(57)【要約】  本発明は、組換え原形質膜をベースとする小胞体に関するものであって、さらに詳細には、１６２番目のアミノ酸であるヒスチジンがアルギニンに置換されたＶＳＶ−Ｇ変異体タンパク質を膜に含む組換え原形質膜をベースとする小胞体及び該組換え原形質膜をベースとする小胞体を含む癌治療用薬学的組成物に関するものである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１６２番目のアミノ酸であるヒスチジンがアルギニンに置換されたＶＳＶ−Ｇ変異体タンパク質が膜に導入された組換え原形質膜をベースとする小胞体。
【請求項２】
エクソソーム、細胞外小胞または細胞由来ナノベジクルである請求項１に記載の組換え原形質膜をベースとする小胞体。
【請求項３】
前記ＶＳＶ−Ｇ変異体タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子コンストラクトに形質転換されて、前記ＶＳＶ−Ｇ変異体タンパク質を過発現する哺乳動物細胞から分離及び精製されたものである請求項１に記載の組換え原形質膜をベースとする小胞体。
【請求項４】
１６２番目のアミノ酸であるヒスチジンがアルギニンに置換されたＶＳＶ−Ｇ変異体タンパク質が膜に導入され、内部に１つまたは２つ以上の免疫原性細胞死誘導剤が取り込まれた組換え原形質膜をベースとする小胞体。
【請求項５】
前記免疫原性細胞死誘導剤は、アントラサイクリン系抗癌剤、タキサン系抗癌剤、抗ＥＧＦＲ抗体、ＢＫチャネル作用剤、ボルテゾミブ、強心性配糖体、シクロホスファミド系抗癌剤、ＧＡＤＤ３４／ＰＰ１阻害剤、ＬＶ−ｔＳＭＡＣ、麻疹ウイルス、ブレオマイシン、ミトキサントロンまたはオキサリプラチンである請求項４に記載の組換え原形質膜をベースとする小胞体。
【請求項６】
請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の組換え原形質膜をベースとする小胞体を有効成分として含む癌治療用薬学的組成物。
【請求項７】
１つまたは２つ以上の抗癌化合物をさらに含む請求項６に記載の癌治療用薬学的組成物。
【請求項８】
前記抗癌化合物は、免疫原性細胞死誘導剤または免疫チェックポイント阻害剤である請求項７に記載の癌治療用薬学的組成物。
【請求項９】
前記免疫原性細胞死誘導剤は、アントラサイクリン系抗癌剤、タキサン系抗癌剤、抗ＥＧＦＲ抗体、ＢＫチャネル作用剤、ボルテゾミブ、強心性配糖体、シクロホスファミド系抗癌剤、ＧＡＤＤ３４／ＰＰ１阻害剤、ＬＶ−ｔＳＭＡＣ、麻疹ウイルス、ブレオマイシン、ミトキサントロンまたはオキサリプラチンである請求項８に記載の癌治療用薬学的組成物。
【請求項１０】
前記アントラサイクリン系抗癌剤は、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ピクサントロン、サバルビシン、またはバルビシンである請求項９に記載の癌治療用薬学的組成物。
【請求項１１】
前記タキサン系抗癌剤は、パクリタキセルまたはドセタキセルである請求項９に記載の癌治療用薬学的組成物。
【請求項１２】
前記抗ＥＧＦＲ抗体は、セツキシマブである請求項９に記載の癌治療用薬学的組成物。
【請求項１３】
ウイルス由来の膜融合性膜タンパク質が膜に導入された組換え原形質膜をベースとする小胞体を有効成分として含む癌治療用薬学的組成物。
【請求項１４】
前記原形質膜をベースとする小胞体は、エクソソーム、細胞外小胞または細胞由来ナノベジクルである請求項１３に記載の癌治療用薬学的組成物。
【請求項１５】
前記ウイルス由来の膜融合性膜タンパク質は、水疱性口内炎ウイルスＶＳＶ−Ｇタンパク質、テナガザル白血病ウイルスＧＡＬＶ．ｆｕｓ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン、呼吸器細胞融合ウイルスＦタンパク質、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１２０またはｇｐ４１、フラビウイルスＥタンパク質、アルファウイルスＥ１タンパク質、バキュロウイルスｇｐ６４、Ｃ型肝炎ウイルスｇｐ３１またはｇｐ７０、麻疹ウイルスＨタンパク質またはＦタンパク質、またはエボラウイルスｇｐ１またはｇｐ２である請求項１３に記載の癌治療用組成物。
【請求項１６】
１つまたは２つ以上の抗癌化合物をさらに含む請求項１２〜請求項１５のいずれか一項に記載の癌治療用薬学的組成物。
【請求項１７】
前記抗癌化合物は、免疫原性細胞死誘導剤または免疫チェックポイント阻害剤である請求項１６に記載の癌治療用薬学的組成物。
【請求項１８】
前記免疫原性細胞死誘導剤は、アントラサイクリン系抗癌剤、タキサン系抗癌剤、抗ＥＧＦＲ抗体、ＢＫチャネル作用剤、ボルテゾミブ、強心性配糖体、シクロホスファミド系抗癌剤、ＧＡＤＤ３４／ＰＰ１阻害剤、ＬＶ−ｔＳＭＡＣ、麻疹ウイルス、ブレオマイシン、ミトキサントロンまたはオキサリプラチンである請求項１７に記載の癌治療用薬学的組成物。
【請求項１９】
前記アントラサイクリン系抗癌剤は、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ピクサントロン、サバルビシン、またはバルビシンである請求項１８に記載の癌治療用薬学的組成物。
【請求項２０】
前記タキサン系抗癌剤は、パクリタキセルまたはドセタキセルである請求項１８に記載の癌治療用薬学的組成物。
【請求項２１】
前記抗ＥＧＦＲ抗体は、セツキシマブである請求項１８に記載の癌治療用薬学的組成物。
【請求項２２】
前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用阻害剤またはＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／Ｂ７−２相互作用阻害剤である請求項３０に記載の癌治療用薬学的組成物。
【請求項２３】
前記ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用阻害剤は、ＰＤ−１またはＰＤＬ１を標的とする抗体または前記抗体の機能性断片または一本鎖をベースとする抗体類似体である請求項１７に記載の癌治療用薬学的組成物。
【請求項２４】
前記ＰＤ−１またはＰＤＬ１を標的とする抗体は、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブまたはアベルマブである請求項２３に記載の癌治療用薬学的組成物。
【請求項２５】
前記ＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／Ｂ７−２相互作用阻害剤は、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−１またはＢ７−２を標的とする抗体または前記抗体の機能性断片または一本鎖をベースとする抗体類似体である請求項２２に記載の癌治療用薬学的組成物。
【請求項２６】
前記ＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／Ｂ７−２相互作用阻害剤は、イピリムマブである請求項２５に記載の癌治療用薬学的組成物。
【請求項２７】
前記一本鎖をベースとする抗体類似体は、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、モノボディ（ｍｏｎｏｂｏｄｙ）、可変性リンパ球受容体（ＶＬＲ）、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）またはラクダ科重鎖断片（ＶＨＨ）である請求項２３または請求項２５に記載の癌治療用薬学的組成物。
【請求項２８】
前記抗癌化合物は、前記組換えエクソソームの内部に封入された請求項１６に記載の癌治療用薬学的組成物。
【請求項２９】
治療的に有効な量の請求項６に記載の癌治療用薬学的組成物を癌にかかった個体に投与する段階を含む前記個体の癌治療方法。
【請求項３０】
治療的に有効な量の請求項１３に記載の癌治療用薬学的組成物を癌にかかった個体に投与する段階を含む前記個体の癌治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な組換え原形質膜をベースとする小胞体に関し、より具体的には、癌治療用の新規な組換え原形質膜をベースとする小胞体に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、身体の他の部位に浸透及び転移の潜在性を有した非正常な細胞成長と関連した一群の疾患を意味する。２０１５年現在、全世界的に９千万人以上の癌患者が存在すると知られており、毎年１千４百万人程度の新規な癌患者が発生している。癌は、ヒトの死亡原因の１５．７％を占め、最も頻発する癌は、男性の場合、肺癌、前立腺癌、大腸癌及び胃癌であり、女性の場合、乳癌、大腸癌、肺癌及び子宮頸部癌である。
【０００３】
癌を治療するために、多様な抗癌剤を利用した化学療法、放射線照射による放射線療法、癌と関連した特定の生体内分子を標的とする抗体療法など多様な治療的アプローチが試みられているが、化学療法剤に使われる抗癌剤や放射線照射の場合、正常細胞にも影響を与えるために、副作用が深刻であり、癌細胞が抗癌剤に対する耐性を獲得して、治療に失敗または再発する場合が頻繁である。
【０００４】
最近、自身の免疫体系を利用した抗癌免疫治療が臨床で驚くべき効果を示しているが、癌の複雑性によって、平均約３０％未満の患者のみで効果を示すという限界点がある。これは、癌細胞が自身の免疫細胞によって「ｓｅｌｆ」と認識されるためであるが、したがって、癌細胞を免疫細胞によって「ｎｏｎ−ｓｅｌｆ」と認識させて、癌細胞の貪食を誘導し、さらに増幅された免疫反応を起こすことが重要である。
【０００５】
エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）は、血液、尿、及び細胞培養の培養培地を含む全ての生物学的液体に存在する細胞由来の小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）であって、細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）または微小胞（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）とも呼ばれる。エクソソームのサイズは、３０ｎｍ〜１００ｎｍであると知られており、多小胞体（ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｂｏｄｙ）が細胞膜と融合する時、細胞から分泌されるか、細胞膜を通じて直接分泌されるか、細胞膜から直接出芽（ｂｕｄｄｉｎｇ）する。エクソソームは、凝固、細胞間信号伝達、及び代謝廃棄物の管理のような多様な過程で重要な役割を果たしていると知られている。エクソソームは、人体の細胞自身と類似した組成を有しているという点で、非免疫原性であるという点で、リポソームやポリマー系のナノ粒子と比較して、薬物伝達体として重要な長所を有している（Ｈａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｉｎ．Ｂ．６（４）：２８７−２９６，２０１６）。これと関連して、エクソソームを用いてドキソルビシンのような抗癌剤を腫瘍組織に伝達するか（Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．３５：２３８３−２３９０，２０１４）、パクリタキセル及びドキソルビシンを血脳障壁を通過して脳に伝達するか（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．３２：２００３−２０１４，２０１５）、パーキンソン病を治療するために、カタラーゼ（ｃａｔａｌａｓｅ）を血脳障壁を通過して伝達するか（Ｈａｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ．２０７：１８−３０，２０１５）、癌を治療するために、特定の遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡを伝達する（Ｓｈｔａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｓｉｇｎａｌ．１１：８８，２０１３）などの多様な試みがあった。
【０００６】
細胞外小胞は、細胞から細胞外環境に放出または分泌される多様な機能のタンパク質、ＲＮＡのような核酸分子または脂質などの多様な生体分子が、これが由来した細胞の細胞膜と同じ脂質二重層の細胞膜で封入された粒子状の構造体を意味する。細胞外小胞体は、通常３０〜１００ｎｍのサイズを有するエクソソームよりもさらに大きな１００ｎｍ〜１μｍの平均直径を有する原形質膜をベースとする小胞体を意味する。
【０００７】
細胞由来ナノベジクル（ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎａｎｏｖｅｓｉｃｌｅ）は、細胞を微小流体チャネルを通過させる押出工程、多段階濾過工程などの人為的な方法により形成されるナノサイズの細胞膜成分である原形質膜によって取り囲まれたナノサイズの小胞体であって、細胞によって分泌されて自然的に生成されるエクソソームや細胞外小胞とは区別される原形質膜をベースとする小胞体を意味する。
【０００８】
一方、ＶＳＶ−Ｇ（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）は、水疱性口内炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）のウイルス粒子（ｖｉｒｉｏｎ）膜に存在する唯一のウイルス糖タンパク質であって、ウイルスの標的細胞への付着及び融合タンパク質として作用する。前記ＶＳＶ−Ｇタンパク質は、２つのＮ連結グリカンを含む膜通過タンパク質であって、他のウイルスタンパク質が存在しない場合、低ｐＨ依存的な方式で膜融合を開始することができる。ＶＳＶ−Ｇタンパク質は、ＤＮＡなど核酸分子と複合体を形成するために、直接的な遺伝子伝達用担体として使われるか、より安定的であり、高力価の偽型（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）マウス白血病ウイルス（ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ、ＭＬＶ）をベースとするレトロウイルス及びレンチウイルスをベースとするベクターを生産することにより、遺伝子治療に効果的に使われてきた。しかし、最近、遺伝子以外に多様なタンパク質を標的細胞に伝達する用途として利用可能性が提示されている（Ｍａｎｇｅｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９（９）：１６５６−１６６６，２０１１）。
【０００９】
前記ＶＳＶ−Ｇタンパク質の構造及び機能についての研究の結果、シグナル配列が除去された成熟タンパク質基準に６０番目、１６２番目及び４０７番目のアミノ酸残基であるヒスチジンがクラスターを形成して、ｐＨセンサーとして作用することが究明されており（Ｒｏｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１３：１８７−１９１，２００６；Ｒｏｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１５：８４３−８４８，２００７）、最近、そのうち、１６２番目のアミノ酸であるヒスチジンがアルギニンに変異される場合（Ｈ１６２Ｒ）、癌細胞を取り囲んだ生理学的ｐＨであるｐＨ６．８で膜融合を誘発して、ＶＳＶ−Ｇ変異体（Ｈ１６２Ｒ）を発現する神経幹細胞投与時に、癌細胞の死滅が促進されると報告されている（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２１（８）：１４９２−１４９７，２０１３）。
【００１０】
しかし、前記先行技術に開示された方法は、神経幹細胞の需給が難しいという点、そして、癌細胞殺滅効果があまり大きくないという点で、実際の臨床への適用には難しい技術である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、前記問題点を含んだ多様な問題点を解決するためのものであって、抗癌剤なしでも、主体的に癌細胞を効率的に死滅させながら、癌微小環境以外の条件では作動しない安全な抗癌治療用の組換え原形質膜をベースとする小胞体を提供することを目的とする。特に、癌細胞を免疫細胞により「敵」と認識されるように「異種化（ｘｅｎｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）」させる組換え原形質膜をベースとする小胞体を提供することである。しかし、このような課題は、例示的なものであって、これにより、本発明の範囲が限定されるものではない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の一態様によれば、１６２番目のアミノ酸であるヒスチジンがアルギニンに置換されたＶＳＶ−Ｇ変異体タンパク質が膜に導入された組換え原形質膜をベースとする小胞体（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｖｅｓｉｃｌｅ）が提供される。
【００１３】
本発明の他の一態様によれば、前記組換え原形質膜をベースとする小胞体を有効成分として含む癌治療用薬学的組成物が提供される。
【００１４】
また、本発明の他の一態様によれば、ウイルス由来の膜融合性膜タンパク質が膜に導入された組換え原形質膜をベースとする小胞体を有効成分として含む癌治療用薬学的組成物が提供される。
【００１５】
また、本発明の他の一態様によれば、１６２番目のアミノ酸であるヒスチジンがアルギニンに置換されたＶＳＶ−Ｇ変異体タンパク質が膜に導入された組換え原形質膜をベースとする小胞体またはウイルス由来の膜融合性膜タンパク質が膜に導入された組換え原形質膜をベースとする小胞体の癌治療剤の製造への用途が提供される。
【００１６】
本発明の他の一態様によれば、前記組換え原形質膜をベースとする小胞体または前記のうちいずれか１つ以上の薬学的組成物を癌にかかった個体に投与する段階を含む前記個体の癌治療方法が提供される。
【発明の効果】
【００１７】
前記のようになされた本発明の一実施形態によれば、本発明は、遺伝子の伝達のような複雑な機構によらずとも、癌を効果的に治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】癌細胞微小環境（ｐＨ６．８）で抗癌免疫効果を誘導する本発明の一実施形態による変異体ＶＳＶ−Ｇ  Ｈ１６２Ｒ（以下、‘ｍＶＳＶ−Ｇ’と略称する）を含む組換えエクソソームの作用機序を概略的に説明する概要図である。
【図２Ａ】本発明の一実施形態による組換えエクソソームを生産するためのプラスミドＤＮＡの概略的な構造を示すプラスミドマップである。
【図２Ｂ】本発明の一実施形態による組換えエクソソームを生産するための野生型ＶＳＶ−Ｇ及び突然変異型ＶＳＶ−Ｇタンパク質の１６２番の位置の変異を示すアミノ酸配列及びそれをコードするポリヌクレオチドの核酸配列を示す。
【図３】本発明の一実施形態によるｍＶＳＶ−Ｇを含む組換えエクソソームの生産過程を示す工程図である。
【図４】本発明の一実施形態による組換えエクソソーム及び前記組換えエクソソームを生産するようにｍＶＳＶ−Ｇ遺伝子コンストラクトで形質移入された細胞抽出物に対するウェスタンブロット分析結果である。
【図５Ａ】本発明の一実施形態によって製造されたｍＶＳＶ−Ｇを含む組換えエクソソームを透過電子顕微鏡で撮影した写真である。
【図５Ｂ】前記組換えエクソソームの粒度を動的光散乱分析で分析した結果を示すヒストグラムである。
【図６Ａ】本発明の一実施形態によるｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏで３種類の癌細胞（４Ｔ１−Ｌｕｃ、ＥＬ４−Ｏｖａ、及びＣＴ２６．ＣＬ２５）を処理した場合の、ｐＨ変化による癌細胞との膜融合程度を確認した結果を示すグラフである（＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１）。
【図６Ｂ】本発明の一実施形態によるｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏで４Ｔ１−Ｌｕｃ細胞を処理した場合の、ｐＨ変化による癌細胞との膜融合の有無を抗ＶＳＶ−Ｇ抗体及び抗Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体（緑色）を用いて染色した後、蛍光顕微鏡撮影した写真である。
【図６Ｃ】３種類の癌細胞（４Ｔ１−Ｌｕｃ、ＥＬ４−Ｏｖａ、及びＣＴ２６．ＣＬ２５）を含んだ多様な細胞表面でＶＳＶ−Ｇの受容体として知られたＬＤＬＲ（ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の発現の有無をウェスタンブロット分析で分析した結果を示す写真である。
【図７Ａ】本発明の一実施形態によるｍＶＳＶ−Ｇ−ＥｘｏがｐＨの変化によって３種類の癌細胞（４Ｔ１−Ｌｕｃ、ＥＬ４−Ｏｖａ、及びＣＴ２６．ＣＬ２５）表面に融合された後、癌細胞同士の融合を促進するか否かを観察するためのフローサイトメトリーの結果を示すヒストグラムである。
【図７Ｂ】前記図７Ａの結果を定量的に測定した結果を示すグラフである。
【図７Ｃ】本発明の一実施形態によるｍＶＳＶ−Ｇ−Ｅｘｏが直接癌細胞（４Ｔ１−Ｌｕｃ、ＥＬ４−Ｏｖａ、及びＣＴ２６．ＣＬ２５）の死滅を誘導するかを確認するための細胞生存性分析結果を示すグラフである（＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１）。
【図８Ａ】本発明の一実施形態によるｍＶＳＶ−Ｇを含む組換えエクソソーム及び対照エクソソーム（Ｃｏｎ−Ｅｘｏ）の４Ｔ１−Ｌｕｃ乳癌細胞に対する大食細胞及び樹状細胞による食細胞作用に及ぼす影響を分析した蛍光顕微鏡撮影分析後、結果を定量化したグラフである。
【図８Ｂ】本発明の一実施形態によるｍＶＳＶ−Ｇを含む組換えエクソソーム及び対照エクソソーム（Ｃｏｎ−Ｅｘｏ）のＥＬ４−Ｏｖａリンパ腫細胞に対する大食細胞及び樹状細胞による食細胞作用に及ぼす影響を分析した蛍光顕微鏡撮影分析後、結果を定量化したグラフである。
【図８Ｃ】本発明の一実施形態によるｍＶＳＶ−Ｇを含む組換えエクソソーム及び対照エクソソーム（Ｃｏｎ−Ｅｘｏ）のＣＴ４６．ＣＬ２５大腸癌細胞に対する大食細胞及び樹状細胞による食細胞作用に及ぼす影響を分析した蛍光顕微鏡撮影分析後、結果を定量化したグラフである（＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１）。
【図９】ＶＳＶＧがＴＬＲ４作用剤（ａｇｏｎｉｓｔ）として作動して樹状細胞の機能を活性化することができるか否かを調査するために、本発明の一実施形態によるｍＶＳＶ−Ｇを含む組換えエクソソーム（ｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏ）及び対照群エクソソーム（Ｃｏｎ−Ｅｘｏ）でそれぞれ骨髄由来樹状細胞を処理した後、前記骨髄由来樹状細胞でのＣＤ４０（左側）及びＣＤ８６（右側）の相対的発現比率の変化を記録したグラフである（＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１）。
【図１０Ａ】本発明の一実施形態によるｍＶＳＶ−Ｇを含む組換えエクソソーム（２００μｇ）を投与した４Ｔ１−Ｌｕｃ乳癌腫瘍モデル動物（Ｂａｌｂ／ｃ、７週齢雌性マウス）での経時的な癌細胞のサイズを比較したグラフである（四角形は対照群、円形はｍＶＳＶ−Ｇを含まない対照群エクソソーム、三角形は本発明の一実施形態によるｍＶＳＶ−Ｇを含む組換えエクソソーム）。
【図１０Ｂ】図１０Ａで癌細胞注入後、１６日経過後、実験動物を屠殺して摘出された癌組織の重量を測定した結果を示すグラフである。
【図１０Ｃ】実験に使われた動物の体重の変化を示すグラフである（＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１）。
【図１１Ａ】本発明の一実施形態によるｍＶＳＶ−Ｇを含む組換えエクソソーム（２００μｇ）を投与したＥＬ４−Ｏｖａリンパ腫腫瘍モデル動物（Ｃ５７ＢＬ／６、７週齢雌性マウス）での経時的な癌細胞のサイズを比較したグラフである（四角形は対照群、円形はｍＶＳＶ−Ｇを含まない対照群エクソソーム、三角形は本発明の一実施形態によるｍＶＳＶ−Ｇを含む組換えエクソソーム）。
【図１１Ｂ】図１１Ａで癌細胞注入後、１６日経過後、実験動物を屠殺して摘出された癌組織の重量を測定した結果を示すグラフである。
【図１１Ｃ】実験に使われた動物の体重の変化を示すグラフである（＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１）。
【図１２】本発明の一実施形態によるｍＶＳＶ−Ｇを含む組換えエクソソーム（ｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏ）、野生型ＶＳＶ−Ｇを含む組換えエクソソーム（ｗｔＶＳＶＧ−Ｅｘｏ）、対照群エクソソーム（Ｃｏｎ−Ｅｘｏ）及び対照群としてＰＢＳを腫瘍モデル動物（ＥＬ４−Ｏｖａ−注入Ｃ５７ＢＬ／６マウス）の癌組織内に投与し、摘出された癌組織を単一細胞化し、抗ＶＳＶ−Ｇ抗体で染色した後、フローサイトメトリーを行った結果を示すグラフである（＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１）。
【図１３Ａ】本発明の一実施形態によるｍＶＳＶ−Ｇを含む組換えエクソソーム（ｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏ）、野生型ＶＳＶ−Ｇを含む組換えエクソソーム（ｗｔＶＳＶＧ−Ｅｘｏ）、対照群エクソソーム（Ｃｏｎ−Ｅｘｏ）及び対照群としてＰＢＳを腫瘍モデル動物（ＥＬ４−Ｏｖａ−注入Ｃ５７ＢＬ／６マウス）の癌組織内に投与し、摘出された腫瘍排液リンパ節を単一細胞化した後、樹状細胞マーカーである抗ＣＤ１１ｃ抗体と抗Ｈ−２ｋｂ  Ｏｖａ抗体とを用いてフローサイトメトリーを行った結果を示すグラフである。
【図１３Ｂ】前記摘出された腫瘍排液リンパ節を単一細胞化した後、抗ＣＤ１１ｃ抗体と抗ＣＤ４０抗体とを用いてフローサイトメトリーを行った結果を示すグラフである。
【図１３Ｃ】前記摘出された腫瘍排液リンパ節を単一細胞化した後、抗ＣＤ１１ｃ抗体と抗ＣＤ８６抗体とを用いてフローサイトメトリーを行った結果を示すグラフである（＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１）。
【図１３Ｄ】腫瘍組織薄片を抗ＣＤ８抗体で染色した後、蛍光顕微鏡を用いて腫瘍組織内のＣＤ８  Ｔ細胞の浸潤程度を分析した結果を示す一連の写真である。
【図１３Ｅ】前記図１３ＤでＣＤ８  Ｔ細胞の癌組織内の浸潤程度を定量化した結果を示すグラフである（＊＊＊：Ｐ＜０．００１）。
【図１４Ａ】本発明の一実施形態によるｍＶＳＶ−Ｇを含む組換えエクソソーム（ｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏ）、野生型ＶＳＶ−Ｇを含む組換えエクソソーム（ｗｔＶＳＶＧ−Ｅｘｏ）、対照群エクソソーム（Ｃｏｎ−Ｅｘｏ）及び対照群としてＰＢＳを腫瘍モデル動物（ＥＬ４−Ｏｖａ−注入Ｃ５７ＢＬ／６マウス）の癌組織内に投与後、摘出された腫瘍組織でＣＤ１１ｃ陽性樹状細胞とＦ４／８０陽性大食細胞とを分離した後、ＯＴ−１形質転換マウス脾臓から分離されたＯＴ−１  ＣＤ８  Ｔ細胞とそれぞれ１：５の比率で共培養した後、培養培地のＩＮＦ−γ発現レベルをＥＬＩＳＡ分析により分析した結果を示すグラフである。
【図１４Ｂ】前記実験動物から摘出された脾臓組織を単一細胞化した脾臓細胞に対照群としてＰＢＳ及び癌特異的抗原である卵アルブミン１０μｇ／ｍｌで２４時間処理した後、培養培地のＩＮＦ−γ発現レベルをＥＬＩＳＡ分析により分析した結果を示すグラフである（＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１）。
【図１５Ａ】本発明の一実施形態によるｍＶＳＶ−Ｇを含む組換えエクソソーム（ｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏ）、対照群エクソソーム（Ｃｏｎ−Ｅｘｏ）及び対照群としてＰＢＳをＥＬ４−Ｏｖａ癌細胞を皮下注入して癌を誘発したヌードマウスの腫瘍組織内に投与後、経時的な腫瘍組織の体積を測定した結果を示すグラフ（左側）及び癌細胞注入後，１７日目のマウスを屠殺し、摘出した腫瘍組織の重量を測定した結果を示すグラフ（右側）であって、低容量（１００μｇ２回）投与による実験の結果を示す。
【図１５Ｂ】本発明の一実施形態によるｍＶＳＶ−Ｇを含む組換えエクソソーム（ｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏ）、対照群エクソソーム（Ｃｏｎ−Ｅｘｏ）及び対照群としてＰＢＳをＥＬ４−Ｏｖａ癌細胞を皮下注入して癌を誘発したヌードマウスの腫瘍組織内に投与後、経時的な腫瘍組織の体積を測定した結果を示すグラフ（左側）及び癌細胞注入後，１７日目のマウスを屠殺し、摘出した腫瘍組織の重量を測定した結果を示すグラフ（右側）であって、同一モデルを用いて高容量（１００μｇ４回）投与による実験の結果を示す。
【図１５Ｃ】本発明の一実施形態によるｍＶＳＶ−Ｇを含む組換えエクソソーム（ｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏ）を抗ＣＤ８抗体の癌細胞注入１日前から３日間隔で腹腔投与し、ＥＬ４−Ｏｖａ癌細胞を皮下注入して癌を誘発したＣ５７ＢＬ／６マウスの腫瘍組織内に投与後、経時的な腫瘍組織の体積を測定した結果を示すグラフ（左側）及び癌細胞注入後、１８日目のマウスを屠殺し、摘出した腫瘍組織の重量を測定した結果を示すグラフ（右側）であって、対照抗体としては組換えＩｇＧを使用した（＊＊＊：Ｐ＜０．００１）。
【図１５Ｄ】本発明の一実施形態によるｍＶＳＶ−Ｇを含む組換えエクソソーム（ｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏ）、対照群エクソソーム（Ｃｏｎ−Ｅｘｏ）及び対照群としてＰＢＳをＥＬ４−Ｏｖａ癌細胞を皮下注入して癌を誘発したＢＡＴＦ３  ＫＯマウス（ＣＤ１０３及びＣＤ８が欠乏した）の腫瘍組織内に投与後、経時的な腫瘍組織の体積を測定した結果を示すグラフ（左側）及び癌細胞注入後、１７日目のマウスを屠殺し、摘出した腫瘍組織の重量を測定した結果を示すグラフ（右側）である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
用語の定義：
本明細書で使われる用語「膜融合性膜タンパク質（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、ウイルス由来の膜タンパク質であって、ウイルスが宿主細胞に浸透するために、宿主細胞への付着及び膜融合を誘発するに当たって、核心的な役割を行うタンパク質を意味する。代表的な例としては、水疱性口内炎ウイルス由来の外被糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）が存在する。
【００２０】
本明細書で使われる用語「水疱性口内炎ウイルスの外被糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇタンパク質）」は、水疱性口内炎ウイルスのウイルス粒子膜に存在する唯一のウイルス糖タンパク質であって、ウイルスの標的細胞への付着及び融合タンパク質として作用する。前記ＶＳＶ−Ｇタンパク質は、２つのＮ連結グリカンを含む膜通過タンパク質であって、他のウイルスタンパク質が存在しない場合、低ｐＨ依存的な方式で膜融合を開始することができる。ＶＳＶ−Ｇタンパク質は、ＤＮＡなど核酸分子と複合体を形成するために、直接的な遺伝子伝達用担体として使われるか、より安定的であり、高力価の偽型マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）をベースとするレトロウイルス及びレンチウイルスをベースとするベクターを生産することにより、遺伝子治療に効果的に使われてきた。しかし、最近、遺伝子以外に多様なタンパク質を標的細胞に伝達する用途として利用可能性が提示されている（Ｍａｎｇｅｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９（９）：１６５６−１６６６，２０１１）。
【００２１】
本明細書で使われる「原形質膜をベースとする小胞体（ｐｌａｓａｍ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｖｅｓｉｃｌｅ）」は、細胞から由来した細胞膜で取り囲まれたナノサイズの小胞体（ｖｅｓｉｃｌｅ）を意味し、細胞から分泌または出芽によって生成されるエクソソーム、細胞外小胞または細胞を押出など人為的な方法を用いて加工して製造される細胞由来ナノベジクルなどがこれに含まれる。
【００２２】
本明細書で使われる用語「エクソソーム」は、血液、尿、及び細胞培養の培養培地を含む全ての生物学的液体に存在する細胞由来の小胞であって、細胞外小胞または微小胞とも呼ばれる。エクソソームのサイズは、３０ｎｍ〜１００ｎｍであると知られており、多小胞体が細胞膜と融合する時、細胞から分泌されるか、細胞膜を通じて直接分泌される。エクソソームは、凝固、細胞間信号伝達、及び代謝廃棄物の管理のような多様な過程で重要な役割を果たしていると知られている。
【００２３】
本明細書で使われる用語「組換えエクソソーム（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｅｘｏｓｏｍｅ）」は、人為的に生産されたエクソソームを意味し、エクソソームを生産することができる宿主細胞（ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ）に遺伝子工学（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）によって外来タンパク質をコードする遺伝子を形質導入して、形質転換宿主細胞を製造した後、前記形質転換宿主細胞を培養し、その培養液から収得されたエクソソームである。前記組換えエクソソームには、形質導入された外来タンパク質が内部またはエクソソーム膜に含まれている。
【００２４】
本明細書で使われる用語「細胞外小胞」は、細胞から細胞外環境に放出または分泌される多様な機能のタンパク質、ＲＮＡのような核酸分子または脂質などの多様な生体分子が、これが由来した細胞の細胞膜と同じ脂質二重層の細胞膜で封入された粒子状の構造体を意味する。細胞外小胞体は、通常３０〜１００ｎｍのサイズを有するエクソソームよりもさらに大きな１００ｎｍ〜１μｍの平均直径を有する原形質膜をベースとする小胞体を意味する。
【００２５】
本明細書で使われる用語「細胞由来ナノベジクル」は、細胞を微小流体チャネルを通過させる押出工程、多段階濾過工程などの人為的な方法により形成されるナノサイズの細胞膜成分である原形質膜によって取り囲まれたナノサイズの小胞体であって、細胞によって分泌されて自然的に生成されるエクソソームや細胞外小胞とは区別される原形質膜をベースとする小胞体を意味する。
【００２６】
本明細書で使われる用語「免疫原性細胞死（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ）」は、アントラサイクリン（ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅｓ）、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）及びボルテゾミブ（ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）のような細胞増殖抑制剤や放射線療法及び光力学治療法によって引き起こされる一種の細胞死を意味する。前記免疫原性細胞死は、一般的な細胞死とは異なっており、癌細胞の免疫学的細胞死は、樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）の活性化とそれによる特異的なＴ細胞反応の活性化とにより効果的な抗癌免疫反応を誘発することができる。免疫原性細胞死を誘発する物質を「免疫原性細胞死誘導剤（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｉｎｄｕｃｅｒ）」と称する。前記免疫原性細胞死及び免疫原性細胞死誘導剤に対しては、Ｋｒｏｅｍｅｒなど（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３１：５１−７２，２０１３）によく整理されている。前記文献は、全体として本明細書に参照として組み込まれる。
【００２７】
本明細書で使われる用語「アントラサイクリン系抗癌剤（ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎ−ｔｙｐｅ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔ）」は、ストレプトマイセス属細菌であるストレプトマイセス属微生物（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ  ｖａｒ．ｃａｅｓｉｕｓ）由来の癌化学療法に使われる細胞周期非特異的な抗癌剤系列を称する。アントラサイクリン系抗癌剤は、白血病、リンパ腫、乳癌、胃癌、子宮癌、卵巣癌、膀胱癌、及び肺癌を含んだ多様な癌の治療に使われるが、従来に開発されている化学療法抗癌剤のうち、最も効果的な抗癌剤の１つである。初めて発見されたアントラサイクリン系抗癌剤としては、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）があり、引き続き開発されているドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、その後に開発されているエピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、ピクサントロン（ｐｉｘａｎｔｒｏｎｅ）、サバルビシン（ｓａｂａｒｕｂｉｃｉｎ）、バルビシン（ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ）などが存在する。アントラサイクリン系抗癌剤の作用機序としては、ＤＮＡ／ＲＮＡ鎖の塩基上の間に挿入されることにより、ＤＮＡ及びＲＮＡ合成を抑制して、迅速に成長する癌細胞の複製を妨害すること、トポイソメラーゼＩＩ酵素活性を抑制して、スーパーコイル化ＤＮＡの緊張緩和を抑制して、転写と複製とを妨害すること、鉄媒介遊離酸素ラジカルの形成によるＤＮＡ、タンパク質及び細胞膜の損傷誘導及びＤＮＡ損傷反応、エピゲノム及び転写体を脱調節するクロマチンからヒストン放逐誘導などが挙論されている。最近の研究によれば、ドキソルビシンがＣＤ４＋細胞を活性化させることにより、Ｔｈ１免疫反応を増加させると報告されており（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．９（１３−１４）：１５３０−１５３９，２００９）、樹状細胞とドキソルビシンの併用投与時に、骨肉腫の免疫学的細胞死（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ）を誘発することにより、抗癌活性を示すと報告されている（Ｋａｗａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｌ．Ｌｅｔｔ．１１：２１６９−２１７５，２０１６）。
【００２８】
本明細書で使われる用語「タキサン系抗癌剤（ｔａｘａｎｏｉｄ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔまたはｔａｘｎｅ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ）」は、イチイ属（Ｔａｘｕｓ  ｓｐ．）の植物から抽出されたジテルペノイドタキサン誘導体（ｄｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄ  ｔａｘａｎｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）であって、細胞内の微小管の組立てを増進させ、解体を阻害する機序を有した有糸分裂阻害剤である。現在常用化された薬物としては、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）及びドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）などが存在し、そのうち、パクリタキセルは、イチイ（Ｔａｘｕｓ  ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）の周皮から抽出したタキサン系抗癌剤であって、１９９２年難治性卵巣癌治療剤として米国ＦＤＡの承認を受け、ドセタキセルは、Ｔａｘｕｓ  ｂａｃｃａｔａから由来したタキサン系抗癌剤であって、パクリタキセルと効能が類似し、乳癌、非細胞肺癌、リンパ腫、膀胱癌などの治療に使われており、パクリタキセルに比べて、親水性が高い特性を有している。最近、タキサン系抗癌剤も、癌細胞を細胞毒性Ｔリンパ球に対して減作させることにより、これら癌細胞の免疫原性細胞死を促進させる機序を有すると明らかになっている。
【００２９】
本明細書で使われる用語「免疫チェックポイント阻害剤（ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」は、Ｔリンパ球のような特定類型の免疫系細胞及び一部の癌細胞によって生産された特定のタンパク質を遮断する類型の薬物を意味するが、これらタンパク質は、免疫反応を抑制し、Ｔリンパ球が癌細胞の殺傷を防止する。したがって、このようなタンパク質が遮断されれば、免疫系の「制動装置」が解除され、Ｔリンパ球が癌細胞をさらによく殺すことができる。前記「免疫チェックポイント」として現在までよく知られたものは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１及びＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／Ｂ７−２などが存在する。ＰＤ−１阻害剤としては、Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ（商標名：Ｋｅｙｔｒｕｄａ）、Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ（商標名：Ｏｐｄｉｖｏ）などが存在し、ＰＤ−１のリガンドであるＰＤ−Ｌ１阻害剤としては、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ（商標名：Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）、及びＡｖｅｌｕｍａｂ（商標名：Ｂａｖｅｎｃｉｏ）などが存在する。一方、ＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／Ｂ７−２の相互作用を阻害するＣＴＬＡ−４阻害剤としては、Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ（商標名：Ｙｅｒｖｏｙ）などがＦＤＡの承認を受けた。最近、数年間、特に、転移性黒色腫（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ）またはホジキンリンパ腫（ｈｏｄｇｋｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）の患者から印象的な成功を収め、他の類型の癌患者を対象とした臨床試験で多くの可能性を示している。
【００３０】
発明の詳細な説明：
本発明の一態様によれば、１６２番目のアミノ酸であるヒスチジンがアルギニンに置換されたＶＳＶ−Ｇ変異体タンパク質が膜に導入された組換え原形質膜をベースとする小胞体が提供される。
【００３１】
組換え原形質膜をベースとする小胞体は、エクソソーム、細胞外小胞または細胞由来ナノベジクルである。
【００３２】
前記組換え原形質膜をベースとする小胞体は、前記ＶＳＶ−Ｇ変異体タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子コンストラクトに形質転換されて、前記ＶＳＶ−Ｇ変異体タンパク質を過発現する哺乳動物細胞、望ましくは、ヒト細胞から分離及び精製されたものである。
【００３３】
前記組換え原形質膜をベースとする小胞体は、前記ＶＳＶ−Ｇ変異体タンパク質が発現されるように形質転換された細胞から収得されたものである。
【００３４】
本発明の他の一態様によれば、１６２番目のアミノ酸であるヒスチジンがアルギニンに置換されたＶＳＶ−Ｇ変異体タンパク質が膜に導入され、内部に１つまたは２つ以上の免疫原性細胞死誘導剤が取り込まれた組換え原形質膜をベースとする小胞体が提供される。
【００３５】
前記組換え原形質膜をベースとする小胞体への薬物の取り込みは、薬物が溶解された細胞培養培地内で組換え原形質膜をベースとする小胞体を生産するように遺伝子操作された細胞を培養することで達成され、分離された組換え原形質膜をベースとする小胞体を前記免疫原性細胞死誘導剤が溶解された溶媒に入れ、超音波を処理して原形質膜をベースとする小胞体を再構築することで生成することができる（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，１２（３）：６５５−６６４，２０１６）。選択的に、原形質膜をベースとする小胞体に薬物が担持される場合、単に分離された原形質膜をベースとする小胞体を薬物と適切な溶媒または培地内で混合した後、適切な時間の間に撹拌して混合する方法を使用し（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１８（９）：１６０６−１６１４，２０１０）、あるいは核酸のような親水性薬物の場合、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて原形質膜をベースとする小胞体内に取り込ませることができる。
【００３６】
前記免疫原性細胞死誘導剤は、アントラサイクリン系抗癌剤、タキサン系抗癌剤、抗ＥＧＦＲ抗体、ＢＫチャネル作用剤、ボルテゾミブ、強心性配糖体（ｃａｒｄｉａｃ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）、シクロホスファミド系抗癌剤、ＧＡＤＤ３４／ＰＰ１阻害剤、ＬＶ−ｔＳＭＡＣ、麻疹（Ｍｅａｓｌｅｓ）ウイルス、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎｅ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）またはオキサリプラチンである。強心性配糖体は、非免疫原性細胞死誘導剤と組み合わせられて使われ、前記ＧＡＤＤ３４／ＰＰ１阻害剤は、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）と組み合わせられて使われ、前記アントラサイクリン系抗癌剤は、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ピクサントロン、サバルビシン、またはバルビシンであり、前記タキサン系抗癌剤は、パクリタキセルまたはドセタキセルであり、前記抗ＥＧＦＲ抗体は、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）である。
【００３７】
本発明の他の一態様によれば、前記組換え原形質膜をベースとする小胞体を有効成分として含む癌治療用薬学的組成物が提供される。
【００３８】
また、本発明の他の一態様によれば、ウイルス由来の膜融合性膜タンパク質が膜に導入された組換え原形質膜をベースとする小胞体を有効成分として含む癌治療用薬学的組成物が提供される。
【００３９】
前記組成物において、前記ウイルス由来の膜融合性膜タンパク質は、水疱性口内炎ウイルスＶＳＶ−Ｇタンパク質、テナガザル白血病ウイルスＧＡＬＶ．ｆｕｓ、インフルエンザウイルスヘマグルチニン、呼吸器細胞融合ウイルスＦタンパク質、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１２０またはｇｐ４１、フラビウイルスＥタンパク質、アルファウイルスＥ１タンパク質、バキュロウイルスｇｐ６４、Ｃ型肝炎ウイルスｇｐ３１またはｇｐ７０、麻疹ウイルスＨタンパク質またはＦタンパク質、またはエボラウイルスｇｐ１またはｇｐ２であり、前記ＶＳＶ−Ｇタンパク質は、野生型ＶＳＶ−Ｇタンパク質または１６２番目のアミノ酸であるヒスチジンがアルギニンに置換されたｐＨ敏感性変異体ＶＳＶ−Ｇタンパク質である。
【００４０】
前記組成物は、１つまたは２つ以上の抗癌化合物をさらに含みうる。
【００４１】
前記抗癌化合物は、免疫原性細胞死誘導剤または免疫チェックポイント阻害剤であり、前記免疫原性細胞死誘導剤は、アントラサイクリン系抗癌剤、タキサン系抗癌剤、抗ＥＧＦＲ抗体、ＢＫチャネル作用剤、ボルテゾミブ、強心性配糖体、シクロホスファミド系抗癌剤、ＧＡＤＤ３４／ＰＰ１阻害剤、ＬＶ−ｔＳＭＡＣ、麻疹ウイルス、ブレオマイシン、ミトキサントロンまたはオキサリプラチンである。前記強心性配糖体は、非免疫原性細胞死誘導剤と組み合わせられて使われ、前記ＧＡＤＤ３４／ＰＰ１阻害剤は、マイトマイシンと組み合わせられて使われ、前記アントラサイクリン系抗癌剤は、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ピクサントロン、サバルビシン、またはバルビシンであり、前記タキサン系抗癌剤は、パクリタキセルまたはドセタキセルであり、前記抗ＥＧＦＲ抗体は、セツキシマブである。一方、前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用阻害剤またはＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／Ｂ７−２相互作用阻害剤であり、前記ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用阻害剤は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１を標的とする抗体または前記抗体の機能性断片または一本鎖をベースとする抗体類似体であり、前記ＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／Ｂ７−２相互作用阻害剤は、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−１またはＢ７−２を標的とする抗体または前記抗体の機能性断片または一本鎖をベースとする抗体類似体であり、前記ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１を標的とする抗体は、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）またはアベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）であり、前記ＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／Ｂ７−２相互作用阻害剤は、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）である。一方、前記抗体の機能性断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦａｂ’であり、前記一本鎖をベースとする抗体類似体は、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、モノボディ（ｍｏｎｏｂｏｄｙ）、可変性リンパ球受容体（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＶＬＲ）、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）またはラクダ科抗体重鎖断片（ＶＨＨ）である。
【００４２】
一方、前記組成物において、前記抗癌化合物は、前記原形質膜をベースとする小胞体の内部に封入されたものであり、単純混合されて剤形化されても、別途に包装されてから使用直前に混合されるか、同時に、または時差を置いて投与されてもよい。但し、前記免疫チェックポイント阻害剤が抗体、抗体の機能性断片または一本鎖をベースとする抗体類似体である場合、エクソソームの内部に封入されるが、単に本発明の細胞由来の組換え原形質膜をベースとする小胞体と併用投与されるか、前記組換え原形質膜をベースとする小胞体の膜表面に提示されることで機能を発揮することができる。前記抗体、抗体の機能性断片または一本鎖をベースとする抗体類似体が組換え原形質膜をベースとする小胞体の膜表面に提示される場合、本発明の一実施形態による免疫チェックポイント阻害剤が膜表面に提示された組換え原形質膜をベースとする小胞体は、本発明で使われたウイルス由来の膜融合性膜タンパク質と同じ方法で遺伝子組換え技術を用いて宿主細胞にそれをコードする遺伝子を形質導入して、宿主細胞の膜表面に提示されるように発現させた後、これら宿主細胞から分泌または出芽するか、または細胞を人為的に加工して製造されたナノサイズの小胞体を収得することで製造可能である。この際、前記抗体、抗体の機能性断片または一本鎖をベースとする抗体類似体は、細胞膜表面に提示のために別途の膜通過ドメインまたはアンカーリングドメインを有するように遺伝子組換えされたものである。選択的に、前記膜通過ドメインまたは膜アンカーリングドメインを有するように遺伝子組換えを行う代わりに、最初から分泌型ではない膜結合形態の抗体であるＩｇＭまたはＩｇＤを使用することも可能である。
【００４３】
前記組成物の場合、前記組換え原形質膜をベースとする小胞体と前記免疫原性細胞死誘導剤は、あらかじめ混合された組成物の形態で提供され、別途に包装されて使用直前に混合されて投与されたり、一定の時間間隔を置いて個別的に投与されたりもする。
【００４４】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体を含みうる。薬学的に許容可能な担体を含む前記組成物は、経口または非経口のさまざまな剤型であり得るが、非経口のための剤型であることが望ましい。製剤化する場合には、通常の充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調剤される。経口投与のための固型製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固型製剤は、１つ以上の化合物に少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使われる。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、よく使われる単純希釈剤である水、流動パラフィン以外に、さまざまな賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれうる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、座剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使われる。座剤の基剤としては、ウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使われる。
【００４５】
前記薬学的組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、溶液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤及び座剤からなる群から選択されるいずか１つの剤型を有しうる。
【００４６】
本発明の薬学的組成物は、経口または非経口投与されうるが、非経口投与される場合、静脈内注射、鼻腔内吸入、筋肉内投与、腹腔内投与、経皮吸収など多様な経路により投与することが可能である。
【００４７】
前記本発明の組成物は、薬学的に有効な量で投与される。
【００４８】
本発明において、用語「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な恩恵／危険の比率で疾患の治療に十分な量を意味し、有効容量レベルは、個体の種類及び重症度、年齢、性別、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、同時使われる薬物を含んだ要素及びその他の医学分野によく知られた要素によって決定されうる。本発明の薬学的組成物は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１ｇ／ｋｇの容量で投与され、さらに望ましくは、１〜５００ｍｇ／ｋｇの投与量で投与される。一方、前記投与量は、患者の年齢、性別及び状態によって適切に調節される。
【００４９】
本発明の薬学的組成物は、個別治療剤として投与するか、他の抗癌剤と併用して投与され、従来の抗癌剤と順次または同時に投与される。そして、単一または多重投与される。前記要素をいずれも考慮して副作用なしに最小限の量で最大効果が得られる量を投与することが重要であり、当業者によって容易に決定されうる。
【００５０】
また、本発明の他の一態様によれば、１６２番目のアミノ酸であるヒスチジンがアルギニンに置換されたＶＳＶ−Ｇ変異体タンパク質が膜に導入された組換え原形質膜をベースとする小胞体またはウイルス由来の膜融合性膜タンパク質が膜に導入された組換え原形質膜をベースとする小胞体の癌治療剤の製造への用途が提供される。
【００５１】
本発明の他の一態様によれば、前記組換え原形質膜をベースとする小胞体または前記のうちいずれか１つ以上の薬学的組成物を癌にかかった個体に投与する段階を含む前記個体の癌治療方法が提供される。
【００５２】
前記癌治療方法において、前記個体は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物である。
【００５３】
本発明者らは、エクソソーム表面に膜融合性膜タンパク質であるＶＳＶ−Ｇタンパク質の低ｐＨ融合誘導変異体（Ｈ１６２Ｒ）を導入して癌細胞を処理する場合、一般的な生理学的条件（ｐＨ７．４）では膜融合が誘発されないが、癌組織の微小環境と類似した条件（ｐＨ６．８）で膜融合が誘発され、このような膜融合によって癌細胞の死滅が可能であり、ＶＳＶ−Ｇ  Ｈ１６２Ｒ変異体タンパク質自体が病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ、ｐａｔｈｏｇｅｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｔｅｒｎ）なので、食細胞の貪食作用及び樹状細胞の交差提示能力（Ｃｒｏｓｓ−ｐｒｉｍｅ  ａｂｉｌｉｔｙ）を亢進させるという仮定下で（図１参照）、ＶＧＶ−Ｇ  Ｈ１６２Ｒ変異体タンパク質を表面に提示する組換えエクソソームを製造した（図２Ａ〜図５Ｂ参照）。実際、前記のように製造された組換えエクソソームは、試験管内条件の実験でｐＨ６．８で選択的に癌細胞の膜融合を誘導するが（図６Ａ〜図７Ｂ参照）、それ自体では癌細胞に対する癌細胞死を誘導しないことを究明した（図７Ｃ参照）。それだけではなく、本発明の一実施形態による組換えエクソソーム（ｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏ）は、大食細胞及び樹状細胞による多様な癌細胞（４Ｔ１−Ｌｕｃ、ＥＬ４−Ｏｖａ及びＣＴ２６．ＣＬ２５）に対する食細胞作用を促進させ（図８Ａ〜図８Ｃ参照）、これは、ＶＳＶＧがＴＬＲ４作用剤として作動することで表われる現象であることを確認した（図９参照）。実際に腫瘍モデル動物に投与した結果、体重減少のような副作用なしに実際癌細胞の成長を有意に抑制することを確認することができ（図１０Ａ〜図１１Ｃ参照）、実験動物から摘出された腫瘍組織の細胞表面でＶＳＶ−Ｇタンパク質が有意に発現されることをフローサイトメトリーにより確認することができた（図１２参照）。前記のような結果は、本発明の組換えエクソソームが多様な機構により抗癌活性を示す多機能性抗癌剤であることを示唆するものである。
【００５４】
また、本発明者らは、本発明の組換え原形質膜をベースとする小胞体の抗癌機序を究明するために、多様な分析を行った結果、本発明の一実施形態による組換えエクソソームは、樹状細胞の癌特異的な抗原表出を増加させ（図１３Ａ）、樹状細胞の成熟を促進させるだけではなく（図１３Ｂ〜図１３Ｃ参照）、腫瘍組織内へのＣＤ８  Ｔ細胞の浸潤を増加させることを確認することができた（図１３Ｄ及び図１３Ｅ参照）。それだけではなく、本発明の一実施形態による組換えエクソソームは、癌組織内の樹状細胞の交差減作能力が有意に向上し（図１４Ａ参照）、このような癌特異的免疫能力は、癌特異的抗原によって誘導されることにより、免疫記憶能力も有していることを確認することができた（図１４Ｂ参照）。
【００５５】
さらに、本発明者らは、本発明の一実施形態による組換えエクソソームがＴ細胞免疫に依存的であるかを確認するために、Ｔ細胞免疫能力が欠けているヌードマウスを用いて動物実験を行った結果、抗癌効果が消えることを確認し（図１５Ａ）、薬物投与量を２倍に増やす場合、抗癌効果が示されることを確認した（図１５Ｂ）。しかし、Ｔ細胞免疫に重要な役割を行うＣＤ１０３及びＣＤ８樹状細胞が欠けているＢＡＴＦ３ノックアウトマウスを利用した動物実験では、本発明の組換えエクソソーム投与群でも何らの抗癌活性が示されず、本発明の一実施形態による組換えエクソソームが樹状細胞を通じて抗癌活性が示されることを確認することができた（図１５Ｄ）。本発明の一実施形態による組換えエクソソームの抗癌作用でＣＤ８  Ｔ細胞の役割を究明するために、抗ＣＤ８抗体を用いてＣＤ８を中和させた野生型マウスを利用した動物実験の結果、抗ＣＤ８抗体を投与してＣＤ８  Ｔ細胞を除去する場合、本発明の一実施形態による組換えエクソソームの抗癌活性が除去されることを確認することができた（図１５Ｃ）。このような結果は、本発明の一実施形態による組換えエクソソームが腫瘍微小環境での個体の樹状細胞の成熟を誘導することにより、癌細胞に対する先天性免疫反応を強化するものだけでなく、ＣＤ８  Ｔ細胞の腫瘍組織内への浸潤を促進させることにより、癌抗原に対する後天的免疫反応までも強化させることにより、抗癌活性を表わすものであることを示すものである。
【００５６】
それだけではなく、本発明者らは、ｐＨ敏感性ＶＳＶ−Ｇタンパク質ではない野生型ＶＳＶ−Ｇタンパク質を膜に含んでいる組換えエクソソームも、その効果は多少落ちるが、Ｔ細胞特異的免疫反応を誘導することにより、抗癌活性を表わすことを実験的に確認した。たとえ癌微小環境で癌細胞と組換えエクソソームとの融合を通じて癌細胞表面にウイルス由来の膜融合性膜タンパク質を提示しないとしても、ＶＳＶ−Ｇタンパク質自体がＴＬＲ４作用剤として作用することができて、野生型ＶＳＶ−Ｇタンパク質を膜に含んでいる組換えエクソソームが誘発するＴ細胞特異的免疫反応が食細胞のＴＬＲ４受容体と結合を通じて食細胞を活性化させて誘発される効果であることを究明した。したがって、ＶＳＶ−Ｇタンパク質以外の他のウイルス由来の膜融合性膜タンパク質も、本発明で使われたｗｔＶＳＶＧエクソソームまたはｍＶＳＶＧエクソソームと類似した効果を示すことができると予想することができる。実際、テナガザル白血病ウイルス由来のＧＡＬＶ．ｆｕｓタンパク質のようなウイルス由来の膜融合性膜タンパク質が腫瘍殺傷性（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ）単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）による抗癌効果を増進させるという報告がある（Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．７（６）：７４８−７５４，２００３）。
【００５７】
前記のような結果は、他の抗癌剤の使用なしに達成されたものであって、ドキソルビシンのような他の免疫原性細胞死誘導剤と併用投与する場合、強力な相乗作用を示すと予想され、したがって、本発明の一実施形態による組換えエクソソームは、従来の抗癌剤の副作用を最小化しながら強力な抗癌作用を示す新たな抗癌治療剤の開発に非常に有用に使われると期待される。
【００５８】
また、本発明の一実施形態では、たとえ組換えエクソソームを用いて抗癌効果を確認したとしても、組換えエクソソームと構造が類似した細胞外小胞及び細胞由来ナノベジクルのような細胞から由来した原形質膜をベースとする小胞体も、ウイルス由来の膜融合性膜タンパク質を膜に含むように宿主細胞を形質転換させた後、形質転換された宿主細胞から通常の方法、すなわち、遺伝子組換えによって製造される場合、本発明の一実施形態による組換えエクソソームと同じ機能を発揮すると予想される。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例及び実験例により本発明をさらに詳しく説明する。しかし、本発明は、以下で開示される実施例及び実験例に限定されるものではなく、互いに異なる多様な形態として具現可能なものであって、以下の実施例は、本発明の開示を完全にし、当業者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものである。
【００６０】
実施例１：ＶＳＶ−Ｇ  Ｈ１６２Ｒコンストラクトの製造
本発明者らは、ＶＳＶ−Ｇ  Ｈ１６２Ｒ変異体タンパク質を含む組換えエクソソームを製造するために、まず、ＶＳＶ−Ｇの１６２番目（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＣＡＣ４７９４４に開示されたタンパク質基準１７８番目）のアミノ酸残基であるヒスチジンがアルギニンに置換されたＨ１６２Ｒ変異体タンパク質をコードする遺伝子コンストラクトを製造した。具体的に、このために、野生型ＶＳＶ−Ｇタンパク質（配列番号１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２）が含まれたプラスミドＤＮＡ（ｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ  Ｅｎｖｅｌｏｐｅ  Ｖｅｃｔｏｒ、ＲＶ−１１０、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ、以下、‘ＶＳＶ−Ｇコンストラクト’と略称する）を鋳型として配列番号３に記載されるフォワードプライマー
【化１】
2020535160.tif 000003
及び配列番号４に記載されるリバースプライマー
【化２】
2020535160.tif 000004
を用いて位置指定突然変異を行った（太字のコードは、変異アミノ酸であるアルギニンに対応する）。
【００６１】
実施例２：ＶＳＶ−Ｇ  Ｈ１６２Ｒ含む組換えエクソソームの製造
本発明者らは、前記実施例１から製造されたＶＳＶ−Ｇ  Ｈ１６２Ｒタンパク質（配列番号５）をコードする遺伝子（配列番号６）が挿入されたｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ  Ｈ１６２Ｒプラスミドベクター（以下、‘ＶＳＶ−Ｇ  Ｈ１６２Ｒコンストラクト’と略称する、図２Ａ及び図２Ｂ）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質移入させた後、４８時間培養した。次に、細胞培養液を回収して、３００ｇで１０分間、２，０００ｇで１０分、１０，０００ｇで３０分の順次遠心分離を行った後、０．２μｍフィルターを用いて濾過した後、再び１５０，０００ｇで３時間限外濾過を行って、ペレットを回収した（図３）。
【００６２】
次に、エクソソーム内にＶＳＶ−Ｇ  Ｈ１６２Ｒ変異体タンパク質が含まれているかを確認するために、前記回収されたエクソソームの一部を破砕した後、抗ＶＳＶ−Ｇ抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ５０５４９）、及び抗Ａｌｉｘ抗体（エクソソームマーカー、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、ｓｃ９９０１０）を用いてウェスタンブロット分析を行った（図４）。その結果、図４に示されたように、形質転換されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びそれから収得した組換えエクソソームいずれでもＶＳＶ−Ｇ  Ｈ１６２Ｒ変異体タンパク質が検出された。図４は、また、エクソソームマーカーであるＡｌｉｘ、ＣＤ６３及びＴＳＧ  １０１に対してウェスタンブロット分析を行った結果を示す。これは、本発明の一実施形態によるＶＳＶ−Ｇ  Ｈ１６２Ｒ変異体タンパク質を発現するように形質転換された細胞から由来したエクソソームに、前記ＶＳＶ−Ｇ  Ｈ１６２Ｒ変異体タンパク質が正常に含まれていることを意味するものである。
【００６３】
引き続き、本発明者らは、前記回収された組換えエクソソームを透過電子顕微鏡で撮影する一方（図５Ａ）、前記組換えエクソソームの粒度を動的光散乱（ｄｙｎａｍｉｃ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＤＬＳ）分析装置（Ｍａｌｖｅｒｎ  ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ｎａｎｏ  ＺＳ，ＵＫ）を用いて分析した（図５Ｂ）。その結果、図５Ｂに示されたように、本発明の一実施形態によって製造された組換えエクソソーム（ｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏ）と対照群エクソソーム（Ｃｏｎ−Ｅｘｏ）いずれもそのサイズが約８０ｎｍの非常に狭いスペクトルを有していると確認された。
【００６４】
比較例：ｗｔＶＳＶＧエクソソームの製造
本発明者らは、比較例として１６２番のアミノ酸が変異されていない野生型ＶＳＶ−Ｇタンパク質が発現されるように遺伝子コンストラクトを製造した後、実施例２の方法を用いて野生型ＶＳＶ−Ｇタンパク質が膜に存在する組換えエクソソーム（ｗｔＶＳＶＧ−Ｅｘｏ）を製造した。
【００６５】
実施例３：ドキソルビシン封入組換えエクソソームの製造
前記実施例２から製造された組換えエクソソームに免疫原性細胞死誘導剤であるドキソルビシン（ＤＯＸ）をロードするために、精製されたエクソソーム（〜１０１１エクソソーム）を、先に１ｍＬ  ＰＢＳ中のＤＯＸと混合する。引き続き、ＤＯＸ−組換えエクソソーム混合物は、次のような設定で超音波処理する：０．２５インチチップがあるＭｏｄｅｌ  ５０５  Ｓｏｎｉｃ  Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒを用いて２０％振幅、３０秒オン／オフ及びサイクル間２分の冷却器を有する３分１回転を合計６回転行い、超音波処理後、Ｅｘｏ−ＤＯＸ溶液を３７℃で６０分間培養して、エクソソーム膜を回収する。過量の遊離薬物は、ＮＡＰ−１０  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用してサイズ排除クロマトグラフィーで除去する。
【００６６】
実験例１：ＶＳＶ−Ｇ  Ｈ１６２Ｒの試験管内条件での癌細胞への融合の有無の分析
本発明者らは、前記実施例２から製造された組換えエクソソームが実際試験管内条件で癌細胞と融合するか否かを確認しようとした。
【００６７】
このために、具体的に、本発明者らは、４Ｔ１−Ｌｕｃマウス乳癌細胞株、ＥＬ４−Ｏｖａリンパ腫細胞株、ＣＴ２６．ＣＬ２５大腸癌細胞株のそれぞれ５×１０５個を１ｍｌ融合緩衝液（１．８ｍＭ  ＮＡＨ２ＰＯ４、８．４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＭＥＳ、２．５ｍＭ  ＮａＣｌ、塩酸でｐＨを７．４、６．８または５．５に調整する）に入れ、５０μｇ  ｍＶＳＶＧ−ＥｘｏまたはｗｔＶＳＶＧ−Ｅｘｏ（ｐＣＭＶ−野生型ＶＳＶＧプラスミドベクターを用いて作ったエクソソーム）と共に３７℃で１０分間融合を行った後、培養培地で洗浄し、１時間３７℃で培養培地で安定化させた。この際、融合緩衝液のｐＨは、ｐＨ７．４またはｐＨ６．８またはｐＨ５．５にグループを区分して進行した。次に、フローサイトメーターを用いて抗ＶＳＶＧ抗体染色により癌細胞表面にｍＶＳＶＧ−ＥｘｏまたはｗｔＶＳＶＧ−Ｅｘｏが融合される程度を評価した。実験の結果、あらゆる癌細胞に対してｗｔＶＳＶＧ−Ｅｘｏの場合、ｐＨ５．５のみで癌細胞膜表面に融合、すなわち、癌細胞膜編集が可能であるということを確認し、一方、ｍＶＳＶＧの場合、ｐＨ５．５だけではなく、腫瘍微小環境のｐＨである６．８でも癌細胞膜表面に融合されることを確認した（図６Ａ）。また、同じ条件で４Ｔ１−Ｌｕｃ細胞を１日前に４ウェルチャンバに３×１０４個で播種し、前記のような条件でｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏを処理した。この際、融合緩衝液のｐＨは、７．４または６．８にグループを区分して進行した。次に、抗ＶＳＶＧ抗体（赤色）と細胞膜染色が可能な抗Ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体（緑色）とを共に染色し、共焦点蛍光顕微鏡を用いて撮影した。その結果、ｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏの場合、ｐＨ７．４では癌細胞膜表面に融合することができなかったが、ｐＨ６．８では融合が可能であることを確認した（図６Ｂ）。
【００６８】
一方、ＶＳＶＧが細胞膜に融合するために結合する細胞膜の受容体としては、ＬＤＬＲ（ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）が最もよく知られている。これにより、本発明者らは、本発明の一実施形態による組換えエクソソームが融合する癌細胞を含む多様な細胞に対して抗ＬＤＬＲ抗体を用いてＬＤＬＲ発現レベルをウェスタンブロッ分析で調査した。その結果、図６Ｃで確認されるように、正常細胞である骨髄由来大食細胞、骨髄由来樹状細胞、そして、脾臓細胞では、ＬＤＬＲが発現されないが、癌細胞である４Ｔ１−Ｌｕｃ、ＥＬ４−Ｏｖａ、そして、ＣＴ２６．ＣＬ２５でＬＤＬＲが発現されることを確認することができ、これは、前記製作されたｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏが癌細胞のみ標的して融合されることを示唆するものである（図６Ｃ）。
【００６９】
実験例２：組換えエクソソームの癌細胞同士の融合を促進するか否か
引き続き、本発明者らは、ｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏが癌細胞表面に融合された後、癌細胞同士の融合を促進するか否かを確認しようとした。このために、具体的に、乳癌細胞株である４Ｔ１−Ｌｕｃ、リンパ腫細胞株であるＥＬ４−Ｏｖａ、大腸癌細胞株であるＣＴ２６．ＣＬ２５のそれぞれ１×１０５個をディープレッド（Ｄｅｅｐ  ｒｅｄ）１μＭまたはＧｒｅｅｎ  ＣＭＦＤＡ  １μＭで染色し、前記実験例１に記載された方法通りにｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏを処理して、ｐＨ７．４またはｐＨ６．８の条件で融合を行った。次に、３５パイ培養皿に播種し、２４時間経過後、癌細胞融合の程度（Ｇｒｅｅｎ  ＣＭＦＤＡ  Ｓｉｇｎａｌ、Ｄｅｅｐ  ｒｅｄ  ｓｉｇｎａｌ  ｄｏｕｂｌｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ）をフローサイトメトリーにより調査した。その結果、図７Ａ及び図７Ｂで確認されるように、４Ｔ１−Ｌｕｃ、ＣＴ２６．ＣＬ２５の場合、ｐＨ７．４よりもｐＨ６．８でｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏによって細胞間融合が有意に促進されることを確認し、ＥＬ４−Ｏｖａの場合にも、たとえ有意していないとしても、融合が増加する傾向を示した。
【００７０】
引き続き、本発明者らは、ｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏ自体が癌細胞死を誘導するか否かを調査した。このために、具体的に、乳癌細胞株である４Ｔ１−Ｌｕｃ、リンパ腫細胞株であるＥＬ４−Ｏｖａ、大腸癌細胞株であるＣＴ２６．ＣＬ２５を前記実験例１に記載された方法のように、ｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏ、対照群エクソソーム（Ｃｏｎ−Ｅｘｏ）または緩衝液（エクソソームなしに融合緩衝液のみ処理）をｐＨ７．４またはｐＨ６．８融合緩衝液を使用して処理することで融合を行った。次に、グループ別に５×１０３個の細胞を正常培地と共に９６ウェルプレートに播種し、２４時間後に、ＣＣＫ分析により細胞生存度（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を測定した。その結果、図７Ｃで確認されるように、全ての実験群で細胞生存度上の差はなく、これは、ｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏが直接的には癌細胞死を誘導しないことを示唆するものである。
【００７１】
実験例３：癌細胞に対する食細胞作用分析
本発明者らは、本発明の一実施形態による融合性エクソソームが大食細胞及び樹状細胞による癌細胞の食細胞作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）を促進させるかを確認するために、食細胞作用分析を行った。
【００７２】
具体的に、本発明者らは、乳癌細胞株である４Ｔ１−Ｌｕｃ、リンパ腫細胞株であるＥＬ４−Ｏｖａ、大腸癌細胞株であるＣＴ２６．ＣＬ２５  ５×１０５個を前記実験例１に記載された方法通りにｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏ、対照群エクソソーム（Ｃｏｎ−Ｅｘｏ）または緩衝液（エクソソームなしに融合緩衝液のみ処理）をｐＨ７．４またはｐＨ６．８の融合緩衝液を使用して処理することで融合を行った。癌細胞膜編集の後、ｐＨ  ｒｏｄｏ  ＳＥ  １２０ｎｇ／ｍｌで癌細胞を染色した。ｇｒｅｅｎ  ＣＭＦＤＡ  １μＭで染色した骨髄由来大食細胞（ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）及び骨髄由来樹状細胞（ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ）とｐＨ  ｒｏｄｏ  ＳＥで染色した癌細胞を１：２の比率で２時間共培養した。次に、蛍光顕微鏡を用いて大食細胞及び樹状細胞が癌細胞をどれほど貪食したかを確認した。実験の結果、図８Ａ〜図８Ｃで確認されるように、他のグループとは異なって、ｐＨ６．８で癌細胞膜を編集したｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏ処理群のみ食細胞（骨髄由来大食細胞及び骨髄由来樹状細胞）による癌細胞貪食作用が増加することを確認した。また、ｐＨ６．８でｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏを用いて癌細胞膜編集した後、抗ＶＳＶＧ抗体を用いて事前遮断（ｐｒｅｂｌｏｃｋｉｎｇ）する場合（グラフ上、ｐｒｅと表記される）、亢進された貪食作用が消えることにより本発明の一実施形態による組換えエクソソームの貪食作用亢進効果は、ｍＶＳＶＧに依存的であることを究明した。
【００７３】
これは、本発明の融合性エクソソームが癌細胞の融合だけではなく、癌細胞に対する大食細胞及び樹状細胞による食細胞作用を促進させることにより、抗癌作用を行う多重機能に基づいた抗癌活性を表わすことを示唆するものである。
【００７４】
実験例４：組換えエクソソームの樹状細胞の成熟促進機構の究明
ＶＳＶ−Ｇタンパク質は、ＴＬＲ４作用剤として知られている。これにより、本発明者らは、本発明の一実施形態による組換えエクソソームが、ＴＬＲ４経路を通じて樹状細胞の成熟を増進させるか否かを調査した。このために、具体的に、６ウェル培養皿に骨髄由来樹状細胞１×１０６個を播種し、ｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏ  ５００ｎｇまたはＣｏｎ−Ｅｘｏ  ５００ｎｇを２４時間処理した。次に、細胞を分離して遠心分離し、樹状細胞の成熟を反映する抗ＣＤ４０抗体及び抗ＣＤ８６抗体を用いて染色した後、フローサイトメトーターにより樹状細胞の成熟を評価した。実験の結果、図９で確認されるように、ｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏによって樹状細胞でのＣＤ４０及びＣＤ８６発現量が増加することを確認し、これは、ｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏが樹状細胞の成熟を促進することができることを意味する。
【００７５】
実験例５：生体内抗癌効果の分析
本発明者らは、前記実験例１〜実験例４の結果から本発明の一実施形態による組換えエクソソームが生体内条件で癌細胞の成長を抑制することができるか否かを調査した。
【００７６】
具体的に、本発明者らは、前記実施例２から収得された組換えエクソソーム（ｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏ）、または対照群エクソソーム（Ｃｏｎ−Ｅｘｏ）１００μｇをマウス４Ｔ１−Ｌｕｃ乳癌細胞１×１０６個を背中側の皮下に接種して（０日目）、癌の発生を誘導した７週齢のＢａｌｂ／ｃ野生型マウス（雌、ｎ＝２１）に癌細胞接種後、５日及び６日目に腫瘍内注入した。この際、対照群としては、ＰＢＳのみ投与した。次に、３日間隔で癌細胞接種１６日まで癌組織のサイズ及び実験動物の体重を確認した（図１０Ａ及び図１０Ｃ）。そして、癌細胞接種１６日経過後、実験動物をいずれも屠殺した後、癌組織を摘出し、重量を測定した（図１０Ｂ）。
【００７７】
また、本発明者らは、Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスの左側の背中にＥＬ４−Ｏｖａ癌細胞１×１０６個を皮下接種して（０日目）、癌の発生を誘導した後、癌細胞接種６日目及び７日目に比較群であるｗｔＶＳＶＧ−Ｅｘｏ  １００μｇ、ｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏ  １００μｇ、Ｃｏｎ−Ｅｘｏ  １００μｇまたはＰＢＳを腫瘍内に注射を用いて投与した。３日間隔で癌のサイズ及び実験動物の体重を測定し（図１１Ａ及び図１１Ｃ）、癌細胞注入後、１８日目にマウスを屠殺して癌組織を摘出後、癌組織の重量を測定した（図１１Ｂ）。
【００７８】
前記実験の結果、図１０Ａ〜図１１Ｃで確認されるように、対照群と比較して、比較群であるｗｔＶＳＶＧ−Ｅｘｏ投与群及びｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏ投与群で有意な抗癌効果を示し、特に、ｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏ投与群で他のグループと比較して最も優れた抗癌効果が観察された。
【００７９】
実験例６：抗癌活性と導入されたＶＳＶ−Ｇの相関関係
本発明者らは、前記実験例５で示された本発明の一実施形態による組換えエクソソームの生体内抗癌効果が、エクソソームに導入されたｍＶＳＶ−Ｇタンパク質による作用であるかを確認するために、腫瘍細胞表面のＶＳＶＧタンパク質の発現レベルを調査した。このために、具体的に、Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスの左側の背中にＥＬ４−Ｏｖａ癌細胞１×１０６個を皮下注入して癌を誘発させ、癌細胞注入後、腫瘍サイズが１００ｍｍ３に到達した時、ｗｔＶＳＶＧ−Ｅｘｏ  １００μｇ、ｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏ  １００μｇ、Ｃｏｎ−Ｅｘｏ  １００μｇまたはＰＢＳを腫瘍内に注射を用いて投与した。投与２時間後、癌組織を摘出し、単一細胞化し、抗ＶＳＶＧ抗体を利用した染色を伴ったフローサイトメトリーを行った（図１２）。実験の結果、図１２で示すように、ｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏグループのみで癌細胞膜表面でＶＳＶＧが発現されることを確認した。
【００８０】
前記のような結果は、本発明の一実施形態による組換えエクソソームの生体内抗癌活性がエクソソーム膜に存在するＶＳＶＧタンパク質が腫瘍微小環境で癌細胞と組換えエクソソームの融合によって癌細胞膜に移転されることによって引き起こされることを立証するものである。
【００８１】
実験例７：組換えエクソソームの抗癌作用機序の研究
７−１：樹状細胞に及ぼす影響調査
本発明者らは、本発明の一実施形態による組換えエクソソームが樹状細胞の機能を活性化させることにより、抗癌活性を示すか否かを調査した。このために、具体的に、Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスの左側の背中にＥＬ４−Ｏｖａ癌細胞１×１０６個を皮下注入して癌を誘発させ、癌細胞注入後、６日目（癌細胞注入した日を０日目とする）、７日目にｗｔＶＳＶＧ−Ｅｘｏ  １００μｇ、ｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏ  １００μｇ、Ｃｏｎ−Ｅｘｏ  １００μｇ、またはＰＢＳを腫瘍内投与した。癌細胞注入後、１８日目にマウスを屠殺して癌組織及び腫瘍排液リンパ節を摘出した。次に、樹状細胞の癌抗原表出の程度を分析するために、単一細胞化した腫瘍排液リンパ節を樹状細胞のマーカーである抗ＣＤ１１ｃ抗体と癌特異的な抗原である卵アルブミン（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）がＭＨＣ−１にロードされたものを測定することができる抗Ｈ−２ｋｂ  Ｏｖａ抗体で染色した後、フローサイトメーターで分析した（図１３Ａ）。その結果、図１３Ａで確認されるように、ｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏ投与群で最も優れた樹状細胞の癌特異的な抗原表出の程度を示した。また、樹状細胞の成熟程度を分析するために、単一細胞化した腫瘍排液リンパ節を樹状細胞のマーカーである抗ＣＤ１１ｃ抗体と樹状細胞の成熟の程度を評価することができる抗ＣＤ４０抗体及び抗ＣＤ８６抗体でそれぞれ染色した後、フローサイトメーターで分析した（図１３Ｂ及び図１３Ｃ）。実験の結果、ｗｔＶＳＶＧ−ＥｘｏとｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏグループいずれも樹状細胞の成熟を促進することができることを確認した。したがって、本発明の一実施形態による組換えエクソソームの樹状細胞機能促進効果は、癌細胞への組換えエクソソームの融合と関係のないＶＳＶＧ自体の機能によるものであることが分かった。
【００８２】
７−２：ＣＤ８  Ｔ細胞の癌組織内への浸潤に及ぼす影響調査
本発明者らは、本発明の一実施形態による組換えエクソソームがＣＤ８  Ｔ細胞の癌組織内への浸潤に及ぼす影響を調査した。このために、具体的に、前記実験例７−１の実験動物から摘出された癌組織をＯＣＴ  ｃｏｍｐｏｕｎｄに包埋して冷凍させた後、凍結薄片を製造して、抗ＣＤ８抗体を用いて染色した後、蛍光顕微鏡により癌組織内ＣＤ８  Ｔ細胞の浸潤程度を比較分析した（図１３Ｄ及び図１３Ｅ）。その結果、ｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏ投与群で最も優れたＣＤ８  Ｔ細胞の浸潤程度を示した。特に、ｗｔＶＳＶＧ−Ｅｘｏ投与群の場合、対照群や対照エクソソーム投与群と差が存在せず、本発明の一実施形態による組換えエクソソームのＣＤ８  Ｔ細胞の浸潤促進活性は、ＶＳＶＧ自体の機能だけではなく、腫瘍微小環境での癌細胞との融合による効果であることが分かった。
【００８３】
７−３：交差減作能力の分析
本発明者らは、本発明の一実施形態による組換えエクソソームがＣＤ８  Ｔ細胞に対する交差能力があるかを調査した。このために、具体的に、Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスの左側の背中にＥＬ４−Ｏｖａ癌細胞１×１０６個を皮下注入して癌を誘発し、癌細胞注入後、６日目（癌細胞注入した日を０日目とする）、７日目にｗｔＶＳＶＧ−Ｅｘｏ  １００μｇ、ｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏ  １００μｇ、Ｃｏｎ−Ｅｘｏ  １００μｇ、ＰＢＳを腫瘍内に注射を用いて投与した。癌細胞注入後、１８日目にマウスを屠殺して癌組織と脾臓組織とを摘出した。大食細胞と樹状細胞との交差減作能力（ｃｒｏｓｓ−ｐｒｉｍｅ  ａｂｉｌｉｔｙ）を評価するために、単一細胞化した癌組織でＦ４／８０またはＣＤ１１ｃ磁性粒子を用いて樹状細胞（ＣＤ１１ｃ−陽性細胞）と大食細胞（Ｆ４／８０−陽性細胞）とを分離した。次に、ＭＨＣ１にロードされた卵アルブミンを認識することができるＯＴ−１  ＣＤ８  Ｔ細胞を有しているＯＴ−１形質転換マウスの脾臓からＣＤ８  Ｔ細胞カラムを用いてＯＴ−１  ＣＤ８  Ｔ細胞を分離し、癌組織から分離した樹状細胞または大食細胞及び前記ＯＴ−１  ＣＤ８  Ｔ細胞をそれぞれ１：５の比率で３日間培養培地で共培養した。３日後に培地を回収して、グループ別に抗ＩＦＮ−γ抗体を利用したＥＬＩＳＡ分析を行って、ＩＮＦ−γの発現レベルを分析した（図１４Ａ）。その結果、他のグループに比べて、ｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏを処理したラットの癌組織で摘出した樹状細胞の交差減作能力が有意に向上していることを確認した。
【００８４】
７−４：免疫記憶能力調査
本発明者らは、本発明の一実施形態による組換えエクソソームが癌治療が終わった後、同じ癌が再発する場合、癌抗原を記憶して癌特異的免疫反応を触発させるか否かを調査した。このために、前記実験例７−３の実験動物から摘出された脾臓組織を単一細胞化した後、５×１０６個を１２ウェル培養皿に１ｍｌ培養培地と共に播種し、ＰＢＳまたは癌特異的な抗原である卵アルブミン１０μｇ／ｍｌで２４時間処理した。次に、培地を回収して、グループ別に抗ＩＦＮ−γ抗体を用いてＥＬＩＳＡ分析を行うことにより、培地内のＩＦＮ−γの発現レベルを分析した（図１４Ｂ）。その結果、図１４Ｂで確認されるように、ｗｔＶＳＶＧ−Ｅｘｏ投与群とｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏ投与群とで有意な癌抗原特異的免疫反応が増加し、特に、ｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏ投与群で最も優れた癌抗原特異的免疫反応が観察された。
【００８５】
７−５：組換えエクソソームの抗癌活性と関連した免疫細胞の究明
本発明者らは、本発明の一実施形態による組換えエクソソームがどのような免疫細胞に依存的であるかを調査しようとした。まず、Ｔ細胞免疫が欠けているヌードマウスでも、食細胞の貪食作用の亢進による抗癌効果が示されるかを確認するために、ＥＬ４−Ｏｖａ癌細胞１×１０６個をヌードマウスの左側の背中に皮下注入して癌を誘発させ、癌細胞注入後、６日目（癌細胞注入した日を０日目とする）、７日目にｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏ  １００μｇ、Ｃｏｎ−Ｅｘｏ  １００μｇまたはＰＢＳを腫瘍内に注射を用いて投与した。３日間隔で癌のサイズを測定し、癌細胞注入後、１８日目にマウスを屠殺して癌組織を摘出して重量を測定した（図１５Ａ）。その結果、図１５Ａで確認されるように、Ｔ細胞が存在したＣ５７ＢＬ／６マウスで示されたｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏの抗癌効果がヌードマウスでは消えることを確認し、それを通じて本発明の一実施形態による組換えエクソソームの抗癌効果は、Ｔ細胞免疫に依存的であることが分かる。Ｔ細胞免疫が欠けているヌードマウスでも、食細胞の貪食作用の亢進による抗癌効果が示されるかを確認するために、ＥＬ４−Ｏｖａ癌細胞１×１０６個をヌードマウスの左側の背中に皮下注入して癌を誘発させ、癌細胞注入後、５日目（癌細胞注入した日を０日目とする）、６日目、７日目、８日目にｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏ  １００μｇ、Ｃｏｎ−Ｅｘｏ  １００μｇまたはＰＢＳを腫瘍内に注射を用いて投与した（他の実験に比べて、２倍多い量である）。３日間隔で癌のサイズを測定し、癌細胞注入後、１７日目にマウスを屠殺して癌組織を摘出して重量を測定した（図１５Ｂ）。その結果、図１５Ｂで確認されるように、既存の薬物投与量を２倍に上げ、さらに癌が小さな時点で実験を進行した時、ｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏの抗癌効果がヌードマウスでも示されることを確認した。これは、本発明の組換えエクソソームがＣＤ８  Ｔ細胞の浸潤能の増加以外にも、食細胞の貪食作用を促進することにより、先天性免疫反応を誘導するためであると推定される。
【００８６】
引き続き、本発明者らは、Ｔ細胞免疫のうち、どのような種類のＴ細胞にｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏの効果が依存的であるかを確認するために、Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスの左側の背中にＥＬ４−Ｏｖａ癌細胞１×１０６個を皮下注入して癌を誘発させ、癌細胞注入後、６日目（癌細胞注入した日を０日目とする）、７日目にｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏ  １００μｇ、Ｃｏｎ−Ｅｘｏ  １００μｇまたはＰＢＳを腫瘍内に注射を用いて投与した。次に、ＣＤ８  Ｔ細胞を除去するために、癌細胞注入１日前から３日間隔で抗ＣＤ８中和抗体を１５０μｇずつ腹腔投与した。３日間隔で癌のサイズを測定し、癌細胞注入後、１８日目にマウスを屠殺して癌組織を摘出して重量を測定した（図１５Ｃ）。その結果、図１５Ｃで確認されるように、Ｔ細胞免疫が保存されたＣ５７ＢＬ／６マウスで示されたｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏの抗癌効果がＣＤ８  Ｔ細胞のないマウスでは消えることを確認した。これは、ｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏ抗癌効果は、ＣＤ８  Ｔ細胞免疫に依存的であることを示唆するものである。
【００８７】
最後に、本発明者らは、Ｔ細胞免疫を形成する時、最も重要な役割を行うＣＤ１０３及びＣＤ８樹状細胞が欠けているＢＡＴＦ３ノックアウトマウスの左側の背中にＥＬ４−Ｏｖａ癌細胞を１×１０６個を皮下注入して癌を誘発させ、癌細胞注入後、６日目（癌細胞注入した日を０日目とする）、７日目にｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏ  １００μｇ、Ｃｏｎ−Ｅｘｏ  １００μｇまたはＰＢＳを腫瘍内に注射を用いて投与した。３日間隔で癌のサイズを測定し、癌細胞注入後、１８日目にマウスを屠殺して癌組織を摘出して重量を測定した（図１５Ｄ）。その結果、図１５Ｄで確認されるように、ＣＤ１０３及びＣＤ８樹状細胞が存在したＣ５７ＢＬ／６マウスで示されたｍＶＳＶＧ−Ｅｘｏの抗癌効果がＢＡＴＦ３ノックアウトマウスでは消えることを確認し、それを通じて本発明の一実施形態による組換えエクソソームの抗癌効果は、ＣＤ１０３及びＣＤ８樹状細胞、そして、Ｔ細胞免疫に依存的であることが分かる。
【００８８】
前記結果は、本発明の一実施形態によるＶＳＶ−Ｇ  Ｈ１６２Ｒ変異体タンパク質を含む組換えエクソソームが癌組織の微小環境のｐＨ条件で特異的な抗癌免疫効果を促進させることを示唆するものである。このような、ＶＳＶ−Ｇ  Ｈ１６２Ｒ変異体タンパク質を含む組換えエクソソームの抗癌効果は、他の抗癌剤の助けなしでも達成されたものであって、他の抗癌剤、特に、免疫原性細胞死誘導剤を内部に封入するか、併用処理時に、顕著な相乗効果が期待される。特に、膜構造である本発明の実施例による組換えエクソソームの内部に、前記抗癌剤を取り込ませる場合、組換えエクソソームが癌細胞に特異的な融合により内部に取り込まれた抗癌剤を癌細胞の内部に伝達することができるために、抗癌剤が一般細胞に作用して発生する副作用を最小化することができるという長所を有している。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
したがって、本発明の一実施形態による組換えエクソソームを含んだ組換え原形質膜をベースとする小胞体は、それ自体でも抗癌活性を有しているだけではなく、他の抗癌剤との併用によりさらに強力な抗癌活性が期待されるので、副作用を最小化しながらも、強力な効果を示す新たな抗癌剤の開発に非常に有用に活用されうる。
【配列表フリーテキスト】
【００９０】
配列番号１は、野生型ＶＳＶ−Ｇタンパク質のアミノ酸配列である。
【００９１】
配列番号２は、前記野生型ＶＳＶ−Ｇタンパク質をコードするポリヌクレオチドの核酸配列である。
【００９２】
配列番号３は、野生型ＶＳＶ−Ｇタンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローニングするために使われたフォワードプライマーの核酸配列である。
【００９３】
配列番号４は、野生型ＶＳＶ−Ｇタンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローニングするために使われたリバースプライマーの核酸配列である。
【００９４】
配列番号５は、本発明の一実施形態によるＨ１６２Ｒ突然変異ＶＳＶ−Ｇタンパク質のアミノ酸配列である。
【００９５】
配列番号６は、Ｈ１６２Ｒ突然変異ＶＳＶ−Ｇタンパク質をコードするポリヌクレオチドの核酸配列である。
【００９６】
配列番号７は、野生型ＶＳＶ−Ｇタンパク質の１６２番目のアミノ酸であるヒスチジン周辺のアミノ酸配列である。
【００９７】
配列番号８は、Ｈ１６２Ｒ突然変異ＶＳＶ−Ｇタンパク質の１６２番目のアミノ酸であるアルギニン周辺のアミノ酸配列である。
【００９８】
配列番号９は、前記野生型ＶＳＶ−Ｇタンパク質の１６２番目のアミノ酸であるヒスチジン周辺のペプチドをコードするポリヌクレオチドの核酸配列である。
【００９９】
配列番号１０は、前記Ｈ１６２Ｒ突然変異ＶＳＶ−Ｇタンパク質の１６２番目のアミノ酸であるアルギニン周辺のペプチドをコードするポリヌクレオチドの核酸配列である。
【０１００】
本発明は、実施例及び実験例を参考にして説明されたが、これは例示的なものに過ぎず、当業者ならば、これより多様な変形及び均等な他実施例及び実験例が可能であるという点を理解できるであろう。したがって、本発明の真の技術的保護範囲は、特許請求の範囲の技術的思想によって決定されるべきである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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