(57)【要約】  本発明は、（ｉ）少なくとも１つのストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔ）株、ここで、該Ｓｔ株は、ガラクトース発酵であり、ここで、該菌株は、グルコキナーゼタンパク質をコードするｇｌｃＫ遺伝子のＤＮＡ配列に突然変異を担持し、ここで、該突然変異は、グルコキナーゼタンパク質を不活化するか、またはその遺伝子の発現に対して負の効果がある、および（ｉｉ）少なくとも１つのラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス（Ｌｂ）株、ここで、該Ｌｂ株は、ラクトース欠損であるか、またはラクトース以外の炭水化物を代謝できる、を含む、発酵乳製品を製造するための組成物に関する。
2020515265.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）少なくとも１つのストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔ）株、
ここで、該Ｓｔ株は、ガラクトース発酵であり、該菌株は、グルコキナーゼタンパク質をコードするｇｌｃＫ遺伝子のＤＮＡ配列に突然変異を担持し、該突然変異は、グルコキナーゼタンパク質を不活化するか、またはその遺伝子の発現に対して負の効果がある、および
（ｉｉ）少なくとも１つのラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス（Ｌｂ）株、
ここで、該Ｌｂ株は、ラクトース欠損であるか、またはラクトース以外の炭水化物を代謝できる、
を含む、発酵乳製品を製造するための組成物。
【請求項２】
前記Ｓｔ株が、２−デオキシグルコース耐性である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記Ｓｔ株が、細胞内へのグルコースの輸送を低減する突然変異を担持する、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記Ｓｔ株が、９．５％のＢ乳中に１０６〜１０７ＣＦＵ／ｍｌの濃度で植菌され、そして、４０℃で２０時間培養されると、その９．５％のＢ乳中のグルコース量を少なくとも５ｍｇ／ｍｌまで増加させる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記Ｓｔ株が、０．０５％のスクロースを含む９．５％のＢ乳中に１０６〜１０７ＣＦＵ／ｍｌの濃度で植菌され、そして、４０℃で２０時間培養されると、その０．０５％のスクロースを含む９．５％のＢ乳中のグルコース量を少なくとも５ｍｇ／ｍｌまで増加させる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記Ｌｂ株が、スクロース、ガラクトースおよびグルコースから成る群から選択される、ラクトース以外の炭水化物を代謝できる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記Ｌｂ株が、グルコースを代謝できる、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記Ｌｂ株が、２０１４年６月１２日付で、ＤＳＭＺ−Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweigに、受託番号ＤＳＭ２８９１０で寄託された菌株およびＤＳＭ２８９１０に由来する突然変異株から成る群から選択され、ここで、該突然変異株は、ラクトースおよびＸ−Ｇａｌを含有する培地上で白色コロニーを作り出す能力を有することをさらなる特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記Ｓｔ株が、２０１４年６月４日付で、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに、受託番号ＤＳＭ３２２２７で寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１９２１６、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（ＤＳＭＺ）GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germanyに、受託番号ＤＳＭ２８８８９で寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１６７３１、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに、受託番号ＤＳＭ２５８５０で寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１５７５７、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに、受託番号ＤＳＭ２５８５１で寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１５８８７、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに、受託番号ＤＳＭ２６７２２で寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１６４０４、およびそれらから誘導された突然変異株から成る群から選択され、ここで、該突然変異株が、出発物質として寄託株のうちの１つを使用することによって得られ、かつ、ここで、該変異株が、前記寄託株のグルコースを分泌する特性を保持するかまたはさらに改善した、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
乳基質を請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物で植菌し、そして発酵させることを含む、発酵乳製品を製造する方法。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物を含む発酵乳製品。
【請求項１２】
発酵乳製品の調製のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、（ｉ）少なくとも１つのストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）（Ｓｔ）株｛ここで、該Ｓｔ株は、ガラクトース発酵であり、ここで、該菌株は、グルコキナーゼタンパク質をコードするｇｌｃＫ遺伝子のＤＮＡ配列に突然変異を担持し、ここで、該突然変異は、グルコキナーゼタンパク質を不活化するか、またはその遺伝子発現に対して負の効果がある｝および（ｉｉ）少なくとも１つのラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）（Ｌｂ）株を含む発酵乳製品を製造するための組成物に関する。斯かる組成物は、増強された甘味を有する発酵乳製品を製造するために使用される。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
不純物が入っていない発酵乳製品は、発酵中の乳酸菌によるラクトースの乳酸への変換の結果、刺激性の味または酸っぱい味によって見分けられる。そのため、それらは、より甘い味の製品を求める購入者の願望を叶えるために、果物、はちみつ、糖または人工甘味料の添加によって甘味が加えられることが多い。
【０００３】
食品産業には、ここ２０年間で蔓延するようになった、太り過ぎおよび肥満問題の克服に協力するように、低カロリー甘味食品の需要がますます高まっている。通常、快い感覚とみなされる甘味は、糖と他のいくつかの物質の存在によって生み出される。糖類の知覚は、大きく異なっている。１００の基準としてスクロースを使用すると、ラクトースの甘味は１６であり、ガラクトースの甘味は３２であり、そして、グルコースの甘味は７４である（Godshall（1988）. Food Technology 42(11） : 71-78）。これにより、ほとんど同じレベルのカロリーを有しているにもかかわらず、グルコースはラクトースより４倍超甘いと知覚される。
【０００４】
発酵食品中の糖は、カロリーの摂取を抑えながら、甘味を提供できるアスパルテーム、アセスルファムＫ、スクラロースおよびサッカリンなどの甘味料に置き換えられることがさらに多い。しかしながら、人工甘味料の使用は、異味をもたらす可能性があり、さらに、人工甘味料の消費が空腹感の増強、アレルギー、癌などの不利益をもたらすことを示唆しているいくつかの研究が、天然甘味料しか含まない、または好ましくは追加の甘味料を全く含まない発酵乳製品に対する消費者の嗜好に寄与している。
【０００５】
これにより、天然の（内的な）甘味が高い発酵乳製品を開発することに特別な課題がある。
【０００６】
発酵乳製品の酸性は、主に存在している乳酸菌と、発酵乳製品を調製するのに使用されるプロセスパラメータに依存する。
【０００７】
二糖であるラクトースの発酵は、乳酸菌で非常によく研究されるが、それはラクトースが乳の主要な炭素源であるからである。多くの種では、ラクトースは取り込み後にβ−ガラクトシダーゼによってグルコースとガラクトースに分割される。グルコースは、グルコキナーゼによってグルコース−６−リン酸にリン酸化され、そして、ほとんどの乳酸菌ではエムデン−マイアーホフ−パルナス経路（Embden-Meyerhof-Parnas pathway）（解糖）を介して発酵させる（図１）。
【０００８】
ストレプトコッカス・サーモフィルスは、生物体が混合スターター培養物の一部として通常使用され、他の成分がラクトバチルス属（Lactobacillus sp.）、例えば、ヨーグルト向けにはラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカスであり、スイスタイプチーズ向けにはラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）である工業的好熱性乳発酵向けに最も幅広く使用される乳酸菌のうちの１つである。
【０００９】
多くの国々において、ヨーグルトの法的な定義では、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカスと並んでストレプトコッカス・サーモフィルスを必要としている。両種とも、ヨーグルトにおいて重要な香気成分であるアセトアルデヒドを望ましい量産生する。
【００１０】
ラクトースとスクロースは、ストレプトコッカス・サーモフィルスによってそれらの構成単糖よりも容易に発酵される。過剰なガラクトースだけが存在する中、ストレプトコッカス・サーモフィルスが使用されているときには、ラクトース分子のグルコース部分が発酵され、ガラクトースが発酵乳製品中に蓄積する。高い酸濃度が発酵を制限しているヨーグルトでは、遊離ガラクトースが残るが、スイスチーズ製造の初期に生じた遊離ガラクトースは、後でラクトバチルス・ヘルベティカスによって発酵させる。
【００１１】
しかしながら、ストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカスの両方から成るガラクトース発酵株は、数人の研究者によって報告されており（Hutkins et al:（1986） J, Dairy Sci, 69(1） ; 1-8; Vaiilancourt et al.（2002） J. Bacteriol. 184(3）; 785-793）、そして、ＷＯ２０１１／０２６８６３（Chr. Hansen）では、ガラクトース発酵であるストレプトコッカス・サーモフィルス株を獲得する方法が記載されている。
【００１２】
食品産業の要望を満たすためには、新しい株、特にストレプトコッカス・サーモフィルス株およびラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス株を提案することが意味を持ち、そしてそれが、グルコースの分泌によって発酵製品中に追加的なカロリーなしでより多くの天然の甘味（内的な甘味）を提供する。
【００１３】
Poolら（2006. Metabolic Engineering 8(5）; 456-464）は、グルコキナーゼをコードする遺伝子、ＥＩＩ（ｍａｎ／ｇｌｃ）の欠失によってグルコース代謝が完全に中断されるラクトコッカス・ラクティス株、および新たに発見されたグルコース−ＰＴＳ ＥＩＩ（ｃｅｌ）を開示している。構築方法は、すべての突然変異の作出について遺伝子組み換えなので、その結果、得られた菌株は、現在のところ食品に使用できない遺伝子組み換え生物（ＧＭＯ）である。
【００１４】
Thompsonら（1985. J Bacteriol. 162(1）; 217-223）は、ストレプトコッカス・ラクティス（Streptococcus lactis）（現在、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）に改名された）におけるラクトース代謝を研究した。この研究では、マンノース−ＰＴＳ系の突然変異株を得るために２−デオキシグルコースが使用された。それに続いて、この突然変異株は、ＵＶ突然変異誘発を使用して突然変異誘発され、その後、レプリカ平板法によってグルコース陰性のコロニーがスクリーニングされた。このように、二重突然変異株（マンノースＰＴＳおよびグルコキナーゼ）が単離された。この二重突然変異株が、「スターター」生物体によるラクトース発酵の調整にかかわる機構を研究するのに使用された。これらの突然変異株は、それらを市販のスターター培養物中に含有するのが不適当とされる、それらの親株と比較していくつかの不利益を有している。突然変異株の細胞収率は、発酵させたラクトース１モルあたり、親株の半分であり、かつ、ラクトースで培養したとき、倍加時間は突然変異株で有意の延長されていた。同様に、乳酸の収率は、発酵されたラクトース１モルあたり、親株の半分であった。乳中のこれらの菌株の挙動は、分析されなかったが、酸性化の速度が有意に減速されるであろうことは予測される。
【００１５】
加えて、ラクトコッカス・ラクティスは、一般に、アセトアルデヒド産生のために選択されることはなく、そして、ヨーグルトの法的な定義の要件の達成に寄与しない。
【００１６】
Chervauxら（2000. Appi. And Environ. Microbiol,, 66, 5306-5311）は、新規に化学的に定義された培地中のラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス株の生理機能を研究し、グルコース発酵を欠いている２−デオキシグルコース耐性突然変異株を単離した。いくつかの異なった表現型が観察され、そして、株に特異的な効果が報告された。
【００１７】
ＷＯ２０１３／１６０４１３は、食品の天然の甘味料および発酵乳のラクトース含有量に関して増強された特性を有するストレプトコッカス・サーモフィルス株およびラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス株、ならびに斯かる菌株をスクリーニングおよび単離する方法を開示する。
【００１８】
ＷＯ２０１５／１９３４４９は、ラクターゼと、グルコース代謝に欠陥がある乳酸菌との組み合わせを使用した、非常に低濃度のラクトースを有する発酵乳製品を製造する方法を開示する。
【００１９】
ＷＯ２０１５／１９３４５９は、低レベルの後酸性化を有する発酵乳製品を製造する方法を開示し、ここで、一実施形態において、グルコース代謝に欠陥がある４つの乳酸菌株の混合物を使用し、ここで、別の実施形態において、ラクトース欠損乳酸菌株の混合物を使用する。
【００２０】
本発明の目的は、少なくとも１つのグルコース欠損ストレプトコッカス・サーモフィルス株および少なくとも１つのラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス株を含む発酵乳製品を製造するための組成物を提供することであり、ここで、該組成物は、改善されたフレーバーを有する発酵乳製品を生じる。
【発明の概要】
【００２１】
この目的は、本発明により達成され、そしてそれは、（ｉ）少なくとも１つのストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔ）株｛ここで、該Ｓｔ株は、ガラクトース発酵であり、ここで、該菌株は、グルコキナーゼタンパク質をコードするｇｌｃＫ遺伝子のＤＮＡ配列に突然変異を担持し、ここで、該突然変異は、グルコキナーゼタンパク質を不活化するか、またはその遺伝子の発現に対して負の効果がある｝および（ｉｉ）少なくとも１つのラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス（Ｌｂ）株｛ここで、該Ｌｂ株は、ラクトース欠損であるか、またはラクトース以外の炭水化物を代謝できる｝を含む発酵乳製品を製造するための組成物を対象としたものである。
【００２２】
ストレプトコッカス・サーモフィルス株およびラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス株を含む発酵乳製品を製造するための従来のスターター培養物に関して、例えば遊離アミノ酸、例えばグルタミン酸などの望ましくない異臭形成のリスクがあることは、周知されている。その異臭は、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス株によって形成され、さらに、形成される異臭レベルが前述の菌株の増殖レベルに依存し、そしてそれが、例えばラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス株の植菌レベル、成長培地のタイプおよび発酵の生育条件、ならびにスターター培養物で使用される特定のストレプトコッカス・サーモフィルス株およびラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス株などの多くの要因によって変化することも、さらに周知されている。少なくとも１つのグルコース欠損ストレプトコッカス・サーモフィルス株および少なくとも１つのラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカスを含み、増強された甘味を有する発酵乳製品を製造するためのスターター培養物に関して、望ましくない異臭の形成が特定の高レベルで存在することが、現在わかっている。これは、斯かるスターター培養物において、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカスが、特定の高い細胞数まで増殖する事実と一致している。
【００２３】
驚いたことに、グルコース欠損ストレプトコッカス・サーモフィルス株を有するスターター培養物を使用した際の異臭の問題は、ラクトース欠損ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス株、例えばラクトース欠損、グルコース陽性ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス株を使用することによって解決され得ることがわかった。また、本発明の組成物で使用されるラクトース欠損ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス株が、まったく後酸性化をもたらさないことがわかった。最後に、グルコース欠損ストレプトコッカス・サーモフィルス株と組み合わせたラクトース欠損ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカスが、従来の、すなわち、ラクトース陽性、グルコース陽性、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス株と比較した場合に、非常に多い細胞数をもたらすことがわかった。
【００２４】
例えば、ラクトース欠損、グルコース陽性ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス株からの異臭の形成を回避すること、およびラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス株がグルコース陽性であり、かつ、グルコースを含有する発酵乳製品中に存在しており、ここで、理論上、該菌株が、発酵乳製品の保管中にも増殖し続けることができるであろう、という事実を考慮すると、後酸性化を回避することが可能であることは、非常に驚くべきことである。
【００２５】
そのうえ、異臭と後酸性化の両方がラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス株の増殖からもたらされるであろうことが通常予想されたので、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス株から異臭の形成を回避すること、および後酸性化を回避する一方で、それと同時に、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス株の多くの細胞数を得ることが可能であることは、より一層驚くべきことである。
【００２６】
理論に縛られることなしに、本発明の驚くべき効果は、従来のラクトース陽性ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカスと比較した場合の、本発明のラクトース欠損ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカスの代謝の相違のためであると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ストレプトコッカス・サーモフィルスにおけるラクトース異化の略図である。ＧｌｃＫ、グルコキナーゼ；ＬａｃＳ、ラクトーストランスポーター；ＬａｃＺ、β−ガラクトシダーゼ；ＧａｌＭ、ムタロターゼ；ＧａｌＫ、ガラクトキナーゼ；ＧａｌＴ、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ；ＧａｌＥ、ＵＤＰ−グルコース４エピメラーゼ；Ｇａｌ１Ｐ、ガラクトース−１−リン酸。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明の詳細な開示
定義
本明細書中で使用される場合、「乳酸菌」という用語は、糖の発酵において主に産生される酸として乳酸、酢酸およびプロピオン酸を含む酸を産生する、グラム陽性微小好気性または嫌気性細菌を指す。産業上最も有用な乳酸菌は、ラクトコッカス亜種（Lactococcus spp.）、ストレプトコッカス亜種（Streptococcus spp.）、ラクトバチルス亜種（Lactobacillus spp.）、ロイコノストック亜種（Leuconostoc spp.）、ペディオコッカス亜種（Pediococcus spp.）、ブレビバクテリウム亜種（Brevibacterium spp.）、エンテロコッカス亜種（Enterococcus spp.）およびプロピオニバクテリウム亜種（Propionibacterium spp.）を含む目である「ラクトバチルス目（Lactobacillales）」に属する。ラクトバチルス属（Lactobacillus sp.）およびストレプトコッカス・サーモフィルスから成る属の細菌を含めた乳酸菌は、発酵乳製品などの酪農製品の生産のために発酵容器やバット内でそのままインキュベーションすることを意図した、バルクスターター繁殖（bulk starter propagation）のための冷凍若しくは凍結乾燥培養物、またはいわゆるダイレクトバットセット（Direct Vat Set）（ＤＶＳ）培養物のいずれかとして通常、酪農業界に供給される。そのような培養物は、一般に、「スターター培養物」または「スターター」と称される。
【００２９】
本願の記載における（特に、以下の特許請求の範囲との関連における）「１つの（「ａ」および「ａｎ」）」ならびに「前記（ｔｈｅ）」という用語、およびこれらの類似語は、他の言及が無い限り、または明確に否定していない限り、単数および複数の両方を包含すると想定される。「含む（「comprising」「having」「including」および「containing」）」という用語は、他に言及が無い限り、非限定的用語（すなわち、「これだけに限定されるものではないが、含む（including, but not limited to）」を意味する）として理解されるべきである。本明細書中の数値範囲の記載は、他に言及が無い限り、単に当該範囲内の各個別の数値を個別に参照する簡単な方法と見なされることが意図され、各個別の数値は、それらが個別に本明細書中に記載されているかのように本明細書中に包含される。本明細書中に記載される全ての方法は、本記載中に他の言及が無い限り、または明確に否定されていない限り、任意の適切な順番で実施され得る。本明細書中の任意のおよび全ての実施例、または例示的用語（「例えば（「such as」）」）は、本発明をより良く明示することのみを意図しており、他の言及が無い限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中のいずれの用語も、本発明の実施に必須の明示されていない要素であることを示唆するものとして解釈されるべきではない。
【００３０】
本発明との関連において、「甘味を増強する」という表現は、グルコキナーゼタンパク質をコードするｇｌｃＫ遺伝子のＤＮＡ配列に突然変異を担持しない母株（mother strain）によってもたらされた甘味と比較した場合の、甘味の増強を意味し、ここで、該突然変異は、グルコキナーゼタンパク質を不活化するか、またはその遺伝子の発現に対して負の効果がある。
「ＣＦＵ」という表現は、はコロニー形成単位を意味する。
【００３１】
本発明の組成物のストレプトコッカス・サーモフィルス株
いくつかの国では、ヨーグルトの法的な定義は、ストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカスの両方の存在を必要としている。両種とも、ヨーグルトの重要な香気成分であるアセトアルデヒドを望ましい量作り出す。
【００３２】
チーズ、例えばモッツァレラおよびピザチーズ、ならびにフェタなどもまた、ストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカスの両方を使用した発酵によって調製される（Hoier et al.（2010） in The Technology of Cheesemak-ing, 2nd Ed. Blackwell Publishing, Oxford; 166-192）。
【００３３】
食品産業の要件を満たすために、追加のカロリーを与えることなく、発酵製品中に直接より多くの天然の甘味（内的な甘味）を産生する新たな菌株、特にラクトバシルス・デルブリッキ亜種ブルガリカス株およびストレプトコッカス・サーモフィルス株を開発することが望ましくなった。
【００３４】
ストレプトコッカス・サーモフィルスは、生物体が混合スターター培養物の一部として通常使用され、他の成分がラクトバチルス属、例えば、ヨーグルトではラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス、そして、スイスタイプチーズではラクトバチルス・ヘルベティカスである商業的な乳発酵に最も幅広く使用される乳酸菌の１つである。
【００３５】
ストレプトコッカス・サーモフィルスが使用されているときには、ラクトース分子のグルコース部分だけがストレプトコッカス・サーモフィルスによって発酵され、ガラクトースが発酵乳製品中に蓄積する。高い酸濃度が発酵を制限しているヨーグルトでは、遊離ガラクトースが残るが、スイスチーズ製造の初期に生じた遊離ガラクトースは、後でラクトバチルス・ヘルベティカスによって発酵される。チーズ製造に使用されるスターター培養物の多くに見られるラクトコッカス・ラクティスもまた、ストレプトコッカス・サーモフィルスによって産生されたガラクトースを消費できる。
【００３６】
できるだけ最適な増殖性能を有するストレプトコッカス・サーモフィルス株を確保するために、本発明者らは、ストレプトコッカス・サーモフィルスのガラクトース発酵株を選択剤である２−デオキシグルコースに晒した。典型的な２−デオキシグルコース耐性突然変異株は、グルコキナーゼをコードする遺伝子内、およびグルコーストランスポーターをコードする遺伝子内に突然変異を有する。２−デオキシグルコースに耐性がある単離された突然変異株、ＣＨＣＣ１６７３１は、そのグルコキナーゼ（ｇｌｃＫ）遺伝子内に突然変異を有する。グルコキナーゼ遺伝子内の突然変異に加えて、ＣＨＣＣ１６７３１およびＣＨＣＣ１９２１６が共に、分泌されたグルコースが細胞内に再び運び込まれないことを意味する突然変異を有する。
【００３７】
驚いたことに、当該突然変異株は単独で、ｐＨ５への酸性化時間は２〜５時間遅れるが、乳をさらに完全に酸性化できる。従って、それらは、発酵乳適用に有用であり、そして、それらは、ヨーグルトの特徴である乳を酸性化する母株の能力を保持している。さらに、０．０５％のスクロースを含む９．５％のＢ乳（B-milk）に突然変異株を植菌し、そして４０℃にて少なくとも２０時間発酵させたとき、突然変異株が高レベルのグルコースを分泌することがわかった。同時に、非常に低レベルのラクトースが、発酵乳中に残っている。そのため、発酵乳製品を製造するための当該菌株の使用は、ラクトース不耐症の人々のために重要であり得る。
【００３８】
その結果、最終的な発酵乳は、Godshall（1988. Food Technology 42(11） :71-78）によって説明されたとおり計算して、高い内的甘味指数を有する。
【００３９】
本発明の一態様において、前記ストレプトコッカス・サーモフィルス株は、ストレプトコッカス・サーモフィルスのガラクトース発酵突然変異株であり、ここで、該突然変異株は、グルコキナーゼタンパク質をコードするｇｌｃＫ遺伝子のＤＮＡ配列内に突然変異を担持し、前記突然変異は、コードされたグルコキナーゼタンパク質を不活化するか、またはその遺伝子の発現に負の効果を有する。グルコキナーゼ活性のレベルまたはグルコキナーゼ遺伝子の発現レベルを計測するための方法は、容易に知られ（Porter et al.（1982） Biochim. Biophys. Acta, 709; 178-186）、そして、市販キットおよび容易に入手可能な材料を使用したトランスクリプトミクスまたは定量的ＰＣＲを用いた酵素アッセイを含んでいる。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態において、本発明のストレプトコッカス・サーモフィルス株は、２−デオキシグルコース耐性である。
【００４１】
細菌の「菌株」は、本明細書中で使用される場合、増殖または繁殖するときに遺伝的に不変のままである細菌を指す。同一の細菌の多様性が含まれる。
【００４２】
「ガラクトース発酵ストレプトコッカス・サーモフィルス株」という用語は、本明細書中で使用される場合、Ｍ１７培地＋２％のガラクトース上／その中で増殖できるストレプトコッカス・サーモフィルス株を指す。ガラクトース発酵ストレプトコッカス・サーモフィルス株は、一晩培養物から１％で植菌し、３７℃で２４時間インキュベートした際に、唯一の炭水化物として２％のガラクトースを含有するＭ１７培養液のｐＨを５．５以下に下げるストレプトコッカス・サーモフィルス株と本明細書中に規定される。
【００４３】
「突然変異がグルコキナーゼタンパク質を不活化する」という用語は、本明細書中で使用される場合、「不活性グルコキナーゼタンパク質」をもたらす突然変異、細胞内に存在している場合、その正常機能を発揮することができないグルコキナーゼタンパク質、ならびにグルコキナーゼタンパク質の形成を妨げるまたはグルコキナーゼタンパク質の分解をもたらす突然変異を指す。
【００４４】
特に、不活性グルコキナーゼタンパク質は、機能的グルコキナーゼタンパク質と比較して、グルコースのグルコース−６−リン酸へのリン酸化を促進することができないか、または著しく遅い速度でしかグルコースのグルコース−６−リン酸へのリン酸化を促進できないタンパク質である。機能的グルコキナーゼタンパク質をコードする遺伝子と比較して、当該不活性グルコキナーゼタンパク質をコードする遺伝子は、その遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内に突然変異を含んでおり、前記突然変異は、これだけに限定されるものではないが、タンパク質の機能的特性を変更させる欠失、フレームシフト突然変異、終止コドンの挿入またはアミノ酸置換をもたらす突然変異、あるいは、遺伝子の転写または翻訳を低減するか、または停止するプロモーター突然変異を含み得る。
【００４５】
好ましい実施形態において、突然変異は、グルコキナーゼタンパク質の活性（グルコースのグルコース−６−リン酸へのリン酸化速度）を少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％程度、例えば少なくとも７０％程度、例えば少なくとも８０％程度、例えば少なくとも９０％程度低減する。
【００４６】
グルコキナーゼ活性は、Poolら（2006, Metabolic Engineering 8;456-464）によって説明されたグルコキナーゼ酵素分析法によって測定できる。
【００４７】
「機能的グルコキナーゼタンパク質（functional glucokinase protein）」という用語は、本明細書中で使用される場合、細胞内に存在している場合には、グルコースのグルコース−６−リン酸へのリン酸化を促進するグルコキナーゼタンパク質を指す。特に、機能的グルコキナーゼタンパク質は、配列番号１の１〜９６６位に相当する配列、あるいは、配列番号１の１−９６６位に対応する配列に対して少なくとも８５％の同一性、例えば少なくとも９０％程度の同一性、例えば少なくとも９５％程度の同一性、例えば少なくとも９８％程度の同一性、例えば少なくとも９９％程度の同一性を有する配列を有するＯＲＦを含む遺伝子によってコードされ得る。
【００４８】
２つの配列のパーセント同一性は、例えばKarlinおよびAltschul（1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87;2264）のアルゴリズム、KarlinおよびAltschul（1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90; 5873-5877）に記載された修正アルゴリズム；MyersおよびMiller（1988. CABIOS 4; 11-17）のアルゴリズム；NeedlemanおよびWunsch（1970. J. Mol. Biol. 48;443-453）のアルゴリズム；ならびにPearsonおよびLipman（1988. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 2444-2448）のアルゴリズムなどの数学的アルゴリズムを使用することによって決定できる。これらの数学的アルゴリズムに基づいて核酸またはアミノ酸の配列同一性を決定するコンピュータソフトウェアもまた入手可能である。例えば、ヌクレオチド配列の比較は、ＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、語長＝１２で行われる。アミノ酸配列の比較は、ＢＬＡＳＴＸプログラム、スコア＝５０、語長＝３を用いて実施できる。ＢＬＡＳＴに関するパラメーターを残すためには、初期設定のパラメーターが使用できる。
【００４９】
多くの国々では、発酵乳製品への遺伝子組み換え生物（ＧＭＯ）の使用が承認されていない。本発明では代わりに、発酵乳製品中での望ましいグルコース蓄積を提供できる天然に存在する突然変異株または誘発された突然変異株を獲得する方法を提供する。
これにより、本発明のより好ましい実施形態において、突然変異株は、天然に存在する突然変異株または誘発された突然変異株である。
【００５０】
「突然変異細菌」または「突然変異株」とは、本明細書中で使用される場合、天然の（自然発生的、自然に生じた）突然変異細菌、または野性型ＤＮＡ内に存在しないそのゲノム（ＤＮＡ）内の１若しくは複数の突然変異を含む誘発された突然変異細菌を指す。「誘発された突然変異株」は。突然変異が、例えば化学的突然変異誘発物質、ＵＶまたはガンマ放射線などを用いた処理などのヒトの処理によって引き起こされた細菌である。対照的に、「自然発生的な突然変異株」または「天然に存在する突然変異株」は、人によって突然変異誘発されていない。突然変異株細菌は、本明細書中では、非ＧＭＯ（非遺伝子組み換え生物）である、すなわち、組み換えＤＮＡ技術によって改変されていない。
【００５１】
「野生型株」は、天然に見られるように、非突然変異型の細菌を指す。
【００５２】
「甘味を付与する特性を有する菌株（strains with a sweetening property）」、「発酵乳製品中でグルコースの望ましい蓄積を提供する菌株（strains which can provide a desirable accumulation of glucose in the fermented milk product）」および「食品の天然の甘味付与に関して優れた特性を有する菌株（strains with enhanced properties for natural sweetening of food products）」などの用語は、乳製品の発酵において本発明の菌株を使用する有利な態様を特徴づけるために本明細書中で互換的に使用される。
【００５３】
好ましい実施形態において、本発明によるストレプトコッカス・サーモフィルスの突然変異株は、９．５％のＢ乳中に１０６〜１０７ＣＦＵ／ｍｌの濃度で植菌され、そして、４０℃で少なくとも２０時間培養されると、その９．５％のＢ乳中のグルコース量を少なくとも５ｍｇ／ｍＬまで増加させる。
【００５４】
別の好ましい実施形態、本発明によるストレプトコッカス・サーモフィルス突然変異株は、０．０５％のスクロースを含む９．５％のＢ乳中に１０６〜１０７ＣＦＵ／ｍｌの濃度で植菌され、そして、４０℃で少なくとも２０時間培養されると、その０．０５％のスクロースを含む９．５％のＢ乳中のグルコース量を少なくとも５ｍｇ／ｍＬまで増加させる。
【００５５】
本明細書の文脈において、９、５％のＢ乳とは、９．５％の乾物量レベルに低脂肪脱脂乳を還元し、９９℃で３０分間低温殺菌し、その後、４０℃に冷まして作られた、煮沸した乳である。
【００５６】
本発明のより好ましい実施形態において、突然変異株は、少なくとも６ｍｇ／ｍＬ、例えば少なくとも７ｍｇ／ｍＬ程度、例えば少なくとも８ｍｇ／ｍＬ程度、例えば少なくとも９ｍｇ／ｍｌ程度、例えば少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ程度、例えば少なくとも１１ｍｇ／ｍｌ程度、例えば少なくとも１２ｍｇ／ｍｌ程度、例えば少なくとも１３ｍｇ／ｍｌ程度、例えば少なくとも１４ｍｇ／ｍｌ程度、例えば少なくとも１５ｍｇ／ｍｌ程度、例えば少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ程度、例えば少なくとも２５ｍｇ／ｍｌなどのグルコース量の増強をもたらす。
【００５７】
本発明の別の実施形態において、ストレプトコッカス・サーモフィルスの突然変異株は２−デオキシグルコースに耐性がある。
【００５８】
本明細書中の「２−デオキシグルコースに耐性」という用語は、特定の突然変異菌株が、２０ｍＭの２−デオキシグルコースを含むＭ１７培地のプレート上に画線接種されたときに、４０℃で２０時間インキュベーション後にコロニーに増殖する能力を有するということによって規定される。培地中の２−デオキシグルコースの存在は、非突然変異菌株の増殖を妨げるであろうが、その一方で、突然変異菌株の増殖が影響を受けないかまたは顕著な影響を受けることはない。耐性の評価においで感受性基準菌株として使用できる非突然変異菌株としては、好ましくは菌株ＣＨＣＣ１４９９４およびＣＨＣＣ１１９７６が挙げられる。
【００５９】
本発明の突然変異株ストレプトコッカス・サーモフィルス株は、９．５％のＢ乳に、１０６〜１０７ＣＦＵ／ｍｌの本発明によるストレプトコッカス・サーモフィルス株を植菌し、本発明に従って４０℃で少なくとも２０時間、そのストレプトコッカス・サーモフィルス株で発酵させたとき、該乳中にグルコースを分泌する。好ましくは、９．５％のＢ乳に、１０６〜１０７ＣＦＵ／ｍｌの本発明によるストレプトコッカス・サーモフィルス株を植菌し、本発明に従って４０℃で少なくとも２０時間、該ストレプトコッカス・サーモフィルス株で発酵させたとき、当該突然変異株は単独で、少なくとも５ｍｇ／ｍｌのグルコースをＢ乳中に分泌する。前記菌株は、ｐＨ５への酸性化時間は２〜５時間遅れるが、乳をさらに完全に酸性化できる。最終的な発酵乳は、その発酵乳中に１５ｍｇ／ｍｌ未満のラクトースしか含んでいない。その結果、最終的な発酵乳は、約２倍以上の高い内的甘味指数を有する。
【００６０】
さらに別の実施形態において、本発明による突然変異株は、その増殖パターンによって特徴づけできる。これは、突然変異株の増殖速度が、Ｍ１７培地＋２％のグルコース中に比べ、Ｍ１７培地＋２％のガラクトース中の方が速いという知見によって例示される。増殖速度は、経時的な６００ナノメートル（ＯＤ６００）で指数増殖期培養の吸光度における推移として計測される。
【００６１】
好ましい実施形態において、増殖速度は、Ｍ１７培地＋２％のグルコース中に比べて、Ｍ１７培地＋２％のガラクトース中で少なくとも５％高い、例えば少なくとも１０％程度高い、例えば少なくとも１５％程度高い、例えば少なくとも２０％程度高い。
【００６２】
ｇｌｃＫ遺伝子における突然変異
好ましい一実施形態において、突然変異は、配列番号２の２４９位において、アルギニンをコードするコドンの、グリシンをコードするコドンでの置換をもたらす。好ましくは、ｇｌｃＫ遺伝子の突然変異は、配列番号１の７４５位において、ＧのＡでの置換をもたらす。菌株ＣＨＣＣ１６７３１には、斯かる突然変異がある。
【００６３】
好ましい実施形態において、突然変異は、配列番号２（未掲載）の７２位において、セリンをコードしているコドンの、プロリンをコードしているコドンでの置き換えをもたらす。好ましくは、ｇｌｃＫ遺伝子内の突然変異は、配列番号１（未掲載）の２１４位におけるＴのＣでの置き換えをもたらす。
【００６４】
別の好ましい実施形態において、突然変異は、配列番号２（未掲載）の１４１位における、トレオニンをコードしているコドンのイソロイシンをコードするコドンでの置き換えをもたらす。
【００６５】
好ましくは、ｇｌｃＫ遺伝子内の突然変異は、配列番号１（未掲載）の４２２位におけるＣのＴでの置き換えをもたらす。
【００６６】
ストレプトコッカス・サーモフィルスのｇｌｃＫ遺伝子が、ｇｌｃＫ遺伝子の他の部位の他のタイプの突然変異によって不活性化され得ることは、強調されるべきである。
【００６７】
細胞内へのグルコースの輸送を低減する突然変異
好ましい実施形態において、ストレプトコッカス・サーモフィルス株は、細胞内へのグルコースの輸送を低減する突然変異を有する。
【００６８】
「細胞内へのグルコースの輸送を低減する突然変異」という用語は、本明細書中で使用される場合、細胞の環境中のグルコースの蓄積をもたらすグルコースの輸送にかかわるタンパク質をコードする遺伝子内の突然変異を指す。ストレプトコッカス・サーモフィルス株の培地中のグルコースレベルは、当業者に知られている方法によって、そして、培地が乳基質であるときには、容易に計測できる。
【００６９】
好ましい実施形態において、突然変異は、細胞内へのグルコースの輸送を、少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％程度、例えば少なくとも７０％程度、例えば少なくとも８０％程度、例えば少なくとも９０％程度低減する。
【００７０】
細胞内へのグルコースの輸送は、Cochuら（2003. Appl Environ Microbiol 69(9）; 5423-5432）によって説明されているグルコース取り込みアッセイによって測定できる。
【００７１】
好ましくは、ストレプトコッカス・サーモフィルス株は、グルコーストランスポーターの成分をコードする遺伝子内に突然変異を担持しており、前記突然変異は、グルコース輸送タンパク質を不活化するか、またはその遺伝子の発現に対して負の効果を有する。
【００７２】
前記成分とは、グルコースの輸送に重要であるグルコース輸送タンパク質のあらゆる成分であってよい。例えば、ストレプトコッカス・サーモフィルスのグルコース／マンノースＰＴＳのあらゆる成分の不活性化が、グルコーストランスポーター機能の不活性化をもたらすことは、企図されている。
【００７３】
「突然変異がグルコーストランスポーターを不活化する」という用語は、本明細書中で使用される場合、「不活性グルコーストランスポーター」をもたらす突然変異、細胞内に存在している場合、その正常機能を発揮することができないグルコース輸送タンパク質、ならびにグルコース輸送タンパク質の形成を妨げるまたはグルコース輸送タンパク質の分解をもたらす突然変異を指す。
【００７４】
特に、不活性グルコース輸送タンパク質は、機能的グルコース輸送タンパク質と比較して、原形質膜を越えるグルコースの輸送を促進することができないまたは著しく遅い速度でしか原形質膜を越えるグルコースの輸送を促進できないタンパク質である。機能的グルコース輸送タンパク質をコードする遺伝子と比較して、当該不活性グルコース輸送タンパク質をコードする遺伝子は、その遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内に突然変異を含んでおり、前記突然変異は、これだけに限定されるものではないが、タンパク質の機能的特性を変更させる欠失、フレームシフト突然変異、終止コドンの挿入またはアミノ酸の置き換えをもたらす突然変異、あるいは、その遺伝子の転写または翻訳を低減または停止するプロモーター突然変異を含み得る。
【００７５】
好ましい実施形態において、突然変異は、グルコース輸送タンパク質の活性（グルコースの輸送の速度）を少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％程度、例えば少なくとも７０％程度、例えば少なくとも８０％程度、例えば少なくとも９０％程度低減する。
グルコーストランスポーター活性は、Cochuら（2003. Appl Environ Microbiol 69(9）; 5423-5432）によって説明されたグルコース取り込みアッセイによって測定できる。
【００７６】
「機能的グルコース輸送タンパク質」という用語、本明細書中で使用される場合、細胞内に存在している場合、原形質膜を越えてグルコースの輸送を促進するグルコース輸送タンパク質を指す。
【００７７】
本発明の好ましい実施形態において、本発明のストレプトコッカス・サーモフィルス株は、グルコース／マンノースホスホトランスフェラーゼ系のＩＩＤＭａｎタンパク質をコードするｍａｎＭ遺伝子のＤＮＡ配列内に突然変異を担持するが、該突然変異は、ＩＩＤＭａｎタンパク質を不活化するか、またはその遺伝子の発現に対して負の効果を有する。
【００７８】
ＣＨＣＣ１６７３１は、グルコース／マンノースホスホトランスフェラーゼ系のＩＩＤＭａｎタンパク質をコードするｍａｎＮ遺伝子の７９位において、トレオニンのプロリンへの変更を有する。好ましくは、ＭａｎＮ遺伝子における突然変異は、配列番号３の２３５位において、ＡのＣでの置換をもたらす。
【００７９】
よって、好ましい実施形態において、本発明のストレプトコッカス・サーモフィルス株は、グルコース／マンノースホスホトランスフェラーゼ系のＩＩＤＭａｎタンパク質をコードするｍａｎＮ遺伝子のＤＮＡ配列における突然変異を担持するが、該突然変異は、配列番号４の７９位において、トレオニンのプロリンへの置換をもたらす。
【００８０】
本発明の別の好ましい実施形態において、本発明のストレプトコッカス・サーモフィルス株は、グルコース／マンノースホスホトランスフェラーゼ系のＩＩＣＭａｎタンパク質をコードするｍａｎＭ遺伝子のＤＮＡ配列内に突然変異を担持するが、該突然変異は、ＩＩＣＭａｎタンパク質を不活化するか、またはその遺伝子の発現に対して負の効果を有する。
【００８１】
特定の好ましい実施形態において、突然変異は、グルコース／マンノースホスホトランスフェラーゼ系のＩＩＣＭａｎタンパク質の配列番号６の２０９位において、グルタミン酸をコードするコドンの終止コドンでの置き換えをもたらす（未掲載）。好ましくは、突然変異は、配列番号５（未掲載）の６２５位においてＧのＴでの置き換えをもたらす。
【００８２】
本発明の好ましいストレプトコッカス・サーモフィルス株
本発明の組成物の好ましい実施形態において、ストレプトコッカス・サーモフィルス株は、受託番号ＤＳＭ３２２２７でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１９２１６、２０１４年６月４日に受託番号ＤＳＭ２８８８９でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（ＤＳＭＺ）GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germanyに寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１６７３１、受託番号ＤＳＭ２５８５０でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１５７５７、受託番号ＤＳＭ２５８５１でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１５８８７、受託番号ＤＳＭ２６７２２でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１６４０４、およびそれらから誘導された突然変異株から成る群から選択され、ここで、該突然変異株は、出発物質として寄託株のうちの１つを使用することによって得られ、かつ、ここで、該変異株は、前記寄託株の食感を加える特性およびグルコースを分泌する特性を保持するかまたはさらに改善した。
【００８３】
本明細書の文脈において、「突然変異株」という用語は、例えば、遺伝子工学、放射線および／または化学的処理から成る手段によって本発明の菌株（またはそれらの母株）から誘導された菌株、または誘導されることができる菌株と理解されるべきである。「それらから誘導された菌株」はまた、自然発生的な突然変異株でもあり得る。「それらから誘導された菌株」が機能上同等な突然変異株、例えば、それらの母株と実質的に同じであるか、または改善された特性を有する突然変異株であることが好ましい。特に、「突然変異株」という用語は、本発明の菌株を、例えばエタンメタンスルホナート（ＥＭＳ）またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトログアニジン（ＮＴＧ）などの化学的突然変異誘発物質、ＵＶ光を用いた処理を含めたいずれかの慣習的に使用されている突然変異誘発処理、または自然に起こっている突然変異株に晒すことによって得られた菌株を指す。突然変異株は、いくつかの突然変異誘発処理に供され得るが（１回の処理とは、１回の突然変異誘発ステップとそれに続くスクリーニング／選択ステップと理解されるべきである）、ここでは２０未満、１０未満、または５未満の処理（またはスクリーニング／選択ステップ）が行われるのが好ましい。ここでの好ましい突然変異株では、母株と比較して、細菌ゲノムのヌクレオチドの１％未満、０．１％未満、０．０１％未満、０．００１％未満または０．０００１％未満が別のヌクレオチドに置き換えられているかまたは欠失している。
【００８４】
甘味を付与するストレプトコッカス・サーモフィルス株を得る方法
本発明の好ましい実施形態において、甘味を付与するストレプトコッカス・サーモフィルス株を発生させるのに使用される出発株は、食感を加えるストレプトコッカス・サーモフィルス株であり、そしてそれは、本願明細書の他の場所に記載したように得られてもよい。
【００８５】
好ましい実施形態において、斯かる食感を加える出発株は、受託番号ＤＳＭ２２９３２でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１１３４２、受託番号ＤＳＭ２２９３４でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１１９７６、受託番号ＤＳＭ２４０９０でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１２３３９、およびそれらから誘導された菌株、から成る群から選択される。
【００８６】
あるいは、甘味を付与するストレプトコッカス・サーモフィルス株を発生するのに使用される出発株は、食感を加えることのないストレプトコッカス・サーモフィルス株であり、その場合、食感を加える特性が、産生された時点で甘味を付与するストレプトコッカス・サーモフィルス株に導入される、すなわち、甘味を付与する菌株が、本願明細書の他の場所に記載された食感を加える菌株を得る方法において出発株として使用される。
【００８７】
甘味を付与するストレプトコッカス・サーモフィルス株の方法の第１ステップは、ガラクトース陽性株、すなわち、炭水化物源としてガラクトースを使用できる菌株、を準備することである。ガラクトース陽性株は、試験すべき細菌を、アガロースプレート、例えば、特定の濃度、例えば２％など、のガラクトース（唯一の炭水化物源）を含有するＭ１７アガロースプレートなど、の上に画線接種するステップ、および該アガロースプレート上で増殖できるコロニーを同定することを含む方法によって得られてもよい。
【００８８】
２−デオキシグルコース、そして、Ｍ１７培地＋２％のグルコース中と比較した、Ｍ１７培地＋２％のガラクトース中の細菌の増殖パターンの測定が、グルコキナーゼ（ｇｌｃＫ）遺伝子内に突然変異を有する細菌の選択に使用される。
【００８９】
突然変異ｇｌｃＫ遺伝子を有するストレプトコッカス・サーモフィルス株をスクリーニングし、そして、単離する方法の一つは、以下のステップ：
ａ）ガラクトース発酵ストレプトコッカス・サーモフィルス母株を提供し、
ｂ）前記母株から誘導された突然変異株ストレプトコッカス・サーモフィルス株のプールから、２−デオキシグルコースに耐性がある突然変異株ストレプトコッカス・サーモフィルス株のプールを選択して、単離し、そして
ｃ）前記２−デオキシグルコースに耐性がある突然変異株ストレプトコッカス・サーモフィルス株のプールから、その突然変異株ストレプトコッカス・サーモフィルス株の増殖速度が、Ｍ１７培地＋２％のガラクトース中でＭ１７培地＋２％のグルコース中に比べて速いことを条件に、突然変異株ストレプトコッカス・サーモフィルス株を選択して、単離すること、
を含む。
【００９０】
本明細書中の「２−デオキシグルコースに耐性」という用語は、特定の突然変異菌株が、２％のラクトースまたは２％のガラクトースを含有するおよび２０ｍＭの２−デオキシグルコースを含有するＭ１７培地のプレート上に画線接種されたときに、４０℃で２０時間インキュベーション後にコロニーに増殖する能力を有するということによって規定される。培地中の２−デオキシグルコースの存在は、非突然変異菌株の増殖を妨げるであろうが、その一方で、突然変異菌株の増殖が影響を受けないかまたは顕著な影響を受けることはない。耐性の評価においで感受性基準菌株として使用できる非突然変異菌株としては、菌株ＣＨＣＣ１１９７６が挙げられる。
【００９１】
ある実施形態において、前記方法は、ステップａ１）前記母株を突然変異誘発に晒すこと、例えば化学的および／または物理的突然変異原などに母株を晒すこと、をさらに含む。
【００９２】
別の実施形態において、前記方法は、ステップｄ）ステップｃ）で選択されたストレプトコッカス・サーモフィルス株から誘導された２−デオキシグルコース耐性ストレプトコッカス・サーモフィルス株のプールから、そのストレプトコッカス・サーモフィルス株の増殖速度が、Ｍ１７培地＋２％のスクロース中で速いが、しかし、Ｍ１７培地＋２％のグルコース中の母株の増殖速度と比較して、減速がゼロであるか、または少なくとも０〜５０％であることを条件に、ストレプトコッカス・サーモフィルス株を選択して、単離すること、をさらに含む。
【００９３】
ガラクトース発酵ストレプトコッカス・サーモフィルス母株は、Ｍ１７培地＋２％のガラクトース上／中で増殖でき、そして、１％で一晩培養物から植菌し、３７℃で２４時間インキュベートしたとき、それらが、唯一の炭水化物として２％のガラクトースを含有するＭ１７培養液中でｐＨを５．５以下に下げる能力を有することによって本明細書中で規定される。当該ガラクトース陽性株は、ＷＯ２０１１／０２６８６３（Chr. Hansen A/S）およびＷＯ２０１１／０９２３００（Chr. Hansen A/S）に記載されている。
【００９４】
本明細書の文脈において、「それらから誘導された菌株」という用語は、例えば、遺伝子工学、放射線および／または化学的処理から成る手段によって食感を加えるまたはガラクトース発酵ストレプトコッカス・サーモフィルス母株から誘導された菌株、または誘導されることができる菌株と理解されるべきである。「それらから誘導された菌株」はまた、自然発生的な突然変異株でもあり得る。「それらから誘導された菌株」が機能上同等な突然変異株、例えば、それらの母株と実質的に同じであるか、または改善された（例えば、食感またはガラクトース発酵に関する）特性を有する突然変異株であることが好ましい。特に、「それらから誘導された菌株」という用語は、本発明の菌株を、例えばエタンメタンスルホナート（ＥＭＳ）またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトログアニジン（ＮＴＧ）などの化学的突然変異誘発物質、ＵＶ光を用いた処理を含めたいずれかの慣習的に使用されている突然変異誘発処理、または自然に起こっている突然変異株に晒すことによって得られた菌株を指す。突然変異株は、いくつかの突然変異誘発処理に供され得るが（１回の処理とは、１回の突然変異誘発ステップとそれに続くスクリーニング／選択ステップと理解されるべきである）、ここでは２０未満、１０未満、または５未満の処理（またはスクリーニング／選択ステップ）が行われるのが好ましい。ここでの好ましい突然変異株では、母株と比較して、細菌ゲノムのヌクレオチドの１％未満、０．１％未満、０．０１％未満、０．００１％未満または０．０００１％未満が別のヌクレオチドに置き換えられているかまたは欠失している。
【００９５】
本発明において、「グルコキナーゼをコードするｇｌｃＫ遺伝子」という表現は、配列番号１のＤＮＡ配列によってコードされた特定のグルコキナーゼを含めた、グルコキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするストレプトコッカス・サーモフィルスの任意のＤＮＡ配列を意味する。グルコキナーゼは、グルコースをグルコース−６−ホスファートに変換する反応を触媒する、図１を参照。
【００９６】
本発明の組成物のラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス株
「ラクトース代謝における欠損」および「ラクトース欠損」という用語は、細胞増殖または細胞生存を維持するための源としてラクトースを使用する能力を部分的にまたは完全に失ったＬＡＢを特徴づけるために、本発明との関連において使用される。それぞれのＬＡＢは、スクロース、ガラクトース、および／またはグルコースから選択された１もしくは複数の炭水化物、または別の発酵可能炭水化物を代謝することができる。これらの炭水化物は、ラクトース欠損変異株による発酵を維持するのに十分な量で乳中には天然に存在しないので、これらの炭水化物を乳に添加する必要がある。ラクトース欠損および部分的欠損ＬＡＢは、ラクトースおよびＸ−Ｇａｌを含む培地上で白色コロニーとして特徴づけることができる。
【００９７】
本発明に関して、「Ｘ−Ｇａｌ」という用語は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクト−ピラノシドを意味し、そしてそれは、Ｘ−Ｇａｌを無色のガラクトースと、自然に二量化して青色色素を形成する５−ブロモ−４−クロロインドキシルとに加水分解するβ−ガラクトシダーゼの発色基質である。
【００９８】
本発明の特定の実施形態において、ラクトース欠損株は、スクロース、ガラクトースおよびグルコースから成る群から選択されるラクトース以外の炭水化物、好ましくはスクロース、を代謝できる。本発明の特定の実施形態において、ラクトース欠損株は、ガラクトースを代謝できる。
【００９９】
本発明の組成物の特定の実施形態において、Ｌｂ株は、２０１４年６月１２日に受託番号ＤＳＭ２８９１０でＤＳＭＺ−Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweigに寄託された菌株およびＤＳＭ２８９１０に由来する突然変異株から成る群から選択され、ここで、該突然変異株は、ラクトースおよびＸ−Ｇａｌを含有する培地上で白色コロニーを作り出す能力を有するとさらに特徴づけられる。
【０１００】
ラクトース欠損株は、突然変異によって好適なラクトース陽性母株から得られてもよい。ラクトース欠損株は、好適な培地、例えば、１％のラクトースおよび２００ｍｇ／ｍｌのＸ−Ｇａｌを含んだＭＲＳアガロースプレート上の（ラクトース欠損表現型を示す）白色コロニーとして、ＵＶ突然変異形成後に選択された。ラクトース陽性株はβ−ガラクトシダーゼ活性を有しているので、ラクトース（lacrosse）陽性株のコロニーは、β−ガラクトシダーゼ活性のため青く見える。ラクトース欠損株を作製するためのラクトース陽性母株として、ＷＯ２０１１／０００８７９のために２００７年４月３日に受託番号ＤＳＭ１９２５２でＤＳＭＺ−Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweigに寄託されたラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス株ＣＨＣＣ１００１９が使用されてもよい。
【０１０１】
組成物
本発明はさらに、１０４〜１０１２ＣＦＵ（コロニー形成単位）／ｇのストレプトコッカス・サーモフィルス株、例えば１０５〜１０１１ＣＦＵ／ｇ程度、例えば１０６〜１０１０ＣＦＵ／ｇ程度、または例えば１０７〜１０９ＣＦＵ／ｇ程度のストレプトコッカス・サーモフィルス株を含む組成物に関する。
【０１０２】
好ましい実施形態において、組成物のストレプトコッカス・サーモフィルス株は、９．５％のＢ乳を酸性化できず、９．５％のＢ乳に１０６〜１０７ＣＦＵ／ｍｌのストレプトコッカス・サーモフィルス株を植菌し、そして、４０℃で１４時間インキュベートしたとき、１．０未満のｐＨ低下をもたらすと規定される。９．５％のＢ乳に１０６〜１０７ＣＦＵ／ｍｌのストレプトコッカス・サーモフィルス株を植菌し、そして、４０℃で１４時間インキュベートしたとき、１．０以上のｐＨ低下をもたらすと規定される、受託番号ＤＳＭ２６７２２でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１６４０４によって９．５％のＢ乳の酸性化を引き起こすことができる量の化合物を、組成物はさらに含む。
【０１０３】
好ましくは、前記化合物はスクロースである。
【０１０４】
好ましくは、スクロースの量は、０．０００００１％〜２％、例えば０．００００１％〜０．２％程度、例えば０．０００１％〜０．１％程度、例えば０．００１％〜０．０５％程度である。
【０１０５】
特に好ましい実施形態において、前記組成物は、１０４〜１０１２ＣＦＵ／ｇのラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス株、例えば１０６〜１０１０ＣＦＵ／ｇ程度、例えば１０５〜１０１１ＣＦＵ／ｇ程度またはとしては、１０７〜１０９ＣＦＵ／ｇ程度のラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス株をさらに含む。
【０１０６】
本発明の特定の実施形態において、組成物は、少なくとも２つのＳｔ株、好ましくは少なくとも３つのＳｔ株、そしてより好ましくは３つのＳｔ株を含んでいる。本発明の特定の実施形態において、組成物は、３つ未満のＬｂ株、好ましくは２つ未満のＬｂ株、そしてより好ましくは１つのＬｂ株を含んでいる。
【０１０７】
本発明の特定の実施形態において、組成物は、２０１４年６月４日に受託番号ＤＳＭ２８８８９でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（ＤＳＭＺ）GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germanyに寄託された菌株ストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ１６７３１、受託番号ＤＳＭ２５８５０でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１５７５７、受託番号ＤＳＭ２６７２２でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託されたストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１６４０４、および２０１４年６月１２日に受託番号ＤＳＭ２８９１０でＤＳＭＺ−Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweigに寄託されたＬｂ株から成る群から選択される少なくとも１つのＳｔ株を含んでいる。
【０１０８】
ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス、ストレプトコッカス・サーモフィルス、および他の乳酸菌は、例えば酪農工業などの、例えば発酵乳製品などの、各種食品の製造に技術的な目的に役立つスターター培養物として一般的に使用される。これにより、別の好ましい実施形態において、前記組成物はスターター培養物として好適である。
【０１０９】
スターター培養物は、液状スターター培養物に加えて、冷凍かまたは乾燥スターター培養物として提供されてもよい。これにより、さらに別の好ましい実施形態において、前記組成物は、冷凍、凍結乾燥または液状の形態である。
【０１１０】
ＷＯ２００５／００３３２７で開示されるように、特定の凍結保護剤をスターター培養物に加えることは、有益である。これにより、本発明によるスターター培養組成物は、イノシン−５’−一リン酸（ＩＭＰ）、アデノシン−５’−一リン酸（ＡＭＰ）、グアノシン−５’−一リン酸（ＧＭＰ）、ウラノシン−５’−一リン酸（ＵＭＰ）、シチジン−５’−一リン酸（ＣＭＰ）、アデニン、グアニン、ウラシル、シトシン、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、ヒポキサンチン、キサンチン、ヒポキサンチン、オロチジン、チミジン、イノシンおよび当該化合物のうちのいずれかの誘導体から成る群から選択される１若しくは複数の凍結保護剤を含んでもよい。
【０１１１】
発酵乳製品を製造する方法
本発明はさらに、乳基質を本発明による組成物で植菌し、そして発酵させることを含む発酵乳製品を製造する方法を対象とする。
【０１１２】
「乳（milk）」という用語は、任意の哺乳類、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、バッファローまたはラクダなどを搾乳して得た乳分泌物として理解されるべきである。好ましい態様において、乳は、牛乳である。
【０１１３】
「乳基質（milk substrate）」という用語は、本発明の方法に係る発酵に供され得る任意の生乳／加工乳材料を指す。従って、有用な乳基質は、これだけに限定されるものではないが、タンパク質を含有する任意の乳または乳様製品の溶液／懸濁物、例えば全乳または低脂肪乳、脱脂乳、バターミルク、還元乳粉、練乳、粉乳、ホエイ、ホエイ透過物、ラクトース、ラクトースの結晶化からの母液、ホエイタンパク質濃縮物、またはクリームを含む。明らかに、乳基質は任意の哺乳類由来であってもよく、例えば実質的に純粋な哺乳類の乳、または還元乳粉である。
【０１１４】
好ましくは、乳基質中のタンパク質の少なくとも一部は、例えばカゼインまたはホエイタンパク質などの乳中に天然に存在するタンパク質である。しかしながら、前記タンパク質の一部は、乳中に天然に存在しないタンパク質であってもよい。
【０１１５】
発酵の前に、当該技術分野で公知の方法に従い乳基質は均質化または殺菌されてもよい。
【０１１６】
本明細書中、「均質化」という用語は、可溶性懸濁物または乳液を取得するための激しい混合を意味する。均質化が発酵の前に実施される場合、それは、乳脂肪が乳から分離しない程度に小さなサイズに分散するように実施されるべきである。これは、乳を高圧で小さなオリフィスを通して押し出すことにより達成され得る。
【０１１７】
本明細書中、「殺菌（pasteurizing）」とは、生きた生物、例えば微生物を減少または死滅させるために乳基質を処理することを意味する。好ましくは、殺菌は、一定時間、特定の温度で乳基質を維持することにより達成される。当該特定の温度は、通常加熱により達成される。殺菌温度および時間は、特定の細菌、例えば有害な細菌を死滅または不活性化するように選択され得る。急速冷却工程が続いてもよい。
【０１１８】
本発明における「発酵」は、微生物の作用により炭水化物がアルコールまたは酸に変換されることを意味する。好ましくは、本発明の方法は、ラクトースを乳酸に変換することを含む。
【０１１９】
発酵乳製品の製造に使用される発酵プロセスは周知であり、当業者は、温度、酸素量、（単数若しくは複数の）微生物の量および特性、ならびに処理時間などの適切な処理条件をどのように選択するかを心得ている。自明であるが、発酵条件は、本発明の達成を支持するように、すなわち、固形または液状の乳製品（発酵乳製品）を得るように選択される。
【０１２０】
「発酵乳製品」という用語は、本明細書中で使用される場合、食料または飼料製品を指し、前記食料または飼料製品の調製は、乳酸菌による乳基質の発酵にかかわっている。本明細書中で使用される場合、「発酵乳製品」としては、これだけに限定されるものではないが、好熱発酵乳製品、例えば、ヨーグルト、中温発酵乳製品、例えば、サワークリームおよびバターミルク、ならびに発酵ホエイなどの製品が挙げられる。
【０１２１】
「好熱性菌」という用語は、本明細書中では、３５℃より高い温度にて最も良好に繁殖する微生物を指す。工業的に最も有用な好熱性菌としては、ストレプトコッカス属の種およびラクトバチルス属の種が挙げられる。「好熱発酵」という用語は、本明細書中では、約３５℃より高い温度、例えば約３５℃〜約４５℃などでの発酵を指す。「好熱発酵乳製品」という用語は、好熱性スターター培養物の好熱発酵により調製された発酵乳製品を指し、斯かる発酵乳製品としては、セットヨーグルト、スタードヨーグルト、飲用ヨーグルト、例えばＹａｋｕｌｔが挙げられる。
【０１２２】
「中温性菌」という用語は、本明細書中では、中程度の温度（１５℃〜３５℃）にて最も良好に繁殖する微生物を指す。工業的に最も有用な中温性菌としては、ラクトコッカス属の種およびロイコノストック属の種が挙げられる。「中温発酵」という用語は、本明細書中では、約２２℃〜約３５℃の間の温度での発酵を指す。「中温発酵乳製品」という用語は、中温性スターター培養物の中温発酵により調製された発酵乳製品を指し、斯かる発酵乳製品としては、バターミルク、サワーミルク、カルチャードミルク、スメタナ、サワークリーム、ケフィールおよびフレッシュチーズ、例えばクアーク、トバログおよびクリームチーズなどが挙げられる。
【０１２３】
好ましい実施形態において、播種されるストレプトコッカス・サーモフィルス細胞の濃度は、乳基質１ｍｌあたり１０４〜１０９ＣＦＵのストレプトコッカス・サーモフィルス細胞、例えば乳基質１ｍｌあたり１０４ＣＦＵ〜１０８ＣＦＵ程度のストレプトコッカス・サーモフィルス細胞である。
【０１２４】
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、ストレプトコッカス・サーモフィルス株は、９．５％のＢ乳を酸性化できず、９．５％のＢ乳に１０６〜１０７ＣＦＵ／ｍｌのストレプトコッカス・サーモフィルス株を植菌し、そして、４０℃で１４時間インキュベートしたとき、１．０未満のｐＨ低下をもたらすと規定される。９．５％のＢ乳に１０６〜１０７ＣＦＵ／ｍｌのストレプトコッカス・サーモフィルス株を植菌し、そして、４０℃で１４時間インキュベートしたとき、１．０以上のｐＨ低下をもたらすと規定される、ストレプトコッカス・サーモフィルス株による９．５％のＢ乳の酸性化を引き起こすことができるような量の化合物が、その乳基質に加えられる。
【０１２５】
好ましくは、前記化合物はスクロースである。
【０１２６】
好ましくは、スクロースの量は、０．０００００１％〜２％、例えば０．００００１％〜０．２％程度、例えば０．０００１％〜０．１％程度、例えば０．００１％〜０．０５％程度である。
【０１２７】
別の好ましい実施形態において、発酵乳製品は、ヨーグルトまたはチーズである。
【０１２８】
ストレプトコッカス・サーモフィルスとラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカスを用いた発酵によって調製されるチーズの例としては、モッツァレラおよびピザチーズが挙げられる（Hoier et al.（2010） in The Technology of Cheese ma king, 2nd Ed. Blackwll Publishing, Oxford; 166-192）。
【０１２９】
好ましくは、発酵乳製品はヨーグルトである。
【０１３０】
本明細書の文脈において、ヨーグルトスターター培養物は、少なくとも１つのラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス株と少なくとも１つのストレプトコッカス・サーモフィルス株を含む細菌培養物である。これによれば、「ヨーグルト」という用語は、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス株とストレプトコッカス・サーモフィルス株を含む組成物を乳に植菌し、そして、発酵させることによって入手可能な発酵乳製品を指す。
【０１３１】
発酵乳製品
本発明はさらに、本発明による組成物を含む発酵乳製品に関する。
【０１３２】
別の好ましい実施形態において、発酵乳製品は、ヨーグルト、チーズ、サワークリームおよびバターミルク、ならびに発酵ホエイであってもよい。好ましくは、発酵乳製品はヨーグルトである。
【０１３３】
本発明の組成物の使用
本発明のさらなる態様は、発酵乳製品の調製のための、本発明による組成物の使用に関する。
【０１３４】
本発明の実施形態は、制限されることのない例によって以下に説明される。
【０１３５】
配列表
配列番号１は、菌株ＣＨＣＣ１６７３１の突然変異グルコキナーゼ遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
配列番号２は、配列番号１によってコードされたアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、菌株ＣＨＣＣ１６７３１の突然変異ＭａｎＮ遺伝子のＤＮＡ配列を示す。
配列番号４は、配列番号３によってコードされたアミノ酸配列を示す。
配列番号５は、菌株ＣＨＣＣ１６７３１のＭａｎＭ遺伝子（突然変異なし）のＤＮＡ配列を示す。
配列番号６は、配列番号５によってコードされたアミノ酸配列を示す。
【実施例】
【０１３６】
材料と方法
培地：
ストレプトコッカス・サーモフィルスに関して、使用する培地は、当業者に知られているＭ１７培地である。
【０１３７】
Ｍ１７アガロース培地は、１リットルのＨ２Ｏあたりの以下の組成を有する：
アガロース、１２．７５ｇ
アスコルビン酸、０．５ｇ
カゼインペプトン（トリプシン消化物）、２．５ｇ
β−グリセロリン酸二ナトリウム五水和物、１９ｇ
硫酸マグネシウム水和物、０．２５ｇ
肉エキス、５ｇ
肉ペプトン（ペプシン消化物）、２．５ｇ
大豆ペプトン（パパイン消化物）、５ｇ
酵母抽出物、２．５ｇ
最終的なｐＨ７．１±０．２（２５℃）、
そして、Ｍ１７培養液は、１リットルのＨ２Ｏあたり以下の組成を有する：
アスコルビン酸、０．５ｇ
硫酸マグネシウム、０．２５ｇ
肉エキス、５ｇ
肉ペプトン（ペプシン消化物）、２．５ｇ
グリセロリン酸ナトリウム、１９ｇ
大豆ペプトン（パパイン消化物）、５ｇ
トリプトン、２．５ｇ
酵母抽出物、２．５ｇ
最終的なｐＨ７．０±０．２（２５℃）。
【０１３８】
添加された炭素源は、無菌のラクトース２０ｇ／ｌ、グルコース２０ｇ／ｌまたはガラクトース２０ｇ／ｌである。
【０１３９】
当業者が知っているとおり、Ｍ１７培地は、ストレプトコッカス・サーモフィルスの増殖に好適であるように考慮された培地である。さらに、当業者が理解しているように、本文脈において、Ｍ１７濃縮物は、様々な供給業者から供給される可能性があるので、特定の供給業者とは無関係に、当業者は、本明細書中の着目の関連細胞について、２−デオキシグルコース耐性に関して（標準的な測定不確実性の範囲内で）本明細書中に関連する同じ結果を得る。
【０１４０】
ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカスを培養するのに使用する培地は、ＭＲＳ−ＩＭ培地であった。ＭＲＳ−ＩＭは、アガロースプレートまたは培養液の形態で使用した。
【０１４１】
ＭＲＳ−ＩＭアガロース培地は、１リットルのＨ２Ｏあたりの以下の組成を有する。
トリプトン                Oxoid L42          １０．０ｇ
酵母抽出物                Oxoid L21          ５．０ｇ
Ｔｗｅｅｎ８０            Merck nr8.22187    １．０ｇ
Ｋ２ＨＰＯ４              Merck nr105104      ２．６ｇ
酢酸Ｎａ                  Merck nr106267      ５．０ｇ
ＭｇＳＯ４、７Ｈ２Ｏ      Merck nr105882      ０．２ｇ
ＭｎＳＯ４、Ｈ２Ｏ        Merck nr105941      ０．０５ｇ
アガロース                SO-BI-GEL          １３．０ｇ
オートクレーブ後に、ｐＨを２５℃にて６．９±０．１に調整する。
【０１４２】
液体培養のために以下の実施例で使用するＭＲＳ−ＩＭ培養液は、１リットルのＨ２Ｏあたり以下の組成を有する：
トリプトン                Oxoid L42          １０．０ｇ
酵母抽出物                Oxoid L21          ５．０ｇ
Ｔｗｅｅｎ８０            Merck nr8.22187    １．０ｇ
Ｋ２ＨＰＯ４              Merck nr105104      ２．６ｇ
酢酸Ｎａ                  Merck nr106267      ５．０ｇ
クエン酸二アンモニウム    Merck nr101154      ２．０ｇ
ＭｇＳＯ４、７Ｈ２Ｏ      Merck nr105882      ０．２ｇ
ＭｎＳＯ４、Ｈ２Ｏ        Merck nr105941      ０．０５ｇ
【０１４３】
オートクレーブ後に、ｐＨを２５℃にて６．９±０．１に調整する。炭素源であるラクトース２０ｇ／ｌまたはグルコース２０ｇ／ｌを、最初に濾過滅菌した後に、オートクレーブ処理した培養液に添加した。
【０１４４】
上記ＭＲＳ−ＩＭ培地は、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカスの増殖を支える培地の能力に影響を及ぼすことなく、ある程度変更できる。さらに、当業者には明らかなように、ＭＲＳ−ＩＭ濃縮物または先に記載した種々の成分は、様々な供給業者から入手でき、そして、ＭＲＳ−ＩＭ培地の調製に使用され得る。これらの培地は、以下の実施例、特に２−デオキシグルコース耐性の選択アッセイに同様に使用する。
【０１４５】
母株
ストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ１１９７６（ＷＯ２０１１／０２６８６３に記載のように、ＧａｌＫ遺伝子に突然変異を有するガラクトース発酵株）。
ストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ１２３３９（ＷＯ２０１１／０９２３００に記載のように、ファージ耐性であり、かつ、食感を加える）。
ストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ１８９４８（ＧａｌＫ遺伝子に突然変異を有する、ＣＧＣＣ１２３３９のガラクトース発酵突然変異株）。
【０１４６】
２−デオキシグルコースの耐性株
ストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ１６１６５（ＣＨＣＣ１１９７６の２−デオキシグルコース耐性突然変異株）。
ストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ１６７３１（甘味を付与し、かつ、食感を加える、ＣＨＣＣ１６１６５の突然変異株）。
ストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ１９２１６（甘味を付与し、かつ、食感を加える、ＣＨＣＣ１８９４８の突然変異株）。
【０１４７】
実施例１：高グルコース分泌を有するストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ１１９７６のグルコースキナーゼ突然変異株の単離のための２−デオキシグルコースの使用
ストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１１９７６の突然変異株を単離するために、単一コロニーの増殖によって得られた細胞を、２％のラクトースを含有する１０ｍｌのＭ１７培養液に植菌し、４０℃で一晩培養した。
【０１４８】
翌日、前記菌株を、２％のガラクトースと、２０ｍＭ（ＣＨＣＣ１１９７６）の濃度の２−デオキシグルコースを含むＭ１７アガロースプレート上に段階希釈で平板培養し、そして、４０℃で２０時間インキュベートした。耐性コロニーを、それらを選択するので、まず同じタイプのアガロースプレート上に再度画線接種した。生存菌株を、２％のラクトース、２％のガラクトースまたは２％のグルコースのいずれかを含む新しいＭ１７培養液の植菌に使用し、そして、増殖を計測した。
【０１４９】
実施例２に概説しているように、こうして、ガラクトースに比べて、グルコース上でより速く増殖できる多数の突然変異株を同定した。１つの当該突然変異株が、ＣＨＣＣ１６１６５であった。
【０１５０】
実施例２：２−デオキシグルコース耐性突然変異株の増殖パターン
ガラクトース上で増殖できる２−デオキシグルコース耐性突然変異株の選択を確実にするために、ガラクトース発酵菌株コレクションから選択した２つの菌株を使用した。これらのガラクトース発酵菌株は、それでも、Ｍ１７培養液＋２％のガラクトース中に比べて、Ｍ１７培養液＋２％のグルコース中で、対数期には少なくとも１０％速く増殖したのに対して、その一方、ＣＨＣＣ１１９７６の２−デオキシグルコース耐性突然変異株誘導体、とりわけ、ＣＨＣＣ１６１６５は、Ｍ１７培養液＋２％のグルコースに比べて、Ｍ１７培養液＋２％のガラクトース中で、対数期にはさらに速く増殖することを特徴とした。
対数期における増殖は、本明細書中では、指数増殖期培養物に関する４０℃での経時的な６００ナノメートル（ＯＤ６００）の吸光度の上昇として計測した。
当業者が知っているように、培養物が指数増殖の状態にあるとき、それは種ごとに異なっていてもよい。当業者は、対数期の増殖、例えばＯＤ６００ ０．１〜１．０の間、をどのように測定するか知っている。
培養物の吸光度（ＯＤ）を、分光光度計で計測した。
【０１５１】
結論：
この実施例２の２−デオキシグルコース耐性突然変異株の増殖パターンに基づいて、−着目の特定の菌株（例えば、関連する市販品からの菌株）に関して−、当業者は、この着目の特定の菌株が、選択した突然変異株の特性である本明細書中に関連する増殖パターンを有するかどうか、規定どおりに試験できる。
【０１５２】
実施例３：ストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ１６１６５の高ラクトース発酵およびグルコース分泌突然変異株の選択
ストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１６１６５の高ラクトース発酵およびグルコース分泌突然変異株を単離するために、単一コロニーの増殖物由来の細胞を、２％のガラクトースを含有する１０ｍｌのＭ１７培養液中に植菌し、４０℃で一晩培養した。
【０１５３】
翌日、前記菌株を、２％のスクロースと、４０ｍＭの濃度の２−デオキシグルコースを含むＭ１７アガロースプレート上に段階希釈で平板培養し、そして、４０℃で２０時間インキュベートした。無作為に１０個のコロニーを、それらのプレートから選択し、そして、２％のスクロースを含有する新しいＭ１７培養液の植菌に使用し、そして、４０℃にて一晩培養した。
【０１５４】
ＣＨＣＣ１６１６５突然変異株を、２％のスクロースを含有する新しいＭ１７培地に移した。
【０１５５】
実施例４．発酵乳の炭水化物分析
実施例３で得られた突然変異株および菌株ＣＨＣＣ１６１６５を、０．０１％のスクロースを含有する９．６％のＢ乳中で培養した。酸性化後に、ＣＨＣＣ１６１６５により酸性化された乳は、１４．９のラクトース濃度、８．４のガラクトース濃度、および５．７のグルコース濃度を有した。比較して、ＣＨＣＣ１６１６５の最高性能の突然変異株により酸性化された乳は、９．３のラクトース濃度、１０．５のガラクトース濃度、および９．９のグルコース濃度を有した。前記のＣＨＣＣ１６１６５の最良の突然変異株を、ＣＨＣＣ１６７３１と呼び、そしてそれを、ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス株ＣＨＣＣ１６１５９およびＣＨＣＣ１６１６０（ＷＯ２０１３／１６０４１３に記載）と組み合わせて使用されたときの、乳の発酵における追加試験に供した。
【０１５６】
ＣＨＣＣ１６１５９およびＣＨＣＣ１６１６０のそれぞれと組み合わせたＣＨＣＣ１６１６５およびＣＨＣＣ１６７３１の一晩培養物を、２００ｍｌのＢ乳のサンプルに追加し、そして、４０℃で酸性化させた。
結果は、表１に列挙されているとおりである：
【０１５７】
【表１】
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【０１５８】
表１の結果から分かるとおり、ＣＨＣＣ１６７３１は、乳からほとんどすべてのラクトースを取り除くことができる。また、ＣＨＣＣ１６７３１は、高レベルのガラクトースおよびグルコースの両方を産生し、そして、乳中に分泌する。スクロースが１００の基準であり、かつ、ラクトースの甘味が１６であり、ガラクトースの甘味が３２であり、グルコースの甘味が７４．３であることを考慮すると、ＣＨＣＣ１６７３１により製造された発酵乳製品は、高度に増強された甘味を有している。
【０１５９】
実施例５．ストレプトコッカスサーモフィルスＣＨＣＣ１２３３９のガラクトース陽性突然変異株の作製
ストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ１２３３９を、２％のラクトースを含有するＭ１７中で４０℃にて一晩培養した。一晩培養物を、２％のガラクトースを含有するＭ１７プレート上に平板培養し（１００μｌ）、そして、嫌気的に４０℃にてインキュベートした。２２個のコロニーが、２％のガラクトースを含有するＭ１７プレート上に現れる。それらのうち１６個を、同じタイプのプレート上に再度画線接種し、およびそれらのうちの８個を、２％のガラクトースを含有する液体Ｍ１７中に移し、そしてそのすべてが増殖し、そして、それらの培養物のうちの４個を冷凍した。冷凍した培養物のうちの２個を、２％のガラクトースおよび４０ｍＭの２−デオキシグルコースを含有するＭ１７プレート上に塗り広げ、各培養物に関して、得られたコロニーのうちの８個を選択した。１６個の２−デオキシグルコース突然変異株を、２％のラクトースおよび２％のガラクトースを含有する液体Ｍ１７中に移し、４０℃にて一晩培養し、その後、該突然変異株を、２％のガラクトースを含有する液体Ｍ１７中で三晩培養し、そして、ガラクトースおよびグルコースの産生を計測し、そして、増殖している間、観察した。ガラクトースおよびグルコース７の産生に基づいて、７個の培養物を、０．０５％のスクロースを含有する２００ｍｌの９．５％Ｂ乳に２ｍｌの培養物を加えることによる、乳の酸性化試験のために選択した。３つの突然変異株が、母株ＣＨＣＣ１２３３９のものに類似した酸性化プロファイルを有していたので、それら３つの突然変異株を、コロニーを選び出すために画線接種し、そして、４８時間インキュベートした。それに続いて、コロニーを、２％のガラクトースを含有する液体Ｍ１７に移し、そして、ＣＨ１２３３９に対するその３つの突然変異株の増殖を試験する。最もよく増殖した突然変異株を選択し、コロニーを選び出すために画線接種を３回おこなうことによってより一層精製して、ＣＨＣＣ１８９４８と呼ばれる精製されたガラクトース陽性株（ＣＨＣＣ１２３３９のガラクトース陽性変異株）を作製した。
【０１６０】
実施例６．グルコースの増強された排出を有するストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ１８９４８の２−デオキシグルコース突然変異株の作製
１００μｌのＣＨＣＣ１８９４８培養物を、２％のガラクトースおよび２０ｍＭまたは４０ｍＭの２−デオキシグルコースを含有するＭ１７プレート上に塗り広げ、４０℃にて一晩インキュベートした。２０ｍＭプレートからの８つのコロニーおよび４０ｍＭプレートからの８つのコロニーを、選択し、そして、２％のガラクトースおよび２０ｍＭの２−デオキシグルコースを含有する液体Ｍ１７中で培養した。得られた培養物を、冷凍し、再度画線接種し、そして、得られたコロニーのうちの１２個を、Ｍ１７培地で開始し、Ｂ乳を酸性化するのに使用した。１％の２−デオキシグルコース突然変異株の一晩培養物を、０．０５％のスクロースを含有する２００ｍｌの９．５％Ｂ乳に植菌し、そして、４０℃にて酸性化した。ＣＨＣＣ１８９４８の２−デオキシグルコース突然変異株の１２個すべてが、低濃度のラクトースおよび高濃度のガラクトースとグルコースを有する発酵乳製品を製造した。７つの突然変異株を、単独での再試験するため、およびラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス株ＣＨＣＣ１６１５９（ＷＯ２０１３／１６０４１３に記載）と一緒に試験するために選択した。再び、１％の２−デオキシグルコース突然変異株の一晩培養を、０．０５％のスクロースを含有する２００ｍｌの９．５％Ｂ乳中に植菌し、そして、４０℃にて酸性化した。
結果を表２に示す：
【０１６１】
【表２】
2020515265.tif 000004
【０１６２】
３つの最良の変異株は、変異株２、３および１２であり、そして、それらを、単独で、ならびにラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス株ＣＨＣＣ１６１５９、ＣＨＣＣ１６１６０およびＣＨＣＣ１６１６１（ＷＯ２０１３／１６０４１３に記載）と組み合わせて、０．０５％のスクロースを含有するＢ乳で再試験した。
結果を表３に示す：
【０１６３】
【表３】
2020515265.tif 000005
【０１６４】
上記のデータに基づいて、ＣＨＣＨ１８９４８−突然変異株３を、最良の変異株として選択し、そして、それをＣＨＣＣ１９２１６と呼んだ。上記のデータから分かるように、ＣＨＣＣ１９２１６は、乳からのラクトースのほとんどすべてを取り除くことができる。また、ＣＨＣＣ１９２１６は、高レベルのガラクトースおよびグルコースの両方を産生し、そして、乳中に分泌する。スクロースが１００の基準であり、かつ、ラクトースの甘味が１６であり、ガラクトースの甘味が３２であり、グルコースの甘味が７４．３であることを考慮すると、ＣＨＣＣ１９２１６により製造された発酵乳製品は、高度に増強された甘味を有している。
【０１６５】
実施例７ＣＨＣＣ１６７３１およびＣＨＣＣ１９２１６の食感を加える特性
菌株ＣＨＣＣ１６７３１およびＣＨＣＣ１９２１６の食感を加える特性を、以下のアッセイの使用によるせん断応力の計測によって試験した：
インキュベーションの７日後に、発酵乳を、１３℃にし、そして、サンプルが均一化するまで、穴あき円板が付いた棒によって緩やかに撹拌した。サンプルの流動学的特性を、
以下の設定を使用したレオメーター（An-ton Paar Physica ASC/DSR301 Rheometer (Autosampler), Anton PaarR GmbH, Austria）により評価した：
【０１６６】
待機時間（ある程度当初の構造まで再建するため）
振動又は旋回無しで５分間
振動（Ｇ＊の計算のためＧ’及びＧ’’を測定するため）
ｙ＝０．３％、振動数（ｆ）＝［０．５...８］Ｈｚ
６０ｓにわたり６つの測定ポイント（１０秒に１回）
旋回（３００ １／ｓでのせん断応力を測定するため）
ｙ＝［０．２７０７−３００］１／ｓおよびｙ＝［２７５−０．２７０７］１／ｓ
３００ １／ｓまで上げて２１０ｓにわたり２１個の測定ポイント（１０秒に１回）
および
０．２７０７ １／ｓまで下げて２１０ｓに渡り２１個の測定ポイント（１０秒に１回）
更なる解析において、３００ １／ｓでのせん断応力を選択した。
【０１６７】
表４で列挙した混合した菌株ＣＨＣＣ１６７３１およびＣＨＣＣ１９２１６を、ｐＨが４．５５に達するまで、０．０２４％の種菌を使用した２００ｍｌの９．５％Ｂ乳サンプルを酸性化するのに使用した。
結果を表４に示す：
【０１６８】
【表４】
2020515265.tif 000006
【０１６９】
結果から分かるように、菌株ＣＨＣＣ１６７３１およびＣＨＣＣ１９２１６は、培養混合物中の唯一のＳ．サーモフィルスとして使用されたとき、それぞれ、４１．３Ｐａおよび５１．５Ｐａのせん断応力を有する発酵乳製品を製造する。組み合わせて使用したとき、菌株ＣＨＣＣ１６７３１とＣＨＣＣ１９２１６は、４３．３Ｐａのせん断応力を有する発酵乳製品を製造する。
【０１７０】
例えば、ＷＯ２０１３／１６０４１３に開示された従来の甘味を付与する株と比較した場合、このレベルのせん断応力は高い。
【０１７１】
実施例８．ラクトース陽性、グルコース陽性Ｌｂによる培養と比較した、本発明の培養の培養組成物のためのラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス（Ｌｂ）のフレーバーと増殖
【０１７２】
実験計画
表５：試験した培養物の組成
【表５】
2020515265.tif 000007
【０１７３】
本発明の培養物は、３つのグルコース欠損ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔ）と１つのラクトース欠損Ｌｂで構成されている。培養物２（比較培養物）は、３つのグルコース欠損Ｓｔおよび１つのラクトース陽性、グルコース陽性（従来の）Ｌｂで構成されている。
【０１７４】
表５に示した組成物を用いた２つの培養物を調製し、そして、４．５５の標的ｐＨに達するまで４３℃にてヨーグルトを製造するためのスターター培養物として発酵に使用した。２つの培養物を、フレーバー、Ｌｂの増殖、後酸性化、炭水化物および流動学に関して比較した。
【０１７５】
乳ベース
乳ベースは、４．５％のタンパク質、１．０％の脂質および０．１％のスクロースを含んだ。
最終的な乳ベースにおいて１％の脂肪含有量を達成するために、０．５％脂肪乳と１．５％脂肪乳を混合し、さらに、０．１％のスクロースを加えた。タンパク質レベルを、脱脂乳粉末（ＳＭＰ）を使用することで４．５％に調整した。水和を６℃にて２時間おこなった。その後、乳を、２００／５０ｂａｒ、６５℃にて均質化し、そして、９５℃にて５分間低温殺菌した。
【０１７６】
ヨーグルト製造パラメーター
発酵中のｐＨを、Ｉｎｔａｐを使用してオンラインで計測した。ヨーグルトがｐＨ４．５５に達したとき、穴あき円板が付いたスティックを使って、ゲルを崩した。次に、そのゲルを、２ｂａｒ、２５℃の後処理ユニット（ＰＴＵ）内で処理し、１２０ｍＬヨーグルトカップに充填し、そして、６℃にて２８日間保存した。
【０１７７】
せん断応力の計測
サンプルの均一性が得られるようにＰＴＵ処理中にゲルが既に崩されていたので、穴あき円板が付いたスティックでサンプルを撹拌することしなかったことを除いて、実施例７に記載の方法を使用した。
【０１７８】
コロニー形成単位の計測
Ｍ１７をＳｔの選択培地として使用し、ＭＲＳｌａｃ（ＭＲＳ＋８％のラクトース）をＬｂの選択培地として使用した。１０×希釈系列を、ヨーグルトで作製した。すべての希釈物を、それぞれＭ１７およびＭＲＳｌａｃアガロースプレート上で平板培養し、そして、３７℃にて２日間嫌気的にインキュベートした。その後、コロニー形成単位をカウントした。
【０１７９】
酸性化
培養物１は、４．５５のｐＨに達するには１０．８時間かかった。培養物２は、４．５５のｐＨに達するには１２．１時間かかった。
【０１８０】
後酸性化
表６：後酸性化
【表６】
2020515265.tif 000008
【０１８１】
Ｌｂの増殖
表７：発酵終了時の培養物の増殖（コロニー形成単位（ＣＦＵ））
【表７】
2020515265.tif 000009
【０１８２】
表７から分かるように、本発明の培養物のＬｂ細胞数は、従来のＬｂ、すなわち、ラクトース陽性、グルコース陽性Ｌｂを用いた比較培養物のＬｂカウントよりはるかに高かった。よって、グルコース欠損Ｓｔおよびラクトース欠損Ｌｂの組み合わせは、発酵終了時に高いレベルのＬｂを生じる。
【０１８３】
流動学
培養物１は、発酵終了時に３００ １／ｓにて４１．１Ｐａのせん断応力を有する。培養物２は、発酵終了時に３００ １／ｓにて２７．３Ｐａのせん断応力を有する。
【０１８４】
炭水化物
表８：発酵終了時の炭水化物レベル
【表８】
2020515265.tif 000010
【０１８５】
フレーバー
フレーバーを、食味検査パネルによる査定によって評価した。培養物１には、まったく異臭がなかった。
【０１８６】
実施例９．グルコース欠損Ｌｂによる培養と比較した、本発明の培養の培養組成物のためのラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス（Ｌｂ）のフレーバーと増殖
【０１８７】
実験計画
表９：試験した培養物の組成
【表９】
2020515265.tif 000011
【０１８８】
本発明の培養物は、３つのグルコース欠損Ｓｔと１つのラクトース欠損Ｌｂで構成されている。培養物２（比較培養物）は、３つのグルコース欠損Ｓｔおよび１つのラクトース陽性、グルコース欠損Ｌｂで構成されている。
【０１８９】
表９に示した組成物を用いた２つの培養物を調製し、そして、４．５５の標的ｐＨに達するまで４３℃にてヨーグルトを製造するためのスターター培養物として発酵に使用した。２つの培養物を、フレーバー（アミノ酸のレベル）、揮発性有機物成分、炭水化物および流動学に関して比較した。
【０１９０】
乳ベース
脱脂乳粉末（ＳＭＰ）またはホエイタンパク質（ＷＰ）のいずれかを用いて調整され、かつ、４．５％のタンパク質、１％の脂質および０．１％のスクロースを含有する、２つの乳ベースを使用した。
最終的な乳ベースにおいて１％の脂肪含有量を達成するために、０．５％脂肪乳と１．５％脂肪乳を混合し、さらに、０．１％のスクロースを加えた。タンパク質レベルを、ＳＭＰまたはＷＰを使用することで４．５％に調整した。水和を６℃にて２時間おこなった。その後、乳を、２００／５０ｂａｒ、６５℃にて均質化し、そして、９５℃にて５分間低温殺菌した。
【０１９１】
ヨーグルト製造パラメーター
発酵中のｐＨを、ＣＩＮＡＣを使用した哺乳瓶においてオンラインで計測した。ヨーグルトがｐＨ４．５５に達したとき、穴あき円板が付いたスティックを使って、ゲルを崩し、そして、均質化した。その後、ヨーグルトを哺乳瓶中で保存した。
【０１９２】
せん断応力の計測
実施例７に記載の方法を使用した。
【０１９３】
流動学
ＳＭＰ乳ベース中の培養物１は、発酵終了時に３００ １／ｓにて４６．２Ｐａのせん断応力を有する。
ＷＰ乳ベース中の培養物１は、発酵終了時に３００ １／ｓにて３９．６Ｐａのせん断応力を有する。
ＳＭＰ乳ベース中の培養物２は、発酵終了時に３００ １／ｓにて４２．０Ｐａのせん断応力を有する。
ＷＰ乳ベース中の培養物２は、発酵終了時に３００ １／ｓにて３８．４Ｐａのせん断応力を有する。
結果から分かるように、培養物１は、培養物２と比較した場合に、せん断応力を有する。
【０１９４】
後酸性化
表１０：後酸性化
【表１０】
2020515265.tif 000012
【０１９５】
Ｌｂの増殖
表１１：発酵終了時の培養物の増殖（コロニー形成単位（ＣＦＵ））
【表１１】
2020515265.tif 000013
【０１９６】
表１１から分かるように、本発明の培養物のＬｂ細胞数は、ラクトース陽性、グルコース欠損Ｌｂを用いた比較培養物のＬｂカウントより低かった。
【０１９７】
炭水化物
表１２：発酵終了時の炭水化物レベル
【表１２】
2020515265.tif 000014
【０１９８】
アミノ酸
表１３：アミノ酸のレベル
【表１３】
2020515265.tif 000015
【０１９９】
グルコース陰性Ｌｂを含むサンプル（培養物２）は、より多くのＴＦＦＡ量を有し、そしてその特徴が、順に、不快なフレーバーにつながり得る、より高いタンパク分解性活性に寄与する。
【０２００】
さらに、グルコース陰性Ｌｂを含有するヨーグルトは、「ブロシー（brothy）」と説明される異臭をもたらすことが知られているグルタミン酸をより大量に含有する。
【０２０１】
そのうえ、苦味のあるアミノ酸であるバリンが、グルコース陰性Ｌｂを含有するヨーグルト中により大量に存在する。
【０２０２】
揮発性有機化合物（ＶＯＣ）
揮発性有機化合物プロファイルは、サンプルのフレーバープロファイルに関する指標を与え得る。５１種類の異なった揮発性有機化合物が計測された。ＷＰ乳ベース中の培養物１に関して、ＷＰ乳ベース中の培養物２と比較して、揮発性有機化合物の量は、５１種類の化合物のうちの４４種類（８６％）と少なかった。ＷＰ乳ベース中の培養物１に関して、ＷＰ乳ベース中の培養物２と比較して、揮発性有機化合物の量は、５１種類の化合物のうちの３４種類（６７％）と少なかった。結論として、本発明の培養物は、比較培養物と比較した場合に、有意に少ない含有量の（化合物群として見なされる）揮発性有機物化合物を有していた。
【０２０３】
実施例１０．本発明の培養組成物のためのラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス（Ｌｂ）の増殖と後酸性化
実験計画
表１４：試験した培養物の組成
【表１４】
2020515265.tif 000016
【０２０４】
表１４に示した組成を有する培養物を調製し、そして、４．５５の標的ｐＨに達するまで４３℃にてヨーグルトを製造するための発酵にスターター培養物として使用した。その培養物を、０．０１％、０．０２％および０．０３％のレベルで植菌した。製造されたヨーグルトを、５℃、１３℃および２５℃にて保存した。その培養物を、ＳｔおよびＬｂの増殖、ならびに後酸性化に関して試験した。
【０２０５】
乳ベース
表１５：乳ベース１および２の組成
【表１５】
2020515265.tif 000017
【０２０６】
表１６：乳ベース３の組成
【表１６】
2020515265.tif 000018
【０２０７】
後酸性化
表１７：後酸性化
【表１７】
2020515265.tif 000019
【０２０８】
表１７から分かるように、後酸性化のレベルは、１３℃および２５℃のより高い保存温度を含めた、試験したすべての植菌レベルおよび保存温度にて非常に低く、ここで、ほとんどの従来のスターター培養物に関しては、Ｌｂの増殖のレベルが高く、それにより、後酸性化が高い。
【０２０９】
ＬｂおよびＳｔの増殖
表１８：ＬｂおよびＳｔの増殖
【表１８】
2020515265.tif 000020
【０２１０】
表１８から分かるように、すべてのレベルの植菌に関して、Ｌｂ細胞数は、発酵終了時に高レベルであった。
【０２１１】
実施例１１．従来のスターター培養物と比較した、本発明の培養組成物のためのラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカス（Ｌｂ）の増殖、後酸性化および炭水化物分析
実験計画
表１９：試験した培養物の組成
【表１９】
2020515265.tif 000021
【０２１２】
表１９に示した組成を有する培養物を調製し、そして、４．５５の標的ｐＨに達するまで４３℃にてヨーグルトを製造するための発酵にスターター培養物として使用した。その培養物を、０．０２％のレベルで植菌した。製造されたヨーグルトを、５℃および１３℃にて保存した。その培養物を、ＳｔおよびＬｂの増殖、後酸性化および炭水化物分析に関して試験した。
YoFlex Premium1.0およびYoflex YF-L901は、ラクトース陽性、グルコース陽性ＳｔおよびＬｂを含む市販されている従来の培養物である。
【０２１３】
乳ベース
表２０：乳ベース１の組成
【表２０】
2020515265.tif 000022
【０２１４】
後酸性化
表２１：後酸性化
【表２１】
2020515265.tif 000023
【０２１５】
表２１から分かるように、本発明の培養物は、低レベルの後酸性化を有し、そしてそれは、従来のスターター培養物と同じレベルである。
【０２１６】
ＬｂおよびＳｔの増殖
表２２：ＬｂおよびＳｔの増殖
【表２２】
2020515265.tif 000024
【０２１７】
表２２から分かるように、本発明の培養物のＬｂ細胞数は、従来の培養物に比べて、発酵終了時により高いレベルであった。
【０２１８】
炭水化物分析
表２３：炭水化物分析
【表２３】
2020515265.tif 000025
【０２１９】
炭水化物のすべての測定を二重反復試験でおこない、そして、表２３は、その２つの測定値の平均値を列挙する。測定を、ヨーグルト保管の７日後に実施した。
【０２２０】
表２３から分かるように、本発明の培養物は、高レベルでグルコースを産生し、そして、保管の７日後に、グルコースは約８ｍｇ／ｇのレベルで存在した。
【０２２１】
寄託と専門家のソリューション
出願人は、下記の寄託された微生物の試料が、特許登録の日まで、専門家のみに利用可能であるべきことを要求する。
【０２２２】
菌株ストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ１１３４２は、２００９年９月８日付で、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（ＤＳＭＺ）GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germanyに、受託番号ＤＳＭ２２９３２で寄託された。
【０２２３】
菌株ストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ１２３３９は、２０１０年１０月１４日付で、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（ＤＳＭＺ）GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germanyに、受託番号ＤＳＭ２４０９０で寄託された。
【０２２４】
菌株ストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ１１９７６は、２００９年９月８日付で、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（ＤＳＭＺ）GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germanyに、受託番号ＤＳＭ２２９３４で寄託された。
【０２２５】
菌株ストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ１６７３１は、２０１４年６月４日付で、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（ＤＳＭＺ）GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germanyに、受託番号ＤＳＭ２８８８９で寄託された。
【０２２６】
菌株ストレプトコッカス・サーモフィルスＣＨＣＣ１９２１６は、２０１５年１２月８日付で、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（ＤＳＭＺ）GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germanyに、受託番号ＤＳＭ３２２２７で寄託された。
【０２２７】
菌株ストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１５７５７は、２０１２年４月３日付で、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（ＤＳＭＺ）GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germanyに、受託番号ＤＳＭ２５８５０で寄託された。
【０２２８】
菌株ストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１５８８７は、２０１２年４月３日付で、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（ＤＳＭＺ）GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germanyに、受託番号ＤＳＭ２５８５１で寄託された。
【０２２９】
菌株ストレプトコッカス・サーモフィルス株ＣＨＣＣ１６４０４は、２０１２年１２月１２日付で、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（ＤＳＭＺ）GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germanyに、受託番号ＤＳＭ２６７２２で寄託された。
【０２３０】
菌株ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカスＣＨＣＣ１８９４４は、２０１４年６月１２日付で、ＤＳＭＺ−Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweigに、受託番号ＤＳＭ２８９１０で寄託された。
【０２３１】
菌株ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカスＣＨＣＣ１００１９は、２００７年４月３日付で、ＤＳＭＺ−Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweigに、受託番号ＤＳＭ１９２５２で寄託された。
【０２３２】
菌株ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカスＣＨＣＣ１６１５９は、２０１２年９月６日付で、ＤＳＭＺ−Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweigに、受託番号ＤＳＭ２６４２０で寄託された。
【０２３３】
菌株ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカスＣＨＣＣ１６１６０は、２０１２年９月６日付で、ＤＳＭＺ−Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweigに、受託番号ＤＳＭ２６４２１で寄託された。
【０２３４】
菌株ラクトバチルス・デルブルッキー亜種ブルガリカスＣＨＣＣ１２８１３は、２０１０年９月２９日付で、ＤＳＭＺ−Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweigに、受託番号ＤＳＭ２４０７４で寄託された。
【０２３５】
寄託は、特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従っておこなわれた。
【０２３６】
参考文献
【化１】
2020515265.tif 000026
【図１】
2020515265.tif 000027
【配列表】
2020515265000001.app
【国際調査報告】
2020515265.tif 000028
2020515265.tif 000029
2020515265.tif 000030