(57)【要約】  本発明は、過剰発現できる核酸であって、ＰｈｏＰおよびＰｈｏＲたんぱく質をコードする核酸を含む、生組換えマイコバクテリウム・ボビス―ＢＣＧ株、および結核（ＴＢ）ワクチンまたは免疫原性組成物を提供する。本発明はまた、該株を用いて、マイコバクテリウム・ツベルクローシスまたはマイコバクテリウム・ボビスによる負荷に対して、哺乳動物を治療または予防するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
過剰発現できる核酸であって、ＰｈｏＰおよびＰｈｏＲたんぱく質をコードする核酸を含む、生組換えマイコバクテリウム・ボビス―ＢＣＧ株。
【請求項２】
ＰｈｏＰおよびＰｈｏＲたんぱく質が、マイコバクテリウム・ツベルクローシスまたはマイコバクテリウム・ボビス由来である、請求項１に記載の生組換えマイコバクテリウム・ボビス―ＢＣＧ株。
【請求項３】
核酸が、
（ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列；または
（ｉｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸の置換、付加、または欠失を有する、ＰｈｏＰたんぱく質、
（ｉｉｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列；または
（ｉｖ）配列番号３で示されるアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸の置換、付加、または欠失を有する、ＰｈｏＲたんぱく質、
をコードする、請求項１に記載の生組換えマイコバクテリウム・ボビス―ＢＣＧ株。
【請求項４】
核酸が、
（ｉ）配列番号２で示されるヌクレオチド配列；
（ｉｉ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、（ｉ）のヌクレオチド配列とハイブリダイズする配列；
（ｉｉｉ）配列番号２で示されるヌクレオチド配列と、少なくとも６０％の配列同一性を有する配列、
（ｉｖ）配列番号４で示されるヌクレオチド配列；
（ｖ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、（ｉｖ）のヌクレオチド配列とハイブリダイズする配列；
（ｖｉ）配列番号４で示されるヌクレオチド配列と、少なくとも６０％の配列同一性を有する配列、
を含む、請求項１に記載の生組換えマイコバクテリウム・ボビス―ＢＣＧ株。
【請求項５】
核酸分子が修飾されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の生組換えマイコバクテリウム・ボビス―ＢＣＧ株。
【請求項６】
マイコバクテリウム・ボビス―ＢＣＧ株が現存するＢＣＧ株から選択され、現存するＢＣＧ株が、マイコバクテリウム・ボビス−ＢＣＧ−Ｒｕｓｓｉａ（ＡＴＣＣ番号：３５７４０）、マイコバクテリウム・ボビス−ＢＣＧ−Ｍｏｒｅａｕ（ＡＴＣＣ番号：３５７３６）、マイコバクテリウム・ボビス−ＢＣＧ−Ｊａｐａｎ（ＡＴＣＣ番号：３５７３７）、マイコバクテリウム・ボビス−ＢＣＧ−Ｓｗｅｄｅｎ（ＡＴＣＣ番号：３５７３２）、マイコバクテリウム・ボビス−ＢＣＧ−Ｂｉｒｋｈａｕｇ（ＡＴＣＣ番号：３５７３１）、マイコバクテリウム・ボビス−ＢＣＧ−Ｐｒａｇｕｅ（ＡＴＣＣ番号：３５７４２）、マイコバクテリウム・ボビス−ＢＣＧ−Ｇｌａｘｏ（ＡＴＣＣ番号：３５７４１）、マイコバクテリウム・ボビス−ＢＣＧ−Ｄｅｎｍａｒｋ（ＡＴＣＣ番号：３５７３３）、マイコバクテリウム・ボビス−ＢＣＧ−Ｔｉｃｅ（ＡＴＣＣ番号：３５７４３、２７２８９）、マイコバクテリウム・ボビス−ＢＣＧ−Ｆｒａｐｐｉｅｒ（ＡＴＣＣ：３５７４６、ＳＭ−Ｒ；ＡＴＣＣ：３５７４７、ＩＮＨ−Ｒ）、マイコバクテリウム・ボビス−ＢＣＧ−コンノート（ＡＴＣＣ：３５７４５）、マイコバクテリウム・ボビス−ＢＣＧ−Ｐｈｉｐｐｓ（ＡＴＣＣ番号：３５７４４）、マイコバクテリウム・ボビス−ＢＣＧ−Ｐａｓｔｅｕｒ（ＡＴＣＣ番号：３５７３４）、ＢＣＧ−Ｍｅｘｉｃａｎ（ＡＴＣＣ番号：３５７３８）およびマイコバクテリウム・ボビス−ＢＣＧ−Ｃｈｉｎａ（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔ）を含むが、これらに限定されない、請求項１〜７のいずれか一項に記載の、生組換えマイコバクテリウム・ボビス―ＢＣＧ株。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の生組換えマイコバクテリウム・ボビス―ＢＣＧ株を含む、医薬組成物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の生組換えマイコバクテリウム・ボビス―ＢＣＧ株を含む、マイコバクテリアによる負荷に対する、哺乳動物の治療または予防のための、ワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項９】
マイコバクテリアが、マイコバクテリウム・ツベルクローシスまたはマイコバクテリウム・ボビスである、請求項８に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１０】
さらに、医薬的に許容される担体を含む、請求項７または８に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１１】
さらに、アジュバントを含む、請求項７または８に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１２】
さらに、１つ以上の他の病原菌由来の免疫原性物質を含む、請求項８〜１１のいずれか一項に記載のワクチンまたは免疫原性組成物。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の生組換えマイコバクテリウム・ボビス―ＢＣＧ株を、哺乳動物に投与することを含む、マイコバクテリウム・ツベルクローシスまたはマイコバクテリウム・ボビスによる負荷に対する、哺乳動物の治療または予防のための方法。
【請求項１４】
哺乳動物がウシである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
哺乳動物がヒトである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
生組換えマイコバクテリウム・ボビス―ＢＣＧ株が、アジュバントの存在下で投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の生組換えマイコバクテリウム・ボビス―ＢＣＧ株を、哺乳動物に投与することを含む、癌に対する哺乳動物の治療または予防のための方法。
【請求項１８】
生組換えマイコバクテリウム・ボビス―ＢＣＧ株が、アジュバントの存在下で投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
癌が膀胱癌である、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、結核（ＴＢ）ワクチンに関する。特に、本発明は、ｐｈｏＰ−ｐｈｏＲ二成分制御系を過剰発現し、結核に対する増強された防御を付与する、組換えＢＣＧを提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
マイコバクテリウム・ツベルクローシス（結核菌、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｍ．ｔｂ））により引き起こされる結核（ＴＢ）は、世界中の感染症による死亡の主な原因としてＨＩＶ／ＡＩＤＳと並んでランク付けされている。２０１４年には、結核により１５０万人が死亡し、９６０万人が新たに感染した。予防ワクチンの不足、薬剤耐性結核菌株の出現、および高い結核菌／ＨＩＶ同時感染率が、ＴＢの流行を助長し続けている。カルメット・ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ））は唯一の認可ＴＢワクチンであり、小児の播種性結核に対して有効であるが１、２、最も一般的で伝染性の結核である、成人の肺結核に対する防御は限定的である。臨床試験により、０〜８０％の範囲の様々な効果が示されている３〜５。
【０００３】
ＢＣＧの効果の変動を説明するための１つの仮説は、ＢＣＧ株の多様性に関するものである６。ＢＣＧはマイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）の毒性株由来であり、１９０８年から１９２１年にかけてのインビトロ継代によるものであった。その後の世界的な配布と１９６０年代までの継続的な継代により、いくつかのＢＣＧ亜系をもたらした。ゲノム領域の欠失および重複、並びに一塩基多型（ＳＮＰ）を含む、ＢＣＧ株の間の遺伝的差異は、十分に立証されている７ー１２。これらの違いが結核に対するＢＣＧの効果に影響するかどうかは議論の余地があり６、１３、現在のところは、複数のＢＣＧ株を直接比較している臨床試験が少ないために、特定の菌株を推奨するにはデータが不十分である１４。
【０００４】
ＴＢワクチンを改善するための現在の戦略には、サブユニットワクチンおよび弱毒生ワクチンの開発がある１５、１６。しかしながら、動物モデルにおいて、ＢＣＧワクチンよりも優れていることが証明されたサブユニットワクチンはない。最近の臨床試験で、ＢＣＧワクチン接種を受けた乳児において、ＭＶＡ８５Ａ（最先端のサブユニットワクチン）の予防効果が見られないことから１７、生ワクチン研究の重要性がさらに強調されている１８。組換えＢＣＧおよび弱毒結核菌株の作製を含む、生ワクチンを開発するための多くのアプローチが探求されてきた。これらのうち、臨床試験に入った３つの生ワクチン（ｒＢＣＧ３０、ＶＰＭ１００２、およびＭＴＢＶＡＣ）を含む、ごくわずかのアプローチが、動物モデルにおいて、ＢＣＧより優れていることが証明されている１６。ｒＢＣＧ３０は抗原Ａｇ８５Ｂを過剰発現する組み換えＢＣＧーＴｉｃｅ株である。モルモットのｒＢＣＧ３０のワクチン接種とそれに続く結核菌の負荷（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）は、親ＢＣＧで免疫されたモルモットと比較して、細菌の負荷量（ｂｕｒｄｅｎ）の０．５〜１．０  ｌｏｇ１０の減少と、生存期間の延長をもたらした１９、２０。しかしながら、ＢＣＧ−コンノートにおけるＡｇ８５Ｂの過剰発現が、防御を改善しないため、この効果は、ＢＣＧ−Ｔｉｃｅに特異的であった２０。ＶＰＭ１００２は、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）のリステリオリジンを発現する組換えＢＣＧである。このワクチンの背後にある理論的根拠は、リステリオリジンがマクロファージのサイトゾルへの、ＢＣＧのファゴソームエスケープを促進し、それによって抗原提示を増加させるという考えであった２１。ＶＰＭ１００２を接種したＢＡＬＢ／ｃマウスは、親株と比較して結核菌の負荷量が０．５〜１．０  ｌｏｇ１０減少した２１、２２；しかし、このような防御の改善はモルモットモデルでは観察されなかった２３。弱毒結核菌はＢＣＧよりも、結核菌の臨床株と、より多くの抗原を共有する可能性があるという理由で、結核菌のｐｈｏＰ欠失変異体株をワクチン候補として評価した２４。結核菌ΔｐｈｏＰは、結核菌負荷に対して、マウスではＢＣＧと同様の防御を示したが、モルモットではより優れた防御を示した２４、２５。安全性を確実にするために、ｆａｄＤ２６を欠失させて、結核菌ΔｐｈｏＰをさらに弱毒化させ（ＭＴＢＶＡＣ）、その株はＳＣＩＤマウスにおいてＢＣＧ−ＰａｓｔｅｕｒまたはＢＣＧ−Ｄａｎｉｓｈに匹敵する安全性プロファイルを示した２６。
【発明の概要】
【０００５】
発明の概要
本発明は、ｐｈｏＰ−ｐｈｏＲの二成分制御系を過剰発現する組換えマイコバクテリア株を含む、結核ワクチンを提供する。現行のＢＣＧワクチン株の免疫原性は、宿主において、結核に対して最適な防御を誘導するのに十分ではない。対照的に、ｐｈｏＰ−ｐｈｏＲを過剰発現する本発明の遺伝子改変されたＢＣＧ株は、より免疫原性が高く、結核に対してより優れた防御を提供する。ＰｈｏＰ−ＰｈｏＲに制御される遺伝子またはたんぱく質の２倍の（またはそれを超える）誘導を引き起こすのに十分なレベルでｐｈｏＰ−ｐｈｏＲを過剰生産する、任意の遺伝子改変されたマイコバクテリアが、本発明の実施において有利に使用され得る。本発明の組換えマイコバクテリアが哺乳動物の宿主に投与されると、ＣＤ４Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの生産が宿主において増加し、当該組換えマイコバクテリアは結核に対する防御を提供する。
【０００６】
ヒトにおいて様々なＢＣＧ株により誘導される免疫応答を比較した研究は、十数回を超えて行われている１４、２７。しかしながら、これらの研究の大多数に含まれていたのは２つ〜３つのＢＣＧ株のみであった。ＢＣＧ株の選択、予防接種時の年齢、および集団の大きさなどの研究デザインの違いにより、決定的な結果は得られていない１４。とはいえ、これらのうちの最大の研究（１９７０年代にＷＨＯにより主導された）では、小児において、１１個のＢＣＧ株を比較した２８。ＢＣＧ−Ｐｒａｇｕｅは、ＢＣＧ−Ｄａｎｉｓｈ、−Ｐａｓｔｅｕｒ、−Ｇｌａｘｏ、−Ｊａｐａｎ、−Ｒｕｓｓｉａ、および−Ｍｏｒｅａｕを含む他のＢＣＧ株よりも、低いツベルクリン反応性を示す異常値であることが判明した２８、２９。その低い免疫原性に対する懸念により、３０年近く使用された後の１９８１年にチェコスロバキアでＢＣＧ−Ｒｕｓｓｉａに置き換えられた３０。ＢＣＧ−Ｐｒａｇｕｅのツベルクリン反応性が低い理由は、不明のままである。しかしながら、本発明者は、ＢＣＧ−ＰｒａｇｕｅのｐｈｏＰが偽遺伝子であり、Ｃ末端ＤＮＡ結合ドメインを破壊する１ｂｐの挿入を含むことを見出した９。他の全てのＢＣＧ株は野生型（ＷＴ）ｐｈｏＰを含有するため、この変異はＢＣＧ−Ｐｒａｇｕｅに特異的である。ＰｈｏＰはＰｈｏＰーＰｈｏＲ二成分系の応答制御因子であり、サブユニットワクチンの構築に使用されてきた２つのＴ細胞抗原（Ａｇ８５Ａ、ＰＰＥ１８）を含む、結核菌における４０を超える遺伝子を正に制御する１６、３１。このように、本発明者は、ＢＣＧ−Ｐｒａｇｕｅの低い免疫原性はｐｈｏＰ変異の結果であり９、ＢＣＧにおけるｐｈｏＰの過剰発現は免疫原性を高め、それ故予防効果を高めるための有効な手段を提供し得ると仮定した。一貫して、本発明者は、国際公開第２０１１／１３０８７８Ａ１号において、ＷＴ  ｐｈｏＰによるＢＣＧ−Ｐｒａｇｕｅの補完、またはＢＣＧーＪａｐａｎにおけるｐｈｏＰの過剰発現が、ＩＦＮ−γの生産を増加させることを示した。
【０００７】
本発明は、ＢＣＧ−ＪａｐａｎなどのＢＣＧ株における、ｐｈｏＰ−ｐｈｏＲの過剰発現がその免疫原性および予防効果を高めたという本発明者の発見に基づいており、これがＢＣＧを改善するための一般的に適用可能なアプローチであり得ることを示唆する。本発明において、組換え株ｒＢＣＧ−Ｊａｐａｎ／ＰｈｏＰＲによるＣ５７ＢＬ／６マウスのワクチン接種が、親ＢＣＧに比べて、ＣＤ４Ｔ細胞によるより高いレベルのＩＦＮ−γ生産を誘導することが証明された。ｒＢＣＧ−Ｊａｐａｎ／ＰｈｏＰＲをワクチン接種したモルモットは、マイコバクテリウム・ツベルクローシスによる負荷に対してより優れた防御を受け、親ＢＣＧで免疫した動物と比較して、有意に長い生存期間、低減された細菌負荷量、およびより軽度の病態を示した。まとめると、ｐｈｏＰ−ｐｈｏＲを過剰発現する本発明の組換えＢＣＧは、現行のＢＣＧよりも、結核に対する防御が強化されることが確認された。
【０００８】
ＰｈｏＰの例示的なアミノ酸配列は、図１Ａ［配列番号１］に提示しており、ＰｈｏＰをコードする例示的なヌクレオチド配列は、図１Ｂ［配列番号２］に提示している。ＰｈｏＲの例示的なアミノ酸配列は、図１Ｃ［配列番号３］に提示しており、ＰｈｏＲをコードする例示的なヌクレオチド配列は、図１Ｄ［配列番号４］に提示している。これらの配列は、パスツール研究所（Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｄｂ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＷｅｂＯｂｊｅｃｔｓ／ＧｅｎｏＬｉｓｔ）で入手可能なゲノム配列に示されているように、ＢＣＧ−Ｐａｓｔｅｕｒ由来のＰｈｏＰおよびＰｈｏＲを表す。
【０００９】
本発明は、ＰｈｏＰ［配列番号１；配列番号２］およびＰｈｏＲ［配列番号３；配列番号４］をコードするＤＮＡを過剰発現する、組換えマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧに関する。
【００１０】
本発明は、過剰発現することができる核酸であって、ＰｈｏＰ［配列番号１；配列番号２］およびＰｈｏＲ［配列番号３；配列番号４］をコードする核酸を含む、組換えマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧに関する。
【００１１】
一実施形態において、組換えマイコバクテリウム・ボビス―ＢＣＧ株は、マイコバクテリウム・ボビス−ＢＣＧ−Ｒｕｓｓｉａ、マイコバクテリウム・ボビス−ＢＣＧ−Ｍｏｒｅａｕ、マイコバクテリウム・ボビス−ＢＣＧ−Ｊａｐａｎ、マイコバクテリウム・ボビス−ＢＣＧ−Ｓｗｅｄｅｎ、マイコバクテリウム・ボビス−ＢＣＧ−Ｂｉｒｋｈａｕｇ、マイコバクテリウム・ボビス−ＢＣＧ−Ｐｒａｇｕｅ、マイコバクテリウム・ボビス−ＢＣＧ−Ｇｌａｘｏ、マイコバクテリウム・ボビス−ＢＣＧ−Ｄｅｎｍａｒｋ、マイコバクテリウム・ボビス−ＢＣＧ−Ｔｉｃｅ、マイコバクテリウム・ボビス−ＢＣＧ−Ｆｒａｐｐｉｅｒ、マイコバクテリウム・ボビス−ＢＣＧ−コンノート、マイコバクテリウム・ボビス−ＢＣＧ−Ｐｈｉｐｐｓ、マイコバクテリウム・ボビス−ＢＣＧ−Ｐａｓｔｅｕｒ、およびマイコバクテリウム・ボビス−ＢＣＧ−Ｃｈｉｎａからなる群から選択される。
【００１２】
加えて、本発明の組換えマイクバクテリアは、ＢＣＧの株に限定される必要はない。当業者であれば、結核菌の弱毒株を含む、他のマイコバクテリア株も使用できることを、認識するであろう。
【００１３】
さらに別の実施形態において、本発明のワクチンは、サブユニットワクチンまたはＤＮＡワクチンであってよい。いくつかの実施形態において、ワクチンは、肺病原菌を介して送達されるであろう。例えば、ＰｈｏＰおよびＰｈｏＲをコードするＤＮＡ配列は、弱毒緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、または他の既知の弱毒真菌もしくはウイルスなどの、肺病原菌の染色体または染色体外核酸に含まれ得る。あるいは、ＰｈｏＰおよびＰｈｏＲレギュロンをコードする核酸は、当業者に知られている他の手段によって、例えば、リポソーム、アデノウイルスなどを介して、送達され得る。
【００１４】
本発明の別の局面は、過剰発現することができる核酸であって、ＰｈｏＰ［配列番号１；配列番号２］およびＰｈｏＲ［配列番号３；配列番号４］をコードする核酸を含む、生組換えマイコバクテリウム・ボビス―ＢＣＧ株を含む、医薬組成物である。
【００１５】
本発明のさらなる局面において、過剰発現することができる核酸であって、ＰｈｏＰ［配列番号１；配列番号２］およびＰｈｏＲ［配列番号３；配列番号４］をコードする核酸を含む、生組換えマイコバクテリウム・ボビス―ＢＣＧ株を含む、マイコバクテリアによる負荷に対する、哺乳動物の治療または予防のための、ワクチンまたは免疫原性組成物がある。
【００１６】
本発明の別の局面は、本発明のワクチンまたは免疫原性組成物を、哺乳動物に投与することを含む、マイコバクテリウム・ツベルクローシスまたはマイコバクテリウム・ボビスによる負荷に対する、哺乳動物の治療または予防のための方法に関する。一実施形態において、哺乳動物はウシ（ｃｏｗ）である。別の実施形態において、哺乳動物はヒトである。さらに別の実施形態において、ワクチンまたは免疫原性組成物は、アジュバントの存在下で投与される。
【００１７】
本発明のさらなる局面は、本発明のワクチンまたは免疫原性組成物を哺乳動物に投与することを含む、癌に対する哺乳動物の治療または予防のための方法である。一実施形態において、癌は膀胱癌である。別の実施形態において、ワクチンまたは免疫原性組成物は、アジュバントの存在下で投与される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ＰｈｏＰ−ｐｈｏＲ配列を示している。（ａ）ＢＣＧ−ＰａｓｔｅｕｒのＰｈｏＰのアミノ酸配列；（ｂ）ＢＣＧ−ＰａｓｔｅｕｒのｐｈｏＰのＤＮＡ配列。（ｃ）ＢＣＧ−ＰａｓｔｅｕｒのＰｈｏＲのアミノ酸配列；（ｄ）ＢＣＧ−ＰａｓｔｅｕｒのｐｈｏＲのＤＮＡ配列。
【００１９】
【図２】図２は、クローニングベクターｐＭＥを示している。
【００２０】
【図３】図３は、構築された、ｐｈｏＰおよびｐｈｏＰ−ｐｈｏＲについての発現ベクターを示している。
【００２１】
【図４】図４は、ｒＢＣＧ−Ｊａｐａｎ／ＰｈｏＰＲが、親ＢＣＧよりも、ＣＤ４Ｔ細胞によるより多くのＩＦＮ−γ生産を誘導することを、示している。
【００２２】
【図５】図５は、ｒＢＣＧ−Ｊａｐａｎ／ＰｈｏＰＲが、結核菌に感染したモルモットの生存期間を延長させることを、示している。
【００２３】
【図６】図６は、ｒＢＣＧ−Ｊａｐａｎ／ＰｈｏＰＲが、結核菌に感染したモルモットの肺の病態を軽減させることを、示している。
【００２４】
【図７】図７は、ｒＢＣＧ−Ｊａｐａｎ／ＰｈｏＰＲが、ＳＣＩＤマウスにおいて安全であることを、示している。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
ＴＢに対する防御には細胞性免疫が必要であり、これは完全には理解されていないが、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞を含む複数の成分を包含する１６、３２、３３。ＢＣＧは、ヘルパーＴ細胞１（Ｔｈ１）型応答を誘導し、主にＣＤ４Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ生産を誘導する３４。伝統的に、ＢＣＧの免疫原性は、ワクチン接種前にツベルクリン陰性であった小児において、ワクチンによって誘導されるツベルクリン（ＰＰＤ、結核菌の精製たんぱく体）感受性を測定することによって決定された３０。ツベルクリン反応性は、防御の代替的指標としてのその使用が近年疑問視されている一方で３５、３６、細胞性免疫応答のためのインビボアッセイおよび免疫原性のためのマーカーとして、使用され続けている１９、３７。これを支持して、ＢＣＧワクチンを接種した乳児におけるツベルクリン反応性とＰＰＤ特異的ＩＦＮ−γレベルの間には強い関連がある３８。さらに、ツベルクリン反応性およびＩＦＮ−γ生産は、若年者における抗ＴＢ免疫の非重複（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）で補完的な指標であることが見出された３９。１９７０年代の研究では、ＢＣＧ−Ｐｒａｇｕｅが、試験した他の１０個のＢＣＧ株よりも、小児およびモルモットで有意に低いツベルクリン反応性を一貫して示すことがわかった２８、２９。その低い免疫原性に対する懸念により、３０年近く使用された後の１９８１年にチェコスロバキアでＢＣＧ−Ｒｕｓｓｉａに置き換えられた３０。
【００２６】
ＢＣＧ−Ｐｒａｇｕｅのツベルクリン反応性が低減した理由は、不明である。本発明者らの以前の研究９で発見したＢＣＧ−ＰｒａｇｕｅのｐｈｏＰ変異が、その免疫原性の低減に寄与していると、本発明者は仮定した。
【００２７】
この仮説を調べるために、最初にインタクトなｐｈｏＰ遺伝子でＢＣＧ−Ｐｒａｇｕｅを補完し、免疫原性に対するその効果を決定した。ＢＣＧ−Ｐａｓｔｅｕｒ由来のＷＴ  ｐｈｏＰ遺伝子を、マルチコピーシャトルベクターｐＭＥにクローニングし、ＢＣＧ−Ｐｒａｇｕｅに導入した（ｒＢＣＧ−Ｐｒａｇｕｅ／ＰｈｏＰ）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、組換えＢＣＧ−Ｐｒａｇｕｅ株をワクチン接種して、ＰＰＤ特異的ＩＦＮ−γの生産をＥＬＩＳＡにより測定した。一貫して、ｒＢＣＧ−Ｐｒａｇｕｅ／ＰｈｏＰは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、より高いレベルのＰＰＤ特異的ＩＦＮ−γの放出を誘導し、これは親株で免疫されたマウスの約２．４倍であった（図４ａ、ｐ＜０．０５）。
【００２８】
ｐｈｏＰの過剰発現が、ＢＣＧ免疫原性を改善するための一般的に適用可能な方法として使用できるかどうかを試験するために、別のＢＣＧ株、ＢＣＧ−Ｊａｐａｎにおいて、ｐｈｏＰを過剰発現する組換えＢＣＧを構築し、ｒＢＣＧーＪａｐａｎ／ＰｈｏＰを作製した。ＰｈｏＲは、未知の細胞外シグナルを感知してＰｈｏＰをリン酸化するヒスチジンキナーゼである３１。ＢＣＧ−Ｊａｐａｎはそのゲノム中に共転写されるインタクトなｐｈｏＰーｐｈｏＲを有するため、この二成分系の機能比を維持するために、ｐｈｏＰおよびｐｈｏＲの両方を過剰発現する、ｒＢＣＧーＪａｐａｎ／ＰｈｏＰＲも作製した。
【００２９】
ＢＣＧ−Ｐｒａｇｕｅで得られた結果と一致して、ｒＢＣＧ−Ｊａｐａｎ／ＰｈｏＰおよびｒＢＣＧーＪａｐａｎ／ＰｈｏＰＲは両方とも、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、親株よりも有意に高いレベルのＰＰＤ特異的ＩＦＮ−γの生産を誘導した（図４ｂ）。興味深いことに、３つの株のうち、ｒＢＣＧ−Ｊａｐａｎ／ＰｈｏＰＲが最も高いレベルのＩＦＮ−γを誘導した。
【００３０】
組換えＢＣＧ株によって誘導されたＩＦＮ−γの起源を決定するために、細胞内サイトカイン染色およびＦＡＣＳ解析も行った。ＣＤ４Ｔ細胞が、ＩＦＮ−γ放出の増強の原因である可能性が高いことを本発明者らは見出した（図４ｃ）。ｒＢＣＧ−Ｊａｐａｎ／ＰｈｏＰＲをワクチン接種したマウスにおけるＩＦＮ−γ生産ＣＤ４Ｔ細胞の頻度は、親株をワクチン接種したマウスの約３．５倍であり、これは、これらの２つのグループ間の全ＩＦＮ−γ生産の倍率差（約２．６倍）と一致する（図４ｂ、ｃ）。
【００３１】
対照的に、どちらの組換えＢＣＧ−Ｊａｐａｎ株も、偽免疫化コントロールと比較して、強いＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導しなかった。組換えＢＣＧ−Ｊａｐａｎ株による他のサイトカイン（ＩＬ−２、ＴＮＦ、ＩＬ−１２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１０）の有意な誘導は検出されなかった。
【００３２】
まとめると、これらの結果は、ｐｈｏＰ変異が、ＢＣＧ−Ｐｒａｇｕｅの低い免疫原性の原因の一部であることを示唆している。さらに重要なことに、ＢＣＧ−ＪａｐａｎにおけるｐｈｏＰ−ｐｈｏＲの過剰発現が、さらにＣＤ４Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ生産をブーストしたが、このことは、これがＢＣＧの予防効果を高めるための一般的に適用可能なアプローチであり得ることを示唆している。
【００３３】
ｐｈｏＰ−ｐｈｏＲの過剰発現が結核菌感染に対するＢＣＧ媒介防御を改善するかどうかを調べるために、本発明者らは長期（１０ヶ月）のモルモット生存実験を行った。モルモット（１グループ当たり１１匹）にｒＢＣＧ−Ｊａｐａｎ／ＰｈｏＰＲ、親株、またはＰＢＳを接種し、ワクチン接種後８週間で、１，０００ＣＦＵ／肺の結核菌Ｈ３７Ｒｖを、噴霧により負荷した。モルモットを、人道的なエンドポイントで安楽死させ、カプラン・マイヤー分析を用いて生存曲線をプロットした。
【００３４】
ＰＢＳ、親、およびｒＢＣＧーＪａｐａｎ／ＰｈｏＰＲグループの生存期間中央値は、それぞれ１８、２７、および３９週間であった（図５ａ）。ログランク解析により、ｒＢＣＧ−Ｊａｐａｎ／ＰｈｏＰＲグループは親ＢＣＧグループ（ｐ＜０．０５）およびＰＢＳグループ（ｐ＜０．０００１）よりも、有意に長く生存したことが明らかになった。親グループはまた、ＰＢＳグループよりも、有意に長く生存した（ｐ＜０．０１）。
【００３５】
ワクチン未接種のモルモットと比較して、親ＢＣＧはモルモットの生存を９週間延長し、一方ｒＢＣＧ−Ｊａｐａｎ／ＰｈｏＰＲはモルモットの生存を２１週間延長した（親グループに対して１３３％の改善）。実験終了後の負荷後４３週目では、親グループでは１匹のモルモットのみが生き残ったのに対して、ｒＢＣＧーＪａｐａｎ／ＰｈｏＰＲグループでは４匹のモルモットが生き残った。ＰＢＳグループの全てのモルモットは２５週目までに感染に屈した。
【００３６】
さらに、モルモットを、人道的または実験的なエンドポイントで安楽死させた後に、モルモットの肺および脾臓を、さらに解析した。以前の観察と同様に、ｒＢＣＧ−Ｊａｐａｎ／ＰｈｏＰＲグループは、肺において、親ＢＣＧグループよりも約１．７ｌｏｇ１０少ない結核菌の数であった（図５ｂ、ｐ＜０．０５）。ＢＣＧ−Ｊａｐａｎ／ＰｈｏＰＲグループの脾臓における、結核菌の負荷量もまた、親ＢＣＧグループよりも約１．０ｌｏｇ１０少なく、この差は、ほぼ有意に近い（ｐ＝０．０６６）。一貫して、ｒＢＣＧ−Ｊａｐａｎ／ＰｈｏＰＲグループは、他の２つのグループと比較して、肺および脾臓の重量が最も低かった（図５ｄ、ｅ）。
【００３７】
５匹のモルモットの肺を、組織学的解析に供した。それら５匹には、人道的なエンドポイントに達した、各グループから１匹のモルモットが含まれ、４３週目の、親グループの唯一の生存動物、およびｒＢＣＧ−Ｊａｐａｎ／ＰｈｏＰＲグループの４匹の生存動物のうち１匹が含まれる。興味深いことに、モルモットの死亡は、下葉（ｃａｕｄａｌ  ｌｏｂｅ）の組織損傷の程度と関連しているようであった。実験終了前に安楽死させた３匹のモルモットは、上葉（Ｃｒａｎｉａｌ  ｌｏｂｅ）の大規模な硬化（ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｉｏｎ）に加えて、下葉の大規模な硬化（図６ａ）または部分的な硬化（図６ｂ、ｃ）を有していた。対照的に、親グループ由来の１匹も上葉に大規模な組織損傷があったという事実にもかかわらず、２匹の生存動物は下葉では健康な組織を有しているように見えた（図６ｄ）。驚くべきことに、ｒＢＣＧ−Ｊａｐａｎ／ＰｈｏＰＲグループの生存動物は、いずれの肺葉においても正常な肺を有し、肺の硬化は見られなかった（図６ｅ）。
【００３８】
ＰｈｏＰは、結核菌の病原性因子であると考えられており２４、その理由の一つは、ＰｈｏＰが、結核菌の病原性の重要なエフェクターである、ＥｓｘＡの分泌を正に制御することにある４０。従って、ＢＣＧにおけるｐｈｏＰ−ｐｈｏＲの過剰発現は、病原性を高め、安全性を危うくし得る。一方で、ｅｓｘＡはすべてのＢＣＧ株のゲノムに存在しないｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  １（ＲＤ１）の一部であるため１２、ｐｈｏＰ−ｐｈｏＲの過剰発現がＢＣＧの病原性に寄与する程度は不明のままである。
【００３９】
これに対処するために、最初にＳＣＩＤマウスに組換えＢＣＧ−Ｊａｐａｎ株を感染させ、最大６週間、標的臓器中の細菌増殖をモニターした。興味深いことに、実験の過程で、肺または脾臓におけるｒＢＣＧ−Ｊａｐａｎ／ＰｈｏＰＲと親ＢＣＧとの増殖の間に有意差はなかった（図７ａ、ｂ）。しかしながら、ｐｈｏＰ単独の過剰発現は、親株およびｒＢＣＧーＪａｐａｎ／ＰｈｏＰＲの両方と比較して、ＳＣＩＤマウスにおけるＢＣＧーＪａｐａｎの複製を、増加させた。
【００４０】
次に、長期間ＳＣＩＤマウス生存実験を行った。ＢＣＧ株の中で最も毒性が高い株である、ＢＣＧ−Ｐａｓｔｅｕｒ４１もまた、比較のために本実験に含めた。ＢＣＧ−Ｐａｓｔｅｕｒ、ｒＢＣＧ−Ｊａｐａｎ／ＰｈｏＰ、およびｒＢＣＧ−Ｊａｐａｎ／ＰｈｏＰＲで感染させたＳＣＩＤマウスの生存期間中央値は、それぞれ、７週間、１４週間、および１９週間であった（図７ｃ）。親株またはＰＢＳで感染させた全てのＳＣＩＤマウスは、実験を終了させた時点である２０週目まで生存した。ログランク解析により、ｒＢＣＧ−Ｊａｐａｎ／ＰｈｏＰＲグループ（ｐ＝０．０２）や親グループ（ｐ＜０．００１）と比較して、ｒＢＣＧ−Ｊａｐａｎ／ＰｈｏＰグループの生存期間が有意に短縮されたことが明らかになり、短期間感染実験において、本グループで見られた高い細菌負荷量と一致している（図７ａ、ｂ）。ＢＣＧ−Ｊａｐａｎ／ＰｈｏＰＲグループはまた、親グループと比較して生存期間の短縮を示した（Ｐ＝０．０２）。重要なことに、ＳＣＩＤマウスでは、ｒＢＣＧーＪａｐａｎ／ＰｈｏＰＲおよびｒＢＣＧーＪａｐａｎ／ＰｈｏＰの両方が、ＢＣＧーＰａｓｔｅｕｒよりも有意に毒性が低かった（ｐ＜０．００１）。まとめると、これらの結果は、ＢＣＧ−ＪａｐａｎにおけるｐｈｏＰ−ｐｈｏＲの過剰発現はＳＣＩＤマウスにおいてその複製を増加させず、病原性の中程度の増加のみを引き起こすことを示唆している。
【００４１】
まとめると、本発明者らは、ｐｈｏＰ−ｐｈｏＲを過剰発現する組換えＢＣＧが、結核に対する防御を強化することを実証した。ｒＢＣＧ−Ｊａｐａｎ／ＰｈｏＰＲの優れた防御が、モルモットにおいて証明され、これは動物モデルにおいて新規ワクチンを試験するための証明（ｈａｌｌｍａｒｋ）である、有意に延長された生存期間および軽減された病態によって証明された。モルモットは、ＴＢワクチンの効果を試験するための、「ゴールドスタンダード」動物モデルである２０。疾患の病態形成、病理学的病変およびＢＣＧワクチン接種への応答は、ヒトで記述されたものに類似している。
【００４２】
新規ＴＢワクチン候補は、発見段階から前臨床開発へ進むための基準を満たさなければならないというコンセンサスがある。これらの基準には、確立された動物モデルにおける、ＩＦＮ−γの強力な誘導、ＢＣＧよりも優れた予防効果、およびＢＣＧに匹敵する安全性プロファイルが含まれる４２。ｒＢＣＧ−Ｊａｐａｎ／ＰｈｏＰＲ株は、すでにこれらの基準を満たしており、したがって、将来の臨床開発のための有望な候補である。
【００４３】
マイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ（Ｍ．Ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ）はまた、膀胱癌の治療にも使用される。多数のランダム化比較臨床試験は、ＢＣＧの膀胱内投与が腫瘍の再発を予防するか、または遅らせることができることを示している４３。ＢＣＧがいかにしてこの効果を発揮するかの詳細は、まだ特定されていない。しかしながら、抗腫瘍反応は、インタクトなＴ細胞応答を必要とし、Ｔｈ１型サイトカインの発現の増加を包含する４４。このように、Ｔｈ１サイトカインＩＦＮ−γの増加を示すｒＢＣＧ−Ｊａｐａｎ／ＰｈｏＰＲなどのＢＣＧ株は、抗腫瘍活性を増強する可能性がある。
【００４４】
要約すると、本発明者らはＴＢや他のマイコバクテリアの感染を防ぐために、ｐｈｏＰーｐｈｏＲを過剰発現する組換えＢＣＧ株を、ワクチンとして使用する。これらの組換えＢＣＧワクチンは、結核に対するより優れた防御免疫を誘導する。
【００４５】
本発明の遺伝子改変された（すなわち、組換え）マイコバクテリアにおいて、ＰｈｏＰおよびＰｈｏＲたんぱく質が過剰発現される。すなわち、これらの２つのたんぱく質が、ＰｈｏＰおよびＰｈｏＲを過剰発現するように遺伝子改変されていない同じマイコバクテリアなどの、好適なコントロール生物を超えるレベルで、発現される。当業者であれば、たんぱく質活性の比較測定、およびそれらの測定のための好適なスタンダードおよびコントロールの使用に精通しているであろう。
【００４６】
マイコバクテリアにおける、ＰｈｏＰおよびＰｈｏＲたんぱく質の過剰発現は、当業界で知られている任意の好適な方法により実施され得る。一般に、該方法は、ＰｈｏＰおよびＰｈｏＲたんぱく質をコードする核酸配列を、本来ｐｈｏＰおよびｐｈｏＲ遺伝子に連結していない発現制御配列に連結することを包含するであろう。当業者であれば、多くのこれらの発現制御配列が公知であること、および本発明における使用に好適であろうことを認識するであろう。例えば、ｐｈｏＰおよびｐｈｏＲ遺伝子の構成的発現が望まれる場合、発現制御配列（例えば、プロモーターおよび関連配列）は、限定されるものではないが、以下のものを含む：マイコバクテリア最適プロモーター：ｈｓｐ６５、ａｃｅまたはｍｓｐ １２プロモーター、Ｔ７プロモーターなど。あるいは、ｐｈｏＰおよびｐｈｏＲの過剰発現は、誘導性であってよく、例えば、テトラサイクリン誘導性プロモーター下であってよい。
【００４７】
本発明に従いコードされるたんぱく質、ポリペプチド、もしくはペプチドには、天然のたんぱく質、ポリペプチド、もしくはペプチド、または天然のたんぱく質、ポリペプチド、もしくはペプチドと同じ機能を有するこれらのホモログが含まれる。これらのホモログには、天然のたんぱく質、ポリペプチド、もしくはペプチドのアミノ酸配列、例えば、配列番号１および配列番号３に示されるアミノ酸配列に、少なくとも６０％、好ましくは約７０％以上、８０％以上、および最も好ましくは９０％以上、例えば、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有する、たんぱく質、ポリペプチド、もしくはペプチドが含まれる。これらのホモログには、天然のたんぱく質、ポリペプチド、もしくはペプチドのアミノ酸配列（例えば、配列番号１および配列番号３に示されるアミノ酸配列）において、１つ以上（例えば、１〜５０、１〜２０、１〜１０、１〜５個）のアミノ酸残基の置換、付加、および欠失を有する、たんぱく質、ポリペプチド、もしくはペプチドが含まれる。これらのホモログには、特に、保存アミノ酸置換を有する、たんぱく質、ポリペプチド、もしくはペプチドが含まれる。
【００４８】
本明細書で用いられる、「ＰｈｏＰ」および「ＰｈｏＲ」という用語は、二成分制御系 ＰｈｏＰ−ｐｈｏＲを指す。ＰｈｏＰは応答制御因子であり、ＰｈｏＲはヒスチジンキナーゼである。本発明に従いコードされるＰｈｏＰまたはＰｈｏＲには、例えば、マイコバクテリウム属由来の、好ましくはマイコバクテリウム・ツベルクローシス、またはマイコバクテリウム・ボビス由来の、天然の、機能的ＰｈｏＰおよびＰｈｏＲ、または、上述したそれらのホモログが含まれる。ＰｈｏＰおよびＰｈｏＲの例示的なアミノ酸配列は、図１ａの配列番号１および図１ｃの配列番号３に、提示されている。
【００４９】
本明細書で使用される「過剰発現する（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓ）」、「過剰発現している（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ）」または「過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」という用語は、組換えバクテリアで発現される標的遺伝子のたんぱく質レベルが、組換えされていない最初のバクテリアで発現される同じたんぱく質のレベルよりも高いことを指す。例えば、組換えバクテリアで発現される目的のたんぱく質は、非組換えバクテリアの、１．１倍、１．５倍、２倍、４倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍以上である。過剰発現は、マルチコピープラスミドの使用および／または強力なプロモーターの使用などの、遺伝子操作によって実施することができる。
【００５０】
核酸分子のバリエーション
修飾
本出願で開示される核酸分子ＤＮＡ配列には、多くの修飾がなされてもよく、このことは、当業者には明らかであろう。本発明には、本出願で開示されているたんぱく質またはペプチドと同じ機能を有するたんぱく質またはペプチドを、細菌または哺乳動物細胞においてコードする、本出願で開示される配列（またはその断片）のヌクレオチド修飾が含まれる。修飾には、１つ以上の（例えば、１〜５０、１〜２０、１〜１０、１〜５個の）ヌクレオチドの置換、挿入、もしくは欠失、または、１つ以上の（例えば、１〜５０、１〜２０、１〜１０、１〜５個の）ヌクレオチドの相対的位置もしくは順序の変更が含まれる。
【００５１】
核酸分子は、ＰｈｏＰおよびＰｈｏＲたんぱく質における保存的アミノ酸変化をコードし得る。本発明は、ＰｈｏＰおよびＰｈｏＲたんぱく質において、保存的アミノ酸変化をコードし、サイレントアミノ酸変化を生み出す、機能的に同等な核酸分子を含む。経験的に保存アミノ酸置換基を特定するための方法は当業界において周知である（例えば、Wu, Thomas D. “Discovering Emperically Conserved Amino Acid Substitution in Databases of Protein Families” （http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=8877523&dopt=Abstract）を参照されたい）。
【００５２】
核酸分子は、ｐｈｏＰおよび／またはｐｈｏＲ遺伝子における、非保存的アミノ酸置換、付加または欠失をコードし得る。本発明には、ＰｈｏＰおよびＰｈｏＲたんぱく質のアミノ酸配列内に、非保存的アミノ酸変化を生じさせる、機能的に同等な核酸分子が含まれる。機能的に同等な核酸分子には、非保存的アミノ酸置換（好ましくは、化学的に類似したアミノ酸の置換）、付加、または欠失を有するが、本出願で開示されるＰｈｏＰおよびＰｈｏＲたんぱく質またはペプチドと同じ、または類似の機能を保持する、ペプチド、ペプチドおよびたんぱく質をコードする、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。本発明には、ＰｈｏＰおよびＰｈｏＲたんぱく質の断片または変異体をコードする、ＤＮＡまたはＲＮＡが含まれる。
【００５３】
該断片は、免疫原として有用であり、免疫原性組成物に含まれる。
【００５４】
これらの断片および変異体のＰｈｏＰおよびＰｈｏＲ様活性は、以下に記載のアッセイにより特定する。
【００５５】
配列同一性
本発明の核酸分子にはまた、本発明の核酸分子と、少なくとも約６０％の同一性、少なくとも７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または最も好ましくは、少なくとも９９％または９９．５％の同一性を有する核酸分子（またはその断片）であって、細菌または哺乳動物細胞において、核酸分子の発現が可能である核酸分子が含まれる。同一性とは、最高位の一致が得られるように整列された、２つのヌクレオチド配列の類似性を指す。同一性は、当業界で公知の方法に従い、計算される。例えば、ヌクレオチド配列（「配列Ａ」と呼ぶ）が配列番号２の一部と９０％の同一性を有する場合、配列Ａは、配列番号２の参照部分のヌクレオチド１００個あたり、１０個の点変異（他のヌクレオチドによる置換など）を含み得ることを除いて、配列番号２の参照部分と同一であろう。
【００５６】
配列同一性（各構築物は、好ましくは、コード化核酸分子インサートを有さない）は、好ましくは、配列番号２で提供される配列またはその相補的配列に対して、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９６％の同一性、少なくとも９７％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または最も好ましくは、少なくとも９９％または９９．５％の同一性に、設定される。配列同一性は、好ましくは、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ウィスコンシン大学）のＧＣＧプログラムで、計算されるであろう。他のプログラムもまた、配列同一性を計算する上で、利用可能である。例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラム（好ましくは、デフォルトパラメータ使用；Thompson, JD et al., Nucleic Acid Res. 22: 4673-4680）、ＢＬＡＳＴ  Ｐ、ＢＬＡＳＴ  Ｘアルゴリズム、ゲノム研究所（Ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）でのマイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ）のＢＬＡＳＴＮ（ｈｔｔｐ：ｔｉｇｒｂｌａｓｔ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／）、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅでのマイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｂｏｖｉｓ）、マイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ（Ｍ．Ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ）  （Ｐａｓｔｕｅｒ）、マイコバクテリウム・マリヌム（Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ）、ライ菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のＢＬＡＳＴＮ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｐｒｏｊｅｃｔｓ／Ｍｉｃｒｏｂｅｓ／）、パスツール研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｐａｓｔｅｒｕｒ）での結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のＢＬＡＳＴ検索（Ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｓｔ）（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｌｉｓｔ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ＴｕｂｅｒｃｕＬｉｓｔ／）、パスツール研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｐａｓｔｅｒｕｒ）でのライ菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）のＢＬＡＳＴ検索（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｌｉｓｔ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／Ｌｅｐｒｏｍａ／）、ミネソタ大学微生物ゲノムプロジェクトでのヨーネ菌（Ｍ．Ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のＢＬＡＳＴＮ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｃ．ｕｍｎ．ｅｄｕ／ＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｊｅｃｔｓ／Ｐｔｂ／およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｃ．ｕｍｎ．ｅｄｕ／ＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｊｅｃｔｓ／ＡＧＡＣ／Ｍｐｔｂ／Ｍｐｔｂｈｏｍｅ．ｈｔｍｌ）、米国の国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）での様々なＢＬＡＳＴ検索（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）、およびＧｅｎｏｍｅＮｅｔ（化学研究所バイオインフォマティクスセンター）での様々なＢＬＡＳＴ検索（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／）が挙げられる。
【００５７】
遺伝暗号は縮重しているので、配列番号２および配列番号４の核酸配列は、ＰｈｏＰおよびＰｈｏＲ活性を有するポリペプチドをコードし得る唯一の配列ではない。本発明は、配列番号２および配列番号４に記載される核酸分子と同じ必須遺伝情報を有する核酸分子を含む。本出願に記載の配列と比較して１つ以上の核酸変化を有し、配列番号１および配列番号３に示されるポリペプチドの生産をもたらす核酸分子（ＲＮＡを含む）は、本発明の範囲内である。
【００５８】
ＰｈｏＰおよびＰｈｏＲたんぱく質をコードする核酸の、他の機能的等価形態は、従来のＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション技術を用いて単離することができる。
【００５９】
ハイブリダイゼーション
本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするために、本出願に記載される核酸分子に、十分な同一性を有する配列を有するＤＮＡを含む（ハイブリダイゼーション技術は、当業界で周知である）。本発明はまた、配列番号２および配列番号４の配列またはそれらの相補的配列の１つ以上にハイブリダイズする核酸分子も含む。これらの核酸分子は、好ましくは、高ストリンジェンシー条件下で、ハイブリダイズする（Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Most Recent Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照されたい）。高ストリンジェンシー洗浄は、好ましくは、低塩濃度（好ましくは約０．２％ＳＳＣ）および約５０〜６５℃の温度を有する。
【００６０】
ワクチン
生組換えワクチンの調製は、当業者に知られている。一般的には、これらのワクチンは、溶液または懸濁液のいずれかとして、注射用として調製される；注射前に液体に溶解または懸濁するのに好適な固体形態も、調製することができる。製剤は、乳化されてもよく、あるいは、該たんぱく質がリポソームに封入されてもよい。生きた免疫原性成分は、医薬的に許容され、かつ有効成分と適合する賦形剤と、しばしば混合される。好適な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせである。さらに、必要に応じて、ワクチンには湿潤剤や乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および／またはワクチンの効果を高めるアジュバントなどの補助物質が少量含まれ得る。有効であり得るアジュバントの例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルームラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ノル−ＭＤＰと呼ばれる）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれる）、およびＲＩＢＩ（２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０（商標）エマルジョン中に、微生物から抽出した３つの化合物である、モノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコレートおよび細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を含む）。
【００６１】
アジュバントの効果は、生組換えマイコバクテリウム・ボビス−ＢＣＧワクチン（これにも、様々なアジュバントが含まれている）の投与の結果生じる、マイコバクテリウム・ツベルクローシス抗原配列を含む免疫原性ポリペプチドに対する、抗体の量を測定することによって決定することができる。
【００６２】
ワクチンは、慣習的に、非経口的に注射により投与され、例えば、皮下にまたは筋肉内に投与される。他の投与様式に適したさらなる製剤には坐剤が含まれ、場合によっては経口製剤が含まれる。坐剤の場合、伝統的な結合剤および担体には、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドが含まれ得る；これらの坐剤は、０．５％〜１０％の範囲、好ましくは１％〜２％の範囲で有効成分を含有する混合物から形成され得る。経口製剤には、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの、通常使用される賦形剤が含まれる。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出製剤または散剤の形態をとり、１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％の有効成分を含む。
【００６３】
ワクチンは、剤形に適合する方法で、かつ、予防上および／または治療上有効となるような量で投与される。
【００６４】
ワクチンは、単回投与スケジュールで与えられてもよく、または好ましくは反復投与スケジュールで与えられてもよい。反復投与スケジュールは、ワクチン接種の初回のコースが１〜１０回の別々の投与であり、その後に免疫応答を維持および／または補強するために必要な時間間隔で与えられる他の投与が続き得るものであり、例えば、１〜４カ月で２回目の投与、また必要ならば、数ヶ月後にその後の投与が続く。投薬計画はまた、少なくとも一部は、個人のニーズによって決定されるであろうし、また、医師の判断に左右されるであろう。
【００６５】
加えて、生組換えマイコバクテリウム・ボビス−ＢＣＧワクチンは、他の免疫調節剤、例えば免疫グロブリンと共に、投与される。
【００６６】
本発明の対象はまた、上記のように規定された生組換えマイコバクテリウム・ボビスーＢＣＧワクチンと、別のワクチン、特に、上記のように規定された別の生組換えマイコバクテリウム・ボビス−ＢＣＧワクチン（これらのワクチンは異なる挿入配列を含む）とを、混合物として、または、混合されるべきものとして含む、多価ワクチン処方である。
【００６７】
医薬組成物
本発明の医薬組成物は、マイコバクテリウム・ツベルクローシスまたはマイコバクテリウム・ボビスによる負荷に対する、哺乳動物の治療または予防のために用いられる。本発明の医薬組成物はまた、変性疾患、障害または癌などの異常な身体状態を有する患者を治療するためにも用いられる。
【００６８】
医薬組成物は、錠剤、エアロゾル投与、気管内注入および静脈内注射などの方法により、ヒトまたは動物に投与することができる。
【実施例】
【００６９】
実施例１: クローニングベクターｐＭＥ
Ｔ７プロモーターを含むカナマイシン耐性シャトルベクターを、以下の通りに得た。ｐＤｒｉｖｅクローニングベクター（Ｑｉａｇｅｎから入手）をＥｃｏＲＩで切断し、自己連結させてｐＤＲＩを作製した。ｐＤＲ１をＳｓｐＩで消化し、１９０３ｐｂの断片産物を単離した。ｐＭＤ３１シャトルベクター(Wu et al., 1993, Molecular Microbiology, 7, 407-417)を、ＳｓｐＩで消化し、３３７９ｂｐ断片を単離した。２つのＳｓｐＩにより作製された断片を連結して、ｐＭＥ（５２８２ｂｐ）を作製した。これは、元のｐＤＲＩＶＥのＴ７プロモーターを含む。クローニングベクターｐＭＥを、図２に示している。
【００７０】
実施例２：ｐｈｏＰおよびｐｈｏＰ−ｐｈｏＲについての発現ベクターの構築
ｐｈｏＰおよびｐｈｏＰ翻訳開始部位の２５７ｂｐ上流領域を含む１０２８ｂｐ産物を、それぞれ、ＫｐｎＩおよびＰｓｔＩ制限酵素部位（下線部）を含む、フォワードプライマーｐｈｏＰ−Ｆ（５’−ＡＡＡＡＡＧＧＴＡＣＣＧＣＴＴＧＴＴＴＧＧＣＣＡＴＧＴＣＡＡＣ−３’）およびリバースプライマーｐｈｏＰ−Ｒ（５’−ＡＡＡＡＡＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＣＣＧＡＴＣＣＧＡＴＴＡＡＣＴＡＣ−３’）を用いて、ＰＣＲにより増幅した。これらの制限酵素部位を用いて、該ＰＣＲ産物を、シャトルベクターｐＭＥに連結させた（ｐＭＥ−ＰｈｏＰ）。同様に、ｐｈｏＰおよびｐｈｏＲ（並びに、２つの遺伝子の遺伝子間領域、ｐｈｏＰ開始コドンの１７７ｂｐ上流、およびｐｈｏＲ終止コドンの７８ｂｐ下流）を含有する２５０１ｂｐのＰＣＲ産物を、ｐＭＥにクローニングすることにより、ｐｈｏＰ−ｐｈｏＲオペロンを発現するベクター（ｐＭＥ−ＰｈｏＰＲ）を構築した。該ＰＣＲ産物は、ＢＣＧ−ＰａｓｔｅｕｒゲノムＤＮＡから、それぞれ、ＫｐｎＩおよびＰｓｔＩ部位（下線部）を含む、フォワードプライマーｐｈｏＰＲ−Ｆ（５’−ＡＡＡＡＡＧＧＴＡＣＣＧＧＴＣＧＣＡＡＴＡＣＣＣＡＣＧＡＧ−３’）およびリバースプライマーｐｈｏＰＲ−Ｒ（５’−ＡＡＡＡＡＣＴＧＣＡＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＴＴＴＣＧＧＣＴＴＴＧ−３’）を用いて、ＰＣＲにより増幅した。構築物を、ＤＮＡ配列決定により確認した。
【００７１】
構築物ならびに空のベクターｐＭＥを、別々にＢＣＧ−ＰｒａｇｕｅおよびＢＣＧ−Ｊａｐａｎにエレクトロポレーションした。組換えＢＣＧの作製は、以下の通りに達成した：Ｍ．ｂｏｖｉｓＢＣＧ−Ｊａｐａｎ（ＡＴＣＣ３５７３７）およびＭ．ｂｏｖｉｓＢＣＧ−Ｐｒａｇｕｅ（ＡＴＣＣ３５７４２）の細胞を、エレクトロポレーションによりプラスミドｐＭＥ−ＰｈｏＰまたはｐＭＥ−ＰｈｏＰＲで形質転換し、エレクトロポレーションした細胞を、１０％ＯＡＤＣ（Ｄｉｆｃｏ）および２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加した７Ｈ１１培地プレート上にプレーティングした。３７℃で４週間インキュベート後、個々のコロニーを選択し、１０％ＡＤＣ（Ｄｉｆｃｏ）および２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加した７Ｈ９液体培地で増殖した。この培地で３週間培養後、選択されたクローンからプラスミドＤＮＡを単離して、ＤＮＡ配列決定により確認した。続いて、１ｍｌの培養物を１ｍｌの５０％滅菌グリセロール溶液と混合することによって、組換えＢＣＧ株の冷凍ストックを作製し、−８０℃で保存した。
【００７２】
構築した、ｐｈｏＰおよびｐｈｏＰ−ｐｈｏＲについての発現ベクターを、図３に示す
【００７３】
実施例３:ｒＢＣＧ−Ｊａｐａｎ／ＰｈｏＰＲは、親ＢＣＧよりも、ＣＤ４Ｔ細胞によってより多くのＩＦＮ−γ生産を誘導する。
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、各実験内で週齢を一致させた（６週齢）。グループ当たり４匹のマウスに、０．２ｍｌ  ＰＢＳ／０．０１％  Ｔｗｅｅｎ８０中のおよそ５×１０４ＣＦＵのＢＣＧ株を、首筋に皮下接種した。コントロールマウスには、０．２ｍｌのＰＢＳ／０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０を与えた。８週間後に、マウスを安楽死させ、脾細胞を単離した。ＩＦＮ−γ生産の定量測定値は、ＯｐｔＥＩＡ  Ｍｏｕｓｅ  ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡセット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、決定した。ＥＬＩＳＡに用いたサンプルは、ＰＰＤ（１０μｇ／ｍｌ）により、７２時間刺激された脾細胞由来の上清であった。手短に言えば、捕捉抗体でプレコートされた９６ウェル平底プレート（Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ）にサンプルを３連で添加し、以下の製造元のプロトコールに従い測定を実施した。吸光度をマイクロプレートリーダーにより、４５０ｎｍで読み取った（ＴＥＣＡＮ  ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００）。ＩＦＮ−γレベルは、ＩＦＮ−γスタンダードを用いて作成した検量線に基づいて計算した。結果を図４ａおよび図４ｂに示す。ＰＰＤ刺激なしのサンプルからの読み値を差し引いた後、データを平均値±ＳＥＭとして示す。図４ａにおいて、両側独立スチューデントｔ検定を行った；図４ｂにおいて、一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ多重比較検定を実施した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【００７４】
組換えＢＣＧ株により誘導されたＩＦＮ−γの起源を決定するために、細胞内サイトカイン染色およびＦＡＣＳ解析もまた行った。手短に言えば、脾細胞を、１００μｌ中、２×１０６細胞／ウェルで、三連で播種し、２．５μｇ／ウェルの精製たんぱく体（ＰＰＤ）（Ｓｔａｔｅｎｓ  Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、またはコントロールとして完全ＲＰＭＩ（ｃＲＰＭＩ；ＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ／１％Ｌ−グルタミン／１％ペニシリン／ストレプトマイシン）により刺激し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。１９時間刺激後、ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、１：１０００の最終希釈倍率で添加し、さらに５時間インキュベートした。合計２４時間の刺激後、プレートを、４℃で、１４００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットを２００μｌのＦＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒ（０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ）で洗浄し、ＦＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒで希釈したＦｃ  Ｂｌｏｃｋ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（１：４００）で再懸濁して、暗所にて氷上で１５分間インキュベートした。ＦＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒをさらに１５０μ添加して混合し、プレートを、４℃で、１４００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を除去して、細胞を細胞外Ｔ細胞表面マーカーについて染色し（ＦＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒに希釈した、ＣＤ３−ＰＥ、ＣＤ４−ＦＩＴＣ、およびＣＤ８ａ−ＰｅｒｃｙＰＣｙ５．５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））、暗所にて氷上で３０分間遠心分離した。細胞外マーカー染色後、細胞を１５０μｌのＦＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、透過処理し、１×ＣｙｔｏＦｉｘ／ＣｙｔｏＰｅｒｍ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２０分間固定した。その後、細胞を、１×ＰｅｒｍＷａｓｈ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で洗浄し、ＩＦＮ−γ−ＡＰＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で３０分間インキュベートして、細胞内ＩＦＮ−γについて染色した。細胞を上述のように遠心分離して、２００μｌのＦＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒに再懸濁し、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で解析した。サンプルあたり合計３０００００事象がリンパ球ゲートに回収され、ＦｌｏｗＪｏ  Ｖ７．６を使用して解析した。解析用のゲートは、アイソタイプコントロールに基づき設定した。ＰＰＤ刺激なしのサンプルからの読み値を差し引いた後、データを平均値±ＳＥＭとして示す。結果を図４ｃに示しており、一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ多重比較検定を、統計解析のために行った。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【００７５】
実施例４:ｒＢＣＧ−Ｊａｐａｎ／ＰｈｏＰＲは、結核菌に感染したモルモットの生存期間を延長させる。
１１匹の雌ハートレイ系モルモット（２００〜２５０ｇ）のグループを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、０．２ｍｌＰＢＳ／０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０中の、ｐＭＥ（ｒＢＣＧ−Ｊａｐａｎ／ｐＭＥ）、ｐＭＥ−ＰｈｏＰＲ（ｒＢＣＧ−Ｊａｐａｎ／ＰｈｏＰＲ）を含有するＢＣＧ−Ｊａｐａｎを、５×１０４ＣＦＵで、または、コントロールとしてＰＢＳ／０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０単独を、皮下にワクチン接種した。ワクチン接種後８週目に、モルモットを、ＧｌａｓＣｏｌネブライザーを使用したエアロゾル経路で、１，０００ＣＦＵの結核菌Ｈ３７Ｒｖを負荷した。モルモットを、人道的なエンドポイントで安楽死させ、カプラン・マイヤー法を用いて生存曲線をプロットした。結果を図５ａに示す。ログランク検定を行い、生存曲線の各対を比較した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【００７６】
人道的なエンドポイントで安楽死させたモルモットの肺および脾臓を、回収した。脾臓と右肺全体を別々にホモジナイズし、７Ｈ１１寒天培地にプレーティングして各臓器の結核菌負荷量を定量した。３７℃で３週間インキュベート後、コロニーをカウントした。結果を図５ｂおよび図５ｃに示す。各グループの全てのモルモットの臓器重量を測定し、結果を図５ｄおよび図５ｅに示す。図５ｂおよび図５ｅのデータは、平均値±ＳＥＭとして示され、一元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ多重比較検定を行った。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【００７７】
実施例５：ｒＢＣＧ−Ｊａｐａｎ／ＰｈｏＰＲは、結核菌に感染したモルモットの肺の病態を軽減させる。
図４に記載の実験から６匹のモルモットを、組織学的分析のために選択した。これらには、それぞれ２５、２７、および３９週目に人道的なエンドポイントに到達した各グループからの１匹のモルモットが含まれる（図６ａ〜図６ｃ）。ｐＭＥ（図６ｂ）およびＰｈｏＰＲ（図６ｃ）のモルモットは、各グループから安楽死させた６番目のモルモットを表す（中央値）。ｐＭＥグループの唯一の生存動物（図６ｄ）およびＰｈｏＰＲグループのランダムに選ばれた１匹の生存動物（図６ｅ）が、含まれた。各モルモットについて、左肺の下葉および上葉の切片を、ヘマトキシリン―エオシン染色により解析した。手短に言えば、ホルマリン固定組織をパラフィンブロックに包埋した。連続切片（５μｍ厚）を調製し、それらを、キシレンを３回交換して（各３分）、脱パラフィン処理を行い、その後４回のアルコール洗浄（１００％、１００％、９５％、７０％、各３分）で再水和した。切片を、ヘマトキシリンおよびエオシン（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で染色して、Ｃｙｔａｔｉｏｎ（商標）５（ＢｉｏＴｅｋ）を用いて調べた。
【００７８】
実施例６:ｒＢＣＧ−Ｊａｐａｎ／ＰｈｏＰＲは、ＳＣＩＤマウスにおいて、安全である。
短期間細菌負荷アッセイ：雌Ｆｏｘ  Ｃｈａｓｅ  ＣＢ１７  ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、週齢を一致させた（７週齢）。１２匹のマウスのグループに、０．２ｍＬのＰＢＳ／０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０中の１０５ＣＦＵのｒＢＣＧ−Ｊａｐａｎ／ｐＭＥ、ｒＢＣＧ−Ｊａｐａｎ／ＰｈｏＰ、またはｒＢＣＧ−Ｊａｐａｎ／ＰｈｏＰＲを、あるいは、コントロールとしてＰＢＳ／０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０単独を、外側尾静脈を介して静脈内に感染させた。感染後１週目、３週目、および６週目に、マウス（各時点でｎ＝４）を安楽死させて、肺および脾臓を回収し、ＰＢＳでホモジナイズして、７Ｈ１１寒天培地にプレーティングして、肺（図７ａ）および脾臓（図７ｂ）における細菌負荷量を決定した。データは、平均値±ＳＤとして示す。二元配置ＡＮＯＶＡおよびボンフェローニ多重比較検定を行った。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【００７９】
長期間生存アッセイ：Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ由来の、１０匹の週齢を一致させた雌ＳＣＩＤマウス（７週齢）のグループを、１０７ＣＦＵのＢＣＧ−Ｐａｓｔｅｕｒ、３つの上述の組換えＢＣＧ−Ｊａｐａｎ株、または上述のＰＢＳ／０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０で、外側尾静脈を介して静脈内に感染させた。感染後１日目に、各グループから３匹のマウスを安楽死させ（感染量を評価するため）、一方で、残りのマウスを、人道的なエンドポイント（最大体重の２０％減）に達するまで毎週モニターした。生存曲線を、カプラン・マイヤー法を用いてプロットした。結果を図７ｃに示す。ログランク検定を行い、各対の生存曲線を比較した。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【００８０】
参考文献
2020508640.tif 000002
【００８１】
2020508640.tif 000003
【００８２】
2020508640.tif 000004
【図１−１】
2020508640.tif 000005
【図１−２】
2020508640.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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2020508640.tif 000015
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