に加えられる有益な効果と高い相補性を有し得る。前臨床での有用性としても、本明細書に記載された方法は、そのような組み合わせ法を試験する先例にない方法を可能にする。もちろん、ネズミモデルがあるが、インビボで有意な期間存在し得るヒトＮＫ細胞を試験する他の方法は存在しない。
【００８２】
９０．要約すると、ＰＭ２１粒子でのこの手順は、典型的にはフィーダー細胞でのエクスビボ増幅でしか実現しないレベルで、インビボでの優先的ＮＫ細胞増幅を可能にするが、フィーダー細胞との細胞培養の必要性または毒性がある高いサイトカイン用量を必要としない。さらに、ＰＭ２１粒子のインビボ送達によるＰＭ２１−ＰＢＭＣは、自家環境で用いられて、ＮＫ細胞機能への他の免疫細胞の有益な相乗効果という利点を享受することができ、さらに抗ＫＩＲ抗体またはＢｉＫＥなどの他の方策と組み合わせてＮＫ細胞の細胞傷害性を最大にすることができる。したがってこの方法は、臨床転換にとって簡単でより修正可能でありながら、潜在的治療有効性のためのＮＫ細胞作製の基準を満たし、癌または他の病弊の処置に影響力があり得る。
【００８３】
２．実施例２：ＰＭ２１粒子によるフコシル化の刺激を通したＮＫ細胞の骨髄トラフィッキング
９１．ＩＬ−２１および４１ｂｂｌの操作された膜結合形態を発現するように形質転換されたＫ５６２細胞（Ｋ５６２.ｍｂ２１.４１ｂｂｌ）から調製されたＰＭ２１粒子は、ＮＫ細胞の効率的な特異的増幅を誘導する。ＮＫ細胞との共培養でフィーダー細胞（ＦＣ２１）として用いられたＰＭ２１粒子またはＫ５６２.ｍｂ２１.４１ｂｂｌにより提供された刺激は、フローサイトメトリーによるＨＥＣＡ−４５２ ｍＡｂ結合により観察されたｓＬｅｘの全フコシル化を誘導する。
【００８４】
９２．ＮＫ細胞をＰＭ２１またはＦＣ２１により増幅し、ＨＥＣＡ４５２ ｍＡｂで染色して、フローサイトメトリーにより分析した。ＨＥＣＡ４５２は、ＰＳＧＬ−１、ＣＤ４４および他のＥ−セレクチンリガンドのフコシル化形態を特異的に認識する。ＰＭ２１またはＦＣ２１で刺激されたＮＫ細胞は、非処置ＮＫ細胞、可溶性サイトカインで処置されたＮＫ細胞、またはｍｂＩＬ２１のみを有する（４１ｂｂｌを有さない）ＮＫ細胞処置フィーダー細胞に比較してフローサイトメトリー分析により有意に高いＭＦＩを有した。このことは、ＰＭ２１粒子および／またはＦＣ２１フィーダー細胞での刺激が骨髄へのＮＫ細胞のトラフィッキングを誘導し得ること、ならびにＰＭ２１またはＦＣ２１での刺激により生成された治療性ＮＫ細胞の骨髄トラフィッキングが骨髄を改善し得ること、および骨髄由来の悪性腫瘍の処置を改善し得ること、を強く示している。
【００８５】
９３．図７は、０、１、７、および１０日の刺激に続くＮＫ細胞のＨＥＣＡ４５２染色に及ぼす可溶性サイトカインの影響を示す。粒子またはフィーダー細胞刺激の影響を図８に示しているが、ここではＮＫ細胞が、Ｋ５６２細胞、または膜結合ＩＬ−２１および４１ＢＢＬを有するＫ５６２細胞を１０、１２、または１４日間刺激し（ＦＣ２１細胞またはＰＭ２１粒子）、ＨＥＣＡ４５２で染色している。Ｋ５６２由来のＦＣ２１フィーダー細胞またはＰＭ２１粒子で刺激されたＮＫ細胞は、ＩＬ−２１を含まないＫ５６２フィーダー細胞で刺激されたＮＫ細胞に比較して著しい活性化を示した。図９および１０は、ＮＫ細胞に及ぼす、様々な条件を利用した１０日間培養の影響を示す。ＮＫ細胞を、示された様々な条件で１０日間培養した。ＮＫ細胞を、Ｓｌｅｘのフコシル化形態を検出するＦＩＴＣコンジュゲート化ＨＥＣＡ４５２  ｍＡｂで探査した。培養物からの細胞を、ＨＥＣＡ４５２−ＦＩＴＣで染色して、ＣＤ５６＋ＣＤ３−でのゲーティングによるフローサイトメトリーにより分析した（ＣＳＴＸ２ ＝ ＣｙｔｏＳｅｎのＫ５６２.ｍｂ２１．４１ｂｂｌ；ＦＣ＝フィーダー細胞;ＰＭ２１＝ＣＳＴＸ２から調製された形質膜粒子）。
【００８６】
９４．休止期間が刺激されたＮＫ細胞に及ぼす影響を知るために（図１１）、ＮＫ細胞をＣＳＴＸ２−ＰＭ２１粒子と共に１０日間培養し（上）、その後、ＰＭ２１粒子を除去した後３日間培養して「休止」させた（下）。ＮＫ細胞を、Ｓｌｅｘのフコシル化形態を検出するＦＩＴＣコンジュゲート化ＨＥＣＡ４５２  ｍＡｂで探査した。培養物からの細胞を、ＨＥＣＡ４５２−ＦＩＴＣで染色して、ＣＤ５６＋ＣＤ３−でのゲーティングによるフローサイトメトリーにより分析した（ＣＳＴＸ２ ＝ ＣｙｔｏＳｅｎのＫ５６２.ｍｂ２１．４１ｂｂｌ；ＦＣ＝フィーダー細胞;ＰＭ２１＝ＣＳＴＸ２から調製された形質膜粒子）。
【００８７】
９５．ＰＭ２１粒子で刺激されたＮＫ細胞は安定しており、凍結解凍工程で生き残り、細胞への認識できる影響はなかった（図１２）。ＮＫ細胞を、ＰＢＭＣから単離し（上）、その後、ＣＳＴＸ２−ＰＭ２１粒子と共に１０日間培養し（中）、その後、凍結保存および解凍した（下）。ＮＫ細胞を、Ｓｌｅｘのフコシル化形態を検出するＦＩＴＣコンジュゲート化ＨＥＣＡ４５２  ｍＡｂで探査した。培養物からの細胞を、ＨＥＣＡ４５２−ＦＩＴＣで染色して、ＣＤ５６＋ＣＤ３−でのゲーティングによるフローサイトメトリーにより分析した（ＣＳＴＸ２ ＝ ＣｙｔｏＳｅｎのＫ５６２.ｍｂ２１．４１ｂｂｌ；ＦＣ＝フィーダー細胞;ＰＭ２１＝ＣＳＴＸ２から調製された形質膜粒子）。
【００８８】
Ｅ．参考資料
Ａｌｔｖａｔｅｒ  Ｂ，  Ｌａｎｄｍｅｉｅｒ  Ｓ，  Ｐｓｃｈｅｒｅｒ  Ｓ，  Ｔｅｍｍｅ  Ｊ，  Ｓｃｈｗｅｅｒ  Ｋ，  Ｋａｉｌａｙａｎｇｉｒｉ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  ２Ｂ４  （ＣＤ２４４）  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００９；１５：４８５７−６６．
Ｂａｃｈａｎｏｖａ  Ｖ，  Ｃｏｏｌｅｙ  Ｓ，  Ｄｅｆｏｒ  ＴＥ，  Ｖｅｒｎｅｒｉｓ  ＭＲ，  Ｚｈａｎｇ  Ｂ，  ＭｃＫｅｎｎａ  ＤＨ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｂｙ  ｈａｐｌｏｉｄｅｎｔｉｃａｌ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｕｓｉｎｇ  ＩＬ−２  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｂｌｏｏｄ  ２０１４；１２３：３８５５−６３．
Ｂｅｒｇ  Ｍ，  Ｌｕｎｄｑｖｉｓｔ  Ａ，  ＭｃＣｏｙ  Ｐ，  Ｊｒ．，  Ｓａｍｓｅｌ  Ｌ，  Ｆａｎ  Ｙ，  Ｔａｗａｂ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ−ｇｒａｄｅ  ｅｘ  ｖｉｖｏ−ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  ｈａｖｅ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ２００９；１１：３４１−５５．
Ｃａｎｙ  Ｊ，  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｒｔ  ＡＢ，  Ｔｏｒｄｏｉｒ  Ｍ，  Ｆｒａｎｓｓｅｎ  ＧＭ，  Ｈａｎｇａｌａｐｕｒａ  ＢＮ，  ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｔａｒｇｅｔ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｒｅｓｉｄｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２Ｒｇ（ｎｕｌｌ）  ｍｉｃｅ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１３；８：ｅ６４３８４．
Ｃａｒｌｓｔｅｎ  Ｍ，  Ｃｈｉｌｄｓ  ＲＷ．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＫ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１５；６：２６６．
Ｃｈａｎｇ  ＹＨ，  Ｃｏｎｎｏｌｌｙ  Ｊ，  Ｓｈｉｍａｓａｋｉ  Ｎ，  Ｍｉｍｕｒａ  Ｋ，  Ｋｏｎｏ  Ｋ，  Ｃａｍｐａｎａ  Ｄ．  Ａ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ＮＫＧ２Ｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１３；７３：１７７７−８６．
Ｃｈｉｌｄｓ  ＲＷ，  Ｃａｒｌｓｔｅｎ  Ｍ．  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：  ｔｈｅ  ｆｏｒｃｅ  ａｗａｋｅｎｓ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ２０１５．
Ｄａｖｉｓ  ＺＢ，  Ｃｏｏｌｅｙ  ＳＡ，  Ｃｉｃｈｏｃｋｉ  Ｆ，  Ｆｅｌｉｃｅｓ  Ｍ，  Ｗａｎｇｅｎ  Ｒ，  Ｌｕｏ  Ｘ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｋｉｌｌｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−Ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｒｅ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  Ａｒｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  Ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  Ｄｏｎｏｒ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２０１５．
Ｄｅｎｍａｎ  ＣＪ，  Ｓｅｎｙｕｋｏｖ  ＶＶ，  Ｓｏｍａｎｃｈｉ  ＳＳ，  Ｐｈａｔａｒｐｅｋａｒ  ＰＶ，  Ｋｏｐｐ  ＬＭ，  Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＪＬ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ  ＩＬ−２１  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１２；７：ｅ３０２６４．
Ｄｉｊｋｅｒｓ  ＰＦ，  Ｂｉｒｋｅｎｋａｍｐ  ＫＵ，  Ｌａｍ  ＥＷ，  Ｔｈｏｍａｓ  ＮＳ，  Ｌａｍｍｅｒｓ  ＪＷ，  Ｋｏｅｎｄｅｒｍａｎ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．  ＦＫＨＲ−Ｌ１  ｃａｎ  ａｃｔ  ａｓ  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ：  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｂ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００２；１５６：５３１−４２．
Ｆｅｈｎｉｇｅｒ  ＴＡ，  Ｃｏｏｐｅｒ  ＭＡ，  Ｎｕｏｖｏ  ＧＪ，  Ｃｅｌｌａ  Ｍ，  Ｆａｃｃｈｅｔｔｉ  Ｆ，  Ｃｏｌｏｎｎａ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｒｅ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅｓ  ａｎｄ  ａｒｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ＩＬ−２：  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｎｅｗ  ｌｉｎｋ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  Ｂｌｏｏｄ  ２００３；１０１：３０５２−７．
Ｆｏｌｅｙ  Ｂ，  Ｃｏｏｌｅｙ  Ｓ，  Ｖｅｒｎｅｒｉｓ  ＭＲ，  Ｃｕｒｔｓｉｎｇｅｒ  Ｊ，  Ｌｕｏ  Ｘ，  Ｗａｌｌｅｒ  ＥＫ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  （ＣＭＶ）−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｅｍｏｒｙ−ｌｉｋｅ  ＮＫＧ２Ｃ（＋）  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ  ａｒｅ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｂｌｅ  ａｎｄ  ｅｘｐａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ  ＣＭＶ  ａｎｔｉｇｅｎ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１２；１８９：５０８２−８．
Ｆｏｌｅｙ  Ｂ，  Ｃｏｏｌｅｙ  Ｓ，  Ｖｅｒｎｅｒｉｓ  ＭＲ，  Ｐｉｔｔ  Ｍ，  Ｃｕｒｔｓｉｎｇｅｒ  Ｊ，  Ｌｕｏ  Ｘ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ａ  ｌａｓｔｉｎｇ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｅｄｕｃａｔｅｄ  ＮＫＧ２Ｃ＋  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｐｏｔｅｎｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｂｌｏｏｄ  ２０１２；１１９：２６６５−７４．
Ｆｕｊｉｓａｋｉ  Ｈ，  Ｋａｋｕｄａ  Ｈ，  Ｓｈｉｍａｓａｋｉ  Ｎ，  Ｉｍａｉ  Ｃ，  Ｍａ  Ｊ，  Ｌｏｃｋｅｙ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００９；６９：４０１０−７．
Ｇｅｌｌｅｒ  ＭＡ，  Ｋｎｏｒｒ  ＤＡ，  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  ＤＡ，  Ｐｒｉｂｙｌ  Ｌ，  Ｂｅｎｄｚｉｃｋ  Ｌ，  ＭｃＣｕｌｌａｒ  Ｖ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｍｏｄｅｌ．  Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ２０１３；１５：１２９７−３０６．
Ｇｌｅａｓｏｎ  ＭＫ，  Ｒｏｓｓ  ＪＡ，  Ｗａｒｌｉｃｋ  ＥＤ，  Ｌｕｎｄ  ＴＣ，  Ｖｅｒｎｅｒｉｓ  ＭＲ，  Ｗｉｅｒｎｉｋ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  ＣＤ１６ｘＣＤ３３  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｅｒ  （ＢｉＫＥ）  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐｒｉｍａｒｙ  ＭＤＳ  ａｎｄ  ＭＤＳＣ  ＣＤ３３＋  ｔａｒｇｅｔｓ．  Ｂｌｏｏｄ  ２０１４；１２３：３０１６−２６．
Ｇｌｉｅｎｋｅ  Ｗ，  Ｅｓｓｅｒ  Ｒ，  Ｐｒｉｅｓｎｅｒ  Ｃ，  Ｓｕｅｒｔｈ  ＪＤ，  Ｓｃｈａｍｂａｃｈ  Ａ，  Ｗｅｌｓ  ＷＳ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｄｖａｎｔａｇｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＣＡＲ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｆｒｏｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２０１５；６：２１．
Ｋｌｉｎｇｅｍａｎｎ  ＨＧ．  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ−ｗｈｅｒｅ  ｄｏ  ｗｅ  ｓｔａｎｄ？  Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ２０１３；１５：１１８５−９４．
Ｋｎｏｒｒ  ＤＡ，  Ｂａｃｈａｎｏｖａ  Ｖ，  Ｖｅｒｎｅｒｉｓ  ＭＲ，  Ｍｉｌｌｅｒ  ＪＳ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｔｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．  Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１４；２６：１６１−７２．
Ｋｏｈｒｔ  ＨＥ，  Ｔｈｉｅｌｅｎｓ  Ａ，  Ｍａｒａｂｅｌｌｅ  Ａ，  Ｓａｇｉｖ−Ｂａｒｆｉ  Ｉ，  Ｓｏｌａ  Ｃ，  Ｃｈａｎｕｃ  Ｆ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｔｉ−ＫＩＲ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｌｙｍｐｈｏｍａ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉ−ＣＤ２０  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  Ｂｌｏｏｄ  ２０１４；１２３：６７８−８６．
Ｌｅｃｌｅｒｃｑ  Ｇ，  Ｄｅｂａｃｋｅｒ  Ｖ，  ｄｅ  Ｓｍｅｄｔ  Ｍ，  Ｐｌｕｍ  Ｊ．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ｏｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｔ／ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９６；１８４：３２５−３６．
Ｍｉｌｌｅｒ  ＪＳ，  Ｒｏｏｎｅｙ  ＣＭ，  Ｃｕｒｔｓｉｎｇｅｒ  Ｊ，  ＭｃＥｌｍｕｒｒｙ  Ｒ，  ＭｃＣｕｌｌａｒ  Ｖ，  Ｖｅｒｎｅｒｉｓ  ＭＲ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｏｍｉｎｇ  ｏｆ  ａｄｏｐｔｉｖｅｌｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ  ｖａｒｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｂｉｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２０１４；２０：１２５２−７．
Ｍｉｌｌｅｒ  ＪＳ，  Ｓｏｉｇｎｉｅｒ  Ｙ，  Ｐａｎｏｓｋａｌｔｓｉｓ−Ｍｏｒｔａｒｉ  Ａ，  ＭｃＮｅａｒｎｅｙ  ＳＡ，  Ｙｕｎ  ＧＨ，  Ｆａｕｔｓｃｈ  ＳＫ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈａｐｌｏｉｄｅｎｔｉｃａｌ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｂｌｏｏｄ  ２００５；１０５：３０５１−７．
Ｍｉｌｌｅｒ  ＪＳ．  Ｓｈｏｕｌｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｅ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｏｒ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｔｏ  ｍａｘｉｍｉｚｅ  ｔｈｅｉｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ？  Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ２００９；１１：２５９−６０．
Ｎｇｕｙｅｎ  Ｓ，  Ｋｕｅｎｔｚ  Ｍ，  Ｖｅｒｎａｎｔ  ＪＰ，  Ｄｈｅｄｉｎ  Ｎ，  Ｂｏｒｉｅｓ  Ｄ，  Ｄｅｂｒｅ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍａｔｕｒｅ  ｄｏｎｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＮＫ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｈａｐｌｏｉｄｅｎｔｉｃａｌ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２００８；２２：３４４−５２．
Ｏｙｅｒ  ＪＬ，  Ｉｇａｒａｓｈｉ  ＲＹ，  Ｋｕｌｉｋｏｗｓｋｉ  ＡＲ，  Ｃｏｌｏｓｉｍｏ  ＤＡ，  Ｓｏｌｈ  ＭＭ，  Ｚａｋａｒｉ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｆｅｅｄｅｒ−ｆｒｅｅ，  ｐａｒｔｉｃｌｅ−ｂａｓｅｄ  ａｐｐｒｏａｃｈ．  Ｂｉｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ２０１５；２１：６３２−９．
Ｐａｒｋ  ＫＵ，  Ｊｉｎ  Ｐ，  Ｓａｂａｔｉｎｏ  Ｍ，  Ｆｅｎｇ  Ｊ，  Ｃｉｖｉｎｉ  Ｓ，  Ｋｈｕｕ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ａｎｄ  ｆｒｅｓｈｌｙ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２０１０；３３：９４５−５５．
Ｐｈａｎ  ＴＧ，  Ｌｏｎｇ  ＧＶ，  Ｓｃｏｌｙｅｒ  ＲＡ．  Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｌｏｎｇ  ｒｏａｄ  ｔｏｗａｒｄｓ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０１５；９３：３２３−５．
Ｒｏｄｅｌｌａ  Ｌ，  Ｚａｍａｉ  Ｌ，  Ｒｅｚｚａｎｉ  Ｒ，  Ａｒｔｉｃｏ  Ｍ，  Ｐｅｒｉ  Ｇ，  Ｆａｌｃｏｎｉ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １５  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  ２００１；１１５：４４２−５０．
Ｒｏｌｌｅ  Ａ，  Ｐｏｌｌｍａｎｎ  Ｊ，  Ｅｗｅｎ  ＥＭ，  Ｌｅ  ＶＴ，  Ｈａｌｅｎｉｕｓ  Ａ，  Ｈｅｎｇｅｌ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．  ＩＬ−１２−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ＨＬＡ−Ｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ＨＣＭＶ−ｄｒｉｖｅｎ  ＮＫＧ２Ｃ＋  ＮＫ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２０１４；１２４：５３０５−１６．
Ｒｏｍａｇｎｅ  Ｆ，  Ａｎｄｒｅ  Ｐ，  Ｓｐｅｅ  Ｐ，  Ｚａｈｎ  Ｓ，  Ａｎｆｏｓｓｉ  Ｎ，  Ｇａｕｔｈｉｅｒ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  １−７Ｆ９，  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉ−ＫＩＲ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈａｔ  ａｕｇｍｅｎｔｓ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｌｏｏｄ  ２００９；１１４：２６６７−７７．
Ｒｏｍｅｅ  Ｒ，  Ｆｏｌｅｙ  Ｂ，  Ｌｅｎｖｉｋ  Ｔ，  Ｗａｎｇ  Ｙ，  Ｚｈａｎｇ  Ｂ，  Ａｎｋａｒｌｏ  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ．  ＮＫ  ｃｅｌｌ  ＣＤ１６  ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ−１７  （ＡＤＡＭ１７）．  Ｂｌｏｏｄ  ２０１３；１２１：３５９９−６０８．
Ｒｏｓｓ  ＭＥ，  Ｃａｌｉｇｉｕｒｉ  ＭＡ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｔｏ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．  Ｂｌｏｏｄ  １９９７；８９：９１０−８．
Ｓａｒｋａｒ  Ｓ，  ｖａｎ  Ｇｅｌｄｅｒ  Ｍ，  Ｎｏｏｒｔ  Ｗ，  Ｘｕ  Ｙ，  Ｒｏｕｓｃｈｏｐ  ＫＭ，  Ｇｒｏｅｎ  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｐｔｉｍａｌ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｋｉｌｌ  ｍｙｅｌｏｍａ：  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＨＬＡ−Ｅ  ａｎｄ  ＮＫＧ２Ａ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２０１５．
Ｓｈｉｍａｓａｋｉ  Ｎ，  Ｆｕｊｉｓａｋｉ  Ｈ，  Ｃｈｏ  Ｄ，  Ｍａｓｓｅｌｌｉ  Ｍ，  Ｌｏｃｋｅｙ  Ｔ，  Ｅｌｄｒｉｄｇｅ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ａｄａｐｔａｂｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．  Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ２０１２；１４：８３０−４０．
Ｓｏｍａｎｃｈｉ  ＳＳ，  Ｓｅｎｙｕｋｏｖ  ＶＶ，  Ｄｅｎｍａｎ  ＣＪ，  Ｌｅｅ  ＤＡ．  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ，  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ  ２０１１．
Ｗｅｓｔ  ＷＨ，  Ｔａｕｅｒ  ＫＷ，  Ｙａｎｎｅｌｌｉ  ＪＲ，  Ｍａｒｓｈａｌｌ  ＧＤ，  Ｏｒｒ  ＤＷ，  Ｔｈｕｒｍａｎ  ＧＢ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｎｓｔａｎｔ−ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ｉｎ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  １９８７；３１６：８９８−９０５．
Ｚｈｕ  ＥＦ，  Ｇａｉ  ＳＡ，  Ｏｐｅｌ  ＣＦ，  Ｋｗａｎ  ＢＨ，  Ｓｕｒａｎａ  Ｒ，  Ｍｉｈｍ  ＭＣ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｉｎｎａｔｅ  ａｎｄ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｓｅｒｕｍ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ  ＩＬ−２．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２０１５；２７：４８９−５０１．
【図１】
2020509021.tif 000003
【図２】
2020509021.tif 000004
【図３】
2020509021.tif 000005
【図４】
2020509021.tif 000006
【図５】
2020509021.tif 000007
【図６】
2020509021.tif 000008
【図７】
2020509021.tif 000009
【図８】
2020509021.tif 000010
【図９】
2020509021.tif 000011
【図１０】
2020509021.tif 000012
【図１１】
2020509021.tif 000013
【図１２】
2020509021.tif 000014
【図１３】
2020509021.tif 000015
【国際調査報告】
2020509021.tif 000016