(57)【要約】  本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む単離された非天然タンパク質であって、８、４７、２０９および／または３５４位のアミノ酸が、配列番号１の前記配列中のその位置に示されたアミノ酸とは異なる任意のアミノ酸によって置換されている、単離された非天然タンパク質に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＳＶ  Ｉｎｄｉａｎａ株の細胞外ドメインのアミノ酸配列である、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む単離された非天然タンパク質であって、
配列番号１の配列中の最初のアミノ酸の位置からナンバリングされる、８、４７、２０９および３５４位の少なくとも１個のアミノ酸が、配列番号１の前記配列中のその位置に示されたアミノ酸とは異なるアミノ酸によって置換されており、
８位での置換が、Ｙを除く、配列番号１の前記配列中のその位置に示されたアミノ酸とは異なる任意のアミノ酸によるものであり、且つ
２０９位での置換が、Ｈを除く、配列番号１の前記配列中のその位置に示されたアミノ酸とは異なる任意のアミノ酸によるものである、前記単離された非天然タンパク質であるか、
或いは
少なくとも１個のアミノ酸の置換、付加または欠失によって配列番号１に記載の前記タンパク質から誘導される任意の相同タンパク質であって、但し、誘導されるタンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を保持し、且つ前記誘導されるタンパク質が、膜融合を誘導する能力を保持し、且つＬＤＬ膜受容体と相互作用する能力を保持し、
配列番号１の前記配列の８、４７、２０９および３５４位と等価な位置に位置する前記相同タンパク質の少なくとも１個のアミノ酸が、配列番号１の配列中のその位置に示されたアミノ酸とは異なるアミノ酸によって置換されており、
８位と等価な位置に位置するアミノ酸の置換が、Ｙを除く、配列番号１の配列中のその位置に示されたアミノ酸とは異なる任意のアミノ酸によるものであり、且つ
２０９位と等価な位置に位置するアミノ酸の置換が、Ｈを除く、配列番号１の配列中のその位置に示されたアミノ酸とは異なる任意のアミノ酸によるものである、前記相同タンパク質であって、
前記単離された非天然タンパク質が、膜融合を誘導する能力を保持し、且つＬＤＬ膜受容体と相互作用することができない、
前記単離された非天然タンパク質または相同タンパク質。
【請求項２】
以下のアミノ酸配列：
−  配列番号１５〜２０；
−  配列番号２１〜２６；
−  配列番号２７〜３２；
−  配列番号３３〜３８；
−  配列番号３９〜４４；
−  配列番号４５〜５０；および
−  配列番号５１〜５６
のうちの１つを含む、請求項１に記載の単離された非天然タンパク質。
【請求項３】
４７位または３５４位、または４７位と３５４位の両方のアミノ酸が、ＫまたはＲを除く任意のアミノ酸、特に、Ａ、Ｇ、ＦまたはＱ、好ましくは、ＡまたはＱによって置換されている、請求項１または２に記載の単離された非天然タンパク質。
【請求項４】
８位および／または２０９位のアミノ酸の、配列番号１の配列中のその位置に示されたアミノ酸、または前記相同タンパク質中の等価な位置に示されたアミノ酸とは異なる任意のアミノ酸による置換をさらに含む、請求項３に記載の単離された非天然タンパク質。
【請求項５】
８位のアミノ酸が、ＨまたはＱまたはＹを除く任意のアミノ酸によって置換されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離された非天然タンパク質。
【請求項６】
２０９位のアミノ酸が、ＹまたはＨを除く任意のアミノ酸によって置換されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離された非天然タンパク質。
【請求項７】
配列番号５７〜１５４のアミノ酸配列の１つを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離された非天然タンパク質。
【請求項８】
１９２〜２０２位、または
２４０〜２５７位、または
３４７〜３５３位、または
３６４〜３６６位、または
３７６〜３７９位
のアミノ酸の間にペプチドの挿入をさらに含み、
前記ペプチドが、配列番号１に記載のタンパク質とは異なるペプチドに由来する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離された非天然タンパク質。
【請求項９】
１位または３５１位と３５２位のアミノ酸の間にペプチドの挿入をさらに含み、前記ペプチドが、配列番号１に記載のタンパク質とは異なるタンパク質に由来する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離された非天然タンパク質。
【請求項１０】
前記ペプチドが、細胞受容体のリガンドの少なくとも一部、好ましくは、ナノボディ、例えば、抗ＨＥＲ２ナノボディ、抗ＭＵＣ１８ナノボディまたは抗ＰＤ−１ナノボディである、請求項８または９に記載の単離された非天然タンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単離された非天然タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単離された非天然タンパク質を発現する組換えウイルス。
【請求項１３】
請求項１１に記載の核酸分子を含む組換えウイルス。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の非天然タンパク質を含有する、もしくは発現する、または請求項１１に記載の核酸分子を含有する、または請求項１２もしくは１３に記載のウイルスによって感染した真核細胞。
【請求項１５】
薬物としての使用のための、以下：
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のタンパク質；または
請求項１１に記載の核酸分子；
請求項１２もしくは１３に記載のウイルス；または
請求項１４に記載の真核細胞
のうちの少なくとも１つを含む組成物。
【請求項１６】
がんを処置するために使用するための、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
脂質膜を、特定の標的、例えば、細胞、特に、がん細胞などの殺傷しようとする細胞に標的化するための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用であって、前記タンパク質は前記脂質膜に固定される、前記使用。
【請求項１８】
脂質膜を、特定の標的、例えば、細胞、特に、がん細胞などの殺傷しようとする細胞に標的化するための請求項１〜１０のいずれか１項に記載のタンパク質であって、前記脂質膜に固定される、前記タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異型ウイルスタンパク質、特に、腫瘍溶解性ウイルスを起源とする変異型タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）は、ラブドウイルス科のベシクロウイルス属に属する一本鎖エンベロープＲＮＡウイルスである。それは、昆虫、ウシ、ウマおよびブタに感染し得るアルボウイルスである。哺乳動物では、正常細胞を残しながら腫瘍細胞に感染し、これらを殺傷するその能力は、それを、がんの処置のための有望な腫瘍溶解性ウイルスにする（Barber, 2005；Fernandez et al., 2002；Hastie et al., 2013）。
ＶＳＶゲノムは、５つの構造タンパク質をコードし、中でも１回膜貫通型糖タンパク質（Ｇ）をコードする。この糖タンパク質は、アミノ末端のシグナルペプチド、約４５０アミノ酸の細胞外ドメイン、単一のアルファヘリックス膜貫通セグメントおよび小さいウイルス内カルボキシ末端ドメインを有する古典的なＩ型膜糖タンパク質である。シグナルペプチドは、小胞体の内腔で切断され、天然の糖タンパク質は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよびウイルス内ドメインで構成される。
【０００３】
Ｇは、ウイルス感染の初期ステップの間に重要な役割を果たす（Albertini et al., 2012b）。第１に、それは、特定の受容体へのウイルスの結合を担う。結合後、ビリオンは、クラスリン媒介性エンドサイトーシス経路によって細胞に進入する。エンドサイトーシス小胞の酸性環境では、Ｇは、ウイルスとエンドソーム膜との融合を誘発し、感染のその後のステップのために細胞質ゾル中にゲノムを放出する。融合は、両方とも三量体である融合前コンフォメーションから融合後コンフォメーションへの低ｐＨ誘導性の大きな構造変化によって触媒される（Roche et al., 2006；Roche et al., 2007）。
Ｇ細胞外ドメインのポリペプチド鎖は、融合ドメイン（ＦＤ）、プレクストリン相同ドメイン（ＰＨＤ）、および三量体化ドメイン（ＴｒＤ）である３つの異なるドメインに折り畳まれる。構造変化の間も、ＦＤ、ＰＨＤおよびＴｒＤは、その三次構造を保持する。それにも拘わらず、それらは、低ｐＨ誘導性のコンフォメーション変化の間に再び折り畳まれるヒンジセグメント（Ｓ１〜Ｓ５）の二次変化のため、その相対的配向の大きな再配列を受ける（Roche et al., 2006；Roche et al., 2007）。
最近、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬ−Ｒ）およびこの受容体ファミリーの他のメンバーが、ＶＳＶ受容体として働くことが示された（Finkelshtein et al., 2013）。
【０００４】
ＬＤＬ−Ｒは、哺乳動物細胞中でコレステロール恒常性を調節するＩ型膜貫通タンパク質である（Brown and Goldstein, 1986）。ＬＤＬ−Ｒは、血漿循環から、コレステロールを担持するリポタンパク質を除去する。中性ｐＨでＬＤＬ−Ｒによって細胞外で結合したリガンドは、内在化した後、エンドソームの酸性環境に放出され、その後のリソソーム分解をもたらす。次いで、受容体は細胞表面に再循環して戻る。ＬＤＬ−Ｒ細胞外ドメインは、リガンド結合ドメイン、表皮増殖因子（ＥＧＦ）前駆体相同ドメインおよびＯ結合オリゴ糖に富むＣ末端ドメインから構成される。リガンド結合ドメインは、７個のシステインリッチリピート（ＣＲ１〜ＣＲ７、図１）から作られる。各リピートは、約４０個のアミノ酸から作られ、３個のジスルフィド架橋に関与する６個のシステイン残基、およびＣａ2+イオンを配位する酸性残基クラスターを含有する。カーゴの細胞内放出は、開いたコンフォメーションから閉じたコンフォメーションへの、ＬＤＬ−Ｒの低ｐＨ誘導性コンフォメーション変化によって駆動される。
ＬＤＬ−Ｒ遺伝子ファミリーは、細胞表面上に存在する膜貫通受容体からなり、リポタンパク質のエンドサイトーシスによる取込みに関与し、リガンド結合のためにＣａ2+を必要とする。これらの受容体は全て、一般的に、いくつかのＣＲリピート（最大数十個）、ＥＧＦ前駆体様リピート、膜貫通領域および少なくとも１個の内在化シグナル配列を含有する細胞内ドメインを有する。それらは、昆虫を含むあらゆる動物に遍在的に見出される。
ＶＳＶ−Ｇは、他のウイルスを偽型化するために広く使用されてきたが、ＶＳＶ−Ｇ偽型化レンチウイルス（ＶＳＶ−Ｇ−ＬＶ）は、ＶＳＶと同じ広い向性を示す。
他方、ＶＳＶ−Ｇ−ＬＶは、ＬＤＬ−Ｒの発現レベルが非常に低いため、非刺激Ｔ細胞、Ｂ細胞、および造血幹細胞への効率的な遺伝子導入を可能にしない（Amirache et al., 2014）。
ＬＤＬ−Ｒ受容体ファミリーメンバーの遍在的分布のため、ＶＳＶおよびＶＳＶ−Ｇ−ＬＶの広い向性は、その治療的使用を制限する。これは、腫瘍細胞を特異的に標的化したい場合の腫瘍治療に特に当てはまる。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の１つの目的は、この欠点を除去することである。
本発明の１つの目的は、特性の１つが欠損した新しい変異型ＶＳＶ−Ｇタンパク質を提供して、このタンパク質を特異的に標的化することである。
本発明の別の目的は、そのようなタンパク質を発現する新しいＶＳＶおよび腫瘍治療におけるその使用を提供することである。
【０００６】
本発明は、ＶＳＶ  Ｉｎｄｉａｎａ株の細胞外ドメインのアミノ酸配列に一致する（である）、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる単離された非天然タンパク質であって、
配列番号１の配列中の最初のアミノ酸の位置からナンバリングされる、８、４７、２０９および３５４位の少なくとも１個のアミノ酸が、配列番号１の前記配列中のその位置に示されたアミノ酸とは異なるアミノ酸によって置換されている、単離された非天然タンパク質、
または少なくとも１個のアミノ酸の置換、付加または欠失によって配列番号１に記載の前記タンパク質から誘導される任意の相同タンパク質であって、但し、誘導されるタンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を保持し、前記誘導されるタンパク質が、膜融合を誘導する能力を保持し、ＬＤＬ膜受容体と相互作用する能力を保持し、
配列番号１の前記配列の８、４７、２０９および３５４位と等価な位置に位置する前記相同タンパク質の少なくとも１個のアミノ酸が、配列番号１の配列中のその位置に示されたアミノ酸とは異なるアミノ酸によって置換されている、相同タンパク質であり、
前記単離された非天然タンパク質が、膜融合を誘導する能力を保持し、ＬＤＬ膜受容体と相互作用することができない、単離された非天然タンパク質または相同タンパク質に関する。
【０００７】
好ましい実施形態では、本発明の単離された非天然タンパク質の配列番号１中の８位（配列番号１の配列中の最初のアミノ酸の位置からナンバリングされる）、または本発明の配列番号１に記載の前記タンパク質から誘導される相同タンパク質中の等価な位置のアミノ酸は、Ｙ残基であってはならない。
好ましい実施形態では、本発明の単離された非天然タンパク質の配列番号１中の２０９位（配列番号１の配列中の最初のアミノ酸の位置からナンバリングされる）、または本発明の配列番号１に記載の前記タンパク質から誘導される相同タンパク質中の等価な位置のアミノ酸は、Ｈ残基であってはならない。
【０００８】
かくして、換言すれば、本発明は、ＶＳＶ  Ｉｎｄｉａｎａ株の細胞外ドメインのアミノ酸配列に一致する（である）、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む単離された非天然タンパク質であって、
配列番号１の配列中の最初のアミノ酸の位置からナンバリングされる、８、４７、２０９および３５４位の少なくとも１個のアミノ酸が、配列番号１の前記配列中のその位置に示されたアミノ酸とは異なるアミノ酸によって置換され、
８位での置換が、Ｙを除く、配列番号１の前記配列中のその位置に示されたアミノ酸とは異なる任意のアミノ酸によるものであり、
２０９位での置換が、Ｈを除く、配列番号１の前記配列中のその位置に示されたアミノ酸とは異なる任意のアミノ酸によるものである、単離された非天然タンパク質であるか、
または少なくとも１個のアミノ酸の置換、付加または欠失によって配列番号１に記載の前記タンパク質から誘導される任意の相同タンパク質であって、但し、誘導されるタンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を保持し、前記誘導されるタンパク質が、膜融合を誘導する能力を保持し、ＬＤＬ膜受容体と相互作用する能力を保持し、
配列番号１の前記配列の８、４７、２０９および３５４位と等価な位置に位置する前記相同タンパク質の少なくとも１個のアミノ酸が、配列番号１の配列中のその位置に示されたアミノ酸とは異なるアミノ酸によって置換され、
８位と等価な位置に位置するアミノ酸の置換が、Ｙを除く、配列番号１の配列中のその位置に示されたアミノ酸とは異なる任意のアミノ酸によるものであり、
２０９位と等価な位置に位置するアミノ酸の置換が、Ｈを除く、配列番号１の配列中のその位置に示されたアミノ酸とは異なる任意のアミノ酸によるものである、相同タンパク質であり、
前記単離された非天然タンパク質が、膜融合を誘導する能力を保持し、ＬＤＬ膜受容体と相互作用することができない、単離された非天然タンパク質または相同タンパク質に関する。
【０００９】
有利には、本発明は、ＶＳＶ  Ｉｎｄｉａｎａ株の細胞外ドメインのアミノ酸配列に一致する（である）、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる単離された非天然タンパク質であって、
配列番号１の配列中の最初のアミノ酸の位置からナンバリングされる、８位、または４７位、または２０９位、または３５４位、または８位と４７位の両方、または８位と２０９位の両方、または８位と３５４位の両方、または４７位と２０９位の両方、または４７位と３５４位の両方、または２０９位と３５４位の両方、または８位および４７位および２０９位、または８位および４７位および３５４位、または８位および２０９位および３５４位、または４７位および２０９位および３５４位、または８位および４７位および２０９位および３５４位のアミノ酸が、配列番号１に見出されるアミノ酸とは異なる任意のアミノ酸によって置換されている、単離された非天然タンパク質、
または少なくとも１個のアミノ酸の置換、付加または欠失によって配列番号１に記載の前記タンパク質から誘導される任意の相同タンパク質であって、但し、誘導されるタンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を保持し、前記誘導されるタンパク質が、膜融合を誘導する能力を保持し、ＬＤＬ膜受容体と相互作用する能力を保持し、
８位、もしくは４７位、もしくは２０９位、もしくは３５４位、または８位と４７位の両方、または８位と２０９位の両方、または８位と３５４位の両方、または４７位と２０９位の両方、または４７位と３５４位の両方、または２０９位と３５４位の両方、または８位および４７位および２０９位、または８位および４７位および３５４位、または８位および２０９位および３５４位、または４７位および２０９位および３５４位、または８位および４７位および２０９位および３５４位と等価な位置に位置する前記相同タンパク質のアミノ酸が、配列番号１に見出されるアミノ酸とは異なる任意のアミノ酸によって置換され、
特に、８位のアミノ酸が、Ｈを除く、好ましくは、Ｙを除く任意のアミノ酸によって置換され、
４７位のアミノ酸が、Ｋを除く任意のアミノ酸によって置換され、
２０９位のアミノ酸が、Ｙを除く、好ましくは、Ｈを除く任意のアミノ酸によって置換され、
３５４位のアミノ酸が、Ｒを除く任意のアミノ酸によって置換され、
ナンバリングが、配列番号１の配列中の最初のアミノ酸の位置から行われる、相同タンパク質であり、
前記単離された非天然タンパク質が、膜融合を誘導する能力を保持し、ＬＤＬ膜受容体と相互作用することができない、単離された非天然タンパク質または相同タンパク質に関する。
【００１０】
有利には、本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる単離された非天然タンパク質、
2020534007.tif 000002
または少なくとも１個のアミノ酸の置換、付加または欠失によって配列番号１に記載の前記タンパク質から誘導される任意のタンパク質であって、但し、配列番号１に記載の前記タンパク質から誘導される前記タンパク質誘導タンパク質が、上記に示された囲みのアミノ酸を保持し、
８位、もしくは４７位、もしくは２０９位、もしくは３５４位、または８位と４７位の両方、または８位と２０９位の両方、または８位と３５４位の両方、または４７位と２０９位の両方、または４７位と３５４位の両方、または２０９位と３５４位の両方、または８位および４７位および２０９位、または８位および４７位および３５４位、または８位および２０９位および３５４位、または４７位および２０９位および３５４位、または８位および４７位および２０９位および３５４位、または配列番号１に記載の前記タンパク質から誘導されるタンパク質中の対応する位置のアミノ酸が、配列番号１に見出されるアミノ酸とは異なる任意のアミノ酸によって置換され、
特に、８位のアミノ酸が、Ｈを除く、好ましくは、Ｙを除く任意のアミノ酸によって置換され、
４７位のアミノ酸が、Ｋを除く任意のアミノ酸によって置換され、
２０９位のアミノ酸が、Ｙを除く、好ましくは、Ｈを除く任意のアミノ酸によって置換され、
３５４位のアミノ酸が、Ｒを除く任意のアミノ酸によって置換され、
ナンバリングが、配列番号１の配列中の最初のアミノ酸の位置から行われる、任意のタンパク質であり、
前記単離された非天然タンパク質が、膜融合を誘導する能力を保持し、ＬＤＬ膜受容体と相互作用することができない、単離された非天然タンパク質または任意のタンパク質に関する。
【００１１】
有利には、本発明は、ＶＳＶ  Ｉｎｄｉａｎａ株の細胞外ドメインのアミノ酸配列に一致する（である）、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる単離された非天然タンパク質であって、
配列番号１の配列中の最初のアミノ酸の位置からナンバリングされる、４７位、もしくは３５４位、または４７位と３５４位の両方のアミノ酸が、任意のアミノ酸によって、特に、ＫまたはＲを除く任意のアミノ酸によって置換されている、単離された非天然タンパク質、
または少なくとも１個のアミノ酸の置換、付加または欠失によって配列番号１に記載の前記タンパク質から誘導される任意の相同タンパク質であって、但し、誘導されるタンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を保持し、前記誘導されるタンパク質が、膜融合を誘導する能力を保持し、ＬＤＬ膜受容体と相互作用する能力を保持し、
４７位もしくは３５４位、または４７位と３５４位の両方と等価な位置に位置する、前記相同タンパク質のアミノ酸が、任意のアミノ酸、特に、ＫまたはＲを除く任意のアミノ酸によって置換され、
ナンバリングが、配列番号１の配列中の最初のアミノ酸の位置から行われる、相同タンパク質であり、
前記単離された非天然タンパク質が、膜融合を誘導する能力を保持し、ＬＤＬ膜受容体と相互作用することができない、単離された非天然タンパク質または相同タンパク質に関する。
【００１２】
一実施形態では、前記単離された非天然タンパク質は、配列番号１の配列中の最初のアミノ酸の位置からナンバリングされる、８位、または２０９位、または８位と２０９位の両方のアミノ酸の、任意のアミノ酸による置換をさらに含み、
好ましくは、８位のアミノ酸は、ＨまたはＹを除く任意のアミノ酸によって置換され、
好ましくは、２０９位のアミノ酸は、ＨまたはＹを除く任意のアミノ酸によって置換されている。
【００１３】
有利には、本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる単離された非天然タンパク質、
2020534007.tif 000003
または少なくとも１個のアミノ酸の置換、付加または欠失によって配列番号１に記載の前記タンパク質から誘導される任意のタンパク質であって、但し、配列番号１に記載の前記タンパク質から誘導される前記タンパク質誘導タンパク質が、上記に示された囲みのアミノ酸を保持し、
４７位、もしくは３５４位、または４７位と３５４位の両方、または配列番号１に記載の前記タンパク質から誘導されるタンパク質中の対応する位置のアミノ酸が、任意のアミノ酸によって、特に、ＫまたはＲを除く任意のアミノ酸によって置換され、
ナンバリングが、配列番号１の配列中の最初のアミノ酸の位置から行われる、任意のタンパク質であり、
前記単離された非天然タンパク質が、膜融合を誘導する能力を保持し、ＬＤＬ膜受容体と相互作用することができない、単離された非天然タンパク質または任意のタンパク質に関する。
【００１４】
一実施形態では、前記単離された非天然タンパク質は、配列番号１の配列中の最初のアミノ酸の位置からナンバリングされる、８位、または２０９位、または８位と２０９位の両方のアミノ酸の、配列番号１の配列中のその位置または前記相同タンパク質中の等価な位置に示されたアミノ酸とは異なる任意のアミノ酸による置換をさらに含み、
好ましくは、８位のアミノ酸は、ＨまたはＹを除く任意のアミノ酸によって置換され、
好ましくは、２０９位のアミノ酸は、ＨまたはＹを除く任意のアミノ酸によって置換されている。
本発明は、８、４７、２０９もしくは３５４位の少なくとも１個のアミノ酸残基、または２個もしくは３個もしくは４個のアミノ酸の組合せの置換が、ＶＳＶ  Ｇタンパク質がその受容体（ＬＤＬ膜受容体）と相互作用するが、特に、低いｐＨで、膜融合を誘導するその特性を保持する能力に影響するという本発明者らによって為された予想外の観察に基づくものである。
【００１５】
本発明は、ＶＳＶのＩｎｄｉａｎａ株の天然形態に対応し、シグナルペプチドを欠く、配列番号１のアミノ酸配列を含有するタンパク質を包含する。本発明はまた、ＶＳＶ株に由来する任意のＧタンパク質も包含するが、但し、前記タンパク質は、配列番号１中の囲みで表されるアミノ酸を保持する。
ＶＳＶ株に由来するＧタンパク質は、配列番号１において矢印で表されるアミノ酸ではない少なくとも１個のアミノ酸の付加、置換または挿入によって異なっていてもよい。
【００１６】
アミノ酸のナンバリングに関して、このナンバリングは、本発明では、配列番号１に記載のＶＳＶ  Ｇ  ＩｎｄｉａｎａのＧタンパク質の天然形態のアミノ酸のナンバリングに従来基づくものである。当業者は、配列アラインメントアルゴリズムおよびプログラム（例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ）を知っており、様々なＧタンパク質の配列を容易に比較し、配列番号１中で得られるナンバリングと比較した所定のＧタンパク質の正確な位置を再計算することができる。明確にするために、８、４７、２０９および３５４位のアミノ酸は、上記の配列番号１中において太字で示される。
本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含有するタンパク質を包含する。本発明はまた、ＶＳＶ株に由来する任意の相同Ｇタンパク質も包含するが、但し、前記タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列との少なくとも７０％の同一性を保持する。
【００１７】
「少なくとも７０％の同一性」とは、本発明では、配列番号１の配列との７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％の同一性を意味する。
同一性のパーセンテージに関して、それは、相同タンパク質の配列中の同じアミノ酸と整列する、配列番号１のアミノ酸残基のパーセンテージによって定義される。配列アラインメントは、専用のアルゴリズムおよびプログラム（例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷなど）を使用して実行される。
【００１８】
したがって、本発明によるタンパク質は、以下のアミノ酸配列から誘導されてもよい：
−  ６３位、または３７０位、またはその両方のアミノ酸が、ＫまたはＲを除く任意のアミノ酸によって置換された、Ｉｎｄｉａｎａ株に由来する完全長ＶＳＶ  Ｇタンパク質である、配列番号２、
−  ４７位、または３５４位、またはその両方のアミノ酸が、ＫまたはＲを除く任意のアミノ酸によって置換された、Ｍａｒｒａｂａ株に由来するＶＳＶ  Ｇタンパク質の細胞外ドメインである、配列番号３、
−  ６３位、または３７０位、またはその両方のアミノ酸が、ＫまたはＲを除く任意のアミノ酸によって置換された、Ｍａｒｒａｂａ株に由来する完全長ＶＳＶ  Ｇタンパク質である、配列番号４、
−  ４７位、または３５８位、またはその両方のアミノ酸が、ＫまたはＲを除く任意のアミノ酸によって置換された、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ株に由来するＶＳＶ  Ｇタンパク質の細胞外ドメインである、配列番号５、
−  ６３位、または３７４位、またはその両方のアミノ酸が、ＫまたはＲを除く任意のアミノ酸によって置換された、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ株に由来する完全長ＶＳＶ  Ｇタンパク質である、配列番号６、
−  ４７位、または３５８位、またはその両方のアミノ酸が、ＫまたはＲを除く任意のアミノ酸によって置換された、Ｃａｒａｊａｓ株に由来するＶＳＶ  Ｇタンパク質の細胞外ドメインである、配列番号７、
−  ６３位、または３７４位、またはその両方のアミノ酸が、ＫまたはＲを除く任意のアミノ酸によって置換された、Ｃａｒａｊａｓ株に由来する完全長ＶＳＶ  Ｇタンパク質である、配列番号８、
−  ４７位、または３５４位、またはその両方のアミノ酸が、ＫまたはＲを除く任意のアミノ酸によって置換された、Ａｌａｇｏａ株に由来するＶＳＶ  Ｇタンパク質の細胞外ドメインである、配列番号９、
−  ６４位、または３７１位、またはその両方のアミノ酸が、ＫまたはＲを除く任意のアミノ酸によって置換された、Ａｌａｇｏａ株に由来する完全長ＶＳＶ  Ｇタンパク質である、配列番号１０、
−  ４７位、または３５４位、またはその両方のアミノ酸が、ＫまたはＲを除く任意のアミノ酸によって置換された、Ｃｏｃａｌ株に由来するＶＳＶ  Ｇタンパク質の細胞外ドメインである、配列番号１１、
−  ６４位、または３７１位、またはその両方のアミノ酸が、ＫまたはＲを除く任意のアミノ酸によって置換された、Ｃｏｃａｌ株に由来する完全長ＶＳＶ  Ｇタンパク質である、配列番号１２、
−  ４７位、または３５４位、またはその両方のアミノ酸が、ＫまたはＲを除く任意のアミノ酸によって置換された、Ｍｏｒｒｅｔｏｎ株に由来するＶＳＶ  Ｇタンパク質の細胞外ドメインである、配列番号１３、および
−  ６４位、または３７１位、またはその両方のアミノ酸が、ＫまたはＲを除く任意のアミノ酸によって置換された、Ｍｏｒｒｅｔｏｎ株に由来する完全長ＶＳＶ  Ｇタンパク質である、配列番号１４。
【００１９】
Ｇタンパク質の結晶学的特性評価によって、本発明者らは、Ｋ４７およびＲ３５４残基が、ＬＤＬに由来する受容体との相互作用にとって非常に重要であることを示した。一方または両方の残基が、異なる物理的および化学的特性を有する別のアミノ酸残基によって置換された場合、得られるＧタンパク質は、細胞受容体と相互作用するその能力を失う。対照的に、同じ得られるタンパク質は、適切なｐＨ条件では、その融合特性を保持する。
【００２０】
本発明では、タンパク質は、単離されており、これは、そのタンパク質がその天然の状況から単離されていることを意味する。タンパク質は、非天然であり、これは、このタンパク質を取得する唯一の方法が、人工の、当業界で周知の技術的方法を使用することによって、研究室において、置換を実行することであることを意味する。
【００２１】
より有利には、本発明は、以前に開示された単離された非天然タンパク質であって、以下のアミノ酸配列の１つを含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなる前記タンパク質に関する：
−  配列番号１５〜２０；
−  配列番号２１〜２６；
−  配列番号２７〜３２；
−  配列番号３３〜３８；
−  配列番号３９〜４４；
−  配列番号４５〜５０；および
−  配列番号５１〜５６
（ここで、４７位、または３５４位、または４７位と３５４位の両方、または配列番号１に記載の前記タンパク質から誘導されるタンパク質中の対応する位置のアミノ酸は、ＫまたはＲを除く任意のアミノ酸である）。換言すれば、本発明では、アミノ酸Ｘａａは、ＲまたはＫを除く任意のアミノ酸に相当する。
配列番号１５は、４７位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ｉｎｄｉａｎａ株に由来するＶＳＶ  Ｇタンパク質の細胞外ドメインに対応する。
配列番号１６は、３５４位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ｉｎｄｉａｎａ株に由来するＶＳＶ  Ｇタンパク質の細胞外ドメインに対応する。
配列番号１７は、４７位および３５４位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ｉｎｄｉａｎａ株に由来するＶＳＶ  Ｇタンパク質の細胞外ドメインに対応する。
配列番号１８は、６３位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ｉｎｄｉａｎａ株に由来する完全長ＶＳＶ  Ｇタンパク質に対応する。
配列番号１９は、３７０位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ｉｎｄｉａｎａ株に由来する完全長ＶＳＶ  Ｇタンパク質に対応する。
配列番号２０は、６３位および３７０位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ｉｎｄｉａｎａ株に由来する完全長ＶＳＶ  Ｇタンパク質に対応する。
配列番号２１は、４７位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ｍａｒｒａｂａ株に由来するＶＳＶ  Ｇタンパク質の細胞外ドメインに対応する。
配列番号２２は、３５４位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ｍａｒｒａｂａ株に由来するＶＳＶ  Ｇタンパク質の細胞外ドメインに対応する。
配列番号２３は、４７位および３５４位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ｍａｒｒａｂａ株に由来するＶＳＶ  Ｇタンパク質の細胞外ドメインに対応する。
【００２２】
配列番号２４は、６３位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ｍａｒｒａｂａ株に由来する完全長ＶＳＶ  Ｇタンパク質に対応する。
配列番号２５は、３７０位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ｍａｒｒａｂａ株に由来する完全長ＶＳＶ  Ｇタンパク質に対応する。
配列番号２６は、６３位および３７０位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ｍａｒｒａｂａ株に由来する完全長ＶＳＶ  Ｇタンパク質に対応する。
配列番号２７は、４７位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ株に由来するＶＳＶ  Ｇタンパク質の細胞外ドメインに対応する。
配列番号２８は、３５８位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ株に由来するＶＳＶ  Ｇタンパク質の細胞外ドメインに対応する。
配列番号２９は、４７位および３５８位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ株に由来するＶＳＶ  Ｇタンパク質の細胞外ドメインに対応する。
配列番号３０は、６３位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ株に由来する完全長ＶＳＶ  Ｇタンパク質に対応する。
配列番号３１は、３７４位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ株に由来する完全長ＶＳＶ  Ｇタンパク質に対応する。
配列番号３２は、６３位および３７４位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ株に由来する完全長ＶＳＶ  Ｇタンパク質に対応する。
配列番号３３は、４７位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ｃａｒａｊａｓ株に由来するＶＳＶ  Ｇタンパク質の細胞外ドメインに対応する。
配列番号３４は、３５８位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ｃａｒａｊａｓ株に由来するＶＳＶ  Ｇタンパク質の細胞外ドメインに対応する。
配列番号３５は、４７位および３５８位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ｃａｒａｊａｓ株に由来するＶＳＶ  Ｇタンパク質の細胞外ドメインに対応する。
配列番号３６は、６８位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ｃａｒａｊａｓ株に由来する完全長ＶＳＶ  Ｇタンパク質に対応する。
配列番号３７は、３７９位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ｃａｒａｊａｓ株に由来する完全長ＶＳＶ  Ｇタンパク質に対応する。
配列番号３８は、６８位および３７９位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ｃａｒａｊａｓ株に由来する完全長ＶＳＶ  Ｇタンパク質に対応する。
配列番号３９は、４７位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ａｌａｇｏａ株に由来するＶＳＶ  Ｇタンパク質の細胞外ドメインに対応する。
配列番号４０は、３５４位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ａｌａｇｏａ株に由来するＶＳＶ  Ｇタンパク質の細胞外ドメインに対応する。
配列番号４１は、４７位および３５４位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ａｌａｇｏａ株に由来するＶＳＶ  Ｇタンパク質の細胞外ドメインに対応する。
配列番号４２は、６４位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ａｌａｇｏａ株に由来する完全長ＶＳＶ  Ｇタンパク質に対応する。
配列番号４３は、３７１位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ａｌａｇｏａ株に由来する完全長ＶＳＶ  Ｇタンパク質に対応する。
配列番号４４は、６４位および３７１位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ａｌａｇｏａ株に由来する完全長ＶＳＶ  Ｇタンパク質に対応する。
配列番号４５は、４７位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ｃｏｃａｌ株に由来するＶＳＶ  Ｇタンパク質の細胞外ドメインに対応する。
配列番号４６は、３５４位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ｃｏｃａｌ株に由来するＶＳＶ  Ｇタンパク質の細胞外ドメインに対応する。
配列番号４７は、４７位および３５４位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ｃｏｃａｌ株に由来するＶＳＶ  Ｇタンパク質の細胞外ドメインに対応する。
配列番号４８は、６４位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ｃｏｃａｌ株に由来する完全長ＶＳＶ  Ｇタンパク質に対応する。
配列番号４９は、３７１位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ｃｏｃａｌ株に由来する完全長ＶＳＶ  Ｇタンパク質に対応する。
配列番号５０は、６４位および３７１位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ｃｏｃａｌ株に由来する完全長ＶＳＶ  Ｇタンパク質に対応する。
配列番号５１は、４７位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ｍｏｒｒｅｔｏｎ株に由来するＶＳＶ  Ｇタンパク質の細胞外ドメインに対応する。
配列番号５２は、３５４位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ｍｏｒｒｅｔｏｎ株に由来するＶＳＶ  Ｇタンパク質の細胞外ドメインに対応する。
配列番号５３は、４７位および３５４位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ｍｏｒｒｅｔｏｎ株に由来するＶＳＶ  Ｇタンパク質の細胞外ドメインに対応する。
配列番号５４は、６４位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ｍｏｒｒｅｔｏｎ株に由来する完全長ＶＳＶ  Ｇタンパク質に対応する。
配列番号５５は、３７１位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ｍｏｒｒｅｔｏｎ株に由来する完全長ＶＳＶ  Ｇタンパク質に対応する。
配列番号５６は、６４位および３７１位にＫまたはＲを除く任意のアミノ酸による置換を有する、Ｍｏｒｒｅｔｏｎ株に由来する完全長ＶＳＶ  Ｇタンパク質に対応する。
換言すれば、本発明は、有利には、以下の配列番号１５〜５６の配列（ここで、Ｘａａは、ＲまたはＫを除く任意のアミノ酸に相当する）の１つを含む、またはそれからなる単離された非天然タンパク質に関する。
有利には、本発明は、４７位、または３５４位、または４７位と３５４位の両方のアミノ酸が、Ａ、Ｇ、ＦまたはＱ、好ましくは、ＡまたはＱによって置換された、上記で定義された単離された非天然タンパク質に関する。
換言すれば、本発明は、有利には、以下の配列：配列番号１５〜５６（ここで、Ｘａａは、ＲまたはＫを除く任意のアミノ酸に相当する）の１つを含む、またはそれからなる単離された非天然タンパク質に関する。
【００２３】
有利には、本発明は、以下の配列番号１５５〜３２２の配列の１つを含む、それから本質的になる、またはそれからなる単離されたタンパク質に関する。換言すれば、本発明は、有利には、以下の配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号１７９、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２３、配列番号２２４、配列番号２２５、配列番号２２６、配列番号２２７、配列番号２２８、配列番号２２９、配列番号２３０、配列番号２３１、配列番号２３２、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３５、配列番号２３６、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９、配列番号２４０、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号２５０、配列番号２５１、配列番号２５２、配列番号２５３、配列番号２５４、配列番号２５５、配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６０、配列番号２６１、配列番号２６２、配列番号２６３、配列番号２６４、配列番号２６５、配列番号２６６、配列番号２６７、配列番号２６８、配列番号２６９、配列番号２７０、配列番号２７１、配列番号２７２、配列番号２７３、配列番号２７４、配列番号２７５、配列番号２７６、配列番号２７７、配列番号２７８、配列番号２７９、配列番号２８０、配列番号２８１、配列番号２８２、配列番号２８３、配列番号２８４、配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号２８７、配列番号２８８、配列番号２８９、配列番号２９０、配列番号２９１、配列番号２９２、配列番号２９３、配列番号２９４、配列番号２９５、配列番号２９６、配列番号２９７、配列番号２９８、配列番号２９９、配列番号３００、配列番号３０１、配列番号３０２、配列番号３０３、配列番号３０４、配列番号３０５、配列番号３０６、配列番号３０７、配列番号３０８、配列番号３０９、配列番号３１０、配列番号３１１、配列番号３１２、配列番号３１３、配列番号３１４、配列番号３１５、配列番号３１６、配列番号３１７、配列番号３１８、配列番号３１９、配列番号３２０、配列番号３２１および配列番号３２２の配列１つを含む、それから本質的になる、またはそれからなる上記で定義された単離されたタンパク質に関する。
【００２４】
より有利には、本発明は、配列番号１の８位または配列番号１に記載された前記タンパク質から誘導されるタンパク質中の対応する位置のアミノ酸が、ＨまたはＱまたはＹを除く任意のアミノ酸によって置換された、上記で定義された単離された非天然タンパク質に関する。
【００２５】
より有利には、本発明は、配列番号１の２０９位または配列番号１に記載された前記タンパク質から誘導されるタンパク質中の対応する位置のアミノ酸が、ＹまたはＨを除く任意のアミノ酸によって置換された、上記で定義された単離された非天然タンパク質に関する。
より有利には、本発明は、前記タンパク質が、以下のアミノ酸配列：配列番号５７〜１５４の１つを含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなる、上記で定義された単離された非天然タンパク質に関する。
【００２６】
配列番号５７〜１５４は、４７位、または３５４位、または４７位と３５４位の両方、または配列番号１に記載の前記タンパク質から誘導されるタンパク質中の対応する位置のアミノ酸が、ＫまたはＲを除く任意のアミノ酸によって置換されているタンパク質であって、
−  配列番号１の８位または配列番号１に記載の前記タンパク質から誘導されるタンパク質中の対応する位置のアミノ酸が、ＨまたはＱを除く、または好ましくは、Ｙを除く任意のアミノ酸によって置換されている、
−  配列番号１の２０９位または配列番号１に記載の前記タンパク質から誘導されるタンパク質中の対応する位置のアミノ酸が、ＹまたはＨを除く任意のアミノ酸によって置換されている、または
−  配列番号１の８位または配列番号１に記載の前記タンパク質から誘導されるタンパク質中の対応する位置のアミノ酸が、ＨまたはＱを除く、または好ましくは、Ｙを除く任意のアミノ酸によって置換され、配列番号１の２０９位または配列番号１に記載の前記タンパク質から誘導されるタンパク質中の対応する位置のアミノ酸が、ＹまたはＨを除く任意のアミノ酸によって置換されている、タンパク質である。
【００２７】
より有利には、本発明は、
１９２〜２０２位、または
２４０〜２５７位、または
３４７〜３５３位、または
３６４〜３６６位、または
３７６〜３７９位
のアミノ酸の間にペプチドの挿入をさらに含み、前記ペプチドが、配列番号１に記載のタンパク質とは異なるタンパク質を起源とする、上記で定義された単離された非天然タンパク質に関する。本発明者らは、上記領域内での、ＶＳＶのＧタンパク質とは異なるタンパク質を起源とするペプチドの挿入が、本発明によるタンパク質の融合特性を変化させないことを同定した。
【００２８】
本発明では、「アミノ酸１９２位〜２０２位、２４０位〜２５７位、３４７位〜３５３位、３６４位〜３６６位、または３７６〜３７９位の間」の挿入は、ペプチドが、
−  ２つの連続するアミノ酸の間、例えば、アミノ酸１９２位〜１９３位の間、１９３および１９４、１９４および１９５、１９５および１９６、１９６および１９７、１９７および１９８、１９８および１９９、１９９および２００、２００および２０１、２０１および２０２、２４０および２４１、２４１および２４２、２４２および２４３、２４３および２４４、２４４および２４５、２４５および２４６、２４６および２４７、２４７および２４８、２４８および２４９、２４９および２５０、２５０および２５１、２５１および２５２、２５２および２５３、２５３および２５４、２５４および２５５、２５５および２５６、２５６および２５７、３４７および３４８、３４８および３４９、３４９および３５０、３５０および３５１、３５１および３５２、３５２および３５３、３６４および３６５、３６５および３６６、３７６および３７７、３７７および３７８、および３７８および３７９
−  または１または複数のアミノ酸の欠失のため、２つの連続しない番号のアミノ酸の間に挿入されることを意味する；例えば、１９３位のアミノ酸が挿入されたペプチド（など）によって欠失または置換されたため、ペプチドを１９２位と１９４位のアミノ酸の間に挿入することができる。
上記説明があれば、当業者は、本発明によって包含される挿入の位置を決定することができる。
【００２９】
より有利には、本発明は、３５１位と３５２位のアミノ酸の間にペプチドの挿入をさらに含み、前記ペプチドが、配列番号１に記載のタンパク質とは異なるタンパク質を起源とする、上記で定義された単離された非天然タンパク質に関する。有利には、本発明は、１位（換言すれば、Ｎ末端、すなわち、１位のアミノ酸の上流）にペプチドの挿入をさらに含み、前記ペプチドが、配列番号１に記載のタンパク質とは異なるタンパク質を起源とする、上記で定義された単離された非天然タンパク質に関する。本発明では、１位でのペプチドの挿入は、上記で定義された非天然タンパク質のＮ末端での前記ペプチドの挿入を意味する。かくして、この実施形態では、上記で定義された前記非天然タンパク質の配列の最初のアミノ酸残基は、保存（維持）される。換言すれば、上記で定義された前記非天然タンパク質の配列の１位の前記最初のアミノ酸残基は、欠失していない。代替的な実施形態では、本発明は、１位のアミノ酸残基の代わりにペプチドの挿入をさらに含み、前記ペプチドが、配列番号１に記載のタンパク質とは異なるタンパク質を起源とする、上記で定義された単離された非天然タンパク質に関する。かくして、この代替的な実施形態では、上記で定義された前記非天然タンパク質の配列の最初のアミノ酸残基は、欠失しており、前記ペプチドの配列と置き換えられている（すなわち、置換されている）。
【００３０】
有利には、本発明者らは、配列番号１の１位（換言すれば、Ｎ末端）での、またはアミノ酸３５１位と３５２位の間、または配列番号２〜１４中の対応する位置での挿入、および４７位、または３５４位またはその両方、または配列番号２〜１４中の対応する位置での変異が、変異型タンパク質の融合特性を改変しないことを同定した。
したがって、本発明者らは、その受容体と相互作用するのを可能にするＶＳＶ  Ｇタンパク質中、これらの２個のアミノ酸の間に、膜タンパク質を特異的に認識するタグペプチド、発光物質、ナノボディまたは任意のペプチドを挿入することを提唱する。
換言すれば、特に有利には、本発明者らは、したがって、２個の上記アミノ酸の間に、目的の細胞の特異的標的化を可能にする任意のペプチドが挿入された、変異型ＶＳＶ  Ｇタンパク質を提供することを提唱する。
より有利には、本発明は、前記ペプチドが細胞受容体のリガンドの少なくとも一部である、上記で定義された単離された非天然タンパク質に関する。
ペプチドまたはナノボディが挿入された、本発明による変異型タンパク質を用いて、目的の細胞、特に、腫瘍細胞を特異的に標的化し、したがって、ウイルスの腫瘍溶解特性を使用することによって、この決定された細胞を特異的に殺傷するＶＳＶを産生することができるようになる。
【００３１】
実際、この場合、本発明によるＧタンパク質は、その天然の受容体（ＬＤＬ−Ｒ）と相互作用しないが、配列番号１の３５１位および３５２位、または配列番号２〜１４中の対応する位置のアミノ酸の間に挿入されたペプチドにとっての標的である受容体を認識するであろう。本発明によるタンパク質はその融合特性を保持するため、タンパク質はウイルス進入を可能にし、したがって、ウイルスは標的細胞を殺傷することができる。
例えば、挿入されるペプチドは、抗ＨＥＲ２ナノボディ、抗ＭＵＣ１８ナノボディまたは抗ＰＤ−１ナノボディであってもよい。
本発明はまた、上記で定義された単離された非天然タンパク質をコードする核酸分子に関する。
換言すれば、本発明は、上記で定義された、配列番号１５〜３２２に記載の任意のタンパク質をコードする核酸分子に関する。
別の態様では、本発明は、上記で定義された単離された非天然タンパク質を発現する組換えウイルスに関する。有利なウイルスは、本発明による変異型タンパク質に対応するＧタンパク質を除く、野生型形態の全てのウイルスタンパク質を発現するＶＳＶである。
有利には、本発明は、上記で定義された核酸分子を含む組換えウイルスに関する。
本発明はまた、上記で定義された単離された非天然タンパク質を含有もしくは発現する、または上記で定義された核酸分子を含有する真核細胞に関する。有利には、本発明は、上記で定義されたウイルスが感染した真核細胞に関する。
【００３２】
本発明はまた、以下：
上記で定義されたタンパク質；または
上記で定義された核酸分子；
上記で定義されたウイルス；または
上記で定義された真核細胞
の少なくとも１つを含む組成物に関する。
特に、本発明は、以下の配列：配列番号１５〜３２２の１つを含む、またはそれからなるＧタンパク質をコードするウイルスを含む組成物に関する。
【００３３】
本発明はまた、薬物としての使用のための、以下：
上記で定義されたタンパク質；または
上記で定義された核酸分子；
上記で定義されたウイルス；または
上記で定義された真核細胞
の少なくとも１つを含む組成物に関する。
特に、本発明は、薬物としての使用のための、以下の配列番号１５〜３２２の配列の１つを含む、またはそれからなるＧタンパク質をコードするウイルスを含む組成物に関する。
有利には、本発明は、がんを処置するために使用するための、上記で定義された組成物に関する。
上記の通り、本発明による変異型タンパク質を発現するウイルスを使用して、決定された細胞を特異的に標的化し、したがって、それらを特異的に殺傷することができる。
本発明は、表面、有利には、脂質膜を、特定の標的、例えば、細胞、特に、がん細胞などの殺傷しようとする細胞に標的化するための、前記表面、有利には、脂質膜中に固定された、上記で定義されたタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用に関する。
【００３４】
本発明では、膜を標的目的地に特異的に向かわせるためにそのような膜に固定される本発明によるタンパク質をｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用することが提唱される。例えば、本発明による変異型タンパク質を、リポソーム、小胞、エキソソームの膜中に、カプセル、ナノ粒子上などに固定して、本発明によるタンパク質が、このリポソーム、小胞、カプセルまたはナノ粒子を、特定の標的、例えば、細胞、特に、がん細胞などの殺傷しようとする細胞に特異的に標的化することができるようにすることができる。
この使用は、本発明によるタンパク質が薬物の特異的標的化を可能にする、薬物送達標的化目的で特に有利である。
薬物は、治療分子、タンパク質、および核酸であってもよい。
本発明は、表面、有利には、脂質膜を、特定の標的、例えば、細胞、特に、がん細胞などの殺傷しようとする細胞に標的化するための使用のための、前記表面、有利には、脂質膜中に固定された、上記で定義されたタンパク質に関する。
【００３５】
本発明では、膜を標的目的地に特異的に向かわせるための使用のためのそのような膜に固定される本発明によるタンパク質が提唱される。例えば、本発明による変異タンパク質を、リポソーム、小胞、エキソソームの膜中に、カプセル、ナノ粒子上などに固定して、本発明によるタンパク質が、このリポソーム、小胞、カプセルまたはナノ粒子を、特定の標的、例えば、細胞、特に、がん細胞などの殺傷しようとする細胞に特異的に標的化することができるようにすることができる。
この使用は、本発明によるタンパク質が薬物を特定の標的、例えば、細胞、特に、がん細胞などの殺傷しようとする細胞に特異的に標的化させる、薬物送達標的化目的で特に有利である。
かくして、本発明は、薬物送達系としての使用のための本発明による変異型タンパク質であって、リポソーム、もしくは小胞、もしくはエキソソームの膜中に、またはカプセル上、もしくはナノ粒子上に固定される、変異型タンパク質に関する。
薬物は、治療分子、タンパク質、および核酸であってもよい。
本発明は、以下の図面および実施例からより良好に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、７個のＣＲモジュール（１〜７）、３個のＥＧＦリピート（ａ、ｂおよびｃ）、表皮増殖因子前駆体様ドメインの７枚羽根βプロペラドメイン（β）（Ｂ．）、およびＯ結合オリゴ糖を含有するＣ末端ドメイン（Ｃ．）を示す、ＬＤＬ−Ｒのモジュール構造の略図である。ＳＰ＝シグナルペプチド；Ｘ＝膜貫通ドメイン。Ａ．：ＣＲドメインおよびＤ．：細胞外ドメイン。
【図２】図２は、ｐＨ８での、ＧＳＨ磁気ビーズに結合した７個のＧＳＴ−ＣＲドメイン（１〜７）と、Ｇｔｈとの相互作用実験のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析の結果を表す。Ｃ．は対照を表す。タンパク質の移動位置を、矢印：Ａ．：Ｇｔｈ、Ｂ．：ＣＲｘ−ＧＳＴおよびＤ．：ＧＳＴで示す。
【図３】図３は、図６および図７に提示される実験を例示する。感染の４時間後、ＢＳＲ細胞を、ＶＳＶ核タンパク質に対する抗体（抗ＶＳＶ  Ｎ抗体）で標識して、感染（緑色蛍光）および表面展示された糖タンパク質によるＣＲドメイン認識を探査するためのＧＳＴ−ＣＲＡＴＴＯ５５０（赤色蛍光）を可視化した。
【図４】図４Ａ〜４Ｉは、蛍光ＧＳＴ−ＣＲ１ＡＴＴＯ５５０、ＧＳＴ−ＣＲ２ＡＴＴＯ５５０およびＧＳＴ−ＣＲ３ＡＴＴＯ５５０を使用した、ＶＳＶに感染したＢＳＲ細胞の表面でのＧの標識化の写真である。感染の４時間後、細胞を、４℃で３０分間、適切なＧＳＴ−ＣＲＡＴＴＯ５５０と共にインキュベートした後、固定および透過処理し、次いで、抗ＶＳＶ  Ｎ抗体を使用して免疫標識化して、感染を可視化した。ＤＡＰＩを使用して、核を染色した。スケールバーは２０μｍである。図４Ａは、抗ＶＳＶ  Ｎ抗体を使用した細胞の標識化を表す。図４Ｂは、蛍光ＧＳＴ−ＣＲ１ＡＴＴＯ５５０を使用した細胞の標識化を表す。図４Ｃは、図６Ａおよび図６Ｂにおける蛍光の重ね合わせを表す。図４Ｄは、抗ＶＳＶ  Ｎ抗体を使用した細胞の標識化を表す。図４Ｅは、蛍光ＧＳＴ−ＣＲ２ＡＴＴＯ５５０を使用した細胞の標識化を表す。図４Ｆは、図６Ｄおよび図６Ｅにおける蛍光の重ね合わせを表す。図４Ｇは、抗ＶＳＶ  Ｎ抗体を使用した細胞の標識化を表す。図４Ｈは、蛍光ＧＳＴ−ＣＲ３ＡＴＴＯ５５０を使用した細胞の標識化を表す。図４Ｉは、図６Ｇおよび図６Ｈにおける蛍光の重ね合わせを表す。
【図５】図５は、２０℃でのＧｔｈとＣＲ１、ＧｔｈとＣＲ２、ＧｔｈとＣＲ３の間のそれぞれの等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）分析の代表的なプロットを表す。結合パラメーターを、一部位結合モデルを用いた曲線適合分析によって決定した。パネル中に示された値は、提示される曲線に対応するものである。本文中に記載されるＫｄ値は、３回の独立実験の平均±標準誤差である。Ｂ−Ｃ  可溶性形態のＣＲドメインによるＶＳＶ感染の阻害。上のｘ軸：時間（分）；上のＹ軸：μｃａｌ／秒；下のｘ軸：モル比および下のｙ軸：注入物質のｋｃａｌ／モル。左パネル：ＣＲ１、中央パネル：ＣＲ２および右パネル：ＣＲ３。
【図６】図６Ａ〜６Ｆは、示された濃度のＧＳＴ−ＣＲ１、ＧＳＴ−ＣＲ２、ＧＳＴ−ＣＲ３（Ａ〜Ｃ）、ＣＲ１、ＣＲ２、またはＣＲ３一価ドメイン（Ｄ〜Ｆ）と共に予めインキュベートしたＶＳＶ−ｅＧＦＰに感染したＢＳＲ細胞の写真を表す。細胞を、感染の４時間後に固定した。感染細胞のみが、ｅＧＦＰを発現している。ＣＲ１もＧＳＴ−ＣＲ１構築物も、感染から細胞を保護しない。ＤＡＰＩを使用して、核を染色した。スケールバーは１００μｍである。
【図７】図７は、リボン表示でのＧｔｈＣＲ２結晶構造の三次元表示である。
【図８】図８は、リボン表示でのＧｔｈＣＲ３結晶構造の三次元表示である。両複合体において、ＣＲドメインは、Ｇの同じ空洞に営巣している。それぞれのＣＲのＮおよびＣ末端を示す。Ｇｔｈの三量体化ドメイン（ＴｒＤ）、プレクストリン相同ドメイン（ＰＨＤ）および融合ドメイン（ＦＤ）を表示する。
【図９】図９は、ＬＤＬ−Ｒ  ＣＲ２とＣＲ３の配列アラインメントである。保存された残基は灰色の囲みで、類似する残基は囲みで示される。Ｃａ2+イオンの結合に関与する酸性残基は、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶで示される。Ｇとの極性接触に関与するＣＲ残基は、それぞれのＣＲ配列上で灰色の記号で標識される（ＣＲ２については明灰色およびＣＲ３については黒色；接触が側鎖を介して確立される場合はドットおよび接触が主鎖を介して確立される場合は三角）。ＣＲモジュールから突出し、Ｇとの疎水性相互作用を確立する芳香族残基は、矢印で示される。
【図１０】図１０Ａは、ＣＲ２の酸性パッチ上へのＧ塩基性残基のドッキングを示す、Ｇｔｈ−ＣＲ接触面上の拡大図に対応する。Ｇ残基Ｈ８、Ｋ４７、Ｙ２０９およびＲ３５４が、相互作用に関与する。それぞれのＣＲドメイン上の残基標識は、接触が主鎖を介して確立される場合は斜体で示される；推定結合は、明灰色の破線として示される。図１０Ｂは、ＣＲ３の酸性パッチ上へのＧ塩基性残基のドッキングを示す、Ｇｔｈ−ＣＲ接触面上の拡大図に対応する。Ｇ残基Ｈ８、Ｋ４７、Ｙ２０９およびＲ３５４が、相互作用に関与する。それぞれのＣＲドメイン上の残基標識は、接触が主鎖を介して確立される場合は斜体で示される；推定結合は、明灰色の破線として示される。
【図１１】図１１Ａ〜Ｎは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の表面でのＷＴおよび変異型糖タンパク質の発現ならびに蛍光ＧＳＴ−ＣＲ２（Ａ〜ＤおよびＩ〜Ｋ）およびＧＳＴ−ＣＲ３（Ｅ〜ＨおよびＬ〜Ｍ）の結合のフローサイトメトリー分析を表す。トランスフェクションの２４時間後、ＷＴおよび変異型Ｇの細胞表面発現を、４℃で１時間、生細胞に直接対する抗Ｇモノクローナル抗体８Ｇ５Ｆ１１を使用して評価した。次いで、細胞を、抗マウスＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８および示されたＧＳＴ−ＣＲＡＴＴＯ５５０染料と同時にインキュベートした。ＧＳＴ−ＣＲドメインに依然として結合することができるＧ構築物をトランスフェクトされた細胞は、ＡＴＴＯ５５０染料に起因する赤色蛍光を示した。それぞれのプロット中に、ＡＴＴＯ５５０陽性細胞のパーセンテージが示される。図１１Ａは、蛍光ＧＳＴ−ＣＲ２のＷＴ糖タンパク質との結合の実験を表す。図１１Ｂは、蛍光ＧＳＴ−ＣＲ２の糖タンパク質Ｈ８Ａ変異体との結合の実験を表す。図１１Ｃは、蛍光ＧＳＴ−ＣＲ２の糖タンパク質Ｙ２０９Ａ変異体との結合の実験を表す。図１１Ｄは、蛍光ＧＳＴ−ＣＲ２の糖タンパク質Ｋ４７Ａ変異体との結合の実験を表す。図１１Ｅは、蛍光ＧＳＴ−ＣＲ３のＷＴ糖タンパク質との結合の実験を表す。図１１Ｆは、蛍光ＧＳＴ−ＣＲ３の糖タンパク質Ｈ８Ａ変異体との結合の実験を表す。図１１Ｇは、蛍光ＧＳＴ−ＣＲ３の糖タンパク質Ｙ２０９Ａ変異体との結合の実験を表す。図１１Ｈは、蛍光ＧＳＴ−ＣＲ３の糖タンパク質Ｋ４７Ａ変異体との結合の実験を表す。図１１Ｉは、蛍光ＧＳＴ−ＣＲ２の糖タンパク質Ｋ４７Ｑ変異体との結合の実験を表す。図１１Ｊは、蛍光ＧＳＴ−ＣＲ２の糖タンパク質Ｒ３５４Ａ変異体との結合の実験を表す。図１１Ｋは、蛍光ＧＳＴ−ＣＲ２の糖タンパク質Ｒ３５４Ｑ変異体との結合の実験を表す。図１１Ｌは、蛍光ＧＳＴ−ＣＲ３の糖タンパク質Ｋ４７Ｑ変異体との結合の実験を表す。図１１Ｍは、蛍光ＧＳＴ−ＣＲ３の糖タンパク質Ｒ３５４Ａ変異体との結合の実験を表す。図１１Ｎは、蛍光ＧＳＴ−ＣＲ３の糖タンパク質Ｒ３５４Ｑ変異体との結合の実験を表す。
【図１２】図１２は、細胞−細胞融合アッセイの略図である。ＢＳＲ細胞に、ＶＳＶ  Ｇ（ＷＴまたは変異型Ｇ）およびＰ−ＧＦＰ（細胞質マーカー）を発現するプラスミドを同時トランスフェクトする。トランスフェクションの２４時間後、細胞を１０分間にわたって、示されたｐＨに調整された培地に曝露した後、ｐＨ７．４のＤＭＥＭによって置き換える。次いで、固定前に、細胞を３７℃で１時間保持する。融合時に、Ｐ−ＧＦＰは合胞体中に拡散する。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｘは、図２０に記載される実験の結果に対応する写真である。図１３Ａは、ｐＨ５．０で空のベクターを用いた実験の結果を表す。図１３Ｂは、ｐＨ５．５で空のベクターを用いた実験の結果を表す。図１３Ｃは、ｐＨ６．０で空のベクターを用いた実験の結果を表す。図１３Ｄは、ｐＨ６．５で空のベクターを用いた実験の結果を表す。図１３Ｅは、ｐＨ７．０で空のベクターを用いた実験の結果を表す。図１３Ｆは、ｐＨ７．５で空のベクターを用いた実験の結果を表す。図１３Ｇは、ｐＨ５．０でＫ４７Ａ変異体を発現するベクターを用いた実験の結果を表す。図１３Ｈは、ｐＨ５．５でＧＫ４７Ａ変異体を発現するベクターを用いた実験の結果を表す。図１３Ｉは、ｐＨ６．０でＫ４７Ａ変異体を発現するベクターを用いた実験の結果を表す。図１３Ｊは、ｐＨ６．５でＫ４７Ａ変異体を発現するベクターを用いた実験の結果を表す。図１３Ｋは、ｐＨ７．０でＫ４７Ａ変異体を発現するベクターを用いた実験の結果を表す。図１３Ｌは、ｐＨ７．５でＫ４７Ａ変異体を発現するベクターを用いた実験の結果を表す。図１３Ｍは、ｐＨ５．０でＲ３５４Ａ変異体を発現するベクターを用いた実験の結果を表す。図１３Ｎは、ｐＨ５．５でＲ３５４Ａ変異体を発現するベクターを用いた実験の結果を表す。図１３Ｏは、ｐＨ６．０でＲ３５４Ａ変異体を発現するベクターを用いた実験の結果を表す。図１３Ｐは、ｐＨ６．５でＲ３５４Ａ変異体を発現するベクターを用いた実験の結果を表す。図１３Ｑは、ｐＨ７．０でＲ３５４Ａ変異体を発現するベクターを用いた実験の結果を表す。図１３Ｒは、ｐＨ７．５でＲ３５４Ａ変異体を発現するベクターを用いた実験の結果を表す。図１３Ｍは、ｐＨ５．０でＷＴ  Ｇタンパク質を発現するベクターを用いた実験の結果を表す。図１３Ｎは、ｐＨ５．５でＷＴ  Ｇタンパク質を発現するベクターを用いた実験の結果を表す。図１３Ｏは、ｐＨ６．０でＷＴ  Ｇタンパク質を発現するベクターを用いた実験の結果を表す。図１３Ｐは、ｐＨ６．５でＷＴ  Ｇタンパク質を発現するベクターを用いた実験の結果を表す。図１３Ｑは、ｐＨ７．０でＷＴ  Ｇタンパク質を発現するベクターを用いた実験の結果を表す。図１３Ｒは、ｐＨ７．５でＷＴ  Ｇタンパク質を発現するベクターを用いた実験の結果を表す。
【図１４】図１４は、野生型ＨＡＰ−１細胞（Ａ）、ＬＤＬ−ＲＫＯ  ＨＡＰ−１細胞（Ｂ）およびＨＥＫ２９３Ｔ（Ｃ）中でのＬＤＬ−Ｒ発現の分析を表す。粗細胞抽出物上でイムノブロットを実施し、抗ＬＤＬ−Ｒ抗体（ＥＰ１５５３Ｙ−１．）を用いて示した。チューブリン（ｔｕｂ）も、ローディング対照としてイムノブロットした（２．）。
【図１５】図１５は、ＶＳＶ−ｅＧＦＰ感染に対するＬＤＬ−Ｒ欠損ＨＡＰ−１細胞の感受性に対するＲＡＰタンパク質の効果を示すヒストグラムである。ＶＳＶ−ｅＧＦＰを使用して、ＲＡＰの存在下（灰色の柱）または非存在下（黒色の柱）でのＨＡＰ−１（Ａ）およびＨＡＰ−１  ＬＤＬ−ＲＫＯ（Ｂ）細胞を感染させた。フローサイトメーターを使用して、ｅＧＦＰを発現する細胞の数を計数することによって、感染性を決定した。データは、３組実施した実験に関する平均および標準誤差を記載する。対応のないＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を使用して、ｐ値を決定した（*ｐ＜０．０１；***非有意）。
【図１６】図１６は、ＶＳＶ  Ｇ変異体を用いて偽型化したＶＳＶΔＧ−ＧＦＰウイルスの生成の略図である。変異型Ｇをその表面上に発現するトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に、ＶＳＶ  Ｇ野生型を用いて偽型化したＶＳＶΔＧ−ＧＦＰを感染させた。感染の１６時間後、変異型ＶＳＶ  Ｇを用いて偽型化したＶＳＶΔＧ−ＧＦＰビリオンを、上清から収獲した。
【図１７】図１７は、ＶＳＶΔＧ−ＧＦＰウイルス粒子中への野生型および変異型Ｇの組込みを表す。野生型ＶＳＶ  Ｇを用いて偽型化したＶＳＶΔＧ−ＧＦＰを使用して、示された変異体をトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に感染させた（ＭＯＩ  １）。感染の１６時間後、ウイルス上清を収集し、濃縮し、ウェスタンブロットによって分析した（抗ＶＳＶ  Ｇ抗体および抗ＶＳＶ  Ｍ抗体を使用する）。
【図１８】図１８は、ＷＴおよび変異型糖タンパク質を用いて偽型化したＶＳＶΔＧ−ＧＦＰの感染性を示すヒストグラムを表す。ＷＴ  ＶＳＶ  Ｇを用いて偽型化したＶＳＶΔＧ−ＧＦＰを使用して、示された変異型糖タンパク質を予めトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に感染させた（ＭＯＩ  １）。ＷＴまたは変異型糖タンパク質によって偽型化したＶＳＶΔＧ−ＧＦＰウイルスを使用して、６時間、ＨＥＫ−２９３Ｔ、ＢＳＲ、ＣＨＯおよびＳ２細胞に感染させた；感染細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーによってＧＦＰを発現する細胞を計数することによって決定した。データは、３つの独立実験に関する平均および標準誤差を記載する。それぞれのバーの上に、力価の減少係数（１に対して正規化されたＷＴ  Ｇによって偽型化したＶＳＶΔＧ−ＧＦＰと比較した）を示す。
【図１９】図１９は、Ｎ末端（成熟タンパク質の１位）へのｍＣｈｅｒｒｙタンパク質の挿入によって、およびアミノ酸３５１位と３５２位の間へのｍＣｈｅｒｒｙタンパク質の挿入によって改変されたＶＳＶ糖タンパク質をコードするｐＣＡＧＧＳプラスミドをトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の写真である。赤色蛍光は、両方の事例において細胞表面に存在し、タンパク質が正確に折り畳まれ、ゴルジ装置を通って輸送されたことを示している。これは、Ｇ上のこれらの２つの位置が任意のペプチドを挿入するのに潜在的に興味深いということを示唆する。
【実施例】
【００３７】
（実施例１）
＜ＶＳＶ糖タンパク質による低密度リポタンパク質受容体認識の構造的基礎＞
本発明者らは、ＶＳＶ  ＧがＬＤＬ−Ｒの２つの異なるＣＲ（システインリッチ）ドメイン（ＣＲ２およびＣＲ３）に独立に結合することができることを同定したが、これらのドメインと複合体を形成するＶＳＶ  Ｇの結晶構造を報告する。その構造は、Ｇ上のＣＲ２およびＣＲ３の結合部位が同一であることを示す。本発明者らは、ＬＤＬ−Ｒ遺伝子がノックアウトされたＨＡＰ−１細胞が、ＶＳＶ感染に依然として罹りやすいことを示し、ＶＳＶ  Ｇが進入のためにＬＤＬ−Ｒ以外の受容体を使用することができることを確認する。しかしながら、ＬＤＬ−Ｒ  ＣＲドメインとの相互作用にとって重要である塩基性残基の変異は、哺乳動物ならびに昆虫細胞中でのＶＳＶの感染性を無効化する。これは、哺乳動物および昆虫細胞中のＶＳＶの受容体だけが、ＬＤＬ−Ｒファミリーのメンバーであること、ならびにＶＳＶ  ＧがそのＣＲドメインと相互作用するように特異的に進化したということを示している。
【００３８】
＜ＬＤＬ−Ｒ  ＣＲ２およびＣＲ３ドメインは、ＶＳＶ  Ｇに結合し、ウイルス感染性を中和する＞
本発明者らは、大腸菌中でグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合物中のそれぞれのＬＤＬ−Ｒ  ＣＲドメインを個別に発現させた。それぞれの融合タンパク質を、グルタチオンでコーティングした磁気ビーズと共にｐＨ８でインキュベートした後、Ｇの細胞外ドメインの可溶性形態を添加した（ウイルス粒子のサーモリシン制限タンパク質溶解によって生成された、ＶＳＶ  Ｇｔｈ、アミノ酸（ＡＡ）残基１〜４２２（図２））。４℃で２０分のインキュベーション後、ビーズを洗浄し、結合したタンパク質をＳＤＳ／ＰＡＧＥ、次いで、クマシーブルー染色によって分析した。これにより、ＣＲ２およびＣＲ３ドメインだけが、ｐＨ８でＶＳＶ  Ｇに直接結合することができることが示された（図２）。さらに、ＡＴＴＯ５５０で蛍光標識されたＧＳＴ−ＣＲ２およびＧＳＴ−ＣＲ３（ＧＳＴ−ＣＲ１ではない）（図３および図４）は、感染細胞の表面に発現されたＶＳＶ  Ｇを特異的に認識した。本発明者らはまた、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）を使用して、溶液中でのＧｔｈに対するＣＲ１、ＣＲ２およびＣＲ３の結合パラメーターを調査した（図５）。ここで再度、ＧとＣＲ１との相互作用は検出されなかった。他方、ＣＲ２とＣＲ３の両方について、発熱性であると考えられる結合反応は、１：１の化学量論を示し、類似するＫｄを示す（ＣＲ３については４．３±１μＭおよびＣＲ２については７．３±１．５μＭ）。
さらに、組換え可溶性ＣＲ２およびＣＲ３ドメインは、単独で、またはＧＳＴとの融合物中で、感染前のウイルス接種物と共にインキュベートした場合、ウイルス感染性を中和することもできる。
＜ＬＤＬ−Ｒ  ＣＲドメインと複合体を形成したＶＳＶ  Ｇ細胞外ドメインの結晶構造＞
本発明者らは、ＣＲ２またはＣＲ３のいずれかと複合体を形成したＧｔｈを結晶化させた。Ｇ上のＣＲドメインの結合部位は、両方の結晶形態において同じである（図７および図８）。
【００３９】
Ｇの２個の塩基性残基（ＴｒＤに由来するＨ８およびＰＨＤに由来するＫ４７）は、ＣＲドメインの八面体型カルシウムケージに属する２個の酸性残基（ＣＲ２上のＤ６９およびＤ７３；ＣＲ３標識されたＩおよびＩＩ上のＤ１０８およびＤ１１２−図９）に向いている。Ｙ２０９およびＲ３５４と一緒に、それらは相互作用にとって重要であると考えられる（図１０ＡおよびＢ）。
【００４０】
＜Ｋ４７およびＲ３５４は、ＬＤＬ−Ｒ  ＣＲドメイン結合にとって必要とされるＧの重要残基である＞
ＬＤＬ−Ｒ  ＣＲドメイン結合へのそれらの寄与を調査するために、本発明者らは、Ｇの残基Ｈ８、Ｋ４７、Ｙ２０９およびＲ３５４をアラニンまたはグルタミンに変異させた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、野生型または変異型ＶＳＶ  Ｇ糖タンパク質（ＷＴ、Ｈ８Ａ、Ｋ４７Ａ、Ｋ４７Ｑ、Ｙ２０９Ａ、Ｒ３５４ＡおよびＲ３５４Ｑ）をコードするプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞をＧ細胞外ドメインに対するＭＡｂと共にインキュベートした。次いで、緑色蛍光抗ＩｇＧ二次抗体およびＡＴＴＯ５５０で蛍光標識されたＧＳＴ−ＣＲ融合タンパク質を、同時に添加した。免疫蛍光標識により、ＷＴおよび全てのＧ変異体が細胞表面に効率的に輸送されることが示された（図１１）。Ｈ８ＡおよびＹ２０９Ａ変異体は、ＷＴ  ＧとしてＧＳＴ−ＣＲドメインに結合するが、他の変異体はその結合能力に影響される（図１１）。Ｋ４７Ｑ、Ｒ３５４ＡおよびＲ３５４Ｑ変異体は、ＧＳＴ−ＣＲ２にも、ＧＳＴ−ＣＲ３にも結合しない。最後に、Ｋ４７Ａ変異体とＣＲ３との間に相互作用は検出されないが、この変異体とＣＲ２との間には残留結合活性が観察される（図１１）。
【００４１】
本発明者らはまた、Ｋ４７ＡおよびＲ３５４Ａ変異体の融合特性をチェックした。このために、ＢＳＲ細胞に、野生型または変異型ＶＳＶ  Ｇ糖タンパク質（ＷＴ、Ｋ４７ＡおよびＲ３５４Ａ）をコードするｐＣＡＧＧＳプラスミドをトランスフェクトした。変異型Ｇタンパク質を発現する細胞は、ＷＴ  Ｇのものと類似する融合表現型を有する（図１３）。これは、変異型糖タンパク質が正確に折り畳まれることを確認し、Ｇ融合活性と受容体認識を切り離すことができることを証明する。
＜他のＬＤＬ−ＲファミリーメンバーはＶＳＶの代替的な受容体である＞
ＬＤＬ−Ｒ遺伝子がノックアウトされたＨＡＰ−１細胞（ＨＡＰ−１  ＬＤＬ−ＲＫＯ）（図１４）は、ＷＴ  ＨＡＰ−１細胞と同程度にＶＳＶ感染に罹りやすい（図１５）。これは、ＬＤＬ−Ｒ以外のＶＳＶ受容体がＨＡＰ−１細胞の表面に存在することを証明する。
【００４２】
ＶＳＶ受容体としての他のＬＤＬ−Ｒファミリーメンバーの役割を評価するために、本発明者らは、ＬＤＬ−Ｒ自体を除く全てのＬＤＬ−Ｒファミリーメンバーへのリガンド結合を遮断する全てのＬＤＬ−Ｒファミリーメンバーの共通リガンドである、受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）の特性を利用した（Finkelshtein et al., 2013）。ＲＡＰは、ＷＴ  ＨＡＰ−１細胞ではなく、ＨＡＰ−１  ＬＤＬ−ＲＫＯにおいてＶＳＶ感染を有意に阻害する（図１５）。これらの結果は、ＶＳＶが代替的な受容体として他のＬＤＬ−Ｒファミリーメンバーを使用することができることを示唆する以前のデータ（Finkelshtein et al., 2013）と一致している。
【００４３】
＜ＣＲドメイン結合部位に影響されたＧ変異体はＧ遺伝子を欠く組換えＶＳＶをレスキューすることができない＞
次いで、本発明者らは、上記の変異型糖タンパク質がウイルス感染を持続させることができるかどうかを検査した。本発明者らは、Ｇエンベロープ遺伝子が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子によって置き換えられ、ＶＳＶ  Ｇ糖タンパク質を用いて偽型化された組換えＶＳＶ（ＶＳＶΔＧ−ＧＦＰ）を使用した。この偽型化された組換え体を使用して、ＷＴまたは変異型糖タンパク質をコードするプラスミドによってトランスフェクトされた、またはトランスフェクトされていないＨＥＫ細胞を感染させた（Ferlin et al., 2014）。８時間後、感染細胞上清を収集した（図１６）。上清中に存在する粒子のエンベロープへの変異型糖タンパク質組込みを、ウェスタンブロットによって検証し（図１７）、偽型化された粒子の感染性を、感染後（ｐ．ｉ．）４時間でフローサイトメトリーによりＧＦＰを発現する細胞を計数することによって、異なる細胞株（哺乳動物ＨＥＫ、ＢＳＲ、ＣＨＯおよびショウジョウバエＳ２細胞）中で分析した（図１８）。Ｋ４７Ａ、Ｋ４７Ｑ、Ｒ３５４ＡおよびＲ３５４Ｑ変異体は、ＶＳＶΔＧ−ＧＦＰの感染性をレスキューしなかった。ＷＴ  Ｇと比較して、感染性は１／１０〜１／１２０に低下した（図１８）。この低下は、２種のハムスター細胞株よりもＨＥＫおよびＳ２細胞株において、より重要であった。哺乳動物細胞株では、Ｈ８ＡおよびＹ２０９Ａ変異体は、ＶＳＶΔＧ−ＧＦＰの感染性をレスキューすることができるが、ＷＴのものよりも低レベルである。Ｓ２細胞株では、それらの感染性は、有意に低下する（Ｈ８Ａ変異体については１／１５およびＹ２０９Ａ変異体については約１／６に）（図１８）。
【００４４】
変異体の融合活性は影響されないため、変異型糖タンパク質を担持する偽型の感染性の喪失は、細胞受容体を認識することができないことに安全に起因し得る。これらの結果は、ＬＤＬ−Ｒ  ＣＲドメインに結合することができないＫ４７Ａ、Ｋ４７Ｑ、Ｒ３５４ＡおよびＲ３５４Ｑ変異体が、他のＶＳＶ受容体に結合するその能力も著しく損傷していることを示す。
【００４５】
＜考察＞
ＬＤＬ−Ｒは、ＶＳＶおよびＶＳＶ−Ｇによって偽型化されたレンチウイルスの主要な進入口であることが証明されている（Finkelshtein et al., 2013）。ここで、本発明者らは、ＶＳＶ−Ｇが類似する親和性でＬＤＬ−Ｒの２個のＣＲドメインに結合することができることを証明する。この相互作用の生物学的関連性は、ＶＳＶ感染を阻害するＣＲ２とＣＲ３の両方の能力によって証明された。ＣＲ２およびＣＲ３と複合体を形成したＶＳＶ  Ｇの結晶構造は、それらが両方とも、その融合前コンフォメーションにおいて糖タンパク質の表面で同じ部位を占有すること、および同じＧ残基がＣＲドメインの正確な固定を確保することを示す。この結合部位は、Ｇがその融合後コンフォメーションにある場合、離れて分割され、Ｇが低いｐＨでＣＲドメインに結合することができない理由を説明する。これは、エンドソーム内腔でのＧとＬＤＬ−Ｒとの相互作用を破壊し、適切な融合部位へのビリオンの輸送を支持し得る。
【００４６】
ＶＳＶ  ＧによるＣＲドメイン認識は、カルシウムを配位する酸性残基に向かう塩基性残基Ｋ４７およびＲ３５４を含む。この結合様式は、ＬＤＬ−ＲファミリーメンバーのＣＲドメインによる内因性リガンド認識について観察されるものと非常に類似しており、実際、Ｋ４７またはＲ３５４のいずれかがアラニンまたはグルタミンで置き換えられた変異型糖タンパク質は、ＣＲドメインに結合することができない。これらの重要残基がベシクロウイルス間で保存されていないことは注目に値する。したがって、ウイルス受容体としてのＬＤＬ−Ｒの使用を、その属の他のメンバーに一般化することはできない。実際、本発明者らは、ＶＳＶ残基４７および３５４に対応する位置に塩基性残基を有しないＣＨＡＶ  Ｇは、ＣＲドメインに結合しないことを示した。
【００４７】
本発明者らの機能分析は、ＨＡＰ−１  ＬＤＬ−ＲＫＯはＨＡＰ−１細胞と同程度に効率的に感染させることができるため、ＬＤＬ−ＲがＶＳＶの唯一の受容体ではないことを確認する。しかしながら、ＣＲドメインに結合することができない変異型糖タンパク質は、哺乳動物細胞においても、昆虫細胞においても、ＶＳＶΔＧ−ＧＦＰ感染性を回復させることができない。この結果の最も倹約的な解釈は、ＨＥＫ細胞中でのＶＳＶの唯一の受容体がＬＤＬ−Ｒファミリーのメンバーであるということである。相互作用の分子的基礎は、これらの全ての受容体について同じであり、そのＣＲドメインに結合するＧの能力を含む。これは、ＬＤＬ−Ｒファミリーの他のメンバーのアンタゴニストであるＲＡＰタンパク質の存在下で観察される感染性の低下と一致する。全体として、本研究は、ＶＳＶ  Ｇが、ＬＤＬ−ＲファミリーのメンバーのＣＲドメインと相互作用するように特異的に進化したことを証明する。この受容体ファミリーの遍在性（無脊椎動物間にも広がっている）は、ＶＳＶの広向性を説明する。
【００４８】
ＧによるＣＲドメイン認識の分子的基礎の特性評価と一緒に、ＶＳＶの受容体がＬＤＬ−Ｒファミリーの全メンバーであるという証明は、向性が改変された組換えＶＳＶを開発する道を開く。実際、（ｉ）天然受容体の向性を除去する点変異および（ｉｉ）腫瘍細胞を特異的に標的化するタンパク質ドメインまたはペプチドの挿入を有する糖タンパク質（Ammayappan et al., 2013）は、完全に再標的化された腫瘍溶解性ＶＳＶの設計を可能にするはずである。そのようなウイルスは、正常な細胞を残しながら、がん性細胞を除去することができるはずである。
【００４９】
＜細胞およびウイルス＞
ＢＨＫ−２１（ベビーハムスター腎臓細胞；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０）のクローンであるＢＳＲおよびＨＥＫ−２９３Ｔ（サルウイルス４０  Ｔ抗原を発現するヒト胚性腎臓細胞；ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−３２１６）細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙから購入した、ＨＡＰ−１  ｗｔおよびＨＡＰ−１  ＬＤＬ−Ｒ欠損細胞（ＨＡＰ−１  ＬＤＬ−ＲＫＯ）を、１０％ＦＣＳを添加したＩｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ）中で増殖させた。ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣から誘導された細胞株）細胞を、２ｍＭグルタミンおよび１０％ＦＣＳを添加したＨａｍ  Ｆ１２培地中で増殖させた。全ての哺乳動物細胞株を、５％ＣＯ２を含む加湿インキュベータ中、３７℃で維持した。ショウジョウバエＳ２細胞を、２８℃で、１０％ＦＣＳを添加したＳｃｈｎｅｉｄｅｒ培地中で増殖させた。
野生型ＶＳＶ（Ｍｕｄｄ−Ｓｕｍｍｅｒ株、Ｉｎｄｉａｎａ血清型）、ＶＳＶΔＧ−ＧＣＨＡＶ（Rose et al., 2000）およびＶＳＶ−ｅＧＦＰを、ＢＳＲ細胞中で増殖させた。
ＶＳＶΔＧ−ＧＦＰは、Ｇタンパク質のコード領域が改変型のＧＦＰ遺伝子で置き換えられ、ＶＳＶ  Ｇタンパク質を用いて偽型化されたＶＳＶゲノム（Ｉｎｄｉａｎａ血清型）の完全長ｃＤＮＡクローンから誘導された組換えＶＳＶである（Ferlin et al., 2014）。ＶＳＶΔＧ−ＧＦＰを、ｐＣＡＧＧＳ−ＶＳＶＧを予めトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞上で増殖させた。
【００５０】
＜プラスミドおよびクローニング＞
ｐＣＡＧＧＳプラスミド中で、クローニングされたＶＳＶ  Ｇ遺伝子（Ｉｎｄｉａｎａ  Ｍｕｄｄ−Ｓｕｍｍｅｒ株）から出発して点変異を創出した。簡単に述べると、所望の変異を含有するフォワードおよびリバースプライマーを、Ｇ遺伝子にフランキングするプライマーの１つと別々に組み合わせて、２つのＰＣＲ産物を生成した。これらの２つのＧ遺伝子断片は、変異を含有する領域において重複し、これをＧｉｂｓｏｎアセンブリ反応キット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してｐＣＡＧＧＳ線状化ベクター中で集合させた。
＜タンパク質の発現、精製および標識化＞
ＶＳＶ  Ｇｔｈを、ウイルス粒子の限定的タンパク質溶解によって取得し、以前に記載されたように（Albertini et al., 2012a）精製した。
【００５１】
ヒトＬＤＬ−Ｒ（ＮＭ＿０００５２７、ＧｅｎＢａｎｋ）の７個のＣＲドメインをコードするＤＮＡ配列を合成し（ＭＷＧ  ｂｉｏｔｅｃｈ）、ｐＧＥＸ−６Ｐ１細菌発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にサブクローニングした。それぞれのタンパク質構築物は、そのＮ末端にＧＳＴタグおよびｐｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ切断部位を含有する。それぞれのＣＲドメインを、（Harper and Speicher, 2011）から誘導された以下のプロトコールを使用して精製した。ＣＲ構築物で形質転換されたＣ４１細菌を、ＯＤが０．６ＡＵに達するまでＬＢ−アンピシリン培地中、３７℃で培養した。次いで、３７℃で５時間、１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いてタンパク質発現を誘導した。細胞を、溶解緩衝液（５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、２％ｗ／ｖサルコシルおよび１ｍＭ  ＤＴＴ）中で超音波処理した。明澄化された上清を、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００の存在下で２時間、グルタチオンアガロースビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共にインキュベートした。次いで、インキュベーション後、ビーズを、平衡化緩衝液（２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ８、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）を用いて十分に洗浄した。次いで、ＧＳＴ−ＣＲ構築物を、２０ｍＭ  ＧＳＨを添加した同じ緩衝液を用いて溶出させた。それぞれのＧＳＴ−ＣＲの精製を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（Ｇｅ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するゲル濾過ステップを用いて達成した。ＣＲドメインを単離するために、精製されたＧＳＴ−ＣＲを、ｐｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼと共にインキュベートし、ゲル濾過カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５（Ｇｅ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に注入した。次いで、純粋なＣＲドメインを含有する画分をプールし、１ｍＭに濃縮し、使用まで−８０℃で保存した。
１ミリグラムの精製されたＧＳＴ−ＣＲ２（またはＧＳＴ−ＣＲ３）を、製造業者の指示書を使用して蛍光染料ＡＴＴＯ５５０  ＮＨＳエステル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で標識した。次いで、標識されたタンパク質を、５０μＭの濃度に希釈し、使用まで−８０℃で保存した。標識比は、１分子あたり約２個の染料であると見積もられた。
【００５２】
＜ＧとＣＲドメインとの結合の特性評価＞
精製されたＧＳＴ−ＣＲドメインを、４℃で２０分間、撹拌下でＧＳＨ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）でコーティングされた磁気ビーズと共にインキュベートした。次いで、スラリーを、適切なｐＨの平衡化緩衝液（２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８または５０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ  ｐＨ６）で洗浄した。精製されたＧｔｈまたはウイルス粒子を、この同じ緩衝液中で２０分間予備インキュベートし、ＧＳＴ−ＣＲ構築物に結合した磁気ビーズまたはＧＳＴのみに添加した。穏やかな撹拌下、２０分間インキュベートした後、スラリーを、適切なｐＨ（８または６のいずれか）の平衡化緩衝液で２回洗浄した。ビーズを、ゲル充填緩衝液中に再懸濁し、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ上で直接分析した。
【００５３】
＜Ｇ（ＷＴまたは変異体）を発現する細胞へのＣＲドメインの結合＞
顕微鏡観察のために、ＢＳＲ細胞を４時間感染させた後、４℃で３０分間、ＧＳＴ−ＣＲ２ＡＴＴＯ５５０またはＧＳＴ−ＣＲ３ＡＴＴＯ５５０と共にインキュベートした。細胞を、４％パラホルムアルデヒドで固定した後、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて透過処理した。核タンパク質を、マウス抗ＶＳＶ  Ｎモノクローナル抗体を使用することによって検出した。ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、二次抗体として使用した。Ｌｅｉｃａ  ＳＰ８共焦点顕微鏡（６３倍油浸対物レンズ）を使用して、画像を捕捉した。
【００５４】
フローサイトメトリー実験のために、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、ＷＴまたは変異型ＧをコードするｐＣＡＧＧＳプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を収集し、Ｇ細胞外ドメインを認識するマウス抗Ｇモノクローナル抗体（８Ｇ５Ｆ１１、ＫｅｒａＦａｓｔ）と共にインキュベートした。次いで、ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８抗体およびＧＳＴ−ＣＲ２ＡＴＴＯ５５０（またはＧＳＴ−ＣＲ３ＡＴＴＯ５５０）を、細胞に同時に添加した。細胞の蛍光を、ＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーターを使用して決定した。
【００５５】
＜偽型＞
８０％集密度のＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、ＰＥＩを使用して、ＷＴまたは変異型ＶＳＶ  ＧをコードするｐＣＡＧＧＳによってトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞に、１のＭＯＩでＶＳＶΔＧ−ＧＦＰを感染させた。感染の２時間後、細胞を洗浄して、接種物から残留ウイルスを除去した。偽型化されたウイルス粒子を含有する細胞上清を、感染の１６時間後に収集した。偽型化されたウイルスの感染力価を、感染の４時間後にＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーターを使用してＧＦＰを発現する細胞を計数することによって、非トランスフェクト細胞上で決定した。偽型化された粒子中へのＷＴおよび変異型Ｇの組込みを、上清濃縮後に抗ＶＳＶ  Ｇ抗体および抗ＶＳＶ  Ｍ抗体を使用するＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析によって評価した。
【００５６】
＜ＨＡＰ−１細胞の感染＞
ＨＡＰ−１細胞を、７０％集密度で播種し、１５分間、５０ｎＭのＲＡＰと共にインキュベートしたか、またはインキュベートしなかった。次いで、細胞を、１のＭＯＩでＶＳＶ−ｅＧＦＰに感染させた。ＲＡＰを、全ての感染時間に維持した。感染細胞（ＧＦＰ陽性）のパーセンテージを、感染の４時間後にＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーターを使用して決定した。
【００５７】
＜ＩＴＣ＞
ＩＴＣ実験を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０および２ｍＭ  ＣａＣｌ２から構成される緩衝液中、ＭｉｃｒｏＣａｌ  ｉＴＣ２００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して２９３Ｋで実施した。５０μＭの濃度のＧｔｈを、６００μＭの濃度でのＣＲドメインの連続注入によって滴定した。滴定シーケンスは、最初に１μＬの注入、次いで、注入間に１８０または２４０秒の間隔を空けて、それぞれ２μＬの注入を１９回含んでいた。ＯｒｉｇｉｎＬａｂソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、生データを分析した。結合パラメーターを、一部位結合モデルを用いた曲線適合分析から抽出した。
【００５８】
＜細胞−細胞融合アッセイ＞
細胞−細胞融合アッセイを、以前に記載されたように実施した（Ferlin et al., 2014）。簡単に述べると、７０％集密度でガラスカバースリップ上に塗布されたＢＳＲ細胞に、ＷＴ  Ｇまたは変異型ＧをコードするｐＣＡＧＧＳプラスミド、およびＧＦＰに融合された狂犬病ウイルスのホスホタンパク質をコードするＰ−ＧＦＰプラスミドを同時トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、３７℃で１０分間、様々なｐＨ（５．０〜７．５）の融合緩衝液（ＤＭＥＭ−１０ｍＭ  ＭＥＳ）と共にインキュベートした。次いで、細胞を１回洗浄し、３７℃で１時間、ｐＨ７．４のＤＭＥＭ−１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、１％ＢＳＡと共にインキュベートした。細胞を、１×ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定した。細胞核をＤＡＰＩで染色し、合胞体形成を、１０倍レンズを備えたＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００蛍光顕微鏡を用いて分析した。
＜文献＞
Albertini, A.A.V., Baquero, E., Ferlin, A., and Gaudin, Y. (2012b). Molecular and Cellular Aspects of Rhabdovirus Entry. Viruses 4, 117-139.
Amirache, F., Levy, C., Costa, C., Mangeot, P.E., Torbett, B.E., Wang, C.X., Negre, D., Cosset, F.L., and Verhoeyen, E. (2014). Mystery solved: VSV-G-LVs do not allow efficient gene transfer into unstimulated T cells, B cells, and HSCs because they lack the LDL receptor. Blood 123, 1422-1424.
Ammayappan, A., Peng, K.W., and Russell, S.J. (2013). Characteristics of oncolytic vesicular stomatitis virus displaying tumor-targeting ligands. J Virol 87, 13543-13555.
Barber, G.N. (2005). VSV-tumor selective replication and protein translation. Oncogene 24, 7710-7719.
Ferlin, A., Raux, H., Baquero, E., Lepault, J., and Gaudin, Y. (2014). Characterization of pH-sensitive molecular switches that trigger the structural transition of vesicular stomatitis virus glycoprotein from the postfusion state toward the prefusion state. J Virol 88, 13396-13409.
Finkelshtein, D., Werman, A., Novick, D., Barak, S., and Rubinstein, M. (2013). LDL receptor and its family members serve as the cellular receptors for vesicular stomatitis virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 110, 7306-7311.
Roche, S., Bressanelli, S., Rey, F.A., and Gaudin, Y. (2006). Crystal structure of the low-pH form of the vesicular stomatitis virus glycoprotein G. Science 313, 187-191.
Roche, S., Rey, F.A., Gaudin, Y., and Bressanelli, S. (2007). Structure of the prefusion form of the vesicular stomatitis virus glycoprotein g. Science 315, 843-848.
【００５９】
（実施例２）
＜改変型Ｇをコードするプラスミドの調製＞
様々な位置にｍＣｈｅｒｒｙが挿入された所望のコードＧ配列を含有するｐＣＡＧＧＳプラスミドの構築物を、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ反応を使用して生成した。空のベクターｐＣＡＧＧＳを、ＥｃｏＲＩ制限酵素を使用して線状化した。次いで、重複部分を有する３つのＰＣＲ産物を生成した。生成物Ｉは、挿入部位の前のＧの断片である；それは、１位にｍＣｈｅｒｒｙを挿入するためのプライマーＩａおよびＩｂ1ならびに３５１位にｍＣｈｅｒｒｙを挿入するためのプライマーＩａおよびＩｂ351を使用して、ＶＳＶ  Ｇ遺伝子上でＰＣＲを実行して生成される。生成物ＩＩは、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子である（１位にｍＣｈｅｒｒｙを挿入するためのプライマーＩＩａ1およびＩＩｂ1ならびに３５１位にｍＣｈｅｒｒｙを挿入するためのプライマーＩＩａ351およびＩＩｂ351を使用する）。生成物ＩＩＩは、挿入部位の後のＧの断片である；それは、１位にｍＣｈｅｒｒｙを挿入するためのプライマーＩＩＩａ1およびＩＩＩｂならびに３５１位にｍＣｈｅｒｒｙを挿入するためのプライマーＩＩＩａ351およびＩＩＩｂを使用して生成される。
【００６０】
プライマー配列を、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって合成した：
Ｉａ：ＴＣＴＣＡＴＣＡＴＴＴＴＧＧＣＡＡＡＧＡＴＧＡＡＧＴＧＣＣＴＴＴＴＧＴＡＣＴＴＡＧ（配列番号３３２）
Ｉｂ1：ＴＴＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＣＡＡＴＴＣＡＣＣＣＣＡＡＴＧＡＡＴＡＡＡＡＡＧ（配列番号３３３）
Ｉｂ351：ＧＣＴＣＡＣＣＡＴＡＧＴＴＣＣＡＣＴＧＡＴＣＡＴＴＣＣＧＡＣＣ（配列番号３３４）
ＩＩａ1：ＣＡＴＴＧＧＧＧＴＧＡＡＴＴＧＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣ（配列番号３３５）
ＩＩａ351：ＡＡＴＧＡＴＣＡＧＴＧＧＡＡＣＴＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣ（配列番号３３６）
ＩＩｂ1：ＡＡＡＩＩｂ１ＣＴＡＴＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣ（配列番号３３７）
ＩＩｂ351：ＧＴＴＣＣＣＴＴＴＣＴＧＴＧＧＴＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣ（配列番号３３８）
ＩＩＩａ1：ＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＧＴＴＣＡＣＣＡＴＡＧＴＴＴＴＴＣＣＡＣＡＣＡ（配列番号３３９）
ＩＩＩａ351：ＣＴＧＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＡＧＡＡＡＧＧＧＡＡＣＴＧＴ（配列番号３４０）
ＩＩＩｂ：ＣＣＧＣＣＣＧＧＧＡＧＣＴＣＧＴＴＡＣＴＴＴＣＣＡＡＧＴＣＧＧＴＴＣ（配列番号３４１）
アガロースゲル上でそれぞれの断片を精製した後、３つの断片＋精製消化されたｐＣＡＧＧＳベクターを等モル濃度で合わせ、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ反応によって集合させる。次いで、ＤＮＡを細菌中に形質転換し、制限消化および／または配列決定によって同定した後、正確なプラスミド産物を増幅した。
【００６１】
（実施例３）
＜改変型ＶＳＶ糖タンパク質の一過的発現＞
トランスフェクションプロトコールは、形質導入しようとする細胞の種類に依存することになる。ＨＥＫ細胞については、本発明者らは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）トランスフェクションプロトコールを使用する。ＢＨＫについては、本発明者らは、リン酸カルシウムトランスフェクションプロトコールまたはＰＥＩを使用する。
【００６２】
カバースリップ上で増殖させた細胞に、ＶＳＶ改変型糖タンパク質をコードするｐＣＡＧＧＳプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの２０時間後、細胞を、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで固定した。洗浄（ＰＢＳで３回）後、カバースライドに、ｉｍｍｕ−ｍｏｕｎｔ  ＤＡＰＩ（ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）をマウントし、Ｚｅｉｓｓ顕微鏡を用いて検査した。赤色蛍光は、両方の事例において細胞表面に存在し、タンパク質がゴルジ装置を通って正確に折り畳まれたことを示している（図１９）。
本発明は、上記の実施形態に限定されない。
【図１】
2020534007.tif 000004
【図２】
2020534007.tif 000005
【図３】
2020534007.tif 000006
【図４】
2020534007.tif 000007
【図５】
2020534007.tif 000008
【図６】
2020534007.tif 000009
【図７】
2020534007.tif 000010
【図８】
2020534007.tif 000011
【図９】
2020534007.tif 000012
【図１０Ａ】
2020534007.tif 000013
【図１０Ｂ】
2020534007.tif 000014
【図１１】
2020534007.tif 000015
【図１２】
2020534007.tif 000016
【図１３】
2020534007.tif 000017
【図１４】
2020534007.tif 000018
【図１５】
2020534007.tif 000019
【図１６】
2020534007.tif 000020
【図１７】
2020534007.tif 000021
【図１８】
2020534007.tif 000022
【図１９】
2020534007.tif 000023
【配列表】
2020534007000001.app
【国際調査報告】
2020534007.tif 000024
2020534007.tif 000025
2020534007.tif 000026