(57)【要約】  Ｘ線結晶解析により、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のＧタンパク質の重要な機能領域の立体構造的特性が明らかにされた。これらのエピトープの模倣体は、免疫原として、抗体および他のモノクローナル結合剤の発見のためのツールとして、ならびにこのウイルスタンパク質の宿主受容体の活性を調節する薬剤としての有用性を有している。【選択図】図３
2020536934.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｇタンパク質の残基１６１〜１９７（配列番号１）、または位置１６９〜１９８（配列番号３）、または位置１５７〜１９７（配列番号４）、または位置１４８〜１９７（配列番号５）、または位置１６１〜１９５（配列番号６）のアミノ酸配列を有するペプチドの変異体またはペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｅｍｉｍｅｔｉｃ）であって、それぞれ、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５もしくは配列番号６のペプチドと比較して、フラクタルカインに応答するケモカイン受容体の活性化に関して減少した活性を有し、
ｍＡｂ  ３Ｄ３、および／もしくは２Ｄ１０および／もしくは３Ｇ１２と結合し、かつ／または
ＲＳＶ  Ｇタンパク質に対して免疫反応性の抗体を誘発する、変異体またはペプチド模倣体。
【請求項２】
抗体への結合時に示される立体構造を保持するように化学的に安定化されている、請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
前記ＲＳＶ  Ｇタンパク質のアミノ酸１６２、１６４、１６６、１７７、１８７、１９２および／または１９３に少なくとも１つの置換を含む、請求項１に記載の変異体。
【請求項４】
ｍＡｂ  ３Ｄ３、および／または２Ｄ１０および／または３Ｇ１２と免疫反応性である、請求項１に記載の変異体またはペプチド模倣体。
【請求項５】
前記ウイルスのＡ株とＢ株との間で保存されているＲＳＶ  Ｇタンパク質のエピトープと免疫反応性のサブｎＭ親和性抗体を誘発する、請求項１に記載の変異体またはペプチド模倣体。
【請求項６】
請求項１に記載の変異体またはペプチド模倣体を活性物質として含む、医薬または動物用組成物またはワクチン。
【請求項７】
対象におけるＲＳＶ感染に対して予防的または治療的効果を発揮する方法であって、そのような効果を必要とする対象に有効量の、請求項５に記載の医薬または動物用組成物またはワクチンを投与することを含む、方法。
【請求項８】
配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６のペプチドの変異体またはペプチド模倣体であって、それぞれ配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６のペプチドと比較して、フラクタルカインに応答するケモカイン受容体を刺激または阻害する、変異体または模倣体。
【請求項９】
それぞれ、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６のペプチドと比較して減少した免疫原性を有する、請求項８に記載の変異体またはペプチド模倣体。
【請求項１０】
前記刺激または阻害が走化性アッセイで決定される、請求項８に記載の変異体またはペプチド模倣体。
【請求項１１】
請求項８に記載の変異体またはペプチド模倣体を活性物質として含む、医薬または動物用組成物。
【請求項１２】
対象において予防的または治療的効果を発揮する方法であって、そのような効果を必要とする対象に、有効量の、請求項１１に記載の医薬または動物用組成物またはワクチンを投与することを含む、方法。
【請求項１３】
ＲＳＶ  Ｇタンパク質の保存領域に対する株非依存性の高親和性および中和活性の特徴を有する結合部分であって、候補結合部分と、図２Ａ、２Ｂまたは２Ｃに示された形状を有する立体構造が保持された形態のペプチドまたはそのペプチド模倣体とを接触させること、及び、前記候補結合部分と前記形状のペプチドまたはペプチド模倣体との間の複合体の存在または不在を検出すること、を含む方法によって同定され、ここで、前記候補結合部分の前記ペプチドまたはペプチド模倣体に対する結合親和性が少なくとも１００ｐＭ程度の強さを示す前記複合体が存在するときは、前記結合部分が前記特性を有していると同定され、ここで、前記候補結合部分はアプタマーまたは代替足場（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）のコンビナトリアルライブラリーのメンバーであるか、または抗体もしくはそのフラグメントである、結合部分。
【請求項１４】
請求項１３に記載の結合部分を有効成分として含む医薬または動物用組成物。
【請求項１５】
対象におけるＲＳＶ感染に関して予防的または治療的処置を提供する方法であって、そのような処置を必要とする対象に有効量の、請求項１４に記載の医薬または動物用組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１６】
請求項１３に記載の結合部分を同定する方法であって、候補結合部分と、図２Ａ、２Ｂまたは２Ｃに示された前記形状を有する立体構造的に拘束された形態のペプチドまたはそのペプチド模倣体とを接触させること、及び、前記候補結合部分と前記形状のペプチドまたはペプチド模倣体との間の複合体の存在または不在を検出すること、を含み、ここで、前記候補結合部分の前記ペプチドまたはペプチド模倣体に対する結合親和性が少なくとも１００ｐＭ程度の強さを示す前記複合体が存在するときは、前記結合部分が前記特性を有していると同定され、ここで、前記候補結合部分はアプタマーまたは代替足場のコンビナトリアルライブラリーのメンバーであるか、または抗体もしくはそのフラグメントである、方法。
【請求項１７】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｇタンパク質の、残基１６１〜１９７（配列番号１）のアミノ酸配列、または位置１６２〜１７２（配列番号２）、もしくは位置１６９〜１９８（配列番号３）、もしくは位置１５７〜１９７（配列番号４）、もしくは位置１４８〜１９７（配列番号５）、もしくは位置１６１〜１９５（配列番号６）のアミノ酸配列を有するペプチドであって、抗体への結合時に示される立体構造を保持するようにそれぞれ化学的に安定化されているペプチド、あるいは
配列番号１〜６の前記ペプチドのいずれかの変異体またはペプチド模倣体であって、それぞれ、配列番号１〜６のいずれかのペプチドと比較して、増強した免疫原性を有するか、または配列番号１〜６のいずれかのペプチドと比較して減少した免疫原性を有する、変異体またはペプチド模倣体。
【請求項１８】
前記化学的安定化が共有結合により架橋することを含むか、または、前記変異体が前記ペプチドのアッセイで使用するための、若しくは前記ペプチドの精製で使用するための部分と結合されている、請求項１７に記載のペプチド。
【請求項１９】
５つ以下のアミノ酸置換および／もしくは欠失および／もしくは付加を含む変異体であり、かつ／またはフラクタルカインに応答するケモカイン受容体を活性化する薬理活性が低下している、請求項１７に記載の変異体。
【請求項２０】
前記変異体の立体構造が化学的に安定化されている、請求項１９に記載の変異体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１０月１３日に出願された米国特許出願第６２／５７２，２７１号、２０１７年１１月１７日に出願された米国特許出願第６２／５８８，０２２号、および２０１８年２月２２日に出願された米国特許出願第６２／６３３，９９９号の利益を主張する。上記の特許出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
配列表の参照による援用
本出願は、電子形式の配列表とともに出願されている。配列表は、２０１８年１０月１２日に作成され、サイズが１７，５００バイトで、３８８５１２０１３７００ＳｅｑＬｉｓｔというタイトルのファイルとして提供される。配列表の電子形式の情報は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００２】
一般に、本発明の分野は感染症の治療である。より具体的には、この分野は呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染の予防および治療である。高分解能構造解析によって定義された広域中和モノクローナル抗体のエピトープは、最適化された免疫原の設計および治療法の発見のためのスクリーニング手段を可能にする。さらに、この分野は、呼吸器合胞体ウイルスの模倣による欠陥宿主免疫機能の治療を含む。
【背景技術】
【０００３】
ＲＳＶは１１のタンパク質をコードする１０の遺伝子を持つマイナス鎖ＲＮＡウイルスであり、一部には感染が強い免疫を与えないため、６０年以上にわたって効果的な管理を難しくした｛Ｂｒｏａｄｂｅｎｔ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｏｔｈｅｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｖｉｒｕｓｅｓ（２０１５）９：１６９−７８｝。これまで、いくつかの実質的な試みにもかかわらず、ワクチンは承認されていない｛Ｊｏｒｑｕｅｒａ，Ｐ．Ａ．ａｎｄ  Ｔｒｉｐｐ，Ｒ．Ａ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｍｅｄ（２０１７）１１（８）：６０９−６１５｝。米国では乳児の５０％超が生後１年間に感染し、ほぼ５％が入院を必要とする｛Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  Ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｉｔｉｓ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ（２０１４）１３４：ｅ６２０−３８｝。乳児期の重度のＲＳＶ疾患は、小児喘息様症状の確証された危険因子である｛Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｅ．Ｗ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１２）２４（６）：７１３−９｝。ＲＳＶ感染に利用可能なのは支持療法のみである。ヒト化マウスｍＡｂ（パリビズマブ、Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）としてＭｅｄｌｍｍｕｎｅより市販されている）を用いた予防は、早産児（妊娠期間２９週未満）が焦点となっており、罹患率を減少させるが死亡率は減少しない高価な治療法である｛Ｍｅｉｓｓｎｅｒ，Ｈ．Ｃ．ａｎｄ  Ｋｉｍｂｅｒｌｉｎ，Ｄ．Ｗ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ（２０１３）１３２：９１５−８｝。パリビズマブは、感染後の治療には安全および有効であることが示されていない｛Ｍａｌｌｅｙ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ（１９９８）１７８：１５５５−６１｝。幼児におけるＲＳＶ感染の世界的な発生率は、米国以外では十分な報告がないが、死亡率が高く、米国の２倍であると考えられている｛Ｎａｉｒ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ（２０１０）３７５（９７２５）：１５４５−１５５５｝。さらに、高齢者で治療された急性呼吸器疾患の最大１２％がＲＳＶ感染に起因し、これらの症例の６〜８％が致命的である。入院は３〜６日続き、かなりの割合が集中治療室に入る｛Ｃｏｌｏｓｉａ，Ａ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ（２０１７）１２（８）：ｅ０１８２３２１｝。ＲＳＶ感染症は免疫不全患者にもよく見られ、死亡率が２５％を超える｛Ｓｈａｈ，Ｄ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ（２０１４）１２３（２１）：３２６３−３２６８｝。
【０００４】
ＲＳＶには２つの主要な表面糖タンパク質、ＦとＧがある。ＲＳＶに対する唯一の市販ｍＡｂ（Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）、上に記載）は、未熟児における予防的使用のみが承認されており、Ｆタンパク質を対象としている。このｍＡｂは、株間でＦタンパク質の配列が保存されているため、幅広く有用である。対照的に、Ｇタンパク質は、配列の中央の領域は高度に保存されているものの、全体的にはかなり可変的である。ＲＳＶの２つのサブタイプであるＡとＢは、約１〜２年の間隔で交互に流行し、世界中で同等の発生率を示す。
【０００５】
ホルマリン不活化ＲＳＶを用いたワクチン接種によるＲＳＶの予防の最初の試みは逆効果であることが判明し、疾患の促進および肺好酸球増多症につながった｛Ｋｉｍ，Ｈ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ（１９６９）８９：４２２−４３４｝。米国特許第８，１７３，１３１号は、ＲＳＶ感染の予防および治療のための、ＲＳＶ  Ｇタンパク質のＣＸ３Ｃケモカインモチーフを含む組成物を開示しており、共に干渉剤として関連する受容体を拘束することでＲＳＶ感染を調節し、または免疫を誘導する。このモチーフは、ＲＳＶがうまく感染するために必要である｛Ｊｅｏｎｇ，Ｋ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ（２０１５）１０（６）：ｅ０１３０５１７｝。米国特許第８，８４６，０５６号は、ワクチン成分としてＲＳＶ  Ｇタンパク質からの免疫原性ペプチドを開示しており、具体的には残基１６４〜１７６または１５５〜２０６を含む。米国特許第９，３２１，８３０号は、ＲＳＶ感染の治療に有用なｍＡｂを開示しており、残基１６７〜１７６を含む領域におけるＲＳＶのＧタンパク質の保存された線形配列に結合する。これらの抗体は天然のヒト免疫レパートリーに由来するため、ヒトの対象に投与した場合、免疫原性は最小であると予想される。細胞質ドメインと膜貫通ドメイン領域の一部を排除するコドン４８での選択的翻訳開始部位の使用により、ＲＳＶ  Ｇタンパク質の約１５％が分泌される｛Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓ，Ｄ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ（１９８８）６２：２２２８−３３｝。この開始部位を削除すると、病原性が大幅に低下する｛Ｓｔｏｂａｒｔ，Ｃ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ（２０１６）７：１３９１６｝、｛Ａｒｎｏｌｄ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００４）３３０：３８４−３９７｝。可溶性因子を中和するためには抗原に対する高い親和性が必要であるため、これは重要であり｛Ｔａｂｒｉｚｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．ＡＡＰＳ  Ｊ（２０１０）１２：３３−４３｝、それゆえ、米国特許第９，３２１，８３０号に開示されている低ｐＭの親和性を有するｍＡｂが有利である。
【０００６】
Ｃｏｌｌａｒｉｎｉ，Ｅ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００９）１８３：６３３８−４５は、ＲＳＶ  Ｇタンパク質の中央保存領域（ＣＣＲ）に結合する高親和性の広域中和ｍＡｂ、ならびに３Ｄ３（１．１ｐＭ）、２Ｂ１１（１０ｐＭ）、３Ｇ１２（５８０ｐＭ）、５Ｄ８（４．４ｎＭ）を含むさまざまな親和性を持つ抗体を記載している。これらのｍＡｂによって定義されるエピトープは特に興味深く、それはヒト抗体が有効性の観点から（健康なドナーからクローン化されている）および安全性の観点から（非特異的な反応性により毒性を生じる可能性が低い）の両方で特に好ましいためである。ｍＡｂ  ３Ｄ３は、インビトロおよびげっ歯類モデルの両方で広域中和活性を示した。短い線状ペプチドのレベルで定義された３Ｄ３のエピトープは、ほぼすべての出回っている株において高度に保存されている。付加的なｍＡｂである２Ｄ１０は、線状ペプチドエピトープとしては定義できないものであり、３Ｄ３よりは効力が低いものの、インビトロのウイルス中和アッセイで活性を有することから興味深い（米国特許第８，２７３，３５４号）。これらの抗体ならびに３Ｇ１２は、上に記載の有用性を決定する際に使われる。
【０００７】
これらの文献および本明細書で引用されたすべての文献の内容は、参照により本明細書に援用される。
【０００８】
ＲＳＶ  ＡおよびＢサブタイプの両方のＧタンパク質の中央領域（残基１３１〜２３０）を含む組換え融合タンパク質は、マウスにおいて効果的な免疫原であることが示された｛Ｌｅｅ，Ｊ．Ｙ．ａｎｄ  Ｃｈａｎｇ，Ｊ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ（２０１７）１２：ｅ０１７５３８４｝。Ｇタンパク質ペプチド残基１４８〜１９８は、ＤＭＳＯおよびＰＢＳ中で乳化され、免疫原としてマウスでも試験がなされ、感染を中和し、ＣＸ３ＣＲ１へのＧタンパク質の結合をブロックし、抗体の誘導に効果的であることが分かった｛Ｃｈｏｉ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１２）２５（３）：１９３−２０３｝。同様に、Ｇタンパク質残基１６９〜１９８を組み込んだナノ粒子によるワクチン接種は、ＲＳＶに暴露したマウスで防御を誘導した｛Ｊｏｒｑｕｅｒａ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ（２０１３）８：ｅ７４９０５｝。この領域からのペプチドの精密な最適化も試みられ、残基１８２〜１８６のＧタンパク質に１つの余分な残基の挿入により、宿主の免疫応答に対するＧタンパク質の有害な影響が大幅に減少した｛Ｂｏｙｏｇｌｕ−Ｂａｒｎｕｍ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ（２０１７）９１（１０）ｐｉｉ：ｅ０２０５９−１６｝。
【０００９】
これらの結果は有望であるが、ＲＳＶ  Ｇタンパク質ワクチンは承認されていない。他の多くのウイルスとは異なり、このウイルスは一般的に繰り返し感染する。Ｇタンパク質の免疫抑制的な性質がこの効果の原因である可能性がある。さらなる改善に役立つ免疫原の品質を定義する基準には、多様なヒト集団にわたる応答の均一性（力価および親和性）、安定性（効果的な冷蔵によるサプライチェーンがない国での使用に特に重要）、特異性（すべての出回っている株に対して有効）、安全性（特に、ＣＸ３Ｃケモカイン受容体に対する有害な薬理活性の欠如）、および応答期間が含まれる。改良されたワクチン成分の設計は本発明の態様の１つであり、究極的にはＧタンパク質の立体構造エピトープと既知の親和性の抗体との相互作用に基づく。
【００１０】
ＲＳＶ感染および疾患におけるＲＳＶ  Ｇタンパク質の重要な役割にもかかわらず、このタンパク質の構造情報はほとんど報告されていない。１６アミノ酸のＲＳＶＧシステインヌースのＮＭＲの溶液構造のみが決定されている｛Ｓｕｇａｗａｒａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｒｅｓ（２００２）６０：２７１−２８２｝。
【発明の概要】
【００１１】
ｍＡｂｓ  ３Ｄ３、２Ｄ１０、および３Ｇ１２と複合体を形成したＧタンパク質のＣＣＲからのペプチドの構造は、Ｘ線結晶解析によって高解像度で決定され、ＲＳＶＧの重要な機能領域を含むアミノ酸１６１−１９７（配列番号１）がＧ糖タンパク質の頂点に位置し、抗体結合にアクセスできることが確立された。
【００１２】
本発明は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）からのＧタンパク質上のエピトープに関連した組成物に関し、宿主細胞因子と相互作用することが知られているＧタンパク質の保存された中央領域（ＣＣＲ）に由来するペプチドに結合した高親和性広域中和モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の結晶学的研究により明らかにされた。これらの組成物には、ＣＸ３Ｃ受容体（ＣＸ３ＣＲ１）を含む宿主細胞因子と相互作用することが知られている領域をも含むＧタンパク質の中央保存領域（ＣＣＲ）の特異的に一部を模倣するペプチドやその他の結合部分が含まれる。より具体的には、ＲＳＶ  Ｇタンパク質は、Ｎ末端サイトゾル領域、膜貫通領域、および非グリコシル化中央保存領域（ＣＣＲ）で区切られた２つのムチン様ドメインからなる可変外部ドメインとして構成されている。ＣＣＲは、アミノ酸１７６〜１８２のシスチンループとＣＸ３Ｃケモカインモチーフ（アミノ酸１８２〜１８６）をさらに含むアミノ酸１７３〜１８６の間のジスルフィド結合によって形成されるシステインヌースを形成する４つのシステイン残基を含む。この領域のエピトープに由来する特異的なペプチドまたはペプチド模倣体は、免疫原として、またはＲＳＶを中和することができる結合剤を発見するためのツールとして使用することができる。本発明はまた、薬理活性を最小化しながら免疫原性を強調する、またはその逆のエピトープ模倣体を含む。
【００１３】
Ｇタンパク質ワクチンの有害な薬理活性は、ＣＸ３ＣＲ１との相互作用であり、炎症などの望ましくない副作用を引き起こす。したがって、機能的なＣＸ３ＣＲ１結合部位を含むペプチドベースのワクチンは、この望ましくない結果を刺激する可能性がある。以下に示すように、Ｇタンパク質と高親和性抗体が相互作用している３次元構造により、ＣＣＲの保存された残基が同定でき、ＣＸ３ＣＲ１結合部位を不活化するように改変して、ワクチンの免疫原性を損なうことなくこの効果を減少または消失させることができる。本明細書中で使用される場合、「改変されたペプチド」および「変異体」は、互換的に使用される。
【００１４】
したがって、一態様では、本発明は、免疫原性であるがＣＸ３ＣＲ１を活性化する能力を欠く、ＣＣＲの全部または一部を含むＧタンパク質またはペプチドの変異体に関する。これらの変異体は、Ｇタンパク質のＣＣＲ内に含まれ、高親和性抗体の結合に関与しないアミノ酸を同定することで、およびそれらを形状またはサイズまたは電荷が異なる側鎖を持つアミノ酸に置換することで、したがってペプチドまたはタンパク質の免疫原性を妨げることなくＲＳＶＧ変異体が受容体に結合するのを阻害することで、設計することができる。特に、本発明は、ＲＳＶ  Ｇタンパク質の１６２、１６４、１６６、１７７、１８７、および／または１９３位の少なくとも１つのアミノ酸置換を含むペプチド（全長ＲＳＶ  Ｇタンパク質を含む）、および野生型ＲＳＶ  Ｇタンパク質と比較して走化性活性が低下したペプチドに関する。
【００１５】
別の態様では、本発明は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｇタンパク質の残基１６１〜１９７のアミノ酸配列（配列番号１）、または位置１６２〜１７２の（配列番号２）、または位置１６９〜１９８の（配列番号３）、または位置１５７〜１９７の（配列番号４）、または位置１４８〜１９７の（配列番号５）、または位置１６１〜１９５の（配列番号６）アミノ酸配列を有し、抗体への結合時に示される立体構造を保持するようにそれぞれ化学的に安定化されたペプチドに関する。
【００１６】
代替免疫原は、少なくとも２つの共有結合で連結した成分を含む分子であって、前記成分は、配列番号２のアミノ酸配列および／または配列番号３のアミノ酸配列のペプチドであるか、または前記成分のそれぞれは、配列番号２および／または配列番号３の対応する変異体またはペプチド模倣体である。
【００１７】
結合部分である可溶性ＲＳＶＧ抗原またはペプチドを模倣するものなどの本発明のペプチドの実施形態は、組換えにより調製することができる。したがって、抗原を模倣するペプチドが簡単に生成され、免疫原性を低減または強化したり、ＣＸ３ＣＲ１受容体の活性化または阻害を提供したりできるＣＣＲ内のバリアントを同定するための包括的な変異分析を促進する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６のペプチドの変異体またはペプチド模倣体を提供し、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６のそれぞれのペプチドと比較して免疫原性が強化されており、前記変異体の立体構造が化学的に安定化されている実施形態を含んでいる。
【００１９】
一部の用途では、免疫原性の低下が有利であり、したがって本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６のペプチドの変異体またはペプチド模倣体も含み、それは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６のそれぞれのペプチドと比較して免疫原性が低下しており、前記変異体の立体構造が化学的に安定化されている実施形態を含んでいる。
【００２０】
ＣＸ３ＣＲ１受容体を阻害または活性化するが、免疫原性が低い薬剤は、一般的に免疫応答を増強または抑制する（ＲＳＶ感染に関係のないものを含む）。したがって、別の態様では、本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６のペプチドの変異体またはペプチド模倣体に関するものであり、それはフラクタルカインに応答するケモカイン受容体ＣＸ３ＣＲ１を刺激または阻害し、特に、この変異体またはペプチド模倣体は、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６のそれぞれのペプチドと比較して免疫原性が低下している。宿主ケモカイン受容体ＣＸ３ＣＲ１の候補部分の好適なインビトロ機能分析相互作用も開示されている。
【００２１】
また、開示された立体構造エピトープに対するペプチド模倣体および変異体ペプチドバリアントなどの試験化合物の忠実度を評価する方法も開示されている。その方法は、天然タンパク質に対して親和性が異なるｍＡｂに対するペプチド模倣体または変異体の相対的結合強度を測定することを含む。天然タンパク質に対して高い親和性でｍＡｂに優先的に結合する薬剤は、弱い親和性でｍＡｂに優先的に結合する薬剤または最適なｍＡｂに対して弱い親和性を持つ薬剤よりも、そのような抗体を誘導し易い。
【００２２】
したがって、本発明の別の態様は、ワクチンに有用な免疫原を同定する方法であり、その方法は候補分子をｍＡｂ  ３Ｄ３、ｍＡｂ  ２Ｄ１０またはｍＡｂ  ３Ｇ１２またはその抗原結合フラグメント、および低親和性でＲＳＶ  Ｇタンパク質と結合する少なくとも１つの結合部分と接触させることを含み、それによって３Ｄ３、ｍＡｂ  ２Ｄ１０、またはｍＡｂ  ３Ｇ１２と優先的に結合する候補分子が、前記の望ましい特性を有する免疫原として同定される。本発明は、こうして同定された分子も含み、それは小分子またはペプチドのコンビナトリアルライブラリーのアプタマーまたはメンバーであり得る。
【００２３】
さらに別の態様では、立体構造エピトープ模倣体は、組換えペプチドであれペプチド模倣体であれ、既知の広域中和ｍＡｂと同様な活性を有する非免疫グロブリン結合部分の均質な組成物の発見に有用なツールを提供する。したがって、本発明は、ＲＳＶ  Ｇタンパク質の保存領域に対する株非依存性で高親和性な特性および中和活性の特性を有する結合部分を同定する方法を含み、その方法は、候補結合部分を立体構造的に拘束された形態の図２Ａ〜Ｃに示される配列番号１〜６のいずれか１つのアミノ酸配列を有するペプチドまたは前記拘束形態のペプチド模倣体と接触させることと、前記候補結合部分と前記ペプチドまたはペプチド模倣体との間の複合体の存在または不在を検出することとを含み、前記ペプチドまたはペプチド模倣体に対する候補結合部分の結合親和性が少なくとも１００ｐＭ程度の強さを示す前記複合体の存在により前記結合部分が前記特徴を有すると同定される。本発明はまた、このようにして同定された結合部分を含む。
【００２４】
本発明はさらに、対象におけるＲＳＶ感染に関して予防的または治療的処置を提供する方法を含み、その方法は、本発明の免疫原または結合部分を含む医薬または動物用組成物をそのような処置を必要とする対象に投与することを含む。本発明はまた、免疫介在性炎症性疾患、慢性疼痛および末梢神経障害を治療する方法を含み、その方法は、Ｃ３ＸＣ受容体と相互作用する本発明のそのような治療化合物を必要とする対象に投与することを含む。これらもまた、医薬または動物用組成物に含まれ得る。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＲＳＶ  Ｇタンパク質およびその中央保存領域（ＣＣＲ）を示す。パネルＡは、ヘパリン結合ドメインの前にあり、ＲＳＶ  Ｇタンパク質の折り返し構造の先端にあるＣＣＲの突出した位置の図である。ＣＣＲ構造［残基１６１〜１９０］がパネルＢに高解像度で示され、点線が構造内の非共有相互作用を示し、領域のＮおよびＣ末端が示されている。
【図２】ＲＳＶ  Ｇタンパク質のＣＣＲにおけるｍＡｂ  ３Ｄ３、２Ｄ１０、および３Ｇ１２の接触領域を示す。パネルＡは、空間充填モデルとしてのＣＣＲの正面図および背面図を示し、黒色の領域はｍＡｂ接触領域である。パネルＢは、ｍＡｂ  ３Ｄ３および２Ｄ１０の可変ドメインをリボンモデルとして、ＲＳＶＧのＣＣＲを空間充填モデルとして示す。パネルＣは、ｍＡｂ  ３Ｇ１２の可変ドメインをリボンモデルとして、ＲＳＶＧのＣＣＲを空間充填モデルとして示す。パネルＢおよびＣでは、ＣＣＲはシステインヌース残基に整列されている。ｍＡｂ  ３Ｄ３と３Ｇ１２は多くの同じアミノ酸と結合するが、各構造におけるＣＣＲの立体構造が異なるため、３次元エピトープは非常に異なっている。
【図３】ＣＸ３Ｃケモカイン受容体１の天然リガンドであるフラクタルカインの構造を示す。パネルＡは、フラクタルカインが受容体に結合している方向を示す。パネルＢは、フラクタルカインを示し、ＣＸ３Ｃモチーフを黒色とした。パネルＣは、ＲＳＶ  Ｇタンパク質［残基１６１〜１９０］の一部を示し、ＣＸ３Ｃモチーフを黒色とした。
【図４】ＲＳＶ  ＧのＣＣＲ（１６１〜１９７、配列番号１）を示す。図４Ａは、ＣＸ３ＣＲ１の結合と活性化に役割を果たす可能性のある高度に保存されたアミノ酸を示す配列ロゴである（各残基の単一アミノ酸の略語の高さは、保存の程度に比例する）。ＣＸ３Ｃモチーフの位置は下線で示され、その部位は配列において高度に保存されていないことが分かるが、３次元構造の決定において重要な役割を果たす。図４Ｂは、ｍＡｂ  ３Ｄ３と２Ｄ１０によって結合された領域の高倍率図である。ｍＡｂエピトープの外側の保存されたアミノ酸は、変異誘発のために選択される。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
ＲＳＶ  Ｇタンパク質の保存された中央領域（ＣＣＲ）に由来する高親和性広域中和モノクローナル抗体（ｍＡｂ）とペプチドの相互作用について、初めて高解像度の構造データが得られた。これらの結果は、他のウイルスで示されているように、免疫原の合理的なエンジニアリングの基盤を提供する｛Ｓｈａｒｏｎ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１４）１４２（１）：１−２３｝。新規構造は、ヘリックス、ジスルフィド結合、および不連続なアミノ酸の間の極性および疎水性相互作用を含む、ＲＳＶＧのＣＣＲ上の２つの隣接する立体構造エピトープを定義する。これらの結果は、線状ＲＳＶＧエピトープペプチドとミスフォールドしたＲＳＶＧがなぜ抗原として十分に効果的でない可能性があるのかを明らかにし、例えば、組換えタンパク質ワクチン（ＢＢＧ２Ｎａ）を用いてＧタンパク質のＣＣＲを標的とする初期の試みでは、健康な若年成人に中和抗体を誘導する適度な能力しか示さず、組換えＧタンパク質を使用した最近の試みでも、高齢者において有効性を確立することができなかった｛Ｒｅｚａｅｅ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｖｉｒｏｌ（２０１７）２４：７０−７８｝。ＲＳＶＧ構造への配列保存のマッピングは、高度に保存されているＲＳＶ表面上の大きな３次元領域を明確にする。
【００２７】
開示されたペプチドまたは変異体のこれらの立体構造の特徴は、化学的架橋剤または非天然アミノ酸の使用によって安定化することができる｛Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｊ．Ａ．Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ（２０１３）１９（３）：１２７−４０｝。
【００２８】
実施例５に示されるように、ＲＳＶＧ［１６２〜１７２］（配列番号２）と複合体化したＦａｂ  ３Ｄ３は、２．４０Åの分解能で決定された。ＲＳＶＧ［１６２〜１７２］ペプチドは、短いヘリックスを有し、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２、と３と軽鎖ＣＤＲ１と３によって形成された約７００Å２の溝に、Ｐｈｅ１６３、Ｐｈｅ１６５、Ｐｈｅ１６８、Ｐｈｅ１７０およびＰｒｏ１７２を含むいくつかの疎水性残基を突出させる。驚いたことに、拡張重鎖ＣＤＲ３の遠位の６アミノ酸は、線状エピトープペプチドとの分子接触を形成していなかった。ＲＳＶＧの大きなフラグメント（ＲＳＶＧ［１６１〜１９７］）（配列番号１）が大腸菌で産生され、その複合体の構造が２．４０Åの解像度で決定された。３Ｄ３との付加的な相互作用には、重鎖ＣＤＲ３とＲＳＶＧシステインヌース（残基１７３〜１８６）との接触、および重鎖ＣＤＲ１および２とＲＳＶＧ残基１８９〜１９０の間の付加的な相互作用が含まれた。要するに、３Ｄ３はＲＳＶＧと不連続に、抗原部位γ１と命名された約１０６０Å２で構成される立体構造エピトープに結合する。
【００２９】
ｍＡｂ２Ｄ１０はＲＳＶＧにも結合するが、そのエピトープは線形エピトープマッピングでは特徴付けられなかった。２Ｄ１０の組換え単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、合成ＲＳＶＧペプチド（ＲＳＶＧ［１６９−１９８］配列番号３）と安定した複合体を形成し、実施例５に示すように、複合体の結晶構造は１．５６Å解像度で決定された。ｍＡｂ２Ｄ１０は、ねじれた重鎖ＣＤＲ３、重鎖ＣＤＲ２、および軽鎖ＣＤＲ３を用いて、ＲＳＶＧシステインヌースの〜５５０Å２のエピトープに結合する。システインヌースの短いヘリックスを形成するＣＸ３Ｃケモカインモチーフは、２Ｄ１０結合によって埋められる。２Ｄ１０エピトープは主に残基１７７〜１８８で構成され、したがって技術的には連続しているが、システインヌースは、抗原部位γ２と命名されたこのエピトープに強い立体構造特性を誘導する２つのネストされたジスルフィド結合を構成する。
【００３０】
これらの研究に使用される３つのペプチドの３次元立体構造は、ほぼ同じように重なる。ＲＳＶＧ配列の多様なセットを使用して、保存レベルをこのコンセンサスＲＳＶＧ構造にマッピングした。全長ＲＳＶＧ（サブタイプＲＳＶ  ＡとＢの間で５３％の相同性）の全体的に高い可変性にもかかわらず、３７アミノ酸フラグメントＲＳＶＧ［１６１〜１９７］は２４の不変残基を含む（サブタイプＲＳＶ  ＡとＢの間で７０％の相同性）。特に、ＣＸ３Ｃモチーフでは、３つの「Ｘ」アミノ酸の１つであるＩｌｅ１８５のみが高度に保存されており、このモチーフだけではＣＸ３ＣＲ１結合部位を構成しないが、ＣＸ３Ｃモチーフの不変システインは、全領域にわたって広範な原子相互作用を形成する高度に保存されたアミノ酸の３次元表面を安定化する。本発明の多くの態様は、これらの発見に由来する。
定義
本明細書で別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００３１】
「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」は互換的に使用され、鎖の長さに関係なく組換え法によって合成できるようにアミド結合を介して結合された天然アミノ酸の鎖を指す。「ペプチド模倣体」は、ＤおよびＬ異性体を含む非天然または合成アミノ酸、ならびにアミド結合または他の結合、例えばエステル、エーテルなど、によって連結されたアミノ酸類似体を含む。「ペプチド模倣体」は、例えばアプタマーを含むペプチドと明らかな類似性のない有機分子も含む。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「結合部分」は、以下に記載されるような抗体および代替の非免疫グロブリン結合部分を含む。「抗体」には、従来の抗体の免疫反応性フラグメント、およびＦａｂ、Ｆ（ａｂａｂ２、Ｆｖフラグメント、一部またはすべての定常領域を有さず重鎖と軽鎖の可変領域が直接結合された単鎖抗体など、免疫特異性を依然として保持するさまざまな断片化された形態を含む。「抗体」には、１つの抗体源に由来する重鎖と軽鎖のペア、および異なる抗体源に由来する重鎖と軽鎖のペアを含む二重特異性抗体も含まれる。同様に、軽鎖はしばしば特異性を破壊することなく交換可能であるため、抗体の特異性を決定する重鎖可変領域から構成される抗体は、異種軽鎖可変領域と組み合わせることができる。例えば、異なる種に由来する定常領域および可変領域を有するキメラ抗体も含まれる。
【００３３】
ｍＡｂの可変領域の場合、よく知られているように、重要なアミノ酸配列はフレームワーク上に配置されたＣＤＲ配列であり、そのフレームワークは特異性に影響を与えたり、親和性を許容できないレベルに低下させたりすることなく変えられる。これらのＣＤＲ領域の定義は、当該技術分野で既知の方法により達成される。具体的には、関連するＣＤＲ領域を同定するのに最も一般的に使用される方法は、Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ（１９７０）１３２：２１１−２５０、および書籍ではＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，３２３ｐａｇｅｓの方法である。別の同様の一般的に使用されている方法はＣｈｏｔｈｉａの方法であり、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（１９８７）１９６：９０１−９１７およびＣｈｏｔｈｉａ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４２：８７７−８８３において発表されている。追加の改変は、Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ，Ｋ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００８）４５：３８３２−３８３９によって提案されている。本明細書に記載されるｍＡｂは、これらのシステムまたは当技術分野で知られている他の認められたシステムのいずれかによって定義されるＣＤＲ領域を含む。
【００３４】
ｍＡｂの結合の特異性は、記載されているように、主に重鎖のＣＤＲ領域によって定義されるが、軽鎖の特異性によっても補完される（軽鎖はいくらか交換可能である）。したがって、本発明のｍＡｂは、重鎖の３つのＣＤＲ領域、および任意選択的にそれに適合する軽鎖の３つのＣＤＲを含み得る。結合親和性は、ＣＤＲがフレームワーク上に配置される方法によっても決定されるため、ｍＡｂには、３つの関連するＣＤＲを含む重鎖の完全な可変領域と、場合により、当の重鎖を補完する軽鎖に関連した３つのＣＤＲを含む完全な軽鎖可変領域が含まれ得る。これは、単一のエピトープに対して免疫特異的であるｍＡｂ、ならびに２つの別々のエピトープに結合できる二重特異性抗体または結合部分に対して当てはまる。
【００３５】
本発明はまた、ｍＡｂの結合特性を模倣する結合部分も含む。ｍＡｂ模倣体には、アプタマー｛Ｙｕ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｓｃｉ（２０１６）１７（３）：３５８｝およびキャメリド、アンチカリン、アンキリン反復タンパク質のような抗体またはそのフラグメント（代替足場）のタンパク質模倣体が含まれる｛Ａｚｈａｒ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌ（２０１７）１０２：６３０−６４１｝。
【００３６】
二重特異性結合部分は、異なる特異性を有する２つの異なる結合部分を共有結合で架橋することによって形成され得る。現在、２つの別個の抗体（二重特異性抗体）からの抗原特異性ドメインを組み込んだ単一の抗体様分子を作製するための複数の技術が存在する。好適な技術は、ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ（メリーランド州、ロックビル）、Ｍｉｃｒｏｍｅｔ（メリーランド州、ベセスダ）およびＭｅｒｒｉｍａｃ（マサチューセッツ州、ケンブリッジ）によって記載されている。（例えば、Ｏｒｃｕｔｔ，Ｋ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ（２０１０）２３：２２１−２２８、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，ＭＡｂｓ（２０１１）１：３、Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（２００９）６９：４９４１−４９４４を参照）．例えば、１つの単一特異性ｍＡｂに由来する重鎖および任意選択的に軽鎖のＣＤＲ領域は、任意の好適な連結手段を介して、重鎖配列のおよび任意選択的に第２のｍＡｂの軽鎖のＣＤＲ領域を含むペプチドに架橋され得る。架橋がアミノ酸配列を介する場合、二重特異性結合部分を組換えにより生成することができ、二重特異性実体全体をコードする核酸が組換えにより発現される。単一の特異性を有する結合部分の場合と同様に、本発明は、二重特異性抗体またはＣＤＲ領域を実際に含む結合エンティティ／結合部分と同じエピトープの一方または両方に結合する結合部分の可能性も含む。本発明はさらに、完全な重鎖および軽鎖配列または完全な重鎖配列および少なくとも軽鎖のＣＤＲまたは重鎖のＣＤＲおよび軽鎖の完全な配列を含む二重特異性構築物を含む。
【００３７】
特に、本発明は、変異体またはペプチド模倣体に関するものであり、そのペプチドは呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｇタンパク質の残基１６１〜１９７（配列番号１）のアミノ酸配列、または位置１６９〜１９８の（配列番号３）、もしくは位置１５７〜１９７の（配列番号４）、もしくは位置１４８〜１９７の（配列番号５）、もしくは位置１６１〜１９５の（配列番号６）アミノ酸配列であり、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６のそれぞれのペプチドと比較して、フラクタルカインに応答するケモカイン受容体の活性化に関して活性が減少したものであり、ｍＡｂ  ３Ｄ３、および／もしくは２Ｄ１０および／もしくは３Ｇ１２と結合し、ならびに／または前記変異体またはペプチド模倣体がＲＳＶ  Ｇタンパク質に対して免疫反応性の抗体を誘発する。いくつかの実施形態では、誘発された抗体は、ウイルスのＡ株とＢ株の間で保存されているＲＳＶ  Ｇタンパク質のエピトープに対してｎＭ未満の親和性を有する。
【００３８】
いくつかの実施形態では、ペプチド模倣体またはペプチドは、抗体への結合時に示される立体構造を保持するために化学的に安定化され、および／またはＲＳＶ  Ｇタンパク質のアミノ酸１６２、１６４、１６６、１７７、１８７、１９２および／または１９３の少なくとも１つの置換を含む。
【００３９】
別の実施形態では、本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６のペプチドの変異体またはペプチド模倣体を含み、それは配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６のそれぞれのペプチドと比較して、フラクタルカインに対するケモカイン受容体応答性を刺激または阻害する。いくつかの実施形態では、変異体またはペプチド模倣体は、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６のそれぞれのペプチドと比較して、免疫原性が低下している。
組換えの態様
本発明の任意のタンパク質またはペプチドは、既知の技術を使用して組換えにより生成され得る。本発明はまた、それらをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ならびにこれらのヌクレオチド配列を含むベクターまたは発現システム、これらのヌクレオチド配列の発現のための発現システムまたはベクターを含む細胞、ならびにこれらの細胞を培養することおよび産生された結合部分を回収することによりペプチドを生成する方法を含む。原核生物、酵母、哺乳動物細胞、昆虫細胞および植物細胞を含む、組換え法で典型的に使用される任意のタイプの細胞を使用することができる。関連するペプチドをコードする１つ以上の組換え分子で形質転換されたヒト細胞（例えば、筋細胞またはリンパ球）も含まれる。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味する。
ＣＸ３Ｃケモカインモチーフに基づく活性
全体として可変であるが、ＲＳＶＧ（２９８残基）には、グリコシル化されない高度に保存された約４０アミノ酸の中央保存領域（ＣＣＲ）が含まれており、ウイルス感染とウイルス病原性の両方で重要な役割を果たすことが示されている。具体的には、ＲＳＶＧのＣＣＲには、ＣＸ３Ｃケモカインモチーフが含まれ、これがヒトケモカイン受容体ＣＸ３ＣＲ１への結合を促進し、ヒト気道上皮細胞でのＲＳＶ感染を促進するだけでなく、ＣＸ３ＣＲ１＋免疫細胞の輸送に影響するシグナル伝達を調節して気道の鬱血を引き起こす。例えば、ＲＳＶ  Ｇタンパク質のＣＣＤに対するｍＡｂによる治療は、接種５日後のアイソタイプのコントロール処理マウスと比較して、肺白血球の総数の減少と関連していたが、抗Ｆ  ｍＡｂ（Ｓｙｎａｇｉｓ）による治療はＢＡＬ細胞の総数を減少しなかった｛Ｃａｉｄｉ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１８）１５４：１４９−１５７｝。
【００４１】
図３に示すように、ＣＸ３Ｃモチーフとその２つのジスルフィド結合の存在を除けば、ＲＳＶＧとＣＸ３ＣＲ１の唯一の既知のリガンドであるフラクタルカイン／ＣＸ３ＣＬ１との間に構造または配列における類似性はない。本発明の別の態様では、同様の機能にもかかわらず、この構造的相違は、この相互作用を選択的に遮断する治療法を開発する機会を提供するものであり、ＨＩＶ共受容体ＣＣＲ５のアンタゴニストにつながった戦略である｛Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ−Ｂｌｕｍ，Ｓ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（２００８）３０：１２２８−１２５０｝。ＣＸ３ＣＲ１の選択的調節が有益である疾患の例には、関節リウマチ｛Ｓｚｅｋａｎｅｃｚ，Ｚ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｔｈ  Ｊ  Ｍｅｄ（２０１１）６９（９）：３５６−６６｝および変形性関節症｛Ｗｏｊｄａｓｉｅｗｉｃｚ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｅｘｐ（Ｗａｒｓｚ）（２０１４）６２（５）：３９５−４０３｝などの免疫介在性炎症性疾患を含む。現在、アテローム性動脈硬化症も炎症性疾患であると考えられており、動物モデルでは、ＣＸ３ＣＲ１の遮断により疾患の重症度が改善される｛Ａｐｏｓｔｏｌａｋｉｓ，Ｓ．ａｎｄ  Ｓｐａｎｄｉｄｏｓ，Ｄ．Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｉｎ．（２０１３）３４（１０）：１２５１−６｝。ケモカイン一般、特に天然のＣＸ３ＣＲ１リガンド（フラクタルカイン）は、慢性疼痛の根底にあると考えられている末梢神経障害にも関与している｛Ｍｏｎｔａｇｕｅ，Ｋ．ａｎｄ  Ｍａｌｃａｎｇｉｏ，Ｍ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ（２０１７）１４１（４）：５２０−５３１｝。そのモチーフを薬剤として使用するには、反復投与を可能にする低い免疫原性が重要である。したがって、２つの別個の抗体エピトープの脱免疫化は、薬理活性に必要な部位の決定に補完的な有用性を提供する。
【００４２】
あるいは、ＣＸ３ＣＲ１結合モチーフの活性の増強を用いると、この受容体の新規な刺激剤を作ることができる。これは、潰瘍性大腸炎などの疾患の治療に役立つ。マウスでは、ＣＸ３ＣＲ１は、腸間膜リンパ節への共生細菌の疾患関連移行の予防に関与する。ＣＸ３ＣＲ１ノックアウトマウスとフラクタルカイン欠損マウスの両方が、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発性大腸炎のモデルにおいて細菌の移行の増加と疾患重症度の著しい増加を示した｛Ｍｅｄｉｎａ−Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ，Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ（２０１１）１２１（１２）：４７８７−９５｝。さらに、ＣＸ３ＣＲ１は、ベータ細胞機能とインスリン分泌の重要な調節因子であることが示されており｛Ｌｅｅ，Ｙ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ（２０１３）１５３（２）：４１３−４２５｝、したがって、ＲＳＶ  Ｇタンパク質の薬理学的モチーフの模倣は、糖尿病を治療するための治療薬として開発することも可能である。
【００４３】
配列番号１〜６の安定化形態またはその変異体もしくはペプチド模倣体およびそれらの特別に拘束された形態の能力は、例えば、以下の実施例４に示される走化性アッセイを使用して、ＣＸ３Ｃ受容体を活性化または阻害する能力について試験することができる。しかしながら、アッセイに好適な任意の方法を使用することもできる。治療に使用する場合、これらの実体が比較的低い免疫原性を有することが有利であり、これも、例えば実施例３に記載のアッセイを使用して試験することができるが、任意の好適な試験を使用することができる。
免疫原
３つの設計目標は、Ｇタンパク質免疫原の最適化を支配し、それぞれが新しい構造情報によって大幅に促進される。
【００４４】
第１に、Ｇタンパク質の薬理活性は、ＲＳＶ感染の状況では有害であり、したがって、免疫原における活性を最小限にすることが好ましい。上記のように、この活性はＣＸ３Ｃ受容体を中心とし、成功した変異体またはペプチド模倣体は、他のアッセイの中でも、走化性アッセイを使用して評価できる。本発明に記載される結晶学的研究により、ワクチンの第２の望ましい特性である免疫原性特性を保持しながら、その置換がＣ３ＸＣ受容体との相互作用を減少させるのに有用であるアミノ酸の同定が可能になる。具体的には、残基１６２、１６４、１６６、１７７、および１８７が、ＲＳＶ  Ｇタンパク質のＣＣＲ領域および／またはＣ３ＸＣモチーフの一部または隣接のいずれかに存在し、本明細書に記載されている高親和性抗体と特異的に結合する残基の中にはないことが分かった。したがって、これらの残基の１つ以上を、電荷または側鎖のサイズと形状を変える代替物で置き換えると、Ｃ３ＸＣ受容体との相互作用を妨げるであろう。
【００４５】
第二に、高親和性抗体は、ウイルス感染細胞によって産生される有害な可溶性Ｇタンパク質を中和するために必要であり、ゆえに免疫原によって生成される抗体はこれらの特性を持つ必要がある。親和性は、実施例２に記載されるＥＬＩＳＡアッセイを使用して、または当該分野で既知の多くの代替方法の１つを使用して、容易に試験され得る。望ましい親和性と中和特性を持つ抗体を生成する免疫原を試験するために、そのような望ましい特性を示すヒトｍＡｂへの結合が評価される。Ｃｏｌｌａｒｉｎｉら（上記）で開示されているように、低ｐＭから低ｎＭまでの３桁にわたって親和性が異なるｍＡｂ：３Ｄ３（１．１ｐＭ）、２Ｂ１１（１０ｐＭ）、３Ｇ１２（５８０ｐＭ）、５Ｄ８（４．４ｎＭ）は、このようなアッセイに利用できる。３Ｄ３もしくは２Ｂ１１などの高親和性ｍＡｂに十分に結合しない、またはＧタンパク質の自然な立体構造に対して低い親和性でｍＡｂによく結合する候補免疫原は、望ましい高親和性ｍＡｂの生成を誘導できない可能性が高く、その逆も同じである。
【００４６】
第３に、ＲＳＶは、ワクチンの配送のための冷蔵サプライチェーンを欠く国を含み世界中で重要な病原体であるため、室温（またはそれ以上）での輸送と保管を可能にする免疫原の安定化も望ましい。他のワクチンで有効な生ウイルスのホルマリン不活化は、最初のそのようなワクチンが後の自然感染時に疾患の悪化を引き起こしたため、ＲＳＶでは許容されない｛Ｋｉｍ，Ｈ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ（１９６９）８９：４２２−３４｝。
【００４７】
この第３の態様、立体構造の安定性に関して、ＲＳＶＦタンパク質で示されたように、抗体−抗原の高解像度構造データに基づいて選択された変異による構造の安定化の結果、親ウイルスに対してよりも高力価でより均一に広く免疫された対象が得られる｛ＭｃＣｌｅｌｌａｎ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３）３４０（６１３６）：１１１３−１１１７｝。Ｇタンパク質のＣＣＲは、合成または組換えのいずれかで作製することができるため、当技術分野で周知の方法を使用して、このペプチドを体系的に変異させることができる。そのような多数のバリアントの評価を容易にするために、インビトロのアッセイが必要である。ｍＡｂ結合、熱安定性の評価、およびＣＸ３ＣＲ１受容体の活性化のための、好適なアッセイが当技術分野で知られている。
【００４８】
冷蔵が必要であるという欠点に加えて、免疫原として柔軟なペプチドを使用すると、しばしば折りたたまれたタンパク質の立体構造エピトープに弱く結合する抗体（ＫＤがμＭ以上）を誘発する。その理由で、立体構造的に拘束された合成エピトープ模倣体は、免疫原の設計において特に興味深く、ＨＩＶ、Ｃ型肝炎、インフルエンザおよびその他への対処を含む例がある｛Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｊ．Ａ．Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ（２０１３）１９（３）：１２７−４０｝。
【００４９】
非天然モチーフを組み込んだペプチドは、しばしばタンパク質分解に対して非常に耐性があり、これは模倣自体とは無関係な有利な特徴である。小分子（「ハプテン」）の欠点は、それら自体が免疫原性でないことが多く、しかしながら、ウイルスのような粒子に埋め込んで免疫系に提示すると、効果的な免疫原になり得る｛Ｂｕｏｎａｇｕｒｏ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐ．Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２０１１）１０：１５６９−１５８３｝。
【００５０】
特に、ＲＳＶのＦタンパク質はそのような模倣を受ける。この例では、効果的な模倣体を作るには２つの「ステープル」（架橋）が必要であり、インビトロのＨｅｐ−２細胞においてＲＳＶ感染を阻害するｎＭ効力を示した｛Ｇａｉｌｌａｒｄ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ（２０１７）６１（４）ｐｉｉ：ｅ０２２４１−１６｝。
【００５１】
さらに、免疫原の３次元構造を拘束して３Ｄ３との高親和性相互作用を保持することは有利であり、簡便なアッセイはＥＬＩＳＡ結合による。文献で知られている熱安定性のアッセイには、タンパク質がアンフォールドして露出された疎水性部位に結合したときの色素の蛍光増加の観察｛Ｂｉｇｇａｒ，Ｋ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（２０１２）５３：２３１−２３８｝や円二色性による二次構造特性の観察｛Ｋｅｌｌｙ，Ｓ．Ｍ．ａｎｄ  Ｐｒｉｃｅ，Ｎ．Ｃ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ（１９９７）１３３８（２）：１６１−１８５｝が含まれる。
【００５２】
上記のように、当技術分野では、親和性の異なる抗体を使用した結合活性および中和能力の評価を含む、適した生理活性について候補変異体およびペプチド模倣体を評価する方法が利用可能である。候補変異体およびペプチド模倣体を構築することに関して、本発明により提供される詳細な構造情報は、標的変異誘発により、免疫原性（または候補免疫原を設計するための上記の宿主ＣＸ３ＣＲ１受容体における薬理活性）に必要な主要な残基を同定することを可能にする。機能を分離するためのそのような「分子解剖」は、製品候補を同定するために非常に有利である。「脱免疫化」（免疫原性の低下）は、外来タンパク質の反復投与を可能にする目的で達成された｛Ｍａｚｏｒ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ（２０１６）７（２１）：２９９１６−２６｝。各残基を順番に変異させ、結果を評価し、そのような変異の組み合わることを含む純粋に経験的な方法は、免疫原性に寄与する可能性が最も高い残基および免疫原性を低下させる可能性が最も高い置換を同定するためのコンピュータ解析によって拡張することができる｛Ｈｅ，Ｌ．ａｎｄ  Ｚｈｕ，Ｊ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｖｉｒｏｌ（２０１５）１１：１０３−１２｝。ＣＸ３ＣＲ１モチーフ内に１つの追加のアミノ酸を挿入すると、薬理活性が低下することが既に知られている｛Ｂｏｙｏｇｌｕ−Ｂａｒｎｕｍ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ（２０１７）９１（１０）ｐｉｉ：ｅ０２０５９−１６｝。不活化部位のさらなる決定は、ウイルスの中和につながる免疫原性を保持しながら、この有害な活性の低減を可能にする。
【００５３】
本明細書に記載の結晶構造により、ＲＳＶ  Ｇタンパク質ＣＣＲとのｍＡｂ境界面の表面形状と相補性が明らかになったが、エネルギー的に重要な相互作用は、構造から直接読み取ることができない。タンパク質−タンパク質境界面の他の例では、特定の残基が「ホットスポット」を構成し、結合エネルギーに不釣り合いに大きく貢献する。これらの特権的な部位は、アラニンスキャニング変異誘発（すなわち、一度に１つの残基をアラニンで置換したバリアントの作製）｛Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｊ．Ａ．Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ（２０１３）１９（３）：１２７−４０｝で同定することができるが、高解像度構造に基づくと、特定の部位はアラニンではなく異なるアミノ酸で置換されるメリットある。
【００５４】
図２に示すように、ｍＡｂ  ３Ｄ３、２Ｄ１０、および３Ｇ１２は同じ領域に全く異なった結合をする。したがって、各部位の脱免疫化は独立に行うことができる。同じプロセスを使用して、免疫原性を高めることもできる。各部位の免疫原性を最適化すると、３Ｄ３部位に最適な免疫原、２Ｄ１０部位に最適な免疫原、および３Ｇ１２部位に最適な免疫原を示すものの中の、２つまたは３つのペプチドの融合を含むワクチンが可能になる。そのような免疫原は、単一の免疫原性部位と比較して、ウイルスエスケープに対する耐性の増加を提供しながら、高親和性ｍＡｂを誘発することができる。ＣＣＲへの２つのｍＡｂの結合（ウイルス表面での同じまたは異なるコピーの分子で）によるアビディティブーストは、多様なヒト集団にわたって、より高い中和能に寄与する。このような複数の抗原ワクチンの前例には、融合前および融合後の立体構造的に安定化された抗原を組み込んだＲＳＶＦタンパク質ワクチン｛Ｃｉｍｉｃａ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１６）２３（６）：４５１−９｝およびＲＳＶのＡ株とＢ株の両方からの残基１３１〜２３０を含むＧタンパク質ワクチン｛Ｌｅｅ，Ｊ．Ｙ．ａｎｄ  Ｃｈａｎｇ，Ｊ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ（２０１７）１２：ｅ０１７５３８４｝が含まれる。Ｂ細胞応答に加えて、Ｔ細胞応答を維持することも新規構造データによって促進され、主要なＴ細胞エピトープは、残基１８５〜１９３にマッピングされている｛Ｖａｒｇａ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０００）１６５（１１）：６４８７−９５｝。
【００５５】
本発明の重要な態様は、ＣＸ３ＣＲ１とのＧタンパク質の相互作用を遮断するｍＡｂを誘導するための効果的な免疫原であり、その免疫原自体は受容体への結合を欠く。ＣＸ３ＣＲ１の結合に必要な残基の同定は、主要な免疫原性エピトープの同定に関してバリアントの同じライブラリーを使用して行われるが、実施例４で記載するように、ＣＸ３ＣＲ１活性化の細胞ベースのアッセイで機能を検定する。ｍＡｂエピトープの外側にあるが保存され、ＣＸ３ＣＲ１結合を低減または排除すると予測されているものなどの追加のバリアントも、この点で有用である。ＣＸ３Ｃモチーフへの余分な残基の挿入などの追加のバリアントも候補となり得る。
代替結合部分の開発
立体構造エピトープ模倣体は、それが組換えペプチドであれ、ペプチド模倣体であれ、アプタマーまたは代替足場などの既知の広域中和ｍＡｂと同様の活性を持つ非免疫グロブリン結合部分の均一な組成物の効率的な発見を可能にする。そのような模倣体は、優れた安定性、より低い製造コスト（例えば、哺乳動物細胞ではなく細菌での発現による）、およびより単純な吸入送達のための製剤を提供することができる。（エピトープ模倣体は、追加のｍＡｂの同定にも使用できる）ヒトＲＳＶのエピトープ模倣体のホモロジーモデリングを使用して、ウシＲＳＶ感染症の治療など、獣医学の適応症に役立つｍＡｂを生成するための類似したエピトープ模倣体を開発することができる。ウシとヒトのＲＳＶ  Ｇタンパク質の間のアミノ酸の相同性は３０％しかないが、両方のウイルスのＧタンパク質は、高度にグリコシル化された２つの可変ドメインが隣接する中央の保存されたシステインヌース領域を持っているという点で類似した特徴を共有する｛Ｇｕｚｍａｎ，Ｅ．ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒ，Ｇ．Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１５）６６（１）：４８−５６｝。
【００５６】
そのような抗体模倣体のライブラリーは、拮抗実験により評価され、模倣体を使用して、３Ｄ３、２Ｄ１０、または３Ｇ１２のようなｍＡｂと競合させて、ＲＳＶ  Ｇタンパク質自体または好ましくは安定した形で立体構造特性を提示するエピトープ模倣体に結合させる。エピトープに対してｍＡｂとうまく競合するそれらの候補は、好適な結合剤として選択される。最適な立体構造への忠実度が異なるエピトープ模倣体への結合に関して候補をランク付けすることにより、さらなる最適化が達成される。エピトープ模倣体の安定化に関して上述したように、エピトープ模倣体の忠実度は、ＲＳＶ  Ｇタンパク質の同じ一般的な領域に低い親和性で結合する３Ｄ３またはｍＡｂなどのｍＡｂの相対的親和性を測定することによって決定することができる。結合剤は、エピトープ模倣体に対してより強い親和性を示し、広域中和活性を持つ既知のｍＡｂへの高い親和性結合を示す場合、優れているとみなされる。
用途
本発明はまた、本発明の結合部分、変異体または他のペプチドまたはペプチド模倣体を活性成分として含む医薬および動物用組成物に関する。組成物は、緩衝液などの生理学的に適合する好適な賦形剤および他の単純な賦形剤を含む。組成物は、追加の活性成分、特に免疫原の場合はワクチンアジュバントとしての免疫系刺激剤も含み得る。医薬または動物用組成物はまた、米国特許第９，７１８，８７５号に記載されているｍＡｂの鼻腔内または吸入送達用の製剤を含む、他の製剤賦形剤を含み得る。
【００５７】
本発明の結合部分はまた、診断において使用され得る。
【００５８】
免疫原は、ＲＳＶに対する免疫応答を生じさせる方法で使用され、それらを含む製剤を、妊婦、幼児、高齢者、または免疫不全の対象などのヒトの対象を含む対象に投与することを含む。本発明の結合部分はまた、治療または予防のために使用され得る。ＲＳＶに関連する他の動物種における感染症も、本発明の免疫原または結合部分によって予防的または治療的に処置され得る。
【００５９】
Ｃ３ＸＣ受容体を調節する変異体またはペプチド模倣体は、関節リウマチ、変形性関節症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、末梢神経障害に起因する慢性疼痛、潰瘍性大腸炎および炎症性腸疾患などの他の状態を治療する方法で使用される。
実施例１：タンパク質の生成
Ａ．Ｆａｂ  ３Ｄ３およびＳｃＦｖ  ２Ｄ１０の生成
組換えｍＡｂ  ３Ｄ３および２Ｄ１０は、ＣＨＯ細胞での一過性トランスフェクションおよび固定化プロテインＡによる精製によって生成された。これらのｍＡｂのＣＤＲは、米国特許第８，２７３，３５４号の図５Ａに開示されており、単鎖Ｆｖ配列は、それぞれ配列番号９および１０として組換え体生成に使用されるものに含まれる。
【００６０】
ただし、Ｆａｂ  ３Ｄ３は、組換えによって生成された３Ｄ３から、固定化パパインとインキュベーションすることによって生成され、Ｆｃフラグメントを固定化プロテインＡで除去した。Ｆａｂ  ３Ｄ３は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０と１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００サイズ排除クロマトグラフィーにより精製された。
【００６１】
配列番号１０に含まれる組換えｓｃＦｖ  ２Ｄ１０の場合、２Ｄ１０重鎖可変領域、（ＧＧＧＧＳ）３ＧＧＧリンカー、および２Ｄ１０軽鎖可変領域をコードするキイロショウジョウバエ用にコドン最適化された合成遺伝子が、ｐＭＴ−ｐｕｒｏにインフレームでクローニングされ、Ｎ末端のＢｉＰシグナル配列とＣ末端のトロンビン切断部位、次いでＴｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐ精製タグを有する。得られたｓｃＦｖ  ２Ｄ１０発現プラスミドを使用して、安定的にトランスフェクトされたＳｃｈｎｅｉｄｅｒ  ２（Ｓ２）昆虫細胞を得た。分泌されたｓｃＦｖ  ２Ｄ１０をＳｔｒｅｐＴｒａｐカラムでアフィニティー精製し、トロンビンプロテアーゼで消化して精製タグを取り除き、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０と１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００サイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。
Ｂ．エピトープの生成
ＲＳＶＧ外部ドメイン（Ｇ［ｅｃｔｏ］）Ｐ０３４２３）をコードする合成遺伝子を、Ｎ末端ＴＰＡシグナル配列とＣ末端タンデム６ヒスチジンおよびＴｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐ精製タグを有するｐＣＦにインフレームでクローニングした（残基６４〜２９８を含む配列番号７、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢエントリー）。Ｇ［ｅｃｔｏ］はＣＨＯ細胞における一過性トランスフェクションによって産生され、分泌されたＧ［ｅｃｔｏ］はＳｔｒｅｐＴｒａｐカラムでアフィニティー精製された。
【００６２】
ＲＳＶＧの残基１６１〜１９７（Ｇ［１６１−１９７］）（配列番号１、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢエントリー  Ｐ０３４２３）をコードする大腸菌用にコドン最適化された合成遺伝子を、Ｃ末端６ヒスチジン精製タグ（配列番号８）とともに、ｐＥＴ５２ｂにクローニングした。ペプチドを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中、１８℃で一晩発現させた。次に、細胞を、２μＭ  ＭｇＣｌ２、ベンゾナーゼ、およびプロテアーゼ阻害剤を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および２５ｍＭイミダゾール（緩衝液Ａ）中で、超音波処理によって溶解した。ＲＳＶＧ［１６１−１９７］は、ＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦアフィニティークロマトグラフィーによって可溶性溶解物から精製され、緩衝液Ｂ（５００ｍＭイミダゾールを含む緩衝液Ａ）への勾配で溶出された。類似の方法を使用して、関連ペプチド（Ｇ［１６２−１７２］（配列番号２）およびＧ［１６９−１９８］（配列番号３））を生成した。
実施例２：ＥＬＩＳＡアッセイ
濃度５μｇ／ｍＬ（合計１５０μＬ）の精製ｍＡｂを、９６ウェルＥＬＩＳＡマイクロタイタープレート中、室温で一晩インキュベートした。次に、プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した。５％ＢＳＡのＰＢＳを１５０μＬ加え、室温で１時間インキュベートした後、ＰＢＳＴで３回洗浄して、ウェルをブロックした。１％ＢＳＡのＰＢＳ中で、５μｇ／ｍＬの組換えＲＳＶＧ［ｅｃｔｏ］または２０μｇ／ｍＬのＲＳＶＧ［１６１−１９７］を、１％ＢＳＡのＰＢＳで１：３に段階希釈した。ウェルを１５０μＬのＲＳＶ  Ｇタンパク質と一緒に室温で１時間インキュベートし、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。次いで、プレートを、１％ＢＳＡのＰＢＳで１：５０００に希釈した１５０μＬのＨＲＰ結合ＨｉｓＰｒｏｂｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と一緒に室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、ペルオキシダーゼ基質ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）を０．０５Ｍリン酸−クエン酸緩衝液ｐＨ５．０および１．５％過酸化水素に加えて室温で１０分間現像した。反応を、２Ｎ硫酸と室温で１０分間インキュベーションして停止させ、４９０ｎｍで吸光度を測定した。ＥＬＩＳＡ実験は、生物学的トリプリケートで行った。
実施例３：免疫原性の試験
本発明のペプチド、変異体およびペプチド模倣体は、以下の基準を使用してマウスモデルで評価される。
【００６３】
【表１】
2020536934.tif 000003
【００６４】
実施例４：走化性アッセイ
ＣＸ３ＣＲ１のＲＳＶＧ調節のためのインビトロアッセイは、ヒト単球ＴＨＰ−１細胞の受容体を介した走化性を測定する｛Ｔｒｉｐｐ，Ｒ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００１）２：７３２−７３８｝。このアッセイでは、組換えＲＳＶＧ［１６１−１９７］は、ＲＳＶＧ外部ドメイン全体と同等のレベルで走化性を誘導し、３Ｄ３または２Ｄ１０または３Ｇ１２とのプレインキュベーションにより、抗ＣＸ３ＣＲ１ポリクローナル血清によって提供されるものと同等なレベルで、活性が遮断された。表２は、３Ｄ３および２Ｄ１０に関するこの分析の結果を示す。
【００６５】
【表２】
2020536934.tif 000004
【００６６】
より詳細には、孔径８μｍのトランスウェルインサートプレートを使用してアッセイを実施した。約２００万対数期のＴＨＰ−１細胞（ヒト白血病単球細胞株）を２回洗浄し、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、インサートプレートの上部チャンバーに加えた。ネガティブコントロールは無血清培地のみで、２５ｎＭ  ｍＡｂを含む無血清培地を下部チャンバーに加えた。ポジティブコントロールとして、１０％ＦＢＳを含む培地を下部チャンバーに加えた。ＲＳＶＧ［ｅｃｔｏ］またはＲＳＶＧ［１６１−１９７］サンプルを、無血清培地中、５ｎＭの最終濃度で下部チャンバーに加えた。ＲＳＶＧ［１６１−１９７］とｍＡｂを含むサンプルの場合、ＲＳＶＧ［１６１−１９７］を５モル濃度過剰のｍＡｂと一緒に室温で２０分間プレインキュベートし、下部チャンバーの無血清培地に加え、最終濃度を５ｎＭのＲＳＶＧ［１６１−１９７］および２５ｎＭのｍＡｂとした。抗ＣＸ３ＣＲ１抗体を含むサンプルの場合、２μＬの１ｍｇ／ｍＬ抗ＣＸ３ＣＲ１ウサギポリクローナル抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃａｔ＃ＰＡ５−１９９１０）を上部チャンバーでＴＨＰ−１細胞と３０分間インキュベートした後、ウェルに移した。組み立てられたプレートを、ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で５時間インキュベートした。下部チャンバーに遊走した細胞をカウントし、無血清培地のみに向かう細胞遊走に対する化学誘引物質に向かう細胞遊走の倍率増加を比較することにより、走化性指標を決定した。実験は少なくとも４回の生物学的反復で行われた。
実施例５：結晶解析による抗体−エピトープ境界面の決定
Ｆａｂ  ３Ｄ３−ＲＳＶＧ［１６２−１７２］複合体の形成および構造決定ＲＳＶＧアミノ酸１６２〜１７２をコードする実施例１Ｂの合成ペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢエントリーＰ０３４２３）（配列番号２）を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０および１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で１７．５ｍｇ／ｍｌの実施例１Ａの精製Ｆａｂ  ３Ｄ３と５モル濃度過剰で混合した。結晶は、２３％ＰＥＧ３３５０および０．０５Ｍ酢酸亜鉛のウェル溶液で、４℃でハンギングドロップ蒸気拡散によって成長させた。結晶を、２６％ＰＥＧ３３５０、０．０５Ｍ酢酸亜鉛、および２５％エチレングリコールの凍結保護溶液に移し、液体窒素で瞬間凍結した。回折データは、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅのビームライン８．３．１において、１．１１５０３Åの波長を使用して、極低温で収集された。単結晶の回折データは、ｉＭｏｓｆｌｍとＡｉｍｌｅｓｓで処理された。Ｆａｂ  ３Ｄ３−ＲＳＶＧ［１６２−１７２］複合体の構造は、Ｆａｂホモロジーモデルとの分子置換およびプログラムＰＨＡＳＥＲによって解析され、ＰＨＥＮＩＸとＣｏｏｔをそれぞれ使用して構造が精密化され手動により再構築された。最終的なＦａｂ  ３Ｄ３−ＲＳＶＧ［１６２−１７２］複合体の構造（ＰＤＢコード５ＷＮＢ）は、次のラマチャンドラン統計値を有した：９６．５％ｆａｖｏｒｅｄ，３．５％ａｌｌｏｗｅｄ，０％ｏｕｔｌｉｅｒｓ。
【００６７】
Ｆａｂ  ３Ｄ３−ＲＳＶＧ［１６１−１９７］複合体の形成および構造決定。精製ＲＳＶＧ［１６１−１９７］を２モル濃度過剰で精製Ｆａｂ  ３Ｄ３と混合し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０および１５０ｍＭ  ＮａＣｌで透析し、１５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。結晶は、２１％ＰＥＧ３３５０および０．２Ｍクエン酸アンモニウムｐＨ７．０のウェル溶液で、２２℃でハンギングドロップ蒸気拡散によって成長させた。結晶を、２５％ＰＥＧ３３５０、０．２Ｍクエン酸アンモニウムｐＨ７．０、および２５％グリセロールの凍結保護溶液に移し、液体窒素で瞬間凍結した。回折データは、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅのビームライン８．３．１において、１．１１５８２Åの波長を使用して、極低温で収集された。回折データは、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅのビームライン８．３．１で、１．１１５０３Åの波長を使用して、極低温で収集された。単結晶の回折データは、ｉＭｏｓｆｌｍとＡｉｍｌｅｓｓで処理された。Ｆａｂ  ３Ｄ３−ＲＳＶＧ［１６１−１９７］複合体の構造は、Ｆａｂ  ３Ｄ３との分子置換およびプログラムＰＨＡＳＥＲによって解析され、ＰＨＥＮＩＸとＣｏｏｔをそれぞれ使用して構造が精密化され手動で再構築された。最終的なＦａｂ  ３Ｄ３−ＲＳＶＧ［１６１−１９７］複合体の構造（ＰＤＢコード５ＷＮＡ）は、次のラマチャンドラン統計値を有した：９７．６％ｆａｖｏｒｅｄ，２．４％ａｌｌｏｗｅｄ，０％ｏｕｔｌｉｅｒｓ。
【００６８】
ｓｃＦｖ  ２Ｄ１０−ＲＳＶＧ［１６９−１９８］複合体の形成および構造決定。ＲＳＶＧアミノ酸１６９から１９８（配列番号３）をコードする合成ペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢエントリーＰ０３４２３）を、６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０および２３０ｍＭ  ＮａＣｌ中、２モル濃度過剰で精製ｓｃＦｖと混合し、１５．０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。結晶は、２４％ＰＥＧ４０００、０．１７Ｍ硫酸アンモニウム、０．０８５Ｍクエン酸ナトリウム  ｐＨ５．６、および１５％グリセロールのウェル溶液を使用して、２２℃でハンギングドロップ蒸気拡散により成長させた。結晶を、２８％ＰＥＧ４０００、０．１７Ｍ硫酸アンモニウム、０．０８５Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ５．６、および１５％グリセロール、および２５％グリセロールの凍結保護溶液に移し、液体窒素で瞬間凍結した。回折データは、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅのビームライン２３−ＩＤ−Ｄにおいて、１．０３３Åの波長を使用して、極低温で収集された。単結晶の回折データはＨＫＬ２０００で処理された。ｓｃＦｖ  ２Ｄ１０−ＲＳＶＧ［１６９−１９８］複合体の構造は、ｓｃＦｖホモロジーモデルとの分子置換とプログラムＰＨＡＳＥＲによって解析され、ＰＨＥＮＩＸとＣｏｏｔをそれぞれ使用して、構造が精密化され手動で再構築された。最終的なｓｃＦｖ  ２Ｄ１０−ＲＳＶＧ［１６９−１９８］複合体の構造（ＰＤＢコード５ＷＮ９）には、次のラマチャンドラン統計値を有した：９９．２％ｆａｖｏｒｅｄ，０．８％ａｌｌｏｗｅｄ，０％ｏｕｔｌｉｅｒｓ。
【００６９】
Ｆａｂ３Ｇ１２−ＲＳＶＧ［１５７−１９７］複合体の形成および構造決定。精製ＲＳＶＧ［１５７−１９７］を２モル濃度過剰で精製Ｆａｂ３Ｇ１２と混合し、複合体を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０および１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００サイズ排除カラムで精製した。複合体を１５．０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。結晶は、１．８Ｍ硫酸アンモニウムと１００ｍＭ酢酸ナトリウム三水和物ｐＨ４．４のウェル溶液で、２２℃でハンギングドロップ蒸気拡散により成長させた。結晶を、２．０Ｍ硫酸アンモニウム、１００ｍＭ酢酸ナトリウム三水和物ｐＨ４．４、および２５％グリセロールの凍結保護溶液に移し、液体窒素で瞬間凍結した。回折データは、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅのビームライン８．３．１において、１．１１５８２Åの波長を使用して、極低温で収集された。単結晶の回折データは、ｉＭｏｓｆｌｍとＡｉｍｌｅｓｓで処理された。Ｆａｂ３Ｇ１２＋ＲＳＶＧ１５７−１９７  複合体の構造は、分子置換プログラムＰＨＡＳＥＲによって解析され、ＰＨＥＮＩＸとＣｏｏｔをそれぞれ使用して、構造が精密化され手動で再構築された。最終的なＦａｂ３Ｇ１２−ＲＳＶＧ［１５７−１９７］複合体の構造（ＰＤＢコード６ＭＫＣ）は、次のラマチャンドラン統計値を有した：９５．７％ｆａｖｏｒｅｄ，４．３％ａｌｌｏｗｅｄ，０％ｏｕｔｌｉｅｒｓ。
【００７０】
表３に結晶学的データをまとめる（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋに寄託された構造：ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｏｒｇ）。
【００７１】
【表３】
2020536934.tif 000005
【００７２】
実施例６：副作用が軽減されたワクチン
図４に示す高親和性抗体２Ｄ１０および３Ｄ３と複合体化したＲＳＶＧのＣＣＲタンパク質の構造の決定は、高親和性ｍＡｂエピトープを生成する能力を損なうことなく、ＣＸ３ＣＲ１結合を無効にするＲＳＶＧ免疫原を設計するためのロードマップを提供する。具体的には、６つの高度に保存されたアミノ酸が同定されており、その側鎖はｍＡｂ  ３Ｄ３および２Ｄ１０と分子接触しないため、これらのｍＡｂと同様の高親和性ｍＡｂの生成に影響を与えることなく置換することができる。したがって、これらの残基は、ＣＸ３ＣＲ１への結合を妨害するための置換の候補である。一般に、電荷の変化（電荷スイッチ）および／またはサイズまたは形状の変化を与えると、立体障害（立体衝突）が起こり、そのような結合に悪影響が生じると予想される。表４は、ＲＳＶＧのＣＣＲタンパク質のこれらの残基の代表的な置換の結果を示す。実施例４に記載された走化性アッセイにより測定されるように、６つの代表的な変異体によるＣＸ３ＣＲ１機能への影響について試験がなされた。表４は、表示された残基のアミノ酸の標準的な１文字略語を用いて重複アッセイ（標準偏差を使用）の結果をまとめたものである。
【００７３】
【表４】
2020536934.tif 000006
【００７４】
示されるように、これらの変異のそれぞれは、走化性活性の低下を示し、最も効果的であったのは位置１７７におけるセリンからアルギニンへの置換である。これらの突然変異の組み合わせは、本発明の範囲内に含まれる。
実施例７：エピトープ模倣体の安定化
合成とアッセイのためコンビナトリアルケミストリー手法を活用した化学合成ペプチドテクノロジーは、ＤＮＡタグと次世代シーケンシングを用いたヒットの逆畳み込みによって非常に大規模なライブラリー（数十億の化合物）の構築とスクリーニングを可能にする進展とともに、エピトープ模倣体を作製する成熟したテクノロジーとなっている｛Ｃｈａｎ，Ａ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ（２０１５）２６：５５−６１｝。例えば、らせん状立体構造は、α−メチル化アミノ酸（例えば、Ａｉｂ）などの立体構造空間が制限されたアミノ酸の挿入により、せん状エピトープを安定化する側鎖の架橋または「ステープル」により、およびヘリックスキャップと水素結合代替物の使用により、安定化し得る。例としては、水素結合代替物としてのヒドラゾン架橋、Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ様ラクタム、ターンを安定させるための偽プロリンなどがある｛Ｅｓｔｉｅｕ−Ｇｉｏｎｎｅｔ，Ｋ．ａｎｄ  Ｇｕｉｃｈａｒｄ，Ｇ．Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ（２０１１）６：９３７−９６３｝。
【００７５】
さらに、インビトロでｍＲＮＡをタンパク質に翻訳するための当該技術分野で既知の技術は、非標準アミノ酸のタンパク質およびペプチドへの導入を可能にし、架橋されたペプチドの形成を促進する｛Ｈａｒｔｍａｎ，Ｍ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ（２００７）２（１０）：ｅ９７２｝。
実施例８：非免疫グロブリン結合剤の同定
本発明のペプチド、変異体およびペプチド模倣体は、有効な非免疫グロブリン結合剤を同定するために使用できる。
【００７６】
さまざまな非免疫グロブリンタンパク質足場が当技術分野で知られており、従来のｍＡｂによって結合されたものと類似したエピトープへの高親和性、高特異性結合から生じる同等な薬理活性を提供する｛Ｓｈａ、Ｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ（２０１７）２６（５）：９１０−９２４｝。例としては、フィブロネクチン、リポカリン、水晶体クリスタリン、テトラネクチン、アンキリン、プロテインＡ（Ｉｇ結合ドメイン）に基づく足場を含む。小さなペプチドファミリーはまた、抗体のような親和性およぶ特異性を有する可能性があり、トリ膵ペプチドおよびコノトキシンが含まれる｛Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ（２００５）１２７：１１７２７−１１７２５｝。同様に、架橋ペプチドは、明確な特異性を備えた高親和性結合剤を生成する能力を提供する。さらに、核酸アプタマーなどの非タンパク質ベースの薬剤も同等の結合を提供する｛Ｓｕｎ，Ｈ．ａｎｄ  Ｚｕ，Ｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２０１５）２０（７）：１１９５９−８０｝。
開示された配列の概要
以下の表で、記載事項に「と付加物」を含むリストの配列は、目的のコード配列に、開始コドン、グリシンスペーサー、ヒスチジンタグなどの発現および／または精製の補助剤、またはＴｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐなどの他の精製補助剤が補充されているものを指す｛Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｔ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ（２０１３）９２（１）：５４−６１｝。これらを、以下の配列表で詳しく説明する。
【００７７】
【表５】
2020536934.tif 000007
【００７８】
配列表
配列番号１
長さ：３７アミノ酸
型：ＰＲＴ
生物名：人工配列
特徴：ｍＡｂ  ３Ｄ３、２Ｄ１０および３Ｇ１２によって認識される免疫原
他の情報：ＲＳＶ  Ｇタンパク質［残基１６１〜１９７］
配列
【００７９】
【化１】
2020536934.tif 000008
【００８０】
配列番号２
長さ：１１アミノ酸
型：ＰＲＴ
生物名：人工配列
特徴：ｍＡｂ  ３Ｄ３によって認識されるがｍＡｂ２Ｄ１０では認識されない免疫原
他の情報：ＲＳＶ  Ｇタンパク質［残基１６２〜１７２］
配列
【００８１】
【化２】
2020536934.tif 000009
【００８２】
配列番号３
長さ：３０アミノ酸
型：ＰＲＴ
生物名：人工配列
特徴：ｍＡｂ２Ｄ１０によって認識されるがｍＡｂ  ３Ｄ３では認識されない免疫原
他の情報：ＲＳＶ  Ｇタンパク質［残基１６９〜１９８］
配列
【００８３】
【化３】
2020536934.tif 000010
【００８４】
配列番号４
長さ：５０アミノ酸
型：ＰＲＴ
生物名：人工配列
特徴：ｍＡｂ  ３Ｄ３、２Ｄ１０、および３Ｇ１２によって認識される免疫原
他の情報：ＲＳＶ  Ｇタンパク質［残基１５７〜１９７］
配列
【００８５】
【化４】
2020536934.tif 000011
【００８６】
配列番号５
長さ：４５アミノ酸
型：ＰＲＴ
生物名：人工配列
特徴：ｍＡｂｓによって認識される免疫原
他の情報：ＲＳＶ  Ｇタンパク質［残基１４８〜１９７］
配列
【００８７】
【化５】
2020536934.tif 000012
【００８８】
配列番号６
長さ：３９アミノ酸
型：ＰＲＴ
生物名：人工配列
特徴：ｍＡｂｓによって認識される免疫原
他の情報：ＲＳＶ  Ｇタンパク質［残基１６１〜１９５］
配列
【００８９】
【化６】
2020536934.tif 000013
【００９０】
配列番号７
長さ：２９５アミノ酸
型：ＰＲＴ
生物名：人工配列
特徴：免疫原
その他の情報：ＲＳＶ  Ｇタンパク質外部ドメイン［ＲＳＶ  Ａ２株の残基６４〜２９８、ＧｅｎＢａｎｋ  ＫＴ９９２０９４．１、２つの同義変異（下線）］  Ｎ末端ＴＰＡ分泌シグナルおよびＣ末端６Ｈｉｓ−２Ｓｔｒｅｐタグを含む
配列
【００９１】
【化７】
2020536934.tif 000014
【００９２】
配列番号１４
ＤＮＡ配列：
【００９３】
【化８】
2020536934.tif 000015
【００９４】
配列番号８
長さ：４５アミノ酸
型：ＰＲＴ
生物名：人工配列
特徴：免疫原を含む
他の情報：ＲＳＶ  Ｇタンパク質［残基１６１〜１９７］  Ｎ末端開始コドンとスペーサーグリシンおよびＣ末端６Ｈｉｓタグを含む
配列
【００９５】
【化９】
2020536934.tif 000016
【００９６】
配列番号１５
ＤＮＡ配列：
【００９７】
【化１０】
2020536934.tif 000017
【００９８】
配列番号９
長さ：５４アミノ酸
型：ＰＲＴ
生物名：人工配列
特徴：免疫原を含む
他の情報：ＲＳＶ  Ｇタンパク質［残基１５７〜１９７］  Ｎ末端開始コドンとスペーサーグリシンおよびＣ末端６Ｈｉｓタグを含む
配列
【００９９】
【化１１】
2020536934.tif 000018
【０１００】
配列番号１６
ＤＮＡ配列：
【０１０１】
【化１２】
2020536934.tif 000019
【０１０２】
配列番号１０
長さ：４５アミノ酸
型：ＰＲＴ
生物名：人工配列
特徴：免疫原を含む
他の情報：ＲＳＶ  Ｇタンパク質［残基１４８〜１９７］  Ｎ末端開始コドンとスペーサーグリシンおよびＣ末端６Ｈｉｓタグを含む
配列
【０１０３】
【化１３】
2020536934.tif 000020
【０１０４】
配列番号１７
ＤＮＡ配列：
【０１０５】
【化１４】
2020536934.tif 000021
【０１０６】
配列番号１１
長さ：３９アミノ酸
型：ＰＲＴ
生物名：人工配列
特徴：免疫原
他の情報：ＲＳＶ  Ｇタンパク質［残基１６１〜１９５］  Ｎ末端開始コドンとスペーサーグリシンおよびＣ末端６Ｈｉｓタグを含む
配列
【０１０７】
【化１５】
2020536934.tif 000022
【０１０８】
配列番号１８
ＤＮＡ配列：
【０１０９】
【化１６】
2020536934.tif 000023
【０１１０】
配列番号１２
長さ：３０８アミノ酸
型：ＰＲＴ
生物名：人工配列
特徴：単鎖抗体
他の情報：ｍＡｂ  ３Ｄ３単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ３Ｄ３）  Ｎ末端Ｂｉｐシグナルシーケンス、内部フレキシブルリンカー、Ｃ末端トロンビンプロテアーゼ切断部位、続いて６Ｈｉｓ−２Ｓｔｒｅｐタグを含む
配列
【０１１１】
【化１７】
2020536934.tif 000024
【０１１２】
配列番号１９
ＤＮＡ配列：
【０１１３】
【化１８】
2020536934.tif 000025
【０１１４】
配列番号１３
長さ：３１５アミノ酸
型：ＰＲＴ
生物名：人工配列
特徴：単鎖抗体
他の情報：ｍＡｂ２Ｄ１０単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ  ２Ｄ１０）  Ｎ末端Ｂｉｐシグナルシーケンス、内部フレキシブルリンカー、およびＣ末端トロンビンプロテアーゼ切断部位、続いて６Ｈｉｓ−２Ｓｔｒｅｐタグを含む
配列
【０１１５】
【化１９】
2020536934.tif 000026
【０１１６】
配列番号２０
ＤＮＡ配列：
【０１１７】
【化２０】
2020536934.tif 000027
【０１１８】
本発明には、以下の実施形態が含まれる。
【０１１９】
１．呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｇタンパク質の残基１６１〜１９７（配列番号１）のアミノ酸配列を有するペプチド、または位置１６２〜１７２（配列番号２）、もしくは位置１６９〜１９８（配列番号３）、もしくは位置１５７〜１９７（配列番号４）、もしくは位置１４８〜１９７（配列番号５）、もしくは位置１６１〜１９５（配列番号６）のアミノ酸配列を有するペプチドであって、それぞれが抗体との結合時に示される立体構造を保持するように化学的に安定化されたペプチド。
【０１２０】
２．前記化学的安定化が共有結合架橋を提供することを含む、上記のペプチド。
【０１２１】
３．配列番号１〜６のいずれか１つのペプチドの変異体またはペプチド模倣体であって、いずれか１つの配列番号１〜６のいずれか１つのそれぞれのペプチドと比較して増強した免疫原性を有する、変異体またはペプチド模倣体。
【０１２２】
４．５つ以下のアミノ酸置換および／または欠失および／または付加を含む変異体である、上記の変異体またはペプチド模倣体。
【０１２３】
５．前記変異体の立体構造が化学的に安定化されている、実施形態３または４に記載の変異体。
【０１２４】
６．配列番号１〜６のいずれか１つのペプチドの変異体またはペプチド模倣体であって、配列番号１〜６のそれぞれのペプチドと比較して低下した免疫原性を有する、変異体またはペプチド模倣体。
【０１２５】
７．５つ以下のアミノ酸置換および／または欠失および／または付加を含む変異体であり、フラクタルカインに応答するケモカイン受容体の活性化に関して変化した薬理活性を有する、上記の変異体またはペプチド模倣体。
【０１２６】
８．前記変異体の立体構造が化学的に安定化されている、実施形態６または７に上に記載の変異体。
【０１２７】
９．免疫原として望ましい特性を有する分子であって、前記特性がＲＳＶ  Ｇタンパク質の保存領域に対して株非依存性の高親和性を有するおよび中和活性を有する抗体の誘導を含み、候補分子をｍＡｂ  ３Ｄ３、２Ｄ１０または３Ｇ１２またはその抗原結合フラグメントとおよびＲＳＶ  Ｇタンパク質に低親和性で結合する少なくとも１つの結合部分と接触させることによって同定され、それによって３Ｄ３、２Ｄ１０、３Ｇ１２またはフラグメントに優先的に結合する候補分子が前記望ましい特性を有する免疫原として同定される、分子。
【０１２８】
１０．候補分子がアプタマーまたは小分子またはペプチドのコンビナトリアルライブラリーのメンバーである、上に記載の分子。
【０１２９】
１１．共有結合で連結された構成要素を含む分子であって、前記構成要素が配列番号２のアミノ酸配列および配列番号３のアミノ酸配列のペプチドであるか、またはそれぞれの前記構成要素が、実施形態３〜８に記載の、配列番号２および／または配列番号３の対応する変異体またはペプチド模倣体である、分子。
【０１３０】
１２．配列番号１または配列番号３〜６のペプチドの変異体またはペプチド模倣体であって、フラクタルカインに応答するケモカイン受容体を刺激または阻害する、変異体またはペプチド模倣体。
【０１３１】
１３．配列番号１または配列番号３〜６のそれぞれのペプチドと比較して減少した免疫原性を有する、上記の変異体またはペプチド模倣体。
【０１３２】
１４．配列番号１または配列番号３〜６のアミノ酸配列を含む変異体ペプチドであって、ＲＳＶ  Ｇタンパク質のアミノ酸１６２、１６４、１６６、１７７、１８７、１９２および／または１９３の少なくとも１つの置換を含み、野生型ＲＳＶ  Ｇタンパク質と比較して減少した走化性活性を示す、変異体ペプチド。
【０１３３】
１５．ＲＳＶに対するワクチンとして使用するための変異体ペプチドを設計する方法であって、高親和性抗体の結合に関与しないＧタンパク質のＣＣＲ内に含まれるアミノ酸を同定することと、それらを異なる形状またはサイズまたは電荷の側鎖を有するアミノ酸で置換することと、よってペプチドまたはタンパク質の免疫原性を妨げることなく受容体（ＣＸ３ＣＲ１）への変異体の結合を阻害することと、を含む、方法。
【０１３４】
１６．実施形態１５にある上記の方法により設計された変異体。
【０１３５】
１７．先行の実施形態のいずれかに記載のペプチドまたは変異体ペプチドであって、前記ペプチドまたは変異体のアッセイにおける使用のための部分、または前記ペプチドまたは変異体の精製における使用のための部分に結合されている、ペプチドまたは変異体ペプチド。
【０１３６】
１８．医薬または動物用組成物であって、上に記載の任意のペプチド、ペプチド模倣体、変異体または分子のうちの少なくとも１つを活性成分として含む、医薬または動物用組成物。
【０１３７】
１９．対象におけるＲＳＶ感染に関して予防的または治療的処置を提供する方法であって、そのような処置を必要とする対象に有効量の直前に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【０１３８】
２０．免疫介在性炎症性疾患、慢性疼痛および末梢神経障害を治療する方法であって、そのような治療を必要とする対象に、有効量の医薬または動物用組成物を投与することを含み、活性物質が実施形態１２または１３に記載されたものである、方法。
【０１３９】
２１．症状が関節リウマチ、変形性関節症またはアテローム性動脈硬化症である、上記の方法。
【０１４０】
２２．上に記載の任意のペプチドまたは変異体の生成のための組換え発現システムであって、その発現のための制御配列に作動可能に連結された前記ペプチドまたは変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸である、組換え発現システム。
【０１４１】
２３．上記の実施形態に記載のいずれかのペプチドまたは変異体を生成するように改変された、組換え宿主細胞。
【０１４２】
２４．ＲＳＶのＧタンパク質またはその保存領域と免疫反応性の抗体に結合する、またはフラクタルカインに結合する受容体に関して変化した活性を有するペプチドまたは変異体を生成する方法であって、前記ペプチドまたは変異体が生成される条件下でこれらの細胞を培養することと、任意選択的に前記培養から前記ペプチドまたは変異体を回収することとを含む、方法。
【０１４３】
２５．免疫原として望ましい特性を有する分子を同定する方法であって、前記特性は、ＲＳＶ  Ｇタンパク質の保存領域に対して株非依存性で高親和性を有する抗体および中和活性を有する抗体の誘導を含み、その方法は、候補分子をｍＡｂ  ３Ｄ３、２Ｄ１０、または３Ｇ１２、またはその抗原結合フラグメントと、およびＲＳＶ  Ｇタンパク質に低親和性で結合する少なくとも１つの結合部分と接触させることを含み、それによって３Ｄ３、２Ｄ１０、または３Ｇ１２に優先的に結合する候補分子が上記の望ましい特性を有する免疫原として同定される、方法。
【０１４４】
２６．候補分子がアプタマーまたは小分子またはペプチドのコンビナトリアルライブラリーのメンバーである、上記の方法。
【０１４５】
２７．ＲＳＶ  Ｇタンパク質の保存領域に対する株非依存性で高親和性の特性および中和活性の特性を有する結合部分を同定する方法であって、その方法は、候補結合部分を立体構造的に拘束された形態の図２Ａ、２Ｂ、または２Ｃに示された形状を有するペプチドまたはそのペプチド模倣体と接触させることと、前記候補結合部分と前記ペプチドまたはペプチド模倣体との間の複合体の存在または不在を検出することとを含み、候補結合部分の前記ペプチドまたはペプチド模倣体に対する結合親和性が少なくとも１００ｐＭ程度の強さを示す前記複合体の存在により前記結合部分が前記特性を有していると同定される、方法。
【０１４６】
２８．候補結合部分がアプタマーまたは代替足場のコンビナトリアルライブラリーのメンバーであるか、または抗体もしくはそのフラグメントである、上記の方法。
【０１４７】
２９．この方法で同定された結合部分。
【０１４８】
３０．医薬または動物用組成物であって、活性成分として上記の結合部分を含む、医薬または動物用組成物。
【０１４９】
３１．対象におけるＲＳＶ感染に関して予防的または治療的処置を提供する方法であって、そのような処置を必要とする対象に有効量のこの医薬または動物用組成物を投与することを含む、方法。
【図１】
2020536934.tif 000028
【図２】
2020536934.tif 000029
【図３】
2020536934.tif 000030
【図４】
2020536934.tif 000031
【配列表】
2020536934000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月29日(2020.6.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｇタンパク質の残基１６１〜１９７（配列番号１）、または位置１６９〜１９８（配列番号３）、または位置１５７〜１９７（配列番号４）、または位置１４８〜１９７（配列番号５）、または位置１６１〜１９５（配列番号６）のアミノ酸配列を有するペプチドの変異体またはペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｅｍｉｍｅｔｉｃ）であって、それぞれ、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５もしくは配列番号６のペプチドと比較して、フラクタルカインに応答するケモカイン受容体の活性化に関して減少した活性を有し、
ｍＡｂ  ３Ｄ３、および／もしくは２Ｄ１０および／もしくは３Ｇ１２と結合し、かつ／または
ＲＳＶ  Ｇタンパク質に対して免疫反応性の抗体を誘発する、変異体またはペプチド模倣体。
【請求項２】
抗体への結合時に示される立体構造を保持するように化学的に安定化されている、請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
前記ＲＳＶ  Ｇタンパク質のアミノ酸１６２、１６４、１６６、１７７、１８７、１９２および／または１９３に少なくとも１つの置換を含む、請求項１に記載の変異体。
【請求項４】
ｍＡｂ  ３Ｄ３、および／または２Ｄ１０および／または３Ｇ１２と免疫反応性である、請求項１に記載の変異体またはペプチド模倣体。
【請求項５】
前記ウイルスのＡ株とＢ株との間で保存されているＲＳＶ  Ｇタンパク質のエピトープと免疫反応性のサブｎＭ親和性抗体を誘発する、請求項１に記載の変異体またはペプチド模倣体。
【請求項６】
請求項１に記載の変異体またはペプチド模倣体を活性物質として含む、医薬または動物用組成物またはワクチン。
【請求項７】
ＲＳＶ感染の予防または治療効果を必要とする対象におけるＲＳＶ感染の予防または治療のための、請求項６に記載の医薬または動物用組成物またはワクチン。
【請求項８】
配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６のペプチドの変異体またはペプチド模倣体であって、それぞれ配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６のペプチドと比較して、フラクタルカインに応答するケモカイン受容体を刺激または阻害する、変異体または模倣体。
【請求項９】
それぞれ、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６のペプチドと比較して減少した免疫原性を有する、請求項８に記載の変異体またはペプチド模倣体。
【請求項１０】
前記刺激または阻害が走化性アッセイで決定される、請求項８に記載の変異体またはペプチド模倣体。
【請求項１１】
請求項８に記載の変異体またはペプチド模倣体を活性物質として含む、医薬または動物用組成物またはワクチン。
【請求項１２】
予防又は治療効果を必要とする対象における予防または治療のための、請求項１１に記載の医薬または動物用組成物またはワクチン。
【請求項１３】
ＲＳＶ  Ｇタンパク質の保存領域に対する株非依存性の高親和性および中和活性の特徴を有する結合部分であって、候補結合部分と、図２Ａ、２Ｂまたは２Ｃに示された形状を有する立体構造が保持された形態のペプチドまたはそのペプチド模倣体とを接触させること、及び、前記候補結合部分と前記形状のペプチドまたはペプチド模倣体との間の複合体の存在または不在を検出すること、を含む方法によって同定され、ここで、前記候補結合部分の前記ペプチドまたはペプチド模倣体に対する結合親和性が少なくとも１００ｐＭ程度の強さを示す前記複合体が存在するときは、前記結合部分が前記特性を有していると同定され、ここで、前記候補結合部分はアプタマーまたは代替足場（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）のコンビナトリアルライブラリーのメンバーであるか、または抗体もしくはそのフラグメントである、結合部分。
【請求項１４】
請求項１３に記載の結合部分を有効成分として含む医薬または動物用組成物。
【請求項１５】
ＲＳＶ感染に対する予防または治療効果を必要とする対象におけるＲＳＶ感染の予防または治療のための、請求項１４に記載の医薬または動物用組成物。
【請求項１６】
請求項１３に記載の結合部分を同定する方法であって、候補結合部分と、図２Ａ、２Ｂまたは２Ｃに示された前記形状を有する立体構造的に拘束された形態のペプチドまたはそのペプチド模倣体とを接触させること、及び、前記候補結合部分と前記形状のペプチドまたはペプチド模倣体との間の複合体の存在または不在を検出すること、を含み、ここで、前記候補結合部分の前記ペプチドまたはペプチド模倣体に対する結合親和性が少なくとも１００ｐＭ程度の強さを示す前記複合体が存在するときは、前記結合部分が前記特性を有していると同定され、ここで、前記候補結合部分はアプタマーまたは代替足場のコンビナトリアルライブラリーのメンバーであるか、または抗体もしくはそのフラグメントである、方法。
【請求項１７】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｇタンパク質の、残基１６１〜１９７（配列番号１）のアミノ酸配列、または位置１６２〜１７２（配列番号２）、もしくは位置１６９〜１９８（配列番号３）、もしくは位置１５７〜１９７（配列番号４）、もしくは位置１４８〜１９７（配列番号５）、もしくは位置１６１〜１９５（配列番号６）のアミノ酸配列を有するペプチドであって、抗体への結合時に示される立体構造を保持するようにそれぞれ化学的に安定化されているペプチド、あるいは
配列番号１〜６の前記ペプチドのいずれかの変異体またはペプチド模倣体であって、それぞれ、配列番号１〜６のいずれかのペプチドと比較して、増強した免疫原性を有するか、または配列番号１〜６のいずれかのペプチドと比較して減少した免疫原性を有する、変異体またはペプチド模倣体。
【請求項１８】
前記化学的安定化が共有結合により架橋することを含むか、または、前記変異体が前記ペプチドのアッセイで使用するための、若しくは前記ペプチドの精製で使用するための部分と結合されている、請求項１７に記載のペプチド。
【請求項１９】
５つ以下のアミノ酸置換および／もしくは欠失および／もしくは付加を含む変異体であり、かつ／またはフラクタルカインに応答するケモカイン受容体を活性化する薬理活性が低下している、請求項１７に記載の変異体。
【請求項２０】
前記変異体の立体構造が化学的に安定化されている、請求項１９に記載の変異体。
【国際調査報告】
2020536934.tif 000032
2020536934.tif 000033
2020536934.tif 000034
2020536934.tif 000035