(57)【要約】本開示は、肝機能を改善するためにインビボで使用することができ、薬剤の肝代謝及び／または肝毒性を決定するためにインビトロで使用することができ、患者の生体液から毒性化合物を除去するためにエクスビボで使用することができる被包化肝組織を提供する。被包化肝組織は、生体適合性架橋ポリマーで少なくとも部分的に被覆された少なくとも１つの肝臓オルガノイドを含む。被包化肝組織の調製プロセスも提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の生体適合性架橋ポリマーで少なくとも部分的に被覆された少なくとも１つの肝臓オルガノイドを含む被包化肝組織であって、前記少なくとも１つの肝臓オルガノイドが、（ｉ）肝細胞、間葉系細胞、及び任意選択の内皮細胞を含む細胞コアを含み、（ｉｉ）実質的に球の形状を有し、（ｉｉｉ）約５０〜約５００μｍの相対直径を有する、前記被包化肝組織。
【請求項２】
前記少なくとも１つの肝臓オルガノイドが、前記第１の生体適合性架橋ポリマーで実質的に被覆される、請求項１に記載の被包化肝組織。
【請求項３】
前記細胞コアが、肝実質細胞及び／または胆管上皮細胞を含む、請求項１または請求項２に記載の被包化肝組織。
【請求項４】
前記第１の生体適合性架橋ポリマーが、ポリ（エチレン）グリコール（ＰＥＧ）を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の被包化肝組織。
【請求項５】
第２の生体適合性架橋ポリマーをさらに含み、前記第１の生体適合性架橋ポリマーが、前記第２の生体適合性架橋ポリマーによって少なくとも部分的に被覆される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の被包化肝組織。
【請求項６】
前記第１の生体適合性架橋ポリマーが、前記第２の生体適合性架橋ポリマーで実質的に被覆される、請求項５に記載の被包化肝組織。
【請求項７】
前記第１の生体適合性架橋ポリマーが、少なくとも部分的に生分解性である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の被包化肝組織。
【請求項８】
前記第２の生体適合性架橋ポリマーが、生分解に対して少なくとも部分的に抵抗性である、請求項５〜７のいずれか１項に記載の被包化肝組織。
【請求項９】
前記第２の生体適合性架橋ポリマーが、ポリ（エチレン）グリコール（ＰＥＧ）を含む、請求項５〜８のいずれか１項に記載の被包化肝組織。
【請求項１０】
前記第１の生体適合性架橋ポリマー全体に分散した複数の肝臓オルガノイドを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の被包化肝組織。
【請求項１１】
被包化肝組織の調製プロセスであって、前記プロセスが、
・（ｉ）肝細胞、間葉系細胞、及び任意選択の内皮細胞を含む細胞コアと、（ｉｉ）実質的に球の形状と、（ｉｉｉ）約５０〜約５００μｍの相対直径と、を有する少なくとも１つの肝臓オルガノイドが得られるように、肝細胞、間葉系細胞、及び任意選択の内皮細胞を混合し、浮遊培養すること、ならびに
・前記少なくとも１つの肝臓オルガノイドを第１の生体適合性架橋ポリマーで少なくとも部分的に被覆すること、
を含む、前記プロセス。
【請求項１２】
前記肝細胞と前記間葉系細胞とが、培養の前に、１：０．２〜７の比で混合される、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記肝細胞と前記内皮細胞とが、培養の前に、１：０．２〜１の比で混合される、請求項１１または請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記肝細胞、前記間葉系細胞、及び前記内皮細胞の少なくとも１つが、幹細胞を分化させることで得られる、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項１４に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記肝細胞が、
・胚体内胚葉及び／もしくは後方前腸から得られる細胞、
・肝芽細胞もしくは肝前駆細胞、ならびに／または
・肝実質細胞、
である、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１７】
前記間葉系細胞が、間葉系幹細胞または間葉系前駆細胞である、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１８】
前記内皮細胞が、内皮前駆細胞である、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの肝臓オルガノイドを前記第１の生体適合性架橋ポリマーで実質的に被覆することを含む、請求項１１〜１８のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２０】
前記第１の生体適合性架橋ポリマーが、ポリ（エチレン）グリコール（ＰＥＧ）を含む、請求項１１〜１９のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２１】
前記第１の生体適合性架橋ポリマーを第２の生体適合性架橋ポリマーで少なくとも部分的に被覆することをさらに含む、請求項１１〜２０のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２２】
前記第１の生体適合性架橋ポリマーを前記第２の生体適合性架橋ポリマーで実質的に被覆することを含む、請求項２１に記載のプロセス。
【請求項２３】
前記第１の生体適合性架橋ポリマーが、少なくとも部分的に生分解性である、請求項１１〜２２のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２４】
前記第２の生体適合性架橋ポリマーが、生分解に対して少なくとも部分的に抵抗性である、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２５】
前記第２の生体適合性架橋ポリマーが、ポリ（エチレン）グリコール（ＰＥＧ）を含む、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２６】
前記第１の生体適合性架橋ポリマーに複数の肝臓オルガノイドを含めることをさらに含む、請求項１１〜２５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２７】
請求項１１〜２６のいずれか１項に記載のプロセスによって入手可能な、被包化肝組織。
【請求項２８】
医薬を製造するための、請求項１〜１０または請求項２７のいずれか１項に記載の被包化肝組織。
【請求項２９】
それを必要とする対象の肝機能を回復または改善するための、請求項１〜１０または請求項２７のいずれか１項に記載の被包化肝組織。
【請求項３０】
肝不全と関連する症状を治療または軽減するための、請求項２９に記載の被包化肝組織。
【請求項３１】
前記肝不全が、急性肝不全、慢性肝不全、または急性増悪する慢性肝不全である、請求項３０に記載の被包化肝組織。
【請求項３２】
肝臓代謝の先天異常と関連する症状を治療または軽減するための、請求項２９に記載の被包化肝組織。
【請求項３３】
それを必要とする対象の肝機能の回復方法または改善方法であって、前記方法が、請求項１〜１０または請求項２７のいずれか１項に記載の被包化肝組織の肝臓オルガノイドを前記対象の前記肝機能が改善するように有効量で前記対象の生体液と接触させることを含む、前記方法。
【請求項３４】
前記肝機能の回復または改善が、肝不全と関連する症状を治療または軽減するためのものである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記肝不全が、急性肝不全、慢性肝不全、または急性増悪する慢性肝不全である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記肝機能の回復または改善が、肝臓代謝の先天異常と関連する症状を治療または軽減するためのものである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記被包化肝組織が、前記第１の生体適合性架橋ポリマー全体に分散した複数の肝臓オルガノイドを含む、請求項２９〜請求項３６のいずれか１項に記載の被包化肝組織または方法。
【請求項３８】
薬剤の肝代謝または肝毒性の決定方法であって、前記方法が、
ａ）試験混合物を得るために、請求項１〜１０または請求項２７のいずれか１項に記載の被包化肝組織と前記薬剤とを接触させること、
ｂ）前記試験混合物における少なくとも１つの薬剤関連肝代謝物または肝臓パラメーターを決定すること、及び
ｃ）前記薬剤の前記肝代謝または前記肝毒性を決定するために、段階ｂ）に記載の少なくとも１つの薬剤関連肝代謝物または肝臓パラメーターを対照の薬剤関連肝代謝物または肝臓パラメーターと比較すること、
を含む、前記方法。
【請求項３９】
前記被包化組織の前記少なくとも１つの肝臓オルガノイドの少なくとも１つの細胞型において前記薬剤が肝毒性を誘導するかどうかを決定するための、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記少なくとも１つの細胞型が、肝実質細胞または胆管上皮細胞である、請求項３８または請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
第１の肝臓オルガノイドを含む第１の被包化肝組織及び第２の肝臓オルガノイドを含む第２の被包化肝組織と前記薬剤とを接触させることを含み、前記第１の肝臓オルガノイドの細胞が、前記第２の肝臓オルガノイドの細胞に対して同種異系である、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記被包化肝組織が、前記第１の生体適合性架橋ポリマー及び前記少なくとも１つの肝臓オルガノイドから本質的になる、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
薬剤の肝代謝を決定するためのキットであって、前記キットが、請求項１〜１０または請求項２７のいずれか１項に記載の被包化肝組織と、請求項３８〜４２のいずれか１項に記載の方法を実施するための説明と、を含む、前記キット。
【請求項４４】
組織培養支持体をさらに含む、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
前記組織培養支持体が、少なくとも１つのウェルを含む、請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
前記被包化肝組織が、前記少なくとも１つのウェルの底に存在する、請求項４５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願及び関連文書の相互参照
本出願は、２０１７年１１月２３日出願の米国仮特許出願第６２／４２５，８１１号の優先権を主張し、当該文献の内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、肝細胞、間葉系細胞、及び任意選択の内皮細胞を含む肝臓オルガノイド（生体適合性架橋ポリマー内に被包され得る）、ならびに肝機能の回復または改善ならびに薬剤（例えば、リード化合物または研究新薬）の肝代謝及び／または肝毒性の決定のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ほとんどの進行性肝疾患では、肝硬変及び慢性肝不全（ＬＦ）が一般的な予後である。肝臓の合成機能及び解毒機能が失われることで、とりわけ、腹水症、肝性脳症、及び胃腸出血などの主要な全身性の悪影響が生じる。さらに、すべての非がん性肝臓関連死のほぼ１０％が急性ＬＦに起因するものであり、急性ＬＦは、臓器の自然再生能を超える突発性の侵襲が肝臓に加わる結果として生じる極めて重篤な進行性症候群である。小児及び青年の急性ＬＦでは、その予後は不良であり、自身の元々の肝臓を失うことなく生き延びる患者は５０％にすぎない。さらに、肝不全には至らないが、肝臓及び肝臓外に重篤な悪影響を伴う肝臓症状がかなり多く存在しており、こうした肝臓症状は、肝臓代謝の先天異常（尿素サイクル異常症、クリグラー・ナジャー症候群、家族性高コレステロール血症など）などである。個別には稀であるものの、まとめて考えると、肝臓に基づく代謝疾患は、小児肝移植の１０％超に相当する。そのような症状に有効な治療は極めて少ない。すべての症例において、治療によって症状が低減され、予後が改善するが、疾患が治癒するわけではない。急性ＬＦ、慢性ＬＦ、及び急性増悪する慢性ＬＦに対する標準的な治療は肝移植であり、肝臓代謝の先天異常に対してもそのほとんどでそうであるが、肝臓死の件数が一年当たり５０００件を超えるのに対し、カナダで毎年実施される移植は４００件にすぎない。肝移植に適合する患者は少数であるため、適合する臓器ドナーを待つ間に死亡する例があまりにも多く見られる。急性ＬＦを患う小児は、自身の疾患が不可逆的に重篤化しすぎる前に、診断から数日以内に移植を受ける必要がある（２０％がドナーを待ちながら死亡する）。幼児ではリスクがさらに高くなり、そのほぼ半分が移植前に死亡し、移植を受けた幼児の５０％が手術後に死亡する。さらに、肝移植には大きな制限が存在する。短期死亡率及び罹患リスクがかなり高いことに加えて、肝移植では、生涯を通じて免疫を抑制する必要があり、肝臓及び肝臓外に重篤かつ長期的な問題を併発することが多い。肝臓代謝の先天異常を患う小児の予後ははるかに良好であるが、そのような患者は、待機リストでの優先度が非常に低く、移植を待つ間に全身性の合併症を発症することが多い。そのようにリスクが高いことは、自身の肝臓を再生させながら肝機能を一次的に置き換えることのみが必要な多くの急性ＬＦ患者、ならびに単一の酵素が欠乏しているが、肝実質は正常であることによって特徴付けられる多くの代謝性肝疾患には不釣り合いなことである。したがって、ＬＦ及び代謝性肝疾患を患う小児及び成人の肝機能を回復させるための新たな治療が緊急に必要とされている。
【０００４】
肝機能を一次的に置き換えるために、部分的肝移植または体外式解毒デバイスに基づく代替手法が長年にわたっていくつか開発されてきたが、そのほとんどで満足のいく結果は得られていない。健康なドナーに由来する初代肝細胞を移植すると、慢性ＬＦ及び肝臓代謝の先天異常を有する患者において一時的な改善誘導が生じることが過去２０年間で示された。そのような手法によって肝疾患に対する細胞治療の実現可能性が示されたが、臓器が不足していること、注射の反復実施及び生涯にわたる免疫抑制が必要であること、ならびに細胞品質が極度にばらつくことによってそのような手法は制限を受ける。
【０００５】
さらに、化学毒性を評価するための代表的な毒性学的手法では、時間もかかり、費用も必要となる複雑なインビボ試験が必要である。動物試験では、動物愛護、時間、及び費用に関する懸念が生じる。さらに、ヒトでの健康への悪影響をげっ歯類でのインビボ試験で予測することの精度については、近年、論争の種となっている。毒性試験においてインビトロモデル系を使用することには多くの利点が存在し、こうした利点には、動物数の低減、動物を維持及び管理する費用の低減、試験に必要な化学物質量の低減、必要時間の短縮、ならびに複数の化学物質及びその代謝物を評価するためのスループットの向上が含まれる。インビトロ系では、化学代謝の試験、毒性機構の評価、酵素動力学の測定、及び用量反応関係の検討も可能になる。腸を介して吸収される任意の化合物、または皮下経路、筋肉内経路、もしくは静脈内経路を介して注射される任意の化合物を代謝、活性化、または不活化することにおいて肝臓は中心的な役割を担っている。初代ヒト肝実質細胞を使用することは、その入手可能性が乏しいこと、ならびにその品質及びインビトロでの代謝活性が極度にばらつくことによって制限されている一方で、入手可能な細胞株は肝臓生理機能を完全に示すものではない。したがって、リード化合物または研究薬物が肝臓によってどのように代謝され、肝毒性を誘導するかどうかを評価するための実行可能なインビトロ培養系を確立する必要がある。
【発明の概要】
【０００６】
第１の態様によれば、本開示は、第１の生体適合性架橋ポリマーで少なくとも部分的に被覆された少なくとも１つの肝臓オルガノイドを含む被包化肝組織を提供する。肝臓オルガノイドは、肝細胞、間葉系細胞、及び任意選択の内皮細胞を含む細胞コアを含む。肝臓オルガノイドは、実質的に球の形状を有し、約５０〜約５００μｍの相対直径を有する。１つの実施形態では、少なくとも１つの肝臓オルガノイドは、第１の生体適合性架橋ポリマーで実質的に被覆される。さらに別の実施形態では、細胞コアは、肝実質細胞及び／または胆管上皮細胞を含む。さらに別の実施形態では、第１の生体適合性架橋ポリマーは、ポリ（エチレン）グリコール（ＰＥＧ）を含む。さらに別の実施形態では、被包化肝組織は、第２の生体適合性架橋ポリマーをさらに含み、第１の生体適合性架橋ポリマーは、第２の生体適合性架橋ポリマーによって少なくとも部分的に被覆される。１つの実施形態では、第１の生体適合性架橋ポリマーは、第２の生体適合性架橋ポリマーで実質的に被覆される。さらに別の実施形態では、第１の生体適合性架橋ポリマーは、少なくとも部分的に生分解性であり、及び／または第２の生体適合性架橋ポリマーは、生分解に対して少なくとも部分的に抵抗性である。さらに別の実施形態では、第２の生体適合性架橋ポリマーは、ポリ（エチレン）グリコール（ＰＥＧ）を含む。さらに別の実施形態では、被包化肝組織は、第１の生体適合性架橋ポリマー全体に分散した複数の肝臓オルガノイドを含む。
【０００７】
第２の態様によれば、本開示は、被包化肝組織の調製プロセスを提供する。広くは、プロセスは、（ｉ）肝細胞、間葉系細胞、及び任意選択の内皮細胞を含む細胞コアと、（ｉｉ）実質的に球の形状と、（ｉｉｉ）約５０〜約５００μｍの相対直径と、を有する少なくとも１つの肝臓オルガノイドが得られるように、肝細胞、間葉系細胞、及び任意選択の内皮細胞を混合し、浮遊培養することを最初に含む。プロセスは、少なくとも１つの肝臓オルガノイドを第１の生体適合性架橋ポリマーで少なくとも部分的に被覆することも含む。１つの実施形態では、肝細胞と間葉系細胞とは、培養の前に、１：０．２〜７の比で混合される。さらに別の実施形態では、肝細胞と内皮細胞とは、培養の前に、１：０．２〜１の比で混合される。１つの実施形態では、肝細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞の少なくとも１つは、幹細胞（例えば、多能性幹細胞など）を分化させることで得られる。さらに別の実施形態では、肝細胞（ｈｅｐａｔｉｃ  ｃｅｌｌ）は、胚体内胚葉、後方前腸、または肝芽細胞から得ることができ、肝芽細胞及び／または肝実質細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）であり得る。さらに別の実施形態では、間葉系細胞は、間葉系幹細胞または間葉系前駆細胞である。さらに別の実施形態では、内皮細胞は、内皮前駆細胞である。１つの実施形態では、プロセスは、少なくとも１つの肝臓オルガノイドを第１の生体適合性架橋ポリマーで実質的に被覆することを含む。別の実施形態では、第１の生体適合性架橋ポリマーは、ポリ（エチレン）グリコール（ＰＥＧ）を含む。さらに別の実施形態では、プロセスは、第１の生体適合性架橋ポリマーを第２の生体適合性架橋ポリマーで少なくとも部分的に被覆することを含む。さらに別の実施形態では、プロセスは、第１の生体適合性架橋ポリマーを第２の生体適合性架橋ポリマーで実質的に被覆することを含む。さらに別の実施形態では、第１の生体適合性架橋ポリマーは、少なくとも部分的に生分解性であり、及び／または第２の生体適合性架橋ポリマーは、生分解に対して少なくとも部分的に抵抗性である。１つの実施形態では、第２の生体適合性架橋ポリマーは、ポリ（エチレン）グリコール（ＰＥＧ）を含む。さらに別の実施形態では、プロセスは、第１の生体適合性架橋ポリマーに複数の肝臓オルガノイドを含めることをさらに含む。
【０００８】
第３の態様によれば、本開示は、本明細書に記載のプロセスによって入手可能な被包化肝組織または当該プロセスによって得られる被包化肝組織を提供する。
【０００９】
第４の態様によれば、本開示は、医薬を製造するための、本明細書に定義される被包化肝組織を提供する。
【００１０】
第５の態様によれば、本開示は、それを必要とする対象の肝機能を回復または改善するための、本明細書に定義される被包化肝組織を提供する。被包化肝組織は、肝不全と関連する症状の治療または軽減に使用することができる。１つの実施形態では、肝不全は、急性肝不全、慢性肝不全、または急性増悪する慢性肝不全であり得る。さらに別の実施形態では、被包化肝組織は、肝臓代謝の先天異常と関連する症状の治療または軽減に使用することができる。さらに別の実施形態では、被包化肝組織は、第１の生体適合性架橋ポリマー中に複数の肝臓オルガノイドを含む。対象は、哺乳類（例えば、ヒト）であり得る。
【００１１】
第６の態様によれば、本開示は、それを必要とする対象の肝機能の回復方法または改善方法を提供する。広くは、方法は、本明細書に記載の被包化肝組織の肝臓オルガノイドを対象の肝機能が改善するように有効量で対象の生体液と接触させることを含む。１つの実施形態では、方法は、肝機能を回復または改善するためのものであり、この肝機能の回復または改善は、肝不全と関連する症状を治療または軽減するためのものである。１つの実施形態では、肝不全は、急性肝不全、慢性肝不全、または急性増悪する慢性肝不全である。さらに別の実施形態では、方法は、代謝の先天異常と関連する肝機能を回復または改善するためのものである。さらに別の実施形態では、被包化肝組織は、第１の生体適合性架橋ポリマー及び第２の生体適合性架橋ポリマーを含む。対象は、哺乳類（例えば、ヒト）であり得る。
【００１２】
第７の態様によれば、本開示は、薬剤の肝代謝及び／または肝毒性の決定方法を提供する。広くは、方法は、ａ）試験混合物を得るために、記載の被包化肝組織と薬剤とを接触させること、ｂ）試験混合物における少なくとも１つの薬剤関連肝代謝物または肝臓パラメーターを決定すること、ならびにｃ）薬剤の肝代謝及び／または肝毒性を決定するために、段階ｂ）に記載の少なくとも１つの薬剤関連肝代謝物または肝臓パラメーターを対照の薬剤関連肝代謝物または肝臓パラメーターと比較すること、を含む。１つの実施形態では、方法は、被包化組織の少なくとも１つの肝臓オルガノイドの少なくとも１つの細胞型（例えば、肝実質細胞または胆管上皮細胞など）において薬剤が肝毒性を誘導するかどうかを決定するためのものである。１つの実施形態では、方法は、第１の肝臓オルガノイドを含む第１の被包化肝組織及び第２の肝臓オルガノイドを含む第２の被包化肝組織と薬剤とを接触させることを含み、第１の肝臓オルガノイドの細胞（例えば、肝実質細胞及び／または胆管上皮細胞）は、第２の肝臓オルガノイドの細胞（例えば、肝実質細胞及び／または胆管上皮細胞）に対して同種異系である。さらに別の実施形態では、被包化肝組織は、第１の生体適合性架橋ポリマー及び少なくとも１つの肝臓オルガノイドから本質的になる。
【００１３】
第８の態様によれば、本開示は、薬剤の肝代謝を決定するためのキットに関し、キットは、本明細書に記載の被包化肝組織と、本明細書に記載の方法を実施するための説明と、を含む。１つの実施形態では、キットは、組織培養支持体をさらに含む。さらに別の実施形態では、組織培養支持体は、少なくとも１つのウェルを含む。さらに別の実施形態では、被包化肝組織は、少なくとも１つのウェルの底に存在する。
【００１４】
このように、本発明の性質を一般に説明してきたが、ここでは添付の図面を参照することで、その好ましい実施形態が例示として示される：
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１Ａ〜１Ｄは、異種成分非含有かつ支持細胞非含有の厳密条件下で末梢血単核細胞から生成したヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の実施形態を示す。（Ａ）ビトロネクチン上でＥ８Ｆｌｅｘ培地におけるｉＰＳＣコロニーの代表的な性状（スケールバー１０００μＭ（上）、２００μＭ（下））を顕微鏡観察像によって示したものである。（Ｂ）線維芽細胞（薄灰色のバー）、胚性幹細胞（ＥＳＣ、白色のバー）、及びｉＰＳＣ（斜線のバー）における多能性遺伝子（ＮＡＮＯＧ、ＰＯＵ５Ｆ１、及びＳＯＸ２）の発現を逆転写リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）によって決定したものである。（Ｃ）ｉＰＳＣの代表的なフローサイトメトリー分析であり、多能性マーカー（ＳＳＥＡ４及びＴＲＡ−１−８１（ゲートした細胞の９０．８％）、ＴＲＡ−１−８１及びＮＡＮＯＧ（ゲートした細胞の８８．８％））が高度に均一に発現していることを示す。（Ｄ）ｉＰＳＣ（上の横列）における多能性マーカー（ＳＯＸ２、ＴＲＡ−１−８１、ＮＡＮＯＧ、ＳＳＥＡ４、及びＰＯＵ５Ｆ１）の発現を免疫蛍光によって決定し、皮膚線維芽細胞（下の横列）のものと比較したものである（スケールバー２００μＭ）。挿入部は、核（ＤＡＰＩ）染色を示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｎは、ｉＰＳＣのインビトロでの分化を示す。（Ａ）ｉＰＳＣ（薄灰色のバー）と比較すると、ｉＰＳＣ由来の内胚葉細胞（白色のバー）では、内胚葉特異的遺伝子（ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４、ＧＡＴＡ４）が上方制御され、多能性遺伝子（ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＰＯＵ５Ｆ１）が下方制御されることをＲＴ−ｑＰＣＲによって測定したものである。結果は、試験したさまざまな遺伝子の倍数変化の対数として示される。（Ｂ）ｉＰＳＣがインビトロでの分化したときの内胚葉特異的マーカー（ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４、ＧＡＴＡ４）の発現を免疫蛍光によって決定したものである（スケールバー２００μＭ）。結果は、胚体内胚葉（上の横列）及び未分化のｉＰＳＣ（下の横列）について示される。挿入部は、核（ＤＡＰＩ）染色を示す。（Ｃ）胚体内胚葉細胞に分化したｉＰＳＣのＦＯＸＡ２マーカー、ＣＸＣＲ４マーカー、及びＳＯＸ１７マーカーを分析した代表的なフローサイトメトリー分析である。細胞の８７．２％がＦＯＸＡ２＋かつＣＸＣＲ４＋であり、その９８．４％がＳＯＸ１７＋でもある（細胞の８５．８％が三重陽性）。（Ｄ）ｉＰＳＣ由来の腹側後方前腸細胞（この細胞からは肝前駆細胞が生じる）におけるＨＮＦ４αの発現増加である。結果は、ｉＰＳＣ、胚体内胚葉に分化したｉＰＳＣ、及び後方前腸に分化したｉＰＳＣにおけるＨＮＦ４α遺伝子のｍＲＮＡ発現の倍数変化として示される。（Ｅ）ｉＰＳＣ由来の肝実質細胞（白色のバー）において肝臓特異的遺伝子（ＡＦＰ、アルブミン、及びＨＮＦ４α）が上方制御されることをＲＴ−ｑＰＣＲによって決定し、未分化のｉＰＳＣ（薄灰色のバー）と比較したものである。結果は、試験したさまざまな遺伝子（Ｘ軸に示される）の倍数変化の対数として示される。（Ｆ）ｉＰＳＣ由来の肝実質細胞（右の縦列）及び未分化のｉＰＳＣ（左の縦列）における肝臓特異的マーカー（ＡＦＰ（上パネル）、アルブミン（中央パネル）、Ｅ−カドヘリン（下パネル））の発現を免疫蛍光によって測定したものである（スケールバー２００μＭ）。（Ｇ）ｉＰＳＣ由来の肝実質細胞の代表的な形態である。（Ｈ）ｉＰＳＣ由来の肝実質細胞は、ＣｙＰ３Ａ４活性（左パネル）、アルブミン（中央パネル）、及び尿素（左パネル）合成などの肝臓特異的機能を獲得する。結果は、未分化のｉＰＳＣ（「ｉＰＳＣ」と記載）、ｉＰＳＣ由来の肝実質細胞（「ｉＰＳＣ−Ｈｅｐ」と記載）、ｉＰＳＣ由来の肝実質前駆細胞（「肝芽細胞」と記載）、ｉＰＳＣ由来の内胚葉細胞（「内胚葉」と記載）、及び初代ヒト肝実質細胞（「ＰＨＨ」と記載）について示される。括弧内の数は、ｉＰＳＣからそれぞれの細胞型を得るのに要した分化日数を示す。（Ｉ）ｉＰＳＣ由来の間葉系前駆細胞の代表的な形態を顕微鏡観察像によって示したものである（スケールバー２００μＭ）。（Ｊ）免疫蛍光（平滑筋アクチン（αＳＭＡ）−左、及びフィブロネクチン−右）またはフローサイトメトリー（ＣＤ９０、ＣＤ１１７、及びＣＤ１３３）によって示される系統特異的マーカーの発現であり、ｉＰＳＣ由来の間葉系前駆細胞（白色のバー）のものと共に示される。結果は、ｉＰＳＣ由来の間葉系細胞（上の横列）及び未分化のｉＰ���Ｃ（下の横列）についての免疫蛍光（左パネル）として示される（スケールバー２００μＭ）。結果は、臍帯マトリックス幹細胞（ＵＣＭＳＣ、薄灰色のバー）及びｉＰＳＣ由来の間葉系細胞（ｉＰＳＣ−ＭＰＣ、白色のバー）についてのフローサイトメトリー（右パネル）としても示される。（Ｋ）ｉＰＳＣ−ＭＰＣは、骨細胞または脂肪細胞へと分化することができ、骨細胞または脂肪細胞は、それぞれアリザリンレッドＳ染色（上パネル）及びＬｉｐｉｄＴｏｘ染色によって示される（スケールバー２００μｍ）。（Ｌ）ｉＰＳＣ由来の内皮前駆細胞（ｉＥＰＣ）の特徴付けである。顕微鏡観察像による代表的な形態（左上パネル、スケールバー２００μＭ）、ＨＵＶＥＣ（薄灰色のバー）及びｉＰＳＣから分化した内皮前駆細胞（白色のバー）における系統特異的マーカー（ＣＤ３１）の発現をフローサイトメトリーによって測定したもの（右上パネル）、またはｉＰＳＣ（左パネル）、ｉＰＳＣから分化した内皮前駆細胞（中央パネル）、もしくはＨＵＶＥＣ（右パネル）について免疫蛍光によってＣＤ３１を測定したもの（下パネル）として結果が示される。（Ｍ）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）において培養すると、ｉＥＰＣが３Ｄ血管構造の形成能を有していたことが代表的な顕微鏡観察像によって示される（内皮管腔（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｔｕｂｅ）形成アッセイ）。左パネルのスケールバーは１０００μｍであり、右パネルのスケールバーは２００μｍである。
【図３】図３Ａ〜３Ｈは、ｉＰＳＣ由来の細胞から調製した肝臓オルガノイドの実施形態を示す。（Ａ）浮遊培養で成長した肝臓オルガノイドの微視的観察像である。当該肝臓オルガノイドは、ｉＰＳＣ由来の内胚葉由来／肝細胞、ＵＣＭＳＣ、及びＨＵＶＥＣで生成したもの（１つの型）（上パネル）、またはｉＰＳＣ由来の内胚葉由来／肝細胞、内皮細胞、及び間葉系細胞で生成したもの（３つの型）（下パネル）であり、播種後日数が１日、２日、３日、７日、９日、または１１日のものである。（Ｂ）１つの型の肝臓オルガノイド（左パネル）及び３つの型の肝臓オルガノイド（右パネル）のヘマトキシリン−エオシン染色である。（Ｃ）肝臓オルガノイドのアルブミン、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）、ＥｐＣａｍ、α−胎児性タンパク質（ＡＦＰ）、ＺＯ１、及びＣＤ３１を示す免疫蛍光である（スケールバー２００μＭ）。（Ｄ）未分化のｉＰＳＣ（斜線のバー）、ｉＰＳＣ由来の肝実質細胞（培養２８日後）（白色のバー）、及び肝臓オルガノイド（培養１０日後）（薄灰色のバー）における肝臓特異的マーカー（ＡＦＰ及びアルブミン）の発現をＲＴ−ｑＰＣＲによって決定したものである。結果は、異なる遺伝子（Ｘ軸の下に示される）に応じたｍＲＮＡ発現の倍数変化の対数として示される。（Ｅ）ｉＰＳＣ由来の肝臓オルガノイドは、初代肝実質細胞に典型的な機能（尿素合成及びアルブミン合成など）を発揮する。未分化のｉＰＳＣ、ｉＰＳＣ由来の内胚葉細胞（分化の１０日後）、ｉＰＳＣ由来の肝芽細胞（ｄ１８：分化の１８日後）、肝芽（ｄ１０：播種の１０日後）、１つの型の肝臓オルガノイド（ｄ１０：播種の１０日後）、３つの型の肝臓オルガノイド（ｄ１０：播種の１０日後）、及び初代ヒト肝実質細胞におけるアルブミン分泌（ｎｇ／２４時間／１ｘ１０６個細胞、左パネル）または尿素分泌（μｇ／２４時間／１ｘ１０６個細胞、右パネル）として結果が示される。（Ｆ）ｉＰＳＣ由来の肝臓オルガノイドは、ＣｙＰ３Ａ４活性を示す。肝芽細胞（ｄ１６：分化の１６日後）、ｉＰＳＣ由来の肝実質細胞（ｄ２８：分化の２８日後）、または３つの型の肝臓オルガノイド（ｄ１０：播種の１０日後）についてのＣｙｐ３Ａ４活性の倍数変化（ｉＰＳＣとの比較時）として結果が示される。
【図４】図４Ａ〜４Ｔは、被包化肝組織の実施形態を示す。（Ａ）肝臓オルガノイドを被包し、被包化肝組織を調製するためのプロセスの実施形態である。（Ｂ）ＰＥＧ被包化肝臓オルガノイド（被包化肝組織）の巨視的性状、及び被包化肝組織の操作である（上の横列：マウスへの移植に使用する準備が整った被包化肝組織、左下及び中央下：９６ウェル形式の被包化肝組織、右下：バイオマテリアル内の肝臓オルガノイドの微視的性状（スケールバー１０００μＭ））。（Ｃ）３つの異なる被包化肝組織の細胞生存性を示す代表的な免疫蛍光である（ｌｉｖｅ／ｄｅａｄアッセイ）。３つの左上パネルのスケールバーは１０００μＭであり、右上パネル及び３つの右下パネルのスケールバーは２００μＭであり、左下パネルのスケールバーは１００μＭである。（Ｄ）２つの代表的な被包化肝組織の組織学的画像である（スケールバー５０μｍ）。（Ｅ）初代肝実質細胞（ＰＨＨ）、ＨｅｐＧ２細胞株の細胞（ＨｅｐＧ２）、ｉＰＳＣ、ｉＰＳＣ由来の肝実質細胞（ｉＨｅｐ、分化の２８日後）、及び被包化肝臓オルガノイド（ＥＬＴ）におけるＣｙＰ３Ａ４活性、尿素産生、α−胎児性タンパク質（ＡＦＰ）分泌、及びアルブミン分泌を比較したものである。ＣｙＰ３Ａ４活性については、細胞／オルガノイドの型に応じた活性（１０６個の肝細胞当たりのＲＬＵまたは相対発光量として示される（＊＊＊＝ｐ＜０．００１））として結果が示される。尿素産生については、細胞／オルガノイドの型に応じて産生した尿素（μｇ／２４時間／１０６個細胞）として結果が示される。ＡＦＰ分泌については、培養時間に応じて被包化肝組織によって分泌されたＡＦＰ量（ｎｇ／１０６個細胞／２４時間として測定したもの（＊＝ｐ＜０．０５））として結果が示される。アルブミン分泌について、培養時間に応じて産生したアルブミン量（ｎｇ／２４時間／１Ｘ１０６個細胞）として結果が示される（＊＊＝ｐ＜０．０１）。（Ｆ）インビトロでの被包化肝組織によるアンモニア代謝（左パネル）及び尿素産生（右パネル）である。アンモニア代謝については、培養時間（時間）に応じたアンモニア濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）として結果が示される（＊＝ｐ＜０．０５）。尿素産生については、アンモニア（１ｍＭ）の非存在下（−）または存在下（＋）で産生した尿素（μｇ／２４時間／１０６個細胞（＊＊＊＝ｐ＜０．００１））として結果が示される。（Ｇ）インビトロでの被包化肝組織によるタクロリムス代謝である。リファンピシンの存在下（黒四角）または非存在下（●）でのインキュベート時間（時間）に応じたタクロリムス濃度（ｎｇ／ｍＬ（＊＊＊＝ｐ＜０．００１））として結果が示される。（Ｈ）凍結前、解凍後、及び解凍の７日後（ｄ７）の被包化肝組織のアルブミン分泌（左パネル）及びＣｙＰ３Ａ４活性（右パネル）である。アルブミン分泌については、試験条件に応じて産生したアルブミン量（ｎｇ／２４時間／１Ｘ１０６個細胞）として結果が示される。ＣｙＰ３Ａ４活性については、試験条件に応じた活性（ＲＬＵ／１０６個細胞）として結果が示される。（Ｉ）被包化肝組織の腹腔内移植の間に得られた巨視的観察像である。（Ｊ）被包化肝臓オルガノイドの腹腔内移植の１週間後（左パネル）また��４週間後（右パネル）に得られた巨視的観察像である（外植ＥＬＴの画像であり、視認可能な癒着または炎症は全く存在しない）。（Ｋ）非被包化ｉＰＳＣの巨視的観察像（左パネル）及び微視的観察像（ヘマトキシリン及びエオシンによる染色、中央パネル及び右パネル）であり、免疫抑制マウスにおいて奇形腫が形成されることを示す。（Ｌ）マウスへの移植から８週間後の被包化ｉＰＳＣの代表的な巨視的観察像であり、当該動物において奇形腫が形成されないことを示す。（Ｍ）混合リンパ球反応（ＭＬＲ）に供されている細胞におけるＣＤ２５、ＨＬＡ−ＤＲ、増殖（カルボキシフルオセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ））、インターフェロン−γ（ＩＦＮｇ）、ＣＤ３＋ＩＦＮｇ、及びＣＤ６９の発現をフローサイトメトリーによって測定したものである。ＭＬＲの条件は、図の左側に示される。（Ｎ）同種異系ＰＢＭＣのみ（エフェクターＰＢＭＣのみ）の存在下、被包に使用するバイオマテリアル単独（バイオマテリアル）の存在下、成熟樹状細胞（ｍＤＣ）の存在下、被包化ｍＤＣの存在下、肝臓オルガノイドの存在下、及び被包化肝臓オルガノイド（ＥＬＴ）の存在下での混合リンパ球反応におけるインターフェロン−γ（ＩＦＮｇ）の産生である。試験条件に応じたＩＦＮｇ量（ｐｇ／ｍＬ）として結果が示される。（Ｏ）細胞及びオルガノイドを被包することで同種異系Ｔ細胞の増殖が阻止される（ＭＬＲアッセイ）。肝臓オルガノイドによって誘発されるＴ細胞の増殖は最小限のものにすぎなかった。同種異系の肝臓オルガノイド、ＰＢＭＣ、または成熟樹状細胞でさえ、被包するとＴ細胞の活性化は全く見られなかった。略語：対照＝細胞なし、＋ゲル＝バイオマテリアル内に被包、同種異系ＤＣ＝同種異系成熟樹状細胞、ＰＢＭＣ＝同種異系末梢血単核細胞、肝臓オルガノイド＝非被包化ｉＰＳＣ由来肝臓オルガノイド、肝臓オルガノイド＋ゲル＝ＥＬＴ。増殖細胞の割合、またはＣＤ２５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ６９、もしくはＩＦＮｇに陽性の細胞の割合として結果が示される（フローサイトメトリーを使用して測定した）。（Ｓ）偽処理動物または被包化肝組織（ＥＬＴ）で処理した動物の生存率（左パネル）及び体重の増減（右パネル）である。生存率については、偽処理動物（破線）及びＥＬＴ処理動物（実線）において肝不全を誘導してから３０日後の生存率として結果が示される。体重の増減については、偽処理動物（黒四角）及びＥＬＴ処理動物（●）について肝不全の０日目の動物の体重と比較したときの７日目の動物の体重の割合として結果が示される（ｐ＝０．００９５）。（Ｑ）二重ＰＥＧ被包の模式図（上）及び二重ＰＥＧ被包化小胞の微視的観察像（スケールバー５００μＭ、ＮＤ：非分解性、Ｄ：分解性）である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
被包化肝組織
被包化肝組織は、生体適合性架橋ポリマーで少なくとも部分的に被覆された肝臓オルガノイドを少なくとも１つ（１つの実施形態では複数）含む。本開示との関連で使用される「肝臓オルガノイド」は、培養された肝細胞、間葉系細胞、及び任意選択の内皮細胞の混合物を指す。いくつかの実施形態では、肝臓オルガノイドは、培養された肝細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞の混合物を含む。肝臓オルガノイドは、一般に、球の形状を有し、その表面は不規則であり得る。肝臓オルガノイドの相対直径は、約５０〜約５００μｍである。肝臓の細胞コアは、肝細胞、間葉系細胞、及び任意選択の内皮細胞から構成されることに加えて、いくつかの実施形態では、培養の間に肝細胞、間葉系細胞、及び任意選択の内皮細胞から産生及び構築された細胞外マトリックスからも構成される。肝臓オルガノイドは、細胞の浮遊培養によって得ることができる。いくつかの実施形態では、具体的には被包化肝組織の培養／分化の前に、内胚葉（例えば、肝臓）由来の肝細胞（例えば、肝実質細胞及び／または胆管上皮細胞など）で肝臓オルガノイドの表面が少なくとも部分的に被覆される（いくつかの実施形態では実質的に被覆される）。別の実施形態では、肝細胞は、細胞コア全体に分散する（しかし、必ずしも均一である必要はない）。被包化肝組織に存在するオルガノイドは、第１の生体適合性架橋ポリマーで少なくとも部分的に被覆される（いくつかの実施形態では実質的に被覆される）。
【００１７】
被包される前は、肝臓オルガノイドは、外来性の細胞外マトリックスを含まない。肝臓オルガノイドは、培養された肝細胞、間葉系細胞、及び任意選択の内皮細胞から実質的に構成される。さらに、肝臓オルガノイド（第１の生体適合性ポリマーに被包されているか、または被包されていないもの）は、肝機能を示し、例えば、肝臓オルガノイドは、アルブミン及び凝固因子の合成、ＣｙＰ３Ａ４活性の発揮、アンモニアから尿素への解毒、ならびに肝臓特異的な薬物（すなわち、タクロリムスまたはリファンピシン）代謝の実施が可能である。
【００１８】
本開示の肝臓オルガノイドは、実質的に球の形状を有すると共に、マイクロメートル範囲の相対直径を有する（例えば、その直径は、１ｍｍ未満である）。１つの実施形態では、肝臓オルガノイドは、それが被包される前は、少なくとも約５０μｍ、少なくとも約６０μｍ、少なくとも約７０μｍ、少なくとも約８０μｍ、少なくとも約９０μｍ、少なくとも約１００μｍ、少なくとも約１１０μｍ、少なくとも約１２０μｍ、少なくとも約１３０μｍ、少なくとも約１４０μｍ、少なくとも約１５０μｍ、少なくとも約１６０μｍ、少なくとも約１７０μｍ、少なくとも約１８０μｍ、少なくとも約１９０μｍ、少なくとも約２００μｍ、少なくとも約２１０μｍ、少なくとも約２２０μｍ、少なくとも約２３０μｍ、少なくとも約２４０μｍ、少なくとも約２５０μｍ、少なくとも約２６０μｍ、少なくとも約２７０μｍ、少なくとも約２８０μｍ、少なくとも約２９０μｍ、少なくとも約３００μｍ、少なくとも約３１０μｍ、少なくとも約３２０μｍ、少なくとも約３３０μｍ、少なくとも約３４０μｍ、少なくとも約３５０μｍ、少なくとも約３６０μｍ、少なくとも約３７０μｍ、少なくとも約３８０μｍ、少なくとも約３９０μｍ、少なくとも約４００μｍ、少なくとも約４１０μｍ、少なくとも約４２０μｍ、少なくとも約４３０μｍ、少なくとも約４４０μｍ、少なくとも約４５０μｍ、少なくとも約４６０μｍ、少なくとも約４７０μｍ、少なくとも約４８０μｍ、または少なくとも約４９０μｍの相対値を有する。さらに別の実施形態では、肝臓オルガノイドは、それが被包される前は、約５００μｍ以下、約４９０μｍ以下、約４８０μｍ以下、約４７０μｍ以下、約４６０μｍ以下、約４５０μｍ以下、約４４０μｍ以下、約４３０μｍ以下、約４２０μｍ以下、約４１０μｍ以下、約４００μｍ以下、約３９０μｍ以下、約３８０μｍ以下、約３７０μｍ以下、約３６０μｍ以下、約３５０μｍ以下、約３４０μｍ以下、約３３０μｍ以下、約３２０μｍ以下、約３１０μｍ以下、約３００μｍ以下、約２９０μｍ以下、約２８０μｍ以下、約２７０μｍ以下、約２６０μｍ以下、約２５０μｍ以下、約２４０μｍ以下、約２３０μｍ以下、約２２０μｍ以下、約２１０μｍ以下、約２００μｍ以下、約１９０μｍ以下、約１８０μｍ以下、約１７０μｍ以下、約１６０μｍ以下、約１５０μｍ以下、約１４０μｍ以下、約１３０μｍ以下、約１２０μｍ以下、約１１０μｍ以下、約１００μｍ以下、約９０μｍ以下、約８０μｍ以下、約７０μｍ以下、または約６０μｍ以下の相対直径を有する。別の実施形態では、肝臓オルガノイドは、それが被包される前は、少なくとも約５０μｍ、少なくとも約６０μｍ、少なくとも約７０μｍ、少なくとも約８０μｍ、少なくとも約９０μｍ、少なくとも約１００μｍ、少なくとも約１１０μｍ、少なくとも約１２０μｍ、少なくとも約１３０μｍ、少なくとも約１４０μｍ、少なくとも約１５０μｍ、少なくとも約１６０μｍ、少なくとも約１７０μｍ、少なくとも約１８０μｍ、少なくとも約１９０μｍ、少なくとも約２００μｍ、少なくとも約２１０μｍ、少なくとも約２２０μｍ、少なくとも約２３０μｍ、少なくとも約２４０μｍ、少なくとも約２５０μｍ、少なくとも約２６０μｍ、少なくとも約２７０μｍ、少なくとも約２８��μｍ、少なくとも約２９０μｍ、少なくとも約３００μｍ、少なくとも約３１０μｍ、少なくとも約３２０μｍ、少なくとも約３３０μｍ、少なくとも約３４０μｍ、少なくとも約３５０μｍ、少なくとも約３６０μｍ、少なくとも約３７０μｍ、少なくとも約３８０μｍ、少なくとも約３９０μｍ、少なくとも約４００μｍ、少なくとも約４１０μｍ、少なくとも約４２０μｍ、少なくとも約４３０μｍ、少なくとも約４４０μｍ、少なくとも約４５０μｍ、少なくとも約４６０μｍ、少なくとも約４７０μｍ、少なくとも約４８０μｍ、または少なくとも約４９０μｍと、約５００μｍ以下、約４９０μｍ以下、約４８０μｍ以下、約４７０μｍ以下、約４６０μｍ以下、約４５０μｍ以下、約４４０μｍ以下、約４３０μｍ以下、約４２０μｍ以下、約４１０μｍ以下、約４００μｍ以下、約３９０μｍ以下、約３８０μｍ以下、約３７０μｍ以下、約３６０μｍ以下、約３５０μｍ以下、約３４０μｍ以下、約３３０μｍ以下、約３２０μｍ以下、約３１０μｍ以下、約３００μｍ以下、約２９０μｍ以下、約２８０μｍ以下、約２７０μｍ以下、約２６０μｍ以下、約２５０μｍ以下、約２４０μｍ以下、約２３０μｍ以下、約２２０μｍ以下、約２１０μｍ以下、約２００μｍ以下、約１９０μｍ以下、約１８０μｍ以下、約１７０μｍ以下、約１６０μｍ以下、約１５０μｍ以下、約１４０μｍ以下、約１３０μｍ以下、約１２０μｍ以下、約１１０μｍ以下、約１００μｍ以下、約９０μｍ以下、約８０μｍ以下、約７０μｍ以下、または約６０μｍ以下と、の間の相対直径を有する。いくつかの実施形態では、肝臓オルガノイドは、それが被包される前は、少なくとも約１００μｍ、少なくとも約１１０μｍ、少なくとも約１２０μｍ、少なくとも約１３０μｍ、少なくとも約１４０μｍ、少なくとも約１５０μｍ、少なくとも約１６０μｍ、少なくとも約１７０μｍ、少なくとも約１８０μｍ、少なくとも約１９０μｍ、少なくとも約２００μｍ、少なくとも約２１０μｍ、少なくとも約２２０μｍ、少なくとも約２３０μｍ、少なくとも約２４０μｍ、少なくとも約２５０μｍ、少なくとも約２６０μｍ、少なくとも約２７０μｍ、少なくとも約２８０、または少なくとも約２９０μｍと、約３００μｍ以下、約２９０μｍ以下、約２８０μｍ以下、約２７０μｍ以下、約２６０μｍ以下、約２５０μｍ以下、約２４０μｍ以下、約２３０μｍ以下、約２２０μｍ以下、約２１０μｍ以下、約２００μｍ以下、約１９０μｍ以下、約１８０μｍ以下、約１７０μｍ以下、約１６０μｍ以下、約１５０μｍ以下、約１４０μｍ以下、約１３０μｍ以下、約１２０μｍ以下、約１１０μｍ以下、約１００μｍ以下、約９０μｍ以下、約８０μｍ以下、約７０μｍ以下、または約６０μｍ以下と、の間の相対直径を有する。さらに別の実施形態では、肝臓オルガノイドは、それが被包される前は、少なくとも約１００μｍ〜約３００μｍ以下の相対直径を有する。例えば、肝臓オルガノイドは、それが被包される前は、少なくとも約１５０μｍ、少なくとも約１６０μｍ、少なくとも約１７０μｍ、少なくとも約１８０μｍ、または少なくとも約１９０μｍ〜２００μｍ未満、１９０μｍ未満、１８０μｍ未満、１７０μｍ未満、または１６０μｍ未満の相対直径を有する。さらに別の実施形態では、肝臓��ルガノイドは、それが被包される前は、少なくとも約１５０μｍ〜約２００μｍ以下の相対直径を有する。肝臓オルガノイドのサイズによって、それに含まれる細胞がさまざまな栄養分に曝露されることが増えると共に、被包化肝組織と接触する生体液／細胞に曝露されることが増えるようになる。いくつかの実施形態では、このことによって、宿主の脈管系（例えば、被包化肝組織が移植されている宿主の脈管系）での肝臓オルガノイドの血管形成を必要とすることなく、肝臓オルガノイドがインビボで生存可能かつ生物学的に活性な状態を保つことができるようになる。
【００１９】
肝臓オルガノイドの内胚葉（肝）細胞は、オルガノイド全体を通じて分散することができ、いくつかの実施形態では、そのいくつかは、肝臓オルガノイドの細胞コアの表面に位置し得る。肝臓オルガノイドの肝細胞は、例えば、胚体内胚葉、後方前腸細胞、肝芽細胞、または肝前駆細胞に由来する細胞であり得る。肝臓オルガノイドの肝細胞は、肝実質細胞及び／または胆管上皮細胞であり得る。肝臓オルガノイドの肝細胞は、単一の細胞型（例えば、胚体内胚葉細胞、後方前腸細胞、肝芽細胞、肝実質細胞、または胆管上皮細胞）に由来するか、あるいは細胞型の混合物（例えば、下記の細胞型の少なくとも２つの混合物：胚体内胚葉細胞、後方前腸細胞、肝芽細胞、肝実質細胞、及び／または胆管上皮細胞）に由来し得る。肝臓オルガノイドのインビトロでの細胞培養の間、または肝臓オルガノイドがインビボに移植されたときでさえ、肝細胞型（複数可）は、変化または分化することができる。例えば、肝臓オルガノイドの肝細胞は、間葉系細胞及び任意選択の内皮細胞との共培養の間、またはインビボに移植されると、（胚体内胚葉、後方前腸、または肝芽細胞から肝実質細胞または胆管上皮細胞へと）分化することができる。肝臓オルガノイドに肝実質細胞が存在するかどうかを決定するために、チトクロムＰ４５０ファミリー３サブファミリーＡメンバー４（ＣｙＰ３Ａ４）、及びαフェトプロテイン（ＡＦＰ）の発現を、当該技術分野において知られる手段によって決定することができる。肝臓オルガノイドに肝実質細胞が存在するかどうかを決定するために、アルブミン、凝固因子、及び尿素の合成／産生、ならびにＣｙＰ３Ａ４の活性を監視することもできる。肝臓オルガノイドに胚体内胚葉または後方前腸細胞が存在するかどうかを決定するために、ＳＯＸ１７、ＦＯＸＡ２、ＣＸＣＲ４、ＧＡＴＡ４、またはＨＮＦ４αの発現を、当該技術分野において知られる手段によって決定することができる。
【００２０】
肝臓オルガノイドの間葉系細胞は、例えば、異なる起源（骨髄（血液を含む）、臍帯、もしくは脂肪組織）の間葉系幹細胞／前駆細胞、脂肪細胞、筋細胞、肝星細胞、筋線維芽細胞、及び／または線維芽細胞であり得る。肝臓オルガノイドの間葉系細胞は、単一の細胞型（例えば、間葉系幹細胞／前駆細胞、脂肪細胞、筋細胞、または線維芽細胞）に由来するか、あるいは細胞型の混合物（例えば、下記の細胞型の少なくとも２つの混合物：間葉系幹細胞／前駆細胞、脂肪細胞、筋細胞、肝星細胞、筋線維芽細胞、及び／または線維芽細胞）に由来し得る。肝臓オルガノイドの間葉系細胞の型は、肝細胞及び任意選択の内皮細胞との共培養の間、またはインビボに移植されると、（間葉系幹細胞／前駆細胞から線維芽細胞、脂肪細胞、または筋細胞へと）分化することができる。間葉系幹細胞／前駆細胞は、数ある遺伝子の中でも特に、α平滑筋アクチン（αＳＭＡ）、フィブロネクチン、ＣＤ９０、及びＣＤ７３を発現することが知られている。肝臓オルガノイドにおける間葉系細胞の位置または存在を決定するために、数ある中でも特に、間葉系系譜に特異的または間葉系系譜と関連する遺伝子またはタンパク質の発現を決定することが可能である。
【００２１】
肝臓オルガノイドの内皮細胞は、存在するとき、例えば、さまざまな起源の内皮前駆細胞及び／または内皮細胞であり得る。肝臓オルガノイドの内皮細胞は、単一の細胞型（例えば、内皮前駆細胞もしくは内皮細胞）に由来するか、または細胞型の混合物（例えば、内皮前駆細胞と内皮細胞との混合物）に由来し得る。肝臓オルガノイドの内皮細胞の型は、内胚葉細胞及び間葉系細胞とのインビトロでの共培養の間、またはインビボに移植されると、（内皮前駆細胞から内皮細胞へと）分化することができる。いくつかの実施形態では、肝臓オルガノイドの内皮細胞は、管腔の内面に内皮細胞が並ぶ（部分的であり得る）毛細管または毛細管様形状を構築することができる。
【００２２】
上記のように、肝臓オルガノイドの細胞コアは、肝細胞、間葉系細胞、及び任意選択の内皮細胞から構成されることに加えて、いくつかの実施形態では、培養の間にこうした細胞によって産生及び構築される細胞外マトリックスからも構成される。肝臓オルガノイドの細胞コアは、壊死細胞／アポトーシス細胞が実質的に少なく（例えば、肝臓オルガノイドの細胞コアは、組織学によって調べると壊死領域を有さない）、この理由は、肝臓オルガノイドが培養される培地から細胞コア全体に栄養分が拡散することができ、これによって細胞コア内の細胞に栄養分を送達することができると共に、細胞コアの細胞の代謝廃棄産物を肝臓オルガノイド外に拡散させることができるためである。肝臓オルガノイド自体（被包前のもの）は、外来性の細胞外マトリックスまたは合成ポリマー材料を含まない（例えば、それが存在しない）。いくつかの実施形態では、肝細胞は、細胞コアの表面に存在し得る。別の実施形態では、肝細胞は、細胞コアの細胞と組み合わさることで、細胞外マトリックス材料（例えば、コラーゲン及びフィブロネクチン）を産生及び構築できることに加えて、いくつかの実施形態では、基底膜材料も産生及び構築できる。
【００２３】
上記のように、肝細胞は、肝臓オルガノイドの細胞コアの表面を少なくとも部分的に被覆することができる。本開示との関連では、「肝細胞は、細胞コアの表面を少なくとも部分的に被覆する」という表現は、細胞コアの表面の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％を肝細胞が占有することを示す。いくつかの実施形態では、肝細胞は、細胞コアの表面を実質的に被覆する。本開示との関連では、「肝細胞は、細胞コアの表面を実質的に被覆する」という表現は、細胞コアの表面の大部分を肝細胞が占有することを示し、例えば、細胞コアの表面の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％を肝細胞が占有する。１つの実施形態では、肝細胞は、細胞コアの表面を完全に被覆する（例えば、細胞コアの表面の９９％超が肝細胞で被覆される）。
【００２４】
１つの実施形態では、本開示の肝臓オルガノイドは、第１の架橋生体適合性ポリマーに被包される前は、哺乳類の肝臓において観測されるものと比較すると、肝実質細胞及び／または胆管上皮細胞と比較して間葉系細胞（及び存在するときは内皮細胞）の比率が高い。しかしながら、第１の架橋生体適合性ポリマーに被包された後は、本開示の肝臓オルガノイドは、間葉系細胞（及び存在するときは内皮細胞）と比較すると肝細胞の比率が高い。哺乳類の肝臓の約９０％は、肝細胞から構成されることが知られている。したがって、本開示のいくつかの実施形態では、肝臓オルガノイドにおける肝細胞の比率は、約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、または約７５％未満（肝臓オルガノイドの総細胞数と比較した場合）である。
【００２５】
肝臓オルガノイドは、異なる起源の細胞から調製することができる。１つの実施形態では、肝細胞、間葉系細胞、または内皮細胞の少なくとも１つは、哺乳類（例えば、ヒト）に由来する。別の実施形態では、肝細胞、間葉系細胞、または内皮細胞の少なくとも２つは、哺乳類（例えば、ヒト）に由来する。さらに別の実施形態では、肝細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞はすべて、哺乳類（例えば、ヒト）に由来する。肝臓オルガノイド内では、異なる起源に由来する細胞を組み合わせることができる。例えば、間葉系細胞及び内皮細胞は、マウス起源またはブタ起源に由来し得る一方で、肝細胞は、ヒト起源に由来し得る。こうした組み合わせは網羅的なものではなく、本開示との関連において適切であり得る追加の組み合わせを当業者なら想定するであろう。
【００２６】
肝臓オルガノイドの細胞は、異なる供給源に由来し得る。例えば、肝臓オルガノイドの細胞は、初代細胞培養、確立された細胞株、または分化した幹細胞に由来し得る。肝臓オルガノイド内では、異なる供給源に由来する細胞を組み合わせることができる。例えば、例えば、肝細胞は、初代細胞培養に由来し得、間葉系細胞は、確立された細胞株に由来し得、内皮細胞は、分化した細胞株に由来し得る。あるいは、肝臓オルガノイド内では、同一の供給源（例えば分化した幹細胞）に由来する細胞を組み合わせることもできる。特定の実施形態では、肝臓オルガノイドの細胞は、肝細胞、間葉系細胞、及び任意選択の内皮細胞に分化している単一の幹細胞集団に由来する。幹細胞集団は、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞に由来し得る。特定の実施形態では、肝臓オルガノイドの細胞は、肝細胞、間葉系細胞、及び任意選択の内皮細胞に分化している単一の多能性幹細胞集団に由来する。
【００２７】
被包化肝組織において使用することができるポリマー（ポリマーマトリックスとも称される）は、肝臓オルガノイド（複数可）の周りにハイドロゲルを形成するものである。当該技術分野では知られることであるが、ハイドロゲルは、水が分散媒体である親水性のポリマー鎖を指す。ハイドロゲルは、天然または合成のポリマーネットワークから得ることができる。本開示との関連では、ハイドロゲル内に被包されることで、包埋される肝臓オルガノイドがポリマーから漏出することが阻止されるため、移植時にレシピエントの体内で肝臓オルガノイドの細胞に起因する免疫反応または腫瘍が生じ得るリスクが排除または低減される。１つの実施形態では、肝臓オルガノイドはそれぞれ、個別に被包され、被包化肝臓オルガノイドは、別の実施形態では、ポリマーマトリックスにさらに含められる。さらに別の実施形態では、肝臓オルガノイドは、それが被包されるようにポリマーマトリックスに含められる。
【００２８】
本開示との関連では、ポリマーは、対象（例えば、ヒト）に導入されたときに毒性を示さない場合に「生体適合性」であると考えられる。本開示との関連では、生体適合性ポリマーは、肝臓オルガノイドの細胞に対して毒性を示さないか、または対象（例えば、ヒト）にインビボ移植されたときに毒性を示さないことが好ましい。肝毒性は、例えば、肝実質細胞のアポトーシス死の割合（例えば、アポトーシスの増加は、肝毒性を示す）、トランスアミナーゼレベル（例えば、トランスアミナーゼレベルの増加は、肝毒性を示す）、肝実質細胞の肥大（例えば、肥大の増加は、肝毒性を示す）、肝実質細胞における微小空胞変性（例えば、変性の増加は、肝毒性を示す）、胆管細胞の死の割合（例えば、胆管細胞の死の割合の増加は、肝毒性を示す）、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）レベル（例えば、ＧＧＴレベルの増加は、肝毒性を示す）を決定することによって測定できる。生体適合性ポリマーには、限定はされないが、糖質（グリコサミノグリカン（ヒアルロン酸（ＨＡ）、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸、アルギン酸、キトサン、ヘパリンなど）、アガロース、デキストラン、セルロース、及び／またはその誘導体）、タンパク質（コラーゲン、エラスチン、フィブリン、アルブミン、ポリ（アミノ酸）、糖タンパク質、抗体、及び／またはその誘導体）、及び／または合成ポリマー（例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、及び／またはポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）に基づくもの）が含まれる。生体適合性ポリマーは、単一のポリマーであるか、または異なるポリマーの混合物（例えば、ＵＳ２０１２／０１４２０６９に記載のもの）であり得る。生体適合性ポリマーの例には、限定はされないが、ポリ（エチレン）グリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、フィブリン、多糖材料（キトサン、プロテオグリカン、またはグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のようなもの）、アルギン酸、コラーゲン、チオール化ヘパリン、及びそれらの混合物が含まれる。いくつかの実施形態では、生体適合性ポリマーは、直鎖状であり得、分岐鎖状であり得、任意選択で、ペプチド（例えば、ＲＧＤ）、増殖因子、インテグリン、または薬物が埋め込まれ得る。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ポリマーは、「低免疫原性ポリマー」であり、レシピエントにおいて免疫応答を誘発しないか、またはこのポリマーによって誘発される免疫応答は最小限のものにすぎない（すなわち、結果的に、このポリマーが分解、改変、または機能喪失を被ることはない）。この低免疫原性ポリマーは、細胞の１つまたは複数の抗原決定基を遮蔽し、そのような抗原決定基が同種異系対象に導入されたときにその抗原決定基に対する免疫応答を低減するか、または阻止することさえもできる。
【００３０】
本開示の被包化肝組織に存在するポリマーは、好ましくは、架橋可能なものであり、例えば、架橋される能力を有する。ポリマーは、熱的、化学的（例えば、１つもしくは複数のペプチド（ＶＰＭＳ、ＲＧＤなど）を使用することによるもの）、またはｐＨもしくは光の使用（例えば、光重合（例えば、ＵＶ光を使用するもの））によって架橋することができる。いくつかの実施形態では、架橋は、肝臓オルガノイド（ポリマーマトリックスによって被包されているか、または被包されていないもの）がポリマーマトリックス内に分散した後に実施することができる。
【００３１】
本開示のポリマーは、完全もしくは部分的に生分解性（例えば、生体の代謝によって加水分解されやすい）であるか、または生分解に対して完全もしくは部分的に抵抗性（例えば、生体の代謝に供されると加水分解抵抗性を示す）であり得る。生体適合性かつ生分解性のポリマーの例には、限定はされないが、ポリ（エチレン−グリコール）−（マレイミド）（ＰＥＧ−Ｍａｌ）８−アームが含まれる。生体適合性かつ生分解抵抗性のポリマーの例には、限定はされないが、ポリ（エチレン−グリコール）−ビニルスルホン（ＰＥＧ−ＶＳ）が含まれる。
【００３２】
被包化肝組織は、肝臓オルガノイドを少なくとも部分的に（いくつかの場合では実質的に）被覆する第１の生体適合性架橋ポリマーを含む。第１の生体適合性ポリマーは、肝臓オルガノイドの細胞と物理的に接触する。本開示との関連では、「第１の生体適合性架橋ポリマーによって少なくとも部分的に被覆された肝臓オルガノイド（複数可）」という表現は、肝臓オルガノイドの表面の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％を第１の生体適合性架橋ポリマーが占有することを示す。いくつかの実施形態では、第１の生体適合性架橋ポリマーは、肝臓オルガノイド（複数可）の表面を実質的に被覆する。本開示との関連では、「第１の生体適合性架橋ポリマーによって実質的に被覆された肝臓オルガノイド（複数可）」という表現は、肝臓オルガノイドの表面の大部分を第１の生体適合性架橋ポリマーが占有することを示し、例えば、オルガノイドの表面の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％を第１の生体適合性架橋ポリマーが占有する。１つの実施形態では、第１の生体適合性架橋ポリマーは、肝臓オルガノイドの表面を完全に被覆する（例えば、肝臓オルガノイドの表面の９９％超が第１の生体適合性架橋ポリマーで被覆される）。
【００３３】
いくつかの実施形態では、被包化肝組織は、第１の生体適合性架橋ポリマーを少なくとも部分的に（いくつかの場合では実質的に）被覆する第２の生体適合性架橋ポリマーも含み得る。第２の生体適合性ポリマーは、第１の生体適合性架橋ポリマーと物理的に接触し、いくつかの実施形態では、肝臓オルガノイドの細胞と物理的に接触する。本開示との関連では、「第２の生体適合性架橋ポリマーによって少なくとも部分的に被覆された第１の生体適合性架橋ポリマー」という表現は、第１の生体適合性架橋ポリマーの表面の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％を第２の生体適合性架橋ポリマーが占有することを示す。いくつかの実施形態では、第２の生体適合性架橋ポリマーは、第１の生体適合性架橋ポリマーの表面を実質的に被覆する。本開示との関連では、「第２の生体適合性架橋ポリマーによって実質的に被覆された第１の生体適合性架橋ポリマー」という表現は、第１の生体適合性架橋ポリマーの表面の大部分を第２の生体適合性架橋ポリマーが占有することを示し、例えば、第１の生体適合性架橋ポリマーの表面の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％を第２の生体適合性架橋ポリマーが占有する。１つの実施形態では、第２の生体適合性架橋ポリマーは、第１の生体適合性架橋ポリマーの表面を完全に被覆する（例えば、第１の生体適合性架橋ポリマーの表面の９９％超が第２の生体適合性架橋ポリマーで被覆される）。さらに別の実施形態では、第２の生体適合性架橋ポリマーは、肝臓オルガノイド（第１の生体適合性架橋ポリマーで少なくとも部分的に被覆されたもの）が散在するマトリックスを形成する。そのような実施形態では、肝臓オルガノイド（第１の生体適合性架橋ポリマーで少なくとも部分的に被覆されたもの）は、その周りに第２の生体適合性架橋マトリックスが存在し得るか、または別の肝臓オルガノイド（第１の生体適合性架橋ポリマーで少なくとも部分的に被覆されたもの）と物理的に接触し得る。被包化肝組織は、第２の生体適合性架橋ポリマーを被覆するための追加の生体適合性架橋ポリマーを含み得る。
【００３４】
第１の生体適合性架橋ポリマーと第２の生体適合性架橋ポリマーとは、同一であるか、または異なり得る。１つの実施形態では、第１の生体適合性架橋ポリマーは、少なくとも部分的に（いくつかの実施形態では完全に）生分解性のポリマーである。別の実施形態では、第２の生体適合性架橋ポリマーは、生分解に対して少なくとも部分的に（いくつかの実施形態では完全に）抵抗性である。さらに別の実施形態では、第１の生体適合性架橋ポリマーは、生分解性ポリマーであり、第２の生体適合性架橋ポリマーは、生分解に対して抵抗性である。そのような実施形態では、第１の生体適合性架橋ポリマーは、第２の生体適合性架橋ポリマーと比較して、より生分解性が高く（例えば、生分解に対する抵抗性が低く）あり得る。
【００３５】
いくつかの実施形態では、第１の生体適合性架橋ポリマーは、複数の肝臓オルガノイドを含む。そのような実施形態では、被包化肝組織は、ｃｍ２当たり少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１２５、少なくとも約１５０、少なくとも約１７５、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、少なくとも約３５０、少なくとも約４００、少なくとも約４５０、または少なくとも約５００の肝臓オルガノイドを含み得る。さらに別の実施形態では、被包化肝組織は、ｃｍ２当たり最大で約５００、最大で約４５０、最大で約４００、最大で約３５０、最大で約３００、最大で約２５０、最大で約２００、最大で約１７５、最大で約１５０、最大で約１２５、最大で約１００、最大で約９０、最大で約８０、最大で約７０、最大で約６０、または最大で約５０の肝臓オルガノイドを含み得る。さらに別の実施形態では、被包化肝組織は、ｃｍ２当たり、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、または約４５０と、約５００、約４５０、約４００、約３５０、約３００、約２５０、約２００、約１７５、約１５０、約１２５、約１００、約９０、約８０、約７０、または約６０と、の間の数の肝臓オルガノイドを含む。さらに別の実施形態では、被包化肝組織は、ｃｍ２当たり約５０〜５００の肝臓オルガノイドを含む。別の実施形態では、被包化肝組織は、ｃｍ３当たり少なくとも約２５０、少なくとも約３００、少なくとも約３５０、少なくとも約４００、少なくとも約４５０、少なくとも約５００、少なくとも約５５０、少なくとも約６００、少なくとも約６５０、少なくとも約７００、少なくとも約７５０、少なくとも約８００、少なくとも約８５０、少なくとも約９００、少なくとも約９５０、少なくとも約１０００、少なくとも約１１００、少なくとも約１２００、少なくとも約１３００、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００、少なくとも約１７００、少なくとも約１８００、少なくとも約１９００、少なくとも約２０００、少なくとも約２１００、少なくとも約２２００、少なくとも約２３００、少なくとも約２４００、または少なくとも約２５００の肝臓オルガノイドを含む。さらに別の実施形態では、被包化肝組織は、ｃｍ３当たり最大で約２５００、最大で約２４００、最大で約２３００、最大で約２２００、最大で約２１００、最大で約２０００、最大で約１９００、最大で約１８００、最大で約１７００、最大で約１６００、最大で約１５００、最大で約１４００、最大で約１３００、最大で約１２００、最大で約１１００、最大で約１０００、最大で約９５０、最大で約９００、最大で約８５０、最大で約８００、最大で約７５０、最大で約７００、最大で約６５０、最大で約６００、最大で約５５０、最大で約５００、最大で約４５０、最大で約４００、最大で約３５０、最大で約３００、または最大で約２５０の肝臓オルガノイドを含む。さらに別の実施形態では、被包化肝組織は、ｃｍ３当たり、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、約７５０、約８００、約８５０、約９００、約９５０、約１０００、約１１００、約１２００、約１３００、約１４００、約１５００、約１６００、約１７００、約１８００、約１９００、約２０００、約２１００、約２２００、約２３００、または約２４００と、約２５００、約２４００、約２３００、約２２００、約２１００、約２０００、約１９００、約１８００、約１７００、約１６００、約１５００、約１４００、約１３００、約１２００、約１１００、約１０００、約９５０、約９００、約８５０、約８００、約７５０、約７００、約６５０、約６００、約５５０、約５００、約４５０、約４００、約３５０、または約３００と、の間の数の肝臓オルガノイドを含む。さらに別の実施形態では、被包化肝組織は、ｃｍ３当たり約２５０〜２５００の肝臓オルガノイドを含む。
【００３６】
１つの実施形態では、被包化肝組織は、培養されるか、またはインビボに移植されると、肝細胞、間葉系細胞、及び任意選択の内皮細胞と関連する遺伝子及びタンパク質を発現することができる。追加の実施形態では、被包化肝組織（インビトロまたはインビボのもの）は、アルブミンの産生、アンモニアからの尿素の合成、ＣｙＰ３Ａ４活性の発揮、及び／または薬物（肝臓によって代謝されることが知られるもの（タクロリムス及び／またはリファンピシンなど）の代謝を行うことができる。いくつかの実施形態では、被包化肝組織は、組織における肝臓オルガノイドのｇ当たり１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１１ｍｇ、１２ｍｇ、１３ｍｇ、１４ｍｇ、１５ｍｇ、１６ｍｇ、１７ｍｇ、１８ｍｇ、１９ｍｇ、または２０ｍｇのアルブミンを産生することができる。別の実施形態では、被包化肝組織は、凍結融解サイクルを１回または複数回まわしても、肝細胞、間葉系細胞、及び任意選択の内皮細胞と関連する遺伝子及びタンパク質の発現、アルブミンの産生、アンモニアからの尿素の合成、ＣｙＰ３Ａ４活性の発揮、及び／または薬物（タクロリムス及び／またはリファンピシンなど）の肝臓特異的代謝を行うことができる。いくつかの実施形態では、被包化肝組織は、凍結後に、組織における肝臓オルガノイドのｇ当たり１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１１ｍｇ、１２ｍｇ、１３ｍｇ、１４ｍｇ、１５ｍｇ、１６ｍｇ、１７ｍｇ、１８ｍｇ、１９ｍｇ、または２０ｍｇのアルブミンを産生することができる。
【００３７】
被包化肝組織の調製プロセス
被包化肝組織の調製プロセスでは、肝臓オルガノイド（複数可）を調製することが最初に必要であり、次に、この（これらの）肝臓オルガノイドを第１の生体適合性架橋ポリマーに（少なくとも部分的に）被包すること（さらに任意選択で、第２の生体適合性架橋ポリマー及び追加の生体適合性架橋ポリマーに被包すること）が必要である。
【００３８】
肝臓オルガノイドは、（ｉ）肝細胞、間葉系細胞、及び任意選択の内皮細胞を含む細胞コアと、（ｉｉ）実質的に球の形状と、（ｉｉｉ）約５０〜約５００μｍの相対直径と、を有する肝臓オルガノイドを得るために必要な条件下で肝細胞、間葉系細胞、及び任意選択の内皮細胞（すべて上記のもの）を共培養することによって調製できる。いくつかの実施形態では、こうした条件には、肝臓オルガノイドの形成が促進されるように細胞を浮遊培養すること（例えば、超低接着条件）が含まれる。
【００３９】
被包化肝組織に含めるべき肝細胞は、異なる起源（例えば、哺乳類）及び供給源（初代細胞培養、細胞株、分化した幹細胞）から得ることができる。肝細胞は、異なる型（胚体内胚葉細胞、後方前腸細胞、肝芽細胞、肝実質細胞、及び／または胆管上皮細胞など）に由来し得る。単一のオルガノイドに由来する肝細胞は、同一または異なる起源に由来し、同一または異なる供給源に由来し、同一または異なる型に由来し得る。１つの実施形態では、胚体内胚葉細胞が使用される。さらに別の実施形態では、胚体内胚葉細胞は、分化性の幹細胞（多能性幹細胞など）から得られる。さらに別の実施形態では、胚体内胚葉に由来する細胞は、分化性の多能性幹細胞から得られる（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１及びノックアウト血清代替物と組み合わせてアクチビンＡと共に多能性幹細胞を培養することによって得られる）。１つの実施形態では、後方前腸に由来する細胞が使用される。さらに別の実施形態では、後方前腸に由来する細胞は、分化性の幹細胞（多能性幹細胞など）から得られる。さらに別の実施形態では、後方前腸に由来する細胞は、分化性の多能性幹細胞から得られる（例えば、インスリン及び／またはＩＷＰ２及び／またはＡ８３−０１の存在下または非存在下でｂＦＧＦ及びノックアウト血清代替物と組み合わせてＢＭＰ４と共に多能性幹細胞を培養することによって得られる）。１つの実施形態では、肝実質細胞及び肝芽細胞が使用される。さらに別の実施形態では、肝実質細胞及び肝芽細胞は、分化性の幹細胞（多能性幹細胞など）から得られる。さらに別の実施形態では、肝実質細胞及び肝芽細胞は、分化性の多能性幹細胞から得られる（例えば、インスリン及び／またはＣＨＩＲ９９０２１、ＩＷＰ２、Ａ８３−０１、ＨＧＦ、オンコスタチンＭ、及び／またはデキサメタゾンの存在下または非存在下でｂＦＧＦ及びノックアウト血清代替物と組み合わせてＢＭＰ４と共に多能性幹細胞を培養することによって得られる）。肝細胞は、新鮮な状態で使用するか、または肝臓オルガノイドの形成に使用するまで凍結保存することができる。
【００４０】
被包化肝組織に含めるべき間葉系細胞は、異なる起源（例えば、哺乳類）及び供給源（初代細胞培養、細胞株、分化した幹細胞）から得ることができる。間葉系細胞は、異なる型（間葉系幹細胞、脂肪細胞、筋細胞、または線維芽細胞など）に由来し得る。単一のオルガノイドに由来する間葉系細胞は、同一または異なる起源に由来し、同一または異なる供給源に由来し、同一または異なる型に由来し得る。１つの実施形態では、間葉系幹細胞／前駆細胞が使用される。さらに別の実施形態では、間葉系幹細胞／前駆細胞は、分化性の幹細胞（多能性幹細胞など）から得られる。さらに別の実施形態では、間葉系幹細胞／前駆細胞は、分化性の多能性幹細胞から得られる（例えば、ノックアウト血清代替物を添加したグルコース高含有ＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ  ｈｉｇｈ  ｇｌｕｃｏｓｅ）においてコートなしのプラスチック上で多能性幹細胞を培養することによって得られる）。間葉系細胞は、新鮮な状態で使用するか、または肝臓オルガノイドの形成に使用するまで凍結保存することができる。
【００４１】
被包化肝組織に含めるべき内皮細胞は、存在するとき、異なる起源（例えば、哺乳類）及び供給源（初代細胞培養、細胞株、分化した幹細胞）から得ることができる。内皮細胞は、異なる型（内皮前駆細胞及び内皮細胞など）に由来し得る。１つの実施形態では、内皮前駆細胞が使用される。単一のオルガノイドに由来する内皮細胞は、同一または異なる起源に由来し、同一または異なる供給源に由来し、同一または異なる型に由来し得る。さらに別の実施形態では、内皮前駆細胞は、分化性の幹細胞（多能性幹細胞など）から得られる。さらに別の実施形態では、内皮前駆細胞は、分化性の多能性幹細胞から得られる（例えば、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦ、及び／またはＶＥＧＦと組み合わせてＣＨＩＲ９９０２１及び／またはアクチビンＡと共に多能性幹細胞を培養することによって得られる）。内皮細胞は、新鮮な状態で使用するか、または肝臓オルガノイドの形成に使用するまで凍結保存することができる。
【００４２】
１つの実施形態では、肝臓オルガノイドは、単一の多能性幹細胞集団から調製される。多能性幹細胞は、ウイルスによる形質導入（例えば、センダイウイルス系を使用することによるもの）などの、当該技術分野において知られる方法を使用して誘導するか、または合成ｍＲＮＡによる手法を使用して誘導することができる。多能性幹細胞集団は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の１つまたは複数のコロニーから得ることができる。同一の多能性幹細胞集団から肝臓オルガノイドが調製される実施形態では、ｉＰＳＣ集団は、少なくとも２つ（いくつかの実施形態では少なくとも３つ）の亜集団に分割され、これらの亜集団は、肝細胞及び間葉系細胞（及びいくつかの実施形態では、内皮細胞）を生成するために異なる培養条件にそれぞれが供される。
【００４３】
異なる細胞がそれぞれ得られると、こうした細胞は、肝臓オルガノイドを生成するために混合され、浮遊培養される。肝臓オルガノイドのサイズを制御するために、１００〜１０００μｍの直径を有するマイクロキャビティを使用する超低接着条件（例えば、浮遊状態となるもの）で細胞を培養することが可能である。いくつかの実施形態では、約５００μｍの直径及び深さを有するマイクロキャビティがｃｍ２当たりに複数存在する。いくつかの実施形態では、最初の肝臓オルガノイドが形成されると、こうした肝臓オルガノイドをバイオリアクターにおいて浮遊培養（成長目的）することができる。内胚葉由来の細胞から肝実質細胞及び／または胆管上皮細胞への分化を促進するために、ノックアウト血清代替物、及び／またはインスリン、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、オンコスタチンＭ、及び／またはデキサメタゾンの存在下で肝臓オルガノイドを培養することができる。１つの実施形態では、０．１〜０．７の間葉系細胞に対して１の内胚葉細胞の比で間葉系細胞と肝細胞とが培養前に混合される。さらに別の実施形態では、内皮細胞が存在するとき、０．２〜１の内皮細胞に対して１の内胚葉細胞の比で内皮細胞と内胚葉細胞とが培養前に混合される。さらに別の実施形態では、肝細胞、間葉系細胞、及び内皮細胞の培養前の比は、１：０．２：０．７である。優先的に増殖することになるものもあれば、優先的に分化することになるものもあるため、異なる細胞間の比は培養の間に変わり得ると理解される。本明細書に記載の肝臓オルガノイドを得るために他の比を使用することができるとも理解される。肝臓オルガノイドの調製プロセスの間に、物理的足場または外来性のマトリックス材料（組織培養容器以外）は全く必要ない。肝臓オルガノイドは、被包化肝組織の調製に直接的に使用することができる。１つの実施形態では、肝臓オルガノイドは、それが被包化肝組織に導入された状態とされるまで凍結保存することができる。
【００４４】
被包化肝組織において使用することができるポリマーは、肝臓オルガノイド（複数可）の周りにハイドロゲルを形成するものである。当該技術分野では知られることであるが、ハイドロゲルは、水が分散媒体である親水性のポリマー鎖を指す。ハイドロゲルは、天然または合成のポリマーネットワークから得ることができる。本開示との関連では、ハイドロゲル内に被包されることで、包埋される肝臓オルガノイドがポリマーから漏出することが阻止されるため、移植時にレシピエントの体内で免疫反応または腫瘍が肝臓オルガノイドの細胞から生じ得るリスクが排除または低減される。
【００４５】
本開示との関連では、ポリマーは、肝臓オルガノイドの細胞に対して毒性を示さないか、または対象（例えば、ヒト）に導入されたときに毒性を示さない場合に「生体適合性」であると考えられる。本開示との関連では、生体適合性ポリマーは、対象（例えば、ヒト）にインビボ移植されたときに肝臓オルガノイドの細胞に対して毒性を示さないことが好ましい。肝毒性は、例えば、肝実質細胞のアポトーシス死の割合（例えば、アポトーシスの増加は、肝毒性を示す）、トランスアミナーゼレベル（例えば、トランスアミナーゼレベルの増加は、肝毒性を示す）、肝実質細胞の肥大（例えば、肥大の増加は、肝毒性を示す）、肝実質細胞における微小空胞変性（例えば、変性の増加は、肝毒性を示す）、胆管細胞の死の割合（例えば、胆管細胞の死の割合の増加は、肝毒性を示す）、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）レベル（例えば、ＧＧＴレベルの増加は、肝毒性を示す）を決定することによって測定できる。生体適合性ポリマーには、限定はされないが、糖質（グリコサミノグリカン（ヒアルロン酸（ＨＡ）、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸、アルギン酸、キトサン、ヘパリンなど）、アガロース、デキストラン、セルロース、及び／またはその誘導体）、タンパク質（コラーゲン、エラスチン、フィブリン、アルブミン、ポリ（アミノ酸）、糖タンパク質、抗体、及び／またはその誘導体）、及び／または合成ポリマー（例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、及び／またはポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）に基づくもの）が含まれる。生体適合性ポリマーは、単一のポリマーであるか、または複数のポリマーの混合物（例えば、ＵＳ２０１２／０１４２００６９に記載のもの）であり得る。生体適合性ポリマーの例には、限定はされないが、ポリ（エチレン）グリコール、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、フィブリン、多糖材料（キトサン、プロテオグリカン、またはグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のようなもの）、アルギン酸、コラーゲン、チオール化ヘパリン、及びそれらの混合物が含まれる。いくつかの実施形態では、生体適合性ポリマーは、直鎖状であり得、分岐鎖状であり得、任意選択で、ペプチド（例えば、ＲＧＤ）、増殖因子、インテグリン、または薬物が埋め込まれ得る。
【００４６】
いくつかの実施形態では、ポリマーは、「低免疫原性ポリマー」であり、レシピエントにおいて免疫応答を誘発しないか、またはこのポリマーによって誘発される免疫応答は最小限のものにすぎない。この低免疫原性ポリマーは、細胞の１つもしくは複数の抗原決定基を遮蔽し、そのような抗原決定基が同種異系対象に導入されたときにその抗原決定基に対する免疫応答を低減するか、または阻止することさえもできる。
【００４７】
本開示の被包化肝組織に存在するポリマーは、好ましくは、架橋可能なものであり、例えば、架橋される能力を有する。ポリマーは、熱的、化学的（例えば、１つもしくは複数のペプチド（ＶＰＭＳ、ＲＧＤなど）を使用することによるもの）、またはｐＨもしくは光の使用（例えば、光重合（例えば、ＵＶ光を使用するもの））によって架橋することができる。
【００４８】
本開示のポリマーは、生分解性（例えば、生体の代謝によって加水分解されやすい）であるか、または生分解に対して完全もしくは部分的に抵抗性（例えば、生体の代謝に供されると加水分解抵抗性を示す）であり得る。生体適合性かつ生分解性のポリマーの例には、限定はされないが、ポリ（エチレン−グリコール）−（マレイミド）（ＰＥＧ−Ｍａｌ）８−アームが含まれる。生体適合性かつ生分解抵抗性のポリマーの例には、限定はされないが、ポリ（エチレン−グリコール）−ビニルスルホン（ＰＥＧ−ＶＳ）が含まれる。
【００４９】
肝臓オルガノイドが得られると、肝臓オルガノイドを少なくとも部分的に（いくつかの実施形態では実質的に）被覆するために肝臓オルガノイドが第１の生体適合性架橋可能ポリマーと接触される。ポリマーは、異なる濃度で使用することができる。１つの実施形態では、肝臓オルガノイドとの接触時のポリマーの濃度は、約１％〜１５％（重量／体積）である。１つの実施形態では、肝臓オルガノイドとの接触時のポリマーの濃度は、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、または少なくとも約１４％である。さらに別の実施形態では、肝臓オルガノイドとの接触時のポリマーの濃度は、約１５％以下、約１４％以下、約１３％以下、約１２％以下、約１１％以下、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、または約２％以下である。肝臓オルガノイドが第１のポリマーと接触されると、第１のポリマーは架橋される（熱的、化学的、またはｐＨもしくは光の使用によって架橋される）。第１の生体適合性ポリマーの架橋は、ポリマーの異なる分子間及び／またはポリマーの同一分子内に追加の結合（いくつかの実施形態では追加の共有結合）を創出することによって達成される。いくつかの実施形態では、第１の生体適合性ポリマーの架橋によって、ポリマー分子と肝臓オルガノイドの表面との間に追加の結合（いくつかの実施形態では追加の共有結合）が創出されることになる。いくつかの実施形態では、第１のポリマーは、少なくとも部分的に生分解性である。
【００５０】
いくつかの実施形態では、第１の生体適合性架橋ポリマーで（少なくとも部分的に）被覆または被包されている肝臓オルガノイドを、当該被包化肝組織を少なくとも部分的に（いくつかの実施形態では実質的に）被覆するために第２の生体適合性架橋可能ポリマーと接触させることができる。被包化肝臓オルガノイドが第２のポリマーと接触されると、第２のポリマーは架橋される（熱的、化学的、またはｐＨもしくは光の使用によって架橋される）。第２の生体適合性ポリマーの架橋は、ポリマーの異なる分子間及び／またはポリマーの同一分子内に追加の結合（いくつかの実施形態では追加の共有結合）を創出することによって達成される。いくつかの実施形態では、第２の生体適合性ポリマーの架橋によって、ポリマー分子と第１の生体適合性架橋ポリマーとの間に加えて、いくつかの実施形態では、ポリマー分子と肝臓オルガノイドの表面との間にも追加の結合（いくつかの実施形態では追加の共有結合）が創出されることになる。いくつかの実施形態では、第２のポリマーは、生分解に対して少なくとも部分的に抵抗性である。
【００５１】
いくつかの実施形態では、プロセスは、被包化肝臓オルガノイド（第１の生体適合性架橋ポリマー／第２の生体適合性架橋ポリマーによって少なくとも部分的に被覆されたもの）を被覆するために、被包化肝臓オルガノイドを追加の生体適合性架橋可能ポリマーと接触させる段階も含む。肝臓オルガノイドが追加のポリマーと接触されると、追加のポリマーは架橋される（熱的、化学的、またはｐＨもしくは光の使用によって架橋される）。追加の生体適合性ポリマーの架橋は、ポリマーの異なる分子間及び／またはポリマーの同一分子内に追加の結合（いくつかの実施形態では追加の共有結合）を創出することによって達成される。いくつかの実施形態では、追加の生体適合性ポリマーの架橋によって、ポリマー分子と第２の生体適合性架橋ポリマーとの間に加えて、いくつかの実施形態では、ポリマー分子と第１の生体適合性架橋ポリマー及び／または肝臓オルガノイドの表面との間にも追加の結合（いくつかの実施形態では追加の共有結合）が創出されることになる。
【００５２】
プロセスは、図４Ａに示されるように、第１の生体適合性架橋ポリマー内に複数の単分散した肝臓オルガノイドが含まれるように設計することができる。図４Ａに示される実施形態では、分化性の単一ｉＰＳＣから肝芽細胞、内皮前駆細胞、及び間葉系前駆細胞が得られる。これらの細胞は、肝臓オルガノイドを形成するために混合され、浮遊共培養される。図４Ａに示される肝臓オルガノイドの実施形態では、（被包化肝組織に肝臓オルガノイドが導入された状態となる前に）肝芽細胞は肝実質細胞に分化しており、この肝実質細胞が、間葉系及び内皮前駆細胞によって形成された細胞コアを実質的に被覆する。図４Ａに示される肝臓オルガノイドの実施形態は、実質的に球の形状を有し、約１５０μＭの相対直径を有する。次に、架橋剤（図４Ａに示されるＵＶ光）を使用し、第１の適合性架橋可能マトリックスに肝臓オルガノイドが被包される。この被包化肝組織は、再生医薬に含めて移植可能な肝組織（例えば、５ｍｍ〜１０ｃｍのサイズを有するもの）として使用することができる。あるいは、肝臓オルガノイドをマルチウェルプレート向けに設計し、スクリーニング対象化合物の代謝または肝毒性を決定するために薬物開発において使用することができる。
【００５３】
プロセスは、第１の生体適合性架橋ポリマーで（少なくとも部分的に）個別に被覆された複数の肝臓オルガノイドが得られるように設計することができ、この複数の肝臓オルガノイドは、次に、第２の生体適合性架橋ポリマーから構成されるマトリックスに組み込まれる。そのような実施形態では、第１の生体適合性架橋ポリマーで（少なくとも部分的に）個別に被覆された複数の肝臓オルガノイドが最初に形成され、この複数の肝臓オルガノイドは、次に、架橋すべき第２の生体適合性架橋可能ポリマーと接触される。
【００５４】
プロセスは、第１の適合性架橋ポリマー及び任意選択の第２の適合性架橋ポリマーによって被覆された複数の個別（例えば、単分散）肝臓オルガノイドが得られるように設計することもできる。そのような実施形態では、被包化肝組織は、ｃｍ２当たり少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１２５、少なくとも約１５０、少なくとも約１７５、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、少なくとも約３５０、少なくとも約４００、少なくとも約４５０、または少なくとも約５００の肝臓オルガノイドを含み得る。さらに別の実施形態では、被包化肝組織は、ｃｍ２当たり最大で約５００、最大で約４５０、最大で約４００、最大で約３５０、最大で約３００、最大で約２５０、最大で約２００、最大で約１７５、最大で約１５０、最大で約１２５、最大で約１００、最大で約９０、最大で約８０、最大で約７０、最大で約６０、または最大で約５０の肝臓オルガノイドを含み得る。さらに別の実施形態では、被包化肝組織は、ｃｍ２当たり、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、または約４５０と、約５００、約４５０、約４００、約３５０、約３００、約２５０、約２００、約１７５、約１５０、約１２５、約１００、約９０、約８０、約７０、または約６０と、の間の数の肝臓オルガノイドを含む。さらに別の実施形態では、被包化肝組織は、ｃｍ２当たり約５０〜５００の肝臓オルガノイドを含む。別の実施形態では、被包化肝組織は、ｃｍ３当たり少なくとも約２５０、少なくとも約３００、少なくとも約３５０、少なくとも約４００、少なくとも約４５０、少なくとも約５００、少なくとも約５５０、少なくとも約６００、少なくとも約６５０、少なくとも約７００、少なくとも約７５０、少なくとも約８００、少なくとも約８５０、少なくとも約９００、少なくとも約９５０、少なくとも約１０００、少なくとも約１１００、少なくとも約１２００、少なくとも約１３００、少なくとも約１４００、少なくとも約１５００、少なくとも約１６００、少なくとも約１７００、少なくとも約１８００、少なくとも約１９００、少なくとも約２０００、少なくとも約２１００、少なくとも約２２００、少なくとも約２３００、少なくとも約２４００、または少なくとも約２５００の肝臓オルガノイドを含む。さらに別の実施形態では、被包化肝組織は、ｃｍ３当たり最大で約２５００、最大で約２４００、最大で約２３００、最大で約２２００、最大で約２１００、最大で約２０００、最大で約１９００、最大で約１８００、最大で約１７００、最大で約１６００、最大で約１５００、最大で約１４００、最大で約１３００、最大で約１２００、最大で約１１００、最大で約１０００、最大で約９５０、最大で約９００、最大で約８５０、最大で約８００、最大で約７５０、最大で約７００、最大で約６５０、最大で約６００、最大で約５５０、最大で約５００、最大で約４５０、最大で約４００、最大で約３５０、最大で約３００、または最大で約２５０の肝臓オルガノイドを含む。さらに別の実施形態では、被包化肝組織は、ｃｍ３当たり、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、約７５０、約８００、約８５０、約９００、約９５０、約１０００、約１１００、約１２００、約１３００、約１４００、約１５００、約１６００、約１７００、約１８００、約１９００、約２０００、約２１００、約２２００、約２３００、または約２４００と、約２５００、約２４００、約２３００、約２２００、約２１００、約２０００、約１９００、約１８００、約１７００、約１６００、約１５００、約１４００、約１３００、約１２００、約１１００、約１０００、約９５０、約９００、約８５０、約８００、約７５０、約７００、約６５０、約６００、約５５０、約５００、約４５０、約４００、約３５０、または約３００と、の間の数の肝臓オルガノイドを含む。さらに別の実施形態では、被包化肝組織は、ｃｍ３当たり約２５０〜２５００の肝臓オルガノイドを含む。
【００５５】
１つの実施形態では、被包化肝組織は、本明細書に記載の治療方法及びスクリーニングにおいて直接的に使用するでき、またはその保管期間を増やすために凍結保存することができる。
【００５６】
被包化肝組織の治療的な使用
本明細書に記載の被包化肝組織は、医薬として使用することができる。本明細書に記載の被包化肝組織は、肝臓の生物学的機能のいくつかを示すため、それを必要とする対象の肝機能を回復または改善するためにインビボまたはエクスビボで使用することができる。肝機能は、例えば、アルブミン及び凝固因子（例えば、フィブリノーゲン、プロトロンビン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、ならびにプロテインＣ、プロテインＳ、及びアンチトロンビン）の合成を決定することによって評価でき、アルブミン及び／または凝固因子の合成の増加は、肝機能の回復または改善を示す。肝機能は、国際標準化比またはＩＮＲを測定することによっても評価できる（例えば、ＩＮＲの減少は、肝機能の回復または改善を示す）。肝機能は、アンモニアから尿素への解毒を測定することによっても評価できる（例えば、アンモニアレベルの減少及び／または尿素レベルの増加は、肝機能の回復または改善を示す）。
【００５７】
被包化肝組織は、治療が意図される対象の生体液と接触する必要がある。そのような実施形態では、被包化肝臓は、対象が必要とする合成タンパク質及び代謝物（アルブミン、凝固因子、及び／または尿素）を生体液に放出すると共に、代謝されるべき毒性物質（アンモニア、非抱合型ビリルビン、コレステロール、チロシンなど）を生体液から吸収することさえできる。被包化肝組織は、肝臓代謝の先天異常において欠損／低下した酵素機能を回復させるために使用することができる。
【００５８】
肝機能を回復または改善させるために、肝機能がほぼ皆無〜皆無に低下した対象に被包化肝組織をインビボ移植することができる。したがって、被包化肝組織は、例えば、腹水と接触するように腹膜腔に移植することができる。あるいは、被包化肝組織は、肝臓液と接触するようにレシピエントの肝臓に移植することができる。さらに別の例では、被包化肝組織は、リンパ液または血液と接触するように皮下または筋肉内に移植することができる。
【００５９】
あるいは、肝機能を回復または改善するために、エクスビボの解毒デバイス（例えば、体外式デバイス）の細胞成分として被包化肝組織を使用することができる。そのような実施形態では、タンパク質及び代謝物（アルブミン、凝固因子、及び／または尿素）を供給し、潜在的に毒性物質（アンモニア、非抱合型ビリルビン、コレステロール、チロシンなど）を吸収または代謝するために治療対象の血液及び／または腹水が被包化肝組織とエクスビボで接触される。
【００６０】
被包化肝組織は、さまざまな対象に使用することができ、こうした対象には、肝機能が回復または改善することで恩恵を受けると想定される哺乳類、特にヒトが含まれる。被包化肝組織の細胞は、治療が意図される対象に対して自家、同種異系、または異種であり得る。しかしながら、被包化肝組織は、意図されるレシピエントの細胞（特に免疫細胞）との物理的接触を阻止するように設計することができるため、意図されるレシピエントによる免疫学的な認識及び反応を阻止するために自家細胞または免疫抑制剤を使用する必要はない。このことは、例えば、１つのみの生体適合性架橋ポリマーを含む被包化肝組織の使用、もしくは第１の生体適合性架橋ポリマーと第２の生体適合性架橋ポリマーとの両方を含む被包化肝組織の使用、及び／または低免疫原性ポリマーの使用によって実施することができる。
【００６１】
いくつかの実施形態では、被包化肝組織は、手術（例えば、腹腔鏡下での手順を使用するもの）によって操作し、対象に導入されるように設計することができる。さらに、肝組織は、生体適合性（いくつかの実施形態では、低免疫原性）ポリマーに被包されているため、肝機能が回復するか、または被包化肝組織がもはや肝機能を改善することができなくなった時点で対象から被包化肝組織を除去することが可能である。
【００６２】
被包化肝組織は、肝不全の治療に使用することができる。肝不全は、修復を上回る損傷を肝臓の大部分が受けると生じ、こうした肝臓はもはや機能することができない。肝不全の初期症状には、嘔気、食欲不振、疲労、及び下痢が含まれる。症状が進行するにつれて、黄疸、出血、腹部の膨隆、精神的な失見当識及び混乱（肝性脳症として知られる）、眠気、ならびに昏睡といった症状も観測され得る。肝不全は、急性、慢性、または急性増悪する慢性ものであり得る。慢性肝不全の最も一般的な原因は、非アルコール性脂肪性肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、長期のアルコール摂取、肝硬変、ヘモクロマトーシス、及び栄養障害である。慢性肝不全では、肝細胞移植は、門脈循環を介して実施されることが最も多い。しかしながら、肝硬変に続いて慢性肝不全を発症する症例では、肝類洞の小孔が消失（毛細血管化）すると、門脈循環を介して注入された注入細胞が肝実質に到達し、肝小葉に埋入することが阻止される可能性がある。これによって、移植細胞の成熟及び機能が妨害され、類洞及び門脈の血栓症などの合併症を発症する可能性がある。本明細書に記載の被包化肝組織は、門脈内注射または免疫抑制を必要としないため、何十万人もの肝硬変患者及び慢性（または急性増悪する慢性）肝不全患者を（移植に不適な患者でさえも）治療し、重篤な合併症（肝性脳症、凝固障害など）を予防または低減し、生存率を改善することが可能であると想定される。
【００６３】
本明細書に記載の被包化肝組織は、急性肝不全の治療にも使用することができる。急性肝不全の最も一般的な原因は、処方薬及び植物由来の医薬に対する反応またはその過剰摂取、ウイルス感染症（Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、及びＣ型肝炎を含む）、ならびに有毒な野生キノコの摂取、自己免疫性肝炎、またはウィルソン病である。急性肝不全は、急激に発症し得るものであり、発症までの時間が４８時間に満たないこともあるため、予防することは困難である。さらに、急性肝不全では、完全に成熟した機能性の肝細胞を対象に移植することが必要になるほど肝機能が損なわれる。いくつかの実施形態では、被包化肝組織は、急性肝不全の症状の治療または軽減に使用することができる。被包化肝組織は、それを必要とする対象に移植されるか、またはそれを必要とする対象の血液を処理するための外部（エクスビボ）解毒デバイス（体外式の肝機能補助、バイオ人工肝臓デバイス、もしくは肝臓透析）として使用される。被包化肝組織における肝臓オルガノイドの数及び症状の重症度に応じて、１または複数の被包化肝組織を使用して対象を治療することができる。被包化肝組織（複数可）は、同時使用または順次使用することができる。肝不全の症状を治療または軽減するために被包化肝組織が使用されるとき、治療されるべき対象に対して同種異系の細胞を使用することができる。
【００６４】
被包化肝組織は、肝臓代謝の一遺伝子性の先天異常（例えば、クリグラー・ナジャー症候群、家族性高コレステロール血症、尿素サイクル異常症（Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素欠損症、カルバモイルリン酸合成酵素欠損症、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、シトルリン血症、アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症、アルギナーゼ欠損症など）、高チロシン血症Ｉ型など）の症状を治療または軽減するためにも使用することができる。この実施形態では、被包化肝組織によって、不足している代謝機能の付与、症状の低減、合併症の予防もしくは低減、及び／または生涯にわたる治療もしくは食事制限を行う必要性の低減もしくは排除がなされる。
【００６５】
被包化肝組織は、免疫抑制を必要とせずに急性及び慢性の肝不全を治療するための植込み型の生産物（例えば、被包化肝組織シート）として設計することができる。そのような実施形態では、植込み型の組織シートは、ｃｍ２当たり約数千の肝臓オルガノイドを含む。いくつかの実施形態では、被包化肝組織シートは、所望の移植部位への操作及び固定が容易になるように容器（例えば、特注の透過性バッグなど）内に配置することができる。別の実施形態では、操作を容易にするために、植込み型の組織シートは、厚さが少なくとも１ｍｍであり得、いくつかの追加の実施形態では、幅が少なくとも５ｍｍ〜１０ｃｍであり得る。被包化肝組織は、必要とされる任意の形状またはサイズにすることができ、実施中に整形または切断することができる。
【００６６】
肝代謝及び肝毒性のスクリーニング方法及びスクリーニングキット
本明細書に記載の被包化肝組織は、少なくともいくらかの肝機能を保持するため、肝臓によって薬剤（薬物候補など）がどのように代謝されるかを決定して創薬を合理化するためのインビトロモデルとして使用することができる。本明細書に記載の被包化肝組織は、薬剤が肝毒性を示すかどうかを決定するためにも使用することができる。全身循環に投与されると、（疑わしい）治療薬剤（認可済または開発中のもの）の圧倒的多数が何らかの様式で肝臓の細胞によって代謝される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の被包化肝組織は、薬剤（推定治療薬剤など）の（存在するのであれば）肝毒性（例えば、薬物誘導性の肝毒性）を決定するために使用することができる。薬物（認可済及び試験研究中のもの）は、肝損傷の重要な原因である。肝損傷を生じさせると報告されている薬物、毒素、及び薬草は９００を超えており、すべての劇症肝不全症例の２０〜４０％で薬物が主な原因である。特異体質による薬物反応では、その約７５％が肝移植または死に至る。薬物誘導性の肝損傷は、認可薬物が取り下げられる最も一般的な理由である。薬剤（薬物など）の肝毒性プロファイルを早期に決定することは、創薬を合理化する上で有益であり得る。
【００６７】
本明細書に記載の被包化肝組織は、少なくともいくらかの肝機能を実際に示すため、薬剤（化学薬剤、生物学的薬剤、天然薬物の製剤または混合物など）の肝代謝及び／または肝毒性を決定するためにインビトロで使用することができる。方法は、単一の薬剤または薬剤の組み合わせの肝代謝を決定するために使用することができる。
【００６８】
そうしたことを実施するために、被包化肝組織の少なくとも１つの肝臓オルガノイドの少なくとも１つ（いくつかの実施形態では、２つまたは３つ）の細胞型に対して薬剤が作用するようになる上で十分な条件下で試験混合物が得られるように試験対象の薬剤または薬剤の組み合わせが被包化肝組織との接触に供される。試験混合物は、薬剤及び被包化肝組織を含む。次に、被包化肝組織の少なくとも１つの肝臓オルガノイドの少なくとも１つ（いくつかの実施形態では、少なくとも２つまたは３つ）の細胞型、または試験混合物において薬剤の少なくとも１つの薬剤関連肝代謝物が決定される。本開示と関連して使用される「薬剤関連代謝物」という表現は、試験される薬剤の加水分解によって形成され得る代謝物を指す。
【００６９】
あるいは、またはさらに、被包化組織の少なくとも１つの肝臓オルガノイドの少なくとも１つ（いくつかの実施形態では、少なくとも２つまたは３つ）の細胞型、または試験混合物において少なくとも１つの肝臓パラメーターが決定される。決定することができる肝臓パラメーターには、限定はされないが、アルブミン産生、尿素産生、ＡＴＰ産生、グルタチオン産生、チトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）代謝活性、肝臓特異的遺伝子もしくはタンパク質（例えば、ＣＹＰ酵素（ＣｙＰ２Ｃ９、ＣｙＰ３Ａ４、ＣｙＰ１Ａ１、ＣｙＰ１Ａ２、ＣｙＰ２Ｂ６、及び／またはＣｙＰ２Ｄ６））の発現、肝臓毒に対する応答、細胞死（例えば、試験混合物における乳酸脱水素酵素もしくはトランスアミナーゼを測定することによるもの）、細胞のアポトーシス、細胞の壊死、細胞の代謝活性（例えば、ｌｉｖｅ／ｄｅａｄアッセイ、カスパーゼ３／７アッセイ、ＭＴＴアッセイ、もしくはＷＳＴ−１に基づく試験）、ミトコンドリア機能、及び／または胆汁酸産生が含まれる。少なくとも１つ（または複数）の肝臓パラメーターが得られると、対応する対照の肝臓パラメーターとその肝臓パラメーターが比較される。１つの実施形態では、対照の肝臓パラメーターは、スクリーニング対象薬剤（もしくはスクリーニング対象薬剤の組み合わせ）の非存在下で得るか、またはスクリーニング対象薬剤（もしくはスクリーニング対象薬剤の組み合わせ）を溶解するための媒体の存在下で得ることができる。決定段階は、被包化肝組織の細胞のすべてまたはいくつかに対して実施することができる。１つの実施形態では、決定段階は、被包化肝組織の肝実質細胞及び／または胆管上皮細胞に対して実施される。
【００７０】
方法は、被包化肝組織の肝臓オルガノイドによって薬剤が代謝されるかどうか、及び／または被包化肝組織の肝臓オルガノイドの細胞に対して薬剤が肝毒性を示すかどうか、を決定するための比較も含む。そうしたことを実施するために、測定される薬剤関連肝代謝物と対照の薬剤関連肝代謝物との間で比較が実施される。例えば、対照の薬剤関連代謝物は、インタクトな（例えば、加水分解を受けていない）形態のその薬剤自体であり得る。対照の薬剤関連代謝物と異なる薬剤関連代謝物が存在することが決定されると、次に、肝細胞によって薬剤がどのように代謝されるかが決定される。測定される肝臓パラメーターと対照の肝臓パラメーターとの間で比較を実施することもできる。例えば、対照の肝臓パラメーターは、薬剤の非存在下で得ることができる。対照の肝臓パラメーターと肝臓パラメーターが異なることが決定されると、次に、薬剤が肝毒性を示すかどうかが決定される。
【００７１】
１つの実施形態では、方法は、スクリーニング対象薬剤（またはスクリーニング対象薬剤の組み合わせ）が肝毒性を示すかどうかを決定するために使用される。そのような実施形態では、スクリーニング対象薬剤（またはスクリーニング対象薬剤の組み合わせ）を接触させることで、被包化肝組織の肝臓オルガノイドの少なくとも１つの細胞（例えば、肝実質細胞または胆管上皮細胞）において毒性が誘導されるかどうかが決定される。毒性は、例えば、細胞死（例えば、試験混合物における乳酸脱水素酵素もしくはトランスアミナーゼを測定することによるもの）、細胞の代謝実行能（例えば、ｌｉｖｅ／ｄｅａｄアッセイ、カスパーゼ３／７アッセイ、ＭＴＴアッセイ、もしくはＷＳＴ−１に基づく試験）、ミトコンドリア機能（例えば、ミトコンドリア機能の低下は、肝毒性を示す）、チトクロムＰ４５０系における１つもしくは複数の酵素（例えば、ＣＹＰ２Ｅ１など）の活性の調節（例えば、チトクロムＰ４５０系の酵素（複数可）の活性増加は、肝毒性を示す）、及び／または胆汁酸産生の調節（例えば、胆汁酸産生の増加は、肝毒性を示す）を決定することによって測定できる。方法は、スクリーニング対象薬剤の毒性結果を対照薬剤（肝毒性を誘導しないことが知られるもの、または肝毒性を誘導することが知られるもの）のものと比較することを含み得る。
【００７２】
方法は、異なる代謝活性を有する肝臓オルガノイドを用いて得られる被包化肝組織に対してスクリーニング対象薬剤（または複数のスクリーニング対象薬剤）を接触させることも含み得る。例えば、異なるレベルで特定の代謝機能を実施するために、異なる起源及び供給源に由来する細胞を使用して肝臓オルガノイドを調製することができる（これによって、一般的な集団の個体間で見られる多様性が得られる）。例えば、代謝活性が異なって得られる被包化肝組織は、そのそれぞれ及びすべてに対して比較しながらスクリーニング対象薬剤を試験することが可能となるように、単一のプレートの異なるウェルで生成することができる。１つの実施形態では、肝臓オルガノイドは、異なる性別、人種、及び／または遺伝子型に由来し得る。こうした異なる性別、人種、及び／または遺伝子型に対してスクリーニング対象薬剤を試験することで、代謝差異の決定、あるいは性別、人種、及び／または遺伝子型のすべてまたはいくつかのみに肝毒性が存在するかどうかの決定が可能であり得る。１つの実施形態では、複数の肝臓オルガノイドの間で肝臓オルガノイドの間葉系成分及び／または内皮成分は同様であり得るが、肝実質細胞及び胆管上皮細胞は、異なる性別、人種、及び／または遺伝子型に由来する。一例として、それぞれの異なる被包化肝組織を異なるウェルに配置（必要であれば複数の反復検体として配置）することができ、同一のスクリーニング対象薬剤を、それぞれの異なる被包化肝組織と接触さることができる。
【００７３】
いくつかの実施形態では、スクリーニング方法において使用される被包化肝組織は、第２の生体適合性架橋ポリマーまたは追加の生体適合性架橋ポリマーを含まず、代わりに、本明細書に記載の肝臓オルガノイド及び第１の生体適合性架橋ポリマーから本質的になる。
【００７４】
スクリーニング方法では、個別に被包されている肝臓オルガノイド、または複数の肝臓オルガノイドを含むマトリックスに被包されている肝臓オルガノイドを使用することができる。後者の場合では、被包化肝組織は、ウェルの底に位置しており、これによって、スクリーニング対象薬剤の添加、及び決定段階前の被包化肝組織の洗浄が非常に簡便となり得る。
【００７５】
本開示は、肝代謝または肝毒性を決定するためのキットも提供する。キットは、本明細書に記載の被包化肝組織と、記載の方法を実施するための説明と、を含む。いくつかの実施形態では、キットは、少なくとも１つのウェルを任意選択で含み得る組織培養支持体をさらに含む。追加の実施形態では、少なくとも１つのウェルの底に被包化肝組織を配置し、必要であれば、ウェルの表面に（共有結合または非共有結合で）付着させることができる。キットは、肝代謝または肝毒性の測定（例えば、ｌｉｖｅ／ｄｅａｄアッセイ、カスパーゼ３／７アッセイ、ＭＴＴアッセイ、ＷＳＴ−１アッセイ、及び／またはＬＤＨの測定）を実施するための試薬も含み得る。
【００７６】
下記の実施例を参照することによって、より容易に本発明が理解されよう。しかしながら、こうした実施例は、本発明の範囲を限定するためではなく、本発明を例示するために提供されるものである。
【実施例】
【００７７】
実施例Ｉ−肝臓オルガノイドの調製
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離。
８ｍＬのヘパリンナトリウムを添加したＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）ＣＰＴ（商標）チューブに血液を直接的に収集した。ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）ＣＰＴ（商標）チューブは室温で保存したが、すぐに処理しない場合でも、保存時間が４時間（時間）を超えないようにした。ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）ＣＰＴ（商標）チューブを室温で２０分間（分）遠心分離（１８００ｇ（２８００ｒｐｍ））した。遠心分離後、５ｍＬピペットを使用し、ゲルの上面に固着している可能性のある細胞を除去するためにゲルプラグに対して血漿を穏やかピペッティングした。５０ｍＬのＦａｌｃｏｎ（商標）チューブに細胞浮遊液を移し、必要に応じてそれぞれのチューブから細胞をプールした。無血清培地であるＳｔｅｍＰｒｏ−３４（登録商標）を添加して総体積を４０ｍＬとした。細胞計数（血球計算盤または自動細胞計数器）及び細胞生存率の決定（Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ（商標）による除外法を使用するもの）を行うために、浮遊液から１０μＬ分量を取り分けた。細胞浮遊液を室温で７分間遠心分離（２５０ｇ（１２００ｒｐｍ））した。遠心分離した細胞を、５Ｘ１０６個生細胞／ｍＬの濃度で完全ＳｔｅｍＰｒｏ−３４（商標）培地に浮遊させ、任意選択で凍結保存した。
【００７８】
ＰＢＭＣの初期化。
サイトカイン（ＳＣＦ、ＦＬＴ３、ＩＬ３、ＩＬ６）を添加した完全ＳｔｅｍＰｒｏ−３４（商標）（ｃＳｔｅｍＰｒｏ−３４（商標））培地に新鮮ＰＢＭＣまたは解凍ＰＢＭＣを初期化の４日前に再浮遊させ、５Ｘ１０５個細胞／ｍＬとして播種し、３７℃／５％ＣＯ２雰囲気下でインキュベートした。ＰＢＭＣの初期化日に細胞の数を数え、センダイウイルスＣｙｔｏＴｕｎｅ２．０（商標）での形質導入を実施した（製造者の説明に従って実施した）。より具体的には、細胞の数を数え、製品検査証（ＣｏＡ）に記載の力価情報を使用し、標的感染多重度（ＭＯＩ）に到達するために必要なそれぞれのウイルスの体積を下記のように決定した：
ウイルス体積（μｌ）＝ＭＯＩ（細胞感染単位またはＣＩＵ／細胞）Ｘ細胞数／ウイルス力価（ＣＩＵ７ｍＬ）Ｘ１０−３（μｌ／ｍＬ）
細胞を収集し、形質導入に向けて２，５〜５Ｘ１０５個細胞／ウェルで６ウェルプレートに細胞を播種した。３つのＣｙｔｏＴｕｎｅ２．０（商標）センダイチューブのそれぞれを、計算した体積とし、１ｍＬのｃＳｔｅｍＰｒｏ−３４（商標）培地（３７℃に予熱したもの）に添加した。この混合物を穏やかにピペッティングした。プレートの縁をＰａｒａｆｉｌｍ（商標）でシールし、室温で９０分間遠心分離（２２５０ｒｐｍ）した。１ｍＬのｃＳｔｅｍＰｒｏ−３４（商標）培地を各ウェルに追加添加し、細胞を一晩インキュベートした。翌日、培養プレートから細胞及び培地を取り出し、１５ｍＬチューブに移した。１ｍＬのｃＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）−３４培地で細胞を穏やかに洗い込むことで、ほとんどの細胞を確実に収集した。細胞浮遊液を１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を捨て、ウェル当たり０，５ｍＬのｃＳｔｅｍＰｒｏ−３４（商標）培地を含む６ウェルプレートに細胞を再浮遊させた。３７℃／５％ＣＯ２雰囲気下で細胞を２日間培養した。初期化から３日後、ビトロネクチンまたはラミニンでコートされた培養皿に、培養皿当たり１００００〜５００００個の生細胞として細胞を播種し、サイトカイン無添加のＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）−３４培地に含めた。初期化から７日後、ｉＰＳＣ培地へと細胞を培地移行させた（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８  Ｆｌｅｘ培地とｃＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）−３４とを１：１の比としたものに最初に細胞を含め、次に、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８  Ｆｌｅｘ（商標）培地のみのものに細胞を含めた）。一般に、初期化から１５〜２１日後にコロニー（例えば、細胞集塊）が出現する。細胞膜マーカーであるＴＲＡ１−６０を対象に生細胞染色を行った後、ピッキングする初期化コロニーを同定及び選択した。詳細には、温かいＰＢＳで細胞を染色した後、ＦＩＴＣ結合型の抗ヒトＴＲＡ１−６０抗体（新鮮なＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８  Ｆｌｅｘ培地で１：１００希釈し、シリンジフィルターＳＦＣＡ膜（０．２μｍ）を使用してフィルターにかけたもの）と共に３７℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、新鮮なＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８  Ｆｌｅｘ培地で細胞を洗浄した後、蛍光顕微鏡下で観察した。初期化が成功したコロニーをマークし、ビトロネクチンでコートされたプレートでの増殖に向けて手動でピッキングした。ピッキングした細胞コロニーを、ビトロネクチンでコートされた培養プレートで完全Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８  Ｆｌｅｘ（商標）培地において３７℃／４％Ｏ２／５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。細胞コロニーを２４時間接着させてから、培地を毎日交換した。その後、ビトロネクチンでコートされた培養容器でＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８  Ｆｌｅｘ培地において当該ｉＰＳＣを培養し、その間、培地交換を毎日実施した。
【００７９】
皮膚線維芽細胞の初期化。
線維芽細胞培地（グルコース高含有ＤＭＥＭ）において形質導入日にウェル当たり２ｘ１０５〜３ｘ１０５個細胞を達成するように、形質導入の２日前に、線維芽細胞を適切な密度で６ウェルプレートに播種した。線維芽細胞の初期化日に細胞の数を数え、センダイウイルスＣｙｔｏＴｕｎｅ２．０（商標）での形質導入を実施した（製造者の説明に従って実施した）。より具体的には、細胞の数を数え、ＣｏＡに記載の力価情報を使用し、標的感染多重度（ＭＯＩ）に到達するために必要なそれぞれのウイルスの体積を下記のように決定した：
ウイルス体積（μｌ）＝ＭＯＩ（ＣＩＵ／細胞）Ｘ細胞数／ウイルス力価（ＣＩＵ／ｍＬ）Ｘ１０−３（μｌ／ｍＬ）
細胞を収集し、形質導入に向けて２，５〜５Ｘ１０５個細胞／ウェルで６ウェルプレートに細胞を播種した。３つのＣｙｔｏＴｕｎｅ２．０（商標）センダイチューブのそれぞれを、計算した体積とし、１ｍＬの線維芽細胞培地（３７℃に予熱したもの）に添加した。この混合物を穏やかにピペッティングした。１ｍＬの線維芽細胞培地を各ウェルに追加添加し、細胞を一晩インキュベートした。翌日、ウイルスを含む培地を除去し、新鮮な培地を添加した。初期化から７日後、線維芽細胞を剥がし、ビトロネクチンでコートされた培養皿（１００ｍｍのペトリ皿）に５ｘ１０５個の細胞を播種した。初期化から８日後、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８  Ｆｌｅｘ（商標）培地に細胞を播種した。一般に、初期化から１５〜２０日後にコロニー（例えば、細胞集塊）が出現する。生細胞染色を実施した後、初期化コロニーを選択した（ＰＢＭＣの初期化について上に記載した手順を参照のこと）。細胞コロニーを手動でピッキングし、ビトロネクチンまたはラミニン−コートでコートされたプレートに移した。初期化して得られた臨床グレードのｉＰＳＣは、自己複製能力、及び多能性幹細胞に典型的な多能性遺伝子発現レベルを獲得しており、これと同時に、単一細胞解析において集団全体で高レベルの均一性を示した。
【００８０】
内胚葉へのｉＰＳＣの分化。
分化の３日前に、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）で単一細胞への剥離を実施し、ラミニン（組換えヒトラミニン５２１）でコートされたプレートに細胞を播種した。播種後の最初の２４時間は、Ｒｅｖｉｔａ  Ｃｅｌｌ（商標）を添加したＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８  Ｆｌｅｘ（商標）培地において細胞を培養した。環境Ｏ２／５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で細胞を一晩置いてから分化を開始した。内胚葉への特異化（ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（１日目及び２日目）を促進するために、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で細胞を洗浄した後、１％のノックアウト血清代替物、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、及び３μＭのＣＨＩＲ９９０２１を添加したＲＰＭＩ／Ｂ２７（インスリン非含有）培地において細胞を培養した。環境Ｏ２／５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で２日間細胞を培養した。内胚葉への拘束（ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）（胚体内胚葉、３日目〜５日目）を促進するために、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で細胞を洗浄した後、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを添加したＲＰＭＩ／Ｂ２７（インスリン非含有）において細胞を培養した。環境Ｏ２／５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で細胞を３日間培養した。後方前腸における分化（６〜８日目）を促進するために、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で細胞を洗浄した後、２％のノックアウト血清代替物、２０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、及び１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したＲＰＭＩ／Ｂ２７培地（インスリン含有）において細胞を３日間培養した。ｉＰＳＣから分化した内胚葉細胞は、得られる胚体内胚葉細胞及び後方前腸細胞に典型的なマーカーをｍＲＮＡレベルにおいてもタンパク質レベルにおいても発現した。
【００８１】
肝実質細胞様細胞（ｉＨｅｐ）へ内胚葉の分化。
肝細胞への特異化（ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（肝芽細胞形成）を促進するために、２％のノックアウト血清代替物、２０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、及び１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したＲＰＭＩ／Ｂ２７培地（インスリン含有）において細胞を２日間培養した。肝成熟における第１の段階（例えば、未成熟肝実質細胞の形成）を促進するために、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地において細胞を洗浄し、２％のノックアウト血清代替物及び２０ｎｇ／ｍＬのＨＧＦを添加したＲＰＭＩ／Ｂ２７（インスリン含有）において細胞を５日間培養した。肝成熟における第２の段階（例えば、成熟肝実質細胞の形成）を促進するために、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で細胞を洗浄し、初代肝実質細胞維持サプリメント、２０ｎｇ／ｍＬのＯＳＭ、及び１０μＭのデキサメタゾンを添加したウィリアムＥ培地において細胞を１０日間培養した。２Ｄで分化すると、内胚葉細胞は、未成熟肝実質細胞様細胞と成熟肝実質細胞様細胞との両方に典型的なマーカーを獲得し、成熟肝実質細胞に特有の機能（アルブミン分泌、尿素合成、及びチトクロムＰ４５０  ３Ａ４活性など）を発揮する。
【００８２】
間葉系前駆細胞（ｉＭＰＣまたはｉＭＳＣ）へのｉＰＳＣの分化。
分化の３日前に、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）で単一細胞への剥離を実施し、ビトロネクチンでコートされたプレートに細胞を播種し、播種後の最初の２４時間は、Ｒｅｖｉｔａ  Ｃｅｌｌ（商標）を添加したＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８  Ｆｌｅｘ（商標）培地において細胞を培養した。ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地において細胞を洗浄した後、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）培地（ＤＭＥＭ／グルコース高含有、１０％のノックアウト血清代替物、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、グルタミン、ＨＥＰＥＳ、非必須アミノ酸）で細胞を２週間培養した。その後、コートなしのプレートでＭＳＣ培地において細胞を培養した。４継代目からの細胞は間葉系前駆細胞であると考えられる。この細胞は、免疫蛍光及びフローサイトメトリーにおいて臍帯マトリックス幹細胞と区別不可能であり、その多能性は、骨形成分化能及び脂質生成分化能によって証明された。
【００８３】
内皮前駆細胞（ｉＥＰＣ）へのｉＰＳＣの分化。
分化の３日前に、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）で単一細胞への剥離を実施し、ラミニン（組換えヒトラミニン５２１）でコートされたプレートに細胞を播種し、播種後の最初の２４時間は、Ｒｅｖｉｔａ  Ｃｅｌｌ（商標）を添加したＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８  Ｆｌｅｘ（商標）培地において細胞を培養した。分化を開始し、中胚葉誘導を促進するために、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で細胞を洗浄し、６μＭのＣＨＩＲ９９０２１、１０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、及び２０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４を添加したＳｔｅｍＤｉｆｆ（商標）ＡＰＥＬ（商標）培地において細胞を２日間培養した。内皮分化を促進するために、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で細胞を洗浄し、１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、及び５０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦを添加したＳｔｅｍＤｉｆｆ（商標）ＡＰＥＬ（商標）培地において細胞を５日間培養した。得られたｉＥＰＣは、臍血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）と同等の形態を獲得しており、ヒト内皮前駆細胞に典型的なマーカー（免疫蛍光で見られるＶＥ−カドヘリン及びフローサイトメトリーにおいて細胞の少なくとも６０％に見られるＣＤ−３１など）を発現し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）において培養（管形成アッセイ）すると、血管を形成することができた。７日目からは、ビトロネクチンでコートされたプレートで内皮増殖培地（完全ＥＢＭ２培地：Ｌｏｎｚａから入手したＥＧＭ２ＢｕｌｌｅｔＫｉｔを添加したＥＢＭ２基本培地）において細胞を維持した。
【００８４】
オルガノイドの生成。
Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）を使用してｉＥＰＣを解離させ、７０００００個生細胞／ｍＬの密度で完全ＥＢＭ２培地に再浮遊させた。Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）でｉＭＰＣを解離させ、２０００００個生細胞／ｍＬの密度で完全ＤＭＥＭ培地に再浮遊させた。Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）で肝細胞を解離させ、１００００００個生細胞／ｍＬの密度で完全ウィリアムＥ培地／完全ＥＢＭ２培地（１：１）に再浮遊させた。これらのｉＥＰＣ、ｉＭＰＣ、及び肝細胞を１（肝細胞）：０．７（ｉＥＰＣ）：０．２（ｉＭＰＣ）の比で混合し、直径及び深さが５００μｍのマイクロキャビティをｃｍ２当たり１５７個有する超低接着性Ｔ−２５スフェロイドマイクロキャビティフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）（フラスコ当たりのマイクロキャビティ総数３２００）（数は概算である）（２０ｎｇ／ｍＬのＯＳＭ及び１０μＭのデキサメタゾンを添加した完全ウィリアムＥ培地／完全ＥＭＢ２培地（１：１）を含む）に播種した。環境Ｏ２／５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で細胞を５日間培養した。
【００８５】
サイズが制御されたオルガノイドの形成（図３Ｃ）。
ｉＥＰＣ、ｉＭＰＣ、及び肝細胞を１（肝細胞）：０．７（ｉＥＰＣ）：０．２（ｉＭＰＣ）の比で混合し、超低接着性（ＵＬＡ）Ｔ−２５スフェロイドマイクロキャビティフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種した。マイクロキャビティはｃｍ２当たり１５７個存在し、マイクロキャビティの直径及び深さは５００μｍであり、フラスコ当たりのマイクロキャビティ総数は３２００である（数は概算である）。オルガノイドは、結果的にサイズがかなり均一なものとなり、約５０〜２５０μｍの直径を有していた。オルガノイドはすべて、同一の配置をとっており、間葉系細胞及び内皮細胞のほとんどがコアに存在し、肝実質細胞及び胆管細胞のほとんどが外面に存在した。そのようなオルガノイドのコアでは壊死は全く見られなかった。当該オルガノイドは、肝臓特異的マーカーを発現し、成熟肝機能（アルブミン分泌（条件培地におけるもの）、尿素合成、及びＣｙＰ３Ａ４活性など）を発揮することができた。
【００８６】
オルガノイドの被包（図４Ａ）。
超低接着性フラスコからオルガノイドを収集し、低速で遠心分離（４００ｇで５分間）してペレットを形成させた。０．１％のＮ−ビニル−２−ピリリドン（ｐｙｒｒｉｌｉｄｏｎｅ）及び０．４ｍｇ／ｍＬのＩｒｇａｃｕｒｅ２９５９を添加し、カルシウム及びマグネシウムを含まない５％の４アームＰＥＧ−ビニルスルホン（２０ｋＤａ）無菌ＰＢＳ溶液にペレット（約３０００のオルガノイド）を再浮遊させた。そのような溶液の５０μＬの液滴（約１００のオルガノイドを含む）をとり、９６ウェルプレートのウェルに入れた後、ＵＶ光下で架橋させた（距離４ｃｍ、１０９０μＷ／ｃｍ２で５分間実施）。生成した被包化肝組織を、２０ｎｇ／ｍＬのＯＳＭ及び１０μＭのデキサメタゾンを添加した完全ウィリアムＥ培地／完全ＥＭＢ２培地（１：１）において５日間維持した。被包から５日後、ＯＳＭの補給を中止し、完全ウィリアムＥ培地／完全ＥＢＭ２培地の比を１：１から４：１に変更した。環境Ｏ２／５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で組織を培養し、１日おきに培地を交換した。条件培地においてアルブミン分泌を毎週評価した。被包化オルガノイドは、ハイドロゲルを介してアルブミンを分泌するその能力を培養期間が７週間を超えても保ち、ポリマー内でその生存及びその分化状態を維持しており、その間、ポリマー外に分泌タンパク質が拡散することも確認された。この被包化肝組織は、その形状及び完全性を損なわずに機器で操作する上で十分な硬さを有している。
【００８７】
分解性ハイドロゲルの調製。
タンパク質分解によって分解可能なＰＥＧビニルスルホンハイドロゲル（「Ｄ−ＰＥＧ−ＶＳ」）を、ＪｅｎＫｅｍから入手した８アームＰＥＧ−ＶＳ（トリペンタエリスリトールコア（Ｍｗ＝４０ｋＤａ））（カタログ番号「８ＡＲＭ（ＴＰ）−ＶＳ」）を用いて調製した。８アームＰＥＧ−ＶＳを最終濃度５％〜１０％（ｗ／ｖ）で等張性ＨＥＰＥＳ緩衝液（０．１ＭのＨＥＰＥＳ、０．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に溶解して分解性ＰＥＧビニルスルホンハイドロゲル前駆体溶液を調製した。その後、３つの反応性チオールを有するプラスミン感受性架橋剤と分解性ＰＥＧビニルスルホンハイドロゲル前駆体溶液を、−ＳＨ基と−ＶＳ基とのモル比が１：１となるように混合した。プラスミン感受性架橋剤は、カスタム合成（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）したものであり、Ａｃ−ＧＣＹＫ↓ＮＳＧＣＹＫ↓ＮＳＣＧ（配列番号１）というアミノ酸配列を有する。プラスミン感受性の架橋を行うアミノ酸配列では、Ｎ末端にアセチル基が付加されることで、この末端に存在する電荷が除去される。上記の矢印は、プロテアーゼによる切断部位を示す。ＰＥＧビニルスルホンハイドロゲル前駆体溶液とプラスミン感受性架橋剤とを混合してマイケル型付加（ＭＴＡ）反応を開始し、この反応を少なくとも５分間進行させることでＰＥＧビニルスルホンハイドロゲルを架橋させ、分解性ＰＥＧビニルスルホンハイドロゲルを生成した。
【００８８】
非分解性ハイドロゲルの調製。
ＪｅｎＫｅｍから入手した４アームＰＥＧ−ＶＳ（ペンタエリスリトールコア（Ｍｗ＝２０ｋＤａ））（カタログ番号「Ａ７０２５−１」または「４ＡＲＭ−ＶＳ」）を用いて非分解性ＰＥＧビニルスルホンハイドロゲル（「ＮＤ−ＰＥＧ−ＶＳ」）を調製した。０．４ｍｇ／１００μｌの光開始剤（例えば、アルファヒドロキシケトン（例えば、ＩＲＧＡＣＵＲＥ２９５９（ＢＡＳＦ、物質番号５５０４７９６２）として販売される２−ヒドロキシ−４’−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−メチルプロピオフェノン）など）（例えば、Ｅｌｉｓｓｅｅｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２６（１１）：１２１１−１８を参照のこと）及び０．１％（ｖ／ｖ）のＮ−ビニル−２−ピリリドン（ｐｙｒｒｉｌｉｄｏｎｅ）（ＰＶＰ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）を含む無菌ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）に最終濃度５％〜１０％（ｗ／ｖ）で４アームＰＥＧ−ＶＳを溶解して非分解性ＰＥＧビニルスルホンハイドロゲル前駆体溶液を調製した。ＰＶＰは、細胞適合性に影響を与えることなくゲル化を増進することが示されている（例えば、Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１４）Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  １０（１）：１０４−１４を参照のこと（参照によって本明細書に組み込まれる））。非分解性ＰＥＧビニルスルホンハイドロゲル前駆体溶液を最終濃度５％〜１０％（ｗ／ｖ）で調製した。この濃度は、２．５〜３０ｍｇ／１００μｌのＰＥＧ−ＶＳに相当する。非分解性ＰＥＧビニルスルホンハイドロゲル前駆体溶液を、一定強度（距離４ｃｍで１０９０μＷ／ｃｍ２）で異なる照射時間（例えば、３〜１０分）紫外線に曝露することで非分解性ＰＥＧビニルスルホンハイドロゲルを調製した。
【００８９】
二重ハイドロゲルの調製。
分解性ＰＥＧビニルスルホンハイドロゲル（「Ｄ−ＰＥＧ−ＶＳ」）を上記のように調製して二重ＰＥＧハイドロゲル調製物の「内部コア」を生成した。内部（分解性）コアのゲル化が完了（固体濃度に応じて約７〜１０分）した後、上記の非分解性ＰＥＧビニルスルホンハイドロゲル前駆体溶液の１０μｌビーズの中心に架橋内部コアを移入し、一定強度（距離４ｃｍで１０９０μＷ／ｃｍ２）で異なる照射時間（約３〜１０分）紫外線に曝露することで「内部コア」の周りに「外部シェル」を生成した。
【００９０】
Ｄ−ＰＥＧ−ＶＳ、ＮＤ−ＰＥＧ−ＶＳ、及び二重ＰＥＧハイドロゲルへの卵巣の被包。
無菌バイオハザードキャビネットにおいて加熱ステージ上で卵巣組織の被包を実施することで、環境による組織への損傷を最小化した。ＰＥＧに基づく移植片を調製するために、インキュベーター中の維持培地から卵巣片を移し、インスリン（２７Ｇ）針を使用して疎水性スライドに乗せた。それぞれの卵巣片の体積は、約１〜１．５ｍｍ３とした。ＰＥＧ前駆体の液滴（５μｌ）を同一のスライドガラスにピペットで乗せ、分解性ＰＥＧビニルスルホンハイドロゲル前駆体溶液の液滴に卵巣片を移入した。Ｄ−ＰＥＧ−ＶＳを調製するために、別の５μｌの溶解したペプチド架橋剤をＰＥＧ−ＶＳの液滴に添加し、混合した。その後、スライドにトップスライドをかぶせ、５分間ゲルを形成させた。ゲル化が完了した後、ハイドロゲルの移植準備が整った。
【００９１】
卵巣組織を含む非分解性ＰＥＧビニルスルホンハイドロゲルを調製するために、開始剤及びＰＶＰを含むＰＥＧビニルスルホン前駆体溶液の液滴（１０μｌ）を疎水性スライドガラスにピペットで乗せた。卵巣組織片をガラスに乗せ、針によって液滴に移入した。組織を含むＰＥＧ−ＶＳ前駆体溶液を一定強度（距離４ｃｍで１０９０μＷ／ｃｍ２）で異なる照射時間（例えば、３〜１０分）紫外線に曝露することで非分解性ＰＥＧビニルスルホンハイドロゲルを調製した。
【００９２】
二重ＰＥＧハイドロゲルに卵巣組織片を被包するために、分解性ＰＥＧビニルスルホンハイドロゲル前駆体溶液の液滴に卵巣片を移入し、上記のようにゲル化させた後、ゲル化した分解性ＰＥＧビニルスルホンハイドロゲルを、二重ハイドロゲルを調製するために、上記のように非分解性ＰＥＧビニルスルホンハイドロゲルに被包した。
【００９３】
実施例ＩＩ−被包化組織の特徴付け
細胞の免疫蛍光。
４％のパラホルムアルデヒドにおいて細胞を固定化し、０，２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ（商標）−１００において細胞の透過処理を室温で５分間実施した。３％のブロッキング血清（一次抗体に対応する）溶液と共に細胞を室温で３０分間インキュベートして非特異部位をブロッキングした。固定化及び透過処理を行った細胞を一次抗体溶液（ＰＢＳ−ＢＳＡ２％において抗体を希釈したもの）と共に室温で１時間インキュベートした。その後、遮光しながら二次標識抗体溶液（蛍光）と共に細胞を室温で３０分間インキュベートした。最後の１５分間は、色素（Ｐｕｒｅｂｌｕｅ（商標）核染色、ＢｉｏＲａｄ）を添加して核を染色した。Ａｎｔｉｆａｄｅ（商標）試薬（ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ）で細胞をマウントした。この手順の翌日に蛍光分析を実施した。
【００９４】
肝臓オルガノイドに対する免疫蛍光。
４％のパラホルムアルデヒドにおいてオルガノイドを固定化した後、パラフィンに包埋した。キシレン溶液及びエタノール溶液の濃度低下系列（１００％から３０％）を使用してパラフィン切片の脱パラフィン処理及び再水和処理を実施した。３％のブロッキング血清（一次抗体に対応する）溶液と共にスライドを室温で２０分間インキュベートして非特異部位をブロッキングした。一次抗体溶液（ＰＢＳ−ＢＳＡ２％において抗体を希釈したもの）と共にスライドを室温で１時間インキュベートした。遮光しながら二次標識抗体溶液（蛍光）と共にスライドを室温で３０分間インキュベートした。ＤＡＰＩを含むＡｎｔｉｆａｄｅ（商標）試薬（ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ）でスライドをマウントした。この手順の翌日に蛍光分析を実施した。
【００９５】
細胞及びオルガノイドに対する免疫蛍光に使用した抗体。
抗ヒトＮＡＮＯＧ（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから入手し、１：１０希釈）、抗ヒトＴＲＡ１−８１（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手し、１：５０希釈）、抗ヒトＳＳＥＡ４（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手し、１：５０希釈）、抗ヒトＰＯＵ５Ｆ１（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから入手し、１：５０希釈）、抗ヒトＳＯＸ２（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから入手し、１：５０希釈）、抗ヒトＦＯＸＡ２（ＡＢＣＡＭから入手し、１：１００希釈）、抗ヒトＳＯＸ１７（ＡＢＣＡＭから入手し、１：１００希釈）、抗ヒトＣＸＣＲ４（ＡＢＣＡＭから入手し、１：１００希釈）、抗ヒトＧＡＴＡ４（ＡＢＣＡＭから入手し、１：５０希釈）、抗ヒトＡＦＰ（ＤＡＫＯから入手し、１：１００希釈）、抗ヒトアルブミン（ＤＡＫＯから入手し、１：１００希釈）、抗ヒトＥ−カドヘリン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手し、１：１００希釈）、抗ヒトαＳＭＡ（ＡＢＣＡＭから入手し、１：１００希釈）、抗ヒトフィブロネクチン（ＡＢＣＡＭから入手し、１：１００希釈）、抗ヒトＣＤ３１（ＡＢＣＡＭから入手し、１：１００希釈）、抗ヒトＶＥ−カドヘリン（ＡＢＣＡＭから入手し、１：１００希釈）、抗ヒトＣＫ１９（ＡＢＣＡＭから入手し、１：１００希釈）、抗ヒトＺＯ１（ＡＢＣＡＭから入手し、１：１００希釈）、抗ヒトＥｐＣＡＭ（ＡＢＣＡＭから入手し、１：１００希釈）。
【００９６】
ＦＡＣＳ分析。
それぞれのアッセイチューブに０．５〜１Ｘ１０６個の細胞を分注した。１００μＬの蛍光色素結合型一次抗体溶液（膜抗原）で細胞を室温（遮光）で２０分間染色した。その後、４％のパラホルムアルデヒドで細胞を室温で１０分間固定化した。１％のＴｒｉｔｏｎＸ（商標）−１００で細胞の透過処理を実施した。１００μＬの蛍光色素結合型抗体溶液で細胞を染色（細胞内抗原）し、暗所において室温で２０分間インキュベートした。０．５ｍＬのＰＢＳ−ＢＳＡ１％に細胞を再浮遊させ、４℃で保持し、解析した。ＦＡＣＳに使用した抗体は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手した：ＰＥ抗ヒトＳＳＥＡ４、Ａｌｅｘａ６４７抗ヒトＮＡＮＯＧ、ＰＥＲＣＰ−ＣＹ５，５抗ヒトＴＲＡ１−８１、ＡＰＣ−Ｒ７００抗ヒトＣＤ１１７、ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ９０、ＰＥ抗ヒトＣＤ１３３、ＰＥ抗ヒトＣＤ３１、ＰＥ抗ヒトＣＤ２５、抗ヒト７ＡＡＤ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄｓから入手したもの：ＡＰＣ抗ヒトＣＤ３、ＰＥｃｙ７抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ、ＰｅｒＣｐ−Ｃｙ５．５抗ヒトＣＤ６９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手したもの：ＦＩＴＣ抗ヒトＣＦＳＥ。
【００９７】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ。
一本鎖ｃＤＮＡを合成するための鋳型として、培養した細胞またはオルガノイドから全ＲＮＡを抽出した（ＲｅｌｉａＰｒｅｐ（商標）ＲＮＡ細胞ミニプレップ系、Ｐｒｏｍｅｇａ）。逆転写を実施してｃＤＮＡを得た。ＰＣＲ反応混合液を調製した後、プレートにロードした。プレートを密封し、遠心分離した後、機器にロードした。標準的なＴａｑＭａｎ  ｑＰＣＲ反応条件を使用した。遺伝子発現の相対定量を計算するために比較ＣＴ（ΔΔＣＴ）法を使用してデータを解析した。下記の遺伝子発現アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃより入手）を使用した：Ｈｓ０４３９９６１０Ｇ１  Ｎａｎｏｇ  Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ、Ｈｓ０１８９５０６１＿Ｕ１  ＰＯＵ５Ｆ  Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ、Ｈｓ１０５３０４９＿Ｓ１  ＳＯＸ２  Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ、Ｈｓ００７５１７５２＿Ｓ１  ＳＯＸ１７  Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ、Ｈｓ００１７１４０３＿Ｍ１  ＧＡＴＡ４  Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ、Ｈｓ００２２３０８５３＿Ｍ１  ＨＮＦ４Ａ  Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ、Ｈｓ００１７３４９０＿Ｍ１  ＡＦＰ  Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ、Ｈｓ００６０９４１１＿Ｍ１アルブミンＴａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ、Ｈｓ９９９９９９０５＿Ｍ１  ＧＡＰＤＨ  Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ。結果は、３つの反復検体から得られた平均発現量として示される。
【００９８】
Ｃｙｐ３Ａ４活性。
Ｃｙｐ３Ａ４活性は、Ｐｒｏｍｅｇａから入手したＰ４５０−Ｇｌｏ（商標）アッセイを製造者の説明に従って使用して評価した。
【００９９】
尿素合成。
尿素合成は、Ｇｅｎｔａｕｒから入手したＱｕａｎｔｉｃｈｒｏｍ尿素アッセイキット（商標）を製造者の説明に従って使用して測定した。
【０１００】
アルブミン産生。
アルブミン産生は、Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ  ｃＳｙｓｔｅｍｓでアルブミンを定量的に測定するＭｕｌｔｉｇｅｎｔ（登録商標）マイクロアルブミンアッセイを使用して評価した。このアッセイは、ヒトのアルブミンに対するポリクローナル抗体を使用する免疫比濁法によるものである。検体（この場合、培地交換から４８時間後に９６ウェルプレートの各ウェルから収集した２００μｌの上清）が試薬と混合されると、検体中のアルブミンが試薬中の抗ヒトアルブミン抗体（ヤギ）と結合することで、溶液の濁度を増加させる不溶性の凝集物が生成する。この濁度は、検体中のアルブミン濃度に比例し、光学的に測定することができる。試薬キット：２Ｋ９８−２０  ＭＵＬＴＩＧＥＮＴマイクロアルブミン。
【０１０１】
ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色。
肝芽、オルガノイド、及び卵巣の切片を蒸留水に含めた。核をミョウバンヘマトキシリンで染色した。水道の流水で切片をすすぎ、０．３％の酸アルコールで分別した。切片をエオシンで２分間染色した。切片を脱水、透徹、及びマウントした。
【０１０２】
混合リンパ球反応。
ＭＬＲは、１０６個のエフェクターＰＢＭＣ、１０５個の同種異系成熟樹状細胞（ｍＤＣ）、６ｘ１０５個の細胞から構成される肝臓オルガノイドのいずれかに対して２回実施した。ＭＬＲの６日間の共培養の前に、標的細胞または標的組織を照射し、そのままにするか、またはハイドロゲルに被包（＋ゲル）した。
【０１０３】
ＩＦＮ−γ産生。
ＩＦＮ−γ産生は、ＰＥＰＲＯＴＥＣＨから入手したヒトＩＦＮ−γ標準ＡＢＴＳ  ＥＬＩＳＡ発色キットを製造者の説明に従って用いて評価した。
【０１０４】
アリザリンレッドＳ染色。
ｉＭＰＣ由来の骨細胞のカルシウム沈着を、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから入手したアリザリンレッドＳ染色を使用して評価した。４％のパラホルムアルデヒドにおいて細胞を固定化した後、ＰＢＳで洗浄し、アリザリンレッドＳと共に室温で５分間インキュベートした。インキュベート後、アリザリンレッドＳ溶液を除去し、ＰＢＳで細胞を洗浄した。染色した検体を微視的に調べた。
【０１０５】
中性脂質染色。
ｉＭＰＣ由来の脂肪細胞における中性脂質染色は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手したＨＣＳ  ＬｉｐｉｄＴＯＸ（商標）中性脂質染色を製造者の説明に従って使用して実施した。
【０１０６】
管形成アッセイ。
ｉＰＳＣ由来の内皮前駆細胞（ｉＥＰＣ）をＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）で解離させた後、増殖因子低減Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコートされた２４ウェルプレートにウェル当たり７ｘ１０４個の密度で播種して完全ＥＢＭ２培地に含めた。プレートを環境Ｏ２／５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で一晩インキュベートした。インキュベートから１６時間後に、光学顕微鏡下で管形成を可視化した。
【０１０７】
細胞生存率アッセイ。
被包化肝組織の細胞生存率は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手した哺乳類細胞用ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）生存率／細胞毒性キットで決定した。ＰＢＳ、エチジウムホモダイマー−１、及びカルセイン−ＡＭを含む１５０μｌの溶液（製造者の説明に従って調製）と共にそれぞれのＥＬＴ（９６ウェルプレートにおいて生成）を、環境Ｏ２／５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、蛍光顕微鏡下で緑色蛍光及び赤色蛍光を解析した。
【０１０８】
アンモニア代謝。
１ｍＭの塩化アンモニウム、４ｍＭのＬ−グルタミン／アラニン、及び４ｍＭのＬ−オルニチンを添加した完全ＥＬＴ培地（完全ウィリアムＥ培地／完全ＥＢＭ２培地（４：１））と共にＥＬＴを２４時間インキュベートした。ＡＢＣＡＭから入手したアンモニアアッセイキットを製造者の説明に従って使用してアンモニア濃度を決定するために、使用済培地を２４時間後に収集し、５００ｇで５分間遠心分離した。１ｍＭの塩化アンモニウム、４ｍＭのＬ−グルタミン／アラニン、及び４ｍＭのＬ−オルニチンを添加した完全ＥＬＴ培地との２４時間のインキュベートの前後に、Ｇｅｎｔａｕｒから入手したＱｕａｎｔｉｃｈｒｏｍ尿素アッセイキット（商標）を製造者の説明に従って使用してＥＬＴの尿素産生を測定した。
【０１０９】
タクロリムス代謝（図４Ｋ）：
Ｆｕｊｉｓａｗａ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手したＦＫ５０６（タクロリムス）を２０ｎｇ／ｍｌとなるように添加した完全ＥＬＴ培地（完全ウィリアムＥ培地／完全ＥＢＭ２培地（４：１））を２０Ｍのリファンピシンを添加または無添加で用いて、ＥＬＴを環境Ｏ２／５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で１２時間インキュベートした。１２時間後、使用済培地を収集し、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法によってタクロリムス濃度を測定した。エレクトロスプレーイオン化を使用する選択的反応監視モードにおいて、ｍ／ｚが８２１，５から７６８，６に移行するアンモニウム付加イオン（タクロリムス）を測定した。
【０１１０】
ＥＬＴの凍結後の特徴付け。
凍結培地（１０％のＤＭＳＯを含む完全ＥＬＴ培地）においてＥＬＴを−８０℃で３日間凍結した。３日後、ＥＬＴを解凍し、解凍から２４時間後及び１週間後にアルブミン産生ならびＣｙＰ３Ａ４活性を上記のように測定した。
【０１１１】
異物反応評価。
免疫抑制処理がなされておらず、免疫能が正常なマウスの腹膜腔内に（図４Ｍに示されるように）ＥＬＴを移植した。次に、１週間後（図４Ｎの左）及び４週間後（図４Ｎの右）に腹膜腔からＥＬＴを取り出し、異物反応の徴候（すなわち、線維症、炎症）の存在について調べた。
【０１１２】
奇形腫形成アッセイ。
未分化ｉＰＳＣをＮＯＤ／ＳＣＩＤ  ＩＬ−２Ｒγ−／−マウスの皮下に注射するか、または当該未分化ｉＰＳＣを５％のＰＥＧ−ＶＳハイドロゲルに被包して当該マウスの皮下に移植した。８週間後、マウスを屠殺し、奇形腫の形成を評価した。
【０１１３】
免疫が抑制されておらず、免疫能が正常な急性肝不全マウスに被包化肝組織を異種移植することの短期インビボ効力の初期評価。
飲水からのＮＴＢＣの補給を中止することによって、免疫能が正常なＦａｈ−／−（高チロシン血症）マウスにおいて急性肝不全を引き起こした。６匹の動物に被包化肝組織を移植し（上記のようにヒト細胞から生成した円柱状被包化肝組織（８ｘ２ｍｍ）を腹腔内に移植した）、３０日間経過観察して生存評価を実施した。異種移植であったが、免疫抑制は一切行わなかった。６匹のマウスには、対照として働く空のバイオマテリアルを移植した。移植後７日目時点の体重減少を二次評価項目として評価した。３０日目の時点で依然として生存している動物はすべて安楽死させ、Ａｂｃａｍから入手したヒトアルブミンＥＬＩＳＡキットを製造者の説明に従って使用し、マウスの血清におけるヒトアルブミンを特異的に測定した。
【０１１４】
異種成分非含有かつ支持細胞非含有の厳密条件下で１４のヒトｉＰＳＣ集団を生成及び維持した（図１Ａ〜Ｄ）。皮膚線維芽細胞または１．５ｍＬの末梢血から６．３±５．６の高度に均一なｉＰＳＣ集団を得た。このｉＰＳＣは、胚体内胚葉及び後方前腸へと再現性よく分化し（図２Ａ〜Ｄ）、次に、肝臓特異的なマーカー及び機能を発現する肝実質細胞様細胞へとさらに分化した（図２Ｅ〜Ｈ）。単一のｉＰＳＣ集団から開始し、肝前駆細胞（肝芽細胞）、内皮前駆細胞、及び間葉系前駆細胞（骨細胞及び脂肪細胞を含む）が得られた（図２Ｉ〜Ｍ）。
【０１１５】
ｉＰＳＣ由来のこれら３つの細胞型を、サイズが固定であり、接着性が非常に低いマイクロウェルにおいて浮遊培養した（図３Ａ）。成熟培地においてマイクロウェル内で５日間分化したオルガノイドは、サイズが制御されており（直径５０〜２５０μｍ、図３Ｃ）、ヒト肝臓を思わせる３Ｄ構造を示し（図３Ｂ及び図３Ｃ）、肝臓マーカーを発現し（図３Ｄ）、顕著なアルブミン分泌能力及び尿素分泌能力（図３Ｅ）ならびにＣｙＰ３Ａ４活性（図３Ｆ）を獲得していた。
【０１１６】
肝臓オルガノイドの成熟を促進し、インビボでのその生存を増進するために、被包方針を開発した（図４Ａ及び図４Ｂ）。２０ｋＤａの４アームＰＥＧ−ＶＳバイオマテリアルを５％含む液体内に複数の肝臓オルガノイド（例えば、５０〜１５０）を分散させた（図４Ａ）。光重合によって被包化肝組織（ＥＬＴ）を得ることが可能になり、このＥＬＴは、手術道具で操作する上で十分な硬さ有していた（図４Ｂ）。そのようなＥＬＴを、植込み型の生産物（８ｘ２ｍｍの円柱状）またはインビトロアッセイ向けのもの（９６ウェル形式）として生成した。被包手順によって顕著な細胞毒性が生じることはなかった（ｌｉｖｅ／ｄｅａｄアッセイでの細胞生存率が＞９０％、図４Ｃ）。バイオマテリアル内では、肝臓オルガノイドが顕著に成熟した一方で、そのサイズが顕著に変化することはなかった。被包から３０日後、オルガノイド全体を通じて肝実質細胞が分散しており、胆管が視認可能であった（図４Ｄ）。肝実質細胞は、成熟しており、成人表現型を獲得していた。被包から７日後、ＥＬＴは、初代ヒト肝実質細胞と比較して同等以上の効率で成熟肝機能（アルブミン及び尿素の分泌、ＣｙＰ３Ａ４活性、アンモニアまたはタクロリムスの代謝の増加、ＡＦＰ分泌の減少）をインビトロで発揮することができた（図４Ｅ〜Ｈ）。アルブミン産生、尿素へのアンモニア代謝は、初代肝実質細胞と比較してＥＬＴにおいて有意に効率が上昇しており、ヒト肝臓と同等であった（アルブミン１２ｍｇ／組織ｇと２０ｍｇ／ヒト肝臓ｇとの対比、アンモニア３４７μｍｏｌ／分／植込み型デバイスと約４００μｍｏｌ／分／肝臓との対比（図４Ｅ〜Ｆ））。ＣｙＰ３Ａ４によるタクロリムス代謝は、ヒト肝臓と同等であり、リファンピシンを補充することによって誘導可能であった（図４Ｇ）。こうした機能はすべて、少なくとも７週間は維持され、時間を経ても安定であった（一方、初代ヒト肝実質細胞は、播種から数日以内にその代謝活性を失う）。ＥＬＴは、その肝機能に有意な減少が全く生じることなく凍結保存に抵抗することができたが（図４Ｈ）、このことは、初代ヒト肝実質細胞には当てはまらないことである。ヒト多能性幹細胞から生成した肝臓オルガノイドを含むＥＬＴを免疫能が正常なマウスの腹腔に移植することでその生体適合性を評価した（図４Ｉ）。１〜４週間後、異物反応は全く認められなかった（癒着なし、炎症なし、図４Ｊ）。肝臓オルガノイドの生成に使用した多能性幹細胞は、免疫抑制ＮＳＧマウスに皮下注射すると奇形腫を形成することができる（図４Ｋ）。そのような多能性幹細胞をＰＥＧに基づく上記のバイオマテリアル内に被包すると、包埋された細胞がレシピエント組織に拡散することが阻止され、これによって奇形腫の形成が阻止された（図４Ｌ）。このことは、被包することで、幹細胞由来の分化細胞またはオルガノイドの移植に起因して腫瘍が形成されるリスクを顕著に低減することができることを示唆している（したがって、ＥＬＴが腫瘍形成能を有さないか、またはＥＬＴの腫瘍形成能が低いことを示唆している）。ＥＬＴの免疫原性、及びバイオマテリアル内への被包によって得られる免疫隔離について評価するために、我々は、混合リンパ球反応アッセイを実施した��図４Ｍ〜Ｏ）。非被包化肝臓オルガノイドは、同種異系エフェクターＴ細胞を活性化する能力が非常に低いことが示された。被包すると、被包化細胞と免疫細胞との間の接触がいずれも阻止され、これによってＴ細胞の活性化が阻止された。同種異系成熟樹状細胞を被包するとＴ細胞が活性化されなかったことから、バイオマテリアルの免疫隔離能力がさらに確認された（図４Ｍ〜Ｏ）。こうしたデータは、免疫抑制を必要とすることなく同種異系被包化肝組織を移植することが可能であることを示唆している。
【０１１７】
免疫能が正常なマウスにおいて概念実証実験を実施した。高チロシン血症Ｆａｈ−／−マウスにおいて急性肝不全を誘導した後、免疫抑制を行うことなく当該動物の腹腔にヒトＥＬＴを移植した。空のバイオマテリアルを移植したマウスを対照とした。手術から７日目の時点で、ＥＬＴを移植したすべてのマウスで体重が増加した一方で、すべての対照で体重が安定または減少した（図４Ｐ）。手術から３０日後、対照の生存率が０％であったこととは対照的に、ＥＬＴを移植したマウスの生存率は６７％であった。３０日目のすべての生存動物の血液においてヒトアルブミンが検出された。このことは、免疫抑制を必要とすることなく、肝不全を患う対象において肝機能を改善させ、生存を改善するという大いなる潜在力をＥＬＴが有することを示唆している。
【０１１８】
本発明は、その特定の実施形態と関連付けて説明されているものの、特許請求の範囲は、実施例に示される好ましい実施形態によって限定されるべきではなく、全体としての説明と整合する最大限に広範な解釈が与えられるべきであることを理解されよう。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図２−７】
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【図２−８】
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【図２−９】
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【図２−１０】
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【図２−１１】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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【図４−７】
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【図４−８】
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【図４−９】
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【図４−１０】
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【図４−１１】
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【図４−１２】
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【図４−１３】
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【図４−１４】
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【図４−１５】
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【図４−１６】
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【図４−１７】
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【図４−１８】
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【図４−１９】
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【図４−２０】
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【図４−２１】
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【図４−２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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