(57)【要約】  バイオフィルムで被覆された薬物ナノ結晶を具備するナノドラッグデリバリーシステムであり、前記薬物が、前記ナノ結晶の物理的形態を直接的に剛性支持骨格として、バイオフィルムに充填されているナノドラッグデリバリーシステムを提供する。ナノドラッグデリバリーシステムは薬物運搬能力が高く、生体適合性が優れ、生体内の循環が長くまたは薬物が徐放放出である利点を奏する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオフィルムで被覆された薬物ナノ結晶を具備するナノドラッグデリバリーシステムであって、前記薬物が、前記ナノ結晶の物理的形態を直接的に剛性支持骨格として、バイオフィルムに充填されていることを特徴とするナノドラッグデリバリーシステム。
【請求項２】
請求項１に記載のナノドラッグデリバリーシステムであって、前記薬物ナノ結晶が、骨格材料と薬物ストレージ体の両方を構成する。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載のナノドラッグデリバリーシステムであって、前記薬物ナノ結晶は、物理的または化学的方法による薬物の処理により形成されるナノスケール結晶である。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載のナノドラッグデリバリーシステムであって、前記薬物ナノ結晶が１０〜１０００ｎｍ、好ましくは１０〜２００ｎｍの粒径を有する。
【請求項５】
請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載のナノドラッグデリバリーシステムであって、前記薬物が治療薬および／または診断薬である。
【請求項６】
請求項５に記載のナノドラッグデリバリーシステムであって、前記治療薬は、物理的または化学的方法により調製された前記ナノ結晶の抗腫瘍薬、抗感染薬、抗心血管及び脳血管疾患の薬、抗リンパ系障害薬、抗免疫系障害薬及び鎮痛薬からなる群から選択される１つまたは複数のものであり、
好ましくは、前記抗腫瘍薬は、パクリタキセルなどのタキサン薬，ドキソルビシンなどのアントラサイクリン薬，カンプトテシン薬、ビンクリスチン薬、ボルテゾミブなどのゾミブ薬，シスプラチン薬，イリノテカンおよび／またはパルテノリドなどの白金薬などからなる群から選択され、前記抗感染薬は、セフトリアキソン、セフォキシチン、アズトレオナム、ストレプトマイシン、アンフォテリシンＢ、バンコマイシン、チゲサイクリン、テイコプラニン、モロキシジン、ビダラビンおよびゾビラックスからなる群から選択され、前記抗心血管及び脳血管疾患の医薬品は、ガングリオシド、フェルラ酸、リグストラジン、トロキセルチン、およびオザグレルナトリウムからなる群から選択され、前記抗リンパ系障害薬はパノビノスタットであり、前記抗免疫系障害薬は、メチルプレドニゾロンおよびシクロスポリンからなる群から選択され、そして、前記鎮痛薬は、モルヒネおよびメタドンからなる群から選択され、
最も好ましくは、前記医薬品はイリノテカン、ドセタキセルまたはカバジタキセルである。
【請求項７】
請求項５に記載のナノドラッグデリバリーシステムであって、前記診断剤は、物理的または化学的方法により形成された前記ナノ結晶の蛍光物質、近赤外色素、および磁気共鳴画像化剤からなる群から選択される１つまたは複数のものである。
【請求項８】
請求項１〜請求項７のいずれか一項に記載のナノドラッグデリバリーシステムであって、
前記バイオフィルムが脂質二重層を有する膜構造を有し、
好ましくは、前記バイオフィルムは天然細胞膜または人工バイオフィルムであり、
より好ましくは、前記天然細胞膜は、赤血球膜，血小板膜，マクロファージ膜，白血球膜および腫瘍細胞膜からなる群から選択される１つまたは複数のものであり、
前記人工バイオフィルムはリポソーム膜であり、
さらに好ましくは、前記バイオフィルムは、赤血球膜、血小板膜および腫瘍細胞膜からなる群から選択される１つまたは複数のものである。
【請求項９】
請求項１〜請求項８のいずれか一項に記載のナノドラッグデリバリーシステムであって、
前記ナノドラッグデリバリーシステムの表面が、標的分子によってさらに修飾されることで、アクティブなターゲティング機能を備えるバイオフィルムで前記ナノ結晶を被覆するナノドラッグデリバリーシステムとして前記ナノドラッグデリバリーシステムを構築し、
前記標的分子は、ポリペプチド標的分子であり、
より好ましくは、前記ポリペプチド標的分子は、ＲＧＤ、ＶＡＰ、ＷＶＡＰ、Ａ７ＲおよびＣＤＸからなる群から選択される１つまたは複数のものである。
【請求項１０】
前記請求項１〜請求項９のいずれか一項に記載のナノドラッグデリバリーシステムの調製する方法であって、薬物をナノ結晶の物理的形態で剛性支持骨格として、バイオフィルムに充填することを含む。
【請求項１１】
前記請求項１〜請求項９のいずれか一項に記載のナノドラッグデリバリーシステムの、生体内治療および／または診断製品用の医薬品の調製への使用。
【請求項１２】
前記請求項１〜請求項８のいずれか一項に記載のナノドラッグデリバリーシステムを必要性がある被験者に投与することを特徴とする医薬品による生体内治療および／または病気の診断をする方法。
【請求項１３】
前記請求項１１に記載の使用又は前記請求項１２に記載の方法であって、前記薬物の生体内治療および／または診断は、医薬品の生体内標的療法および／または医薬品の生体内標的診断である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬学分野に属し、バイオフィルム被覆ナノ薬物（バイオフィルムで被覆される薬物）のナノ結晶の調製方法および当該方法の、バイオフィルム被覆ナノ結晶によるナノドラッグデリバリーシステムの構築への使用に関する。具体的には、本発明は、薬物のナノ結晶をそのまま剛性支持骨格としてバイオフィルムで被覆されることにより、バイオフィルム被覆薬物ナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムを調製する方法、及び当該方法の、バイオフィルム被覆ナノ結晶を調製するナノドラッグデリバリーシステムへの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオフィルム被覆ナノドラッグデリバリーシステム（ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ）は剛性に支持されたナノ粒子に一層のバイオフィルムを被覆して形成したドラッグデリバリーシステムであり、通常支持されたナノ粒子は有機高分子材料或いは無機材料で形成されるものである。リポソーム、ポリマーミセル、ナノ粒子などの従来のドラッグデリバリーシステムと比較して、バイオフィルム被覆ナノデリバリーシステムには次の利点がある：１）良好な生体適合性と高い安全性；２）全身循環時間が長い；３）  従来の長期循環ナノ製剤と比較して、ＰＥＧ化修飾がなく、免疫原性が低い。さらに、バイオフィルム被覆ナノドラッグデリバリーシステムは、ホモロジー傾向又は表面の標的分子の修飾により、ターゲディング機能を具備することができる。
【０００３】
バイオフィルム被覆ナノドラッグデリバリーシステムは、バイオフィルム（バイオ膜）に薬物を吸着させるか、或いは、支持骨格内にカプセル化することで形成してもよい。膜に吸着された薬物負荷法は、一般的にバイオフィルムに特異的に吸着する物質、例えば細菌毒素による赤血球膜の自然な吸着作用を利用して、赤血球膜でナノ粒子を被覆して毒素を吸着し免疫防止および治療に用いるのに使用される。ただし、この方法はほとんどの薬物には適用されない。支持骨格に薬物を被覆する方法は、最初に有機ポリマー担体（一般的に使用されるＰＬＧＡ（ポリ（乳酸グリコール）））または無機担体（メソポーラス材料）によって形成されたナノ粒子に薬物をカプセルし、次に押し圧または超音波法によってバイオフィルムで被覆させることで、薬物を充填したバイオフィルム被覆ナノドラッグデリバリーシステムが形成される。ただし、ＰＬＧＡナノ粒子による薬物負荷は、薬物分子と担体の適合性が低いことが原因であることが多く、その結果、薬物負荷が低い。無機メソポーラス材料による薬物負荷は、高い薬物担持能力を有するが、無機担体が分解せず、生体適合性に乏しいため、実用には限界がある。
【０００４】
薬物ナノ結晶とは、薬物分子の結晶化で形成されるナノメートルスケール且つ硬い薬物結晶である。薬物ナノ結晶は薬物中間体として、薬物溶解の改善と薬物のバイオアベイラビリティの改善のために、経口製剤の研究開発に広く用いられている。さらに、薬物はナノ結晶の形で存在し、持続放出機能を有する。
【０００５】
本発明は、剛性薬物ナノ結晶を支持骨格として、バイオフィルム被覆ナノドラッグデリバリーシステムを調製する方法を提供する。この方法では、従来のバイオフィルム被覆ナノドラッグデリバリーシステムで一般的に使用されていたＰＬＧＡまたは無機メソポーラス材料を、薬物ナノ結晶で置き換えることによって、バイオフィルム被覆ナノドラッグデリバリーシステムに必要な支持構造を提供すると共に、薬物デリバリーを実現した。
この方法で構築されたバイオフィルム被覆薬物ナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムには、以下の利点がある：
１）薬物運搬能力が高く、臨床薬の用量要求を満たすことができる。
２）担体材料の使用が回避され、これによりドラッグデリバリーシステムの生体適合性と安全性が向上させる。
３）薬物ナノ結晶の比表面エネルギーが低下し、薬物ナノ結晶の安定性を向上させる。
４）薬物ナノ結晶の持続放出特性を有すると共に、且つバイオフィルム被覆ナノドラッグデリバリーシステムの生体内の循環が長いという利点を奏する。
したがって、この方法には大きな潜在的使用価値がある。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、バイオフィルム被覆薬物ナノ結晶を調製する方法を提供する。
本発明を説明する前に、本明細書で使用される用語は次のように定義される。
用語アルギニル−グリシル−アスパラギン酸（ＲＧＤ）は、インテグリンに対して高い結合活性を有するポリペプチドを指す。
用語トリペプチドプロリン−バリン−アラニン（ＶＡＰ）は、グルコース調節タンパク質ＧＲＰ７８に対する高い結合活性を有するポリペプチドを指す。
用語テトラペプチドトリプトファン−プロリン−バリン−アラニン（ＷＶＡＰ）は、クオラムセンシング受容体とグルコース調節タンパク質ＧＲＰ７８の両方に対して高い結合  活性を有するポリペプチドを指す。
用語ヘプタペプチドＡＴＷＬＰＰＲ（Ａ７Ｒ）は、血管内皮成長因子受容体−２およびニューロピリン−１の両方に対して高い結合活性を有するポリペプチドを指す。
用語ＦＫＥＳＷＲＥＡＲＧＴＲＩＥＲＧ（ＣＤＸ）は、アセチルコリン受容体に対する高い結合活性を有するポリペプチドを指す。
用語Ｕ８７細胞は、ヒトＵ８７悪性神経膠腫細胞を指す。
用語ＰＬＧＡは、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）を指す。
用語Ｆ１２７は、ポロキサマー、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンエーテルブロック共重合体を指す。
ＰＥＧという用語はポリエチレングリコールを指す。
用語ＤＳＰＥは、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを指す。
用語ＰＢＳは、リン酸緩衝生理食塩水を指す。
用語ＦＢＳは、ウシ胎児血清を指す。
【０００７】
本発明の第１の態様では、ナノドラッグデリバリーシステムが提供される。このナノドラッグデリバリーシステムは、バイオフィルムで被覆された薬物ナノ結晶（バイオフィルム被覆薬物ナノ結晶）を含み、前記薬物は、ナノ結晶の物理的形態を剛性支持骨格として直接用いられ、バイオフィルムで覆われている（即ち、バイオフィルムの中に充填されている）。
【０００８】
本発明の第１の態様におけるナノドラッグデリバリーシステムによれば、薬物ナノ結晶は、骨格材料であると共に薬物ストレージ体である。
【０００９】
本発明の第１の態様におけるナノドラッグデリバリーシステムによれば、薬物ナノ結晶は、物理的または化学的方法による薬物の処理により形成されたナノスケール結晶（ｎａｎｏｓｃａｌｅ  ｃｒｙｓｔａｌ）である。
【００１０】
本発明の第１の態様におけるナノドラッグデリバリーシステムによれば、薬物ナノ結晶は、１０〜１０００ｎｍ、好ましくは１０〜２００ｎｍの粒径を有する。
【００１１】
本発明の第１の態様におけるナノドラッグデリバリーシステムによれば、薬物は治療薬および／または診断薬である。
【００１２】
好ましくは、前記治療薬は、物理的または化学的方法によってナノ結晶に調製することができる抗腫瘍薬、抗感染薬、抗心血管及び脳血管疾患の薬、抗リンパ系障害薬、抗免疫系障害薬および鎮痛薬からなる群から選択される１つまたは複数である。
【００１３】
好ましくは、前記抗腫瘍薬は、パクリタキセルなどのタキサン薬、ドキソルビシンなどのアントラサイクリン薬、カンプトテシン薬、ビンクリスチン薬、ボルテゾミブなどのゾミブ薬、シスプラチンなどのプラチナベースの薬物、イリノテカンおよび／またはパルテノライド薬物からなる群から選択されるものである。前記抗感染薬は、セフトリアキソン、セフォキシチン、アズトレオナム、ストレプトマイシン、アンフォテリシンＢ、バンコマイシン、チゲサイクリン、テイコプラニン、モロキシジン、ビダラビンおよびゾビラックスからなる群から選択されるものである。前記抗心血管及び脳血管疾患の薬は、ガングリオシド、フェルラ酸、リグストラジン、トロキセルチンおよびオザグレルナトリウムからなる群から選択されたものである。前記抗リンパ系障害薬はパノビノスタットである。前記抗免疫系障害薬は、メチルプレドニゾロンおよびシクロスポリンからなる群から選択されるものである。前記鎮痛薬は、モルヒネおよびメタドンからなる群から選択されるものである。
【００１４】
最も好ましくは、薬物はイリノテカン、ドセタキセルまたはカバジタキセルである。
【００１５】
好ましくは、診断薬は、物理的または化学的方法によりナノ結晶に調製することができる、蛍光物質、近赤外色素、および磁気共鳴画像化剤からなる群から選択される１つまたは複数である。
【００１６】
本発明の第１の態様におけるナノドラッグデリバリーシステムによれば、バイオフィルムは脂質二重層を有する膜構造を有する。
【００１７】
好ましくは、バイオフィルムは、天然の細胞膜または人工バイオフィルムである。
【００１８】
より好ましくは、天然の細胞膜は、赤血球膜、血小板膜、マクロファージ膜、白血球膜、および腫瘍細胞膜からなる群から選択される１つまたは複数である。人工バイオフィルムはリポソーム膜である。
【００１９】
さらに好ましくは、バイオフィルムは、赤血球膜、血小板膜、および腫瘍細胞膜からなる群から選択される１つまたは複数である。
【００２０】
本発明の第１の態様におけるナノドラッグデリバリーシステムによれば、ナノドラッグデリバリーシステムの表面は、標的分子によりさらに修飾され、これにより、アクティブなターゲティング機能を備えるバイオフィルム被覆ナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムとしてナノドラッグデリバリーシステムを構築する。
【００２１】
好ましくは、標的分子はポリペプチド標的分子である。
【００２２】
より好ましくは、ポリペプチド標的化分子は、ＲＧＤ、ＶＡＰ、ＷＶＡＰ、Ａ７Ｒ、およびＣＤＸからなる群から選択される１つまたは複数である。
【００２３】
本発明の第２の態様では、本発明の第１の態様に記載されたナノドラッグデリバリーシステムを調製する方法が提供される。この方法には、物理的形態の薬物ナノ結晶を硬い支持骨格として直接使用すること、およびバイオフィルムに充填することが含まれる。
【００２４】
本発明の第３の態様では、本発明の第１の態様におけるナノドラッグデリバリーシステムの、生体内治療および／または診断製品用の薬剤の調製における使用が提供される。
【００２５】
本発明の第４の態様では、本発明の第１の態様のナノドラッグデリバリーシステムを需要のある対象（被験者）に投与することを含む、インビボで疾患を治療および／または診断するための薬剤の使用方法が提供される。
【００２６】
本発明の第３の態様の使用または本発明の第４の態様の方法によれば、インビボでの治療および／または診断は、薬物のインビボ標的療法および／または薬物のインビボ標的診断である。
【００２７】
本発明では、バイオフィルム被覆ナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムの調製における本発明の方法の使用を提供する。
【００２８】
具体的には、本発明により提供されるバイオフィルム被覆薬物ナノ結晶を調製する方法は、薬物をナノ結晶に形成し、次いでナノ結晶を剛性支持骨格として直接使用してバイオフィルムで被覆し、バイオフィルム被覆薬物ナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムを得る工程を含む。
【００２９】
薬物のナノ結晶は、物理的または化学的処理によって得ることができ、得られたナノ結晶の粒子サイズは、１０〜１０００  ｎｍ、好ましくは１０〜２００  ｎｍに制御される。薬物ナノ結晶は、治療薬または診断薬で構成される。治療薬は、物理的または化学的にナノ結晶に調製することが可能な抗腫瘍薬（例えば、パクリタキセルなどのタキサン薬、ドキソルビシンなどのアントラサイクリン薬、カンプトテシン薬、ビンクリスチン薬、ボルテゾミブなどのゾミブ薬、シスプラチンなどのプラチナベースの薬物、イリノテカン、パルテノライド薬物など）、抗感染薬（例えば、セフトリアキソン、セフォキシチン、アズトレオナム、ストレプトマイシン、アンフォテリシンＢ、バンコマイシン、チゲサイクリン、テイコプラニン、モロキシジン、ビダラビンおよびゾビラックスなど）、抗心血管及び脳血管疾患の薬（例えば、ガングリオシド、フェルラ酸、リグストラジン、トロキセルチンおよびオザグレルナトリウムなど）、抗リンパ系障害薬（例えば、パノビノスタットなど）、抗免疫系障害薬（例えば、メチルプレドニゾロン、シクロスポリンなど）、および鎮痛薬（例えば、モルヒネ、メタドンなど）が挙げられる。診断薬は、物理的または化学的方法によりナノ結晶に調製することが可能な蛍光物質（例えば、フルオレセイン、ローダミンなど）、近赤外染料（例えば、ｃｙ５．５、ＩＲ８２０、ＤｉＲなど）、および磁気共鳴イメージング剤（例えば、Ｇｄ剤、酸化鉄など）が挙げられる。選択されたバイオフィルムは、脂質二重層を有する膜構造であり、これは、赤血球膜、血小板膜、マクロファージ膜、白血球膜、腫瘍細胞膜などの天然の細胞膜であってもよいし、リポソーム膜などの人工バイオフィルムであってもよい。
【００３０】
本発明により提供される方法によって、赤血球膜被覆イリノテカンナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステム、血小板膜被覆イリノテカンナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステム、赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムおよびＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムが、形成される。
【００３１】
本発明の赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノフィルムおよびＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムは、インビボでの腫瘍標的化薬物デリバリーに使用することができるため、抗腫瘍に用いられる。
【００３２】
本発明は、バイオフィルム被覆薬物ナノ結晶を調製する方法、及び当該方法がバイオフィルム被覆ナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムの形成における使用、及び当該方法によって構築された赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステム及びＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムを腫瘍治療の基礎とすることを提供する。本発明の試験結果によると、本発明の方法により調製されたバイオフィルム被覆薬物ナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステム、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により示される明確な核膜構造、さらに、薬物ナノ結晶の安定性が大幅に改善され、薬物ナノ結晶がバイオフィルムで効率的に被覆されていることを示す。生体外放出の結果によると、バイオフィルム被覆薬物ナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムが顕著な薬物持続放出特性を有することを示す。生体内薬物動態の結果によると、バイオフィルム被覆薬物ナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムが、体内での薬物の循環時間を大幅に延長する長い循環の利点を奏することを示す。バイオフィルム被覆／ターゲティング分子修飾バイオフィルム被覆薬物ナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムは、受動的または能動的なターゲティングにより腫瘍組織を濃縮することができ、腫瘍成長に対してより強い抑制効果を発揮する。さらに、バイオフィルム被覆薬物ナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムは、市販の製剤や薬物ナノ結晶と比較して、安全性が優れている。上記の結果によれば、本発明により提供されるバイオフィルム被覆薬物ナノ結晶を調製する方法は、バイオフィルム被覆薬物ナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムを調製するために使用でき、既存のバイオフィルムで被覆するナノドラッグデリバリーシステムおよびその薬物運搬構築方法と比較して大きな利点を奏し、良好な用途の見通しがある。
【００３３】
１．赤血球膜、血小板膜、腫瘍細胞膜被覆イリノテカン／カバジタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムの調製と特性評価
生体動物の標的細胞（赤血球または血小板）または腫瘍細胞を採取して、細胞膜を収集し、細胞膜懸濁液を調製する。イリノテカン／カバジタキセルに適切な量の界面活性剤を加えて、フィルム形成および水和後に薬物ナノ結晶懸濁液を形成する。細胞膜懸濁液を薬物ナノ結晶懸濁液と混合して、超音波処理してバイオフィルムで被覆されたイリノテカンナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムを得る。形態はＴＥＭによって特徴付けられる。
【００３４】
２．赤血球膜、ＲＧＤ、ＶＡＰ、ＷＶＡＰ、Ａ７ＲまたはＣＤＸ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムの調製と特性評価
赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムは、上記と同様方法により調製／特性評価される。
ＲＧＤ、ＶＡＰ、ＷＶＡＰ、Ａ７ＲまたはＣＤＸの修飾は、まず脂質挿入法によりストレプトアビジンで赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムの表面を修飾し、次にビオチン化ＲＧＤ、ビオチン化ＶＡＰとインキュベートすることにより行われる。ビオチン化ＷＶＡＰ、ビオチン化Ａ７Ｒまたはビオチン化ＣＤＸによって、ＲＧＤ、ＶＡＰ、ＷＶＡＰ、Ａ７ＲまたはＣＤＸ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶が得られる。薬物のインビトロ放出は、透析バッグ法によって特定される。
【００３５】
３．赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムとＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムのインビボ薬物動態測定
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＩＣＲ）マウスに、市販のドセタキセル注射液、ドセタキセルナノ結晶、赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステム、ＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムを尾静脈注射液によって投与する。一定時間後に血液が採取し、血液中の薬物の濃度が高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）メソッドによって決定され、薬物動態曲線がプロットされる。
【００３６】
４．赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムおよびＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムの生体内組織分布測定
Ｕ８７皮下異種移植モデルヌードマウスまたはＵ８７脳内同所性腫瘍モデルヌードマウスに、市販のドセタキセル注射液、赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステム、ＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムを尾静脈注射によって投入した。そして、一定時間後に、組織、臓器および全血を採取し、組織および血液中の薬物の濃度はＨＰＬＣによって特定される。
【００３７】
５．赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムとＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムのインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）薬力学的評価
市販のドセタキセル注射液、ドセタキセルナノ結晶、赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステム、およびＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムが神経膠腫細胞Ｕ８７のインビドロ成長に対する抑制効果を、３−（４、５−ジメチル−２−チアゾリル）−２、５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）アッセイにより調査される。
【００３８】
６．赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムとＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムのインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）薬力学的評価
Ｕ８７皮下異種移植モデルヌードマウスに、通常の生理食塩水、市販のドセタキセル注射液、ドセタキセルナノ結晶、赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステム、およびＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムを尾静脈注射で投与される。生体内での抗腫瘍効果は、腫瘍体積と生存時間を指標として評価される。
Ｕ８７脳内同所性腫瘍モデルヌードマウスに、生理食塩水、市販のドセタキセル注射液液、赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステム、ＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムが尾静脈注射で投与される。生体内での抗腫瘍効果は、生存時間を指標として評価される。
【００３９】
７．赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムとＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムの安全性評価
通常のヌードマウスには、生理食塩水、市販のドセタキセル注射液、赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステム、およびＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムを尾静脈注射で投与する。生体内の安全性は、全血の白血球レベルとマウスのクレアチニンクリアランス率を指標として使用して評価される。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、赤血球膜被覆イリノテカンナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムおよび血小板膜被覆イリノテカンナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムの電子顕微鏡写真を示す：図からわかるように、イリノテカンナノ結晶（Ａ）は棒状である。赤血球膜被覆イリノテカンナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステム（Ｂ）と血小板膜被覆イリノテカンナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステム（Ｃ）は、粒径が約４０ｎｍの球状である。
【図２】図２は、赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムの電子顕微鏡写真を示す：図からわかるように、ドセタキセルナノ結晶（Ａ）は、粒径が約３０ｎｍの球状である。赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステム（Ｂ）は、球状を呈し、明確な核膜構造を有し、粒径が約７０ｎｍである。
【図３】図３は、赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムおよびＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムのインビトロ放出曲線を示す：図は、ドセタキセルナノ結晶（ＤＴＸ  ＮＣｓ）、赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶（ＲＢＣ／ＤＴＸ  ＮＣｓ）のナノドラッグデリバリーシステム、ＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステム（ＲＧＤ−ＲＢＣ／ＤＴＸ  ＮＣｓ）がＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）中にリリースしたことを示す。その結果によれば、ドセタキセルが赤血球膜で被覆された後、良好な持続放出能力を有し、標的分子の修飾が放出に影響を及ぼさないことを示す。
【図４】図４は、赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムおよびＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムのインビボ薬物動態曲線およびパラメーター表を示す：図と表からわかるように、ＲＧＤで修飾されているかどうかにかかわらず、赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶（ＲＢＣ／ＤＴＸ  ＮＣｓ）のナノドラッグデリバリーシステムは、ドセタキセルナノ結晶（ＤＴＸ  ＮＣｓ）および市販のドセタキセル注射液（ＤＴＸ）と比較して、マウス体内での循環時間がより長く、且つ標的分子の修飾がマウスの薬物動態に大きな影響を与えない。
【図５】図５は、Ｕ８７皮下異種移植モデルマウスにおける赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムおよびＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムの組織分布を示す棒グラフである：図からわかるように、ＲＧＤで修飾されているかどうかにかかわらず、赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶（ＲＢＣ／ＤＴＸ  ＮＣｓ）のナノドラッグデリバリーシステムは、市販のドセタキセル注射液（ＤＴＸ）と比較して、マウスの肝臓での分布が減少し、血液及び腫瘍での分布が増加し、且つ標的分子の修飾が腫瘍部位での薬物の蓄積を著しく増加させることができる。
【図６】図６は、Ｕ８７脳内同所性腫瘍モデルヌードマウスにおける、赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムおよびＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムの組織分布を示す棒グラフである：図からわかるように、市販のドセタキセル注射液（ＤＴＸ）と比較して、ＲＧＤで修飾されているかどうかにかかわらず、赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶（ＲＢＣ／ＤＴＸ  ＮＣｓ）のナノドラッグデリバリーシステムは、マウスの肝臓での分布が減少し、血液での分布が増加し、それに、標的分子の修飾が、ナノドラッグデリバリーシステムを血液脳腫瘍関門を越えて運ぶことができ、腫瘍部位での薬物の蓄積を著しく増加させることができる。
【図７】図７は、赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムおよびＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムのインビトロ抗Ｕ８７細胞活性曲線を示す：図からわかるように、Ｕ８７細胞は、それぞれ市販のドセタキセル注射液液（ＤＴＸ）、ドセタキセルナノ結晶（ＤＴＸ  ＮＣｓ）、赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶（ＲＢＣ／ＤＴＸ  ＮＣｓ）のナノドラッグデリバリーシステム、ＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノクリスタ（ＲＧＤ−ＲＢＣ／ＤＴＸ  ＮＣｓ）のナノドラッグデリバリーシステムと４８時間インキュベートされた後、ＩＣ５０はそれぞれ４１．６ｎＭ、４９．７ｎＭ、２３３．８ｎＭおよび１３．８ｎＭである。その結果、ＲＧＤで修飾されているかどうかにかかわらず、ＲＢＣ／ＤＴＸ  ＮＣｓはインビトロでＵ８７細胞の成長を抑制でき、ＲＧＤ修飾のＲＢＣ／ＤＴＸ  ＮＣｓのインビトロ抗腫瘍活性は、標的のないグループのそれよりもはるかに優れる。
【図８】図８は、赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムおよびＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムの抗Ｕ８７皮下腫瘍評価を示す：図Ａは、Ｕ８７皮下移植ヌードマウスの腫瘍体積の経時変化曲線を示す；図Ｂは、Ｕ８７皮下移植ヌードマウスの生存曲線を示す；図Ｃは、投与後２８日目の様々な群の腫瘍抑制率の比較である；図Ｄは、投与後の生存期間中央値での様々なグループの腫瘍抑制率の比較である。結果は、ドセタキセルナノ結晶（ＤＴＸ  ＮＣｓ）を投与すると、モデルのヌードマウスがすぐに死ぬことを示す。赤血球膜（ＲＢＣ／ＤＴＸ  ＮＣｓ）で被覆された後のドセタキセルナノ結晶は、通常の生理食塩水（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））（生存期間の中央値は２７．５日）と市販のドセタキセル注射液（ＤＴＸ）（生存期間の中央値は３８日）、赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶（ＲＢＣ／ＤＴＸ  ＮＣｓ）のナノドラッグデリバリーシステムは、モデルヌードマウスの生存期間を大幅に延長する（生存期間の中央値は４２日である）。  ＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶（ＲＧＤ−ＲＢＣ／ＤＴＸ  ＮＣｓ）のナノドラッグデリバリーシステムは、モデルヌードマウスの生存期間を最も大幅に延長する（生存期間の中央値は４７日である）。投与後２８日目の各群の腫瘍抑制率をそれぞれ以下に示す：ＲＢＣ／ＤＴＸ  ＮＣｓ群の腫瘍抑制率は８９．１８±６．７５％であり、ＲＧＤ−ＲＢＣ／ＤＴＸ  ＮＣｓ群の腫瘍抑制率は９７．２８±２．４６％であり、ＤＴＸグループのそれ（５３．２８±１９．７９％）よりも有意に高い。投与後の生存期間中央値における各グループの腫瘍抑制率は、それぞれ以下のとおりである。ＲＢＣ／  ＤＴＸ  ＮＣｓ群の腫瘍抑制率は３３．７６％±６．３７％であり、ＲＧＤ−ＲＢＣ  ／  ＤＴＸ  ＮＣｓの腫瘍抑制率はグループが７７．２４％±６．５８％であり、これはＤＴＸグループのそれ（４．９３％±２．５２％）よりも有意に高い。結果は、ＲＧＤ−ＲＢＣ／ＤＴＸ  ＮＣｓがインビボで最高の抗腫瘍効果を有することを示す。
【図９】図９は、赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムおよびＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムの抗Ｕ８７脳内同所性腫瘍評価を示す：Ｕ８７脳内同所性腫瘍モデルヌードマウスの生存曲線を図に示す。その結果、通常の生理食塩水（ＰＢＳ）（生存期間の中央値は３２日），市販のドセタキセル注射液（ＤＴＸ）（生存期間の中央値は３２．５日）および赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶（ＲＢＣ／ＤＴＸ  ＮＣｓ）のナノドラッグデリバリーシステム（生存期間中央値は３４．５日）と比較して、ＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶（ＲＧＤ−ＲＢＣ／ＤＴＸ  ＮＣｓ）のナノドラッグデリバリーシステムは、マウス生存期間を大幅に延長する（生存期間の中央値は６２日である）。
【図１０】図１０は、赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムおよびＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムの生体内安全性評価を示す：図Ａは、正常なヌードマウスへの投与後１２日以内の全血中の白血球数の変化を示す。その結果、市販のドセタキセル注射液（ＤＴＸ）が明らかに、マウスの白血球のレベルを低下させ、投与後５日で最小値に達し、投与後１０日で正常レベルに戻ることを示す。赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶（ＲＢＣ／ＤＴＸ  ＮＣｓ）のナノドラッグデリバリーシステムとＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶（ＲＧＤ−ＲＢＣ／ＤＴＸ  ＮＣｓ）のナノドラッグデリバリーシステムは、白血球数の減少を大幅に遅らせることができる。図Ｂは、正常なヌードマウスへの投与の１２日後のクレアチニンクリアランス率を示す。その結果、ＤＴＸがマウスのクレアチニンクリアランス率を大幅に低下させ、腎毒性を有し、ＲＢＣ／ＤＴＸ  ＮＣｓ、ＲＧＤ−ＲＢＣ／ＤＴＸ  ＮＣｓ及び生理食塩水グループのクレアチニンクリアランス率が明確に相違しない。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
以下の実施例は、本発明のさらなる理解を助けるために提供されるが、本発明は、以下の説明の範囲に限定されない。
【００４２】
実施例１：赤血球膜被覆、血小板膜被覆、腫瘍細胞膜被覆イリノテカンおよびカバジタキセルナノ結晶、のナノドラッグデリバリーシステムの調製および特徴
【００４３】
１．赤血球膜被覆イリノテカンナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムの調製と特性評価
【００４４】
雄のＩＣＲマウスの全血を採取し、４℃で５分間、１０００ｇ／分で遠心分離し、上層の血清および白血球は除去し、下層の赤血球を１×ＰＢＳで洗浄した後、０．２５×ＰＢＳに４℃で３０分間再懸濁し、ヘモグロビンを４℃で７分間１５０００ｇ／分の遠心分離により除去し、得られた淡赤色赤血球膜を再懸濁して再蒸留水に保存し、その膜タンパク質濃度をビシンコニン酸（ＢＣＡ）キットにより検出した。４ｍｇのイリノテカンと適切な量の界面活性剤Ｆ１２７を秤量し、２５ｍＬのナス型フラスコに入れた後、適切な量のメタノールを加えて溶解し、膜の水和を形成させ、調製することによって、良好な分散性を持つイリノテカンナノ結晶を得た。赤血球膜懸濁液を１００Ｗで３分間超音波処理して、赤血球膜小胞を得た。次に、４ｍｇ／ｍＬのイリノテカンナノ結晶溶液を赤血球膜小胞（２：１、ｗ／ｗ）と混合し、超音波処理して赤血球膜で被覆されたイリノテカンナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムを得た。その形態は、酢酸ウラニルネガティブステイン電子顕微鏡法により観察された。結果を図１に示す。
【００４５】
２．血小板膜被覆イリノテカンナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムの調製と特性評価
【００４６】
雄のＩＣＲマウスの全血を採取し、４℃で５分間３００ｇ／分で遠心分離して上清を取得し、取得した上清を２０００ｇ／分で５分間遠心分離し、生成した上清を除去し、下層の血小板を再蒸留水で洗浄した後、凍結と解凍を３回繰り返し、その後、２００００ｇ／分で７分間遠心分離した後、得られた白色血小板膜を再懸濁し、再蒸留水に保存し、その膜タンパク質濃度をＢＣＡキットにより検出した。血小板膜懸濁液を上記のイリノテカンナノ結晶溶液で上記１と同様な処理をすることで、血小板膜で被覆されたイリノテカンナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムを得た。その形態は、酢酸ウラニルネガティブステイン電子顕微鏡法により観察された。結果を図１に示す。
【００４７】
３．腫瘍細胞膜被覆イリノテカンナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムの調製
【００４８】
腫瘍細胞（Ｕ８７）を緩衝液（２０．５ｇのマンニトールと１３ｇのスクロースを５００  ｍＬのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（Ｔｒｉｓ）緩衝液、ｐＨ  ７．５に溶解することにより得られる）に移し、８００ｇ／分で５分間遠心分離し、上清を除去し、残渣物質に上記緩衝液を加え、さらにエチレンジアミン四酢酸とプロテアーゼ抑制剤を加え、超音波均質化を行い、均質化した溶液を８００ｇ／分で５分間遠心分離して上清を取得し、取得した上清を−２０℃で８０００ｇ／分で２５分間遠心分離して上清を取得し、取得した上清を−２０℃で３００００ｇ／分で３５分間遠心分離し、上清を捨てて腫瘍細胞膜を得た。腫瘍細胞膜を再懸濁し、０．２ｍＭエチレンジアミン四酢酸溶液に保存し、その膜タンパク質濃度をＢＣＡキットで検出した。腫瘍細胞膜懸濁液を上記のイリノテカンナノ結晶溶液で上記１と同様な処理をすることで、腫瘍細胞膜被覆イリノテカンナノ結晶のナノ薬物デリバリーを得た。
【００４９】
４．赤血球膜被覆、血小板膜被覆、腫瘍細胞膜被覆カバジタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムの調製
【００５０】
調製方法は、赤血球膜被覆、血小板膜被覆、腫瘍細胞膜被覆イリノテカンナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムの調節方法と同様である。
【００５１】
実施形態２：赤血球膜、ＲＧＤ、ＶＡＰ、ＷＶＡＰ、Ａ７Ｒ及びＣＤＸ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムの調製および特徴
【００５２】
１．赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムの調製と特性評価
【００５３】
調製および特性評価の方法は、赤血球膜被覆イリノテカンナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムと同様である。結果を図２に示す。
【００５４】
２．ＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムの調製
【００５５】
基本調製プロセスは、赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムと同様である。ＲＧＤの修正方法は次のとおりである：４０μＬのストレプトアビジン−ＰＥＧ３４００−ＤＳＰＥのＰＢＳ溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を、１００μＬの全血から得られた赤血球膜小胞と３７°Ｃの水浴で３０分間インキュベートして、ストレプトアビジン−赤血球膜小胞が得られた。得られたストレプトアビジン−赤血球膜小胞をドセタキセルナノ結晶と混合し、超音波処理して、ストレプトアビジン修飾赤血球膜被覆ナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムを得た。次に、１００μＬのビオチン−ＰＥＧ３５００−ＲＧＤのＰＢＳ溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ）を加え、３７°Ｃの水浴で１０分間インキュベートして、ＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のドラッグデリバリーシステムを取得した。
【００５６】
３．ＶＡＰ、ＷＶＡＰ、Ａ７Ｒ、またはＣＤＸ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムの調製
【００５７】
調製方法は、ＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムと同様である。
【００５８】
実施形態３：赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムおよびＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムのインビトロ放出試験
【００５９】
インビトロ放出は、透析バッグ法により決定された。０．３ｍＬのドセタキセルナノ結晶（ＤＴＸ  ＮＣｓ）、赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステム（ＲＢＣ／ＤＴＸ  ＮＣｓ）、ＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステム（ＲＧＤ−  ＲＢＣ／ＤＴＸ  ＮＣｓ）をそれぞれ透析バッグ（７ｋＤａの分子量カットオフ）に入れて密封し、ｐＨ  ７．４のＰＢＳ溶液（１％ドデシル硫酸ナトリウムを含む）６ｍＬに入れ、３７°Ｃで振った。そして、放出培地０．２  ｍＬをそれぞれ１５分、３０分、１時間、１．５時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間および７２時間で採取し、同量の新鮮な培地を加えた。採取した溶液を適切に希釈し、ドセタキセル濃度をＨＰＬＣ法で決定し、放出曲線をプロットした。結果を図３に示す。
【００６０】
実施形態４：赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムおよびＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムのインビボ薬物動態試験
【００６１】
ＩＣＲマウスに、それぞれ１５０μＬの、市販のドセタキセル注射液剤（ＤＴＸ）、ドセタキセルナノ結晶（ＤＴＸ  ＮＣｓ）、赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステム（ＲＢＣ／ＤＴＸ  ＮＣｓ）、およびＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステム（ＲＧＤ−ＲＢＣ／ＤＴＸ  ＮＣｓ）を尾静脈注射液した。そして、それぞれ５０μＬの全血を５分、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、および７２時間で採取し、ジエチルエーテルとテトラヒドロフランで構成される溶液（１：４）で２回抽出した後で、蒸発乾燥させ、アセトニトリルに再溶解させ、ＨＰＬＣ分析を行った。結果を図４に示す。
【００６２】
実施形態５：赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムおよびＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムのインビボ組織分布試験
【００６３】
Ｕ８７皮下腫瘍または同所性動物モデルを構築し、１５０μＬの市販のドセタキセル注射液（ＤＴＸ）、赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステム（ＲＢＣ／ＤＴＸ  ＮＣｓ）、およびＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステム（ＲＧＤ−ＲＢＣ／ＤＴＸ  ＮＣｓ）を尾静脈注射した。組織と全血はそれぞれ２時間と２４時間で採取した。組織を均質化し、ジエチルエーテルとテトラヒドロフラン（１：４）で構成される溶液で２回抽出し、蒸発乾燥させ、アセトニトリルに再溶解させ、ＨＰＬＣ分析を行った。結果を図５および６に示す。
【００６４】
実施形態６：赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムおよびＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムのインビトロ薬力学的評価
【００６５】
市販のドセタキセル注射液（ＤＴＸ）、ドセタキセルナノ結晶（ＤＴＸ  ＮＣｓ）、赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステム（ＲＢＣ／ＤＴＸ  ＮＣｓ）、およびＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステム（ＲＧＤ−ＲＢＣ／ＤＴＸ  ＮＣｓ）がＵ８７腫瘍細胞のインビトロ成長に対する抑制効果を、ＭＴＴアッセイによって測定した。対数増殖期のＵ８７細胞を０．２５％トリプシンで消化し、ピペットで単一細胞にした後、細胞を１０％ＦＢＳを含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に懸濁し、９６細胞培養プレートに３０００細胞／ウェルの密度および０．２ｍＬ／ウェルの容量で接種し、その中で、細胞を含まない培地をブランクウェルとして追加するために、３つのウェルを残した。培養は二酸化炭素インキュベーターで２４時間行った。薬物の各グループは、細胞培養培地で順次６倍希釈された。９６ウェル細胞培養プレートの細胞培養培地を吸引し、各ウェルに２００μＬシリーズ濃度の薬液を加えた。各濃度に対して３つのウェルを設定し、培養液のみを添加した３つのウェルをコントロールウェルとして設定した。４８時間培養した後、２０μＬのＭＴＴ試薬（５  ｍｇ  ／  ｍＬ）をテストウェル、コントロールウェル、およびブランクウェルに加えて４時間インキュベートし、その後培地を廃棄した。１５０μＬのジメチルスルホキシドを各ウェルに添加し、生成した青紫色結晶が十分に溶解するまで振盪した後、マイクロプレートリーダーで各ウェルの４９０ｎｍでの吸光度（Ａ）を測定した。細胞生存率は、次の式に従って計算された。
生存率＝（Ａ４９０テストウェル−Ａ４９０ブランクウェル）／（Ａ４９０コントロールウェル−Ａ４９０ブランクウェル）×１００％
薬物濃度の対数にわたる生存率をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアによってプロットし（図７）、最大抑制濃度の半分（ＩＣ５０）を計算した。
【００６６】
実施形態７：赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムおよびＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムのインビボ薬力学的評価
【００６７】
Ｕ８７皮下腫瘍動物モデルを構築し、腫瘍サイズを定期的に観察し、腫瘍サイズが１５０ｍｍ３に達したとき、グループに分けて試験を実施した。そして、それぞれＰＢＳ（ｐＨ７．４）、市販のドセタキセル注射液（ＤＴＸ）、ドセタキセルナノ結晶（ＤＴＸ  ＮＣｓ）、赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステム（ＲＢＣ／ＤＴＸ  ＮＣｓ）、およびＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステム（ＲＧＤ−ＲＢＣ／ＤＴＸ  ＮＣｓ）を尾静脈注射した。ドセタキセルは、単回投与で２５ｍｇ／ｋｇの総用量で投与された。ヌードマウスの生存時間を記録し（図８Ａ）、腫瘍の長径（ａ）と短径（ｂ）を１日おきに測定した。各グループのヌードマウスの腫瘍体積を式に従って計算し、経時的な腫瘍体積の曲線をプロットし（図８Ｂ）、腫瘍抑制率を計算した（図８Ｃおよび８Ｄ）。腫瘍体積は、次の式に従って計算された。
Ｖ腫瘍体積＝  ０．５（ａ×ｂ２）
腫瘍抑制率は次の式で計算された：
Ｔｕｍｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｒａｔｅ腫瘍抑制率（％）＝（１−Ｖ試験群腫瘍体積／Ｖ対照群腫瘍体積）×１００
【００６８】
Ｕ８７同所性腫瘍動物モデルを構築し、そして、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、市販のドセタキセル注射液（ＤＴＸ）、ドセタキセルナノ結晶（ＤＴＸ  ＮＣｓ）、赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステム（ＲＢＣ／ＤＴＸ  ＮＣｓ）、およびＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステム（ＲＧＤ−ＲＢＣ／ＤＴＸ  ＮＣｓ）を尾静脈注射した。ドセタキセルは、単回投与で２５ｍｇ／ｋｇの総用量で投与された。ヌードマウスの生存時間を記録した（図９）。
【００６９】
実施形態８：赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムおよびＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステムの安全性評価
【００７０】
正常なヌードマウスには、生理食塩水、市販のドセタキセル注射液（ＤＴＸ）、赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステム（ＲＢＣ／ＤＴＸ  ＮＣｓ）、およびＲＧＤ修飾赤血球膜被覆ドセタキセルナノ結晶のナノドラッグデリバリーシステム（ＲＧＤ−ＲＢＣ／ＤＴＸ  ＮＣｓ）を尾静脈注射した。ドセタキセルは、単回投与で２５ｍｇ／ｋｇの総用量で投与された。投与後１、３、５、７、９、および１１日ごとに全血を採取し、白血球数を測定した（図１０Ａ）。投与後１２日目に血清を採取し、クレアチニンクリアランス率を測定した（図１０Ｂ）。
【図１】
2020515642.tif 000003
【図２】
2020515642.tif 000004
【図３】
2020515642.tif 000005
【図４】
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【図５】
2020515642.tif 000007
【図６】
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【図７】
2020515642.tif 000009
【図８】
2020515642.tif 000010
【図９】
2020515642.tif 000011
【図１０】
2020515642.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】令和1年12月11日(2019.12.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオフィルムで被覆された薬物ナノ結晶を具備するナノドラッグデリバリーシステムであって、前記薬物が、前記ナノ結晶の物理的形態を直接的に剛性支持骨格として、バイオフィルムに充填されていることを特徴とするナノドラッグデリバリーシステム。
【請求項２】
請求項１に記載のナノドラッグデリバリーシステムであって、前記薬物ナノ結晶が、骨格材料と薬物ストレージ体の両方を構成する。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載のナノドラッグデリバリーシステムであって、前記薬物ナノ結晶は、物理的または化学的方法による薬物の処理により形成されるナノスケール結晶である。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載のナノドラッグデリバリーシステムであって、前記薬物ナノ結晶が１０〜１０００ｎｍ、好ましくは１０〜２００ｎｍの粒径を有する。
【請求項５】
請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載のナノドラッグデリバリーシステムであって、前記薬物が治療薬および／または診断薬である。
【請求項６】
請求項５に記載のナノドラッグデリバリーシステムであって、前記治療薬は、物理的または化学的方法により調製された前記ナノ結晶の抗腫瘍薬、抗感染薬、抗心血管及び脳血管疾患の薬、抗リンパ系障害薬、抗免疫系障害薬及び鎮痛薬からなる群から選択される１つまたは複数のものであり、
好ましくは、前記抗腫瘍薬は、パクリタキセルなどのタキサン薬，ドキソルビシンなどのアントラサイクリン薬，カンプトテシン薬、ビンクリスチン薬、ボルテゾミブなどのゾミブ薬，シスプラチン薬，イリノテカンおよび／またはパルテノリドなどの白金薬などからなる群から選択され、前記抗感染薬は、セフトリアキソン、セフォキシチン、アズトレオナム、ストレプトマイシン、アンフォテリシンＢ、バンコマイシン、チゲサイクリン、テイコプラニン、モロキシジン、ビダラビンおよびゾビラックスからなる群から選択され、前記抗心血管及び脳血管疾患の医薬品は、ガングリオシド、フェルラ酸、リグストラジン、トロキセルチン、およびオザグレルナトリウムからなる群から選択され、前記抗リンパ系障害薬はパノビノスタットであり、前記抗免疫系障害薬は、メチルプレドニゾロンおよびシクロスポリンからなる群から選択され、そして、前記鎮痛薬は、モルヒネおよびメタドンからなる群から選択され、
最も好ましくは、前記医薬品はイリノテカン、ドセタキセルまたはカバジタキセルである。
【請求項７】
請求項５に記載のナノドラッグデリバリーシステムであって、前記診断剤は、物理的または化学的方法により形成された前記ナノ結晶の蛍光物質、近赤外色素、および磁気共鳴画像化剤からなる群から選択される１つまたは複数のものである。
【請求項８】
請求項１〜請求項７のいずれか一項に記載のナノドラッグデリバリーシステムであって、
前記バイオフィルムが脂質二重層を有する膜構造を有し、
好ましくは、前記バイオフィルムは天然細胞膜または人工バイオフィルムであり、
より好ましくは、前記天然細胞膜は、赤血球膜，血小板膜，マクロファージ膜，白血球膜および腫瘍細胞膜からなる群から選択される１つまたは複数のものであり、
前記人工バイオフィルムはリポソーム膜であり、
さらに好ましくは、前記バイオフィルムは、赤血球膜、血小板膜および腫瘍細胞膜からなる群から選択される１つまたは複数のものである。
【請求項９】
請求項１〜請求項８のいずれか一項に記載のナノドラッグデリバリーシステムであって、
前記ナノドラッグデリバリーシステムの表面が、標的分子によってさらに修飾されることで、アクティブなターゲティング機能を備えるバイオフィルムで前記ナノ結晶を被覆するナノドラッグデリバリーシステムとして前記ナノドラッグデリバリーシステムを構築し、
前記標的分子は、ポリペプチド標的分子であり、
より好ましくは、前記ポリペプチド標的分子は、ＲＧＤ、ＶＡＰ、ＷＶＡＰ、Ａ７ＲおよびＣＤＸからなる群から選択される１つまたは複数のものである。
【請求項１０】
前記請求項１〜請求項９のいずれか一項に記載のナノドラッグデリバリーシステムの調製する方法であって、薬物をナノ結晶の物理的形態で剛性支持骨格として、バイオフィルムに充填することを含む。
【請求項１１】
前記請求項１〜請求項９のいずれか一項に記載のナノドラッグデリバリーシステムの、生体内治療および／または診断製品用の医薬品の調製への使用。
【国際調査報告】
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