(57)【要約】  本発明は、2つの軽鎖重鎖ペアを含む二価抗体を提供する。軽鎖重鎖ペアのN末端の１つまたは2つは、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカーを介して、コイルドコイル形成ペプチドに連結されており、このペプチドは会合して、少なくとも1つの軽鎖重鎖ペアの標的に対する結合親和性を低下させる、コイルドコイルを形成するものである。【選択図】図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
2つの軽鎖および重鎖ペアを含有する二価抗体であって、2つの軽鎖および重鎖ペアの少なくとも一方の軽鎖および重鎖のN末端が、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカーを介して、コイルドコイル形成ペプチドに連結されており、該コイルドコイル形成ペプチドは、会合して、該軽鎖重鎖ペアの標的への結合親和性を低下させるコイルドコイルを形成するものである、前記二価抗体。
【請求項２】
前記の2ペアの両方の軽鎖および重鎖が、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカーを介して、コイルドコイル形成ペプチドに連結されており、該コイルドコイル形成ペプチドは、会合して、軽鎖重鎖ペアと標的との結合親和性を低下させるコイルドコイルを形成するものである、請求項１に記載の二価抗体。
【請求項３】
前記ペプチドがジスルフィド橋を形成することなく会合する、請求項１または２に記載の二価抗体。
【請求項４】
細胞傷害性または細胞増殖抑制性薬物と複合体化した、請求項１〜３のいずれか1項に記載の二価抗体。
【請求項５】
二価抗体のシステイン残基を介して細胞傷害性または細胞増殖抑制性薬物と複合体化した、請求項４に記載の二価抗体。
【請求項６】
2つの軽鎖および重鎖ペアが同一である、請求項１〜５のいずれか1項に記載の二価抗体。
【請求項７】
2つの軽鎖および重鎖ペアが異なっている、請求項１〜５のいずれか1項に記載の二価抗体。
【請求項８】
2つの軽鎖および重鎖ペアが、異なる標的に対する特異性を有する、請求項７に記載の二価抗体。
【請求項９】
2つの軽鎖および重鎖ペアが、同じ標的に対する特異性を有する、請求項７に記載の二価抗体。
【請求項１０】
前記の2ペアの一方であって一方のみが、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカーを介して、コイルドコイル形成ペプチドに連結されており、該コイルドコイル形成ペプチドは、会合して、軽鎖重鎖ペアと標的との結合親和性を低下させるコイルドコイルを形成するものである、請求項８に記載の二価抗体。
【請求項１１】
軽鎖が軽鎖可変領域および軽鎖定常領域を含み、重鎖が重鎖可変領域および重鎖定常領域を含む、請求項１〜１０のいずれか1項に記載の二価抗体。
【請求項１２】
重鎖定常領域がCH1、ヒンジ、CH2およびCH3を含む、請求項１０に記載の二価抗体。
【請求項１３】
2つの軽鎖が第1の異種ペプチドに連結され、2つの重鎖が第2の異種ペプチドに連結されている、請求項１〜１２のいずれか1項に記載の二価抗体。
【請求項１４】
プロテアーゼ切断部位がMMP#1またはMMP#2のいずれかである、請求項１〜１３のいずれか1項に記載の二価抗体。
【請求項１５】
標的、または複数の標的のうち1つが、CD19、CD30、LIV-1、CD70、またはCD74のいずれかである、請求項１〜１４のいずれか1項に記載の二価抗体。
【請求項１６】
結合が少なくとも100倍低下している、請求項１〜１５のいずれか1項に記載の二価抗体。
【請求項１７】
結合が200〜5000倍低下している、請求項１〜１６のいずれか1項に記載の二価抗体。
【請求項１８】
結合が200〜1500倍低下している、請求項１〜１７のいずれか1項に記載の二価抗体。
【請求項１９】
複合体の細胞傷害性が少なくとも100倍低下している、請求項４または５に記載の二価抗体。
【請求項２０】
複合体の細胞傷害性が200〜5000倍低下している、請求項４または５に記載の二価抗体。
【請求項２１】
コイルドコイル形成ペプチドが重鎖および軽鎖のN末端に同じ向きで連結されている、請求項１〜２０のいずれか1項に記載の二価抗体。
【請求項２２】
コイルドコイル形成ペプチドが重鎖および軽鎖のN末端に逆向きで連結されている、請求項１〜２１のいずれか1項に記載の二価抗体。
【請求項２３】
複数コピーのコイルドコイル形成ペプチドが重鎖および軽鎖のN末端に直列に並んで連結されている、請求項１〜２２のいずれか1項に記載の二価抗体。
【請求項２４】
リンカーが、1〜20、2〜15、3〜12、4〜10、5、6、7、8、9、または10アミノ酸長である、請求項１〜２３のいずれか1項に記載の二価抗体。
【請求項２５】
リンカーが、GSIPVSLRSG（配列番号43）を含んでなる、または前記配列からなる、アミノ酸配列を有する、請求項１〜２４のいずれか1項に記載の二価抗体。
【請求項２６】
プロテアーゼ切断部位がMMP2プロテアーゼ部位である、請求項１〜２５のいずれか1項に記載の二価抗体。
【請求項２７】
配列QGASTSVDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKLGSIPVSLRSG(配列番号34)からなるペプチドが、軽鎖に連結される、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカーおよびコイルドコイル形成ペプチドを与え、配列QGASTTVAQLEEKVKTLRAENYELKSEVQRLEEQVAQLGSIPVSLRSG（配列番号31）からなるペプチドが、重鎖に連結される、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカーおよびコイルドコイル形成ペプチドを与える、請求項１〜２４のいずれか1項に記載の二価抗体。
【請求項２８】
配列QGASTSVDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKLGSIPVSLRSG(配列番号34)を含んでなるペプチドが、軽鎖に連結される、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカーおよびコイルドコイル形成ペプチドを与え、配列QGASTTVAQLEEKVKTLRAENYELKSEVQRLEEQVAQLGSIPVSLRSG（配列番号31）を含んでなるペプチドが、重鎖に連結される、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカーおよびコイルドコイル形成ペプチドを与える、請求項１〜２４のいずれか1項に記載の二価抗体。
【請求項２９】
配列QGASTTVAQLEEKVKTLRAENYELKSEVQRLEEQVAQLGSIPVSLRSG（配列番号31）からなるペプチドが、軽鎖に連結される、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカーおよびコイルドコイル形成ペプチドを与え、配列QGASTSVDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKLGSIPVSLRSG(配列番号34)からなるペプチドが、重鎖に連結される、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカーおよびコイルドコイル形成ペプチドを与える、請求項１〜２４のいずれか1項に記載の二価抗体。
【請求項３０】
配列QGASTTVAQLEEKVKTLRAENYELKSEVQRLEEQVAQLGSIPVSLRSG（配列番号31）を含んでなるペプチドが、軽鎖に連結される、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカーおよびコイルドコイル形成ペプチドを与え、配列QGASTSVDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKLGSIPVSLRSG(配列番号34)を含んでなるペプチドが、重鎖に連結される、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカーおよびコイルドコイル形成ペプチドを与える、請求項１〜２４のいずれか1項に記載の二価抗体。
【請求項３１】
配列GASTSVDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKLGSIPVSLRSG（配列番号64）からなるペプチドが、軽鎖に連結される、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカーおよびコイルドコイル形成ペプチドを与え、配列GASTTVAQLEEKVKTLRAENYELKSEVQRLEEQVAQLGSIPVSLRSG（配列番号65）からなるペプチドが、重鎖に連結される、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカーおよびコイルドコイル形成ペプチドを与える、請求項１〜２４のいずれか1項に記載の二価抗体。
【請求項３２】
配列GASTSVDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKLGSIPVSLRSG（配列番号64）を含んでなるペプチドが、軽鎖に連結される、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカーおよびコイルドコイル形成ペプチドを与え、配列GASTTVAQLEEKVKTLRAENYELKSEVQRLEEQVAQLGSIPVSLRSG（配列番号65）を含んでなるペプチドが、重鎖に連結される、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカーおよびコイルドコイル形成ペプチドを与える、請求項１〜２４のいずれか1項に記載の二価抗体。
【請求項３３】
配列GASTTVAQLEEKVKTLRAENYELKSEVQRLEEQVAQLGSIPVSLRSG（配列番号65）からなるペプチドが、軽鎖に連結される、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカーおよびコイルドコイル形成ペプチドを与え、配列GASTSVDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKLGSIPVSLRSG（配列番号64）からなるペプチドが、重鎖に連結される、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカーおよびコイルドコイル形成ペプチドを与える、請求項１〜２４のいずれか1項に記載の二価抗体。
【請求項３４】
配列GASTTVAQLEEKVKTLRAENYELKSEVQRLEEQVAQLGSIPVSLRSG（配列番号65）を含んでなるペプチドが、軽鎖に連結される、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカーおよびコイルドコイル形成ペプチドを与え、配列GASTSVDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKLGSIPVSLRSG（配列番号64）を含んでなるペプチドが、重鎖に連結される、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカーおよびコイルドコイル形成ペプチドを与える、請求項１〜２４のいずれか1項に記載の二価抗体。
【請求項３５】
標的の一方が免疫細胞の表面抗原であり、もう一方ががん細胞の表面抗原である、請求項８に記載の二価抗体。
【請求項３６】
免疫細胞の表面抗原がCD3である、請求項３５に記載の二価抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はコイルドコイルでマスキングされた二価抗体に関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は2016年12月9日出願のUS 62/432,472の利益を主張するものであって、この出願は、参考としてそのまま本明細書に組み入れられる。
【０００３】
配列表の参照
本出願は、2017年12月8日作成の50キロバイトのファイル、506990SEQLIST.TXTに配列表の電子データを含んでおり、これは参考として本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００４】
現行の抗体による治療法は、意図した標的に対する選択性が最善ではない可能性がある。モノクローナル抗体は、通常、その設定標的との結合に対して特異的であるが、標的分子のほとんどは、病気の部位に対して特異的ではなく、病気の部位以外の細胞もしくは組織に存在しうる。
【０００５】
抗体結合を阻害する阻害ドメインもしくはマスキングドメインに結合している切断可能なリンカーを有するように抗体を操作することによって、こうしたオフターゲット効果を克服するためのいくつかのアプローチが報告されている（たとえば、WO2003/068934、WO2004/009638、WO 2009/025846、WO2101/081173およびWO2014103973を参照されたい）。リンカーは、特定の組織または病変に特異的な酵素で切断されるようにデザインすることができるので、抗体を望ましい場所で優先的に活性化することが可能となる。マスキング部分は、抗体の結合部位に直接結合することによって機能することができるが、立体障害を介して間接的に作用する可能性もある。さまざまなマスキング部分、リンカー、プロテアーゼ部位、および会合フォーマットが提案されている。マスキングの程度は、マスキング部分と、抗体の発現、精製、結合、または薬物動態との適合性に応じて、異なるフォーマット間でさまざまとすることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第2003/068934号パンフレット
【特許文献２】国際公開第2004/009638号パンフレット
【特許文献３】国際公開第 2009/025846号パンフレット
【特許文献４】国際公開第2101/081173号パンフレット
【特許文献５】国際公開第2014103973号パンフレット
【発明の概要】
【０００７】
請求項に関わる発明の概要
【０００８】
本発明は、2つの軽鎖重鎖ペアを含む二価抗体を提供するが、このペアの少なくとも一方の軽鎖および重鎖のN末端は、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカーを介して、コイルドコイル形成ペプチドに連結されており、これらのペプチドは会合して、軽鎖重鎖ペアの標的に対する結合親和性を低下させるコイルドコイルを形成するものである。場合によっては、2つのペアの両方の軽鎖および重鎖が、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカーを介してコイルドコイル形成ペプチドに連結されていることもあり、これらのペプチドは会合して、軽鎖重鎖ペアの標的に対する結合親和性を低下させるコイルドコイルを形成するものである。
【０００９】
場合により、ペプチドは、ジスルフィド橋を形成することなく会合することがある。場合により、二価抗体は、細胞傷害性薬物または細胞増殖抑制性薬物に結合していてもよい。場合により、細胞傷害性薬物または細胞増殖抑制性薬物は、二価抗体のシステイン残基を介して結合していてもよい。場合により、2つの軽鎖-重鎖ペアは同一であってもよい。場合により、2つの軽鎖-重鎖ペアは異なっていてもよい。場合により、軽鎖は、軽鎖可変領域および軽鎖定常領域を含んでいてもよく、重鎖は、重鎖可変領域および重鎖定常領域を含んでいてもよい。場合により、重鎖は、CH1領域、ヒンジ領域、CH2領域およびCH3領域を含んでいてもよい。場合により、2つの軽鎖は第1の異種ペプチドに連結されていてもよく、2つの重鎖は第2の異種ペプチドに連結されていてもよい。場合により、プロテアーゼ切断部位はMMP#1またはMMP#2のいずれかとすることができる。場合により、標的はCD19、CD30、LIV-1、CD70、またはCD74のうち任意のものを選択できる。場合により、結合を少なくとも100倍低下させることができる。場合により、結合を200〜5000倍、200〜4000倍、または200〜1500倍減少させることもある。場合により、複合体の細胞傷害性を少なくとも100倍軽減させることができる。場合により、複合体の細胞傷害性を200〜5000倍低下させすこともある。場合により、コイルドコイル形成ペプチドは、重鎖および軽鎖のN末端に、逆向き（相対する向き）で連結されていてもよい。場合により、コイルドコイル形成ペプチドの複数コピーを、直列（タンデム）に、重鎖および軽鎖のN末端に連結してもよい。
【００１０】
場合により、配列番号44の配列を含んでなる、またはその配列からなるペプチドは、軽鎖に連結される、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカーおよびコイルドコイル形成ペプチドをもたらし、配列番号47のペプチドは、重鎖に連結される、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカーおよびコイルドコイル形成ペプチドをもたらすことができる。
【００１１】
別の実施形態において、配列番号46の配列を含んでなる、またはその配列からなるペプチドは、重鎖に連結される、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカーおよびコイルドコイル形成ペプチドをもたらし、配列番号47のペプチドは、軽鎖に連結される、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカーおよびコイルドコイル形成ペプチドを与える。
【００１２】
別の実施形態において、配列QGASTSVDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKLGSIPVSLRSG（配列番号34）を含んでなる、またはその配列からなるペプチドは、重鎖に連結される、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカーおよびコイルドコイル形成ペプチドをもたらし、配列QGASTTVAQLEEKVKTLRAENYELKSEVQRLEEQVAQLGSIPVSLRSG（配列番号31）のペプチドは、軽鎖に連結される、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカーおよびコイルドコイル形成ペプチドをもたらす。
【００１３】
別の実施形態において、配列QGASTSVDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKLGSIPVSLRSG（配列番号34）を含んでなる、またはその配列からなるペプチドは、軽鎖に連結される、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカーおよびコイルドコイル形成ペプチドをもたらし、配列QGASTTVAQLEEKVKTLRAENYELKSEVQRLEEQVAQLGSIPVSLRSG（配列番号31）のペプチドは、重鎖に連結される、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカーおよびコイルドコイル形成ペプチドを与える。
【００１４】
別の実施形態において、配列GASTSVDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKLGSIPVSLRSG（配列番号64）を含んでなる、またはその配列からなるペプチドは、重鎖に連結される、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカーおよびコイルドコイル形成ペプチドをもたらし、配列GASTTVAQLEEKVKTLRAENYELKSEVQRLEEQVAQLGSIPVSLRSG（配列番号65）のペプチドは、軽鎖に連結される、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカーおよびコイルドコイル形成ペプチドをもたらす。
【００１５】
別の実施形態において、配列GASTSVDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKLGSIPVSLRSG（配列番号65）を含んでなる、またはその配列からなるペプチドは、軽鎖に連結される、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカーおよびコイルドコイル形成ペプチドをもたらし、配列GASTTVAQLEEKVKTLRAENYELKSEVQRLEEQVAQLGSIPVSLRSG（配列番号64）のペプチドは、重鎖に連結される、プロテアーゼ切断部位を含有するリンカーおよびコイルドコイル形成ペプチドをもたらす。
【００１６】
場合により、リンカーは、1〜20、2〜15、3〜12、4〜10、5、6、7、8、9、または10アミノ酸長とすることができる。好ましいリンカーは、GSIPVSLRSG（配列番号48）を含んでなる、またはその配列からなる、アミノ酸配列を有する。一部のリンカーはMMP2プロテアーゼ部位を含有する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】図1Aは、コイルドコイル形成ペプチド、リンカー、およびプロテアーゼ部位の例を示す。M11 CCおよびM15 CCでは、SGGGGG（配列番号22）およびGGGGS（配列番号24）がリンカーである。PLGVR（配列番号23）はプロテアーゼ切断部位であり、残りの配列はコイルドコイルペプチドである。配列番号20は、プロテアーゼ部位を含むリンカーに結合したM11コイルドコイルペプチド（軽鎖に関連付けて示される）であり、配列番号25は、プロテアーゼ部位を含むリンカーに結合したM11コイルドコイルペプチド（重鎖に関連付けて示される）である。配列番号21は、M11コイルドコイルペプチド（軽鎖に関連付けて示される）であり、配列番号26は、M11コイルドコイルペプチド（重鎖に関連付けて示される）である。配列番号27は、プロテアーゼ部位を含むリンカーに結合したM15コイルドコイルペプチド（軽鎖に関連付けて示される）であり、配列番号29は、プロテアーゼ部位を含むリンカーに結合したM15コイルドコイルペプチド（重鎖に関連付けて示される）である。配列番号28は、M15コイルドコイルペプチド（軽鎖に関連付けて示される）であり、配列番号30は、M15コイルドコイルペプチド（重鎖に関連付けて示される）である。VelCCにおいてGSおよびSGはリンカーであり、IPVSLR（配列番号33）はプロテアーゼ切断部位であり、残りの配列はコイルドコイルペプチドである。配列番号31は、プロテアーゼ部位を含むリンカーに結合したVelコイルドコイルペプチド（軽鎖に関連付けて示される）であり、配列番号34は、プロテアーゼ部位を含むリンカーに結合したVelコイルドコイルペプチド（重鎖に関連付けて示される）である。配列番号32は、Velコイルドコイルペプチド（軽鎖に関連付けて示される）であり、配列番号35は、Velコイルドコイルペプチド（重鎖に関連付けて示される）である。図1Aに示されるVelコイルドコイルペプチドは、さらにN末端Qを追加することができる。
【図１Ｂ】図1Bは、N末端システインを有するコイルドコイル形成ペプチド、リンカー、およびプロテアーゼ部位の例を示す。CM11 CCおよびCM15 CCにおいて、SGGGGG（配列番号22）およびGGGGS（配列番号24）はリンカーである。PLGVR（配列番号23）はプロテアーゼ切断部位であり、残りの配列はコイルドコイルペプチドである。配列番号36は、プロテアーゼ部位を含むリンカーに結合したCM11コイルドコイルペプチド（軽鎖に関連付けて示される）であり、配列番号38は、プロテアーゼ部位を含むリンカーに結合したCM11コイルドコイルペプチド（重鎖に関連付けて示される）である。配列番号37は、CM11コイルドコイルペプチド（軽鎖に関連付けて示される）であり、配列番号39は、CM11コイルドコイルペプチド（重鎖に関連付けて示される）である。配列番号40は、プロテアーゼ部位を含むリンカーに結合したCM15コイルドコイルペプチド（軽鎖に関連付けて示される）であり、配列番号42は、プロテアーゼ部位を含むリンカーに結合したCM15コイルドコイルペプチド（重鎖に関連付けて示される）である。配列番号41は、CM15コイルドコイルペプチド（軽鎖に関連付けて示される）であり、配列番号43は、CM15コイルドコイルペプチド（重鎖に関連付けて示される）である。CVelにおいてGSおよびSGはリンカーであり、IPVSLR（配列番号33）はプロテアーゼ切断部位であり、残りの配列はコイルドコイルペプチドである。配列番号44は、プロテアーゼ部位を含むリンカーに結合したCVelコイルドコイルペプチド（軽鎖に関連付けて示される）であり、配列番号46は、プロテアーゼ部位を含むリンカーに結合したCVelコイルドコイルペプチド（重鎖に関連付けて示される）である。配列番号45は、CVelコイルドコイルペプチド（軽鎖に関連付けて示される）であり、配列番号47は、CVelコイルドコイルペプチド（重鎖に関連付けて示される）である。
【図２】図2は、血漿中でインキュベートされたさまざまなコイルドコイルでマスキングされた抗体について、時間に対する抗体濃度を、対照のhBU12ecと比較して示す。
【図３】図3は、マスキングされた抗体と接触させた腫瘍組織サンプルを示す。
【図４】図4は、FACSに基づいた飽和結合アッセイを用いて、Antigen 1（抗原1）陽性細胞と結合した、マスキングされた抗Antigen 1抗体を示す。
【図５】図5は、ペプチド配列の切断を測定するために使用されるPLRP-MSの例を示す。CVelにおいてGSおよびSGはリンカーであり、IPVSLR（配列番号33）はプロテアーゼ切断部位であり、残りの配列はコイルドコイルペプチドである。配列番号44は、プロテアーゼ部位を含むリンカーに結合したCVelコイルドコイルペプチド（軽鎖に関連付けて示される）であり、配列番号46は、プロテアーゼ部位を含むリンカーに結合したCVelコイルドコイルペプチド（重鎖に関連付けて示される）である。配列番号45は、CVelコイルドコイルペプチド（軽鎖に関連付けて示される）であり、配列番号47は、CVelコイルドコイルペプチド（重鎖に関連付けて示される）である。
【図６】図6Aおよび6Bは、さまざまな組織における、リンカーCVelまたはVelを有するhAg-2のin vivo比較データを示す。図6Aは、3日目および4日目の、腫瘍、肺、肝臓および血漿における、リンカーCVelまたはVelを有するhAg-2のin vivo比較を示す。図6Bは、1、2、および4日目の、腫瘍、肺、および血漿における、リンカーVel-IPVを有するhAg-2のin vivo比較を示す。
【図７】図7A-Cは、3つの異なる細胞株：HCT116（図7A）、SW780（図7B）、およびHT1080（図7C）における、CVelまたはVelコイルドコイルを用いた、抗Ag2のマスキング効果を示す。
【図８】図8A-Cは、マスキングされていない、およびVelでマスキングされた、さまざまな切断配列を有する、抗CD19抗体薬物複合体の比較を示す。図8Aは、マスキングされていない、およびVelでマスキングされた抗CD19 ADCの、CD19陽性Ramos細胞との結合を示す；図8Bは、CD19陽性Ramos細胞に対する抗CD19 ADCの抗増殖活性を示す；図8Cは、NSGマウスのRamos異種移植片における、マスキングされていない、およびVelでマスキングされた抗CD19抗体薬物複合体の抗腫瘍活性を示す。
【図９】図9A-Dは、マスキングされていない、およびマスキングされた抗マウスCD13抗体145-2C11の比較を示す。図9Aは、マスキングされた抗マウスCD13抗体145-2C11の結合活性を示す；図9Bは、BALB/ｃマウスにおける、マスキングされていない、およびマスキングされた抗マウスCD13抗体145-2C11の、標的による薬物消長を示す；図9CおよびDは、抗マウスCD13抗体145-2C11によるサイトカイン放出、IFNγ（図9C）およびIL-2（図9D）、の低減を示す。
【図１０】図10は、さまざまなコイルドコイルドメインを有する、マスキングされた抗ヒトAg2抗体の安定性を、BALB/cマウスの静脈内投与によって示す。
【図１１】図11A-Cは、マスキングされていない、およびマスキングされた抗マウスAg2抗体の活性を示す。図11Aは、ヒトAg2抗体に対して使用されたのと同じVelおよびIPVでマスキングされたマウス反応性抗Ag2抗体を示す；図11Bは、BALB/cマウスにおけるマスキングされた抗マウスAg2抗体に関する血小板枯渇の検討を示す；図11Cは、マスキングされた抗マウスVel-IPV-Ag2抗体の薬物動態を示す。
【図１２】図12A-Dは、A20リンパ腫モデルにおける、抗マウスAg2抗体の抗腫瘍活性を示す。図12Aは、末梢Ag2(+)細胞に及ぼす、マスキングされていない、およびVel-IPVマスキングされた抗Ag2抗体の影響を示す；図12Bは、マスキングされていない、およびVel-IPVマスキングされた抗Ag2抗体の処理後の、経時的な腫瘍量の変化を示す；図12Cは、マスキングされていない、およびVel-IPVマスキングされた抗Ag2抗体の、末梢細胞との結合を示す；ならびに、図12Dは、マスキングされていない、およびVel-IPVマスキングされた抗Ag2抗体の腫瘍細胞との結合を示す。
【図１３】図13A-Cは、抗Ag2抗体の薬物動態および忍容性に及ぼすマスキングの影響を示す。図13Aは、抗Ag2抗体およびVel-IPV抗Ag2抗体の薬物動態を、汎用全抗体（TAb）ELISAを用いて示す；図13Bは、これらのAg2(+)細胞の枯渇を比較することによって、Vel-IPVによる抗Ag2のマスキングの影響を示す；図13Cは、サイトカイン産生に及ぼす、Vel-IPVによる抗Ag2のマスキングの影響を示す。
【図１４】図14Aおよび14Bは、L428異種移植片における抗Ag2抗体の抗腫瘍活性を示す。図14Aは、Vel-PLGLAG抗Ag2およびVel-LALGPG抗Ag2の処理後の、腫瘍量の変化を示す；図14Bは、Vel-PLGLAG抗Ag2およびVel-LALGPG抗Ag2の処理後の、L428細胞の変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
定義
単離された抗体またはADCは、典型的には、その製造または精製から生じる夾雑タンパク質およびその他の夾雑物で少なくとも50% w/wの純度であるが、抗体が、その使用を容易にすることを目的とする、過剰な製薬上許容されるキャリアー（1つまたは複数）または他の媒体と結びついている可能性は排除されない。抗体またはADCは、製造または精製からの夾雑タンパク質および夾雑物で、少なくとも60%、70%、80%、90%、95%または99% w/wの純度であることもある。
【００１９】
抗体の、単独での、またはADCの構成成分としての、標的抗原に対する特異的結合は、少なくとも106、107、108、109、または1010 M-1の親和性を意味する。特異的結合は、検出できるほど大きく、少なくとも1つの無関係な標的に対して生じる非特異的結合から区別することができる。特異的結合は、特定の官能基間の結合の形成、または特別な空間的適合性（たとえば、鍵と鍵穴の様式）の結果であると考えられるのに対して、非特異的結合は通常、ファンデルワールス力の結果である。しかしながら、特異的結合は、モノクローナル抗体が唯一の標的と結合することを、必ずしも意味するものではない。
【００２０】
抗体の基本構造単位は、サブユニットの四量体である。それぞれの四量体は、2対のポリペプチド鎖を含み、各ペアは1つの「軽」鎖（約25 kDa）および1つの「重」鎖（約50-70 kDa）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識に一義的に関与する、約100-110またはそれ以上のアミノ酸からなる可変領域を含む。この可変領域は、初めは、切断可能なシグナルペプチドに連結されて発現される。シグナルペプチドのない可変領域は、成熟可変領域と呼ばれることもある。したがって、たとえば、軽鎖成熟可変領域は、軽鎖シグナルペプチドを持たない軽鎖可変領域である。各鎖のカルボキシ末端部分は定常領域となる。重鎖定常領域は、エフェクター機能に一義的に関与する。
【００２１】
軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンに分類され、それぞれIgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEとして抗体のアイソタイプを規定する。軽鎖および重鎖において、可変領域と定常領域は、約12個またはそれ以上のアミノ酸からなる“J”領域によって連結されており、重鎖については約10個またはそれ以上のアミノ酸からなる“D”領域も含まれる。（概略は、Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989, Ch. 7を参照されたいが、これは参考としてそのまま本明細書に含められる）。
【００２２】
それぞれの軽鎖/重鎖ペアの成熟可変領域は、抗体結合部位を形成する。したがって、インタクトな抗体は2つの結合部位を有する。二機能性もしくは二重特異性抗体の場合を除き、2つの結合部位は同一である。その鎖はいずれも、相補性決定領域もしくはCDRとも呼ばれる3つの超可変領域で連結された、比較的保存されたフレームワーク領域（FR）という、同一の一般構造を示す。各ペアのそれぞれの鎖のCDRはフレームワーク領域によって配置され、特異的なエピトープとの結合が可能になる。軽鎖および重鎖はともに、N末端からC末端に向かって、ドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3およびFR4を含有する。各ドメインへのアミノ酸の割当は、Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991)、またはChothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989)、の定義に則している。Kabatは、広く使用されるナンバリング規則（Kabatナンバリング）も提供しており、異なる重鎖間、または異なる軽鎖間で対応する残基には同じ番号が割り振られる。
【００２３】
「抗体」という用語は、インタクトな抗体、ならびにその結合フラグメントを含む。典型的には、抗体フラグメントは、標的との特異的結合をめぐって、その起源であるインタクトな抗体と競合するが、そうしたフラグメントには、分離された重鎖、軽鎖、Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab)c、ダイアボディ、Dab、ナノボディ、およびFvが含まれる。フラグメントは、組換えDNA技法によって、またはインタクトな免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的分離によって、作製することができる。「抗体」という用語は、ダイアボディ（ホモ二量体Fvフラグメント）もしくはミニボディ（minibody）（VL-VH-CH3）、二重特異性抗体なども含む。二重特異性もしくは二機能性抗体は、2つの異なる重鎖/軽鎖ペア、ならびに2つの異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である（たとえば、Songsivilai and Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-53 (1992)を参照されたい）。「抗体」という用語には、抗体そのもの（ネイキッド抗体）、または細胞傷害性薬物もしくは細胞増殖抑制性薬物に結合された抗体が含まれる。
【００２４】
「エピトープ」という用語は、抗体が結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、連続したアミノ酸から形成されてもよいが、1つもしくは複数のタンパク質の三次フォールディングによって並置される不連続なアミノ酸から形成されることもある。連続したアミノ酸から形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒に暴露されたときに維持されるのに対して、三次フォールディングにより形成されたエピトープは、変性溶媒による処理で失われる。エピトープは、典型的には、少なくとも3つのアミノ酸、通常はそれ以上の、少なくとも5個、もしくは8-10個のアミノ酸を、ユニークな立体構造の中に含んでいる。エピトープの立体構造を決定する方法には、たとえば、x線結晶構造解析および2次元核磁気共鳴がある。たとえば、Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996)を参照されたい。
【００２５】
同一のエピトープまたはオーバーラップするエピトープを認識する抗体は、標的抗原に対して、ある抗体が別の抗体の結合と競合する能力を示す、シンプルなイムノアッセイで同定することができる。抗体のエピトープは、その抗原に結合する抗体のx線結晶構造解析によって、接触している残基を同定して、決定することもできる。あるいはまた、一方の抗体の結合を減少または消滅させる、抗原におけるすべてのアミノ酸変異が、もう一方の抗体の結合を減少または消滅させるならば、2つの抗体は同一のエピトープを有する。一方の抗体の結合を減少または消滅させるアミノ酸変異の中に、もう一方の抗体の結合を減少または消滅させるものがあるならば、2つの抗体はオーバーラップしたエピトープを有する。
【００２６】
抗体間の競合は、被験抗体が共通抗原に対する基準抗体の特異的結合を阻害するアッセイで測定することができる（たとえば、Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990を参照されたい）。競合的結合アッセイで測定して、過剰量の被験抗体（たとえば少なくとも2x、5x、10x、20xまたは100x）が基準抗体の結合を、少なくとも50%、好ましくは75%、90%または99%阻害するならば、被験抗体は基準抗体と競合する。競合アッセイで同定された抗体（競合する抗体）には、基準抗体と同じエピトープに結合する抗体、ならびに、基準抗体の結合するエピトープに十分近接した隣接エピトープに結合して立体障害を生じる抗体がある。
【００２７】
「患者」という用語には、予防的または治療的処置を受けるヒトおよび他の哺乳動物被験体が含まれる。
【００２８】
アミノ酸置換を保存的または非保存的として分類するために、アミノ酸を次のようにグループ化する：グループI（疎水性側鎖）：Met、Ala、Val、Leu、Ile；グループII（中性親水性側鎖）：Cys、Ser、Thr；グループIII（酸性側鎖）：Asp、Glu；グループIV（塩基性側鎖）：Asn、Gln、His、Lys、Arg；グループV（鎖配向に影響を及ぼす残基）：Gly、Pro；およびグループVI（芳香族側鎖）：Trp、Tyr、Phe。保存的置換は、同一分類内のアミノ酸の間の置換であることが必要である。非保存的置換は、これらの分類のうち1分類のメンバーを別の分類のメンバーと交換することとなる。
【００２９】
配列同一性パーセントは、最大限にアラインされた配列で決定される。
【００３０】
配列同一性は、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.）などのアルゴリズムを使用しデフォルトのギャップパラメーターを用いて配列をアラインすることによって、または観察と最適なアラインメントによって、求めることができる（すなわち、比較ウィンドウの全体にわたって配列類似性の最高パーセントをもたらす）。配列同一性パーセントは、比較ウィンドウ全体にわたって2つの最適にアラインされた配列を比較し、マッチする位置の数を得るために、両方の配列に同一残基が存在する位置の数を求め、比較ウィンドウにおいてギャップの数を考慮しないでマッチした位置の数を、マッチおよびミスマッチ位置の総数（すなわちウィンドウサイズ）で割って、結果を100倍することによって計算し、配列同一性パーセントを得る。抗体配列はKabatのナンバリング規則によって、同じ番号を付された位置を占める残基が揃うようにアラインされる。アラインメント後、被験配列と基準配列であれば、被験配列と基準配列との配列同一性パーセントは、ギャップの数を考慮しないで、被験配列と基準配列の両方で同一のアミノ酸によって占められる位置の数を、2つの領域のアラインされた位置の総数で割って、パーセンテージに変換するために100を掛けたものである。
【００３１】
1つもしくは複数の列挙された要素を「含む」組成物または方法は、具体的に列挙されていない他の要素を含んでいてもよい。たとえば、抗体を含む組成物は、抗体を単独で含んでいてもよいが、他の成分と組み合わせて含んでいてもよい。
【００３２】
値の範囲の表示（記載）は、その範囲内の、またはその範囲を定めるすべての整数を含む。
【００３３】
抗体のエフェクター機能は、IgのFcドメインが寄与する機能のことをいう。そのような機能は、たとえば、抗体依存性細胞傷害、抗体依存性細胞食作用、または補体依存性細胞傷害とすることができる。そうした機能は、たとえば、食作用もしくは溶解作用を有する免疫細胞上のFc受容体へのFcエフェクタードメインの結合によって、または補体系の補体へのFcエフェクタードメインの結合によってなされると考えられる。典型的には、Fcの結合した細胞もしくは補体成分による影響は、結果として標的細胞の阻害および/または不足をもたらす。抗体のFc領域は、Fc受容体（FcR）発現細胞を動員し、そうした細胞を抗体で覆われた標的細胞と近接させることができる。FcγRIII (CD16)、FcγRII (CD32)、およびFcγRIII (CD64)などのIgGに対する表面FcRを発現する細胞は、IgGで覆われた細胞の破壊のためにエフェクター細胞として機能することができる。こうしたエフェクター細胞には、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー（NK）細胞、好中球、および好酸球がある。IgGによるFcγRの結合は、抗体依存性細胞傷害（ADCC）もしくは抗体依存性細胞食作用（ADCP）を活性化する。ADCCには、膜孔形成タンパク質およびプロテアーゼを介してCD16+エフェクター細胞が関与するのに対して、食作用には、CD32+およびCD64+エフェクター細胞が関与する（Fundamental Immunology, 4th ed., Paul ed., Lippincott-Raven, N.Y., 1997, Chapters 3, 17 and 30; Uchida et al., 2004, J. Exp. Med. 199:1659-69; Akewanlop et al., 2001, Cancer Res. 61:4061-65; Watanabe et al., 1999, Breast Cancer Res. Treat. 53:199-207を参照されたい）。ADCCおよびADCPに加えて、細胞に結合した抗体のFc領域は、補体古典経路を活性化して補体依存性細胞傷害（CDC）を引き起こすこともできる。補体系のC1qは、抗体が抗原と複合体を形成すると、抗体のFc領域に結合する。細胞に結合した抗体とC1qの結合は、C4およびC2のプロテアーゼ活性化に関与するイベントのカスケードを開始させ、C3転換酵素を生成させることができる。C3転換酵素によるC3のC3bへの切断によって、C5b、C6、C7、C8およびC9などの終末補体成分の活性化が可能になる。まとめると、これらのタンパク質は、抗体で覆われた細胞表面に細胞膜障害性複合体孔を形成する。これらの孔は、細胞膜の完全性を破壊し、標的細胞を死滅させる（Immunobiology, 6th ed., Janeway et al., Garland Science, N. Y., 2005, Chapter 2を参照されたい）。
【００３４】
「細胞傷害効果」は、標的細胞の減少、除去、および/または死滅を意味する。「細胞傷害性薬物」は、細胞に対する細胞傷害効果を有する薬剤を指す。細胞傷害性薬物は、抗体と結合することができるが、抗体と併用して投与することもできる。
【００３５】
「細胞増殖抑制効果」は、細胞増殖の阻害を意味する。「細胞増殖抑制性薬物」は、それによって特定の細胞サブセットの成長および/または増殖を阻害する、細胞に対する細胞増殖抑制効果を有する薬物を指す。細胞増殖抑制性薬物は、抗体と結合することができるが、抗体と併用して投与することもできる。
【００３６】
「製薬上許容される」という用語は、動物、より詳細にはヒトに使用するために、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認され、もしくは承認可能であること、または米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する。「製薬上適合性のある成分」という用語は、抗体もしくはADCと組み合わせられる、製薬上許容される賦形剤、アジュバント、添加剤、または溶媒を指す。
【００３７】
「製薬上許容される塩」という表現は、抗体もしくはその複合体、または抗体とともに投与される薬剤の製薬上許容される有機塩もしくは無機塩を指す。例となる塩には、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、過リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチジン酸塩(gentisinate)、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、糖酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p-トルエンスルホン酸、およびパモ酸（すなわち1,1’-メチレンビス-(2-ヒドロキシ-3-ナフトエ酸))塩がある。製薬上許容される塩は、たとえば酢酸イオン、コハク酸イオンまたは他の対イオンなどの、別の分子を含むことになる。対イオンは、親化合物の電荷を安定化する任意の有機もしくは無機部分であってもよい。さらに、製薬上許容される塩は、その構造内に1つ以上の電荷を帯びた原子を有することがある。複数の荷電原子が製薬上許容される塩の一部であるような事例は、複数の対イオンを有する可能性がある。したがって、製薬上許容される塩は、1つもしくは複数の荷電原子、および/または1つもしくは複数の対イオンを有する可能性がある。文脈から明らかでない限り、マスキング型もしくは非マスキング型の抗体もしくは抗体薬物複合体はいずれも、製薬上許容される塩の形で与えられる可能性がある。
【００３８】
文脈からそうでないことが明らかでない限り、「約」という用語は、表示された値の標準偏差の範囲内の値を含む。
【００３９】
ヒト化抗体は、非ヒト「ドナー」抗体に由来するCDRをヒト「アクセプター」抗体配列の中につなぎ合わせた遺伝子組換え抗体である（たとえば、Queen, U.S. Pat. Nos. 5,530,101 and 5,585,089; Winter, U.S. Pat. No. 5,225,539, Carter, U.S. Pat. No. 6,407,213, Adair, U.S. Pat. Nos. 5,859,205 6,881,557, Foote, U.S. Pat. No. 6,881,557を参照されたい）。アクセプター抗体配列は、たとえば、成熟ヒト抗体配列、そうした配列の合成物、ヒト抗体配列のコンセンサス配列、または生殖系列領域配列とすることができる。したがって、ヒト化抗体は、ドナー抗体に完全に、または実質的に由来する、好ましくはKabatにより定義されたそのCDR、ならびに、あるとすれば、ヒト抗体配列に完全に、または実質的に由来する、可変領域フレームワーク配列および定常領域を有する抗体である。ナノボディおよびdAb以外は、ヒト化抗体はヒト化重鎖およびヒト化軽鎖を含有する。対応する残基（Kabatにより定義される）の少なくとも85%、90%、95%または100%がそれぞれのCDR間で同一である場合、ヒト化抗体中のCDRは、実質的に、非ヒト抗体中の対応するCDRに由来する。Kabatにより定義される対応する残基の少なくとも85%、90%、95%または100%が同一であるならば、抗体鎖の可変領域フレームワーク配列、または抗体鎖の定常領域は、実質的に、それぞれヒト可変領域フレームワーク配列またはヒト定常領域に由来する。
【００４０】
キメラ抗体は、非ヒト抗体（たとえばマウス）の軽鎖および重鎖の成熟可変領域を、ヒトもしくは非ヒト霊長類軽鎖および重鎖定常領域と組み合わせた抗体である。このような抗体は実質的に、または完全に、マウス抗体の結合特異性を保持しているが、3分の2はヒトもしくは非ヒト霊長類配列である。
【００４１】
べニア抗体（ベニア化された抗体、veneered antibody）は、複数のCDRの一部、通常すべて、を保持し、非ヒト抗体の非ヒト可変領域フレームワークの一部を保持するが、BまたはT細胞エピトープ、たとえば露出残基（Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991）に関与する可能性がある他の可変領域フレームワーク残基を、ヒト抗体配列の対応する位置からの残基で置き換えた、ヒト化抗体の一種である。その結果、抗体において、CDRは完全に、または実質的に非ヒト抗体に由来し、非ヒト抗体の可変領域フレームワークは置換によってよりヒトに近くなっている。
【００４２】
抗体薬物複合体（ADC）は、薬物と結合した抗体を含む。薬物は、薬理活性、通常は細胞傷害活性または細胞増殖抑制活性を有することが判明し、または推測される化合物である。
【００４３】
詳細な説明
I.総論
本発明は、可変領域が、可変領域鎖のN末端とコイルドコイル形成ペプチドとの結合によってマスキングされた抗体を提供する。コイルドコイル形成ペプチドは、互いに結合して、コイルドコイルを形成する（すなわち、それぞれのペプチドはおのおのコイルを形成しており、こうしたコイルが互いに巻きついてらせん状になる）。本発明の実践のためにメカニズムの理解は必要ないが、コイルドコイルは、抗体結合部位とその標的との結合を立体的に阻害するとされている。その技術は、二価抗体（すなわち2つの結合部位を有する）を含めて、あらゆる形の抗体に対して実践することができる。コイルドコイル形成ペプチド間の非共有結合は、抗体可変領域の結合を阻害する安定したコイルドコイルの形成に十分である；たとえば、コイルドコイル形成ペプチドが、それぞれのペプチドの末端システイン間のジスルフィド橋によりさらに連結される必要はない。天然に存在しないシステインが存在することは不利益となる可能性があり、それは、そうしたシステインがミスフォールディングもしくは間違った複合体化の問題を引き起こす可能性があるからである。この方式による抗体のマスキングは、100倍を超えて結合親和性（ならびに、ADCの場合は細胞傷害活性）を低下させることができる。非マスキングに対して発現、精製、複合体化、薬物動態、または結合もしくはその他の活性を有意に損なうことなく、この方式で抗体をマスキングすることができる。
【００４４】
II. コイルドコイル
コイルドコイル形成ペプチドは、互いに会合してコイルドコイルを形成することができるペプチド対である。「コイルドコイル」は、絡み合って超らせん構造となったアルファヘリックスの束を指す専門用語である。ロイシンジッパー形成ペプチドは、会合してコイルドコイルを形成することができるペプチドの一例である。本発明で形成されるコイルドコイルは、典型的には2つのコイルドコイル形成ペプチドから形作られる。コイルドコイルは、ペプチドについては、並列した、または反対方向のアルファヘリックスで形成することができる（その例を図1Aおよび1Bに示す）。コイルドコイルはさらに、knobs-into-holesと呼ばれる、束の中心部でのアミノ酸側鎖のパッキングを特徴としており、そこでは、一方のヘリックス由来の残基（knob）が、対面するヘリックスの4つの側鎖で囲まれたスペース（hole）の中に納まっている。knobs-into-holes相互作用に関与する残基は通常、疎水性であるのに対して、外側の残基は親水性であるので、一連のコイルドコイルは、側鎖の化学的性質として「7つ組の（7アミノ酸）」繰り返しを示す。コイルドコイル形成ペプチドの7アミノ酸繰り返しについて共通する式の例がWO2011034605で与えられる。
式1：(X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7)n
X1は疎水性アミノ酸またはアスパラギンである
X2、X3およびX6は任意のアミノ酸である
X4は疎水性アミノ酸である
X5およびX7はいずれも荷電アミノ酸残基である
式2：(X1’, X2’, X3’, X4’, X5, X6, X7)n
X1’は疎水性アミノ酸またはアスパラギンである
X2’、X’3およびX’6はいずれも任意のアミノ酸残基である
X4’は疎水性アミノ酸である
X5’およびX7’はいずれも荷電アミノ酸残基である
この式1および式2においてnは2以上である；ならびに
第1のコイルドコイル形成ペプチドにおけるそれぞれの7アミノ酸繰り返しは、第2のコイルドコイル形成ペプチドのX’7残基と反対の荷電を有するX5残基を含有し、第1のコイルドコイル形成ペプチドは、第2のコイルドコイル形成ペプチドのX’5残基と反対の荷電を有するX7残基を含有する。コイルドコイル形成ペプチド内の7アミノ酸繰り返しは、式1または2に従うが、互いに同一であっても異なっていてもよい。
【００４５】
コイルドコイルはホモ二量体またはヘテロ二量体とすることができる。コイルドコイルペプチド対の例としては、
A2B1   GASTSVDELQAEVDQLQDENYALKTKVAQLRKKVEKLSE、配列番号66および
GASTTVAQLRERVKTLRAQNYELESEVQRLREQVAQLA、配列番号NO:67、
CA2B1   EACGASTSVDELQAEVDQLQDENYALKTKVAQLRKKVEKLSE、配列番号68および
EACGASTTVAQLRERVKTLRAQNYELESEVQRLREQVAQLA、配列番号69、
M11   LEIEAAFLERENTALETRVAELRQRVQRARNRVSQYRTRY、配列番号26および
LEIRAAFLRQRNTALRTEVAELEQEVQRLENEVSQYETRY、配列番号21、
CM11   EACGALEIEAAFLERENTALETRVAELRQRVQRARNRVSQYRTRY、配列番号39および
EACGALEIRAAFLRQRNTALRTEVAELEQEVQRLENEVSQYETRY、配列番号37、
M15   LEIRAAFLRRRNTALRTRVAELRQRVQRLRNIVSQYETRY、配列番号30および
LEIEAAFLEQENTALETEVAELEQEVQRLENIVSQYETRY、配列番号28、
CM15   EACGALEIRAAFLRRRNTALRTRVAELRQRVQRLRNIVSQYETRY、配列番号43、および
EACGALEIEAAFLEQENTALETEVAELEQEVQRLENIVSQYETRY、配列番号41、
Vel   (Q)GASTSVDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKL、配列番号35および
(Q)GASTTVAQLEEKVKTLRAENYELKSEVQRLEEQVAQL、配列番号32、
CVel   EACGASTSVDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKL、配列番号47および
EACGASTTVAQLEEKVKTLRAENYELKSEVQRLEEQVAQL、配列番号45、
Fos-Jun   AGLTDTLQAETDQLEDKKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAH、配列番号70および
AGRIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNY、配列番号71、
CFos-Jun   EACGAGLTDTLQAETDQLEDKKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAH、配列番号72および
EACGAGRIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNY、配列番号73、
A4B4   GKIAALKQKIAALKYKNAALKKKIAALKQ、配列番号74および
GEIAALEQEIAALEKENAALEWEIAALEQ、配列番号75、ならびに
CA4B4   EACGAGKIAALKQKIAALKYKNAALKKKIAALKQ、配列番号76および
EACGAGEIAALEQEIAALEKENAALEWEIAALEQ、配列番号77がある。
【００４６】
コイルドコイル形成ペプチド対の例の一部を、表1ならびに図1Aおよび1Bにも示す。図1Aおよび1Bに示す配列内のハイフンは、異なる配列セグメントを表す。配列は、左から右へ向かって、コイルドコイルペプチド、人工的リンカー、人工的リンカー内のプロテアーゼ切断部位、および人工的リンカーの残りの部分である。ペプチド配列はそのまま使用することができるが、その成分を別の組み合わせで使用することもできる。たとえば、Velコイルドコイル形成ペプチドは、他のリンカー配列とともに使用することができる。軽鎖用に示される配列を重鎖とともに使用してもよく、その逆も可能である。
【００４７】
好ましい組み合わせは、配列番号44（図1BのCVel CC）のアミノ酸を含んでなる、またはそれらからなるペプチドと、配列番号46（図1BのCVel CC）の配列のペプチドとの組み合わせであって、前者は軽鎖に連結される、プロテアーゼ切断部位を含むリンカーおよびコイルドコイル形成ペプチドを提供し、後者は重鎖に連結される、プロテアーゼ切断部位を含むリンカーおよびコイルドコイル形成ペプチドを提供するが、その逆もある。これらの配列からなる、またはこれらの配列を含んでなるペプチドは、本明細書に記載のいかなる抗体にも連結することができる。
【００４８】
別の好ましい組み合わせは、配列番号31（Vel CC）もしくは配列番号65（N末端Qなし）のアミノ酸を含んでなる、またはそれらからなるペプチドと、配列番号34（Vel CC）もしくは配列番号64（N末端Qなし）の配列のペプチドとの組み合わせであって、前者は、軽鎖に連結される、プロテアーゼ切断部位を含むリンカーおよびコイルドコイル形成ペプチドを提供し、後者は重鎖に連結される、プロテアーゼ切断部位を含むリンカーおよびコイルドコイル形成ペプチドを提供するが、その逆もある。これらの配列からなる、またはこれらの配列を含んでなるペプチドは、本明細書に記載のいかなる抗体にも連結することができる。
【００４９】
【表１】
2020500900.tif 000003
【００５０】
これらのペプチドに対して少なくとも80%、90%もしくは95%同一性を有し、それでもなおコイルドコイルを形成する能力を有する、これらのペプチドのバリアントも使用することができる。あらゆる置換は好ましくは保存的置換である。上記のように、アミノ酸の種類によって式中で位置を占めるアミノ酸を分類する方式に則って、コイルドコイル形成ペプチドを隣接する7アミノ酸セグメントにさらに分割することができる7アミノ酸繰り返しパターンは、保持されることが好ましい。好ましくは、7つ組のアミノ酸について、わずかに1つもしくは2つの置換が存在し、そうした置換はいずれも保存的である。
【００５１】
N末端残基がQである、あらゆるコイルドコイル形成ペプチド配列において、Qは任意である。N末端残基がQ以外である、あらゆるコイルドコイル形成ペプチドにおいて、Qを付加してN末端残基とすることができる。N末端残基としてQが存在すると、シグナル配列プロセシングを促進することができる。
【００５２】
III. リンカーおよび切断部位
リンカーは、ペプチドドメインを連結するためのリンカーとして通常使用される、任意のアミノ酸セグメントとすることができる。適当なリンカーの長さはさまざまであってよく、たとえば、1〜20、2〜15、3〜12、4〜10、5、6、7、8、9または10アミノ酸とすることができる。そうしたリンカーにはポリグリシンのセグメントもある。このようなリンカーには、1つもしくは複数のセリン残基を含むものもあり、多くの場合グリシン残基に隣接する位置にある。他のリンカーは1つもしくは複数のアラニン残基を含む。グリシン、およびグリシン-セリンポリマーは相対的に構造化されないので、構成要素の間でニュートラルなつなぎとして機能することができる。グリシンは、アラニンよりも有意に大きなphi-psi空間にアクセスし、長い側鎖を有する残基よりはるかに制限されない（Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)を参照されたい）。リンカーの例にはS(G)nSの形をとるものもあり、式中nは5〜20である。他のリンカーの例としては、(G)n、グリシン-セリンポリマー（たとえば(GS)n、(GSGGS)n [(GSGGS)は配列番号49である]、および(GGGS)n [(GGGS)は配列番号50である]など、式中nは1以上の整数である）、グリシン-アラニンポリマー、アラニン-セリンポリマー、ならびに当技術分野で公知の他のフレキシブルリンカーがある。リンカーの例には、Ser-(Gly)10-Ser (配列番号51)、Gly-Gly- Ala-Ala (配列番号52)、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (配列番号24)、Leu- Ala- Ala- Ala- Ala (配列番号53)、Gly-Gly-Ser-Gly (配列番号54)、Gly-Gly-Ser-Gly-Gly (配列番号55)、Gly-Ser-Gly-Ser-Gly (配列番号56)、Gly-Ser-Gly-Gly-Gly (配列番号57)、Gly-Gly-Gly-Ser-Gly (配列番号58)、Gly-Ser-Ser-Ser-Gly (配列番号59)などもある。
【００５３】
プロテアーゼ部位は、好ましくは、マスキングされた抗体と接触するように細胞外で発現されたプロテアーゼによって認識され、切断されて、マスキングされた抗体を遊離し、それがその標的、たとえば受容体細胞外ドメインもしくは可溶性リガンドなど、と接触することを可能にする。いくつかのマトリックスメタロプロテイナーゼ部位（MMP1-28）が適している。MMPは組織リモデリングの一因となり、形態形成、血管新生および転移などの腫瘍形成過程に関与する。プロテアーゼ部位の例としては、PLG-XXX (配列番号60)、MMP群に関する周知の内在性配列、PLG-VR (配列番号23) (WO2014193973)、IPVSLR (配列番号33) (Turk et al., Nat. Biotechnol., 2001, 19, 661-667)、LSGRSDNH (配列番号61) (Cytomyx)、GPLGVR (配列番号62) (Chang et al., Clin. Cancer Res. 2012 Jan 1; 18(1):238-47)、VPMS-MRGG (MMP1、配列番号78)、RPFS-MIMG (MMP3、配列番号79)、IPES-LRAG (MMP14、配列番号80)、-VPLS*LTMG (配列番号81) (Turk et al., Nat. Biotechnol., 2001, 19, 661-667)がある。他のプロテアーゼ部位の例には、PLGLAG (配列番号82)、LALGPG (配列番号83)、およびYGRAA (配列番号84)がある。
【００５４】
さらに他の例が、初期の研究、たとえばUS2013/0309230、WO2009/025846、WO2010/081173、WO2014/107599、WO2015/048329、US20160160263、およびRatnikov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 111: E4148-E4155 (2014)で与えられる。
【００５５】
プロテアーゼ部位を含むリンカーに結合されたコイルドコイル形成ペプチドの例の一部は、図1Aおよび1Bに示される。こうしたペプチドの構成要素は、ハイフンで分けられている（すなわち、コイルドコイル形成ペプチド-リンカーの左側部分-プロテアーゼ部位-リンカーの右側部分）。
【００５６】
IV. 抗体ならびに抗体とコイルドコイルとの結合
コイルドコイル形成ペプチドは、プロテアーゼ部位を含むリンカーを介して、抗体可変領域のN末端に連結される。典型的な抗体は、重鎖および軽鎖可変領域を含んでおり、その場合、コイルドコイル形成ペプチドは、それぞれのN末端に連結される。二価抗体は2つの結合部位を有し、それらは同一であっても同一でなくてもよい。通常の単一特異性抗体では、結合部位は同一であって、その抗体は2つの同一な軽鎖重鎖ペアを有する。この場合、それぞれの重鎖は同一のコイルドコイル形成ペプチドに連結され、それぞれの軽鎖は同一のコイルドコイル形成ペプチドに連結される（これは重鎖に連結されるペプチドと同じでも、同じでなくてもよい）。
【００５７】
二重特異性抗体において、結合部位は異なっており、2つの異なる重鎖軽鎖ペアから形成される。結合部位は、異なる標的に対する特異性、または同一標的上の異なるエピトープに対する特異性を有する可能性がある。結合部位が、異なる標的に対する特異性を有する場合、それらの標的は同一細胞上にある（たとえば、がん細胞上の2つの異なる表面抗原）かまたは、2つの異なる細胞上にある（たとえば、1つはがん細胞上の表面抗原であり、また1つはT細胞などの免疫細胞上の表面抗原である）可能性がある。たとえば、二重特異性抗体の一方の結合部位は、CD3もしくは4-1BBに対するものとすることができる。
【００５８】
二重特異性抗体において、一方の結合部位の重鎖および軽鎖可変領域をそれぞれ、コイルドコイル形成ペプチドに連結することができる。もう一方の結合部位の重鎖および軽鎖可変領域は、同様にコイルドコイルペプチドに連結されていても、連結されていなくてもよい。両方の結合部位の重鎖軽鎖ペアが、いずれもコイルドコイルペプチドに連結されているならば、典型的には、2つの重鎖可変領域は、2つの軽鎖可変領域と同じタイプのコイルドコイル形成ペプチドに連結されている。結合部位を2つともマスキングすることは、たとえば、2つの結合部位が同一腫瘍上の表面抗原に対して特異性を有する場合に、有用となりうる。結合部位の一方だけをマスキングすることは、たとえば、一方の結合部位が腫瘍表面抗原に特異的で、もう一方が免疫細胞上の表面抗原に特異性を有する場合に、有用となる可能性がある。腫瘍表面抗原または免疫細胞抗原に対して特異性を有する結合部位のいずれか一方をマスキングすることができる。腫瘍表面抗原および免疫細胞の両方に特異性を有する二重特異性抗体には、両方の部位をマスキングしたものもある。
【００５９】
上記のように、コイルドコイル形成ペプチドは、プロテアーゼ部位を含むリンカーを介して、抗体可変領域に連結される。典型的には、同一のプロテアーゼ切断部位を有する同一リンカーが、抗体の重鎖もしくは軽鎖可変領域のそれぞれとコイルドコイルペプチドとの結合に使用される。プロテアーゼ切断部位は、がんなどの、目的とする標的組織または病変において、細胞外に存在するプロテアーゼによる切断を受けやすいものとすべきであって、その結果、リンカーの切断は、抗体の活性をマスキングしているコイルドコイルから抗体を遊離し、細胞表面抗原もしくは可溶性リガンドなどの設定された標的に対して抗体の結合を可能にする。
【００６０】
マスキングされた抗体は、通常、可変領域だけでなく、定常領域の全部または一部を含んでおり、これは、軽鎖定常領域、CH1、ヒンジ領域、CH2およびCH3領域のいずれか、またはすべてを含むことができる。他の抗体と同様に、1つもしくは複数のC末端残基が、タンパク質分解的にプロセシングされ、または誘導体化されることがある。
【００６１】
コイルドコイルは、ホモ二量体を形成する同一のペプチド、またはヘテロ二量体を形成する2つの異なるペプチドから形成することができる。ホモ二量体を形成するために、抗体軽鎖および重鎖は同じコイルドコイル形成ペプチドに連結される。ヘテロ二量体を形成するために、抗体軽鎖および重鎖は異なるコイルドコイルペプチドに連結される。コイルドコイル形成ペプチドペアによっては、逆向きも可能ではあるが、ペアの一方が抗体重鎖に、もう一方が抗体軽鎖に連結されることが好ましい。
【００６２】
それぞれの抗体鎖は、1つのコイルドコイル形成ペプチドと連結されてもよいが、複数の上記ペプチド（たとえば、2、3、4または5コピーのペプチド）と直列（タンデム）に連結されてもよい。後者の場合、タンデム結合したペプチドは、通常同一である。またタンデム結合が用いられる場合、軽鎖および重鎖は通常、同数のペプチドと連結される。
【００６３】
抗体鎖とコイルドコイル形成ペプチドとの結合は、抗体の結合親和性を、そうした結合のない、またはそうした結合を切断した後の、同一抗体と比べて、たとえば、少なくとも10、50、100、200、500、1000、1500、2000、4000、5000または10,000倍低下させることができる。そうした抗体の中には、結合親和性が50〜10,000、50〜5000、50〜4000、50〜1000、100〜10,000、100〜5000、100〜4000、200〜10,000、200〜5000、50〜1500、100〜1500、200〜1500、200〜1000、500〜1500、50〜1000、100〜1000、200〜1000、500〜1000、50〜500、100〜500倍低下したものもある。ADCC、食作用、およびCDCなどの、抗体のエフェクター機能、または抗体薬物複合体における薬物との結合の結果としての細胞傷害性は、同様の倍数または範囲で減少させることができる。抗体をタンパク質分解性切断で脱マスキングすると、回復された抗体は、マスキングされたことのない、そのほかは同一の対照抗体と比べて、5倍、2倍、1.5倍以内の、または好ましくは実験誤差の範囲内で不変の、親和性またはエフェクター機能を有することができる。
【００６４】
V. 抗体薬物複合体
コイルドコイル形成ペプチドは、ネイキッド抗体との結合だけでなく、抗体薬物複合体（ADC）として細胞傷害性または細胞増殖抑制性成分と結合した抗体にも連結することができる。ネイキッド抗体と比べて、ADCは追加機構、特に抗体と結合した毒性成分の細胞内部への送達をもたらし、それによって細胞を死滅させ、あるいはそうでなくてもその増殖を抑制する。現在、2つのADCが販売されている：ブレンツキシマブベドチン（抗CD30、商標名：アドセトリス（ADCETRIS）（登録商標）、Seattle GeneticsおよびMillennium/Takedaにより販売）ならびにトラスツズマブエムタンシン（抗HER2、商標名：カドサイラ（Kadcyla）（登録商標）、GenentechおよびRocheにより販売）。他の多くのADCがさまざまな開発段階にある。
【００６５】
薬物と抗体とを結合するための技法はよく知られている（たとえば、Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy,” in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy (Reisfeld et al. eds., Alan R. Liss, Inc., 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery," in Controlled Drug Delivery (Robinson et al. eds., Marcel Dekker, Inc., 2nd ed. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (Pinchera et al. eds., 1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy (Baldwin et al. eds., Academic Press, 1985); およびThorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58を参照されたい。また、たとえばWO 89/12624も参照されたい。）。
【００６６】
薬物は通常、リジン側鎖のアミノ基を介して、またはシステイン側鎖の遊離スルフヒドリル基を介して、結合される。システイン残基は、抗体中に天然に存在してもよい（たとえば鎖間ジスルフィド）が、変異誘発によって導入することもできる。システインは遊離スルフヒドリル基を含有し、これはアミンよりも求核性が強く、通常、タンパク質においてもっとも反応性の高い官能基である。スルフヒドリルはほとんどのアミンとは異なり、中性pHにおいて反応性が高いので、アミンの存在下で選択的に他の分子と結合することができる。この選択性によって、スルフヒドリル基は抗体を連結するための最適なリンカーとなる。抗体分子当たりの薬物分子数の平均は、多くの場合1、2、3、4、5、6、7、または8個であり、たとえば2〜8個または3〜8個である。
【００６７】
薬物は、それが（たとえば、加水分解によって、抗体分解によって、または切断試薬によって）抗体から切り離されない限り、その活性を小さくするように、結合することができる。こうした薬物は切断可能なリンカーによって抗体に結合されるが、このリンカーは標的細胞の細胞内環境中での切断に対しては感受性であるが、細胞外環境に対しては実質的に感受性でないリンカーであって、その複合体は、標的細胞によって内部移行されると（たとえば、エンドソーム環境中、または、たとえばpH感受性もしくはプロテアーゼ感受性によって、リソソーム環境中で、またはカベオラ環境中で）抗体から切断されることになる。
【００６８】
典型的には、ADCは薬物と抗体の間にリンカー領域を含んでなる。リンカーは、細胞内条件下で切断可能となり、そうしてリンカーの切断は細胞内環境中で（たとえば、リソソームまたはエンドソームまたはカベオラの内部で）抗体から薬物を遊離させることになる。リンカーは、たとえば、リソソームプロテアーゼもしくはエンドソームプロテアーゼなどの細胞内ペプチダーゼもしくはプロテアーゼ酵素によって切断される、ペプチドリンカーとすることができる。典型的には、ペプチドリンカーは少なくとも2アミノ酸長または少なくとも3アミノ酸長である。切断作用物質には、カテプシンBおよびC、ならびにプラスミンを含めることができる（たとえば、Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123を参照されたい）。もっとも典型的なのは、標的細胞内に存在する酵素によって切断可能なペプチドリンカーである。たとえば、がん組織中で高度に発現される、チオール依存性プロテアーゼであるカテプシンBによって切断可能なペプチドリンカーを使用することができる（たとえば、Phe-LeuまたはGly-Phe-Leu-Gly (配列番号63) ペプチドを含有するリンカー）。このようなリンカーは他に、たとえば、US 6,214,345に記載されている。細胞内プロテアーゼにより切断可能なペプチドリンカーの例には、Val-CitリンカーまたはPhe-Lysジペプチドが含まれる（たとえば、US 6,214,345を参照されたいが、これはVal-Citリンカーを有するドキソルビシンの合成を記載する）。薬物の細胞内プロテアーゼ遊離を用いることの利点は、その薬剤が結合されているときには通常、弱められており、その複合体の血清安定性が通常は高いという点である。
【００６９】
切断可能なリンカーは、pH感受性、すなわち特定のpH値における加水分解に対して感受性であってもよい。典型的には、pH感受性リンカーは、酸性条件下で加水分解可能である。たとえば、たとえば、リソソーム内で加水分解可能な、酸に不安定なリンカー（たとえば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、cis-アコニット酸アミド、オルトエステル、アセタール、ケタールなど）を使用することができる（たとえば、US 5,122,368; 5,824,805; 5,622,929; Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661を参照されたい）。このようなリンカーは、血中のような中性pH条件下では比較的安定であるが、リソソームのおおよそのpHであるpH 5.5ないし5.0より低いpHでは不安定である。このような加水分解可能なリンカーの一例が、チオエーテルリンカーである（たとえばアシルヒドラゾン結合を介して薬物に結合されるチオエーテルなど（たとえばUS 5,622,929を参照されたい））。
【００７０】
他のリンカーは還元条件下で切断可能である（たとえばジスルフィドリンカー）。ジスルフィドリンカーには、SATA (N-スクシンイミジル-S-アセチルチオ酢酸)、SPDP (N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸)、SPDB (N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)酪酸) およびSMPT (N-スクシンイミジル-オキシカルボニル-alpha-メチル-alpha-(2-ピリジル-ジチオ)トルエン)、SPDBおよびSMPTを用いて作製できるリンカーが含まれる（たとえば、Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak et al., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987を参照されたい。またU.S. Patent No. 4,880,935も参照されたい）。
【００７１】
リンカーは、マロン酸リンカー（Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93）、マレイミドベンゾイルリンカー（Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1299-1304）、または3’-N-アミドアナログ（Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1305-12）であってもよい。
【００７２】
リンカーは、薬物にじかに（直接）結合している、マレイミド-アルキレン-またはマレイミド-アリールリンカーのような切断できないリンカーであってもよい（たとえば薬物）。活性のある薬物-リンカーは、抗体の分解によって遊離される。
【００７３】
リンカーは、抗体上に存在する基と反応する官能基を含んでなるものである。たとえば、リンカーは、リンカーの硫黄原子と抗体の硫黄原子との間のジスルフィド結合を介して、抗体に連結されることがある。別の例として、リンカーは、Stretcher Unit（伸長単位）のマレイミド基を介して抗体の硫黄原子との結合を形成することができる。硫黄原子は、鎖間ジスルフィドのシステイン残基、または抗体に導入されたシステイン残基に由来するものとすることができる。
【００７４】
抗体に結合できる細胞傷害性薬物の有用な種類としては、たとえば、抗チューブリン薬、DNA副溝結合薬、DNA複製阻害薬、化学療法増感薬、ピロロベンゾジアゼピン二量体などが挙げられる。他の種類の細胞傷害性薬物の例としては、アントラサイクリン、アウリスタチン、カンプトテシン、デュオカルマイシン、エトポシド、マイタンシノイド、およびビンカアルカロイドがある。細胞傷害性薬物の例の中には、アウリスタチン（たとえば、アウリスタチンE、AFP、MMAF、MMAE）、DNA副溝結合薬（たとえば、エンジインおよびレキシトロプシン）、デュオカルマイシン、タキサン（たとえば、パクリタキセルおよびドセタキセル）、ビンカアルカロイド、ドキソルビシン、モルホリノドキソルビシン、およびシアノモルホリノドキソルビシンなどもある。
【００７５】
細胞傷害性薬物は、化学療法薬、たとえば、ドキソルビシン、パクリタキセル、メルファラン、ビンカアルカロイド、メトトレキサート、マイトマイシンC、またはエトポシドなどとすることができる。薬物はまた、CC-1065アナログ、カリケアミシン、マイタンシン、ドキソルビシン10のアナログ、リゾキシン、またはパリトキシンとすることもできる。
【００７６】
細胞傷害性薬物はアウリスタチンであってもよい。アウリスタチンは、アウリスタチンE誘導体、たとえばアウリスタチンEとケト酸との間で形成されるエステル、とすることができる。たとえば、アウリスタチンEは、パラアセチル安息香酸またはベンゾイル吉草酸と反応させて、それぞれAEBおよびAEVBを生成することができる。他の典型的なアウリスタチンとしては、AFP、MMAF、およびMMAEがある。さまざまなアウリスタチンの合成および構造は、たとえば、US 2005-0238649およびUS2006-0074008に記載されている。
【００７７】
細胞傷害性薬物はDNA副溝結合薬とすることができる。（たとえばUS 6,130,237を参照されたい）。たとえば、副溝結合薬は、CBI化合物またはエンジイン（たとえばカリケアミシン）とすることができる。もう１つのタイプの副溝結合薬は、ピロロベンゾジアゼピン（PBD）二量体である。PBDは、そのN10-C11イミン/部分を介した、DNAの副溝内にあるグアニン残基のC2位アミノ基との共有結合によって、その生物活性を発揮する。
【００７８】
PBDは次の一般構造を有する：
【化１】
2020500900.tif 000004
【００７９】
これらのPBDは、芳香環Aおよびピロール環Cの両方で、置換基の数、種類、および位置が異なり、C環の飽和度が異なる。B環では、N10-C11の位置に、イミン（N=C）、カルビノールアミン（NH-CH(OH)）、またはカルビノールアミンメチルエーテル（NH-CH(OMe)）のいずれかが存在し、これがDNAのアルキル化に関与する求電子中心となる。既知の天然物はすべて、キラルC11a位においてS型の立体配置を有し、そのためPBDは、C環からA環に向かって見たときに、右巻きとなっている。このことが、B型DNAの副溝と同じらせん性であるための適切な三次元形状をPBDに与え、結合部位におけるぴったりしたフィットをもたらす。副溝において付加物を形成するPBDの能力によって、PBDはDNAプロセシングに干渉することが可能になり、したがって、PBDを抗腫瘍薬として使用することが可能になる。
【００８０】
これらの分子の生物活性は、2つのPBD単位を、フレキシブルリンカーを介してC8/C’-ヒドロキシル官能基によって繋ぎ合わせることによって強化することができる。PBD二量体は、パリンドローム5’-Pu-GATC-Py-3’鎖間架橋のような配列選択的DNA損傷を形成すると考えられ、それが主にPBD二量体の生物活性に関与していると考えられる。
【００８１】
ある実施形態において、PBDベースの抗体薬物複合体は、抗体に連結されたPBD二量体を含んでなる。PBD二量体を形成する単量体は、同一でも別々でもよく、すなわち対照または非対称とすることができる。PBD二量体は、リンカーと結合するのに適した任意の位置で抗体に連結することができる。たとえば、ある実施形態において、PBD二量体は、C2の位置に抗体とその化合物を連結するためのアンカーとなる置換基を有することがある。別の実施形態において、PBD二量体のN10の位置が、抗体とその化合物を連結するためのアンカーとなることがある。
【００８２】
典型的には、PBDベースの抗体薬物複合体は、PBD薬物と、原発がんの抗原に結合する抗体との間にリンカーを含んでなる。リンカーは、切断可能なユニット（たとえば、酵素の標的基質となるアミノ酸もしくはアミノ酸の連続配列）、または切断できないリンカー（たとえば、抗体の分解により遊離されるリンカー）を含む可能性がある。リンカーはさらに、抗体との結合のためにマレイミド基、たとえばマレイミドカプリルを含んでいてもよい。リンカーは、実施形態によっては、さらに、たとえばp-アミノベンジルアルコール (PAB)ユニットのような自壊性基を含有することもある。
【００８３】
複合体用のPBDの例は、WO 2011/130613に記載され、下記のとおりであるが、式中の波線はリンカーとの結合部位を示しており、あるいはその製薬上許容される塩である。
【００８４】
【化２】
2020500900.tif 000005
リンカーの例は次のとおりであるが、式中の波線は薬物との結合部位を示しており、抗体はマレイミド基で連結される。
【００８５】
【化３】
2020500900.tif 000006
【００８６】
PBDベースの抗体薬物複合体の例には、以下に示す抗体薬物複合体（式中、Abは本明細書に記載の抗体である）
【化４】
2020500900.tif 000007
またはその製薬上許容される塩がある。薬物負荷量は、抗体当たりの薬物リンカー分子の数、pで表される。
【００８７】
細胞傷害性もしくは細胞増殖抑制性薬物は、抗チューブリン薬とすることができる。抗チューブリン薬の例には、タキサン（たとえばタキソール（登録商標）（パクリタキセル）、タキソテール（登録商標）（ドセタキセル））、T67 (Tularik)、ビンカアルカロイド（たとえばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびビノレルビン）、およびアウリスタチン（たとえばアウリスタチンE、AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB）がある。アウリスタチンの例を以下の図III-XIIIに示す。他の適当な抗チューブリン薬には、たとえば、バッカチン誘導体、タキサンアナログ（たとえばエポチロンAおよびB）、ノコダゾール、コルヒチンおよびコルセミド、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、マイタンシノイド、コンブレタスタチン、ディスコデルモリド、およびエリュテロビンなどがある。
【００８８】
細胞傷害性薬物は、別の一群の抗チューブリン薬であるマイタンシノイドとすることができる。たとえば、マイタンシノイドは、マイタンシン、またはDM-1もしくはDM-4などの薬物リンカーを含有するマイタンシンとすることができる（ImmunoGen, Inc.; see also Chari et al., 1992, Cancer Res. 52:127-131）。
【００８９】
抗体薬物複合体の例として、次のvcMMAEおよびmcMMAF抗体薬物複合体、またはその製薬上許容される塩が挙げられるが、このpは薬物負荷量を表し、1から20までの範囲であって、Abは抗体である。
【００９０】
【化５】
2020500900.tif 000008
vcMMAE
【００９１】
【化６】
2020500900.tif 000009
mcMMAF
【００９２】
VI. 標的
抗体には、非ヒト抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体およびベニヤ抗体、ナノボディ、dAbs、scFV’s、Fabsなどがある。そうした抗体の中にはがん細胞抗原に特異的なものもあり、細胞表面上の抗原は、抗体が結合すると細胞の内部に移行可能となることが好ましい。抗体が向かうことができる標的としては、がん細胞上の受容体、およびそのリガンドまたは対抗受容体が挙げられる（たとえばCD3、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD40、CD44、CD52、CD70、CD79a、CD123、Her-2、EphA2、リンパ球関連抗原1、VEGFもしくはVEGFR、CTLA-4、LIV-1、ネクチン-4、CD74、およびSLTRK-6）。
【００９３】
本発明の方法を適用するのに適した市販の抗体およびその標的の例には、ブレンツキシマブもしくはブレンツキシマブベドチン、CD30、アレムツズマブ、CD52、リツキシマブ、CD20、トラスツズマブHer/neu、ニモツズマブ、セツキシマブ、EGFR、ベバシズマブ、VEGF、パリビズマブ、RSV、アブシキマブ、GpIIb/IIIa、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブ、ゴリムマブTNFα、バシリキシマブ、ダクリズマブ、IL-2、オマリズマブ、IgE、ゲムツズマブもしくはvadastuximab、CD33、ナタリズマブ、VLA-4、ベドリズマブ α4β7、ベリムマブ、BAFF、オテリキシズマブ、テプリズマブ CD3、オファツムマブ、オクレリズマブ CD20、エプラツズマブ CD22、アレムツズマブ CD52、エクリズマブ C5、カナキムマブ IL-1β、メポリズマブ IL-5、レスリズマブ、トシリズマブ IL-6R、ウステキヌマブ、ブリアキヌマブ IL-12、23、hBU12 (CD19) (US20120294853)、ヒト化1F6もしくは2F12 (CD70) (US20120294863)、BR2-14aおよびBR2-22a (LIV-1) (WO2012078688)がある。抗体例の配列のいくつかは、配列表で与えられる。
【００９４】
VII. 医薬組成物および治療法
上記の方法にしたがって作製されたマスキングされた抗体（マスキングされたネイキッド抗体およびADCを含める）は有効な投与計画で投与されるが、その有効な投与計画とは、上記のあらゆる適応症を含めて、がん、自己免疫疾患、もしくは感染症などの、治療を目指す疾患の発症を遅らせ、重症度を軽減し、それ以上の増悪を抑制し、および/または、少なくとも1つの徴候もしくは症状を改善する、投与量、投与経路、および投与回数を意味している。患者がすでに疾患に罹患しているならば、その投与計画は、治療上有効な投与計画ということができる。患者の疾患リスクは母集団より高いがまだ症状は出ていないならば、投与計画は、予防上有効な投与計画ということができる。場合によっては、個々の患者において、治療上または予防上の有効性を、ヒストリカルコントロールまたは同一患者の過去の経験と比べて観察することができる。他の例では、治療患者集団における前臨床試験または臨床試験で、未治療患者のコントロール集団と比較して、治療上または予防上の有効性を示すことができる。
【００９５】
マスキングされた抗体に関する投与量はたとえば、1 mg/kg〜100 mg/kg、5 mg〜50 mg/kg、10 mg〜25 mg/kg、1 mg/kg〜7.5 mg/kg、または2 mg/kg〜7.5 mg/kgまたは3 mg/kg〜7.5 mg/kg被験体体重、または0.1〜20、または0.5〜5 mg/kg体重（たとえば0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10 mg/kg）または固定用量として10〜15000、200〜15000もしくは500〜10,000 mgである。方法によって、患者は、3週間に1回、またはそれ以上の期間ごとに1回投与される、少なくとも1.5 mg/kg、少なくとも2 mg/kgまたは少なくとも3 mg/kg、4 mg/kg、5 mg/kg、6 mg/kg、7 mg/kg、8 mg/kg、または9mg/kgまたは10 mg/kgのいずれかの用量を投与されることがある。マスキングされた活性モノクローナル抗体薬物複合体、たとえばアウリスタチンの複合体、の投与量はたとえば、1 mg/kg〜7.5 mg/kg、または2 mg/kg〜7.5 mg/kgまたは3 mg/kg〜7.5 mg/kg被験体体重、または0.1〜20、または0.5〜5 mg/kg体重（たとえば、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10 mg/kg）または固定用量として10〜1500もしくは200〜1500 mgである。マスキングされた高活性モノクローナル抗体薬物複合体、たとえばPBDの複合体、の投与量はたとえば、1.0μg/kg〜1.0 mg/kg、または1.0μg/kg〜500.0μg/kg被験体体重である。方法によっては、患者は、マスキングされたADCを、2、3、または4週間おきに投与される。投与量は、その治療が予防的であるか治療的であるかにかかわらず、また、その疾患が急性か慢性かにかかわらず、数ある要因の中で、投与回数、患者の状態、ならびに、前治療があればそれに対する反応に左右される。用量はまた、結合、エフェクター機能または細胞傷害性の低下にも左右される。概して、マスキングのない同じ抗体よりも多くの投与量のマスキングされた抗体を投与することができる。
【００９６】
投与は、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、くも膜下腔内、腹腔内、局所、鼻腔内、または筋肉内とすることができる。投与は、たとえば腫瘍内などに、直接局在化させることもできる。静脈内もしくは皮下投与によって体循環に入る投与が好ましい。静脈内投与はたとえば、30〜90分のように時間をかける点滴によって、または単回ボーラス注入によって、行うことができる。
【００９７】
投与回数は、特に、血液循環中でのマスキングされた抗体の半減期、患者の状態、および投与経路によって決まる。頻度は、毎日、毎週、毎月、3か月ごと、または患者の状態の変化もしくは治療中のがんの進行に応じて不規則な間隔とすることができる。静脈内投与の頻度は、より頻回の、またはより少ない投与もありうるが、たとえば、一連の治療期間にわたって週2回から年4回までである。静脈内投与の他の頻度の例は、より頻回の、またはより少ない投与もありうるが、たとえば、一連の治療期間にわたって週1回から4週間に3回までである。皮下投与については、投与頻度はたとえば、より頻回の、またはより少ない投与もありうるが、毎日から毎月である。
【００９８】
投薬回数は、疾患の特性（たとえば、急性症状を呈するか慢性症状か）および治療に対する疾患の反応によって決まる。急性疾患、または慢性疾患の急性増悪には、1〜10回で十分なことが多い。急性疾患、または慢性疾患の急性増悪に対して、単回ボーラス投与、場合によっては分割された形の投与で十分なこともある。急性疾患もしくは急性増悪の再発に対して治療を繰り返すことができる。慢性疾患に対しては、少なくとも1、5もしくは10年間、または患者の一生の間、抗体を一定間隔で、たとえば毎週、隔週、毎月、3か月ごと、6か月ごとに、投与することができる。
【００９９】
非経口投与用の医薬組成物は、無菌で、実質的に等張性（240〜360 mOsm/kg）であって、GMP条件下で製造されることが好ましい。医薬組成物は単位剤形（すなわち1回投与分の剤形）として提供することができる。医薬組成物は、1つもしくは複数の生理学的に許容される基剤、賦形剤、添加剤もしくは補助剤を用いて製剤することができる。製剤は選択される投与経路次第で決まる。注射用には、マスキングされた抗体は、水溶液として製剤されるが、好ましくはハンクス液、リンゲル液、または生理食塩水もしくは酢酸バッファー（注射部位の不快感を低減するため）などの生理的に適合するバッファー中で製剤することができる。溶液は、懸濁剤、安定化剤および/または分散剤などの配合剤を含有することができる。あるいはまた、抗体は、適切な溶媒、たとえば滅菌発熱性物質除去蒸留水、による使用前構成用に、凍結乾燥された形をとることもある。液体製剤中の抗体濃度は、たとえば、10 mg/mlなど、1〜100 mg/mlとすることができる。
【０１００】
本発明のマスキングされた抗体による治療は、化学療法、放射線照射、幹細胞治療、外科手術、抗ウイルス薬、抗生物質、免疫抑制薬もしくは免疫刺激薬、または治療中の疾患に対して有効な他の治療と、併用することができる。がんまたは自己免疫疾患治療用のADCとともに投与することができる、有用な他の薬剤群には、たとえば、がん細胞上に発現される他の受容体に対する抗体、抗チューブリン薬（たとえばアウリスタチン）、DNA副溝結合薬、DNA複製阻害薬、アルキル化薬（たとえば、シスプラチン、モノ（プラチナ）、ビス（プラチナ）および三核プラチナ錯体、ならびにカルボプラチンなどの、プラチナ錯体）、アントラサイクリン類、抗生物質、葉酸代謝拮抗薬、代謝拮抗薬、化学療法増感薬、デュオカルマイシン類、エトポシド類、フッ化ピリミジン類、イオノフォア類、レキシトロプシン類（lexitropsins）、ニトロソウレア類、プラチノール類(platinols)、予備形成化合物、プリン代謝拮抗薬、ピューロマイシン類、放射線増感薬、ステロイド類、タキサン類、トポイソメラーゼ阻害薬、ビンカアルカロイド類などがある。
【０１０１】
マスキングされた抗体による治療は、マスキングされた抗体なしである以外は同じ治療（たとえば化学療法）と比べて、腫瘍患者の無増悪生存期間中央値または全生存期間を、特に再発性または難治性の場合、少なくとも30%もしくは40%、好ましくは50%、60%〜70%、または100%以上も長くすることができる。それに加えて、またはその代わりに、マスキングされた抗体を含む治療（たとえば標準的化学療法）は、マスキングされた抗体なしである以外は同じ治療（たとえば化学療法）と比べて、腫瘍患者の完全奏効率、部分奏効率、もしくは客観的奏効率（完全＋部分）を、少なくとも30%もしくは40%、好ましくは50%、60%〜70%だけ高め、または100%も高めることができる。
【０１０２】
典型的には、臨床試験（たとえば第II相、第II/III相もしくは第III相試験）において、前記の、標準治療のみ（または＋プラセボ）を受けた対照患者群に対する、標準治療＋マスキングされた抗体による治療を受けた患者の無増悪生存期間中央値および/または奏効率の増加は、統計上有意であり、たとえばp = 0.05もしくは0.01、または0.001レベルである。完全奏効率および部分奏効率は、たとえば国立がん研究所および/または食品医薬品局により記載または承認された、がんの臨床試験で通常使用される客観的基準によって求められる。
【０１０３】
明確な理解のために本発明を詳細に記述したが、一定の変更を添付の請求の範囲内で実行できることは明白である。本出願に記載の出版物、アクセッション番号、ウェブサイト、特許文書などはすべて、参考としてその全体が、それぞれが個別に示されているのと同じように本明細書に含まれる。その範囲内でさまざまな情報が、さまざまな時点の引用を伴っており、本出願の有効出願日の時点で存在する情報を意味する。有効出願日は、当該のアクセッション番号を開示するもっとも早い優先出願の日付である。文脈から明らかでない限り、本発明のいかなる要素、実施形態、ステップ、特徴もしくは態様も、他のいずれかと組み合わせて実施することができる。
（実施例）
【実施例１】
【０１０４】
マスキングされた抗体の調製および性質検討
すべての化学薬品は特に他に指示のない限りSigma Aldrichから購入した。すべてのプロテアーゼは、ヒトMMP2 (Sino Biological)を除いて、R&D Systemsから購入した。プロテアーゼ阻害薬は、特に明記しない限りEMD Milliporeから購入した。マレイミドを含有するピロロベンゾジアゼピン（PBD）リンカーは既報のとおり調製した（Jeffrey et. al., Bioconjugate Chemistry, 2013, 24, 1256-1263）。Mc-MMAFリンカーはCD19研究（たとえばUS20120294853）に報告されるとおり調製した。
【０１０５】
抗体産生
抗体は、Expi HEK細胞、Expi-CHO、またはCHO-DG44細胞の一過性トランスフェクションまたは安定的トランスフェクションによって発現させ、MabSelect SuReカラム（GE Healthcare）、サイズ排除クロマトグラフィー、およびポストプロテインA法によって精製した。産生されたそれぞれの抗体は、重鎖定常領域に遺伝子改変によるシステイン（S239C）を含有する。S239C定常領域変異体の名前は、名称ecを含む。抗体の配列は配列表に与えられる。
【０１０６】
抗体の蛍光標識
抗体は、業者のプロトコルにしたがって、Alexa Fluor488または647 NHS Ester (Life Technologies, A20000, A20006)を用いて蛍光標識した。簡単に説明すると、抗体（1当量）を、室温（RT）にて1時間pH 8でフルオロフォア（4当量）とともにインキュベートした。蛍光抗体は、Nap5カラム(GE Healthcare Life Sciences, 17-0853-02)を用いて精製し、フルオロフォアローディングはUV-Vis (Agilent)によって測定した。典型的なフルオロフォアローディングは抗体当たり3〜5フルオロフォアであった。
【０１０７】
競合結合実験
マスキングされた抗体の細胞結合を評価するために、2x105の指示された細胞（Raji、Ramos、PC3、Daudi）を、染色バッファー（PBS、2% FBS、0.2% NaN3）中の競合物質（マスキングされた抗体）の段階希釈物と混合した蛍光標識親抗体と合わせた。サンプルを1時間インキュベートしてから氷冷染色バッファーで2回洗浄した。標識された細胞を、生育不能細胞を排除するようにゲーティングされたBD LSRII上でフローサイトメトリーで調べ、Flowing Software (Turku Centre for Biotechnology)を用いて分析した。IC50は、GraphPad Prism 6を用いて計算した。
【０１０８】
コイルドコイルブロッキングドメインを用いて、4つの抗体（CD19に対するhBU12、Antigen 1 (cAg-1)に対する抗Antigen 1抗体、EphA2に対する1C1、およびCD74に対するHuMab CD74-011）を調べた。抗体CD74は軽鎖（配列番号1）および重鎖（配列番号2）を含んでなる。A3B3、A4B4、CVel、antipO、およびdHLXの配列は、抗体の軽鎖および重鎖のN末端に融合された。結合を調べるために、FACSによる競合アッセイを用いて、親抗体に置き換わるために必要な競合抗体の濃度が高いことを明らかにしたが、その結果を表2〜5に示す。コイルドコイルペプチドと結合することができる他の抗体は、配列番号3〜19である。配列番号3はhBU12重鎖可変領域のアミノ酸配列、配列番号4はhBU12軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。配列番号5は2H12 LG軽鎖可変領域のアミノ酸配列、配列番号6は2H12 HI重鎖可変領域のアミノ酸配列である。配列番号7は軽鎖定常領域；PRT/1；ヒトの軽鎖定常領域のアミノ酸配列である。配列番号8はCH1-CH3；PRT/1；ヒトのアミノ酸配列である。配列番号9は重鎖CH1-CH3 (no c-term K)；PRT/1；ヒトのアミノ酸配列である。配列番号10はS239C重鎖CH1-CH3；PRT/1；ヒトのアミノ酸配列である。配列番号11はS239C重鎖CH1-CH3 (no c-term K)；PRT/1；ヒトのアミノ酸配列である。配列番号12はh7G3、CD123 Abの重鎖可変領域のアミノ酸配列、配列番号13はh7G3、CD123 Abの軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。配列番号14はH1F6軽鎖可変領域、CD70 Abのアミノ酸配列、配列番号15はH1F6重鎖可変領域、CD70 Abのアミノ酸配列である。配列番号16はヒト化20F3 LD、CD352 Abの成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列、配列番号17はヒト化20F3 HD、CD352 Abの成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。配列番号18はhLiv1 mAb2 HG；PRT/1；人工のアミノ酸配列、配列番号19はhLiv1 mAb2 LG；PRT/1；人工のアミノ酸配列である。
【０１０９】
【表２】
2020500900.tif 000010
【０１１０】
【表３】
2020500900.tif 000011
【０１１１】
マスキングされたhBU12抗体の結合は、CD19陽性Raji細胞上で評価した。たとえばA3B3、A4B4、antipO、およびdHLXなどのさまざまなコイルドコイルを、ヒンジブロッカーのようにテストした。たとえば、表1およびWO2014/193973を参照されたい。同方向ホモ二量体ブロッキングドメインについては、コイルドコイルの親和性とブロッキング能力との間に明白な差異がある。A3B3（マイクロモル親和性コイル）は抗体の結合を83倍低下させるのに対して、もっと高親和性のフェムトモルレベルの共有結合性コイル（A4B4およびCVel）は、300倍以上も結合を低下させた。逆方向コイル（antipO）はブロックせず、結合は38倍低下した。ヘリックス・ターン・ヘリックス・ブロッキングドメイン（dHLX）は300倍を超える結合低下を示し、ヒンジブロッカーは269倍減少させた。hBu12の例において、A3B3およびantipOコイルは、他のコイルおよびヒンジと比べてブロックが少なかったが、残りのドメインのブロッキング能力をはっきり説明することは困難であった。
【０１１２】
マスキングされたcAg-1抗体は、コイルドコイルのブロッキング能力のより識別的な検討をもたらした。ヒンジ、A3B3、およびantipOでブロックされたcAg-1抗体は、結合を20倍〜50倍ブロックした。dHLXでブロックされたcAg-1は、233倍結合を低下させる能力を有した。2つのもっとも高親和性コイルドコイル、A4B4およびCVel、は、約1000倍の結合低下という、最高倍率の変化を示した。このデータから、高親和性を有する同方向コイルは、最高のブロッキング能力を示したので、他の抗体をさらに調べるために進められた。
【０１１３】
EphA2に対する1C1、ならびにCD74に対するHuMab-CD74-011を調べる実験において、その抗体はブロックが困難であることが判明した。CVelマスキングドメインは、1C1について43倍、HuMab-CD774-01については26倍、結合を低下させた。dHLXマスキングドメインは、EphA2に対する1C1の結合を16倍低下させ、ヒンジブロッカーは、CD74に対するHuMab-CD74-011の結合を14倍低下させた。テストした残りのマスキングドメインは、抗体の結合を変化させることができなかった（0.6〜6倍の変化）。ブロッキングパネルを改善するために、第2世代のコイルドコイルマスキングドメインをデザインした。
【０１１４】
第2世代のブロッキングドメインはすべて、2つのペプチド間でナノモル以上の親和性を有する同方向コイルドコイルとした。さらに、N末端ジスルフィドのブロッキング能力への寄与を調べるために、それぞれのコイルドコイルはN末端システインを考慮してデザインされた。4つの新たなコイルドコイルペア（N末端システインあり、およびなし）ならびにVel（CVelのシステインを欠いたバージョン）を、Antigen 1（抗原1）に対する抗体に付加して、ブロッキングを調べた。5つすべてのコイルドコイルペア（N末端システインあり、およびなし）は、抗体の結合を>200倍低下させる能力を有していた。こうした結合実験は、コイルが同方向であってナノモル以上の親和性を有するならば、コイルドコイルによるマスキングドメインが総じて成功することを示した。
【０１１５】
飽和結合実験
2x105個の指定の細胞（Raji、SW780、HT1080）を、段階希釈した指定の抗体と、染色バッファー（PBS、5% FBS、0.2% NaN3）中で混合した。サンプルを氷上で1時間インキュベートし、氷冷染色バッファーで2回洗浄した。細胞は、抗ヒトIgG-AF647（Jacksonimmuno、染色バッファー中1:200希釈）とともに氷上で1時間、再懸濁した。細胞は氷冷染色バッファーで2回洗浄し、染色バッファー中で再懸濁した。標識された細胞は、生育不能細胞を排除するようにゲーティングされたBD LSRII上で、フローサイトメトリーによって調べ、Flowing Software (Turku Centre for Biotechnology)を用いて分析した。そのKdはGraphPad Prism 6を用いて計算した。
【０１１６】
マスキングされたcAg-1抗体の第2世代も、FACSによる飽和結合アッセイを用いて、Antigen 1陽性Raji細胞との結合を調べた。表4および図4に示すように、cAg-1のブロッキングは、使用されるコイルドコイルペアに応じてさまざまであった。A2B1 cAg-1は101倍、M15は201倍、そしてVelは279倍、結合を低下させた。M11およびFos/Junはそれぞれ、520倍および472倍、結合を低下させた。M11およびM15についてはN末端ジスルフィドを付加することに関して明確な利点はなかったが、結合倍数の差が小さくなった。A2B1については、N末端結合の追加は結合の低下を2倍にした。
【０１１７】
同様の検討をHT1080細胞およびSW780細胞でも行った。Kd値を表6および7にまとめている。一部の例では、おそらくコイルドコイルドメインの細胞表面との相互作用に起因して、非特異的結合が認められた。そのため、Kdを正確に特定することができず、このような例は*N/Aで示した。表5に示すように、HT1080細胞では、A2B1 cAg-1は514倍、M15 cAg-1は549倍、そしてM11 cAg-1は1336倍、結合を低下させた。A2B1およびM15についてはN末端ジスルフィドを付加することに関して明確な利点はなかった。表6に示すように、SW780細胞では、A2B1 cAg-1は101倍、M15 cAg-1は153倍、M11 cAg-1は216倍、そしてVelは252倍、結合を低下させた。
【０１１８】
マスキングされていない抗ヒトAg2抗体、およびコイルドコイルでマスキングされた抗ヒトAg2抗体の結合を、HT1080、HCT116、およびSW780細胞株で、フローサイトメトリーによって評価した。それぞれのマスキングされた抗体の濃度を増加させて、抗原陽性細胞に添加し、氷上で30分間インキュベートした。結合した抗体を、フルオロフォア標識抗ヒトFc抗体を用いて検出し、そのデータをGraphPad Prismを用いてプロットした。Kd値を表8〜10にまとめている。表7に示すようにHT1080細胞では、A2B1 cAg-2、M15 cAg-2、M11 cAg-2、およびVel cAg-2は、少なくとも95倍、結合を低下させた。3つの異なる細胞株においてCVelもしくはVelコイルドコイルのいずれかを用いた抗Ag2のマスキングの効果を比較することによって、そのデータから、VelコイルドコイルがCVelより大幅に結合を阻害することが判明した（図7A〜C）。
【０１１９】
【表４】
2020500900.tif 000012
【０１２０】
【表５】
2020500900.tif 000013
【０１２１】
【表６】
2020500900.tif 000014
【０１２２】
【表７】
2020500900.tif 000015
【０１２３】
【表８】
2020500900.tif 000016
【０１２４】
【表９】
2020500900.tif 000017
【実施例２】
【０１２５】
さまざまなコイルドコイルペプチドのマスキング活性
表10は、さまざまな抗体に組み込まれ、さまざまな細胞株上で調べられた、さまざまなコイルドコイル形成ペプチドペアについての、結合の減少倍率を示す。活性はhBU12抗体、cAg-1、1C1、HuMab-CD74-011、およびhAg-2と称されるAntigen 2（抗原2）に対する抗体を用いて調べた。hBU12ecについてはRaji上で、cAg-1ecについてはRamos上で、そしてhAg-2についてはRaji上で、100倍を超えるマスキングが観察された。
【表１０】
2020500900.tif 000018
【実施例３】
【０１２６】
さまざまなプロテアーゼによるさまざまなプロテアーゼ部位の切断活性
MMPは、1.25 mM 酢酸4-アミノフェニル水銀 (APMA)とともに37℃にて1時間から24時間インキュベートすることによって、すべて活性化された。レグマインは、50 mM酢酸ナトリウム、100 mM NaCl、pH 4.0中で37℃にて2時間で活性化された。
【０１２７】
切断配列の切断特性を評価するために、抗体（10μg）を、37℃にて一晩、メーカーにより報告された値で示されるように、400 pmol/minの標準化されたプロテアーゼとともにインキュベートした。切断はWaters Acquity/Xevo UPLCを用いて評価したが、切断された断片および切断されない断片は、過剰量のDTTにより還元され、PLRP-MS 3μm カラム (Agilent)を用いて分離し、UNIFI (Waters)によって分析した。図5に示すように、PLRP-MSを用いて、ペプチド配列の切断を測定した。CVel抗Antigen 1軽鎖は、29639.9 Daの計算質量を有し、測定質量は29640.2 Daである。切断された抗Antigen 1軽鎖は、24623.3 Daの計算質量を有し、実測質量は24623.8 Daであった。
【０１２８】
3つのプロテアーゼ切断部位（MMP#1、MMP#2およびCytomX）のプロテアーゼ切断特性を、ヒトおよびマウス/ラットMMP、ADAMファミリー、uPA、マトリプターゼ、ならびにレグマインなどの腫瘍関連プロテアーゼのパネルに対して調べた。さらに、細胞外プロテアーゼtPAおよびFactor Xaによる配列の切断を調べた。これらの3つのプロテアーゼ切断部位におけるプロテアーゼ切断特性を表11に示す。
【０１２９】
（hBU12抗体骨格にN末端融合された）ペプチドを37℃にて一晩400 pmol/minの標準化されたプロテアーゼとともにインキュベートし、切断について評価した。MMP#1は、大部分のMMP、ならびにuPAおよびマトリプターゼによって切断された。MMP#2は、MMP13を除くほぼすべてのMMPで切断され、他のプロテアーゼ群ではそのままであった。CytomX配列は、uPA、マトリプターゼ、およびレグマインによってのみ切断された。総じてこのデータは、MMP#1が、他の2つのプロテアーゼ切断部位にくらべて、プロテアーゼ群の中でいずれとも反応することを示唆する。
【０１３０】
結合アッセイおよび細胞傷害性アッセイに使用されるすべての切断された抗体について、マスキングされた抗体（50-250μg）を37℃にて一晩、ヒトMMP2（1μg）とともにインキュベートした。
【０１３１】
【表１１】
2020500900.tif 000019
【実施例４】
【０１３２】
マスキングされた抗体のpIの変化
抗体は、バッファー交換して10 mMリン酸ナトリウムpH 6.5中とし、使用濃度の2 mg/mLに希釈した。サンプルは、尿素、キャリアアンホライト、メチルセルロースおよび2つのpIマーカー、pI 6.14および9.5、を含有する溶液中に希釈した。iCE3 Capillary IEF System (Protein Simple)を用いてサンプルを分析し、2つの標準物質を用いて等電点を計算した。等電点(pI)は、マスキングドメインの付加による変動の可能性を評価するために測定した。表12は、対照hBU12ec抗体と比較した、マスキングされたhBU12ec (anti-cd19)抗体のpI計算値および測定値を示す。親抗体のpI測定値（8.3）は、ヒンジブロッカー（8.7〜8.8）ならびにA4B4およびdHLXコイルドコイル（9.1）の付加によって増加した。CVelコイルはpIが7.2に低下した。概して、マスキングされたhBU12抗体のpIは親の1ユニットの範囲内であった。抗Ag-1マスキング抗体はいずれも、7.7〜8.8のpI値を有し、そのN末端結合コイルドコイルは概して、表13に示すように未結合の対応物より低いpIを有していた。
【０１３３】
【表１２】
2020500900.tif 000020
【０１３４】
【表１３】
2020500900.tif 000021
【実施例５】
【０１３５】
マスキングされた抗体の薬物動態（PK）値
放射性標識抗体を用いて薬物動態（PK）実験を行った。抗体（1 mg）を55μCi N10プロピオン酸スクシンイミジル、[プロピオン酸-2,3-3H]-（Moravek Biochemicals, Brea, CA, 80 Ci/mmol、1 mCi/ml、9:1 ヘキサン:酢酸エチル溶液）とともに、pH 8.0で室温にて2時間インキュベートした。混合物を4,000 xgで5分間遠心分離し、下部の水層を移した。この水層を希釈して、アミコンウルトラ（Amicon Ultra）-15遠心式フィルターユニット (Millipore, Cat. No.: UFC903024, 30 kDa MWCO)を用いて4回濃縮し、過剰な放射性物質を除去した。放射性標識抗体は、滅菌済み0.22μm ウルトラフリー（Ultrafree）-MC 遠心式フィルターユニット(Millipore, Billerica, MA)を通して濾過し、最終抗体濃度およびADC濃度を分光光度法で測定した。それぞれの生成物の比活性（μCi/mg）を、液体シンチレーション計測によって測定した。放射性標識抗体を、0.5mg/kgでBalb/Cマウスに、尾静脈から注射した（用量群ごとに動物6個体、無作為割り当て）。血液をさまざまな時点で伏在静脈からK2 EDTAチューブに採取し、処理して血漿とした。血漿サンプルを、Ecoscint-A液体シンチレーションカクテル（National Diagnostics）に添加し、液体シンチレーション計測によって全放射能を測定した。放射性標識サンプルの比活性を用いて、各時点の抗体濃度を計算した。
【０１３６】
さまざまなヒンジおよびコイルドコイルでマスキングされたhBU12抗体のPKをBalb/Cマウスで評価した。0.5 mg/kgの抗体を注射し、血漿中に存在する全抗体を測定した。マスキングされたhBU12抗体は、dHLX hBU12を除いて、親抗体と類似したPKを示した。
【０１３７】
図2は、血漿中でインキュベートした、さまざまなコイルドコイルでマスキングされた抗体について、時間に対する抗体濃度を、hBU12ec対照と比較して示す。コイルドコイルでマスキングされた抗体のほとんどは、対照と類似した薬物動態挙動を示した。
【実施例６】
【０１３８】
マスキングされた抗体薬物複合体（ADC）の調製および細胞傷害性アッセイ
抗体、抗体鎖間ジスルフィドは、過剰量のTCEPにより還元され（20当量、pH 8、37℃、90分）、そのTCEPはAmiconスピンフィルター（EMD Millipore UFC503096）を用いてバッファー交換により除去された。ジスルフィドは、デヒドロアスコルビン酸（Sigma Aldrich 261556）を用いて（20当量、pH 7.4、室温、45分、2回添加）、再酸化した（人工的に作られたチオールを除く）。過剰なデヒドロアスコルビン酸は、希釈および濃縮をAmiconスピンフィルターで3回繰り返して除去した。プロピレングリコールを反応混合物に加えて、終濃度50%とした。PBDリンカー（3当量）の溶液をプロピレングリコールで希釈して、239位に2つの遊離チオールを含有する、再酸化された抗体（1当量）に添加した。反応を30分間進行させた後、水中の活性炭スラリーにより30分間処理した。活性炭を濾過により除去し、反応物を、Nap5カラム（GE Healthcare Life Sciences, 17-0853-02）を用いてさらに精製した。混合された4ロードのmc-MMAF ADCについて、抗体鎖間ジスルフィドは2.1当量のTCEPを用いて、pH 8で60分間、部分的に還元された。その後、過剰なTCEPは、希釈と濃縮を2回繰り返して除去された。その時点で、4.4モル当量の薬物リンカーを、部分還元抗体に添加した。複合体化の後、過剰な薬物リンカーを、QuadraSil MPチオール樹脂を用いて15分間で除去し、その後、PD-10ゲル濾過カラムを用いて脱塩してPBS、pH 7.4中とした。すべてのADCについて、薬物ローディングはPLRP-MSで測定し、凝集の程度はサイズ排除クロマトグラフィーにより測定した。
【０１３９】
細胞生存アッセイは、RealTime-Glo (Promega)を用いて行った。Ramos細胞（700細胞/ウェル）は、メーカーのプロトコルにしたがって、培養液中で、底が透明な96ウェル培養プレート上に蒔いた。PBD結合ADCの希釈物を各ウェルに添加し（1000 ng/mL〜0 ng/mL）、サンプルを37℃にて138時間インキュベートした。プレートリーダー（Envision 4605）を用いて発光を測定した。GraphPad Prism6を用いてデータをあてはめ、IC50を計算した。IC50値を用いて、マスキングされたADCに対する親ADCの細胞傷害性の変化を比較した。
【０１４０】
表14は、対照ADCと比較したマスキングされたADCの結合および細胞傷害性データを示す。コイルドコイルでマスキングされた抗体の細胞傷害性は、RajiもしくはRamos細胞との結合と同程度に低下した。細胞傷害性は、マスキングを外すと、実験誤差の範囲内で、対照抗体と同レベルまで回復した。
【０１４１】
マスキングされたhBU12抗体（Hinge、A4B4、CVel）は、マスキングされたADCを作製するためにピロロベンゾジアゼピン（PBD）と結合された。マスキングされたADCに関する結合は、競合FACSを用いて評価した。データから、PBDの付加は、ブロッキング能力に影響を与えないことが判明した。マスキングされた抗体は、親抗体と比べて結合が>100倍低下していた。マスキングドメインが切断されると、結合は親抗体の約2倍に回復した。
【０１４２】
細胞傷害性アッセイは、ヒンジブロックされたADCと2つのコイルドコイルでブロックされたADCとの間に相違を示した。Hinge hBU12は、結合データが>100倍の低下であるのに対して細胞傷害性は156倍低下した。A4B4 hBU12 ADCは、結合の>60倍の減少に対して、細胞傷害性の490倍の低下を示し、CVel hBU12 ADCは結合が>160倍変化したのに対して、細胞傷害性は1317倍の低下を示した。CVelマスキングドメインを切断すると、細胞傷害性は親ADCの1.2倍まで回復する。hBU12 ADCについては、結合の低下は、細胞傷害性の低下によく相関する。
【０１４３】
【表１４】
2020500900.tif 000022
【実施例７】
【０１４４】
マスキングされた抗体のex vivoザイモグラフィー
図3は、マスキングされた抗体に接触した腫瘍組織サンプルを示す。抗体は、抗体のマスキングを外すのに有効なプロテアーゼを発現する、腫瘍細胞のもっとも近くでマスキングが外される。脱マスキングされた抗体は腫瘍特異的染色をもたらす。
【０１４５】
異種移植マウスから採取された腫瘍は、OCT凍結包埋剤中で凍結し、凍結薄片とした（5μm）。その切片を熱不活化ヒト血清でブロックし、洗浄して、AF647標識抗体とともにインキュベートした。腫瘍切片は、プロテアーゼ活性の対照としてプロテアーゼカクテルで1時間（1:100 PCIIIおよび50μm Galardin）前処理し、またはPBSで前処理した。抗体は、室温で1時間インキュベートし、TBSTで3回洗浄し、DAPI含有封入剤（ThermoFisher, P36962）でシールした。次に、蛍光顕微鏡（Olympus）を用いて腫瘍切片を可視化し、AF647標識抗体の結合を評価した。
【０１４６】
マスキングされた抗体の腫瘍関連プロテアーゼ切断を評価するために、MMP活性を評価する目的でex vivoアプローチを利用した。蛍光標識hAg-2およびCVel hAg-2をHT1080腫瘍切片上でインキュベートした。インキュベーション後、その切片は、蛍光シグナルによって結合について可視化した。CVel hAg-2は親抗体と同程度に腫瘍切片に結合した。プロテアーゼ阻害剤による腫瘍切片の前処理は、CVel hAg-2の結合を抑制した。このデータは、マスキングされた抗体の結合がプロテアーゼ依存性であることを示唆する。
【０１４７】
HT1080異種移植片を移植されたマウスは、5 mg/kgの各抗体（hAg-2、CVelAg-2、VelAg-2）を投与された。投与の1、3、および5日後に腫瘍を採取した。所定の時点（1、3、4日）で、マウスを屠殺し、組織および血漿を採取した。組織はホモジナイズし、ヒト抗体はIgSelect樹脂を用いて生体試料から精製した。捕捉された抗体は、還元し、SDS-PAGEによって分離した後、HRP結合抗ヒトFc抗体を用いてウェスタンブロットにより探索した。切断された抗体パーセントは、約5 kDaだけサイズが異なる、マスキングあり、およびマスキングなしの重鎖に対応するバンドの濃度測定によって評価した。どの検査時点でも、血漿もしくは肝臓においてごくわずかのマスキングされていない抗体（< 5 %）が検出された。図6Aおよび6Bは、指定の組織における、CVelおよびVelでブロックされたhAg-2抗体の切断を示す。抗体の切断は、各時点について3つの別個のマウスに分けられた。第4のマウスは腫瘍を含有しなかった。3日目に、VelhAg-2は、CVelhAg-2構築物より多くの切断を示した。さらに、正常組織より多くの切断産物が腫瘍に存在した。4日目に、VelhAg-2は、CvelhAg-2に見られた変動しやすい切断に対して、マスキングされた構築物の一貫したロバストな切断を示した。
【実施例８】
【０１４８】
Velでマスキングされた抗CD19抗体薬物複合体（ADC）に関する検討
マスキングされていない、およびVelでマスキングされた抗CD19ADCとさまざまな切断配列との結合を、CD19陽性Romas細胞を用いてフリーサイトメトリーで調べた。結合した抗体は、フルオロフォア標識抗ヒト二次抗体を用いて図8Aに示すように検出した。
【０１４９】
抗CD19ADCの抗増殖活性は、CD19陽性Romas細胞で評価した。Romas細胞は、ADCとともに96時間インキュベートし、細胞増殖への影響は、図8Bに示すように、Cell Titer Glo (Promega)を用いて評価した。
【０１５０】
マスキングされていない、およびVelでマスキングされた抗CD19抗体薬物複合体の抗腫瘍活性は、NSGマウスにおけるRomas異種移植モデルにおいて調べた。すべてのADCは、腹腔内注射により6 mg/kgの用量で投与された。結果を図8Cに示す。
【実施例９】
【０１５１】
マスキングされた抗マウスCD3抗体145-2C11に関する検討
抗マウスCD3抗体145-2C11のマスキングは、Vel-IPVを用いて行われた。結合はCD3(+) HT-2を用いてフローサイトメトリーで評価した。結合した抗体の検出には、フルオロフォア標識抗マウスFc抗体を使用した。抗マウスCD3抗体がVel-IPVによってマスキングされると、図9Aに示すように、最小限の抗体結合が観察された。
【０１５２】
Vel-IPVによるマスキングは、BALB/cマウスにおいて145-2C11の、標的による薬物消長を改善した。抗体は、リジンの結合を介して3H-プロオピオン酸で標識し、1 mg/kgの静脈内（IV）投与でBALB/cマウスに投与した。抗体濃度は、さまざまな時点で採取された血漿のシンチレーション計測によって測定した。血漿中の145-2C11の濃度は、投与後2日以内に検出可能な量を下回ったが、Vel-IPV-145-2C11濃度は、図9Bに示すように投与後14日まで、測定することができた。
【０１５３】
抗CD3抗体145-2C11（mIgG2a骨格を有する）によるサイトカイン放出の低減は、BALB/cマウスにおいてIV注射で評価した。マウスに25μgの抗体を注射し、投与後24時間まで一連の時点で、血清サイトカインレベルを測定した。図9C-Dに示すように、マスキングされない145-2C11と比較して、マスキングされた抗CD3抗体については、IFNγおよびIL-2の有意な減少が検出された。
【実施例１０】
【０１５４】
マスキングされた抗ヒトおよび抗マウスAg2抗体に関する検討
さまざまなコイルドコイルドメインを有する、マスキングされた抗ヒトAg2抗体の安定性を、BALB/cへの静脈内投与によって評価した。抗体は5 mg/kgで投与された。所定の時点（3日）で、投与を受けたマウスから血漿を採取した。IgSelect樹脂を用いて、ヒト抗体を血漿から精製した。捕捉された抗体を還元し、SDS-PAGEで分離した後、HRP結合抗ヒトFc抗体を用いてウェスタンブロットで探索した。切断された抗体パーセントは、約5 kDaだけサイズが異なる、マスキングあり、およびマスキングなしの重鎖に対応するバンドの濃度測定によって評価した。図10に示すように、M15はCM15と比較して安定ではない。A2B1とCA2B1との間に有意な差異はない。VelとCVelとの相違は明らかでない。
【０１５５】
マウス反応性抗Ag2抗体は、ヒトAg2抗体で使用されるのと同じVelおよびIPV配列を用いてマスキングすることができた。これらの構築物によるマスキングは、図11Aに示すように、抗体とマウスAg2陽性細胞との結合をブロックした。
【０１５６】
抗マウスAg2抗体は、10 mg/kgの単回IV投与で投与されると、BALB/cマウスにおいて血小板の枯渇を促す。その一方、マウスがVel-IPV-抗-Ag2を10 mg/kg IVの用量で投与されると、こうした枯渇は見られなかった。この結果を図11Bに示す。
【０１５７】
マスキングされた抗マウスVel-IPV-Ag2抗体は、マスキングされていない抗Ag2と比べて、BALB/cマウスの血漿中での薬物動態を改善したが、このことは、マスキングされた抗体が、標的による薬物消長を回避できることを示す。Vel-IPV-抗Ag2および抗Ag2抗体は、リジンの結合を介して3Hプロピオン酸で標識し、1 mg/kgのIV投与でBALB/cマウスに投与した。抗体濃度は、さまざまな時点で採取された血漿のシンチレーション計測によって測定した。血漿中の抗Ag2の濃度は、15分以内に検出可能な量を下回ったが、Vel-IPV-抗Ag2濃度は、投与後7日まで測定することができた。結果を図11Cに示す。
【０１５８】
抗マウスAg2抗体は、A20リンパ腫モデルにおいて抗腫瘍活性を生じたが、同時に末梢Ag2(+)細胞の枯渇をもたらした。マスキングされたVel-IPV-抗Ag2抗体は、同様の活性を与えるが、細胞枯渇への影響を抑止した。Vel-IPV-抗Ag2抗体は、末梢抗原の低下を回避したが、腫瘍結合を維持した。結果を図12A-Dに示す。
【０１５９】
抗Ag2 IgG1抗体バリアントの薬物動態および忍容性を改善することができる、マスキングの能力を調べるために、カニクイザルにおいて一連のIV単回投与を行った。テストした抗Ag2 IgG1抗体は、発現および配列においてヒトおよびカニクイザルの種を超えて高度に保存されており、ヒトおよびカニクイザルのAg2と交差反応性があった。カニクイザルおよびヒト組織のパネルに関する、in situゲルザイモグラフィーによるプロテアーゼ活性の評価から、プロテアーゼ活性レベルもこれらの種を超えて高度に保存されていることが示された。したがって、カニクイザルは抗Ag2抗体の薬物動態および忍容性に及ぼすマスキングの影響を評価するのに適した種である。
【０１６０】
抗Ag2およびVel-IPV-抗Ag2の薬物動態は、汎用全抗体（TAb）ELISAによって評価した。汎用TAb ELISAは、抗Ag2およびVel-IPV-抗Ag2のヒト軽鎖κと結合する、抗ヒト軽鎖κmABでコートされた96ウェルマイクロタイタープレートを使用する。それはカニクイザル軽鎖κと交差反応しない。検討サンプルは、プールされたナイーブな、カニクイザルK2EDTA血漿を用いて、抗Ag2用のアッセイのダイナミックレンジ（10 (LLOQ) から1280 ng/mL (ULOQ)まで）、またはVel-IPV-抗Ag2用のアッセイのダイナミックレンジ（20 (LLOQ) から2560 ng/mL (ULOQ)まで）に希釈された。希釈されたサンプルは、QCおよびキャリブレーターとともに、アッセイバッファーにより1:20の最小必要希釈度（Minimum Required Dilution（MRD））に希釈された後、ブロックおよび洗浄済みのプレートに添加された。室温にて1時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、結合したアナライトをビオチン化抗ヒト軽鎖κmAB（捕捉試薬と同じクローン）で検出し、続いてストレプトアビジンに結合した西洋わさびペルオキシダーゼポリマー（ポリHRP-SA）を添加した。インキュベーションおよび洗浄の後、HRP基質3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン(TMB)をプレートに添加し、10分間発色させた。1N HClで反応を止め、プレートはSpectromax M5プレートリーダーで450 nm - 630 nmにおいて読み取った。正味の吸光度値をWatson LIMS v. 7.4.2にインポートし、5-PL非線形回帰を行って吸光度をサンプル中の全抗体ng/mLに変換した。結果を図13Aに示す。
【０１６１】
抗Ag2抗体は、カニクイザルの末梢においてAg2発現細胞の枯渇をもたらす。Vel-IPVを用いた抗Ag2のマスキングの影響を、細胞計数によってこうした末梢Ag2(+)細胞の枯渇を比較することで評価した。1 mg/kgの用量において抗Ag2は、末梢Ag2(+)細胞の顕著な減少を引き起こしたのに対して、Vel-IPV-抗Ag2の投与は、同じ細胞集団に最小限の変化をもたらした。10 mg/kg用量のVel-IPV-抗Ag2は、1 mg/kg用量の抗Ag2と同様の薬物動態効果をもたらした。結果を図13Bに示す。
【０１６２】
抗Ag2抗体はまた、IL10などのサイトカイン産生にも関与する。サイトカイン産生へのマスキングの影響は、さまざまな時点でカニクイザルから得られた血清の、Luminexマルチサイトカインパネル分析によって評価した。マスキングされていない抗体と比較して、IL10産生の有意な減少が、Vel-IPV-抗Ag2について観察された。結果を図13Cに示す。
【０１６３】
抗Ag2抗体は、1 mg/kgで4回、4日ごとに静脈内に投与されると、L428異種移植片において抗腫瘍活性を促す。さまざまな、プロテアーゼで切断可能なリンカー配列を有するVel-抗Ag2抗体の抗腫瘍活性を、L428異種移植片モデルにおいて比較した。意図したMMP切断可能配列 -PLGLAG- を含有するVel-抗Ag2は、マスキングされていない抗体と同様の抗腫瘍効果を与えた。その一方で、組み替えられた配列 -LALGPG- を含有するVel-抗Ag2抗体は弱められた抗腫瘍活性をもたらした。注目すべきことに、上記の2つのVel-抗Ag2抗体はいずれも、in vitroでL428細胞に結合したが、これは、in vivo活性の差異が、2つの異なるマスキングされた抗体に関する結合の相違によるものでないことを示す。結果を図14Aおよび14Bに示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2020500900.tif 000032
【図１０】
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【図１１】
2020500900.tif 000034
【図１２】
2020500900.tif 000035
【図１３】
2020500900.tif 000036
【図１４】
2020500900.tif 000037
【配列表】
2020500900000001.app
【国際調査報告】
2020500900.tif 000038
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