(57)【要約】  軟組織充填剤の分野におけるＨＡおよびＨＡｐをベースとした組成物、およびその製造方法。任意により、経皮充填剤は、顔の組織にボリュームを加えることにより、顔の組織増強を強化するのに有用であり、皺および皺の重なりを修正し、顔の滑らかな外観を復元する。任意により、経皮充填剤は、ＨＡｐに化学結合した非架橋または架橋ＨＡを含む。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖およびＨＡｐを含み、前記多糖がＨＡｐに化学結合している、組成物。
【請求項２】
前記多糖が、ＨＡまたはヘパロサンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記化学結合がカップリング剤により得られ、かつ前記多糖がＨＡを含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記カップリング剤が、ＢＤＤＥ、有機官能性シラン、ジルコン酸塩、チタン酸塩、エポキシ化合物、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）、ホルムアルデヒド、ポリアジリジン、アミノ酸またはエステル、カルボジイミド、デンドリマー、ＰＯＳＳ（登録商標）およびアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）からなる群から選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記有機官能性シランが、少なくとも１つのアルコキシ基または少なくとも１つの塩素原子を有する、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記有機官能性シランが、式Ｒ−Ｓｉ−Ｘ３を有し、式中、Ｘは表面の反応基に加水分解し得るアルコキシ基であり、Ｒは、ＨＡｐと反応し得る有機官能基である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記有機官能性シランが、エポキシ官能基シラン、ビニル官能基シラン、またはアミノ官能基を特徴とするシランからなる群から選択される、請求項４〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記エポキシ官能基シランが、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランまたは３−グリシドキシプロピルトリエトキシシランのうちの１つ以上を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ビニル官能基シランが、ビニルトリメトキシシラン、ビニルトリエトキシシランまたはビニルトリクロロシランのうちの１つ以上を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記アミノ官能基シランが、３−アミノプロピルトリエトキシシランまたは３−アミノプロピルトリメトキシシランのうちの１つ以上を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＨＡｐが、前記有機官能性シランで前処理されている、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ＨＡｐが、ＨＡへの導入前に前記有機官能性シランでコーティングされた微粒子の形態である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ＨＡｐが、１ｎｍ〜１００ｎｍの範囲の粒子サイズを有するナノ粉末の形態である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＨＡが、前記ＨＡｐとの反応の前において非架橋のままである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ＨＡｐがミクロスフェアの形態で存在する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ＨＡｐが、１０μｍ〜１００μｍの範囲の粒子サイズを有する粒子中に存在する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ＨＡｐが、小さい表面積を有する円形であり、均一、もしくは滑らかな形状を有する、または代替的に、不規則、多孔、中空、花様の多孔中空ミクロフェアである形状、または大きい表面積を有する粒子中に存在する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
経皮充填剤として哺乳動物対象への挿入に好適である担体をさらに含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記哺乳動物対象がヒト対象である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
顔面組織の増強を強化するために適合された、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
ＨＡの前記濃度が、１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの範囲である、請求項１〜２０のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２２】
ＨＡの濃度が、１５〜３０ｍｇ／ｍｌの範囲にある、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
麻酔剤、抗酸化剤、またはビタミンのうちの１つ以上をさらに含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
ＨＡ鎖を架橋するための多官能性架橋剤として使用されるデンドリマーをさらに含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記デンドリマーが、低下した粘度、および組織内においてより長い寿命を有する、より柔らかいゲルを有することを特徴とする組成物を生成するのに好適である量で存在する、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
ＨＡの複数の部分が非架橋であり、前記デンドリマーが架橋剤として使用されて、非架橋ＨＡの少なくとも一部分を架橋し、これにより、前記組成物の粘度が低下して、細ゲージ針からの前記組成物の押出しを支援する、請求項２４または２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記細ゲージ針が、２７Ｇ〜３０Ｇの範囲のゲージを有する、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記デンドリマーがエポキシ官能性デンドリマーを含む、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
前記より長い寿命が、ＨＡ経皮充填剤の場合よりも少なくとも２０％〜少なくとも５００％長い範囲である、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
ＨＡ鎖を架橋するための多官能性架橋剤として使用されるＰＯＳＳ（登録商標）をさらに含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
前記ＰＯＳＳ（登録商標）が、低下した粘度、および前記組織内においてより長い寿命を有するより柔らかいゲルを特徴とする組成物を提供する量で存在する、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
ＨＡの一部分が非架橋であり、前記ＰＯＳＳ（登録商標）が架橋剤として使用されて、非架橋ＨＡの前記一部分を架橋し、それにより、前記組成物の粘度が低下して、細ゲージ針からの前記組成物の押出しを支援する、請求項３０または３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記ＰＯＳＳ（登録商標）が、前記ＨＡと前記ＨＡｐとを連結するカップリング剤として機能する適切な有機官能基により調整されている、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
前記有機官能基が、アルコキシ官能基およびエポキシ官能基を含む、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記ＨＡｐが、複数のドメインを有する三次元架橋シラン多層を特徴とし、少なくとも１つのドメインがシラン処理され、少なくとも１つのドメインがシランを含まない、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
前記ＨＡｐが、ヤヌス粒子を形成した後に粒子の形態であり、前記粒子が、一方がシランによりサイズ決めされた半球表面と、他方が未処理の半球とを含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
前記ＨＡｐが、異なるシラン試薬の適用後、ヤヌス粒子を形成した後に粒子の形態であり、粒子の異なるドメインまたは半分を異なる試薬で部分的に処理する、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３８】
前記ＨＡ鎖が粒子の添加により安定化されている、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記粒子が化学結合したＨＡｐ粒子を含む、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記ＨＡが、カップリング剤を用いて前記ＨＡｐに連結される、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の組成物を製造する方法。
【請求項４１】
前記ＨＡｐが微粒子の形態であり、前記カップリング剤が前記微粒子の表面改質として適用される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
シランを前記微粒子に適用し、前記ＨＡｐミクロスフェアを温度７０℃〜１０５℃の範囲のオーブンで１〜２４時間硬化させることをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記シランが、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランを含み、前記硬化が７０℃で２４時間実施される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
シランを前記微粒子に適用し、前記ＨＡｐミクロスフェアを室温で一晩硬化させることをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
マスキング法に従ってＨＡｐ粒子を処理することを含み、二相間の界面で前記粒子を捕捉し、それにより未処理の半球をマスキングし、他の半球を修飾することを含む、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記処理相が、シリル化プロセスにより処理される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
異なる官能基を有する異なるシラン試薬でＨＡｐ粒子を処理することを含む、請求項４０〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記処理が、前記異なるシラン試薬を用いて、前記ＨＡｐ粒子のヤヌス粒子を調製することを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
請求項４０〜４８のいずれか一項に記載の方法に従って調製された組成物。
【請求項５０】
ＨＡ、ＨＡｐおよびデンドリマーを含む組成物であって、前記デンドリマーがＨＡ鎖を架橋するための多官能性架橋剤として使用される、組成物。
【請求項５１】
前記ＨＡの一部分が非架橋であり、前記デンドリマーが架橋剤として使用されて、細ゲージ針からの押出しを支援するために添加される非架橋ＨＡの前記一部分を架橋する、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
前記デンドリマーが、エポキシ官能性デンドリマーを含む、請求項５０または５１に記載の組成物。
【請求項５３】
ＨＡ、ＨＡｐおよびＰＯＳＳ（登録商標）を含む組成物であって、前記ＰＯＳＳ（登録商標）がＨＡ鎖を架橋するための多官能性架橋剤として使用される、組成物。
【請求項５４】
前記ＨＡの一部分が非架橋であり、前記ＰＯＳＳ（登録商標）が架橋剤として使用され、細ゲージ針からの押出しを支援するために添加される非架橋ＨＡの前記一部分を架橋する、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５５】
前記ＰＯＳＳ（登録商標）が、低下した粘度、および組織内においてより長い寿命を有するより柔らかいゲルを特徴とする組成物を提供する量で存在する、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
前記ＨＡと前記ＨＡｐとを連結するカップリング剤として機能する好適な有機官能基により調整されたＰＯＳＳ（登録商標）をさらに含む、請求項５０〜５５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５７】
前記有機官能基が、アルコキシ官能基およびエポキシ官能基を含む、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５８】
請求項１〜５７のいずれか一項に記載の組成物を対象の顔面組織に挿入することを含む、顔面組織増強のための方法。
【請求項５９】
顔の組織にボリュームを加えること、皺および皺の重なりを修正すること、または顔の滑らかな外観を回復すること、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上を実行することをさらに含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記組成物は、ＨＡ鎖を架橋するための多官能性架橋剤として使用されるデンドリマーをさらに含み、それにより、前記組成物は、低下した粘度、および組織内においてより長い寿命を有するより柔らかいゲルである、請求項５８または５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記組成物は、ＨＡ鎖を架橋するための多官能性架橋剤として使用されるＰＯＳＳ（登録商標）をさらに含み、それにより、前記組成物は、低下した粘度、および組織内においてより長い寿命を有するより柔らかいゲルである、請求項５８または５９に記載の方法。
【請求項６２】
鼻の再形成および／または先端移植のために前記組成物を適用することをさらに含む、請求項５８〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
関節潤滑のために前記組成物を適用することを含む、請求項６８〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、軟組織充填剤に関し、具体的には、ヒアルロン酸およびヒドロキシアパタイトをベースとして、別個に、および組み合わせて真皮および皮下移植可能な充填剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、３つの層を含み、各層が、特定のタスクを実行する。外側の薄く、強靭な層は、表皮である。表皮は、厚さが、瞼の０．０５ｍｍから足裏および手のひらの０．８〜１．５ｍｍまで異なる。表皮の細胞のほとんどは、角化細胞である。新しい角化細胞は、基底層と呼ばれる表皮の最深層の細胞から発生し、表皮の表面に向かって移動して古い細胞を置き換える。表皮の最外側部分の角質層は、ほとんどの細菌、ウイルス、化学物質が体内に入るのを防ぐ防水障壁である。メラノサイト細胞は、基底層全体に散在し、色素メラニンを生成する。これが皮膚の色に寄与し、紫外線をフィルタリングする。表皮には、感染に対して身体を守る皮膚の免疫系の一部であるランゲルハンス細胞も含まれている。表皮の下に真皮がある。真皮は、厚さが、瞼の０．６ｍｍから、足裏および手のひらの３〜５ｍｍまで異なる。
【０００３】
真皮は、皮膚に柔軟性および強度を付与するコラーゲン、エラスチン、およびフィブリリンで主に作られた繊維状の弾性組織の厚い層である。コラーゲン繊維は、真皮の７０％を占め、エラスチンが通常の弾力性および柔軟性を維持しながら、強度および靭性を付与する。真皮は、痛み、触覚、圧力、温度を感じる神経終末を含む。また、真皮は、熱およびストレスに反応して汗を生成する汗腺を含み、体の冷却を助ける。また、真皮には、毛包に油（皮脂）を収容する油（皮脂）腺が含まれ、これにより、皮膚の水分および柔らかさを保つ。また、真皮は、体温の調節、傷害からの保護、感覚の増強を助ける毛包を含む。また、真皮は、皮膚に栄養を供給し、体温を調節するのを助ける血管を含む。真皮の下には下皮があり、皮下脂肪層または皮下組織としても知られている。これは、体脂肪の約５０％の脂肪の層である。脂肪は、脂肪細胞と呼ばれる生細胞に含まれ、繊維組織によって共に保持されている。脂肪層は、皮膚を骨および筋肉に付着させ、身体の断熱を助け、保護パッドを提供し、エネルギー貯蔵領域として機能する。
【０００４】
顔の老化は、皮膚、軟組織、および頭蓋顔面の骨格への累積的な影響により、皮膚表面の皺、形状（ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ）、および顔のボリュームの喪失を引き起こす、生涯にわたって生じる動的プロセスの表現（ｍａｎｉｆｅｓｔ）である。こうした老化の影響としては、重力、進行性の骨吸収、組織の弾力性の低下、および皮下脂肪の再分布、ふくよかさ（ｆｕｌｌｎｅｓｓ）の喪失が挙げられる。ホルモンの不均衡、太陽への曝露、精神的ストレス、食事、仕事の習慣、疾患、薬物乱用、および喫煙も顔の魅力に影響を与え得る。
【０００５】
骨の萎縮、ならびに骨の膨張および骨の損失の動態は、頭蓋顔面の骨格が老化する原因である。骨吸収は、生体計測によるボリュームの損失をもたらし得、重なっている軟組織および皮膚は、骨の構造的支持がなく、有意な変化を受け得る。例えば、上顎が吸収されると、上唇の支持の喪失となり得、頬脂肪パッドの変位となり、それぞれ、口周の皺および鼻唇の皺の重なりの原因になり得る。若々しい顔は、表面脂肪と深部脂肪とのバランスの取れた分布により、軟組織にふくよかさが付与される、丸い顔の形状を特徴とする。脂肪の再分布および喪失により、軟組織の支持およびふくよかさが徐々に失われ、その結果、例えば、額、頬骨などの脂肪の喪失などの軟部組織の降下、および顎、鼻唇の皺の重なりなどでの脂肪の増加などがもたらされる。
【０００６】
顔の外観および構造を考慮する場合には、顔を３つの領域に分割すると好都合である。上部の３分の１には、額および眉を含み、中央の３分の１には、顔面中部および鼻を含み、下部の３分の１には、顎、顎線および首を含む。顔面中部には、目、鼻、唇、頬骨（中央の顔面の三角形）を含み、主に顔の審美性および魅力である知覚に寄与する。
【０００７】
額、眉、側頭、および上眼瞼領域などの上面は、皮下のふくよかさの喪失の影響を受け、額線が生じる。この領域における筋肉の作用は、若者では、額の皮下のふくよかさによって比較的隠れている。それが加齢と共に、ふくよかさが喪失し、皺および皺の重なりとなる。眉の下垂の印象は、外側の眉の支持の喪失および上眼瞼のふくよかさの喪失の結果である。
【０００８】
目、鼻、唇、頬骨（中央の顔面の三角形）などの顔面中部は、皮下のふくよかさの喪失の影響を受ける。「目尻の皺」は、眼輪筋周辺の皮下のふくよかさの喪失の結果である。また、眼輪筋の境界が明白になり、これが頬骨の隆起（ｚｙｇｏｍａｔｉｃ  ｅｍｉｎｅｎｃｅ）上の頬骨の三日月部（ｍａｌａｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔ）および鼻顎の皺の重なりの発達に寄与する。下眼瞼に蓄積された脂肪が枯渇して、痩せた外観が生じるため、年齢とともに眼窩周囲の涙溝の凹みが生じる。眼輪筋と下眼瞼との間で、ふくよかさが失われることにより、組織がより近位になることで、夜の十分な睡眠をとった後であっても、皮膚の色が濃くなり、疲労し、消耗した目の外観となる。暗色も、真皮メラニン沈着に起因し得る。鼻唇の皺の重なりは、下垂性頬脂肪の下降が原因で発生する。鼻はまた、眉間のふくよかさの喪失、鼻および上部背部（頭側の鼻）および鼻の長さの増長の錯覚に寄与する鼻先端下垂などの老化の影響を受けやすい。下垂した顎は、鼻の長さが増長した外観の原因ともなり得る。顎、顎線、および首などの下部の顔面は、加齢とともに脂肪の蓄積を呈し、その結果、皮膚が比較的過剰になり、顎線の画成の喪失となる。下顎骨の境界に対する脂肪の降下は、顔の顎の形成となる。「首のたるみ」の変形は、支持されていない皮膚の下垂、顎パッド、および七面鳥の編み枝に似た広頚筋の下方への引っ張りの結果である。それ以外に、年齢とともに、広頚筋の収縮により、首に垂直な線維帯が生じる。
【０００９】
顔の若返りの主な目標は、顔の形状の回復である。顔の若返りは、外科的および非外科的処置によって達成できる。手術としては、リフトから脂肪吸引、脂肪移動まで、幅広い手技が挙げられる。リサーフェシング技術を使用して、皮膚の表面を修正し、細線、不規則な色素沈着、汚れなどの光老化の影響を修正する。リサーフェシングは、化学ピール、マイクロダーマブレーション、レーザーリサーフェシングによって実現される。現在、患者は、顔のボリュームを回復し、顔の非対称性を修正し得るか、または既存の顔の特徴を即時の美容結果および短い回復時間により向上させ得る非外科的処置を好み、求めている。これは、注入によって投与される広範囲の物質によって達成される。主な用途は、顔のボリュームの喪失を補うための線、皺、皺の重なりの治療のためである。これには、神経毒（ボツリヌス毒素を使用して筋肉を弱め、動線を最小限に抑える）、ボリュームフィラー、コラーゲン刺激剤の注入が挙げられる。
【００１０】
ヒアルロン酸（ＨＡ）は、数百万ダルトン（Ｄａ）以下の分子量（ＭＷ）のβ−１，３およびβ−１，４グリコシド結合によって交互に連結されたグルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンの繰り返し二糖単位で構成される天然の直鎖多糖類である。生理的条件下では、ＨＡは、イオン化された形態のヒアルロン酸塩であり、ナトリウム、カルシウムなどを対イオンとして、例えばヒアルロン酸ナトリウム（ＮａＨＡ）で見られる。ヒトの身体では、皮膚、臍帯、硝子体液において高濃度で見られる。ＨＡは、グリコシド結合に隣接するかさ高いＮ−アセチル基によるグリコシド結合の回転が制限されることにより、比較的硬い分子である。その自然に発生する立体構造はらせんであり、このらせん構造は、異なる官能基（例えば、アミン、カルボキシル、ヒドロキシルなど）の間に形成される水素結合によってさらに強化される。工業規模のＨＡの主な供給源は、大規模の精製を必要とする鶏冠などの動物組織由来のもの、および連鎖球菌ズーエピデミクス細菌由来のＨＡ発酵などの微生物連鎖球菌発酵由来のものである。
【００１１】
ＨＡは、重要な構造的、レオロジー的、生理学的、生物学的機能を有している。ＨＡは、水溶液中で高粘弾性物質を形成するために、大量の水を吸収する能力を有し、水分保持能力を有している。その吸収能力および粘弾性性質が免疫原性および毒性の欠如と連結することにより、組織内での機械的ストレスを満たし、コーティングし、潤滑し、かつ維持することができる。したがって、ＨＡは、美容、生物医学、製薬、および食品業界においてさまざまな用途が見つかっている。ＨＡは生体適合性があるが、生分解性であり、ヒアルロニダーゼなどの酵素によって容易に分解され（酵素分解）、比較的短い、組織内での滞留時間を有する。半減期は、約１週間未満である。また、ＨＡは、考えられ得るいかなる期間であっても、高温に耐えることができず、加水分解による熱分解を受ける。これは、フリーラジカルにより分解されることを意味する。例えば、１２１℃で数分間オートクレーブ処理する条件下での水溶液中のＨＡは、ＭＷが大幅に低下する。ＭＷの減少は、６０℃を超えると指数関数的に加速される。ＨＡは、酵素分解、熱的分解、およびラジカル分解以外に、例えば、せん断力による分解などの機械的分解を受ける。上記のすべてのタイプの分解は、比較的短い、組織内での滞留時間を有する。
【００１２】
有機基を用いたＨＡの化学修飾、官能化、または誘導体化により、制御された様式でのＨＡの化学的特性および物理的特性の改変を行い、新たに所望され、改善された特性を有する新規生体材料を得ることができる。修飾の種類および程度に応じて、修飾ＨＡは、天然ＨＡとは異なる化学物質であり、このため、天然性が低い可能性があり、生体適合性およびその生物学的挙動さえも改変させ得る。それにもかかわらず、修飾が医療用途としてのその機能をもたらす利点および結果を測定する必要がある。例えば、ＨＡは、有機溶媒に対して低い溶解度を有する。アルコールと反応することで、疎油性がより親油性に変化し、そのため、有機溶媒での溶解性が高まり得る。ＨＡ誘導体は、水への溶解性が低いため、ｉｎ  ｖｉｖｏでの滞留時間が長くなり得る。さらに、薬物などの分子との改善された相互作用を有し得る。別の例は、美容インプラントとして使用される架橋ＨＡハイドロゲルであり、組織を増強し、ボリュームを加え、皺を減らすために皮膚に導入される美容用経皮充填剤が、その臨床的成功に不可欠であるＨＡのｉｎ  ｖｉｖｏ滞留時間を延ばすことを目的としている。
【００１３】
美容および増強の目的でのＨＡ分子のＭＷは、通常、約数十万〜数百万Ｄａである。経皮充填剤として使用され得る非架橋ＨＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性を維持するために高ＭＷを有し、細ゲージ針（一般に２７Ｇ以上の範囲の針、実際には３０Ｇまでの針と呼ばれる）から注入するには非常に粘性が高く、低ＭＷでは、容易に注入できるが、安定性に欠ける。この欠点を克服する方法のうちの１つは、架橋としての化学修飾によるものである。ＨＡ化学架橋は、非架橋ＨＡを架橋剤と反応させて、改善されたｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を有するＨＡヒドロゲルを含む水性媒体にもはや水溶性ではないＨＡ無限三次元（３Ｄ）ネットワークを形成することにより達成される。それにもかかわらず、この化学反応ステップまたは修飾ステップは、化学試薬の取り扱いおよび反応生成物の精製のさらなるステップを追加する。通常、化学試薬は水溶性であり、化学反応および精製は、水性媒体で行われる。前述のように、修飾が医療用途としてのその機能をもたらす利点および結果を測定する必要がある。その記載に従って、架橋ＨＡゲルは非架橋ＨＡの欠点を克服し、皮膚充填剤として使用して、例えば、顔組織にボリュームを加えることによる顔組織の増強など、美容目的としての組織の増強、皺および皺の重なりの修正、顔に滑らかな外観を復元することが可能になる。
【００１４】
ヒドロキシアパタイト（ＨＡｐ）は、次の化学式：Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２（Ｃａ／Ｐ比＝１．６７）を有する。ＨＡｐは、粒子状のリン酸カルシウムセラミックである。ＨＡｐは、地質学的堆積物として自然に発生し、脊椎動物の骨、軟骨、エナメル質、象牙質、セメント質などの正常な生体組織、および血管および皮膚など、多くの病理学的石灰化部位で発生する。ヒトの骨の７５％ｗ（特に指定のない限り、重量あたりの重量のすべての割合（百分率））は、骨にその剛性および機械的負荷に対する耐性を付与するバイオアパタイトで構成されている。バイオアパタイトの形態は、六角形構造を有する平坦な細長い粒子である。
【００１５】
ＨＡｐは、移植可能な材料であり、生理的条件下で熱力学的に安定し、優れた生体適合性（非毒性、非免疫原性）および生物活性を有し、細胞の形成および組織の修復を刺激する可能性がある。ＨＡｐは、細胞応答、コラーゲン合成を刺激し得、細胞形質転換ビヒクル、遺伝子送達ビヒクルなどとして使用される。ＨＡｐは、修復および交換することを目的として、骨および歯の代替材料などの組織工学用途での使用が発見されている。プラズマ溶射、水熱合成法、凍結乾燥、ゾル−ゲル、相転換、メカノケミカル合成、化学沈殿などのＨＡｐの合成について報告された多くの方法が存在する。報告された合成ＨＡｐの形態は、単斜晶または六角形晶子のいずれかであり、医療目的の場合の主要な因子は、Ｃａ／Ｐ比および粉末粒子のサイズである。典型的には、ＨＡｐ粉末は、１０μｍ〜１００μｍの範囲の粒径を有する。典型的には、ナノ粉末形態のＨＡｐは、１ｎｍ〜１００ｎｍの範囲の粒径を有する。典型的には、経皮充填剤中のＨＡｐ粒子は、円形であり、均一で、滑らかであり、小さい表面積を有する。それにもかかわらず、ＨＡｐ粒子は、不規則な形状を有する場合もあり、多孔、中空、花様の多孔中空ミクロスフェア、または大きい表面積を有する他の好適な任意の形状であってもよい。
【００１６】
一般に、ＨＡベースの経皮および皮下充填剤は、約数十万〜数百万ＤａのＨＡを含み、任意により、アルカリ条件または酸性条件下で、ＨＡと共有結合を形成する二官能性または多官能性架橋剤を含む。例えば、アルカリ条件下では、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）および１，２−エタンジオールジグリシジルエーテル（ＥＤＤＥ）などのジエポキシドは、ヒドロキシル基と反応してエーテル連結を形成し、酸性条件下では、その代わりに生じる反応によりエステルが形成される。市場で最も一般的な経皮充填剤は、ＢＤＤＥおよびジビニルスルホン（ＤＶＳ）などの架橋剤により架橋された。それにもかかわらず、これらに限定されないが、エポキシ化合物、ＤＶＳ、ホルムアルデヒド、ポリアジリジン、アミノ酸またはエステル、カルボジイミドなど、他の任意の二官能性または多官能性架橋剤を、ＨＡとの直接反応において、架橋に使用してもよい。ＨＡは、一方ではＨＡに結合し、他方では追加の単一の二官能性または多官能性架橋剤に結合する側鎖として二官能性または多官能性分子を使用することによって架橋できるか、または生のいくつかの架橋剤が側基の両端を結合するために使用される。
【００１７】
加えて、ＨＡは、細ゲージ針からの押出しを支援するために、約数十万〜数百万Ｄａの非架橋ＨＡを含んでもよい。さらに、ＨＡは、麻酔薬、抗酸化剤、ビタミンなど、各々がその独自の特性を有する１つ以上の活性補充剤を含み得る。いくつかの例は、これらに限定されないが、それぞれリドカイン、マンニトール、ビタミンＣなどである。ＨＡ経皮充填剤中のＨＡの濃度は、１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ、より具体的には１５〜３０ｍｇ／ｍｌの範囲であり得、各濃度は、組織の充填および増強のために、特定の領域に対して最も好適である。
【００１８】
架橋ＨＡ経皮充填剤を調製する典型的な方法論には、当業者に公知であるいくつかの基本的なステップを含む。第１のステップは、乾燥ＨＡの水和である。次のステップでは、アルカリ環境または酸性環境のいずれかにおいて、ＨＡを架橋するために、ＨＡを架橋剤に導入する。次のステップには、通常、透析によって残留架橋剤を除去し、精製水またはリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を使用して架橋ＨＡを膨潤させることを含む。例えば、ほとんどの残留架橋剤が除去されるまで、数日間１２，０００ＭＷカットオフを有する透析バッグで透析する。次のステップには、活性補充剤を添加すること、および非架橋ＨＡを添加すること、および組成物全体を均質化することを含む。次のステップには、レオロジー特性、押出し力、ｐＨ、浸透圧などの適切な経皮充填剤の特性を備えたＨＡ経皮充填剤を仕上げるために滅菌することを含む。
【００１９】
一般に、ＨＡｐ経皮充填剤は、担体材料として作用する高粘性液体またはゲルに均一に懸濁された６０％ｗ／ｗ以下のＨＡｐミクロスフェア粒子を含む。典型的には、経皮充填剤中のＨＡｐ粒子は、直径約１０〜１００μ、最も好ましくは直径２５〜５０μの直径を有する円形であり、均一かつ滑らかであり、小さい表面積である。一例では、ＨＡｐミクロスフェアは、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、グリセリン、および水で構成される担体に懸濁される。別の例では、ＨＡｐミクロスフェアは、ＨＡおよび水で構成される担体に懸濁される。別の例では、ＨＡｐミクロスフェアは、ＨＡ架橋プロセス中またはその後に、ＨＡｐミクロスフェアが添加される、上述の架橋ＨＡからなる担体に懸濁される。これらの組成物および相対的成分濃度は、当業者に公知であり、例えば、こうした組成物中の一般的なＨＡｐ濃度は、５５．７％ｗ／ｗ以下である。実施例のすべてにおいて、ＨＡｐミクロスフェアは、高粘性液体またはゲル中に懸濁されており、ＨＡとＨＡｐとの間に実際の結合は存在しない。担体は、ＨＡｐミクロスフェアを組織の充填および増強のために指定された領域に移動させ、ミクロスフェアがシリンジおよび身体内の両方で凝集するのを防ぐ手段として機能する。担体は、ＨＡｐの沈降および相分離を防ぐのに役立つ。さらに、ミクロスフェアを所望の場所に保持するために、ミクロスフェアが注入領域内で分散するのを防ぐ。
【発明の概要】
【００２０】
本発明は、少なくともいくつかの実施形態では、軟組織充填剤の分野における、ＨＡおよびＨＡｐをベースにした組成物、およびその製造方法を特徴とする。任意により、経皮充填剤は、顔の組織にボリュームを加えることにより、顔の組織増強を強化するのに有用であり、皺および皺の重なりを修正し、顔の滑らかな外観を復元する。任意により、経皮充填剤は、ＨＡｐに化学結合した非架橋または架橋ＨＡを含む。ＨＡｐの表面に化学的に固定させたＨＡの組み合わせは、双方の成分の分解が遅いことから、これらの本来の能力を低下させることなく、長期にわたり組織を増強する相乗効果を有し、皮膚の若返り成分として機能する。本発明のこれらのおよび他の態様および利点は、詳細な説明においてより容易に理解および認識され得る。
【００２１】
本明細書では、添付の図面を参照して、単なる例として本発明を説明する。ここで詳細に図面を具体的に参照すると、示されている詳細は一例としてのものであり、本発明の実施形態の例示的な説明のみを目的としており、本発明の原理および概念的側面の最も有用であり、かつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示されている。これに関して、本発明の基本的な理解に必要なものよりも詳細に本発明の構造の詳細を示す試みは行われず、図面と共に行われる説明により、本発明のいくつかの形態をどのように実際に具体化することができるかが当業者に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＳＥＭにおいて、未処理ＨＡｐミクロスフェアを示す図である。
【図２】３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランで処理後の、ＳＥＭにおいて、処理済みＨＡｐミクロスフェアを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
背景技術によれば、ＨＡｐミクロスフェアは、高粘性液体またはゲルである担体に添加される。一例では、ＨＡｐミクロスフェアが架橋ＨＡに加えられ、再び担体として機能する。ＨＡとＨＡｐとの両方の組み合わせには、相乗効果ではなく相加効果を有する。相加効果は次のとおりである：ＨＡｐミクロスフェアは、自然の組織成長およびＨＡの水和および細胞外マトリックスの支持のための足場として機能する異物反応を有さずに、ゆっくりと分解する。ＨＡとＨＡｐとの相乗効果は、架橋ＨＡネットワークおよびＨＡｐミクロスフェアが単純な混合物を形成するという事実により、非常に疑わしく、この場合、ＨＡゲルは連続相であり、ＨＡｐミクロスフェアは分散相である。このような単純な混合では、各成分は、相乗効果を有することなく、独自の特性を維持する。
【００２４】
さらに、架橋前にＨＡｐをＨＡに添加することで、ＨＡによってカプセル化されたＨＡｐの以下の構造のカプセル化構造を形成し得ることが主張された。このカプセル化構造により、分解されるまで、ＨＡとして、ＨＡｐの分解が延長され得、ＨＡｐの分解を防ぎ得るシールドとして機能することが主張された。ここでも、これらの従来技術の組成物では、ＨＡｐとＨＡの間に実際の結合がないという事実のため、この点は疑わしい。
【００２５】
まず、カプセル化ＨＡｐとＨＡとの理想的な状態または系においては、カプセルが破られるまでは、ＨＡのカプセル化によるＨＡｐの分解から保護するメカニズムが存在する。この理想的な状態は、カプセルの厚さに応じて発生する。しかし、こうした理想的な状態であっても、ＨＡ分解から保護するメカニズムは存在しない。第二に、この系は理想的ではないため、結果として、ＨＡｐミクロスフェアの大部分がカプセル化されていない。ミクロスフェアの状態は、ＨＡｐミクロスフェアの部分的なＨＡ被覆から非ＨＡカプセル化までの範囲である。単一の仮説によって制限されることを望むものではないが、これは、ＨＡｐミクロスフェアがＨＡ鎖よりも数桁大きい（端から端までの距離）という事実による可能性が高い。
【００２６】
先行技術の組成物では、こうした短鎖は撹拌され、必ずしもＨＡｐミクロスフェアを捕捉するものではない局所的なマイクロ３Ｄネットワークが形成され、その結果、一部がカプセル化されたＨＡｐミクロスフェアであり、一部が、カプセル化されていないＨＡｐミクロスフェアとなる。カプセル化されたＨＡｐミクロスフェアのほとんどは、上記で説明した相対的なサイズにより、カプセル化されていない可能性がある。また、この結果は、単純な混合であり、実際のカプセル化ではないと考えられ得る。
【００２７】
したがって、ＨＡおよびＨＡｐに基づいて異なる経皮充填剤を同じ領域に別々に注入して、通常行われている混合から同じ利得を得ることができる。さらに、高濃度のＨＡｐミクロスフェアを架橋ＨＡに単に添加するのみで、非架橋ＨＡ担体と比較して、粘性効果および高い押出し力がさらに有害な影響を及ぼす。この問題を克服する簡単な解決策は、ＨＡｐミクロスフェアの濃度を低下させることである。それでも、同じ領域に異なる種類の経皮充填剤を使用することで、この問題の克服を補助し得る。
【００２８】
ＨＡおよびＨＡｐの両方の相乗効果を達成するために、添加剤としてＨＡｐを含む、ＨＡベースの複合体を形成することが望ましい。複合体は、異なる明確な機能性を有する複数の添加剤と、ポリマーの固有の特性をはるかに上回る改善された特性を備えたポリマーベースの材料を形成するため、または新しい特性を付与するために、それらを結合および連結するポリマーマトリックスとのブレンドとして表す。ＨＡ複合体料の特性は、ＨＡｐミクロスフェアの分数体積のみでなく、ポリマーネットワークおよび界面パラメータなどのＨＡゲルとの化学的および物理的相互作用（混和性、湿潤性、結合、「接着性」としてまとめて記載されるもの）にも依存する。複合体の特性を改善するには、接着性が重要である。さらに、接着性の向上は、ネットワーク内での添加剤のより良好な分散も支援する。
【００２９】
カップリング剤は、古典的な見方では、２つの異なる材料、通常は、無機材料と有機材料（ＨＡとＨＡｐの場合など）の間に化学結合をもたらす化合物として定義される。カップリング剤は、イオン相互作用、水素結合などから、弱いファンデルワールス（ＶＤＷ）相互作用まで、２つの異なる材料間の化学結合以外の相互作用ももたらし得る。一例として、ポリマーと添加剤との混合中にカップリング剤を適用してもよい。別の例では、カップリング剤は、添加剤の表面改質として、またはポリマー鎖に導入され、その後に他の部分との相互作用が続く新規官能基、ならびにそれらの組み合わせとして適用され得る。上記のすべては、ポリマーと添加剤間の接着性を高めるための経路として考えられる。添加剤とポリマーとの間での接着性の増大は、強力な化学結合または電気的引力から弱いＶＤＷ相互作用にまで及ぶ。
【００３０】
上記で説明したカップリング剤の任意のメカニズムの使用が可能であるが、最も好ましいのは、上記で説明した熱分解、せん断分解、酵素分解など、ＨＡの感度による表面改質の使用である。さらに、架橋ＨＡを含む複合体の場合、混合中または官能基として導入されたカップリング剤を使用することで、ＨＡの架橋段階を干渉して、架橋ゲルを形成し得る。
【００３１】
接触しているＨＡおよびＨＡｐは、わずかなＶＤＷの相互作用、水素結合、または永続的ではないと考えられるイオン相互作用さえ有し得る。その一方で、永続的と見なされ得るＨＡとＨＡｐとの間での共有結合を作り出すことにより、結果的に、ＨＡおよびＨＡｐの両方の利点を有する実際の複合体料が形成される。ＨＡｐ表面とＨＡ分子との間の化学結合を達成する最も簡単な様式は、カップリング剤の使用、特に有機官能性シランによる表面処理によるものである。シランカップリング剤の一種であるシラン表面処理は、添加剤の表面化学およびポリマーに応じて選択される。他の種類のカップリング剤、例えばジルコン酸塩、チタン酸塩などを同じ様式で使用し得る。ＨＡとＨＡｐとの間の共有結合を達成する他の経路としては、架橋剤、キレート剤の使用、または複数のカップリング剤を生で使用すること（化学結合と同じ効果をもたらし得る添加物の表面を指す）さえ挙げられる。
【００３２】
ＨＡｐは、ＶＤＷおよび水素結合の相互作用により凝集する傾向を有する。シランを使用する別の利点は、これらの相互作用を排除し、立体障害にある程度寄与することにより、凝集を防ぐ一助となることである。
【００３３】
有機官能性シランの最も一般的な化学構造は、Ｒ−Ｓｉ−Ｘ３であり、式中、Ｘは、表面の反応基に加水分解し得るアルコキシ基であり、Ｒは、ポリマーマトリックスと反応し得る有機官能基である。３個未満のアルコキシ基を有する他の種類の有機官能性シランも、表面との反応に好適である。あるいは、Ｘは、塩素原子である。それにもかかわらず、これらの材料の使用は、加水分解に伴う腐食性、可燃性、または毒性の副産物の取り扱いが困難であることから、商業的に制限されている。
【００３４】
シランを挿入するには、主に２つの手法がある。
ａ．前処理−反応を加速させる水で希釈した有機溶媒中の純粋なシランまたはその溶液を添加剤に直接適用する。通常、この技術は、添加剤にシラン剤を噴霧または浸漬することにより実現する（表面仕上げ）。
ｂ．シランを、ポリマー、その後未処理添加剤に添加する。この技術は、まれであると考えられる。
【００３５】
ＨＡおよびＨＡｐの場合、好ましい方法は、ＨＡに導入される前に、ＨＡｐ粒子がシランによりコーティングされる前処理である。
【００３６】
工業用前処理プロセスの結果、厚い三次元架橋シラン多層（ポリシロキサンネットワーク）が形成される。現在、気相シリル化技術によってのみ得ることができるシラン単分子層は、通常、工業的実施の範囲外である。
【００３７】
シランの有機官能基は、ポリマーと添加剤との間で有利な相互作用の種類によって選択される。相互作用は、わずかな弱いＶＤＷ力、親水性と疎水性との相互作用から化学共有結合までである可能性がある。さまざまなＲ基が考えられ、特定の種は、ポリマーマトリックスに対する親和性によって選択される。所定のポリマーに複数の種類のシランを効果的に使用できることに留意されたい。したがって、特定のポリマーについては、選択された最も好適な有機官能性シランカップリング剤は、ポリマーとのネットワークを形成するために、化学結合およびマトリックスを通る相互拡散をもたらす。
【００３８】
例えば、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランまたは３−グリシドキシプロピルトリエトキシシランなどのシラン表面処理、またはＢＤＤＥ架橋剤として作用し、ＨＡゲル硬化中に発生する化学反応に関与して、表面処理されたＨＡｐとＨＡとの間に結合を形成し得る他のエポキシ官能基シラン。
【００３９】
ＨＡの一般的なＢＤＤＥ硬化メカニズムとしては、化学式１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルのＢＤＤＥとの反応が挙げられる。これは、アルカリ条件下で、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランがＨＡｐをＨＡに架橋できる官能性エポキシ基を有するように、ＨＡと架橋剤との間に安定した共有エーテル結合をもたらす２つの官能性エポキシ基を有する。３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランのＲ−基であるエポキシ基は、ＢＤＤＥの役割を果たし、架橋剤として作用し得る。上で述べたように、架橋剤は、ＨＡとＨＡｐとの間の共有結合を達成するための経路でもある。この場合、ＢＤＤＥは、一方では、ＨＡへの結合として、他方ではＨＡｐの表面への結合として、ＨＡとＨＡｐの間を結合でき、エーテル連結を形成するか、極端な場合には、ＨＡｐの表面のラジカル消光を形成できる。こうした系での問題は、ＨＡおよびＨＡｐの両方の架橋部位での競合により、ＨＡ鎖自体の間でのＨＡ鎖の架橋およびＨＡとＨＡｐとの架橋の両方において、架橋度を制御することである。ＨＡｐを表面処理し、その後架橋して、ＨＡおよびＨＡｐ複合体を形成する方法と同等であるか、または（存在する場合には）あらゆる特性を達成するためには、より高い濃度のＢＤＤＥが必要となる。
【００４０】
別の可能性は、ＤＶＳ架橋剤として作用し、ＨＡゲル硬化中に発生する化学反応に関与して、表面処理されたＨＡｐとＨＡとの間に結合を形成し得るクロロシランまたは他のビニル官能基シランの例としてのビニルトリメトキシシランまたはビニルトリエトキシシランまたはビニルトリクロロシランである。
【００４１】
ＨＡの一般的なＤＶＳ硬化メカニズムとしては、ＤＶＳとの反応が挙げられる。ＤＶＳは、ビニルトリメトキシシランがＨＡｐをＨＡに架橋できる官能性ビニル基を有しているのと同様に、アルカリ性条件下でＨＡと架橋剤との間に安定した共有エーテル結合を生成する２つの官能性ビニル基を有する。ビニルトリメトキシシランのＲ基であるビニル基は、ＤＶＳの役割を果たし、架橋剤として作用し得る。
【００４２】
ＨＡおよびＨＡｐを架橋する可能性の数は膨大である。別の例は、架橋剤としてのアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）、および３−アミノプロピルトリエトキシシラン、または３−アミノプロピルトリメトキシシランであるか、または他のアミノ官能基シランがＡＤＨの役割を果たし、架橋剤として作用し得る。しかし、上記で説明したように、ＨＡの感度のために、すべての反応が好ましいものではない。シランの例であるエポキシ官能基シランおよびビニル官能基シランは、経皮充填剤市場で最も一般的なＨＡ架橋手順を模倣しており、架橋ＨＡ組成物の有無にかかわらず、ＨＡおよびＨＡｐ複合体において、容易に実施され得る。前述のように、ＨＡｐミクロスフェア表面でのシリル化中に、三次元架橋シラン多層が形成される。三次元構造のため、表面で結合シランが完全に被覆されることはない。したがって、表面にはシラン処理されたドメインと、シランを含まないドメインとがあり、海内での島または相互に接続された（ブリッジされた）島として可視化されたより大きい未処理領域に、孤立しているか、または相互接続された処理パッチの形状を表面に付与する。表面結合シランドメインは、遊離ＨＡｐ表面の海に広がる島である。海内の島の表面テクスチャは、使用するシランの濃度に応じて調整され得る。
【００４３】
濃度の変化に限定されることを望むものではないが、ヤヌス粒子技術などの表面形状および親和性を調整するために他の方法が適用されてもよい。ヤヌス粒子は、２つの異なる物理特性を有する反対称粒子であり、例えば、シランによりサイズ決めされた半球表面および未処理の半球表面を有するＨＡｐ粒子である。表面の形状および親和性は、２つの半球間で異なる。ヤヌス粒子を形成するさまざまな方法が存在し、適用され得る。例えば、粒子が二相間の界面に補足され、未処理の半球がマスクされ、他の半球がサイズ決めされ、したがって粒子表面の改変が一方の側にのみ行われるマスキング方法である。
【００４４】
表面の形状および親和性を調整するこうした方法の別の例は、異なる機能性を有するシラン試薬の混合物、例えばＨＡ鎖と反応し得るシランと、反応しないシランの混合物の使用である。極端な場合、一方の半球表面が反応性シランによりサイズ決めされ、他方の半球が非反応性シランでサイズ決めされたヤヌス粒子を形成する。言及された例のいずれにおいても、シラン処理された領域は、より大きい未処理領域において孤立しているか、または相互接続された処理パッチの形状を有する。表面処理は、数ミクロンスケールでサイズ決めされたミクロスフェアでの数ナノメートルスケールである。この種類の表面形状により、ＨＡｐの分解が遅くなり、自然の組織成長の足場として機能し得る。こうした構造では、分解は、未処理のＨＡｐミクロスフェアよりも遅い場合もあると仮定することが合理的である。
【００４５】
ＨＡ鎖は、表面処理されたＨＡｐの表面に吸着される。表面に吸着されたＨＡ鎖は、トレイン（表面と接触している鎖の一部）、ループ（表面と接触していない鎖の一部であり、２つのトレインによって結合されている）、および２つのテール（表面と接触していない鎖の一部であり、一方の側がトレインによって結合され、他方の側が空いている）を形成する。吸着には、物理的相互作用および化学結合の形成を伴い、それぞれ、物理吸着および化学吸着と称されている。したがって、ＨＡ鎖のトレインの一部が表面に共有結合により接着し、吸着が不可逆的かつ永続的であると仮定することは合理的である。この構造は、ＨＡｐミクロスフェアが、形成されたゲルの架橋部位としても作用することを意味する。表面処理されたミクロスフェアの存在下において、架橋剤濃度を低下させて、同じ架橋効果を有し得ることから、これらのミクロスフェアは、ある程度架橋剤に置き換えることができると仮定することは、合理的である。加えて、架橋部位としてのミクロスフェアの効果は、局所的な機械的強度の増大であり、アンカー部位では、特に深い皺でより安定したボリューム効果を支援し得る。加えて、表面に付着しているＨＡ鎖は、酵素分解を受けにくい。トレインと定義された鎖のこうした部分は、表面に結合しているため、酵素による分解を受けにくいと仮定することが合理的である。ループおよびテールとして定義された鎖の一部の分解は、それらの相対的なサイズおよび酵素による接近性に依存する。したがって、ＨＡｐミクロスフェアの近位にあるＨＡ鎖全体は、酵素分解を受ける傾向が少ないため、注入された領域において、より強力なボリューム効果および寿命の長い使用を支援し得る。加えて、ミクロスフェアがアンカー点として作用する架橋としてＨＡｐを含むＨＡ複合体の機械的強度が向上することは、動的な皺および皺の重なりが筋肉の作用に対してより高い抵抗力を必要とする領域で大幅に支援し得る。上記から、化学結合したＨＡｐ粒子を含むＨＡは、機械的抵抗性、分解抵抗性など改善された特性を有するか、または必要な用途に応じて特性が調整され得る、複合体、強化ゲルと考えられることが明確に理解される。ＨＡ鎖を固定する効果のために、生分解性または非生分解性であり、不活性であるか、または刺激性の他の種類の表面処理ミクロスフェア（ポリ乳酸ミクロスフェアなど）が使用され得る。
【００４６】
前述のように、複合体よりも、単純な混合物中で接触しているＨＡおよびＨＡｐは、わずかなＶＤＷの相互作用、水素結合、さらには永続的ではないとみなされているイオン相互作用さえも有し得る。注入時に、混合物は、わずかなＶＤＷ、水素結合、またはＨＡおよびＨＡｐのいずれかとのイオン相互作用の同じ相互作用を有し得る体組織および体液にさらされ、これにより、ＨＡとＨＡｐの間の永続的な化学共有相互作用とは対照的に、ＨＡとＨＡｐとの相互作用が喪失し得る。
【００４７】
したがって、混合物中では、ＨＡ鎖およびＨＡｐミクロスフェアが単独で注入されたかのように分解するが、複合体中では、相乗効果では、ＨＡ鎖およびＨＡｐミクロスフェアの両方がはるかに遅く分解し、これにより身体内での使用期間がｉｎ  ｖｉｖｏでの滞留時間より長くなり、このため、組織の増強が延長され得る。上記のように、架橋剤を使用することは、ＨＡの化学修飾または架橋安定化として考えられ、化学結合粒子を添加することは、粒子への架橋によるＨＡの物理的および化学的修飾と考えられ得る。後者は、架橋安定化に加えて、一般的な粒子、特にＨＡｐによるＨＡ安定化の方法でもある。
【００４８】
ＨＡおよびＨＡｐ複合体の使用により生じ得るあるいくつかの追加の利点は、ＨＡｐが不透明であるためにティンダル効果を回避するか、またはＨＡが半透明であるために薄い領域の白色度を低下させることである。さらに、ＨＡｐは、放射線不透過性であり、このため、注入中または注入後に、Ｘ線撮影で組成物全体を容易に検出できる。
【００４９】
全体として、シラン表面処理セラミックＨＡｐなどの無機基によるＨＡの化学修飾、機能化、または誘導体化と見なすことができ、これにより、ＨＡの化学的特性および物理的特性を制御された様式で変化させて、新しい所望の改善された特性を有する新しい生体材料を得ることができる。
【００５０】
上記のように、ＨＡおよび二官能性または多官能性架橋剤は、アルカリ性または酸性条件下で共有結合を形成し得る。デンドリマーの多官能性架橋剤を添加すると、組織内において粘度が低下し、寿命が長くなるという別の利点がもたらされ得る。デンドリマーは、楕円形状または球状形状を画成する、正確な分子量の多分岐構造を有する巨大分子である。デンドリマーは、中心コアを組み上げたものであり、その形状を画成する「世代」と呼ばれる分岐における一連の根本同心層である。通常、他の部分と反応し得る有効な官能基は、最外側の世代（すなわち、分岐の最外側部分）にある。例えば、ＨＡと、ＢＤＤＥ（二エポキシ官能性架橋剤）およびエポキシ官能性樹状分子の両方との反応により、より柔らかいゲルとなり得、細ゲージ針からの押出し力が低下し、デンドリマー架橋の樹枝状構造により、組織内において寿命がより長いゲルとなり得る。
【００５１】
あるいは、経皮充填剤中の非架橋ＨＡは、その一部またはすべてを、エポキシ官能性デンドリマーを使用して架橋することができ、これにより低粘度を維持することで、細ゲージ針からの押出しを助け、組織内で、非架橋ＨＡよりも長い寿命をある程度呈し得る。細ゲージ針は、例えば、２７Ｇ〜３０Ｇの範囲のゲージを有する針である。任意により、より長い寿命とは、ＨＡ経皮充填剤組成物の寿命よりも少なくとも２０％長く、少なくとも５０％長く、少なくとも１００％長く、少なくとも２００％長く、少なくとも５００％長く、またはそれらの間の任意の整数値であってもよい。寿命が長くなるのは架橋ＨＡであり、これは例えばＢＤＤＥおよびデンドリマーと架橋され得る。最終的な経皮充填剤などのゲル製品は、例えば、約９０％の架橋ゲルおよび１０％の非架橋ＨＡを含み得る。非架橋ＨＡが存在することで、ゲルの粘度が低下し、ゲルを滑らかにしてシリンジからの押出しを容易にする。
【００５２】
こうしたエポキシ官能性デンドリマーの非限定的な例は、Ｍｕｌｔｉｐｌｙ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ：Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ−Ｇｒｏｕｐ−Ｆｒｅｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  Ｔｈｉｏｌ−Ｅｐｏｘｙ「Ｃｌｉｃｋ」Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＳＣ  Ａｄｖａｎｃｅｓ、２０１５年５月４日に提示、Ｋｈａｎら；例えば、エポキシデンドリマーの非限定的な例としての分子８を参照されたい）に見出すことができる。
【００５３】
上記のように、ＨＡおよび二官能性または多官能性架橋剤は、アルカリ性または酸性条件下で共有結合を形成し得る。例えば、エポキシ官能性ＰＯＳＳ（登録商標）（グリシジルＰＯＳＳ（登録商標）（エポキシ官能性シルセスキオキサン））などの、多官能性架橋剤として、ＰＯＳＳ（登録商標）（多面体オリゴマーシルセスキオキサン）ケージ分子を添加することで、いくつかの利点（粘度の低下および組織内でより長い寿命となる）をもたらし得る。異なる有機官能基は、例えば、グリシジルＰＯＳＳ（登録商標）中のエポキシ官能基など、ベースケージ構造に合わせて調整され得る。例えば、ＢＤＤＥおよびグリシジルＰＯＳＳ（登録商標）分子の両方とＨＡとが反応することで、グリシジルＰＯＳＳ（登録商標）架橋のケージ構造により、より柔らかいゲルおよび細ゲージ針からの低い押出し力、および組織内においてより長い寿命を有するゲルをもたらし得る。あるいは、経皮充填剤中の非架橋ＨＡは、その一部またはすべてを、グリシジルＰＯＳＳ（登録商標）を使用して架橋することができ、これにより低粘度を維持することで、細ゲージ針からの押出しを助け、組織内で、非架橋ＨＡよりも長い寿命をある程度呈し得る。
【００５４】
また、細ゲージおよび／またはより長い寿命の上記の説明は、ＰＯＳＳ（登録商標）を用いる本実施形態に適用し得る。
【００５５】
また、適切な有機官能基により調整されたＰＯＳＳ（登録商標）は、例えば、シランおよびエポキシ官能基などのアルコキシ官能基が両方ともベースケージ構造内に存在する場合には、カップリング剤としても機能し得る。こうしたＰＯＳＳ（登録商標）構造は、シラン表面処理としてのみ、ＨＡおよびＨＡｐの両端に連結し得る。カップリング剤としてＰＯＳＳ（登録商標）を適用する手順は、上記と同様である。
【００５６】
上記の材料は、多糖類、特に、例えばカップリング剤の使用によりＨＡｐなどの粒子状リン酸カルシウムセラミックに化学結合したＨＡを特徴としていたが、決してこれに限定することを意図するものではない。ヘパロサンなどの他の多糖類は、ＨＡのＨＡｐへの同一の結合手順に従い得、生分解性ポリ乳酸ミクロスフェアなどの他のタイプの表面処理ミクロスフェアは、表面固定ＨＡ鎖においてＨＡｐの役割を果たし得る。
【００５７】
上記は、経皮充填剤、特に顔面経皮充填剤に関するものであるが、決して限定的な場合を意味するものではない。頸部、臀部、胸部、乳房、手、ふくらはぎなど、身体の他の解剖学的領域は、充填または増強することができ、加えて、経皮充填剤が、鼻の再形成、先端移植において、非外科的代替または手術の補完として使用され得る。さらに、経皮充填剤は、瘢痕、ニキビ跡、妊娠線などの皮膚の跡をぼかすために全身において使用可能である。加えて、ＨＡｐが主成分である骨および歯の再建などの分野において利点が見つかっており、本剤が使用され得る。さらに、関節の可動性および衝撃吸収能力を改善するための関節潤滑などの分野で、利点が見つかっており、使用され得る。
【００５８】
実施例１−シラン表面処理
１．シラン処理溶液の調製（全量中２％のシラン）：
９３．２５ボリューム％。メタノールは、３．９３ボリューム％の蒸留水と混合する。０．８１ボリューム％の酢酸を加えて、溶液をｐＨ４．５〜５．５に緩衝する。２ボリューム％の官能性シランを溶液に添加する。より低いシラン濃度を使用して、表面シラン被覆率を調整することができる。
【００５９】
２．シラン処理：
溶液を１〜１０分間撹拌し、その間に溶液中にシラノール基が形成される。ＨＡｐミクロスフェアは、約３０分間で溶液に導入されている。次に、ＨＡｐミクロスフェアを純メタノールで２回洗浄する。ＨＡｐミクロスフェアは、１〜２４時間、７０℃〜１０５℃の範囲の温度を有するオーブンに挿入して、硬化させ、シラン層を形成する手順を終了させるか、または室温で一晩放置して硬化させる。与えられる時間および温度は、シランの種類に依存する：例えば、２４時間７０℃は、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランに好適であり、シランエポキシ官能基の分解を防ぐ。
【００６０】
高せん断ミキサー、ローターステーターミキサー、ホモジナイザー、またはプローブ型超音波発生装置を使用して、ミクロスフェアの凝集を防ぐことができる。
【００６１】
実施例２−ＨＡｐミクロスフェア含有非架橋ＨＡ経皮充填配合物
繊維または粉末である任意の形態の、例えばＭＷ２メガＤａの原料ＮａＨＡが、アルカリ溶液に導入される。ＮａＨＡは、均一なＨＡ粘性液体が形成されるまで、室温で数時間、アルカリ溶液で撹拌させ、溶解、および水和させる。
【００６２】
３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン表面処理されたＨＡｐは、撹拌下でＨＡ粘性液体に導入されて分散液を形成する。分散液を数時間５０℃まで加熱して、ＨＡと表面処理ＨＡｐとの間の結合形成を可能にする。分散液が高粘度であり、高粘度であるためにミクロスフェアが分散液中に固定化されている場合には、この反応は、撹拌を行わずに使用してもよい。ミクロスフェアの沈込みが不安定な場合、ミキサーまたはプローブ型超音波発生装置を使用して、ミクロスフェアの沈込みおよび凝集を防ぐことができる。次に、分散液を冷却して、室温に戻す。次に、分散液を膨潤させ、１２，０００ＭＷカットオフを有する透析バッグ内でＰＢＳにより数日間透析して、低分子量の残留物を除去する。ＰＢＳは、定期的に交換して、新鮮なＰＢＳを分散液に導入する。例えば、膨潤の程度は、３０％ｖ／ｖ以下のＨＡｐを含む分散液を形成するように決定される。相乗効果により、ＨＡおよびＨＡｐの両方の濃度が低下し得るが、それでもこの濃度は、市販の一般的な経皮充填剤と同じ効果を有する。分散液は、シリンジに充填され、滅菌され、すぐに使用できる。あるいは、ＨＡ表面結合ＨＡｐミクロスフェアは、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、グリセリン、および水で構成される他のゲル担体に組み込むことができる。
【００６３】
実施例３−ＨＡｐミクロスフェア含有架橋ＨＡ経皮充填剤配合物
架橋手順の基本的なステップは、当業者に公知である。繊維または粉末である任意の形態の、例えば２メガＤａの原料ＮａＨＡが、アルカリ溶液に導入される。ＮａＨＡは、均一なＨＡ粘性液体が形成されるまで、室温で数時間、アルカリ溶液で撹拌させ、溶解、および水和させる。
【００６４】
ＢＤＤＥおよび３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン表面処理ＨＡｐは、撹拌下でＨＡ粘性液体に導入され、分散液を形成する。分散液を数時間５０℃まで加熱して、ＨＡと表面処理ＨＡｐとの間の結合形成を可能にする。分散液が高粘度であり、高粘度であるためにミクロスフェアが分散液中に固定化されている場合には、この反応は、撹拌を行わずに使用してもよい。ミクロスフェアの沈込みが不安定な場合、ミキサーまたはプローブ型超音波発生装置を使用して、ミクロスフェアの沈込みおよび凝集を防ぐことができる。次に、複合ゲルを冷却して室温に戻す。次に、複合ゲルを膨潤させ、１２，０００ＭＷカットオフを有する透析バッグにおいてＰＢＳを用いて数日間透析して、過剰なＢＤＤＥなど、低分子量の残留物を除去する。ＰＢＳは、定期的に交換して、新鮮なＰＢＳを複合ゲルに導入する。非架橋ＨＡを複合ゲルに添加して、押出し力の低下を助ける。例えば、複合ゲルには、３０％ｖ／ｖ  ＨＡｐを含み得る。複合ゲルは、シリンジに充填され、滅菌され、すぐに使用できる。
【００６５】
実施例４−シラン処理粒子の試験
ＨＡｐミクロスフェアは、上記の実施例１に従って調製した。
使用される材料：
１．ＨＡｐミクロスフェア医療グレード、球状１５〜６０ミクロン、Ｄ５０＝３５ミクロン。
２．３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン＞９８％Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ
３．メタノール＞９９．９％ＨＰＬＣグレードＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ
４．酢酸＞９９．７％  ＡＣＳ試薬グレード  Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ
ＳＥＭ＋ＥＤＳ：
装置：Ｐｈｅｎｏｍ  ＰｒｏＸデスクトップＳＥＭ
【００６６】
ＳＥＭ＋ＥＤＳ分析
走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）をエネルギー分散分光法（ＥＤＳ）技術と組み合わせて使用して、未処理ＨＡｐミクロスフェアおよび３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン処理ＨＡｐミクロスフェアの局所化学的、元素分析を得た。表面の元素濃度のＳＥＭ顕微鏡写真およびＥＤＳ定量分析を得た。
【００６７】
図１および図２に示すＳＥＭ顕微鏡写真は、それぞれ、未処理および３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン処理ＨＡｐミクロスフェアを示している。ミクロスフェアは両セットとも、類似した形態学的構造を呈しており、これにより、ＨＡｐミクロスフェアにシラン表面処理を適用しても、ミクロスフェアを劣化させることはなかったことが示される。
【００６８】
未処理のＨＡｐのＥＤＳ分析により、ＨＡｐで予想されるＣａ、Ｐ、およびＯ原子の存在が明らかになった。表１に見られ得るように、Ｃａ／Ｐの原子比は、ＨＡｐで予想とおり〜１．６７である。
【００６９】
３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン処理ＨＡｐのＥＤＳ分析により、Ｃａ、ＰおよびＯ原子に加えて、Ｓｉ原子の存在が明らかになり、これは、シラン表面処理の存在を示している。上記のように、工業的前処理プロセスの結果として、厚い三次元架橋シラン多層（ポリシロキサンネットワーク）が形成され、これは、表２からわかるように、Ｃａ／Ｐの原子比が理論値１．６７から逸脱している可能性があり、また、未処理表面に対して、シラン表面処理が存在していることを示している。
【表１】
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【表２】
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【００７０】
本発明をその特定の実施形態と併せて説明してきたが、多くの代替形態、修正形態、および変形形態が当業者には明らかであろうことは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨および広い範囲内に含まれるすべてのこうした代替形態、修正形態および変形形態を包含することが意図されている。すべての出版物、特許、特許出願および本明細書内で言及された受託番号によって識別される配列は、個々の出版物、特許、特許出願、またはそれらの受託番号によって識別される配列が、参照により本明細書に組み込まれることが具体的にかつ個別に示されているように、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、本出願における任意の参考文献の引用または特定は、こうした参考文献が本発明に対する先行技術として利用可能であることの承認として解釈されるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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