(57)【要約】  本発明は、任意選択的には共界面活性剤の存在下において、４〜６．５のｐＨでのエマルションの安定化のための界面活性剤としての、選択図に示すような次の式（ＩＩ）を有するコポリマーの使用（用途、使用法）に関する。この式において、Ａ１は、リンカー、好ましくは、酵素切断可能なペプチド配列である。ｙは、０または１である。ＡＡは、疎水性アミノ酸の残基である。ｘは、１７〜２７０の整数であり、ｎは、５〜１７０の整数であり、ｍは、０〜８０の整数である。【選択図】図６
2020536088.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
任意選択的には共界面活性剤の存在下において、４〜６．５、好ましくは５〜６のｐＨでのエマルションの安定化のための界面活性剤としての、次の式（ＩＩ）を有するコポリマーの使用であって、
【化１】
2020536088.tif 000055
ここで、式中、
−  Ａ１は、リンカー、好ましくは、酵素切断可能なペプチド配列であり、ｙは、０または１であり、
−  ＡＡは、バリン、ロイシン、イソロイシン、またはフェニルアラニンなどの疎水性アミノ酸の残基であり、
−  ｘは、１７〜２７０、好ましくは１７〜１１４の整数であり、
−  ｎは、５〜１７０の整数であり、
−  ｍは、０〜８０の整数である、
ことを特徴とする、コポリマーの使用。
【請求項２】
ｙが１である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
Ａ１が、特に、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）によって、特に、ＭＭＰ２またはＭＭＰ９によって切断可能な酵素切断可能なペプチド配列である、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
Ａ１が、４〜１０個のアミノ酸、好ましくは、４〜７個のアミノ酸を備えたペプチドであって、特に、少なくとも１つのグリシン残基、好ましくは、少なくとも２つのグリシン残基、および任意選択でベータアラニンなどのβ配置にある少なくとも１つの追加のアミノ酸を含有するペプチドである、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
Ａ１が、以下のペプチド：βΑ−ＰＶＧＬＩＧ、βΑ−ＧＦＬＧ、βΑ−ＧＲＦＧ、およびβΑ−ＧＦＫＦＬＧからなる群から選択される、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
ｙが０であるところの式（ＩＩ）のコポリマーの、請求項１に記載の使用であって、
そのコポリマーは以下の式（Ｉ）を有する、
【化２】
2020536088.tif 000056
ここで、式中、ＡＡ、ｘ、ｍおよびｎは、請求項１で定義されたとおりである、
請求項１に記載の使用。
【請求項７】
ｙ＝１、Ａ１がβΑ−ＰＶＧＬＩＧであり、ｍが０であり、ｎが１００、１５０、もしくは１７０であり、ｘが１１４であるところの、又は、
ｙ＝１、Ａ１がβΑ−ＰＶＧＬＩＧであり、ｍが１６であり、ｎが６１であり、ｘが１１４であるところの、又は、
ｙ＝１、Ａ１がβΑ−ＰＶＧＬＩＧであり、ｍが１１であり、ｎが４６であり、ｘが１１４であるところの、
式（ＩＩ）のコポリマーの、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
ｍが０であり、ｎが９６、１００、もしくは１５１であり、ｘが１１４であるところの、又は、
ｍが５であり、ｎが１６であり、ｘが１１４であるところの、又は、
ｍが１１であり、ｎが４４であり、ｘが１１４であるところの、又は、
ｍが１１であり、ｎが４６であり、ｘが１１４であるところの、
式（Ｉ）のコポリマーの、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
共界面活性剤の存在下での、請求項１〜８のいずれかに定義された式（Ｉ）または式（ＩＩ）のコポリマーの、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記共界面活性剤が１０未満の親水性親油性バランス（ＨＬＢ）を有する、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
水、グリセロール、または油の単一の液滴を含むコアを含んでなる、５０ｎｍ〜５００μｍの直径を有するカプセルであって、
前記コアが、前記単一の液滴を完全にカプセル化する１つのポリマーシェルによって囲まれており、前記ポリマーシェルが、請求項１の式（ＩＩ）を有するコポリマー、または請求項１に定義された式（ＩＩ）を有する架橋コポリマーからなる、カプセル。
【請求項１２】
式（ＩＩ）において、ｙが１である、請求項１１に記載のカプセル。
【請求項１３】
前記コアが少なくとも１種の活性化合物を更に含む、請求項１２に記載のカプセル。
【請求項１４】
式（ＩＩ）において、ｙが０である、請求項１１に記載のカプセル。
【請求項１５】
水、グリセロール、または油の単一の液滴を含むコアを含んでなる、５０ｎｍ〜５００μｍの直径を有するカプセルであって、
前記コアが、前記単一の液滴を完全にカプセル化する１つのポリマーシェルによって囲まれており、前記ポリマーシェルが、請求項６で定義された式（Ｉ）のコポリマー、または請求項６で定義された式（Ｉ）の架橋コポリマーからなる、カプセル。
【請求項１６】
前記ポリマーシェルが式（Ｉ）または（ＩＩ）のコポリマーからなり、ｍが０である、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載のカプセル。
【請求項１７】
前記コアが水の単一の液滴を含む、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載のカプセル。
【請求項１８】
前記コアがグリセロールの単一の液滴を含む、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載のカプセル。
【請求項１９】
前記コアが油の単一の液滴を含む、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載のカプセル。
【請求項２０】
前記油が、植物油、並びに、
パルミチン酸オクチル、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド、イソノナン酸イソデシル、イソヘキサデカン、スクアレン（フィトスクアレン）、シモンジアキネンシス（ホホバ）種油、および、シリコーンに基づく油などの化粧用油、
からなる群から選択され、
特に前記油が、パルミチン酸オクチル、ドデカン、オリーブ油、またはひまわり油である、請求項１１〜１６および１９のいずれか一項に記載のカプセル。
【請求項２１】
前記ポリマーシェルが式（Ｉ）のコポリマーからなり、そこでは、
ｍが０であり、ｎが１００もしくは１５１であり、ｘが１１４である、又は、
ｍが５であり、ｎが１６であり、ｘが１１４である、又は、
ｍが１１であり、ｎが４６であり、ｘが１１４である、
請求項１１〜２０のいずれか一項に記載のカプセル。
【請求項２２】
前記ポリマーシェルが式（ＩＩ）のコポリマーからなり、そこでは、
ｙ＝１、Ａ１がβΑ−ＰＶＧＬＩＧであり、ｍが０であり、ｎが１００、１５０、もしくは１７０であり、ｘが１１４である、又は、
ｙ＝１、Ａ１がβΑ−ＰＶＧＬＩＧであり、ｍが１６であり、ｎが６１であり、ｘが１１４である、又は、
ｙ＝１、Ａ１がβΑ−ＰＶＧＬＩＧであり、ｍが１１であり、ｎが４６であり、ｘが１１４である、
請求項１１〜２０のいずれか一項に記載のカプセル。
【請求項２３】
請求項１１〜２２のいずれかに記載のカプセルを少なくとも１種、含んでなる組成物。
【請求項２４】
分散水相と、連続脂肪相とを含む、油中水型エマルション(water-in-oil emulsion)であって、
−  前記連続脂肪相が少なくとも１種の油を含み、当該油は、好ましくは、植物油、化粧用油、および水非混和性有機溶媒からなる群から選択されるものであり、特に、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド油、パルミチン酸オクチル、ドデカン、オリーブ油、またはひまわり油であり、
−  前記分散水相が少なくとも１種の、請求項１１〜１７および２０〜２２のいずれか一項に記載のカプセルを含む、
ことを特徴とする、油中水型エマルション。
【請求項２５】
前記カプセルが活性化合物を更に含む、請求項２４に記載の油中水型エマルション。
【請求項２６】
分散脂肪相と、連続水相とを含む水中油型エマルション(oil-in-water emulsion)であって、
−  前記連続水相がｐＨ４〜６．５、好ましくはｐＨ５〜６の水を含み、
−  前記分散脂肪相が少なくとも１種の、請求項１１〜１６、および１９〜２２のいずれか一項に記載のカプセルを含む、
ことを特徴とする、水中油型エマルション。
【請求項２７】
前記カプセルが活性化合物を更に含む、請求項２６に記載の水中油型エマルション。
【請求項２８】
分散グリセロール相と、連続脂肪相とを含む、油中グリセロール型エマルション(glycerol-in-oil emulsion)であって、
−  前記連続脂肪相が少なくとも１種の油を含み、当該油は、好ましくは、植物油、化粧用油、および水非混和性有機溶媒からなる群から選択されるものであり、特に、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド油、パルミチン酸オクチル、ドデカン、オリーブ油、またはひまわり油であり、
−  前記分散グリセロール相が少なくとも１種の、請求項１１〜１６、１８、および２０〜２２のいずれか一項に記載のカプセルを含む、
ことを特徴とする、油中グリセロール型エマルション。
【請求項２９】
前記カプセルが活性化合物を更に含む、請求項２８に記載の油中グリセロール型エマルション。
【請求項３０】
分散脂肪相と、連続相とを含むグリセロール中油型エマルション(oil-in-glycerol emulsion)であって、
−  前記連続相がグリセロールを含み、
−  前記分散脂肪相が少なくとも１種の、請求項１１〜１６、および１９〜２２のいずれか一項に記載のカプセルを含む、
ことを特徴とする、グリセロール中油型エマルション。
【請求項３１】
前記カプセルが活性化合物を更に含む、請求項３０に記載のグリセロール中油型エマルション。
【請求項３２】
疎水性活性化合物のカプセル化のための方法であって、
−  疎水性活性化合物を、少なくとも１種の油を含む脂肪溶液に溶解することによって脂肪相を調製するステップと、
−  ４〜６．５、好ましくは５〜６のｐＨの水溶液またはグリセロール溶液を調製するステップであって、前記溶液が請求項１又は６に記載の式（Ｉ）又は式（ＩＩ）を有するコポリマーを含有する、ステップと、
−  上記で定義した共界面活性剤を添加する任意選択的なステップと、
−  前記疎水性活性化合物を含有する油の単一の液滴を含むコアを含んでなる、５０ｎｍ〜５００μｍの直径を有するカプセルを得るために、前記脂肪相を前記水溶液またはグリセロール溶液に分散させるステップであって、前記コアが、前記単一の液滴を完全にカプセル化する１つのポリマーシェルによって囲まれており、前記ポリマーシェルが式（Ｉ）又は式（ＩＩ）を有するコポリマーからなる、ステップと、
−  例えば、遠心分離または透析によって、少なくとも１種の疎水性活性化合物をカプセル化している前記カプセルを回収する任意選択的なステップと、
を備えてなる、疎水性活性化合物のカプセル化のための方法。
【請求項３３】
親水性活性化合物のカプセル化のための方法であって、
−  親水性活性化合物を水に溶解することによって水相を、又は、親水性活性化合物をグリセロールに溶解することによってグリセロール相を、ｐＨ４〜６．５にて、好ましくはｐＨ５〜６にて調製するステップであって、前記溶液が請求項１又は６で定義された式（Ｉ）又は式（ＩＩ）を有するコポリマーを含有する、ステップと、
−  少なくとも１種の油を含む脂肪溶液を調製するステップと、
−  上記で定義した共界面活性剤を添加する任意選択的なステップと、
−  前記親水性活性化合物を含有する水またはグリセロールの単一の液滴を含むコアを含んでなる、５０ｎｍ〜５００μｍの直径を有するカプセルを得るために、前記水相またはグリセロール相を前記脂肪溶液に分散させるステップであって、前記コアが、前記単一の液滴を完全にカプセル化する１つのポリマーシェルによって囲まれており、前記ポリマーシェルが式（Ｉ）又は式（ＩＩ）を有するコポリマーからなる、ステップと、
−  例えば、遠心分離または透析によって、少なくとも１種の親水性活性化合物をカプセル化している前記カプセルを回収する任意選択的なステップと、
を備えてなる、親水性活性化合物のカプセル化のための方法。
【請求項３４】
少なくとも１種の活性化合物の放出のための方法であって、
−  請求項３２又は３３に記載の親水性又は疎水性活性化合物の少なくとも一種をカプセル化している少なくとも１種のカプセルを、水溶液に加えるステップと、
−  前記活性化合物を前記水溶液中に放出させるために、前記溶液のｐＨを、少なくとも６．５の値、または４未満、好ましくは３未満の値に調整するステップと、
を備えてなる、少なくとも１種の活性化合物の放出のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に、疎水性または親水性活性化合物のカプセル化のための、新しいｐＨ応答性ポリマー乳化剤およびその使用に関する。本発明は、刺激応答性エマルションの調製、得られたエマルション、およびその使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレングリコール）に基づくコポリマーは、水中油型または油中水型エマルションを安定させるために広く使用されている。ブロックコポリマー、すなわち、ジブロックまたはトリブロックの重合度および／または構造を変化させることによって、親水性・親油性バランスを調整することができる。しかしながら、これらのコポリマーはいずれも、ｐＨ応答性マクロ乳化剤ではない。
【０００３】
最近のいくつかの研究は、エマルションの安定化のためのポリペプチドの使用を扱っている。例えば、Ｍｗが５０，０００〜１００，０００ｇｍｏｌ−１のポリ（グルタミン酸）ＰＧｌｕホモポリマーが植物油のエマルションの室温での安定化に使用された（非特許文献１）。安定な水中油型エマルションがｐＨ＞５で得られた。
【０００４】
永続的な疎水性ブロックとしてのポリロイシンブロックを有するポリ（Ｌ−リジン．ＨＢｒ）ｘ−ｂ−ポリ（ラセミロイシン）ｙおよびポリ（Ｌ−リジン．ＨＢｒ）ｘ−ｂ−ポリ（Ｌ−ロイシン）ｙは、それぞれ、ダブルエマルション、および水中油型エマルションのみを作製するためのマクロ乳化剤として使用された。特に、非特許文献２の記事では、両方の相とのポリ（Ｌ−リジン．ＨＢｒ）ｘ−ｂ−ポリ（ラセミロイシン）ｙの親和性による水中油中水型ダブルエマルションの作製について扱っているが、ｐＨ応答性マクロ乳化剤には関係していない。
【０００５】
活性成分または薬物をカプセル化するために、多数の系が開発されてきた。しかしながら、カプセル化された化合物の放出を誘発するためにトリガーされ得るカプセル化技術の例は、ほとんどない。
【０００６】
食品のカプセル化では、胃で遭遇する酸性環境から関連化合物を保護するために、アルギン酸塩に基づくカプセルが使用されてきた。分解性ポリエステルに基づく他の合成ポリマーも使用されてきた。これらのポリマーでは、放出は、ポリマーの分解によって決定され、バースト放出ではなく、化合物の連続的放出をもたらす。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】（なし）
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００６，１２８，６５４０−６５４１
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ，２００８，４５５，８５（ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０７１９７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
今日まで、活性化合物のトリガーされた放出を可能にするカプセルなどの系が依然として必要とされている。
本発明の目的は、ｐＨ応答性ポリマーマクロ乳化剤を提供することである。
本発明の目的はまた、疎水性または親水性活性化合物のカプセル化を可能にすることができるポリマー乳化剤を提供することである。
本発明の目的はまた、サイズが容易に調整される、活性化合物を含有するカプセルを提供することである。
本発明の目的はまた、疎水性または親水性活性化合物のカプセル化のための方法であって、活性化合物の放出が迅速であり得、ｐＨ変化によりトリガーされ得る方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従って本発明は、（任意選択で、共界面活性剤の存在下での、）４〜６．５、好ましくは、５〜６のｐＨのエマルションの安定化のための界面活性剤としての、以下の式（ＩＩ）を有するコポリマーの使用に関する：
【化１】
2020536088.tif 000003
式中、
−  Ａ１は、リンカー、好ましくは、酵素切断可能なペプチド配列であり、ｙは、０または１であり、
−  ＡＡは、バリン、ロイシン、イソロイシン、またはフェニルアラニンなどの疎水性アミノ酸の残基であり、
−  ｘは、１７〜２７０、好ましくは、１７〜１１４の整数であり、
−  ｎは、５〜１７０の整数であり、
−  ｍは、０〜８０の整数である。
【００１１】
本発明のコポリマーは、ＰＥＧブロック、ＧｌｕおよびＡＡアミノ酸を含むブロック、ならびにリンカーＡ１を含む。一実施形態によれば、本発明のコポリマーは、ジブロックコポリマー（１つのブロックがアミノ酸を含み、１つのブロックがＰＥＧ基を含む）である。
一実施形態によれば、式（ＩＩ）において、繰返し単位ＡＡおよびＧｌｕは、ランダムに共重合される。
本出願内では、本発明のコポリマーは、中立に、Ｐ（Ｇｌｕｎ−ｃｏ−（ＡＡ）ｍ）−ｂ−（Ａ１）ｙ−ｂ−ＰＥＧｘまたはＰ（Ｇｌｕｎ−ｃｏ−（ＡＡ）ｍ）−（Ａ１）ｙ−ＰＥＧｘとも示され得る。
【００１２】
本発明は、４〜６．５、好ましくは、５〜６のｐＨのエマルションの安定化のための界面活性剤としての、以下の式（ＩＩ）を有するコポリマーの使用にも関する：
【化２】
2020536088.tif 000004
式中、
−  Ａ１は、リンカー、好ましくは、酵素切断可能なペプチド配列であり、ｙは、０または１であり、
−  ＡＡは、バリン、ロイシン、イオソロイシン、またはフェニルアラニンなどの疎水性アミノ酸の残基であり、
−  ｘは、１７〜２７０、好ましくは、１７〜１１４の整数であり、
−  ｎは、５〜１７０の整数であり、
−  ｍは、０〜８０の整数である。
【００１３】
本発明は、共界面活性剤の存在下での、４〜６．５、好ましくは、５〜６のｐＨのエマルションの安定化のための界面活性剤としての、以下の式（ＩＩ）を有するコポリマーの使用にも関する：
【化３】
2020536088.tif 000005
式中、
−  Ａ１は、リンカー、好ましくは、酵素切断可能なペプチド配列であり、ｙは、０または１であり、
−  ＡＡは、バリン、ロイシン、イオソロイシン、またはフェニルアラニンなどの疎水性アミノ酸の残基であり、
−  ｘは、１７〜２７０、好ましくは１７〜１１４の整数であり、
−  ｎは、５〜１７０の整数であり、
−  ｍは、０〜８０の整数である。
【００１４】
本発明は、４〜６．５、好ましくは、５〜６のｐＨのエマルションの安定化のための界面活性剤としての、以下の式（ＩＩ）を有するコポリマーの使用にも関する：
【化４】
2020536088.tif 000006
式中、
−  Ａ１は、リンカーであり、
−  ＡＡは、バリン、ロイシン、イオソロイシン、またはフェニルアラニンなどの疎水性アミノ酸の残基であり、
−  ｘは、１７〜２７０、好ましくは１７〜１１４の整数であり、
−  ｎは、５〜１７０の整数であり、
−  ｍは、０〜８０の整数である。
【００１５】
本発明は、共界面活性剤の存在下での、４〜６．５、好ましくは、５〜６のｐＨのエマルションの安定化のための界面活性剤としての、以下の式（Ｉ）を有するコポリマーの使用にも関する：
【化５】
2020536088.tif 000007
式中、
−  ＡＡは、バリン、ロイシン、イオソロイシン、またはフェニルアラニンなどの疎水性アミノ酸の残基であり、
−  ｘは、１７〜２７０、好ましくは、１７〜１１４の整数であり、
−  ｎは、５〜１６０の整数であり、
−  ｍは、０〜８０の整数である。
【００１６】
本発明は、４〜６．５、好ましくは、５〜６のｐＨのエマルションの安定化のための界面活性剤としての上記で定義した式（Ｉ）を有するコポリマーの使用にも関する。
実際、上記で定義した式（Ｉ）または（ＩＩ）のコポリマーは、興味深いｐＨ応答性乳化特性を有し、エマルションのｐＨに依存するポリマー乳化剤として使用され得る。
式（Ｉ）または（ＩＩ）のコポリマーは、４〜６．５のｐＨを有するエマルションを安定化し得る。実際、コポリマーを含むエマルションは、数か月間経時的に安定である。
このｐＨ範囲外では、このコポリマーは、長期間エマルションを安定化できない、すなわち、解乳化が１週間未満で起こった。
【００１７】
式（ＩＩ）のコポリマーは、上記で定義したリンカーＡ１を含み得る。好ましくは、リンカーＡ１は、ペプチドリンカーである。
好ましくは、Ａ１は、酵素切断可能なペプチド配列、特に、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）によって、特に、ＭＭＰ２またはＭＭＰ９によって切断可能なペプチド配列である。
好ましい実施形態によれば、Ａ１は、４〜１０個のアミノ酸、好ましくは、４〜７個のアミノ酸を含み、特に、少なくとも１つのグリシン残基、好ましくは、少なくとも２つのグリシン残基、および任意選択でβ配置にある少なくとも１つの追加のアミノ酸を含有するペプチドであるリンカーである。一実施形態によれば、Ａ１は、好ましくは、ペプチドのＮまたはＣ末端に、β配置にある少なくとも１つの追加のアミノ酸も含み得る。好ましい実施形態によれば、Ａ１は、ベータアラニン（βＡ）を含む。
好ましい実施形態によれば、Ａ１は、４〜１０個のアミノ酸、およびβ配置にある少なくとも１つのさらなるアミノ酸を含むペプチドを含有するリンカーである。
好ましい実施形態によれば、Ａ１は、以下のペプチド：βＡ−ＰＶＧＬＩＧ、βＡ−ＧＦＬＧ、βΑ−ＧＲＦＧ、およびβＡ−ＧＦＫＦＬＧからなる群から選択される。より好ましくは、Ａ１は、式βＡ−ＰＶＧＬＩＧのペプチドである。
【００１８】
一実施形態では、式（Ｉ）または（ＩＩ）のコポリマーは、共界面活性剤と組み合わせて使用される。
好ましくは、共界面活性剤は、１０未満、好ましくは、３〜７の親水性親油性バランス（ＨＬＢ）を有する共界面活性剤からなる群から選択される。
本発明によれば、ＨＬＢは、界面活性剤に関して、それが親水性または疎水性である程度の尺度であり、グリフィンによって記載されているように、分子の異なる領域の値を計算することによって決定される。
非イオン性界面活性剤に関するグリフィン法は、次のように記載されている：
ＨＬＢ＝２０＊Ｍｈ／Ｍ
ここで、Ｍｈは、分子の親水性部分の分子量であり、Ｍは、分子全体の分子量であり、０〜２０のスケールで結果が得られる。０のＨＬＢ値は、完全に疎水性の分子に相当し、２０の値は、完全に親水性の分子に相当する。
【００１９】
好ましい実施形態によれば、共界面活性剤は、グリセロールのオキシアルキレン化（より詳細にはポリオキシエチレン化）脂肪酸エステルなどの非イオン性乳化剤、ソルビタンのオキシアルキレン化脂肪酸エステル、オキシアルキレン化（オキシエチレン化および／またはオキシプロピレン化）脂肪酸エステル、オキシアルキレン化（オキシエチレン化および／またはオキシプロピレン化）脂肪アルコールエーテル、ショ糖ステアリン酸塩などの糖エステル、およびステアリン酸グリセリルとステアリン酸ＰＥＧ−４０の混合物などのその混合物、ならびにショ糖ステアリン酸塩などの糖のエステル、または脂肪アルコールと糖のエーテル、特に、アルキルポリグルコシド（ＡＰＧ）から選択される。
ソルビタンのアルキルエステルおよびポリアルキルエステルとして、ポリオキシエチレン化されているか否かにかかわらず、０〜１００の範囲の多数のエチレンオキシド（ＥＯ）パターンを有するものが好ましくは使用される。例えば、ラウリン酸ソルビタン４または２０ＯＥ、特に、ポリソルベート２０（またはポリオキシエチレン（２０）モノラウリン酸ソルビタン）、パルミチン酸ソルビタン２０ＯＥ、ステアリン酸ソルビタン２０ＯＥまたはオレイン酸ソルビタン２０ＯＥを挙げることができる。Ｍａｓｓｏｃａｒｅ  ＳＭＯの商品名で販売されている製品などのオレイン酸ソルビタン、またはＭａｓｓｏｃａｒｅ  ＳＭＰの商品名で販売されている製品などのパルミチン酸ソルビタン、またはステアリン酸ソルビタンも挙げることができる。
【００２０】
グリセロールのアルキルエステルおよびポリアルキルエステルとして、ポリオキシエチレン化されているか否かにかかわらず、０〜１００の範囲の多数のエチレンオキシド（ＥＯ）パターンおよび１〜３０の範囲の多数のグリセロールパターンを有するものが好ましくは使用される。例えば、ジステアリン酸ＰＥＧ−１５０、モノラウリン酸ヘキサグリセリル、またはステアリン酸グリセリルとステアリン酸ＰＥＧ−１００の混合物を挙げることができる。
【００２１】
好ましい共界面活性剤は、ポリグリセリル−３ソルビチルリンセデート（ＳｉｎｅｒｇａからＥｗｏｃｒｅａｍ（登録商標）の商品名で販売されている製品など）、オレイン酸ソルビタン（Ｍａｓｓｏｃａｒｅ  ＳＭＯの商品名で販売されている製品など）、パルミチン酸ソルビタン（Ｍａｓｓｏｃａｒｅ  ＳＭＰの商品名で販売されている製品など）、ステアリン酸ソルビタンス、およびポリグリセリル−１０デカオレエート（Ｐｏｌｙａｌｄｏ（登録商標）１０−１０−０の商品名で販売されている製品など）、ならびにその混合物からなる群から選択される。
【００２２】
本発明は、５０ｎｍ〜５００μｍの直径を有するカプセルであって、水、グリセロール、または油の単一の液滴を含むまたはこれらからなるコアを含む、５０ｎｍ〜５００μｍの直径を有するカプセルであって、
コアが単一の液滴を完全にカプセル化する１つのポリマーシェルによって囲まれており、ポリマーシェルが上記で定義した式（ＩＩ）を有するおそらく架橋されたコポリマーからなるまたは実質的になる５０ｎｍ〜５００μｍの直径を有するカプセルにも関する。
本出願内では、「おそらく架橋されたコポリマー」という表現は、コポリマーが架橋されているかまたは架橋されていないコポリマーであることを意味する。したがって、一実施形態では、「おそらく架橋されたコポリマー」は、式（Ｉ）または（ＩＩ）のコポリマーを意味する。代わりに、別の実施形態では、「おそらく架橋されたコポリマー」は、式（Ｉ）または（ＩＩ）の架橋コポリマーを意味する。
一実施形態によれば、本発明のカプセルのポリマーシェルは、式（ＩＩ）を有するコポリマーからなり、コポリマーは、架橋されているかまたは架橋されていない。一実施形態によれば、本発明のカプセルのポリマーシェルは、式（ＩＩ）を有する架橋コポリマーからなる。一実施形態によれば、本発明のカプセルのポリマーシェルは、式（ＩＩ）を有する非架橋コポリマーからなる。
一実施形態によれば、本発明のカプセルのポリマーシェルは、式（Ｉ）を有するコポリマーからなり、コポリマーは、架橋されているかまたは架橋されていない。一実施形態によれば、本発明のカプセルのポリマーシェルは、式（Ｉ）を有する架橋コポリマーからなる。一実施形態によれば、本発明のカプセルのポリマーシェルは、式（Ｉ）を有する非架橋コポリマーからなる。
【００２３】
一実施形態によれば、本発明は、５０ｎｍ〜５００μｍの直径を有するカプセルであって、水、グリセロール、または油の単一の液滴を含むコアを含む、５０ｎｍ〜５００μｍの直径を有するカプセルであって、
コアが単一の液滴を完全にカプセル化する１つのポリマーシェルによって囲まれており、ポリマーシェルが上記で定義した式（ＩＩ）を有するコポリマーからなる、５０ｎｍ〜５００μｍの直径を有するカプセルに関する。
【００２４】
本発明は、５０ｎｍ〜５００μｍの直径を有するカプセルであって、水、グリセロール、または油の単一の液滴を含むまたはこれらからなるコアを含む、５０ｎｍ〜５００μｍの直径を有するカプセルであって、
コアが単一の液滴を完全にカプセル化する１つのポリマーシェルによって囲まれており、ポリマーシェルが以下の式（Ｉ）を有するおそらく架橋されたコポリマーからなるまたは実質的になる、５０ｎｍ〜５００μｍの直径を有するカプセルにも関する：
【化６】
2020536088.tif 000008
式中、
−  ＡＡは、バリン、ロイシン、イオソロイシン、フェニルアラニンなどの疎水性アミノ酸の残基であり、
−  ｘは、１７〜２７０、好ましくは、１７〜１１４の整数であり、
−  ｎは、５〜１６０の整数であり、
−  ｍは、０〜８０の整数である。
【００２５】
一実施形態によれば、本発明は、５０ｎｍ〜５００μｍの直径を有するカプセルであって、水、グリセロール、または油の単一の液滴を含むコアを含む、５０ｎｍ〜５００μｍの直径を有するカプセルであって、コアが単一の液滴を完全にカプセル化する１つのポリマーシェルによって囲まれており、ポリマーシェルが上記で定義した式（Ｉ）を有するコポリマーからなる、５０ｎｍ〜５００μｍの直径を有するカプセルにも関する。
【００２６】
本発明によるカプセルは、それらのサイズに応じて、ナノカプセルとも称され得る。
本発明によるカプセルは、コアシェル構造を有する。上記のように、それらは、水、グリセロール、または油でできたコアを含み、上記で定義した式（Ｉ）または（ＩＩ）のポリマーでできたポリマーシェルによって囲まれている。
【００２７】
本発明によれば、カプセルのサイズは、それらの直径に相当する。この直径は、以下の方法のいずれかによって測定でされ得る。
−  動的光散乱による：流体力学的直径を６３３ｎｍで動作する４ｍＷ  Ｈｅ−Ｎｅ固体レーザーを備えたＭａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ＮａｎｏＺＳ機器を使用して、２５℃で測定した。後方散乱光を１７３°で検出し、平均粒子径を、１０秒間の３０回の実行にわたる相関関数の２次フィッティングから計算した。すべての測定を、０．０１ｗ／ｖ％のラテックス水溶液で３回行った。ラテックスの希釈に使用した脱イオン水のｐＨは、水中油型エマルションに基づくカプセル分散液のｐＨ（ｐＨ５．５）と一致し、０．２０μｍ膜で限外濾過して、ほこりを取り除いた。
−  または：少量のＨｙｄｒｏ２０００ＳＭ試料分散ユニット（約５０ｍＬ）、６３３ｎｍで動作するＨｅＮｅレーザー、および４６６ｎｍで動作する固体青色レーザーを備えたＭａｌｖｅｒｎ  Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ２０００または３０００装置をｐＨ１０のエマルションのサイズを調整するために使用した。分析中のエマルションのクリーミングを回避するために、撹拌速度を１０００または２０００ｒｐｍに調整した。平均液滴直径を、体積平均直径（Ｄ４／３）とし、これは、数学的にＤ４／３＝ΣＤｉ４Ｎｉ／ΣＤｉ３Ｎｉとして表される。各直径の標準偏差は、サイズ分布の幅を示す。各測定後、セルをエタノールで１回すすぎ、その後水で３回すすいだ。セルのガラス壁をレンズのクリーニング用ティッシュで注意深く拭き、相互汚染を回避し、レーザーを検出器の中央に配置した。このセットアップにより、試料チャンバーのｐＨが１０〜３に調整された後、連続測定を行うことができた。これにより、ｐＨの変化に関して液滴の安定性を調べることができた。
−  または：希釈したエマルションの液滴を顕微鏡のスライドに置き、画像を記録するためにＰＣラップトップに接続された光学顕微鏡（Ｊａｍｅｓ  Ｓｗｉｆｔ  ＭＰ３５０２、Ｐｒｉｏｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．）を使用して検視した。この手法を使用して、平均液滴直径を推定した。水相を元の位置で酸性化した後のｏ／ｗエマルション液滴の応答もこの機器を使用して評価した。
好ましくは、カプセルの直径は、動的光散乱（ＤＬＳ）またはレーザー回折によって測定され得、どちらの方法も同じ結果をもたらす。最も好ましくは、カプセルの直径は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される。
本出願内では、カプセルのサイズについて与えられた値は、ＤＬＳによりサイズを測定することによって得られる。
【００２８】
本発明によれば、「カプセル」という表現は、上記で定義したコアシェル構造が、ジブロックコポリマーがそれらのｐＨ範囲のポリペプチドブロックの疎水性により自発的にそれらの物体を形成しているミセルや小胞の場合のような自己組織化現象の結果ではないことを意味する。本発明では、カプセルは、水またはグリセロールまたは油の液滴をその相当する非混和性相、すなわち、それぞれ油または水またはグリセロール中に形成するために十分なエネルギーを必要とする。
本発明によれば、液滴を形成するために必要なエネルギーは、高剪断混合、超音波処理または高圧均質化プロセスによって適用され得る。
本発明によれば、「実質的になる」という表現は、ポリマーシェルが、上記で定義した式（Ｉ）または（ＩＩ）の架橋コポリマー以外の化合物を含み得ることを意味する。しかしながら、これらの化合物は、好ましくは、いかなる構造化効果も有さない。
【００２９】
コア（Core）
一実施形態によれば、本発明によるカプセルのコアは、水の単一の液滴を含むか、またはそれからなる。
一実施形態によれば、本発明によるカプセルのコアは、グリセロールの単一の液滴を含むか、またはそれからなる。
別の実施形態によれば、本発明によるカプセルのコアは、油の単一の液滴を含むか、またはそれからなる。
好ましくは、油は、植物油、並びに、
パルミチン酸オクチル、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド、イソノナン酸イソデシル、イソヘキサデカン、スクアレン（フィトスクアレン）、シモンジアキネンシス（ホホバ）種油およびシリコーンに基づく油などの化粧用油、からなる群から選択される。
油は、クロロホルムまたはジクロロメタンなどの任意の水非混和性有機溶媒とすることもできる。
より好ましくは、油は、ドデカン、オリーブ油、パルミチン酸オクチル、またはひまわり油である。
【００３０】
一実施形態によれば、本発明によるカプセルのコアは、少なくとも１つの活性化合物をさらに含む。
活性化合物として、以下のもの：薬物、ビタミン、抗酸化剤、天然成分、天然抽出物、ペプチド、食品、天然または親水性ポリマー（ヒアルロン酸など）、およびそれらの混合物が挙げられる。活性化合物は、親水性または疎水性とすることができる。
好ましい活性化合物として、以下のものが挙げられる：ビタミンＡの前駆体としてのパルミチン酸レチニルおよびレチノール、クルクミン、ビタミンＥの前駆体としてのα−トコフェロール、Ｏ／Ｗ系に関する油相に溶解される疎水性化合物のセラミド、およびＷ／Ｏ系に関する水相に溶解されるグリセルリチン酸二カリウムおよびヒアルロン酸。
好ましくは、活性化合物は、以下のものから選択される：ウコン根抽出物、セラミドＮＧ、パルミチン酸レチニル、グリチルリチン酸二カリウム、およびヒアルロン酸。
【００３１】
ポリマーシェル（Polymeric shell）
本発明によるカプセルのポリマーシェルは、式Ｐ（Ｇｌｕｎ−ＡＡｍ）−（Ａ１）ｙ−ＰＥＧｘによっても示され得る上記で定義したコポリマーでできており、ＡＡ、Ａ１、ｙ、ｘ、ｍ、およびｎは、上記で定義したとおりである。ＰＥＧは、ポリ（エチレングリコール）を指す。
したがって、式（Ｉ）または（ＩＩ）のコポリマーは、ＰＥＧブロックおよびポリペプチドブロックを含む。
ポリペプチドブロックは、ＧｌｕおよびおそらくＡＡ単位を含み、単位は、ランダムに分布している。
本発明によれば、ＡＡは、疎水性アミノ酸であり、好ましくは、バリン、ロイシン、イソロイシン、またはフェニルアラニンであり、特に、ＡＡは、バリンである。
【００３２】
一実施形態によれば、上記で定義した式（Ｉ）または（ＩＩ）では、ｍは、０〜４０の整数であり、好ましくは、０である。
【００３３】
一実施形態によれば、本発明に従って使用されるコポリマーは、以下の式（Ｉ−１）を有する：
【化７】
2020536088.tif 000009
式中、ｘ、ｎ、およびｍは、式（Ｉ）において上記で定義したとおりである。
式（Ｉ−１）のコポリマーは、以下のようにも表され得る：
【化８】
2020536088.tif 000010
【００３４】
一実施形態によれば、上記で定義した式（Ｉ）または（Ｉ−１）では、ｍは、０である。一実施形態によれば、上記で定義した式（ＩＩ）では、ｍは、０である。
【００３５】
好ましくは、本発明のカプセルのポリマーシェルは、式（Ｉ）のコポリマーからなり、式中、ｘは、４０〜１２０、好ましくは、４４〜１１４の整数であり、最も好ましくは、４４または１１４である。
好ましくは、本発明のカプセルのポリマーシェルは、式（Ｉ）のコポリマーからなり、式中、ｎは、１０〜１６０、好ましくは、１５〜１５５、より好ましくは、１５〜１５１の整数であり、最も好ましくは、１５、１６、２５、３６、４６、４７、５８、９６、および１５１である。
好ましくは、本発明のカプセルのポリマーシェルは、式（Ｉ）のコポリマーからなり、式中、ｍは、０であるか、または５〜１５の整数であり、好ましくは、０、５、７、または１１である。
【００３６】
好ましくは、本発明のカプセルのポリマーシェルは、式（ＩＩ）のコポリマーからなり、式中、ｘは、４０〜１２０、好ましくは、４４〜１１４の整数であり、最も好ましくは、４４または１１４であり、ｙ＝１、Ａ１は、βΑ−ＰＶＧＬＩＧである。
好ましくは、本発明のカプセルのポリマーシェルは、式（ＩＩ）のコポリマーからなり、式中、ｎは、１０〜１７０、好ましくは、６０〜１７０の整数であり、最も好ましくは、６１、１００、１５０、および１７０であり、ｙ＝１、Ａ１は、βＡ−ＰＶＧＬＩＧである。
好ましくは、本発明のカプセルのポリマーシェルは、式（ＩＩ）のコポリマーからなり、式中、ｍは、０であるか、または５〜２０の整数であり、好ましくは、０または１６である。
【００３７】
好ましくは、本発明のカプセルのポリマーシェルは、式（Ｉ）のコポリマーからなり、式中、
−  ｘは、４０〜１２０、好ましくは、４４〜１１４の整数であり、最も好ましくは、４４または１１４であり、
−  ｍは、０であり、
−  ｎは、１０〜１６０、好ましくは、１５〜１５５、より好ましくは１５〜１５１の整数であり、最も好ましくは１５、１６、２５、３６、４６、４７、５８、９６、および１５１である。
好ましくは、本発明のカプセルのポリマーシェルは、式（Ｉ）のコポリマーからなり、式中、ｍは、０であり、ｎは、９６、１００、もしくは１５１であり、ｘは、１１４である、またはｍは、５であり、ｎは、１６であり、ｘは、１１４である、またはｍは、１１であり、ｎは、４４であり、ｘは、１１４である、またはｍは、１１であり、ｎは、４６であり、ｘは、１１４である。
【００３８】
好ましくは、本発明のカプセルのポリマーシェルは、式（ＩＩ）のコポリマーからなり、式中、
−  ｙ＝１、Ａ１は、βΑ−ＰＶＧＬＩＧであり、
−  ｘは、４０〜１２０、好ましくは、４４〜１１４の整数であり、最も好ましくは、１１４であり、
−  ｍは、０であり、
−  ｎは、６０〜１７０の整数であり、最も好ましくは、１００、１５０、および１７０である。
好ましくは、本発明のカプセルのポリマーシェルは、式（ＩＩ）のコポリマーからなり、式中、ｙ＝１、Ａ１は、βＡ−ＰＶＧＬＩＧであり、ｍは、０であり、ｎは、１００、１５０、もしくは１７０であり、ｘは、１１４である、
またはｙ＝１、Ａ１は、βΑ−ＰＶＧＬＩＧであり、ｍは、１６であり、ｎは、６１であり、ｘは、１１４である、
またはｙ＝１、Ａ１は、βΑ−ＰＶＧＬＩＧ、ｍは、１１であり、ｎは、４６であり、ｘは、１１４である。
【００３９】
より好ましくは、本発明のカプセルのポリマーシェルは、以下の式の１つを有するコポリマーからなる：
ＰＥＧ４４−ＰＧＩｕ２５、これは、ＰＥＧ４４−ｂ−ＰＧＩｕ２５とも表記され得る、
ＰＥＧ４４−ＰＧＩｕ３６、これは、ＰＥＧ４４−ｂ−ＰＧＩｕ３６とも表記され得る、
ＰＥＧ４４−ＰＧＩｕ４７、これは、ＰＥＧ４４−ｂ−ＰＧＩｕ４７とも表記され得る、
ＰＥＧ４４−ＰＧＩｕ５８、これは、ＰＥＧ４４−ｂ−ＰＧＩｕ５８とも表記され得る、
ＰＥＧ４４−ＰＧＩｕ１００、これは、ＰＥＧ４４−ｂ−ＰＧＩｕ１００とも表記され得る、
ＰＥＧ１１４−ＰＧＩｕ１５１、これは、ＰＥＧ１４４−ｂ−ＰＧＩｕ１５１とも表記され得る、
ＰＥＧ１１４−ＰＧＩｕ９６、これは、ＰＥＧ１４４−ｂ−ＰＧＩｕ９６とも表記され得る、
ＰＥＧ１１４−Ｐ（Ｇｌｕ４６−Ｖａｌ１１）、これは、ＰＥＧ１１４−Ｐ（Ｇｌｕ４６−ｃｏ−Ｖａｌ１１）またはＰＥＧ１１４−ｂ−Ｐ（Ｇｌｕ４６−ｃｏ−Ｖａｌ１１）とも表記され得る、
ＰＥＧ１１４−Ｐ（Ｇｌｕ５１−Ｖａｌ６）、これは、ＰＥＧ１１４−Ｐ（Ｇｌｕ５１−ｃｏ−Ｖａｌ６）またはＰＥＧ１１４−ｂ−Ｐ（Ｇｌｕ５１−ｃｏ−Ｖａｌ６）とも表記され得る、
ＰＥＧ４４−Ｐ（Ｇｌｕ１５−Ｖａｌ７）、これは、ＰＥＧ４４−Ｐ（Ｇｌｕ１５−ｃｏ−Ｖａｌ７）またはＰＥＧ４４−ｂ−Ｐ（Ｇｌｕ１５−ｃｏ−Ｖａｌ７）とも表記され得る、
ＰＥＧ１１４−Ｐ（Ｇｌｕ１６−Ｖａｌ５）、これは、ＰＥＧ１１４−Ｐ（Ｇｌｕ１６−ｃｏ−Ｖａｌ５）またはＰＥＧ１１４−ｂ−Ｐ（Ｇｌｕ１６−ｃｏ−Ｖａｌ５）とも表記され得る、
ＰＥＧ１１４−Ｐ（Ｇｌｕ４６−Ｖａｌ１１）、これは、ＰＥＧ１１４−Ｐ（Ｇｌｕ４６−ｃｏ−Ｖａｌ１１）またはＰＥＧ１１４−ｂ−Ｐ（Ｇｌｕ４６−ｃｏ−Ｖａｌ１１）と表記され得る。
【００４０】
より好ましくは、本発明のカプセルのポリマーシェルは、以下の式の１つを有するコポリマー（ＩＩ）からなる：
ＰＧＩｕ１５０−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ＰＥＧ１１４、これは、ＰＧＩｕ１５０−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４とも表記され得る、
ＰＧＩｕ１００−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ＰＥＧ１１４、これは、ＰＧＩｕ１００−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４とも表記され得る、
ＰＧＩｕ１７０−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ＰＥＧ１１４、これは、ＰＧＩｕ１７０−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４とも表記され得る、
Ｐ（Ｇｌｕ４６−Ｖａｌ１１）−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ＰＥＧ１１４、これは、Ｐ（Ｇｌｕ４６−ｃｏ−Ｖａｌ１１）−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ＰＥＧ１１４またはＰ（Ｇｌｕ４６−ｃｏ−Ｖａｌ１１）−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４とも表記され得る、
Ｐ（Ｇｌｕ６１−Ｖａｌ１６）−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ＰＥＧ１１４、これは、Ｐ（Ｇｌｕ６１−ｃｏ−Ｖａｌ１６）−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ＰＥＧ１１４またはＰ（Ｇｌｕ６１−ｃｏ−Ｖａｌ１６）−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４とも表記され得る。
【００４１】
一実施形態によれば、上記で定義したカプセルのポリマーシェルは、架橋され得る。特に、Ｇｌｕ単位は、エチレンジアミンまたはビス（ヘキサメチレン）トリアミンなどであるが、これらに限定されないジアミン化合物を使用してアミド化を介して架橋され得る。
【００４２】
一実施形態によれば、カプセルは、上記で定義した式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（Ｉ−１）のコポリマーでできたポリマーシェルによって囲まれた、親水性活性化合物をおそらく含む、水の単一の液滴を含む。
一実施形態によれば、カプセルは、上記で定義した式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（Ｉ−１）のコポリマーでできたポリマーシェルによって囲まれた、疎水性活性化合物をおそらく含む、油の単一の液滴を含む。
【００４３】
本発明は、少なくとも１つの上記で定義したカプセルを含む組成物にも関する。
本発明は、上記で定義した１つまたはいくつかのカプセルを含む組成物であって、カプセルが水の単一の液滴を含み、上記で定義した式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（Ｉ−１）のコポリマーでできたポリマーシェルによって囲まれている親水性活性化合物をおそらく含む、上記で定義した１つまたはいくつかのカプセルを含む組成物にも関する。
本発明は、上記で定義した１つまたはいくつかのカプセルを含む組成物であって、カプセルがグリセロールの単一の液滴を含み、上記で定義した式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（Ｉ−１）のコポリマーでできたポリマーシェルによって囲まれている親水性活性化合物をおそらく含む、上記で定義した１つまたはいくつかのカプセルを含む組成物にも関する。
本発明は、上記で定義した１つまたはいくつかのカプセルを含む組成物であって、カプセルが油の単一の液滴を含み、上記で定義した式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（Ｉ−１）のコポリマーでできたポリマーシェルによって囲まれている疎水性活性化合物をおそらく含む、上記で定義した１つまたはいくつかのカプセルを含む組成物にも関する。
【００４４】
本発明は、分散水相と、連続脂肪相とを含む油中水型エマルションであって、
−  連続脂肪相が、植物油、パルミチン酸オクチル、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド、イソノナン酸イソデシル、イソヘキサデカン、スクアレン（フィトスクアレン）、またはシモンジアキネンシス（ホホバ）種油などの化粧用油、およびクロロホルムまたはジクロロメタンなどの水非混和性有機溶媒からなる群から好ましくは選択される少なくとも１つの油を含み、特に、パルミチン酸オクチル、ドデカン、オリーブ油またはひまわり油であり、
−  分散水相が、水の単一の液滴からなる、またはそれを含むコアを含む、少なくとも１つの上記で定義したカプセルを含む、
分散水相および連続脂肪相を含む油中水型エマルションにも関する。
【００４５】
一実施形態によれば、カプセルは、親水性活性化合物をさらに含む。好ましくは、カプセルのコアは、少なくとも１つの親水性活性化合物を含む。
本発明によれば、親水性化合物をカプセル化するための油中水型エマルションは、水相に基づいて、１重量％〜２０重量％の式（Ｉ）または（ＩＩ）のコポリマーを使用して、１重量％〜５０重量％の水から調製され得る。カプセル化された親水性活性化合物の量は、水相へのその溶解性に依存する。
一実施形態によれば、油中水型エマルションは、上記で定義した共界面活性剤も含む。好ましくは、エマルション中の共界面活性剤の濃度は、エマルションの総重量に対して、１重量％〜３０重量％、好ましくは、５重量％〜２０重量％である。
一実施形態によれば、油中水型エマルションを作製するための式（Ｉ）または（ＩＩ）のコポリマーの量は、エマルションの総重量に基づいて、０．１重量％〜２０重量％、好ましくは、０．２重量％〜１０重量％、より好ましくは０．５重量％〜５重量％である。
一実施形態によれば、重量％でのコポリマー：共界面活性剤の比は、０．９５：４．７２、０．９：９、０．８３：１６．５３、１：１６、２：１６、好ましくは、０．８３：１６．５３、１：１６、２：１６である。
【００４６】
本発明は、分散脂肪相と、連続水相とを含む水中油型エマルションであって、
−  連続水相がｐＨ４〜６．５、好ましくはｐＨ５〜６の水を含み、
−  分散脂肪相が、油の単一の液滴からなる、またはそれを含むコアを含む、少なくとも１つの上記で定義したカプセルを含む、
水中油型エマルションにも関する。
一実施形態によれば、カプセルは、疎水性活性化合物をさらに含む。好ましくは、カプセルのコアは、少なくとも１つの疎水性活性化合物を含む。
本発明によれば、疎水性化合物をカプセル化するための水中油型エマルションは、油相に基づいて、１重量％〜２０重量％の式（Ｉ）または（ＩＩ）のコポリマーを使用して、１重量％〜５０重量％の油から調製され得る。カプセル化された化合物の量は、油中の活性成分の溶解性の最大量に依存する。
一実施形態によれば、水中油型エマルションは、上記で定義した共界面活性剤も含む。好ましくは、エマルション中の共界面活性剤の濃度は、エマルションの総重量に対して、１重量％〜３０重量％、好ましくは、５重量％〜２０重量％である。
【００４７】
本発明は、分散グリセロール相と、連続脂肪相とを含む油中グリセロール型エマルションであって、
−  連続脂肪相が、植物油、パルミチン酸オクチル、イソノナン酸イソデシル、イソヘキサデカン、スクアレン（フィトスクアレン）、またはシモンジアキネンシス（ホホバ）種油などの化粧用油、およびクロロホルムまたはジクロロメタンなどの水非混和性有機溶媒からなる群から好ましくは選択される少なくとも１つの油を含み、特に、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド、パルミチン酸オクチル、ドデカン、オリーブ油またはひまわり油であり、
−  分散グリセロール相が、グリセロールの単一の液滴からなる、またはそれを含むコアを含む、少なくとも１つの上記で定義したカプセルを含む、
分散水相および連続脂肪相を含む油中グリセロール型エマルションにも関する。
一実施形態によれば、カプセルは、親水性活性化合物をさらに含む。好ましくは、カプセルのコアは、少なくとも１つの親水性活性化合物を含む。
本発明によれば、親水性化合物をカプセル化するための油中グリセロール型エマルションは、分散相に基づいて、１重量％〜２０重量％の式（Ｉ）または（ＩＩ）のコポリマーを使用して、１重量％〜５０重量％のグリセロールから調製され得る。カプセル化された親水性活性化合物の量は、分散相へのその溶解性に依存する。
一実施形態によれば、油中グリセロール型エマルションは、上記で定義した共界面活性剤も含む。好ましくは、エマルション中の共界面活性剤の濃度は、エマルションの総重量に対して、１重量％〜３０重量％、好ましくは、５重量％〜２０重量％である。
一実施形態によれば、重量％でのコポリマー：共界面活性剤の比は、０．９５：４．７２、０．９：９、０．８３：１６．５３、１：１６、２：１６、好ましくは、０．８３：１６．５３、１：１６、および２：１６である。
【００４８】
本発明は、分散脂肪相と、連続相とを含むグリセロール中油型エマルションであって、
−  連続相がグリセロールを含み、
−  分散脂肪相が、油の単一の液滴からなる、またはそれを含むコアを含む、少なくとも１つの上記で定義したカプセルを含む、
グリセロール中油型エマルションにも関する。
一実施形態によれば、カプセルは、疎水性活性化合物をさらに含む。好ましくは、カプセルのコアは、少なくとも１つの疎水性活性化合物を含む。
本発明によれば、疎水性化合物をカプセル化するためのグリセロール中油型エマルションは、油相に基づいて、１重量％〜２０重量％の式（Ｉ）または（ＩＩ）のコポリマーを使用して、１重量％〜５０重量％の油から調製され得る。カプセル化された化合物の量は、油中の活性成分の溶解性の最大量に依存する。
一実施形態によれば、グリセロール中油型エマルションは、上記で定義した共界面活性剤も含む。好ましくは、エマルション中の共界面活性剤の濃度は、エマルションの総重量に対して、１重量％〜３０重量％、好ましくは、５重量％〜２０重量％である。
【００４９】
一実施形態によれば、本発明によるエマルションでは、式（Ｉ）または（ＩＩ）のコポリマーの量は、エマルションの総重量に対して、１重量％〜１０重量％である。
一実施形態によれば、本発明によるエマルションでは、分散相の量は、エマルションの総重量に対して、１重量％〜５０重量％である。
【００５０】
本発明は、疎水性活性化合物のカプセル化のための方法であって、
−  疎水性活性化合物を少なくとも１つの油を含む脂肪溶液に溶解することによって脂肪相を調製するステップと、
−  上記で定義した共界面活性剤を添加する任意選択のステップと、
−  ４〜６．５、好ましくは、５〜６のｐＨの水溶液を調製するステップであって、溶液が上記で定義した式（Ｉ）または（ＩＩ）を有するコポリマーを含有するステップと、
−  ５０ｎｍ〜５００μｍの直径を有するカプセルであって、疎水性活性化合物を含有する油の単一の液滴からなる、またはそれを含むコアを含む、５０ｎｍ〜５００μｍの直径を有するカプセルであって、コアが単一の液滴を完全にカプセル化する１つのポリマーシェルによって囲まれており、ポリマーシェルが式（Ｉ）または（ＩＩ）を有するコポリマーからなる、５０ｎｍ〜５００μｍの直径を有するカプセルを得るために、脂肪相を水溶液に分散させるステップと、
−  例えば、遠心分離または透析によって、少なくとも１つの疎水性活性化合物をカプセル化しているカプセルを回収する任意選択のステップと
を含む、疎水性活性化合物のカプセル化のための方法にも関する。
【００５１】
本発明は、疎水性活性化合物のカプセル化のための方法であって、
−  疎水性活性化合物を少なくとも１つの油を含む脂肪溶液に溶解することによって脂肪相を調製するステップと、
−  上記で定義した共界面活性剤を添加する任意選択のステップと、
−  上記で定義した式（Ｉ）または（ＩＩ）を有するコポリマーを含有するグリセロール溶液を調製するステップと、
−  ５０ｎｍ〜５００μｍの直径を有するカプセルであって疎水性活性化合物を含有する油の単一の液滴からなる、またはそれを含むコアを含む、５０ｎｍ〜５００μｍの直径を有するカプセルであって、コアが単一の液滴を完全にカプセル化する１つのポリマーシェルによって囲まれており、前記ポリマーシェルが式（Ｉ）または（ＩＩ）を有するコポリマーからなる、５０ｎｍ〜５００μｍの直径を有するカプセルを得るために、脂肪相をグリセロール溶液に分散させるステップと、
−  例えば、遠心分離または透析によって、少なくとも１つの疎水性活性化合物をカプセル化しているカプセルを回収する任意選択のステップと
を含む、疎水性活性化合物のカプセル化のための方法にも関する。
【００５２】
本発明は、親水性活性化合物のカプセル化のための方法であって、
−  親水性活性化合物を水に溶解することによって、４〜６．５、好ましくは、５〜６のｐＨの水相を調製するステップであって、溶液が上記で定義した式（Ｉ）または（ＩＩ）を有するコポリマーを含有するステップと、
−  少なくとも１つの油を含む脂肪溶液を調製するステップと、
−  上記で定義した共界面活性剤を添加する任意選択のステップと、
−  ５０ｎｍ〜５００μｍの直径を有するカプセルであって、親水性活性化合物を含有する水の単一の液滴からなる、またはそれを含むコアを含む、５０ｎｍ〜５００μｍの直径を有するカプセルであって、コアが単一の液滴を完全にカプセル化する１つのポリマーシェルによって囲まれており、ポリマーシェルが式（Ｉ）または（ＩＩ）を有するコポリマーからなる、５０ｎｍ〜５００μｍの直径を有するカプセルを得るために、水相を脂肪溶液に分散させるステップと、
−  例えば、遠心分離または透析によって、少なくとも１つの親水性活性化合物をカプセル化するカプセルを回収する任意選択のステップと
を含む、親水性活性化合物のカプセル化のための方法にも関する。
【００５３】
本発明は、親水性活性化合物のカプセル化のための方法であって、
−  親水性活性化合物をグリセロールに溶解することによってグリセロール相を調製するステップであって、溶液が、上記で定義した式（Ｉ）または（ＩＩ）を有するコポリマーを含有するステップと、
−  少なくとも１つの油を含む脂肪溶液を調製するステップと、
−  上記で定義した共界面活性剤を添加する任意選択のステップと、
−  ５０ｎｍ〜５００μｍの直径を有するカプセルであって親水性活性化合物を含有するグリセロールの単一の液滴からなる、またはそれを含むコアを含む、５０ｎｍ〜５００μｍの直径を有するカプセルであって、コアが前記単一の液滴を完全にカプセル化する１つのポリマーシェルによって囲まれており、ポリマーシェルが式（Ｉ）または（ＩＩ）を有するコポリマーからなる、５０ｎｍ〜５００μｍの直径を有するカプセルを得るために、グリセロール相を脂肪溶液に分散させるステップと、
−  例えば、遠心分離または透析によって、少なくとも１つの親水性活性化合物をカプセル化するカプセルを回収する任意選択のステップと
を含む、親水性活性化合物のカプセル化のための方法にも関する。
【００５４】
別の実施形態によれば、親水性活性化合物のカプセル化は、上記で定義した架橋コポリマーと共に本発明によるカプセルの存在下で、親水性活性化合物を水またはグリセロールに添加し、ｐＨの変化によって活性成分を充填し、放出することによって行われ得る。
【００５５】
本発明によれば、任意のプロセスが超音波処理、高電位分散機（ｕｌｔｒａ  ｔｕｒｒａｘ（登録商標）など）分散機、高圧ホモジナイザー、または高剪断機械撹拌機の使用などの乳化によって使用され得る。
【００５６】
本発明は、少なくとも１つの活性化合物の放出のための方法であって、
−  上記で定義した少なくとも１つの親水性または疎水性活性化合物をカプセル化している少なくとも１つのカプセルを水溶液中に添加するステップと、
−  活性化合物を水溶液に放出するために、溶液のｐＨを少なくとも６．５の値または４未満、好ましくは３未満の値に調整するステップと
を含む、少なくとも１つの活性化合物の放出のための方法にも関する。
【００５７】
本発明によるカプセル化および放出プロセスは、化合物が最初にカプセル化され、カプセル化相において保護されなければならない、健康、化粧品、食品、パーソナルおよびホームケア用途に使用され得る。化合物を送達する場所でのｐＨの変化による標的放出は、化合物のより高い活性を保証する。このようなｐＨの変化は、がん治療のためのエンドサイトーシス、食品用途に関する胃から血流への移行、化粧品に関する皮膚による吸収、創傷治癒および皮膚科学中に起こり得る。
【００５８】
本発明の目的のために、所与の範囲は、範囲の下限と上限の両方の終点を含む。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】ポリペプチドブロックのＤＰの関数としての１重量％ジブロックコポリマー［ｘ＝４４または１１４、（ｎ＋ｍ）＝５、１１、および２２であるＰＥＧｘ−ｂ−Ｐ（ＧＩＵｎ−ｃｏ−Ｖａｌｍ）、ここで、ｍは、全ポリペプチドＤＰ、すなわちｎ＋ｍの約３０％である］を含有する、クエン酸緩衝液を有するｐＨ５．５に調整された水溶液を有する５０重量％ドデカン油を用いて、２つの異なるＰＥＧマクロ開始剤で調製された２分間の超音波処理によって得られた２５℃でＤＬＳによって測定されたカプセルの流体力学的直径の変化を示す図である。
【図２】１重量％のＰＥＧ１１４−Ｐ（Ｇｌｕ１６−ｃｏ−Ｖａｌ５）ジブロックコポリマーを含有するクエン酸緩衝液の水溶液を有する５０重量％ｎ−ドデカンを異なる時間超音波処理することによって得られた、それぞれＤＬＳおよびＬＤによって決定される、エマルション液滴の流体力学的直径および体積平均直径の変化を示す図である。なお、黒い四角は、体積平均直径（μｍ）に相当し、黒いひし形は、流体力学的直径（ｎｍ）に相当する。
【図３】５重量％（黒い四角）または１０重量％（黒い丸）のＰＥＧ１１４−Ｐ（Ｇｌｕ１６−ｃｏ−Ｖａｌ５）ジブロックコポリマーを含有するクエン酸緩衝液の水溶液を有する異なる量のｎ−ドデカン油を１０分間超音波処理することによって得られた、エマルション液滴のＤＬＳによって決定された流体力学的直径の変化を示す図である。
【図４】ｐＨ５．５（白抜きの記号）のクエン酸緩衝液に、またはｐＨ７．４のリン酸緩衝液（塗りつぶされた記号）に再分散された、ＰＥＧ４４−Ｐ（Ｇｌｕ１５−ｃｏ−Ｖａｌ７）（ひし形）およびＰＥＧ１１４−Ｐ（Ｇｌｕ４６−ｃｏ−Ｖａｌ１１）（三角形）を用いて調製されたｎ−ドデカンに基づくカプセルの吸光度の変化を示す図である。
【図５】ｐＨ５．５のクエン酸緩衝液（白抜きの記号）またはｐＨ７．４のリン酸緩衝液（塗りつぶされた記号）に再分散された、ＰＥＧ４４−ＰＧＩｕ５８（ひし形）およびＰＥＧ１１４−ＰＧＩｕ１５１（三角形）を用いて調製されたパルミチン酸オクチルに基づくカプセルの吸光度の変化に関する図である。
【図６】本願の国際公開公報（ＷＯ２０１９／０６８９３６）のフロントページのＡｂｓｔｒａｃｔ（要約）で選択された図（化学式を表示）である。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
事例（EXAMPLES）
［式（Ｉ）のコポリマーの調製］
ポリ（エチレングリコール）−ｂ−ポリ（グルタミン酸−ｃｏ−バリン）［ＰＥＧｘ−Ｐ（Ｇｌｕｎ−Ｖａｌｍ）またはＰＥＧｘ−ｂ−Ｐ（ＧＩｕｎ−ｃｏ−Ｖａｌｍ）とも表記され、ｘ＝１６、４４、または１１４＜ｎ＜１６０かつ０＜ｍ＜４０］に基づくいくつかのジブロックコポリマーを調製した。
【００６１】
材料および方法
すべての化学物質をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、受け取ったまま使用した。メチルおよびアミン末端ポリエチレングリコール（分子量２，０００ｇ／ｍｏｌおよび５，０００ｇ／ｍｏｌ）を、ＲＡＰＰポリマーから購入し、使用前にトルエン中で乾燥させた。γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸Ｎ−カルボン酸無水物（γ−ＢＬＧ  ＮＣＡ）およびＬ−バリンＮ−カルボン酸無水物（Ｖａｌ  ＮＣＡ）をＩｓｏｃｈｅｍから購入した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ  ＡＣ４００分光計で記録した。ポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸−ｃｏ−Ｌ−バリン）前駆体のモル質量および多分散性を２つのＰＬｇｅｌ混合カラム（７．５×３００ｍｍ）および１つのＰＬｇｅｌ５μｍガードカラム（７．５×５０ｍｍ）を備えた分子ふるいクロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定し、屈折率検出器（Ｊａｓｃｏ  １５３０−ＲＩ）およびＵＶ検出器（Ｊａｓｃｏ  ８７５−ＵＶ）の２つの検出器をこの決定に使用し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）をＬｉＢｒ（１ｇ／Ｌ）の存在下、６０℃で溶離液（０．８ｍＬ／ｍｉｎ）として使用した。
【００６２】
手順（Procedure）
一般的な合成方法
これらのコポリマーを得るために、アミン末端ＰＥＧを開環共重合によるγ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸（ＢＬＧ）とバリンｃｏ−アミノ酸の共重合の開始剤として使用した（スキーム１）。
明確なジブロックコポリマーをＧＰＣ分析で判断されるように得た。１Ｈ  ＮＭＲ分光法により、各ｃｏ−アミノ酸の重合度を計算することができた。
【化９】
2020536088.tif 000011
【００６３】
スキーム２に示すように、ＢＬＧユニットの脱保護からなる第２のステップを行って、相当するＰＥＧ４４−Ｐ（Ｇｌｕｎ−Ｖａｌｍ）を得た。
【化１０】
2020536088.tif 000012
ＰＥＧ４４−Ｐ（Ｇｌｕｎ−Ｖａｌｍ）は、ｘ＝４４、ＡＡがバリンである、上記で定義した式（Ｉ）のコポリマーに相当する。
【００６４】
１Ｈ  ＮＭＲによって計算された脱保護の程度は、すべてのコポリマーに関して９０％を超えていた。
【００６５】
ＰＥＧブロックとポリペプチドブロックに関する異なる重合度をターゲットにして、ジブロックコポリマーの界面活性を変化させた。
【００６６】
現在のファミリーの任意のブロックコポリマーを生成するための一般的な合成プロトコル
すべての化学物質をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、受け取ったまま使用した。すべてのＮ−カルボン酸無水物ＮＣＡペプチドモノマーをＩｓｏｃｈｅｍから購入した。様々な［モノマー］／［ＰＥＧ−マクロ開始剤］モル比を使用して、異なる親水性重量分率およびモル質量を有するコポリマーを得た。
例えば、ＰＥＧ４４−ｂ−ＰＢＬＧ２５を調製するために、ＰＥＧ−ＮＨ２（Ｍｎ＝２，０００ｇ／ｍｏｌ、１ｅｑ）を窒素下で乾燥トルエンに溶解し、３回の凍結ポンプ融解サイクルで脱気し、凍結蒸留して、微量の水を除去した。無水溶媒（好ましくは、ＤＭＦまたはＤＭＳＯ）をそれに添加した。次いで、γ−ＢＬＧ  ＮＣＡ（ＮＨ２機能まで２５ｅｑ）を純粋なアルゴン下でグローブボックス内で計量し、火炎乾燥したシュレンクに導入し、２ｍＬの無水ＤＭＳＯで溶解した。溶液を１０分間撹拌し、無水ＤＭＦまたはＤＭＳＯ中のＰＥＧ−ＮＨ２溶液に窒素パージしたシリンジで添加した。溶液を完全なモノマー転換に達するように５〜２０℃で終夜から数日撹拌して、ジエチルエーテル中で沈殿させ、真空下で乾燥して、白色粉末を得た。同じプロトコルを使用して、異なるｃｏ−アミノ酸（グルタミン酸ベンジルおよびバリンだけでなく、フェニルアラニンなどを結合させた）を有するコポリマーを得た。組成をＮ−カルボン酸無水物ＮＣＡモノマー対ＰＥＧ−ＮＨ２マクロ開始剤の比で制御した。次いで、グルタミン酸ベンジルのベンジル基の脱保護は、酸性または塩基性の脱保護方法を使用して行われ得る。ここでは、我々は、コポリマーをＨＢｒ（酢酸溶液中３３％）／ＴＦＡに室温で９０分間溶解することにある酸性経路を選択して、式ＰＥＧｘ−Ｐ（Ｇｌｕｎ−ＡＡｍ）（ＡＡは、上記で定義したとおりである）とも示され得る、上記で定義した式（Ｉ）の最終的コポリマーを得た。
【００６７】
特定の例を生成するための詳細な合成プロトコル
ポリ（エチレングリコール）−ｂ−ポリ（グルタミン酸）ＰＥＧ４４−Ｐ（Ｇｌｕｎ）の合成：ＰＥＧ４４−ＰＧＩｕ５８の例
γ−ＢＬＧ  ＮＣＡ（３．４ｇ、１４．５ｍｍｏｌ）を純粋なアルゴン下でグローブボックス内で計量し、火炎乾燥したシュレンクに導入し、５ｍＬの無水ＤＭＦで溶解した。溶液を１０分間撹拌し、メチルおよびアミン末端ポリエチレングリコール（２ＫＤａ、０．５ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ溶液（１ｇ／ｍＬ、注入量：１ｍＬ）から窒素パージしたシリンジで添加した。混合物を５℃で（または２５℃で）１日撹拌し、ジエチルエーテル中で沈殿させ、真空下で乾燥させて、白色粉末を得た。目標とする５８の重合度に相当する１２．７０２ｇ．ｍｏｌ−１（１Ｈ  ＮＭＲで決定）の分子量を有するポリペプチドを得た。次いで、相当するコポリマーをＴＦＡ（１００ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、ＨＢｒ溶液（酢酸中３３重量％）を注意深く滴下した。反応混合物を室温で９０分間撹拌し、ポリマーをＥｔ２Ｏ中で２回沈殿させ、真空下で乾燥させた。次いで、それをＤＭＳＯに溶解し、水（ＭＷＣＯ１ＫＤａ）に対して透析し、凍結乾燥して、白色粉末を得た。精製後の収量：８７％
【００６８】
ポリ（エチレングリコール）−ｂ−ポリ（グルタミン酸）ＰＥＧ１１４−Ｐ（Ｇｌｕｎ）の合成：ＰＥＧ１１４−ＰＧＩｕ１５１の例
γ−ＢＬＧ  ＮＣＡ（３．４５ｇ、１５．１ｍｍｏｌ）を純粋なアルゴン下でグローブボックス内で計量し、火炎乾燥したシュレンクに導入し、５ｍＬの無水ＤＭＦで溶解した。溶液を１０分間撹拌し、メチルおよびアミン末端ポリエチレングリコール（５ＫＤａ、０．５ｇ、０．１ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ溶液（１ｇ／ｍＬ、注入量：１ｍＬ）から窒素パージしたシリンジで添加した。混合物を５℃で（または２５℃で）１日撹拌し、ジエチルエーテル中で沈殿させ、真空下で乾燥させて、白色粉末を得た。目標とする１５１の重合度に相当する３３．０６９ｇ．ｍｏｌ−１（１Ｈ  ＮＭＲで決定）の分子量を有するポリペプチドを得た。ＰＥＧ−ｂ−ＰＢＬＧ（ＣＤＣＩ３／ＴＦＡ）の典型的な１Ｈ  ＮＭＲシグナル：δ＝７．８５（ｄ，Ｃ（Ｏ）ＣＨ［（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ２−Ｐｈ］ＮＨ、δ＝７．３０（ｍ，ＣＨ２Ｐｈ）、δ＝５．０５（ｍ，ＣＨ２Ｐｈ）、δ＝４．５５（ｓ，Ｃ（Ｏ）ＣＨ−［（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ２−Ｐｈ］ＮＨ）、δ＝３．８５（ｓ，Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２  ＰＥＧ）δ＝２．４３（ｔ，Ｃ（Ｏ）ＣＨ［ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ２−Ｐｈ］ＮＨ）、δ＝２．０８、１．９２（ｍ，Ｃ（Ｏ）ＣＨ［（ＣＨ２ＣＨ２Ｃ−（Ｏ）ＯＣＨ２−Ｐｈ］ＮＨ）。
次いで、相当するコポリマーをＴＦＡ（１００ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、ＨＢｒ溶液（酢酸中３３重量％）を注意深く滴下した。反応混合物を室温で９０分間撹拌し、ポリマーをＥｔ２Ｏ中で２回沈殿させ、真空下で乾燥させた。次いで、それをＤＭＳＯに溶解し、水（ＭＷＣＯ  １ＫＤａ）に対して透析し、凍結乾燥して、白色粉末を得た。精製後の収量：８３％
ＰＥＧ−ｂ−ＰＧＡ（ＤＭＳＯ−ｄ６／ＴＦＡ）の典型的な１Ｈ  ＮＭＲシグナル：δ＝８．２５（ｓ，Ｃ（Ｏ）ＣＨ−［（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）ＯＨ］ＮＨ、δ＝３．９３（ｍ，Ｃ（Ｏ）ＣＨ−［（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）ＯＨ］ＮＨ）、δ＝３．４４（ｓ，Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２  ＰＥＧ）、δ＝３．１４（ｓ，ＣＨ３−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ  ＰＥＧ）δ＝２．２５（ｍ，Ｃ（Ｏ）ＣＨ［ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＨ］−ＮＨ）、δ＝１．９０、（ｍ，Ｃ（Ｏ）ＣＨ−［（ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＨ］ＮＨ）。
【００６９】
ポリ（エチレングリコール）−ｂ−ポリ（グルタミン酸−ｃｏ−バリン）ＰＥＧＸ−Ｐ（Ｇｌｕｎ−Ｖａｌｍ）の合成：ＰＥＧ４４−Ｐ（Ｇｌｕ１５−Ｖａｌ７）の例
γ−ＢＬＧ  ＮＣＡ（０．８８ｇ、３．７５ｍｍｏｌ）およびＶａｌ  ＮＣＡ（０．２５ｇ、１．７５ｍｍｏｌ）をアルゴン下でグローブボックス内で計量し、火炎乾燥したシュレンクに導入し、５ｍＬの無水ＤＭＳＯで溶解した。溶液を１０分間撹拌し、メチルおよびアミン末端ポリエチレングリコール（２ＫＤａ、０．５ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＳＯ溶液（１ｇ／ｍＬ、注入量：１ｍＬ）から窒素パージしたシリンジで添加した。混合物を２５℃で１日撹拌し、ジエチルエーテル中で沈殿させ、真空下で乾燥させて、白色粉末を得た。目標とする２２の総重合度に相当する３．９７８ｇ．ｍｏｌ−１（１Ｈ  ＮＭＲで決定）の分子量を有するコポリペプチドを得た。次いで、相当するコポリマーをＴＦＡ（１００ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、ＨＢｒ溶液（酢酸中３３重量％）を注意深く滴下した。反応混合物を室温で９０分間撹拌し、ポリマーをＥｔ２Ｏ中で２回沈殿させ、真空下で乾燥させた。次いで、それをＤＭＳＯに溶解し、水（ＭＷＣＯ  １ＫＤａ）に対して透析し、凍結乾燥して、白色粉末を得た。精製後の収量：８２％
【００７０】
ポリ（エチレングリコール）−ｂ−ポリ（グルタミン酸−ｃｏ−バリン）ＰＥＧＸ−Ｐ（Ｇｌｕｎ−Ｖａｌｍ）の合成：ＰＥＧ１１４−Ｐ（Ｇｌｕ５１−Ｖａｌ６）の例
γ−ＢＬＧ  ＮＣＡ（１．０ｇ、４．６ｍｍｏｌ）およびＶａｌ  ＮＣＡ（０．２３３ｇ、１．１ｍｍｏｌ）をアルゴン下でグローブボックス内で計量し、火炎乾燥したシュレンクに導入し、４０ｍＬの無水ＤＭＳＯで溶解した。溶液を１０分間撹拌し、メチルおよびアミン末端ポリエチレングリコール（５，０００ｇ．ｍｏｌ−１、０．３６２ｇ、７．２４×１０−２ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＳＯ溶液（１ｇ／ｍＬ−１、注入量：０．３６ｍＬ）から窒素パージしたシリンジで添加した。混合物を２５℃で２日間撹拌し、水に対して３日間透析し（ＭＷＣＯ  １ＫＤａ）、凍結乾燥して白色粉末を得た。目標とする５７の総重合度に相当する１１，７６３ｇ．ｍｏｌ−１の総分子量を有するコポリペプチドを得た。収量＝１．０３ｇ（８７％）
ＰＥＯ１１４−ｂ−Ｐ（ＢＬＧ５１−ｃｏ−Ｖａｌ６）（ＤＭＳＯ−ｄ６／ＴＦＡ）の典型的な１Ｈ  ＮＭＲシグナル：δ＝８．５０−７．９５（ｍ，Ｃ（Ｏ）ＣＨ−［（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）ＯＨ］ＮＨおよびＣ（Ｏ）−ＣＨ［ＣＨ（ＣＨ３）２］−ＮＨ）、δ＝７．２７（ｍ，ＣＨ２Ｐｈ  ＢＬＧ）、δ＝５．０２（ｍ，ＣＨ２Ｐｈ  ＢＬＧ）、δ＝３．９４（ｍ，Ｃ（Ｏ）ＣＨ−［（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ２−Ｐｈ］ＮＨおよびＣ（Ｏ）−ＣＨ［ＣＨ（ＣＨ３）２］−ＮＨ）、δ＝３．４９（ｓ，Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２  ＰＥＯ）、δ＝３．２５（ｓ，ＣＨ３−Ｏ  ＰＥＯ）、δ＝２．７３−１．７５（ｍ，Ｃ（Ｏ）ＣＨ−［ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＨ］−ＮＨおよびＣ（Ｏ）ＣＨ−［（ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＨ］ＮＨ）、δ＝１．２３（ｍ，Ｃ（Ｏ）−ＣＨ［ＣＨ（ＣＨ３）２］−ＮＨ）、δ＝０．９０（ｍ，Ｃ（Ｏ）−ＣＨ［ＣＨ（ＣＨ３）２］−ＮＨ）。
【００７１】
次いで、相当するコポリマー（１ｇ、５．９５×１０−２ｍｍｏｌ、３．０３ｍｍｏｌのＢＬＧ単位）をＴＦＡ（１００ｍｇ．ｍＬ−１）に溶解し、ＨＢｒ溶液（酢酸中３３重量％、１．４３ｍＬ、２５ｍｍｏｌ）を注意深く滴下した。反応混合物を室温で９０分間撹拌し、ポリマーをＥｔ２Ｏ中で２回沈殿させ、真空下で乾燥させた。次いで、それをＮａＯＨ（ｐＨ＝９）の存在下でＤＭＳＯおよび水に溶解し、７日間水に対して透析し（ＭＷＣＯ  １ＫＤａ）、凍結乾燥して白色粉末を得た。収量：７００ｍｇ（９４％）および総収量＝８２％
ＰＥＯ１１４−ｂ−Ｐ（Ｇｌｕ５１−ｃｏ−Ｖａｌ６）（ＤＭＳＯ−ｄ６／ＴＦＡ）の典型的な１Ｈ  ＮＭＲシグナル：δ＝８．５０−７．９５（ｍ，Ｃ（Ｏ）ＣＨ−［（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）ＯＨ］ＮＨおよびＣ（Ｏ）−ＣＨ［ＣＨ（ＣＨ３）２］−ＮＨ）、δ＝３．９４（ｍ，Ｃ（Ｏ）ＣＨ−［（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ２−Ｐｈ］ＮＨおよびＣ（Ｏ）−ＣＨ［ＣＨ（ＣＨ３）２］−ＮＨ）、δ＝３．４９（ｓ，Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２  ＰＥＯ）、δ＝３．１８（ｓ，ＣＨ３−Ｏ  ＰＥＯ）、δ＝２．７０−１．８０（ｍ，Ｃ（Ｏ）ＣＨ−［ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＨ］−ＮＨおよびＣ（Ｏ）ＣＨ−［（ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＯＨ］ＮＨ）、δ＝１．１８（ｍ，Ｃ（Ｏ）−ＣＨ［ＣＨ（ＣＨ３）２］−ＮＨ）、δ＝０．８８（ｍ，Ｃ（Ｏ）−ＣＨ［ＣＨ（ＣＨ３）２］−ＮＨ）。
【００７２】
【表１】
2020536088.tif 000013
【００７３】
［カプセルの調製］
一般的な手順
カプセルを調製するための典型的な手順は、超音波処理器を２分間使用して、１〜２０重量％のジブロックコポリマーを含む等容量の水溶液および油を乳化することである。試験されたすべてのジブロックコポリマーは、種々の油または有機相（ドデカン、ひまわり油、オリーブ油、パルミチン酸オクチル、クロロホルム）を使用して安定なエマルションを調製するための効率的な安定剤であった。エマルションの型、すなわち、水中油型または油中水型を滴下試験技術によって確認した。
滴下試験技術は、最終エマルションの液滴を乳化に使用される水溶液または相当する油に添加することからなる。液滴が再分散するのを可能にする相は、分散剤相を示し、したがって、他の相は、ジブロックコポリマーによって安定化される分散相である。一方、エマルションの液滴が分散相に添加された場合、再分散は、観察されず、エマルションの液滴は、試験相と非混和性のままであろう。同様に、分散剤相の導電率は、通常、滴下試験を確認するために使用される。通常、油は、典型的に＞１００μＳ．ｍ−１の良好な導電率を示す水と比較して導電率が低い（γ＜１μＳ．ｍ−１）。どちらの試験でも、ドデカン、ひまわり、オリーブ油を使用し、ジブロックコポリマーを含有する水相をｐＨ５．５に調整した場合、すべての場合に水中油型エマルションが得られたことが確認された。クロロホルムを非混和性相として使用した場合、液滴が再分散した。
【００７４】
水中油型エマルションの一般的なプロトコル
乳化する５０％油の２ｇの水中油型エマルションの典型的な手順は、以下のとおりであった。最初に、ＨＣｌまたはクエン酸緩衝液でｐＨ５．５に調整された１〜１０重量％の濃度のジブロックコポリマーを含有する１ｇの水溶液を、５ｍＬバイアルに添加した。次いで、１ｇの疎水性相（ドデカン油、ひまわり油、オリーブ油、パルミチン酸オクチル、ホホバ油、イソノナン酸イソノニル、スクアレン、イソヘキサデカン、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド、イソノナン酸イソデシル）をバイアルに添加した。
次いで、この油／水混合物を、超音波処理器ＵＰ４００Ｓ（ＨＩＥＬＳＣＨＥＲ）を使用して２分間均質化した（他の超音波処理時間は、４、６、および８分を用いた）。高エネルギーの超音波処理プロセスからの加熱を制限するために、混合物を氷浴に置いたことは注目すべきである。
【００７５】
【表２】
2020536088.tif 000014
【００７６】
油中水型エマルションを作製するための式（Ｉ）または（ＩＩ）のコポリマーの量は、製剤の総重量に基づいて、０．１重量％〜２０重量％の間、好ましくは、０．２重量％〜１０重量％の間、より好ましくは０．５重量％〜５重量％の間で変動し得る。
【００７７】
油中水型エマルションの一般的なプロトコル
乳化する５０重量％水相の２ｇの油中水型エマルションの典型的な手順は、以下のとおりであった。最初に、濃度１重量％のジブロックコポリマーを含有する１ｇのクロロホルムまたはジクロロメタンを５ｍＬバイアルに添加した。次いで、ＨＣｌまたはクエン酸緩衝液でｐＨ５．５に調整された１ｇの水相をバイアルに添加した。
次いで、この有機溶媒／水混合物を、超音波処理器ＵＰ４００Ｓ（ＨＩＥＬＳＣＨＥＲ）を使用して２分間均質化した。高エネルギーの超音波処理プロセスからの加熱を制限するために、混合物を氷浴に置いたことは注目すべきである。
同様の油中水型エマルションが、ジブロックコポリマーをクロロホルムまたはジクロロメタン相の代わりに水相に溶解した場合に得られた。
【００７８】
ＰＥＧホモポリマーを使用した対照実験により、ＰＥＧは、界面活性を示さず、マクロ乳化剤として使用できないことが確認された。一方、ＰＧＡホモポリマーは、界面活性を示し（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００６，１２８，６５４０−６５４１）、カプセルを形成することができた。しかしながら、そのようなカプセルは、塩の存在下では不安定であるようであり、マクロ乳化剤のジブロック構造が安定なナノカプセルを得るために重大であることが確認された。
【００７９】
水中油型エマルションの乳化剤としてＰＥＧホモポリマーを使用した対照実験のプロトコル
水中油型エマルションの典型的な手順：最初に、濃度が１０重量％の、５，０００ｇｍｏｌ−１の分子量を有するＰＥＧ１１４ホモポリマーまたは２，０００ｇｍｏｌ−１の分子量を有するＰＥＧ４４ホモポリマージアクリレート（ＰＥＧＤＡ）を含有する１ｇの水溶液を５ｍＬバイアルに添加した。次いで、１ｇの疎水性相（ドデカン油、ひまわり油、オリーブ油、パルミチン酸オクチル、またはイソヘキサデカン）をバイアルに添加した。
次いで、この油／水混合物を、超音波処理器ＵＰ４００Ｓ（ＨＩＥＬＳＣＨＥＲ）を使用して１０分間均質化した。高エネルギーの超音波処理プロセスからの加熱を制限するために、混合物を氷浴に置いたことは注目すべきである。
１０重量％のＰＥＧＤＡを含有する１ｇの水溶液および１ｇのドデカンに基づく油／水混合物の１０分間の超音波処理の後、相分離がほんの数分で起こった。ＰＥＧホモポリマーに関してＰＥＧＤＡを変更しても、ドデカンでの安定なエマルションの作製を達成できなかった。同様の結果が、ＰＥＧＤＡとＰＥＧの両方に関してひまわり油、オリーブ油、パルミチン酸オクチル、またはイソヘキサデカンなどの試した様々な油で得られた。これらの結果により、式（Ｉ）および（ＩＩ）のポリペプチドブロックなしでのＰＥＧ単独では、エマルションを安定化できないことが確認された。
【００８０】
ジアミン化合物を有する架橋カプセルの一般的なプロトコル
異なる量のエチレンジアミンまたはビス（ヘキサメチレン）トリアミンをコポリマーを含まない相に添加し、これらの化合物からの第一級アミンとジブロックコポリマーのグルタミン酸残基からのカルボン酸の数の比は、ＮＨ２：ＣＯＯＨ：１：１、１：２、および１：４であった以外は、１重量％コポリマーを使用して５０重量％の水中油または油中水と同じプロトコルに従った。ジアミン化合物を水相に置いたとき、ジブロックコポリマーのグルタミン酸単位からのカルボン酸単位の総量に基づいて１０倍過剰のエチル（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を添加した。同様に、エマルションを作製するための水相に溶解したカルボン酸の量に基づいて、１０倍のジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を水非混和性相に添加して、コポリマーを架橋した。
連続相（水中油型系では水、油中水型系では水非混和性相）に添加されたジアミンクロスリンカーの量が多いほど、異なる液滴間の相互架橋が観察されたことに留意することが重要である。
【００８１】
［カプセルのサイズ］
図１に示すように、ブロックＰＥＧとポリペプチドの両方の重合度を上げることで、カプセルのサイズを小さくすることができる。カプセルの流体力学的直径を上記で説明した実験条件で動的光散乱によって測定した。
油相でのジブロックコポリマーの溶解性の欠如とこの結果を組み合わせると、油／水界面でのマクロ乳化剤の吸着がわかりる。しかしながら、より長いポリペプチドブロックでより小さなカプセルが得られた。したがって、安定化のメカニズムは、油／水界面での疎水性ポリペプチドの吸着と想定される。その場合、より長いポリペプチドは、油／水界面でより広い領域をカバーし、より小さなカプセルをもたらす。ＰＥＧの立体障害も安定化メカニズムに影響を与える可能性があることに言及することが重要である。その効果も、より長いＰＥＧがより多くのスペースを必要とする可能性があるのと同じように進むはずである。これは、安定なエマルションを得るために、十分に長いＰＧＩｕが実際には必要であるため、得られた結果と十分一致している。
より詳細には、ＰＥＧ−ＰＧＩｕジブロックコポリマーに関して、安定なエマルションを得るために、Ｇｌｕアミノ酸の最小重合度が必要であった。すなわち、それぞれ、ＤＰ１６、４４、１１４のＰＥＧの場合、ＤＰ＞２０、３６、および５０。これは、ＰＥＧ４４−ＰＧＩｕ３６を乳化剤として使用した場合に、以下に示されることになり、その安定なエマルションは、低ｐＨ（ｐＨ５．５付近）で使用されたどの油でも達成できなかった。
【００８２】
興味深いことに、コポリマーの量および超音波処理の時間を増やすことで、カプセルの直径をさらに小さくすることができた。カプセルの直径を、少なくとも１０分間強い超音波処理を適用することによってのみ３分の１に減少できることを確認するのは興味深い（図２）。カプセルの直径を上記で説明した実験条件で動的光散乱によって測定し、超音波処理時間が長くなるとサイズが小さくなる傾向が、レーザー回折によっても確認された。
【００８３】
同様に、カプセルの直径をジブロックコポリマーの量を増やし、分散相の量を減らすことで減らすことができる（図３）。
【００８４】
異なるＰＥＧ−ＰＧＩｕでの水中油型エマルションの作製のプロトコル。
乳化する２ｇの５０％ドデカン油の水中油型エマルションの典型的な手順は、以下のとおりである。最初に、１重量％のジブロックコポリマー、すなわち［ＰＥＧｘ−Ｐ（Ｇｌｕｎ−Ｖａｌｍ）、ここで、ｘ＝４４または１１４、（ｎ＋ｍ）＝５、１１、２２であり、式中、ｍは、全ポリペプチドＤＰ、すなわちｎ＋ｍの約３０％である］を含有するｐＨ５．５の１ｇのクエン酸緩衝液の水溶液を添加した。次いで、１ｇのドデカン油をバイアルに添加した。
混合物を、パルス時間なしでフルパワーで超音波処理器ＵＰ４００Ｓ（ＨＩＥＬＳＣＨＥＲ）を使用して、２分間超音波処理した。
【００８５】
異なる超音波処理時間での水中油型エマルションの作製のためのプロトコル
乳化する２ｇの５０％ドデカン油の水中油型エマルションの典型的な手順は、以下のとおりである。最初に、１重量％のＰＥＧ１１４−Ｐ（Ｇｌｕ１６−Ｖａｌ５）ジブロックコポリマーを含有するｐＨ５．５の１ｇのクエン酸緩衝液の水溶液。次いで、１ｇのドデカン油をバイアルに添加した。
次いで、この油／水混合物を、超音波処理器ＵＰ４００Ｓ（ＨＩＥＬＳＣＨＥＲ）を使用して２分間均質化した（他の超音波処理時間は、４、６、および８分を用いた）。高エネルギーの超音波処理プロセスからの加熱を制限するために、混合物を氷浴に置いたことは注目すべきである。
【００８６】
［安定性］
ドデカン、オリーブ油、ひまわり油、パルミチン酸オクチル、イソヘキサデカンに基づき、ｘ＝４４または１１６、５＜ｎ＜５０、１＜ｍ＜１１のＰＥＧｘ−Ｐ（Ｇｌｕｎ−Ｖａｌｍ）ジブロックコポリマーで安定化されたすべてのカプセルは、ｐＨ５．５で数ヶ月間安定であった。ＰＥＧｘ−ＰＧＩｕｍの場合、バリンｃｏアミノ酸の不在は、ジブロックコポリマーの界面活性を明らかに低下させており、安定なナノカプセルの形成は、ＰＥＧブロックとポリペプチドブロックの両方の長さに依存していた。例えば、短いＰＥＧブロック、すなわち、ｘ＝１７を含有するジブロックコポリマーと上記の油のいずれかを用いてカプセルを調製することはできない。中間の長さのＰＥＧブロックでは、パルミチン酸オクチル以外のどの油でもＰＥＧ４４−ＰＧＩｕ３６に基づくカプセルを作製できないことが見出された。一方、安定なカプセルをｎ−ドデカン、ひまわり油、オリーブ油でＰＥＧ４４−ＰＧＩｕ４７およびＰＥＧ４４−ＰＧＩｕ５８で調製した。興味深いことに、ＰＥＧ１１７−ＰＧＩｕｍジブロックコポリマーの場合、より短いＰＧＩｕ、すなわちｍ≧２０で安定なカプセルが達成された。一方、パルミチン酸オクチルを乳化した場合、安定性の問題が見出された。これは、この油の極性が異なるためと考えられる。パルミチン酸オクチルでは、安定なカプセルがｎ＞５０のＰＥＧ１１７−ＰＧＩｕｎでのみ得られる。
【００８７】
エマルションの安定性を研究するためのプロトコル
最初に、前述のようにエマルションを調製した場合、目視検査を使用して、相分離が観察されたときの短期安定性を決定した。そうするために、エマルションを室温の通常の条件で静置した。分散液の表面での油液滴の出現を安定性の喪失とみなし、１週間後に相分離を示さなかったエマルションを動的光散乱によって行ったさらなる長期安定性研究のために考慮した。毎週、２μｌのエマルションを１ｍＬの脱イオン水に再分散し、流体力学的直径をＤＬＳで測定した。流体力学的直径が安定なままである場合、エマルションを安定とみなした。逆に、流体力学的直径の増加が観察された場合、エマルションは、不安定とみなした。
より興味深いことに、ＰＥＧｘ−Ｐ（Ｇｌｕｎ−Ｖａｌｍ）ジブロックコポリマーは、乳化のｐＨに応じて異なる安定性を示すように見えた。
オリーブ油に基づく安定なナノカプセルをｐＨ５．５のＰＥＧ４４−ＰＧＩｕ４７およびＰＥＧ４４−ＰＧＩｕ５８ジブロックコポリマーで得た。しかしながら、ｐＨ＞７．４で調製した同じエマルションは、安定ではなく、解乳化が１か月以内に起こった。この結果は、ジブロックコポリマーの界面活性がｐＨに依存することを示している。このような挙動は、ＰＧＩｕブロックの特徴の変化に起因していた。明らかに、ＰＥＧブロックは、ｐＨに関係なく水溶性であるが、ＰＧＩｕブロックは、アミノ酸単位のカルボン酸残基のプロトン化およびカルボキシレートアニオンの存在下でｐＨ＞ｐＫａで親水性になるため、ｐＨを下げると疎水性が増加する。したがって、低ｐＨでは、ポリペプチドブロックは、十分に疎水性であり、油／水界面で吸着する。一方、ＰＧＩｕが親水性である場合、疎水性界面との親和性の欠如により、マクロ乳化剤の界面活性がなくなり、安定なエマルションが達成されなかった。非常に低いｐＨ（＜３）では、解乳化も以前に説明されているように（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００６、１２８、６５４０−６５４１）、α−ヘリックス内のＰＧＩｕブロックの再配置により起こることに言及することは非常に重要である。
したがって、ＰＥＧ−ＰＧＩｕコポリマーは、十分なＧｌｕアミノ酸単位がプロトン化され、疎水性であり、油／水界面でのブロックの吸着を確実にするが、その天然の構成でのポリペプチドブロックの本来の再配置を回避するのに多すぎない場合、結果として生じるエマルションに対して安定性のウィンドウを示す。
【００８８】
より興味深いことに、ジブロックコポリマーＰＥＧ−ＰＧＩｕの界面活性は、元の位置で変化する可能性があり、その結果、油と水の界面からジブロックコポリマーが脱着または分離し、カプセルのコアの放出につながった。例えば、ｐＨ４．５で調製され、ＰＥＧ４４−ＰＧＩｕ５８によって安定化されたｎ−ドデカンに基づく安定なカプセルは、ｐＨ７．４を超えるｐＨに調整し、エマルション液滴の分散液を穏やかにシェイキングすることによって解乳化できる。加えて、水相のｐＨを４．５〜５．５のｐＨに再調整することによって、新しいカプセルを作製できる。２分間の超音波処理後、安定なエマルションが再び得られた。ジブロックコポリマーの界面活性の元の位置でのこの変化は、マクロ乳化剤がｐＨ応答性であることを明らかにした。
【００８９】
ナノカプセルのｐＨ依存性
カプセルのｐＨ依存性を評価するために、乳化プロセスを異なるｐＨ、すなわち、５．５（前述のように）、７．４および２で行った。そうするために、コポリマーを溶解するために使用される水溶液を、それぞれｐＨ７．４および２に濃ＮａＯＨまたはＨＣｌで調整した。上記で説明したように二相性混合物を調製した後、超音波処理を２〜１０分間行った。解乳化を確認するための目視検査を使用して、ｐＨ７．４およびｐＨ２でのこれらのエマルションの安定性を検証した。すべての場合で、ｐＨ５．５で以前に安定であったカプセルは、エマルションがｐＨ７．４および２で行われた場合に解乳化が観察されたため、不安定であることがわかった。
【００９０】
カプセルのｐＨ応答性
エマルションの安定性に対するｐＨの効果を実証するために、ｐＨ５．５で高い安定性をすでに示したカプセルを、濃ＮａＯＨを添加するか、またはリン酸緩衝液にｐＨ７．４でナノカプセルを再分散させることによって、ｐＨ７．４に調整した。最初に、目視検査を使用して、カプセルの安定性を検証した。カプセルがｐＨ応答性である場合、乳白色の溶液は、明らかに透明になった。
数時間以内に、ｐＨ７．５に調整されたエマルションは、透明になったが、ｐＨ５．５に維持された対照実験は、乳白色のままであった。
ｐＨ変更後のエマルションの吸光度の変化を使用して、ＵＶ分光法（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＵＶ−２４０１ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計）を使用して、ｐＨを変更した後の解乳化をモニターした。そうするために、５μＬの元の分散液をｐＨ７．４のリン酸緩衝液に再分散した。５００ｎｍでのカプセル分散液の吸光度を経時的にモニターした（図４）。
【００９１】
図４から、ブロックポリペプチドを有するジブロックコポリマーで調製されたカプセルがＶａｌおよびＧｌｕ  ｃｏアミノ酸を含む場合、解乳化がｐＨ７．４で起こり、分散吸光度が著しく低下したことが明らかである。しかしながら、両方のカプセルについて、最初に吸光度が増加し、次に劇的に減少することがわかる。この増加は、より高い回折でより大きな粒子に合体したカプセルの最初の不安定化によるもので、最初はより高い吸光度であった。この合体ステップの後、カプセルは、完全に破壊され、透明な溶液がもたらされた。一方、同じカプセルをｐＨ５．５のクエン酸緩衝液に入れた場合、吸光度は、一定のままであり、コロイド系の安定性を実証している。
ＰＥＧｘ−ＰＧＩｕｎまたはＰＧＩｕｎ−Ａ１  ＰＥＧｘジブロックコポリマーで調製したカプセルの場合、ｐＨ応答性が遅いように見え、１５時間後に完全な解乳化が起こることを除いて、同様の傾向が観察された。
ＤＬＳキュベットの目視検査により、水性分散液の表面に油性の汚れが現れ、解乳化が起こったことが確認された。
【００９２】
これとは別に、非混和性相としてクロロホルムも使用した。
この場合、異なる結果が得られた。ＰＥＧブロックの長さに応じて、位相反転が観察された。例えば、比較的短いＰＥＧブロック（ＤＰ＝１７）では、水中クロロホルム型エマルションが形成された。しかしながら、より長いＰＥＧブロック（４４および１１４）では、クロロホルム中水型エマルションが得られた。水とクロロホルムの両方に可溶であるＰＥＧは、鎖が十分に長い場合、有機相にあることを好むように見える。
ＰＥＧは他の油に溶解性ではなかったため、これは、非混和性相としてのクロロホルムでのみ観察されている。
【００９３】
［架橋］
安定性を改善し、新しい型のカプセルを作製するために、油／水界面で吸着されたＧｌｕアミノ酸残基を元々の場所で架橋することが決定された。
吸着したジブロックコポリマーを、エチレンジアミンまたはビス（ヘキサメチレン）トリアミンなどのジアミン化合物を使用して、Ｇｌｕ単位のアミド化によって架橋した。ドデカンへのジアミン架橋剤の溶解性の欠如のために、架橋反応を水相を通して行った。最初に、油／水界面に吸着したジブロックのカルボン酸を、ＥＤＣを使用して活性化した。次いで、ジアミン架橋剤を、水カプセル中のｎ−ドデカンの希釈分散液にゆっくりと添加した。
【００９４】
最初に、すべてのコポリマーが界面に吸着されていると仮定して、ジアミン架橋剤の量を添加して、水分散液に存在するすべてのＧｌｕ単位と反応させた。光学顕微鏡の研究では、吸着したコポリマーの架橋が成功したことを示し得る元の液滴のいくらかの変形が示された。液滴の島も観察され、これは、隣接する液滴の架橋を示している。添加された架橋剤の量が多いため、液滴の相互架橋が予想された。
少量のジアミン架橋剤を使用して、液滴の相互架橋を最小限にした。架橋後の液滴の変形は、なお観察されたが、存在する凝集体は少なかった。しかしながら、光学画像を詳しく見ると、架橋反応後の液滴の直径が大きくなっている。この結果により、液滴間架橋もこの濃度の架橋剤で起こったことが確認される。
次いで、油／水界面に吸着したジブロックコポリマーを、２５ｍｏｌ％の利用可能なＧｌｕ単位のみを使用して架橋した（すべてのジブロックコポリマーが油／水界面に吸着していると仮定して）。光学顕微鏡写真により、油液滴の相互架橋が最小限に抑えられている一方、特に、ＰＥＧ４４−ＰＧＩｕ５８で安定化されたｐＨ２．６の液滴に関して、液滴の直径が元の直径と同じままであることが確認された。液滴のいくつかは、架橋反応によって生成された機械的応力が原因であろう球形を示さなかったことに注目する価値がある。
【００９５】
ｐＨ８付近でｐＫａを示す第二級アミンを組み込むために、ＰＥＧｘ−ＰＧＩｕｎブロックコポリマーも、ビス（ヘキサメチレン）トリアミンを使用して架橋した。エチレンジアミンで得られた結果と同様に、大きな液滴は、球形を失ったように見えた。一方、小さな液滴は、球形のままであり、それらの直径は、変化しないままであった。
【００９６】
要約すると、クロロホルム中水型エマルションテンプレートから調製されたカプセルは、使用する架橋剤および分散液のｐＨによって異なる状態で存在する。ビス（ヘキシルメチレン）トリアミンを架橋剤として使用した場合、ポリペプチドブロックの溶解性が高いため、カプセルは、膨潤した膜で負に帯電していた。ＧＡ単位のカルボン酸のプロトン化により、分散液のｐＨが低下すると、膜の解膨潤が観察された。ｐＨ＜４では、陽イオン電荷を有するより小さなカプセルが得られたが、プロトン化された第二級アミンの存在により、膜が十分に親水性になって、わずかに膨潤し、完全に不透過性ではない。同様に、エチレンジアミンで架橋されたカプセルは、アルカリ性ｐＨで膨潤したアニオン性膜を示した。Ｇｌｕアミノ酸単位のプロトン化と静電反発力の損失によりｐＨが低下すると、膜厚が減少した。ｐＨ＜４では、ポリペプチドブロックの疎水性のため、カプセルの膜は、完全に閉じている。さらに、ｐＨ３で観察される減少は、親水性化合物をカプセル化する保護バリアの形成を確実にし得る。
【実施例】
【００９７】
［実施例Ｉ］：ＰＥＧ１１４−Ｐ（Ｇｌｕ４６−ｃｏ−Ｖａｌ１１）を使用したウコン根抽出物のカプセル化のためのグリセロール中油型エマルション
【表３】
2020536088.tif 000015
乳化プロセス
ポリペプチドに基づくブロックコポリマー（ＰＥＧ１１４−Ｐ（Ｇｌｕ４６−ｃｏ−Ｖａｌ１１））を、最初に８０℃で１時間、次いで周囲温度で磁気撹拌下（１８時間、２５０ｒｐｍ）でグリセロールに溶解した。その後、プレエマルションを、グリセロール相へのパルミチン酸オクチルおよびウコン根抽出物混合物の添加（ＲＴ、２５０ｒｐｍ、１０分）によって、形成した。混合物を室温で３０分間撹拌した（２５０ｒｐｍ）。各成分の量を上記の製剤に示す。
乳化は、１００％の振幅で超音波処理器ＵＰ４００Ｓ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ）を使用した混合物の超音波処理、および５００ｒｐｍで撹拌した１０分間（４００Ｈｚ）の１．０サイクルで構成された。
エマルション特徴付け
外観：最終的なナノカプセルの外観を視覚的に分析した。透明で粘稠な良質のエマルション（沈殿なし）が達成された。
粒子サイズ：平均粒子サイズ強度および多分散性指数をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって測定した。試料を、エマルションをＤＤＩ水で１重量％に近い濃度まで希釈することによって調製した。測定を２５℃で３連で行った。
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｚｓ：粒子サイズ（ｎｍ）＝１２５ｎｍ、ＰＤＩ＝０．２５
【００９８】
［実施例ＩＩ］：ＰＥＧ１１４−Ｐ（Ｇｌｕ４６−ｃｏ−Ｖａｌ１１）を使用したセラミドＮＧのカプセル化のためのグリセロール中油型エマルション
【表４】
2020536088.tif 000016
乳化プロセス
ポリペプチドに基づくブロックコポリマー（ＰＥＧ１１４−Ｐ（Ｇｌｕ４６−ｃｏ−Ｖａｌ１１））を、最初に８０℃で１時間、次いで周囲温度で磁気撹拌下（１８時間、２５０ｒｐｍ）でグリセロールに溶解した。混合物を１０分間、９５℃にさらに調整した。一方、セラミドＮＧ、ジラウラミドグルタミドリジンナトリウム、およびオクチルドデカノールを９５℃（２５０ｒｐｍ）で１０分間混合した。その後、プレエマルションを、オクチルドデカノール相をグリセロール相に９５℃で２０分間（２５０ｒｐｍ）混合することによって、形成した。各成分の量を上記の製剤に示す。
乳化は、１００％の振幅で超音波処理器ＵＰ４００Ｓ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ）を使用した混合物の超音波処理、および５００ｒｐｍ、６０℃で撹拌した１０分間（４００Ｈｚ）の１．０サイクル（油浴を使用して望ましい温度に達した）で構成された。
エマルション特徴付け
外観：最終的なナノカプセルの外観を視覚的に分析した。乳白色で粘稠な良質のエマルション（沈殿なし）が達成された。
粒子サイズ：平均粒子サイズ強度および多分散性指数をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって測定した。試料を、エマルションをＤＤＩ水で１重量％に近い濃度まで希釈することによって調製した。測定を２５℃で３連で行った。
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｚｓ：粒子サイズ（ｎｍ）＝１５０ｎｍ、ＰＤＩ＝０．０５
【００９９】
［実施例ＩＩＩ］：ＰＥＧ１１４−Ｐ（Ｇｌｕ４６−ｃｏ−Ｖａｌ１１）を使用したカプセル化されたパルミチン酸レチニルのカプセル化のためのグリセロール中油型エマルション
【表５】
2020536088.tif 000017
乳化プロセス
ポリペプチドに基づくブロックコポリマー（ＰＥＧ１１４−Ｐ（Ｇｌｕ４６−ｃｏ−Ｖａｌ１１））を８０℃で１時間グリセロールに溶解し、磁気撹拌下（１８時間、２５０ｒｐｍ）で周囲温度に保った。その後、プレエマルションを、グリセロール相へのパルミチン酸オクチルおよびパルミチン酸レチニル混合物の添加（ＲＴ、２５０ｒｐｍ、１０分）によって、形成した。混合物を撹拌した（ＲＴ、２５０ｒｐｍ、３０分）。各成分の量を上記の製剤に示す。
乳化は、１００％の振幅で超音波処理器ＵＰ４００Ｓ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ）を使用した混合物の超音波処理、および５００ｒｐｍで撹拌した１０分間（４００Ｈｚ）の１．０サイクルで構成された。
エマルション特徴付け
外観：最終的なナノカプセルの外観を視覚的に分析した。透明／黄色がかった粘稠な良質のエマルション（沈殿なし）が達成された。
粒子サイズ：平均粒子サイズ強度および多分散性指数をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって測定した。試料を、エマルションをＤＤＩ水で１重量％に近い濃度まで希釈することによって調製した。測定を２５℃で３連で行った。
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｚｓ：粒子サイズ（ｎｍ）＝１３５ｎｍ、ＰＤＩ＝０．０９
【０１００】
［実施例ＩＶ］：ＰＥＧ１１４−ＰＧＩｕ１５１を使用したウコン根抽出物のカプセル化のためのグリセロール中油型エマルション
【表６】
2020536088.tif 000018
乳化プロセス
ポリペプチドに基づくブロックコポリマー（ＰＥＧ１１４−ＰＧＩｕ１５１）を、最初に８０℃で１時間、次いで周囲温度で磁気撹拌下（１８時間、２５０ｒｐｍ）でグリセロールに溶解した。その後、プレエマルションを、グリセロール相へのパルミチン酸オクチルおよびウコン根抽出物混合物の添加（ＲＴ、２５０ｒｐｍ、１０分）によって、形成した。混合物を室温で３０分間撹拌した（２５０ｒｐｍ）。各成分の量を上記の製剤に示す。
乳化は、１００％の振幅で超音波処理器ＵＰ４００Ｓ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ）を使用した混合物の超音波処理、および５００ｒｐｍで撹拌した１０分間（４００Ｈｚ）の１．０サイクルで構成された。
エマルション特徴付け
外観：最終的なナノカプセルの外観を視覚的に分析した。透明で粘稠な良質のエマルション（沈殿なし）が達成された。
粒子サイズ：平均粒子サイズ強度および多分散性指数をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって測定した。試料を、エマルションをＤＤＩ水で１重量％に近い濃度まで希釈することによって調製した。測定を２５℃で３連で行った。
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｚｓ：粒子サイズ（ｎｍ）＝２５５ｎｍ、ＰＤＩ＝０．２０
【０１０１】
［実施例Ｖ］：ＰＥＧ１１４−ＰＧＩｕ１５１を使用したセラミドＮＧのカプセル化のためのグリセロール中油型エマルション
【表７】
2020536088.tif 000019
乳化プロセス
ポリペプチドに基づくブロックコポリマー（ＰＥＧ１１４−ＰＧＩｕ１５１）を、最初に８０℃で１時間、次いで周囲温度で磁気撹拌下（１８時間、２５０ｒｐｍ）でグリセロールに溶解した。混合物を１０分間、９５℃にさらに調整した。一方、セラミドＮＧ、ジラウラミドグルタミドリジンナトリウム、およびオクチルドデカノールを９５℃（２５０ｒｐｍ）で１０分間混合した。その後、プレエマルションを、オクチルドデカノール相をグリセロール相に混合することによって、形成した。混合物を撹拌した（９５℃、２５０ｒｐｍ、２０分）。各成分の量を上記の製剤に示す。
乳化は、１００％の振幅で超音波処理器ＵＰ４００Ｓ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ）を使用した混合物の超音波処理、および５００ｒｐｍ、６０℃で撹拌した１０分間（４００Ｈｚ）の１．０サイクル（油浴を使用して望ましい温度に達した）で構成された。
エマルション特徴付け
外観：最終的なナノカプセルの外観を視覚的に分析した。乳白色で粘稠な良質のエマルション（沈殿なし）が達成された。
粒子サイズ：平均粒子サイズ強度および多分散性指数をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって測定した。試料を、エマルションをＤＤＩ水で１重量％に近い濃度まで希釈することによって調製した。測定を２５℃で３連で行った。
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｚｓ：粒子サイズ（ｎｍ）＝１６０ｎｍ、ＰＤＩ＝０．０４
【０１０２】
［実施例ＶＩ］：ＰＥＧ１１４−ＰＧＩｕ１５１を使用したパルミチン酸レチニルのカプセル化のためのグリセロール中油型エマルション
【表８】
2020536088.tif 000020
乳化プロセス
ポリペプチドに基づくブロックコポリマー（ＰＥＧ１１４−ＰＧＩｕ１５１）を、８０℃で１時間、および磁気撹拌下（２５０ｒｐｍ）で周囲温度で１８時間、グリセロールに溶解した。その後、プレエマルションを、グリセロール相へのパルミチン酸オクチルおよびパルミチン酸レチニル混合物の添加（ＲＴ、２５０ｒｐｍ、１０分）によって、形成した。混合物を撹拌した（ＲＴ、２５０ｒｐｍ、３０分）。各成分の量を上記の製剤に示す。
乳化は、１００％の振幅で超音波処理器ＵＰ４００Ｓ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ）を使用した混合物の超音波処理、および５００ｒｐｍで撹拌した１０分間（４００Ｈｚ）の１．０サイクルで構成された。
エマルション特徴付け
外観：最終的なナノカプセルの外観を視覚的に分析した。透明／黄色がかった粘稠な良質のエマルション（沈殿なし）が達成された。
粒子サイズ：平均粒子サイズ強度および多分散性指数をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって測定した。試料を、エマルションをＤＤＩ水で１重量％に近い濃度まで希釈することによって調製した。測定を２５℃で３連で行った。
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｚｓ：粒子サイズ（ｎｍ）＝２６０ｎｍ、ＰＤＩ＝０．２
【０１０３】
［リンカーを有する式（ＩＩ）のコポリマーの合成］
【０１０４】
上記の例では、使用されるコポリマーは、特に、以下の命名法を用いて、上記で定義した式（ＩＩ）に基づいて表され得る：ポリ（グルタミン酸−ｃｏ−バリン）−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ポリ（エチレングリコール）［Ｐ（Ｇｌｕｎ−ｃｏ−Ｖａｌｍ）−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４。
【０１０５】
上記で定義した式（ＩＩ）のコポリマーを得ることを目的として、酵素特異的切断可能ペプチド配列、すなわちβＡｌａ−ＰｒｏＶａｌＧｌｙＬｅｕｌｌｅＧｌｙ（１文字のアミノ酸コードでは、βＡｌａ−ＰＶＧＬＩＧと表示）をポリマーブロック間の酵素切断可能リンカーとして使用した。より具体的には、以下のコポリマーを合成した：ポリ（グルタミン酸−ｃｏ−バリン）−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ポリ（エチレングリコール）［Ｐ（Ｇｌｕｎ−ｃｏ−Ｖａｌｍ）−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４、ここで、６１≦ｎ≦１７０および０≦ｍ≦１６］。ｍ＝０の場合、ブロックコポリマーは、ＰＧｌｕｎ−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４と表示される。合成は、４つの主要なステップで行われる。
【０１０６】
ステップ１：最初に、Ｆｍｏｃ保護ペプチド配列Ｆｍｏｃ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ＯＨペプチド（Ｂｉｏｍａｔｉｋから購入）（βＡは、ベータアラニンを表し、短いリンカーとして導入した）を乾燥ＤＣＭ（２０ｍｇ、０．０２３５ｍｍｏｌ）に溶解し、１０分間撹拌した。次いで、メチルおよびアミン末端ポリエチレンオキシド（５，０００ｇ．ｍｏｌ−１、９８ｍｇ、０．０１９６ｍｍｏｌ）を、窒素パージしたシリンジを用いて、無水ＤＣＭ溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ、注入量：８００μＬ）から添加し、その後、ＥＤＣ．ＣＩ（７．５ｍｇ、０．００３９ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．４８ｍｇ、０．３９μｍｏｌ）を添加した。溶液を２０℃で２４時間撹拌し、ＤＣＭおよび水を使用した抽出によって精製し、その後Ｅｔ２Ｏで沈殿させ、高真空下で乾燥させた。
ステップ２：ペプチドのＮ末端Ｆｍｏｃグループの除去をＦｍｏｃ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ポリ（エチレンオキシド）１１４をＤＭＦ（１５ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、ピペリジンの溶液をピペリジン／ＤＭＦ（１：４）の最終比まで滴下することによって達成した。反応混合物を室温で４５分間撹拌した。コンジュゲートΗ−βΑ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ポリ（エチレンオキシド）１１４を、ミリＱ水（ＭＷＣＯ１ｋＤａ）に対する透析によって精製し、その後凍結乾燥した。
ステップ３：次のステップでは、ＮＣＡ−ＢＬＧ（０．２８ｇ、１．０ｍｍｏｌ）を、グローブボックス内で純粋なアルゴン下で計量し、火炎乾燥したシュレンクに導入し、２ｍＬの無水ＤＭＦで溶解した。溶液を１０分間撹拌し、無水ＤＭＦ中の溶液から窒素パージしたシリンジを用いて、Η−βΑ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ポリ（エチレンオキシド）１１４（６０ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を２５℃で終夜撹拌し、Ｅｔ２Ｏで沈殿させ、３回洗浄し、真空下で乾燥させた。
ステップ４：最後に、Ｐ（ＢＬＧ）−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４をＴＦＡ（５０ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、その後、ＨＢｒ溶液（酢酸中３３重量％、２５７μＬ、１．５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、ジブロックコポリマーＰＧＩｕｘ−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４をＥｔ２Ｏ中で２回沈殿させ、真空下で乾燥させた。次いで、それをＤＭＳＯに溶解し、水およびＮａＯＨを添加した後、６日間ミリＱ水（ＭＷＣＯ３．５ｋＤａ）に対して透析し、凍結乾燥して、白色粉末を得た。
【０１０７】
ＰＧｌｕｘ−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４コポリマーを得るための一般的な戦略をスキーム３に示す。
【化１１】
2020536088.tif 000021
【０１０８】
Ｐ（Ｇｌｕｎ−ｃｏ−Ｖａｌｍ）−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４コポリマーの合成は、ステップ３でのＮＣＡ−ＢＬＧとＮＣＡ−Ｖａｌの共重合を伴った。ＮＣＡ−ＢＬＧ対ＮＣＡ−Ｖａｌの比は、ＢＬＧおよびＶａｌモノマーの相対量（ｎおよびｍ）および目標とする重合度（ｎ＋ｍ）に適合している。Ｐ（Ｇｌｕｎ−ｃｏ−Ｖａｌｍ）−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４コポリマーを得るための一般的な戦略をスキーム４に示す。
【化１２】
2020536088.tif 000022
【０１０９】
上記のプロトコルを適用することによって、以下のコポリマーを調製した：ＰＧＩｕ１５０−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４、ＰＧＩｕ１００−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４、ＰＧＩｕ１７０−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４、Ｐ（Ｇｌｕ６１−ｃｏ−Ｖａｌ１６）−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４、およびＰ（Ｇｌｕ４６−ｃｏ−Ｖａｌ１１）−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４。
【０１１０】
［リンカーを有する式（ＩＩ）のコポリマーの使用］
【０１１１】
（実施例１）：ＰＧＩｕ１５０−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４を使用することによるグリセロール中油型エマルション。
【表９】
2020536088.tif 000023
乳化プロセス
ポリペプチドに基づくブロックコポリマー（ＰＧＩｕ１５０−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４）を、磁気撹拌下で周囲温度でクエン酸緩衝液に溶解した（３０分、２５０ｒｐｍ）。その後、プレエマルションを、水相へのパルミチン酸オクチル混合物の添加によって、形成した。混合物を撹拌した（ＲＴ、２５０ｒｐｍ、３０分）。乳化は、１００％の振幅で超音波処理器ＵＰ４００Ｓ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ）を使用した混合物の超音波処理、および５００ｒｐｍで撹拌した３０分間（４００Ｈｚ）の１．０サイクルで構成された。使用量を上記の製剤に示す。
エマルション特徴付け
外観：最終的なナノカプセルの外観を視覚的に分析した。
粒子サイズ：平均粒子サイズ強度および多分散性指数をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって測定した。試料を、エマルションをパルミチン酸オクチルで１重量％に近い濃度まで希釈することによって調製した。測定を２５℃で３連で行った。
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｚｓ：粒子サイズ（ｎｍ）＝２２０ｎｍ、ＰＤＩ＝０．２３
【０１１２】
（実施例２）：ＰＧｌｕ１００−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４を使用することによるグリセロール中油型エマルション。
【表１０】
2020536088.tif 000024
乳化プロセス
ポリペプチドに基づくブロックコポリマー（ＰＧｌｕ１００−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４）を、磁気撹拌下（４８時間、２５０ｒｐｍ）で周囲温度でグリセロールに溶解した。その後、プレエマルションを、水相へのパルミチン酸オクチル混合物の添加によって、形成した。混合物を撹拌した（ＲＴ、２５０ｒｐｍ、３０分）。乳化は、１００％の振幅で超音波処理器ＵＰ４００Ｓ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ）を使用した混合物の超音波処理、および５００ｒｐｍで撹拌した３０分間（４００Ｈｚ）の１．０サイクルで構成された。使用量を上記の製剤に示す。
エマルション特徴付け
外観：最終的なナノカプセルの外観を視覚的に分析した。
粒子サイズ：平均粒子サイズ強度および多分散性指数をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって測定した。試料を、エマルションをパルミチン酸オクチルで１重量％に近い濃度まで希釈することによって調製した。測定を２５℃で３連で行った。
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｚｓ：粒子サイズ（ｎｍ）＝６２０ｎｍ、ＰＤＩ＝０．９２
【０１１３】
（実施例３）：ＰＧＩｕ１７０−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４を使用することによるグリセロール中油型エマルション。
【表１１】
2020536088.tif 000025
乳化プロセス
ポリペプチドに基づくブロックコポリマー（ＰＧＩｕ１００−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４）を、磁気撹拌下で周囲温度でクエン酸緩衝液に溶解した（３０分、２５０ｒｐｍ）。その後、プレエマルションを、水相へのパルミチン酸オクチル混合物の添加によって、形成した。混合物を撹拌した（ＲＴ、２５０ｒｐｍ、３０分）。乳化は、１００％の振幅で超音波処理器ＵＰ４００Ｓ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ）を使用した混合物の超音波処理、および５００ｒｐｍで撹拌した３０分間（４００Ｈｚ）の１．０サイクルで構成された。使用量を上記の製剤に示す。
エマルション特徴付け
外観：最終的なナノカプセルの外観を視覚的に分析した。
粒子サイズ：平均粒子サイズ強度および多分散性指数をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって測定した。試料を、エマルションをパルミチン酸オクチルで１重量％に近い濃度まで希釈することによって調製した。測定を２５℃で３連で行った。
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｚｓ：粒子サイズ（ｎｍ）＝１８０ｎｍ、ＰＤＩ＝０．１４
【０１１４】
（実施例４）：Ｐ（Ｇｌｕ６１−ｃｏ−Ｖａｌ１６）−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４を使用することによるグリセロール中油型エマルション。
【表１２】
2020536088.tif 000026
乳化プロセス
ポリペプチドに基づくブロックコポリマー（Ｐ（Ｇｌｕ６１−ｃｏ−Ｖａｌ１６）−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４）を、磁気撹拌下で周囲温度でクエン酸緩衝液に溶解した（３０分、２５０ｒｐｍ）。その後、プレエマルションを、水相へのパルミチン酸オクチル混合物の添加によって、形成した。混合物を撹拌した（ＲＴ、２５０ｒｐｍ、３０分）。乳化は、１００％の振幅で超音波処理器ＵＰ４００Ｓ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ）を使用した混合物の超音波処理、および５００ｒｐｍで撹拌しながらの３０分間（４００Ｈｚ）の１．０サイクルで構成された。使用量を上記の製剤に示す。
エマルション特徴付け
外観：最終的なナノカプセルの外観を視覚的に分析した。
粒子サイズ：平均粒子サイズ強度および多分散性指数をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって測定した。試料を、エマルションをパルミチン酸オクチルで１重量％に近い濃度まで希釈することによって調製した。測定を２５℃で３連で行った。
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｚｓ：粒子サイズ（ｎｍ）＝２１０ｎｍ、ＰＤＩ＝０．２１
【０１１５】
（実施例５）：ＰＧＩｕ１５０−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４を使用したウコン根抽出物のカプセル化のためのグリセロール中油型エマルション
【表１３】
2020536088.tif 000027
乳化プロセス
ポリペプチドに基づくブロックコポリマー（ＰＧＩｕ１５０−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４）を、最初に８０℃で１時間、後に磁気撹拌下（２５０ｒｐｍ）で周囲温度で１８時間、グリセロールに溶解した。その後、プレエマルションを、グリセロール相へのパルミチン酸オクチルおよびウコン根抽出物混合物の添加（ＲＴ、２５０ｒｐｍ、１０分）によって、形成した。混合物を撹拌した（ＲＴ、２５０ｒｐｍ、３０分）。各成分の量を上記の製剤に示す。
乳化は、１００％の振幅で超音波処理器ＵＰ４００Ｓ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ）を使用した混合物の超音波処理、および５００ｒｐｍで撹拌した１０分間（４００Ｈｚ）の１．０サイクルで構成された。
エマルション特徴付け
外観：最終的なナノカプセルの外観を視覚的に分析した。透明で粘稠な良質のエマルション（沈殿なし）が達成された。
粒子サイズ：平均粒子サイズ強度および多分散性指数をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって測定した。試料を、エマルションをＤＤＩ水で１重量％に近い濃度まで希釈することによって調製した。測定を２５℃で３連で行った。
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｚｓ：粒子サイズ（ｎｍ）＝２９０ｎｍ、ＰＤＩ＝０．４０
【０１１６】
（実施例６）：ＰＧＩｕ１５０−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４を使用したセラミドＮＧのカプセル化のためのグリセロール中油型エマルション
【表１４】
2020536088.tif 000028
乳化プロセス
ポリペプチドに基づくブロックコポリマー（ＰＧＩｕ１５０−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４）を、８０℃で１時間、および磁気撹拌下（２５０ｒｐｍ）で周囲温度で１８時間、グリセロールに溶解した。混合物を１０分間、９５℃にさらに調整した。一方、セラミドＮＧ、ジラウラミドグルタミドリジンナトリウム、およびオクチルドデカノールを９５℃（２５０ｒｐｍ）で１０分間混合した。その後、プレエマルションを、オクチルドデカノール相をグリセロール相に混合することによって、形成した。混合物を撹拌した（９５℃、２５０ｒｐｍ、２０分）。各成分の量を上記の製剤に示す。
乳化は、１００％の振幅で超音波処理器ＵＰ４００Ｓ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ）を使用した混合物の超音波処理、および５００ｒｐｍ、６０℃で撹拌した１０分間（４００Ｈｚ）の１．０サイクル（油浴を使用して望ましい温度に達した）で構成された。
エマルション特徴付け
外観：最終的なナノカプセルの外観を視覚的に分析した。乳白色で粘稠な良質のエマルション（沈殿なし）が達成された。
粒子サイズ：平均粒子サイズ強度および多分散性指数をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって測定した。試料を、エマルションをＤＤＩ水で１重量％に近い濃度まで希釈することによって調製した。測定を２５℃で３連で行った。
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｚｓ：粒子サイズ（ｎｍ）＝１６５ｎｍ、ＰＤＩ＝０．０６
【０１１７】
（実施例７）：ＰＧｌｕ１５０−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４を使用したパルミチン酸レチニルのカプセル化のためのグリセロール中油型エマルション
【表１５】
2020536088.tif 000029
乳化プロセス
ポリペプチドに基づくブロックコポリマー（ＰＧｌｕ１５０−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４）を、８０℃で１時間、および磁気撹拌下（２５０ｒｐｍ）で周囲温度で１８時間、グリセロールに溶解した。その後、プレエマルションを、グリセロール相へのパルミチン酸オクチルおよびパルミチン酸レチニル混合物の添加（ＲＴ、２５０ｒｐｍ、１０分）によって、形成した。混合物を撹拌した（ＲＴ、２５０ｒｐｍ、３０分）。各成分の量を上記の製剤に示す。
乳化は、１００％の振幅で超音波処理器ＵＰ４００Ｓ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ）を使用した混合物の超音波処理、および５００ｒｐｍで撹拌した１０分間（４００Ｈｚ）の１．０サイクルで構成された。
エマルション特徴付け
外観：最終的なナノカプセルの外観を視覚的に分析した。透明／黄色がかった粘稠な良質のエマルション（沈殿なし）が達成された。
粒子サイズ：平均粒子サイズ強度および多分散性指数をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって測定した。試料を、エマルションをＤＤＩ水で１重量％に近い濃度まで希釈することによって調製した。測定を２５℃で３連で行った。
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｚｓ：粒子サイズ（ｎｍ）＝２４０ｎｍ、ＰＤＩ＝０．１８。
【０１１８】
（実施例８）：Ｐ（Ｇｌｕ４６−ｃｏ−Ｖａｌ１１）−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４を使用したウコン根抽出物のカプセル化のためのグリセロール中油型エマルション
【表１６】
2020536088.tif 000030
乳化プロセス
ポリペプチドに基づくブロックコポリマー（Ｐ（Ｇｌｕ４６−ｃｏ−Ｖａｌ１１）−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４）を、８０℃で１時間、および磁気撹拌下（２５０ｒｐｍ）で周囲温度で１８時間、グリセロールに溶解した。その後、プレエマルションを、グリセロール相へのパルミチン酸オクチルおよびウコン根抽出物混合物の添加（ＲＴ、２５０ｒｐｍ、１０分）によって、形成した。混合物を機械的撹拌下（４０℃、２５０ｒｐｍ、１０分間）で撹拌した。各成分の量を上記の製剤に示す。
乳化は、４５０／４５ｂａｒの圧力で９サイクル動作する２ステージのＮｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ  Ｐａｎｄａ２Ｋ高圧ホモジナイザーを使用して混合物を均質化することで構成された。
エマルション特徴付け
外観：最終的なナノカプセルの外観を視覚的に分析した。透明で粘稠な良質のエマルション（沈殿なし）が達成された。
粒子サイズ：平均粒子サイズ強度および多分散性指数をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって測定した。試料を、エマルションをＤＤＩ水で１重量％に近い濃度まで希釈することによって調製した。測定を２５℃で３連で行った。
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｚｓ：粒子サイズ（ｎｍ）＝２２０ｎｍ、ＰＤＩ＝０．２０。
【０１１９】
（実施例９）：Ｐ（Ｇｌｕ４６−ｃｏ−Ｖａｌ１１）−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４を使用したセラミドＮＧのカプセル化のためのグリセロール中油型エマルション
【表１７】
2020536088.tif 000031
乳化プロセス
ポリペプチドに基づくブロックコポリマー（Ｐ（Ｇｌｕ４６−ｃｏ−Ｖａｌ１１）−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４）を、８０℃で１時間、および磁気撹拌下（２５０ｒｐｍ）で周囲温度で１８時間、グリセロールに溶解した。混合物を１０分間、９５℃にさらに調整した。一方、セラミドＮＧ、ジラウラミドグルタミドリジンナトリウム、およびオクチルドデカノールを９５℃（２５０ｒｐｍ）で１０分間混合した。その後、プレエマルションを、オクチルドデカノール相をグリセロール相に混合することによって、形成した。混合物を撹拌した（９５℃、２５０ｒｐｍ、２０分）。各成分の量を上記の製剤に示す。
乳化は、１００％の振幅で超音波処理器ＵＰ４００Ｓ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ）を使用した混合物の超音波処理、および５００ｒｐｍ、６０℃で撹拌した１０分間（４００Ｈｚ）の１．０サイクル（油浴を使用して望ましい温度に達した）で構成された。
エマルション特徴付け
外観：最終的なナノカプセルの外観を視覚的に分析した。乳白色で粘稠な良質のエマルション（沈殿なし）が達成された。
粒子サイズ：平均粒子サイズ強度および多分散性指数をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって測定した。試料を、エマルションをＤＤＩ水で１重量％に近い濃度まで希釈することによって調製した。測定を２５℃で３連で行った。
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｚｓ：粒子サイズ（ｎｍ）＝１９０ｎｍ、ＰＤＩ＝０．０４。
【０１２０】
（実施例１０）：Ｐ（Ｇｌｕ４６−ｃｏ−Ｖａｌ１１）−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４を使用したパルミチン酸レチニルのカプセル化のためのグリセロール中油型エマルション
【表１８】
2020536088.tif 000032
乳化プロセス
ポリペプチドに基づくブロックコポリマー（Ｐ（Ｇｌｕ４６−ｃｏ−Ｖａｌ１１）−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４）を、最初に８０℃で１時間、後に磁気撹拌下（１８時間、２５０ｒｐｍ）で周囲温度でグリセロールに溶解した。その後、プレエマルションを、グリセロール相へのパルミチン酸オクチルおよびパルミチン酸レチニル混合物の添加（ＲＴ、２５０ｒｐｍ、１０分）によって、形成した。混合物を撹拌した（ＲＴ、２５０ｒｐｍ、１０分）。乳化は、１００％の振幅で超音波処理器ＵＰ４００Ｓ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ）を使用した混合物の超音波処理、および５００ｒｐｍで撹拌した１０分間（４００Ｈｚ）の１．０サイクルで構成された。各成分の量を上記の製剤に示す。
エマルション特徴付け
外観：最終的なナノカプセルの外観を視覚的に分析した。透明／黄色がかった粘稠な良質のエマルション（沈殿なし）が達成された。
粒子サイズ：平均粒子サイズ強度および多分散性指数をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって測定した。試料を、エマルションをＤＤＩ水で１重量％に近い濃度まで希釈することによって調製した。測定を２５℃で３連で行った。
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｚｓ：粒子サイズ（ｎｍ）＝１５５ｎｍ、ＰＤＩ＝０．１０。
【０１２１】
［共界面活性剤(co-surfactant)の使用］
【０１２２】
上記のブロックコポリマーを、エマルションの作製のための界面活性剤として使用した。ブロックコポリマーと共安定剤の組合せが、親水性活性化合物をカプセル化することができる油中水型および油中グリセロール型ナノカプセルを作製するための効率的な方法であることを実証した。安定なエマルション（粒子サイズに大きな変化がない最低１か月）を作製するために、種々の型の共界面活性剤（または共安定剤）を選択した。
乳化プロセスを、界面活性剤、グリセロールまたは水、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド（ＭＣＴ）油、および油中水型エマルションに適した低ＨＬＢ（親水性親油性バランス）の共界面活性剤を含むプレエマルションを最初に調製し、次いで超音波処理（小規模）または高圧均質化（大規模）によって混合物を乳化することによって行った。実験条件を各例でさらに説明する。
【０１２３】
粒子サイズおよび粒子サイズ分布を動的光散乱測定（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ）によって分析した。ＤＬＳの試料をエマルションをＭＣＴ油で１重量％に近い濃度に希釈することによって調製した。測定を２０℃で３連で行った。
いくつかの例では、粒子サイズの追加の測定をレーザー回折技術（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ）によって行った。
【０１２４】
実施例Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩに示されるように、共界面活性剤の濃度が油中グリセロール型エマルションのカプセル沈殿を回避するための所望の小さいサイズのエマルションを達成するための決定的パラメーターであることが実証された。使用した最良の共界面活性剤は、以下のとおりであった。
・ＥＷＯＣＲＥＡＭ、ソルビトールおよび亜麻仁（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）由来の脂肪酸を有するポリグリセリルエステル（ＨＬＢ：５）、
・Ｍａｓｓｏｃａｒｅ  ＳＭＯ、オレイン酸ソルビタン（ＨＬＢ４．３）、
・Ｍａｓｓａｃｏｒｅ  ＳＭＰ、パルミチン酸ソルビタン（ＨＬＢ６．７）、
・ポリアルド（登録商標）１０−１０−０、ポリグリセリル−１０デカオレエート（ＨＬＢ３）、
・ステアリン酸ソルビタン（ＨＬＢ４．３）。
【０１２５】
（実施例１１）：４．７２重量％のＥｗｏｃｒｅａｍ濃度を有する油中グリセロール型エマルション。
【表１９】
2020536088.tif 000033
乳化プロセス
ペプチドに基づくブロックコポリマーを、終夜磁気撹拌下（２５０ｒｐｍ）で周囲温度でグリセロールに溶解した。その後、プレエマルションを、グリセロール相へのＭＣＴ油／ＥＷＯＣＲＥＡＭ（２５０ｒｐｍ、５分）混合物の添加によって形成した。プレエマルション形成を、磁気撹拌（２５０ｒｐｍ）下で周囲温度で、３０分間行った。
乳化は、１００％の振幅で超音波処理器ＵＰ４００Ｓ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ）を使用した混合物の超音波処理、および５００ｒｐｍで３０分間（４００Ｈｚ）の１．０サイクルで構成された。使用量を上記の製剤に示す。
エマルション特徴付け
外観：最終的なナノカプセルの外観を視覚的に分析した。乳白色の良質のエマルション（沈殿なし）が達成された。
粒子サイズ：平均粒子サイズ強度および多分散性指数をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって測定した。試料を、エマルションをＭＣＴ油で１重量％に近い濃度まで希釈することによって調製した。測定を２０℃で３連で行った。
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｚｓ：粒子サイズ（ｎｍ）＝２６０ｎｍ、ＰＤＩ＝０．１２
安定性：最終的なナノカプセルの安定性を視覚的に分析した。
エマルションは、２週間安定であることが示された。
【０１２６】
（実施例１２）：９．００重量％のＥｗｏｃｒｅａｍ濃度を有する油中グリセロール型エマルション。
【表２０】
2020536088.tif 000034
乳化プロセス
ペプチドに基づくブロックコポリマーを、終夜磁気撹拌下で周囲温度でグリセロールに溶解した。その後、プレエマルションを、グリセロール相へのＭＣＴ油／ＥＷＯＣＲＥＡＭ（２５０ｒｐｍ、５分）混合物の添加によって形成した。プレエマルション形成を、磁気撹拌（２５０ｒｐｍ）下で周囲温度で、３０分間行った。
乳化は、１００％の振幅で超音波処理器ＵＰ４００Ｓ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ）を使用した混合物の超音波処理、および５００ｒｐｍで３０分間（４００Ｈｚ）の１．０サイクルで構成された。使用量を上記の製剤に示す。
エマルション特徴付け
外観：最終的なナノカプセルの外観を視覚的に分析した。乳白色の良質のエマルション（沈殿なし）が達成された。
粒子サイズ：平均粒子サイズ強度および多分散性指数をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって測定した。試料を、エマルションをＭＣＴ油で１重量％の濃度に希釈することによって調製した。測定を２０℃で３連で行った。
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｚｓ：粒子サイズ（ｎｍ）＝３００ｎｍ、ＰＤＩ＝０．２
安定性：最終的なナノカプセルの安定性を視覚的に分析した。
エマルションは、２週間安定であることが示された。
【０１２７】
（実施例１３）：１６．５３重量％のＥｗｏｃｒｅａｍ濃度を有する油中グリセロール型エマルション。
【表２１】
2020536088.tif 000035
乳化プロセス
ペプチドに基づくブロックコポリマーを、終夜磁気撹拌下で周囲温度でグリセロールに溶解した。その後、プレエマルションを、グリセロール相へのＭＣＴ油／ＥＷＯＣＲＥＡＭ（２５０ｒｐｍ、５分）混合物の添加によって形成した。プレエマルション形成を、磁気撹拌（２５０ｒｐｍ）下で周囲温度で、３０分間行った。
乳化は、１００％の振幅で超音波処理器ＵＰ４００Ｓ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ）を使用した混合物の超音波処理、および５００ｒｐｍで３０分間（４００Ｈｚ）の１．０サイクルで構成された。使用量を上記の製剤に示す。
エマルションの特徴付け
外観：最終的なナノカプセルの外観を視覚的に分析した。乳白色の良質のエマルション（沈殿なし）が達成された。
粒子サイズ：平均粒子サイズ強度および多分散性指数をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって測定した。試料を、エマルションをＭＣＴ油で１重量％に近い濃度まで希釈することによって調製した。さらに、測定を２０℃で３連で行った。
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｚｓ：粒子サイズ（ｎｍ）＝１５０ｎｍ、ＰＤＩ＝０．１１
安定性：最終的なナノカプセルの安定性を視覚的に分析した。
エマルションは、長期安定性を示した（サイズに著しい変化なしで１か月を超えて）
【０１２８】
（実施例１４）：１６．５３重量％のＥｗｏｃｒｅａｍ濃度を有する油中水型エマルション。
【表２２】
2020536088.tif 000036
乳化プロセス
ペプチドに基づくブロックコポリマーを、終夜磁気撹拌下で周囲温度でｐＨ＝５．５の緩衝水に溶解した。その後、プレエマルションを、グリセロール相へのＭＣＴ油／ＥＷＯＣＲＥＡＭ混合物の添加によって形成した。プレエマルション形成を、磁気撹拌（２５０ｒｐｍ）下で周囲温度で、３０分間行った。
乳化は、１００％の振幅で超音波処理器ＵＰ４００Ｓ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ）を使用した混合物の超音波処理、および３０分間（４００Ｈｚ）の１．０サイクルで構成された。使用量を上記の製剤に示す。
エマルションの特徴付け
外観：最終的なナノカプセルの外観を視覚的に分析した。
粒子サイズ：平均粒子サイズ強度および多分散性指数をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって測定した。試料を、エマルションをＭＣＴ油で１重量％に近い濃度まで希釈することによって調製した。測定を２０℃で３連で行った。
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｚｓ：粒子サイズ：１８０ｎｍ、ＰＤＩ：０．１４
安定性：最終的なナノカプセルの安定性を視覚的におよびＤＬＳ測定によって分析した。
エマルションは、長期安定性を示した（ＤＬＳ測定によって判断されるように、サイズに著しい変化なしで１か月を超えて）
【０１２９】
実証されているように、ブロックコポリマーと共界面活性剤の濃度のバランスは、カプセルの最終的なサイズを決定する重大なパラメーターであった。共界面活性剤の添加なしで、ブロックコポリマー単独で作製されたエマルションは、沈殿を示す非常に大きなカプセルをもたらしたが、バイアルを手動で撹拌した後、容易に再分散できたことは、言及する価値がある。さらに、共安定剤単独は、最高使用濃度（１６．６７重量％）でさえも、安定な高品質のエマルションを形成することができなかった（実施例１５および１６）。したがって、暴露された実施例は、共界面活性剤の添加により、より小さい直径のカプセルが得られ、カプセルの沈殿を回避し、これによって、より見栄えのよい乳白色の溶液をもたらすことを実証した。
【０１３０】
（実施例１５）：界面活性剤としてのブロックコポリマーを有し、共安定剤を有さない油中グリセロール型エマルション。
【表２３】
2020536088.tif 000037
乳化プロセス
ペプチドに基づくブロックコポリマーを、終夜磁気撹拌下で周囲温度でグリセロールに溶解した。その後、プレエマルションを、混合物へのＭＣＴ油の添加によって形成した。プレエマルション形成を、磁気撹拌しながら（２５０ｒｐｍ）周囲温度で、３０分間行った。
乳化は、１００％の振幅で超音波処理器ＵＰ４００Ｓ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ）を使用した二相性混合物の超音波処理、および５００ｒｐｍで３０分間（４００Ｈｚ）の１．０サイクルで構成された。使用量を上記の製剤に示す。
エマルション特徴付け
外観：最終的なナノカプセルの外観を視覚的に分析した。大きなグリセロール液滴により沈殿が観察された
粒子サイズ：３５２０ｎｍ、ＰＤＩ：０．３１
安定性：最終的なナノカプセルの安定性を視覚的に分析した。
１か月を超えて安定しているが、沈殿が数時間以内に観察された。沈殿したカプセルは、穏やかに手で震盪することにより容易に再分散できることに留意することが重要である。
【０１３１】
実施例１６：界面活性剤としてのブロックコポリマーなしで、共安定剤（ソルビトールおよび亜麻仁（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）油由来の脂肪酸を有するポリグリセリルエステル、商品名：ＥＷＯＣＲＥＡＭ））のみで作製された油中グリセロール型エマルション
【表２４】
2020536088.tif 000038
乳化プロセス
共界面活性剤およびＭＣＴを最初に磁気撹拌（２５０ｒｐｍ）下で周囲温度で混合して、油相を形成した。プレエマルションを、グリセロールを混合物に同じ撹拌条件で３０分間添加することによってさらに作製した。
乳化は、１００％の振幅で超音波処理器ＵＰ４００Ｓ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ）を使用した二相性混合物の超音波処理、および５００ｒｐｍで３０分間（４００Ｈｚ）の１．０サイクルで構成された。使用量を上記の製剤に示す。
エマルション特徴付け
外観：最終的なナノカプセルの外観を視覚的に分析した。沈殿を有する低品質のエマルション
粒子サイズ：
測定せず
安定性：最終的なナノカプセルの安定性を視覚的に分析した。
安定ではない（２４時間未満で相分離）
【０１３２】
ブロックコポリマーと追加の共安定剤の組合せにより、種々の型のブロックコポリマーを有する高品質のエマルションの長期安定性が保証された（実施例１７、１８、および１９）。
【０１３３】
（実施例１７）：ＰＥＧ１１４−Ｐ（Ｇｌｕ４６−ｃｏ−Ｖａｌ１１）ペプチドに基づくブロックコポリマーを有する油中グリセロール型エマルション
【表２５】
2020536088.tif 000039
乳化プロセス
ポリペプチドに基づくブロックコポリマーを、終夜磁気撹拌下で周囲温度でグリセロールに溶解した。その後、プレエマルションを、グリセロール相へのＭＣＴ油／ＥＷＯＣＲＥＡＭ（２５０ｒｐｍ、５分）混合物の添加によって形成した。プレエマルション形成を、磁気撹拌（２５０ｒｐｍ）下で周囲温度で、３０分間行った。
乳化は、１００％の振幅で超音波処理器ＵＰ４００Ｓ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ）を使用した混合物の超音波処理、および３０分間（４００Ｈｚ）５００ｒｐｍの１．０サイクルで構成された。使用量を上記の製剤に示す。
エマルションの特徴付け
外観：最終的なナノカプセルの外観を視覚的に分析した。乳白色の良質のエマルション（沈殿もクリーミングもなし）が達成された。
粒子サイズ：  平均粒子サイズ強度および多分散性指数をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって測定した。試料を、エマルションをＭＣＴ油で１重量％に近い濃度まで希釈することによって調製した。測定を２０℃で３連で行った。
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｚｓ：粒子サイズ（ｎｍ）＝９０ｎｍ、ＰＤＩ＝０．１７
安定性：最終的なナノカプセルの安定性を視覚的におよびＤＬＳ測定によって分析した。
エマルションは、長期安定性を示した（サイズに著しい変化なしで１か月を超えて）。実際、８か月後の粒子サイズは、７０ｎｍであった（ＰＤＩ＝０．２４）。
【０１３４】
（実施例１８）：ＰＥＧ１１４−ＰＧＩｕ９６ペプチドに基づくブロックコポリマーを有する油中グリセロール型エマルション。
【表２６】
2020536088.tif 000040
乳化プロセス
ペプチドに基づくブロックコポリマーを、終夜磁気撹拌下で周囲温度でグリセロールに溶解した。その後、プレエマルションを、グリセロール相へのＭＣＴ油／ＥＷＯＣＲＥＡＭ（２５０ｒｐｍ、５分）混合物の添加によって形成した。プレエマルション形成を、磁気撹拌（２５０ｒｐｍ）下で周囲温度で、３０分間行った。
乳化は、１００％の振幅で超音波処理器ＵＰ４００Ｓ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ）を使用した混合物の超音波処理、および５００ｒｐｍで３０分間（４００Ｈｚ）の１．０サイクルで構成された。使用量を上記の製剤に示す。
エマルションの特徴付け
外観：最終的なナノカプセルの外観を視覚的に分析した。乳白色の良質のエマルション（沈殿もクリーミングもなし）が達成された。
粒子サイズ：平均粒子サイズ強度および多分散性指数をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって測定した。試料を、エマルションをＭＣＴ油で１重量％に近い濃度まで希釈することによって調製した。測定を２０℃で３連で行った。
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｚｓ：粒子サイズ（ｎｍ）＝９０ｎｍ、ＰＤＩ＝０．１７
安定性：最終的なナノカプセルの安定性を視覚的に分析した。
エマルションは、長期安定性を示した（外観に著しい変化なしで１か月を超えて）。
【０１３５】
（実施例１９）：ＰＥＧ１１４−ＰＧＩｕ１５１ペプチドに基づくブロックコポリマーを有する油中グリセロール型エマルション。
【表２７】
2020536088.tif 000041
乳化プロセス
ペプチドに基づくブロックコポリマーを、終夜磁気撹拌下で周囲温度でグリセロールに溶解した。その後、プレエマルションを、グリセロール相へのＭＣＴ油／ＥＷＯＣＲＥＡＭ（２５０ｒｐｍ、５分）混合物の添加によって形成した。プレエマルション形成を、磁気撹拌（２５０ｒｐｍ）下で周囲温度で、３０分間行った。
乳化は、１００％の振幅で超音波処理器ＵＰ４００Ｓ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ）を使用した混合物の超音波処理、および５５０ｒｐｍで３０分間（４００Ｈｚ）の１．０サイクルで構成された。使用量を上記の製剤に示す。
エマルションの特徴付け
外観：最終的なナノカプセルの外観を視覚的に分析した。
乳白色の良質のエマルション（沈殿もクリーミングもなし）が達成された。
粒子サイズ：  平均粒子サイズ強度および多分散性指数をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって測定した。試料を、エマルションをＭＣＴ油で１重量％に近い濃度まで希釈することによって調製した。測定を２０℃で３連で行った。
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｚｓ：粒子サイズ（ｎｍ）＝２６０ｎｍ、ＰＤＩ＝０．１２
安定性：最終的なナノカプセルの安定性を視覚的に分析した。
エマルションは、長期安定性を示した（外観に著しい変化なしで１か月を超えて）。
【０１３６】
上記のように、親水性活性成分を効率的にカプセル化することができる水中油型およびグリセロール中油型エマルションを作製するために、種々の型の共安定剤（または共界面活性剤）が使用され得る。例が、以下の実施例２０に見出され得る。
【０１３７】
（実施例２０）：別の共界面活性剤：ポリグリセリル−１０デカオレエート、商品名Ｐｏｌｙａｌｄｏ（登録商標）１０−１０−０を有する油中水型エマルション
【表２８】
2020536088.tif 000042
乳化プロセス
ペプチドに基づくブロックコポリマーを、終夜磁気撹拌下で周囲温度で蒸留水に溶解した。その後、プレエマルションを、水相へのＭＣＴ油／ＰＯＬＹＡＬＤＯ  １０−１０−０混合物（２５０ｒｐｍ、５分）の添加によって形成した。プレエマルション形成を、磁気撹拌（２５０ｒｐｍ）下で周囲温度で、３０分間行った。
乳化は、１００％の振幅で超音波処理器ＵＰ４００Ｓ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ）を使用した混合物の超音波処理、および５００ｒｐｍで３０分間（４００Ｈｚ）の１．０サイクルで構成された。使用量を上記の製剤に示す。
エマルションの特徴付け
外観：最終的なナノカプセルの外観を視覚的に分析した。
乳白色の良質のエマルション（沈殿もクリーミングもなし）が達成された。
粒子サイズ：  平均粒子サイズ強度および多分散性指数をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって測定した。試料を、エマルションをＭＣＴ油で１重量％に近い濃度まで希釈することによって調製した。測定を２０℃で３連で行った。
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｚｓ：粒子サイズ（ｎｍ）＝３２０ｎｍ、ＰＤＩ＝０．７
安定性：最終的なナノカプセルの安定性を視覚的に分析した。
沈殿が１週間後に観察されたが、エマルションは、手で震盪すること（ハンドシェイキング）によって穏やかに再分散させた後、安定しているように見えた。
【０１３８】
水中油型およびグリセロール中油型エマルションは、種々の型の活性成分を効果的にカプセル化することが実証された。さらに、超音波処理器の代わりに高圧均質化を使用することによって、エマルション作製は、スケーラブルであることが実証された。
グリチルリチン酸二カリウム（ＤＰＧ）を効果的にカプセル化する製剤の小規模および大規模作製の例を実施例２１に示す。スケールアップ作製の優れた再現性が実証された。
【０１３９】
（実施例２１）：カプセル化されたＤＰＧを有するエマルション（小規模および大規模のエマルション）
【表２９】
2020536088.tif 000043
乳化プロセス
「超音波処理プロセスによる小規模」
最初に、ＤＰＧを、２５０ｒｐｍの磁気撹拌下で３０分間７５℃でグリセロールに溶解した。ＤＰＧが適切に溶解したら、ペプチドに基づくブロックコポリマーを添加し、さらに３０分間混合した。
その後、プレエマルションを、グリセロール相へのＭＣＴ油／ＥＷＯＣＲＥＡＭ（２５０ｒｐｍ、５分）混合物の添加によって形成した。プレエマルション形成を、磁気撹拌（３００ｒｐｍ）下で周囲温度で、３０分間行った。
乳化は、１００％の振幅で超音波処理器ＵＰ４００Ｓ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ）を使用した混合物の超音波処理、および５００ｒｐｍで３０分間（４００Ｈｚ）の１．０サイクルで構成された。使用量を上記の製剤に示す。
「高圧ホモジナイザープロセスによる大規模」
最初に、ＤＰＧを、２５０ｒｐｍの磁気撹拌下で３０分間８０℃でグリセロールに溶解した。ＤＰＧが適切に溶解したら、ペプチドに基づくブロックコポリマーを添加し、さらに１時間混合した。
その後、プレエマルションを、グリセロール相へのＭＣＴ油／ＥＷＯＣＲＥＡＭ混合物の添加（５分、２５０ｒｐｍ）によって形成した。プレエマルション形成を、機械的撹拌下で周囲温度で、２０分間行った。
乳化を、４５および４５０ｂａｒの圧力での８サイクルにわたる２バルブ高圧ホモジナイザー中での均質化によって行った。使用量を上記の製剤に示す。
エマルションの特徴付け
外観：最終的なナノカプセルの外観を視覚的に分析した。
小規模：乳白色で黄色に見える良質のエマルション（沈殿もクリーミングもなし）が達成された。
大規模：乳白色で黄色に見える良質のエマルション（沈殿もクリーミングもなし）が達成された。
粒子サイズ：  平均粒子サイズ強度および多分散性指数をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって測定した。試料を、エマルションをＭＣＴ油で１重量％に近い濃度まで希釈することによって調製した。測定を２０℃で３連で行った。さらに、大規模に作製された試料をレーザー回折（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ）を使用してさらに特徴付けた。
小規模
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｚｓ：粒子サイズ（ｎｍ）＝１４０ｎｍ、ＰＤＩ＝０．０７
大規模
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｚｓ：粒子サイズ（ｎｍ）＝１６０ｎｍ、ＰＤＩ＝０．１５
マスターサイザの結果は、大きな粒子の小さな集団の存在を示した。
安定性：最終的なナノカプセルの安定性を視覚的におよびＤＬＳ測定によって分析した。
エマルションは、長期安定性を示した（サイズに著しい変化なしで１か月を超えて）。実際、３か月後の粒子サイズは、１９０ｎｍであった（ＰＤＩ＝０．１２）。
【０１４０】
ヒアルロン酸などの他の天然で感知可能な活性物質も、本特許で特許請求されている製剤を使用してうまくカプセル化された（実施例２２）。
【０１４１】
（実施例２２）：カプセル化されたヒアルロン酸を有するエマルション。
【表３０】
2020536088.tif 000044
乳化プロセス
ヒアルロン酸を、最初に周囲温度で５分間磁気撹拌によって水に溶解した。ペプチドに基づくブロックコポリマーを前の混合物に添加し、終夜磁気撹拌下で周囲温度で混合した。その後、プレエマルションを、水相へのＭＣＴ油／Ｅｗｏｃｒｅａｍ（５分、２５０ｒｐｍ）混合物の添加によって形成した。プレエマルション形成を、磁気撹拌（２５０ｒｐｍ）下で周囲温度で、３０分間行った。
乳化は、１００％の振幅で超音波処理器ＵＰ４００Ｓ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ）を使用した混合物の超音波処理、および５００ｒｐｍで３０分間（４００Ｈｚ）の１．０サイクルで構成された。使用量を上記の製剤に示す。
エマルションの特徴付け
外観：最終的なナノカプセルの外観を視覚的に分析した。ほぼ透明で良質のエマルション（沈殿もクリーミングもなし）が達成された。
粒子サイズ：  平均粒子サイズ強度および多分散性指数をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって測定した。試料を、エマルションをＭＣＴ油で１重量％に近い濃度まで希釈することによって調製した。測定を２０℃で３連で行った。さらに、マスターサイザを、試料を特性付けるためにも使用した。
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｚｓ：粒子サイズ（ｎｍ）＝１１０ｎｍ、ＰＤＩ＝０．２
より大きなサイズの粒子（１０μｍを超える）の大きな集団の存在がレーザー回折により観察された。
安定性：最終的なナノカプセルの安定性を視覚的に分析した。
エマルションは、少なくとも１週間良好な安定性を示した。
【０１４２】
（実施例２３）：ＰＧｌｕ１５０−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４を使用した油中グリセロール型エマルション
【表３１】
2020536088.tif 000045
乳化プロセス
ポリペプチドに基づくブロックコポリマー（ＰＧＩｕ１５０−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４）を、最初に８５℃で１時間、後に磁気撹拌下（１８時間、２５０ｒｐｍ）で周囲温度でグリセロールに溶解した。その後、プレエマルションを、グリセロール相へのＭＣＴ油／ＥＷＯＣＲＥＡＭ（２５０ｒｐｍ、３０分）混合物の添加によって形成した。プレエマルション形成を、磁気撹拌（４００ｒｐｍ）下で周囲温度で、２時間行った。各成分の量を上記の製剤に示す。
乳化は、１００％の振幅で超音波処理器ＵＰ４００Ｓ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ）を使用した混合物の超音波処理、および５００ｒｐｍで撹拌した３０分間（４００Ｈｚ）の１．０サイクルで構成された。
エマルション特徴付け
外観：最終的なナノカプセルの外観を視覚的に分析した。乳白色の良質なエマルション（沈殿なし）が達成された。
粒子サイズ：  平均粒子サイズ強度および多分散性指数をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって測定した。試料を、エマルションをＭＣＴ油で１重量％に近い濃度まで希釈することによって調製した。測定を２０℃で３連で行った。
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｚｓ：粒子サイズ（ｎｍ）＝２１０ｎｍ、ＰＤＩ＝０．４。
【０１４３】
（実施例２４）：Ｐ（Ｇｌｕ４６−ｃｏ−Ｖａｌ１１）−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４を使用した油中グリセロール型エマルション
【表３２】
2020536088.tif 000046
乳化プロセス
ポリペプチドに基づくブロックコポリマー（Ｐ（Ｇｌｕ４６−ｃｏ−Ｖａｌ１１）−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４）を、最初に８０℃で１時間、後に磁気撹拌下（１８時間、２５０ｒｐｍ）で周囲温度でグリセロールに溶解した。その後、プレエマルションを、グリセロール相へのＭＣＴ油／ＥＷＯＣＲＥＡＭ（２５０ｒｐｍ、３０分）混合物の添加によって形成した。プレエマルション形成を、磁気撹拌（２５０ｒｐｍ）下で周囲温度で、３時間行った。各成分の量を上記の製剤に示す。
乳化は、１００％の振幅で超音波処理器ＵＰ４００Ｓ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ）を使用した混合物の超音波処理、および５００ｒｐｍで撹拌した３０分間（４００Ｈｚ）の１．０サイクルで構成された。
エマルション特徴付け
外観：最終的なナノカプセルの外観を視覚的に分析した。
乳白色の良質なエマルション（沈殿なし）が達成された。
粒子サイズ：  平均粒子サイズ強度および多分散性指数をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって測定した。試料を、エマルションをＭＣＴ油で１重量％に近い濃度まで希釈することによって調製した。測定を２０℃で３連で行った。
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｚｓ：粒子サイズ（ｎｍ）＝６６０ｎｍ、ＰＤＩ＝０．６０
【０１４４】
［共界面活性剤を有する式（Ｉ）に基づく活性成分のカプセル化の例］
【０１４５】
［実施例ＶＩＩ］：ＰＥＧ１１４−ＰＧｌｕ１５１を使用したグリチルリチン酸二カリウムのカプセル化のための油中グリセロール型エマルション
【表３３】
2020536088.tif 000047
乳化プロセス
グリチルリチン酸二カリウム（ＤＰＧ）を８０℃で３０分間、２５０ｒｐｍでグリセロールに溶解した。次いで、ポリペプチドに基づくブロックコポリマー（ＰＥＧ１１４−ＰＧＩｕ１５１）を、最初に８５℃で３０分間、後に磁気撹拌下（１８時間、２５０ｒｐｍ）で周囲温度でグリセロール／ＤＰＧ混合物に溶解した。その後、プレエマルションを、グリセロール相へのＭＣＴ油／ＥＷＯＣＲＥＡＭ（２５０ｒｐｍ、３０分）混合物の添加によって形成した。プレエマルション形成を、磁気撹拌（２５０ｒｐｍ）下で周囲温度で、３０分間行った。各成分の量を上記の製剤に示す。
乳化は、１００％の振幅で超音波処理器ＵＰ４００Ｓ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ）を使用した混合物の超音波処理、および５００ｒｐｍで３０分間（４００Ｈｚ）の１．０サイクルで構成された。
エマルション特徴付け
外観：最終的なナノカプセルの外観を視覚的に分析した。
乳白色の良質なエマルション（沈殿なし）が達成された。
粒子サイズ：  平均粒子サイズ強度および多分散性指数をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって測定した。試料を、エマルションをＭＣＴ油で１重量％に近い濃度まで希釈することによって調製した。測定を２０℃で３連で行った。
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｚｓ：粒子サイズ（ｎｍ）＝２１０ｎｍ、ＰＤＩ＝０．２０。
【０１４６】
［実施例ＶＩＩＩ］：ＰＥＧ１１４−ＰＧｌｕ１５１を使用したヒアルロン酸のカプセル化のための油中水型エマルション
【表３４】
2020536088.tif 000048
乳化プロセス
ヒアルロン酸を周囲温度で２５０ｒｐｍで１０分間水に溶解した。次いで、ポリペプチドに基づくブロックコポリマー（ＰＥＧ１１４−ＰＧＩｕ１５１）を周囲温度で１時間混合物に溶解した。その後、プレエマルションを、水相へのイソノナン酸イソノニル／ＥＷＯＣＲＥＡＭ（２５０ｒｐｍ、３０分）混合物の添加によって形成した。プレエマルション形成を、機械的撹拌下（５００ｒｐｍ）で周囲温度で、１０分間行った。各成分の量を上記の製剤に示す。
乳化は、４５０／４５ｂａｒの圧力で９サイクル動作する２ステージのＮｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ  Ｐａｎｄａ２Ｋ高圧ホモジナイザーを使用して混合物を均質化することで構成された。
エマルション特徴付け
外観：最終的なナノカプセルの外観を視覚的に分析した。
乳白色の良質なエマルション（沈殿なし）が達成された。
粒子サイズ：  平均粒子サイズ強度および多分散性指数をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって測定した。試料を、エマルションをイソノナン酸イソノニルで１重量％に近い濃度まで希釈することによって調製した。測定を２０℃で３連で行った。
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｚｓ：粒子サイズ（ｎｍ）＝１２０ｎｍ、ＰＤＩ＝０．１。
【０１４７】
［共界面活性剤を有する式（ＩＩ）に基づく活性成分のカプセル化の例］
【０１４８】
［実施例ＸＶ］：ＰＧｌｕ１５０−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４を使用したグリチルリチン酸二カリウムのカプセル化のための油中グリセロール型エマルション
【表３５】
2020536088.tif 000049
乳化プロセス
グリチルリチン酸二カリウム（ＤＰＧ）を８０℃で３０分間、２５０ｒｐｍでグリセロールに溶解した。次いで、ポリペプチドに基づくブロックコポリマー（ＰＧＩｕ１５０−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４）を、最初に８５℃で１時間、後に磁気撹拌下（１８時間、２５０ｒｐｍ）で周囲温度でグリセロール／ＤＰＧ混合物に溶解した。その後、プレエマルションを、グリセロール相へのＭＣＴ油／ＥＷＯＣＲＥＡＭ（２５０ｒｐｍ、３０分）混合物の添加によって形成した。プレエマルション形成を、機械的撹拌下（２５０ｒｐｍ）で８５℃で、１５分間行った。各成分の量を上記の製剤に示す。
乳化は、４５０／４５ｂａｒの圧力で９サイクル動作する２ステージのＮｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ  Ｐａｎｄａ２Ｋ高圧ホモジナイザーを使用して混合物を均質化することで構成された。
エマルション特徴付け
外観：最終的なナノカプセルの外観を視覚的に分析した。
乳白色の良質なエマルション（沈殿なし）が達成された。
粒子サイズ：  平均粒子サイズ強度および多分散性指数をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって測定した。試料を、エマルションをＭＣＴ油で１重量％に近い濃度まで希釈することによって調製した。測定を２０℃で３連で行った。
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｚｓ：粒子サイズ（ｎｍ）＝１５０ｎｍ、ＰＤＩ＝０．１０
【０１４９】
［実施例ＸＶＩ］：ＰＧｌｕ１５０−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４を使用したヒアルロン酸のカプセル化のための油中水型エマルション
【表３６】
2020536088.tif 000050
乳化プロセス
ヒアルロン酸を周囲温度で２５０ｒｐｍで１０分間水に溶解した。次いで、ポリペプチドに基づくブロックコポリマー（ＰＧＩｕ１５０−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４）を周囲温度で１８時間混合物に溶解した。その後、プレエマルションを、水相へのイソノナン酸イソノニル／ＥＷＯＣＲＥＡＭ（２５０ｒｐｍ、３０分）混合物の添加によって形成した。プレエマルション形成を、機械的撹拌下（５００ｒｐｍ）で周囲温度で、１０分間行った。各成分の量を上記の製剤に示す。
乳化は、４５０／４５ｂａｒの圧力で９サイクル動作する２ステージのＮｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ  Ｐａｎｄａ２Ｋ高圧ホモジナイザーを使用して混合物を均質化することで構成された。
エマルション特徴付け
外観：最終的なナノカプセルの外観を視覚的に分析した。
乳白色の良質なエマルション（沈殿なし）が達成された。
粒子サイズ：  平均粒子サイズ強度および多分散性指数をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって測定した。試料を、エマルションをイソノナン酸イソノニルで１重量％に近い濃度まで希釈することによって調製した。測定を２０℃で３連で行った。
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｚｓ：粒子サイズ（ｎｍ）＝１１０ｎｍ、ＰＤＩ＝０．０９
【０１５０】
［実施例ＸＶＩＩ］：Ｐ（Ｇｌｕ４６−ｃｏ−Ｖａｌ１１）−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬ１Ｇ−ｂ−ＰＥＧ１１４を使用したグリチルリチン酸二カリウムのカプセル化のための油中グリセロール型エマルション
【表３７】
2020536088.tif 000051
乳化プロセス
グリチルリチン酸二カリウム（ＤＰＧ）を８０℃で３０分間、２５０ｒｐｍでグリセロールに溶解した。次いで、ポリペプチドに基づくブロックコポリマー（Ｐ（Ｇｌｕ４６−ｃｏ−Ｖａｌ１１）−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４）を、最初に８０℃で１時間、後に磁気撹拌下（１８時間、２５０ｒｐｍ）で周囲温度でグリセロール／ＤＰＧ混合物に溶解した。その後、プレエマルションを、グリセロール相へのＭＣＴ油／ＥＷＯＣＲＥＡＭ（２５０ｒｐｍ、３０分）混合物の添加によって形成した。プレエマルション形成を、機械的撹拌下（２５０ｒｐｍ）で８５℃で、１５分間行った。各成分の量を上記の製剤に示す。
乳化は、４５０／４５ｂａｒの圧力で９サイクル動作する２ステージのＮｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ  Ｐａｎｄａ２Ｋ高圧ホモジナイザーを使用して混合物を均質化することで構成された。
エマルション特徴付け
外観：最終的なナノカプセルの外観を視覚的に分析した。
乳白色の良質なエマルション（沈殿なし）が達成された。
粒子サイズ：  平均粒子サイズ強度および多分散性指数をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって測定した。試料を、エマルションをＭＣＴ油で１重量％に近い濃度まで希釈することによって調製した。測定を２０℃で３連で行った。
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｚｓ：粒子サイズ（ｎｍ）＝１６０ｎｍ、ＰＤＩ＝０．０５
【０１５１】
［実施例ＸＶＩＩＩ］：Ｐ（Ｇｌｕ４６−ｃｏ−Ｖａｌ１１）−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４を使用したヒアルロン酸のカプセル化のための油中水型エマルション
【表３８】
2020536088.tif 000052
乳化プロセス
ヒアルロン酸を周囲温度で２５０ｒｐｍで１０分間水に溶解した。次いで、ポリペプチドに基づくブロックコポリマー（Ｐ（Ｇｌｕ４６−ｃｏ−Ｖａｌ１１）−ｂ−βＡ−ＰＶＧＬＩＧ−ｂ−ＰＥＧ１１４）を周囲温度で１８時間混合物に溶解した。その後、プレエマルションを、水相へのイソノナン酸イソノニル／ＥＷＯＣＲＥＡＭ（２５０ｒｐｍ、３０分）混合物の添加によって形成した。プレエマルション形成を、機械的撹拌下（５００ｒｐｍ）で周囲温度で、１０分間行った。各成分の量を上記の製剤に示す。
乳化は、４５０／４５ｂａｒの圧力で９サイクル動作する２ステージのＮｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ  Ｐａｎｄａ２Ｋ高圧ホモジナイザーを使用して混合物を均質化することで構成された。
エマルション特徴付け
外観：最終的なナノカプセルの外観を視覚的に分析した。
乳白色の良質なエマルション（沈殿なし）が達成された。
粒子サイズ：  平均粒子サイズ強度および多分散性指数をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって測定した。試料を、エマルションをイソノナン酸イソノニルで１重量％に近い濃度まで希釈することによって調製した。測定を２０℃で３連で行った。
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｚｓ：粒子サイズ（ｎｍ）＝１１５ｎｍ、ＰＤＩ＝０．１４。
【０１５２】
［付記］
完全性のために、本発明の様々な態様を以下の番号が付けられた「条項」に示す。
【０１５３】
条項１．
５０ｎｍ〜５００μｍの直径を有するカプセルであって、水または油の単一の液滴からなるコアを含む、５０ｎｍ〜５００μｍの直径を有するカプセルであってコアが単一の液滴を完全にカプセル化する１つのポリマーシェルによって囲まれており、ポリマーシェルが以下の式（Ｉ）を有するおそらく架橋されたコポリマーからなる、５０ｎｍ〜５００μｍの直径を有するカプセル：
【化１３】
2020536088.tif 000053
式中、
−  ＡＡは、バリン、ロイシン、イオソロイシン、フェニルアラニンなどの疎水性アミノ酸の残基であり、
−  ｘは、１７〜２７０、好ましくは１７〜１１４の整数であり、
−  ｎは、５〜１６０の整数であり、
−  ｍは、０〜８０の整数である。
【０１５４】
条項２．コアが、薬物、ビタミン、抗酸化剤、天然成分、天然抽出物、ペプチド、食品、天然または親水性ポリマー、およびそれらの混合物からなる群から好ましくは選択される少なくとも１つの活性化合物をさらに含む、条項１に記載のカプセル。
条項３．ポリマーシェルが、ｍが０である式（Ｉ）のコポリマーからなる、条項１または２に記載のカプセル。
条項４．コアが水の単一の液滴からなる、条項１〜３のいずれか１項に記載のカプセル。
条項５．コアが油の単一の液滴からなる、条項１〜３のいずれか１項に記載のカプセル。
条項６．油が、植物油、パルミチン酸オクチル、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド、イソノナン酸イソデシル、イソヘキサデカン、スクアレン（フィトスクアレン）、またはシモンジアキネンシス（ホホバ）油などの化粧用油からなる群から選択され、特に、パルミチン酸オクチル、ドデカン、オリーブ油、またはひまわり油である、条項１〜３、および５のいずれか一項に記載のカプセル。
条項７．ポリマーシェルが式（Ｉ）のコポリマーからなり、式中、ｍは、０であり、ｎは、１００または１５１であり、ｘは、１１４である、またはｍは、５であり、ｎは、１６であり、ｘは、１１４である、またはｍは、１１であり、ｎは、４６であり、ｘは、１１４である、条項１〜６のいずれか一項に記載のカプセル。
【０１５５】
条項８．
４〜６．５、好ましくは、５〜６のｐＨのエマルションの安定化のための界面活性剤としての、以下の式（Ｉ）を有するコポリマーの使用：
【化１４】
2020536088.tif 000054
式中、
−  ＡＡは、バリン、ロイシン、イオソロイシン、またはフェニルアラニンなどの疎水性アミノ酸の残基であり、
−  ｘは、１７〜２７０、好ましくは１７〜１１４の整数であり、
−  ｎは、５〜１６０の整数であり、
−  ｍは、０〜８０の整数である。
【０１５６】
条項９．少なくとも１つの条項１〜７のいずれかに記載のカプセルを含む組成物。
条項１０．油中水型エマルションであって、分散水相と、連続脂肪相とを含む、油中水型エマルションであって、
−  連続脂肪相が、植物油、化粧用油、および水非混和性有機溶媒からなる群から好ましくは選択される少なくとも１つの油を含み、特に、パルミチン酸オクチル、ドデカン、オリーブ油、またはひまわり油であり、
−  分散水相が少なくとも１つの条項１〜４、および７のいずれか一項に記載のカプセルを含む、
油中水型エマルション。
条項１１．カプセルが活性化合物をさらに含む、条項１０に記載の油中水型エマルション。
条項１２．水中油型エマルションであって、分散脂肪相と、連続水相とを含む水中油型エマルションであって、
−  連続水相がｐＨ４〜６．５、好ましくは５〜６の水を含み、
−  分散脂肪相が少なくとも１つの条項１〜３、および５〜７のいずれか一項に記載のカプセルを含む、
水中油型エマルション。
条項１３．カプセルが活性化合物をさらに含む、条項１２に記載の水中油型エマルション。
【０１５７】
条項１４．
疎水性活性化合物のカプセル化のための方法であって、
−  疎水性活性化合物を少なくとも１つの油を含む脂肪溶液に溶解することによって脂肪相を調製するステップと、
−  ４〜６．５、好ましくは、５〜６のｐＨの水溶液を調製するステップであって、溶液が条項１〜７のいずれか一項に記載の式（Ｉ）を有するコポリマーを含有するステップと、
−  ５０ｎｍ〜５００μｍの直径を有するカプセルであって、疎水性活性化合物を含有する油の単一の液滴からなるコアを含む、５０ｎｍ〜５００μｍの直径を有するカプセルであって、コアが前記単一の液滴を完全にカプセル化する１つのポリマーシェルによって囲まれており、ポリマーシェルが式（Ｉ）を有するコポリマーからなる、５０ｎｍ〜５００μｍの直径を有するカプセルを得るために、脂肪相を水溶液に分散させるステップと、
−  例えば、遠心分離または透析によって、少なくとも１つの疎水性活性化合物をカプセル化しているカプセルを回収する任意選択のステップと、
を含む、疎水性活性化合物のカプセル化のための方法。
【０１５８】
条項１５．
親水性活性化合物のカプセル化のための方法であって、
−  親水性活性化合物を水に溶解することによって水相を調製するステップと、
−  ４〜６．５、好ましくは、５〜６のｐＨの脂肪溶液を調製するステップであって、溶液が条項１〜７のいずれか一項に記載の式（Ｉ）を有するコポリマーを含有するステップと、
−  ５０ｎｍ〜５００μｍの直径を有するカプセルであって、親水性活性化合物を含有する水の単一の液滴からなるコアを含む、５０ｎｍ〜５００μｍの直径を有するカプセルであって、コアが前記単一の液滴を完全にカプセル化する１つのポリマーシェルによって囲まれており、ポリマーシェルが式（Ｉ）を有するコポリマーからなる、５０ｎｍ〜５００μｍの直径を有するカプセルを得るために、水相を脂肪溶液に分散させるステップと、
−  例えば、遠心分離または透析によって、少なくとも１つの親水性活性化合物をカプセル化するカプセルを回収するステップと、
を含む、親水性活性化合物のカプセル化のための方法。
【０１５９】
条項１６．
少なくとも１つの活性化合物の放出のための方法であって、
−  少なくとも１つの、条項１４または１５に記載の親水性または疎水性活性化合物をカプセル化している少なくとも１つのカプセルを水溶液に添加するステップと、
−  活性化合物を水溶液に放出するために、溶液のｐＨを少なくとも６．５の値、または４未満（好ましくは３未満）の値に調整するステップと、
を含む、少なくとも１つの活性化合物の放出のための方法。
【図１】
2020536088.tif 000057
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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2020536088.tif 000063
2020536088.tif 000064
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【国際調査報告】
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2020536088.tif 000070
2020536088.tif 000071
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