(57)【要約】  本出願は、伝統的漢方薬から複数の化合物を抽出すること、または核酸送達を促進することが可能な化合物を合成すること、ならびに抽出された化合物または複数の組合せを使用して、ｓＲＮＡなどの核酸の標的細胞内への吸収および進入を促進し、それを必要とする対象の標的部位内への核酸の進入を容易にすることに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸送達試薬を製造するための、下記式を有する天然に（伝統的漢方薬抽出物を含む）または合成に由来する化合物の使用であって、抽出物は、下記式の構造を有するか、または下記式の構造を有する化合物を含み、
【化１】
2020515616.tif 000034
式中、Ｌ１、Ｌ２、もしくはＬ３は存在しないか、またはＬ１、Ｌ２、およびＬ３は、各々独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）−、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ２−、
【化２】
2020515616.tif 000035
からなる群から選択され、
但し、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３の最大で２つは存在せず、
２価基Ｌ１およびＬ２に関して、左側のダッシュ「−」は、それぞれ基ＡおよびＢに連結され、右側のダッシュ「−」は、中央の炭素原子に連結され、
２価基Ｌ３に関して、左側のダッシュ「−」は、中央の炭素原子に連結され、右側のダッシュ「−」は、基Ｑに連結され、
Ａ、Ｂ、およびＱは、各々独立して、Ｈ、−ＯＨ、Ｃ１〜２０アルキル、Ｃ１〜２０アルケニル、Ｃ１〜２０ヘテロアルキル、Ｃ１〜２０ヘテロアルケニル、−ＮＨ２、および−ＮＲ３＋からなる群から選択され、Ｒは、ＨまたはＣ１〜６アルキルであり、
ｎは、整数０、１、２、３、または４であり、
好ましくは、核酸は、小分子核酸であり、好ましくは一本鎖または二本鎖であり、好ましくは、小分子核酸の長さは、１４〜３２ｂｐ、１６〜２８ｂｐ、または１８〜２４ｂｐであり、
好ましくは、伝統的漢方薬は、ロディオラ・クレヌラータ、モウコタンポポ、アンドログラフィス・パニクラータ、およびスイカズラの煎出片からなる群から選択され、好ましくは、抽出物は、脂溶性成分をＢｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法で抽出することにより、より好ましくは、漢方薬煎出片を水に浸漬し、その後激しい加熱およびゆっくりとした加熱を順に実施することにより得られ、加熱した漢方薬スープを濃縮し、その後クロロホルム−メタノールおよび水を順に添加して撹拌し、クロロホルム層を得、
好ましくは、試薬は、経口試薬であり、好ましくは、核酸は、がん、例えば胃がんまたは肺がんなどの疾患を処置するために使用される、使用。
【請求項２】
前記構造において、
Ｌ１は、存在しないか、またはＬ１は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２−、および−ＣＨ（ＯＨ）−から選択され、
Ｌ２は、存在しないか、またはＬ２は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、および−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−から選択され、
Ｌ３は、存在しないか、またはＬ３は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）−、−ＣＨ２−、および
【化３】
2020515616.tif 000036
からなる群から選択され、
Ａは、Ｈ、Ｃ１〜２０アルキル、およびＣ１〜２０アルケニルからなる群から選択され、
Ｂは、Ｈ、−ＮＨ２、Ｃ１〜２０アルキル、およびＣ１〜２０アルケニルからなる群から選択され、
Ｑは、Ｈ、−ＯＨ、Ｃ１〜２０アルキルおよびＣ１〜２０アルケニル、ならびに−ＮＲ３＋からなる群から選択され、ＲはＨまたはＣ１〜６アルキルである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記化合物は、下記式の構造：
【化４】
2020515616.tif 000037
を有する、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
構造において、
Ａは、Ｈ、Ｃ１０〜２０アルキル、およびＣ１０〜２０アルケニルからなる群から選択され、
Ｂは、Ｈ、−ＮＨ２、Ｃ１０〜２０アルキル、およびＣ１０〜２０アルケニルからなる群から選択され、
Ｑは、Ｈ、−ＯＨ、Ｃ１０〜２０アルキル、およびＣ１０〜２０アルケニル、ならびに−ＮＲ３＋からなる群から選択され、ＲはＨまたはＣ１〜４アルキルである、前記請求項のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記構造において、
Ａは、Ｈ、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基、および直鎖Ｃ１５〜１８アルケニル基からなる群から選択され、
Ｂは、Ｈ、−ＮＨ２、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基、および直鎖Ｃ１５〜１８アルケニル基からなる群から選択され、
Ｑは、Ｈ、−ＯＨ、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基、および直鎖Ｃ１５〜１８アルケニル基、ならびに−ＮＲ３＋からなる群から選択され、ＲはＨまたはＣ１〜４アルキル基であり、
Ａ、Ｂ、およびＱのアルケニル基は、１〜５個の二重結合を有する、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記構造のＡ、Ｂ、Ｑにおいて、アルケニル基は、１〜４個の二重結合を有し、Ｚ配置にある、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
Ａ、Ｂ、Ｑにおいて、アルケニル基は、１〜３個の二重結合を有し、Ｚ配置にある、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記抽出物は、下記式から選択されるか、または下記式から選択される化合物を含み、
【化５】
2020515616.tif 000038
式中、
Ａは、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基および直鎖Ｃ１５〜１８アルケニル基から選択され、
Ｂは、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基および直鎖Ｃ１５〜１８アルケニル基から選択され、
Ｑは、Ｈ、−ＯＨ、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基、および直鎖Ｃ１５〜１８アルケニル基、ならびに−ＮＲ３＋からなる群から選択され、ＲはＨまたはメチルであり、
Ｌ３は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である、前記請求項のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
抽出物は、リゾレシチン、セラミド、ジグリセリド、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、トリグリセリド、モノガラクトシルジグリセリド、（神経）スフィンゴシン、ホスファチジルエタノール、モノアシルグリセロール、脂肪酸、血小板活性化因子、またはジメチルホスファチジルエタノールアミンであるかまたはそれを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記抽出物は、表１に示されている脂質から選択されるか、または表１から選択されるいずれか１つまたは複数の脂質を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
前記抽出物は、番号４１、番号７１、番号１１、番号１２、番号３８、番号６４、番号４０、番号３７、番号３９、番号６０、番号６２として表１に示されている脂質のいずれか１つ、または表１の他の脂質のいずれか１つもしくは複数とのその組合せ、またはいずれか１つもしくは複数の脂質および他の関連化学物質とのその組合せを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
核酸送達試薬の製造における、表１に示されているいずれか１つまたは複数の脂質を含む組合せの使用であって、好ましくは、組合せは、番号４１、番号７１、番号１１、番号１２、番号３８、番号６４、番号４０、番号３７、番号３９、番号６０、および番号６２として表１に示されている脂質のいずれか１つ、または表１の他の脂質のいずれか１つもしくは複数とのその組合せ、またはいずれか１つもしくは複数の脂質および他の関連化学物質とのその組合せを含み、好ましくは、前記核酸は、小分子核酸であり、好ましくは一本鎖または二本鎖であり、好ましくは、小分子核酸は、１４〜３２ｂｐ、１６〜２８ｂｐ、または１８〜２４ｂｐの長さを有し、好ましくは、試薬は、経口試薬であり、好ましくは、核酸は、がん、例えば胃がんまたは肺がんなどの疾患を処置するために使用される、使用。
【請求項１３】
核酸送達試薬の製造における、伝統的漢方薬の使用であって、好ましくは、核酸は、小分子核酸であり、好ましくは一本鎖または二本鎖であり、好ましくは、小分子核酸は、１４〜３２ｂｐ、１６〜２８ｂｐ、または１８〜２４ｂｐの長さを有し、好ましくは、試薬は、経口試薬であり、好ましくは、核酸は、がん、例えば胃がんまたは肺がんなどの疾患を処置するために使用される、使用。
【請求項１４】
前記伝統的漢方薬は、ロディオラ・クレヌラータ、モウコタンポポ、アンドログラフィス・パニクラータ、およびスイカズラ漢方薬煎出片から選択される、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
試薬は、伝統的漢方薬から抽出されるかまたは人為的に合成される化合物を含み、好ましくは、化合物は、脂溶性成分をＢｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法で抽出することにより、または伝統的漢方薬を煎出することにより得られ、より好ましくは、漢方薬煎出片を水に浸漬し、その後激しい加熱およびゆっくりとした加熱を順に実施し、加熱した漢方薬スープを濃縮し、その後クロロホルム−メタノール、クロロホルムおよび水を順に添加して撹拌し、クロロホルム層を得る、請求項１３または１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記化合物は、請求項１〜１１のいずれか一項に示されている構造を有するか、あるいは試薬は、表１に示されているいずれか１つまたは複数の脂質、好ましくは、番号４１、番号７１、番号１１、番号１２、番号３８、番号６４、番号４０、番号３７、番号３９、番号６０、および番号６２として表１に示されている脂質のいずれか１つ、または表１の他の脂質のいずれか１つもしくは複数とのその組合せ、またはいずれか１つもしくは複数の脂質および他の関連化学物質とのその組合せを含む、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
化合物は、リゾレシチン、セラミド、ジグリセリド、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、トリグリセリド、モノガラクトシルジグリセリド、（神経性）スフィンゴシン、ホスファチジルエタノール、モノアシルグリセロール、脂肪酸、血小板活性化因子、またはジメチルホスファチジルエタノールアミンからなる群から選択される、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
化合物は、表１から選択される、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記化合物は、番号４１、番号７１、番号１１、番号１２、番号３８、番号６４、番号４０、番号３７、番号３９、番号６０、および番号６２として表１に示されている脂質から選択される、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
送達は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞送達またはｉｎ  ｖｉｖｏ胃腸管送達を含む、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２１】
使用は、脂質核酸混合物の製造を含む、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
脂質核酸混合物は、煮沸法により、または逆相蒸散法により、または直接混合により製造される、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
煮沸法での温度は、約４℃から約１００℃まで、約２５℃から約１００℃まで、好ましくは、約８０℃から約１００℃まで、すなわち、４℃、３７℃、６０℃、８０℃、または１００℃であり、逆相蒸散法での温度は、約２５℃から約７０℃まで、好ましくは、約５５℃である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の構造の１つまたは複数の脂質抽出物および核酸を含む医薬組成物であって、好ましくは、脂質は、表１のいずれか１つまたは複数の脂質、好ましくは、番号４１、番号７１、番号１１、番号１２、番号３８、番号６４、番号４０、番号３７、番号３９、番号６０、および番号６２として表１に示されているいずれか１つの脂質、または表１の他の脂質のいずれか１つまたは複数とのその組合せ、またはいずれか１つもしくは複数の脂質および他の関連化学物質とのその組合せから選択され、好ましくは、核酸は、小分子核酸であり、好ましくは一本鎖または二本鎖であり、好ましくは、小分子核酸は、１４〜３２ｂｐ、１６〜２８ｂｐ、または１８〜２４ｂｐの長さを有し、好ましくは、医薬組成物は、経口医薬組合せであり、好ましくは、医薬組成物は、がん、例えば胃がんまたは肺がんなどの疾患を処置するために使用される、医薬組成物。
【請求項２５】
脂質および核酸の少なくとも一部または全部は、脂質核酸混合物の形態で存在する、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
脂質核酸混合物は、煮沸法により、または逆相蒸散法により、または直接混合により製造される、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
煮沸法での温度は、約４℃から約１００℃まで、約２５℃から約１００℃まで、好ましくは、約８０℃から約１００℃まで、すなわち、４℃、３７℃、６０℃、８０℃、または１００℃であり、逆相蒸散法での温度は、約２５℃から約７０℃まで、好ましくは、約５５℃である、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の構造を有し、好ましくは、表１の、好ましくは、番号４１、番号７１、番号１１、番号１２、番号３８、番号６４、番号４０、番号３７、番号３９、番号６０、および番号６２として表１に示されているいずれか１つまたは複数の脂質、または表１の他の脂質のいずれか１つもしくは複数とのその組合せ、またはいずれか１つもしくは複数の脂質および他の関連化学物質とのその組合せから選択される１つまたは複数の脂質、核酸を含むキットであって、脂質および核酸は、各々独立して第１の容器および第２の容器に入れて提供され、第１の容器および第２の容器は同じであってもよくまたは異なっていてもよく、好ましくは、核酸は、小分子核酸であり、好ましくは一本鎖または二本鎖であり、好ましくは、小分子核酸は、１４〜３２ｂｐ、１６〜２８ｂｐ、または１８〜２４ｂｐの長さを有し、好ましくは、キットは、経口キットであり、好ましくは、キットは、がん、例えば胃がんまたは肺がんなどの疾患を処置するために使用される、キット。
【請求項２９】
前記脂質および核酸の少なくとも一部または全部は、使用直前に脂質核酸混合物へと調製される、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
脂質核酸混合物の調製方法は、煮沸法であるか、または逆相蒸散法であるか、または直接混合である、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
前記煮沸法での温度は、約４℃から約１００℃まで、約２５℃から約１００℃まで、好ましくは、約８０℃から約１００℃まで、すなわち、４℃、３７℃、６０℃、８０℃、または１００℃であり、逆相蒸散法での温度は、約２５℃から約７０℃まで、好ましくは、約５５℃である、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
核酸を標的細胞内へと送達する方法であって、核酸は、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の医薬組成物または請求項２８〜３１のいずれか一項に記載のキットの形態で提供され、好ましくは、核酸は、小分子核酸であり、好ましくは、一本鎖または二本鎖であり、好ましくは、小分子核酸は、１４〜３２ｂｐ、１６〜２８ｂｐ、または１８〜２４ｂｐの長さを有し、好ましくは、核酸は、がん、例えば胃がんまたは肺がんなどの疾患を処置するために使用される、方法。
【請求項３３】
核酸を、それを必要とする対象にｉｎ  ｖｉｖｏで送達する方法であって、核酸は、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の医薬組成物または請求項２８〜３１のいずれか一項に記載のキットから提供され、好ましくは、前記核酸は、小分子核酸であり、好ましくは、一本鎖または二本鎖であり、好ましくは、前記小分子核酸は、１４〜３２ｂｐ、１６〜２８ｂｐ、または１８〜２４ｂｐの長さを有し、好ましくは、前記核酸は、がん、例えば胃がんまたは肺がんなどの疾患を処置するために使用される、方法。
【請求項３４】
対象は、ヒト、または哺乳動物などの動物である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
核酸は、対象の血液循環または標的組織／細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで送達される、請求項３３〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の医薬組成物または請求項２８〜３１のいずれか一項に記載のキットを、必要とする対象に消化管により直接送達することを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
核酸および脂質は、投与および／または注射用に調製されている、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の医薬組成物または請求項２８〜３１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３８】
核酸および脂質は、消化投与または呼吸投与用に調製されている、請求項３７に記載の医薬組成物またはキット。
【請求項３９】
核酸および脂質は、経口投与または吸入投与用に調製されている、請求項３７または３８に記載の医薬組成物またはキット。
【請求項４０】
核酸は、小分子ＲＮＡである、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の医薬組成物またはキット。
【請求項４１】
核酸は、ステム−ループ構造を有する、請求項３７〜４０のいずれか一項に記載の医薬組成物またはキット。
【請求項４２】
小分子ＲＮＡは、１４〜３２ｂｐまたは１８〜２４ｂｐの長さを有し、例えば、長さは、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、および３２ｂｐである、請求項３７〜４１のいずれか一項に記載の医薬組成物またはキット。
【請求項４３】
伝統的漢方薬から抽出されるかまたは人為的に合成される、核酸送達に使用することができる化合物であって、以下の構造を有し、
【化６】
2020515616.tif 000039
Ｌ１、Ｌ２、もしくはＬ３は存在しないか、またはＬ１、Ｌ２、およびＬ３は、各々独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）−、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ２−、
【化７】
2020515616.tif 000040
からなる群から選択され、
但し、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３の最大で２つは存在せず、
２価基Ｌ１、Ｌ２に関して、左側のダッシュ「−」は、それぞれ基ＡおよびＢに連結され、右側のダッシュ「−」は、中央の炭素原子に連結され、
２価基Ｌ３に関して、左側のダッシュ「−」は、中央の炭素原子に連結され、右側のダッシュ「−」は、基Ｑに連結され、
Ａ、Ｂ、およびＱは、各々独立して、Ｈ、−ＯＨ、Ｃ１〜２０アルキル、Ｃ１〜２０アルケニル、Ｃ１〜２０ヘテロアルキル、Ｃ１〜２０ヘテロアルケニル、−ＮＨ２、および−ＮＲ３＋からなる群から選択され、Ｒは、ＨまたはＣ１〜６アルキルであり、
ｎは、０、１、２、３、または４の整数であり、好ましくは、化合物は経口化合物であり、好ましくは、核酸は、がん、例えば胃がんまたは肺がんなどの疾患を処置するために使用される、化合物。
【請求項４４】
Ｌ１は存在しないか、またはＬ１は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２−および−ＣＨ（ＯＨ）−からなる群から選択され、
Ｌ２は存在しないか、またはＬ２は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−および−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−からなる群から選択され、
Ｌ３は存在しないか、またはＬ３は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）−、−ＣＨ２−、および
【化８】
2020515616.tif 000041
からなる群から選択され、
Ａは、Ｈ、Ｃ１〜２０アルキル、およびＣ１〜２０アルケニルからなる群から選択され、
Ｂは、Ｈ、−ＮＨ２、Ｃ１〜２０アルキル、およびＣ１〜２０アルケニルからなる群から選択され、
Ｑは、Ｈ、−ＯＨ、Ｃ１〜２０アルキルおよびＣ１〜２０アルケニル、ならびに−ＮＲ３＋からなる群から選択され、ＲはＨまたはＣ１〜６アルキルであり、好ましくは、伝統的漢方薬は、ロディオラ・クレヌラータ、モウコタンポポ、アンドログラフィス・パニクラータ、およびスイカズラ漢方薬煎出片から選択され、好ましくは、化合物は、脂溶性成分をＢｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法で抽出することにより、より好ましくは、漢方薬煎出片を水に浸漬し、その後激しい加熱およびゆっくりとした加熱を順に実施することにより得られ、加熱した漢方薬スープを濃縮し、その後クロロホルム−メタノール、クロロホルムおよび水を添加して撹拌し、クロロホルム層を得、好ましくは、核酸は、小分子核酸であり、好ましくは一本鎖または二本鎖であり、小分子核酸は、１４〜３２ｂｐ、１６〜２８ｂｐ、または１８〜２４ｂｐの長さを有する、請求項４３に記載の化合物。
【請求項４５】
下記式を有する、請求項４３または４４に記載の化合物。
【化９】
2020515616.tif 000042
【請求項４６】
Ａは、Ｈ、Ｃ１０〜２０アルキルおよびＣ１０〜２０アルケニルからなる群から選択され、
Ｂは、Ｈ、−ＮＨ２、Ｃ１０〜２０アルキル、およびＣ１０〜２０アルケニルからなる群から選択され、
Ｑは、Ｈ、−ＯＨ、Ｃ１０〜２０アルキル、およびＣ１０〜２０アルケニル、ならびに−ＮＲ３＋からなる群から選択され、ＲはＨまたはＣ１〜４アルキルである、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４７】
Ａは、Ｈ、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基、および直鎖Ｃ１５〜１８アルケニル基からなる群から選択され、
Ｂは、Ｈ、−ＮＨ２、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基、および直鎖Ｃ１５〜１８アルケニル基からなる群から選択され、
Ｑは、Ｈ、−ＯＨ、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基、および直鎖Ｃ１５〜１８アルケニル基、ならびに−ＮＲ３＋からなる群から選択され、ＲはＨまたはＣ１〜４アルキル基であり、
Ａ、Ｂ、およびＱのアルケニル基は、１〜５個の二重結合を有する、請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４８】
前記構造のＡ、Ｂ、Ｑにおいて、アルケニル基は、１〜４個の二重結合を有し、Ｚ配置にある、請求項４３〜４７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４９】
構造のＡ、Ｂ、Ｑにおいて、アルケニル基は、１〜３個の二重結合を有し、Ｚ配置にある、請求項４３〜４８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５０】
下記式から選択され、
【化１０】
2020515616.tif 000043
式中、
Ａは、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基および直鎖Ｃ１５〜１８アルケニル基からなる群から選択され、
Ｂは、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基および直鎖Ｃ１５〜１８アルケニル基からなる群から選択され、
Ｑは、Ｈ、−ＯＨ、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基、および直鎖Ｃ１５〜１８アルケニル基、ならびに−ＮＲ３＋からなる群から選択され、ＲはＨまたはメチルであり、
Ｌ３は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である、請求項４３〜４９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５１】
表１に示されている脂質から選択される、請求項４３〜５０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５２】
番号４１、番号７１、番号１１、番号１２、番号３８、番号６４、番号４０、番号３７、番号３９、番号６０、または番号６２として表１に示されている脂質から選択される、請求項４３〜５１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５３】
核酸送達を容易にする方法であって、核酸および伝統的漢方薬抽出物、天然または合成に由来する任意の化合物、好ましくは、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の脂質を加熱または加温することを含み、加熱または加温の温度は、好ましくは、約４℃から約１００℃まで、約２５℃から約１００℃まで、好ましくは約５０℃から約１００℃まで、より好ましくは、約９５℃から約１００℃まで、特に好ましくは、約８０℃から約１００℃まで、すなわち、４℃、３７℃、６０℃、８０℃、または１００℃であり、好ましくは、核酸は、小分子核酸であり、好ましくは一本鎖または二本鎖であり、好ましくは、小分子核酸は、１４〜３２ｂｐ、１６〜２８ｂｐ、または１８〜２４ｂｐの長さを有し、好ましくは、核酸送達は、経口投与により、好ましくは、核酸は、がん、例えば胃がんまたは肺がんなどの疾患を処置するために使用される、方法。
【請求項５４】
伝統的漢方薬抽出物は、請求項１〜９のいずれか一項に記載の構造の化合物を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
伝統的漢方薬抽出物は、表１に示されているいずれか１つまたは複数の脂質を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
伝統的漢方薬抽出物は、番号４１、番号７１、番号１１、番号１２、番号３８、番号６４、番号４０、番号３７、番号３９、番号６０、番号６２として表１に示されている脂質のいずれか１つ、または表１の他の脂質のいずれか１つもしくは複数とのその組合せ、またはいずれか１つもしくは複数の脂質および他の関連化学物質とのその組合せを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
組合せは、下記のいずれか１つである：
番号８：番号４１＝６：１の脂質組合せ；番号３８：番号４１＝６：１の脂質組合せ；番号３９：番号４１＝６：１の脂質組合せ；番号４０：番号４１＝６：１の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４１：番号２９＝１：１：２：１の脂質組合せ；番号４０：番号１２：番号４１＝２：４：３の脂質組合せ；番号１２：番号４１＝１：６の脂質組合せ；番号１２：番号４１＝１：１の脂質組合せ；番号１２：番号４１＝６：１の脂質組合せ；番号４０：番号１２：番号４１＝２：２：２の脂質組合せ；番号４：番号１２：番号４１＝１：１：１の脂質組合せ；番号１：番号２：番号３：番号１９：番号３５＝１：１：１：１：１のＤＧ組合せ；番号６：番号９：番号１０：番号１３：番号１５：番号１６：番号１８：番号２０：番号２１：番号２２：番号２３：番号２４：番号２５：番号２６：番号２７：番号２８：番号３２：番号３３＝１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１のＴＧ組合せ；番号３６：番号３７＝１：１のＬＰＣ組合せ；番号１１：番号１２＝１：１のＰＣ組合せ；番号８：番号３８＝１：１のＰＥ組合せ；番号４：番号１４＝１：１のＣｅｒ組合せ；番号１７：番号３０：番号３１＝１：１：１のＳｏ組合せ；番号５、番号７を含まない番号１〜３６の等容積組合せ；番号５、番号７、番号３４を含まない番号１〜３６の等容積組合せ；番号５、番号７、番号１、番号２、番号３、番号１９、番号３５を含まない番号１〜３６の等容積組合せ；番号５、番号７、番号６、番号９、番号１０、番号１３、番号１５、番号１６、番号１８、番号２０、番号２１、番号２２、番号２３、番号２４、番号２５、番号２６、番号２７、番号２８、番号３２、番号３３を含まない番号１〜３６の等容積組合せ；番号５、番号７、番号３６、番号３７を含まない番号１〜３６の等容積組合せ；番号５、番号７、番号１１、番号１２を含まない番号１〜３６の等容積組合せ；番号５、番号７、番号８を含まない番号１〜３６の等容積組合せ；番号５、番号７、番号４、番号１４を含まない番号１〜３６の等容積組合せ；番号５、番号７、番号２９を含まない番号１〜３６の等容積組合せ；番号１：番号３４＝２：１の脂質組合せ；番号１：前記ＤＧ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号１：前記ＴＧ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号１：前記ＬＰＣ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号１：番号８＝２：１の脂質組合せ；番号１：番号１２＝２：１の脂質組合せ；番号１：前記Ｃｅｒ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号１：前記Ｓｏ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号１：番号２９＝２：１の脂質組合せ；番号１：番号８：番号１２＝１：１：１の脂質組合せ；番号８：番号３４＝２：１の脂質組合せ；番号８：前記ＤＧ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号８：前記ＴＧ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号８：前記ＬＰＣ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号８：番号３７＝４：１の脂質組合せ；番号８：番号１２＝２：１の脂質組合せ；番号８：前記Ｃｅｒ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号８：前記Ｓｏ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号８：番号３１＝６：１の脂質組合せ；番号８：番号２９＝２：１の脂質組合せ；番号１２：番号３４＝２：１の脂質組合せ；番号１２：前記ＤＧ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号１２：前記ＴＧ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号１２：前記ＬＰＣ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号１２：番号８＝２：１の脂質組合せ；番号１１：前記Ｃｅｒ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号１２：前記Ｓｏ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号１２：番号２９＝２：１の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号１＆２＝２：１：１の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号１５＝２：１：１の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号３６＆３７＝２：１：１の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号１１＝２：１：１の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号１２＝２：１：１の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号４＝２：１：１の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号３１＝２：１：１の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２９＝２：１：１の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号３４＝３：２：１の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号３４＝４：２：３の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２＝４：２：３の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２＝１６：８：３の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号３２＝４：２：３の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号３７＝４：２：３の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号１１＝４：２：３の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号３８＝４：２：３の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号４＝４：２：３の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号３１＝４：２：３の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２９＝４：２：３の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２９：番号３１＝２：１：１：１の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２９：番号３１：番号３４＝４：２：２：２：５の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２９：番号３１：番号２＝４：２：２：２：５の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２９：番号３１：番号３２＝４：２：２：２：５の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２９：番号３１：番号１１＝４：２：２：２：５の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２９：番号３１：番号３７＝４：２：２：２：５の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２９：番号３１：番号３８＝４：２：２：２：５の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２９：番号３１：番号４＝４：２：２：２：５の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２９：番号３１：番号４：番号１：番号１６＝２：１：１：３：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号８：番号１２：番号１＆２＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号８：番号１２：番号１５＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号８：番号１２：番号３６＆３７＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号８：番号１２：番号１２＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号８：番号１２：番号４＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号８：番号１２：番号３１＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号８：番号１２：番号２９＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号８：番号３４：番号１＆２＝２：１：１の脂質組合せ；番号８：番号３４：番号１５＝２：１：１の脂質組合せ；番号８：番号３４：番号３６＆３７＝２：１：１の脂質組合せ；番号８：番号３４：番号１２＝２：１：１の脂質組合せ；番号８：番号３４：番号４＝２：１：１の脂質組合せ；番号８：番号３４：番号３１＝２：１：１の脂質組合せ；番号８：番号３４：番号２９＝２：１：１の脂質組合せ；番号８：番号３１：番号３４＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号３１：番号２＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号３１：番号３７＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号３１：番号１１＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号３１：番号１２＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号３１：番号４＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号３１：番号２９＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号３１：番号３２＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号４：番号３４＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号４：番号２＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号４：番号３７＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号４：番号１２＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号４：番号３１＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号４：番号２９＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号４：番号３２＝１２：３：５の脂質組合せ；番号３８：番号３４＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号１＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号２＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号１＆２＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号１５＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号３２＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号３７＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号３７＝４：１の脂質組合せ；番号３８：番号１１＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号１２＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号１１＆１２＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号１２＝４：１の脂質組合せ；番号３８：番号８＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号４＝２：１の脂質組合せ；番号３８：Ｓｏ（３０）＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号３１＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号２９＝２：１の脂質組合せ；番号１：番号３８：番号１２：番号３４＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号３８：番号１２：番号１５＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号３８：番号１２：番号３７＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号３８：番号１２：番号８＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号３８：番号１２：番号４＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号３８：番号１２：番号３１＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号３８：番号１２：番号２９＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号１＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号１５＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号３７＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号１２＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号８＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号４＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号３１＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号２９＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号１＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号２＝４：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号１５＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号３７＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号８＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号３１＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号２９＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号１：番号１５：番号３４＝２２：２２：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号１：番号１５：番号３７＝２２：２２：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号１：番号１５：番号４＝２２：２２：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号１：番号１５：番号３１＝２２：２２：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号１：番号１５：番号２９＝２２：２２：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号３７：番号１＝４４：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号３７：番号１５＝４４：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号３７：番号１２＝４４：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号３７：番号４＝４４：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号３７：番号３１＝４４：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号３４＝４４：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号１＝４４：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号１５＝４４：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号３７＝４４：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号３７＝８：２：５：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号３１＝４４：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号２９＝４４：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号２９：番号３４＝８８：４４：６６：７２：１３５の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号２９：番号１＝８８：４４：６６：７２：１３５の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号２９：番号１５＝８８：４４：６６：７２：１３５の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号２９：番号３７＝８８：４４：６６：７２：１３５の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号２９：番号３１＝８８：４４：６６：７２：１３５の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号２＝２０：１０：１５：９の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号６＝２
０：１０：１５：９の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号１７＝２０：１０：１５：９の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号２９＝２０：１０：１５：９の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号３４＝２０：１０：１５：９の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号３７＝２０：１０：１５：９の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号３１：番号３４＝２：１：３：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号３１：番号１＝２：１：３：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号３１：番号１５＝２：１：３：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号３１：番号３７＝２：１：３：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号３１：番号４＝２：１：３：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号３１：番号２９＝２：１：３：３の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号３７：番号３１：番号１＝８８：４４：６６：７２：１３５の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号３７：番号３１：番号１５＝８８：４４：６６：７２：１３５の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号３７：番号３１：番号１２＝８８：４４：６６：７２：１３５の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号３７：番号３１：番号４＝８８：４４：６６：７２：１３５の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号３７：番号３１：番号２９＝８８：４４：６６：７２：１３５の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号３４＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号１＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号２＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号１＆２＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号２＝３２：８：５の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号３２＝３２：８：５の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号１５＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号３２＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号８＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号１１＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号１２＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号１１＆１２＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号１２＝４：１：１の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号４＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号３０＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号３１＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号２９＝４：２：３の脂質組合せ；番号８：番号３７：番号３２＝４：１：２の脂質組合せ；番号８：番号３７：番号２＝４：１：２の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号１５：番号３４＝６４：１６：１０：４５の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号１５：番号１＝６４：１６：１０：４５の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号１５：番号１２＝６４：１６：１０：４５の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号１５：番号４＝６４：１６：１０：４５の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号１５：番号３１＝６４：１６：１０：４５の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号１５：番号２９＝６４：１６：１０：４５の脂質組合せ；番号３８：番号２：番号３７＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号２：番号３１＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号２：番号２９＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号２：番号３４＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号２：番号３２＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号２：番号１２＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号２：番号１２＝４：５：１の脂質組合せ；番号３８：番号２：番号４＝４：２：３の脂質組合せ；番号１＆２、番号１１＆１２、および番号３６＆３７は、それぞれ、任意の比率の脂質番号１および番号２、任意の比率の脂質番号１１および番号１２、任意の比率の脂質番号３６および番号３７を表す、請求項１１、１２、または１６に記載の使用、請求項２４に記載の医薬組成物、または請求項２８に記載のキット。
【請求項５８】
核酸送達試薬を製造するための、下記式を有する化合物の使用であって、
【化１１】
2020515616.tif 000044
式中、
Ｌ１、Ｌ２、もしくはＬ３は、存在しないか、またはＬ１、Ｌ２、およびＬ３は、各々独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−からなる群から選択され、
但し、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３の最大で２つは存在せず、
２価基Ｌ１、Ｌ２に関して、左側のダッシュ「−」は、それぞれ基ＡおよびＢに連結され、右側のダッシュ「−」は、中央の炭素原子に連結され、
２価基Ｌ３に関して、左側のダッシュ「−」は、中央の炭素原子に連結され、右側のダッシュ「−」は、基Ｑに連結され、
Ａ、Ｂ、およびＱは、独立して、Ｈ、−ＯＨ、Ｃ１〜２０アルキル、Ｃ１〜２０アルケニル、−ＮＨ２、および−ＮＲ３＋からなる群から選択され、Ｒは、ＨまたはＣ１〜６アルキルであり、
好ましくは、試薬は、経口試薬であり、好ましくは、核酸は、がん、例えば胃がんまたは肺がんなどの疾患を処置するために使用される、使用。
【請求項５９】
化合物は、以下の構造を有し、
【化１２】
2020515616.tif 000045
式中、
Ａは、直鎖Ｃ１０〜２０アルキル基および直鎖Ｃ１０〜２０アルケニル基からなる群から選択され、
Ｂは、直鎖Ｃ１０〜２０アルキル基および直鎖Ｃ１０〜２０アルケニル基からなる群から選択され、
Ｑは、−ＯＨであり、
好ましくは、
Ａは、直鎖Ｃ１５〜２０アルキル基および直鎖Ｃ１５〜２０アルケニル基からなる群から選択され、
Ｂは、直鎖Ｃ１５〜２０アルキル基および直鎖Ｃ１５〜２０アルケニル基からなる群から選択され、
Ｑは、−ＯＨであり、
好ましくは、
Ａは、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基および直鎖Ｃ１５〜１８アルケニル基からなる群から選択され、
Ｂは、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基および直鎖Ｃ１５〜１８アルケニル基からなる群から選択され、
Ｑは、−ＯＨである、請求項５８に記載の使用。
【請求項６０】
化合物は、以下の構造を有し、
【化１３】
2020515616.tif 000046
式中、
Ａは、直鎖Ｃ１０〜２０アルキル基および直鎖Ｃ１０〜２２アルケニル基からなる群から選択され、
Ｂは、直鎖Ｃ１０〜２０アルキル基および直鎖Ｃ１０〜２２アルケニル基からなる群から選択され、
Ｑは、直鎖Ｃ１０〜２０アルキル基および直鎖Ｃ１０〜２２アルケニル基からなる群から選択され、
好ましくは、
Ａは、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基および直鎖Ｃ１５〜２２アルケニル基からなる群から選択され、
Ｂは、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基および直鎖Ｃ１５〜２２アルケニル基からなる群から選択され、
Ｑは、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基および直鎖Ｃ１５〜２２アルケニル基からなる群から選択され、
好ましくは、
Ａは、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基および直鎖Ｃ１５〜２０アルケニル基からなる群から選択され、
Ｂは、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基および直鎖Ｃ１５〜２０アルケニル基からなる群から選択され、
Ｑは、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基および直鎖Ｃ１５〜２０アルケニル基からなる群から選択される、請求項５８に記載の使用。
【請求項６１】
化合物は、以下の構造を有し、
【化１４】
2020515616.tif 000047
式中、
Ａは、直鎖Ｃ１０〜２０アルキル基および直鎖Ｃ１０〜２０アルケニル基からなる群から選択され、
Ｂは、直鎖Ｃ１０〜２０アルキル基および直鎖Ｃ１０〜２０アルケニル基からなる群から選択され、
Ｑは、−ＯＨであり、
好ましくは、
Ａは、直鎖Ｃ１５〜２０アルキル基および直鎖Ｃ１５〜１８アルケニル基からなる群から選択され、
Ｂは、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基および直鎖Ｃ１５〜１８アルケニル基からなる群から選択され、
Ｑは、−ＯＨであり、
好ましくは、
Ａは、直鎖Ｃ１５〜２０アルキル基であり、
Ｂは、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基であり、
Ｑは、−ＯＨである、請求項５８に記載の使用。
【請求項６２】
化合物は、以下の構造を有し、
【化１５】
2020515616.tif 000048
式中、
Ａは、直鎖Ｃ１０〜２０アルキル基および直鎖Ｃ１０〜２０アルケニル基からなる群から選択され、
Ｑは、−ＯＨであり、
好ましくは、
Ａは、直鎖Ｃ１０〜２０アルキル基および直鎖Ｃ１５〜１８アルケニル基からなる群から選択され、
Ｑは、−ＯＨであり、
好ましくは、
Ａは、直鎖Ｃ１５〜２０アルキル基であり、
Ｑは、−ＯＨである、請求項５８に記載の使用。
【請求項６３】
脂質または化合物は、以下の構造を有し、
【化１６】
2020515616.tif 000049
式中、
Ａは、直鎖Ｃ１０〜２０アルキル基および直鎖Ｃ１０〜２０アルケニル基からなる群から選択され、
Ｂは、直鎖Ｃ１０〜２０アルキル基および直鎖Ｃ１０〜２０アルケニル基からなる群から選択され、
Ｑは、−ＯＨであり、
好ましくは、
Ａは、直鎖Ｃ１５〜２０アルキル基および直鎖Ｃ１５〜２０アルケニル基からなる群から選択され、
Ｂは、直鎖Ｃ１５〜２０アルキル基および直鎖Ｃ１５〜２０アルケニル基からなる群から選択され、
Ｑは、−ＯＨであり、
好ましくは、
Ａは、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基および直鎖Ｃ１５〜１８アルケニル基からなる群から選択され、
Ｂは、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基および直鎖Ｃ１５〜１８アルケニル基からなる群から選択され、
Ｑは、−ＯＨである、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の使用、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の医薬組成物、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載のキット、請求項３２〜３６および５３〜５６のいずれか一項に記載の方法、または請求項４３に記載の方法。
【請求項６４】
前記化合物は、以下の構造を有し、
【化１７】
2020515616.tif 000050
式中、
Ａは、直鎖Ｃ１０〜２０アルキル基および直鎖Ｃ１０〜２２アルケニル基からなる群から選択され、
Ｂは、直鎖Ｃ１０〜２０アルキル基および直鎖Ｃ１０〜２２アルケニル基からなる群から選択され、
Ｑは、直鎖Ｃ１０〜２０アルキル基および直鎖Ｃ１０〜２２アルケニル基からなる群から選択され、
好ましくは、
Ａは、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基および直鎖Ｃ１５〜２２アルケニル基からなる群から選択され、
Ｂは、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基および直鎖Ｃ１５〜２２アルケニル基からなる群から選択され、
Ｑは、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基および直鎖Ｃ１５〜２２アルケニル基からなる群から選択され、
好ましくは、
Ａは、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基および直鎖Ｃ１５〜２０アルケニル基からなる群から選択され、
Ｂは、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基および直鎖Ｃ１５〜２０アルケニル基からなる群から選択され、
Ｑは、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基および直鎖Ｃ１５〜２０アルケニル基からなる群から選択される、請求項６３に記載の使用、医薬組成物、キット、または方法。
【請求項６５】
化合物は、以下の構造を有し、
【化１８】
2020515616.tif 000051
式中、
Ａは、直鎖Ｃ１０〜２０アルキル基および直鎖Ｃ１０〜２０アルケニル基からなる群から選択され、
Ｂは、直鎖Ｃ１０〜２０アルキル基および直鎖Ｃ１０〜２０アルケニル基からなる群から選択され、
Ｑは、−ＯＨであり、
好ましくは、
Ａは、直鎖Ｃ１５〜２０アルキル基および直鎖Ｃ１５〜１８アルケニル基からなる群から選択され、
Ｂは、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基および直鎖Ｃ１５〜１８アルケニル基からなる群から選択され、
Ｑは、−ＯＨであり、
好ましくは、
Ａは、直鎖Ｃ１５〜２０アルキル基であり、
Ｂは、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基であり、
Ｑは、−ＯＨである、請求項６３に記載の使用、医薬組成物、キット、または方法。
【請求項６６】
化合物は、以下の構造を有し、
【化１９】
2020515616.tif 000052
式中、
Ａは、直鎖Ｃ１０〜２０アルキル基および直鎖Ｃ１０〜２０アルケニル基からなる群から選択され、
Ｑは、−ＯＨであり、
好ましくは、
Ａは、直鎖Ｃ１０〜２０アルキル基および直鎖Ｃ１５〜１８アルケニル基からなる群から選択され、
Ｑは、−ＯＨであり、
好ましくは、
Ａは、直鎖Ｃ１５〜２０アルキル基であり、
Ｑは、−ＯＨである、請求項６３に記載の使用、医薬組成物、キット、または方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、伝統的漢方薬から抽出されたかまたは合成された、核酸送達を促進することが可能な種々の化合物に関し、また、ｓＲＮＡなどの核酸の標的細胞内への吸収および進入を促進し、それを必要とする対象の標的部位内への進入をｉｎ  ｖｉｖｏで促進するための、抽出された化合物またはそれらの種々の化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
この数十年間で、ＲＮＡ分子を含む核酸分子を治療薬として使用するという概念は、臨床的に現実性のある概念となっている。実際、核酸分子は、治療薬にふさわしい多数の特性を有する。核酸分子は、タンパク質、低分子、または他の核酸との結合を可能にする複雑な立体構造へとフォールディングすることができ、一部は、触媒中心をも形成することができる。ＲＮＡｉのエフェクター分子としての低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、治療薬としてますます広範な有望性を示している。現在、様々なｓｉＲＮＡ薬が臨床治験に入っており、良好な開発有望性を示している。一般に、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および他の非コード小分子ＲＮＡは、同義的に小分子核酸または小分子ＲＮＡ（ｓＲＮＡ）と呼ばれる。しかしながら、核酸分子は、容易に分解され、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期が比較的短いため、一般に、治療薬の選択肢としては不良であるとみなされている。
【０００３】
したがって、小分子ＲＮＡを含む核酸分子を、それらの生物学的活性および治療または予防効果を達成するために、標的器官および標的細胞へと効率的にｉｎ  ｖｉｖｏで送達する方法は、当業者により考慮されるべき課題である。
【発明の概要】
【０００４】
本発明者は、広範な試験を実施した結果、意外にも、一部の伝統的漢方薬（ロディオラ・クレヌラータ〔Rhodiola crenulata〕、モウコタンポポ〔Taraxacum mongolicum〕、アンドログラフィス・パニクラータ〔Andrographis paniculata〕、およびスイカズラ〔Lonicera japonica〕を含む）の一部の脂質成分および伝統的漢方薬に由来する脂質が、小分子ＲＮＡなどの核酸の、それを必要とする対象の細胞および／または標的部分内への吸収／進入を促進することができることを発見した。本発明では、脂質成分は、合成である。
【０００５】
具体的には、１つの態様では、本出願は、伝統的漢方薬から抽出された以下の構造を有する化合物、および核酸送達用の試薬を製造するための化合物の使用に関する。
【０００６】
【化１】
2020515616.tif 000002
式中、Ｌ１、Ｌ２、もしくはＬ３は存在しないか、またはＬ１、Ｌ２、およびＬ３は、各々独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ２−、
【０００７】
【化２】
2020515616.tif 000003
からなる群から選択され、
但し、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３の最大で２つは存在せず、
２価基Ｌ１、Ｌ２に関して、左側のダッシュ「−」は、それぞれ基ＡおよびＢに連結され、右側のダッシュ「−」は、中央の炭素原子に連結され、
２価基Ｌ３に関して、左側のダッシュ「−」は、中央の炭素原子に連結され、右側のダッシュ「−」は、基Ｑに連結され、
Ａ、Ｂ、およびＱは、各々独立して、Ｈ、−ＯＨ、Ｃ１〜２０アルキル、Ｃ１〜２０アルケニル、Ｃ１〜２０ヘテロアルキル、Ｃ１〜２０ヘテロアルケニル、−ＮＨ２、および−ＮＲ３＋からなる群から選択され、Ｒは、ＨまたはＣ１〜６アルキルであり、
ｎは、整数０、１、２、３、または４である。
【０００８】
前記使用における一実施形態では、化合物の構造において、
Ｌ１は、存在しないか、またはＬ１は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２−、および−ＣＨ（ＯＨ）−から選択され、
Ｌ２は、存在しないか、またはＬ２は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、および−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−から選択され、
Ｌ３は、存在しないか、またはＬ３は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）−、−ＣＨ２−、および
【０００９】
【化３】
2020515616.tif 000004
から選択され、
Ａは、Ｈ、Ｃ１〜２０アルキル、およびＣ１〜２０アルケニルからなる群から選択され、
Ｂは、Ｈ、−ＮＨ２、Ｃ１〜２０アルキル、およびＣ１〜２０アルケニルからなる群から選択され、
Ｑは、Ｈ、−ＯＨ、Ｃ１〜２０アルキル、およびＣ１〜２０アルケニル、ならびに−ＮＲ３＋からなる群から選択され、ＲはＨまたはＣ１〜６アルキルである。
【００１０】
一実施形態では、化合物は、下記式を有する。
【００１１】
【化４】
2020515616.tif 000005
【００１２】
一実施形態では、化合物の構造において、
Ａは、Ｈ、Ｃ１０〜２０アルキルおよびＣ１０〜２０アルケニルからなる群から選択され、
Ｂは、Ｈ、−ＮＨ２、Ｃ１０〜２０アルキル、およびＣ１０〜２０アルケニルからなる群から選択され、
Ｑは、Ｈ、−ＯＨ、Ｃ１０〜２０アルキル、およびＣ１０〜２０アルケニル、ならびに−ＮＲ３＋からなる群から選択され、ＲはＨまたはＣ１〜４アルキルである。
【００１３】
一実施形態では、化合物の構造において、
Ａは、Ｈ、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基、および直鎖Ｃ１５〜１８アルケニル基からなる群から選択され、
Ｂは、Ｈ、−ＮＨ２、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基、および直鎖Ｃ１５〜１８アルケニル基からなる群から選択され、
Ｑは、Ｈ、−ＯＨ、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基、および直鎖Ｃ１５〜１８アルケニル基、ならびに−ＮＲ３＋からなる群から選択され、ＲはＨまたはＣ１〜４アルキル基であり、
Ａ、Ｂ、Ｑのアルケニル基は、１〜５個の二重結合を有する。
【００１４】
一実施形態では、構造のＡ、Ｂ、Ｑにおいて、アルケニル基は、１〜３個の二重結合を有し、Ｚ配置にある。
【００１５】
一実施形態では、前記化合物は、下記式：
【００１６】
【化５】
2020515616.tif 000006
から選択され、
式中、
Ａは、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基および直鎖Ｃ１５〜１８アルケニル基から選択され、
Ｂは、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基および直鎖Ｃ１５〜１８アルケニル基から選択され、
Ｑは、Ｈ、−ＯＨ、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基、および直鎖Ｃ１５〜１８アルケニル基、ならびに−ＮＲ３＋からなる群から選択され、ＲはＨまたはメチルであり、
Ｌ３は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である。
【００１７】
一実施形態では、化合物は、リゾレシチン、セラミド、ジグリセリド、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、トリグリセリド、モノガラクトシルジグリセリド、スフィンゴシン、ホスファチジルエタノール、モノアシルグリセロール、脂肪酸、血小板活性化因子、またはジメチルホスファチジルエタノールアミンである。
【００１８】
一実施形態では、化合物は、表１に示されている脂質である。
【００１９】
一実施形態では、化合物は、番号１１、番号１２、番号４１、番号７１、番号３８、番号６４、番号４０、番号３７、番号３９、番号６０、または番号６２として表１に示されている脂質である。
【００２０】
第２の態様では、本出願は、上記化合物のいずれか１つまたは複数を含む組合せの使用に関する。好ましくは、脂質のいずれか１つまたは複数は、核酸送達試薬を製造するために、表１から選択される。好ましくは、組合せは、番号１１、番号１２、番号４１、番号７１、番号３８、番号６４、番号４０、番号３７、番号３９、番号６０、もしくは番号６２として表１に示されている脂質のいずれか１つ、または表１の他の脂質のいずれか１つもしくは複数とのその組合せを含む。
【００２１】
第３の態様では、本出願は、核酸送達試薬を製造するための、伝統的漢方薬の使用に関する。
【００２２】
一実施形態では、伝統的漢方薬は、ロディオラ・クレヌラータ、モウコタンポポ、アンドログラフィス・パニクラータ、およびスイカズラ漢方薬煎出片から選択される。
【００２３】
一実施形態では、試薬は、伝統的漢方薬から抽出された化合物を含む。好ましくは、試薬は、上記化合物のいずれか１つまたは複数、好ましくは、表１から選択されるいずれか１つまたは複数の脂質を含む。好ましくは、試薬は、番号１１、番号１２、番号４１、番号７１、番号３８、番号６４、番号４０、番号３７、番号３９、番号６０、もしくは番号６２として表１に示されている脂質のいずれか１つ、または表１に示されている他の脂質のいずれか１つまたは複数とのその組合せを含む。
【００２４】
一実施形態では、化合物は、伝統的漢方薬を煎出することにより抽出される。別の実施形態では、化合物は、伝統的漢方薬片を水に浸漬し、その後、激しい加熱およびゆっくりとした加熱を順に実施することにより抽出し、その後、加熱した漢方薬スープを濃縮し、その後、クロロホルム−メタノール、クロロホルムおよび水を順に添加して撹拌し、クロロホルム層を得る。
【００２５】
一実施形態では、化合物は、上述の実施形態のいずれか１つに示されている構造を有する。
【００２６】
一実施形態では、化合物は、リゾレシチン、セラミド、ジグリセリド、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、トリグリセリド、モノガラクトシルジグリセリド、（神経性）スフィンゴシン、ホスファチジルエタノール、モノアシルグリセロール、脂肪酸、血小板活性化因子、またはジメチルホスファチジルエタノールアミンである。
【００２７】
一実施形態では、化合物は、表１から選択される。
【００２８】
一実施形態では、化合物は、番号１１、番号１２、番号４１、番号７１、番号３８、番号６４、番号４０、番号３７、番号３９、番号６０、または番号６２として表１に示されている脂質である。
【００２９】
一実施形態では、送達は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞送達またはｉｎ  ｖｉｖｏ胃腸管送達を含む。
【００３０】
一実施形態では、使用は、脂質核酸混合物の製造を含む。
【００３１】
一実施形態では、脂質核酸混合物は、煮沸法により、または逆相蒸散法により、または直接混合により製造される。
【００３２】
一実施形態では、前記煮沸法での温度は、約２５℃から約１００℃まで、好ましくは約８０℃から約１００℃までであり、逆相蒸散法での温度は、約２５℃から約７０℃まで、好ましくは約５５℃である。
【００３３】
第４の態様では、本出願は、上述の実施形態のいずれか１つの構造の化合物および核酸を含む医薬組成物に関する。好ましくは、前記医薬組成物は、上記化合物のいずれか１つまたは複数、好ましくは、表１から選択される１つまたは複数の脂質を含む。好ましくは、医薬組成物は、番号１１、番号１２、番号４１、番号７１、番号３８、番号６４、番号４０、番号３７、番号３９、番号６０、もしくは番号６２として表１に示されている脂質のいずれか１つ、または表１に示されている他の脂質のいずれか１つもしくは複数および他の関連化学物質とのその組合せを含む。
【００３４】
一実施形態では、前記医薬組成物では、脂質および核酸は、少なくとも部分的にはまたは全体が、脂質核酸混合物の形態で存在している。
【００３５】
一実施形態では、前記医薬組成物では、脂質核酸混合物は、煮沸法により、または逆相蒸散法により、または直接混合により製造される。
【００３６】
一実施形態では、前記医薬組成物では、煮沸法での温度は、２５℃から約１００℃まで、好ましくは約８０℃から１００℃までである。逆相蒸散法での温度は、約２５℃から約７０℃まで、好ましくは約５５℃である。
【００３７】
第５の態様では、本出願は、上述の実施形態の脂質および核酸を含むキットであって、脂質および核酸は、各々独立して第１の容器および第２の容器に入れて提供されており、第１の容器および第２の容器は、同じであってもよくまたは異なっていてもよいキットに関する。好ましくは、キットは、上記化合物のいずれか１つまたは複数、好ましくは、表１から選択される１つまたは複数の脂質を含む。好ましくは、キットは、番号１１、番号１２、番号４１、番号７１、番号３８、番号６４、番号４０、番号３７、番号３９、番号６０、もしくは番号６２として表１に示されている脂質のいずれか１つ、または表１に示されている他の脂質のいずれか１つもしくは複数とのその組合せ、またはいずれか１つもしくは複数の脂質および他の関連化学物質とのその組合せを含む。
【００３８】
一実施形態では、前記医薬組成物では、脂質および核酸は、少なくとも部分的にまたは全体が、使用直前に脂質核酸混合物へと製造される。
【００３９】
一実施形態では、前記医薬組成物では、脂質核酸混合物は、煮沸法により、または逆相蒸散法により、または直接混合により製造される。
【００４０】
一実施形態では、前記医薬組成物では、煮沸法での温度は、２５℃から約１００℃まで、好ましくは約１００℃であり、逆相蒸散法での温度は、約２５℃から約７０℃まで、好ましくは約５５℃である。
【００４１】
第６の態様では、本出願は、核酸を標的細胞内へと送達する方法であって、上述の実施形態のいずれか１つの医薬組成物またはキットの形態で核酸を提供することを含む方法に関する。
【００４２】
第７の態様では、本出願は、核酸を、それを必要とする対象にｉｎ  ｖｉｖｏで送達する方法であって、上述のいずれか１つの医薬組成物またはキットの形態で核酸を提供することを含む方法に関する。
【００４３】
一実施形態では、上記方法では、対象は、ヒト、または哺乳動物などの動物である。
【００４４】
一実施形態では、上記方法では、核酸は、対象の血液循環または標的組織／細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで送達される。
【００４５】
一実施形態では、上記方法は、上述の実施形態のいずれか１つの医薬組成物またはキットを、それを必要とする対象に消化管により直接送達することを含む。
【００４６】
上述の態様または実施形態のいずれか１つでは、例えば、医薬組成物またはキットでは、核酸および脂質は、局所投与用および／または注射用に製造される。
【００４７】
上述の態様または実施形態のいずれか１つでは、例えば、医薬組成物またはキットでは、核酸および脂質は、消化投与用、呼吸投与用、および／または注射用に製造される。
【００４８】
上述の態様または実施形態のいずれか１つでは、例えば、医薬組成物またはキットでは、核酸および脂質は、経口投与用、吸入投与用、および／または注射用に製造される。
【００４９】
上述の態様または実施形態のいずれか１つでは、例えば、医薬組成物またはキットでは、核酸は、小分子ＲＮＡである。
【００５０】
上述の態様または実施形態のいずれか１つでは、例えば、医薬組成物またはキットでは、核酸は、ステム−ループ構造を有する。
【００５１】
上述の態様または実施形態のいずれか１つでは、例えば、医薬組成物またはキットでは、小分子ＲＮＡは、１４〜３２ｂｐまたは１８〜２４ｂｐの長さ、例えば、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、および３２ｂｐの長さを有する。
【００５２】
上述の態様または実施形態のいずれか１つでは、医薬組成物、キット、または化合物は、経口投与することができる。
【００５３】
上述の態様または実施形態のいずれか１つでは、核酸は、がん、例えば胃がんまたは肺がんなどの疾患を処置するために使用することができる。
【００５４】
上述の態様または実施形態のいずれか１つでは、脂質組合せを使用することができ、脂質組合せは、以下のいずれか１つである：番号８：番号４１＝６：１の脂質組合せ；番号３８：番号４１＝６：１の脂質組合せ；番号３９：番号４１＝６：１の脂質組合せ；番号４０：番号４１＝６：１の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４１：番号２９＝１：１：２：１の脂質組合せ；番号４０：番号１２：番号４１＝２：４：３の脂質組合せ；番号１２：番号４１＝１：６の脂質組合せ；番号１２：番号４１＝１：１の脂質組合せ；番号１２：番号４１＝６：１の脂質組合せ；番号４０：番号１２：番号４１＝２：２：２の脂質組合せ；番号４：番号１２：番号４１＝１：１：１の脂質組合せ；番号１：番号２：番号３：番号１９：番号３５＝１：１：１：１：１のＤＧ組合せ；番号６：番号９：番号１０：番号１３：番号１５：番号１６：番号１８：番号２０：番号２１：番号２２：番号２３：番号２４：番号２５：番号２６：番号２７：番号２８：番号３２：番号３３＝１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１：１のＴＧ組合せ；番号３６：番号３７＝１：１のＬＰＣ組合せ；番号１１：番号１２＝１：１のＰＣ組合せ；番号８：番号３８＝１：１のＰＥ組合せ；番号４：番号１４＝１：１のＣｅｒ組合せ；番号１７：番号３０：番号３１＝１：１：１のＳｏ組合せ；番号５、番号７を含まない番号１〜３６の等容積組合せ；番号５、番号７、番号３４を含まない番号１〜３６の等容積組合せ；番号５、番号７、番号１、番号２、番号３、番号１９、番号３５を含まない番号１〜３６の等容積組合せ；番号５、番号７、番号６、番号９、番号１０、番号１３、番号１５、番号１６、番号１８、番号２０、番号２１、番号２２、番号２３、番号２４、番号２５、番号２６、番号２７、番号２８、番号３２、番号３３を含まない番号１〜３６の等容積組合せ；番号５、番号７、番号３６、番号３７を含まない番号１〜３６の等容積組合せ；番号５、番号７、番号１１、番号１２を含まない番号１〜３６の等容積組合せ；番号５、番号７、番号８を含まない番号１〜３６の等容積組合せ；番号５、番号７、番号４、番号１４を含まない番号１〜３６の等容積組合せ；番号５、番号７、番号２９を含まない番号１〜３６の等容積組合せ；番号１：番号３４＝２：１の脂質組合せ；番号１：前記ＤＧ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号１：前記ＴＧ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号１：前記ＬＰＣ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号１：番号８＝２：１の脂質組合せ；番号１：番号１２＝２：１の脂質組合せ；番号１：前記Ｃｅｒ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号１：前記Ｓｏ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号１：番号２９＝２：１の脂質組合せ；番号１：番号８：番号１２＝１：１：１の脂質組合せ；番号８：番号３４＝２：１の脂質組合せ；番号８：前記ＤＧ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号８：前記ＴＧ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号８：前記ＬＰＣ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号８：番号３７＝４：１の脂質組合せ；番号８：番号１２＝２：１の脂質組合せ；番号８：前記Ｃｅｒ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号８：前記Ｓｏ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号８：番号３１＝６：１の脂質組合せ；番号８：番号２９＝２：１の脂質組合せ；番号１２：番号３４＝２：１の脂質組合せ；番号１２：前記ＤＧ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号１２：前記ＴＧ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号１２：前記ＬＰＣ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号１２：番号８＝２：１の脂質組合せ；番号１２：前記Ｃｅｒ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号１２：前記Ｓｏ組合せ＝２：１の脂質組合せ；番号１２：番号２９＝２：１の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号１＆２＝２：１：１の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号１５＝２：１：１の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号３６＆３７＝２：１：１の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号１１＝２：１：１の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号１２＝２：１：１の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号４＝２：１：１の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号３１＝２：１：１の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２９＝２：１：１の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号３４＝３：２：１の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号３４＝４：２：３の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２＝４：２：３の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２＝１６：８：３の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号３２＝４：２：３の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号３７＝４：２：３の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号１１＝４：２：３の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号３８＝４：２：３の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号４＝４：２：３の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号３１＝４：２：３の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２９＝４：２：３の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２９：番号３１＝２：１：１：１の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２９：番号３１：番号３４＝４：２：２：２：５の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２９：番号３１：番号２＝４：２：２：２：５の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２９：番号３１：番号３２＝４：２：２：２：５の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２９：番号３１：番号１１＝４：２：２：２：５の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２９：番号３１：番号３７＝４：２：２：２：５の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２９：番号３１：番号３８＝４：２：２：２：５の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２９：番号３１：番号４＝４：２：２：２：５の脂質組合せ；番号１２：番号８：番号２９：番号３１：番号４：番号１：番号１６＝２：１：１：３：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号８：番号１２：番号１＆２＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号８：番号１２：番号１５＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号８：番号１２：番号３６＆３７＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号８：番号１２：番号１２＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号８：番号１２：番号４＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号８：番号１２：番号３１＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号８：番号１２：番号２９＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号８：番号３４：番号１＆２＝２：１：１の脂質組合せ；番号８：番号３４：番号１５＝２：１：１の脂質組合せ；番号８：番号３４：番号３６＆３７＝２：１：１の脂質組合せ；番号８：番号３４：番号１２＝２：１：１の脂質組合せ；番号８：番号３４：番号４＝２：１：１の脂質組合せ；番号８：番号３４：番号３１＝２：１：１の脂質組合せ；番号８：番号３４：番号２９＝２：１：１の脂質組合せ；番号８：番号３１：番号３４＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号３１：番号２＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号３１：番号３７＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号３１：番号１１＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号３１：番号１２＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号３１：番号４＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号３１：番号２９＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号３１：番号３２＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号４：番号３４＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号４：番号２＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号４：番号３７＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号４：番号１２＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号４：番号３１＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号４：番号２９＝１２：３：５の脂質組合せ；番号８：番号４：番号３２＝１２：３：５の脂質組合せ；番号３８：番号３４＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号１＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号２＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号１＆２＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号１５＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号３２＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号３７＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号３７＝４：１の脂質組合せ；番号３８：番号１１＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号１２＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号１１＆１２＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号１２＝４：１の脂質組合せ；番号３８：番号８＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号４＝２：１の脂質組合せ；番号３８：Ｓｏ（３０）＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号３１＝２：１の脂質組合せ；番号３８：番号２９＝２：１の脂質組合せ；番号１：番号３８：番号１２：番号３４＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号３８：番号１２：番号１５＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号３８：番号１２：番号３７＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号３８：番号１２：番号８＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号３８：番号１２：番号４＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号３８：番号１２：番号３１＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号１：番号３８：番号１２：番号２９＝２：２：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号１＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号１５＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号３７＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号１２＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号８＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号４＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号３１＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号２９＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号１＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号２＝４：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号１５＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号３７＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号８＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号３１＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号２９＝２：１：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号１：番号１５：番号３４＝２２：２２：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号１：番号１５：番号３７＝２２：２２：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号１：番号１５：番号４＝２２：２２：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号１：番号１５：番号３１＝２２：２２：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号１：番号１５：番号２９＝２２：２２：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号３７：番号１＝４４：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号３７：番号１５＝４４：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号３７：番号１２＝４４：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号３７：番号４＝４４：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号３７：番号３１＝４４：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号３４＝４４：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号１＝４４：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号１５＝４４：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号３７＝４４：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号３７＝８：２：５：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号３１＝４４：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号２９＝４４：２２：３３：３６の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号２９：番号３４＝８８：４４：６６：７２：１３５の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号２９：番号１＝８８：４４：６６：７２：１３５の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号２９：番号１５＝８８：４４：６６：７２：１３５の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号２９：番号３７＝８８：４４：６６：７２：１３５の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号２９：番号３１＝８８：４４：６６：７２：１３５の脂質
組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号２＝２０：１０：１５：９の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号６＝２０：１０：１５：９の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号１７＝２０：１０：１５：９の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号２９＝２０：１０：１５：９の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号３４＝２０：１０：１５：９の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号４：番号３７＝２０：１０：１５：９の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号３１：番号３４＝２：１：３：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号３１：番号１＝２：１：３：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号３１：番号１５＝２：１：３：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号３１：番号３７＝２：１：３：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号３１：番号４＝２：１：３：３の脂質組合せ；番号３８：番号１２：番号３１：番号２９＝２：１：３：３の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号３７：番号３１：番号１＝８８：４４：６６：７２：１３５の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号３７：番号３１：番号１５＝８８：４４：６６：７２：１３５の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号３７：番号３１：番号１２＝８８：４４：６６：７２：１３５の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号３７：番号３１：番号４＝８８：４４：６６：７２：１３５の脂質組合せ；番号３８：番号３４：番号３７：番号３１：番号２９＝８８：４４：６６：７２：１３５の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号３４＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号１＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号２＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号１＆２＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号２＝３２：８：５の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号３２＝３２：８：５の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号１５＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号３２＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号８＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号１１＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号１２＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号１１＆１２＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号１２＝４：１：１の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号４＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号３０＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号３１＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号２９＝４：２：３の脂質組合せ；番号８：番号３７：番号３２＝４：１：２の脂質組合せ；番号８：番号３７：番号２＝４：１：２の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号１５：番号３４＝６４：１６：１０：４５の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号１５：番号１＝６４：１６：１０：４５の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号１５：番号１２＝６４：１６：１０：４５の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号１５：番号４＝６４：１６：１０：４５の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号１５：番号３１＝６４：１６：１０：４５の脂質組合せ；番号３８：番号３７：番号１５：番号２９＝６４：１６：１０：４５の脂質組合せ；番号３８：番号２：番号３７＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号２：番号３１＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号２：番号２９＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号２：番号３４＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号２：番号３２＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号２：番号１２＝４：２：３の脂質組合せ；番号３８：番号２：番号１２＝４：５：１の脂質組合せ；番号３８：番号２：番号４＝４：２：３の脂質組合せ。一実施形態では、脂質番号１＆２、番号１１＆１２、または番号３６＆３７は、それぞれ、任意の比率の脂質番号１および番号２、任意の比率の脂質番号１１および番号１２、任意の比率の脂質番号３６および番号３７を表すことができる。
【００５５】
また、本出願は、下記式の構造を有する化合物、化合物を含む組合せまたは組成物、および化合物、組合せ、または組成物を、核酸送達のために使用する方法、および核酸送達試薬を製造するための、化合物、組合せ、または組成物の使用を提供する。
【００５６】
【化６】
2020515616.tif 000007
式中、
Ｌ１、Ｌ２、もしくはＬ３は、存在しないか、またはＬ１、Ｌ２、およびＬ３は、各々独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−からなる群から選択され、
但し、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３の最大で２つは存在せず、
２価基Ｌ１、Ｌ２に関して、左側のダッシュ「−」は、それぞれ基ＡおよびＢに連結され、右側のダッシュ「−」は、中央の炭素原子に連結され、
２価基Ｌ３に関して、左側のダッシュ「−」は、中央の炭素原子に連結され、右側のダッシュ「−」は、基Ｑに連結され、
Ａ、Ｂ、およびＱは、Ｈ、−ＯＨ、Ｃ１０〜２０アルキル、Ｃ１０〜２０アルケニル、−ＮＨ２、および−ＮＲ３＋からなる群から選択され、Ｒは、ＨまたはＣ１〜６アルキルである。
【００５７】
一実施形態では、化合物は、以下の構造を有していてもよく、
【００５８】
【化７】
2020515616.tif 000008
式中、
Ａは、直鎖Ｃ１０〜２０アルキル基および直鎖Ｃ１０〜２０アルケニル基からなる群から選択され、
Ｂは、直鎖Ｃ１０〜２０アルキル基および直鎖Ｃ１０〜２０アルケニル基からなる群から選択され、
Ｑは−ＯＨであり、
好ましくは、
Ａは、直鎖Ｃ１５〜２０アルキル基および直鎖Ｃ１５〜２０アルケニル基からなる群から選択され、
Ｂは、直鎖Ｃ１５〜２０アルキル基および直鎖Ｃ１５〜２０アルケニル基からなる群から選択され、
Ｑは−ＯＨであり、
好ましくは、
Ａは、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基および直鎖Ｃ１５〜１８アルケニル基からなる群から選択され、
Ｂは、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基および直鎖Ｃ１５〜１８アルケニル基からなる群から選択され、
Ｑは−ＯＨである。
【００５９】
別の実施形態では、前記化合物は、以下の構造を有していてもよく、
【００６０】
【化８】
2020515616.tif 000009
式中、
Ａは、直鎖Ｃ１０〜２０アルキル基および直鎖Ｃ１０〜２２アルケニル基からなる群から選択され、
Ｂは、直鎖Ｃ１０〜２０アルキル基および直鎖Ｃ１０〜２２アルケニル基からなる群から選択され、
Ｑは、直鎖Ｃ１０〜２０アルキル基および直鎖Ｃ１０〜２２アルケニル基からなる群から選択され、
好ましくは、
Ａは、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基および直鎖Ｃ１５〜２２アルケニル基からなる群から選択され、
Ｂは、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基および直鎖Ｃ１５〜２２アルケニル基からなる群から選択され、
Ｑは、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基および直鎖Ｃ１５〜２２アルケニル基からなる群から選択され、
好ましくは、
Ａは、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基および直鎖Ｃ１５〜２０アルケニル基からなる群から選択され、
Ｂは、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基および直鎖Ｃ１５〜２０アルケニル基からなる群から選択され、
Ｑは、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基および直鎖Ｃ１５〜２０アルケニル基からなる群から選択される。
【００６１】
別の実施形態では、化合物は、以下の構造を有していてもよく、
【００６２】
【化９】
2020515616.tif 000010
式中、
Ａは、直鎖Ｃ１０〜２０アルキル基および直鎖Ｃ１０〜２０アルケニル基からなる群から選択され、
Ｂは、直鎖Ｃ１０〜２０アルキル基および直鎖Ｃ１０〜２０アルケニル基からなる群から選択され、
Ｑは、−ＯＨであり、
好ましくは、
Ａは、直鎖Ｃ１５〜２０アルキル基および直鎖Ｃ１５〜１８アルケニル基からなる群から選択され、
Ｂは、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基および直鎖Ｃ１５〜１８アルケニル基からなる群から選択され、
Ｑは、−ＯＨであり、
好ましくは、
Ａは、直鎖Ｃ１５〜２０アルキル基であり、
Ｂは、直鎖Ｃ１５〜１８アルキル基であり、
Ｑは、−ＯＨである。
【００６３】
別の実施形態では、化合物は、以下の構造を有していてもよく、
【００６４】
【化１０】
2020515616.tif 000011
式中、
Ａは、直鎖Ｃ１０〜２０アルキル基および直鎖Ｃ１０〜２０アルケニル基からなる群から選択され、
Ｑは、−ＯＨであり、
好ましくは、
Ａは、直鎖Ｃ１０〜２０アルキル基および直鎖Ｃ１５〜１８アルケニル基からなる群から選択され、
Ｑは、−ＯＨであり、
好ましくは、
Ａは、直鎖Ｃ１５〜２０アルキル基であり、
Ｑは、−ＯＨである。
【００６５】
本出願の任意の態様または実施形態では、化合物は、上記に記載されている化合物であってもよい。
【００６６】
本出願の任意の態様または実施形態では、化合物、抽出物、または組成物は、合成に由来してもよく、天然に由来してもよく、または伝統的漢方薬から抽出してもよい。
【００６７】
本出願により提供される上記技術的解決法は、核酸の高効率標的送達を著しく向上させることができ、低封入率、安全性不良、安定性不良、複雑な製造プロセス、生成物の不均質性、低再現性、および標的指向性を向上させる必要があることを含む、従来技術の核酸リポソームの欠点を克服することができる。
【００６８】
【表１−１（１）】
2020515616.tif 000012
【表１−１（２）】
2020515616.tif 000013
【表１−１（３）】
2020515616.tif 000014
【００６９】
【表１−２（１）】
2020515616.tif 000015
【表１−２（２）】
2020515616.tif 000016
【表１−２（３）】
2020515616.tif 000017
【表１−２（４）】
2020515616.tif 000018
【００７０】
【表１−２（５）】
2020515616.tif 000019
【表１−２（６）】
2020515616.tif 000020
【表１−２（７）】
2020515616.tif 000021
【表１−２（８）】
2020515616.tif 000022
【表１−２（９）】
2020515616.tif 000023
【００７１】
用語の定義
本明細書で使用されている用語は、言及されている置換基とその親部分との間の結合の結合レベルを示すために、その前および／または後に単一ダッシュ「−」（または横線）または二重ダッシュ「＝」を有している場合があり、単一ダッシュ「−」（または横線）は単結合を指し、二重ダッシュは二重結合を指し、単一ダッシュまたは二重ダッシュが存在しない場合、置換基とその親部分との間には単結合が形成されていることが理解され、加えて、置換基は、ダッシュが別様に指示していない限り、「左から右へ」であると解釈されるべきであり、例えば、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシカルボニルオキシ基および−ＯＣ（Ｏ）ＯＣ１〜Ｃ６アルキル基は、同じ官能基を指す。
【００７２】
用語「アルキル」は、本明細書で使用される場合、直鎖または分岐飽和炭化水素鎖を指す。本明細書に記載されているように、アルキル基は、１〜２０個の炭素原子（すなわち、Ｃ１〜２０アルキル）、１〜８個の炭素原子（すなわち、Ｃ１〜８アルキル）、１〜６個の炭素原子（すなわち、Ｃ１〜６アルキル）、または１〜４個の炭素原子（すなわち、Ｃ１〜４アルキル）を有する。一実施形態では、アルキル基は、Ｃ１０〜２０アルキル基である。一実施形態では、アルキル基は、Ｃ１５〜２０アルキル基である。一実施形態では、アルキル基は、Ｃ１５〜１８アルキル基、すなわち、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８アルキル基である。
【００７３】
用語「アルケニル」は、本明細書で使用される場合、少なくとも１つの炭素間二重結合を含み、２〜２０個の炭素原子（すなわち、Ｃ２〜２０アルケニル）、２〜８個の炭素原子（すなわち、Ｃ２〜８アルケニル）、２〜６個の炭素原子（すなわち、Ｃ２〜６アルケニル）、または２〜４個の炭素原子（すなわち、Ｃ２〜４アルケニル）を有する脂肪族基を指す。一実施形態では、アルケニル基は、Ｃ１０〜２０アルケニル基である。一実施形態では、アルケニル基は、Ｃ１５〜２０アルケニル基である。一実施形態では、アルケニル基は、Ｃ１５〜１８アルケニル基、すなわち、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８アルケニル基である。
【００７４】
用語「ヘテロアルキル」および「ヘテロアルケニル」は、本明細書で使用される場合、それぞれ、上記で定義されているアルキルおよびアルケニルであって、１つまたは複数の炭素原子が、各々独立して、同じまたは異なるヘテロ原子基により置換されているアルキルおよびアルケニルを指す。例えば、１、２、または３個の炭素原子が、独立して、同じまたは異なるヘテロ原子基により置換されていてもよい。ヘテロ原子基としては、これらに限定されないが、−ＮＲ１−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、および−Ｓ（Ｏ）２−などが挙げられ、式中Ｒ１は、Ｈ、アルキルである。ヘテロアルキル基の例としては、−ＯＣＨ３、−ＣＨ２ＯＣＨ３、−ＳＣＨ３、−ＣＨ２ＳＣＨ３、−ＮＲ１ＣＨ３、および−ＣＨ２ＮＲ１ＣＨ３が挙げられ、式中Ｒ１は、水素、アルキルである。
【００７５】
本明細書に記載の用語「逆相蒸散法」は、核酸の水溶液を、脂質の有機溶媒溶液に添加し、超音波処理し、蒸発させて有機溶媒を除去し、その後水和して、脂質核酸混合物を得ることを指す。
【００７６】
本明細書に記載の用語「煮沸法」（「加熱法」とも呼ばれる）は、脂質の有機溶媒溶液を核酸の水溶液に添加し、約１００℃で３０分間煮沸して、脂質核酸混合物を得ることを指す。方法は、煮沸による加熱に限定されず、当技術分野で公知の他の加熱または昇温手段も使用することができる。
【００７７】
逆相蒸散法および煮沸法は、制御された温度および混合条件下で実施される。好適な処理時間および温度は、当業者であれば容易に決定することができる。例えば、逆相蒸散法の温度は、好ましくは約２５℃から約７０℃まで、より好ましくは約３０℃から約６５℃まで、より好ましくは約４０℃から約６０℃までの範囲であり、特に約５５℃である。煮沸法の温度は、好ましくは約２５℃から約１００℃まで、より好ましくは約５０℃から約１００℃まで、より好ましくは約９５℃から約１００℃まで、特に好ましくは約８０℃から１００℃までの範囲である。
【００７８】
本明細書に記載の核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡ、好ましくは小分子ＲＮＡ、例えば、１４〜３２ｂｐ、１６〜２８ｂｐ、１８〜２４ｂｐの長さ、特に１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２ｂｐの長さを有する小分子ＲＮＡを含む。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】細胞（ヒト胃がん細胞株ＮＣＩ−Ｎ８７）内への核酸（ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７）吸収および進入に対する１２個の脂質の効果（逆相蒸散法）。
【図２】２７個の単一脂質は、ＭＲＣ−５細胞株内への核酸の進入を促進する（逆相蒸散法）。
【図３】２３個の単一脂質は、ＭＲＣ−５細胞株内への核酸の進入を促進する（煮沸法）。
【図４】２３個の単一脂質は、Ａ５４９細胞株内への核酸の進入を促進する（煮沸法）。
【図５】脂質組合せは、ＭＲＣ−５細胞株内への核酸の進入を促進することができる（逆相蒸散法）。
【図６】脂質組合せは、Ａ５４９細胞株内への核酸の進入を促進することができる（逆相蒸散法）。
【図７】脂質組合せは、ＭＲＣ−５細胞株内への核酸の進入を促進することができる（煮沸法）。
【図８】脂質組合せは、Ａ５４９細胞株内への核酸の進入を促進することができる（煮沸法）。
【図９】様々なタイプの脂質組合せが、Ｃａｃｏ−２細胞株内への核酸の進入を促進する（逆相蒸散法）。
【図１０】様々なタイプの脂質組合せが、Ｃａｃｏ−２細胞株内への核酸の進入を促進する（煮沸法）。
【図１１Ａ】単一脂質（番号１１および番号１２）は、様々な細胞内への、様々な配列を有する核酸の進入を促進する。
【図１１Ｂ】単一脂質（番号１１および番号１２）は、様々な細胞内への、様々な配列を有する核酸の進入を促進する。
【図１１Ｃ】単一脂質（番号１１および番号１２）は、様々な細胞内への、様々な配列を有する核酸の進入を促進する。
【図１２】蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション実験は、核酸が、単一脂質の補助により細胞質内へと進入することを示す。
【図１３】単一脂質（番号１１および番号１２）は、核酸が、細胞内へと進入して、遺伝子３’ＵＴＲ領域を標的とすることを促進する。
【図１４】単一脂質（番号１１および番号１２）は、核酸が、消化管により血液および肺内へ進入することを促進する。
【図１５】逆相蒸散法および煮沸法により調製された脂質組合せは、核酸が、消化管により血液および肺内へと進入することを促進する。
【図１６】様々なタイプの脂質組合せが、一本鎖核酸をＭＲＣ−５内に送達する。
【図１７Ａ】脂質組合せは、一本鎖核酸を、ＭＲＣ−５またはＣａｃｏ−２細胞内に送達する。
【図１７Ｂ】脂質組合せは、一本鎖核酸を、ＭＲＣ−５またはＣａｃｏ−２細胞内に送達する。
【図１８】脂質組合せは、一本鎖核酸を、細胞内に送達する。
【図１９】脂質組合せは、一本鎖核酸を、細胞内に送達する。
【図２０】脂質組合せは、一本鎖核酸を、細胞内に送達する。
【図２１】脂質組合せは、一本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。
【図２２】脂質組合せは、一本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。
【図２３】脂質組合せは、一本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。
【図２４】脂質組合せは、一本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。
【図２５】脂質組合せは、一本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。
【図２６】脂質組合せは、一本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。
【図２７】脂質組合せは、一本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。
【図２８】脂質組合せは、一本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。
【図２９】脂質組合せは、一本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。
【図３０】脂質組合せは、一本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。
【図３１】脂質組合せは、一本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。
【図３２】脂質組合せは、一本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。
【図３３】脂質組合せは、二本鎖核酸を、ＭＲＣ−５細胞内に送達する。
【図３４】脂質組合せは、二本鎖核酸を、ＭＲＣ−５細胞内に送達する。
【図３５】脂質組合せは、二本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。
【図３６】脂質組合せは、二本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。
【図３７】脂質組合せは、二本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。
【図３８】脂質組合せは、二本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。
【図３９】脂質組合せは、二本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。
【図４０】脂質組合せは、二本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。
【図４１】脂質組合せは、二本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。
【図４２】脂質組合せは、二本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内に送達する。
【図４３】脂質組合せは、二本鎖核酸を、ＭＲＣ−５細胞内に送達する。
【図４４】脂質組合せは、二本鎖核酸を、ＭＲＣ−５細胞内に送達する。
【図４５】脂質組合せは、二本鎖核酸を、ＭＲＣ−５細胞内に送達する。
【図４６】脂質組合せは、二本鎖核酸を、ＭＲＣ−５細胞内に送達する。
【図４７】脂質組合せは、二本鎖核酸を、ＭＲＣ−５細胞内に送達する。
【図４８】脂質組合せは、二本鎖核酸を、ＭＲＣ−５細胞内に送達する。
【図４９】脂質組合せは、二本鎖核酸を、ＭＲＣ−５細胞内に送達する。
【図５０】脂質組合せは、核酸が、消化管を介して肺内に進入することを促進する。
【図５１】番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）は、ＭＲＣ−５細胞内への抗線維化ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の進入を媒介する。
【図５２】番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）は、Ａ５４９細胞内へのｓｉＲＮＡの進入を媒介する。
【図５３】番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）は、Ａ５４９細胞内へのｓｉＲＮＡの進入を媒介する。
【図５４】番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）は、ＴＨＰ−１細胞内へのｓｉＲＮＡの進入を媒介する。
【図５５】番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号２（ＤＧ）（ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：３）は、ＭＲＣ−５細胞内への抗線維化ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の進入を媒介する。
【図５６】番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号２（ＤＧ）（ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：３）脂質混合物は、ＸＲＮ２  ｓｉＲＮＡが、Ａ５４９細胞内に進入して、遺伝子発現を阻害することを媒介する。
【図５７】番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号４（Ｃｅｒ）（ｖ：ｖ：ｖ＝１：２：１）脂質混合物は、ＭＲＣ−５細胞内への抗線維化ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の進入を媒介する（煮沸法）。
【図５８】番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号４（Ｃｅｒ）（ｖ：ｖ：ｖ＝１：２：１）脂質混合物は、ＮＦκＢ  ｓｉＲＮＡが、ＴＨＰ−１細胞内に進入して、遺伝子発現を阻害することを媒介する（煮沸法）。
【図５９】番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号ＰＣ（１１）（ｖ：ｖ：ｖ＝１：２：１）脂質混合物は、ＸＲＮ２  ｓｉＲＮＡが、Ａ５４９細胞内に進入して、遺伝子発現を阻害することを媒介する。
【図６０】番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号ＬＰＣ（３７）（ｖ：ｖ：ｖ＝１：２：１）脂質混合物は、ＸＲＮ２  ｓｉＲＮＡが、Ａ５４９細胞内に進入して、遺伝子発現を阻害することを媒介する。
【図６１】番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号ＭＧ（３４）（ｖ：ｖ：ｖ＝２：３：１）脂質混合物は、ＣＰＳＦ４  ｓｉＲＮＡが、Ａ５４９細胞内に進入して、遺伝子発現を阻害することを媒介する。
【図６２】番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）：番号３２（ＴＧ）（ｖ：ｖ：ｖ＝３２：８：５）脂質混合物は、ＭＲＣ−５細胞内への抗線維化ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の進入を媒介する（煮沸法）。
【図６３】番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）：番号３２（ＴＧ）（ｖ：ｖ：ｖ＝３２：８：５）脂質混合物は、ＸＲＮ２  ｓｉＲＮＡが、Ａ５４９細胞内に進入して、遺伝子発現を阻害することを媒介する。
【図６４】番号１（ＤＧ）：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号４（Ｃｅｒ）：番号３１（Ｓｏ）：番号２９（ＦＡ）：番号１６（ＴＧ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝２：１：２：２：３：１：３）は、ＭＲＣ−５細胞内への抗線維化ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の進入を媒介する（煮沸法）。
【図６５】番号１（ＤＧ）：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号４（Ｃｅｒ）：番号３１（Ｓｏ）：番号２９（ＦＡ）：番号１６（ＴＧ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝２：１：２：２：３：１：３）脂質混合物は、ＸＲＮ２  ｓｉＲＮＡが、Ａ５４９内に進入して、遺伝子発現を阻害することを媒介する（煮沸法）。
【図６６】番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号３１（Ｓｏ）：番号２９（ＦＡ）：番号４（Ｃｅｒ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：２：２：２：５）は、ＭＲＣ−５細胞内への、抗線維化ＨＪＴ小分子ＲＮＡ  ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−３、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ａ２、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｈ３、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の進入を媒介する（煮沸法）。
【図６７】番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号３１（Ｓｏ）：番号２９（ＦＡ）：番号４（Ｃｅｒ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：２：２：５）脂質混合物は、核酸を細胞内へと効果的に送達することができる。
【図６８】番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）（ｖ：ｖ＝４：１）は、ＭＲＣ−５細胞内への、抗線維化ＨＪＴ小分子ＲＮＡ  ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−３、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ａ２、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｈ３、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の進入を媒介する（煮沸法）。
【図６９】番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）（ｖ：ｖ＝４：１）脂質混合物は、ＸＲＮ２  ｓｉＲＮＡが、Ａ５４９細胞内に進入して、遺伝子発現を阻害することを媒介する（煮沸法）。
【図７０】番号３８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号２（ＤＧ）（ｖ：ｖ：ｖ＝４：１：３）脂質混合物は、ＸＲＮ２  ｓｉＲＮＡが、Ａ５４９細胞内に進入して、遺伝子発現を阻害することを媒介する。
【図７１】番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ：ｖ＝４：１：１）脂質混合物は、ＸＲＮ２  ｓｉＲＮＡが、Ａ５４９細胞内に進入して、遺伝子発現を阻害することを媒介する（逆相蒸散法）。
【図７２】番号４（Ｃｅｒ）：番号１２（ＰＣ）：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝５：２：８：３）脂質混合物は、ＭＲＣ−５細胞内への、抗線維化小分子ＲＮＡ  ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−３、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ａ２、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｈ３、およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の進入を媒介する（煮沸法）。
【図７３】番号４（Ｃｅｒ）：番号１２（ＰＣ）：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝５：２：８：３）脂質混合物は、ＸＲＮ２  ｓｉＲＮＡがＡ５４９細胞内に進入して、遺伝子発現を阻害することを媒介する（煮沸法）。
【図７４】番号３８（ＰＥ）：番号２（ＤＧ）：番号３１（Ｓｏ）（ｖ：ｖ：ｖ＝４：２：３）脂質混合物は、ＭＲＣ−５細胞内への抗線維化小分子ＲＮＡ  ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−３、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ａ２、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｈ３、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の進入を媒介する（煮沸法）。
【図７５】番号３８（ＰＥ）：番号２（ＤＧ）：番号３１（Ｓｏ）（ｖ：ｖ：ｖ＝４：２：３）脂質混合物は、ＸＲＮ２  ｓｉＲＮＡが、Ａ５４９細胞内に進入して、遺伝子発現を阻害することを媒介する（煮沸法）。
【図７６】脂質番号４１は、異なる調製方法（煮沸法または逆相蒸散法）により二本鎖ＲＮＡをＡ５４９細胞内へと送達する。
【図７７】脂質番号４１は、異なる調製方法（煮沸法または逆相蒸散法）により二本鎖ＲＮＡをＭＲＣ−５細胞内へと送達する。
【図７８】脂質番号４１は、煮沸法により、一本鎖ＲＮＡをＡ５４９およびＭＲＣ−５細胞内へと送達する。
【図７９】脂質による核酸送達の効率を、デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）技術により決定する。
【図８０】脂質による核酸送達の効率を、フローサイトメトリー技術により決定した。
【図８１】脂質により細胞に送達された核酸の局在化を、共焦点蛍光顕微鏡法により観察する。
【図８２】脂質による核酸送達の効率を、ウエスタンブロッティングアッセイにより決定した。
【図８３】単一脂質番号４１は、ＭＲＣ−５細胞内への抗線維化ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の進入を媒介する（煮沸法）。
【図８４】核酸送達における、脂質組合せ１（番号８＋番号４１＝６：１）および脂質組合せ２（番号３８＋番号４１＝６：１）の効果。
【図８５】核酸送達における、脂質組合せ３（番号３９＋番号４１＝６：１）および脂質組合せ４（番号４０＋番号４１＝６：１）の効果。
【図８６】核酸送達における、脂質組合せ５（３８＋１２＋４１＋２９＝１：２：１：１）の効果。
【図８７】核酸送達における、脂質組合せ６（４０（ＰＥ）＋１２（ＰＣ）＋４１（Ｓｏ）＝２：４：３）の効果。
【図８８】核酸送達における、脂質組合せ７（１２（ＰＣ）＋４１（Ｓｏ）＝１：６）および脂質組合せ８（１２（ＰＣ）＋４１（Ｓｏ）＝１：１）の効果。
【図８９】核酸送達における、脂質組合せ９（１２（ＰＣ）＋４１（Ｓｏ）＝６：１）および脂質組合せ１０（４０（ＰＣ）＋１２（ＰＣ）＋４１（Ｓｏ）＝２：２：２）の効果。
【図９０】核酸送達における、脂質組合せ１１（４（Ｃｅｒ）＋１２（ＰＣ）＋４１（Ｓｏ）＝１：１：１）の効果。
【図９１】脂質３８は、煮沸法により、二本鎖ＲＮＡをＡ５４９およびＭＲＣ−５細胞内へと送達する。
【図９２】脂質３８は、煮沸法により、一本鎖ＲＮＡをＡ５４９細胞およびＭＲＣ−５細胞内へと送達する。
【図９３】脂質による核酸送達の効率を、デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）技術により決定した。
【図９４】脂質による核酸送達の効率を、フローサイトメトリー技術により決定した。
【図９５】脂質により細胞に送達された核酸の位置を、共焦点蛍光顕微鏡法により観察する。
【図９６】脂質６４は、異なる調製方法（煮沸法または逆相蒸散法）により、二本鎖ＲＮＡをＡ５４９細胞内へと送達する。
【図９７】フローサイトメトリー技術により決定した、脂質による核酸送達の効率。
【図９８】共焦点蛍光顕微鏡法により観察した、脂質により細胞に送達された核酸の局在化。
【図９９】デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）技術により決定した、脂質による核酸送達の効率。
【図１００】共焦点蛍光顕微鏡法により観察した、脂質により細胞に送達された核酸の位置。
【図１０１】ウエスタンブロッティングアッセイにより決定した、脂質による核酸送達の効率。
【図１０２】単一ホスファチジルエタノールアミン脂質４０は、抗線維化二本鎖ＲＮＡ  ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７が、ＭＲＣ−５細胞内に進入して、フィブロネクチンタンパク質発現レベルを下方制御することを媒介する。
【図１０３】煮沸法により調製された脂質３８は、一本鎖ＲＮＡをＡ５４９およびＭＲＣ−５細胞内へと送達する。
【図１０４】異なる方法（煮沸法または逆相蒸散法）により調製された脂質３９は、二本鎖ＲＮＡをＡ５４９細胞内へと送達する。
【図１０５】デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）技術により決定した、脂質による核酸送達の効率。
【図１０６】異なる方法（煮沸法または逆相蒸散法）により調製された脂質６０は、二本鎖ＲＮＡをＡ５４９細胞内へと送達する。
【図１０７】異なる方法（煮沸法または逆相蒸散法）により調製された脂質６２は、二本鎖ＲＮＡをＡ５４９細胞内へと送達する。
【図１０８】脂質番号４１は、血液中への小分子ＲＮＡの進入を促進し、血液中での分解からそれを保護する。
【図１０９】脂質番号４１は、胃細胞内への小分子ＲＮＡの進入を促進し、胃での分解からそれを保護する。
【図１１０】脂質番号４１は、小腸細胞内への小分子ＲＮＡの進入を促進し、小腸での分解からそれを保護する。
【図１１１】脂質番号４１は、肝臓内への小分子ＲＮＡの進入を促進し、肝臓での分解からそれを保護する。
【図１１２】単一ＰＥ（番号３８）は、一本鎖ｓＲＮＡ核酸を、経口投与によりマウス血液中へと効果的に送達する。
【図１１３】単一ＰＥ（番号４０）は、一本鎖ｓＲＮＡ核酸を、経口投与によりマウス血液中へと効果的に送達する。
【図１１４】単一ＰＥ（番号６４）は、一本鎖ｓＲＮＡ核酸を、経口投与によりマウス血液中へと効果的に送達する。
【図１１５】単一ＰＥ（番号７１）は、一本鎖ｓＲＮＡ核酸を、経口投与によりマウス血液中へと効果的に送達する。
【図１１６】脂質は、様々な温度勾配にて、一本鎖核酸をＭＲＣ−５細胞内へと効果的に送達する。
【発明を実施するための形態】
【００８０】
以下は、本出願のさらなる説明であるが、いかなる点でも本発明を限定することは意図されておらず、本出願の教示に基づいてなされるあらゆる変更は、本出願の保護の範囲内に入る。
【００８１】
本出願では、脂溶性成分を、Ｂｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒ法により、伝統的漢方薬（ロディオラ・クレヌラータ、モウコタンポポ、アンドログラフィス・パニクラータ、およびスイカズラ）から抽出し、脂質成分を、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより同定した（合計１３８個の脂質成分を、１２５個はポジティブモードで、１３個はネガティブモードで同定した）。それらのうち７１個（表１−１〜表１−３を参照）を、脂質核酸混合物の調製に使用し、それらが、外因性核酸の細胞吸収および進入を促進することができたか否かを観察した。なお、本出願で使用された脂質は、商業的に購入されたか、または商業的に合成されたものであり、伝統的漢方薬から直接的に抽出したものではなかったことが留意されるべきである。本発明者は、驚くべきことに、種々の脂質が、核酸の細胞吸収および進入を効果的に促進する脂質核酸混合物を形成することができ（図１〜１１６を参照）、臨床の場面で核酸薬送達の効率を増加させる可能性を有することを見出した。さらなる研究は、本出願の脂質核酸混合物が、異なる細胞株で核酸吸収および進入の効率を促進することを示したが、異なる細胞株で差異が観察された（図１〜１０を参照）。これは、標的化薬物送達の可能性を切り開くものである。さらに、そのような脂質核酸混合物による核酸送達は、配列特異的ではなく、異なる配列、および小分子ＲＮＡのサイズに相当するサイズ（例えば、約２０ｂｐ）を有する核酸断片を送達することが可能である（図１１を参照）。加えて、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）により、煎出物に由来する脂質により形成された脂質核酸混合物が、細胞質内への外因性核酸の進入を効果的に促進することができることが確認された（図１２を参照）。本発明者は、意外にも、煮沸法または逆相蒸散法により調製された脂質核酸混合物が、血液循環および標的組織内への、非侵襲性経路を介した（例えば、消化管、呼吸器、および局所投与による）ｓＲＮＡなどの核酸の進入を容易にすることができることを発見した（図１４〜１５を参照）。また、本発明者は、驚くべきことに、本出願の脂質が、細胞内へのｓＲＮＡなどの核酸の進入を促進し、それらの標的配列の発現を調節（例えば、阻害）することが可能であるが、非標的配列に対してはそのような調節効果を示さないため、標的特異的調節であることが示唆され、核酸薬を送達するための手段として使用することができることを発見した（図１３を参照）。
【００８２】
上記の予期しない発見に基づき、本発明者らは、本出願に到達した。
【００８３】
一態様では、本出願は、核酸送達を容易にするための、伝統的漢方薬から抽出された化合物であって、リゾレシチン、セラミド、ジグリセリド、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、トリグリセリド、モノガラクトシルジグリセリド、スフィンゴシン、ホスファチジルエタノール、モノアシルグリセロール、脂肪酸、血小板活性化因子、またはジメチルホスファチジルエタノールアミンからなる群から選択され、好ましくは、表１に示されている脂質から選択される化合物を提供する。一実施形態では、脂質は、非天然であり、例えば、合成であるか、または発酵で製造される。
【００８４】
一実施形態では、脂質は、核酸を標的細胞内へと送達するために使用される。別の実施形態では、脂質は、それを必要とする対象内へと、ならびにその血液循環および／または標的部位／細胞内へと核酸を送達するために使用される。
【００８５】
好ましい実施形態では、脂質は、ホスファチジルコリン、例えば、１−ステアロイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホコリン（ＰＣ（１８：０／１８：２）、すなわち表１の脂質番号１１）および１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホコリン（ＰＣ（１６：０／１８：２）、すなわち表１の脂質番号１２）から選択される。これら２つのホスホコリン（ＰＣ）は、核酸を効率的に封入すること、または細胞内への核酸の進入を促進することを可能にする。一実施形態では、脂質は、表１の脂質番号４１、すなわちスフィンガニン（ｄ２２：０）であってもよく、核酸を効率的に封入すること、または細胞内への核酸の進入を促進することが可能である。
【００８６】
別の態様では、本出願は、上記脂質および核酸を含む医薬組成物を提供する。好ましくは、核酸は、小分子ＲＮＡである。
【００８７】
一実施形態では、本出願の医薬組成物は、非侵襲性経路（例えば、局所投与）および／または注射による投与用に、例えば、消化管、呼吸器、および／または注射による投与用に、例えば、経口投与、吸入、および／または注射用に調製することができる。一部の場合では、侵襲性経路が好ましい（例えば、筋肉内、皮下、静脈内、動脈内、腹腔内を含む注射、および標的組織内への注射）；他の場合では、非侵襲性経路が好ましい。
【００８８】
別の実施形態では、本出願の医薬組成物では、脂質および核酸の少なくとも一部または全部を、脂質核酸混合物の形態に調製することができる。脂質核酸混合物を製造するための種々の方法は幅広く開示されており、脂質核酸混合物の製造に好適な方法は、実際の必要性に応じて選択することができる。
【００８９】
第３の態様では、本出願は、本明細書に記載の脂質および核酸を含むキットであって、脂質および核酸は、各々独立して、第１の容器および第２の容器に入れて提供されているキットを提供する。第１の容器および第２の容器は、同じであってもよく、または異なっていてもよい。一部の実施形態では、脂質および核酸の少なくとも一部または全部は、使用直前に脂質核酸混合物へと調製される。
【００９０】
第４の態様では、本出願は、核酸を標的組織／細胞内へと送達する方法であって、核酸は、本明細書に記載の医薬組成物またはキットの形態で提供される方法を提供する。
【００９１】
第５の態様では、本出願は、核酸を、それを必要とする対象内にｉｎ  ｖｉｖｏで送達する方法であって、本明細書に記載の医薬組成物またはキットの形態で核酸を提供し、例えば、核酸を対象の血液循環または標的組織／細胞内へとｉｎ  ｖｉｖｏで送達し、例えば、脂質および核酸は、非侵襲性経路（例えば、局所投与）および／または注射により、例えば、消化管、呼吸器、および／または注射により、例えば、経口投与、吸入、および／または注射により投与される、方法を提供する。
【００９２】
第６の態様では、本出願は、核酸で予防および／または処置することができる疾患／障害を予防および／または処置する方法であって、本明細書に記載されている医薬組成物またはキットを、それを必要とする対象に提供することを含み、例えば、脂質および核酸は、非侵襲性経路（例えば、局所投与）によりおよび／または注射により、例えば、消化管、呼吸器、および／または注射により、例えば、経口投与、吸入、および／または注射により投与される、方法を提供する。驚くべきことに、非侵襲性の投与経路（例えば、経口投与、胃管栄養、および吸入などを含む、消化管、呼吸器による）は、核酸の進入および有効性を著しく促進することができる。
【００９３】
第７の態様では、本出願は、医薬組成物またはキットを製造するための方法、および上記態様に記載されている方法における医薬組成物および／またはキットの使用を提供する。また、上記に記載されている種々の方法に使用される脂質、医薬組成物、および／またはキットも提供される。
【００９４】
本出願の種々の実施形態では、核酸は、小分子ＲＮＡであってもよく、例えば、小分子ＲＮＡは、１４〜３２ｂｐ、１６〜２８ｂｐ、１８〜２４ｂｐの長さ、特に、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２ｂｐの長さを有していてもよい。加えて、小分子ＲＮＡは、例えば、ステム−ループ構造を有する一本鎖であってもよく、または二本鎖であってもよい。例えば、核酸は、以下の配列：ｕｇａｇｇｕａｇｕａ  ｇｇｕｕｇｕｇｕｇｇ  ｕｕｇｕａａｇｃを有するＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７であってもよい。
【００９５】
一実施形態では、本出願の医薬組成物またはキットまたは化合物は、がん、例えば胃がんおよび肺がんなどの疾患を処置するために使用することができる。
【００９６】
一実施形態では、本出願の医薬組成物またはキットまたは化合物は、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞（胃がん細胞）、ＭＲＣ−５細胞（肺線維芽細胞）、およびＡ５４９細胞（肺がん細胞）の増殖を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで処置、例えば、阻害するために使用することができる。
【００９７】
本出願の種々の実施形態では、脂質核酸混合物は、様々な方法、例えば、逆相蒸散法または煮沸法により得ることができる。逆相蒸散法では、核酸の水溶液を、脂質の有機溶媒溶液に添加し、超音波処理し、蒸発させて有機溶媒を除去し、その後水和して、脂質核酸混合物を得る。本出願に記載されている煮沸法は、脂質の有機溶媒溶液を核酸の水溶液に添加し、約１００℃で３０分間煮沸して、脂質核酸混合物を得ることを指す。逆相蒸散法および煮沸法は、制御された温度および混合条件下で実施される。好適な処理時間および温度は、当業者であれば容易に決定することができる。例えば、逆相蒸散法の温度は、好ましくは約２５℃から約７０℃まで、より好ましくは約３０℃から約６５℃まで、より好ましくは約４０℃から約６０℃までの範囲であってもよく、特に好ましくは約５５℃であってもよい。煮沸法（加熱法とも呼ばれる）の温度は、好ましくは約２５℃から約１００℃まで、より好ましくは約５０℃から約１００℃まで、より好ましくは約９５℃から約１００℃までの範囲であってもよく、特に好ましくは約１００℃であってもよい。
【実施例】
【００９８】
以下の実施例は、本明細書で開示された発明の例示に過ぎず、添付の特許請求の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【００９９】
【表２】
2020515616.tif 000024
【０１００】
表１に番号１〜３２として示されている脂質の実施例
１．伝統的漢方薬からの脂質の抽出
１．１  伝統的漢方薬の煎出
１）１００ｇの漢方薬煎出片（Ｎｉｎｇｂｏ  Ｈａｉｓｈｕ  Ｑｉａｎｃａｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入したロディオラ・クレヌラータ；Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｔｏｎｇｒｅｎｔａｎｇ  ｐｈａｒｍａｃｙから購入したモウコタンポポ、スイカズラ、アンドログラフィス・パニクラータ）を１０００ｍＬのｄｄＨ２Ｏに添加し、３０分間浸漬した。
【０１０１】
２）漢方薬煎出ポットを、激しく加熱して１５分間、およびゆっくりと加熱して２０分間煮沸した。
【０１０２】
３）４００ｍＬの加熱した漢方薬スープを、６０℃、６０ｒｐｍでロータリーエバポレータに添加し、１００ｍＬに濃縮した。
【０１０３】
１．２  脂質抽出
１）６００ｍｌのクロロホルム−メタノール混合物（クロロホルム：メタノール＝１：２、ｖ／ｖ）を、上記ステップ１．１から得られた漢方薬スープ（ロータリーエバポレータにより濃縮された）に添加して、クロロホルム：メタノール：水＝１：２：０．８にし、１０〜１５分間撹拌して混合した。
【０１０４】
２）２００ｍＬのクロロホルムを、エルレンマイヤーフラスコに添加し、１０分間撹拌して混合した。
【０１０５】
３）２００ｍＬのｄｄＨ２Ｏを、エルレンマイヤーフラスコに添加して、クロロホルム：メタノール：水＝２：２：１：８にし、１０分間撹拌して混合した。
【０１０６】
４）上部層の液体および中間層の不溶性物質を除去し、下部クロロホルム層を得た。−４０℃で保管した。
【０１０７】
１．３  脂質成分のＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ同定
機器設定
１）クロマトグラフィー設定：
機器：Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００；カラム：Ｋｉｎｅｔｅｘ  Ｃ１８（１００×２．１ｍｍ、１．９μｍ）；カラム温度：４５℃；移動相Ａ：アセトニトリル：水（Ｖ／Ｖ、６０：４０）、１０ｍｍｏｌ／Ｌギ酸アンモニウムを含む溶液、移動相Ｂ：アセトニトリル：イソプロパノール（１０：９０、Ｖ／Ｖ）、１０ｍｍｏｌ／Ｌギ酸アンモニウムおよび０．１％ギ酸を含む溶液。流速：０．４ｍＬ／分；インジェクション容積：４μｌ。
【０１０８】
２）質量分析パラメーター：
ａ）ポジティブモード：ヒーター温度３００℃、シースガス流速、４５ａｒｂ、補助ガス流速、１５ａｒｂ、スイープガス流速、１ａｒｂ、スプレー電圧、３．０ｋＶ、キャピラリー温度、３５０℃、Ｓ−レンズＲＦレベル、３０％。スキャン範囲：２００〜１５００。
【０１０９】
ｂ）ネガティブモード：ヒーター温度３００℃、シースガス流速、４５ａｒｂ、補助ガス流速、１５ａｒｂ、スイープガス流速、１ａｒｂ、スプレー電圧、２．５ｋＶ、キャピラリー温度、３５０℃、Ｓ−レンズＲＦレベル、６０％。スキャン範囲：２００〜１５００。
【０１１０】
１．４  漢方薬に由来する脂質の同定
脂質成分をＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより同定した。伝統的漢方薬に由来する合計１３８個の脂質成分を同定した。そのうち１２５個はポジティブモードで、１３個はネガティブモードで同定した。表１に示されている化合物番号１〜３２に対して、以下の実験を実施した。
【０１１１】
なお、下記で試験した脂質はすべて、表１−１に記載されているように、商業的に購入されたかまたは商業的に合成され、使用されたことが留意されるべきである。
【０１１２】
２．脂質核酸混合物の製造
２．１  逆相蒸散法：
６００μｌの脂質のジエチルエーテル溶液を調製し、表１に示されている脂質番号に従ってグループ化した。ジエチルエーテル溶液は、脂質群番号１／２／４／９／１４／１８／１９／２０／２１／２２／２３／２４／２５／２６／２７／２８／２９／３０／３２の場合は０．０１７８５７ｍｇ／ｍＬ、脂質群番号３／８／１０／１１／１２／１３の場合は０．０３５７１４ｍｇ／ｍＬ、脂質群番号６／１５／１６／１７／３１の場合は０．００３５７１４ｍｇ／ｍＬの濃度を有していた。脂質溶液を、１２０μｌのＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖ＲＮＡのＤＥＰＣ処置水溶液（１５ｎｍｏｌ）に、５：１の容積比で添加し、３分間超音波処理した。ジエチルエーテルを、５５℃での蒸発により除去し、６００μｌのＤＥＰＣ水を水和のために添加して、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７脂質混合物を得た。
【０１１３】
２．２  煮沸法：
６０μｌの脂質のクロロホルム溶液を調製し、表１に示されている脂質番号に従ってグループ化した。クロロホルム溶液は、脂質群番号１／２／４／９／１４／１８／１９／２０／２１／２２／２３／２４／２５／２６／２７／２８／２９／３０／３２の場合は５ｍｇ／ｍＬ、脂質群番号３／８／１０／１１／１２／１３の場合は１０ｍｇ／ｍＬ、脂質群番号６／１５／１６／１７／３２の場合は１ｍｇ／ｍＬの濃度を有していた。上記脂質クロロホルム溶液を、６００μｌのＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖ＲＮＡのＤＥＰＣ処置水溶液（１５ｎｍｏｌ）と混合し、１００℃で３０分間加熱して、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７脂質混合物を得た。
【０１１４】
３．脂質核酸混合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ送達実験
３．１  ＮＣＩ−Ｎ８７細胞（胃がん細胞）、ＭＲＣ−５細胞（肺線維芽細胞）、Ａ５４９細胞（肺がん細胞）を対数増殖期まで培養し、その後、１×１０６／２ｍＬ培地／ウェルの細胞密度で６−ウェルプレートにプレーティングした。ＭＲＣ−５細胞を、イーグルＭＥＭ培地（ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）で培養した。Ａ５４９細胞を、ハムＦ−１２培地（ＨｙＣｌｏｎｅ）で培養した。ＮＣＩ−Ｎ８７細胞をＲＰＭＩ−１６４０培地（ＨｙＣｌｏｎｅ）で培養した。その後、３７℃で一晩インキュベーションし、細胞が壁面に付着した後、追跡実験を実施した。
【０１１５】
３．２  実験群は以下の通り。
１）  ＮＣ群：未処置細胞を指す。この群は、負の対照群としての役目を果たした。
【０１１６】
２）ＲＮＡｉｍａｘ処置群：２μｌ  ＲＮＡｉｍａｘトランスフェクション試薬およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は、２００ｎＭであった。この群は、陽性対照群としての役目を果たした。
【０１１７】
３）自由取込み群：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は２００ｎＭであった）。この群は陰性対照群としての役目を果たした。
【０１１８】
４）脂質核酸混合物：ステップ２で調製した脂質およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度を、２００ｎＭに維持した。
【０１１９】
３．３  小分子ＲＮＡと共に３時間共インキュベーションした後、細胞を、ＰＢＳで２〜３回洗浄した。細胞を、ＴＲＩｚｏｌ溶解緩衝液を用いて回収し、全ＲＮＡを抽出した。細胞に進入した小分子ＲＮＡの存在量を、ＲＴ−ｑＰＣＲにより検出し、ＲＮＡの局在化を、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより検出した。各検出方法のプロトコールは以下の通りであった。
【０１２０】
３．３．１  小分子ＲＮＡのＲＴ−ｑＰＣＲ検出（Ｔａｑｍａｎプローブ法）
１）ｓＲＮＡをｃＤＮＡへと逆転写した。逆転写キット（ＴａｑＭａｎ（登録商標）マイクロＲＮＡ逆転写キット、カタログ番号４３６６５９７）を使用して、ｓＲＮＡをｃＤＮＡへと逆転写した。逆転写系は以下の通りであった：１００ｍＭ  ｄＮＴＰ（ｄＴＴＰを有する）０．１５μｌ、ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ（商標）逆転写酵素５０Ｕ／μｌ  １．００μｌ、１０×ＲＴ緩衝液１．５μｌ、ＲＮａｓｅ阻害剤（２０Ｕ／μｌ）０．１９μｌ、無ヌクレアーゼＨ２Ｏ  ４．６μｌ、５μｌのＲＮＡ鋳型（２００ｎｇ／μｌ）を混合した後で、添加した。３μｌの５×Ｔａｑｍａｎプローブプライマーを混合し、混合した後で短時間遠心分離した後で添加し、その後氷上で５分間維持してから、ＰＣＲ反応器にロードした。反応条件は以下の通りであった：（１）１６℃、３０分間；（２）４２℃、３０分間；（３）８５℃、５分間；（４）４℃、反応停止。反応後に１０μｌの無ＲＮａｓｅ  ｄｄＨ２Ｏを添加して、最終容積を２５μｌにした。逆転写プロセスで使用したＴａｑｍａｎプローブプライマーは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより合成された（Ｕ６：４４４０８８７、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７：４３９８９８７）。
【０１２１】
２）定量ＰＣＲ増幅反応：ｑＰＣＲ反応系は、ＵＮＧを含む５μｌの２×ＴａｑＭａｎ（登録商標）ユニバーサルマスターミックスＩＩ、０．５μｌの２０×Ｔａｑｍａｎプライマー、逆転写による１μｌのｃＤＮＡ、３．５μｌの無ＲＮａｓｅ  ｄＨ２Ｏを含む、１０μｌの総容積を有していた。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０蛍光定量ＰＣＲ機器を使用した。ＰＣＲ反応条件は、以下の通りであった：５０℃で２分間、プレ変性のために９５℃で１０分間、その後ＰＣＲ増幅サイクル：（１）９５℃、１５秒間；（２）６０℃、６０秒間；（３）６０℃、６０秒間；合計４０サイクル；最後に４０℃で１０秒間の冷却。増幅反応用のＴａｑｍａｎプローブは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより設計および合成された（Ｕ６：４４４０８８７、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７：４３９８９８７）。
【０１２２】
３）相対的発現レベルを、２−ΔＣｔ法により算出した。
３．３．２  小分子ＲＮＡのＲＴ−ｑＰＣＲ検出（ＳＹＢＲグリーン色素法）
１）ｓＲＮＡをｃＤＮＡへと逆転写した。逆転写キット（高容量ｃＤＮＡ逆転写キット、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３６８８１３）を使用して、ステム−ループ法によりｓＲＮＡをｃＤＮＡへと逆転した。逆転写系は、以下の通りであった：ＲＮＡ鋳型（１５０ｎｇ／μｌ）１０μｌ、１０×ＲＴ緩衝液、２．０μｌ、２５×ｄＮＴＰミックス（１００ｍＭ）０．８μｌ、Ｕ６  ＲＴステム−ループプライマー２．０μｌ、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ＲＴ−ｍ７ステム−ループプライマー２．０μｌ、ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ（商標）逆転写酵素１．０μｌ、ＲＮａｓｅ阻害剤１．０μｌ、無ヌクレアーゼＨ２Ｏ  １．２μｌを、短時間遠心分離した後ＰＣＲ反応器にロードした。反応条件は、以下の通りであった：（１）２５℃、１０分間；（２）３７℃、１２０分間；（３）８５℃、５分間；（４）４℃、反応停止。反応後に２０μｌの無ＲＮａｓｅ  ｄｄＨ２Ｏを添加して、最終容積を４０μｌにした。逆転写プロセスに使用したステム−ループプライマーは、Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｔｓｉｎｇｋｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．により合成された（Ｕ６  ＲＴプライマー：ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＡＡＡＡＡＴＡＴＧ；ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７  ＲＴステム−ループプライマー：ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＣＧＣＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＧＣＴＴＡＣＡＡ）。
【０１２３】
２）定量ＰＣＲ増幅反応：ｑＰＣＲ反応系は、５μＬの２×ＳＹＢＲグリーンマスターミックス、０．５μｌのフォワードプライマー（１０μＭ）、０．５μｌのリバースプライマー（１０μＭ）、逆転写による１μｌのｃＤＮＡ、３μｌの無ＲＮａｓｅ  ｄＨ２Ｏを含む、１０μｌの総容積を有する。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０蛍光定量ＰＣＲ機器を使用した。ＰＣＲ反応条件は、以下の通りであった：プレ変性のために９５℃で５分間、その後ＰＣＲ増幅サイクル：（１）９５℃、１０秒間；（２）５５℃、１０秒間；（３）７２℃、２０秒間；合計４０サイクル；最後に４０℃で１０秒間の冷却。増幅反応のフォワードおよびリバースプライマーは両方とも、Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｔｓｉｎｇｋｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．により設計および合成された（Ｕ６  Ｆプライマー：ＧＣＧＣＧＴＣＧＴＧＡＡＧＣＧＴＴＣ、Ｕ６  Ｒプライマー：ＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴ、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７  Ｆプライマー：ＴＣＧＣＧＣＴＧＡＧＧＴＡＧＴＡＧＧＴＴ、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７  Ｒプライマー：ＧＴＧＣＡＣＧＣＴＣＣＧＡＧＧＴ）。
【０１２４】
３）相対的発現レベルを、２−ΔＣｔ法により算出した。
３．３．３  小分子ＲＮＡの蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
１）培地を除去し、ＰＢＳ（５００μｌ／ウェル）で３回洗浄した。
２）室温にて２０分間４％パラホルムアルデヒドで固定する（５００μｌ／ウェル、ＰＢＳ緩衝液で調製）。
３）１×ＰＢＳ（５００μｌ／ウェル）で洗浄し、新たな１×ＰＢＳ（５００μｌ／ウェル）に５分間浸漬する。
４）ＰＢＳを除去し、細胞を、１０分間室温にてＰＫ（プロテイナーゼＫ）緩衝液で透過処理した。
５）１×ＰＢＳ緩衝液（５００μｌ／ウェル）で洗浄し、室温にて１０分間４％パラホルムアルデヒドで固定する（５００μｌ／ウェル、ＰＢＳ緩衝液で調製）。
６）１×ＰＢＳで洗浄し、新たな１×ＰＢＳ（５００μｌ／ウェル）に５分間浸漬する。
７）細胞を、室温にて１０分間０．１ＭのＴＥＡで処理した。
８）１×ＰＢＳ（５００μｌ／ウェル）で洗浄し、新たな１×ＰＢＳ（５００μｌ／ウェル）に５分間浸漬する。
９）培養プレートを、ハイブリダイゼーション緩衝液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｔ、２５０μｇ／ｍＬ酵母ＲＮＡ、５００μｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡ）中のハイブリダイゼーションカセットに設置し、室温で１時間プレインキュベートした。
１０）ＲＮＡプローブ（ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７プローブ：５’−ＧＣＴＴＡＣＡＡＣＣＡＣＡＣＡＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡ−３’、スクランブルプローブ：５’−ＣＡＧＴＡＣＴＴＴＴＧＴＧＴＡＧＴＡＣＡＡ−３’、Ｕ６プローブ：５’−ＴＴＴＧＣＧＴＧＴＣＡＴＣＣＴＴＧＣＧ−３’）をハイブリダイゼーション緩衝液に添加し（ＲＮＡプローブの濃度は、０．１〜０．２ｎｇ／μｌであった）、８５℃で５分間変性させ、素早く氷上に置く。
１１）ステップ９のプレハイブリダイゼーション緩衝液を除去し、それをステップ１０のＲＮＡプローブを含むハイブリダイゼーション緩衝液に取り替え、その後プレートをハイブリダイゼーションカセットに設置し、６５℃で一晩（１２〜１６時間）インキュベートする。
１２）０．２×ＳＳＣ溶液を６５℃に予加熱し、各回２０分間０．２×ＳＳＣ（１ｍＬ／ウェル）で３回洗浄する。
１３）室温の０．２×ＳＳＣ溶液（１ｍＬ／ウェル）を添加し、５分間静置する。
１４）０．２×ＳＳＣを吸引し、緩衝液Ｂ１（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４〜７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）を添加し、室温で各回５分間２回洗浄する。
１５）ＰＢＳで３回、各回５分間洗浄する。
１６）共焦点顕微鏡で観察する。
【０１２５】
３．４  細胞内への核酸の吸収および進入に対する伝統的漢方薬抽出物の効果
１）表１に示されている３０個の脂質を実験のために選択した。実験群は、表１に示されている脂質番号に従って付番した。脂質核酸混合物を、ステップ２に記載されている逆相蒸散法および煮沸法に従って調製した。ステップ３．１〜３．３による脂質核酸混合物を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏ送達実験を実施し、細胞内ＲＮＡの存在量を決定した。
【０１２６】
実験結果を図１〜４に示した。図１〜２は、逆相蒸散法により調製した脂質核酸混合物が、ＮＣＩ−Ｎ８７およびＭＲＣ−５細胞に核酸を送達することに成功することができたことを示した。図３〜４は、煮沸法により調製した脂質核酸混合物が、ＭＲＣ−５およびＡ５４９細胞に核酸を送達することに成功することができたことを示した。
【０１２７】
２）さらに、表１の種々の脂質を組み合わせた。２００μｌの脂質組合せのジエチルエーテル溶液（番号１／２／４／９／１８／１９／２０／２１／２２／２３／２４／２５／２６／２７／２８／２９の脂質組合せの場合は０．００３２６ｍｇ／ｍＬ、番号３／８／１０／１３の脂質組合せの場合は０．００６５２ｍｇ／ｍＬ、番号５／１６／１７の脂質組合せの場合は０．０００６５２ｍｇ／ｍＬの濃度を有する）および３μｌの脂質組合せのクロロホルム溶液（番号１／２／４／９／１８／１９／２０／２１／２２／２３／２４／２５／２６／２７／２８／２９の脂質組合せの場合は５ｍｇ／ｍＬ、番号３／８／１０／１３の脂質組合せの場合は１０ｍｇ／ｍＬ、番号１５／１６／１７の脂質組合せの場合は１ｍｇ／ｍＬの濃度を有する）を調製した。上記脂質を等容積で混合して、混合脂質を得、下記に記載されているように、それぞれ逆相蒸散法および煮沸法により脂質核酸混合物を調製した。ステップ３．１〜３．３による脂質核酸混合物を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏ送達実験を実施し、細胞内ＲＮＡの存在量を決定した。
【０１２８】
逆相蒸散法による脂質組合せおよび核酸の混合物の調製：
２００μｌの脂質組合せのジエチルエーテル溶液を、脂質溶液とＲＮＡとの間の５：１の容積比で、４０μｌのＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７水溶液（５μＭ）に添加し、３分間超音波処理した。ジエチルエーテルを、５５℃での蒸発により除去し、その後水和のために２００μｌのＤＥＰＣ水を添加して、脂質核酸混合物を得た。
【０１２９】
煮沸法による脂質組合せおよび核酸の混合物の製造：
３μｌの脂質組合せのクロロホルム溶液を、１００μｌのＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７水溶液（２μｌ）と混合し、１００℃で３０分間加熱した。
【０１３０】
実験結果を図５〜８に示した。図５〜６は、逆相蒸散法により調製した脂質組合せおよび核酸の混合物が、標的細胞内への核酸の進入を容易にすることに成功することができたことを示した。図７〜８は、煮沸法による脂質組合せおよび核酸の混合物が、標的細胞内への核酸の進入を容易にすることに成功することができたことを示した。
【０１３１】
３）表１に示されている様々なタイプの脂質、例えば、ＴＧ混合物およびＤＧ混合物などを組み合わせ、それぞれ逆相蒸散法および煮沸法により脂質核酸混合物の調製に使用した。ステップ３．１〜３．３による脂質核酸混合物を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏ送達実験を実施し、細胞内ＲＮＡの存在量、細胞内局在化、および標的領域を決定した。
【０１３２】
様々なタイプの脂質を、以下のように組み合わせた。
組合せ１：脂質番号１〜３２、番号１／２／３／４／６／８／９／１０／１３〜３２の組合せ、但し、脂質番号５、７、１１、および１２は含まない、
組合せ２：脂質番号２９を含まない組合せ１、
組合せ３：脂質番号１、２、３、１９を含まない組合せ１、
組合せ４：脂質番号４、１４を含まない組合せ１、
組合せ５：脂質番号６、９、１０、１３、１５、１６、１８、２０〜２８、３２を含まない組合せ１、
組合せ６：脂質番号８を含まない組合せ１、
組合せ７：脂質番号１７、３０、３１を含まない組合せ１、
ＦＡ：脂質番号２９、
ＤＧ組合せ：脂質番号１、２、３、１９の組合せ、
Ｃｅｒ組合せ：脂質番号４、１４の組合せ、
ＴＧ組合せ：脂質番号６、９、１０、１３、１５、１６、１８、２０〜２８、３２の組合せ、
ＰＥ組合せ：脂質番号８、
Ｓｏ組合せ：脂質番号１７、３０、３１の組合せ。
【０１３３】
実験結果を図９〜１０に示した。結果は、異なる方法（煮沸または逆相蒸散）による様々なタイプの脂質組合せ（例えば、ＴＧの混合物、ＤＧの混合物など）が、標的細胞内への核酸の進入を促進することができたことを示した。
【０１３４】
４）さらに、脂質番号１１および番号１２を、異なる配列を有する核酸を送達する核酸の効率、ならびに核酸の局在化および標的遺伝子領域を調査するための実験のために選択した。プロトコールは以下の通りであった。
【０１３５】
大豆ＰＣ、脂質番号１１（１８：０／１８：２）および脂質番号１２（１６：０／１８：２）ならびに種々の小分子ＲＮＡ（下記の表３を参照）の混合物を、逆相蒸散法により調製し、その後、Ａ５４９細胞株に添加した（ｓＲＮＡの終濃度は、２００ｎＭであった）。陰性対照群（対照）を、同じ濃度のｓＲＮＡに直接添加した。陽性対照群（ＲＮＡｉｍａｘ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉｍａｘ（トランスフェクション試薬６μｌ／ウェル）でトランスフェクトした。細胞内のｓＲＮＡの存在量を、３時間後にＴａｑｍａｎプローブにより検出し、ｓＲＮＡの相対的発現レベルを、２−ΔＣｔ法により算出した。
【０１３６】
実験結果を図１１〜１３に示した。図１１Ａ〜Ｃは、対照と比較して、２つの脂質（脂質番号１１（１８：０／１８：２）および脂質番号１２（１６：０／１８：２））が、異なる配列を有する核酸分子の種々の細胞内への進入を効果的に促進することができたことを示した。図１２は、脂質番号１１（１８：０／１８：２）および脂質番号１２（１６：０／１８：２）により送達された核酸が、細胞質内に進入し、主に細胞質に局在化されたことを示した。加えて、図１３を参照すると、本発明者は、意外にも、脂質番号１１および番号１２が両方とも、核酸の小断片の進入を促進し、それらの標的遺伝子の野生型３’ＵＴＲｓにそれらが作用し、標的遺伝子の野生型３’ＵＴＲを有するルシフェラーゼの相対的発現レベルを低減させたが、それらの標的遺伝子の変異３’ＵＴＲには作用しなかったことを見出した。それは、核酸薬を送達するための手段として使用することができる。
【０１３７】
４．脂質核酸混合物のｉｎ  ｖｉｖｏ送達実験
４．１  実験ステップ
１．脂質核酸混合物の調製：脂質番号１１または番号１２と核酸との混合物、ならびに番号１／２／４／９／１４／１８／１９／２０／２１／２２／２３／２４／２５／２６／２７／２８／２９／３０／３２、番号３／８／１０／１１／１２／１３、および番号６／１５／１６／１７／３１の脂質組合せと核酸との混合物を、逆相蒸散法および煮沸法により調製した（ステップ２．１〜２．２を参照）。
【０１３８】
２．胃管栄養を、６〜８週齢の雄Ｃ５７マウスに対して２００μｌ／動物で実施し、以下のようにグループ化した。
（１）対照群（自由取込み群）：無処置、または胃管栄養によりＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７を投与した。
（２）脂質番号１１（１８：０／１８：２）群：胃管栄養により、脂質番号１１（１８：０／１８：２）か、脂質番号１１（１８：０／１８：２）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の混合物を投与した。
（３）脂質番号１２（１６：０／１８：２）群：胃管栄養により、脂質番号１２（１６：０／１８：２）か、脂質番号１２（１６：０／１８：２）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の混合物を投与した。
【０１３９】
３．試料収集：胃管栄養の６時間後、マウス全血（５００μｌ）および肺（１１０ｍｇ）を、それぞれ１．５ｍＬのＴＲＩｚｏｌ−ＬＳまたは３ｍＬのＴＲＩｚｏｌにより収集し、ホモジナイズし、その後保管のために−８０℃下で凍結した。
【０１４０】
４．全ＲＮＡ抽出：（１）ＴＲＩｚｏｌまたはＴＲＩｚｏｌ−ＬＳ溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を細胞に添加し、その後、室温で５分間静置して完全に溶解させた（マウス肺組織の場合、１．０ｍＬのＴＲＩｚｏｌ溶解緩衝液を１００ｍｇの組織に添加し、溶液をホモジナイザーで粉砕し、４℃で１０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離して、ホモジナイズされなかった組織沈殿物を除去した。マウス全血の場合、１．５ｍＬのＴＲＩｚｏｌ−ＬＳ溶解緩衝液を５００μｌの全血に添加し、４℃で１０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離して、完全に開裂されていない沈殿物を除去した）。（２）４℃で５分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離し、沈殿物を廃棄する。（３）クロロホルムを２００μｌ／ｍＬ  ＴＲＩｚｏｌの比率で添加し、ボルテックスして混合し、室温で１５分間静置させる。（４）４℃で１５分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離し、上部水相を別の遠心分離チューブにピペットする。（５）ステップ４を反復し、等量のクロロホルムを上部水相に添加し、十分に混合し、室温で１０分間維持させ、４℃で１５分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離する。（６）上部水相を吸い出して、新たなＥＰチューブに移し、イソプロパノールを０．５ｍｌ／ｍＬのＴＲＩｚｏｌの比率で添加し、混合し、室温で５〜１０分間維持させる。（７）４℃で１０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離し、沈殿物を廃棄する。（８）１ｍＬの７５％エタノールを添加し、遠心分離チューブを穏やかに振盪し、沈殿物を懸濁させる。（９）４℃にて５分間８０００ｇで遠心分離し、沈殿物をできるだけ廃棄する。（１０）室温で５〜１０分間乾燥し、ＲＮＡ試料を、５０μｌのＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏに溶解する。
【０１４１】
５．ＲＴ−ｑＰＣＲ検出：上記セクション３．３．１および３．３．２に記載されている方法を参照されたい。
【０１４２】
４．２  実験結果
図１４を参照すると、本発明者は、意外にも、脂質番号１１（１８：０／１８：２）および脂質番号１２（１６：０／１８：２）が、（非侵襲性）胃管栄養により、血液および肺内への核酸の小断片の進入を促進することができたことを発見した。それらは、核酸薬を送達するための手段として使用することができる。驚くべきことに、直接煮沸法により得られた脂質核酸混合物は、著しい送達効果を達成した。
【０１４３】
図１５を参照すると、本発明者は、驚くべきことに、２８個の脂質の混合物が、（非侵襲性）胃管栄養により、血液中への核酸の小断片の進入を容易にすることができたことを見出した。それらは、核酸薬を送達するための手段として使用することができる。驚くべきことに、直接煮沸法により得られた脂質組合せと核酸との混合物は、著しい送達効果を達成した。
【０１４４】
表１に番号１〜７１として示されている脂質の実施例
方法
１．伝統的漢方薬からの脂質の抽出
１．１  漢方薬の煎出
１）１００ｇの漢方薬煎出片（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｔｏｎｇｒｅｎｔａｎｇ  ｐｈａｒｍａｃｙから購入したロディオラ・クレヌラータ、モウコタンポポ、スイカズラ、およびアンドログラフィス・パニクラータ）を１０００ｍＬのｄｄＨ２Ｏに添加し、３０分間浸漬した。
【０１４５】
２）漢方薬煎出ポットを、激しく加熱して１５分間、およびゆっくりと加熱して２０分間煮沸した。
【０１４６】
３）４００ｍＬの加熱した漢方薬スープを、ロータリーエバポレータに添加し、６０℃、６０ｒｐｍで３０分間にわたって１００ｍＬに濃縮した。
【０１４７】
１．２  脂質抽出
１）１６０ｍｌの漢方薬スープ（ロータリーエバポレータにより濃縮した）に、クロロホルム−メタノール混合物（クロロホルム：メタノール＝１：２、ｖ／ｖ）６００ｍＬを添加して、クロロホルム：メタノール：水＝１：２：０．８にし、１０〜１５分間撹拌して混合した。
【０１４８】
２）２００ｍＬのクロロホルムを、エルレンマイヤーフラスコに添加し、１０分間撹拌して混合した。
【０１４９】
３）２００ｍＬのｄｄＨ２Ｏを、エルレンマイヤーフラスコに添加して、クロロホルム：メタノール：水＝２：２：１：８にし、１０分間撹拌して混合した。
【０１５０】
４）上部層の液体および中間層の不溶性物質を除去し、下部層のクロロホルム層を取り出し、−４０℃で保管した。
【０１５１】
１．３  脂質成分のＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ同定
機器設定
１）クロマトグラフィー設定：
機器：Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００；カラム：Ｋｉｎｅｔｅｘ  Ｃ１８（１００×２．１ｍｍ、１．９μｍ）；カラム温度：４５℃；移動相Ａ：アセトニトリル：水（Ｖ／Ｖ、６０：４０）、１０ｍｍｏｌ／Ｌギ酸アンモニウムを含む溶液、移動相Ｂ：アセトニトリル：イソプロパノール（１０：９０、Ｖ／Ｖ）、１０ｍｍｏｌ／Ｌギ酸アンモニウムおよび０．１％ギ酸を含む溶液。流速：０．４ｍＬ／分；インジェクション容積：４μｌ。
【０１５２】
２）質量分析パラメーター：
ａ）ポジティブモード：ヒーター温度３００℃、シースガス流速、４５ａｒｂ、補助ガス流速、１５ａｒｂ、スイープガス流速、１ａｒｂ、スプレー電圧、３．０ｋＶ、キャピラリー温度、３５０℃、Ｓ−レンズＲＦレベル、３０％。スキャン範囲：２００〜１５００。
【０１５３】
ｂ）ネガティブモード：ヒーター温度３００℃、シースガス流速、４５ａｒｂ、補助ガス流速、１５ａｒｂ、スイープガス流速、１ａｒｂ、スプレー電圧、２．５ｋＶ、キャピラリー温度、３５０℃、Ｓ−レンズＲＦレベル、６０％。スキャン範囲：２００〜１５００。
【０１５４】
１．４  漢方薬に由来する脂質の同定
脂質成分をＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより同定した。伝統的漢方薬に由来する合計１３８個の脂質成分を同定した。そのうち１２５個はポジティブモードで、１３個はネガティブモードで同定した。表１に示されている化合物１〜６９に対して、以下の実験を実施した。なお、下記で試験した脂質はすべて、表１−１に記載されているように、商業的に購入されたかまたは商業的に合成され、使用されたことが留意されるべきである。
【０１５５】
２．脂質核酸混合物の製造
２．１  逆相蒸散法：
１００μｌの脂質のジエチルエーテル溶液を調製し、表１に示されている脂質番号に従ってグループ化した（脂質濃度は、下記の表に示されている）。脂質溶液に、２０μｌの核酸溶液（ＨＪＴ  ｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ）を５：１の容積比で添加し、３分後に超音波処理した。ジエチルエーテルを、５５℃での蒸発により除去し、その後、水和のために１００μｌのＤＥＰＣ水を添加し、核酸脂質混合物を得た。
【０１５６】
【表３】
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【０１５７】
２．２  煮沸法：
１００μＬの核酸溶液（ＨＪＴ  ｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ）を、２〜５μＬの脂質溶液に添加し（濃度は表１に示されている）、混合し、８０〜１００℃で１５〜３０分間加熱して、核酸脂質混合物を得た。
【０１５８】
３．脂質核酸混合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ送達実験
３．１  脂質により送達された核酸の細胞内発現のリアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）検出。
３．１．１  ＭＲＣ−５細胞（肺胚線維芽細胞）、Ａ５４９細胞（ヒト肺腺癌細胞）、Ｃａｃｏ−２細胞（ヒト結腸腺癌細胞）（Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した）を対数増殖期まで培養し、その後、６×１０５／１ｍＬ培地／ウェルの細胞密度で１２−ウェルプレートにプレーティングした。ＭＲＣ−５およびＣａｃｏ−２細胞を、イーグルＭＥＭ培地（ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）で培養し、Ａ５４９細胞をハムＦ−１２培地（ＨｙＣｌｏｎｅ）で培養し、その後３７℃で一晩インキュベーションし、細胞が壁面に付着した後で追跡実験を実施した。
【０１５９】
３．１．２  実験群は以下の通り。
１）ナイーブ群：これは、未処理細胞を指し、この群は、ブランク対照群としての役目を果たした。
【０１６０】
２）ＲＮＡｉｍａｘ処理群：２μｌ  Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉｍａｘトランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸの正式名称、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した）でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。この群は、陽性対照群としての役目を果たした。
【０１６１】
３）自由取込み群：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１００ｎＭであった）。この群は陰性対照群としての役目を果たした。
【０１６２】
４）脂質核酸混合物：ステップ２で調製した脂質およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。
【０１６３】
３．１．３  細胞と共に１２〜２４時間共インキュベーションした後、細胞を、ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を、ＴＲＩｚｏｌ溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した）を用いて回収し、全ＲＮＡを抽出した。細胞に進入したＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の存在量を、ＲＴ−ｑＰＣＲにより検出した。プロトコールは以下の通りであった。
【０１６４】
１）全細胞ＲＮＡの抽出：
Ａ．  １２−ウェルプレートで培養された細胞（約１×１０６細胞／ウェル）に対して、１ｍＬ  ＴＲＩｚｏｌ溶解緩衝液を各ウェルに添加し、その後氷上に置いた。試料すべてにＴＲＩｚｏｌを添加した後、室温で５分間静置させて、完全に溶解させた。
Ｂ．  ４℃で５分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離し、ペレットを廃棄し、新たな遠心分離チューブにＴＲＩｚｏｌを移す。
Ｃ．  ２００μＬクロロホルム／ｍＬ  ＴＲＩｚｏｌの比率でクロロホルムを添加し、混合し、室温で５分間静置させる。
Ｄ．  ４℃で１５分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離する。
Ｅ．  上部水相を別の遠心分離チューブにピペットし、０．５ｍＬイソプロパノール／ｍＬ  ＴＲＩｚｏｌの比率でイソプロパノールを添加し、室温で５〜１０分間静置させる。
Ｆ．  ４℃で１５分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を廃棄し、ＲＮＡがチューブの底部に沈殿することを可能にする。
Ｇ．  １ｍＬの７５％エタノールを添加し、チューブを穏やかに振盪して、沈殿物を懸濁させる。
Ｈ．  ４℃で１０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を廃棄し、１ｍＬの７５％エタノールを添加し、遠心分離チューブを穏やかに振盪して、沈殿物を懸濁させる。
Ｉ．  ４℃で１０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を廃棄し、室温で乾燥し、ＲＮＡ試料を５０μＬの無ＲＮａｓｅ  Ｈ２Ｏに溶解し、ＯＤ値を測定することによりＲＮＡ濃度を定量化する。
【０１６５】
２）全ＲＮＡをｃＤＮＡへと逆転写した。逆転写キット（高容量ｃＤＮＡ逆転写キット、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３６８８１３）を使用して、ステム−ループ法によりｓＲＮＡをｃＤＮＡへと逆転写した（例えば、ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ  ＲＴ−ＰＣＲ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００５  Ｎｏｖ  ２７；３３（２０）：ｅ１７９によるマイクロＲＮＡのリアルタイム定量化を参照。この文献は、参照により本明細書に組み込まれる）。逆転写系は以下の通りであった：鋳型ＲＮＡ（１５０ｎｇ／μＬ）１０μＬ、１０×ＲＴ緩衝液２．０μＬ、２５×ｄＮＴＰミックス（１００ｍＭ）０．８μＬ、Ｕ６  ＲＴステム−ループプライマー２．０μＬ、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７  ＲＴステム−ループプライマー２．０μＬ、ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ（商標）逆転写酵素１．０μＬ、ＲＮａｓｅ阻害剤１．０μＬ、無ヌクレアーゼＨ２Ｏ  １．２μＬを、短時間遠心分離した後、ＰＣＲ反応器にロードした。反応条件は以下の通りであった：（１）２５℃、１０分間；（２）３７℃、１２０分間；（３）８５℃、５分間；（４）４℃、反応停止。反応後に２０μｌの無ＲＮａｓｅ  ｄｄＨ２Ｏを添加して、最終容積を４０μｌにした。逆転写プロセスに使用したステム−ループプライマーは、Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｔｓｉｎｇｋｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．により合成された（Ｕ６  ＲＴプライマー、ＲＴ−ｑＰＣＲ反応による小分子ＲＮＡの定量化は、相対的であるに過ぎない場合があるため、相対発現レベルを算出するための標準参照遺伝子としてＵ６を使用した）：ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＡＡＡＡＡＴＡＴＧ；ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７  ＲＴステム−ループプライマー：ＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＣＧＣＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＧＣＴＴＡＣＡＡ）。
【０１６６】
３）定量ＰＣＲ増幅反応：ｑＰＣＲ反応系は、５μＬの２×ＳＹＢＲグリーンマスターミックス、０．５μｌのフォワードプライマー（１０μＭ）、０．５μｌのリバースプライマー（１０μＭ）、逆転写による１μｌのｃＤＮＡ、３μｌの無ＲＮａｓｅ  ｄＨ２Ｏを含む、１０μｌの全容積を有していた。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０蛍光定量ＰＣＲ機器を使用した。ＰＣＲ反応条件は、以下の通りであった：プレ変性のために９５℃で５分間、その後ＰＣＲ増幅サイクル：（１）９５℃、１０秒間；（２）５５℃、１０秒間；（３）７２℃、２０秒間；合計４０サイクル；最後に４０℃で１０秒間の冷却。増幅反応のフォワードおよびリバースプライマーは両方とも、Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｔｓｉｎｇｋｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．により設計および合成された（Ｕ６フォワードプライマー：ＧＣＧＣＧＴＣＧＴＧＡＡＧＣＧＴＴＣ、Ｕ６リバースプライマー：ＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴ、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７フォワードプライマー：ＴＣＧＣＧＣＴＧＡＧＧＴＡＧＴＡＧＧＴＴ、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７リバースプライマー：ＧＴＧＣＡＣＧＣＴＣＣＧＡＧＧＴ）。
【０１６７】
４）２−ΔＣｔ法（相対的遺伝子発現レベル＝２−（Ｃｔ標的遺伝子−Ｃｔ内部基準遺伝子））を使用して、進入の相対量（一本鎖または二本鎖ＲＮＡ）を算出した。
【０１６８】
３．２  ｍＲＮＡ発現レベルのリアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）検出
３．２．１  ＴＨＰ−１細胞（ヒト単球）を対数増殖期まで培養し、その後、６×１０５／１ｍＬ培地の細胞密度で１２−ウェルプレートにプレーティングした。ＴＨＰ−１細胞を、ＲＰＭＩ−１６４０培地（ＨｙＣｌｏｎｅ）で培養した。細胞を３７℃で一晩インキュベートし、細胞が壁面に付着した後で追跡実験を実施した。
【０１６９】
３．２．２  実験群は以下の通りであった。
１）ナイーブ群：未処理ＴＨＰ−１細胞を指し、この群は、ブランク対照群としての役目を果たした。
【０１７０】
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉｍａｘトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および核酸溶液（ＴＮＦα  ｓｉＲＮＡ）を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。核酸の終濃度は、４００ｎＭであった。この群は、陽性対照群としての役目を果たした。
【０１７１】
３）自由取込み群：核酸溶液（ＴＮＦα  ｓｉＲＮＡ）を、直接添加した（終濃度は４００ｎＭであった）。この群は陰性対照群としての役目を果たした。
【０１７２】
４）脂質核酸混合物：ステップ２で調製した脂質および核酸の混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は、４００ｎＭであった。
【０１７３】
３．２．３  処理の２４時間後、細胞を、１μｇ／ｍＬ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＰＳ（リポポリサッカリド、ＬＰＳ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）０１１１：Ｂ４、Ｌ４３９１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で刺激し、９時間後にＴＲＩｚｏｌ溶解緩衝液を使用して回収して、全ＲＮＡを抽出した。ＴＮＦ−αのｍＲＮＡ発現レベル（ケースバイケースで異なる以下の実施例の標的遺伝子は図に示した）を、ＲＴ−ｑＰＣＲ（ＳＹＢＲグリーン色素法）により決定した。プロトコールは以下の通りであった。
【０１７４】
１）細胞からの全ＲＮＡの抽出：手順は、セクション３．１．３の全ＲＮＡの抽出法と同じであった。
【０１７５】
２）全ＲＮＡをｃＤＮＡへと逆転写した。逆転写キット（高容量ｃＤＮＡ逆転写キット、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３６８８１３）を使用して全ＲＮＡをｃＤＮＡへと逆転写した。逆転写系は以下の通りであった：鋳型ＲＮＡ（１５０ｎｇ／μＬ）１０μＬ、１０×ＲＴ緩衝液２．０μＬ、２５×ｄＮＴＰミックス（１００ｍＭ）０．８μＬ、ランダムプライマー２．０μＬ、ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ（商標）逆転写酵素１．０μＬ、ＲＮａｓｅ阻害剤１．０μＬ、無ヌクレアーゼＨ２Ｏ  ３．２μＬを、短時間遠心分離した後、ＰＣＲ反応器にロードした。反応条件は以下の通りであった：（１）２５℃、１０分間；（２）３７℃、１２０分間；（３）８５℃、５分間；（４）４℃、反応停止。反応後に２０μｌの無ＲＮａｓｅ  ｄｄＨ２Ｏを添加して、最終容積を４０μｌにした。
【０１７６】
３）定量ＰＣＲ増幅反応：ｑＰＣＲ反応系の全容積は、５μＬの２×ＳＹＢＲグリーンマスターミックス、０．５μｌのフォワードプライマー（１０μＭ）、０．５μｌのリバースプライマー（１０μＭ）、逆転写による１μｌのｃＤＮＡ、３μｌの無ＲＮａｓｅ  ｄＨ２Ｏを含む１０μｌであった。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０蛍光定量ＰＣＲ機器を使用した。ＰＣＲ反応条件は、以下の通りであった：プレ変性のために９５℃で５分間、その後ＰＣＲ増幅サイクル：（１）９５℃、１０秒間；（２）５５℃、１０秒間；（３）７２℃、２０秒間；合計４０サイクル；最後に４０℃で１０秒間の冷却。増幅反応のフォワードおよびリバースプライマーは両方とも、Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｑｉｎｇｋｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．により設計および合成された。プライマー配列は以下の通りであった：内部基準遺伝子ＵＢＣのフォワードプライマー：ＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＧＴＣＧＴＡＣＣＣＴＧ、内部基準遺伝子ＵＢＣのリバースプライマー：ＧＧＴＣＴＴＧＣＣＡＧＴＧＡＧＴＧＴＣＴ；標的遺伝子ＴＮＦ−αのフォワードプライマー：ＣＴＧＣＣＣＣＡＡＴＣＣＣＴＴＴＡＴＴ：標的遺伝子ＴＮＦ−αのリバースプライマー：ＣＣＣＡＡＴＴＣＴＣＴＴＴＴＴＧＡＧＣＣ。
【０１７７】
４）相対発現レベルを、上記に記載のように２−ΔＣｔ法により算出した。
【０１７８】
３．３  タンパク質発現レベルのウエスタンブロット検出
３．３．１  ＭＲＣ−５細胞（肺胚繊維芽細胞）およびＡ５４９細胞（ヒト肺腺癌細胞）を対数増殖期まで培養し、その後、６×１０５／１ｍＬ培地／ウェルの細胞密度で１２−ウェルプレートにプレーティングした。ＭＲＣ−５細胞を、イーグルＭＥＭ培地（ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）で培養し、Ａ５４９細胞を、ハムＦ−１２培地（ＨｙＣｌｏｎｅ）で培養した。その後、３７℃で一晩インキュベーションし、細胞が壁面に付着した後、追跡実験を実施した。
【０１７９】
３．３．２  実験群は以下の通りであった。
１）ナイーブ群：これは、未処理細胞を指し、この群は、ブランク対照群としての役目を果たした。
【０１８０】
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉｍａｘトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および核酸溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。核酸の終濃度は、４００ｎＭであった。この群は、陽性対照群としての役目を果たした。
【０１８１】
３）自由取込み群：核酸溶液を、直接添加した（終濃度は４００ｎＭであった）。この群は陰性対照群としての役目を果たした。
【０１８２】
４）脂質核酸混合物：ステップ２で調製した脂質および核酸の混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は、４００ｎＭであった。
【０１８３】
３．３．３  処理の２４時間後、細胞を、刺激剤（二本鎖ＲＮＡウィルス模倣体としての１μｇ／ｍＬポリ（Ｉ：Ｃ）（Ｐ１５３０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）または３ｎｇ／ｍＬ形質転換増殖因子ＴＧＦβ１（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ））で刺激した。細胞を、強力なＲＩＰＡ溶解緩衝液を使用して回収し、しばらくの間インキュベーションした後、ウエスタンブロットを使用して、関連遺伝子のタンパク質発現レベルを検出した（関連遺伝子のタイプは、ケースバイケースで異なり、対応する図に示した）（ＲＥＬ−Ａのタンパク質発現レベルを、Ａ５４９細胞を内部標準タンパク質としてのβ−アクチンと共にポリ（Ｉ：Ｃ）により刺激した２４時間後に検出し、フィブロネクチンおよびα−ＳＭＡのタンパク質発現レベルを、ＭＲＣ−５細胞を内部標準タンパク質としてのＧＡＰＤＨと共にＴＧＦ−β１で刺激した７２時間後に検出し、対応するノックダウン遺伝子のタンパク質発現を、内部標準タンパク質としてのβ−アクチンを用いたｓｉＲＮＡ送達アッセイで検出した）。プロトコールは以下の通りであった。
【０１８４】
１）タンパク質試料の収集およびＢＣＡ法による濃度の決定。
Ａ．  培地を廃棄し、１ｍＬのＰＢＳ緩衝液を、１２−ウェルプレートの各ウェルに添加して、細胞を１回洗浄し、１００μＬの予冷強力ＲＩＰＡ溶解緩衝液を各細胞に添加し、ピペットチップで細胞を掻爬し、遠心分離チューブに移し、溶解のために２０分間氷上に置いて維持する。
Ｂ．  ４℃で１０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を新たな遠心分離チューブに移す。
Ｃ．  ＢＣＡ試薬ＡおよびＢ（５０：１、ｖ／ｖ）を徹底的に混合して、ＢＣＡ作業溶液を調製する。
Ｄ．  ２５μＬの新たに調製したＢＳＡ標準溶液および試験しようとする試料を、９６−ウェルプレートに添加し、２００μＬのＢＣＡ作業溶液を各ウェルに添加し、十分に混合し、３７℃で３０分間インキュベートする。
Ｅ．  紫外分光光度計（Ｓｙｎｅｒｇｙ４多機能マイクロプレートリーダー）を使用して、５６２ｎｍの吸光度を測定し、標準曲線により試料中のタンパク濃度を算出する。
Ｆ．  各試料の濃度が同じになるように、ＲＩＰＡ溶解緩衝液およびローディング緩衝液で各試料の濃度を調整する。
Ｇ．  ９５℃で１０分間変性させる。
【０１８５】
２）ウエスタンブロット
Ａ．  ゲル調製：１０％の濃度を有する分離ゲル（下層ゲル）、および５％の濃度を有する濃縮ゲル（上層ゲル）を使用した。１５−ウェルコムでレーンを作り、等量のタンパク質を各レーンにロードした。
Ｂ．  タンパク質電気泳動：電気泳動緩衝液を添加し、８０Ｖの初期電圧を電気泳動に使用する。ブロモフェノールブルー色素が分離ゲルに到達したら、電圧を１２０Ｖに上昇させ、ブロモフェノールブルー色素が底部に到達し、分離ゲルを完全に通り抜けるまで電気泳動を継続する。
Ｃ．  湿式転写：以下の順序：転写パッド（陽極）−スポンジ−濾紙−ゲル−ＰＶＤＦ膜−濾紙−スポンジ−転写パッド（陰極）のアッセンブリを製作し、アッセンブリを取り付け、転写デバイス全体を４℃の低温庫に入れ、定電流を３００ｍＡに設定して、１２０分間の転写を行う。
Ｄ．  ブロッキング：移転後に膜を３％ＢＳＡブロッキング溶液に入れ、室温で１時間ブロッキングする。
Ｅ．  一次抗体インキュベーション：ブロッキングしたＰＶＤＦ膜をハイブリダイゼーションバッグに移し、対応する一次抗体（一次抗体情報は、以下の通りであった）を含む３％ＢＳＡブロッキング溶液を添加し、バッグから気泡を除去し、４℃で一晩インキュベートする。
【０１８６】
【表４】
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【０１８７】
Ｆ．  膜洗浄：ＰＶＤＦ膜を取り出し、膜を、ＴＢＳＴで３回、各回１０分間洗浄する。
Ｇ．  二次抗体インキュベーション：ＴＢＳＴを廃棄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を有するヤギ抗ウサギまたはヤギ抗マウス二次抗体（Ｈａｎｇｚｈｏｕ  Ｌｉａｎｋｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入した）を含む３％ＢＳＡブロッキング溶液（二次抗体の希釈率は１：５０００であった）を添加し、室温で１時間インキュベートする。
Ｈ．  膜洗浄：膜を、ＴＢＳＴで３回、各回１０分間洗浄する。
Ｉ．  現像：ウエスタン用現像溶液（１：１、Ｖ／Ｖ、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入したＥＣＬ化学ルミネセンス現像溶液）を調製し、調製した現像溶液を、タンパク質が結合している側の膜に均等に添加し、プラスチックラップで薄膜を注意深く包み、現像後に観察する。
Ｊ．  分析：分析は、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを使用して実施した。
【０１８８】
４．脂質核酸混合物のｉｎ  ｖｉｖｏ送達実験
４．１  実験ステップ
１）脂質核酸混合物の調製：煮沸法を使用した。４００μＬのＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７（５ｎｍｏｌ）一本鎖ＲＮＡのＤＥＰＣ処理溶液に、９μＬまたは１８μＬの脂質組合せ（脂質ＰＥ（番号３８）＆ＬＰＣ（番号３７）＆ＴＧ（番号３２）、４：２：３、Ｖ／Ｖ／Ｖ）をそれぞれ添加し、混合し、１００℃で３０分間加熱した。
【０１８９】
２）６〜８週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ野生型マウスに対するＲＮＡの胃内投与：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７水溶液、または脂質およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の混合物溶液を、胃管栄養針を使用して４００μＬ／動物で投与した（ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７、５ｎｍｏｌ／動物）。群は以下の通りであった：
Ａ．  対照群（ナイーブ群）：いかなる処置も受けなかったマウス、
Ｂ．  陰性対照群（脂質群）：９μＬの脂質組合せ（脂質ＰＥ（番号３８）＆ＬＰＣ（番号３７）＆ＴＧ（番号３２）、４：２：３、Ｖ／Ｖ／Ｖ）の胃内投与、
Ｃ．  自由取込み群：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖ＲＮＡ溶液の直接胃内投与、
Ｄ．  脂質および核酸混合物群：脂質組合せおよびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖ＲＮＡの混合物の胃内投与。
【０１９０】
３）試料収集：胃内投与の３時間後に、マウス肺全体を、３ｍＬのＴＲＩｚｏｌで溶解し、ホモジナイズし、−８０℃で凍結した。
【０１９１】
４）全ＲＮＡ抽出：
Ａ．  ３．０ｍＬのＴＲＩｚｏｌ溶解緩衝液をマウス肺組織に添加し、ホモジナイザーで粉砕し、４℃で１０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離し、ホモジナイズできなかった組織沈殿物を除去する。
Ｂ．  クロロホルムを２００μｌ／ｍＬ  ＴＲＩｚｏｌの比率で添加し、十分に振盪して混合し、室温で１５分間維持する。
Ｃ．  ４℃で１５分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離し、上部水相を別の遠心分離チューブにピペットする。
Ｄ．  上記のステップを反復し、等量のクロロホルムを上部水相に添加し、十分に混合し、室温で１０分間維持する。
Ｅ．  ４℃で１５分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離する。
Ｆ．  上部水相を取り出して、新たなＥＰチューブに移し、イソプロパノールを０．５ｍｌ／ｍＬ  ＴＲＩｚｏｌの比率で添加し、混合し、室温で５〜１０分間維持する。
Ｇ．  ４℃で１５分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を廃棄する。
Ｈ．  １ｍＬの７５％エタノールを添加し、遠心分離チューブを穏やかに振盪し、沈殿物を懸濁させる。
Ｉ．  ４℃で１０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を廃棄する。
Ｊ．  室温で５〜１０分間乾燥し、ＲＮＡ試料を、５０μｌのＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏに溶解する。
【０１９２】
５）ＲＴ−ｑＰＣＲ（ＳＹＢＲグリーンユニバーサル色素法）によりＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の存在量を検出する。
【０１９３】
別様の指定がない限り、一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液は、ＤＥＰＣ処理水溶液中の一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７を指す。二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液は、ＤＥＰＣ処理水溶液中の二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７を指す。
【０１９４】
［実施例１−１］
様々なタイプの脂質組合せによるＭＲＣ−５細胞内への一本鎖核酸の送達
１．実験群
１）ナイーブ群：未処理ＭＲＣ−５細胞
【０１９５】
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌのＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７のＤＥＰＣ処理水溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は２００ｎＭであった。
【０１９６】
３）自由取込み群：一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は２００ｎＭであった）。
【０１９７】
４）脂質核酸混合物：煮沸法により処理した、３μＬの単一脂質または脂質組合せおよびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は２００ｎＭであった。
【０１９８】
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液に、３μＬの単一脂質または脂質組合せのクロロホルム溶液（５ｍｇ／ｍＬの濃度を有する脂質番号１／２／４／９／１４／１８／１９／２０／２１／２２／２３／２４／２５／２６／２７／２８／２９／３０／３２のクロロホルム溶液、および１０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する脂質番号３／８／１０／１１／１２／１３／３３／３４／３５／３６のクロロホルム溶液、１ｍｇ／ｍＬの濃度を有する脂質番号６／１５／１６／１７／３１のクロロホルム溶液）を添加し、１００℃で３０分間加熱した。
ａ）脂質組合せ：
ｂ）ＭＧ（モノグリセリド）：３μＬ脂質番号３４、
ｃ）ＤＧ（ジグリセリド）：等容積の脂質番号１／２／３／１９／３５のクロロホルム溶液の３μＬ混合物、
ｄ）ＴＧ（トリグリセリド）：等容積の脂質番号６／９／１０／１３／１５／１６／１８／２０／２１／２２／２３／２４／２５／２６／２７／２８／３２／３３のクロロホルム溶液の３μＬ混合物、
ｅ）ＬＰＣ（リゾホスファチジルコリン）：等容積の脂質番号３６／３７のクロロホルム溶液の３μＬ混合物、
ｆ）ＰＣ（ホスファチジルコリン）：等容積の脂質番号１１／１２のクロロホルム溶液の３μＬ混合物、
ｇ）ＰＥ（ホスファチジルエタノールアミン）：等容積の脂質番号８／３８のクロロホルム溶液の３μＬ混合物、
ｈ）Ｃｅｒ（セラミド）：等容積の脂質番号４／１４のクロロホルム溶液の３μＬ混合物、
ｉ）Ｓｏ：（スフィンゴシン）等容積の脂質番号１７／３０／３１のクロロホルム溶液の３μＬ混合物、
ｊ）  ＦＡ（脂肪酸）：３μＬの脂質番号２９、
ｋ）混合物：等容積の脂質番号１〜３６（番号５／７を含まない）のクロロホルム溶液の３μＬ混合物、
ｌ）混合物１：等容積の脂質番号１〜３６（番号５／７／３４を含まない）のクロロホルム溶液の３μＬ混合物、
ｍ）混合物２：等容積の脂質番号１〜３６（番号５／７／１／２／３／１９／３５を含まない）のクロロホルム溶液の３μＬ混合物、
ｎ）混合物３：等容積の脂質番号１〜３６（番号５／７／６／９／１０／１３／１５／１６／１８／２０／２１／２２／２３／２４／２５／２６／２７／２８／３２／３３を含まない）のクロロホルム溶液の３μＬ混合物、
ｏ）混合物４：等容積の脂質番号１〜３６（番号５／７／３６／３７を含まない）のクロロホルム溶液の３μＬ混合物、
ｐ）混合物５：等容積の脂質番号１〜３６（番号５／７／１１／１２を含まない）のクロロホルム溶液の３μＬ混合物、
ｑ）混合物６：等容積の脂質番号１〜３６（番号５／７／８を含まない）のクロロホルム溶液の３μＬ混合物、
ｒ）混合物７：等容積の脂質番号１〜３６（番号５／７／４／１４を含まない）のクロロホルム溶液の３μＬ混合物、
ｓ）混合物８：等容積の脂質番号１〜３６（番号５／７／２９を含まない）のクロロホルム溶液の３μＬ混合物。
【０１９９】
２）実験条件：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は２００ｎＭであった。細胞に添加した１２時間後、細胞に進入したＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の量を、ＲＴ−ｑＰＣＲ法（ＳＹＢＲグリーンユニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
【０２００】
結論：結果は、上記脂質組合せがすべて、自由取込み群と比較して、細胞内への核酸送達に効果的であり（図１６を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。混合物２、混合物３、混合物５、混合物７により媒介された核酸は、より多くの量がＭＲＣ−５細胞に進入した。
【０２０１】
［実施例１−２］
脂質組合せによるＭＲＣ−５細胞およびＣａｃｏ−２細胞内への一本鎖核酸の送達
１．実験群：
試験しようとする細胞は、ＭＲＣ−５細胞およびＣａｃｏ−２細胞であった。
１）ナイーブ群：未処理細胞
【０２０２】
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌのＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は２００ｎＭであった。
【０２０３】
３）自由取込み群：一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は２００ｎＭであった）。
【０２０４】
４）単一脂質および核酸による処理群：煮沸法により処理した、３μＬの単一脂質（番号１または８または１２）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は２００ｎＭであった。
【０２０５】
５）脂質組合せ混合物および核酸混合物による処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（等容積で混合した番号１／８／１２）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は２００ｎＭであった。
【０２０６】
６）脂質組合せおよび核酸混合物による処理群：煮沸法により処理した、３μＬ脂質組合せ（２μＬの単一脂質番号１または番号８または番号１２および１μＬの以下のタイプの脂質（ＭＧ、ＤＧ、ＴＧ、ＬＰＣ、Ｃｅｒ、Ｓｏ、またはＦＡ）の混合物）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は２００ｎＭであった。図１７Ａおよび１７Ｂでは、処理群を、まとめて、番号１  ２μＬ＋ミックス  １μＬ、番号８  ２μＬ＋ミックス  １μＬ、および番号１２  ２μＬ＋ミックス  １μＬとして表し、横線内では、ＭＧは、２μＬの番号１または番号８または番号１２の単一脂質＋１μＬのＭＧを表し、ＤＧは、２μＬの番号１または番号８または番号１２の単一脂質＋１μＬのＤＧを表し、ＴＧは、２μＬの番号１または番号８または番号１２の単一脂質＋１μＬのＴＧを表し、ＬＰＣは、２μＬの番号１または番号８または番号１２の単一脂質＋１μＬのＬＰＣを表し、Ｃｅｒは、２μＬの番号１または番号８または番号１２の単一脂質＋１μＬのＣｅｒを表し、Ｓｏは、２μＬの番号１または番号８または番号１２の単一脂質＋１μＬのＳｏを表し、ＦＡは、２μＬの番号１または番号８または番号１２の単一脂質＋１μＬのＦＡを表していた。
【０２０７】
２．実験手順
１）煮沸法の条件：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液に、３μＬの単一脂質（５ｍｇ／ｍＬの濃度を有する脂質番号１のクロロホルム溶液、１０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する脂質番号８／１２のクロロホルム溶液）または脂質組合せを添加し、１００℃で３０分間加熱した。
ＭＧ（モノグリセリド）：２μＬの脂質番号３４、
ＤＧ（ジグリセリド）：等容積の脂質番号１／２／３／１９／３５のクロロホルム溶液の２μＬ混合物、
ＴＧ（トリグリセリド）：等容積の脂質番号６／９／１０／１３／１５／１６／１８／２０／２１／２２／２３／２４／２５／２６／２７／２８／３２／３３のクロロホルム溶液の２μＬ混合物、
ＬＰＣ（リゾホスファチジルコリン）：等容積の脂質番号３６／３７のクロロホルム溶液の２μＬ混合物、
Ｃｅｒ（セラミド）：等容積の脂質番号４／１４のクロロホルム溶液の２μＬ混合物、
Ｓｏ：（スフィンゴシン）：等容積の脂質番号１７／３０／３１のクロロホルム溶液の２μＬ混合物、
ＦＡ（脂肪酸）：２μＬの脂質番号２９。
【０２０８】
２）実験条件：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は２００ｎＭであった。細胞に添加した２４時間後、細胞内に進入したＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の量を、ＲＴ−ｑＰＣＲ法（ＳＹＢＲグリーンユニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
【０２０９】
結論：結果は、ＭＲＣ−５細胞の場合、混合物（等容積で混合した番号１／８／１２）、番号１  ２μＬ＋番号８  １μＬ、番号１  ２μＬ＋番号１２  １μＬ、番号１  ２μＬ＋ＭＧ  １μＬ、番号８  ２μＬ＋ＭＧ  １μＬ、番号１２  ２μＬ＋番号８  １μＬ、および番号１２  ２μＬ＋Ｓｏ  １μＬが、核酸をより効率的に送達したことを示した。
【０２１０】
Ｃａｃｏ−２細胞の場合、混合物（等容積の番号１／８／１２）、番号１  ２μＬ＋番号８  １μＬ、番号１  ２μＬ＋番号１２  １μＬ、番号１  ２μＬ＋ＭＧ  １μＬ、番号８  ２μＬ＋ＭＧ  １μＬ、番号１２  ２μＬ＋番号８  １μＬ、番号１２  ２μＬ＋ＬＰＣ  １μＬ、および番号１２  ２μＬ＋Ｓｏ  １μＬが、核酸をより効率的に送達した。
【０２１１】
［実施例１−３］
脂質組合せによる細胞内への一本鎖核酸の送達
細胞タイプ：Ａ５４９、ＭＲＣ−５、およびＣａｃｏ−２細胞。
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
【０２１２】
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌのＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
【０２１３】
３）自由取込み群：一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１００ｎＭであった）。
【０２１４】
４）単一脂質および核酸による処理群：煮沸法により処理した、３μＬの単一脂質（番号８または番号１２）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０２１５】
５）脂質組合せＰＣ（番号１２）＆ＰＥ（番号８）および核酸混合物による処理群：煮沸法により処理した、２．２５μＬの脂質組合せ（ＰＣ（番号１２）＆ＰＥ（番号８）、２：１、Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０２１６】
６）脂質組合せおよび核酸混合物による処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（２．２５μＬの脂質組合せＰＣ（番号１２）＆ＰＥ（番号８）および０．７５μＬの以下のタイプの脂質：ＤＧ、ＴＧ、ＬＰＣ、ＰＣ、Ｃｅｒ、Ｓｏ、またはＦＡの混合物）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。図１８では、混合物処理群は、「２．２５μＬ＋０．７５μＬ」の上方の横線内の処理群に対応する。
【０２１７】
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液に、単一脂質（１０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する脂質番号８／１２のクロロホルム溶液）または脂質組合せを添加し、１００℃で３０分間加熱した。
ＤＧ（ジグリセリド）：等容積の脂質番号１／２のクロロホルム溶液の０．７５μＬ混合物、
ＴＧ（トリグリセリド）：０．７５μＬの脂質番号１５のクロロホルム溶液、
ＬＰＣ（リゾホスファチジルコリン）：等容積の脂質番号３６／３７のクロロホルム溶液の０．７５μＬ混合物、
ＰＣ（リゾホスファチジルコリン）：０．７５μＬの脂質番号１２のクロロホルム溶液、
Ｃｅｒ（セラミド）：０．７５μＬの脂質番号４のクロロホルム溶液、
Ｓｏ：（スフィンゴシン）：０．７５μＬの脂質番号３１のクロロホルム溶液、
ＦＡ（脂肪酸）：０．７５μＬの脂質番号２９。
【０２１８】
２）実験条件：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。細胞に添加した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の量を、ＲＴ−ｑＰＣＲ法（ＳＹＢＲグリーンユニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
【０２１９】
結論：結果は、上記単一脂質および脂質組合せがすべて、自由取込み群と比較して、細胞内への核酸送達に効果的であり（図１８を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。
【０２２０】
Ａ５４９、ＭＲＣ−５、およびＣａｃｏ−２細胞の場合、２．２５μＬのＰＣ（番号１２）＆ＰＥ（番号８）＋０．７５μＬのＤＧ（等容積の脂質番号１／２のクロロホルム溶液の混合物）が、最良の送達効率を達成した。
【０２２１】
［実施例１−４］
脂質組合せによる細胞内への一本鎖核酸の送達
細胞タイプ：Ａ５４９、ＭＲＣ−５、およびＣａｃｏ−２細胞。
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
【０２２２】
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌのＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
【０２２３】
３）自由取込み群：一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１００ｎＭであった）。
【０２２４】
４）単一脂質および核酸による処理群：煮沸法により処理した、３μＬの単一脂質（番号８または番号１２）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０２２５】
５）脂質組合せＤＧ（番号１）＆ＰＥ（番号８）＆ＰＣ（番号１２）および核酸混合物による処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（ＤＧ（番号１）＆ＰＥ（番号８）＆ＰＣ（番号１２）、１：１：１、Ｖ／Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０２２６】
６）脂質組合せおよび核酸混合物による処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（２μＬの脂質組合せＤＧ（番号１）＆ＰＥ（番号８）＆ＰＣ（番号１２）および１μＬの以下のタイプの脂質：ＤＧ、ＴＧ、ＬＰＣ、ＰＣ、Ｃｅｒ、Ｓｏ、またはＦＡの混合物）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。図１９では、混合物処理群は、２μＬの脂質組合せＤＧ（番号１）＆ＰＥ（番号８）＆ＰＣ（番号１２）＋１μＬの上方の横線内の処理群に対応する。
【０２２７】
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液に、３μＬの単一脂質（５ｍｇ／ｍＬの濃度を有する脂質番号１のクロロホルム溶液、１０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する脂質番号８／１２のクロロホルム溶液）または脂質組合せを添加し、１００℃で３０分間加熱した。
ＤＧ（ジグリセリド）：等容積の脂質番号１／２のクロロホルム溶液の１μＬ混合物、
ＴＧ（トリグリセリド）：１μＬの脂質番号１５のクロロホルム溶液、
ＬＰＣ（リゾホスファチジルコリン）：等容積の脂質番号３６／３７のクロロホルム溶液の１μＬ混合物、
ＰＣ（リゾホスファチジルコリン）：１μＬの脂質番号１２のクロロホルム溶液、
Ｃｅｒ（セラミド）：１μＬの脂質番号４のクロロホルム溶液、
Ｓｏ：（スフィンゴシン）：１μＬの脂質番号３１のクロロホルム溶液、
ＦＡ（脂肪酸）：１μＬの脂質番号２９。
【０２２８】
２）実験条件：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。細胞に添加した２４時間後、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の量を、ＲＴ−ｑＰＣＲ法（ＳＹＢＲグリーンユニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
【０２２９】
結論：結果は、上記脂質組合せが、自由取込み群と比較して、細胞内への核酸送達に効果的であり（図１９を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。
【０２３０】
Ａ５４９、ＭＲＣ−５、およびＣａｃｏ−２細胞の場合、２μＬのＤＧ（番号１）＆ＰＥ（番号８）＆ＰＣ（番号１２）＋１μＬのＴＧ（番号１５）が、最良の送達効率を達成した。
【０２３１】
［実施例１−５］
脂質組合せによる細胞内への一本鎖核酸の送達
細胞タイプ：Ａ５４９、ＭＲＣ−５、およびＣａｃｏ−２細胞。
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
【０２３２】
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌのＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
【０２３３】
３）自由取込み群：一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１００ｎＭであった）。
【０２３４】
４）単一脂質および核酸の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの番号８の単一脂質およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０２３５】
５）脂質組合せＰＥ（番号８）＆ＭＧ（番号３４）および核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、２．２５μＬの脂質組合せ（ＰＥ（番号８）＆ＭＧ（番号３４）、２：１、Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０２３６】
６）脂質組合せおよび核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（２．２５μＬの脂質組合せＰＥ（番号８）＆ＭＧ（番号３４）および０．７５μＬの以下のタイプの脂質：ＤＧ、ＴＧ、ＬＰＣ、ＰＣ、Ｃｅｒ、Ｓｏ、またはＦＡの混合物）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。図２０では、混合物処理群は、「２．２５μＬ［脂質組合せＰＥ（番号８）＆ＭＧ（番号３４）］＋０．７５μＬ」の上方の横線内の処理群に対応する。
【０２３７】
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液に、単一脂質（１０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する脂質番号８のクロロホルム溶液）または脂質組合せを添加し、１００℃で３０分間加熱した。
ＤＧ（ジグリセリド）：等容積の脂質番号１／２のクロロホルム溶液の０．７５μＬ混合物、
ＴＧ（トリグリセリド）：０．７５μＬの脂質番号１５のクロロホルム溶液、
ＬＰＣ（リゾホスファチジルコリン）：等容積の脂質番号３６／３７のクロロホルム溶液の０．７５μＬ混合物、
ＰＣ（リゾホスファチジルコリン）：０．７５μＬの脂質番号１２のクロロホルム溶液、
Ｃｅｒ（セラミド）：０．７５μＬの脂質番号４のクロロホルム溶液、
Ｓｏ：（スフィンゴシン）：０．７５μＬの脂質番号３１のクロロホルム溶液、
ＦＡ（脂肪酸）：０．７５μＬの脂質番号２９。
【０２３８】
２）実験条件：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。細胞に添加した２４時間後、細胞内に進入したＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の量を、ＲＴ−ｑＰＣＲ法（ＳＹＢＲグリーンユニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
【０２３９】
結論：結果は、上記単一脂質および脂質組合せが、自由取込み群と比較して、細胞内への核酸送達に効果的であり（図２０を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。
【０２４０】
Ａ５４９、ＭＲＣ−５、およびＣａｃｏ−２細胞の場合、２．２５μＬのＰＥ（番号８）＆ＭＧ（番号３４）＋０．７５μＬのＳｏ（番号３１）が、最良の送達効率を達成した。
【０２４１】
［実施例１−６］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への一本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理Ａ５４９細胞
【０２４２】
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌのＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
【０２４３】
３）自由取込み群：一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１００ｎＭであった）。
【０２４４】
４）単一脂質および核酸による処理群：煮沸法により処理した、３μＬの単一脂質番号３８およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０２４５】
５）脂質組合せおよび核酸混合物による処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（２μＬの単一脂質番号３８および１μＬの以下のタイプの脂質：ＭＧ、ＤＧ、ＴＧ、ＬＰＣ、ＰＣ、ＰＥ、Ｃｅｒ、Ｓｏ、またはＦＡの混合物）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０２４６】
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液に、３μＬの単一脂質（１０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する脂質番号３８のクロロホルム溶液）または脂質組合せを添加し、１００℃で３０分間加熱した。
ＭＧ（モノグリセリド）：１μＬの脂質番号３４、
ＤＧ（ジグリセリド）：１μＬの脂質番号１のクロロホルム溶液、
ＴＧ（トリグリセリド）：１μＬの脂質番号１５のクロロホルム溶液、
ＬＰＣ（リゾホスファチジルコリン）：１μＬの脂質番号３７のクロロホルム溶液、
ＰＣ（リゾホスファチジルコリン）：１μＬの脂質番号１２のクロロホルム溶液、
ＰＥ（ホスファチジルエタノールアミン）：１μＬの脂質番号８のクロロホルム溶液、
Ｃｅｒ（セラミド）：１μＬの脂質番号４のクロロホルム溶液、
Ｓｏ：（スフィンゴシン）：１μＬの脂質番号３１のクロロホルム溶液、
ＦＡ（脂肪酸）：１μＬの脂質番号２９のクロロホルム溶液。
【０２４７】
２）実験条件：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。細胞に添加した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の量を、ＲＴ−ｑＰＣＲ法（ＳＹＢＲグリーンユニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
【０２４８】
結論：結果は、Ａ５４９細胞の場合、上記の２μＬの単一の脂質番号３８および１μＬのＬＰＣ（番号３７）、ＴＧ（番号１５）、ＰＣ（番号１２）、ＤＧ（番号１）が、自由取込み群と比較して、細胞内への核酸送達に効果的であったことを示した（図２１を参照）。
【０２４９】
［実施例１−７］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への一本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理Ａ５４９細胞
【０２５０】
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌのＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
【０２５１】
３）自由取込み群：一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１００ｎＭであった）。
【０２５２】
４）脂質組合せＤＧ（番号１）＆ＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）および核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（ＤＧ（番号１）＆ＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）、１：１：１、Ｖ／Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０２５３】
５）脂質組合せおよび核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（２μＬの脂質組合せＤＧ（番号１）＆ＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）および１μＬの以下のタイプの脂質：ＭＧ、ＴＧ、ＬＰＣ、ＰＥ、Ｃｅｒ、Ｓｏ、またはＦＡの混合物）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０２５４】
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液に、３μＬの脂質組合せを添加し、１００℃で３０分間加熱した。
Ｍｇ（モノグリセリド）：１μＬの脂質番号３４、
ＴＧ（トリグリセリド）：１μＬの脂質番号１５のクロロホルム溶液、
ＬＰＣ（リゾホスファチジルコリン）：１μＬの脂質番号３７のクロロホルム溶液、
ＰＥ（ホスファチジルエタノールアミン）：１μＬの脂質番号８のクロロホルム溶液、
Ｃｅｒ（セラミド）：１μＬの脂質番号４のクロロホルム溶液、
Ｓｏ：（スフィンゴシン）：１μＬの脂質番号３１のクロロホルム溶液、
ＦＡ（脂肪酸）：１μＬの脂質番号２９のクロロホルム溶液。
【０２５５】
２）実験条件：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。細胞に添加した２４時間後、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の量を、ＲＴ−ｑＰＣＲ法（ＳＹＢＲグリーンユニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
【０２５６】
結論：結果は、上記の２μＬの脂質組合せＤＧ（番号１）＆ＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）および１μＬのＴＧ（番号１５）、Ｃｅｒ（番号４）、Ｓｏ（番号３１）、ＦＡ（番号２９）、ＬＰＣ（番号３７）、ＰＥ（番号８）がすべて、自由取込み群と比較して、Ａ５４９細胞内への核酸送達に効果的であり（図２２を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有することを示した。
【０２５７】
［実施例１−８］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への一本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理Ａ５４９細胞
【０２５８】
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌのＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
【０２５９】
３）自由取込み群：一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１００ｎＭであった）。
【０２６０】
４）脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＭＧ（番号３４）および核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（ＰＥ（番号３８）＆ＭＧ（番号３４）、２：１、Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０２６１】
５）脂質組合せおよび核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（２μＬの脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＭＧ（番号３４）および１μＬの以下のタイプの脂質：ＤＧ、ＴＧ、ＬＰＣ、ＰＣ、ＰＥ、Ｃｅｒ、Ｓｏ、またはＦＡの混合物）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０２６２】
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液に、３μＬの脂質組合せを添加し、１００℃で３０分間加熱した。
ＤＧ（ジグリセリド）：１μＬの脂質番号１のクロロホルム溶液、
ＴＧ（トリグリセリド）：１μＬの脂質番号１５のクロロホルム溶液、
ＬＰＣ（リゾホスファチジルコリン）：１μＬの脂質番号３７のクロロホルム溶液、
ＰＣ（ホスファチジルコリン）：１μＬの脂質番号１２のクロロホルム溶液、
ＰＥ（ホスファチジルエタノールアミン）：１μＬの脂質番号８のクロロホルム溶液、
Ｃｅｒ（セラミド）：１μＬの脂質番号４のクロロホルム溶液、
Ｓｏ：（スフィンゴシン）：１μＬの脂質番号３１のクロロホルム溶液、
ＦＡ（脂肪酸）：１μＬの脂質番号２９のクロロホルム溶液。
【０２６３】
２）実験条件：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。細胞に添加した２４時間後、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の量を、ＲＴ−ｑＰＣＲ法（ＳＹＢＲグリーンユニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
【０２６４】
結論：結果は、上記の脂質組合せがすべて、細胞内へ核酸送達に効果的であり（図２３を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有し、２μＬ脂の質組合せＰＥ（番号３８）＆ＭＧ（番号３４）および１μＬのＬＰＣ（番号３７）が、最良の送達効果を達成したことを示した。
【０２６５】
［実施例１−９］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への一本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
【０２６６】
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌのＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
【０２６７】
３）自由取込み群：一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１００ｎＭであった）。
【０２６８】
４）脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）および核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（ＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）、２：１、Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０２６９】
５）脂質組合せおよび核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（２μＬの脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）および１μＬの以下のタイプの脂質：ＭＧ、ＤＧ、ＴＧ、ＬＰＣ、ＰＥ、Ｃｅｒ、Ｓｏ、またはＦＡの混合物）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０２７０】
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液に、３μＬの脂質組合せを添加し、１００℃で３０分間加熱した。
ＭＧ（モノグリセリド）：１μＬの脂質番号３４、
ＤＧ（ジグリセリド）：１μＬの脂質番号１のクロロホルム溶液、
ＴＧ（トリグリセリド）：１μＬの脂質番号１５のクロロホルム溶液、
ＬＰＣ（リゾホスファチジルコリン）：１μＬの脂質番号３７のクロロホルム溶液、
ＰＥ（ホスファチジルエタノールアミン）：１μＬの脂質番号８のクロロホルム溶液、
Ｃｅｒ（セラミド）：１μＬの脂質番号４のクロロホルム溶液、
Ｓｏ：（スフィンゴシン）：１μＬの脂質番号３１のクロロホルム溶液、
ＦＡ（脂肪酸）：１μＬの脂質番号２９。
【０２７１】
２）実験条件：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の量を、ＲＴ−ｑＰＣＲ法（ＳＹＢＲグリーンユニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
【０２７２】
結論：結果は、上記の脂質組合せが、細胞内へ核酸送達に効果的であり（図２４を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有し、２μＬ脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号４）および１μＬのＣｅｒ（番号４）が、最良の効果を達成したことを示した。
【０２７３】
［実施例１−１０］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への一本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
【０２７４】
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌのＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
【０２７５】
３）自由取込み群：一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１００ｎＭであった）。
【０２７６】
４）脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆ＤＧ（番号１）＆ＴＧ（番号１５）および核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（ＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆ＤＧ（番号１）＆ＴＧ（番号１５）、２：２：２：３、Ｖ／Ｖ／Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０２７７】
５）脂質組合せおよび核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（２．２μＬの脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆ＤＧ（番号１）＆ＴＧ（番号１５）および０．８μＬの以下のタイプの脂質：ＭＧ、ＬＰＣ、Ｃｅｒ、Ｓｏ、またはＦＡの混合物）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０２７８】
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液に、３μＬの脂質組合せを添加し、１００℃で３０分間加熱した。
ＭＧ（モノグリセリド）：０．８μＬの脂質番号３４、
ＬＰＣ（リゾホスファチジルコリン）：０．８μＬの脂質番号３７のクロロホルム溶液、
Ｃｅｒ（セラミド）：０．８μＬの脂質番号４のクロロホルム溶液、
Ｓｏ：（スフィンゴシン）：０．８μＬの脂質番号３１のクロロホルム溶液、
ＦＡ（脂肪酸）：０．８μＬの脂質番号２９。
【０２７９】
２）実験条件：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の量を、ＲＴ−ｑＰＣＲ法（ＳＹＢＲグリーンユニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
【０２８０】
結論：結果は、上記の脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であり（図２５を参照）、２．２μＬの脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆ＤＧ（番号１）＆ＴＧ（番号１５）、２．２μＬの脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆ＤＧ（番号１）＆ＴＧ（番号１５）、および０．８μＬのＬＰＣ（番号３７）またはＳｏ（番号３１）が、相対的により良好な送達効率を達成したことを示した。
【０２８１】
［実施例１−１１］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への一本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
【０２８２】
２）ＲＮＡｉｍａｘ処理群：２μｌ  ＲＮＡｉｍａｘトランスフェクション試薬および一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
【０２８３】
３）自由取込み群：一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１００ｎＭであった）。
【０２８４】
４）脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＭＧ（番号３４）＆ＬＰＣ（番号３７）および核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（ＰＥ（番号３８）＆ＭＧ（番号３４）＆ＬＰＣ（番号３７）、４：２：３、Ｖ／Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０２８５】
５）脂質組合せおよび核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（２．２μＬの脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＭＧ（番号３４）＆ＬＰＣ（番号３７）および０．８μＬの以下のタイプの脂質：ＤＧ、ＴＧ、ＰＣ、Ｃｅｒ、またはＳｏの混合物）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０２８６】
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液に、３μＬの脂質組合せを添加し、１００℃で３０分間加熱した。
ＤＧ（ジグリセリド）：０．８μＬの脂質番号１のクロロホルム溶液
ＴＧ（トリグリセリド）：０．８μＬの脂質番号１５のクロロホルム溶液、
ＰＣ（ホスファチジルコリン）：０．８μＬの脂質番号１２のクロロホルム溶液、
Ｃｅｒ（セラミド）：０．８μＬの脂質番号４のクロロホルム溶液、
Ｓｏ：（スフィンゴシン）：０．８μＬの脂質番号３１のクロロホルム溶液。
【０２８７】
２）実験条件：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の量を、ＲＴ−ｑＰＣＲ法（ＳＹＢＲグリーンユニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
【０２８８】
結論：結果は、上記脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であり（図２６を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。
【０２８９】
［実施例１−１２］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への一本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
【０２９０】
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌのＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
【０２９１】
３）自由取込み群：一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１００ｎＭであった）。
【０２９２】
４）脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆Ｃｅｒ（番号４）および核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（ＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆Ｃｅｒ（番号４）、４：２：３、Ｖ／Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０２９３】
５）脂質組合せおよび核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（２．２μＬの脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆Ｃｅｒ（番号４）および０．８μＬの以下のタイプの脂質：ＭＧ、ＤＧ、ＴＧ、ＬＰＣ、Ｓｏ、またはＦＡの混合物）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０２９４】
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液に、３μＬの脂質組合せを添加し、１００℃で３０分間加熱した。
ＭＧ（モノグリセリド）：０．８μＬの脂質番号３４、
ＤＧ（ジグリセリド）：０．８μＬの脂質番号１のクロロホルム溶液、
ＴＧ（トリグリセリド）：０．８μＬの脂質番号１５のクロロホルム溶液、
ＬＰＣ（リゾホスファチジルコリン）：０．８μＬの脂質番号３７のクロロホルム溶液、
Ｓｏ：（スフィンゴシン）：０．８μＬの脂質番号３１のクロロホルム溶液、
ＦＡ（脂肪酸）：０．８μＬの脂質番号２９のクロロホルム溶液。
【０２９５】
２）実験条件：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の量を、ＲＴ−ｑＰＣＲ法（ＳＹＢＲグリーンユニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
【０２９６】
結論：結果は、上記の脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であり（図２７を参照）、２．２μＬの脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆Ｃｅｒ（番号４）および０．８μＬのＦＡ（番号２９）が、最良の送達効果を達成したことを示した。
【０２９７】
［実施例１−１３］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への一本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
【０２９８】
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌのＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
【０２９９】
３）自由取込み群：一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１００ｎＭであった）。
【０３００】
４）脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆Ｃｅｒ（番号４）＆ＦＡ（番号２９）および核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（ＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆Ｃｅｒ（番号４）＆ＦＡ（番号２９）、４４：２２：３３：３６、Ｖ／Ｖ／Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０３０１】
５）脂質組合せおよび核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（ＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆Ｃｅｒ（番号４）＆ＦＡ（番号２９）および１μＬの以下のタイプの脂質の混合物）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０３０２】
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液に、３μＬの脂質組合せを添加し、１００℃で３０分間加熱した。
ＭＧ（モノグリセリド）：１μＬの脂質番号３４、
ＤＧ（ジグリセリド）：１μＬの脂質番号１のクロロホルム溶液、
ＴＧ（トリグリセリド）：１μＬの脂質番号１５のクロロホルム溶液、
ＬＰＣ（リゾホスファチジルコリン）：１μＬの脂質番号３７のクロロホルム溶液、
Ｓｏ：（スフィンゴシン）：１μＬの脂質番号３１のクロロホルム溶液。
【０３０３】
２）実験条件：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の量を、ＲＴ−ｑＰＣＲ法（ＳＹＢＲグリーンユニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
【０３０４】
結論：結果は、上記脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であり（図２８を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。
【０３０５】
［実施例１−１４］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への一本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
【０３０６】
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌのＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
【０３０７】
３）自由取込み群：一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１００ｎＭであった）。
【０３０８】
４）脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆Ｓｏ（番号３１）および核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（ＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆Ｓｏ（番号３１）、２：１：３、Ｖ／Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０３０９】
５）脂質組合せおよび核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（２μＬのＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆Ｓｏ（番号３１）および１μＬの以下のタイプの脂質：ＭＧ、ＤＧ、ＴＧ、ＬＰＣ、Ｃｅｒ、またはＦＡの混合物）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０３１０】
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液に、３μＬの脂質組合せを添加し、１００℃で３０分間加熱した。
ＤＧ（ジグリセリド）：１μＬの脂質番号１のクロロホルム溶液、
ＴＧ（トリグリセリド）：１μＬの脂質番号１５のクロロホルム溶液、
ＰＣ（ホスファチジルコリン）：１μＬの脂質番号１２のクロロホルム溶液、
Ｃｅｒ（セラミド）：１μＬの脂質番号４のクロロホルム溶液、
ＦＡ（脂肪酸）：１μＬの脂質番号２９のクロロホルム溶液。
【０３１１】
２）実験条件：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の量を、ＲＴ−ｑＰＣＲ法（ＳＹＢＲグリーンユニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
【０３１２】
結論：結果は、上記の脂質組合せが、細胞内へ核酸送達に効果的であり（図２９を参照）、２μＬの脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆Ｓｏ（番号３１）および１μＬのＦＡ（番号２９）が、最良の送達効果を達成したことを示した。
【０３１３】
［実施例１−１５］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への一本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
【０３１４】
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌのＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
【０３１５】
３）自由取込み群：一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１００ｎＭであった）。
【０３１６】
４）脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＭＧ（番号３４）＆ＬＰＣ（番号３７）＆Ｓｏ（番号３１）および核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（ＰＥ（番号３８）＆ＭＧ（番号３４）＆ＬＰＣ（番号３７）＆Ｓｏ（番号３１）、４４：２２：３３：３６、Ｖ／Ｖ／Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０３１７】
５）脂質組合せおよび核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（２μＬのＰＥ（番号３８）＆ＭＧ（番号３４）＆ＬＰＣ（番号３７）＆Ｓｏ（番号３１）および１μＬの以下のタイプの脂質：ＤＧ、ＴＧ、ＰＣ、Ｃｅｒ、またはＦＡの混合物）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０３１８】
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液に、３μＬの脂質組合せを添加し、１００℃で３０分間加熱した。
ＤＧ（ジグリセリド）：１μＬの脂質番号１のクロロホルム溶液、
ＴＧ（トリグリセリド）：１μＬの脂質番号１５のクロロホルム溶液、
ＰＣ（ホスファチジルコリン）：１μＬの脂質番号１２のクロロホルム溶液、
Ｃｅｒ（セラミド）：１μＬの脂質番号４のクロロホルム溶液、
ＦＡ（脂肪酸）：１μＬの脂質番号２９のクロロホルム溶液。
【０３１９】
２）実験条件：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の量を、ＲＴ−ｑＰＣＲ法（ＳＹＢＲグリーンユニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
【０３２０】
結論：結果は、自由取込み群と比較して、１μＬのＤＧ（番号１）、ＴＧ（番号１５）、ＰＣ（番号１２）、Ｃｅｒ（番号４）、またはＦＡ（番号２９）を、２μＬのＰＥ（番号３８）＆ＭＧ（番号３４）＆ＬＰＣ（番号３７）＆Ｓｏ（番号３１）を追加すると、細胞内に核酸を効率的に送達することができ（図３０を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。１μＬのＰＣ（番号１２）の追加が、最良の核酸送達効率を達成し、送達効率を増強することができた。
【０３２１】
［実施例１−１６］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への一本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
【０３２２】
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌ  ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
【０３２３】
３）自由取込み群：一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１００ｎＭであった）。
【０３２４】
４）脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＬＰＣ（番号３７）および核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（ＰＥ（番号３８）＆ＬＰＣ（番号３７）、２：１、Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０３２５】
５）脂質組合せおよび核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（２μＬのＰＥ（番号３８）＆ＬＰＣ（番号３７）および１μＬの以下のタイプの脂質：ＭＧ、ＤＧ、ＴＧ、ＰＣ、Ｃｅｒ、Ｓｏ、またはＦＡの混合物）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０３２６】
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液に、３μＬの脂質組合せを添加し、１００℃で３０分間加熱した。
ＭＧ（モノグリセリド）：１μＬの脂質番号３４、
ＤＧ（ジグリセリド）：１μＬの脂質番号１のクロロホルム溶液、
ＴＧ（トリグリセリド）：１μＬの脂質番号１５のクロロホルム溶液、
ＰＣ（ホスファチジルコリン）：１μＬの脂質番号１２のクロロホルム溶液、
Ｃｅｒ（セラミド）：１μＬの脂質番号４のクロロホルム溶液、
Ｓｏ：（スフィンゴシン）：１μＬの脂質番号３１のクロロホルム溶液、
ＦＡ（脂肪酸）：１μＬの脂質番号２９のクロロホルム溶液。
【０３２７】
２）実験条件：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の量を、ＲＴ−ｑＰＣＲ法（ＳＹＢＲグリーンユニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
【０３２８】
結論：結果は、自由取込み群と比較して、上記脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であり（図３１を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。１μＬのＴＧ（番号１５）を、２μＬの脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＬＰＣ（番号３７）に追加することにより、最良の核酸送達効果が達成された。
【０３２９】
［実施例１−１７］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への一本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
【０３３０】
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌ  ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
【０３３１】
３）自由取込み群：一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１００ｎＭであった）。
【０３３２】
４）脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＬＰＣ（番号３７）＆ＴＧ（番号１５）および核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（ＰＥ（番号３８）＆ＬＰＣ（番号３７）＆ＴＧ（番号１５）、３２：８：５、Ｖ／Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０３３３】
５）脂質組合せおよび核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（２μＬのＰＥ（番号３８）＆ＬＰＣ（番号３７）＆ＴＧ（番号１５）および１μＬの以下のタイプの脂質：ＭＧ、ＤＧ、ＰＣ、Ｃｅｒ、Ｓｏ、またはＦＡの混合物）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０３３４】
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液に、３μＬの脂質組合せを添加し、１００℃で３０分間加熱した。
ＭＧ（モノグリセリド）：１μＬの脂質番号３４、
ＤＧ（ジグリセリド）：１μＬの脂質番号１のクロロホルム溶液、
ＰＣ（ホスファチジルコリン）：１μＬの脂質番号１２のクロロホルム溶液、
Ｃｅｒ（セラミド）：１μＬの脂質番号４のクロロホルム溶液、
Ｓｏ：（スフィンゴシン）：１μＬの脂質番号３１のクロロホルム溶液、
ＦＡ（脂肪酸）：１μＬの脂質番号２９のクロロホルム溶液。
【０３３５】
２）実験条件：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の量を、ＲＴ−ｑＰＣＲ法（ＳＹＢＲグリーンユニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
【０３３６】
結論：結果は、上記脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であり（図３２を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＬＰＣ（番号３７）＆ＴＧ（番号１５）は、核酸を効率的に細胞内へと送達した。他のタイプの脂質を、脂質組合せＰＥ（番号３８）＆ＬＰＣ（番号３７）＆ＴＧ（番号１５）にさらに付加しても、この効果は増強されなかった。
【０３３７】
［実施例２−１］
脂質組合せによるＭＲＣ−５細胞内への二本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
【０３３８】
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌ  ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。二本鎖ＨＪＴｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
【０３３９】
３）自由取込み群：二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１００ｎＭであった）。
【０３４０】
４）単一脂質および核酸の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの単一脂質番号３８およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０３４１】
５）脂質組合せおよび核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（２μＬの単一脂質番号３８および１μＬの脂質番号８、１、２、１１、１２、３４、３７、４、３０、３１、２９、３２、１＋２（等容積で混合）、または１１＋１２（等容積で混合）の混合物のクロロホルム溶液）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０３４２】
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液に、３μＬの単一脂質（１０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する脂質番号３８のクロロホルム溶液）または脂質組合せを添加し、１００℃で３０分間加熱した。
【０３４３】
２）実験条件：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の量を、ＲＴ−ｑＰＣＲ法（ＳＹＢＲグリーンユニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
【０３４４】
結論：結果は、上記の単一脂質および脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であり（図３３を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。単一脂質番号３８は、核酸をＭＲＣ−５細胞内へと効果的に送達し、トランスフェクション試薬ＲＮＡｉＭＡＸに近い効果を示した。他の脂質をそれに追加しても、効果のさらなる増強はなかった。
【０３４５】
［実施例２−２］
脂質組合せによるＭＲＣ−５細胞内への二本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
【０３４６】
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌ  ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
【０３４７】
３）自由取込み群：二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１００ｎＭであった）。
【０３４８】
４）脂質組合せ（番号３８＆番号３７、２：１、Ｖ／Ｖ）および核酸の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せおよびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０３４９】
５）脂質組合せおよび核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（２μＬの脂質組合せ番号３８＆番号３７ならびに１μＬの脂質番号８、１、２、１１、１２、３４、３７、４、３０、３１、２９、３２、１＋２（等容積で混合）、または１１＋１２（等容積で混合）の混合物のクロロホルム溶液）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０３５０】
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液に、３μＬの脂質組合せを添加し、１００℃で３０分間加熱した。
【０３５１】
２）実験条件：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の量を、ＲＴ−ｑＰＣＲ法（ＳＹＢＲグリーンユニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
【０３５２】
結論：結果は、上記の単一脂質および脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であり（図３４を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。脂質番号３８＆番号３７混合物は、核酸をＭＲＣ−５細胞内へと効率的に送達した。１μＬの脂質を、２μＬの番号３８＆番号３７混合物に追加すると、番号１１および３４を除いて、この効果を増強することができた。加えて、意外にも、１μＬの脂質番号３２を、２μＬの番号３８＆番号３７混合物に追加すると、最良の効果が達成され、ＲＮＡｉＭＡＸの効果よりさらに良好であった。
【０３５３】
［実施例２−３］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への二本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
【０３５４】
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌ  ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
【０３５５】
３）自由取込み群：二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１００ｎＭであった）。
【０３５６】
４）脂質組合せ（ＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆Ｃｅｒ（番号４））および核酸の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（ＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆Ｃｅｒ（番号４）、４：２：３、Ｖ／Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０３５７】
５）脂質組合せおよび核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（２．５μＬのＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆Ｃｅｒ（番号４）および０．５μＬの脂質（ＤＧ（番号２）、ＴＧ（番号６）、Ｓｏ（番号１７）、ＦＡ（番号２９）、ＭＧ（番号３４）、およびＬＰＣ（番号３７）の混合物）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０３５８】
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬのＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖溶液に、３μＬの脂質組合せを添加し、１００℃で３０分間加熱した。
【０３５９】
２）実験条件：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の量を、ＲＴ−ｑＰＣＲ法（ＳＹＢＲグリーンユニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
【０３６０】
結論：結果は、上記の単一脂質および脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であり（図３５を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。１／５  ＬＰＣ（番号３７）を、ＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆Ｃｅｒ（番号４）混合物に追加することにより、核酸送達の効果を著しく増強することができた。加えて、ＤＧ（番号２）およびＴＧ（番号１６）を追加することによっても、送達効果をさらに増強することができた。
【０３６１】
［実施例２−４］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への二本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
【０３６２】
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌのＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
【０３６３】
３）自由取込み群：二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１００ｎＭであった）。
【０３６４】
４）脂質組合せ（ＰＥ（番号３８）＆ＤＧ（番号２））および核酸の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（ＰＥ（番号３８）＆ＤＧ（番号２）、２：１、Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０３６５】
５）脂質組合せおよび核酸混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（２μＬのＰＥ（番号３８）＆ＤＧ（番号２）および他の脂質である１μＬの番号３７、３１、２９、３４、１２、または４の混合物）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０３６６】
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液に、３μＬの脂質組合せを添加し、１００℃で３０分間加熱した。
【０３６７】
２）実験条件：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の量を、ＲＴ−ｑＰＣＲ法（ＳＹＢＲグリーンユニバーサル色素法）により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
【０３６８】
結論：結果は、上記の単一脂質および脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であり（図３６を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。脂質組合せ（２μＬのＰＥ（番号３８）＆ＤＧ（番号２）混合物）は、二本鎖核酸を、Ａ５４９細胞内へと効果的に送達することができた。この脂質組合せと比較して、２：１の比率で混合した、２μＬのＰＥ（番号３８）＆ＤＧ（番号２）および番号３７、３１、１２、または４の脂質組合せは、送達効率を増強することができた。
【０３６９】
［実施例２−５］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への二本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
【０３７０】
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌ  ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
【０３７１】
３）自由取込み群：二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１００ｎＭであった）。
【０３７２】
４）煮沸法により処理した、脂質組合せ（ＰＥ（番号３８）＆ＬＰＣ（番号３７）、４：１、Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０３７３】
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液に、３μＬの脂質組合せを添加し、７０℃で３０分間加熱した。
【０３７４】
２）実験条件：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の量を、ＲＴ−ｑＰＣＲ法により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
【０３７５】
結論：結果は、上記脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であり（図３７を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有し、トランスフェクション試薬ＲＮＡｉＭＡＸに近い効果を有していたことを示した。
【０３７６】
［実施例２−６］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への二本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
【０３７７】
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌ  ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
【０３７８】
３）自由取込み群：二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１００ｎＭであった）。
【０３７９】
４）煮沸法により処理した、脂質組合せ（ＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）、４：１、Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０３８０】
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液に、３μＬの脂質組合せを添加し、７０℃で３０分間加熱した。
【０３８１】
２）実験条件：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の量を、ＲＴ−ｑＰＣＲ法により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
【０３８２】
結論：結果は、上記脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であり（図３８を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。効果は、ＲＮＡｉＭＡＸの効果よりも良好であるかまたは同じである。
【０３８３】
［実施例２−７］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への二本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
【０３８４】
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌ  ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
【０３８５】
３）自由取込み群：二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１００ｎＭであった）。
【０３８６】
４）煮沸法により処理した、脂質組合せ（ＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆ＤＧ（番号２）、４：１：５、Ｖ／Ｖ／Ｖ）および二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０３８７】
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液に、２μＬの脂質組合せを添加し、８０℃で３０分間加熱した。
【０３８８】
２）実験条件：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の量を、ＲＴ−ｑＰＣＲ法により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
【０３８９】
結論：結果は、上記脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であり（図３９を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。脂質組合せ（ＰＥ（番号３８）＆ＰＣ（番号１２）＆ＤＧ（番号２）、４：１：５、Ｖ／Ｖ／Ｖ）は、ＲＮＡｉＭＡＸよりも、Ａ５４９細胞内への二本鎖核酸送達により良好な効果を示した。
【０３９０】
［実施例２−８］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への二本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
【０３９１】
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌ  ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
【０３９２】
３）自由取込み群：二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１００ｎＭであった）。
【０３９３】
４）煮沸法により処理した、脂質組合せ（ＰＥ（番号３８）＆ＬＰＣ（番号３７）＆ＤＧ（番号２）、３２：８：５、Ｖ／Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０３９４】
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液に、２μＬの脂質組合せを添加し、８０℃で３０分間加熱した。
【０３９５】
２）実験条件：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の量を、ＲＴ−ｑＰＣＲ法により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
【０３９６】
結論：結果は、上記脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であり（図４０を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。効果は、ＲＮＡｉＭＡＸの効果と類似していた。
【０３９７】
［実施例２−９］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への二本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
【０３９８】
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌ  ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
【０３９９】
３）自由取込み群：二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１００ｎＭであった）。
【０４００】
４）煮沸法により処理した、脂質組合せ（ＰＥ（番号８）＆ＰＣ（番号１２）、１：２、Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０４０１】
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液に、２μＬの脂質組合せを添加し、８０℃で３０分間加熱した。
【０４０２】
２）実験条件：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の量を、ＲＴ−ｑＰＣＲ法により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
【０４０３】
結論：結果は、上記脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であり（図４１を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。脂質組合せ（ＰＥ（番号８）＆ＰＣ（番号１２）、１：２、Ｖ／Ｖ）は、ＲＮＡｉＭＡＸよりも、Ａ５４９細胞内への二本鎖核酸送達により良好な効果を示した。
【０４０４】
［実施例２−１０］
脂質組合せによるＡ５４９細胞内への二本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
【０４０５】
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌ  ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
【０４０６】
３）自由取込み群：二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１００ｎＭであった）。
【０４０７】
４）煮沸法により処理した、脂質組合せ（ＰＥ（番号８）＆ＬＰＣ（番号３７）、４：１、Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０４０８】
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液に、２μＬの脂質組合せを添加し、８０℃で３０分間加熱した。
【０４０９】
２）実験条件：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の量を、ＲＴ−ｑＰＣＲ法により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
【０４１０】
結論：結果は、上記脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であり（図４２を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。
【０４１１】
［実施例２−１１］
脂質組合せによるＭＲＣ−５細胞内への二本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
【０４１２】
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌ  ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
【０４１３】
３）自由取込み群：二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１００ｎＭであった）。
【０４１４】
４）煮沸法により処理した、脂質組合せ（ＰＥ（番号８）＆ＰＣ（番号１２）、１：２、Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０４１５】
５）脂質組合せおよび二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（２μＬのＰＥ（番号８）＆ＰＣ（番号１２）および１μＬの他のタイプの脂質（ＭＧ（番号３４）、ＤＧ（番号２）、ＴＧ（番号３２）、ＬＰＣ（番号３７）、ＰＣ（番号１１）、ＰＥ（番号３８）、Ｃｅｒ（番号４）、Ｓｏ（番号３１）、またはＦＡ（番号２９））および二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０４１６】
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液に、３μＬの脂質組合せを添加し、８０℃で３０分間加熱した。
【０４１７】
２）実験条件：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の量を、ＲＴ−ｑＰＣＲ法により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
【０４１８】
結論：結果は、上記脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であり（図４３を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。ＰＥ（番号８）＆ＰＣ（番号１２）は、核酸を細胞内へと効果的に送達することができ、ＲＮＡｉＭＡＸよりも有意に良好な効果を有していた。ＰＥ（番号８）＆ＰＣ（番号１２）と比較して、ＰＥ（番号８）＆ＰＣ（番号１２）およびＣｅｒ（番号４）またはＰＥ（番号３８）の２：１比の混合物は、この効果を増強することができた。
【０４１９】
［実施例２−１２］
脂質組合せによるＭＲＣ−５細胞内への二本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
【０４２０】
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌ  ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
【０４２１】
３）自由取込み群：二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１００ｎＭであった）。
【０４２２】
４）煮沸法により処理した、脂質組合せ（ＰＥ（番号８）＆ＰＣ（番号１２）＆ＤＧ（番号２）、８：１６：３、Ｖ／Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０４２３】
５）．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液に、２μＬの脂質組合せを添加し、８０℃で３０分間加熱した。
【０４２４】
２）実験条件：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の量を、ＲＴ−ｑＰＣＲ法により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
【０４２５】
結論：結果は、自由取込み群およびＲＮＡｉＭＡＸ群と比較して、脂質組合せ（ＰＥ（番号８）＆ＰＣ（番号１２）＆ＤＧ（番号２）、８：１６：３、Ｖ／Ｖ／Ｖ）が、ＲＮＡｉＭＡＸよりも良好な送達効果を示し（図４４を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。
【０４２６】
［実施例２−１３］
脂質組合せによるＭＲＣ−５細胞内への二本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
【０４２７】
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌ  ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
【０４２８】
３）自由取込み群：二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１００ｎＭであった）。
【０４２９】
４）煮沸法により処理した、脂質組合せおよびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
混合物１：ＰＥ（番号８）：ＬＰＣ（番号３７）：ＴＧ（番号３２）−４：１：２
混合物２：ＰＥ（番号８）：ＬＰＣ（番号３７）：ＤＧ（番号２）−４：１：２
混合物３：ＰＥ（番号８）：ＰＣ（番号１２）：Ｓｏ（番号３１）：ＦＡ（番号２９）−１：２：１：１
【０４３０】
５）．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液に、２．５μＬの脂質組合せを添加し、９０℃で１５分間加熱した。
【０４３１】
２）実験条件：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の量を、ＲＴ−ｑＰＣＲ法により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
【０４３２】
結論：結果は、上記脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であり（図４５を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。ＲＮＡｉＭＡＸ群と比較して、混合物１：ＰＥ（番号８）：ＬＰＣ（番号３７）：ＴＧ（番号３２）−４：１：２および混合物２：ＰＥ（番号８）：ＬＰＣ（番号３７）：ＤＧ（番号２）−４：１：２は、同等の送達効果を示したが、混合物３：ＰＥ（番号８）：ＰＣ（番号１２）：Ｓｏ（番号３１）：ＦＡ（番号２９）−１：２：１：１は、より良好な効果を示した。
【０４３３】
［実施例２−１４］
脂質組合せによるＭＲＣ−５細胞内への二本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞を指す。
【０４３４】
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌ  ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
【０４３５】
３）自由取込み群：二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１００ｎＭであった）。
【０４３６】
４）脂質組合せ混合物および二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（ＰＥ（番号８）：ＰＣ（番号１２）：Ｓｏ（番号３１）：ＦＡ（番号２９）−１：２：１：１）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０４３７】
５）脂質組合せおよび二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７混合物の処理群：煮沸法により処理した、３μＬの脂質組合せ（２μＬの脂質組合せミックスおよび図４６に示されている１μＬの他のタイプの脂質、すなわち脂質番号３４、２、３２、１１、３７、３８、または４の混合物）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０４３８】
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液に、３μＬの脂質組合せを添加し、９０℃で１５分間加熱した。
【０４３９】
２）実験条件：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の量を、ＲＴ−ｑＰＣＲ法により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
【０４４０】
結論：結果は、上記脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であり（図４６を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。混合物（ＰＥ（番号８）：ＰＣ（番号１２）：Ｓｏ（番号３１）：ＦＡ（番号２９）−１：２：１：１）は、ＲＮＡｉＭＡＸよりも良好な送達効果を示した。混合物（ＰＥ（番号８）：ＰＣ（番号１２）：Ｓｏ（番号３１）：ＦＡ（番号２９）−１：２：１：１）を、脂質番号２、３８、または４に２：１の比率で追加すると、混合物（ＰＥ（番号８）：ＰＣ（番号１２）：Ｓｏ（番号３１）：ＦＡ（番号２９）−１：２：１：１）と比較して、送達効果を増強することができた。
【０４４１】
［実施例２−１５］
脂質組合せによるＭＲＣ−５細胞内への二本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
【０４４２】
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌ  ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
【０４４３】
３）自由取込み群：二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１００ｎＭであった）。
【０４４４】
４）煮沸法により処理した、脂質組合せ（ＰＥ（番号８）＆Ｓｏ（番号３１）、６：１、Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０４４５】
５）．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液に、２μＬの脂質組合せを添加し、９０℃で１５分間加熱した。
【０４４６】
２）実験条件：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加した２４時間後、細胞に進入したＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の量を、ＲＴ−ｑＰＣＲ法により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
【０４４７】
結論：結果は、脂質組合せ（ＰＥ（番号８）＆Ｓｏ（番号３１）、６：１、Ｖ／Ｖ）が、ＲＮＡｉＭＡＸよりも良好な送達効果を示し（図４７を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。
【０４４８】
［実施例２−１６］
脂質組合せによるＭＲＣ−５細胞内への二本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
【０４４９】
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌ  ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
【０４５０】
３）自由取込み群：二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１００ｎＭであった）。
【０４５１】
４）脂質組合せ（ＰＥ（番号８）＆Ｓｏ（番号３１）、４：１、Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７混合物の処理群：煮沸法により処理した、２μＬの脂質組合せおよびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０４５２】
５）脂質組合せおよび二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７混合物の処理群：煮沸法により処理した、脂質組合せ（ＰＥ（番号８）＆Ｓｏ（番号３１）、４：１、Ｖ／Ｖ）および他のタイプの脂質（ＭＧ（番号３４）、ＤＧ（番号２）、ＬＰＣ（番号３７）、ＰＣ（番号１２）、ＰＣ（番号１１）、Ｃｅｒ（番号４）、ＦＡ（番号２９）、またはＴＧ（番号３２）、１２：３：５、Ｖ／Ｖ、図４８）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０４５３】
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液に、２μＬの脂質組合せを添加し、９０℃で１５分間加熱した。
【０４５４】
２）実験条件：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加した１２時間後、細胞に進入したＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の量を、ＲＴ−ｑＰＣＲ法により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
【０４５５】
結論：結果は、上記脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であり（図４８を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。ＰＥ（番号８）：Ｓｏ（番号３１）（４：１、Ｖ／Ｖ）は、核酸を細胞内へと効果的に送達することができ、ＲＮＡｉＭＡＸに近い効果を有していた。ＰＥ（番号８）：Ｓｏ（番号３１）およびＭＧ（番号３４）、ＤＧ（番号２）、ＰＣ（番号１２）、ＰＣ（番号１１）、またはＴＧ（番号３２）の１２：３：５比の混合物は、ＰＥ（番号８）：Ｓｏ（番号３１）と比較して、核酸送達の効果を増強することができ、ＰＥ（番号８）：Ｓｏ（番号３１）：ＰＣ（番号１１）は、最良の効果を示し、ＲＮＡｉＭＡＸよりも有意に良好であった。
【０４５６】
［実施例２−１７］
脂質組合せによるＭＲＣ−５細胞内への二本鎖核酸の送達
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞
【０４５７】
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μｌ  ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
【０４５８】
３）自由取込み群：二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、直接添加した（終濃度は１００ｎＭであった）。
【０４５９】
４）脂質組合せ（ＰＥ（番号８）：Ｃｅｒ（番号４）、４：１、Ｖ／Ｖ）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７混合物の処理群：煮沸法により処理した、２μＬの脂質組合せおよびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０４６０】
５）脂質組合せおよび二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７混合物の処理群：煮沸法により処理した、脂質組合せ（ＰＥ（番号８）：Ｃｅｒ（番号４）および他のタイプの脂質ＭＧ（番号３４）、ＤＧ（番号２）、ＬＰＣ（番号３７）、ＰＣ（番号１２）、ＰＣ（番号３１）、ＦＡ（番号２９）、またはＴＧ（番号３２）の混合物、１２：３：５、Ｖ／Ｖ、図４９）および二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０４６１】
２．実験手順
１）煮沸法条件：１００μＬの二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液に、２μＬの脂質組合せを添加し、９０℃で１５分間加熱した。
【０４６２】
２）実験条件：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。細胞に添加した１２時間後、細胞に進入したＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の量を、ＲＴ−ｑＰＣＲ法により検出した。プロトコールは、「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｉｄ」を参照されたい。実験は、すべて三連で実施した。
【０４６３】
結論：結果は、上記脂質組合せが、細胞内への核酸送達に効果的であり（図４９を参照）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。脂質組合せＰＥ（番号８）：Ｃｅｒ（番号４）は、核酸を細胞内へと効果的に送達することができ、ＲＮＡｉＭＡＸに近い効果を有していた。ＰＥ（番号８）：Ｓｏ（番号３１）、およびＤＧ（番号２）、ＦＡ（番号２９）、またはＴＧ（番号３２）の１２：３：５比の混合物は、ＰＥ（番号８）：Ｓｏ（番号３１）と比較して、核酸送達の効果を増強することができ、ＦＡ（番号２９）は、ＰＥ（番号８）：Ｓｏ（番号３１）の送達効果を有意に向上させることができた（ＲＮＡｉＭＡＸよりも有意に良好）。
【０４６４】
［実施例３］
脂質組合せは、消化管を介して肺内への核酸進入を促進する
脂質組合せは、以下の通りであった。
脂質ＰＥ（番号３８）＆ＬＰＣ（番号３７）＆ＴＧ（番号３２）、４：２：３、Ｖ／Ｖ／Ｖ
【０４６５】
１．脂質核酸混合物の調製
方法：煮沸法
４００μＬのＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７（５ｎｍｏｌ）一本鎖ＲＮＡのＤＥＰＣ処理水溶液に、９μＬまたは１８μＬの脂質組合せ（脂質ＰＥ（番号３８）＆ＬＰＣ（番号３７）＆ＴＧ（番号３２）、４：２：３、Ｖ／Ｖ／Ｖ）を添加し、混合し、１００℃で３０分間加熱した。
【０４６６】
２．消化管を介した核酸の送達実験
６〜８週齢雄Ｃ５７マウスにＲＮＡを胃管栄養により投与した。ＨＪＴｓＲＮＡ−ｍ７の水溶液または脂質およびＨＪＴｓＲＮＡ−ｍ７の混合物溶液を、胃管栄養針により、４００μＬ／動物（ＨＪＴｓＲＮＡ−ｍ７、５ｎｍｏｌ／動物）で投与した。群は以下の通りであった。
（１）対照群（ナイーブ群）：いかなる処置も受けなかったマウス、
（２）陰性対照群（脂質群）：９μＬの脂質組合せ（脂質ＰＥ（番号３８）＆ＬＰＣ（番号３７）＆ＴＧ（番号３２）、４：２：３、Ｖ／Ｖ／Ｖ）の胃管栄養による投与、
（３）自由取込み群：一本鎖ＨＪＴｓＲＮＡ−ｍ７  ＲＮＡの胃管栄養による直接投与、
（４）脂質および核酸混合物群：脂質組合せおよび一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７  ＲＮＡの混合物の胃管栄養による投与。
【０４６７】
胃管栄養による投与の３時間後、マウスの肺全体を、３ｍＬのＴＲＩｚｏｌで溶解し、全ＲＮＡを抽出し、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の存在量をＲＴ−ｑＰＣＲにより検出した。
【０４６８】
結論：図５０に示されているように、９μＬまたは１８μＬの脂質組合せ（脂質ＰＥ（番号３８）＆ＬＰＣ（番号３７）＆ＴＧ（番号３２）、４：２：３、Ｖ／Ｖ／Ｖ）は、自由取込み群と比較して、肺組織内への核酸の小断片の進入を有意に促進した（＊は、０．０５未満のＰ値を示す）。胃管栄養によるこの（非侵襲性）投与では、脂質組合せ（脂質ＰＥ（番号３８）＆ＬＰＣ（番号３７）＆ＴＧ（番号３２）、４：２：３、Ｖ／Ｖ／Ｖ）は、核酸の小断片の肺組織への進入を促進することができ、核酸薬送達の手段として使用することができる可能性があった。
【０４６９】
［実施例４］
中国伝統医薬由来脂質混合物により媒介される細胞内への二本鎖核酸の送達の機能実験
【０４７０】
１．番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）脂質混合物は、核酸が細胞内に進入して機能することを媒介した。
【０４７１】
実験方法：ウエスタンブロット、上記の「タンパク質発現レベルのウエスタンブロット検出」を参照されたい。
【０４７２】
１）番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）脂質混合物は、ＭＲＣ−５細胞内への抗線維化二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の進入を媒介した。
【０４７３】
図５１に示されているように、煮沸法および逆相蒸散法により、番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）脂質混合物は、核酸を細胞内に効果的に送達して、機能させることができた。
【０４７４】
ナイーブ群：未処理ＭＲＣ−５細胞、すなわちブランク対照群。
【０４７５】
ＴＧＦβＧ１群：ＭＲＣ−５細胞を、ＴＧＦβ１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）で刺激し、試料を７２時間後に収集した。
【０４７６】
ＮＣ群：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）の脂質組合せおよび二本鎖ＮＣ模倣体の混合物を、ＭＲＣ−５細胞に添加し、十分に混合した。核酸の終濃度は２００ｎＭであった。２４時間後、細胞をＴＧＦβ１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）で刺激し、ＴＧＦβ１により刺激した７２時間後に試料を収集した。
【０４７７】
Ｍ７群：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）の脂質組合せと二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７との混合物を、ＭＲＣ−５細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は２００ｎＭであった。２４時間後、細胞をＴＧＦβ１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）で刺激し、７２時間後に試料を収集した。
【０４７８】
２）番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）脂質混合物は、Ａ５４９細胞内へのｓｉＲＮＡの進入を媒介した。
【０４７９】
図５２および５３に示されているように、煮沸法により、脂質番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）脂質混合物は、核酸を細胞内へと効果的に送達して、タンパク質発現をノックダウンすることができた。
【０４８０】
図５２のナイーブ群：未処理細胞、すなわちブランク対照群。
【０４８１】
ｓｉ−ＮＣ：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）の脂質組合せおよびｓｉ−ＮＣ（Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ  Ｒｉｂｏｂｉｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．により合成、配列不明）の混合物を、Ａ５４９細胞に添加し、混合した。終濃度は４００ｎＭであった。４８時間後に細胞を回収し、ＲＩＰＡ強力溶解緩衝液により溶解して、タンパク質試料を収集した。
【０４８２】
ｓｉ−ＣＰＳＦ３０:：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）の脂質組合せおよびｓｉ−ＣＰＳＦ３０の混合物を、Ａ５４９細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。４８時間後に細胞を回収し、ＲＩＰＡ強力溶解緩衝液により溶解して、タンパク質試料を収集した。
【０４８３】
ｓｉ−ＬＡＭＰ１：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）の脂質組合せおよびｓｉ−ＬＡＭＰ１の混合物を、Ａ５４９細胞に添加し、混合した。終濃度は４００ｎＭであった。４８時間後に細胞を回収し、ＲＩＰＡ強力溶解緩衝液により溶解して、タンパク質試料を収集した。
【０４８４】
ｓｉ−ＬＡＭＰ２：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）の脂質組合せおよびｓｉ−ＬＡＭＰ２の混合物を、Ａ５４９細胞に添加し、混合した。終濃度は４００ｎＭであった。４８時間後に細胞を回収し、ＲＩＰＡ強力溶解緩衝液により溶解して、タンパク質試料を収集した。
【０４８５】
図５３に示されている自由取込み群：核酸溶液を直接添加した。
【０４８６】
Ｌｉｐｏ２０００群：２μＬ  Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびｓｉ−ＮＦ−κＢ溶液を、１００μＬのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、２つを混合し、１５分間維持させ、細胞に添加した。核酸溶液の終濃度は４００ｎＭであった。２４時間後、細胞をｐｏｌｙＩ：Ｃで刺激し（濃度は１μｇ／ｍＬであった）、６時間後にタンパク質試料を収集した。
【０４８７】
番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（１：２）：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（１：２）を、加熱法によりｓｉ−ＮＦ−κＢ溶液と混合し、その後細胞に添加した。核酸溶液の終濃度は４００ｎＭであった。２４時間後に細胞をｐｏｌｙＩ：Ｃで刺激し（濃度は１μｇ／ｍＬであった）、６時間後にタンパク質試料を収集した。
【０４８８】
上記核酸のタイプおよび配列は表２を参照されたい。
【０４８９】
３）番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）脂質混合物は、ＴＨＰ−１細胞内へのｓｉＲＮＡの進入を媒介した。
図５４に示されているように、煮沸法により、番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）脂質混合物は、核酸を細胞内に効果的に送達して、機能させることができた。
【０４９０】
ナイーブ群：未処理細胞、すなわちブランク対照群。
【０４９１】
ＬＰＳ群：ｓｉＲＮＡ無し、しかしながら、ＬＰＳのみを刺激のために添加した。終濃度は１μｇ／ｍＬであった。９時間後にＲＮＡ試料および細胞上清を回収した。
【０４９２】
ｓｉ−ＮＣ群：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）の脂質組合せおよびｓｉ−ＮＣの混合物を、ＴＨＰ−１細胞に添加し、混合した。終濃度は４００ｎＭであった。ＬＰＳを、２４時間後に１μｇ／ｍＬの終濃度で刺激のために添加し、刺激の９時間後、細胞のＴＲＩｚｏｌ溶解物を収集し、ＥＬＩＳＡ検出のために上清を収集した。
【０４９３】
ｓｉ−ＴＮＦα群：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）の脂質組合せおよびｓｉ−ＴＮＦαの混合物を、ＴＨＰ−１細胞に添加し、混合した。終濃度は４００ｎＭであった。ＬＰＳを、２４時間後に１μｇ／ｍＬの終濃度で刺激のために添加し、刺激の９時間後、細胞のＴＲＩｚｏｌ溶解物を収集し、ＥＬＩＳＡ検出のために上清を収集した。
【０４９４】
２．番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号２（ＤＧ）（ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：３）脂質混合物は、核酸が細胞内に進入して機能することを媒介した。
【０４９５】
１）番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号２（ＤＧ）（ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：３）脂質混合物は、ＭＲＣ−５細胞内への抗線維化ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の進入を媒介した。
【０４９６】
図５５に示されているように、煮沸法により、番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号２（ＤＧ）（ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：３）脂質混合物は、抗線維化ＨＪＴｓＲＮＡ−ｍ７を、ＭＲＣ−５細胞内へと効果的に送達して、フィブロネクチンタンパク質発現を低減することができた。
【０４９７】
２）番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号２（ＤＧ）（ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：３）脂質混合物は、ＸＲＮ２  ｓｉＲＮＡがＡ５４９細胞内に進入して遺伝子発現を阻害することを媒介した。
【０４９８】
図５６に示されているように、煮沸法により、番号２（ＤＧ）を、番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号２０（ＤＧ）、ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：３の混合物に追加することにより、核酸を細胞内へと効果的に送達して機能させることができた。
【０４９９】
ナイーブ群：未処理Ａ５４９細胞。
【０５００】
ＮＣ  ｓｉＲＮＡ群：煮沸法により調製した、番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号２（ＤＧ）（ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：３）の脂質混合物およびｓｉ−ＮＣの混合物を細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０５０１】
ＸＲＮ２  ｓｉＲＮＡ群：煮沸法により調製した、番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号２（ＤＧ）（ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：３）の脂質混合物およびＸＲＮ２  ｓｉＲＮＡの混合物を細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０５０２】
３．番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号４（Ｃｅｒ）（ｖ：ｖ：ｖ＝１：２：１）脂質混合物は、核酸が細胞内に進入して機能することを媒介した。
【０５０３】
１）番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号４（Ｃｅｒ）（ｖ：ｖ：ｖ＝１：２：１）脂質混合物は、抗線維化ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７がＭＲＣ−５細胞内に進入して機能することを媒介した（煮沸法）。
【０５０４】
図５７に示されているように、煮沸法により、番号４（Ｃｅｒ）を、番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号２（ＤＧ）（ｖ：ｖ＝１：２）の脂質混合物にｖ：ｖ：ｖ＝１：２：１で追加することにより、抗線維化ＨＪＴｓＲＮＡ−ｍ７を、ＭＲＣ−５細胞内へと効果的に送達して、フィブロネクチンタンパク質発現を低減することができた。
【０５０５】
ナイーブ群：未処理細胞。
【０５０６】
ＴＧＦ−β１群：ＴＧＦ−β１タンパク質を、刺激のために３ｎｇ／ｍＬの終濃度で添加し、７２時間後に試料を収集した。
【０５０７】
ＮＣ群：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）：番号３２（ＴＧ）の脂質組合せ（ｖ：ｖ：ｖ＝３２：８：５）を使用して、ＮＣ模倣体を送達した。２４時間後、ＴＧＦ−β１  ＴＧＦｂ１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）を刺激のために添加し、７２時間後に試料を収集した。
【０５０８】
ｍ７群：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号４（Ｃｅｒ）（ｖ：ｖ：ｖ＝１：２：１）の脂質組合せと二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７との混合物を、ＭＲＣ−５細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。２４時間後、ＴＧＦ−β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）を刺激のために添加し、７２時間後に試料を収集した。
【０５０９】
２）番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号４（Ｃｅｒ）（ｖ：ｖ：ｖ＝１：２：１）脂質混合物は、ＮＦ−κＢ  ｓｉＲＮＡがＡ５４９細胞内に進入して遺伝子発現を阻害することを媒介した（煮沸法）。
【０５１０】
図５８に示されているように、番号４（Ｃｅｒ）を、番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）の脂質混合物にｖ：ｖ：ｖ＝１：２：１で追加することにより、核酸を細胞内へと効果的に送達して機能させることができた。
【０５１１】
ナイーブ群：未処理細胞。
【０５１２】
ｓｉ−ＮＣ群：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号４（Ｃｅｒ）（ｖ：ｖ：ｖ＝１：２：１）の脂質混合物およびｓｉ−ＮＣ  ｓｉＮＣの混合物を細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０５１３】
ｓｉ−ＮＦ−κＢ群：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号４（Ｃｅｒ）（ｖ：ｖ：ｖ＝１：２：１）の脂質混合物およびｓｉ−ＮＦ−κＢ  ｓｉＲＮＡの混合物を細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０５１４】
４．番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号ＰＣ（１１）（ｖ：ｖ：ｖ＝１：２：１）脂質混合物は、核酸が細胞内に進入して機能することを媒介した。
【０５１５】
１）番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号ＰＣ（１１）（ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：３）脂質混合物は、ＸＲＮ２  ｓｉＲＮＡがＡ５４９細胞内に進入して遺伝子発現を阻害することを媒介した。
図５９に示されているように、番号１１（ＰＣ）を、番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）の混合物にｖ：ｖ：ｖ＝１：２：１で追加することにより、核酸を細胞内へと効果的に送達して機能させることができた。
【０５１６】
ナイーブ群：未処理細胞。
【０５１７】
ｓｉ−ＮＣ  ｓｉＮＣ群：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号ＰＣ（１１）（ｖ：ｖ：ｖ＝１：２：１）の脂質混合物およびｓｉ−ＮＣの混合物を細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０５１８】
ｓｉ−ＸＲＮ２群：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号ＰＣ（１１）（ｖ：ｖ：ｖ＝１：２：１）の脂質混合物およびＸＲＮ２  ｓｉＲＮＡの混合物を細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０５１９】
５．番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号ＬＰＣ（３７）（ｖ：ｖ：ｖ＝１：２：１）脂質混合物は、核酸が細胞内に進入して機能することを媒介した。
【０５２０】
１）番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号ＬＰＣ（３７）（ｖ：ｖ：ｖ＝１：２：１）脂質混合物は、ＸＲＮ２  ｓｉＲＮＡがＡ５４９細胞内に進入して遺伝子発現を阻害することを媒介した。
【０５２１】
図６０に示されているように、番号３７（ＬＰＣ）を、番号８（ＰＥ）、番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ＝１：２）の脂質混合物に、ｖ：ｖ：ｖ＝１：２：１で追加することに基づいて、核酸を細胞内へと効果的に送達して、機能させることができた。
【０５２２】
ナイーブ群：未処理細胞。
【０５２３】
ｓｉ−ＮＣ群：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号ＬＰＣ（３７）（ｖ：ｖ：ｖ＝１：２：１）の脂質混合物およびｓｉ−ＮＣの混合物を細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０５２４】
ｓｉ−ＸＲＮ２群：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号ＬＰＣ（３７）（ｖ：ｖ：ｖ＝１：２：１）の脂質混合物およびＸＲＮ２  ｓｉＲＮＡの混合物を細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０５２５】
６．番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号ＭＧ（３４）（ｖ：ｖ：ｖ＝２：３：１）脂質混合物は、核酸が細胞内に進入して機能することを媒介した。
【０５２６】
１）番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号ＭＧ（３４）（ｖ：ｖ：ｖ＝２：３：１）脂質混合物は、ＣＰＳＦ４  ｓｉＲＮＡがＡ５４９細胞内に進入して遺伝子発現を阻害することを媒介した。
【０５２７】
ナイーブ群：未処理細胞。
【０５２８】
ｓｉ−ＮＣ  ｓｉＮＣ群：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号ＭＧ（３４）（ｖ：ｖ：ｖ＝２：３：１）の脂質混合物およびｓｉ−ＮＣｓｉＮＣの混合物を細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０５２９】
ｓｉ−ＣＰＳＦ４群：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号ＭＧ（３４）（ｖ：ｖ：ｖ＝２：３：１）の脂質混合物およびＣＰＳＦ４  ｓｉＲＮＡの混合物を細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０５３０】
図６１に示されているように、番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号ＭＧ（３４）（ｖ：ｖ：ｖ＝２：３：１）脂質混合物は、核酸を細胞内に効果的に送達して、機能させることができた。
【０５３１】
７．番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）：番号３２（ＴＧ）（ｖ：ｖ：ｖ＝３２：８：５）脂質混合物は、核酸が細胞内に進入して機能することを媒介した。
【０５３２】
１）番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）：番号３２（ＴＧ）（ｖ：ｖ：ｖ＝３２：８：５）脂質混合物は、ＭＲＣ−５細胞内への抗線維化ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の進入を媒介した（煮沸法）。
【０５３３】
図６２に示されているように、ｍ７バンドは、対照と比較してより薄色であった。Ｍ７の効果は、細胞を未刺激レベルに回復させるには十分ではなかった。
【０５３４】
ナイーブ群：未処理細胞、すなわちブランク対照群。
【０５３５】
ＴＧＦ−β１群：細胞を、ＴＧＦ−β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）で刺激し、７２時間後に試料を収集した。
【０５３６】
ＮＣ群：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）：番号３２（ＴＧ）の脂質組合せ（ｖ：ｖ：ｖ＝３２：８：５）を使用して、ＮＣ模倣体を送達した。２４時間後、細胞をＴＧＦ−β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）で刺激し、７２時間後に試料を収集した。
【０５３７】
Ｍ７群：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）：番号３２（ＴＧ）（ｖ：ｖ：ｖ＝３２：８：５）の脂質組合せと二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７との混合物を、ＭＲＣ−５細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。２４時間後、細胞をＴＧＦ−β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）で刺激し、７２時間後に試料を収集した。
【０５３８】
２）番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）：番号３２（ＴＧ）（ｖ：ｖ：ｖ＝３２：８：５）脂質混合物は、ＸＲＮ２  ｓｉＲＮＡがＡ５４９細胞内に進入して遺伝子発現を阻害することを媒介した。
【０５３９】
図６３に示されているように、番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）：番号３２（ＴＧ）（ｖ：ｖ：ｖ＝３２：８：５）脂質混合物は、核酸を効果的に送達して細胞内に進入させ、機能させることができた。
【０５４０】
ｓｉ−ＮＣ群：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）：番号３２（ＴＧ）（ｖ：ｖ：ｖ＝３２：８：５）の脂質混合物およびｓｉ−ＮＣの混合物を細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０５４１】
ｓｉ−ＸＲＮ２群：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）：番号３２（ＴＧ）（ｖ：ｖ：ｖ＝３２：８：５）の脂質混合物およびＸＲＮ２  ｓｉＲＮＡの混合物を細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０５４２】
８．番号１（ＤＧ）：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号４（Ｃｅｒ）：番号３１（Ｓｏ）：番号２９（ＦＡ）：番号１６（ＴＧ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝２：１：２：２：３：１：３）脂質混合物は、核酸が細胞内に進入して機能することを媒介した。
【０５４３】
１）図６４に示されているように、番号１（ＤＧ）：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号４（Ｃｅｒ）：番号３１（Ｓｏ）：番号２９（ＦＡ）：番号１６（ＴＧ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝２：１：２：２：３：１：３）脂質混合物は、ＭＲＣ−５細胞内への抗線維化ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の進入を媒介した（煮沸法）。
【０５４４】
ナイーブ群：未処理細胞、すなわちブランク対照群。
【０５４５】
ＴＧＦ−β１群：細胞を、ＴＧＦ−β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）で刺激し、７２時間後に試料を収集した。
【０５４６】
ＮＣ群：番号１（ＤＧ）：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号４（Ｃｅｒ）：番号３１（Ｓｏ）：番号２９（ＦＡ）：番号１６（ＴＧ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝２：１：２：２：３：１：３）の脂質組合せを使用して、ＮＣ模倣体を送達した。２４時間後、ＴＧＦ−β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）を刺激のために添加し、７２時間後に試料を収集した。
【０５４７】
Ｍ７群：番号１（ＤＧ）：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号４（Ｃｅｒ）：番号３１（Ｓｏ）：番号２９（ＦＡ）：番号１６（ＴＧ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝２：１：２：２：３：１：３）の脂質組合せと二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７との混合物を、ＭＲＣ−５細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。２４時間後、ＴＧＦ−β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）を刺激のために添加し、７２時間後に試料を収集した。
【０５４８】
２）図６５に示されているように、番号１（ＤＧ）：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号４（Ｃｅｒ）：番号３１（Ｓｏ）：番号２９（ＦＡ）：番号１６（ＴＧ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝２：１：２：２：３：１：３）脂質混合物は、ＸＲＮ２  ｓｉＲＮＡがＡ５４９細胞内に進入して、遺伝子発現を阻害することを媒介した（煮沸法）。
【０５４９】
番号１（ＤＧ）：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号４（Ｃｅｒ）：番号３１（Ｓｏ）：番号２９（ＦＡ）：番号１６（ＴＧ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝２：１：２：２：３：１：３）脂質混合物は、核酸を効果的に送達して細胞に進入させ、機能させることができた。
【０５５０】
ｓｉ−ＮＣ群：番号１（ＤＧ）：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号４（Ｃｅｒ）：番号３１（Ｓｏ）：番号２９（ＦＡ）：番号１６（ＴＧ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝２：１：２：２：３：１：３）脂質混合物およびｓｉ−ＮＣの混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０５５１】
ｓｉ−ＸＲＮ２群：番号１（ＤＧ）：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号４（Ｃｅｒ）：番号３１（Ｓｏ）：番号２９（ＦＡ）：番号１６（ＴＧ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝２：１：２：２：３：１：３）脂質混合物およびｓｉ−ＸＲＮ２  ｓｉＲＮＡの混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０５５２】
９．番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号３１（Ｓｏ）：番号２９（ＦＡ）：番号４（Ｃｅｒ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：２：２：５）脂質混合物は、核酸が細胞内に進入して機能することを媒介した。
【０５５３】
１）図６６に示されているように、番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号３１（Ｓｏ）：番号２９（ＦＡ）：番号４（Ｃｅｒ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：２：２：５）脂質混合物は、ＭＲＣ−５細胞内への抗線維化ＨＪＴ−ｓＲＮＡ、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−３、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ａ２、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｈ３、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の進入を媒介した（煮沸法）。
【０５５４】
ナイーブ群：未処理細胞、すなわちブランク対照群。
【０５５５】
ＴＧＦ−β１群：細胞を、ＴＧＦ−β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）で刺激し、７２時間後に試料を収集した。
【０５５６】
ＮＣ群：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号３１（Ｓｏ）：番号２９（ＦＡ）：番号４（Ｃｅｒ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：２：２：５）の脂質組合せを使用して、ＮＣ模倣体を送達した。２４時間後、細胞をＴＧＦ−β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）で刺激し、７２時間後に試料を収集した。
【０５５７】
Ｍ７群：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号３１（Ｓｏ）：番号２９（ＦＡ）：番号４（Ｃｅｒ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：２：２：５）の脂質組合せとＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖との混合物を、ＭＲＣ−５細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。２４時間後、細胞をＴＧＦ−β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）で刺激し、７２時間後に試料を収集した。
【０５５８】
２）図６７に示されているように、番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号３１（Ｓｏ）：番号２９（ＦＡ）：番号４（Ｃｅｒ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：２：２：５）脂質混合物は、ＸＲＮ２  ｓｉＲＮＡがＡ５４９細胞内に進入して、遺伝子発現を阻害することを媒介した（煮沸法）。
【０５５９】
番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号３１（Ｓｏ）：番号２９（ＦＡ）：番号４（Ｃｅｒ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：２：２：５）脂質混合物は、核酸を細胞内に効果的に送達して機能させることができた。
【０５６０】
ｓｉ−ＮＣ群：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号３１（Ｓｏ）：番号２９（ＦＡ）：番号４（Ｃｅｒ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：２：２：５）の脂質混合物およびｓｉ−ＮＣの混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０５６１】
ｓｉ−ＸＲＮ２群：番号８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号３１（Ｓｏ）：番号２９（ＦＡ）：番号４（Ｃｅｒ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝２：４：２：２：５）の脂質混合物およびＸＲＮ２  ｓｉＲＮＡの混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０５６２】
１０．番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）（ｖ：ｖ＝４：１）脂質混合物は、核酸が細胞内に進入して機能することを媒介した。
【０５６３】
１）図６８に示されているように、番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）（ｖ：ｖ＝４：１）脂質混合物は、ＭＲＣ−５細胞内への抗線維化ＨＪＴ−ｓＲＮＡ、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−３、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ａ２、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｈ３、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の進入を媒介した（煮沸法）。
【０５６４】
ナイーブ群：未処理細胞、すなわちブランク対照群。
【０５６５】
ＴＧＦ−β１群：細胞を、ＴＧＦ−β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）で刺激し、７２時間後に試料を収集した。
【０５６６】
ＮＣ群：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）（ｖ：ｖ＝４：１）の脂質組合せを使用して、ＮＣ模倣体を送達した。２４時間後、細胞をＴＧＦ−β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）で刺激し、７２時間後に試料を収集した。
【０５６７】
Ｍ７群：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）（ｖ：ｖ＝４：１）の脂質組合せとＨＪＴ−ｓＲＮＡ−３、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ａ２、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｈ３、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７との混合物を、ＭＲＣ−５細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。２４時間後、細胞をＴＧＦ−β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）で刺激し、７２時間後に試料を収集した。
【０５６８】
２）図６９に示されているように、番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）（ｖ：ｖ＝４：１）脂質混合物は、ＸＲＮ２  ｓｉＲＮＡがＡ５４９細胞内に進入して遺伝子発現を阻害することを媒介した（煮沸法）。
番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）（ｖ：ｖ＝４：１）脂質混合物は、核酸を効果的に送達して細胞内に進入させ、機能させることができた。
【０５６９】
ｓｉ−ＮＣ群：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）（ｖ：ｖ＝４：１）の脂質混合物およびｓｉ−ＮＣの混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０５７０】
ｓｉ−ＸＲＮ２群：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）（ｖ：ｖ＝４：１）の脂質混合物およびＸＲＮ２  ｓｉＲＮＡの混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０５７１】
１１．番号３８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号２（ＤＧ）（ｖ：ｖ：ｖ＝４：１：３）脂質混合物は、核酸が細胞内に進入して機能することを媒介した。
【０５７２】
図７０に示されているように、番号３８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号２（ＤＧ）（ｖ：ｖ：ｖ＝４：１：３）脂質混合物は、ＸＲＮ２  ｓｉＲＮＡがＡ５４９細胞内に進入して遺伝子発現を阻害することを媒介した。
【０５７３】
番号８（ＰＥ）の代わりの番号３８（ＰＥ）と、番号１２（ＰＣ）、番号２（ＤＧ）との脂質混合物（ｖ：ｖ：ｖ＝４：１：３）は、核酸を効果的に送達して細胞に進入させ、機能させることができた。
【０５７４】
ｓｉ−ＮＣ群：番号３８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号２（ＤＧ）（ｖ：ｖ：ｖ＝４：１：３）の脂質混合物およびｓｉ−ＮＣの混合物を細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０５７５】
ｓｉ−ＸＲＮ２群：番号３８（ＰＥ）：番号１２（ＰＣ）：番号２（ＤＧ）（ｖ：ｖ：ｖ＝４：１：３）の脂質混合物およびＸＲＮ２  ｓｉＲＮＡの混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０５７６】
１２．番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ：ｖ＝４：１：１）脂質混合物は、核酸が細胞内に進入して機能することを媒介した。
【０５７７】
図７１に示されているように、番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ：ｖ＝４：１：１）脂質混合物は、ＸＲＮ２  ｓｉＲＮＡがＡ５４９細胞内に進入して遺伝子発現を阻害することを媒介した（逆相蒸散法）。
【０５７８】
番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ：ｖ＝４：１：１）を、番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）（ｖ：ｖ＝４：１）の脂質混合物に追加することにより、核酸を細胞内へと効果的に送達して、遺伝子発現を阻害することができた。
【０５７９】
ｓｉ−ＮＣ群：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ：ｖ＝４：１：１）の脂質混合物およびｓｉ−ＮＣの混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０５８０】
ｓｉ−ＲＮＡ群：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）：番号１２（ＰＣ）（ｖ：ｖ：ｖ＝４：１：１）の脂質混合物およびＸＲＮ２  ｓｉＲＮＡ、β−アクチン  ｓｉＲＮＡ、Ｓｓｕ７２  ｓｉＲＮＡ、またはＣＰＳＦ４  ｓｉＲＮＡの混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０５８１】
１３．番号４（Ｃｅｒ）：番号１２（ＰＣ）：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝５：２：８：３）脂質混合物は、核酸が細胞内に進入して機能することを媒介した。
【０５８２】
１）図７２に示されているように、番号４（Ｃｅｒ）を、番号３８（ＰＥ）、番号３７（ＬＰＣ）、番号１２（ＰＣ）の脂質混合物に追加することにより、番号４（Ｃｅｒ）：番号１２（ＰＣ）：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝５：２：８：３）の脂質混合物がもたらされ、これは、抗線維化ＨＪＴ−ｓＲＮＡ、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−３、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ａ２、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｈ３、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖ＲＮＡがＭＲＣ−５細胞内に進入して、フィブロネクチン発現レベルを低減することを媒介した（煮沸法）。
【０５８３】
ナイーブ群：未処理細胞、すなわちブランク対照群。
【０５８４】
ＴＧＦ−β１群：細胞を、ＴＧＦ−β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）で刺激し、７２時間後に試料を収集した。
【０５８５】
ＮＣ群：番号４（Ｃｅｒ）：番号１２（ＰＣ）：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝５：２：８：３）の脂質組合せを使用して、ＮＣ模倣体を送達した。２４時間後、刺激のためにＴＧＦ−β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）を添加し、７２時間後に試料を収集した。
【０５８６】
ＨＪＴ−３＆ａ２＆ｈ３群：番号４（Ｃｅｒ）：番号１２（ＰＣ）：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝５：２：８：３）の脂質混合物と、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−３、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ａ２、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｈ３、およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖との混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０５８７】
ｍ７群：番号４（Ｃｅｒ）：番号１２（ＰＣ）：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝５：２：８：３）の脂質組合せと、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７との混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０５８８】
２）図７３に示されているように、番号４（Ｃｅｒ）：番号１２（ＰＣ）：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝５：２：８：３）脂質混合物は、ＸＲＮ２  ｓｉＲＮＡが細胞内に進入して遺伝子発現を阻害することを媒介した。
【０５８９】
ｓｉ−ＮＣ群：番号４（Ｃｅｒ）：番号１２（ＰＣ）：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝５：２：８：３）の脂質混合物およびｓｉ−ＮＣの混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０５９０】
ｓｉ−ＸＲＮ２群：番号４（Ｃｅｒ）：番号１２（ＰＣ）：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）（ｖ：ｖ：ｖ：ｖ＝５：２：８：３）の脂質混合物およびＸＲＮ２  ｓｉＲＮＡの混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０５９１】
１４．番号３８（ＰＥ）：番号２（ＤＧ）：番号３１（Ｓｏ）（ｖ：ｖ：ｖ＝４：２：３）脂質混合物は、核酸が細胞内に進入して機能することを媒介した。
【０５９２】
１）図７４に示されているように、番号３８（ＰＥ）：番号２（ＤＧ）：番号３１（Ｓｏ）（ｖ：ｖ：ｖ＝４：２：３）脂質混合物は、抗線維化ＨＪＴ−ｓＲＮＡ、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−３、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ａ２、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｈ３、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖ＲＮＡがＭＲＣ−５細胞内に進入して、フィブロネクチン発現レベルを低減することを媒介した（煮沸法）。
【０５９３】
ナイーブ群：未処理細胞、すなわちブランク対照群。
【０５９４】
ＴＧＦ−β１群：細胞を、ＴＧＦ−β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）で刺激し、７２時間後に試料を収集した。
【０５９５】
ＮＣ群：番号３８（ＰＥ）：番号２（ＤＧ）：番号３１（Ｓｏ）（ｖ：ｖ：ｖ＝４：２：３）の脂質組合せを使用して、ＮＣ模倣体を送達した。２４時間後、刺激のためにＴＧＦ−β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）を添加し、７２時間後に試料を収集した。
【０５９６】
ＨＪＴ−３＆ａ２＆ｈ３群：番号３８（ＰＥ）：番号２（ＤＧ）：番号３１（Ｓｏ）（ｖ：ｖ：ｖ＝４：２：３）の脂質混合物と、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−３、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ａ２、およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｈ３との混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０５９７】
Ｍ７群：番号３８（ＰＥ）：番号３７（ＬＰＣ）（ｖ：ｖ＝４：１）の脂質組合せとＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７との混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０５９８】
２）図７５に示されているように、番号３８（ＰＥ）：番号２（ＤＧ）：番号３１（Ｓｏ）（ｖ：ｖ：ｖ＝４：２：３）脂質混合物は、ＸＲＮ２  ｓｉＲＮＡがＡ５４９細胞内に進入して遺伝子発現を阻害することを媒介した（煮沸法）。
【０５９９】
番号３８（ＰＥ）：番号２（ＤＧ）：番号３１（Ｓｏ）（ｖ：ｖ：ｖ＝４：２：３）脂質混合物は、ＸＲＮ２  ｓｉＲＮＡをＡ５４９細胞内に効果的に送達して機能させた。
【０６００】
ｓｉ−ＮＣ群：番号３８（ＰＥ）：番号２（ＤＧ）：番号３１（Ｓｏ）（ｖ：ｖ：ｖ＝４：２：３）の脂質混合物およびｓｉ−ＮＣの混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０６０１】
ｓｉ−ＸＲＮ２群：番号３８（ＰＥ）：番号２（ＤＧ）：番号３１（Ｓｏ）（ｖ：ｖ：ｖ＝４：２：３）の脂質混合物およびＸＲＮ２  ｓｉＲＮＡの混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０６０２】
［実施例５］
脂質番号４１およびその組成物の効果の検証
Ｉ．単一脂質は、異なる調製方法（逆相蒸散法および煮沸法）により、核酸（二本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＲＮＡ）を細胞内へと送達した。
脂質番号４１。スフィンガニン（ｄ２２：０）
【０６０３】
【化１１】
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【０６０４】
１．脂質による核酸送達の効率の定量リアルタイムＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）検出
図７６に示されているように、異なる方法（煮沸法または逆相蒸散法）により調製された脂質番号４１は、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖ＲＮＡをＡ５４９細胞内へと送達した。Ａ５４９細胞では、煮沸法の場合、脂質番号４１の送達効果は、ＲＮＡｉＭＡＸの送達効率の約２倍であった。逆相蒸散法の場合も、脂質番号４１の送達効果は、ＲＮＡｉＭＡＸの送達効果よりも有意に高かった。
【０６０５】
図７７に示されているように、異なる方法（煮沸法または逆相蒸散法）により調製された脂質番号４１は、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖ＲＮＡをＭＲＣ−５細胞内へと送達した。ＭＲＣ−５細胞では、煮沸法の場合、脂質番号４１は、二本鎖ＲＮＡをＭＲＣ−５細胞内へと送達した。逆相蒸散法の場合、脂質番号４１の送達効果は、ＲＮＡｉＭＡＸの送達効果よりも有意に高かった。
【０６０６】
図７８に示されているように、脂質番号４１は、煮沸法により、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖ＲＮＡを、Ａ５４９およびＭＲＣ−５細胞内へと送達した。
【０６０７】
２．脂質による核酸送達の効率のデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）検出
２．１  実験材料：Ａ５４９細胞は、Ｃｅｌｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入し、ＴＲＩｚｏｌ溶解緩衝液は、Ｓｉｇｍａから購入し、高容量ｃＲＮＡ逆転写キットは、ＡＢＩ、ＵＳＡから購入し、デジタルＰＣＲ関連試薬は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＵＳＡから購入した。
【０６０８】
２．２  実験方法：全細胞ＲＮＡを収集し、上記の方法に従ってＴＲＩｚｏｌ溶解緩衝液により抽出し、高容量ｃＲＮＡ逆転写キットを使用して、ｃＤＮＡへと逆転写し、異なる群に由来するｃＤＮＡを、デジタルＰＣＲ反応にかけた。プロトコールは、ＱＸ２００  Ｄｒｏｐｌｅｔ  ＲｅａｄｅｒおよびＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェアマニュアルを参照して、結果をＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェアを使用して分析した。群は以下の通りであった：（１）ナイーブ群：処理していないＡ５４９細胞。（２）自由取込み群：細胞を、ＨＪＴｓＲＮＡ−ｍ７  ｄｓＲＮＡと共に直接的に６時間インキュベートした。（３）ＲＮＡｉＭＡＸ群：Ａ５４９細胞を、ＲＮＡｉＭＡＸによりＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７  ｄｓＲＮＡでトランスフェクトし、６時間後に試料を検出のために収集した。（４）番号４１群：異なる方法（煮沸法または逆相蒸散法）により調製した脂質番号４１は、二本鎖ＲＮＡをＡ５４９細胞内へと送達した。６時間後に試料を検出のために収集した。
【０６０９】
実験結果および分析：図７９に示されているように、脂質番号４１は、煮沸法および逆相蒸散法の両方により、ＨＪＴーｓＲＮＡ−ｍ７  ｄｓＲＮＡをＡ５４９細胞内へと効果的に送達することができた。煮沸法は、逆相蒸散法よりも良好な効果を示した。
【０６１０】
３．脂質による核酸送達の効率のフローサイトメトリー検出
実験材料：Ａ５４９細胞（Ｃｅｌｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入）、ＦＡＭ−ｓＲＮＡ（Ｒｉｂｏｂｉｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）、脂質番号４１、Ａｃｃｕｒｉ（登録商標）Ｃ６機器（ＢＤ、ＵＳＡから購入）。
【０６１１】
実験方法：ＰＧＹ−ｓＲＮＡ−６−ＦＡＭを、１００μｌの水に溶解し、４μｌの脂質と混合し、煮沸法により調製した。その後、混合物を、Ａ５４９細胞に滴下し、共インキュベーションの６時間後、試料を以下の通り、検出のために収集した：まず、ＰＢＳで３回洗浄し、その後トリプシンで３分間消化し、トリプシンを除去し、再びＰＢＳで洗浄し、その後細胞を吹下した。検出は、Ａｃｃｕｒｉ（登録商標）Ｃ６機器を使用して実施した。
【０６１２】
図８０に示されている実験結果：脂質番号４１は、ＰＧＹ−ｓＲＮＡ−６一本鎖ＲＮＡの送達に９４．１％の効率を示した。これは、陽性対照ＲＮＡｉＭＡＸの６９．４％よりも高かった。また、脂質番号４１は、ＰＧＹ−ｓＲＮＡ−６二本鎖ＲＮＡの送達に９６．７％の効率を示した。これも、陽性対照ＲＮＡｉＭＡＸの９４．９％よりも高かった。脂質４１は、一本鎖および二本鎖核酸をＡ５４９細胞内へと効果的に送達することができた。
【０６１３】
４．脂質により細胞に送達された核酸の局在化の共焦点蛍光顕微鏡法による観察
実験材料：Ａ５４９細胞（Ｃｅｌｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した）、ＰＧＹ−ｓＲＮＡ−６−Ｃｙ３（Ｒｉｂｏｂｉｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入した）、脂質番号４１、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７８０（Ｚｅｉｓｓ、ドイツから購入した）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ファロイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡから購入した）、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡから購入した）、パラホルムアルデヒド（ｓｉｇｍａ、ＵＳＡから購入した）。
【０６１４】
実験方法：ＰＧＹ−ｓＲＮＡ−６−ＦＡＭを、１００μｌの水に溶解し、４μｌの脂質と混合し、煮沸法により調製した。その後、混合物をＡ５４９細胞に滴下し、共インキュベーションの６時間後、試料をＰＢＳで３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ファロイジンで３０分間の染色し、ＰＢＳで３回洗浄し、ＤＡＰＩで５分間染色し、ＰＢＳで洗浄し、その後密封した。
【０６１５】
図８１に示されている実験結果：赤色のＰＧＹ−ｓＲＮＡ−６−Ｃｙ３の進入を、共焦点顕微鏡で明白に観察することができた。脂質番号４１は、二本鎖核酸をＡ５４９細胞内へと効果的に送達することができた。
【０６１６】
５．脂質による核酸送達の効率のウエスタンブロット検出
図８２に示されているように、単一脂質番号４１は、ｓＲＮＡｉがＭＲＣ−５Ａ５４９細胞内に進入してタンパク質発現をノックダウンすることを媒介した（逆相蒸散法による）。タンパク質レベルでは、単一脂質番号４１により媒介されたタンパク質ノックダウン効果は、ＲＮＡｉＭＡＸにより媒介されたＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の阻害効果よりも有意に高かった。
【０６１７】
ナイーブ群：未処理ＭＲＣ−５Ａ５４９細胞。
【０６１８】
ｓｉＮＣ群：単一脂質番号４１およびｓｉＮＣの混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０６１９】
ｓｉＮＣ群：単一脂質番号４１およびＬＡＭＰ２、ＸＰＮ２、Ｓｓｕ７２、ＣＰＳＦ４、またはβ−アクチン  ｓｉＲＮＡの混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０６２０】
自由取込み群：試験物質を直接添加した。
【０６２１】
ＲＮＡｉＭＡＸ群：２ｕｌ  ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および核酸溶液を、１００ｕｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、２つを混合し、１５分間維持させ、細胞に添加し、その後混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０６２２】
Ｓｏ（４１）群（逆相蒸散法）：脂質番号４１および核酸の混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０６２３】
図８３に示されているように、単一脂質番号４１は、ＭＲＣ−５細胞内への抗線維化ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖の進入を媒介した（逆相蒸散法）。タンパク質レベルでは、単一脂質番号４１が媒介したＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７阻害は、ＲＮＡｉＭＡＸが媒介したＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７阻害よりも高かった。
【０６２４】
ＴＧＦβ１群：ＴＧＦ−β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）を刺激のために添加し、７２時間後に試料を収集した。
【０６２５】
ＮＣ群：単一脂質番号４１は、ＮＣ模倣体を送達した。２４時間後、細胞をＴＧＦ−β１  ＴＧＦｂ１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）で刺激し、７２時間後に試料を収集した。
【０６２６】
ＨＪＴ−３＆ａ２＆Ｈ３群：単一脂質番号４１ならびにＨＪＴ−ｓＲＮＡ−３、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ａ２、およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｈ３の混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０６２７】
ｍ７群：単一脂質番号４１およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０６２８】
６．脂質番号４１のｉｎ  ｖｉｖｏ結果の要約
［実験方法］
６〜８週齢マウス、２２〜２４ｇを、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの動物センターのＳＰＦ室で飼育した。胃内投与の前に、マウスを１２時間絶食させた。マウスを、ランダムに３群に分割した：（１）対照群、４００μｌのＤＥＰＣ処理水、胃内投与；（２）自由取込み群、小分子ＲＮＡ（ＰＧＹ−ｓＲＮＡ−２６、ＰＧＹ−ｓＲＮＡ−３２、およびＰＧＹ−ｓＲＮＡ−２３）、各小分子ＲＮＡ  １ｎｍｏｌ／動物、４００μｌのＤＥＰＣ処理水に溶解、胃内投与；（３）脂質番号４１群：加熱法により調製した小分子ＲＮＡ（ＰＧＹ−ｓＲＮＡ−２６およびＰＧＹ−ｓＲＮＡ−３２）および脂質番号４１の混合物を胃内投与した。各小分子ＲＮＡ  １ｎｍｏｌ／動物、脂質番号４１  １０μｌ／動物、４００μｌのＤＥＰＣ処理水に溶解。組織および器官試料はすべて、胃内投与の６時間後に収集した。小分子ＲＮＡはすべて、３ｐ末端２−Ｏメチル化により修飾された一本鎖ＲＮＡであった。
【０６２９】
［実験結果］
図１０８に示されているように、脂質番号４１は、血液中への小分子ＲＮＡの進入を促進し、血液中での分解からそれを保護することができた。
【０６３０】
図１０９に示されているように、脂質番号４１は、胃細胞内への小分子ＲＮＡの進入を促進し、胃での分解からそれを保護することができた。
【０６３１】
図１１０に示されているように、脂質番号４１は、小腸細胞内への小分子ＲＮＡの進入を促進し、小腸での分解からそれを保護することができた。
【０６３２】
図１１１に示されているように、脂質番号４１は、肝臓内への小分子ＲＮＡの進入を促進し、肝臓での分解からそれを保護することができた。
【０６３３】
７．脂質番号４１を含む脂質組合せの核酸送達に対する効果
１）核酸送達に対する、脂質組合せ１（番号８＋番号４１＝６：１）および脂質組合せ２（番号３８＋番号４１＝６：１）の効果。
【０６３４】
図８４に示されているように、脂質組合せ１（番号８＋番号４１＝６：１）および脂質組合せ２（番号３８＋番号４１＝６：１）は、ＭＲＣ−５細胞内への抗線維化ＨＪＴ−３＆ａ２＆Ｈ３、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の進入を媒介し（加熱法）、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の有意な阻害効果をタンパク質レベルで媒介した。
【０６３５】
ＴＧＦ：ＴＧＦ−β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）を刺激のために添加し、７２時間後に試料を収集した。
【０６３６】
ＮＣ群：単一脂質番号４１を使用して、ＮＣ模倣体を送達した。２４時間後、ＴＧＦ−β１  ＴＧＦｂ１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）を刺激のために添加し、７２時間後に試料を収集した。
【０６３７】
ＨＪＴ−３＆ａ２＆Ｈ３群：脂質混合物と、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−３、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ａ２、およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｈ３との混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０６３８】
ＨＪＴ−ｍ７群：脂質混合物およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０６３９】
２）核酸送達に対する、脂質組合せ３（番号３９＋番号４１＝６：１）および脂質組合せ４（番号４０＋番号４１＝６：１）の効果。
【０６４０】
図８５に示されているように、脂質組合せ３（番号３９＋番号４１＝６：１）および脂質組合せ４（番号４０＋番号４１＝６：１）は、ＭＲＣ−５細胞内への抗線維化ＨＪＴ−３＆ａ２＆Ｈ３、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の進入を媒介し（加熱法）、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の有意な阻害効果をタンパク質レベルで媒介した。
【０６４１】
ＴＧＦ：ＴＧＦ−β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）を刺激のために添加し、７２時間後に試料を収集した。
【０６４２】
ＮＣ群：単一脂質番号４１を使用して、ＮＣ模倣体を送達した。２４時間後、ＴＧＦ−β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）を刺激のために添加し、７２時間後に試料を収集した。
【０６４３】
ＨＪＴ−３＆ａ２＆Ｈ３群：脂質混合物と、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−３、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ａ２、およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−Ｈ３との混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０６４４】
ＨＪＴ−ｍ７：脂質混合物およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０６４５】
３）核酸送達に対する、脂質組合せ５（番号３８＋１２＋４１＋２９＝１：２：１：１）の効果。
【０６４６】
図８６に示されているように、脂質組合せ５（番号３８＋１２＋４１＋２９＝１：２：１：１）は、ＭＲＣ−５細胞内への抗線維化ＨＪＴ−３＆ａ２＆Ｈ３およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の進入を媒介し（加熱法）、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の有意な阻害効果をタンパク質レベルで媒介した。
【０６４７】
ＴＧＦ：ＴＧＦ−β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）を刺激のために添加し、７２時間後に試料を収集した。
【０６４８】
ＮＣ群：単一脂質番号４１を使用して、ＮＣ模倣体を送達した。２４時間後、ＴＧＦ−β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）を刺激のために添加し、７２時間後に試料を収集した。
【０６４９】
ＨＪＴ−３＆ａ２＆Ｈ３群：脂質混合物と、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−３、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ａ２、およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−Ｈ３混合物との混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０６５０】
ＨＪＴ−ｍ７：脂質混合物およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０６５１】
４）核酸送達に対する、脂質組合せ６（番号４０（ＰＥ）＋番号１２（ＰＣ）＋番号４１（Ｓｏ）＝２：４：３）の効果。
【０６５２】
図８７に示されているように、脂質組合せ６（番号４０（ＰＥ）＋番号１２（ＰＣ）＋番号４１（Ｓｏ）＝２：４：３）は、ＭＲＣ−５細胞内への抗線維化ＨＪＴ−３＆ａ２＆Ｈ３、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の進入を媒介し（煮沸法および逆相蒸散法）、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の有意な阻害効果をタンパク質レベルで媒介した。
【０６５３】
ＴＧＦ：ＴＧＦ−β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）を刺激のために添加し、７２時間後に試料を収集した。
【０６５４】
３’−ＮＣ群：脂質番号４１を使用して、ＮＣ模倣体を送達し、２４時間後、ＴＧＦ−β１  ＴＧＦｂ１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）を刺激のために添加し、７２時間後に試料を収集した。
【０６５５】
３’−３＆ａ２＆Ｈ３群：脂質混合物と、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−３、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ａ２、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−Ｈ３との混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０６５６】
３’−ｍ７：脂質混合物およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０６５７】
右側の図：脂質−ＲＮＡ混合物を逆相蒸散法により調製した。脂質組合せ６（番号４０（ＰＥ）＋番号１２（ＰＣ）＋番号４１（Ｓｏ）＝２：４：３）は、ＸＲＮ２、Ｓｓｕ７２、ＣＰＳＦ４  ｓｉＲＮＡを、Ａ５４９細胞内に効果的に送達することができた。それにより、タンパク質レベルでの発現レベルが有意に低減される。
【０６５８】
ｓｉＮＣ：脂質混合物およびｓｉＮＣの混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０６５９】
ｓｉＲＮＡ：脂質混合物およびＸＲＮ２、Ｓｓｕ７２、ＣＰＳＦ４  ｓｉＲＮＡの混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０６６０】
５）核酸送達に対する、脂質組合せ７（番号１２（ＰＣ）＋番号４１（Ｓｏ）＝６：１）および脂質組合せ８（番号１２（ＰＣ）＋番号４１（Ｓｏ）＝６：１）の効果。
【０６６１】
図８８に示されているように、逆相蒸散法により、脂質組合せ７（番号１２（ＰＣ）＋番号４１（Ｓｏ）＝６：１）および脂質組合せ８（番号１２（ＰＣ）＋番号４１（Ｓｏ）＝６：１）は、Ｓｓｕ７２、ＣＰＳＦ４  ｓｉＲＮＡをＡ５４９細胞内へと効果的に送達することができ、タンパク質レベルでの発現レベルが有意に低減された。
【０６６２】
ｓｉＮＣ：脂質混合物およびｓｉＮＣの混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０６６３】
ｓｉＲＮＡ：脂質混合物およびＸＲＮ２、Ｓｓｕ７２、ＣＰＳＦ４  ｓｉＲＮＡの混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０６６４】
６）核酸送達に対する、脂質組合せ９（番号１２（ＰＣ）＋番号４１（Ｓｏ）＝６：１）および脂質組合せ１０（番号４０（ＰＥ）＋番号１２（ＰＣ）＋番号４１（Ｓｏ）＝２：２：２）の効果。
【０６６５】
図８９に示されているように、逆相蒸散法により、脂質組合せ９（番号１２（ＰＣ）＋番号４１（Ｓｏ）＝６：１）および脂質組合せ１０（番号４０（ＰＥ）＋番号１２（ＰＣ）＋番号４１（Ｓｏ）＝２：２：２）は、ＸＲＮ２、Ｓｓｕ７２、ＣＰＳＦ４  ｓｉＲＮＡをＡ５４９細胞内へと効果的に送達することができ、タンパク質レベルでの発現レベルが有意に低減された。
【０６６６】
ｓｉＮＣ：脂質混合物およびｓｉＮＣの混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０６６７】
ｓｉＲＮＡ：脂質混合物およびＸＲＮ２、Ｓｓｕ７２、ＣＰＳＦ４  ｓｉＲＮＡの混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０６６８】
７）核酸送達に対する、脂質組合せ１１（番号４（Ｃｅｒ）＋番号１２（ＰＣ）＋番号４１（Ｓｏ）＝１：１：１）の効果。
【０６６９】
図９０に示されているように、逆相蒸散法により、脂質組合せ１１（番号４（Ｃｅｒ）＋番号１２（ＰＣ）＋番号４１（Ｓｏ）＝１：１：１）は、Ｓｓｕ７２  ｓｉＲＮＡをＡ５４９細胞内へと効果的に送達することができ、タンパク質レベルでの発現レベルが有意に低減された。
【０６７０】
ｓｉＮＣ：脂質混合物およびｓｉＮＣの混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０６７１】
ｓｉＳｓｕ７２：脂質混合物およびＳｓｕ７２  ｓｉＲＮＡの混合物を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０６７２】
［実施例６］
脂質番号３８およびその組合せの効果の検証
脂質番号３８ＰＥ（１６：０／１６：１）
【０６７３】
【化１２】
2020515616.tif 000028
【０６７４】
１．脂質による核酸送達の効率の定量リアルタイムＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）検出
（１）煮沸法による脂質番号３８は、二本鎖ＲＮＡをＡ５４９およびＭＲＣ−５細胞内へと送達した。
【０６７５】
図９１に示されているように、加熱法による脂質番号３８は、二本鎖ＲＮＡをＡ５４９およびＭＲＣ−５細胞内へと送達した。ＭＲＣ−５細胞では、加熱法の場合、二本鎖ＲＮＡに対する脂質番号３８の送達効果は、ＲＮＡｉＭＡＸの送達効果の約２倍であった。
【０６７６】
１）ナイーブ群：未処理Ａ５４９細胞。
【０６７７】
２）自由取込み群：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７  ｄｓＲＮＡを、細胞と共に直接的に１２時間インキュベートした。核酸の終濃度は１００ｎＭであった。
【０６７８】
３）ＲＮＡｉＭＡＸ群：２μｌ  ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間静置させ、細胞に添加し、その後混合した。ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖の終濃度は１００ｎＭであった。
【０６７９】
４）脂質および核酸の処理群：２．５μＬの単一脂質番号３８およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、煮沸法または逆相蒸散法により調製し、その後Ａ５４９細胞に添加した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。１２時間後、試料を収集して、進入の量を検出した。
【０６８０】
（２）煮沸法による脂質番号３８は、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖ＲＮＡを、Ａ５４９およびＭＲＣ−５細胞内へと送達した。
図９２に示されているように、加熱法による脂質番号３８は、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖ＲＮＡをＡ５４９およびＭＲＣ−５細胞内へと送達した。送達効率は、ＲＮＡｉＭＡＸの送達効率よりもはるかに高かった。
【０６８１】
１）ナイーブ群：未処理Ａ５４９細胞。
【０６８２】
２）自由取込み群：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖ＲＮＡを、細胞と共に直接的に１２時間インキュベートした。核酸の終濃度は１００ｎＭであった。
【０６８３】
３）ＲＮＡｉＭＡＸ群：２μｌ  ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間維持させ、細胞に添加し、その後混合した。一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。
【０６８４】
４）脂質および核酸の処理群：２．５μＬの単一脂質番号６４およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、煮沸法または逆相蒸散法により調製し、その後Ａ５４９細胞に添加した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。１２時間後、試料を収集して、進入の量を検出した。
【０６８５】
２．脂質による核酸送達の効率のデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）検出
２．１  実験材料：Ａ５４９細胞は、Ｃｅｌｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入し、ＴＲＩｚｏｌ溶解緩衝液は、Ｓｉｇｍａから購入し、高容量ｃＲＮＡ逆転写キットは、ＡＢＩ、ＵＳＡから購入し、デジタルＰＣＲ関連試薬は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＵＳＡから購入した。
【０６８６】
２．２  実験方法：全ＲＮＡを収集し、上記の方法に従ってＴＲＩｚｏｌ溶解緩衝液により抽出し、高容量ｃＲＮＡ逆転写キットを使用して、ｃＤＮＡへと逆転写し、異なる群に由来するｃＤＮＡを、デジタルＰＣＲ反応にかけた。プロトコールは、ＱＸ２００  Ｄｒｏｐｌｅｔ  ＲｅａｄｅｒおよびＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェアマニュアルを参照；結果をＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェアを使用して分析した。
【０６８７】
（１）ナイーブ群：いかなる処理もしていないＡ５４９細胞。
【０６８８】
（２）自由取込み群：細胞を、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７  ｄｓＲＮＡと共に直接的に６時間共インキュベートした。
【０６８９】
（３）ＲＮＡｉＭＡＸ群：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７  ｄｓＲＮＡを、ＲＮＡｉＭＡＸによりＡ５４９細胞内へとトランスフェクトし、６時間後に試料を検出のために収集した。
【０６９０】
（４）番号３８群：脂質番号３８は、異なる調製方法（煮沸法または逆相蒸散法）により、二本鎖ＲＮＡをＡ５４９細胞内へと送達した。６時間後に試料を検出のために収集した。
【０６９１】
実験結果および分析：図９３に示されているように、煮沸法または逆相蒸散法では、脂質番号３８は、ＨＪＴｓＲＮＡ−ｍ７  ｄｓＲＮＡをＡ５４９細胞内に効果的に送達することができた。
【０６９２】
３．脂質による核酸送達の効率のフローサイトメトリー検出
実験材料：Ａ５４９細胞（Ｃｅｌｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入）、ＦＡＭ−ｓＲＮＡ（Ｒｉｂｏｂｉｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．から購入）、脂質番号３８、Ａｃｃｕｒｉ（登録商標）Ｃ６機器（ＢＤ、ＵＳＡから購入）。
【０６９３】
実験方法：ＰＧＹ−ｓＲＮＡ−６−ＦＡＭを、１００μｌの水に溶解し、４μｌの脂質と混合し、煮沸法により脂質−ｓＲＮＡ混合物へと調製した。その後、混合物をＡ５４９細胞に滴下し、共インキュベーションの６時間後、試料を収集し、ＰＢＳで３回洗浄し、その後トリプシンで単離細胞へと消化し、洗浄してＰＢＳに再懸濁し、その後Ａｃｃｕｒｉ（登録商標）Ｃ６機器で検出するために吹下した。
【０６９４】
実験結果（図９４に示されている）：脂質番号３８は、７２．５％の効率でＰＧＹ−ｓＲＮＡ−６一本鎖ＲＮＡを送達した。これは、陽性対照ＲＮＡｉＭＡＸの効率と近かった。
【０６９５】
４．脂質により細胞に送達された核酸の位置を観察するための共焦点蛍光顕微鏡法
実験材料：Ａ５４９細胞（Ｃｅｌｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した）、ＰＧＹ−ｓＲＮＡ−６−Ｃｙ３（Ｒｉｂｏｂｉｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入した）、脂質番号３８、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７８０（Ｚｅｉｓｓ、ドイツから購入した）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ファロイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡから購入した）、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡから購入した）、パラホルムアルデヒド（ｓｉｇｍａ、ＵＳＡから購入した）。
【０６９６】
実験方法：ＰＧＹ−ｓＲＮＡ−６−ＦＡＭを、１００μｌの水に溶解し、４μｌの脂質と混合し、煮沸法により調製した。その後、混合物をＡ５４９細胞に滴下し、共インキュベーションの６時間後、試料をＰＢＳで３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ファロイジンで３０分間染色し、ＰＢＳで３回洗浄し、ＤＡＰＩで５分間染色し、ＰＢＳで洗浄し、その後密封した。
【０６９７】
実験結果（図９５に示されている）：赤色のＰＧＹ−ｓＲＮＡ−６−Ｃｙ３の進入を、共焦点顕微鏡で明白に観察することができた。脂質番号３８−ｓＲＮＡ混合物は、二本鎖核酸をＡ５４９細胞内へと効果的に送達することができた。
【０６９８】
［実施例７］
脂質番号６４およびその組成物の効果の検証
脂質番号６４ＰＥ（１５：０／２４：１（１５Ｚ））
【０６９９】
【化１３】
2020515616.tif 000029
【０７００】
１．脂質による核酸送達の効率の定量リアルタイムＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）検出
（１）異なる方法（煮沸法または逆相蒸散法）により調製された脂質番号６４は、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖ＲＮＡをＡ５４９細胞内へと送達した。
【０７０１】
図９６に示されているように、脂質６４は、異なる調製方法（煮沸法または逆相蒸散法）により、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖ＲＮＡをＡ５４９細胞内へと送達した。Ａ５４９細胞では、煮沸法の場合、脂質番号６４の送達効果は、ＲＮＡｉＭＡＸの送達効果の約３倍であった。
【０７０２】
１）ナイーブ群：未処理Ａ５４９細胞。
【０７０３】
２）自由取込み群：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７  ｄｓＲＮＡを、細胞と共に直接的に１２時間インキュベートした。核酸の終濃度は１００ｎＭであった。
【０７０４】
３）ＲＮＡｉＭＡＸ群：２μｌ  ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、混合し、１５分間維持させ、細胞に添加し、その後混合した。ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖の終濃度は、１００ｎＭであった。
【０７０５】
４）脂質および核酸の処理群：２．５μＬの単一脂質番号６４およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、煮沸法または逆相蒸散法により調製し、その後Ａ５４９細胞に添加した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。１２時間後、試料を収集して、進入の量を検出した。
【０７０６】
２．脂質による核酸送達の効率のフローサイトメトリー検出
実験材料：Ａ５４９細胞（Ｃｅｌｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入）、ＦＡＭ−ｓＲＮＡ（Ｒｉｂｏｂｉｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）、脂質番号６４、Ａｃｃｕｒｉ（登録商標）Ｃ６機器（ＢＤ、ＵＳＡから購入）。
【０７０７】
実験方法：ＦＡＭ−ｓＲＮＡを、１００μｌの水に溶解し、４μｌの脂質と混合し、煮沸法により調製した。その後、脂質−ｓＲＮＡ混合物をＡ５４９細胞に滴下し、共インキュベーションの６時間後、試料を収集し、ＰＢＳで３回洗浄し、その後トリプシンで単離細胞へと消化し、ＰＢＳに再懸濁し、その後Ａｃｃｕｒｉ（登録商標）Ｃ６機器で検出するために吹下した。
【０７０８】
実験結果（図９７に示されている）：脂質番号６４は、陽性対照ＲＮＡｉＭＡＸの効率の約半分（１／２）の効率で、ＰＧＹ−ｓＲＮＡ−６一本鎖ＲＮＡを送達した。
【０７０９】
３．脂質により細胞に送達された核酸の位置を観察するための共焦点蛍光顕微鏡法
実験材料：Ａ５４９細胞（Ｃｅｌｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した）、ＰＧＹ−ｓＲＮＡ−６−Ｃｙ３（Ｒｉｂｏｂｉｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入した）、脂質番号６４、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７８０（Ｚｅｉｓｓ、ドイツから購入した）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ファロイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡから購入した）、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡから購入した）、パラホルムアルデヒド（ｓｉｇｍａ、ＵＳＡから購入した）。
【０７１０】
実験方法：ＰＧＹ−ｓＲＮＡ−６−ＦＡＭを、１００μｌの水に溶解し、４μｌの脂質と混合し、煮沸法により調製した。その後、混合物をＡ５４９細胞に滴下し、共インキュベーションの６時間後、試料をＰＢＳで３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ファロイジンで３０分間染色し、ＰＢＳで３回洗浄し、ＤＡＰＩで５分間染色し、ＰＢＳで洗浄し、その後密封した。
【０７１１】
実験結果（図９８に示されている）：赤色のＰＧＹ−ｓＲＮＡ−６−Ｃｙ３の進入を、共焦点顕微鏡で明白に観察することができた。脂質番号６４は、一本鎖ＲＮＡをＡ５４９細胞内へと効果的に送達することができた。
【０７１２】
［実施例８］
脂質番号４０およびその組成物の効果の検証
脂質番号４０ＰＥ（１６：０／２２：１）
【０７１３】
【化１４】
2020515616.tif 000030
【０７１４】
１．脂質による核酸送達の効率の定量リアルタイムＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）検出
（１）異なる方法（煮沸法または逆相蒸散法）により調製された脂質番号４０は、二本鎖ＲＮＡをＡ５４９細胞内へと送達した。
【０７１５】
図９９に示されているように、異なる方法（煮沸法または逆相蒸散法）により調製された脂質番号４０は、二本鎖ＲＮＡをＡ５４９細胞内へと送達した。Ａ５４９細胞では、逆相蒸散法の場合、脂質番号４０の送達効果は、ＲＮＡｉＭＡＸの送達効果の約半分（１／２）であった。
【０７１６】
１）ナイーブ群：未処理Ａ５４９細胞。
【０７１７】
２）自由取込み群：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７  ｄｓＲＮＡを、細胞と共に直接的に１２時間インキュベートした。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０７１８】
３）ＲＮＡｉＭＡＸ群：２μＬ  ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μＬのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間維持させ、細胞に添加し、その後混合した。ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖の終濃度は１００ｎＭであった。
【０７１９】
４）脂質および核酸の処理群：２．５μＬの単一脂質番号４０およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、煮沸法または逆相蒸散法により調製し、Ａ５４９細胞に添加した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。１２時間後、試料を収集して、進入の量を検出した。
【０７２０】
２．脂質による核酸送達の効率のデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）検出
２．１  実験材料：Ａ５４９細胞は、Ｃｅｌｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入し、ＴＲＩｚｏｌ溶解緩衝液は、Ｓｉｇｍａから購入し、ＴａｑＭａｎ（商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＫｉｔＨｉｇｈは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入し、デジタルＰＣＲ関連試薬は、Ｂｉｏ−Ｒａｄから購入した。
【０７２１】
２．２  実験方法：全ＲＮＡを収集し、上記の方法に従ってＴＲＩｚｏｌ溶解緩衝液により抽出し、ＴａｑＭａｎ（商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＫｉｔＨｉｇｈを使用して、ｃＤＮＡへと逆転写し、異なる群に由来するｃＤＮＡを、デジタルＰＣＲ反応にかけた。プロトコールは、ＱＸ２００  Ｄｒｏｐｌｅｔ  ＲｅａｄｅｒおよびＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェアマニュアルを参照；結果をＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェアを使用して分析した。
【０７２２】
（１）ナイーブ群：いかなる処理もしていないＡ５４９細胞
【０７２３】
（２）自由取込み群：細胞を、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７  ｄｓＲＮＡと共に直接的に６時間共インキュベートした。
【０７２４】
（３）ＲＮＡｉＭＡＸ群：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７  ｄｓＲＮＡを、ＲＮＡｉＭＡＸによりＡ５４９細胞内へとトランスフェクトし、６時間後に試料を検出のために収集した。
【０７２５】
（４）番号４０群：異なる方法（煮沸法または逆相蒸散法）により調製した脂質番号４０は、二本鎖ＲＮＡをＡ５４９細胞内へと送達した。６時間後に試料を検出のために収集した。
【０７２６】
実験結果および分析：図１００に示されているように、煮沸法または逆相蒸散法では、脂質番号４０は、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７  ｄｓＲＮＡをＡ５４９細胞内へと効果的に送達することができた。
【０７２７】
３．脂質により細胞に送達された核酸の位置を観察するための共焦点蛍光顕微鏡法
実験材料：Ａ５４９細胞（Ｃｅｌｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した）、ＰＧＹ−ｓＲＮＡ−６−Ｃｙ３（Ｒｉｂｏｂｉｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入した）、脂質番号４０、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７８０（Ｚｅｉｓｓ、ドイツから購入した）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ファロイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡから購入した）、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡから購入した）、パラホルムアルデヒド（ｓｉｇｍａ、ＵＳＡから購入した）。
【０７２８】
実験方法：ＰＧＹ−ｓＲＮＡ−６−ＦＡＭを、１００μｌの水に溶解し、４μｌの脂質と混合し、煮沸法により調製した。その後、混合物をＡ５４９細胞に滴下し、共インキュベーションの６時間後、試料をＰＢＳで３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ファロイジンで３０分間染色し、ＰＢＳで３回洗浄し、ＤＡＰＩで５分間染色し、ＰＢＳで洗浄し、その後密封した。
【０７２９】
実験結果（図１０１に示されている）：赤色のＰＧＹ−ｓＲＮＡ−６−Ｃｙ３の進入を、共焦点顕微鏡で明白に観察することができた。脂質番号４０は、一本鎖ＲＮＡをＡ５４９細胞内へと効果的に送達することができた。
【０７３０】
４．脂質による核酸送達の効率のウエスタンブロッティング検出
図１０２に示されているように、ホスファチジルエタノールアミン単一脂質番号４０は、抗線維化二本鎖ＲＮＡ  ＨＪＴｓＲＮＡ−ｍ７がＭＲＣ−５細胞内へと進入して、フィブロネクチンタンパク質発現を下方制御することを媒介した。
【０７３１】
ＴＧＦ：ＴＧＦ−β１タンパク質（３ｎｇ／ｍＬの終濃度）を刺激のために添加し、７２時間後に試料を収集した。
【０７３２】
３’−ＮＣ群：脂質混合物を使用してＮＣ模倣体を送達し、２４時間後、細胞をＴＧＦ−β１タンパク質（終濃度は３ｎｇ／ｍＬであった）で刺激し、７２時間後に試料を収集した。
【０７３３】
３’−ｍ７群：脂質混合物およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖核酸溶液を、細胞に添加し、混合した。核酸の終濃度は４００ｎＭであった。
【０７３４】
［実施例８］
脂質番号３７の効果の検証
脂質番号３７ＬＰＣ（１８：３）
【０７３５】
【化１５】
2020515616.tif 000031
【０７３６】
１．脂質による核酸送達の効率の定量リアルタイムＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）検出
（１）脂質番号３７は、煮沸法により、一本鎖ＲＮＡをＡ５４９およびＭＲＣ−５細胞内へと送達した。
【０７３７】
図１０３に示されているように、一本鎖ＲＮＡは、煮沸法により、Ａ５４９およびＭＲＣ５細胞内へと送達された。
【０７３８】
１）ナイーブ群：未処理Ａ５４９細胞。
【０７３９】
２）自由取込み群：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７  ｄｓＲＮＡを、細胞と共に直接的に３時間インキュベートした。核酸の終濃度は１００ｎＭであった。
【０７４０】
３）ＲＮＡｉＭＡＸ群：２μＬ  ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μＬのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、混合し、１５分間維持させ、細胞に添加し、混合した。ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖の終濃度は、１００ｎＭであった。
【０７４１】
４）脂質および核酸の処理群：２．５μＬの単一脂質番号３９およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７一本鎖核酸溶液の混合物を、煮沸法または逆相蒸散法により調製し、Ａ５４９細胞に添加した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。３時間後、試料を収集して、進入の量を検出した。
【０７４２】
［実施例９］
脂質番号３９の効果の検証
脂質番号３９ＰＥ（１６：１−１８：１）
【０７４３】
【化１６】
2020515616.tif 000032
【０７４４】
１．脂質による核酸送達の効率の定量リアルタイムＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）検出
図１０４に示されているように、異なる方法（煮沸法または逆相蒸散法）により調製された脂質番号３９は、二本鎖ＲＮＡをＡ５４９細胞内へと送達した。
【０７４５】
１）ナイーブ群：未処理Ａ５４９細胞。
【０７４６】
２）自由取込み群：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７  ｄｓＲＮＡを、細胞と共に直接的に６時間インキュベートした。核酸の終濃度は１００ｎＭであった。
【０７４７】
３）ＲＮＡｉＭＡＸ群：２μＬ  ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μＬのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、混合し、１５分間維持させ、細胞に添加し、混合した。ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖の終濃度は１００ｎＭであった。
【０７４８】
４）脂質および核酸の処理群：２．５μＬの単一脂質番号３９およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、煮沸法または逆相蒸散法により調製し、Ａ５４９細胞に添加した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。１２時間後、試料を収集して、進入の量を検出した。
【０７４９】
２．脂質による核酸送達の効率のデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）検出
２．１  実験材料：Ａ５４９細胞は、Ｃｅｌｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入し、ＴＲＩｚｏｌ溶解緩衝液は、Ｓｉｇｍａから購入し、高容量ｃＲＮＡ逆転写キットは、ＡＢＩ、ＵＳＡから購入し、デジタルＰＣＲ関連試薬は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＵＳＡから購入した。
【０７５０】
２．２  実験方法：全ＲＮＡを収集し、上記の方法に従ってＴＲＩｚｏｌ溶解緩衝液により抽出し、高容量ｃＲＮＡ逆転写キットを使用してｃＤＮＡへと逆転写し、異なる群に由来するｃＤＮＡを、デジタルＰＣＲ反応にかけた。プロトコールは、ＱＸ２００  Ｄｒｏｐｌｅｔ  ＲｅａｄｅｒおよびＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェアマニュアルを参照；結果をＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェアを使用して分析した。
【０７５１】
（１）ナイーブ群：いかなる処理もしていないＡ５４９細胞。
【０７５２】
（２）自由取込み群：細胞を、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７  ｄｓＲＮＡと共に直接的に６時間；１２時間共インキュベートした。
【０７５３】
（３）ＲＮＡｉＭＡＸ群：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７  ｄｓＲＮＡを、ＲＮＡｉＭＡＸによりＡ５４９細胞内へとトランスフェクトし、６時間後、１２時間後に試料を検出のために収集した。
【０７５４】
（４）番号３９群：脂質番号３９は、逆相蒸散法により、二本鎖ＲＮＡをＡ５４９細胞内へと送達した。６時間、１２時間後に試料を検出のために収集した。
【０７５５】
図１０５に示されているように、逆相蒸散法により、脂質番号３９は、ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７  ｄｓＲＮＡをＡ５４９細胞内へと効果的に送達することができた。
【０７５６】
［実施例１０］
脂質番号６０および番号６１２の効果の検証
脂質番号６０  ｄＭｅＰＥ（１６：１／１６：１）
【０７５７】
【化１７】
2020515616.tif 000033
【０７５８】
１．脂質による核酸送達の効率の定量リアルタイムＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）検出
図１０６に示されているように、異なる方法（煮沸法または逆相蒸散法）により調製された脂質番号６０は、二本鎖ＲＮＡをＡ５４９細胞内へと送達した。
【０７５９】
７）ナイーブ群：未処理Ａ５４９細胞。
【０７６０】
８）自由取込み群：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７  ｄｓＲＮＡを、細胞と共に直接的に６時間インキュベートした。核酸の終濃度は１００ｎＭであった。
【０７６１】
ＲＮＡｉＭＡＸ群：２μＬ  ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μＬのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間維持させ、細胞に添加し、その後混合した。二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は１００ｎＭであった。
【０７６２】
４）脂質および核酸：２．５μＬの単一脂質番号６０およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、煮沸法または逆相蒸散法により調製し、細胞に添加した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。１２時間後、試料を収集して、進入の量を検出した。
【０７６３】
脂質番号６２  ｄＭｅＰＥ（１６：１／１８：１）
１．脂質による核酸送達の効率の定量リアルタイムＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）検出
図１０７に示されているように、異なる方法（煮沸法または逆相蒸散法）により調製した脂質番号６２は、二本鎖ＲＮＡをＡ５４９細胞内へと送達した。
【０７６４】
１）ナイーブ群：未処理Ａ５４９細胞。
【０７６５】
２）自由取込み群：ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７  ｄｓＲＮＡを、細胞と共に直接的に６時間インキュベートした。核酸の終濃度は１００ｎＭであった。
【０７６６】
３）ＲＮＡｉＭＡＸ群：２μＬ  ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および二本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μＬのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間維持させ、細胞に添加し、その後混合した。ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖の終濃度は１００ｎＭであった。
【０７６７】
４）脂質および核酸の処理群：２．５μＬの単一脂質番号６２およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、煮沸法または逆相蒸散法により調製し、細胞に添加した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。１２時間後、試料を収集して、進入の量を検出した。
【０７６８】
脂質核酸混合物のＩｎ  ｖｉｖｏ送達実験
１．実験動物：Ｃ５７マウス、雄、およそ６週齢。
【０７６９】
２．脂質混合物の製造：調製は、マウス１匹当たり１０μｌの脂質−１ｎｍｏｌ  ｓＲＮＡの用量に基づき以下のように実施した：１ｎｍｏｌの各ｓＲＮＡを、５００μｌのＤＥＰＣ水に溶解し、１０μｌの対応する脂質を添加し、ピペットして徹底的に混合し、次いで９０℃にて１５分間の水浴後に自然冷却し、胃管栄養で投与する。
【０７７０】
３．ｓＲＮＡ：ＰＧＹ−ｓＲＮＡ−２６、ＰＧＹｓＲＮＡ−３２
【０７７１】
４．実験群：
１）ナイーブ群：５００μｌの生理食塩水の胃内投与。
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：１０μｌのＲＮＡｉＭＡＸ−１ｎｍｏｌ  ｓＲＮＡを、徹底的に混合し、各マウスに胃内投与した。この群は、陽性対照群としての役目を果たした。ＲＮＡｉＭＡＸは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。
３）自由取込み群：ｓＲＮＡ溶液（１ｎｍｏｌ／動物、５００μＬ）を直接添加した。この群は対照としての役目を果たした。
４）脂質核酸混合物の処理群：ステップ２で調製した脂質−ｓＲＮＡ混合物を胃内投与した。
【０７７２】
５．進入の相対量の検出
１）組織サンプリングおよびＲＮＡの抽出：マウスに胃管栄養した６時間後に、５００μｌの血液を眼球から採取し、１．５ｍｌのＴｒｉｚｏｌ試薬ＬＳを添加して徹底的に混合および溶解し、３ｍｌのＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した）を組織試料に添加し、完全に溶解するまでホモジナイズする。組織はサンプリングした：肝臓／胃／小腸。
【０７７３】
２）ｃＤＮＡへのｓＲＮＡの逆転写：逆転写キット（高容量ｃＤＮＡ逆転写キット、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３６８８１３）を使用して、全ＲＮＡをｃＤＮＡへと逆転写した。逆転写系は以下の通りであった：鋳型ＲＮＡ（１５０ｎｇ／μＬ）１０μＬ、１０×ＲＴ緩衝液、２．０μＬ、２５×ｄＮＴＰミックス（１００ｍＭ）０．８μＬ、ランダムプライマー  ２．０μＬ、ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ（商標）逆転写酵素  １．０μＬ、ＲＮａｓｅ阻害剤  １．０μＬ、無ヌクレアーゼＨ２Ｏ  ３．２μＬ。短時間遠心分離した後、反応をＰＣＲ反応器にロードした。反応条件は以下の通りであった：（１）２５℃、１０分間；（２）３７℃、１２０分間；（３）８５℃、５分間；（４）４℃、反応停止。反応後に２０μＬの無ＲＮａｓｅ  ｄｄＨ２Ｏを添加して、最終容積を４０μＬにした。
【０７７４】
３）定量ＰＣＲ増幅反応：ｑＰＣＲ反応系は、５μｌの２×ＳＹＢＲグリーンマスターミックス、０．５μｌのフォワードプライマー（１０μＭ）、０．５μＬのリバースプライマー、逆転写による１μｌのｃＤＮＡ、３μｌの無ＲＮａｓｅ  ｄＨ２Ｏを含む１０μｌの全容積を有していた。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０蛍光定量ＰＣＲ機器を使用した。ＰＣＲ反応条件は以下の通りであった：９５℃で５分間のプレ変性、その後ＰＣＲ増幅サイクル：（１）９５℃、１０秒間；（２）５５℃、１０秒間；（３）７２℃、２０秒間；合計４０サイクル；最後に４０℃で１０秒間の冷却。増幅反応のフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｑｉｎｇ  ｋｅ  Ｎｅｗ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．により設計および合成された。（Ｕ６  Ｆプライマー：ＧＣＧＣＧＴＣＧＴＧＡＡＧＣＧＴＴＣ、Ｕ６  Ｒプライマー：ＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴ）。
【０７７５】
３）相対発現量を、２−ΔＣｔ法で算出した。
【０７７６】
［実施例１１−１］
単一脂質番号４１による一本鎖核酸のｉｎ  ｖｉｖｏでの送達
１．実験動物：Ｃ５７マウス、雄、およそ６週齢。
１）ナイーブ群：５００μｌの生理食塩水の胃内投与。
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：１０μｌのＲＮＡｉＭＡＸ−１ｎｍｏｌ  ｓＲＮＡを混合し、各マウスに胃内投与した。この群は、陽性対照群としての役目を果たした。ＲＮＡｉＭＡＸは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。
３）自由取込み群：一本鎖ｓＲＮＡ混合物溶液（各１ｎｍｏｌ）を直接添加した（各１ｎｍｏｌ）
４）単一脂質および核酸混合物の処理群：１０μＬの単一脂質（番号４１）と一本鎖ｓＲＮＡ混合物溶液（ＰＧＹ−ｓＲＮＡ−２３、ＰＧＹ−ｓＲＮＡ−２６、およびＰＧＹ−ｓＲＮＡ−３２、各１ｎｍｏｌ）との混合物を、加熱法により処理し、その後胃内投与でマウスに投与した。
【０７７７】
２．胃内投与の１２時間後、眼球から血液を採取し、種々の組織（肝臓／胃／小腸）をサンプリングした。ＴＲＩｚｏｌを使用して完全に溶解し、ＲＮＡを抽出して、進入の量を検出した。
【０７７８】
結論：
図１０８に示されているように、単一ＰＥ（番号４１）は、ｓＲＮＡ一本鎖核酸を、経口投与によりマウス血液中へと効果的に送達し、ｓＲＮＡを分解から保護することができた。送達効果は、ＰＯＰＣおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸよりも良好であった。
【０７７９】
図１０９に示されているように、単一ＰＥ（番号４１）は、ｓＲＮＡ一本鎖核酸を、経口投与によりマウス胃内へと効果的に送達し、ｓＲＮＡを分解から保護することができた。
【０７８０】
図１１０に示されているように、単一ＰＥ（番号４１）は、ｓＲＮＡ一本鎖核酸を、経口投与によりマウス小腸内へと効果的に送達し、ｓＲＮＡを分解から保護することができた。
【０７８１】
図１１１に示されているように、単一ＰＥ（番号４１）は、ｓＲＮＡ一本鎖核酸を、経口投与によりマウス肝臓内へと効果的に送達し、ｓＲＮＡを分解から保護することができた。
【０７８２】
［実施例１１−２］
ｉｎ  ｖｉｖｏでの単一脂質番号３８による一本鎖核酸の送達
１．実験動物：Ｃ５７マウス、雄、およそ６週齢。
１）ナイーブ群：５００μｌの生理食塩水の胃内投与。
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：１０μｌのＲＮＡｉＭＡＸ−１ｎｍｏｌ  ｓＲＮＡを混合し、各マウスに胃内投与した。この群は、陽性対照群としての役目を果たした。ＲＮＡｉＭＡＸは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。
３）自由取込み群：一本鎖ｓＲＮＡ混合物溶液（各１ｎｍｏｌ）を直接添加した（各１ｎｍｏｌ）。
４）ＰＯＰＣおよび核酸の処理群：加熱法により処理した、１０μＬのＰＯＰＣおよび一本鎖ＰＧＹ−ｓＲＮＡ−３２  ｓＲＮＡ（各１ｎｍｏｌ）混合物溶液の混合物を、胃管栄養によりマウスに投与した。
５）単一脂質および核酸混合物の処理群：加熱法により処理した、１０μＬの単一脂質（番号３８）および一本鎖ｓＲＮＡ（ＰＧＹ−ｓＲＮＡ−３２）混合物溶液（各１ｎｍｏｌ）の混合物を、経管栄養によりマウスに投与した。
【０７８３】
２．胃管栄養の１２時間後に、眼球から血液を採取し、進入の量を検出するために、ＴＲＩｚｏｌにより溶解して、ＲＮＡを抽出した。
【０７８４】
結論：
図１１２に示されているように、単一ＰＥ（番号３８）は、ｓＲＮＡ一本鎖核酸を、経口投与によりマウス血液中へと効果的に送達することができた。送達効果は、ＰＯＰＣおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸよりも良好であった。
【０７８５】
［実施例１１−３］
ｉｎ  ｖｉｖｏでの単一脂質番号４０による一本鎖核酸の送達
１．実験動物：Ｃ５７マウス、雄、およそ６週齢。
１）ナイーブ群：５００μｌの生理食塩水の胃内投与。
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：１０μｌのＲＮＡｉＭＡＸ−１ｎｍｏｌ  ｓＲＮＡを混合し、各マウスに胃内投与した。この群は、陽性対照群としての役目を果たした。ＲＮＡｉＭＡＸは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。
３）自由取込み群：一本鎖ｓＲＮＡ混合物溶液を直接添加した（各１ｎｍｏｌ）。
４）ＰＯＰＣおよび核酸の処理群：加熱法により処理した、１０μＬのＰＯＰＣおよび一本鎖ｓＲＮＡ（各１ｎｍｏｌ）混合物溶液の混合物を、胃管栄養によりマウスに投与した。
５）単一脂質および核酸混合物の処理群：加熱法により処理した、１０μＬの単一脂質（番号４０）および一本鎖ｓＲＮＡ（ＰＧＹ−ｓＲＮＡ−３２およびＰＧＹ−ｓＲＮＡ−２６、各１ｎｍｏｌ）混合物溶液の混合物を、経管栄養によりマウスに投与した。
【０７８６】
２．胃管栄養の１２時間後に、眼球から血液を採取し、進入の量を検出するために、ＴＲＩｚｏｌにより溶解して、ＲＮＡを抽出した。
【０７８７】
結論：
図１１３に示されているように、単一ＰＥ（番号４０）は、ｓＲＮＡ一本鎖核酸を、経口投与によりマウス血液中へと効果的に送達することができた。送達効果は、ＰＯＰＣおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸよりも良好であった。
【０７８８】
［実施例１１−４］
ｉｎ  ｖｉｖｏでの単一脂質番号６４による一本鎖核酸の送達
１．実験動物：Ｃ５７マウス、雄、およそ６週齢。
１）ナイーブ群：５００μｌの生理食塩水の胃内投与。
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：１０μｌのＲＮＡｉＭＡＸ−１ｎｍｏｌ  ｓＲＮＡを混合し、各マウスに胃内投与した。この群は、陽性対照群としての役目を果たした。ＲＮＡｉＭＡＸは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。
３）自由取込み群：一本鎖ｓＲＮＡ混合物溶液を直接添加した（各１ｎｍｏｌ）。
４）ＰＯＰＣおよび核酸の処理群：加熱法により処理した、１０μＬのＰＯＰＣおよび一本鎖ｓＲＮＡ（各１ｎｍｏｌ）混合物溶液の混合物を、胃管栄養によりマウスに投与した。
５）単一脂質および核酸混合物の処理群：加熱法により処理した、１０μＬの単一脂質（番号６４）および一本鎖ｓＲＮＡ（ＰＧＹ−ｓＲＮＡ−３２、各１ｎｍｏｌ）混合物溶液の混合物を、経管栄養によりマウスに投与した。
【０７８９】
２．胃管栄養の１２時間後に、眼球から血液を採取し、進入の量を検出するために、ＴＲＩｚｏｌにより溶解して、ＲＮＡを抽出した。
【０７９０】
結論：
図１１４に示されているように、単一ＰＥ（番号６４）は、ｓＲＮＡ一本鎖核酸を、経口投与によりマウス血液中へと効果的に送達することができた。送達効果は、ＰＯＰＣおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸよりも良好であった。
【０７９１】
［実施例１１−５］
ｉｎ  ｖｉｖｏでの単一脂質番号７１による一本鎖核酸の送達
１．実験動物：Ｃ５７マウス、雄、およそ６週齢。
１）ナイーブ群：５００μｌの生理食塩水の胃内投与。
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：１０μｌのＲＮＡｉＭＡＸ−１ｎｍｏｌ  ｓＲＮＡを混合し、各マウスに胃内投与した。この群は、陽性対照群としての役目を果たした。ＲＮＡｉＭＡＸは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。
３）自由取込み群：一本鎖ｓＲＮＡ混合物溶液を直接添加した（各１ｎｍｏｌ）。
４）ＰＯＰＣおよび核酸の処理群：加熱法により処理した、１０μＬのＰＯＰＣおよび一本鎖ｓＲＮＡ（各１ｎｍｏｌ）混合物溶液の混合物を、胃管栄養によりマウスに投与した。
５）単一脂質および核酸混合物の処理群：加熱法により処理した、１０μＬの単一脂質（番号７１）および一本鎖ｓＲＮＡ混合物（ＰＧＹ−ｓＲＮＡ−３２、各１ｎｍｏｌ）溶液の混合物を、経管栄養によりマウスに投与した。
【０７９２】
２．胃管栄養の１２時間後に、眼球から血液を採取し、進入の量を検出するために、ＴＲＩｚｏｌにより溶解して、ＲＮＡを抽出した。
【０７９３】
結論：
図１１５に示されているように、単一ＰＥ（番号７１）は、ｓＲＮＡ一本鎖核酸を、経口投与によりマウス血液中へと効果的に送達することができた。送達効果は、ＰＯＰＣおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸよりも良好であった。
【０７９４】
［実施例１２］
脂質は、様々な温度勾配にて、一本鎖核酸をＭＲＣ−５細胞内へと効果的に送達する。
１．実験群：
１）ナイーブ群：未処理細胞。
２）ＲＮＡｉＭＡＸ処理群：２μＬ  ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬および一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液を、１００μＬのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地でそれぞれ希釈し、その後、２つを混合し、１５分間維持させ、細胞に添加し、その後混合した。一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の終濃度は、１００ｎＭであった。
３）単一脂質および核酸混合物の処理群：異なる温度にて煮沸法により処理した、２．５μＬの単一脂質（番号３８）およびＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７二本鎖核酸溶液の混合物を、細胞に添加し、その後混合した。ＲＮＡの終濃度は１００ｎＭであった。
【０７９５】
４℃：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液に、２．５μＬの単一脂質を添加し、１５分間４℃に置いておいた。細胞に添加した６時間後に、細胞でのＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の発現レベルをＲＴ−ｑＰＣＲにより検出した。
【０７９６】
３７℃：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液に、２．５μＬの単一脂質を添加し、１５分間３７℃に置いておいた。細胞に添加した６時間後に、細胞でのＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の発現レベルをＲＴ−ｑＰＣＲにより検出した。
【０７９７】
６０℃：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液に、２．５μＬの単一脂質を添加し、１５分間５０℃に置いておいた。細胞に添加した６時間後に、細胞でのＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の発現レベルをＲＴ−ｑＰＣＲにより検出した。
【０７９８】
８０℃：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液に、２．５μＬの単一脂質を添加し、１５分間５０℃に置いておいた。細胞に添加した６時間後に、細胞でのＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の発現レベルをＲＴ−ｑＰＣＲにより検出した。
【０７９９】
１００℃：１００μＬの一本鎖ＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７溶液に、２．５μＬの単一脂質を添加し、１５分間５０℃に置いておいた。細胞に添加した６時間後に、細胞でのＨＪＴ−ｓＲＮＡ−ｍ７の発現レベルをＲＴ−ｑＰＣＲにより検出した。
【０８００】
結論：
図１１６に示されているように、結果は、異なる温度条件での煮沸法による脂質が、核酸を細胞内へと効果的に送達することができ（統計的に有意に、ｐ＜０．０１）、臨床の場面で核酸薬の送達効率を向上させる可能性を有していたことを示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９７】
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【図９８】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０２】
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【図１０３】
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【図１０４】
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【図１０５】
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【図１０６】
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【図１０７】
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【図１０８】
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【図１０９】
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【図１１０】
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【図１１１】
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【図１１２】
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【図１１３】
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【図１１４】
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【図１１５】
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【図１１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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