(57)【要約】  本発明は、安定剤として使用するための組成物並びに生体試料、とりわけ全血を安定化するため、とりわけ無細胞核酸の含量及び完全性を安定化するための方法に関する。組成物は、水溶液において、7以下、好ましくは3.5〜7.0のpH値に緩衝する少なくとも1種の緩衝物質と、2価カチオンのための少なくとも1種のキレート形成剤と、ウロトロピンと、任意選択でPEGとを有する又はそれらからなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中に含まれる無細胞核酸のための安定剤としての組成物の使用であって、組成物が、水溶液において、7以下のpH値に緩衝する少なくとも1種の緩衝物質と、好ましくはキレート形成剤である少なくとも1種の凝固防止剤と、ウロトロピンと、任意選択でPEGとを有することを特徴とする、使用。
【請求項２】
組成物が、水溶液において、少なくとも1種の緩衝物質と、キレート形成剤である少なくとも1種の凝固防止剤と、ウロトロピンと、任意選択でPEGとからなることを特徴とする、請求項1に記載の使用。
【請求項３】
生体試料中に含まれる無細胞核酸のための安定剤としての組成物の使用であって、組成物が、乾燥混合物として、生体試料を7以下のpH値に緩衝するように適合されている少なくとも1種の緩衝物質と、好ましくはキレート形成剤である少なくとも1種の凝固防止剤と、ウロトロピンと、任意選択でPEGとを有することを特徴とする、使用。
【請求項４】
組成物が、遊離した又は溶解したホルムアルデヒドのためのスカベンジャー化合物を含有しないことを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
少なくとも1種の緩衝物質が、水溶液を3.5〜7の範囲のpH値に緩衝し、0.3〜1Mのクエン酸塩の濃度に相当する緩衝能を有し、前記溶液中に1〜30質量/容量%のウロトロピンが溶解していることを特徴とする、請求項1から4のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
少なくとも1種の緩衝物質及びキレート形成剤である少なくとも1種の凝固防止剤が、クエン酸緩衝剤によって形成されていることを特徴とする、請求項1から5のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
少なくとも1種の緩衝物質が、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、MES(2-N-モルホリノエタノールスルホン酸)、PIPES(ピペラジン-N,N'-ビス-2-エタノスルホン酸)、MOPS(3-N-モルホリノプロパンスルホン酸)、リン酸緩衝剤及びこれらの少なくとも2種の混合物から選択され、少なくとも1種の凝固防止剤が、クエン酸塩及びEDTA並びにこれらの混合物から選択されるキレート形成剤であることを特徴とする、請求項1から6のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
無細胞核酸のための安定剤としての使用、引き続いての無細胞分画の単離及び無細胞分画中に含まれる核酸の分析を特徴とする、請求項1から7のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
生体試料中に含まれる細胞のための安定剤としての使用、引き続いての細胞含有分画の単離及びその中に含まれる細胞の分析を特徴とする、請求項1から8のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
細胞含有分画の細胞の分析が、細胞中に含まれる核酸の分析及び/又は細胞表面に結合したタンパク質の免疫学的分析を含むことを特徴とする、請求項9に記載の使用。
【請求項１１】
生体試料が全血であり、組成物が、採血管を対応させた取り込まれるべき最大の試料容量の20%までの容量割合で、採血管中に含まれることを特徴とする、請求項1から10のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
生体試料が尿であることを特徴とする、請求項1から10のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
生体試料が、組成物との混合物において0〜37℃で1時間〜14日間にわたり安定であることを特徴とする、請求項1から12のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
生体試料のための安定剤として使用するための組成物であって、組成物が、7以下のpH値に緩衝する少なくとも1種の緩衝物質と、好ましくはカルシウムイオンのためのキレート形成剤である少なくとも1種の凝固防止剤と、ウロトロピンと、任意選択でPEGと、任意選択で水とからなることを特徴とする、組成物。
【請求項１５】
組成物が、任意選択で水溶液において、緩衝物質としてのクエン酸緩衝剤と凝固防止剤としてのキレート形成剤とウロトロピンとからなり、クエン酸緩衝剤が、3.5〜7の範囲のpH値に緩衝することを特徴とする、請求項14に記載の組成物。
【請求項１６】
組成物が、水溶液において、緩衝物質兼キレート形成剤としてのクエン酸緩衝剤とウロトロピンとからなり、クエン酸緩衝剤が、3.5〜7の範囲のpH値に緩衝し、溶液中に1〜30質量/容量%のウロトロピンが溶解していることを特徴とする、請求項15に記載の組成物。
【請求項１７】
採血管が、請求項1から11又は13のいずれか一項に記載の生体試料中に含まれる無細胞核酸のための安定剤として使用する組成物を、採血管中に取り込まれる最大の試料容量の20%までの容量割合で含むことを特徴とする、採血管。
【請求項１８】
生体試料の無細胞核酸を安定化し、分析するための方法であって、
-  試料を請求項1から14のいずれか一項に記載の使用のための組成物と接触させて、試料と組成物との混合物を製造する工程と、
-  試料と組成物との混合物を0〜37℃で1時間〜14日間にわたり貯蔵する工程と
を含む、方法。
【請求項１９】
組成物を、試料の容量の最大20%の容量比で試料と接触させることを特徴とする、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
-  貯蔵に引き続いて混合物を細胞含有分画及び無細胞分画へ分離する工程と、
-  無細胞分画及び/若しくは細胞含有分画の核酸を分析する工程、並びに/又は細胞含有分画中の細胞表面に結合されたタンパク質を分析する工程と
を特徴とする、請求項18又は19に記載の方法。
【請求項２１】
混合物の分離後に無細胞分画へプロテイナーゼを添加し、引き続きその混合物をインキュベートすることを特徴とする、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
無細胞分画から核酸を単離し、引き続き分析することを特徴とする、請求項20又は21に記載の方法。
【請求項２３】
生体試料が、全血又は尿であることを特徴とする、請求項20から22のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無細胞核酸、とりわけ無細胞DNA及び/又はRNAを安定化するための方法及び組成物、並びに代替的に又は追加的に生体試料、とりわけ全血又は血漿又は尿からの細胞を安定化するための方法及び組成物、並びに生体試料における無細胞核酸及び/又は細胞のための安定剤としての組成物の使用に関する。組成物は、例えば採血管によって、無細胞試料又は細胞含有試料に添加することができ、この採血管に直接全血を取り込んでおき、採血管を対応させた最大の血液容量の例えば20%まで組成物を装入する。生体試料としての尿の場合に、組成物は試料容器に装入されていても又はその中に充填された試料に添加されてもよく、組成物を試料に対して又は予め決められた試料容量について予め決められた容量比で装入又は添加することがそれぞれ好ましい。
【０００２】
方法及び組成物は、とりわけ例えばハイブリダイゼーション、シーケンシング又は増幅による、任意選択で例えば核酸用の吸着剤への吸着に引き続いての溶出による事前の単離を伴う更なる分析のために、生体試料中に含まれる無細胞核酸を安定化する利点を有する。無細胞核酸の安定化は、とりわけ無細胞核酸の量及び構造の保持であり、これは無細胞核酸の完全性とも称し得る。
【０００３】
組成物及び方法は、好ましくは試料中に含まれる細胞を、例えば自発的溶解に対して安定化する作用も有するので、一方で、採取された試料において、細胞中に含まれる核酸は放出されないか又はより低い程度で放出され、試料の無細胞核酸とは混ざらず、他方で、試料から細胞を分離し得ることで、細胞を実質的に溶解による妨害なく、例えば無細胞核酸なしに分析することができる。この場合に、細胞は試料のドナーの細胞、すなわち内生細胞、例えば上皮細胞及び/又は腫瘍細胞でもよく、細胞は外生細胞、例えば細菌、菌類若しくは酵母又はウイルスでもよい。
【０００４】
組成物と生体試料との混合物から分離された細胞の分析は、細胞内タンパク質及び/又は表面に結合されたタンパク質の、例えば免疫学的分析による分析を含み得る。組成物は、好ましくは細胞上の表面に結合されたタンパク質の安定化をもたらす。
【背景技術】
【０００５】
WO 2013/123030 A2は、無細胞DNAの後の分析のために全血を安定化するために、ホルムアルデヒド放出化合物、とりわけジアゾリジニル尿素又はイミダゾリジニル尿素を、遊離ホルムアルデヒドの除去のためのスカベンジャー、例えばアミノ酸、とりわけグリシン、アルキルアミン、ポリアミンと組み合わせて、それぞれ抗凝固剤としてのEDTAと共に混合することを記載している。
【０００６】
Umetaniら、Clinical Chemistry 52:6、1062-1069 (2006)は、115bpの1つの断片(ALU 115)が247bpの別の断片(ALU 247)内に存在するALU繰り返し配列からの2つの断片の定量的PCR増幅による血清中の無細胞DNAの安定性の分析について記載している。増幅物の量の比率は、DNAの品質についての尺度である。
【０００７】
ALU 247 / ALU 115のPCR増幅物の商が1であること、つまりALU 247とALU 115とが同量であることはgDNAに特有であるとみなされる。それというのも、そのような試料は小さな鋳型に加えてより長い鋳型も含むからである。無細胞(cf)DNAについて、Hao, T. B.、Shi, W.、Shen, X. J.、Qi, J.、Wu, X. H.、Wu, Y.、Tang, Y. Y.、Ju, S. Q.「Circulating cell-free DNA in Serum as a biomarker for diagnosis and prognostic prediction of colorectal cancer」、British Journal of Cancer 111、1482 - 1489 (2014)は、約0.3のALU 247/ALU 115の商を挙げている。
【０００８】
WO 2013/045458は、全血の安定化のために、高張添加剤としてのジヒドロキシアセトンと、細胞外核酸のための安定剤としてのN,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジエチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミド又はN,N-ジエチルアセトアミドと、好ましくは抗凝固剤としてのキレート形成剤と、とりわけカスパーゼ阻害剤であるアポトーシスの阻害剤とからの混合物を記載している。
【０００９】
WO 2007/073397 A1は、抗細菌剤としてメテナミン(ウロトロピンに相当)を含有し得る、緩衝剤中にアニオン性多糖類及び麻酔薬を有する膀胱疾患の治療のための医薬組成物を記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】WO 2013/123030 A2
【特許文献２】WO 2013/045458
【特許文献３】WO 2007/073397 A1
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Umetaniら、Clinical Chemistry 52:6、1062-1069 (2006)
【非特許文献２】Hao, T. B.、Shi, W.、Shen, X. J.、Qi, J.、Wu, X. H.、Wu, Y.、Tang, Y. Y.、Ju, S. Q.「Circulating cell-free DNA in Serum as a biomarker for diagnosis and prognostic prediction of colorectal cancer」、British Journal of Cancer 111、1482 - 1489 (2014)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、後の分析のために生体試料中、とりわけ全血又は尿中の無細胞核酸、例えばDNA又は細胞を安定化するための代替的な組成物及び代替的な方法であって、組成物が好ましくは貯蔵安定であり、更に好ましくは様々な成分を公知の手段よりも少数有する、代替的な組成物及び代替的な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の課題は、特許請求の範囲の特徴、とりわけ安定剤として使用するための組成物並びに生体試料、とりわけ全血又は尿を安定化するため、とりわけ無細胞核酸の含量及び完全性を安定化するため、及び/又は細胞の含量及び完全性を安定化するための方法により解決される。組成物は、とりわけ全血のための安定剤として使用するために、水溶液において、7以下、好ましくは3.5〜7.0のpH値に緩衝する少なくとも1種の緩衝物質であって、とりわけ組成物と生体試料との混合物をこのpH値へ緩衝するように適合されている緩衝物質と、少なくとも1種の凝固防止剤及び/又は少なくとも1種のキレート形成剤、とりわけ2価カチオン、好ましくはカルシウムイオンのための少なくとも1種のキレート形成剤と、ウロトロピンと、任意選択でPEGとを有するか又はそれらからなる。キレート形成剤、とりわけEDTAは凝固防止剤でもあるので、本発明の目的のために凝固防止剤はキレート形成剤によって形成されてもよい。生体試料としての尿のための安定剤として使用するために、組成物は、緩衝物質及びウロトロピンを乾燥混合物として、例えば粉末形で又は好ましくは水溶液において、任意選択で少なくとも1種の凝固防止剤及び/又はキレート形成剤と一緒に有し得るか又はそれらからなり得る。一般的に、生体試料は動物又は人間の組織又は体液の試料であることが好ましい。
【００１４】
少なくとも1種の緩衝物質は、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、MES(2-N-モルホリノエタノールスルホン酸)、PIPES(ピペラジン-N,N'-ビス-2-エタノスルホン酸)、MOPS(3-N-モルホリノプロパンスルホン酸)、リン酸緩衝剤及びこれらの少なくとも2種の混合物から選択し得る又はそれらからなり得る。少なくとも1種の凝固防止剤は、例えば任意選択でキレート形成剤との混合物においてヒルジンであり得る。好ましくは凝固防止剤は、例えばクエン酸塩及びEDTA並びにこれらの混合物から選択し得る又はそれらからなり得るキレート形成剤である。
【００１５】
組成物は、遊離した又は水中に溶解したホルムアルデヒドのスカベンジャーとして添加される化合物、とりわけグリシンがなくてもよく、及び/又は例えば組成物がクエン酸塩を含有する場合、追加のキレート形成剤、とりわけEDTA(エチレンジアミン四酢酸)がなくてもよい。特に好ましくは、組成物はクエン酸緩衝剤及びウロトロピンの水溶液からなる。尿中の無細胞核酸及び/若しくは細胞のための安定剤として使用するため、又は尿中の無細胞核酸及び/若しくは細胞を安定化するための方法において、組成物は、乾燥混合物において、任意選択で凝固防止剤及び/又はキレート形成剤と一緒にクエン酸緩衝剤及びウロトロピンからなってよく、組成物においてクエン酸緩衝剤は、とりわけ予め決められた試料容量について、試料中で7以下、好ましくは3.5〜7.0のpH値に緩衝するように調整されている。
【００１６】
緩衝物質は、好ましくはクエン酸緩衝溶液の緩衝能を有し、これは、0.3〜1M、より好ましくは0.4〜0.7Mの範囲、例えば0.5Mの濃度を有し、3.5〜7、好ましくは4〜6.5、試料としての全血のために例えばpH4〜4.5の範囲のpH値、一般的により好ましくは4.5又は4.2のpH値を有し、例えば生体試料と組成物との混合物をこれらのpH値に緩衝するように適合されている。ウロトロピン(ヘキサメチレンテトラミン)の含量は、好ましくは、緩衝溶液において1〜30質量/容量%、好ましくは2又は5〜25質量/容量%又は20質量/容量%まで、例えば5〜19又は8質量/容量%までの範囲内である。好ましくは、緩衝物質は、0.3〜1M、より好ましくは0.4〜0.7Mの範囲の、例えば0.5Mの濃度のクエン酸緩衝剤であり、3.5〜7の範囲内のpH値、好ましくはpH4〜6.0、試料としての全血のために例えばpH4〜4.5、一般的により好ましくは4.5又は4.2のpH値を有し、好ましくは、生体試料と組成物とからの混合物をこれらのpH値に緩衝するように適合されている。
【００１７】
クエン酸緩衝剤は、EDTAを含有しなくても全血の凝固を十分に防止することが明らかになった。したがって、少なくとも1種の緩衝物質及び少なくとも1種のキレート形成剤は、クエン酸緩衝剤から形成されてもよい。
【００１８】
好ましくは、とりわけ生体試料としての全血の場合に、本発明による組成物は、好ましくはクエン酸緩衝剤である緩衝剤を水中で製造し、pH値を調整し、引き続きウロトロピンを添加して溶解させることによって作製される。好ましくは、緩衝剤は、例えばクエン酸又は酢酸である緩衝物質の水溶液と、緩衝物質の塩、例えばクエン酸三ナトリウム又は酢酸ナトリウムの水溶液とを混合することによって、緩衝剤、例えばクエン酸緩衝剤又は酢酸緩衝剤のそれぞれ所望の濃度で製造される。
【００１９】
代替的に、酸及び酸の塩は、液体添加時に所望のpH値に調整される比率で乾式で混合される。
【００２０】
本発明による組成物は、生体試料、とりわけ全血又は尿のための、とりわけ生体試料中に含まれる無細胞核酸、DNA及び/又はRNAのための安定剤として使用するために適しており、それに引き続き無細胞分画、例えば無細胞血漿又は細胞が単離される。無細胞分画から、とりわけ無細胞核酸を分析し得る。この場合に、組成物は、生体試料、とりわけ全血において無細胞核酸、とりわけ無細胞DNA又は無細胞RNAの量及び構造を安定化し、実質的にこれらの核酸の量又は構造の変化を防ぐのに適しているため、組成物によって実質的に核酸の後の分析の妨げとなるこれらの核酸の量又は構造の変化は引き起こされないことが明らかになった。核酸の後の分析は、例えばハイブリダイゼーション、シーケンシング又は増幅、例えばPCRによって行い得る。
【００２１】
PEG、例えばPEG 6000〜PEG 20000又はそれらの混合物が任意に含まれることで、溶血が妨げられる。組成物は、とりわけ無細胞核酸の後の分析のために、好ましくは核酸用の吸着剤への吸着による核酸の単離を伴って使用する場合に、PEGを含有しない。
【００２２】
本発明による組成物と混合された生体試料の細胞は、核酸、とりわけDNA及びRNAのその含量を実質的に不変に留め、無細胞分画の核酸の含量に影響を及ぼさないという点で優れている。
【００２３】
本発明による組成物は、安定化作用を達成するために、例えば少なくとも1ヶ月間、より好ましくは少なくとも2ヶ月間、例えば8ヶ月間まで又は6ヶ月間まで0〜30℃、より好ましくは5〜20℃で貯蔵安定であるという利点を有する。組成物は、それが採血管に含まれていて血液を取り込むためにその中に装入されている場合又は尿試料容器中に含まれていて尿を充填するためにその中に装入されている場合にも更に貯蔵安定である。それに相応して、本発明は、組成物が含まれる採血管並びに全血試料である生体試料の無細胞核酸及び/又は細胞を安定化するためのその使用にも関する。それに相応して、本発明は、組成物が収容されている尿試料容器並びに尿試料である生体試料の無細胞核酸及び/又は細胞を安定化するためのその使用にも関する。
【００２４】
遊離した又は水中に溶解したホルムアルデヒドのためのスカベンジャー化合物の含量を有さず、かつ例えばEDTA等の抗凝固剤の追加の含量を有しない組成物が、核酸及び/又は細胞の安定化のために適していることが明らかになった。目下、組成物の貯蔵安定性及び生体試料に対するその安定化作用は、組成物中及び試料との混合物中のウロトロピンが、タンパク質の安定化又は失活のために十分な濃度の遊離ホルムアルデヒドと平衡状態で存在することに起因するものとみなされる。
【００２５】
好ましくは、組成物は、採血管中に、例えば、採血管中に取り込み得る、又は採血管を最大限対応させた全血容量の最大20%、少なくとも2%、好ましくは5〜15%、とりわけ8%〜12%の容量割合、例えば10%で含まれる。好ましくは、組成物は、尿試料容器中に、例えば、尿試料容器中に充填し得る、又は尿試料容器を最大限対応させた尿容量の最大20%、少なくとも2%、好ましくは5〜15%、とりわけ8〜12%の容量割合、例えば10%で含まれる。
【００２６】
とりわけ全血である生体試料を安定化するための方法は、
-  試料と組成物とを、好ましくは最大20%、好ましくは5〜15%、とりわけ8〜12%の、好ましくは水溶液である組成物対試料の容量比において接触させて、試料と組成物とからの混合物を製造する工程と、
-  任意選択で、試料と組成物とからの混合物を、0℃以上で、例えば0〜37℃で、例えば0〜30℃で、より好ましくは5〜20℃又は22.5℃で、例えば1時間〜14日間、好ましくは5時間〜5日間又は3日間まで又は2日間までにわたり貯蔵する工程と、
-  任意選択で、引き続き混合物を細胞含有分画と無細胞分画とに分離する工程と、
-  好ましくは、混合物の分離後に、生じた無細胞分画へプロテイナーゼ、例えばプロテイナーゼKを添加する工程と、
-  混合物の核酸をその無細胞分画から分析する工程、及び/又は細胞を細胞含有分画から分析する工程と、
を有する。
【００２７】
生体試料の無細胞核酸を安定化し、分析するための方法は、例えば、試料と、試料中に含まれる無細胞核酸のための安定剤として使用するための組成物とを接触させて、試料と組成物とからの混合物を製造する工程と、試料と組成物とからの混合物を0℃〜30℃で少なくとも1時間〜14日間にわたり貯蔵し、好ましくは引き続き混合物を細胞含有分画と無細胞分画とに分離する工程と、好ましくは混合物の分離後に、生じた無細胞分画へプロテイナーゼ、例えばプロテイナーゼKを添加する工程と、混合物の核酸をその無細胞分画から分析する工程、及び/又は細胞を細胞含有分画から分析する工程とを有するか又はこれらの工程からなる。
【００２８】
混合物の分析には、任意選択で、好ましくは核酸用の吸着剤と接触させて、引き続き吸着剤を洗浄して、結合された核酸を吸着剤から溶出させることによる核酸の単離が含まれる。対応する吸着剤、例えばイオン交換材料は、例えばMacherey-Nagel社のDNA単離キット(NucleoSnap DNA Plasma)又はQiagen社のDNA単離キット(QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit)に含まれる。
【００２９】
混合物の細胞含有分画及び無細胞分画への分離は、一般に、例えばろ過若しくは遠心分離及び/又は吸着により行うことができる。
【００３０】
一般に、とりわけ試料としての尿の場合に、方法は、とりわけ無細胞分画に関して、遊離核酸のための少なくとも1つの濃縮工程、例えば核酸の沈殿及び/又は核酸の吸着材、例えば吸着剤で被覆されている常磁性粒子への吸着を含み得る。
【００３１】
細胞含有分画の分析は、任意選択で、細胞含有分画からの細胞の濃縮、例えば細胞の吸着材、例えば吸着剤、例えば抗体で被覆されている常磁性粒子への吸着を含み得る。
【００３２】
任意選択で、生体試料と組成物との混合物から無細胞分画が分離された細胞含有分画は、本明細書で安定剤として記載されているような水性組成物中に懸濁及び溶解し得る。
【００３３】
本発明をここで、実施例に基づき図面を参照してより詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】種々の貯蔵期間後の試料からの無細胞DNAのPCR増幅の結果を示す図である。
【図２】種々の貯蔵期間後の増幅物の濃度の商としての2つのDNA断片のPCR増幅の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００３５】
全血からの無細胞DNAの単離及び分析
水中の0.5Mのクエン酸(一水和物)及び水中の0.5Mのクエン酸三ナトリウム(二水和物)をpH4.2に達するまで混合し、引き続き18質量/容量%のウロトロピンを添加及び溶解させることによって、組成物を製造した。
【００３６】
生体試料のための例として、4.9mlの全血を3人のドナーから、それぞれ4本の0.49mlの組成物(全血の10容量%)を含む同一の採血管に取り込んだ。全血と組成物とからのこの混合物を含み、22.5℃で貯蔵されたこれらの採血管のうち、それぞれ1本を0日目(T0)、3日目(T3)、7日目(T7)及び14日目(T14)に後処理し、そこから無細胞DNAを単離して分析した。このために、各採血管から無細胞分画を、2段階の遠心分離過程(10分間、2,000×g;15分間、15,000×g)により作製した。
【００３７】
こうして作製された安定化のための組成物を含有する無細胞血漿から、NucleoSnap DNA Plasma Kit(Macherey-Nagel社から入手可能)を用いて無細胞DNAを単離した。キットの指示とは異なり、3.0mlではなく1.7mlの無細胞血漿を使用し、溶解バッファーVL及びエタノールも同様に3mlから1.7mlに減らした。室温及び56℃でのプロテイナーゼKと一緒での無細胞血漿のためのインキュベート時間を、それぞれ5分間から15分間へ更に延長した。
【００３８】
無細胞DNAの分析は、115bpの断片のALU 115及び247bpの断片のALU 247の定量的PCRによる増幅によってUmetani et al. (2006)により記載されるように行った。
【００３９】
図1は、アリコートの0日目(T0)、3日目(T3=Tx)、7日目(T7=Tx)及び14日目(T14=Tx)の示された時点までのALU 115の濃度と0日目(T0)のALU 115の濃度とからの商の平均値を示す。この場合に、1の商(Tx/T0)は、混合物中の無細胞DNAの濃度が不変又は安定に留まることと、また混合物の無細胞DNAがPCRによって不変に増幅可能であることを示している。この結果は、全血と組成物とからの混合物中の無細胞DNAが、22.5℃で少なくとも14日間の貯蔵期間にわたり濃度及び構造において引き続いての分析のために安定化されることを示している。
【００４０】
図2は、25℃での貯蔵の示された時点(本発明による組成物(cfDNA Exact)について0日目(0)、3日目(3)、7日目(7)、10日目(10)及び14日目(14)並びにEDTA試料(EDTA)について0日目(0)及び7日目(7))でのALU 247及びALU 115の例における、無細胞DNA(cfDNA)の絶対量の商を示す。その結果は、本発明による組成物(Exact)によるインキュベート時間にわたって一定の商に基づいて安定化を示している。安定化されていないEDTAで抗凝固化された試料において、ALU 247/ALU 115の商は、貯蔵期間が増えるとともに増加する。血液試料/生体試料の不十分な安定化は、細胞の溶解、ひいてはゲノムDNA(gDNA)の放出をもたらす。ALU 247/ALU 115の商が1であること、つまり同量のALU 247及びALU 115はgDNAに特有である。
【００４１】
これらの結果はまた、組成物が、吸着剤への核酸の吸着による組成物と血漿との無細胞混合物からの無細胞核酸の後の単離のために適しているか又はこの単離を妨害しないことを示している。
【実施例２】
【００４２】
全血からの細胞の単離及び分析
実施例1に相応して、組成物と全血とからの混合物を製造し、22.5℃で貯蔵した。第2の全血試料は、凝固を防ぐために本発明による組成物の代わりに生理食塩溶液及びEDTA(1.6mg/ml血液)を含有した。両方の種類の全血試料のうち、0日目、1日目、3日目及び5日目に各5.0mlを赤血球溶解に供し、循環内皮細胞(cEC)を、Miltenyi Biotech社のcEC Enrichment and Enumeration Kitによって濃縮して分析した。健康な人の場合に、循環内皮細胞の数は、約1〜20細胞/mlである。異なる疾患の場合に、cECの数は部分的に大幅に増加する。安定化調製物は、貯蔵された血液試料中のcECの数が安定であることを保証せねばならない。キットについて記載された分析の後に、検出されたcECの数が、本発明により安定化された試料においてのみ貯蔵時間にわたって一定に留まることが分かった。
【実施例３】
【００４３】
尿からの無細胞DNAの単離及び分析
水中の0.5Mのクエン酸(一水和物)及び水中の0.5Mのクエン酸三ナトリウム(二水和物)をpH4.2に達するまで混合し、引き続き15質量/容量%のウロトロピンを添加及び溶解させることによって、組成物を製造した。
【００４４】
生体試料のための例として、90mlの尿を試料採取直後に1/10容量の組成物と混合した。22.5℃で貯蔵されたこの混合物から、それぞれ1つのアリコートを0日目、3日目、7日目及び14日目に後処理し、そこから無細胞DNAを単離して分析した。そのために、1つのアリコートからそれぞれ1つの無細胞分画を、15000×gで15分間の遠心分離及び無細胞分画の分離によって作製した。こうして作製された安定化のための組成物を含有する無細胞分画から、NucleoSnap DNA Plasma Kit(Macherey-Nagel社から入手可能)を用いて無細胞DNAを単離した。
【００４５】
未処理とし、又は同容量の生理食塩溶液の添加物若しくは溶解した緩衝物質のみの添加物と混合し、同じ貯蔵を行った尿試料と比較して、無細胞DNAは組成物により安定化されたことが分かった。
【実施例４】
【００４６】
尿中の安定化された細胞の分析
実施例3に相応して、尿に前立腺癌細胞(LnCap)を加え、組成物による安定化又は生理食塩溶液との比較のために混合して貯蔵した。
【００４７】
分析は比較試料の同じ貯蔵時間後に遠心分離により沈降された細胞に対して行った。本発明による組成物のみが、添加された細胞のフローサイトメトリー検出を可能にすることが明らかになった。
【００４８】
未処理で又は同容量の生理食塩溶液の添加物若しくは溶解した緩衝物質のみの添加物を加えて同じ貯蔵を行った尿試料と比較して、組成物が細胞の表面マーカーを貯蔵の間に安定化することが分かった。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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