(57)【要約】本発明は、ワクチンのための分子アジュバントとしての、ＧＨＲＰ−６及び１つの構造アナログの使用に関する。他の適用の中で、これらのワクチンは、哺乳類、鳥類及び水生生物に影響する感染性病原体（ウイルス、細菌及び外部寄生虫のような）によって引き起こされる疾患の予防のために用いられ得る。ＧＨＲＰ−６及びそのアナログＡ２３３は、所与の抗原と組み合わせられた場合に、アジュバントとして有効である。これは、ＧＨＲＰ−６及びそのアナログＡ２３３が所与の抗原に対する特異的免疫応答を促進するからである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクチンの製造における分子アジュバントとしての、配列番号：１又は配列番号：２として同定された成長ホルモン分泌促進ペプチドの使用。
【請求項２】
前記ワクチンが、感染性病原体によって引き起こされる疾患の予防において使用される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記疾患が、哺乳類、鳥類又は魚類に影響する、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
配列番号：１又は配列番号：２として同定された成長ホルモン分泌促進ペプチド、少なくとも１つのワクチン抗原、及び薬学的に許容される賦形剤又は希釈剤を含む、ワクチン組成物。
【請求項５】
前記ワクチン抗原が、ペプチド、タンパク質、ウイルス及び弱毒化細菌からなる群から選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
哺乳類、鳥類又は魚類において経口的に又は注射によって投与される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ワクチンが魚類へ経口で投与される場合に、配列番号：１又は配列番号：２の配列の前記ペプチドが、５０〜６００μｇ／ｋｇの処方された餌の濃度である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
ワクチン抗原に対する免疫応答を増加させる方法であって、前記抗原の分子アジュバントとして、有効量の配列番号：１又は配列番号：２として同定された成長ホルモン分泌促進ペプチドが投与される、前記方法。
【請求項９】
前記ワクチン抗原が、感染性病原体によって引き起こされる疾患の予防のために使用される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ワクチン抗原及び前記分子アジュバントペプチドが経口経路によって投与される場合に、配列番号：１又は配列番号：２の配列の前記ペプチドが、５０〜６００μｇ／ｋｇの処方された餌で使用される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ワクチン抗原及び前記分子アジュバントペプチドが注射によって投与される場合に、配列番号：１又は配列番号：２の配列のペプチドが、０．１〜４０μｇ／ｇ動物体重で用いられる、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特にワクチン及びそれらのためのアジュバントの開発についての分子生物学及び免疫学の分野に関する。特に、本発明は、ワクチンのための分子アジュバントとしての、合成の成長ホルモン放出ペプチドＧＨＲＰ−６及びその構造アナログＡ２３３から選択される、成長ホルモン分泌促進ペプチドの使用を開示する。
【背景技術】
【０００２】
成長ホルモン分泌促進物質（ＧＨＳ）（Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．２００５，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．５７：５４１−５４６）は、成長ホルモン（ＧＨ）の分泌をインビトロ及びインビボで刺激するペプチジル分子及び非ペプチジル分子を包含する、化合物のファミリーである（Ｔａｎｎｅｎｂａｕｍ  ａｎｄ  Ｂｏｗｅｒｓ，２００１，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  １４：２１−２７）。グレリンは、成長ホルモン分泌促進物質受容体（ＧＨＳ−Ｒ）についての内在性リガンドである（Ｋｏｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  ４０２：６５６−６６０）。それは、エネルギーバランスの調節、食欲及び代謝シグナルを包含する複数のプロセスにとりわけ関与する（Ｄｉｘｉｔ  ａｎｄ  Ｔａｕｂ，２００５，Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌｙ  ４０：９００−９１０）。加えて、それは抗炎症作用を発揮し、ファゴサイトーシスを修飾し、胸腺リンパ球新生を増進するだけではなく、敗血症性ショックを減弱させる（Ｈａｔｔｏｒｉ，２００９，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８６：４２８４−４２９１）。
【０００３】
ＧＨＳは、ＧＨ分泌を刺激することに加えて、哺乳類、鳥類及び魚類における食欲及び体重増加を調節する（Ｋａｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ａ  １４９：１０９−１２８）。ＧＨＳは、複数の研究において心臓機能変数をインビボで改善すること、及び癌細胞の増殖を阻害することによる、心臓保護特性も有する（Ｌｏｃａｔｅｌｌｉ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓｏｎｉ，１９９９，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４０：４０２４−４０３１；Ｔｉｖｅｓｔｅｎ  ａｎｄ  Ｂｏｌｌａｎｏ，２０００，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４１：６０−６６；Ｃａｓｓｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８６：１７３８−１７４５）。さらに、ＧＨＳは炎症及び老化等のプロセスに関与する（Ｈａｔｔｏｒｉ，２００９，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８６：４２８４−４２９１）。
【０００４】
ヘキサマーＧＨＲＰ−６（そのアミノ酸配列はＨｉｓ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２である）は、哺乳類及び鳥類（Ｂｏｗｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１４：１５３７−４５）に加えて、甲殻類（欧州特許第ＥＰ１４７７１８１Ｂ１号）における成長ホルモンの放出の引き金となることによって、非常に強力で安全であるということが公知である。
【０００５】
動物モデルにおいて、グレリンの抗炎症効果の例が記載されている（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．１６，４３６−４４２）。大部分のそれらの研究において、病変又は用量、及び使用される治療スケジュールにかかわらず、アシル化グレリンの使用が炎症誘発性サイトカインの発現及び／又は産生を抑制することが示唆された（Ｂａａｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ３４０：４４−５８）。死亡率、ならびにインビボ及びインビトロでリポポリサッカライド（ＬＰＳ）によって引き起こされる炎症性効果に加えて、齧歯類モデルにおける敗血症の減弱におけるその役割は以前に提案されていた（Ｄｉｘｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１４：５７−６６；Ｔａｕｂ，２００７，Ｖｉｔａｍ．Ｈｏｒｍ．７７：３２５−３４６）。
【０００６】
慢性炎症のマウスモデルで遂行された研究において、グレリン及び合成アゴニストＧＨＲＰ−２は、活性化されたマクロファージからのインターロイキン６（ＩＬ−６）及び硝酸の放出を有意に阻害し、関節炎を減弱した（Ｇｒａｎａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２８８：Ｅ４８６−Ｅ４９２）。さらに、遂行された類似の研究はそれらの抗炎症効果を証明した（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１３０（６），１７０７−１７２０）。
【０００７】
２０１１年にＬｏｆｔｉ及び共同研究者によって遂行された研究（Ｌｏｆｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｋａｆｋａｓ  Ｕｎｉｖ  Ｖｅｔ  Ｆａｋ  Ｄｅｒｇ  １７（６）：９４９−９５２）において、卵内のグレリンの注射は、新しく孵化したニワトリにおける白血球鑑別カウントに影響した。用量１００ｎｇによるインキュベーションの１０日目に、それは、偽好酸球、好塩基球及び好酸球のカウント、ならびに偽好酸球／リンパ球比の増加を引き起こしたが、リンパ球を減少させた。
【０００８】
硬骨魚類の事例において、インビトロの研究は、グレリンによるニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｍｙｋｉｓｓ）白血球の処理が、これらの細胞においてスーパーオキシドアニオンの産生、ＧＨメッセンジャーＲＮＡのレベル、及びスーパーオキシドジスムターゼを増加させることを示した（Ｙａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１８９：５７−６５）。その研究において、［Ｄ−Ｌｙｓ３］−ＧＨＲＰ−６分泌促進物質受容体アンタゴニストによる事前のインキュベーション、及びＧＨの免疫中和は、この活性酸素種（Ｏ２・−）の産生を減少させたことが報告され、それは白血球へのグレリンの効果がＧＨ分泌によって媒介されることを示唆する（Ｙａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１５２：３５３−３５８）。その一方で、ＧＨＲＰ−６アナログ分泌促進物質ペプチド（Ａ２３３）により実行されたインビトロの研究は、ティラピア（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ属の種）白血球におけるファゴサイトーシス活性の指標（スーパーオキシドアニオン等）の産生が刺激されることを示した（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｊ．ｏｆ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２１４：４０９−４１９）。同じ研究において、浸漬浴によるＡ２３３の投与は、ティラピア仔魚（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ属の種）において、酵素スーパーオキシドジスムターゼによる抗酸化防衛のパラメーターに加えて、レクチン力価及び抗プロテアーゼ活性を刺激することが証明された。ＧＨＲＰ−６を経口的に与えられた稚ティラピアにおいて遂行された他の実験において、レクチン力価及び胃粘膜の上皮内リンパ球の数の増加があった（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ  ４５２  ３０４−３１０）。この後者のパラメーターは先天性免疫系に関連し、非特異的であり、特定の抗原の投与に関連しない。
【０００９】
異なる病原体に対する防御免疫は、適切なワクチンアジュバントにより生成され得る応答を要求する（Ａｗａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４：１−１０）。したがって、新規のアジュバントを同定及び開発すること、従来のワクチン接種ストラテジーへこれまで抵抗性があった病原体に対するワクチンの開発に取り組むこと、ならびに利用可能な認可アジュバントがほとんどないという限定を克服することが必要である（Ｈａｒａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２８（１２）：２３６３−６；Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｂｒａｚ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ  ４５（８）：６８１−９２）。
【００１０】
多くのアジュバントが強い非特異的炎症応答を増強し、共投与された抗原の免疫原性を増加させるが、望まれない効果も引き起こし、そういう訳で、ワクチンによって付与される至適で安全な保護を得るために、より特異的かつより直接的な免疫応答を惹起する新しいアジュバントを開発することが必要である。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、共投与された抗原への免疫応答を有効に促進することが可能なアジュバントの提供によって、上記の問題を解決する。本発明は、異なる免疫戦略において使用されるワクチンの製造における分子アジュバントとしての成長ホルモン分泌促進ペプチド（配列番号：１（ＧＨＲＰ−６）又は配列番号：２（Ａ２３３）として同定された）の使用を開示する。本発明の一実施形態において、前記ワクチンは感染性病原体によって引き起こされる疾患の予防において使用される。特定の実施形態において、これらの疾患は哺乳類、鳥類又は魚類に影響し；感染性病原体はとりわけウイルス、細菌及び外部寄生虫であり得る。
【００１２】
本発明の文脈において、「分子アジュバント」という用語は、ワクチン抗原に対する免疫応答をポジティブに修飾でき、その増加をもたらす物質を指す。現在まで分子アジュバントとしてのグレリン及びそのアナログの使用を実証又は示唆する研究はない。これとは対照的に、炎症性疾患の治療のためのグレリンの使用が提案されてきた（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １３０（６），１７０７−１７２０；Ｂａａｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ３４０：４４−５８）。既存の知識を考慮すると、ＧＨＲＰ−６又はＡ２３３をワクチン抗原と組み合わせて投与することが前記抗原に対する特異的免疫応答を刺激することを実証するという本発明において見出された効果は、予想外のものである。
【００１３】
別の実施形態において、配列番号：１（ＧＨＲＰ−６）又は配列番号：２（Ａ２３３）として同定された成長ホルモン分泌促進ペプチド、少なくともワクチン抗原、及び薬理学的に許容される賦形剤又は希釈剤を含む、ワクチン組成物も記載される。本発明のワクチン組成物は、本技術分野において当業者に公知のワクチンアジュバントとして作用する他の化合物を含み得る。これらのアジュバント内に、例えばアルミニウム塩及び油性アジュバントがある。
【００１４】
本発明の異なる実施形態を例証するために、ワクチン組成物はその中に様々な抗原及びＧＨＲＰ−６又はＡ２３３ペプチドを含んでいた。ＧＨＲＰ−６又はその構造アナログＡ２３３と組み合わせる抗原には、オボアルブミン（ＯＶＡ）、デング熱２ウイルスカプシドタンパク質（Ｃ２）、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓからのｐＰ０ペプチド（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｍａｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｖａｃｃｉｎｅ  ３０：１７８２−１７８９）、キメラタンパク質Ｐ０−ｍｙ３２（Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ  ｓａｌｍｏｎｉｓの２つの抗原の融合ポリペプチド）、ならびにＬ．ｓａｌｍｏｎｉｓからのＰ０及びＴ細胞エピトープの融合ポリペプチド（Ｐ０−ＴＴ）がある。本発明への限定ではないが、組成物はマウス、鳥類及び魚類へ投与され、前記分泌促進物質についてアジュバント効果が初めて実証された。予想外に、抗原と組み合わせたＧＨＲＰ−６又はＡ２３３の投与が、複数の動物種において、抗原特異的抗体レベルを増加させることが観察された。
【００１５】
本発明の一実施形態において、ワクチン抗原は、ペプチド、タンパク質、ウイルス、及び弱毒化細菌からなる群から選択される。本発明の１つの好ましい実施形態において、前記ワクチンは、哺乳類、鳥類又は魚類へ投与される。より好ましい実施形態において、本発明のワクチン組成物は、経口的又は注射によって投与可能（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｂｌｅ）である。特定の実施形態において、ワクチン組成物中で、配列番号：１又は配列番号：２のペプチドは、ワクチンが魚類へ経口で投与される場合に、５０〜６００μｇ／ｋｇの処方された餌の濃度である。
【００１６】
本発明はワクチン抗原に対する免疫応答を増加させる方法も開示し、それは、前記抗原の分子アジュバントとしての有効量の成長ホルモン分泌促進ペプチド（配列番号：１（ＧＨＲＰ−６）又は配列番号：２（Ａ２３３）として同定される）の投与によって特徴づけられる。本発明の一実施形態において、ワクチン抗原は感染性病原体によって引き起こされる疾患の予防のために使用される。前記方法の特定の実施形態において、ワクチン抗原及びアジュバントペプチドが経口で投与される場合に、配列番号：１又は配列番号：２の配列のペプチドは、５０〜６００μｇ／ｋｇの処方された餌で用いられる。前記方法の別の実施形態において、分子アジュバントとして作用するワクチン抗原及びペプチドが注射によって投与されるならば、配列番号：１又は配列番号：２の配列のペプチドは、０．１〜４０μｇ／ｇの動物体重で用いられる。本発明の目的のために、ペプチドＧＨＲＰ−６及びＡ２３３（公知のＧＨ分泌促進物質）は化学合成によって得られる。
【００１７】
本発明の様々な実施形態において示されるように、対象となる抗原に対する免疫応答の増加は、様々な感染性病原体（ウイルス、細菌及び外部寄生虫の実体が挙げられる）に対するより高いレベルの保護を導く。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＯＶＡ、ＧＨＲＰ−６及びフロイントアジュバント、又はＯＶＡ及びフロイントアジュバントにより免疫したマウスにおける抗体応答。Ａ．皮下経路（ｓ．ｃ）によって免疫した群における免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の力価。Ｂ．腹腔内経路（ｉ．ｐ）によって免疫した群におけるＩｇＧの力価。各々の群内の中央値及び標準偏差を示す。＊＊はｐ＜０．００１４を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。
【図２】ｓ．ｃ経路及びｉ．ｐ経路によって、ＯＶＡ、ＧＨＲＰ−６及びフロイントアジュバント（それぞれ群３及び４）；又はｓ．ｃ経路及びｉ．ｐ経路によってＯＶＡ及びフロイントアジュバント（それぞれ群５及び６）により免疫したマウスにおける抗体応答。Ａ．ＩｇＧ１の力価。Ｂ．ＩｇＧ２ａの力価。各々の群内の中央値及び標準偏差を示す。＊＊はｐ＜０．００１４を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。
【図３】ｉ．ｐ経路によって、Ａ２３３ペプチド、ＯＶＡ及びフロイントアジュバント；又はＯＶＡ及びフロイントアジュバントにより免疫したマウスにおけるＩｇＧ力価。免疫スケジュールの２２日目に抽出した血清中で検出された抗体のレベルを示す。各々の群内の中央値及び標準偏差を示す。＊＊はｐ＜０．００１４を示す。
【図４】ｓ．ｃ経路によって、Ｃ２及びアルミニウム；又はＣ２、ＧＨＲＰ−６及びアルミニウムにより免疫した群におけるＩｇＧ力価（免疫スケジュールの２８日目に検出した）。各々の群内の中央値及び標準偏差を示す。＊はｐ＜０．０５を示す。
【図５】ｉ．ｐ経路によって、Ｐ０及びフロイントアジュバント；又はＰ０、ＧＨＲＰ−６及びフロイントアジュバントにより免疫したマウスにおける免疫スケジュールの３６日目のＩｇＧ力価。各々の群内の中央値及び標準偏差を示す。＊はｐ＜０．０５を示す。
【図６】免疫原をｉ．ｐ．経路によって投与し、実験の２８日目に検出した、Ｐ０−ｍｙ３２、又はＧＨＲＰ−６もしくはペプチドＡ２３３と組み合わせたＰ０−ｍｙ３２により免疫したティラピアにおける免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）力価。Ａ．及びＣ．ｍｙ−３２に対するＩｇＭの力価。Ｂ及びＤ．Ｐ０に対するＩｇＭの力価。Ａ及びＢ中でＧＨＲＰ−６有り又は無しで処理した動物における力価を示す一方で、Ｃ及びＤ中でＡ２３３有り又は無しで処理した動物における力価を示す。各々の群内の中央値及び標準偏差を示す。＊はｐ＜０．０１を示し、＊＊はｐ＜０．００１４を示し、＊＊＊はｐ＜０００１を示す。
【図７】Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０を含むＰ０−ｍｙ３２処方、又はＧＨＲＰ−６及びＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０を含むＰ０−ｍｙ３２による免疫後の、実験の２８日目で１：１０００を超えるＩｇＭ力価のティラピアのパーセント。Ａ．抗ｍｙ３２の応答動物のパーセンテージ。Ｂ．抗Ｐ０の応答動物のパーセンテージ。
【図８】Ｐ０−ＴＴ、又はＧＨＲＰ−６もしくはペプチドＡ２３３の存在下でＰ０−ＴＴによりｉ．ｐ．経路によって魚に免疫した、ナマズ（ｃｌａｒｉａ）における、実験の２８日目のＩｇＭ抗体の応答。Ａ．アジュバントとしてのＧＨＲＰ−６による評価実験群における抗Ｐ０の力価。Ｂ．アジュバントとしてのＡ２３３による評価実験群における抗Ｐ０の力価。免疫原はすべてＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０と組み合わせた。
【図９】マゴイにおけるＡｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａに対する凝集抗体の力価。Ｙ軸値は中央値±標準誤差を表わす。＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す。群１：ＰＢＳを注射した。群２：ホルマリン不活性化Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ細胞を注射した。群３：ホルマリン不活性化Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ細胞及びＧＨＲＰ−６（１匹の魚あたり２０μｇ）を注射した。免疫原はすべてＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０と組み合わせた。
【実施例】
【００１９】
例１  ＯＶＡに対する体液性免疫応答へのＧＨＲＰ−６の共投与の効果
３６匹のメスＢＡＬＢ／ｃマウスを使用した。各々６匹の動物の６つの研究群を分離した。３つの群をｓ．ｃ経路によって免疫し、残りをｉ．ｐ経路によって処理した。すべての群において、免疫原をフロイントアジュバントにより乳化した。
群１：プラセボ（リン酸緩衝食塩水、ＰＢＳと略）。ｓ．ｃ経路。
群２：プラセボ（ＰＢＳ）。ｉ．ｐ．経路。
群３：１０μｇ／動物でＧＨＲＰ−６及び５μｇ／動物でＯＶＡ。ｓ．ｃ．経路。
群４：１０μｇ／動物でＧＨＲＰ−６及び５μｇ／動物でＯＶＡ。ｉ．ｐ経路。
群５：５μｇ／動物でＯＶＡ。ｓ．ｃ．経路。
群６：５μｇ／動物でＯＶＡ。ｉ．ｐ．経路。
【００２０】
すべての群におけるマウスは１５０μＬの免疫原を受け、免疫スケジュールの１及び１５日目に動物へ投与された。０（免疫前血清）、８、１５、２２、３６、４３及び５０日目に血液抽出を遂行した。全ＩｇＧ力価、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａを評価した。第１の免疫において完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）及び次の免疫においてフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）を使用した。
【００２１】
ＧＨＲＰ−６及びＯＶＡ（ｓ．ｃ経路によって）により免疫された群の動物は、実験の２２、３６、４３及び５０日目に、同じ経路によってＧＨＲＰ−６無しのＯＶＡを受けた群のものよりも高い力価（統計的有意差による：ｐ＜０．０５）を有していた（図１Ａ）。同じ免疫原であるが腹腔内経路によって注射した動物は、実験の３６及び４３日目に同じ挙動であった（図１Ｂ）。
【００２２】
ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａの力価を、ｓ．ｃ経路及びｉ．ｐ経路によってＧＨＲＰ−６有り又は無しのＯＶＡにより免疫された群において、３６日目に抽出した血清中で決定した（図２Ａ及び２Ｂ）。両方の投与経路について、ＧＨＲＰ−６により処理した群と前記分泌促進物質を受けなかった群との間で、ＩｇＧ２ａ力価の有意差は観察されなかった。（図２Ａ及び２Ｂ）。有意差は両方の投与経路においてＩｇＧ１について観察され、ＧＨＲＰ−６の存在下においてワクチン接種した群においてより高かった。
【００２３】
比ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ（それぞれＴｈ２又はＴｈ１の応答への差異的な反応性の測定値として）は、ＯＶＡ及びフロイントアジュバントのみを注射した群に比較して、ＧＨＲＰ−６及びフロイントアジュバントの存在下においてＯＶＡをｉ．ｐ経路によって免疫した群において有意に上回っていた。この比を表１中で示し、データは、群中の６匹の動物に対応するＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａの比の平均を表わす。
【表１】
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【００２４】
例２  ＯＶＡに対する体液性免疫応答へのペプチドＡ２３３の共投与の効果
ペプチドＡ２３３がＯＶＡへのアジュバント効果を発揮するかどうかを評価するために、１８匹のメスＢＡＬＢ／ｃマウスを使用した。すべての群におけるマウスはｉ．ｐ経路によって１５０μＬの免疫原を受け、免疫スケジュールの１及び１５日目に動物へ与えられた。０（免疫前血清）、８、１５、２２、３６、４３及び５０日目に血液サンプルを採取した。血清中に存在する全ＩｇＧの力価を評価した。動物を、５μｇのＯＶＡ／動物及び１０μｇのＡ２３３／動物（群２）、又は５μｇのＯＶＡ／動物（群３）により免疫した。対照群はＰＢＳ（群１）を注射した。すべての免疫原をフロイントアジュバントにより乳化した。
【００２５】
ＯＶＡ及びペプチドＡ２３３を注射した動物において、免疫スケジュールの２２日目に、ＯＶＡ単独により免疫したものと比較して、抗ＯＶＡの抗体力価で有意な増加があった（図３）。
【００２６】
例３  Ｃ２抗原に対する体液性免疫応答へのＧＨＲＰ−６の共投与の効果
Ｃ２抗原（デング熱ウイルスカプシドタンパク質）を、１５ｋＤａの分子量を備えたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ中で組み換えタンパク質として得た。Ｃ２によりワクチン接種したマウスにおける液性免疫応答及び細胞性免疫応答を評価するために、ＧＨＲＰ−６の存在又は非存在下において、６週齢の２４匹のメスＢＡＬＢ／ｃマウスを選択した。それらを３つの群へと分配した。実験群に従って各々の動物に免疫原を与えた。
群１：１０μｇのＣ２。
群２：１０μｇのＧＨＲＰ−６と共処理した１０μｇのＣ２。
群３：ＰＢＳ。
【００２７】
すべての群において、免疫原は水酸化アルミニウム（アラムとしても公知）をさらに含んでいた。免疫スケジュールの０、１５及び３０日目にｓ．ｃ経路によって、免疫を遂行した。血液サンプルを０（免疫前）、７、１６、２１、２８及び３５日目に採取して、全ＩｇＧ力価を査定した。
【００２８】
図４は、免疫スケジュールの２８日目に、群２（Ｃ２及びＧＨＲＰ−６により処理した）は、群１（ＧＨＲＰ−６無しでＣ２及びアジュバント水酸化アルミニウムにより処理した）に比較して、抗Ｃ２  ＩｇＧ力価の有意な増加を示したことを示す。
【００２９】
例４  Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓのペプチドＰ０に対する体液性免疫応答へのＧＨＲＰ−６の共投与の効果
ペプチドＰ０は、マダニＲ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓとその哺乳類宿主との間で、リボソームタンパク質Ｐ０のあまり配列同一性のない領域に対応する断片である。ＧＨＲＰ−６及びＰ０の共投与によって刺激された体液性免疫応答を評価するために、２４匹のメスの６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを選択し、８匹のマウスの３つの群へと分割した。各々の動物は、免疫スケジュールの１、１５及び２９日目にｉ．ｐ経路によって１５０μＬの免疫原を受けた。第１の免疫においてＦＣＡを用い、他の２つの投与においてＦＩＡを使用した。
群１  対照（ＰＢＳ）。
群２  １００μｇのＰ０。
群３  ２００μｇのＧＨＲＰ−６と共処理した１００μｇのＰ０。
【００３０】
血液サンプルを０（免疫前血清）、８、１６、２１、２８、３６、４３、５０及び５８日目に採取して、全ＩｇＧレベルを決定した。Ｐ０により免疫した動物において、ＧＨＲＰ−６の存在下で、スケジュールの３６日目の抗Ｐ０抗体レベルを示す図５中で観察されるように、ＧＨＲＰ−６を受けなかったものに比較して、ＩｇＧ力価の有意な増加があった。
【００３１】
例５  ティラピア（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ種）におけるＰ０−ｍｙ３２タンパク質に対する体液性免疫応答へのＧＨＲＰ−６又はペプチドＡ２３３の共投与の効果
Ｌ．ｓａｌｍｏｎｉｓのＰ０リボソームタンパク質の３５アミノ酸ペプチドをコードする相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）を、同じ外部寄生虫のｍｙ３２タンパク質をコードするｃＤＮＡのＮ末端部へ融合したもの（Ｃａｒｐｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｅｘｐ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ  １３５：１８８−１９９）を、宿主細菌Ｅ．ｃｏｌｉにおける対象となる遺伝子の誘導発現のためにデザインされたベクター中にクローン化することによって、キメラタンパク質Ｐ０−ｍｙ３２を生成した。このタンパク質を細菌中で産生し、金属キレート親和性クロマトグラフィーによってヒスチジンテイルを備えた融合タンパク質として精製した。
【００３２】
免疫実験を達成するために、Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ  ｎｉｌｏｔｉｃｕｓのオス稚魚の６つの研究群を、各々１５匹の動物により形成した。すべての群において、免疫原を、Ｍｏｎｔａｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０によりアジュバント化して、ｉ．ｐ．経路によって投与した。実験群は以下の免疫原を受けた。
群１：ＰＢＳ。
群２：Ｐ０−ｍｙ３２（１μｇ／ｇ魚体重）。
群３：２０μｇのＧＨＲＰ−６により共処理したＰ０−ｍｙ３２（１μｇ／ｇ魚体重）。
群４：２０μｇのＡ２３３により共処理したＰ０−ｍｙ３２（１μｇ／ｇ魚体重）。
群５：Ｐ０−ｍｙ３２（１μｇ／ｇ魚体重）。この群の魚に、注射でのｍｙ３２の投与の１週間前及び１週間後に、１ｋｇの餌あたり１００μｇのＧＨＲＰ−６を処方した餌を１日２回与えた。
【００３３】
実験の経過の間に、群１〜４中の魚に、体重の１％の率でバランスのとれた非薬用の商業的な処方で１日２回餌を与えた。免疫をスケジュールの０及び１４日目に遂行した。血液サンプルを実験の開始から０、２１、２８及び３５日目で採取した。ＧＨＲＰ−６の存在下でＰ０−ｍｙ３２を注射したティラピアにおいて、Ｐ０−ｍｙ３２を注射した群に比較して、抗ｍｙ３２のＩｇＭ抗体力価の増加があった。
【００３４】
２８日目に抽出した血清中の抗体のレベルを示す図６Ａ中で示されるように、この増加は統計的に有意であった。同じ効果は抗Ｐ０ＩｇＭ力価について観察された（図６Ｂ）。対照群に比較して、キメラ抗原とＡ２３３の共投与は、２つの構成要素に対するＩｇＭ力価の増加も可能にした（図６Ｃ及び６Ｄ）。Ｐ０−ｍｙ３２を注射し同時にＧＨＲＰ−６を含有する餌を与えた群も、修飾されない餌を与えたキメラタンパク質を注射した群に比較して、力価の増加を示した（表２）。
【表２】
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【００３５】
加えて、ｉ．ｐ経路によってＧＨＲＰ−６を含有する免疫原を注射した群（群３）において、ペプチドＧＨＲＰ−６を受けずにＰ０−ｍｙ３２により処理した群（群２）に比較して、１：１０００を超えるＩｇＭ力価の有るキメラタンパク質の両方の構成要素についての応答動物の数は、より高かった。それは図７Ａ及び７Ｂ中で理解することができる。
【００３６】
例６  ナマズ（Ｃｌａｒｉａｓ  ｇａｒｉｅｐｉｎｕｓ）における体液性免疫応答へのＧＨＲＰ−６又はＡ２３３及びＰ０−ＴＴタンパク質の共投与の効果
キメラタンパク質Ｐ０−ＴＴは、ａ）３５のアミノ酸（Ｌ．ｓａｌｍｏｎｉｓのＰ０リボソームタンパク質とその宿主のうちの１つ（Ｓａｌｍｏ  ｓａｌａｒ）における同じタンパク質との間であまり保存されていない領域に対応する）によって構成された、ｐＰ０と命名されたペプチド、ならびにｂ）それぞれはしかウイルス及び破傷風トキソイドに由来する２つのＴ細胞エピトープに基づく。実験のために、Ｃ．ｇａｒｉｅｐｉｎｕｓの４つの研究群を形成し、各々の群中に１２匹の動物があった。１グラムの動物体重あたり１μｇのＰ０−ＴＴタンパク質（群２）、又は１匹の動物あたり２０μｇのＧＨＲＰ−６もしくはＡ２３３のいずれかと共投与した、同じ用量のキメラタンパク質Ｐ０−ＴＴ（１μｇ／ｇ動物体重）（それぞれ群３及び４）により、１２０μＬの全体積でｉ．ｐ．経路によって、これらの動物を免疫した。対照群（群１）は同じ体積のＰＢＳを受けた。すべての群に対応する免疫原を、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０油性アジュバントにより乳化した。免疫を投与スケジュールの０及び１４日目に同じ条件下で遂行した。血液サンプルを実験の開始からカウントして０、２１、２８及び３５日目で採取した。
【００３７】
Ｐ０−ＴＴ及びＧＨＲＰ−６により免疫したナマズにおいて、ＧＨＲＰ−６ペプチド無しのＰ０−ＴＴを注射した群に比較した場合に、抗Ｐ０のＩｇＭ抗体力価の増加があり、それは２８日目で統計的有意差を有していた（図８Ａ）。同じ効果は、Ｐ０−ＴＴ及びＡ２３３の投与後の得られた力価について観察された（図８Ｂ）。
【００３８】
例７  細菌Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａに対するマゴイ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ）の体液性免疫応答へのＧＨＲＰ−６のアジュバント効果の実証
実験を４０±１０ｇのコイ（Ｃ．ｃａｒｐｉｏ）により実行した。これらの動物を２８±２℃の温度で６００Ｌの水槽中で飼育した。３つの実験群（各々１０匹のコイ）を確立し、以下の免疫原をｉ．ｐ．経路によって注射した。
群１：ＰＢＳ＋Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０。
群２：不活性化Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ細胞（１×１０８コロニー形成単位、ＣＦＵと省略）＋Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０。
群３：不活性化Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ細胞（１×１０８ＣＦＵ）＋２０μｇのＧＨＲＰ−６／魚＋Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０。
【００３９】
魚に０及び１４日目に注射し、血液サンプルを０及び２１日目に尾静脈から収集した。Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａに対する凝集抗体の力価は、ＧＨＲＰ−６ペプチド無しの細菌により免疫された群に比較して、細菌及びＧＨＲＰ−６により免疫された群において有意により高かったことを、この結果は示した（図９）。これらの結果は、魚における分子アジュバントとしてのＧＨＲＰ−６の効果を確証する。Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ細胞の調製及び抗体力価の測定を、以前の報告（Ｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｆｉｓｈ  ＆  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，５７−６９）に従って遂行した。
【００４０】
例８  不活性化Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ細菌及びＧＨＲＰ−６ペプチドと共投与した不活性化細菌により免疫した魚における制御された攻撃投与実験
実験を３０±５ｇのマゴイ（Ｃ．ｃａｒｐｉｏ）により実行した。これらの動物を３０±２℃の温度で２５０Ｌの水槽中で飼育した。３つの実験群（各々２０匹のコイ）を確立し、動物に以下をｉ．ｐ．経路によって注射した。
群１：ＰＢＳ＋Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０。
群２：不活性化Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ細胞（１×１０８ＣＦＵ）＋Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０。
群３：不活性化Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ細胞（１×１０８ＣＦＵ）＋２０μｇのＧＨＲＰ−６／魚＋Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０。
【００４１】
魚に０及び１４日目に注射した。攻撃投与を細菌の５０％致死用量（ＬＤ５０）のｉ．ｐ注射によって２１日目に遂行し、各々の群における死亡率を７日間記録した。相対的生存率（ＲＳＲ）を以下のように計算した。
ＲＳＲ（％）＝（対照の％死亡率−処理した動物の％死亡率）／（対照の％死亡率）×１００。
【００４２】
その結果として、６５％のＲＳＲは群２及び９５％のＲＳＲは群３において得られ、ＧＨＲＰ−６の投与が、病原体によりワクチン接種し攻撃投与した魚における生存率を増加させることを実証する。
【００４３】
例９  ：ウシ血清アルブミンに対するニワトリの体液性免疫応答へのＧＨＲＰ−６のアジュバント効果の実証
１５羽の新生ブロイラー（ハイブリッドＥＢ３４  Ｃｒｏｎｉｓｈ×Ｗｈｉｔｅ  Ｐｌｙｍｏｔｈ  Ｒｏｃｋタイプ）を使用し、それらを各々が５羽の動物の３つの実験群へと分割した。動物を、１羽の動物あたり５μｇのＢＳＡ（群２）、又は１羽の動物あたり５μｇのＢＳＡ及び２０μｇのＧＨＲＰ−６（群３）により、ｉ．ｐ経路によって免疫スケジュールの１２及び１８日目に免疫した。対照群（群１）をＰＢＳにより免疫した。血清中のＩｇＹ抗体のレベルを実験の２５日目に決定した。ＢＳＡにより免疫した群の動物ならびにＢＳＡ及びＧＨＲＰ−６を受けた動物における抗体力価間に統計的有意差があった（表３）。
【表３】
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【配列表フリーテキスト】
【００４４】
配列番号１：＜２２３＞アミド化
配列番号２：＜２２３＞人工配列の記載：ペプチドＡ２３３、ＬｙｓとＡｓｐとの間でラクタム結合を含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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