(57)【要約】  本発明は、カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドに関し、このポリペプチドは、配列番号１または配列番号３に示される配列を含むカウレン酸１３−ヒドロキシラーゼと整列された場合に、１３６位、２４８位、３３６位、または４０３位の任意のアミノ酸位置に対応する少なくとも１つのアミノ酸置換をアミノ酸配列を含み、前記位置は、配列番号１または配列番号３を基準に定義され、このポリペプチドは、カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性を有する参照ポリペプチドと比較して改変された１つまたは複数の特性を有する。本発明のポリペプチドは、ステビオールまたはステビオール配糖体の産生のために組換え宿主で使用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１または配列番号３に示される配列を含むカウレン酸１３−ヒドロキシラーゼと整列された場合に：
１３６位、２４８位、３３６位、または４０３位
の任意のアミノ酸に対応する少なくとも１つのアミノ酸の置換を含むアミノ酸配列を含む、カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドであって、
前記位置が、配列番号１または配列番号３を基準に定義され、前記ポリペプチドが、カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性を有する参照ポリペプチドと比較して改変された１つまたは複数の特性を有する、ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１または配列番号３を基準に定義される１３６位、２４８位、３３６位、または４０３位の任意のアミノ酸に対応する、カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドにおける位置が、１０のギャップオープンペナルティーおよび０．５のギャップ伸長ペナルティーを用いる、置換マトリックスとしてＥＢＬＯＳＵＭ６２を使用するＥＭＢＯＳＳ  Ｎｅｅｄｌｅアラインメント法を用いて、カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１または配列番号３に示されるアミノ酸配列に整列させることによって同定される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記改変された特性が、改変されたカウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性である、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記参照ポリペプチドが、配列番号１または配列番号３のカウレン酸１３−ヒドロキシラーゼを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
（ｉ）メチオニンもしくはバリンが１３６位に存在し；
（ｉｉ）アスパラギンが２４８位に存在し；
（ｉｉｉ）セリンが３３６位に存在し；かつ／または
（ｉｖ）グリシンが４０３位に存在し、
前記位置が、配列番号１または配列番号３を基準に定義される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号１または配列番号３と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
配列番号５、７、９、１１、または１３のいずれか１つに対して少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
【請求項９】
任意選択により、ステビオールまたはステビオール配糖体を産生することができる、請求項８に記載の核酸を含む組換え宿主。
【請求項１０】
ｅｎｔ−コパリルピロリン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド；
ｅｎｔ−カウレンシンターゼ活性を有するポリペプチド；および
ｅｎｔ−カウレンオキシダーゼ活性を有するポリペプチド；および、任意選択による、
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドとは異なる、カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド
をコードする１つまたは複数の組換えヌクレオチド配列（複数可）を含む、請求項９に記載の組換え宿主。
【請求項１１】
ＮＡＤＰＨ−チトクロームｐ４５０レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換え核酸配列を含む、請求項９または１０に記載の組換え宿主。
【請求項１２】
（ｉ）ＵＧＴ７４Ｇ１活性を有するポリペプチド；
（ｉｉ）ＵＧＴ２活性を有するポリペプチド；
（ｉｉｉ）ＵＧＴ８５Ｃ２活性を有するポリペプチド；および
（ｉｖ）ＵＧＴ７６Ｇ１活性を有するポリペプチド；
のうちの１つまたは複数をコードする組換え核酸配列を含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の組換え宿主。
【請求項１３】
サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、イサチェンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ブレタノミセス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）属、パキソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ヤマダザイマ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）属、またはエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属のうちの１つに属する、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ）細胞、イサチェンキア・オリエンタリス（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）細胞、または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞の１つに属する、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の組換え宿主。
【請求項１４】
請求項９〜１３のいずれか一項に記載の組換え宿主を適切な発酵培地中で発酵させること、および任意選択による、ステビオールまたはステビオール配糖体を回収することを含む、ステビオールまたはステビオール配糖体の調製プロセス。
【請求項１５】
請求項１４に記載のプロセスによって得ることができるステビオール配糖体を含む発酵ブロス。
【請求項１６】
請求項１４に記載のプロセスによって得られるか、または請求項１５に記載の発酵ブロスから得られる１つまたは複数のステビオール配糖体を含む組成物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の組成物を含む食品、飼料、または飲料。
【請求項１８】
ステビオールまたは第１のステビオール配糖体を第２のステビオール配糖体に変換するための方法であって：
・ステビオールまたは第１のステビオール配糖体を、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の組換え宿主、そのような組換え宿主に由来する無細胞抽出物、またはそれらのいずれかに由来する酵素調製物と接触させる工程；
・それにより、前記ステビオールまたは第１のステビオール配糖体を前記第２のステビオール配糖体に変換する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［分野］
本開示は、カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードする配列を含む核酸に関する。本開示はまた、核酸を含む核酸構築物、および核酸または核酸構築物を含む発現ベクターに関する。さらに、本開示は、核酸、核酸構築物、または発現ベクターを含む組換え宿主に関する。本開示はまた、組換え宿主を発酵させることを含むステビオールまたはステビオール配糖体の調製のためのプロセス、そのようなプロセスによって得られる発酵ブロス、およびそのプロセスによって得られる、または発酵ブロスから得られるステビオール配糖体に関する。加えて、本開示は、２つ以上のステビオール配糖体を含む組成物、およびステビオール配糖体または組成物を含む食品、飼料、または飲料に関する。さらに、本開示は、第１のステビオール配糖体を第２のステビオール配糖体に変換するための方法、およびカウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドの生産方法に関する。
【０００２】
［背景］
多年生植物、ステビア・レバウディアナ・ベルトニー（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  Ｂｅｒｔ）の葉には、ステビオール配糖体として知られている非常に甘い化合物が大量に蓄積されている。これらの化合物の生物学的機能は不明であるが、それらは、代替の強力な甘味料として商業的意味を有する。
【０００３】
これらの甘いステビオール配糖体は、多くの強力な甘味料の機能特性および知覚特性よりも優れていると思われる機能特性および知覚特性を有する。さらに、研究により、ステビオシドがＩＩ型糖尿病患者の血糖値を下げることができ、そして中等度の高血圧患者の血圧を下げることができることが示唆されている。
【０００４】
ステビオール配糖体は、ステビアの葉に蓄積し、それらは葉の乾燥重量の１０〜２０％を占め得る。ステビオシドおよびレバウジオシドＡは、熱安定性、かつｐＨ安定性であり、炭酸飲料での使用に適しており、他の多くの食品にも使用することができる。ステビオシドは、スクロースよりも１１０〜２７０倍甘く、レバウジオシドＡは、スクロースよりも１５０〜３２０倍甘い。さらに、レバウジオシドＤは、ステビアの葉に蓄積する強力なジテルペン配糖体甘味料でもある。レバウジオシドＤは、スクロースの約２００倍甘い可能性がある。レバウジオシドＭは、さらに強力なジテルペン配糖体甘味料である。レバウジオシドＭは、特定のステビア品種の葉に微量で存在するが、優れた味覚プロファイルを有することが示唆されている。
【０００５】
ステビオール配糖体は、従来、ステビア植物から抽出されてきた。ステビアでは、ジベレリン酸（ＧＡ）生合成の中間体である（−）−カウレン酸が、四環式ジテルペンステビオールに変換され、次いで多段階グリコシル化経路を経て様々なステビオール配糖体を形成する。しかしながら、収量は、変動し、農業および環境条件によって影響を受ける可能性がある。また、ステビア栽培は、かなりの土地面積、収穫前の長い時間、多大な労働力、ならびに配糖体の抽出および精製のための追加費用を必要とする。
【０００６】
ごく最近になって、発酵プロセスを用いたステビオール配糖体の生産に関心が集まってきている。国際公開第２０１３／１１０６７３号パンフレットおよび同第２０１５／００７７４８号パンフレットに、少なくともステビオール配糖体レバウジオシドＡおよびレバウジオシドＤを生産するために使用できる微生物が記載されている。
【０００７】
より多量のステビオール配糖体を産生することができ、かつ／または追加もしくは新規のステビオール配糖体および／もしくはより多量の特定のステビオール配糖体および／もしくは所望の割合の異なるステビオール配糖体を有するステビオール配糖体の混合物を産生できるようにするためには、そのような微生物のさらなる改良が望ましい。
【０００８】
［概要］
本開示は、新規なカウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ（ＫＡＨ）ポリペプチド、すなわちＫＡＨ活性を有する新規なポリペプチドの同定に基づく。これらのポリペプチドは、ステビオールおよび／または１つもしくは複数のステビオール配糖体の産生に適した組換え宿主の作製に使用することができる。
【０００９】
そのような組換え宿主は、参照カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼを発現する組換え宿主と比較して、より多量のステビオール配糖体およびより少量の不所望の産物を産生し得る。より多量のステビオール配糖体および／またはより少量の不所望の産物の産生により、ステビオール配糖体の回収をより容易になり得る。また、より高い収量を得ることができる。
【００１０】
したがって、本開示は、カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドに関し、このポリペプチドは、配列番号１（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ由来の野生型ＫＡＨ配列）または配列番号３（ＫＡＨ４＿ｍ４）に示される配列を含むカウレン酸１３−ヒドロキシラーゼと整列された場合に：
１３６位、２４８位、３３６位、または４０３位
の任意のアミノ酸に対応するアミノ酸の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を含み、
前記位置は、配列番号１または配列番号３を基準に定義され、このポリペプチドは、カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性を有する参照ポリペプチドと比較して改変された１つまたは複数の特性を有する。
【００１１】
本開示はまた以下に関する：
・配列番号５、７、９、１１、または１３に対して少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも約９６％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド；
・本開示のカウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列を含む核酸；
・適切な発現宿主においてカウレン酸１３−ヒドロキシラーゼの発現を誘導することができる１つまたは複数の制御配列に機能的に連結された、本開示の核酸を含む核酸構築物；
・本開示による核酸または核酸構築物を含む発現ベクター；
・本開示の核酸、核酸構築物、または発現ベクターを含む組換え宿主；
・本明細書で開示されるような組換え宿主を適当な発酵培地中で発酵させること、および任意選択による、ステビオールまたはステビオール配糖体を回収することを含む、ステビオールまたはステビオール配糖体の調製プロセス；
・本明細書に開示されるステビオールまたはステビオール配糖体の調製プロセスによって得られるステビオール配糖体を含む発酵ブロス；
・本明細書に開示されるステビオールもしくはステビオール配糖体の調製プロセスによって得られるか、または本明細書に開示されるステビオール配糖体を含む発酵ブロスから得られるステビオール配糖体；
・本明細書に開示されるステビオールもしくはステビオール配糖体の調製プロセスによって得られるか、または本明細書に開示されるステビオール配糖体を含む発酵ブロスから得られる２つ以上のステビオール配糖体を含む組成物；
・本明細書に開示されるステビオールもしくはステビオール配糖体の調製プロセスによって得られるステビオール配糖体を含む、あるいは本明細書に開示されるステビオールもしくはステビオール配糖体の調製プロセスによって得られるか、または本明細書に開示されるステビオール配糖体を含む発酵ブロスから得られる組成物を含む食品、飼料、または飲料；
・第１のステビオール配糖体を第２のステビオール配糖体に変換する方法であって：
前記第１のステビオール配糖体を本明細書に開示される組換え宿主、そのような組換え宿主由来の無細胞抽出物、またはそれらのいずれかに由来の酵素調製物と接触させる工程；
それにより、第１のステビオール配糖体を第２のステビオール配糖体に変換する工程を含む、方法；ならびに
・本明細書に開示される宿主細胞を、カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼの産生に適した条件下で培養する工程、および任意選択による、カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼを回収する工程を含む、カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼを生産するための方法。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ステビオール配糖体の生合成をもたらす潜在的経路のすべてではなく、いくつかの概略図を示す。
【図２】図２は、（Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）での相同組換えを可能にする）ＩＮＴ３組み込みフランク（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｆｌａｎｋ）を含むベクターにクローニングされた、ＫＡＨ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、ならびにＫＡＨ４およびＨｙｇＢ（ハイグロマイシンに対する耐性をコードする）のプロモーター−ｏｒｆ−ターミネーターのプラスミドマップを示す。
【００１３】
［配列表の説明］
配列番号１は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のカウレン酸１３−ヒドロキシラーゼポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００１４】
配列番号２は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現に最適化されたコドン対である、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のカウレン酸１３−ヒドロキシラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。
【００１５】
配列番号３は、ＫＡＨ４＿ｍ４ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【００１６】
配列番号４は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現に最適化されたコドン対である、ＫＡＨ４＿ｍ４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。
【００１７】
配列番号５〜１４は表１に示されている。
【００１８】
配列番号１５は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現に最適化されたコドン対である、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）由来のヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。
【００１９】
配列番号１６は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現に最適化されたコドン対である、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）由来のゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。
【００２０】
配列番号１７は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現に最適化されたコドンである、ムコール・シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｅｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）由来のゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。
【００２１】
配列番号１８は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現に最適化されたコドン対である、ステビア・レバウディアナ（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）由来のコパリルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。
【００２２】
配列番号１９は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現に最適化されたコドン対である、ステビア・レバウディアナ（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）由来のカウレンシンターゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。
【００２３】
配列番号２０は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現に最適化されたコドン対である、イネ馬鹿苗病菌（Ｇｉｂｅｒｅｌｌａ  ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）由来のカウレンオキシダーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。
【００２４】
配列番号２１は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現に最適化されたコドン対である、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のチトクロームＰ４５０レダクターゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。
【００２５】
配列番号２２は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現に最適化されたコドン対である、ステビア・レバウディアナ（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）由来のＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。
【００２６】
配列番号２３は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現に最適化されたコドン対である、ステビア・レバウディアナ（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）由来のＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼポリペプチドの変異体をコードするヌクレオチド配列を示す。
【００２７】
配列番号２４は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現に最適化されたコドン対である、ステビア・レバウディアナ（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）由来のＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。
【００２８】
配列番号２５は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現に最適化されたコドン対である、ステビア・レバウディアナ（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）由来のＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。
【００２９】
［詳細な説明］
本明細書および添付の特許請求の範囲を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という語、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの変形は包含的に解釈されるべきである。すなわち、これらの語は、文脈が許す限り、具体的に列挙されていない他の要素または整数の包含の可能性を伝えることを意図している。
【００３０】
冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、冠詞の文法上の目的語の１つまたは２つ以上（すなわち、１つまたは少なくとも１つ）を指すために本明細書で使用される。例として、「１つの要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または２つ以上の要素を意味し得る。
【００３１】
したがって、本開示によると、カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドが提供される。本開示のポリペプチドは、カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性を有する。カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性は、ステビオールを形成するＣ−１３位における（−）−カウレン酸のヒドロキシル化の活性である。
【００３２】
本明細書における「レバウジオシド」は、「Ｒｅｂ」または「ｒｅｂ」などと略すことがある。
【００３３】
したがって、本開示の目的のために、カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドは、ｅｎｔ−カウレン酸由来のステビオール（ｅｎｔ−ｋａｕｒ−１６−エン−１３−オール−１９−酸）の生成を触媒するかまたは部分的に触媒することができるポリペプチドであり得る。したがって、本開示の目的のために、ポリペプチドは、ＮＡＤＰＨおよびＯ２を使用して、ステビオール（ｅｎｔ−ｋａｕｒ−１６−エン−１３−オール−１９−酸）の生成を触媒するかまたは部分的に触媒することができるカウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドであり得る。
【００３４】
そのような活性はまた、ｅｎｔ−ｋａ  １３−ヒドロキシラーゼ活性またはｅｎｔ−カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性と呼ぶこともある。
【００３５】
本開示のポリペプチドは、カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性を有する参照ポリペプチドと比較して改変された１つまたは複数の特性を有する。
【００３６】
本開示によるポリペプチドは、カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性を有する参照ポリペプチドと比較して改変されたカウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性を有し得る。
【００３７】
そのようなポリペプチドは、参照ポリペプチドと比較して低下した特異的カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性を有し得る。
【００３８】
そのようなポリペプチドは、参照ポリペプチドと比較して増加した特異的カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性を有し得る。
【００３９】
本開示によるポリペプチドは、天然に存在しないポリペプチドであり得る。
【００４０】
本明細書では、本開示のポリペプチドは、「カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ」酵素またはポリペプチド、「カウレン酸ヒドロキシラーゼ」酵素またはポリペプチド、「ＫＡＨ」酵素またはポリペプチドなどと呼ぶことがある。
【００４１】
本開示のＫＡＨポリペプチド（例えば、本明細書に示される１つまたは複数の置換を有するポリペプチド）は、配列番号１または配列番号３のＫＡＨなどの参照ＫＡＨポリペプチドと少なくとも約６０％、７０％、８０％の同一性、例えば、参照ポリペプチドと少なくとも約８５％の同一性、例えば、参照ポリペプチドと少なくとも約９０％の同一性、参照ポリペプチドと少なくとも約９５％の同一性、参照ポリペプチドと少なくとも約９８％の同一性、または参照ポリペプチドと少なくとも約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。そのようなＫＡＨポリペプチドは、典型的には、配列番号１または配列番号３を基準に定義される
１３６位、２４８位、３３６位、または４０３位
に対応する位置から選択される１つもしくは複数の置換または置換のセットを有するであろう。
【００４２】
参照ＫＡＨにおいて本明細書で定義される位置のうちの１つに対応するアミノ酸位置は、記載された任意のアミノ酸位置と多重（タンパク質）配列アラインメントにおいて整列する位置であり得る。
【００４３】
配列番号１または配列番号３を基準に定義される１３６位、２４８位、３３６位、または４０３位のうちの１つに対応するアミノ酸位置は、ＫＡＨポリペプチド配列が適切な配列アラインメント法によって配列番号１または３に示されるアミノ酸配列と整列された場合にＫＡＨポリペプチド配列において同定される位置である。適切な配列アラインメント法は、互いの配列の比較、およびＫＡＨポリペプチドのアミノ酸配列における位置の同定を可能にする方法であり、配列番号１または３に示されるアミノ酸配列と比較すると、同じアミノ酸が存在する（同一の位置）か、または別のアミノ酸が存在する（置換）か、または１つまたは複数の余分なアミノ酸が存在する（挿入または伸長）か、またはアミノ酸が存在しない（欠失または切断）。
【００４４】
２つのアミノ酸配列の比較を可能にする適切な方法は、当業者に公知の任意の適切なペアワイズ配列アラインメント法、好ましくはグローバルペアワイズ配列アラインメント法であり得る。好ましいグローバルペアワイズ配列アラインメント法は、本明細書に記載されるＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアラインメントアルゴリズム（２つの配列の全長に沿ってそれらの最適なアラインメント（ギャップを含む）を見出すことを目的とする）（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３−４５３）に基づくＥＭＢＯＳＳ  Ｎｅｅｄｌｅ法である。一実施形態では、アミノ酸配列は、好ましくは１０のギャップオープンペナルティーおよび０．５のギャップ伸長ペナルティーを用いる、置換マトリックスとしてＥＢＬＯＳＵＭ６２を使用するＥＭＢＯＳＳ  Ｎｅｅｄｌｅアラインメント法を使用して、配列番号１または３に示されるアミノ酸配列と整列される。
【００４５】
本開示による一実施形態では、配列番号１または配列番号３を基準に定義される１３６位、２４８位、３３６位、または４０３位の任意のアミノ酸に対応する、ＫＡＨ活性を有するポリペプチドにおける位置は、１０のギャップオープンペナルティーおよび０．５のギャップ伸長ペナルティーを用いる、置換マトリックスとしてＥＢＬＯＳＵＭ６２を使用するＥＭＢＯＳＳパッケージのＮＥＥＤＬＥプログラムなどのＥＭＢＯＳＳ  Ｎｅｅｄｌｅアラインメント法を用いて、本開示のＫＡＨ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１または３に示されるアミノ酸配列に整列させることによって同定される。
【００４６】
本開示のＫＡＨは、典型的にはＫＡＨ活性を維持するであろう。すなわち、本開示のＫＡＨは、参照ポリペプチドと比較して改変された活性を有するが、典型的には上記の反応を触媒することができるであろう。
【００４７】
好ましくは、本開示のＫＡＨポリペプチドは、典型的にはそれが由来する参照ポリペプチドと比較して、典型的には比活性および／または基質特異性に関して改善された特性を示すであろう。そのような改善された特性は、典型的には、例えばステビオールおよび／またはステビオール配糖体の生産方法（組換え宿主でＫＡＨを発現させることによる）において、以下に示すようにＫＡＨを使用した場合に適切な特性である。
【００４８】
したがって、本開示のＫＡＨは、典型的には、（参照ポリペプチドを発現する、ステビオールおよび／またはステビオール配糖体を産生することができる組換え宿主と比較して）ステビオールおよび／またはステビオール配糖体を産生することができる組換え宿主における前記ステビオールおよび／またはステビオール配糖体の産生を増加させることができるＫＡＨである。すなわち、宿主細胞における本開示のＫＡＨポリペプチドの過剰発現は、典型的には、（配列番号１または配列番号３のＫＡＨなどの）宿主ポリペプチドを過剰発現する宿主細胞と比較して、ステビオールおよび／またはステビオール配糖体の産生の増加をもたらすであろう。
【００４９】
本開示のＫＡＨは、典型的には、（参照ポリペプチドを発現する、ステビオールおよび／またはステビオール配糖体を産生することができる組換え宿主と比較して）ステビオールおよび／またはステビオール配糖体を産生することができる組換え宿主における１つまたは複数のカウレン酸配糖体などの非ステビオール配糖体の産生を減少させることができるＫＡＨであり得る。すなわち、宿主細胞における本開示のＫＡＨポリペプチドの過剰発現は、典型的には、（配列番号１または配列番号３のＫＡＨなどの）宿主ポリペプチドを過剰発現する宿主細胞と比較して、ステビオールおよび／またはステビオール配糖体の産生の増加をもたらすであろう。
【００５０】
少量の非ステビオール配糖体産物の産生により、ステビオール配糖体の回収がより容易になり得る。また、より高い収量を得ることができる。
【００５１】
参照ＫＡＨに対して改善された特性を示すＫＡＨは、例えばステビオールまたはステビオール配糖体の生産方法において、典型的にはＫＡＨが本明細書に示される使用により適するように、関連する特性、例えば比活性の測定可能な減少または増加を実証するＫＡＨである。
【００５２】
ＫＡＨポリペプチドは、参照ポリペプチドと比較して１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、および／もしくは挿入、ならびに／または参照ポリペプチドと比較して１つまたは複数の切断を有するアミノ酸配列を含む。ＫＡＨポリペプチドは、本明細書に記載される１つまたは複数の置換を含み得る。
【００５３】
例えば本明細書に示されるＫＡＨ活性を有するポリペプチドであって、配列番号１または配列番号３に示される配列を含むＫＡＨと整列された場合に、
１３６位、２４８位、３３６位、または４０３位
のアミノ酸のいずれかに対応するアミノ酸の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を含み、
前記位置は、配列番号１または配列番号３を基準に定義され、ＫＡＨは、ＫＡＨ活性を有する参照ポリペプチドと比較して改変された１つまたは複数の特性を有する、ポリペプチド。
【００５４】
アミノ酸の置換は、特定の位置のアミノ酸残基が異なるアミノ酸で置換されていることを示すものとする。
【００５５】
したがって、例えば本明細書に示されるＫＡＨ活性を有するポリペプチドであって、配列番号１または配列番号３に示される配列を含むＫＡＨと整列された場合に、
１３６位、２４８位、３３６位、または４０３位
の任意のアミノ酸に対応するアミノ酸残基の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を含み、
前記位置は、配列番号１または配列番号３を基準に定義され、ＫＡＨは、ＫＡＨ活性を有する参照ポリペプチドと比較して改変された１つまたは複数の特性を有する、ポリペプチド。
【００５６】
したがって、前記位置のうちの１つまたは複数に存在するアミノ酸は、参照配列中のその位置に存在するアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換されるであろう（その位置は、配列番号１または配列番号３を基準に定義される）。
【００５７】
本開示のＫＡＨは、上記の置換のうちの１つを含んでもよいし、またはそれらの２つ、３つもしくは４つの任意の組み合わせを含んでもよい。
【００５８】
本開示のＫＡＨポリペプチドは：
（ｉ）メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、グルタミン（Ｑ）、ヒスチジン（Ｈ）、もしくはトレオニン（Ｔ）が１３６位に対応する位置に存在し；
（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、トレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、もしくはプロリン（Ｐ）が２４８位に対応する位置に存在し；
（ｉｉｉ）セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、もしくはイソロイシン（Ｉ）が３３６位に対応する位置に存在し；かつ／または
（ｉｖ）グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、メチオニン（Ｍ）、もしくはセリン（Ｓ）が４０３位に対応する位置に存在する、ＫＡＨポリペプチドであり得、
前記位置は、配列番号１または配列番号３を基準に定義される。
【００５９】
上で定義された置換のうちの２つ、３つ、または４つの任意の組み合わせを使用して、本開示のＫＡＨを定義することができる。
【００６０】
本開示のＫＡＨポリペプチドは、好ましくは：
（ｉ）メチオニン（Ｍ）もしくはバリン（Ｖ）が１３６位に対応する位置に存在し；
（ｉｉ）アスパラギン（Ｎ）が２４８位に対応する位置に存在し；
（ｉｉｉ）セリン（Ｓ）が３３６位に対応する位置に存在し；かつ／または
（ｉｖ）グリシン（Ｇ）が４０３位に対応する位置に存在する、ＫＡＨポリペプチドであり得、
前記位置は、配列番号１または配列番号３を基準に定義される。
【００６１】
上で定義された置換の任意の組み合わせを使用して、本開示のＫＡＨを定義することができる。
【００６２】
したがって、本開示のＫＡＨポリペプチドは、配列番号１または配列番号３に示される配列を含むＫＡＨと整列された場合に、任意のアミノ酸に対応する少なくとも以下のアミノ酸の置換：
１３６位および２４８位
１３６位および３３６位
１３６位および４０３位
２４８位および３３６位
２４８位および４０３位
３３６位および４０３位
１３６位、２４８位、および４０３位
１３６位、３３６位、および４０３位
１３６位、２４８位、および３３６位
２４８位、３３６位、および４０３位、または
１３６位、２４８位、３３６位、および４０３位
を含むアミノ酸配列を含み得、
前記位置は、配列番号１または配列番号３を基準に定義される。
【００６３】
したがって、本開示のＫＡＨポリペプチドは、配列番号１または配列番号３に示される配列を含むＫＡＨと整列された場合に、任意のアミノ酸に対応する少なくとも以下のアミノ酸の置換：
（ａ）１３６位に対応する位置に存在するメチオニン（Ｍ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはフェニルアラニン（Ｆ）、もしくはトリプトファン（Ｗ）、もしくはグルタミン（Ｑ）、もしくはヒスチジン（Ｈ）、もしくはトレオニン（Ｔ）、および２４８位に対応する位置に存在するアスパラギン（Ｎ）、もしくはグルタミン（Ｑ）、もしくはトレオニン（Ｔ）、もしくはグリシン（Ｇ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはイソロイシン（Ｉ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはフェニルアラニン（Ｆ）、もしくはプロリン（Ｐ）；
（ｂ）１３６位に対応する位置に存在するメチオニン（Ｍ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはアラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）、もしくはトリプトファン（Ｗ）、もしくはグルタミン（Ｑ）、もしくはヒスチジン（Ｈ）、もしくはトレオニン（Ｔ）、および３３６位に対応する位置に存在するセリン（Ｓ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはイソロイシン（Ｉ）；
（ｃ）１３６位に対応する位置に存在するメチオニン（Ｍ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはアラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）、もしくはトリプトファン（Ｗ）、もしくはグルタミン（Ｑ）、もしくはヒスチジン（Ｈ）、もしくはトレオニン（Ｔ）、および４０３位に対応する位置に存在するグリシン（Ｇ）、もしくはロイシン（Ｌ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはメチオニン（Ｍ）、もしくはセリン（Ｓ）；
（ｄ）２４８位に対応する位置に存在するアスパラギン（Ｎ）、もしくはグルタミン（Ｑ）、もしくはトレオニン（Ｔ）、もしくはグリシン（Ｇ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはイソロイシン（Ｉ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはフェニルアラニン（Ｆ）、もしくはプロリン（Ｐ）、および３３６位に対応する位置に存在するセリン（Ｓ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはイソロイシン（Ｉ）；
（ｅ）２４８位に対応する位置に存在するアスパラギン（Ｎ）、もしくはグルタミン（Ｑ）、もしくはトレオニン（Ｔ）、もしくはグリシン（Ｇ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはイソロイシン（Ｉ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはフェニルアラニン（Ｆ）、もしくはプロリン（Ｐ）、および４０３位に対応する位置に存在するグリシン（Ｇ）、もしくはロイシン（Ｌ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはメチオニン（Ｍ）、もしくはセリン（Ｓ）；
（ｆ）３３６位に対応する位置に存在するセリン（Ｓ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはイソロイシン（Ｉ）、および４０３位に対応する位置に存在するグリシン（Ｇ）、もしくはロイシン（Ｌ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはメチオニン（Ｍ）、もしくはセリン（Ｓ）；
（ｇ）１３６位に対応する位置に存在するメチオニン（Ｍ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはアラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）、もしくはトリプトファン（Ｗ）、もしくはグルタミン（Ｑ）、もしくはヒスチジン（Ｈ）、もしくはトレオニン（Ｔ）、２４８位に対応する位置に存在するアスパラギン（Ｎ）、もしくはグルタミン（Ｑ）、もしくはトレオニン（Ｔ）、もしくはグリシン（Ｇ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはイソロイシン（Ｉ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはフェニルアラニン（Ｆ）、もしくはプロリン（Ｐ）、および４０３位に対応する位置に存在するグリシン（Ｇ）、もしくはロイシン（Ｌ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはメチオニン（Ｍ）、もしくはセリン（Ｓ）；
（ｈ）１３６位に対応する位置に存在するメチオニン（Ｍ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはアラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）、もしくはトリプトファン（Ｗ）、もしくはグルタミン（Ｑ）、もしくはヒスチジン（Ｈ）、もしくはトレオニン（Ｔ）、３３６位に対応する位置に存在するセリン（Ｓ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはイソロイシン（Ｉ）、および４０３位に対応する位置に存在するグリシン（Ｇ）、もしくはロイシン（Ｌ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはメチオニン（Ｍ）、もしくはセリン（Ｓ）；
（ｉ）１３６位に対応する位置に存在するメチオニン（Ｍ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはアラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）、もしくはトリプトファン（Ｗ）、もしくはグルタミン（Ｑ）、もしくはヒスチジン（Ｈ）、もしくはトレオニン（Ｔ）、２４８位に対応する位置に存在するアスパラギン（Ｎ）、もしくはグルタミン（Ｑ）、もしくはトレオニン（Ｔ）、もしくはグリシン（Ｇ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはイソロイシン（Ｉ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはフェニルアラニン（Ｆ）、もしくはプロリン（Ｐ）、および３３６位に対応する位置に存在するセリン（Ｓ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはイソロイシン（Ｉ）；
（ｊ）２４８位に対応する位置に存在するアスパラギン（Ｎ）、もしくはグルタミン（Ｑ）、もしくはトレオニン（Ｔ）、もしくはグリシン（Ｇ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはイソロイシン（Ｉ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはフェニルアラニン（Ｆ）、もしくはプロリン（Ｐ）、３３６位に対応する位置に存在するセリン（Ｓ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはイソロイシン（Ｉ）、および４０３位に対応する位置に存在するグリシン（Ｇ）、もしくはロイシン（Ｌ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはメチオニン（Ｍ）、もしくはセリン（Ｓ）、または
（ｋ）１３６位に対応する位置に存在するメチオニン（Ｍ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはアラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）、もしくはトリプトファン（Ｗ）、もしくはグルタミン（Ｑ）、もしくはヒスチジン（Ｈ）、もしくはトレオニン（Ｔ）、２４８位に対応する位置に存在するアスパラギン（Ｎ）、もしくはグルタミン（Ｑ）、もしくはトレオニン（Ｔ）、もしくはグリシン（Ｇ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはイソロイシン（Ｉ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはフェニルアラニン（Ｆ）、もしくはプロリン（Ｐ）、３３６位に対応する位置に存在するセリン（Ｓ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはイソロイシン（Ｉ）、および４０３位に対応する位置に存在するグリシン（Ｇ）、もしくはロイシン（Ｌ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはメチオニン（Ｍ）、もしくはセリン（Ｓ）、を含むアミノ酸配列を含み得、
前記位置は、配列番号１または配列番号３を基準に定義される。
【００６４】
本開示のＫＡＨポリペプチドは、上で定義された５つの置換位置のうちの１つまたは複数以外のさらなる置換、例えば、１つまたは複数のさらなる置換、付加、または欠失を含み得る。
【００６５】
本開示のＫＡＨは、この種の異なる種類の改変の組み合わせを含み得る。ＫＡＨは、１つ、２つ、３つ、４つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、またはそれ以上のそのような改変（すべて同じ種類の改変であってもよいし、または異なる種類の改変であってもよい）を含み得る。典型的には、さらなる改変は置換であり得る。本開示のＫＡＨポリペプチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含み得る。しかしながら、ＫＡＨポリペプチドは、１３６位、２４８位、３３６位、または４０３位における置換の任意の組み合わせを含み得、前記位置は、配列番号１または配列番号３に示されるような適切な参照配列を基準に定義される。
【００６６】
宿主細胞は、本開示の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のＫＡＨをコードする核酸を含み得る。そのようなＫＡＨポリペプチドは、同じであっても異なっていてもよい。宿主細胞は、配列番号１または配列番号３のＫＡＨをコードする核酸、および本開示の１つまたは複数のＫＡＨをコードする核酸を含み得る。すなわち、宿主は、配列番号１または配列番号３のＫＡＨをコードする核酸、および本開示の１つまたは複数のＫＡＨをコードする核酸を含み得、これらはそれぞれ、コピー中に１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上存在し得る。
【００６７】
ＫＡＨポリペプチドは、典型的には、参照ポリペプチドと比較して改変されたＫＡＨ活性を有するであろう。典型的には、改変された活性は、組換え宿主におけるステビオールおよび／またはステビオール配糖体の産生に関して定義することができる。
【００６８】
改変された活性は、参照ポリペプチド、例えば配列番号１または配列番号３のポリペプチドを過剰発現する同等の宿主細胞の産生レベルと比較して、ＫＡＨが宿主細胞で過剰発現されるときのステビオールおよび／またはステビオール配糖体の産生の増加に関して定義することができる。
【００６９】
改変された活性は、参照ポリペプチド、例えば配列番号１または配列番号３のポリペプチドを過剰発現する同等の宿主細胞の産生レベルと比較して、ＫＡＨが宿主細胞で過剰発現されるときの非ステビオール配糖体、例えばカウレン酸配糖体などの不所望の産物の産生の減少に関して定義することができる。
【００７０】
改変された活性は、２つのステビオール配糖体の産生比の変化に関して定義することができ、参照ポリペプチド、例えば、配列番号１または配列番号３の参照ポリペプチドを過剰発現する同等の宿主細胞の産生レベルと比較して、ＫＡＨが宿主細胞において過剰発現される場合、例えばレバウジオシドＡ：レバウジオシドＭの比率が増加し得る、あるいはレバウジオシドＭ：レバウジオシドＡの比率が増加し得る。
【００７１】
改変された活性は、産生されたステビオール配糖体の合計のカウレン酸−配糖体の合計に対する比率の変化によって定義することができ、例えばステビオール配糖体の合計：カウレン酸−配糖体の合計の比率は、参照ポリペプチド、例えば配列番号１または配列番号３のポリペプチドを過剰発現する同等の宿主細胞の産生レベルと比較して、ＫＡＨが宿主細胞で過剰発現されるときに増加し得る。
【００７２】
改変された活性はまた、例えば、参照ポリペプチド、例えば配列番号１または配列番号３のポリペプチドよりも長い半減期を有するＫＡＨの安定性の増加に関して定義することもできる。
【００７３】
改変された活性はまた、参照ポリペプチド、例えば配列番号１または配列番号３のポリペプチドと比較して、より効率的な電子伝達に関して、例えばより少ないデカップリングに関して定義することもできる。
【００７４】
改変された活性はまた、参照ポリペプチド、例えば配列番号１または配列番号３のポリペプチドと比較して、宿主細胞内のより効率的な電子局在化に関して定義することもできる。
【００７５】
ＫＡＨは、例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、またはそれ以上の産生レベルを増加させ得る可能性がある。産生レベルは、ｇ／Ｌまたはｍｏｌ／Ｌ（Ｍ）で表すことができるため、ステビオールおよび／またはステビオール配糖体の産生レベルの増加は、ｇ／Ｌまたはｍｏｌ／Ｌでの高い生産レベルによってはっきりと分かるであろう。
【００７６】
１つまたは複数のカウレン酸配糖体などの不所望の産物の場合、ＫＡＨは、例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、またはそれ以上の産生レベルを減少させることが可能であり得る。ＫＡＨは、この比率を、例えば、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、またはそれ以上増加させることが可能であり得る。
【００７７】
上記のように、これはまた、ステビオール配糖体の合計：カウレン酸−配糖体の合計の増加に関しても定義することもできる。
【００７８】
「ポリペプチド」という語は、本明細書では、約７個を超えるアミノ酸残基を含む鎖に対して使用される。本明細書のすべてのポリペプチド配列は、左から右に、アミノ末端からカルボキシ末端への方向に書かれる。本明細書で使用されるアミノ酸の一文字コードは当技術分野で一般的に知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）に見ることができる。
【００７９】
本開示のＫＡＨポリペプチドは、実質的に単離された形態などの単離された形態であり得る。「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質とは、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質のことである。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製された組換えポリペプチドと同様に、本開示の目的のために単離されたと見なされる。本開示によるＫＡＨポリペプチドは、当技術分野において公知の方法によって組換え細胞の培養物から回収および精製することができる。
【００８０】
本開示のＫＡＨポリペプチドは、化学合成手順の生成物、ならびに、例えば細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物の細胞を含む原核宿主または真核宿主からの組換え技術によって産生される産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に応じて、本開示のポリペプチドは、グリコシル化されていてもグリコシル化されていなくてもよい。さらに、本開示のポリペプチドは、場合によっては宿主媒介プロセスの結果として、最初の改変されたメチオニン残基も含み得る。
【００８１】
本開示はまた、本開示によるＫＡＨポリペプチドの生物学的に活性な断片を特徴とする。そのような断片は、「本開示のＫＡＨ」という用語に包含されると見なされる。
【００８２】
本開示のＫＡＨポリペプチドの生物学的に活性な断片は、完全長タンパク質より少ないアミノ酸を含むが対応する完全長タンパク質の少なくとも１つの生物学的活性を示す、本開示のＫＡＨタンパク質のアミノ酸配列と十分に同一であるかまたはこのアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。典型的には、生物学的に活性な断片は、本開示のＫＡＨタンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。本開示のＫＡＨの生物学的に活性な断片は、例えば、１０、２５、５０、１００、またはそれ以上のアミノ酸長であるポリペプチドであり得る。さらに、タンパク質の他の領域が欠失している他の生物学的に活性な部分は、組換え技術によって調製することができ、かつ本開示のポリペプチドの天然の形態の１つまたは複数の生物学的活性について評価することができる。
【００８３】
典型的には、本開示のＫＡＨのタンパク質断片は、本明細書で定義される１つまたは複数の置換を含むであろう。
【００８４】
本開示はまた、上記の生物学的に活性な断片をコードする核酸断片を特徴とする（これらの生物学的に活性な断片はそれ自体が本開示のＫＡＨである）。
【００８５】
本開示は、本開示のＫＡＨポリペプチド（およびその生物学的に活性な断片）をコードする配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本開示はまた、本開示のＫＡＨポリペプチドの少なくとも１つの機能的ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。典型的には、そのようなドメインは、本明細書に記載されている１つまたは複数の置換を含むであろう。
【００８６】
本開示の核酸分子は、本明細書に提供される配列情報と組み合わせて使用される、当業者に周知の標準的な分子生物学的技術を用いて作製することができる。例えば、標準的な合成技術を用いて、必要とされる核酸分子を、ＰＣＲによって作製するか、または新規に合成することができる。そのような合成プロセスは、典型的には自動化プロセスであろう。
【００８７】
本開示の核酸は、参照ＫＡＨをコードする核酸と比較して、１つまたは複数の欠失、すなわちギャップを含み得る。そのような欠失／ギャップは、適切なオリゴヌクレオチドを用いる部位特異的突然変異誘発法を用いて生成することもできる。そのような欠失を生じさせるための技術は当業者に周知である。
【００８８】
さらに、本開示によるヌクレオチド配列に対応するか、またはそれとハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術によって、例えば自動ＤＮＡ合成装置を用いて調製することができる。
【００８９】
また、相補的な核酸およびアンチセンス核酸も本開示に含まれる。別のヌクレオチド配列に相補的な核酸分子は、他のヌクレオチド配列にハイブリダイズして安定な二本鎖を形成することができるように他のヌクレオチド配列に十分に相補的な核酸分子である。
【００９０】
本開示の一態様は、本開示のＫＡＨポリペプチド、またはその生物学的に活性な断片もしくはドメインをコードする単離された核酸分子、ならびに本明細書に開示されるポリペプチドをコードする核酸分子を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとしての使用に十分な核酸分子、および本開示の核酸分子の調製などのための、核酸分子の増幅または突然変異のためのＰＣＲプライマーとしての使用に適した、そのような核酸分子の断片に関する。
【００９１】
「単離された核酸」または「単離されたポリヌクレオチド」は、それが由来する生物の天然に存在するゲノムにおいて直接隣接しているコード配列（５’末端のコード配列および３’末端のコード配列）の両方と直接隣接していないＤＮＡまたはＲＮＡである。したがって、一実施形態では、単離された核酸は、コード配列に直接隣接している５’非コード（例えば、プロモーター）配列の一部またはすべてを含む。したがって、この用語は、例えば、ベクター、自律的に複製するプラスミドもしくはウイルス、あるいは原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれているか、または他の配列とは独立に別の分子（例えば、ＰＣＲもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理によって作製されるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片）として存在する組換えＤＮＡを含む。この用語はまた、細胞物質、ウイルス物質、または培養培地（組換えＤＮＡ技術によって作製された場合）、または化学的前駆体もしくは他の化学物質（化学的に合成された場合）を実質的に含まない追加のポリペプチドをコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも含む。さらに、「単離された核酸断片」は、断片として天然に存在しない、かつ天然の状態でも見出されないであろう核酸断片である。
【００９２】
本明細書で使用される「核酸」、「ポリヌクレオチド」、または「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、およびヌクレオチド類似体を用いて作製されたＤＮＡまたはＲＮＡの類似体を含むことが意図されている。核酸分子は、一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。核酸は、オリゴヌクレオチド類似体または誘導体（例えば、イノシンまたはホスホロチオエートヌクレオチド）を用いて合成することができる。そのようなオリゴヌクレオチドを使用して、例えば、変更された塩基対形成能力または高いヌクレアーゼ耐性を有する核酸を調製することができる。
【００９３】
本開示はまた、本開示のＫＡＨポリペプチドをコードする核酸配列、およびそれに機能的に連結された、宿主細胞中でこの核酸配列の発現を可能にする制御配列を含む核酸構築物にも関する。核酸構築物は、ＫＡＨポリペプチドの発現を達成するために、発現ベクターなどのベクターおよび／または宿主細胞に組み込むことができる。
【００９４】
「核酸構築物」という用語は、本明細書では、天然に存在する遺伝子から単離された、またはより典型的には、天然には存在しないように組み合わせられて並置された核酸のセグメントを含むように改変された、一本鎖または二本鎖の核酸分子と呼ばれる。用語、核酸構築物は、コード配列の発現に必要な制御配列のすべてを含む場合、用語「発現カセット」と同義であり、前記制御配列は、前記コード配列に機能的に連結されている。
【００９５】
本明細書で使用される「機能的に連結された」という用語は、機能的関係におけるポリヌクレオチド要素（またはコード配列または核酸配列）の連結を指す。核酸配列は、別の核酸配列と機能的な関係に配置されている場合、「機能的に連結されて」いる。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に機能的に連結されている。
【００９６】
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、遺伝子の転写開始部位の転写の方向に対して上流に位置する１つまたは複数の遺伝子の転写を制御するように機能する核酸断片を指し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位、および当業者に公知の任意の他のＤＮＡ配列の存在によって構造的に識別される。「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境および発生条件下で活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境または発生制御下で活性であるプロモーターである。
【００９７】
ＫＡＨポリペプチドなどの酵素、または本開示の組換え宿主細胞に導入される任意の他の酵素のような酵素をコードするヌクレオチド配列の発現を達成するために使用することができるプロモーターは、発現される酵素をコードするヌクレオチド配列に固有ではない、すなわち、それが機能的に連結されているヌクレオチド配列（コード配列）に対して異種であるプロモーターであり得る。好ましくは、プロモーターは、宿主細胞に対して相同、すなわち内因性である。
【００９８】
この文脈における適切なプロモーターには、構成的および誘導性の天然プロモーターならびに遺伝子的に操作されたプロモーターの両方が含まれ、それらは当業者に周知である。宿主細胞における適切なプロモーターは、ＧＡＬ７、ＧＡＬ１０、またはＧＡＬ１、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＡＤＨ１、ＰＧＬ、ＰＨ０５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ、およびＡＯＸ１であり得る。他の適切なプロモーターには、ＰＤＣ、ＧＰＤ１、ＰＧＫ１、ＴＥＦ１、およびＴＤＨが含まれる。
【００９９】
通常は、酵素をコードするヌクレオチド配列はターミネーターを含む。宿主細胞において機能的であるいずれのターミネーターも、本開示で使用することができる。好ましいターミネーターは、宿主細胞の天然遺伝子から得られる。適切なターミネーター配列は、当技術分野で周知である。好ましくは、そのようなターミネーターは、本開示の宿主細胞におけるナンセンス媒介ｍＲＮＡ崩壊（ｎｏｎｓｅｎｓｅ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍＲＮＡ  ｄｅｃａｙ）を防止する変異と組み合わせられる（例えば、Ｓｈｉｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６１：１４６５−１４８２を参照）。
【０１００】
本開示はさらに、本開示の核酸または本開示の核酸構築物を含む（すなわち、本開示のＫＡＨポリペプチドをコードする配列を含む）ベクター、好ましくは発現ベクターに関する。
【０１０１】
ＫＡＨの発現および／または翻訳を促進するために、ＫＡＨをコードする遺伝子がインビトロまたは本開示の宿主細胞における発現および／または翻訳のための適切な制御配列に機能的に連結されるように、ＫＡＨをコードする核酸配列を発現ベクターに含めることができる。すなわち、本開示は、本開示の核酸または核酸構築物を含む発現ベクターを提供する。
【０１０２】
発現ベクターは、組換えＤＮＡ法に便利に供することができ、かつＫＡＨポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現をもたらすことができる任意のベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される細胞とベクターとの適合性によって決まる。ベクターは、線状または閉環状プラスミドであり得る。ベクターは、自律的に複製するベクター、すなわち、その複製が染色体の複製とは独立している染色体外の実体として存在するベクター、例えば、プラスミド、染色体外要素、ミニ染色体、または人工染色体であり得る。真菌起源の宿主細胞での使用を意図している場合、適切なエピソーム核酸構築物は、例えば、酵母２μもしくはｐＫＤ１プラスミド（Ｇｌｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：９６８−９７５）、またはＡＭＡプラスミド（Ｆｉｅｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ．２９：４８２−４８９）に基づいてもよい。
【０１０３】
あるいは、発現ベクターは、宿主細胞に導入されるとゲノムに組み込まれ、それが組み込まれている染色体と一緒に複製される発現ベクターであり得る。組込みクローニングベクターは、宿主細胞の染色体中に無作為にまたは所定の標的遺伝子座に組み込まれ得る。本開示の好ましい実施形態では、組込みクローニングベクターは、クローニングベクターの宿主細胞のゲノム中の所定の遺伝子座への組込みを標的とするための、この所定の標的遺伝子座におけるＤＮＡ配列と相同なＤＮＡ断片を含む。標的組込みを促進するために、クローニングベクターは、好ましくは細胞の形質転換の前に線状化される。線状化は、好ましくは、クローニングベクターの少なくとも一方の末端、好ましくは両方の末端が標的遺伝子座に相同な配列に隣接するように行われる。標的遺伝子座に隣接する相同配列の長さは、好ましくは、少なくとも２０ｂｐ、少なくとも３０ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ、少なくとも０．１ｋｂ、少なくとも０．２ｋｂ、少なくとも０．５ｋｂ、少なくとも１ｋｂ、少なくとも２ｋｂ、またはそれ以上である。宿主細胞のゲノムへの標的組込み、すなわち所定の標的遺伝子座への組込みの効率は、宿主細胞の増強された相同組換え能力によって高められる。
【０１０４】
標的遺伝子座と相同であるクローニングベクター中の相同フランキングＤＮＡ配列は、高度に発現された遺伝子座から得ることができる、すなわちそれらは、宿主細胞中で高い発現レベルが可能である遺伝子から得られることを意味する。高い発現レベルが可能な遺伝子、すなわち高度に発現される遺伝子は、本明細書では、例えば誘導条件下で、そのｍＲＮＡが全細胞ｍＲＮＡの少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）を構成することができる遺伝子、あるいは、その遺伝子産物が全細胞タンパク質の少なくとも１％（ｗ／ｗ）を構成することができる、または分泌遺伝子産物の場合には、少なくとも０．１ｇ／ｌのレベルまで分泌され得る遺伝子として定義される。より典型的には、標的遺伝子座は、遺伝子間位置であり得るため、遺伝子は中断されない。そのような遺伝子座はまた、高い発現レベルを提供し得る。したがって、クローニングベクター中の相同フランキングＤＮＡ配列は、遺伝子間標的遺伝子座と相同であり得る。
【０１０５】
核酸構築物または発現ベクターは、本開示の宿主細胞中で、インビボで構築され、任意選択により、単一工程で細胞のゲノムに組み込むことができる（例えば、国際公開第２０１３／０７６２８０号パンフレットを参照）。
【０１０６】
本開示の核酸構築物または発現ベクターの２つ以上のコピーを宿主細胞に挿入して、核酸構築物内に含まれる核酸配列によってコードされるＫＡＨポリペプチドの産生（過剰発現）を増加させることができる。これは、好ましくは、そのゲノムに２コピー以上の核酸を組み込むことによって、より好ましくは、上で定義したように定義された遺伝子座への核酸の組込みを標的化することによって行うことができる。
【０１０７】
発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどのような要因に依存し得ることを当業者は理解されよう。本開示の発現ベクターを宿主細胞に導入し、これにより、本明細書に記載される核酸によってコードされるタンパク質またはペプチド（例えば、配列番号１または配列番号３のＫＡＨ、例えば機能的等価物または断片、または１つ以上のそのようなＫＡＨを含む融合タンパク質）を産生させることができる。
【０１０８】
本開示の核酸構築物およびベクターは、原核宿主細胞または真核宿主細胞における本開示のＫＡＨポリペプチドの発現用に設計することができる。
【０１０９】
本開示の核酸構築物および／または発現ベクターを、従来の形質転換またはトランスフェクション技術によって原核細胞または真核細胞に導入することができる。本明細書で使用する「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、当業者に周知の宿主細胞に外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を導入するための当技術分野で承認されている様々な技術を指すものとする。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするのに適した方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ，ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）、および他の実験マニュアルに見ることができる。
【０１１０】
本開示による「機能的等価物」は、本明細書で定義される本開示のＫＡＨの特定の機能を示すポリペプチドをコードする単離された核酸断片である。したがって、機能的等価物は、生物学的に活性な断片も包含し、そして、それら自体が本開示の用語「ＫＡＨ」（など）に包含される。
【０１１１】
好ましくは、本開示の機能的等価物は、本明細書に記載の１つまたは複数の置換を含む。しかしながら、機能的等価物は、上記の置換に加えて１つまたは複数の改変を含み得る。
【０１１２】
機能的核酸等価物は、典型的には、サイレント変異、またはコードされたＫＡＨポリペプチドの生物学的機能を変更しない変異を含み得る。したがって、本開示は、特定の生物学的活性、すなわちＫＡＨ活性に必須ではないアミノ酸残基の変化を含むＫＡＨタンパク質をコードする核酸分子を提供する。
【０１１３】
ＫＡＨタンパク質のそのような機能的等価物は、それらが由来する親ＫＡＨ配列とはアミノ酸配列が異なるが、その少なくとも１つの生物学的活性をなお保持する、好ましくは、少なくともＫＡＨ活性を保持する。当業者は、本開示によるヌクレオチド配列に変異によって変化を導入し、それにより、そのようなタンパク質の機能を実質的に変更することなく、得られるタンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらすことができることを理解されよう。
【０１１４】
一実施形態では、単離された核酸分子は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、このタンパク質は、親ＫＡＨまたは参照アミノ酸配列（例えば、配列番号１または配列番号３に示される）に対して少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１１５】
したがって、本開示のＫＡＨの機能的等価物は、好ましくは、親ＫＡＨアミノ酸配列または参照ポリペプチド配列（例えば、配列番号１または配列番号３に示され、典型的には、親ＫＡＨポリペプチドの少なくとも１つの機能的活性も保持する）に対して少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、９８％、約９９％、またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質である。
【０１１６】
カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性を有する本開示のポリペプチドは、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１３のいずれか１つに対して、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０１１７】
本開示のＫＡＨポリペプチドは、表１に定義される配列または表１に定義される置換パターン（位置に関しては、正確でなくても同じアミノ酸置換である）を有し得る。
【０１１８】
本開示のＫＡＨポリペプチドは、例えば、適切な参照ポリペプチドの変異体、例えば置換変異体のライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。候補変異体は、宿主細胞で発現された場合、ステビオールまたはステビオール配糖体の産生を（参照ポリペプチドを発現する対応する宿主細胞と比較して）増加させるそれらの能力に基づいてスクリーニングすることができる。
【０１１９】
本開示による核酸の断片は、機能的なポリペプチドをコードしない配列を含み得るか、またはそれからなり得る。そのような核酸は、ＰＣＲ反応用のプローブまたはプライマーとして機能し得る。
【０１２０】
機能的なポリペプチドをコードするかまたは非機能的なポリペプチドをコードするかにかかわらず、本開示による核酸は、ハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして使用することができる。ＫＡＨ活性を有するポリペプチドをコードしない本開示の核酸分子の使用は、とりわけ、（１）Ｖｅｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載されている、ＫＡＨコード遺伝子の正確な染色体位置を提供するための、中期染色体スプレッドへのインサイチューハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨ）；（２）特定の組織および／または細胞におけるＫＡＨ  ｍＲＮＡの発現を検出するためのノーザンブロット分析；および（３）所与の生物学的（例えば、組織）試料中のプローブまたはプライマーにハイブリダイズ可能な核酸の存在を分析するための診断ツールとして使用することができるそのようなプローブおよびプライマー、を含む。
【０１２１】
所与の参照ＫＡＨ酵素に基づく本開示のＫＡＨは、以下の標準的手順によって得ることができる：
−変異誘発（エラーを起こしやすい、ドープされたオリゴ、スパイクされたオリゴ）または変異体の合成
−例えばＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）またはＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における形質転換
−形質転換体の培養、形質転換体の選択
−例えばＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）またはＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現
−例えばステビオールまたはステビオール配糖体の生産に基づく一次スクリーニング
−改善されたＫＡＨの同定。
【０１２２】
一実施形態では、本開示は、本開示によるＫＡＨポリペプチドを作製する方法に関し、この方法は、以下を含む：
（ａ）参照ＫＡＨポリペプチド（すなわち鋳型または出発ポリペプチド）を選択する工程；
（ｂ）１３６位、２４８位、３３６位または４０３位
のいずれかに対応する少なくとも１つのアミノ酸残基を置換する工程であって、
前記位置が配列番号１または配列番号３を基準に定義される、工程；
（ｃ）任意選択による、（ｂ）で定義される１つまたは複数のさらなるアミノ酸を置換する工程；
（ｄ）工程（ａ）〜（ｃ）から得られるＫＡＨを調製する工程；
（ｅ）例えば実施例に記載されているように、ＫＡＨの特性を決定する工程；および
（ｆ）参照ＫＡＨポリペプチドと比較して変更された特性を有するＫＡＨを選択する工程。
【０１２３】
本開示によるＫＡＨポリペプチドを作製する方法における好ましい実施形態では、参照ＫＡＨポリペプチドは配列番号１または配列番号３に示される配列を有する。
【０１２４】
より好ましくは、本開示による方法の工程（ｂ）において、１３６位、２４８位、３３６位または４０３位のいずれかに対応する少なくとも１つのアミノ酸残基が置換され、前記位置が配列番号１または配列番号３を基準に定義される。参照ポリペプチドは、配列番号１または配列番号３と少なくとも約８０％の相同性を有し得る。
【０１２５】
別の実施形態では、本開示は、本開示の核酸、核酸構築物、またはベクターを含む宿主細胞、例えば形質転換宿主細胞または組換え宿主細胞を特徴とする。本開示による「宿主細胞」または「組換え細胞」は、典型的には、組換えＤＮＡ技術によって本開示による核酸、すなわち本開示のＫＡＨをコードする核酸が導入された細胞（または祖先にこの核酸が導入された細胞）である。本開示の文脈において、本開示による「宿主細胞」または前記宿主細胞の親は、あらゆる種類の宿主細胞であり得る。
【０１２６】
したがって、本開示の宿主細胞は、本開示の１つまたは複数のＫＡＨポリペプチドをコードする組換え核酸を含み得る。
【０１２７】
宿主細胞が真核生物または原核生物の細胞である、前の請求項のいずれか一項に記載の宿主細胞。したがって、原核細胞および真核細胞の両方は、例えば細菌、真菌、および酵母などに含まれ、特に好ましいのは、酵母、例えばＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、およびＫ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）由来の細胞である。宿主細胞には、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、および脈絡叢細胞系などの哺乳動物細胞株も含まれるが、これらに限定されない。
【０１２８】
したがって、本開示は、ＫＡＨの産生方法を提供し、この方法は、ＫＡＨの産生に適した条件下で本明細書に記載の宿主細胞を培養すること、および任意選択による、ＫＡＨを回収することを含む。典型的には、宿主細胞は、ステビオールまたはステビオール配糖体を産生することができる。
【０１２９】
本開示の組換え宿主は、本明細書に記載の任意のポリペプチドを含み得る。典型的には、本開示の組換え宿主は、ステビオール配糖体を産生することができる。典型的には、本開示の組換え宿主は、ステビオール配糖体などのグリコシル化ジテルペンを産生することができる。例えば、本開示の組換え宿主は、例えば、ステビオール−１３−モノシド、ステビオール−１９−モノシド、１３−［（β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ］カウル−１６−エン−１８−酸２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシルエステル、ルブソシド、ステビオシド、ステビオール−１９−ジシド（ｄｉｓｉｄｅ）、ステビオールビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＤ、またはレバウジオシドＭのうちの１つまたは複数を産生することが可能であり得る。
【０１３０】
本開示の組換え宿主は、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）活性を有する１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の組換え核酸配列を含み得る。
【０１３１】
本開示の目的のために、ＵＧＴ活性を有するポリペプチドは、グリコシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４）活性を有するポリペプチドであり、すなわち活性化ヌクレオチド糖（「グリコシルドナー」としても知られる）から通常はアルコールであるグリコシル受容体分子への単糖単位の転移のための触媒として作用し得る。ＵＧＴのためのグリコシルドナーは、典型的には、ヌクレオチド糖ウリジン二リン酸グルコース（ウラシル二リン酸グルコース、ＵＤＰグルコース）である。
【０１３２】
そのような追加のＵＧＴは、所望のステビオール配糖体を生成するように選択することができる。ステビオール配糖体形成の概略図は、Ｈｕｍｐｈｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００６）６１：４７−６２、およびＭｏｈａｍｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １６８（２０１１）１１３６−１１４１に示されている。さらに、図１は、ステビオール配糖体形成の概略図を示す。
【０１３３】
したがって、本開示の組換え宿主は、以下のうちの１つまたは複数をコードする１つまたは複数の組換え核酸配列を含み得る：
（ｉ）ＵＧＴ７４Ｇ１活性を有するポリペプチド；
（ｉｉ）ＵＧＴ２活性を有するポリペプチド；
（ｉｉ）ＵＧＴ８５Ｃ２活性を有するポリペプチド；および
（ｉｉｉ）ＵＧＴ７６Ｇ１活性を有するポリペプチド。
【０１３４】
本開示での使用に適した組換え酵母は、ステビオールへのＣ−１３−グルコースの付加を触媒することができるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る。すなわち、本開示の方法での使用に適した組換え酵母は、ステビオールがステビオールモノシドに変換される反応を触媒することができるＵＧＴを含み得る。
【０１３５】
本開示の方法での使用に適したそのような組換え酵母は、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）ＵＧＴ８５Ｃ２によって示される活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得、それにより、このヌクレオチド配列が、酵母の形質転換時にステビオールをステビオールモノシドに変換する能力をその酵母に付与する。
【０１３６】
ＵＧＴ８５Ｃ２活性は、ステビオールの１３−ＯＨへのグルコース単位の転移である。したがって、適切なＵＧＴ８５Ｃ２は、ウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール１３−ＯＨトランスフェラーゼ、およびウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール−１９−０−グルコシド１３−ＯＨトランスフェラーゼとして機能し得る。機能的ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドはまた、ステビオールおよびステビオール−１９−Ｏ−グルコシド以外のステビオール配糖体基質を利用するグルコシルトランスフェラーゼ反応を触媒し得る。そのような配列は、本明細書でＵＧＴ１配列と呼ばれることがある。
【０１３７】
本開示での使用に適した組換え酵母は、ＵＧＴ２活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る。
【０１３８】
ＵＧＴ２活性を有するポリペプチドは、グルコース部分を受容体分子ステビオール−１３−Ｏ−グルコシドの１３−Ｏ−グルコースのＣ−２’に転移させる、ウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール−１３−Ｏ−グルコシドトランスフェラーゼ（ステビオール−１３−モノグルコシド１，２−グルコシラーゼとも呼ばれる）として機能するポリペプチドである。典型的には、適切なＵＧＴ２ポリペプチドはまた、グルコース部分を受容体分子ルブソシドの１３−Ｏ−グルコースのＣ−２’に転移させるウリジン５’−ジホスホグルコシル：ルブソシドトランスフェラーゼとしても機能する。
【０１３９】
ＵＧＴ２活性を有するポリペプチドはまた、ステビオール−１３−０−グルコシドおよびルブソシド以外のステビオール配糖体基質を利用する反応を触媒することもでき、例えば、機能的ＵＧＴ２ポリペプチドは、基質としてステビオシドを利用して、グルコース部分を１９−Ｏ−グルコース残基のＣ−２’に転移させてレバウジオシドＥを生成し得る。機能的ＵＧＴ２ポリペプチドはまた、基質としてレバウジオシドＡを利用して、グルコース部分を１９−Ｏ−グルコース残基のＣ−２’に転移させてレバウジオシドＤを生成し得る。しかしながら、機能的ＵＧＴ２ポリペプチドは、典型的にはＣ−１３位に１，３−結合グルコースを有するステビオール化合物にグルコース部分を転移しない、すなわちステビオール１，３−ビオシドおよび１，３−ステビオシドへのグルコース部分の転移が典型的には起きない。
【０１４０】
ＵＧＴ２活性を有するポリペプチドはまた、ウリジン二リン酸グルコース以外のドナーから糖部分を転移し得る。例えば、ＵＧＴ２活性を有するポリペプチドは、ウリジン５’−ジホスホＤ−キシロシル：ステビオール−１３−Ｏ−グルコシドトランスフェラーゼとして作用し、キシロース部分を受容体分子ステビオール−１３−Ｏ−グルコシドの１３−Ｏ−グルコースのＣ−２’に転移させる。別の例として、ＵＧＴ２活性を有するポリペプチドは、ウリジン５’−ジホスホ−Ｌ−ラムノシル：ステビオール−１３−０−グルコシドトランスフェラーゼとして作用することができ、ラムノース部分を受容体分子ステビオールの１３−Ｏ−グルコースのＣ−２’に転移させる。
【０１４１】
本開示の方法での使用に適した組換え酵母は、ＵＧＴ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、およびＣ−１９−グルコースのステビオールビオシドへの付加を触媒することができるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る。すなわち、本開示の組換え酵母は、ステビオールビオシドがステビオシドに変換される反応を触媒することができるＵＧＴを含み得る。したがって、そのような組換え酵母は、ステビオールビオシドをステビオシドに変換することが可能であり得る。そのようなヌクレオチド配列の発現は、少なくともステビオシドを産生する能力を組換え酵母に付与し得る。
【０１４２】
したがって、本開示の方法で使用するのに適した組換え酵母は、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）ＵＧＴ７４Ｇ１によって示される活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も含み得、それにより、このヌクレオチド配列が、酵母の形質転換時にステビオールビオシドをステビオシドに変換する能力を細胞に付与する。
【０１４３】
適切なＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドは、グルコース単位をステビオールの１３−ＯＨまたは１９−ＣＯＯＨに転移させることが可能であり得る。適切なＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドは、ウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール１９−ＣＯＯＨトランスフェラーゼおよびウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド１９−ＣＯＯＨトランスフェラーゼとして機能し得る。機能的ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドはまた、ステビオールおよびステビオール−１３−Ｏ−グルコシド以外のステビオール配糖体基質を利用するか、またはウリジン二リン酸グルコース以外のドナーから糖部分を転移させるグリコシルトランスフェラーゼ反応を触媒し得る。そのような配列は、本明細書ではＵＧＴ３配列と呼ばれることがある。
【０１４４】
本開示の方法での使用に適した組換え酵母は、ステビオシドのＣ−１３位でグルコースのＣ−３’のグルコシル化を触媒することができるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る。すなわち、本開示の方法での使用に適した組換え酵母は、ステビオシドがレバウジオシドＡに変換される反応を触媒することができるＵＧＴを含み得る。したがって、そのような組換え酵母は、ステビオシドをレバウジオシドＡに変換することが可能であり得る。そのようなヌクレオチド配列の発現は、少なくともレバウジオシドＡを産生する能力を酵母に付与し得る。
【０１４５】
したがって、本開示の方法での使用に適した組換え酵母はまた、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）ＵＧＴ７６Ｇ１によって示される活性をするポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得、それにより、このヌクレオチド配列が、酵母の形質転換時にステビオシドをレバウジオシドＡに変換する能力をその酵母に付与する。
【０１４６】
適切なＵＧＴ７６Ｇ１は、受容体分子ステビオール１，２グリコシドのＣ−１３−Ｏ−グルコースのＣ−３’にグルコース部分を付加する。したがって、ＵＧＴ７６Ｇ１は、例えば、ウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール１３−０−１，２グルコシドＣ−３’グルコシルトランスフェラーゼおよびウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール−１９−０−グルコース、１３−０−１，２ビオシドＣ−３’グルコシルトランスフェラーゼとして機能する。機能的ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドはまた、グルコース以外の糖を含むステビオール配糖体基質、例えばステビオールラムノシドおよびステビオールキシロシドを利用するグルコシルトランスフェラーゼ反応を触媒し得る。そのような配列は、本明細書ではＵＧＴ４配列と呼ばれることがある。あるいは、またはさらに、ＵＧＴ４は、ＲｅｂＤをＲｅｂＭに変換することが可能であり得る。
【０１４７】
本開示の方法での使用に適した組換え酵母は、典型的には、ＵＧＴ１活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、ＵＧＴ２活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、ＵＧＴ３活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、およびＵＧＴ４活性を有する少なくとも１つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。これらの核酸配列のうちの１つまたは複数は組換え体であり得る。所与の核酸は、上記の活性のうちの１つまたは複数を有するポリペプチドをコードし得る。例えば、核酸は、上記の活性のうちの２つ、３つ、または４つを有するポリペプチドをコードし得る。好ましくは、本開示の方法に使用するための組換え酵母は、ＵＧＴ１、ＵＧＴ２、およびＵＧＴ３、およびＵＧＴ４活性を含む。適切なＵＧＴ１、ＵＧＴ２、ＵＧＴ３、およびＵＧＴ４の配列は、国際公開第２０１５／００７７４８号パンフレットの表１に示されている。
【０１４８】
本開示の組換え宿主は、いずれか１つのＵＧＴ活性、例えばＵＧＴ１、２、３、または４活性を有するポリペプチドをコードする２つ以上の核酸配列を含み得る。本開示の組換え宿主が、任意の１つのＵＧＴ活性を有するポリペプチドをコードする２つ以上の核酸配列を含む場合、それらの核酸配列は、同じであっても異なっていてもよく、かつ／または同じポリペプチドをコードしてもよいし、もしくは異なるポリペプチドをコードしてもよい。特に、本開示の組換え宿主は、２つの異なるＵＧＴ２ポリペプチドをコードする核酸配列を含み得る。
【０１４９】
本開示による組換え宿主は、以下のうちの１つまたは複数をコードする１つまたは複数の組換えヌクレオチド配列を含み得る：
ｅｎｔ−コパリルピロリン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド；
ｅｎｔ−カウレンシンターゼ活性を有するポリペプチド；および
ｅｎｔ−カウレンオキシダーゼ活性を有するポリペプチド。
【０１５０】
本開示による組換え宿主は、本開示のＫＡＨポリペプチド以外の、カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換えヌクレオチド配列を含み得る。すなわち、本開示の組換え宿主は、本開示のＫＡＨポリペプチドである、カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性を有する２つ以上の異なるポリペプチドを含む１つまたは複数のヌクレオチド配列を含み得る。
【０１５１】
本開示の目的のために、ｅｎｔ−コパリルピロリン酸シンターゼ（ＥＣ５．５．１．１３）を有するポリペプチドは、以下の化学反応を触媒することができる：
【化１】
2020500520.tif 000002
【０１５２】
この酵素は、１つの基質、ゲラニルゲラニルピロリン酸、および１つの生成物、ｅｎｔ−コパリルピロリン酸を有する。この酵素は、ジベレリン生合成に関与している。この酵素は、イソメラーゼのファミリー、特に分子内リアーゼのクラスに属する。この酵素クラスの系統名は、ｅｎｔ−コパリル−二リン酸リアーゼ（非環化）である。一般に使用されている他の名称は、ｅｎｔ−コパリルピロリン酸シンターゼ、ｅｎｔ−カウレンシンターゼＡ、およびｅｎｔ−カウレンシンテターゼＡを有することを含む。
【０１５３】
ｅｎｔ−コパリルピロリン酸シンターゼをコードする適切な核酸配列は、例えば、国際公開第２０１５／００７７４８号パンフレットの配列番号１、３、５、７、１７、１９、５９、６１、１４１、１４２、１５１、１５２、１５３、１５４、１５９、１６０、１８２、または１８４に示される配列を含み得る。
【０１５４】
本開示の目的のために、ｅｎｔ−カウレンシンターゼ活性（ＥＣ４．２．３．１９）を有するポリペプチドは、化学反応を触媒することができるポリペプチドである：
【化２】
2020500520.tif 000003
【０１５５】
したがって、この酵素は、１つの基質、ｅｎｔ−コパリル二リン酸、ならびに２つの生成物、ｅｎｔ−カウレンおよび二リン酸塩を有する。
【０１５６】
この酵素は、リアーゼのファミリー、特にリン酸に作用する炭素−酸素リアーゼのファミリーに属する。この酵素クラスの系統名は、ｅｎｔ−コパリル二リン酸二リン酸リアーゼ（環化、ｅｎｔ−カウレン形成）である。一般に使用されている他の名称には、ｅｎｔ−カウレンシンターゼＢ、ｅｎｔ−カウレンシンテターゼＢ、ｅｎｔ−コパリル二リン酸二リン酸リアーゼ、および（環化）が含まれる。この酵素は、ジテルペノイド生合成に関与している。
【０１５７】
ｅｎｔ−カウレンシンターゼをコードする適切な核酸配列は、例えば、国際公開第２０１５／００７７４８号パンフレットの配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９、６３、６５、１４３、１４４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１８３、または１８４に示される配列を含み得る。
【０１５８】
ｅｎｔ−コパリル二リン酸シンターゼはまた、同じタンパク質分子に関連した異なるｅｎｔ−カウレンシンターゼ活性を有し得る。ｅｎｔ−カウレンシンターゼによって触媒される反応は、ジベレリンへの生合成経路における次の過程である。２つのタイプの酵素活性は異なっており、タンパク質のｅｎｔ−カウレンシンターゼ活性を抑制するための部位特異的変異誘発は、ｅｎｔ−コパリルピロリン酸の蓄積をもたらす。
【０１５９】
したがって、本開示の組換え宿主で使用される単一ヌクレオチド配列は、ｅｎｔ−コパリルピロリン酸シンターゼ活性およびｅｎｔ−カウレンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードし得る。あるいは、２つの活性は、２つの異なる別個のヌクレオチド配列をコードし得る。
【０１６０】
本開示の目的のために、ｅｎｔ−カウレンオキシダーゼ活性（ＥＣ１．１４．１３．７８）を有するポリペプチドは、ｅｎｔ−カウレンの４−メチル基の３回の連続的酸化を触媒して、カウレン酸を得ることができるポリペプチドである。そのような活性は、典型的にはチトクロームＰ４５０の存在を必要とする。
【０１６１】
ｅｎｔ−カウレンオキシダーゼをコードする適切な核酸配列は、例えば、国際公開第２０１５／００７７４８号パンフレットの配列番号２１、２３、２５、６７、８５、１４５、１６１、１６２、１６３、１８０、または１８６に示される配列を含み得る。
【０１６２】
本開示のＫＡＨポリペプチド以外の、カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼをコードする適切な核酸配列は、例えば、国際公開第２０１５／００７７４８号パンフレットの配列番号２７、２９、３１、３３、６９、８９、９１、９３、９５、９７、１４６、１６４、１６５、１６６、１６７、または１８５に示される配列を含み得る。
【０１６３】
本開示の組換え宿主は、ＮＡＤＰＨ−チトクロームｐ４５０レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換え核酸配列を含み得る。すなわち、本開示の組換え宿主は、ＮＡＤＰＨ−チトクロームｐ４５０レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現することが可能であり得る。本開示の目的のために、ＮＡＤＰＨ−チトクロームＰ４５０レダクターゼ活性（ＥＣ１．６．２．４；ＮＡＤＰＨ：フェリヘムタンパク質オキシドレダクターゼ（ｆｅｒｒｉｈｅｍｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、ＮＡＤＰＨ：ヘムタンパク質オキシドレダクターゼ（ｈｅｍｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を有するポリペプチド、ＮＡＤＰＨ：Ｐ４５０オキシドレダクターゼ、Ｐ４５０レダクターゼ、ＰＯＲ、ＣＰＲ、ＣＹＰＯＲとしても知られる）は、典型的には、ＦＡＤおよびＦＭＮ含有酵素ＮＡＤＰＨ：チトクロームＰ４５０レダクターゼ（ＰＯＲ；ＥＣ１．６．２．４）から真核細胞のミクロソーム中のチトクロームＰ４５０への電子移動を可能にする膜結合酵素であるポリペプチドである。
【０１６４】
本開示の組換え宿主では、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）を産生する宿主の能力を、上方制御することができる。本開示の文脈では、上方制御されるとは、組換え宿主が同等の非組換え宿主よりも多くのＧＧＰＰを産生することを意味する。
【０１６５】
したがって、本開示の組換え宿主は、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ、ファルネシル−ピロリン酸シンテターゼ、およびゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼをコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含むことができ、それにより、このヌクレオチド配列が、微生物の形質転換時に高レベルのＧＧＰＰを産生する能力を微生物に付与する。したがって、本開示による組換え宿主は、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ、ファルネシル−ピロリン酸シンテターゼ、およびゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼのうちの１つまたは複数をコードする１つまたは複数の組換え核酸配列を含み得る。
【０１６６】
したがって、本開示の組換え宿主は、以下のうちの１つまたは複数をコードする核酸配列を含み得る：
ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ活性を有するポリペプチド；
ファルネシル−ピロリン酸シンテターゼ活性を有するポリペプチド：
ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド。
【０１６７】
本明細書で定義される宿主または宿主細胞は、遺伝子操作に適した生物であり、かつ標的産物の工業生産に有用な細胞密度で培養することができるものである。適切な宿主は、微生物、例えば発酵装置内に維持され得る微生物であり得る。宿主細胞は、天然に見られる宿主細胞、または遺伝子操作もしくは古典的な変異誘発後の親宿主細胞に由来する宿主細胞であり得る。
【０１６８】
本明細書で使用される組換え宿主は、本明細書で定義される１つまたは複数のヌクレオチド配列で遺伝子改変された、または形質転換／トランスフェクトされた組換え宿主である。１つまたは複数のそのようなヌクレオチド配列の存在は、ステビオールまたはステビオール配糖体、特に１つまたは複数のステビオール配糖体を産生する微生物の能力を変更する。非組換え宿主、すなわち、形質転換／トランスフェクトまたは遺伝子改変されていない宿主は、典型的には、細胞がステビオール配糖体を産生することを可能にする１つまたは複数のヌクレオチド配列を含まない。したがって、非組換え宿主は、典型的にはステビオール配糖体を天然に産生しない宿主であるが、ステビオールまたはステビオール配糖体を天然に産生し、かつ本開示に従って改変されている（したがってステビオール配糖体を産生するように改変された能力を有する）宿主は、本開示による組換え宿主と見なされる。
【０１６９】
特に、ｅｎｔ−コパリルピロリン酸シンターゼ、ｅｎｔ−カウレンシンターゼ、ｅｎｔ−カウレンオキシダーゼ、およびカウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ、ＵＧＴ、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ、ファルネシル−ピロリン酸シンテターゼ、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、およびＮＡＤＰＨ−チトクロームｐ４５０レダクターゼからなる群から選択される酵素が宿主に固有であること、ならびにこれらの酵素をコードする１つまたは複数のヌクレオチド配列による形質転換が、ステビオールまたはステビオール配糖体を産生する能力を宿主細胞に付与するために必ずしも存在しなくてもよいことが可能であり得る。本開示による好ましい宿主は、ＧＧＰＰを天然に（すなわち、その非組換え形態で）産生することができる組換え宿主であり得る。
【０１７０】
宿主微生物によるステビオールまたはステビオール配糖体の産生のさらなる改善は、古典的な菌株の改良によって達成することができる。
【０１７１】
宿主細胞は、原核生物、古細菌、または真核生物の宿主細胞であり得る。
【０１７２】
原核宿主細胞は、限定されるものではないが、細菌宿主細胞であり得る。真核宿主細胞は、限定されるものではないが、酵母、真菌、アメーバ、藻類、動物、昆虫の宿主細胞であり得る。
【０１７３】
真核宿主細胞は、真菌宿主細胞であり得る。「真菌」は、真菌類（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）の亜門のすべての種を含む（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．Ｊ．，１９６２，Ｉｎ：Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。したがって、真菌という用語は、とりわけ、糸状菌および酵母を含む。
【０１７４】
「糸状菌」は、本明細書では、（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５、前出により定義される）真菌類（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）および卵菌類（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）の亜門のすべての糸状形態を含む真核微生物として定義される。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、および他の複雑な多糖類からなる菌糸体壁によって特徴付けられる。栄養増殖は、菌糸伸長によるものであり、炭素異化作用は絶対好気性である。糸状菌株には、限定されるものではないが、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アガリクス（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、オーレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、コリナスカス（Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フィリバシジウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポーテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、モナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトーラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、ネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロミセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、ファネロシェテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、ポドスポラ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ）、ピクノポラス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ）、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、シゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、ソルダリア（Ｓｏｒｄａｒｉａ）、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、ラサムソニア（Ｒａｓｍｓｏｎｉａ）、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の菌株が含まれる。宿主細胞として役割を果たすことができる好ましい糸状菌の菌株は、種アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）、アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、ラサムソニア・エマーソニイ（Ｒａｓａｍｓｏｎｉａ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）（以前はタラロミセス・エマーソニイ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）として知られていた）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、クリソスポリウム・ラクノウェンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、ミセリオフトーラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｙｌａ）に属��る。形質転換細胞および非形質転換細胞の発酵特性を比較するための参照宿主細胞には、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ１２０．４９、ＣＢＳ５１３．８８、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＡＴＣＣ１６８６８、ＡＴＣＣ２０４２３、ＩＦＯ４１７７、ＡＴＣＣ１０１１、ＡＴＣＣ９５７６、ＡＴＣＣ１４４８８〜１４４９１、ＡＴＣＣ１１６０１、ＡＴＣＣ１２８９２、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ＡＦ２９３（ＣＢＳ１０１３５５）、Ｐ．クリソゲナム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ＣＢＳ４５５．９５、ペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）ＡＴＣＣ３８０６５、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）Ｐ２、アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ＡＴＣＣ３６２２５、ＡＴＣＣ４８２７２、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ＡＴＣＣ２６９２１、ＡＴＣＣ５６７６５、ＡＴＣＣ２６９２１、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）ＡＴＣＣ１１９０６、クリソスポリウム・ラクノウェンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）ＡＴＣＣ４４００６、およびこれらすべての菌株の誘導株が含まれる。糸状菌宿主細胞として特に好ましいのは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）ＣＢＳ５１３．８８およびその誘導株である。
【０１７５】
真核宿主細胞は、酵母細胞であり得る。好ましい酵母宿主細胞は、属：サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）（例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．バヤナス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、Ｓ．パストリアヌス（Ｓ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）、Ｓ．カールスベルゲンシス（Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ））、ブレタノミセス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）（例えば、Ｃ．クルセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）、Ｃ．レヴカウフィ（Ｃ．ｒｅｖｋａｕｆｉ）、Ｃ．プルケリマ（Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ユチリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ））、イサチェンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）（例えば、Ｉ．オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ））、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）（例えば、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ））、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、パキソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、シュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）（例えば、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（以前はカンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）と分類されていた））、ヤマダザイマ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）から選択することができる。
【０１７６】
原核宿主細胞は、細菌宿主細胞であり得る。細菌宿主細胞は、グラム陰性細菌またはグラム陽性細菌であり得る。細菌の例としては、限定されるものではないが、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属（例えば、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．プンティス（Ｂ．ｐｕｎｔｉｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．ハロデュラン（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ））、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、キサントバクタ―（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（例えば、菌株ＤＨ１ＯＢ、Ｓｔｂｌ２、ＤＨ５−α、ＤＢ３、ＤＢ３．１）、ＤＢ４、ＤＢ５、ＪＤＰ６８２、およびｃｃｄＡ−ｏｖｅｒ（例えば、米国特許出願第０９／５１８，１８８号明細書）））、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）（例えば、Ｓ．マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｓａｎｓ））、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、Ｐ．アエルギノサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）（例えば、Ｓ．ティフィリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、チフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉ））に属する細菌が挙げられる。細菌にはまた、限定されるものではないが、光合成細菌（例えば、緑色非硫黄細菌（例えば、クロロフレクサス（Ｃｈｏｒｏｆｌｅｘｕｓ）細菌（例えば、Ｃ．オーランティアカス（Ｃ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ））、クロロネマ（Ｃｈｌｏｒｏｎｅｍａ）（例えば、Ｃ．ギガテウム（Ｃ．ｇｉｇａｔｅｕｍ）））、緑色硫黄細菌（例えば、クロロビウム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）細菌（例えば、Ｃ．リミコーラ（Ｃ．ｌｉｍｉｃｏｌａ））、ペロディクション（Ｐｅｌｏｄｉｃｔｙｏｎ）（例えば、Ｐ．ルテオルム（Ｐ．ｌｕｔｅｏｌｕｍ））、紅色硫黄細菌（例えば、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）（例えば、Ｃ．オケニイ（Ｃ．ｏｋｅｎｉｉ）））、および紅色非硫黄細菌（例えば、ロドスピリルム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）（例えば、Ｒ．ルブルム（Ｒ．ｒｕｂｒｕｍ））、光合成細菌（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）（例えば、Ｒ．スフェロイデス（Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、Ｒ．カプスラタス（Ｒ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ））、およびロドミクロビウム（Ｒｈｏｄｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）細菌（例えば、Ｒ．バネリイ（Ｒ．ｖａｎｅｌｌｉｉ））が含まれる。
【０１７７】
宿主細胞は、非微生物由来の宿主細胞であり得る。そのような細胞の例としては、限定されるものではないが、昆虫細胞（例えば、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）（例えば、キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ））、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）（例えば、Ｓ．フルギペルダ（Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）Ｓｆ９またはＳｆ２１細胞）、およびトリコプルサ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓａ）（例えば、Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ細胞）；線虫細胞（例えば、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）細胞）；鳥細胞；両生類細胞（例えば、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）細胞）；爬虫類細胞；および哺乳動物細胞（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＨＫ細胞、Ｐｅｒ−Ｃ６細胞、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞、およびＨｅＬａ細胞）が挙げられる。
【０１７８】
本開示は、以下の工程を含む、本開示のポリペプチドを産生させるための方法をさらに提供する：
（ａ）宿主細胞によるポリペプチドの産生を促進する条件下で本開示の組換え宿主細胞を培養する工程、および任意選択による、
（ｂ）ポリペプチドを回収する工程。
【０１７９】
本開示による組換え宿主は、当技術分野で公知の任意の適切な炭素源上で増殖することができ、そしてそれをステビオール配糖体、例えばステビオール配糖体に変換することができる。組換え宿主は、植物バイオマス、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン、ラムノース、ガラクトース、フコース、マルトース、マルトデキストリン、リボース、リブロース、またはデンプン、デンプン誘導体、スクロース、グルコース、ラクトース、またはグリセロールを直接変換可能であり得る。したがって、好ましい宿主は、セルロースのグルコースモノマーへの変換、およびヘミセルロースのキシロースおよびアラビノースモノマーへの変換に必要なセルラーゼ（エンドセルラーゼおよびエキソセルラーゼ）およびヘミセルラーゼ（例えば、エンド−およびエキソ−キシラナーゼ、アラビナーゼ）、ならびにペクチンをグルクロン酸およびガラクツロン酸に変換することができるペクチナーゼ、またはデンプンをグルコースモノマーに変換することができるアミラーゼなどの酵素を発現する。好ましくは、宿主は、グルコース、キシロース、アラビノース、スクロース、ラクトース、およびグリセロールからなる群から選択される炭素源を変換することができる。宿主細胞は、例えば、国際公開第０３／０６２４３０号パンフレット、同第０６／００９４３４号パンフレット、欧州特許第１４９９７０８Ｂ１号明細書、国際公開第２００６０９６１３０号パンフレット、または同第０４／０９９３８１号パンフレットに記載されているような真核宿主細胞であり得る。
【０１８０】
したがって、さらなる態様では、本開示は、ステビオール配糖体を調製するためのプロセスも提供し、このプロセスは、適切な発酵培地中で少なくとも１つのステビオール配糖体を産生することができる本開示の組換え宿主を発酵させる工程、および任意選択による、ステビオール配糖体を回収する工程を含む。
【０１８１】
ステビオール配糖体は、例えば、ステビオール−１３−モノシド、ステビオール−１９−モノシド、１３−［（β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ）カウル−１６−エン−１８−酸２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシルエステル、ルブソシド、ステビオシド、ステビオール−１９−ジシド、ステビオールビオシド、ｒｅｂＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＤ、またはレバウジオシドＭであり得る。
【０１８２】
ステビオール配糖体の産生のためのプロセスで使用される発酵培地は、特定の宿主細胞の増殖を可能にする任意の適切な発酵培地であり得る。発酵培地の必須要素は、当業者に公知であり、選択された宿主細胞に適合させることができる。
【０１８３】
好ましくは、発酵培地は、植物バイオマス、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン、ラムノース、ガラクトース、フコース、フルクトース、マルトース、マルトデキストリン、リボース、リブロース、またはデンプン、デンプン誘導体、グルコース、スクロース、ラクトース、脂肪酸、トリグリセリド、およびグリセロールからなる群から選択される炭素源を含む。好ましくは、発酵培地はまた、尿素などの窒素源、または硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、もしくはリン酸アンモニウムなどのアンモニウム塩も含む。
【０１８４】
本開示による発酵プロセスは、バッチ式、流加式、または連続式で行うことができる。別個の加水分解および発酵（ＳＨＦ）プロセスまたは同時糖化発酵（ＳＳＦ）プロセスもまた適用することができる。これらの発酵プロセス方式の組み合わせもまた、最適な生産性のために可能であり得る。ＳＳＦプロセスは、デンプン、セルロース、ヘミセルロース、またはペクチンが発酵プロセスにおいて炭素源として使用される場合、特に魅力的であり得、このプロセスでは、基質を加水分解するためにセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、またはペクチナーゼなどの加水分解酵素を添加することが必要であり得る。
【０１８５】
ステビオール配糖体の調製のためのプロセスで使用される組換え宿主は、本明細書で上記定義された任意の適切な組換え宿主であり得る。ほとんどの真核細胞は、増殖のために無菌条件を必要とせず、かつバクテリオファージ感染に対して非感受性であるため、本開示による組換え真核宿主をこのプロセスで使用することは有利であり得る。さらに、真核宿主細胞は、細菌汚染を防止するために低ｐＨで増殖させることができる。
【０１８６】
本開示による組換え宿主は、通性嫌気性微生物であり得る。通性嫌気性組換え宿主は、好気的に高い細胞濃度まで増殖させることができる。次いで、この嫌気性相は、高い細胞密度で実施することができ、このことが、実質的に必要とされる発酵量を減少させ、そして好気性微生物による汚染のリスクを最小限にすることができる。
【０１８７】
本開示によるステビオール配糖体の産生のための発酵プロセスは、好気性発酵プロセスでも嫌気性発酵プロセスでもよい。
【０１８８】
嫌気性発酵プロセスは、本明細書では、酸素の非存在下、または実質的に酸素が消費されずに、好ましくは５ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ未満、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ未満、または１ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ未満の消費で行われ、有機分子が電子供与体および電子受容体の両方として機能する発酵プロセスとして定義することができる。本開示による発酵プロセスはまた、最初に好気的条件下で、続いて嫌気的条件下で行うこともできる。
【０１８９】
発酵プロセスはまた、酸素制限、または微好気的条件下で行うこともできる。あるいは、発酵プロセスは、最初に好気的条件下で行い、続いて酸素制限条件下で行うことができる。酸素制限発酵プロセスは、酸素の気体から液体への移動によって酸素の消費が制限されるプロセスである。酸素制限の程度は、流入ガス流の量および組成、ならびに使用される発酵装置の実際の混合／物質移動特性によって決定される。
【０１９０】
本開示によるプロセスでのステビオール配糖体の産生は、宿主細胞の増殖期の間、定常（定常状態）期の間、または両期の間に起こり得る。発酵工程を異なる温度で行うことが可能であり得る。
【０１９１】
ステビオール配糖体の産生のためのプロセスは、組換え宿主にとって最適な温度で行うことができる。最適増殖温度は、各形質転換組換え宿主ごとに異なり得、そして当業者に公知である。最小の感染感受性および最低の冷却費用の下で、非無菌条件下で生物を効率的に成長させるための最適温度は、野生型生物にとって最適温度よりも高い可能性がある。あるいは、このプロセスは、組換え宿主の増殖には最適ではない温度で行うことができる。
【０１９２】
本開示によるステビオール配糖体の産生のためのプロセスは、任意の適切なｐＨ値で行うことができる。組換え宿主が酵母である場合、発酵培地中のｐＨは、好ましくは６未満、好ましくは５．５未満、好ましくは５未満、好ましくは４．５未満、好ましくは４未満、好ましくはｐＨ３．５未満、またはｐＨ３．０未満、またはｐＨ２．５未満、好ましくはｐＨ２超の値を有する。これらの低いｐＨ値で発酵を行うことの利点は、発酵培地中の汚染細菌の増殖を防止できることである。
【０１９３】
このようなプロセスは、工業的規模で行うことができる。そのようなプロセスの産物は、例えば、ステビオール−１３−モノシド、ステビオール−１９−モノシド、１３−［（β−Ｄ−グルコピラノシル）オキシ）カウル−１６−エン−１８−酸２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシルエステル、ルブソシド、ステビオシド、ステビオール−１９−ジシド、ステビオールビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＤ、またはレバウジオシドＭの１つまたは複数などの、１つまたは複数のステビオール配糖体である。
【０１９４】
発酵培地からのステビオール配糖体の回収は、当技術分野で公知の方法、例えば蒸留、真空抽出、溶媒抽出、または蒸発によって行うことができる。
【０１９５】
本開示によるステビオール配糖体の産生のためのプロセスでは、５ｍｇ／ｌ超の発酵ブロス、好ましくは１０ｍｇ／ｌ超、好ましくは２０ｍｇ／ｌ超、好ましくは３０ｍｇ／ｌ超の発酵ブロス、好ましくは４０ｍｇ／ｌ超、より好ましくは５０ｍｇ／ｌ超、好ましくは６０ｍｇ／ｌ超、好ましくは７０超、好ましくは８０ｍｇ／ｌ超、好ましくは１００ｍｇ／ｌ超、好ましくは１ｇ／ｌ超、好ましくは５ｇ／ｌ超、好ましくは１０ｇ／ｌ超の濃度を達成することが可能であり得るが、通常は７０ｇ／ｌ未満である。
【０１９６】
本開示は、ステビオール配糖体の調製のための本開示のプロセスによって得ることができるステビオール配糖体を含む発酵ブロスをさらに提供する。
【０１９７】
本開示によるブロスは、本開示の組換え宿主細胞を含み得る。あるいは、本開示のブロスは、本開示のすべての宿主細胞が存在しない、または実質的に存在しないブロス、例えば上清であり得る。
【０１９８】
１つまたは複数のステビオール配糖体が微生物内で発現される事象では、そのような細胞は、それらを放出するように処理する必要があり得る。優先的には、少なくとも１つのステビオール配糖体、例えばｒｅｂＡ、ｒｅｂＤ、またはｒｅｂＭが細胞外で産生される。
【０１９９】
本開示によるブロスは、本開示のポリペプチドの代わりに参照ポリペプチドが発現される組換え宿主から産生されるブロスと比較して多い、少なくとも１つのステビオール配糖体、例えばｒｅｂＡ、ｒｅｂＤ、またはｒｅｂＭを含み得る。
【０２００】
本開示によるブロスは、参照ポリペプチドが本開示のポリペプチドの代わりに発現される組換え宿主から産生されるブロスと比較して少ない、少なくとも１つの非ステビオール配糖体、例えば、１つまたは複数のカウレン酸配糖体を含み得る。
【０２０１】
本開示はまた、ステビオール配糖体の調製のための本開示によるプロセスによって得られるか、または本開示の発酵ブロスから得ることができるステビオール配糖体を提供する。そのようなステビオール配糖体は、天然に存在しないステビオール配糖体、すなわち植物中で産生されないステビオール配糖体であり得る。
【０２０２】
ステビオール配糖体の調製のための本開示のプロセスによって得ることができる、または本開示の発酵ブロスから得ることができる、１つまたは複数、例えば２つ以上のステビオール配糖体を含む組成物も提供される。そのような組成物において、１つまたは複数のステビオール配糖体は、天然に存在しないステビオール配糖体、すなわち植物中で産生されないステビオール配糖体であり得る。
【０２０３】
さらに、本開示は、ステビオールまたは第１のステビオール配糖体を第２のステビオール配糖体に変換するための方法を提供し、この方法は：
・前記ステビオールまたは第１のステビオール配糖体を、本開示の組換え宿主、そのような組換え宿主に由来する無細胞抽出物、またはそれらのいずれかに由来する酵素調製物と接触させる工程；
・それにより、第１のステビオール配糖体を第２のステビオール配糖体に変換する工程、を含む。
【０２０４】
第１のステビオール配糖体は、図１に例示されるステビオール配糖体などの任意のステビオール配糖体であり得る。第２のステビオール配糖体は、第１のステビオール配糖体（例えば、図１に例示される任意のステビオール配糖体）に対するＵＧＴ酵素の作用によって産生される任意のステビオール配糖体であり得る。
【０２０５】
そのような方法では、第２のステビオール配糖体は、例えば、ｒｅｂＡ、ｒｅｂＥ、ｒｅｂＤ、またはＲｅｂＭであり得る。
【０２０６】
そのような方法では、第１のステビオール配糖体は、ステビオシド、ｒｅｂＢ、ｒｅｂＡ、ｒｅｂＥ、またはｒｅｂＤであり得、そして第２のステビオール配糖体は、ｒｅｂＡ、ｒｅｂＤ、またはｒｅｂＭであり得る。
【０２０７】
好ましくは、第１のステビオール配糖体がｒｅｂＡであり、かつ第２のステビオール配糖体がｒｅｂＤであるか、または第１のステビオール配糖体がｒｅｂＤであり、かつ第２のステビオール配糖体がｒｅｂＭである。
【０２０８】
すなわち、本開示は、生物変換または生体内変換の方法に関する。
【０２０９】
本開示による発酵プロセスによって産生されるステビオール配糖体または組成物は、そのような化合物に公知の任意の用途で使用することができる。特に、それらのステビオール配糖体または組成物は、例えば食品または飲料に甘味料として使用することができる。したがって、本開示にしたがって、本開示のステビオール配糖体または組成物を含む食品、飼料、または飲料が提供される。
【０２１０】
例えば、ステビオール配糖体または本開示の組成物は、ソフトドリンク、卓上甘味料、チューインガム、ヨーグルトなどの乳製品（例えば、プレーンヨーグルト）、ケーキ、シリアルもしくはシリアルベースの食品、栄養補助食品、医薬品、食用ゲル、菓子製品、化粧品、練り歯磨き、または他の口腔用組成物などに配合することができる。さらに、ステビオール配糖体または本開示の組成物は、飲料、食品、および人間の消費専用の他の製品のためだけではなく、改善された特性を有する動物の飼料および餌のための甘味料として使用することができる。
【０２１１】
したがって、本開示は、とりわけ、本開示のプロセスにしたがって調製されたステビオール配糖体を含む食品、飼料、または飲料を提供する。
【０２１２】
食品、飲料、医薬品、化粧品、卓上製品、チューインガムの製造中に、混合、混練、溶解、酸洗い、浸透、浸出、散水、噴霧、注入、および他の方法などの従来の方法を使用することができる。
【０２１３】
ステビオール配糖体または本開示の組成物は、乾燥形態または液体形態で使用することができる。ステビオール配糖体または本開示の組成物は、食品の加熱処理の前後に添加することができる。甘味料の量は、使用目的によって異なる。ステビオール配糖体または本開示の組成物は、単独でまたは他の化合物と組み合わせて添加することができる。
【０２１４】
本開示の方法にしたがって製造される化合物は、１つまたは複数のさらなるノンカロリー甘味料またはカロリー甘味料と混合することができる。そのような混合は、風味または時間的プロファイルまたは安定性を改善するために使用することができる。広範囲のノンカロリー甘味料およびカロリー甘味料の両方が、ステビオール配糖体または本開示の組成物と混合するのに適し得る。例えば、モグロシド、モナチン、アスパルテーム、アセスルファム塩、シクラメート、スクラロース、サッカリン塩、またはエリトリトールなどのノンカロリー甘味料。ステビオール配糖体または本開示の組成物と混合するのに適したカロリー甘味料には、糖アルコールおよび炭水化物、例えばスクロース、グルコース、フルクトース、およびＨＦＣＳが含まれる。グリシン、アラニン、またはセリンなどの甘味アミノ酸も使用することができる。
【０２１５】
ステビオール配糖体または本開示の組成物は、天然甘味抑制剤などの甘味抑制剤と組み合わせて使用することができる。ステビオール配糖体または本開示の組成物は、アミノ酸またはその塩などの旨味増強剤と組み合わせてもよい。
【０２１６】
ステビオール配糖体または本開示の組成物は、ポリオールまたは糖アルコール、炭水化物、生理活性物質、または機能性成分（例えば、カロテノイド、食物繊維、脂肪酸、サポニン、抗酸化剤、栄養補助食品、フラボノイド、イソチオシアネート、フェノール、植物ステロールまたはスタノール（フィトステロールおよびフィトスタノール）、ポリオール、プレバイオティック、プロバイオティック、フィトエストロゲン、大豆タンパク質、硫化物／チオール、アミノ酸、タンパク質、ビタミン、ミネラル、および／または心血管、コレステロール低下、もしくは抗炎症などの健康上の利点に基づいて分類される物質と組み合わせることができる。
【０２１７】
ステビオール配糖体を含む組成物または本開示の組成物は、香味剤、芳香成分、ヌクレオチド、有機酸、有機酸塩、無機酸、苦味化合物、タンパク質もしくはタンパク質加水分解物、界面活性剤、フラボノイド、収斂性化合物、ビタミン、食物繊維、抗酸化剤、脂肪酸、および／または塩を含み得る。
【０２１８】
ステビオール配糖体または本開示の組成物は、ゼロカロリー、低カロリー、または糖尿病用飲料、および改善された味覚特性を有する食品を製造するための高強度甘味料として適用することができる。また、ステビオール配糖体または本開示の組成物は、飲料、食品、医薬品、および砂糖が使用できないその他の製品にも使用できる。
【０２１９】
さらに、ステビオール配糖体または本開示の組成物は、飲料、食料、および人間の消費専用の他の製品のためだけではなく、改善された特性を有する動物の飼料および餌のための甘味料としても使用することができる。
【０２２０】
ステビオール配糖体または本開示の組成物を甘味化合物として使用できる製品の例は、ウォッカ、ワイン、ビール、酒、日本酒などのアルコール飲料；天然ジュース、清涼飲料、炭酸ソフトドリンク、ダイエット飲料、ゼロカロリー飲料、低カロリー飲料および食品、ヨーグルト飲料、即席ジュース、インスタントコーヒー、インスタント飲料の粉末タイプ、缶詰製品、シロップ、発酵大豆ペースト、醤油、酢、ドレッシング、マヨネーズ、ケチャップ、カレー、スープ、インスタントブイヨン、粉末醤油、粉末酢、ビスケット類、煎餅、クラッカー、パン、チョコレート、キャラメル、キャンディ、チューインガム、ゼリー、プリン、保存加工された果物および野菜、生クリーム、ジャム、マーマレード、フラワーペースト、粉ミルク、アイスクリーム、シャーベット、野菜や果物の瓶詰め、缶詰されたゆで豆、肉および食品の甘煮、野菜農産物、シーフード、ハム、ソーセージ、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、魚肉ペースト、魚のフライ、乾燥シーフード、冷凍食品、保存加工された海藻、保存加工された肉、タバコ、医薬品、ならびにその他多くの製品であり得る。原則として、ステビオール配糖体または本開示の組成物は無制限の用途を有し得る。
【０２２１】
甘味組成物は、飲料を含み、飲料の非限定的な例としては、非炭酸飲料および炭酸飲料、例えば、コーラ、ジンジャーエール、ルートビア、サイダー、フルーツ風味のソフトドリンク（例えば、レモンライムまたはオレンジのようなシトラス風味のソフトドリンク）、および粉末ソフトドリンクなど；果物または野菜から生産されたフルーツジュース、絞り汁などを含むフルーツジュース、果物の粒子を含むフルーツジュース、フルーツ飲料、フルーツジュース飲料、フルーツジュースを含む飲料、フルーツフレーバーの飲料、野菜ジュース、野菜を含むジュース、および果物や野菜を含むミックスジュース；スポーツ飲料、エネルギー飲料、ニアウォーター、および同様の飲料（例えば、天然または合成風味剤を含む水）；茶または好みのタイプの飲料、例えば、コーヒー、ココア、紅茶、緑茶、およびウーロン茶など；乳成分含有飲料、例えば、ミルク飲料、乳成分含有コーヒー、カフェオレ、ミルクティー、フルーツミルク飲料、飲料ヨーグルト、または乳酸菌飲料など；ならびに乳製品が挙げられる。
【０２２２】
一般に、甘味組成物中に存在する甘味料の量は、甘味組成物の特定の種類およびその所望の甘味に応じて大幅に異なる。当業者は、甘味組成物に入れるための適切な甘味料の量を容易に見きわめることができる。
【０２２３】
ステビオール配糖体または本開示の組成物は、乾燥形態または液体形態で使用することができる。ステビオール配糖体または本開示の組成物は、食品の加熱処理の前後に添加することができる。甘味料の量は、使用目的によって異なる。ステビオール配糖体または本開示の組成物は、単独でまたは他の化合物と組み合わせて添加することができる。
【０２２４】
食品、飲料、医薬品、化粧品、卓上製品、チューインガムの製造中に、混合、混練、溶解、酸洗い、浸透、浸出、散水、噴霧、注入、および他の方法などの従来の方法を使用することができる。
【０２２５】
したがって、本開示の組成物は、成分の均一で一様なまたは均一な混合物を提供する、当業者に公知の任意の方法によって生産することができる。これらの方法としては、乾式混合、噴霧乾燥、凝集、湿式造粒、圧縮、および共結晶化などが挙げられる。
【０２２６】
固体形態では、ステビオール配糖体または本開示の組成物は、小袋、パケット、大きなバッグまたは箱、立方体、錠剤、ミスト、または溶解可能なストリップを含む、甘味を付けるべき食料品への送達に適した任意の形態で消費者に提供することができる。本組成物は、単位用量としてまたはバルク形態で送達することができる。
【０２２７】
液体甘味料系ならびに液体、半流動体、ペースト、およびクリームの形態の好都合の範囲の組成物のために、上記の甘味料製品のいずれかを含む任意の組み合わせまたは上記生産された製品の組み合わせを携行する、またはディスペンスする、または保存する、または輸送するのに便利な、任意の形状または形態の適切な包装材料を使用する適切な包装が発明されるものとする。
【０２２８】
本組成物は、種々の増量剤、機能性成分、着色剤、香料を含み得る。
【０２２９】
「配列相同性」または「配列同一性」という用語は、本明細書では互換的に使用される。本開示の目的のために、本明細書では、２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の配列相同性または配列同一性のパーセンテージを決定するために、最適な比較目的でこれらの配列が整列されると定義される。２つの配列間のアラインメントを最適化するために、比較される２つの配列のいずれかにギャップを導入することができる。そのようなアラインメントは、比較されている配列の全長にわたって行うことができる。あるいは、アラインメントは、より短い長さにわたって、例えば約２０、約５０、約１００、またはそれ以上の核酸／塩基またはアミノ酸にわたって行ってもよい。配列同一性は、報告される整列領域にわたる２つの配列間の完全な一致のパーセンテージである。
【０２３０】
２つの配列間の配列の比較および配列同一性のパーセンテージの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。当業者は、２つの配列を整列させ、そして２つの配列間の同一性を決定するための何種類かのコンピュータープログラムが利用可能であるという事実を承知しているであろう（Ｋｒｕｓｋａｌ，Ｊ．Ｂ．（１９８３）Ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  Ｉｎ  Ｄ．Ｓａｎｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｊ．Ｂ．Ｋｒｕｓｋａｌ，（ｅｄ．），Ｔｉｍｅ  ｗａｒｐｓ，ｓｔｒｉｎｇ  ｅｄｉｔｓ  ａｎｄ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ｔｈｅ  ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，ｐｐ．１−４４  Ａｄｄｉｓｏｎ  Ｗｅｓｌｅｙ）。２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間のパーセント配列同一性は、２つの配列のアラインメントのためのＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して決定することができる（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３−４５３）。アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の両方をアルゴリズムによって整列させることができる。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムは、コンピュータープログラムＮＥＥＤＬＥに実装されている。本開示の目的のために、ＥＭＢＯＳＳパッケージからのＮＥＥＤＬＥプログラムを使用した（ｖｅｒｓｉｏｎ２．８．０  ｏｒ  ｈｉｇｈｅｒ，ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ（２０００）Ｒｉｃｅ，Ｐ．Ｌｏｎｇｄｅｎ，Ｉ．ａｎｄ  Ｂｌｅａｓｂｙ，Ａ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６，（６）ｐｐ２７６−２７７，ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ／）。タンパク質配列については、ＥＢＬＯＳＵＭ６２を置換マトリックスに使用する。ヌクレオチド配列については、ＥＤＮＡＦＵＬＬを使用する。使用される任意のパラメータは、１０のギャップオープンペナルティーおよび０．５のギャップ伸長ペナルティーである。当業者は、すべてのこれらの異なるパラメータがわずかに異なる結果をもたらすが、異なるアルゴリズムを使用するときに２つの配列の全体的なパーセンテージ同一性が有意に変化しないことを理解するであろう。
【０２３１】
上記のプログラムＮＥＥＤＬＥによるアラインメント後、クエリー配列と本開示の配列との間の配列同一性のパーセンテージは、以下のように計算される：両方の配列において同一のアミノ酸または同一のヌクレオチドを示すアライメントにおける対応する位置の数を、アラインメントのギャップの総数を差し引いた後のアライメントの全長で除す。本明細書で定義される同一性は、ＮＯＢＲＩＥＦオプションを使用することによってＮＥＥＤＬＥから得ることができ、プログラムの出力に「最長同一性」としてラベル付けされる。
【０２３２】
本開示の核酸配列およびタンパク質配列は、例えば他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定するために公共のデータベースに対して検索を行うための「クエリー配列」としてさらに使用することができる。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ２．０）を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本開示の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本開示のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行うことができる。比較目的のためにギャップ挿入アライメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２に記載されているように利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／にある国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のホームページを参照されたい。
【０２３３】
［本開示の実施形態：］
１．配列番号１または配列番号３に示される配列を含むカウレン酸１３−ヒドロキシラーゼと整列された場合に、
１３６位、２４８位、３３６位、または４０３位
の任意のアミノ酸に対応するアミノ酸の少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を含む、カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドであって、
前記位置が、配列番号１または配列番号３を基準に定義され、このポリペプチドは、カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性を有する参照ポリペプチドと比較して改変された１つまたは複数の特性を有する、ポリペプチド。
【０２３４】
２．配列番号１または配列番号３を基準に定義される１３６位、２４８位、３３６位、または４０３位の任意のアミノ酸に対応する、カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドにおける位置が、１０のギャップオープンペナルティーおよび０．５のギャップ伸長ペナルティーを用いる、置換マトリックスとしてＥＢＬＯＳＵＭ６２を使用するＥＭＢＯＳＳ  Ｎｅｅｄｌｅアラインメント法を用いて、カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１または配列番号３に示されるアミノ酸配列に整列させることによって同定される、実施形態１に記載のポリペプチド。
【０２３５】
３．改変された特性が、改変されたカウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性である、実施形態１に記載のポリペプチド。
【０２３６】
４．参照ポリペプチドが、配列番号１または配列番号３のカウレン酸１３−ヒドロキシラーゼを含む、実施形態１または２に記載のポリペプチド。
【０２３７】
５．ｉ．メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、グルタミン（Ｑ）、ヒスチジン（Ｈ）、もしくはトレオニン（Ｔ）が１３６位に対応する位置に存在し；かつ／または
ｉｉ．アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、トレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、もしくはプロリン（Ｐ）が２４８位に対応する位置に存在し；かつ／または
ｉｉｉ．セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、もしくはイソロイシン（Ｉ）が３３６位に対応する位置に存在し；かつ／または
ｉｖ．グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、メチオニン（Ｍ）、もしくはセリン（Ｓ）が４０３位に対応する位置に存在し、
前記位置が、配列番号１または配列番号３を基準に定義される、実施形態１〜４のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【０２３８】
６．（ｉ）メチオニンもしくはバリンが１３６位に存在し；
（ｉｉ）アスパラギンが２４８位に存在し；
（ｉｉｉ）セリンが３３６位に存在し；かつ／または
（ｉｖ）グリシンが４０３位に存在し、
前記位置が、配列番号１または配列番号３を基準に定義される、実施形態１〜５のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【０２３９】
７．配列番号１または配列番号３に示される配列を含むＫＡＨと整列された場合に、任意のアミノ酸に対応する少なくとも以下のアミノ酸の置換：
１３６位および２４８位
１３６位および３３６位
１３６位および４０３位
２４８位および３３６位
２４８位および４０３位
３３６位および４０３位
１３６位、２４８位、および４０３位
１３６位、３３６位、および４０３位
１３６位、２４８位、および３３６位
２４８位、３３６位、および４０３位、または
１３６位、２４８位、３３６位、および４０３位
を含むアミノ酸配列を含み、
前記位置が、配列番号１または配列番号３を基準に定義される、実施形態１〜６のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【０２４０】
８．配列番号１または配列番号３に示される配列を含むＫＡＨと整列された場合に、任意のアミノ酸に対応する少なくとも以下のアミノ酸の置換：
（ａ）１３６位に対応する位置に存在するメチオニン（Ｍ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはフェニルアラニン（Ｆ）、もしくはトリプトファン（Ｗ）、もしくはグルタミン（Ｑ）、もしくはヒスチジン（Ｈ）、もしくはトレオニン（Ｔ）、および２４８位に対応する位置に存在するアスパラギン（Ｎ）、もしくはグルタミン（Ｑ）、もしくはトレオニン（Ｔ）、もしくはグリシン（Ｇ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはイソロイシン（Ｉ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはフェニルアラニン（Ｆ）、もしくはプロリン（Ｐ）；
（ｂ）１３６位に対応する位置に存在するメチオニン（Ｍ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはアラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）、もしくはトリプトファン（Ｗ）、もしくはグルタミン（Ｑ）、もしくはヒスチジン（Ｈ）、もしくはトレオニン（Ｔ）、および３３６位に対応する位置に存在するセリン（Ｓ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはイソロイシン（Ｉ）；
（ｃ）１３６位に対応する位置に存在するメチオニン（Ｍ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはアラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）、もしくはトリプトファン（Ｗ）、もしくはグルタミン（Ｑ）、もしくはヒスチジン（Ｈ）、もしくはトレオニン（Ｔ）、および４０３位に対応する位置に存在するグリシン（Ｇ）、もしくはロイシン（Ｌ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはメチオニン（Ｍ）、もしくはセリン（Ｓ）；
（ｄ）２４８位に対応する位置に存在するアスパラギン（Ｎ）、もしくはグルタミン（Ｑ）、もしくはトレオニン（Ｔ）、もしくはグリシン（Ｇ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはイソロイシン（Ｉ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはフェニルアラニン（Ｆ）、もしくはプロリン（Ｐ）、および３３６位に対応する位置に存在するセリン（Ｓ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはイソロイシン（Ｉ）；
（ｅ）２４８位に対応する位置に存在するアスパラギン（Ｎ）、もしくはグルタミン（Ｑ）、もしくはトレオニン（Ｔ）、もしくはグリシン（Ｇ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはイソロイシン（Ｉ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはフェニルアラニン（Ｆ）、もしくはプロリン（Ｐ）、および４０３位に対応する位置に存在するグリシン（Ｇ）、もしくはロイシン（Ｌ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはメチオニン（Ｍ）、もしくはセリン（Ｓ）；
（ｆ）３３６位に対応する位置に存在するセリン（Ｓ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはイソロイシン（Ｉ）、および４０３位に対応する位置に存在するグリシン（Ｇ）、もしくはロイシン（Ｌ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはメチオニン（Ｍ）、もしくはセリン（Ｓ）；
（ｇ）１３６位に対応する位置に存在するメチオニン（Ｍ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはアラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）、もしくはトリプトファン（Ｗ）、もしくはグルタミン（Ｑ）、もしくはヒスチジン（Ｈ）、もしくはトレオニン（Ｔ）、２４８位に対応する位置に存在するアスパラギン（Ｎ）、もしくはグルタミン（Ｑ）、もしくはトレオニン（Ｔ）、もしくはグリシン（Ｇ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはイソロイシン（Ｉ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはフェニルアラニン（Ｆ）、もしくはプロリン（Ｐ）、および４０３位に対応する位置に存在するグリシン（Ｇ）、もしくはロイシン（Ｌ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはメチオニン（Ｍ）、もしくはセリン（Ｓ）；
（ｈ）１３６位に対応する位置に存在するメチオニン（Ｍ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはアラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）、もしくはトリプトファン（Ｗ）、もしくはグルタミン（Ｑ）、もしくはヒスチジン（Ｈ）、もしくはトレオニン（Ｔ）、３３６位に対応する位置に存在するセリン（Ｓ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはイソロイシン（Ｉ）、および４０３位に対応する位置に存在するグリシン（Ｇ）、もしくはロイシン（Ｌ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはメチオニン（Ｍ）、もしくはセリン（Ｓ）；
（ｉ）１３６位に対応する位置に存在するメチオニン（Ｍ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはアラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）、もしくはトリプトファン（Ｗ）、もしくはグルタミン（Ｑ）、もしくはヒスチジン（Ｈ）、もしくはトレオニン（Ｔ）、２４８位に対応する位置に存在するアスパラギン（Ｎ）、もしくはグルタミン（Ｑ）、もしくはトレオニン（Ｔ）、もしくはグリシン（Ｇ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはイソロイシン（Ｉ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはフェニルアラニン（Ｆ）、もしくはプロリン（Ｐ）、および３３６位に対応する位置に存在するセリン（Ｓ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはイソロイシン（Ｉ）；
（ｊ）２４８位に対応する位置に存在するアスパラギン（Ｎ）、もしくはグルタミン（Ｑ）、もしくはトレオニン（Ｔ）、もしくはグリシン（Ｇ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはイソロイシン（Ｉ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはフェニルアラニン（Ｆ）、もしくはプロリン（Ｐ）、３３６位に対応する位置に存在するセリン（Ｓ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはイソロイシン（Ｉ）、および４０３位に対応する位置に存在するグリシン（Ｇ）、もしくはロイシン（Ｌ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはメチオニン（Ｍ）、もしくはセリン（Ｓ）、または
（ｋ）１３６位に対応する位置に存在するメチオニン（Ｍ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはアラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）、もしくはトリプトファン（Ｗ）、もしくはグルタミン（Ｑ）、もしくはヒスチジン（Ｈ）、もしくはトレオニン（Ｔ）、２４８位に対応する位置に存在するアスパラギン（Ｎ）、もしくはグルタミン（Ｑ）、もしくはトレオニン（Ｔ）、もしくはグリシン（Ｇ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはイソロイシン（Ｉ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはフェニルアラニン（Ｆ）、もしくはプロリン（Ｐ）、３３６位に対応する位置に存在するセリン（Ｓ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはイソロイシン（Ｉ）、および４０３位に対応する位置に存在するグリシン（Ｇ）、もしくはロイシン（Ｌ）、もしくはバリン（Ｖ）、もしくはアラニン（Ａ）、もしくはメチオニン（Ｍ）、もしくはセリン（Ｓ）、
を含むアミノ酸配列を含み、
前記位置が、配列番号１または配列番号３を基準に定義される、実施形態１〜７のいずれか１つの記載のポリペプチド。
【０２４１】
９．天然に存在しないポリペプチドである、実施形態１〜８のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【０２４２】
１０．実施形態の１〜９のいずれか１つで定義された置換以外のさらなる置換を含む、実施形態１〜９のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【０２４３】
１１．配列番号１または配列番号３と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【０２４４】
１２．配列番号５、７、９、１１、または１３のいずれか１つに対して少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド。
【０２４５】
１３．実施形態１〜１２のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
【０２４６】
１４．適切な発現宿主においてカウレン酸１３−ヒドロキシラーゼの発現を誘導することができる１つまたは複数の制御配列に機能的に連結されている、実施形態１３に記載の核酸配列を含む核酸構築物。
【０２４７】
１５．実施形態１４に記載の核酸または実施形態１３に記載の核酸構築物を含む発現ベクター。
【０２４８】
１６．実施形態１３に記載の核酸、実施形態１４に記載の核酸構築物、または実施形態１５に記載の発現ベクターを含む組換え宿主。
【０２４９】
１７．ステビオールまたはステビオール配糖体を産生することができる、実施形態１６に記載の組換え宿主。
【０２５０】
１８．ｅｎｔ−コパリルピロリン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド；
ｅｎｔ−カウレンシンターゼ活性を有するポリペプチド；および
ｅｎｔ−カウレンオキシダーゼ活性を有するポリペプチド；および、任意選択による、
実施形態１〜１２のいずれか１つに記載のポリペプチドとは異なる、カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド
をコードする１つまたは複数の組換えヌクレオチド配列を含む、実施形態１６または１７に記載の組換え宿主。
【０２５１】
１９．ＮＡＤＰＨ−チトクロームｐ４５０レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換え核酸配列を含む、実施形態１６〜１８のいずれか１つに記載の組換え宿主。
【０２５２】
２０．（ｉ）ＵＧＴ７４Ｇ１活性を有するポリペプチド；
（ｉｉ）ＵＧＴ２活性を有するポリペプチド；
（ｉｉｉ）ＵＧＴ８５Ｃ２活性を有するポリペプチド；および
（ｉｖ）ＵＧＴ７６Ｇ１活性を有するポリペプチド
のうちの１つまたは複数をコードする組換え核酸配列を含む、実施形態１６〜１９のいずれか１つに記載の組換え宿主。
【０２５３】
２１．宿主がサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、イサチェンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ブレタノミセス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）属、パキソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ヤマダザイマ（Ｙａｍａｄａｚｙｍａ）属、またはエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属のうちの１つに属する、実施形態１６〜２０のいずれか１つに記載の組換え宿主。
【０２５４】
２２．組換え宿主がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ）細胞、イサチェンキア・オリエンタリス（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）細胞、または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞である、実施形態２１に記載の組換え宿主。
【０２５５】
２３．宿主のゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）を産生する能力が上方制御されている、実施形態１６〜２２のいずれか１つに記載の組換え宿主。
【０２５６】
２４．ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ活性を有するポリペプチド；
ファルネシル−ピロリン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド；
ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド
の１つまたは複数をコードする核酸配列を含む、実施形態１６〜２３のいずれか１つに記載の組換え宿主。
【０２５７】
２５．実施形態１〜１２のいずれか１つに記載のＫＡＨポリペプチドを生産するための方法であって：
（ａ）参照ＫＡＨポリペプチド（例えば、配列番号１または配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有する参照ポリペプチド）を選択する工程；
（ｂ）１３６位、２４８位、３３６位、または４０３位
のいずれかに対応する少なくとも１つのアミノ酸残基を置換する工程であって、
前記位置が、配列番号１または配列番号３を基準に定義される、工程；
（ｃ）任意選択による、（ｂ）で定義された１つまたは複数のさらなるアミノ酸を置換する工程；
（ｄ）工程（ａ）〜（ｃ）から得られるＫＡＨを調製する工程；
（ｅ）例えば実施例に記載されるようにＫＡＨの特性を決定する工程；および
（ｆ）参照ＫＡＨポリペプチドと比較して改変された特性を有するＫＡＨを選択する工程、
を含む、方法。
【０２５８】
２６．実施形態１６〜２４のいずれか１つに記載の組換え宿主を適切な発酵培地中で発酵させる工程、および任意選択による、ステビオールまたはステビオール配糖体を回収する工程を含む、ステビオールまたはステビオール配糖体を調製するためのプロセス。
【０２５９】
２７．工業的規模で行われる、ステビオール配糖体の調製のための実施形態２６に記載のプロセス。
【０２６０】
２８．実施形態２６または２７に記載のプロセスによって得ることができるステビオール配糖体を含む発酵ブロス。
【０２６１】
２９．実施形態２６または２７に記載のプロセスによって得られるか、または実施形態２８に記載の発酵ブロスから得られるステビオール配糖体。
【０２６２】
３０．実施形態２９に記載の１つまたは複数のステビオール配糖体を含む組成物。
【０２６３】
３１．実施形態２９に記載のステビオール配糖体または実施形態３０に記載の組成物を含む食品、飼料、または飲料。
【０２６４】
３２．ステビオールまたは第１のステビオール配糖体を第２のステビオール配糖体に変換するための方法であって：
・前記ステビオールまたは第１のステビオール配糖体を、実施形態１６〜２４のいずれか１つに記載の組換え宿主、そのような組換え宿主に由来する無細胞抽出物、またはそれらのいずれかに由来する酵素調製物と接触させる工程；
・それにより、ステビオールまたは第１のステビオール配糖体を第２のステビオール配糖体に変換する工程を含む、方法。
【０２６５】
３３．第２のステビオール配糖体が：ｒｅｂＡ、ｒｅｂＥ、ｒｅｂＤ、またはＲｅｂＭである、実施形態３２に記載の方法。
【０２６６】
３４．第１のステビオール配糖体が、ステビオシド、ｒｅｂＢ、ｒｅｂＡ、ｒｅｂＥ、またはｒｅｂＤであり、第２のステビオール配糖体が、ｒｅｂＡ、ｒｅｂＤ、またはｒｅｂＭである、実施形態３３に記載の方法。
【０２６７】
３５．実施形態１〜１２のいずれか１つに記載のカウレン酸１３−ヒドロキシラーゼを生産するための方法であって、実施形態１６〜２４のいずれか１つに記載の組換え宿主細胞を、この宿主細胞がカウレン酸１３−ヒドロキシラーゼを産生するのに適した条件下で培養する工程、および任意選択による、カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼを回収する工程、を含む方法。
【０２６８】
先行技術として与えられる特許文献または他の資料への本明細書での言及は、その文献または資料が既知であること、またはそれらに含まれる情報が任意の特許請求の範囲の優先日現在の一般的な知識の一部であることの承認と見なされるべきではない。
【０２６９】
本明細書に記載の各参考文献の開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２７０】
本開示は、以下の実施例によってさらに説明される。
【０２７１】
［実施例］
［概要］
宿主細胞における酵素の過剰発現などの標準的な遺伝学的技術、ならびに宿主細胞のさらなる遺伝子改変は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ（２００１）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、またはＦ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）に記載されているような当技術分野において公知の方法である。真菌宿主細胞の形質転換および遺伝子改変の方法は、例えば、欧州特許出願公開第Ａ−０６３５５７４号明細書、国際公開第９８／４６７７２号パンフレット、同第９９／６０１０２号パンフレット、および同第００／３７６７１号パンフレットから知られている。
【０２７２】
［実施例１．ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるＫＡＨの発現］
異なるカウレン酸ヒドロキシラーゼ（ＫＡＨ）をコードする遺伝子（以下の表１を参照）をＤＮＡ２．０のベクター中のクローン化遺伝子として注文し、この遺伝子は、ＩＮＴ３組み込みフランク（Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における相同組換えを可能にする）ならびにＫＡＨおよびＨｙｇＢのプロモーター−ｏｒｆ−ターミネーター（ハイグロマイシンに対する耐性をコードする）を含んでいた。プラスミドマップについては図２を参照されたい。
【０２７３】
【表１】
2020500520.tif 000004
【０２７４】
組込みフランク、ＫＡＨ、およびＨｙｇＢ発現カセットを含む発現経路をプラスミドからＰＣＲ増幅した。精製したＰＣＲ産物を、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株ＳＴＶ２２２６に形質転換し、そしてハイグロマイシン耐性コロニーを選択した。ＳＴＶ２２２６株は、ＫＡＨを除き、ステビオール配糖体を生産するためにステビオール配糖体の産生に必要とされるすべての遺伝子を既に発現している。この株の遺伝子含有量を以下の表２に示す。類似の株の構築は、国際公開第２０１３／１１０６７３号パンフレットおよび同第２０１５／００７７４８号パンフレットにさらに詳細に記載されている。ＳＴＶ２２２６株は、標的組み込みの効率を高めるために、ｋｕ７０遺伝子中に１６５８ｂｐの内部欠失を含む。
【０２７５】
【表２】
2020500520.tif 000005
【０２７６】
［実施例２．ＫＡＨ遺伝子を発現する株におけるグリコシル化カウレン酸およびステビオール配糖体の産生］
異なるＫＡＨ遺伝子で形質転換されたＳＴＶ２２２６を、ハイグロマイシンを含むＹＰｈＤプレートに播種し、単一コロニー分離株を得て産生試験を行った：前培養として、グルコースを含む２００μｌのＹＥＰに、ハイグロマイシンを含むＹＥＰｈ−Ｄ寒天プレートからのコロニー材料を接種した。前培養物を、Ｉｎｆｏｒｓインキュベーター内で３０℃、７５０ｒｐｍ、および湿度８０％で７２時間インキュベートした。４０μｌの前培養物を使用して、炭素源としてグルコースを含む２．５ｍｌのミネラル培地に接種した。これらの産生培養物を、Ｉｎｆｏｒｓインキュベーター内で３０℃、５５０ｒｐｍ、湿度８０％で１２０時間インキュベートした。この産生培養物を、３０００ｇでの１０分間の遠心分離によりペレット化した。遠心分離後、上清を移して３３％アセトニトリルで希釈し、ＬＣ／ＭＳを使用して、ステビオール、ステビオール配糖体、カウレン酸（ＫＡ）、およびグリコシル化カウレン酸（ＫＡ−配糖体）について分析した。データを示すために、ステビオール配糖体力価（ｍＭ）およびＫＡ−配糖体力価（ｍＭ）を、ＫＡＨ４＿ｍ４（配列番号２）で形質転換したＳＴＶ２２２６で得られた力価に対して正規化した。結果の概要については、表３を参照されたい。
【０２７７】
【表３】
2020500520.tif 000006
【０２７８】
ステビオール配糖体の合計には、ステビオール−１３−モノシド、ステビオール−１９−モノシド、ステビオールビオシド、ルブソシド、レバウジオシドＢ、ステビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＥ、レボウジオシドＤ、およびレバウジオシドＭが含まれる。ＫＡ−配糖体の合計には、ＫＡ、ＫＡ−１９−モノグルコシド、ＫＡ−１９−ジグルコシド、およびＫＡ−１９−トリグルコシドが含まれる。
【０２７９】
ＫＡＨ遺伝子ＫＡＨ４＿ｐ１９、ＫＡＨ４＿ｐ２０、ＫＡＨ４＿ｐ２１、およびＫＡＨ４＿ｐ２２を発現した株は、より高い力価のステビオール配糖体を産生した。これらの遺伝子のうちのいくつかの発現により、ＫＡＨ４＿ｍ４と比較して総ステビオール配糖体産生において３０％以上の改善がもたらされた。不所望のＫＡ−配糖体の生成は、遺伝子ＫＡＨ４＿ｐ１８、ＫＡＨ４＿ｐ２０、ＫＡＨ４＿ｐ２１、およびＫＡＨ４＿ｐ２２で大幅に減少した。所望の産物（ステビオール配糖体）の不所望の副産物（ＫＡ−配糖体）に対する比率が、いくつかのＫＡＨ遺伝子では、ＫＡＨ４＿ｍ４を発現する株と比較して、遺伝子ＫＡＨ４＿ｐ１８〜ＫＡＨ４＿ｐ２２を発現するすべての株で実に２倍を超えて増加した。これらの結果は、ＫＡＨ４＿ｐ１８〜ＫＡＨ４＿ｐ２２酵素がステビオール配糖体の産生に有益であることを例示する。
【０２８０】
［実施例３．バイオリアクターにおけるグリコシル化カウレン酸およびステビオール配糖体の産生］
上記のように構築された、ＫＡＨ４＿ｍ４（参照）、ＫＡＨ４＿ｐ２０、およびＫＡＨ４＿ｐ２１を発現する３つの株を、５０ｍｌのミネラル培地を含む５００ｍＬの振盪フラスコ中、３０℃および２８０ｒｐｍで３日間培養した。続いて、振盪フラスコの内容物６ｍｌを、出発容量０．３Ｌの発酵槽に移した。アンモニア（１２．５重量％）を添加することによってｐＨを５．０に制御した。温度は３０℃に制御した。グルコース濃度は、発酵槽に供給されるグルコースの制御により制限し続けた。振盪フラスコのミネラル培地および発酵は、Ｖｅｒｄｕｙｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｖｅｒｄｕｙｎ  Ｃ，Ｐｏｓｔｍａ  Ｅ，Ｓｃｈｅｆｆｅｒｓ  ＷＡ，Ｖａｎ  Ｄｉｊｋｅｎ  ＪＰ．Ｙｅａｓｔ，１９９２  Ｊｕｌ；８（７）：５０１−５１７）に基づいた。ブロス試料を水および３３％アセトニトリルで希釈し、ＬＣ／ＭＳで分析した。
【０２８１】
【表４】
2020500520.tif 000007
【０２８２】
ステビオール配糖体の合計には、ステビオール、ステビオール−１３−モノシド、ステビオール−１９−モノシド、ステビオールビオシド、ルブソシド、レバウジオシドＢ、ステビオシド、レボウジオシドＡ、レボウジオシドＥ、レボウジオシドＤ、およびレボウジオシドＭが含まれる。ＫＡ−配糖体の合計には、ＫＡ、ＫＡ−１９−モノグルコシド、ＫＡ−１９−ジグルコシド、およびＫＡ−１９−トリグルコシドが含まれる。
【０２８３】
本発明者らは、ＫＡＨ４＿ｐ２０が発現されると、ステビオール配糖体の量が増加し、総ステビオール配糖体の生産量が２０％増加することを観察した。さらに、ＫＡ−配糖体の量は３５％を超えて減少する。ＫＡＨ４＿ｐ２１が発現されると、ＫＡ−配糖体の減少はさらに大きく、６０％を超える減少である。結果として、ＫＡＨ４＿ｐ２０の発現またはＫＡＨ４＿ｐ２１の発現では、ステビオール配糖体のＫＡ−配糖体に対する比率は、ＫＡＨ４＿ｍ４を発現する株と比較して劇的に増加する。ＫＡＨ４＿ｐ２０またはＫＡＨ４＿ｐ２１の使用は、ステビオール配糖体の生産および精製に良い効果をもたらすであろう。
【図１】
2020500520.tif 000008
【図２】
2020500520.tif 000009
【配列表】
2020500520000001.app
【国際調査報告】
2020500520.tif 000010
2020500520.tif 000011
2020500520.tif 000012