(57)【要約】  様々な実施形態では、治療剤の送達に有用である、変形可能なナノスケールビヒクル（ＤＮＶ）が提供される。ある種の実施形態では、ＤＮＶは経皮送達ができ、さらに血液脳関門を通過することができる。
2020515638.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種または複数の両親媒性ベジクル形成脂質、
コレステロール、及び
非イオン性界面活性剤
を含む、変形可能なナノスケール薬物送達ビヒクルであって、
フラボノイド（バイオフラバノイド）、イソフラボノイド、ネオフラボノイドもしくはこれらのプロドラッグ、及び／または
レスベラトロールもしくはレスベラトロール類似体、及び／または
キノンオキシドレダクターゼ（ＮＱＯ２）阻害剤、及び／または
ビスホスホネート、及び／または
抗体、及び／または
アプタマーもしくはｍｉＲＮＡ
を含む、前記ナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項２】
フラボノイド（バイオフラバノイド）、イソフラボノイド、ネオフラボノイドまたはこれらのプロドラッグを含む、請求項１に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項３】
ヘスペリジン、クエルシトリン、ルチン、タンゲレチン、ルテオリン、アピゲニン、タンゲレチン、ケルセチン、ケンフェロール、ミリセチン、フィセチン、ガランギン、イソラムネチン、パキポドール、ラムナジン、ピラノフラボノール、フラノフラボノール、ヘスペレチン、ナリンゲニン、エリオジクチオール、ホモエリオジクチオール、タキシホリン及びジヒドロケンフェロールまたはこれらのプロドラッグからなる群から選択される薬剤を含む、請求項２に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項４】
ガランギンを含む、請求項２に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項５】
プロガランギンを含む、請求項２に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項６】
ルチンを含む、請求項２に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項７】
レスベラトロールまたはレスベラトロール類似体を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項８】
レスベラトロールを含む、請求項７に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項９】
レスベラトロール類似体を含む、請求項７に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項１０】
前記レスベラトロール類似体が、２，３’，５’，６−テトラヒドロキシ−トランス−スチルベン、３，３’，４，４’−テトラヒドロキシ−トランス−スチルベンからなる群から選択される、請求項９に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項１１】
前記レスベラトロール類似体が図１４に示すレスベラトロール類似体からなる群から選択される、請求項９に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項１２】
抗体を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項１３】
前記抗体が神経変性障害の治療に有用な抗体である、請求項１２に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項１４】
前記神経変性障害が、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脳性麻痺、認知症／前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、ハンチントン病、軽度認知機能障害（ＭＣＩ）、パーキンソン病（ＰＤ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、虚血／卒中、タウオパチー、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）及び慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）からなる群から選択される障害を含む、請求項１７に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項１５】
前記抗体が、ベータアミロイド（Ａβ）、アルファシヌクレイン（α−ｓｙｎ）、タウ、ＡＰＰ及びＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ−４３）またはこれらの断片からなる群から選択されるタンパク質に結合する、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項１６】
前記抗体が、有毒なオリゴマータンパク質変異体に結合するが、前記タンパク質のモノマー、原線維または非疾患関連の形態に結合しない、請求項１５に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項１７】
前記抗体がＡβまたはその断片に結合する抗体である、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項１８】
前記抗体が、バピネオズマブ（ヒト化３Ｄ６）、ソラネズマブ（ヒト化ｍ２６６）、ガンテネルマブ、クレネズマブ（ヒト化ＩｇＧ４）、ＢＡＮ２４０１（ヒト化ｍＡｂ１５８）、ＧＳＫ９３３７７６（ヒト化ＩｇＧ１）、ＡＡＢ−００３（Ｆｃ操作バピネオズマブ）及びＳＡＲ２２８８１０（ヒト化１３Ｃ３）、ＢＩＩＢ０３７／ＢＡＲＴ（完全ヒトＩｇＧ１）からなる群から選択される抗体を含む、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項１９】
阻害性ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）及び／またはアプタマーを含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項２０】
前記アプタマーが、ベータアミロイド（Ａβ）、アルファシヌクレイン（α−ｓｙｎ）、タウ、ＡＰＰ及びＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ−４３）またはこれらの断片からなる群から選択されるタンパク質に結合する、請求項１９に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項２１】
前記阻害性ＲＮＡが、ベータアミロイド（Ａβ）、アルファシヌクレイン（α−ｓｙｎ）、タウ、ＡＰＰ及びＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ−４３）またはこれらの断片からなる群から選択されるタンパク質の発現を阻害する、請求項１９に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項２２】
キノンオキシドレダクターゼ（ＮＱＯ２）阻害剤を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項２３】
前記ＮｑＯ２阻害剤が、ＮＳＣ１４２２９（キナクリン）、ＮＳＣ９８５８、ＮＳＣ１１２３２、ＮＳＣ１２５４７、ＮＳＣ１３０００、ＮＳＣ１３４８４、ＮＳＣ１７６０２、ＮＳＣ２８４８７、ＮＳＣ６４９２４、ＮＳＣ７１７９５、ＮＳＣ７６７５０、ＮＳＣ１０１９８４、ＮＳＣ１４０２６８、ＮＳＣ１５６５２９、ＮＳＣ１６４０１７、ＮＳＣ２１９７３３、ＮＳＣ２７０９０４、ＮＳＣ２７３８２９、ＮＳＣ３０５８３１、ＮＳＣ３０５８３６、ＮＳＣ３２２０８７、ＮＳＣ３５６８２１、ＮＳＣ３７４７１８、ＮＳＣ４０７３５６、ＮＳＣ６１７９３３、ＮＳＣ６１７９３９、ＮＳＣ６２０３１８、ＮＳＣ６２８４４０、ＮＳＣ６３３２３９、ＮＳＣ６４８４２４、ＮＳＣ６５８８３５、ＮＳＣ６８２４５４、レスベラトロール、レスベラトロール類似体及びイマチニブからなる群から選択される、請求項２２に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項２４】
ビスホスホネートを含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項２５】
アデンドロネート／コレカルシフェロール、エチドロネート、ゾレドロン酸（ゾレンドロネート）、イバンドロネート、リセドロネート、アレンドロネート、パミドロネート、ネリドロネート、オルパドロネート及びチルドロネートからなる群から選択されるビスホスホネートを含む、請求項２４に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項２６】
ゾレドロン酸（ゾレンドロネート）を含む、請求項２４に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項２７】
前記両親媒性ベジクル形成脂質がリン脂質を含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項２８】
前記リン脂質が、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ−１−プロピル）、トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＡＰ）及び１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）からなる群から選択される、請求項２７に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項２９】
ミセルを含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項３０】
リポソームを含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項３１】
少なくとも２種のリン脂質を含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項３２】
前記リン脂質がＤＰＰＣ及び第２のリン脂質を含む、請求項２７〜３１のいずれか１項に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項３３】
ＤＰＰＣ対前記第２のリン脂質の比が２：１〜１：２の範囲である、請求項３２に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項３４】
ＤＰＰＣ対前記第２のリン脂質の比が約１：１である、請求項３２に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項３５】
総リン脂質対コレステロールの比が約１２：２〜約５：４もしくは約５：３、または約１０：２〜約６：２の範囲である、請求項２７〜３４のいずれか１項に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項３６】
リン脂質対第２のリン脂質対コレステロールの比が約４：４：２である、請求項３５に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項３７】
リン脂質対第２のリン脂質の比が約５：３である、請求項３５に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項３８】
脂質（コレステロールを含む）対非イオン性界面活性剤のｗ／ｗ比が約８５：５〜約８５：２５または約８５：１０〜約８５：２０の範囲である、請求項１〜３７のいずれか１項に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項３９】
脂質（コレステロールを含む）対界面活性剤のｗ／ｗ比が約８５：１５である、請求項３８に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項４０】
前記非イオン性界面活性剤が、Ｓｐａｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、ＢＲＩＪ（登録商標）７６（ステアリルポリ（１０）オキシエチレンエーテル）、ＢＲＩＪ（登録商標）７８（ステアリルポリ（２０）オキシエチレンエーテル）、ＢＲＩＪ（登録商標）９６（オレイルポリ（１０）オキシエチレンエーテル）及びＢＲＩＪ（登録商標）７２１（ステアリルポリ（２１）オキシエチレンエーテル）からなる群から選択される界面活性剤を含む、請求項１〜３９のいずれか１項に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項４１】
約１０重量％〜約２０重量％または約１５重量％のＳｐａｎ８０を含む、請求項４０に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項４２】
中性（無電荷）である、請求項１〜４０のいずれか１項に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項４３】
前記リン脂質がＤＰＰＣ及びＤＯＰＥを含む、請求項４２に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項４４】
陽イオン性である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項４５】
前記リン脂質がＤＰＰＣ及びＤＯＴＡＰを含む、請求項４４に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項４６】
陰イオン性である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項４７】
前記リン脂質がＤＰＰＣ及びＤＨＰを含む、請求項４６に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項４８】
前記ビヒクル（ＤＮＶ）が球状の形ではない、請求項１〜４７のいずれか１項に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項４９】
前記ビヒクル（ＤＮＶ）が不規則な形である、請求項１〜４８のいずれか１項に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項５０】
前記ビヒクル（ＤＮＶ）が安定的であり、少なくとも１週間または少なくとも２週間または少なくとも３週間または少なくとも４週間または少なくとも２か月間または少なくとも３か月間または少なくとも４か月間または少なくとも５か月間または少なくとも６か月間または少なくとも９か月間または少なくとも１２か月間または少なくとも１８か月間または少なくとも２４か月間凍結乾燥粉末として保存された後、機能的ＤＮＶに再構成され得る、請求項１〜４９のいずれか１項に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項５１】
血清半減期を延ばすためにポリマーで機能化される、請求項１〜５０のいずれか１項に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項５２】
前記ポリマーがポリエチレングリコール及び／またはセルロースもしくは変性セルロースを含む、請求項５１に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項５３】
前記ＤＮＶが、約５０ｎｍまたは約６０ｎｍまたは約７０ｎｍまたは約８０ｎｍまたは約９０ｎｍまたは約１００ｎｍから約１０μｍまたは約５μｍまたは約１μｍまたは約９００ｎｍまたは約８００ｎｍまたは約７００ｎｍまたは約６００ｎｍまたは約５００ｎｍまたは約４００ｎｍまたは約３００ｎｍまでの平均直径のサイズの範囲である、請求項１〜５２のいずれか１項に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項５４】
前記ＤＮＶが約５０ｎｍから約２７５ｎｍまでの平均直径のサイズの範囲である、請求項１〜５２のいずれか１項に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項５５】
前記ＤＮＶが約５０ｎｍの平均直径、または約１００ｎｍの平均直径、または約１５０ｎｍの平均直径である、請求項１〜５２のいずれか１項に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項５６】
細胞表面マーカーに結合する抗体またはリガンドに結合している、請求項１〜５５のいずれか１項に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項５７】
前記細胞表面マーカーが腫瘍細胞のマーカーである、請求項５６に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項５８】
前記細胞表面マーカーが表１のマーカーを含む、請求項５７に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項５９】
脳標的化分子及び／または脳透過性が増大している分子に結合している、請求項１〜５５のいずれか１項に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項６０】
前記脳標的化分子及び／または脳透過性が増大している分子が、トランスフェリン、インスリン、脳透過性が増大している小分子、例えば、ベンゾジアゼピン、中性アミノ酸トランスポーターリガンド及びグルコース輸送体リガンドからなる群から選択される、請求項５９に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項６１】
トランスフェリンがナノスケール薬物送達ビヒクルに結合している、請求項６０に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項６２】
葉酸がナノスケール薬物送達ビヒクルに結合している、請求項６０に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【請求項６３】
請求項１〜６２のいずれか１項に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル及び医薬的に許容可能な担体を含む、医薬製剤。
【請求項６４】
経口送達、イソフォレッティク送達、皮下送達、経皮送達、非経口送達、エアロゾル投与、吸入による投与、静脈内投与及び直腸内投与からなる群から選択される経路による送達のために調合される、請求項６３に記載の製剤。
【請求項６５】
経口投与のために調合される、請求項６４に記載の製剤。
【請求項６６】
経皮投与のために調合される、請求項６４に記載の製剤。
【請求項６７】
経皮パッチ剤として提供される、請求項６６に記載の製剤。
【請求項６８】
全身投与のために調合される、請求項６４に記載の製剤。
【請求項６９】
単位投与製剤である、請求項６３〜６８のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項７０】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載の有効量の積載されたナノスケール薬物送達ビヒクルを、それらを必要とする対象に投与すること
を含む、神経変性脳障害の治療または予防の方法。
【請求項７１】
前記神経変性脳障害が、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脳性麻痺、認知症／前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、ハンチントン病、軽度認知機能障害（ＭＣＩ）、パーキンソン病（ＰＤ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、虚血／卒中、タウオパチー、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）及び慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）からなる群から選択される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記ＤＳＶ（複数可）が、アミロイド形成経路の阻害剤またはＡＰＰプロセシングをアミロイド形成から非アミロイド形成経路に切り替える薬剤を含む、請求項７０〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前アルツハイマー状態及び／または認知機能障害の発症を予防するか遅らせる、及び／または前アルツハイマー状態及び／または認知機能障害の１つもしくは複数の症状を改善する、及び／または前アルツハイマー状態もしくは認知機能障害のアルツハイマー病への進行を予防するか遅らせる、及び／またはアルツハイマー病の１つもしくは複数の症状を改善する、及び／またはアルツハイマー病を回復させる、及び／またはアルツハイマー病の進行の速度を低下させる、請求項７０〜７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
治療剤を対象に送達する方法であって、前記薬剤が、フラボノイド（バイオフラバノイド）、イソフラボノイド、ネオフラボノイドもしくはこれらのプロドラッグ、及び／または
レスベラトロールもしくはレスベラトロール類似体、及び／または
キノンオキシドレダクターゼ（ＮＱＯ２）阻害剤、及び／または
ビスホスホネート、及び／または
抗体、
及び／または
アプタマーもしくは阻害性ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）
を含み、
請求項１〜６２のいずれか１項に記載のナノスケール薬物送達ビヒクルを前記対象に投与することを含み、前記ナノスケール送達ビヒクルが前記治療剤を含む、前記方法。
【請求項７５】
前記対象がヒトである、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記対象がヒト以外の哺乳動物である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記ナノスケール薬物送達ビヒクルが、経口送達、イソフォレッティク送達、皮下送達、経皮送達、非経口送達、エアロゾル投与、吸入による投与、静脈内投与及び直腸内投与からなる群から選択される経路を介して送達される、請求項７４〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記ナノスケール薬物送達ビヒクルが血液脳関門を超えてカーゴを送達する、請求項７４〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記ナノスケール薬物送達ビヒクルが経皮的に適用され、前記血液脳関門を超えてカーゴを送達する、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記ナノスケール薬物送達ビヒクルが頭蓋顔面骨及び／または口腔骨にカーゴを局部的に送達する、請求項７４〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
前記ナノスケール薬物送達ビヒクルが歯槽骨にカーゴを送達する、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記ナノスケール薬物送達ビヒクルが局所、皮内または皮下部位にカーゴを局部的に送達する、請求項７４〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
前記ナノスケール薬物送達ビヒクルが頭蓋冠の皮膚に及び／または下部の骨にカーゴを送達する、請求項７４〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記ナノスケール薬物送達ビヒクルが口腔粘膜に適用される、請求項７４〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年４月３日に出願されたＵＳＳＮ６２／４８０，９２４に対する利益及び優先権を主張し、これは、すべての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府の支援の記載
［該当なし］
【背景技術】
【０００３】
現代の医学は、様々な疾患病態を首尾よく治療することができる新薬及び関連する送達システムを我々に提供する。しかし、薬物は標的部位のみで有効であり、体循環において無効である、またはさらには有毒でさえある場合が多い。したがって、局在型薬物送達システムは、投薬量を低減させ、他の毒性薬物の有効性を増大させ、有害作用を低減または排除し、その結果として、患者の服薬遵守及び転帰を増大させる可能性があると思われる。
【０００４】
１９を超える認可された経皮的薬物送達システム及びいくつかの実験的なもの、例えば、パッチ剤、マイクロニードル、プラスチックポリマー及び脂質ナノ粒子ならびにハイドロゲルマトリックスが存在する（例えば、Ｐｒａｕｓｎｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６（１１）：１２６１−２６８、Ｐｅｔｅｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．１７３（１−２）：１９３−２０２、Ｍａｄｈａｖ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．，９（６）：６２９−６４７、Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．１５３（２）：１０６−１１６を参照されたい）。これらのシステムは、輸送、安全性及び有効性の改善に悩まされることが多い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＵＳＳＮ６２／４８０，９２４
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｐｒａｕｓｎｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６（１１）：１２６１−２６８
【非特許文献２】Ｐｅｔｅｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．１７３（１−２）：１９３−２０２
【非特許文献３】Ｍａｄｈａｖ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．，９（６）：６２９−６４７
【非特許文献４】Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．１５３（２）：１０６−１１６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
様々な実施形態では、治療剤の送達に有用である、変形可能なナノスケールビヒクル（ＤＮＶ）が提供される。ある種の実施形態では、ＤＮＶは経皮送達ができ、さらに血液脳関門を通過することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書で企図される様々な実施形態は、以下の１つまたは複数を含むことができるが、それらに限定される必要はない：
【０００９】
実施形態１：１種または複数の両親媒性ベジクル形成脂質、
コレステロール、及び
非イオン性界面活性剤
を含む、変形可能なナノスケール薬物送達ビヒクルであって、
フラボノイド（バイオフラバノイド）、イソフラボノイド、ネオフラボノイドもしくはこれらのプロドラッグ、及び／または
レスベラトロールもしくはレスベラトロール類似体、及び／または
キノンオキシドレダクターゼ（ＮＱＯ２）阻害剤、及び／または
ビスホスホネート、及び／または
抗体、及び／または
アプタマーもしくはｍｉＲＮＡ
を含む、前記ナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００１０】
実施形態２：フラボノイド（バイオフラバノイド）、イソフラボノイド、ネオフラボノイドまたはこれらのプロドラッグを含む、実施形態１に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００１１】
実施形態３：ヘスペリジン、クエルシトリン、ルチン、タンゲレチン、ルテオリン、アピゲニン、タンゲレチン、ケルセチン、ケンフェロール、ミリセチン、フィセチン、ガランギン、イソラムネチン、パキポドール、ラムナジン、ピラノフラボノール、フラノフラボノール、ヘスペレチン、ナリンゲニン、エリオジクチオール、ホモエリオジクチオール、タキシホリン及びジヒドロケンフェロールまたはこれらのプロドラッグからなる群から選択される薬剤を含む、実施形態２に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００１２】
実施形態４：ガランギンを含む、実施形態２に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００１３】
実施形態５：プロガランギンを含む、実施形態２に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００１４】
実施形態６：ルチンを含む、実施形態２に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００１５】
実施形態７：レスベラトロールまたはレスベラトロール類似体を含む、実施形態１〜６のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００１６】
実施形態８：レスベラトロールを含む、実施形態７に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００１７】
実施形態９：レスベラトロール類似体を含む、実施形態７に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００１８】
実施形態１０：前記レスベラトロール類似体が２，３’，５’，６−テトラヒドロキシ−トランス−スチルベン、３，３’，４，４’−テトラヒドロキシ−トランス−スチルベンからなる群から選択される、実施形態９に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００１９】
実施形態１１：前記レスベラトロール類似体が図１４に示すレスベラトロール類似体からなる群から選択される、実施形態９に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００２０】
実施形態１２：抗体を含む、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００２１】
実施形態１３：前記抗体が神経変性障害の治療に有用な抗体である、実施形態１２に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００２２】
実施形態１４：前記神経変性障害が、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脳性麻痺、認知症／前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、ハンチントン病、軽度認知機能障害（ＭＣＩ）、パーキンソン病（ＰＤ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、虚血／卒中、タウオパチー、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）及び慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）からなる群から選択される障害を含む、実施形態１７に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００２３】
実施形態１５：前記抗体が、ベータアミロイド（Ａβ）、アルファシヌクレイン（α−ｓｙｎ）、タウ、ＡＰＰ及びＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ−４３）またはこれらの断片からなる群から選択されるタンパク質に結合する、実施形態１２〜１４のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００２４】
実施形態１６：前記抗体が、有毒なオリゴマータンパク質変異体に結合するが、前記タンパク質のモノマー、原線維または非疾患関連の形態に結合しない、実施形態１５に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００２５】
実施形態１７：前記抗体がＡβまたはその断片に結合する抗体である、実施形態１２〜１６のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００２６】
実施形態１８：前記抗体が、バピネオズマブ（ヒト化３Ｄ６）、ソラネズマブ（ヒト化ｍ２６６）、ガンテネルマブ、クレネズマブ（ヒト化ＩｇＧ４）、ＢＡＮ２４０１（ヒト化ｍＡｂ１５８）、ＧＳＫ９３３７７６（ヒト化ＩｇＧ１）、ＡＡＢ−００３（Ｆｃ操作バピネオズマブ）及びＳＡＲ２２８８１０（ヒト化１３Ｃ３）、ＢＩＩＢ０３７／ＢＡＲＴ（完全ヒトＩｇＧ１）からなる群から選択される抗体を含む、実施形態１２〜１７のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００２７】
実施形態１９：阻害性ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）及び／またはアプタマーを含む、実施形態１〜１８のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００２８】
実施形態２０：前記アプタマーが、ベータアミロイド（Ａβ）、アルファシヌクレイン（α−ｓｙｎ）、タウ、ＡＰＰ及びＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ−４３）またはこれらの断片からなる群から選択されるタンパク質に結合する、実施形態１９に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００２９】
実施形態２１：前記阻害性ＲＮＡが、ベータアミロイド（Ａβ）、アルファシヌクレイン（α−ｓｙｎ）、タウ、ＡＰＰ及びＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ−４３）またはこれらの断片からなる群から選択されるタンパク質の発現を阻害する、実施形態１９に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００３０】
実施形態２２：キノンオキシドレダクターゼ（ＮＱＯ２）阻害剤を含む、実施形態１〜２１のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００３１】
実施形態２３：前記ＮｑＯ２阻害剤が、ＮＳＣ１４２２９（キナクリン）、ＮＳＣ９８５８、ＮＳＣ１１２３２、ＮＳＣ１２５４７、ＮＳＣ１３０００、ＮＳＣ１３４８４、ＮＳＣ１７６０２、ＮＳＣ２８４８７、ＮＳＣ６４９２４、ＮＳＣ７１７９５、ＮＳＣ７６７５０、ＮＳＣ１０１９８４、ＮＳＣ１４０２６８、ＮＳＣ１５６５２９、ＮＳＣ１６４０１７、ＮＳＣ２１９７３３、ＮＳＣ２７０９０４、ＮＳＣ２７３８２９、ＮＳＣ３０５８３１、ＮＳＣ３０５８３６、ＮＳＣ３２２０８７、ＮＳＣ３５６８２１、ＮＳＣ３７４７１８、ＮＳＣ４０７３５６、ＮＳＣ６１７９３３、ＮＳＣ６１７９３９、ＮＳＣ６２０３１８、ＮＳＣ６２８４４０、ＮＳＣ６３３２３９、ＮＳＣ６４８４２４、ＮＳＣ６５８８３５、ＮＳＣ６８２４５４、レスベラトロール、レスベラトロール類似体及びイマチニブからなる群から選択される、実施形態２２に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００３２】
実施形態２４：ビスホスホネートを含む、実施形態１〜２３のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００３３】
実施形態２５：アデンドロネート／コレカルシフェロール、エチドロネート、ゾレドロン酸（ゾレンドロネート）、イバンドロネート、リセドロネート、アレンドロネート、パミドロネート、ネリドロネート、オルパドロネート及びチルドロネートからなる群から選択されるビスホスホネートを含む、実施形態２４に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００３４】
実施形態２６：ゾレドロン酸（ゾレンドロネート）を含む、実施形態２４に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００３５】
実施形態２７：前記両親媒性ベジクル形成脂質がリン脂質を含む、実施形態１〜２６のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００３６】
実施形態２８：前記リン脂質が、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ−１−プロピル）、トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＡＰ）及び１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）からなる群から選択される、実施形態２７に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００３７】
実施形態２９：ミセルを含む、実施形態１〜２８のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００３８】
実施形態３０：リポソームを含む、実施形態１〜２８のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００３９】
実施形態３１：少なくとも２種のリン脂質を含む、実施形態１〜３０のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００４０】
実施形態３２：前記リン脂質がＤＰＰＣ及び第２のリン脂質を含む、実施形態２７〜３１のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００４１】
実施形態３３：ＤＰＰＣ対前記第２のリン脂質の比が２：１〜１：２の範囲である、実施形態３２に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００４２】
実施形態３４：ＤＰＰＣ対前記第２のリン脂質の比が約１：１である、実施形態３２に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００４３】
実施形態３５：総リン脂質対コレステロールの比が約１２：２〜約５：４もしくは約５：３、または約１０：２〜約６：２の範囲である、実施形態２７〜３４のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００４４】
実施形態３６：リン脂質対第２のリン脂質対コレステロールの比が約４：４：２である、実施形態３５に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００４５】
実施形態３７：リン脂質対第２のリン脂質の比が約５：３である、実施形態３５に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００４６】
実施形態３８：脂質（コレステロールを含む）対非イオン性界面活性剤のｗ／ｗ比が約８５：５〜約８５：２５または約８５：１０〜約８５：２０の範囲である、実施形態１〜３７のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００４７】
実施形態３９：脂質（コレステロールを含む）対界面活性剤のｗ／ｗ比が約８５：１５である、実施形態３８に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００４８】
実施形態４０：前記非イオン性界面活性剤が、Ｓｐａｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、ＢＲＩＪ（登録商標）７６（ステアリルポリ（１０）オキシエチレンエーテル）、ＢＲＩＪ（登録商標）７８（ステアリルポリ（２０）オキシエチレンエーテル）、ＢＲＩＪ（登録商標）９６（オレイルポリ（１０）オキシエチレンエーテル）及びＢＲＩＪ（登録商標）７２１（ステアリルポリ（２１）オキシエチレンエーテル）からなる群から選択される界面活性剤を含む、実施形態１〜３９のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００４９】
実施形態４１：約１０重量％〜約２０重量％または約１５重量％のＳｐａｎ８０を含む、実施形態４０に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００５０】
実施形態４２：中性（無電荷）である、実施形態１〜４０のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００５１】
実施形態４３：前記リン脂質がＤＰＰＣ及びＤＯＰＥを含む、実施形態４２に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００５２】
実施形態４４：陽イオン性である、実施形態１〜３０のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００５３】
実施形態４５：前記リン脂質がＤＰＰＣ及びＤＯＴＡＰを含む、実施形態４４に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００５４】
実施形態４６：陰イオン性である、実施形態１〜３０のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００５５】
実施形態４７：前記リン脂質がＤＰＰＣ及びＤＨＰを含む、実施形態４６に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００５６】
実施形態４８：前記ビヒクル（ＤＮＶ）が球状の形ではない、実施形態１〜４７のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００５７】
実施形態４９：前記ビヒクル（ＤＮＶ）が不規則な形である、実施形態１〜４８のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００５８】
実施形態５０：前記ビヒクル（ＤＮＶ）が安定的であり、少なくとも１週間または少なくとも２週間または少なくとも３週間または少なくとも４週間または少なくとも２か月間または少なくとも３か月間または少なくとも４か月間または少なくとも５か月間または少なくとも６か月間または少なくとも９か月間または少なくとも１２か月間または少なくとも１８か月間または少なくとも２４か月間凍結乾燥粉末として保存された後、機能的ＤＮＶに再構成され得る、実施形態１〜４９のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００５９】
実施形態５１：血清半減期を延ばすためにポリマーで機能化される、実施形態１〜５０のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００６０】
実施形態５２：前記ポリマーがポリエチレングリコール及び／またはセルロースもしくは変性セルロースを含む、実施形態５１に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００６１】
実施形態５３：前記ＤＮＶが、約５０ｎｍまたは約６０ｎｍまたは約７０ｎｍまたは約８０ｎｍまたは約９０ｎｍまたは約１００ｎｍから約１０μｍまたは約５μｍまたは約１μｍまたは約９００ｎｍまたは約８００ｎｍまたは約７００ｎｍまたは約６００ｎｍまたは約５００ｎｍまたは約４００ｎｍまたは約３００ｎｍまでの平均直径のサイズの範囲である、実施形態１〜５２のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００６２】
実施形態５４：前記ＤＮＶが約５０ｎｍから約２７５ｎｍまでの平均直径のサイズの範囲である、実施形態１〜５２のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００６３】
実施形態５５：前記ＤＮＶが約５０ｎｍの平均直径、または約１００ｎｍの平均直径、または約１５０ｎｍの平均直径である、実施形態１〜５２のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００６４】
実施形態５６：細胞表面マーカーに結合する抗体またはリガンドに結合している、実施形態１〜５５のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００６５】
実施形態５７：前記細胞表面マーカーが腫瘍細胞のマーカーである、実施形態５６に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００６６】
実施形態５８：前記細胞表面マーカーが表１のマーカーを含む、実施形態５７に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００６７】
実施形態５９：脳標的化分子及び／または脳透過性が増大している分子に結合している、実施形態１〜５５のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００６８】
実施形態６０：前記脳標的化分子及び／または脳透過性が増大している分子が、トランスフェリン、インスリン、脳透過性が増大している小分子、例えば、ベンゾジアゼピン、中性アミノ酸トランスポーターリガンド及びグルコース輸送体リガンドからなる群から選択される、実施形態５９に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００６９】
実施形態６１：トランスフェリンがナノスケール薬物送達ビヒクルに結合している、実施形態６０に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００７０】
実施形態６２：葉酸がナノスケール薬物送達ビヒクルに結合している、実施形態６０に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００７１】
実施形態６３：実施形態１〜６２のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル及び医薬的に許容可能な担体を含む、医薬製剤。
【００７２】
実施形態６４：経口送達、イソフォレッティク送達（ｉｓｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）、皮下送達、経皮送達、非経口送達、エアロゾル投与、吸入による投与、静脈内投与及び直腸内投与からなる群から選択される経路による送達のために調合される、実施形態６３に記載の製剤。
【００７３】
実施形態６５：経口投与のために調合される、実施形態６４に記載の製剤。
【００７４】
実施形態６６：経皮投与のために調合される、実施形態６４に記載の製剤。
【００７５】
実施形態６７：経皮パッチ剤として提供される、実施形態６６に記載の製剤。
【００７６】
実施形態６８：全身投与のために調合される、実施形態６４に記載の製剤。
【００７７】
実施形態６９：単位投与製剤である、実施形態６３〜６８のいずれか１つに記載の製剤。
【００７８】
実施形態７０：実施形態１〜２８のいずれか１つに記載の有効量の積載されたナノスケール薬物送達ビヒクルを、それらを必要とする対象に投与すること
を含む、神経変性脳障害の治療または予防の方法。
【００７９】
実施形態７１：前記神経変性脳障害が、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脳性麻痺、認知症／前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、ハンチントン病、軽度認知機能障害（ＭＣＩ）、パーキンソン病（ＰＤ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、虚血／卒中、タウオパチー、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）及び慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）からなる群から選択される、実施形態７０に記載の方法。
【００８０】
実施形態７２：前記ＤＳＶ（複数可）が、アミロイド形成経路の阻害剤またはＡＰＰプロセシングをアミロイド形成から非アミロイド形成経路に切り替える薬剤を含む、実施形態７０〜７１のいずれか１つに記載の方法。
【００８１】
実施形態７３：前アルツハイマー状態及び／または認知機能障害の発症を予防するか遅らせる、及び／または前アルツハイマー状態及び／または認知機能障害の１つもしくは複数の症状を改善する、及び／または前アルツハイマー状態もしくは認知機能障害のアルツハイマー病への進行を予防するか遅らせる、及び／またはアルツハイマー病の１つもしくは複数の症状を改善する、及び／またはアルツハイマー病を回復させる、及び／またはアルツハイマー病の進行の速度を低下させる、実施形態７０〜７２のいずれか１つに記載の方法。
【００８２】
実施形態７４：治療剤を対象に送達する方法であって、前記薬剤が、フラボノイド（バイオフラバノイド）、イソフラボノイド、ネオフラボノイドもしくはこれらのプロドラッグ、及び／またはレスベラトロールもしくはレスベラトロール類似体、及び／またはキノンオキシドレダクターゼ（ＮＱＯ２）阻害剤、及び／またはビスホスホネート、及び／または抗体、及び／またはアプタマーもしくは阻害性ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）を含む実施形態１〜６２のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクルを前記対象に投与することを含み、前記ナノスケール送達ビヒクルが前記治療剤を含む、前記方法。
【００８３】
実施形態７５：前記対象がヒトである、実施形態７４に記載の方法。
【００８４】
実施形態７６：前記対象がヒト以外の哺乳動物である、実施形態７４に記載の方法。
【００８５】
実施形態７７：前記ナノスケール薬物送達ビヒクルが、経口送達、イソフォレッティク送達、皮下送達、経皮送達、非経口送達、エアロゾル投与、吸入による投与、静脈内投与及び直腸内投与からなる群から選択される経路を介して送達される、実施形態７４〜７６のいずれか１つに記載の方法。
【００８６】
実施形態７８：前記ナノスケール薬物送達ビヒクルが血液脳関門を超えてカーゴを送達する、実施形態７４〜７６のいずれか１つに記載の方法。
【００８７】
実施形態７９：前記ナノスケール薬物送達ビヒクルが経皮的に適用され、血液脳関門を超えてカーゴを送達する、実施形態７８に記載の方法。
【００８８】
実施形態８０：前記ナノスケール薬物送達ビヒクルが頭蓋顔面骨及び／または口腔骨にカーゴを局部的に送達する、実施形態７４〜７６のいずれか１つに記載の方法。
【００８９】
実施形態８１：前記ナノスケール薬物送達ビヒクルが歯槽骨にカーゴを送達する、実施形態８０に記載の方法。
【００９０】
実施形態８２：前記ナノスケール薬物送達ビヒクルが局所、皮内または皮下部位にカーゴを局部的に送達する、実施形態７４〜７６のいずれか１つに記載の方法。
【００９１】
実施形態８３：前記ナノスケール薬物送達ビヒクルが頭蓋冠の皮膚に及び／または下部の骨にカーゴを送達する、実施形態７４〜７６のいずれか１つに記載の方法。
【００９２】
実施形態８４：前記ナノスケール薬物送達ビヒクルが口腔粘膜に適用される、実施形態７４〜７６のいずれか１つに記載の方法。
【００９３】
実施形態８５：前記ビヒクルが、
１種または複数の両親媒性ベジクル形成脂質、
コレステロール、及び
非イオン性界面活性剤
を含む、変形可能なナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００９４】
実施形態８６：前記両親媒性ベジクル形成脂質がリン脂質を含む、実施形態８５に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００９５】
実施形態８７：前記リン脂質が、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ−１−プロピル）、トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＡＰ）及び１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）からなる群から選択される、実施形態８６に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００９６】
実施形態８８：ミセルを含む、実施形態８５〜８７のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００９７】
実施形態８９：リポソームを含む、実施形態８５〜８７のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００９８】
実施形態９０：少なくとも２種のリン脂質を含む、実施形態８５〜８９のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【００９９】
実施形態９１：前記リン脂質がＤＰＰＣ及び第２のリン脂質を含む、実施形態８６〜９０のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１００】
実施形態９２：ＤＰＰＣ対前記第２のリン脂質の比が２：１〜１：２の範囲である、実施形態９１に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１０１】
実施形態９３：ＤＰＰＣ対前記第２のリン脂質の比が約１：１である、実施形態９１に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１０２】
実施形態９４：総リン脂質対コレステロールの比が約１２：２〜約５：４もしくは約５：３、または約１０：２〜約６：２の範囲である、実施形態８６〜９３のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１０３】
実施形態９５：リン脂質対第２のリン脂質対コレステロールの比が約４：４：２である、実施形態９４に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１０４】
実施形態９６：リン脂質対第２のリン脂質の比が約５：３である、実施形態９４に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１０５】
実施形態９７：脂質（コレステロールを含む）対非イオン性界面活性剤のｗ／ｗ比が約８５：５〜約８５：２５または約８５：１０〜約８５：２０の範囲である、実施形態８５〜９６のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１０６】
実施形態９８：脂質（コレステロールを含む）対界面活性剤のｗ／ｗ比が約８５：１５である、実施形態９７に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１０７】
実施形態９９：前記非イオン性界面活性剤が、Ｓｐａｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０、ＢＲＩＪ（登録商標）７６（ステアリルポリ（１０）オキシエチレンエーテル）、ＢＲＩＪ（登録商標）７８（ステアリルポリ（２０）オキシエチレンエーテル）、ＢＲＩＪ（登録商標）９６（オレイルポリ（１０）オキシエチレンエーテル）及びＢＲＩＪ（登録商標）７２１（ステアリルポリ（２１）オキシエチレンエーテル）からなる群から選択される界面活性剤を含む、実施形態８５〜９８のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１０８】
実施形態１００：約１０重量％〜約２０重量％または約１５重量％のＳｐａｎ８０を含む、実施形態９９に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１０９】
実施形態１０１：中性（無電荷）である、実施形態８５〜９９のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１１０】
実施形態１０２：前記リン脂質がＤＰＰＣ及びＤＯＰＥを含む、実施形態１０１に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１１１】
実施形態１０３：陽イオン性である、実施形態８５〜８９のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１１２】
実施形態１０４：前記リン脂質がＤＰＰＣ及びＤＯＴＡＰを含む、実施形態１０３に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１１３】
実施形態１０５：陰イオン性である、実施形態８５〜８９のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１１４】
実施形態１０６：前記リン脂質がＤＰＰＣ及びＤＨＰを含む、実施形態１０５に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１１５】
実施形態１０７：前記ビヒクル（ＤＮＶ）が球状の形ではない、実施形態８５〜１０６のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１１６】
実施形態１０８：前記ビヒクル（ＤＮＶ）が不規則な形である、実施形態８５〜１０７のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１１７】
実施形態１０９：前記ビヒクル（ＤＮＶ）が安定的であり、少なくとも１週間または少なくとも２週間または少なくとも３週間または少なくとも４週間または少なくとも２か月間または少なくとも３か月間または少なくとも４か月間または少なくとも５か月間または少なくとも６か月間または少なくとも９か月間または少なくとも１２か月間または少なくとも１８か月間または少なくとも２４か月間凍結乾燥粉末として保存された後、機能的ＤＮＶに再構成され得る、実施形態８５〜１０８のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１１８】
実施形態１１０：血清半減期を延ばすためにポリマーで機能化される、実施形態８５〜１０９のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１１９】
実施形態１１１：前記ポリマーがポリエチレングリコール及び／またはセルロースもしくは変性セルロースを含む、実施形態１１０に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１２０】
実施形態１１２：前記ＤＮＶが、約５０ｎｍまたは約６０ｎｍまたは約７０ｎｍまたは約８０ｎｍまたは約９０ｎｍまたは約１００ｎｍから約１０μｍまたは約５μｍまたは約１μｍまたは約９００ｎｍまたは約８００ｎｍまたは約７００ｎｍまたは約６００ｎｍまたは約５００ｎｍまたは約４００ｎｍまたは約３００ｎｍまでの平均直径のサイズの範囲である、実施形態８５〜１１１のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１２１】
実施形態１１３：前記ＤＮＶが約５０ｎｍから約２７５ｎｍまでの平均直径のサイズの範囲である、実施形態８５〜１１１のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１２２】
実施形態１１４：前記ＤＮＶが約５０ｎｍの平均直径、または約１００ｎｍの平均直径、または約１５０ｎｍの平均直径である、実施形態８５〜１１１のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１２３】
実施形態１１５：細胞表面マーカーに結合する抗体またはリガンドに結合している、実施形態８５〜１１４のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１２４】
実施形態１１６：前記細胞表面マーカーが腫瘍細胞のマーカーである、実施形態１１５に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１２５】
実施形態１１７：前記細胞表面マーカーが表１のマーカーを含む、実施形態１１６に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１２６】
実施形態１１８：脳標的化分子及び／または脳透過性が増大している分子に結合している、実施形態８５〜１１４のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１２７】
実施形態１１９：前記脳標的化分子及び／または脳透過性が増大している分子が、トランスフェリン、インスリン、脳透過性が増大している小分子、例えば、ベンゾジアゼピン、中性アミノ酸トランスポーターリガンド及びグルコース輸送体リガンドからなる群から選択される、実施形態１１８に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１２８】
実施形態１２０：トランスフェリンがナノスケール薬物送達ビヒクルに結合している、実施形態１１９に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１２９】
実施形態１２１：葉酸がナノスケール薬物送達ビヒクルに結合している、実施形態１１９に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１３０】
実施形態１２２：前記ＤＮＶがアミロイド形成経路の阻害剤またはＡＰＰプロセシングをアミロイド形成から非アミロイド形成経路に切り替える薬剤を含む、実施形態８５〜１２１のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１３１】
実施形態１２３：前記ＤＮＶが、ＡＰＰまたはｓＡＰＰα、ガランギン、ジスルフィラム及び／またはその類似体、ホノキオール及び／またはその類似体、トロピセトロン及び／またはその類似体、ニメタゼパム及び／またはその類似体、トロピノール−エステル及び／または関連したエステル及び／またはそれらの類似体、ＴｒｋＡキナーゼ阻害剤（例えば、ＡＤＤＮ−１３５１）及び／またはその類似体、Ｄ２受容体アゴニスト、アルファ１−アドレナリン受容体アンタゴニストならびにＡＰＰ特異的ＢＡＣＥ阻害剤、例えば、限定されないが、ガランギン、ガランギンプロドラッグ、ルチン、ルチンプロドラッグならびに他のフラボノイド及びフラボノイドプロドラッグ、ならびに（例えば、その中で記載されるヒダントインについて参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４１２７０４２（ＰＣＴ／ＰＣＴ／ＵＳ１４／０１６１００）に記載されているような）ヒダントインからなる群から選択される薬剤を含む、実施形態１２２に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１３２】
実施形態１２４：前記ＤＮＶが、可溶性ベータ−ＮＲＧ１（ニューレグリン−１）（これは、認知促進であることが示され、脳のＥｒｂＢ４シグナリングに関与する、ＮＲＧ１のＢＡＣＥ切断断片（例えば、ｒｈＮＲＧ１７７−２４４）である）を含む、実施形態１２２に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１３３】
実施形態１２５：フラボノイド（バイオフラバノイド）、イソフラボノイド、ネオフラボノイドまたはこれらのプロドラッグを含む、実施形態８５〜１２４のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１３４】
実施形態１２６：ヘスペリジン、クエルシトリン、ルチン、タンゲレチン、ルテオリン、アピゲニン、タンゲレチン、ケルセチン、ケンフェロール、ミリセチン、フィセチン、ガランギン、イソラムネチン、パキポドール、ラムナジン、ピラノフラボノール、フラノフラボノール、ヘスペレチン、ナリンゲニン、エリオジクチオール、ホモエリオジクチオール、タキシホリン及びジヒドロケンフェロールまたはこれらのプロドラッグからなる群から選択される薬剤を含む、実施形態１２５に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１３５】
実施形態１２７：ガランギンを含む、実施形態１２５に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１３６】
実施形態１２８：プロガランギンを含む、実施形態１２５に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１３７】
実施形態１２９：ルチンを含む、実施形態１２５に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１３８】
実施形態１３０：レスベラトロールまたはレスベラトロール類似体を含む、実施形態８５〜１２９のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１３９】
実施形態１３１：レスベラトロールを含む、実施形態１３０に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１４０】
実施形態１３２：レスベラトロール類似体を含む、実施形態１３０に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１４１】
実施形態１３３：前記レスベラトロール類似体が２，３’，５’，６−テトラヒドロキシ−トランス−スチルベン、３，３’，４，４’−テトラヒドロキシ−トランス−スチルベンからなる群から選択される、実施形態１３２に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１４２】
実施形態１３４：前記レスベラトロール類似体が図１４に示すレスベラトロール類似体からなる群から選択される、実施形態４２に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１４３】
実施形態１３５：キノンオキシドレダクターゼ（ＮＱＯ２）阻害剤を含む、実施形態８５〜１３４のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１４４】
実施形態１３６：ビスホスホネートを含む、実施形態８５〜１２１のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１４５】
実施形態１３７：アデンドロネート／コレカルシフェロール、エチドロネート、ゾレドロン酸（ゾレンドロネート）、イバンドロネート、リセドロネート、アレンドロネート、パミドロネート、ネリドロネート、オルパドロネート及びチルドロネートからなる群から選択されるビスホスホネートを含む、実施形態１３６に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１４６】
実施形態１３８：ゾレドロン酸（ゾレンドロネート）を含む、実施形態１３６に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１４７】
実施形態１３９：細胞毒性剤及び／または細胞分裂阻害剤を含む、実施形態８５〜１２１のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１４８】
実施形態１４０：前記細胞毒性剤及び／または細胞分裂阻害剤がＩＤＨ１阻害剤、微小管阻害剤、ＤＮＡ損傷剤及びポリメラーゼ阻害剤からなる群から選択される、実施形態１３９に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１４９】
実施形態１４１：前記細胞毒性剤または細胞分裂阻害剤がチューブリン阻害剤を含む、実施形態１４０に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１５０】
実施形態１４２：前記細胞毒性剤または細胞分裂阻害剤がオーリスタチン、ドラスタチン−１０、天然物ドラスタチン−１０の合成誘導体及びマイタンシンまたはマイタンシン誘導体からなる群から選択される薬物を含む、実施形態１４１に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１５１】
実施形態１４３：前記細胞毒性剤または細胞分裂阻害剤がモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、オーリスタチンＥ（ＡＥ）、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、ｖｃＭＭＡＥ及びｖｃＭＭＡＦからなる群から選択される薬物を含む、実施形態１４１に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１５２】
実施形態１４４：前記細胞毒性剤または細胞分裂阻害剤がメルタンシン（ＤＭ１）、ＤＭ３及びＤＭ４からなる群から選択されるマイタンシンを含む、実施形態１４１に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１５３】
実施形態１４５：前記細胞毒性剤または細胞分裂阻害剤がＤＮＡ損傷剤を含む、実施形態１４０に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１５４】
実施形態１４６：前記細胞毒性剤または細胞分裂阻害剤がカリケアマイシン、デュオカルマイシン及びピロロベンゾジアゼピンからなる群から選択される薬物を含む、実施形態１４５に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１５５】
実施形態１４７：前記細胞毒性剤または細胞分裂阻害剤がカリケアマイシンまたはカリケアマイシン類似体を含む、実施形態１４６に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１５６】
実施形態１４８：前記細胞毒性剤または細胞分裂阻害剤がデュオカルマイシンを含む、実施形態１４６に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１５７】
実施形態１４９：前記細胞毒性剤または細胞分裂阻害剤がデュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、シクロプロピルベンゾインドールデュオカルマイシン（ＣＣ−１０６５）、センタナマイシン（Ｃｅｎｔａｎａｍｙｃｉｎ）、ラケルマイシン、アドゼレシン、ビゼレシン及びカルゼルシンからなる群から選択されるデュオカルマイシンを含む、実施形態１４８に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１５８】
実施形態１５０：前記細胞毒性剤または細胞分裂阻害剤がピロロベンゾジアゼピンまたはピロロベンゾジアゼピン二量体を含む、実施形態１４６に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１５９】
実施形態１５１：前記細胞毒性剤または細胞分裂阻害剤が、アントラマイシン（及びその二量体）、マゼトラマイシン（及びその二量体）、トメイマイシン（及びその二量体）、プロトラカルシン（及びその二量体）、チカマイシン（及びその二量体）、ネオトラマイシンＡ（及びその二量体）、ネオトラマイシンＢ（及びその二量体）、ＤＣ−８１（及びその二量体）、シビロマイシン（及びその二量体）、ポロトラマイシンＡ（及びその二量体）、ポロトラマイシンＢ（及びその二量体）、シバノマイシン（Ｓｉｂａｎｏｍｙｃｉｎ）（及びその二量体）、アベイマイシン（及びその二量体）、ＳＧ２０００及びＳＧ２２８５からなる群から選択される薬物を含む、実施形態１５０に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１６０】
実施形態１５２：前記細胞毒性剤及び／または細胞分裂阻害剤が薬物含み、オーリスタチン、ドラスタチン、コルヒチン、コンブレタスタチン及びｍＴＯＲ／ＰＩ３Ｋ阻害剤からなる群から選択される、実施形態１３９に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１６１】
実施形態１５３：前記細胞毒性剤及び／または細胞分裂阻害剤が、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、カペシタビン、５−トリフルオロメチル−２’−デオキシウリジン、メトトレキサートナトリウム、ラルチトレキセド、ペメトレキセド、シトシンアラビノシド、６−メルカプトプリン、アザチオプリン、６−チオグアニン（６−ＴＧ）、ペントスタチン、リン酸フルダラビン、クラドリビン、フロクスウリジン（５−フルオロ−２）、リボヌクレオチド還元酵素阻害剤（ＲＮＲ）、シクロホスファミド、ネオサール、イホスファミド、チオテパ、１，３−ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロソ尿素（ＢＣＮＵ）、１，−（２−クロロエチル）−３−シクロヘキシル−１−ニトロソ尿素、メチル（ＣＣＮＵ）、ヘキサメチルメラミン、ブスルファン、プロカルバジンＨＣＬ、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、クロラムブシル、メルファラン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ベンダムスチン、カルムスチン、クロロメチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、フォテムスチン、ロムスチン、マンノスルファン、ネダプラチン、ニムスチン、プレドニムスチン、ラニムスチン、サトラプラチン、セムスチン、ストレプトゾシン、テモゾロミド、トレオスルファン、トリアジコン、トリエチレンメラミン、チオテパ、四硝酸トリプラチン、トロホスファミド、ウラムスチン、ドキソルビシン、ダウノルビシンクエン酸塩、ミトキサントロン、アクチノマイシンＤ、エトポシド、トポテカンＨＣＬ、テニポシド（ＶＭ−２６）、イリノテカンＨＣＬ（ＣＰＴ−１１）、カンプトテシン、ベロテカン、ルビテカン、ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、酒石酸ビノレルビン、硫酸ビンデシン、パクリタキセル、ドセタキセル、ナノ粒子パクリタキセル、アブラキサン、イキサベピロン、ラロタキセル、オルタタキセル、テセタキセル、ビンフルニン、レチノイン酸、レチノイン酸誘導体、ドキシルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、シクロホスファミド、イホスファミド、シスプラチン、５−フルオロウラシル、カンプトテシン誘導体、インターフェロン、タモキシフェン及びタキソールからなる群から選択される薬物を含む、実施形態１３９に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１６２】
実施形態１５４：前記細胞毒性剤及び／または細胞分裂阻害剤が細胞毒を含む、実施形態１３９に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１６３】
実施形態１５５：前記抗体がジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、リシン、アブリン、サポリン及びチミジンキナーゼからなる群から選択される細胞毒に結合している、実施形態１５４に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。
【０１６４】
実施形態１５６：実施形態８５〜１５５のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクル及び医薬的に許容可能な担体を含む、医薬製剤。
【０１６５】
実施形態１５７：経口送達、イソフォレッティク送達、皮下送達、経皮送達、非経口送達、エアロゾル投与、吸入による投与、静脈内投与及び直腸内投与からなる群から選択される経路による送達のために調合される、実施形態１５６に記載の製剤。
【０１６６】
実施形態１５８：経口投与のために調合される、実施形態１５７に記載の製剤。
【０１６７】
実施形態１５９：経皮投与のために調合される、実施形態１５７に記載の製剤。
【０１６８】
実施形態１６０：経皮パッチ剤として提供される、実施形態１５９に記載の製剤。
【０１６９】
実施形態１６１：全身投与のために調合される、実施形態１５７に記載の製剤。
【０１７０】
実施形態１６２：単位投与製剤である、実施形態１５６〜１６１のいずれか１つに記載の製剤。
【０１７１】
実施形態１６３：実施形態１２２〜１３５のいずれか１つに記載の有効量の積載されたナノスケール薬物送達ビヒクルを、それらを必要とする対象に投与すること
を含む、神経変性脳障害の治療または予防の方法。
【０１７２】
実施形態１６４：前記神経変性脳障害が、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、軽度認知機能障害、認知症、虚血、卒中、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）及び脳性麻痺からなる群から選択される、実施形態１６３に記載の方法。
【０１７３】
実施形態１６５：前記ＤＳＶ（複数可）が、アミロイド形成経路の阻害剤またはＡＰＰプロセシングをアミロイド形成から非アミロイド形成経路に切り替える薬剤を含む、実施形態１６３〜１６４のいずれか１つに記載の方法。
【０１７４】
実施形態１６６：前アルツハイマー状態及び／または認知機能障害の発症を予防するか遅らせる、及び／または前アルツハイマー状態及び／または認知機能障害の１つもしくは複数の症状を改善する、及び／または前アルツハイマー状態もしくは認知機能障害のアルツハイマー病への進行を予防するか遅らせる、及び／またはアルツハイマー病の１つもしくは複数の症状を改善する、及び／またはアルツハイマー病を回復させる、及び／またはアルツハイマー病の進行の速度を低下させる、実施形態１６３〜１６５のいずれか１つに記載の方法。
【０１７５】
実施形態１６７：治療剤及び／またはイメージング剤を対象に送達する方法であって、実施形態８５〜１２１のいずれか１つに記載のナノスケール薬物送達ビヒクルを前記対象に投与することを含み、前記ナノスケール送達ビヒクルが前記治療剤及び／またはイメージング剤を含む、前記方法。
【０１７６】
実施形態１６８：前記ナノスケール送達ビヒクルが実施形態１２２〜１５５のいずれか１つに記載のナノスケール送達ビヒクルである、実施形態１６７に記載の方法。
【０１７７】
実施形態１６９：前記対象がヒトである、実施形態１６７〜１６８のいずれか１つに記載の方法。
【０１７８】
実施形態１７０：前記対象がヒト以外の哺乳動物である、実施形態１６７〜１６８のいずれか１つに記載の方法。
【０１７９】
実施形態１７１：前記ナノスケール薬物送達ビヒクルが、経口送達、イソフォレッティク送達、皮下送達、経皮送達、非経口送達、エアロゾル投与、吸入による投与、静脈内投与及び直腸内投与からなる群から選択される経路を介して送達される、実施形態１６７〜１７０のいずれか１つに記載の方法。
【０１８０】
実施形態１７２：前記ナノスケール薬物送達ビヒクルが血液脳関門を超えてカーゴを送達する、実施形態１６７〜１７０のいずれか１つに記載の方法。
【０１８１】
実施形態１７３：前記ナノスケール薬物送達ビヒクルが経皮的に適用され、血液脳関門を超えてカーゴを送達する、実施形態１７２に記載の方法。
【０１８２】
実施形態１７４：前記ナノスケール薬物送達ビヒクルが頭蓋顔面骨及び／または口腔骨にカーゴを局部的に送達する、実施形態１６７〜１７０のいずれか１つに記載の方法。
【０１８３】
実施形態１７５：前記ナノスケール薬物送達ビヒクルが歯槽骨にカーゴを送達する、実施形態１７４に記載の方法。
【０１８４】
実施形態１７６：前記ナノスケール薬物送達ビヒクルが局所、皮内または皮下部位にカーゴを局部的に送達する、実施形態１６７〜１７０のいずれか１つに記載の方法。
【０１８５】
実施形態１７７：前記ナノスケール薬物送達ビヒクルが頭蓋冠の皮膚に及び／または下部の骨にカーゴを送達する、実施形態１６７〜１７０のいずれか１つに記載の方法。
【０１８６】
実施形態１７８：前記ナノスケール薬物送達ビヒクルが口腔粘膜に適用される、実施形態１６７〜１７０のいずれか１つに記載の方法。
【０１８７】
実施形態１７９：実施形態８５〜１１７のいずれか１つに記載の変形可能なナノスケール薬物送達ビヒクルを作製する方法であって、制御された流量比及び圧力で、マイクロチャネル中の有機相及び水性相においてＤＮＶ構成要素を組み合わせること、ならびにＤＮＶを含む得られた試料を収集することを含む、前記方法。
【０１８８】
実施形態１８０：前記試料が透析されて、透析された試料を生成する、実施形態１７９に記載の方法。
【０１８９】
実施形態１８１：前記透析された試料が粉末に凍結乾燥される、実施形態１７９〜１８０のいずれか１つに記載の方法。
【０１９０】
定義
用語「対象」、「個体」及び「患者」は、互換的に、哺乳動物、好ましくはヒトまたはヒト以外の霊長類を指すが、飼育哺乳動物（例えば、イヌまたはネコ）、実験用哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット）及び農業用哺乳動物（例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ）も指す。様々な実施形態では、対象は、外来患者として、病院、精神医療施設の医師または他の医療従事者のケアを受けている、または他の臨床状況下の、ヒト（例えば、成人男性、成人女性、青年男性、青年女性、男児、女児）であり得る。ある種の実施形態では、対象は医師または他の医療従事者のケアまたは指示を受けていなくてもよい。
【０１９１】
本明細書で使用する場合、用語「製剤」または「薬物製剤」または「剤形」または「医薬製剤」は、対象へ送達するための少なくとも１種の治療剤または医薬用物質を含む組成物を指す。ある種の実施形態では、剤形は、所与の「製剤」または「薬物製剤」を含み、ロゼンジ剤、丸剤、錠剤、カプセル剤、坐剤、膜、ストリップ、液剤、パッチ剤、フィルム、ゲル剤、噴霧剤の形態または他の形態で患者に投与され得る。
【０１９２】
本明細書で使用する場合、「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片に実質的にコードされる１つまたは複数のポリペプチドからなるタンパク質を指す。認められている免疫グロブリン遺伝子としては、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン及びミュー定常領域遺伝子、ならびに種々の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンとして分類され、それらが次に、それぞれ、免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥを規定する。
【０１９３】
典型的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含むことが知られている。各四量体はポリペプチド鎖の２つの同一対から構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）及び１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、主として抗原認識に関与する、約１００〜１１０個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれこれらの軽鎖及び重鎖を指す。
【０１９４】
抗体は、インタクトな免疫グロブリンとして、または様々なペプチダーゼを用いた消化によって生成されるいくつかの十分に特徴づけられた断片として存在する。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域中のジスルフィド結合より下で抗体を消化して、Ｆ（ａｂ）’２、すなわち、それ自体がジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１に結合している軽鎖である、Ｆａｂの二量体を生成する。Ｆ（ａｂ）’２は、穏やかな条件下で還元されて、ヒンジ領域中のジスルフィド結合が破壊され、それによって、（Ｆａｂ’）２二量体がＦａｂ’単量体に変換され得る。Ｆａｂ’単量体は、本質的に、ヒンジ領域部分を有するＦａｂである（他の抗体断片のより詳細な説明について、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ，ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）を参照されたい）。インタクトな抗体の消化の観点から様々な抗体断片が定義されるが、そのようなＦａｂ’断片は、化学的に、または組換えＤＮＡ法を利用して、デノボ合成することができることを当業者は認識するであろう。したがって、本明細書で使用する場合、抗体という用語は、全抗体の改変によって生成されたか、組換えＤＮＡ法を使用してデノボ合成されたかのいずれかの抗体断片も含む。好ましい抗体としては、単鎖抗体（単一のポリペプチド鎖として存在する抗体）、より好ましくは、可変重鎖及び可変軽鎖が（直接的に、またはペプチドリンカーを介して）互いに結合して連続的なポリペプチドを形成する単鎖Ｆｖ抗体（ｓＦｖまたはｓｃＦｖ）が挙げられる。単鎖Ｆｖ抗体は、直接的に結合しているか、ペプチドをコードするリンカーによって結合しているかのいずれかのＶＨ−及びＶＬ−コード配列を含む核酸から発現され得る、共有結合したＶＨ−ＶＬヘテロ二量体である。Ｈｕｓｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９−５８８３。ＶＨ及びＶＬは、単一のポリペプチド鎖としてそれぞれに結合するが、ＶＨ及びＶＬドメインは非共有結合的に会合する。糸状ファージの表面で発現される最初の機能的抗体分子は単鎖Ｆｖ’ｓ（ｓｃＦｖ）であったが、代替の発現ストラテジーも成功した。例えば、鎖のうちの１つ（重または軽）がｇ３カプシドタンパク質に融合し、相補鎖が可溶性分子としてペリプラズムに排出される場合、Ｆａｂ分子はファージ上に提示され得る。２つの鎖は同じまたは異なるレプリコン上にコードされ得、重要な点は、各Ｆａｂ分子の２つの抗体鎖が翻訳後に会合し、鎖のうちの１つの例えばｇ３ｐへの結合を介して二量体がファージ粒子に組み込まれることである（例えば、米国特許第５７３３７４３号を参照されたい）。ｓｃＦｖ抗体、ならびに抗体Ｖ領域由来の、天然に凝集したが化学的に分離された軽及び重ポリペプチド鎖を、抗原結合部位の構造と実質的に類似している三次元構造にフォールドする分子に変換するいくつかの他の構造物が、当業者に既知である（例えば、米国特許第５，０９１，５１３号、第５，１３２，４０５号及び第４，９５６，７７８号を参照されたい）。特に好ましい抗体は、ファージ上に提示されたすべてを含むべきである（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ及びジスルフィド結合したＦｖ（Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８：１３２３−１３３１）。
【図面の簡単な説明】
【０１９５】
【図１Ａ】ＤＮＶを製造するのに使用されるデバイスの一実施形態を図示する図である。マイクロ流体チャネルを左上に示す。マイクロ流体リアクターシステム（下部）とともにマイクロ流体リアクター（右上）を示す。
【図１Ｂ】親水性ゾレドロネートをカプセル化するＡＦ−ＺＯＬ  ＤＮＶの調製のための、マイクロ流体合成スキームを図示する図である。
【図２】変形可能なナノスケールビヒクルの視覚化を図示する図である。変薬物が積載され、新しく切断した雲母上で調製され、原子間力顕微鏡によって流体中で画像化された、形可能なナノスケールビヒクル（ＤＮＶ）。位相解析によって、従来のリポソーム（ｎＤＮＶ）は球形であるが、ＤＮＶは形が変形している（球状でない）ことが示される。
【図３Ａ】従来のリポソーム、及びマイクロ流体アプローチによって生成され、おおよそ２００ｎｍのサイズを有する、薬物ＡＦ−ＺＯＬをカプセル化するＤＮＶの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像である。下部は、凍結乾燥粉末として保存してから数週間後のマイクロ流体生成ＤＮＶのＴＥＭ画像である。
【図３Ｂ】良好なＤＮＶ安定性を示すＡＦ−ＺＯＬ  ＤＮＶの共焦点画像である。
【図４】薬物積載ＤＮＶの集団特性を図示する図である。最初の凍結乾燥後のサイズ対強度のプロットを示す。
【図５Ａ】ＡＦ−ＺＯＬ  ＤＮＶが口腔粘膜関門を透過し、ペイロードを局部的に送達することを示す図である。マウス口腔粘膜の適用部位の画像を示す。
【図５Ｂ】ＡＦ−ＺＯＬ  ＤＮＶが口腔粘膜関門を透過し、ペイロードを局部的に送達することを示す図である。適用してから４８時間後に切除した歯肉組織のＬＡＳ−３０００画像を示す。部位（ｉｉ）は最少の蛍光を示し、これは、適用した積載されたＤＮＶの高い浸透を示唆することに留意されたい。
【図５Ｃ】ＡＦ−ＺＯＬ  ＤＮＶが口腔粘膜関門を透過し、ペイロードを局部的に送達することを示す図である。適用部位の下部の歯槽骨のＬＡＳ−３０００画像を示し、これは、ＤＮＶが口腔粘膜を通って浸透し、非標識の大腿骨によって示されるように、全身的な漏出なしで、骨標的化蛍光タグを送達したことを示す。
【図６】巨視的図である、ＡＦ−ＺＯＬが積載されたＤＮＶの画像を示す。
【図７】局所的に適用したＤＮＶがペイロードを皮膚層内に局部的に送達することを示す図である。図７Ａは、適用部位、すなわち、耳と耳の間の頭蓋の上の剃った皮膚を示す画像である。図７Ｂは、適用してから４８時間のマウスから切除した頭蓋冠の皮膚のＬＡＳ−３０００蛍光画像を示す。
【図８】頭蓋冠骨の蛍光強度に基づくと、（従来のリポソームまたはビヒクル中の薬物と比べて）ＤＮＶ中のＡＦ−ＺＯＬの有意な経皮送達を図示する図である。これは、概念実証を示す。
【図９】図９Ａは、ガランギンを含むＤＶＮの調製のための、マイクロ流体合成スキームを図示する図である。図９Ｂは、脳浸透性が低いバイオフラボノイドである疎水性薬物ガランギン及びガランギンプロドラッグであるプロガランギン（ＰＧ−１）の構造を図示する図である。
【図１０−１】Ａ．おおよそ１５０ｎｍのサイズを示すマイクロ流体生成Ｌｉｐｏ−ＧＡＬ  ＤＮＶのＤＬＳ分析を図示する図である。
【図１０−２】Ｂ．ＤＮＶ（複数可）及び従来のリポソームの回収後のサイズ及びカプセル化効率を示図である。Ｃ．Ｇａｌ−ＤＮＶの概略図である。
【図１１Ａ】トランスフェリンコンジュゲート化リン脂質（Ｔｆ−ＤＰＰＥ）の合成を図示する図である。活性エステルカップリングを図示する。
【図１１Ｂ】トランスフェリンコンジュゲート化リン脂質（Ｔｆ−ＤＰＰＥ）の合成を図示する図である。クリック化学を図示する。図１１Ｂに示すように、カルボジイミド化学を使用して、ＤＤＰＥを小分子にコンジュゲートした。クリック化学を使用して、ＤＤＰＥを小分子にコンジュゲートした。精製後、ＤＤＰＥ−脳標的化分子誘導体コンジュゲートを凍結乾燥し、Ｔ−ＤＮＶ合成に必要とされるまで−２０℃で保存した。ＤＤＰＥ−分子誘導体をマイクロ流体中で使用して、脳標的化ＤＮＶを調製することができる。このコンジュゲートは、スケーラビリティ及び再現性について医薬的に受け入れられるグレードのＴ−ＤＮＶの調製を可能にする。Ｘ＝アミドまたはトリアゾール。
【図１２】Ｔ−ＤＮＶ−Ｇａｌのマイクロ流体リアクター合成（上部パネル）図示し、ＤＮＶ−ＧａｌとＴ−ＤＮＶ−Ｇａｌの模式的な比較を示す図である。
【図１３−１】Ａ．ＤＤＰＥ−トランスフェリンコンジュゲート（トランスフェリンあたり約３つのＤＤＰＥ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトログラムを図示する図である。
【図１３−２】Ｂ．Ｔｆ−  ＤＤＰＥ及びトランスフェリンのＳＤＳ  ＰＡＧＥを図示する図である。これは、ＤＤＰＥ−Ｔとトランスフェリンの同様の泳動を示す。Ｃ．Ｔｆ−Ｌｉｐｏ−ＧＡＬの代表的な概略図である。
【図１４−１】レスベラトロール（（トランス−３，４’，５−トリヒドロキシスチルベン）及び様々なレスベラトロール（スチルベン）類似体を図示する図である。
【図１４−２】図１４−１の続きである。
【図１５】鉄が積載されているトランスフェリン（Ｔｆ）が細胞表面上のトランスフェリン受容体に結合することを図示する図である。次いで、これは、受容体媒介性エンドサイトーシスを介して細胞の内側に輸送される。
【図１６】Ｃａｃｏ−２細胞における浸透性試験を示す図である。頂端側チャンバーは、ガランギンまたはレスベラトロールが充填されたＤＮＶを含む。基底側チャンバーからの試料を分析して、浸透係数を決定する。
【図１７】上部：経時的なガランギンの透過（μｍｏｌ／ｓｅｃ）、下部：経時的なレスベラトロールの透過（μｍｏｌ／ｓｅｃ）を示す図である。Ｇａｌ：ガランギン、ＧＤ：ガランギンＤＮＶ、ＧＴＤ：トランスフェリンを有するガランギンＤＮＶ、Ｒｅｓ：レスベラトロール、ＲＤ：レスベラトロールＤＮＶ、ＲＴＤ：トランスフェリンを有するレスベラトロールＤＮＶ。
【図１８】各化合物に対する浸透係数（Ｐａｐｐ）を示す図である。
【図１９Ａ】投与後の時間の関数としてのガランギン及びプロガランギンの脳及び血漿レベルを示す図である。
【図１９Ｂ】Ａβ４０及びＡβ４２に対するガランギン及びプロガランギンの効果を示す図である。
【図２０】ＤＮＶの調製の一実施形態におけるリアクターの設定（上部）、及びＤＮＶ（複数可）と従来のリポソームのある種の違い（下部）を図示する図である。
【図２１】図２１Ａ及び２１Ｂは、マイクロ流体リアクターを使用するＤＮＶ合成を図示する図である。
【図２２】ＤＮＶ（複数可）と従来のリポソームの比較を示す図である。
【図２３】トランスフェリンで機能化されたＤＮＶ（複数可）の製造（上部）及び構造（下部）を図示する図である。
【図２４】ＤＮＶ（複数可）、ガランギン含有ＤＮＶ（複数可）（ＤＮＶ−Ｇａｌ）、トランスフェリンで機能化された空のＤＮＶ（Ｔ−ＤＮＶ）、及びガランギンを含み、トランスフェリンで機能化されたＤＮＶ（複数可）（Ｔ−ＤＮＶ−Ｇａｌ）の画像を示す図である。
【図２５】密着細胞層のＤＮＶ透過を評価するための頂端側チャンバーの構成を図示する図である。
【図２６】ＣＡＣＯ−２細胞浸透性モデルにおける、Ｇａｌ、ＤＮＶ−Ｇａｌ及びＴ−ＤＮＶ−Ｇａｌの浸透性を示す図である。
【図２７】ｓＡＰＰαを組み込むＤＳＮＶに対するインビトロ機能アッセイの結果を示すである。ｓＡＰＰβ及びＡβ１−４２の低減は標的結合を示す。
【図２８】ｓＡＡＰα−ＤＮＶに対する薬物動態（ＰＫ）を示す図である。これは、ｉ．ｖ．経路を使用する、マウスにおける概念実証送達を例示する。
【図２９】インビボでｓＡＰＰα−ＤＮＶを使用するＣＮＳ送達を図示する図である。
【図３０】Ｅ４ＦＡＤマウスにおける、脳送達されるｓＡＰＰαの薬力学的効果を示す図である。ｓＡＰＰαは、ＢＡＣＥ切断されたｓＡＰＰβのレベルを低下させる。
【図３１】変形可能なナノスケールベジクル（ＤＮＶＬ）を使用する経皮的薬物送達を図示する図である。パネルＡ）ＤＮＶの設計。パネルＢ）表皮の横断面。パネルＣ）ＤＮＶ中に製剤化された、蛍光標識されたビスホスホネート薬物ゾレドロネート。パネルＤ）再懸濁され、マウス頭蓋冠の皮膚に適用された、ＡＦ６４７−ＺＯＬ  ＤＮＶ粉末。パネルＥ）皮膚組織を介する、ＡＦ６４７−ＡＯＬ  ＤＮＶの頭蓋冠骨への送達。
【図３２】経口腔粘膜薬物送達を介する口腔内適用を図示する図である。パネルＡ）口蓋粘膜組織へ適用された、再懸濁されたＡＦ６４７−ＺＯＬ  ＤＮＶ粉末。パネルＢ）経皮的送達を実証する、口蓋骨表面に接着しているＡＦ６４７−ＺＯＬ。
【発明を実施するための形態】
【０１９６】
様々な実施形態では、治療剤の送達に有用である、変形可能なナノスケールビヒクル（ＤＮＶ）が提供される。ある種の実施形態では、変形可能なナノスケールビヒクル（ＤＮＶ）は、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ−１−プロピル）トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＡＰ）及び／または１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）などのリン脂質から構成される弾性ナノ粒子である。様々な実施形態では、リン脂質に加えて、ＤＮＶは、膜調節因子として働くことができるコレステロール、ならびにナノ粒子の脂質二重層に変形性を与える、エッジ活性化因子として働くことができる非イオン性界面活性剤（例示的であるが、非限定的な製剤は、Ｓｐａｎ８０（ソルビタンラウレートもしくはソルビタンモノラウレートとしても知られる）及び／またはＴｗｅｅｎ２０（ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレートもしくはポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートとしても知られる）を使用する）を含む。
【０１９７】
様々な実施形態では、本明細書に記載のＤＮＶは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができ、カーゴ（例えば、本明細書に記載の１種または複数の治療剤（複数可）様に）を脳／ＣＮＳに送達するのに使用することができる。血液脳関門を超えるそのような送達は、限定されないが、経鼻吸入、経口吸入などを含めたエアロゾル投与、経口送達、イソフォレッティク送達、皮下送達、経皮送達、非経口送達、静脈内投与、動脈内投与、デポー送達及び直腸内投与を含めたいくつかの様式のうちのいずれかによるＤＮＶの投与によって達成することができる。
【０１９８】
ある種の実施形態では、ＤＮＶは、血液脳関門（ＢＢＢ）を超えて中枢神経系（ＣＮＳ）へカーゴを送達するための経皮パッチ剤中に提供される。ＤＮＶそれ自体を合成する方法に加えて、脳へカーゴ（薬物、タンパク質、抗体、ＲＮＡまたはＤＮＡ）を送達するためのＣＮＳ標的ＤＮＶが積載された経皮パッチ剤が提供される。
【０１９９】
ある種の実施形態では、ＤＮＶは、ＤＮＶの非ＣＮＳ局在型送達のためのパッチ剤、カプセル剤、液剤（など）として提供され得る。ある場合には、ＤＮＶの全身的な分布が回避される、非常に局在型の非ＣＮＳ送達が、有効な治療に必要とされる。電荷が高まり、その結果分布が制限されたＤＮＶを合成することができる。
【０２００】
ある種の実施形態では、標的ＤＮＶが企図される。ＣＮＳの内側及び外側の両方で、カーゴ（薬物、タンパク質など）を特定の細胞型、例えば腫瘍細胞への送達を制限することが望ましい場合もある。したがって、標的細胞と特異的に相互作用するリガンド、例えば、ＦＡ受容体発現細胞を標的にする葉酸、またはＢＢＢにおいてトランスフェリン受容体と相互作用するトランスフェリン（Ｔｆ）で外面が装飾されているＤＮＶが提供される。他の例示的標的を以下の表１に示す。
【０２０１】
ＤＮＶ
【０２０２】
様々な実施形態では、本明細書で企図されるＤＮＶは、一般に疎水性尾部基及び極性頭部基の両方を有する両親媒性脂質を含む１種または複数のベジクル形成脂質、コレステロール及び界面活性剤を含む。ベジクル形成脂質の特性は、（ａ）リン脂質で例示されるように、水中で二重層ベジクルを自発的に形成するか、（ｂ）二重層膜の内部の疎水性領域と接触している疎水性部分及び外面の膜の極性表面に向かっている極性頭部基を有することによって、脂質二重層中に安定して組み込まれるかのいずれかの能力である。ある種の実施形態では、ＤＮＶで使用するためのベジクル形成脂質は、上記の特性のうちの１つを有する任意の従来の脂質を含むことができる。
【０２０３】
ある種の実施形態では、このタイプのベジクル形成脂質は、２つの炭化水素尾部または鎖、典型的にはアシル基及び極性頭部基を有するものである。リン脂質、例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）及びホスファチジルイノシトール（ＰＩ）がこのクラスに含まれ、この場合、２つの炭化水素鎖は、典型的には約１４〜２２個の間の炭素原子の長さであり、様々な程度の不飽和度を有する。ある種の実施形態では、適切なリン脂質としてはＰＥ及びＰＣが挙げられる。１つの例示的ＰＣは水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）である。単鎖脂質、例えばスフィンゴミエリン（ＳＭ）なども使用することができる。ある種の実施形態では、リン脂質は、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ−１−プロピル）トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＡＰ）及び／または１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）などの１種または複数のリン脂質を含む。
【０２０４】
アシル鎖が様々な程度の飽和度を有する上記の脂質及びリン脂質を市販品として入手でき、または公開された方法に従って調製することができる。ある種の実施形態に含まれ得る他の脂質は、スフィンゴ脂質及び糖脂質である。本明細書で使用する場合、用語「スフィンゴ脂質」は、２つの炭化水素鎖を有する脂質であって、それらのうちの１つがスフィンゴシンの炭化水素鎖である脂質を包含する。用語「糖脂質」は、１つまたは複数の糖残基も含むスフィンゴ脂質を指す。
【０２０５】
様々な実施形態では、ＤＮＶは、主にリン脂質から構成されるＤＮＶを安定化することができる脂質をさらに含む。この群の例示的脂質は、２０〜４５モルパーセントの間のレベルのコレステロールである。
【０２０６】
様々な実施形態では、ＤＮＶは、親水性ポリマー鎖の表面コーティングをさらに含むことができる。ある種の実施形態では、上記のうちのいずれかのもの（これらが挙げられるが、限定されない）に使用することができる親水性ポリマー鎖で誘導体化された１種または複数の脂質（例えば、リン脂質）をＤＮＶ組成物中に含むことによって、親水性ポリマーを、ＤＮＶ中に含むことができるが、ある種の実施形態では、ジアシル鎖を有するベジクル形成脂質、例えばリン脂質が好ましい。１つの例示的リン脂質はホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）であり、これは、標的化分子、例えばトランスフェリン、葉酸などとカップリングされ得る活性化ポリマーへのカップリングに好都合な反応性アミノ基を含む。１つの例示的ＰＥはジステアロイルＰＥ（ＤＳＰＥ）である。別の例は、親水性ポリマー鎖で誘導体化された、ジアシルグリセロールまたはジアルキルグリセロールでなどの、非リン脂質２本鎖両親媒性脂質である。
【０２０７】
ある種の実施形態では、血清半減期を延ばすためにＤＮＶで使用するための、及び／または抗体もしくはリガンドをカップリングするための、親水性ポリマーは、ある種の実施形態では、１，０００〜１０，０００ダルトンの間、または１，０００〜５，０００ダルトンの間、または好ましくは２，０００〜５，０００ダルトンの間の分子量を有するＰＥＧ鎖としての、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧのメトキシまたはエトキシキャップ化類似体も有用な親水性ポリマーであり、様々なポリマーサイズ、例えば、１２０〜２０，０００ダルトンで市販されている。
【０２０８】
適切であり得る他の親水性ポリマーとしては、限定されないが、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリビニルピロリドン、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド及び誘導体化セルロース、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロースが挙げられる。
【０２０９】
リン脂質に結合したこれらのポリマーを含む脂質−ポリマーコンジュゲートの調製は、例えば、米国特許第５，３９５，６１９号に記載されている。ある種の実施形態では、典型的には、約０．１〜２０モルパーセントの間のポリマー誘導体化脂質が、リポソーム形成中にリポソーム形成成分中に含まれる。ポリマー誘導体化脂質は市販されてもいる（例えば、ＳＵＮＢＲＩＴＥ（Ｒ），ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｊａｐａｎ．）。
【０２１０】
様々な実施形態では、親水性ポリマー鎖は、そのようなコーティングの非存在下でＤＮＶの血液循環時間を延ばすのに十分である、親水性鎖の表面コーティングを提供する。
【０２１１】
例示的な非限定的一実施形態では、脂質（コレステロールを含む）及びエッジ活性化因子は８５：１５ｗ／ｗ比で存在する。
【０２１２】
使用される脂質成分の正確なモル比及びタイプは、ＤＮＶの意図された適用に基づいて決定される。例えば、経口腔粘膜的及び経皮的局所適用のために、例示的であるが非限定な一実施形態では、５：３：２のモル比（ＤＰＰＣ：コレステロール：ＤＯＴＡＰ）が使用され、この混合物は１５重量％のＳｐａｎ８０を含む。
【０２１３】
イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）などの有機溶媒に溶解されたこれらの成分は、２５℃〜４０℃の範囲の温度及び１バールの圧力での効率的且つ連続的な合成のために、マイクロ流体リアクターシステム中への別々の投入を介して水溶液（ＰＢＳまたはＤＩ水）と混合される。マイクロ流体リアクターチャネルは、高いずり応力及び乱流が最小限である制御された混合を提供し、明確なＤＮＶ集団をもたらし、適切なまたは均一なサイズを得るための、超音波処理または押出成形などの後処理の必要性を排除する。有機相から水性相への移行の際に、記載された成分は、水性溶媒におけるそれらの熱力学的安定性に従って、ＤＮＶに自己構成する。それらは無毒であり、バッチ間の変動性がほとんどない高い再現性で調製され、スケーラブルであり、集団及び分布が非常に均一であり、サイズが調整可能であり、非常に局在型のペイロード送達を提供する。本発明者らの研究は、この方法が５０ｎｍからミクロンの範囲のサイズを有する均一なＤＮＶ集団を生成することができることを示す。
【０２１４】
ある種の実施形態では、ＤＮＶは、約５０ｎｍまたは約６０ｎｍまたは約７０ｎｍまたは約８０ｎｍまたは約９０ｎｍまたは約１００ｎｍから約１０μｍまたは約５μｍまたは約１μｍまたは約９００ｎｍまたは約８００ｎｍまたは約７００ｎｍまたは約６００ｎｍまたは約５００ｎｍまたは約４００ｎｍまたは約３００ｎｍまでの平均直径のサイズの範囲である。ある種の実施形態では、ＤＮＶは、約５０ｎｍから約２７５ｎｍまでの平均直径のサイズの範囲である。ある種の実施形態では、ＤＮＶは、約５０ｎｍの平均直径、または約１００ｎｍの平均直径、または約１５０ｎｍの平均直径、または約２００ｎｍの平均直径、または約２５０ｎｍの平均直径である。
【０２１５】
結果として得られるＤＮＶのサイズは、主に水性相及び脂質含有有機相の間の流量比（ＦＲＲ）の調節によって、調整することができる。本発明者らの調査によって、流量比を増加させることが、結果として得られるＤＮＶのサイズを直接的に減少させること、及びサイズの変動性を低減させることが示された。経口腔粘膜及び局所適用については、２５０ｎｍが中心のサイズのＤＮＶを前述の成分から得るために、１００のＦＲＲが使用される。使用される成分の特定のタイプに応じて、同じＦＲＲが異なるサイズのＤＮＶを生成し得ることに留意されたい。
【０２１６】
ＤＮＶは、限定されないが、小分子ならびにタンパク質、ＲＮＡ及びＤＮＡを含めた様々なクラスの薬物をカプセル化するように合成することができる。これは、親水性薬物と疎水性薬物の両方または他のカーゴを効率的にカプセル化することができる。本発明者らは、特にフルオレセイン誘導体などの親水性薬物をカプセル化するＤＮＶ、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）及び／または蛍光的にタグ付けされた骨標的化薬物またはタグがない薬物を含むＤＮＶを首尾よく合成することができる。疎水性薬物の場合には、本発明者らは、限定されないがガランギンなどの低水溶性の分子をカプセル化するために、ＤＮＶを積極的に使用する。タンパク質の場合は、本発明者らは、限定されないがｓＡＰＰアルファ及びＢＤＮＦなどのタンパク質をカプセル化するために、ＤＮＶを積極的に使用し、または核酸の場合は、本発明者らは、限定されないが、脳内の疾患標的に影響を及ぼすｍｉＲＮＡなどの核酸をカプセル化するために。ＤＮＶを積極的に使用する。これらのＤＮＶは、血液脳関門を通って送達される（経ＢＢＢ送達）ように合成される。所与の薬物の溶解度は、それがマイクロ流体リアクターに導入される相（有機または水性）を規定し、薬物とＤＮＶ成分の両方が同じ（有機）相に存在する場合に、カプセル化が最高になる。
【０２１７】
ＤＮＶに関する別の重要な調整可能な特色は電荷である。ＤＮＶの電荷は、適用部位からの分散の程度をある程度決定する。荷電したリン脂質成分の様々な組み合わせの使用を通して、様々な電荷濃度（ゼータ電位）のＤＮＶを作出することができる。本発明者らは、中性（ＤＰＰＣ、コレステロール、ＤＯＰＥ）、陽イオン性（ＤＰＰＣ、コレステロール、ＤＯＴＡＰ）及び陰イオン性（ＤＰＰＣ、コレステロール、ＤＨＰ）のＤＮＶを合成した。電荷の量は、ＤＮＶ調製混合物中の特定の荷電成分の濃度を調節することによって調整することができる。電荷を調整することによって、ＤＮＶ送達を局部的送達に制限することができ、または全身的送達させることを可能にすることができる。
【０２１８】
サイズ、カーゴ、変形性及び電荷に加えて、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または他のポリマーの付加によって、ＤＮＶの半減期を延ばすことができる。治療目標に応じて、ＰＥＧの付加はオプションである。
【０２１９】
標的ＤＮＶ
カーゴ、サイズ及び変形性に加えて、限定されないが、それぞれトランスフェリン（（Ｔｆ）また葉酸受容体を発現する細胞の標的化を可能にするトランスフェリンまたは葉酸などの標的化薬剤で外面が「装飾されている」ＤＮＶを合成することができる。これらの受容体はＢＢＢまたは腫瘍細胞で発現していることが多く、したがって、これらの標的化薬剤を有するＤＮＶはＢＢＢに結合し、ＢＢＢを通過することができ、これらの細胞が標的にされ得る。他の細胞型は、ＤＮＶ表面で他のリガンドを使用することによって、特異的に標的にされ得る。
【０２２０】
一般に、標的化薬剤は、任意の目的の標的、例えば、器官、組織、細胞、細胞外基質または細胞内領域と関連する標的に会合することができる。ある種の実施形態では、標的は、特定の病態、例えばがん状態と関連し得る。いくつかの実施形態では、標的化薬剤は、１つのみの標的、例えば受容体に特異的であり得る。適切な標的としては、限定されないが、核酸、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの修飾誘導体を挙げることができる。適切な標的としては、限定されないが、タンパク質、例えば、細胞外タンパク質、受容体、細胞表面レセプター、腫瘍マーカー、膜貫通タンパク質、酵素または抗体も挙げることができる。適切な標的としては、炭水化物、例えば細胞表面上に存在し得る、単糖、二糖または多糖などを挙げることができる。
【０２２１】
ある種の実施形態では、標的化薬剤は、標的リガンド（例えば、ＲＧＤ含有ペプチド、標的リガンドの小分子模倣物（例えば、ペプチド模倣リガンド）または特定の標的に対して特異的な抗体もしくは抗体断片を含むことができる。いくつかの実施形態では、標的化薬剤は、葉酸誘導体、Ｂ−１２誘導体、インテグリンＲＧＤペプチド、ＮＧＲ誘導体、ソマトスタチン誘導体またはソマトスタチン受容体に結合するペプチド、例えば、オクトレオチド及びオクトレオテートなどをさらに含むことができる。ある種の実施形態では、標的化薬剤はアプタマーを含むこともできる。アプタマーは、目的の標的と会合または結合するように設計することができる。アプタマーは、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び／またはペプチドから構成され得、アプタマーのある種の態様が当技術分野で周知である（例えば、Ｋｌｕｓｓｍａｎ，Ｓ．，Ｅｄ．，Ｔｈｅ  Ａｐｔａｍｅｒ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ（２００６）、Ｎｉｓｓｅｎｂａｕｍ（２００８）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２６（８）：４４２−４４９などを参照されたい）。
【０２２２】
ある種の実施形態では、ＤＮＶは、細胞表面マーカーに結合するリガンドまたは抗体に結合している。ある種の実施形態では、マーカーは腫瘍マーカーであり、抗体／リガンドは、ＤＮＶをがん細胞（例えば、腫瘍部位）に導く／局在化させる働きをすることができる。
【０２２３】
適切な腫瘍マーカーの例示的であるが限定的でないリストを表１に提供する。これら及び他のがんマーカーに対する抗体は当業者に既知であり、市販品として入手することができ、または、例えばファージディスプレイ技術を使用して、容易に生成することができる。
【０２２４】
【表１−１】
2020515638.tif 000003
【表１−２】
2020515638.tif 000004
【表１−３】
2020515638.tif 000005
【表１−４】
2020515638.tif 000006
【表１−５】
2020515638.tif 000007
【表１−６】
2020515638.tif 000008
【表１−７】
2020515638.tif 000009
【０２２５】
脂質含構築物と標的化薬剤をカップリングする方法は当業者に周知である。例としては、限定されないが、例えば、二官能性カップリング剤、例えば、グルタルアルデヒド、ジイミドエステル、芳香族及び脂肪族のジイソシアネート、ジカルボン酸のビス−ｐ−ニトロフェニルエステル、芳香族ジスルホニルクロリド、ならびに二官能性アリールハライド、例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、ｐ，ｐ’−ジフルオロｍ，ｍ’−ジニトロジフェニルスルホン、スルフヒドリル反応性マレイミドなどを使用する従来の化学反応による、ビオチン及びアビジンまたはストレプトアビジンの使用（例えば、米国特許第ＵＳ４，８８５，１７２Ａ号を参照されたい）が挙げられる。そのようなカップリングに適用することができる適切な反応は、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．１，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９６７に記載されている。
【０２２６】
本明細書に記載のＤＮＶは多数の利点を提供し、その利点には、限定されないが、以下が含まれる：
１）ＤＮＶは、（ｉ）口腔粘膜を通って、（ｉｉ）皮膚相中に、（ｉｉｉ）経皮的に、局在型薬物送達を増大させる能力を有する、
２）ＤＮＶは、ＣＮＳ障害のために、血液脳関門を通って脳へ小分子、タンパク質、ＲＮＡ及び／または抗体を送達することを可能にするまたは増大させる可能性がある、
３）ＤＮＶは、標的細胞タイプに特異的にカーゴを送達し、したがって、オフターゲット作用または副作用を回避する可能性がある。
【０２２７】
血液脳関門（ＢＢＢ）は、ＡＤ及びＰＤなどの神経障害の治療に使用することができる治療用分子を制限する。限定されないが、小分子、ペプチド、タンパク質、抗体、アプタマー、ｍｉＲＮＡ及び小分子ポリマーコンジュゲートを含めた様々な分子を脳へ輸送する性能をＤＮＶ中に有することによって、こうした壊滅的な障害の治療のために評価及び開発され得る治療剤の種類が増加する。さらに、ＤＮＶは、高齢または病気の患者集団において投薬及び服薬遵守の容易さを高め得る、経皮的経路を含めた多数の投与経路による送達を容易にすることができる。さらに、標的ＤＮＶはある種の細胞型のみへの治療剤の送達を可能にし、したがって、副作用を制限する。
【０２２８】
既存のリポソーム技術はどれも、次いで血液脳関門（ＢＢＢ）も通過する治療剤を経皮的に効果的に送達することが示されてないと考えられる。ＣＮＳ障害のための治療剤は、ＢＢＢを通過するその能力によって制限される。これは、ＣＮＳ障害のために評価及び開発され得る多くの潜在的な新規治療剤を排除する。さらに、患者の服薬遵守は好結果の治療の障壁である。本明細書に記載のＤＮＶは、様々な分子がＡＤ及びＰＤのようなＣＮＳ障害の治療において評価されることを可能にし、それにより、そのようなＣＮＳ障害のための有効な新しい治療剤の発見の成功を増加させる可能性がある。
【０２２９】
ＤＮＶは、より大きなクラスの分子の送達を可能にする。既存の技術はたいてい小分子に限定されている。ＤＮＶは、毒性がほとんどまたは全くなく、局在型送達において、より深い生存可能な組織を損傷しない。ＤＮＶは、皮膚に施される超音波、電気または化学的促進剤を必要としない。
【０２３０】
主に全身的経路による薬物のカプセル化及び送達のためのいくつかのリポソームベースアプローチは存在するが、本明細書に記載のＤＮＶは、最終的な脳送達のための経皮的経路によって薬物を送達するためのＤＮＶを生成するために、リポソーム技術の使用の可能性を初めて提供する。さらに、フローケミストリー装置を使用してマイクロリアクター中で本明細書に記載のＤＮＶを生成することができるという発見によって、ＣＮＳを標的とする薬物積載弾性リポソームを、高度な品質管理で、非常に小さく且つ均一な直径で、可能性として大規模に調製することが可能になる。
【０２３１】
積載されたＤＮＶ
本明細書に記載のＤＮＶは、いくつかの標的のうちのいずれかに１種または複数の治療剤を送達するのに有効である。そのような薬剤としては、限定されないが、神経変性脳障害の治療または予防のための治療剤、ビスホスホネート、抗新生物剤（例えば、細胞毒性剤及び／または細胞分裂阻害剤）を、またはカプセル化が所望される本質的にいかなる他の薬剤をも挙げることができる。
【０２３２】
神経変性障害の治療または予防のための薬剤
ある種の実施形態では、ＤＮＶは、血液脳関門を超えて治療剤を効果的に輸送し、１種または複数の治療剤部分を中枢神経系に（例えば、脳に）送達するのに有効である。ある種の実施形態では、そのようなものは神経変性脳障害の治療または予防のための薬剤を含むことができる。そのような神経変性脳障害としては、限定されないが、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、軽度認知機能障害、認知症、虚血、卒中、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、脳性麻痺などが挙げられる。
【０２３３】
したがって、ある種の実施形態では、そのような薬剤が積載されたＤＮＶは、神経変性状態の治療及び／または予防で使用することができる。例えば、ある種の実施形態では、そのような薬剤が積載されたＤＮＶは、前アルツハイマー状態及び／または認知機能障害の発症を予防するもしくは遅らせる、及び／または前アルツハイマー状態及び／または認知機能障害の１つもしくは複数の症状を改善する、または前アルツハイマー状態もしくは認知機能障害のアルツハイマー病への進行を予防するもしくは遅らせる、またはアルツハイマー病の１つもしくは複数の症状を改善する、及び／またはアルツハイマー病を回復させる、及び／またはアルツハイマー病の進行の速度を低下させるのに使用することができる。
【０２３４】
ある種の実施形態では、ＤＮＶ（複数可）は、アミロイド形成経路の阻害剤またはＡＰＰプロセシングをアミロイド形成から非アミロイド形成経路に切り替える薬剤を含む。
【０２３５】
ある種の実施形態では、神経変性脳障害の治療または予防のための薬剤としては、限定されないが、アミロイド形成経路の阻害剤またはＡＰＰプロセシングをアミロイド形成から非アミロイド形成経路に切り替える薬剤が挙げられる。ある種の実施形態では、神経変性脳障害の治療または予防のための薬剤としては、限定されないが、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４８４７２（ＷＯ２０１２／０２４６１６）に記載されているような、トロピセトロンもしくはその類似体、ジスルフィラムもしくはその類似体、ホノキオールもしくはその類似体及び／またはニメタゼパムもしくはその類似体、及び／またはＰＣＴ／ＵＳ２０１２／００５１４２６（ＷＯ２０１３／０２６０２１）に記載されているようなＴｒｋＡキナーゼ阻害剤（例えば、ＡＤＤＮ−１３５１）及び／またはその類似体、及び／またはＤ２受容体アゴニスト、及び／またはアルファ１−アドレナリン受容体アンタゴニスト、及び／またはＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４９２２３（ＷＯ２０１３／０１９９０１）に記載されているようなトロピノールエステル、及び／またはＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０１６１００（ＷＯ２０１４／１２７０４２）に記載されているようなヒダントイン、及び／またはＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０４５９２８（ＷＯ２０１６／０２８９１０）に記載されているようなアラプロクラートケト類似体（例えば、２−アミノ−６−（４−クロロフェニル）−５，５−ジメチル−３−ヘキサノン及び５−アミノ−１−（４−クロロフェニル）−２，２−ジメチル−３−ヘキサノン）、イソプロピルアラプロクラート類似体（例えば、２−（４−クロロフェニル）−１，１−ジメチル２−アミノ−３−メチルブタン酸、２−ジエチルアミノエチル２，２−ジフェニルペンタノエート（プロアジフェン）、２−（４−クロロフェニル）−１，１−ジメチルエチル２−アミノ−３−メチルブタン酸（ＧＥＡ８５７）など）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２４８１（ＷＯ２０１３／１４２３７０）に記載されているようなＡＰＰ特異的ＢＡＣＥ阻害剤（ＡＳＢＩ）、及び／またはバイオフラボノイドもしくは以下に記載のようなそれらのプロドラッグ、及び／またはレスベラトロールもしくは以下に記載のようなレスベラトロール類似体が挙げられる。
【０２３６】
ある種の実施形態では、神経変性脳障害の治療または予防のための薬剤としては、ＡＳＢＩ、例えば、ガランギン、ルチン、ガランギンプロドラッグまたはルチンプロドラッグが挙げられる。
【０２３７】
バイオフラバノイド及びバイオフラバノイドプロドラッグ
ある種のフラボノイド（例えば、ルチン、ガランギンなど）がＡＰＰ特異的ＢＡＣＥ阻害剤として働くことができ、様々な神経変性障害の治療及び／または予防で有効であると考えられていることが示されている（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２４８１（ＷＯ２０１３／１４２３７０を参照されたい）。さらに、多数の他のフラボノイドが神経保護効果を有することが知られている。
【０２３８】
したがって、ある種の実施形態では、ＤＮＶ（複数可）は１種または複数のフラボノイド（複数可）（バイオフラバノイド（複数可））、イソフラボノイド（複数可）（例えば、３−フェニルクロメン−４−オン（３−フェニル−１，４−ベンゾピロン）構造に由来する）、及び／またはネオフラボノイド（複数可）（例えば、３−フェニルクロメン−４−オン（３−フェニル−１，４−ベンゾピロン）構造に由来する）が積載される。例示的であるが非限定なフラボノイドとしては、限定されないが、ヘスペリジン（フラバノンヘスペレチンの１つのグリコシド）、クエルシトリン、ルチン（フラボノールケルセチンの２つのグリコシド）及びフラボンタンゲレチンが挙げられる。ある種の実施形態では、フラボノイドはフラボノイドプロドラッグである。ある種の実施形態では、フラボノイドはガランギンを含む。ある種の実施形態では、フラボノイドはルチンを含む。ある種の実施形態では、フラボノイドはケルセチンを含む。
【０２３９】
ある種の実施形態では、ＤＮＶはフラボンが積載される。例示的フラボンとしては、限定されないが、ルテオリン、アピゲニン、タンゲレチンなどが挙げられる。ある種の実施形態では、ＤＮＶは１種または複数のフラバノール、例えば、アウエルセチン、ケンフェロール、ミリセチン、フィセチン、ガランギン、イソラムネチン、パキポドール、ラムナジン、ピラノフラボノール、フラノフラボノールなどが積載される。ある種の実施形態では、ＤＮＶはフラバノン、例えば、ヘスペレチン、ナリンゲニン、エリオジクチオール、ホモエリオジクチオールなどが積載される。ある種の実施形態では、ＤＮＶはフラバノノール、例えば、タキシホリン（またはジヒドロケルセチン）、ジヒドロケンフェロールなどが積載される。
【０２４０】
レスベラトロール及びその類似体
ある種の実施形態では、ＤＮＶ（複数可）はレスベラトロール及び／または１種または複数のレスベラトロール類似体が積載される。レスベラトロール類似体は当業者に周知である。例示的であるが非限定なレスベラトロール類似体の例を図１４に示す。そのような化合物を合成する方法は当業者に周知である。例えば、図１４の化合物４〜７についての合成スキームはＲｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃｈｅｍ．＆  Ｂｉｏｄｉｖ．，３：９７５−９８１によって記載されており、図１４の化合物１５ａ〜１５ｄについての合成スキームはＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１６：１００１３−１００２１によって記載されており、図１４の化合物１６〜１８についての合成スキームはＬｉｕ（２０１２）Ｓｔｅｒｏｉｄｓ，７７：４１９−４２３によって記載されており、図１４の化合物２３についての合成スキームはＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｂｕｌｌ．，５３：１５８７−１５９０によって記載されており、図１４の化合物２４及び２５についての合成スキームはＬｕ（２０１３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５６：５８４３−５８５９によって提供され、他の例示される類似体についての合成スキームは、特に、Ｏｇａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１２９０：２１−２９に見出すことができる。類似体はＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５：９７−１０５によっても記載される。
【０２４１】
キノンオキシドレダクターゼ２（ＮＱ０２）の阻害剤
ある種の実施形態では、ＤＮＶ（複数可）は、レスベラトロールの他にＮＱＯ２阻害剤、例えば、限定されないが、イマチニブ、メラトニン９−アミノアクリジン（Ｎｏｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．１１（１）：１９４−２０３）が積載されている。そのような化合物を合成する方法は当業者に周知である。ある種の実施形態では、ＮＱＯ２阻害剤は、ＮＳＣ１４２２９（キナクリン）、ＮＳＣ９８５８、ＮＳＣ１１２３２、ＮＳＣ１２５４７、ＮＳＣ１３０００、ＮＳＣ１３４８４、ＮＳＣ１７６０２、ＮＳＣ２８４８７、ＮＳＣ６４９２４、ＮＳＣ７１７９５、ＮＳＣ７６７５０、ＮＳＣ１０１９８４、ＮＳＣ１４０２６８、ＮＳＣ１５６５２９、ＮＳＣ１６４０１７、ＮＳＣ２１９７３３、ＮＳＣ２７０９０４、ＮＳＣ２７３８２９、ＮＳＣ３０５８３１、ＮＳＣ３０５８３６、ＮＳＣ３２２０８７、ＮＳＣ３５６８２１、ＮＳＣ３７４７１８、ＮＳＣ４０７３５６、ＮＳＣ６１７９３３、ＮＳＣ６１７９３９、ＮＳＣ６２０３１８、ＮＳＣ６２８４４０、ＮＳＣ６３３２３９、ＮＳＣ６４８４２４、ＮＳＣ６５８８３５、ＮＳＣ６８２４５４、レスベラトロール、レスベラトロール類似体及びイマチニブからなる群から選択される部分を含む。
【０２４２】
ビスホスホネート
いくつかのビスホスホネート（ＢＰ）は、経口投与される場合に、例えば腸上皮の潰瘍を含めたいくつかの重大な有害副作用を有するので、ＩＶ注入により投与されている。これは、ＩＶ注入のクリニックに毎月行く必要がある患者にとってかなりの負担であった。
【０２４３】
蛍光コンジュゲートビスホスホネート含有ＤＮＶとして本明細書の例示的実施形態のうちの１つ。変形可能なナノスケールビヒクル（ＤＮＶ）が安全且つ有効な経皮的及び経口腔粘膜的適用を補助することが示された。この知見は、経口投与されるＤＮＶ−ＢＰが、現在の副作用なしで、腸上皮内層を通過することによって血液循環にＢＰを安全に移行させることができることを直接示唆する。
【０２４４】
したがって、ある種の実施形態では、ＤＮＶ（複数可）は積載され、１種または複数のビスホネートが提供される。例示的ビスホスホネートとしては、限定されないが、アデンドロネート／コレカルシフェロール（例えば、ＦＯＭＡＸ（登録商標）ＰＬＵＳ  Ｄ）、エチドロネート（例えば、ＤＩＤＲＯＮＥＬ（登録商標））、ゾレドロン酸（ゾレンドロネート）（例えば、ＺＯＭＥＴＡ（登録商標）、ＲＥＣＬＡＳＴ（登録商標）、ＡＣＬＡＳＴＡ（登録商標））、イバンドロネート（例えば、ＢＯＮＩＶＡ（登録商標））、リセドロネート（例えば、ＡＴＥＬＶＩＡ（登録商標）、ＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標））、アレンドロネート（例えば、ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標）、ＢＩＮＯＳＴＯ（登録商標））、パミドロネート（例えば、ＡＲＥＤＩＡ（登録商標））、ネリドロネート（例えば、ＮＥＲＩＸＩＡ（登録商標））、オルパドロネート、チルドロネート（例えば、ＳＫＥＬＩＤ（登録商標））などが挙げられる。
【０２４５】
細胞毒性剤及び／または細胞分裂阻害剤
本明細書に記載のＤＮＶは、がん細胞などの標的細胞に１種または複数の治療剤を送達するのにも有効である。したがって、ある種の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＶは、細胞毒性剤及び／または細胞分裂阻害剤を含む。例示的細胞毒性剤及び／または細胞分裂阻害剤としては、限定されないが、ＩＤＨ１阻害剤、微小管阻害剤、ＤＮＡ損傷剤、ポリメラーゼ阻害剤などが挙げられる。ある種の実施形態では、細胞毒性剤または細胞分裂阻害剤は、チューブリン阻害剤（例えば、オーリスタチン、ドラスタチン−１０、天然物ドラスタチン−１０の合成誘導体、マイタンシンまたはマイタンシン誘導体など）を含む。ある種の実施形態では、細胞毒性剤または細胞分裂阻害剤は、モノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、オーリスタチンＥ（ＡＥ）、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、ｖｃＭＭＡＥ及びｖｃＭＭＡＦからなる群から選択される薬物を含む。ある種の実施形態では、細胞毒性剤または細胞分裂阻害剤は、メルタンシン（ＤＭ１）、ＤＭ３及びＤＭ４からなる群から選択されるマイタンシンを含む。
【０２４６】
細胞毒性剤または細胞分裂阻害剤がＤＮＡ損傷剤（例えば、カリケアマイシン、カリケアマイシン類似体、デュオカルマイシン、デュオカルマイシン類似体、ピロロベンゾジアゼピン、ピロロベンゾジアゼピン類似体など）を含む、請求項４２に記載のナノスケール薬物送達ビヒクル。ある種の実施形態では、細胞毒性剤または細胞分裂阻害剤は、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢ１、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣ１、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、シクロプロピルベンゾインドールデュオカルマイシン（ＣＣ−１０６５）、センタナマイシン、ラケルマイシン、アドゼレシン、ビゼレシン及びカルゼルシンからなる群から選択されるデュオカルマイシンを含む。
【０２４７】
ある種の実施形態では、前記細胞毒性剤または細胞分裂阻害剤は、ピロロベンゾジアゼピンまたはピロロベンゾジアゼピン二量体（例えば、アントラマイシン（及びその二量体）、マゼトラマイシン（及びその二量体）、トメイマイシン（及びその二量体）、プロトラカルシン（及びその二量体）、チカマイシン（及びその二量体）、ネオトラマイシンＡ（及びその二量体）、ネオトラマイシンＢ（及びその二量体）、ＤＣ−８１（及びその二量体）、シビロマイシン（及びその二量体）、ポロトラマイシンＡ（及びその二量体）、ポロトラマイシンＢ（及びその二量体）、シバノマイシン（及びその二量体）、アベイマイシン（及びその二量体）、ＳＧ２０００、ＳＧ２２８５、など）を含む。
【０２４８】
ある種の実施形態では、細胞毒性剤または細胞分裂阻害剤は薬物を含み、オーリスタチン、ドラスタチン、コルヒチン、コンブレタスタチン及びｍＴＯＲ／ＰＩ３Ｋ阻害剤からなる群から選択される。
【０２４９】
ある種の実施形態では、細胞毒性剤または細胞分裂阻害剤は、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、カペシタビン、５−トリフルオロメチル−２’−デオキシウリジン、メトトレキサートナトリウム、ラルチトレキセド、ペメトレキセド、シトシンアラビノシド、６−メルカプトプリン、アザチオプリン、６−チオグアニン（６−ＴＧ）、ペントスタチン、リン酸フルダラビン、クラドリビン、フロクスウリジン（５−フルオロ−２）、リボヌクレオチド還元酵素阻害剤（ＲＮＲ）、シクロホスファミド、ネオサール、イホスファミド、チオテパ、１，３−ビス（２−クロロエチル）−１−ニトロソ尿素（ＢＣＮＵ）、１，−（２−クロロエチル）−３−シクロヘキシル−１−ニトロソ尿素、メチル（ＣＣＮＵ）、ヘキサメチルメラミン、ブスルファン、プロカルバジンＨＣＬ、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、クロラムブシル、メルファラン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ベンダムスチン、カルムスチン、クロロメチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、フォテムスチン、ロムスチン、マンノスルファン、ネダプラチン、ニムスチン、プレドニムスチン、ラニムスチン、サトラプラチン、セムスチン、ストレプトゾシン、テモゾロミド、トレオスルファン、トリアジコン、トリエチレンメラミン、チオテパ、四硝酸トリプラチン、トロホスファミド、ウラムスチン、ドキソルビシン、ダウノルビシンクエン酸塩、ミトキサントロン、アクチノマイシンＤ、エトポシド、トポテカンＨＣＬ、テニポシド（ＶＭ−２６）、イリノテカンＨＣＬ（ＣＰＴ−１１）、カンプトテシン、ベロテカン、ルビテカン、ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、酒石酸ビノレルビン、硫酸ビンデシン、パクリタキセル、ドセタキセル、ナノ粒子パクリタキセル、アブラキサン、イキサベピロン、ラロタキセル、オルタタキセル、テセタキセル、ビンフルニン、レチノイン酸、レチノイン酸誘導体、ドキシルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、シクロホスファミド、イホスファミド、シスプラチン、５−フルオロウラシル、カンプトテシン誘導体、インターフェロン、タモキシフェン及びタキソールからなる群から選択される薬物を含む。
【０２５０】
ある種の実施形態では、前記細胞毒性剤または細胞分裂阻害剤は、細胞毒（例えば、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、リシン、アブリン、サポリン、チミジンキナーゼなど）を含む。
【０２５１】
本明細書に記載のＤＮＶ中にカプセル化することができる前述の薬剤は、例示であり、限定的ではない。本明細書に提供される教示を使用して、多数の他の薬剤をカプセル化するためにＤＮＶを容易に使用することができる。
【０２５２】
コンビナトリアル薬物送達プラットフォーム
ある種の実施形態では、２種以上の薬物をＤＮＶ中にカプセル化することができる。薬物のうちの１つは、例えば、限定されないが、神経炎症を防ぐキナーゼ阻害剤、例えば、マサチニブまたはその類似体でもよく、他の薬物は、限定されないが、ｓＡＰＰα促進剤でもよい。
【０２５３】
医薬製剤
様々な実施形態では、本明細書で企図される医薬製剤は、一般に、（例えば、１種または複数の治療剤を含む）本明細書に記載のＤＮＶ及び医薬的に許容可能な担体含む。用語「担体」は、医薬製剤のための希釈剤またはビヒクルとして使用される不活性な物質を典型的には指す。この用語は、組成物に凝集性を与える、典型的には不活性な物質も包含し得る。典型的には、生理学的に許容可能な担体は液体形態で存在する。液状担体の例としては、限定されないが、生理食塩水、リン酸緩衝液、通常の緩衝食塩水（１３５〜１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）、水、緩衝水、０．４％食塩水、０．３％グリシン、０．３Ｍショ糖（及び他の炭水化物）、安定性を増強する糖タンパク質（例えば、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンなど）などが挙げられる。生理学的に許容可能な担体は、投与される特定の組成物によって、及び組成物を投与するのに使用される特定の方法によって、ある程度決定されるので、本発明の医薬組成物の多種多様の適切な製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａａｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ｔｈ  ｅｄ．（１９８５）を参照されたい）。
【０２５４】
様々な実施形態では、医薬製剤は、従来の周知の無菌化技法によって滅菌され得、または滅菌条件下で生成されてもよい。水溶液は使用のためにパッケージ化され得、または無菌状態化で濾過され、凍結乾燥され得、凍結乾燥調製は、投与より前に滅菌水溶液と混合される。ある種の実施形態では、組成物は、生理的条件に近づけるために必要とされる医薬的に許容可能な補助物質、例えば、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、浸透圧調整剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート及びトリエタノールアミンオレエートを含むことができる。組成物を安定化するために、凍結乾燥組成物に対する安定化剤などの糖を含むこともできる。
【０２５５】
例えば、関節内、静脈内、筋肉内、腫瘍内、皮内、腹腔内及び皮下経路によるなどの非経口投与に適した医薬組成物は、水性及び非水性の等張滅菌注射液を含むことができる。ある種の実施形態では、注射液は、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬及び意図された受容者の血液と製剤を等張にする溶質、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤及び防腐剤を含むことができる水性及び非水性の滅菌懸濁液を含むことができる。注射液及び懸濁液は、滅菌粉末、例えば、凍結乾燥リポソームから調製することもできる。ある種の実施形態では、組成物は、例えば、静脈内注入によって、腹腔内に、膀胱内に、または髄腔内に投与することができる。様々な実施形態では、非経口投与及び静脈内投与も企図される。リポソーム組成物の製剤は、単位用量または多用量の密閉容器、例えば、アンプル及びバイアルに入れて提供することができる。
【０２５６】
ある種の実施形態では、医薬組成物は、エアロゾルとしての投与のために、例えば、経口及び／または経鼻吸入のために、製剤化される。
【０２５７】
ある種の実施形態では、医薬組成物は、局所送達、皮内送達、皮下送達及び／または経皮送達のために製剤化される。
【０２５８】
ある種の実施形態では、医薬組成物は、口腔粘膜、腟粘膜及び／または直腸粘膜への適用のために製剤化される。
【０２５９】
ある種の実施形態では、医薬組成物は単位剤形である。そのような形態では、組成物は適切な分量の活性成分を含む単位用量、例えば、ＤＮＶ製剤に細分される。単位剤形はパッケージ化された組成物であり得、パッケージは個別の分量の医薬組成物を含む。組成物は、必要に応じて、他の適合性の治療剤を含むこともできる。
【０２６０】
ある種の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＶは、従来の経皮的薬物送達システム、すなわち、経皮「パッチ剤」を使用して、皮膚を通して送達され得、ここで、活性薬剤（複数可）（例えば、ＤＮＶ及び／またはその製剤）は、皮膚に貼られる薬物送達デバイスとして働くラミネート構造内に典型的には含まれる。そのような構造では、例えば、ＤＮＶ及び／またはその製剤は、上部バッキング層の下部の層または「リザーバー」中に典型的には含まれる。この文脈での用語「リザーバー」は、例えば皮膚の表面への送達に最終的に利用可能なＤＮＶ及び／またはその製剤の分量を指すことが理解されよう。したがって、例えば、「リザーバー」は、パッチ剤のバッキング層上の接着剤の中に、または当業者に既知の様々な異なるマトリックス製剤のうちのいずれかの中に活性成分（複数可）を含むことができる。パッチ剤は単一のリザーバーを含むことができ、またはこれは複数のリザーバーを含むことができる。
【０２６１】
例示的一実施形態では、リザーバーは、薬物送達の間にシステムを皮膚に貼る働きをする、医薬的に許容可能な接触性接着材料のポリマーマトリックスを含む。適切な皮膚接触性接着材料の例としては、限定されないが、ポリエチレン、ポリシロキサン、ポリイソブチレン、ポリアクリレート、ポリウレタンなどが挙げられる。あるいは、例えば、ＤＮＶ及び／またはＤＮＶ製剤リザーバーならびに皮膚接触性接着剤は分離した別々の層として存在し、接着剤はリザーバーの下にあり、この場合、これは、上記のポリマーマトリックスのいずれかでもよく、またはこれは、液体もしくはハイドロゲルのリザーバーでもよく、またはある種の他の形態をとってもよい。デバイスの上面として働く、これらのラミネート中のバッキング層は、好ましくは、「パッチ剤」の主要構造要素として機能し、デバイスにその柔軟性の大部分を与える。バッキング層のために選択される材料は、好ましくは、活性薬剤（複数可）（例えば、ＤＮＶ及び／またはその製剤）ならびに存在する任意の他の材料に対して実質的に不浸透性である。
【０２６２】
あるいは、他の医薬的送達システムを用いることができる。例えば、リポソーム、エマルジョン及びマイクロエマルジョン／ナノエマルジョンが、医薬的に活性な化合物を保護及び送達するのに使用することができる送達ビヒクルの周知の例である。ジメチルスルホキシドなどのある種の有機溶媒も用いることができるが、通常、より大きな毒性という代償を払う。
【実施例】
【０２６３】
以下の実施例は、請求される発明を限定するためではなく、例示するために提供される。
【０２６４】
実施例１
ＤＮＶの調製及び特徴づけ
１つのそのような技術、すなわち変形可能なナノスケールビヒクル（ＤＮＶ）に対する本発明者らの調査をここに示す。様々な例示的実施形態では、薬物送達ビヒクルは、生物由来の成分及びビヒクルに変形性を与えるための複数の所有の成分から構成される。
【０２６５】
これらのＤＮＶの効率的且つ連続的な合成のために、マイクロ流体リアクターを利用した。それらは無毒であり、調製が容易であり、スケーラブルで、再現性が高く、集団及び分布が非常に均一であり、制御可能なサイズであり、非常に局在型のペイロード送達を提供する。
【０２６６】
様々な実施形態では、本明細書に記載のＤＮＶは、頭蓋顔面骨及び／または口腔骨へ局部的に薬物を送達するための効率的なビヒクルを提供する。本明細書で例示するように、様々な実施形態では、蛍光的にタグ付けされた親水性薬物を輸送するために陽イオン性ＤＮＶを合成し、これをマウス（ｎ＝４）の（ｉ）剃った頭皮及び（ｉｉ）口腔の歯肉表面に閉塞せずに適用して、その浸透性及び薬物流動を試験した。本発明者らの結果は、理論通り、陽イオン性ＤＮＶは、いかなる全身的なペイロードの漏出もなく、経口適用の場合には歯槽骨のその標的に、皮膚適用の際には皮膚層に到達し、そのペイロードを送達できることを示す。
【０２６７】
材料
マイクロ流体リアクターシステム（図１Ａ）、２６μＬ〜１０００ｕＬリアクターチップ（図１Ａ示すようにチップに入れる前にマイクロミキサーを使用する）。ＤＩ水、ＰＢＳ、イソプロピルアルコール、クロロホルム、透析膜、凍結乾燥器、ＤＮＶ構成要素（膜成分、膜制御因子及び変形性成分を含む）。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚシリーズ）、動的光散乱機（Ｗｙａｔｔ）。透過型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ）。ミニ押出機及び５０ｎｍ孔径の膜（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）。ＬＡＳ−３０００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）。
【０２６８】
プロトタイプＤＮＶの調製
蛍光ビスホスホネートであるＡＦ６４７−ゾレドロネート（ＡＦ−ＺＯＬ）の経皮送達のためのＤＮＶを、図１Ｂに示すスキームを使用してマイクロ流体リアクター中で調製し、これは、図１Ｂに示すように使用される正確に制御された流量比、室温及び室力で、有機相及び水性相中で構成要素を組み合わせ、マイクロチャネル中で高速の高いずり応力及び制御された混合を提供し、乱流を低減させ、結果として得られるＡＦ−ＺＯＬ  ＤＮＶのサイズ及び分散度を最小にする。
【０２６９】
次いで、収集した試料を２０Ｋ膜を介して２回一晩透析した。透析に続いて、典型的には液体窒素（７７Ｋ）中での長期保存のために、試料を２回凍結乾燥して、粉末にした。ＤＮＶは、麻酔をかけたマウスに対して直接的にピペットで与えることによる局所及び歯肉適用のために、適切なビヒクル中で１０μＬの最終量に再懸濁することができ、または剃った頭蓋冠の皮膚表面に適用するためにゲル剤に組み込むことができる。この領域の意図された最終的な臨床的使用は、予め充填されたシリンジ、スワブまたはゲルパッチ剤の形態である可能性がある。
【０２７０】
特徴づけ
原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）、透過型電子顕微鏡ならびに空の及び積載されたＤＮＶの電気的特性のためのＭａｌｖｅｒｎのＺｅｔａｓｉｚｅｒｆｏｒを使用して、ＤＮＶの特徴づけを行った。
【０２７１】
サイズ−ＤＮＶのサイズ測定値及び分散度の分析結果は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚシリーズ）を介して得て、動的光散乱法（Ｗｙａｔｔ）によって裏づけた。
【０２７２】
ゼータ電位−懸濁液中のＤＮＶのゼータ電位は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ測定（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚシリーズ）によって得た。
【０２７３】
封入効率−超遠心分離法（２時間で１００，０００Ｇ）または透析のいずれかによる、ＤＮＶにカプセル化された薬物と遊離薬物の分離。上清と再懸濁したＤＮＶ溶液の両方を蛍光分光測定によって分析して、封入された薬物と遊離薬物を比較した。封入効率＝（全薬物−遊離薬物）＊１００％。これらの研究のために、フルオレセイン誘導体、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を使用した。
【０２７４】
弾性−異なるように製剤化されたビヒクルの弾性の定性的比較を、ミニ押出機及び５０ｎｍ孔径の膜（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）を用いて行った。
【０２７５】
空の及び積載されたＤＮＶの電気的特性を表２に示す。ＤＮＶのＡＦＭイメージングを図２に示し、ＤＮＶのＴＥＭ画像を図３Ａに示し、共焦点顕微鏡を使用した、保存及び再懸濁後のベジクル存在率は、ベジクルから薬物漏出がないことを図３Ｂに示す。ＤＮＶと従来のリポソームの両方は、マイクロ流体リアクターを使用して調製し、上記のように特徴づけされた。
【表２】
2020515638.tif 000010
【０２７６】
図４ＡはＤＮＶのサイズ分布を示し、表３はＤＮＶと従来のリポソームの両方についての特徴づけの概要を示す。
【表３】
2020515638.tif 000011
【０２７７】
実施例２
インビボ研究：経口腔粘膜的及び経皮的局所適用におけるＤＮＶの適用＆技術革新
ＤＮＶが口腔粘膜の歯肉表面に及び頭蓋冠の皮膚に適用されたマウスにおけるインビボ試験は、ＤＮＶが、全身的なペイロードの漏出なしで、口腔粘膜関門を効率的に透過し、下部の歯槽骨に局部的に薬物を送達できることを示した。経皮的局所適用の場合には、ＤＮＶは、頭蓋骨を通ってまたは全身的に透過し、頭蓋骨にまたは全身的に薬物を送達することなく、皮膚の層内にペイロードを送達した。
【０２７８】
特に、２つの適用部位、（ｉ）歯肉表面及び（ｉｉ）頭蓋冠の皮膚（それぞれｎ＝２）におけるＤＮＶの能力を試験するために、マウス（ｎ＝４）でインビボ研究を行った。蛍光性骨標的化薬物をカプセル化するＤＮＶに対して、空のＤＮＶの陰性対照を使用し、試験した。マウスを屠殺し、適用してから４８時間に組織及び骨を分析した。
【０２７９】
本研究は、ＤＮＶの変形性によって、こうしたナノビヒクル（ナノスケールベジクル）が、破裂することなしにそのペイロードを保持しながら、その直径よりもかなり小さい孔を無理して通り抜けることが可能になることを示唆する。これによって、それらが、特に妨げになる関門、例えば口腔粘膜を通ってより深く浸透すること、及び全身的なペイロードの漏出なしで標的部位のみに進入することによって、潜在的な合併症を回避することが可能になる（例えば、図４Ｂ、５Ａ〜５Ｃ、図６、図７Ａ及び７Ｂ及び図８を参照されたい。
【０２８０】
考察
約２００ｎｍのサイズのＤＮＶの非常に均一な集団を効率的に合成して、マイクロ流体リアクターから、急速で、制御され且つ連続的な様式で蛍光性骨標的化親水性薬物をカプセル化した。本明細書では、陽イオン性ＤＮＶを合成したが、特定の荷電成分の組み込みのみが異なる同じ変形性成分を用いて、陰イオン性及び中性のＤＮＶも同様に合成することができる。
【０２８１】
マウスにおけるインビボ試験、特に、口腔粘膜への及び頭蓋冠の皮膚への適用は、ビヒクルが、全身的なペイロードの漏出なしで、口腔粘膜関門を効率的に透過し、下部の歯槽骨に局部的に薬物を送達できることを示した。局所適用の場合には、ＤＮＶは、頭蓋骨を通ってまたは全身的に透過し、頭蓋骨にまたは全身的に薬物を送達することなく、皮膚の層内にペイロードを送達した。
【０２８２】
本研究は、それらの変形性によって、こうしたナノビヒクルが、破裂することなしにそのペイロードを保持しながら、その直径よりもかなり小さい孔を無理して通り抜けることが可能になることを示唆する。これによって、それらが、特に妨げになる関門、例えば口腔粘膜を通ってより深く浸透すること、及び全身的なペイロードの漏出なしで標的部位に進入することによって、潜在的な合併症を回避することが可能になる。
【０２８３】
皮膚におけるＤＮＶのインピーダンスは、適用時のそれらのサイズに起因し得る。均一ではあるが、２回目の凍結乾燥の後、集団は約６００ｎｍのサイズであった。研究によって、２００ｎｍのサイズを超えるナノ粒子は角質層を通って透過するのが困難であるように思われることが示される（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）ＡＡＰＳ  Ｊ．１１（１）：５４−６４、Ｈｏｌｐｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２７（７）：１２２４−１２３６、Ｓｅｎｔｊｕｒｃ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．５９（１）：８７−９７）。皮膚浸透に対するＤＮＶのサイズの効果を決定するためのさらなる実験が現在進行中である。
【０２８４】
結論
組織学的解析によって、皮膚、歯肉及び骨における蓄積部位の決定が可能になる。その生分解性、比較的無視できる毒性、合成の容易さ及び大規模製造の可能性を考えれば、これらのＤＮＶ担体は、口腔粘膜関門を介し、皮膚へ局部的に新規な局部的送達システムを提供し、これは、いくつかの歯科目的、機能性化粧品目的または再生目的に有用であり得る。
【０２８５】
実施例３
経血液脳関門送達のための変形可能なナノスケールビヒクル
材料
変形可能なナノスケールビヒクル（ＤＮＶ）の構成要素は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ及びＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓから購入した。２つのポンプ、注射器、インジェクションループ、マイクロリアクター及びチップホルダーを含むマイクロ流体システムは、Ｓｙｒｒｉｓから購入した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、無水イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）、クロロホルム及びガランギン（ＧＡＬ）は、Ｓｉｇｍａから入手した。透析膜、０．１μｍ及び０．２μｍのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルター、凍結乾燥器、ロータリーエバポレーター及び遠心分離管は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから得た。動的光散乱機はＷｙａｔからであり、透過型電子顕微鏡はＪＥＯＬからであり、原子間力顕微鏡はＢｒｕｋｅｒからであり、質量分析計はＡｄｖｉｏｎからであった。
【０２８６】
方法
様々な実施形態では、ＤＮＶ構成要素は、脂質の陰イオン性リン脂質、コレステロール、及び非イオン性界面活性剤Ｓｐａｎ８０から構成される。使用する正確な脂質成分、界面活性剤及びモル比は、図９のスキームに示すように、ＤＮＶの意図された適用に基づいて決定される。例示的であるが非限定な実施形態では、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、コレステロール及びジヘキサデシルホスフェート（ＤＨＰ）をクロロホルムに溶解し、４：４：２のモル比で混合する。次いで、クロロホルムを一晩またはロータリーエバポレーター中で蒸発させた。この脂質混合物をＩＰＡに溶解して、２０ｍＭの濃度を得た。次いで、１．５％（脂質混合物のｗ／ｗ）のＴｗｅｅｎ２０またはＳｐａｎ８０を脂質混合物に加え、混合した。１０ミリモル濃度のガランギン（ＧＡＬ）をＩＰＡに溶解し、４：１のモル比の脂質／界面活性剤混合物に加え、続いて、０．２μｍのＰＥＳフィルターを通して濾過した。０．１μｍのＰＥＳフィルターを使用して、ＰＢＳ及び蒸留（ｄｄ）水を濾過する。３〜４の流量比（ＩＰＡに対するＰＢＳまたはｄｄ水）をポンプに設定し、このシステムをＩＰＡ及びＰＢＳまたは蒸留水のいずれかで洗浄した。典型的には２６μＬのマイクロリアクター（しかし、より大きなサイズのリアクターをサイズ及び形態を最適化するために使用することができる）をＤＮＶの合成に使用することができる。マイクロ流体システムを一旦洗浄したら、脂質／ＧＡＬ／界面活性剤混合物をインジェクションループ中にロードし、次いで、２５〜４０℃及び１バールの圧力で第２のポンプを使用して、水溶液（ＰＢＳまたはｄｄ水）とともにマイクロリアクターを通してポンピングして、ＧＡＬカプセル化ＤＮＶ（Ｌｉｐｏ−ＧＡＬ）を生成する。ＤＮＶを合成した後、透析及び凍結乾燥または超遠心分離法のいずれかによってこれらを濃縮して、ＤＮＶのペレットを生成する。次いで、ＤＬＳによってサイズの特徴づけを行い、サイズ分布を図１０に示す。超遠心分離法または透析を使用して、リポソーム中に組み込まれなかったＧＡＬを溶液から除去する。
【０２８７】
特徴づけ
Ｗｙａｔｔの機器の動的光散乱法によって、Ｌｉｐｏ−ＧＡＬ  ＤＮＶのサイズを測定した（図１０）。透過型電子顕微鏡及び原子間力顕微鏡によってこの測定を確証する。ＨＰＬＣ及び質量分析を使用して遊離ＧＡＬを計算することによって、封入効率を計算する。
【０２８８】
考察
変形可能なナノスケールビヒクルは、ある種の実施形態では、リン脂質、例えば、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ−１−プロピル）トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から構成される、弾性ナノ粒子である。リン脂質の他に、ＤＮＶは、２つの重要な成分：膜制御因子であるコレステロール及びナノ粒子の脂質二重層に変形性を加えるエッジ活性化因子として働く非イオン性界面活性剤（例えば、Ｓｐａｎ８０、Ｔｗｅｅｎ２０など）を含む。
【０２８９】
例示的であるが非限定な一実施形態では、脂質（コレステロールを含む）及びエッジ活性化因子は８５：１５のｗ／ｗ比で存在する。
【０２９０】
使用される脂質成分の正確なモル比及びタイプは、ＤＮＶの意図された適用に基づいて決定される。例えば、経口腔粘膜及び局所適用についての例示的一実施形態では、５：３：２のモル比（ＤＰＰＣ：コレステロール：ＤＯＴＡＰ）を使用することができ、混合物は１５重量％のＳｐａｎ８０を含む。
【０２９１】
イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）などの有機溶媒に溶解されたこれらの成分は、２５℃〜４０℃及び１バールの圧力での効率的且つ連続的な合成のために、マイクロ流体リアクターシステム中への別々の投入を介して水溶液（ＰＢＳまたはＤＩ水）と混合される。マイクロ流体リアクターチャネルは、高いずり応力及び乱流が最小限である制御された混合を提供し、明確なＤＮＶ集団をもたらし、適切なサイズを得るための、超音波処理または押出成形などの後処理の必要性を排除する。有機相から水性相への移行際に、記載された成分は、水性溶媒におけるそれらの熱力学的安定性に従って、ＤＮＶに自己構成する。
【０２９２】
ＤＮＶは、無毒であり、バッチ間の変動性がほとんどなく非常に再現性よく調製され、スケーラブルであり、集団及び分布が非常に均一であり、サイズが調整可能であり、非常に局在型のペイロード送達を提供する。本発明者らの研究は、この方法は、５０ｎｍのサイズからミクロン範囲のサイズの均一集団を生成することができることを示す。結果として得られるＤＮＶのサイズは、主に水性相及び脂質含有有機相の間の流量比（ＦＲＲ）の調節によって、調製される。本発明者らの調査によって、流量比を増加させることが、結果として得られるＤＮＶのサイズを直接的に減少させること、及びサイズの分散度を低減させることが示された。経口腔粘膜及び局所適用については、２５０ｎｍが中心のサイズのＤＮＶを前述の成分から得るために、１００のＦＲＲを使用した。使用される成分の特定のタイプに応じて、同じＦＲＲが異なるサイズのＤＮＶを生成し得ることに留意されたい。
【０２９３】
ＤＮＶは、例えば、小分子、タンパク質、ＲＮＡ及びＤＮＡを含めた様々なクラスの薬物をカプセル化するように合成することができる。これは、親水性薬物及び疎水性薬物の両方を効率的にカプセル化することができるが、後者でより好結果である。本発明者らの研究では、本発明者らは、以下の親水性薬物を首尾よくカプセル化するようにＤＮＶを合成した：フルオレセイン誘導体、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）及び蛍光的にタグ付けされた骨標的化薬物。疎水性薬物の場合には、本発明者らは、血液脳関門を通って送達されるように、ガランギンをカプセル化するためにＤＮＶを積極的に使用する。所与の薬物の溶解度は、それがマイクロ流体リアクターに導入される相（有機または水性）を規定し、薬物とＤＮＶ成分の両方が同じ（有機）相に存在する場合に、カプセル化が最高になる。
【０２９４】
別の興味深い調整可能な特色はＤＮＶに含まれる電荷であり、荷電したリン脂質成分の様々な組み合わせの使用を通して、様々な電荷濃度（ゼータ電位）のＤＮＶを作出することができる。本発明者らは、中性（ＤＰＰＣ、コレステロール、ＤＯＰＥ）、陽イオン性（ＤＰＰＣ、コレステロール、ＤＯＴＡＰ）及び陰イオン性（ＤＰＰＣ、コレステロール、ＤＨＰ）のＤＮＶを合成した。電荷の強度は、ＤＮＶ調製混合物中の特定の荷電成分の濃度を調節することによって調整することができる。
【０２９５】
インビボ使用（経口腔粘膜及び局所適用）のためのプロトタイプの調製。
【０２９６】
マイクロ流体リアクターから収集したＤＮＶ試料を、２０Ｋ膜を介して２回一晩透析して、溶液から遊離薬物の９９．９％を除去する。透析に続いて、試料を凍結乾燥して粉末にし、１０μＬの最終量に再懸濁し、これは、麻酔をかけたマウスに対して直接的にピペットで与えることによる局所及び歯肉適用に適切である。この領域の意図された最終的な臨床的使用は、予め充填されたシリンジの形態である可能性がある。
【０２９７】
経口腔粘膜及び局所適用におけるＤＮＶの適用＆技術革新：マウスにおけるインビボ試験、特に、口腔粘膜の歯肉表面への、及び頭蓋冠の皮膚への適用は、ビヒクルは、全身的なペイロードの漏出なしで、口腔粘膜関門を効率的に透過し、下部の歯槽骨に局部的に薬物を送達できることを示した。局所適用の場合には、ＤＮＶは、頭蓋骨を通ってまたは全身的に透過し、頭蓋骨にまたは全身的に薬物を送達することなく、皮膚の層内にペイロードを送達した。
【０２９８】
本研究は、ＤＮＶの変形性によって、こうしたナノビヒクルが、破裂することなしにそのペイロードを保持しながら、その直径よりもかなり小さい孔を無理して通り抜けることが可能になることを示唆する。これによって、それらが、特に妨げになる関門、例えば口腔粘膜を通ってより深く浸透すること、及び全身的なペイロードの漏出なしで標的部位に進入することによって、潜在的な合併症を回避することが可能になる。
【０２９９】
材料（特徴づけを含む）
マイクロ流体リアクターシステム、２６μＬリアクターチップ（サイズ及び形態を制御するために、より大きなサイズを必要に応じて使用することができる）、ＤＩ水、ＰＢＳ、イソプロピルアルコール、クロロホルム、透析膜、凍結乾燥器、ＤＮＶ構成要素（膜成分、膜制御因子及び変形性成分を含む）。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚシリーズ）、動的光散乱機（Ｗｙａｔｔ）。透過型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ）。原子間力顕微鏡（Ｂｒｕｋｅｒ）。
【０３００】
本発明者らの研究では、サイズ、ゼータ電位、封入効率、定性的弾性及び形態の点から様々な合成ＤＮＶ集団を特徴づけした。
【０３０１】
さらに、これらのＤＮＶは、水性懸濁液中で長期間にわたり安定なままであり、おそらく融合現象のために集団均一性のいくらかの低減はあるが、２か月後でさえも存在可能なままである。
【０３０２】
ＤＮＶの血液脳関門浸透性の特徴づけは、Ｃａｃｏ−２細胞系を使用して測定し、さらに、マウスで薬物動態研究を行うことによって確証した。
【０３０３】
実施例４
血液脳関門（ＢＢＢ）を透過することができる安定なＣＮＳ標的リポソームを生成するためのＤＮＶの使用
Ｔｆ−Ｌｉｐｏ−ＧＡＬ  ＤＮＶは、ＤＤＰＥ（１８：１ドデカニルＰＥ、または１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（ドデカニル））がコンジュゲートされたトランスフェリン（Ｔｆ）タンパク質を有機相中に含むことによって、マイクロ流体リアクター中で、実施例３に記載されているように調製することができる。ＤＮＶの単離は、超遠心分離法を使用する上記の通りである。
【０３０４】
Ｔｆ−ＤＤＰＥコンジュゲートの合成
ＰＢＳ中でカルボジイミド化学（Ｍｕｔｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）を利用して、トランスフェリンをＤＤＰＥにコンジュゲートした。概して、ＤＤＰＥへのトランスフェリンのコンジュゲーションのために、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド（ＮＨＳ）及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ．ＨＣｌ）を、１：５：５（ＤＤＰＥ：ＥＤＣ．ＨＣｌ：ＮＨＳ）のモル比で、ＤＤＰＥのＰＢＳ溶液（ｐＨ５．８）に加えた。特に、１．５ｍＬ  ＰＢＳ（ｐＨ５．８）中のＤＤＰＥ（５０ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＥＤＣ．ＨＣｌ（４９ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）及びＮＨＳ（３０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を２５℃で５時間撹拌し、続いて、４℃で２４時間撹拌した。粗混合物を１ｍＬの２％（ｗ／ｖ）トランスフェリンとさらに混合し、４℃で８時間撹拌した。反応混合物をさらに２つの一定分量に分割し、蒸留水（ｄｄＨ２Ｏ）に対して３ｍＬの透析カセット（ＭＷカットオフ：２０ｋＤａ）によって４８時間透析し、する過剰なＤＤＰＥ、ＮＨＳ及びＥＤＣ塩酸塩を除去するために、最初の２時間後に頻繁にｄｄＨ２Ｏを変え、１２時間毎に３回繰り返した。得られた溶液を急速凍結し、凍結乾燥して、無色の粉末としてＤＤＰＥ−トランスフェリンコンジュゲートを良好な収率で得て、リポソーム合成に必要となるまで、これを不活性雰囲気下で−２０℃で保存した（図１２）。Ｔｆ−Ｌｉｐｏ−ＧＡＬについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び代表的な漫画図とともにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる特徴づけを図１３に示す。ＭＡＬＤＩ質量分光分析は、ＤＤＰＥ対トランスフェリンの比が（４：１）であることを示す。
【０３０５】
脳浸透性小分子−ＤＤＰＥコンジュゲートの合成
図１１Ｂに示すように、ベンゾジアゼピンなどの脳浸透性が高まった脳浸透性小分子鋳型、または中性アミノ酸トランスポーター（ＬＡＴ１）もしくはグルコース輸送体（ＧｌｕＴ１）などのトランスポーターを使用する分子を、図１１Ａに示す活性エステルカップリングを介して、または図１１Ｂに示すクリック化学を介して、ＤＤＰＥに固着させることができる。ＤＤＰＥへの小分子の共有結合性カップリングは、Ｃｕ（Ｉ）触媒化アジド−アルキン付加環化（ＣｕＡＡＣ）またはＣｕ（Ｉ）フリーアジドクリック化学反応を使用して行うことができるであろう。
【０３０６】
実施例５
例えば多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）の治療のための、血液脳関門（ＢＢＢ）を透過することができる安定なＣＮＳ標的リポソームを生成するためのＤＮＶの使用
すべてのがんの中で最も侵襲性であり、致死的である多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）の治療のための潜在的な治療剤を送達するために、ＤＮＶを使用することができる。ＧＢＭは従来の治療に不応性であり、これは、部分的には、ＧＢＭ細胞の浸潤性及びこれらの腫瘍の中枢神経系（ＣＮＳ）への隔離によるものである。
【０３０７】
ＧＢＭは軽度神経膠腫から生じ得、これらの７０％より多くが機能獲得型の酵素活性の増大につながるイソクエン酸デヒドロゲナーゼＩＤＨ１／２変異を有するので、治療剤として、ＩＤＨ１阻害剤に関心が持たれている。本発明者らは、様々な神経膠腫細胞株ならびに神経膠腫及びＧＢＭのインビボモデルにおいて有効性を試験するために、ＡＧＩ−５１９８などの市販のＩＤＨ１阻害剤をＤＮＶ中にカプセル化している。
【０３０８】
さらに、＞５０％のヒト腫瘍で見つかる変異した腫瘍抑制因子ｐ５３が、機能喪失型をもたらす、凝集傾向のあるペプチドを生成することが、最近の研究によって示されたので、本発明者らは、ｐ５３凝集の妨害物もカプセル化している。ＤＮＶにおけるこれらのペプチド性妨害物の送達は、任意の抗腫瘍効果のインビボ評価を可能にするであろう。
【０３０９】
実施例６
ＡＤのための、ＢＢＢを超えてより大きな生体分子を送達するためのＤＮＶの使用
ｓＡＰＰαはＡＰＰのアルファプロセシング由来の１００Ｋｄの断片であり、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂによって、ベータセクレターゼＢＡＣＥ１を阻害することが最近示された。ＢＡＣＥ阻害剤はアルツハイマー病（ＡＤ）治療剤としての可能性があるので、ＢＢＢを超えるｓＡＰＰαの送達は、潜在的なＢＡＣＥ阻害剤としてのその評価を可能にするであろう。本発明者らは、組換えで生成されたｓＡＰＰαを安定してカプセル化するためのＤＮＶを生成しており、それらの有効性をＡＤマウスモデルで評価するつもりである。
【０３１０】
実施例７
ＡＤのための、ＢＢＢ超えて脳にｍｉＲＮＡを送達ためのＤＮＶの使用
ＤＮＶは、アルツハイマー病（ＡＤ）の治療のために、ｍｉＲＮＡ−１０７（ｍｉＲ−１０７）などのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の送達に使用することもできる。ｍｉＲＮＡは、遺伝子発現の調節因子として機能する非タンパク質コードＲＮＡである低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の内生的に発現している形態である。ｍｉＲ−１０７は、初期ＡＤの脳脊髄液（ＣＳＦ）で低下していることが示されており、この低下は、ＢＡＣＥの発現及び活性のアップレギュレーションを介して疾患の進行を促進し得る。したがって、脳内のｍｉＲ−１０７のレベルの増大は、潜在的に、ＢＡＣＥの発現及び活性を正常化する、Ａβペプチドの生成（ＡＤの病態に関与する）を低減する、ｓＡＰＰαを増大させる、及びＡＤの潜在的な治療方法である可能性がある。本発明者らのマイクロ流体リアクター中で調製したＣＮＳ標的ＤＮＶにおけるｍｉＲ−１０７の送達は、インビボでＢＡＣＥをモジュレートする可能性を与える。本発明者らは、ＢＢＢ浸透性と有効性の両方について、ＡＤマウスにおいてこれらのＤＮＶを試験する予定である。同様に、ＡＤ及び他のＣＮＳ障害における疾患病態をモジュレートする他のｍｉＲＮＡを合成し、インビボで試験することができる。
【０３１１】
実施例８
パーキンソン病（ＰＤ）のための、経皮的適用によってＢＢＢ超えて脳に薬物を送達するためのＤＮＶの使用
送達を容易にする及び服薬遵守を高めるために、ＰＤ薬のプラミペキソールをカプセル化し、経皮的に送達するのにＤＮＶを使用することができる。プラミペキソールは、脳においてドーパミン受容体を刺激する、良好な水溶性を有する低分子量の治療剤である。その高い極性の親水性（実験的に測定すると０．４のｌｏｇＰ）のために、角質層（皮膚の外層）を超えて遊離薬物を経皮送達することは困難である。本発明者らは、これらのＤＮＶナノ粒子が角質層を通過し、脳へのプラミペキソールの経皮送達を可能にする能力を試験するために、プラミペキソールをＤＮＶ中にカプセル化している。
【０３１２】
実施例９
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）のための、サーチュイン１（ＳｉｒＴ１）促進剤を送達するためのＤＮＶの使用
ＤＮＶは、ＡＬＳ療法のために、サーチュイン１（ＳｉｒＴ１）促進剤をカプセル化するために使用することもできる。ＡＬＳのマウスモデルにおけるインビボ研究によって、ＳｉｒＴ１レベルの増大がＡＬＳ表現型を改善することが示された。ＳｉｒＴ１レベルを増大させる分子が、ＡＬＳ治療のための経皮送達のためにＤＮＶ中にカプセル化され、ＡＬＳのマウスモデルにおいて試験されるであろう。
【０３１３】
実施例１０
トランスフェリンを有するまたは有さない、ガランギン含有及びレスベラトロール含有変形可能ナノベジクルの浸透性を決定するための、Ｃａｃｏ−２細胞の使用
実施例１０の概要
アルツハイマー病（ＡＤ）などの神経変性障害の治療における共通の課題は、血液脳関門（ＢＢＢ）を透過し、中枢神経系に化合物を効果的に送達することである。本発明者らは、典型的にはＢＢＢを透過することができない潜在的な治療剤をカプセル化する、トランスフェリンを有するまたは有さない変形可能ナノベジクル（ＤＮＶ）を合成することによって問題に取り組む。２つのそのような化合物は、ガランギン（図９Ｂを参照されたい）及びレスベラトロール（図１４を参照されたい）である。トランスフェリンを有するまたは有さないＤＮＶがＢＢＢ超えてこれらの化合物を輸送する能力を試験する目的で、ＢＢＢを作り出すのに役立つ密着結合を模倣するためにＣａｃｏ−２細胞を使用する。ガランギンとレスベラトロールの両方とも、これらがＤＮＶ中にパッケージ化された場合に、Ｃａｃｏ−２細胞をより良く透過することができたが、トランスフェリンを含むＤＮＶとトランスフェリンを含まないＤＮＶの間に差はなかった。
【０３１４】
実施例１０の背景
ある種の実施形態では、変形可能なナノベジクル（ＤＮＶ）は、表面活性剤Ｓｐａｎ８０を含むリポソームである（図２）。本発明者らは、化合物をＤＮＶ中にカプセル化するためにマイクロ流体リアクターを使用する。２つのそのような化合物は、ショウガの根から単離されたバイオフラボノイドであるガランギン、ならびに赤ワイン、ピーナッツ及び他の食物で見つかるスチルベンであるレスベラトロールである。これらの化合物は、ＡＤに対して潜在的な治療特性を有するが、これらは、その治療効果を示すために、ＢＢＢを透過することができない。ＤＮＶがＢＢＢを透過する能力を潜在的に増強するために、トランスフェリンもそれらに加えた。以前の研究において、図１５に示すように、内皮細胞は、受容体媒介性メカニズムによって、トランスフェリンに結合したリポソームを吸収した。この経路は、ＤＮＶがＣａｃｏ−２細胞に結合し、次いでそれらの密着結合を通過する能力を増強し得る。本発明者らは、トランスフェリンを有するまたは有さないＤＮＶがＢＢＢを透過する能力を試験するために、ＢＢＢで見られるものと類似した密着結合を形成するＣａｃｏ−２細胞（上皮性ヒト結腸腺癌）を使用する。
【０３１５】
方法
ＤＮＶは、ＤＭＰＣ、ＤＣＰ及びＣＨ（２：２：１）をガランギンまたはレスベラトロールのいずれかとともにＩＰＡに溶解して、１０ｍＭ溶液を生成することによって作出した。トランスフェリンを有するＤＮＶを作出するために、脂質質量の０．１％でトランスフェリンを加えた。次いで、５００μＬ／分の流量でこの溶液をマイクロ流体リアクターにインジェクトし、一方で、５ｍＬ／分の流量で水もインジェクトする。Ｃａｃｏ−２細胞は、３回の継代にわたって増殖させてから、トランスウェルインサートに単層としてプレーティングした。次いで、さらに１か月増殖させる。トランスフェリンを有するまたは有さない、ガランギンパッケージ化及びトランスフェリンパッケージ化ＤＮＶを、各トランスウェルインサートの頂端側チャンバーに入れ、１５分毎に、基底側チャンバーからの半量を除去し、ＨＢＳＳと交換した（図１６）。ＬＣ−ＭＳを使用してこれらの試料のそれぞれの薬物濃度を決定し、各化合物の受動性移行に対する浸透係数を式：Ｐａｐｐ＝（ｄＱ／ｄｔ）（１／（ＡＣ０））を用いて計算し、式中、ｄＱ／ｄｔは経時的に膜に浸透する薬物の量（ｃｍ／秒）であり、Ａはフィルターの表面積（ｃｍ２）であり、Ｃ０はドナーチャンバー中の初期濃度（μｍｏｌ／ｃｍ３）である。
【０３１６】
結果
レスベラトロール及びガランギンは、これらがＤＮＶ中にパッケージ化されていた場合に、Ｃａｃｏ−２細胞をより良く透過することができたが、トランスフェリンを有するまたは有さないＤＮＶが細胞を透過する能力の間に差はなかったに（図１７）。トランスフェリンを有するレスベラトロールＤＮＶ（ＲＴＤ）及びトランスフェリンを有さないレスベラトロールＤＮＶ（ＲＤ）の両方とも、遊離レスベラトロールよりも大きな浸透係数を有していた（図１８）。図１７の本質的にゼロの勾配及び図１８の低Ｐａｐｐによって分かるように、トランスフェリンを有するガランギンＤＮＶ（ＧＴＤ）及びトランスフェリンを有さないガランギンＤＮＶ（ＧＤ）は、１５分の最初の時点の前に平衡状態に達した。
【０３１７】
結論
これらのデータは、ＤＮＶが、通常は不浸透性の化合物をＢＢＢを通ってＣＮＳ中に効果的に送達するであろうことを示唆する。
【０３１８】
実施例１１
ＧＡＬ−ＤＮＶ及びＴ−ＤＮＶのカプセル化及び試験
マウスにおけるガランギン及びプロガランギンの薬物動態を図１９Ａ及び１９Ｂに示す。これらに示すように、ガランギンの低い脳レベルが観察され、１時間でおよそ５０ｎｇ／ｇのＣｍａｘ及び低い脳対血漿比（１：１０）であった（図１９Ａ）。ガランギンはＡβ４０レベルを低減することが観察されたが、Ａβ４２レベルには効果がなかった（図１９Ｂ）。プロガランギンは、Ａβ４０及びＡβ４２のレベルを低減した（図１９Ｂ）。
【０３１９】
薬物動態が確立されたので、変形可能ナノベジクル（ＤＮＶ）がより効果的にガランギンを脳に向けることができるかどうかを確かめることに決めた。さらに、脳浸透性を増強することが知られているトランスフェリンが有用であるかどうかを試験することが所望されたので、トランスフェリンを用いてまたは用いないでＧａｌ−ＤＮＶを調製した。
【０３２０】
本明細書に記載のリン脂質ベースの変形可能ナノベジクル（ＤＮＶ）は、限定されないが、以下のものを含めたいくつかの利点を提供する：
形状の柔軟性、
多様なクラスの治療剤のカプセル化、及び
局在型経皮送達と同時に全身的曝露を最小にすること（例えば、図２０を参照されたい）。
【０３２１】
図２１Ａ及び２１Ｂに例示するように、本明細書に記載のＤＮＶの合成のためにマイクロ流体リアクターを使用した。ＤＮＶのマイクロ流体リアクターベースの合成は、流速、モル濃度及び流量比などの入力パラメータの変更を可能にし、重要なＤＮＶ特性（例えば、サイズ、弾性及び表面電荷）の微調整を可能にする。
【０３２２】
図２１Ａに例示するように、マイクロ流体リアクターを使用して、全流量（ＴＦＲ）及び流量比（ＦＲＲ）を調節して、ＤＮＶのサイズを微調整することができる。ＦＲＲはリポソームのサイズと逆相関していることに留意されたい。
【０３２３】
図２２は、従来のリポソームとＤＮＶの間の組成のある種の違いを図示し、一方で、図１０Ａは、ＤＬＳによるＤＮＶ（複数可）と従来のリポソームの物理的特性の違いを示し、図１０Ｂは、ＤＮＶ（複数可）と従来のリポソームの回収後のサイズ及びカプセル化効率を示す。
【０３２４】
上記のように、トランスフェリンで機能化されたＤＮＶ（複数可）を調製することを決定した。トランスフェリンは、脳、毛細血管内皮細胞（ＢＭＶＥＣ）及び脳神経膠腫細胞で高発現しているトランスフェリング受容体（ＴＲ）に結合する血清糖タンパク質（約８０ＫＤａ）である。トランスフェリングは、受容体媒介性エンドサイトーシスを介して血液脳関門を通過することができ（例えば、図１５を参照されたい）、Ｔｆ含有ナノ粒子はｓｉＲＮＡをがん患者に送達するために使用されており、機能的ｓｉＲＮＡを黒色腫腫瘍に用量依存的に送達することが示されている。しかし、血液からの受容体結合、ＢＢＢ超えるトランスサイトーシス及び受容体から脳実質内への遊離を可能にするために、結合活性が適切にモジュレートされなければならない。トランスフェリンで機能化されたＤＮＶが治療剤（例えば、ガランギン）の脳への送達を向上させることができるかどうかを判定するために、実験を行った。
【０３２５】
トランスフェリンで機能されたＤＮＶ（複数可）を調製するために、カルボジイミド化学を使用して、ＤＤＰＥをホロ−トランスフェリンにコンジュゲートした（例えば、図１１の反応スキームを参照されたい）。マイクロ流体リアクターを使用して、機能化ＤＮＶ（複数可）を合成した（例えば、図２３を参照されたい）。透析を使用して、過剰なＮＨＳ、ＥＤＣ及び未コンジュゲートＤＤＰＥを除去した。精製後に、ＤＤＰＥ−Ｔコンジュゲートを凍結乾燥し、Ｔ−ＤＮＶ合成に必要とされるまで、−２０℃で保存した。Ｔｔは何か月も−２０℃で安定である。
【０３２６】
ＤＮＶ（複数可）、ガランギン含有ＤＮＶ（複数可）、トランスフェリンで機能されたＤＮＶ（複数可）及びトランスフェリンで機能されたＤＮＶの画像を図２４に示す。
【０３２７】
ＤＤＰＥ−Ｔコンジュゲートを、精製及び凍結乾燥後にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって特徴づけし（例えば、図１３Ａを参照されたい）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＤＤＰＥ−Ｔとトランスフェリンについて同様の泳動を示した（図１３Ｂ）。ＤＮＶの概略図を図１３Ｃに示す。
【０３２８】
血液脳関門をシミュレートするＣＡＣＯ−２細胞モデルを使用して、ＧＡＬ−ＤＮＶ（複数可）及びＧＡＬ−Ｔ−ＤＮＶの細胞浸透性を使用した（例えば、図２５を参照されたい）。
【０３２９】
Ｃａｃｏ−２細胞モデルを介するＤＮＶの輸送を、２１間の培養期間の後に評価した。試験物の濃度は１００μｍであり、細胞播種密度は２．５×１０５であり、ＴＥＥＲは＞３５０Ωｃｍ２であった。この分析は、Ｇａｌ−ＤＮＶ及びＧａｌ−Ｔ−ＤＮＶが本モデルにおいて同様の浸透性を有することを示した（例えば、図２６を参照されたい）。
【０３３０】
実施例１２
ｓＡＰＰα−ＤＮＶを使用するＣＮＳ送達
ｓＡＰＰαは大きな６７８アミノ酸のタンパク質である。ｓＡＰＰα含有ＤＮＶ（ｓＡＰＰα  ＤＮＶ）は、本明細書に記載のように生成した。表４はｓＡＰＰα−ＤＮＶの特徴づけを例示する。
【表４】
2020515638.tif 000012
【０３３１】
ＣＨＯ−７Ｗ細胞でｓＡＰＰα−ＤＮＶを試験した。ｓＡＰＰβ及びＡβ１−４２は、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ検出キットを使用して、培地からアッセイした。ｓＡＰＰβ及びＡβｌ−４２の低減が観察され（例えば、図２７を参照されたい）、これは、ＤＮＶに含まれるｓＡＰＰαがＤＮＶ合成後に機能的であり、標的結合を示したことを示す。
【０３３２】
野生型マウスに２０μｇのｓＡＰＰα−ＤＮＶを静脈内投与し、１時間後及び２４時間後に安楽死させ、脳を食塩水で灌流し、ホモジナイズし、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ検出キットを使用して、脳ホモジネートにおいてｓＡＰＰαレベルを評価した。ｓＡＰＰαは、１時間後の脳ホモジネートにおいて検出された（例えば、図２８を参照されたい）。
【０３３３】
野生型マウスに２０μｇのｓＡＰＰα−ＤＮＶを皮下（Ｓｕｂ  Ｑ）または腹腔内（ＩＰ）のいずれかで投与した。投薬の１時間後及び４時間後にマウスを安楽死させ、脳を食塩水で灌流し、ホモジナイズし、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ検出キットを使用して、脳ホモジネートにおいてｓＡＰＰαレベルを評価した。ｓＡＰＰαは、１時間後の脳ホモジネートにおいて検出された。この結果は、Ｓｕｂ  Ｑ経路によって、１時間で脳内に１．８ｎＭのｓＡＰＰαを、４時間で脳内に１．８５ｎＭのｓＡＰＰαを検出することが可能であることを示す。ＩＰ経路によって、１．７ｎＭ及び１．８ｎＭのｓＡＰＰαを、それぞれ１時間及び４時間で検出することができた（例えば、図２９を参照されたい）。比較すると、ＩＶ経路によって脳内に約１２ｎＭのｓＡＰＰαを検出することができた。
【０３３４】
２０μｇのｓＡＰＰα−ＤＮＶまたは２０μｇのｓＡＰＰα及び空のＤＮＶ（対照）をＥ４ＦＡＤマウスに静脈内投与した。１時間後にマウスを安楽死させ、脳を食塩水で灌流し、ホモジナイズし、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ検出キットを使用して、脳ホモジネートにおいてｓＡＰＰα及びｓＡＰＰβレベルを評価した。ｓＡＰＰβの低減傾向が観察された（Ｐ約０．０７３１）（例えば、図３０を参照されたい）。ｓＡＰＰα単独またはビヒクルは、ｓＡＰＰβレベルの低減を引き起こさなかった。
【０３３５】
上で例示するように、ある種の実施形態では、本明細書に記載の変形可能なナノスケールベジクル（ＤＮＶ）は、その中のペイロードを維持しながら変形することができる＜２００ｎｍのリポソームを含む。様々な実施形態では、これらは、ＧＲＡＳ（一般に安全と認められる（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  ｒｅｇａｒｄｅｄ  ａｓ  ｓａｆｅ））材料から構成され、小分子、親油性及び親水性の両方、ＤＮＡ／ＲＮＡ／ｓｉＲＮＡ及びペプチド／タンパク質／アプタマーならびにこれらの組み合わせを含めた様々な分子をカプセル化することができる。ＤＮＶの表面は、異なる表面電荷、より長い循環半減期のためのＰＥＧのような分子、及び標的薬物送達のための担体タンパク質を含むように容易に改変することができる。ＤＮＶは、そのサイズ、ゼータ電位を制御することを可能にし、スケーラビリティ及びバッチ間の再現性を可能にするマイクロ流体リアクター中で容易に合成することができる。本発明者らが合成するＤＮＶは、凍結乾燥粉末として容易に保存することができ、本発明者らは、この形態が少なくとも６か月にわたって保存中に安定であると決定した。
【０３３６】
上で示すように、本発明者らは、大きな神経栄養因子、すなわち、可溶性アミロイド前駆体タンパク質−α（ｓＡＰＰα、６７８アミノ酸タンパク質）を使用して概念実証を示し、ＤＮＶ−ｓＡＰＰαを用いて、約１２ｎＭの薬理学的に適切な用量のｓＡＰＰαの脳への送達が達成され、標的結合がもたらされることを示した。
【０３３７】
したがって、特定部分の送達のためにＤＮＶを最適化することができることが認識されるであろうが、ＤＮＶプラットフォームは大分子をＣＮＳに送達できることが示される。
【０３３８】
中枢神経系（ＣＮＳ）への薬物送達は、特に大きな生体分子について困難であった。これは、アルツハイマー病（ＡＤ）及び他の神経変性障害の治療のための抗体の送達に特に当てはまる。抗脳腫瘍治療剤が同様の障壁に直面している。したがって、ある種の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＶプラットフォームは、神経変性障害、例えば、ＡＤ、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、卒中、術後認知機能障害（ＰＯＣＤ）、及び脳腫瘍の免疫療法における広範な適用として、大きな生体分子のＣＮＳ送達に使用することができる。
【０３３９】
したがって、ある種の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＶは、抗体の送達に適していると考えられている。抗体は、本明細書に記載のマイクロ流体リアクターを使用してカプセル化することができる。Ａｂ−ＤＮＶは、特に、脳送達を確定するために静脈内（ｉ．ｖ．）及びｓｕｂ  Ｑ経路によって投与することができる。抗体が標識される場合は、動物全体のイメージングとともに脳のホモジネート及び切片の蛍光イメージングによって、脳内の抗体分布を決定することができる。
【０３４０】
本明細書に記載のＤＮＶを使用してＣＮＳへ送達することができる例示的抗体としては、限定されないが、ｓｃＦｖ、ＩｇＧ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２及び（ｓｃＦｖ’）２が挙げられる。
【０３４１】
ある種の実施形態では、本明細書に記載のＤＮＶ中で送達される抗体は、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脳性麻痺、認知症／前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、ハンチントン病、軽度認知機能障害（ＭＣＩ）、パーキンソン病（ＰＤ）、原発性側索硬化症（ＰＬＳ）、虚血／卒中、タウオパチー、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥなど）の治療で有効性を有すると考えられている抗体である。
【０３４２】
ある種の実施形態では、抗体は、神経変性障害と関連して選択されるタンパク質（例えば、ベータアミロイド（Ａβ）、アルファシヌクレイン（α−ｓｙｎ）、タウ、ＡＰＰ及びＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ−４３）またはこれらの断片）に結合するものである。ある種の実施形態では、抗体は、これらのタンパク質の有毒なオリゴマー変異体に結合するが、前記タンパク質のモノマー、原線維または非疾患関連の形態には結合しない。
【０３４３】
例示的抗体としては、限定されないが、Ａβまたはその断片及び／またはその前駆体に結合する抗体が挙げられる。ある種の実施形態では、抗体は、バピネオズマブ（ヒト化３Ｄ６、Ｊａｎｓｓｅｎ／Ｐｆｉｚｅｒ）、ソラネズマブ（ヒト化ｍ２６６、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ガンテネルマブ（完全ヒト、Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ）、クレネズマブ（ヒト化ＩｇＧ４、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＢＡＮ２４０１（ヒト化ｍＡｂ１５８、Ｅｉｓａｉ  Ｉｎｃ．）、ＧＳＫ９３３７７６（ヒト化ＩｇＧ１、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＡＡＢ−００３（Ｆｃ操作バピネオズマブ、Ｊａｎｓｓｅｎ／Ｐｆｉｚｅｒ）、ＳＡＲ２２８８１０（ヒト化１３Ｃ３、Ｓａｎｏｆｉ）、ＢＩＩＢ０３７／ＢＡＲＴ（完全ヒトＩｇＧ１、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）からなる群から選択される抗体であり得る。これらの抗体の標的エピトープは当業者に既知であり、特に、表に記載される。
【表５−１】
2020515638.tif 000013
【表５−２】
2020515638.tif 000014
【表５−３】
2020515638.tif 000015
【０３４４】
ある種の実施形態では、ナノスケール薬物送達ビヒクルは、阻害性ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）及び／またはアプタマーを含む。ある種の実施形態では、アプタマーは、ベータアミロイド（Ａβ）、アルファシヌクレイン（α−ｓｙｎ）、タウ、ＡＰＰ及びＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ−４３）またはこれらの断片からなる群から選択されるタンパク質に結合する、ＤＮＡまたはタンパク質アプタマーである。ある種の実施形態では、阻害性ＲＮＡは、ベータアミロイド（Ａβ）、アルファシヌクレイン（α−ｓｙｎ）、タウ、ＡＰＰ及びＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質４３（ＴＤＰ−４３）またはこれらの断片からなる群から選択されるタンパク質の発現を阻害する。
【０３４５】
前述の抗体、アプタマー及び阻害性ＲＮＡは、例示的且つ非限定的である。本明細書で提供される教示を使用して、限定されないが、抗体、タンパク質、核酸などを含めたいくつかの部分を送達するために、ＤＮＶを容易に使用することができる。
【０３４６】
実施例１３
口腔粘膜を介する経皮的送達
図３１は、経皮的薬物送達のための本明細書に記載のＤＮＶの使用を図示する。図３１に図示するように、パネルＡ、変形可能なナノスケールベジクル（ＤＮＶ）は、ＤＮＶ内のペイロードを輸送しながら上皮細胞間を通過するために、柔軟であり、形態を変えるように、表面活性剤を有する脂質外部層を用いて設計されている。下部の結合組織に到達した後、ＤＮＶは、局所治療のためにペイロードを放出する。Ｃ  ＡＦ６４７−２０Ｌ  ＤＮＶ。表皮は、非常にケラチン化した外部層及び増殖性且つ分化性のケラチノサイト層から構成される（図３１、パネルＢ）。ＤＮＶは、上皮密着結合を通過することができ、真皮への薬物送達を可能にする。図３１、パネルＣ）は、ＤＮＶ及び変形不可能な従来のリポソーム（ｎＤＮＶ）中に製剤化された蛍光標識されたビスホスホネート薬物ゾレドロネート（ＡＦ６４７−２０Ｌ）を示す。共焦点レーザー走査顕微鏡観察は、ＤＮＶ及びｎＤＮＶ中にＡＦ６４７シグナルを示した。凍結乾燥したＡＦ６４７−２０Ｌ  ＤＮＶ粉末を医療グレードの食塩水に再懸濁し、マウス頭蓋冠の皮膚に適用した（図３１、パネルＤ）。本発明者らは、ＤＮＶがマウス皮膚のケラチン化表皮を透過できることを示した。ＤＮＶ、ｎＤＮＶまたは水溶液中のＡＦ６４７−ＺＯＬを適用してから３日後に、マウス頭蓋冠の検体を採取し、ＡＦ６４７−ＺＯＬの蛍光シグナルを測定した。ＤＮＶは、皮膚組織を通って、下部の頭蓋冠骨にＡＦ６４７−２０Ｌを送達した（図３１、パネルＥ）。
【０３４７】
図３２は、経口腔粘膜薬物送達を介する口腔内適用を図示する。本研究は、マウス上顎口腔粘膜を通って透過し、ＡＦ６４７−ＺＯＬペイロードを放出し、次いで、これが上顎骨で吸収されるためのＤＮＶの有効性を評価するように設計された。
【０３４８】
凍結乾燥したＡＦ６４７−ＺＯＬ  ＤＮＶ粉末を、純水（ＭＱＷ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）溶液に再懸濁した。麻酔をかけたマウスに、ＡＦ６４７−ＺＯＬ  ＤＮＶ溶液を口蓋粘膜組織上に単に滴下し、特注のマウスガードで１時間覆った（図３２、パネルＡ）。ＡＦ６４７−ＺＯＬ  ＤＮＶの適用から３日後に、マウスの上顎骨を採取し、口蓋骨表面に接着しているＡＦ６４７−ＺＯＬを測定した。本研究は、ＭＱＷに再懸濁されたＤＮＶ製剤中のＡＦ６４７−ＺＯＬが経口腔粘膜薬物送達に対する有意な有効性を達成したことを示した（図３２、パネルＢを参照されたい）。
【０３４９】
本明細書に記載の実施例及び実施形態は例示目的のためのみであること及びそれらを鑑みて様々な改変または変更が当業者に示唆され、そのような様々な改変または変更が本出願の趣旨及び範囲内及び添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが理解されよう。本明細書で引用されるすべての刊行物、特許及び特許出願は、すべての目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
2020515638.tif 000016
【図１Ｂ】
2020515638.tif 000017
【図２】
2020515638.tif 000018
【図３Ａ】
2020515638.tif 000019
【図３Ｂ】
2020515638.tif 000020
【図４】
2020515638.tif 000021
【図５Ａ】
2020515638.tif 000022
【図５Ｂ】
2020515638.tif 000023
【図５Ｃ】
2020515638.tif 000024
【図６】
2020515638.tif 000025
【図７】
2020515638.tif 000026
【図８】
2020515638.tif 000027
【図９】
2020515638.tif 000028
【図１０−１】
2020515638.tif 000029
【図１０−２】
2020515638.tif 000030
【図１１Ａ】
2020515638.tif 000031
【図１１Ｂ】
2020515638.tif 000032
【図１２】
2020515638.tif 000033
【図１３−１】
2020515638.tif 000034
【図１３−２】
2020515638.tif 000035
【図１４−１】
2020515638.tif 000036
【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2020515638.tif 000040
【図１８】
2020515638.tif 000041
【図１９Ａ】
2020515638.tif 000042
【図１９Ｂ】
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【図２０】
2020515638.tif 000044
【図２１】
2020515638.tif 000045
【図２２】
2020515638.tif 000046
【図２３】
2020515638.tif 000047
【図２４】
2020515638.tif 000048
【図２５】
2020515638.tif 000049
【図２６】
2020515638.tif 000050
【図２７】
2020515638.tif 000051
【図２８】
2020515638.tif 000052
【図２９】
2020515638.tif 000053
【図３０】
2020515638.tif 000054
【図３１】
2020515638.tif 000055
【図３２】
2020515638.tif 000056
【国際調査報告】
2020515638.tif 000057
2020515638.tif 000058
2020515638.tif 000059