(57)【要約】  機能的ミエリン産生を増進させる細胞を生成する方法であって：（ｉ）ミエリン産生を阻害する能力が減少するように、内因性ＰＬＰ１遺伝子が修飾されている；（ｉｉ）ＰＬＰ１発現を促進する能力が減少するように、内因性ＰＬＰ１遺伝子制御要素が修飾されている；（ｉｉｉ）ＰＬＰ１発現を阻害する能力が増加するように、内因性ＰＬＰ１遺伝子制御要素が修飾されている；または（ｉｖ）ＰＬＰ１発現レベルが減少するように、内因性ＰＬＰ１遺伝子産物、またはＰＬＰ１発現を促進するＰＬＰ１制御要素遺伝子産物が修飾されている；ように細胞を遺伝子修飾する工程を含み、ここで、該細胞が機能的ミエリンを産生する、前記方法。
2020500537.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能的ミエリン産生を増進させる細胞を生成する方法であって：
（ｉ）ミエリン産生を阻害する能力が減少するように、内因性ＰＬＰ１遺伝子が修飾されている；
（ｉｉ）ＰＬＰ１発現を促進する能力が減少するように、内因性ＰＬＰ１遺伝子制御要素が修飾されている；
（ｉｉｉ）ＰＬＰ１発現を阻害する能力が増加するように、内因性ＰＬＰ１遺伝子制御要素が修飾されている、および／または
（ｉｖ）ＰＬＰ１発現レベルが減少するように、内因性ＰＬＰ１遺伝子産物、またはＰＬＰ１発現を促進するＰＬＰ１制御要素遺伝子産物が修飾されている；
ように細胞を遺伝子修飾する工程を含み、
ここで、該細胞が機能的ミエリンを産生するか、あるいは機能的ミエリンを産生する細胞を産生するかまたはこうした細胞に分化する前駆細胞である、
前記方法。
【請求項２】
内因性ＰＬＰ１遺伝子の前記修飾が、内因性ＰＬＰ１遺伝子の発現を減少させるかまたはＰＬＰ１転写物のナンセンス仲介性崩壊を引き起こす突然変異の導入を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
内因性ＰＬＰ１遺伝子または内因性ＰＬＰ１遺伝子制御要素が点突然変異を含み、そして内因性ＰＬＰ１遺伝子または内因性ＰＬＰ１遺伝子制御要素の前記修飾が、点突然変異の野生型配列への修正を含む、請求項１の方法。
【請求項４】
内因性ＰＬＰ１遺伝子制御要素が、ＰＬＰ１遺伝子制御要素の活性を改変するインデルの導入を含む、請求項１〜３のいずれか一項の方法。
【請求項５】
内因性ＰＬＰ１遺伝子制御要素がＰＬＰ１エンハンサーまたはプロモーターである、請求項４の方法。
【請求項６】
内因性ＰＬＰ１遺伝子または内因性ＰＬＰ１遺伝子制御要素の修飾が、ＰＬＰ１におけるヌクレオチド挿入または欠失（インデル）を含む遺伝子修飾の導入を含む、請求項１〜５のいずれか一項の方法。
【請求項７】
内因性ＰＬＰ１遺伝子の修飾が、ＰＬＰ１の大きなエクソン性欠失を含む遺伝子修飾の導入を含む、請求項１〜６のいずれか一項の方法。
【請求項８】
内因性ＰＬＰ１遺伝子が、有害な疾患誘発性突然変異体ＰＬＰ１遺伝子である、請求項１〜７のいずれか一項の方法。
【請求項９】
ヌクレアーゼを用いて細胞を遺伝子修飾する、請求項１〜８のいずれか一項の方法。
【請求項１０】
ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥエフェクター（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系またはＮｇＡｇｏ系を含む、請求項９の方法。
【請求項１１】
内因性ＰＬＰ１遺伝子が、エクソン１またはエクソン３で、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ヌクレアーゼで修飾されている、請求項９の方法。
【請求項１２】
内因性ＰＬＰ１遺伝子が、エクソン３の５’端で、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ヌクレアーゼで修飾されている、請求項１１の方法。
【請求項１３】
ＰＬＰ１遺伝子産物の修飾が、細胞に遺伝子サイレンシング剤を送達する工程を含む、請求項１〜１２のいずれか一項の方法。
【請求項１４】
遺伝子サイレンシング剤が、ＲＮＡｉ構築物（例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ）を含む、請求項１３の方法。
【請求項１５】
遺伝子サイレンシング剤が、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む、請求項１３の方法。
【請求項１６】
遺伝子修飾された細胞が、（例えば細胞におけるＰＬＰ１関連毒性の減少によって）増進されたミエリン産生を示す、請求項１〜１５のいずれか一項の方法。
【請求項１７】
内因性ＰＬＰ１遺伝子またはＰＬＰ１遺伝子制御要素の修飾が、細胞におけるＰＬＰ１関連細胞ストレスを軽減する、請求項１〜１６のいずれか一項の方法。
【請求項１８】
ヌクレアーゼまたは遺伝子サイレンシング剤を含む送達ビヒクルと細胞を接触させる工程を含む、請求項９〜１５のいずれか一項の方法。
【請求項１９】
送達ビヒクルがＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである、請求項１８の方法。
【請求項２０】
（ａ）機能的ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９（例えばＣａｓ９またはＣａｓ９オルソログｃＤＮＡ）をコードする核酸を含む第一のＡＡＶベクター、および内因性ＰＬＰ１遺伝子または内因性ＰＬＰ１遺伝子制御要素におけるターゲット部位に特異的なガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列を含む第二のＡＡＶベクター、および場合によって、内因性ＰＬＰ１遺伝子または内因性ＰＬＰ１遺伝子制御要素の欠陥または突然変異部分の修正または置換のためのドナー核酸配列を含む第三のＡＡＶベクターと、細胞を接触させるか；あるいは
（ｂ）機能的ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９（例えばＣａｓ９またはＣａｓ９オルソログｃＤＮＡ）、およびシスにコードされ、そして内因性ＰＬＰ１遺伝子または内因性ＰＬＰ１遺伝子制御要素におけるターゲット部位に特異的なガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードする核酸を含む第一のＡＡＶベクター、ならびに場合によって、内因性ＰＬＰ１遺伝子または内因性ＰＬＰ１遺伝子制御要素の欠陥または突然変異部分の修正または置換のためのドナー核酸配列を含む第三のＡＡＶベクターと、細胞を接触させる
工程を含む、請求項１９の方法。
【請求項２１】
第一のＡＡＶベクターが、以下の要素：
ｉ）５’ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）；
ｉｉ）プロモーターおよび場合によるエンハンサー；
ｉｉｉ）機能的ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９をコードするＣａｓ９  ｃＤＮＡ；
ｉｖ）ポリアデニル化シグナル；および、
ｖ）３’ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）；
の１つまたはそれより多くを、場合によって５’→３’方向にさらに含む、請求項２０の方法。
【請求項２２】
第二または第三のＡＡＶベクター（存在する場合）が、以下の要素：
ｉ）５’ＡＡＶ  ＩＴＲ；
ｉｉ）プロモーターおよび場合によるエンハンサー；
ｉｉｉ）ガイドＲＮＡ配列；
ｉｖ）スタッファーまたはフィラー核酸配列；および、
ｖ）３’ＡＡＶ  ＩＴＲ；
の１つまたはそれより多くを、場合によって５’→３’方向にさらに含む、請求項２０および２１の方法。
【請求項２３】
第三のＡＡＶベクター（存在する場合）が、以下の要素：
ｉ）５’ＡＡＶ  ＩＴＲ；
ｉｉ）５’スライス（ｓｌｉｃｅ）アクセプター部位；
ｉｉｉ）ドナー核酸配列；
ｉｖ）ポリアデニル化シグナル；および、
ｖ）ＡＡＶ  ３’  ＩＴＲ；
の１つまたはそれより多くを、場合によって５’→３’方向にさらに含む、請求項２０〜２２のいずれかの方法。
【請求項２４】
第一、第二、および／または第三のＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、あるいはその混合物、変異体または誘導体の任意の血清型より選択される、ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３カプシドを含む、請求項１９〜２３のいずれかの方法。
【請求項２５】
５’  ＡＡＶ  ＩＴＲが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはそのキメラもしくは融合体のいずれか１つより選択されるか、あるいは３’  ＡＡＶ  ＩＴＲが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはそのキメラもしくは融合体のいずれか１つより選択される、請求項２１〜２４のいずれかの方法。
【請求項２６】
細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、またはｅｘ  ｖｉｖｏで接触させる、請求項１８〜２５のいずれか一項の方法。
【請求項２７】
請求項２０〜２６のいずれか一項の第一および第二のＡＡＶベクター（および場合によって第三のＡＡＶベクター）を含む、組成物。
【請求項２８】
請求項２７の組成物を含む、医薬組成物。
【請求項２９】
請求項１〜２６のいずれか一項の方法によって生成される遺伝子修飾細胞。
【請求項３０】
細胞が、神経幹細胞（ＮＳＣ）、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）、またはオリゴデンドロサイト細胞より選択される、請求項２９の細胞。
【請求項３１】
細胞がＮＳＣまたはＯＰＣである、請求項３０の細胞。
【請求項３２】
請求項２９〜３１のいずれか一項の細胞に由来する、遺伝子修飾細胞。
【請求項３３】
請求項２９〜３２のいずれか一項の遺伝子修飾細胞を含む、組成物。
【請求項３４】
被験体において、ミエリン関連障害を治療する方法であって、請求項１〜２６のいずれか一項の方法によって生成された細胞を被験体に投与し、それによって被験体において機能的ミエリンを産生する工程を含み、ここで、ミエリン関連障害が、好ましくは異常なＰＬＰ１遺伝子活性および／または発現によって特徴付けられる、前記方法。
【請求項３５】
被験体において、ミエリン関連障害を治療する方法であって、請求項１〜２６のいずれか一項の方法にしたがって被験体の細胞を遺伝子修飾し、それによって被験体において機能的ミエリンを産生する工程を含み、ここで、ミエリン関連障害が、好ましくは異常なＰＬＰ１遺伝子活性および／または発現によって特徴付けられる、前記方法。
【請求項３６】
ミエリン関連障害が、多発性硬化症（ＭＳ）、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、横断性脊髄炎、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、ギラン・バレー症候群、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中央ミエリン溶解（ＣＰＭ）、副腎白質ジストロフィー、アレクサンダー病、ペリツェウス・メルツバッハ病（ＰＭＤ）、ウォラー変性、視神経炎、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄傷害、外傷性脳傷害、放射線照射後の傷害、化学療法の神経学的合併症、脳卒中、急性虚血性視神経症、ビタミンＥ欠乏、孤立性ビタミンＥ欠乏症候群、ＡＲ、バッセン・コーンツヴァイク症候群、マルキアファーヴァ・ビニャミ症候群、異染性白質ジストロフィー、三叉神経痛、急性散在性脳炎、マリー・シャルコー・ツース病およびベル麻痺より選択される、請求項３４または３５の方法。
【請求項３７】
ミエリン関連障害が白質ジストロフィーを含む、請求項３４または３５の方法。
【請求項３８】
ミエリン関連障害がペリツェウス・メルツバッハ病（ＰＭＤ）を含む、請求項３４または３５の方法。
【請求項３９】
被験体の寿命を、ミエリン関連障害を持たない対照被験体の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または約１００％まで回復させる、請求項３８の方法。
【請求項４０】
前記ミエリン関連障害を伴う被験体の少なくとも１つの症状（単数または複数）を回復させる、請求項３８または３９の方法。
【請求項４１】
被験体の機能を、ミエリン関連障害を持たない対照被験体の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または約１００％まで回復し、好ましくは機能が運動協調、自発運動、および軸索伝達速度である、請求項３８〜４０のいずれか一項の方法。
【請求項４２】
細胞が、遺伝子修飾ＮＳＣ、ＯＰＣ、およびオリゴデンドロサイトからなる群より選択される、請求項３４〜４１のいずれか一項の方法。
【請求項４３】
内因性ＰＬＰ１遺伝子またはその遺伝子制御要素、またはその部分（例えば４．８、４．５、４．０、３．５、３．０、２．５、２．０、１．５または１．０ｋｂより長くない部分）が不活性化されるか、破壊されるか、修正されるかまたは置換される、請求項３４〜４２のいずれか一項の方法。
【請求項４４】
被験体が哺乳動物、例えばヒト（例えば２０歳、１５歳、１０歳、５歳、３歳、２歳、１歳、６ヶ月齢、３ヶ月齢、１ヶ月齢、２週齢、１週齢、３日齢、または１日齢より若いヒト）である、請求項３４〜４３のいずれか一項の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する参照
[0001]本出願は、２０１６年１２月８日出願の米国仮特許出願第６２／４３１，７８７号、および２０１７年８月８日出願の米国仮特許出願第６２／５４２，６６０号の出願日の優先権を請求し、該出願各々の全内容は、本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
[0002]ミエリン関連障害は、数百万の人々に影響を及ぼし、罹患した個人およびその家族に対して、疾病率および死亡率の重い負担を課す。白質ジストロフィーは遺伝性ミエリン関連障害であり、米国において、合計で、７，５００人の新生児のうち１人に影響を及ぼす。これらの障害は、疾患修飾療法を欠き、そして必然的に小児期および青年期に、深刻な疾病率および死亡率を生じる。いくつかの一般的な白質ジストロフィーは、中枢神経系（ＣＮＳ）におけるオリゴデンドロサイトによる神経軸索の不適切なミエリン形成（ミエリン・ラッピング）を生じる、既知の遺伝子突然変異を有する。
【０００３】
[0003]ペリツェウス・メルツバッハ病（ＰＭＤ）は特に重度の白質ジストロフィーであり、４ヶ月齢までに重大な認知および運動欠陥を、そして小児期または青年期初期に死亡を引き起こす。より極端な症例では、患者は誕生２週間以内に症状を経験し、歩くこともまたは話すことも学ばず、そして１０歳になる前に疾患に屈する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
[0004]不運なことに、これらの障害の多くの根底にある病理学的プロセスは、ほとんど理解されないままであり、そして疾患修飾療法はほとんど存在しない。したがって、中枢神経系ミエリンに影響を及ぼす障害に対する療法に関して、差し迫った必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
[0005]本明細書記載の態様は、遺伝子治療またはゲノム操作を用いて、ミエリン関連障害を治療するための組成物および方法に関する。
[0006]したがって、１つの側面において、本発明は、機能的ミエリン産生を増進させる細胞を生成する方法であって：（ｉ）ミエリン産生を阻害する能力が減少するように、内因性ＰＬＰ１遺伝子が修飾されている；（ｉｉ）ＰＬＰ１発現を促進する能力が減少するように、内因性ＰＬＰ１遺伝子制御要素が修飾されている；（ｉｉｉ）ＰＬＰ１発現を阻害する能力が増加するように、内因性ＰＬＰ１遺伝子制御要素が修飾されている；あるいは（ｉｖ）ＰＬＰ１発現レベルが減少するように、内因性ＰＬＰ１遺伝子産物、またはＰＬＰ１発現を促進するＰＬＰ１制御要素遺伝子産物が修飾されているように、細胞を遺伝子修飾する工程を含み、ここで、該細胞が機能的ミエリンを産生するか、あるいは機能的ミエリンを産生する細胞を産生するかまたはこうした細胞に分化する前駆細胞である、前記方法を提供する。
【０００６】
[0007]いくつかの態様において、生成される細胞は、細胞におけるＰＬＰ１関連毒性を減少させることによって、ミエリン産生を増進させる。特定の態様において、内因性ＰＬＰ１遺伝子またはＰＬＰ１遺伝子制御要素の修飾は、細胞におけるＰＬＰ１関連細胞ストレスを軽減する。
【０００７】
[0008]いくつかの態様において、内因性ＰＬＰ１遺伝子の修飾には、内因性ＰＬＰ１遺伝子の発現を減少させるかまたはＰＬＰ１転写物の（例えばナンセンス仲介性崩壊を通じた）分解を生じる突然変異の導入が含まれることも可能である。
【０００８】
[0009]特定の態様において、内因性ＰＬＰ１遺伝子または内因性ＰＬＰ１遺伝子制御要素は点突然変異を含み、そして内因性ＰＬＰ１遺伝子または内因性ＰＬＰ１遺伝子制御要素の前記修飾は、点突然変異の野生型配列への修正を含む。
【０００９】
[0010]特定の態様において、内因性ＰＬＰ１遺伝子制御要素は、ＰＬＰ１エンハンサーまたはプロモーターである。
[0011]いくつかの態様において、内因性ＰＬＰ１遺伝子制御要素の遺伝子修飾には、ＰＬＰ１遺伝子制御要素の活性を改変する小さい挿入または欠失（インデル）、あるいはＰＬＰ１のより大きなエクソン性欠失の導入が含まれることも可能である。
【００１０】
[0012]特定の態様において、遺伝子修飾には、エクソン１における開始コドン近傍またはＰＬＰ１の最初の３つのエクソンのいずれかの位置における大きな欠失が含まれることも可能である。例示的な態様において、遺伝子修飾には、ＰＬＰ１のエクソン３の５’端での大きな欠失が含まれることも可能である。
【００１１】
[0013]他の態様において、内因性ＰＬＰ１遺伝子制御要素の修飾には、ＰＬＰ１遺伝子制御要素、例えばＰＬＰ１エンハンサーまたはプロモーターの活性を改変する、インデルまたはより大きな欠失の導入が含まれることも可能である。いくつかの側面において、内因性ＰＬＰ１遺伝子制御要素は、ＰＬＰ１転写を促進する能力が減少するように修飾される。例えば、修飾には、ＰＬＰ１エンハンサーまたはプロモーターの破壊が含まれることも可能である。
【００１２】
[0014]特定の態様において、内因性ＰＬＰ１遺伝子は、有害な疾患誘発性突然変異体ＰＬＰ１遺伝子である。
[0015]いくつかの態様において、内因性ＰＬＰ１遺伝子またはＰＬＰ１遺伝子制御要素の修飾は、ヌクレアーゼを用いて作製可能である。ヌクレアーゼには、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥエフェクター（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系またはＮｇＡｇｏ系が含まれうる。
【００１３】
[0016]特定の態様において、ヌクレアーゼには、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が含まれうる。例えば、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系には、ＩＩ型Ｃａｓ９に基づくＣＲＩＳＰＲ系またはＶ型Ｃｐｆ１に基づくＣＲＩＳＰＲ系が含まれうる。
【００１４】
[0017]特定の態様において、ＰＬＰ１遺伝子は、エクソン１またはエクソン３で、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ヌクレアーゼで修飾される。特定の態様において、ＰＬＰ１遺伝子は、エクソン３の５’端で、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ヌクレアーゼで修飾される。特定の態様において、ＰＬＰ１遺伝子は、エクソン１における開始コドンの破壊によって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ヌクレアーゼで修飾される。
【００１５】
[0018]いくつかの態様において、ＰＬＰ１遺伝子産物またはＰＬＰ１制御要素遺伝子産物の修飾には、細胞に遺伝子サイレンシング剤を送達する工程が含まれる。いくつかの態様において、遺伝子サイレンシング剤には、ＲＮＡｉ構築物（例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ、あるいは転写されてこれらを産生可能である構築物）が含まれることも可能である。
【００１６】
[0019]いくつかの態様において、遺伝子サイレンシング剤には、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）が含まれることも可能である。
[0020]特定の態様において、遺伝子修飾された細胞は、（例えば細胞におけるＰＬＰ１関連毒性の減少によって）増進されたミエリン産生を示す。
【００１７】
[0021]特定の態様において、方法は、ヌクレアーゼまたは遺伝子サイレンシング剤を含む送達ビヒクルと細胞を接触させる工程を含む。
[0022]特定の態様において、送達ビヒクルは、ＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである。
【００１８】
[0023]特定の態様において、方法は：（ａ）機能的ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９（例えばＣａｓ９またはＣａｓ９オルソログｃＤＮＡ）をコードする核酸を含む第一のＡＡＶベクター、および内因性ＰＬＰ１遺伝子または内因性ＰＬＰ１遺伝子制御要素におけるターゲット部位に特異的なガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列を含む第二のＡＡＶベクター、および場合によって、内因性ＰＬＰ１遺伝子または内因性ＰＬＰ１遺伝子制御要素の欠陥または突然変異部分の修正または置換のためのドナー核酸配列を含む第三のＡＡＶベクターと、細胞を接触させるか；あるいは（ｂ）機能的ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９（例えばＣａｓ９またはＣａｓ９オルソログｃＤＮＡ）、およびシスにコードされ、そして内因性ＰＬＰ１遺伝子または内因性ＰＬＰ１遺伝子制御要素におけるターゲット部位に特異的なガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードする核酸を含む第一のＡＡＶベクター、ならびに場合によって、内因性ＰＬＰ１遺伝子または内因性ＰＬＰ１遺伝子制御要素の欠陥または突然変異部分の修正または置換のためのドナー核酸配列を含む第三のＡＡＶベクターと、細胞を接触させる工程を含む。
【００１９】
[0024]特定の態様において、第一のＡＡＶベクターは、以下の要素：ｉ）５’ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）；ｉｉ）プロモーターおよび場合によるエンハンサー；ｉｉｉ）機能的ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９をコードするＣａｓ９  ｃＤＮＡ；ｉｖ）ポリアデニル化シグナル；および、ｖ）３’ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）；の１つまたはそれより多くを、場合によって５’→３’方向にさらに含む。
【００２０】
[0025]特定の態様において、プロモーターおよび場合によるエンハンサーは、遍在性または恒常性プロモーターおよび場合による遍在性または恒常性エンハンサー；制御可能、誘導性または脱抑制可能プロモーターおよび場合による制御可能、誘導性または脱抑制可能エンハンサー；組織特異的プロモーターおよび場合による組織特異的エンハンサー；ウイルスプロモーターおよび場合によるウイルスエンハンサー；接合体、ＯＰＣ、ＮＳＣ、またはオリゴデンドロサイトにおいて活性であるプロモーター；ウイルスプロモーター、場合によってＣＭＶプロモーター、またはウイルスエンハンサー；哺乳動物ベータアクチンプロモーター；ニワトリベータアクチンプロモーター；哺乳動物Ｕ６プロモーター；またはヒトＵ６プロモーターであることも可能である。
【００２１】
[0026]特定の態様において、第二または第三のＡＡＶベクター（存在する場合）は、以下の要素：ｉ）５’ＡＡＶ  ＩＴＲ；ｉｉ）プロモーターおよび場合によるエンハンサー；ｉｉｉ）ガイドＲＮＡ配列；ｉｖ）スタッファーまたはフィラー核酸配列；および、ｖ）３’ＡＡＶ  ＩＴＲ；の１つまたはそれより多くを、場合によって５’→３’方向にさらに含む。
【００２２】
[0027]特定の態様において、第三のＡＡＶベクター（存在する場合）は、以下の要素：ｉ）５’ＡＡＶ  ＩＴＲ；ｉｉ）５’スライス（ｓｌｉｃｅ）アクセプター部位；ｉｉｉ）ドナー核酸配列；ｉｖ）ポリアデニル化シグナル；および、ｖ）ＡＡＶ  ３’  ＩＴＲ；の１つまたはそれより多くを、場合によって５’→３’方向にさらに含む。
【００２３】
[0028]特定の態様において、第一、第二、および／または第三のＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、あるいはその混合物、変異体または誘導体の任意の血清型より選択される、ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３カプシドを含む。
【００２４】
[0029]特定の態様において、５’  ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはそのキメラもしくは融合体のいずれか１つより選択されるか、あるいは３’   ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはそのキメラもしくは融合体のいずれか１つより選択される。
【００２５】
[0030]特定の態様において、細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、またはｅｘ  ｖｉｖｏで接触させる。
[0031]本発明の別の側面は、本明細書記載の態様いずれかの第一および第二のＡＡＶベクター（および場合によって第三のＡＡＶベクター）を含む、組成物を提供する。
【００２６】
[0032]本発明の別の側面は、本明細書記載の組成物を含む、医薬組成物を提供する。
[0033]本発明の別の側面は、遺伝子修飾細胞を提供する。細胞は：（ｉ）ミエリン産生を阻害する能力が減少するように、内因性ＰＬＰ１遺伝子が修飾されている；（ｉｉ）ＰＬＰ１発現を促進する能力が減少するように、内因性ＰＬＰ１遺伝子制御要素が修飾されている；（ｉｉｉ）ＰＬＰ１発現を阻害する能力が増加するように、内因性ＰＬＰ１遺伝子制御要素が修飾されている；あるいは（ｉｖ）ＰＬＰ１発現レベルが減少するように、内因性ＰＬＰ１遺伝子産物、またはＰＬＰ１発現を促進するＰＬＰ１制御要素遺伝子産物が修飾されているように遺伝子修飾されている；ことも可能であり、ここで、該細胞は機能的ミエリンを産生するか、あるいは機能的ミエリンを産生する細胞を産生するかまたはこうした細胞に分化する前駆細胞である。
【００２７】
[0034]特定の態様において、細胞は、神経幹細胞（ＮＳＣ）、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）、ニューロン細胞、および、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、上衣細胞、またはミクログリア細胞などのグリア細胞、好ましくはＮＳＣ、ＯＰＣ、およびオリゴデンドロサイト、より好ましくはＮＳＣまたはＯＰＣより選択される。
【００２８】
[0035]本発明のさらに他の側面は：（ｉ）ミエリン産生を阻害する能力が減少するように、内因性ＰＬＰ１遺伝子が修飾されている；（ｉｉ）ＰＬＰ１発現を促進する能力が減少するように、内因性ＰＬＰ１遺伝子制御要素が修飾されている；（ｉｉｉ）ＰＬＰ１発現を阻害する能力が増加するように、内因性ＰＬＰ１遺伝子制御要素が修飾されている：あるいは（ｉｖ）ＰＬＰ１発現レベルが減少するよう、内因性ＰＬＰ１遺伝子産物またはＰＬＰ１発現を促進するＰＬＰ１制御要素遺伝子産物が修飾されているように遺伝子修飾されている細胞に由来するかまたはこうした細胞から分化した、遺伝子修飾細胞に関し、ここで、該細胞は機能的ミエリンを産生するか、あるいは機能的ミエリンを産生する細胞を産生するかまたはこうした細胞に分化する前駆細胞である。
【００２９】
[0036]本発明のさらに他の側面は、上記の遺伝子修飾細胞を含む組成物、および被験体においてミエリン関連障害を治療する方法に関する。該方法には：（ｉ）ミエリン産生を阻害する能力が減少するように、内因性ＰＬＰ１遺伝子が修飾されている；（ｉｉ）ＰＬＰ１発現を促進する能力が減少するように、内因性ＰＬＰ１遺伝子制御要素が修飾されている；（ｉｉｉ）ＰＬＰ１発現を阻害する能力が増加するように、内因性ＰＬＰ１遺伝子制御要素が修飾されている；あるいは（ｉｖ）ＰＬＰ１発現レベルが減少するよう、内因性ＰＬＰ１遺伝子産物またはＰＬＰ１発現を促進するＰＬＰ１制御要素遺伝子産物が修飾されているように遺伝子修飾されている細胞であって、被験体において、機能的ミエリンを産生するか、あるいは機能的ミエリンを産生する細胞を産生するかまたはこうした細胞に分化する前駆細胞である、前記細胞を、被験体に投与する工程が含まれることも可能である。
【００３０】
[0037]関連する側面において、本発明は、被験体において、ミエリン関連障害を治療する方法であって、本明細書記載の本発明の方法にしたがって被験体の細胞を遺伝子修飾し、それによって被験体において機能的ミエリンを産生する工程を含み、ここで、ミエリン関連障害が、好ましくは異常なＰＬＰ１遺伝子活性および／または発現によって特徴付けられる、前記方法を提供する。
【００３１】
[0038]特定の態様において、ミエリン関連障害は、多発性硬化症（ＭＳ）、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、横断性脊髄炎、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、ギラン・バレー症候群、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中央ミエリン溶解（ＣＰＭ）、副腎白質ジストロフィー、アレクサンダー病、ペリツェウス・メルツバッハ病（ＰＭＤ）、ウォラー変性、視神経炎、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄傷害、外傷性脳傷害、放射線照射後の傷害、化学療法の神経学的合併症、脳卒中、急性虚血性視神経症、ビタミンＥ欠乏、孤立性ビタミンＥ欠乏症候群、バッセン・コーンツヴァイク症候群、マルキアファーヴァ・ビニャミ症候群、三叉神経痛、マリー・シャルコー・ツース病、ベル麻痺、および白質ジストロフィーより選択される。
【００３２】
[0039]他の態様において、ミエリン関連障害は、白質ジストロフィー、例えばミエリン塩基性タンパク質欠損を伴う１８ｑ症候群、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性散在性白質脳炎、急性出血性白質脳症、副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）、副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）、成人発症型常染色体優性白質ジストロフィー（ＡＤＬＤ）、成人ポリグルコサン小体病、アイカルディ・グティエール症候群、アレクサンダー病、神経軸索球体を伴う常染色体優性びまん性白質脳症（ＨＤＬＳ）、常染色体優性後期発症型白質脳症、カナバン病、びまん性ＣＮＳミエリン形成不全を伴う小児期運動失調（ＣＡＣＨまたは白質消失病）、皮質下梗塞と白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症（ＣＡＤＡＳＩＬ）、カルシウム沈着および嚢胞を伴う脳網膜微細血管造影、脳腱黄色腫症（ＣＴＸ）、中枢神経系ミエリン形成不全を伴う小児期運動失調（ＣＡＣＨ）、白質脳症を伴う頭蓋骨骨幹端異形成症、嚢胞性白質脳症（ＲＮＡＳＥＴ２関連）、超長鎖脂肪酸伸長４（ＥＬＯＶＬ４；偽シェーグレン・ラルソン）、臨床症状を伴わない広範囲脳白質異常、小脳失調および認知症として現れる家族性成人発症型白質ジストロフィー、成人発症型認知症および異常糖脂質貯蔵を伴う家族性白質ジストロフィー、脂肪酸２−ヒドロキシラーゼ不全、フコシドーシス、福山型先天性筋ジストロフィー、ガラクトシアリドーシス、グロボイド細胞白質ジストロフィー（クラッベ病）、ＧＭ１ガングリオシドーシス、ＧＭ２ガングリオシドーシス（テイ・サックス病）、慢性進行性多発性硬化症模倣性の遺伝性成人発症型白質ジストロフィー、軸索球体を伴う遺伝性びまん性白質脳症（ＨＤＬＳ）、基底核および小脳の萎縮を伴うミエリン形成不全（Ｈ−ＡＢＣ）、ミエリン形成不全、低ゴナドトロピン性、性腺機能低下および歯数不足（４Ｈ症候群）、白質ジストロフィーを伴う脂肪膜性骨形成異常（那須病）、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、皮質下嚢胞を伴う大頭型白質脳症（ＭＬＣ）、軸索球体を伴う神経軸索白質脳症（球体を伴う遺伝性びまん性白質脳症−ＨＤＬＳ）、新生児副腎白質ジストロフィー（ＮＡＬＤ）、大脳白質異常を伴う眼歯牙指（Ｏｃｕｌｏｄｅｔａｔｏｌｄｉｇｉｔａｌ）異形成、色素沈着グリアを伴う正染性白質ジストロフィー、卵巣白質ジストロフィー症候群、ペリツェウス・メルツバッハ病（Ｘ染色体連鎖痙性対麻痺）、レフサム病、シェーグレン・ラルソン症候群、スダン好性白質ジストロフィー、ファン・デル・ナープ症候群（皮質下嚢胞を伴う空胞化白質ジストロフィーまたはＭＬＣ）、白質消失病（ＶＷＭ）またはびまん性中枢神経系ミエリン形成不全を伴う小児期運動失調（ＣＡＣＨ）、Ｘ染色体連鎖副腎白質ジストロフィー（Ｘ−ＡＬＤ）、ツェルウェーガー症候群スペクトラム：ツェルウェーガー症候群、新生児副腎白質ジストロフィー、ならびに乳児レフサム病であることも可能である。
【００３３】
[0040]特定の態様において、ミエリン関連障害には、ペリツェウス・メルツバッハ病（ＰＭＤ）が含まれる。
[0041]特定の態様において、方法は、被験体の寿命を、ミエリン関連障害を持たない対照被験体の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または約１００％まで回復する。
【００３４】
[0042]特定の態様において、方法は、前記ミエリン関連障害に関連する被験体の少なくとも１つの症状を軽減する。
[0043]特定の態様において、方法は、被験体の機能を、ミエリン関連障害を持たない対照被験体の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または約１００％まで回復させ、好ましくは機能は運動協調、自発運動、および軸索伝達速度である。
【００３５】
[0044]特定の態様において、細胞は、遺伝子修飾ＮＳＣ、ＯＰＣ、ニューロン細胞、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、上衣細胞、およびミクログリア細胞からなる群より選択され、好ましくはＮＳＣ、ＯＰＣ、またはオリゴデンドロサイトである。
【００３６】
[0045]特定の態様において、内因性ＰＬＰ１遺伝子またはその遺伝子制御要素、あるいはその部分（例えば４．８、４．５、４．０、３．５、３．０、２．５、２．０、１．５または１．０ｋｂより長くない部分）が不活性化されるか、破壊されるか、修正されるかまたは置換される。
【００３７】
[0046]特定の態様において、被験体は、哺乳動物、例えばヒト（例えば２０歳、１５歳、１０歳、５歳、３歳、２歳、１歳、６ヶ月齢、３ヶ月齢、１ヶ月齢、２週齢、１週齢、３日齢、または１日齢より若いヒト）である。
【００３８】
[0047]本明細書に開示する特徴のすべては、任意の組み合わせで組み合わせ可能である。本明細書に開示する各特徴は、別に明記されない限り、同じ、同等の、または類似の目的を果たす別の特徴によって置換可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】[0048]図１は、野生型のＭＢＰ（ミエリン塩基性タンパク質）染色と区別不能である、ＰＬＰ１インデル修正ｊｉｍｐｙ（またはｃｒｉｍｐｙ）ＰＭＤモデルマウスにおける中枢神経系の完全ミエリン形成を示す、組織学的分析の画像である。
【図２】[0049]図２は、マウスＰＬＰ１遺伝子におけるｊｉｍｐｙ遺伝子突然変異の位置、および最終的にオリゴデンドロサイトの死を引き起こす、生じる遺伝子産物を示す模式図（正確な縮尺ではない）である。図の下部は、約２３日間の生存中央値を持つｊｉｍｐｙマウスの非常に減少した寿命を示す。
【図３】[0050]図３は、ｊｉｍｐｙマウス脳における重度のミエリン形成不全を示す。野生型対照のものに比較して、生後１９日（Ｐ１９）ｊｉｍｐｙマウス脳切片における成熟オリゴデンドロサイトを示す、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）染色が有意により少ないことに注目されたい。ｊｉｍｐｙマウスはまた、同じ日齢で、企図振戦および運動失調の神経学的症状も示す（データ未提示）。
【図４】[0051]図４および５は、エクソン３のＣＲＩＳＰＲ  ＳｐＣａｓ９／二重ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）ターゲティングを通じて、ｊｉｍｐｙマウスの接合体においてＰＬＰ１遺伝子をノックアウトして、ＣＲＩＳＰＲ−ノックアウトｊｉｍｐｙ（ＣＲ−ｉｍｐｙ［またはｃｒｉｍｐｙ］）子孫マウスを生成する、例示的なアプローチを示す模式図である。図４は、エクソン３におけるｓｇＲＮＡターゲティング部位の相対的位置を示す。
【図５】図４および５は、エクソン３のＣＲＩＳＰＲ  ＳｐＣａｓ９／二重ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）ターゲティングを通じて、ｊｉｍｐｙマウスの接合体においてＰＬＰ１遺伝子をノックアウトして、ＣＲＩＳＰＲ−ノックアウトｊｉｍｐｙ（ＣＲ−ｉｍｐｙ［またはｃｒｉｍｐｙ］）子孫マウスを生成する、例示的なアプローチを示す模式図である。図５は、ｓｇＲＮＡおよびＳｐＣａｓ９  ｍＲＮＡを受け入れるためのｊｉｍｐｙ雄接合体を生成する一般的な実験アプローチを示す。ｊｉｍｐｙ  ＰＬＰ１遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９仲介性ノックアウトが成功すると、代理ホスト雌からＰＬＰ１ヌル雄ＣＲ−ｉｍｐｙ創始者が生まれる。さらなる特徴付けのため、２世代を親系統に交配して、子孫マウスを生じる。生後２１日（Ｐ２１）、大部分のｊｉｍｐｙマウスは重度の神経学的症状を示すかまたは死亡したが、ＣＲ−ｉｍｐｙマウスは、明白な表現型を欠いた（データ未提示）。
【図６】[0052]図６は、ＣＲ−ｉｍｐｙマウスがｊｉｍｐｙおよび野生型対照に比較して、回復した寿命を有することを示す。
【図７】[0053]図７は、ＣＲ−ｉｍｐｙマウスが、ＭＢＰを検出する全脳ＩＨＣによって、成熟オリゴデンドロサイトの回復を示すことを示す。生後１９日および６ヶ月を比較されたい。
【図８】[0054]図８は、ＣＲ−ｉｍｐｙマウスの運動協調性を評価するためのロータロッド試験に関する模式図を示し、ここで、回転バーを加速した際に、回転バーから落ちるまでの時間を測定することによって、運動協調性を定量化する。生後１９日（Ｐ１９）、生後２ヶ月、および生後６ヶ月に、野生型、ｊｉｍｐｙ、およびＣＲ−ｉｍｐｙマウスにおいて、各時点で、測定を行った。異なる値間の統計的相違を、ｐ値によって示す。結果は、野生型およびｊｉｍｐｙマウスに比較して、ＣＲ−ｉｍｐｙマウスにおける運動協調性が回復したことを示す。
【図９】[0055]図９は、ＣＲ−ｉｍｐｙマウスの自発運動活性を評価するためのオープンフィールド試験に関する模式図を示し、ここで、５分間の自動化ビデオ追跡によって追跡されるような、ボックス中の移動総距離を測定することによって、自発運動活性を定量化する。生後１９日（Ｐ１９）、生後２ヶ月、および生後６ヶ月に、野生型、ｊｉｍｐｙ、およびＣＲ−ｉｍｐｙマウスにおいて、各時点で、測定を行った。異なる値間の統計的有意性を、ｐ値によって示す。結果は、野生型およびｊｉｍｐｙマウスに比較して、ＣＲ−ｉｍｐｙマウスにおける自発運動活性が回復したことを示す。
【図１０】[0056]図１０は、視神経伝導速度試験、ならびに、より迅速なおよびより緩慢な伝導ピークである、それぞれ第一のピークおよび第二のピークの代表的な結果に関する模式図を示す。ミエリン形成され、そしてより大きな直径を持つ軸索は、一般的に、ミエリン形成されず、そしてより小さな直径を持つ軸索に比較して、より迅速な伝導度を有する。生後１９日（Ｐ１９）、それぞれ、第一および第二のピークによって測定されるような迅速なおよび緩慢な伝導速度は、どちらも、野生型、ｊｉｍｐｙマウス、およびＣＲ−ｉｍｐｙマウスの任意の２つの間で、統計的に有意に異なる。しかし、生後６ヶ月では、すべてのｊｉｍｐｙマウスは死亡していたが、野生型およびＣＲ−ｉｍｐｙマウスの間には相違は観察されない。
【図１１】[0057]図１１は、生後６ヶ月での野生型およびＣＲ−ｉｍｐｙマウスの間の視神経ＥＭ画像において、識別可能な相違がないことを示す。
【図１２】[0058]図１２は、例えばＳａＣａｓ９および単一ｓｇＲＮＡをコードするＡＡＶウイルスベクターを通じて、患者の脳において、突然変異体ＯＰＣを少なくとも部分的に修正可能である、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９仲介性遺伝子サイレンシングを出生後の脳に送達する、本発明の１つの態様を示す模式図である。こうして修正されたＯＰＣは、適切な時期に、いかなる突然変異体オリゴデンドロサイトも打ち負かし、こうして患者ニューロンの十分に回復されたミエリン形成および機能を提供する、オリゴデンドロサイトを提供するであろう。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
定義
[0059]便宜上、明細書、実施例、および付随する請求項で使用する特定の用語をここに集める。別に定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術的および科学的用語は、本出願が属する一般の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００４１】
[0060]冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書において、冠詞の文法的対象の１つまたは１つより多く（すなわち少なくとも１つ）を指す。例えば、「要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または１つより多い要素を意味する。
【００４２】
[0061]用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含まれている（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｅ）」および「有している（ｈａｖｉｎｇ）」は、包括的なオープンな意味で用いられ、すなわち、さらなる要素が含まれてもよいことを意味する。用語「例えば（ｓｕｃｈ  ａｓ、ｅ．ｇ．）」は、本明細書において、限定されず、そして例示目的のみのためのものである。「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「限定されるわけではないが含まれる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」は、交換可能に用いられる。
【００４３】
[0062]用語「または（ｏｒ）」は、本明細書において、背景が別に明らかに示さない限り、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味すると理解されるものとする。
[0063]本明細書において、用語「約」または「およそ」は、参照数量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量または長さに対して、最大１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％異なる数量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。１つの態様において、用語「約」または「およそ」は、参照数量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量または長さに関して±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％の数量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量または長さの範囲を指す。
【００４４】
[0064]句「非経口投与」および「非経口的に投与する」は、当該技術分野に認識される用語であり、そしてこれらには、腸内および外用投与以外の投与の様式、例えば注射が含まれ、そして限定なしに、静脈内、筋内、胸膜内、血管内、心膜内、動脈内、クモ膜下腔内、嚢内、眼窩内、心内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内および胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｍａｌ）注射および注入が含まれる。
【００４５】
[0065]用語「治療する」は、当該技術分野に認識され、そしてこれには、被験体において疾患、障害または状態を阻害し、例えばその進行を妨害し；そして疾患、障害または状態を軽減し、例えば疾患、障害および／または状態の後退を引き起こすことが含まれる。疾患または状態の治療には、根底にある病理生理が影響を受けないとしても、特定の疾患または状態の少なくとも１つの症状を回復させることが含まれる。
【００４６】
[0066]用語「防止する」は、当該技術分野に認識され、そしてこれには、疾患、障害および／または状態に素因がある可能性もあるが、まだそれらを有するとは診断されていない被験体において、疾患、障害または状態が起こることを停止することが含まれる。疾患に関連する状態の防止には、疾患が診断されて後であるが、状態が診断される前に、状態が起こることを停止することが含まれる。
【００４７】
[0067]用語「医薬組成物」は、被験体に投与するために適した型で、開示する化合物を含有する配合物を指す。好ましい態様において、医薬組成物は、バルクであるか、または単位剤形である。単位剤形は、多様な型のいずれかであり、これには例えば、カプセル、ＩＶバッグ、錠剤、エアロゾル吸入器上の単一ポンプ、またはバイアルが含まれる。組成物の単位用量中の活性成分（例えば開示する化合物またはその塩の配合物）の量は、有効な量であり、そして関与する特定の治療にしたがって多様である。当業者は、ときに、患者の年齢および状態に応じて、投薬量にルーチンの変動を行うことが必要であることを認識するであろう。投薬量はまた、投与経路に応じるであろう。多様な経路が意図され、これには経口、肺、直腸、非経口、経皮、皮下、静脈内、筋内、腹腔内、鼻内、吸入等が含まれる。本明細書記載の化合物の外用または経皮投与のための投薬型には、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ジェル、溶液、パッチ、噴霧化化合物、および吸入剤が含まれる。好ましい態様において、活性化合物を、無菌条件下で、薬学的に許容されうるキャリアーと、そして必要とされる任意の保存剤、緩衝剤、または噴霧剤と混合する。
【００４８】
[0068]句「薬学的に許容される」は、当該技術分野に認識される。特定の態様において、該用語には、正当な医学的判断の範囲内で、妥当な利益／リスク比と釣り合って、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、あるいは他の問題または合併症を伴わずにヒトおよび動物の組織と接触させるための使用に適している組成物、ポリマーおよび他の物質および／または投薬型が含まれる。
【００４９】
[0069]句「薬学的に許容されるキャリアー」は、当該技術分野に認識され、そしてこれには、例えば、１つの臓器または体の部分から、別の臓器または体の部分に、任意の対象組成物を運ぶかまたは輸送する際に関与する、薬学的に許容される物質、組成物またはビヒクル、例えば液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または被包物質が含まれる。各キャリアーは、対象組成物の他の成分と適合する意味で、「許容性」でなければならず、そして患者に有害でない。特定の態様において、薬学的に許容されうるキャリアーは、非発熱性である。薬学的に許容されうるキャリアーとして働きうる物質のいくつかの例には：（１）糖、例えばラクトース、グルコースおよびスクロース；（２）デンプン、例えばコーンスターチおよびジャガイモデンプン；（３）セルロース、およびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；（４）粉末化トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）賦形剤、例えばココアバターおよび座薬ワックス；（９）油、例えばピーナツ油、綿実油、ヒマワリ油、ゴマ油、オリーブオイル、コーン油およびダイズ油；（１０）グリコール、例えばプロピレングリコール、（１１）ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；（１２）エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質不含水；（１７）等張性生理食塩水；（１８）リンゲル溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝溶液；および（２１）薬学的配合物に使用される他の非毒性適合物質が含まれる。
【００５０】
[0070]用語「予防的」または「療法的」治療は、当該技術分野に認識され、そしてこれには、１つまたはそれより多くの対象組成物の宿主への投与が含まれる。望ましくない状態（例えば、宿主動物の疾患または他の望ましくない状態、例えば限定されるわけではないがミエリン形成障害、ミエリン欠陥、ミエリン喪失および無効なミエリン修復）の臨床的徴候前に投与される場合、治療は予防的であり、すなわち治療は、望ましくない状態を発展させることから宿主を保護する一方、望ましくない状態の徴候後に投与される場合、治療は療法的である（すなわち、治療は、存在する望ましくない状態またはその副作用を減少させるか、回復させるか、または安定化させるよう意図される）。
【００５１】
[0071]用語「療法剤」、「薬剤」、「医薬品」および「生物活性物質」は、当該技術分野に認識され、そしてこれらには、疾患または状態を治療するため、患者または被験体において局所的または全身性に作用する、生物学的、生理学的、または薬理学的に活性である物質である、分子および他の剤が含まれる。該用語には、限定なしに、その薬学的に許容されうる塩およびプロドラッグが含まれる。こうした剤は、酸性、塩基性、または塩であってもよく；これらは中性分子、極性分子、または水素結合が可能な分子複合体であってもよく；これらは、患者または被験体に投与された際に生物学的に活性化される、エーテル、エステル、アミド等の形のプロドラッグであってもよい。
【００５２】
[0072]句「療法的に有効な量」または「薬学的に有効な量」は、当該技術分野に認識される用語である。特定の態様において、該用語は、任意の医学的治療に適用可能な、妥当な利益／リスク比で、何らかの望ましい効果を生じる療法剤の量を指す。特定の態様において、該用語は、特定の療法措置のターゲットを排除するか、減少させるかまたは維持するために必要なまたは十分な量を指す。有効量は、治療する疾患または状態、投与する特定のターゲティング化構築物、被験体のサイズ、あるいは疾患または状態の重症度に応じて多様でありうる。一般の当業者は、過度の実験を必要とすることなく、特定の化合物の有効量を経験的に決定することも可能である。特定の態様において、ｉｎ  ｖｉｖｏ使用のための剤（例えば本明細書記載の組成物または遺伝子修飾細胞）の療法的有効量は：ポリマーの化学的および物理的特性に部分的に依存するであろう、ポリマーマトリックスからの剤の放出速度；剤の同一性；投与の様式および方法；ならびに剤に加えて、ポリマーマトリックス中に取り込まれる任意の他の物質を含む、多くの要因に応じる可能性があるであろう。
【００５３】
[0073]用語「核酸」、「ヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」は、交換可能に用いられ、そして直鎖または環状コンホメーションで、そして一本鎖または二本鎖型のいずれかの、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のため、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定するとは見なされないものとする。該用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分が修飾されたヌクレオチド（例えばホスホロチオエート主鎖）を含むことも可能である。一般的に、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対形成特異性を有し；すなわちＡの類似体はＴと塩基対形成するであろう。
【００５４】
[0074]用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すよう、交換可能に用いられる。該用語はまた、１つまたはそれより多いアミノ酸が、対応する天然存在アミノ酸の化学的類似体または修飾誘導体である、アミノ酸ポリマーにも当てはまる。
【００５５】
[0075]「機能ドメイン」は、特定の活性を含むポリペプチドのドメインである。機能ドメインが所持しうる活性の限定されない例は、ヌクレアーゼ活性、転写制御活性、ウイルスカプシド認識活性等である。
【００５６】
[0076]「結合」は、巨大分子間（例えばタンパク質および核酸間）の配列特異的非共有結合性相互作用を指す。相互作用全体が配列特異的である限り、結合相互作用のすべての構成要素が配列特異的である必要はない（例えばＤＮＡ主鎖中のリン酸残基と接触する）。こうした相互作用は、一般的に、１０−６Ｍ−１またはそれより低い解離定数（Ｋｄ）によって特徴付けられる。「アフィニティ」は結合強度を指し；結合アフィニティ増加は、より低いＫｄと相関する。
【００５７】
[0077]「結合タンパク質」は、別の分子に結合可能であるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合可能である。タンパク質結合性タンパク質の場合、自身に結合してもよい（ホモ二量体、ホモ三量体等を形成する）し、そして／または単数または複数の異なるタンパク質の１つまたはそれより多い分子に結合してもよい。結合タンパク質は、１より多いタイプの結合活性を有することも可能である。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合およびタンパク質結合活性を有する。
【００５８】
[0078]「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、亜鉛イオンの配位を通じて構造が安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である、１つまたはそれより多いジンクフィンガーを通じて、配列特異的方式でＤＮＡに結合する、タンパク質、またはより大きなタンパク質内のドメインである。用語、ジンクフィンガーＤＮＡ結合性タンパク質は、しばしば、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略される。
【００５９】
[0079]「ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つまたはそれより多いＴＡＬＥリピートドメイン／単位を含むポリペプチドである。リピートドメインは、ＴＡＬＥのその同族（ｃｏｇｎａｔｅ）ターゲットＤＮＡ配列への結合に関与する。単一「リピート単位」（「リピート」とも称される）は、典型的には長さ３３〜３５アミノ酸であり、そして天然存在ＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥリピート配列と少なくともある程度の配列相同性を示す。
【００６０】
[0080]ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ結合ドメインは、例えば天然存在ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識らせん領域の操作（１つまたはそれより多いアミノ酸の改変）を通じて、あらかじめ決定したヌクレオチド配列に結合するように「操作」されることも可能である。したがって、操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、非天然存在のタンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を操作するための限定されない例は、設計および選択である。設計されたＤＮＡ結合タンパク質は、その設計／組成が、主に合理的基準から生じる、天然には存在しないタンパク質である。設計のための合理的基準には、置換ルール、ならびに存在するＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥ設計および結合データの情報を保存するデータベース中の情報をプロセシングするためのコンピュータ化アルゴリズムの適用が含まれる。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号；第６，４５３，２４２号；第６，５３４，２６１号および第８，５８５，５２６を参照されたい；また、ＷＯ  ９８／５３０５８；ＷＯ  ９８／５３０５９；ＷＯ  ９８／５３０６０；ＷＯ  ０２／０１６５３６およびＷＯ  ０３／０１６４９６を参照されたい。
【００６１】
[0081]「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、その産生が、主にファージディスプレイ、相互作用トラップまたはハイブリッド選択などの実験的なプロセスから生じる、天然には見られないタンパク質である。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号；第５，９２５，５２３号；第６，００７，９８８号；第６，０１３，４５３号；第６，２００，７５９号；第８，５８６，５２６号；ＷＯ  ９５／１９４３１；ＷＯ  ９６／０６１６６；ＷＯ  ９８／５３０５７；ＷＯ  ９８／５４３１１；ＷＯ  ００／２７８７８；ＷＯ  ０１／６０９７０、ＷＯ  ０１／８８１９７、ＷＯ  ０２／０９９０８４を参照されたい。
【００６２】
[0082]一般的に、「ＣＲＩＳＰＲ」（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）はまたＳＰＩＤＲ（SPacer Interspersed Direct Repeats、スペーサー散在型ダイレクトリピート）としても知られており、通常、特定の細菌種に特異的であるＤＮＡ遺伝子座のファミリーを指す。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）に認識される散在型短配列リピート（ＳＳＲ）の別個のクラス（Ｉｓｈｉｎｏら（１９８７）  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １６９：５４２９−５４３３；およびＮａｋａｔａら，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８９）  １７１：３５５３−３５５６）および関連遺伝子を含む。類似の散在型ＳＳＲは、ハロフェラックス・メディテラネイ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、および結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）において同定されてきている（Ｇｒｏｅｎｅｎら（１９９３）  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  １０：１０５７−１０６５；  Ｈｏｅら（１９９９）  Ｅｍｅｒｇ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．，  ５：２５４−２６３；  Ｍａｓｅｐｏｈｌら（１９９６）  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １３０７：２６−３０；およびＭｏｊｉｃａら（１９９５）  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  １７：８５−９３を参照されたい）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、典型的には、リピートの構造によって他のＳＳＲとは異なり、これは短い規則的に間隔をあけたリピート（short regularly spaced repeats、ＳＲＳＲ）と名付けられている（Ｊａｎｓｓｅｎら（２００２）  ＯＭＩＣＳ  Ｊ．  Ｉｎｔｅｇ．  Ｂｉｏｌ．，  ６：２３−３３；およびＭｏｊｉｃａら（２０００）  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ３６：２４４−２４６）。一般的に、リピートは、実質的に一定の長さを持つユニークな介在性配列によって規則的に間隔を開けられたクラスターとして存在する短い要素である。（Ｍｏｊｉｃａら（２０００）、上記）。リピート配列は、系統間で非常に保存されているが、間隔を開けられたリピートの数およびスペーサー領域の配列は、典型的には系統間で異なる（ｖａｎ  Ｅｍｂｄｅｎら，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  （２００２）  １８２：２３９３−２４０１）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、４０を超える原核生物で同定されてきており、こうした原核生物には、限定されるわけではないが、エロピルム属（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ）、ピロバキュルム属（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）、スルホロブス属（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）、アルケオグロブス属（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロカルキュラ属（Ｈａｌｏｃａｒｃｕｌａ）、メタノバクテリウム属（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎ）、メタノコッカス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノサルシナ属（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）、メタノピルス属（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ）、ピロコッカス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ピクロフィルス属（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）、テルニオプラスニア属（Ｔｈｅｒｎｉｏｐｌａｓｎｉａ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅ��ａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アキフルクス属（Ａｑｕｉｆｒｘ）、ポルフブロモナス属（Ｐｏｒｐｈｖｒｏｍｏｎａｓ）、クロロビウム属（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、テルムス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、テルモナエロバクター属（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、フゾバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アザルクス属（Ａｚａｒｃｕｓ）、クロモバクテリウム属（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、デスルフォビブリオ属（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、ゲオバクター属（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ）、ミロコッカス属（Ｍｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ウォリネラ属（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、メチロコッカス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、フォトバクテリウム属（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、およびテルモトガ属（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）が含まれる。
【００６３】
[0083]「ＣＲＩＳＰＲ系」は、集合的に、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現に関与するかまたはその活性を方向付ける転写物および他の要素を指し、これには、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えばｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（「ダイレクトリピート」および内因性ＣＲＩＳＰＲ系の背景において、ｔｒａｃｒＲＮＡにプロセシングされる部分的ダイレクトリピートを含む）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の背景において、「スペーサー」とも称される）、またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列および転写物が含まれる。いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲ系の１つまたはそれより多い要素は、クラス１、Ｉ型またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系に由来する。いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲ系の１つまたはそれより多い要素は、クラス２、ＩＩ型またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ系に由来する。いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲ系の１つまたはそれより多い要素は、内因性ＣＲＩＳＰＲ系を含む特定の生物、例えばストレプトコッカス・ピオゲネスに由来する。一般的に、ＣＲＩＳＰＲ系は、ターゲット配列部位で、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する要素（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の背景において、プロトスペーサーとも称される）によって特徴付けられる。ＣＲＩＳＰＲ複合体形成の背景において、「ターゲット配列」は、ガイド配列が相補性を有するように設計されている配列を指し、ここでターゲット配列およびガイド配列の間のハイブリダイゼーションが、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションを引き起こし、そしてＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するために十分な相補性があれば、完全な相補性は必ずしも必要とされない。ターゲット配列は、任意のポリヌクレオチド、例えばＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドを含むことも可能である。いくつかの態様において、ターゲット配列は、細胞の核または細胞質に位置する。ターゲット配列を含むターゲティングされる遺伝子座への組換えのために使用可能な配列またはテンプレートは、「編集テンプレート」または「編集ポリヌクレオチド」または「編集配列」と称される。本発明の側面において、外因性テンプレートポリヌクレオチドは、編集テンプレートと称されうる。本発明の側面において、組換えは相同組換えである。
【００６４】
[0084]「ＮｇＡｇｏ」は遺伝子サイレンシングに関与すると考えられる原核生物アルゴノートタンパク質である。ＮｇＡｇｏは、古細菌、ナトロノバクテリウム・グレゴリー（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒｅｇｏｒｙｉ）に由来する（例えばＧａｏら（２０１６）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３４，  ７６８−７７３を参照されたい）。「ＮｇＡｇｏ系」は、ＮｇＡｇｏ酵素による切断のための、例えば一本鎖ガイドＤＮＡを含む、必要な構成要素すべてである。
【００６５】
[0085]「組換え」は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換プロセスを指し、限定されるわけではないが、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によるドナー捕捉および相同組換えが含まれる。本開示の目的のため、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば、相同組換え修復機構を通じた、細胞における二本鎖切断の修復中に起こる、こうした交換の特殊な型を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「ターゲット」分子（すなわち二本鎖切断を経たもの）のテンプレート修復に対して「ドナー」分子を用い、そして「非交叉遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として多様に知られ、これは該プロセスが、ドナーからターゲットへの遺伝情報のトランスファーを導くためである。いかなる特定の理論によって束縛されることも望ましくないが、こうしたトランスファーは、切断されたターゲットおよびドナーの間に形成されるヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ修正、および／またはドナーを用いて遺伝情報を再合成して、これがターゲットの一部となる「合成依存性鎖アニーリング」、および／または関連プロセスを伴うことも可能である。こうした特殊化ＨＲは、しばしば、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部またはすべてがターゲットポリヌクレオチド内に取り込まれるように、ターゲット分子の配列の改変を生じる。
【００６６】
[0086]開示の方法において、本明細書に記載するような１つまたはそれより多いターゲティング化ヌクレアーゼは、あらかじめ決定した部位で、ターゲット配列（例えば細胞クロマチン）において切断する（例えば１つまたはそれより多い一本鎖ニックおよび／または１つまたはそれより多い二本鎖切断［ＤＳＢ］を生成する）。ＤＳＢは、相同組換え修復（ＨＤＲ）による、または非相同組換え修復機構（例えばＮＨＥＪ）による、欠失および／または挿入を生じることも可能である。欠失には、任意の数の塩基対が含まれてもよい。同様に、挿入には、例えば、場合によって切断領域中のヌクレオチド配列に相同性を有する、「ドナー」ポリヌクレオチドの組込みを含めて、任意の数の塩基対が含まれてもよい。
【００６７】
[0087]特定の態様において、本発明の方法は、任意の適切なヌクレアーゼ、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ヌクレアーゼを用いて、ターゲット遺伝子（例えばＰＬＰ１遺伝子またはその制御要素）中にＤＳＢを生じ、そして生じた修復（例えばＮＨＥＪ）は、ＰＬＰ１遺伝子またはその制御要素の機能を破壊して、減少したまたは排除されたＰＬＰ１機能を生じる、小さい挿入または欠失（例えばインデル）を生成する。この態様において、本発明の方法には、ドナー配列は必要ではない。
【００６８】
[0088]他の態様において、ドナー配列は、欠陥ＰＬＰ１遺伝子またはその制御要素を修復するかまたは置換する方法に含まれてもよい。ドナー配列は、物理的に組み込まれてもよいし、あるいはドナーポリヌクレオチドは、相同組換えを通じた切断の修復のためのテンプレートとして用いられ、細胞クロマチン内にドナーにおけるようなヌクレオチド配列のすべてまたは部分の導入を生じる。したがって、細胞クロマチンにおける第一の配列は、改変されてもよく、そして特定の態様において、ドナーポリヌクレオチドに存在する配列に変換されてもよい。したがって、用語「置換する」または「置換」の使用は、１つのヌクレオチド配列の別のものによる置換（すなわち情報という意味で配列の置換）を示すよう理解され、そして必ずしも１つのポリヌクレオチドの別のものによる物理的または化学的置換を必要としない。
【００６９】
[0089]本明細書記載の任意の方法において、さらなる対のジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓまたはＮｇＡｇｏ系を、細胞内のさらなるターゲット部位のさらなる（例えば２またはそれより多い）二本鎖切断に使用可能である（例えばＰＬＰ１のような同じターゲット遺伝子内であるが、異なるターゲティング部位で）。
【００７０】
[0090]本明細書に記載する任意の方法を、任意のサイズのドナーの挿入、および／または関心対象の遺伝子（単数または複数）の発現を破壊するドナー配列のターゲティング化組込みによる細胞における１つまたはそれより多いターゲット配列の部分的または完全な不活性化に用いてもよい。部分的または完全に不活性化された遺伝子を持つ細胞株もまた、提供される。
【００７１】
[0091]本明細書記載の任意の方法において、外因性ヌクレオチド配列（「ドナー配列」または「導入遺伝子」）は、関心対象の領域中のゲノム配列に、相同であるが同一でない配列を含有し、それによって関心対象の領域中に非同一配列を挿入する相同組換えを刺激することも可能である。したがって、特定の態様において、関心対象の領域中の配列に相同であるドナー配列部分は、置換されるゲノム配列に対して、約８０〜９９％（またはその間の任意の整数）の間の配列同一性を示す。他の態様において、ドナーおよびゲノム配列の間の相同性は、９９％より高く、例えば１００の連続塩基対に渡ってドナーおよびゲノム配列の間で１ヌクレオチドのみが異なる場合である。特定の例において、ドナー配列の非相同部分は、新規配列が関心の領域内に導入されるように、関心対象の領域に存在しない配列を含有することも可能である。これらの例において、非相同配列には、一般的に、関心対象の領域中の配列に相同であるかまたは同一である、５０〜１，０００塩基対（またはその間の任意の整数）、または１，０００を超える任意の数の塩基対の配列が隣接する。他の態様において、ドナー配列は、第一の配列に非相同性であり、そして非相同組換え機構によってゲノム内に挿入される。
【００７２】
[0092]「遺伝子修飾された」は、核酸の配列が、修飾される前の核酸に比較した際に改変されるように、核酸に行われる修飾を指す。細胞を遺伝子修飾することは、細胞内の細胞性核酸を修飾することを指し、細胞内の内因性および／または外因性核酸、例えばゲノムＤＮＡおよび転写されたｍＲＮＡに対する遺伝子修飾が含まれる。遺伝子修飾は、細胞内の内因性および／または外因性核酸における切断、欠失、および挿入、外因性ＤＮＡの組込み、遺伝子修正ならびに／あるいは遺伝子突然変異を含むことも可能である。
【００７３】
[0093]「切断」は、核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）分子の共有結合性主鎖の破壊を指す。切断は、限定されるわけではないが、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を含む、多様な方法によって開始されることも可能である。一本鎖切断および二本鎖切断はどちらも可能であり、そして二本鎖切断は、２つの別個の一本鎖切断事象の結果として起こることも可能である。ＤＮＡ切断は、平滑端または付着端のいずれかの産生を生じることも可能である。特定の態様において、ターゲティング化二本鎖ＤＮＡ切断には融合ポリペプチドを用いる。
【００７４】
[0094]「切断ハーフドメイン」は、第二のポリペプチド（同一であるかまたは異なるかいずれか）と組み合わされて、切断活性（好ましくは二重鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。用語「第一および第二の切断ハーフドメイン」、「＋および−切断ハーフドメイン」ならびに「右および左切断ハーフドメイン」は、交換可能に用いられ、二量体化する切断ハーフドメインの対を指す。
【００７５】
[0095]「操作された切断ハーフドメイン」は、別の切断ハーフドメイン（例えば別の操作された切断ハーフドメイン）と偏性の（ｏｂｌｉｇａｔｅ）ヘテロ二量体を形成するように修飾されている切断ハーフドメインである。本明細書にその全体が援用される、米国特許公報第２００５／００６４４７４号、第２００７０２１８５２８号、第２００８０１３１９６２号および第２０１１０２０１０５５号もまた参照されたい。
【００７６】
[0096]用語「配列」は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく；直鎖、環状または分枝鎖であってもよく、そして一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい、任意の長さのヌクレオチド配列を指す。
【００７７】
[0097]用語「ドナー配列」は、ゲノム内に挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、任意の長さであってもよく、例えば長さ２〜１００，０００，０００ヌクレオチド（またはその間のもしくはそれより多い任意の整数値）の間、好ましくは長さ約１００〜１００，０００ヌクレオチド（またはその間の任意の整数値）の間、より好ましくは長さ約２０００〜２０，０００ヌクレオチド（またはその間の任意の整数値）の間、そしてさらにより好ましくは約５〜１５ｋｂ（またはその間の任意の値）の間であってもよい。
【００７８】
[0098]「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、ならびにヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。真核細胞クロマチンの大部分は、ヌクレオソームの形で存在し、ここで、ヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４の各２つを含む八量体と会合するおよそ１５０塩基対のＤＮＡを含み；そして（生物に応じて多様な長さの）リンカーＤＮＡがヌクレオソームコアの間に伸長する。ヒストンＨ１の分子は、一般的にリンカーＤＮＡと会合する。本開示の目的のため、用語「クロマチン」は、原核生物および真核生物両方のすべてのタイプの細胞核タンパク質を含むよう意図される。細胞クロマチンには、染色体およびエピソームクロマチン（例えばミトコンドリアＤＮＡ）の両方が含まれる。
【００７９】
[0099]「染色体」は、細胞ゲノムのすべてまたは部分を含むクロマチン複合体である。細胞ゲノムはしばしば、核型によって特徴付けられ、核型は、細胞ゲノムを含む染色体すべてのコレクションである。細胞のゲノムは、１つまたはそれより多い染色体を含むことも可能である。
【００８０】
[00100]「エピソーム」は、複製する核酸、核タンパク質複合体または細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む他の構造である。エピソームの例には、プラスミドおよび特定のウイルスゲノム／ベクター（例えばＡＡＶベクターおよびコードされる配列）が含まれる。
【００８１】
[00101]「アクセス可能領域」は、核酸中に存在するターゲット部位が、ターゲット部位を認識する外因性分子によって結合可能である細胞クロマチン中の部位である。いかなる特定の理論によって束縛されることも望ましくないが、アクセス可能な領域は、ヌクレオソーム構造内にパッケージングされないものであると考えられる。アクセス可能な領域の特徴的な構造は、しばしば、化学的および酵素的プローブ、例えばヌクレアーゼに対する感受性によって検出されうる。
【００８２】
[00102]「ターゲット部位」または「ターゲット配列」は、結合のための十分な条件が存在する場合、結合分子が結合するであろう核酸の部分を定義する核酸配列である。
[00103]「外因性」分子は、通常は細胞中に存在しないが、１つまたはそれより多い、遺伝子的、生化学的または他の方法によって、細胞内に導入可能な分子である。「細胞中の正常な存在」は、細胞の特定の発生段階および環境条件に関して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生中にのみ存在する分子は、成体筋細胞に関しては外因性分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、非熱ショック細胞に関しては外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全内因性分子の機能型または正常に機能する内因性分子の機能不全型を含むことも可能である。
【００８３】
[00104]外因性分子は、とりわけ、コンビナトリアルケミストリープロセスによって生成されるような小分子、または巨大分子、例えばタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記分子の任意の修飾された誘導体、あるいは上記分子の１つまたはそれより多くを含む任意の複合体であることも可能である。核酸には、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれ、一本鎖または二本鎖であってもよく；直鎖、分枝鎖または環状であってもよく；そして任意の長さであってもよい。核酸には、二重鎖形成可能なもの、ならびに三重鎖形成核酸が含まれる。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質には、限定されるわけではないが、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレースおよびヘリカーゼが含まれる。
【００８４】
[00105]外因性分子は、内因性分子と同じタイプの分子、例えば外因性タンパク質または核酸であってもよい。例えば、外因性核酸は、感染性ウイルスゲノム、細胞内に導入されるプラスミドまたはエピソーム、あるいは細胞中に通常は存在しない染色体を含むことも可能である。外因性分子の細胞内への導入のための方法は、当業者に知られ、そしてこれには、限定されるわけではないが、脂質仲介性トランスファー（すなわち中性および陽イオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介性トランスファーおよびウイルスベクター仲介性トランスファーが含まれる。外因性分子はまた、内因性分子と同じタイプの分子であるが、細胞が由来するものとは異なる種に由来するものであってもよい。例えば、ヒト核酸配列を、マウスまたはハムスターに元来由来する細胞株内に導入することも可能である。外因性分子を植物細胞内に導入するための方法が当業者に知られ、そしてこれには、限定されるわけではないが、プロトプラスト形質転換、シリコンカーバイド（例えばＷＨＩＳＫＥＲＳＴＭ）、アグロバクテリウム仲介性形質転換、脂質仲介性トランスファー（すなわち中性および陽イオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、微粒子銃（例えば「遺伝子銃」を用いる）、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介性トランスファーおよびウイルスベクター仲介性トランスファーが含まれる。
【００８５】
[00106]対照的に「内因性」分子は、特定の発生段階、特定の環境条件下で、特定の細胞中に通常存在するものである。例えば、内因性核酸は、染色体や、ミトコンドリア、葉緑体または他の細胞内小器官のゲノム、あるいは天然存在エピソーム核酸を含むことも可能である。さらなる内因性分子には、タンパク質、例えば転写因子および酵素が含まれることも可能である。
【００８６】
[00107]本明細書において、用語「外因性核酸の産物」には、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド産物の両方、例えば転写産物（ポリヌクレオチド、例えばＲＮＡ）および翻訳産物（ポリペプチド）が含まれる。
【００８７】
[00108]「融合」分子は、２またはそれより多いサブユニット分子が、好ましくは共有結合性、連結されている分子である。サブユニット分子は、同じ化学的タイプの分子であってもよいし、または異なる化学的タイプの分子であってもよい。第一のタイプの融合分子の例には、限定されるわけではないが、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよび１つまたはそれより多い活性化ドメインの間の融合）および融合核酸（例えば、上記の融合タンパク質をコードする核酸）が含まれる。第二のタイプの融合分子の例には、限定されるわけではないが、三重鎖形成核酸およびポリペプチドの間の融合、ならびに副溝結合剤および核酸の間の融合が含まれる。
【００８８】
[00109]細胞における融合タンパク質の発現は、細胞への融合タンパク質の送達から、または細胞への融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの送達から生じることも可能であり、ここでポリヌクレオチドは転写され、そして転写物は翻訳されて、融合タンパク質を生成する。トランススプライシング、ポリペプチド切断およびポリペプチド連結はまた、細胞におけるタンパク質の発現に関与することも可能である。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチド送達のための方法は、本開示の別の箇所に提示される。
【００８９】
[00110]「遺伝子」には、本開示の目的のため、遺伝子産物（以下を参照されたい）をコードするＤＮＡ領域、ならびにこうした遺伝子制御要素配列が、コードおよび／または転写される配列に隣接していてもまたはいなくても、遺伝子産物の産生を制御するＤＮＡ領域（遺伝子制御要素）が含まれる。したがって、遺伝子には、必ずしも限定されるわけではないが、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳制御配列、例えばリボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界要素、複製起点、マトリックス付着部位および遺伝子座制御領域が含まれる。
【００９０】
[00111]「遺伝子発現」は、遺伝子中に含有される情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えばｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡまたはＲＮＡの任意の他のタイプ）またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であってもよい。遺伝子産物にはまた、例えば、キャップ付加、ポリアデニル化、メチル化、および編集などのプロセスによって修飾されるＲＮＡ、ならびに例えばメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリスチン化、およびグリコシル化によって修飾されるタンパク質も含まれる。
【００９１】
[00112]遺伝子発現の「調節」は、遺伝子活性の変化を指す。発現の調節には、限定されるわけではないが、遺伝子活性化および遺伝子抑制、ならびにタンパク質およびｍＲＮＡなどの遺伝子発現産物の活性および／または安定性（例えば転写、翻訳、および／または翻訳後レベルでの発現調節）が含まれることも可能である。ゲノム編集（例えば切断、改変、不活性化、ランダム突然変異）を用いて、発現を調節することも可能であり、また、ＲＮＡｉまたはアンチセンスオリゴ（ＡＳＯ）仲介性ｍＲＮＡ切断および／または翻訳遮断も使用可能である。遺伝子不活性化は、本明細書に記載するようなＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＮｇＡｇｏまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含まない細胞に比較した際、遺伝子発現のいかなる減少も指す。したがって、遺伝子不活性化は、部分的または完全であってもよい。
【００９２】
[00113]「関心対象の領域」は、外因性分子が結合することが望ましい細胞クロマチンの任意の領域、例えば、遺伝子、あるいは遺伝子内または遺伝子に隣接した非コード配列である。結合は、ターゲティング化ＤＮＡ切断および／またはターゲティング化組換えの目的のためであってもよい。関心対象の領域は、例えば、染色体、エピソーム、細胞内小器官ゲノム（例えばミトコンドリア、葉緑体）、または感染性ウイルスゲノム中に存在していてもよい。関心対象の領域は、遺伝子のコード領域内、転写された非コード領域内、例えばリーダー配列、トレーラー配列またはイントロン内、あるいはコード領域の上流または下流の非転写領域内であってもよい。関心対象の領域は、単一ヌクレオチド対と同程度に小さいか、または長さ最大２，０００ヌクレオチド対、またはヌクレオチド対の任意の整数値であってもよい。
【００９３】
[00114]「真核」細胞には、限定されるわけではないが、幹細胞（多能性および多分化能）を含む、真菌細胞（例えば酵母）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞（例えばオリゴデンドロサイト）が含まれる。
【００９４】
[00115]用語「機能可能であるような連結」および「機能可能であるように連結された」（または「機能的連結」）は、２またはそれより多い構成要素（例えば配列要素）の並置に関して、交換可能に用いられ、ここで、構成要素は、両方の構成要素が正常に機能し、そして少なくとも１つの構成要素が少なくとも１つの他の構成要素に対して発揮する機能を仲介可能である可能性を許容するように配置される。例示のため、転写制御要素配列が、１つまたはそれより多い転写制御要素の存在または非存在に反応して、コード配列の転写レベルを調節するならば、転写制御要素配列、例えばプロモーターは、コード配列に機能可能であるように連結されている。転写制御要素配列は、一般的に、コード配列とシスで、機能可能であるように連結されるが、コード配列に直接隣接している必要はない。例えば、エンハンサーは、隣接していないとしても、コード配列に機能可能であるように連結された転写制御要素配列である。
【００９５】
[00116]融合ポリペプチドに関して、用語「機能可能であるように連結された」は、構成要素の各々が、このように連結されていなかった場合にそうであるように、他の構成要素に連結した際も同じ機能を実行するという事実を指すことも可能である。例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＮｇＡｇｏまたはＣａｓ  ＤＮＡ結合ドメインが活性化ドメインに融合している融合ポリペプチドに関して、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＮｇＡｇｏまたはＣａｓ  ＤＮＡ結合ドメイン部分がそのターゲット部位および／または結合部位に結合可能である一方、活性化ドメインが遺伝子発現を上方制御可能であるならば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＮｇＡｇｏまたはＣａｓ  ＤＮＡ結合ドメイン、および活性化ドメインは、機能可能であるように連結されている。ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＮｇＡｇｏまたはＣａｓ  ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインに融合している融合ポリペプチドの場合、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＮｇＡｇｏまたはＣａｓ  ＤＮＡ結合ドメインがそのターゲット部位および／または結合部位に結合可能である一方、切断ドメイン部分がターゲット部位の近傍でＤＮＡを切断可能であるならば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＮｇＡｇｏまたはＣａｓ  ＤＮＡ結合ドメイン、および切断ドメインは、機能可能であるように連結されている。
【００９６】
[00117]タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的断片」は、その配列が、全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能を保持する、タンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的断片は、対応する天然分子より多い、少ないまたはそれと同じ数の残基を所持してもよく、そして／または１つまたはそれより多いアミノ酸またはヌクレオチド置換を含有してもよい。核酸の機能（例えばコード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、当該技術分野に周知である。同様に、タンパク質機能を決定するための方法が周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合、電気泳動移動度シフト、または免疫沈降アッセイによって決定可能である。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動によってアッセイ可能である。Ａｕｓｕｂｅｌら、上記を参照されたい。タンパク質が別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば共免疫沈澱、２ハイブリッドアッセイあるいは遺伝的および生化学的両方の補完によって決定可能である。例えば、Ｆｉｅｌｄｓら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５−２４６；米国特許第５，５８５，２４５号およびＰＣＴ  ＷＯ  ９８／４４３５０を参照されたい。
【００９７】
[00118]「ベクター」は、ターゲット細胞に遺伝子配列をトランスファー可能である。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、および「遺伝子トランスファーベクター」は、関心対象の遺伝子の発現を指示可能であり、そしてターゲット細胞に遺伝子配列をトランスファー可能である任意の核酸構築物を意味する。したがって、該用語には、クローニング、および発現ビヒクル、ならびに組込みベクターが含まれる。
【００９８】
[00119]用語「被験体」および「患者」は、交換可能に用いられ、そして哺乳動物、例えばヒト患者および非ヒト霊長類、ならびに実験動物、例えばウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、および他の動物を指す。したがって、用語「被験体」または「患者」は、本明細書において、本発明のヌクレアーゼ、ドナーおよび／または遺伝子修飾細胞を投与可能な任意の哺乳動物患者または被験体を意味する。本発明の被験体には、ミエリン関連障害を持つものが含まれる。
【００９９】
[00120]「幹細胞性」は、任意の細胞が幹細胞様の様式で作用する相対的能力、すなわち任意の特定の幹細胞が有しうる、全能性、多能性、または少能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｃｙ）、および拡張されたかまたは不確定の自己再生の度合いを指す。
【０１００】
[00121]「機能的ミエリン産生を増進させる細胞」によって、（修飾を伴わない細胞に比較した際に）ミエリン産生量の増加を示す細胞、および／または細胞によって産生されたミエリンの機能的能力の改善を示す細胞を意味する。
【０１０１】
[00122]用語「インデル」は、生物または細胞のヌクレオチド配列における塩基の挿入、欠失、その組み合わせを指す。挿入（挿入突然変異とも称される）は、ヌクレオチド配列への１つまたはそれより多いヌクレオチド塩基対の付加であり、一方、欠失は、ヌクレオチド配列の部分が取り除かれる突然変異を指す。単一塩基から染色体の全ピースまで、任意の数のヌクレオチドが挿入されるかまたは欠失されることも可能である。
【０１０２】
[00123]「ナンセンス仲介性崩壊」は、未成熟な翻訳終結コドン（ＰＴＣ）を含有するｍＲＮＡ転写物を排除する、真核細胞における翻訳カップリング機構を指す。哺乳動物細胞において、多くの例で、ＰＴＣがイントロン上流に位置する場合にのみ、強いｍＲＮＡ減少が起こるため、ＮＭＤはまた、プレｍＲＮＡスプライシングにも結び付けられる。
【０１０３】
概要
[00124]本明細書記載の態様は、プロテオリピドタンパク質１（ＰＬＰ１）遺伝子を破壊するかまたは不活性化するように遺伝子修飾された細胞を生成する方法、およびヒトミエリン関連障害の治療におけるその使用のための方法に関する。本出願は、部分的に、グリア細胞および接合体におけるＰＬＰ１不活性化インデルの効率的な部位特異的導入の立証に基づく。ＰＬＰ１遺伝子のヌクレアーゼ仲介性編集は、ミエリン関連障害ペリツェウス・メルツバッハ病（ＰＭＤ）のｊｉｍｐｙマウスモデルにおいて正常な機能および完全な寿命を回復するとともに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＭＤモデル・グリア細胞における機能を回復することが示されてきている。理論によって束縛されることなしに、ＰＬＰ１関連毒性は、ＰＬＰ１遺伝子の不活性化によってバイパスされ、それによって修飾されたグリア細胞またはオリゴデンドロサイトが機能的ミエリンを作製する能力を増進させると考えられる。
【０１０４】
[00125]本明細書に記載するのは、ＰＬＰ１遺伝子またはその制御要素における部位特異的挿入または欠失（インデル）である。ＰＬＰ１遺伝子をターゲティングする際、これは、ＰＬＰ１発現の有効でそして永続的な不活性化または減少を提供するであろう。部位特異的ヌクレアーゼまたは遺伝子編集ＰＬＰ１遺伝子破壊組成物は、例えば、１つまたはそれより多いＡＡＶベクター、インテグラーゼ欠損レンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）、および／または核酸、例えばプラスミド、ミニサークルプラスミドおよびオリゴヌクレオチドを用いて送達することも可能である。
【０１０５】
[00126]やはり本明細書において、神経幹細胞（ＮＳＣ）および／またはオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）およびその子孫において、増進された機能的ミエリン産生能を生成するため、ＰＬＰ１遺伝子またはその遺伝子制御要素の正確なｉｎ  ｓｉｔｕ編集を記載する。ＮＳＣおよび／またはＯＰＣにおける内因性ＰＬＰ１遺伝子内へのｉｎ  ｓｉｔｕの破壊性突然変異のヌクレアーゼまたは遺伝子編集仲介性導入は、編集された細胞の子孫に、これらの増進された能力を与える。さらに、ＮＳＣまたはＯＰＣにおける内因性遺伝子へのｉｎ  ｓｉｔｕのＰＬＰ１制御遺伝子の特異的ノックアウトまたは突然変異は、細胞の子孫における、増進された／改善された機能的ミエリン産生を与える。
【０１０６】
[00127]細胞機能および生存度に有意に影響を及ぼすことなく、記載するような細胞および方法を、動物モデルおよび／またはヒト患者に移植することも可能である。さらに、細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで持続する能力を維持し、そして移植後、被験体における機能的ミエリン産生を増進させることも可能である。
【０１０７】
[00128]方法の実施、ならびに本明細書に開示する組成物の調製および使用は、別に示されない限り、当該技術分野の技術内であるような、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算機化学、細胞培養、組換えＤＮＡおよび関連分野における慣用的な技術を使用する。これらの技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，  第２版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９および第３版，  ２００１；  Ａｕｓｕｂｅｌら，  ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８７および定期的改訂版；  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹシリーズ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；  Ｗｏｌｆｆｅ，  ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮ，  第３版，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  １９９８；  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，  Ｖｏｌ．  ３０４，  “Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ”  （Ｐ．  Ｍ．  ＷａｓｓａｒｍａｎおよびＡ．  Ｐ．  Ｗｏｌｆｆｅ監修），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  １９９９；ならびにＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，  Ｖｏｌ．  １１９，  “Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”  （Ｐ．  Ｂ．  Ｂｅｃｋｅｒ監修）  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  １９９９を参照されたい。
【０１０８】
[00129]本発明のさらなる側面を以下のセクションに記載する。
融合分子
[00130]本明細書に記載するのは、細胞における、選択されるターゲット遺伝子（例えばＰＬＰ１またはその遺伝子制御要素）の切断に有用な組成物、例えばヌクレアーゼである。特定の態様において、融合分子（例えばヌクレアーゼ）の１つまたはそれより多い構成要素は、天然存在である。他の態様において、融合分子（例えばヌクレアーゼ）の１つまたはそれより多い構成要素は、非天然存在であり、すなわちＤＮＡ結合ドメイン（単数または複数）および／または切断ドメイン（単数または複数）において操作されている。例えば、天然存在ヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、選択されるターゲット部位に結合するように改変されていることも可能である（例えば、同族結合部位とは異なる部位に結合するように操作されているメガヌクレアーゼ）。他の態様において、ヌクレアーゼは、異種ＤＮＡ結合および切断ドメインを含む（例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ；ＴＡＬエフェクタードメインＤＮＡ結合タンパク質；異種切断ドメインを含むメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン）。
【０１０９】
ＤＮＡ結合ドメイン
[00131]特定の態様において、本明細書記載の組成物および方法は、ドナー分子への結合および／または細胞ゲノム中の関心対象の領域への結合のため、メガヌクレアーゼ（ホーミング・エンドヌクレアーゼ）ＤＮＡ結合ドメインを使用する。天然存在メガヌクレアーゼは、１５〜４０塩基対切断部位を認識し、そして一般的に４つのファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−ＣｙｓｔボックスファミリーおよびＨＮＨファミリーにグループ分けされる。例示的なホーミング・エンドヌクレアーゼには、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩが含まれる。その認識配列が知られる。米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；  Ｂｅｌｆｏｒｔら（１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８；  Ｄｕｊｏｎら（１９８９）  Ｇｅｎｅ  ８２：１１５−１１８；  Ｐｅｒｌｅｒら（１９９４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２，  １１２５−１１２７；  Ｊａｓｉｎ  （１９９６）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４−２２８；  Ｇｉｍｂｌｅら（１９９６）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２６３：１６３−１８０；  Ａｒｇａｓｔら（１９９８）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２８０：  ３４５−３５３、およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログを参照されたい。さらに、ホーミング・エンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性を操作して、非天然ターゲット部位に結合させることも可能である。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００２）  Ｍｏｌｅｃ．  Ｃｅｌｌ  １０：８９５−９０５；  Ｅｐｉｎａｔら（２００３）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２９５２−２９６２；  Ａｓｈｗｏｒｔｈら（２００６）  Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：６５６−６５９；  Ｐａｑｕｅｓら（２００７）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：４９−６６；米国特許公報第２００７０１１７１２８号もまた参照されたい。ホーミング・エンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、全体として、ヌクレアーゼの背景で改変されることも可能であるし（すなわちヌクレアーゼが同族切断ドメインを含むように）、または異種切断ドメインに融合させることも可能である。
【０１１０】
[00132]他の態様において、本明細書記載の方法および組成物で用いるヌクレアーゼの１つまたはそれより多くのＤＮＡ結合ドメインは、天然存在または操作された（非天然存在）ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、その全体が本明細書に援用される米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。キサントモナス属の植物病原性細菌は、重要な作物植物において多くの疾患を引き起こすことが知られる。キサントモナス属の病原性は、植物細胞内に２５を超える異なるエフェクタータンパク質を注入する、保存されたＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）系に依存する。これらの注入されるタンパク質の中には、植物転写活性化因子を模倣し、そして植物トランスクリプトームを操作する転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターがある（Ｋａｙら（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：６４８−６５１を参照されたい）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する。最もよく特徴付けられたＴＡＬエフェクターの１つは、キサントモナス・キャンペストグリスｐｖ．ベシカトリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｇｒｉｓ  ｐｖ．  Ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ）由来のＡｖｒＢｓ３である（Ｂｏｎａｓら（１９８９）  Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２１８：  １２７−１３６およびＷＯ２０１００７９４３０を参照されたい）。ＴＡＬエフェクターは、タンデムリピートの中心化ドメインを含有し、各リピートはおよそ３４アミノ酸を含有し、これはこれらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性に重要である。さらに、これらは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含有する（概説に関しては、Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ  Ｓら（２００６）  Ｊ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １６３（３）：  ２５６−２７２を参照されたい）。さらに、植物病原性細菌、ラルストニア・ソラナセアルム（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）において、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と称される２つの遺伝子は、Ｒ．ソラナセアルム次亜種１株ＧＭ１０００および次亜種４株ＲＳ  １０００中にあり、キサントモナス属のＡｖｒＢｓ３ファミリーと相同であることが見出されてきている（Ｈｅｕｅｒら（２００７）  Ａｐｐｌ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒ  Ｍｉｃｒｏ  ７３（１３）：  ４３７９−４３８４を参照されたい）。これらの遺伝子は、ヌクレオチド配列で互いに９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７のリピートドメインにおいて、１，５７５ｂｐの欠失がある点で異なる。しかし、どちらの遺伝子産物も、キサントモナス属のＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と、４０％未満の配列同一性しか持たない。例えば、本明細書にその全体が援用される米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。
【０１１１】
[00133]これらのＴＡＬエフェクターの特異性は、タンデムリピート中に見られる配列に依存する。リピートされる配列は、およそ１０２ｂｐであり、そしてリピートは、典型的には互いに９１〜１００％相同である（Ｂｏｎａｓら、同書）。リピートの多型性は、通常、１２および１３位に位置し、そしてＴＡＬエフェクターのターゲット配列中の隣接ヌクレオチドの同一性と、１２および１３位での高頻度可変性二残基（ＲＶＤ）の同一性の間には、１対１対応があるようである（ＭｏｓｃｏｕおよびＢｏｇｄａｎｏｖｅ，  （２００９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６：１５０１ならびにＢｏｃｈら（２００９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６：１５０９−１５１２を参照されたい）。実験的に、これらのＴＡＬエフェクターのＤＮＡ認識のための天然コードは、１２および１３位のＨＤ配列がシトシン（Ｃ）への結合を導き、ＮＧがＴに結合し、ＮＩがＡ、Ｃ、ＧまたはＴに結合し、ＮＮがＡまたはＧに結合し、そしてＩＮＧがＴに結合するように決定されてきている。これらのＤＮＡ結合リピートは、リピートの新規の組み合わせおよび数を含むタンパク質に組み立てられて、新規配列と相互作用可能であり、そして植物細胞において、非内因性レポーター遺伝子の発現を活性化可能である人工的転写因子が作製されてきている（Ｂｏｃｈら、同書）。操作されたＴＡＬタンパク質は、Ｆоｋ１切断ハーフドメインに連結されて、ＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ融合体（ＴＡＬＥＮ）を生じている。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号；  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら（（２０１０）  ＜Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｅｐｕｂ  １０．１５３４／ｇｅｎｅｔｉｃｓ．  １１０．１２０７１７）を参照されたい。特定の態様において、ＴＡＬＥドメインは、米国特許第８，５８６，５２６号に記載されるようなＮキャップおよび／またはＣキャップを含む。
【０１１２】
[00134]特定の態様において、ｉｎ  ｖｉｖｏ切断および／または細胞ゲノムのターゲティング化切断に用いられる１つまたはそれより多くのヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、選択されるターゲット部位に結合するように操作されている点で非天然存在である。例えば、すべてその全体が本明細書に援用される、Ｂｅｅｒｌｉら（２００２）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０：１３５−１４１；  Ｐａｂｏら（２００１）  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０；  Ｉｓａｌａｎら（２００１）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０；  Ｓｅｇａｌら（２００１）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７；  Ｃｈｏｏら（２０００）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６；米国特許第６，４５３，２４２号；第６，５３４，２６１号；第６，５９９，６９２号；第６，５０３，７１７号；第６，６８９，５５８号；第７，０３０，２１５号；第６，７９４，１３６号；第７，０６７，３１７号；第７，２６２，０５４号；第７，０７０，９３４号；第７，３６１，６３５号；第７，２５３，２７３号；および米国特許公報第２００５／００６４４７４号；第２００７／０２１８５２８号；第２００５／０２６７０６１号を参照されたい。
【０１１３】
[00135]操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然存在ジンクフィンガータンパク質に比較して、新規結合特異性を有することも可能である。操作法には、限定されるわけではないが、合理的設計および多様なタイプの選択が含まれる。合理的設計には、例えば、３つ組（または４つ組）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの使用が含まれ、ここで各３つ組または４つ組ヌクレオチド配列は、特定の３つ組または４つ組配列に結合するジンクフィンガーの１つまたはそれより多いアミノ酸配列と会合する。例えば、本明細書にその全体が援用される、共有米国特許第６，４５３，２４２号および第６，５３４，２６１号を参照されたい。
【０１１４】
[00136]ファージディスプレイおよび２ハイブリッド系を含む例示的な選択法が、米国特許第５，７８９，５３８号；第５，９２５，５２３号；第６，００７，９８８号；第６，０１３，４５３号；第６，４１０，２４８号；第６，１４０，４６６号；第６，２００，７５９号；および第６，２４２，５６８号；ならびにＷＯ  ９８／３７１８６；  ＷＯ  ９８／５３０５７；  ＷＯ  ００／２７８７８；  ＷＯ  ０１／８８１９７およびＧＢ  ２，３３８，２３７に開示される。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインに関する結合特異性の増進が、例えば、共有ＷＯ  ０２／０７７２２７に記載されてきている。
【０１１５】
[00137]さらに、これらのおよび他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガーのジンクフィンガータンパク質は、例えば長さ５またはそれより多いアミノ酸のリンカーを含む、任意の適切なリンカー配列を用いて、ともに連結されることも可能である。長さ６またはそれより多いアミノ酸の例示的なリンカー配列に関しては、米国特許第６，４７９，６２６号；第６，９０３，１８５号；および第７，１５３，９４９号もまた参照されたい。本明細書記載のタンパク質には、タンパク質の個々のジンクフィンガーの間の適切なリンカーの任意の組み合わせが含まれることも可能である。
【０１１６】
[00138]いくつかの側面において、ＤＮＡ結合ドメインは、ＰＬＰ１遺伝子またはＰＬＰ１遺伝子制御要素をターゲティングする。
[00139]ターゲット部位の選択；ＺＦＰならびに融合タンパク質（および該タンパク質をコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は、当業者に知られ、そして米国特許第６，１４０，０８１号；第５，７８９，５３８号；第６，４５３，２４２号；第６，５３４，２６１号；第５，９２５，５２３号；第６，００７，９８８号；第６，０１３，４５３号；第６，２００，７５９号；  ＷＯ  ９５／１９４３１；  ＷＯ  ９６／０６１６６；  ＷＯ  ９８／５３０５７；  ＷＯ  ９８／５４３１１；  ＷＯ  ００／２７８７８；  ＷＯ  ０１／６０９７０  ＷＯ  ０１／８８１９７；  ＷＯ  ０２／０９９０８４；  ＷＯ  ９８／５３０５８；  ＷＯ  ９８／５３０５９；  ＷＯ  ９８／５３０６０；  ＷＯ  ０２／０１６５３６およびＷＯ  ０３／０１６４９６に詳細に記載される。
【０１１７】
[00140]さらに、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガーのジンクフィンガータンパク質は、例えば長さ５またはそれより多いアミノ酸のリンカーを含む、任意の適切なリンカー配列を用いて、ともに連結されることも可能である。長さ６またはそれより多いアミノ酸の例示的なリンカー配列に関しては、米国特許第６，４７９，６２６号；第６，９０３，１８５号；および第７，１５３，９４９号もまた参照されたい。本明細書記載のタンパク質には、タンパク質の個々のジンクフィンガーの間の適切なリンカーの任意の組み合わせが含まれることも可能である。
【０１１８】
[00141]特定の態様において、ＤＮＡ結合ドメインは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の一部である。例えば米国特許第８，６９７，３５９号および米国特許出願第１４／２７８，９０３号を参照されたい。系のＲＮＡ構成要素をコードするＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）遺伝子座、およびタンパク質をコードするｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座（Ｊａｎｓｅｎら，  ２００２．  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４３：  １５６５−１５７５；  Ｍａｋａｒｏｖａら，  ２００２．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３０：  ４８２−４９６；  Ｍａｋａｒｏｖａら，  ２００６．  Ｂｉｏｌ．  Ｄｉｒｅｃｔ  １：  ７；  Ｈａｆｔら，  ２００５．  ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｂｉｏｌ．  １：  ｅ６０）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の遺伝子配列を構成する。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子ならびにＣＲＩＳＰＲ仲介性核酸切断の特異性をプログラミング可能な非コードＲＮＡ要素の組み合わせを含有する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、２つのクラスに分離される。クラス１は、いくつかのＣａｓタンパク質をＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とともに用いて、機能的エンドヌクレアーゼを構築する。クラス２  ＣＲＩＳＰＲ系は、ｃｒＲＮＡと単一のＣａｓタンパク質を用いる。
【０１１９】
[00142]クラス２  ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最もよく特徴付けされている系の１つであり、そして４つの連続工程で、ターゲティング化ＤＮＡ二重鎖切断を実行する。第一に、２つの非コーディングＲＮＡ、プレｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡがＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第二に、ｔｒａｃｒＲＮＡがプレｃｒＲＮＡのリピート領域にハイブリダイズし、そしてプレｃｒＲＮＡの、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡへのプロセシングを仲介する。第三に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が、ｃｒＲＮＡ上のスペーサー、およびターゲット認識のさらなる必要条件であるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接するターゲットＤＮＡ上のプロトスペーサーの間のワトソン・クリック塩基対形成を通じて、ターゲットＤＮＡに機能的ドメイン（例えばヌクレアーゼ、例えばＣａｓ）を導く。最後に、Ｃａｓ９が、ターゲットＤＮＡの切断を仲介して、プロトスペーサー内の二重鎖切断を生成する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性は、３つの工程：（ｉ）「適応」と称されるプロセスにおける、将来の攻撃を防止するための、異質な（ａｌｉｅｎ）ＤＮＡ配列のＣＲＩＳＰＲアレイへの挿入；（ｉｉ）適切なタンパク質の発現、ならびにアレイの発現およびプロセシング、その後（ｉｉｉ）異質な核酸でのＲＮＡ仲介性干渉を含む。したがって、細菌細胞において、いわゆる「Ｃａｓ」タンパク質のいくつかは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の天然機能に関与し、そして異質なＤＮＡの挿入などの機能において役割を果たす。
【０１２０】
[00143]特定の態様において、Ｃａｓタンパク質は、天然存在Ｃａｓタンパク質の「機能的誘導体」であることも可能である。天然配列ポリペプチドの「機能的誘導体」は、天然配列ポリペプチドと共通の定性的生物学的特性を有する化合物である。「機能的誘導体」には、対応する天然配列ポリペプチドと共通の生物学的活性を有する限り、限定されるわけではないが、天然配列の断片および天然配列ポリペプチドの誘導体、ならびにその断片が含まれる。本明細書で意図する生物学的活性は、機能的誘導体が、ＤＮＡ基質を断片に加水分解する能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列変異体、共有結合性の修飾の両方、およびその融合体、例えば誘導体Ｃａｓタンパク質を含む。Ｃａｓポリペプチドまたはその断片の適切な誘導体には、限定されるわけではないが、Ｃａｓタンパク質またはその断片の突然変異体、融合体、共有結合性の修飾が含まれる。Ｃａｓタンパク質またはその断片、ならびにＣａｓタンパク質またはその断片の誘導体を含むＣａｓタンパク質は、細胞から得られうるか、または化学的に合成されるか、あるいはこれらの２つの方法の組み合わせによることも可能である。細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生する細胞、あるいはＣａｓタンパク質を天然に産生し、そして遺伝子操作されて内因性Ｃａｓタンパク質をより高い発現レベルで産生する細胞、または内因性Ｃａｓと同じもしくは異なるＣａｓをコードする、外因性に導入された核酸から、Ｃａｓタンパク質を産生する細胞であることも可能である。いくつかの場合、細胞は天然にはＣａｓタンパク質を産生せず、そしてＣａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作される。いくつかの態様において、Ｃａｓタンパク質は、ＡＡＶベクターを通じた送達のための小さいＣａｓ９オルソログである（Ｒａｎら（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ  ５１０，  ｐ．１８６）。特定の態様において、Ｃａｓタンパク質はＳａＣａｓ９またはＳｐＣａｓ９Ｃａｓタンパク質である。
【０１２１】
[00144]特定の態様において、Ｃａｓ９タンパク質は、哺乳動物Ｃａｓ９、あるいはストレプトコッカス・ピオゲネス、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  Ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｎｏｎｉａｅ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、ストレプトコッカス・ムタンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、バチルス・スミシー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ）、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、マイコプラズマ・カニス（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｃａｎｉｓ）またはエンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、スッテレラ・ワドスウォーセンシス（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ）、フィリファクター・アロシス（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ  ａｌｏｃｉｓ）、ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、カンピロバクター・ラリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｒｉ）、コリネバクター・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ  ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ）、パルビバキュルム・ラバメンチボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ  ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、マイコプラズマ・ガリセプティクム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）、黄色ブドウ球菌亜種アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｕｂｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ  Ａｕｒｅｕｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ・パリ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ  Ｐａｒｉｓ）、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、スタフィロコッカス・シュードインターメディウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、またはナイセリア・シネレ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ）由来のＣａｓ９である。
【０１２２】
[00145]特定の態様において、Ｃａｓ９タンパク質は、１つまたはそれより多い核局在配列を有する。
[00146]いくつかの態様において、ＤＮＡ結合ドメインは、クラス２  Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  Ｃｐｆ１系の一部である。Ｃａｓ９同様、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを含有するが、これらはＣａｓ９の第二のＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインおよびＮ末端アルファらせん認識ローブを欠く。Ｃｐｆ１は、付着パターンでＤＮＡを切断し、そして切断のため、Ｃａｓ９によって必要とされる２つ（ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡ）ではなく、１つのＲＮＡしか必要としない。Ｃｐｆ１の付着端切断パターンは、伝統的な制限酵素クローニングと似た、方向性遺伝子トランスファーの可能性を開く。付着端仲介性遺伝子トランスファーは、相同組換え修復（ＨＤＲ）を通じて修飾することが困難な非分裂細胞をターゲティングするために特に有用である可能性もある。Ｃｐｆ１はまた、ＣＲＩＳＰＲによってターゲティング可能な部位の数を、ＳｐＣａｓ９によって好まれる３’−ＮＧＧ  ＰＡＭ部位を欠くＡＴリッチ領域またはＡＴリッチゲノムに拡大する（例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅら（２０１５）  Ｃｅｌｌ  １６３（３）：７５９−７７１およびＭａｋａｒｏｖａら，  （２０１５）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １３（１１）：７２２−７３６を参照されたい）。
【０１２３】
[00147]いくつかの態様において、ＤＮＡ結合ドメインは、ヒト細胞におけるゲノム編集に適したアルゴノートエンドヌクレアーゼ系の一部である。ヒト細胞におけるゲノム編集に適した例示的なアルゴノートエンドヌクレアーゼ系には、ナトロノバクテリウム・グレゴリー由来のアルゴノートＤＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（ＮｇＡｇо）が含まれることも可能である（Ｇａｏら（２０１６）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  ３４：  ７６８−７７３）。ＮｇＡｇｏは、〜２４ヌクレオチドの５’リン酸化一本鎖ガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に結合し、そしてｇＤＮＡを装填した際、部位特異的ＤＮＡ二本鎖切断を効率的に生成する。５’リン酸化ｓｓＤＮＡをガイド分子として用いると、細胞オリゴヌクレオチドがＮｇＡｇｏをミスリードする可能性が減少する。ガイド分子は、タンパク質発現中のＮｇＡｇｏにしか付着できない。ガイドが装填されたなら、ＮｇＡｇｏはそのｇＤＮＡに対して、自由に遊離するｓｓＤＮＡを交換不能となる。ＮｇＡｇｏ−ｇＤＮＡ系は、Ｃａｓ９がそうであるようにはプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を必要とせず、そしてガイド−ターゲットミスマッチに対する寛容性が低く、そして（Ｇ＋Ｃ）リッチゲノムターゲットを編集する際に高い効率を所持するようである。
【０１２４】
[00148]恣意的なＤＮＡ配列の外因性ガイドＤＮＡを、ＮｇＡｇｏタンパク質上に装填することも可能である。ＮｇＡｇｏ切断の特異性は、ガイドＤＮＡによって導かれるため、研究者が特定する外因性のガイドＤＮＡで形成されるＮｇＡｇｏ−ＤＮＡ複合体は、したがって、ＮｇＡｇｏターゲットＤＮＡ切断を、研究者が特定する相補的なターゲットＤＮＡに導くであろう。この方式で、ＤＮＡ中にターゲティング化二本鎖切断を生成することも可能である。ＮｇＡｇｏガイドＤＮＡ系（または他の生物由来のオルソログＡｇｏ−ガイドＤＮＡ系）は、細胞内のゲノムＤＮＡのターゲティング化切断を可能にする。こうした切断は、一本鎖または二本鎖のいずれかであることも可能である。哺乳動物ゲノムＤＮＡの切断のため、哺乳動物細胞における発現のために最適化されたＮｇＡｇｏコドンの型の使用が好ましいであろう。さらに、ＮｇＡｇｏタンパク質が細胞透過性ペプチドに融合される、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成されるＮｇＡｇｏ−ＤＮＡ複合体で細胞を処理することが好ましい可能性もある。さらに、突然変異誘発を通じて、３７℃で改善された活性を有するＮｇＡｇｏタンパク質の型を用いることが好ましい可能性もある。Ａｇｏ−ＲＮＡ仲介性ＤＮＡ切断を用い、ＤＮＡ切断の開発のために当該技術分野において標準的である技術を用いて、遺伝子ノックアウト、ターゲティング化遺伝子付加、遺伝子修正、ターゲティング化遺伝子欠失を含む、多数の結果に影響を及ぼすことも可能である。
【０１２５】
[00149]したがって、ヌクレアーゼには、塩基を挿入または欠失して（インデルを生成して）遺伝子発現を不活性化するかまたは減少させることが望ましい、任意の遺伝子（例えばＰＬＰ１）におけるターゲット部位に特異的に結合するＤＮＡ結合ドメインが含まれる。
【０１２６】
切断ドメイン
[00150]任意の適切な切断ドメインを、機能可能であるようにＤＮＡ結合ドメインに連結して、ヌクレアーゼを形成することも可能である。例えば、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインがヌクレアーゼドメインに融合されて、ＺＦＮが生成されてきており、ＺＦＮは、操作された（ＺＦＰ）ＤＮＡ結合ドメインを通じて、意図される核酸ターゲットを認識し、そして多様な生物におけるゲノム修飾での使用のためを含めて、ヌクレアーゼ活性を通じて、ＤＮＡをＺＦＰ結合部位の近くで切断することも可能である、機能的実体である。例えば、米国特許公報２００３０２３２４１０；  ２００５０２０８４８９；  ２００５００２６１５７；  ２００５００６４４７４；  ２００６０１８８９８７；  ２００６００６３２３１；および国際公報ＷＯ  ０７／０１４２７５を参照されたい。同様に、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、ＴＡＬＥＮを生成するヌクレアーゼドメインに融合されてきている。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。
【０１２７】
[00151]上述のように、切断ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインに対して異種であることも可能であり、例えばジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ由来の切断ドメイン、またはＴＡＬＥＮ  ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメイン、またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインおよび異なるヌクレアーゼ由来の切断ドメインであってもよい。異種切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得られることも可能である。切断ドメインが由来しうる例示的なエンドヌクレアーゼには、限定されるわけではないが、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミング・エンドヌクレアーゼが含まれる。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が知られる（例えばＳ１ヌクレアーゼ；マング・ビーン（ｍｕｎｇ  ｂｅａｎ）ヌクレアーゼ；膵臓ＤＮａｓｅ  Ｉ；ミクロコッカス・ヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ）。これらの酵素（またはその機能的断片）の１つまたはそれより多くを切断ドメインおよび切断ハーフドメインの供給源として用いることも可能である。
【０１２８】
[00152]同様に、切断ハーフドメインは、切断活性のために二量体化が必要な、上に示すような任意のヌクレアーゼまたはその断片に由来することも可能である。一般的に、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含むならば、切断のために２つの融合タンパク質が必要である。あるいは、２つの切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質を用いてもよい。２つの切断ハーフドメインが同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来してもよいし、または各切断ハーフドメインが異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来していてもよい。さらに、２つの融合タンパク質のターゲット部位は、好ましくは、互いに対して、それぞれのターゲット部位への２つの融合タンパク質の結合が、例えば二量体化により、切断ハーフドメインが機能的切断ドメインを形成することを可能にする空間的配向で、切断ハーフドメインを互いに対して配置するように、配置される。したがって、特定の態様において、ターゲット部位の近位端は、５〜８ヌクレオチドまたは１５〜１８ヌクレオチド離れている。しかし、任意の整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２つのターゲット部位の間に介在していることも可能である（例えば２〜５０ヌクレオチド対またはそれより多く）。一般的に、切断部位はターゲット部位間にある。
【０１２９】
[00153]制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、そしてＤＮＡへの（認識部位での）配列特異的結合、および結合部位でのまたはその近傍でのＤＮＡの切断が可能である。特定の制限酵素（例えばＩＩＳ型）は、認識部位から離れた部位でＤＮＡを切断し、そして分離可能な結合および切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素Ｆｏｋ  Ｉは、一方の鎖上の認識部位から９ヌクレオチドおよびもう一方の鎖上の認識部位から１３ヌクレオチドで、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；第５，４３６，１５０号および第５，４８７，９９４号；ならびにＬｉら（１９９２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ８９：４２７５−４２７９；  Ｌｉら（１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：２７６４−２７６８；  Ｋｉｍら（１９９４ａ）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：８８３−８８７；  Ｋｉｍら（１９９４ｂ）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９：３１，９７８−３１，９８２を参照されたい。したがって、１つの態様において、融合タンパク質は、操作されていてもまたはされていなくてもよい、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素由来の切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）および１つまたはそれより多いジンクフィンガー結合ドメインを含む。
【０１３０】
[00154]切断ドメインが結合ドメインとは分離可能である例示的なＩＩＳ型制限酵素はＦｏｋ  Ｉである。この特定の酵素は、二量体として活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅら（１９９８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：  １０，５７０−１０，５７５。したがって、本開示の目的のため、開示した融合タンパク質に用いるＦｏｋ  Ｉ酵素の部分は、切断ハーフドメインと見なされる。したがって、ジンクフィンガー−Ｆｏｋ  Ｉ融合体を用いたターゲティング化二本鎖切断および／または細胞性配列のターゲティング化置換のため、各々、Ｆｏｋ  Ｉ切断ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質を用いて、触媒活性切断ドメインを再構成することも可能である。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋ  Ｉ切断ハーフドメインを含有する単一ポリペプチド分子もまた使用可能である。ジンクフィンガー−Ｆｏｋ  Ｉ融合体を用いたターゲティング化切断およびターゲティング化配列改変のためのパラメータは、本開示の別の箇所に提供される。
【０１３１】
[00155]切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持するか、または機能的切断ドメインを形成するために多量体化（例えば二量体化）する能力を保持する、タンパク質の任意の部分であることも可能である。
【０１３２】
[00156]例示的なＩＩＳ型制限酵素が、本明細書にその全体が援用される国際公報ＷＯ  ０７／０１４２７５に記載される。さらなる制限酵素はまた、分離可能な結合および切断ドメインも含有し、そしてこれらは本開示によって意図される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら（２００３）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１：４１８−４２０を参照されたい。
【０１３３】
[00157]特定の態様において、切断ドメインは、例えば、本明細書にすべての開示の全体が援用される、米国特許公報第２００５００６４４７４号；第２００６０１８８９８７号；第２００７０３０５３４６号および第２００８０１３１９６２号に記載されるように、ホモ二量体化を最小限にするかまたは防止する、１つまたはそれより多い操作された切断ハーフドメイン（二量体化ドメイン突然変異体とも称される）を含む。Ｆｏｋ  １の４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、および５３８位のアミノ酸残基はすべて、Ｆｏｋ１切断ハーフドメインの二量体化に影響を及ぼすためのターゲットである。
【０１３４】
[00158]１より多い突然変異を含む切断ドメインを用いてもよく、例えば、「Ｅ４９０Ｋ：１５３８Ｋ」と称される操作された切断ハーフドメインを産生するための、１つの切断ハーフドメインにおける４９０位（Ｅ→Ｋ）および５３８位（Ｉ→Ｋ）の突然変異、そして「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９」と称される操作された切断ハーフドメインを産生するための、別の切断ハーフドメインにおける４８６位（Ｑ→Ｅ）および４９９位（Ｉ→Ｌ）の突然変異によるもの；４８６位の野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基に、４９９位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基に、そして４９６位の野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基に置換する突然変異（それぞれ「ＥＬＤ」および「ＥＬＥ」ドメインとも称される）；４９０、５３８および５３７位（野生型ＦｏｋＩに比較した番号付け）での突然変異を含む操作された切断ハーフドメイン、例えば４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基に、５３８位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基に、そして５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基に置換する突然変異（それぞれ「ＫＫＫ」および「ＫＫＲ」ドメインとも称される）；ならびに／あるいは４９０位および５３７位（野生型ＦｏｋＩに比較した番号付け）の突然変異を含む操作された切断ハーフドメイン、例えば４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基に、そして５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基に置換する突然変異（それぞれ「ＫＩＫ」および「ＫＩＲ」ドメインと称される）がある。例えば、その開示の全体がすべての目的のために本明細書に援用される、米国特許第７，９１４，７９６号；第８，０３４，５９８号および第８，６２３，６１８号を参照されたい。他の態様において、操作された切断ハーフドメインは、「シャーキー」および／または「シャーキーの」突然変異を含む（Ｇｕｏら，  （２０１０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４００（１）：９６−１０７を参照されたい）。
【０１３５】
[00159]あるいは、ヌクレアーゼは、いわゆる「スプリット酵素」技術を用いて、核酸ターゲット部位でｉｎ  ｖｉｖｏで組み立て可能である（例えば米国特許公報第２００９００６８１６４号を参照されたい）。こうしたスプリット酵素の構成要素は、別個の発現構築物上で発現されることも可能であるし、あるいは個々の構成要素が、例えば自己切断２ＡペプチドまたはＩＲＥＳ配列によって分離される１つのオープンリーディングフレーム中で連結されることも可能である。構成要素は、個々のジンクフィンガー結合ドメインまたはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであることも可能である。
【０１３６】
[00160]例えば米国特許第８，５６３，３１４号に記載されるような酵母に基づく染色体系において、使用前に、ヌクレアーゼを活性に関してスクリーニングすることも可能である。
【０１３７】
[00161]Ｃａｓ９関連ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、２つのＲＮＡ非コード構成要素：ｔｒａｃｒＲＮＡ、および同一のダイレクトリピート（ＤＲ）が間に配置されるヌクレアーゼガイド配列（スペーサー）を含有するプレｃｒＲＮＡアレイを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いてゲノム操作を達成するため、これらのＲＮＡの両方の機能が存在しなければならない（Ｃｏｎｇら，  （２０１３）  Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ１／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ  １２３１１４３を参照されたい）。いくつかの態様において、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびプレｃｒＲＮＡは別個の発現構築物を通じて、または別個のＲＮＡとして供給される。
【０１３８】
[00162]他の態様において、操作された成熟ｃｒＲＮＡ（ターゲット特異性を与える）をｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｃａｓ９との相互作用を供給する）に融合させてキメラｃｒ−ＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド（単一ガイドＲＮＡまたはｓｇＲＮＡとも称される）を生成するように、キメラＲＮＡを構築する。したがって、Ｃａｓ９ヌクレアーゼとともに、本発明の方法におけるＰＬＰ１遺伝子の修飾は、非可変足場配列の５’のターゲットＤＮＡに特異的なおよそ２０塩基の配列を含有するｓｇＲＮＡの導入を必要とする。ｓｇＲＮＡは、ＲＮＡとして、またはプロモーター下のｓｇＲＮＡコード配列を含むプラスミドで形質転換することによって、送達可能である。特定の態様において、ＰＬＰ１遺伝子の修飾において使用するためのｓｇＲＮＡ配列には、限定されるわけではないが、ＰＬＰ１遺伝子のエクソン３をターゲティングするＡＡＧＡＣＣＡＣＣＡＴＣＴＧＣＧＧＣＡＡＮＧＧ（配列番号１）およびＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＣＣＣＡＴＡＡＮＧＧ（配列番号２）、ＰＬＰ１遺伝子のエクソン１をターゲティングするＧＴＣＡＧＡＧＴＧＣＣＡＡＡＧＡＣＡＴＧＧＮＮＧＲＲＴ（配列番号３）が含まれる。
【０１３９】
ターゲット部位
[00163]上に詳細に記載するように、ＤＮＡ結合ドメインは、選択する任意の配列に結合するように操作されうる。操作されたＤＮＡ結合ドメインは、天然存在ＤＮＡ結合ドメインに比較して、新規結合特異性を有しうる。
【０１４０】
[00164]特定の態様において、ターゲット部位（単数または複数）は、内因性ＰＬＰ１遺伝子のエクソンにある。ターゲティングのための適切なゲノムエクソン領域の限定されない例には、ＰＬＰ１のエクソン１または３または７が含まれる。いくつかの態様において、ターゲット部位には、ＰＬＰ１のエクソン３の５’の約８０のヌクレオチドセグメントが含まれる。
【０１４１】
[00165]特定の態様において、ヌクレアーゼはＰＬＰ１遺伝子をターゲティングする。特定の態様において、ヌクレアーゼは、プロモーターまたはエンハンサーなどのＰＬＰ１遺伝子制御要素をターゲティングする。
【０１４２】
ドナー
[00166]特定の態様において、本開示は、細胞ゲノム内への外因性配列のヌクレアーゼ仲介性ターゲティング化組込みに関する。上述のように、外因性配列（「ドナー配列」または「ドナー」または「導入遺伝子」とも称される）の挿入は、例えば特定する領域の欠失（例えばＰＭＤ患者の約７０％に現れるＰＬＰ１遺伝子複製の１つのコピーの欠失）および／または突然変異体遺伝子（例えばＰＭＤ患者の約３０％に現れるＰＬＰ１点突然変異）の修正または野生型遺伝子の発現増加のためである。ドナー配列が、典型的には、配置されるゲノム配列と同一ではないことが容易に明らかであろう。ドナー配列は、関心対象の位置での効率的なＨＤＲを可能にするため、相同性の２つの領域が隣接した非相同配列を含有することも可能であるし、または非相同組換え修復機構を通じて組み込まれることも可能である。さらに、ドナー配列は、細胞性クロマチンの関心対象の領域に相同でない配列を含有するベクター分子を含むことも可能である。ドナー分子は、細胞ＤＮＡに相同な、いくつかの不連続領域を含有することも可能である。さらに、関心対象の領域に通常存在しない配列のターゲティング化挿入のため、前記配列は、ドナー核酸分子中に存在し、そして関心対象の領域中の配列に相同な領域が隣接していることも可能である。
【０１４３】
[00167]ヌクレアーゼと同様に、ドナーをいかなる型で導入することも可能である。特定の態様において、当該技術分野に知られる方法によって、ＤＮＡおよび／またはウイルスベクターを用いて、ドナーを導入することも可能である。例えば、米国特許公報第２０１０００４７８０５号および第２０１１０２０７２２１号を参照されたい。ドナーは、二本鎖または一本鎖型で細胞に導入可能である。ドナーは環状または直鎖型で細胞に導入可能である。直鎖型で導入する場合、当業者に知られる方法によって、ドナー配列の末端を（例えばエキソヌクレアーゼ分解から）保護することも可能である。例えば、１つまたはそれより多いジデオキシヌクレオチド残基を直鎖分子の３’末端に付加し、そして／または自己相補オリゴヌクレオチドを一方または両方の末端に連結する。例えば、Ｃｈａｎｇら（１９８７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ８４：４９５９−４９６３；  Ｎｅｈｌｓら（１９９６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：８８６−８８９を参照されたい。分解から外因性ポリヌクレオチドを保護するためのさらなる方法には、限定されるわけではないが、末端アミノ基（単数または複数）の付加、および修飾ヌクレオチド間連結の使用、例えばホスホロチオエート、ホスホロアミデート、およびＯ−メチルリボースまたはデオキシリボース残基の使用が含まれる。
【０１４４】
[00168]特定の態様において、ドナーには、長さ１ｋｂより長い、例えば２〜２００ｋｂの間、２〜１０ｋｂ（またはその間の任意の値）の間の配列（例えばコード配列、導入遺伝子とも称される）が含まれる。ドナーにはまた、少なくとも１つのヌクレアーゼターゲット部位も含まれることも可能である。特定の態様において、ドナーには、少なくとも２つのターゲット部位、例えばＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＮｇＡｇｏまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの対に関するものが含まれる。典型的には、ヌクレアーゼターゲット部位は、導入遺伝子を切断するため、導入遺伝子配列の外側、例えば導入遺伝子配列の５’および／または３’である。ヌクレアーゼ切断部位（単数または複数）は、任意のヌクレアーゼ（単数または複数）に関するものであることも可能である。特定の態様において、二本鎖ドナーに含有されるヌクレアーゼターゲット部位（単数または複数）は、切断されるドナーが相同性に非依存性の方法を通じて組み込まれている、内因性ターゲットを切断するために用いられる同じヌクレアーゼ（単数または複数）に関するものである。
【０１４５】
[00169]ドナーは、その発現が、組込み部位で、内因性プロモーター、すなわちドナーが挿入される内因性遺伝子の発現を駆動するプロモーターによって駆動されるように挿入されることも可能である。しかし、ドナーが、プロモーターおよび／またはエンハンサー、例えば恒常性プロモーターあるいは誘導性または組織特異的プロモーターを含むことも可能であることが明らかであろう。
【０１４６】
[00170]内因性遺伝子のすべてかいくつかが発現されるかまたはまったく発現されないように、内因性遺伝子内にドナー分子を挿入することも可能である。いくつかの態様において、導入遺伝子は、ＰＬＰ１が不活性化されるかまたはその発現が減少するように、ＰＬＰ１またはＰＬＰ１遺伝子制御要素内に組み込まれる。
【０１４７】
[00171]さらに、発現のために必要とはされないが、外因性配列にはまた、転写または翻訳制御または他の配列、例えばプロモーター、エンハンサー、インスレーター、内部リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列および／またはポリアデニル化シグナルが含まれることも可能である。さらに、スプライスアクセプター配列が含まれることも可能である。例示的なスプライスアクセプター部位配列が当業者に知られ、そしてこれには、例としてのみであるが、ＣＴＧＡＣＣＴＣＴＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＣＡＣＡＧ（配列番号４）（ヒトＨＢＢ遺伝子由来）およびＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧ（配列番号５）（ヒト免疫グロブリンガンマ遺伝子由来）が含まれる。
【０１４８】
[00172]本明細書記載のドナー配列（導入遺伝子および／または修復テンプレート）は、当該技術分野に知られる標準的技術、例えばＰＣＲを用いて、プラスミド、細胞または他の供給源から単離されることも可能である。使用のためのドナーには、環状スーパーコイル、環状弛緩、直鎖等を含む多様な形態タイプが含まれることも可能である。あるいは、これらは、標準的なオリゴヌクレオチド合成技術を用いて、化学的に合成されてもよい。さらに、ドナーは、メチル化されていてもまたはメチル化を欠いていてもよい。ドナーは、細菌または酵母人工染色体（ＢＡＣまたはＹＡＣ）の形であることも可能である。
【０１４９】
[00173]本明細書記載のドナーポリヌクレオチドには、１つまたはそれより多い非天然塩基および／または主鎖が含まれることも可能である。特に、本明細書記載の方法を用いて、メチル化シトシンを含むドナー分子の挿入を実行して、関心対象の領域において、転写静止状態を達成することも可能である。
【０１５０】
[00174]外因性（ドナー）ポリヌクレオチドは、関心対象の任意の配列（外因性配列）を含むことも可能である。例示的な外因性配列には、限定されるわけではないが、任意のポリペプチドコード配列（例えばｃＤＮＡ）、プロモーター配列、エンハンサー配列、エピトープタグ、マーカー遺伝子、切断酵素認識部位および多様なタイプの発現構築物が含まれる。マーカー遺伝子には、限定されるわけではないが、抗生物質耐性（例えばアンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を仲介するタンパク質をコードする配列、着色または蛍光または発光タンパク質（例えば緑色蛍光タンパク質、増進緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）をコードする配列、ならびに増進された細胞増殖および／または遺伝子増幅を仲介するタンパク質（例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ）をコードする配列が含まれる。エピトープタグには、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡまたは任意の検出可能アミノ酸配列の１つまたはそれより多いコピーが含まれる。
【０１５１】
[00175]いくつかの態様において、ドナーは、限定されるわけではないが、抗体、抗原、酵素、受容体（細胞表面または核）、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、レポーターポリペプチド、増殖因子、および上記いずれかの機能的断片を含む、細胞における発現が望ましい、任意のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。コード配列は、例えばｃＤＮＡであることも可能である。
【０１５２】
[00176]特定の態様において、外因性配列は、ターゲティング化組込みを経ている細胞の選択を可能にする、マーカー遺伝子（上記）、およびさらなる機能性をコードする連結された配列を含むことも可能である。マーカー遺伝子の限定されない例には、ＧＦＰ、薬剤選択マーカー（単数または複数）等が含まれる。
【０１５３】
[00177]特定の態様において、ドナーには、例えば、突然変異有害内因性配列を置換する野生型遺伝子が含まれることも可能である。例えば、野生型（または他の機能的）遺伝子配列を、遺伝子の内因性コピーが突然変異されている幹細胞のゲノム内に挿入することも可能である。他の態様において、ドナーには、例えば、野生型内因性遺伝子を置換する突然変異体遺伝子が含まれることも可能である。例えば、野生型ＰＬＰ１配列を幹細胞のゲノム内に挿入して、ミエリン関連障害に関与する内因性有害突然変異体ＰＬＰ１遺伝子を突然変異させることも可能である。
【０１５４】
[00178]本明細書の解説にしたがった、こうした発現カセットの構築は、分子生物学の技術分野に周知の方法論を利用する（例えばＡｕｓｕｂｅｌまたはＭａｎｉａｔｉｓを参照されたい）。トランスジェニック動物を生成するための発現カセットの使用の前に、適切な細胞株（例えば初代細胞、形質転換細胞、または不死化細胞株）に発現カセットを導入することによって、選択した制御要素と関連するストレス誘導因子に対する発現カセットの反応性を試験することも可能である。
【０１５５】
[00179]さらに、発現には必要ではないが、外因性配列にはまた、転写または翻訳制御配列、例えばプロモーター、エンハンサー、インスレーター、内部リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列および／またはポリアデニル化シグナルもまた含まれることも可能である。さらに、関心対象の遺伝子の制御要素を、レポーター遺伝子に機能可能であるように連結して、キメラ遺伝子を生成することも可能である（例えばレポーター発現カセット）。
【０１５６】
[00180]非コード核酸配列のターゲティング化挿入もまた達成可能である。アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする配列もまた、ターゲティング化挿入に使用可能である。
【０１５７】
[00181]さらなる態様において、ドナー核酸は、さらなるヌクレアーゼ設計のための特異的ターゲット部位である非コード配列を含むことも可能である。続いて、元来のドナー分子が切断され、そして関心対象の別のドナー分子の挿入によって修飾されるように、さらなるヌクレアーゼを細胞で発現させることも可能である。この方式で、ドナー分子の反復組込みが生成され、関心対象の特定の遺伝子座または安全なハーバー遺伝子座で特質スタッキング（ｔｒａｉｔ  ｓｔａｃｋｉｎｇ）を可能にすることも可能である。
【０１５８】
[00182]いくつかの態様において、ペリツェウス・メルツバッハ病（ＰＭＤ）のｊｉｍｐｙマウスモデルにおける再ミエリン形成および臨床的重症度の減少を評価するｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを用いて、本明細書記載の療法的遺伝子修飾組成物をさらにスクリーニングすることも可能である。
【０１５９】
遺伝子サイレンシング
[00183]特定の態様において、ヌクレアーゼはＰＬＰ１遺伝子をターゲティングする。特定の態様において、ヌクレアーゼは、ＰＬＰ１遺伝子制御要素、例えばプロモーターまたはエンハンサーをターゲティングする。
【０１６０】
[00184]いくつかの態様において、内因性ＰＬＰ１遺伝子産物またはＰＬＰ１発現を促進するＰＬＰ１制御要素遺伝子産物を修飾して、ＰＬＰ１発現レベルを減少させる。特定の態様において、遺伝子サイレンシングを用いて、内因性ＰＬＰ１遺伝子産物またはＰＬＰ１制御要素遺伝子産物を修飾して、細胞におけるＰＬＰ１発現レベルを減少させる。
【０１６１】
[00185]他の態様において、その必要がある被験体の組織または細胞において、ＰＬＰ１発現を促進するＰＬＰ１またはＰＬＰ１制御要素の発現を減少させるかまたは阻害する、遺伝子サイレンシング剤の使用を通じて、内因性ＰＬＰ１遺伝子産物またはＰＬＰ１制御要素遺伝子産物を修飾する。「発現」は、遺伝子産物（典型的にはタンパク質、場合によって翻訳後修飾されたまたは機能的／構造性ＲＮＡ）を産生する、遺伝子からの情報の全体の流れを意味する。
【０１６２】
[00186]いくつかの態様において、剤には、細胞におけるＰＬＰ１発現を阻害するかまたは減少させるＲＮＡｉ構築物が含まれることも可能である。ＲＮＡｉ構築物は、ターゲット遺伝子の発現を特異的に遮断しうる二本鎖ＲＮＡを含む。「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」は、元来、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が特異的に、そして転写後の方式で、遺伝子発現をブロッキングする、植物および虫において観察される現象に適用された用語である。
【０１６３】
[00187]本明細書において、用語「ｄｓＲＮＡ」は、ｓｉＲＮＡ分子、または二本鎖特徴を含み、そして細胞においてｓｉＲＮＡにプロセシングされることが可能な他のＲＮＡ分子、例えばヘアピンＲＮＡ部分（ｓｈＲＮＡ）およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を指す。
【０１６４】
[00188]用語「機能喪失」は、対象のＲＮＡｉ法によって阻害される遺伝子を指す場合、ＲＮＡｉ構築物の非存在下でのレベルに比較した際の遺伝子の発現レベルの減少を指す。
【０１６５】
[00189]本明細書において、句「ＲＮＡｉを仲介する」は、ＲＮＡｉプロセスにより分解されようとするＲＮＡを区別する能力を指し（示し）、例えば分解は配列非依存性ｄｓＲＮＡ反応、例えばＰＫＲ反応ではなく、配列特異的方式で起こる。
【０１６６】
[00190]本明細書において、用語「ＲＮＡｉ構築物」は、ｉｎ  ｖｉｖｏで切断されて、ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡを形成可能である、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ヘアピンＲＮＡ、および他のＲＮＡ種（例えばｍｉＲＮＡ）を含めて、本明細書全体で用いられる一般的な用語である。本明細書のＲＮＡｉ構築物にはまた、細胞においてｄｓＲＮＡまたはヘアピンＲＮＡを形成する転写物、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏでｓｉＲＮＡを産生可能な転写物を生じさせることが可能な発現ベクター（ＲＮＡｉ発現ベクターとも称される）が含まれる。
【０１６７】
[00191]「ＲＮＡｉ発現ベクター」（本明細書において、「ｄｓＲＮＡコードプラスミド」とも称される）は、構築物が発現される細胞において、ｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ部分を産生するＲＮＡを発現する（転写する）ために用いられる複製可能核酸構築物を指す。こうしたベクターには、（１）遺伝子発現において制御性の役割を有する遺伝子要素（単数または複数）、例えばプロモーター、オペレーターまたはエンハンサーであって、（２）転写されて二本鎖ＲＮＡを生じる「コード」配列（細胞においてアニーリングしてｓｉＲＮＡを形成する２つのＲＮＡ部分、またはｓｉＲＮＡにプロセシング可能な単一のヘアピンＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ）に機能可能であるように連結されている（１）の遺伝子要素、ならびに（３）適切な転写開始および終結配列の組み立てを含む転写ユニットが含まれる。
【０１６８】
[00192]プロモーターおよび他の制御要素の選択は、一般的に、意図される宿主細胞、例えばＯＰＣにしたがって多様である。一般的に、組換えＤＮＡ技術における有用性の発現ベクターは、しばしば、環状二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」の形であり、プラスミドは、そのベクター型において、染色体には結合しない。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に用いられる型であるため、交換可能に用いられる。しかし、本出願は、同等の機能を提供するもの、そして続いて当該技術分野に知られるようになる他の型の発現ベクターを記載する。
【０１６９】
[00193]ＲＮＡｉ構築物は、細胞の生理学的条件下で、阻害しようとする遺伝子（すなわち「ターゲット」遺伝子）のｍＲＮＡ転写物の少なくとも部分のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含有する。二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡｉを仲介する能力を有する天然ＲＮＡに十分に類似であればよい。したがって、態様は、遺伝子突然変異、系統多型または進化分岐により期待されうる配列変動を許容する。ターゲット配列およびＲＮＡｉ構築物配列の間の許容されるヌクレオチドミスマッチの数は、５塩基対中１、または１０塩基対中１、または２０塩基対中１、または５０塩基対中１より多くない。ｓｉＲＮＡ二重鎖の中心のミスマッチは、最も重要であり、そして本質的にターゲットＲＮＡの切断を無効にしうる。対照的に、ターゲットＲＮＡに相補的であるｓｉＲＮＡ鎖の３’端のヌクレオチドは、ターゲット認識の特異性に有意には寄与しない。
【０１７０】
[00194]当該技術分野に知られる配列比較および整列アルゴリズムによって、そして例えば、デフォルトパラメータを用いてＢＥＳＴＦＩＴソフトウェアプログラムに実装されるようなスミス・ウォーターマンアルゴリズム（例えばウィスコンシン大学遺伝子計算グループ）によって、ヌクレオチド配列間の相違パーセントを計算することによって、配列同一性を最適化することも可能である。阻害性ＲＮＡおよびターゲット遺伝子の部分の間の９０％より高い配列同一性、またはさらに１００％の配列同一性が好ましい。あるいは、ＲＮＡの二重鎖領域を、ターゲット遺伝子転写物の部分とハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列として、機能的に定義することも可能である。
【０１７１】
[00195]化学合成法によって、または組換え核酸技術によって、ＲＮＡｉ構築物の産生を実行することも可能である。処理される細胞の内因性ＲＮＡポリメラーゼは、ｉｎ  ｖｉｖｏで転写を仲介することも可能であるし、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏの転写のために、クローニングされたＲＮＡポリメラーゼを用いることも可能である。例えば、細胞ヌクレアーゼに対する感受性を減少させ、生物学的利用能を改善し、配合物特性を改善し、そして／または他の薬力学的特性を変化させるために、ＲＮＡｉ構築物には、リン酸−糖主鎖またはヌクレオシドのいずれかに対する修飾が含まれることも可能である。例えば、天然ＲＮＡのホスホジエステル連結を修飾して、窒素またはイオウヘテロ原子の少なくとも１つを含めることも可能である。特異的遺伝子阻害を可能にする一方、ｄｓＲＮＡに対する一般的な反応を回避するように、ＲＮＡ構造において修飾をあつらえることも可能である。同様に、塩基を修飾して、アデノシンデアミナーゼの活性をブロックすることも可能である。ＲＮＡｉ構築物を酵素的に産生するかまたは部分的／完全有機合成によって産生することも可能であり、修飾されたリボヌクレオチドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素的または有機的合成によって、導入することも可能である。
【０１７２】
[00196]ＲＮＡｉ構築物を修飾するために、ＲＮＡ分子を化学的に修飾する方法を適応させることも可能である（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  ２５：７７６−７８０；  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇ  ７：８９−９８；  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２３：２６６１−２６６８；  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  ７：５５−６１を参照されたい）。単に例示するために、ＲＮＡｉ構築物の主鎖は、ホスホロチオエート、ホスホロアミダイト、ホスホジチオエート、キメラメチルホスホネートーホスホジエステル、ペプチド核酸、５−プロピニル−ピリミジン含有オリゴマーまたは糖修飾で修飾されていることも可能である（例えば２’置換リボヌクレオシド、ａ−立体配置）。
【０１７３】
[00197]単一の自己相補的ＲＮＡ鎖または２つの相補的ＲＮＡ鎖によって、二本鎖構造を形成することも可能である。ＲＮＡ二重鎖形成は、細胞の内側または外側のいずれで開始することも可能である。細胞あたり少なくとも１コピーの送達を可能にする量で、ＲＮＡを導入することも可能である。二本鎖物質のより多い用量（例えば細胞あたり少なくとも５、１０、１００、５００または１０００コピー）がより効果的な阻害を生じる可能性もある一方、より少ない用量もまた、特定の適用には有用でありうる。ＲＮＡの二重鎖領域に対応するヌクレオチド配列が、遺伝子阻害のためにターゲティングされる点で、阻害は配列特異的である。
【０１７４】
[00198]特定の態様において、対象のＲＮＡｉ構築物は、「小分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」である。これらの核酸は、長さおよそ１９〜３０ヌクレオチドであり、さらにより好ましくは長さ２１〜２３ヌクレオチドであり、例えばその長さは、より長い二本鎖ＲＮＡを「ダイシング」するヌクレアーゼによって生成される断片に対応する。ｓｉＲＮＡは、ヌクレアーゼ複合体を補充し、そして特定の配列に対する対形成によって、該複合体をターゲットｍＲＮＡに導くと理解される。その結果、ターゲットｍＲＮＡは、タンパク質複合体中のヌクレアーゼによって分解される。特定の態様において、２１〜２３ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ分子は、３’ヒドロキシル基を含む。
【０１７５】
[00199]本明細書記載のｓｉＲＮＡ分子は、当業者に知られるいくつかの技術を用いて得られうる。例えば、当該技術分野に知られる方法を用いて、ｓｉＲＮＡを化学的に合成するかまたは組換え的に産生することも可能である。例えば、短いセンスおよびアンチセンスＲＮＡオリゴマーを合成し、そしてアニーリングして、各端に２ヌクレオチドのオーバーハングを含む二本鎖ＲＮＡ構造を形成することも可能である（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ９８：９７４２−９７４７；  ＥＭＢＯ  Ｊ，  ２０：６８７７−８８）。次いで、これらの二本鎖ｓｉＲＮＡ構造を、受動的取り込みまたは選択する送達系、例えば以下に記載するもののいずれかによって、細胞に直接導入することも可能である。
【０１７６】
[00200]特定の態様において、例えば酵素ダイサーの存在下で、より長い二本鎖ＲＮＡのプロセシングによって、ｓｉＲＮＡ構築物を生成することも可能である。１つの態様において、ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系を用いる。この態様において、ｄｓＲＮＡを、ショウジョウバエ属胚由来の可溶性抽出物と組み合わせて、それによって組み合わせを生じる。該組み合わせを、ｄｓＲＮＡが約２１〜約２３ヌクレオチドのＲＮＡ分子にプロセシングされる条件下で維持する。
【０１７７】
[00201]当業者に知られる多くの技術を用いて、ｓｉＲＮＡを精製することも可能である。例えば、ゲル電気泳動を用いて、ｓｉＲＮＡを精製することも可能である。あるいは、非変性法、例えば非変性カラムクロマトグラフィを用いて、ｓｉＲＮＡを精製することも可能である。さらに、クロマトグラフィ（例えばサイズ排除クロマトグラフィ）、グリセロール勾配遠心分離、抗体を伴うアフィニティ精製を用いて、ｓｉＲＮＡを精製することも可能である。
【０１７８】
[00202]特定の態様において、ＲＮＡｉ構築物は、ヘアピン構築物の形である（ヘアピンＲＮＡと称される）。ヘアピンＲＮＡは、外因性に合成されてもよいし、またはｉｎ  ｖｉｖｏでＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターから転写することによって形成されてもよい。哺乳動物細胞においてこうしたヘアピンＲＮＡを作製し、そして遺伝子サイレンシングに用いる例は、例えば、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ，  ２００２，  １６：９４８−５８；  Ｎａｔｕｒｅ，  ２００２，  ４１８：３８−９；  ＲＮＡ，  ２００２，  ８：８４２−５０；およびＰｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，  ２００２，  ９９：６０４７−５２に記載される。好ましくは、こうしたヘアピンＲＮＡは、望ましい遺伝子の連続してそして安定した抑制を確実にするために、細胞または動物において操作される。ｓｉＲＮＡが細胞におけるヘアピンＲＮＡをプロセシングすることによって産生可能であることが当該技術分野に知られる。
【０１７９】
[00203]特定の態様において、ＲＮＡｉ構築物は、マイクロＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの形である。ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって、それ自体の遺伝子またはイントロンのいずれかから転写される非コード一本鎖ＲＮＡである。転写後、一次ｍｉＲＮＡはまず、ステム−ループ構造を持つプレｍｉＲＮＡ（約７０ヌクレオチド）にプロセシングされ、そして次いで、機能的ｍｉＲＮＡ（２１〜２３ヌクレオチド）にプロセシングされる。ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡと同様、ｍｉＲＮＡはまた、ｍＲＮＡ分解および転写後遺伝子サイレンシングのため、ＲＩＳＣを用い、そして関心対象の任意のｍＲＮＡをターゲティングする潜在能力を有する。ターゲットｍＲＮＡと完全な相補性を有するｓｉＲＮＡとは対照的に、ｍｉＲＮＡは、ターゲットｍＲＮＡに不完全にしか結合しない。この部分的相補性結合は、各ｍｉＲＮＡがターゲットｍＲＮＡの多くの類似のセットと潜在的に相互作用することを可能にする。ｍＲＮＡ分解に加えて、ｍｉＲＮＡは、エンドヌクレアーゼ切断を伴わない翻訳的抑制を引き起こしうる。したがって、ｍｉＲＮＡにターゲティングされる遺伝子は、ターゲットのｍＲＮＡレベルに影響を及ぼすことなく、翻訳的に制御されうる。ｓｉＲＮＡに勝るｍｉＲＮＡの潜在的な利点は、１つの単一のｍｉＲＮＡ転写物が多数のｓｉＲＮＡにプロセシングされうることである。
【０１８０】
[00204]さらに他の態様において、例えば転写産物として、二本鎖ＲＮＡを送達するためにプラスミドを用いる。こうした態様において、ＲＮＡｉ構築物のセンスおよびアンチセンス鎖の各々に関して、「コード配列」を含むようにプラスミドを設計する。コード配列は、例えば逆位プロモーターによって隣接される、同じ配列であってもよいし、または各々別個のプロモーターの転写調節下にある、２つの別個の配列であってもよい。コード配列が転写された後、相補的ＲＮＡ転写物は塩基対形成して、二本鎖ＲＮＡを形成する。
【０１８１】
[00205]ＰＣＴ出願ＷＯ０１／７７３５０は、真核細胞において、同じ導入遺伝子のセンスおよびアンチセンスＲＮＡ転写物の両方を生じる、導入遺伝子の二方向性転写のためのベクターの例を記載する。したがって、特定の態様は、以下のユニークな特性を有する組換えベクターを提供し；該ベクターは、反対方向に配置され、そして関心対象のＲＮＡｉ構築物の導入遺伝子に隣接する、２つの重複転写単位を有するウイルスレプリコンを含み、ここで２つの重複転写単位は、宿主細胞において、同じ導入遺伝子断片から、センスおよびアンチセンスＲＮＡ転写物の両方を生じる。
【０１８２】
[00206]いくつかの態様において、レンチウイルスベクターをｓｉＲＮＡ、例えば小分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の長期発現に用いて、ＰＬＰ１遺伝子の発現をノックダウンすることも可能である。遺伝子治療のためのレンチウイルスベクターの使用に関するいくつかの安全上の懸念があり続けているが、自己不活性化レンチウイルスベクターは、これらが哺乳動物細胞に容易にトランスフェクションするため、遺伝子治療の優れた候補と見なされる。
【０１８３】
[00207]例えば、ＯｌｉｇｏＥｎｇｅｎｅソフトウェア（ＯｌｉｇｏＥｎｇｅｎｅ、ワシントン州シアトル）を用いてｓｉＲＮＡのターゲットとしての配列を同定し、ＰＬＰ１発現の小分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）下方制御を生成することも可能である。オリゴ配列をアニーリングし、そして直線化ｐＳＵＰＥＲ  ＲＮＡｉベクター（ＯｌｉｇｏＥｎｇｅｎｅ、ワシントン州シアトル）に連結し、そして大腸菌株ＤＨ５α細胞に形質転換することも可能である。陽性クローンを選択した後、カルシウム沈殿によって、プラスミドを２９３Ｔ細胞にトランスフェクションすることも可能である。次いで、ｓｈＲＮＡを含有する収集したウイルス上清を用いて、ＰＬＰ１遺伝子産物を下方制御して、それによって細胞におけるＰＬＰ１発現レベルを減少させるために、哺乳動物細胞を感染させることも可能である。
【０１８４】
[00208]ＤＮＡ用に開発されたキャリアーを、部分的に、その類似の物理化学的特性のために、ＲＮＡｉに用いることもまた可能である。これらのキャリアーは、広く、２つのカテゴリー、すなわちウイルス性および非ウイルス性に分けることができる。ＲＮＡｉのためのウイルス送達系に関する最近の総説を参照されたい（本明細書に援用される、ＣａｓｔａｎｏｔｔｏおよびＲｏｓｓｉ，  Ｔｈｅ  ｐｒｏｍｉｓｅｓ  ａｎｄ  ｐｉｔｆａｌｌｓ  ｏｆ  ＲＮＡ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４５７（７２２８）：４２６−３３，  ２００９）。非ウイルス性ＲＮＡｉベクターは、典型的には、陽性荷電ベクター（例えば、陽イオン性細胞透過性ペプチド、陽イオン性ポリマーおよびデンドリマー、ならびに陽イオン性脂質）とＲＮＡｉ構築物を複合体化し；小分子（例えばコレステロール、胆汁酸、および脂質）、ポリマー、抗体、およびＲＮＡとＲＮＡｉ構築物をコンジュゲート化し；そしてＲＮＡｉ構築物をナノ微粒子配合物中に被包することを伴う。ＲＮＡ主鎖の修飾は、そのＲＮＡｉ効率に影響を及ぼすことなく、ｓｉＲＮＡの安定性を改善する。ＲＮＡｉ送達系の選択は、ｓｉＲＮＡの特性、ターゲット細胞のタイプ、およびｉｎ  ｖｉｖｏ適用のための送達経路に応じうる。
【０１８５】
[00209]特定の態様において、ＲＮＡｉ構築物を、陽イオン性細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を通じて送達する。ＣＰＰは、タンパク質（例えば抗体）、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびプラスミドＤＮＡを含む、巨大分子の細胞内送達に用いられてきている。伝統的なエンドサイトーシス経路を利用することに加えて、ＣＰＰ仲介性ＲＮＡｉ送達系は、静電相互作用を通じて非共有結合性複合体を形成する（非共有結合性ＣＰＰ−ｓｉＲＮＡ）か、またはジスルフィド結合を通じて共有結合性架橋を形成する（共有結合性ＣＰＰ−ｓｉＲＮＡ）かいずれかであり、そして細胞膜を横断することによって、直接、細胞に進入可能である。
【０１８６】
[00210]特定の態様において、ＲＮＡｉ構築物を、ポリマー性およびデンドリマー性キャリアーを通じて送達する。直鎖または分枝鎖陽イオン性ポリマーは、ＤＮＡおよびＲＮＡのためのよく確立された効率的なトランスフェクション剤である。これらの陽性荷電ポリマーは、静電相互作用を通じて、核酸の陰性荷電リン酸とポリプレックスを形成することによって働く。ｓｉＲＮＡの他の適切なポリマー性キャリアーには、ミセル、ナノプレックス、ナノカプセル、およびナノジェルが含まれる。ポリプレックスの特性（例えばサイズ、表面荷電、および構造）は、ｓｉＲＮＡのリン酸基の数に対する、陽イオン性ポリマーの陽性電荷の比に依存する。多様なポリマー、例えばポリ−ｌ−リジン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ−ｄ，ｌ−ラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧＡ）、ポリ（アルキルシアノアクリレート）、キトサン、およびゼラチンが適切である。他のものには、陽性荷電表面基を含むデンドリマーが含まれ、その正確なコア−シェルナノ構造が、内部被包、表面吸着、または化学的コンジュゲート化による薬剤装填を可能にする。例示的なデンドリマーには、デンドリマーの表面の特徴を改善するため、場合によるＰＥＧ化を伴う、陽イオン性ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ、アミノ末端表面）；ポリ（プロピレンイミン）（ＰＰＩ）、およびシクロデキストリン含有陽イオン性ポリマーおよびデンドリマーが含まれる。
【０１８７】
[00211]特定の態様において、ＲＮＡｉ構築物をバイオコンジュゲートとして送達する。安定性、細胞内在化、または細胞特異的活性ターゲティング化送達を改善するため、小分子（例えばコレステロール、胆汁酸、および脂質）、ペプチド（例えば陽イオン性細胞透過性ペプチド）、ポリマー（例えばエンドソーム溶解剤、両親媒性ポリ（ビニルエーテル）ＰＢＡＶＥ）、タンパク質（例えば抗体）、およびアプタマー（例えばＲＮＡアプタマー）を含む多様な分子と、ＲＮＡｉ構築物をコンジュゲート化することも可能である。
【０１８８】
[00212]特定の態様において、ＲＮＡｉ構築物を、リポソーム、ミセル、マイクロエマルジョン、および固形脂質ナノ粒子を含む、脂質に基づくキャリアーと共に送達する。リポソームは、相対的に単純であり、そして薬学的特性が周知であるため、一般的なｓｉＲＮＡキャリアーである。癌薬剤のいくつかのリポソームキャリアーは、ヒトにおいて優れた安全性記録を示しており、そして１つ（Ｄｏｘｉｌ）は、ヒト使用のため、ＦＤＡ認可を受けている。脂質に基づくキャリアーもまた、内皮、ＲＥＳ臓器（例えば肝臓）、および固形腫瘍のターゲット部位に、ｓｉＲＮＡを送達するために成功裡に用いられてきている（例えば、陽イオン性および融合性脂質のリポソームに装填されたｓｉＲＮＡの静脈内または腹腔内注射）。
【０１８９】
[00213]特定の態様において、ＲＮＡｉ構築物を、分子トロイの木馬（例えばトロイの木馬リポソーム（ＴＨＬ）配合物）およびアビジン−ビオチン技術の使用とともに送達する。分子トロイの木馬はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏでｓｈＲＮＡ発現プラスミドＤＮＡを脳に送達する、トロイの木馬リポソームとしても配合可能である。非ウイルス性遺伝子治療の送達と同様、小分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードするプラスミドＤＮＡはまた、ＰＥＧ化イムノリポソーム（ＰＩＬ）と共に、静脈内投与後に、脳に送達されうる。例えば、プラスミドＤＮＡをリポソーム（例えば１００ｎｍリポソーム）中に被包してもよく、これがＰＥＧ化され、そして受容体特異的ターゲティングモノクローナル抗体（ＭＡｂ）とコンジュゲート化される。この送達手段を用いると、ＰＩＬを伴う毎週の静脈内ＲＮＡｉは、ヒト上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）の９０％のノックダウンを可能にし、これは頭蓋内脳癌を有するマウスにおいて、生存時間の９０％の増加を生じる。同じ技術を用いて、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを含む他のＲＮＡｉ構築物を、脳に送達することも可能である。例えば、ｓｉＲＮＡは、ターゲティングＭＡｂおよびストレプトアビジンのコンジュゲートの産生と平行して、モノビオチン化されてもよい。
【０１９０】
[00214]分子トロイの木馬（ＭＴＨ）は、血液脳関門（ＢＢＢ）を渡る受容体仲介性輸送（ＲＭＴ）を経る、内因性ペプチドまたはペプチド模倣性モノクローナル抗体（ＭＡｂ）である。ペプチド模倣性ＭＡｂは、ＢＢＢ受容体上の細胞外表面エピトープに結合し、これによって、内因性リガンドのＢＢＢ輸送の干渉を伴わずに、ＭＡｂがＢＢＢを渡ってＲＭＴを経ることが可能になる。ペプチド模倣性ＭＡｂは、ＢＢＢ  ＲＭＴ系を通じて、ＢＢＢを渡って、任意の付着した薬剤を、またはさらにプラスミドＤＮＡを運びうる。
【０１９１】
[00215]脳薬剤送達のため、種特異的ＭＡｂ分子トロイの木馬のパネルが開発されてきている。例えば、マウスにおける薬剤送達のため、マウスＴｆＲに対するラット８Ｄ３  Ｍａｂが用いられる。このＭＴＨは、ラットでは活性でない。ラットにおける脳薬剤送達のため、ラットＴｆＲに対するネズミＯＸ２６  ＭＡｂが用いられ、そしてこのＭＴＨはマウスまたは他の種において活性ではない。旧世界霊長類、例えばアカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）に対する脳薬剤送達のため、ヒトインスリン受容体（ＨＩＲ）に対するネズミ８３−１４  ＭＡｂが用いられる。ＨＩＲＭＡｂは、新世界霊長類、例えばリスザル（ｓｑｕｉｒｒｅｌ  ｍｏｎｋｅｙ）において活性ではない。ＨＩＲＭＡｂの遺伝子操作された型、キメラＨＩＲＭＡｂおよびヒト化ＨＩＲＭＡｂがどちらも産生されており、ヒトにおける脳薬剤送達が可能であった。
【０１９２】
[00216]分子トロイの木馬の静脈内投与後の脳へのタンパク質療法剤送達は、いくつかの実験系に関してｉｎ  ｖｉｖｏでの薬理学的実施に変形されてきている。Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ（Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．  ５９（２−３）：１４１−１５２，  ２００７）を参照されたい。静脈内投与を伴う、ｉｎ  ｖｉｖｏでの脳への組換えタンパク質送達のこれらの研究は、ＢＢＢ  ＭＴＨが、ｉｎ  ｖｉｖｏで、脳内に巨大分子療法剤を送達可能であることを立証する。
【０１９３】
[00217]ｉｎ  ｖｉｖｏでの非ウイルス性プラスミドＤＮＡ送達のため、トロイの木馬リポソーム（ＴＨＬ）配合物を開発し、それによって、ＭＴＨはｉｎ  ｖｉｖｏで安定であるような方式で非ウイルスプラスミドＤＮＡと会合する。特に、単一プラスミドＤＮＡ分子は、〜１００ｎｍリポソーム内部に被包され、その表面は数千のポリマー鎖、例えば２０００Ｄａポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とコンジュゲート化される。ＰＥＧ鎖の１〜２％の先端は、ＭＴＨとして作用する受容体（Ｒ）特異的ＭＡｂとコンジュゲート化される。これは、プラスミドＤＮＡを被包するＰＥＧ化イムノリポソーム（ＰＩＬ）の配合を生じる。ターゲティングＭＡｂは、ＢＢＢ受容体に結合して、血液から脳間質液へのＲＭＴを誘発する。続いて、ターゲティングＭＡｂは、脳細胞上の同じ受容体に結合して、脳細胞内空間内への受容体仲介性エンドサイトーシスを誘発する。通常、内因性リガンド、インスリンを核区画に送達するインスリン受容体の場合、インスリン受容体は、プラスミドＤＮＡを脳細胞の核に送達し、その後、内因性導入遺伝子の発現が続く。典型的な配合物において、個々のリポソームにコンジュゲート化された３０〜８０のＭＡｂ分子がある。リポソーム内部に完全には被包されない任意のＤＮＡは、ヌクレアーゼ処理によって、徹底的に除去可能である。
【０１９４】
[00218]この技術を用いて、ルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子（および類似の方式の多くの他の遺伝子）は、０．２ｍＬの体積中、マウスあたり５μｇプラスミドＤＮＡの用量で、成体マウスへの静脈内注射によって、トロイの木馬リポソームでマウス脳に送達されてきている。この非ウイルス配合物の静脈内投与にしたがって、脳全体で導入遺伝子の全体の発現があった。発現パターンは、神経トランスフェリン受容体の発現と平行し、該受容体は、脳において遍在性である。導入遺伝子は、皮質および皮質下構造の両方、脈絡叢中、海馬中、中脳中、脊髄中で発現され、そして小脳のプルキニエ細胞層で高発現される。トロイの木馬リポソーム技術は、非ウイルス性配合物の静脈内投与後２４時間以内に、「成体トランスジェニック」を可能にする。遺伝子は、脳の実質的にすべての細胞に送達される。１０μｇプラスミドＤＮＡ／ｋｇ体重の用量で、およそ３つ〜４つのプラスミドＤＮＡ分子を成体霊長類脳の各脳細胞に送達することも可能である。
【０１９５】
[00219]同様の研究において、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）ｃＤＮＡが、ＳＶ４０プロモーターによって駆動される発現プラスミド中に配合された。ラットＴｆＲに対するネズミＯＸ２６  ＭＡｂを用いて、ラット脳にターゲティング化されたトロイの木馬リポソーム中に、ＴＨ発現プラスミドが被包された。トロイの木馬リポソームを伴うＴＨ遺伝子治療は、病変と同側の線条体ＴＨ酵素活性の完全な正常化を生じ、そしてアポモルヒネによって誘導される異常な回転行動の８２％の減少を生じた。Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ（Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．  ５９（２−３）：１４１−１５２，  ２００７）を参照されたい。
【０１９６】
[00220]特定の態様において、組織特異的プロモーターを用いて、脳において導入遺伝子（例えばＲＮＡｉ構築物またはＡＳＯ）の発現を駆動し、そして制限する。本発明で使用可能な１つの脳特異的プロモーターは、末梢（非ＣＮＳ）組織における導入遺伝子の発現を除去するため、ヒトグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）遺伝子の５’隣接配列（ＦＳ）を有することも可能である。したがって、組織特異的プロモーターおよびトロイの木馬リポソーム送達技術の組み合わせた使用によって、療法遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏ発現の特定の臓器または組織タイプ、例えば脳への局在化が可能になる。
【０１９７】
[00221]ＲＮＡｉ構築物（ＴｆＲ  ＭＡｂでターゲティングされるトロイの木馬リポソームに被包される）のＩＶ注射は、脳におけるＲＮＡｉ構築物（ｓｈＲＮＡコードプラスミドＤＮＡ）の発現を送達し、そして脳腫瘍において、ターゲット遺伝子発現の９０％ノックダウンを達成するために用いられてきている。対側性の脳において、ターゲット遺伝子の測定可能な活性はなく、そしてＲＮＡｉ遺伝子治療は、非ターゲット遺伝子の発現に影響を持たなかった。Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ（Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．  ５９（２−３）：１４１−１５２，  ２００７）を参照されたい。したがって、ＲＮＡｉのｉｎ  ｖｉｖｏ療法的効果は、ＲＮＡｉ技術とトロイの木馬リポソームターゲティング化技術を組み合わせることによって可能となった。
【０１９８】
[00222]アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＡＳＯ）、アンチセンスペプチド核酸（ＰＮＡ）、またはｓｉＲＮＡいずれかの送達は、分子トロイの木馬へのこれらの剤の高アフィニティ付着を必要とする。ＭＴＨおよび核酸療法剤の間の結合は、ｉｎ  ｖｉｖｏの循環中で安定でなければならない。いくつかの態様において、こうした核酸を、ポリ陽イオン性ブリッジ、例えばポリリジンまたはプロタミンを通じてターゲティングリガンドに付着させることも可能である。あるいは、他の態様において、アビジン−ビオチン技術を用いて、こうした核酸療法剤をターゲティングリガンドに付着させてもよい。
【０１９９】
[00223]アビジンまたはストレプトアビジンおよびビオチンの間の結合は、非常に緊密であり、そして血清タンパク質によって破壊されない。ターゲティングＭＡｂおよびアビジンまたはストレプトアビジン（ＳＡ）のいずれかのコンジュゲートを１つのバイアル中で配合することも可能である。第二のバイアルにおいて、モノビオチン化アンチセンス剤（ＡＳＯ）またはＲＮＡｉ／ｓｉＲＮＡを産生する。２つのバイアルを静脈内投与直前に混合する。ビオチンのアビジンまたはＳＡ結合のアフィニティが非常に高いため、アンチセンス剤またはｓｉＲＮＡ、およびターゲティングＭＡｂの間のコンジュゲートが即時形成される。アビジンまたはＳＡへのビオチン結合の解離半減期は８９日であり、そして解離定数は１０−１５Ｍである。したがって、アンチセンス剤およびターゲティングＭＡｂの間の循環中のｉｎ  ｖｉｖｏでの会合は、静脈内投与後、数時間損なわれない（ｉｎｔａｃｔ）ままである。アビジン−ビオチン連結を通じたターゲティングＭＡｂへのアンチセンス剤の付着は、ターゲットＲＮＡとアンチセンス剤のハイブリダイゼーションに阻害性の影響を持たない。これは、ＲＮａｓｅ保護アッセイおよびノーザンブロッティングの両方による以前の研究において立証された。
【０２００】
[00224]この技術を用いて、ＡＳＯ剤（ホスホロチオエート（ＰＳ）およびペプチド核酸（ＰＮＡ）、例えばモノビオチン化ＰＮＡ）ならびにＲＮＡｉ構築物（例えばモノビオチン化ｓｉＲＮＡ）は、ＭＴＨを用いて、脳に送達されてきている。
【０２０１】
[00225]特定の態様において、モノビオチン化ｓｉＲＮＡを用いる代わりに、ＳＡおよび分子トロイの木馬の化学的コンジュゲートが用いられる。さらに別の態様において、ＭＡｂ−アビジン融合タンパク質を用いる。モノビオチン化ｓｉＲＮＡ、およびＭＴＨ−ＳＡまたはＭＴＨ−アビジンコンジュゲートを、静脈内投与の前に混合することも可能である。ＭＴＨは、ＰＮＡアンチセンス剤に関して以前示されたものと同様に、ＢＢＢおよびＢＣＭを渡ってｓｉＲＮＡ分子を運ぶことも可能である。
【０２０２】
[00226]別の態様において、ＰＬＰ１またはＰＬＰ１発現を促進するＰＬＰ１制御要素の発現を減少させるかまたは阻害する遺伝子サイレンシング剤には、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）が含まれることも可能である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定のタンパク質をコードするｍＲＮＡのコード鎖（センス鎖）に相補的な（またはアンチセンスである）比較的短い核酸である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的にはＲＮＡに基づくが、これらはまた、ＤＮＡに基づくことも可能である。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、しばしば、その安定性を増加させるように修飾されている。
【０２０３】
[00227]これらの比較的短いオリゴヌクレオチドのｍＲＮＡへの結合は、内因性ＲＮａｓｅによるメッセージの分解を誘発する二本鎖ＲＮＡの伸展を誘導すると考えられる。さらに、オリゴヌクレオチドはときに、メッセージのプロモーター近傍に結合するように特に設計され、そしてこれらの状況下では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、さらに、メッセージの翻訳と干渉する可能性もある。アンチセンスオリゴヌクレオチドが機能する特定の機構に関わらず、細胞または組織へのその投与は、特定のタンパク質をコードするｍＲＮＡの分解を可能にする。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定のタンパク質（例えばＰＬＰ１）の発現および／または活性を減少させる。
【０２０４】
[00228]オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖の、ＤＮＡまたはＲＮＡあるいはそのキメラ混合物または誘導体または修飾型であることも可能である。オリゴヌクレオチドを塩基部分、糖部分、またはリン酸主鎖で修飾して、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーション等を改善することも可能である。オリゴヌクレオチドには、他の付随する基、例えばペプチド（例えば宿主細胞受容体にターゲティングするため）、または細胞膜（例えばＰｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８６：６５５３−６５５６；  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８４：６４８−６５２；１９８８年１２月１５日公開のＰＣＴ公報第ＷＯ８８／０９８１０号を参照されたい）もしくは血液脳関門（例えば１９８８年４月２５日公開のＰＣＴ公報第ＷＯ８９／１０１３４号を参照されたい）を渡る輸送を促進する剤、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤（例えばＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８−９７６を参照されたい）あるいは挿入剤（例えばＰｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ５：５３９−５４９を参照されたい）が含まれることも可能である。この目的に向けて、オリゴヌクレオチドを別の分子とコンジュゲート化するかまたはカップリングすることも可能である。
【０２０５】
[00229]本明細書記載のオリゴヌクレオチドを当該技術分野に知られる標準法によって、例えば自動化ＤＮＡ合成装置（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ等より商業的に入手可能なものなど）の使用によって合成することも可能である。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、Ｓｔｅｉｎら（Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：３２０９）の方法によって合成することも可能であるし、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドを制御孔ガラスポリマー支持体の使用によって調製することも可能である（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８５：７４４８−７４５１）。
【０２０６】
[00230]適切なオリゴヌクレオチドの選択は当業者によって実行可能である。特定のタンパク質をコードする核酸配列が与えられたならば、当業者は、タンパク質に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ系でこれらのオリゴヌクレオチドを試験して、これらが、特定のタンパク質をコードするｍＲＮＡに結合し、そしてその分解を仲介することを確認することも可能である。特定のタンパク質に特異的に結合し、そしてその分解を仲介するアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計するため、オリゴヌクレオチドによって認識される配列が、その特定のタンパク質にユニークであるかまたは実質的にユニークであることが重要である。例えば、タンパク質に渡ってしばしばリピートされる配列は、特定のメッセージを特異的に認識しそして分解するオリゴヌクレオチドの設計には理想的な選択ではない可能性がある。当業者は、オリゴヌクレオチドを設計し、そしてそのオリゴヌクレオチドの配列を、公的に利用可能なデータベースに寄託されている核酸配列に比較して、その配列が特定のタンパク質に特異的であるかまたは実質的に特異的であることを確認することも可能である。
【０２０７】
[00231]アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に送達するためのいくつかの方法が開発されてきており：例えばアンチセンス分子を組織部位に直接注射してもよいし、または望ましい細胞をターゲティングするように設計された修飾アンチセンス分子（例えばターゲット細胞表面上に発現される受容体または抗原に特異的に結合するペプチドまたは抗体に連結されたアンチセンス）を全身に投与してもよい。
【０２０８】
[00232]しかし、特定の例において、内因性ｍＲＮＡの翻訳を抑制するために十分なアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞内濃度を達成することは困難でありうる。したがって、別のアプローチは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、強力なｐｏｌ  ＩＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩプロモーターの制御下に配置されている組換えＤＮＡ構築物を利用する。例えば、ベクターが細胞に取り込まれ、そしてアンチセンスＲＮＡの転写を導くように、ｉｎ  ｖｉｖｏでベクターを導入することも可能である。こうしたベクターは、転写されて望ましいアンチセンスＲＮＡを産生可能であるならば、エピソームに留まることも可能であるし、または染色体に組み込まれることも可能である。こうしたベクターは、当該技術分野で標準的な組換えＤＮＡ技術法によって構築されうる。ベクターは、哺乳動物細胞における複製および発現に用いられる、プラスミド、ウイルス性、または当該技術分野に知られる他のベクターであることも可能である。
【０２０９】
[00233]アンチセンスＲＮＡをコードする配列の発現は、哺乳動物、好ましくはヒト細胞において作用することが当該技術分野に知られるプロモーターによるものであることも可能である。こうしたプロモーターは、誘導性または恒常性であってもよい。こうしたプロモーターには、限定されるわけではないが：ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復配列中に含有されるプロモーター（Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ７８：１４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の制御配列（Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）等が含まれる。プラスミドのタイプである、コスミド、ＹＡＣまたはウイルスベクターを用いて、組織部位に直接導入可能である組換えＤＮＡ構築物を調製することも可能である。あるいは、望ましい組織に選択的に感染するウイルスベクターを用いてもよく、この場合、別の経路（例えば全身性）によって投与を達成することも可能である。
【０２１０】
細胞
[00234]したがって、本明細書に提供するのは、、例えばＰＬＰ１のエクソン１または３のヌクレオチド配列のターゲティング化欠失、あるいはＰＬＰ１発現を不活性化するかまたは減少させる他の修飾（単数または複数）といった、ＰＬＰ１遺伝子中に挿入または欠失（インデル）を含む、遺伝子修飾細胞である。細胞は、好ましくは、機能的ミエリンを産生するか、またはミエリン産生細胞の前駆細胞である。特定の態様において、細胞は、接合体、卵、神経幹細胞（ＮＳＣ）、ＯＰＣ、またはオリゴデンドロサイトである。特定の態様において、遺伝子修飾細胞は、ＰＬＰ１のエクソン３の５’端に、ＰＬＰ１発現を不活性化する約８０ヌクレオチドのターゲティング化欠失を含む。やはり提供するのは、ＰＬＰ１転写または翻訳に関与するＰＬＰ１制御要素が修飾されている、遺伝子修飾細胞である。
【０２１１】
[00235]インデル（挿入または欠失）は、典型的には、１つまたはそれより多いヌクレアーゼを用いて、細胞ゲノム内にターゲティング化方式で組み込まれる。特定の態様において、インデルは、例えばＰＬＰ１遺伝子の不活性化のため、ＰＬＰ１に組み込まれる。特定の態様において、インデルは、ヌクレアーゼによる二本鎖切断（ＤＳＢ）の導入（例えばＰＬＰ１遺伝子またはその制御要素中）後、ＮＨＥＪまたは他の修復機構の結果として生成される。他の態様において、インデルは、ＰＬＰ１と関連する内因性ゲノム遺伝子座、例えばＰＬＰ１遺伝子制御要素、例えばエンハンサーまたはプロモーター内、に組み込まれる。本明細書記載の細胞のいずれかにおいて、組込みは、エクソンおよび／またはイントロン内であることも可能である（例えばＰＬＰ１のエクソン１または３）。
【０２１２】
[00236]ランダムな組込みおよび欠失とは異なり、ターゲティング化組込みまたは欠失は、インデルが特定の遺伝子内に組み込まれることを確実にする。インデルは、ターゲット遺伝子のどこに組み込まれることも可能である。特定の態様において、インデルまたはドナー配列は、ヌクレアーゼ切断部位、またはその近傍に組み込まれ、例えば切断部位の上流または下流１〜３０００（またはその間の任意の値）塩基対内、より好ましくは切断部位のいずれかの側の１〜１０００（またはその間の任意の値）塩基対内、あるいは１〜５００（またはその間の任意の値）塩基対内、あるいは切断部位のいずれかの側の１〜１００（またはその間の任意の値）塩基対内である。特定の態様において、ドナー導入遺伝子を含む、組み込まれる配列には、いかなるベクター配列（例えばウイルスベクター配列）も含まれない。
【０２１３】
[00237]限定されるわけではないが、細胞および細胞株を含む、任意の細胞タイプを、本明細書に記載するように、ＰＬＰ１発現を不活性化するかまたは減少させる配列を含むように遺伝子修飾することも可能である。本明細書に記載するような細胞の他の限定されない例には、接合体、神経幹細胞（ＮＳＣ）、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）、ニューロン細胞、およびグリア細胞、例えばオリゴデンドロサイト、アストロサイト、上衣細胞、またはミクログリア細胞が含まれる。本明細書に記載するような細胞の他の限定されない例には、自己（例えば患者由来）または非相同（同種）多能、全能または多分化能幹細胞（例えば胚性幹細胞等）が含まれる。特定の態様において、本明細書に記載するような細胞はＯＰＣである。
【０２１４】
[00238]本明細書に記載するような細胞は、障害を持つ被験体におけるミエリン関連障害を、例えばｅｘ  ｖｉｖｏ療法によって治療し、そして／または防止する際に有用である。ヌクレアーゼ修飾細胞を拡大して、そして次いで、標準技術を用いて、患者内に再導入することも可能である。例えば、Ｔｅｂａｓら（２０１４）  Ｎｅｗ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３７０（１０）：９０１を参照されたい。幹細胞の場合、被験体内への注入後、これらの前駆体の、不活性化ＰＬＰ１を発現する細胞へのｉｎ  ｖｉｖｏ分化もまた起こる。本明細書に記載するような細胞を含む医薬組成物もまた提供する。さらに、患者への投与前に、細胞を凍結保存することも可能である。
【０２１５】
[00239]本明細書に記載するような細胞およびｅｘ  ｖｉｖｏ法は、被験体におけるミエリン関連障害の治療および／または防止を提供し、そして連続した予防的薬剤投与または危険な療法の必要性を排除する。こうしたものとして、本明細書に記載する発明は、ミエリン関連障害を治療し、そして／または防止する、より安全で、費用効率的であり、そして時間効率のよい方法を提供する。
【０２１６】
送達
[00240]本明細書に記載するヌクレアーゼ、これらのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチド、ならびにタンパク質、オリゴヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチドを含む組成物を、任意の適切な手段によって送達してもよい。特定の態様において、ヌクレアーゼおよび／またはドナーをｉｎ  ｖｉｖｏで送達する。他の態様において、ミエリン関連障害患者にｅｘ  ｖｉｖｏ送達する際に有用である修飾細胞の提供のため、ヌクレアーゼおよび／またはドナーを、単離細胞（例えば自己または非相同幹細胞）に送達する。
【０２１７】
[00241]本明細書に記載するようなヌクレアーゼを送達する方法は、例えば、そのすべての開示が全体で本明細書に援用される、米国特許第６，４５３，２４２号；第６，５０３，７１７号；第６，５３４，２６１号；第６，５９９，６９２号；第６，６０７，８８２号；第６，６８９，５５８号；第６，８２４，９７８号；第６，９３３，１１３号；第６，９７９，５３９号；第７，０１３，２１９号；および第７，１６３，８２４号に記載される。
【０２１８】
[00242]本明細書に記載するようなヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物はまた、裸のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）ならびに構成要素の１つまたはそれより多くをコードする配列を含有するベクターを含む、任意の核酸送達機構を用いても送達可能である。限定されるわけではないが、プラスミドベクター、ＤＮＡミニサークル、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター；ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター等、およびその組み合わせを含む、任意のベクター系が使用可能である。本明細書にその全体が援用される、米国特許第６，５３４，２６１号；第６，６０７，８８２号；第６，８２４，９７８号；第６，９３３，１１３号；第６，９７９，５３９号；第７，０１３，２１９号；および第７，１６３，８２４号、ならびに米国特許出願第１４／２７１，００８号もまた参照されたい。さらに、これらの系のいずれも、治療に必要な配列の１つまたはそれより多くを含むことも可能であることが明らかであろう。したがって、１つまたはそれより多いヌクレアーゼおよびドナー構築物が細胞内に導入される際、ヌクレアーゼおよび／またはドナーポリヌクレオチドは、同じ送達系または異なる送達機構で運ばれることも可能である。多数の系を用いる場合、各送達機構は、１つまたは多数のヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物（例えば１つまたはそれより多いヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡならびに／あるいは１つまたはそれより多いドナー構築物を所持するｍＲＮＡまたはＡＡＶ）をコードする配列を含むことも可能である。
【０２１９】
[00243]適切なベクターには、非組込み性、非免疫原性で、そして分裂中細胞および静止細胞の両方を感染させることが可能な送達ベクターが含まれることも可能である。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよびｓｇＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ送達は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターによって仲介可能である。ｉｎ  ｖｉｖｏ送達のためのＡＡＶベクターには、中枢神経系に浸透し、そして被験体の中枢神経系のグリアミエリン産生細胞タイプ（オリゴデンドロサイト、ＯＰＣ、ＮＰＣ等）を感染させる能力を有するＡＡＶ血清型が含まれる。例示的な態様において、ＡＡＶベクターをＣａｓ９ヌクレアーゼ（例えばＳａＣａｓ９またはＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼ）のｉｎ  ｖｉｖｏ送達に使用する。特定の態様において、ヌクレアーゼＳａＣａｓ９およびｓｇＲＮＡを、細胞におけるＰＬＰ１のヌクレアーゼ仲介性遺伝子破壊のために、１つのＡＡＶベクター内にパッケージングする。以下のさらなる詳細を参照されたい。
【０２２０】
[00244]慣用的なウイルスおよび非ウイルスに基づく遺伝子トランスファー法を用いて、細胞（例えば哺乳動物細胞）およびターゲット組織において、ヌクレアーゼおよびドナー構築物をコードする核酸を導入することも可能である。非ウイルスベクター送達系には、ＤＮＡプラスミド、ＤＮＡミニサークル、裸の核酸、および送達ビヒクル、例えばリポソーム、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、ポリ乳酸・グリコール酸ナノ粒子、ポリアミン錯体化剤、またはポロキサマーなどの送達ビヒクルと複合体化した核酸が含まれる。ウイルスベクター送達系には、細胞への送達後、エピソームまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有する、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが含まれる。遺伝子治療法の概説に関しては、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：８０８−８１３（１９９２）；  Ｎａｂｅｌ  ＆  Ｆｅｌｇｎｅｒ，  ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：２１１−２１７（１９９３）；  Ｍｉｔａｎｉ  ＆  Ｃａｓｋｅｙ，  ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６２−１６６（１９９３）；  Ｄｉｌｌｏｎ，  ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６７−１７５（１９９３）；  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：４５５−４６０（１９９２）；  Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６（１０）：１１４９−１１５４（１９８８）；  Ｖｉｇｎｅ，  Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８：３５−３６（１９９５）；  Ｋｒｅｍｅｒ  ＆  Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ５１（１）：３１−４４（１９９５）；  Ｈａｄｄａｄａら，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中  ＤｏｅｒｆｌｅｒおよびＢоｅｈｍ（監修）（１９９５）；およびＹｕら，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１３−２６（１９９４）を参照されたい。
【０２２１】
[00245]核酸の非ウイルス送達法には、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、キャップ化ＲＮＡ、人工的ビリオン、および剤により増進されたＤＮＡ取り込みが含まれる。例えばＳｏｎｉｔｒｏｎ  ２０００系（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を用いたソノポレーションもまた、核酸送達に使用可能である。
【０２２２】
[00246]さらなる例示的な核酸送達系には、Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ドイツ・ケルン）、Ｍａｘｃｙｔｅ，  Ｉｎｃ．（メリーランド州ロックビル）、ＢＴＸ分子送達系（マサチューセッツ州ホリストン）およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ，（例えば米国特許第６，００８，３３６号を参照されたい）に提供されるものが含まれる。リポフェクションは、例えば米国特許第５，０４９，３８６号；第４，９４６，７８７号；および第４，８９７，３５５号に記載され、そしてリポフェクション試薬は商業的に販売されている（例えばトランスフェクタムＴＭおよびリポフェクチンＴＭ）。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適した陽イオン性および中性脂質には、Ｆｅｌｇｎｅｒ、ＷＯ  ９１／１７４２４、ＷＯ  ９１／１６０２４のものが含まれる。いくつかの側面において、ヌクレアーゼをｍＲＮＡとして（例えばエレクトロポレーションを用いて）送達し、そしてウイルスベクター、ミニサークルＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、直鎖ＤＮＡ、リポソーム、ナノ粒子等の他の様式を通じて、導入遺伝子を送達する。
【０２２３】
[00247]イムノ脂質複合体などのターゲティング化されるリポソームを含む、脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４０４−４１０（１９９５）；  Ｂｌａｅｓｅら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）；  Ｂｅｈｒら，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ５：３８２−３８９（１９９４）；  Ｒｅｍｙら，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ５：６４７−６５４（１９９４）；  Ｇａｏら，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：７１０−７２２（１９９５）；  Ａｈｍａｄら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５２：４８１７−４８２０（１９９２）；米国特許第４，１８６，１８３号、第４，２１７，３４４号、第４，２３５，８７１号、第４，２６１，９７５号、第４，４８５，０５４号、第４，５０１，７２８号、第４，７７４，０８５号、第４，８３７，０２８号、および４，９４６，７８７を参照されたい）。
【０２２４】
[00248]さらなる送達法には、送達しようとする核酸のＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）へのパッケージングの使用が含まれる。これらのＥＤＶは、二重特異性抗体を用いて、ターゲット組織に特異的に送達され、ここで、抗体の１つのアームはターゲット組織に対する特異性を有し、そしてもう一方はＥＤＶに特異性を有する。抗体は、ＥＤＶをターゲット細胞表面に運び、そして次いで、ＥＤＶはエンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれる。ひとたび細胞内に入ると、内容物が放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄら（２００９）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２７（７）：６４３を参照されたい）。
【０２２５】
[00249]操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードするか、あるいはターゲット細胞内部でｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡを産生可能なＲＮＡｉ構築物をコードする核酸の送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスに基づく系の使用は、体内で、特定の細胞にウイルスをターゲティングし、そしてウイルスペイロードを核に輸送するための非常に発展したプロセスを利用する。ウイルスベクターを被験体に直接投与してもよい（ｉｎ  ｖｉｖｏ）し、またはこれらを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞を処理し、そして修飾された細胞を被験体に投与してもよい（ｅｘ  ｖｉｖｏ）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の送達のための慣用的なウイルスに基づく系には、限定されるわけではないが、遺伝子トランスファーのためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルスおよび単純ヘルペスウイルスベクターが含まれる。宿主ゲノムにおける組込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルス遺伝子トランスファー法で可能であり、しばしば、挿入された導入遺伝子の長期発現を生じる。さらに、多くの異なる細胞タイプおよびターゲット組織において、高い形質導入効率が観察されてきている。
【０２２６】
[00250]レトロウイルスの向性は外来エンベロープタンパク質を取り込むことによって改変可能であり、ターゲット細胞の潜在的なターゲット集団を拡大可能である。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入または感染可能であり、そして典型的には高ウイルス力価を生じるレトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子トランスファー系の選択は、ターゲット組織に応じる。レトロウイルスベクターは、最大６〜１０ｋｂの外来配列のためのパッケージング能を持つシス作用性末端反復配列で構成される。ベクターの複製およびパッケージングには、最小限のシス作用性ＬＴＲで十分であり、これは次いで、ターゲット細胞内への療法的遺伝子の組込みに用いられて、永続的な導入遺伝子発現を提供する。広く用いられるレトロウイルスベクターには、ネズミ白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル（ｇｉｂｂｏｎ  ａｐｅ）白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびその組み合わせに基づくものが含まれる（例えばＢｕｃｈｓｃｈｅｒら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６６：２７３１−２７３９（１９９２）；  Ｊｏｈａｎｎら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６６：１６３５−１６４０（１９９２）；  Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら，  Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９（１９９０）；  Ｗｉｌｓｏｎら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８（１９８９）；  Ｍｉｌｌｅｒら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６５：２２２０−２２２４（１９９１）；  ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照されたい）。
【０２２７】
[00251]アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞タイプにおいて、非常に高い形質導入効率であることが可能であり、そして細胞分裂を必要としない。こうしたベクターを用いて、高力価および高レベルの発現が得られてきている。このベクターは、比較的単純な系で、多量に産生可能である。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターもまた、例えば核酸およびペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生において、そしてｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子治療法のために、ターゲット核酸を細胞に形質導入するために用いられる（例えば、Ｗｅｓｔら，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６０：３８−４７（１９８７）；米国特許第４，７９７，３６８号；  ＷＯ  ９３／２４６４１；  Ｋｏｔｉｎ，  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１（１９９４）；  Ｍｕｚｙｃｚｋａ，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９４：１３５１（１９９４）を参照されたい）。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号；  Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５：３２５１−３２６０（１９８５）；  Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ら，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４：２０７２−２０８１（１９８４）；  Ｈｅｒｍｏｎａｔ  ＆  Ｍｕｚｙｃｚｋａ，  ＰＮＡＳ８１：６４６６−６４７０（１９８４）；およびＳａｍｕｌｓｋｉら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６３：０３８２２−３８２８（１９８９）を含む、いくつかの刊行物に記載されている。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６およびＡＡＶ８、ＡＡＶ  ８．２、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ  ｒｈ１０、ならびに偽型ＡＡＶ、例えばＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／６を含む、任意のＡＡＶ血清型が使用可能である。さらなるアデノウイルスに基づくベクターには、Ｄｅｖｅｒｍａｎら（２０１６）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０４−２０９に記載されるＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂベクターなどの、静脈内注射後に哺乳動物中枢神経系（ＣＮＳ）に効率的にそして広く形質導入するＡＡＶ変異体が含まれる。
【０２２８】
[00252]形質導入剤を生成するための、ヘルパー細胞株に挿入された遺伝子による欠陥ベクターの補完を伴うアプローチを利用する、少なくとも６つのウイルスベクターアプローチが、現在、臨床試験において遺伝子トランスファーに利用可能である。
【０２２９】
[00253]ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験に用いられているレトロウイルスの例である（Ｄｕｎｂａｒら，  Ｂｌｏｏｄ  ８５：３０４８−３０５（１９９５）；  Ｋｏｈｎら，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．１：１０１７−１０２（１９９５）；  Ｍａｌｅｃｈら，  ＰＮＡＳ  ９４：２２  １２１３３−１２１３８（１９９７））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療試験において用いられた第一の療法ベクターであった（Ｂｌａｅｓｅら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４７５−４８０（１９９５））。ＭＦＧ−Ｓパッケージングベクターに関しては、５０％またはそれより大きい形質導入効率が観察されてきている（Ｅｌｌｅｍら，  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ４４（１）：１０−２０（１９９７）；  Ｄｒａｎｏｆｆら，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１：１１１−２（１９９７）。
【０２３０】
[00254]組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損性および非病原性パルボウイルス・アデノ随伴２型ウイルスに基づく有望な代替遺伝子送達系である。すべてのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶの１４５塩基対（ｂｐ）末端逆位配列のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入細胞ゲノム内への組込みによる、効率的な遺伝子トランスファーおよび安定導入遺伝子送達は、このベクター系の重要な特徴である（Ｗａｇｎｅｒら，  Ｌａｎｃｅｔ３５１：９１１７  １７０２−３（１９９８），  Ｋｅａｒｎｓら，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ９：７４８−５５（１９９６））。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０、ならびにライブラリーから選択された操作された突然変異体を含むそのすべての変異体を含む他のＡＡＶ血清型もまた、本発明にしたがって使用可能である。
【０２３１】
[00255]複製不全組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）を高力価で産生可能であり、そして該ベクターは、いくつかの異なる細胞タイプを容易に感染させることも可能である。大部分のアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄ  Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置換するように操作され；続いて、複製不全ベクターはヒト２９３細胞中で増幅されて、トランスで、欠失した遺伝子機能を供給する。Ａｄベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏで、分裂していない分化した細胞、例えば肝臓、腎臓および筋肉で見られるものを含む、多数のタイプの組織に形質導入可能である。慣用的なＡｄベクターは、大きな運搬能を有する。臨床試験において、Ａｄベクターの使用例は、筋内注射を用いて、抗腫瘍免疫のためのポリヌクレオチド療法を伴った（Ｓｔｅｒｍａｎら，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ７：１０８３−９（１９９８））。臨床試験における遺伝子トランスファーのためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例には、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒら，  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ２４：１  ５−１０（１９９６）；  Ｓｔｅｒｍａｎら，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ９：７  １０８３−１０８９（１９９８）；  Ｗｅｌｓｈら，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２：２０５−１８（１９９５）；  Ａｌｖａｒｅｚら，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ５：５９７−６１３（１９９７）；  Ｔｏｐｆら，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ５：５０７−５１３（１９９８）；  Ｓｔｅｒｍａｎら，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ７：１０８３−１０８９（１９９８）が含まれる。
【０２３２】
[00256]パッケージング細胞を用いて、宿主細胞に感染可能なウイルス粒子を形成する。こうした細胞株には、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするΨ２細胞またはＰＡ３１７細胞が含まれる。遺伝子治療に用いるウイルスベクターは、通常、ウイルス粒子に核酸ベクターをパッケージングする、産生細胞株によって生成される。該ベクターは、典型的には、パッケージングおよび宿主内への続く組込み（適用可能な場合）に必要な最小限のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現されるべきタンパク質をコードする発現カセットによって置換されている。失われたウイルス機能は、パッケージング細胞株によって、トランスで供給される。例えば遺伝子治療で用いるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージングおよび宿主ゲノム内への組込みに必要な、ＡＡＶゲノム由来の末端逆位（ＩＴＲ）配列しか所持しない。ウイルスＤＮＡは、細胞株であって他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐおよびｃａｐ、をコードするがＩＴＲ配列を欠く、ヘルパープラスミドを含有する、前記細胞株においてパッケージングされる。該細胞株はまた、ヘルパーとしてのアデノウイルスにも感染する。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製、およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列を欠くため、有意な量ではパッケージングされない。アデノウイルスの混入は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりもより感受性である熱処理によって、減少させることも可能である。
【０２３３】
[00257]多くの遺伝子治療適用において、遺伝子治療ベクターは、特定の組織タイプに対する高い度合いの特異性で送達されることが望ましい。したがって、ウイルスの外表面上のウイルスコートタンパク質を含む融合タンパク質として、リガンドを発現させることによって、所定の細胞タイプに特異性を有するように、ウイルスベクターを修飾することも可能である。関心対象の細胞タイプ上に存在することが知られる受容体に対するアフィニティを有するように、リガンドを選択する。例えば、Ｈａｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２：９７４７−９７５１（１９９５）は、モロニーネズミ白血病ウイルスを修飾して、ｇｐ７０に融合したヒト・ヘレグリンを発現させることが可能であり、そして該組換えウイルスが、ヒト上皮増殖因子受容体を発現する特定のヒト乳癌細胞を感染させることを報告した。この原理を他のウイルス−ターゲット細胞対に拡大することも可能であり、ここで、ターゲット細胞は受容体を発現し、そしてウイルスは、細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質を発現する。例えば、実質的に任意の選択される細胞受容体に対する特異性結合アフィニティを有する抗体断片（例えばＦＡＢまたはＦｖ）をディスプレイするように、糸状ファージを操作することも可能である。上記の説明は、主に、ウイルスベクターに当てはまるが、同じ原理が非ウイルスベクターにも当てはまりうる。特定のターゲット細胞による取り込みを支持する特異的取り込み配列を含有するように、こうしたベクターを操作することも可能である。
【０２３４】
[00258]個々の被験体への投与によって、典型的には全身投与（例えば静脈内、腹腔内、筋内、皮下、舌下または頭蓋内注入）、以下に記載するような局所適用、または肺吸入を通じて、ｉｎ  ｖｉｖｏで遺伝子治療ベクターを送達することも可能である。あるいは、ベクターを、ｅｘ  ｖｉｖｏで、細胞に、例えば個々の患者から外植された細胞（例えばＯＰＣ）または普遍的ドナー神経幹細胞に送達してもよく、その後、通常、ベクターを取り込んだ細胞を選択した後、患者に該細胞を再移植することも可能である。
【０２３５】
[00259]ヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物を含有するベクター（例えばレトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ、リポソーム等）を、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞の形質導入のため、生物に直接投与することも可能である。あるいは、裸のＤＮＡを投与することも可能である。投与は、限定されるわけではないが、注射、注入、局所適用、吸入およびエレクトロポレーションを含む、グリア細胞と最終的に接触する分子を導入するために通常用いられる経路いずれかによる。こうした核酸を投与する適切な方法が利用可能であり、そして当業者に周知であり、そして１より多い経路を用いて、特定の組成物を投与することも可能であるが、特定の経路はしばしば、別の経路よりもより即時性があり、そしてより有効な反応を提供可能である。
【０２３６】
[00260]本明細書記載のポリヌクレオチドの導入に適したベクターには、非組込みレンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）が含まれる。例えば、Ｏｒｙら（１９９６）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：１１３８２−１１３８８；  Ｄｕｌｌら（１９９８）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２：８４６３−８４７１；  Ｚｕｆｆｅｒｙら（１９９８）  Ｊ．  Ｖｉｒｏ．  ７２：９８７３−９８８０；  Ｆｏｌｌｅｎｚｉら（２０００）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２５：２１７−２２２；  米国特許公報第２００９／０５４９８５号を参照されたい。
【０２３７】
[00261]薬学的に許容されうるキャリアーは、部分的に、投与される特定の組成物によって、ならびに組成物の投与に用いる特定の方法によって決定される。したがって、以下に記載するように、利用可能な医薬組成物の非常に多様な適切な配合物がある（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、１９８９を参照されたい）。
【０２３８】
[00262]ヌクレアーゼコード配列およびドナー構築物を、同じまたは異なる系を用いて送達することも可能であることが明らかであろう。例えば、ドナーポリヌクレオチドをＡＡＶによって運んでもよい一方、１つまたはそれより多いヌクレアーゼをｍＲＮＡによって運んでもよい。さらに、同じまたは異なる経路（筋内注射、尾静脈注射、他の静脈内注射、腹腔内投与および／または筋内注射）によって異なる系を投与してもよい。多数のベクターを同時にまたは任意の連続した順序で送達してもよい。
【０２３９】
[00263]ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ投与の両方のための配合物には、液体中の懸濁物または乳化液体が含まれる。活性成分はしばしば、薬学的に許容可能であり、そして活性成分と適合する賦形剤と混合される。適切な賦形剤には、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、およびその組み合わせが含まれる。さらに、組成物は、少量の補助剤、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤、または医薬組成物の有効性を増進させる他の試薬を含有することも可能である。
【０２４０】
ＡＡＶによって送達される、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ仲介性遺伝子サイレンシング
[00264]特定の態様において、ＰＬＰ１遺伝子またはその制御要素、あるいはその一部を特異的にターゲティングするガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を送達することによって、本発明の方法を実行することも可能である。
【０２４１】
[00265]１つの態様において、この系は、場合による第三のＡＡＶベクターとともに、２つのＡＡＶベクターを使用することも可能であり：１つはＣａｓ９またはその機能的オルソログをコードし、１つはＰＬＰ１遺伝子または制御要素のターゲティング化切断のためのガイドＲＮＡ配列を含有し、そして場合によって、別の１つは、欠陥ＰＬＰ１遺伝子の修復または置換のため、切断部位で挿入されるべき、突然変異ＰＬＰ１遺伝子（例えばＰＬＰ１点突然変異）のドナーｃＤＮＡ配列を含有する。ドナー対Ｃａｓ９構築物投与比は、１：１〜５：１の間のいずれかの範囲でありうる。
【０２４２】
[00266]別の態様において、この系は、２つのＡＡＶベクターを使用することも可能であり：１つは長さ３．５ｋｂ未満のＣａｓ９オルソログをコードし、そしてシスでコードされるガイドＲＮＡを有し、そして１つのベクターは、切断部位で挿入されるべき、突然変異ＰＬＰ１遺伝子のドナーｃＤＮＡ配列を含有する。４．８ｋｂより大きいターゲットに関しては、このドナーは、突然変異遺伝子の大部分の上流の修正を可能にする、該遺伝子の最大４．８ｋｂの３’ｃＤＮＡ部分、または次いで正しい下流配列にスプライシングされるであろう、該遺伝子の５’プロモーターおよび上流ｃＤＮＡ部分のいずれかを含有することも可能である。
【０２４３】
[00267]さらなる態様において、この系は、２つのＡＡＶベクターを使用し：１つはＣａｓ９または機能的オルソログをコードし、そして１つはターゲット遺伝子の切断のための特異的なガイドＲＮＡ配列を含有する。
【０２４４】
[00268]さらに別の態様において、この系は、１つのＡＡＶベクターを使用し、該ベクターは、機能的ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９をコードする核酸、およびターゲット遺伝子（例えばＰＬＰ１）の切断のための特異的なガイドＲＮＡを含む。
【０２４５】
[00269]１つの態様において、方法は、ターゲット遺伝子に結合し、前記ターゲット遺伝子／ポリヌクレオチドの切断を達成して、それによってターゲット遺伝子を修飾する、例えばターゲット遺伝子を破壊するか、あるいはドナー核酸でターゲット遺伝子のすべてまたは部分を修正するかまたは置換する、ＣＲＩＳＰＲ系の要素を含む、１つまたはそれより多いＡＡＶベクター（典型的には１つ、２つまたは３つのＡＡＶベクター）を提供する工程を含む。前記ＣＲＩＳＰＲ系の要素には、ガイドＲＮＡ配列と複合体化可能であるＣＲＩＳＰＲ酵素、前記ターゲット遺伝子内でターゲット配列にハイブリダイズ可能な前記ガイドＲＮＡが含まれる。
【０２４６】
[00270]ターゲット遺伝子での切断は、ＣＲＩＳＰＲ酵素による１つまたは２つの鎖を切断する工程を含む。いくつかの態様において、方法には、ドナー核酸の導入による、切断されたターゲット遺伝子の修正または置換が含まれ、ドナー核酸は、突然変異または欠陥ターゲット遺伝子を修正するタンパク質をコードする。
【０２４７】
[00271]本明細書に記載するようなＣａｓ遺伝子には、限定されるわけではないが、Ｃａｓ３またはＣａｓ９が含まれる。酵素は、Ｃａｓ９相同体またはオルソログであってもよい。Ｃａｓ９オルソログには、ストレプトコッカス・ピオゲネス、髄膜炎菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス、肺炎球菌、カンピロバクター・コリ、カンピロバクター・ジェジュニ、ストレプトコッカス・ムタンス、パスツレラ・マルトシダ、ビフィドバクテリウム・ロングム、バチルス・スミシー、トレポネーマ・デンティコラ、マイコプラズマ・カニスおよびエンテロコッカス・フェカリス由来のＣａｓ９が含まれることも可能である。Ｃａｓ９には、これらの生物に由来する突然変異Ｃａｓ９が含まれることも可能である。
【０２４８】
[00272]例示的なＡＡＶベクターには、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＲｈｌＯ、Ｒｈ７４またはＡＡＶ−２ｉ８のいずれかのカプシド配列、あるいはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＲｈｌＯ、Ｒｈ７４またはＡＡＶ−２ｉ８のカプシド変異体が含まれる。本発明の組換えＡＡＶベクターにはまた、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＲｈｌＯ、Ｒｈ７４またはＡＡＶ−２ｉ８、およびその変異体も含まれる。
【０２４９】
[00273]特定のカプシド変異体には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＲｈｌＯ、Ｒｈ７４またはＡＡＶ−２ｉ８のカプシド変異体、例えばアミノ酸置換、欠失または挿入／付加を含むカプシド配列が含まれる。
【０２５０】
[00274]ＡＡＶベクターには、シスまたはトランスで機能するさらなる要素が含まれることも可能である。特定の態様において、ベクターゲノムを含むＡＡＶベクターはまた：ドナー配列の５’または３’末端に隣接する１つまたはそれより多い末端逆位（ＩＴＲ）配列；ドナー配列の転写を駆動する発現制御要素（例えばプロモーターまたはエンハンサー）、例えば恒常的または調節可能制御要素、または組織特異的発現制御要素；イントロン配列、スタッファーまたはフィラーポリヌクレオチド配列；および／またはドナー配列の３’に位置するポリ−アデニン配列も有する。
【０２５１】
[00275]典型的には、発現制御要素は、機能可能であるように連結されたポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼす核酸配列（単数または複数）である。本明細書に示すような発現制御要素を含む制御要素、例えばベクター内に存在するプロモーターおよびエンハンサーが、適切な核酸転写および翻訳（例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロンに関するスプライシングシグナル、ｍＲＮＡのインフレーム翻訳を可能にする遺伝子の正しいリーディングフレームの維持、および停止コドン等）、およびＡＡＶパッケージングを促進するために含まれる。こうした要素は、典型的にはシスで作用し、「シス作用性」要素と称されるが、また、トランスで作用することも可能である。
【０２５２】
[00276]転写、翻訳、スプライシング、メッセージ安定性等のレベルで、発現制御を達成することも可能である。典型的には、転写を調節する発現制御要素は、転写される核酸の５’端（すなわち「上流」）の近傍に並置される。発現制御要素はまた、転写される配列の３’端（すなわち「下流」）または転写物内（例えばイントロン中）に位置することも可能である。発現制御要素は、転写される配列に隣接して、または該配列から離れて位置することも可能である。典型的には、特定のベクター、例えばＡＡＶベクターのポリヌクレオチド長限界のため、こうした発現制御要素は、転写される核酸の１〜１０００ヌクレオチド以内にあるであろう。
【０２５３】
[00277]「プロモーター」は、本明細書において、隣接配列に機能可能であるように連結され、そしてプロモーターが存在しなかった際に発現される量と比較した際、核酸から発現される量を増加させる。
【０２５４】
[00278]「エンハンサー」は、本明細書において、核酸に隣接して位置し、典型的にはプロモーター要素の上流に位置するが、また、ＤＮＡ配列（例えばドナー核酸）の下流またはその内部で機能し、そしてこうした位置に位置することも可能である。エンハンサー要素は、核酸の上流または下流の１００塩基対、２００塩基対、あるいは３００またはそれより多い塩基対以内に位置することも可能である。エンハンサー要素はまた、典型的には核酸の発現を増加させる。
【０２５５】
[00279]発現制御要素には、多くの異なる細胞タイプにおいて、ポリヌクレオチドの発現を駆動可能な、遍在性または雑多なプロモーター／エンハンサーが含まれる。こうした要素には、限定されるわけではないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）極初期プロモーター／エンハンサー配列、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター／エンハンサー配列および多様な哺乳動物細胞タイプで活性である他のウイルスプロモーター／エンハンサー、または天然に存在しない合成要素（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔら，  Ｃｅｌｌ，  ４１  ：５２１−５３０（１９８５）を参照されたい）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）プロモーター、細胞質βアクチンプロモーターおよびホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが含まれる。
【０２５６】
[00280]発現制御要素にはまた、本明細書において、「組織特異的発現制御要素／プロモーター」と称される、特定の組織または細胞タイプにおいて活性であるものが含まれることも可能である。組織特異的発現制御要素は、典型的には、特定の細胞または組織（例えば眼、網膜、中枢神経系、脊髄、眼、網膜等）で活性である。特定の態様において、組織特異的発現制御要素は、ＣＮＳ、例えば神経幹細胞、ＯＰＣ、オリゴデンドロサイト等で活性である。特定の態様において、組織特異的発現制御要素は、接合体または卵において活性である。
【０２５７】
[00281]発現制御要素は、典型的にはこれらの細胞、組織または臓器において活性であり、これは、これらが特定の細胞、組織または臓器タイプにユニークである転写活性化タンパク質、または他の転写制御因子によって認識されるためである。
【０２５８】
[00282]発現制御要素はまた、制御可能な、すなわち、シグナルまたは刺激が、機能可能であるように連結された核酸の発現を増加させるかまたは減少させる方式で、発現を与えることも可能である。シグナルまたは刺激に対して反応して、機能可能であるように連結された核酸の発現を増加させる制御可能要素はまた、「誘導性要素」（すなわちシグナルによって誘導される）とも称される。特定の例には、限定されるわけではないが、ホルモン（例えばステロイド）誘導性プロモーターが含まれる。シグナルまたは刺激に対して反応して、機能可能であるように連結された核酸の発現を減少させる制御可能要素は、「抑制性要素」（すなわちシグナルが除去されるかまたは存在しない際に、発現が増加するように、シグナルが発現を減少させる）と称される。典型的には、こうした要素によって与えられる増加または減少の量は、存在するシグナルまたは刺激の量に比例し；シグナルまたは刺激の量が多ければ、発現の増加または減少はより多くなる。
【０２５９】
[00283]発現制御要素にはまた、天然要素（単数または複数）も含まれる。核酸の発現が天然発現を模倣可能であることが望ましい場合、天然制御要素（例えばプロモーター）を用いることも可能である。核酸の発現が時間的にまたは発生的に、あるいは組織特異的方式で、あるいは特定の転写刺激に反応して制御されるべきである場合、天然要素を用いることも可能である。他の天然発現制御要素、例えばイントロン、ポリアデニル化部位またはＫｏｚａｋコンセンサス配列もまた、用いてもよい。
【０２６０】
[00284]ＡＡＶベクターにはまた、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列も含まれてもよい。例えば、ドナー核酸が、約４．７ｋｂ未満の長さを有する場合、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、ドナー核酸と組み合わされた際、組み合わせた全長が約３．０〜５．５ｋｂの間、または約４．０〜５．０ｋｂの間、または約４．３〜４．８ｋｂの間であるような長さを有する。
【０２６１】
[00285]フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、ベクターの機能または活性を妨げないように、任意の望ましい位で、ベクター配列中に位置することも可能である。１つの側面において、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、ドナー核酸配列のそれぞれの５’および／または３’末端に隣接する、５’および／または３’  ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＲｈｌＯ、Ｒｈ７４またはＡＡＶ−２ｉ８、およびその変異体のＩＴＲ）の間に位置する。
【０２６２】
[00286]典型的には、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、不活性または非侵害性であり、そして機能または活性を持たない。多様な特定の側面において、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、細菌ポリヌクレオチド配列ではなく、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、タンパク質またはペプチドをコードする配列ではなく、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は：ドナー配列、ＡＡＶ末端逆位（ＩＴＲ）配列、発現制御要素、またはポリアデニル化（ポリＡ）シグナルのいずれとも異なる配列である。多様な特定の側面において、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は、ドナー配列と関連するまたは関連しない、イントロン配列である。
【０２６３】
[00287]イントロンは、ウイルス粒子へのＡＡＶベクターパッケージングのための長さを達成するため、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列としても機能可能である。フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列として機能するイントロンおよびイントロン断片（例えばＦＩＸのイントロンＩの部分）はまた、発現を増進させることも可能である。イントロン要素の包含は、イントロン要素の非存在下での発現に比較して、発現を増進させることも可能である（Ｋｕｒａｃｈｉら、１９９５、上記）。
【０２６４】
[00288]イントロンの使用は、天然存在ゲノム配列に限定されず、そして完全に異なる遺伝子または他のＤＮＡ配列と関連するイントロンが含まれることも可能である。したがって、核酸の他の非翻訳（非タンパク質コード）領域、例えば同族（関連）遺伝子および非同族（非関連）遺伝子由来のゲノム配列中に見られるイントロンもまた、本発明にしたがって、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列として機能することも可能である。
【０２６５】
[00289]ドナー核酸、発現制御要素、ＩＴＲ、ポリＡ配列、フィラーまたはスタッファーポリヌクレオチド配列は長さが多様でありうる。特定の側面において、長さ約１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７５、７５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜７５０、７５０〜１，０００、１，０００〜１，５００、１，５００〜２，０００、２，０００〜２，５００、２，５００〜３，０００、３，０００〜３，５００、３，５００〜４，０００、４，０００〜４，５００、４，５００〜５，０００またはそれより多いヌクレオチドで、最大ＡＡＶパッケージングサイズ限界までの配列であってもよい。
【０２６６】
[00290]ＡＡＶベクターによって、Ｃａｓ９コード配列およびｓｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をターゲット細胞内に導入し／トランスファーし／形質転換し／トランスフェクションすることも可能である。用語「形質導入する」および「トランスフェクションする」は、核酸などの分子の、細胞または宿主生物内への導入を指す。したがって、形質導入細胞（例えば哺乳動物における、例えば細胞または組織または臓器細胞）は、外因性分子、例えばポリヌクレオチドまたはタンパク質（例えば導入遺伝子）の細胞内への取り込み後の細胞における遺伝子変化を意味する。したがって、「形質導入」細胞は、外因性分子が導入されている細胞またはその子孫である。本発明の方法および使用において、形質導入細胞は、被験体中、例えばｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏであってもよい。
【０２６７】
[00291]本発明の方法および使用は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ／ｓｇＲＮＡおよび場合によってドナー核酸（導入遺伝子）を、分裂細胞および／または非分裂細胞を含む、宿主細胞内に送達する（形質導入する）ための手段を提供する。本発明のＡＡＶベクター、方法、使用、および薬学的配合物は、さらに、治療法として、これらを必要とする被験体に、核酸またはタンパク質を送達するか、投与するかまたは提供する方法において、有用である。この方式で、核酸が転写され、そして被験体においてｉｎ  ｖｉｖｏでタンパク質が産生されることも可能である。被験体は、核酸またはタンパク質の欠陥を有するため、あるいは被験体における核酸またはタンパク質の産生が、治療法または別のものとして、何らかの療法効果を与えるために、被験体が、核酸またはタンパク質から利益を得るかまたはこれらを必要としていることも可能である。
【０２６８】
[00292]多様な態様において、ＡＡＶベクターは、被験体における真核細胞に送達される。被験体は、典型的には動物であり、そしてこれには、ヒトおよび獣医学的適用が含まれる。したがって、適切な被験体には、哺乳動物、例えばヒト、ならびに非ヒト哺乳動物（例えば霊長類）が含まれる。他の被験体には、霊長類（類人猿、テナガザル、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、マカク）、家畜動物（イヌおよびネコ）、農場動物（ニワトリおよびアヒルなどの家禽類、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）、および実験動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット）が含まれる。ヒト被験体には、胎児、新生児、幼児、若年層および成体被験体が含まれる。例えば、被験体は、２０歳、１５歳、１０歳、５歳、３歳、２歳、１歳、６ヶ月、３ヶ月、または１ヶ月より若いヒトであることも可能である。被験体にはまた、動物疾患モデル、例えば血液凝固疾患および当業者に知られる他のもののマウスおよび他の動物モデルが含まれることも可能である。
【０２６９】
[00293]治療に適した被験体には、機能的遺伝子産物（タンパク質）の不十分な量を産生するか、または該産物に欠陥を有するか、あるいは異常な、部分的に機能的なまたは非機能的な遺伝子産物（タンパク質）を産生しているか、またはそれらのリスクを有し、これらが疾患につながりうる、被験体が含まれる。特定の態様において、被験体は、欠陥遺伝子（例えばＰＬＰ１）を破壊するか、修正するかまたは置換することから利益を得るかまたはその必要があるか、あるいは欠陥または部分的機能または活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を破壊するか、修正するかまたは置換する必要がある。
【０２７０】
[00294]治療の療法的または有益な効果は、したがって、特定の被験体に提供される任意の客観的または主観的に測定可能または検出可能な改善または利益である。療法的または有益な効果は、疾患の特定の不都合な症状、障害、疾病または合併症のすべてまたはいずれかの完全な除去であってもよいが、必ずしもその必要はない。したがって、疾患によって引き起こされるかまたは疾患と関連する不都合な症状、障害、疾病、または合併症の増加性の改善または部分的減少があるか、あるいは短いまたは長い期間（時間、日、週、月等）に渡って、疾患によって引き起こされるかまたは疾患と関連する、１つまたはそれより多い不都合な症状、障害、疾病、または合併症の悪化または進行の阻害、減少、縮小、抑制、防止、限定または制御がある場合、満足できる臨床的終点が達成される。
【０２７１】
[00295]療法効果を達成するための用量、例えば、ベクターゲノム中／体重キログラムあたり（ｖｇ／ｋｇ）の用量は、限定されるわけではないが：投与経路、療法効果を達成するために必要な核酸発現、治療する特定の疾患、ベクターに対する任意の宿主免疫反応、および発現されるタンパク質安定性を含む、いくつかの要因に基づいて、多様であろう。当業者は、前述の要因ならびに他の要因に基づいて、特定の疾患または障害を有する患者を治療するためのｒＡＡＶ／ベクターゲノム用量範囲を決定することも可能である。
【０２７２】
[00296]疾患によって引き起こされるかまたは疾患に関連する不都合な症状、状態、合併症等が発展する前に、被験体への投与またはｉｎ  ｖｉｖｏ送達を行うことも可能である。例えば、（例えば遺伝子）スクリーニングを用いて、本発明の組成物、方法および使用のための候補として被験体を同定することも可能である。したがって、こうした被験体には、機能的遺伝子産物（タンパク質）の不十分な量または欠陥に関して陽性とスクリーニングされたもの、あるいは異常な、部分的に機能的なまたは非機能的な遺伝子産物（タンパク質）を産生するものが含まれる。
【０２７３】
[00297]投与または送達の方法には、被験体と適合する任意の様式が含まれる。本発明の方法および使用には、全身、領域性、または局所性の、あるいは任意の経路による、例えば注射または注入による、送達および投与が含まれる。こうした送達および投与には、非経口、例えば眼内、血管内、静脈内、筋内、腹腔内、皮内、皮下、または経粘膜が含まれる。例示的な投与および送達経路には、静脈内（ｉ．ｖ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、動脈内、皮下、胸膜内、挿管、肺内、腔内、イオン注入、臓器内、リンパ内が含まれる。特定の態様において、ＡＡＶベクターを非経口的に、例えば静脈内、動脈内、眼内、筋内、皮下で、あるいはカテーテルまたは挿管を通じて、投与するかまたは送達する。
【０２７４】
[00298]用量は、治療が向けられる疾患のタイプ、発症、進行、重症度、頻度、期間、または可能性、望ましい臨床終点、以前のまたは同時の治療、被験体の全身の健康状態、年齢、性別、人種または免疫学的適格性、および当業者に認識されるであろう他の要因で多様である可能性もあり、そしてこれらに応じる可能性もある。用量、数、頻度、または期間を、治療または療法の不都合な副作用、合併症または他のリスク要因、および被験体の状態のいずれかによって示されるように、比例して増加させるかまたは減少させることも可能である。当業者は、療法または予防的利益を提供するために十分な量を提供するために必要な投薬量およびタイミングに影響を及ぼしうる要因を認識するであろう。
【０２７５】
[00299]対象のＡＡＶベクター、および他の組成物を、医薬組成物、例えば薬学的に許容されうるキャリアーまたは賦形剤内に取り込むことも可能である。こうした医薬組成物は、とりわけ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで被験体への投与および送達に有用である。
【０２７６】
[00300]本明細書において、用語「薬学的に許容される」および「生理学的に許容されうる」は、投与、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達または接触の１つまたはそれより多い経路に適切な、生物学的に許容される気体、液体または固体の配合物、あるいはその混合物を意味する。「薬学的に許容される」または「生理学的に許容される」組成物は、生物学的にまたは別の意味で望ましくないものではない物質であり、例えば物質は、実質的に望ましくない生物学的影響を引き起こすことなく、被験体に投与可能である。したがって、こうした医薬組成物は、例えば、被験体へのウイルスベクターまたはウイルス粒子の投与において使用可能である。
【０２７７】
[00301]こうした組成物には、薬学的投与、あるいはｉｎ  ｖｉｖｏ接触または送達に適合した、溶媒（水性または非水性）、溶液（水性または非水性）、エマルジョン（例えば水中油または油中水）、懸濁物、シロップ、エリキシル剤、分散および懸濁媒体、コーティング、等張性剤および吸収促進剤または遅延剤が含まれる。水性および非水性溶媒、溶液および懸濁物には、懸濁剤および増粘剤が含まれることも可能である。こうした薬学的に許容されうるキャリアーには、錠剤（コーティングまたは非コーティング）、カプセル（硬または軟）、マイクロビーズ、粉末、顆粒および結晶が含まれる。補助的活性化合物（例えば保存剤、抗菌剤、抗ウイルス剤および抗真菌剤）もまた、組成物内に取り込まれることも可能である。
【０２７８】
[00302]本明細書に示すかまたは当業者に知られるように、投与または送達の特定の経路に適合するよう、医薬組成物を配合することも可能である。したがって、医薬組成物には、多様な経路による投与に適したキャリアー、希釈剤、または賦形剤が含まれる。
【０２７９】
[00303]非経口投与に適した組成物は、活性化合物の水性および非水性溶液、懸濁物またはエマルジョンを含み、その調製は典型的には無菌であり、そして意図されるレシピエントの血液と等張であることも可能である。限定されない例示的な例には、水、生理食塩水、デキストロース、フルクトース、エタノール、動物性、植物性、または合成油が含まれる。
【０２８０】
[00304]共溶媒およびアジュバントを配合物に添加することも可能である。共溶媒の限定されない例は、ヒドロキシル基または他の極性基を含有し、例えばアルコール、例えばイソプロピルアルコール；グリコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、グリコールエーテル；グリセロール；ポリオキシエチレンアルコールおよびポリオキシエチレン脂肪酸エステルが含まれる。アジュバントには、例えば界面活性剤、例えばダイズレシチンおよびオレイン酸；ソルビタンエステル、例えば三オレイン酸ソルビタン；ならびにポリビニルピロリドンが含まれる。
【０２８１】
[00305]本発明の組成物、方法および使用に適した医薬組成物および送達系が、当該技術分野に知られる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２００３）  第２０版，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ；  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）  第１８版，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ；  Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ（１９９６）  第１２版，  Ｍｅｒｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ，  ＮＪ；  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｓｏｌｉｄ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ（１９９３），  Ｔｅｃｈｎｏｎｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｉｎｃ．，  Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，  Ｐａ．；  ＡｎｓｅｌおよびＳｔｏｋｌｏｓａ，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（２００１）  第１１版，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  ＭＤ；およびＰｏｚｎａｎｓｋｙら，  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９８０），  Ｒ．  Ｌ．  Ｊｕｌｉａｎｏ，  ｅｄ．，  Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｎ．Ｙ．，  ｐｐ．  ２５３−３１５を参照されたい）。
【０２８２】
[00306]「単位剤形」は、本明細書において、治療しようとする被験体に対して、単一投薬型として適した、物理的に別個の単位を指し：各単位は、あらかじめ決定された量を含有し、場合によって薬学的キャリアー（賦形剤、希釈剤、ビヒクルまたは充填剤）と関連して、１つまたはそれより多い用量で投与された際に、望ましい効果（例えば予防的または療法的効果）を生じるように計算されている。単位剤形は、例えばアンプルおよびバイアル内にあることも可能であり、これらには、液体組成物、あるいはフリーズドライまたは凍結乾燥状態の組成物が含まれていてもよく；ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与または送達前に、例えば、無菌液体キャリアーを添加することも可能である。個々の単位剤形は、多用量のキットまたは容器中に含まれていることも可能である。投与を容易にし、そして投薬型を均質にするために、ＡＡＶベクター、およびその医薬組成物を、単一または多数の単位剤形でパッケージングすることも可能である。
【０２８３】
[00307]関連態様において、本明細書に記載するＡＡＶ送達系を、ターゲット細胞（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏいずれかのＯＰＣまたはＮＳＣ）への送達、他のヌクレアーゼ（例えばＴＡＬＥＮまたはＺＦＮ）またはＲＮＡｉ構築物（機能的ｓｉＲＮＡをコードし、そしてターゲット細胞内部に入ったら、該ｓｉＲＮＡを産生する）またはＡＳＯ構築物（機能的アンチセンスオリゴをコードし、そして産生する）に容易に適応させることも可能である。
【０２８４】
適用
[00308]本明細書に開示する方法および組成物は、ミエリン関連障害のための細胞に基づく療法を提供するためのものである。細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで修飾することも可能であるし、またはｅｘ  ｖｉｖｏで修飾し、そして続いて被験体に投与することも可能である。いくつかの態様において、患者の中枢神経系におけるＮＳＣ、ＯＰＣ、ニューロン細胞、およびグリア細胞、例えばオリゴデンドロサイト、アストロサイト、上衣細胞、およびミクログリア細胞がｉｎ  ｓｉｔｕで編集されるであろう。いくつかの態様において、細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで修飾し、そして患者に移植する。
【０２８５】
[00309]被験体自身の細胞を使用すると、移植のためにドナーおよびレシピエントの間のＨＬＡマッチングの必要性が排除される。さらに、本明細書記載の遺伝子修飾細胞は、幹細胞を被験体から単離することが可能であり、そしてこれらの細胞が遺伝子修飾を保持し、そしてこれらを１つまたはそれより多いさらなる被験体に投与することも可能である点で、連続（二次）移植に適していることも示されてきている。したがって、方法および組成物は、ミエリン関連障害の治療および／または防止を提供する。
【０２８６】
[00310]ＰＬＰ１、ＰＬＰ１の一部、またはＰＬＰ制御要素のターゲティング化欠失を用いて、異常な遺伝子を修正するか、内因性遺伝子内で機能喪失突然変異を生成するか、または内因性遺伝子の発現を変化させることも可能である。他の側面において、ＰＬＰ１またはＰＬＰ１遺伝子制御要素ヌクレオチド配列の抗ＰＬＰ１ドナーのターゲティング化組込みを用いて、異常な遺伝子を修正するか、野生型遺伝子を挿入するか、内因性遺伝子内に機能獲得突然変異を生成するか、または内因性遺伝子の発現を変化させることも可能である。例えば、ＰＬＰ１をコードする導入遺伝子またはＰＬＰ１遺伝子制御要素導入遺伝子を細胞内に組み込んで、機能的ミエリン産生を増進させることが可能な非有害タンパク質を産生する細胞（例えばオリゴデンドロサイトまたは前駆体）を提供することも可能である。ＰＬＰ１またはＰＬＰ１遺伝子制御要素のターゲティング化ノックアウトまたは遺伝子サイレンシング、あるいは本明細書記載の方法による修飾は、ＰＬＰ１遺伝子の不活性化を通じてＰＬＰ１毒性を減少させることによって、機能的ミエリン産生を増進させる細胞を提供することも可能である。ゲノム編集にはまた、例えば内因性ＰＬＰ１遺伝子発現を修飾するため、内因性遺伝子における突然変異（例えば点突然変異）の修正または導入が含まれることも可能である。
【０２８７】
[00311]本明細書記載の組成物（例えば細胞および／またはヌクレオチド）を被験体に投与して、ミエリン関連疾患および障害を治療することも可能である。本発明のいくつかの側面によって治療が意図される、ミエリン関連疾患および障害には、被験体における脱髄、不十分なミエリン形成および再ミエリン形成、または髄鞘形成異常に関連する、任意の疾患、状態（例えば外傷性脊髄傷害および脳梗塞から生じるもの）、または障害が含まれることも可能である。本明細書に用いるようなミエリン関連障害は、多様な神経毒性侵襲から生じるミエリン形成関連障害または脱髄から生じることも可能である。「脱髄」は、本明細書において、脱髄の作用、または神経を損傷するミエリン鞘の喪失を指し、そして多発性硬化症、横断性脊髄炎、慢性炎症性脱髄ニューロパチー、およびギラン・バレー症候群を含む、いくつかの神経変性自己免疫疾患の特徴である。白質ジストロフィーは、遺伝性酵素欠損によって引き起こされ、ＣＮＳ白質内でのミエリン鞘の異常な形成、破壊、および／または異常な代謝回転を引き起こす。後天性および遺伝性ミエリン障害はどちらも、劣った予後を共有し、大きな身体障害につながる。したがって、本発明のいくつかの態様には、被験体における神経変性自己免疫疾患の治療のための方法が含まれることも可能である。ニューロンの再ミエリン形成は、オリゴデンドロサイトを必要とする。用語「再ミエリン形成」は、本明細書において、ミエリン産生細胞を置換するかまたはその機能を回復させることによる、神経のミエリン鞘の再生成を指す。
【０２８８】
[00312]本発明の方法によって治療されるかまたは回復することも可能なミエリン関連疾患または障害には、被験体の脳細胞、例えばＣＮＳニューロンにおける髄鞘形成異常または脱髄に関連する疾患、障害または傷害が含まれる。こうした疾患には、限定されるわけではないが、ニューロン周囲のミエリンが存在しないか、不完全であるか、適切に形成されないか、または変質している、疾患および障害が含まれる。こうした疾患には、限定されるわけではないが、多発性硬化症（ＭＳ）、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中央ミエリン溶解（ＣＰＭ）、副腎白質ジストロフィー、アレクサンダー病、ペリツェウス・メルツバッハ病（ＰＭＤ）、ウォラー変性、視神経炎、横断性脊髄炎、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄傷害、外傷性脳傷害、放射線照射後の傷害、化学療法の神経学的合併症、脳卒中、急性虚血性視神経症、ビタミンＥ欠乏、孤立性ビタミンＥ欠乏症候群、ＡＲ、バッセン・コーンツヴァイク症候群、マルキアファーヴァ・ビニャミ症候群、異染性白質ジストロフィー、三叉神経痛、急性散在性脳炎、ギラン・バレー症候群、マリー・シャルコー・ツース病およびベル麻痺が含まれる。
【０２８９】
[00313]本発明の方法によって治療されるかまたは回復することも可能なミエリン関連疾患または障害には、ミエリン欠陥によって特徴付けられる疾患または障害が含まれる。中枢神経系における不十分なミエリン形成は、非常に多様な神経学的障害に関連付けられてきている。これらの中で、脳室周囲白質軟化症の小児における前脳ミエリン形成における先天的欠損が、神経学的病的状態に寄与する、脳性麻痺の型がある（Ｇｏｌｄｍａｎら，  ２００８）  Ｇｏｌｄｍａｎ，  Ｓ．Ａ．，  Ｓｃｈａｎｚ，  Ｓ．，およびＷｉｎｄｒｅｍ，  Ｍ．Ｓ．（２００８）．  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  ｍｙｅｌｉｎ．  Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．  １７，  Ｒ７６−８３。年齢スペクトルのもう一方の端で、ミエリン喪失および無効な修復は、老化と関連する認知機能の低下に寄与する可能性もある（Ｋｏｈａｍａら，  ２０１１）  Ｋｏｈａｍａ，  Ｓ．  Ｇ．，  Ｒｏｓｅｎｅ，  Ｄ．  Ｌ．，およびＳｈｅｒｍａｎ，  Ｌ．  Ｓ．  （２０１１）  Ａｇｅ  （Ｄｏｒｄｒ）．Ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｗｈｉｔｅ  ｍａｔｔｅｒ：  ｆｒｏｍ  ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ  ｄｉｓｔｕｒｂａｎｃｅｓ  ｔｏ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｄｅｃｌｉｎｅ。したがって、ミエリン形成および／または再ミエリン形成を増進させる有効な化合物および方法が、疾患進行を停止し、そしてＰＭＤにおいて、そして非常に多様なミエリン関連障害において、機能を回復させる際に、実質的な療法的な利益を有しうることが意図される。
【０２９０】
[00314]いくつかの態様において、ミエリン依存性プロセスを増進させるかまたは促進するため、ミエリン関連障害を持たない、そして／または持つと予期されない被験体に、本発明の組成物を投与することも可能である。いくつかの態様において、認知的に健康な被験体において、ミエリン依存性プロセスであることが知られる認知を増進させるため、本明細書記載の化合物を被験体に投与してＣＮＳニューロンのミエリン形成を促進することも可能である。特定の態様において、本明細書記載の化合物を、認知増進性（向知性）剤と組み合わせて投与することも可能である。例示的な剤には、健康な個体において、認知機能、特に実行機能、記憶、創造性、または意欲を改善させる任意の薬剤、サプリメント、または他の物質が含まれる。限定されない例には、ラセタム（例えばピラセタム、オキシラセタム、およびアニラセタム）、栄養補助食品（例えばオトメアゼナ（Ｂａｃｏｐａ  ｍｏｎｎｉｅｒｉ）、オタネニンジン（Ｐａｎａｘ  ｇｉｎｓｅｎｇ）、イチョウ（Ｇｉｎｋｏ  ｂｉｌｏｂａ）、およびＧＡＢＡ）、刺激剤（例えばアンフェタミン薬剤、メチルフェニデート、覚醒促進剤（ｅｕｇｅｒｏｉｃｓ）、キサンチン、およびニコチン）、Ｌ−テアニン、トルカポーネ、レボドパ、アトモキセチン、およびデシプラミンが含まれる。
【０２９１】
[00315]本発明の１つの特定の側面は、被験体におけるＰＭＤの治療を意図する。該方法には、被験体に、療法的有効量の上述の遺伝子修飾細胞またはヌクレオチド組成物を投与する工程を含む。
【０２９２】
[00316]全体の投薬量は、被験体の全身の健康状態、被験体の疾患状態、状態の重症度、改善の観察、ならびに選択した剤（単数または複数）の配合および投与経路を含む、いくつかの要因に応じた、療法的有効量であろう。療法的有効量の決定は、当業者の能力内である。正確な配合、投与経路および投薬量は、被験体の状態を考慮して、個々の医師によって選択されうる。
【０２９３】
[00317]特定の態様において、未処理ＣＮＳニューロンまたは被験体のミエリンタンパク質のレベルに比較した際、少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％、６５０％、７００％、７５０％、８００％、８５０％、９００％、９５０％、または１０００％のミエリンタンパク質（例えばＭＢＰ）の量の増加によって、被験体におけるＣＮＳニューロンのミエリン産生を増進させるために有効な量で、本明細書記載の遺伝子修飾細胞またはヌクレオチド組成物を投与することも可能である。
【０２９４】
[00318]他の態様において、未処理ＣＮＳニューロンまたは被験体における生存ニューロンの数に比較した際、少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％、６５０％、７００％、７５０％、８００％、８５０％、９００％、９５０％、または１０００％の生存ニューロンの数の増加によって、被験体におけるＣＮＳニューロンの生存を促進するために有効な量で、遺伝子修飾細胞またはヌクレオチド組成物を投与することも可能である。
【０２９５】
[00319]ミエリン関連障害を患う被験体を治療するための別の戦略は、オリゴデンドロサイト分化および／または増殖誘導剤（単数または複数）ならびに／あるいは抗神経変性疾患剤の療法的有効量とともに、本明細書記載の遺伝子修飾細胞またはヌクレオチド組成物の療法的有効量を投与することである。抗神経変性疾患剤の例には、Ｌ−ドパ、コリンエステラーゼ阻害剤、抗コリン剤、ドーパミンアゴニスト、ステロイド、ならびにインターフェロン、モノクローナル抗体、およびグラチラマー酢酸剤を含む免疫調節剤が含まれる。
【０２９６】
[00320]したがって、本発明のさらなる側面において、本明細書記載の遺伝子修飾細胞またはヌクレオチド組成物を、神経変性およびミエリン関連障害を治療するための補助療法との組み合わせ療法の一部として、投与することも可能である。
【０２９７】
[00321]句「組み合わせ療法」は、本明細書記載のオリゴデンドロサイト前駆体分化誘導性化合物および療法剤を、これらの療法剤の共作用から有益な効果を提供するよう意図される特定の治療措置の一部として投与することを含む。組み合わせとして投与する際、オリゴデンドロサイト前駆体分化誘導化合物および療法剤は、別個の組成物として配合することも可能である。組み合わせにおけるこれらの療法剤の投与は、典型的には、定義される期間（選択する組み合わせに応じて、通常、分、時間、日、または週）に渡って実行される。
【０２９８】
[00322]「組み合わせ療法」は、これらの療法剤を連続方式で、すなわち各療法剤を異なる時点で投与するもの、ならびに実質的に同時の方式でのこれらの療法剤または療法剤の少なくとも２つの投与を含むよう意図される。実質的に同時の投与は、例えば、被験体に、固定された比の各療法剤を有する単一のカプセルを、または各療法剤の単一のカプセルを複数、投与することによって、達成可能である。各療法剤の連続したまたは実質的に同時の投与は、限定されるわけではないが、経口経路、静脈内経路、筋内経路、および粘膜組織を通じた直接吸収を含む、任意の適切な経路によって達成可能である。療法剤を同じ経路によって、または異なる経路によって、投与することも可能である。例えば、選択される組み合わせの第一の療法剤を静脈内注射によって投与する一方、組み合わせの他の療法剤を経口投与することも可能である。あるいは、例えば、すべての療法剤を経口投与することも可能であるし、あるいはすべての療法剤を静脈内注射によって投与することも可能である。療法剤を投与する順序は厳密に重大ではない。「組み合わせ療法」はまた、他の生物学的活性成分（例えば限定されるわけではないが、第二のおよび異なる療法剤）および非薬剤療法（例えば手術）とさらに組み合わせた、上述の療法剤の投与を含むことも可能である。
【０２９９】
[00323]本発明の別の側面において、本明細書記載の遺伝子修飾細胞またはヌクレオチド組成物を含む組み合わせ療法で投与される療法剤には、少なくとも１つの抗神経変性剤、例えば限定されるわけではないが免疫療法剤が含まれることも可能である。
【０３００】
[00324]本発明の方法において使用するための免疫療法剤には、疾患の免疫構成要素、および／または多発性硬化症などの寛解再発ミエリン関連障害における急性攻撃中に明示される急性炎症性反応をターゲティングする療法が含まれることも可能である。例には、限定されるわけではないが、免疫調節剤、例えばインターフェロン・ベータ１ａおよびベータ１ｂ（それぞれＡｖｏｎｅｘおよびＢｅｔａｓｅｒｏｎ）、ネタリズマズ（Ｃｏｐａｘｏｎｅ）、ネタリズマブ（Ｔｙｓａｂｒｉ）、グラチラマー酢酸（Ｃｏｐａｘｏｎｅ）またはミトキサントロンが含まれる。
【０３０１】
[00325]本発明はさらに、以下の実施例によって例示され、該実施例は、請求項の範囲を限定することを意図されない。
【実施例】
【０３０２】
実施例１  遺伝性ミエリン障害を治療するためのヌクレアーゼ仲介性ＰＬＰ１不活性化
序論
[00326]異常なミエリン形成は、異常なニューロンシグナル伝達および神経学的機能不全を生じる。内因性のミエリン形成細胞内での遺伝子異常の修正による、これらの患者におけるミエリン形成能の回復は、有望な治癒の手段を代表するが、この療法アプローチの実現可能性はいまだに立証されていない。したがって、本発明者らは、ペリツェウス・メルツバッハ病（ＰＭＤ）と称される重度の原型白質ジストロフィーに焦点を当てることによって、このパラダイムを検証することを選択した。
【０３０３】
[00327]ＰＭＤは、プロテオリピドタンパク質１（ＰＬＰ１）における突然変異によって引き起こされる、ミエリンの重度Ｘ染色体連鎖遺伝子障害である。ＰＭＤ患者は、典型的には、顕著な認知および運動不能を含む、重度の神経学的疾患を経験し、該疾患は小児期または青年期中に回避不能に早期死亡に達する。したがって、本発明者らは、ＰＬＰ１発現を有効にそして永続的に不活性化するかまたは減少させるＰＬＰ１遺伝子またはその制御要素におけるヌクレアーゼ仲介性挿入または欠失（インデル）の導入（ＰＬＰ１−インデル）を通じて重度ＰＭＤ患者を治療可能であるかどうかを決定することを試みた。ヌクレアーゼ仲介性インデルは、神経幹細胞またはオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）を含む、オリゴデンドロサイトまたはその前駆体をターゲティングすることも可能である。前駆細胞のターゲティングは、ＰＬＰインデル前駆細胞が、患者の一生に渡って、機能的ＰＬＰ１インデル・オリゴデンドロサイトを生成し続けるため、永続的でそして自己増幅性の療法を提供するであろう。多くの別個のおよび多様なＰＭＤ原因突然変異が患者において既に同定されていることを考慮すると、本発明者らのＰＬＰ１インデルアプローチは、すべてのＰＭＤ患者に適用可能な普遍的アプローチを提供するために、ユニークである。
【０３０４】
ｊｉｍｐｙマウス
[00328]ＰＬＰ１−インデル療法剤を開発するため、本発明者らは、ｊｉｍｐｙと称されるＰＭＤマウスモデルを利用した。このマウスは、ＰＬＰ１遺伝子のイントロン４のスプライスアクセプター部位に点突然変異を宿して、ミスフォールディングＰＬＰ１を導き、最終的に、オリゴデンドロサイト喪失、顕著なミエリン形成低下、重度の振戦、運動失調、癲癇、および生後３週までの早期死亡を引き起こす。したがって、該モデルは、ヒト患者で見られる重度ＰＭＤの多くの側面を有効に再現する。
【０３０５】
[00329]ｊｉｍｐｙマウスは、ＰＭＤの最も重症のモデルを代表する。図２は、マウスＰＬＰ１遺伝子におけるｊｉｍｐｙ遺伝子突然変異の位置、およびその結果生じる遺伝子産物であって最終的にオリゴデンドロサイトの死を引き起こす遺伝子産物を示す模式図（正確な縮尺ではない）である。図の下部は、わずか約２３日の生存中央値を示すｊｉｍｐｙマウスの非常に減少した寿命を示す。
【０３０６】
[00330]図３は、ｊｉｍｐｙマウス脳における重度の低ミエリン形成を示す。野生型対照のものに比較して、Ｐ１９（出生後１９日目）ｊｉｍｐｙマウス脳切片における有意により少ないＭＢＰ染色に注目されたい。ｊｉｍｐｙマウスはまた、同じ年齢で、企図振戦および運動失調も示す（データ未提示）。
【０３０７】
ガイドＲＮＡ選択および検証
[00331]ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９は、ヌクレアーゼＣａｓ９および２２ｂｐの単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の導入によって、哺乳動物細胞においてインデルを誘導する、効率的なヌクレアーゼ仲介性の系の一例である。適切なｓｇＲＮＡは、Ｈｓｕら（２０１３）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１，  ８２７−８３２に記載されるように設計された。特に、ｓｇＲＮＡは、オンターゲットを最大にし、そしてオフターゲットインデル形成を最小限にするとともに、ナンセンス仲介性崩壊の効率を増加させるため、初期エクソンターゲティングを行うよう選択された。ｓｇＲＮＡは、ＣｌｏｎｔｅｃｈのＧｕｉｄｅ−ｉｔ  ｓｇＲＮＡスクリーニングキットによって、ヌクレアーゼ活性に関して検証され、そしてＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｎｅｏｎトランスフェクション系を用いて、マウスおよびヒト細胞内で、ＳａＣａｓ９またはＳｐＣａｓ９およびｓｇＲＮＡを発現するプラスミドをエレクトロポレーションすることによる、機能的インデル誘導に関して検証された。ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ系を用いたディープシーケンシングを通じたインデル形成の定量化によって、切断効率およびｓｇＲＮＡランキングを決定した。トップのｓｇＲＮＡを表１に詳述する。
【０３０８】
表１：検証されたｓｇＲＮＡ配列のトップ
【０３０９】
【表１】
2020500537.tif 000003
[00332]図４および５は、ＣＲ−ｉｍｐｙ  ＫＯ子孫マウスを生成するため、エクソン３のＣＲＩＳＰＲ  ＳｐＣａｓ９／二重ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）ターゲティングを通じて、ｊｉｍｐｙマウスの接合体においてＰＬＰ１遺伝子をノックアウトする例示的アプローチを示す模式図である。図４は、エクソン３におけるｓｇＲＮＡ  ＡおよびＢターゲティング部位の相対的位置を示す。図５は、ｓｇＲＮＡおよびＳｐＣａｓ９  ｍＲＮＡを受け取るためのｊｉｍｐｙ雄接合体を生成する、一般的な実験アプローチを示す。ｊｉｍｐｙ  ＰＬＰ１遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９仲介性ノックアウトが成功すると、ＰＬＰ１ヌル雄ＣＲ−ｉｍｐｙ創始者（founder）が、代理ホスト雌によって生まれる。親系統に２世代交配すると、さらなる特徴付けのための子孫マウスが生じる。
【０３１０】
動物におけるＳＰＣａｓ９仲介性ＰＬＰ１欠失
[00333]本発明者らの療法的ＰＬＰ１インデル戦略の最初の概念実証として、ｊｉｍｐｙブリーダー由来の接合体に２００ｎｇ／μｌ  ＳｐＣａｓ９  ｍＲＮＡおよび各１０ｎｇ／μｌのｓｇＲＮＡ  ＡおよびＢをエレクトロポレーションし、そして次いで、代理雌に移植した（図５を参照されたい）。これは、ＰＬＰ１のエクソン３の５’端に〜８０ヌクレオチド欠失を持つ、ＣＲＩＳＰＲ−ノックアウトｊｉｍｐｙ（ＣＲ−ｉｍｐｙ［またはｃｒｉｍｐｙ］）雄マウスの生成を生じた。ｊｉｍｐｙ雄は、重症の表現型を示し、そして生後３週目までに死亡する一方、ｃｒｉｍｐｙ雄は、振戦、癲癇、運動失調、または早期死亡をまったく示さないように、ｊｉｍｐｙ雄とは非常に異なった（データ未提示）。驚くべきことに、このｃｒｉｍｐｙ雄は、成功裡に交配し、そして組織学的分析のために屠殺するまで６ヶ月以上生存し、該分析によって、野生型と区別不能な、中枢神経系の完全ミエリン形成を示した（図１を参照されたい）。ｃｒｉｍｐｙアレルの健康な孫への伝達によって、本発明者らのＰＬＰ１インデル治療の劇的な療法効果が確認される。
【０３１１】
[00334]実際、図６は、ＣＲ−ｉｍｐｙマウスが、ｊｉｍｐｙおよび野生型対照と比較して、回復された寿命を有することを示す（各群に関してｎ＞１５、ｐ＜０．０００１）。
【０３１２】
[00335]図７は、ＣＲ−ｉｍｐｙマウスが、ＭＢＰを検出する全脳ＩＨＣによって成熟オリゴデンドロサイトの回復を示すことを示す。生後Ｄ１９で、野生型およびＣＲ−ｉｍｐｙマウスは、どちらも、ｊｉｍｐｙマウスのものよりも有意により多いＭＢＰ染色を有する。生後６ヶ月では、すべてのｊｉｍｐｙマウスが死亡していたが、野生型およびＣＲ−ｉｍｐｙマウスにおけるＭＢＰ染色レベルは区別不能である。
【０３１３】
[00336]２つのさらなる機能試験を用いて、ＣＲ−ｉｍｐｙマウスにおける運動協調および自発運動の回復を評価した。
[00337]図８は、ＣＲ−ｉｍｐｙマウスの運動協調を評価するためのロータロッド試験の模式図を示し、ここで、回転バーを加速させた際に、回転バーから落ちる時間を測定することによって、運動協調を定量化する。測定を生後Ｐ１９、２ヶ月、および６ヶ月に、各時点の野生型、ｊｉｍｐｙ、およびＣＲ−ｉｍｐｙマウスで行った。異なる値間の統計的有意性をｐ値によって示す。Ｐ１９では、野生型およびＣＲ−ｉｍｐｙマウスはどちらも、ｊｉｍｐｙマウスのものと比較して、落ちるまでに統計的に有意により長い時間を有した。生後２ヶ月および６ヶ月では、すべてのｊｉｍｐｙマウスは死亡したが、野生型およびＣＲ−ｉｍｐｙマウスにおける落ちるまでの測定時間のレベルは区別不能である。この結果は、野生型およびｊｉｍｐｙマウスに比較した、ＣＲ−ｉｍｐｙマウスの運動協調の回復を示す。
【０３１４】
[00338]図９は、ＣＲ−ｉｍｐｙマウスの自発運動活性を評価するためのオープンフィールド試験の模式図を示し、ここで、５分間の自動化ビデオ追跡によって追跡されるようなボックス中の総移動距離を測定することによって、自発運動活性を定量化する。測定を生後Ｐ１９、２ヶ月、および６ヶ月に、各時点の野生型、ｊｉｍｐｙ、およびＣＲ−ｉｍｐｙマウスで行った。異なる値間の統計的有意性をｐ値によって示す。Ｐ１９では、野生型およびＣＲ−ｉｍｐｙマウスはどちらも、ｊｉｍｐｙマウスのものと比較して、統計的に有意により長い総距離を移動した。生後２および６ヶ月では、すべてのｊｉｍｐｙマウスは死亡していたが、野生型およびＣＲ−ｉｍｐｙマウスにおいて測定された総移動距離のレベルは区別不能である。結果は、野生型およびｊｉｍｐｙマウスに比較した、ＣＲ−ｉｍｐｙマウスにおける自発運動活性の回復を示す。
【０３１５】
[00339]軸索刺激後、伝導速度の測定に基づいて、さらなる機能試験を行った。図１０は、視神経伝導速度試験の模式図、ならびにより迅速なおよびより緩慢な伝導ピーク、それぞれ第一ピークおよび第二ピークの代表的な結果を示す。ミエリン形成され、そして大きな直径の軸索は、一般的に、ミエリン形成されず、そしてより小さい直径の軸索に比較して、より迅速な伝導度を有する。生後Ｄ１９での、それぞれ、第一および第二ピークによって測定されるような、迅速および緩慢伝導速度は、どちらも、野生型、ｊｉｍｐｙマウス、およびＣＲ−ｉｍｐｙマウスのいずれか２つの間で、統計的に有意に異なる。しかし、生後６ヶ月では、すべてのｊｉｍｐｙマウスは死亡していたが、野生型およびＣＲ−ｉｍｐｙマウスの間の相違は、あるとしても、統計的に有意ではなくなる。これは、軸索伝導速度はＣＲ−ｉｍｐｙマウスにおいて加速し、最初は野生型マウスのものに後れを取っているが、最終的に長期に渡って追いつくことを示唆する。
【０３１６】
[00340]実際、約６ヶ月齢での野生型およびＣＲ−ｉｍｐｙマウス視神経の電子顕微鏡（ＥＭ）画像化は、区別可能な相違を示さない。図１１を参照されたい。
[00341]ＣＲ−ｉｍｐｙマウスが６ヶ月で野生型のものと類似の機能的成績を示し続ける事実によって、遺伝子治療仲介性修正の長期の機能的安定性が示唆される。
【０３１７】
[00342]これらの結果は、ＰＬＰ１における不活性化インデルの導入が、ＰＭＤのマウスモデルを完全にレスキュー可能であることを示す。
要約
[00343]本開示は、遺伝子修飾細胞を生成する方法、およびヒトミエリン障害の治療におけるその使用法を含む。特に、本発明者らは、ペリツェウス・メルツバッハ病（ＰＭＤ）と称される白質ジストロフィーの背景において有効性が立証された、ミエリン関連障害のための新規療法アプローチとしてプロテオリピドタンパク質１（ＰＬＰ１）遺伝子のヌクレアーゼ仲介性遺伝子破壊を用いた。
【０３１８】
[00344]図１２は、患者の脳において、少なくとも部分的に突然変異体ＯＰＣを修正可能である、例えばＳａＣａｓ９およびｓｇＲＮＡをコードするＡＡＶウイルスベクターを通じて、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９仲介性遺伝子サイレンシングを新生児脳に送達する、本発明の１つの態様を示す模式図である。こうして修正されたＯＰＣは、適切な時期に、いかなる突然変異ＯＰＣも打ち負かし、こうして患者ニューロンの十分に回復されたミエリン形成および機能を提供するであろう。
【０３１９】
[00345]本発明者らの戦略は、機能的ミエリンを作製する能力を増進させるＰＬＰ１遺伝子の不活性化を通じて、ＰＬＰ１関連毒性をバイパスする。いくつかの例において、患者の中枢神経系において、神経幹細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）、または他のグリア細胞をｉｎ  ｓｉｔｕで編集することも可能である。別の例において、細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで修飾して、そして患者に移植することも可能である。
【０３２０】
[00346]より具体的には、本発明者らは、ＰＬＰ１遺伝子またはＰＬＰ１遺伝子制御要素におけるインデルのヌクレアーゼ仲介性生成を用いて、それぞれＰＬＰ１翻訳または転写を不活性化する、新規療法戦略を示した。本発明者らは、齧歯類におけるｉｎ  ｖｉｖｏでのＰＬＰ１遺伝子のヌクレアーゼ仲介性編集が、ＰＭＤの重症型を有するマウスに対して、正常な機能および完全な寿命を回復させることを示した。本発明者らは、ＰＬＰ１のこの混乱が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＭＤモデル細胞に対して機能を回復させることを示した。これらの概念実証研究の一部として、部位特異的ガイドＲＮＡを伴うＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼを例示するが、この療法戦略は、任意の部位特異的ヌクレアーゼまたは遺伝子編集技術を含むことも可能である。
【０３２１】
[00347]ＰＭＤおよび他の白質ジストロフィー患者に対する療法剤の開発は、患者に見られる広範囲の多様なＤＮＡ突然変異によって、困難である。本明細書において、本発明者らは、すべてのＰＭＤ患者に対する普遍的な療法剤を提供する。この単一の方法／産物をすべてのＰＭＤ患者において用いて、有害な突然変異体ＰＬＰ１遺伝子を有効に不活性化することも可能である。さらに、ＰＬＰ１遺伝子の不活性化は、オリゴデンドロサイトにおいて、細胞ストレスを軽減するために、他のミエリン障害においても有益でありうる。したがって、この療法アプローチにはかなりの価値があり、そしてＰＬＰ１不活性化臨床療法を追及する際に、強い薬学的および経済的関心がある。
【０３２２】
[00348]本明細書記載の方法が、いくつかの方式で、そして当該技術分野に周知の多様な修飾および並べ替えを伴って実行可能であることが理解されるべきである。作用様式に関して示されるいかなる理論も、いかなる意味でも本発明を限定すると見なされるべきではなく、本発明の方法がより完全に理解されるように提示されていることもまた認識されうる。
【０３２３】
[00349]上記明細書に言及するすべての刊行物および特許は、本明細書に援用される。
実施例２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のＡＡＶ送達を用いた、ＰＬＰ１の出生後不活性化
[00350]本実施例は、ＰＬＰ１の出生後不活性化を用いて、ＰＭＤを有効に治療するか、またはＰＭＤの重症度を減少させることも可能であることを立証する。
【０３２４】
[00351]患者におけるＰＬＰ１遺伝子座をターゲティングするｓｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の送達を容易にするため、ＰＨＰ．Ｂを含むいくつかのＣＮＳターゲティング化ＡＡＶ血清型を生成し、そしてＯＰＣに対するＡＡＶ向性を検証した。ＡＡＶ構築物（ＡＡＶ９またはＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ）は、ＳａＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（ＣＭＶ−ＳａＣａｓ９、ＣＭＶプロモーターの制御下のＳａＣａｓ９コード配列）と、ＰＬＰ１に対する部位特異的ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（Ｕ６−ｓｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡはＵ６プロモーターの制御下にある）を含有し、これはＰＬＰ１遺伝子中にインデルを生成し、そしてこうして欠陥ＰＬＰ１タンパク質の発現を防止するよう設計されている。
【０３２５】
[00352]Ｃａｓｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの施設動物飼育使用委員会によって再検討された、認可されたプロトコルにしたがって、マウスを維持した。マウスを、１２時間昼光周期下で、温度および湿度管理飼育装置内で飼育し、そして自由に食物へのアクセスを可能にした。
【０３２６】
[00353]次いで、ｊｉｍｐｙ（ペリツェウス・メルツバッハ病の重症マウスモデル）マウスを、ＣＲＩＳＰＲ含有ＡＡＶまたはＧＦＰコード対照の定位的脳室内注射を通じて治療した。特に、雄出生後第０日の仔をｊｉｍｐｙ交配ペアから得て、そして寒冷麻酔を用いて迅速に麻酔した。
【０３２７】
[00354]３２ゲージ針を伴う１０μＬハミルトン・シリンジに、ＣＭＶ−ＳａＣａｓ９およびＰＬＰ１をターゲティングするＵ６−ｓｇＲＮＡをパッケージングしているＡＡＶ（ＡＡＶ９またはＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ）を装填した。矢状縫合およびラムダ縫合の交点から目まで、位置２／５で、約２ｍｍの深さまで、頭蓋を通じて針を下げた。２μＬのウイルス溶液を側脳室内に注入した。次いで、脳室系に対して、約１ｘ１０１０〜１ｘ１０１１ベクターゲノムの総送達のため、同じ座標および注射体積を用いて、対側性側脳室において、注射を反復した。同じ処置を対照マウスに関しても反復した。
【０３２８】
[00355]仔を加熱パッド上で回復させ、そして次いで母に戻した。２週齢までに重度の運動表現型（例えば企図振戦および癲癇）を示し、そして３週齢までに死亡する、未治療またはビヒクル治療ｊｉｍｐｙ動物と比較した際の表現型改善に関して、仔を毎日監視した。
【０３２９】
[00356]３週を超えて生存した、治療した動物を、行動（例えば運動成績に関するロータロッドおよびオープンフィールド試験、実施例１ならびに図８および９を参照されたい）、組織学（ミエリンタンパク質に関するＣＮＳの免疫染色およびミエリン微細構造に関する電子顕微鏡、実施例１ならびに図７および１１を参照されたい）、または寿命延長統計分析に関する毎日の監視（実施例１および図６を参照されたい）を用いて分析する。
【０３３０】
[00357]さらに、ＣＮＳにおいて編集される必要がある細胞の数に関する空間的要件（遺伝子編集細胞の「用量反応」）を決定して、免疫組織化学での機能的反応を生成する。
[00358]最後に、出生後Ｐ１、Ｐ７、およびＰ１４で、最適化構築物を導入することによって、時間的関連を調べる。
【０３３１】
[00359]定義される療法ウィンドウ内での最適化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９アプローチは、突然変異体ＰＬＰ１タンパク質の発現を減少させ、治療される個体の寿命を増加させ、そして軸索のミエリン形成を回復させる。
【０３３２】
実施例３  アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を用いた、ＰＬＰ１の出生後ノックダウン
[00360]本実施例は、ＡＳＯを用いてＰＬＰ１遺伝子活性の出生後下方制御またはノックダウンを用いて、ＰＭＤを有効に治療するか、またはＰＭＤの重症度を減少させることも可能であることを立証する。
【０３３３】
[00361]Ｃａｓｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの施設動物飼育使用委員会によって審査された、認可されたプロトコルにしたがって、マウスを維持する。マウスを、１２時間昼光周期下で、温度および湿度管理飼育装置内で飼育し、そして自由に食物へのアクセスを可能にする。
【０３３４】
[00362]出生後第０日の雄の仔を、ｊｉｍｐｙ（ペリツェウス・メルツバッハ病の重症マウスモデル）交配ペアから得て、そして寒冷麻酔を用いて迅速に麻酔する。３２ゲージ針を伴う１０μＬハミルトン・シリンジに、ＰＬＰ１をターゲティングするアンチセンスオリゴヌクレオチドを装填する。矢状縫合およびラムダ縫合の交点から目まで、位置２／５で、約２ｍｍの深さまで、頭蓋を通じて針を下げる。２μＬのＡＳＯ溶液を側脳室内に注入した。次いで、脳室系に対して、約１０〜７５μｇのＡＳＯの総送達のため、同じ座標および注射体積を用いて、対側性側脳室において、注射を反復する。
【０３３５】
[00363]仔を加熱パッド上で回復させ、そして次いで母に戻す。２週齢までに重度の運動表現型（例えば企図振戦および癲癇）を示し、そして３週齢までに死亡する、未治療またはビヒクル治療ｊｉｍｐｙ動物と比較した際の表現型改善に関して、仔を毎日監視する。
【０３３６】
[00364]３週を超えて生存した、治療した動物を、行動（例えば運動成績に関するロータロッドおよびオープンフィールド試験、実施例１ならびに図８および９を参照されたい）、組織学（ミエリンタンパク質に関するＣＮＳの免疫染色およびミエリン微細構造に関する電子顕微鏡、実施例１ならびに図７および１１を参照されたい）、または寿命延長統計分析に関する毎日の監視（実施例１および図６を参照されたい）を用いて分析する。
【０３３７】
実施例４  ＲＮＡｉを用いたＰＬＰ１の出生後ノックダウン
[00365]本実施例は、ＲＮＡｉを用いたＰＬＰ１遺伝子活性の出生後下方制御またはノックダウンを用いて、ＰＭＤを有効に治療するか、またはＰＭＤの重症度を減少させることも可能であることを立証する。
【０３３８】
[00366]Ｃａｓｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの施設動物飼育使用委員会によって再検討された、認可されたプロトコルにしたがって、マウスを維持する。マウスを、１２時間昼光周期下で、温度および湿度管理飼育装置内で飼育し、そして自由に食物へのアクセスを可能にする。
【０３３９】
[00367]出生後第０日の雄の仔を、ｊｉｍｐｙ（ペリツェウス・メルツバッハ病の重症マウスモデル）交配ペアから得て、そして寒冷麻酔を用いて迅速に麻酔する。３２ゲージ針を伴う１０μＬハミルトン・シリンジに、ＰＬＰ１をターゲティングするＣＭＶ−ＲＮＡｉ（ＣＭＶプロモーターの制御下で細胞内で転写されて、機能的ＲＮＡｉ分子を生成可能であり、これが次いでＰＬＰ１をターゲティングするｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ／ｍｉＲＮＡにプロセシングされうる、ＲＮＡｉ構築物）をパッケージングしているＡＡＶ（ＡＡＶ９またはＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ）を装填する。あるいは、針に、非ウイルスｓｉＲＮＡキャリアー、例えば細胞透過性ペプチド、ポリマー、デンドリマー、ｓｉＲＮＡバイオコンジュゲート、および脂質に基づくｓｉＲＮＡキャリアー等を用いて、ＰＬＰ１をターゲティングするＲＮＡｉ構築物の非ウイルス性配合物を装填する。矢状縫合およびラムダ縫合の交点から目まで、位置２／５で、約２ｍｍの深さまで、頭蓋を通じて針を下げる。２μＬのＲＮＡｉ溶液を側脳室内に注入する。次いで、同じ座標および注射体積を用いて、対側性側脳室において、注射を反復する。
【０３４０】
[00368]仔を加熱パッド上で回復させ、そして次いで母に戻す。２週齢までに重度の運動表現型（例えば企図振戦および癲癇）を示し、そして３週齢までに死亡する、未治療またはビヒクル治療ｊｉｍｐｙ動物と比較した際の表現型改善に関して、仔を毎日監視する。
【０３４１】
[00369]３週を超えて生存した、治療した動物を、行動（例えば運動成績に関するロータロッドおよびオープンフィールド試験、実施例１ならびに図８および９を参照されたい）、組織学（ミエリンタンパク質に関するＣＮＳの免疫染色およびミエリン微細構造に関する電子顕微鏡、実施例１ならびに図７および１１を参照されたい）、または寿命延長統計分析に関する毎日の監視（実施例１および図６を参照されたい）を用いて分析する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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