(57)【要約】  免疫グロブリンのＦｃ部分を介して連結されたＧＬＰ−１およびＦＧＦ２１を含む融合タンパク質を提供する。ＧＬＰ−１およびＦＧＦ２１はそれぞれ、そのアナログまたはバリアントで置き替えることができ、Ｆｃ部分（ＩｇＧ４から誘導されうる）は、融合タンパク質の安定性および活性をさらに高める置換を含みうる。これらのフラグメントは、ペプチドリンカーを介して連結されうる。融合タンパク質は、グルコースおよび脂質レベルの低下ならびに体重減少のために臨床的に使用されうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のポリペプチドであるグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）またはそのアナログ、第２のポリペプチドであるＩｇＧ４ Ｆｃ部分、および第３のポリペプチドである線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）またはそのバリアントを含むか、またはそれらからなる融合タンパク質において、第１のポリペプチドが第２のポリペプチドに第１のリンカーを介して連結され、第３のポリペプチドが第２のポリペプチドに第２のリンカーを介して連結され、野生型ＩｇＧ４ Ｆｃと比較して、前記ＩｇＧ４ Ｆｃ部分の２２８位のセリンがプロリンで置換され、前記ＩｇＧ４ Ｆｃ部分の４０９位のアルギニンがリジンで置換されている、融合タンパク質。
【請求項２】
ＩｇＧ４ Ｆｃ部分が、野生型ＩｇＧ４ Ｆｃと比較しての、Ｅ２３３Ｐ、Ｆ２３４ＶもしくはＦ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥまたはＬ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ、またはＫ４４７から選択される１つまたはそれ以上の変異をさらに含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
ＩｇＧ４ Ｆｃ部分が、下記の変異の組み合わせの１つをさらに含む、請求項１に記載の融合タンパク質：
野生型ＩｇＧ４ Ｆｃと比較しての、
１）Ｓ２２８ＰおよびＲ４０９Ｋ；
２）Ｓ２２８Ｐ、Ｅ２３３ＰおよびＲ４０９Ｋ；
３）Ｓ２２８Ｐ、Ｎ２９７ＡおよびＲ４０９Ｋ；
４）Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＲ４０９Ｋ；
５）Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ｖ、Ｌ２３５ＥおよびＲ４０９Ｋ；ならびに
６）Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｒ４０９ＫおよびＫ４４７。
【請求項４】
ＩｇＧ４ Ｆｃ部分が、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
ＧＬＰ−１のアナログが、配列番号７（ＨＸ１ＥＧＴＦＴＳＤＶ ＳＳＹＬＥＸ２ＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷＬＸ３Ｘ４ＧＸ５ Ｘ６）［ここで、Ｘ１はＧまたはＶから選択され；Ｘ２はＥまたはＧから選択され；Ｘ３はＶまたはＫから選択され；Ｘ４はＫまたはＮから選択され；Ｘ５はＧまたはＥから選択され；Ｘ６はＧ、Ｐまたは不存在から選択される］のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
ＧＬＰ−１のアナログが、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
ＦＧＦ２１のバリアントが、少なくとも１つのアミノ酸変異を１７０位、１７１位または１７２位に含み、ここで、
１７０位のアミノ酸変異は、Ｇ１７０Ｅ、Ｇ１７０Ａ、Ｇ１７０Ｃ、Ｇ１７０Ｄ、Ｇ１７０Ｎ、およびＧ１７０Ｓからなる群から選択され；
１７１位のアミノ酸変異は、Ｐ１７１Ａ、Ｐ１７１Ｅ、Ｐ１７１Ｈ、Ｐ１７１Ｑ、Ｐ１７１Ｔ、Ｐ１７１Ｙ、Ｐ１７１Ｗ、Ｐ１７１Ｃ、Ｐ１７１Ｇ、Ｐ１７１Ｓ、およびＰ１７１Ｔからなる群から選択され；
１７２位のアミノ酸変異は、Ｓ１７２Ｌ、Ｓ１７２Ｉ、Ｓ１７２Ｖ、Ｓ１７２Ａ、およびＳ１７２Ｍからなる群から選択される、
請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
ＦＧＦ２１のバリアントが、少なくとも１つのアミノ酸変異を１７０位または１７１位または１７２位に含み、ここで、
１７０位のアミノ酸変異は、Ｇ１７０Ｅ、Ｇ１７０Ａ、Ｇ１７０Ｄ、およびＧ１７０Ｓからなる群から選択され；
１７１位のアミノ酸変異は、Ｐ１７１Ａ、Ｐ１７１Ｅ、Ｐ１７１Ｑ、Ｐ１７１Ｗ、Ｐ１７１Ｃ、Ｐ１７１Ｇ、およびＰ１７１Ｔからなる群から選択され；
１７２位のアミノ酸変異は、Ｓ１７２Ｌ、Ｓ１７２Ｖ、およびＳ１７２Ｍからなる群から選択される、
請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
ＦＧＦ２１のバリアントが、少なくとも１つのアミノ酸変異を１７０位または１７１位または１７２位に含み、ここで、
１７０位のアミノ酸変異は、Ｇ１７０Ｅ、およびＧ１７０Ａからなる群から選択され；
１７１位のアミノ酸変異は、Ｐ１７１Ａ、Ｐ１７１Ｃ、およびＰ１７１Ｇからなる群から選択され；
１７２位のアミノ酸変異は、Ｓ１７２Ｌである、
請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
ＦＧＦ２１のバリアントが、さらに１つまたはそれ以上の変異を、４５位、９８位、１００位、１５０位、１５１位、１５２位、１６７位、１７５位、１７９位および１８０位からなる群から選択される１つまたはそれ以上の位置に含み、ここで、
４５位のアミノ酸変異は、Ａ４５Ｋ、Ａ４５Ｒ、Ａ４５Ｅ、およびＡ４５Ｑからなる群から選択され；
９８位のアミノ酸変異は、Ｌ９８Ｄ、Ｌ９８Ｒ、Ｌ９８Ｅ、Ｌ９８Ｑ、Ｌ９８Ｋ、およびＬ９８Ｔからなる群から選択され；
１００位のアミノ酸変異はＬ１００Ｋであり；
１５０位のアミノ酸変異はＰ１５０Ａであり；
１５１位のアミノ酸変異はＧ１５１Ａであり；
１５２位のアミノ酸変異はＩ１５２Ｖであり；
１６７位のアミノ酸変異は、Ｓ１６７Ｈ、Ｓ１６７Ｃ、またはＳ１６７Ｒからなる群から選択され；
１７５位のアミノ酸変異は、Ｒ１７５Ｌ、Ｒ１７５Ｈ、またはＲ１７５Ｐからなる群から選択され；
１７９位のアミノ酸変異は、Ｙ１７９Ｓ、Ｙ１７９Ａ、およびＹ１７９Ｆからなる群から選択され；
１８０位のアミノ酸変異は、Ａ１８０Ｓ、Ａ１８０Ｅ、およびＡ１８０Ｇからなる群から選択される、
請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
ＦＧＦ２１のバリアントが、さらに１つまたはそれ以上の変異を、４５位、９８位、１６７位、１７５位、１７９位および１８０位からなる群から選択される１つまたはそれ以上の位置に含み、ここで、
４５位のアミノ酸変異は、Ａ４５Ｋ、Ａ４５Ｒ、Ａ４５Ｅ、およびＡ４５Ｑからなる群から選択され；
９８位のアミノ酸変異は、Ｌ９８Ｄ、Ｌ９８Ｒ、Ｌ９８Ｅ、Ｌ９８Ｑ、Ｌ９８Ｋ、およびＬ９８Ｔからなる群から選択され；
１６７位のアミノ酸変異は、Ｓ１６７Ｈ、またはＳ１６７Ｃであり；
１７５位のアミノ酸変異は、Ｒ１７５Ｌ、またはＲ１７５Ｈであり；
１７９位のアミノ酸変異は、Ｙ１７９Ｓ、Ｙ１７９Ａ、およびＹ１７９Ｆからなる群から選択され；
１８０位のアミノ酸変異は、Ａ１８０Ｓ、Ａ１８０Ｅ、およびＡ１８０Ｇからなる群から選択される、
請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
ＦＧＦ２１のバリアントが、さらに１つまたはそれ以上の変異を、９８位、１６７位、１７５位および１７９位からなる群から選択される１つまたはそれ以上の位置に含み、ここで、
９８位のアミノ酸変異は、Ｌ９８Ｄ、およびＬ９８Ｒからなる群から選択され；
１６７位のアミノ酸変異は、Ｓ１６７Ｈであり；
１７５位のアミノ酸変異は、Ｒ１７５Ｌであり；
１７９位のアミノ酸変異は、Ｙ１７９Ｆである、
請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
ＦＧＦ２１のバリアントが、少なくともアミノ酸変異を９８位または１７１位の１つまたはそれ以上の位置に含み、ここで、
９８位のアミノ酸変異は、Ｌ９８Ｄ、およびＬ９８Ｒからなる群から選択され；
１７１位のアミノ酸変異は、Ｐ１７１Ａ、およびＰ１７１Ｇからなる群から選択される、
請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
ＦＧＦ２１のバリアントが、さらに１つまたはそれ以上の変異を、１６７位、１７５位および１７９位からなる群から選択される１つまたはそれ以上の位置に含み、ここで、
１６７位のアミノ酸変異は、Ｓ１６７Ｈ、およびＳ１６７Ｃからなる群から選択され；
１７５位のアミノ酸変異は、Ｒ１７５Ｌ、Ｒ１７５Ｈ、およびＰ１７５Ｐからなる群から選択され；
１７９位のアミノ酸変異は、Ｙ１７９Ｓ、およびＹ１７９Ｆからなる群から選択される、
請求項１３に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
ＦＧＦ２１のバリアントが、さらに１つまたはそれ以上の変異を、１６７位、１７５位および１７９位からなる群から選択される１つまたはそれ以上の位置に含み、ここで、
１６７位のアミノ酸変異は、Ｓ１６７Ｈであり；
１７５位のアミノ酸変異は、Ｒ１７５Ｌであり；
１７９位のアミノ酸変異は、Ｙ１７９Ｆである、
請求項１３に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
第１のリンカーおよび第２のリンカーがそれぞれ、５〜５０アミノ酸残基のポリペプチドを含み、該ポリペプチドは少なくとも５０％のＧを含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
第１のリンカーおよび／または第２のリンカーがそれぞれ独立に、１、２または３のＧリッチポリペプチドを含む、請求項１６に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
第１のリンカーおよび第２のリンカーがそれぞれ独立に、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡから選択される、請求項１６に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
融合タンパク質が、ホモ二量体融合タンパク質または非ホモ二量体融合タンパク質である、請求項１〜１８のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項２０に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２２】
請求項２１に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２３】
請求項２２に記載のベクターを宿主細胞において発現させることを含む、請求項１〜１９のいずれかに記載の融合タンパク質を製造する方法。
【請求項２４】
請求項１〜１９のいずれかに記載の融合タンパク質、および場合により１つまたはそれ以上の薬学的に許容しうる添加剤を含む医薬組成物。
【請求項２５】
請求項１〜１９のいずれかに記載の融合タンパク質の、代謝疾患の処置に使用される医薬組成物の製造における使用。
【請求項２６】
代謝疾患が、糖尿病、肥満および脂肪肝から選択される、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
請求項１〜１９のいずれかに記載の融合タンパク質または請求項２４に記載の医薬組成物を処置有効量で患者に投与することを含む、代謝疾患を処置する方法。
【請求項２８】
代謝疾患の処置において使用するための、請求項１〜１９のいずれかに記載の融合タンパク質または請求項２４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は、参照によりその全体を本書の一部とする、国家知識産権局に２０１７年３月１４日に出願された中国特許出願第201710148158.7号、および国家知識産権局に２０１８年２月８日に出願された中国特許出願第201810129427.X号に基づく優先権の利益を主張する。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は、免疫グロブリンのＦｃ部分を介して連結された線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）およびグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）を含む融合タンパク質、ならびに代謝疾患の処置のための該融合タンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
糖尿病治療用の薬剤には、現在、経口小分子薬剤、インスリン、およびＧＬＰ−１受容体アゴニスト薬剤の３つのカテゴリーがある。小分子薬剤による長期治療は、明らかな副作用をもたらし、糖尿病後の血糖コントロールも満足できるものではない。インスリンによる糖尿病治療では多回注射（少なくとも１日１回）が必要であり、また、個々の用量が異なると容易に低血糖症が引き起こされる。単剤のＧＬＰ−１受容体アゴニストは第一選択薬ではなく、糖尿病の代謝異常によって引き起こされる心血管合併症に対する効果が限定的である。
【０００４】
グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）は、腸のＬ細胞により分泌されるインクレチンの１種である。これは、患者においてインスリンバランスを維持するように、インスリンを分泌するよう膵島β細胞を刺激する。天然のＧＬＰ−１はインビトロでせいぜい２分間しかもたないので、薬剤として有効ではない。ここ数年、Eli Lilly、Novo Nordisk、GSKを含む複数のグループが、該タンパク質の長時間作用型ＧＬＰ−１型血糖低下薬への変換を競って探索している。現在、デュラグルチドのような最も長時間作用するＧＬＰ−１薬剤は、ＧＬＰ−１タンパク質に抗体断片を融合したことによって、週１回の投与が可能となっている。しかしながら、デュラグルチドによるグルコース低下曲線は安定ではなく、治療の翌日には血中グルコースが上昇し始めることが研究によりわかっている。したがって、このような状況は、糖尿病のコントロールのために理想的なものではなく、さまざまな合併症をもたらしうる。
【０００５】
２型糖尿病には、末梢インスリン抵抗性、および膵β細胞によるグルコース依存性インスリン分泌の障害という、２つの主要な特徴がある。糖尿病のような代謝障害はしばしば、さまざまな複雑な要因によって引き起こされるので、複数の代謝経路を改善することが非常に有益であると考えられる。
【０００６】
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ２１）は、最近発見されたサイトカインである。これは、ＧＬＵＴ１受容体を刺激して細胞内へのグルコース輸送を促進することができ、したがって、糖尿病を治療するための薬剤として使用されうる。しかしながら、ＦＧＦ２１を医薬として用いるには大きな問題がある。ＦＧＦ２１は半減期が短く、マウスモデルにおいて約１時間である（最大の生物学的活性は６時間以上維持されうるが）。ＦＧＦ２１が短時間で分解する理由として、体内のプロテアーゼがあり、また、インビトロで凝集物を形成する傾向があるので免疫原性が生じ、これが半減期の延長に対して不利に働く、ということがある。
【０００７】
近年、ＦＧＦ２１の医薬用途の開発のために、ＦＧＦ２１のインビボ安定性を高めるためのさまざまな試みがなされており、例えば、WO 2003011213、WO 2005072769、WO 2005061712、WO 2006065582、WO 2010065439、WO2013052311、WO 2013188182、WO 2013033452、WO 2005091944、WO 2012066075、WO 2013188181に記載されるように、ＦＧＦ２１の天然の配列に基づき、さまざまな部位での変異、アミノ酸／脂肪鎖の挿入、またはいくつかのアミノ酸の欠失がなされている。
【発明の概要】
【０００８】
本開示は、過去に開示された融合タンパク質とは異なる変異部位を有する、ＧＬＰ−１およびＦＧＦ２１を含む二重標的融合タンパク質提供する。驚くべきことに、本発明者は、本発明の二重標的融合タンパク質は、より安定であり、顕著に延長された半減期を有し、血中の糖、脂質、体重等の低下において相乗的に作用することを見出した。
【０００９】
本発明の一側面において、第１のポリペプチドであるＧＬＰ−１またはそのアナログ、第２のポリペプチドであるＩｇＧ４ Ｆｃ部分、および第３のポリペプチドであるＦＧＦ２１またはそのバリアントを含むか、またはそれらからなる融合タンパク質において、第１のポリペプチドが第２のポリペプチドに第１のリンカーを介して連結され、第３のポリペプチドが第２のポリペプチドに第２のリンカーを介して連結され、野生型ＩｇＧ４ Ｆｃ部分と比較して、前記ＩｇＧ４ Ｆｃ部分の２２８位のセリンがプロリンで置換され、前記ＩｇＧ４ Ｆｃ部分の４０９位のアルギニンがリジンで置換されている融合タンパク質が提供される。このようにして、該融合タンパク質は安全性および安定性が高められており、したがって半減期が顕著に延長されている。
【００１０】
第１のポリペプチドであるＧＬＰ−１アナログは、天然ＧＬＰ−１配列（配列番号１４）において１〜１０（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）のアミノ酸が置換、欠失または挿入されたものを含み、それにより、ＧＬＰ−１の生物学的活性を維持または向上しながらＧＬＰ−１のインビボ半減期を延長する。
【００１１】
いくつかの態様において、ＧＬＰ−１アナログは、配列番号７（ＨＸ１ＥＧＴＦＴＳＤＶ ＳＳＹＬＥＸ２ＱＡＡＫ ＥＦＩＡＷＬＸ３Ｘ４ＧＸ５ Ｘ６）［ここで、Ｘ１はＧまたはＶから選択され；Ｘ２はＥまたはＧから選択され；Ｘ３はＶまたはＫから選択され；Ｘ４はＫまたはＮから選択され；Ｘ５はＧまたはＥから選択され；Ｘ６はＧもしくはＰから選択されるか、または存在しない］のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００１２】
他の態様において、ＧＬＰ−１アナログは、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００１３】
いくつかの態様において、第２のポリペプチドであるＩｇＧ４ Ｆｃ部分は、以下から選択される１つまたはそれ以上の変異をさらに含む：野生型ＩｇＧ４ Ｆｃ部分と比較しての、Ｅ２３３Ｐ、Ｆ２３４ＶまたはＦ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥまたはＬ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｋ４４７。
【００１４】
他の態様において、ＩｇＧ４ Ｆｃ部分は、下記の変異の組み合わせの１つを含む：
野生型ＩｇＧ４ Ｆｃ部分と比較しての、
１）Ｓ２２８ＰおよびＲ４０９Ｋ；
２）Ｓ２２８Ｐ、Ｅ２３３ＰおよびＲ４０９Ｋ；
３）Ｓ２２８Ｐ、Ｎ２９７ＡおよびＲ４０９Ｋ；
４）Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＲ４０９Ｋ；
５）Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ｖ、Ｌ２３５ＥおよびＲ４０９Ｋ；ならびに
６）Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｒ４０９ＫおよびＫ４４７。
【００１５】
さらに別の態様において、ＩｇＧ４ Ｆｃ部分は、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００１６】
第３のポリペプチドであるＦＧＦ２１バリアントは、天然ＦＧＦ２１配列において１つまたはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失または挿入されたものを含み、それにより、ＦＧＦ２１のインビボ半減期を延長し、ＦＧＦ２１の生物学的活性を維持または向上する。
【００１７】
いくつかの態様において、ＦＧＦ２１バリアントは、少なくとも１つの変異を１７０位または１７１位または１７２位に含み；１７０位のアミノ酸変異は、Ｇ１７０Ｅ、Ｇ１７０Ａ、Ｇ１７０Ｃ、Ｇ１７０Ｄ、Ｇ１７０Ｎ、およびＧ１７０Ｓからなる群から選択され；１７１位のアミノ酸変異は、Ｐ１７１Ａ、Ｐ１７１Ｅ、Ｐ１７１Ｈ、Ｐ１７１Ｑ、Ｐ１７１Ｔ、Ｐ１７１Ｙ、Ｐ１７１Ｗ、Ｐ１７１Ｃ、Ｐ１７１Ｇ、Ｐ１７１Ｓ、およびＰ１７１Ｔからなる群から選択され；１７２位のアミノ酸変異は、Ｓ１７２Ｌ、Ｓ１７２Ｉ、Ｓ１７２Ｖ、Ｓ１７２Ａ、およびＳ１７２Ｍからなる群から選択される。いくつかの態様において、１７０位のアミノ酸変異は、Ｇ１７０Ｅ、Ｇ１７０Ａ、Ｇ１７０Ｄ、およびＧ１７０Ｓからなる群から選択され；１７１位のアミノ酸変異は、Ｐ１７１Ａ、Ｐ１７１Ｅ、Ｐ１７１Ｑ、Ｐ１７１Ｗ、Ｐ１７１Ｃ、Ｐ１７１Ｇ、およびＰ１７１Ｔからなる群から選択され；１７２位のアミノ酸変異は、Ｓ１７２Ｌ、Ｓ１７２Ｖ、およびＳ１７２Ｍからなる群から選択される。いくつかの態様において、１７０位のアミノ酸変異は、Ｇ１７０Ｅ、およびＧ１７０Ａからなる群から選択され；１７１位のアミノ酸変異は、Ｐ１７１Ａ、Ｐ１７１Ｃ、およびＰ１７１Ｇからなる群から選択され；１７２位のアミノ酸変異は、Ｓ１７２Ｌである。
【００１８】
いくつかの態様において、ＦＧＦ２１バリアントは、さらに１つまたはそれ以上の変異を、４５位、９８位、１００位、１１８位、１３４位、１５０位、１５１位、１５２位、１６７位、１７５位、１７９位、および１８０位からなる群から選択される１つまたはそれ以上の位置に含む。いくつかの態様において、４５位のアミノ酸変異は、Ａ４５Ｋ、Ａ４５Ｒ、Ａ４５Ｅ、およびＡ４５Ｑからなる群から選択され；９８位のアミノ酸変異は、Ｌ９８Ｄ、Ｌ９８Ｒ、Ｌ９８Ｅ、Ｌ９８Ｑ、Ｌ９８Ｋ、およびＬ９８Ｔからなる群から選択され；１００位のアミノ酸変異はＬ１００Ｋであり；１１８位のアミノ酸変異はＬ１１８Ｃであり；１３４位のアミノ酸変異はＡ１３４Ｃであり；１５０位のアミノ酸変異はＰ１５０Ａであり；１５１位のアミノ酸変異はＧ１５１Ａであり；１５２位のアミノ酸変異はＩ１５２Ｖであり；１６７位のアミノ酸変異は、Ｓ１６７Ｈ、Ｓ１６７Ｃ、およびＳ１６７Ｒからなる群から選択され；１７５位のアミノ酸変異は、Ｒ１７５Ｌ、Ｒ１７５Ｈ、およびＲ１７５Ｐからなる群から選択され；１７９位のアミノ酸変異は、Ｙ１７９Ｓ、Ｙ１７９Ａ、およびＹ１７９Ｆからなる群から選択され；１８０位のアミノ酸変異は、Ａ１８０Ｓ、Ａ１８０Ｅ、およびＡ１８０Ｇからなる群から選択される。
【００１９】
いくつかの態様において、ＦＧＦ２１バリアントは、さらに１つまたはそれ以上の変異を、４５位、９８位、１００位、１６７位、１７５位、１７９位、および１８０位からなる群から選択される１つまたはそれ以上の位置に含む。いくつかの態様において、４５位のアミノ酸変異は、Ａ４５Ｋ、Ａ４５Ｒ、Ａ４５Ｅ、およびＡ４５Ｑからなる群から選択され；９８位のアミノ酸変異は、Ｌ９８Ｄ、Ｌ９８Ｒ、Ｌ９８Ｅ、Ｌ９８Ｑ、Ｌ９８Ｋ、およびＬ９８Ｔからなる群から選択され；１００位のアミノ酸変異はＬ１００Ｋであり；１６７位のアミノ酸変異は、Ｓ１６７Ｈ、およびＳ１６７Ｃからなる群から選択され；１７５位のアミノ酸変異は、Ｒ１７５Ｌ、およびＲ１７５Ｈからなる群から選択され；１７９位のアミノ酸変異は、Ｙ１７９Ｓ、Ｙ１７９Ａ、およびＹ１７９Ｆからなる群から選択され；１８０位のアミノ酸変異は、Ａ１８０Ｓ、Ａ１８０Ｅ、およびＡ１８０Ｇからなる群から選択される。
【００２０】
他のいくつかの態様において、ＦＧＦ２１バリアントは、さらに１つまたはそれ以上の変異を、４５位、９８位、１６７位、１７５位、１７９位、および１８０位からなる群から選択される１つまたはそれ以上の位置に含む。いくつかの態様において、４５位のアミノ酸変異は、Ａ４５Ｋ、Ａ４５Ｒ、Ａ４５Ｅ、およびＡ４５Ｑからなる群から選択され；９８位のアミノ酸変異は、Ｌ９８Ｄ、Ｌ９８Ｒ、Ｌ９８Ｅ、Ｌ９８Ｑ、Ｌ９８Ｋ、およびＬ９８Ｔからなる群から選択され；１６７位のアミノ酸変異は、Ｓ１６７Ｈ、およびＳ１６７Ｃからなる群から選択され；１７５位のアミノ酸変異は、Ｒ１７５Ｌ、およびＲ１７５Ｈからなる群から選択され；１７９位のアミノ酸変異は、Ｙ１７９Ｓ、Ｙ１７９Ａ、およびＹ１７９Ｆからなる群から選択され；１８０位のアミノ酸変異は、Ａ１８０Ｓ、Ａ１８０Ｅ、およびＡ１８０Ｇからなる群から選択される。
【００２１】
他のいくつかの態様において、ＦＧＦ２１バリアントは、さらに１つまたはそれ以上の変異を、９８位、１６７位、１７５位、および１７９位からなる群から選択される１つまたはそれ以上の位置に含む。いくつかの態様において、９８位のアミノ酸変異は、Ｌ９８Ｄ、Ｌ９８Ｒ、Ｌ９８Ｅ、およびＬ９８Ｋからなる群から選択され；１６７位のアミノ酸変異は、Ｓ１６７Ｈ、およびＳ１６７Ｃからなる群から選択され；１７５位のアミノ酸変異は、Ｒ１７５Ｌ、およびＲ１７５Ｈからなる群から選択され；１７９位のアミノ酸変異は、Ｙ１７９Ｓ、およびＹ１７９Ｆからなる群から選択される。
【００２２】
他のいくつかの態様において、ＦＧＦ２１バリアントは、さらに１つまたはそれ以上の変異を、９８位、１６７位、１７５位、および１７９位からなる群から選択される１つまたはそれ以上の位置に含む。いくつかの態様において、９８位のアミノ酸変異は、Ｌ９８Ｄ、およびＬ９８Ｒからなる群から選択され；１６７位のアミノ酸変異はＳ１６７Ｈであり；１７５位のアミノ酸変異はＲ１７５Ｌであり；１７９位のアミノ酸変異はＹ１７９Ｆである。
【００２３】
いくつかの態様において、ＦＧＦ２１バリアントは、少なくともアミノ酸変異を９８位または１７１位の１つまたはそれ以上の位置に含み、ここで、９８位のアミノ酸変異は、Ｌ９８Ｄ、およびＬ９８Ｒからなる群から選択され；１７０位のアミノ酸変異はＰ１７１Ａ、およびＰ１７１Ｇからなる群から選択される。いくつかの態様において、ＦＧＦ２１バリアントは、さらに１つまたはそれ以上の変異を、１６７位、１７５位、および１７９位からなる群から選択される１つまたはそれ以上の位置に含み、ここで、１６７位のアミノ酸変異は、Ｓ１６７Ｈ、およびＳ１６７Ｃからなる群から選択され；１７５位のアミノ酸変異は、Ｒ１７５Ｌ、Ｒ１７５Ｈ、およびＲ１７５Ｐからなる群から選択され；１７９位のアミノ酸変異は、Ｙ１７９Ｓ、およびＹ１７９Ｆからなる群から選択される。
【００２４】
いくつかの態様において、ＦＧＦ２１バリアントは、少なくともアミノ酸変異を、９８位または１７１位の１つまたはそれ以上の位置に含み、ここで、９８位のアミノ酸変異はＬ９８Ｒであり；１７０位のアミノ酸変異は、Ｐ１７１Ａ、およびＰ１７１Ｇからなる群から選択される。いくつかの態様において、ＦＧＦ２１バリアントは、さらに１つまたはそれ以上の変異を、１６７位、１７５位、および１７９位からなる群から選択される１つまたはそれ以上の位置に含み、ここで、１６７位のアミノ酸変異はＳ１６７Ｈであり；１７５位のアミノ酸変異はＲ１７５Ｌであり；１７９位のアミノ酸変異は、Ｙ１７９Ｆである。
【００２５】
他の態様において、ＦＧＦ２１バリアントは、下記の変異の組み合わせの１つを含む：
１）Ｌ９８ＲおよびＰ１７１Ｇ；
２）Ｌ９８ＲおよびＰ１７１Ａ；
３）Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１ＧおよびＹ１７９Ｆ；
４）Ｌ９８Ｒ、Ｐ１７１ＧおよびＡ１８０Ｅ；
５）Ｌ９８Ｒ、Ｇ１７０Ｅ、Ｐ１７１ＡおよびＳ１７２Ｌ；
６）Ｌ９８Ｒ、Ｓ１６７ＨおよびＰ１７１Ａ；ならびに
７）Ｌ９８Ｒ、Ｓ１６７Ｈ、Ｐ１７１ＡおよびＲ１７５Ｌ。
【００２６】
さらに別の態様において、ＦＧＦ２１バリアントはさらに、
ａ）８アミノ酸残基以下のアミノ末端トランケーション；
ｂ）１２アミノ酸残基以下のカルボキシ末端トランケーション；
ｃ）８アミノ酸残基以下のアミノ末端トランケーション、および１２アミノ酸残基以下のカルボキシ末端トランケーション；または
ｄ）６アミノ酸残基以下のカルボキシ末端伸長
を含む。
【００２７】
本発明において、第１のポリペプチドおよび第３のポリペプチドはＩｇＧ４ Ｆｃ部分に、それぞれ第１のリンカーおよび第２のリンカーによって融合され、第１のリンカーおよび／または第２のリンカーは、５〜５０アミノ酸残基のポリペプチドを含み、該ポリペプチドは少なくとも５０％のＧを含む。いくつかの態様において、第１のリンカーおよび第２のリンカーはそれぞれ独立に、１、２または３のＧリッチポリペプチドを含む。他のいくつかの態様において、第１のリンカーおよび第２のリンカーはそれぞれ独立に、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳまたはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号：１３）またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡから選択される。
【００２８】
いくつかの態様において、融合タンパク質は、ホモ二量体融合タンパク質である。
いくつかの態様において、融合タンパク質は、非ホモ二量体融合タンパク質である。
【００２９】
本発明の他の一側面において、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。
本発明のさらなる一側面において、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。
本発明のさらなる一側面において、本発明のベクターを含む宿主細胞が提供される。
【００３０】
本発明のさらなる一側面において、本発明のベクターを宿主細胞において発現させることを含む、本発明の融合タンパク質を製造する方法が提供される。
【００３１】
本発明の他の一側面において、本発明の融合タンパク質、および場合により１つまたはそれ以上の薬学的に許容しうる添加剤を含む組成物（例えば医薬組成物）が提供される。そのような薬学的に許容しうる添加剤は、薬学的に許容しうる担体、賦形剤、希釈剤、ビヒクル、および医薬製剤において必要とされる他の添加剤、またはそれらの任意の組み合わせを包含するが、それに限定されない。
【００３２】
本発明の融合タンパク質または組成物（例えば医薬組成物）は、代謝疾患の処置のために使用することができる。代謝疾患は、糖尿病、肥満および脂肪肝から選択しうる。
【００３３】
本発明の他の一側面において、本発明の融合タンパク質の、医薬組成物の製造における使用が提供される。いくつかの態様において、該医薬組成物は、代謝疾患の処置のために使用される。代謝疾患は、例えば、糖尿病、肥満および脂肪肝から選択しうる。
【００３４】
本発明の他の一側面において、本発明の融合タンパク質または医薬組成物を処置有効量で必要とする対象に投与することを含む、代謝疾患を処置する方法が提供される。代謝疾患は、例えば、糖尿病、肥満および脂肪肝から選択しうる。
【００３５】
本発明の他の一側面において、代謝疾患の処置のための融合タンパク質または医薬組成物が提供される。代謝疾患は、糖尿病、肥満および脂肪肝から選択しうる。
【００３６】
本発明により提供される融合タンパク質は、下記の利点を有する：本発明の融合タンパク質は、安定性が改善されており、より安全であり、これは、二量体の解離が回避され、したがって体内の抗体とのランダムな組み合わせが回避されることによる；本発明の融合タンパク質は、半減期が延長されており、投与の間隔を１週間よりも長くでき、患者のコンプライアンスが高められる；本発明の融合タンパク質は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣ作用を誘発しない。他の一側面において、本発明により提供される、第１のポリペプチド、第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドを含むホモ二量体融合タンパク質は、代謝疾患に対する良好な生物学的活性、安定した血糖低下作用（第１のポリペプチドおよび第３のポリペプチドによる顕著な相乗効果による）、および他の生物学的活性（例えば良好な脂質低下作用、体重減少作用等）を包含する顕著な利点を有する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１に、ホモ二量体融合タンパク質の一態様の図を示す。
【図２】図２に、ＧＬＰ−１Ｒ細胞モデルを用いて測定した、デュラグルチドまたはＤ３Ｆ１の関数としてのｃＡＭＰ濃度のプロットを示す。
【図３】図３に、融合タンパク質Ｄ１Ｆ１、Ｄ１Ｆ２、Ｄ６Ｆ１およびＤ７Ｆ１の、マイクロカロリメトリー示差走査カロリメトリーの曲線を示す。
【図４】図４に、ｄｂ／ｄｂマウスモデルにおける、デュラグルチド、Ｓ１Ｆ１およびＤ１Ｆ１の投与後の血中グルコースレベルを示す。
【図５】図５に、ｄｂ／ｄｂマウスモデルにおける、融合タンパク質Ｄ１Ｆ１、Ｄ２Ｆ１およびＤ７Ｆ１の投与後の血中グルコースレベルを示す。
【図６】図６に、ｄｂ／ｄｂマウスモデルにおける、融合タンパク質Ｄ３Ｆ１、Ｄ４Ｆ１およびＤ５Ｆ１の投与後の血糖低下効果を示す。
【図７】図７に、ｄｂ／ｄｂマウスモデルにおける、デュラグルチド、Ｓ１Ｆ１およびＤ１Ｆ１の投与後の総コレステロール低下効果を示す。
【図８】図８に、ｄｂ／ｄｂマウスモデルにおける、デュラグルチド、Ｓ１Ｆ１およびＤ１Ｆ１の投与後のトリグリセリド低下効果を示す。
【図９】図９に、ｄｂ／ｄｂマウスモデルにおける、融合タンパク質Ｄ１Ｆ２、Ｄ２Ｆ１およびＤ７Ｆ１の投与後のトリグリセリド低下効果を示す。
【図１０】図１０に、ｄｂ／ｄｂマウスモデルにおける、融合タンパク質Ｄ１Ｆ２、Ｄ２Ｆ１およびＤ７Ｆ１の投与後の総コレステロール低下効果を示す。
【図１１】図１１に、ｄｂ／ｄｂマウスモデルにおける、融合タンパク質Ｄ１Ｆ１、Ｄ２Ｆ１およびＤ７Ｆ１の投与後の高密度リポタンパク質低下効果を示す。
【図１２】図１２に、ｄｂ／ｄｂマウスモデルにおける、融合タンパク質Ｄ１Ｆ１、Ｄ２Ｆ１およびＤ７Ｆ１の投与後の低密度リポタンパク質低下効果を示す。
【図１３】図１３に、ｄｂ／ｄｂマウスモデルにおける、融合タンパク質Ｄ３Ｆ１、Ｄ４Ｆ１、Ｄ５Ｆ１の投与後のトリグリセリド低下効果を示す。
【図１４】図１４に、ｄｂ／ｄｂマウスモデルにおける、融合タンパク質Ｄ３Ｆ１、Ｄ４Ｆ１およびＤ５Ｆ１の投与後の総コレステロール低下効果を示す。
【図１５】図１５に、ｄｂ／ｄｂマウスモデルにおける、融合タンパク質Ｄ３Ｆ１、Ｄ４Ｆ１およびＤ５Ｆ１の投与後の低密度リポタンパク質低下効果を示す。
【図１６】図１６に、ｄｂ／ｄｂマウスモデルにおける、デュラグルチド、Ｓ１Ｆ１、およびＤ１Ｆ１の投与後の体重減少効果を示す。
【図１７】図１７に、ｏｂ／ｏｂマウスモデルにおける、デュラグルチドおよびＤ５Ｆ１の投与後の血糖低下効果を示す。
【図１８】図１８に、ｏｂ／ｏｂマウスモデルにおいて１６時間の絶食後にデュラグルチドおよびＤ５Ｆ１を投与した後の血中グルコース濃度を示す。
【図１９】図１９に、ｏｂ／ｏｂマウスモデルにおける、デュラグルチドおよびＤ５Ｆ１の投与後の脂肪肝改善効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明のさらなる特徴および利点は、以下の詳細な説明により明らかにされる。しかしながら、詳細な説明および実施例は、本発明の好ましい態様を示すものではあるが説明のためのものに過ぎないこと、詳細な説明から、当業者には、本発明の精神および範囲内での多くの変更および改変が明らかになることを理解すべきである。
【００３９】
用語の定義
本書において、「天然ＧＬＰ−１配列」とは、天然に存在するＧＬＰ−１の配列からＮ末端６ペプチドの切り詰めによって誘導される、生物学的活性を有する天然ＧＬＰ−１（７−３７）配列を指す。天然ＧＬＰ−１配列、すなわち天然ＧＬＰ−１（７−３７）配列は、ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶ  ＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫ  ＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ  Ｇ（配列番号１４）である。
【００４０】
本書において、「ＧＬＰ−１の生物学的活性」とは、例えばインスリン分泌の刺激、グルカゴン分泌の抑制、胃内容排出の抑制、胃または腸の運動の抑制、および体重減少の誘導といった、ＧＬＰ−１により誘導されるさまざまな生物学的作用を指す。ＧＬＰ−１の特筆すべき特徴は、低血糖に関連するリスクを伴わずにインスリン分泌を刺激しうるということである。
【００４１】
本書に記載される「Ｆｃ部分」は、抗体のヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３定常領域構造からなる。抗体は、抗原に結合する「Ｆａｂ」と称される可変ドメイン、およびエフェクター機能（例えば、補体活性化および食細胞による攻撃）に関与する「Ｆｃ」と称される定常ドメインという、機能的に独立した２つの部分を含む。Ｆｃは血清中の半減期が長いが、Ｆａｂは半減期が短い（Capon et al., 1989, Nature 337: 525-31）。Ｆｃドメインは、治療用のタンパク質と連結されると、より長い半減期を提供することができ、またはＦｃ受容体結合、プロテインＡ結合、補体結合または胎盤通過といった機能を組み込むことができる（Capon et al., 1989）。本書において用いられる用語「Ｆｃ部分」は、天然の抗体（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）から誘導される野生型Ｆｃ部分の配列を指し、そのバリアントもまた包含する。該バリアントは、例えば本書に開示するような、１つまたはそれ以上アミノ酸置換、付加および／または欠失を含みうる。いくつかの態様において、Ｆｃ部分のバリアントは、例えばＦｃ受容体への結合性のような、野生型Ｆｃ部分の活性を維持する。
【００４２】
本書に記載されるＩｇＧ４ Ｆｃ部分のアミノ酸番号は、ＥＵナンバリングシステムに従い、例えば「Ｓ２２８Ｐ」とは、ＥＵナンバリングシステムに従う２２８位のセリンがプロリンに置換されていることを意味し、「Ｋ４４７」とは、ＥＵナンバリングシステムに従う４４７位のリジンが欠失しているかまたは不存在であることを意味する。
【００４３】
ＦＧＦ２１野生型配列は、ＮＣＢＩリファレンス配列番号ＮＰ＿０６１９８６．１の２０９のアミノ酸を含み；成熟ＦＧＦ２１配列は１８１のアミノ酸を含み、ＦＧＦ２１野生型が含むリーダー配列を欠く。本書において「天然ＦＧＦ２１配列」とは、下記アミノ酸配列（配列番号１５）を有する成熟ＦＧＦ２１配列を指し、「ＦＧＦ２１バリアント」とは、下記ＦＧＦ２１アミノ酸配列（配列番号１５）を有するポリペプチドの変異体であり、アミノ酸変異部位の番号は、下記配列（配列番号１５）における番号である。ＦＧＦ２１バリアントのアミノ酸配列は、天然ＦＧＦ２１アミノ酸配列とは１つまたはそれ以上のアミノ酸において異なる。ＦＧＦ２１バリアントは、天然ＦＧＦ２１ポリペプチド中の特定の位置における天然または非天然アミノ酸での改変によって得ることができる。そのような改変は、特定の位置における１つまたはそれ以上の保存的または非保存的アミノ酸の挿入、置換または欠失、および特定の位置における非アミノ酸構造の導入を包含する。
配列番号１５：ＨＰＩＰＤＳＳＰＬＬ  ＱＦＧＧＱＶＲＱＲＹ  ＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥ  ＡＨＬＥＩＲＥＤＧＴ  ＶＧＧＡＡＤＱＳＰＥ  ＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰ  ＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴ  ＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧ  ＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰ  ＥＡＣＳＦＲＥＬＬＬ  ＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥ  ＡＨＧＬＰＬＨＬＰＧ  ＮＫＳＰＨＲＤＰＡＰ  ＲＧＰＡＲＦＬＰＬＰ  ＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰ  ＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶ  ＧＳＳＤＰＬＳＭＶＧ  ＰＳＱＧＲＳＰＳＹＡ  Ｓ
【００４４】
ＦＧＦ２１バリアントは、上記に加えて、またはその代わりに、アミノ酸の欠失を含むことができ、これは、Ｎ末端トランケーション、Ｃ末端トランケーションもしくは非末端の欠失またはそれらの任意の組み合わせでありうる。Ｎ末端トランケーション、Ｃ末端トランケーションおよび／または非末端欠失を含むバリアントは、本発明の文脈において「欠失バリアント」または「フラグメント」と称される。用語「欠失バリアント」および「フラグメント」は、本書おいて互換的に用いられる。フラグメントは、天然に生じうるか（例えばスプライスバリアント）、または、例えば遺伝子的手段により、人工的に作られる。
【００４５】
「保存的アミノ酸置換」は、天然アミノ酸配列の残基（すなわち、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチド配列においてある特定の位置に存在する残基）を、その位置のアミノ酸残基の極性または荷電にほとんどまたは全く影響しないように非天然の残基（すなわち、野生型ＦＧＦ２１ポリペプチド配列においてある特定の位置に存在しない残基）で置換するものを包含しうる。保存的アミノ酸置換は、非天然アミノ酸残基を、生物学的システム合成よりも、一般的には化学的ペプチド合成によって、組み込むものをも包含する。これには、ペプチド模倣体、およびアミノ酸部分の他の入れ替え形態が含まれる。
【００４６】
天然に存在する残基は、共通する側鎖の性質に基づいて、下記の群に分類されうる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ；
（２）中性親水性：Ｃ、Ｓ、Ｔ；
（３）酸性：Ｄ、Ｅ；
（４）塩基性：Ｎ、Ｑ、Ｈ、Ｋ、Ｒ；
（５）鎖の配向に影響する残基：Ｇ、Ｐ；および
（６）芳香族性：Ｗ、Ｙ、Ｆ。
【００４７】
保存的置換は、前記カテゴリーの一員を、同じカテゴリーの別の一員に置き換えるものを包含しうる。
【００４８】
いくつかの保存的アミノ酸置換を次表に示す：
2020509761.tif 000002
【００４９】
次表にも保存的アミノ酸置換の例を挙げる。０またはそれ以上の値は、２つのアミノ酸が、それらの間で保存的アミノ酸置換されることを示す。
2020509761.tif 000003
【００５０】
本発明の融合タンパク質を作製する際、必ずしも必要ではないが、リンカーまたはコネクターを用いうる。リンカーが存在する場合、それは主にスペーサーとして機能するので、その化学構造はフレキシブルでありうる。リンカーは、ペプチド結合で連結したアミノ酸からなりうる。本発明のいくつかの態様において、リンカーは、ペプチド結合で連結した１〜２０のアミノ酸からなりうる。いくつかの態様において、該１〜２０のアミノ酸は、２０の天然アミノ酸から選択される。さまざまな態様において、前記１〜２０のアミノ酸は、アミノ酸グリシン、セリン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミンおよびリジンから選択される。いくつかの態様において、リンカーは、立体障害のない複数のアミノ酸からなる。他のいくつかの態様においては、立体障害のないアミノ酸はグリシンおよびアラニンからなる。本発明のＧリッチポリペプチドは、（Ｇ）３−Ｓ、すなわち「ＧＧＧＳ」、（Ｇ）４−Ｓ、すなわち「ＧＧＧＧＳ」、（Ｇ）５−Ｓ、すなわち「ＧＧＧＧＧＳ」から選択されうる。いくつかの態様において、リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡを含む。他の適当なリンカーは、ＧＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＫＧＧＧＧ、ＧＧＧＮＧＳＧＧ、ＧＧＧＣＧＧＧＧ、およびＧＰＮＧＧを包含する。本発明の二重標的融合タンパク質のために、１５アミノ酸残基のリンカーが特に良好な役割を果たすことがわかったが、本発明はどのような長さまたは組成のリンカーをも包含する。
【００５１】
本書に挙げるリンカーは例であって、本書に開示されるリンカーは、より長いものであってもよく、また、他の残基を含むものであってもよい。本発明におけるリンカーは、非ペプチドリンカーであってもよい。例えば、アルキルリンカー、例えば−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−Ｃ（Ｏ）−［ここで、ｓ＝２〜２０］を使用することができる。そのようなアルキルリンカーは、低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ６）、低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２またはフェニルを包含するがそれらに限定されない、任意の非立体障害基でさらに置換されうる。非ペプチドリンカーの例として、ポリエチレングリコールリンカーも挙げることができ、該リンカーの分子量は１００〜５０００ｋＤ、例えば１００〜５００ｋＤである。
【００５２】
本書において、「１つまたはそれ以上の」アミノ酸置換が規定されるとき、「それ以上」とは、１以上、例えば１〜３０、１〜２０、１〜１０、１〜５、または例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９および３０を意味する。
【００５３】
本書において記載される「第１の」および「第２の」は、単に区別して記載することを目的とするものであって、特別な意味を持つものではない。
【００５４】
本書において記載される「ＡＤＣＣ作用」とは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。ヒトＩｇＧサブクラス（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４）は、異なる生物学的活性（エフェクター機能と呼ばれる）を有する。そのようなエフェクター機能はしばしば、ＦｃγＲ受容体（ＦｃγＲ）との相互作用によって、または補体１（Ｃ１ｑ）サブコンポーネントへの結合によって仲介される。ここで、補体１サブコンポーネントは、免疫グロブリンＧまたは免疫グロブリンＭの重鎖を認識し、それに結合して、古典的補体経路を開始させる。ＦｃγＲへの結合は、抗体依存性の細胞仲介細胞溶解をもたらすことができ、補体因子への結合は、補体仲介細胞溶解、すなわち補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をもたらすことができる。
【００５５】
本書において、用語「含む」は、通常、挙げられている要素について言うが、他の要素を除外するものではない。
【００５６】
用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は互換的に用いられ、最も広い意味において、２つまたはそれ以上のサブユニットのアミノ酸、アミノ酸アナログまたはペプチド模倣体が化合した物を指す。サブユニットは、ペプチド結合によって連結されうる。他の一態様において、サブユニットは、他の結合、例えばエステル、エーテル、アミノ基等によって連結されうる。タンパク質またはポリペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含まなくてはならず、タンパク質またはペプチド配列を構成しうるアミノ酸の最大数に制限はない。本書において、用語「アミノ酸」とは、アミノ酸のＤおよびＬ光学異性体を包含する天然および／または非天然もしくは合成のアミノ酸、例えばグリシン、ＤおよびＬ光学異性体、アミノ酸アナログ、およびペプチド模倣体を指す。
【００５７】
「相同性」または「同一性」または「類似性」とは、２つのペプチド間、または２つの核酸分子間の、配列の類似性をいう。相同性は、比較の目的でアラインすることができる各配列の位置を比較することによって決定することができる。比較する配列中の位置が同じ塩基またはアミノ酸で占められているとき、それら分子は当該位置において相同である。配列間の相同性の程度は、配列間のマッチまたは相同な位置の数によって変化する。本開示の配列の１つに対して、「無関係」または「非相同」の配列は、同一性が４０％未満であるか、または同一性が２５％未満である。
【００５８】
本明細書を通して、ポリペプチド配列比較に関し、用語「少なくとも８０％の配列同一性」が用いられる。この表現は通常、各リファレンス配列に対する配列同一性が少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％であることをいう。
【００５９】
用語「約」は、数値に関して用いられるとき、挙げられる値よりも５％小さい下限値から５％大きい上限値までの範囲の数値を包含することを意図するものである。
【００６０】
用語「融合タンパク質」とは一般に、２つまたはそれ以上のタンパク質またはポリペプチドから導かれるタンパク質を指す。２つまたはそれ以上のタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子または核酸分子を連結して、融合遺伝子または融合核酸分子を形成することができる。融合遺伝子または融合核酸分子は、融合タンパク質をコードしうる。融合遺伝子の翻訳によって、融合前の２つまたはそれ以上のタンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つ、またはその各々の性質を有する、単一のポリペプチドが生成する。組換え融合タンパク質は、生物学的研究または治療のためにＤＮＡ組換え技術によって人為的に作製される。組換え融合タンパク質は、融合遺伝子を遺伝子操作することによって作製される。本発明は、組換え融合タンパク質に関し、本書において用語「融合タンパク質」および「組換え融合タンパク質」は同じ意味で使用される。本書に記載される融合タンパク質は全般に、少なくとも２つのドメイン（ＡおよびＣ）、および場合により第３の成分である、前記２つのドメインの間のリンカーを含む。組換え融合タンパク質の作製は当分野において知られており、そのためには通常、第１のタンパク質またはポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列から終止コドンを除去する。その後、第２のタンパク質のｃＤＮＡ配列を、ライゲーションまたはオーバーラップエクステンションＰＣＲによって、インフレームで付加する。最後に、細胞に、そのＤＮＡ配列を単一のタンパク質として発現させる。タンパク質は、元の２つのタンパク質またはポリペプチドの完全な配列を含むように、またはいずれかにおいて断片のみを含むように、操作することができる。
【００６１】
本明細書および特許請求の範囲において用いられる単数形（"a"、"an"および"the"）は、文脈からそうでないことが明らかでない限り、対象とされる物が複数である場合を包含する。例えば、単数形の用語「薬学的に許容しうる担体」は、その混合物を包含して、複数の薬学的に許容しうる担体を包含する。
【００６２】
「組成物」は通常、２つまたはそれ以上の物質の組み合わせであり、例えば活性物質と他の不活性または活性化合物との組み合わせである。
【００６３】
「医薬組成物」は通常、インビボまたはインビトロもしくはエクスビボでの診断または治療に使用するのに適するように、活性物質を不活性または活性の担体と組み合わせたものを含む。
【００６４】
本発明において、用語「処置有効量」とは通常、対象において処置の利益をもたらすのに必要な活性成分の最低用量を言う。例えば、２型糖尿病、肥満もしくはメタボリックシンドロームを呈するかまたはそれに罹患し易い患者に関しては、または該疾患の発症の防止においては、「処置有効量」とは、該疾患に関連するかまたはそれにより妨げられる、病理学的状態、疾患進行または生理学的状態を、誘導、改善または誘起することができる用量のことである。本発明において、用語「対象」または「患者」はヒトでありうるが、非ヒト動物であってもよく、特に、イヌ、ネコ等のコンパニオンアニマル、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマのような家畜、またはラット、マウス、モルモット等の実験動物でありうる。
【００６５】
本発明において、「ＸｎＹ」なる表現は、配列中のアミノ酸残基置換を説明するとき、配列中の位置ｎにおける残基Ｘが残基Ｙで置換されていることを示す。例えば、「Ｒ１７５Ｌ」というアミノ酸置換は、配列中の位置１７５における残基Ｒが残基Ｌで置換されていることを意味する。
【００６６】
融合タンパク質、製造方法および適用
本発明者は、既知の二重標的融合タンパク質は、二量体解離の問題を完全には回避できないことを見出した。その理由は、２００アミノ酸の鎖の３Ｄ構造において生じる相互作用において、二重標的融合タンパク質Ｆｃの他方の端に対するものが増加することにありうる。したがって、二量体解離の回避のためには、より安定なＩｇＧ４ Ｆｃタンパク質構造が必要である。
【００６７】
本発明者による多大な研究に基づき、驚くべきことに、ＩｇＧ４のＦｃに２つの変異（Ｓ２２８ＰおよびＲ４０９Ｋ）を導入すると、ＩｇＧ４ Ｆｃ部分の構造の安定性が顕著に高まることがわかった。また、該変異Ｆｃは、通常用いられるＦｃと比較して、低減されたＡＤＣＣまたはＣＤＣ作用をもたらす（または該作用を全くもたらさない）ことがわかった。したがって、本発明は、安定性が高く、かつＡＤＣＣ／ＣＤＣ作用の少ない融合タンパク質構造を提供する。
【００６８】
本発明は、一側面において、
Ａ−Ｌ１−Ｂ−Ｌ２−Ｃ  または  Ｃ−Ｌ１−Ｂ−Ｌ２−Ａ
を含むか、またはそれからなる融合タンパク質を提供し、ここで、
Ａは、配列番号１（ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶ  ＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫ  ＥＦＩＡＷＬＶＫＧＧ  Ｇ）のアミノ酸配列、または配列番号１のアミノ酸配列との同一性が少なくとも約８０％、配列番号１のアミノ酸配列との同一性が少なくとも約９０％、配列番号１のアミノ酸配列との同一性が少なくとも約９５％、配列番号１のアミノ酸配列との同一性が少なくとも約９８％、または配列番号１のアミノ酸配列との同一性が少なくとも約９９％であるアミノ酸配列を含むＧＬＰ−１受容体アゴニストであり；
Ｂは、配列番号２（ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰ  ＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰ  ＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫ  ＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥ  ＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱ  ＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹ  ＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ  ＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳ  ＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶ  ＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥ  ＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬ  ＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫ  ＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶ  ＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭ  ＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬ  ＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡ  ＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥ  ＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬ  ＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳ  ＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱ  ＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭ  ＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱ  ＫＳＬＳＬＳＬＧ）のアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列との同一性が少なくとも約９５％、配列番号２のアミノ酸配列との同一性が少なくとも約９８％、または配列番号２のアミノ酸配列との同一性が少なくとも約９９％であるアミノ酸配列を含むＩｇＧ４−Ｆｃ変異体であり、ここで、Ｂは、１０番目のアミノ酸残基としてＰを含み（ＥＵ番号２２８に対応）、１９１番目のアミノ酸残基としてＫを含み（ＥＵ番号４０９に対応）；
Ｃは、配列番号６（ＨＰＩＰＤＳＳＰＬＬ  ＱＦＧＧＱＶＲＱＲＹ  ＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥ  ＡＨＬＥＩＲＥＤＧＴ  ＶＧＧＡＡＤＱＳＰＥ  ＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰ  ＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴ  ＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧ  ＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰ  ＥＡＣＳＦＲＥＲＬＬ  ＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥ  ＡＨＧＬＰＬＨＬＰＧ  ＮＫＳＰＨＲＤＰＡＰ  ＲＧＰＡＲＦＬＰＬＰ  ＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰ  ＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶ  ＧＳＳＤＰＬＳＭＶＧ  ＧＳＱＧＲＳＰＳＹＡ  Ｓ）のアミノ酸配列、または配列番号６のアミノ酸配列との同一性が少なくとも約９０％、配列番号６のアミノ酸配列との同一性が少なくとも約９５％、配列番号６のアミノ酸配列との同一性が少なくとも約９８％、または配列番号６のアミノ酸配列との同一性が少なくとも約９９％であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、ＦＧＦ２１活性を有するＦＧＦ２１であり；
Ｌ１および／またはＬ２は、５〜５０のアミノ酸残基を含み、Ｇを少なくとも５０％含むポリペプチドである。
【００６９】
いくつかの態様において、Ａは配列番号７（ＨＸ１ＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＸ２ＱＡＡＫ  ＥＦＩＡＷＬＸ３Ｘ４ＧＸ５Ｘ６）（配列番号７）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ここで、
Ｘ１は、ＧまたはＶから選択され；
Ｘ２は、ＥまたはＧから選択され；
Ｘ３は、ＶまたはＫから選択され；
Ｘ４は、ＫまたはＮから選択され；
Ｘ５は、ＧまたはＥから選択され；
Ｘ６は、ＧもしくはＰから選択されるか、または存在しない。
【００７０】
他のいくつかの態様において、Ａは配列番号１のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００７１】
いくつかの態様において、Ｂは配列番号８：
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰ  ＣＰＡＰＸ７Ｘ８Ｘ９ＧＧＰ  ＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫ  ＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥ  ＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱ  ＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹ  ＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ  ＴＫＰＲＥＥＱＦＸ１０Ｓ  ＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶ  ＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥ  ＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬ  ＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫ  ＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶ  ＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭ  ＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬ  ＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡ  ＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥ  ＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬ  ＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳ  ＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱ  ＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭ  ＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱ  ＫＳＬＳＬＳＬＧＸ１１（配列番号８）
のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ここで、
Ｘ７は、ＰまたはＥから選択され；
Ｘ８は、Ｆ、ＶまたはＡから選択され；
Ｘ９は、Ｌ、ＥまたはＡから選択され；
Ｘ１０は、ＮまたはＡから選択され；
Ｘ１１は、Ｋまたは不存在から選択される。
【００７２】
他のいくつかの態様において、Ｂは配列番号２のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００７３】
いくつかの態様において、Ｃは配列番号９：
ＨＰＩＰＤＳＳＰＬＬ  ＱＦＧＧＱＶＲＱＲＹ  ＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥ  ＡＨＬＥＩＲＥＤＧＴ  ＶＧＧＡＸ１２ＤＱＳＰＥ  ＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰ  ＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴ  ＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧ  ＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰ  ＥＡＣＳＦＲＥＸ１３ＬＸ１４  ＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥ  ＡＨＧＬＰＬＨＸ１５ＰＧ  ＮＫＳＰＨＲＤＰＡＰ  ＲＧＰＸ１６ＲＦＬＰＬＰ  ＧＬＰＰＡＬＰＥＰＸ１７  Ｘ１８Ｘ１９ＬＡＰＱＰＰＤＶ  ＧＳＳＤＰＬＸ２０ＭＶＸ２１  Ｘ２２Ｘ２３ＱＧ  Ｘ２４ＳＰＳＸ２５Ｘ２６  Ｓ（配列番号９）
のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ここで、
Ｘ１２は、Ａ、Ｋ、Ｒ、ＥまたはＱから選択され；
Ｘ１３は、Ｌ、Ｄ、Ｒ、Ｅ、Ｑ、ＫまたはＴから選択され；
Ｘ１４は、ＬまたはＫから選択され；
Ｘ１５は、ＬまたはＣから選択され；
Ｘ１６は、ＡまたはＣから選択され；
Ｘ１７は、ＰまたはＡから選択され；
Ｘ１８は、ＧまたはＡから選択され；
Ｘ１９は、ＩまたはＶから選択され；
Ｘ２０は、Ｓ、Ｈ、ＣまたはＲから選択され；
Ｘ２１は、Ｇ、Ｅ、Ａ、ＤまたはＳから選択され；
Ｘ２２は、Ｐ、Ａ、Ｅ、Ｑ、Ｗ、Ｃ、ＧまたはＴから選択され；
Ｘ２３は、Ｓ、Ｌ、ＶまたはＭから選択され；
Ｘ２４は、Ｒ、Ｌ、ＨまたはＰから選択され；
Ｘ２５は、Ｙ、Ｓ、ＡまたはＦから選択され；
Ｘ２６は、Ａ、Ｓ、ＥまたはＧから選択される。
【００７４】
他のいくつかの態様において、Ｃはさらに、
ａ）８アミノ酸残基以下のアミノ末端トランケーション；
ｂ）１２アミノ酸残基以下のカルボキシ末端トランケーション；
ｃ）８アミノ酸残基以下のアミノ末端トランケーション、および１２アミノ酸残基以下のカルボキシ末端トランケーション；または
ｄ）６アミノ酸残基以下のカルボキシ末端伸長
を含む。
【００７５】
いくつかの態様において、Ｌ１および／またはＬ２は、１、２または３のＧリッチポリペプチドを含み、いくつかの態様において、Ｌ１および／またはＬ２は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳまたはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３）またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡから選択される。
【００７６】
いくつかの態様において、融合タンパク質はホモ二量体である。
他のいくつかの態様において、融合タンパク質は非ホモ二量体である。
【００７７】
天然のＦＧＦ２１分子は、プロテアーゼによる加水分解を受け易い部位を有し、インビボでのその半減期は非常に短い。ＦＧＦ２１の３次元構造は解明されていないので、研究者は、より長い半減期を持つようにその構造を改変するさまざまな試みを行っている。そのような試みは、天然のアミノ酸配列に基づく、アミノ酸のトランケーション、伸長、置換、挿入または欠失を包含する。部位を１つ１つ変異させて、活性および半減期に影響する重要なコア部分を見出そうとしている研究者もいる。
【００７８】
本発明は、ＧＬＰ−１およびＦＧＦ２１の二重標的融合タンパク質であって、既に知られている融合タンパク質とは異なる変異部位を有するものを提供する。本発明者は予想外にも、本発明が提供する融合タンパク質は、より長い半減期を有し、１週間を超える期間で投与しうることを見出した。さらに有益なことには、本発明の融合タンパク質は、相乗作用を示し、顕著に安定した血糖低下作用を示し、脂質低下および体重減少という良好な生物学的活性を示す。
【００７９】
本発明は他の一側面において、
Ａ−Ｌ１−Ｂ−Ｌ２−Ｃ
を含むか、またはそれからなる、ホモ二量体融合タンパク質を提供し、ここで、
Ａは、配列番号１０（ＨＸ１ＥＧＴＦＴＳＤＶ  ＳＳＹＬＥＸ２ＱＡＡＫ  ＥＦＩＡＷＬＶＫＧＸ５Ｇ）のアミノ酸配列を含むＧＬＰ−１受容体アゴニストであり、ここで、Ｘ１は、ＧまたはＶから選択され、Ｘ２は、ＥまたはＧから選択され、Ｘ５は、ＧまたはＥから選択され；
Ｂは、配列番号１１（ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰ  ＣＰＡＰＥＸ８Ｘ９ＧＧＰ  ＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫ  ＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥ  ＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱ  ＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹ  ＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ  ＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳ  ＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶ  ＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥ  ＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬ  ＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫ  ＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶ  ＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭ  ＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬ  ＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡ  ＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥ  ＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬ  ＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳ  ＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱ  ＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭ  ＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱ  ＫＳＬＳＬＳＬＧＸ１１）を含むＩｇＧ４−Ｆｃバリアントであり、ここで、Ｘ８は、Ｆ、ＶまたはＡから選択され、Ｘ９は、Ｌ、ＥまたはＡから選択され、Ｘ１１は、Ｋまたは不存在から選択され；
Ｃは、配列番号１２（ＨＰＩＰＤＳＳＰＬＬ  ＱＦＧＧＱＶＲＱＲＹ  ＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥ  ＡＨＬＥＩＲＥＤＧＴ  ＶＧＧＡＶＤＱＳＰＥ  ＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰ  ＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴ  ＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧ  ＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰ  ＥＡＣＳＦＲＥＸ１３ＬＬ  ＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥ  ＡＨＧＬＰＬＨＬＰＧ  ＮＫＳＰＨＲＤＰＡＰ  ＲＧＰＡＲＦＬＰＬＰ  ＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰ  ＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶ  ＧＳＳＤＰＬ  Ｘ２０ＭＶＧ  Ｘ２２ＳＱＧ  Ｘ２４２４ＳＰＳＸ２５Ａ  Ｓ）を含むＦＧＦ２１であり、ここで、Ｘ１３は、Ｌ、Ｄ、Ｒ、Ｅから選択され、Ｘ２０は、Ｓ、ＨまたはＣから選択され、Ｘ２２は、ＡまたはＧから選択され、Ｘ２４は、Ｒ、ＬまたはＰから選択され、Ｘ２５の位置におけるアミノ酸変異は、Ｙ、Ｓ、Ｆから選択され；
Ｌ１および／またはＬ２は、５〜５０のアミノ酸残基を含み、Ｇを少なくとも５０％含むポリペプチドである。
【００８０】
いくつかの態様において、Ａは、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
いくつかの態様において、Ｂは、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００８１】
いくつかの態様において、ホモ二量体融合タンパク質は、配列番号５、１７、１８、１９、２０、２１のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００８２】
本発明は他の一側面において、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態、またはｃＤＮＡおよび合成ＤＮＡを包含するＤＮＡの形態でありうる。ＤＮＡは、２本鎖または１本鎖でありうる。本発明のタンパク質をコードする配列は、遺伝暗号の冗長性または縮重のために、異なりうる。本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下のものを含みうる：タンパク質をコードする配列のみ；タンパク質をコードする配列および他のコード配列、例えばリーダーもしくは分泌配列またはプレタンパク質配列；タンパク質をコードする配列および非コード配列、例えばイントロンまたはタンパク質コード配列の５’および／または３’非コード配列。用語「タンパク質をコードするポリヌクレオチド」は、タンパク質をコードする配列だけでなく他のコード配列および／または非コード配列をも含みうるポリヌクレオチドを包含する。
【００８３】
本発明はさらなる側面において、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。発現ベクターは通常、宿主生物中で、宿主の染色体ＤＮＡとは別のものとして、または宿主の染色体ＤＮＡと一体化された部分として、複製する。通常、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能にするように、テトラサイクリン、ネオマイシンおよびジヒドロ葉酸レダクターゼのような選択マーカーを含む。
【００８４】
本発明はさらなる側面において、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明の二重標的タンパク質は、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ、ＮＳＯ、ＨＥＫ２９３もしくはＣＯＳ細胞において、または細菌細胞、例えば大腸菌、枯草菌、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescence）において、または真菌もしくは酵母細胞において、容易に製造することができる。宿主細胞（例えばＨＥＫ２９３）は、当分野で知られる方法で培養される。
【００８５】
本発明はさらなる側面において、本発明のベクターを宿主細胞中で発現させることを含む、本発明の融合タンパク質を製造する方法を提供する。関心のポリヌクレオチド配列（例えば、二重標的融合タンパク質および発現調節の配列）を含むベクターを、宿主細胞に周知の方法で導入することができる。そのような方法は、宿主細胞の種類に応じて異なる。例えば、原核生物細胞に対しては塩化カルシウムによる形質転換が広く行われ、他の宿主細胞に対してはリン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションが用いられうる。
【００８６】
本発明はさらなる一側面において、本発明の融合タンパク質の、医薬組成物の製造における使用が提供され、該医薬組成物は、本発明の融合タンパク質、および少なくとも１つの薬学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤を含む。いくつかの態様において、該医薬は、代謝疾患の処置のために用いられる。いくつかの態様において、代謝疾患は、糖尿病、例えば２型糖尿病である。他のいくつかの態様において、代謝疾患は肥満症である。他のいくつかの態様は、代謝異常、例えば脂質異常症、高血圧症、脂肪肝（例えば非アルコール性脂肪肝（ＮＡＳＨ））、心血管疾患（例えばアテローム性動脈硬化症および老化）を包含する。
【００８７】
実施例
本発明は以下の実施例によってさらに理解されるが、実施例は本発明の例に過ぎない。そのような例示される態様は、本発明のある１つの側面を説明することを意図したものに過ぎないので、それによって本発明の範囲が限定されるものではない。機能的に等価ないずれの方法も、本発明の範囲に含まれる。本書に記載されるものに加えて、本発明のさまざまな変化形が、上記の説明および図面から当業者には明らかになるであろう。そのような変化形も特許請求の範囲に含まれる。
【実施例１】
【００８８】
ベクターの構築
融合タンパク質キャリアを、分子クローニング法を用いて調製した。融合タンパク質の変異および配列を表１に示す。
【表１】
2020509761.tif 000004
【００８９】
デュラグルチドおよびＳ１Ｆ１融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、Kingsbury Biotechnology Co., Ltd. によって化学的方法で合成された。Ｄ１Ｆ１融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ＧＬＰ−１およびＦｃ−ＦＧＦ２１をそれぞれコードするヌクレオチド配列のフラグメントをＳＯＥ−ＰＣＲ法で連結することによって得、ＧＬＰ−１およびＦｃ−ＦＧＦ２１をそれぞれコードするヌクレオチド配列は、鋳型としてデュラグルチドおよびＳ１Ｆ１融合タンパク質ヌクレオチド配列を用い、プライマーを設計して、ＰＣＲによって得た。
【００９０】
Ｄ１Ｆ２、Ｄ２Ｆ１、Ｄ３Ｆ１、Ｄ４Ｆ１、Ｄ５Ｆ１、Ｄ６Ｆ１およびＤ７Ｆ１融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、Suzhou Genewiz Biological Technology Co., Ltdによって化学的方法で合成された。
【００９１】
ヌクレオチド配列およびベクタープラスミドｐｃＤＮＡ３．４を、３７℃でエンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ（TAKARA, Japan）により切断した。切断産物を、Gel Extraction Kit（OMEGA, America）を製造者の指示書にしたがって用いる精製によって回収した。精製した標的遺伝子を、DNA Ligation Kit Ver.2.1（TAKARA, Japan）を製造者の指示書にしたがって用いてベクターとライゲートし、１６℃で１時間インキュベートして、組換え発現プラスミドを得た。
【００９２】
上記組換えプラスミドをＤＨ５ａコンピテントセルに導入した。細菌をアンピシリンプレートに適用した。該プレート上のモノクローナルを採取し、１ｍｌのＬＢ培地（ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌおよび寒天２％、抗生物質含量１００ｇ／ｍＬ）中で、プラスミドの抽出のために培養した。配列決定および確認の後、一連の確認された正しい発現ベクターを、Invitrogen Plasmid Kitを用いて抽出し、制限酵素ＰｖｕＩ（TAKARA, Japan）で切断した。線状化の後、生成物をエタノール沈殿法で精製し、使用するまで−２０℃で貯蔵した。
【実施例２】
【００９３】
細胞におけるコード化デュラグルチドベクターのトランスフェクションおよび発現
CHOK1SV GS-KO（Lonza）宿主細胞をCD CHO培地（gibco）に再懸濁した後、約８×１０５細胞／ｍＬの細胞密度で細胞を収集しトランスフェクトした。細胞数約１×１０７で細胞をトランスフェクトし、ベクターは約４０μｇであり、トランスフェクションは電気ショックによった（Bio-Rad, Gene PulS Xcell）。ショックを与えた後、細胞を２０ｍＬのCD CHO培地中で培養した。培養の２日目に、細胞を２００ｇで１０分間の遠心処理によって収集した。ＭＳＸ（sigma）の添加によって５０μｇの終濃度とした２０ｍＬのCD CHO培地に細胞を再懸濁して培養した。細胞の密度が約０．６×１０６細胞／ｍＬに達したら、得られたクローン混合物をCD CHO培地で継代した。継代細胞密度は約０．２×１０６細胞／ｍＬであった。細胞の生存度が約９０％の時点で、細胞培養液を収集した。
【実施例３】
【００９４】
細胞におけるＳ１Ｆ１およびＤ１Ｆ１、Ｄ１Ｆ２、Ｄ２Ｆ１、Ｄ３Ｆ１、Ｄ４Ｆ１、Ｄ５Ｆ１、Ｄ６Ｆ１、Ｄ７Ｆ１融合タンパク質ベクターのトランスフェクションおよび発現
ＨＥＫ２９３Ｆ宿主細胞（Invitrogen, Freestyle 293F）を293 Expression Medium（Invitrogen）に再懸濁した後、約１×１０６細胞／ｍＬの細胞密度で細胞を収集しトランスフェクトした。FreeStyle（商標）MAX Reagent Transfection Kitを用いて細胞をトランスフェクトした。約３×１０７の細胞が存在し、ベクターは約３７．５μｇであった。トランスフェクション後、細胞を３０ｍＬの293 Expression Medium中で培養した。培養の２日目に、ゲネチシン（merck）による形質転換体のスクリーニングを開始した。細胞増殖による必要に応じて、スクリーニングのための培地を３〜５日置きに交換した。約１４日の選抜の後、耐性クローンが出現し、これを増殖させることができた。細胞継代密度は約０．５×１０６細胞／ｍＬであった。得られたクローン混合物を、293 Expression Mediumで継代培養した。細胞生存率が約９０％の時点で、細胞培養液を収集した。
【実施例４】
【００９５】
収集した細胞培養液からのタンパク質の精製
実施例２および３に記載される８つの融合タンパク質の翻訳レベルを調べた。収集した細胞培養培地を、プロテインＡクロマトグラフィー（EzFast Protein A Diamond, Bestchrom）によって精製した。平衡化溶液は、２０ｍＭ ＰＢＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４であった。融合タンパク質デュラグルチドおよびＳ１Ｆ１を、０．１Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ３．２±０．２で溶出した。Ｄ１Ｆ１、Ｄ１Ｆ２、Ｄ２Ｆ１、Ｄ３Ｆ１、Ｄ４Ｆ１、Ｄ５Ｆ１、Ｄ６Ｆ１、Ｄ７Ｆ１融合タンパク質を、０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．２±０．２で溶出した。目的の溶出液を目的の吸収ピークにおいて収集し、ＰＢＳ緩衝液に対して透析し、サンプルの一部を質量分析に付した。質量分析による分子量実測値は、分子量理論値と一致し、融合タンパク質はホモ二量体の形態であった。融合タンパク質は目的の融合タンパク質であることが確認された。収集したサンプルはまた、還元および非還元で、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により分析した。電気泳動により、理論値と一致するバンドサイズを有する単一のバンドが示された。
【実施例５】
【００９６】
融合タンパク質刺激によりＨＥＫ２９３／ＧＬＰ−１Ｒ／ＫＬＢ細胞モデルにおいて産生されたｃＡＭＰの検出
試験融合タンパク質で刺激したＧＬＰ−１Ｒ／ＫＬＢＧＬＰ−１発現ＨＥＫ２９３細胞は、ｃＡＭＰを産生した。ｃＡＭＰアッセイキット（Cisbio 62AM6PEC）を使用して、融合タンパク質の濃度、および刺激により産生されたｃＡＭＰの量を、試験化合物のインビトロ活性を評価する用量応答曲線を作製するために測定した。デュラグルチドおよびＤ３Ｆ１融合タンパク質群を含む、２つの融合タンパク質を試験した。ｃＡＭＰ試験の結果を、図２および表２に示す。
【００９７】
【表２】
2020509761.tif 000005
【実施例６】
【００９８】
マイクロカロリメトリー示差走査型カロリメトリー（ＤＳＣ）による、融合タンパク質の安定性に対する、Ｆｃ４０９のＲからＫへの変異の効果の試験
実施例４において得た融合タンパク質Ｄ１Ｆ１、Ｄ１Ｆ２、Ｄ６Ｆ１およびＤ７Ｆ１をそれぞれ、ブランク緩衝系（２０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で１ｍｇ／ｍｌに希釈し、５００μＬを採りＤＳＣ（Microcal vp-Capillary DSC）分析に付した。走査温度は２０℃から１００℃で、加熱速度は１℃／分であった。マイクロカロリメトリー走査型カロリメトリーの結果を図３に示す。Origin（商標）を用いるフィッテイングにより得られたＴｍ値を表３に示す。
【００９９】
【表３】
2020509761.tif 000006
【０１００】
相転移温度Ｔｍが高いほど、分子の安定性が大きい。上記結果からわかるように、Ｄ７Ｆ１、Ｄ６Ｆ１およびＤ１Ｆ１のサンプルのＴｍ１値およびＴｍ２値はほぼ同じであり、このことは、これら３つのタンパク質の安定性はかなり同じ程度であることを示している。Ｄ１Ｆ２のＴｍ１値は他の３つのサンプルとほぼ同じであるが、Ｄ１Ｆ２のＴｍ２値は他のサンプルのＴｍ２値よりも顕著に低い。Ｄ１Ｆ１およびＤ１Ｆ２タンパク質の構造解析により、主な相違はＩｇＧ４ ＦｃのＣＨ３ドメインにおける４０９位アミノ酸ＲのＫへの変異であり、この変異が、Ｄ１Ｆ１にＤ１Ｆ２よりも顕著に高いＴｍ２をもたらしたと結論付けることができる。上記結果により、Ｄ１Ｆ１においてＩｇＧ４ ＦｃのＣＨ３ドメインにおける４０９位ＲがＫに変異されていることにより、該ドメインのＴｍ値が高められ、したがってタンパク質の安定性が高められたことが示された。
【実施例７】
【０１０１】
融合タンパク質の血糖低下作用に対する、ＲからＫへのＦｃ４０９変異の効果の検討
ｄｂ／ｄｂマウスモデル（Institute of Model Animal Science, Nanjing University）において融合タンパク質の効果を調べた。マウスを無作為に、ブランク群、Ｄ１Ｆ１群およびＤ１Ｆ２群を含む３群に分けた。各ｄｂ／ｄｂマウスに２４．５ｎＭ／ｋｇの融合タンパク質を注射した。投与体積は１０ｍｌ／ｋｇであった。融合タンパク質毎に７匹のマウスを用い、投与は１回の注射によって行い、いくつかの時点で血中グルコースレベルを測定した。結果を表４に示す。ＩｇＧ４ Ｆｃの４０９位をＫに変異した結果、血糖低下作用の持続時間を延長することができた。
【０１０２】
【表４】
2020509761.tif 000007
【実施例８】
【０１０３】
ｄｂ／ｄｂマウスモデルにおけるデュラグルチド、Ｓ１Ｆ１、Ｄ１Ｆ１の血糖低下作用の検討
融合タンパク質の効果をｄｂ／ｄｂマウスモデル（Institute of Model Animal Science, Nanjing University）において試験した。試験において、一連の精製融合タンパク質を１０ｍＭ  ＰＢＳで希釈した。マウスを無作為に、ブランク群、デュラグルチド群、Ｓ１Ｆ１群およびＤ１Ｆ１群を含む４群に分けた。各ｄｂ／ｄｂマウスに４０ｎＭ／ｋｇの融合タンパク質を注射した。投与体積は３ｍｌ／ｋｇであった。融合タンパク質毎に１０匹のマウスを用い、２週間にわたり週１回の注射を行った。投与後のサンプル血中グルコースの変化の結果を、図４に示す。Ｄ１Ｆ１群は顕著に優れた血糖低下を示し、その血糖低下曲線は、デュラグルチドおよびＳ１Ｆ１群のいずれのものよりも安定していた。
【実施例９】
【０１０４】
ｄｂ／ｄｂマウスモデルにおけるＤ１Ｆ１、Ｄ２Ｆ１、Ｄ７Ｆ１の血糖低下作用の検討
融合タンパク質の効果をｄｂ／ｄｂマウスモデル（Institute of Model Animal Science, Nanjing University）において試験した。マウスを無作為に、ブランク群（１０ｍＭ ＰＢＳ）、Ｄ１Ｆ１群、Ｄ２Ｆ１群およびＤ７Ｆ１群を含む４群に分けた。各ｄｂ／ｄｂマウスに２４．５ｎＭ／ｋｇの融合タンパク質（１０ｍＭ ＰＢＳで希釈）を注射した。投与体積は１０ｍｌ／ｋｇであった。融合タンパク質毎に７匹のマウスを用い、注射は１回行い、いくつかの時点で血中グルコースレベルを測定した。結果を、図５に示す。Ｄ１Ｆ１およびＤ２Ｆ１がＤ７Ｆ１よりも優れた血糖低下作用を有することが示された。
【実施例１０】
【０１０５】
ｄｂ／ｄｂマウスモデルにおけるＤ３Ｆ１、Ｄ４Ｆ１、Ｄ５Ｆ１の血糖低下作用の検討
融合タンパク質の効果をｄｂ／ｄｂマウスモデル（Institute of Model Animal Science, Nanjing University）において試験した。試験において、一連の精製融合タンパク質を１０ｍＭ  ＰＢＳで希釈した。マウスを無作為に、ブランク群（１０ｍＭ ＰＢＳ）、Ｄ３Ｆ１群、Ｄ４Ｆ１群およびＤ５Ｆ１群を含む４群に分けた。各ｄｂ／ｄｂマウスに３０ｎＭ／ｋｇの融合タンパク質（１０ｍＭ ＰＢＳで希釈）を注射した。投与体積は１０ｍｌ／ｋｇであった。融合タンパク質毎に９匹のマウスを用い、２週間にわたり週１回の注射を行った。投与後のサンプル血中グルコースの変化の結果を、図６に示す。Ｄ３Ｆ１、Ｄ４Ｆ１およびＤ５Ｆ１は、より優れた血糖低下作用を示した。
【実施例１１】
【０１０６】
ｄｂ／ｄｂマウスモデルにおけるデュラグルチド、Ｓ１Ｆ１、Ｄ１Ｆ１の脂質低下作用の検討
ｄｂ／ｄｂモデルマウス（Institute of Model Animal Science, Nanjing University）を無作為に、ブランク群（１０ｍＭ ＰＢＳ）、デュラグルチド群、Ｓ１Ｆ１群およびＤ１Ｆ１群を含む４群に分けた。各ｄｂ／ｄｂマウスに４０ｎＭ／ｋｇの融合タンパク質（１０ｍＭ ＰＢＳで希釈）を注射した。投与体積は３ｍｌ／ｋｇであった。融合タンパク質毎に１０匹のマウスを用い、２週間にわたり週１回の注射を行った。最初の投与から１４日後にすべてのマウスを殺し、血中総コレステロール（ＴＣＨＯ）量（図７）およびトリグリセリド（ＴＧ）量（図８）を測定した。Ｄ１Ｆ１は、Ｓ１Ｆ１群およびデュラグルチド群よりも、総コレステロールおよびトリグリセリド量の低下能力に優れていた。
【実施例１２】
【０１０７】
ｄｂ／ｄｂマウスモデルにおけるＤ１Ｆ２、Ｄ２Ｆ１およびＤ７Ｆ１の脂質低下作用の検討
ｄｂ／ｄｂモデルマウス（Institute of Model Animal Science, Nanjing University）を無作為に、ブランク群（１０ｍＭ ＰＢＳ）、Ｄ１Ｆ２群、Ｄ２Ｆ１群およびＤ７Ｆ１群を含む４群に分けた。各ｄｂ／ｄｂマウスに２４．５ｎＭ／ｋｇの融合タンパク質（１０ｍＭ ＰＢＳで希釈）を注射した。投与体積は１０ｍｌ／ｋｇであった。融合タンパク質毎に７匹のマウスを用い、注射は１回行った。単回投与後１４日間の血清トリグリセリド（ＴＧ）試験の結果を図９に、総コレステロール（ＴＣ）量の結果を図１に、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ−Ｃ）量の結果を図１に、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ−Ｃ）量の結果を図１２に示す。Ｄ１Ｆ２およびＤ２Ｆ１群は、天然のＦＧＦ２１配列を含むＤ７Ｆ１よりも高いトリグリセリド低下作用を示した。Ｄ２Ｆ１は、ＩｇＧ４ Ｆｃの４０９位が変異されていないＤ１Ｆ２よりも高いトリグリセリドおよび総コレステロール低下作用を示した。
【実施例１３】
【０１０８】
ｄｂ／ｄｂマウスモデルにおけるＤ３Ｆ２、Ｄ４Ｆ１、Ｄ５Ｆ１の脂質低下作用の検討
ｄｂ／ｄｂモデルマウス（Institute of Model Animal Science, Nanjing University）を無作為に、ブランク群（１０ｍＭ ＰＢＳ）、Ｄ３Ｆ１群、Ｄ４Ｆ１群およびＤ５Ｆ１群を含む４群に分けた。各ｄｂ／ｄｂマウスに３０ｎＭ／ｋｇの融合タンパク質（１０ｍＭ ＰＢＳで希釈）を注射した。投与体積は３ｍｌ／ｋｇであった。融合タンパク質毎に９匹のマウスを用い、２週間にわたり週１回の注射を行った。最初の投与から１４日後の血清トリグリセリド（ＴＧ）の結果を図１３に示す。総コレステロール（ＴＣＨＯ）の結果を図１４に示す。低密度リポタンパク質（ＬＤＬ−Ｃ）の結果を図１５に示す。
【実施例１４】
【０１０９】
ｄｂ／ｄｂマウスモデルにおけるデュラグルチド、Ｓ１Ｆ１、Ｄ１Ｆ１の体重減少作用の検討
ｄｂ／ｄｂモデルマウス（Institute of Model Animal Science, Nanjing University）を無作為に、ブランク群（１０ｍＭ ＰＢＳ）、デュラグルチド群、Ｓ１Ｆ１群およびＤ１Ｆ１群を含む４群に分けた。各ｄｂ／ｄｂマウスに４０ｎＭ／ｋｇの融合タンパク質（１０ｍＭ ＰＢＳで希釈）を注射した。投与体積は３ｍｌ／ｋｇであった。融合タンパク質毎に１０匹のマウスを用い、２週間にわたり週１回の注射を行った。投与後、毎日体重を測定した。結果を図１６に示す。
【実施例１５】
【０１１０】
デュラグルチド、Ｄ１Ｆ１の薬物動態の検討
雄ＩＣＲマウス（Hunan Si Lake）を３匹ずつの２群に分けた。各マウスに、１０ｎｍｏｌ／ｋｇのデュラグルチド、または１０ｎｍｏｌ／ｋｇのＤ１Ｆ１（１０ｍＭ ＰＢＳで希釈）を皮下注射した。投与前および投与後１、５、７、２４、４８、９６、１４４、１９２、２４０、２８８時間の各時点で、静脈血を後眼窩静脈叢から採取した。抗ＧＬＰ−１抗体（Bioporto, CAT.NO. ABS 033-10）を捕捉抗体として使用し、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（Southern Biotech, CAT.NO. 9200-05）を検出抗体として使用して、ＥＬＩＳＡ法により薬物動態パラメータを測定した。結果を表５に示す。
【０１１１】
【表５】
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【０１１２】
Ｄ１Ｆ２融合タンパク質の平均血漿暴露（ＡＵＣlast）およびＣｍａｘは、デュラグルチドのものよりも有意に高かった。このことは、ＦＧＦ２１との融合によって、融合タンパク質の吸収が高められうることを示している。ＭＲＴlastは、薬物分子の平均体内保持時間を示し、これは、マウスにおいてＤ１Ｆ１およびデュラグルチドの両方で同等であった。
【実施例１６】
【０１１３】
ｏｂ／ｏｂマウスモデルにおける、デュラグルチド、Ｄ５Ｆ１の薬物動態の検討
ｏｂ／ｏｂモデル（Institute of Model Animal Science, Nanjing University）を無作為に、ブランク群（１０ｍＭ ＰＢＳ）、Ｄ５Ｆ１  １０ｎｍｏｌ／ｋｇ群、Ｄ５Ｆ１  ２０ｎｍｏｌ／ｋｇ群およびデュラグルチド２０ｎｍｏｌ／ｋｇ群（１０ｍＭ ＰＢＳで希釈）を含む４群に分けた。投与体積は３ｍｌ／ｋｇであった。融合タンパク質毎に９匹のマウスを用い、連続する３週にわたり週２回の注射を行った。各投与についてのサンプル血中グルコース試験の結果を図１７に示す。デュラグルチドと比べて、Ｄ５Ｆ１はより良好な血糖低下作用を示し、Ｄ５Ｆ１群の血糖低下曲線はより安定していた。最後の投与から２日後に１６時間にわたり眼窩から採血し、血清を収集した。血清グルコースをモニターした（結果を図１８に示す）。切開して肝臓の重量を測定した（結果を図１９に示す）。肝臓重量の結果によると、Ｄ５Ｆ１群においては脂肪肝の改善がより大きかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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